CN115707778B - 重组柯萨奇病毒a10病毒样颗粒及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及医药领域，特别是涉及重组柯萨奇病毒A10病毒样颗粒及其用途，所述重组柯萨奇病毒A10病毒样颗粒由基因组中整合有编码柯萨奇病毒A10的VP0、VP3和VP1衣壳蛋白的细胞系产生。本发明还提供所述重组柯萨奇病毒A10病毒样颗粒在制备预防手足口病产品中的用途。所述预防手足口病产品为药物组合物，例如为疫苗组合物。在免疫原性研究中发现本发明的柯萨奇病毒A10VLP可在小鼠体内诱导良好的免疫反应，提示该VLP可作为柯萨奇病毒A10的候选疫苗。

Description

重组柯萨奇病毒A10病毒样颗粒及其用途

技术领域

本发明涉及医药领域，特别是涉及重组柯萨奇病毒A10病毒样颗粒及其用途。

背景技术

手足口病是一种5岁以下儿童常见的婴幼儿传染病，主要临床表现为手、足和口等部位出现小疱疹或小溃疡，少数患儿可引起肺水肿、无菌性脑膜脑炎、心肌炎等一系列并发症甚至导致死亡。手足口病是由人肠道病毒属的柯萨奇病毒A组16、4、5、7、9、10，B组2、5型以及肠道病毒71型和埃可病毒30感染引起的，其中肠道病毒71和柯萨奇病毒A16是导致手足口病暴发的主要病原体。近年来由柯萨奇病毒A6和A10感染的报道越来越常见。目前尚无针对柯萨奇病毒A10的特异性药物，因此疫苗就成为预防柯萨奇病毒A10感染的最有效的方法。应用传统的灭活疫苗的方法开发柯萨奇病毒A10疫苗已经有学者进行过研究并且可以诱导小鼠产生良好的免疫反应。不过灭活疫苗存在表位破坏，灭活不充分以及成本高等问题。

柯萨奇病毒A10属于小RNA病毒科肠道病毒属，为无包膜的二十面立体对称球形颗粒，直径约30nm，其基因组是单股正链RNA，两端为保守的非编码区，中间为一个开放阅读框的编码区，此编码区编码结构蛋白P1和非结构蛋白P2与P3，其中P1可被蛋白酶3CD切割为衣壳蛋白VP0、VP3和VP1，并组装成病毒的衣壳。这些衣壳蛋白与病毒RNA可进一步组装为真病毒，并伴随着VP0切割为VP4和VP2。据报道，柯萨奇病毒A10灭活病毒可以诱导小鼠产生良好的免疫反应，不过灭活疫苗存在表位破坏、灭活不充分以及成本高等问题。病毒样颗粒(Virus-like particle，VLP)与病毒在形态与组成上相似，可诱导较好的免疫反应，为柯萨奇病毒A10疫苗的开发提供了一种方案。研究表明，共表达柯萨奇病毒A10结构蛋白P1和3CD后可切割为VP0、VP3和VP1衣壳蛋白，并进一步组装成柯萨奇病毒A10 VLP，且该VLP可以保护小鼠免受柯萨奇病毒A10致死性攻击。但通过共表达P1和3CD获取的VLP，可能存在P1的不完全切割；此外，VP1衣壳蛋白易发生降解，这些均会影响VLP组成的一致性，这对产品的质量控制造成较大的潜在风险。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供重组柯萨奇病毒A10病毒样颗粒及其用途，用于解决现有技术中的问题。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供多核苷酸，所述多核苷酸包括编码柯萨奇病毒A10的VP0、VP1和VP3衣壳蛋白的核苷酸，所述多核苷酸不包括RBS序列和编码柯萨奇病毒A10其他衣壳蛋白的核苷酸。

本发明还提供一种核酸构建体，所述核酸构建体包括所述多核苷酸。

本发明还提供一种细胞系，所述细胞系中包括所述核酸构建体，或基因组中整合有所述多核苷酸。

本发明还提供一种重组柯萨奇病毒A10病毒样颗粒，所述重组柯萨奇病毒A10病毒样颗粒包括VP0、VP3和VP1衣壳蛋白，不包括柯萨奇病毒A10其他衣壳蛋白。

本发明还提供所述重组柯萨奇病毒A10病毒样颗粒在制备预防手足口病产品中的用途。

本发明还提供一种用于预防手足口病的药物组合物，所述药物组合物包括所述重组柯萨奇病毒A10病毒样颗粒和药学上可接受的载体。

如上所述，本发明的重组柯萨奇病毒A10病毒样颗粒及其用途，具有以下有益效果：病毒样颗粒与病毒在形态与组成上相似，免疫原性研究发现柯萨奇病毒A10VLP可在小鼠体内诱导良好的中和抗体水平，即可诱导较好的免疫反应，为柯萨奇病毒A10疫苗的开发提供了解决方案，该VLP可作为柯萨奇病毒A10的候选疫苗，为预防柯萨奇病毒A10感染提供有效方法。

附图说明

图1显示为本发明的pPink/HC-A10 VP031表达质粒的表达框示意图，PAOX1为AOX1启动子，CYC1 TT为CYC1终止子，VP0、VP3和VP1为柯萨奇病毒A10衣壳蛋白序列。

图2显示为SDS-PAGE分析柯萨奇病毒A10 VLP，其中(A)为A10 VLP^-full的SDS-PAGE分析，(B)为A10 VLP^-N50的SDS-PAGE分析，(C)为A10 VLP^-N72的SDS-PAGE分析。

图3显示为柯萨奇病毒A10 VLP的粒径分析图，其中(A)为A10 VLP^-full的动态光散射分析，(B)为A10 VLP^-N50的动态光散射分析，(C)为A10 VLP^-N72的动态光散射分析。

图4显示柯萨奇病毒A10 VLP免疫血清特异抗体滴度，其中(A)第二次免疫后血清滴度(A10 VLP^-full、A10 VLP^-N50及A10 VLP^-N72免疫原性比较)；(B)为第三次免疫后血清滴度(A10 VLP^-full、A10 VLP^-N50及A10 VLP^-N72免疫原性比较)。为了方便统计，将OD450nm吸光值大于0.15的最高稀释倍数的倒数定位该样品的特异抗体滴度，横线显示为几何平均值。

具体实施方式

为避免结构蛋白P1的不完全切割，本发明构建了含有柯萨奇病毒A10 VP0、VP3和VP1三个串联表达框的毕赤酵母表达菌株，并成功纯化了VLP^-full。为了解决VP1的降解问题，本发明在串联表达柯萨奇病毒A10 VP0、VP3和VP1的基础上，对VP1 N端进行50个和72个氨基酸的截短，并获得了毕赤酵母表达菌株和纯化后的VLP^-N50和VLP^-N72。SDS-PAGE显示VLP^-N50和VLP^-N72的VP1均无明显降解，且免疫小鼠发现不论VLP^-N50还是VLP^-N72诱导的免疫水平均与VLP^-full相当。因此，经串联表达衣壳蛋白VP0、VP3和截短VP1获得的柯萨奇病毒A10 VLP不仅解决了P1不完全切割和VP1降解的组成均一性问题，同时兼具良好的免疫原性，为柯萨奇疫病毒A10疫苗的研发提供了新思路。

基于以上，本发明提供一种多核苷酸，所述多核苷酸包括编码柯萨奇病毒A10的VP0、VP3和VP1衣壳蛋白的核苷酸，不包括RBS序列和编码柯萨奇病毒A10其他衣壳蛋白的核苷酸。

如图1所示，所述多核苷酸包括编码柯萨奇病毒A10的VP0、VP3和VP1衣壳蛋白的的核苷酸排列顺序为：VP0-VP3-VP1。

所述多核苷酸中表达各衣壳蛋白的表达框在所述多核苷酸中串联。

在如图1所示的实施例中，具体的串联方式为启动子-VP0-终止子-启动子-VP3-终止子-启动子-VP1-终止子。当然，在其他实施方式中，三个表达框的串联方式也可以是以下中的任一种：启动子-VP0-终止子-启动子-VP1-终止子-启动子-VP3-终止子、启动子-VP3-终止子-启动子-VP0-终止子-启动子-VP1-终止子、启动子-VP3-终止子-启动子-VP1-终止子-启动子-VP0-终止子、启动子-VP1-终止子-启动子-VP3-终止子-启动子-VP0-终止子、启动子-VP1-终止子-启动子-VP0-终止子-启动子-VP3-终止子。在一种实施方式中，所述启动子为AOX1启动子，所述终止子为CYC1终止子。由于各蛋白均为独立的开放阅读框，因此不同的串联方式均能达到与实施例相同的效果。

所述编码柯萨奇病毒A10的VP0衣壳蛋白的核苷酸为VP0全长核苷酸序列或截短的核苷酸，所述编码柯萨奇病毒VP1衣壳蛋白的核苷酸为VP1全长核苷酸序列或截短的核苷酸，所述编码柯萨奇病毒VP3衣壳蛋白的核苷酸为编码柯萨奇病毒A10的VP3衣壳蛋白的全长核苷酸序列或截短的核苷酸序列。

在一种实施方式中，所述截短的核苷酸可以是VP1截短0-216个核苷酸，VP0截短0-243个核苷酸，VP3截短0-171个核苷酸。

在一种实施方式中，所述多核苷酸编码的柯萨奇病毒A10的VP1衣壳蛋白为截短45-75个氨基酸的VP1衣壳蛋白。优选的，为截短50～72个氨基酸。具体的，例如为以下中的任一：截短45～50个氨基酸、截短50～55个氨基酸、截短55～60个氨基酸、截短60～65个氨基酸、截短65～70个氨基酸、截短70～72个氨基酸、截短72～75个氨基酸。

在一种实施方式中，编码柯萨奇病毒A10的VP0衣壳蛋白的核苷酸序列如SEQ IDNO:8所示。编码柯萨奇病毒A10的VP3衣壳蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示。编码柯萨奇病毒A10的VP1衣壳蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12所示。

在一种实施方式中，与SEQ ID NO.8～12所示序列的同源性在95％以上的序列，或与SEQ ID NO.8～12所示序列互补的序列也能达到与本发明实施例相同的效果。

所述多核苷酸中不包括编码P1、3CD蛋白的核苷酸。

所述多核苷酸的序列为经过密码子优化后得到的序列。

在一种实施方式中，所述编码柯萨奇病毒A10的VP0衣壳蛋白的核苷酸编码氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示的VP0衣壳蛋白；所述编码柯萨奇病毒A10的VP3衣壳蛋白的核苷酸编码氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示的VP3衣壳蛋白；所述编码柯萨奇病毒A10的VP1衣壳蛋白的核苷酸编码氨基酸序列如SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7所示的VP1衣壳蛋白。

在一种实施方式中，所述柯萨奇病毒A10的VP1衣壳蛋白的氨基酸序列选自以下任一项：1)如SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7所示的序列；2)与SEQ ID NO:5或SEQID NO:6或SEQ ID NO:7所示序列的同源性在95％、96％、97％、98％或99％以上的序列；3)与前两项任一所述的序列互补的序列。

本发明还提供一种核酸构建体，所述核酸构建体包括所述多核苷酸。

术语“核酸构建体”是指可以被引入靶细胞或组织中的人工构建的核酸区段，所述核酸构建体包括载体骨架即表达载体与表达框，所述核酸构建体可以为质粒。

所述核酸构建体中VP0、VP3和VP1表达框可以是各自独立的单拷贝或多拷贝。较佳的，所述核酸构建体中VP0、VP3和VP1表达框均为单拷贝。

所述核酸构建体中除包括所述多核苷酸中所含的柯萨奇病毒A10的衣壳蛋白核苷酸外，不包括编码柯萨奇病毒A10其他衣壳蛋白的核苷酸。

在一种实施方式中，所述核酸构建体还包括表达载体。所述表达载体可以是现有技术中任意适于表达柯萨奇病毒的表达载体，例如为酵母表达载体。较佳的为毕赤酵母表达载体pPink-HC(厂家：Invitrogen)。

在一种实施方式中，所述核酸构建体核苷酸序列如SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:15所示。

