CN109232726B

CN109232726B - 蛋白质OsVPE2在调控植物液泡无机磷输出能力中的应用

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Publication number: CN109232726B
Application number: CN201811318436.XA
Authority: CN
Inventors: 易可可; 徐磊; 赵红玉
Original assignee: Institute of Agricultural Resources and Regional Planning of CAAS
Current assignee: Institute of Agricultural Resources and Regional Planning of CAAS
Priority date: 2018-11-07
Filing date: 2018-11-07
Publication date: 2020-11-24
Anticipated expiration: 2038-11-07
Also published as: CN109232726A

Abstract

本发明公开了蛋白质OsVPE2在调控植物液泡无机磷输出能力中的应用。蛋白质OsVPE2的氨基酸序列如序列表中序列3所示。提高出发植物中蛋白质OsVPE2的表达量和/或活性，得到转OsVPE2基因植物；与水稻品种石狩白毛相比，转OsVPE2基因植物的液泡无机磷输出能力提高，液泡里的无机磷浓度降低。抑制出发植物中蛋白质OsVPE2的表达量和/或活性，得到OsVPE2基因敲除水稻植株；与水稻品种石狩白毛相比，OsVPE2基因敲除水稻植株的液泡无机磷输出能力降低，液泡里的无机磷浓度增加。由此可见，蛋白质OsVPE2可以调控植物液泡无机磷输出能力，进而调节液泡里的无机磷浓度。本发明具有重要的应用价值。

Description

蛋白质OsVPE2在调控植物液泡无机磷输出能力中的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及蛋白质OsVPE2在调控植物液泡无机磷输出能力中的应用。

背景技术

磷素是植物生长发育所必需的大量元素，是许多代谢物和生物大分子的重要组分，并且在能量转化和信号转导等生化过程中起重要作用。当土壤缺磷时，植物一般会出现生长矮小、分蘖减少和产量降低等现象。因此，提高作物磷肥利用率，减少磷肥施用量，对水稻优质高产、保护环境都有重要的作用。而充分了解植物磷素吸收和利用的分子生理机制，是提高植物磷素吸收和利用效率的前提。

植物通过磷酸盐转运体从外界吸收磷酸盐并分配到不同的器官。对植物进行磷吸收动力学分析表明，高等植物中同时存在两种磷酸盐吸收转运系统：一类是在磷供应充足时负责磷吸收和转运的低亲和磷酸盐转运体；另一类是在磷供应不足时诱导表达，增加有效磷的吸收和转运的高亲和磷酸盐转运体，高亲和磷酸盐转运体是植物从根部吸收磷的主要系统。目前已知的磷酸转运体有：质膜定位的PHT1家族，主要负责从根部吸收土壤中的无机磷；PHT3家族负责将细胞质中的无机磷向线粒体内转运；PHT2家族，PHT4家族，XPT，TPT，PPT，GPT1主要负责叶绿体和高尔基体的无机磷转运；PHO1定位于内质网和高尔基体，主要在根的木质部表达，负责无机磷从根到地上部的转移。

植物中的大部分无机磷储存于液泡中，当无机磷缺乏时，液泡中的无机磷被释放到细胞质来维持细胞质中的无机磷水平。所以，液泡中磷素的储存和输出对于维持植物中的磷素平衡非常重要。提高作物中液泡磷的输出，有利于提高磷素的利用效率。

发明内容

本发明的目的是提高植物液泡磷的输出能力，从而提高磷素的利用效率。

本保护首先保护蛋白质OsVPE2的应用可为X1)或X2)或X3)或X4)：

X1)调控植物液泡无机磷输出能力；

X2)调控植物液泡里的无机磷浓度；

X3)调控植物无机磷输出能力；

X4)调控植物的无机磷浓度。

上述应用中，所述蛋白质OsVPE2可为a1)或a2)或a3)：

a1)氨基酸序列是序列表中序列3所示的蛋白质；

a2)在序列表中序列3所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；

a3)将序列表中序列3所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与植物液泡无机磷输出能力和/或植物液泡里的无机磷浓度和/或植物无机磷输出能力和/或植物的无机磷浓度相关的蛋白质。

其中，序列表中序列3由499个氨基酸残基组成。

为了使a1)中的蛋白质便于纯化，可在序列表中序列3所示的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1.标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
FLAG	8	DYKDDDDK
			Strep-tag II	8	WSHPQFEK
c-myc	10	EQKLISEEDL

上述a3)中的蛋白质，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

上述a3)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

上述a3)中的蛋白质的编码基因可通过将序列表中序列2所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

本发明还保护编码上述任一所述蛋白质OsVPE2的核酸分子的应用，可为X1)或X2)或X3)或X4)：

X1)调控植物液泡无机磷输出能力；

X2)调控植物液泡里的无机磷浓度；

X3)调控植物无机磷输出能力；

X4)调控植物的无机磷浓度。

上述应用中，所述编码蛋白质OsVPE2的核酸分子可为如下b1)或b2)或b3)或b4)或b5)所示的DNA分子：

b1)编码区如序列表中序列2所示的DNA分子；

b2)核苷酸序列是序列表中序列2所示的DNA分子；

b3)核苷酸序列是序列表中序列1所示的DNA分子；

b4)与b1)或b2)或b3)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述蛋白质OsVPE2的DNA分子；

b5)在严格条件下与b1)或b2)或b3)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述蛋白质OsVPE2的DNA分子。

其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。

其中，序列表中序列1由1585个核苷酸组成，序列表中序列2由1500个核苷酸组成，序列表中序列2的核苷酸编码序列表中序列3所示的氨基酸序列。

本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码所述蛋白质OsVPE2的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的所述蛋白质OsVPE2的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码所述蛋白质OsVPE2，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码序列表的序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质OsVPE2的核苷酸序列具有75％或更高，或80％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

上述任一所述的应用中，所述调控植物液泡无机磷输出能力可为提高植物液泡无机磷输出能力或降低植物液泡无机磷输出能力。所述调控植物液泡里的无机磷浓度可为增加植物液泡里的无机磷浓度或降低植物液泡里的无机磷浓度。所述调控植物无机磷输出能力可为提高植物无机磷输出能力或降低植物无机磷输出能力。所述调控植物的无机磷浓度可为增加植物的无机磷浓度或降低植物的无机磷浓度。

本发明还保护一种培育转基因植物甲的方法，可包括如下步骤：提高出发植物中上述任一所述蛋白质OsVPE2的表达量和/或活性，得到转基因植物甲；与出发植物相比，转基因植物甲的液泡无机磷输出能力提高和/或液泡里的无机磷浓度降低和/或无机磷输出能力提高和/或无机磷浓度降低。

上述方法中，所述“提高出发植物中所述蛋白质OsVPE2的表达量和/或活性”可通过转基因、多拷贝、改变启动子、调控因子等本领域熟知的方法，达到增加植物中所述蛋白质OsVPE2表达量和/或活性的效果。

上述方法中，所述“提高出发植物中所述蛋白质OsVPE2的表达量和/或活性”具体可通过向出发植物中导入编码所述蛋白质OsVPE2的核酸分子实现。

上述方法中，所述“向出发植物中导入编码所述蛋白质OsVPE2的核酸分子”可通过向出发植物中导入重组载体实现；所述重组载体可为向表达载体插入编码所述蛋白质OsVPE2的核酸分子，得到的重组质粒。所述重组载体可为实施例提及的重组质粒pCAMBIA1300-35S-OsVPE2-rbcs。所述重组质粒pCAMBIA1300-35S-OsVPE2-rbcs具体是将序列表中的序列2所示的DNA分子插入pCAMBIA1300-35S-rbcs载体的限制性内切酶KpnI和SalI识别位点之间，得到的重组质粒。

