CN102154229A

CN102154229A - 一种ev71病毒样颗粒及以其制备的手足口病疫苗

Info

Publication number: CN102154229A
Application number: CN 201010585028
Authority: CN
Inventors: 张定梅; 陆家海; 曹开源; 黎孟枫
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2010-12-13
Filing date: 2010-12-13
Publication date: 2011-08-17

Abstract

本发明涉及一种EV71病毒样颗粒及以其制备的手足口病疫苗，所述EV71病毒样颗粒按照以下步骤制备：(1)重组质粒的构建：用肠道病毒EV71的P1蛋白基因和3CD蛋白酶基因与pGAPZαA质粒分别连接后构建P1-pGAPZαA和3CD-pGAPZαA重组质粒；(2)重组质粒转入表达菌株：所述重组质粒依次转入毕赤酵母SMD1168表达菌株，得到P1-pGAPZαA-3CD-pGAPZαA-SMD1168重组表达菌株；(3)菌体培养及EV71病毒样颗粒纯化：培养所述毕赤酵母重组表达菌株，离心分离上清液，所述上清液经超速离心后的沉淀用蔗糖密度梯度离心，获得EV71病毒样颗粒。本发明的EV71病毒样颗粒易于通过菌体培养获得，稳定性好、易于纯化，适于制备疫苗，且便于工业化生产。

Description

一种EV71病毒样颗粒及以其制备的手足口病疫苗

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种EV71病毒样颗粒及以其制备的手足口病疫苗。

背景技术

自1957年以来，手足口病在世界多个国家爆发流行，特别是20世纪90年代以来，在亚太地区流行日益猖獗。2007年以来中国大陆发生手足口病爆发流行，至2010年9月底，累计报告300多万儿童感染手足口病，严重威胁儿童的身体健康和生命安全。手足口病的病原体主要是小RNA病毒，肠道病毒属成员，主要是柯萨奇A组16型(Coxsakie A₁₆，CoxA16)和肠道病毒71型(enterovirus 71，EV71)，其中EV71病毒是导致神经系统并发症和死亡病例的主要病原体。

目前还没有有效的疫苗用以预防EV71，但脊髓灰质炎疫苗在控制全球脊髓灰质炎病毒传播中的成功实践，给EV71疫苗的研制带来了希望。不同形式的EV71疫苗都处于研发阶段，研究发现福尔马林灭活的EV71疫苗产生的中和抗体(1∶64)比自然感染的中和抗体(1∶128)低，可能是因为福尔马林灭活的EV71疫苗在制备过程中破坏了B细胞表位。研究也发现热灭活的全病毒疫苗诱导的中和抗体滴度比自然感染明显低，可能也与破坏构象表位有关；并且灭活疫苗存在灭活不完全的风险。减毒活疫苗可以保存构象表位，但也存在毒力回复的风险。

病毒样颗粒(Virus Like Particle，VLP)疫苗的发展为如何研发既保持构象表位并且无毒力回复风险的疫苗提供了一种新的研究策略。VLP疫苗是通过分子生物学技术，表达病毒的一个或多个结构蛋白，这些结构蛋白具有天然的自装配能力，可形成与真正病毒颗粒相同或相似的空心颗粒，没有病毒的核酸，不能自主复制，没有感染性，不存在灭活不完全或毒力回复的风险，并且表面有高密度的病毒抗原，保存了构象表位，可通过和全病毒疫苗一样的途径呈递给免疫细胞，有效诱导机体免疫系统产生免疫保护反应。

目前国内外有多家研究组进行EV71病毒颗粒疫苗的研制，发表的文献(Chung YC，Huang JH，Lai CW，et al.Expression，purification and characterization of enterovirus-71 virus-like particles.World J Gastroenterol 2006；12：921-927；)主要用重组杆状病毒表达系统在昆虫细胞中表达EV71的3CD和P1蛋白，3CD蛋白酶能将P1前蛋白酶切为VP1，VP3和VP0三个蛋白，这三个蛋白能自动组装成VLPs，能诱导产生Th1和Th2免疫反应。用VLPs免疫的母鼠能给用EV71病毒致死攻击的乳鼠提供免疫保护，表明EV71VLPs是一种有效的疫苗。但是，由于目前主要用昆虫细胞制备VLPs，培养条件要求较高；又由于是胞内表达，VLP纯化过程复杂，限制了大规模的生产需求；而且杆状病毒-昆虫细胞系统另一个主要的缺陷是产生杆状病毒颗粒及其他明显影响疫苗效果的污染物，由于杆状病毒颗粒很难和制备的VLP分离开来，制备的VLP应用于临床需要进行化学灭活处理等措施，这些处理可能会影响制备的VLP的质量。

发明内容

有鉴于此，为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种从新的表达系统获得的EV71病毒样颗粒，该EV71病毒样颗粒易于培养获得，适合工业化生产，且便于纯化。

本发明的另一目的是提供以上述EV71病毒样颗粒制备的手足口病疫苗。

本发明提供的一种EV71病毒样颗粒，其中，所述EV71病毒样颗粒的制备过程包括：(1)重组质粒的构建：用EV71病毒的P1蛋白基因和3CD蛋白酶基因与pGAPZαA质粒分别连接后构建P1-pGAPZαA和3CD-pGAPZαA重组质粒；(2)重组质粒转入表达菌株：所述重组质粒依次转入毕赤酵母SMD1168表达菌株，得到P1-pGAPZαA-3CD-pGAPZαA-SMD1168毕赤酵母重组表达菌株；(3)菌体培养及EV71病毒样颗粒纯化：培养所述毕赤酵母重组表达菌株，离心分离上清液，所述上清液经超速离心后的沉淀用蔗糖密度梯度离心，获得EV71病毒样颗粒。

本发明通过构建并培养能够表达EV71病毒样颗粒的毕赤酵母重组表达菌株，成功的获得了一种易于通过菌体培养获得，适合工业化生产，且便于纯化的EV71病毒样颗粒。

进一步，所述P1-pGAPZαA重组质粒是将P1蛋白基因与pGAPZaA质粒均用PmlI内切酶和SaclI内切酶分步双酶切后，用T4DNA连接酶将P1基因和pGAPZaA质粒双酶切产物连接得到。

进一步，所述3CD-pGAPZαA重组质粒是将所述3CD蛋白酶基因和pGAPZaA质粒均用EcoRI和XbaI内切酶分步双酶切后，用T4DNA连接酶将3CD蛋白酶基因和pGAPZaA质粒双酶切产物连接得到。

进一步，所述3CD蛋白酶基因和P1蛋白基因是以EV71病毒RNA反转录的cDNA为模板，用PCR方法扩增获得。

进一步，所述重组质粒转入表达菌株是用电穿孔仪先将所述3CD-pGAPZαA质粒转入SMD1168酵母表达菌株，用低浓度博莱霉素zeocin筛选得到3CD-pGAPZαA-SMD1168重组表达菌株，然后再将所述P1-pGAPZαA质粒转入3CD-pGAPZαA-SMD1168重组表达菌株，用高浓度博莱霉素zeocin筛选得到P1-pGAPZαA-3CD-pGAPZαA-SMD1168重组表达菌株。

