CN111886342A - 拉沙疫苗 - Google Patents

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M·马泰奥
S·贝兹
F·坦吉
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Institut Pasteur de Lille
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Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Institut Pasteur de Lille
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Abstract

本发明涉及表达拉沙病毒多肽的重组麻疹病毒，尤其涉及由麻疹病毒和/或含有拉沙病毒蛋白的病毒样颗粒(VLP)表达的免疫原性LASV颗粒。这些颗粒是在施用后能够在宿主中复制的重组感染性颗粒。本发明提供了产生这些重组感染性颗粒的手段，特别是核酸构建体、载体、细胞和拯救系统。本发明还涉及这些重组感染性颗粒，特别是以组合物的形式，更具体地在疫苗制剂中，用于治疗或预防拉沙病毒感染的用途。

Description

拉沙疫苗
技术领域
本申请总体上涉及重组基因构建体，其包含重组麻疹病毒并表达至少一种拉沙病毒(Lassa virus)多肽、蛋白质、抗原或其抗原性片段。本申请还涉及基因构建体或病毒的用途，更具体地，涉及基因构建体或病毒在诱导针对拉沙病毒(LASV)和/或麻疹病毒(MV或MeV)的保护中的用途。
更特别地，本发明的手段致力于重组核酸构建体，该重组核酸构建体允许表达以下LASV的多肽中的至少一种或其截短形式或其抗原性片段：核蛋白(NP)、糖蛋白前体(GPC)、锌结合蛋白(Z)或天然NP蛋白的突变形式(突变的NP或mNP)，其中NP蛋白的核酸外切酶活性已被降低。
本发明还涉及一种重组MeV-LASV病毒，其表达至少一种前述LASV多肽、其抗原性片段或其抗原或其截短形式，即NP、mNP、GPC和/或Z。本发明还涉及由麻疹病毒表达并包含LASV多肽(尤其是至少GPC多肽或蛋白质，或其抗原性片段)的免疫原性颗粒，和/或至少包含Z多肽或蛋白质或其抗原性片段的感染性病毒样颗粒(VLP)，所述免疫原性颗粒和/或VLP能够引起针对LASV的细胞应答和/或体液应答，特别是T细胞应答，特别是CD4+和/或CD8+T细胞应答。
特别地，本发明涉及这些基因构建体、重组核酸构建体、表达载体如质粒载体等、重组病毒感染性颗粒(VLP)在诱导宿主内的免疫原性或抗原性应答中的用途。
背景技术
拉沙病毒(LASV)是沙粒病毒科(Arenaviridae family)的一种古老沙粒病毒。LASV是有包膜的、单链的、两段式的双义RNA病毒(ambisense RNA virus)。他们的基因组包含两个RNA片段，每个片段编码两种蛋白质，每种意义上的一种，共编码四种病毒蛋白质。较大的片段(约7kb)编码锌结合蛋白Z。Z蛋白调节复制和转录。较大的片段还编码RNA聚合酶L。较小的片段(约3.4kb)编码核蛋白(NP)和糖蛋白前体(GPC)，它们在翻译后被切割成包膜糖蛋白GP1和GP2和稳定的信号肽SSP。这两种糖蛋白介导宿主细胞进入。L聚合酶蛋白内包含沙粒病毒的合成能力。该蛋白质使用病毒RNA模板，该模板包含由NP蛋白和病毒核糖核蛋白包裹的基因组RNA。感染后，病毒被递送到宿主细胞的细胞质中，L聚合酶蛋白从位于每个基因组RNA片段3'末端的基因组启动子启动转录。初级转录导致合成以反基因组方向编码的病毒基因(即NP和L基因)的mRNA。转录终止于基因组区域内茎环结构的远端。然后，L聚合酶移动穿过基因组区域以产生互补的反基因组RNA。该RNA用作合成病毒基因GPC和Z的mRNA以及合成全长基因组RNA的模板。
LASV是人类拉沙热(一种严重的出血热)的病因。该病毒的天然贮存库是非洲啮齿动物Mastomys natalensis。拉沙病毒是从啮齿动物传播给人类的，但该病毒也可能会在人与人之间传播，从而引起局部暴发。
每年在西非的流行地区，特别是在几内亚、利比里亚、尼日利亚和塞拉利昂，据报道有100000至300000例患者，有时多达500000例患者患有拉沙热。因此，在这些地区，拉沙热是主要的公共卫生问题。该疾病的严重程度从无症状感染到导致致命性出血热的严重并发症不等。临床体征和症状包括发烧，咳嗽，胸痛，排尿困难，头痛，呕吐，腹泻，咽炎，结膜炎，出血和面部浮肿。LASV感染患者的死亡率很高，在LASV分布的某些地区，死亡率约为10％。幼儿的死亡率高达50％。此外，大约20％的幸存者表现出包括听力障碍在内的长期并发症。因此，拉沙热对这些地区的人口有严重影响，是一个主要的健康问题。最近，拉沙热感染的分布似乎在其他西非国家中蔓延，因为过去十年间在马里，加纳，科特迪瓦和布基纳法索都报告了病例。
尽管它于1969年在尼日利亚发现，但目前尚无针对拉沙热的预防或预防性治疗方法。大多数患者接受抗病毒药物利巴韦林治疗。不幸的是，仅在疾病过程的早期给药时，用该药物治疗似乎才最有效，而且还不能完全有效。还应在支持性护理下完成治疗，例如维持血压和氧合作用，保持体液和电解质平衡以及治疗其他任何感染。因此，可能难以有效治疗拉沙热蔓延的西非流行地区的患者。
感染是否导致严重疾病或死亡似乎取决于宿主的免疫应答。大多数严重病例包括有缺陷的细胞应答，其中树突状细胞和巨噬细胞大量释放LASV，但未被活化，因此不会产生细胞因子或产生的细胞因子不足。疾病的严重程度，以及病毒在新的地理区域内的扩散和传播，都是需要解决的严重卫生公共事务。
在这种情况下，开发预防性疗法(如预防性疫苗)是满足这些人群需求的首要任务。因此，需要一种能够治疗或预防LASV感染(包括预防LASV原发感染的后果，特别是预防拉沙热)的完全有效的治疗方法。
预防LASV感染的最有前途的疗法之一是预防接种，但目前尚无此类疫苗。预防将是控制LASV感染和保护当地居民的最简单、最安全的方法。尽管有这样的迫切需求，但尚未有候选疫苗成功地进入临床试验。
因此，需要疫苗和用于制备疫苗的产品(例如活性成分)，以及用于生产这些产品和疫苗的方法。候选疫苗在免疫有需要的人时应该安全有效，没有明显的副作用，并诱导产生中和LASV的抗体，以及可能的T细胞，例如T辅助细胞和/或细胞毒性T细胞。换言之，疫苗应引起强烈的细胞应答和/或体液应答。有利地，疫苗应在单次免疫后赋予消除性免疫。为此，需要一种疫苗，该疫苗可在受感染的细胞(特别是宿主的受感染细胞)中在体内产生LASV蛋白和/或LASV VLP并因此提供有效的持久免疫力，特别是该疫苗仅在单个或两个给药步骤后即可诱导终身免疫。
另一个需求是促进难以获得医疗中心等服务的人群的疫苗接种。可以引起针对两种病原的免疫作用的候选疫苗可以增强这些人群的整体健康水平。因此，单次疫苗接种可允许针对上述区域中存在的几种病原进行免疫。特别是，为了完全根除麻疹病毒(MeV)，针对MeV和LASV进行免疫的疫苗显然可以保护这些人群免受这两个主要威胁，尤其是在西非。
麻疹病毒已于1954年分离出来(Enders,J.F.和T.C.Peebles.1954.Propagationin tissue cultures of cytopathogenic agents from patients with measles.Proc.Soc.Exp.Biol.Med.86:277-286)。麻疹病毒是单股反链病毒目(order mononegavirales)的成员，即具有非节段负链RNA基因组的病毒。MeV的非节段基因组具有反信使极性(antimessage polarity)，可导致基因组RNA既不体内或体外翻译，纯化后也不具有感染性。已研究和报道了非节段(-)链RNA病毒的转录和复制以及它们组装成病毒颗粒，特别是在Fields virology(第3版，第1卷，1996，Lippincott–Raven publishers–Fields BN等)中。麻疹病毒的转录和复制不涉及被感染细胞的核，而是像LASV一样在宿主细胞的细胞质中发生。MeV的基因组包含编码六个主要结构蛋白(分别命名为N、P、M、F、H和L)的基因，以及来自P基因(C和V)的另外两个非结构蛋白。基因顺序如下：从基因组RNA的3'末端；5'端的N、P(包括C和V)、M、F、H和L大型聚合酶。基因组在基因间区域M/F还包含非编码区。该非编码区包含未翻译RNA的约100个核苷酸。被引用的基因分别编码病毒的核衣壳蛋白或核蛋白(N)、磷蛋白(P)、大蛋白(L)，它们共同围绕基因组RNA组装以提供核衣壳、血凝素(H)、融合蛋白(F)和基质蛋白(M)。
已经自MeV病毒衍生了减毒病毒以提供疫苗株，尤其是来自Schwarz株。Schwarz麻疹疫苗是目前可用于预防麻疹的安全有效的疫苗。除提供疫苗外，减毒的麻疹病毒株(如Schwarz株)已证明是稳定的，适合用于设计有效的递送载体以针对其他病毒(如寨卡病毒(Zika virus)或基孔肯雅病毒(Chikungunya virus))进行免疫。在过去的30年中，麻疹疫苗已应用于数亿儿童，并证明了其有效性和安全性。它在许多国家大规模生产，并以低成本出售。
发明内容
为了至少部分地解决现有技术的缺点，发明人基于重组基因构建体，尤其是基于重组核酸构建体(其在感染复制性麻疹病毒中包含编码拉沙病毒多肽、蛋白质或抗原或其抗原性片段的克隆的多核苷酸)，实现了疫苗活性成分(或组分)的生产。当重组麻疹病毒在给药后在宿主中复制时，可以回收疫苗。因此，本发明涉及一种LASV疫苗，特别是一种儿科疫苗，并且涉及一种基于减毒的麻疹病毒株(例如可商购的已知疫苗株，尤其是广泛使用的Schwarz麻疹疫苗)的活性成分。由于所有这些原因，发明人使用减毒的麻疹病毒来产生稳定表达LASV的结构抗原的重组麻疹病毒颗粒，特别是其免疫原性颗粒和/或VLP。本发明的麻疹方法符合未来LASV疫苗的所有相关标准。
本发明的一个目的是提供一种基因构建体，特别是重组基因构建体，特别是核酸构建体，用于从核酸构建体中回收感染性病毒，特别是表达LASV颗粒以及可选的LASV病毒样颗粒(VLP)的麻疹病毒。
因此，本发明涉及一种核酸构建体，其包含：编码麻疹病毒的全长反基因组(+)RNA链的cDNA分子和编码拉沙病毒的至少一种多肽或至少一种蛋白质或至少一种抗原或其至少一种抗原性片段的第一异源多核苷酸，所述至少一种多肽或至少一种蛋白质或至少一种抗原或其至少一种抗原性片段选自下组：核蛋白(NP)、突变核蛋白(mNP)、锌结合蛋白(Z)和糖蛋白前体(GPC)。第一异源多核苷酸可操作地克隆到插入MeV的反基因组(+)RNA链的cDNA内的附加转录单元(ATU)内。在图1和图31至图36以及实施例中说明了根据该实施方案的特定核酸构建体。
在以上定义中，表述“编码”包括cDNA允许全长反基因组(+)RNA转录的能力，所述cDNA特别用作转录的模板，并在适当情况下翻译成产物表达到细胞或细胞系中。因此，当cDNA是双链分子时，其中一条链与麻疹病毒的反基因组(+)RNA具有相同的核苷酸序列(其内克隆了第一个异源多核苷酸)，除了cDNA中“U”核苷酸被“T”核苷酸替代。本发明的核酸构建体可以包含控制编码序列转录的调控元件，特别是转录的启动子和终止序列，以及可能的增强子和其他顺式作用元件。这些调控元件相对于由LASV基因产生或衍生的异源多核苷酸可以是异源的，特别是可以是麻疹病毒株的调控元件。
可以被表述“可操作地连接”取代的表述“可操作地克隆”是指异源多核苷酸在本发明的核酸构建体内的功能性克隆或插入，使得所述多核苷酸和核酸构建体特别地在细胞、细胞系、宿主细胞中被有效地或高效地转录以及翻译(如果合适的话)，所述细胞、细胞系、宿主细胞被用作拯救系统的一部分，用于产生表达LASV的至少一种多肽，或至少一种蛋白质，或至少一种抗原或其至少一种抗原性片段的重组感染性MeV颗粒或MeV。换言之，当置于适当条件下时，本发明的核酸构建体允许产生感染性反基因组(+)RNA，该感染性反基因组(+)RNA能够产生LASV的至少一种多肽，或至少一种蛋白质，或至少一种抗原，或至少其抗原性片段。
在本发明的特定实施方案中，核酸构建体符合麻疹病毒基因组的六(6)规则，该核酸构建体包含编码MeV的全长感染性反基因组(+)RNA链的核苷酸的cDNA但没有可操作地克隆的异源多核苷酸。换言之，编码MeV的全长感染性反基因组(+)RNA链的核苷酸的cDNA是多六聚体cDNA。
麻疹病毒基因组的组织及其复制和转录过程在现有技术中已得到充分鉴定，并且在Horikami S.M.和Moyer S.A.(Curr.Top.Microbiol.Immunol.(1995)191,35-50)或Combredet C.等(Journal of Virology,2003年11月,11546-11554页)中特别公开了病毒的Schwarz疫苗接种株，或在Neumann G.等(Journal of General Virology(2002)83,2635-2662)中公开了被广泛认定的负义RNA病毒。
“六规则”表达为以下事实：存在于代表MeV(+)链RNA基因组的核酸中或包含MeV(+)链RNA基因组的核酸构建体中的核苷酸总数为六的倍数。在现有技术中已经公认“六规则”是关于麻疹病毒基因组中核苷酸总数的要求，这使得能够有效或优化地复制MeV基因组RNA。在定义满足六规则的核酸构建体的本发明的实施方案中，所述规则适用于指定编码全长MV(+)链RNA基因组的cDNA的核酸构建体。在这方面，六规则分别适用于编码麻疹病毒的全长感染性反基因组(+)RNA链的核苷酸序列的cDNA，可能但不一定适用于克隆到所述cDNA中并编码LASV的至少一种多肽的多核苷酸。
本发明的核酸构建体尤其是纯化的DNA分子，其通过可操作地克隆或连接在一起的MeV的至少一种多核苷酸和LASV的至少一种或几种多核苷酸的重组而获得或可获得。
根据本发明，通过在编码麻疹病毒的全长反基因组(+)RNA的cDNA中克隆一个或多个多核苷酸来制备核酸构建体，该多核苷酸编码选自下组的至少一种多肽或蛋白质或抗原或其抗原性片段：LASV的GPC蛋白，NP蛋白，mNP蛋白和Z蛋白。MeV基因组在图1A中示出，而根据本发明的几种核酸构建体在图1B和图31至图36中示出。或者，可使用合成核酸片段或从模板聚合的步骤，包括通过PCR，来制备本发明的核酸构建体。本发明的多核苷酸和核酸构建体可以根据本领域中任何已知的方法来制备，并且特别地可以被克隆，通过聚合特别是使用PCR方法获得或可以被合成。
异源多核苷酸可由几种其他多核苷酸的融合而产生，每个多核苷酸编码LASV的特定多肽或其特定蛋白质、抗原或其抗原性片段。例如，异源多核苷酸可以由多核苷酸的融合而产生，每个多核苷酸编码单个蛋白、GPC蛋白和NP蛋白或mNP蛋白，例如，这两个多核苷酸通过接头序列在核酸构建体中连接。接头序列是本领域众所周知的，并且可以是包含麻疹病毒的调控序列或由麻疹病毒的调控序列组成的短核苷酸序列。
因此，异源多核苷酸可编码单个多肽、两个不同的多肽、两个相同的多肽、三个不同的多肽、两个相同的多肽和另一个多肽、四个不同的多肽、两个相同的多肽和另外两个相同的多肽、两个相同的多肽和另外两个不同的多肽、三个相同的多肽和另一个不同的多肽。这些编码至少两种(相同或不同)多肽的多核苷酸中的任何一种都可以由几种多核苷酸的融合而产生，或者可以使用合成核酸片段或从模板聚合的步骤来制备，包括通过PCR。或者，这些多核苷酸中的任何一个可以是从拉沙病毒的基因组RNA在逆转录后产生的cDNA，所述cDNA是完整的基因组cDNA或其片段，并且编码LASV的多肽。
将异源多核苷酸，尤其是LASV基因，克隆到插入MeV的cDNA中的附加转录单元(ATU)内。ATU序列是本领域技术人员已知的，并且包含MeV cDNA中转基因的MeV依赖性表达所必需的顺式作用序列(用于克隆成MeV的cDNA的步骤)，例如前面的基因的启动子，由编码LASV多肽的多核苷酸代表的插入多个克隆位点盒中的插入物。可以如Billeter等人在WO97/06270中所公开的那样进一步定义ATU。在图1A中呈现了三种ATU。ATU也可以被定义为插入在MeV的cDNA内，特别是在MeV基因组的N-P基因间区域之间，和/或在MeV基因组的基因间H-L区域之间的多克隆盒。ATU可以包含MeV的P基因转录所必需的顺式作用序列。不同的ATU(特别是ATU1和ATU2)的核酸序列可以是相同的。
ATU通常位于分别对应于聚合酶的起始密码子和终止密码子的两个CTT密码子之间。ATU可以进一步包含ATG和TAG密码子，ATG和TAG密码子分别对应于用于翻译在ATU内克隆的异源多核苷酸的起始密码子和终止密码子。或者，ATU位于ATG和TAG密码子之间，ATG和TAG密码子分别对应于用于翻译在ATU内克隆的异源多核苷酸的起始密码子和终止密码子。ATU可以进一步包含ATG和TAG密码子，ATG和TAG密码子分别对应于用于翻译在ATU内克隆的异源多核苷酸的起始密码子和终止密码子。在本发明的一个优选的实施方案中，ATU是包含SEQ ID No：16或由其组成的多核苷酸。
SEQ ID No：16
SEQ ID No：16是位于编码麻疹病毒的全长反基因组(+)RNA链的cDNA分子内的ATU序列。粗体为分别对应于聚合酶的起始密码子和终止密码子的CTT密码子。在对应于用于翻译ATU内克隆的异源多核苷酸的起始密码子和终止密码子的ATG和TAG密码子下加下划线。
CTTAGGAACCAGGTCCACACAGCCGCCAGCCCATCAacgcgtacgATG*TAGgcgcgca gcgcttagacgtctcgcgaTCGATACTAGTACAACCTAAATCCATTATAAAAAACTT
其中，*对应于编码至少一种LASV多肽的异源密码子优化的序列多核苷酸。
具有编码GPC多肽的异源多核苷酸的ATU例如位于SEQ ID No：9的氨基酸残基3487和5071之间。SEQ ID No：17对应于ATU，其包含编码GPC蛋白的密码子优化的异源多核苷酸作为克隆插入物。
ATU(编号为ATU2)位于MeV的P基因和M基因之间。另一个ATU(编号为ATU1)位于MeV的N基因的上游。另一个ATU(编号为ATU3)位于MeV的基因H和L之间。已经观察到，MeV的病毒RNA的转录遵循从5'末端到3'末端的梯度(gradient)。这解释了，如果将异源多核苷酸插入ATU1、ATU2或ATU3中，取决于异源多核苷酸插入的位置，其表达水平将变化并且或多或少有效。
术语“多肽”与术语“抗原”或“蛋白质”或“抗原性片段”可互换使用，并且定义了由氨基酸残基连结而成的分子。特别地，本申请中公开的多肽源自LASV，并且是抗原、蛋白质、结构蛋白或其抗原性片段，其可以与天然蛋白质相同，或者可以通过突变衍生而来，包括通过取代(特别是保守氨基酸残基的取代)或添加氨基酸残基或通过翻译后的二次修饰或通过缺失天然蛋白质的一部分而导致片段相对于天然参考蛋白质具有缩短的大小。片段被包含在本发明中的程度，使得它们带有适合于引发宿主，特别是人类宿主(包括儿童宿主)中的免疫应答(优选能够保护免受LASV感染或LASV相关疾病的应答)的天然蛋白的表位。表位特别是涉及引发细胞介导的免疫应答(CMI应答)的T表位的类型。T表位通过呈现可以结合II类MHC分子的T细胞表位的某些部分而参与T细胞的刺激，从而导致T细胞的活化。或者，表位可以是涉及在宿主中激活抗体的产生的B型，该宿主已施用蛋白质或在施用本发明的感染性复制颗粒后在其中表达蛋白质。片段的大小可代表LASV菌株Josiah的天然蛋白的氨基酸序列大小的超过50％，优选至少90％或95％。多肽可以与LASV菌株Josiah的天然蛋白具有至少50％(优选至少60％，优选至少70％，优选至少85％或至少95％)的同一性。
在本发明的一个特定实施方案中，可操作地克隆到反基因组(+)RNA的cDNA内的每个多核苷酸编码包含位于任何一种LASV多肽内的表位的多肽。根据该实施方案，表位序列与天然LASV蛋白的表位序列具有100％的同一性。此类表位在免疫表位数据库和分析资源(www.iedb.org)中列出。在由多核苷酸编码并具有如本文定义的表位序列的LASV的多肽内，不属于任何表位的氨基酸残基可以与天然LASV蛋白的序列不同。“LASV的多肽”是指本文定义的“多肽”(多肽、抗原、蛋白质或其抗原性片段)，其氨基酸序列与LASV菌株(尤其是LASV菌株Josiah)中的对应物相同，包括多肽，该多肽是LASV蛋白质的天然成熟或前体，或者是其抗原性片段或本文定义的突变体，特别是与天然存在的LASV GPC、NP或Z蛋白具有至少50％、至少80％、特别有利地至少90％或优选至少95％的氨基酸序列同一性的抗原性片段或突变体。氨基酸序列同一性可以通过本领域技术人员使用手动比对或使用多种可用的比对程序(例如，BLASTP-http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)通过比对来确定。可以相对于本文所示的特定氨基酸序列，尤其是选自SEQ ID No：1、SEQ ID No：3、SEQ ID No：5和SEQID No：7的氨基酸序列，来定义本发明的LASV多肽的片段或突变体。在本发明的一个特定实施方案中，所述多肽与它们的LASV菌株Josiah的天然蛋白或与SEQ ID No：1、SEQ ID No：3、SEQ ID No：5或SEQ ID No：7的多肽具有至少50％、至少80％、特别有利地至少90％或优选至少95％的氨基酸序列同一性。
根据本发明的一方面，从分离和纯化的LASV野生株(包括基因组已被全部或部分测序的任何Lassa菌株)的基因组中产生或衍生出编码LASV的至少一种多肽的多核苷酸。这些序列中的至少一些可以在NCBI核苷酸数据库中找到。特别地，编码至少一种LASV多肽的多核苷酸可以衍生或产生自Clinical Sequencing Uncovers Origins and Evolution ofLassa Virus(Andersen Kristian G等；2015；Cell.2015年8月13日；162(4):738–750.doi:10.1016/j.cell.2015.07.020)中(特别是在列出了菌株名称和序列的相应登录参考的出版物的补充数据中)测序和引用的任何Lassa菌株。优选地，多核苷酸是从Josiah菌株中产生或衍生的，该菌株的两个RNA片段的基因组序列可以在GenBank登录号J04324.1(编码NP蛋白和GPC蛋白的短基因组RNA)和欧洲核苷酸档案库(European Nucleotide Archive)登录号U73034.2(编码Z蛋白和L蛋白的长基因组RNA)下找到。LASV菌株Josiah的天然蛋白可以定义为具有由RNA片段产生的序列，该RNA片段在GenBank登录号J04324.1(编码NP蛋白和GPC蛋白的短基因组RNA)和欧洲核苷酸档案库登录号U73034.2(长基因组RNA)下找到。在多核苷酸的定义中出现的术语“衍生”仅表示所述多核苷酸的序列可以与LASV菌株中的相应序列相同或可以在编码满足本发明“多肽”定义的LASV的多肽、抗原、蛋白质或其片段的程度上变化。特别地，当针对这样的序列进行密码子优化时，多核苷酸衍生自LASV菌株的核酸。因此，该术语不限制多核苷酸的生产方式。
或者，片段可以是具有至少10个氨基酸残基的短多肽，其具有免疫表位数据库和分析资源(www.iedb.orq)中列出的天然蛋白的表位。在这方面，片段还包括多表位。
根据本发明的另一个实施方案，所述核酸构建体还包含第二异源多核苷酸，其编码LASV的至少一个多肽或其抗原性片段，所述至少一个多肽或其抗原性片段选自下组：GPC蛋白、NP蛋白、mNP蛋白和Z蛋白，第二异源多核苷酸在不同于第一个克隆的异源多核苷酸的位置(优选在MeV的N基因上游)处可操作地克隆到另一个ATU中，所述另一个ATU(特别是ATU1)插入到MeV的N基因的上游。第二异源多核苷酸或其抗原性片段特别编码至少一种与第一异源多核苷酸编码的多肽不同的多肽或其抗原性片段。
根据该实施方案，有利地，另一个ATU(编号为ATU1)位于cDNA分子的N端序列中，该cDNA分子编码MeV的N基因上游的MeV反基因组的全长(+)RNA链，而另一个ATU(ATU2)优选位于病毒的P基因和M基因之间。由于MeV的病毒RNA的转录遵循从5'末端到3'末端的梯度，本发明人发现，当Z蛋白由至少一种异源多核苷酸编码时，在编码麻疹病毒的全长反基因组(+)RNA的cDNA中的不同位置克隆两个多核苷酸，可能导致抗原颗粒和/或LASV病毒样颗粒(VLP)产量更高，而当多核苷酸都被克隆到一个相同的位置时，这个产量可能就不那么重要了。此外，将异源多核苷酸克隆在不同位置可以减少被编码的多肽表达的减弱。实际上，当几个基因被克隆到单个ATU内时，它可能导致被编码的多肽的表达减少。根据该实施方案的特定核酸构建体在图1b和实施例中示出。
在另一个ATU中，第二多核苷酸可以编码先前列出的LASV的多肽或其抗原性片段中的任何一个。因此，位于另一ATU内的第二多核苷酸可以编码与插入在第一ATU内的第一多核苷酸相同的多肽，或者第二多核苷酸可以与第一多核苷酸编码至少一个共同的多肽。在本发明的一个优选实施方案中，第一多核苷酸和第二多核苷酸编码至少一个不同的多肽或其抗原性片段。
编码MeV的全长反基因组(+)RNA链的cDNA分子可以为MeV的减毒株特有的或可以从MeV的减毒株获得。MeV的“减毒株”定义为在同一宿主中无毒或比母株毒性低的菌株，同时当在宿主中给药以保持免疫显性的T细胞和B细胞表位以及可能的佐剂(例如诱导T细胞共刺激蛋白或细胞因子IL-12)时，保持免疫原性和可能的佐剂性。
相应地，麻疹病毒的减毒株是指已在选定细胞上连续传代并且可能适应于其他细胞以产生适于制备人疫苗株的种子株的菌株，该菌株具有稳定的基因组，不允许逆转致病性或整合到宿主染色体。作为特定的“减毒株”，疫苗的批准株是满足FDA(美国食品药品管理局)定义的标准的适合本发明的减毒株；即经过严格审查实验室和临床数据(www.fda.gov/cber/vaccine/vacappr.htm)后，它符合安全性、功效、质量和可重复性标准。
特别地，从减毒病毒株获得编码MeV的全长反基因组(+)RNA链的cDNA分子，所述减毒病毒株选自Schwarz菌株、Zagreb菌株、AIK-C菌株、Moraten菌株、Philips菌株、Beckenham 4A菌株、Beckenham 16菌株、Edmonston种子A菌株、Edmonston种子B菌株、CAM-70菌株、TD 97菌株、Leningrad-16菌株、上海191菌株和Belgrade菌株。所有这些菌株已在现有技术中描述。本发明特别使用已经被允许用作商业疫苗的菌株。特别地，从Schwarz菌株获得编码MeV的全长反基因组(+)RNA链的cDNA分子。
根据本发明的一个特定实施方案，将cDNA分子置于异源表达控制序列的控制下。
当在不能利用其天然控制序列使cDNA完全转录的细胞类型中寻找该cDNA的表达时，插入这种用于cDNA表达的对照是有利的。
根据本发明的特定实施方案，异源表达控制序列包含T7启动子和T7终止子序列。这些序列分别位于MeV的全长反基因组(+)RNA链的编码序列的5'和3'处，并来自该编码序列周围的相邻序列。
在本发明的一个特定实施方案中，上文定义的cDNA分子被修饰，即包含另外的核苷酸序列或基序。
在一个优选的实施方案中，根据本发明使用的cDNA分子在其5'端还包含GGG基序(邻近编码MeV批准疫苗株的全长反基因组(+)RNA链的核苷酸序列的第一核苷酸)，其后是锤头状核酶序列，并且在其3'端包含核酶序列(邻近编码全长反基因组(+)RNA链的所述核苷酸序列的最后一个核苷酸)。丁型肝炎病毒核酶(δ)适合于进行该优选实施方案。
邻近上述编码序列的第一个核苷酸的位于5′端的GGG基序提高了所述cDNA编码序列的转录效率。正确装配麻疹病毒颗粒的要求是，编码反基因组(+)RNA的cDNA符合六规则，当添加GGG基序时，核酶也被添加到cDNA编码序列的5'端，即GGG基序的3'端，以便能够在MeV的全长反基因组(+)RNA链的第一个编码核苷酸处切割转录物。
为了制备本发明的核酸构建体，通过已知方法制备了编码现有技术中公开的麻疹病毒的全长反基因组(+)RNA的cDNA分子。当将所获得的cDNA插入载体例如质粒中时，所获得的cDNA特别为涉及重组麻疹病毒颗粒的拯救(rescue)的基因组载体提供了基础。
适用于制备本发明核酸构建体的特定cDNA分子是使用麻疹病毒的Schwarz株获得的。质粒pTM-MVSchw包含与Schwarz MV疫苗株的反基因组相对应的感染性MeV cDNA，并用于制备包含本发明的异源多核苷酸的重组载体，该质粒pTM-MVSchw已经在别处描述了(Combredet,C.等,A molecularly cloned Schwarz strain of measles virus vaccineinduces strong immune responses in macaques and transgenic mice.J Virol,2003.77(21):第11546-54页)。因此，本发明中使用的cDNA可以如WO2004/000876中所公开地获得，或者可以由巴斯德研究所(Institut Pasteur)在2002年6月12日以编号I-2889保藏在CNCM的质粒pTM-MVSchw获得，其序列在WO2004/000876中公开，通过引用并入本文。质粒pTM-MVSchw已获自Bluescript质粒，并且包含编码置于T7RNA聚合酶的启动子控制下的Schwarz菌株的全长麻疹病毒(+)RNA链的多核苷酸。它具有18967个核苷酸和以SEQ ID NO：15表示的序列。可以从由减毒MeV的病毒颗粒中纯化的核酸(例如本文所述的那些)类似地获得其他MeV株的cDNA分子(为方便起见，也称为麻疹病毒的cDNA或MeV cDNA)。另一个转录单元可以是先前插入载体中的多克隆位点盒，如Combredet等(2003年)所述。ATU可以包含插入的LASV基因转录所必需的顺式作用序列。异源多核苷酸克隆或插入到上文定义的附加转录单元(ATU)内。
异源多核苷酸也可以克隆或插入到另一个ATU内。例如，可以在MeV的H基因和L基因之间插入第三ATU，并且可以将第一异源多核苷酸或第二异源多核苷酸克隆或插入到该第三ATU内。在本发明的一个特定实施方案中，核酸构建体可包含：插入到第一ATU内的第一异源多核苷酸、在与第一ATU不同的位置处插入到第二ATU中的第二异源多核苷酸序列，以及在与第一ATU和第二ATU不同的位置处插入到第三ATU中的第三异源多核苷酸序列。
在一个优选的实施方案中，核酸构建体包含编码特定突变的NP蛋白或其抗原性片段的异源多核苷酸。可以使天然NP蛋白突变以降低NP蛋白的核酸外切酶活性。可以通过荧光素酶测定法，使用置于IRF3依赖性启动子控制下的荧光素酶报告基因(如PMID：21085117中所述且如图29所示)，来测定核酸外切酶活性降低的NP蛋白。NP参与病毒诱导的对I型IFN信号传导的抑制(Martinez-Sobrido，2006)。该活性与天然NP蛋白的C-末端结构域关联。功能分析证实了LASV NP的核酸外切酶活性，这已被证明是其I型IFN抵抗功能(counteracting function)的关键步骤(Qi，2010年)。因此，发明人在NP蛋白的核酸外切酶结构域内引入了两个突变。NP蛋白的核酸外切酶结构域位于NP蛋白的C末端结构域内，特别是在SEQ ID No：3的氨基酸残基341和569之间。因此，突变的NP蛋白特别地由在上文定义的核酸外切酶结构域内(通过删除和/或添加和/或取代任何氨基酸残基)突变的天然NP蛋白产生，并且根据上文所述的荧光素酶测定，其核酸外切酶活性被降低。特别地，取代SEQ IDNo：3的至少一个氨基酸残基D389、E391、D466、D533和H528可以得到没有核酸外切酶活性的突变的NP蛋白。特别地，可以例如通过用丙氨酸取代天冬氨酸来突变SEQ ID No：3的389位的氨基酸残基。或者，可以例如通过用丙氨酸取代甘氨酸来突变SEQ ID No：3的392位的氨基酸残基。在一个优选的实施方案中，SEQ ID No：3的389和392位的两个氨基酸残基通过取代而突变。在一个更优选的实施方案中，mNP蛋白具有SEQ ID No：5的序列。
根据该实施方案，由多核苷酸编码的mNP多肽允许诱导I型IFN。换言之，天然NP的免疫抑制功能在mNP中被关闭。因此，提供了包含多核苷酸的核酸构建体，所述多核苷酸提高了嵌合重组MeV-LASV感染性颗粒免疫原性的效率。
根据一个优选的实施方案，本发明还涉及多核苷酸的修饰，特别是优化，以允许LASV多肽、蛋白质、抗原或其片段在宿主细胞中有效表达。
因此，可以进行多核苷酸序列的优化，避免核酸分子的顺式作用域：内部TATA盒，Chi-位点和核糖体进入位点；富含AT或富含GC的序列延伸；ARE、INS、CRS序列元素；重复序列和RNA二级结构；隐蔽的剪接供体和受体位点，分支点。
优化的多核苷酸还可以进行密码子优化以在特定细胞类型中表达，特别是可以针对Maccaca密码子用法或人密码子用法进行修饰。该优化允许增加嵌合感染性颗粒在细胞中产生的效率，而不会影响所表达蛋白质的氨基酸组成。
特别地，可以通过修饰密码子中的摆动位置来进行编码LASV多肽的多核苷酸的优化，而不影响相对于原始密码子从所述密码子翻译的氨基酸残基的身份。
还进行了优化以避免麻疹病毒的编辑样(editing-like)序列。麻疹病毒转录本的编辑是一个特别地在由麻疹病毒的P基因编码的转录本中发生的过程。通过在P转录本的特定位点插入额外的G残基来进行的这种编辑产生了一种与P蛋白相比截短的新蛋白。仅添加单个G残基即可导致V蛋白表达，该V蛋白含有独特的羧基末端(Cattaneo R等，Cell.1989年3月10日；56(5):759-64)。
在根据本发明该特定实施方案的多核苷酸中，来自麻疹病毒的以下编辑样序列可以被突变：AAAGGG，AAAAGG，GGGAAA，GGGGAA，以及它们的互补序列：TTTCCC，TTTTCC，CCCTTT，CCCCTT。例如，AAAGGG可以突变为AAAGGC，AAAAGG可以突变为AGAAGG或TAAAGG或GAAAGG，GGGAAA可以突变为GCGAAA。
因此，异源多核苷酸可包含以下序列中的任何一个，或多个以下序列，或以下序列中的至少两个，或以下序列中的至少三个，或以下四个序列：
-编码GPC蛋白的SEQ ID No：2；和/或
-编码NP蛋白的SEQ ID No：4；和/或
-编码mNP蛋白的SEQ ID No：6；和/或
-编码Z蛋白的SEQ ID No：8。
在异源多核苷酸中，上文定义的每个序列可以出现一次或多次。在本发明的一个优选实施方案中，每个序列在单个异源多核苷酸内出现一次，或每个序列在合起来的异源多核苷酸内出现一次。
根据本发明的特定实施方案中的任一个，提供了包含多核苷酸的核酸构建体，所述多核苷酸提高了嵌合重组MeV-LASV感染性颗粒产生的效率。
备选地或互补地，异源多核苷酸可以编码以下多肽或其抗原性片段中的任何一个，或以下多肽中的至少两个，或以下多肽中的至少三个，或以下四个多肽：
-SEQ ID No：1的GPC蛋白或其抗原性片段；和/或
-SEQ ID No：3的NP蛋白或其抗原性片段；和/或
-SEQ ID No：5的mNP蛋白或其抗原性片段；和/或
-SEQ ID No：7的Z蛋白或其抗原性片段。
应该注意的是，多核苷酸可以一次或多次编码上文所定义的多肽。在一个优选的实施方案中，每个多肽在单个异源多核苷酸内编码一次，更优选地，每个多肽在多个多肽内编码一次。根据本发明的一个具体实施方案，将其中每个多核苷酸编码至少一个LASV蛋白的几个多核苷酸组合或融合以形成编码LASV的几个蛋白的多核苷酸。这些多核苷酸可以通过以下方式彼此区分：它们编码LASV的各种菌株的蛋白质，或它们编码LASV菌株的不同蛋白质。
在一个特定的实施方案中，本发明的核酸构建体从5'至3'端包含以下多核苷酸：
(a)编码MeV的N蛋白的多核苷酸；
(b)编码MeV的P蛋白的多核苷酸；
(c)第一异源多核苷酸，其编码选自LASV的GPC蛋白、NP蛋白、mNP蛋白和Z蛋白的至少一种多肽或其抗原性片段；特别是编码单个多肽，该单个多肽是GPC蛋白或其抗原性片段；或编码至少两个多肽，该两个多肽是GPC蛋白或其抗原性片段以及NP蛋白或mNP蛋白，或其抗原性片段；特别是编码GPC蛋白和mNP蛋白，其中，第一多核苷酸特别地可操作地克隆在ATU，特别是ATU2中；
(d)编码MeV的M蛋白的多核苷酸；
(e)编码MeV的F蛋白的多核苷酸；
(f)编码MeV的H蛋白的多核苷酸；
(g)编码MeV的L蛋白的多核苷酸；
其中，在病毒复制和转录调节因子如MeV前导序列和尾随序列的控制下，所述多核苷酸在核酸构建体内可操作地连接。
图1B中示意性地示出了根据本发明获得的该实施方案的几个示例：名为MeV-GPCLASV；MeV-NP+GPCLASV；MeV-NPExoN+GPCLASV的构建体属于该特定实施方案，但是也包含图1B中未示出的其他构建体，例如MeV-GPCLASV+NP；MeV-GPCLASV+NPExoN；MeV-Z+GPCLASV；MeV-GPCLASV+Z；MeV-Z+NP；MeV-Z+NPExoN；MeV-NP+Z；MeV-NPExoN+Z；MeV-Z+GPCLASV+NP；MeV-Z+GPCLASV+NPExoN；MeV-Z-NP-GPCLASV；MeV-Z-NPExoN-GPCLASV；MeV-GPCLASV+NP+Z；MeV-GPCLASV+NPExoN+Z；MeV-GPCLASV+Z+NP；MeV-GPCLASV+Z+NPExoN；MeV-NP+GPCLASV+Z；MeV-NP-Z+GPCLASV；MeV-NPExoN+GPCLASV+Z；MeV-NPExoN-Z+GPCLASV；
其中，
MeV对应于编码麻疹病毒(MeV)的全长反基因组(+)RNA链的cDNA分子；
GPCLASV对应于编码GPC蛋白的多肽或其抗原性片段的多核苷酸；
NP对应于编码NP蛋白的多肽或其抗原性片段的多核苷酸。
NPExoN对应于编码mNP蛋白的多肽或其抗原性片段的多核苷酸；
Z对应于编码Z蛋白的多肽或其抗原性片段的多核苷酸；
