CN108690823A

CN108690823A - 一种装载dna的布鲁氏菌菌蜕复合疫苗

Info

Publication number: CN108690823A
Application number: CN201810378042.7A
Authority: CN
Inventors: 温丽娟; 王林叶; 布和; 刘裕; 李敏; 高强
Original assignee: INNER MONGOLIA HUAXI BIOTECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: INNER MONGOLIA HUAXI BIOTECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2018-04-25
Filing date: 2018-04-25
Publication date: 2018-10-23

Abstract

本发明公开了一种装载DNA的布鲁氏菌菌蜕复合疫苗。其制备方法如下：将含有编码温敏调控蛋白cI857的核酸分子、编码噬菌体裂解蛋白E的核酸分子和编码细菌核酸酶蛋白A的核酸分子的自杀质粒导入布鲁氏菌，利用同源重组技术获得重组布鲁氏菌；培养该菌株，得到培养菌液，然后高温处理，收集菌体，加入目的DNA，得到装载DNA的布鲁氏菌菌蜕复合疫苗。该复合疫苗具有以下优点：一是具有菌蜕的特征，与现有的死疫苗或减毒活疫苗相比，副作用小，安全性高，保护效果良好；二是菌蜕作为一种安全有效的DNA疫苗递送载体，能将核酸疫苗导入抗原提呈细胞，并高效表达。本发明对控制布鲁氏菌病的流行和传播具有重要的实际意义，应用前景广阔。

Description

一种装载DNA的布鲁氏菌菌蜕复合疫苗

技术领域

本发明属于基因工程药物领域，具体涉及一种装载DNA的布鲁氏菌菌蜕复合疫苗。

背景技术

布鲁氏菌病(布病)是由布氏杆菌(Brucella)引起的以流产和发热为特征的人兽共患传染病，该病流行范围广泛、传染性强，严重的威胁着人和多种动物的生命健康。目前，用于布鲁氏菌病防控的弱毒活疫苗主要有牛型19号弱毒菌株(S19)、羊型Rev.1弱毒菌株、羊型5号弱毒菌株(M5)和猪型2号弱毒菌株(S2)，其中前两种来自于国外，后两种为国内自主研制。这些弱毒活疫苗在布病的防控方面发挥了重要作用，但在布病的免疫预防过程中还存在着一些致命的缺陷，主要表现两个方面：一是当前使用的减毒活疫苗毒性大，而且存在毒力返祖的现象，会对人或动物机体造成伤害；二是应用当前的减毒活疫苗免疫后的动物仍然可能感染其它菌株，致使免疫机体后产生的各种血清反应和野生流行致病菌感染所产生的各种血清反应极其相似，因此造成了无法判定动物是否被其它菌株感染，从而干扰临床诊断。

细菌菌蜕疫苗是一种缺少细胞浆和核酸而导致无繁殖能力的新型灭活菌苗。裂解基因E表达形成的跨膜孔道，能使细胞主要内容物在渗透作用下流失，进而使细菌丧失繁殖能力，由此产生的细菌空壳极大程度地保留了抗原表位，因此比传统灭活菌苗具有更加理想的免疫效果。同时，细菌菌壳还可作为免疫佐剂或递送载体携带DNA、蛋白质或者药物到达靶向部位发挥更加有效的免疫作用。

布鲁氏菌为胞内感染菌，其免疫以细胞免疫为主。DNA疫苗免疫动物可以长期持续的表达目的蛋白，然后以肽的形式递呈给MHCI，再激活抗原特异性T细胞，诱发细胞介导的免疫反应从而克服常规疫苗细胞免疫不足的缺陷，为控制布鲁氏菌病提供了一条可行途径。

L7/L12蛋白是布鲁氏菌的一种核糖体蛋白，在各种生物型布鲁氏菌中较为保守，是布鲁氏菌侵染宿主过程中的优势抗原。研究表明，L7/L12蛋白能特异性的刺激感染动物的单核细胞，刺激CD4+Th1淋巴辅助细胞释放IFN-γ因子，从而起到增强免疫保护效果的作用，是公认的DNA疫苗候选抗原。P39(布鲁氏菌胞质结合蛋白)是很好的T细胞抗原，存在于所有布鲁氏菌基因组中，能诱发强烈的迟发性超敏反应(DTH)并产生IFN-γ，是公认的DNA疫苗侯选分子。BLS公认具有聚合和放大抗原免疫原性的特性。研究表明，向BLS的氨基末端插入外源性多肽片段不会改变BLS的三维结构，这为BLS作为提高抗原免疫原性的聚合功能提供了基础保证，将Omp31的1oop区的27个氨基酸与BLS连接制备重组蛋白，免疫Balb/C小鼠后用绵羊附睾型布鲁氏菌攻毒，其保护性与羊型Rev.1弱毒菌株相当。

目前还没有一种DNA疫苗可以代替现有的死苗和弱毒苗，除了DNA疫苗安全性问题，主要是其所诱导的保护性免疫反应不够高。究其原因可能是所选择的保护性抗原免疫源性不好或者是所构建的布鲁氏菌DNA疫苗虽然能在真核细胞中表达目的抗原，但在动物体内其表达量较低或某个时间段出现了基因沉寂不表达的情况。因此，研制一种既具有良好的免疫保护效果，且安全性高，同时又能区分自然感染和疫苗免疫的带有标记的布鲁氏菌核酸菌蜕复合疫苗具有重要的实际意义。

发明内容

本发明的目的为提供一种装载DNA的布鲁氏菌菌蜕复合疫苗。

本发明首先提供了一种重组布鲁氏菌。所述重组布鲁氏菌通过具有温控调节功能的蛋白调节噬菌体裂解蛋白E和细菌核酸酶蛋白A的含量和/或活性。

所述重组布鲁氏菌中，当温度低于30℃时，具有温控调节功能的蛋白的表达使噬菌体裂解蛋白E和核酸酶蛋白A的含量和/或活性被稳定地抑制；当温度高于30℃时，具有温控调节功能的蛋白因热失活而使噬菌体裂解蛋白E和核酸酶蛋白A的含量和/或活性提高，在42℃时达到最佳状态。

所述布鲁氏菌可为光滑型布鲁氏菌或粗糙型布鲁氏菌。所述粗糙型布鲁氏菌可为天然粗糙型布鲁氏菌或经基因工程改造后获得的粗糙型布鲁氏菌。所述光滑型布鲁氏菌可为天然光滑型布鲁氏菌或经基因工程改造后获得的光滑型布鲁氏菌。

所述粗糙型布鲁氏菌具体可通过将布鲁氏菌基因组中编码糖苷转移酶(Gene ID为HQ845203.1)的基因(wboA基因)敲除或破坏获得。所述“将布鲁氏菌基因组中编码糖苷转移酶的基因敲除或破坏”具体可通过同源重组实现无痕缺失突变。

所述光滑型布鲁氏菌具体可通过将布鲁氏菌基因组中编码可溶性外周浆蛋白(Gene ID为AY166769)的基因(bp26基因)敲除或破坏获得。所述“将布鲁氏菌基因组中编码可溶性外周浆蛋白的基因敲除或破坏”具体可通过同源重组实现无痕缺失突变。

所述“具有温控调节功能的蛋白”可为温敏调控蛋白cI857。所述温敏调控蛋白cI857的氨基酸序列如序列表中序列7所示。所述噬菌体裂解蛋白E可为噬菌体PhiX174裂解蛋白E(Gene ID：9626372)。所述细菌核酸酶蛋白A可为金黄色葡萄球菌核酸酶蛋白A(GeneID：21281729)。

所述重组布鲁氏菌中可含有温敏调控蛋白cI857、噬菌体裂解蛋白E和细菌核酸酶蛋白A的编码基因或表达盒。

上述任一所述重组布鲁氏菌的制备方法也属于本发明的保护范围。

上述任一所述重组布鲁氏菌的制备方法可如下：将含有编码所述具有温控调节功能的蛋白的核酸分子(如温敏调控基因cI857)、编码噬菌体裂解蛋白E的核酸分子和编码细菌核酸酶蛋白A的核酸分子的自杀质粒导入布鲁氏菌，利用同源重组技术获得重组布鲁氏菌。

上述任一所述温敏调控基因cI857的核苷酸序列可如序列表中序列2自5’末端起第1－714位所示。

上述任一所述编码噬菌体PhiX174裂解蛋白E的核酸分子的核苷酸序列可如序列表中序列2自5’末端起第1143－1415位所示。

上述任一所述编码金黄色葡萄球菌核酸酶蛋白A的核酸分子的核苷酸序列可如序列表中序列2自5’末端起第1461－2147位所示。

所述“含有编码温敏调控蛋白cI857的核酸分子(即温敏调控基因cI857)、编码噬菌体裂解蛋白E的核酸分子和编码细菌核酸酶蛋白A的核酸分子的自杀质粒”可为含有序列表中序列2所示的核苷酸序列的自杀质粒。序列表中序列2中，自5’末端起第1－714位为温敏调控基因cI857，第762－789位编码lambda PR启动子，第976－1004位编码lambda PL启动子，第1143－1415位为裂解基因E，第1461－2147位为金黄色葡萄球菌核酸酶A基因，第2330－2416位编码rrnB T1终止子，第2508－2535位编码rrnB T2终止子。

所述布鲁氏菌可为布鲁氏菌疫苗株、布鲁氏菌强毒株或临床分离流行株。所述布鲁氏菌可为猪种布氏杆菌、羊种布氏杆菌、牛种布氏杆菌、犬种布氏杆菌、沙林鼠种布氏杆菌或绵羊附睾种布氏杆菌。所述布鲁氏菌疫苗株具体可为布鲁氏菌活疫苗S2。所述布鲁氏菌强毒株具体可为布鲁氏菌强毒株16M。布鲁氏菌活疫苗S2属于猪种布氏杆菌。布鲁氏菌强毒株16M属于羊种布鲁氏菌。