进一步，所述低浓度博莱霉素zeocin是指100μg/ml浓度的博莱霉素，所述高浓度zeocin是指500μg/ml浓度的博莱霉素。

进一步，所述EV71病毒样颗粒纯化是将所述毕赤酵母重组表达菌株培养菌液5000转/分钟转速离心10分钟，取上清，超速离心28000转/分钟转速离心4小时，弃上清，沉淀用磷酸盐缓冲液PBS溶解，铺于不连续重量百分比蔗糖梯度15％、30％、45％和60％上，于28000转/分钟4℃离心1小时，收集15％-30％层病毒带，用磷酸缓冲液稀释，28000转/分钟4℃离心2.5小时，弃去上清液，即得纯化的EV71病毒样颗粒。

本发明提供的一种手足口病疫苗，所述疫苗的制备方法包括：(1)重组质粒的构建：用EV71病毒P1蛋白基因和3CD蛋白酶基因与pGAPZαA质粒分别连接后构建P1-pGAPZαA和3CD-pGAPZαA重组质粒；(2)重组质粒转入表达菌株：所述重组质粒依次转入毕赤酵母SMD1168表达菌株，得到P1-pGAPZαA-3CD-pGAPZαA-SMD1168重组表达菌株；(3)菌体培养及EV71病毒样颗粒纯化：培养所述毕赤酵母重组表达菌株，离心分离上清液，所述上清液经超速离心后沉淀用蔗糖密度梯度离心，获得EV71病毒样颗粒；(4)制备疫苗：所述EV71病毒样颗粒用磷酸缓冲液溶解到40μg/ml，与等体积弗氏完全佐剂相混合制成疫苗。

本发明的有益效果在于：

1.表达本发明EV71病毒样颗粒的毕赤酵母重组表达菌株易于筛选得到：重组转化子具有Zeocin抗性标记基因，可直接用Zeocin进行筛选，大大简化了重组转化酵母的筛选过程。

2.本发明的EV71病毒样颗粒适于制备疫苗：本发明选择的毕赤酵母重组表达菌株具有真核生物表达蛋白质的特点---正确加工、修饰、合理的空间折叠，不含内毒素和其他有害物质，使用安全；由于毕赤酵母加到翻译蛋白上的糖链比酿酒酵母短得多，并且毕赤酵母极少出现过渡糖基化，可避免外源蛋白生产过强的免疫原性或因糖链过长干扰外源蛋白正确折叠而影响其功能。

3.适于工业化生产：本发明选择的毕赤酵母重组表达菌株同时具有原核细胞生长快、易于培养、遗传操作简单、繁殖速度快，对培养条件要求低，培养基价廉，能进行高密度培养，且能耐受较高的液体静压，便于工业化生产等特点。

4.稳定性好：pGAPZαA质粒能与酵母宿主细胞的染色体基因组DNA发生同源重组，质粒稳定，不易丢失；所采用的毕赤酵母SMD1168菌株是蛋白酶缺陷菌株，可有效降低外源目的蛋白的酶解。

5.便于纯化：启动子为GAP，不需甲醇诱导，便于疫苗生产；同时含有α分泌信号，将蛋白分泌至胞外，便于纯化。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步的详细描述，其中：

图1为本发明构建的3CD-pGAPZαA重组质粒构建流程图；

图2为本发明构建的P1-pGAPZαA重组质粒构建流程图；

图3为本发明构建的P1-pGAPZαA-3CD-pGAPZαA-SMD1168重组菌株表达制备EV71病毒样颗粒构建流程图；

图4 为本发明EV71病毒样颗粒与对照组免疫小鼠后总IgG抗体滴度图；

图5 为本发明EV71病毒样颗粒与对照组中和抗体滴度图；

图6 为本发明EV71病毒样颗粒与对照组免疫小鼠淋巴细胞增殖图；

图7 为本发明EV71病毒样颗粒与对照组VLP刺激脾细胞产生细胞因子的浓度图；

其中：1：SMD1168菌对照组 2：空质粒重组菌对照组

3：灭活疫苗组 4：VLP组

具体实施方式

以下将参照附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述，优选实施例仅为了说明本发明，而不是为了限制本发明的保护范围。

实施例本发明EV71病毒样颗粒的制备

本发明所采用的RT-PCR、酶切、连接等分子生物学实验方法可参考《分子克隆》第二版。

制备本发明EV71病毒样颗粒的基础材料包括：EV71病毒P1基因、3CD基因、pGAPZαA质粒(美国Invitrogen公司产品)、SMD1168酵母菌株(美国Invitrogen公司产品)。

一、P1基因，3CD基因克隆

1.第一链cDNA制备

用上海生工重组禽类成髓纤维病毒逆转录酶(AMV)第一链cDNA反转录试剂盒将EV71病毒RNA反转录为cDNA。

2.引物设计

借助Primer Premier 5.0软件设计P1基因和3CD基因引物，由上海生工合成，下横线为酶切位点：

P1-上游引物：(Pml I)5’-TATCTACACGTGCATGGGTTCGCAGGTGTCTAC-3’；

P1-下游引物：(SacII)5’-TATCGTCCGCGGCTAAAGAGTAGTGATCGCTGT-3’；

3CD-上游引物：(EcoRI)5’-AGCAGAATTCATGGGCCCGAGTCTTGATTT-3’；

3CD-下游引物：(XbaI)5’-GCCGTCTAGACTAAAATAACTCGAGCCAATTGCGTC-3’。

3.EV71 P1和3CD基因PCR扩增

用Takara公司PrimerSTAR HS DNA多聚酶以反转录的cDNA为模板用PCR方法扩增P1基因和3CD基因，方法如下：

P1基因PCR反应体系：

dH2O 31.5μl

5×PrimerSTAR HS DNA polymerase buffer 10μl

dNTP(2.5mmol) 4μl

P1上游引物(10μmol) 1μl

cDNA 2μl

PrimerSTAR HS DNA polymerase 0.5μl

50μl

P1基因PCR反应条件：

98℃，10s，

60℃，15s，

72℃，3min；30个循环；

72℃，10min；

4℃。

3CD基因PCR反应体系：

dH2O 31.5μl

5×PrimerSTAR HS DNA polymerase buffer 10μl

dNTP(2.5mmol) 4μl

3CD上游引物(10μmol) 1μl

cDNA 2μl

PrimerSTAR HS DNA polymerase 0.5μl

50μl

3CD基因PCR反应条件：

98℃，10s，

60℃，15s，

72℃，2min；30个循环；

72℃，10min；

4℃。

4.P1基因，3CD基因，pGAPZαA双酶切

P1基因和pGAPZaA质粒用PmlI内切酶(NEB公司)和SacII(NEB公司)内切酶分步进行酶切，3CD基因和pGAPZaA质粒用EcoRI(NEB公司)和XbaI(NEB公司)内切酶分步进行酶切。

4.1纯化P1基因和3CD基因PCR产物

用上海生工UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒回收纯化P1基因和3CD基因PCR产物，方法步骤如下：