本发明还提供一种细胞系，所述细胞系中包括所述核酸构建体，或基因组中整合有所述多核苷酸。

所述细胞系为真核细胞。在一种实施方式中，所述细胞系为将所述核酸构建体转导入毕赤酵母细胞得到。

本发明还提供一种重组柯萨奇病毒A10病毒样颗粒，所述重组柯萨奇病毒A10病毒样颗粒包括VP0、VP3和VP1衣壳蛋白，不包括柯萨奇病毒A10其他衣壳蛋白。

所述重组柯萨奇病毒A10病毒样颗粒由所述细胞系产生。

重组柯萨奇病毒A10病毒样颗粒的水合直径为35nm～45nm。所述重组柯萨奇病毒A10病毒样颗粒的大小均一。

本发明还提供所述重组柯萨奇病毒A10病毒样颗粒的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：

1)培养所述细胞系，使其表达重组柯萨奇病毒A10病毒样颗粒；

2)分离出所述细胞系表达的重组柯萨奇病毒A10病毒样颗粒。

在一种实施方式中，培养所述细胞系的条件为28℃-30℃，250-300rpm。

在一种实施方式中，所述细胞系通过将所述核酸构建体转导入宿主细胞得到。在一种实施方式中，所述宿主细胞为毕赤酵母细胞。

在一种实施方式中，所述核酸构建体的制备方法包括如下步骤：

1)将密码子优化后的表达柯萨奇病毒A10衣壳蛋白的核苷酸分别克隆入不同的表达载体中，获得中间构建体；

2)将步骤1)获得的中间构建体重组后获得所述核酸构建体。

本发明还提供所述重组柯萨奇病毒A10病毒样颗粒在制备预防手足口病产品中的用途。

在一种实施方式中，所述手足口病为柯萨奇病毒A10感染的手足口病。

所述预防手足口病产品为药物组合物。所述药物组合物例如为疫苗组合物。

本发明还提供一种用于预防手足口病的药物组合物，所述药物组合物包括所述重组柯萨奇病毒A10病毒样颗粒和药学上可接受的载体。

所述药物组合物可以是单价的(仅含有一种病毒样颗粒)，也可以是多价的(含有多种病毒样颗粒)。

所述药物组合物可制备成各种常规剂型，例如：注射剂、粒剂、片剂、丸剂、栓剂、胶囊、悬浮液、喷雾剂等。

所述药物组合物包括预防或治疗有效量的本发明病毒样颗粒或多核苷酸。

术语“预防或治疗有效量”指药物组合物治疗、缓解或预防目标疾病或状况的量，或是表现出可检测的治疗或预防效果的量。即病毒样颗粒的量在所选用的给药路径中足以引发免疫应答，能有效促使保护宿主抵抗相关的疾病。该效果可通过例如抗原水平来检测。治疗效果也包括生理性症状的减少。对于某一对象的精确有效量取决于该对象的体型和健康状况、病症的性质和程度、以及选择给予的治疗剂和/或治疗剂的组合。因此，预先指定准确的有效量是没用的。然而，对于某给定的状况而言，可以用常规实验来确定该有效量。

在一种实施方式中，为了本发明的目的，有效的剂量为给予个体约0.001毫克/千克至1000毫克/千克，较佳地约0.01毫克/千克至100毫克/千克体重的病毒样颗粒。

药物组合物还可含有药学上可接受的载体。术语“药学上可接受的载体”指用于药物组合物(例如本发明的重组病毒样颗粒)给药的载体。该术语指这样一些药剂载体：它们本身不诱导产生对接受该组合物的个体有害的抗体，且给药后没有过分的毒性。合适的载体可以是大的、代谢缓慢的大分子，如蛋白质、多糖、聚乳酸(polylactic acid)、聚乙醇酸等。这些载体是本领域普通技术人员所熟知的。药学上可接受的载体可包括液体，如水、盐水、甘油和乙醇。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等。通常，可将组合物制成可注射剂，例如液体溶液或悬液；还可制成在注射前适合配入溶液或悬液、液体赋形剂的固体形式。脂质体也包括在药学上可接受的载体的定义中。

一旦配成本发明的组合物，可将其直接给予对象。待治疗的对象可以是哺乳动物，尤其是人。

所述药物组合物例如为疫苗组合物。疫苗组合物可用已知的方法将本发明的病毒样颗粒直接施用于个体。通常采用与常规疫苗相同的施用途径和/或模拟病原体感染路径施用这些疫苗。

给予本发明药物组合物的途径包括：肌内、皮下、皮内、肺内、静脉内、经鼻、经口服或其它肠胃外给药途径。如果需要，可以组合给药途径，或根据疾病情况进行调节。疫苗组合物可以单剂量或多剂量给予，且可以包括给予加强剂量以引发和/或维持免疫力。

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

实施例中利用毕赤酵母串联表达柯萨奇病毒A10的VP0、VP3和不同程度N端氨基酸截短的VP1(N50和N72)衣壳蛋白，获得了成功组装的柯萨奇病毒A10 VLP^-N50和A10 VLP^-N72，这两种VLP不存在P1不完全切割的问题且VP1无明显降解，解决了柯萨奇病毒A10 VLP组成均一性及可能潜在的安全性问题；进一步的免疫原性研究发现A10 VLP^-N50和A10 VLP^-N72均可在小鼠体内诱导良好的抗体水平，提示这两种VLP可作为柯萨奇病毒A10的候选疫苗。

实施例1柯萨奇病毒A10表达质粒构建

为了使表达达到最优，将柯萨奇病毒A10结构蛋白P1氨基酸序列根据毕赤酵母密码子偏好性进行优化合成。利用EcoRⅠ和KpnⅠ位点连入pPinK-HC质粒中，得到质粒pPink/HC-A10 P1。柯萨奇病毒A10结构蛋白P1氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，其中1-324为VP0氨基酸序列(SEQ ID NO:3)，325-564为VP3氨基酸序列(SEQ ID NO:4)，565-862为VP1氨基酸序列(SEQ ID NO:5)。优化后的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。VP0的核苷酸序列如SEQ IDNO:8所示，即SEQ ID NO:2中的1-972。VP3的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示，即SEQ ID NO:2中的973-1692。VP1的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示，即SEQ ID NO:2中的1693-2586。VP1^-N50的核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示。VP1^-N72的核苷酸序列如SEQ ID NO:12所示。VP1^-N50的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示。VP1^-N72的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示。

表达质粒的制备：根据优化后VP0、VP1、VP3的核苷酸序列及表达载体pPink-HC(购自Invitrogen)多克隆位点处序列设计合成重组引物(表1，其中HS10VP1^-N50-R和HS10VP1^-N72-R与HS10VP1-R序列相同，表1中未重复列出)，使用同源重组试剂盒(购自诺唯赞)将VP0、VP3、VP1、VP1^-N50和VP1^-N72通过重组的方式分别连接到载体pPinK-HC中分别得到中间质粒pPink/HC-A10 VP0、pPink/HC-A10 VP3、pPink/HC-A10 VP1、pPink/HC-A10 VP1^-N50和pPink/HC-A10 VP1^-N72；利用同尾酶BglⅡ和BamHⅠ以酶切连接的方法依次将中间质粒中A10VP3表达框和A10 VP0表达框连入pPink/HC-A10 VP1、pPink/HC-A10 VP1^-N50或pPink/HC-A10 VP1^-N72中，分别得到终质粒pPink/HC-A10 VPN^-full(核苷酸序列如SEQ ID NO:13所示)、pPink/HC-A10 VPN^-N50(核苷酸序列如SEQ ID NO:14所示)和pPink/HC-A10 VPN^-N72(核苷酸序列如SEQ ID NO:15所示)，示意图如图1所示。

表1同源重组引物序列

引物名称	序列号	引物序列
			HS10 VP0-F	SEQ ID NO:16	5’-caactaattattcgaaacggaattcaccatgggtgctcaagtttctac-3’
HS10VP0-R	SEQ ID NO:17	5’-ctgtatttaaatggccggccggtacctcattattgagaaacagcttgtctc-3’
			HS10VP3-F	SEQ ID NO:18	5’-caactaattattcgaaacggaattcaccatgggtattccagctgagttg-3’
HS10VP3-R	SEQ ID NO:19	5’-ctgtatttaaatggccggccggtacctcattattgcaaaacagcttgttgag-3’
			HS10VP1-F	SEQ ID NO:20	5’-caactaattattcgaaacggaattcaccatgggcgaccgggtggccg-3’
HS10VP1-R	SEQ ID NO:21	5’-ctgtatttaaatggccggccggtacctcattacagtgtggtgatggcggtc-3’
			HS10VP1-N50-F	SEQ ID NO:22	5’-acaactaattattcgaaacggaattcaccatggagacgggggccacgtcc-3’
HS10VP1-N72-F	SEQ ID NO:23	5’-acaactaattattcgaaacggaattcaccatgaacggggttttggaaacg-3’

实施例2柯萨奇病毒A10高表达菌株的筛选、表达与纯化

高表达菌株的筛选

将实施例1制备的三个终质粒pPink/HC-A10 VPN^-full、pPink/HC-A10 VPN^-N50或pPink/HC-A10 VPN^-N72分别使用内切酶AflⅡ进行线性化，并用乙醇沉淀法进行纯化回收；利用电转的方法将线性化质粒分别导入不同的毕赤酵母中进行基因重组，涂布PAD平板与30℃进行培养；3天后，挑取大的白色菌落与24孔深孔板中进行甲醇诱导表达，诱导表达48h后收取诱导菌体使用营养筛选法和夹心ELISA的方法进行表达检测，表达量高的作为高表达株A10 VLP^-full、A10 VLP^-N50和A10 VLP^-N72，各高表达菌株目的基因序列经测序分析与理论核苷酸序列一致。

夹心ELISA方法所用的兔抗柯萨奇病毒A10多抗血清和柯萨奇病毒A10特异的鼠单抗均为本公司自制，制备步骤如下：(1)兔抗柯萨奇病毒A10多抗血清：将纯化后的柯萨奇病毒A10 VLP(500μg/只)与弗氏佐剂1:1混合乳化后皮下多点注射成年的新西兰大白兔(1ml/只)，两次免疫间隔4周共免疫4次，第4次免疫2周后采取兔血清备用；(2)柯萨奇病毒A10特异的鼠单抗：将纯化后的柯萨奇病毒A10 VLP(5μg/只)与铝佐剂(500μg/只)充分混合后，腹腔注射小鼠，两次免疫间隔2周共免疫4次，第4次免疫后2周取脾脏细胞与骨髓瘤细胞融合后筛选得到柯萨奇病毒A10特异的鼠单抗细胞株，将该细胞株腹腔注射小鼠后获得腹水，经protein G填料纯化后获得A10特异的鼠单抗备用。

夹心ELISA方法操作步骤如下：将兔抗柯萨奇病毒A10多抗血清按1:2000进行稀释包被于96孔酶标板中，50μl/孔，4℃包被过夜后用5％脱脂奶粉进行封闭；将菌体用PBS重悬，加入等体积玻璃珠后70HZ破碎120s，离心后取上清备用；破菌上清和柯萨奇病毒A10VLP自制标品用2％脱脂奶粉进行适当的稀释后加到封闭后的酶标板中，于37℃进行孵育；2h后，加入柯萨奇病毒A10特异的鼠单抗，于37℃进行孵育；2h后，加入1:5000稀释的HRP标记的山羊抗鼠二抗，37℃孵育1h后进行显色并读取450nm吸光值，并根据标曲计算VLP含量。

表达与纯化

将筛选得到的高表达株A10 VLP^-full、A10 VLP^-N50和A10 VLP^-N72分别接种于BMGY培养基，培养24h后更换为BMMY培养基进行诱导表达，诱导48h离心收获菌体。将菌体用PBS重悬后使用高压匀浆机1200bar进行破菌，离心后收集上清进行PEG沉降，复溶后的上清使用DEAE填料进行纯化，最终获得目的VLPs，分别命名为A10 VLP^-full、A10 VLP^-N50和A10 VLP^-N72。

实施例3柯萨奇病毒A10 VLP聚丙烯酰胺凝胶电泳

将纯化后的样品与上样缓冲液混合，100℃加热5-10min后上样到12％SDS-聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳，电泳结束后进行考马斯亮蓝染色。蔗糖梯度样品SDS-PAGE结果显示各VLP均由VP0、VP1和VP3组成，A10 VLP^-full(图2A)的VP1出现降解，而A10 VLP^-N50(图2B)和A10 VLP^-N72(图2C)无明显降解。此外，由于是串联表达VP0、VP3和VP1衣壳蛋白，故A10 VLP^-full、A10 VLP^-N50和A10 VLP^-N72不存在切割不完全的问题，也不存在3CD残留问题。

实施例4柯萨奇病毒A10 VLP的粒径研究

将纯化后的柯萨奇病毒A10 VLP用PBS稀释至50-200ng/μl，取1ml加入样品池中，避免产生气泡，将样品池放入Zetasizer设备中采用动态光散射的方法测定其水合直径并进行数据分析。结果如图3所示，A10 VLP^-full、A10 VLP^-N50和A10 VLP^-N72的水合直径相似均为40nm左右，故A10 VLP^-full、A10 VLP^-N50和A10 VLP^-N72均组装良好。

