KR102511472B1 - 양성 가닥 rna 바이러스에 의해 유발되는 감염성 질환에 대한 백신 - Google Patents

Abstract

(+)SS RNA 바이러스에 의해 유발되는 질환으로부터 대상체를 보호하기 위한 조성물이 본원에 기술되어 있다. 상기 조성물은 (i) 진핵 세포 RNA 중합효소 프로모터에 작동 가능하도록 결합된, 감염성 (+)SS RNA 바이러스의 RNA 분자를 암호화하는 DNA를 함유하는 벡터와, 담체를 포함하거나; 또는 (ii) (i)의 벡터로 형질감염된 진핵 세포로부터 수득된 (+)SS RNA 바이러스와, 담체를 포함한다.

Description

양성 가닥 RNA 바이러스에 의해 유발되는 감염성 질환에 대한 백신

관련 출원

본 출원은, 전체로서 본원에 참조로 인용되어 있는 미국 가출원 제62/426,708호(2016년 11월 28일 출원)의 이익을 주장한다.

분야

양성 센스 단일 가닥 RNA 바이러스에 의해 유발되는 질환에 대항하여 대상체를 보호하기 위한 조성물이 기술되어 있다.

바이러스는 유전 물질과 단백질로 이루어진 작은 비세포성 유기체이다. 상이한 유형의 바이러스들이 존재한다. 예를 들어 바이러스는 숙주의 핵 내에서 복제하는 DNA 바이러스, 또는 세포의 세포질 내에서 복제하는 RNA 바이러스일 수 있다. 바이러스는 이중 가닥 또는 단일 가닥일 수 있다. 더욱이 단일 가닥 RNA 바이러스는 양성(+, 센스) 가닥 또는 음성(-) 가닥일 수 있다. 이와 같은 상이한 유형의 바이러스는 다양한 바이러스성 감염을 유발한다.

바이러스 감염은, 병원성 바이러스가 유기체의 체내에 침투하여 들어갈 때 발생한다. 일단 바이러스가 유기체의 체내에 들어가면, 바이러스는 자신을 세포에 부착시키고, 세포가 파열(cell burst) 또는 사멸할 때까지 세포가 새로운 바이러스를 복제하도록 세포를 재프로그래밍(reprogramming)하여, 인간과 동물에서 바이러스가 다양한 감염성 질환을 유발시키며 급속하게 퍼져나갈 수 있게 한다. 바이러스에 의해 유발되는 감염성 질환은 보통 감기, 독감 및 사마귀(warts)를 포함한다. 그러나 바이러스는 또한 AIDS, 천연두(small pox), 포진(herpes), 출혈열(hemorrhagic fever), 소아마비(polio), 홍역(measles), 유행성이하선염(mumps) 및 풍진(rubella)과 같은 중증 질환을 일으키기도 한다.

백신이 개발되면서, 소아마비, 홍역, 유행성이하선염 및 풍진과 같은 질환의 발생이 성공적으로 감소하였다. 종래의 백신은 약독화된 생 바이러스를 함유한다. 그러나, 이러한 바이러스는 병원성이 더 큰 표현형으로 되돌아갈 잠재성을 가지며, 면역 약화된 숙주에서는 저 약독화(under-attenuated)될 수 있으므로, 다양한 바이러스 시스템 안에서 지속적인 면역성을 유도하는, 안전하고 면역원성인 백신이 개발될 필요가 있다.

최근 몇 년간, 약독화된 생 바이러스를 생체 내에서 생산하는 iDNA®(Medigen, Inc.) 백신이 개발되었다. 다수의 RNA 바이러스의 전장 cDNA가 대장균(E.coli) 플라스미드 안에 클로닝되어 iDNA® 백신이 생산되었다. 그러나, 전장 바이러스 cDNA는 종종 대장균에서 독성을 보였고 다량으로 제조될 수 없었기 때문에, 다수의 사례에서 이러한 플라스미드를 제조하는 것은 어려운 일이었다.

감염성 (+)SS RNA 바이러스의 RNA 분자를 암호화하는 DNA로서, 세포, 특히 진핵 세포 내 발현에 적합한 프로모터에 작동 가능하도록 결합된 DNA를 포함하는 벡터가 본원에 기술되어 있다. 감염성 (+)SS RNA 바이러스는 적어도 2개의 상이한 (+)SS RNA 바이러스의 RNA 서열에 의해 암호화된 키메라 바이러스일 수 있다.

전술된 벡터로 진핵 세포를 형질감염시킴으로써 수득된 클론 정제 (+)SS RNA 바이러스의 동종 집단도 또한 본원에 기술되어 있다.

벡터 또는 클론 정제 (+)SS RNA 바이러스의 동종 집단과, 담체(carrier)를 포함하는 조성물이 본원에 기술되어 있다. 벡터와 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학 조성물도 또한 기술되어 있다.

본 발명에는 또한 벡터를 포함하는 백신과, 클론 정제 (+)SS RNA 바이러스의 동종 집단을 포함하는 백신이 기술되어 있다. 백신의 벡터는 비병원성 및/또는 약독화 (+)SS RNA 바이러스의 RNA 분자를 암호화하는 DNA를 포함한다. 백신의 클론 정제 (+)SS RNA 바이러스 동종 집단은 비병원성 및/또는 약독화된 (+)SS RNA 바이러스들이다. 더욱이 본 발명에는 감염성 (+)SS RNA 바이러스에 의해 유발되는 질환에 대항하여 대상체를 면역화 및 보호하기 위해 백신을 사용하는 방법이 또한 기술되어 있다.

나아가, 본 발명에는 백신을 제조하고 클론 정제 (+)SS RNA 바이러스의 동종 집단을 수득하기 위하여 본원에 기술된 벡터를 사용하는 방법이 기술되어 있다. 더욱이 본 발명에는 본원에 기술된 벡터로 형질 감염된 숙주 세포를 수득하기 위해 벡터를 사용하는 방법이 기술되어 있다.

도 1a 및 도 1b는, SA-14-14-2 JEV 균주의 합성 cDNA를 함유하는 pMG8009 JEV DNA 백신의 제조를 보여주고 있다. 도 1a: CMV 프로모터, 전장 JEV SA14-14-2 합성 cDNA 및 합성 인트론 3개를 포함하는 DNA 구조체가 도식적으로 도시되어 있다. CMV 프로모터, JEV 유전자 및 인트론 1 ~ 3(*)의 위치들이 도식적으로 나타나 있다(비례가 아님). 도 1b: 독립적인 대장균(E.coli) 콜로니 10개로부터 단리된 플라스미드 DNA의 1% 겔 전기영동 결과. pMG8009는 화학적인 컴피턴트 E.coli Stbl3 세포에 형질전환시키고, 50 μg/ml 카나마이신을 함유하는 LB 아가 플레이트에서 성장시켰다. 상기 플레이트에서 독립적 콜로니 10개를 2 ml LB 배양액 중에서 성장시켜, DNA를 단리한 후 멸균수 50 μl 중에 재현탁하였다. 이로부터 얻어진 플라스미드 DNA 1 μl를 1% TAE 아가로스 겔 상에 로딩하였다.
도 2a ~ 도 2c는, pMG8009 iDNA® 플라스미드로 형질감염된 Vero 세포 내 JEV 바이러스의 발현을 보여주고 있다. 도 2a: 전기천공에 의해 pMG8009 iDNA® 플라스미드 1 μg으로 형질감염된 Vero 세포의 감염성 중심 검정법(Infectious Center Assay; ICA). 도 2b: 마우스 항-JEV(ATCC VR-1259AF) 항체를 사용한 웨스턴 블럿(Western blot). 레인 M은 SeeBlue Plus 2 단백질 분자량 마커(Thermo)를 나타낸다. 레인 1은 pMG8009-형질감염된 Vero 세포의 JEV 항원을 나타낸다. 레인 2는 비형질감염된 Vero 세포를 나타낸다. 도 2c: 항-JEV 마우스 ATCC VR-1259AF를 사용하는 간접 IFA. 패널 1, 2, 3은 각각 pMG8009-형질감염된 Vero 세포(배율: 170배), 비형질감염된 Vero 세포(배율: 170배) 및 형질감염된 Vero 세포(배율: 400배)를 나타낸다.
도 3a 및 도 3b는 pMG8009 iDNA® 플라스미드로 형질감염된 Vero 세포로부터 유래하는 배지 중 JEV 바이러스의 검출 결과를 보여주는 것이다. 도 3a: BHK 세포 의 플라크 검정법. 위 패널: 바이러스-감염된 Vero 세포(전기천공되지 않음)로부터의 성장 배지의 플라크 검정 결과로, 1000 PFU만큼으로 감염된지 7일 후 채취한 시료(도 3b의 시료 #6). 아래 패널: pMG8009-형질감염된 Vero 세포(전기천공된 후)로부터의 성장 배지의 플라크 검정 결과로, DNA 10 ng이 형질감염된지 7일 후 채취한 시료(도 3b의 시료 #2). 도 3b: pMG8009 iDNA®로 형질감염된 Vero 세포 배지(시료 2, 3, 4) 또는 pMG8009-유래 바이러스로 감염된 Vero 세포 배지(시료 5 및 6) 내 JEV 바이러스의 성장 곡선들. 시료 5 및 6은, 전기천공 과정이 Vero 세포 내 바이러스의 성장에 영향을 미치는지를 확인하기 위해, 전기천공된 Vero 세포 및 전기천공되지 않은 Vero 세포 각각을 pMG8009-유래 백신 바이러스 1000 PFU만큼으로 감염시킨 경우를 나타낸다.
도 4는 BALB/c 마우스에 있어서 pMG8009 JEV 백신의 면역원성을 IFA를 통해 보여주는 것이다. 0일에 마우스는 pMG8009 플라스미드 5 μg으로 백신화되었다(근육 내, 전기천공법 사용). 항체를 확인하기 위하여, 21일에 마우스를 대상으로 채혈이 이루어졌다. 백신화된 마우스로부터 얻은 혈청은 IFA를 통해 챔버 슬라이드에서 1:10 희석율로 JEV-감염 Vero 세포를 프로빙(probing)하기 위해 사용되었다. 마우스 혈청으로 배양한 후, Vero 세포는 마우스 IgG(H+L)에 대한 항체로서, 플루오레세인(fluorescein)-표지화된 항체로 처리하여 JEV 항원을 발현하는 세포를 가시화하였다. 슬라이드는 프로피디움 요오드화물 핵 대비 염색제를 함유하는 마운팅 배지(mounting medium)로 덮은 후, 현미경으로 관찰하였다.
도 5a ~ 도 5g는, CMV 즉시 초기 프로모터에 작동 가능하도록 결합되고, pUC 백본 플라스미드(backbone plasmid)에 삽입된, JEV(균주명: SA14-14-2)의 전장 게놈 RNA를 암호화하는 cDNA를 포함하는 pMG8009 플라스미드의 뉴클레오티드 서열(서열 번호 1)을 나타낸다. pUC 플라스미드의 뉴클레오티드와 인트론은 알파벳 대문자로 표시되어 있다. CMV 프로모터는 이탤릭체로 표시되어 있다. JEV의 게놈 RNA를 암호화하는 cDNA는 굵은 글씨체로 표시되어 있다. 인트론은 밑줄로 나타냈다.

본 발명은 RNA 바이러스, 구체적으로 (+)SS RNA 바이러스에 의해 유발되는 질환으로부터 보호하기 위한 백신을 제공한다. (+)SS RNA 바이러스 과는 아스트로비리대(Astroviridae), 칼리시비리대(Caliciviridae) 및 피코나비리대(Picornaviridae), 코로노비리대(Coronoviridae), 레트로비리대(Retroviridae), 토가비리대(Togaviridae), 및 플라비비리대(Flaviviridae)를 포함한다. 예로서, 아스트로비리대 과는 인간 아스트로바이러스를 포함하고; 칼리시비리대 과는 노르워크(Norwalk) 바이러스를 포함하며; 피코나비리대 과는 콕사키바이러스(coxsackievirus), A형 간염 바이러스, 소아마비바이러스 및 코감기바이러스를 포함하고; 코로노비리대 과는 코로나바이러스와 SAR 바이러스를 포함하며; 레트로비리대 과는 알파레트로바이러스, 베타레트로바이러스, 델타레트로바이러스, 렌티바이러스 및 스푸마바이러스를 포함하고; 토가비리대 과는 풍진 바이러스 및 알파 바이러스를 포함하며; 플라비비리대 과는 C형 간염 바이러스 및 플라비바이러스를 포함한다.

구현예들에서, 본원에 기술된 백신은 알파바이러스에 의해 유발되는 질환으로부터 보호한다. 알파바이러스는 바마 포레스트 바이러스(Barmah Forest virus), 이스턴(Eastern) 말 뇌염 바이러스, 치쿤구니야(Chikungunya) 바이러스, 오뇽뇽(O'Nyong Nyong) 바이러스, 로스 리버(Ross River) 바이러스, 셈리키 포레스트(Semliki Forest) 바이러스, 파나마(Panama) 바이러스, 베네주엘라(Venezuelan) 말 뇌염 바이러스, 웨스턴(Western) 말 뇌염 바이러스 및 신드비스(Sindbis) 바이러스를 포함한다.

구현예들에서, 본원에 기술된 백신은 플라비바이러스에 의해 유발되는 질환으로부터 보호한다. 플라비바이러스는 황열(Yellow fever) 바이러스, 뎅기(Dengue) 바이러스, 웨스트 나일(West Nile) 바이러스, 지카(Zika) 바이러스, 진드기 매개 뇌염 바이러스 및 일본 뇌염 바이러스를 포함한다.

널리 공지된 바와 같이, (+)SS RNA 바이러스는 바이러스성 위장염, A형 간염, C형 간염, 뎅기열, 황열, 웨스트 나일 열, 소아마비, 중증 급성 호흡기증후군 바이러스(Severe Acute Respiratory Syndrome virus; SARS), 뇌염, 홍역, 유행성이하선염, 풍진 및 구제역을 비롯하여 다양한 질환을 일으킨다. 본원에 사용된 바와 같은 "(+)SS RNA 바이러스에 의해 유발되는 질환"이란 용어는, (+)SS RNA 바이러스에 의해 유발되는 감염을 포함한다.

구현예들에서, 본원에 기술된 백신은 뇌염, 예를 들어 JEV에 의해 유발되는 뇌염으로부터 보호한다.

본원에 기술된 백신은, (i) 감염성 (+)SS RNA 바이러스의 RNA를 암호화하는 DNA, 예컨대 감염성 (+)SS RNA 바이러스의 RNA를 암호화하는 플라스미드 DNA를 포함하는 벡터; 또는 (ii) (i)의 벡터로 형질감염된 세포로부터 수득된 클론 정제 감염성 (+)SS RNA 바이러스의 동종 집단을 치료적 유효량으로 포함한다. 더욱이 이 벡터 내에 함유된 DNA는 비병원성 및/또는 약독화 (+)SS RNA 바이러스를 암호화하고, 이 DNA는 진핵 세포 내 발현에 적합한 프로모터를 포함한다.

본원에 사용된 바와 같은 "감염성" 바이러스란 용어는, 세포에 침입하여 들어가 증식(복제) 및 번식을 할 수 있는 바이러스를 지칭한다. 감염성 바이러스는 질환을 유발할 수 있거나, 부지불식간에 번식할 수 있다. 그러므로, 감염성(복제성) 바이러스는 병원성이거나 비병원성일 수 있다. 구현예들에서, 감염성 바이러스는 백신에 사용될 경우 비병원성 및/또는 약독화된다. 감염성 (+)SS RNA 바이러스는 자체의 전장 RNA 게놈 서열에 의해 암호화되는 바이러스를 포함한다. 특정 구현예들에서, 본 발명은 (+)SS RNA 바이러스에 의해 유발되는 질환으로부터 대상체를 보호하기 위하여 생 바이러스를 생산하는 감염성 DNA(iDNA®) 백신을 제공한다.