(1)P1基因和3CD基因PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳；

(2)紫外灯下切下含有目的DNA的琼脂糖凝胶，放在1.5ml离心管中，用1ml TE缓冲液洗一次。用吸头彻底吸掉液体并用之捣碎凝胶。离心数秒，加入4倍凝胶体积的溶胶液Binding Buffer II；

(3)将离心管放在60℃水浴中10min，每2min温和地颠倒以加速凝胶的溶化；

(4)等凝胶彻底融化成为胶溶液后，将胶溶液转移到套放在2ml收集管内带吸附膜的UNIQ-10柱中，静置2min，8000rpm离心1min；

(5)取下UNIQ-10柱，倒掉收集管中的滤液，将UNIQ-10柱重新装在收集管中；

(6)加入500μl洗涤液WB于离心柱中，8000rpm离心1min；

(7)倒掉收集管中的滤液，将UNIQ-10柱重新装在收集管中。再加入500μl洗涤液WB于离心柱中8000rpm离心1min；

(8)弃滤液，将UNIQ-10柱重新装在收集管中，12,000rpm离心2min，取下UNIQ-10柱自然晾干10min；

(9)将晾干后的UNIQ-10柱装在一个新的高压灭菌处理过的1.5ml离心管中，向离心柱膜中央加入40μl洗脱液(Elution Buffer)，室温静置5min；

(10)12,000rpm离心1分钟，洗脱DNA，冻存于-20℃备用。

4.2提取pGAPZαA质粒

用上海生工小量质粒提取试剂盒提取pGAPZαA质粒，方法如下：

(1)用接种环接种含pGAPZαA质粒DH5α冻存菌于Zeocin+(25μg/mL)LB平皿，37℃培养16h；

(2)用无菌牙签从LB平板挑取白色单菌落，接种于3mL Zeocin+(25μg/mL)LB培养液中，37℃ 250r/min振荡培养12-16h；

(3)无菌移取1.5mL菌液置eppendorf管中，12000r/min离心3min，弃上清；

(4)每管加入100μL预冷的Sollution I(含RNase A)，用涡旋器振荡悬浮；

(5)加入200μL新配制的Sollution II，温和倒置3-4次混匀，使细菌裂解，室温放置2min；

(6)加入350μL预冷的SollutionIII，颠倒混和10次，使之充分中和，室温放置5min；

(7)12000r/min离心10min；

(8)将上清转移至套放在2ml收集管内带吸附膜的UNIQ-10柱中，静置2min，8000rpm离心30s；

(9)取下UNIQ-10柱，倒掉收集管中的滤液，将UNIQ-10柱重新装在收集管中；

(10)加入500μl洗涤液WB于离心柱中，10000rpm室温离心1min；

(11)倒掉收集管中的滤液，将UNIQ-10柱重新装在收集管中。再加入500μl洗涤液WB于离心柱中10000rpm室温离心1min；

(12)弃滤液，将UNIQ-10柱重新装在收集管中，12,000rpm离心2min，取下UNIQ-10柱自然晾干10min；

(13)将晾干后的UNIQ-10柱装在一个新的高压灭菌处理过的1.5ml离心管中，向离心柱膜中央加入40μl洗脱液(Elution Buffer)，室温静置5min；

(14)12,000rpm离心1分钟，洗脱DNA，冻存于-20℃备用。

4.3P1基因和pGAPZαA质粒SacII单酶切

(1)纯化的P1基因用SacII单酶切，反应体系：

dH2O 37μl

10×NEB buffer 4 5μl

P1 PCR胶回收产物(290μg/ml) 7μl

SacII 1μl

50μl

(2)pGAPZaA用SacII单酶切，反应体系：

dH2O 6μl

10×NEB buffer 4 5μl

pGAPZaA质粒(53μg/ml) 38μl

SacII 1μl

50μl

(3)P1基因和pGAPZaA SacII单酶切条件

37℃，2h，

65℃，20min。

4.43CD基因和pGAPZaA质粒EcoRI单酶切

(1)纯化的3CD基因用EcoRI单酶切，反应体系：

dH2O 30μl

10×NEB EcoRI buffer 5μl

3CD PCR胶回收产物(145μg/ml) 14μl

EcoRI 1μl

50μl

(2)提取的pGAPZaA用EcoRI单酶切，反应体系：

dH2O 6μl

10×NEB EcoRI buffer 5μl

pGAPZaA(53μg/ml) 38μl

EcoRI 1μl

50μl

(3)3CD基因和pGAPZaA EcoRI单酶切条件：

37℃，2h，

65℃，20min。

4.5P1基因，pGAPZaA SacII单酶切产物，3CD基因和pGAPZaA EcoRI单酶切产物分别纯化

用上海生工PCR产物回收试剂盒分别回收，按厂家说明书进行操作，步骤如下：

(1)将酶切产物移至灭菌的1.5ml离心管中，加入5倍体积的溶胶液Binding Buffer II；

(2)将混合液转移到套放在2ml收集管内带吸附膜的UNIQ-10柱中，室温静置2min，6000rpm离心1min；

(3)取下UNIQ-10柱，倒掉收集管中的滤液，将UNIQ-10柱重新装在收集管中；

(4)加入500μl洗涤液WB于离心柱中，8000rpm离心1min；

(5)倒掉收集管中的滤液，将UNIQ-10柱重新装在收集管中。再加入500μl洗涤液WB于离心柱中8000rpm离心1min；

(6)弃滤液，将UNIQ-10柱重新装在收集管中，12000rpm离心2min，取下UNIQ-10柱自然晾干10min；

(7)将晾干后的UNIQ-10柱装在一个新的高压灭菌处理过的1.5ml离心管中，向离心柱膜中央加入40μl洗脱液(Elution Buffer)，室温静置5min。

(8)12000rpm离心1分钟，洗脱DNA，冻存于-20℃备用。

4.6P1基因，pGAPZaA SacII单酶切纯化产物用PmlI二次酶切

(1)P1基因SacII单酶切纯化产物用PmlI双酶切反应体系：

dH2O 8.5μl

10×NEB buffer 1 5μl

P1 SacII单酶切回收产物 35μl

100×BSA 0.5μl

PmlI 1μl

50μl

(2)pGAPZaA质粒SacII单酶切纯化产物用PmlI双酶切反应体系：

dH2O 8.5μl

10×NEB buffer 1 5μl

pGAPZaA SacII单酶切回收产物 35μl

100×BSA 0.5μl

PmlI 1μl

50μl

(3)P1基因SacII单酶切纯化产物和pGAPZaA质粒SacII单酶切纯化产物PmlI双酶切条件：

37℃，2h，

65℃，20min。

4.7 3CD基因，pGAPZaA EcoRI单酶切回收产物XbaI进行双酶切

(1)3CD基因EcoRI单酶切回收产物XbaI双酶切反应体系：

dH2O 12.5μl

10×NEB buffer 2 5μl

3CD XbaI单酶切回收产物 31μl

100×BSA 0.5μl

XbaI 1μl

50μl

(2)pGAPZaA EcoRI单酶切回收产物XbaI双酶切反应体系：

dH2O 12.5μl

10×NEB buffer 2 5μl

3CD XbaI单酶切回收产物 31μl

100×BSA 0.5μl

XbaI 1μl

50μl

(3)3CD基因EcoRI单酶切回收产物，pGAPZaA EcoRI单酶切回收产物XbaI双酶切条件

37℃，2h，

65℃，20min。

5.双酶切产物纯化

P1基因，pGAPZaA SacII，PmlI双酶切产物，3CD基因和pGAPZaAEcoRI，XbaI双酶切用上海生工PCR产物回收试剂盒分别回收，按厂家说明书进行操作，同本章1.6.1。