表述“N蛋白”、“P蛋白”、“M蛋白”、“F蛋白”、“H蛋白”和“L蛋白”分别是指麻疹病毒的核蛋白(N)、磷蛋白(P)、基质蛋白(M)、融合蛋白(F)、血凝素蛋白(H)和RNA聚合酶大蛋白(L)，并涵盖了各自的多肽或其抗原性片段。这些成分已经在现有技术中被确定，并且特别在Fields，Virology(Knipe&Howley，2001)中公开。
在本发明的另一个特定实施方案中，核酸构建体从5’至3’末端包含以下多核苷酸：
(a)第二异源多核苷酸，其编码选自LASV的GPC蛋白、NP蛋白、mNP蛋白和Z蛋白的至少一种多肽或其抗原性片段；特别是编码Z蛋白或其抗原性片段，其中，第二多核苷酸可操作地克隆在位于MeV的N基因上游的ATU中，特别是在ATU1中；
(b)编码MeV的N蛋白的多核苷酸；
(c)编码MeV的P蛋白的多核苷酸；
(d)第一异源多核苷酸，其编码选自LASV的GPC蛋白、NP蛋白、mNP蛋白和Z蛋白的至少一种多肽或其抗原性片段；特别是编码单个多肽，该单个多肽是GPC蛋白或其抗原性片段；或编码至少两个多肽，该两个多肽是GPC蛋白或其抗原性片段以及NP蛋白或mNP蛋白，或其抗原性片段；特别是编码GPC蛋白和mNP蛋白，其中，第一多核苷酸特别地可操作地克隆在ATU，特别是ATU2中；
(e)编码MeV的M蛋白的多核苷酸；
(f)编码MeV的F蛋白的多核苷酸；
(g)编码MeV的H蛋白的多核苷酸；
(h)编码MeV的L蛋白的多核苷酸，
其中，在病毒复制和转录调节因子如MeV前导序列和尾随序列的控制下，所述多核苷酸在核酸构建体内可操作地连接。
图1B中示意性地示出了该实施方案的几个示例：名为Z-MeV-GPCLASV；Z-MeV-NP+GPCLASV；Z-MeV-NPExoN+GPCLASV的构建体包含在该特定实施方案中。当LASV的蛋白以MeV命名时，该蛋白被克隆到位于MeV的N基因上游的另一个转录单元内。应当注意的是，几个未示出的构建体也包括在该实施方案中。例如，可以将异源多核苷酸克隆在第三ATU内。对应于Z-MeV-GPCLASV(ATU2)+NP(ATU3)或Z-MeV-NP(ATU2)-GPCLASV(ATU3)或Z-MeV-GPCLASV(ATU2)+mNP(ATU3)或Z-MeV-mNP(ATU2)-GPCLASV(ATU3)的核酸构建体也包括在本发明中。应当注意，可以将编码Z多肽、GPC多肽和/或NP或mNP多肽中的至少一个或任意一个的异源多核苷酸插入到ATU3内。这里使用的各种术语与先前的特定实施方案中使用的术语具有相同的含义。
在本发明的特定实施方案中，核酸构建体在第一异源多核苷酸内包含编码NP蛋白(优选SEQ ID No：3的NP蛋白)或其抗原性片段的核酸；以及编码GPC蛋白(优选SEQ ID No：1的GPC蛋白)的核酸。在一个优选的实施方案中，该第一异源多核苷酸被克隆在MeV的P基因和M基因之间，优选在如上文所定义的ATU2中。
在本发明的特定实施方案中，核酸构建体在第一异源多核苷酸内包含编码NP蛋白的SEQ ID No：4的核酸和编码GPC蛋白的SEQ ID No：2的核酸，优选这两个核酸被接头序列分开。在一个优选的实施方案中，SEQ ID No：4的核酸位于SEQ ID No：2的核酸上游。例如，这在图1B上用名为MeV-NP+GPCLASV的构建体进行了说明。
在本发明的一个特定实施方案中，核酸构建体在第一异源多核苷酸内包含编码mNP蛋白(优选SEQ ID No：5的mNP蛋白)或其抗原性片段的核酸；以及编码GPC蛋白(优选SEQID No：1的GPC蛋白)的核酸。
在本发明的特定实施方案中，核酸构建体在第一异源多核苷酸内包含编码mNP蛋白的SEQ ID No：6的核酸和编码GPC蛋白的SEQ ID No：2的核酸，优选这两个核酸被接头序列分开。在一个优选的实施方案中，SEQ ID No：6的核酸位于SEQ ID No：2的核酸的上游(朝向构建体的5'末端)，如图1B所示，其中构建体名为MeV-NPExoN+GPCLASV。在一个优选的实施方案中，该第一异源多核苷酸被克隆在MeV的P基因和M基因之间，优选在如上文所定义的ATU2中。
在本发明的一个特定实施方案中，核酸构建体包含第一异源多核苷酸和第二异源多核苷酸，其中：
-第二异源多核苷酸包含编码Z蛋白或其抗原性片段，优选SEQ ID No：7的Z蛋白的核酸；优选第二异源多核苷酸克隆在如上文所定义的ATU1中，
-第一异源多核苷酸包含编码GPC蛋白或其抗原性片段，优选SEQ ID No：1的GPC蛋白的核酸，优选第一异源多核苷酸克隆在如上文所定义的ATU2中。
在本发明的特定实施方案中，核酸构建体包含第一异源多核苷酸和第二异源多核苷酸，其中：
-第二异源多核苷酸包含编码Z蛋白的SEQ ID No：8的核酸，优选第二异源多核苷酸克隆在如上文所定义的ATU1中，
-第一异源多核苷酸包含编码GPC蛋白的SEQ ID No：2的核酸，优选第一异源多核苷酸克隆在如上文所定义的ATU2中。
在本发明的一个特定实施方案中，核酸构建体包含重组cDNA，其序列选自以下：
SEQ ID No：9(MeV-GPC)；
SEQ ID No：10(MeV-NP-GPC)；
SEQ ID No：11(MeV-mNP-GPC)；
SED ID No：12(Z-MeV-GPC)；
SEQ ID No：13(Z-MeV-NP-GPC)；和
SEQ ID No：14(Z-MeV-mNP-GPC)，
其中，所述序列描述如下：
SEQ ID NO：9
SEQ ID No：9是根据本发明特定实施方案的核酸构建体的序列，其中所述构建体包含pTM1-MVSchwarz载体，其中编码LASV菌株Josiah的GPC蛋白的序列已被克隆在附加转录单元2中。
SEQ ID NO：10
SEQ ID No：10是根据本发明另一个特定实施方案的核酸构建体的序列，其中所述构建体包含pTM1-MVSchwarz载体，其中编码LASV菌株Josiah的GPC蛋白的序列已被克隆在附加转录单元2中，编码LASV菌株Josiah的NP蛋白的序列已被克隆在附加转录单元2中。
SEQ ID NO：11
SEQ ID No：11是根据本发明另一个特定实施方案的核酸构建体的序列，其中所述构建体包含pTM1-MVSchwarz载体，其中编码LASV菌株Josiah的GPC蛋白的序列已被克隆在附加转录单元2中，编码LASV菌株Josiah的突变NP蛋白的序列已被克隆在附加转录单元2中。
SEQ ID NO：12
SEQ ID No：12是根据本发明另一个特定实施方案的核酸构建体的序列，其中所述构建体包含pTM1-MVSchwarz载体，其中编码LASV菌株Josiah的GPC蛋白的序列已被克隆在附加转录单元2中，编码LASV菌株Josiah的Z蛋白的序列已被克隆在附加转录单元1中。
SEQ ID NO：13
SEQ ID No：13是根据本发明另一个具体实施方案的核酸构建体的序列，其中所述构建体包含pTM1-MVSchwarz载体，其中编码LASV菌株Josiah的GPC蛋白的序列已被克隆在附加转录单元2中，编码LASV菌株Josiah的NP蛋白的序列已被克隆在附加转录单元2中，编码LASV菌株Josiah的Z蛋白的序列已被克隆在附加转录单元1中。
SEQ ID NO：14
SEQ ID No：14是根据本发明另一个具体实施方案的核酸构建体的序列，其中所述构建体包含pTM1-MVSchwarz载体，其中编码LASV菌株Josiah的GPC蛋白的序列已被克隆在附加转录单元2中，编码LASV菌株Josiah的突变NP蛋白的序列已被克隆在附加转录单元2中，编码LASV菌株Josiah的Z蛋白的序列已被克隆在附加转录单元1中。
本发明还涉及转移载体，当从辅助细胞或生产细胞中拯救时，其可用于制备重组MeV-LASV颗粒。在图31至36中显示了几个转移载体。在本发明的优选实施方案中，转移载体是适合于辅助细胞或生产细胞转染的转移载体质粒，并包含根据本发明的核酸构建体。转移载体质粒可以获自Bluescript质粒，并且可以通过将本发明的异源多核苷酸克隆在上文所述的pTM-MVSchw质粒中而获得。在本发明的特定实施方案中，转移质粒载体具有SEQ IDNo：9、SEQ ID No：10、SEQ ID No：11、SEQ ID No：12、SEQ ID No：13或SEQ ID No：14的序列。
本发明还涉及转移质粒载体的用途或根据本发明的核酸构建体的用途，用于转化适于拯救重组病毒MeV-LASV颗粒的细胞，特别地用于分别用含有本发明核酸构建体的质粒或病毒载体转染或转导此类细胞，所述细胞根据其表达所需的麻疹病毒蛋白的能力选择，以进行病毒重组基因组的适当复制、转录和衣壳化，该病毒重组基因组对应于重组的、感染性的、复制的重组MeV-LASV颗粒中的本发明的核酸构建体。
本发明的核酸构建体和转移质粒载体适合并用于制备重组感染复制性重组麻疹-拉沙病毒(MeV-LASV)，因此，所述核酸构建体和转移质粒载体旨在插入到转移基因组载体中，其因此包含麻疹病毒，尤其是Schwarz株的cDNA分子，用于生产所述重组MeV-LASV病毒和表达LASV多肽，当Z蛋白由至少一种异源多核苷酸编码时，可能为LASV VLP。pTM-MVSchw质粒适于通过插入本文所述的异源多核苷酸来制备转移载体，所述异源多核苷酸对于表达LASV多肽、蛋白质、抗原或其抗原性片段是必需的。如本文所用，术语“病毒样颗粒”(VLP)是指在至少一个属性上类似于病毒但尚未被证明具有感染性的结构。根据本发明的病毒样颗粒不携带编码病毒样颗粒的蛋白质的遗传信息，通常，病毒样颗粒缺乏病毒基因组，因此是非感染性和非复制性的。根据本发明，可以大量产生病毒样颗粒，并与MeV-LASV重组颗粒一起表达。
本发明还涉及通过本发明的转移载体和提供辅助功能和蛋白质的其他多核苷酸如此转化的细胞或细胞系。因此，在所述细胞中存在多核苷酸，所述多核苷酸编码特别包括麻疹病毒的N蛋白、P蛋白和L蛋白(即能够形成核糖核蛋白(RNP)复合物的天然MeV蛋白或其功能变体)的蛋白(优选至少对于在重组病毒MeV-LASV颗粒的转录和复制中起作用的N蛋白和P蛋白为稳定表达的蛋白)。N蛋白和P蛋白可以在细胞中由包含其编码序列的质粒表达，或者由插入细胞基因组中的DNA分子表达。L蛋白可以由不同的质粒表达。它可能暂时性表达。辅助细胞还能够表达适合于确保合成衍生自本发明核酸构建体的重组RNA的RNA聚合酶(可能为稳定表达的RNA聚合酶)。RNA聚合酶可以是T7噬菌体聚合酶或其核形式(nlsT7)。
在一个实施方案中，麻疹病毒的cDNA克隆与N蛋白和/或P蛋白和/或L蛋白来自相同的麻疹病毒株。在另一个实施方案中，麻疹病毒的cDNA克隆与N蛋白和/或P蛋白和/或L蛋白来自不同的病毒株。
当Z蛋白由至少一种异源多核苷酸编码时，用根据本发明的核酸构建体转化或转染的细胞能够产生重组麻疹病毒和/或LASV VLP。因此，重组麻疹病毒在其基因组中包含本发明的核酸构建体，并且能够表达LASV的至少一种多肽、蛋白质或其抗原性片段。因此，本发明的麻疹病毒能够表达GPC蛋白或GPC多肽或其抗原性片段；和/或NP蛋白或NP多肽或其抗原性片段；和/或mNP蛋白，或mNP多肽，或其抗原性片段；和/或Z蛋白，或Z多肽，或其抗原性片段。LASV VLP至少包含Z蛋白或其抗原性片段，并且可以进一步包含LASV的一种其他多肽；GPC蛋白，GPC蛋白的片段(如GP1或GP2)，NP蛋白和/或mNP蛋白。在一个优选的实施方案中，LASV VLP包含Z蛋白或其抗原性片段，以及GPC蛋白或其抗原性片段，或GPC蛋白的片段(如GP1和/或GP2)。在另一个优选的实施方案中，LASV VLP包含Z蛋白或其抗原性片段，GPC蛋白或其抗原性片段，以及mNP蛋白或NP蛋白或其抗原性片段。
在本发明的优选实施方案中，重组麻疹病毒表达LASV的GPC蛋白和mNP蛋白。在本发明的另一个优选实施方案中，重组麻疹病毒表达LASV的GPC蛋白和Z蛋白。
此外，根据本发明的一些实施方案，重组麻疹病毒还表达麻疹病毒的至少一种多肽或蛋白质或其抗原性片段。换言之，重组麻疹病毒表达以下多肽中的至少一种：MeV的N蛋白、P蛋白、M蛋白、F蛋白、H蛋白和L蛋白。
根据该实施方案，重组病毒表达麻疹病毒和拉沙病毒的重组抗原性颗粒，从而允许引起针对LASV的多肽和针对MeV的多肽的细胞应答，或体液应答，或细胞和体液应答。在本发明的特定实施方案中，引起细胞应答包括引起T细胞应答，特别是CD4+和/或CD8+T细胞应答。
因此，本发明涉及制备重组感染性麻疹病毒颗粒的方法，该方法包括：
(a)用本发明的核酸构建体或本发明的转移质粒载体转染稳定表达T7RNA聚合酶和麻疹N和P蛋白的细胞，特别是辅助细胞，特别是HEK293辅助细胞；
(b)将转染的细胞维持在适于产生重组麻疹病毒和/或LASV VLP的条件下；
(c)通过与步骤(b)的转染细胞共培养来感染能够使重组麻疹病毒和/或LASVVLP繁殖的细胞；
(d)收获重组麻疹病毒和/或LASV VLP，该重组麻疹病毒表达至少一种LASV蛋白，优选至少GPC蛋白和可选的NP蛋白、mNP蛋白和/或Z蛋白，优选表达GPC蛋白和mNP蛋白；该LASV VLP至少表达Z蛋白，可能还表达另一种选自GPC蛋白、NP蛋白和/或mNP蛋白的LASV蛋白。
根据一个特定的实施方案，本发明涉及一种制备重组感染性麻疹病毒颗粒的方法，该方法包括：
a)在辅助细胞系中转移，特别是转染本发明的核酸构建体或含有该核酸构建体的转移载体，该辅助细胞系还表达MeV的反基因组(+)RNA序列在允许病毒颗粒组装的条件下从其cDNA转录、复制和衣壳化所必需的蛋白质，和
b)回收表达至少一种LASV的多肽或蛋白质或其抗原性片段的重组感染性MeV-LASV病毒。
根据本发明的特定实施方案，该方法包括：
a)用本发明的核酸构建体、用转移质粒载体转染辅助细胞，其中所述辅助细胞能够表达辅助功能以表达RNA聚合酶和表达MeV病毒的N蛋白、P蛋白和L蛋白；
b)将步骤1)的所述转染的辅助细胞与传代细胞共培养，该传代细胞适用于cDNA来源的MeV减毒株的传代；
c)回收表达LASV的至少一种多肽的重组感染性MeV-LASV病毒。
根据本发明的另一个特定实施方案，用于产生重组感染性MeV-LASV的方法包括：
a)将稳定产生RNA聚合酶、麻疹病毒的核蛋白(N)和麻疹病毒的聚合酶辅因子磷蛋白(P)的细胞或细胞培养物与本发明的核酸构建体以及包含编码麻疹病毒的RNA聚合酶大蛋白(L)的核酸的载体重组，和
b)从所述重组细胞或重组细胞培养物中回收感染性MeV-LASV病毒。
根据该方法的特定实施方案，产生重组MeV，其表达至少包含GPC蛋白的LASV蛋白和/或至少包含Z蛋白的LASV VLP，其中重组MeV和/或VLP可以表达至少一种其他LASV蛋白或抗原或其抗原性片段，例如GPC或其片段，尤其是GP1和/或GP2，以及可选的LASV的mNP。在其他实施方案中，LASV VLP包含Z蛋白或其片段，和可选的GPC蛋白，并且可能包含GP1和/或GP2。在本发明的一个优选实施方案中，LASV VLP包含Z蛋白或其抗原性片段和GPC蛋白或其抗原性片段。作为说明，拯救表达LASV蛋白(特别是LASV VLP)的重组MeV的方法包括以下步骤：
1)与(i)转移载体(尤其是质粒)和(ii)编码MeV L聚合酶cDNA的载体(尤其是质粒)一起共转染稳定表达T7RNA聚合酶以及麻疹N蛋白和P蛋白的辅助细胞，特别是HEK293辅助细胞，该转移载体包含编码麻疹病毒的全长反基因组(+)RNA的cDNA，该cDNA与至少一种编码至少一种LASV蛋白(例如编码GPC蛋白、NP蛋白、mNP蛋白和/或Z蛋白)的多核苷酸重组；
2)在能够产生MV-LASV重组病毒的条件下，培养所述共转染的辅助细胞；
3)通过将步骤2)的所述辅助细胞与能够进行后述繁殖的细胞例如Vero细胞共培养，来繁殖如此产生的重组病毒；
4)回收复制的MeV-LASV重组病毒和LASV蛋白，尤其是LASV病毒样颗粒。
如本文所用，“重组”是指例如以载体的形式将至少一种多核苷酸引入细胞，所述多核苷酸(全部或部分)整合或不整合到细胞中。
根据一个具体的实施方案，可以与第一多核苷酸获得重组，该第一多核苷酸是本发明的核酸构建体。重组还可以或可替代地包括引入多核苷酸，该多核苷酸是编码麻疹病毒的RNA聚合酶大蛋白(L)的载体，其表达的定义，性质和稳定性已在本文中描述。
根据本发明，稳定产生RNA聚合酶、麻疹病毒的核蛋白(N)和麻疹病毒的聚合酶辅因子磷蛋白(P)的细胞或细胞系或细胞培养物是如本说明书中定义的细胞或细胞系或本说明书中定义的细胞培养物，即，也是已经某种程度上通过引入一种以上如上定义的多核苷酸而被转化的重组细胞。在本发明的一个特定实施方案中，稳定产生RNA聚合酶、N蛋白和P蛋白的细胞或细胞系或细胞培养物不产生麻疹病毒的L蛋白或不稳定地产生麻疹病毒的L蛋白，例如，使其能够瞬时表达或产生。本发明的重组MeV-LASV病毒的产生可涉及如本文所述转化的细胞的转移。如本文所用，“转移”是指重组细胞铺板到不同类型的细胞上，特别是不同类型的细胞的单层上。后面的这些细胞是感受态细胞以维持感染性重组MeV-LASV病毒的复制和产生，即分别在细胞内部形成感染性病毒以及可能在细胞外释放这些感染性病毒，同时可能释放LASV免疫原性颗粒和/或LASV VLP。该转移导致本发明的重组细胞与如前文所定义的感受态细胞的共培养。
当重组细胞不是有效的病毒产生培养物时，即当不能从这些重组细胞中有效地回收感染性重组MeV-LASV病毒时，上述转移可以是附加的，即可选的步骤。在将本发明的重组细胞与本发明的任何核酸构建体以及可选的载体(其包含编码麻疹病毒的RNA聚合酶大蛋白(L)的核酸)进一步重组之后，引入该步骤。
在本发明的一个特定实施方案中，需要转移步骤，因为通常为了易于重组的能力而选择的重组细胞在维持和生产重组感染性MeV-LASV病毒方面不够有效。在所述实施方案中，上述方法的步骤1)的细胞或细胞系或细胞培养物是根据本发明的重组细胞或细胞系或重组细胞培养物。
适用于制备本发明重组细胞的细胞是原核或真核细胞，特别是动物或植物细胞，更特别是哺乳动物细胞，例如人细胞或非人哺乳动物细胞或禽类细胞或酵母细胞。在一个特定的实施方案中，在细胞基因组重组之前，从原代培养物或细胞系中分离细胞。本发明的细胞可以是分裂细胞或非分裂细胞。
根据一个优选的实施方案，辅助细胞衍生自人胚胎肾细胞系293，该细胞系293以编号CRL-1573保藏在ATCC中。特定细胞系293是WO2008/078198中公开的细胞系，在以下实施例中称为293T7/N/P。因此，本发明还涉及用根据本发明的任何实施方案的核酸构建体转染或转化，或用转移质粒载体转染的宿主细胞，特别是禽类细胞或哺乳动物细胞。合适的细胞是VERO NK细胞(非洲绿猴肾细胞)和MRC5细胞(医学研究理事会细胞株5)。根据该方法的另一方面，适合于传代的细胞是CEF细胞(鸡胚成纤维细胞)。CEF细胞可以用从EARLMorizeau(8rue Moulin，28190Dangers，法国)或任何其他受精鸡蛋的生产商那里获得的受精鸡蛋制备。
根据本发明公开的方法有利地用于生产适于用作免疫组合物的感染复制性重组MeV-LASV病毒。因此，本发明涉及一种组合物，特别是一种抗原性组合物，其活性成分包括从本发明的核酸构建体拯救并且特别是通过所公开的方法获得的感染复制性重组MeV-LASV病毒。该组合物可以是用于向有此需要的人，特别是儿童给药的疫苗组合物。所述组合物可以用于抗LASV感染的治疗。所述组合物可以用于提供针对LASV的保护。因此，该组合物可以是用于针对LASV感染的保护性或预防性治疗的免疫原性或抗原性组合物。特别地，组合物中的活性组分或活性成分包括重组MeV-LASV颗粒，所述重组MeV-LASV颗粒从根据本发明的转移质粒载体中拯救，并且可选地与包含LASV的Z蛋白和可选的其他蛋白的VLP或其抗原性片段联合。在本发明的上下文中，术语“联合的(associated)”或“联合(inassociation)”是指MeV-LASV重组病毒颗粒和LASV多肽或蛋白质(特别是作为VLP)通常以物理上独立的实体形式存在于单个组合物中。在本发明的一个具体实施方案中，该组合物是疫苗。
本发明还涉及重组MeV-LASV感染复制性病毒颗粒，其与LASV多肽或蛋白质，或其抗原性片段联合，可能与LASV VLP或根据本发明的任何组合物联合，该颗粒用于治疗或预防受试者，特别是人类受试者，特别是儿童的拉沙病毒感染。
本发明还涉及重组MeV-LASV感染复制性病毒和联合的LASV多肽或蛋白质或其抗原性片段，以及可能联合的LASV VLP在给药方案和剂量方案中的应用，其特别地在人类受试者，特别是儿童中引发针对LASV病毒感染或诱导的疾病的免疫应答，有利的保护性免疫应答。
在本发明的一个特定实施方案中，该组合物或该组合物的使用能够在单次注射后引起受试者，特别是人类受试者，特别是儿童的免疫。换言之，该组合物或该组合物的使用可能需要单次施用选择剂量的重组MeV-LASV感染复制性病毒。或者，它可能需要在初免-加强免疫(prime-boost)方案中多次给药。可以使用由重组MeV-LASV感染复制性病毒和联合的LASV多肽和蛋白质，或其抗原性片段和/或LASV VLP组成的相同活性成分来实现初免和加强。
本发明还涉及不同活性成分的组装，包括重组MeV-LASV感染复制性病毒和联合的LASV多肽或蛋白质和/或LASV VLP作为这些成分之一。活性成分的组装有利地用于宿主，特别是人类宿主的免疫。
发明人已经示出，施用重组MeV-LASV感染复制性病毒会引起免疫应答，特别是引起针对LASV相关多肽的中和抗体的产生。由此表明，施用本发明的活性成分会引发宿主免疫。本发明的疫苗是安全的，使宿主内产生免疫应答，尤其包括CD4+和CD8+T细胞应答。如实施例所示，本发明的疫苗会诱导抗原特异性T细胞应答。另外，业已显示，经免疫接种的猴子宿主可在致命剂量的LASV激发(challenge)后存活。
在对宿主进行免疫接种和LASV激发后，免疫接种的猴子宿主中，肝酶(ALT和AST)、乳酸脱氢酶(LDH)、C反应蛋白(CRP)和白蛋白的水平保持正常或略有增加，而这些水平在非免疫宿主中增加了几倍。
本发明的组合物能够引发重组LASV特异性免疫球蛋白(特别是IgM和IgG)以及中和抗体的产生。本发明的组合物是安全的疫苗，对宿主是免疫原性的和有效的。该组合物及其用途在疫苗接种的宿主中至少赋予T细胞应答，并且可以赋予针对拉沙病毒感染的免疫力。
本发明的组合物还能够引起MeV特异性免疫球蛋白(特别是IgM和IgG)以及中和抗体的产生。本发明的组合物是安全的疫苗，对宿主是免疫原性的和有效的。该组合物及其用途在疫苗接种的宿主中至少赋予T细胞应答，并且可以赋予针对麻疹病毒感染的免疫力。
本发明的组合物还涉及重组MeV-LASV感染复制性病毒和联合的LASV多肽或蛋白质或其抗原性片段，以及可能联合的LASV VLP在给药方案和剂量方案的应用，其特别地在人类受试者，尤其是儿童中，引发针对麻疹病毒感染或诱导的疾病的免疫应答，有利的保护性免疫应答。
本发明还涉及重组MeV-LASV感染复制性病毒颗粒与LASV多肽或蛋白质或其抗原性片段和/或LASV VLP或本发明的任何组合物联合，用于在受试者，特别是人类受试者，尤其是儿童中治疗或预防麻疹病毒感染。
本发明还涉及异源多核苷酸，其包含编码GPC蛋白、Z蛋白、NP蛋白和/或mNP蛋白的密码子优化的序列中的任何一个。因此，本发明还涉及包含SEQ ID No：2、SEQ ID No：4、SEQID No：6和/或SEQ ID No：8的密码子优化的多核苷酸或由SEQ ID No：2、SEQ ID No：4、SEQID No：6和/或SEQ ID No：8组成的密码子优化的多核苷酸。
附图说明
本申请引用的一些附图是彩色的。提交的申请书包含附图的彩色打印件，因此可以通过在专利局检查申请文件进行访问。
图1.核酸构建体的示意图。A：MeV载体。B：根据本发明的核酸构建体。MeV基因以灰色表示，LASV基因以绿色，蓝色和红色表示。对于MV基因：N(核蛋白)；P/V/C(磷酸蛋白和V/C蛋白)；M(基质(matrix))；F(融合蛋白)；H(血凝素)：L(聚合酶)。对于LASV基因：NP(核蛋白)；NPEXON(在某些附图上也称为NPKO；编码核酸外切酶活性降低的突变NP的突变序列)；GPC(糖蛋白前体)；Z(锌结合蛋白)。ATU由黑色箭头指示。ATU1位于MeV的N基因左侧上游，而ATU2位于中间，P和M(MeV)基因之间。
图2.病毒在Vero E6细胞上的生长动力学。MeV-GFP对应于其中编码绿色荧光蛋白的多核苷酸已插入ATU2中的构建体。MeV-GPCLASV对应于其中编码LASV的GPC蛋白的多核苷酸已插入ATU2中的构建体。MeV-NP+GPCLASV对应于其中编码LASV的GPC蛋白和NP蛋白的基因已插入ATU2中的构建体。MeV-NPExoN+GPCLASV对应于这样的构建体：其中编码LASV的GPC蛋白和突变的NP蛋白(核酸外切酶活性降低)的多核苷酸已插入ATU2中。MeV-Z+GPCLASV对应于这样的构建体：其中编码GPC蛋白的多核苷酸已插入ATU2中，并且其中编码Z蛋白的多核苷酸已插入ATU1中。在典型实验中获得的滴度，通过3个独立实验的TCID50进行测量。表示为平均值和标准误差。
图3.LASV蛋白(GPC\NP和Z)和MeV蛋白(F)在受感染的Vero E6细胞和受感染的Vero E6细胞的上清液中的表达。如材料和方法中详述，通过免疫印迹(Westernblot)评估每种构建体的效果。NI：未感染的细胞。ns：非特异性。
图4.MeV-GFP在人外周血单核细胞衍生的免疫抗原呈递细胞中进入和复制。
图5.I型IFN在感染了不同MeV-LASV载体的人原代巨噬细胞中的表达。通过qPCR分析I型IFN反应(IFNa1、IFNa2和IFNb的定量表达)进行定量RNA分析。感染后24小时表达。所有结果均相对于GAPDH基因归一化，并表示为相对于GAPDH的诱导倍数。
图6.在用不同的MeV-LASV载体感染的巨噬细胞中，分化标记CD80、CD86和CD83CD40簇的细胞表面表达。流式细胞术检测感染后48h共激活分子的细胞表面表达。
图7.I型IFN在感染了不同MeV-LASV载体的人原代树突状细胞中的表达。通过qPCR分析I型IFN反应(IFNa1、IFNa2和IFNb的定量表达)进行定量RNA分析。感染后24小时表达。所有结果均相对于GAPDH基因归一化，并表示为相对于GAPDH的诱导倍数。
图8.在感染了不同MeV-LASV载体的人原代树突状细胞中，分化标记CD80、CD86、CD83和CD40簇的细胞表面表达。流式细胞术检测感染后48h共激活分子的细胞表面表达。
图9.免疫后30天期间食蟹猴(Macaca fascicularis)的体温。分别用重组MeV菌株Schwarz疫苗、重组MeV-NPExoN-GPC疫苗和重组Z-MeV-GPC疫苗的2.106组织培养感染剂量50(TCID50)，对3只、4只和4只猴子进行皮下免疫。
图10.接种疫苗的食蟹猴(Macaca fascicularis)中的LASV抗原特异性CD4和CD8T细胞应答。通过重叠对GPC、NP和Z特异的肽刺激全血后的流式细胞术。
图11.用致死剂量的LASV菌株Josiah激发(challenge)后，食蟹猴(Macacafascicularis)的临床评分。临床评分基于体温、体重、正常进食和进水的能力、行为、临床体征。15分是杀死的终点。致死剂量的LASV菌株包含皮下注射到动物中的1.500FFU LASV菌株Josiah。
图12.用致死剂量的LASV菌株Josiah激发后的食蟹猴(Macaca fascicularis)的体温。
图13.经免疫接种的食蟹猴的血浆中的肝酶(AST和ALT)水平。
图14.用致死剂量的LASV菌株Josiah激发后的食蟹猴(Macaca fascicularis)中LDH(A)、CRP(B)和白蛋白(C)的血浆水平。
图15.用致死剂量的LASV菌株Josiah激发后的食蟹猴的病毒血症(RNA(A)和滴度(B))。通过qPCR进行RNA定量。根据本领域已知的方法滴定。
图16.用致死剂量的LASV菌株Josiah激发后的食蟹猴的鼻腔(A)和口腔分泌物(B)以及尿液(C)中的病毒RNA定量。通过qPCR进行RNA定量。
图17.在被激发过的食蟹猴(事先用不同的MeV-LASV免疫接种)的器官中检测到的LASV RNA水平。
图18.在被激发过的食蟹猴(事先用不同的MeV-LASV免疫接种)的器官中检测到的LASV感染滴度。
图19.在用致死剂量的LASV菌株Josiah激发过的食蟹猴中，针对LASV的IgM和IgG响应。A.IgM LASV特异性。B：IgG LASV特异性。通过ELISA测量免疫球蛋白水平。根据450nM处的吸光度计算光密度。
图20.免疫接种后LASV GP和NP特异性CD8+和CD4+T细胞应答。使用流式细胞术，测定在用覆盖整个LASV GP和NP的重叠肽刺激后产生IFNg、TNFa和/或IL-2的CD8+和CD4+T细胞的百分比。
图21.免疫接种过的食蟹猴在用致死剂量的LASV菌株Josiah激发后的LASV抗原特异性CD4和CD8T细胞应答。通过重叠对GPC和NP特异的肽刺激全血后的流式细胞术。
图22.用致死剂量的LASV菌株Josiah激发后的食蟹猴中CD4和CD8T细胞的增殖和活化。通过Ki67染色评估CD8增殖(A)。CD4(B)和CD8(C)活化通过定量颗粒酶B的表达来评估。
图23.LASV激发后的LASV GP和NP特异性CD8+T细胞应答。用流式细胞术，测定在用覆盖整个LASV GP(23A)和NP(23B)的重叠肽进行LASV激发后产生IFNg、TNFa和/或IL-2的CD8+T细胞的百分比。使用饼图显示了响应的T细胞的不同亚群的比例。
图24.LASV激发后的LASV GP和NP特异性CD4+T细胞应答。用流式细胞术，测定在用覆盖整个LASV GP(23A)和NP(23B)的重叠肽进行LASV激发后产生IFNg、TNFa和/或IL-2的CD4+T细胞的百分比。使用饼图显示了响应的T细胞的不同亚群的比例。
图25.对在MeV-NPExoN-GPCLASV免疫后不同时间点收集的食蟹猴PBMC中获得的转录组数据进行KEGG通路分析。
图26.对在用MeV-Z+GPCLASV免疫接种后不同时间点收集的食蟹猴PBMC中获得的转录组数据进行KEGG通路分析。
图27.经免疫的猴子在LASV激发后血浆中细胞因子的定量。在LASV激发后，在用MeV-、MeV-NPExoN-GPCLASV和MeV-Z+GPCLASV免疫接种过的食蟹猴的血浆中定量了不同的细胞因子。显示了不同条件之间的显著差异(p<0.05)：n-c(MeV-NPExoN-GPCLASV和MeV)、n-z(MeV-NPExoN-GPCLASV和MeV-Z+GPCLASV)以及n-cz(MeV-NPExoN-GPCLASV和MeV；MeV-NPExoN-GPCLASV和MeV-Z+GPCLASV)。
图28.在用致死剂量的LASV菌株Josiah激发过的食蟹猴中，针对MeV的IgM和IgG应答。A：IgM MeV特异性。B：IgG MeV特异性。对于用MeV构建体免疫的猴子，在第7天和第14天未测量IgG和IgM MeV特异性。
图29.测定天然NP蛋白和突变NP蛋白的核酸外切酶活性。荧光素酶活性病毒诱导的和免疫刺激RNA诱导的干扰素β激活的诱导倍数。CT：对照。NPLASV：天然NP蛋白。NPExoNLASV：SEQ ID No：5的突变NP蛋白。SeV：moi＝1的仙台病毒(Sendai Virus)。
图30.MeV-NPExoN-GPCLASV嗜性(tropism)分析。CHO细胞系感染了用LASV GPC假型化的Mopeia病毒或MeV-NPExoN-GPCLASV。通过用抗GP1抗体染色来分析GPC的表达。细胞核为蓝色，抗GP1染色为绿色。
图31.根据本发明的第一实施方案的转移载体质粒的示意图。转移载体具有SEQID No：9的序列。编码N蛋白的麻疹基因位于核苷酸189和1767之间。编码P蛋白的麻疹基因位于核苷酸1889和3412之间。编码GPC的SEQ ID No：2的经密码子优化的异源多核苷酸位于核苷酸3532和5007之间。ATU2位于减去异源多核苷酸插入片段的核苷酸3487和5071之间。编码M蛋白的麻疹基因位于核苷酸5104和6111之间。
图32.根据本发明的第二实施方案的转移载体质粒的示意图。转移载体具有SEQID No：10的序列。编码N蛋白的麻疹基因位于核苷酸190和1767之间。编码P蛋白的麻疹基因位于核苷酸1889和3412之间。编码NP蛋白的SEQ ID No：4的经密码子优化的异源多核苷酸位于核苷酸3532和5241之间。编码GPC的SEQ ID No：2的经密码子优化的异源多核苷酸位于核苷酸5386和6861之间。包含麻疹病毒的调节序列的接头序列位于核苷酸5242和5385之间。ATU2位于减去异源多核苷酸插入片段和接头序列的核苷酸3487和6925之间。编码M蛋白的麻疹基因位于核苷酸6958和7965之间。
图33.根据本发明的第三实施方案的转移载体质粒的示意图。转移载体具有SEQID No：11的序列。编码N蛋白的麻疹基因位于核苷酸190和1767之间。编码P蛋白的麻疹基因位于核苷酸1889和3412之间。编码突变的NP蛋白的SEQ ID No：6的经密码子优化的异源多核苷酸位于核苷酸3532和5241之间。编码GPC的SEQ ID No：2的经密码子优化的异源多核苷酸位于核苷酸5386和6861之间。包含麻疹病毒的调节序列的接头序列位于核苷酸5242和5385之间。ATU2位于减去异源多核苷酸插入片段和接头序列的核苷酸3487和6925之间。编码M蛋白的麻疹基因位于核苷酸6958和7965之间。
图34.根据本发明的第四实施方案的转移载体质粒的示意图。转移载体具有SEQID No：12的序列。编码Z蛋白的SEQ ID No：8的经密码子优化的异源多核苷酸位于核苷酸193和504之间。编码N蛋白的麻疹基因位于核苷酸646和2223之间。编码P蛋白的麻疹基因位于核苷酸2345和3868之间。编码GPC的SEQ ID No：2的经密码子优化的异源多核苷酸位于核苷酸3988和5463之间。编码M蛋白的麻疹基因位于核苷酸5560和6567之间。
图35.根据本发明的第五实施方案的转移载体质粒的示意图。转移载体具有SEQID No：13的序列。编码Z蛋白的SEQ ID No：8的经密码子优化的异源多核苷酸位于核苷酸193和504之间。编码N蛋白的麻疹基因位于核苷酸646和2223之间。编码P蛋白的麻疹基因位于核苷酸2345和3868之间。编码NP蛋白的SEQ ID No：4的经密码子优化的异源多核苷酸位于核苷酸3988和5697之间。编码GPC的SEQ ID No：2的经密码子优化的异源多核苷酸位于核苷酸5842和7317之间。编码M蛋白的麻疹基因位于核苷酸7414和8421之间。
图36.根据本发明的第六实施方案的转移载体质粒的示意图。转移载体具有SEQID No：14的序列。编码Z蛋白的SEQ ID No：8的经密码子优化的异源多核苷酸位于核苷酸193和504之间。编码N蛋白的麻疹基因位于核苷酸646和2223之间。编码P蛋白的麻疹基因位于核苷酸2345和3868之间。编码突变的NP蛋白的SEQ ID No：6的经密码子优化的异源多核苷酸位于核苷酸3988和5697之间。编码GPC的SEQ ID No：2的经密码子优化的异源多核苷酸位于核苷酸5842和7317之间。编码M蛋白的麻疹基因位于核苷酸7414和8421之间。
实施例
材料和方法
细胞和病毒
稳定表达T7聚合酶以及麻疹N蛋白和P蛋白的293T7/N/P细胞用于拯救重组麻疹病毒，并如{Combredet，2003#76}所述进行维护。Vero NK细胞在补充了5％FCS和0.5％青霉素-链霉素的Glutamax Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM，Life Technologies)中生长。血液样本是从Etablissement
Figure BDA0002548019650000291
du Sang(EFS，法国里昂)获得的。通过Ficoll密度梯度离心(GE Healthcare)纯化单核细胞。首先通过在PBS中50％Percoll(GE Healthcare，韦利济，法国)的缓冲垫上离心从外周血单核细胞中分离单核细胞，然后根据制造商的说明使用单核细胞分离试剂盒II(Miltenyi Biotec，法国巴黎)纯化单核细胞。通过将单核细胞在补充有50ng/mL M-CSF的RPMI，10％SVF，10％自体血清中孵育6天来获得巨噬细胞。每2天添加M-CSF，并替换40％的培养基。
质粒构建体
将LASV GPC、NP和Z(LASV菌株Josiah)的经密码子优化的ORF克隆到pTM1-MVSchwarz载体中的附加转录单元(ATU)中，该转录单元(ATU)位于核酸蛋白(N)的上游(对于ATU1为Z)或位于Schwarz MV基因组的磷蛋白(P)和基质(M)基因之间(ATU2，仅GPC或NP+GPC)，如先前所述(Combredet，C.等，A molecularly cloned Schwarz strain of measlesvirus vaccine induces strong immune responses in macaques and transgenicmice.J Virol,2003.77(21):11546-54页)。通过测序验证所有质粒构建体。
免疫印迹和抗体
在Co-IP缓冲液中裂解感染了重组MeV-GFP、MeV-GPCLASV、MeV-NP+GPCLASV、MeV-NPExoN+GPCLASV或MeV-Z+GPCLASV的Vero NK细胞，并通过离心清除。然后在变性条件下在4-12％预制凝胶(Biorad)上分离裂解物和培养上清液，并将其转移到PVDF膜上。膜用针对GP1(内部小鼠单克隆生产)、NP(小鼠抗LASV血清)、Z(内部兔多克隆生产)或F(兔多克隆Fcyt，R.Cattaneo赠与)的一抗染色。细胞裂解物也用偶联至辣根过氧化物酶(HRP)的抗肌动蛋白抗体染色。用偶联HRP的二抗染色后，使用West Dura底物(West Dura substrate)(Pierce)显露膜，并使用LAS4000成像仪(GE Healthcare)拍照。