实施例5柯萨奇病毒A10 VLP的免疫原性

为了确定VP1 N端的截短是否影响柯萨奇病毒A10 VLP的免疫原性，我们将A10VLP^-full、A10 VLP^-N50和A10 VLP^-N72分别免疫小鼠，具体步骤如下：6-8周龄雌性ICR小鼠，共分为2组，每组5-6只。将VLP^-full(10μg/只)、VLP^-N50(10μg/只)或VLP^-N72(10μg/只)与铝佐剂(80μg/只)室温振荡吸附1-2h，然后进行腹腔注射，共免疫3次，每两次免疫之间间隔2周。分别于第二次免疫后和第三次免疫后2周采取小鼠血清测定特异抗体滴度。柯萨奇病毒A10VLP特异抗体滴度测定

将兔抗柯萨奇病毒A10 VLP包被于96孔酶标板中，20ng/孔，4℃包被过夜后用5％脱脂奶粉进行封闭；将血清样品用2％脱脂奶粉进行倍比稀释后加到封闭后的酶标板中，于37℃进行孵育；2h后，加入1:5000稀释的HRP标记的山羊抗鼠二抗，37℃孵育1h后进行显色并读取450nm吸光值。如图4A-B所示，不论免疫2次(图4A)还是3次(图4B)VLP^-N50和VLP^-N72均可诱导与VLP^-full相当水平的特异性抗体。

使用GraphPad Prism 8.3.0进行数据处理，使用t检验进行差异分析，P＜0.05，*，P＜0.01，**，P＜0.001，***。

本发明将含柯萨奇病毒A10 VP0、VP1与VP3串联表达框的表达载体导入毕赤酵母，以达到同时表达柯萨奇病毒A10 VP0、VP1与VP3衣壳蛋白的目的，经检测发现VP0、VP1与VP3衣壳蛋白可成功表达且可自发组装VLP。VLP^-full不存在P1切割不完全的问题，可在小鼠体内诱导较高特异抗体反应，但VLP^-full仍存在VP1不同程度降解的问题。为解决该问题，本发明在衣壳蛋白串联表达的基础上对VP1 N端进行不同程度的截短，SDS-PAGE结果显示VLP^-N50和VLP^-N72的VP1均无明显的降解；此外，VLP^-N50和VLP^-N72，亦可诱导良好的免疫反应，且抗体水平与VLP^-full相当。

综上，VLP^-N50和VLP^-N72组成均一且免疫原性良好，可用于柯萨奇病毒A10进一步的疫苗研发。

以上的实施例是为了说明本发明公开的实施方案，并不能理解为对本发明的限制。此外，本文所列出的各种修改以及发明中方法的变化，在不脱离本发明的范围和精神的前提下对本领域内的技术人员来说是显而易见的。虽然已结合本发明的多种具体优选实施例对本发明进行了具体的描述，但应当理解，本发明不应仅限于这些具体实施例。事实上，各种如上所述的对本领域内的技术人员来说显而易见的修改来获取发明都应包括在本发明的范围内。

序列表

<110> 华淞（上海）生物医药科技有限公司

<120> 重组柯萨奇病毒A10病毒样颗粒及其用途

<160> 23

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 862

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Gly Ala Gln Val Ser Thr Gln Lys Ser Gly Ser His Glu Thr Gly

1 5 10 15

Asn Val Ala Thr Gly Gly Ser Thr Ile Asn Phe Thr Asn Ile Asn Tyr

20 25 30

Tyr Lys Asp Ser Tyr Ala Ala Ser Ala Thr Arg Gln Asp Phe Thr Gln

35 40 45

Asp Pro Lys Lys Phe Thr Gln Pro Val Leu Asp Ser Ile Arg Glu Leu

50 55 60

Ser Ala Pro Leu Asn Ser Pro Ser Val Glu Ala Cys Gly Tyr Ser Asp

65 70 75 80

Arg Val Ala Gln Leu Thr Val Gly Asn Ser Ser Ile Thr Thr Gln Glu

85 90 95

Ala Ala Asn Ile Val Leu Ala Tyr Gly Glu Trp Pro Glu Tyr Cys Pro

100 105 110

Asp Thr Asp Ala Thr Ala Val Asp Lys Pro Thr Arg Pro Asp Val Ser

115 120 125

Val Asn Arg Phe Tyr Thr Leu Asp Ser Lys Met Trp Gln Glu Asn Ser

130 135 140

Thr Gly Trp Tyr Trp Lys Phe Pro Asp Val Leu Asn Lys Thr Gly Val

145 150 155 160

Phe Gly Gln Asn Ala Gln Phe His Tyr Leu Tyr Arg Ser Gly Phe Cys

165 170 175

Leu His Val Gln Cys Asn Ala Ser Lys Phe His Gln Gly Ala Leu Leu

180 185 190

Val Ala Val Ile Pro Glu Phe Val Ile Ala Gly Arg Gly Ser Asn Thr

195 200 205

Lys Pro Asn Glu Ala Pro His Pro Gly Phe Thr Thr Thr Phe Pro Gly

210 215 220

Thr Thr Gly Ala Thr Phe His Asp Pro Tyr Val Leu Asp Ser Gly Val

225 230 235 240

Pro Leu Ser Gln Ala Leu Ile Tyr Pro His Gln Trp Ile Asn Leu Arg

245 250 255

Thr Asn Asn Cys Ala Thr Val Ile Val Pro Tyr Ile Asn Ala Val Pro

260 265 270

Phe Asp Ser Ala Ile Asn His Ser Asn Phe Gly Leu Ile Val Ile Pro

275 280 285

Val Ser Pro Leu Lys Tyr Ser Ser Gly Ala Thr Thr Ala Ile Pro Ile

290 295 300

Thr Ile Thr Ile Ala Pro Leu Asn Ser Glu Phe Gly Gly Leu Arg Gln

305 310 315 320

Ala Val Ser Gln Gly Ile Pro Ala Glu Leu Arg Pro Gly Thr Asn Gln

325 330 335

Phe Leu Thr Thr Asp Asp Asp Thr Ala Ala Pro Ile Leu Pro Gly Phe

340 345 350

Thr Pro Thr Pro Thr Ile His Ile Pro Gly Glu Val His Ser Leu Leu

355 360 365

Glu Leu Cys Arg Val Glu Thr Ile Leu Glu Val Asn Asn Thr Thr Glu

370 375 380

Ala Thr Gly Leu Thr Arg Leu Leu Ile Pro Val Ser Ser Gln Asn Lys

385 390 395 400

Ala Asp Glu Leu Cys Ala Ala Phe Met Val Asp Pro Gly Arg Ile Gly

405 410 415

Pro Trp Gln Ser Thr Leu Val Gly Gln Ile Cys Arg Tyr Tyr Thr Gln

420 425 430

Trp Ser Gly Ser Leu Lys Val Thr Phe Met Phe Thr Gly Ser Phe Met

435 440 445

Ala Thr Gly Lys Met Leu Val Ala Tyr Ser Pro Pro Gly Ser Ala Gln

450 455 460

Pro Ala Asn Arg Glu Thr Ala Met Leu Gly Thr His Val Ile Trp Asp

465 470 475 480

Phe Gly Leu Gln Ser Ser Val Ser Leu Val Ile Pro Trp Ile Ser Asn

485 490 495

Thr His Phe Arg Thr Ala Lys Thr Gly Gly Asn Tyr Asp Tyr Tyr Thr

500 505 510

Ala Gly Val Val Thr Leu Trp Tyr Gln Thr Asn Tyr Val Val Pro Pro

515 520 525

Glu Thr Pro Gly Glu Ala Tyr Ile Ile Ala Met Gly Ala Ala Gln Asp

530 535 540

Asn Phe Thr Leu Lys Ile Cys Lys Asp Thr Asp Glu Val Thr Gln Gln

545 550 555 560

Ala Val Leu Gln Gly Asp Pro Val Glu Asp Ile Ile His Asp Ala Leu

565 570 575

Gly Asn Thr Ala Arg Arg Ala Ile Ser Ser Val Thr Asn Val Glu Ser

580 585 590

Ala Ala Asn Thr Thr Pro Ser Ser His Arg Leu Glu Thr Gly Arg Val

595 600 605

Pro Ala Leu Gln Ala Ala Glu Thr Gly Ala Thr Ser Asn Ala Thr Asp

610 615 620

Glu Asn Met Ile Glu Thr Arg Cys Val Val Asn Arg Asn Gly Val Leu

625 630 635 640

Glu Thr Thr Ile Asn His Phe Phe Ser Arg Ser Gly Leu Val Gly Val

645 650 655

Val Asn Leu Thr Asp Gly Gly Thr Asp Thr Thr Gly Tyr Ala Thr Trp

660 665 670

Asp Ile Asp Ile Met Gly Phe Val Gln Leu Arg Arg Lys Cys Glu Met

675 680 685

Phe Thr Tyr Met Arg Phe Asn Ala Glu Phe Thr Phe Val Thr Thr Thr

690 695 700

Lys Asn Gly Glu Ala Arg Pro Tyr Met Leu Gln Tyr Met Tyr Val Pro

705 710 715 720

Pro Gly Ala Pro Lys Pro Thr Gly Arg Asp Ala Phe Gln Trp Gln Thr

725 730 735

Ala Thr Asn Pro Ser Val Phe Val Lys Leu Thr Asp Pro Pro Ala Gln

740 745 750

Val Ser Val Pro Phe Met Ser Pro Ala Ser Ala Tyr Gln Trp Phe Tyr

755 760 765

Asp Gly Tyr Pro Thr Phe Gly Gln His Pro Glu Thr Ser Asn Thr Thr

770 775 780

Tyr Gly Leu Cys Pro Asn Asn Met Met Gly Thr Phe Ala Val Arg Val

785 790 795 800

Val Ser Arg Glu Ala Ser Gln Leu Lys Leu Gln Thr Arg Val Tyr Met

805 810 815

Lys Leu Lys His Val Arg Ala Trp Val Pro Arg Pro Ile Arg Ser Gln

820 825 830

Pro Tyr Leu Leu Lys Asn Phe Pro Asn Tyr Asp Ser Ser Lys Val Thr

835 840 845

Asn Ser Ala Arg Asp Arg Ser Ser Ile Lys Gln Ala Asn Met

850 855 860

<210> 2

<211> 2586

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgggcgctc aggtaagcac tcagaaatcc ggttcacacg aaaccggaaa cgtagccacc 60