종래의 DNA 백신들과는 대조적으로, iDNA® 백신은 생체 내에서 DNA 착수성(DNA-lanched) 약독화 생 바이러스를 생산한다. 종래의 DNA 백신은 오로지 관심있는 특이 유전자를 암호화하는 DNA 서열만을 함유하였던 반면에, iDNA® 백신은 (+)SS RNA 바이러스의 전체 기능성 게놈 RNA를 암호화하는 DNA를 포함한다. 더욱이 숙주 세포의 세포질 내에서 복제하고, 숙주 세포의 핵에는 도입되지 않는 (+)SS RNA 바이러스와는 달리, iDNA® 백신의 DNA는 복제 개시를 위하여 숙주 세포의 핵에 도입된다. iDNA® 백신의 DNA가 숙주 세포에 주입될 때, 이 DNA는 복제를 위해 감염성 (+)SS RNA 바이러스의 전체 게놈 RNA를 전사하는 핵으로 도입된다. 감염성 (+)SS RNA 바이러스의 전사된 기능성 게놈 RNA는 추후 바이러스 자손을 수득하기 위한 복제 및 번식을 위하여 숙주 세포의 세포질로 이동하게 된다. 이러한 과정은 백신 생산시 통상 발견되는 돌연변이와 복귀 가능성을 감소시킨다.

종래의 DNA 백신과 유사하게, iDNA® 백신은 저렴하며 제조가 간단하다. 더욱이 약독화된 생 바이러스는 대상체 내 백신이 투여된 부위에서 생산될 수 있기 때문에, iDNA® 백신은 면역성을 신속하게 유도한다. 뿐만 아니라, 약독화된 생 바이러스가 생산되기 때문에 면역성을 유도하는데에는 단지 소량의 용량이 필요할 뿐이다. 게다가 iDNA® 백신은 클론 정제 약독화 (+)SS RNA 바이러스의 유전적으로 안정적인 동종 집단을 생체 내에서 생산하는데, 이 점은 백신의 안전성을 개선시킨다.

또한 iDNA® 기술은 백신으로서 사용될 클론 정제 약독화 (+)SS RNA 바이러스의 유전적으로 안정적인 동종 집단을 생산하기 위해 사용될 수 있다. (+) SS RNA 바이러스는 유전적으로 안정적인 iDNA®로부터 착수되므로, iDNA® 기술은 (+)SS RNA 바이러스 RNA의 유전자 돌연변이유발 가능성을 적어도 약 50%, 70%, 80%, 90% 또는 99%까지 감소시킬 수 있다. 구현예들에서, 본 발명에는 약독화 (+)SS RNA 바이러스의 동종 집단을 포함하는 백신이 기술되어 있다.

iDNA® 기술은 백신을 시험관 내 또는 생체 내 생산하기 위해 DNA 벡터를 사용하는 것에 바탕을 두고 있다. 본 발명 전반에 있어서 "벡터" 및 "플라스미드"란 용어는 호환되어 사용된다. 구현예들에서, 본 발명은 세포, 예컨대 진핵 세포 내에서의 발현에 적합한 프로모터에 작동 가능하도록 결합된, RNA 분자를 암호화하는 DNA를 포함하는 벡터를 제공한다. 구현예들에서, DNA는 (+)SS RNA 바이러스의 전장(게놈) RNA를 암호화하는 cDNA 분자이다. 구현예들에서, RNA 분자는 감염성 (+)SS RNA 바이러스를 암호화한다. DNA 분자는 인트론을 적어도 3개 포함한다. 인트론들 중 적어도 하나는 (+)SS RNA 바이러스의 비구조적 단백질을 암호화하는 유전자(또는 이러한 단백질을 암호화하는 DNA의 한 영역) 내에 위치하고, 인트론 하나는 (+)SS RNA 바이러스의 구조적 단백질을 암호화하는 유전자(또는 이러한 단백질을 암호화하는 DNA의 한 영역) 내에 위치한다.

본원에 기술된 벡터는 RNA 분자를 암호화하는 DNA 이외에도 조절 요소들을 포함한다. 조절 요소로서는, 예를 들어 하나 이상의 프로모터, 폴리 A 테일, 터미네이터, 인핸서, 리보자임, 내부 리보좀 도입 부위 또는 핵 운반 요소를 포함한다. 프로모터는 숙주 세포 내에서의 발현에 적합한 것들을 포함한다. 구현예들에서, 프로모터는 진핵 세포, 예컨대 포유동물 세포 내에서의 발현에 적합한 것이다. 이러한 프로모터의 일례로서는 진핵 세포 RNA 중합효소 프로모터가 있다. 진핵 세포 내에서의 벡터 발현을 위한 프로모터의 다른 예들로서는 CMV, RSV, SV40, HSV, 인간 Pol I, 인간 Pol II 및 인간 Pol III를 포함한다. 특정 구현예들에서, 프로모터는 CMV 프로모터이다.

벡터 내 전사 개시 부위에 대한 프로모터의 위치는 중요하다. 일례로서, 프로모터는 RNA 분자를 암호화하는 DNA의 5' 말단의 약 5 내지 약 100개 뉴클레오티드, 약 10개 내지 약 50개 뉴클레오티드, 또는 약 10개 내지 약 20개 뉴클레오티드 상류에 위치할 수 있다. 구현예들에서, 본원에 기술된 벡터는 RNA 분자를 암호화하는 DNA의 5' 말단의 약 12개 내지 약 18개 뉴클레오티드 상류에 위치하는 CMV 프로모터를 포함한다. 특정 구현예들에서, CMV 프로모터의 최적 위치는 RNA 분자를 암호화하는 DNA의 5' 말단의 약 15개 뉴클레오티드 상류(upstream)이다.

구현예들에서, 폴리 A 테일은 RNA 분자를 암호화하는 DNA의 3' 말단의 약 0개 내지 약 500개 뉴클레오티드 하류(downstream)에 위치한다.

구현예들에서, 벡터는 또한 전사된 RNA 분자의 합성과, 세포 핵으로부터 세포질로의 이동을 보장하는 요소들을 포함한다.

구현예들에서, 벡터에 함유된 DNA는 감염성 (+)SS RNA 바이러스를 암호화하는 RNA 분자를 암호화한다. 특정 구현예들에서, 감염성 (+)SS RNA 바이러스는 비병원성 및/또는 약독화 바이러스이다.

구현예들에서, 감염성 (+)SS RNA 바이러스는 플라비바이러스이다. 플라비바이러스의 예들로서는 JEV, 뎅기 바이러스, 황열 바이러스, 웨스트 나일 바이러스 및 지카 바이러스를 포함한다. 구현예들에서, 플라비바이러스는 JEV이다. JEV는 비병원성 바이러스이다. 특정 구현예들에서, JEV는 비병원성 및/또는 약독화 바이러스이다. 약독화 JEV의 일례로서는 SA14-14-2 균주(GenBank 등록번호 AF315119)가 있다.

균주를 약독화하거나 균주의 약독화를 더 개선하기 위하여, 감염성 (+)SS RNA 바이러스의 RNA를 암호화하는 DNA에 변형이 일어날 수 있다. 감염성과 원하는 치료적 효과를 여전히 유지하면서 충분한 약독화를 보장하고/보장하거나 다른 특징을 도입하기 위하여 DNA는 변형될 수 있다. 약독화의 최적화는 백신을 개선하고 백신화와 연관된 부작용을 감소시킬 수 있다. 구현예들에서, 감염성 (+)SS RNA 바이러스의 RNA를 암호화하는 DNA는 하나 이상의 핵산의 삽입, 결실 및/또는 치환에 의해 변형될 수 있다. 일례로서, 변형 DNA는 감염성 (+)SS RNA 바이러스를 암호화하는 야생형 서열과의 서열 동일성이 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 97% 또는 99%일 수 있다.

더욱이 iDNA 기술이 사용되면 자연적으로 약독화된 바이러스가 생산된다. 이처럼 iDNA 기술에 의해 생산된 바이러스는 원래의 야생형 또는 자연 발생 바이러스와 비교해서 약독화된 것이다. 게다가 이러한 바이러스는, 이 바이러스 집단이 주입된 후 대상체의 수를 바탕으로 측정되는 바에 의하면, 종래의 방법에 의해 제조된 약독화 바이러스보다 적어도 20% 더 약독화된 것이다(Poirier et al. 2017). 본 발명에는 본원에 기술된 iDNA 기술에 의해 생산된 (+)SS RNA 바이러스로서, 종래의 방법에 의해 제조된 약독화 바이러스보다 적어도 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25% 또는 30% 더 약독화된 (+)SS RNA 바이러스가 기술되어 있다.

벡터 내에 함유된 DNA는 비병원성 및/또는 약독화된 감염성 (+)SS RNA 바이러스의 RNA 분자를 암호화한다. 구현예들에서, 벡터 내에 함유된 DNA는 비병원성 및/또는 약독화된 감염성 JEV, 뎅기열 바이러스, 황열 바이러스, 웨스트 나일 바이러스 또는 지카 바이러스를 암호화한다.

벡터 내에 함유된 DNA는 또한 적어도 2개의 상이한 (+)SS RNA 바이러스의 RNA를 포함하는 키메라 RNA 분자를 암호화할 수 있다. 제2 (+)SS RNA 바이러스의 RNA는 제1 (+)SS RNA 바이러스를 암호화하는 전장 RNA의 일부를 대체한다. 그러므로, 키메라 RNA 분자는 감염성 키메라 (+)SS RNA 바이러스를 암호화하고, 비병원성 및/또는 약독화될 수 있다. 구현예들에서, 벡터 내에 함유된 DNA는 동일 속에 속하는 적어도 2개의 상이한 (+)SS RNA 바이러스로부터 유래하는 RNA를 포함하는 키메라 (+)SS RNA 바이러스를 암호화한다. 일례로서, 제1 (+)SS RNA 바이러스는 플라비바이러스이고, 제2 (+)SS RNA 바이러스는 또 다른 플라비바이러스이다. 다른 예로서, 제1 (+)SS RNA 바이러스는 JEV인 한편, 제2 (+)SS RNA 바이러스는 뎅기 바이러스, 황열 바이러스, 웨스트 나일 바이러스 또는 지카 바이러스이다. 구현예들에서, DNA는 JEV 및 지카 바이러스의 RNA를 포함하는 키메라 RNA 분자를 암호화한다. 다른 예로서는 황열 바이러스 및 뎅기열 바이러스의 키메라 RNA 분자, 또는 황열 바이러스 및 지카 바이러스의 키메라 RNA 분자, 또는 황열 바이러스 및 지카 바이러스의 키메라 RNA 분자, 또는 황열 바이러스 및 웨스트 나일 바이러스의 키메라 RNA 분자를 암호화하는 DNA를 포함한다. 이처럼 키메라 바이러스를 암호화하는 DNA 벡터는 면역 반응을 유도할 것이고, 하나의 플라비바이러스 또는 2개 이상의 플라비바이러스에 의한 감염으로부터 보호한다.

키메라 RNA 분자는 제1 (+)SS RNA 바이러스로부터 유래하는 핵산 서열의 적어도 약 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80% 또는 85%를 함유할 수 있다.

본 발명에는 본원에 기술된 (+)SS RNA 바이러스를 암호화하는 iDNA 플라스미드의 번식(propagation)을 위해 사용되는 숙주 세포, 구체적으로 대장균(E.coli) 내 DNA의 안정성을 개선하고, 숙주 세포 내 DNA의 수율을 개선하기 위해 (+)SS RNA 분자를 암호화하는 DNA에 인트론을 삽입하는 것에 대해 기술되어 있다. 구현예들에서, RNA 분자를 암호화하는 DNA는 인트론을 3개 포함한다. "인트론"이란 용어는 단백질을 암호화하지 않고, 유전자 서열의 중간에 끼어들어가 있으며, 추후 유전자 서열의 기능을 회복시키는 스플라이싱(splicing) 기작에 의해 제거될 수 있는, 인트론 RNA를 암호화하는 DNA의 단편을 지칭한다. 인트론은 종결 코돈 하나 또는 종결 코돈 수 개를 함유할 수 있다. DNA 중 종결 코돈의 예들로서는 TAA, TAG 및 TGA를 포함한다. 기타 공지된 인트론도 또한 사용될 수 있다. 특정 구현예들에서, 본원에 기술된 DNA 중 인트론 서열은 마우스 면역글로불린 H 사슬 V-영역 전구체 유전자(Genbank 등록번호 M12880)로부터 유래한다.

구현예들에서, DNA는 적어도 3개의 인트론, 적어도 4개의 인트론, 적어도 5개의 인트론, 적어도 6개의 인트론, 적어도 7개의 인트론, 적어도 8개의 인트론, 적어도 9개의 인트론 또는 적어도 10개의 인트론을 함유한다. 인트론의 배치상태는 실험을 통하여 확인될 수 있거나, 또는 당 분야에 공지된 방법을 사용하여 프로모터를 예측함으로써 확인될 수 있다(Shahmuradov 2017). 인트론들 중 적어도 하나는 (+)SS RNA 바이러스의 비구조적(NS) 단백질을 암호화하는 유전자에 삽입되고, 인트론들 중 적어도 하나는 구조적 단백질을 암호화하는 유전자에 삽입된다.

(+)SS RNA 바이러스는 구조적 유전자 및 비구조적 유전자를 포함한다. 일례로서, 플라비바이러스의 비구조적 단백질은 NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, 2K, NS4B 및 NS5 단백질을 포함한다. 플라비바이러스의 구조적 단백질은 외피 단백질(Cap), 막 단백질(prM/M) 및 피막 단백질(Env)을 포함한다. 구현예들에서, 인트론들 중 적어도 하나는 플라비바이러스의 NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, 2K, NS4B 또는 NS5 단백질을 암호화하는 유전자에 삽입되고, 인트론들 중 적어도 하나는 플라비바이러스의 Cap, Env 또는 prM/M 단백질을 암호화하는 유전자에 삽입된다. 플라비바이러스의 이러한 구조적 단백질 및 비구조적 단백질은 플라비바이러스의 구조적 유전자 및 비구조적 유전자에 의해 암호화되는 폴리단백질의 일부이다.

구현예들에서, 플라비바이러스는 약독화 JEV SA14-14-2 균주이고, JEV SA14-14-2 균주의 뉴클레오티드 서열은 GenBank 등록번호(GB Acc.) AF315119.1로 제공된다. 이하 표 1에 나타낸 바와 같이, (GB 등록번호 AF315119.1의) 96번 내지 2477번 뉴클레오티드는 구조적 단백질(Cap, prM/M 및 Env)을 암호화하고, 2478번 내지 10391번 뉴클레오티드는 비구조적 단백질(NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B 및 NS5)을 암호화한다. 다른 구현예들에서, 인트론들 중 적어도 하나는 GB 등록번호 AF315119.1의 96번 내지 2477번 뉴클레오티드 사이에 삽입되고, 적어도 하나의 인트론은 GB 등록번호 AF315119.1의 2478번 내지 10391번 뉴클레오티드 사이에 삽입된다. 특정 구현예들에서, 인트론은 GenBank 등록번호 AF315119로 제공되는 JEV 균주 SA14-14-2의 뉴클레오티드 서열 중 414번 뉴클레오티드(외피), 2213번 뉴클레오티드(피막) 및 3134번 뉴클레오티드에 삽입된다.

구현예들에서, 플라비바이러스는 황열 YF17D 균주이고, YF17D 균주의 뉴클레오티드 서열은 GB 등록번호 X03700.1로서 제공된다. 이하 표 1에 나타낸 바와 같이, (GB 등록번호 X03700.1의) 122번 내지 2452번 뉴클레오티드는 구조적 단백질(Cap, prM/M 및 Env)을 암호화하고, 2453번 내지 10354번 뉴클레오티드는 비구조적 단백질(NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B 및 NS5)을 암호화한다. 특정 구현예들에서, 인트론들 중 적어도 하나는 GB 등록번호 X03700.1의 122번 내지 2452번 뉴클레오티드 사이에 삽입되고, 적어도 하나의 인트론은 GB 등록번호 X03700.1의 2453번 내지 10354번 뉴클레오티드 사이에 삽입된다.