具体的，本发明的实施例1制备的布鲁氏菌菌蜕菌株n1-n10均是粗糙型布鲁氏菌，是向布鲁氏菌活疫苗S2中导入温控裂解型自杀质粒PUSacB-ΔwboA-TLC得到的。温控裂解型自杀质粒PUSacB-ΔwboA-TLC具体可为将自杀质粒PUSacB的限制性内切酶SacⅠ和BamHⅠ识别序列间的小片段替换为序列表中序列3所示的DNA分子(wboA基因的上游同源臂序列)，限制性内切酶BamHⅠ和SalⅠ识别序列间的小片段替换为序列表中序列2所示的DNA分子，限制性内切酶SalⅠ和SphⅠ识别序列间的小片段替换为序列表中序列4所示的DNA分子(wboA基因的下游同源臂序列)，得到的重组质粒。wboA基因的上游同源臂序列和下游同源臂序列，与布鲁氏菌活疫苗S2基因组发生同源重组后，wboA基因被破坏。wboA基因的缺失或破坏或敲除会影响布鲁氏菌光滑型表型的形成，但不会影响其免疫保护效果，可作为区分疫苗免疫与自然感染的候选靶分子。

具体的，本发明的实施例3制备的布鲁氏菌菌蜕菌株K1-K10均是光滑型布鲁氏菌，是向布鲁氏菌活疫苗S2中导入温控裂解型自杀质粒PUSacB-Δbp26-TLC得到的。温控裂解型自杀质粒PUSacB-Δbp26-TLC具体可为将自杀质粒PUSacB的限制性内切酶SacⅠ和BamHⅠ识别序列间的小片段替换为序列表中序列5所示的DNA分子(bp26基因的上游同源臂序列)，限制性内切酶BamHⅠ和SalⅠ识别序列间的小片段替换为序列表中序列2所示的DNA分子，限制性内切酶SalⅠ和SphⅠ识别序列间的小片段替换为序列表中序列6所示的DNA分子(bp26基因的下游同源臂序列)，得到的重组质粒。bp26基因的上游同源臂序列和下游同源臂序列，与布鲁氏菌活疫苗S2基因组发生同源重组后，bp26基因被破坏。bp26基因的缺失或破坏或敲除不会影响免疫保护效果，可作为区分疫苗免疫与自然感染的候选靶分子。

本发明还保护一种布鲁氏菌菌蜕，是采用上述任一所述重组布鲁氏菌制备得到的菌蜕。

本发明还保护制备布鲁氏菌菌蜕的方法，可包括如下步骤：

(1)培养上述任一所述重组布鲁氏菌，得到培养菌液；

(2)高温处理步骤(1)得到的培养菌液，收集菌体，冻融，获得布鲁氏菌菌蜕。

本发明还保护一种装载DNA的布鲁氏菌核酸菌蜕复合疫苗，是将目的DNA装载于所述布鲁氏菌菌蜕得到的。

所述“目的DNA装载于所述布鲁氏菌菌蜕”可通过将质粒或双链DNA分子装载于所述布鲁氏菌菌蜕实现；所述质粒或双链DNA分子可含有目的DNA。

本发明还保护制备装载DNA的布鲁氏菌核酸菌蜕复合疫苗的方法，可包括如下步骤：

(1)培养上述任一所述重组布鲁氏菌，得到培养菌液；

(2)高温处理步骤(1)得到的培养菌液，收集菌体，冻融，获得布鲁氏菌菌蜕；

(3)向步骤(2)获得的布鲁氏菌菌蜕中加入目的DNA，培养，得到装载DNA的布鲁氏菌核酸菌蜕复合疫苗。

上述任一所述步骤(1)中，所述培养的培养基可为TSB培养基。培养温度可为25-30℃(如25℃、28℃、30℃)。

上述任一所述步骤(1)中，所述“培养上述任一所述布鲁氏菌菌蜕菌株，得到培养菌液”具体可为：首先将布鲁氏菌菌蜕菌株单克隆接种于TSB培养基，28℃、200rmp振荡培养12h，得到菌液；然后该菌液接种(接种比为2％(v/v))于TSB培养基，28℃、200rmp振荡培养至OD_600nm值达到1.5左右，得到培养菌液。

上述任一所述步骤(2)中，所述高温可为40℃以上(如42℃)。所述“收集菌体并冻融”为收集菌体，加入高渗溶液冻融。所述高渗溶液具体可为3-7％(m/v)NaCl水溶液(如5％(m/v)NaCl水溶液)。所述冻融的时间为20-40min(如20min、30min或40min)。

上述任一所述步骤(2)中，所述“高温处理步骤(1)得到的培养菌液，收集菌体并冻融，获得布鲁氏菌菌蜕”具体可为：首先取步骤(1)得到的培养菌液，42℃、200rmp振荡培养72h；然后离心，收集菌体，用PBS缓冲液洗涤；最后加入5％(m/v)NaCl水溶液，冻融30min，用PBS缓冲液重悬，得到布鲁氏菌菌蜕。所述PBS缓冲液具体可为pH7.2、0.1mM的PBS缓冲液。

上述任一所述步骤(3)中，所述目的DNA可为表达BLS蛋白(Gene ID：KJ401344.1)、L7/L12蛋白(Gene ID：KF362131)和P39蛋白(Gene ID：JF918761.1)的重组质粒。所述重组质粒具体可为将载体PVAX1的限制性内切酶NheⅠ和XbaⅠ识别序列间的小片段替换为DNA分子得到的；该DNA分子中依次含有BLS基因、L7/L12基因、CAT启动子和P39基因。

上述任一所述步骤(3)中，所述培养具体可为先28℃处理90min，然后加入CaCl₂并使其浓度为25mM，37℃孵育过夜，室温、20000g离心20min，收集菌体沉淀即为得到装载DNA的布鲁氏菌核酸菌蜕复合疫苗。

上述任一所述重组布鲁氏菌、上述任一所述布鲁氏菌菌蜕或上述任一所述装载DNA的布鲁氏菌核酸菌蜕复合疫苗的免疫途径可为b1)至b7)中的任一种：b1)皮下注射；b2)皮内注射；b3)肌肉注射；b4)腹腔注射；b5)黏膜途径；b6)口服给药；b7)鼻内给药。

上述任一所述重组布鲁氏菌、上述任一所述布鲁氏菌菌蜕或上述任一所述装载DNA的布鲁氏菌核酸菌蜕复合疫苗的免疫对象可为c1)至c5)中的任一种：c1)人；c2)家畜动物；c3)羊；c4)牛；c5)猪。

本发明还保护上述任一所述重组布鲁氏菌、上述任一所述布鲁氏菌菌蜕或上述任一所述装载DNA的布鲁氏菌核酸菌蜕复合疫苗的应用。上述任一所述重组布鲁氏菌、上述任一所述布鲁氏菌菌蜕或上述任一所述装载DNA的布鲁氏菌核酸菌蜕复合疫苗的应用可为a1)或a2)或a3)：

a1)预防布鲁氏菌病；

a2)制备预防布鲁氏菌病的产品；

a3)鉴别疫苗免疫和自然感染。

本发明还保护上述任一所述装载DNA的布鲁氏菌核酸菌蜕复合疫苗联合重组疫苗、亚单位疫苗或减毒活疫苗的应用，可为a1)或a2)或a3)：

a1)预防布鲁氏菌病；

a2)制备预防布鲁氏菌病的产品；

a3)鉴别疫苗免疫和自然感染。

上述应用中，所述的重组疫苗、亚单位疫苗或减毒活疫苗也用于预防布鲁氏菌病。联合应用的效果一般更好。例如与减毒活疫苗的联合应用，可以减低减毒活疫苗的应用剂量，从而可降低感染的风险。

本发明还保护上述任一所述装载DNA的布鲁氏菌核酸菌蜕复合疫苗和免疫佐剂的应用，可为a1)或a2)或a3)：

a1)预防布鲁氏菌病；

a2)制备预防布鲁氏菌病的产品；

a3)鉴别疫苗免疫和自然感染。

上述应用中，所述免疫佐剂可用于提高免疫效果。

上述应用中，所述免疫佐剂具体可为聚肌胞稀释液、壳聚糖、细胞因子佐剂、SPO1佐剂。具体的，上述任一所述装载DNA的布鲁氏菌核酸菌蜕复合疫苗和免疫佐剂可以不同比例混合，然后再进行免疫。

本发明制备的装载DNA的布鲁氏菌核酸菌蜕复合疫苗具有以下优点：一是具有菌蜕的特征，与现有的死疫苗或减毒活疫苗相比，副作用小，安全性高，保护效果良好；二是菌蜕可以作为一种安全有效的DNA疫苗递送载体，能将核酸疫苗导入抗原提呈细胞，并使它得到高效表达；三是由于缺失了wboA基因或bp26基因，与目前正研究的布鲁氏菌菌蜕或正在应用的减毒活疫苗相比，可以根据该基因的免疫生物学特性建立区分疫苗免疫和自然感染的鉴别诊断方法，以致于能够将疫苗免疫与野生流行致病菌感染进行区分，对控制布鲁氏菌病的流行和传播具有重要的实际意义，应用前景广阔。

附图说明

图1为自杀质粒PUSacB的图谱。

图2为布鲁氏菌菌蜕菌株n1(重组菌n1)的生长曲线。

图3为RBG(PVAX1-BLP)接种小鼠血清抗体水平的检测。

图4为RBG(PVAX1-BLP)接种小鼠细胞因子的检测。

图5为布鲁氏菌菌蜕菌株K1(重组菌K1)的生长曲线。

图6为SBG(PVAX1-BLP)接种小鼠血清抗体水平的检测。

图7为SBG(PVAX1-BLP)接种小鼠细胞因子的检测。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

自杀质粒PUSacB(环形)的核苷酸序列如序列表中序列1所示。自杀质粒PUSacB的图谱见图1。

布鲁氏菌活疫苗S2为内蒙古金宇宝灵生物制品有限公司的产品。TSB培养基和TSA培养基均为BD公司的产品。琼脂糖凝胶回收试剂盒为天根生化科技(北京)有限公司的产品。PBV220质粒为长沙爱科博生物科技有限公司的产品。载体PVAX1为军事医学科学院微生物流行病研究所免疫室提供。辣根过氧化酶标记的羊抗鼠IgG为SIGMA公司的产品。EZ-Sep^TMMouse 1×淋巴细胞分离液为达科为公司的产品。小鼠细胞因子ELISPOT试剂盒为BD公司的产品。布鲁氏菌强毒株16M为军事医学科学院微生物流行病研究所菌毒种库的产品。

