CN104237508A - 一种结核分枝杆菌的检测试剂盒及应用 - Google Patents

一种结核分枝杆菌的检测试剂盒及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种结核分枝杆菌的检测试剂盒及应用，一种结核分支杆菌的检测试剂盒，包括包被液；洗涤液；封闭液；终止液；抗原Rv1040c；抗原Rv2309A。本发明所述试剂盒具有操作简便、成本低、精确度高、操作者友好、设备简便等优点，本发明利用混合抗原进行包被，克服了单一抗原在进行诊断时，存在很大的个体差异性的问题，并且，混合抗原的检测效果在灵敏度，精确性和特异性方面都要优于单独抗原。与目前市售的同类试剂盒相比，无论是在特异性、假阳性率或是检出率上，优势更明显，本发明所述的试剂盒在检测结核分枝杆菌上具备广阔的应用前景。

Description

一种结核分枝杆菌的检测试剂盒及应用
技术领域
本发明属于免疫检测技术领域，具体涉及一种结核分枝杆菌的检测试剂盒，同时还涉及该试剂盒在检测结核病药物中的应用。
背景技术
结核病是一种严重的传染性疾病，是当今世界面临的主要公共健康问题之一，曾在世界范围内出现过大流行。它的病原体是结核分枝杆菌，属分支杆菌属。随着比较有效的抗结核药物的出现，结核病的发展在全球得到过充分的抑制，但是近些年来由于结核分枝杆菌多重耐药菌株的出现，使结核病的发病率又再度回升，全球结核病形势出现了恶化趋势。据WHO统计，全球约有1/3的人口（约20亿）被结核分支杆菌感染。据我国在2000年的第四次全国结核病流行病学的抽样调查结果估算，我国约有450万活动性肺结核病人，每年有13万人死于肺结核，是全球22个结核病高负担国家之一，结核病人数为世界第二。
早期的诊断治疗对于结核病的预防和治疗有着非常重要的作用，现阶段的诊断包括痰涂片法、痰结核菌培养、X线检查和血清学检测等方法。其中，血清学检测由于其操作简便、成本低、精确度高、操作者友好、设备简便等优点，在对结核病的检测方面应用前景非常广阔，但是现在所使用的抗原存在着特异性差、假阳性率高的缺点，并且现在的一些商业试剂盒检出率低、假阳性率高，因此急需研发出更为有效的特异性抗原来提高血清学检测的效果。
发明内容
本发明的目的是在于提供了一种结核分枝杆菌的检测试剂盒，本试剂盒由一对混合抗原组成，为Rv1040c和Rv2309A，其序列分别为SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。单一抗原在进行诊断时，会存在很大的个体差异性，而混合抗原的出现可以克服这一缺点。并且，混合抗原的检测效果在灵敏度，精确性和特异性方面都要优于单独抗原。
本发明的另一个目的是在于提供了一种结核分枝杆菌试剂盒在制备检测结核分枝杆菌试剂中的应用，本试剂盒与商业试剂盒TB-DOT相比，其灵敏度，精确性和特异性都要优于TB-DOT。和商业试剂盒TB-CHECK-1相比，在灵敏度和精确度方面都要优于TB-CHECK-1。
为了实现上述的目的，本发明采用以下技术措施：
本发明通过基因工程手段，将结核分枝杆菌Rv1040c和Rv2309A蛋白在体外表达、纯化，并将Rv1040c和Rv2309A蛋白混合制备混合抗原及抗原检测试剂盒，本试剂盒能特异性的检测结核分枝杆菌的抗体，能区分经卡介苗免疫的健康人群和被结核分枝杆菌感染的患结核病的人群。可用于结核病的临床血清学检测。
一种检测结核分枝杆菌的试剂盒，它包括以下组份：
包被液：0.05MpH9.6的碳酸盐缓冲液；
洗涤液：含0.05%(v/v)吐温-20的PBS溶液；
封闭液：含5%（w/v）脱脂牛奶的洗涤液；
终止液：2M H2SO4；
抗原Rv1040c，其序列为SEQ ID NO.2所示；
抗原Rv2309A，其序列为SEQ ID NO.3所示。
一种结核分枝杆菌基因表达载体组氨酸标签融合表达载体pETXba的构建方法，其步骤如下:
（1）将商业购买的载体pET28a上的XbaⅠ酶切位点消除，获得一个中间载体pET28a-ΔX；
（2）将步骤（1）获得的载体pET28a-ΔX用限制性内切酶NdeⅠ和XhoⅠ进行消化；
（3）利用极端嗜热古菌S.solfataricus的cdc62基因作为第一个媒介基因，通过PCR的方法从极端嗜热古菌S.solfataricus基因组中扩增获得末端含有NdeⅠ和XhoⅠ酶切位点的cdc62媒介基因；
（4）将步骤（3）获得的媒介基因cdc62用限制性内切酶NdeⅠ和XhoⅠ进行消化；
（5）将步骤（2）获得的载体和步骤（4）获得.的媒介基因在16℃连接过夜，得到第二个中间载体pET28a-62；
（6）将步骤（5）获得的载体pET28a-62用限制性内切酶EcoRⅠ和XhoⅠ进行消化；
（7）利用极端嗜热古菌S.solfataricus的微型染色体维持基因MCM作为第二个媒介基因，通过PCR方法获得末端含有EcoRⅠ和XhoⅠ限制性酶切位点的MCM媒介基因；
（8）将步骤（7）获得的MCM媒介基因用EcoRⅠ和XhoⅠ限制性内切酶消化；
（9）将步骤（6）获得的载体pET28a-26和步骤（8）获得的媒介基因MCM在16℃连接过夜。
通过以上方式获得的表达载体pETXba，其大小为6526bp（专利号：ZL200910060952.1），序列为SEQ ID NO.1所示。它还包括一个适用于克隆结核分枝杆菌所编码基因的多克隆位点。
上述步骤（3）中的cdc62基因扩增所用引物对的序列如下：
正向引物：GCGCGGCATATGAGAATTCATGAGTGATATAATTGATGAG，
反向引物：ATATGACTCGAGTACTCCAGAGATCAGCAAACCT；