病毒拯救和滴定
如前所述(Combredet,2003；Radecke,F.等，Rescue of measles viruses fromcloned DNA.Embo J,1995.14(23):5773-84页；WO2008/078198)，拯救了表达LASV抗原的重组麻疹病毒。简言之，用编码麻疹L聚合酶和所需MeV载体的反基因组片段的质粒转染293T7/N/P细胞。挑选克隆合胞体并用于感染6孔板中的Vero NK细胞。当合胞体已达到孔表面的约50％时，将细胞分离并覆盖在10cm器皿中的Vero NK细胞上，产生第1代(P1)储备液。为了制备更高传代的病毒储备液，以0.01的感染复数(MOI)感染Vero NK细胞，然后在32℃下孵育2至3天。为了收获病毒，将细胞刮入Opti-MEM I减血清培养基中并冻融两次。通过在Vero NK细胞上50％组织培养物感染剂量(TCID50)滴定确定滴度。
定量RNA分析
对于RT-qPCR实验，根据制造商的说明，使用Rneasy Mini试剂盒(Qiagen，科特布夫，法国)和DNase补充步骤(使用Turbo DNA free试剂盒Ambion(Thermo FisherScientific)添加)从模拟或感染的细胞中分离总RNA。使用Superscript III进行cDNA的合成，并使用Gene Expression Master Mix试剂盒(Applied Biosystems，Thermo FisherScientific)进行扩增。对于I型IFN，引物/探针混合物是在内部开发的。在LightCycler480(Roche Diagnostics，梅兰，法国)中进行qPCR分析。所有基因的表达参照GAPDH基因的表达归一化，并表示为相对于GAPDH的诱导倍数。为了进行病毒RNA定量，将NP ORF的771-934pb区的RNA探针克隆到pGEM载体(Promega)中，以生成T7聚合酶驱动的转录本。RNA探针经过DNAse处理、纯化和定量(Dropsense96，Trinean，根特，比利时)。使用LASV特异性引物，使用EuroBioGreen qPCR Mix Lo-ROX(Eurobio，尤里斯，法国)进行病毒RNA的定量PCR。
MP活化、T细胞活化和增殖的流式细胞术
感染后48小时，将受Mock和MOI 1感染的MP分离，用人IgG饱和，并用针对CD40、CD83，CD80和CD86(BD Biosciences，罗纳-阿尔卑斯，法国)的抗体表面染色，然后在PBS/1％PFA中进行最终固定。从新鲜全血中分析LASV抗原特异性T细胞。将细胞与GPC、NP或Z重叠肽库在CD28和CD49d抗体(2μg/ml)和布雷菲德菌素A(Brefeldin A)(10μg/ml)存在下于37℃孵育6小时。SEA(1μg/ml)或PBS分别用作活化的阳性对照或阴性对照。肽的长度为15-mer氨基酸(每种1μg/ml)，重叠11个残基，涵盖了LASV菌株Josiah的完整GPC、NP或Z ORF。在对CD3，CD4和CD8(BD Biosciences)进行细胞表面染色之前，将PBS-EDTA 20mM加入样品中。然后使用PharmLyse(BD Biosciences)裂解红细胞。然后固定细胞，并用针对IFNγ的抗体(Biolegend)透化细胞以进行细胞内染色。对于增殖和活化，使用Ki67或Granzyme B抗体对孔进行染色。使用LSR Fortessa细胞仪(BD Biosciences)或10色Gallios细胞仪(BeckmanCoulter)通过流式细胞术分析细胞。使用Kaluza软件(Beckman Coulter)分析数据。
用LASV激发过的食蟹猴
通过分别皮下注射MeV-NPExoN+GPCLASV或MeV-Z+GPCLASV的2.106TCID50在A2设施(SILABE，法国)中免疫4只雄性食蟹猴(Macaca Fascicularis，32-39个月大，3-4kg)的组。用MeV疫苗株Schwarz免疫另一个3只猴子的对照组。在最初的两周内每2-3天进行抽血、口腔、鼻拭子和尿液采样，然后每周一次，直到第37天，以评估针对LASV GPC、NP或Z的疫苗复制和排出(shedding)、IgM和IgG应答以及T细胞应答。37天后，将猴子运送到BSL-4设施(Laboratoire P4-Inserm Jean Mérieux)，在那里使用1500FFU的LASV菌株Josiah对其进行皮下激发。跟踪动物的疾病临床体征，并根据基于体温、体重、进食、水合、行为和临床体征的评分对动物实施安乐死。将实验终点置于激发后第28天，并根据验证的实验程序对所有存活至此时间点的动物实施安乐死。在最初的两周内每2-3天进行抽血、口腔、鼻拭子和尿液采样，然后每周一次，直到第28天，以评估针对LASV GPC、NP或Z的LASV病毒的复制和排出、IgM和IgG应答以及T细胞应答。这项研究已获得斯特拉斯堡动物实验伦理区域委员会(APAFIS#6543-20160826144775)和罗纳阿尔卑斯大区动物实验伦理区域委员会(CECCAPP20161110143954)的批准。
测定天然NP蛋白和突变NP蛋白的核酸外切酶活性(图29)：
用磷酸钙与100ng载体(该载体表达来自IFN-β基因的已知功能启动子序列(pIFNβ-LUC)的萤火虫荧光素酶(Fluc)报告基因)、可变量的天然(野生型)LASV NP载体或突变型LASV NP载体，以及50ng用于转染标准化的表达β-gal的质粒，共转染293T细胞。转染后24小时，用仙台病毒(Sendai virus)(moi＝1)感染细胞以诱导IFN-β表达。在24hpi时，制备了细胞裂解液用于荧光素酶和β-gal检测。基于β-gal值将Fluc活性归一化。为了确定NP是否具有核酸外切酶活性，分析了其对免疫刺激RNA诱导的IFN产生的抑制作用，用pIFNβ-LUC、可变量的天然(WT)LASV NP载体或突变型LASV NP载体，以及用于转染标准化的表达β-gal的质粒，转染HEK293细胞。18小时后，通过lipofectamine 2000用1μg的Poly(I：C)或250ng的Pichinde病毒体RNA转染细胞。在免疫刺激RNA转染后18小时测定荧光素酶活性，并基于β-gal活性进行归一化。核酸外切酶活性降低的突变NP蛋白不能抑制免疫刺激RNA诱导的IFN产生。
实施例1-表达LASV抗原的重组MeV病毒的产生
为了确定什么是引入MeV载体以获得最佳免疫原性的LASV抗原最佳组合，我们已经使用Schwarz MeV疫苗平台产生了几种MeV/LASV疫苗候选物(图1A)，其单独表达GPC或与NP(在核酸外切酶结构域中突变或不突变，以消除LASV NP中包含的免疫抑制功能)或GPC和Z结合表达，以便在体内产生抗原性LASV病毒样颗粒(VLP)。我们还制备了在核酸外切酶结构域表达Z、GPC和NP突变或未突变的构建体。将GPC和NP基因克隆到附加转录单元2(ATU2)的MeV P和M基因之间。Z基因被克隆到ATU1中N基因的上游(图1B)。
除MeV/LASV-Z+GPC(与其他构建体相比，其毒性减弱约一个对数(log))以外，所有病毒均被拯救并在Vero E6细胞上生长至与ATU2的表达GFP的对照MeV-GFP相似的滴度(图2)。使用针对LASV GPC、NP或Z或针对麻疹融合蛋白F的特异性抗体，通过Western blot控制不同LASV抗原的表达(图3)。在感染了MeV-GPCLASV、MeV-NP+GPCLASV、MeV-NPExoN+GPCLASV和MeV-Z+GPCLASV的Vero E6细胞中检测到GPC的表达；在感染了MeV-NP+GPCLASV、MeV-NPExoN+GPCLASV和MeV-Z+GPCLASV的Vero E6细胞中检测到NP的表达；仅在感染了MeV-Z+GPCLASV的细胞中检测到Z的表达。在所有感染了MeV的细胞中检测到MeV F的表达。如预期的那样，在感染了MeV-Z+GPCLASV的细胞的上清液中还检测到随Z一起的GPC，支持了GPC与Z一起以VLP形式释放。所有载体传代10次而没有损失LASV抗原表达。
实施例2-在人原代抗原呈递细胞中表达LASV抗原的MeV病毒的免疫原性
为了表征人类免疫细胞中不同MeV载体的免疫原性，我们感染了单核细胞衍生的巨噬细胞和树突状细胞。MeV进入这些细胞并在这些细胞中复制，如图4中GFP的表达所示。但是，病毒不能在这些细胞中有效复制，因为在感染后第1天几乎无法检测到感染滴度，而且随着时间的推移，滴度不会增加，这可能是由于诱导了抗病毒先天应答。
我们通过结合活化标记的流式细胞仪分析和1型IFN反应的qPCR分析，分析了巨噬细胞和树突状细胞对不同重组病毒的免疫应答。在感染后24小时，我们通过qPCR分析了不同载体诱导的I型IFN反应(图5)。在巨噬细胞中，MeV-GPCLASV和MeV-Z+GPCLASV诱导了与对照MeV-GFP相同水平的IFNα-1、α-2和β。但是，添加的LASV NP减少了近3log的I型IFN(MeV-NP+GPCLASV)的诱导，但是LASV NP(MeV-NPExoN+GPCLASV)的ExoN结构域的突变将I型IFN的诱导恢复到与MeV-GFP和-GPCLASV相当的水平。该结果表明，LASV NP可以通过其ExoN活性控制I型IFN的诱导，这很可能是通过消化在MeV复制过程中表达的dsRNA分子实现的(Son，2015)。然后我们研究了感染后48小时巨噬细胞中不同载体对共激活分子的诱导作用(图6)。重要的是，共激活分子的细胞表面表达对于激活T细胞应答至关重要。如图6所示，所有载体诱导CD80、CD86和CD83的强烈细胞表面表达。值得注意的是，与被其他载体感染的巨噬细胞中的表达相比，MeV-NP+GPCLASV感染的巨噬细胞中的表达降低了，但是当LASV NP的ExoN结构域发生突变时，表达得以恢复。
对树突状细胞进行了类似的实验(图7和8)。如在巨噬细胞中观察到的，MeV-GPCLASV和MeV-Z+GPCLASV诱导的IFNα-1、α-2和β的水平与对照MeV-GFP相同(图7)。LASV NP的添加也减少了I型IFN的诱导，但是LASV NP的ExoN结构域的突变将I型IFN的诱导恢复到与MeV-GFP、MeV-Z+GPCLASV和MeV-GPCLASV相当的水平。在被MeV-GFP、MeV-Z+GPCLASV和MeV-GPCLASV感染的树突状细胞中，类似地诱导了共激活分子CD80、CD86、CD83和CD40的表达(图8)。
MeV-LASV疫苗株诱导I型IFN反应和共激活分子的细胞表面表达；野生型NP的存在会大大降低疫苗诱导这些作用的能力，但是ExoN域内的突变会恢复疫苗诱导这些作用的能力。
实施例3-食蟹猴中两种疫苗的安全性、免疫原性和功效
基于在人类巨噬细胞中获得的结果，我们决定在食蟹猴(其是研究LASV发病机理的金标准模型)中测试两种候选疫苗。3只对照动物分别用2.106TCID50的重组MeV株Schwarz疫苗进行皮下免疫，两组4只动物分别用2.106TCID50的MeV-NPExoN+GPCLASV和MeV-Z+GPCLASV进行皮下免疫。然后在免疫后37天跟踪动物的健康状况(体温、体重、呼吸频率)，未观察到不良反应。值得注意的是，利用腹膜内装置不断监测，动物的体温并未因免疫而改变(图9)。
在免疫后的两周内，我们每2-3天评估一次免疫动物的病毒血症，然后每周一次，并且在血浆和PBMC中均无法检测到任何痕量的病毒RNA。同样，我们无法在接种疫苗的动物的鼻腔和口腔分泌物或尿液中检测到任何病毒RNA。因此，看来候选疫苗在猴子中是安全的，并且在免疫后的任何时候都不会排出。
为了评估载体的免疫原性，我们进行了ELISA以检测LASV特异性IgM和IgG。我们在MeV-Z+GPCLASV免疫的动物中无法检测到特异性IgM和IgG，在免疫后第37天，我们仅在4只MeV-NPExoN+GPCLASV疫苗接种的动物中的3只中检测到了低水平的LASV特异性IgG。另外，1只MeV-NPExoN+GPCLASV疫苗接种的动物具有中和抗体，如噬斑减少中和试验(1：100滴度)所证实。我们还在通过重叠对GPC、NP或Z特异的肽刺激全血后，通过流式细胞术评估了LASV特异性T细胞应答。在MeV-NPExoN+GPCLASV疫苗接种的动物中，我们从第7天开始检测到针对GP的CD4和CD8T细胞应答，其在免疫后第14天下降(图10A和10C，橙色条)。在这些动物中，我们还检测了免疫后第10天到第21天之间针对NP的CD4和CD8T细胞应答(图10B和10D，橙色条)。在MeV-Z+GPCLASV免疫的动物中，与MeV-NPExoN+GPCLASV疫苗接种的动物相比，针对GPC的CD4T细胞应答被延迟，从免疫后第10天开始，一直持续到接种后第21天(图10A，绿色条)。GPC特异的CD8T细胞应答于第7天以低水平开始，但在免疫后第21天达到峰值(图10C，绿色条)。从第7天开始直到第30天，还检测到CD4和CD8Z特异性T细胞应答，在免疫后第21天达到峰值(图10B和10D，绿色条)。重要的是，在MeV疫苗接种的对照动物中未检测到针对LASV抗原的T细胞应答。因此，两种候选疫苗均诱导LASV抗原特异性T细胞应答，其中MeV-NPExoN+GPCLASV诱导的应答早于MeV-Z+GPCLASV。
实施例4-疫苗的功效
为了测试候选疫苗的功效，在免疫接种后第37天用致死剂量(1,500ffu，皮下)的LASV菌株Josiah激发免疫接种过的动物。然后对动物进行长达30天的监测，并根据它们的体温、体重、正常进食和进水的能力、行为、临床体征进行临床评分，得分为15作为杀死的终点。三只对照动物的评分从第3天开始增加，并且分别在激发后第12、14和15天被处以安乐死(图11A)。
相反，所有接种疫苗的动物都从LASV感染中存活，但临床结果因疫苗而异。实际上，MeV-NPExoN+GPCLASV疫苗接种的动物到第5天的临床评分略有增加(最大评分为3，图11B)，主要是由于温度升高(参见图12，中图)。与此相对，MeV-Z+GPCLASV免疫的动物在第3天与第12天之间出现严重症状，例如高烧(参见图12，下图)，而2只动物在第12天时完全恢复了，另外2只动物喂食和进水困难，表现出虚脱，一只动物出现平衡问题，到第30天体重减轻了超过7.5％，达到了14分(图11C)。
在感染过程中，我们还跟踪了血浆中的一些生物学参数，例如肝酶水平(ALT和AST)、乳酸脱氢酶(LDH)、C反应蛋白(CRP)和白蛋白等。在对照动物中，肝酶的水平从第6天开始一直持续增加，直到动物死亡(图13，左图)。相反，在MeV-NPExoN+GPCLASV疫苗接种的动物中，肝酶水平在任何时候都保持正常(图13，中图)，在MeV-Z+GPCLASV免疫的动物中，在第6天和第15天之间仅略有增加(图13，右图)。
LDH的血浆水平是组织损伤的标志。在对照动物中，LDH水平在激发后第6天开始增加，并这样一直持续到动物死亡(图14A，左图)。在感染过程中，MeV-NPExoN+GPCLASV疫苗接种的动物未观察到增加(图14A，中图)。但是，在MeV-Z+GPCLASV免疫的动物中，第6天和第15天之间LDH水平升高，尤其是对于第9天具有与对照动物相似的LDH值的两只动物(图14A，右图)，表明这些动物有一些组织损伤。炎症标记物CRP的水平在对照动物中也迅速增加直至死亡(图14B，左图)。在MeV-NPExoN+GPCLASV组中，CRP值仍然很低，除了有一只动物在第6天时CRP水平短暂升高之外(图14B，中图)。与之相对，MeV-Z+GPCLASV组的所有动物的CRP水平在第3天与第15天之间均升高(图14B，右图)。在这一组中，一只动物在第15天与第30天之间显示出第二波CRP合成，表明LASV病毒仍在该动物中复制(图14B，右图，浅绿色)。我们还跟踪了免疫猴子中白蛋白的血浆水平，白蛋白是肾脏和肝脏功能障碍的标志。在对照动物中，白蛋白水平从第3天开始不断下降(图14C，左图)，而在MeV-NPExoN+GPCLASV免疫的动物中这些水平保持稳定(图14C，中图)。在MeV-Z+GPCLASV组中，在第3天与第12天之间，所有动物的白蛋白血浆水平均下降，但这些水平最终在第15天时恢复正常(图14C，右图)。
激发后，还通过qRT-PCR和滴定法监测被激发的动物的病毒血症。如图15A所示，从第3天到杀死之日，被感染的对照的血液中RNA水平持续增加，对于一只动物，在第15天达到每毫升109个RNA拷贝的峰值(左图)。在这些动物中也检测到了感染性滴度(图15B，左图)。在MeV-NPExoN+GPCLASV疫苗接种的动物中，仅在激发后第6天检测到病毒RNA，并且与对照动物相比检测到的病毒RNA水平较低(图15A，中图)，未检测到相关病毒血症(图15B，中图)。在MeV-Z+GPCLASV免疫的动物中，病毒RNA的水平更高，在第6天达到约每毫升106个RNA拷贝的峰值，并一直下降到第15天(图15A，右图)。值得注意的是，到第15天时，一只动物的血液中RNA拷贝数有所反弹(图15A，右图，浅绿色)，这可能与在同一只动物中观察到的CRP反弹相关(图14B，右图)。此外，对于血液中显示延长的RNA水平的动物，所有动物在第6天到第15天均检测到感染滴度(图15B，右图)。
除病毒血症外，我们还评估了被激发过的动物的鼻拭和口腔拭子中病毒RNA的存在。如图16所示，病毒RNA的水平在第9天在对照动物的鼻腔和口腔分泌物中达到峰值(图16A和B，左图)并下降，但在死亡时仍可检测到。同样，在MeV-Z+GPCLASV免疫的动物中，这些分泌物中的病毒RNA水平在第9天达到峰值，到第15天时有1或2只动物反弹(图16A和B，右图)。与此相对，在第3天，在一只动物的鼻拭子中以及在第6天，在另一只动物的鼻拭子中，只检测到少量的LASV RNA(图16A和B，中图)，且与感染性病毒的存在无关(数据未显示)。此外，我们追踪了被激发过的动物的尿液中病毒RNA的排出情况。仅在激发后第9天或第15天开始，分别在对照动物和MeV-Z+GPCLASV免疫的动物中检测到LASV RNA水平(图16C)。
在对用MeV、MeV-NPExoN-GPCLASV和MeV-Z-GPCLASV免疫的动物进行尸检时收集的不同器官中，分析了LASV RNA的量(图17)以及LASV感染滴度(图18)。所有MeV对照动物在每个受测器官中均呈现可检测量的LASV RNA和高病毒滴度，但在膀胱中，只有一只动物呈现可检测量的LASV RNA。在脾、肝和肺中发现最高的感染滴度。在用MeV-Z+GPCLASV免疫的所有动物中，在腹股沟淋巴结，肠系膜淋巴结和脾中发现了可检测量的LASV RNA，并且在所有器官中都检测到了可检测量的LASV RNA，但从未在该组的单个动物中检测到。两只动物在腹股沟淋巴结中呈现出拉沙病毒的感染滴度，而另一只动物在脾中呈现出拉沙病毒的感染滴度，而其他器官没有感染性病毒。在用MeV-NPExoN+GPCLASV免疫的动物组中，在1到3只动物的淋巴器官和肺中发现了可检测量的LASV RNA，但RNA的存在与感染性拉沙病毒的存在无关。
实施例5-对LASV的免疫应答
为了确定对感染的免疫应答，我们首先测量了用LASV激发后产生的LASV特异性免疫球蛋白的水平。在所有动物中，IgM应答均从第9天开始，并在第12天达到峰值(图19A)。有趣的是，对照组和MeV-Z+GPCLASV组的动物在第12天的IgM水平较高，这表明IgM应答水平与保护并没有正相关，而与病毒载量正相关。就IgG应答而言，我们发现到第9天时，所有MeV-NPExoN+GPCLASV疫苗接种动物中的LASV-lgG均被强烈诱导，而在MeV-Z+GPCLASV免疫的动物中，IgG应答仅在第15天达到相似的水平(图19B)。在任何时间点，对照动物中LASV特异性IgG的水平都非常低。另外，已经在免疫后的不同时间点，在用MeV-NPExoN-GPCLASV、MeV-Z+GPCLASV和MeV免疫的猴子的血浆中测定了血清中和(seroneutralisation)滴度(结果在表1中示出)。激发时(即免疫接种后第37天，表1中的J0)，每组至少一只动物的中和滴度(neutralization titer)为1/100e。激发后十五天，直到尸检日，与用MeV疫苗接种的动物相反，用MeV-NPExoN-GPCLASV和MeV-Z+GPCLASV疫苗接种的所有动物的中和抗体都在1/100e和1/500e之间。用MeV-Z+GPCLASV疫苗接种的猴子的滴度在第30天最高。除对照动物外，在所有动物中均检测到中和抗体。
表1：在被激发过的猴子的血浆中测得的血清中和滴度
Figure BDA0002548019650000371
还通过定量T细胞的百分比来监测对LASV抗原特异的CD8+和CD4+T细胞的诱导，免疫后，T细胞会响应覆盖整个LASV GP，NP和Z蛋白(图20)的重叠肽而产生IFNg、TNFa和/或IL-2。T细胞对Z肽没有应答(数据未显示)。与基线水平(第0天)和MeV对照动物相比，响应GP和NP肽的产生细胞因子的T细胞数量仅适度增加，而TNFa是参与该响应的主要细胞因子。然而，已经观察到，在用MeV-NPExon-GPCLASV免疫后21天，产生GP特异性细胞因子的CD8+和CD4+T细胞的百分比增加不显著，而在用MeV-Z+GPCLASV免疫后没有观察到该增加。此外，在免疫动物中14天后，产生NP特异性细胞因子的CD4+和CD8+T细胞出现，并在22天后仍然存在。
同样，在T细胞活化试验中，使用重叠肽激发后，我们追踪了T细胞对LASV GPC、NP或Z的应答。在MeV-NPExoN+GPCLASV疫苗接种的动物中，针对GPC和NP的CD8和CD4应答较早且很强，在第9天达到峰值，然后缓慢下降(图21，橙色条)。在MeV-Z+GPCLASV免疫的动物中，针对GPC的CD8和CD4应答被延迟，强度降低，在第12天达到峰值(图21，绿色条)。这些动物没有表现出LASV-Z特异性细胞应答。对照动物仅在第6天和第12天之间经历了针对GPC和NP的非常弱且短暂的CD8和CD4应答(图21，红色条)。
如Ki67染色评估，CD8应答的强度与这些细胞的增殖相关(图22A)，与对照动物和MeV-Z+GPCLASV免疫的动物相比，MeV-NPExoN+GPCLASV免疫的动物在第9天的CD8T细胞有较强的增殖，仅在第15天才达到较轻的增殖峰(分别比较橙色条与红色条和绿色条)。这种增殖还与CD8和CD4T细胞应答的细胞毒性表型有关，如在MeV-NPExoN+GPCLASV免疫的动物中颗粒酶B的早期和强表达以及对照动物和MeV-Z+GPCLASV免疫的动物的延迟应答所示(图22B和C，比较橙色条和绿色条)。
已经监测了用LASV激发过的动物中LASV GP和NP特异性T细胞的诱导。激发后用LASV Z肽刺激PBMC后未观察到细胞因子的产生(数据未显示)。关于在被激发过的动物中产生细胞因子的CD8+和CD4+T细胞的数据分别示于图23和24。在用MeV免疫的动物中，未发现大量应答细胞。在用MeV-NPExoN+GPCLASV免疫的动物中，响应于LASV GPC肽，在激发后第12天，响应GPC肽的产生细胞因子的CD8+和CD4+T细胞百分比分别上升至2％和0.6％，然后在第22天恢复至基线水平。T细胞的主要部分仅产生IFNg，但产生至少2种细胞因子的多功能CD8+和CD4+T细胞(Pf-T)的比例从第12天到第30天增加。在CD4+T细胞组中，直到激发后第30天，产生IFNg的细胞的百分比下降，而Pf-T则相反，其上升到59％。在用MeV-Z+GPCLASV免疫的动物中，分别从第15天和第12天开始观察到中等数量的产生细胞因子的CD4+和CD8+T细胞。大多数T细胞仅产生IFNg，CD8+T细胞的Pf-T比例保持在20％左右，而CD4+T细胞的Pf-T比例上升至40％。激发后第30天，对于所有免疫的猴子，T细胞的显著部分仅产生TNFa。
响应于LASV NP肽，用MeV免疫的动物仅在激发后第15天才检测到痕量的产生细胞因子的T细胞。用MeV-Z+GPCLASV免疫的动物在激发后第6天就检测到应答T细胞，在第12天达到峰值。T细胞的表型在6天后是多样的，而在第9天，主要存在分泌TNFa的T细胞。在第12天，产生IFNg的T细胞占主导地位，而Pf-T比例增加直到第30天。
用MeV-NPExoN+GPCLASV和MeV-Z+GPCLASV免疫的猴子的PBMC的总细胞RNA含量也已在免疫后的不同时间提取，以进行RNAseq并分析不同时间点PBMC中基因的差异表达。为了鉴定与那些基因相关的通路，已经使用ClusterProfiler(KEGG分析)对差异表达的基因进行了富集分析。用MeV-NPExoN+GPCLASV和MeV-Z+GPCLASV免疫后，随时间差异调节的通路分别示于图25和26。在用MeV-NPExoN+GPCLASV免疫的动物中，免疫应答的相关通路在免疫后的第一周被激活(D2对D0、D4对D0和D7对D0)。造血细胞谱系和磷脂酶D通路的激活表明免疫细胞在前四天内强烈增殖，与吞噬功能(FCγR介导的吞噬作用)和趋化因子信号传导相关。直到第七天，Th1、Th2和Th17的应答增强，表明T细胞增殖。在免疫后的第二周，激活了参与免疫应答调节的通路，特别是泛素介导的蛋白水解，NF-kB信号传导和11-17信号通路。与在用MeV-NPExoN+GPCLASV免疫的动物中观察到的结果相比，用MeV-Z+GPCLASV免疫看起来诱导了较弱的免疫应答，在免疫后第4天弱而短暂地激活Th1、Th2和Th17，以及随后激活NF-kB和IL-17信号通路(在第14天)。总而言之，不同通路的激活支持对免疫的主动和有效的细胞应答。
观察到免疫接种后和LASV激发后动物血浆中可溶性介质的释放。在使用Luminex分析定量的29种分析物中，免疫后动物之间未发现可溶性介质水平的差异(数据未显示)。在被激发过的动物中(图27)，在所有动物的血浆中检测到IFNg的瞬时释放，其水平分别在免疫后的动物和MeV对照动物感染后第6天和第9天达到峰值。但是，在用MeV-NPExoN+GPCLASV免疫的猴子的血浆中观察到了较低的浓度。所有动物中穿孔素的浓度一直上升到第9天或第12天，然后下降到低水平直到第22天。再次，在用MeV-NPExoN+GPCLASV免疫的猴子中观察到的水平较低。在感染后第9天，在用MeV和MeV-Z+GPCLASV免疫的猴子中观察到可溶性CD137(sCD137)水平升高，而在用MeV-NPExoN+GPCLASV免疫的动物中仅观察到中等浓度的sCD137。到第6天，IL-6出现在所有动物的血浆中，并在第9天仍存在于接种MeV和MeV-Z+GPCLASV的动物中，而在用MeV-NPExoN+GPCLASV免疫的动物的血浆中不再检测到IL-6。在MeV动物的血浆中，IL-6水平仍在升高，而在用MeV-Z+GPCLASV免疫的动物的血浆中，升高是适度的。从第6天起，在用MeV和MeV-Z+GPCLASV免疫的动物的血浆中观察到IL-8含量升高，而在MeV-NPExoN+GPCLASV猴子中，在第9天和第12天之间仅检测到低浓度的IL-8。在MeV-NPExoN+GPCLASV猴子的血浆中未检测到IL-18，而在用MeV和MeV-Z+GPCLASV免疫的动物中分别检测到高水平IL-18和低水平IL-18。在MeV-NPExoN+GPCLASV猴子中，MCP1保持在基线水平。与此相对，分别从第6天和第9天开始，在MeV和MeV-Z+GPCLASV动物中发现了高浓度。在MeV-Z+GPCLASV猴子中，IL-10和IL-1受体拮抗剂(IL-1RA)的水平升高直到第9天，然后在第22天下降至低水平。在MeV动物中，IL-10和IL-1RA水平仍在升高，而在用MeV-NPExoN+GPCLASV免疫的动物的血浆中，除了在6天后检测到少量外，未释放IL-10和IL-1RA。
实施例6：对MeV的免疫应答
激发后，还通过ELISA评估了针对MeV特异性免疫球蛋白产生的MeV特异性免疫球蛋白的水平(图28A：IgM，28B：IgG)。在所有动物(MeV组，MeV-NPExoN+GPCLASV组；MeV-Z+GPCLASV组)中均产生IgM和IgG MeV特异性。MeV-NPExoN-GPCLASV、MeV-Z+GPCLASV和MeV疫苗可诱导类似的MeV特异性IgM和IgG应答(图28)。给这些动物接种MeV(图28)，并对用MeV-NPExoN+GPCLASV或MeV-Z+GPCLASV免疫的动物针对LASV(见图15)和MeV(图28)进行疫苗接种。
实施例7：MeV-LASV疫苗株的嗜性(tropism)
已经分析了MeV-LASV的嗜性。拉沙病毒使用α-肌营养不良(α-DG)作为受体。MeV的疫苗株使用CD46、SLAM和粘连蛋白-4作为受体。Mopeia病毒已用作对照，以分析将拉沙抗原引入MeV载体是否对MeV疫苗株的嗜性产生影响。Mopeia病毒是与拉沙病毒密切相关的一种沙粒病毒，并使用相同的受体。如图30所示，用拉沙病毒GPC假型化的Mopeia病毒在表达α-DG的CHO-K1细胞和表达α-DG和人CD46的CHO-hCD46细胞中复制，其中在两个细胞系中用抗GP1染色均为阳性。相反，MeV-NPExoN+GPCLASV不能在CHO-K1细胞中复制，而可以在CHO-hCD46细胞系中复制(图30，底部图片)。因此，将拉沙抗原引入MeV载体不会延长MeV的嗜性。
结论
总之，MeV-NPExoN+GPCLASV和MeV-Z+GPCLASV疫苗在非人类灵长类动物中都是安全、免疫原性和有效的。单次免疫后，二者均保护食蟹猴免受LASV菌株Josiah的致死性激发。然而，MeV-NPExoN+GPCLASV在所有接种疫苗的猴子中均具有最佳的保护，并具有强大的T细胞应答和几乎灭菌的免疫力。因此，该载体是人类进行临床试验的首选选择。该载体在激发前的免疫原性当然可以通过初免/加强免疫策略来改善。尽管如此，我们在这里带来了原理上的证明，即单次免疫可以保护100％的受激发动物。此外，这些载体应能保护猴子免受麻疹的侵害，因此，除了紧急疫苗外，还可以在LASV和MeV都是主要公共卫生问题的流行病国家中用作二价疫苗。
SEQ ID NO：1
SEQ ID No：1对应于通过经密码子优化的SEQ ID No：2序列编码的拉沙病毒株Josiah的重组GPC蛋白。
MGQIVTFFQEVPHVIEEVMNIVLIALSVLAVLKGLYNFATCGLVGLVTFLLLCGRSCTTSLYKGVYELQTLELNMETLNMTMPLSCTKNNSHHYIMVGNETGLELTLTNTSIINHKFCNLSDAHKKNLYDHALMSIISTFHLSIPNFNQYEAMSCDFNGGKISVQYNLSHSYAGDAANHCGTVANGVLQTFMRMAWGGSYIALDSGRGNWDCIMTSYQYLIIQNTTWEDHCQFSRPSPIGYLGLLSQRTRDIYISRRLLGTFTWTLSDSEGKDTPGGYCLTRWMLIEAELKCFGNTAVAKCNEKHDEEFCDMLRLFDFNKQAIQRLKAEAQMSIQLINKAVNALINDQLIMKNHLRDIMGIPYCNYSKYWYLNHTTTGRTSLPKCWLVSNGSYLNETHFSDDIEQQADNMITEMLQKEYMERQGKTPLGLVDLFVFSTSFYLISIFLHLVKIPTHRHIVGKSCPKPHRLNHMGICSCGLYKQPGVPVKWKR*
SEQ ID NO：2
SEQ ID No：2对应于编码SEQ ID No.1的GPC蛋白的经密码子优化的核苷酸序列。
Figure BDA0002548019650000411
SEQ ID NO：3
SEQ ID No：3对应于通过经密码子优化的SEQ ID No：4序列编码的拉沙病毒株Josiah的重组NP蛋白。
MSASKEIKSFLWTQSLRRELSGYCSNIKLQVVKDAQALLHGLDFSEVSNVQRLMRKERRDDNDLKRLRDLNQAVNNLVELKSTQQKSILRVGTLTSDDLLILAADLEKLKSKVIRTERPLSAGVYMGNLSSQQLDQRRALLNMIGMSGGNQGARAGRDGVVRVWDVKNAELLNNQFGTMPSLTLACLTKQGQVDLNDAVQALTDLGLIYTAKYPNTSDLDRLTQSHPILNMIDTKKSSLNISGYNFSLGAAVKAGACMLDGGNMLETIKVSPQTMDGILKSILKVKKALGMFISDTPGERNPYENILYKICLSGDGWPYIASRTSITGRAWENTVVDLESDGKPQKADSNNSSKSLQSAGFTAGLTYSQLMTLKDAMLQLDPNAKTWMDIEGRPEDPVEIALYQPSSGCYIHFFREPTDLKQFKQDAKYSHGIDVTDLFATQPGLTSAVIDALPRNMVITCQGSDDIRKLLESQGRKDIKLIDIALSKTDSRKYENAVWDQYKDLCHMHTGVVVEKKKRGGKEEITPHCALMDCIMFDAAVSGGLNTSVLRAVLPRDMVFRTSTPRVVL*
SEQ ID NO：4
SEQ ID No：4对应于编码SEQ ID No.3的NP蛋白的经密码子优化的核苷酸序列。
Figure BDA0002548019650000421
Figure BDA0002548019650000431
SEQ ID NO：5
SEQ ID No：5对应于通过经密码子优化的SEQ ID No：6的序列编码的拉沙病毒株Josiah的重组突变的NP蛋白，其中NP蛋白的核酸外切酶活性已降低。氨基酸388和氨基酸391已突变(M388D和E391 G)。
MSASKEIKSFLWTQSLRRELSGYCSNIKLQVVKDAQALLHGLDFSEVSNVQRLMRKERRDDNDLKRLRDLNQAVNNLVELKSTQQKSILRVGTLTSDDLLILAADLEKLKSKVIRTERPLSAGVYMGNLSSQQLDQRRALLNMIGMSGGNQGARAGRDGVVRVWDVKNAELLNNQFGTMPSLTLACLTKQGQVDLNDAVQALTDLGLIYTAKYPNTSDLDRLTQSHPILNMIDTKKSSLNISGYNFSLGAAVKAGACMLDGGNMLETIKVSPQTMDGILKSILKVKKALGMFISDTPGERNPYENILYKICLSGDGWPYIASRTSITGRAWENTVVDLESDGKPQKADSNNSSKSLQSAGFTAGLTYSQLMTLKDAMLQLDPNAKTWMAIEARPEDPVEIALYQPSSGCYIHFFREPTDLKQFKQDAKYSHGIDVTDLFATQPGLTSAVIDALPRNMVITCQGSDDIRKLLESQGRKDIKLIDIALSKTDSRKYENAVWDQYKDLCHMHTGVVVEKKKRGGKEEITPHCALMDCIMFDAAVSGGLNTSVLRAVLPRDMVFRTSTPRVVL*
SEQ ID NO：6
SEQ ID No：6对应于编码SEQ ID No.5的突变NP蛋白的经密码子优化的核苷酸序列。核苷酸11661 1175和1176已突变(C1166A，C1175G和C1176A)。
Figure BDA0002548019650000432
Figure BDA0002548019650000441
SEQ ID NO：7
SEQ ID No：7对应于通过经密码子优化的SEQ ID No：8的序列编码的拉沙病毒株Josiah的重组Z蛋白。
MGNKQAKAPESKDSPRASLIPDATHLGPQFCKSCWFENKGLVECNNHYLCLNCLTLLLSVSNRCPICKMPLPTKLRPSAAPTAPPTGAADSIRPPPYSP*
SEQ ID NO：8
SEQ ID No：8对应于编码SEQ ID No.7的Z蛋白的经密码子优化的核苷酸序列。
Figure BDA0002548019650000442
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序列表
<110> 巴斯德研究所（INSTITUT PASTEUR）
法国国家科学研究中心（CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE (CNRS) ）
<120> 拉沙疫苗
<130> B12929A - AD/HLQ/KN
<140> PCT/FRXX XXX XXX
<141> 2018-12-20
<150> US 62/609155
<151> 2017-12-21
<160> 17
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 491
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 蛋白GPC
<400> 1
Met Gly Gln Ile Val Thr Phe Phe Gln Glu Val Pro His Val Ile Glu
1 5 10 15
Glu Val Met Asn Ile Val Leu Ile Ala Leu Ser Val Leu Ala Val Leu
20 25 30
Lys Gly Leu Tyr Asn Phe Ala Thr Cys Gly Leu Val Gly Leu Val Thr
35 40 45
Phe Leu Leu Leu Cys Gly Arg Ser Cys Thr Thr Ser Leu Tyr Lys Gly
50 55 60
Val Tyr Glu Leu Gln Thr Leu Glu Leu Asn Met Glu Thr Leu Asn Met
65 70 75 80
Thr Met Pro Leu Ser Cys Thr Lys Asn Asn Ser His His Tyr Ile Met
85 90 95
