CN110214182A - 用于i型黏多糖贮积症的基因治疗 - Google Patents

用于i型黏多糖贮积症的基因治疗 Download PDF

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Abstract

本发明提供了用于治疗MPS I的组合物和方法。

Description

用于I型黏多糖贮积症的基因治疗
相关申请的交叉引用
本申请根据35 U.S.C.§119(e)要求于2016年12月6日提交的美国临时申请第62/430,795号的权益，所述申请通过引用整体并入本文。
关于序列表的陈述
与本申请相关的序列表以文本格式提供以代替纸质副本，并且特此通过引用并入本说明书中。含有序列表的文本文件的名称是BLBD_081_01WO_ST25.txt。所述文本文件为24KB，于2017年12月6日创建并且在提交本说明书的同时通过EFS-Web以电子方式提交。
技术领域
本发明涉及基因治疗。更具体地说，本发明涉及基因治疗组合物以及使用基因治疗组合物治疗I型黏多糖贮积症(MPS I)的方法。
背景技术
黏多糖贮积症(MPS)是一类被称为溶酶体贮积病的严重遗传疾病。MPS妨碍身体持续分解和回收特定黏多糖的能力。
I型黏多糖贮积症(MPS I)是影响身体的许多部位的病症。这种病状曾被分为三种单独的综合征：贺勒氏综合征(Hurler syndrome，MPS I-H)、贺勒-施艾氏综合征(Hurler-Scheie syndrome，MPS I-H/S)和施艾氏综合征(Scheie syndrome，MPS I-S)，从最严重到最不严重列出。因为这三种综合征中的每一种综合征之间存在很大程度的重叠，所以MPS I目前分为严重型和减弱型。严重型MPS I大约每100,000个新生儿中发生1例。减弱型MPS I不太常见，并且大约每500,000个新生儿中发生1例。
患有MPS I的人具有α-L艾杜糖醛酸酶基因(IDUA)的缺陷拷贝，所述缺陷拷贝编码α-L艾杜糖醛酸酶(IDUA)。IDUA负责通过水解存在于被称为硫酸乙酰肝素和硫酸皮肤素的两种糖胺聚糖(GAG)中的未硫酸化的α-L-艾杜糖醛酸来分解被称为GAG或黏多糖的大糖分子。IDUA功能的丧失允许未消化的硫酸皮肤素和硫酸乙酰肝素以及其它有害物质在整个身体的细胞中积聚。
虽然两种形式的MPS I都可能影响许多不同的器官和组织，但是患有严重型MPS I的人经历从失明、听力丧失、学习和语言迟缓、呼吸和心脏问题开始的神经功能逐渐下降。发育迟缓通常在1岁时出现，并且严重受影响的个体最终失去基本的功能性技能(发育倒退)。患有这种形式的病状的儿童通常寿命缩短，有时仅活到童年晚期。减弱型MPS I的特征在于角膜混浊、心脏瓣膜缺陷和骨骼畸形，并且患有这种形式的疾病的个体通常活到成年期并且寿命可能会或可能不会缩短。一些患有减弱型的人还存在学习障碍，而其它人则不存在智能障碍。心脏病和气道阻塞是患有两种类型的MPS I的患者死亡的主要原因。
虽然治疗可以改善患有MPS I的个体的生命长度和生活质量，但是没有治愈方法。
发明内容
本发明总体上部分涉及用于治疗、预防I型黏多糖贮积症(MPS I)或减轻其至少一种症状的基因治疗组合物和方法。在特定实施例中，所述MPS I是贺勒氏综合征(MPS I-H)、贺勒-施艾氏综合征(MPS I-H/S)或施艾氏综合征(MPS I-S)。在特定实施例中，所述MPS I是严重型MPS I或减弱型MPS I。
在各个实施例中，提供了一种多核苷酸，其包括：左(5')慢病毒LTR；Psi(ψ)包装信号；逆转录病毒输出元件；中心聚嘌呤段/DNA瓣(cPPT/FLAP)；可操作地连接到编码α-L艾杜糖醛酸酶(IDUA)多肽的多核苷酸的启动子；以及右(3')慢病毒LTR。
在特定实施例中，所述慢病毒选自由以下组成的组：HIV(人类免疫缺陷病毒；包含HIV 1型和HIV 2型)；维斯纳-梅迪病毒(VMV)病毒；山羊关节炎-脑炎病毒(CAEV)；马传染性贫血病毒(EIAV)；猫免疫缺陷病毒(FIV)；牛免疫缺陷病毒(BIV)；以及猿猴免疫缺陷病毒(SIV)。
在某些实施例中，所述慢病毒是HIV-1或HIV-2。
在一些实施例中，所述慢病毒是HIV-1。
在另外的实施例中，所述5'LTR的启动子用选自由以下组成的组的异源启动子替代：巨细胞病毒(CMV)启动子、劳斯肉瘤病毒(RSV)启动子和猿猴病毒40(SV40)启动子。
在进一步实施例中，所述3'LTR包括一种或多种修饰。
在一些实施例中，所述3'LTR包括防止第一轮病毒复制之外的病毒转录的一种或多种缺失。
在特定实施例中，所述3'LTR包括所述3'LTR的U3区中TATA框以及Sp1和NF-κB转录因子结合位点的缺失。
在一些实施例中，所述3'LTR是自身失活(SIN)LTR。
在某些实施例中，所述可操作地连接到编码IDUA多肽的多核苷酸的启动子选自由以下组成的组：整合素亚单元αM(ITGAM；CD11b)启动子、CD68启动子、C-X3-C基序趋化因子受体1(CX3CR1)启动子、离子钙结合衔接分子1(IBA1)启动子、跨膜蛋白119(TMEM119)启动子、碎裂样(spalt like)转录因子1(SALL1)启动子、粘附G蛋白偶联受体E1(F4/80)启动子、骨髓增生性肉瘤病毒增强子阴性对照区缺失并且dl587rev引物结合位点取代的(MND)启动子和其转录活性片段。
在某些实施例中，所述可操作地连接到编码IDUA多肽的多核苷酸的启动子包括骨髓增生性肉瘤病毒增强子阴性对照区缺失并且dl587rev引物结合位点取代的(MND)启动子或其转录活性片段。
在另外的实施例中，所述可操作地连接到编码IDUA多肽的多核苷酸的启动子包括延伸因子1α(EF1α)启动子或其转录活性片段。
在特定实施例中，所述可操作地连接到编码IDUA多肽的多核苷酸的启动子是短EF1α启动子。
在一些实施例中，所述可操作地连接到编码IDUA多肽的多核苷酸的启动子是长EF1α启动子。
在进一步实施例中，编码所述IDUA多肽的所述多核苷酸是cDNA。
在特定实施例中，编码所述IDUA多肽的所述多核苷酸是针对表达而优化的密码子。
在特定实施例中，提供了一种多核苷酸，其包括：左(5')HIV-1 LTR；Psi(ψ)包装信号；RRE逆转录病毒输出元件；cPPT/FLAP；可操作地连接到编码IDUA多肽的多核苷酸的MND启动子或EF1α启动子；以及右(3')HIV-1 LTR。
在特定实施例中，提供了一种多核苷酸，其包括：左(5')CMV启动子/HIV-1嵌合LTR；Psi(ψ)包装信号；RRE逆转录病毒输出元件；cPPT/FLAP；可操作地连接到编码IDUA多肽的多核苷酸的MND启动子或EF1α启动子；以及右(3')SIN HIV-1 LTR。
在特定实施例中，所述多核苷酸进一步包括牛生长激素多腺苷酸化信号或兔β-球蛋白多腺苷酸化信号。
在各个实施例中，提供了一种用慢病毒载体转导的哺乳动物细胞，所述慢病毒载体包括本文所设想的多核苷酸。
在一些实施例中，所述细胞是造血细胞。
在某些实施例中，所述细胞是CD34+细胞。
在特定实施例中，所述细胞是干细胞或祖细胞。
在各个实施例中，一种生产细胞，其包括：编码gag的第一多核苷酸、编码pol的第二多核苷酸、编码env的第三多核苷酸和本文所设想的多核苷酸。
在各个特定实施例中，提供了一种由本文所设想的生产细胞产生的慢病毒载体。
在某些实施例中，提供了一种组合物，其包括包括本文所设想的多核苷酸的慢病毒载体或哺乳动物细胞。
在各个进一步实施例中，提供了一种药物组合物，其包括药学上可接受的载剂和包括本文所设想的多核苷酸的慢病毒载体或哺乳动物细胞。
在各个另外的实施例中，提供了一种治疗MPS I的方法，其包括向受试者施用以下：包括多核苷酸的慢病毒载体；用包括多核苷酸的慢病毒载体转导的细胞；或本文所设想的哺乳动物细胞。
在一些实施例中，提供了一种治疗MPS I的方法，其包括向受试者施用本文所设想的药物组合物。
在各个特定实施例中，提供了一种减少与受试者的MPS I相关的至少一种症状的方法，其包括向受试者施用以下：包括多核苷酸的慢病毒载体；用包括多核苷酸的慢病毒载体转导的细胞；或本文所设想的哺乳动物细胞。
在各个实施例中，提供了一种减少与受试者的MPS I相关的至少一种症状的方法，其包括向受试者施用本文所设想的药物组合物。
在特定实施例中，所述MPS I是贺勒氏综合征(MPS I-H)。
在特定实施例中，所述MPS I是贺勒-施艾氏综合征(MPS I-H/S)。
在特定实施例中，所述MPS I是施艾氏综合征(MPS I-S)。
在特定实施例中，所述MPS I是严重型MPS I。
在特定实施例中，所述MPS I是减弱型MPS I。
在一些实施例中，至少一种症状选自由以下组成的组：GAG积聚、失明、听力丧失、学习和语言迟缓、呼吸系统疾病、心脏病、骨骼畸形和认知功能下降。
附图说明
图1示出了编码IDUA的慢病毒载体的示例性架构。
图2A示出了测定野生型对照细胞、IDUA-/-细胞和用编码IDUA的慢病毒载体转导的IDUA-/-细胞(pMND-IDUA和pEF1α-IDUA)中的IDUA酶活性的代表性实验的数据。
图2B示出了：与在野生型细胞和未转导的IDUA-/-成纤维细胞中测定的本底水平相比，用编码IDUA的慢病毒载体转导的IDUA-/-成纤维细胞细胞分泌了约10到20倍的活性IDUA到细胞培养上清液中。
图3示出了来自野生型对照细胞、IDUA-/-细胞(GM0798和GM06214)和用编码IDUA的慢病毒载体转导的IDUA-/-细胞(MND.IDUA和EF1α(EFS).IDUA)的细胞裂解物中的IDUA和肌动蛋白表达的蛋白质印迹。
图4示出了：与模拟物转导的细胞相比，用包括连接到编码IDUA的多核苷酸的MND或EF1α启动子的LVV转导的人类CD34+细胞表现出类似的生长动力学。
图5示出了用包括连接到编码IDUA的多核苷酸的MND或EF1α启动子的LVV转导并用细胞因子培养7天的人类CD34+细胞的VCN。
图6示出了用包括连接到编码IDUA的多核苷酸的MND或EF1α启动子的LVV转导的人类CD34+细胞在甲基纤维素培养物中在第12天的个别集落VCN。
图7示出了来自用包括连接到编码IDUA的多核苷酸的MND或EF1α启动子的LVV转导并用细胞因子培养7天的人类CD34+细胞的细胞沉淀物和上清液中的IDUA活性。
图8示出了来自用包括连接到编码IDUA的多核苷酸的MND或EF1α启动子的LVV转导的人类CD34+细胞的细胞沉淀物中在甲基纤维素培养物中在第12天的IDUA活性。
图9示出了用包括连接到编码IDUA的多核苷酸的MND或EF1α启动子的LVV转导并用细胞因子培养7天的三种人类CD34+供体细胞的VCN。
序列标识符简要说明
SEQ ID NO:1阐述了编码α-L艾杜糖醛酸酶(IDUA)多肽的示例性慢病毒载体的序列。
SEQ ID NO:2阐述了编码IDUA多肽的示例性慢病毒载体的序列。
SEQ ID NO:3-13阐述了各种连接子的氨基酸序列。
SEQ ID NO:14-16阐述了蛋白酶切割位点和自切割多肽切割位点的氨基酸序列。
具体实施方式
A.概述
本发明总体上部分涉及用于治疗、预防MPS I，包含贺勒氏综合征(MPS I-H)、贺勒-施艾氏综合征(MPS I-H/S)、施艾氏综合征(MPS I-S)、严重型MPS I和减弱型MPS I，或减轻其至少一种症状的经改进的基因治疗组合物和方法。
患有MPS I的儿童可能在出生时没有MPS I的体征或症状，但是有些人在肚脐(脐疝)或下腹部(腹股沟疝)周围有柔软的外翻(out-pouching)。患有严重型MPS I的个体通常在出生后的第一年内开始显示出所述病状的其它体征和症状，而减弱型MPS I的患者则具有稍后在儿童时期发展的较轻微特征。
MPS I可能与巨头症、脑积水、心脏瓣膜异常、面部特征奇特、肝肿大、脾肿大以及巨舌症相关。声带也可以扩大，从而导致声音暗沉、声音嘶哑。一些患有MPS I的人气道可能变窄，从而引起频繁的上呼吸道感染和睡眠期间呼吸短暂暂停(睡眠呼吸暂停)。患有MPS I的个体还可能出现眼睛的透明覆盖膜(角膜)的混浊，这可能引起严重的视力丧失。受影响的个体还可能患有听力丧失和复发性耳部感染。一些患有MPS I的个体身材矮小并且关节畸形(挛缩)，这些会影响活动能力。大多数患有严重型MPS I的个体还患有多发性骨发育障碍、腕管综合征和颈椎管狭窄，这些可能压迫和损伤脊髓。
虽然两种形式的MPS I都可能影响许多不同的器官和组织，但是患有严重型MPS I的人在1到4岁之间经历从失明、听力丧失、学习和语言迟缓、呼吸和心脏问题开始逐渐丧失神经功能的症状，并且然后通常在二十岁以前死亡。患有减弱型MPS I的个体通常寿命不会缩短，并且表现出角膜混浊、心脏瓣膜缺陷和骨骼畸形。
在各个实施例中，设想了编码α-L艾杜糖醛酸酶(IDUA)的基因治疗载体。基因治疗优先地包含可操作地连接到编码IDUA多肽的核苷酸的启动子。基因治疗载体可以是病毒载体，包含但不限于γ逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺相关病毒(AAV)载体、腺病毒载体或疱疹病毒载体。
各个实施例中还提供了用本文所设想的基因治疗载体转导的细胞。在一些优选实施例中，经过转导的细胞是造血细胞，包含但不限于CD34+细胞。
在各个其它实施例中，本文所设想的基因治疗组合物优选地施用于已被诊断为患有或患有MPS I的受试者。
在各个其它实施例中，本文所设想的基因治疗组合物优选地施用于在IDUA基因中具有一种或多种突变的受试者。
除非特别相反地指示，否则特定实施例的实践将采用本领域技术范围内的化学、生物化学、有机化学、分子生物学、微生物学、重组DNA技术、遗传学、免疫学和细胞生物学的常规方法，出于说明的目的，以下描述了所述方法中的许多方法。这些技术在文献中有充分说明。参见例如Sambrook等人,《分子克隆：实验手册(Molecular Cloning:A LaboratoryManual)》(第3版,2001)；Sambrook等人,《分子克隆：实验手册》(第2版,1989)；Maniatis等人,《分子克隆：实验手册》(1982)；Ausubel等人,《当代分子生物学实验指南(CurrentProtocols in Molecular Biology)》(约翰·威利父子出版公司(Wiley and Sons),2008年7月更新)；《精编分子生物学实验指南：当代分子生物学实验指南的方法概要(ShortProtocols in Molecular Biology:A Compendium of Methods from Current Protocolsin Molecular Biology)》,格林出版协会和威利跨学科出版社(Greene Pub.Associatesand Wiley-Interscience)；Glover,《DNA克隆：实用方法(DNACloning:A PracticalApproach)》,第I卷和第II卷(IRL出版社(IRL Press),牛津,1985)；Anand,《复杂基因组分析技术(Techniques for the Analysis of Complex Genomes)》,(学术出版社(AcademicPress),纽约,1992)；《转录与转译(Transcription and Translation)》(B.Hames和S.Higgins编辑,1984)；Perbal,《分子克隆实用指南(A Practical Guide to MolecularCloning)》(1984)；Harlow和Lane,《抗体(Antibodies)》,(冷泉港实验室出版社(ColdSpring Harbor Laboratory Press),纽约冷泉港,1998)《当代免疫学指南(CurrentProtocols in Immunology)》(编辑：Q.E.Coligan、A.M.Kruisbeek、D.H.Margulies、E.M.Shevach和W.Strober,1991)：《免疫学年度评论(Annual Review of Immunology)》；以及《免疫学进展(Advances in Immunology)》等期刊上的专著。
B.定义
除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。尽管类似于或等效于本文所描述的方法和材料的任何方法和材料可以用于实践或测试特定实施例，但本文描述了组合物、方法和材料的优选实施例。出于本公开的目的，以下术语定义如下。
本文中使用冠词“一个/种(a/an)”和“所述(the)”指代一个/种或多于一个/种(即，至少一个/种或一个/种或多个/种)所述冠词的语法宾语。举例来说，“元件”意指一个元件或者一个或多个元件。
替代方案(例如，“或”)的使用应该理解为意指替代方案中的一个、两个或其任何组合。
术语“和/或”应该理解为意指替代方案中的一种或两种。
如本文所使用的，术语“约(about或approximately)”指代与参考数量、水平、值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度相比，变化幅度高达15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％的数量、水平、值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度。在一个实施例中，术语“约”指代参考数量、水平、值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度的±15％、±10％、±9％、±8％、±7％、±6％、±5％、±4％、±3％、±2％或±1％的数量、水平、值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度。
在一个实施例中，范围例如1到5、约1到5或约1到约5指代所述范围所涵盖的每个数值。例如，在一个非限制性而仅仅是说明性的实施例中，范围“1到5”相当于表达1、2、3、4、5；或1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5或5.0；或1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9或5.0。
如本文所使用的，术语“基本上(substantially)”指代与参考数量、水平、值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度相比80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的数量、水平、值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度。在一个实施例中，“基本上相同”指代产生与参考数量、水平、值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度大致相同的效应例如生理效应的数量、水平、值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度。
贯穿本说明书，除非上下文另有要求，否则词语“包括(comprise)”、“包括(comprises)”和“包括(comprising)”将被理解为暗示包含所陈述的步骤或元件或步骤或元件组，但不排除任何其它步骤或元件或步骤或元件组。“由……组成”意指包含并且限于，无论在短语“由……组成”之后是什么。因此，短语“由……组成”指示所列出的元件是必需的或强制性的，并且可以不存在其它元件。“基本上由……组成”意指包含在所述短语之后所列出的任何元件，并且限于不干扰或促进本公开中针对所列元件指定的活动或行为的其它元件。因此，短语“基本上由……组成”指示所列元件是必需的或强制性的，但不存在实质上影响所列元件的活动或动作的其它元件。
贯穿本说明书中对“一个实施例”、“实施例”、“特定实施例”、“相关实施例”、“某个实施例”、“另外的实施例”或“进一步实施例”或其组合的引用意味着结合所述实施例所描述的特定特征、结构或特性包含在至少一个实施例中。因此，上述短语在贯穿本说明书的各个地方的出现不一定全部指代同一个实施例。此外，在一个或多个实施例中，可以以任何适合的方式组合特定特征、结构或特性。还应理解的是，在一个实施例中对特征的肯定叙述充当在特定实施例中排除所述特征的基础。
“增强”或“促进”或“增加”或“扩展”通常指代与媒剂或对照分子/组合物相比，本文所设想的组合物和/或方法引发、引起或产生更高生理应答的能力。“增加的”或“增强的”量通常是“统计上显著”的量，并且可以包含1.1、1.2、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30或更多倍(例如，500倍、1000倍)(包含所有整数以及其之间并且超过1的小数点，如1.5、1.6、1.7、1.8等)于对照的量的增加。