上述步骤（7）中MCM基因扩增所需的引物对的序列如下：
正向引物：GAGCGAATTCGTTGGAAATTCCTAGTAAAC，
反向引物：GGATGGCTCGAGTCTAGACTTTTTTGTAACAT。
Rv1040c和Rv2309A抗原表达载体的构建方法，其步骤是：
(1)根据GeneBank提供的结核分枝杆菌H37Rv基因组序列，查出Rv1040c和Rv2309A的序列并设计引物，通过PCR得到上述两个基因。PCR结果见图1。
(2)将PCR产物分别酶切，用同样的方法酶切表达载体pETXba，之后将Rv1040c和Rv2309A分别和酶切过的pET表达载体连接，分别转化大肠杆菌DH5α，制备质粒。质粒电泳结果见图2。
一种结核分枝杆菌蛋白质在大肠杆菌中的外源表达和蛋白质的纯化，其步骤是：
将得到的pET-Rv1040c和pET-Rv2309A转化BL21（DE3）菌株，从转化的培养皿上挑取单菌落分别进行诱导表达，纯化。蛋白质试表达结果见图3，蛋白质纯化结果见图4。最终得到Rv1040c和Rv2309A抗原，其序列分别为SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。
一种结核分枝杆菌试剂盒在制备检测结核病试剂中的应用，其步骤是：
包被液：0.05M、pH9.6的碳酸盐缓冲液（Na2CO3：1.59g;NaHCO3：2.93g;加蒸馏水定容至1L）;
洗涤液：含0.05%(v/v)吐温-20的PBS溶液（PBS配方参见《分子克隆技术操作指南》）；
封闭液：含5%（w/v）脱脂牛奶的洗涤液；
终止液：2M H2SO4；
具体实施步骤：
1.包被：用包被液将混合抗原稀释，再用微量移液器吸取稀释好的样品加入ELISA板内，每孔100μl，4℃过夜；在每孔中加入的100μl包被液中，每孔中含有Rv1040c37μmol，含有Rv2309A:28μmol。
2.洗涤：次日从4℃取出步骤1的ELISA板，甩干内容物，向孔内加入洗涤液，每孔200μl，静置3分钟，甩干，再加洗涤液，如此泡洗三次，最后一次甩干后，将ELISA板朝下放在滤纸上反复拍打干净；
3.封闭；向步骤2的ELISA板中加入封闭液，每孔200μl，37℃温育30min；
4.洗涤：同步骤2的方法；
5.加入一抗反应：向步骤4的ELISA板中加入结核病人血清（湖北省武汉市结核病防治所）稀释液稀释400倍，每孔100μl，37℃温育30min；血清排列方式见表5
6.洗涤：同步骤2的方法；
7.加入二抗反应：向步骤6的ELISA板中加入二抗（购自武汉意德生物技术有限公司）稀释液稀释5000倍，每孔100μl，37℃温育30min；
8.洗涤：同步骤2的方法；
9.显色：向步骤8的ELISA板中加入TMB底物（购自武汉意德生物技术有限公司）显色，每孔100μl，避光30min；
10.终止反应：向步骤9的ELISA板中加入终止液终止显色反应；
11.结果读取：利用酶标仪读取OD450的值，
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
1.单一抗原在进行诊断时，会存在很大的个体差异性，本发明利用混合抗原进行包被，的出现可以克服这一缺点。并且，混合抗原的检测效果在灵敏度，精确性和特异性方面都要优于单独抗原。
2.操作简便，成本低廉，高通量，能提高结核病检测的灵敏度和精确性。
附图说明
图1为一种Rv1040c和Rv2309A的PCR图片
从左至右：第一泳道为Marker,第二为Rv1040c第三为Rv2309A。
图2为一种Rv1040c和Rv2309A质粒PCR示意图。
从左至右：第一泳道为Marker,第二为Rv1040c第三为Rv2309A。
图3为一种Rv1040c和Rv2309A蛋白质试表达示意图。
从左至右：第一泳道为Marker,第二泳道为Rv1040c诱导前的菌体，第三泳道为Rv1040c诱导后的蛋白质表达情况，第四泳道为Rv2309A诱导前的菌体，第五泳道为Rv2309A诱导后的菌体.
图4为一种Rv1040c和Rv2309A蛋白质表达示意图。
第一泳道为Marker,第二为Rv1040c第三为Rv2309A.
图5为一种TB-DOT试剂盒示意图。
图6为一种TB-CHECK-1试剂盒示意图。
具体实施方式
本发明说如未特别提及，所用引物均有由Invitrogen公司合成；所有未特别说明的实验方案或条件均为常规。
实施例1：
一种检测结核分枝杆菌的试剂盒，它包括以下组份：
包被液：0.05M pH9.6的碳酸盐缓冲液（Na2CO3：1.59g;NaHCO3：2.93g;加蒸馏水定容至1L）；
洗涤液：含0.05%(v/v)吐温-20的PBS溶液；
封闭液：含5%（w/v）脱脂牛奶的洗涤液；
终止液：2M H2SO4；
抗原Rv1040c，其序列为SEQ ID NO.2所示；
抗原Rv2309A，其序列为SEQ ID NO.3所示。
实施例2：
结核分枝杆菌基因Rv1040c和Rv2309A的PCR扩增：
以结核分枝杆菌（来自武汉市医疗救治中心）提取H37Rv的总基因组（登录号为NC000962）的DNA，提取方法如下：
1)将结核分枝杆菌菌液1ml分装到1.5ml离心管，12000rpm/min离心1min。
2)去上清，加入1ml单蒸水，于金属加热器上100℃煮10min。
3)12000rpm/min离心1min，吸取上清，上清即含H37Rv总基因组，备用。
以提取的总基因组为模版、，根据Rv1040c（gene bank ID：888533）和Rv2309A（gene bank ID：3205076）设计的引物进行PCR，扩增出所需基因。