所述转基因植物甲具体可为实施例提及的OsVPE2-OE-1至OsVPE2-OE-28。

本发明还保护一种培育转基因植物乙的方法，可包括如下步骤：抑制出发植物中上述任一所述蛋白质OsVPE2的表达量和/或活性，得到转基因植物乙；与出发植物相比，转基因植物乙的液泡无机磷输出能力降低和/或液泡里的无机磷浓度增加和/或无机磷输出能力降低和/或无机磷浓度增加。

上述方法中，所述“抑制出发植物中所述蛋白质OsVPE2的表达量和/或活性”可通过基因定点编辑、RNA干扰、同源重组、基因敲除等本领域熟知的方法，达到抑制所述蛋白质OsVPE2的表达量和/或活性的目的。

上述方法中，所述“抑制出发植物中所述蛋白质OsVPE2的表达量和/或活性”具体可为使出发植物含有CRISPR-Cas9系统；所述CRISPR-Cas9系统中含有sgRNA；所述sgRNA识别的靶标可为出发植物的OsVPE2基因，对出发植物中的OsVPE2基因进行基因编辑。

上述方法中，所述“使出发植物含有CRISPR-Cas9系统”具体可通过向出发植物中导入含有CRISPR-Cas9系统的载体实现。

上述方法中，所述sgRNA识别的靶位点可为5’-CAAAGTTGGGGTCCTCTCCA-3’。

上述方法中，所述“含有CRISPR-Cas9系统的载体”可为实施例提及的载体pYLCRISPR/Cas9-OsVPE2。所述载体pYLCRISPR/Cas9-OsVPE2可为根据植物CRISPR/Cas9载体系统靶位点的要求，选择OsVPE2基因的靶序列为5’-CAAAGTTGGGGTCCTCTCCA-3’，然后按照文献(Ma X，Zhang Q，Zhu Q，Liu W，Chen Y，Qiu R，Wang B，Yang Z，Li H，Lin Y，Xie Y，Shen R，Chen S，Wang Z，Chen Y，Guo J，Chen L，Zhao X，Dong Z，Liu YG(2015)A RobustCRISPR/Cas9 System for Convenient，High-Efficiency Multiplex Genome Editing inMonocot and Dicot Plants.Mol Plant 8:1274-1284)中的方法构建而成。

所述转基因植物乙具体可为实施例提及的水稻纯合突变体Osvpe2。与水稻品种石狩白毛相比，水稻纯合突变体Osvpe2两条同源染色体上OsVPE2基因的相同位置(具体为序列表中序列1自5’末端起第195位)均插入一个碱基C。由于碱基C的插入，导致OsVPE2基因的阅读框移码，进而蛋白质OsVPE2的功能失活，蛋白质OsVPE2的表达量和/或活性受到抑制。

本发明还保护一种植物育种方法，可包括如下步骤：增加植物中上述任一所述蛋白质OsVPE2的含量和/或活性，从而提高液泡无机磷输出能力和/或降低液泡里的无机磷浓度和/或提高无机磷输出能力和/或降低无机磷浓度。

本发明还保护一种植物育种方法，可包括如下步骤：降低植物中上述任一所述蛋白质OsVPE2的含量和/或活性，从而降低液泡无机磷输出能力和/或增加液泡里的无机磷浓度和/或降低无机磷输出能力和/或增加无机磷浓度。

上述任一所述植物可为如下c1)至c5)中的任一种：c1)双子叶植物；c2)单子叶植物；c3)禾本科植物；c4)水稻；c5)水稻品种石狩白毛。

实验证明，向水稻品种石狩白毛中导入重组质粒pCAMBIA1300-35S-OsVPE2-rbcs，得到转OsVPE2基因植物；与水稻品种石狩白毛相比，转OsVPE2基因植物的液泡无机磷输出能力提高，液泡里的无机磷浓度降低。向水稻品种石狩白毛中导入载体pYLCRISPR/Cas9-OsVPE2，得到OsVPE2基因敲除水稻植株；与水稻品种石狩白毛相比，OsVPE2基因敲除水稻植株的液泡无机磷输出能力降低，液泡里的无机磷浓度增加。由此可见，蛋白质OsVPE2可以调控植物液泡无机磷输出能力，进而调节液泡里的无机磷浓度。本发明具有重要的应用价值。

附图说明

图1为pCAMBIA1300-35S-rbcs载体的图谱。

图2为水稻品种石狩白毛植株和OsVPE2-OE-23超表达植株根中液泡内的无机磷浓度测定结果。

图3为水稻品种石狩白毛植株和纯合突变体Osvpe2植株根中液泡内的无机磷浓度测定结果。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

光照交替培养即光培养和暗培养交替，条件为：30℃；12小时光照培养/22℃；12小时黑暗培养；光照培养时的光照强度为3000Lux。

诱导培养基：取N6大量50mL、B5微量10mL、NB有机10mL、铁盐10mL、2.0mg 2，4-D、0.5g L-谷氨酰胺、2.8g L-脯氨酸、0.3g水解酪蛋白和30g蔗糖，用蒸馏水定容至1L，然后调节pH值至5.8，加入4g植物凝胶。121℃高压灭菌15min。

共培养基：取N6大量50mL、B5微量10mL、NB有机10mL、铁盐10mL、2.0mg 2，4-D、0.5gL-谷氨酰胺、2.8g L-脯氨酸、0.6g水解酪蛋白、10g葡萄糖和30g蔗糖，用蒸馏水定容至1L，然后调节pH值至5.2，加入4g植物凝胶。121℃高压灭菌15min。恢复至常温后，加入乙酰丁香酮并使其在体系中的浓度为200μmol/L。

选择培养基：取N6大量50mL、B5微量10mL、NB有机10mL、铁盐10mL、2.0mg 2，4-D、0.5g L-谷氨酰胺、2.8g L-脯氨酸、0.6g水解酪蛋白和30g蔗糖，用蒸馏水定容至1L，然后调节pH值至5.8，加入4g植物凝胶。121℃高压灭菌15min。恢复至常温后，加入潮霉素和头孢，并使潮霉素在体系中的浓度为50mg/L，头孢在体系中的浓度为500mg/L。

分化培养基：取N6大量50mL、B5微量10mL、NB有机10mL、铁盐10mL、0.5g L-谷氨酰胺、0.5g L-脯氨酸、1.0g水解酪蛋白、3.0mg 6-BA、0.5mg NAA、30g蔗糖和20g山梨醇，用蒸馏水定容至1L，然后调节pH值至5.8，加入4g植物凝胶。121℃高压灭菌15min。

生根培养基：取N6大量50mL、B5微量10mL、NB有机10mL、铁盐10mL和20g蔗糖，用蒸馏水定容至1L，然后调节pH值至5.8，加入3.5g植物凝胶。121℃高压灭菌15min。

AAM转化液：取AA大量100mL、B5微量10mL、NB有机10mL、铁盐10mL、0.3g水解酪蛋白和30g麦芽糖，用蒸馏水定容至1L，然后调节pH值至5.5。121℃高压灭菌15min。恢复至常温后，加入乙酰丁香酮并使其在体系中的浓度为200μmol/L。