구현예들에서, 플라비바이러스는 웨스트 나일 바이러스(WNV)의 균주이고, 이 WNV 균주의 뉴클레오티드 서열은 GB 등록번호 KM659876.1로서 제공된다. 이하 표 1에 나타낸 바와 같이, (GB 등록번호 KM659876.1의) 97번 내지 2469번 뉴클레오티드는 구조적 단백질(Cap, prM/M 및 Env)을 암호화하고, 2470번 내지 10396번 뉴클레오티드는 비구조적 단백질(NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, 2K, NS4B 및 NS5)을 암호화한다. 특정 구현예들에서, 인트론들 중 적어도 하나는 GB 등록번호 KM659876.1의 97번 내지 2469번 뉴클레오티드 사이에 삽입되고, 적어도 하나의 인트론은 GB 등록번호 KM659876.1의 2470번 내지 10398번 뉴클레오티드 사이에 삽입된다.

구현예들에서, 플라비바이러스는 뎅기 2 PDK-53 균주이고, 뎅기 2 PDK-53 균주의 뉴클레오티드 서열은 GB 등록번호 M84728.1로서 제공된다. 이하 표 1에 나타낸 바와 같이, (GB 등록번호 M84728.1.의) 100번 내지 2421번 뉴클레오티드는 구조적 단백질(Cap, prM/M 및 Env)을 암호화하고, 2422번 내지 10269번 뉴클레오티드는 비구조적 단백질(NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, 2K, NS4B 및 NS5)을 암호화한다. 특정 구현예들에서, 인트론들 중 적어도 하나는 GB 등록번호 M84728.1의 100번 내지 2421번 뉴클레오티드 사이에 삽입되고, 적어도 하나의 인트론은 GB 등록번호 M84728.1의 2422번 내지 10269번 뉴클레오티드 사이에 삽입된다.

구현예들에서, 플라비바이러스는 지카 바이러스 균주이고, 지카 균주의 뉴클레오티드 서열은 GB 등록번호 NC_012532로서 제공된다. 이하 표 1에 나타낸 바와 같이, (GB 등록번호 NC_012532.의) 107번 내지 2476번 뉴클레오티드는 구조적 단백질(Cap, prM/M 및 Env)을 암호화하고, 2477번 내지 10363번 뉴클레오티드는 비구조적 단백질(NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, 2K, NS4B 및 NS5)을 암호화한다. 특정 구현예들에서, 인트론들 중 적어도 하나는 GB 등록번호 NC_012532의 107번 내지 2476번 뉴클레오티드 사이에 삽입되고, 적어도 하나의 인트론은 GB 등록번호 NC_012532의 2477번 내지 10363번 뉴클레오티드 사이에 삽입된다.

다른 예로서, 알파바이러스의 비구조적 단백질은 nsP1, nsP2, nsP3 및 nsP4 단백질을 포함한다. 알파바이러스의 구조적 단백질은 외피(Cap), E3, E2, 6K 및 E1 단백질을 포함한다. 구현예들에서, 인트론들 중 적어도 하나는 알파바이러스의 nsP1, nsP2, nsP3 또는 nsP4 단백질을 암호화하는 유전자에 삽입되고, 인트론들 중 적어도 하나는 알파바이러스의 Cap, E3, E2, 6K 또는 E1 단백질을 암호화하는 유전자에 삽입된다. 알파바이러스의 경우 비구조적 단백질과 구조적 단백질은 별도 폴리단백질 각각의 일부이므로, 비구조적 유전자들은 함께 폴리단백질을 암호화하고, 구조적 유전자들은 함께 제2의 폴리단백질을 암호화한다.

구현예들에서, 알파바이러스는 VEEV TC-83 균주이고, VEEV 균주의 뉴클레오티드 서열은 GB 등록번호 L01443으로서 제공된다. 이하 표 2에 나타낸 바와 같이, (GB 등록번호 L01443의) 45번 내지 7523번 뉴클레오티드는 비구조적 단백질(nsP1, nsP2, nsP3 및 nsP4)을 암호화하고, 7562번 내지 11326번 뉴클레오티드는 구조적 단백질(Cap, E3, E2, 6K 및 E1)을 암호화한다. 다른 구현예들에서, 인트론들 중 적어도 하나는 GB 등록번호 L01443의 45번 내지 7523번 뉴클레오티드 사이에 삽입되고, 적어도 하나의 인트론은 GB 등록번호 L01443의 7562번 내지 11326번 뉴클레오티드 사이에 삽입된다.

구현예들에서, 알파바이러스는 CHIKV 181/25 균주이고, CHIKV 균주의 뉴클레오티드 서열은 GB 등록번호 L37661.3으로서 제공된다. 이하 표 2에 나타낸 바와 같이, (GB 등록번호 L37661.3의) 50번 내지 7471번 뉴클레오티드는 비구조적 단백질(nsP1, nsP2, nsP3 및 nsP4)을 암호화하고, 7450번 내지 11283번 뉴클레오티드는 구조적 단백질(CAP, E3, E2, 6K 및 E1)을 암호화한다. 다른 구현예들에서, 인트론들 중 적어도 하나는 GB 등록번호 L37661.3의 50번 내지 7471번 뉴클레오티드 사이에 삽입되고, 적어도 하나의 인트론은 GB 등록번호 L37661.3의 7540번 내지 11283번 뉴클레오티드 사이에 삽입된다.

추가의 예로서, 피코나바이러스의 비구조적 단백질로서는 P2-A, P2-B, P2-C, P3-A, P3-B, P3-C 및 P3-D 단백질을 포함한다. 피코나바이러스의 구조적 단백질로서는 P1-A, P1-B, P1-C 및 P1-D 단백질을 포함한다. 구현예들에서, 인트론들 중 적어도 하나는 피코나바이러스의 P2-A, P2-B, P2-C, P3-A, P3-B, P3-C 또는 P3-D 단백질을 암호화하는 유전자에 삽입되고, 인트론들 중 적어도 하나는 피코나바이러스의 P1-A, P1-B, P1-C 또는 P1-D 단백질을 암호화하는 유전자에 삽입된다. 피코나바이러스의 이러한 구조적 단백질 및 비구조적 단백질은 피코나바이러스의 구조적 유전자 및 비구조적 유전자에 의해 암호화되는 폴리단백질의 일부이다.

구현예들에서, 피코나바이러스는 약독화 인간 소아마비바이러스 2 균주이고, 인간 소아마비바이러스 2 균주의 뉴클레오티드 서열은 GB 등록번호 D00625.1로서 제공된다. 이하 표 3에 나타낸 바와 같이, (GB 등록번호 D00625.1의) 748번 내지 3384번 뉴클레오티드는 구조적 단백질(P1-A, P1-B, P1-C 및 P1-D)을 암호화하고, 3385번 내지 7362번 뉴클레오티드는 비구조적 단백질(P2-A, P2-B, P2-C, P3-A, P3-B, P3-C 및 P3-D)을 암호화한다. 다른 구현예들에서, 인트론들 중 적어도 하나는 GB 등록번호 D00625.1의 748번 내지 3384번 뉴클레오티드 사이에 삽입되고, 적어도 하나의 인트론은 GB 등록번호 D00625.1의 3385번 내지 7362번 뉴클레오티드 사이에 삽입된다.

구현예들에서, (+)SS RNA 바이러스는 약독화 바이러스이거나, 또는 iDNA 기술 공정을 통하여 생산될 때 약독화된다(또는 향상된 약독화를 보인다). 표 1, 2 및 3은 예시적 (+)SS RNA 바이러스들을 나타낸다. (+)SS RNA 바이러스 및 (+)SS RNA 바이러스의 각 유형의 다양한 균주의 다른 예들도 또한 나타낸다.

[표 1]

[표 2]

[표 3]

구현예들에서, 본원에 기술된 벡터 내에 함유된 DNA는 (+)SS RNA 바이러스를 암호화하는 DNA를 포함한다. 다른 구현예들에서, (+)SS RNA 바이러스를 암호화하는 DNA는 GB 등록번호 AF315119.1, X03700.1, KM659876.1, M84728.1, NC_012532, L01443, L37661.3 또는 D00625.1로서 제시되며, 적어도 3개의 인트론을 포함하도록 변형되었다. 인트론들 중 적어도 하나는 (+)SS RNA 바이러스의 구조적 단백질을 암호화하는 DNA 영역 내에 있고, 인트론들 중 적어도 하나는 비구조적 단백질을 암호화하는 DNA 영역 내에 있다.

특정 구현예들에서, 본원에 기술된 벡터에 함유된 DNA는 서열 번호 1로서 제시된다.

구현예들에서, 벡터 내에 함유된 (+)SS RNA 바이러스를 암호화하는 DNA는 매우 낮은 엄중도(stringency) 조건, 낮은 엄중도 조건, 중간 엄중도 조건, 중간-높은 엄중도 조건, 높은 엄중도 조건, 또는 매우 높은 엄중도 조건 하에서 서열 번호 1 또는 이의 상보성 가닥으로 혼성화된다. 구현예들에서, (+)SS RNA를 암호화하는 DNA는 본원에 기술된 다양한 엄중도 조건에서 서열 번호 1의 대략 1011번 내지 12320번 뉴클레오티드 또는 이의 상보성 가닥으로 혼성화된다. 엄중도 조건은 전체로서 참조로 인용되어 있는 문헌[Sambrook et al. (J. Sambrook, E. F. Fritsch, and T. Maniatis, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d edition, Cold Spring Harbor, N.Y.)]에 제공되어 있다.

구현예들에서, 벡터 내에 함유된, (+)SS RNA 바이러스를 암호화하는 DNA는 매우 낮은 엄중도 조건, 낮은 엄중도 조건, 중간 엄중도 조건, 중간-높은 엄중도 조건, 높은 엄중도 조건, 또는 매우 높은 엄중도 조건 하에서 GB 등록번호 AF315119.1, X03700.1, KM659876.1, M84728.1, NC_012532, L01443, L37661.3, or D00625.1로서 제시된 DNA 또는 이의 상보성 가닥으로 혼성화되고, (+)SS RNA 바이러스를 암호화하는 DNA는 적어도 3개의 인트론을 포함하는데, 이 인트론들 중 하나는 구조적 단백질을 암호화하는 DNA 영역 내에 존재하고, 이 인트론들 중 하나는 비구조적 단백질을 암호화하는 DNA 영역 내에 존재한다.

구현예들에서, 벡터 내에 함유된 (+)SS RNA 바이러스를 암호화하는 DNA는 서열 번호 1과의 서열 동일성이 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%이다. 본 발명의 목적을 위하여, 두 데옥시리보뉴클레오티드 서열 간의 동일성 정도는, EMBOSS 팩키지의 Needle 프로그램, 바람직하게 3.0.0 버전 또는 그 이후의 것에서 실행된 바와 같은 Needleman-Wunsch 알고리즘을 이용하여 결정한다.

구현예들에서, 벡터 내에 함유된 (+)SS RNA 바이러스를 암호화하는 DNA는 GB 등록번호 AF315119.1, X03700.1, KM659876.1, M84728.1, NC_012532, L01443, L37661.3 또는 D00625.1로서 제시된 DNA와의 서열 동일성이 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%이고, (+)SS RNA 바이러스를 암호화하는 DNA는 적어도 3개의 인트론을 포함하는데, 이 인트론들 중 하나는 구조적 단백질을 암호화하는 DNA 영역 내에 존재하고, 이 인트론들 중 하나는 비구조적 단백질을 암호화하는 DNA 영역 내에 존재한다.

구현예들에서, 벡터 내에 함유된 DNA에 의해 암호화되는 (+)SS RNA 바이러스의 아미노산 서열은 GB 등록번호 AF315119.1, X03700.1, KM659876.1, M84728.1, NC_012532, L01443, L37661.3 또는 D00625.1로서 제시되는 아미노산 서열과의 서열 동일성이 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%이다. (+)SS RNA 바이러스의 아미노산 서열을 암호화하는 DNA는 적어도 3개의 인트론을 포함하는데, 이 인트론들 중 하나는 구조적 단백질을 암호화하는 DNA 영역 내에 존재하고, 이 인트론들 중 하나는 비구조적 단백질을 암호화하는 DNA 영역 내에 존재한다.

본 발명은 또한 본원에 기술된 DNA를 다량으로 제조하는 방법도 제공한다. RNA 분자를 암호화하는 DNA는 화학적으로 합성되어, 복제를 위해 원하는 벡터에 클로닝될 수 있다. 다량의 DNA를 제조하기 위한 방법은, DNA를 함유하는 벡터로 숙주 세포를 형질전환시키는 단계와, DNA를 함유하는 벡터가 다량 복제될 수 있는 조건하에 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함한다. DNA를 제조하기 위한 숙주 세포는 세균 세포를 포함한다. 구현예들에서, 세균 세포는 대장균(E.coli)을 포함한다. 상기 DNA를 제조하기 위한 다른 적합한 숙주 세포 또는 화학적 수단도 또한 사용될 수 있다.

추가로, 본 발명은 감염성 (+)SS RNA 바이러스의 게놈 RNA를 암호화하는 DNA의 세균 숙주 세포(예컨대 E.coli) 내에서의 안정성과 수율을 개선하는 방법을 제공한다. 관심있는 cDNA를 함유하는 플라스미드의 불안정성 및/또는 독성으로 말미암아, 일부 (+)SS RNA 바이러스, 예컨대 황열 바이러스 또는 JEV를 비롯한 플라비바이러스의 DNA, 특히 cDNA는 E.coli 내에서 플라스미드로서 번식시키기가 매우 어렵다. 과거에는 플라스미드의 수율을 개선하기 위하여, 플라비바이러스 DNA의 수율뿐만 아니라 독성을 감소시킨 저-복사 플라스미드가 사용되었다. 더욱이, 플라스미드의 안정성을 개선하기 위해 인트론이 삽입되었다. 인트론 2개가 저-복사 JEV cDNA 플라스미드에 삽입되었으며, 그 결과 전장 클론의 안정성이 개선되었다(Yamashchikov et al. 2001). 그러나, 특히 백신을 제조하기 위해서는 플라스미드의 고 수율 생산이 바람직하다.

본 발명은 세균 숙주 세포, 예컨대 E.coli 내에서 (+)SS RNA 바이러스를 암호화하는 cDNA를 번식시키기 위하여 표준 고-복사 플라스미드를 이용하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 3개 이상의 인트론을 (+)SS RNA 바이러스의 cDNA에 혼입시키는 단계를 포함한다. 인트론들 중 적어도 하나는 (+)SS RNA 바이러스의 구조적 단백질을 암호화하는 영역 내에 존재하고, 인트론들 중 적어도 하나는 (+)SS RNA 바이러스의 NS 단백질을 암호화하는 영역 내에 존재한다.

감염성 (+)SS RNA 바이러스를 암호화하는 원래 서열을 복구시키기 위해서, 각각의 인트론은 전사가 진행되는 동안 RNA로부터 개별적으로 스플라이싱하여 제거되어야 하므로, 다수의 인트론이 안정성을 향상시키고, 수율을 높이는 것에 효과적이라는 것이 놀라운 일이다. 더욱이, 인트론이 수 개(예를 들어 3개 이상) 존재할 때, 대안적 스플라이싱이 진행될 가능성은 증가하므로, 하나의 인트론은 제2 또는 제3 인트론과 함께 스플라이싱으로 제거될 것이고, 그 결과 인트론들 사이의 유전자(또는 뉴클레오티드)의 결실이 초래될 것이다. 이러한 대안적 스플라이싱의 과정은 결실을 유도하고, 그 결과 비 활동성 바이러스가 수득된다. 본 발명은 세균 숙주 세포, 예컨대 E.coli 내에서 안정적인 플라스미드를 제조하는 방법을 제공한다. cDNA를 삽입하기 위해서는 임의의 플라스미드 또는 바이러스 벡터, 예를 들어 pcDNA3.1, pBR322, pCI, pUC, pCR, pCR-TOPO, 백시니아 벡터, AAV 벡터, 아데노바이러스 벡터와, 세균 숙주 세포 내 번식을 위한 것으로 당 분야에 공지된 기타 플라스미드 또는 벡터가 사용될 수 있다. 소프트웨어 프로그램 및 공지된 방법이 세균 숙주에 최적인 프로모터를 예측하는데 이용될 수 있다. 적어도 3개의 인트론을 함유하는, cDNA 포함 플라스미드는 대조군에 비하여 세균 숙주 세포 내에서의 안정성이 향상된 것을 특징으로 한다. 플라스미드의 수율은 또한 대조군 플라스미드의 수율에 비하여 증가한다. 대조군 플라스미드는 3개 미만의 인트론을 가지고, (+)SS RNA 바이러스의 게놈 RNA를 암호화하는, cDNA를 포함하는 플라스미드이다.

cDNA는 또한 조절 요소, 예컨대 진핵 숙주 세포에서의 발현에 적합하고, (+)SS RNA 바이러스를 암호화하는 DNA에 작동 가능하도록 결합된 프로모터를 포함할 수도 있다.