其中，引物设计方法为：应用BioEdit软件，根据编码基因内部的酶切位点，选择基因内部没有的酶切位点组合来设计引物，二个基因都选取EcoRⅠ和XbaⅠ的组合，引物具体如下：
Rv1040c f:ATCG GAATTC GC ATGTCATTCCTCAAGACAGT
Rv1040c r:TATATA TCTAGA CTAGACGGTTGCTGGCTTGG
Rv2309A f:ATAT GAATTC AT TTGGCCACCAGTAGCGACGA
Rv2309A r:TATATA TCTAGA TCATGGGCCGACAGGAAGCT
表1PCR体系
表2Rv1040c和Rv2309A PCR反应条件
实施例3：
表达载体pETEXba的改造
（1）通过末端补齐修饰的方法（具体参见Takara公司T4DNA Polymerase使用方法）将商用的pET28a（购自Novagen公司）载体上的XbaⅠ酶切位点消除，获得一个中间载体，命名为pET28a-△X；
（2）将步骤（1）获得的中间载体pET28a-△X用限制性内切酶NdeⅠ和XhoⅠ进行消化；
（3）利用极端嗜热古菌S.Solfataricus的cdc62基因（GeneBank ID：1455035）(Bender A,Pringle JR.Multicopy suppression of the cdc24budding defect in yeast by CDC42and three newly identified genes including the ras-related gene RSR1[J].Proceedings of the National Academy of Sciences,1989,86(24):9976-9980.)作为改造载体的第一个媒介基因。该基因是通过PCR的方法在极端嗜热古菌S.solfataricus基因组中扩增（正向引物14bEcoR-f：GCGCGGCATATGAGAATTCATGAGTGATATAATTGATGAG，反向引物14bEcoR-r：ATATGACTCGAGTACTCCAGAGATCAGCAAACCT，下划线为酶切位点，PCR条件见表3从获得末端含有NdeⅠ和XhoⅠ酶切位点的cdc62基因片段；
表3古菌基因PCR反应条件
（4）将步骤（3）获得的媒介基因片段cdc62用限制性内切酶NdeⅠ和XhoⅠ进行消化；
（5）将通过步骤（2）和步骤（4）获得的载体和媒介基因在16℃进行连接过夜，得到中间载体，命名为pET8a-62；
（6）将步骤（5）获得的中间载体pET28a-62用限制性内切酶EcoRⅠ和XhoⅠ进行消化；
（7）利用极端嗜热古菌S.solfataricus的微型染色体维持基因（mini-chromosome maintenance-like gene,MCM,Genebank ID:1455038）(Slaymaker IM,Fu Y,Toso DB,et al.Mini-chromosome maintenance complexes form a filament to remodel DNA structure and topology[J].Nucleic acids research,2013,41(5):3446-3456.)作为改造载体的原始媒介基因。通过PCR（正向引物Trgada-f:GAGCGAATTCGTTGGAAATTCCTAGTAAAC,反向引物Adaptor-r:GGATGGCTCGAGTCTAGACTAGACTTTTTTGTAACAT,下划线为酶切位点，PCR条件见表3，从极嗜热古菌S.solfataricus的基因组中扩增得2.0kb的MCM基因。由于在MCM内部存在两个BamHⅠ限制性内切酶识别位点，将该片段经BamHⅠ充分酶切形成缺失844个碱基的片段。随后将该片段经末端补齐修饰方法（具体方法参见Takara公司T4DNA Polymerase使用方法）处理形成末端含有EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位点，大小为1.2kb的MCM媒介基因；
（8）利用极端嗜热古菌S.solfataricus的微型染色体维持基因（mini-chromosome maintenance-like gene,MCM,Genebank ID:1455038）作为改造载体的第二个媒介基因。通过PCR的方法（正向引物TrgXcm-f:GAGCGAATTCGTTGGAAATTCCTAGTAAAC，反向引物Xcm-r:GGATGGCTCGAGTCTAGACTAGACTTTTTTGTAACAT，下划线为酶切位点，PCR条件见表3，以在步骤（7）中获得的MCM媒介基因为模版扩增获得末端含有EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位点的MCM媒介基因；
（9）将步骤（8）获得的MCM媒介基因用限制性内切酶EcoRⅠ和XhoⅠ进行消化；
(10)将通过步骤（6）和步骤（9）获得的载体和媒介基因在16℃进行连接过夜，得到改造成功的表达载体，命名为pETEXba（专利号：ZL200910060952.1），其大小为6526bp，其序列为SEQ ID NO.1所示。
实施例4：
将结核分枝杆菌编码基因的PCR产物克隆至pETEXba载体
(1)将通过PCR得到的基因片段Rv1040c和Rv2309A分别用限制性内切酶EcoRⅠ和XbaⅠ消化；
(2)将通过实施例2得到的pETXba载体用限制性内切酶EcoRⅠ和XbaⅠ消化；