6.纯化双酶切产物连接

用Takara公司的T4DNA连接酶分别将P1基因和pGAPZaA质粒双酶切产物(SacII，PmlI)，3CD基因和pGAPZaA质粒双酶切产物(EcoRI，XbaI)进行连接。

(1)P1基因和pGAPZaA质粒双酶切产物连接体系：

10×T4 DNA ligase buffer 1μl

P1基因双酶切产物(SacII，PmlI) 7μl

pGAPZaA双酶切产物(SacII，PmlI) 1μl

T4 DNA ligase 1μl

10μl

P1基因和pGAPZaA质粒双酶切产物连接条件：

16℃，24h。

(2)3CD基因和pGAPZaA质粒双酶切产物连接体系：

dH2O

5μl

10×T4 DNA ligase buffer

2.5μl

3CD基因双酶切产物 15μl

pGAPZaA双酶切产物(EcoRI，XbaI) 1.5μl

T4 DNA ligase 1μl

25μl

pGAPZaA(EcoRI，XbaI)自连对照连接体系：

dH2O

20μ1

10×T4 DNA ligase buffer 2.5μl

pGAPZaA双酶切产物(EcoRI，XbaI) 1.5μl

T4 DNA ligase 1μl

25μl

3CD基因和pGAPZaA质粒双酶切产物连接条件：

16℃，20h。

7.转化DH5a感受态细胞

P1基因和pGAPZaA质粒连接产物，3CD基因和pGAPZαA质粒连接产物，pGAPZαA(SacII，PmlI)自连对照，pGAPZαA(EcoRI，XbaI)自连对照连接产物分别转化DH5a感受态细胞，用抗生素Zeocin+LB(25μg/ml)平板筛选阳性克隆。方法如下：

(1)取出4管100μlDH5α感受态细胞，置冰上；

(2)分别加入P1基因-pGAPZαA质粒，3CD基因-pGAPZαA质粒连接产物pGAPZαA(SacII，PmlI)自连对照，pGAPZαA(EcoRI，XbaI)自连对照连接产，各10μl，轻轻摇匀，冰上放置30min；

(3)42℃水浴中热击90s；

(4)迅速置冰上4min；

(5)向管中加入1mlLB液体培养基(不含抗生素)；

(6)移入试管中，37℃振荡培养1h，使细菌恢复正常生长状态，并表达质粒抗性基因；

(7)取500μl涂布于含抗生素Zeocin+LB(25μg/ml)的筛选平板上，倒置37℃培养16h。

8.阳性克隆鉴定

挑取阳性克隆，用Zeocin+LB(25μg/ml)培养，用菌液为模板分别做P1基因，3CD基因PCR进行筛选初步鉴定，PCR条件如上。扩增出P1基因或3CD基因菌落为阳性菌落，培养提取重组质粒，分别命名为P1-pGAPZαA，3CD-pGAPZαA，以提取质粒为模板，再用PCR进行鉴定，阳性质粒送上海生工进行测序对连接插入方向和基因序列进行鉴定，测序引物为质粒多克隆酶切位点两端序列，上游引物：5-CTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAG-3’；下游引物：’-GCGCTATTCAGATCCTCTTCTG-3’。

二、制备重组酵母菌株

1.重组质粒线性化

用BspHI(NEB公司切酶单酶切P1-pGAPZaA，3CD-pGAPZaA重组质粒，使线性化。

(1)P1-pGAPZaA BspHI单酶切体系：

dH2O 48μl

10×NEB buffer 4 10μl

P1-pGAPZaA 40μl(2μg)

BspHI 2μl

100μl

(2)3CD-pGAPZaA BspHI单酶切体系：

dH2O 48μl

10×NEB buffer 4 10μl

3CD-pGAPZaA 40μl(2μg)

BspHI 2μl

100μl

(3)BspHI单酶切条件：

37℃，10h，

65℃，20min。

2.线性化重组质粒转化SMD1168酵母菌株

2.1SMD1168酵母感受态制备

(1)取SMD1168菌种用接种环接种在YPD培养皿，30℃培养约48h；

(2)挑取SMD1168单克隆接种于3ml YPD液体培养基中，30℃，300rpm培养约20h；

(3)取1ml菌液接种于100ml YPD中，30℃，300rpm培养至OD600为1.35，约10h；

(4)3000g，4℃离心5min，弃上清；

(5)沉淀中加入8mlYPD和2mlHEPES，悬浮细胞，轻轻混匀；

(6)加入250μl 1M DTT，30℃静置培养15min；

(7)加入约40ml预冷的1M山梨醇至终体积50ml；

(8)3000g，4℃离心5min，弃上清；

(9)加入50ml预冷的1M山梨醇，轻轻吹打，悬浮细胞；

(10)3000g，4℃离心5min，弃上清；

(11)加入25ml预冷的1M山梨醇，轻轻吹打，悬浮细胞；

(12)3000g，4℃离心5min，弃上清；

(13)加入100μl预冷的1M山梨醇，轻轻吹打，悬浮细胞，置冰上。

2.2电穿孔转化SMD1168感受态细胞

(1)电转杯用预冷的灭菌水和1M山梨醇分别冲洗三遍，置冰上预冷；

(2)取1μg线性化的P1-pGAPZaA或3CD-pGAPZaA和40μl制备的SMD1168感受态细胞在冰上混匀，加入电转杯中；

(3)2000V，8msec电击；

(4)往电转杯中迅速加入1ml预冷的1M山梨醇；

(5)转入15ml离心管中，30℃静置培养1h；

(6)加入1ml YPD，200rpm，30℃培养1h；

(7)取菌液200μl，涂Zeocin+YPD(100μg/ml)平板，筛选3CD-pGAPZaA阳性克隆。

3.SMD1168重组菌株鉴定

3.1菌液培养

挑取阳性克隆接种于5ml Zeocin+YPD(100μg/ml)培养液中培养约24h。

3.2提取酵母基因组

用天根生物公司酵母基因组提取试剂盒提取阳性菌株基因组DNA，方法如下：

(1)取酵母细胞，12000rpm离心1min，尽量吸除上清；

(2)向菌体中加入600μl山梨醇buffer，加入大约50Ulyticase，充分混匀。30℃处理30min，4000rpm离心10min，弃上清，收集沉淀；

(3)向沉淀中加入200μl缓冲液GA重悬沉淀，充分混匀；

(4)加入20μl蛋白酶K溶液，混匀；

(5)加入220μl缓冲液GB，充分颠倒混匀，70℃放置10min，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠；

(6)加入220μl无水乙醇，充分颠倒混匀，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠；

(7)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个放入收集管的吸附柱中，12000rpm离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中；