SOC培养基：含2％(m/v)蛋白胨、0.5％(m/v)酵母浸粉、0.05％(m/v)NaCl、2.5mMKCl、10mM MgCl₂和20mM葡萄糖的水溶液。

HBS缓冲液：溶质及其浓度为100mM NaCl、10mM sodium acetate和10mM HEPES，溶剂为水，pH值为7.0。

PBS缓冲液：将2.86g Na₂HPO₄.12H₂O、0.312g NaH₂PO₄.2H₂O和8.5NaCl溶于水，用水定容至1L，调节pH值至7.2。

布鲁氏菌甲醛灭活疫苗：先将布鲁氏菌活疫苗S2经0.4％(v/v)甲醛处理灭活，然后用PBS缓冲液洗涤两次，最后用PBS缓冲液重悬。

温敏调控蛋白cI857的氨基酸序列如序列表中序列7所示。

实施例1、装载DNA的粗糙型布鲁氏菌菌蜕复合疫苗的制备

一、温控裂解型自杀质粒PUSacB-ΔwboA-TLC的构建

1、引物的合成

根据GenBank公开的布鲁氏菌全基因组的wboA基因(genebank号：HQ845203.1)的上下游同源臂核苷酸序列，设计并合成引物wboA-N-F、引物wboA-N-R、引物wboA-C-F和引物wboA-C-R。

各个引物的核苷酸序列如下：

引物wboA-N-F：5’-CGCGAGCTCCTGGCGTCAGCAATCAGAG-3’(下划线为限制性内切酶SacⅠ的识别位点)；

引物wboA-N-R：5’-CGCGGATCCGTGCAACGACCTCAACTTCC-3’(下划线为限制性内切酶BamHⅠ的识别位点)；

引物wboA-C-F：5’-CGCGTCGACACGCCATCGAACCTTATCTG-3’(下划线为限制性内切酶SalⅠ的识别位点)；

引物wboA-C-R：5’-CGCGCATGCCCGGAATTCCGGCTATCGTGCGATTCT-3’(下划线为限制性内切酶SphⅠ的识别位点)。

2、温控裂解型自杀质粒PUSacB-ΔwboA-TLC的构建

(1)以布鲁氏菌活疫苗S2的基因组DNA为模板，采用引物wboA-N-F和引物wboA-N-R进行PCR扩增，得到PCR扩增产物甲。采用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收PCR扩增产物甲中约888bp的双链DNA分子，该双链DNA分子即为wboA基因上游同源臂序列(以下简称wboA-N序列)。

(2)用限制性内切酶SacⅠ和BamHⅠ双酶切wboA-N序列，回收约888bp的DNA片段1。

(3)用限制性内切酶SacⅠ和BamHⅠ双酶切自杀质粒PUSacB，回收约4730bp的载体骨架1。

(4)将DNA片段1与载体骨架1连接，得到重组质粒PUSacB-ΔwboA-N。

(5)以布鲁氏菌活疫苗S2的基因组DNA为模板，采用引物wboA-C-F和引物wboA-C-R进行PCR扩增，得到PCR扩增产物乙。采用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收PCR扩增产物乙中约897bp的双链DNA分子，该双链DNA分子即为wboA基因下游同源臂序列(以下简称wboA-C序列)。

(6)用限制性内切酶SalⅠ和SphⅠ双酶切wboA-C序列，回收约897bp的DNA片段2。

(7)用限制性内切酶SalⅠ和SphⅠ双酶切重组质粒PUSacB-ΔwboA-N，回收约5618bp的载体骨架2。

(8)将DNA片段2与载体骨架2连接，得到重组质粒PUSacB-ΔwboA。

(9)根据GenBank公开的噬菌体PhiX174裂解基因E(Accession：9626372)和金黄色葡萄球菌核酸酶A基因(Accession：21281729)及PBV220质粒上的温敏调控基因λPL/PR-cI857和rrnBT1T2终止子的序列，人工合成序列表中序列2所示的双链DNA分子。序列表中序列2中，自5’末端起第1－714位为温敏调控基因cI857，第762－789位编码lambda PR启动子，第976－1004位编码lambda PL启动子，第1143－1415位为裂解基因E，第1461－2147位为金黄色葡萄球菌核酸酶A基因，第2330－2416位编码rrnB T1终止子，第2508－2535位编码rrnB T2终止子。

(10)将序列表中序列2所示的双链DNA分子和PUC57载体进行连接，得到重组质粒PUC57-TLC。

(11)用限制性内切酶BamHⅠ和SalⅠ双酶切重组质粒PUC57-TLC，回收约2630bp的DNA片段3。

(12)用限制性内切酶BamHⅠ和SalⅠ双酶切重组质粒PUSacB-ΔwboA，回收约6515bp的载体骨架3。

(13)将DNA片段3与载体骨架3连接，得到温控裂解型自杀质粒PUSacB-ΔwboA-TLC。

将温控裂解型自杀质粒PUSacB-ΔwboA-TLC进行测序。根据测序结果，对温控裂解型自杀质粒PUSacB-ΔwboA-TLC进行结构描述如下：将自杀质粒PUSacB的限制性内切酶SacⅠ和BamHⅠ识别序列间的小片段替换为序列表中序列3所示的DNA分子，限制性内切酶BamHⅠ和SalⅠ识别序列间的小片段替换为序列表中序列2所示的DNA分子，限制性内切酶SalⅠ和SphⅠ识别序列间的小片段替换为序列表中序列4所示的DNA分子。

二、重组质粒PVAX1-BLS-L7/L12-P39的构建

1、引物的合成

(1)根据GenBank公开的布鲁氏菌BLS基因(Accession：KJ401344.1)的核苷酸序列，设计并合成引物BLS-F：5’-TATTGCTAGCGCCACCATGAACCAAAGCTGTCCGAAC-3’(下划线为限制性内切酶NheⅠ的识别位点)和引物BLS-R：5’-ATCTTTGCGAGATCAGCCATGACAAGCGCGGCGATGCGGCT-3’。

(2)根据GenBank公开的布鲁氏菌L7/L12基因(Accession：KF362131)的核苷酸序列，设计并合成引物L7/L12-F：5’-AGCCGCATCGCCGCGCTTGTCATGGCTGATCTCGCAAAGAT-3’和引物L7/L12-R：5’-TATTGGATCCTTACTTGAGTTCAACCTTGGC-3’(下划线为限制性内切酶BamHⅠ的识别位点)。

(3)根据GenBank公开的布鲁氏菌P39基因(Accession：JF918761.1)的核苷酸序列，设计并合成引物P39-F：5’-CAGGAGCTAAGGAAGCTAAAATGGGCGCCTGTTGCCAATGCGCAGG-3’和引物P39-R：5’-GCCTCTAGATTATTTTGCGGCTTCAACCGCCACAACG-3’(下划线为限制性内切酶XbaⅠ的识别位点)。

(4)根据氯霉素乙酰转移酶(CAT)的启动子序列，设计并合成引物CAT-F：5’-TATTGGATCCGTTTACAGCTAGCTCAGTCCTAG-3’(下划线为限制性内切酶BamHⅠ的识别位点)和引物CAT-R：5’-GCGCATTGGCAACAGGCGCCCATTTTAGCTTCCTTAGCTCCTGAAAATCTCG-3’。

2、重组质粒PVAX1-BLS-L7/L12-P39的构建

(1)以布鲁氏菌活疫苗S2的基因组DNA为模板，采用引物BLS-F和引物BLS-R进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。采用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收该PCR扩增产物中约474bp的双链DNA分子，该双链DNA分子即为BLS序列。

(2)以布鲁氏菌活疫苗S2的基因组DNA为模板，采用引物L7/L12-F和引物L7/L12-R进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。采用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收该PCR扩增产物中约372bp的双链DNA分子，该双链DNA分子即为L7/L12序列。

(3)将BLS序列和L7/L12序列等质量混合，得到混合溶液。

(4)以步骤(3)得到的混合溶液为模板，采用引物BLS-F和引物L7/L12-R进行overlap PCR扩增，得到PCR扩增产物。采用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收该PCR扩增产物中约876bp的双链DNA分子，该双链DNA分子即为融合片段BLS-L7/L12。

(5)用限制性内切酶NheⅠ和BamHⅠ双酶切融合片段BLS-L7/L12，回收约876bp的DNA片段甲。

(6)用限制性内切酶NheⅠ和BamHⅠ双酶切载体PVAX1，回收约3000bp的载体骨架甲。

(7)将DNA片段甲与载体骨架甲连接，得到重组质粒PVAX1-BLS-L7/L12。

(8)以布鲁氏菌活疫苗S2的基因组DNA为模板，采用引物P39-F和引物P39-R进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。采用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收该PCR扩增产物中约1206bp的双链DNA分子，该双链DNA分子即为P39序列。

(9)以布鲁氏菌活疫苗S2的基因组DNA为模板，采用CAT-F和引物CAT-R进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。采用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收该PCR扩增产物中约142bp的双链DNA分子，该双链DNA分子即为CAT序列。

(10)将P39序列和CAT序列等质量混合，得到混合溶液。

(11)以步骤(10)得到的混合溶液为模板，采用引物CAT-F和引物P39-R进行overlap PCR扩增，得到PCR扩增产物。采用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收该PCR扩增产物中约1348bp的双链DNA分子，该双链DNA分子即为融合片段P39-CAT。

(12)用限制性内切酶BamHⅠ和XbaⅠ双酶切融合片段P39-CAT，回收约1348bp的DNA片段乙。

(13)用限制性内切酶BamHⅠ和XbaⅠ双酶切重组质粒PVAX1-BLS-L7/L12，回收约3876bp的载体骨架乙。

(14)将DNA片段乙与载体骨架乙连接，得到重组质粒PVAX1-BLS-L7/L12-P39。

将重组质粒PVAX1-BLS-L7/L12-P39进行测序。根据测序结果，对重组质粒PVAX1-BLS-L7/L12-P39进行结构描述如下：将载体PVAX1的限制性内切酶NheⅠ和XbaⅠ识别序列间的小片段替换为目标DNA分子，目标DNA分子中依次含有BLS基因、L7/L12基因、CAT启动子和P39基因。重组质粒PVAX1-BLS-L7/L12-P39表达BLS蛋白(Gene ID：KJ401344.1)、L7/L12蛋白(Gene ID：KF362131)和P39蛋白(Gene ID：JF918761.1)。