N6大量：将硝酸钾56.6g、氯化钙3.32g、硫酸镁2.70g、磷酸二氢钾8.0g和硫酸铵9.26g溶于水，然后用水定容至1L。

B5微量：将碘化钾0.0750g、硼酸0.30g、硫酸锰1.0g、硫酸锌0.2g和硫酸铜0.0025g溶于水，然后用水定容至1L。

NB有机：将烟酸1g、盐酸吡哆醇1g、盐酸硫胺素10g和肌醇10g溶于水，然后用水定容至1L。

铁盐：将硫酸亚铁2.78g和乙二铵四乙酸二钠3.73g溶于水，然后用水定容至1L。

AA大量：将氯化钾2.95g、氯化钙0.15g、硫酸镁0.25g和磷酸二氢钾0.15g溶于水，然后用水定容至1L。

水稻标准营养液的配方见表2。

表2

试剂	g/10L
		NH<sub>4</sub>NO<sub>3</sub>	0.914
CaCl<sub>2</sub>	0.886
		MgSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O	3.240
K<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>	0.714
		NaH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>·2H<sub>2</sub>O	0.403
Na<sub>2</sub>EDTA·2H<sub>2</sub>O	0.09315
		FeSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O	0.06965
MnCl<sub>2</sub>·4H<sub>2</sub>O	0.015
		H<sub>3</sub>BO<sub>3</sub>	0.00934
(NH<sub>4</sub>)<sub>6</sub>·Mo<sub>7</sub>O<sub>24</sub>·4H<sub>2</sub>O	0.000074
		ZnSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O	0.000035
CuSO<sub>4</sub>·5H<sub>2</sub>O	0.000031

水稻基因组中，OsVPE2基因的核苷酸序列如序列表中序列1所示，其编码区的核苷酸序列如序列表中序列2所示。序列表中的序列2所示的DNA分子编码序列表中的序列3所示的OsVPE2蛋白。

实施例1、转OsVPE2基因水稻的液泡输出无机磷的能力提高

一、重组质粒pCAMBIA1300-35S-OsVPE2-rbcs的构建

1、取水稻品种日本晴的叶片，先用液氮充分研磨，然后用QIAGEN公司的RNeasyPlant Mini KitRNA提取日本晴的总RNA(详细的提取步骤见试剂盒的说明书)，用NanoDropND-1000核酸检测仪测量RNA样品的浓度及质量。

2、在离心管(规格为0.2mL)中加入日本晴的总RNA2μg、1μLdNTP(浓度为10mM)和1μLOligo(dT)20，加水补足体积到10μL，65℃温育5min后，立即放置冰上冷却。然后依次添加2μL 10×RT buffer、4μL MgCl₂(浓度为25mM)、2μL DTT水溶液(浓度为0.1M)、1μL RNaseOUT和1μ

III RT，50℃温育50min，85℃加热5min终止反应，得到反转录产物。向反转录产物中加入40μL ddH₂O进行稀释，得到稀释液(稀释液中含日本晴的cDNA)。-20℃保存样品。

Oligo(dT)20、10×RT buffer、RNaseOUT和

III RT均为Invitrogen公司生产的

III第一链合成系统中组件。

3、以步骤2得到的稀释液为模板，以引物F：5’-GACGAGCTGAGCTCGGTACCATGGCTCATTCTCATGAAA(下划线为限制性内切酶KpnI的识别位点)和引物R：5’-GAACCTGCAGGTCGACTTACACCTCATCTGAGTAGG-3’(下划线为限制性内切酶SalI的识别位点)进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

4、完成步骤3后，将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，然后用凝胶回收试剂盒(QIAGEN公司的产品)回收约1500bp的DNA片段。

5、取步骤4回收的DNA片段，用限制性内切酶KpnI和SalI双酶切，用凝胶回收试剂盒回收酶切产物。

6、取pCAMBIA1300-35S-rbcs载体(pCAMBIA1300-35S-rbcs载体的核苷酸序列如序列表中序列4所示，图谱见图1)，用限制性内切酶KpnI和SalI双酶切，用凝胶回收试剂盒回收约10107bp的载体骨架。

7、将步骤6得到的酶切产物和步骤7得到的载体骨架进行连接，得到重组质粒pCAMBIA1300-35S-OsVPE2-rbcs。

将重组质粒pCAMBIA1300-35S-OsVPE2-rbcs进行测序。根据测序结果，对重组质粒pCAMBIA1300-35S-OsVPE2-rbcs进行结构描述如下：将序列表中的序列2所示的DNA分子(OsVPE2基因)插入pCAMBIA1300-35S-rbcs载体的限制性内切酶KpnI和SalI识别位点之间，得到的重组质粒。重组质粒pCAMBIA1300-35S-OsVPE2-rbcs表达序列表中序列3所示的OsVPE2蛋白。

二、T₀代拟转OsVPE2基因水稻的获得

1、采用电激转化法，将重组质粒pCAMBIA1300-35S-OsVPE2-rbcs导入根癌农杆菌EHA105，得到重组农杆菌，命名为EHA105/35S-OsVPE2。

2、将EHA105/35S-OsVPE2单克隆接种于20mL含卡那霉素50mg/L和利福平50mg/L的YEB液体培养基，28℃、220rpm震荡培养12～16h后，然后按2％(v/v)的比例接种于AAM转化液，28℃、220rpm振荡培养至OD₆₀₀值达到0.5左右，得到农杆菌侵染液。

3、水稻品种石狩白毛的种子去壳脱粒，置于100mL三角瓶中，加入70％(v/v)乙醇水溶液浸泡30sec，再置于25％(v/v)次氯酸钠水溶液中，120rpm震荡灭菌30min，无菌水冲洗3次，用滤纸吸干水分，然后将种子胚朝下置于诱导培养基上诱导愈伤，30℃全光照诱导7天，长出的愈伤掐芽后用于水稻转化。

4、完成步骤3后，取生长状态较好的胚性愈伤组织，浸泡于步骤2得到的农杆菌侵染液，28℃、80rpm摇床轻摇愈伤，侵染30min，然后，放在铺有一层灭菌滤纸的共培养基上，25℃暗培养4天。

5、取步骤4得到的愈伤组织，置于选择培养基，光照交替培养2周后，更换新的选择培养基，愈伤组织继续光照交替培养2周，将原愈伤组织上长出的抗性愈伤组织转移至选择培养基上，光照交替培养2周。

6、完成步骤5后，取生长旺盛的抗性愈伤组织，置于分化培养基，光照交替培养3周，抗性愈伤组织上分化出抗性小芽。

7、完成步骤6后，取抗性小芽，置于生根培养基，光照交替培养，得到抗性植株。待抗性植株长至6～10cm时，进行开放式水培养，长出新根后移栽温室，得到T₀代拟转OsVPE2基因水稻植株。

三、T₀代拟转OsVPE2基因水稻的鉴定

1、分别提取T₀代拟转OsVPE2基因水稻叶片的基因组DNA并以其作为模板，采用引物F：5’-GGCTTGGAAGATACCTGGAGT-3’和引物R：5’-ACAGTTTTCCCAATGCCATAATACT-3’组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。如果PCR扩增产物中含有约750bp的DNA片段，则相应的T₀代拟转OsVPE2基因水稻鉴定为T₀代转OsVPE2基因水稻。

经鉴定，获得28株T₀代转OsVPE2基因水稻，依次命名为OsVPE2-OE-1至OsVPE2-OE-28。

2、分别提取OsVPE2-OE-1至OsVPE2-OE-28、水稻品种石狩白毛的总RNA，将总RNA反转录出第一链cDNA。以cDNA为模板，RT-PCR检测OsVPE2基因的表达量。鉴定OsVPE2基因的引物为：5’-GGCTTGGAAGATACCTGGAGT-3’和5’-AGGTACTCACCGCCAATAGGT-3。