Val Gly Asn Glu Thr Gly Leu Glu Leu Thr Leu Thr Asn Thr Ser Ile
100 105 110
Ile Asn His Lys Phe Cys Asn Leu Ser Asp Ala His Lys Lys Asn Leu
115 120 125
Tyr Asp His Ala Leu Met Ser Ile Ile Ser Thr Phe His Leu Ser Ile
130 135 140
Pro Asn Phe Asn Gln Tyr Glu Ala Met Ser Cys Asp Phe Asn Gly Gly
145 150 155 160
Lys Ile Ser Val Gln Tyr Asn Leu Ser His Ser Tyr Ala Gly Asp Ala
165 170 175
Ala Asn His Cys Gly Thr Val Ala Asn Gly Val Leu Gln Thr Phe Met
180 185 190
Arg Met Ala Trp Gly Gly Ser Tyr Ile Ala Leu Asp Ser Gly Arg Gly
195 200 205
Asn Trp Asp Cys Ile Met Thr Ser Tyr Gln Tyr Leu Ile Ile Gln Asn
210 215 220
Thr Thr Trp Glu Asp His Cys Gln Phe Ser Arg Pro Ser Pro Ile Gly
225 230 235 240
Tyr Leu Gly Leu Leu Ser Gln Arg Thr Arg Asp Ile Tyr Ile Ser Arg
245 250 255
Arg Leu Leu Gly Thr Phe Thr Trp Thr Leu Ser Asp Ser Glu Gly Lys
260 265 270
Asp Thr Pro Gly Gly Tyr Cys Leu Thr Arg Trp Met Leu Ile Glu Ala
275 280 285
Glu Leu Lys Cys Phe Gly Asn Thr Ala Val Ala Lys Cys Asn Glu Lys
290 295 300
His Asp Glu Glu Phe Cys Asp Met Leu Arg Leu Phe Asp Phe Asn Lys
305 310 315 320
Gln Ala Ile Gln Arg Leu Lys Ala Glu Ala Gln Met Ser Ile Gln Leu
325 330 335
Ile Asn Lys Ala Val Asn Ala Leu Ile Asn Asp Gln Leu Ile Met Lys
340 345 350
Asn His Leu Arg Asp Ile Met Gly Ile Pro Tyr Cys Asn Tyr Ser Lys
355 360 365
Tyr Trp Tyr Leu Asn His Thr Thr Thr Gly Arg Thr Ser Leu Pro Lys
370 375 380
Cys Trp Leu Val Ser Asn Gly Ser Tyr Leu Asn Glu Thr His Phe Ser
385 390 395 400
Asp Asp Ile Glu Gln Gln Ala Asp Asn Met Ile Thr Glu Met Leu Gln
405 410 415
Lys Glu Tyr Met Glu Arg Gln Gly Lys Thr Pro Leu Gly Leu Val Asp
420 425 430
Leu Phe Val Phe Ser Thr Ser Phe Tyr Leu Ile Ser Ile Phe Leu His
435 440 445
Leu Val Lys Ile Pro Thr His Arg His Ile Val Gly Lys Ser Cys Pro
450 455 460
Lys Pro His Arg Leu Asn His Met Gly Ile Cys Ser Cys Gly Leu Tyr
465 470 475 480
Lys Gln Pro Gly Val Pro Val Lys Trp Lys Arg
485 490
<210> 2
<211> 1476
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 密码子优化的cDNA GPC
<400> 2
atgggccaga ttgtcacatt ctttcaggaa gtgccacacg tcattgagga ggtcatgaac 60
atcgtgctga ttgctctgtc agtgctggca gtgctgaaag gactgtacaa cttcgctacc 120
tgtggactgg tgggactggt cacattcctg ctgctgtgcg gcagaagttg cactacctca 180
ctgtacaaag gagtgtacga gctgcagact ctggaactga acatggagac actgaatatg 240
acaatgcctc tgagctgcac caagaataat agccaccact atatcatggt cgggaacgaa 300
accggcctgg aactgaccct gacaaacacc agcatcatta accacaagtt ctgcaatctg 360
agcgacgctc acaagaagaa cctgtatgac cacgctctga tgtccatcat cagtaccttt 420
cacctgtcca tccccaattt caaccagtac gaggcaatgt catgcgactt caacgggggc 480
aagatcagtg tccagtacaa cctgagccac tcctacgccg gcgacgcagc caaccactgc 540
ggaactgtcg ccaatggcgt gctgcagaca ttcatgagga tggcatgggg gggatcttac 600
atcgcactgg atagcggcag gggcaattgg gattgcatca tgacttccta tcagtatctg 660
attatccaga atactacatg ggaggatcat tgccagttca gtcggcccag ccctattgga 720
tatctggggc tgctgtcaca gagaacacgg gatatctata tttcaagacg cctgctgggc 780
acattcactt ggacactgtc agacagtgag ggcaaggata ctccaggggg ctactgcctg 840
acacgatgga tgctgatcga agcagagctg aaatgcttcg gcaataccgc agtggccaag 900
tgcaacgaga aacacgacga ggagttctgc gacatgctga ggctgttcga cttcaacaaa 960
caggctatcc agagactgaa ggcagaagcc cagatgtcaa tccagctgat caacaaggca 1020
gtgaacgccc tgatcaacga ccagctgatc atgaagaacc acctgagaga cattatgggc 1080
atcccctact gtaattacag caagtattgg tacctgaacc acactacaac cgggagaaca 1140
tccctgccca agtgctggct ggtcagcaat gggagttatc tgaatgaaac ccatttcagc 1200
gacgatatcg aacagcaggc tgacaacatg atcacagaga tgctgcagaa agagtacatg 1260
gaaagacagg gcaagacacc actgggactg gtcgatctgt tcgtcttctc cactagcttc 1320
tatctgattt ccatcttcct gcacctggtg aagatcccca ctcataggca cattgtcggc 1380
aagagttgcc ctaaacccca taggctgaat cacatgggga tttgtagttg cggcctgtat 1440
aagcagcctg gcgtgcctgt gaaatggaag agatga 1476
<210> 3
<211> 569
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 蛋白NP
<400> 3
Met Ser Ala Ser Lys Glu Ile Lys Ser Phe Leu Trp Thr Gln Ser Leu
1 5 10 15
Arg Arg Glu Leu Ser Gly Tyr Cys Ser Asn Ile Lys Leu Gln Val Val
20 25 30
Lys Asp Ala Gln Ala Leu Leu His Gly Leu Asp Phe Ser Glu Val Ser
35 40 45
Asn Val Gln Arg Leu Met Arg Lys Glu Arg Arg Asp Asp Asn Asp Leu
50 55 60
Lys Arg Leu Arg Asp Leu Asn Gln Ala Val Asn Asn Leu Val Glu Leu
65 70 75 80
Lys Ser Thr Gln Gln Lys Ser Ile Leu Arg Val Gly Thr Leu Thr Ser
85 90 95
Asp Asp Leu Leu Ile Leu Ala Ala Asp Leu Glu Lys Leu Lys Ser Lys
100 105 110
Val Ile Arg Thr Glu Arg Pro Leu Ser Ala Gly Val Tyr Met Gly Asn
115 120 125
Leu Ser Ser Gln Gln Leu Asp Gln Arg Arg Ala Leu Leu Asn Met Ile
130 135 140
Gly Met Ser Gly Gly Asn Gln Gly Ala Arg Ala Gly Arg Asp Gly Val
145 150 155 160
Val Arg Val Trp Asp Val Lys Asn Ala Glu Leu Leu Asn Asn Gln Phe
165 170 175
Gly Thr Met Pro Ser Leu Thr Leu Ala Cys Leu Thr Lys Gln Gly Gln
180 185 190
Val Asp Leu Asn Asp Ala Val Gln Ala Leu Thr Asp Leu Gly Leu Ile
195 200 205
Tyr Thr Ala Lys Tyr Pro Asn Thr Ser Asp Leu Asp Arg Leu Thr Gln
210 215 220
Ser His Pro Ile Leu Asn Met Ile Asp Thr Lys Lys Ser Ser Leu Asn
225 230 235 240
Ile Ser Gly Tyr Asn Phe Ser Leu Gly Ala Ala Val Lys Ala Gly Ala
245 250 255
Cys Met Leu Asp Gly Gly Asn Met Leu Glu Thr Ile Lys Val Ser Pro
260 265 270
Gln Thr Met Asp Gly Ile Leu Lys Ser Ile Leu Lys Val Lys Lys Ala
275 280 285
Leu Gly Met Phe Ile Ser Asp Thr Pro Gly Glu Arg Asn Pro Tyr Glu
290 295 300
Asn Ile Leu Tyr Lys Ile Cys Leu Ser Gly Asp Gly Trp Pro Tyr Ile
305 310 315 320
Ala Ser Arg Thr Ser Ile Thr Gly Arg Ala Trp Glu Asn Thr Val Val
325 330 335
Asp Leu Glu Ser Asp Gly Lys Pro Gln Lys Ala Asp Ser Asn Asn Ser
340 345 350
Ser Lys Ser Leu Gln Ser Ala Gly Phe Thr Ala Gly Leu Thr Tyr Ser
355 360 365
Gln Leu Met Thr Leu Lys Asp Ala Met Leu Gln Leu Asp Pro Asn Ala
370 375 380
Lys Thr Trp Met Asp Ile Glu Gly Arg Pro Glu Asp Pro Val Glu Ile
385 390 395 400
Ala Leu Tyr Gln Pro Ser Ser Gly Cys Tyr Ile His Phe Phe Arg Glu
405 410 415
Pro Thr Asp Leu Lys Gln Phe Lys Gln Asp Ala Lys Tyr Ser His Gly
420 425 430
Ile Asp Val Thr Asp Leu Phe Ala Thr Gln Pro Gly Leu Thr Ser Ala
435 440 445
Val Ile Asp Ala Leu Pro Arg Asn Met Val Ile Thr Cys Gln Gly Ser
450 455 460
Asp Asp Ile Arg Lys Leu Leu Glu Ser Gln Gly Arg Lys Asp Ile Lys
465 470 475 480
Leu Ile Asp Ile Ala Leu Ser Lys Thr Asp Ser Arg Lys Tyr Glu Asn
485 490 495
Ala Val Trp Asp Gln Tyr Lys Asp Leu Cys His Met His Thr Gly Val
500 505 510
Val Val Glu Lys Lys Lys Arg Gly Gly Lys Glu Glu Ile Thr Pro His
515 520 525
Cys Ala Leu Met Asp Cys Ile Met Phe Asp Ala Ala Val Ser Gly Gly
530 535 540
Leu Asn Thr Ser Val Leu Arg Ala Val Leu Pro Arg Asp Met Val Phe
545 550 555 560
Arg Thr Ser Thr Pro Arg Val Val Leu
565
<210> 4
<211> 1710
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 密码子优化的cDNA NP
<400> 4
atgagtgcca gcaaagaaat caagagcttc ctgtggaccc agagtctgcg gagggaactg 60
agcggatact gtagcaacat caaactgcag gtggtcaagg acgctcaggc actgctgcat 120
gggctggact tctccgaggt gtctaatgtg cagcggctga tgcggaaaga acggagggac 180
gataatgacc tgaagcgact gcgcgacctg aaccaggcag tgaacaatct ggtcgagctg 240
aagagcaccc agcagaaatc aatcctgcgg gtcgggacac tgacatctga cgacctgctg 300
atcctggctg cagacctgga gaagctgaaa tcgaaagtga tccgcaccga aaggccactg 360
tccgccgggg tctacatggg caatctgtct tcccagcagc tggaccagag gcgggctctg 420
ctgaacatga ttgggatgtc cggaggaaat cagggagcta gagccgggag ggacggagtc 480
gtgcgggtct gggacgtgaa gaatgccgaa ctgctgaaca accagttcgg gaccatgcca 540
agtctgacac tggcatgcct gactaaacag ggccaggtgg atctgaatga tgcagtccag 600
gctctgaccg acctgggcct gatctacacc gccaagtacc ccaatactag cgacctggat 660
agactgaccc agagccaccc catcctgaac atgatcgaca ctaagaagtc ctcactgaac 720
atcagtggct ataatttctc cctgggggca gcagtcaagg ctggcgcatg catgctggac 780
ggcgggaata tgctggaaac catcaaagtg tctccccaga ccatggatgg catcctgaaa 840
tctattctga aagtcaagaa ggccctggga atgtttattt cagacacccc cggcgagagg 900
aatccatatg agaacattct gtataagatt tgcctgagtg gcgacgggtg gccatacatt 960
gcaagccgga catcaattac cggaagagct tgggagaata cagtcgtgga cctggaaagc 1020
gacggcaagc cccagaaggc cgactcaaac aactcctcaa agagtctgca gtcagctggc 1080
ttcacagcag ggctgactta ctcccagctg atgacactga aggacgcaat gctgcagctg 1140
gacccaaacg ctaagacatg gatggacatc gagggacggc cagaagatcc agtggaaatc 1200
gcactgtatc agccatcatc cggatgctat atccatttct tccgggaacc aactgatctg 1260
aagcagttca agcaggatgc aaagtactcc cacggaatcg atgtcaccga tctgttcgca 1320
acccagccag gactgacatc agccgtcatc gatgccctgc ctaggaacat ggtcattact 1380
tgccagggct ccgacgatat taggaagctg ctggagagcc agggacggaa ggatatcaaa 1440
ctgatcgata ttgccctgtc taagactgat agccggaaat atgagaatgc agtctgggat 1500
cagtacaagg acctgtgcca tatgcatacc ggagtggtcg tcgagaagaa gaagaggggc 1560
ggaaaggaag agatcacacc ccactgtgcc ctgatggatt gcatcatgtt cgacgcagcc 1620
gtgtccgggg gcctgaacac ctcagtcctg agggctgtcc tgccaagaga tatggtgttt 1680
agaacttcaa ccccaagagt cgtcctgtaa 1710
<210> 5
<211> 569
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 突变蛋白NP
<400> 5
Met Ser Ala Ser Lys Glu Ile Lys Ser Phe Leu Trp Thr Gln Ser Leu
1 5 10 15
Arg Arg Glu Leu Ser Gly Tyr Cys Ser Asn Ile Lys Leu Gln Val Val
20 25 30
Lys Asp Ala Gln Ala Leu Leu His Gly Leu Asp Phe Ser Glu Val Ser
35 40 45
Asn Val Gln Arg Leu Met Arg Lys Glu Arg Arg Asp Asp Asn Asp Leu
50 55 60
Lys Arg Leu Arg Asp Leu Asn Gln Ala Val Asn Asn Leu Val Glu Leu
65 70 75 80
Lys Ser Thr Gln Gln Lys Ser Ile Leu Arg Val Gly Thr Leu Thr Ser
85 90 95
Asp Asp Leu Leu Ile Leu Ala Ala Asp Leu Glu Lys Leu Lys Ser Lys
100 105 110
Val Ile Arg Thr Glu Arg Pro Leu Ser Ala Gly Val Tyr Met Gly Asn
115 120 125
Leu Ser Ser Gln Gln Leu Asp Gln Arg Arg Ala Leu Leu Asn Met Ile
130 135 140
Gly Met Ser Gly Gly Asn Gln Gly Ala Arg Ala Gly Arg Asp Gly Val
145 150 155 160
Val Arg Val Trp Asp Val Lys Asn Ala Glu Leu Leu Asn Asn Gln Phe
165 170 175
Gly Thr Met Pro Ser Leu Thr Leu Ala Cys Leu Thr Lys Gln Gly Gln
180 185 190
Val Asp Leu Asn Asp Ala Val Gln Ala Leu Thr Asp Leu Gly Leu Ile
195 200 205
Tyr Thr Ala Lys Tyr Pro Asn Thr Ser Asp Leu Asp Arg Leu Thr Gln
210 215 220
Ser His Pro Ile Leu Asn Met Ile Asp Thr Lys Lys Ser Ser Leu Asn
225 230 235 240
Ile Ser Gly Tyr Asn Phe Ser Leu Gly Ala Ala Val Lys Ala Gly Ala
245 250 255
Cys Met Leu Asp Gly Gly Asn Met Leu Glu Thr Ile Lys Val Ser Pro
260 265 270
Gln Thr Met Asp Gly Ile Leu Lys Ser Ile Leu Lys Val Lys Lys Ala
275 280 285
Leu Gly Met Phe Ile Ser Asp Thr Pro Gly Glu Arg Asn Pro Tyr Glu
290 295 300
Asn Ile Leu Tyr Lys Ile Cys Leu Ser Gly Asp Gly Trp Pro Tyr Ile
305 310 315 320
Ala Ser Arg Thr Ser Ile Thr Gly Arg Ala Trp Glu Asn Thr Val Val
325 330 335
Asp Leu Glu Ser Asp Gly Lys Pro Gln Lys Ala Asp Ser Asn Asn Ser
340 345 350
Ser Lys Ser Leu Gln Ser Ala Gly Phe Thr Ala Gly Leu Thr Tyr Ser
355 360 365
Gln Leu Met Thr Leu Lys Asp Ala Met Leu Gln Leu Asp Pro Asn Ala
370 375 380
Lys Thr Trp Met Ala Ile Glu Ala Arg Pro Glu Asp Pro Val Glu Ile
385 390 395 400
Ala Leu Tyr Gln Pro Ser Ser Gly Cys Tyr Ile His Phe Phe Arg Glu
405 410 415
Pro Thr Asp Leu Lys Gln Phe Lys Gln Asp Ala Lys Tyr Ser His Gly
420 425 430
Ile Asp Val Thr Asp Leu Phe Ala Thr Gln Pro Gly Leu Thr Ser Ala
435 440 445
Val Ile Asp Ala Leu Pro Arg Asn Met Val Ile Thr Cys Gln Gly Ser
450 455 460
Asp Asp Ile Arg Lys Leu Leu Glu Ser Gln Gly Arg Lys Asp Ile Lys
465 470 475 480
Leu Ile Asp Ile Ala Leu Ser Lys Thr Asp Ser Arg Lys Tyr Glu Asn
485 490 495
Ala Val Trp Asp Gln Tyr Lys Asp Leu Cys His Met His Thr Gly Val
500 505 510
Val Val Glu Lys Lys Lys Arg Gly Gly Lys Glu Glu Ile Thr Pro His
515 520 525
Cys Ala Leu Met Asp Cys Ile Met Phe Asp Ala Ala Val Ser Gly Gly
530 535 540
Leu Asn Thr Ser Val Leu Arg Ala Val Leu Pro Arg Asp Met Val Phe
545 550 555 560
Arg Thr Ser Thr Pro Arg Val Val Leu
565
<210> 6
<211> 1710
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 密码子优化的cDNA突变NP
<400> 6
atgagtgcca gcaaagaaat caagagcttc ctgtggaccc agagtctgcg gagggaactg 60
agcggatact gtagcaacat caaactgcag gtggtcaagg acgctcaggc actgctgcat 120
gggctggact tctccgaggt gtctaatgtg cagcggctga tgcggaaaga acggagggac 180
gataatgacc tgaagcgact gcgcgacctg aaccaggcag tgaacaatct ggtcgagctg 240
aagagcaccc agcagaaatc aatcctgcgg gtcgggacac tgacatctga cgacctgctg 300
atcctggctg cagacctgga gaagctgaaa tcgaaagtga tccgcaccga aaggccactg 360
tccgccgggg tctacatggg caatctgtct tcccagcagc tggaccagag gcgggctctg 420
ctgaacatga ttgggatgtc cggaggaaat cagggagcta gagccgggag ggacggagtc 480
gtgcgggtct gggacgtgaa gaatgccgaa ctgctgaaca accagttcgg gaccatgcca 540
agtctgacac tggcatgcct gactaaacag ggccaggtgg atctgaatga tgcagtccag 600
gctctgaccg acctgggcct gatctacacc gccaagtacc ccaatactag cgacctggat 660
agactgaccc agagccaccc catcctgaac atgatcgaca ctaagaagtc ctcactgaac 720
atcagtggct ataatttctc cctgggggca gcagtcaagg ctggcgcatg catgctggac 780
ggcgggaata tgctggaaac catcaaagtg tctccccaga ccatggatgg catcctgaaa 840
tctattctga aagtcaagaa ggccctggga atgtttattt cagacacccc cggcgagagg 900
aatccatatg agaacattct gtataagatt tgcctgagtg gcgacgggtg gccatacatt 960
gcaagccgga catcaattac cggaagagct tgggagaata cagtcgtgga cctggaaagc 1020
gacggcaagc cccagaaggc cgactcaaac aactcctcaa agagtctgca gtcagctggc 1080
ttcacagcag ggctgactta ctcccagctg atgacactga aggacgcaat gctgcagctg 1140
gacccaaacg ctaagacatg gatggccatc gaggcccggc cagaagatcc agtggaaatc 1200
gcactgtatc agccatcatc cggatgctat atccatttct tccgggaacc aactgatctg 1260
aagcagttca agcaggatgc aaagtactcc cacggaatcg atgtcaccga tctgttcgca 1320
acccagccag gactgacatc agccgtcatc gatgccctgc ctaggaacat ggtcattact 1380
tgccagggct ccgacgatat taggaagctg ctggagagcc agggacggaa ggatatcaaa 1440
ctgatcgata ttgccctgtc taagactgat agccggaaat atgagaatgc agtctgggat 1500
cagtacaagg acctgtgcca tatgcatacc ggagtggtcg tcgagaagaa gaagaggggc 1560
ggaaaggaag agatcacacc ccactgtgcc ctgatggatt gcatcatgtt cgacgcagcc 1620
gtgtccgggg gcctgaacac ctcagtcctg agggctgtcc tgccaagaga tatggtgttt 1680
agaacttcaa ccccaagagt cgtcctgtaa 1710
<210> 7
<211> 99
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 蛋白Z
<400> 7
Met Gly Asn Lys Gln Ala Lys Ala Pro Glu Ser Lys Asp Ser Pro Arg
1 5 10 15
Ala Ser Leu Ile Pro Asp Ala Thr His Leu Gly Pro Gln Phe Cys Lys
20 25 30
Ser Cys Trp Phe Glu Asn Lys Gly Leu Val Glu Cys Asn Asn His Tyr
35 40 45
Leu Cys Leu Asn Cys Leu Thr Leu Leu Leu Ser Val Ser Asn Arg Cys
50 55 60
Pro Ile Cys Lys Met Pro Leu Pro Thr Lys Leu Arg Pro Ser Ala Ala
65 70 75 80
Pro Thr Ala Pro Pro Thr Gly Ala Ala Asp Ser Ile Arg Pro Pro Pro
85 90 95
Tyr Ser Pro
<210> 8
<211> 300
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 密码子优化的cDNA Z
<400> 8
atgggcaata agcaggcaaa ggcacccgaa agcaaggatt cacctagagc atcactgatt 60
cccgacgcaa ctcatctggg gccacagttc tgcaaatcct gttggttcga gaacaaaggc 120
ctggtggagt gcaataacca ctacctgtgc ctgaactgtc tgacactgct gctgagtgtg 180
agcaacagat gcccaatctg caagatgcct ctgccaacaa agctgaggcc ttctgctgca 240
cccaccgcac caccaactgg agccgcagac agcattagac cccccccata ctcaccataa 300
<210> 9
<211> 20551
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 质粒MeV-GPC
<400> 9
gcggccgcta atacgactca ctatagggcc aactttgttt ggtctgatga gtccgtgagg 60
acgaaacccg gagtcccggg tcaccaaaca aagttgggta aggatagttc aatcaatgat 120
catcttctag tgcacttagg attcaagatc ctattatcag ggacaagagc aggattaggg 180
atatccgaga tggccacact tttaaggagc ttagcattgt tcaaaagaaa caaggacaaa 240
ccacccatta catcaggatc cggtggagcc atcagaggaa tcaaacacat tattatagta 300
ccaatccctg gagattcctc aattaccact cgatccagac ttctggaccg gttggtgagg 360
ttaattggaa acccggatgt gagcgggccc aaactaacag gggcactaat aggtatatta 420
tccttatttg tggagtctcc aggtcaattg attcagagga tcaccgatga ccctgacgtt 480
agcataaggc tgttagaggt tgtccagagt gaccagtcac aatctggcct taccttcgca 540
tcaagaggta ccaacatgga ggatgaggcg gaccaatact tttcacatga tgatccaatt 600
agtagtgatc aatccaggtt cggatggttc gggaacaagg aaatctcaga tattgaagtg 660
caagaccctg agggattcaa catgattctg ggtaccatcc tagcccaaat ttgggtcttg 720
ctcgcaaagg cggttacggc cccagacacg gcagctgatt cggagctaag aaggtggata 780
aagtacaccc aacaaagaag ggtagttggt gaatttagat tggagagaaa atggttggat 840
gtggtgagga acaggattgc cgaggacctc tccttacgcc gattcatggt cgctctaatc 900
ctggatatca agagaacacc cggaaacaaa cccaggattg ctgaaatgat atgtgacatt 960
gatacatata tcgtagaggc aggattagcc agttttatcc tgactattaa gtttgggata 1020
gaaactatgt atcctgctct tggactgcat gaatttgctg gtgagttatc cacacttgag 1080
tccttgatga acctttacca gcaaatgggg gaaactgcac cctacatggt aatcctggag 1140
aactcaattc agaacaagtt cagtgcagga tcataccctc tgctctggag ctatgccatg 1200
ggagtaggag tggaacttga aaactccatg ggaggtttga actttggccg atcttacttt 1260
gatccagcat attttagatt agggcaagag atggtaagga ggtcagctgg aaaggtcagt 1320
tccacattgg catctgaact cggtatcact gccgaggatg caaggcttgt ttcagagatt 1380
gcaatgcata ctactgagga caagatcagt agagcggttg gacccagaca agcccaagta 1440
tcatttctac acggtgatca aagtgagaat gagctaccga gattgggggg caaggaagat 1500