三、布鲁氏菌菌蜕菌株的构建

1、布鲁氏菌S2感受态细胞的制备

(1)挑取在TSA平板上新鲜培养的布鲁氏菌活疫苗S2的单菌落，接种于5mL TSB培养基，37℃、200rmp振荡培养12h，得到培养菌液。

(2)将2mL步骤(1)得到的培养菌液接种于100mL TSB培养基，37℃、200rmp振荡培养至OD_600nm值达到0.8～0.9，得到培养菌液。

(3)将步骤(2)得到的培养菌液冰浴30min，然后4℃、4000rpm离心5min，收集菌体。

(4)取步骤(3)收集的菌体，先用预冷的10％(v/v)甘油水溶液洗涤3次，每次5min；然后用1mL 10％(v/v)甘油水溶液重悬，得到布鲁氏菌S2感受态细胞。

取重悬液，按50μL/管分装，-80℃保存备用。

2、电转化

(1)将3μg步骤一构建的温控裂解型自杀质粒PUSacB-ΔwboA-TLC和50μL布鲁氏菌S2感受态细胞充分混匀，得到混合液。

(2)取步骤(1)得到的混合液，冰浴10-15min。

(3)将完成步骤(2)的混合液全部加入到预冷的2mm的电击杯中(贴壁加入避免产生气泡)，先冰浴10-15min，然后电击(电击参数为：1.8kV、25μF、400Ω)。

(4)完成步骤(3)后，取所述电击杯，加入1mL预热的SOC培养基重悬，得到重悬液。

(5)将步骤(4)得到的重悬液转入离心管(规格为1.5mL)，37℃、150rmp培养24h，然后取100μL涂布于含有25μg/mL卡那霉素的TSA平板上，37℃培养。

3、布鲁氏菌菌蜕菌株的筛选

(1)挑取电转化后37℃培养5d～7d的单菌落，接种于5mL TSB培养基，37℃、150rmp培养12h，得到培养菌液。

(2)取步骤(1)得到的培养菌液，适当稀释后涂布在含5％蔗糖的TSA平板上，37℃培养5d～7d。

(3)完成步骤(2)后，挑取单菌落进行菌落PCR，然后进行如下判断：如果某单菌落的PCR扩增产物中含有750bp的条带，则该单菌落为发生同源重组的布鲁氏菌菌蜕菌株。进行菌落PCR的引物为Lysis E-F：5’-ATGGTACGCTGGACTTTGTGGGATACCCT-3’和Lysis E-R：5’-TTATTGACCTGAATCAGCGTTGTCTTCGC-3’。

经菌落PCR检测，共获得10个布鲁氏菌菌蜕菌株，依次命名为布鲁氏菌菌蜕菌株n1-布鲁氏菌菌蜕菌株n10。

4、遗传稳定性的鉴定

对布鲁氏菌菌蜕菌株n1-布鲁氏菌菌蜕菌株n10连续传15代。每代进行菌落PCR，进行菌落PCR的引物同步骤3。

结果表明，布鲁氏菌菌蜕菌株n1-布鲁氏菌菌蜕菌株n10在传代过程中，单菌落的PCR扩增产物中均含有750bp的条带。由此可见，布鲁氏菌菌蜕菌株n1-布鲁氏菌菌蜕菌株n10的遗传稳定性较高。

wboA基因编码布鲁氏菌脂多糖(LPS)O-侧链合成必须的糖苷转移酶(Gene ID为HQ845203.1)。温控裂解型自杀质粒PUSacB-ΔwboA-TLC中含有wboA基因的上游同源臂序列和下游同源臂序列，与布鲁氏菌基因组发生同源重组后，wboA基因被破坏。wboA基因的缺失或破坏或敲除会影响布鲁氏菌光滑型表型的形成，即形成粗糙型表型的布鲁氏菌。因此，布鲁氏菌菌蜕菌株n1-布鲁氏菌菌蜕菌株n10均为粗糙型布鲁氏菌菌蜕菌株。

随机选择布鲁氏菌菌蜕菌株n1进行后续实验。

四、装载DNA的粗糙型布鲁氏菌菌蜕复合疫苗的制备

1、布鲁氏菌菌蜕的制备

利用布鲁氏菌菌蜕菌株n1在42℃下温控阻遏蛋白失活使噬菌体PhiX174裂解基因E在布鲁氏菌中表达发挥裂解功能，金黄色葡萄球菌核酸酶基因A可导致细胞内核酸酶的聚集，使细菌DNA降解为100bp左右的片段。采用噬菌体PhiX174裂解基因E和金黄色葡萄球菌核酸酶基因A的联合表达可使布鲁氏菌菌体充分裂解，主要内容物流失而形成完整的细菌空壳，且不会干扰布鲁氏菌菌蜕的生产率。

(1)将布鲁氏菌菌蜕菌株n1接种于5mL TSB培养基，28℃、200rmp振荡培养12h，得到培养菌液。

(2)将步骤(1)得到的培养菌液接种于TSB培养基(接种比为2％(v/v))，28℃、200rmp振荡培养至OD_600nm值达到1.5左右，得到培养菌液。

(3)取步骤(2)得到的培养菌液(即诱导前菌液)，42℃、200rmp振荡培养(培养温度升高至42℃可诱导噬菌体PhiX174裂解蛋白E和金黄色葡萄球菌核酸酶蛋白A表达)。培养期间，每隔6h取样并检测OD_600nm值。OD_600nm值趋于平稳时，停止培养(停止培养时的菌液即为诱导后菌液)。

对照1：取步骤(2)得到的培养菌液，28℃、200rmp振荡培养72h。

对照2：将布鲁氏菌活疫苗S2接种于5mL TSB培养基，28℃、200rmp振荡培养12h，得到培养菌液1。将该培养菌液1接种于TSB培养基(接种比为2％(v/v))，28℃、200rmp振荡培养至OD_600nm值达到1.5左右，得到培养菌液2。取培养菌液2，28℃、200rmp振荡培养72h。

以培养时间为横坐标，OD_600nm值为纵坐标，绘制生长曲线。

取100μL诱导前菌液或诱导后菌液，适当稀释后涂布于TSA平板上进行活菌检测，然后计算菌蜕率。菌蜕率＝(100μL诱导前菌液中活菌数量－100μL诱导后菌液中活菌数量)/100μL诱导前菌液中活菌数量×100％。

生长曲线见图2所示(重组菌n1在28℃培养为对照1，菌S2在28℃培养为对照2，重组菌n1为布鲁氏菌菌蜕菌株n1)。结果表明，诱导第24h，布鲁氏菌菌蜕菌株n1的OD_600nm值达到最大，之后OD_600nm值一直下降。诱导72h后，布鲁氏菌菌蜕菌株n1的菌蜕率达到99.99％。

(4)取步骤(3)诱导72h后得到的诱导后菌液，离心，收集菌体。

(5)取步骤(4)收集的菌体，用pH7.2、0.1mM的PBS缓冲液洗涤3次。

(6)取完成步骤(5)的菌体，加入5％(m/v)NaCl水溶液，冻融30min；然后用pH7.2、0.1mM的PBS缓冲液重悬，得到布鲁氏菌菌蜕溶液。

将布鲁氏菌菌蜕溶液-70℃保存备用。

2、装载DNA的粗糙型布鲁氏菌菌蜕复合疫苗的制备

(1)取步骤1制备的布鲁氏菌菌蜕(含3.4mg布鲁氏菌菌蜕)，加入500μL含10mg/mL重组质粒PVAX1-BLS-L7/L12-P39的HBS缓冲液中，得到重悬液。重悬液中的DNA浓度(10mg/mL)即为装载前上清中DNA浓度。

(2)取步骤(1)得到的重悬液，28℃水浴90min，然后加入CaCl₂，得到封闭体系。该封闭体系中，CaCl₂的浓度为25mM。

(3)取步骤(2)得到的封闭体系，37℃孵育过夜；然后室温、20000g离心20min，收集菌体沉淀和上清(该上清中的DNA浓度即为装载后上清中DNA浓度)。沉淀即为装载DNA的粗糙型布鲁氏菌菌蜕复合疫苗(以下简称RBG(PVAX1-BLP))。

测定步骤(3)收集的上清的DNA浓度，然后计算菌蜕(即步骤(3)收集的菌体沉淀)的装载效率。装载效率＝(10mg/mL－装载后上清中DNA浓度)/10mg/mL×100％。

步骤(3)收集的菌体沉淀的装载效率为63％。

实施例2、实施例1制备的装载DNA的粗糙型布鲁氏菌菌蜕复合疫苗的应用

一、安全性试验

1、取40只6～8周龄、体重18～20g的健康的雌性BALB/C小鼠，随机分为4组，每组10只。

2、完成步骤1后，4组小鼠分别进行如下处理：

第1组(S2组)：每只小鼠通过腹腔注射接种布鲁氏菌活疫苗S2；接种剂量为5×10⁸CFU/只；

第2组(RBG(PVAX1-BLP)组)：每只小鼠通过腹腔注射接种实施例1制备的装载DNA的粗糙型布鲁氏菌菌蜕复合疫苗；接种剂量为5×10⁹CFU/只；

第3组(FKB组)：每只小鼠通过腹腔注射接种布鲁氏菌甲醛灭活疫苗；接种剂量为5×10⁹CFU/只；

第4组(阴性对照组)：每只小鼠通过腹腔注射接种PBS缓冲液；接种剂量为200μL/只。

3、完成步骤2后，连续观察7天，记录小鼠的体征变化和死亡情况。

实验结果见表1。结果表明，7天内，S2组3只小鼠死亡，7只小鼠出现耸毛、精神萎靡和颤抖状态等临床症状(5天后恢复)，其它3组小鼠均未出现任何临床症状，表现正常。

表1.小鼠生理体征

	S2组	FKB组	RBG(PVAX1-BLP)组	阴性对照组
					1d	BC	E	E	E
2d	BCD	E	E	E
					3d	ABCD	E	E	E
4d	ABCD	E	E	E
					5d	BC	E	E	E
6d	E	E	E	E
					7d	E	E	E	E

