CN108841862A - 一种含有ha蛋白融合标签的植物表达质粒载体及其载体的构建方法 - Google Patents

一种含有ha蛋白融合标签的植物表达质粒载体及其载体的构建方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开的一种含有HA蛋白融合标签的植物表达质粒载体，为该载体在植物表达质粒载体的C端含有HA蛋白融合标签。构建所述质粒载体方法，包括如下步骤：(1)以pCAMBIA1302为出发质粒，采用Eco065I酶切该质粒，然后用Klenow Fragment酶将Eco065I酶切后的粘性末端补平成平末端，再用SpeI酶切，通过凝胶电泳切胶回收大片段；(2)全序列合成包含编码3个HA蛋白的核苷酸序列；(3)设计扩增引物；(4)在N端加上SpeI酶切位点，在C端加上一个核苷酸G；用SpeI酶切该合成片段；最后连接产物，热激转化DH5α,通过PCR鉴定得到阳性克隆。本发明的优点在于，得到HA蛋白融合标签的植物表达质粒载体，进而帮助使用者快速的研究蛋白功能，并且不会对目标蛋白自身的功能发生干扰，保证能够准确地研究蛋白的功能。

Description

一种含有HA蛋白融合标签的植物表达质粒载体及其载体的构 建方法
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，具体为一种含有HA蛋白融合标签的植物表达质粒载体及其载体的构建方法。
背景技术
HA标签来源于人类流感病毒的红细胞血凝素的98-106位的9个氨基酸，具很强的免疫反应性，对目标蛋白的空间结构影响小，重组的HA标签蛋白可以使用偶联有HA高特异性单克隆抗体的树脂来完成高效纯化。被广泛用于HA融合目标蛋白的分离、纯化和检测。而要将HA蛋白标签规模化、产业化推广，势必要提供一种带有常用的融合蛋白标签的植物表达质粒载体。pCAMBIA的一系列载体被全球许多植物分子生物学实验室广泛使用。随着基因功能和蛋白功能研究的兴起，重组蛋白表达技术现已经广泛应用于生物学各个具体领域，特别是蛋白的体内功能研究和蛋白质的大规模生产都需要应用重组蛋白表达载体。pCAMBIA的系列载体要么不含有蛋白融合标签，必须要制备研究的蛋白自身的特异性抗体，费时费力，不利于快速地研究蛋白功能；要么含有较大的蛋白融合标签(例如GFP和GUS等)，而这些大的蛋白融合标签经常会对目标蛋白自身的功能发生干扰，因此也不利于准确地研究蛋白的功能。所以，本领域技术人员亟待要解决的技术问题是如何构建出含有HA融合蛋白标签的pCAMBIA载体。
发明内容
为了解决现有技术中缺少HA蛋白融合标签融合的植物表达质粒载体的问题，本发明提供了一种含有HA蛋白融合标签的植物表达质粒载体及其载体的构建方法，实现的目的为，能够得到一种含有HA蛋白融合标签的植物表达质粒载体，进而帮助使用者快速的研究蛋白功能，并且不会对目标蛋白自身的功能发生干扰，保证能够准确地研究蛋白的功能。
为了实现上述目的，本发明提供的技术方案为，本发明公开的一种含有HA蛋白融合标签的植物表达质粒载体，该载体为在植物表达质粒载体的C端含有HA蛋白融合标签。
具体地，该载体包含有三段编码HA蛋白标签Tyr-Pro-Tyr-Asp-Val-Pro-Asp-Tyr-Ala的基因片段，所述三个HA蛋白的核苷酸序列分别如SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ IDNo.3所示。
具体地，该载体的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。
优选的，本发明还公开了构建上述所述质粒载体的方法，包括如下步骤：
(1)以pCAMBIA1302为出发质粒，采用Eco065I酶切该质粒，然后用KlenowFragment酶将Eco065I酶切后的粘性末端补平成平末端，反应体系：50微升的总体积，包括5微升的10X Klenow Fragment Buffer、0.5微升的10mM dNTPs、10微升浓度为50纳克/微升的上述用Eco065I酶切后的质粒片段、32.5微升的超纯水和2微升的Takara的KlenowFragment酶；再用SpeI酶切，通过凝胶电泳切胶回收9802bp的大片段；
(2)全序列合成包含编码3个HA蛋白的核苷酸序列，全序列合成包含编码3个HA蛋白的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示；
(3)设计用于扩增包含编码3个HA蛋白的核苷酸序列基因片段的扩增引物，上游引物如SEQ ID No.6所示，下游引物如SEQ ID No.7所示；采用New England Biolabs的Phusion High-Fidelity DNA Polymerase进行扩增反应，扩增体系：50微升的总体积，包括10微升的5X Phusion HF Buffer、1微升的10mM dNTPs、2.5微升的10微摩尔上游引物、2.5微升的10微摩尔下游引物、1微升浓度为40纳克/微升的上述合成的包含编码3个HA蛋白的核苷酸序列基因片段、32.5微升的超纯水和0.5微升的Phusion High-Fidelity DNAPolymerase；