본 발명에는 본원에 기술된 벡터와 담체를 포함하는 조성물이 기술되어 있다, 상기 조성물은 벡터와 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학 조성물일 수 있다. 상기 조성물은 유효량만큼의 벡터를 포함할 수 있다. 상기 조성물은 질환을 예방 및 치료하기 위한 벡터를 치료적 유효량만큼 포함할 수 있다. 치료의 목적으로 벡터 내에 함유된 DNA는 비병원성 및/또는 약독화 바이러스 또는 키메라 바이러스의 RNA 분자를 암호화한다. 특정 구현예들에서, 상기 조성물은 (+)SS RNA 바이러스에 의해 유발되는 질환에 대항해서 보호하는 백신으로서 사용된다.

본 발명에는 본원에 기술된 벡터로 형질감염된 숙주 세포가 기술되어 있다. 숙주 세포는 원핵 세포 또는 진핵 세포, 예컨대 포유동물 세포일 수 있다. 원핵 세포로서는 E.coli를 포함한다. 진핵 세포로서는 새끼 햄스터 신장(BHK) 세포, Vero 세포, CHO 세포 또는 MDCK를 포함한다.

본 발명에는 또한 본원에 기술된 벡터로부터 수득된 바이러스와, 담체를 포함하는 조성물이 기술되어 있다. 본원에 기술된 조성물은 iDNA® 기술을 사용하여 생산된 클론 정제 바이러스의 동종 집단을 포함한다. iDNA® 기술은 바이러스의 동종 집단을 생산한다. 일례로서, iDNA® 기술에 의해 생산된 바이러스 집단은 동일한 뉴클레오티드 서열을 가지는 바이러스를 높은 비율로 함유한다. 구현예들에서, 본원에 기술된 (+)SS RNA 바이러스 동종 집단은 동일한 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되는 바이러스를 종래의 방법에 의해 생산된 (+)SS RNA 바이러스 집단보다 적어도 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45% 또는 50% 더 많이 함유한다. 일례로서, 본원에 기술된 JEV 바이러스의 동종 집단은 서열 번호 1에 의해 암호화되는 JEV를 종래의 방법에 의해 생산된 JEV 집단보다 적어도 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45% 또는 50% 더 많이 함유한다.

더욱이, (+)SS RNA 바이러스 동종 집단은 바이러스 유사종(quasispecies)을 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99%보다 더 많이 함유할 수 있다.

상기 조성물은 유효량만큼의 바이러스와, 담체를 포함할 수 있다. 상기 조성물은 약학 조성물일 수 있으며, 질환의 치료 및 예방을 위한 치료적 유효량만큼의 바이러스와, 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 치료의 목적으로, 상기 조성물의 바이러스 동종 집단은 비병원성 바이러스, 약독화 바이러스, 또는 비병원성이자 약독화된 바이러스를 포함하고, 또한 비병원성 생 바이러스, 약독화된 생 바이러스, 또는 비병원성이자 약독화된 생 바이러스를 포함할 수도 있다. 특정 구현예들에서, 클론 정제 바이러스의 동종 집단을 포함하는 상기 조성물은 (+)SS RNA 바이러스에 의해 유발되는 질환에 대항하여 보호하는 백신으로서 사용된다.

담체는 본원에 기술된 백터와 함께 투여되는 희석제, 보조제, 부형제 또는 비이클을 포함한다. 목적한다면, 상기 조성물은 또한 소량의 습윤제 또는 유화제, pH 완충제를 함유할 수 있다. 이러한 조성물은 용액, 현탁액, 에멀전, 정제(tablet), 알약(pill), 캡슐, 분말, 지연 방출형 제제 및 이것들의 조합 등의 형태를 취할 수 있다.

약학적으로 허용 가능한 담체란, 부작용 없이 대상체에 주입될 수 있는, 본원에 기술된 벡터를 함유하기 위한 비이클을 지칭한다. 약학적으로 허용 가능한 담체로서는 멸균 액체, 예컨대 물과 오일, 예컨대 석유, 동물성, 식물성 또는 합성 기원의 것들, 예컨대 피넛 오일, 대두 오일, 미네랄 오일, 참깨 오일 및 이것들의 조합 등을 포함한다. 약학적으로 허용 가능한 담체로서 적합한 것들로는 전분, 글루코스, 락토스, 수크로스, 젤라틴, 맥아, 쌀, 밀가루, 백악, 실리카 겔, 스테아르산나트륨, 모노스테아르산글리세롤, 활석, 염화나트륨, 건조 탈지유, 글리세롤, 프로필렌, 글리콜, 물. 에탄올 및 이것들의 조합 등을 포함한다. 적합한 약학 담체의 기타 예들은 문헌["Remington's Pharmaceutical Sciences" by E. W. Martin]에 기술되어 있다.

본 발명은 또한 클론 정제 (+)SS RNA 생 바이러스의 동종 집단을 제조하기 위한 방법을 제공한다. 상기 방법은, 본원에 기술된 벡터로 진핵 숙주 세포를 형질감염시키는 단계, (+)SS RNA 생 바이러스의 생산이 허용되는 조건 하에 이 숙주 세포를 배양하는 단계, 그리고 숙주 세포 성장을 위한 배양 배지로부터 (+)SS RNA 생 바이러스를 단리하여, 클론 정제 (+)SS RNA 생 바이러스의 동종 집단을 수득하는 단계를 포함한다. 클론 정제 (+)SS RNA 생 바이러스의 동종 집단을 제조하기 위한 진핵 숙주 세포의 예들로서는 Vero 세포, CHO 세포 및 MDCK 세포와, 기타 포유동물 세포를 포함한다.

구현예들에서, 바로 위에 기술된 방법은 대상체를 면역화하기 위한 백신으로서 사용하기 위한, 클론 정제 (+)SS RNA 생 바이러스의 동종 집단을 치료적 유효량으로 포함하는 약학 조성물을 제조하는데 사용될 수 있다.

본원에 기술된 약학 조성물은 백신으로 제제화될 수 있다. 본원에 기술된 백신은, 진핵 세포 내에서의 발현에 적합한 프로모터에 작동 가능하도록 결합된, 감염성이되 비병원성 및/또는 약독화된 (+)SS RNA 바이러스의 전장 게놈 RNA 분자를 암호화하는 DNA를 포함하는, 적당하게 제제화된 벡터로서 본원에 기술된 것을 포함한다. 이러한 DNA는, 대상체에 주입될 때 약독화 바이러스의 제한된 복제를 개시할 것이며, 방어적 면역 반응을 유도할 것이다.

본 발명에는 (+)SS RNA 바이러스에 의해 유발되는 질환으로부터 대상체를 보호하기 위해 본원에 기술된 백신과 조성물을 사용하기 위한 방법이 기술되어 있다. 대상체로서는 인간과 수의학적 동물(개, 고양이, 파충류, 조류 등), 예컨대 가축(말, 소, 염소, 돼지, 닭 등) 및 연구용 동물(원숭이, 래트, 마우스, 어류 등)을 포함한다. "~의 필요가 있는(~를 필요로 하는)" 대상체는 (+)SS RNA 바이러스에 의해 유발되는 질환에 대한 백신화 또는 면역화 필요가 있는 대상체이다. 본원에 기술된 백신은 포유동물 대상체, 구체적으로 인간을 질환으로부터 보호하기 위해 특별히 제제화될 수 있다.

본원에 사용된 바와 같은 "질환에 대항하여 보호하는"이란 용어는 질환을 예방 및 치료하는 것을 포함한다. "치료하는 것", "치료"등의 용어는, 원하는 약리적 및/또는 생리적 효과를 수득하는 것을 지칭하고, (+)SS RNA 바이러스에 의해 유발되는 질환의 증상들이 완전히 없어지거나, 임상학적으로/임상학적으로나 정량적으로 측정 가능한 임의의 정도까지 완화되는 과정을 지칭하기 위해 사용된다. "예방하는 것"이란 용어는, (+)SS RNA 바이러스에 의해 유발되는 질환이 막아지고/막아지거나 지연되는 과정을 지칭한다. 구현예들에서, 본원에 기술된 백신은, T 세포 반응, 항원에 대한 항체의 증가한 혈청 중 수준, 항원(예컨대 (+)SS RNA 바이러스 폴리펩티드)에 대한 중화 항체의 존재 또는 이것들의 조합을 포함하는 "면역 반응"을 유도함으로써 (+)SS RNA 바이러스에 의해 유발되는 질환에 대항하여 보호한다. "보호" 또는 "보호 면역성"이란 용어는, (+)SS RNA 바이러스에 의해 유발되는 질환 또는 사멸에 대항해서 (부분적으로나 전체적으로) 보호하는 면역화가 진행되는 동안에 유도되는 혈청 항체의 능력 또는 T 세포 반응을 포함한다.

본원에 기술된 백신은 (+)SS RNA 바이러스에 의해 유발되는 질환에 대항하여 보호하기 위한 여러 방식으로 이용될 수 있다. 본원에 기술된 벡터를 함유하는 백신은 전기천공법, 리포펙션(lipofection), 유전자 총, 미세주입, 극미립자, 미소 캡슐, 세포 융합, DEAE 덱스트란, 인산칼슘 침전법 또는 기타 유전자 운반 방법을 비롯한 다양한 방법에 의해 직접 대상체에 투여될 수 있다. 대상체의 조직 내에서 감염성 전장 (+)SS RNA는 약독화 (+)SS RNA 생 바이러스의 생체 내 생산을 개시하는 전사에 의해 생산된다. (+)SS RNA 바이러스는 대상체 조직 내 세포로부터 생체 내 방출되어, 백신에 대한 유효 면역 반응의 유도를 개시한다.

더욱이, iDNA® 기술이 사용되면, 벡터는 전기천공법 또는 당 분야에 공지된 기타 임의의 허용 가능한 방법에 의해 진핵 세포에 도입될 수 있다. 유전적으로 안정적인, 서열 결정된 DNA 벡터의 도입에 의해 생산된 약독화 생 바이러스는 동종 바이러스 집단으로서, 소수의 유사종을 함유하므로, 종래의 약독화 생 백신에 비해 이점을 제공한다. 그러므로 본원에 기술된 벡터로부터 생산된 약독화 생 바이러스의 동종 집단은 대상체에의 백신 투여에 적합한, 약학적으로 허용 가능한 제제로 구성될 수 있다.

백신의 투여는 통상 백신화에 사용되는 임의의 경로, 예컨대 국소, 피하, 정맥내, 근육내, 진피내, 복막내, 경구, 흡입 경로 또는 이것들의 조합에 의할 수 있다.

본원에 기술된 백신은 본원에 기술된 벡터 또는 본원에 기술된 클론 정제 (+)SS RNA 바이러스의 동종 집단을 치료적 유효량으로 포함한다. "치료적 유효량"은, 조성물이 투여된 대상체 내에서 과도한 부작용을 일으키지 않고 백신이 자신의 면역학적 역할을 수행하는데 필요한 양이다. 투여될 정확한 양은 인자들, 예컨대 사용된 전사 프로모터 및 번역 프로모터의 세기, 치료중인 병태의 유형, 투여 방식뿐만 아니라 조성물 중 기타 성분들에 따라서 달라질 것이다. 구현예들에서, 백신은 벡터를 약 1 ng 내지 약 1 mg 포함한다.

본원에 기술된 백신은, 종래의 DNA 백신과는 달리, 다수 회의 면역증강과정을 거치지 않고 1회의 백신화로도 유효 면역성을 유도할 수 있다. 더욱이 단지 소량의 벡터 또는 클론 정제 (+)SS RNA 바이러스 동종 집단만이 필요할 뿐이다. 구현예들에서, 약 1 ng 내지 약 1 μg, 약 10 ng 내지 약 1 μg, 또는 약 100 ng 내지 약 1 μg과 같은 소량의 벡터 또는 바이러스 동종 집단이 사용될 수 있었다. 또한, 종래의 DNA 백신과 비교하였을 때, 약 5배 내지 약 100배 적은 양만큼의 벡터, 약 10배 내지 약 100배 적은 양만큼의 벡터, 약 25배 내지 약 100배 적은 양만큼의 벡터, 또는 약 50배 내지 약 100배 적은 양만큼의 벡터 또는 바이러스 집단이 사용될 수 있었다.

구현예들에서, DNA 백신의 면역원성은 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 보조제 또는 면역자극제, 예컨대 알파-인터페론, 베타-인터페론, 감마-인터페론, 과립구 대식세포 콜로니 자극인자("GM-CSF"), 대식세포 콜로니 자극 인자("M-CSF"), 인터루킨 2("IL-2"), 인터루킨 12("IL-12"), 및 CpG 올리고뉴클레오티드와 함께 제제화됨으로써 변형될 수 있다. 이러한 조성물을 제조하기 위하여, 당 분야에 널리 공지된 방법이 사용될 수 있다. 임의의 구현예들에서, DNA는 메틸화되지 않은 CpG 모티프를 함유하는 벡터로서 E.coli 세포 내에서 생산되고, 이 DNA 자체는 톨-유사(toll-like) 수용체를 통해 면역계를 활성화하는 면역자극 분자를 구성한다.

당 업자에 의해 이해될 수 있는 바와 같이, 본원에 개시된 각각의 구현예는 자체의 구체적으로 진술된 요소, 단계, 성분 또는 구성성분을 포함할 수 있거나, 본질적으로 이것들로 이루어질 수 있거나, 필수적으로 구성될 수 있거나, 또는 구성될 수 있다. 그러므로 "~를 포함하다(include)" 또는 "~를 포함하는(including)"과 같은 용어들은 "~를 포함하다(comprise), ~로 구성되다(consist of), 또는 ~으로 필수 구성되다(consist essentially of)"를 지칭하는 것으로 해석되어야 할 것이다. 과도적 용어 "~를 포함하다(comprise)" 또는 "~를 포함하다(comprises)"는, ~를 포함하되, 그에 한정되는 것은 아님을 의미하고, 지정되지 않은 요소들, 단계들, 성분들 또는 구성성분들을 (이것들이 다량으로 존재할 때조차도) 포함할 수 있다. 과도적 어구 "~으로 구성되는(consisting of)"은, 지정되지 않은 임의의 요소, 단계, 성분 또는 구성성분을 배제한다. 과도적 어구 "~으로 필수 구성되는(consisting essentially of)"은, 구현예의 범위를, 지정된 요소들, 단계들, 성분들 또는 구성성분들과, 이 구현예에 실질적으로 영향을 주지 않는 요소들, 단계들, 성분들 또는 구성성분들에 한정한다. 일례로서, 중대한 효과의 부재는 본원에 기술된 백신에 의해 통계학적으로 유의미한 바이러스 감염 방어 효능의 부재에 의해 입증된다.

달리 명시되지 않는 한, 명세서와 특허청구범위에서 사용된 성분들, 특성들, 예컨대 분자량, 반응 조건 등에 관한 양을 표현하는 모든 수는, 모든 경우 "약"이란 용어에 의해 수식되는 것으로 이해되어야 할 것이다. 그러므로 상충되도록 명시되지 않는 한, 명세서와 이에 첨부된 특허청구범위에 제시된 수치 매개변수는 본 발명에 의해 수득하고자 하는, 원하는 특성들에 따라서 달라질 수 있는 근사값이다. 특허청구범위에 대한 균등론의 적용을 한정하고자 하는 시도로서가 아닌 최소한으로, 각각의 수치 매개변수는 적어도 보고된 유의미한 십진수의 수치에 비추어, 그리고 통상의 반올림 기법을 적용함으로써 해석되어야 한다. 더 명확하게 표현해야 할 때, "약"이란 용어는, 진술된 수치값 또는 수치 범위와 함께 사용될 때 당 업자에 의해 합리적으로 부여되는 의미를 가지는데, 즉 진술된 값이나 범위보다 약간 더 많거나 약간 더 적은 값이나 범위로부터, 진술된 값의 ±20%; 진술된 값의 ±19%; 진술된 값의 ±18%; 진술된 값의 ±17%; 진술된 값의 ±16%; 진술된 값의 ±15%; 진술된 값의 ±14%; 진술된 값의 ±13%; 진술된 값의 ±12%; 진술된 값의 ±11%; 진술된 값의 ±10%; 진술된 값의 ±9%; 진술된 값의 ±8%; 진술된 값의 ±7%; 진술된 값의 ±6%; 진술된 값의 ±5%; 진술된 값의 ±4%; 진술된 값의 ±3%; 진술된 값의 ±2%; 또는 진술된 값의 ±1%의 범위 이내까지 나타내는 의미를 가진다.