注：A：死亡；B：精神萎靡；C：耸毛；D：颤抖；E：正常

二、免疫保护性试验

2、完成步骤1后，4组小鼠分别进行如下处理：

第1组(S2组)：每只小鼠通过腹腔注射接种布鲁氏菌活疫苗S2；接种剂量为1×10⁷CFU/只；

第2组(RBG(PVAX1-BLP)组)：每只小鼠通过腹腔注射接种实施例1制备的装载DNA的粗糙型布鲁氏菌菌蜕复合疫苗；接种剂量为1×10⁸CFU/只；

第3组(FKB组)：每只小鼠通过腹腔注射接种布鲁氏菌甲醛灭活疫苗；接种剂量为1×10⁸CFU/只；

3、分别于完成步骤2后的第7天、第14天和第28天，将各组小鼠断尾采血，然后采用ELISA方法检测血清中IgG抗体水平。其中包被抗原为热灭活的布鲁氏菌活疫苗S2，二抗为辣根过氧化酶标记的羊抗鼠IgG，以邻苯二胺显色，测其450nm处吸光值，检测其抗体水平。

部分实验结果见图3(S2为S2组，RBG(PVAX1-BLP)为RBG(PVAX1-BLP)组，FKB为FKB组，PBS为阴性对照组)。结果表明，随着免疫时间的增加，各组抗体效价逐步上升，S2组、RBG(PVAX1-BLP)组、FKB组的小鼠均能检测到抗体水平，而阴性对照组的小鼠未检测到相应抗体。RBG(PVAX1-BLP)组小鼠血清抗体滴度略高于S2组，并且显著高于FKB组。

4、完成步骤2后的第30天，将各组小鼠取4只，处死后无菌分离脾脏，再采用EZ-Sep^TM Mouse 1×淋巴细胞分离液分离小鼠脾脏淋巴细胞，最后用小鼠细胞因子ELISPOT试剂盒测定IL-4和IFN-γ细胞因子的水平。

实验结果见图4(S2为S2组，RBG(PVAX1-BLP)为RBG(PVAX1-BLP)组，FKB为FKB组，ConA为阳性对照，PBS为阴性对照组)：RBG(PVAX1-BLP)组小鼠分泌IFN-γ水平与S2组小鼠分泌的IFN-γ水平无显著差异，但均显著高于FKB组和阴性对照组；RBG(PVAX1-BLP)组、S2组和FKB组小鼠分泌的IL-4水平与阴性对照组均无明显差异。结果表明，实施例1制备的装载DNA的粗糙型布鲁氏菌菌蜕复合疫苗能够诱发细胞免疫。

5、完成步骤2后的第45天，各组小鼠通过腹腔注射接种布鲁氏菌强毒株16M，接种剂量为1×10⁵CFU/只(约0.2mL)。

6、完成步骤5后的第14天，将各组小鼠处死，无菌分离小鼠脾脏，计算脾菌数。Log10CFU平均值±SD即为每组的免疫保护结果，与阴性对照组对比得出各组的免疫保护单位。

部分各组脾脏载菌量变化见表2。与阴性对照组相比，实施例1制备的装载DNA的粗糙型布鲁氏菌菌蜕复合疫苗、布鲁氏菌甲醛灭活疫苗和布鲁氏菌活疫苗S2免疫小鼠后起到了一定的攻毒保护力，其保护单位分别为2.37、1.35和2.29；其中RBG(PVAX1-BLP)组和S2组的保护力相当，且优于FKB组。结果表明，实施例1制备的装载DNA的粗糙型布鲁氏菌菌蜕复合疫苗与布鲁氏菌活疫苗S2均具有良好的的免疫保护性。

表2.小鼠免疫保护效力比较

注:保护单位为阴性对照组小鼠脾脏细菌数的对数值减去免疫组小鼠脾脏细菌数的对数值；同列数据肩标相同字母表示差异不显著(p>0.05)，肩标不同字母表示差异显著(p≤0.05)；“-”表示不存在。

实施例3、装载DNA的光滑型布鲁氏菌菌蜕复合疫苗的制备

一、温控裂解型自杀质粒PUSacB-Δbp26-TLC的构建

1、引物的合成

根据GenBank公开的布鲁氏菌全基因组的bp26基因(genebank号：AY166769)的上下游同源臂核苷酸序列，设计并合成引物bp26-N-F、引物bp26-N-R、引物bp26-C-F和引物bp26-C-R。各个引物的核苷酸序列如下：

引物bp26-N-F：5’-CGCGAGCTCCGTGTTGTGCGCCTGAAGCGCAAT-3’(下划线为限制性内切酶SacⅠ的识别位点)；

引物bp26-N-R：5’-CGCGGATCCGACGAGCATGATTGTGGAAAATGA-3’(下划线为限制性内切酶BamHⅠ的识别位点)；

引物bp26-C-F：5’-CGCGTCGACCTTGGCCGTGTGGTGGAAATCAG-3’(下划线为限制性内切酶SalⅠ的识别位点)；

引物bp26-C-R：5’-CGCGCATGCCCGTTCATCATTTGGGGACTA-3’(下划线为限制性内切酶SphⅠ的识别位点)。

2、温控裂解型自杀质粒PUSacB-Δbp26-TLC的构建

(1)以布鲁氏菌活疫苗S2的基因组DNA为模板，采用引物bp26-N-F和引物bp26-N-R进行PCR扩增，得到PCR扩增产物甲。采用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收PCR扩增产物甲中约504bp的双链DNA分子，该双链DNA分子即为bp26基因上游同源臂序列(以下简称bp26-N序列)。

(2)用限制性内切酶SacⅠ和BamHⅠ双酶切bp26-N序列，回收约504bp的DNA片段1。

(4)将DNA片段1与载体骨架1连接，得到重组质粒PUSacB-Δbp26-N。

(5)以布鲁氏菌活疫苗S2的基因组DNA为模板，采用引物bp26-C-F和引物bp26-C-R进行PCR扩增，得到PCR扩增产物乙。采用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收PCR扩增产物乙中约762bp的双链DNA分子，该双链DNA分子即为bp26基因下游同源臂序列(以下简称bp26-C序列)。

(6)用限制性内切酶SalⅠ和SphⅠ双酶切bp26-C序列，回收约762bp的DNA片段2。

(7)用限制性内切酶SalⅠ和SphⅠ双酶切重组质粒PUSacB-Δbp26-N，回收约5234bp的载体骨架2。

(8)将DNA片段2与载体骨架2连接，得到重组质粒PUSacB-Δbp26。

(9)根据GenBank公开的噬菌体PhiX174裂解基因E(Accession：9626372)和金黄色葡萄球菌核酸酶A基因(Accession：21281729)及PBV220质粒上的温敏调控基因

λPL/PR-cI857和rrnBT1T2终止子的序列，人工合成序列表中序列2所示的双链DNA分子。序列表中序列2中，自5’末端起第1－714位为温敏调控基因cI857，第762－789位编码lambda PR启动子，第976－1004位编码lambda PL启动子，第1143－1415位为裂解基因E，第1461－2147位为金黄色葡萄球菌核酸酶A基因，第2330－2416位编码rrnB T1终止子，第2508－2535位编码rrnB T2终止子。

(11)用限制性内切酶BamHⅠ和SalⅠ双酶切重组质粒PUC57-TLC，回收得到约2630bp的DNA片段3。

(12)用限制性内切酶BamHⅠ和SalⅠ双酶切重组质粒PUSacB-Δbp26，回收约5996bp的载体骨架3。

(13)将DNA片段3与载体骨架3连接，得到温控裂解型自杀质粒PUSacB-Δbp26-TLC。

将温控裂解型自杀质粒PUSacB-Δbp26-TLC进行测序。根据测序结果，对温控裂解型自杀质粒PUSacB-Δbp26-TLC进行结构描述如下：将自杀质粒PUSacB的限制性内切酶SacⅠ和BamHⅠ识别序列间的小片段替换为序列表中序列5所示的DNA分子，限制性内切酶BamHⅠ和SalⅠ识别序列间的小片段替换为序列表中序列2所示的DNA分子，限制性内切酶SalⅠ和SphⅠ识别序列间的小片段替换为序列表中序列6所示的DNA分子。

二、重组质粒PVAX1-BLS-L7/L12-P39的构建

同实施例1中步骤二。

三、布鲁氏菌菌蜕菌株的构建

1、布鲁氏菌S2感受态细胞的制备

同实施例1步骤三中1。

2、电转化

按照实施例1步骤三中2的步骤，将温控裂解型自杀质粒PUSacB-ΔwboA-TLC替换为步骤一构建的温控裂解型自杀质粒PUSacB-Δbp26-TLC，其它步骤均不变。

3、布鲁氏菌菌蜕菌株的筛选

经菌落PCR检测，共获得10个布鲁氏菌菌蜕菌株，依次命名为布鲁氏菌菌蜕菌株K1-布鲁氏菌菌蜕菌株K10。

4、遗传稳定性的鉴定

对布鲁氏菌菌蜕菌株K1-布鲁氏菌菌蜕菌株K10连续传15代。每代进行菌落PCR，进行菌落PCR的引物同步骤3。

结果表明，布鲁氏菌菌蜕菌株K1-布鲁氏菌菌蜕菌株K10在传代过程中，单菌落的PCR扩增产物中均含有750bp的条带。由此可见，布鲁氏菌菌蜕菌株K1-布鲁氏菌菌蜕菌株K10的遗传稳定性较高。

bp26基因编码布鲁氏菌可溶性外周浆蛋白(Gene ID为AY166769)。温控裂解型自杀质粒PUSacB-Δbp26-TLC中含有bp26基因的上游同源臂序列和下游同源臂序列，与布鲁氏菌基因组发生同源重组后，bp26基因被破坏。bp26基因的缺失或破坏或敲除不会影响其免疫保护效果，可作为区分疫苗免疫与自然感染的候选靶分子。因此，布鲁氏菌菌蜕菌株K1-布鲁氏菌菌蜕菌株K10均为光滑型布鲁氏菌菌蜕菌株。