“减少”、或“下降”、或“减轻”、或“降低”或“减缓”总体上指代与媒剂或对照组合物或方法的应答相比，导致减少的生理应答的组合物或方法。“减少的”或“降低的”量的经过转导的细胞通常是“统计上显著的”量，并且可以包含1.1、1.2、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30或更多倍(例如，500倍、1000倍)(包含所有整数以及其之间并且超过1的小数点，例如，1.5、1.6、1.7、1.8等)于对照的量的增加。
“保持(maintain或maintenance)”、或“维持”、“无变化”、或“无实质变化”或“无实质减少”总体上指代与媒剂、对照分子/组合物或特定细胞的应答引起的应答相当的生理应答。相当的应答是与参考应答没有显著差异或可测量的差异的应答。
“MPS I”指代I型黏多糖贮积症(MPS I)。在特定实施例中，MPS I的特征在于α-L艾杜糖醛酸酶基因(IDUA)中的一种或多种突变，所述一种或多种突变降低IDUA的功能、活性和/或表达。在特定实施例中，MPS I指代贺勒氏综合征(MPS I-H)。在特定实施例中，MPS I指代贺勒-施艾氏综合征(MPS I-H/S)。在特定实施例中，MPS I指代施艾氏综合征(MPS I-H/S)。在特定实施例中，MPS I指代严重型MPS I。在特定实施例中，MPS I指代减弱型MPS I。
以下说明中，阐述了某些具体细节以便提供对本文所设想的本发明的各个说明性实施例的全面理解。然而，本领域技术人员应理解，可以在没有这些细节的情况下实践特定说明性实施例。另外，应理解，源自本文所描述的结构和取代基的各个组合的单独载体或载体组由本申请公开到与单独阐述每个载体或每组载体相同的程度。因此，特定载体结构或特定取代基的选择在本公开的范围内。
C.多肽
除非相反地指出，否则“多肽”、“多肽片段”、“肽”和“蛋白质”可互换使用并且根据常规含义使用，即作为氨基酸序列。在一个实施例中，“多肽”包含融合多肽和其它变体。可以使用各种熟知的重组和/或合成技术中的任何技术来制备多肽。多肽不限于具体长度，例如，多肽可以包括全长蛋白序列、全长蛋白质的片段或融合蛋白，并且可以包含多肽的转译后修饰例如糖基化、乙酰化、磷酸化等以及本领域已知的天然存在的和非天然存在的其它修饰。
在各个实施例中，本文中设想了多肽，包含但不限于IDUA多肽。
如本文所使用的，“分离的肽”或“分离的多肽”等指代从细胞环境中以及从与细胞的其它组分的缔合中体外分离和/或纯化的肽或多肽分子，即所述肽或多肽分子未与体内物质显著缔合。
多肽包含“多肽变体”。多肽变体与天然存在的多肽的不同之处可以在于一个或多个氨基酸取代、缺失、添加和/或插入。此类变体可以是天然存在的或可以通过合成产生，例如通过修饰上述多肽序列的一个或多个氨基酸。例如，在特定实施例中，可能期望通过将一个或多个取代、缺失、添加和/或插入引入到多肽中来改善多肽的生物学特性。在特定实施例中，多肽包含与本文所设想的参考序列中的任何参考序列具有至少约65％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％,85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸同一性的多肽变体，通常其中变体保持参考序列的至少一种生物活性。
多肽变体包含生物活性“多肽片段”。如本文所使用的，术语“生物活性片段”或“最小生物活性片段”指代保留天然存在的多肽活性的至少100％、至少90％、至少80％、至少70％、至少60％、至少50％、至少40％、至少30％、至少20％、至少10％或至少5％的多肽片段。多肽片段指代多肽，所述多肽可以是具有氨基末端缺失、羧基末端缺失和/或天然存在的或重组产生的多肽的一个或多个氨基酸的内部缺失或取代的单体或多聚体。在某些实施例中，多肽片段可以包括长度为至少5个到约1700个氨基酸的氨基酸链。应当理解的是，在某些实施例中，片段长度为至少5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个、50个、55个、60个、65个、70个、75个、80个、85个、90个、95个、100个、110个、150个、200个、250个、300个、350个、400个、450个、500个、550个、600个、650个、700个、750个、800个、850个、900个、950个、1000个、1100个、1200个、1300个、1400个、1500个、1600个、1700个或更多个氨基酸。
多肽片段的说明性实例包含催化结构域等。
如上文中指出的，可以以各种方式来改变多肽，包含氨基酸取代、缺失、截短和插入。用于此类操纵的方法在本领域中是熟知的。例如，可以通过DNA的突变来制备参考多肽的氨基酸序列变体。用于诱变和核苷酸序列改变的方法在本领域中是熟知的。参见，例如，Kunkel(1985,《美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.)》82:488-492)；Kunkel等人(1987,《酶学方法(Methods in Enzymol)》,154:367-382)；美国专利第4,873,192号；Watson,J.D.等人(《基因的分子生物学(Molecular Biology of the Gene)》,第四版,本杰明/卡明斯出版公司(Benjamin/Cummings),加利福尼亚州门洛帕克市,1987)以及其中引用的参考文献。关于不影响所关注蛋白质的生物活性的适当氨基酸取代的指导可以在Dayhoff等人,(1978)《蛋白序列和结构图谱学(Atlas of Protein Sequence andStructure)》(美国国家生物医学研究基金会(Natl.Biomed.Res.Found.),华盛顿特区)的模型中找到。
在某些实施例中，变体将含有一个或多个保守取代。“保守取代”是其中氨基酸被具有类似性质的另一个氨基酸取代从而使得肽化学领域的技术人员预期多肽的二级结构和亲水性基本上未改变的取代。可以对特定实施例中所设想的多核苷酸和多肽的结构中进行修饰，多肽包含具有至少约并且仍然获得对具有期望特性的变体或衍生多肽进行编码的功能分子的多肽。当期望改变多肽的氨基酸序列以创建等效或甚至改进的变体多肽时，本领域技术人员例如可以改变编码DNA序列的密码子中的一个或多个密码子。
使用本领域中公知的计算机程序如DNASTAR、DNA Strider、Geneious、Mac Vector或Vector NTI软件，可以发现在确定可以不消除生物活性的情况下取代、插入或缺失哪些氨基酸残基方面的指导。优选地，本文所公开的蛋白质变体的氨基酸改变是保守氨基酸改变，即带类似电荷或不带电荷的氨基酸的取代。保守氨基酸改变涉及在侧链方面相关的氨基酸的家族中的一个氨基酸的取代。天然存在的氨基酸通常分为四个家族：酸性氨基酸(天冬氨酸、谷氨酸)、碱性氨基酸(赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、非极性氨基酸(丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)和极性不带电氨基酸(甘氨酸、天冬酰胺、谷胺酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸)。苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸有时被共同分类为芳香族氨基酸。在肽或蛋白质中，适当的氨基酸保守取代对于本领域的技术人员来说是已知的，并且通常可以在不改变所得分子的生物活性的情况下进行。本领域技术人员认识到，一般而言，在多肽的非必要区中的单氨基酸取代基本上不改变生物活性(参见，例如，Watson等人《基因的分子生物学》,第4版,1987,本杰明/卡明斯出版公司,第224页)。
在进行此类改变时，可以考虑氨基酸的亲水指数。亲水氨基酸指数在赋予蛋白质交互性生物功能方面的重要性在本领域中普遍理解的(Kyte和Doolittle，1982，通过引用并入本文)。已经基于氨基酸的亲水性和电荷特性为每个氨基酸分配了亲水指数(Kyte和Doolittle，1982)。这些值为：异亮氨酸(+4.5)；缬氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/半胱氨酸(+2.5)；蛋氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(0.4)；苏氨酸(0.7)；丝氨酸(0.8)；色氨酸(0.9)；酪氨酸(1.3)；脯氨酸(1.6)；组氨酸(3.2)；谷氨酸(3.5)；谷氨酰胺(3.5)；天冬氨酸(3.5)；天冬酰胺(3.5)；赖氨酸(3.9)；以及精氨酸(4.5)。
本领域中已知某些氨基酸可以被具有类似亲水指数或得分的其它氨基酸取代并且仍导致具有类似生物活性的蛋白质，即仍获得生物功能等效蛋白质。在进行此类改变时，优选亲水指数在±2以内的氨基酸的取代，特别优选亲水指数在±1以内的氨基酸的取代，并且甚至更加特别优选亲水指数在±0.5以内的氨基酸的取代。在本领域中还应理解，可以基于亲水性来有效地进行相似氨基酸的取代。
如美国专利第4,554,101号中所详述的，已经为氨基酸残基分配了以下亲水性值：精氨酸(+3.0)；赖氨酸(+3.0)；天冬氨酸(+3.0±1)；谷氨酸(+3.0±1)；丝氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；苏氨酸(-0.4)；脯氨酸(–0.5±1)；丙氨酸(-0.5)；组氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；蛋氨酸(-1.3)；缬氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；异亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)；色氨酸(-3.4)。应当理解的是，氨基酸可以取代具有相似亲水性值的另一种氨基酸，并且仍然获得生物学上等同的，并且特别是免疫学上等同的蛋白质。在这种改变时，优选亲水性值在±2以内的氨基酸的取代，特别优选亲水性值在±1以内的氨基酸的取代，更特别优选亲水性值在±0.5以内的氨基酸的取代。
如上文所概述的，氨基酸取代可以基于氨基酸侧链取代基的相对相似性，例如其疏水性、亲水性、电荷、大小等。
多肽变体进一步包含糖基化形式、与其它分子的聚集共轭物和与不相关化学部分(例如，聚乙二醇化分子)的共价共轭物。如本领域中已知的，可以通过将功能与在氨基酸链中或在N末端或C末端残基处发现的基团连接来制备共价变体。变体还包含等位基因变体、物种变体和突变蛋白。不影响蛋白质的功能活性的区截短或缺失也是变体。
特定实施例中设想的多肽包含融合多肽。在特定实施例中，提供了融合多肽和编码融合多肽的多核苷酸。融合多肽和融合蛋白指代具有至少两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个多肽片段的多肽。
在另一个实施例中，可以将两个或更多个多肽表达为包括如本文中其它地方所公开的一个或多个自切割多肽序列的融合蛋白。
融合多肽可以包括一个或多个多肽结构域或片段，包含但不限于信号肽、细胞渗透性肽结构域(CPP)、DNA结合结构域、核酸酶结构域、染色质重塑结构域、组蛋白修饰结构域、表观遗传修饰结构域、外结构域(exodomain)、细胞外配体结合结构域、抗原结合结构域、跨膜结构域、细胞内信号传导结构域、多聚化结构域、表位标签(例如，麦芽糖结合蛋白(“MBP”)、谷胱甘肽S转移酶(GST)、HIS6、MYC、FLAG、V5、VSV-G和HA)、多肽连接子以及多肽切割信号。融合多肽通常是C末端连接到N末端，但其也可以是C末端连接到C末端、N末端连接到N末端或N末端连接到C末端。在特定实施例中，融合蛋白的多肽可以采取任何顺序。融合多肽或融合蛋白还可以包含保守修饰的变体、多态变体、等位基因、突变体、子序列和种间同系物，只要保持融合多肽的期望活性即可。融合多肽可以通过化学合成法或通过两个部分之间的化学连接产生或者通常可以使用其它标准技术制备。包括融合多肽的连接的DNA序列可操作地连接到如本文其它地方所公开的适合的转录或转译控制元件。
融合多肽可以任选地包括可以用于连接多肽内的一个或多个多肽或结构域的连接子。肽连接子序列可以用于将任何两个或更多个多肽组分分开足够的距离，以确保每个多肽折叠成其适当的二级结构和三级结构，以便使多肽结构域发挥其期望功能。
示例性连接子包含但不限于以下氨基酸序列：甘氨酸聚合物(G)n；甘氨酸-丝氨酸聚合物(G1-5S1-5)n，其中n是至少为一、二、三、四或五的整数；甘氨酸-丙氨酸聚合物；丙氨酸-丝氨酸聚合物；GGG(SEQ ID NO:3)；DGGGS(SEQ ID NO:4)；TGEKP(SEQ ID NO:5)(参见例如，Liu等人,《美国国家科学院院刊》5525-5530(1997))；GGRR(SEQ ID NO:6)(Pomerantz等人,1995,同上)；(GGGGS)n，其中n＝1、2、3、4或5(SEQ ID NO:7)(Kim等人,《美国国家科学院院刊》93,1156-1160(1996))；EGKSSGSGSESKVD(SEQ ID NO:8)(Chaudhary等人,1990,《美国国家科学院院刊》87:1066-1070)；KESGSVSSEQLAQFRSLD(SEQ ID NO:9)(Bird等人,1988,《科学(Science)》242:423-426)；GGRRGGGS(SEQ ID NO:10)；LRQRDGERP(SEQ ID NO:11)；LRQKDGGGSERP(SEQ ID NO:12)；LRQKD(GGGS)2ERP(SEQ ID NO:13)。可替代地，可以使用能够建模DNA结合位点和肽本身两者的计算机程序(Desjarlais和Berg,《美国国家科学院院刊》90:2256-2260(1993))或通过噬菌体显示法来合理地设计柔性连接子。
融合多肽可以进一步包括本文所描述的多肽结构域中的每个多肽结构域之间或内源性开放阅读框与供体修复模板编码的多肽之间的多肽切割信号。另外，可以将多肽切割位点置于任何连接子肽序列中。示例性多肽切割信号包含多肽切割识别位点，如蛋白酶切割位点、核酸酶切割位点(例如，稀有限制酶识别位点、自切割核酶识别位点)和自切割病毒寡肽(参见deFelipe和Ryan,2004《转运(Traffic)》,5(8)；616-26)。
合适的蛋白酶切割位点和自切割肽对于本领域的技术人员来说是已知的(参见例如，Ryan等人,1997《通用病毒学杂志(J.Gener.Virol.)》78,699-722；Scymczak等人(2004)《自然生物科技(Nature Biotech.)》5,589-594)。示例性蛋白酶切割位点包含但不限于以下的切割位点：马铃薯Y病毒NIa蛋白酶(例如，烟草蚀斑病毒蛋白酶)、马铃薯Y病毒HC蛋白酶、马铃薯Y病毒P1(P35)蛋白酶、byo病毒NIa蛋白酶、byo病毒RNA-2编码蛋白酶、口蹄疫病毒L蛋白酶、肠病毒2A蛋白酶、鼻病毒2A蛋白酶、小rna 3C蛋白酶、豇豆花叶病毒24K蛋白酶、线虫传多面体病毒24K蛋白酶、RTSV(水稻东格鲁球状病毒)3C样蛋白酶、PYVF(欧防风黄点病毒)3C样蛋白酶、肝素、凝血酶、因子Xa和肠激酶。在一个实施例中，由于TEV(烟草蚀纹病毒)蛋白酶切割位点的切割严格度高，所以优选TEV蛋白酶切割位点，例如EXXYXQ(G/S)(SEQID NO:14)，例如ENLYFQG(SEQ ID NO:15)和ENLYFQS(SEQ ID NO:16)，其中X表示任何氨基酸(由TEV进行的切割发生在Q与G或Q与S之间)。
在某些实施例中，自切割多肽位点包括2A或2A样位点、序列或结构域(Donnelly等人,2001《通用病毒学杂志(J.Gener.Virol.)》82:1027-1041))。在特定实施例中，病毒2A肽是口疮病毒2A肽、马铃薯Y病毒2A肽或心脏病毒2A肽。
在各个实施例中，通过一个或多个蛋白质去稳定序列或蛋白质降解序列(降解决定子)来调节本文所设想的多肽或融合多肽的表达或稳定性。本文中设想了用于使蛋白质去稳定以执行其蛋白酶体迅速周转的几种策略。
蛋白质去稳定序列的说明性实例包含但不限于：去稳定框(destabilizationbox)(D框)，细胞周期依赖性蛋白质中存在必须经历迅速并且完整的泛素介导的蛋白酶解以在细胞周期内实现循环的九氨基酸(参见例如，Yamano等人,1998《欧洲分子生物学杂志(Embo J)》17:5670-8)；KEN框，由Cdh1靶向的APC识别信号(参见例如，Pfleger等人,2000《基因与发育(Genes Dev)》14:655-65)；O框，存在于起点识别复合物蛋白1(ORC1)中的基序，所述基序在M期结束时并且贯穿大部分G1通过由Fzr/Cdh1活化的后期促进复合物(APC)降解(参见例如，Araki等人,2005《基因与发育》19(20):2458-2465)；A框，存在于Aurora-A中的基序，所述基序在有丝分裂退出期间通过Cdh1降解(参见例如，Littlepage等人,2002《基因与发育》16:2274-2285)；PEST结构域，富集于脯氨酸(P)、谷氨酸(E)、丝氨酸(S)和苏氨酸(T)中并且靶向用于蛋白酶体迅速破坏的蛋白质的基序(Rechsteiner等人,1996《生物化学科学趋势(TrensBiochem Sci.)》21(7):267-271)；N端规则基序、N降解决定子基序和泛素融合降解(UFD)基序，所述基序被迅速处理以用于蛋白酶体破坏(参见例如，Dantuma等人,2000《自然生物科技》18:538-4)。
适合用于特定实施例中的降解决定子的进一步说明性实例包含但不限于配体可控降解决定子和温度可调降解决定子。配体可控降解决定子的非限制性实例包括通过盾1(Shield 1)稳定(参见例如Bonger等人,2011《自然-化学病毒学(Nat Chem Virol.)》7(8):531-537)、通过生长素去稳定(参见例如，Nishimura等人,2009《自然方法(Nat Methods)》6(12):917-922)、以及通过甲氧苄氨嘧啶稳定的配体可控降解决定子(参见例如，Iwamoto等人,2010《生物化学(Chem Biol)》17(9):981-8)。
温度可调降解决定子的非限制性实例包含但不限于DHFRTS降解决定子(参见例如，Dohmen等人,1994《科学》263(5151):1273-1276)。
在特定实施例中，本文所设想的多肽包括选自由以下组成的组的一个或多个降解序列：D框、O框、A框、KEN基序、PEST基序、周期素A和UFD结构域/底物、配体可控降解决定子和温度可调降解决定子。
D.多核苷酸
如本文所使用的，术语“多核苷酸”或“核酸”指代脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)和DNA/RNA杂交体。多核苷酸可以是单链或双链以及重组、合成或分离的。多核苷酸包含但不限于：前信使RNA(前mRNA)、信使RNA(mRNA)、RNA、短干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA(shRNA)、微RNA(miRNA)、核酶、合成RNA、基因组RNA(gRNA)、正链RNA(RNA(+))、负链RNA(RNA(-))、tracrRNA、crRNA、单导RNA(sgRNA)、合成RNA、基因组DNA(gDNA)、PCR扩增DNA、互补DNA(cDNA)、合成DNA或重组DNA。多核苷酸指代长度为至少5个、至少10个、至少15个、至少20个、至少25个、至少30个、至少40个、至少50个、至少100个、至少200个、至少300个、至少400个、至少500个、至少1000个、至少5000个、至少10000个或至少15000个或更多个核苷酸以及所有中间长度的核苷酸的聚合形式，或者是核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸或者是任一类型核苷酸的修饰形式。容易理解的是，在此上下文中，“中间长度”指代所引用值之间的任何长度，如6、7、8、9等，101、102、103等；151、152、153等；201、202、203等。在特定实施例中，多核苷酸或变体与参考序列具有至少或约50％、55％、60％、65％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。