(8)向吸附柱CB3中加入500ul缓冲液GD，12000rpm离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中；

(9)向吸附柱CB3中加入700μl漂洗液PW，12000rpm离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中；

(10)向吸附柱CB3中加入500μl漂洗液PW，12000rpm离心30s，倒掉废液；

(11)将吸附柱CB3放入收集管中，12000rpm离心2min，倒掉废液，将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液；

(12)将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50-200μl洗脱缓冲液TE，室温放置5min，120000rpm离心2min，将溶液收集到离心管中。

3.3重组菌株PCR鉴定

取提取的酵母基因组DNA2μl为模板，用PCR方法扩增P1或3CD基因，PCR结果阳性者为重组成功菌株。

4.P1-pGAPZαA-3CD-pGAPZaA-SMD1168重组菌株制备及鉴定

(1)用3CD-pGAPZaA重组SMD1168菌株制备成感受态细胞，方法同上；

(2)用线性化P1-pGAPZaA电转制备的3CD-pGAPZaA重组SMD1168感受态细胞，方法同上；

(3)用抗生素Zeocin+YPD(500μg/ml)平板筛选P1-pGAPZaA-3CD-pGAPZaA重组SMD1168阳性克隆，方法同上；

(4)挑取阳性克隆接种于5ml Zeocin+YPD(100μg/ml)培养液中培养约24h；

(5)用天根公司酵母基因组提取试剂盒提取阳性菌株基因组DNA；

(6)取提取的酵母基因组DNA2μl为模板，用PCR方法扩增P1和3CD基因，P1和3CD共同阳性者为重组成功菌株，命名为P1-pGAPZaA-3CD-pGAPZaASMD1168酵母菌株。

5.病毒样颗粒纯化

培养菌液50ml，5000rpm离心10min，取上清，超速离心28000rpm/min离心4h，弃上清，沉淀用PBS溶解。然后铺于不连续蔗糖梯度(15，30，45和60％)上，于28,000rpm/min 4℃离心1h，分别收集15％-30％、3％-45％、45％-60％三层病毒带。用磷酸缓冲液稀释，28,000rpm/min 4℃离心2.5h，弃去上清液，将沉淀溶于TE(10mmol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTA，pH 7.4)溶液中。从15％-30％这条带内取乳白色病毒带，即为纯化的病毒样颗粒。

试验例 EV71病毒样颗粒免疫原性试验

1.材料和方法

1.1免疫原制备

5L培养基接种P1-pGAPZαA-3CD-pGAPZαA SMD1168重组菌后，30℃，250rpm/min，培养96h，5,000rpm/min离心10min，取上清，超速离心28,000rpm/min离心4h，弃上清，沉淀用PBS溶解。然后铺于不连续蔗糖梯度(15，30，45和60％)上，于28,000rpm/min 4℃离心1h，收集15％-30％之间乳白色带，用磷酸缓冲液稀释，28,000rpm/min 4℃离心2.5h，弃去上清液，得EV71 VLP(即本发明的EV71病毒样颗粒)。

RDa细胞培养EV71毒株，收获病毒液，病毒液超速离心后用不连续蔗糖密度梯度进行纯化，纯化方法同制备EV71 VLP。纯化的病毒56℃灭活30min，作为灭活疫苗组。

培养SMD1168菌和空质粒(pGAPZαA)SMD1168重组菌，用与制备VLP同样的方法处理菌液，得到的产物作为对照组，分别称为SMD1168菌对照组和空质粒重组菌对照组。

1.2小鼠免疫

在中山大学实验动物中心购买6-8周雌性，BABL/C小鼠40只，在中山大学公共卫生学院SPF二级实验室饲养。共分4组，每组10只小鼠，第一组为SMD1168菌对照组，第二组为空质粒重组菌对照组，第三组为灭活疫苗组，第四组为VLP组。每组制备产物用PBS溶解为40μg/ml，每只小鼠用0.25ml(10μg)产物和等体积弗氏完全佐剂进行免疫，免疫方式均为皮下注射；初次免疫后第2，4，6，8，10，12，14，16周从尾静脉取血，离心取上清，-80℃保存；初次免疫后第4周，各组用与初次免疫相同的抗原进行加强免疫；初次免疫后第16周，颈椎脱臼处死所有小鼠取脾。

1.3体液免疫检测

1.3.1三明治ELISA法检测总IgG

(1)包被：取96孔ELISA微孔板，每孔加入100μl 1∶2000倍稀释的兔抗EV71抗体，4℃过夜；

(2)封闭：加入5％脱脂奶粉进行封闭，室温摇床，反应2h；

(3)洗涤：弃封闭液，用TBST洗板3次；

(4)加抗原：加入100μl热灭活EV71病毒，37℃反应2h；

(5)洗涤：弃去灭活病毒液，用TBST洗板5次，在滤纸上印干；

(6)加一抗血清：加入倍比稀释的血清(2²-2¹²)，37℃反应2h；

(7)洗涤：弃去倍比稀释的血清，用TBST洗板5次，在滤纸上印干；

(8)加二抗：加入1∶3000倍稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG二抗；

(9)洗涤：弃二抗，用TBST洗板5次，在滤纸上印干

(10)加入底物显色：每孔加入100ul 3，3，5，5-四甲基联苯胺，充分混匀后置37℃，15min；

(11)终止反应：显色结束后，每孔加入100μL 2M的H₂SO₄终止液终止反应；

(12)测定光密度OD值：30min内用酶标仪在450nm处测OD值，≥阴性对照孔OD值1.5倍判为阳性。

1.3.2中和抗体检测

1.3.2.1TCID50测定

1.3.2.1.1材料与试剂

(1)EV71病毒悬液；

(2)RDa细胞；

(3)消化液：0.25％胰蛋白酶；

(4)DMEM维持液(DMEM+2％胎牛血清、1％青链酶素)；

(5)DMEM培养液(DMEM+10％胎牛血清、1％青链酶素)。

1.3.2.1.2实验前准备

实验所用RDa细胞在细胞培养室常规传代培养，置CO₂孵箱培养至单层细胞，接种病毒前，弃掉细胞培养液，用Hank’s洗3次。

1.3.2.1.3操作方法

(1)将稀释管按10^-1～10^-6依次标记，在SYSUB3生物安全柜里用1ml的微量移液器给每管加入900μlDMEM维持液；

(2)用移液器吸取EV71病毒100μl加在第一管900μl维持液中，轻吹打三到五次混匀，制成标准毒株的10^-1稀释度，换上一个新的带滤芯的Tip头，取10^-1稀释度100μl到第二管，轻轻混匀，重复稀释步骤到10^-6；

(3)用移液器将稀释的病毒溶液接种事先准备的RDa 96孔培养板。每孔加入100μl病毒稀释液，每一个稀释度接种4孔，同时设正常细胞对照。用医用胶布封住四周后，将细胞培养板置37℃ 5％ CO₂温箱孵育7d；

(4)每24h在倒置显微镜下观察细胞CPE变化，以0-25％细胞CPE变化为“+”，26-50％细胞CPE变化为“++”，51-75％细胞CPE变化为“+++”，76-100％细胞形态变化为“++++”，正常细胞形态为“-”；