随机选择布鲁氏菌菌蜕菌株K1进行后续实验。

四、装载DNA的光滑型布鲁氏菌菌蜕复合疫苗的制备

1、布鲁氏菌菌蜕的制备

按照实施例1步骤四中1的步骤，将布鲁氏菌菌蜕菌株n1替换为布鲁氏菌菌蜕菌株K1，其它步骤均不变，得到布鲁氏菌菌蜕溶液。

生长曲线见图5所示(重组菌K1在28℃培养为对照1，菌S2在28℃培养为对照2，重组菌K1即布鲁氏菌菌蜕菌株K1)。结果表明，诱导第24h，布鲁氏菌菌蜕菌株K1的OD_600nm值达到最大，之后OD_600nm值一直下降。诱导72h后，布鲁氏菌菌蜕菌株K1的菌蜕率达到99.99％。

2、装载DNA的光滑型布鲁氏菌菌蜕复合疫苗的制备

按照实施例1步骤四中2的步骤，将“布鲁氏菌菌蜕”替换为步骤1制备的布鲁氏菌菌蜕，其它步骤均不变，得到装载DNA的光滑型布鲁氏菌菌蜕复合疫苗(以下简称SBG(PVAX1-BLP))。

步骤(3)收集的菌体沉淀的装载效率为68％。

实施例4、实施例3制备的装载DNA的光滑型布鲁氏菌菌蜕复合疫苗的应用

一、安全性试验

2、完成步骤1后，4组小鼠分别进行如下处理：

第2组(SBG(PVAX1-BLP)组)：每只小鼠通过腹腔注射接种实施例3制备的装载DNA的光滑型布鲁氏菌菌蜕复合疫苗；接种剂量为5×10⁹CFU/只；

实验结果见表3。结果表明，7天内，S2组3只小鼠死亡，7只小鼠出现耸毛、精神萎靡和颤抖状态等临床症状(5天后恢复)，其它3组小鼠均未出现任何临床症状，表现正常。

表3.小鼠生理体征

	S2组	FKB组	SBG(PVAX1-BLP)组	阴性对照组
					1d	BC	E	E	E
2d	BCD	E	E	E
					3d	ABCD	E	E	E
4d	ABCD	E	E	E
					5d	BC	E	E	E
6d	E	E	E	E
					7d	E	E	E	E

注：A：死亡；B：精神萎靡；C：耸毛；D：颤抖；E：正常

二、免疫保护性试验

2、完成步骤1后，4组小鼠分别进行如下处理：

第2组(SBG(PVAX1-BLP)组)：每只小鼠通过腹腔注射接种实施例3制备的装载DNA的光滑型布鲁氏菌菌蜕复合疫苗；接种剂量为1×10⁸CFU/只；

部分实验结果见图6(S2为S2组，SBG(PVAX1-BLP)为SBG(PVAX1-BLP)组，FKB为FKB组，PBS为阴性对照组)。结果表明，随着免疫时间的增加，各组抗体效价逐步上升，S2组、SBG(PVAX1-BLP)组、FKB组的小鼠均能检测到抗体水平，而阴性对照组的小鼠未检测到相应抗体。SBG(PVAX1-BLP)组小鼠血清抗体滴度略高于S2组，并且显著高于FKB组。

实验结果见图7(S2为S2组，SBG(PVAX1-BLP)为SBG(PVAX1-BLP)组，FKB为FKB组，ConA为阳性对照，PBS为阴性对照组)：SBG(PVAX1-BLP)组小鼠分泌IFN-γ水平与S2组小鼠分泌的IFN-γ水平无显著差异，但均显著高于FKB组和阴性对照组；SBG(PVAX1-BLP)组、S2组和FKB组小鼠分泌的IL-4水平与阴性对照组均无明显差异。

结果表明，实施例3制备的装载DNA的光滑型布鲁氏菌菌蜕复合疫苗能够诱发细胞免疫。

部分各组脾脏载菌量变化见表4。与阴性对照组相比，实施例3制备的装载DNA的光滑型布鲁氏菌菌蜕复合疫苗、布鲁氏菌甲醛灭活疫苗和布鲁氏菌活疫苗S2免疫小鼠后起到了一定的攻毒保护力，其保护单位分别为2.51、1.35和2.29；其中SBG(PVAX1-BLP)组和S2组的保护力相当，且优于FKB组。结果表明，实施例3制备的装载DNA的光滑型布鲁氏菌菌蜕复合疫苗与布鲁氏菌活疫苗S2均具有良好的的免疫保护性。

表4.小鼠免疫保护效力比较

注：保护单位为阴性对照组小鼠脾脏细菌数的对数值减去免疫组小鼠脾脏细菌数的对数值；同列数据肩标相同字母表示差异不显著(p>0.05)，肩标不同字母表示差异显著(p≤0.05)；“-”表示不存在。