ggtgggtcta cgatcaattt tacaaatata aattattata aggattctta cgcagcctcc 120

gcaaccagac aagactttac ccaggacccc aaaaaattca cccaaccagt attggattcg 180

attagagaac tcagcgcgcc cttaaatagt ccttcagttg aggcatgcgg atacagcgat 240

agagtggcgc aactaacagt cggcaacagc tccatcacga ctcaggaggc agccaacatc 300

gtcctcgctt atggggagtg gcccgagtac tgtcctgata ctgacgccac agcagtcgat 360

aagcctacac ggcctgatgt gtcggttaat cgcttctaca ctcttgatag taagatgtgg 420

caggagaact ctacaggttg gtattggaaa ttcccggacg tcttaaataa gactggcgtg 480

ttcgggcaga atgctcagtt ccactacctg taccgctcag ggttttgcct tcatgttcaa 540

tgtaacgcca gtaagtttca tcagggcgcc ttactagtag cggtgatccc cgaatttgtg 600

attgcggggc gaggttcaaa tacgaaaccg aatgaggcgc cacatcccgg attcacaaca 660

accttcccag ggactactgg agctactttt catgacccat acgtgctaga ctccggggtg 720

ccactctctc aggccctaat ttatcctcat caatggatta atttgcgaac gaataactgc 780

gctacagtga tcgtcccgta cattaatgct gttccttttg atagcgctat caaccactct 840

aacttcggcc tcatcgttat cccggtgagt cctctgaagt atagttcagg tgcgacgacc 900

gcaattccaa taactattac gatagctccg ttaaatagcg agttcggtgg tctgcgacag 960

gcagtctcgc agggcatacc agcagagctg aggccgggaa ccaaccaatt tctcacaacg 1020

gacgatgata cagcggcccc catccttcca ggcttcacac ctacccccac catacatatc 1080

ccgggcgaag tccactctct cttggaactt tgccgtgtcg aaactatctt ggaggtgaac 1140

aacacgactg aagcaacagg actcacgcgt cttttaatac ctgtctcttc gcaaaacaag 1200

gcggacgagt tatgcgcggc ctttatggtc gatccgggac ggattggccc atggcaatca 1260

actctagtag gtcagatatg taggtactat acccagtggt ctggttcgtt aaaagttact 1320

tttatgttta ctgggagttt catggccaca ggtaagatgc tggttgccta ctcaccaccg 1380

gggtctgccc agcccgcgaa cagagaaacg gcaatgctag gtacacacgt catatgggat 1440

tttggccttc agagttcagt atccctggtg attccttgga ttagcaatac acactttcgc 1500

acagccaaga cgggaggaaa ctacgactac tataccgcgg gtgtagttac cttatggtat 1560

caaacgaact atgttgttcc acccgaaaca cccggcgaag cttacatcat agccatggga 1620

gcagcacagg acaattttac cctgaaaatt tgtaaggata ctgacgaggt gacccaacaa 1680

gctgttctgc aaggggaccc tgttgaggat ataattcacg atgcgttggg taacacggcg 1740

cgcagggcta tatcatcggt taccaatgtc gaaagtgccg caaatacaac accatcgtcg 1800

catcgtctcg agactgggag agtccctgca ctacaagccg ccgagacggg ggccacgtcc 1860

aacgcaacgg acgaaaatat gatagaaacg aggtgtgtcg tgaatcggaa cggggttttg 1920

gaaacgacta ttaaccactt cttcagcagg agtggactag taggggtcgt caaccttact 1980

gacggaggca ccgacaccac tggctatgct acctgggata tcgacattat gggtttcgta 2040

caactacgtc gtaaatgcga gatgtttaca tatatgaggt tcaacgctga gtttacattt 2100

gtcaccacga caaaaaacgg cgaggcccga ccgtatatgc ttcagtacat gtatgtgccc 2160

cccggtgctc caaaaccaac tggaagagac gcattccaat ggcaaactgc aacgaatccg 2220

tccgtgtttg taaagctcac tgatccgcct gctcaagttt ccgtaccgtt catgtcaccc 2280

gcttccgcct atcaatggtt ctatgatgga tatcccacct tcggacaaca ccctgaaacg 2340

tccaatacta cttatggctt atgtccgaat aatatgatgg gtacgttcgc tgtacgggta 2400

gtttcacgag aagcaagcca gttaaaactt caaacacggg tatacatgaa gttgaaacat 2460

gtgcgggcgt gggtgcctcg ccctatacgt agccagccat acctgctcaa aaattttccg 2520

aattatgact cttcgaaggt tacgaactca gctcgcgacc gatcgtcgat caaacaagcg 2580

aacatg 2586

<210> 3

<211> 324

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Met Gly Ala Gln Val Ser Thr Gln Lys Ser Gly Ser His Glu Thr Gly

1 5 10 15

Asn Val Ala Thr Gly Gly Ser Thr Ile Asn Phe Thr Asn Ile Asn Tyr

20 25 30

Tyr Lys Asp Ser Tyr Ala Ala Ser Ala Thr Arg Gln Asp Phe Thr Gln

35 40 45

Asp Pro Lys Lys Phe Thr Gln Pro Val Leu Asp Ser Ile Arg Glu Leu

50 55 60

Ser Ala Pro Leu Asn Ser Pro Ser Val Glu Ala Cys Gly Tyr Ser Asp

65 70 75 80

Arg Val Ala Gln Leu Thr Val Gly Asn Ser Ser Ile Thr Thr Gln Glu

85 90 95

Ala Ala Asn Ile Val Leu Ala Tyr Gly Glu Trp Pro Glu Tyr Cys Pro

100 105 110

Asp Thr Asp Ala Thr Ala Val Asp Lys Pro Thr Arg Pro Asp Val Ser

115 120 125

Val Asn Arg Phe Tyr Thr Leu Asp Ser Lys Met Trp Gln Glu Asn Ser

130 135 140

Thr Gly Trp Tyr Trp Lys Phe Pro Asp Val Leu Asn Lys Thr Gly Val

145 150 155 160

Phe Gly Gln Asn Ala Gln Phe His Tyr Leu Tyr Arg Ser Gly Phe Cys

165 170 175

Leu His Val Gln Cys Asn Ala Ser Lys Phe His Gln Gly Ala Leu Leu

180 185 190

Val Ala Val Ile Pro Glu Phe Val Ile Ala Gly Arg Gly Ser Asn Thr

195 200 205

Lys Pro Asn Glu Ala Pro His Pro Gly Phe Thr Thr Thr Phe Pro Gly

210 215 220

Thr Thr Gly Ala Thr Phe His Asp Pro Tyr Val Leu Asp Ser Gly Val

225 230 235 240

Pro Leu Ser Gln Ala Leu Ile Tyr Pro His Gln Trp Ile Asn Leu Arg

245 250 255

Thr Asn Asn Cys Ala Thr Val Ile Val Pro Tyr Ile Asn Ala Val Pro

260 265 270

Phe Asp Ser Ala Ile Asn His Ser Asn Phe Gly Leu Ile Val Ile Pro

275 280 285

Val Ser Pro Leu Lys Tyr Ser Ser Gly Ala Thr Thr Ala Ile Pro Ile

290 295 300

Thr Ile Thr Ile Ala Pro Leu Asn Ser Glu Phe Gly Gly Leu Arg Gln

305 310 315 320

Ala Val Ser Gln

<210> 4

<211> 241

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Met Gly Ile Pro Ala Glu Leu Arg Pro Gly Thr Asn Gln Phe Leu Thr

1 5 10 15

Thr Asp Asp Asp Thr Ala Ala Pro Ile Leu Pro Gly Phe Thr Pro Thr

20 25 30

Pro Thr Ile His Ile Pro Gly Glu Val His Ser Leu Leu Glu Leu Cys

35 40 45

Arg Val Glu Thr Ile Leu Glu Val Asn Asn Thr Thr Glu Ala Thr Gly

50 55 60

Leu Thr Arg Leu Leu Ile Pro Val Ser Ser Gln Asn Lys Ala Asp Glu

65 70 75 80

Leu Cys Ala Ala Phe Met Val Asp Pro Gly Arg Ile Gly Pro Trp Gln

85 90 95

Ser Thr Leu Val Gly Gln Ile Cys Arg Tyr Tyr Thr Gln Trp Ser Gly

100 105 110

Ser Leu Lys Val Thr Phe Met Phe Thr Gly Ser Phe Met Ala Thr Gly

115 120 125

Lys Met Leu Val Ala Tyr Ser Pro Pro Gly Ser Ala Gln Pro Ala Asn

130 135 140

Arg Glu Thr Ala Met Leu Gly Thr His Val Ile Trp Asp Phe Gly Leu

145 150 155 160

Gln Ser Ser Val Ser Leu Val Ile Pro Trp Ile Ser Asn Thr His Phe

165 170 175

Arg Thr Ala Lys Thr Gly Gly Asn Tyr Asp Tyr Tyr Thr Ala Gly Val

180 185 190

Val Thr Leu Trp Tyr Gln Thr Asn Tyr Val Val Pro Pro Glu Thr Pro

195 200 205

Gly Glu Ala Tyr Ile Ile Ala Met Gly Ala Ala Gln Asp Asn Phe Thr

210 215 220

Leu Lys Ile Cys Lys Asp Thr Asp Glu Val Thr Gln Gln Ala Val Leu

225 230 235 240

Gln

<210> 5

<211> 299

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Met Gly Asp Pro Val Glu Asp Ile Ile His Asp Ala Leu Gly Asn Thr

1 5 10 15

Ala Arg Arg Ala Ile Ser Ser Val Thr Asn Val Glu Ser Ala Ala Asn

20 25 30

Thr Thr Pro Ser Ser His Arg Leu Glu Thr Gly Arg Val Pro Ala Leu

35 40 45

Gln Ala Ala Glu Thr Gly Ala Thr Ser Asn Ala Thr Asp Glu Asn Met

50 55 60

Ile Glu Thr Arg Cys Val Val Asn Arg Asn Gly Val Leu Glu Thr Thr

65 70 75 80

Ile Asn His Phe Phe Ser Arg Ser Gly Leu Val Gly Val Val Asn Leu

85 90 95

Thr Asp Gly Gly Thr Asp Thr Thr Gly Tyr Ala Thr Trp Asp Ile Asp

100 105 110

Ile Met Gly Phe Val Gln Leu Arg Arg Lys Cys Glu Met Phe Thr Tyr

115 120 125

Met Arg Phe Asn Ala Glu Phe Thr Phe Val Thr Thr Thr Lys Asn Gly

130 135 140

Glu Ala Arg Pro Tyr Met Leu Gln Tyr Met Tyr Val Pro Pro Gly Ala

145 150 155 160

Pro Lys Pro Thr Gly Arg Asp Ala Phe Gln Trp Gln Thr Ala Thr Asn

165 170 175

Pro Ser Val Phe Val Lys Leu Thr Asp Pro Pro Ala Gln Val Ser Val

180 185 190

Pro Phe Met Ser Pro Ala Ser Ala Tyr Gln Trp Phe Tyr Asp Gly Tyr

195 200 205

Pro Thr Phe Gly Gln His Pro Glu Thr Ser Asn Thr Thr Tyr Gly Leu

210 215 220

Cys Pro Asn Asn Met Met Gly Thr Phe Ala Val Arg Val Val Ser Arg

225 230 235 240

Glu Ala Ser Gln Leu Lys Leu Gln Thr Arg Val Tyr Met Lys Leu Lys

245 250 255

His Val Arg Ala Trp Val Pro Arg Pro Ile Arg Ser Gln Pro Tyr Leu

260 265 270

Leu Lys Asn Phe Pro Asn Tyr Asp Ser Ser Lys Val Thr Asn Ser Ala

275 280 285

Arg Asp Arg Ser Ser Ile Lys Gln Ala Asn Met

290 295

<210> 6

<211> 249

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Met Glu Thr Gly Ala Thr Ser Asn Ala Thr Asp Glu Asn Met Ile Glu

1 5 10 15

Thr Arg Cys Val Val Asn Arg Asn Gly Val Leu Glu Thr Thr Ile Asn

20 25 30

His Phe Phe Ser Arg Ser Gly Leu Val Gly Val Val Asn Leu Thr Asp

35 40 45

Gly Gly Thr Asp Thr Thr Gly Tyr Ala Thr Trp Asp Ile Asp Ile Met

50 55 60

Gly Phe Val Gln Leu Arg Arg Lys Cys Glu Met Phe Thr Tyr Met Arg

65 70 75 80

Phe Asn Ala Glu Phe Thr Phe Val Thr Thr Thr Lys Asn Gly Glu Ala

85 90 95

Arg Pro Tyr Met Leu Gln Tyr Met Tyr Val Pro Pro Gly Ala Pro Lys

100 105 110

Pro Thr Gly Arg Asp Ala Phe Gln Trp Gln Thr Ala Thr Asn Pro Ser

115 120 125

Val Phe Val Lys Leu Thr Asp Pro Pro Ala Gln Val Ser Val Pro Phe

130 135 140

Met Ser Pro Ala Ser Ala Tyr Gln Trp Phe Tyr Asp Gly Tyr Pro Thr

145 150 155 160

Phe Gly Gln His Pro Glu Thr Ser Asn Thr Thr Tyr Gly Leu Cys Pro

165 170 175

Asn Asn Met Met Gly Thr Phe Ala Val Arg Val Val Ser Arg Glu Ala

180 185 190

Ser Gln Leu Lys Leu Gln Thr Arg Val Tyr Met Lys Leu Lys His Val

195 200 205

Arg Ala Trp Val Pro Arg Pro Ile Arg Ser Gln Pro Tyr Leu Leu Lys

210 215 220

Asn Phe Pro Asn Tyr Asp Ser Ser Lys Val Thr Asn Ser Ala Arg Asp

225 230 235 240

Arg Ser Ser Ile Lys Gln Ala Asn Met

245

<210> 7

<211> 227

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Met Asn Gly Val Leu Glu Thr Thr Ile Asn His Phe Phe Ser Arg Ser