aggagggtca aacagagtcg aggagaagcc agggagagct acagagaaac cgggcccagc 1560
agagcaagtg atgcgagagc tgcccatctt ccaaccggca cacccctaga cattgacact 1620
gcaacggagt ccagccaaga tccgcaggac agtcgaaggt cagctgacgc cctgcttagg 1680
ctgcaagcca tggcaggaat ctcggaagaa caaggctcag acacggacac ccctatagtg 1740
tacaatgaca gaaatcttct agactaggtg cgagaggccg agggccagaa caacatccgc 1800
ctaccatcca tcattgttat aaaaaactta ggaaccaggt ccacacagcc gccagcccat 1860
caaccatcca ctcccacgat tggagccaat ggcagaagag caggcacgcc atgtcaaaaa 1920
cggactggaa tgcatccggg ctctcaaggc cgagcccatc ggctcactgg ccatcgagga 1980
agctatggca gcatggtcag aaatatcaga caacccagga caggagcgag ccacctgcag 2040
ggaagagaag gcaggcagtt cgggtctcag caaaccatgc ctctcagcaa ttggatcaac 2100
tgaaggcggt gcacctcgca tccgcggtca gggacctgga gagagcgatg acgacgctga 2160
aactttggga atccccccaa gaaatctcca ggcatcaagc actgggttac agtgttatta 2220
cgtttatgat cacagcggtg aagcggttaa gggaatccaa gatgctgact ctatcatggt 2280
tcaatcaggc cttgatggtg atagcaccct ctcaggagga gacaatgaat ctgaaaacag 2340
cgatgtggat attggcgaac ctgataccga gggatatgct atcactgacc ggggatctgc 2400
tcccatctct atggggttca gggcttctga tgttgaaact gcagaaggag gggagatcca 2460
cgagctcctg agactccaat ccagaggcaa caactttccg aagcttggga aaactctcaa 2520
tgttcctccg cccccggacc ccggtagggc cagcacttcc gggacaccca ttaaaaaggg 2580
cacagacgcg agattagcct catttggaac ggagatcgcg tctttattga caggtggtgc 2640
aacccaatgt gctcgaaagt caccctcgga accatcaggg ccaggtgcac ctgcggggaa 2700
tgtccccgag tgtgtgagca atgccgcact gatacaggag tggacacccg aatctggtac 2760
cacaatctcc ccgagatccc agaataatga agaaggggga gactattatg atgatgagct 2820
gttctctgat gtccaagata ttaaaacagc cttggccaaa atacacgagg ataatcagaa 2880
gataatctcc aagctagaat cactgctgtt attgaaggga gaagttgagt caattaagaa 2940
gcagatcaac aggcaaaata tcagcatatc caccctggaa ggacacctct caagcatcat 3000
gatcgccatt cctggacttg ggaaggatcc caacgacccc actgcagatg tcgaaatcaa 3060
tcccgacttg aaacccatca taggcagaga ttcaggccga gcactggccg aagttctcaa 3120
gaaacccgtt gccagccgac aactccaagg aatgacaaat ggacggacca gttccagagg 3180
acagctgctg aaggaatttc agctaaagcc gatcgggaaa aagatgagct cagccgtcgg 3240
gtttgttcct gacaccggcc ctgcatcacg cagtgtaatc cgctccatta taaaatccag 3300
ccggctagag gaggatcgga agcgttacct gatgactctc cttgatgata tcaaaggagc 3360
caatgatctt gccaagttcc accagatgct gatgaagata ataatgaagt agctacagct 3420
caacttacct gccaacccca tgccagtcga cccaactagc ctaccctcca tcattgttat 3480
aaaaaactta ggaaccaggt ccacacagcc gccagcccat caacgcgtac gatgggccag 3540
attgtcacat tctttcagga agtgccacac gtcattgagg aggtcatgaa catcgtgctg 3600
attgctctgt cagtgctggc agtgctgaaa ggactgtaca acttcgctac ctgtggactg 3660
gtgggactgg tcacattcct gctgctgtgc ggcagaagtt gcactacctc actgtacaaa 3720
ggagtgtacg agctgcagac tctggaactg aacatggaga cactgaatat gacaatgcct 3780
ctgagctgca ccaagaataa tagccaccac tatatcatgg tcgggaacga aaccggcctg 3840
gaactgaccc tgacaaacac cagcatcatt aaccacaagt tctgcaatct gagcgacgct 3900
cacaagaaga acctgtatga ccacgctctg atgtccatca tcagtacctt tcacctgtcc 3960
atccccaatt tcaaccagta cgaggcaatg tcatgcgact tcaacggggg caagatcagt 4020
gtccagtaca acctgagcca ctcctacgcc ggcgacgcag ccaaccactg cggaactgtc 4080
gccaatggcg tgctgcagac attcatgagg atggcatggg ggggatctta catcgcactg 4140
gatagcggca ggggcaattg ggattgcatc atgacttcct atcagtatct gattatccag 4200
aatactacat gggaggatca ttgccagttc agtcggccca gccctattgg atatctgggg 4260
ctgctgtcac agagaacacg ggatatctat atttcaagac gcctgctggg cacattcact 4320
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aaacacgacg aggagttctg cgacatgctg aggctgttcg acttcaacaa acaggctatc 4500
cagagactga aggcagaagc ccagatgtca atccagctga tcaacaaggc agtgaacgcc 4560
ctgatcaacg accagctgat catgaagaac cacctgagag acattatggg catcccctac 4620
tgtaattaca gcaagtattg gtacctgaac cacactacaa ccgggagaac atccctgccc 4680
aagtgctggc tggtcagcaa tgggagttat ctgaatgaaa cccatttcag cgacgatatc 4740
gaacagcagg ctgacaacat gatcacagag atgctgcaga aagagtacat ggaaagacag 4800
ggcaagacac cactgggact ggtcgatctg ttcgtcttct ccactagctt ctatctgatt 4860
tccatcttcc tgcacctggt gaagatcccc actcataggc acattgtcgg caagagttgc 4920
cctaaacccc ataggctgaa tcacatgggg atttgtagtt gcggcctgta taagcagcct 4980
ggcgtgcctg tgaaatggaa gagatgagcg cgcagcgctt agacgtctcg cgatcgatac 5040
tagtacaacc taaatccatt ataaaaaact taggagcaaa gtgattgcct cccaaggtcc 5100
acaatgacag agacctacga cttcgacaag tcggcatggg acatcaaagg gtcgatcgct 5160
ccgatacaac ccaccaccta cagtgatggc aggctggtgc cccaggtcag agtcatagat 5220
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gaggacagcg attccctagg gcctccaatc gggcgagcat ttgggttcct gcccttaggt 5340
gttggcagat ccacagcaaa gcccgaaaaa ctcctcaaag aggccactga gcttgacata 5400
gttgttagac gtacagcagg gctcaatgaa aaactggtgt tctacaacaa caccccacta 5460
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gtgtgcaatg cggttaatct gataccgctc gataccccgc agaggttccg tgttgtttat 5580
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attagaagca caggcaaaat gagcaagact ctccatgcac aactcgggtt caagaagacc 5940
ttatgttacc cgctgatgga tatcaatgaa gaccttaatc gattactctg gaggagcaga 6000
tgcaagatag taagaatcca ggcagttttg cagccatcag ttcctcaaga attccgcatt 6060
tacgacgacg tgatcataaa tgatgaccaa ggactattca aagttctgta gaccgtagtg 6120
cccagcaatg cccgaaaacg acccccctca caatgacagc cagaaggccc ggacaaaaaa 6180
gccccctccg aaagactcca cggaccaagc gagaggccag ccagcagccg acggcaagcg 6240
cgaacaccag gcggccccag cacagaacag ccctgacaca aggccaccac cagccacccc 6300
aatctgcatc ctcctcgtgg gacccccgag gaccaacccc caaggctgcc cccgatccaa 6360
accaccaacc gcatccccac cacccccggg aaagaaaccc ccagcaattg gaaggcccct 6420
ccccctcttc ctcaacacaa gaactccaca accgaaccgc acaagcgacc gaggtgaccc 6480
aaccgcaggc atccgactcc ctagacagat cctctctccc cggcaaacta aacaaaactt 6540
agggccaagg aacatacaca cccaacagaa cccagacccc ggcccacggc gccgcgcccc 6600
caacccccga caaccagagg gagcccccaa ccaatcccgc cggctccccc ggtgcccaca 6660
ggcagggaca ccaacccccg aacagaccca gcacccaacc atcgacaatc caagacgggg 6720
gggccccccc aaaaaaaggc ccccaggggc cgacagccag caccgcgagg aagcccaccc 6780
accccacaca cgaccacggc aaccaaacca gaacccagac caccctgggc caccagctcc 6840
cagactcggc catcaccccg cagaaaggaa aggccacaac ccgcgcaccc cagccccgat 6900
ccggcgggga gccacccaac ccgaaccagc acccaagagc gatccccgaa ggacccccga 6960
accgcaaagg acatcagtat cccacagcct ctccaagtcc cccggtctcc tcctcttctc 7020
gaagggacca aaagatcaat ccaccacacc cgacgacact caactcccca cccctaaagg 7080
agacaccggg aatcccagaa tcaagactca tccaatgtcc atcatgggtc tcaaggtgaa 7140
cgtctctgcc atattcatgg cagtactgtt aactctccaa acacccaccg gtcaaatcca 7200
ttggggcaat ctctctaaga taggggtggt aggaatagga agtgcaagct acaaagttat 7260
gactcgttcc agccatcaat cattagtcat aaaattaatg cccaatataa ctctcctcaa 7320
taactgcacg agggtagaga ttgcagaata caggagacta ctgagaacag ttttggaacc 7380
aattagagat gcacttaatg caatgaccca gaatataaga ccggttcaga gtgtagcttc 7440
aagtaggaga cacaagagat ttgcgggagt agtcctggca ggtgcggccc taggcgttgc 7500
cacagctgct cagataacag ccggcattgc acttcaccag tccatgctga actctcaagc 7560
catcgacaat ctgagagcga gcctggaaac tactaatcag gcaattgaga caatcagaca 7620
agcagggcag gagatgatat tggctgttca gggtgtccaa gactacatca ataatgagct 7680
gataccgtct atgaaccaac tatcttgtga tttaatcggc cagaagctcg ggctcaaatt 7740
gctcagatac tatacagaaa tcctgtcatt atttggcccc agtttacggg accccatatc 7800
tgcggagata tctatccagg ctttgagcta tgcgcttgga ggagacatca ataaggtgtt 7860
agaaaagctc ggatacagtg gaggtgattt actgggcatc ttagagagcg gaggaataaa 7920
ggcccggata actcacgtcg acacagagtc ctacttcatt gtcctcagta tagcctatcc 7980
gacgctgtcc gagattaagg gggtgattgt ccaccggcta gagggggtct cgtacaacat 8040
aggctctcaa gagtggtata ccactgtgcc caagtatgtt gcaacccaag ggtaccttat 8100
ctcgaatttt gatgagtcat cgtgtacttt catgccagag gggactgtgt gcagccaaaa 8160
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aatagccaat tgtgcatcaa tcctttgcaa gtgttacaca acaggaacga tcattaatca 8340
agaccctgac aagatcctaa catacattgc tgccgatcac tgcccggtag tcgaggtgaa 8400
cggcgtgacc atccaagtcg ggagcaggag gtatccagac gctgtgtact tgcacagaat 8460
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caccacaacg agaccggata aatgccttct acaaagataa cccccatccc aagggaagta 9000
ggatagtcat taacagagaa catcttatga ttgatagacc ttatgttttg ctggctgttc 9060
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actcaatcga gcatcaggtc aaggacgtgc tgacaccact cttcaaaatc atcggtgatg 9240
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gggaagattc tatcacaatt ccctatcagg gatcagggaa aggtgtcagc ttccagctcg 9900
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tccaatatgt tttggcaacc tacgatactt ccagggttga acatgctgtg gtttattacg 10560
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gaaccaatca catgatgtca cccagacatc aggcataccc actagtgtga aatagacatc 10860
agaattaaga aaaacgtagg gtccaagtgg ttccccgtta tggactcgct atctgtcaac 10920
cagatcttat accctgaagt tcacctagat agcccgatag ttaccaataa gatagtagcc 10980
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ccaaattgta atcaggattt atttaacata gaagacaaag agtcaacgag gaagatccgt 11220
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gttttgatgt attgtgatgt catagagggg aggttaatga cagagaccgc tatgactatt 11640
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ctgtttgtca gaaacatcgg tgatccagta acatcatcaa ttgctgatct caagagaatg 13800
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ctccggaacc ctaatcctgc cctaggtggt taggcattat ttgcaatata ttaaagaaaa 17520
ctttgaaaat acgaagtttc tattcccagc tttgtctggt ggccggcatg gtcccagcct 17580
cctcgctggc gccggctggg caacattccg aggggaccgt cccctcggta atggcgaatg 17640
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ccctttagtg agggttaatt ccgagcttgg cgtaatcatg gtcatagctg tttcctgtgt 17880
gaaattgtta tccgctcaca attccacaca acataggagc cggaagcata aagtgtaaag 17940
cctggggtgc ctaatgagtg aggtaactca cattaattgc gttgcgctca ctgcccgctt 18000
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ttccgcgcac atttccccga aaagtgccac ctgaaattgt aaacgttaat attttgttaa 20040
aattcgcgtt aaatttttgt taaatcagct cattttttaa ccaataggcc gaaatcggca 20100
aaatccctta taaatcaaaa gaatagaccg agatagggtt gagtgttgtt ccagtttgga 20160
acaagagtcc actattaaag aacgtggact ccaacgtcaa agggcgaaaa accgtctatc 20220
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<211> 22405
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
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atgcattggt gaactcaact ctactggaga ccagaacaac caatcagttc ctagctgtct 11340
caaagggaaa ctgctcaggg cccactacaa tcagaggtca attctcaaac atgtcgctgt 11400
ccctgttaga cttgtattta ggtcgaggtt acaatgtgtc atctatagtc actatgacat 11460
cccagggaat gtatggggga acttacctag tggaaaagcc taatctgagc agcaaaaggt 11520
cagagttgtc acaactgagc atgtaccgag tgtttgaagt aggtgttatc agaaatccgg 11580
gtttgggggc tccggtgttc catatgacaa actatcttga gcaaccagtc agtaatgatc 11640
tcagcaactg tatggtggct ttgggggagc tcaaactcgc agccctttgt cacggggaag 11700
attctatcac aattccctat cagggatcag ggaaaggtgt cagcttccag ctcgtcaagc 11760
taggtgtctg gaaatcccca accgacatgc aatcctgggt ccccttatca acggatgatc 11820
cagtgataga caggctttac ctctcatctc acagaggtgt tatcgctgac aatcaagcaa 11880
aatgggctgt cccgacaaca cgaacagatg acaagttgcg aatggagaca tgcttccaac 11940
aggcgtgtaa gggtaaaatc caagcactct gcgagaatcc cgagtgggca ccattgaagg 12000
ataacaggat tccttcatac ggggtcttgt ctgttgatct gagtctgaca gttgagctta 12060
aaatcaaaat tgcttcggga ttcgggccat tgatcacaca cggttcaggg atggacctat 12120
acaaatccaa ccacaacaat gtgtattggc tgactatccc gccaatgaag aacctagcct 12180
taggtgtaat caacacattg gagtggatac cgagattcaa ggttagtccc tacctcttca 12240
ctgtcccaat taaggaagca ggcgaagact gccatgcccc aacataccta cctgcggagg 12300
tggatggtga tgtcaaactc agttccaatc tggtgattct acctggtcaa gatctccaat 12360
atgttttggc aacctacgat acttccaggg ttgaacatgc tgtggtttat tacgtttaca 12420
gcccaagccg ctcattttct tacttttatc cttttaggtt gcctataaag ggggtcccca 12480
tcgaattaca agtggaatgc ttcacatggg accaaaaact ctggtgccgt cacttctgtg 12540
tgcttgcgga ctcagaatct ggtggacata tcactcactc tgggatggtg ggcatgggag 12600
tcagctgcac agtcacccgg gaagatggaa ccaatcgcag atagggctgc tagtgaacca 12660
atcacatgat gtcacccaga catcaggcat acccactagt gtgaaataga catcagaatt 12720
aagaaaaacg tagggtccaa gtggttcccc gttatggact cgctatctgt caaccagatc 12780
ttataccctg aagttcacct agatagcccg atagttacca ataagatagt agccatcctg 12840
gagtatgctc gagtccctca cgcttacagc ctggaggacc ctacactgtg tcagaacatc 12900
aagcaccgcc taaaaaacgg attttccaac caaatgatta taaacaatgt ggaagttggg 12960
aatgtcatca agtccaagct taggagttat ccggcccact ctcatattcc atatccaaat 13020
tgtaatcagg atttatttaa catagaagac aaagagtcaa cgaggaagat ccgtgaactc 13080
ctcaaaaagg ggaattcgct gtactccaaa gtcagtgata aggttttcca atgcttaagg 13140
gacactaact cacggcttgg cctaggctcc gaattgaggg aggacatcaa ggagaaagtt 13200
attaacttgg gagtttacat gcacagctcc cagtggtttg agccctttct gttttggttt 13260
acagtcaaga ctgagatgag gtcagtgatt aaatcacaaa cccatacttg ccataggagg 13320
agacacacac ctgtattctt cactggtagt tcagttgagt tgctaatctc tcgtgacctt 13380
gttgctataa tcagtaaaga gtctcaacat gtatattacc tgacatttga actggttttg 13440
atgtattgtg atgtcataga ggggaggtta atgacagaga ccgctatgac tattgatgct 13500
aggtatacag agcttctagg aagagtcaga tacatgtgga aactgataga tggtttcttc 13560
cctgcactcg ggaatccaac ttatcaaatt gtagccatgc tggagcctct ttcacttgct 13620
tacctgcagc tgagggatat aacagtagaa ctcagaggtg ctttccttaa ccactgcttt 13680
actgaaatac atgatgttct tgaccaaaac gggttttctg atgaaggtac ttatcatgag 13740
ttaactgaag ctctagatta cattttcata actgatgaca tacatctgac aggggagatt 13800
ttctcatttt tcagaagttt cggccacccc agacttgaag cagtaacggc tgctgaaaat 13860
gttaggaaat acatgaatca gcctaaagtc attgtgtatg agactctgat gaaaggtcat 13920
gccatatttt gtggaatcat aatcaacggc tatcgtgaca ggcacggagg cagttggcca 13980
ccgctgaccc tccccctgca tgctgcagac acaatccgga atgctcaagc ttcaggtgaa 14040
gggttaacac atgagcagtg cgttgataac tggaaatctt ttgctggagt gaaatttggc 14100
tgctttatgc ctcttagcct ggatagtgat ctgacaatgt acctaaagga caaggcactt 14160
gctgctctcc aaagggaatg ggattcagtt tacccgaaag agttcctgcg ttacgaccct 14220
cccaagggaa ccgggtcacg gaggcttgta gatgttttcc ttaatgattc gagctttgac 14280
ccatatgatg tgataatgta tgttgtaagt ggagcttacc tccatgaccc tgagttcaac 14340
ctgtcttaca gcctgaaaga aaaggagatc aaggaaacag gtagactttt tgctaaaatg 14400
acttacaaaa tgagggcatg ccaagtgatt gctgaaaatc taatctcaaa cgggattggc 14460
aaatatttta aggacaatgg gatggccaag gatgagcacg atttgactaa ggcactccac 14520
actctagctg tctcaggagt ccccaaagat ctcaaagaaa gtcacagggg ggggccagtc 14580
ttaaaaacct actcccgaag cccagtccac acaagtacca ggaacgtgag agcagcaaaa 14640
gggtttatag ggttccctca agtaattcgg caggaccaag acactgatca tccggagaat 14700
atggaagctt acgagacagt cagtgcattt atcacgactg atctcaagaa gtactgcctt 14760
aattggagat atgagaccat cagcttgttt gcacagaggc taaatgagat ttacggattg 14820
ccctcatttt tccagtggct gcataagagg cttgagacct ctgtcctgta tgtaagtgac 14880
cctcattgcc cccccgacct tgacgcccat atcccgttat ataaagtccc caatgatcaa 14940
atcttcatta agtaccctat gggaggtata gaagggtatt gtcagaagct gtggaccatc 15000
agcaccattc cctatctata cctggctgct tatgagagcg gagtaaggat tgcttcgtta 15060
gtgcaagggg acaatcagac catagccgta acaaaaaggg tacccagcac atggccctac 15120
aaccttaaga aacgggaagc tgctagagta actagagatt actttgtaat tcttaggcaa 15180
aggctacatg atattggcca tcacctcaag gcaaatgaga caattgtttc atcacatttt 15240
tttgtctatt caaaaggaat atattatgat gggctacttg tgtcccaatc actcaagagc 15300
atcgcaagat gtgtattctg gtcagagact atagttgatg aaacaagggc agcatgcagt 15360
aatattgcta caacaatggc taaaagcatc gagagaggtt atgaccgtta ccttgcatat 15420
tccctgaacg tcctaaaagt gatacagcaa attctgatct ctcttggctt cacaatcaat 15480
tcaaccatga cccgggatgt agtcataccc ctcctcacaa acaacgacct cttaataagg 15540
atggcactgt tgcccgctcc tattgggggg atgaattatc tgaatatgag caggctgttt 15600
gtcagaaaca tcggtgatcc agtaacatca tcaattgctg atctcaagag aatgattctc 15660
gcctcactaa tgcctgaaga gaccctccat caagtaatga cacaacaacc gggggactct 15720
tcattcctag actgggctag cgacccttac tcagcaaatc ttgtatgtgt ccagagcatc 15780
actagactcc tcaagaacat aactgcaagg tttgtcctga tccatagtcc aaacccaatg 15840
ttaaaaggat tattccatga tgacagtaaa gaagaggacg agggactggc ggcattcctc 15900
atggacaggc atattatagt acctagggca gctcatgaaa tcctggatca tagtgtcaca 15960
ggggcaagag agtctattgc aggcatgctg gataccacaa aaggcttgat tcgagccagc 16020
atgaggaagg gggggttaac ctctcgagtg ataaccagat tgtccaatta tgactatgaa 16080
caattcagag cagggatggt gctattgaca ggaagaaaga gaaatgtcct cattgacaaa 16140
gagtcatgtt cagtgcagct ggcgagagct ctaagaagcc atatgtgggc gaggctagct 16200
cgaggacggc ctatttacgg ccttgaggtc cctgatgtac tagaatctat gcgaggccac 16260
cttattcggc gtcatgagac atgtgtcatc tgcgagtgtg gatcagtcaa ctacggatgg 16320
ttttttgtcc cctcgggttg ccaactggat gatattgaca aggaaacatc atccttgaga 16380
gtcccatata ttggttctac cactgatgag agaacagaca tgaagcttgc cttcgtaaga 16440
gccccaagtc gatccttgcg atctgctgtt agaatagcaa cagtgtactc atgggcttac 16500
ggtgatgatg atagctcttg gaacgaagcc tggttgttgg ctaggcaaag ggccaatgtg 16560
agcctggagg agctaagggt gatcactccc atctcaactt cgactaattt agcgcatagg 16620