结果表明，与水稻品种石狩白毛相比，24株T₀代转OsVPE2基因水稻的OsVPE2基因的表达量增强10倍以上。选取OsVPE2基因的表达量明显增强的OsVPE2-OE-23进行后续实验。

四、表型分析

分别取水稻品种石狩白毛种子或OsVPE2-OE-23的T₂代纯合体种子，剥壳后，用清水浸泡，37℃浸种至露白(2-3天)，期间早晚换水。将露白的水稻种子播种于装有水稻标准营养液的尼龙网纱上面(pH值约5.5)，在水稻培养室(白天30℃，晚上22℃，光强3000Lux，光照时间12个h)中培养7天，然后挑取长势一致的水稻苗转到水稻培养槽(规格为32L)里继续在水稻标准营养液中培养一周，得到水稻植株。

利用核磁共振技术测定水稻植株根中液泡内的无机磷浓度。核磁共振实验条件和方法参照文献：刘于.(2015).基于核磁共振的水稻根细胞内pH值的测定方法.植物生理学报51(5):792-796。

结果如图2所示((WT为水稻品种石狩白毛植株，OsVPE2-OE-23为OsVPE2-OE-23植株)。结果表明，与水稻品种石狩白毛植株相比，OsVPE2-OE-23植株液泡输出无机磷的能力显著提高，导致液泡里的无机磷浓度显著下降。

实施例2、OsVPE2基因敲除水稻液泡输出无机磷的能力降低

一、OsVPE2基因敲除载体的构建

根据植物CRISPR/Cas9载体系统靶位点的要求，选择OsVPE2基因的靶序列为5’-CAAAGTTGGGGTCCTCTCCA-3’，然后按照文献(Ma X，Zhang Q，Zhu Q，Liu W，Chen Y，Qiu R，Wang B，Yang Z，Li H，Lin Y，Xie Y，Shen R，Chen S，Wang Z，Chen Y，Guo J，Chen L，ZhaoX，Dong Z，Liu YG(2015)A Robust CRISPR/Cas9 System for Convenient，High-Efficiency Multiplex Genome Editing in Monocot and Dicot Plants.Mol Plant 8:1274-1284)中的方法，构建载体pYLCRISPR/Cas9-OsVPE2。

二、T₀代OsVPE2基因敲除水稻的获得

1、采用电激转化法，将pYLCRISPR/Cas9-OsVPE2导入根癌农杆菌EHA105，得到重组农杆菌，命名为EHA105/Cas9-OsVPE2。

2、将EHA105/Cas9-OsVPE2单克隆接种于20mL含卡那霉素50mg/L和利福平50mg/L的YEB液体培养基，28℃、220rpm震荡培养12～16h后，然后按2％(v/v)的比例接种于AAM转化液，28℃、220rpm振荡培养至OD₆₀₀值达到0.5左右，得到农杆菌侵染液。

7、完成步骤6后，取抗性小芽，置于生根培养基，光照交替培养，得到抗性植株。待抗性植株长至6～10cm时，进行开放式水培养，长出新根后移栽温室，得到T₀代OsVPE2基因敲除水稻植株。

三、T₀代OsVPE2基因敲除水稻的鉴定

1、分别提取T₀代OsVPE2基因敲除水稻叶片的基因组DNA并以其作为模板，以5’-GCTGATCTTCGTCTCATCTACC-3’和5’-GCTCCACCGTCAATGTAACCGG-3’为引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。如果PCR扩增产物中含有655bp的DNA片段，则相应的T₀代OsVPE2基因敲除水稻鉴定为T₀代OsVPE2基因敲除水稻阳性苗。

2、分别以T₀代OsVPE2基因敲除水稻阳性苗叶片的基因组DNA为模板，以5’-TTCATATGACTAGGAAGATACC-3’和5’-GACAGAAGTGTGTGCATTCCAA-3’为引物进行PCR扩增，得到长度为461bp的PCR扩增产物。

3、将步骤2得到的PCR扩增产物进行测序，测序结果与序列表中序列1所示的核苷酸序列进行比对，然后判断T₀代OsVPE2基因敲除水稻阳性苗中OsVPE2基因的突变位置与形式。

经检测，获得了一个纯合突变体Osvpe2。纯合突变体Osvpe2两条同源染色体上OsVPE2基因的相同位置(序列表中序列1自5’末端起第195位)插入一个碱基C。由于碱基C的插入，导致OsVPE2基因的阅读框移码，进而OsVPE2蛋白的功能失活。

四、表型分析

分别取水稻品种石狩白毛种子或纯合突变体Osvpe2种子，剥壳后，用清水浸泡，37℃浸种至露白(2-3天)，期间早晚换水。将露白的水稻种子播种于装有水稻全营养液的尼龙网纱上面(pH值约5.5)，在水稻培养室(白天30℃，晚上22℃，光强3000Lux，光照时间12个h)中培养7天，然后挑取长势一致的水稻苗转到水稻培养槽(规格为32L)里继续在水稻标准营养液中培养一周，得到水稻植株。

结果如图3所示(WT为水稻品种石狩白毛植株，Osvpe2为纯合突变体Osvpe2植株)。结果表明，与水稻品种石狩白毛植株相比，纯合突变体Osvpe2植株液泡输出无机磷的能力显著降低，导致液泡里的无机磷浓度显著升高。