扩增程序：98℃运行30秒；然后30个循环的：98℃运行10秒；60℃运行30秒；72℃运行10秒；最后72℃运行10分钟；
(4)扩增后最终在全序列合成的基因片段的N端加上SpeI酶切位点，在C端加上一个核苷酸G；用SpeI酶切该合成片段，凝胶电泳后切胶回收该片段；最后利用T4 DNA连接酶连接上述酶切后回收纯化的片段；将连接反应的产物，热激转化DH5α,通过PCR鉴定得到阳性克隆；质粒载体的序列通过测序验证。
采用上述方法构建的本发明的质粒载体，可以通过NcoI和SpeI将目的基因的基因片段引入载体中，确保目的基因的核苷酸序列与C端的3个串联重复的编码HA蛋白的核苷酸序列在同一读码框。本发明构建的质粒载体用于在植物中表达目的基因的重组蛋白。
本发明采用上述技术方案具有以下有益效果，相较于现有技术中pCAMBIA载体与大的蛋白融合标签融合，经常会对目标蛋白自身的功能发生干扰，不能够准确地研究蛋白的功能，本发明提供的这种HA蛋白融合标签不影响蛋白功能，进而有效保证研究蛋白功能的准确性；现有技术中无大的蛋白标签pCAMBIA载体时，要想研究蛋白功能，必须要制备研究的蛋白自身的特异性抗体，但是这种方法费时费力，不利于快速地研究蛋白功能，而本发明构建这种HA标签质粒载体周期时间短，成本低廉，在保证了时间性的同时又能够节约成本，非常适宜产业化推广。
附图说明
图1为本发明实施例一中含有HA蛋白融合标签的植物表达质粒载体的遗传图谱。
图2为本发明实施例一中HA蛋白标签融合CHIL基因后并不影响CHIL基因在植物体内的生物学功能。图中，Extractable PAs by DMACA是DMACA法测定的可溶单宁，Extractable PAs by Butanol是Butanol法测定的可溶单宁，Non-extractable PAs是不可溶单宁。纵坐标为单宁的相对含量“relative level of PAs”。Col为野生型，chil-1和chil-2为CHIL基因的突变体，pCHIL:CHIL为在chil-1突变体中表达CHIL自身基因的转基因株系，pCHIL:CHIL-3HA为在chil-1突变体中表达CHIL融合3个串联重复的HA标签蛋白的转基因株系。Col野生型的单宁含量作为1。＊＊表示达到统计学p<0.01水平上的显著差异。
具体实施方式
实施例一：本发明公开的一种含有HA蛋白融合标签的植物表达质粒载体，该载体为在植物表达质粒载体的C端含有HA蛋白融合标签的植物表达质粒载体。具体地，该载体包含有三段编码HA蛋白标签Tyr-Pro-Tyr-Asp-Val-Pro-Asp-Tyr-Ala的基因片段，所述三个HA蛋白的核苷酸序列分别如SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3所示。SEQ ID No.1和SEQ ID No.2之间的连接序列为SEQ ID No.8，SEQ ID No.2和SEQ ID No.3之间的连接序列为SEQ ID No.9。
该载体还包括现有技术中转录启动子、转录终止子、卡那霉素编码序列和复制子片段，该载体的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。本发明的载体，其遗传图谱如图1所示。
相较于现有技术中pCAMBIA载体与大的蛋白融合标签融合，经常会对目标蛋白自身的功能发生干扰，不能够准确地研究蛋白的功能，本发明提供的这种HA蛋白融合标签不影响蛋白功能，进而有效保证研究蛋白功能的准确性，以下通过列举试验例用以说明：利用本发明的质粒载体，可以通过NcoI和SpeI将目的基因的基因片段引入载体中，确保目的基因的核苷酸序列与C端的3个串联重复的编码HA蛋白的核苷酸序列在同一读码框。我们实验室发现拟南芥CHIL基因的突变体chil-1和chil-2中单宁的含量显著减少。在chil-1突变体中转入拟南芥CHIL的全长基因(包括启动子和全长基因组序列)，转基因株系能够恢复单宁的含量至野生型的水平。随后，我们将CHIL的全长基因通过引物SEQ ID No.10和SEQ IDNo.11进行PCR扩增，然后利用BamHI和SpeI酶切，连接引入本发明的质粒载体中，将最终质粒载体导入农杆菌GV3101，通过花侵染法转入拟南芥chil-1突变体中。三个转基因株系pCHIL:CHIL-3HA-1、pCHIL:CHIL-3HA-2和pCHIL:CHIL-3HA-3中单宁的含量均恢复到野生型的水平，与在chil-1突变体中表达pCHIL:CHIL的转基因株系的单宁含量之间没有显著差异。这些说明HA蛋白标签融合CHIL基因后并不影响CHIL基因在植物体内的生物学功能。该试验效果如图2所示。在这里需要说明的是，为了确保试验结果的稳定性，这样的试验平行重复多次，在这里只不过列举了其中一个试验用以给出示例而已。