본 발명의 넓은 범위를 제시하는 수치 범위와 배개변수는 근사값임에도 불구하고, 특정 예들에 제시된 수치값들은 가능한 정확하게 보고된다. 그러나 임의의 수치값은, 오차가 발생하는 각각의 시험 측정치들에서 발견되는 표준 편차로부터 필연적으로 유래될 수밖에 없는 임의의 오차들을 본질적으로 함유한다.

본 발명을 기술하는 내용에서(특히 하기 특허청구의범위 청구항들의 내용에서) 사용된 용어 "하나의(a)", "하나의(an)", "상기(the)" 및 유사 지시대상은, 본원에 달리 명시되어 있지 않거나 내용에 의해 분명히 상충되지 않는다면, 단수 및 복수 둘 다를 포괄하는 것으로 해석되어야 할 것이다. 본원에서 어떤 값의 범위에 대한 인용은, 오로지 해당 범위 내에 포함되는 각각의 별도 값을 개별적으로 지칭하는 간략한 방법으로서 사용되도록 의도되는 것일 뿐이다. 본원에 달리 명시되지 않는 한, 각각의 개별 값은 마치 그 값이 본원에 개별적으로 인용되어 있는 것처럼 본 발명의 명세서에 인용되어 있다. 본원에 기술된 모든 방법은, 본원에 달리 명시되지 않거나 내용에 의해 분명히 상충되지 않는 한, 임의의 적합한 순서로 수행될 수 있다. 본원에 기술된 임의의 예와 모든 예들, 또는 예시를 나타내는 용어(예를 들어 "예컨대")의 사용은, 오로지 본 발명을 더 잘 설명하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위에 대하여 달리 청구되는 제한을 두는 것은 아니다. 본 명세서 중 그 어떤 용어도 본 발명의 실시에 필수적인 요소이되, 청구되지 않은 임의의 요소를 명시하는 것으로서 해석되어서는 안될 것이다.

하기 실시예들은 예시적 구현예들과 방법들을 예시하는 것이다. 이 실시예들은 본 발명의 범위를 제한하고자 하는 것은 아닐뿐더러 본 발명의 범위를 제한하는 것으로서 해석되어서도 안된다. 본 방법은, 본원에 구체적으로 기술된 바와 같지 않게 실시될 수 있음은 분명할 것이다. 본원의 교시내용에 비추어 다수의 수정 및 변형이 될 수 있으므로, 이러한 수정 및 변형은 본 발명의 범위 안에 속한다.

예시적 구현예들

1. 벡터 또는 DNA의 진핵 세포 내 발현에 적합한 프로모터에 작동 가능하도록 결합된, RNA 분자를 암호화하는 DNA를 포함하는 벡터로서, 상기 RNA 분자는 감염성 양성 단일 가닥((+)SS) RNA 바이러스를 암호화하고, 상기 DNA는 인트론을 적어도 3개 포함하는 벡터.

2. 구현예 1의 벡터로서, 상기 (+)SS RNA 바이러스는 플라비바이러스, 알파바이러스, 피코나바이러스, 루비바이러스, 코로나바이러스, 노르워크 바이러스, A형 간염 바이러스, C형 간염 바이러스, 중증 급성 호흡기(SAR) 바이러스 및 렌티바이러스인 벡터.

3. 구현예 1 또는 2의 벡터로서, 상기 플라비바이러스는 일본 뇌염 바이러스(JEV), 뎅기 바이러스, 황열 바이러스, 웨스트 나일 바이러스, 진드기 매개 뇌염 바이러스, C형 간염 바이러스 및 지카 바이러스인 벡터.

4. 구현예 1 내지 3 중 어느 한 구현예의 벡터로서, 상기 플라비바이러스는 JEV인 벡터.

5. 벡터 또는 DNA의 진핵 세포 내 발현에 적합한 프로모터에 작동 가능하도록 결합된, 키메라 RNA 분자를 암호화하는 DNA를 포함하는 벡터로서, 상기 키메라 RNA 분자는 감염성 (+) SS RNA 바이러스를 암호화하고, 상기 DNA는 인트론을 적어도 3개 포함하는 벡터.

6. 구현예 5의 벡터로서, 상기 (+)SS RNA 바이러스는 적어도 2개의 상이한 (+)SS RNA 바이러스의 RNA를 포함하는 키메라 RNA 분자에 의해 암호화되는 벡터.

7. 구현예 5 또는 6의 벡터로서, 상기 적어도 2개의 상이한 (+)SS RNA 바이러스는 JEV 및 적어도 하나의 다른 바이러스, 황열 바이러스 및 적어도 하나의 다른 바이러스, 그리고 뎅기 바이러스 및 적어도 하나의 다른 바이러스를 포함하는 벡터.

8. 구현예 4 내지 7 중 어느 한 구현예의 벡터로서, 상기 적어도 하나의 다른 바이러스는 지카 바이러스, 웨스트 나일 바이러스, 황열 바이러스 또는 뎅기 바이러스인 벡터.

9. 구현예 4 내지 8 중 어느 한 구현예의 벡터로서, 상기 적어도 2개의 (+)SS RNA 바이러스는 JEV 및 지카 바이러스인 벡터.

10. 구현예 1 내지 9 중 어느 한 구현예의 벡터로서, 상기 적어도 하나의 인트론은 비구조적 단백질을 암호화하는 영역 내에 존재하고, 하나의 인트론은 구조적 단백질을 암호화하는 영역 내에 존재하는 벡터.

11. 구현예 1 내지 10 중 어느 한 구현예의 벡터로서, 상기 인트론은 종결 코돈 하나 또는 종결 코돈 수개를 함유하는 벡터.

12. 구현예 1 내지 11 중 어느 한 구현예의 벡터로서, 상기 DNA는 인트론을 3개 포함하는 벡터.

13. 구현예 1 내지 12 중 어느 한 구현예의 벡터로서, 상기 DNA는 적어도 4개의 인트론, 적어도 5개의 인트론 또는 적어도 6개의 인트론을 포함하는 벡터.

14. 구현예 1 내지 13 중 어느 한 구현예의 벡터로서, 상기 감염성 (+)SS RNA 바이러스는 비병원성 바이러스인 벡터.

15. 구현예 1 내지 14 중 어느 한 구현예의 벡터로서, 상기 비병원성 바이러스는 약독화 바이러스인 벡터.

16. 구현예 1 내지 15 중 어느 한 구현예의 벡터로서, 상기 프로모터는 CMV 프로모터, RSV 프로모터, SV40 프로모터, HSV 프로모터, 인간 Pol I 프로모터, 인간 Pol II 프로모터 또는 인간 Pol III 프로모터인 벡터.

17. 구현예 1 내지 16 중 어느 한 구현예의 벡터로서, 상기 프로모터는 전사 개시 부위의 약 12개 내지 약 18개 뉴클레오티드 상류에 위치하는 벡터.

18. 구현예 1 내지 17 중 어느 한 구현예의 벡터로서, 상기 프로모터는 전사 개시 부위의 약 15개 뉴클레오티드 상류에 위치하는 벡터.

19. 구현예 1 내지 18 중 어느 한 구현예의 벡터 및 담체를 포함하는 조성물.

20. 구현예 1 내지 20 중 어느한 구현예의 벡터 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학 조성물.

21. 구현예 1 내지 20 중 어느 한 구현예에 기술된 벡터를 치료적 유효량으로 포함하는 백신.

22. 구현예 1 내지 21 중 어느 한 구현예에 기술된 벡터를 포함하는 약학 조성물을 치료적 유효량으로 포함하는 백신.

23. 구현예 1 내지 23 중 어느 한 구현예에 기술된 벡터로 형질감염된 진핵 세포로부터 수득된 클론 정제 (+)SS RNA 바이러스의 동종 집단.

24. 구현예 23의 클론 정제 (+)SS RNA 바이러스의 동종 집단과, 담체를 포함하는 조성물.

25. 구현예 23 또는 24의 클론 정제 (+)SS RNA 바이러스의 동종 집단과, 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학 조성물.

26. 구현예 1 내지 25 중 어느 한 구현예에 기술된 벡터로 형질감염된 세포로부터 수득된, 클론 정제 (+)SS RNA 생 바이러스의 동종 집단을 치료적 유효량으로 포함하는 백신.

27. 클론 정제 (+)SS RNA 생 바이러스의 동종 집단을 제조하는 방법으로서, 상기 방법은 구현예 1 내지 26 중 어느 한 구현예에 기술된 벡터로 진핵 세포를 형질감염시키는 단계와, (+)SS RNA 바이러스를 단리함으로써 클론 정제 (+)SS RNA 생 바이러스의 동종 집단을 수득하는 단계를 포함하는 방법.

28. 구현예 1 내지 27 중 어느 한 구현예의 방법으로서, 상기 진핵 세포는 Vero 세포, CHO 세포 또는 MDCK 세포인 방법.

29. 감염성 (+)SS RNA 바이러스에 의해 유발되는 질환에 대항하여 대상체를 보호하기 위한 백신을 제조하는 방법으로서, 상기 방법은 구현예 1 내지 29 중 어느 한 구현예의 벡터로 진핵 세포를 형질감염시키는 단계와, 형질감염된 진핵 세포를 배양하는 단계, 그리고 (+)SS RNA 바이러스를 단리하여 백신을 수득하는 단계를 포함하는 방법.

30. 구현예 1 내지 29 중 어느 한 구현예의 방법으로서, 상기 진핵 세포는 Vero 세포, CHO 세포 또는 MDCK 세포인 방법.

31. 감염성 (+)SS RNA 바이러스에 의해 유발되는 질환에 대항하여 대상체를 보호하기 위한 방법으로서, 상기 방법은 구현예 1 내지 30 중 어느 한 구현예의 백신을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 방법.

32. 구현예 1 내지 31 중 어느 한 구현예의 방법으로서, 상기 대상체는 포유동물인 방법.

33. 구현예 1 내지 32 중 어느 한 구현예의 방법으로서, 상기 포유동물은 인간 또는 수의학적 동물인 방법.

34. 감염성 (+)SS RNA 바이러스의 게놈 RNA를 암호화하는 DNA를 포함하는 안정한 플라스미드를 제조하는 방법으로서, 상기 방법은 적어도 3개의 인트론을 DNA에 도입하는 단계를 포함하고, 적어도 하나의 인트론은 (+)SS RNA 바이러스의 구조적 단백질을 암호화하는 영역 내에 존재하며, 적어도 하나의 인트론은 (+)SS RNA 바이러스의 비구조적 단백질을 암호화하는 영역 내에 존재하는 방법.

35. 구현예 1 내지 34 중 어느 한 구현예에 기술된 벡터를 제조하는 방법으로서, 이 방법은 구현예 1 내지 34 중 어느 한 구현예에 기술된 벡터로 숙주 세포를 형질감염시키는 단계와, 숙주 세포로부터 상기 벡터를 단리하는 단계를 포함하는 방법.

36. 구현예 1 내지 34 중 어느 한 구현예에 기술된 벡터로 형질감염된 단리 세포.

37. 감염성 (+)SS RNA 바이러스에 의해 유발되는 질환에 대항하여 대상체를 보호하는 방법으로서, 상기 방법은 구현예 1 내지 36 중 어느 한 구현예에 기술된 클론 정제 (+)SS RNA 생 바이러스 동종 집단을 포함하는 백신을 투여하는 단계를 포함하는 방법.

실시예

도입. 일본 뇌염 바이러스(JEV)는 (+)SS RNA 바이러스이다. 이는, 아시아-태평양 지역에서 주로 어린이와 젊은 성인들에게 발병하는 급성 바이러스성 뇌염의 주요 원인이다. JEV는 아시아를 도처에서 전염병을 유발시키고, 모기인 큘렉스 트리타에니오린쿠스(Culex tritaeniorhynchus)에 의해 전파된다. 4가지 유형의 JEV 백신이 전 세계 여러 지역에서 승인을 받았다(CDC, 2016; WHO, 2015). 지난 수십년 동안 사멸한 바이러스 백신이 조직 배양 또는 마우스 뇌에서 제조되어, 풍토병 발생 국가 거주자 및 여행자를 면역화하기 위해 사용되어 왔다. 이러한 백신의 비용, 효능 및 안전성에 관한 특징들과 연관된 관심들이, 생 약독화 백신 SA14-14-2, 키메라 백신 YF-JEV뿐만 아니라, 정제된 비활성화, 조직 배양액 유래 백신(Halstead and Thomas, 2011)을 비롯한 대안적 백신의 개발을 이끌었다. 현재 야생형 부모 균주 SA14로부터 유래한 약독화 균주 SA14-14-2가 백신 개발 및 생산에 가장 일반적으로 사용되는 균주이다. 그러나, 이용가능한 임상 및 실험적 JEV 백신에도 불구하고, 현재 이용가능한 백신의 한계로 말미암아 JEV 백신화에 대한 개선이 필요한 실정이다. 실험적 접근법들 중 구조적 또는 비구조적 JEV 단백질을 발현하였던 플라스미드 DNA 백신이 개발되었다. DNA 백신은 마우스 모델에 있어서 치사량의 JEV에 의한 면역공격에 대항하여 검출 가능한 정도의 보호효능을 유도하였다(Putnak et al., 2003).

최근 들어, DNA 착수성 생 약독화 백신이 기술되고 있는데, 이는 DNA 백신의 화학적 및 유전적 안정성과 통상의 생 약독화 백신의 효능을 합한 것이다(Pushko et al., 2016; Tretyakova et al., 2014a; Tretyakova et al., 2013; Tretyakova et al., 2014b). 이 플랫폼은 감염성 클론 기술을 바탕으로 하며, 생 약독화 바이러스를 시험관 내 또는 생체 내에서 착수(launching)시킬 수 있는 플라스미드 DNA를 나타낸다(Jiang et al., 2015; Lukashevich, 2014; Tretyakova et al., 2014a; Tretyakova et al., 2013; Tretyakova et al., 2014b). DNA 착수성 생 약독화 백신은 종종 표준 DNA 백신과 구별하기 위해 iDNA® 백신이라고도 말한다(Pushko et al., 2016; Tretyakova et al., 2014a; Tretyakova et al., 2013; Tretyakova et al., 2014b). 이전의 연구에서, 전장 JEV 감염성 클론이 제조되어 DNA 착수성 바이러스를 시험관 내에서 제조하는데 사용되었으며, JEV 복제는 세포 배양액 중에서 연구되었다. DNA 착수성 JEV 플라비바이러스의 시험관 내 복제가 확인된 바 있다(Mishin et al., 2001; Yamshchikov et al., 2001). 그러나, DNA 착수성 생 약독화 JEV 백신은 아직 생체 내에서 평가된 적이 없다. 이에 관한 잠재적 이유 하나는, 안정적인 전장 JEV 클론을 생산함에 있어서의 어려움이었다. 플라스미드의 안정성을 개선하기 위하여, 인트론 2개가 저-복사 JEV cDNA 플라스미드에 삽입되었고, 그 결과 전장 클론의 안정성이 개선되었다(Yamshchikov et al., 2001).

현재 연구에 있어서, DNA 착수성 생 약독화 JEV 백신은 SA14-14-2 백신의 알려진 서열을 바탕으로 제조되었다. 플라스미드는, SA14-14-2 균주의 전체 합성 cDNA를 사용하여 제조되었다. E.coli 내 전장 플라스미드의 생산 수율은, 합성 인트론 3개를 JEV cDNA의 구조적 유전자와 비구조적 유전자 둘 다에 삽입함으로써 개선되었다. 백신 플라스미드는 처음에 JEV 백신을 시험관 내에서 착수하기 위해 확인되었다. 더욱이 이 같은 신규 iDNA® 백신은 BALB/c 마우스에서 면역원성과, 바이러스 중화 반응의 유도에 대해 평가되었다. 플라스미드 500 ng 또는 5 μg 중 어느 하나의 용량만큼의 1회 투여 백신화 이후 중화 항체가 검출되었는데, 이 점은 DNA 착수성 생 약독화 백신 접근법이 신규한 JEV 백신의 개발에 이용될 수 있음을 시사한다.