(3)将步骤（1）获得的基因片段和步骤（2）获得的载体分别在16℃连接过夜；转化大肠杆菌，挑取阳性克隆测序正确后获得质粒pET-1040c和pET-2309A。
实施例5：
蛋白质的诱导表达
本实施例中使用的通用LB培养基和附加的卡那霉素（见具体步骤所示）配方参见J.萨姆布鲁克，EF.佛里奇，T.曼尼阿蒂斯著，黄培堂，王嘉玺等译，分子克隆实验指南（第三版），科学出版社，2002年。
(1)将通过实施例3获得的质粒pET-1040c和pET-2309A分别转化BL21(DE3)菌株（购自上海超研生物科技有限公司）；
(2)从步骤（1）转化到的平板上挑取单菌落接入2.5ml含有卡那霉素（30μg/ml）的LB培养基中，于37℃摇床培养过夜；
(3)把步骤（2）获得的过夜培养物取2ml转接至200ml含有卡那霉素（30μg/ml）的LB培养基中，于37℃扩大培养至OD600=1.0。剩余培养物作为菌种保存至-20℃；
(4)向步骤（3）获得的200ml菌液中加入IPTG（异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，终浓度1.0mM）的LB培养基，于37℃摇床继续培养4个小时；
(5)将步骤（4）获得的菌液收集至100ml离心管，8000转/分钟离心2分钟，倒掉上清，菌体于-20℃保存。
实施例6：
蛋白质的变性纯化
本实施例中使用的缓冲液B、C和E配方参见下表3
表4实施例5中使用的缓冲液BC和E的组分及其配比
(1)向在实施例4中收集的菌体加入约30ml Buffer B重悬，37℃摇床过夜，使菌体充分裂解；
(2)将步骤(1)裂解后的菌体于4℃，9000转/分钟离心30分钟，将上清取出备用；
(3)将步骤(2)得到的上清流过含有加镍之后的镍亲和层析胶珠(购自GE公司)的蛋白质纯化柱；
(4)向步骤(3)的蛋白质纯化柱中加入30ml Buffer C冲洗；
(5)向步骤(4)的蛋白质纯化柱中加入5ml Buffer E冲洗，接好冲洗过柱的样品备用，经过SDS-PAGE检测纯化的结果。Rv1040c蛋白质的浓度为4.1mg/ml，其序列为SEQ ID NO.2所示；Rv2309A蛋白质的浓度为11.05mg/ml，其序列为SEQ ID NO.3所示。
实施例：7
一种结核分枝杆菌试剂盒在制备检测结核分枝杆菌试剂中的应用，其步骤是：
本实施例中使用的缓冲液配方如下：
包被液：0.05M、pH9.6的碳酸盐缓冲液（Na2CO3：1.59g;NaHCO3：2.93g;加蒸馏水定容至1L）;
洗涤液：含0.05%(v/v)吐温-20的PBS溶液（PBS配方参见《分子克隆技术操作指南》）；
封闭液：含5%（w/v）脱脂牛奶的洗涤液；
终止液：2M H2SO4；
具体实施步骤：
1.包被：用包被液将混合抗原稀释，再用微量移液器吸取稀释好的样品加入ELISA板内，每孔100μl，4℃过夜；在每孔中加入的100μl包被液，每孔中含有Rv1040c37μmol，含有Rv2309A:28μmol。
2.洗涤：次日从4℃取出步骤1的ELISA板，甩干内容物，向孔内加入洗涤液，每孔200μl，静置3分钟，甩干，再加洗涤液，如此泡洗三次，最后一次甩干后，将ELISA板朝下放在滤纸上反复拍打干净；
3.封闭；向步骤2的ELISA板中加入封闭液，每孔200μl，37℃温育30min；
4.洗涤：同步骤2的方法；
5.加入一抗反应：向步骤4的ELISA板中加入结核病人血清（湖北省武汉市结核病防治所）稀释液稀释400倍，每孔100μl，37℃温育30min；血清排列方式见表5
6.洗涤：同步骤2的方法；
7.加入二抗反应：向步骤6的ELISA板中加入二抗（购自武汉意德生物技术有限公司）稀释液稀释5000倍，每孔100μl，37℃温育30min；
8.洗涤：同步骤2的方法；
9.显色：向步骤8的ELISA板中加入TMB底物（购自武汉意德生物技术有限公司）显色，每孔100μl，避光30min；
10.终止反应：向步骤9的ELISA板中加入终止液终止显色反应；
11.结果读取：利用酶标仪读取OD450的值，检测结果见表8。
表5血清排列方式
备注：P代表病人血清，H代表健康人血清。
实施例8：
用商业试剂盒TB-DOT（购自上海奥普生物醫藥有限公司）和TB-CHECK-1（购自上海宏泰生物工程有限公司）检测血清，和本发明的ELISA方法对比。
详细检测方法参见产品说明书。
表6TB-DOT检测结果：
注：1表示检测结果显阳性，0表示检测结果显阴性
表7TB-CHECK-1检测结果：
注：1表示检测结果显阳性，0表示检测结果显阴性
表8Rv1040c和Rv2309A的ELISA检测结果
数据处理方法
1、试剂盒数据处理方法。
真阴性：在健康人中检测结果显阴性
真阳性：在病人中检测结果显阳性
假阴性：在病人中检测结果显阴性
假阳性：在健康人中检测结果显阳性
灵敏度=真阳性/(真阳性+假阴性)×100%
特异性=真阴性/(假阳性+真阴性)×100%
精确度=(真阳性+真阴性)/样本总数×100%
2、ELISA数据处理方法
Cut off value=临床阴性血清OD450平均值+2×临床阴性血清OD450标准差
真阴性：在健康人中检测结果＜Cut off value
真阳性：在病人中检测结果＞Cut off value
假阴性：在病人中检测结果＜Cut off value
假阳性：在健康人中检测结果＞Cut off value
灵敏度=真阳性/(真阳性+假阴性)×100%
特异性=真阴性/(假阳性+真阴性)×100%
精确度=(真阳性+真阴性)/样本总数×100%
表9ELISA与其他试剂盒结果
                         SEQUENCE LISTING
 