1 5 10 15

Gly Leu Val Gly Val Val Asn Leu Thr Asp Gly Gly Thr Asp Thr Thr

20 25 30

Gly Tyr Ala Thr Trp Asp Ile Asp Ile Met Gly Phe Val Gln Leu Arg

35 40 45

Arg Lys Cys Glu Met Phe Thr Tyr Met Arg Phe Asn Ala Glu Phe Thr

50 55 60

Phe Val Thr Thr Thr Lys Asn Gly Glu Ala Arg Pro Tyr Met Leu Gln

65 70 75 80

Tyr Met Tyr Val Pro Pro Gly Ala Pro Lys Pro Thr Gly Arg Asp Ala

85 90 95

Phe Gln Trp Gln Thr Ala Thr Asn Pro Ser Val Phe Val Lys Leu Thr

100 105 110

Asp Pro Pro Ala Gln Val Ser Val Pro Phe Met Ser Pro Ala Ser Ala

115 120 125

Tyr Gln Trp Phe Tyr Asp Gly Tyr Pro Thr Phe Gly Gln His Pro Glu

130 135 140

Thr Ser Asn Thr Thr Tyr Gly Leu Cys Pro Asn Asn Met Met Gly Thr

145 150 155 160

Phe Ala Val Arg Val Val Ser Arg Glu Ala Ser Gln Leu Lys Leu Gln

165 170 175

Thr Arg Val Tyr Met Lys Leu Lys His Val Arg Ala Trp Val Pro Arg

180 185 190

Pro Ile Arg Ser Gln Pro Tyr Leu Leu Lys Asn Phe Pro Asn Tyr Asp

195 200 205

Ser Ser Lys Val Thr Asn Ser Ala Arg Asp Arg Ser Ser Ile Lys Gln

210 215 220

Ala Asn Met

225

<210> 8

<211> 972

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

atgggcgctc aggtaagcac tcagaaatcc ggttcacacg aaaccggaaa cgtagccacc 60

ggtgggtcta cgatcaattt tacaaatata aattattata aggattctta cgcagcctcc 120

gcaaccagac aagactttac ccaggacccc aaaaaattca cccaaccagt attggattcg 180

attagagaac tcagcgcgcc cttaaatagt ccttcagttg aggcatgcgg atacagcgat 240

agagtggcgc aactaacagt cggcaacagc tccatcacga ctcaggaggc agccaacatc 300

gtcctcgctt atggggagtg gcccgagtac tgtcctgata ctgacgccac agcagtcgat 360

aagcctacac ggcctgatgt gtcggttaat cgcttctaca ctcttgatag taagatgtgg 420

caggagaact ctacaggttg gtattggaaa ttcccggacg tcttaaataa gactggcgtg 480

ttcgggcaga atgctcagtt ccactacctg taccgctcag ggttttgcct tcatgttcaa 540

tgtaacgcca gtaagtttca tcagggcgcc ttactagtag cggtgatccc cgaatttgtg 600

attgcggggc gaggttcaaa tacgaaaccg aatgaggcgc cacatcccgg attcacaaca 660

accttcccag ggactactgg agctactttt catgacccat acgtgctaga ctccggggtg 720

ccactctctc aggccctaat ttatcctcat caatggatta atttgcgaac gaataactgc 780

gctacagtga tcgtcccgta cattaatgct gttccttttg atagcgctat caaccactct 840

aacttcggcc tcatcgttat cccggtgagt cctctgaagt atagttcagg tgcgacgacc 900

gcaattccaa taactattac gatagctccg ttaaatagcg agttcggtgg tctgcgacag 960

gcagtctcgc ag 972

<210> 9

<211> 723

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

atgggcatac cagcagagct gaggccggga accaaccaat ttctcacaac ggacgatgat 60

acagcggccc ccatccttcc aggcttcaca cctaccccca ccatacatat cccgggcgaa 120

gtccactctc tcttggaact ttgccgtgtc gaaactatct tggaggtgaa caacacgact 180

gaagcaacag gactcacgcg tcttttaata cctgtctctt cgcaaaacaa ggcggacgag 240

ttatgcgcgg cctttatggt cgatccggga cggattggcc catggcaatc aactctagta 300

ggtcagatat gtaggtacta tacccagtgg tctggttcgt taaaagttac ttttatgttt 360

actgggagtt tcatggccac aggtaagatg ctggttgcct actcaccacc ggggtctgcc 420

cagcccgcga acagagaaac ggcaatgcta ggtacacacg tcatatggga ttttggcctt 480

cagagttcag tatccctggt gattccttgg attagcaata cacactttcg cacagccaag 540

acgggaggaa actacgacta ctataccgcg ggtgtagtta ccttatggta tcaaacgaac 600

tatgttgttc cacccgaaac acccggcgaa gcttacatca tagccatggg agcagcacag 660

gacaatttta ccctgaaaat ttgtaaggat actgacgagg tgacccaaca agctgttctg 720

caa 723

<210> 10

<211> 897

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

atgggggacc ctgttgagga tataattcac gatgcgttgg gtaacacggc gcgcagggct 60

atatcatcgg ttaccaatgt cgaaagtgcc gcaaatacaa caccatcgtc gcatcgtctc 120

gagactggga gagtccctgc actacaagcc gccgagacgg gggccacgtc caacgcaacg 180

gacgaaaata tgatagaaac gaggtgtgtc gtgaatcgga acggggtttt ggaaacgact 240

attaaccact tcttcagcag gagtggacta gtaggggtcg tcaaccttac tgacggaggc 300

accgacacca ctggctatgc tacctgggat atcgacatta tgggtttcgt acaactacgt 360

cgtaaatgcg agatgtttac atatatgagg ttcaacgctg agtttacatt tgtcaccacg 420

acaaaaaacg gcgaggcccg accgtatatg cttcagtaca tgtatgtgcc ccccggtgct 480

ccaaaaccaa ctggaagaga cgcattccaa tggcaaactg caacgaatcc gtccgtgttt 540

gtaaagctca ctgatccgcc tgctcaagtt tccgtaccgt tcatgtcacc cgcttccgcc 600

tatcaatggt tctatgatgg atatcccacc ttcggacaac accctgaaac gtccaatact 660

acttatggct tatgtccgaa taatatgatg ggtacgttcg ctgtacgggt agtttcacga 720

gaagcaagcc agttaaaact tcaaacacgg gtatacatga agttgaaaca tgtgcgggcg 780

tgggtgcctc gccctatacg tagccagcca tacctgctca aaaattttcc gaattatgac 840

tcttcgaagg ttacgaactc agctcgcgac cgatcgtcga tcaaacaagc gaacatg 897

<210> 11

<211> 747

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

atggagacgg gggccacgtc caacgcaacg gacgaaaata tgatagaaac gaggtgtgtc 60

gtgaatcgga acggggtttt ggaaacgact attaaccact tcttcagcag gagtggacta 120

gtaggggtcg tcaaccttac tgacggaggc accgacacca ctggctatgc tacctgggat 180

atcgacatta tgggtttcgt acaactacgt cgtaaatgcg agatgtttac atatatgagg 240

ttcaacgctg agtttacatt tgtcaccacg acaaaaaacg gcgaggcccg accgtatatg 300

cttcagtaca tgtatgtgcc ccccggtgct ccaaaaccaa ctggaagaga cgcattccaa 360

tggcaaactg caacgaatcc gtccgtgttt gtaaagctca ctgatccgcc tgctcaagtt 420

tccgtaccgt tcatgtcacc cgcttccgcc tatcaatggt tctatgatgg atatcccacc 480

ttcggacaac accctgaaac gtccaatact acttatggct tatgtccgaa taatatgatg 540

ggtacgttcg ctgtacgggt agtttcacga gaagcaagcc agttaaaact tcaaacacgg 600

gtatacatga agttgaaaca tgtgcgggcg tgggtgcctc gccctatacg tagccagcca 660

tacctgctca aaaattttcc gaattatgac tcttcgaagg ttacgaactc agctcgcgac 720

cgatcgtcga tcaaacaagc gaacatg 747

<210> 12

<211> 681

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

atgaacgggg ttttggaaac gactattaac cacttcttca gcaggagtgg actagtaggg 60

gtcgtcaacc ttactgacgg aggcaccgac accactggct atgctacctg ggatatcgac 120

attatgggtt tcgtacaact acgtcgtaaa tgcgagatgt ttacatatat gaggttcaac 180

gctgagttta catttgtcac cacgacaaaa aacggcgagg cccgaccgta tatgcttcag 240

tacatgtatg tgccccccgg tgctccaaaa ccaactggaa gagacgcatt ccaatggcaa 300

actgcaacga atccgtccgt gtttgtaaag ctcactgatc cgcctgctca agtttccgta 360

ccgttcatgt cacccgcttc cgcctatcaa tggttctatg atggatatcc caccttcgga 420

caacaccctg aaacgtccaa tactacttat ggcttatgtc cgaataatat gatgggtacg 480

ttcgctgtac gggtagtttc acgagaagca agccagttaa aacttcaaac acgggtatac 540

atgaagttga aacatgtgcg ggcgtgggtg cctcgcccta tacgtagcca gccatacctg 600

ctcaaaaatt ttccgaatta tgactcttcg aaggttacga actcagctcg cgaccgatcg 660

tcgatcaaac aagcgaacat g 681

<210> 13

<211> 12759

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

agatctaaca tccaaagacg aaaggttgaa tgaaaccttt ttgccatccg acatccacag 60

gtccattctc acacataagt gccaaacgca acaggagggg atacactagc agcagaccgt 120

tgcaaacgca ggacctccac tcctcttctc ctcaacaccc acttttgcca tcgaaaaacc 180

agcccagtta ttgggcttga ttggagctcg ctcattccaa ttccttctat taggctacta 240

acaccatgac tttattagcc tgtctatcct ggcccccctg gcgaggttca tgtttgttta 300

tttccgaatg caacaagctc cgcattacac ccgaacatca ctccagatga gggctttctg 360

agtgtggggt caaatagttt catgttcccc aaatggccca aaactgacag tttaaacgct 420

gtcttggaac ctaatatgac aaaagcgtga tctcatccaa gatgaactaa gtttggttcg 480

ttgaaatgct aacggccagt tggtcaaaaa gaaacttcca aaagtcggca taccgtttgt 540

cttgtttggt attgattgac gaatgctcaa aaataatctc attaatgctt agcgcagtct 600

ctctatcgct tctgaacccc ggtgcacctg tgccgaaacg caaatgggga aacacccgct 660

ttttggatga ttatgcattg tctccacatt gtatgcttcc aagattctgg tgggaatact 720

gctgatagcc taacgttcat gatcaaaatt taactgttct aacccctact tgacagcaat 780

atataaacag aaggaagctg ccctgtctta aacctttttt tttatcatca ttattagctt 840

actttcataa ttgcgactgg ttccaattga caagcttttg attttaacga cttttaacga 900

caacttgaga agatcaaaaa acaactaatt attcgaaacg gaattcacca tgggcgctca 960

ggtaagcact cagaaatccg gttcacacga aaccggaaac gtagccaccg gtgggtctac 1020

gatcaatttt acaaatataa attattataa ggattcttac gcagcctccg caaccagaca 1080

agactttacc caggacccca aaaaattcac ccaaccagta ttggattcga ttagagaact 1140

cagcgcgccc ttaaatagtc cttcagttga ggcatgcgga tacagcgata gagtggcgca 1200

actaacagtc ggcaacagct ccatcacgac tcaggaggca gccaacatcg tcctcgctta 1260

tggggagtgg cccgagtact gtcctgatac tgacgccaca gcagtcgata agcctacacg 1320

gcctgatgtg tcggttaatc gcttctacac tcttgatagt aagatgtggc aggagaactc 1380

tacaggttgg tattggaaat tcccggacgt cttaaataag actggcgtgt tcgggcagaa 1440

tgctcagttc cactacctgt accgctcagg gttttgcctt catgttcaat gtaacgccag 1500

taagtttcat cagggcgcct tactagtagc ggtgatcccc gaatttgtga ttgcggggcg 1560

aggttcaaat acgaaaccga atgaggcgcc acatcccgga ttcacaacaa ccttcccagg 1620

gactactgga gctacttttc atgacccata cgtgctagac tccggggtgc cactctctca 1680

ggccctaatt tatcctcatc aatggattaa tttgcgaacg aataactgcg ctacagtgat 1740

cgtcccgtac attaatgctg ttccttttga tagcgctatc aaccactcta acttcggcct 1800

catcgttatc ccggtgagtc ctctgaagta tagttcaggt gcgacgaccg caattccaat 1860

aactattacg atagctccgt taaatagcga gttcggtggt ctgcgacagg cagtctcgca 1920

gtaatgaggt accggccggc catttaaata caggcccctt ttcctttgtc gatatcatgt 1980

aattagttat gtcacgctta cattcacgcc ctcctcccac atccgctcta accgaaaagg 2040

aaggagttag acaacctgaa gtctaggtcc ctatttattt tttttaatag ttatgttagt 2100

attaagaacg ttatttatat ttcaaatttt tctttttttt ctgtacaaac gcgtgtacgc 2160

atgtaacatt atactgaaaa ccttgcttga gaaggttttg ggacgctcga aggctttaat 2220