ttgagggatc gtagcactca agtgaaatac tcaggtacat cccttgtccg agtggcgagg 16680
tataccacaa tctccaacga caatctctca tttgtcatat cagataagaa ggttgatact 16740
aactttatat accaacaagg aatgcttcta gggttgggtg ttttagaaac attgtttcga 16800
ctcgagaaag ataccggatc atctaacacg gtattacatc ttcacgtcga aacagattgt 16860
tgcgtgatcc cgatgataga tcatcccagg atacccagct cccgcaagct agagctgagg 16920
gcagagctat gtaccaaccc attgatatat gataatgcac ctttaattga cagagatgca 16980
acaaggctat acacccagag ccataggagg caccttgtgg aatttgttac atggtccaca 17040
ccccaactat atcacatttt agctaagtcc acagcactat ctatgattga cctggtaaca 17100
aaatttgaga aggaccatat gaatgaaatt tcagctctca taggggatga cgatatcaat 17160
agtttcataa ctgagtttct gctcatagag ccaagattat tcactatcta cttgggccag 17220
tgtgcggcca tcaattgggc atttgatgta cattatcata gaccatcagg gaaatatcag 17280
atgggtgagc tgttgtcatc gttcctttct agaatgagca aaggagtgtt taaggtgctt 17340
gtcaatgctc taagccaccc aaagatctac aagaaattct ggcattgtgg tattatagag 17400
cctatccatg gtccttcact tgatgctcaa aacttgcaca caactgtgtg caacatggtt 17460
tacacatgct atatgaccta cctcgacctg ttgttgaatg aagagttaga agagttcaca 17520
tttctcttgt gtgaaagcga cgaggatgta gtaccggaca gattcgacaa catccaggca 17580
aaacacttat gtgttctggc agatttgtac tgtcaaccag ggacctgccc accaattcga 17640
ggtctaagac cggtagagaa atgtgcagtt ctaaccgacc atatcaaggc agaggctatg 17700
ttatctccag caggatcttc gtggaacata aatccaatta ttgtagacca ttactcatgc 17760
tctctgactt atctccggcg aggatcgatc aaacagataa gattgagagt tgatccagga 17820
ttcattttcg acgccctcgc tgaggtaaat gtcagtcagc caaagatcgg cagcaacaac 17880
atctcaaata tgagcatcaa ggctttcaga cccccacacg atgatgttgc aaaattgctc 17940
aaagatatca acacaagcaa gcacaatctt cccatttcag ggggcaatct cgccaattat 18000
gaaatccatg ctttccgcag aatcgggttg aactcatctg cttgctacaa agctgttgag 18060
atatcaacat taattaggag atgccttgag ccaggggagg acggcttgtt cttgggtgag 18120
ggatcgggtt ctatgttgat cacttataaa gagatactta aactaaacaa gtgcttctat 18180
aatagtgggg tttccgccaa ttctagatct ggtcaaaggg aattagcacc ctatccctcc 18240
gaagttggcc ttgtcgaaca cagaatggga gtaggtaata ttgtcaaagt gctctttaac 18300
gggaggcccg aagtcacgtg ggtaggcagt gtagattgct tcaatttcat agttagtaat 18360
atccctacct ctagtgtggg gtttatccat tcagatatag agaccttgcc tgacaaagat 18420
actatagaga agctagagga attggcagcc atcttatcga tggctctgct cctgggcaaa 18480
ataggatcaa tactggtgat taagcttatg cctttcagcg gggattttgt tcagggattt 18540
ataagttatg tagggtctca ttatagagaa gtgaaccttg tataccctag atacagcaac 18600
ttcatctcta ctgaatctta tttggttatg acagatctca aggctaaccg gctaatgaat 18660
cctgaaaaga ttaagcagca gataattgaa tcatctgtga ggacttcacc tggacttata 18720
ggtcacatcc tatccattaa gcaactaagc tgcatacaag caattgtggg agacgcagtt 18780
agtagaggtg atatcaatcc tactctgaaa aaacttacac ctatagagca ggtgctgatc 18840
aattgcgggt tggcaattaa cggacctaag ctgtgcaaag aattgatcca ccatgatgtt 18900
gcctcagggc aagatggatt gcttaattct atactcatcc tctacaggga gttggcaaga 18960
ttcaaagaca accaaagaag tcaacaaggg atgttccacg cttaccccgt attggtaagt 19020
agcaggcaac gagaacttat atctaggatc acccgcaaat tctgggggca cattcttctt 19080
tactccggga acaaaaagtt gataaataag tttatccaga atctcaagtc cggctatctg 19140
atactagact tacaccagaa tatcttcgtt aagaatctat ccaagtcaga gaaacagatt 19200
attatgacgg ggggtttgaa acgtgagtgg gtttttaagg taacagtcaa ggagaccaaa 19260
gaatggtata agttagtcgg atacagtgcc ctgattaagg actaattggt tgaactccgg 19320
aaccctaatc ctgccctagg tggttaggca ttatttgcaa tatattaaag aaaactttga 19380
aaatacgaag tttctattcc cagctttgtc tggtggccgg catggtccca gcctcctcgc 19440
tggcgccggc tgggcaacat tccgagggga ccgtcccctc ggtaatggcg aatgggacgc 19500
ggccgatccg gctgctaaca aagcccgaaa ggaagctgag ttggctgctg ccaccgctga 19560
gcaataacta gcataacccc ttggggcctc taaacgggtc ttgaggggtt ttttgctgaa 19620
aggaggaact atatccggat gcggccgcgg gccctatggt acccagcttt tgttcccttt 19680
agtgagggtt aattccgagc ttggcgtaat catggtcata gctgtttcct gtgtgaaatt 19740
gttatccgct cacaattcca cacaacatag gagccggaag cataaagtgt aaagcctggg 19800
gtgcctaatg agtgaggtaa ctcacattaa ttgcgttgcg ctcactgccc gctttccagt 19860
cgggaaacct gtcgtgccag ctgcattaat gaatcggcca acgcgcgggg agaggcggtt 19920
tgcgtattgg gcgctcttcc gcttcctcgc tcactgactc gctgcgctcg gtcgttcggc 19980
tgcggcgagc ggtatcagct cactcaaagg cggtaatacg gttatccaca gaatcagggg 20040
ataacgcagg aaagaacatg tgagcaaaag gccagcaaaa ggccaggaac cgtaaaaagg 20100
ccgcgttgct ggcgtttttc cataggctcg gcccccctga cgagcatcac aaaaatcgac 20160
gctcaagtca gaggtggcga aacccgacag gactataaag ataccaggcg ttcccccctg 20220
gaagctccct cgtgcgctct cctgttccga ccctgccgct taccggatac ctgtccgcct 20280
ttctcccttc gggaagcgtg gcgctttctc aatgctcacg ctgtaggtat ctcagttcgg 20340
tgtaggtcgt tcgctccaag ctgggctgtg tgcacgaacc ccccgttcag cccgaccgct 20400
gcgccttatc cggtaactat cgtcttgagt ccaacccggt aagacacgac ttatcgccac 20460
tggcagcagc cactggtaac aggattagca gagcgaggta tgtaggcggt gctacagagt 20520
tcttgaagtg gtggcctaac tacggctaca ctagaaggac agtatttggt atctgcgctc 20580
tgctgaagcc agttaccttc ggaaaaagag ttggtagctc ttgatccggc aaacaaacca 20640
ccgctggtag cggtggtttt tttgtttgca agcagcagat tacgcgcaga aaaaaaggat 20700
ctcaagaaga tcctttgatc ttttctacgg ggtctgacgc tcagtggaac gaaaactcac 20760
gttaagggat tttggtcatg agattatcaa aaaggatctt cacctagatc cttttaaatt 20820
aaaaatgaag ttttaaatca atctaaagta tatatgagta aacttggtct gacagttacc 20880
aatgcttaat cagtgaggca cctatctcag cgatctgtct atttcgttca tccatagttg 20940
cctgactgcc cgtcgtgtag ataactacga tacgggaggg cttaccatct ggccccagtg 21000
ctgcaatgat accgcgagac ccacgctcac cggctccaga tttatcagca ataaaccagc 21060
cagccggaag ggccgagcgc agaagtggtc ctgcaacttt atccgcctcc atccagtcta 21120
ttaattgttg ccgggaagct agagtaagta gttcgccagt taatagtttg cgcaacgttg 21180
ttgccattgc tacaggcatc gtggtgtcac gctcgtcgtt tggtatggct tcattcagct 21240
ccggttccca acgatcaagg cgagttacat gatcccccat gttgtgaaaa aaagcggtta 21300
gctccttcgg tcctccgatc gttgtcagaa gtaagttggc cgcagtgtta tcactcatgc 21360
ttatggcagc actgcataat tctcttactg tcatgccatc cgtaagatgc ttttctgtga 21420
ctggtgagta ctcaaccaag tcattctgag aatagtgtat gcggcgaccg agttgctctt 21480
gcccggcgtc aatacgggat aataccgcgc cacatagcag aactttaaaa gtgctcatca 21540
ttggaaaacg ttcttcgggg cgaaaactct caaggatctt accgctgttg agatccagtt 21600
cgatgtaacc cactcgtgca cccaactgat cttcagcatc ttttactttc accagcgttt 21660
ctgggtgagc aaaaacagga aggcaaaatg ccgcaaaaaa gggaataagg gcgacacgga 21720
aatgttgaat actcatactc ttcctttttc aatattattg aagcatttat cagggttatt 21780
gtctcatgag cggatacata tttgaatgta tttagaaaaa taaacaaata ggggttccgc 21840
gcacatttcc ccgaaaagtg ccacctgaaa ttgtaaacgt taatattttg ttaaaattcg 21900
cgttaaattt ttgttaaatc agctcatttt ttaaccaata ggccgaaatc ggcaaaatcc 21960
cttataaatc aaaagaatag accgagatag ggttgagtgt tgttccagtt tggaacaaga 22020
gtccactatt aaagaacgtg gactccaacg tcaaagggcg aaaaaccgtc tatcagggcg 22080
atggcccact acgtgaacca tcaccctaat caagtttttt ggggtcgagg tgccgtaaag 22140
cactaaatcg gaaccctaaa gggagccccc gatttagagc ttgacgggga aagccggcga 22200
acgtggcgag aaaggaaggg aagaaagcga aaggagcggg cgctagggcg ctggcaagtg 22260
tagcggtcac gctgcgcgta accaccacac ccgccgcgct taatgcgccg ctacagggcg 22320
cgtcccattc gccattcagg ctgcgcaact gttgggaagg gcgatcggtg cgggcctctt 22380
cgctattacg ccagccaccg cggtg 22405
<210> 11
<211> 22405
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 质粒MeV-mNP+GPC
<400> 11
gcggccgcta atacgactca ctatagggcc aactttgttt ggtctgatga gtccgtgagg 60
acgaaacccg gagtcccggg tcaccaaaca aagttgggta aggatagttc aatcaatgat 120
catcttctag tgcacttagg attcaagatc ctattatcag ggacaagagc aggattaggg 180
atatccgaga tggccacact tttaaggagc ttagcattgt tcaaaagaaa caaggacaaa 240
ccacccatta catcaggatc cggtggagcc atcagaggaa tcaaacacat tattatagta 300
ccaatccctg gagattcctc aattaccact cgatccagac ttctggaccg gttggtgagg 360
ttaattggaa acccggatgt gagcgggccc aaactaacag gggcactaat aggtatatta 420
tccttatttg tggagtctcc aggtcaattg attcagagga tcaccgatga ccctgacgtt 480
agcataaggc tgttagaggt tgtccagagt gaccagtcac aatctggcct taccttcgca 540
tcaagaggta ccaacatgga ggatgaggcg gaccaatact tttcacatga tgatccaatt 600
agtagtgatc aatccaggtt cggatggttc gggaacaagg aaatctcaga tattgaagtg 660
caagaccctg agggattcaa catgattctg ggtaccatcc tagcccaaat ttgggtcttg 720
ctcgcaaagg cggttacggc cccagacacg gcagctgatt cggagctaag aaggtggata 780
aagtacaccc aacaaagaag ggtagttggt gaatttagat tggagagaaa atggttggat 840
gtggtgagga acaggattgc cgaggacctc tccttacgcc gattcatggt cgctctaatc 900
ctggatatca agagaacacc cggaaacaaa cccaggattg ctgaaatgat atgtgacatt 960
gatacatata tcgtagaggc aggattagcc agttttatcc tgactattaa gtttgggata 1020
gaaactatgt atcctgctct tggactgcat gaatttgctg gtgagttatc cacacttgag 1080
tccttgatga acctttacca gcaaatgggg gaaactgcac cctacatggt aatcctggag 1140
aactcaattc agaacaagtt cagtgcagga tcataccctc tgctctggag ctatgccatg 1200
ggagtaggag tggaacttga aaactccatg ggaggtttga actttggccg atcttacttt 1260
gatccagcat attttagatt agggcaagag atggtaagga ggtcagctgg aaaggtcagt 1320
tccacattgg catctgaact cggtatcact gccgaggatg caaggcttgt ttcagagatt 1380
gcaatgcata ctactgagga caagatcagt agagcggttg gacccagaca agcccaagta 1440
tcatttctac acggtgatca aagtgagaat gagctaccga gattgggggg caaggaagat 1500
aggagggtca aacagagtcg aggagaagcc agggagagct acagagaaac cgggcccagc 1560
agagcaagtg atgcgagagc tgcccatctt ccaaccggca cacccctaga cattgacact 1620
gcaacggagt ccagccaaga tccgcaggac agtcgaaggt cagctgacgc cctgcttagg 1680
ctgcaagcca tggcaggaat ctcggaagaa caaggctcag acacggacac ccctatagtg 1740
tacaatgaca gaaatcttct agactaggtg cgagaggccg agggccagaa caacatccgc 1800
ctaccatcca tcattgttat aaaaaactta ggaaccaggt ccacacagcc gccagcccat 1860
caaccatcca ctcccacgat tggagccaat ggcagaagag caggcacgcc atgtcaaaaa 1920
cggactggaa tgcatccggg ctctcaaggc cgagcccatc ggctcactgg ccatcgagga 1980
agctatggca gcatggtcag aaatatcaga caacccagga caggagcgag ccacctgcag 2040
ggaagagaag gcaggcagtt cgggtctcag caaaccatgc ctctcagcaa ttggatcaac 2100
tgaaggcggt gcacctcgca tccgcggtca gggacctgga gagagcgatg acgacgctga 2160
aactttggga atccccccaa gaaatctcca ggcatcaagc actgggttac agtgttatta 2220
cgtttatgat cacagcggtg aagcggttaa gggaatccaa gatgctgact ctatcatggt 2280
tcaatcaggc cttgatggtg atagcaccct ctcaggagga gacaatgaat ctgaaaacag 2340
cgatgtggat attggcgaac ctgataccga gggatatgct atcactgacc ggggatctgc 2400
tcccatctct atggggttca gggcttctga tgttgaaact gcagaaggag gggagatcca 2460
cgagctcctg agactccaat ccagaggcaa caactttccg aagcttggga aaactctcaa 2520
tgttcctccg cccccggacc ccggtagggc cagcacttcc gggacaccca ttaaaaaggg 2580
cacagacgcg agattagcct catttggaac ggagatcgcg tctttattga caggtggtgc 2640
aacccaatgt gctcgaaagt caccctcgga accatcaggg ccaggtgcac ctgcggggaa 2700
tgtccccgag tgtgtgagca atgccgcact gatacaggag tggacacccg aatctggtac 2760
cacaatctcc ccgagatccc agaataatga agaaggggga gactattatg atgatgagct 2820
gttctctgat gtccaagata ttaaaacagc cttggccaaa atacacgagg ataatcagaa 2880
gataatctcc aagctagaat cactgctgtt attgaaggga gaagttgagt caattaagaa 2940
gcagatcaac aggcaaaata tcagcatatc caccctggaa ggacacctct caagcatcat 3000
gatcgccatt cctggacttg ggaaggatcc caacgacccc actgcagatg tcgaaatcaa 3060
tcccgacttg aaacccatca taggcagaga ttcaggccga gcactggccg aagttctcaa 3120
gaaacccgtt gccagccgac aactccaagg aatgacaaat ggacggacca gttccagagg 3180
acagctgctg aaggaatttc agctaaagcc gatcgggaaa aagatgagct cagccgtcgg 3240
gtttgttcct gacaccggcc ctgcatcacg cagtgtaatc cgctccatta taaaatccag 3300
ccggctagag gaggatcgga agcgttacct gatgactctc cttgatgata tcaaaggagc 3360
caatgatctt gccaagttcc accagatgct gatgaagata ataatgaagt agctacagct 3420
caacttacct gccaacccca tgccagtcga cccaactagc ctaccctcca tcattgttat 3480
aaaaaactta ggaaccaggt ccacacagcc gccagcccat caacgcgtac gatgagtgcc 3540
agcaaagaaa tcaagagctt cctgtggacc cagagtctgc ggagggaact gagcggatac 3600
tgtagcaaca tcaaactgca ggtggtcaag gacgctcagg cactgctgca tgggctggac 3660
ttctccgagg tgtctaatgt gcagcggctg atgcggaaag aacggaggga cgataatgac 3720
ctgaagcgac tgcgcgacct gaaccaggca gtgaacaatc tggtcgagct gaagagcacc 3780
cagcagaaat caatcctgcg ggtcgggaca ctgacatctg acgacctgct gatcctggct 3840
gcagacctgg agaagctgaa atcgaaagtg atccgcaccg aaaggccact gtccgccggg 3900
gtctacatgg gcaatctgtc ttcccagcag ctggaccaga ggcgggctct gctgaacatg 3960
attgggatgt ccggaggaaa tcagggagct agagccggga gggacggagt cgtgcgggtc 4020
tgggacgtga agaatgccga actgctgaac aaccagttcg ggaccatgcc aagtctgaca 4080
ctggcatgcc tgactaaaca gggccaggtg gatctgaatg atgcagtcca ggctctgacc 4140
gacctgggcc tgatctacac cgccaagtac cccaatacta gcgacctgga tagactgacc 4200
cagagccacc ccatcctgaa catgatcgac actaagaagt cctcactgaa catcagtggc 4260
tataatttct ccctgggggc agcagtcaag gctggcgcat gcatgctgga cggcgggaat 4320
atgctggaaa ccatcaaagt gtctccccag accatggatg gcatcctgaa atctattctg 4380
aaagtcaaga aggccctggg aatgtttatt tcagacaccc ccggcgagag gaatccatat 4440
gagaacattc tgtataagat ttgcctgagt ggcgacgggt ggccatacat tgcaagccgg 4500
acatcaatta ccggaagagc ttgggagaat acagtcgtgg acctggaaag cgacggcaag 4560
ccccagaagg ccgactcaaa caactcctca aagagtctgc agtcagctgg cttcacagca 4620
gggctgactt actcccagct gatgacactg aaggacgcaa tgctgcagct ggacccaaac 4680
gctaagacat ggatggccat cgaggcccgg ccagaagatc cagtggaaat cgcactgtat 4740
cagccatcat ccggatgcta tatccatttc ttccgggaac caactgatct gaagcagttc 4800
aagcaggatg caaagtactc ccacggaatc gatgtcaccg atctgttcgc aacccagcca 4860
ggactgacat cagccgtcat cgatgccctg cctaggaaca tggtcattac ttgccagggc 4920
tccgacgata ttaggaagct gctggagagc cagggacgga aggatatcaa actgatcgat 4980
attgccctgt ctaagactga tagccggaaa tatgagaatg cagtctggga tcagtacaag 5040
gacctgtgcc atatgcatac cggagtggtc gtcgagaaga agaagagggg cggaaaggaa 5100
gagatcacac cccactgtgc cctgatggat tgcatcatgt tcgacgcagc cgtgtccggg 5160
ggcctgaaca cctcagtcct gagggctgtc ctgccaagag atatggtgtt tagaacttca 5220
accccaagag tcgtcctgta attcgaacta cagctcaact tacctgccaa ccccatgcca 5280
gtcgacccaa ctagtacaac ctaaatccat tataaaaaac ttaggaacca ggtccacaca 5340
gccgccagcc catcaaccat ccactcccac gattggaggc cggccatggg ccagattgtc 5400
acattctttc aggaagtgcc acacgtcatt gaggaggtca tgaacatcgt gctgattgct 5460
ctgtcagtgc tggcagtgct gaaaggactg tacaacttcg ctacctgtgg actggtggga 5520
ctggtcacat tcctgctgct gtgcggcaga agttgcacta cctcactgta caaaggagtg 5580
tacgagctgc agactctgga actgaacatg gagacactga atatgacaat gcctctgagc 5640
tgcaccaaga ataatagcca ccactatatc atggtcggga acgaaaccgg cctggaactg 5700
accctgacaa acaccagcat cattaaccac aagttctgca atctgagcga cgctcacaag 5760
aagaacctgt atgaccacgc tctgatgtcc atcatcagta cctttcacct gtccatcccc 5820
aatttcaacc agtacgaggc aatgtcatgc gacttcaacg ggggcaagat cagtgtccag 5880
tacaacctga gccactccta cgccggcgac gcagccaacc actgcggaac tgtcgccaat 5940
ggcgtgctgc agacattcat gaggatggca tgggggggat cttacatcgc actggatagc 6000
ggcaggggca attgggattg catcatgact tcctatcagt atctgattat ccagaatact 6060
acatgggagg atcattgcca gttcagtcgg cccagcccta ttggatatct ggggctgctg 6120
tcacagagaa cacgggatat ctatatttca agacgcctgc tgggcacatt cacttggaca 6180
ctgtcagaca gtgagggcaa ggatactcca gggggctact gcctgacacg atggatgctg 6240
atcgaagcag agctgaaatg cttcggcaat accgcagtgg ccaagtgcaa cgagaaacac 6300
gacgaggagt tctgcgacat gctgaggctg ttcgacttca acaaacaggc tatccagaga 6360
ctgaaggcag aagcccagat gtcaatccag ctgatcaaca aggcagtgaa cgccctgatc 6420
aacgaccagc tgatcatgaa gaaccacctg agagacatta tgggcatccc ctactgtaat 6480
tacagcaagt attggtacct gaaccacact acaaccggga gaacatccct gcccaagtgc 6540
tggctggtca gcaatgggag ttatctgaat gaaacccatt tcagcgacga tatcgaacag 6600
caggctgaca acatgatcac agagatgctg cagaaagagt acatggaaag acagggcaag 6660
acaccactgg gactggtcga tctgttcgtc ttctccacta gcttctatct gatttccatc 6720
ttcctgcacc tggtgaagat ccccactcat aggcacattg tcggcaagag ttgccctaaa 6780
ccccataggc tgaatcacat ggggatttgt agttgcggcc tgtataagca gcctggcgtg 6840
cctgtgaagt ggaagagatg agcgcgcagc gcttagacgt ctcgcgatcg atactagtac 6900
aacctaaatc cattataaaa aacttaggag caaagtgatt gcctcccaag gtccacaatg 6960
acagagacct acgacttcga caagtcggca tgggacatca aagggtcgat cgctccgata 7020
caacccacca cctacagtga tggcaggctg gtgccccagg tcagagtcat agatcctggt 7080
ctaggcgaca ggaaggatga atgctttatg tacatgtttc tgctgggggt tgttgaggac 7140
agcgattccc tagggcctcc aatcgggcga gcatttgggt tcctgccctt aggtgttggc 7200
agatccacag caaagcccga aaaactcctc aaagaggcca ctgagcttga catagttgtt 7260
agacgtacag cagggctcaa tgaaaaactg gtgttctaca acaacacccc actaactctc 7320
ctcacacctt ggagaaaggt cctaacaaca gggagtgtct tcaacgcaaa ccaagtgtgc 7380
aatgcggtta atctgatacc gctcgatacc ccgcagaggt tccgtgttgt ttatatgagc 7440
atcacccgtc tttcggataa cgggtattac accgttccta gaagaatgct ggaattcaga 7500
tcggtcaatg cagtggcctt caacctgctg gtgaccctta ggattgacaa ggcgataggc 7560
cctgggaaga tcatcgacaa tacagagcaa cttcctgagg caacatttat ggtccacatc 7620
gggaacttca ggagaaagaa gagtgaagtc tactctgccg attattgcaa aatgaaaatc 7680
gaaaagatgg gcctggtttt tgcacttggt gggatagggg gcaccagtct tcacattaga 7740
agcacaggca aaatgagcaa gactctccat gcacaactcg ggttcaagaa gaccttatgt 7800
tacccgctga tggatatcaa tgaagacctt aatcgattac tctggaggag cagatgcaag 7860