<110> 蛋白质OsVPE2在调控植物液泡无机磷输出能力中的应用

<120> 中国农业科学院农业资源与农业区划研究所

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1585

<212> DNA

<213> 水稻（Oryza sativa L.）

<400> 1

atggctcatt ctcatgaaat gacgagtagg aaacctcctg gtattcgatt attcggaggc 60

attacggtgc tacggacgta ccagacactt gttttggtgc ttacatttgt cgcgtatact 120

tgctttcata tgactaggaa gataccgagt attgttaaga gcgtgcttga tccacagaca 180

aagttggggt cctctccatg gggacgactg cacacaaaaa acactcttaa catcggttgg 240

ttgccgttta acaccattga tggctcagca ttgcttggtg agatagatgt ggcgtttctt 300

gcggtttatt ctgttgggat gttctttgct ggacatcttg gtgaccgcat ggatttaagg 360

atcttcctga caattggcat gtttggaact gctgtgttca ctgccctttt tggtgctgga 420

tattggctaa atatccacaa tttctactat ttcctggtca ttcagatgat tgccggttta 480

ttccaagcaa ttggatggcc ttcagttgtc gcgattgttg gaaactggtt tggaaaaagc 540

aagaggggat tgattatggg catttggaat gcacacactt ctgtcggcaa catatctggt 600

tcactgctgg ctgcatttct gctgaagttt gggtggggct ggtcatttgc catccccagc 660

ttaatcatgg ttgctgtcgg gttgttggtg tttgtcttct taccggttag cccagaggtg 720

atggagatag acattgatga tggggagata agctctgtta aggatactac caaggagccc 780

ctcttggaac caggacaaga agtgaaacac aatgcagtag gtttcttaga ggcttggaag 840

atacctggag ttgcgccctt tgctctgtgc ctcttcttct ccaaattggt tgcttacacc 900

ttcttgtatt ggctaccgtt ctacatcagt catacacgta agcgctcttt ttccaacttc 960

cttcaacttg tgtgcaaaac tgtttttagt gtgcttttct aacagaactt cacttgtttc 1020

agctattggc ggtgagtacc tctcagatgc tttggctggc agcctatcaa caatctttga 1080

tgttggaggc gtgttgggtg gagtccttgc tggtcacatc tcggatcgct taaatgcacg 1140

agcggttaca gctgccagct tcatgtactg cgcgatacct gccctcttcc tataccgcac 1200

atacggcagc atgtcgataa tgtggaacat ttgcctcatg ttcatcaccg ggatgttcgt 1260

caatggtcct tatgccctaa tcacaactgc agtgtcagct gaccttggca ctcacagctc 1320

attgaatgga aattcccggg cattggctac tgtgacagcc atcattgacg ggaccgggtc 1380

tgttggcgcc gccattgggc cattgctgac aggctacatc tcgtcgagta gttggagcgc 1440

tgtgttcacg atgcttatgg cagcagctct ccttgctggg ctcctcttga cacaacttgt 1500

gtgcagtgaa ctaaaaggaa aggcgacctc caatgcgagc aaggatgtcg ccgatgctca 1560

aggtacctac tcagatgagg tgtaa 1585

<210> 2

<211> 1500

<212> DNA

<213> 水稻（Oryza sativa L.）

<400> 2

atggctcatt ctcatgaaat gacgagtagg aaacctcctg gtattcgatt attcggaggc 60

attacggtgc tacggacgta ccagacactt gttttggtgc ttacatttgt cgcgtatact 120

tgctttcata tgactaggaa gataccgagt attgttaaga gcgtgcttga tccacagaca 180

aagttggggt cctctccatg gggacgactg cacacaaaaa acactcttaa catcggttgg 240

ttgccgttta acaccattga tggctcagca ttgcttggtg agatagatgt ggcgtttctt 300

gcggtttatt ctgttgggat gttctttgct ggacatcttg gtgaccgcat ggatttaagg 360

atcttcctga caattggcat gtttggaact gctgtgttca ctgccctttt tggtgctgga 420

tattggctaa atatccacaa tttctactat ttcctggtca ttcagatgat tgccggttta 480

ttccaagcaa ttggatggcc ttcagttgtc gcgattgttg gaaactggtt tggaaaaagc 540

aagaggggat tgattatggg catttggaat gcacacactt ctgtcggcaa catatctggt 600

tcactgctgg ctgcatttct gctgaagttt gggtggggct ggtcatttgc catccccagc 660

ttaatcatgg ttgctgtcgg gttgttggtg tttgtcttct taccggttag cccagaggtg 720

atggagatag acattgatga tggggagata agctctgtta aggatactac caaggagccc 780

ctcttggaac caggacaaga agtgaaacac aatgcagtag gtttcttaga ggcttggaag 840

atacctggag ttgcgccctt tgctctgtgc ctcttcttct ccaaattggt tgcttacacc 900

ttcttgtatt ggctaccgtt ctacatcagt catacaccta ttggcggtga gtacctctca 960

gatgctttgg ctggcagcct atcaacaatc tttgatgttg gaggcgtgtt gggtggagtc 1020

cttgctggtc acatctcgga tcgcttaaat gcacgagcgg ttacagctgc cagcttcatg 1080

tactgcgcga tacctgccct cttcctatac cgcacatacg gcagcatgtc gataatgtgg 1140

aacatttgcc tcatgttcat caccgggatg ttcgtcaatg gtccttatgc cctaatcaca 1200

actgcagtgt cagctgacct tggcactcac agctcattga atggaaattc ccgggcattg 1260

gctactgtga cagccatcat tgacgggacc gggtctgttg gcgccgccat tgggccattg 1320

ctgacaggct acatctcgtc gagtagttgg agcgctgtgt tcacgatgct tatggcagca 1380

gctctccttg ctgggctcct cttgacacaa cttgtgtgca gtgaactaaa aggaaaggcg 1440

acctccaatg cgagcaagga tgtcgccgat gctcaaggta cctactcaga tgaggtgtaa 1500

<210> 3

<211> 499

<212> PRT

<213> 水稻（Oryza sativa L.）

<400> 3

Met Ala His Ser His Glu Met Thr Ser Arg Lys Pro Pro Gly Ile Arg

1 5 10 15

Leu Phe Gly Gly Ile Thr Val Leu Arg Thr Tyr Gln Thr Leu Val Leu

20 25 30

Val Leu Thr Phe Val Ala Tyr Thr Cys Phe His Met Thr Arg Lys Ile

35 40 45

Pro Ser Ile Val Lys Ser Val Leu Asp Pro Gln Thr Lys Leu Gly Ser

50 55 60

Ser Pro Trp Gly Arg Leu His Thr Lys Asn Thr Leu Asn Ile Gly Trp

65 70 75 80

Leu Pro Phe Asn Thr Ile Asp Gly Ser Ala Leu Leu Gly Glu Ile Asp

85 90 95

Val Ala Phe Leu Ala Val Tyr Ser Val Gly Met Phe Phe Ala Gly His

100 105 110

Leu Gly Asp Arg Met Asp Leu Arg Ile Phe Leu Thr Ile Gly Met Phe

115 120 125

Gly Thr Ala Val Phe Thr Ala Leu Phe Gly Ala Gly Tyr Trp Leu Asn

130 135 140

Ile His Asn Phe Tyr Tyr Phe Leu Val Ile Gln Met Ile Ala Gly Leu

145 150 155 160

Phe Gln Ala Ile Gly Trp Pro Ser Val Val Ala Ile Val Gly Asn Trp

165 170 175

Phe Gly Lys Ser Lys Arg Gly Leu Ile Met Gly Ile Trp Asn Ala His

180 185 190

Thr Ser Val Gly Asn Ile Ser Gly Ser Leu Leu Ala Ala Phe Leu Leu