<110> 内蒙古华希生物科技有限公司

<120> 一种装载DNA的布鲁氏菌菌蜕复合疫苗

<160> 7

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 4730

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 1

tcagggcgcg tcagcgggtg ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga 60

gcagattgta ctgagagtgc accatttatt tgttaactgt taattgtcct tgttcaagga 120

tgctgtcttt gacaacagat gttttcttgc ctttgatgtt cagcaggaag cttggcgcaa 180

acgttgattg tttgtctgcg tagaatcctc tgtttgtcat atagcttgta atcacgacat 240

tgtttccttt cgcttgaggt acagcgaagt gtgagtaagt aaaggttaca tcgttaggat 300

caagatccat ttttaacaca aggccagttt tgttcagcgg cttgtatggg ccagttaaag 360

aattagaaac ataaccaagc atgtaaatat cgttagacgt aatgccgtca atcgtcattt 420

ttgatccgcg ggagtcagtg aacaggtacc atttgccgtt cattttaaag acgttcgcgc 480

gttcaatttc atctgttact gtgttagatg caatcagcgg tttcatcact tttttcagtg 540

tgtaatcatc gtttagctca atcataccga gagcgccgtt tgctaactca gccgtgcgtt 600

ttttatcgct ttgcagaagt ttttgacttt cttgacggaa gaatgatgtg cttttgccat 660

agtatgcttt gttaaataaa gattcttcgc cttggtagcc atcttcagtt ccagtgtttg 720

cttcaaatac taagtatttg tggcctttat cttctacgta gtgaggatct ctcagcgtat 780

ggttgtcgcc tgagctgtag ttgccttcat cgatgaactg ctgtacattt tgatacgttt 840

ttccgtcacc gtcaaagatt gatttataat cctctacacc gttgatgttc aaagagctgt 900

ctgatgctga tacgttaact tgtgcagttg tcagtgtttg tttgccgtaa tgtttaccgg 960

agaaatcagt gtagaataaa cggatttttc cgtcagatgt aaatgtggct gaacctgacc 1020

attcttgtgt ttggtctttt aggatagaat catttgcatc gaatttgtcg ctgtctttaa 1080

agacgcggcc agcgtttttc cagctgtcaa tagaagtttc gccgactttt tgatagaaca 1140

tgtaaatcga tgtgtcatcc gcatttttag gatctccggc taatgcaaag acgatgtggt 1200

agccgtgata gtttgcgaca gtgccgtcag cgttttgtaa tggccagctg tcccaaacgt 1260

ccaggccttt tgcagaagag atatttttaa ttgtggacga atcgaactca ggaacttgat 1320

atttttcatt tttttgctgt tcagggattt gcagcatatc atggcgtgta atatgggaaa 1380

tgccgtatgt ttccttatat ggcttttggt tcgtttcttt cgcaaacgct tgagttgcgc 1440

ctcctgccag cagtgcggta gtaaaggtta atactgttgc ttgttttgca aactttttga 1500

tgttcatcat atgcggtgtg aaataccgca cagatgcgta aggagaaaat accgcatcag 1560

gcgccattcg ccattcaggc tgcgcaactg ttgggaaggg cgatcggtgc gggcctcttc 1620

gctattacgc cagctggcga aagggggatg tgctgcaagg cgattaagtt gggtaacgcc 1680

agggttttcc cagtcacgac gttgtaaaac gacggccagt gaattcgagc tcggtacccg 1740

gggatcctct agagtcgacc tgcaggcatg caagcttggc gtaatcatgg tcatagctgt 1800

ttcctgtgtg aaattgttat ccgctcacaa ttccacacaa catacgagcc ggaagcataa 1860

agtgtaaagc ctggggtgcc taatgagtga gctaactcac attaattgcg ttgcgctcac 1920

tgcccgcttt ccagtcggga aacctgtcgt gccagctgca ttaatgaatc ggccaacgcg 1980

cggggagagg cggtttgcgt attgggcgct cttccgcttc ctcgctcact gactcgctgc 2040

gctcggtcgt tcggctgcgg cgagcggtat cagctcactc aaaggcggta atacggttat 2100

ccacagaatc aggggataac gcaggaaaga acatgtgagc aaaaggccag caaaaggcca 2160

ggaaccgtaa aaaggccgcg ttgctggcgt ttttccatag gctccgcccc cctgacgagc 2220

atcacaaaaa tcgacgctca agtcagaggt ggcgaaaccc gacaggacta taaagatacc 2280

aggcgtttcc ccctggaagc tccctcgtgc gctctcctgt tccgaccctg ccgcttaccg 2340

gatacctgtc cgcctttctc ccttcgggaa gcgtggcgct ttctcatagc tcacgctgta 2400

ggtatctcag ttcggtgtag gtcgttcgct ccaagctggg ctgtgtgcac gaaccccccg 2460

ttcagcccga ccgctgcgcc ttatccggta actatcgtct tgagtccaac ccggtaagac 2520

acgacttatc gccactggca gcagccactg gtaacaggat tagcagagcg aggtatgtag 2580

gcggtgctac agagttcttg aagtggtggc ctaactacgg ctacactaga agaacagtat 2640

ttggtatctg cgctctgctg aagccagtta ccttcggaaa aagagttggt agctcttgat 2700

ccggcaaaca aaccaccgct ggtagcggtg gtttttttgt ttgcaagcag cagattacgc 2760

gcagaaaaaa aggatctcaa gaagatcctt tgatcttttc tacggggtct gacgctcagt 2820

ggaacgaaaa ctcacgttaa gggattttgg tcatgagatc tatgggagtt acgatttcgg 2880

gtatgacagg tgcagggagc atccggcaca acaaccgcag cttctcagcg gcgaatgtag 2940

accggagccg gacggagcag aacattgttt tctgcaacga ggatctgaag caggtctatc 3000

atatggtctt tgatgaagct ctcgcagcct acaacgcaaa gaaaaccaaa acgagagata 3060

agataccgga ctactatgag catatccggc agagtaaaca ggaaaagctg ttccatgaag 3120

cgatcttcca gatcggcaac atgagcgact gtgggtgcgg tacgccggac ggagaacggg 3180

cggcggcagc tctgaaagat tttgcggagt cttttgcaga acgcaacccc catctgcggg 3240

tgttcaatat ggtgctgcac atggacgagg caacgcccca tctccatgtc gattttatcc 3300

ctgtggcaac ggagcagtca agaggacttt ctacaagggt atctatgaaa caggcattga 3360

agcagcaggg gtttgtcggt gtcggcagaa agcagaccga atgggcggcg tggatggaac 3420

gggagaaaga agctctgacg gagatcgccc agcggcacga ttttgaaatt atctctctcg 3480

gcacgaacag accgcacatg gacttgccgc agttcaagga agcggctgcg aggctggaag 3540

cggtgcagca gcagacagcg gcagtagagc gggaggttgc tgagctggaa cggcagcggg 3600

acgctctgaa aggcactgtg cggctcttaa aggaggctga cagggtaaat gcacccctgc 3660

atgatattca gccggaaaag acgctcacag gggcagtaaa gggcgtgacg gtggatcagg 3720

tcgagcagtc taaagaaaat ggcactgcgc agcgtgacgg atcggcacaa ggtacaggag 3780

ctgacggagg aaaacacccg tctgcggtca caggtgccgt ccatgaagaa gcggctggaa 3840

gaagcgcagc ggcagcagag gcttgaagat ctagtaatac aaggggtgtt atgagccata 3900

ttcaacggga aacgtcttgc tctaggccgc gattaaattc caacatggat gctgatttat 3960

atgggtataa atgggctcgc gataatgtcg ggcaatcagg tgcgacaatc tatcgattgt 4020

atgggaagcc cgatgcgcca gagttgtttc tgaaacatgg caaaggtagc gttgccaatg 4080

atgttacaga tgagatggtc agactaaact ggctgacgga atttatgcct cttccgacca 4140

tcaagcattt tatccgtact cctgatgatg catggttact caccactgcg atccccggga 4200

aaacagcatt ccaggtatta gaagaatatc ctgattcagg tgaaaatatt gttgatgcgc 4260

tggcagtgtt cctgcgccgg ttgcattcga ttcctgtttg taattgtcct tttaacagcg 4320

atcgcgtatt tcgtctcgct caggcgcaat cacgaatgaa taacggtttg gttgatgcga 4380

gtgattttga tgacgagcgt aatggctggc ctgttgaaca agtctggaaa gaaatgcata 4440

aacttttgcc attctcaccg gattcagtcg tcactcatgg tgatttctca cttgataacc 4500

ttatttttga cgaggggaaa ttaataggtt gtattgatgt tggacgagtc ggaatcgcag 4560

accgatacca ggatcttgcc atcctatgga actgcctcgg tgagttttct ccttcattac 4620

agaaacggct ttttcaaaaa tatggtattg ataatcctga tatgaataaa ttgcagtttc 4680

atttgatgct cgatgagttt ttctaagaat taattcatga gcgggtgcac 4730

<210> 2

<211> 2630

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 2

tcagccaaac gtctcttcag gccactgact agcgataact ttccccacaa cggaacaact 60

ctcattgcat gggatcattg ggtactgtgg gtttagtggt tgtaaaaaca cctgaccgct 120

atccctgatc agtttcttga aggtaaactc atcaccccca agtctggcta tgcagaaatc 180

acctggctca acagcctgct cagggtcaac gagaattaac attccgtcag gaaagcttgg 240

cttggagcct gttggtgcgg tcatggaatt accttcaacc tcaagccaga atgcagaatc 300

actggctttt ttggttgtgc ttacccatct ctccgcatca cctttggtaa aggttctaag 360

cttaggtgag aacatccctg cctgaacatg agaaaaaaca gggtactcat actcacttct 420

aagtgacggc tgcatactaa ccgcttcata catctcgtag atttctctgg cgattgaagg 480

gctaaattct tcaacgctaa ctttgagaat ttttgcaagc aatgcggcgt tataagcatt 540

taatgcattg atgccattaa ataaagcacc aacgcctgac tgccccatcc ccatcttgtc 600

tgcgacagat tcctgggata agccaagttc atttttcttt ttttcataaa ttgctttaag 660

gcgacgtgcg tcctcaagct gctcttgtgt taatggtttc ttttttgtgc tcatacgtta 720

aatctatcac cgcaagggat aaatatctaa caccgtgcgt gttgactatt ttacctctgg 780

cggtgataat ggttgcatgt actaaggagg ttgtatggaa caacgcataa ccctgaaaga 840

ttatgcaatg cgctttgggc aaaccaagac agctaaaaga tctctcacct accaaacaat 900

gcccccctgc aaaaaataaa ttcatataaa aaacatacag ataaccatct gcggtgataa 960

attatctctg gcggtgttga cataaatacc actggcggtg atactgagca catcagcagg 1020

acgcactgac caccatgaag gtgacgctct taaaaattaa gccctgaaga agggcagcat 1080

tcaaagcaga aggctttggg gtgtgtgata cgaaacgaag cattggttaa aaattaagga 1140

ggatggtacg ctggactttg tgggataccc tcgctttcct gctcctgttg agtttattgc 1200

tgccgtcatt gcttattatg ttcatcccgt caacattcaa acggcctgtc tcatcatgga 1260

aggcgctgaa tttacggaaa acattattaa tggcgtcgag cgtccggtta aagccgctga 1320

attgttcgcg tttaccttgc gtgtacgcgc aggaaacact gacgttctta ctgacgcaga 1380

agaaaacgtg cgtcaaaaat tacgtgcgga aggagggtgg tggtggttct ggtggtggtg 1440

gttctggtgg tggtggttct atgacagaat acttattaag tgctggcata tgtatggcaa 1500

ttgtttcaat attacttata gggatggcta tcagtaatgt ttcgaaaggg caatacgcaa 1560

agaggttttt ctttttcgct actagttgct tagtgttaac tttagttgta gtttcaagtc 1620

taagtagctc agcaaatgca tcacaaacag ataacggcgt aaatagaagt ggttctgaac 1680