构建上述载体的方法可采用任何一种现有技术方法。另外，本实施例中无特殊说明的操作手法均为现有技术，故不在此过多解释。
实施例二：本发明公开的一种含有HA蛋白融合标签的植物表达质粒载体，该载体为在植物表达质粒载体的C端含有HA蛋白融合标签的植物表达质粒载体。具体地，该载体包含有三段编码HA蛋白标签Tyr-Pro-Tyr-Asp-Val-Pro-Asp-Tyr-Ala的基因片段，所述三个HA蛋白的核苷酸序列分别如SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3所示。SEQ ID No.1和SEQ ID No.2之间的连接序列为SEQ ID No.8，SEQ ID No.2和SEQ ID No.3之间的连接序列为SEQ ID No.9。
该载体还包括现有技术中转录启动子、转录终止子、卡那霉素编码序列和复制子片段，该载体的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。
优选的，构建所述质粒载体的方法包括如下步骤：
(1)以pCAMBIA1302为出发质粒，采用Eco065I酶切该质粒，然后用KlenowFragment酶将Eco065I酶切后的粘性末端补平成平末端，反应体系：50微升的总体积，包括5微升的10X Klenow Fragment Buffer、0.5微升的10mM dNTPs、10微升浓度为50纳克/微升的上述用Eco065I酶切后的质粒片段、32.5微升的超纯水和2微升的Takara的KlenowFragment酶；再用SpeI酶切，通过凝胶电泳切胶回收9802bp的大片段；
(2)全序列合成包含编码3个HA蛋白的核苷酸序列，全序列合成包含编码3个HA蛋白的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示；
(3)设计用于扩增包含编码3个HA蛋白的核苷酸序列基因片段的扩增引物，上游引物如SEQ ID No.6所示，下游引物如SEQ ID No.7所示；采用New England Biolabs的Phusion High-Fidelity DNA Polymerase进行扩增反应，扩增体系：50微升的总体积，包括10微升的5X Phusion HF Buffer、1微升的10mM dNTPs、2.5微升的10微摩尔上游引物、2.5微升的10微摩尔下游引物、1微升浓度为40纳克/微升的上述合成的包含编码3个HA蛋白的核苷酸序列基因片段、32.5微升的超纯水和0.5微升的Phusion High-Fidelity DNAPolymerase；
扩增程序：98℃运行30秒；然后30个循环的：98℃运行10秒；60℃运行30秒；72℃运行10秒；最后72℃运行10分钟；(4)扩增后最终在全序列合成的基因片段的N端加上SpeI酶切位点，在C端加上一个核苷酸G；用SpeI酶切该合成片段，凝胶电泳后切胶回收该片段；最后利用T4 DNA连接酶连接上述酶切后回收纯化的片段；将连接反应的产物，热激转化DH5α,通过PCR鉴定得到阳性克隆；质粒载体的序列通过测序验证。
现有技术中无大的蛋白标签pCAMBIA载体时，要想研究蛋白功能，必须要制备研究的蛋白自身的特异性抗体，但是这种方法费时费力，不利于快速地研究蛋白功能，而本发明构建这种HA标签质粒载体周期时间短，成本低廉，在保证了时间性的同时又能够节约成本，以下表格内容是根据某公司的服务报价和实验周期安排，制备蛋白自身的单克隆抗体需要花费超过4万元，需要耗费37周时间。而采用HA标签抗体只需花费不到1万元，10周以内的时间。
本实施例中无特殊说明的操作手法均为现有技术，故不在此过多解释。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所
<120> 一种含有HA蛋白融合标签的植物表达质粒载体及其载体的构建方法
<160> 11
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 27
<212> DNA
<213> 第一段编码HA蛋白标签的基因片段(2 Ambystoma laterale x Ambystomajeffersonianum)
<400> 1
tacccatacg atgttcctga ctatgcg 27
<210> 2
<211> 27
<212> DNA
<213> 第二段编码HA蛋白标签的基因片段(2 Ambystoma laterale x Ambystomajeffersonianum)
<400> 2
tatccctatg acgtcccgga ctatgca 27
<210> 3
<211> 27
<212> DNA
<213> 第三段编码HA蛋白标签的基因片段(2 Ambystoma laterale x Ambystomajeffersonianum)
<400> 3
tatccatatg acgttccaga ttacgct 27
<210> 4
<211> 9940
<212> DNA