195 200 205

Lys Phe Gly Trp Gly Trp Ser Phe Ala Ile Pro Ser Leu Ile Met Val

210 215 220

Ala Val Gly Leu Leu Val Phe Val Phe Leu Pro Val Ser Pro Glu Val

225 230 235 240

Met Glu Ile Asp Ile Asp Asp Gly Glu Ile Ser Ser Val Lys Asp Thr

245 250 255

Thr Lys Glu Pro Leu Leu Glu Pro Gly Gln Glu Val Lys His Asn Ala

260 265 270

Val Gly Phe Leu Glu Ala Trp Lys Ile Pro Gly Val Ala Pro Phe Ala

275 280 285

Leu Cys Leu Phe Phe Ser Lys Leu Val Ala Tyr Thr Phe Leu Tyr Trp

290 295 300

Leu Pro Phe Tyr Ile Ser His Thr Pro Ile Gly Gly Glu Tyr Leu Ser

305 310 315 320

Asp Ala Leu Ala Gly Ser Leu Ser Thr Ile Phe Asp Val Gly Gly Val

325 330 335

Leu Gly Gly Val Leu Ala Gly His Ile Ser Asp Arg Leu Asn Ala Arg

340 345 350

Ala Val Thr Ala Ala Ser Phe Met Tyr Cys Ala Ile Pro Ala Leu Phe

355 360 365

Leu Tyr Arg Thr Tyr Gly Ser Met Ser Ile Met Trp Asn Ile Cys Leu

370 375 380

Met Phe Ile Thr Gly Met Phe Val Asn Gly Pro Tyr Ala Leu Ile Thr

385 390 395 400

Thr Ala Val Ser Ala Asp Leu Gly Thr His Ser Ser Leu Asn Gly Asn

405 410 415

Ser Arg Ala Leu Ala Thr Val Thr Ala Ile Ile Asp Gly Thr Gly Ser

420 425 430

Val Gly Ala Ala Ile Gly Pro Leu Leu Thr Gly Tyr Ile Ser Ser Ser

435 440 445

Ser Trp Ser Ala Val Phe Thr Met Leu Met Ala Ala Ala Leu Leu Ala

450 455 460

Gly Leu Leu Leu Thr Gln Leu Val Cys Ser Glu Leu Lys Gly Lys Ala

465 470 475 480

Thr Ser Asn Ala Ser Lys Asp Val Ala Asp Ala Gln Gly Thr Tyr Ser

485 490 495

Asp Glu Val

<210> 4

<211> 10107

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 4

aattcaattc ggtccccaga ttagcctttt caatttcaga aagaatgcta acccacagat 60

ggttagagag gcttacgcag caggtctcat caagacgatc tacccgagca ataatctcca 120

ggaaatcaaa taccttccca agaaggttaa agatgcagtc aaaagattca ggactaactg 180

catcaagaac acagagaaag atatatttct caagatcaga agtactattc cagtatggac 240

gattcaaggc ttgcttcaca aaccaaggca agtaatagag attggagtct ctaaaaaggt 300

agttcccact gaatcaaagg ccatggagtc aaagattcaa atagaggacc taacagaact 360

cgccgtaaag actggcgaac agttcataca gagtctctta cgactcaatg acaagaagaa 420

aatcttcgtc aacatggtgg agcacgacac acttgtctac tccaaaaata tcaaagatac 480

agtctcagaa gaccaaaggg caattgagac ttttcaacaa agggtaatat ccggaaacct 540

cctcggattc cattgcccag ctatctgtca ctttattgtg aagatagtgg aaaaggaagg 600

tggctcctac aaatgccatc attgcgataa aggaaaggcc atcgttgaag atgcctctgc 660

cgacagtggt cccaaagatg gacccccacc cacgaggagc atcgtggaaa aagaagacgt 720

tccaaccacg tcttcaaagc aagtggattg atgtgatatc tccactgacg taagggatga 780

cgcacaatcc cactatcctt cgcaagaccc ttcctctata taaggaagtt catttcattt 840

ggagagaaca cgggggacga gctgagctcg gtacccgggg atcctctaga gtcgacctgc 900

aggttcgagt attatggcat tgggaaaact gtttttcttg taccatttgt tgtgcttgta 960

atttactgtg ttttttattc ggttttcgct atcgaactgt gaaatggaaa tggatggaga 1020

agagttaatg aatgatatgg tccttttgtt cattctcaaa ttaatattat ttgttttttc 1080

tcttatttgt tgtgtgttga atttgaaatt ataagagata tgcaaacatt ttgttttgag 1140

taaaaatgtg tcaaatcgtg gcctctaatg accgaagtta atatgaggag taaaacacta 1200

agcttggcac tggccgtcgt tttacaacgt cgtgactggg aaaaccctgg cgttacccaa 1260

cttaatcgcc ttgcagcaca tccccctttc gccagctggc gtaatagcga agaggcccgc 1320

accgatcgcc cttcccaaca gttgcgcagc ctgaatggcg aatgctagag cagcttgagc 1380

ttggatcaga ttgtcgtttc ccgccttcag tttaaactat cagtgtttga caggatatat 1440

tggcgggtaa acctaagaga aaagagcgtt tattagaata acggatattt aaaagggcgt 1500

gaaaaggttt atccgttcgt ccatttgtat gtgcatgcca accacagggt tcccctcggg 1560

atcaaagtac tttgatccaa cccctccgct gctatagtgc agtcggcttc tgacgttcag 1620

tgcagccgtc ttctgaaaac gacatgtcgc acaagtccta agttacgcga caggctgccg 1680

ccctgccctt ttcctggcgt tttcttgtcg cgtgttttag tcgcataaag tagaatactt 1740

gcgactagaa ccggagacat tacgccatga acaagagcgc cgccgctggc ctgctgggct 1800

atgcccgcgt cagcaccgac gaccaggact tgaccaacca acgggccgaa ctgcacgcgg 1860

ccggctgcac caagctgttt tccgagaaga tcaccggcac caggcgcgac cgcccggagc 1920

tggccaggat gcttgaccac ctacgccctg gcgacgttgt gacagtgacc aggctagacc 1980

gcctggcccg cagcacccgc gacctactgg acattgccga gcgcatccag gaggccggcg 2040

cgggcctgcg tagcctggca gagccgtggg ccgacaccac cacgccggcc ggccgcatgg 2100

tgttgaccgt gttcgccggc attgccgagt tcgagcgttc cctaatcatc gaccgcaccc 2160

ggagcgggcg cgaggccgcc aaggcccgag gcgtgaagtt tggcccccgc cctaccctca 2220

ccccggcaca gatcgcgcac gcccgcgagc tgatcgacca ggaaggccgc accgtgaaag 2280

aggcggctgc actgcttggc gtgcatcgct cgaccctgta ccgcgcactt gagcgcagcg 2340

aggaagtgac gcccaccgag gccaggcggc gcggtgcctt ccgtgaggac gcattgaccg 2400

aggccgacgc cctggcggcc gccgagaatg aacgccaaga ggaacaagca tgaaaccgca 2460

ccaggacggc caggacgaac cgtttttcat taccgaagag atcgaggcgg agatgatcgc 2520

ggccgggtac gtgttcgagc cgcccgcgca cgtctcaacc gtgcggctgc atgaaatcct 2580

ggccggtttg tctgatgcca agctggcggc ctggccggcc agcttggccg ctgaagaaac 2640

cgagcgccgc cgtctaaaaa ggtgatgtgt atttgagtaa aacagcttgc gtcatgcggt 2700

cgctgcgtat atgatgcgat gagtaaataa acaaatacgc aaggggaacg catgaaggtt 2760

atcgctgtac ttaaccagaa aggcgggtca ggcaagacga ccatcgcaac ccatctagcc 2820