재료 및 방법

세포주 및 바이러스: 아프리카 녹색 원숭이(African green monkey; Vero) 및 새끼 햄스터 신장(BHK) 세포주를 미국 모식균 배양 수집소(ATCC, Manassas, VA)에서 수득하여, 가습 항온처리기(37℃ 및 5% CO₂) 내에서 10% 소 태아 혈청(FBS) 및 황산겐타마이신(10 μg/ml)이 보충된 αMEM 배지(Thermo Scientific (Thermo), Carlsbad, CA) 중에 유지시켰다.

플라스미드 및 iDNA ®의 제조: JEV 생 약독화 백신 균주 SA14-14-2에 대한 cDNA의 전장 뉴클레오티드 서열(Genbank 등록번호 AF315119.1)을, 생물학적 합성 기술을 이용하여 제조하였다(Wimmer et al., 2009). 이로부터 생성된 완전 JEV cDNA 서열을, pMB1 복제 원점(origin of replication)을 운반하는 카나마이신 내성 고-복사 pUC57 플라스미드(Genscript, Piscataway, NJ)에 클로닝하였다. 기타 임의의 표준 플라스미드 또는 바이러스 벡터, 예컨대 pcDNA3.1, pBR322, pCI, pUC, pCR, pCR-TOPO, 백시니아 벡터, AAV 벡터, 아데노바이러스 벡터, 그리고 당 분야에 공지된 기타 플라스미드 또는 벡터가 cDNA 삽입에 사용될 수 있다. CMV 주요 즉시 초기 프로모터를 전장 SA14-14-2 cDNA로부터의 상류에 삽입하였다. 뿐만 아니라, E.coli에 잠재적으로 독성일 수 있는 단백질의 합성을 막기 위하여 합성 인트론 3개를 예측 세균 프로모터의 하류에 있는 JEV 서열에 삽입하였다. 인트론 삽입을 위한 부위를 규명하기 위해 BPROM 소프트웨어(SoftBerry, Mount Kisco, NY)를 사용하여 E. coli 프로모터를 예측하였다. 다른 소프트웨어 또는 방법도 또한 프로모터를 예측하는데 이용될 수 있다. 키메라 인트론 3개를 표준 분자 생물학 방법을 이용하여 SA14-14-2 cDNA의 외피, 피막 및 NS1 유전자에 삽입하였다. 마우스 면역글로불린 H 사슬 V-영역 전구체 유전자(Genbank 등록번호 M12880) 또는 기타 인트론 서열 원으로부터 인트론 서열을 수득하였다. 결과적으로 CMV 프로모터의 전사 제어 하에 SA14-14-2 전장 게놈 RNA를 암호화하였던 플라스미드 pMG8009를 생산하였다(도 1). E.coli 균주 Stbl3(Thermo)로부터 플라스미드를 단리하여, DNA 서열 결정에 의해 확인한 다음, 정량한 후, -20℃에 보관하였다.

형질감염 및 시험관 내 검정: Vero 세포를 전기천공법에 의해 pMG8009 또는 대조군 플라스미드 DNA(농도 10 ng 내지 1 μg 범위)로 형질감염시켰다. 이전에 기본적으로 기술된 바와 같이 형질감염을 수행하였다(Messer et al., 2012; Tretyakova et al., 2013). 형질감염된 Vero 세포 내에서의 바이러스 생산 및 SA14-14-2 항원의 발현을, 감염성 중심 검정법(ICA), 간접 면역형광 검정법(IFA) 및 웨스턴 블럿에 의해 확인하였다. 형질감염된 Vero 세포로부터 성장 배지에 분비된 JEV 백신 바이러스를 BHK 세포 내 표준적 플라크 검정법에 의해 검출하였다.

pMG8009로 형질감염되었거나, 생 바이러스로 감염된 Vero 세포를 사용하여 감염성 중심 검정법(ICA)을 수행하였다. Vero 세포를 10% FBS 함유 완전 αMEM으로 10배 희석한 다음, 4 시간 동안 6-웰 플레이트에 부착되도록 허용한 후, 1% 아가로스 오버레이(overlay)로 덮었다. 플레이트를 5% CO₂ 및 37℃에서 3일 동안 항온처리하여, 플라크를 생성시켰으며, 뉴트럴 레드(neutral red)에 의한 염색을 이용하여 상기 플라크를 가시화하였다.

간접 면역형광 검정법(IFA)을 위하여, pMG8009 DNA 형질감염된 Vero 세포를, 완전 αMEM의 8웰 챔버 슬라이드에 접종하였다. 형질감염후 48시간 경과 시, 세포를 PBS로 헹구고, 건조시킨 다음, 차가운 아세톤으로 고정시켰으며, JEV 특이적 마우스 항혈청 VR-1259AF(ATCC)를 사용하고, 이후에 마우스 IgG에 대한, 2차 플루오레세인-표지화 항체(H+L)(Kirkegaard and Perry, Gaithersburg, MD)를 사용하여 전술된 바와 같이 IFA를 수행하였다(Pushko et al., 2001; Tretyakova et al., 2014b). 프로피디움 요오드화물 대비 염색제를 함유하는 마운팅 배지(Vector Labs, Burlingame, CA)를 사용하여 세포의 핵을 가시화하였다.

SDS-PAGE 및 웨스턴 블럿을 사용하여, iDNA®로 형질감염된 Vero 세포 내 JEV 항원을 검출하였다. 형질감염된 Vero 세포를 형질감염 후 9일차에 수집한 다음, 2-머캡토에탄올을 함유하는 SDS-PAGE 시료 완충제에 용해시켰으며, 단백질을 4% ~ 12% SDS-PAGE에 의해 분리하였다. 단백질을 니트로셀룰로스 막에 옮기고 나서, VR-1259AF JEV 특이 항혈청으로, 이후에는 알칼리 접합 2차 항체로 프로빙한 다음, 1원성 BCIP/NBT 포스파타아제 기질(KPL, Gaithersburg, MD)을 사용하여 염색하였다.

마지막으로, BHK 세포 내 표준적 플라크 검정법에 의해 성장 배지 중 바이러스의 존재를 확인하였다. 바이러스 성장 곡선에 대해 24시간 간격으로 시료를 채취하였다. 평균 값과 표준 편차 값을 확정하였다. 매 실험을 적어도 2회 수행함으로써 재현가능성을 보증하였다.

형질감염된 세포로부터 유래한 바이러스를 감염 후 9일차에 수집하였다. 수집 후 백신 바이러스를 원심분리(3000 x g, 10분)에 의해 청정화하고 나서, -80℃에 동결시켰다.

면역화 및 혈청 시험: iDNA® 플라스미드를 E.coli로부터 단리한 다음, 인산염 완충 염수(PBS)로 제제화하여 최종 농도 0.4 mg/ml가 되도록 만들었다. 4주령의 암컷 BALB/c 마우스를 이소플루란으로 마취한 다음, pMG8009 iDNA® 백신 5 μg 또는 500 ng만큼(용량 50 μl)을 중앙 대퇴부, 전경골근에 근육내(i.m.) 투여하여 이 마우스를 백신화하였다(Noble Life Sciences, Woodbine, MD). iDNA® 주사 후, 타 문헌에 기술된 바와 같이 동물을 전기천공시켰다(Tretyakova et al., 2013). 탄도 DNA 전달(유전자 총 등), 생체 내 형질감염 시약(PEI, 리포좀 등)을 이용하는 화학적 형질감염, (BTX(Gentronics), TriGrid(Ichor Medical Systems, Inc., San Diego, CA), Inovio, 또는 당 분야에 허용되는 기타 전극이나 기구를 사용하는) 전기천공 디바이스를 비롯하여, 생체 내 형질감염을 위한 다양한 방법들이 사용될 수 있었다. 대조군으로서, 비관련 유전자를 발현하는 플라스미드를 유사하게 전기천공주입하였다. 백신화 이후, 감염에 대한 임상 징후를 동물이 보이는지 확인하기 위해 동물을 매일 관찰하였다. 바이러스혈증 검출을 위해 3일차 및 4일차에 혈청을 수집하였고, 21일차(실험 1)와 28일차(실험 2)에는 항체 반응 평가를 위해 혈청을 수집하였다. 바이러스혈증(viremia) 검출을 위해 직접 플라크 검정법으로 혈청을 개별 시험하였다. 대안적으로, 혈청 중 바이러스를 증폭시키기 위하여 각 혈청을 Vero 세포와 10일 동안 항온처리한 다음, 수집하였다. 수집시 Vero 세포를 대상으로 세포병변효과(CPE)에 대해 관찰하였으며, 이 때 수집된 배지는 플라크 검정법으로 시험하였다.

항체 반응을 확인하기 위하여, 플라크 감소 중화 시험(PRNT), 웨스턴 블럿 및 IFA를 수행하였다. PRNT를 위하여, 열-불활성화된 혈청의 연속 2배 희석액 500 PFU/ml을 함유하는 동 부피(0.1 ml)의 바이러스 현탁액을 37℃에서 1시간 동안 항온처리한 다음, 혈청-바이러스 혼합물을 12-웰 플레이트 내 BHK 세포 단일층상에 도말하였다. αMEM 중의 아가로스 오버레이를 첨가하고, 플레이트를 37℃에서 3일 동안 항온처리한 다음, 뉴트럴 레드 염색 및 플라크 계수 측정을 실시하였다. 종말점 PRNT₅₀ 역가를, 혈청이 존재하지 않는 웰에 비하여 플라크를 50%까지 감소시킬 때의 혈청 최고 희석률로서 표현하였다.

IFA에 의해 항체 반응을 확인하기 위하여, 처음에 Vero 세포 단일층을 완전 αMEM 중 챔버 슬라이드에서 24시간 동안 10² PFU/웰의 JEV 백신 바이러스로 감염시켰다. 그 다음, 감염된 Vero 세포를 아세톤으로 고정하고 나서, 기본적으로 전술된 바와 같이 부동화 항원으로 사용하였다. JEV 감염 Vero 세포 단일층을, 백신화된 실험용 마우스로부터 얻은 혈청으로 프로빙함으로써, 혈청 중 JEV-특이적 항체를 검출하였다. 대조군으로서, 백신화되지 않은 마우스로부터 얻은 혈청을 사용하였다.

실시예 1: DNA 착수성 JEV 백신의 디자인 및 제조: CMV 주요 즉시 초기 프로모터를 pUC57 플라스미드 내 전장 합성 JEV cDNA 상류에 삽입하여 JEV pMG8009 iDNA® 백신을 제조하였다. 결과로서, pMG8009 플라스미드는 CMV 프로모터의 하류에 JEV 균주 SA-14-14-2 게놈 RNA의 전장 cDNA 카피를 함유하게 되었다. pUC 과는 pMB1 서열에 돌연변이를 가져, 복제수(copy number)의 20배 ~ 35배 증가가 초래되었던 관계로, 세포당 대략 500개의 카피가 존재하였다(Wu and Liu, 2010). RNA의 진정 5'말단부는 플라비바이러스 복제에 중요하였기 때문에(Khromykh et al., 2001), CMV 프로모터와 JEV cDNA 5' 사이의 간격은, JEV 게놈 RNA의 기능성 5' 말단부 전사가 보장되도록 최적화되었다. 리보자임은 JEV 서열의 3' 말단 하류에 포함시켰다. 이전의 연구에 따르면(Yamshchikov et al., 2001), 인트론 2개를 외피 및 E 유전자에 삽입하였을 때 cDNA 클론의 안정성이 개선된다고 하므로, 이전에 보고된 방법(Yamshchikov et al., 2001)과 유사하게 처음에 인트론 2개를 외피 및 E 유전자에 삽입하였다. 그러나 이로부터 생성된 전장 JEV cDNA는 E. coli 균주 DH5α에서뿐만 아니라, 균주 Stbl3에서도 pUC57 백본의 컨텍스트에서 낮은 플라스미드 생산 수율을 보였으며, DNA는 충분한 양으로 단리될 수 없었다. 다른 플라비바이러스와 유사하게 JEV의 cDNA는 독성 단백질의 합성을 유도하는 잠재성(cryptic) 세균 프로모터를 함유하므로, E. coli 내 DNA 수율과 유전적 안정성에 영향을 미친다는 가설이 세워졌다(Rice et al., 1989; Tretyakova et al., 2014b; Yamshchikov et al., 2001). 유전적 안정성을 개선하고 플라스미드의 생산을 증가시키고자, 제3의 인트론 서열을 전장 JEV cDNA에 삽입하였다. 돌연변이유발법과, JEV 서열 내 세균 프로모터 예측에 의해 인트론 삽입 부위를 선택하였다. NS1 내 수개의 추정 세균 프로모터가 동정되었다. 그러므로, 추가의 합성 인트론을 JEV NS1 유전자에 도입하였으며, 그 결과 JEV SA-14-14-2 cDNA의 외피, E 및 NS1 유전자 내에 인트론이 3개 존재하는, 전장 cDNA 함유 플라스미드 pMG8009가 제조되었다(도 1a). 플라스미드 pMG8009를 E.coli Stbl3 세포로부터 단리하였다. 이로부터 생성된 pMG8009-JEV를 DNA 서열결정에 의해 확인하였다.

실시예 2: E. coli 내 pMG8009의 특성규명: 플라스미드 pMG8009를 대상으로 성장 및 DNA 수율에 대해 E.coli 내에서 평가하였다. 하나의 실험에서, 화학적인 컴피턴트 E.coli Stbl3 세포를 pMG8009로 형질전환시키고 나서, 10개의 무작위 콜로니로부터의 DNA 수율을 검사하였다(도 1b). 플라스미드 DNA 수율, 크기 및 외관은 단리주들 간에 거의 동일하였으며, 부모 플라스미드와 유사하였는데, 이 점은 pMG8009의 균일성과 유전적 안정성을 시사하는 것이다. Stbl3 세포로부터의 pMG8009 수득량은 대략 0.5 mg/ml였다(도 1b). pMG8009 iDNA® 플라스미드를 E.coli Stbl3 세포로부터 단리하였으며, 그 결과 멸균되고, 내독소를 가지지 않는 DNA(수퍼코일 분률(supercoiled fraction)이 95%이고, A260/A280 비는 약 1.8)가 수득되었다.