<110>  华中农业大学
 
<120>  一种结核分枝杆菌的检测试剂盒及应用
 
<130>  一种结核分枝杆菌的检测试剂盒及应用
 
<160>  3    
 
<170>  PatentIn version 3.1
 
<210>  1
<211>  6526
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  1
atccggatat agttcctcct ttcagcaaaa aacccctcaa gacccgttta gaggccccaa     60
 
ggggttatgc tagttattgc tcagcggtgg cagcagccaa ctcagcttcc tttcgggctt    120
 
tgttagcagc cggatctcag tggtggtggt ggtggtgctc gagtctagac tagacttttt    180
 
tgtaacattc tggttttgct tcatatatta taccactctt tctcatatct gtaagtaatt    240
 
tttctatatt acttttttca atgcctactt gttgagcttc ttttagtatg tccttaactt    300
 
ttgcgcactc agaacttaca gctaaactat ctattatttc tattattttc atcattttct    360
 
ctctagcgct tttaggttta ccagtcatta ttgtatctat atctattttt ccactttcca    420
 
tatcaactcc tacactctct aggaaaagtc tcatgatatt tattgctctt tctgcatctt    480
 
ctctagtgac ttcagcctta agagccatct tggcataggc ttctgaaatt cttattaaag    540
 
cctctaattg tcttggagtt atcaatattg ggctatcagg tgtttctgag cttttcttcc    600
 
tcatttctac gaagaaatct gtaatcagat tcttagcctc actagtaatt tttggtgtaa    660
 
cgtatttcct tgcatatgct atatattttc ttaatgtatc tatatctata atattttttg    720
 
tggattttcc tgaatgtaca tctaatatgt aattcgcaag ttctctatct tgttcacctg    780
 
gttgatcctt tagtataaat attaggtcaa atcttgacaa gattgttgga ggtaggttga    840
 
tattatcaga cactggtctt tcacttatgt atctcccgaa tttcggattc cctgcagcta    900
 
taactgcagc cctagcgttt aatttagcta ctattccagc ttttgctatt gagactgtct    960
 
gttgttccat tgcctcatga atggctactc tatcttcatc cctcatcttg tctatttcat   1020
 
caataactgc tattccacca tcagcaagta ctaacgcacc agcttctaag taatactctc   1080
 
cagttccctt ttctcttact acagcagctg ttaaacctgc agctgtggat ccaattgcaa   1140
 
gatatgatca tacaatgcac cttccagaat tggtagaata attttggtat tatttattat   1200
 
ctcataagcc aaattttcat tgaacgaaag tacatcagaa aattctatta taagactttt   1260
 
tttcctatac gctactagct cgtttatcct ctcgatatat ttgttttgat tattgttacc   1320
 
cttgaaagtt gtcagaaact ctataaatac gtctctatag tcaatctgtt tactaggaat   1380
 
ttccaagaat tctcatatgg ctgccgcgcg gcaccaggcc gctgctgtga tgatgatgat   1440
 
gatggctgct gcccatggta tatctccttc ttaaagttaa acaaaattat ttctagaggg   1500
 
gaattgttat ccgctcacaa ttcccctata gtgagtcgta ttaatttcgc gggatcgaga   1560
 
tctcgatcct ctacgccgga cgcatcgtgg ccggcatcac cggcgccaca ggtgcggttg   1620
 
ctggcgccta tatcgccgac atcaccgatg gggaagatcg ggctcgccac ttcgggctca   1680
 
tgagcgcttg tttcggcgtg ggtatggtgg caggccccgt ggccggggga ctgttgggcg   1740
 
ccatctcctt gcatgcacca ttccttgcgg cggcggtgct caacggcctc aacctactac   1800
 
tgggctgctt cctaatgcag gagtcgcata agggagagcg tcgagatccc ggacaccatc   1860
 
gaatggcgca aaacctttcg cggtatggca tgatagcgcc cggaagagag tcaattcagg   1920
 
gtggtgaatg tgaaaccagt aacgttatac gatgtcgcag agtatgccgg tgtctcttat   1980
 
cagaccgttt cccgcgtggt gaaccaggcc agccacgttt ctgcgaaaac gcgggaaaaa   2040
 
gtggaagcgg cgatggcgga gctgaattac attcccaacc gcgtggcaca acaactggcg   2100
 
ggcaaacagt cgttgctgat tggcgttgcc acctccagtc tggccctgca cgcgccgtcg   2160
 
caaattgtcg cggcgattaa atctcgcgcc gatcaactgg gtgccagcgt ggtggtgtcg   2220
 
atggtagaac gaagcggcgt cgaagcctgt aaagcggcgg tgcacaatct tctcgcgcaa   2280
 
cgcgtcagtg ggctgatcat taactatccg ctggatgacc aggatgccat tgctgtggaa   2340
 
gctgcctgca ctaatgttcc ggcgttattt cttgatgtct ctgaccagac acccatcaac   2400
 
agtattattt tctcccatga agacggtacg cgactgggcg tggagcatct ggtcgcattg   2460
 