cgcgccctgc aactcgccgg ggccgatgtt ctgttagtcg attccgatcc ccagggcagt 2880

gcccgcgatt gggcggccgt gcgggaagat caaccgctaa ccgttgtcgg catcgaccgc 2940

ccgacgattg accgcgacgt gaaggccatc ggccggcgcg acttcgtagt gatcgacgga 3000

gcgccccagg cggcggactt ggctgtgtcc gcgatcaagg cagccgactt cgtgctgatt 3060

ccggtgcagc caagccctta cgacatatgg gccaccgccg acctggtgga gctggttaag 3120

cagcgcattg aggtcacgga tggaaggcta caagcggcct ttgtcgtgtc gcgggcgatc 3180

aaaggcacgc gcatcggcgg tgaggttgcc gaggcgctgg ccgggtacga gctgcccatt 3240

cttgagtccc gtatcacgca gcgcgtgagc tacccaggca ctgccgccgc cggcacaacc 3300

gttcttgaat cagaacccga gggcgacgct gcccgcgagg tccaggcgct ggccgctgaa 3360

attaaatcaa aactcatttg agttaatgag gtaaagagaa aatgagcaaa agcacaaaca 3420

cgctaagtgc cggccgtccg agcgcacgca gcagcaaggc tgcaacgttg gccagcctgg 3480

cagacacgcc agccatgaag cgggtcaact ttcagttgcc ggcggaggat cacaccaagc 3540

tgaagatgta cgcggtacgc caaggcaaga ccattaccga gctgctatct gaatacatcg 3600

cgcagctacc agagtaaatg agcaaatgaa taaatgagta gatgaatttt agcggctaaa 3660

ggaggcggca tggaaaatca agaacaacca ggcaccgacg ccgtggaatg ccccatgtgt 3720

ggaggaacgg gcggttggcc aggcgtaagc ggctgggttg tctgccggcc ctgcaatggc 3780

actggaaccc ccaagcccga ggaatcggcg tgacggtcgc aaaccatccg gcccggtaca 3840

aatcggcgcg gcgctgggtg atgacctggt ggagaagttg aaggccgcgc aggccgccca 3900

gcggcaacgc atcgaggcag aagcacgccc cggtgaatcg tggcaagcgg ccgctgatcg 3960

aatccgcaaa gaatcccggc aaccgccggc agccggtgcg ccgtcgatta ggaagccgcc 4020

caagggcgac gagcaaccag attttttcgt tccgatgctc tatgacgtgg gcacccgcga 4080

tagtcgcagc atcatggacg tggccgtttt ccgtctgtcg aagcgtgacc gacgagctgg 4140

cgaggtgatc cgctacgagc ttccagacgg gcacgtagag gtttccgcag ggccggccgg 4200

catggccagt gtgtgggatt acgacctggt actgatggcg gtttcccatc taaccgaatc 4260

catgaaccga taccgggaag ggaagggaga caagcccggc cgcgtgttcc gtccacacgt 4320

tgcggacgta ctcaagttct gccggcgagc cgatggcgga aagcagaaag acgacctggt 4380

agaaacctgc attcggttaa acaccacgca cgttgccatg cagcgtacga agaaggccaa 4440

gaacggccgc ctggtgacgg tatccgaggg tgaagccttg attagccgct acaagatcgt 4500

aaagagcgaa accgggcggc cggagtacat cgagatcgag ctagctgatt ggatgtaccg 4560

cgagatcaca gaaggcaaga acccggacgt gctgacggtt caccccgatt actttttgat 4620

cgatcccggc atcggccgtt ttctctaccg cctggcacgc cgcgccgcag gcaaggcaga 4680

agccagatgg ttgttcaaga cgatctacga acgcagtggc agcgccggag agttcaagaa 4740

gttctgtttc accgtgcgca agctgatcgg gtcaaatgac ctgccggagt acgatttgaa 4800

ggaggaggcg gggcaggctg gcccgatcct agtcatgcgc taccgcaacc tgatcgaggg 4860

cgaagcatcc gccggttcct aatgtacgga gcagatgcta gggcaaattg ccctagcagg 4920

ggaaaaaggt cgaaaaggtc tctttcctgt ggatagcacg tacattggga acccaaagcc 4980

gtacattggg aaccggaacc cgtacattgg gaacccaaag ccgtacattg ggaaccggtc 5040

acacatgtaa gtgactgata taaaagagaa aaaaggcgat ttttccgcct aaaactcttt 5100

aaaacttatt aaaactctta aaacccgcct ggcctgtgca taactgtctg gccagcgcac 5160

agccgaagag ctgcaaaaag cgcctaccct tcggtcgctg cgctccctac gccccgccgc 5220

ttcgcgtcgg cctatcgcgg ccgctggccg ctcaaaaatg gctggcctac ggccaggcaa 5280

tctaccaggg cgcggacaag ccgcgccgtc gccactcgac cgccggcgcc cacatcaagg 5340

caccctgcct cgcgcgtttc ggtgatgacg gtgaaaacct ctgacacatg cagctcccgg 5400

agacggtcac agcttgtctg taagcggatg ccgggagcag acaagcccgt cagggcgcgt 5460

cagcgggtgt tggcgggtgt cggggcgcag ccatgaccca gtcacgtagc gatagcggag 5520

tgtatactgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc accatatgcg 5580

gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgct cttccgcttc 5640

ctcgctcact gactcgctgc gctcggtcgt tcggctgcgg cgagcggtat cagctcactc 5700

aaaggcggta atacggttat ccacagaatc aggggataac gcaggaaaga acatgtgagc 5760

aaaaggccag caaaaggcca ggaaccgtaa aaaggccgcg ttgctggcgt ttttccatag 5820

gctccgcccc cctgacgagc atcacaaaaa tcgacgctca agtcagaggt ggcgaaaccc 5880

gacaggacta taaagatacc aggcgtttcc ccctggaagc tccctcgtgc gctctcctgt 5940

tccgaccctg ccgcttaccg gatacctgtc cgcctttctc ccttcgggaa gcgtggcgct 6000

ttctcatagc tcacgctgta ggtatctcag ttcggtgtag gtcgttcgct ccaagctggg 6060

ctgtgtgcac gaaccccccg ttcagcccga ccgctgcgcc ttatccggta actatcgtct 6120

tgagtccaac ccggtaagac acgacttatc gccactggca gcagccactg gtaacaggat 6180

tagcagagcg aggtatgtag gcggtgctac agagttcttg aagtggtggc ctaactacgg 6240

ctacactaga aggacagtat ttggtatctg cgctctgctg aagccagtta ccttcggaaa 6300

aagagttggt agctcttgat ccggcaaaca aaccaccgct ggtagcggtg gtttttttgt 6360

ttgcaagcag cagattacgc gcagaaaaaa aggatctcaa gaagatcctt tgatcttttc 6420

tacggggtct gacgctcagt ggaacgaaaa ctcacgttaa gggattttgg tcatgcattc 6480

taggtactaa aacaattcat ccagtaaaat ataatatttt attttctccc aatcaggctt 6540

gatccccagt aagtcaaaaa atagctcgac atactgttct tccccgatat cctccctgat 6600

cgaccggacg cagaaggcaa tgtcatacca cttgtccgcc ctgccgcttc tcccaagatc 6660

aataaagcca cttactttgc catctttcac aaagatgttg ctgtctccca ggtcgccgtg 6720

ggaaaagaca agttcctctt cgggcttttc cgtctttaaa aaatcataca gctcgcgcgg 6780

atctttaaat ggagtgtctt cttcccagtt ttcgcaatcc acatcggcca gatcgttatt 6840

cagtaagtaa tccaattcgg ctaagcggct gtctaagcta ttcgtatagg gacaatccga 6900

tatgtcgatg gagtgaaaga gcctgatgca ctccgcatac agctcgataa tcttttcagg 6960