atagtaagaa tccaggcagt tttgcagcca tcagttcctc aagaattccg catttacgac 7920
gacgtgatca taaatgatga ccaaggacta ttcaaagttc tgtagaccgt agtgcccagc 7980
aatgcccgaa aacgaccccc ctcacaatga cagccagaag gcccggacaa aaaagccccc 8040
tccgaaagac tccacggacc aagcgagagg ccagccagca gccgacggca agcgcgaaca 8100
ccaggcggcc ccagcacaga acagccctga cacaaggcca ccaccagcca ccccaatctg 8160
catcctcctc gtgggacccc cgaggaccaa cccccaaggc tgcccccgat ccaaaccacc 8220
aaccgcatcc ccaccacccc cgggaaagaa acccccagca attggaaggc ccctccccct 8280
cttcctcaac acaagaactc cacaaccgaa ccgcacaagc gaccgaggtg acccaaccgc 8340
aggcatccga ctccctagac agatcctctc tccccggcaa actaaacaaa acttagggcc 8400
aaggaacata cacacccaac agaacccaga ccccggccca cggcgccgcg cccccaaccc 8460
ccgacaacca gagggagccc ccaaccaatc ccgccggctc ccccggtgcc cacaggcagg 8520
gacaccaacc cccgaacaga cccagcaccc aaccatcgac aatccaagac gggggggccc 8580
ccccaaaaaa aggcccccag gggccgacag ccagcaccgc gaggaagccc acccacccca 8640
cacacgacca cggcaaccaa accagaaccc agaccaccct gggccaccag ctcccagact 8700
cggccatcac cccgcagaaa ggaaaggcca caacccgcgc accccagccc cgatccggcg 8760
gggagccacc caacccgaac cagcacccaa gagcgatccc cgaaggaccc ccgaaccgca 8820
aaggacatca gtatcccaca gcctctccaa gtcccccggt ctcctcctct tctcgaaggg 8880
accaaaagat caatccacca cacccgacga cactcaactc cccaccccta aaggagacac 8940
cgggaatccc agaatcaaga ctcatccaat gtccatcatg ggtctcaagg tgaacgtctc 9000
tgccatattc atggcagtac tgttaactct ccaaacaccc accggtcaaa tccattgggg 9060
caatctctct aagatagggg tggtaggaat aggaagtgca agctacaaag ttatgactcg 9120
ttccagccat caatcattag tcataaaatt aatgcccaat ataactctcc tcaataactg 9180
cacgagggta gagattgcag aatacaggag actactgaga acagttttgg aaccaattag 9240
agatgcactt aatgcaatga cccagaatat aagaccggtt cagagtgtag cttcaagtag 9300
gagacacaag agatttgcgg gagtagtcct ggcaggtgcg gccctaggcg ttgccacagc 9360
tgctcagata acagccggca ttgcacttca ccagtccatg ctgaactctc aagccatcga 9420
caatctgaga gcgagcctgg aaactactaa tcaggcaatt gagacaatca gacaagcagg 9480
gcaggagatg atattggctg ttcagggtgt ccaagactac atcaataatg agctgatacc 9540
gtctatgaac caactatctt gtgatttaat cggccagaag ctcgggctca aattgctcag 9600
atactataca gaaatcctgt cattatttgg ccccagttta cgggacccca tatctgcgga 9660
gatatctatc caggctttga gctatgcgct tggaggagac atcaataagg tgttagaaaa 9720
gctcggatac agtggaggtg atttactggg catcttagag agcggaggaa taaaggcccg 9780
gataactcac gtcgacacag agtcctactt cattgtcctc agtatagcct atccgacgct 9840
gtccgagatt aagggggtga ttgtccaccg gctagagggg gtctcgtaca acataggctc 9900
tcaagagtgg tataccactg tgcccaagta tgttgcaacc caagggtacc ttatctcgaa 9960
ttttgatgag tcatcgtgta ctttcatgcc agaggggact gtgtgcagcc aaaatgcctt 10020
gtacccgatg agtcctctgc tccaagaatg cctccggggg tacaccaagt cctgtgctcg 10080
tacactcgta tccgggtctt ttgggaaccg gttcatttta tcacaaggga acctaatagc 10140
caattgtgca tcaatccttt gcaagtgtta cacaacagga acgatcatta atcaagaccc 10200
tgacaagatc ctaacataca ttgctgccga tcactgcccg gtagtcgagg tgaacggcgt 10260
gaccatccaa gtcgggagca ggaggtatcc agacgctgtg tacttgcaca gaattgacct 10320
cggtcctccc atatcattgg agaggttgga cgtagggaca aatctgggga atgcaattgc 10380
taagttggag gatgccaagg aattgttgga gtcatcggac cagatattga ggagtatgaa 10440
aggtttatcg agcactagca tagtctacat cctgattgca gtgtgtcttg gagggttgat 10500
agggatcccc gctttaatat gttgctgcag ggggcgttgt aacaaaaagg gagaacaagt 10560
tggtatgtca agaccaggcc taaagcctga tcttacggga acatcaaaat cctatgtaag 10620
gtcgctctga tcctctacaa ctcttgaaac acaaatgtcc cacaagtctc ctcttcgtca 10680
tcaagcaacc accgcaccca gcatcaagcc cacctgaaat tatctccggc ttccctctgg 10740
ccgaacaata tcggtagtta atcaaaactt agggtgcaag atcatccaca atgtcaccac 10800
aacgagaccg gataaatgcc ttctacaaag ataaccccca tcccaaggga agtaggatag 10860
tcattaacag agaacatctt atgattgata gaccttatgt tttgctggct gttctgtttg 10920
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ccatctacac cgcagagatc cataaaagcc tcagcaccaa tctagatgta actaactcaa 11040
tcgagcatca ggtcaaggac gtgctgacac cactcttcaa aatcatcggt gatgaagtgg 11100
gcctgaggac acctcagaga ttcactgacc tagtgaaatt aatctctgac aagattaaat 11160
tccttaatcc ggatagggag tacgacttca gagatctcac ttggtgtatc aacccgccag 11220
agagaatcaa attggattat gatcaatact gtgcagatgt ggctgctgaa gagctcatga 11280
atgcattggt gaactcaact ctactggaga ccagaacaac caatcagttc ctagctgtct 11340
caaagggaaa ctgctcaggg cccactacaa tcagaggtca attctcaaac atgtcgctgt 11400
ccctgttaga cttgtattta ggtcgaggtt acaatgtgtc atctatagtc actatgacat 11460
cccagggaat gtatggggga acttacctag tggaaaagcc taatctgagc agcaaaaggt 11520
cagagttgtc acaactgagc atgtaccgag tgtttgaagt aggtgttatc agaaatccgg 11580
gtttgggggc tccggtgttc catatgacaa actatcttga gcaaccagtc agtaatgatc 11640
tcagcaactg tatggtggct ttgggggagc tcaaactcgc agccctttgt cacggggaag 11700
attctatcac aattccctat cagggatcag ggaaaggtgt cagcttccag ctcgtcaagc 11760
taggtgtctg gaaatcccca accgacatgc aatcctgggt ccccttatca acggatgatc 11820
cagtgataga caggctttac ctctcatctc acagaggtgt tatcgctgac aatcaagcaa 11880
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aggcgtgtaa gggtaaaatc caagcactct gcgagaatcc cgagtgggca ccattgaagg 12000
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ctgtcccaat taaggaagca ggcgaagact gccatgcccc aacataccta cctgcggagg 12300
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atgttttggc aacctacgat acttccaggg ttgaacatgc tgtggtttat tacgtttaca 12420
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tcagctgcac agtcacccgg gaagatggaa ccaatcgcag atagggctgc tagtgaacca 12660
atcacatgat gtcacccaga catcaggcat acccactagt gtgaaataga catcagaatt 12720
aagaaaaacg tagggtccaa gtggttcccc gttatggact cgctatctgt caaccagatc 12780
ttataccctg aagttcacct agatagcccg atagttacca ataagatagt agccatcctg 12840
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aagcaccgcc taaaaaacgg attttccaac caaatgatta taaacaatgt ggaagttggg 12960
aatgtcatca agtccaagct taggagttat ccggcccact ctcatattcc atatccaaat 13020
tgtaatcagg atttatttaa catagaagac aaagagtcaa cgaggaagat ccgtgaactc 13080
ctcaaaaagg ggaattcgct gtactccaaa gtcagtgata aggttttcca atgcttaagg 13140
gacactaact cacggcttgg cctaggctcc gaattgaggg aggacatcaa ggagaaagtt 13200
attaacttgg gagtttacat gcacagctcc cagtggtttg agccctttct gttttggttt 13260
acagtcaaga ctgagatgag gtcagtgatt aaatcacaaa cccatacttg ccataggagg 13320
agacacacac ctgtattctt cactggtagt tcagttgagt tgctaatctc tcgtgacctt 13380
gttgctataa tcagtaaaga gtctcaacat gtatattacc tgacatttga actggttttg 13440
atgtattgtg atgtcataga ggggaggtta atgacagaga ccgctatgac tattgatgct 13500
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cctgcactcg ggaatccaac ttatcaaatt gtagccatgc tggagcctct ttcacttgct 13620
tacctgcagc tgagggatat aacagtagaa ctcagaggtg ctttccttaa ccactgcttt 13680
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cctcattgcc cccccgacct tgacgcccat atcccgttat ataaagtccc caatgatcaa 14940
atcttcatta agtaccctat gggaggtata gaagggtatt gtcagaagct gtggaccatc 15000
agcaccattc cctatctata cctggctgct tatgagagcg gagtaaggat tgcttcgtta 15060
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aggctacatg atattggcca tcacctcaag gcaaatgaga caattgtttc atcacatttt 15240
tttgtctatt caaaaggaat atattatgat gggctacttg tgtcccaatc actcaagagc 15300
atcgcaagat gtgtattctg gtcagagact atagttgatg aaacaagggc agcatgcagt 15360
aatattgcta caacaatggc taaaagcatc gagagaggtt atgaccgtta ccttgcatat 15420
tccctgaacg tcctaaaagt gatacagcaa attctgatct ctcttggctt cacaatcaat 15480
tcaaccatga cccgggatgt agtcataccc ctcctcacaa acaacgacct cttaataagg 15540
atggcactgt tgcccgctcc tattgggggg atgaattatc tgaatatgag caggctgttt 15600
gtcagaaaca tcggtgatcc agtaacatca tcaattgctg atctcaagag aatgattctc 15660
gcctcactaa tgcctgaaga gaccctccat caagtaatga cacaacaacc gggggactct 15720
tcattcctag actgggctag cgacccttac tcagcaaatc ttgtatgtgt ccagagcatc 15780
actagactcc tcaagaacat aactgcaagg tttgtcctga tccatagtcc aaacccaatg 15840
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ggggcaagag agtctattgc aggcatgctg gataccacaa aaggcttgat tcgagccagc 16020
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gtcccatata ttggttctac cactgatgag agaacagaca tgaagcttgc cttcgtaaga 16440
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tataccacaa tctccaacga caatctctca tttgtcatat cagataagaa ggttgatact 16740
aactttatat accaacaagg aatgcttcta gggttgggtg ttttagaaac attgtttcga 16800
ctcgagaaag ataccggatc atctaacacg gtattacatc ttcacgtcga aacagattgt 16860
tgcgtgatcc cgatgataga tcatcccagg atacccagct cccgcaagct agagctgagg 16920
gcagagctat gtaccaaccc attgatatat gataatgcac ctttaattga cagagatgca 16980
acaaggctat acacccagag ccataggagg caccttgtgg aatttgttac atggtccaca 17040
ccccaactat atcacatttt agctaagtcc acagcactat ctatgattga cctggtaaca 17100
aaatttgaga aggaccatat gaatgaaatt tcagctctca taggggatga cgatatcaat 17160
agtttcataa ctgagtttct gctcatagag ccaagattat tcactatcta cttgggccag 17220
tgtgcggcca tcaattgggc atttgatgta cattatcata gaccatcagg gaaatatcag 17280
atgggtgagc tgttgtcatc gttcctttct agaatgagca aaggagtgtt taaggtgctt 17340
gtcaatgctc taagccaccc aaagatctac aagaaattct ggcattgtgg tattatagag 17400
cctatccatg gtccttcact tgatgctcaa aacttgcaca caactgtgtg caacatggtt 17460
tacacatgct atatgaccta cctcgacctg ttgttgaatg aagagttaga agagttcaca 17520
tttctcttgt gtgaaagcga cgaggatgta gtaccggaca gattcgacaa catccaggca 17580
aaacacttat gtgttctggc agatttgtac tgtcaaccag ggacctgccc accaattcga 17640
ggtctaagac cggtagagaa atgtgcagtt ctaaccgacc atatcaaggc agaggctatg 17700
ttatctccag caggatcttc gtggaacata aatccaatta ttgtagacca ttactcatgc 17760
tctctgactt atctccggcg aggatcgatc aaacagataa gattgagagt tgatccagga 17820
ttcattttcg acgccctcgc tgaggtaaat gtcagtcagc caaagatcgg cagcaacaac 17880
atctcaaata tgagcatcaa ggctttcaga cccccacacg atgatgttgc aaaattgctc 17940
aaagatatca acacaagcaa gcacaatctt cccatttcag ggggcaatct cgccaattat 18000
gaaatccatg ctttccgcag aatcgggttg aactcatctg cttgctacaa agctgttgag 18060
atatcaacat taattaggag atgccttgag ccaggggagg acggcttgtt cttgggtgag 18120
ggatcgggtt ctatgttgat cacttataaa gagatactta aactaaacaa gtgcttctat 18180
aatagtgggg tttccgccaa ttctagatct ggtcaaaggg aattagcacc ctatccctcc 18240
gaagttggcc ttgtcgaaca cagaatggga gtaggtaata ttgtcaaagt gctctttaac 18300
gggaggcccg aagtcacgtg ggtaggcagt gtagattgct tcaatttcat agttagtaat 18360
atccctacct ctagtgtggg gtttatccat tcagatatag agaccttgcc tgacaaagat 18420
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ataggatcaa tactggtgat taagcttatg cctttcagcg gggattttgt tcagggattt 18540
ataagttatg tagggtctca ttatagagaa gtgaaccttg tataccctag atacagcaac 18600
ttcatctcta ctgaatctta tttggttatg acagatctca aggctaaccg gctaatgaat 18660
cctgaaaaga ttaagcagca gataattgaa tcatctgtga ggacttcacc tggacttata 18720
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agtagaggtg atatcaatcc tactctgaaa aaacttacac ctatagagca ggtgctgatc 18840
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ttcaaagaca accaaagaag tcaacaaggg atgttccacg cttaccccgt attggtaagt 19020
agcaggcaac gagaacttat atctaggatc acccgcaaat tctgggggca cattcttctt 19080
tactccggga acaaaaagtt gataaataag tttatccaga atctcaagtc cggctatctg 19140
atactagact tacaccagaa tatcttcgtt aagaatctat ccaagtcaga gaaacagatt 19200
attatgacgg ggggtttgaa acgtgagtgg gtttttaagg taacagtcaa ggagaccaaa 19260
gaatggtata agttagtcgg atacagtgcc ctgattaagg actaattggt tgaactccgg 19320
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agtgagggtt aattccgagc ttggcgtaat catggtcata gctgtttcct gtgtgaaatt 19740
gttatccgct cacaattcca cacaacatag gagccggaag cataaagtgt aaagcctggg 19800
gtgcctaatg agtgaggtaa ctcacattaa ttgcgttgcg ctcactgccc gctttccagt 19860
cgggaaacct gtcgtgccag ctgcattaat gaatcggcca acgcgcgggg agaggcggtt 19920
tgcgtattgg gcgctcttcc gcttcctcgc tcactgactc gctgcgctcg gtcgttcggc 19980
tgcggcgagc ggtatcagct cactcaaagg cggtaatacg gttatccaca gaatcagggg 20040
ataacgcagg aaagaacatg tgagcaaaag gccagcaaaa ggccaggaac cgtaaaaagg 20100
ccgcgttgct ggcgtttttc cataggctcg gcccccctga cgagcatcac aaaaatcgac 20160
gctcaagtca gaggtggcga aacccgacag gactataaag ataccaggcg ttcccccctg 20220
gaagctccct cgtgcgctct cctgttccga ccctgccgct taccggatac ctgtccgcct 20280
ttctcccttc gggaagcgtg gcgctttctc aatgctcacg ctgtaggtat ctcagttcgg 20340
tgtaggtcgt tcgctccaag ctgggctgtg tgcacgaacc ccccgttcag cccgaccgct 20400
gcgccttatc cggtaactat cgtcttgagt ccaacccggt aagacacgac ttatcgccac 20460
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tcttgaagtg gtggcctaac tacggctaca ctagaaggac agtatttggt atctgcgctc 20580
tgctgaagcc agttaccttc ggaaaaagag ttggtagctc ttgatccggc aaacaaacca 20640
ccgctggtag cggtggtttt tttgtttgca agcagcagat tacgcgcaga aaaaaaggat 20700
ctcaagaaga tcctttgatc ttttctacgg ggtctgacgc tcagtggaac gaaaactcac 20760
gttaagggat tttggtcatg agattatcaa aaaggatctt cacctagatc cttttaaatt 20820
aaaaatgaag ttttaaatca atctaaagta tatatgagta aacttggtct gacagttacc 20880
aatgcttaat cagtgaggca cctatctcag cgatctgtct atttcgttca tccatagttg 20940
cctgactgcc cgtcgtgtag ataactacga tacgggaggg cttaccatct ggccccagtg 21000
ctgcaatgat accgcgagac ccacgctcac cggctccaga tttatcagca ataaaccagc 21060
cagccggaag ggccgagcgc agaagtggtc ctgcaacttt atccgcctcc atccagtcta 21120
ttaattgttg ccgggaagct agagtaagta gttcgccagt taatagtttg cgcaacgttg 21180
ttgccattgc tacaggcatc gtggtgtcac gctcgtcgtt tggtatggct tcattcagct 21240
ccggttccca acgatcaagg cgagttacat gatcccccat gttgtgaaaa aaagcggtta 21300
gctccttcgg tcctccgatc gttgtcagaa gtaagttggc cgcagtgtta tcactcatgc 21360
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ctggtgagta ctcaaccaag tcattctgag aatagtgtat gcggcgaccg agttgctctt 21480
gcccggcgtc aatacgggat aataccgcgc cacatagcag aactttaaaa gtgctcatca 21540
ttggaaaacg ttcttcgggg cgaaaactct caaggatctt accgctgttg agatccagtt 21600
cgatgtaacc cactcgtgca cccaactgat cttcagcatc ttttactttc accagcgttt 21660
ctgggtgagc aaaaacagga aggcaaaatg ccgcaaaaaa gggaataagg gcgacacgga 21720
aatgttgaat actcatactc ttcctttttc aatattattg aagcatttat cagggttatt 21780
gtctcatgag cggatacata tttgaatgta tttagaaaaa taaacaaata ggggttccgc 21840
gcacatttcc ccgaaaagtg ccacctgaaa ttgtaaacgt taatattttg ttaaaattcg 21900
cgttaaattt ttgttaaatc agctcatttt ttaaccaata ggccgaaatc ggcaaaatcc 21960
cttataaatc aaaagaatag accgagatag ggttgagtgt tgttccagtt tggaacaaga 22020
gtccactatt aaagaacgtg gactccaacg tcaaagggcg aaaaaccgtc tatcagggcg 22080
atggcccact acgtgaacca tcaccctaat caagtttttt ggggtcgagg tgccgtaaag 22140
cactaaatcg gaaccctaaa gggagccccc gatttagagc ttgacgggga aagccggcga 22200
acgtggcgag aaaggaaggg aagaaagcga aaggagcggg cgctagggcg ctggcaagtg 22260
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cgtcccattc gccattcagg ctgcgcaact gttgggaagg gcgatcggtg cgggcctctt 22380
cgctattacg ccagccaccg cggtg 22405
<210> 12
<211> 21007
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 质粒MeV-Z-GPC
<400> 12
gcggccgcta atacgactca ctatagggcc aactttgttt ggtctgatga gtccgtgagg 60
acgaaacccg gagtcccggg tcaccaaaca aagttgggta aggatagttc aatcaatgat 120
catcttctag tgcacttagg attcaagatc ctattatcag ggacaagagc aggattaggg 180
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cctagagcat cactgattcc cgacgcaact catctggggc cacagttctg caaatcctgt 300
tggttcgaga acaaaggcct ggtggagtgc aataaccact acctgtgcct gaactgtctg 360
acactgctgc tgagtgtgag caacagatgc ccaatctgca agatgcctct gccaacaaag 420
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cccccatact caccataagc gcgcagcgct tagacgtctc gcgatcgatt agtgcgagag 540
gccgagggcc agaacaacat ccgcctacca tccatcattg ttataaaaaa cttaggattc 600
aagatcctat tatcagggac aagagcagga ttagggatat ccgagatggc cacactttta 660
aggagcttag cattgttcaa aagaaacaag gacaaaccac ccattacatc aggatccggt 720
ggagccatca gaggaatcaa acacattatt atagtaccaa tccctggaga ttcctcaatt 780
accactcgat ccagacttct ggaccggttg gtgaggttaa ttggaaaccc ggatgtgagc 840
gggcccaaac taacaggggc actaataggt atattatcct tatttgtgga gtctccaggt 900
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gaggcggacc aatacttttc acatgatgat ccaattagta gtgatcaatc caggttcgga 1080
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attctgggta ccatcctagc ccaaatttgg gtcttgctcg caaaggcggt tacggcccca 1200
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gttggtgaat ttagattgga gagaaaatgg ttggatgtgg tgaggaacag gattgccgag 1320
gacctctcct tacgccgatt catggtcgct ctaatcctgg atatcaagag aacacccgga 1380
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gccaatggca gaagagcagg cacgccatgt caaaaacgga ctggaatgca tccgggctct 2400
caaggccgag cccatcggct cactggccat cgaggaagct atggcagcat ggtcagaaat 2460
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cggtcaggga cctggagaga gcgatgacga cgctgaaact ttgggaatcc ccccaagaaa 2640
tctccaggca tcaagcactg ggttacagtg ttattacgtt tatgatcaca gcggtgaagc 2700
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caccctctca ggaggagaca atgaatctga aaacagcgat gtggatattg gcgaacctga 2820
taccgaggga tatgctatca ctgaccgggg atctgctccc atctctatgg ggttcagggc 2880
ttctgatgtt gaaactgcag aaggagggga gatccacgag ctcctgagac tccaatccag 2940