ttgcaagctg gatctaacat ccaaagacga aaggttgaat gaaacctttt tgccatccga 2280

catccacagg tccattctca cacataagtg ccaaacgcaa caggagggga tacactagca 2340

gcagaccgtt gcaaacgcag gacctccact cctcttctcc tcaacaccca cttttgccat 2400

cgaaaaacca gcccagttat tgggcttgat tggagctcgc tcattccaat tccttctatt 2460

aggctactaa caccatgact ttattagcct gtctatcctg gcccccctgg cgaggttcat 2520

gtttgtttat ttccgaatgc aacaagctcc gcattacacc cgaacatcac tccagatgag 2580

ggctttctga gtgtggggtc aaatagtttc atgttcccca aatggcccaa aactgacagt 2640

ttaaacgctg tcttggaacc taatatgaca aaagcgtgat ctcatccaag atgaactaag 2700

tttggttcgt tgaaatgcta acggccagtt ggtcaaaaag aaacttccaa aagtcggcat 2760

accgtttgtc ttgtttggta ttgattgacg aatgctcaaa aataatctca ttaatgctta 2820

gcgcagtctc tctatcgctt ctgaaccccg gtgcacctgt gccgaaacgc aaatggggaa 2880

acacccgctt tttggatgat tatgcattgt ctccacattg tatgcttcca agattctggt 2940

gggaatactg ctgatagcct aacgttcatg atcaaaattt aactgttcta acccctactt 3000

gacagcaata tataaacaga aggaagctgc cctgtcttaa accttttttt ttatcatcat 3060

tattagctta ctttcataat tgcgactggt tccaattgac aagcttttga ttttaacgac 3120

ttttaacgac aacttgagaa gatcaaaaaa caactaatta ttcgaaacgg aattcaccat 3180

gggcatacca gcagagctga ggccgggaac caaccaattt ctcacaacgg acgatgatac 3240

agcggccccc atccttccag gcttcacacc tacccccacc atacatatcc cgggcgaagt 3300

ccactctctc ttggaacttt gccgtgtcga aactatcttg gaggtgaaca acacgactga 3360

agcaacagga ctcacgcgtc ttttaatacc tgtctcttcg caaaacaagg cggacgagtt 3420

atgcgcggcc tttatggtcg atccgggacg gattggccca tggcaatcaa ctctagtagg 3480

tcagatatgt aggtactata cccagtggtc tggttcgtta aaagttactt ttatgtttac 3540

tgggagtttc atggccacag gtaagatgct ggttgcctac tcaccaccgg ggtctgccca 3600

gcccgcgaac agagaaacgg caatgctagg tacacacgtc atatgggatt ttggccttca 3660

gagttcagta tccctggtga ttccttggat tagcaataca cactttcgca cagccaagac 3720

gggaggaaac tacgactact ataccgcggg tgtagttacc ttatggtatc aaacgaacta 3780

tgttgttcca cccgaaacac ccggcgaagc ttacatcata gccatgggag cagcacagga 3840

caattttacc ctgaaaattt gtaaggatac tgacgaggtg acccaacaag ctgttctgca 3900

ataatgaggt accggccggc catttaaata caggcccctt ttcctttgtc gatatcatgt 3960

aattagttat gtcacgctta cattcacgcc ctcctcccac atccgctcta accgaaaagg 4020

aaggagttag acaacctgaa gtctaggtcc ctatttattt tttttaatag ttatgttagt 4080

attaagaacg ttatttatat ttcaaatttt tctttttttt ctgtacaaac gcgtgtacgc 4140

atgtaacatt atactgaaaa ccttgcttga gaaggttttg ggacgctcga aggctttaat 4200

ttgcaagctg gatctaacat ccaaagacga aaggttgaat gaaacctttt tgccatccga 4260

catccacagg tccattctca cacataagtg ccaaacgcaa caggagggga tacactagca 4320

gcagaccgtt gcaaacgcag gacctccact cctcttctcc tcaacaccca cttttgccat 4380

cgaaaaacca gcccagttat tgggcttgat tggagctcgc tcattccaat tccttctatt 4440

aggctactaa caccatgact ttattagcct gtctatcctg gcccccctgg cgaggttcat 4500

gtttgtttat ttccgaatgc aacaagctcc gcattacacc cgaacatcac tccagatgag 4560

ggctttctga gtgtggggtc aaatagtttc atgttcccca aatggcccaa aactgacagt 4620

ttaaacgctg tcttggaacc taatatgaca aaagcgtgat ctcatccaag atgaactaag 4680

tttggttcgt tgaaatgcta acggccagtt ggtcaaaaag aaacttccaa aagtcggcat 4740

accgtttgtc ttgtttggta ttgattgacg aatgctcaaa aataatctca ttaatgctta 4800

gcgcagtctc tctatcgctt ctgaaccccg gtgcacctgt gccgaaacgc aaatggggaa 4860

acacccgctt tttggatgat tatgcattgt ctccacattg tatgcttcca agattctggt 4920

gggaatactg ctgatagcct aacgttcatg atcaaaattt aactgttcta acccctactt 4980

gacagcaata tataaacaga aggaagctgc cctgtcttaa accttttttt ttatcatcat 5040

tattagctta ctttcataat tgcgactggt tccaattgac aagcttttga ttttaacgac 5100

ttttaacgac aacttgagaa gatcaaaaaa caactaatta ttcgaaacgg aattcaccat 5160

gggggaccct gttgaggata taattcacga tgcgttgggt aacacggcgc gcagggctat 5220

atcatcggtt accaatgtcg aaagtgccgc aaatacaaca ccatcgtcgc atcgtctcga 5280

gactgggaga gtccctgcac tacaagccgc cgagacgggg gccacgtcca acgcaacgga 5340

cgaaaatatg atagaaacga ggtgtgtcgt gaatcggaac ggggttttgg aaacgactat 5400

taaccacttc ttcagcagga gtggactagt aggggtcgtc aaccttactg acggaggcac 5460

cgacaccact ggctatgcta cctgggatat cgacattatg ggtttcgtac aactacgtcg 5520

taaatgcgag atgtttacat atatgaggtt caacgctgag tttacatttg tcaccacgac 5580

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aaaaccaact ggaagagacg cattccaatg gcaaactgca acgaatccgt ccgtgtttgt 5700

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tcaatggttc tatgatggat atcccacctt cggacaacac cctgaaacgt ccaatactac 5820

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agcaagccag ttaaaacttc aaacacgggt atacatgaag ttgaaacatg tgcgggcgtg 5940

ggtgcctcgc cctatacgta gccagccata cctgctcaaa aattttccga attatgactc 6000

ttcgaaggtt acgaactcag ctcgcgaccg atcgtcgatc aaacaagcga acatgtaatg 6060

aggtaccggc cggccattta aatacaggcc ccttttcctt tgtcgatatc atgtaattag 6120

ttatgtcacg cttacattca cgccctcctc ccacatccgc tctaaccgaa aaggaaggag 6180

ttagacaacc tgaagtctag gtccctattt atttttttta atagttatgt tagtattaag 6240

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cattatactg aaaaccttgc ttgagaaggt tttgggacgc tcgaaggctt taatttgcaa 6360

gctggatccg cggccgcctt ccaaactctc atggattctc aggtaatagg tattctagga 6420

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gtagagattg agcatgtcaa cacagatgct ctaaagagag ttcaagacag aactggaatc 6660

aagatatatc ctttaccaga gacaatcgaa ctaatcaagg ataagtactt gcaaaaggaa 6720

catttgatca agcacaacat ttcggtgaca aagtctcagg gtatagaatc taatgaaaag 6780

gcgctgcttt tgtttggaga agagaatgga tttccatatc tgttgaagtc ccggactatg 6840

gcttatgatg gaagaggcaa ttttgtagtg gagtctaaag aggacatcag taaggcatta 6900

gagttcttga aagatcgtcc attgtatgcc gagaagtttg ctccttttgt taaagaatta 6960

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gtgcacaagg acaatatctg tcatattgtg tatgctccgg ccagagttaa tgacaccatc 7080

caaaagaaag ctcaaatatt agctgaaaac actgtgaaga ctttcccagg cgctggaatc 7140

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aggccccaca attctggtca ctatacaatc gatgcatgtg taacatctca gttcgaagca 7260

catgtaagag ccataactgg tctgccaatg ccactagatt tcaccaaact atctacttcc 7320

aacaccaacg ctattatgct caatgttttg ggtgctgaaa aatctcacgg ggaattagag 7380

ttttgtagaa gagccttaga aacacccggt gcttctgtat atctgtacgg aaagaccacc 7440

cgattggctc gtaagatggg tcatatcaac ataataggat cttccatgtt ggaagcagaa 7500

caaaagttag agtacattct agaagaatca acccacttac catccagtac tgtatcagct 7560

gacactaaac cgttggttgg agttatcatg ggttcagact ctgatctacc tgtgatttcg 7620

aaaggttgcg atattttaaa acagtttggt gttccattcg aagttactat tgtctctgct 7680

catagaacac cacagagaat gaccagatat gcctttgaag ccgctagtag aggtatcaag 7740

gctatcattg caggtgctgg tggtgctgct catcttccag gaatggttgc tgccatgact 7800

ccgttgccag tcattggtgt tcctgtcaag ggctctacgt tggatggtgt agactcgcta 7860

cactcgattg tccaaatgcc tagaggtgtt cctgtggcta cggttgctat caacaacgcc 7920

accaatgccg ctctgttggc catcaggatt ttaggtacaa ttgaccacaa atggcaaaag 7980

gaaatgtcca agtatatgaa tgcaatggag accgaagtgt tggggaaggc atccaacttg 8040

gaatctgaag ggtatgaatc ctatttgaag aatcgtcttt gaatttagta ttgtttttta 8100

atagatgtat atataatagt acacgtaact tatctattcc attcataatt ttattttaaa 8160

ggttcggtag aaatttgtcc tccaaaaagt tggttagagc ctggcagttt tgataggcat 8220

tattatagat tgggtaatat ttaccctgca cctggaggaa ctttgcaaag agcctcatgt 8280

gcggcgcgcc aggccataat ggccaaacgg tttctcaatt actatatact actaaccatt 8340

tacctgtagc gtatttcttt tccctcttcg cgaaagctca agggcatctt cttgactcat 8400

gaaaaatatc tggatttctt ctgacagatc atcacccttg agcccaactc tctagcctat 8460

gagtgtaagt gatagtcatc ttgcaacaga ttattttgga acgcaactaa caaagcagat 8520

acacccttca gcagaatcct ttctggatat tgtgaagaat gatcgccaaa gtcacagtcc 8580

tgagacagtt cctaatcttt accccattta caagttcatc caatcagact tcttaacgcc 8640

tcatctggct tatatcaagc ttaccaacag ttcagaaact cccagtccaa gtttcttgct 8700

tgaaagtgcg aagaatggtg acaccgttga caggtacacc tttatgggac attcccccag 8760

aaaaataatc aagactgggc ctttagaggg tgctgaagtt gaccccttgg tgcttctgga 8820

aaaagaactg aagggcacca gacaagcgca acttcctggt attcctcgtc taagtggtgg 8880

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ttttgacaat gtttatcaaa gattccaggt aattggaaac gtttctctat ccgttgatga 9060

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taaagtggta tttgacaata aaactgttcc ctactatgaa cagaaagata ttattcaagg 9180

ccaaacgttc acctctaata ttggtcagga agggtatgaa aaccatgttc gcaagctgaa 9240

agaacatatt ctgaaaggag acatcttcca agctgttccc tctcaaaggg tagccaggcc 9300

gacctcattg caccctttca acatctatcg tcatttgaga actgtcaatc cttctccata 9360

catgttctat attgactatc tagacttcca agttgttggt gcttcacctg aattactagt 9420

taaatccgac aacaacaaca aaatcatcac acatcctatt gctggaactc ttcccagagg 9480

taaaactatc gaagaggacg acaattatgc taagcaattg aagtcgtctt tgaaagacag 9540

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agaattggaa ggagaaaaga gaggtgttta tgcgggggcc gtaggacact ggtcgtacga 9840

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cgataggttg gccagagacg agaatcaaag tgaatccgaa gaaaacgatc aatgaacgga 10080

ggacgtaagt aggaatttat ggtttggcca taatggccta gcttggcgta atcatggtca 10140

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cgctgtaggt atctcagttc ggtgtaggtc gttcgctcca agctgggctg tgtgcacgaa 10800