<213> 含有HA蛋白融合标签的植物表达质粒载体的基因序列(2 Ambystomalaterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 4
catggtagat ctgactagtg atgggcgcat cttttaccca tacgatgttc ctgactatgc 60
gggctatccc tatgacgtcc cggactatgc aggggtcacc tatccatatg acgttccaga 120
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tcatataatt tctgttgaat tacgttaagc atgtaataat taacatgtaa tgcatgacgt 300
tatttatgag atgggttttt atgattagag tcccgcaatt atacatttaa tacgcgatag 360
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ccatttgtat gtgcatgcca accacagggt tcccctcggg atcaaagtac tttgatccaa 600
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cggagtacat cgagatcgag ctagctgatt ggatgtaccg cgagatcaca gaaggcaaga 3600
acccggacgt gctgacggtt caccccgatt actttttgat cgatcccggc atcggccgtt 3660
ttctctaccg cctggcacgc cgcgccgcag gcaaggcaga agccagatgg ttgttcaaga 3720
cgatctacga acgcagtggc agcgccggag agttcaagaa gttctgtttc accgtgcgca 3780
agctgatcgg gtcaaatgac ctgccggagt acgatttgaa ggaggaggcg gggcaggctg 3840
gcccgatcct agtcatgcgc taccgcaacc tgatcgaggg cgaagcatcc gccggttcct 3900
aatgtacgga gcagatgcta gggcaaattg ccctagcagg ggaaaaaggt cgaaaaggtc 3960
tctttcctgt ggatagcacg tacattggga acccaaagcc gtacattggg aaccggaacc 4020
cgtacattgg gaacccaaag ccgtacattg ggaaccggtc acacatgtaa gtgactgata 4080
taaaagagaa aaaaggcgat ttttccgcct aaaactcttt aaaacttatt aaaactctta 4140
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cgcctaccct tcggtcgctg cgctccctac gccccgccgc ttcgcgtcgg cctatcgcgg 4260
ccgctggccg ctcaaaaatg gctggcctac ggccaggcaa tctaccaggg cgcggacaag 4320
ccgcgccgtc gccactcgac cgccggcgcc cacatcaagg caccctgcct cgcgcgtttc 4380
ggtgatgacg gtgaaaacct ctgacacatg cagctcccgg agacggtcac agcttgtctg 4440
taagcggatg ccgggagcag acaagcccgt cagggcgcgt cagcgggtgt tggcgggtgt 4500
cggggcgcag ccatgaccca gtcacgtagc gatagcggag tgtatactgg cttaactatg 4560
cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc accatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat 4620
gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgct cttccgcttc ctcgctcact gactcgctgc 4680
gctcggtcgt tcggctgcgg cgagcggtat cagctcactc aaaggcggta atacggttat 4740
ccacagaatc aggggataac gcaggaaaga acatgtgagc aaaaggccag caaaaggcca 4800