在特定实施例中，多核苷酸可以是密码子优化的。如本文所使用的，术语“密码子优化的”指代取代编码多肽的多核苷酸中的密码子以增加多肽的表达、稳定性和/或活性。影响密码子优化的因素包含但不限于以下中的一种或多种：(i)两个或更多个生物体或基因或通过合成构造的偏倚表格之间的密码子偏倚的变化；(ii)生物体、基因或基因组内的密码子偏倚度的变化；(iii)密码子的系统变化，包含上下文；(iv)密码子根据其解码tRNA的变化；(v)密码子根据GC％总体上或在三联体中的一个位置处的变化；(vi)与参考序列例如天然存在的序列的相似度的变化；(vii)密码子频率截止的变化；(viii)从DNA序列转录的mRNA的结构性质；(ix)关于设计密码子取代组所基于的DNA序列的功能的先验知识；和/或(x)每个氨基酸的密码子组的系统变化。
多核苷酸的说明性实例包含但不限于SEQ ID NO:1-2中所阐述的多核苷酸序列。
在各个说明性实施例中，本文所设想的多核苷酸包含但不限于包括表达载体、病毒载体、转移质粒、表达盒的多核苷酸和编码α-L艾杜糖醛酸酶(IDUA)多肽的多核苷酸。
α-L艾杜糖醛酸酶(IDUA)基因编码IDUA(也称为MPS I和IDA)，所述IDUA是蛋白质的硫酸酯酶家族的成员。通常，人类IDUA蛋白以前体形式产生。人类IDUA为653个氨基酸并且包含信号肽(1-26)、(β/α)8TIM桶结构域(42-396)、具有短螺旋-环-螺旋结构域(482-508)的β-夹心结构域(β-sandwich domain)(27-42和397-545)和Ig样结构域(546-642)。IDUA水解两种糖胺聚糖、硫酸皮肤素和硫酸乙酰肝素的末端α-L-艾杜糖醛酸残基。这种水解是这些糖胺聚糖的溶酶体降解所必需的。此基因中造成酶缺乏的突变导致常染色体隐性病I型黏多糖贮积症(MPS I)。此基因的突变与常染色体隐性溶酶体贮积病I型黏多糖贮积症相关。
如本文所使用的，术语“多核苷酸变体”和“变体”等指代显示出与参考多核苷酸序列或在严格条件下与参考序列杂交的多核苷酸具有实质序列同一性的多核苷酸。这些术语还涵盖通过添加、缺失、取代或修饰至少一个核苷酸而区别于参考多核苷酸的多核苷酸。因此，术语“多核苷酸变体”和“变体”包含其中已添加或缺失、或修饰或用不同核苷酸替换一个或多个核苷酸的多核苷酸。在此方面，本领域中充分理解的是，可以对参考多核苷酸作出包括突变、添加、缺失以及取代在内的某些改变，由此所改变的多核苷酸保留所述参考多核苷酸的生物功能或活性。
如本文所使用的，陈述“序列同一性”或例如包括“与……50％相同的序列”指代序列在一个比较窗口内在逐核苷酸的基础上或在逐氨基酸的基础上相同的程度。因此，“序列同一性百分比”可以通过以下来计算：在比较窗口内比较两个经过最佳比对的序列，确定相同的核酸碱基(例如，A、T、C、G、I)或相同的氨基酸残基(例如，Ala、Pro、Ser、Thr、Gly、Val、Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、Lys、Arg、His、Asp、Glu、Asn、Gln、Cys和Met)出现在这两个序列中的位置的数目以产生匹配位置的数目，用匹配位置的数目除以比较窗口中的位置的总数(即，窗口大小)，以及将结果乘以100以产生序列同一性百分比。包含与本文所描述的参考序列中的任何参考序列具有至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的核苷酸和多肽，通常其中多肽变体保持参考多肽的至少一种生物活性。
如本文所使用的，“分离的多核苷酸”指代已经从在天然存在状态下与其侧接的序列中纯化的多核苷酸，例如已经从通常邻接于其的序列中移除的DNA片段。在特定实施例中，“分离的多核苷酸”指代互补DNA(cDNA)、重组多核苷酸、合成多核苷酸或并不天然存在但已经通过人工制成的其它多核苷酸。
描述多核苷酸的朝向的术语包含：5'(通常是具有自由磷酸基的多核苷酸的端)和3'(通常是具有自由羟基(OH)的多核苷酸的端)。多核苷酸序列可以注释以5'-3'朝向或3'-5'朝向。对于DNA和mRNA，5'-3'链被命名为“有义”、“正”或“编码”链，因为其序列与前信使(前mRNA)的序列相同[RNA中的尿嘧啶(U)而非DNA中的胸腺嘧啶(T)除外]。对于DNA和mRNA，作为通过RNA聚合酶转录的链的3'-5'互补链被命名为“模板”、“反义”、“负”或“非编码”链。如本文所使用的，术语“相反朝向”指代以3'-5'朝向书写的5'-3'序列或以5'-3'朝向书写的3'-5'序列。
术语“互补”和“互补性”指代通过碱基配对规则相关的多核苷酸(即，核苷酸序列)。例如，DNA序列5'A G T C A T G 3'的互补链是3'T C A G T A C 5'。后一个序列常常写成左边为5'端并且右边为3'端的相反补体5'C A T G A C T 3'。与其相反补体相等的序列被称为回文序列。互补性可以是“部分的”，其中核酸的碱基中仅一些碱基根据碱基配对规则是匹配的。或者，在核酸之间可以存在“完全”或“全部”的互补性。
如本文所使用的，术语“核酸盒”或“表达盒”指代载体内的可以表达RNA以及因此多肽的基因序列。在一个实施例中，核酸盒含有所关注的一个或多个基因，例如，所关注的一个或多个多核苷酸。在另一个实施例中，核酸盒含有一个或多个表达控制序列，例如启动子、增强子、poly(A)序列和所关注的一个或多个基因，例如所关注的一个或多个多核苷酸。载体可以包括一个、两个、三个、四个、五个或更多个核酸盒。核酸盒在载体内在位置和顺序上被朝向为使得可以将盒中的核酸转录成RNA并在必要时转译成蛋白质或多肽、经历在经过转化的细胞中具有活性所需的适当的转译后修饰并且通过靶向适合的细胞内区室或分泌到细胞外区室中而移位到适合的区室中以实现生物活性。优选地，盒使其3'端和5'端适于准备好插入到载体中，例如其在每个端处具有限制性核酸内切酶位点。在优选实施例中，核酸盒含有用于治疗、预防或减轻遗传性病状的治疗基因序列。盒可以作为单个单元移除和插入到质粒或病毒载体中。
如本文所使用的，术语“所关注的一个或多个多核苷酸”指代插入到期望表达的表达载体中的一个或多个多核苷酸，例如，编码多肽(即，所关注的多肽)的多核苷酸。在优选实施例中，本发明的载体和/或质粒包括所关注的一个或多个多核苷酸，例如编码IDUA多肽的多核苷酸。在某些实施例中，所关注的多核苷酸对在治疗、预防或减轻神经元蜡样脂褐质沉积症方面提供治疗效果的多肽进行编码，所述多肽可被称为“治疗多肽”，例如编码IDUA多肽的多核苷酸。
在某些实施例中，所关注的多核苷酸包括抑制性多核苷酸，包含但不限于crRNA、tracrRNA、单向导RNA(sgRNA)、siRNA、miRNA、shRNA、核酶或另一种抑制性RNA。
不管编码序列自身的长度如何，多核苷酸可以与如本文其它地方公开的或如本领域中熟知的其它DNA序列组合，如启动子和/或增强子、未转译区(UTR)、Kozak序列、多腺苷酸化信号、另外的限制酶位点、多个克隆位点、内部核糖体进入位点(IRES)、重组酶识别位点(例如，LoxP、FRT和Att位点)、终止密码子、转录终止信号、转录后应答元件以及编码自切割多肽的多核苷酸、表位标签，使得其整体长度可以显著变化。因此，设想可以采用几乎任何长度的多核苷酸片段，其中总长度优选地受限于制备的容易性和在预期重组DNA方案中的使用。
可以使用本领域中熟知并且可获得的各种既定技术来制备、操纵、表达和/或递送多核苷酸。为了表达期望的多肽，可以降编码多肽的核苷酸序列插入到适合的载体中。
载体的说明性实例包含但不限于质粒、自主复制序列和可转座元件，例如睡美人(Sleeping Beauty)、PiggyBac。
载体的另外的说明性实例包含但不限于质粒、噬菌粒、粘粒、如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或源自P1的人工染色体(PAC)等人工染色体、如λ噬菌体或M13噬菌体等细菌噬菌体以及动物病毒。
可用作载体的病毒的说明性实例包含但不限于逆转录病毒(包含慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(例如，单纯性疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒和乳多空病毒(例如，SV40)。
表达载体的说明性实例包含但不限于：用于在哺乳动物细胞中表达的pClneo载体(普洛麦格公司(Promega))；用于慢病毒介导的基因转移和在哺乳动物细胞中表达的pLenti4/V5-DESTTM、pLenti6/V5-DESTTM和pLenti6.2/V5-GW/lacZ(英杰公司(Invitrogen))。在特定实施例中，本文所公开的多肽的编码序列可以连接到此类表达载体中以在哺乳动物细胞中表达多肽。
在特定实施例中，载体是附加型载体或保持在染色体外的载体。如本文所使用的，术语“附加型”指代能够复制而不整合到宿主的染色体DNA中并且不会从分裂的宿主细胞中逐渐丧失的载体，这还意味着所述载体在染色体外或附加地复制。
表达载体中存在的“表达控制序列”、“控制元件”或“调节序列”是载体的那些非转译区——复制起点、选择盒、启动子、增强子、转译起始信号(夏因达尔加诺(ShineDalgarno)序列或Kozak序列)内含子、转录后调节元件、多腺苷酸化序列、5'和3'未转译区——其与宿主细胞蛋白交互以进行转录和转译。此类元件的长度和特异性可能有所不同。根据所利用的载体系统和宿主，可以使用任何数量的适合的转录和转译元件，包含普遍存在的启动子和诱导型启动子。
在特定实施例中，多核苷酸是包含但不限于表达载体和病毒载体的载体并且包含外源性、内源性或异源性控制序列，如启动子和/或增强子。“内源性”控制序列是天然连接到基因组中的给定基因的序列。“外源性”控制序列是通过基因操纵(即，分子生物技术)被放置成与基因并置，使得所述基因的转录由所连接的增强子/启动子引导的控制序列。“异源性”控制序列是来自与被基因操纵的细胞不同的物种的外源性序列。“合成”控制序列可以包括一个或多个内源性和/或外源性序列的元件和/或为特定基因治疗提供最佳启动子和/或增强子活性的在体外或经由计算机模拟确定的序列。
如本文所使用的，术语“启动子”指代RNA聚合酶结合到的多核苷酸(DNA或RNA)的识别位点。RNA聚合酶引发并转录可操作地连接到启动子的多核苷酸。在特定实施例中，哺乳动物细胞中可操作的启动子包括定位在引发转录的位点上游大约25个到30个碱基处的AT富含区和/或发现于距离转录起始点上游70个到80个碱基处的另一个序列，即CNCAAT区，其中N可以是任何核苷酸。
术语“增强子”指代含有能够提供增强的转录并且在一些情况下可以不依赖于其相对于另一个控制序列的朝向而起作用的序列的DNA片段。增强子可以与启动子和/或另一个增强子元件协作地或加性地起作用。术语“启动子/增强子”指代含有能够提供启动子功能和增强子功能两者的序列的DNA片段。
术语“可操作地连接”指代并置，其中所描述的组分处于允许所述组分按其预期方式起作用的关系。在一个实施例中，所述术语指代核酸表达控制序列(如启动子和/或增强子)与第二多核苷酸序列，例如所关注的多核苷酸，之间的功能性连接，其中表达控制序列引导与第二序列相对应的核酸的转录。
如本文所使用的，术语“组成型表达控制序列”指代不断地或连续地允许可操作连接的序列的转录的启动子、增强子或启动子/增强子。组成型表达控制序列可以是允许在各种各样的细胞和组织类型中表达的“普遍存在的”启动子、增强子或启动子/增强子或分别允许在受限种类的细胞和组织类型中表达的“细胞特异性”、“细胞类型特异性”、“细胞谱系特异性”或“组织特异性”启动子、增强子或启动子/增强子。
适合在特定实施例中使用的说明性普遍存在的表达控制序列包含但不限于巨细胞病毒(CMV)立即早期启动子、病毒性猿猴病毒40(SV40)(例如，早期或晚期)、莫洛尼氏鼠白血病病毒(MoMLV)LTR启动子、劳斯肉瘤病毒(RSV)LTR、单纯性疱疹病毒(HSV)(胸苷激酶)启动子、来自牛痘病毒的H5、P7.5和P11启动子、短延伸因子1-α(EF1a-短)启动子、长延伸因子1-α(EF1a-长)启动子、早期生长应答1(EGR1)、铁蛋白H(FerH)、铁蛋白L(FerL)、3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)、真核转译起始因子4A1(EIF4A1)、热休克70kDa蛋白5(HSPA5)、热休克蛋白90kDaβ、成员1(HSP90B1)、热休克蛋白70kDa(HSP70)、β-驱动蛋白(β-KIN)、人类ROSA26基因座(Irions等人,《自然生物科技》25,1477-1482(2007))、泛素C启动子(UBC)、磷酸甘油酸激酶-1(PGK)启动子、巨细胞病毒增强子/鸡β-肌动蛋白(CAG)启动子、β-肌动蛋白启动子和骨髓增生性肉瘤病毒增强子阴性对照区缺失并且dl587rev引物结合位点取代的(MND)启动子(Challita等人,《病毒学杂志(J Virol.)》69(2):748-55(1995))。
在特定实施例中，可以期望使用细胞、细胞类型、细胞谱系或组织特异性表达控制序列来实现期望的多核苷酸序列的细胞类型特异性、谱系特异性或组织特异性表达(例如，以在仅细胞类型、细胞谱系或组织的子集中或在具体发育阶段期间表达编码多肽的特定核酸)。
组织特异性启动子的说明性实例包含但不限于：B29启动子(B细胞表达)、runt转录因子(CBFa2)启动子(干细胞特异性表达)、CD14启动子(单核细胞细胞表达)、CD43启动子(白细胞和血小板表达)、CD45启动子(造血细胞表达)、CD68启动子(巨噬细胞表达)、CYP4503A4启动子(肝细胞表达)、结蛋白启动子(肌肉表达)、弹性蛋白酶1启动子(胰腺腺泡细胞表达)、内皮糖蛋白启动子(内皮细胞表达)、成纤维细胞特异性蛋白1启动子(FSP1)启动子(成纤维细胞细胞表达)、纤连蛋白启动子(成纤维细胞细胞表达)、fms相关酪氨酸激酶1(FLT1)启动子(内皮细胞表达)、胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)启动子(星形细胞表达)、胰岛素启动子(胰腺β细胞表达)、整合素、α2b(ITGA2B)启动子(巨核细胞)、细胞间粘附分子2(ICAM-2)启动子(内皮细胞)、干扰素β(IFN-β)启动子(造血细胞)、角蛋白5启动子(角化细胞表达)、肌红蛋白(MB)启动子(肌肉表达)、成肌分化1(MYOD1)启动子(肌肉表达)、肾病蛋白启动子(足细胞表达)、骨γ-羧基谷氨酸蛋白2(OG-2)启动子(成骨细胞表达)、3-酮酸CoA转移酶2B(Oxct2B)启动子(单倍体-精子细胞表达)、表面活性蛋白B(SP-B)启动子(肺表达)、突触蛋白启动子(神经元表达)、威斯科特-奥尔德里奇综合征(Wiskott-Aldrich syndrome)蛋白(WASP)启动子(造血细胞表达)。
如本文所使用的，“条件表达”可以指任何类型的条件表达，包含但不限于：诱导型表达；可阻遏型表达；在具有特定生理、生物或疾病状态等的细胞或组织中的表达。此定义不旨在排除细胞类型或组织特异性表达。某些实施例提供了所关注的多核苷酸的条件表达，例如，表达通过使细胞、组织、生物体等经受使多核苷酸被表达或使所关注的多核苷酸编码的多核苷酸的表达增加或减少的处理或条件来控制。
诱导型启动子/系统的说明性实例包含但不限于类固醇诱导型启动子，如编码糖皮质激素或雌性激素受体的基因的启动子(可通过用相应激素处理来诱导)、金属硫蛋白启动子(可通过用各种重金属处理来诱导)、MX-1启动子(可通过干扰素诱导)、“基因开关(GeneSwitch)”米非司酮可调系统(Sirin等人,2003,《基因(Gene)》,323:67)、cumate诱导型基因开关(WO 2002/088346)、四环素依赖性调节系统等。
还可以通过使用位点特异性DNA重组酶来实现条件表达。根据某些实施例，多核苷酸包括至少一个(通常两个)用于位点特异性重组酶介导的重组的位点。如本文所使用的，术语“重组酶”或“位点特异性重组酶”包含切除或整合蛋白、酶、辅因子或在涉及一个或多个重组位点(例如，两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个)的重组反应中涉及的相关蛋白质，所述相关蛋白质可以是野生型蛋白质(参见Landy,《生物技术时论(Current Opinion in Biotechnology)》3:699-707(1993))或其突变体、衍生物(例如，含有重组蛋白序列或其片段的融合蛋白)、片段和变体。适合于在特定实施例中使用的重组酶的说明性实例包含但不限于：Cre、Int、IHF、Xis、Flp、Fis、Hin、Gin、ΦC31、Cin、Tn3解离酶、TndX、XerC、XerD、TnpX、Hjc、Gin、SpCCE1和ParA。
多核苷酸可以包括各种各样的位点特异性重组酶中的任何位点特异性重组酶的一个或多个重组位点。应理解，位点特异性重组酶的靶位点是整合载体，例如逆转录载体或慢病毒载体，所需的任何一个或多个位点的补充。如本文所使用的，术语“重组序列”、“重组位点”或“位点特异性重组位点”指代重组酶识别和结合的特定核酸序列。
例如，Cre重组酶的一个重组位点是loxP，所述loxP是包括侧接8碱基对核心序列的具两个13碱基对反向重复序列(充当重组酶结合位点)的34碱基对序列(参见Sauer,B.,《生物技术时论》5:521-527(1994)的图1)。其它说明性loxP位点包含但不限于：lox511(Hoess等人,1996；Bethke和Sauer,1997)、lox5171(Lee和Saito,1998)、lox2272(Lee和Saito,1998)、m2(Langer等人,2002)、lox71(Albert等人,1995)以及lox66(Albert等人,1995)。
FLP重组酶的适当识别位点包含但不限于：FRT(McLeod等人,1996)；F1、F2、F3(Schlake和Bode,1994)；F4、F5(Schlake和Bode,1994)；FRT(LE)(Senecoff等人,1988)；FRT(RE)(Senecoff等人,1988)。
识别序列的其它实例为通过重组酶λ整合酶，例如phi-c31，识别的attB、attP、attL和attR序列。SSR仅介导异型位点attB(长度为34bp)与attP(长度为39bp)之间的重组(Groth等人,2000)。分别针对细菌基因组和噬菌体基因组上的噬菌体整合酶的附接位点命名的attB和attP均含有通过同源二聚体相似地结合的不完美反向重复序列(Groth等人,2000)。产物位点attL和attR对于介导的进一步重组具有有效惰性(Belteki等人,2003)，从而使应答不可逆。对于催化插入，已经发现，携带attB的DNA插入到基因组attP位点中比attP位点插入到基因组attB位点中更容易(Thyagarajan等人,2001；Belteki等人,2003)。因此，典型的策略通过同源重组将携带attP的“对接位点”定位到限定的基因座中，然后所述基因座与携带attB的进入序列配合以便插入。
在特定实施例中，为了实现多个多肽中的每一个多肽的有效转译，可以通过一个或多个IRES序列或编码自切割多肽的多核苷酸序列来分离多核苷酸序列。
如本文所使用的，“内部核糖体进入位点”或“IRES”指代促进内部核糖体直接进入顺反子(蛋白编码区)的如ATG等起始密码子由此导致基因的非帽依赖性转译的元件。参见例如，Jackson等人,1990《生物化学科学趋势》15(12):477-83以及Jackson和Kaminski1995《RNA》1(10):985-1000。本领域的技术人员通常采用的IRES的实例包含美国专利第6,692,736号中所描述的IRES。本领域已知的“IRES”的进一步实例包含但不限于可从小核糖核酸病毒(Jackson等人,1990)获得的IRES以及可从病毒或细胞mRNA源获得的IRES，所述病毒或细胞mRNA源如例如免疫球蛋白重链结合蛋白(BiP)、血管内皮生长因子(VEGF)(Huez等人,1998《分子细胞生物学(Mol.Cell.Biol)》18(11):6178-6190)、成纤维细胞生长因子2(FGF-2)和胰岛素样生长因子(IGFII)、可转译起始因子eIF4G和酵母转录因子TFIID和HAP4、可从诺瓦根公司(Novagen)商购获得的脑心肌炎病毒(EMCV)(Duke等人,1992《病毒学杂志》66(3):1602-9)以及VEGF IRES(Huez等人,1998《分子细胞生物学》18(11):6178-90)。已经报道了小核糖核酸病毒科(Picornaviridae)、二顺反子病毒科(Dicistroviridae)和黄病毒科(Flaviviridae)物种的病毒基因组中以及HCV、弗里德鼠白血病病毒(Friendmurine leukemia virus，FrMLV)和莫洛尼氏鼠白血病病毒(Moloney murine leukemiavirus，MoMLV)中的IRES。