(5)采用Reed-Muench法，计算病毒感染细胞的半数浓度TCID50效价，见表1。

表1 病毒感染细胞的半数浓度TCID50效价计算

注：所指方向为累加的方向；下同。

由表1看出，能使50％细胞管出现病变的病毒稀释度在10^-4～10^-5之间，其距离比例为：

TCID50＝高于50％病变的病毒最高稀释度的对数+距离比例

高于50％病变的病毒最高稀释度的对数+距离比例＝-5+0.5＝-4.5

故能使50％细胞管发生病变的病毒稀释度为10^-4.5，即TCID₅₀为4.5，当病毒悬液做10^4.5倍稀释时，0.1ml中含1个TCID₅₀。

1.3.2.2中和试验

1.3.2.2.1试剂与材料

(1)已滴定的EV71病毒悬液

(2)试验所采小鼠血清320份

(3)阳性血清对照：已知EV71病人血清1份

(4)阴性血清对照：婴儿脐带血清1份

(5)RDa细胞

1.3.2.2.2实验准备

实验所用RDa细胞在细胞培养室常规传代培养，置CO2孵箱培养至单层细胞，在接种病毒前，弃掉细胞培养液，用Hank’s洗3次。

1.3.2.2.3实验方法

(1)血清稀释：在II级生物安全柜里，用1ml的微量移液器将小鼠血清、阳性对照血清及阴性对照血清，分别Eppendorf管里用MEM维持液做倍比稀释，使其稀释度分别为原血清的1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128，1∶256，1∶512，1∶1024，1∶2048，每管含0.5ml；

(2)以上各组检测血清都设对照，由于血清的量十分有限，因此血清对照，用每组份血清的最低稀释度加0.5ml的维持液；

(3)病毒的稀释：所使用的病毒稀释液，使用前在生物安全柜里，用MEM维持液稀释至100 TCID₅₀/0.1ml含量；

(4)血清与抗原结合：用1ml微量移液器分别在上述各稀释的血清管内加0.5ml(既与血清等量)的病毒稀释液(滴度为100 TCID₅₀/0.1ml)，轻轻吹打三到五次混匀，拧紧螺旋盖，用封口膜封口后置37℃水浴1h。病毒对照为100 TCID₅₀的病毒稀释液加0.5ml的维持液；正常细胞对照仅含维持液；

(5)接种细胞：用1ml的微量移液器将每个稀释度的血清接种到事先准备的RDa 96孔培养板上，每一稀释度接种4孔，每孔0.1ml。为了防止病毒对照样品气溶胶从96孔培养板的四周释放，将接种好样品的96孔培养板用医用胶布封住培养板的四周，置37℃ CO₂培养。

1.3.2.2.4结果分析

逐日观察细胞CPE变化，并记录结果，观察5-7d，以0-25％细胞CPE变化为“+”，26-50％细胞CPE变化为“++”，51-75％细胞CPE变化为“+++”，76-100％细胞CPE变化为“++++”，正常细胞形态为“-”。以病毒对照出现“+++-++++”时，结束试验。细胞对照孔应该有完整的细胞单层，病毒对照孔应完全出现CPE变化。

1.3.2.2.550％血清中和终点的计算

以能保护50％细胞孔不被感染的血清稀释度作为终点。中和滴度的计算可用Reed-Muench计算公式。参见表2：

表2.免疫小鼠血清50％血清中和终点的计算

由表结果，能保护50％细胞孔不致病变的血清稀释度在1∶32与1∶64之间。具体计算如下：

低于50％病变率血清稀释度的对数+距离比例×稀释系数的对数

＝-1.5+0.5×(-0.3)

＝-1.5+(-0.15)

＝-1.65

-1.65的反对数＝1/45

既1∶45的血清可保护50％细胞不产生病变。

1.4细胞免疫检测

1.4.1淋巴细胞增殖试验

1.4.1.1试剂和仪器

(1)MTT：称取50mg MTT，溶于10ml PBS后，终浓度为5mg/ml，然后用0.22μm滤器过滤除菌，无菌条件下用EP管分装，-20℃避光保存。

(2)电子天平、PBS液、二甲基亚砜、无菌针头过滤器、细胞计数仪、无菌操作台，CO2培养箱，酶标仪。

1.4.1.2原理

淋巴细胞增殖和分化是机体免疫应答过程的一个重要阶段。因此，检测淋巴细胞增殖水平是细胞免疫研究和临床免疫功能检测的一种常用方法。T细胞、B细胞表面具有识别抗原的受体和有丝分裂原受体，在特异性抗原刺激下可使相应淋巴细胞克隆发生增殖。甲基噻唑基四唑(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)可作为线粒体中琥珀酸脱氢酶的底物。当有活细胞存在时，线粒体内琥珀酸脱氢酶可将淡黄色的MTT还原成紫兰色的甲臢，而死细胞无此功能。二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)能溶解细胞中的甲臢，在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比，用酶联免疫检测仪在490 nm波长处测定其光吸收值，可根据所测的OD值反映活细胞的数量和活性。

1.4.1.3方法

(1)小鼠颈椎脱臼处死，75％乙醇浸泡3min，取出小鼠置于无菌滤纸上，左腹侧朝上；

(2)在小鼠左腹侧中部剪开小口，撕开皮肤，暴露腹壁，可见红色长条状脾脏；

(3)在脾脏下侧提起腹膜，剪开后上翻，暴露脾脏，镊子提起脾脏，用眼科剪分离脾脏下面的结缔组织，取出脾脏，放入盛有5ml PBS液的培养皿中；

(4)制备脾细胞悬液：用剪刀将脾剪碎，用注射器针芯轻轻研压脾脏，经200目筛网过滤，用2ml PBS液洗3次，每次1,000rpm/min离心5min。取出100ul，用15ml PBS稀释后在细胞计数仪上进行细胞计数，用1640培养基稀释细胞浓度为5×10⁵/ml；

(5)淋巴细胞增殖反应：将5×10⁵/ml脾细胞悬液加入96孔培养板中，每份脾细胞悬液共分成6个孔，150ul/孔，其中2个实验孔，每孔加入50ul VLPs；两个阴性对照孔，每孔加入50ul 1640培养基；2个阳性对照孔，加入50ul ConA。置5％CO₂，37℃培养72h，在培养结束前5h，于培养板各孔内加入5mg/ml MTT液，20ul/孔；

(6)测OD值：1,000g离心10min弃上清，各孔内加入150μl DMSO，溶解10min，30min内用酶标测定仪测OD值，测定波长为570nm；

(7)实验结果：将实验组和对照组6个复孔的OD值平均，计算刺激指数(Stimulate Index，SI)＝(实验组平均OD值或阳性对照组平均OD值-阴性对照组OD值)/阴性对照组平均OD值。

1.4.2细胞因子检测

1.4.2.1试剂盒

上海西唐生物科技有限公司小鼠白介素-2(IL-2)，白介素-4(IL-4)，白介素-12(IL-12)ELISA试剂盒，小鼠干扰素-γ(IFN-γ)ELISA试剂盒。