ggtcaccagc aaatcgcgct gttagcgggc ccattaagtt ctgtctcggc gcgtctgcgt   2520
 
ctggctggct ggcataaata tctcactcgc aatcaaattc agccgatagc ggaacgggaa   2580
 
ggcgactgga gtgccatgtc cggttttcaa caaaccatgc aaatgctgaa tgagggcatc   2640
 
gttcccactg cgatgctggt tgccaacgat cagatggcgc tgggcgcaat gcgcgccatt   2700
 
accgagtccg ggctgcgcgt tggtgcggat atctcggtag tgggatacga cgataccgaa   2760
 
gacagctcat gttatatccc gccgttaacc accatcaaac aggattttcg cctgctgggg   2820
 
caaaccagcg tggaccgctt gctgcaactc tctcagggcc aggcggtgaa gggcaatcag   2880
 
ctgttgcccg tctcactggt gaaaagaaaa accaccctgg cgcccaatac gcaaaccgcc   2940
 
tctccccgcg cgttggccga ttcattaatg cagctggcac gacaggtttc ccgactggaa   3000
 
agcgggcagt gagcgcaacg caattaatgt aagttagctc actcattagg caccgggatc   3060
 
tcgaccgatg cccttgagag ccttcaaccc agtcagctcc ttccggtggg cgcggggcat   3120
 
gactatcgtc gccgcactta tgactgtctt ctttatcatg caactcgtag gacaggtgcc   3180
 
ggcagcgctc tgggtcattt tcggcgagga ccgctttcgc tggagcgcga cgatgatcgg   3240
 
cctgtcgctt gcggtattcg gaatcttgca cgccctcgct caagccttcg tcactggtcc   3300
 
cgccaccaaa cgtttcggcg agaagcaggc cattatcgcc ggcatggcgg ccccacgggt   3360
 
gcgcatgatc gtgctcctgt cgttgaggac ccggctaggc tggcggggtt gccttactgg   3420
 
ttagcagaat gaatcaccga tacgcgagcg aacgtgaagc gactgctgct gcaaaacgtc   3480
 
tgcgacctga gcaacaacat gaatggtctt cggtttccgt gtttcgtaaa gtctggaaac   3540
 
gcggaagtca gcgccctgca ccattatgtt ccggatctgc atcgcaggat gctgctggct   3600
 
accctgtgga acacctacat ctgtattaac gaagcgctgg cattgaccct gagtgatttt   3660
 
tctctggtcc cgccgcatcc ataccgccag ttgtttaccc tcacaacgtt ccagtaaccg   3720
 
ggcatgttca tcatcagtaa cccgtatcgt gagcatcctc tctcgtttca tcggtatcat   3780
 
tacccccatg aacagaaatc ccccttacac ggaggcatca gtgaccaaac aggaaaaaac   3840
 
cgcccttaac atggcccgct ttatcagaag ccagacatta acgcttctgg agaaactcaa   3900
 
cgagctggac gcggatgaac aggcagacat ctgtgaatcg cttcacgacc acgctgatga   3960
 
gctttaccgc agctgcctcg cgcgtttcgg tgatgacggt gaaaacctct gacacatgca   4020
 
gctcccggag acggtcacag cttgtctgta agcggatgcc gggagcagac aagcccgtca   4080
 
gggcgcgtca gcgggtgttg gcgggtgtcg gggcgcagcc atgacccagt cacgtagcga   4140
 
tagcggagtg tatactggct taactatgcg gcatcagagc agattgtact gagagtgcac   4200
 
catatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgct   4260
 
cttccgcttc ctcgctcact gactcgctgc gctcggtcgt tcggctgcgg cgagcggtat   4320
 
cagctcactc aaaggcggta atacggttat ccacagaatc aggggataac gcaggaaaga   4380
 
acatgtgagc aaaaggccag caaaaggcca ggaaccgtaa aaaggccgcg ttgctggcgt   4440
 
ttttccatag gctccgcccc cctgacgagc atcacaaaaa tcgacgctca agtcagaggt   4500
 
ggcgaaaccc gacaggacta taaagatacc aggcgtttcc ccctggaagc tccctcgtgc   4560
 
gctctcctgt tccgaccctg ccgcttaccg gatacctgtc cgcctttctc ccttcgggaa   4620
 
gcgtggcgct ttctcatagc tcacgctgta ggtatctcag ttcggtgtag gtcgttcgct   4680
 
ccaagctggg ctgtgtgcac gaaccccccg ttcagcccga ccgctgcgcc ttatccggta   4740
 
actatcgtct tgagtccaac ccggtaagac acgacttatc gccactggca gcagccactg   4800
 
gtaacaggat tagcagagcg aggtatgtag gcggtgctac agagttcttg aagtggtggc   4860
 
ctaactacgg ctacactaga aggacagtat ttggtatctg cgctctgctg aagccagtta   4920
 
ccttcggaaa aagagttggt agctcttgat ccggcaaaca aaccaccgct ggtagcggtg   4980
 
gtttttttgt ttgcaagcag cagattacgc gcagaaaaaa aggatctcaa gaagatcctt   5040
 