실시예 3: iDNA ® 로부터의 JEV 백신 바이러스 시험관 내 복제; JEV 백신 생 바이러스의 복제를 착수하기 위하여, Vero 세포를 전기천공법에 의해 pMG8009 플라스미드로 형질감염시켰다. 형질감염된 Vero 세포를 대상으로 ICA, IFA, 웨스턴블럿에 의해 JEV 백신 바이러스 발현에 대하여 분석하였으며, 이때 형질감염된 세포로부터 유래한 배지를 플라크 검정에 의해 시험하였다. ICA를 위하여, 전기천공된 Vero 세포 현탁액을 6-웰 플레이트에 접종하고 나서, 1% 아가로스로 덮었다. 72시간 경과시 감염성 중심 IC로부터 바이러스가 복제되었음을 나타내는 플라크가 검출되었다(도 2). pMG8009-JEV의 특이적 감염성은 약 10³ IC/μg인 것으로 산정되었다. 형질감염된 세포 내에서의 JEV 항원의 발현을 SDS-PAGE 및 웨스턴 블럿에 의해 추가로 검사하였다. iDNA®-형질감염된 Vero 세포에서 항원 밴드가 검출되었다(도 2b, 레인 1). 웨스턴 블럿을 통하여, E, NS1 및 prM 단백질의 분지량과 일치하는 JEV 항원의 존재를 확인하였다. 예상대로 감염되지 않은 Vero 세포에서는 밴드가 검출되지 않았다(도 2b, 레인 2). 게다가, 형질감염된 세포 내 JEV 항원의 발현은 형질감염후 24시간 경과시 마우스 항-JEV 항혈청을 사용하는 IFA에 의해 확인되었다(도 2c). JEV 양성 세포의 초점이 검출되었던 반면에(도 2c, 패널 1), 비형질감염된 Vero 대조군에서는 양성 세포 또는 초점이 검출되지 않았다(도 2c, 패널 2). 플라비바이러스에 대해 예상한 대로 JEV 항원의 발현은 형질감염된 세포의 세포질 내에서 확인되었다(도 2c, 패널 1 및 3).

iDNA®-형질감염된 Vero 세포로부터의 성장 배지를 대상으로 복제중인 바이러스가 존재하는지에 대해 플라크 검정법으로 검사하였다(도 3). pMG8009 iDNA®의 용량을 증량하면서 이 pMG8009 iDNA®가 생 JEV를 시험관 내 착수시키는 능력에 대해 평가하였다. Vero 세포를 pMG8009 플라스미드(용량 범위: 10 ng 내지 1 μg) 로 형질감염시켰다. 양성 대조군으로서 (전기천공되었거나 처리되지 않은) Vero 세포를 1000 PFU의 JEV로 감염시켰다. 음성 대조군은 PBS로 처리하였다. 예상대로 PBS로 처리된 Vero 세포에서는 복제중인 바이러스가 검출되지 않았다(데이터는 나타내지 않음). 다양한 양(10 ng 내지 1000 ng)의 iDNA® 플라스미드로 형질감염되었거나, 또는 10³ PFU의 JEV 바이러스로 감염된 Vero 세포의 상청액 시료 중에는 플라크가 검출되었는데, 이 점은 iDNA® 플라스미드가 백신 생 바이러스의 복제를 착수하였고, 인트론 삽입은 pMG8009가 JEV 백신 생 바이러스의 복제를 개시하는 능력에 영향을 미치지 못하였음을 시사하는 것이다(도 3a). iDNA® 착수성 SA-14-14-2 백신이 고전적 약독화 생 바이러스 SA-14-14-2에 비하여 유전적 안정성이 더 클 것이라 제안하는 것은 타당하다. 형질감염/감염된 세포로부터의 바이러스의 성장 곡선은 도 3b에 나타냈다. 바이러스 피크 역가는 시험한 모든 DNA 용량에서 유사하였다. pMG8009 1 μg으로 형질감염된 세포로부터의 배양 배지 중, 피크 역가는 형질감염후 6일 경과시에 1000 PFU의 JEV가 감염된 세포와 유사하게 10⁶ ~ 10⁷ PFU/ml에 달하였다. 이 실험은, 바이러스 복제 역학의 관점에서 1000 PFU의 바이러스에 대하여 DNA 1 μg이 등가임을 시사한다. 그러나 DNA 10 ng 또는 100 ng이 사용되었을 때 복제 개시가 지연되는 것을 통해 DNA 용량 의존성을 확인할 수 있었다. Vero 세포가 pMG8009 10 ng 또는 100 ng으로 형질감염되었을 때 피크 역가에 이르는 시간은 대략 48시간 내지 72시간 지연되는 것이 관찰되었다. 도 3b에 나타낸 바와 같이, 단지 10 ng만큼의 DNA가 형질감염되기만 해도 JEV 바이러스 복제가 초래되었으며, 이 경우 피크 바이러스 역가는 9일차에 대략 10⁶ ~ 10⁷ PFU/ml에 도달하였고, 피크 역가는 상기보다 더 많은 양의 DNA로 형질감염이 이루어졌을 때의 피크 역가와 유사하였다(도 3b).

이러한 결과들은, Vero 세포에서 JEV 백신 바이러스를 착수시키기 위한 iDNA®의 최소 용량이 10 ng 미만이며(도 3b), 이 점은 YF 플라비바이러스(Tretyakova et al., 2014b)와, VEEV 및 CHIKV 알파바이러스(Tretyakova et al., 2014a; Tretyakova et al., 2013)를 암호화하는 iDNA® 플라스미드에 의한 본 발명자들의 이전 발견과 일치한다

실시예 4: BALB /c 마우스에서 JEV iDNA ® 백신의 면역원성: pMG8009 iDNA® 플라스미드가 생체 내에서 면역원성인지 여부를 확인하기 위하여, 주사-전기천공(pMG8009 플라스미드 단일 용량)에 의해 BALB/c 마우스를 백신화하였다. JEV 백신은 항체 유도를 바탕으로 하는 것으로서, 중화 역가 1:10이 방어 효능을 보이는 것으로 간주된다(Plotkin, 2010). 따라서, 중화 항체를 비롯한 혈청 항체 반응이 검출되는지에 초점이 맞추어졌다. iDNA® 500 ng 또는 5 μg 중 어느 한 용량만큼을 단일 근육내 주사한 다음 전기천공법을 수행하여 마우스를 백신화하였다. 대조군으로서, 비관련성 유전자를 발현하는 비관련성 DNA를 주사하여 마우스를 백신화하였다. 백신화한 후, 모든 마우스는 주사 부위에 검출가능한 병상을 보인다거나 백신화로 인한 부작용을 보인다거나 하지 않고 건강한 상태로 유지되었다. 백신화된 마우스에서는 3일차 및 4일차에, 직접 플라크 검정법을 통하여 바이러스혈증이 검출되지 않았거나, 또는 각각의 혈청을 Vero 세포와 함께 10일 동안 항온처리하여 바이러스 증식을 시도한 후 CPE 분석 및 플라크 검정법을 통하여 바이러스혈증이 검출되지 않았다(표 4). 이 결과는, iDNA® 주사 후 3일차 및 4일차에 복제중인 백신 바이러스는 유의미한 정도로 존재하지 않았음을 보여준다. 혈청 항체를 검출하기 위하여, IFA 및 PRNT 방법이 사용되었다. IFA를 위해, 처음에 Vero 세포를 챔버 슬라이드에서 100 PFU의 SA-14-414-2 바이러스로 감염시킨 다음, 고정하고 나서, 면역화된 마우스 혈청(희석율 1:10)으로 프로빙하였다(도 4). pMG8009 5 μg으로 백신화된 모든 실험용 마우스는 혈청전환되었음이 IFA에 의해 밝혀졌다(도 4 및 표 I 참조).

[표 4]

pMG8009 500 ng으로 백신화된 모든 마우스에 있어서의 혈청전환(seroconvertion) 또한 간접 형광도 항체(IFA)에 의해 검출되었다(표 I). 비록 IFA는 정량적 방법이 아니지만, 500 ng 용량으로 백신화된 마우스 군 유래 혈청에 비하여 5 μg 용량으로 백신화된 마우스 유래 혈청에서 증가한 형광 세기가 관찰되었다(데이터는 나타내지 않음). pMG8009 백신화 마우스 혈청에서 중화 항체도 또한 PRNT에 의해 검출되었다(표 4). 5 μg 백신화 군의 경우, 대부분의 마우스는 PRNT₅₀ 역가가 10(이 값은 이전에 기술된 바와 같이(Plotkin, 2010) JEV에 대항하는 보호 역가와 유사함)이었는데, 이때 마우스 한 마리의 역가는 40이었고, 마우스 한 마리의 역가는 검출 불가능한 정도였다. 500 ng 백신화 군의 경우, 모든 마우스는 PRNT₅₀ 역가가 10 내지 40의 범위였다.

실시예 5: JEV iDNA ®는 JEV 감염에 대항하여 보호한다: 비변형 IFN 반응을 보이지 않는 AG129 마우스는 독성 DENV 및 WNV, 그리고 VEEV 및 YFV 백신 균주뿐만 아니라, JEV 백신 균주 SA14-14-2 바이러스에도 취약한 것으로 알려져 있다. 인터페론-결핍 AG129 마우스를 전술된 바와 같이, 아니면 이와 유사하게 JEV iDNA® 플라스미드로 백신화하였다. 대조군으로서, 마우스에 PBS를 주사하여 투여하였다. JEV 생 약독화 백신 SA14-14-2를 감염 시도 바이러스로서 복막 내(i.p.) 주사하였다. 이환율(morbidity) 또는 폐사율(mortality)을 관찰하여 기록함으로써 iDNA® 백신화의 보호 효과를 확인하였다. 백신화된 마우스에서는 면역공격에 대항하는 보호 효과가 관찰되었던 반면에, 백신화되지 않은 마우스에서는 보호 효과가 관찰되지 않았다.

실시예 6: 수의학적 백신화: 돼지를 전술된 바와 같이, 아니면 이와 유사하게 JEV iDNA® 플라스미드로 백신화하였다. 대조군으로서, 돼지에 PBS를 주사하였다. 야생형 독성 JEV 바이러스를 감염 시도 바이러스로서 주사하였다. 돼지에 있어서의 이환율 또는 폐사율을 관찰하여 iDNA® 백신화의 보호 효과를 확인하였다. 백신화된 돼지에서는 면역공격에 대항하는 보호 효과가 관찰되었던 반면에, 백신화되지 않은 동물에서는 방어 효과가 관찰되지 않았다.

결론: JEV는 플라비바이러스 과의 일원으로서, 일본 뇌염, 즉 모기에 의해 전파되어 돼지에서 증식하는 풍토성 질환의 원인이다. 전염성 JEV의 전파가 동남아시아 및 서 태평양 24개국의, JEV 감염 위험에 노출된 30억명을 초과하는 사람들에서 보고된 바 있다(WHO, 2015). 이 질환에 대한 특별한 치료법은 없으며, 다만 현재 행해지고 있는 치료적 접근법은 환자가 감염을 이겨내도록 지원해주는 것에 초점을 맞추고 있다. 그러나 예방적 백신은 전 세계적으로 이용 가능하다. 비활성화 마우스 뇌 유래 백신, 비활성화 Vero 세포 유래 백신, 생 약독화 백신 및 생 재조합 백신을 비롯하여, JEV 백신에는 4가지 주요 유형이 존재한다(WHO, 2015). 지난 수년에 걸쳐 중국에서 제조된 생 약독화 SA14-14-2 백신이 전염병 발병 국가에서 가장 널리 사용되는 백신이 되었다. 세포 배양을 기반으로 하는 비활성화 백신과, 황열 백신 균주를 기반으로 하는 생 재조합 백신도 또한 승인받아 WHO 품질인증을 받았다. 미국의 경우, JEV 전파 시즌 동안 전염병 발병 지역에서 한달 이상 보낼 계획을 갖고 있는 여행자들에게 백신화가 권장된다. 비활성화 Vero 세포 배양액 유래 IXIARO 백신은 미국에서 승인받은 유일한 백신으로서(CDC, 2016), 28일 간격으로 2회 용량이 투여된다. JEV에 대한 수의학적 백신화도 또한 수행되었는데, 이 경우 생 약독화 및 비활성화 백신은 돼지에 대해 이용가능하다(Lutticken et al., 2007).

이전의 결과들은, 생 JEV 백신이든 비활성화 JEV 백신이든 둘 다 안전하고 JEV에 대해 유효할 뿐만 아니라, 강력한 교차 면역성과, 뎅기 바이러스 및 관련 플라비바이러스에 대한 보호 효과를 유도할 수 있음을 시사하였다(Li et al., 2016). 그러나 성인에서는 JEV 백신 촉발 뎅기 바이러스 감염-증강 항체의 적응증도 또한 발생하였다(Saito et al., 2016). 따라서, 추가의 연구가 필요하며, 기존의 백신들이 많이 있음에도 불구, 현재 사용되는 백신들의 한계점들로 말미암아 JEV 백신화의 개선이 필요할 수 있다.

JEV용 DNA 백신의 안전하고 저렴한 제제로서의 잠재성으로 말미암아, 이 JEV용 DNA 백신이 전통적인 백신에 대한 대안으로서 연구되었다. JEV 단백질들을 발현하였던 플라스미드가 사용되어 실험용 DNA 백신이 개발되었다(Putnak et al., 2003). E 단백질을 발현하는 플라스미드는, 보호 효과에 대한 중요한 지표인 JEV 중화 항체를 유도하였다(Konishi et al., 1999). prM 및 E 단백질을 암호화하는 플라스미드 DNA 백신은, E 단백질만을 발현하는 구조체에 비하여 더욱 유효한 백신화를 제공하는 것으로 보였다(Konishi et al., 2003; Wu et al., 2006). 그러나 다른 표준 DNA 백신과 유사하게, JEV 단백질을 암호화하는 플라스미드 DNA의 면역원성은 비활성화 백신의 면역원성에 비해 비교적 작았다(Bharati et al., 2005; Kaur et al., 2002). 개질된 보조제와 전기천공법이 사용됨으로써 면역 반응은 증대될 수 있었다. JEV의 prM-E 단백질을 발현하는 DNA 백신은, 근육내 주사 후 마우스에서 유효한 것으로 발견되었지만; 전기천공법 수행과 함께 투여될 때, 마우스 및 돼지 모델에서의 면역반응은 개선되었다(Sheng et al., 2016). prM-E DNA 기반 백신의 면역원성을 향상시키기 위하여 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자를 사용하는 것이 보고된 바 있다(Zhai et al., 2015).

DNA 착수성 생 약독화 백신이 구성되어, 신규의 실험적 DNA 기반 JEV용 백신이 제조되었다. pMG8009 중 CMV 프로모터의 하류에 SA-14-14-2 균주의 전장 합성 cDNA를 도입한 결과, "감염성" 게놈 바이러스 RNA의 전사와, 진핵 세포에서의 백신 바이러스의 착수가 초래되었다. DNA 착수성 iDNA® 백신의 이점으로서는, 유전적 및 물리적 안정성, 생산의 용이성, 그리고 DNA 백신의 높은 순도뿐만 아니라, 생 약독화 백신의 높은 효능을 포함한다(Pushko et al., 2016). 백신 생산에 사용되는 통상의 세포 기질은 종종 차세대 서열결정법(NGS) 및 기타 방법에 의해 동정될 수 있는 잠복 바이러스로 오염된다(Onions et al., 2011). 이와는 대조적으로, 무 내독소 DNA는 잠복 바이러스 또는 세포 배양액 생산과 연관된 불순물 없이 단리될 수 있다. 그러나 전장 플라비바이러스 cDNA는 이 cDNA의 E.coli 내 불안정성으로 말미암아 제조가 극도로 어려웠다(Rice et al., 1989; Tretyakova et al., 2014b; Tsetsarkin et al., 2016; Yamshchikov et al., 2001). 변별적 합성 인트론 서열 3개를 구조적 및 비구조적 JEV 유전자에 삽입함으로써, E.coli 내에서 전장 JEV cDNA 클론을 제조하고자 하는 도전이 현 연구에서 달성되었다. 이전의 연구에서는 JEV 구조적 유전자에 인트론 2개가 삽입되었으며, 이로써 전장 클론의 제조가 가속화되었다(Yamshchikov et al., 2001). 구조적 유전자에 인트론 2개를 삽입하는 이외에도 비구조적 유전자에 제3의 인트론을 포함시키면, cDNA 제조가 개선되었을 뿐만 아니라, 카나마이신 내성을 가지는 pUC 백본의 수율도 상당히 개선되었음이 발견되었다. 더욱이 생체 내에서의 1차적 개념 증명을 통해서는, pMG8009 플라스미드 500 ng 또는 5 μg 중 어느 하나의 단일 용량이 마우스에서 JEV 중화 항체를 비롯한 JEV에 대한 면역 반응을 유도하였음이 입증되었다. 약독화 생 바이러스는 본 발명자들의 시험관 내 관찰과 유사하게 생체 내에서 착수된다는 가설이 세워졌다. 그러나 바이러스혈증 실험에서는 마우스 내에서 생 바이러스가 검출되지 않았다. 이 점은, 생 백신에 대한 안전성의 이점을 나타낼 수 있는 바이러스혈증 수준이 낮음을 시사한다. 앞서 황열 바이러스, 플라비바이러스 과의 또 다른 일원(Jiang et al., 2015; Tretyakova et al., 2014b), 웨스트 나일 플라비바이러스(Hall et al., 2003; Yamshchikov, 2015; Yamshchikov et al., 2015)용 DNA 착수성 실험 백신뿐만 아니라, 알파바이러스(Tretyakova et al., 2014a; Tretyakova et al., 2013)용 백신도 또한 제조되었다. iDNA® 유래 치쿤구니야 바이러스(CHIKV)는 세포 배양액 유래 CHIKV 바이러스에 비하여 유전적 안정성이 더 크다는 것 또한 NGS에 의해 확인되었다(Hidajat et al., 2016). 뿐만 아니라, JEV 감염성 클론은, 앞서 키메라 황열 기반 백신에서 보인 바와 같이, 플라비바이러스, 예컨대 지카, 뎅기 및 웨스트 나일 바이러스를 비롯한 다른 바이러스용인 키메라 JEV 기반 백신을 제조하기 위한 벡터 플랫폼으로 사용될 수 있다(Guy et al., 2010). 마지막으로, SA-14-14-2 JEV 백신용 합성 DNA는, 기존의 생 약독화 백신의 DNA 백신 형태로의 전환을 위한 생물학적 합성 방법의 성공적 적용을 보여주었다(Wimmer et al., 2009). 이 DNA 백신은 서브유닛 백신의 발현을 위할 뿐만 아니라 생 백신의 발현을 위해서도 구성될 수 있다(Pushko et al., 2016).