gctttgttca tcttcatact cttccgagca aaggacgcca tcggcctcac tcatgagcag 7020

attgctccag ccatcatgcc gttcaaagtg caggaccttt ggaacaggca gctttccttc 7080

cagccatagc atcatgtcct tttcccgttc cacatcatag gtggtccctt tataccggct 7140

gtccgtcatt tttaaatata ggttttcatt ttctcccacc agcttatata ccttagcagg 7200

agacattcct tccgtatctt ttacgcagcg gtatttttcg atcagttttt tcaattccgg 7260

tgatattctc attttagcca tttattattt ccttcctctt ttctacagta tttaaagata 7320

ccccaagaag ctaattataa caagacgaac tccaattcac tgttccttgc attctaaaac 7380

cttaaatacc agaaaacagc tttttcaaag ttgttttcaa agttggcgta taacatagta 7440

tcgacggagc cgattttgaa accgcggtga tcacaggcag caacgctctg tcatcgttac 7500

aatcaacatg ctaccctccg cgagatcatc cgtgtttcaa acccggcagc ttagttgccg 7560

ttcttccgaa tagcatcggt aacatgagca aagtctgccg ccttacaacg gctctcccgc 7620

tgacgccgtc ccggactgat gggctgcctg tatcgagtgg tgattttgtg ccgagctgcc 7680

ggtcggggag ctgttggctg gctggtggca ggatatattg tggtgtaaac aaattgacgc 7740

ttagacaact taataacaca ttgcggacgt ttttaatgta ctgaattaac gccgaattaa 7800

ttcgggggat ctggatttta gtactggatt ttggttttag gaattagaaa ttttattgat 7860

agaagtattt tacaaataca aatacatact aagggtttct tatatgctca acacatgagc 7920

gaaaccctat aggaacccta attcccttat ctgggaacta ctcacacatt attatggaga 7980

aactcgagct tgtcgatcga cagatccggt cggcatctac tctatttctt tgccctcgga 8040

cgagtgctgg ggcgtcggtt tccactatcg gcgagtactt ctacacagcc atcggtccag 8100

acggccgcgc ttctgcgggc gatttgtgta cgcccgacag tcccggctcc ggatcggacg 8160

attgcgtcgc atcgaccctg cgcccaagct gcatcatcga aattgccgtc aaccaagctc 8220

tgatagagtt ggtcaagacc aatgcggagc atatacgccc ggagtcgtgg cgatcctgca 8280

agctccggat gcctccgctc gaagtagcgc gtctgctgct ccatacaagc caaccacggc 8340

ctccagaaga agatgttggc gacctcgtat tgggaatccc cgaacatcgc ctcgctccag 8400

tcaatgaccg ctgttatgcg gccattgtcc gtcaggacat tgttggagcc gaaatccgcg 8460

tgcacgaggt gccggacttc ggggcagtcc tcggcccaaa gcatcagctc atcgagagcc 8520

tgcgcgacgg acgcactgac ggtgtcgtcc atcacagttt gccagtgata cacatgggga 8580

tcagcaatcg cgcatatgaa atcacgccat gtagtgtatt gaccgattcc ttgcggtccg 8640

aatgggccga acccgctcgt ctggctaaga tcggccgcag cgatcgcatc catagcctcc 8700

gcgaccggtt gtagaacagc gggcagttcg gtttcaggca ggtcttgcaa cgtgacaccc 8760

tgtgcacggc gggagatgca ataggtcagg ctctcgctaa actccccaat gtcaagcact 8820

tccggaatcg ggagcgcggc cgatgcaaag tgccgataaa cataacgatc tttgtagaaa 8880

ccatcggcgc agctatttac ccgcaggaca tatccacgcc ctcctacatc gaagctgaaa 8940

gcacgagatt cttcgccctc cgagagctgc atcaggtcgg agacgctgtc gaacttttcg 9000

atcagaaact tctcgacaga cgtcgcggtg agttcaggct ttttcatatc tcattgcccc 9060

cccggatctg cgaaagctcg agagagatag atttgtagag agagactggt gatttcagcg 9120

tgtcctctcc aaatgaaatg aacttcctta tatagaggaa ggtcttgcga aggatagtgg 9180

gattgtgcgt catcccttac gtcagtggag atatcacatc aatccacttg ctttgaagac 9240

gtggttggaa cgtcttcttt ttccacgatg ctcctcgtgg gtgggggtcc atctttggga 9300

ccactgtcgg cagaggcatc ttgaacgata gcctttcctt tatcgcaatg atggcatttg 9360

taggtgccac cttccttttc tactgtcctt ttgatgaagt gacagatagc tgggcaatgg 9420

aatccgagga ggtttcccga tattaccctt tgttgaaaag tctcaatagc cctttggtct 9480

tctgagactg tatctttgat attcttggag tagacgagag tgtcgtgctc caccatgtta 9540

tcacatcaat ccacttgctt tgaagacgtg gttggaacgt cttctttttc cacgatgctc 9600

ctcgtgggtg ggggtccatc tttgggacca ctgtcggcag aggcatcttg aacgatagcc 9660

tttcctttat cgcaatgatg gcatttgtag gtgccacctt ccttttctac tgtccttttg 9720

atgaagtgac agatagctgg gcaatggaat ccgaggaggt ttcccgatat taccctttgt 9780

tgaaaagtct caatagccct ttggtcttct gagactgtat ctttgatatt cttggagtag 9840

acgagagtgt cgtgctccac catgttggca agctgctcta gccaatacgc aaaccgcctc 9900

tccccgcgcg ttggccgatt cattaatgca gctggcacga caggtttccc gactggaaag 9960

cgggcagtga gcgcaacgca attaatgtga gttagctcac tcattaggca ccccaggctt 10020

tacactttat gcttccggct cgtatgttgt gtggaattgt gagcggataa caatttcaca 10080

caggaaacag ctatgaccat gattacg 10107

Claims

1.蛋白质OsVPE2的应用，为X1）或X2）：

X1）调控水稻液泡无机磷输出能力；

X2）调控水稻液泡里的无机磷浓度；

所述蛋白质OsVPE2的氨基酸序列是序列表中序列3所示的蛋白质；

所述调控为过表达蛋白质OsVPE2时，水稻液泡无机磷输出能力提高和/或水稻液泡里的无机磷浓度降低；

所述调控为抑制蛋白质OsVPE2时，水稻液泡无机磷输出能力降低和/或水稻液泡里的无机磷浓度增加。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述水稻为水稻品种石狩白毛。

3.编码权利要求1中所述蛋白质OsVPE2的核酸分子的应用，为X1）或X2）：

X1）调控水稻液泡无机磷输出能力；

X2）调控水稻液泡里的无机磷浓度；

所述调控为表达所述核酸分子时，水稻液泡无机磷输出能力提高和/或水稻液泡里的无机磷浓度降低；

所述调控为抑制所述核酸分子的表达时，水稻液泡无机磷输出能力降低和/或水稻液泡里的无机磷浓度增加。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于：所述核酸分子为序列表中序列2所示的DNA分子。

5.如权利要求3或4所述的应用，其特征在于：所述水稻为水稻品种石狩白毛。

6.一种培育转基因水稻甲的方法，包括如下步骤：提高出发水稻中权利要求1中所述蛋白质OsVPE2的表达量和/或活性，得到转基因水稻甲；与出发水稻相比，转基因水稻甲的液泡无机磷输出能力提高和/或液泡里的无机磷浓度降低。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于：所述水稻为水稻品种石狩白毛。

8.一种培育转基因水稻乙的方法，包括如下步骤：抑制出发水稻中权利要求1中所述蛋白质OsVPE2的表达量和/或活性，得到转基因水稻乙；与出发水稻相比，转基因水稻乙的液泡无机磷输出能力降低和/或液泡里的无机磷浓度增加。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于：所述水稻为水稻品种石狩白毛。

10.一种水稻育种方法，包括如下步骤：增加水稻中权利要求1中所述蛋白质OsVPE2的含量和/或活性，从而提高液泡无机磷输出能力和/或降低液泡里的无机磷浓度。

11.如权利要求10所述的方法，其特征在于：所述水稻为水稻品种石狩白毛。

12.一种水稻育种方法，包括如下步骤：降低水稻中权利要求1中所述蛋白质OsVPE2的含量和/或活性，从而降低液泡无机磷输出能力和/或增加液泡里的无机磷浓度。

13.如权利要求12所述的方法，其特征在于：所述水稻为水稻品种石狩白毛。