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agcccagtta ttgggcttga ttggagctcg ctcattccaa ttccttctat taggctacta 240

acaccatgac tttattagcc tgtctatcct ggcccccctg gcgaggttca tgtttgttta 300

tttccgaatg caacaagctc cgcattacac ccgaacatca ctccagatga gggctttctg 360

agtgtggggt caaatagttt catgttcccc aaatggccca aaactgacag tttaaacgct 420

gtcttggaac ctaatatgac aaaagcgtga tctcatccaa gatgaactaa gtttggttcg 480

ttgaaatgct aacggccagt tggtcaaaaa gaaacttcca aaagtcggca taccgtttgt 540

cttgtttggt attgattgac gaatgctcaa aaataatctc attaatgctt agcgcagtct 600

ctctatcgct tctgaacccc ggtgcacctg tgccgaaacg caaatgggga aacacccgct 660

ttttggatga ttatgcattg tctccacatt gtatgcttcc aagattctgg tgggaatact 720

gctgatagcc taacgttcat gatcaaaatt taactgttct aacccctact tgacagcaat 780

atataaacag aaggaagctg ccctgtctta aacctttttt tttatcatca ttattagctt 840

actttcataa ttgcgactgg ttccaattga caagcttttg attttaacga cttttaacga 900

caacttgaga agatcaaaaa acaactaatt attcgaaacg gaattcacca tgggcgctca 960

ggtaagcact cagaaatccg gttcacacga aaccggaaac gtagccaccg gtgggtctac 1020

gatcaatttt acaaatataa attattataa ggattcttac gcagcctccg caaccagaca 1080

agactttacc caggacccca aaaaattcac ccaaccagta ttggattcga ttagagaact 1140

cagcgcgccc ttaaatagtc cttcagttga ggcatgcgga tacagcgata gagtggcgca 1200

actaacagtc ggcaacagct ccatcacgac tcaggaggca gccaacatcg tcctcgctta 1260

tggggagtgg cccgagtact gtcctgatac tgacgccaca gcagtcgata agcctacacg 1320

gcctgatgtg tcggttaatc gcttctacac tcttgatagt aagatgtggc aggagaactc 1380

tacaggttgg tattggaaat tcccggacgt cttaaataag actggcgtgt tcgggcagaa 1440

tgctcagttc cactacctgt accgctcagg gttttgcctt catgttcaat gtaacgccag 1500

taagtttcat cagggcgcct tactagtagc ggtgatcccc gaatttgtga ttgcggggcg 1560

aggttcaaat acgaaaccga atgaggcgcc acatcccgga ttcacaacaa ccttcccagg 1620

gactactgga gctacttttc atgacccata cgtgctagac tccggggtgc cactctctca 1680

ggccctaatt tatcctcatc aatggattaa tttgcgaacg aataactgcg ctacagtgat 1740

cgtcccgtac attaatgctg ttccttttga tagcgctatc aaccactcta acttcggcct 1800

catcgttatc ccggtgagtc ctctgaagta tagttcaggt gcgacgaccg caattccaat 1860

aactattacg atagctccgt taaatagcga gttcggtggt ctgcgacagg cagtctcgca 1920

gtaatgaggt accggccggc catttaaata caggcccctt ttcctttgtc gatatcatgt 1980

aattagttat gtcacgctta cattcacgcc ctcctcccac atccgctcta accgaaaagg 2040

aaggagttag acaacctgaa gtctaggtcc ctatttattt tttttaatag ttatgttagt 2100

attaagaacg ttatttatat ttcaaatttt tctttttttt ctgtacaaac gcgtgtacgc 2160

atgtaacatt atactgaaaa ccttgcttga gaaggttttg ggacgctcga aggctttaat 2220

ttgcaagctg gatctaacat ccaaagacga aaggttgaat gaaacctttt tgccatccga 2280

catccacagg tccattctca cacataagtg ccaaacgcaa caggagggga tacactagca 2340

gcagaccgtt gcaaacgcag gacctccact cctcttctcc tcaacaccca cttttgccat 2400

cgaaaaacca gcccagttat tgggcttgat tggagctcgc tcattccaat tccttctatt 2460

aggctactaa caccatgact ttattagcct gtctatcctg gcccccctgg cgaggttcat 2520

gtttgtttat ttccgaatgc aacaagctcc gcattacacc cgaacatcac tccagatgag 2580

ggctttctga gtgtggggtc aaatagtttc atgttcccca aatggcccaa aactgacagt 2640

ttaaacgctg tcttggaacc taatatgaca aaagcgtgat ctcatccaag atgaactaag 2700

tttggttcgt tgaaatgcta acggccagtt ggtcaaaaag aaacttccaa aagtcggcat 2760

accgtttgtc ttgtttggta ttgattgacg aatgctcaaa aataatctca ttaatgctta 2820

gcgcagtctc tctatcgctt ctgaaccccg gtgcacctgt gccgaaacgc aaatggggaa 2880

acacccgctt tttggatgat tatgcattgt ctccacattg tatgcttcca agattctggt 2940

gggaatactg ctgatagcct aacgttcatg atcaaaattt aactgttcta acccctactt 3000

gacagcaata tataaacaga aggaagctgc cctgtcttaa accttttttt ttatcatcat 3060

tattagctta ctttcataat tgcgactggt tccaattgac aagcttttga ttttaacgac 3120

ttttaacgac aacttgagaa gatcaaaaaa caactaatta ttcgaaacgg aattcaccat 3180

gggcatacca gcagagctga ggccgggaac caaccaattt ctcacaacgg acgatgatac 3240

agcggccccc atccttccag gcttcacacc tacccccacc atacatatcc cgggcgaagt 3300

ccactctctc ttggaacttt gccgtgtcga aactatcttg gaggtgaaca acacgactga 3360

agcaacagga ctcacgcgtc ttttaatacc tgtctcttcg caaaacaagg cggacgagtt 3420

atgcgcggcc tttatggtcg atccgggacg gattggccca tggcaatcaa ctctagtagg 3480

tcagatatgt aggtactata cccagtggtc tggttcgtta aaagttactt ttatgtttac 3540

tgggagtttc atggccacag gtaagatgct ggttgcctac tcaccaccgg ggtctgccca 3600

gcccgcgaac agagaaacgg caatgctagg tacacacgtc atatgggatt ttggccttca 3660

gagttcagta tccctggtga ttccttggat tagcaataca cactttcgca cagccaagac 3720

gggaggaaac tacgactact ataccgcggg tgtagttacc ttatggtatc aaacgaacta 3780

tgttgttcca cccgaaacac ccggcgaagc ttacatcata gccatgggag cagcacagga 3840

caattttacc ctgaaaattt gtaaggatac tgacgaggtg acccaacaag ctgttctgca 3900

ataatgaggt accggccggc catttaaata caggcccctt ttcctttgtc gatatcatgt 3960

aattagttat gtcacgctta cattcacgcc ctcctcccac atccgctcta accgaaaagg 4020

aaggagttag acaacctgaa gtctaggtcc ctatttattt tttttaatag ttatgttagt 4080

attaagaacg ttatttatat ttcaaatttt tctttttttt ctgtacaaac gcgtgtacgc 4140

atgtaacatt atactgaaaa ccttgcttga gaaggttttg ggacgctcga aggctttaat 4200

ttgcaagctg gatctaacat ccaaagacga aaggttgaat gaaacctttt tgccatccga 4260

catccacagg tccattctca cacataagtg ccaaacgcaa caggagggga tacactagca 4320

gcagaccgtt gcaaacgcag gacctccact cctcttctcc tcaacaccca cttttgccat 4380

cgaaaaacca gcccagttat tgggcttgat tggagctcgc tcattccaat tccttctatt 4440

aggctactaa caccatgact ttattagcct gtctatcctg gcccccctgg cgaggttcat 4500

gtttgtttat ttccgaatgc aacaagctcc gcattacacc cgaacatcac tccagatgag 4560

ggctttctga gtgtggggtc aaatagtttc atgttcccca aatggcccaa aactgacagt 4620

ttaaacgctg tcttggaacc taatatgaca aaagcgtgat ctcatccaag atgaactaag 4680

tttggttcgt tgaaatgcta acggccagtt ggtcaaaaag aaacttccaa aagtcggcat 4740

accgtttgtc ttgtttggta ttgattgacg aatgctcaaa aataatctca ttaatgctta 4800

gcgcagtctc tctatcgctt ctgaaccccg gtgcacctgt gccgaaacgc aaatggggaa 4860

acacccgctt tttggatgat tatgcattgt ctccacattg tatgcttcca agattctggt 4920

gggaatactg ctgatagcct aacgttcatg atcaaaattt aactgttcta acccctactt 4980

gacagcaata tataaacaga aggaagctgc cctgtcttaa accttttttt ttatcatcat 5040

tattagctta ctttcataat tgcgactggt tccaattgac aagcttttga ttttaacgac 5100

ttttaacgac aacttgagaa gatcaaaaaa caactaatta ttcgaaacgg aattcaccat 5160

gaacggggtt ttggaaacga ctattaacca cttcttcagc aggagtggac tagtaggggt 5220

cgtcaacctt actgacggag gcaccgacac cactggctat gctacctggg atatcgacat 5280

tatgggtttc gtacaactac gtcgtaaatg cgagatgttt acatatatga ggttcaacgc 5340

tgagtttaca tttgtcacca cgacaaaaaa cggcgaggcc cgaccgtata tgcttcagta 5400

catgtatgtg ccccccggtg ctccaaaacc aactggaaga gacgcattcc aatggcaaac 5460

tgcaacgaat ccgtccgtgt ttgtaaagct cactgatccg cctgctcaag tttccgtacc 5520

gttcatgtca cccgcttccg cctatcaatg gttctatgat ggatatccca ccttcggaca 5580

acaccctgaa acgtccaata ctacttatgg cttatgtccg aataatatga tgggtacgtt 5640

cgctgtacgg gtagtttcac gagaagcaag ccagttaaaa cttcaaacac gggtatacat 5700

gaagttgaaa catgtgcggg cgtgggtgcc tcgccctata cgtagccagc catacctgct 5760

caaaaatttt ccgaattatg actcttcgaa ggttacgaac tcagctcgcg accgatcgtc 5820

gatcaaacaa gcgaacatgt aatgaggtac cggccggcca tttaaataca ggcccctttt 5880

cctttgtcga tatcatgtaa ttagttatgt cacgcttaca ttcacgccct cctcccacat 5940

ccgctctaac cgaaaaggaa ggagttagac aacctgaagt ctaggtccct atttattttt 6000

tttaatagtt atgttagtat taagaacgtt atttatattt caaatttttc ttttttttct 6060

gtacaaacgc gtgtacgcat gtaacattat actgaaaacc ttgcttgaga aggttttggg 6120

acgctcgaag gctttaattt gcaagctgga tccgcggccg ccttccaaac tctcatggat 6180

tctcaggtaa taggtattct aggaggaggc cagctaggcc gaatgattgt tgaggccgct 6240

agcaggctca atatcaagac cgtgattctt gatgatggtt tttcacctgc taagcacatt 6300

aatgctgcgc aagaccacat cgacggatca ttcaaagatg aggaggctat cgccaagtta 6360

gctgccaaat gtgatgttct cactgtagag attgagcatg tcaacacaga tgctctaaag 6420

agagttcaag acagaactgg aatcaagata tatcctttac cagagacaat cgaactaatc 6480

aaggataagt acttgcaaaa ggaacatttg atcaagcaca acatttcggt gacaaagtct 6540

cagggtatag aatctaatga aaaggcgctg cttttgtttg gagaagagaa tggatttcca 6600

tatctgttga agtcccggac tatggcttat gatggaagag gcaattttgt agtggagtct 6660

aaagaggaca tcagtaaggc attagagttc ttgaaagatc gtccattgta tgccgagaag 6720

tttgctcctt ttgttaaaga attagcggta atggttgtga gatcactgga aggcgaagta 6780

ttctcctacc caaccgtaga aactgtgcac aaggacaata tctgtcatat tgtgtatgct 6840

ccggccagag ttaatgacac catccaaaag aaagctcaaa tattagctga aaacactgtg 6900

aagactttcc caggcgctgg aatcttcgga gttgagatgt tcctattgtc tgatggagaa 6960

cttcttgtaa atgagattgc tccaaggccc cacaattctg gtcactatac aatcgatgca 7020

tgtgtaacat ctcagttcga agcacatgta agagccataa ctggtctgcc aatgccacta 7080

gatttcacca aactatctac ttccaacacc aacgctatta tgctcaatgt tttgggtgct 7140

gaaaaatctc acggggaatt agagttttgt agaagagcct tagaaacacc cggtgcttct 7200

gtatatctgt acggaaagac cacccgattg gctcgtaaga tgggtcatat caacataata 7260

ggatcttcca tgttggaagc agaacaaaag ttagagtaca ttctagaaga atcaacccac 7320

ttaccatcca gtactgtatc agctgacact aaaccgttgg ttggagttat catgggttca 7380