在一个实施例中，本文设想的多核苷酸中使用的IRES是EMCV IRES。
在特定实施例中，多核苷酸包括具有共有Kozak序列并编码期望多肽的多核苷酸。如本文所使用的，术语“Kozak序列”指代大大促进mRNA与核糖体的小亚单元的初始结合并增加转译的短核苷酸序列。共有Kozak序列是(GCC)RCCATGG(SEQ ID NO：17)，其中R是嘌呤(A或G)(Kozak,1986《细胞(Cell)》44(2):283-92以及Kozak,1987《核酸研究(NucleicAcids Res.)》15(20):8125-48)。
引导异源核酸转录物的高效终止和多腺苷酸化的元件增加异源基因表达。转录终止信号通常存在于多腺苷酸化信号的下游。在特定实施例中，载体包括对待表达的多肽进行编码的多核苷酸的3'处的多腺苷酸化序列。如本文所使用的术语“polyA位点”或“polyA序列”表示通过RNA聚合酶II引导新生RNA转录物的终止和多腺苷酸化二者的DNA序列。多腺苷酸化序列可以通过向编码序列的3'端添加polyA尾来促进mRNA稳定性，并且因此有助于提高转译效率。重组转录物的高效多腺苷酸化是期望的，因为缺乏polyA尾的转录物不稳定并且被快速降解。可以在载体中使用的polyA信号的说明性实例包含理想的polyA序列(例如，AATAAA、ATTAAA、AGTAAA)、牛生长激素polyA序列(BGHpA)、兔β-球蛋白polyA序列(rβgpA)或本领域已知的另一种适合的异源或同源polyA序列。
在一些实施例中，多核苷酸或含有多核苷酸的细胞利用自杀基因，包含用于减小直接毒性和/或不受控制的增殖的风险的诱导型自杀基因。在具体实施例中，自杀基因对含有多核苷酸或细胞的宿主不产生免疫性。可以使用的自杀基因的某个实例是半胱天冬酶-9或半胱天冬酶-8或胞嘧啶脱氨酶。可以使用特定的二聚化学诱导剂(CID)来活化半胱天冬酶-9。
在某些实施例中，多核苷酸包括使本文所设想的经过基因修饰的细胞易于在体内经历阴性选择的基因片段。“阴性选择”指代可能由于个体的体内条件的改变而被消除的所输注细胞。阴性可选择表型可以由对所施用药剂，例如化合物，赋予敏感性的基因的插入而产生。阴性选择基因在本领域中是熟知的并且包含但不限于：赋予更昔洛韦(ganciclovir)敏感性的单纯疱疹病毒I型胸苷激酶(HSV-I TK)基因；细胞次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶(HPRT)基因、细胞腺嘌呤磷酸核糖基转移酶(APRT)基因和细菌胞嘧啶脱氨酶。
在一些实施例中，经过基因修饰的细胞包括多核苷酸，所述多核苷酸进一步包括能够在体外选择阴性可选择表型的细胞的阳性标志物。阳性可选择标志物可以是某种基因，所述基因在被引入到宿主细胞中后表达允许对携带所述基因的细胞的阳性选择的显性表型。此类型的基因在本领域中是已知的，并且包含但不限于：赋予对潮霉素B的抗性的潮霉素-B磷酸转移酶基因(hph)、来自为对抗生素G418的抗性指定遗传代码的Tn5的氨基糖苷磷酸转移酶基因(neo或aph)、二氢叶酸还原酶(DHFR)基因、腺苷脱氨酶基因(ADA)以及多耐药性(MDR)基因。
在一个实施例中，阳性可选择标志物和阴性可选择元件连接，使得阴性可选择元件的丧失也必然伴随着阳性可选择标志物的丧失。在特定实施例中，阳性可选择标志物和阴性可选择标志物融合，使得一者的丧失必然导致另一者的丧失。作为表达产物产生赋予上文所描述的期望阳性选择特征和阴性选择特征的多肽的融合多核苷酸的实例是潮霉素磷酸转移酶胸苷激酶融合基因(HyTK)。此基因的表达产生赋予对体外阳性选择的潮霉素B抗性以及对体内阴性选择的更昔洛韦敏感性的多肽。还参见S.D.Lupton的公开案PCTUS91/08442和PCT/US94/05601，其描述了使用通过将显性阳性可选择标志物与阴性可选择标志物融合产生的双功能可选择融合基因。
优选的阳性可选择标志物源自选自由hph、nco和gpt组成的组的基因，并且优选的阴性可选择标志物源自由胞嘧啶脱氨酶、HSV-I TK、VZV TK、HPRT、APRT和gpt组成的组的基因。特定实施例中设想的示例性双功能可选择融合基因包含但不限于这样的基因：其中阳性可选择标志物源自hph或neo并且阴性可选择标志物源自胞嘧啶脱氨酶或者TK基因或可选择标志物。
术语“载体”在本文中用于指代能够转移或转运另一个核酸分子的核酸分子。被转移的核酸通常连接到，例如插入到，载体核酸分子中。载体可以包含引导细胞中的自主复制的序列或可以包含足以允许整合到宿主细胞DNA中的序列。载体的说明性实例包含但不限于质粒(例如，DNA质粒或RNA质粒)、转座子、粘粒、细菌人工染色体和病毒载体。
递送特定实施例中设想的多核苷酸的说明性方法包含但不限于：电穿孔、声致穿孔、脂质转染、显微注射、基因枪法、病毒体、脂质体、免疫脂质体、聚阳离子或脂质:核酸共轭物、裸DNA、人工病毒粒子、DEAE-右旋糖酐介导的转移、基因枪和热休克。
在特定实施例中所设想的适合在特定实施例中使用的多核苷酸递送系统的说明性实例包含但不限于由阿马夏生物系统公司(Amaxa Biosystems)、马克赛特公司(Maxcyte,Inc.)、BTX分子递送系统公司(BTX Molecular Delivery Systems)和哥白尼治疗公司(Copernicus Therapeutics Inc.)提供的系统。脂质转染试剂是商业销售的(例如，TransfectamTM和LipofectinTM)。已经在文献中描述了适合于多核苷酸的高效受体识别脂质转染的阳离子脂质和中性脂质。参见例如，Liu等人(2003)《基因治疗(Gene Therapy)》10:180-187；以及Balazs等人(2011)《药物递送杂志(Journal of Drug Delivery)》2011:1-12。在特定实施例中还设想了抗体靶向的、源自细菌的、基于无生命纳米细胞的递送。
在优选实施例中，可以通过病毒法将编码一个或多个治疗多肽或融合多肽的多核苷酸引入到靶细胞中。
E.病毒载体
可以通过非病毒法或病毒法将编码一个或多个治疗多肽或融合多肽的多核苷酸引入到靶细胞中。在特定实施例中，使用载体，优选地病毒载体，更优选地逆转录病毒载体并且甚至更优选地慢病毒载体将编码IDUA多肽的多核苷酸引入到靶细胞中。
如对于本领域技术人员显而易见的是，术语“病毒载体”广泛用于指代包含通常促进核酸分子转移或整合到细胞的基因组中的病毒源性核酸元件的核酸分子(例如，转移质粒)或指代介导核酸转移的病毒或病毒颗粒。病毒颗粒通常将包含各种病毒组分并且有时还包含除了一个或多个核酸之外的宿主细胞组分。
在特定实施例中设想的适合在特定实施例中使用的病毒载体系统的说明性实例包含但不限于用于基因转移的腺相关病毒(AAV)、逆转录病毒、单纯性疱疹病毒、腺病毒、牛痘病毒。
逆转录病毒是用于基因递送的常见工具(Miller,2000,《自然(Nature)》357:455-460)。如本文所使用的，术语“逆转录病毒”指代一种RNA病毒，所述RNA病毒将其基因组RNA逆转录为线性双链DNA拷贝并且随后将其基因组DNA共价整合到宿主基因组中。一旦病毒整合到宿主基因组中，其就被称为“前病毒”。前病毒充当RNA聚合酶II的模板并且引导对产生新的病毒颗粒所需的结构蛋白质和酶进行编码的RNA分子的表达。
适合用于特定实施例的说明性逆转录病毒包含但不限于：莫洛尼氏鼠白血病病毒(M-MuLV)、莫洛尼氏鼠肉瘤病毒(MoMSV)、哈维鼠肉瘤病毒(HaMuSV)、鼠乳腺肿瘤病毒(MuMTV)、长臂猿白血病病毒(GaLV)、猫白血病病毒(FLV)、泡沫病毒、弗里德鼠白血病病毒、鼠干细胞病毒(MSCV)和劳斯肉瘤病毒(RSV)以及慢病毒。
如本文所使用的，术语“慢病毒”指代复杂逆转录病毒的组(或属)。说明性慢病毒包含但不限于：HIV(人类免疫缺陷病毒；包含HIV 1型和HIV 2型)；维斯纳-梅迪病毒(VMV)病毒；山羊关节炎-脑炎病毒(CAEV)；马传染性贫血病毒(EIAV)；猫免疫缺陷病毒(FIV)；牛免疫缺陷病毒(BIV)；以及猿猴免疫缺陷病毒(SIV)。在一个实施例中，优选基于HIV的载体主链(即，HIV顺式作用序列元件)。在特定实施例中，使用慢病毒将编码IDUA多肽的多核苷酸递送到细胞。
术语病毒载体可以指代能够将核酸转移到细胞中的病毒或病毒颗粒或指代被转移的核酸本身。病毒载体和转移质粒含有主要源自病毒的结构和/或功能遗传元件。术语“逆转录病毒载体”指代含有主要源自逆转录病毒的结构和功能遗传元件或其部分的病毒载体或质粒。术语“慢病毒载体”指代含有主要源自慢病毒的结构和功能遗传元件或其部分(包含LTR)的病毒载体或质粒。术语“杂交载体”指代含有逆转录病毒(例如慢病毒)序列和非慢病毒病毒序列两者的载体、LTR或其它核酸。在一个实施例中，杂交载体指代包括用于逆转录、复制、整合和/或包装的逆转录病毒(例如慢病毒)序列的载体或转移质粒。
在特定实施例中，可以使用术语“慢病毒载体”、“慢病毒表达载体”来指代慢病毒转移质粒和/或传染性慢病毒颗粒。当本文中引用如克隆位点、启动子、调节元件、异源核酸等元件时，应理解，这些元件的序列以RNA形式存在于慢病毒颗粒中并且以DNA形式存在于DNA质粒中。
在各个实施例中，本文所设想的慢病毒载体包括一个或多个LTR以及以下附属元件中的一种或多种或全部：cPPT/FLAP、Psi(Ψ)包装信号、输出元件、可操作地连接到编码IDUA多肽的启动子、poly(A)序列，并且可以任选地包括WPRE或HPRE、隔离子元件、可选择标志物和细胞自杀基因，如本文其它地方讨论的。
在特定实施例中，本文所设想的慢病毒载体可以是整合的或非整合的或整合缺陷型慢病毒。如本文所使用的，术语“整合缺陷型慢病毒”指代具有缺乏将病毒基因组整合到宿主细胞的基因组中的能力的整合酶的慢病毒。专利申请WO 2006/010834中已经描述了无整合能力的病毒载体，所述专利申请通过引用整体并入本文。
适于减小整合酶活性的HIV-1pol基因的说明性突变包含但不限于：H12N、H12C、H16C、H16V、S81R、D41A、K42A、H51A、Q53C、D55V、D64E、D64V、E69A、K71A、E85A、E87A、D116N、D1161、D116A、N120G、N1201、N120E、E152G、E152A、D35E、K156E、K156A、E157A、K159E、K159A、K160A、R166A、D167A、E170A、H171A、K173A、K186Q、K186T、K188T、E198A、R199c、R199T、R199A、D202A、K211A、Q214L、Q216L、Q221L、W235F、W235E、K236S、K236A、K246A、G247W、D253A、R262A、R263A和K264H。
术语“长末端重复序列(LTR)”指代位于逆转录病毒DNA的末端处的碱基对的结构域，所述结构域在其天然序列环境中是直接重复序列并含有U3、R和U5区。LTR含有包含转录控制元件的多个调节信号、多腺苷酸化信号以及复制和整合病毒基因组所需的序列。与5'LTR相邻的是逆转录基因组(tRNA引物结合位点)和将病毒RNA高效包装成颗粒(Psi位点)所需的序列。
如本文所使用的，术语“包装信号”或“包装序列”、“psi”和符号“Ψ”指代位于逆转录病毒基因组内在病毒颗粒形成期间衣壳化逆转录病毒RNA链所需的非编码序列，参见Clever等人,1995《病毒学杂志》,第69卷,第4期；第2101-2109页。
由于修饰LTR，慢病毒载体优选地含有几种安全性增强。“自身失活”(SIN)载体指代复制缺陷型载体，例如其中被称为U3区的右(3')LTR增强子-启动子区已经被修饰(例如，通过缺失或取代)以防止第一轮病毒复制之外的病毒转录。在进一步实施例中，修饰3'LTR，使得U5区例如被理想的poly(A)序列替代。通过用异源启动子替代5'LTR的U3区来提供另外的安全性增强以驱动病毒颗粒产生期间病毒基因组的转录。可以使用的异源启动子的实例包含例如病毒性猿猴病毒40(SV40)(例如，早期或晚期)、巨细胞病毒(CMV)(例如，立即早期)、莫洛尼氏鼠白血病病毒(MoMLV)、劳斯肉瘤病毒(RSV)和单纯性疱疹病毒(HSV)(胸苷激酶)启动子。典型的启动子能够以非Tat依赖性方式驱动高水平转录。这种替代减小用于产生能够进行复制的病毒的重组的可能性，因为病毒产生系统中不存在完整的U3序列。应注意，还包含对LTR的修饰，如对3'LTR、5'LTR或3'LTR和5'LTR两者的修饰。
如本文所使用的，术语“FLAP元件”或“cPPT/FLAP”指代序列包含逆转录病毒，例如HIV-1和HIV-2，的中心多嘌呤段和中心终止序列(cPPT和CTS)的核酸。在美国专利第6,682,907号和Zennou等人,2000,《细胞》,101:173中描述了适合的FLAP元件。在HIV-1逆转录期间，正链DNA在中心聚嘌呤段(cPPT)处的中心起始和在中心终止序列(CTS)处的中心终止导致形成三链DNA结构：HIV-1中心DNA瓣。尽管不希望受到任何理论的约束，但是DNA瓣可以充当慢病毒基因组核输入的顺式活性决定子和/或可以增加病毒的滴度。在特定实施例中，逆转录病毒或慢病毒载体主链包括载体中的所关注的异源基因上游或下游的一个或多个FLAP元件。例如，在特定实施例中，转移质粒包含FLAP元件。在一个实施例中，载体包括从HIV-1中分离的FLAP元件。在另一个实施例中，慢病毒载体含有在cPPT和/或CTS元件中具有一种或多种突变的FLAP元件。在又另一个实施例中，慢病毒载体包括cPPT或CTS元件。在又另一个实施例中，慢病毒载体不包括cPPT或CTS元件。
术语“输出元件”指代调节RNA转录物从细胞的核到细胞质的转运的顺式作用转录后调节元件。RNA输出元件的实例包含但不限于人类免疫缺陷病毒(HIV)rev应答元件(RRE)(参见例如，Culle等人,1991《病毒学杂志》65:1053；和Culle等人,1991《细胞》58:423)以及乙型肝炎病毒转录后调节元件(HPRE)。
在特定实施例中，通过将转录后调节元件、高效的多腺苷酸化位点和任选地转录终止信号结合到载体中来增加异源序列在病毒载体中的表达。各种转录后调节元件可以增加异源核酸在蛋白质处的表达，例如土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE；Zufferey等人,1999,《病毒学杂志》,73:2886)；乙型肝炎病毒中存在的转录后调节元件(HPRE)(Huang等人,《分子细胞生物学》,5:3864)；等等(Liu等人,1995,《基因与发育》,9:1766)。在特定实施例中，载体包括转录后调节元件，如WPRE或HPRE。在特定实施例中，载体缺乏或不包括转录后调节元件，如WPRE或HPRE。
引导异源核酸转录物的高效终止和多腺苷酸化的元件增加异源基因表达。可以在载体中使用的polyA信号的说明性实例包含理想的polyA序列(例如，AATAAA、ATTAAA、AGTAAA)、牛生长激素polyA序列(BGHpA)、兔β-球蛋白polyA序列(rβgpA)或本领域已知的另一种适合的异源或同源polyA序列。
根据某些具体实施例，大多数或全部病毒载体主链序列源自慢病毒，例如HIV-1。然而，应理解，可以使用或组合许多不同来源的逆转录病毒和/或慢病毒序列，或者可以容置慢病毒序列中的某些慢病毒序列的多种取代和改变而不损害转移载体执行本文所描述的功能的能力。此外，各种慢病毒载体在本领域中是已知的，参见Naldini等人,(1996a、1996b和1998)；Zufferey等人,(1997)；Dull等人,1998,美国专利第6,013,516号；和美国专利第5,994,136号，所述文献中的许多文献可以适合于产生病毒载体或转移质粒。
在特定实施例中，逆转录病毒载体包括：左(5')慢病毒LTR；Psi(ψ)包装信号；逆转录病毒输出元件；cPPT/FLAP；可操作地连接到编码α-L艾杜糖醛酸酶(IDUA)多肽的多核苷酸的启动子；以及右(3')慢病毒LTR。在某些实施例中，逆转录病毒载体优选地是慢病毒载体，更优选地是HIV慢病毒载体并且甚至优选地是HIV-1慢病毒载体。
在特定实施例中，慢病毒载体包括：左(5')慢病毒LTR，其中用异源启动子替代LTR的启动子区；Psi(ψ)包装信号；逆转录病毒输出元件；cPPT/FLAP；可操作地连接到编码α-L艾杜糖醛酸酶(IDUA)多肽的多核苷酸的启动子；以及右(3')慢病毒LTR。在某些实施例中，异源启动子是巨细胞病毒(CMV)启动子、劳斯肉瘤病毒(RSV)启动子或猿猴病毒40(SV40)启动子。
在特定实施例中，慢病毒载体包括：左(5')慢病毒LTR；Psi(ψ)包装信号；逆转录病毒输出元件；cPPT/FLAP；可操作地连接到编码α-L艾杜糖醛酸酶(IDUA)多肽的多核苷酸的启动子；以及右(3')慢病毒LTR，相比于未修饰的LTR，其包括一种或多种修饰。在某些实施例中，3'LTR优选地包括防止第一轮病毒复制之外的病毒转录的一种或多种缺失，更优选地包括3'LTR的U3区中TATA框以及Sp1和NF-κB转录因子结合位点的缺失并且甚至更优选地是自身失活(SIN)LTR。
在特定实施例中，慢病毒载体包括：左(5')慢病毒LTR，其中用异源启动子替代LTR的启动子区；Psi(ψ)包装信号；逆转录病毒输出元件；cPPT/FLAP；可操作地连接到编码α-L艾杜糖醛酸酶(IDUA)多肽的多核苷酸的启动子；以及右(3')慢病毒SIN LTR。
在特定实施例中，慢病毒载体包括：左(5')慢病毒LTR，其中用异源启动子替代LTR的启动子区；Psi(ψ)包装信号；逆转录病毒输出元件；cPPT/FLAP；骨髓增生性肉瘤病毒增强子阴性对照区缺失并且dl587rev引物结合位点取代的(MND)启动子或其转录活性片段，其可操作地连接到编码人类α-L艾杜糖醛酸酶(IDUA)多肽的多核苷酸；以及右(3')慢病毒SINLTR。
在特定实施例中，慢病毒载体包括：左(5')慢病毒LTR，其中用异源启动子替代LTR的启动子区；Psi(ψ)包装信号；逆转录病毒输出元件；cPPT/FLAP；延伸因子1α(EF1α)启动子或其转录活性片段，其可操作地连接到编码人类α-L艾杜糖醛酸酶(IDUA)多肽的多核苷酸；以及右(3')慢病毒SIN LTR。在优选实施例中，EF1α启动子缺乏人类EF1a基因的第一内含子并且被称为“EF1α短启动子”。在其它实施例中，EF1α启动子包括人类EF1a基因的第一内含子并且被称为“EF1α长启动子”。
在特定实施例中，慢病毒载体包括：左(5')CMV启动子/HIV-1嵌合LTR；Psi(ψ)包装信号；RRE逆转录病毒输出元件；cPPT/FLAP；MND启动子或EF1α短启动子，其可操作地连接到编码人类α-L艾杜糖醛酸酶(IDUA)多肽的多核苷酸；以及右(3')慢病毒SIN LTR。
在特定实施例中，慢病毒载体包括：左(5')CMV启动子/HIV-1嵌合LTR；Psi(ψ)包装信号；RRE逆转录病毒输出元件；cPPT/FLAP；MND启动子或EF1α短启动子，其可操作地连接到编码人类α-L艾杜糖醛酸酶(IDUA)多肽的多核苷酸；右(3')慢病毒SIN LTR；以及异源多腺苷酸化信号。在某些实施例中，多腺苷酸化信号是人工多腺苷酸化信号、牛生长激素多腺苷酸化信号或兔β-球蛋白多腺苷酸化信号。
对于实现合理的病毒滴度来说，大规模病毒颗粒产生通常是必需的。病毒颗粒通过将转移载体转染到包括病毒结构和/或附属基因，例如gag、pol、env、tat、rev、vif、vpr、vpu、vpx或nef基因或其它逆转录病毒基因，中的包装细胞来产生。
如本文所使用的，术语“包装载体”指代缺乏包装信号并且包括编码一个、两个、三个、四个或更多个病毒结构和/或附属基因的多核苷酸的表达载体或病毒载体。典型地，包装载体包含在包装细胞中并且通过转染、转导或感染引入到细胞中。用于转染、转导或感染的方法对于本领域的技术人员来说是熟知的。可以通过转染、转导或感染将逆转录病毒/慢病毒转移载体引入到包装细胞系中以产生生产细胞或细胞系。可以通过标准方法将包装载体引入到人类细胞或细胞系中，所述标准方法包含例如磷酸钙转染、脂质转染或电穿孔。在一些实施例中，将包装载体连同如新霉素、潮霉素、嘌呤霉素、杀稻瘟菌素、博莱霉素、胸苷激酶、DHFR、Gln合成酶或ADA等显性可选择标志物一起引入到细胞中，随后在适合的药物存在的情况下进行选择并且分离克隆物。可以将可选择标志物物理地连接到由包装载体，例如由IRES或自切割病毒肽，编码的基因。