전술된 특허대상은 오로지 예시를 위해서만 기술되어 있으며, 본 발명을 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다. 본원에 기술된 특허 대상에는, 예시적 구현예들과, 예시 및 기술된 응용예를 따르지 않고, 이하 특허청구범위에 제시된 본 발명의 진정한 사상과 범위를 벗어나지 않으면서 다양한 변형 및 변화가 가하여질 수 있다.

본 명세서에 인용된 모든 공보, 특허 및 특허 출원은, 각각의 개별 공보, 특허 또는 특허 출원이 마치 참조로 인용되어 있다고 구체적이고도 개별적으로 명시되어 있는 것처럼, 전체가 본원에 참조로 인용되어 있다. 전술된 바가 다양한 구현예들의 관점에서 기술되었을 때, 당 업자는 다양한 변형, 치환, 생략 및 변화가 이 다양한 구체예들이 이루는 사상으로부터 벗어나지 않고 적용됨을 이해할 것이다.

참고문헌

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tggtggttct 8160 catcccagaa ccggaaaaac agaggtcaca gacagataac caactggcgg tgtttctcat 8220 ctgtgtcttg accgtggttg gagtggtggc agcaaacgag tacgggatgc tagaaaaaac 8280 caaagcggat ctcaagagca tgtttggcgg aaagacgcag gcatcaggac tgactggatt 8340 gccaagcatg gcactggacc tgcgtccagc cacagcctgg gcactgtatg gggggagcac 8400 agtcgtgcta acccctcttc tgaagcacct gatcacgtcg gaatacgtca ccacatcgct 8460 agcttcaatt aactcacaag ctggctcatt attcgtcttg ccacgaggcg tgccttttac 8520 cgacctagac ttgactgttg gcctcgtctt ccttggctgt tggggtcaag tcaccctcac 8580 aacgtttctg acagccatgg ttctggcgac acttcactat gggtacatgc tccctggatg 8640 gcaagcagaa gcactcaggg ctgcccagag aaggacagcg gctggaataa tgaagaatgc 8700 cgttgttgac ggaatggtcg ccactgatgt gcctgaactg gaaaggacta ctcctctgat 8760 gcaaaagaaa gtcggacagg tgctcctcat aggggtaagc gtggcagcgt tcctcgtcaa 8820 ccctaatgtc accactgtga gagaagcagg ggtgttggtg acggcggcta cgcttacttt 8880 gtgggacaat ggagccagtg ccgtttggaa ttccaccaca gccacgggac tctgccatgt 8940 catgcgaggt agctacctgg ctggaggctc cattgcttgg actctcatca 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gatttagaaa atgaagctaa 10680 ggtactggag ctcctagacg gtgaacaccg catgctcgcc cgagccataa ttgaactgac 10740 ttacaggcac aaagtggtca aggtcatgag acctgcagca gaaggaaaga ccgtgatgga 10800 cgtgatatca agagaagatc aaagggggag tggacaggtg gtcacttatg ctcttaacac 10860 tttcacgaac atcgctgtcc agctcgtcag gctgatggag gctgaggggg tcattggacc 10920 acaacacttg gaacatctac ctaggaaaaa caagatagct gtcaggacct ggctctttga 10980 gaatggagag gagagagtga ccaggatggc gatcagcgga gacgactgtg ccgtcaaacc 11040 gctggacgac agattcgcca cagccctcca cttcctcaac gcaatgtcaa aggtcagaaa 11100 agacatccag gaatggaagc cttcgcatgg ctggcacgat tggcagcaag ttcccttctg 11160 ttctaaccat tttcaggaga ttgtgatgaa agatggaagg agtatagttg tcccgtgcag 11220 aggacaggat gagctgatag gcagggctcg catctctcct ggagctggat ggaatgtgaa 11280 ggacacagct tgcctggcca aagcatatgc acagatgtgg ctactcctat acttccatcg 11340 cagggacttg cgtctcatgg caaatgcgat ttgctcagca gtgccagtag attgggtgcc 11400 cacaggcagg acatcctggt caatacactc gaaaggagag tggatgacca cggaagacat 11460 gctgcaggtc tggaacagag tttggattga agaaaatgaa tggatgatgg acaagactcc 11520 aatcacaagc tggacagacg ttccgtatgt gggaaagcgc gaggacatct ggtgtggcag 11580 cctcatcgga acgcgatcca gagcaacctg ggctgagaac atctatgcgg cgataaacca 11640 ggttagagct gtcattggga aagaaaatta tgttgactac atgacctcac tcaggagata 11700 cgaagacgtc ttgatccagg aagacagggt catctagtgt gatttaaggt agaaaagtag 11760 actatgtaaa caatgtaaat gagaaaatgc atgcatatgg agtcaggcca gcaaaagctg 11820 ccaccggata ctgggtagac ggtgctgcct gcgtctcagt cccaggagga ctgggttaac 11880 aaatctgaca acagaaagtg agaaagccct cagaaccgtc tcggaagtag gtccctgctc 11940 actggaagtt gaaagaccaa cgtcaggcca caaatttgtg ccactccgct agggagtgcg 12000 gcctgcgcag ccccaggagg actgggttac caaagccgtt gaggccccca cggcccaagc 12060 ctcgtctagg atgcaataga cgaggtgtaa ggactagagg ttagaggaga ccccgtggaa 12120 acaacaacat gcggcccaag ccccctcgaa gctgtagagg aggtggaagg actagaggtt 12180 agaggagacc ccgcatttgc atcaaacagc atattgacac ctgggaatag actgggagat 12240 cttctgctct atctcaacat cagctactag gcacagagcg ccgaagtatg tagctggtgg 12300 tgaggaagaa cacaggatct ctcgagtggg tcggcatggc atctccacct cctcgcggtc 12360 cgacctgggc atccgaagga ggacgcacgt ccactcggat ggctaaggga gagccacgag 12420 ctcctcgaca gatcataatc agccatacca catttgtaga ggttttactt gctttaaaaa 12480 acctcccaca cctccccctg aacctgaaac ataaaatgaa tgcaattgtt gttgttaact 12540 tgtttattgc agcttataat ggttacaaat aaagcaatag catcacaaat ttcacaaata 12600 aagcattttt ttcactgcat tctagttgtg gtttgtccaa actcatcaag atgtatacaa 12660 gcttggtgta atcatggtca tagctgtttc ctgtgtgaaa ttgttatccg ctcacaattc 12720 cacacaacat acgagccgga agcataaagt gtaaagcctg gggtgcctaa tgagtgagct 12780 aactcacatt aattgcgttg cgctcactgc ccgctttcca gtcgggaaac ctgtcgtgcc 12840 agctgcatta atgaatcggc caacgcgcgg ggagaggcgg tttgcgtatt gggcgctctt 12900 ccgcttcctc gctcactgac tcgctgcgct cggtcgttcg gctgcggcga gcggtatcag 12960 ctcactcaaa ggcggtaata cggttatcca cagaatcagg ggataacgca ggaaagaaca 13020 tgtgagcaaa aggccagcaa aaggccagga accgtaaaaa ggccgcgttg ctggcgtttt 13080 tccataggct ccgcccccct gacgagcatc acaaaaatcg acgctcaagt cagaggtggc 13140 gaaacccgac 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tggtatcggt ctgcgattcc gactcgtcca acatcaatac aacctattaa tttcccctcg 14040 tcaaaaataa ggttatcaag tgagaaatca ccatgagtga cgactgaatc cggtgagaat 14100 ggcaaaagtt tatgcatttc tttccagact tgttcaacag gccagccatt acgctcgtca 14160 tcaaaatcac tcgcatcaac caaaccgtta ttcattcgtg attgcgcctg agcgagacga 14220 aatacgcgat cgctgttaaa aggacaatta caaacaggaa tcgaatgcaa ccggcgcagg 14280 aacactgcca gcgcatcaac aatattttca cctgaatcag gatattcttc taatacctgg 14340 aatgctgttt ttccggggat cgcagtggtg agtaaccatg catcatcagg agtacggata 14400 aaatgcttga tggtcggaag aggcataaat tccgtcagcc agtttagtct gaccatctca 14460 tctgtaacat cattggcaac gctacctttg ccatgtttca gaaacaactc tggcgcatcg 14520 ggcttcccat acaagcgata gattgtcgca cctgattgcc cgacattatc gcgagcccat 14580 ttatacccat ataaatcagc atccatgttg gaatttaatc gcggcctcga cgtttcccgt 14640 tgaatatggc tcataacacc ccttgtatta ctgtttatgt aagcagacag ttttattgtt 14700 catgatgata tatttttatc ttgtgcaatg taacatcaga gattttgaga cacgggccag 14760 agctgca 14767

Claims (35)

1. 진핵 세포 내 DNA의 발현용 프로모터에 작동 가능하도록 결합된, RNA 분자를 암호화하는 DNA를 포함하는 벡터로서,
   상기 RNA 분자는 감염성 양성 단일 가닥 (positive single stranded, (+)SS) RNA 바이러스를 암호화하고; 상기 감염성 (+)SS RNA 바이러스는 플라비비리대(Flaviviridae) 과(family)이며; 상기 DNA는 3개의 인트론을 포함하고;
   상기 RNA 분자를 암호화하는 DNA는 서열번호 1을 포함하거나;
   상기 RNA 분자를 암호화하는 DNA는 서열번호 1과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 포함하거나;
   상기 RNA 분자를 암호화하는 DNA는 JEV SA14-14-2 균주의 핵산 서열을 암호화하는 DNA와 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 포함하고, 상기 인트론은 JEV SA14-14-2 균주의 핵산 서열을 암호화하는 DNA의 414번째 뉴클레오티드, 2213번째 뉴클레오티드 및 3134번째 뉴클레오티드 바로(immediately) 다음 위치에 삽입되거나; 또는
   상기 RNA 분자를 암호화하는 DNA는 JEV SA14-14-2 균주의 핵산 서열을 암호화하고, 상기 인트론은 JEV SA14-14-2 균주의 핵산 서열을 암호화하는 DNA의 414번째 뉴클레오티드, 2213번째 뉴클레오티드 및 3134번째 뉴클레오티드 바로 다음 위치에 삽입된 것인, 벡터.
   
2. 제1항에 있어서,
   상기 감염성 (+)SS RNA 바이러스는 플라비바이러스를 포함하고;
   상기 플라비바이러스는 일본 뇌염 바이러스(JEV), 뎅기 바이러스, 황열 바이러스, 웨스트 나일 바이러스, 진드기 매개 뇌염 바이러스, C형 간염 바이러스 또는 지카 바이러스를 포함하는 것인 벡터.
   
3. 제1항에 있어서,
   상기 감염성 (+)SS RNA 바이러스는 적어도 2개의 감염성 (+)SS RNA 바이러스의 RNA를 포함하는 키메라 RNA 분자에 의해 암호화되고,
   상기 적어도 2개의 감염성 (+)SS RNA 바이러스는, JEV; 및 뎅기 바이러스, 황열 바이러스, 웨스트 나일 바이러스, 진드기 매개 뇌염 바이러스, C형 간염 바이러스 및 지카 바이러스로 이루어진 군으로부터 선택된 1 종인 것인 벡터.
   
4. 제1항에 있어서,
   상기 인트론은 적어도 하나의 종결 코돈을 함유하는 것인 벡터.
   
5. 제1항에 있어서,
   상기 감염성 (+)SS RNA 바이러스는 비병원성 바이러스이고,
   상기 비병원성 바이러스는 약독화 바이러스인 것인 벡터.
   
6. 제1항에 있어서,
   상기 프로모터는 CMV 프로모터, RSV 프로모터, SV40 프로모터, HSV 프로모터, 인간 Pol I 프로모터, 인간 Pol II 프로모터 또는 인간 Pol III 프로모터인 것인 벡터.
   
7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 벡터 및 담체를 포함하는, 조성물.
   
8. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 벡터로 형질감염된 진핵 세포로부터 수득된 감염성 (+)SS RNA 바이러스..
   
9. 제8항의 감염성 (+)SS RNA 바이러스 및 담체를 포함하는, 조성물.
   
10. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 벡터 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는, 감염성 (+)SS RNA 바이러스에 의해 유발되는 질환에 대해 대상체를 보호하기 위한 약학적 조성물.
    
11. 치료적 유효량의 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 벡터를 포함하는, 감염성 (+)SS RNA 바이러스에 의해 유발되는 질환에 대해 대상체를 보호하기 위한 백신 조성물.
    
12. 제11항에 있어서,
    상기 대상체는 포유동물이고, 상기 포유동물은 인간 또는 수의학적 동물인 것인, 백신 조성물.
    
13. 감염성 (+)SS RNA 생 바이러스를 제조하는 방법으로서,
    상기 방법은, 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 벡터로 진핵 세포를 형질감염시키는 단계; 및 상기 형질감염된 진핵 세포로부터 감염성 (+)SS RNA 생 바이러스를 단리하여 수득하는 단계; 를 포함하고,
    상기 진핵 세포는 Vero 세포, CHO 세포 또는 MDCK 세포인 방법.
    
14. 감염성 (+)SS RNA 바이러스에 의해 유발되는 질환에 대해 대상체를 보호하기 위한 백신 조성물을 제조하는 방법으로서,
    상기 방법은, 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 벡터로 진핵 세포를 형질감염시키는 단계; 및 상기 형질감염된 진핵 세포로부터 감염성 (+)SS RNA 바이러스를 단리하여 수득하는 단계; 를 포함하고,
    상기 진핵 세포는 Vero 세포, CHO 세포 또는 MDCK 세포인 방법.
    
15. 감염성 (+)SS RNA 바이러스의 게놈 RNA를 암호화하는 DNA를 포함하는 플라스미드를 제조하는 방법으로서,
    상기 방법은, 플라비비리대(Flaviviridae) 과(family)인 감염성 (+)SS RNA 바이러스의 게놈 RNA를 암호화하는 DNA를 획득하는 단계; 및 3개의 인트론을 상기 DNA에 도입하는 단계; 를 포함하고;
    상기 RNA 분자를 암호화하는 DNA는 서열번호 1을 포함하거나;
    상기 RNA 분자를 암호화하는 DNA는 서열번호 1과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 포함하거나;
    상기 RNA 분자를 암호화하는 DNA는 JEV SA14-14-2 균주의 핵산 서열을 암호화하는 DNA와 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 포함하고, 상기 인트론은 JEV SA14-14-2 균주의 핵산 서열을 암호화하는 DNA의 414번째 뉴클레오티드, 2213번째 뉴클레오티드 및 3134번째 뉴클레오티드 바로(immediately) 다음 위치에 삽입되거나; 또는
    상기 RNA 분자를 암호화하는 DNA는 JEV SA14-14-2 균주의 핵산 서열을 암호화하고, 상기 인트론은 JEV SA14-14-2 균주의 핵산 서열을 암호화하는 DNA의 414번째 뉴클레오티드, 2213번째 뉴클레오티드 및 3134번째 뉴클레오티드 바로 다음 위치에 삽입된 것이고;
    상기 인트론은 1 개 이상의 종결 코돈을 함유하는 것인, 방법.
    
16. 벡터를 제조하는 방법으로서,
    상기 방법은 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 벡터로 숙주 세포를 형질감염시키는 단계와, 상기 숙주 세포로부터 벡터를 단리하는 단계를 포함하는 방법.
    
17. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 벡터로 형질감염된 단리 세포.
    
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