gactctgatc tacctgtgat ttcgaaaggt tgcgatattt taaaacagtt tggtgttcca 7440

ttcgaagtta ctattgtctc tgctcataga acaccacaga gaatgaccag atatgccttt 7500

gaagccgcta gtagaggtat caaggctatc attgcaggtg ctggtggtgc tgctcatctt 7560

ccaggaatgg ttgctgccat gactccgttg ccagtcattg gtgttcctgt caagggctct 7620

acgttggatg gtgtagactc gctacactcg attgtccaaa tgcctagagg tgttcctgtg 7680

gctacggttg ctatcaacaa cgccaccaat gccgctctgt tggccatcag gattttaggt 7740

acaattgacc acaaatggca aaaggaaatg tccaagtata tgaatgcaat ggagaccgaa 7800

gtgttgggga aggcatccaa cttggaatct gaagggtatg aatcctattt gaagaatcgt 7860

ctttgaattt agtattgttt tttaatagat gtatatataa tagtacacgt aacttatcta 7920

ttccattcat aattttattt taaaggttcg gtagaaattt gtcctccaaa aagttggtta 7980

gagcctggca gttttgatag gcattattat agattgggta atatttaccc tgcacctgga 8040

ggaactttgc aaagagcctc atgtgcggcg cgccaggcca taatggccaa acggtttctc 8100

aattactata tactactaac catttacctg tagcgtattt cttttccctc ttcgcgaaag 8160

ctcaagggca tcttcttgac tcatgaaaaa tatctggatt tcttctgaca gatcatcacc 8220

cttgagccca actctctagc ctatgagtgt aagtgatagt catcttgcaa cagattattt 8280

tggaacgcaa ctaacaaagc agatacaccc ttcagcagaa tcctttctgg atattgtgaa 8340

gaatgatcgc caaagtcaca gtcctgagac agttcctaat ctttacccca tttacaagtt 8400

catccaatca gacttcttaa cgcctcatct ggcttatatc aagcttacca acagttcaga 8460

aactcccagt ccaagtttct tgcttgaaag tgcgaagaat ggtgacaccg ttgacaggta 8520

cacctttatg ggacattccc ccagaaaaat aatcaagact gggcctttag agggtgctga 8580

agttgacccc ttggtgcttc tggaaaaaga actgaagggc accagacaag cgcaacttcc 8640

tggtattcct cgtctaagtg gtggtgccat aggatacatc tcgtacgatt gtattaagta 8700

ctttgaacca aaaactgaaa gaaaactgaa agatgttttg caacttccgg aagcagcttt 8760

gatgttgttc gacacgatcg tggcttttga caatgtttat caaagattcc aggtaattgg 8820

aaacgtttct ctatccgttg atgactcgga cgaagctatt cttgagaaat attataagac 8880

aagagaagaa gtggaaaaga tcagtaaagt ggtatttgac aataaaactg ttccctacta 8940

tgaacagaaa gatattattc aaggccaaac gttcacctct aatattggtc aggaagggta 9000

tgaaaaccat gttcgcaagc tgaaagaaca tattctgaaa ggagacatct tccaagctgt 9060

tccctctcaa agggtagcca ggccgacctc attgcaccct ttcaacatct atcgtcattt 9120

gagaactgtc aatccttctc catacatgtt ctatattgac tatctagact tccaagttgt 9180

tggtgcttca cctgaattac tagttaaatc cgacaacaac aacaaaatca tcacacatcc 9240

tattgctgga actcttccca gaggtaaaac tatcgaagag gacgacaatt atgctaagca 9300

attgaagtcg tctttgaaag acagggccga gcacgtcatg ctggtagatt tggccagaaa 9360

tgatattaac cgtgtgtgtg agcccaccag taccacggtt gatcgtttat tgactgtgga 9420

gagattttct catgtgatgc atcttgtgtc agaagtcagt ggaacattga gaccaaacaa 9480

gactcgcttc gatgctttca gatccatttt cccagcagga accgtctccg gtgctccgaa 9540

ggtaagagca atgcaactca taggagaatt ggaaggagaa aagagaggtg tttatgcggg 9600

ggccgtagga cactggtcgt acgatggaaa atcgatggac acatgtattg ccttaagaac 9660

aatggtcgtc aaggacggtg tcgcttacct tcaagccgga ggtggaattg tctacgattc 9720

tgacccctat gacgagtaca tcgaaaccat gaacaaaatg agatccaaca ataacaccat 9780

cttggaggct gagaaaatct ggaccgatag gttggccaga gacgagaatc aaagtgaatc 9840

cgaagaaaac gatcaatgaa cggaggacgt aagtaggaat ttatggtttg gccataatgg 9900

cctagcttgg cgtaatcatg gtcatagctg tttcctgtgt gaaattgtta tccgctcaca 9960

attccacaca acatacgagc cggaagcata aagtgtaaag cctggggtgc ctaatgagtg 10020

agctaactca cattaattgc gttgcgctca ctgcccgctt tccagtcggg aaacctgtcg 10080

tgccagctgc attaatgaat cggccaacgc gcggggagag gcggtttgcg tattgggcgc 10140

tcttccgctt cctcgctcac tgactcgctg cgctcggtcg ttcggctgcg gcgagcggta 10200

tcagctcact caaaggcggt aatacggtta tccacagaat caggggataa cgcaggaaag 10260

aacatgtgag caaaaggcca gcaaaaggcc aggaaccgta aaaaggccgc gttgctggcg 10320

tttttccata ggctccgccc ccctgacgag catcacaaaa atcgacgctc aagtcagagg 10380

tggcgaaacc cgacaggact ataaagatac caggcgtttc cccctggaag ctccctcgtg 10440

cgctctcctg ttccgaccct gccgcttacc ggatacctgt ccgcctttct cccttcggga 10500

agcgtggcgc tttctcatag ctcacgctgt aggtatctca gttcggtgta ggtcgttcgc 10560

tccaagctgg gctgtgtgca cgaacccccc gttcagcccg accgctgcgc cttatccggt 10620

aactatcgtc ttgagtccaa cccggtaaga cacgacttat cgccactggc agcagccact 10680

ggtaacagga ttagcagagc gaggtatgta ggcggtgcta cagagttctt gaagtggtgg 10740

cctaactacg gctacactag aaggacagta tttggtatct gcgctctgct gaagccagtt 10800

accttcggaa aaagagttgg tagctcttga tccggcaaac aaaccaccgc tggtagcggt 10860

ggtttttttg tttgcaagca gcagattacg cgcagaaaaa aaggatctca agaagatcct 10920

ttgatctttt ctacggggtc tgacgctcag tggaacgaaa actcacgtta agggattttg 10980

gtcatgagat tatcaaaaag gatcttcacc tagatccttt taaattaaaa atgaagtttt 11040

aaatcaatct aaagtatata tgagtaaact tggtctgaca gttaccaatg cttaatcagt 11100

gaggcaccta tctcagcgat ctgtctattt cgttcatcca tagttgcctg actccccgtc 11160

gtgtagataa ctacgatacg ggagggctta ccatctggcc ccagtgctgc aatgataccg 11220

cgagacccac gctcaccggc tccagattta tcagcaataa accagccagc cggaagggcc 11280

gagcgcagaa gtggtcctgc aactttatcc gcctccatcc agtctattaa ttgttgccgg 11340

gaagctagag taagtagttc gccagttaat agtttgcgca acgttgttgc cattgctaca 11400

ggcatcgtgg tgtcacgctc gtcgtttggt atggcttcat tcagctccgg ttcccaacga 11460

tcaaggcgag ttacatgatc ccccatgttg tgcaaaaaag cggttagctc cttcggtcct 11520

ccgatcgttg tcagaagtaa gttggccgca gtgttatcac tcatggttat ggcagcactg 11580

cataattctc ttactgtcat gccatccgta agatgctttt ctgtgactgg tgagtactca 11640

accaagtcat tctgagaata gtgtatgcgg cgaccgagtt gctcttgccc ggcgtcaata 11700

cgggataata ccgcgccaca tagcagaact ttaaaagtgc tcatcattgg aaaacgttct 11760

tcggggcgaa aactctcaag gatcttaccg ctgttgagat ccagttcgat gtaacccact 11820

cgtgcaccca actgatcttc agcatctttt actttcacca gcgtttctgg gtgagcaaaa 11880

acaggaaggc aaaatgccgc aaaaaaggga ataagggcga cacggaaatg ttgaatactc 11940

atactcttcc tttttcaata ttattgaagc atttatcagg gttattgtct catgagcgga 12000

tacatatttg aatgtattta gaaaaataaa caaatagggg ttccgcgcac atttccccga 12060

aaagtgccac ctgacgtcta agaaaccatt attatcatga cattaaccta taaaaatagg 12120

cgtatcacga ggccctttcg tctcgcgcgt ttcggtgatg acggtgaaaa cctctgacac 12180

atgcagctcc cggagacggt cacagcttgt ctgtaagcgg atgccgggag cagacaagcc 12240

cgtcagggcg cgtcagcggg tgttggcggg tgtcggggct ggcttaacta tgcggcatca 12300

gagcagattg tactgagagt gcaccatatg cggtgtgaaa taccgcacag atgcgtaagg 12360

agaaaatacc gcatcaggcg ccattcgcca ttcaggctgc gcaactgttg ggaagggcga 12420

tcggtgcggg cctcttcgct attacgccag ctggcgaaag ggggatgtgc tgcaaggcga 12480

ttaagttggg taacgccagg gttttcccag tcacgacgtt gtaaaacgac ggccagtgaa 12540

ttg 12543

<210> 16

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

caactaatta ttcgaaacgg aattcaccat gggtgctcaa gtttctac 48

<210> 17

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

ctgtatttaa atggccggcc ggtacctcat tattgagaaa cagcttgtct c 51

<210> 18

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

caactaatta ttcgaaacgg aattcaccat gggtattcca gctgagttg 49

<210> 19

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

ctgtatttaa atggccggcc ggtacctcat tattgcaaaa cagcttgttg ag 52

<210> 20

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

caactaatta ttcgaaacgg aattcaccat gggcgaccgg gtggccg 47

<210> 21

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

ctgtatttaa atggccggcc ggtacctcat tacagtgtgg tgatggcggt c 51

<210> 22

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

acaactaatt attcgaaacg gaattcacca tggagacggg ggccacgtcc 50

<210> 23

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

acaactaatt attcgaaacg gaattcacca tgaacggggt tttggaaacg 50

Claims (12)

1.一种多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸包括编码柯萨奇病毒A10的VP0、VP1和VP3衣壳蛋白的核苷酸，所述多核苷酸不包括RBS序列和编码柯萨奇病毒A10其他衣壳蛋白的核苷酸，所述编码柯萨奇病毒A10的VP0衣壳蛋白的核苷酸编码氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示的VP0衣壳蛋白，所述编码柯萨奇病毒A10的VP3衣壳蛋白的核苷酸编码氨基酸序列如SEQID NO:4所示的VP3衣壳蛋白，所述柯萨奇病毒A10的VP1衣壳蛋白为在SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列的N端截短50-72个氨基酸后得到的VP1衣壳蛋白，所述多核苷酸中各核苷酸的排列为：启动子-VP0-终止子-启动子-VP3-终止子-启动子-VP1-终止子。

2.如权利要求1所述的多核苷酸，其特征在于，还包括以下中的一项或几项：

1）编码柯萨奇病毒A10的VP0衣壳蛋白的核苷酸的序列如SEQ ID NO:8所示；

2）编码柯萨奇病毒A10的VP3衣壳蛋白的核苷酸的序列如SEQ ID NO:9所示；

3）编码柯萨奇病毒A10的VP1衣壳蛋白的核苷酸的序列如SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12所示。

3.如权利要求1所述的多核苷酸，其特征在于，还包括：所述编码柯萨奇病毒A10的VP1衣壳蛋白的核苷酸编码氨基酸序列如SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7所示的VP1衣壳蛋白。

4.一种核酸构建体，其特征在于，所述核酸构建体包括权利要求1-3任一所述的多核苷酸。

5.根据权利要求4所述的核酸构建体，其特征在于，所述核酸构建体的表达载体为酵母表达载体。

6.根据权利要求4所述的核酸构建体，其特征在于，所述核酸构建体的核苷酸序列如SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:15所示。

7.一种细胞系，其特征在于，所述细胞系中包括权利要求4-6任一所述的核酸构建体，或基因组中整合有权利要求1-3任一所述的多核苷酸。

8.根据权利要求7所述的细胞系，其特征在于，所述细胞系为毕赤酵母细胞系。

9.一种重组柯萨奇病毒A10病毒样颗粒，其特征在于，所述重组柯萨奇病毒A10病毒样颗粒包括VP0、VP3和VP1衣壳蛋白，不包括柯萨奇病毒A10其他衣壳蛋白，所述重组柯萨奇病毒A10病毒样颗粒由权利要求7或8所述的细胞系产生。

10.权利要求9所述的重组柯萨奇病毒A10病毒样颗粒在制备预防手足口病产品中的用途。

11.一种用于预防手足口病的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括权利要求9所述的重组柯萨奇病毒A10病毒样颗粒和药学上可接受的载体。

12.根据权利要求11所述的药物组合物，所述药物组合物为疫苗组合物。