病毒包膜蛋白(env)确定可以通过最终由细胞系产生的重组逆转录病毒感染和转化的宿主细胞的范围。在如HIV-1、HIV-2、SIV、FIV和EIV等慢病毒的情况下，env蛋白包含gp41和gp120。优选地，由包装细胞表达的病毒env蛋白编码在来自病毒gag和pol基因的单独载体上，如之前已经描述的。
可以在特定实施例中采用的源自逆转录病毒的env基因的说明性实施例包含但不限于：MLV包膜、10A1包膜、BAEV、FeLV-B、RD114、SSAV、埃博拉病毒(Ebola)、仙台病毒(Sendai)、FPV(鸡瘟病毒)和流感病毒包膜。类似地，可以利用编码来自RNA病毒(例如，以下RNA病毒家族：小RNA病毒科、杯状病毒科、星状病毒科、披膜病毒科、黄病毒科、冠状病毒科、副黏液病毒科、弹状病毒科、丝状病毒科、正黏液病毒科、布尼亚病毒科、沙粒病毒科、呼肠孤病毒科、双RNA病毒科、逆转录病毒科)以及来自DNA病毒(以下家族：圆环病毒科乳、小DNA病毒科、肝DNA病毒科、多空病毒科、腺病毒科、疱疹病毒科、痘病毒科和虹彩病毒科)的包膜的基因。这些病毒的代表性实例包含但不限于FeLV、VEE、HFVW、WDSV、SFV、狂犬病毒、ALV、BIV、BLV、EBV、CAEV、SNV、ChTLV、STLV、MPMV、SMRV、RAV、FuSV、MH2、AEV、AMV、CT10和EIAV。
在其它实施例中，用于假型包装病毒的包膜蛋白包含但不限于以下病毒中的任何病毒：甲型流感，如H1N1、H1N2、H3N2和H5N1(禽流感)；乙型流感；丙型流感病毒；甲型肝炎病毒；乙型肝炎病毒；丙型肝炎病毒；丁型肝炎病毒；戊型肝炎病毒；轮状病毒；诺瓦克病毒群组中的任何病毒；肠道腺病毒；细小病毒；登革热病毒；猴痘；单股负链病毒；狂犬病毒属，如狂犬病毒、拉各斯蝙蝠病毒、莫科拉病毒、杜温哈格病毒、欧洲蝙蝠病毒1和2以及澳大利亚蝙蝠病毒；暂时热病毒；水疱性病毒；水疱性口炎病毒(VSV)；疱疹病毒，如单纯性疱疹病毒1型和2型、水痘带状疱疹、巨细胞病毒、艾巴氏病毒(Epstein-Bar virus，EBV)、人类疱疹病毒(HHV)、人类疱疹病毒6型和8型；人类免疫缺陷病毒(HIV)；乳头瘤病毒；鼠γ疱疹病毒；沙粒病毒，如阿根廷出血热病毒、玻利维亚出血热病毒、萨比亚相关出血热病毒、委内瑞拉出血热病毒、拉沙热病毒、马秋波病毒(Machupo virus)、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)；布尼亚病毒科，如克里米亚-刚果出血热病毒、汉坦病毒、肾综合征出血热引起的病毒、裂谷热病毒；丝状病毒科(线状病毒)，包含埃博拉出血热和马尔堡出血热；黄病毒科，包含科萨努尔森林病病毒、鄂木斯克出血热病毒、蜱媒脑炎引起的病毒；以及副黏液病毒科，如亨德拉病毒和尼帕病毒；大天花和小天花(天花)；α病毒，如委内瑞拉马脑炎病毒、东部马脑炎病毒、西部马脑炎病毒、SARS相关冠状病毒(SARS-CoV)、西尼罗河病毒、任何脑炎引起的病毒。
在一个实施例中，提供了产生用VSV-G糖蛋白假型包装的重组逆转录病毒，例如慢病毒，的包装细胞。
如本文所使用的术语“假型”或“假型包装”指代病毒包膜蛋白已经被具有优选特性的另一病毒的病毒包膜蛋白取代的病毒。例如，HIV可以用水疱性口炎病毒G蛋白(VSV-G)包膜蛋白进行假型包装，这允许HIV感染更广泛范围的细胞，因为HIV包膜蛋白(由env基因编码)通常使病毒靶向CD4+呈递细胞。在优选实施例中，慢病毒包膜蛋白用VSV-G进行假型包装。在一个实施例中，提供了产生用VSV-G包膜糖蛋白进行假型包装的重组逆转录病毒，例如慢病毒，的包装细胞。
如本文所使用的，术语“包装细胞系”关于不含包装信号但稳定或瞬时表达正确包装病毒颗粒所需的病毒结构蛋白和复制酶(例如，gag、gol和env)的细胞系使用。可以采用任何适合的细胞系来制备包装细胞。通常，细胞是哺乳动物细胞。在特定实施例中，用于产生包装细胞系的细胞是人类细胞。可以使用的适合的细胞系包含例如CHO细胞、BHK细胞、MDCK细胞、C3H 10T1/2细胞、FLY细胞、Psi-2细胞、BOSC 23细胞、PA317细胞、WEHI细胞、COS细胞、BSC 1细胞、BSC 40细胞、BMT 10细胞、VERO细胞、W138细胞、MRC5细胞、A549细胞、HT1080细胞、293细胞、293T细胞、B-50细胞、3T3细胞、NIH3T3细胞、HepG2细胞、Saos-2细胞、Huh7细胞、HeLa细胞、W163细胞、211细胞和211A细胞。在优选实施例中，包装细胞为293细胞、293T细胞或A549细胞。在另一个优选实施例中，细胞是A549细胞。
如本文所使用的，术语“生产细胞系”指代能够产生重组逆转录病毒颗粒的细胞系，包括包含包装信号的包装细胞系和转移载体构建体。可以使用常规技术来执行传染性病毒颗粒和病毒储备溶液的产生。制备病毒储备溶液的方法在本领域中是熟知的并且由例如以下说明：Y.Soneoka等人(1995)《核酸研究》23:628-633；以及N.R.Landau等人(1992)《病毒学杂志》66:5110-5113。可以使用常规技术从包装细胞中收集传染性病毒颗粒。例如，可以通过细胞裂解或收集细胞培养物的上清液来收集传染性颗粒，如本领域中已知的。任选地，在必要时，可以纯化所收集到的病毒颗粒。适合的纯化技术对于本领域的技术人员来说是熟知的。
在特定实施例中，用表达一个或多个多肽的病毒载体转导以产生向受试者施用以治疗和/或预防贺勒氏综合征和/或减轻其至少一种症状的经过基因修饰的细胞的宿主细胞。根据某些实施例可以利用的、关于病毒载体在基因治疗中的使用的其它方法可以在例如以下中找到：Kay,M.A.(1997)《胸(Chest)》111(6增刊):138S-142S；Ferry,N.和Heard,J.M.(1998)《人类基因治疗(Hum.Gene Ther.)》9:1975-81；Shiratory,Y.等人(1999)《肝(Liver)》19:265-74；Oka,K.等人(2000)《脂类学时论(Curr.Opin.Lipidol.)》11:179-86；Thule,P.M.和Liu,J.M.(2000)《基因治疗》7:1744-52；Yang,N.S.(1992)《生物技术关键评论(Crit.Rev.Biotechnol.)》12:335-56；Alt,M.(1995)《肝脏病学杂志(J.Hepatol.)》23:746-58；Brody,S.L.和Crystal,R.G.(1994)《纽约科学学术年报(Ann.N.Y.Acad.Sci)》716:90-101；Strayer,D.S.(1999)《研究用药物专家评论(Expert Opin.Investig.Drugs)》8:2159-2172.Smith-Arica,J.R.和Bartlett,J.S.(2001)《心脏病学最新报告(Curr.Cardiol.Rep.)》3:43-49；以及Lee,H.C.等人(2000)《自然》408:483-8。
“宿主细胞”包含用本文所设想的重组载体或多核苷酸在体内、离体或在体外转染、感染或转导的细胞。宿主细胞可以包含包装细胞、生产细胞和用病毒载体感染的细胞。在特定实施例中，将用本发明的病毒载体感染的宿主细胞施用于需要治疗的受试者。在某些实施例中，术语“靶细胞”与宿主细胞可互换使用并且指代期望细胞类型的经过转染、感染或转导的细胞。在特定实施例中，靶细胞是干细胞或祖细胞。在某些优选实施例中，靶细胞是体细胞，例如成体干细胞、祖细胞或分化细胞。在特定优选实施例中，靶细胞是造血细胞，例如造血干细胞或造血祖细胞或者CD34+细胞。本文中讨论了进一步的治疗靶细胞。
F.经过基因修饰的细胞
在各个实施例中，对细胞进行基因修饰以表达IDUA多肽，并且使用经过基因修饰的细胞来治疗神经元蜡样脂褐质沉积症。可以离体、在体外或离体对细胞进行基因修饰。如本文所使用的，术语“基因工程化”或“基因修饰”指代将额外的遗传物质以DNA或RNA的形式添加到细胞中的总遗传物质中。术语“经过基因修饰的细胞”、“经过修饰的细胞”和“经过基因工程化的细胞”可互换使用。如本文所使用的，术语“基因治疗”指代将额外的遗传物质以DNA或RNA的形式引入到细胞中的总遗传物质中，所述额外的遗传物质恢复、校正或修饰基因的表达或实现表达治疗多肽，例如IDUA，的目的。
细胞可以是自体的(autologous/autogeneic)(“自身”)或非自体的(“非自身”，例如同种异体(allogeneic)、同基因(syngeneic)或异种异体(xenogeneic))。如本文所使用的，“自体”指代来自同一受试者的细胞。如本文所使用的，“同种异体”指代同一物种的与相比之下的细胞在基因上有所不同的细胞。如本文所使用的，“同基因”指代不同受试者的与相比之下的细胞在基因上相同的细胞。如本文所使用的，“异种异体”指代与相比之下的细胞属于不同物种的细胞。在优选实施例中，细胞是同种异体的。
在特定实施例中，将编码IDUA的载体引入到一个或多个动物细胞中，优选哺乳动物，例如非人类灵长类或人类，并且更优选地人类。
在某些实施例中，用本文所设想的载体来转导细胞群。如本文所使用的，术语“细胞群”指代可以由任何数目和/或组合的同质或异质细胞类型构成的多个细胞，如本文其它地方所描述的。例如，为了转导造血干细胞或造血祖细胞，可以从脐带血、胎盘血、骨髓或外周血中分离或获得细胞群。细胞群可以包括约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％或约100％的待转导靶细胞类型。在某些实施例中，可以使用本领域中已知的方法从异质细胞群中分离或纯化造血干细胞或造血祖细胞。
在特定实施例中，细胞是原代细胞。如本文所使用的，术语“原代细胞”在本领域中已知用于指代已经从组织中分离并且已经建立用于在体外或离体生长的细胞。对应细胞已经经历了非常少(如果有的话)的群体倍增并且因此更能代表组织的主要功能组分，从而表示体内状态的更具代表性模型，所述相应细胞与连续细胞系相比源自所述组织。用于从各种组织获得样品的方法和用于建立原代细胞系的方法在本领域中是熟知的(参见例如，Jones和Wise,《分子生物学方法(Methods Mol Biol.)》1997)。在本发明的方法中使用的原代细胞源自例如血液、淋巴瘤和上皮性肿瘤。在一个实施例中，原代细胞是造血干细胞或造血祖细胞。
术语“干细胞”指代作为能够进行以下的未分化细胞的细胞：(1)长期自我更新或能够产生原始细胞的至少一个相同拷贝；(2)在单细胞水平下分化成多种专门的细胞类型并且在某种情况下仅一种专门的细胞类型；以及(3)在体内功能性地再生组织。干细胞根据其发育潜能被细分为全能的、专能的、多能的、寡能/单能的。“自我更新”指代具有产生未改变的子细胞并产生专门的细胞类型的独特能力(潜能)的细胞。自我更新可以通过两种方式实现。不对称细胞分裂产生一个与亲本细胞相同的子细胞和一个与亲本细胞不同并且是祖细胞或分化细胞的子细胞。对称细胞分裂产生两个相同的子细胞。细胞的“增殖”或“扩增”指代对称分裂的细胞。
如本文所使用的，术语“祖先”或“祖细胞”指代细胞具有自我更新和分化成更成熟细胞的能力。许多祖细胞沿着单个谱系分化，但可能具有相当广泛的增殖能力。
造血干细胞(HSC)产生能够在生物体的生命周期内产生整个成熟血细胞库的定向造血祖细胞(HPC)。术语“造血干细胞”或“HSC”指代产生生物体的所有血细胞类型的多能干细胞，包含髓系(例如，单核细胞和巨噬细胞、中性粒细胞、嗜碱细胞、嗜酸性粒细胞、红细胞、巨核细胞/血小板、树突细胞)和淋巴谱系(例如，T细胞、B细胞、NK细胞)以及本领域中已知的其它谱系(参见Fei,R.等人,美国专利第5,635,387号；McGlave等人,美国专利第5,460,964号；Simmons,P等人,美国专利第5,677,136号；Tsukamoto等人,美国专利第5,750,397号；Schwartz等人,美国专利第5,759,793号；DiGuisto等人,美国专利第5,681,599号；Tsukamoto等人,美国专利第5,716,827号)。在一个实施例中，HSC是CD34+细胞。当移植到被致命地照射的动物或人类中时，造血干细胞和造血祖细胞可以重新填充红系中性粒细胞-巨噬细胞、巨核细胞和淋巴造血细胞池。
用本文所设想的组合物和方法转导的优选靶细胞类型包含造血细胞，优选地人类造血细胞，更优选地人类造血干细胞和人类造血祖细胞并且甚至更优选地CD34+人类造血干细胞。
用于获得用本文所设想的方法和组合物转导的造血细胞的说明性来源包含但不限于：脐带血、骨髓或动员的外周血。
在特定实施例中，用本文所设想的编码IDUA的病毒载体转导的造血细胞包含CD34+细胞。如本文所使用的，术语“CD34+细胞”指代在其细胞表面上表达CD34蛋白的细胞。如本文所使用的，“CD34”指代常常充当细胞-细胞粘附因子的细胞表面糖蛋白(例如，唾液黏蛋白)。CD34+是造血干细胞和造血祖细胞两者的细胞表面标志物。
适于用本文所设想的方法和组合物进行转导的造血干细胞和造血祖细胞的另外的说明性实例包含属于CD34+CD38LoCD90+CD45RA-的造血细胞、属于CD34+、CD59+、Thy1/CD90+、CD38Lo/-、C-试剂盒/CD117+和Lin(-)的造血细胞以及属于CD133+的造血细胞。
在一个实施例中，用本文所设想的编码IDUA的病毒载体转导的造血细胞包含CD34+CD133+细胞。
存在用于表征造血层级的各种方法。一种表征方法是SLAM代码。SLAM(信号传导淋巴细胞活化分子)家族是由基因大多数串联定位在染色体1(鼠)上的单个基因座中、全都属于免疫球蛋白基因超家族的子集并且最初被认为参与T细胞刺激的>10个分子构成的组。这个家族包含CD48、CD150、CD244等，CD150是创始成员，并且因此也被称为slamF1，即，SLAM家族成员1。造血层级的签名SLAM代码为：造血干细胞(HSC)——CD150+CD48-CD244-；多能祖细胞(MPP)——CD150-CD48-CD244+；谱系限制性祖细胞(LRP)——CD150-CD48+CD244+；共同髓系祖细胞(CMP)——lin-SCA-1-c-试剂盒+CD34+CD16/32中；粒细胞-巨噬细胞祖细胞(GMP)——lin-SCA-1-c-试剂盒+CD34+CD16/32高；以及巨核细胞-红系祖细胞(MEP)——lin-SCA-1-c-试剂盒+CD34-CD16/32低。
在一个实施例中，用本文所设想的编码IDUA的病毒载体转导的造血细胞包含CD150+CD48-CD244-细胞。
在各个实施例中，提供了包括用如本文所设想的编码IDUA的病毒载体转导的造血干细胞和造血祖细胞(HSPC)的造血细胞群。在优选实施例中，HSPC是CD34+造血细胞。
G.组合物和配制品
本文所设想的组合物和配制品可以包括任何数目的本文所设想的经过转导或未经转导的细胞或其组合、病毒载体、多肽和多核苷酸的组合。组合物包含但不限于药物组合物。“药物组合物”指代用药学上可接受的载剂配制的用于单独地或与一种或多种其它治疗模式组合地施用于细胞或动物的组合物。还应理解，如果需要，组合物也可以与其它药剂组合施用，如例如细胞因子、生长因子、激素、小分子、前药、药物、抗体或其它各种具有药学活性的药剂。在特定实施例中，对还可以包含在组合物中的其它组分几乎不存在限制，条件是另外的药剂不对组合物递送预期治疗的能力造成不利影响。
本文所设想的特定离体和体外配制品和组合物可以包括用药学上可接受的载剂配制以单独地或与一种或多种其它治疗模式组合地施用于细胞、组织、器官或动物的经过转导或未经过转导的细胞或其组合以及病毒载体的组合。
本文所设想的特定体内配制品和组合物可以包括用药学上可接受的载剂配制以单独地或与一种或多种其它治疗模式组合地施用于细胞、组织、器官或动物的病毒载体的组合。
在某些实施例中，本文所设想的组合物包括细胞群，所述细胞群包括治疗有效量的用一种或多种药学上可接受的载剂配制的经过转导的细胞，例如造血细胞、造血干细胞、造血祖细胞、CD34+细胞、CD133+细胞等。
在某些其它实施例中，本发明提供了包括逆转录病毒载体，例如用一种或多种药学上可接受的载剂配制的慢病毒载体，的组合物。
本文所设想的药物组合物包括包含如本文所设想的编码IDUA的载体或前病毒以及药学上可接受的载剂的经过转导的细胞。
短语“药学上可接受的”在本文中用于指在正确医学判断的范围内适合于与人类和动物的组织接触使用而不会产生过多毒性、刺激、过敏反应或其它问题或并发症的、与合理的益处/风险比相称的那些化合物、材料、组合物和/或剂型。
术语“药学上可接受的载剂”指代与治疗细胞一起施用的稀释剂、佐剂、赋形剂或媒剂。药物载剂的说明性实例可以是无菌液体，如细胞培养基、水和油，包含石油、动物、植物或合成来源的油，如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。还可以采用盐水溶液和葡萄糖和甘油水溶液作为液体载剂，尤其是用于可注射溶液的液体载剂。在特定实施例中，适合的药物赋形剂包含淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、水稻、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等。除了任何常规培养基或药剂与活性成分不相容的情况之外，设想了其在药物组合物中的用途。还可以将补充性活性成分结合到组合物中。
在一个实施例中，包括药学上可接受的载剂的组合物适于施用于受试者。在特定实施例中，包括载剂的组合物适于肠胃外施用，例如血管内(静脉内或动脉内)、腹膜内或肌内施用。在特定实施例中，包括药学上可接受的载剂的组合物适合于心室内、脊柱内或鞘内施用。药学上可接受的载剂包含无菌水溶液、细胞培养基或分散体。将这种培养基和药剂用于具有药学活性的物质在本领域中是熟知的。除了任何常规培养基或药剂与经过转导的细胞不相容的情况之外，设想了其在药物组合物中的用途。
在特定实施例中，本文所设想的组合物包括经过基因修饰的造血干细胞和/或造血祖细胞以及药学上可接受的载剂。本文所设想的包括基于细胞的组合物的组合物可以通过肠内或肠胃外施用方法单独地或与其它适合的化合物组合地施用以实现期望的治疗目的。
药学上可接受的载剂必须具有足够高的纯度和足够低的毒性以使其适于施用于正在治疗的人类受试者。药学上可接受的载剂应当保持或增加组合物的稳定性。药学上可接受的载剂可以是液体的或固体的并且在考虑计划的施用方式的情况下被选择以在与组合物的其它组分组合时提供期望的体积、一致性等。例如，药学上可接受的载剂可以是但不限于结合剂(例如，预胶化玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮或羟丙基甲基纤维素等)、填充剂(例如，乳糖和其它糖、微晶纤维素、果胶、明胶、硫酸钙、乙基纤维素、聚丙烯酸酯、磷酸氢钙等)、润滑剂(例如，硬脂酸镁、滑石、硅石、胶体二氧化硅、硬脂酸、金属硬脂酸盐、氢化植物油、玉米淀粉、聚乙二醇、苯甲酸钠、乙酸钠等)、崩解剂(例如，淀粉、羧基乙酸淀粉钠等)或润湿剂(例如，月桂基硫酸钠等)。用于本文所设想的组合物的其它适合的药学上可接受的载剂包含但不限于水、盐溶液、醇、聚乙二醇、明胶、直链淀粉、硬脂酸镁、滑石、硅酸、粘性石蜡、羟甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮等等。
此类载剂溶液还可以含有缓冲剂、稀释剂和其它适合的添加剂。如本文所使用的，术语“缓冲剂”指代化学成分中和酸或碱而不显著改变pH的溶液或液体。本文所设想的缓冲剂的实例包含但不限于达尔伯克氏磷酸盐缓冲盐水(PBS)、林格氏溶液、5％葡萄糖水溶液(D5W)、生理盐水(0.9％NaCl)。
药学上可接受的载剂可以存在的量足以使组合物的pH保持处于约7。可替代地，组合物的pH的范围为约6.8到约7.4，例如6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3和7.4。在仍另一个实施例中，组合物的pH为约7.4。
本文所设想的组合物可以包括无毒的药学上可接受的培养基。组合物可以是悬浮液。如本文所使用的，术语“悬浮液”指代细胞未连接到固相载体的非粘附性条件。例如，可以搅拌或搅动保持为悬浮液的细胞并且所述细胞未粘附到载体，如培养皿。
在特定实施例中，本文所设想的组合物在悬浮液中配制，其中造血干细胞和/或造血祖细胞分散在可接受的液体培养基或溶液，例如盐水或无血清培养基，内，在静脉注射(IV)袋中等。可接受的稀释剂包含但不限于水、勃脉力(PlasmaLyte)、林格氏溶液、等渗氯化钠(盐水)溶液、无血清细胞培养基和适于低温储存的培养基，例如培养基。