atccaacagt atatagtgca acttcaacta aaaaattaca taaagaacct gcgacattaa 1740

ttaaagcgat tgatggtgat acggttaaat taatgtacaa aggtcaacca atgacattta 1800

gactattatt ggtggataca cctgaaacaa agcatcctaa aaaaggtgta gagaaatatg 1860

gtcctgaagc aagtgcattt acgaaaaaaa tggtagaaaa tgcaaagaaa attgaagtcg 1920

agtttgacaa aggccaaaga actgataaat atggacgtgg cttagcgtat atttatgctg 1980

atggaaaaat ggtaaacgaa gctttagttc gtcaaggctt ggctaaagtt gcttatgttt 2040

ataaacctaa caatacacat gaacaacttt taagaaaaag tgaagcacaa gcgaaaaaag 2100

agaaattaaa tatttggagc gaagacaacg ctgattcagg tcaataagaa gattttcagc 2160

ctgatacaga ttaaatcaga acgcagaagc ggtctgataa aacagaattt gcctcccggc 2220

agtagcgcgg tggtcccacc tgaccccatg ccgaactcag aagtgaaacg ccgtagcgcc 2280

gatggtagtg tggggtctcc ccatgcgaga gtagccaact gccaggcatc aaataaaacg 2340

aaaggctcag tcgaaagact gggcctttcg ttttatctgt tgtttgtcgg tgaacgctct 2400

cctgagtagg acaaatccgc cgggagcgga tttgaacgtt gcgaagcaac ggcccggagg 2460

gtggcgggca ggacgcccgc cataaactgc caggcatcaa aggaatcaga aggccatcct 2520

gacggatggc ctttttgcgt ttctacaaac tctttgttta tttttctaaa tacattcaaa 2580

tatgtatccg ctcatgagac aataaccctg ataaatgctt caataatatt 2630

<210> 3

<211> 888

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 3

cagccacacc ttatgtttgg gacattttaa ttaggaacgt ttatgccttc ggatgccgtg 60

ggcgtggcat ccgcatgagg gatggctttg cgtttctgcg ctttgaagat gttgaaattg 120

ggttagggcc gcaatatggt ggtgtaagcc taccagcata tgagtttcga aattttgagg 180

ggttatttct tcgccgcacc gaagccactg gattggatgg atatacagac cttggatacg 240

tcccagatgc tgaacagcgg gggttcatct ttgcagacgg agcagccctc cacatcaata 300

gcctgtttgc agataataac aagggtgatg gcgtgttttg ccaaaacgtc caatacgtag 360

atggaaacga tctcaattca tccatcgacg gcggaactgg gttcaatttt atcaacgtag 420

atcgcataaa catcaatacg atccgcagtg gtggccgccg gaatatggca ccaggaaatc 480

ttaacactgt ttcccaaggt atctctttga atgcaaattg tcagactgta attataggca 540

acgcagttac ccacaactgg tgaagtcacg gtttttatag ccaagctcag gacattttgg 600

ttaatggtct gatatcacgt gataatggcg gaagggggta cgttgcagag ggttcagcag 660

ggtcatctct cctaaatggg gccgttttca gagataatgt agcagggaat tattttacag 720

gagggacaag cgtaaaccat ctcgcgaacc tccaacttca taactctagc accgggggga 780

aaacttttgt ggccaatgtc accacaaatg ggtctgcata acggtccttg ccattttaac 840

tataaatgag ctattcccgc gcattaagag tagacacggg aaatcagt 888

<210> 4

<211> 897

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 4

gacaaggagt atgcggagct tcttgcttca gcttgtttcc tttggcatcc aactttggca 60

gacaacggaa cttttgctgc ggtcgaagcg gcatatatgg gatgtccaac gctttcaaac 120

gactacccgc agatgcggta tatttctaac cgtttcgaaa ttcccatgca gtattttaac 180

gcaaggtctg tgaaggaaat ggcatcagcg cttaagcaaa tggaggagac gccaatagat 240

gtaggtttat tgccaagtcg agaaacccta tctctgcatt cgtgggaagc tcacgcttcc 300

gaatactggg atgtgatcgt gagggcagcg gcatgaataa gctcggcgtg tttatcggct 360

ataacccagg ccaattagat ccatatcagg gtatttctcg cttaattgca ttcgtgatca 420

agggggcctt gaaccagggt agcggtgtaa caattgcttg ccccggctgg ctaaaggacg 480

atgtacgtgt tcttttggaa gatgctgata tcccacttga agcggtcaaa attatcgcga 540

cgaatggtca gcctccattg gcttcgttat ggaagttgag agataagttc cgtaagagac 600

ggacgagtaa acgaaaacgt ctctggctgg agcgctatgg caaaaatgtt gcaaattttg 660

ttgcagaatg gctttcttcg cgctcgtatt gggggatttt tttgggggct gctgcaattg 720

ctgtagtgac tattctactt gccgtaccaa ttgctatagc cttcaccgct cttatcggtc 780

ttctatttgc tcgtcggctt attagacgtg ttatcaggtc aaagcttggt ttgttttttc 840

acaaaaatgc caatcaattc aacaaattaa tgtcatctga tgaaaccatc gaccgga 897

<210> 5

<211> 504

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 5

cgtgttgtgc gcctgaagcg caatggctaa ccttttggct aaccgatttc tggctaacct 60

taacgtattg atttaattga ttaatttaga tgaatggtgg gcccggaggg actcgaaccc 120

ccaaccaagc ggttatgagc cgccggctct aaccaattga gctacaggcc ccacgcaccc 180

ttgccctacc cgaaagaaag ccgggataca agctgtcaaa tgcaacactt gccctaatgc 240

gcacatattc agttgcaatc cataggtttg aagtcacgat gctttcaatt tgaaccgagg 300

gtgcaacagg cgtccatctc aaatcaatca acttctctcc ttgcataaaa ggagacttaa 360

gaacacaatg atttcaaaga caaagcagcc gcccctgaca taacccgctt tgtccaaatt 420

ttttcaactt ttcctgtagg agattttatg aacactcgtg ctagcaattt tctcgcagcc 480

tcattttcca caatcatgct cgtc 504

<210> 6

<211> 762

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 6

cttggccgtg tggtggaaat cagtgaactg agccgcccgc ccatgccgat gccaattgcg 60

cgcggacagt tcagaaccat gctagcagcc gcaccggaca attccgtgcc gattgccgca 120

ggcgaaaaca gctataacgt atcggtcaat gtcgtttttg aaatcaagta aatagctggg 180

gtatgacgcc ctttgccacc tgatacaaaa cgccggcctg gtttcacagg ccggtttttt 240

tgattagagc gcgtttcgat ctgattgaat ccgatcggcg ctctaatcct ttgttttgac 300

gcgcatcttt tccgaaaacc gtttcacact tttcgggatg cggtctagcg gatgatcggg 360

caaccgcgcg tatcggcaaa tgtcacgctc gtcggacgac catggcggaa cccacgcacg 420

gtaacggtgc gcccgcgata ggtgacgcgg gcattgcgga tacccatgcg atgagccttc 480

atcttcgcgc cctcaaccga gcagccgcga acgattgggc gatgatgatg acggcgataa 540

tccacattca taaccgaaga atgcgcagcc gtcgtaatcg ccggtgccat aacggcggaa 600

gcggcattgg ccgaagccga tgcgctgaac atggctgcaa caccaatagc tgcggtaacg 660

acgaacgatt tgagcgaaat aacggacatt ctgaacctct ttcgatttgc tttcgggctt 720

tcgcctgaga cacccgatag ttagtcccca aatgatgaac gg 762

<210> 7

<211> 237

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 7

Met Ser Thr Lys Lys Lys Pro Leu Thr Gln Glu Gln Leu Glu Asp Ala

1 5 10 15

Arg Arg Leu Lys Ala Ile Tyr Glu Lys Lys Lys Asn Glu Leu Gly Leu

20 25 30

Ser Gln Glu Ser Val Ala Asp Lys Met Gly Met Gly Gln Ser Gly Val

35 40 45

Gly Ala Leu Phe Asn Gly Ile Asn Ala Leu Asn Ala Tyr Asn Ala Ala

50 55 60

Leu Leu Ala Lys Ile Leu Lys Val Ser Val Glu Glu Phe Ser Pro Ser

65 70 75 80

Ile Ala Arg Glu Ile Tyr Glu Met Tyr Glu Ala Val Ser Met Gln Pro

85 90 95

Ser Leu Arg Ser Glu Tyr Glu Tyr Pro Val Phe Ser His Val Gln Ala

100 105 110

Gly Met Phe Ser Pro Lys Leu Arg Thr Phe Thr Lys Gly Asp Ala Glu

115 120 125

Arg Trp Val Ser Thr Thr Lys Lys Ala Ser Asp Ser Ala Phe Trp Leu

130 135 140

Glu Val Glu Gly Asn Ser Met Thr Ala Pro Thr Gly Ser Lys Pro Ser

145 150 155 160

Phe Pro Asp Gly Met Leu Ile Leu Val Asp Pro Glu Gln Ala Val Glu

165 170 175

Pro Gly Asp Phe Cys Ile Ala Arg Leu Gly Gly Asp Glu Phe Thr Phe

180 185 190

Lys Lys Leu Ile Arg Asp Ser Gly Gln Val Phe Leu Gln Pro Leu Asn

195 200 205

Pro Gln Tyr Pro Met Ile Pro Cys Asn Glu Ser Cys Ser Val Val Gly

210 215 220

Lys Val Ile Ala Ser Gln Trp Pro Glu Glu Thr Phe Gly

225 230 235

Claims

1.一种重组布鲁氏菌，其特征在于：通过具有温控调节功能的蛋白调节噬菌体裂解蛋白E和细菌核酸酶蛋白A的含量和/或活性。

2.如权利要求1所述的重组布鲁氏菌，其特征在于：所述“具有温控调节功能的蛋白”为温敏调控蛋白cI857；所述噬菌体裂解蛋白E为噬菌体PhiX174裂解蛋白E；所述细菌核酸酶蛋白A为金黄色葡萄球菌核酸酶蛋白A。

3.如权利要求1或2所述的重组布鲁氏菌，其特征在于：所述布鲁氏菌为粗糙型布鲁氏菌或光滑型布鲁氏菌。

4.如权利要求3所述的重组布鲁氏菌，其特征在于：所述粗糙型布鲁氏菌通过将布鲁氏菌基因组中编码糖苷转移酶的基因敲除或破坏获得；所述光滑型布鲁氏菌通过将布鲁氏菌基因组中编码可溶性外周浆蛋白的基因敲除或破坏获得。

5.如权利要求1至4任一所述的重组布鲁氏菌，其特征在于：所述布鲁氏菌为猪种布氏杆菌、羊种布氏杆菌、牛种布氏杆菌、犬种布氏杆菌、沙林鼠种布氏杆菌或绵羊附睾种布氏杆菌。

6.权利要求1至5任一所述的重组布鲁氏菌的制备方法，为将含有编码权利要求1或2所述具有温控调节功能的蛋白的核酸分子、编码权利要求1或2噬菌体裂解蛋白E的核酸分子和编码权利要求1或2细菌核酸酶蛋白A的核酸分子的自杀质粒导入布鲁氏菌，利用同源重组技术获得重组布鲁氏菌。

7.一种布鲁氏菌菌蜕，是采用权利要求1至5任一所述重组布鲁氏菌制备得到的菌蜕。

8.一种装载DNA的布鲁氏菌核酸菌蜕复合疫苗，是将目的DNA装载于权利要求7所述布鲁氏菌菌蜕得到的。

9.如权利要求8所述装载DNA的布鲁氏菌核酸菌蜕复合疫苗，其特征在于：所述“目的DNA装载于所述布鲁氏菌菌蜕”是将质粒或双链DNA分子装载于所述布鲁氏菌菌蜕实现的；所述质粒或双链DNA分子含有目的DNA。

10.如权利要求8或9所述装载DNA的布鲁氏菌核酸菌蜕复合疫苗，其特征在于：所述目的DNA为表达BLS蛋白、L7/L12蛋白和P39蛋白的重组质粒。

11.如权利要求1至5任一所述的重组布鲁氏菌、或、权利要求7所述布鲁氏菌菌蜕、或、权利要求8至10任一所述装载DNA的布鲁氏菌核酸菌蜕复合疫苗，其特征在于：所述重组布鲁氏菌、所述布鲁氏菌菌蜕或所述装载DNA的布鲁氏菌核酸菌蜕复合疫苗的免疫途径为b1)至b7)中的任一种：b1)皮下注射；b2)皮内注射；b3)肌肉注射；b4)腹腔注射；b5)黏膜途径；b6)口服给药；b7)鼻内给药。

12.如权利要求1至5任一所述的重组布鲁氏菌、或、权利要求7所述布鲁氏菌菌蜕、或、权利要求8至10任一所述装载DNA的布鲁氏菌核酸菌蜕复合疫苗，其特征在于：所述重组布鲁氏菌、所述布鲁氏菌菌蜕或所述装载DNA的布鲁氏菌核酸菌蜕复合疫苗的免疫对象为c1)至c5)中的任一种：c1)人；c2)家畜动物；c3)羊；c4)牛；c5)猪。

13.权利要求1、2、3、4、5、11或12任一所述的重组布鲁氏菌、或、权利要求7、11或12任一所述布鲁氏菌菌蜕、或、权利要求8、9、10、11或12任一所述装载DNA的布鲁氏菌核酸菌蜕复合疫苗的应用，为a1)或a2)或a3)：

a1)预防布鲁氏菌病；

a2)制备预防布鲁氏菌病的产品；

a3)鉴别疫苗免疫和自然感染。

14.权利要求8、9、10、11或12任一所述装载DNA的布鲁氏菌核酸菌蜕复合疫苗联合重组疫苗、亚单位疫苗或减毒活疫苗的应用，为a1)或a2)或a3)：

a1)预防布鲁氏菌病；

a2)制备预防布鲁氏菌病的产品；

a3)鉴别疫苗免疫和自然感染。

15.权利要求8、9、10、11或12任一所述装载DNA的布鲁氏菌核酸菌蜕复合疫苗和免疫佐剂的应用，为a1)或a2)或a3)：

a1)预防布鲁氏菌病；

a2)制备预防布鲁氏菌病的产品；

a3)鉴别疫苗免疫和自然感染。