tgatcttttc tacggggtct gacgctcagt ggaacgaaaa ctcacgttaa gggattttgg   5100
 
tcatgaacaa taaaactgtc tgcttacata aacagtaata caaggggtgt tatgagccat   5160
 
attcaacggg aaacgtcttg ctctaggccg cgattaaatt ccaacatgga tgctgattta   5220
 
tatgggtata aatgggctcg cgataatgtc gggcaatcag gtgcgacaat ctatcgattg   5280
 
tatgggaagc ccgatgcgcc agagttgttt ctgaaacatg gcaaaggtag cgttgccaat   5340
 
gatgttacag atgagatggt cagactaaac tggctgacgg aatttatgcc tcttccgacc   5400
 
atcaagcatt ttatccgtac tcctgatgat gcatggttac tcaccactgc gatccccggg   5460
 
aaaacagcat tccaggtatt agaagaatat cctgattcag gtgaaaatat tgttgatgcg   5520
 
ctggcagtgt tcctgcgccg gttgcattcg attcctgttt gtaattgtcc ttttaacagc   5580
 
gatcgcgtat ttcgtctcgc tcaggcgcaa tcacgaatga ataacggttt ggttgatgcg   5640
 
agtgattttg atgacgagcg taatggctgg cctgttgaac aagtctggaa agaaatgcat   5700
 
aaacttttgc cattctcacc ggattcagtc gtcactcatg gtgatttctc acttgataac   5760
 
cttatttttg acgaggggaa attaataggt tgtattgatg ttggacgagt cggaatcgca   5820
 
gaccgatacc aggatcttgc catcctatgg aactgcctcg gtgagttttc tccttcatta   5880
 
cagaaacggc tttttcaaaa atatggtatt gataatcctg atatgaataa attgcagttt   5940
 
catttgatgc tcgatgagtt tttctaagaa ttaattcatg agcggataca tatttgaatg   6000
 
tatttagaaa aataaacaaa taggggttcc gcgcacattt ccccgaaaag tgccacctga   6060
 
aattgtaaac gttaatattt tgttaaaatt cgcgttaaat ttttgttaaa tcagctcatt   6120
 
ttttaaccaa taggccgaaa tcggcaaaat cccttataaa tcaaaagaat agaccgagat   6180
 
agggttgagt gttgttccag tttggaacaa gagtccacta ttaaagaacg tggactccaa   6240
 
cgtcaaaggg cgaaaaaccg tctatcaggg cgatggccca ctacgtgaac catcacccta   6300
 
atcaagtttt ttggggtcga ggtgccgtaa agcactaaat cggaacccta aagggagccc   6360
 
ccgatttaga gcttgacggg gaaagccggc gaacgtggcg agaaaggaag ggaagaaagc   6420
 
gaaaggagcg ggcgctaggg cgctggcaag tgtagcggtc acgctgcgcg taaccaccac   6480
 
acccgccgcg cttaatgcgc cgctacaggg cgcgtcccat tcgcca                  6526
 
 
<210>  2
<211>  275
<212>  PRT
<213>  结核分枝杆菌
 
<400>  2
 
Met Ser Phe Leu Lys Thr Val Pro Glu Glu Leu Thr Ala Ala Ala Ala
1               5                   10                  15     
 
 
Gln Leu Gly Thr Ile Gly Ala Ala Met Ala Ala Gln Asn Ala Ala Ala
            20                  25                  30          
 
 
Ala Ala Pro Thr Thr Ala Ile Ala Pro Ala Ala Leu Asp Glu Val Ser
        35                  40                  45             
 
 
Ala Leu Gln Ala Ala Leu Phe Thr Ala Tyr Gly Thr Phe Tyr Gln Gln
    50                  55                  60                  
 
 
Val Ser Ala Glu Ala Gln Ala Met His Asp Met Phe Val Asn Thr Leu
65                  70                  75                  80 
 
 
Gly Ile Ser Ala Gly Thr Tyr Gly Val Thr Glu Ser Leu Asn Ser Ser
                85                  90                  95     
 
 
Ala Ala Ala Ser Pro Leu Ser Gly Ile Thr Gly Glu Ala Ser Ala Ile
            100                 105                 110        
 
 
Ile Gln Ala Thr Thr Gly Leu Phe Pro Pro Glu Leu Ser Gly Gly Ile
        115                 120                 125            
 
 
Gly Asn Ile Leu Asn Ile Gly Ala Gly Asn Trp Ala Ser Ala Thr Ser
    130                 135                 140                
 
 
Thr Leu Ile Gly Leu Ala Gly Gly Gly Leu Leu Pro Ala Glu Glu Ala
145                 150                 155                 160
 