1.4.2.2原理

采用双抗体夹心ELISA法，用小鼠IL-2/IL-4/IL-12/IFN-γ单抗包被于酶标板上，标准品和样品中的IL-2/IL-4/IL-12/IFN-γ与单抗结合，加入生物素化的抗小鼠IL-2/IL-4/IL-12/IFN-γ，形成免疫复合物连接在板上，辣根过氧化物酶标记的Streptavidin与生物素结合，加入底物工作液显色，最后加终止液硫酸，在450nm处测OD值，IL-2/IL-4/IL-12/IFN-γ浓度与OD值成正比，可通过绘制标准曲线求出标本中的IL-2/IL-4/IL-12/IFN-γ浓度。

1.4.2.3检测步骤

(1)标本：如上述所制备实验小鼠脾细胞，用50ul VLPs刺激后48h，收集培养上清液。

(2)标准品配制：使用前加入0.5ml蒸馏水混匀，配成20ng/ml的溶液。设标准管8管，第一管加标本稀释液900μl，第二管至第八管加入标本稀释液500μl。在第一管中加入20ng/ml的标准品溶液100μl混匀后取出500μl，移至第二管。如此反复做对倍稀释，从第七管中吸出500μl弃去，第八管为空白对照。

(3)加样：每孔各加入标准品或待测样品100μl，将反应板充分混匀后置37℃，120min；

(4)洗板：用洗涤液将反应板充分洗涤5次，在滤纸上印干；

(5)每孔中加入第一抗体工作液100μl。将反应板充分混匀后置37℃，60min；

(6)洗板：用洗涤液将反应板充分洗涤5次，在滤纸上印干；

(7)每孔中加入酶标抗体工作液100μl。将反应板充分混匀后置37℃，30min；

(8)洗板：用洗涤液将反应板充分洗涤5次，在滤纸上印干；

(9)每孔加入底物工作液100μl。置37℃暗处反应15min；

(10)每孔加入100μl终止液混匀；

(11)30min内用酶标仪在450nm处测OD值。

1.4.2.4绘制标准曲线

以标准品2000、1000、500、250、125、62、31、0pg/ml为横坐标，OD值为纵坐标，用SPSS13.0做散点图，绘制标准曲线，做线性回归，计算回归方程。

1.4.2.5统计分析

将IgG，中和抗体，刺激指数和细胞因子数据录入Excel和SPSS13.0，用SPSS13.0计算均数和标准差，用两独立样本t检验进行比较，α＝0.05，用Excel作图。

2.结果

2.1总IgG滴度测定

为了评价所制备的EV71 VLP能否诱导机体产生抗体，用纯化的VLP免疫雌性BALB/c小鼠，并于4周后加强免疫；一组小鼠用灭活疫苗进行免疫，以比较VLP和灭活疫苗的差异，同时用SMD1168菌和空质粒重组菌作为阴性对照组。倍比稀释免疫血清，用ELISA法检测IgG，以能检测到IgG的最高稀释倍数，做为抗体滴度。初次免疫后每隔两周尾静脉取血，结果表明SMD1168菌和空质粒重组菌作为阴性对照组诱导产生的IgG抗体很低，VLP组和灭活疫苗组产生了较高的抗体滴度，加强免疫后抗体滴度进一步升高，第8周达到最高，为2¹¹，16周时仍能保持较高的抗体滴度。和灭活疫苗组相比，VLP组诱导产生的抗体滴度稍高，但差异没有统计学意义。见表3，图4：

表3 IgG抗体滴度

2.2中和抗体滴度测定

为了解实验小鼠产生的抗体免疫保护能力，进行了中和试验。血清倍比稀释后与100 TCID50EV71病毒混匀，把能中和出现50％细胞病变的最高稀释倍数做为中和抗体滴度。由于在本实验中最小稀释率为2²，所以所有比2²低的中和抗体滴度按2²计算。SMD1168菌对照组和空质粒重组菌对照组产生的中和抗体滴度很难检测到。VLP组和灭活疫苗组中和抗体的增长趋势同总IgG的趋势一致，在第8周达到最高峰约2⁷，并能保持最低16周，t检验结果表明VLP组和灭活疫苗组产生的中和抗体滴度没有统计学差异，见表4，图5。

表4 血清中和抗体滴度

2.3淋巴细胞增殖试验

为了探讨制备的EV71 VLP能否诱导产生T细胞反应，在初次免疫后16周，处死小鼠，取脾脏细胞，用VLP进行刺激，进行了淋巴细胞增殖试验，结果见表5、6，图6。Con A作为阳性对照，对所有实验小鼠脾细胞进行刺激，以了解脾细胞健康状态。图6显示不同组刺激指数(SI)的差异，在VLP的刺激下，VLP组和灭活疫苗组的SI是SMD1168菌对照组和空质粒重组菌对照组的约2倍，差异有统计学意义(P＜0.001)，表明用VLP组和灭活疫苗组免疫小鼠能激活T细胞增殖反应。VLP组和灭活疫苗组的SI差异也有统计学意义(p＜0.05)。

表5 淋巴细胞增殖试验结果

表6 各试验组刺激指数

2.4细胞因子检测

用ELISA检测VLP刺激后脾细胞培养液中IL-2，IL-4，IL-12和INF-γ浓度。用SPSS13.0做标准品浓度和OD值的标准曲线，得回归方程，根据回归方程，用测得的样品的OD值计算样品中细胞因子的浓度，见表7和表8。

表7 脾细胞培养液IL-2，IL-4，IL-12和INF-γ的浓度

表8 脾细胞培养液IL-2，IL-4，IL-12和INF-γ的浓度均值

VLP组和灭活疫苗组脾细胞产生的IL-2水平高于SMD1168菌对照组和空质粒重组菌对照组(p＜0.05)，见图7(A)，表明诱导产生了Th1细胞免疫反应。VLP组和灭活疫苗组脾细胞产生的IL-4水平也高于SMD1168菌对照组和空质粒重组菌对照组(p＜0.05)，见图7(B)，表明诱导产生了Th2细胞免疫反应，同时VLP组比灭活疫苗组脾细胞产生的IL-4水平高(p＜0.05)。但是VLP组和灭活疫苗组脾细胞产生IL-12水平与SMD1168菌对照组和空质粒重组菌对照组相当，没有统计学差异(p＞0.05)，见图7(C)。图7(D)显示VLP组和灭活疫苗组脾细胞产生的IFN-γ水平相当(p＞0.05)，远远高于SMD1168菌对照组和空质粒重组菌对照组脾细胞产生的IFN-γ水平(p＜0.05)，进一步证实了VLP能诱导T细胞反应。

序列表

<110>张，定梅

陆，家海

曹，开源

黎，孟枫

<120>一种EV71病毒样颗粒及用其制备的手足口病疫苗

<130>Chung YC，Huang JH，Lai CW，et al.Expression，purification and characterization of enterovirus-71 virus-like particles.World JGastroenterol 2006；12：921-927