ggaaccgtaa aaaggccgcg ttgctggcgt ttttccatag gctccgcccc cctgacgagc 4860
atcacaaaaa tcgacgctca agtcagaggt ggcgaaaccc gacaggacta taaagatacc 4920
aggcgtttcc ccctggaagc tccctcgtgc gctctcctgt tccgaccctg ccgcttaccg 4980
gatacctgtc cgcctttctc ccttcgggaa gcgtggcgct ttctcatagc tcacgctgta 5040
ggtatctcag ttcggtgtag gtcgttcgct ccaagctggg ctgtgtgcac gaaccccccg 5100
ttcagcccga ccgctgcgcc ttatccggta actatcgtct tgagtccaac ccggtaagac 5160
acgacttatc gccactggca gcagccactg gtaacaggat tagcagagcg aggtatgtag 5220
gcggtgctac agagttcttg aagtggtggc ctaactacgg ctacactaga aggacagtat 5280
ttggtatctg cgctctgctg aagccagtta ccttcggaaa aagagttggt agctcttgat 5340
ccggcaaaca aaccaccgct ggtagcggtg gtttttttgt ttgcaagcag cagattacgc 5400
gcagaaaaaa aggatctcaa gaagatcctt tgatcttttc tacggggtct gacgctcagt 5460
ggaacgaaaa ctcacgttaa gggattttgg tcatgcattc taggtactaa aacaattcat 5520
ccagtaaaat ataatatttt attttctccc aatcaggctt gatccccagt aagtcaaaaa 5580
atagctcgac atactgttct tccccgatat cctccctgat cgaccggacg cagaaggcaa 5640
tgtcatacca cttgtccgcc ctgccgcttc tcccaagatc aataaagcca cttactttgc 5700
catctttcac aaagatgttg ctgtctccca ggtcgccgtg ggaaaagaca agttcctctt 5760
cgggcttttc cgtctttaaa aaatcataca gctcgcgcgg atctttaaat ggagtgtctt 5820
cttcccagtt ttcgcaatcc acatcggcca gatcgttatt cagtaagtaa tccaattcgg 5880
ctaagcggct gtctaagcta ttcgtatagg gacaatccga tatgtcgatg gagtgaaaga 5940
gcctgatgca ctccgcatac agctcgataa tcttttcagg gctttgttca tcttcatact 6000
cttccgagca aaggacgcca tcggcctcac tcatgagcag attgctccag ccatcatgcc 6060
gttcaaagtg caggaccttt ggaacaggca gctttccttc cagccatagc atcatgtcct 6120
tttcccgttc cacatcatag gtggtccctt tataccggct gtccgtcatt tttaaatata 6180
ggttttcatt ttctcccacc agcttatata ccttagcagg agacattcct tccgtatctt 6240
ttacgcagcg gtatttttcg atcagttttt tcaattccgg tgatattctc attttagcca 6300
tttattattt ccttcctctt ttctacagta tttaaagata ccccaagaag ctaattataa 6360
caagacgaac tccaattcac tgttccttgc attctaaaac cttaaatacc agaaaacagc 6420
tttttcaaag ttgttttcaa agttggcgta taacatagta tcgacggagc cgattttgaa 6480
accgcggtga tcacaggcag caacgctctg tcatcgttac aatcaacatg ctaccctccg 6540
cgagatcatc cgtgtttcaa acccggcagc ttagttgccg ttcttccgaa tagcatcggt 6600