在某些实施例中，药学上可接受的载剂基本上不含人类或动物来源的天然蛋白质并且适于储存包括细胞群，例如造血干细胞和造血祖细胞，的组合物。药物组合物旨在施用到人类患者中并且因此基本上不含细胞培养组分，如牛血清白蛋白、马血清和胎牛血清。
在一些实施例中，组合物在药学上可接受的细胞培养基中配制。此类组合物适于施用于人类受试者。在特定实施例中，药学上可接受的细胞培养基是无血清培养基。
无血清培养基相比于含有血清的培养基具有若干优点，包含组合物得到简化并且得到更好定义、污染物程度得到减小、可能的传染剂来源得到消除以及成本降低。在各个实施例中，无血清培养基是无动物的并且可以任选地是无蛋白质的。任选地，培养基可以含有生物药学上可接受的重组蛋白。“无动物”培养基指代组合物源自非动物来源的培养基。重组蛋白替代无动物培养基中的天然动物蛋白质，并且营养物从合成的、植物或微生物来源获得。相比之下，“无蛋白质”培养基被定义为基本上不含蛋白质。
特定实施例中使用的无血清培养基的说明性实例包含但不限于QBSF-60(质量生物有限公司(Quality Biological,Inc.))、StemPro-34(生命技术公司(LifeTechnologies))和X-VIVO 10。
在优选实施例中，在勃脉力中制备包括造血干细胞和/或造血祖细胞的组合物。
在各个实施例中，在低温保存培养基中制备包括造血干细胞和/或造血祖细胞的组合物。例如，可以使用具有低温保存药剂的低温保存培养基在解冻后保持高细胞存活率结果。特定实施例中使用的低温保存培养基的说明性实例包含但不限于CryoStor CS10、CryoStor CS5和CryoStor CS2。
在一个实施例中，组合物在包括50:50勃脉力A:CryoStor CS10的溶液中配制。
在特定实施例中，组合物基本上不含支原体、内毒素和微生物污染。关于内毒素，“基本上不含”是指每剂细胞的内毒素含量低于FDA针对生物制剂允许的含量，其为每天5EU/kg体重的总内毒素，针对平均70kg的人而言为每总剂量细胞350EU。在特定实施例中，包括用本文所设想的逆转录病毒载体转导的造血干细胞或造血祖细胞的组合物含有约0.5EU/mL到约5.0EU/mL、或约0.5EU/mL、1.0EU/mL、1.5EU/mL、2.0EU/mL、2.5EU/mL、3.0EU/mL、3.5EU/mL、4.0EU/mL、4.5EU/mL或5.0EU/mL。
在某些实施例中，设想了适于递送病毒载体系统(即，病毒介导的转导)的组合物和配制品，包含但不限于逆转录病毒(例如，慢病毒)载体。
用于离体递送的示例性配制品还可以包含使用本领域中已知的各种转染剂，如磷酸钙、电穿孔、热休克和各种脂质体配制品(即，脂质介导的转染)。如下文中更加详细地描述的，脂质体是截留一小部分水性流体的脂质双层。DNA自发缔合到阳离子脂质体的外表面(借助于其电荷)，并且这些脂质体将与细胞膜交互。
在特定实施例中，对药学上可接受的载剂溶液的配制对本领域的技术人员来说是熟知的，这和开发用于将本文所描述的特定组合物用于各种治疗方案中的适合的给药和治疗方案一样，包含例如肠内和肠胃外，例如血管内、静脉内、动脉内、骨内、心室内、脑内、颅内、脊柱内、鞘内和髓内施用和配制。本领域技术人员应当理解，本文所设想的特定实施例可以包括如制药领域中熟知并且在例如以下各项中描述的配制品等其它配制品：《雷明顿：药学科学与实践(Remington:The Science and Practice of Pharmacy)》,第20版,马里兰巴尔的摩:利平科特·威廉斯·威尔金斯出版公司(Lippincott Williams&Wilkins),2005，所述文献通过引用整体并入本文。
H.基因治疗方法
本文所设想的经过基因修饰的细胞提供了用于预防、治疗和减轻MPS I或用于预防、治疗或减轻与MPS I或具有减少或消除IDUA表达和/或活性的IDUA基因的突变的受试者相关的至少一种症状的经改进的药物产品。在一个实施例中，所述MPS I是贺勒氏综合征(MPS I-H)。在一个实施例中，所述MPS I是贺勒-施艾氏综合征(MPS I-H/S)。在一个实施例中，所述MPS I是施艾氏综合征(MPS I-S)。在一个实施例中，所述MPS I是严重型MPS I。在一个实施例中，所述MPS I是减弱型MPS I。
如本文所使用的，术语“药物产品”指代使用本文所设想的组合物和方法产生的经过基因修饰的细胞。在特定实施例中，药物产品包括经过基因修饰的造血干细胞或造血祖细胞，例如CD34+细胞。在不希望受任何特定理论约束的情况下，增加药物产品中治疗基因的量可以允许治疗在体内不具有相应基因的表达或在体内具有相应基因的最小表达的受试者，由此显著增加向基因治疗先前并不是可行治疗选项的受试者给与基因治疗的机会。
本文所设想的经过转导的细胞和对应逆转录病毒载体提供了经改进的基因治疗方法。如本文所使用的，术语“基因治疗”指代将基因引入到细胞的基因组中。在各个实施例中，本发明的病毒载体包括表达控制序列，所述表达控制序列表达编码多肽的治疗转基因，所述治疗转基因向被诊断患有或疑似患有MPS I的受试者或具有包括减少IDUA表达和/或活性的一种或多种突变的IDUA基因的受试者提供治疗、预防或改善效果。
在各个实施例中，通过直接注射将逆转录病毒载体体内施用到需要基因治疗的受试者的细胞、组织或器官。在各个其它实施例中，用本文所设想的载体在体外或离体转导细胞，并且任选地离体扩增所述细胞。然后将经过转导的细胞施用于需要基因治疗的受试者。
适于在本文所设想的基因治疗方法中进行转导和施用的细胞包含但不限于如本文其它地方描述的干细胞、祖细胞和分化细胞。在某些实施例中，经过转导的细胞是如本文其它地方描述的造血干细胞或造血祖细胞。
在本文所设想的基因治疗组合物和方法中使用的优选细胞包含自体(“自身”)细胞。
如本文所使用的，术语“个体”和“受试者”通常可互换使用并且指代表现出可以用本文其它地方设想的基因治疗载体、基于细胞的疗法和方法治疗的疾病、病状或病症的症状的任何动物。在优选实施例中，受试者包含表现出可以用本文其它地方设想的基因治疗载体、基于细胞的疗法和方法治疗的神经元蜡样脂褐质沉积症的症状的任何动物。适合的受试者(例如，患者)包含实验用动物(如小鼠、大鼠、兔或豚鼠)、农场动物和家养动物或宠物(如猫或狗)。包含非人类灵长类和优选地人类患者。典型的受试者包含患有MPS I、已经被诊断患有MPS I或有患MPS I的风险的人类患者。
如本文所使用的，术语“患者”指代已经诊断患有可以用本文其它地方公开的基因治疗载体、基于细胞的疗法和方法治疗的特定疾病、病状或病症的受试者。
如本文所使用的，“治疗(treatment或treating)”包含对疾病或病理状况的症状或病理的任何有益的或期望的效果并且甚至可以包含正在治疗的疾病或病症的一个或多个可测量标志物的最低限度的减少。治疗可以涉及任选地减少疾病或病症或者延迟疾病或病症的进展。“治疗”不一定指示完全根除或治愈疾病或病症或其相关症状。
如本文所使用的，“预防(prevent)”和如“预防(prevented/preventing)”等类似词语指示用于预防、抑制或减少疾病或病症发生或复发的可能性。预防还指代延迟疾病或病症的发作或复发或者延迟疾病或病症的症状的发生或复发。如本文所使用的，“预防(prevention)”和类似词语还包含在疾病或病症发作或复发之前减少疾病或病症的强度、效果、症状和/或负担。
如本文所使用的，短语“减轻……的至少一种症状”指代减少正在治疗的受试者的疾病或病症的一种或多种症状。在特定实施例中，正在治疗的疾病或病症是MPS I，其中所述至少一种症状选自由以下组成的组：在一些实施例中，至少一种症状选自由以下组成的组：GAG积聚、失明、听力丧失、学习和语言迟缓、呼吸系统疾病、心脏病、骨骼畸形和认知功能下降。
在特定实施例中，向受试者施用足以治疗、预防贺勒氏综合征或减轻其至少一种症状的量的经过基因修饰的细胞或基因治疗载体。
在特定实施例中，向受试者施用足以治疗、预防贺勒-施艾氏综合征(MPS I-H/S)或减轻其至少一种症状的量的经过基因修饰的细胞或基因治疗载体。
在特定实施例中，向受试者施用足以治疗、预防施艾氏综合征(MPS I-S)或减轻其至少一种症状的量的经过基因修饰的细胞或基因治疗载体。
在特定实施例中，向受试者施用足以治疗、预防严重型MPS I或减轻其至少一种症状的量的经过基因修饰的细胞或基因治疗载体。
在特定实施例中，向受试者施用足以治疗、预防减弱型MPS I或减轻其至少一种症状的经过基因修饰的细胞或基因治疗载体。
如本文所使用的，术语“量”指代有效实现包含临床结果在内的有益的或期望的预防或治疗结果的病毒或经过转导的治疗细胞的“量”。
“预防有效量”指代有效实现期望预防结果的病毒或经过转导的治疗细胞的量。通常，但不一定，因为预防剂量是在疾病之前或疾病早期用于受试者的，所以预防有效量小于治疗有效量。
病毒或经过转导的治疗细胞的“治疗有效量”可以根据如以下等因素而变化：个体的疾病状态、年龄、性别和体重以及干细胞和祖细胞在个体中引发期望应答的能力。治疗有效量还是治疗有益效果胜于病毒或经过转导的治疗细胞的任何有毒或有害效果的量。术语“治疗有效量”包含有效“治疗”受试者(例如，患者)的量。
在不希望受任何特定理论约束的情况下，相比于现有方法，本发明的载体、组合物和方法所提供的重要优点是可以通过施用包括高百分比的经过转导的细胞的细胞群实现的高基因治疗功效。
经过转导的细胞可以作为骨髓或脐带血移植物的一部分施用到已经或尚未经历骨髓消融治疗的个体中。在一个实施例中，本发明的经过转导的细胞在骨髓移植物中施用于已经经历化学消融或放射消融骨髓治疗的个体。
在一个实施例中，向受试者静脉内递送某剂量的经过转导的细胞。在优选实施例中，向受试者静脉内施用经过转导的造血干细胞。
在一个说明性实施例中，向受试者提供的有效量的经过转导的细胞为至少2×106个细胞/千克、至少3×106个细胞/千克、至少4×106个细胞/千克、至少5×106个细胞/千克、至少6×106个细胞/千克、至少7×106个细胞/千克、至少8×106个细胞/千克、至少9×106个细胞/千克或至少10×106个细胞/千克或更多个细胞/千克，包含所有中间细胞剂量。
在另一个说明性实施例中，向受试者提供的有效量的经过转导的细胞为约2×106个细胞/千克、约3×106个细胞/千克、约4×106个细胞/千克、约5×106个细胞/千克、约6×106个细胞/千克、约7×106个细胞/千克、约8×106个细胞/千克、约9×106个细胞/千克或约10×106个细胞/千克或更多个细胞/千克，包含所有中间细胞剂量。
在另一个说明性实施例中，向受试者提供的有效量的经过转导的细胞为约2×106个细胞/千克到约10×106个细胞/千克、约3×106个细胞/千克到约10×106个细胞/千克、约4×106个细胞/千克到约10×106个细胞/千克、约5×106个细胞/千克到约10×106个细胞/千克、2×106个细胞/千克到约6×106个细胞/千克、2×106个细胞/千克到约7×106个细胞/千克、2×106个细胞/千克到约8×106个细胞/千克、3×106个细胞/千克到约6×106个细胞/千克、3×106个细胞/千克到约7×106个细胞/千克、3×106个细胞/千克到约8×106个细胞/千克、4×106个细胞/千克到约6×106个细胞/千克、4×106个细胞/千克到约7×106个细胞/千克、4×106个细胞/千克到约8×106个细胞/千克、5×106个细胞/千克到约6×106个细胞/千克、5×106个细胞/千克到约7×106个细胞/千克、5×106个细胞/千克到约8×106个细胞/千克或6×106个细胞/千克到约8×106个细胞/千克，包含所有中间细胞剂量。
在某些实施例中，通常可以说，包括本文所描述的经过基因修饰的细胞的药物组合物可以以如下剂量施用：102到1010个细胞/千克体重，优选105到107个细胞/千克体重，包含但不限于1×106个细胞/毫升、2×106个细胞/毫升、3×106个细胞/毫升、4×106个细胞/毫升、5×106个细胞/毫升、6×106个细胞/毫升、7×106个细胞/毫升、8×106个细胞/毫升、9×106个细胞/毫升、10×106个细胞/毫升以及那些范围内的所有整数值。细胞的数目将取决于组合物的期望最终用途，其中包含的细胞的类型也是如此。对于一些实施例中提供的用途，细胞的体积通常为一升或更少，可以为500mL或更少，甚至250mL或100mL或更少。因此，在特定实施例中，期望细胞的密度通常大于106个细胞/毫升、107个细胞/毫升或108个细胞/毫升。临床上相关数目的细胞可以分配到累积等于或超过105个、106个、107个、108个、109个、1010个、1011个或1012个细胞的多次输注中。基于细胞的组合物可以按这些范围内的剂量多次施用。细胞对经历治疗的患者而言可以是同种异体的、同基因的、异种异体的或自体的。
剂量的一些变化必然会根据正在治疗的受试者的病症而发生。在任何情况下，负责施用的人将确定适合于个体受试者的剂量。
本领域普通技术人员将能够使用常规方法以确定有效量的包括本文所设想的经过转导的细胞或基因治疗载体的组合物的适当施用途径和正确剂量。
在特定实施例中，可能需要多次施用本文所设想的药物组合物来实现治疗。在特定实施例中，药物产品被施用一次。在某些实施例中，在1年、2年、5年、10年或更久的跨度内1次、2次、3次、4次、5次、6次、7次、8次、9次或10次或更多次地施用药物产品。
本说明书中引用的所有出版物、专利申请和经发布专利通过引用并入本文，如同每个单独的出版物、专利申请或经发布专利具体地并且单独地指示通过引用并入一样。
尽管已经出于清楚理解的目的通过说明和举例的方式稍为详细地描述了前述实施例，但是根据本文设想的教导，本领域的普通技术人员将容易清楚的是，可以在不脱离随附权利要求的精神或范围的情况下对其进行某些改变和修改。仅通过说明的方式而不是通过限制的方式提供以下实例。本领域技术人员将容易认识到可以被改变或修改以产生本质上类似的结果的各种非关键参数。
实例
实例1
IDUA载体的构建
构建以下：含有嵌合5'LTR的第三代慢病毒载体；骨髓增生性肉瘤病毒增强子阴性对照区缺失并且dl587rev引物结合位点取代的(MND)启动子或短延伸因子1α(EF1α)启动子；编码α-L艾杜糖醛酸酶(IDUA)多肽的多核苷酸；以及自身失活(SIN)3'LTR。参见例如，图1和SEQ ID NO:1和2。表1和表2示出了编码IDUA的示例性慢病毒载体的各个核苷酸片段的同一性、基因银行参考(Genbank Reference)、来源名称和引证。
表1：pMND-IDUA LVV
表2：pEF1α-IDUA LVV
实例2
用编码IDUA的慢病毒载体转导的成纤维细胞
从科里尔研究所细胞库(Coriell Institute Cell Repository)(细胞系GM6214(W402X/W402X)、GM798(W402X/W402X))获取由于IDUA基因的纯合子突变而缺乏IDUA活性的人类成纤维细胞(IDUA-/-细胞)并且在转导之前，将所述人类成纤维细胞在达尔伯克氏改良伊格尔培养基(Dulbecco's Modified Eagle Medium，DMEM)加10％胎牛血清(FBS)中培养二十四小时。将经过培养的IDUA-/-细胞重新悬浮于5.0E4个细胞/毫升的DMEM加10％FBS中，并且将2mL此细胞悬浮液按孔铺板于6孔组织培养板中并且放置在37℃下。细胞接种后二十四小时，用1mL任一未经纯化的慢病毒载体来转导细胞。将1mL DMEM加10％FBS加入到对照孔中，并且将细胞放置在37℃孵育器中。转导后二十四小时，进行完全培养基交换。转导后四十八小时，将来自每个孔的250uL上清液移出到无菌埃彭道夫管(Eppendorf tube)中并在-80℃下冷冻。用1mL磷酸盐缓冲盐水洗涤细胞并使用0.5mL 1X TryplE表达酶提升(赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher))。将细胞移出到两个无菌埃彭道夫管中(每样品两个管)并以1500rpm沉淀五分钟。抽吸上清液，并且在-80℃下冷冻细胞沉淀物。
实例3
用编码IDUA的慢病毒载体转导的细胞中的蛋白质表达
将来自野生型对照细胞、IDUA-/-细胞(GM0798和GM06214)和用编码IDUA的慢病毒载体转导的IDUA-/-细胞(MND.IDUA和EF1α(EFS).IDUA)的经过冷冻的细胞沉淀物在冰上解冻以进行蛋白质印迹法。向每种细胞沉淀物中加入300μL哺乳动物蛋白质提取试剂和3μL100X HALT蛋白酶抑制剂混合物(赛默飞世尔科技公司)。通过缓慢地上下移液将沉淀物重新悬浮，并且将细胞在板摇床上在室温下孵育10分钟。将细胞在4℃下以14,000rpm离心十五分钟，并且将上清液移出到无菌埃彭道夫管中。通过向475μL 4X Laemmli样品缓冲液(伯乐公司(Bio-Rad))中加入25μLβ-巯基乙醇来制备上样染料。将样品以3:1的样品:上样染料比率混合，30μL所制备的上样染料:90μL样品。将20μL的每种样品和8μL Precision PlusProtein Kaleidoscope序列梯上样到NuPage 4-12Bis-Tris蛋白凝胶的孔中。将凝胶在200V下在1X MES SDS运行缓冲液中运行40分钟。
使用iBlot 7分钟转移系统上的iBlot转移堆叠来转移凝胶。将膜在室温下在1XTris缓冲盐水中冲洗五分钟。将膜在4℃下在Odyssey封闭缓冲液加1:500稀释的鼠抗IDUA抗体(MAB4119(R&D系统公司(R&D Systems))和1:1000稀释的小鼠抗β-肌动蛋白抗体(艾博抗公司(Abcam)ab3280)中孵育。第二天早晨，将膜在室温下在Tris缓冲盐水中冲洗三遍，持续五分钟。在Odyssey封闭缓冲液中含有1:1000稀释的800RD驴抗小鼠IgG(Licor 926-32212)的第二抗体混合物。将膜在第二抗体混合物中在室温下孵育一小时并在室温下用Tris缓冲盐水冲洗三次，持续五分钟。在Licor Odyssey CLX成像系统上对印迹进行成像。
图3示出了来自野生型对照细胞、IDUA-/-细胞(GM0798和GM06214)和用编码IDUA的慢病毒载体转导的IDUA-/-细胞(MND.IDUA和EF1α(EFS).IDUA)的细胞裂解物中的IDUA和肌动蛋白表达的蛋白质印迹。
实例4
用编码IDUA的慢病毒载体转导的IDUA-/-细胞中的IDUA活性的恢复
将来自野生型对照细胞、IDUA-/-细胞和用编码IDUA的慢病毒载体转导的IDUA-/-细胞(pMND-IDUA和pEF1α-IDUA)的细胞沉淀物重新悬浮于150μL乙酸盐缓冲液(0.1M乙酸钠(NaAc)、0.15M氯化钠(NaCl)(pH为4.0)、10uM胃酶抑素A和10uM反式-环氧琥珀酰基-L-亮氨酰氨基-(4-胍基)丁烷(E64))中。基于4-MU-αL-艾杜糖醛酸苷底物的切割、基于以下文献所描述的方法计算IDUA活性的荧光计测量：Ou等人,2014《分子遗传学和代谢(Mol Gen Met)》111:113-5。将细胞裂解液或细胞上清液的15到25μg总蛋白在37℃下与最终浓度为62.5μM的4-MU-αL-艾杜糖醛酸苷一起在150μl乙酸盐缓冲液中孵育20小时。通过加入100μl 0.5MEDTA(pH为12.0)来停止测定。使用美国分子仪器公司(Molecular Devices)SpectraMax M2分光荧光计(激发(Ex.)355、发射(Em.)460)来测量荧光性。
图2A示出了测定野生型对照细胞、IDUA-/-细胞和用编码IDUA的慢病毒载体转导的IDUA-/-细胞(pMND-IDUA和pEF1α-IDUA)中的IDUA酶活性的代表性实验的结果。经过转导的细胞中的IDUA过表达还导致酶活性IDUA分泌在细胞培养上清液中。患者和野生型成纤维细胞两者的IDUA活性均保持处于本底水平；而IDUA在经过转导的IDUA-/-成纤维细胞中的过表达使上清液中的IDUA活性增加10到20倍。图2B.因此，IDUA基因治疗不仅校正了经过转导的细胞，而且有可能校正邻近细胞中的IDUA缺乏。
实例5
用编码IDUA的LVV转导的HCD34+细胞中的
活性酶表达
用包括连接到编码IDUA的多核苷酸的MND或EF1α启动子的慢病毒载体(LVV)转导人类CD34+细胞(MPS I)。将细胞在含有细胞因子的培养基中预刺激48小时并使用200μg/mL泊咯沙姆(poloxamer)338和10μM PGE2在MOI为5、15或30下转导24小时。在转导后，将细胞铺板在甲基纤维素中并培养12天以允许造血祖细胞集落形成或在含有细胞因子的培养基中培养7天。在沉淀物和上清液中分析样品的细胞生长、VCN、个别集落VCN和％LVV+细胞以及IDUA活性。
与模拟物相比，培养物中的细胞表现出类似的生长动力学，从而表明LVV均未导致毒性。图4.