 
Ala Glu Ala Ala Ser Ala Leu Gly Gly Glu Ala Ala Leu Gly Glu Leu
                165                 170                 175    
 
 
Gly Ala Leu Gly Ala Ala Glu Ala Ala Leu Gly Glu Ala Gly Ile Ala
            180                 185                 190        
 
 
Ala Gly Leu Gly Ser Ala Ser Ala Ile Gly Met Leu Ser Val Pro Pro
        195                 200                 205            
 
 
Ala Trp Ala Gly Gln Ala Thr Leu Val Ser Thr Thr Ser Thr Leu Pro
    210                 215                 220                
 
 
Gly Ala Gly Trp Thr Ala Ala Ala Pro Gln Ala Ala Ala Gly Thr Phe
225                 230                 235                 240
 
 
Ile Pro Gly Met Pro Gly Val Ala Ser Ala Ala Arg Asn Ser Ala Gly
                245                 250                 255    
 
 
Phe Gly Ala Pro Arg Tyr Gly Val Lys Pro Ile Val Met Pro Lys Pro
            260                 265                 270        
 
 
Ala Thr Val
        275
 
 
<210>  3
<211>  95
<212>  PRT
<213>  结核分枝杆菌
 
<400>  3
 
Met Ala Thr Ser Ser Asp Asp Ile Thr Ile Asn Arg His Pro Pro Leu
1               5                   10                  15     
 
 
Asn Cys Ala Val Asn Arg His Asp Glu Ser Arg Arg Ser Pro Leu Arg
            20                  25                  30         
 
 
Arg Gly Leu Leu Ala Asn Gly Leu Arg Glu Arg Gln Ala Gly Ala Leu
        35                  40                  45              
 
 
Phe Glu Arg Tyr Glu Ser Gln Phe Asp Ser Phe Gly Tyr Ile Glu Lys
    50                  55                  60                 
 
 
Val Arg Tyr Arg Gly Ser Gly Tyr Arg Val Glu Asp Val Tyr Ala Arg
65                  70                  75                  80 
 
 
Ala Asp Ser Gly Pro Ser Ala Gly Ala Glu Leu Pro Val Gly Pro
                85                  90                  95 
 
 

Claims (2)

1.一种检测结核分枝杆菌的试剂盒，包括以下组份：  
包被液：0.05M pH9.6的碳酸盐缓冲液；
洗涤液：含0.05% v/v吐温-20的PBS溶液；
封闭液：含5% w/v 脱脂牛奶的洗涤液；
终止液：2M H2SO4；
抗原Rv1040c，其序列为SEQ ID NO.2所示；
抗原Rv2309A，其序列为SEQ ID NO.3所示。
2.权利要求1所述试剂盒在制备检测结核分枝杆菌试剂中的应用。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109395099A (zh) * 2018-12-13 2019-03-01 北京祥瑞生物制品有限公司 一种提高结核菌素bcg-ppd皮试诊断试剂稳定性的方法
CN113985026A (zh) * 2021-09-29 2022-01-28 重庆市畜牧科学院 一种检测羊副结核分枝杆菌的elisa试剂盒及其应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101687027A (zh) * 2007-04-04 2010-03-31 传染性疾病研究院 包含结核分枝杆菌多肽及其融合的免疫原性组合物
CN101900727A (zh) * 2010-06-01 2010-12-01 华中农业大学 一种应用Rv3872新型融合蛋白制备的牛结核抗体鉴别检测试纸条

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101687027A (zh) * 2007-04-04 2010-03-31 传染性疾病研究院 包含结核分枝杆菌多肽及其融合的免疫原性组合物
CN101900727A (zh) * 2010-06-01 2010-12-01 华中农业大学 一种应用Rv3872新型融合蛋白制备的牛结核抗体鉴别检测试纸条

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JEAN-CHRISTOPHE CAMUS,ET AL: "Re-annotation of the genome sequence of Mycobacterium tuberculosis H37Rv", 《MICROBIOLOGY》 *
LEW J.M.: "www.uniprot.org_uniprot_L7N666", 《EMBL》 *
LEW J.M.: "www.uniprot.org_uniprot_L7N667", 《EMBL》 *
NICOLAAS C GEY VAN PITTIUS，ET AL: "Evolution and expansion of the Mycobacterium tuberculosis PE and PPE multigene families and their association with the duplication of the ESAT-6 (esx) gene cluster regions", 《BMC EVOLUTIONARY BIOLOGY》 *
S. T. COLE,ET AL: "Deciphering the biology of Mycobacterium tuberculosis from the complete genome sequence", 《NATURE》 *
吴静希: "结核分支杆菌PE/PPE特异性基因的克隆表达及初步应用", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库 医药卫生科技辑》 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109395099A (zh) * 2018-12-13 2019-03-01 北京祥瑞生物制品有限公司 一种提高结核菌素bcg-ppd皮试诊断试剂稳定性的方法
CN109395099B (zh) * 2018-12-13 2020-02-21 北京祥瑞生物制品有限公司 一种提高结核菌素bcg-ppd皮试诊断试剂稳定性的方法
CN113985026A (zh) * 2021-09-29 2022-01-28 重庆市畜牧科学院 一种检测羊副结核分枝杆菌的elisa试剂盒及其应用
CN113985026B (zh) * 2021-09-29 2023-12-26 重庆市畜牧科学院 一种检测羊副结核分枝杆菌的elisa试剂盒及其应用

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