aacatgagca aagtctgccg ccttacaacg gctctcccgc tgacgccgtc ccggactgat 6660
gggctgcctg tatcgagtgg tgattttgtg ccgagctgcc ggtcggggag ctgttggctg 6720
gctggtggca ggatatattg tggtgtaaac aaattgacgc ttagacaact taataacaca 6780
ttgcggacgt ttttaatgta ctgaattaac gccgaattaa ttcgggggat ctggatttta 6840
gtactggatt ttggttttag gaattagaaa ttttattgat agaagtattt tacaaataca 6900
aatacatact aagggtttct tatatgctca acacatgagc gaaaccctat aggaacccta 6960
attcccttat ctgggaacta ctcacacatt attatggaga aactcgagct tgtcgatcga 7020
cagatccggt cggcatctac tctatttctt tgccctcgga cgagtgctgg ggcgtcggtt 7080
tccactatcg gcgagtactt ctacacagcc atcggtccag acggccgcgc ttctgcgggc 7140
gatttgtgta cgcccgacag tcccggctcc ggatcggacg attgcgtcgc atcgaccctg 7200
cgcccaagct gcatcatcga aattgccgtc aaccaagctc tgatagagtt ggtcaagacc 7260
aatgcggagc atatacgccc ggagtcgtgg cgatcctgca agctccggat gcctccgctc 7320
gaagtagcgc gtctgctgct ccatacaagc caaccacggc ctccagaaga agatgttggc 7380
gacctcgtat tgggaatccc cgaacatcgc ctcgctccag tcaatgaccg ctgttatgcg 7440
gccattgtcc gtcaggacat tgttggagcc gaaatccgcg tgcacgaggt gccggacttc 7500
ggggcagtcc tcggcccaaa gcatcagctc atcgagagcc tgcgcgacgg acgcactgac 7560
ggtgtcgtcc atcacagttt gccagtgata cacatgggga tcagcaatcg cgcatatgaa 7620
atcacgccat gtagtgtatt gaccgattcc ttgcggtccg aatgggccga acccgctcgt 7680
ctggctaaga tcggccgcag cgatcgcatc catagcctcc gcgaccggtt gtagaacagc 7740
gggcagttcg gtttcaggca ggtcttgcaa cgtgacaccc tgtgcacggc gggagatgca 7800
ataggtcagg ctctcgctaa actccccaat gtcaagcact tccggaatcg ggagcgcggc 7860
cgatgcaaag tgccgataaa cataacgatc tttgtagaaa ccatcggcgc agctatttac 7920
ccgcaggaca tatccacgcc ctcctacatc gaagctgaaa gcacgagatt cttcgccctc 7980
cgagagctgc atcaggtcgg agacgctgtc gaacttttcg atcagaaact tctcgacaga 8040
cgtcgcggtg agttcaggct ttttcatatc tcattgcccc ccgggatctg cgaaagctcg 8100
agagagatag atttgtagag agagactggt gatttcagcg tgtcctctcc aaatgaaatg 8160
aacttcctta tatagaggaa ggtcttgcga aggatagtgg gattgtgcgt catcccttac 8220
gtcagtggag atatcacatc aatccacttg ctttgaagac gtggttggaa cgtcttcttt 8280
ttccacgatg ctcctcgtgg gtgggggtcc atctttggga ccactgtcgg cagaggcatc 8340
ttgaacgata gcctttcctt tatcgcaatg atggcatttg taggtgccac cttccttttc 8400