测量在细胞因子中培养7天的经过转导的细胞中的VCN。用每个载体进行的转导跨所有MOI导致高VCN。含有MND的载体比含有EF1α的载体实现更高的VCN。图5.
从第12天甲基纤维素培养物中取出来自MOI 5样品的个别集落，并通过qPCR分析VCN和％LVV+细胞。两种载体均导致高于3的平均VCN和高％LVV+。MND载体稍微更高效地转导细胞。图6.
将经过转导的细胞在细胞因子中培养7天后，测定细胞沉淀物和上清液的IDUA活性。对于两种载体，跨MOI，IDUA活性在细胞沉淀物中是相等的。图7，左侧面板。相比EF1α载体，MND载体在上清液中具有更高水平的IDUA活性。图7，右侧面板。
还测量来自第12天甲基纤维素的总汇集集落中的IDUA活性。经过转导的细胞跨MOI和载体表现出相等的IDUA活性。图8.
实例6
用编码IDUA的LVV转导的HCD34+细胞和鼠LIN-细胞
用包括连接到编码IDUA的多核苷酸的MND或EF1α启动子的慢病毒载体(LVV)转导来自三种供体的人类CD34+细胞和小鼠Lin-细胞。将细胞在含有细胞因子的培养基中预刺激48小时并使用200μg/mL泊咯沙姆338和10μM PGE2在范围为2到60的MOI下转导24小时。在转导后，将细胞在含有细胞因子的培养基中培养7天。
测量在细胞因子中培养7天的经过转导的细胞中的VCN。跨所有供体，随着MOI增加，VCN呈上升趋势。图9.
实例7
体内IDUA基因治疗模型
向具有IDUA突变的小鼠施用用编码IDUA的慢病毒载体转导的HSC并对小鼠进行表型表征。IDUA突变型小鼠将经历治疗以消融骨髓造血干细胞并在不超过2周龄时向所述小鼠施用用编码IDUA的慢病毒载体转导的HSC。
从初始治疗后第一天开始进行临床评估，并且在约4周龄时，小鼠将经历临床评估，所述临床评估包含观察震颤、总体身体状况、增重(每周，在约4周龄时开始)、握力(每两周，在约8周龄时开始)、转棒(在约13、18周龄时)和步态分析(在约16和约24周龄时)。
除了行为测定之外，将在移植后测试小鼠的其它参数以评估其在造血干细胞治疗后的总体健康和免疫系统重构，包含全临床血液化学小组、用于评估储存物质、神经元和胶质细胞数目以及矢状切面形态(例如，轴突变性)的CNS总体形态学和组织学分析、受IDUA缺乏影响的组织的交叉校正(表达)的证明、血液/脑/组织裂解物的IDUA酶活性、骨髓形态、所有实验结束时小鼠骨髓中的载体拷贝数目的测量；以及移植的细胞的鉴别。
总之，在以下权利要求中，所使用的术语不应当被解释为将权利要求限制于本说明书和权利要求中所公开的特定实施例，而是应当被解释为包含所有可能的实施例，连同这种权利要求有权获得的等效物的整个范围。因此，权利要求不受本公开限制。
序列表
<110> 蓝鸟生物公司（bluebird bio, Inc.）
肯德里克•戈斯（Goss, Kendrick）
杰弗里•帕森斯（Parsons, Geoffrey）
<120> 用于I型黏多糖贮积症的基因治疗
<130> BLBD-081/01WO
<150> US 62/430,795
<151> 2016-12-06
<160> 17
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 7833
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 编码α-L艾杜糖醛酸酶（IDUA）多肽的合成的慢病毒载体
<400> 1
tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 60
cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120
ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 180
accatcatat gccagcctat ggtgacattg attattgact agttattaat agtaatcaat 240
tacggggtca ttagttcata gcccatatat ggagttccgc gttacataac ttacggtaaa 300
tggcccgcct ggctgaccgc ccaacgaccc ccgcccattg acgtcaataa tgacgtatgt 360
tcccatagta acgccaatag ggactttcca ttgacgtcaa tgggtggagt atttacggta 420
aactgcccac ttggcagtac atcaagtgta tcatatgcca agtacgcccc ctattgacgt 480
caatgacggt aaatggcccg cctggcatta tgcccagtac atgaccttat gggactttcc 540
tacttggcag tacatctacg tattagtcat cgctattacc atggtgatgc ggttttggca 600
gtacatcaat gggcgtggat agcggtttga ctcacgggga tttccaagtc tccaccccat 660
tgacgtcaat gggagtttgt tttggcacca aaatcaacgg gactttccaa aatgtcgtaa 720
caactccgcc ccattgacgc aaatgggcgg taggcgtgta cggtgggagg tctatataag 780
cagagctcgt ttagtgaacc gggtctctct ggttagacca gatctgagcc tgggagctct 840
ctggctaact agggaaccca ctgcttaagc ctcaataaag cttgccttga gtgctcaaag 900
tagtgtgtgc ccgtctgttg tgtgactctg gtaactagag atccctcaga cccttttagt 960
cagtgtggaa aatctctagc agtggcgccc gaacagggac ttgaaagcga aagtaaagcc 1020
agaggagatc tctcgacgca ggactcggct tgctgaagcg cgcacggcaa gaggcgaggg 1080
gcggcgactg gtgagtacgc caaaaatttt gactagcgga ggctagaagg agagagtagg 1140
gtgcgagagc gtcggtatta agcgggggag aattagataa atgggaaaaa attcggttaa 1200
ggccaggggg aaagaaacaa tataaactaa aacatatagt tagggcaagc agggagctag 1260
aacgattcgc agttaatcct ggccttttag agacatcaga aggctgtaga caaatactgg 1320
gacagctaca accatccctt cagacaggat cagaagaact tagatcatta tataatacaa 1380
tagcagtcct ctattgtgtg catcaaagga tagatgtaaa agacaccaag gaagccttag 1440
ataagataga ggaagagcaa aacaaaagta agaaaaaggc acagcaagca gcagctgaca 1500
caggaaacaa cagccaggtc agccaaaatt accctatagt gcagaacctc caggggcaaa 1560
tggtacatca ggccatatca cctagaactt taaattaaga cagcagtaca aatggcagta 1620
ttcatccaca attttaaaag aaaagggggg attggggggt acagtgcagg ggaaagaata 1680
gtagacataa tagcaacaga catacaaact aaagaattac aaaaacaaat tacaaaaatt 1740
caaaattttc gggtttatta cagggacagc agagatccag tttggaaagg accagcaaag 1800
ctcctctgga aaggtgaagg ggcagtagta atacaagata atagtgacat aaaagtagtg 1860
ccaagaagaa aagcaaagat catcagggat tatggaaaac agatggcagg tgatgattgt 1920
gtggcaagta gacaggatga ggattaacac atggaaaaga ttagtaaaac accatagctc 1980
tagagcgatc ccgatcttca gacctggagg aggagatatg agggacaatt ggagaagtga 2040
attatataaa tataaagtag taaaaattga accattagga gtagcaccca ccaaggcaaa 2100
gagaagagtg gtgcagagag aaaaaagagc agtgggaata ggagctttgt tccttgggtt 2160
cttgggagca gcaggaagca ctatgggcgc agcgtcaatg acgctgacgg tacaggccag 2220
acaattattg tctggtatag tgcagcagca gaacaatttg ctgagggcta ttgaggcgca 2280
acagcatctg ttgcaactca cagtctgggg catcaagcag ctccaggcaa gaatcctggc 2340
tgtggaaaga tacctaaagg atcaacagct cctggggatt tggggttgct ctggaaaact 2400
catttgcacc actgctgtgc cttggaatgc tagttggagt aataaatctc tggaacagat 2460
ttggaatcac acgacctgga tggagtggga cagagaaatt aacaattaca caagcttggt 2520
aggtttaaga atagtttttg ctgtactttc tatagtgaat agagttaggc agggatattc 2580
accattatcg tttcagaccc acctcccaac cccgagggga cccgacaggc ccgaaggaat 2640
agaagaagaa ggtggagaga gagacagaga cagatccatt cgattagtga acggatccat 2700
ctcgacggaa tgaaagaccc cacctgtagg tttggcaagc taggatcaag gttaggaaca 2760
gagagacagc agaatatggg ccaaacagga tatctgtggt aagcagttcc tgccccggct 2820
cagggccaag aacagttgga acagcagaat atgggccaaa caggatatct gtggtaagca 2880
gttcctgccc cggctcaggg ccaagaacag atggtcccca gatgcggtcc cgccctcagc 2940
agtttctaga gaaccatcag atgtttccag ggtgccccaa ggacctgaaa tgaccctgtg 3000
ccttatttga actaaccaat cagttcgctt ctcgcttctg ttcgcgcgct tctgctcccc 3060
gagctcaata aaagagccca caacccctca ctcggcgcga ttcacctgac gcgtctacgc 3120
caccatgcgg cccctgaggc ccagggcggc gctcctggcc ctccttgcct ccctgttggc 3180
ggccccccct gtggcccccg cggaggcccc ccacctcgtg cacgtggatg ccgccagggc 3240
tctgtggcca ctccggcggt tctggcggag cacaggtttc tgcccaccat tgccgcactc 3300
ccaagctgat cagtacgtgc tgagctggga ccagcagctg aacctggctt acgtgggagc 3360
cgtgccgcac cggggcatca aacaagtccg gactcactgg ctcctggaac tcgtgactac 3420
ccgggggtca accggtcgcg gcttgtcgta caactttacc cacctggatg gctacctgga 3480
tcttctccgc gaaaaccagt tgctgccggg atttgagctc atggggtcgg cctccggcca 3540
cttcactgac ttcgaggaca agcaacaagt gttcgagtgg aaggacctgg tgtcctccct 3600
ggcccggaga tacatcggcc gctacggact ggcccacgtg tccaagtgga acttcgaaac 3660
ctggaatgag ccagaccacc acgacttcga caacgtgtcg atgaccatgc agggattcct 3720
gaactactac gacgcctgca gcgaagggtt gcgggccgca tcccccgccc ttcggcttgg 3780
cgggcccgga gactcctttc acaccccgcc gcggagcccg ctcagctggg gactgctgag 3840
acactgtcac gacggaacca acttcttcac tggcgaagcc ggagtcaggc tggactacat 3900
ttcgctgcat cgcaaggggg cgcggtcgtc catttcgatt ctggagcagg agaaggtcgt 3960
ggcacagcag atccgccagc tgttcccgaa gttcgctgat accccaatct acaacgacga 4020
agccgatccg cttgtcggct ggagcctgcc tcagccgtgg cgcgccgacg tgacctacgc 4080
ggctatggtg gtcaaggtca tcgcacagca ccagaacctc ctgctggcga acactacttc 4140
ggccttccct tacgcccttc tgtccaacga taacgccttc ctgtcctacc atccacatcc 4200
gttcgcccaa agaaccctga ctgcgcggtt ccaagtcaac aatacccgac cgcctcacgt 4260
gcaacttctg cgcaagcctg tgctcaccgc tatgggcctc ttggccctgc tggacgagga 4320
gcaactgtgg gccgaggtgt cccaggccgg gacggtgttg gactcaaacc acaccgtggg 4380
cgtgctggcc agcgcgcaca gaccccaggg acccgctgat gcatggcgcg cggccgtgct 4440
tatctacgca tctgacgaca ctagggccca tcccaaccgc tccgtcgccg tgaccctgag 4500
actgagagga gtgccacccg gtcctggcct cgtctatgtg acccgctacc tcgacaatgg 4560
actctgttcc cccgatggag aatggcgcag gctcgggcgg ccggtgttcc ctaccgccga 4620
acagtttaga agaatgcgcg ccgcggaaga tccggtggcc gcagcgcctc ggccgctgcc 4680
ggctggcgga cggctgaccc tgcgccctgc cctgcgactg ccgtcactcc tgctggtcca 4740
tgtctgcgcc cggcctgaga agccgccagg acaggtcacc cggctgcgcg ccctgccgct 4800
gacccaggga cagctcgtgc tcgtgtggtc cgacgagcac gtcggctcca agtgcctctg 4860
gacctatgaa atccagttca gccaggacgg gaaagcctac accccggtgt cgaggaagcc 4920
atccactttc aacctgttcg tgttctcacc tgacacgggt gccgtgtcag ggagctacag 4980
agtgcgggcc ctggactact gggcacggcc gggccccttc tccgacccgg tgccctacct 5040
ggaagtgcca gtgccgcgcg gaccgcctag ccccggcaac ccttagtaat gacaggtacc 5100
tttaagacca atgacttaca aggcagctgt agatcttagc cactttttaa aagaaaaggg 5160
gggactggaa gggctaattc actcccaaag aagacaagat ctgctttttg cctgtactgg 5220
gtctctctgg ttagaccaga tctgagcctg ggagctctct ggctaactag ggaacccact 5280
gcttaagcct caataaagct tgccttgagt gcttcaatgt gtgtgttggt tttttgtgtg 5340
tcgaaattct agcgattcta gcttggcgta atcatggtca tagctgtttc ctgtgtgaaa 5400
ttgttatccg ctcacaattc cacacaacat acgagccgga agcataaagt gtaaagcctg 5460
gggtgcctaa tgagtgagct aactcacatt aattgcgttg cgctcactgc ccgctttcca 5520
gtcgggaaac ctgtcgtgcc agctgcatta atgaatcggc caacgcgcgg ggagaggcgg 5580
tttgcgtatt gggcgctctt ccgcttcctc gctcactgac tcgctgcgct cggtcgttcg 5640
gctgcggcga gcggtatcag ctcactcaaa ggcggtaata cggttatcca cagaatcagg 5700
ggataacgca ggaaagaaca tgtgagcaaa aggccagcaa aaggccagga accgtaaaaa 5760
ggccgcgttg ctggcgtttt tccataggct ccgcccccct gacgagcatc acaaaaatcg 5820
acgctcaagt cagaggtggc gaaacccgac aggactataa agataccagg cgtttccccc 5880
tggaagctcc ctcgtgcgct ctcctgttcc gaccctgccg cttaccggat acctgtccgc 5940
ctttctccct tcgggaagcg tggcgctttc tcatagctca cgctgtaggt atctcagttc 6000
ggtgtaggtc gttcgctcca agctgggctg tgtgcacgaa ccccccgttc agcccgaccg 6060
ctgcgcctta tccggtaact atcgtcttga gtccaacccg gtaagacacg acttatcgcc 6120
actggcagca gccactggta acaggattag cagagcgagg tatgtaggcg gtgctacaga 6180
gttcttgaag tggtggccta actacggcta cactagaaga acagtatttg gtatctgcgc 6240
tctgctgaag ccagttacct tcggaaaaag agttggtagc tcttgatccg gcaaacaaac 6300
caccgctggt agcggtggtt tttttgtttg caagcagcag attacgcgca gaaaaaaagg 6360
atctcaagaa gatcctttga tcttttctac ggggtctgac gctcagtgga acgaaaactc 6420
acgttaaggg attttggtca tgagattatc aaaaaggatc ttcacctaga tccttttaaa 6480
ttaaaaatga agttttaaat caatctaaag tatatatgag taaacttggt ctgacagtta 6540
ccaatgctta atcagtgagg cacctatctc agcgatctgt ctatttcgtt catccatagt 6600
tgcctgactc cccgtcgtgt agataactac gatacgggag ggcttaccat ctggccccag 6660
tgctgcaatg ataccgcgag acccacgctc accggctcca gatttatcag caataaacca 6720
gccagccgga agggccgagc gcagaagtgg tcctgcaact ttatccgcct ccatccagtc 6780
tattaattgt tgccgggaag ctagagtaag tagttcgcca gttaatagtt tgcgcaacgt 6840
tgttgccatt gctacaggca tcgtggtgtc acgctcgtcg tttggtatgg cttcattcag 6900
ctccggttcc caacgatcaa ggcgagttac atgatccccc atgttgtgca aaaaagcggt 6960
tagctccttc ggtcctccga tcgttgtcag aagtaagttg gccgcagtgt tatcactcat 7020
ggttatggca gcactgcata attctcttac tgtcatgcca tccgtaagat gcttttctgt 7080
gactggtgag tactcaacca agtcattctg agaatagtgt atgcggcgac cgagttgctc 7140
ttgcccggcg tcaatacggg ataataccgc gccacatagc agaactttaa aagtgctcat 7200
cattggaaaa cgttcttcgg ggcgaaaact ctcaaggatc ttaccgctgt tgagatccag 7260
ttcgatgtaa cccactcgtg cacccaactg atcttcagca tcttttactt tcaccagcgt 7320
ttctgggtga gcaaaaacag gaaggcaaaa tgccgcaaaa aagggaataa gggcgacacg 7380
gaaatgttga atactcatac tcttcctttt tcaatattat tgaagcattt atcagggtta 7440
ttgtctcatg agcggataca tatttgaatg tatttagaaa aataaacaaa taggggttcc 7500
gcgcacattt ccccgaaaag tgccacctgg gactagcttt ttgcaaaagc ctaggcctcc 7560
aaaaaagcct cctcactact tctggaatag ctcagaggcc gaggcggcct cggcctctgc 7620
ataaataaaa aaaattagtc agccatgggg cggagaatgg gcggaactgg gcggagttag 7680
gggcgggatg ggcggagtta ggggcgggac tatggttgct gactaattga gatgagcttg 7740
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<210> 2
<211> 7967
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 编码IDUA多肽的合成的慢病毒载体
<400> 2
tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 60
cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120
ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 180
accatcatat gccagcctat ggtgacattg attattgact agttattaat agtaatcaat 240
tacggggtca ttagttcata gcccatatat ggagttccgc gttacataac ttacggtaaa 300
tggcccgcct ggctgaccgc ccaacgaccc ccgcccattg acgtcaataa tgacgtatgt 360
tcccatagta acgccaatag ggactttcca ttgacgtcaa tgggtggagt atttacggta 420
aactgcccac ttggcagtac atcaagtgta tcatatgcca agtacgcccc ctattgacgt 480
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gtacatcaat gggcgtggat agcggtttga ctcacgggga tttccaagtc tccaccccat 660
tgacgtcaat gggagtttgt tttggcacca aaatcaacgg gactttccaa aatgtcgtaa 720
caactccgcc ccattgacgc aaatgggcgg taggcgtgta cggtgggagg tctatataag 780
cagagctcgt ttagtgaacc gggtctctct ggttagacca gatctgagcc tgggagctct 840
ctggctaact agggaaccca ctgcttaagc ctcaataaag cttgccttga gtgctcaaag 900
tagtgtgtgc ccgtctgttg tgtgactctg gtaactagag atccctcaga cccttttagt 960
cagtgtggaa aatctctagc agtggcgccc gaacagggac ttgaaagcga aagtaaagcc 1020
agaggagatc tctcgacgca ggactcggct tgctgaagcg cgcacggcaa gaggcgaggg 1080
gcggcgactg gtgagtacgc caaaaatttt gactagcgga ggctagaagg agagagtagg 1140
gtgcgagagc gtcggtatta agcgggggag aattagataa atgggaaaaa attcggttaa 1200
ggccaggggg aaagaaacaa tataaactaa aacatatagt tagggcaagc agggagctag 1260
aacgattcgc agttaatcct ggccttttag agacatcaga aggctgtaga caaatactgg 1320
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ataagataga ggaagagcaa aacaaaagta agaaaaaggc acagcaagca gcagctgaca 1500