<160>6

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>2589

<212>DNA

<213>Enterovirus 71

<400>1

atgggttcgc aggtgtctac acagcgctcc ggttctcacg aaaactcaaa ctcagccact 60

gagggttcca ccataaacta caccaccatt aattactaca aagactccta tgctgccaca 120

gcaggcaaac agagtctcaa gcaggatcca gacaagtttg caaatcctgt taaagacatc 180

tttactgaaa tggcagcgcc actgaaatcc ccatccgctg aggcatgtgg atacagtgat 240

cgagtggcgc aattaactat tggcaactcc accatcacca cgcaagaagc ggctaacatt 300

atagtcggtt atggtgagtg gccttcctac tgctcggatt ctgacgctac agcagtggat 360

aagccaacgc gcccggacgt ttcagtgaac aggttttata cattggacac taaattgtgg 420

gagaaatcgt ccaagggatg gtactggaag tttccggatg tgttaactga aaccggggtt 480

tttgggcaaa atgcacaatt ccactacctc taccgatcag ggttctgtat tcacgtacag 540

tgcaatgcta gtaaattcca ccaaggagca ctcctagttg ctgtcctacc agagtacgtc 600

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<210>2

<211>1941

<212>DNA

<213>Enterovirus 71

<400>2

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<211>3147

<212>DNA

<213>Pichia farinosa

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<210>6

<211>10734

<212>DNA

<213>Pichia farinosa

<400>6

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ccaagggatg gtactggaag tttccggatg tgttaactga aaccggggtt tttgggcaaa 1260

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cgtgcacacc caccggggaa gttgtcccac aattgctcca gtatatgttt gtgccacctg 2940

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caagttgggc acttacgaga agaccggtct tgctagattc taatcaagag gatgtcagaa 3540

tgccatttgc ctgagagatg caggcttcat ttttgatact tttttatttg taacctatat 3600

agtataggat tttttttgtc attttgtttc ttctcgtacg agcttgctcc tgatcagcct 3660

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ttttctcgga ctccgcgcat cgccgtacca cttcaaaaca cccaagcaca gcatactaaa 3900

ttttccctct ttcttcctct agggtgtcgt taattacccg tactaaaggt ttggaaaaga 3960

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ccgcttaccg gatacctgtc cgcctttctc ccttcgggaa gcgtggcgct ttctcaatgc 10260

tcacgctgta ggtatctcag ttcggtgtag gtcgttcgct ccaagctggg ctgtgtgcac 10320

gaaccccccg ttcagcccga ccgctgcgcc ttatccggta actatcgtct tgagtccaac 10380

ccggtaagac acgacttatc gccactggca gcagccactg gtaacaggat tagcagagcg 10440

aggtatgtag gcggtgctac agagttcttg aagtggtggc ctaactacgg ctacactaga 10500

aggacagtat ttggtatctg cgctctgctg aagccagtta ccttcggaaa aagagttggt 10560

agctcttgat ccggcaaaca aaccaccgct ggtagcggtg gtttttttgt ttgcaagcag 10620

cagattacgc gcagaaaaaa aggatctcaa gaagatcctt tgatcttttc tacggggtct 10680

gacgctcagt ggaacgaaaa ctcacgttaa gggattttgg tcatgcatga gatc 10734

Claims

1.一种EV71病毒样颗粒，其特征在于，所述EV71病毒样颗粒的制备方法包括：

(1)重组质粒的构建：用EV71病毒的P1蛋白基因和3CD蛋白酶基因与pGAPZαA质粒分别连接后构建P1-pGAPZαA和3CD-pGAPZαA重组质粒；

(2)重组质粒转入表达菌株：所述重组质粒依次转入毕赤酵母SMD1168表达菌株，得到P1-pGAPZαA-3CD-pGAPZαA-SMD1168毕赤酵母重组表达菌株；(3)菌体培养及EV71病毒样颗粒纯化：培养所述毕赤酵母重组表达菌株，离心分离上清液，所述上清液经超速离心后的沉淀用蔗糖密度梯度离心，获得EV71病毒样颗粒。

2.按照权利要求1所述的EV71病毒样颗粒，其特征在于：所述P1-pGAPZαA重组质粒是将P1蛋白基因与pGAPZaA质粒均用PmlI内切酶和SacII内切酶分步双酶切后，用T4DNA连接酶将P1基因和pGAPZaA质粒双酶切产物连接得到。

3.按照权利要求1所述的EV7 1病毒样颗粒，其特征在于：所述3CD-pGAPZαA重组质粒是将所述3CD蛋白酶基因和pGAPZaA质粒均用EcoRI和XbaI内切酶分步双酶切后，用T4DNA连接酶将3CD蛋白酶基因和pGAPZaA质粒双酶切产物连接得到。

4.按照权利要求1所述的EV71病毒样颗粒，其特征在于：所述3CD蛋白酶基因和P1蛋白基因是以EV71病毒RNA反转录的cDNA为模板，用PCR方法扩增获得。

5.按照权利要求1所述的EV71病毒样颗粒，其特征在于：所述重组质粒转入表达菌株是用电穿孔仪先将所述3CD-pGAPZαA质粒转入SMD1168酵母表达菌株，用低浓度博莱霉素zeocin筛选得到3CD-pGAPZαA-SMD1168重组表达菌株，然后再将所述P1-pGAPZαA质粒转入3CD-pGAPZαA-SMD1168重组表达菌株，用高浓度博莱霉素zeocin筛选得到P1-pGAPZαA-3CD-pGAPZαA-SMD1168重组表达菌株。

6.按照权利要求1所述的EV71病毒样颗粒，其特征在于：所述低浓度博莱霉素zeocin是指100μg/ml浓度的博莱霉素，所述高浓度zeocin是指500μg/ml浓度的博莱霉素。

7.按照权利要求1所述的EV71病毒样颗粒，其特征在于，所述EV71病毒样颗粒纯化是将所述毕赤酵母重组表达菌株培养菌液5000转/分钟转速离心10分钟，取上清，超速离心28000转/分钟转速离心4小时，弃上清，沉淀用磷酸盐缓冲溶液PBS溶解，铺于不连续重量百分比蔗糖梯度15％、30％、45％和60％上，于28000转/分钟4℃离心1小时，收集15％-30％层病毒带，用磷酸缓冲液稀释，28000转/分钟4℃离心2.5小时，弃去上清液，即得纯化的EV71病毒样颗粒。

8.一种手足口病疫苗，其特征在于，所述疫苗的制备方法包括：(1)重组质粒的构建：用EV71病毒的P1蛋白基因和3CD蛋白酶基因与pGAPZαA质粒分别连接后构建P1-pGAPZαA和3CD-pGAPZαA重组质粒；(2)重组质粒转入表达菌株：所述重组质粒转入毕赤酵母SMD1168表达菌株，得到P1-pGAPZαA-3CD-pGAPZαA-SMD1168毕赤酵母重组表达菌株；(3)菌体培养及EV71病毒样颗粒纯化：培养所述毕赤酵母重组表达菌株，离心分离上清液，所述上清液经超速离心后的沉淀用蔗糖密度梯度离心，获得EV71病毒样颗粒，(4)制备疫苗：所述EV71病毒样颗粒用磷酸缓冲液溶解到40μg/ml，与等体积弗氏完全佐剂相混合制成疫苗。