tactgtcctt ttgatgaagt gacagatagc tgggcaatgg aatccgagga ggtttcccga 8460
tattaccctt tgttgaaaag tctcaatagc cctttggtct tctgagactg tatctttgat 8520
attcttggag tagacgagag tgtcgtgctc caccatgtta tcacatcaat ccacttgctt 8580
tgaagacgtg gttggaacgt cttctttttc cacgatgctc ctcgtgggtg ggggtccatc 8640
tttgggacca ctgtcggcag aggcatcttg aacgatagcc tttcctttat cgcaatgatg 8700
gcatttgtag gtgccacctt ccttttctac tgtccttttg atgaagtgac agatagctgg 8760
gcaatggaat ccgaggaggt ttcccgatat taccctttgt tgaaaagtct caatagccct 8820
ttggtcttct gagactgtat ctttgatatt cttggagtag acgagagtgt cgtgctccac 8880
catgttggca agctgctcta gccaatacgc aaaccgcctc tccccgcgcg ttggccgatt 8940
cattaatgca gctggcacga caggtttccc gactggaaag cgggcagtga gcgcaacgca 9000
attaatgtga gttagctcac tcattaggca ccccaggctt tacactttat gcttccggct 9060
cgtatgttgt gtggaattgt gagcggataa caatttcaca caggaaacag ctatgaccat 9120
gattacgaat tcgagctcgg tacccgggga tcctctagag tcgacctgca ggcatgcaag 9180
cttggcactg gccgtcgttt tacaacgtcg tgactgggaa aaccctggcg ttacccaact 9240
taatcgcctt gcagcacatc cccctttcgc cagctggcgt aatagcgaag aggcccgcac 9300
cgatcgccct tcccaacagt tgcgcagcct gaatggcgaa tgctagagca gcttgagctt 9360
ggatcagatt gtcgtttccc gccttcagtt tagcttcatg gagtcaaaga ttcaaataga 9420
ggacctaaca gaactcgccg taaagactgg cgaacagttc atacagagtc tcttacgact 9480
caatgacaag aagaaaatct tcgtcaacat ggtggagcac gacacacttg tctactccaa 9540
aaatatcaaa gatacagtct cagaagacca aagggcaatt gagacttttc aacaaagggt 9600
aatatccgga aacctcctcg gattccattg cccagctatc tgtcacttta ttgtgaagat 9660
agtggaaaag gaaggtggct cctacaaatg ccatcattgc gataaaggaa aggccatcgt 9720
tgaagatgcc tctgccgaca gtggtcccaa agatggaccc ccacccacga ggagcatcgt 9780
ggaaaaagaa gacgttccaa ccacgtcttc aaagcaagtg gattgatgtg atatctccac 9840
tgacgtaagg gatgacgcac aatcccacta tccttcgcaa gacccttcct ctatataagg 9900
aagttcattt catttggaga gaacacgggg gactcttgac 9940
<210> 5
<211> 132
<212> DNA
<213> 全序列合成包含编码3个HA蛋白的核苷酸序列(2 Ambystoma laterale xAmbystoma jeffersonianum)
<400> 5
gatgggcgca tcttttaccc atacgatgtt cctgactatg cgggctatcc ctatgacgtc 60
ccggactatg caggggtcac ctatccatat gacgttccag attacgctgc tagatcttag 120
tacgtgtgaa tt 132
<210> 6
<211> 30
<212> DNA
<213> 扩增包含编码3个HA蛋白的核苷酸序列基因片段的上游引物(2 Ambystomalaterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 6