caggaaacaa cagccaggtc agccaaaatt accctatagt gcagaacctc caggggcaaa 1560
tggtacatca ggccatatca cctagaactt taaattaaga cagcagtaca aatggcagta 1620
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gtagacataa tagcaacaga catacaaact aaagaattac aaaaacaaat tacaaaaatt 1740
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tagagcgatc ccgatcttca gacctggagg aggagatatg agggacaatt ggagaagtga 2040
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gagaagagtg gtgcagagag aaaaaagagc agtgggaata ggagctttgt tccttgggtt 2160
cttgggagca gcaggaagca ctatgggcgc agcgtcaatg acgctgacgg tacaggccag 2220
acaattattg tctggtatag tgcagcagca gaacaatttg ctgagggcta ttgaggcgca 2280
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tgtggaaaga tacctaaagg atcaacagct cctggggatt tggggttgct ctggaaaact 2400
catttgcacc actgctgtgc cttggaatgc tagttggagt aataaatctc tggaacagat 2460
ttggaatcac acgacctgga tggagtggga cagagaaatt aacaattaca caagcttggt 2520
aggtttaaga atagtttttg ctgtactttc tatagtgaat agagttaggc agggatattc 2580
accattatcg tttcagaccc acctcccaac cccgagggga cccgacaggc ccgaaggaat 2640
agaagaagaa ggtggagaga gagacagaga cagatccatt cgattagtga acggatccaa 2700
ggatctgcga tcgctccggt gcccgtcagt gggcagagcg cacatcgccc acagtccccg 2760
agaagttggg gggaggggtc ggcaattgaa cgggtgccta gagaaggtgg cgcggggtaa 2820
actgggaaag tgatgtcgtg tactggctcc gcctttttcc cgagggtggg ggagaaccgt 2880
atataagtgc agtagtcgcc gtgaacgttc tttttcgcaa cgggtttgcc gccagaacac 2940
agctgaagct tcgaggggct cgcatctctc cttcacgcgc ccgccgccct acctgaggcc 3000
gccatccacg ccggttgagt cgcgttctgc cgcctcccgc ctgtggtgcc tcctgaactg 3060
cgtccgccgt ctaggtaagt ttaaagctca ggtcgagacc gggcctttgt ccggcgctcc 3120
cttggagcct acctagactc agccggctct ccacgctttg cctgaccctg cttgctcaac 3180
tctacgtctt tgtttcgttt tctgttctgc gccgttacag atccaagctg tgaccggcgc 3240
ctacgcgtct acgccaccat gcggcccctg aggcccaggg cggcgctcct ggccctcctt 3300
gcctccctgt tggcggcccc ccctgtggcc cccgcggagg ccccccacct cgtgcacgtg 3360
gatgccgcca gggctctgtg gccactccgg cggttctggc ggagcacagg tttctgccca 3420
ccattgccgc actcccaagc tgatcagtac gtgctgagct gggaccagca gctgaacctg 3480
gcttacgtgg gagccgtgcc gcaccggggc atcaaacaag tccggactca ctggctcctg 3540
gaactcgtga ctacccgggg gtcaaccggt cgcggcttgt cgtacaactt tacccacctg 3600
gatggctacc tggatcttct ccgcgaaaac cagttgctgc cgggatttga gctcatgggg 3660
tcggcctccg gccacttcac tgacttcgag gacaagcaac aagtgttcga gtggaaggac 3720
ctggtgtcct ccctggcccg gagatacatc ggccgctacg gactggccca cgtgtccaag 3780
tggaacttcg aaacctggaa tgagccagac caccacgact tcgacaacgt gtcgatgacc 3840
atgcagggat tcctgaacta ctacgacgcc tgcagcgaag ggttgcgggc cgcatccccc 3900
gcccttcggc ttggcgggcc cggagactcc tttcacaccc cgccgcggag cccgctcagc 3960
tggggactgc tgagacactg tcacgacgga accaacttct tcactggcga agccggagtc 4020
aggctggact acatttcgct gcatcgcaag ggggcgcggt cgtccatttc gattctggag 4080
caggagaagg tcgtggcaca gcagatccgc cagctgttcc cgaagttcgc tgatacccca 4140
atctacaacg acgaagccga tccgcttgtc ggctggagcc tgcctcagcc gtggcgcgcc 4200
gacgtgacct acgcggctat ggtggtcaag gtcatcgcac agcaccagaa cctcctgctg 4260
gcgaacacta cttcggcctt cccttacgcc cttctgtcca acgataacgc cttcctgtcc 4320
taccatccac atccgttcgc ccaaagaacc ctgactgcgc ggttccaagt caacaatacc 4380
cgaccgcctc acgtgcaact tctgcgcaag cctgtgctca ccgctatggg cctcttggcc 4440
ctgctggacg aggagcaact gtgggccgag gtgtcccagg ccgggacggt gttggactca 4500
aaccacaccg tgggcgtgct ggccagcgcg cacagacccc agggacccgc tgatgcatgg 4560
cgcgcggccg tgcttatcta cgcatctgac gacactaggg cccatcccaa ccgctccgtc 4620
gccgtgaccc tgagactgag aggagtgcca cccggtcctg gcctcgtcta tgtgacccgc 4680
tacctcgaca atggactctg ttcccccgat ggagaatggc gcaggctcgg gcggccggtg 4740
ttccctaccg ccgaacagtt tagaagaatg cgcgccgcgg aagatccggt ggccgcagcg 4800
cctcggccgc tgccggctgg cggacggctg accctgcgcc ctgccctgcg actgccgtca 4860
ctcctgctgg tccatgtctg cgcccggcct gagaagccgc caggacaggt cacccggctg 4920
cgcgccctgc cgctgaccca gggacagctc gtgctcgtgt ggtccgacga gcacgtcggc 4980
tccaagtgcc tctggaccta tgaaatccag ttcagccagg acgggaaagc ctacaccccg 5040
gtgtcgagga agccatccac tttcaacctg ttcgtgttct cacctgacac gggtgccgtg 5100
tcagggagct acagagtgcg ggccctggac tactgggcac ggccgggccc cttctccgac 5160
ccggtgccct acctggaagt gccagtgccg cgcggaccgc ctagccccgg caacccttag 5220
taatgacagg tacctttaag accaatgact tacaaggcag ctgtagatct tagccacttt 5280
ttaaaagaaa aggggggact ggaagggcta attcactccc aaagaagaca agatctgctt 5340
tttgcctgta ctgggtctct ctggttagac cagatctgag cctgggagct ctctggctaa 5400
ctagggaacc cactgcttaa gcctcaataa agcttgcctt gagtgcttca atgtgtgtgt 5460
tggttttttg tgtgtcgaaa ttctagcgat tctagcttgg cgtaatcatg gtcatagctg 5520
tttcctgtgt gaaattgtta tccgctcaca attccacaca acatacgagc cggaagcata 5580
aagtgtaaag cctggggtgc ctaatgagtg agctaactca cattaattgc gttgcgctca 5640
ctgcccgctt tccagtcggg aaacctgtcg tgccagctgc attaatgaat cggccaacgc 5700
gcggggagag gcggtttgcg tattgggcgc tcttccgctt cctcgctcac tgactcgctg 5760
cgctcggtcg ttcggctgcg gcgagcggta tcagctcact caaaggcggt aatacggtta 5820
tccacagaat caggggataa cgcaggaaag aacatgtgag caaaaggcca gcaaaaggcc 5880
aggaaccgta aaaaggccgc gttgctggcg tttttccata ggctccgccc ccctgacgag 5940
catcacaaaa atcgacgctc aagtcagagg tggcgaaacc cgacaggact ataaagatac 6000
caggcgtttc cccctggaag ctccctcgtg cgctctcctg ttccgaccct gccgcttacc 6060
ggatacctgt ccgcctttct cccttcggga agcgtggcgc tttctcatag ctcacgctgt 6120
aggtatctca gttcggtgta ggtcgttcgc tccaagctgg gctgtgtgca cgaacccccc 6180
gttcagcccg accgctgcgc cttatccggt aactatcgtc ttgagtccaa cccggtaaga 6240
cacgacttat cgccactggc agcagccact ggtaacagga ttagcagagc gaggtatgta 6300
ggcggtgcta cagagttctt gaagtggtgg cctaactacg gctacactag aagaacagta 6360
tttggtatct gcgctctgct gaagccagtt accttcggaa aaagagttgg tagctcttga 6420
tccggcaaac aaaccaccgc tggtagcggt ggtttttttg tttgcaagca gcagattacg 6480
cgcagaaaaa aaggatctca agaagatcct ttgatctttt ctacggggtc tgacgctcag 6540
tggaacgaaa actcacgtta agggattttg gtcatgagat tatcaaaaag gatcttcacc 6600
tagatccttt taaattaaaa atgaagtttt aaatcaatct aaagtatata tgagtaaact 6660
tggtctgaca gttaccaatg cttaatcagt gaggcaccta tctcagcgat ctgtctattt 6720
cgttcatcca tagttgcctg actccccgtc gtgtagataa ctacgatacg ggagggctta 6780
ccatctggcc ccagtgctgc aatgataccg cgagacccac gctcaccggc tccagattta 6840
tcagcaataa accagccagc cggaagggcc gagcgcagaa gtggtcctgc aactttatcc 6900
gcctccatcc agtctattaa ttgttgccgg gaagctagag taagtagttc gccagttaat 6960
agtttgcgca acgttgttgc cattgctaca ggcatcgtgg tgtcacgctc gtcgtttggt 7020
atggcttcat tcagctccgg ttcccaacga tcaaggcgag ttacatgatc ccccatgttg 7080
tgcaaaaaag cggttagctc cttcggtcct ccgatcgttg tcagaagtaa gttggccgca 7140
gtgttatcac tcatggttat ggcagcactg cataattctc ttactgtcat gccatccgta 7200
agatgctttt ctgtgactgg tgagtactca accaagtcat tctgagaata gtgtatgcgg 7260
cgaccgagtt gctcttgccc ggcgtcaata cgggataata ccgcgccaca tagcagaact 7320
ttaaaagtgc tcatcattgg aaaacgttct tcggggcgaa aactctcaag gatcttaccg 7380
ctgttgagat ccagttcgat gtaacccact cgtgcaccca actgatcttc agcatctttt 7440
actttcacca gcgtttctgg gtgagcaaaa acaggaaggc aaaatgccgc aaaaaaggga 7500
ataagggcga cacggaaatg ttgaatactc atactcttcc tttttcaata ttattgaagc 7560
atttatcagg gttattgtct catgagcgga tacatatttg aatgtattta gaaaaataaa 7620
caaatagggg ttccgcgcac atttccccga aaagtgccac ctgggactag ctttttgcaa 7680
aagcctaggc ctccaaaaaa gcctcctcac tacttctgga atagctcaga ggccgaggcg 7740
gcctcggcct ctgcataaat aaaaaaaatt agtcagccat ggggcggaga atgggcggaa 7800
ctgggcggag ttaggggcgg gatgggcgga gttaggggcg ggactatggt tgctgactaa 7860
ttgagatgag cttgcatgcc gacattgatt attgactagt ccctaagaaa ccattcttat 7920
catgacatta acctataaaa ataggcgtat cacgaggccc tttcgtc 7967
<210> 3
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 示例性连接子序列
<400> 3
Gly Gly Gly
1
<210> 4
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 示例性连接子序列
<400> 4
Asp Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 5
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 示例性连接子序列
<400> 5
Thr Gly Glu Lys Pro
1 5
<210> 6
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 示例性连接子序列
<400> 6
Gly Gly Arg Arg
1
<210> 7
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 示例性连接子序列
<400> 7
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 8
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 示例性连接子序列
<400> 8
Glu Gly Lys Ser Ser Gly Ser Gly Ser Glu Ser Lys Val Asp
1 5 10
<210> 9
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 示例性连接子序列
<400> 9
Lys Glu Ser Gly Ser Val Ser Ser Glu Gln Leu Ala Gln Phe Arg Ser
1 5 10 15
Leu Asp
<210> 10
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 示例性连接子序列
<400> 10
Gly Gly Arg Arg Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 11
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 示例性连接子序列
<400> 11
Leu Arg Gln Arg Asp Gly Glu Arg Pro
1 5
<210> 12
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 示例性连接子序列
<400> 12
Leu Arg Gln Lys Asp Gly Gly Gly Ser Glu Arg Pro
1 5 10
<210> 13
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 示例性连接子序列
<400> 13
Leu Arg Gln Lys Asp Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Arg Pro
1 5 10 15
<210> 14
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> TEV蛋白酶的切割序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(3)
<223> Xaa是任何氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(5)
<223> Xaa是任何氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7)..(7)
<223> Xaa = Gly或Ser
<400> 14
Glu Xaa Xaa Tyr Xaa Gln Xaa
1 5
<210> 15
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> TEV蛋白酶的切割序列
<400> 15
Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly
1 5
<210> 16
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> TEV蛋白酶的切割序列
<400> 16
Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Ser
1 5
<210> 17
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 共有Kozak序列
<400> 17
gccrccatgg 10

Claims (33)

1.一种多核苷酸，其包括：
(a)左(5')慢病毒LTR；
(b)Psi(ψ)包装信号；
(c)逆转录病毒输出元件；
(d)中心聚嘌呤段/DNA瓣(cPPT/FLAP)；
(e)可操作地连接到编码α-L艾杜糖醛酸酶(IDUA)多肽的多核苷酸的启动子；以及
(f)右(3')慢病毒LTR。
2.根据权利要求1所述的多核苷酸，其中所述慢病毒选自由以下组成的组：HIV(人类免疫缺陷病毒；包含HIV1型和HIV2型)；维斯纳-梅迪病毒(VMV)病毒；山羊关节炎-脑炎病毒(CAEV)；马传染性贫血病毒(EIAV)；猫免疫缺陷病毒(FIV)；牛免疫缺陷病毒(BIV)；以及猿猴免疫缺陷病毒(SIV)。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的多核苷酸，其中所述慢病毒是HIV-1或HIV-2。
4.根据权利要求1到3中任一项所述的多核苷酸，其中所述慢病毒是HIV-1。
5.根据权利要求1到4中任一项所述的多核苷酸，其中所述5'LTR的启动子用选自由以下组成的组的异源启动子替代：巨细胞病毒(CMV)启动子、劳斯肉瘤病毒(RSV)启动子和猿猴病毒40(SV40)启动子。
6.根据权利要求1到5中任一项所述的多核苷酸，其中所述3'LTR包括一种或多种修饰。
7.根据权利要求1到6中任一项所述的多核苷酸，其中所述3'LTR包括防止第一轮病毒复制之外的病毒转录的一种或多种缺失。
8.根据权利要求1到6中任一项所述的多核苷酸，其中所述3'LTR包括所述3'LTR的U3区中TATA框以及Sp1和NF-κB转录因子结合位点的缺失。
9.根据权利要求1到6中任一项所述的多核苷酸，其中所述3'LTR是自身失活(SIN)LTR。
10.根据权利要求1到9中任一项所述的多核苷酸，其中所述可操作地连接到编码IDUA多肽的多核苷酸的启动子选自由以下组成的组：整合素亚单元αM(ITGAM；CD11b)启动子、CD68启动子、C-X3-C基序趋化因子受体1(CX3CR1)启动子、离子钙结合衔接分子1(IBA1)启动子、跨膜蛋白119(TMEM119)启动子、碎裂样(spalt like)转录因子1(SALL1)启动子、粘附G蛋白偶联受体E1(F4/80)启动子、骨髓增生性肉瘤病毒增强子阴性对照区缺失并且dl587rev引物结合位点取代的(MND)启动子和其转录活性片段。
11.根据权利要求1到9中任一项所述的多核苷酸，其中所述可操作地连接到编码IDUA多肽的多核苷酸的启动子包括延伸因子1α(EF1α)启动子或其转录活性片段。
12.根据权利要求1到9中任一项所述的多核苷酸，其中所述可操作地连接到编码IDUA多肽的多核苷酸的启动子是短EF1α启动子。
13.根据权利要求1到9中任一项所述的多核苷酸，其中所述可操作地连接到编码IDUA多肽的多核苷酸的启动子是长EF1α启动子。
14.根据权利要求1到13中任一项所述的多核苷酸，其中编码所述IDUA多肽的所述多核苷酸是cDNA。
15.根据权利要求1到14中任一项所述的多核苷酸，其中编码所述IDUA多肽的所述多核苷酸是针对表达而优化的密码子。
16.一种多核苷酸，其包括：
(a)左(5')HIV-1LTR；
(b)Psi(ψ)包装信号；
(c)RRE逆转录病毒输出元件；
(d)cPPT/FLAP；
(e)可操作地连接到编码IDUA多肽的多核苷酸的MND启动子或EF1α启动子；以及
(f)右(3')HIV-1LTR。
17.一种多核苷酸，其包括：
(a)左(5')CMV启动子/HIV-1嵌合LTR；
(b)Psi(ψ)包装信号；
(c)RRE逆转录病毒输出元件；
(d)cPPT/FLAP；
(e)可操作地连接到编码IDUA多肽的多核苷酸的MND启动子或EF1α启动子；以及
(f)右(3')SIN HIV-1LTR。
18.根据权利要求1到17中任一项所述的多核苷酸，其进一步包括牛生长激素多腺苷酸化信号或兔β-球蛋白多腺苷酸化信号。
19.一种用慢病毒载体转导的哺乳动物细胞，所述慢病毒载体包括根据权利要求1到18中任一项所述的多核苷酸。
20.根据权利要求19所述的哺乳动物细胞，其中所述细胞是造血细胞。
21.根据权利要求19或权利要求20所述的哺乳动物细胞，其中所述细胞是CD34+细胞。
22.根据权利要求19到21中任一项所述的哺乳动物细胞，其中所述细胞是干细胞或祖细胞。
23.一种生产细胞，其包括：编码gag的第一多核苷酸、编码pol的第二多核苷酸、编码env的第三多核苷酸和根据权利要求1到18中任一项所述的多核苷酸。
24.一种由根据权利要求23所述的生产细胞产生的慢病毒载体。
25.一种组合物，其包括有包括根据权利要求1到18中任一项所述的多核苷酸的慢病毒载体或根据权利要求19到22中任一项所述的哺乳动物细胞。
26.一种药物组合物，其包括药学上可接受的载剂和包括根据权利要求1到18中任一项所述的多核苷酸的慢病毒载体或根据权利要求19到22中任一项所述的哺乳动物细胞。
27.一种治疗MPS I的方法，其包括向受试者施用以下：包括根据权利要求1到18中任一项所述的多核苷酸的慢病毒载体；用包括根据权利要求1到18中任一项所述的多核苷酸的慢病毒载体转导的细胞；或根据权利要求19到22中任一项所述的哺乳动物细胞。
28.一种治疗MPSI的方法，其包括向受试者施用根据权利要求26所述的药物组合物。
29.一种减少与受试者的MPS I相关的至少一种症状的方法，其包括向受试者施用以下：包括根据权利要求1到18中任一项所述的多核苷酸的慢病毒载体；用包括根据权利要求1到18中任一项所述的多核苷酸的慢病毒载体转导的细胞；或根据权利要求19到22中任一项所述的哺乳动物细胞。
30.一种减少与受试者的MPS I相关的至少一种症状的方法，其包括向受试者施用根据权利要求26所述的药物组合物。
31.根据权利要求29或30所述的方法，其中所述MPSI是贺勒氏综合征(MPSI-H)、贺勒-施艾氏综合征(MPSI-H/S)或施艾氏综合征(MPSI-S)。
32.根据权利要求29或30所述的方法，其中所述MPS I是严重型MPS I或减弱型MPSI。
33.根据权利要求29或权利要求30所述的方法，其中所述至少一种症状选自由以下组成的组：GAG积聚、失明、听力丧失、学习和语言迟缓、呼吸系统疾病、心脏病、骨骼畸形和认知功能下降。
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