ctgactagtg atgggcgcat cttttaccca 30
<210> 7
<211> 30
<212> DNA
<213> 扩增包含编码3个HA蛋白的核苷酸序列基因片段的下游引物(2 Ambystomalaterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 7
caattcacac gtactaagat ctagcagcgt 30
<210> 8
<211> 3
<212> DNA
<213> SEQ ID No.1和SEQ ID No.2之间的连接序列(2 Ambystoma laterale xAmbystoma jeffersonianum)
<400> 8
ggc 3
<210> 9
<211> 9
<212> DNA
<213> SEQ ID No.2和SEQ ID No.3之间的连接序列(2 Ambystoma laterale xAmbystoma jeffersonianum)
<400> 9
ggggtcacc 9
<210> 10
<211> 31
<212> DNA
<213> 扩增CHIL的全长基因上游引物(2 Ambystoma laterale x Ambystomajeffersonianum)
<400> 10
tttggatcct ggggtggagt caagcatttt t 31
<210> 11
<211> 32
<212> DNA
<213> 扩增CHIL的全长基因下游引物(2 Ambystoma laterale x Ambystomajeffersonianum)
<400> 11
tttactagtg gttaaaactg cggagattga at 32

Claims (4)

1.一种含有HA蛋白融合标签的植物表达质粒载体，其特征在于，该载体为在植物表达质粒载体的C端含有HA蛋白融合标签。
2.根据权利要求1所述的含有HA蛋白融合标签的植物表达质粒载体，其特征在于，该载体包含有三段编码HA蛋白标签Tyr-Pro-Tyr-Asp-Val-Pro-Asp-Tyr-Ala的基因片段，所述三个HA蛋白的核苷酸序列分别如SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3所示。
3.根据权利要求1所述的含有HA蛋白融合标签的植物表达质粒载体，其特征在于，该载体的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。
4.一种构建权利要求1-3任意一项所述含有HA蛋白融合标签的植物表达质粒载体的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：
(1)以pCAMBIA1302为出发质粒，采用Eco065 I酶切该质粒，然后用Klenow Fragment酶将Eco065 I酶切后的粘性末端补平成平末端，反应体系：50微升的总体积，包括5微升的10XKlenow Fragment Buffer、0.5微升的10mM dNTPs、10微升浓度为50纳克/微升的上述用Eco065 I酶切后的质粒片段、32.5微升的超纯水和2微升的Takara的Klenow Fragment酶；再用Spe I酶切，通过凝胶电泳切胶回收9802bp的大片段；
(2)全序列合成包含编码3个HA蛋白的核苷酸序列，全序列合成包含编码3个HA蛋白的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示；
(3)设计用于扩增包含编码3个HA蛋白的核苷酸序列基因片段的扩增引物，上游引物如SEQ ID No.6所示，下游引物如SEQ ID No.7所示；采用New England Biolabs的PhusionHigh-Fidelity DNA Polymerase进行扩增反应，扩增体系：50微升的总体积，包括10微升的5X Phusion HF Buffer、1微升的10mM dNTPs、2.5微升的10微摩尔上游引物、2.5微升的10微摩尔下游引物、1微升浓度为40纳克/微升的上述合成的包含编码3个HA蛋白的核苷酸序列基因片段、32.5微升的超纯水和0.5微升的Phusion High-Fidelity DNA Polymerase；
扩增程序：98℃运行30秒；然后30个循环的：98℃运行10秒；60℃运行30秒；72℃运行10秒；最后72℃运行10分钟；(4)扩增后最终在全序列合成的基因片段的N端加上Spe I酶切位点，在C端加上一个核苷酸G；用Spe I酶切该合成片段，凝胶电泳后切胶回收该片段；最后利用T4 DNA连接酶连接上述酶切后回收纯化的片段；将连接反应的产物，热激转化DH5α,通过PCR鉴定得到阳性克隆；质粒载体的序列通过测序验证。
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