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tagggccagc acttccggga cacccattaa aaagggcaca gacgcgagat tagcctcatt 3060
tggaacggag atcgcgtctt tattgacagg tggtgcaacc caatgtgctc gaaagtcacc 3120
ctcggaacca tcagggccag gtgcacctgc ggggaatgtc cccgagtgtg tgagcaatgc 3180
cgcactgata caggagtgga cacccgaatc tggtaccaca atctccccga gatcccagaa 3240
taatgaagaa gggggagact attatgatga tgagctgttc tctgatgtcc aagatattaa 3300
aacagccttg gccaaaatac acgaggataa tcagaagata atctccaagc tagaatcact 3360
gctgttattg aagggagaag ttgagtcaat taagaagcag atcaacaggc aaaatatcag 3420
catatccacc ctggaaggac acctctcaag catcatgatc gccattcctg gacttgggaa 3480
ggatcccaac gaccccactg cagatgtcga aatcaatccc gacttgaaac ccatcatagg 3540
cagagattca ggccgagcac tggccgaagt tctcaagaaa cccgttgcca gccgacaact 3600
ccaaggaatg acaaatggac ggaccagttc cagaggacag ctgctgaagg aatttcagct 3660
aaagccgatc gggaaaaaga tgagctcagc cgtcgggttt gttcctgaca ccggccctgc 3720
atcacgcagt gtaatccgct ccattataaa atccagccgg ctagaggagg atcggaagcg 3780
ttacctgatg actctccttg atgatatcaa aggagccaat gatcttgcca agttccacca 3840
gatgctgatg aagataataa tgaagtagct acagctcaac ttacctgcca accccatgcc 3900
agtcgaccca actagcctac cctccatcat tgttataaaa aacttaggaa ccaggtccac 3960
acagccgcca gcccatcaac gcgtacgatg ggccagattg tcacattctt tcaggaagtg 4020
ccacacgtca ttgaggaggt catgaacatc gtgctgattg ctctgtcagt gctggcagtg 4080
ctgaaaggac tgtacaactt cgctacctgt ggactggtgg gactggtcac attcctgctg 4140
ctgtgcggca gaagttgcac tacctcactg tacaaaggag tgtacgagct gcagactctg 4200
gaactgaaca tggagacact gaatatgaca atgcctctga gctgcaccaa gaataatagc 4260
caccactata tcatggtcgg gaacgaaacc ggcctggaac tgaccctgac aaacaccagc 4320
atcattaacc acaagttctg caatctgagc gacgctcaca agaagaacct gtatgaccac 4380
gctctgatgt ccatcatcag tacctttcac ctgtccatcc ccaatttcaa ccagtacgag 4440
gcaatgtcat gcgacttcaa cgggggcaag atcagtgtcc agtacaacct gagccactcc 4500
tacgccggcg acgcagccaa ccactgcgga actgtcgcca atggcgtgct gcagacattc 4560
atgaggatgg catggggggg atcttacatc gcactggata gcggcagggg caattgggat 4620
tgcatcatga cttcctatca gtatctgatt atccagaata ctacatggga ggatcattgc 4680
cagttcagtc ggcccagccc tattggatat ctggggctgc tgtcacagag aacacgggat 4740
atctatattt caagacgcct gctgggcaca ttcacttgga cactgtcaga cagtgagggc 4800
aaggatactc cagggggcta ctgcctgaca cgatggatgc tgatcgaagc agagctgaaa 4860
tgcttcggca ataccgcagt ggccaagtgc aacgagaaac acgacgagga gttctgcgac 4920
atgctgaggc tgttcgactt caacaaacag gctatccaga gactgaaggc agaagcccag 4980
atgtcaatcc agctgatcaa caaggcagtg aacgccctga tcaacgacca gctgatcatg 5040
aagaaccacc tgagagacat tatgggcatc ccctactgta attacagcaa gtattggtac 5100
ctgaaccaca ctacaaccgg gagaacatcc ctgcccaagt gctggctggt cagcaatggg 5160
agttatctga atgaaaccca tttcagcgac gatatcgaac agcaggctga caacatgatc 5220
acagagatgc tgcagaaaga gtacatggaa agacagggca agacaccact gggactggtc 5280
gatctgttcg tcttctccac tagcttctat ctgatttcca tcttcctgca cctggtgaag 5340
atccccactc ataggcacat tgtcggcaag agttgcccta aaccccatag gctgaatcac 5400
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aaaccagaac ccagaccacc ctgggccacc agctcccaga ctcggccatc accccgcaga 7320
aaggaaaggc cacaacccgc gcaccccagc cccgatccgg cggggagcca cccaacccga 7380
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agagtcctac ttcattgtcc tcagtatagc ctatccgacg ctgtccgaga ttaagggggt 8460
gattgtccac cggctagagg gggtctcgta caacataggc tctcaagagt ggtataccac 8520
tgtgcccaag tatgttgcaa cccaagggta ccttatctcg aattttgatg agtcatcgtg 8580
tactttcatg ccagagggga ctgtgtgcag ccaaaatgcc ttgtacccga tgagtcctct 8640
gctccaagaa tgcctccggg ggtacaccaa gtcctgtgct cgtacactcg tatccgggtc 8700
ttttgggaac cggttcattt tatcacaagg gaacctaata gccaattgtg catcaatcct 8760
ttgcaagtgt tacacaacag gaacgatcat taatcaagac cctgacaaga tcctaacata 8820
cattgctgcc gatcactgcc cggtagtcga ggtgaacggc gtgaccatcc aagtcgggag 8880
caggaggtat ccagacgctg tgtacttgca cagaattgac ctcggtcctc ccatatcatt 8940
ggagaggttg gacgtaggga caaatctggg gaatgcaatt gctaagttgg aggatgccaa 9000
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gcatgtaccg agtgtttgaa gtaggtgtta tcagaaatcc gggtttgggg gctccggtgt 10200
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caaccgacat gcaatcctgg gtccccttat caacggatga tccagtgata gacaggcttt 10440
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cacgaacaga tgacaagttg cgaatggaga catgcttcca acaggcgtgt aagggtaaaa 10560
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cttactttta tccttttagg ttgcctataa agggggtccc catcgaatta caagtggaat 11100
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ctagatagcc cgatagttac caataagata gtagccatcc tggagtatgc tcgagtccct 11460
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ctgtactcca aagtcagtga taaggttttc caatgcttaa gggacactaa ctcacggctt 11760
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ttcactggta gttcagttga gttgctaatc tctcgtgacc ttgttgctat aatcagtaaa 12000
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tccataggct cggcccccct gacgagcatc acaaaaatcg acgctcaagt cagaggtggc 18780
gaaacccgac aggactataa agataccagg cgttcccccc tggaagctcc ctcgtgcgct 18840
ctcctgttcc gaccctgccg cttaccggat acctgtccgc ctttctccct tcgggaagcg 18900
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cgcggtg 21007
<210> 13
<211> 22861
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 质粒MeV-Z-NP-GPC
<400> 13
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catcttctag tgcacttagg attcaagatc ctattatcag ggacaagagc aggattaggg 180
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gccgagggcc agaacaacat ccgcctacca tccatcattg ttataaaaaa cttaggattc 600
aagatcctat tatcagggac aagagcagga ttagggatat ccgagatggc cacactttta 660
aggagcttag cattgttcaa aagaaacaag gacaaaccac ccattacatc aggatccggt 720
ggagccatca gaggaatcaa acacattatt atagtaccaa tccctggaga ttcctcaatt 780
accactcgat ccagacttct ggaccggttg gtgaggttaa ttggaaaccc ggatgtgagc 840
gggcccaaac taacaggggc actaataggt atattatcct tatttgtgga gtctccaggt 900
caattgattc agaggatcac cgatgaccct gacgttagca taaggctgtt agaggttgtc 960
cagagtgacc agtcacaatc tggccttacc ttcgcatcaa gaggtaccaa catggaggat 1020
gaggcggacc aatacttttc acatgatgat ccaattagta gtgatcaatc caggttcgga 1080
tggttcggga acaaggaaat ctcagatatt gaagtgcaag accctgaggg attcaacatg 1140
attctgggta ccatcctagc ccaaatttgg gtcttgctcg caaaggcggt tacggcccca 1200
gacacggcag ctgattcgga gctaagaagg tggataaagt acacccaaca aagaagggta 1260
gttggtgaat ttagattgga gagaaaatgg ttggatgtgg tgaggaacag gattgccgag 1320
gacctctcct tacgccgatt catggtcgct ctaatcctgg atatcaagag aacacccgga 1380
aacaaaccca ggattgctga aatgatatgt gacattgata catatatcgt agaggcagga 1440
ttagccagtt ttatcctgac tattaagttt gggatagaaa ctatgtatcc tgctcttgga 1500
ctgcatgaat ttgctggtga gttatccaca cttgagtcct tgatgaacct ttaccagcaa 1560
atgggggaaa ctgcacccta catggtaatc ctggagaact caattcagaa caagttcagt 1620
gcaggatcat accctctgct ctggagctat gccatgggag taggagtgga acttgaaaac 1680
tccatgggag gtttgaactt tggccgatct tactttgatc cagcatattt tagattaggg 1740
caagagatgg taaggaggtc agctggaaag gtcagttcca cattggcatc tgaactcggt 1800
atcactgccg aggatgcaag gcttgtttca gagattgcaa tgcatactac tgaggacaag 1860
atcagtagag cggttggacc cagacaagcc caagtatcat ttctacacgg tgatcaaagt 1920
gagaatgagc taccgagatt ggggggcaag gaagatagga gggtcaaaca gagtcgagga 1980
gaagccaggg agagctacag agaaaccggg cccagcagag caagtgatgc gagagctgcc 2040
catcttccaa ccggcacacc cctagacatt gacactgcaa cggagtccag ccaagatccg 2100
caggacagtc gaaggtcagc tgacgccctg cttaggctgc aagccatggc aggaatctcg 2160
gaagaacaag gctcagacac ggacacccct atagtgtaca atgacagaaa tcttctagac 2220
taggtgcgag aggccgaggg ccagaacaac atccgcctac catccatcat tgttataaaa 2280
aacttaggaa ccaggtccac acagccgcca gcccatcaac catccactcc cacgattgga 2340
gccaatggca gaagagcagg cacgccatgt caaaaacgga ctggaatgca tccgggctct 2400
caaggccgag cccatcggct cactggccat cgaggaagct atggcagcat ggtcagaaat 2460
atcagacaac ccaggacagg agcgagccac ctgcagggaa gagaaggcag gcagttcggg 2520
tctcagcaaa ccatgcctct cagcaattgg atcaactgaa ggcggtgcac ctcgcatccg 2580
cggtcaggga cctggagaga gcgatgacga cgctgaaact ttgggaatcc ccccaagaaa 2640
tctccaggca tcaagcactg ggttacagtg ttattacgtt tatgatcaca gcggtgaagc 2700
ggttaaggga atccaagatg ctgactctat catggttcaa tcaggccttg atggtgatag 2760
caccctctca ggaggagaca atgaatctga aaacagcgat gtggatattg gcgaacctga 2820
taccgaggga tatgctatca ctgaccgggg atctgctccc atctctatgg ggttcagggc 2880
ttctgatgtt gaaactgcag aaggagggga gatccacgag ctcctgagac tccaatccag 2940
aggcaacaac tttccgaagc ttgggaaaac tctcaatgtt cctccgcccc cggaccccgg 3000
tagggccagc acttccggga cacccattaa aaagggcaca gacgcgagat tagcctcatt 3060
tggaacggag atcgcgtctt tattgacagg tggtgcaacc caatgtgctc gaaagtcacc 3120
ctcggaacca tcagggccag gtgcacctgc ggggaatgtc cccgagtgtg tgagcaatgc 3180
cgcactgata caggagtgga cacccgaatc tggtaccaca atctccccga gatcccagaa 3240
taatgaagaa gggggagact attatgatga tgagctgttc tctgatgtcc aagatattaa 3300
aacagccttg gccaaaatac acgaggataa tcagaagata atctccaagc tagaatcact 3360
gctgttattg aagggagaag ttgagtcaat taagaagcag atcaacaggc aaaatatcag 3420
catatccacc ctggaaggac acctctcaag catcatgatc gccattcctg gacttgggaa 3480
ggatcccaac gaccccactg cagatgtcga aatcaatccc gacttgaaac ccatcatagg 3540
cagagattca ggccgagcac tggccgaagt tctcaagaaa cccgttgcca gccgacaact 3600
ccaaggaatg acaaatggac ggaccagttc cagaggacag ctgctgaagg aatttcagct 3660
aaagccgatc gggaaaaaga tgagctcagc cgtcgggttt gttcctgaca ccggccctgc 3720
atcacgcagt gtaatccgct ccattataaa atccagccgg ctagaggagg atcggaagcg 3780
ttacctgatg actctccttg atgatatcaa aggagccaat gatcttgcca agttccacca 3840
gatgctgatg aagataataa tgaagtagct acagctcaac ttacctgcca accccatgcc 3900
agtcgaccca actagcctac cctccatcat tgttataaaa aacttaggaa ccaggtccac 3960
acagccgcca gcccatcaac gcgtacgatg agtgccagca aagaaatcaa gagcttcctg 4020
tggacccaga gtctgcggag ggaactgagc ggatactgta gcaacatcaa actgcaggtg 4080
gtcaaggacg ctcaggcact gctgcatggg ctggacttct ccgaggtgtc taatgtgcag 4140
cggctgatgc ggaaagaacg gagggacgat aatgacctga agcgactgcg cgacctgaac 4200
caggcagtga acaatctggt cgagctgaag agcacccagc agaaatcaat cctgcgggtc 4260
gggacactga catctgacga cctgctgatc ctggctgcag acctggagaa gctgaaatcg 4320
aaagtgatcc gcaccgaaag gccactgtcc gccggggtct acatgggcaa tctgtcttcc 4380
cagcagctgg accagaggcg ggctctgctg aacatgattg ggatgtccgg aggaaatcag 4440
ggagctagag ccgggaggga cggagtcgtg cgggtctggg acgtgaagaa tgccgaactg 4500
ctgaacaacc agttcgggac catgccaagt ctgacactgg catgcctgac taaacagggc 4560
caggtggatc tgaatgatgc agtccaggct ctgaccgacc tgggcctgat ctacaccgcc 4620
aagtacccca atactagcga cctggataga ctgacccaga gccaccccat cctgaacatg 4680
atcgacacta agaagtcctc actgaacatc agtggctata atttctccct gggggcagca 4740
gtcaaggctg gcgcatgcat gctggacggc gggaatatgc tggaaaccat caaagtgtct 4800
ccccagacca tggatggcat cctgaaatct attctgaaag tcaagaaggc cctgggaatg 4860
tttatttcag acacccccgg cgagaggaat ccatatgaga acattctgta taagatttgc 4920
ctgagtggcg acgggtggcc atacattgca agccggacat caattaccgg aagagcttgg 4980
gagaatacag tcgtggacct ggaaagcgac ggcaagcccc agaaggccga ctcaaacaac 5040
tcctcaaaga gtctgcagtc agctggcttc acagcagggc tgacttactc ccagctgatg 5100
acactgaagg acgcaatgct gcagctggac ccaaacgcta agacatggat ggacatcgag 5160
ggacggccag aagatccagt ggaaatcgca ctgtatcagc catcatccgg atgctatatc 5220
catttcttcc gggaaccaac tgatctgaag cagttcaagc aggatgcaaa gtactcccac 5280
ggaatcgatg tcaccgatct gttcgcaacc cagccaggac tgacatcagc cgtcatcgat 5340
gccctgccta ggaacatggt cattacttgc cagggctccg acgatattag gaagctgctg 5400
gagagccagg gacggaagga tatcaaactg atcgatattg ccctgtctaa gactgatagc 5460
cggaaatatg agaatgcagt ctgggatcag tacaaggacc tgtgccatat gcataccgga 5520
gtggtcgtcg agaagaagaa gaggggcgga aaggaagaga tcacacccca ctgtgccctg 5580
atggattgca tcatgttcga cgcagccgtg tccgggggcc tgaacacctc agtcctgagg 5640
gctgtcctgc caagagatat ggtgtttaga acttcaaccc caagagtcgt cctgtaattc 5700
gaactacagc tcaacttacc tgccaacccc atgccagtcg acccaactag tacaacctaa 5760
atccattata aaaaacttag gaaccaggtc cacacagccg ccagcccatc aaccatccac 5820
tcccacgatt ggaggccggc catgggccag attgtcacat tctttcagga agtgccacac 5880
gtcattgagg aggtcatgaa catcgtgctg attgctctgt cagtgctggc agtgctgaaa 5940
ggactgtaca acttcgctac ctgtggactg gtgggactgg tcacattcct gctgctgtgc 6000
ggcagaagtt gcactacctc actgtacaaa ggagtgtacg agctgcagac tctggaactg 6060
aacatggaga cactgaatat gacaatgcct ctgagctgca ccaagaataa tagccaccac 6120
tatatcatgg tcgggaacga aaccggcctg gaactgaccc tgacaaacac cagcatcatt 6180
aaccacaagt tctgcaatct gagcgacgct cacaagaaga acctgtatga ccacgctctg 6240
atgtccatca tcagtacctt tcacctgtcc atccccaatt tcaaccagta cgaggcaatg 6300
tcatgcgact tcaacggggg caagatcagt gtccagtaca acctgagcca ctcctacgcc 6360
ggcgacgcag ccaaccactg cggaactgtc gccaatggcg tgctgcagac attcatgagg 6420
atggcatggg ggggatctta catcgcactg gatagcggca ggggcaattg ggattgcatc 6480
atgacttcct atcagtatct gattatccag aatactacat gggaggatca ttgccagttc 6540
agtcggccca gccctattgg atatctgggg ctgctgtcac agagaacacg ggatatctat 6600
atttcaagac gcctgctggg cacattcact tggacactgt cagacagtga gggcaaggat 6660
actccagggg gctactgcct gacacgatgg atgctgatcg aagcagagct gaaatgcttc 6720
ggcaataccg cagtggccaa gtgcaacgag aaacacgacg aggagttctg cgacatgctg 6780
aggctgttcg acttcaacaa acaggctatc cagagactga aggcagaagc ccagatgtca 6840
atccagctga tcaacaaggc agtgaacgcc ctgatcaacg accagctgat catgaagaac 6900
cacctgagag acattatggg catcccctac tgtaattaca gcaagtattg gtacctgaac 6960
cacactacaa ccgggagaac atccctgccc aagtgctggc tggtcagcaa tgggagttat 7020
ctgaatgaaa cccatttcag cgacgatatc gaacagcagg ctgacaacat gatcacagag 7080
atgctgcaga aagagtacat ggaaagacag ggcaagacac cactgggact ggtcgatctg 7140
ttcgtcttct ccactagctt ctatctgatt tccatcttcc tgcacctggt gaagatcccc 7200
actcataggc acattgtcgg caagagttgc cctaaacccc ataggctgaa tcacatgggg 7260
atttgtagtt gcggcctgta taagcagcct ggcgtgcctg tgaagtggaa gagatgagcg 7320
cgcagcgctt agacgtctcg cgatcgatac tagtacaacc taaatccatt ataaaaaact 7380
taggagcaaa gtgattgcct cccaaggtcc acaatgacag agacctacga cttcgacaag 7440
tcggcatggg acatcaaagg gtcgatcgct ccgatacaac ccaccaccta cagtgatggc 7500
aggctggtgc cccaggtcag agtcatagat cctggtctag gcgacaggaa ggatgaatgc 7560
tttatgtaca tgtttctgct gggggttgtt gaggacagcg attccctagg gcctccaatc 7620
gggcgagcat ttgggttcct gcccttaggt gttggcagat ccacagcaaa gcccgaaaaa 7680
ctcctcaaag aggccactga gcttgacata gttgttagac gtacagcagg gctcaatgaa 7740
aaactggtgt tctacaacaa caccccacta actctcctca caccttggag aaaggtccta 7800
acaacaggga gtgtcttcaa cgcaaaccaa gtgtgcaatg cggttaatct gataccgctc 7860
gataccccgc agaggttccg tgttgtttat atgagcatca cccgtctttc ggataacggg 7920
tattacaccg ttcctagaag aatgctggaa ttcagatcgg tcaatgcagt ggccttcaac 7980
ctgctggtga cccttaggat tgacaaggcg ataggccctg ggaagatcat cgacaataca 8040
gagcaacttc ctgaggcaac atttatggtc cacatcggga acttcaggag aaagaagagt 8100
gaagtctact ctgccgatta ttgcaaaatg aaaatcgaaa agatgggcct ggtttttgca 8160
cttggtggga tagggggcac cagtcttcac attagaagca caggcaaaat gagcaagact 8220
ctccatgcac aactcgggtt caagaagacc ttatgttacc cgctgatgga tatcaatgaa 8280
gaccttaatc gattactctg gaggagcaga tgcaagatag taagaatcca ggcagttttg 8340
cagccatcag ttcctcaaga attccgcatt tacgacgacg tgatcataaa tgatgaccaa 8400
ggactattca aagttctgta gaccgtagtg cccagcaatg cccgaaaacg acccccctca 8460
caatgacagc cagaaggccc ggacaaaaaa gccccctccg aaagactcca cggaccaagc 8520
gagaggccag ccagcagccg acggcaagcg cgaacaccag gcggccccag cacagaacag 8580
ccctgacaca aggccaccac cagccacccc aatctgcatc ctcctcgtgg gacccccgag 8640
gaccaacccc caaggctgcc cccgatccaa accaccaacc gcatccccac cacccccggg 8700
aaagaaaccc ccagcaattg gaaggcccct ccccctcttc ctcaacacaa gaactccaca 8760
accgaaccgc acaagcgacc gaggtgaccc aaccgcaggc atccgactcc ctagacagat 8820
cctctctccc cggcaaacta aacaaaactt agggccaagg aacatacaca cccaacagaa 8880
cccagacccc ggcccacggc gccgcgcccc caacccccga caaccagagg gagcccccaa 8940
ccaatcccgc cggctccccc ggtgcccaca ggcagggaca ccaacccccg aacagaccca 9000
gcacccaacc atcgacaatc caagacgggg gggccccccc aaaaaaaggc ccccaggggc 9060
cgacagccag caccgcgagg aagcccaccc accccacaca cgaccacggc aaccaaacca 9120
gaacccagac caccctgggc caccagctcc cagactcggc catcaccccg cagaaaggaa 9180
aggccacaac ccgcgcaccc cagccccgat ccggcgggga gccacccaac ccgaaccagc 9240
acccaagagc gatccccgaa ggacccccga accgcaaagg acatcagtat cccacagcct 9300
ctccaagtcc cccggtctcc tcctcttctc gaagggacca aaagatcaat ccaccacacc 9360
cgacgacact caactcccca cccctaaagg agacaccggg aatcccagaa tcaagactca 9420
tccaatgtcc atcatgggtc tcaaggtgaa cgtctctgcc atattcatgg cagtactgtt 9480
aactctccaa acacccaccg gtcaaatcca ttggggcaat ctctctaaga taggggtggt 9540
aggaatagga agtgcaagct acaaagttat gactcgttcc agccatcaat cattagtcat 9600
aaaattaatg cccaatataa ctctcctcaa taactgcacg agggtagaga ttgcagaata 9660
caggagacta ctgagaacag ttttggaacc aattagagat gcacttaatg caatgaccca 9720
gaatataaga ccggttcaga gtgtagcttc aagtaggaga cacaagagat ttgcgggagt 9780
agtcctggca ggtgcggccc taggcgttgc cacagctgct cagataacag ccggcattgc 9840
acttcaccag tccatgctga actctcaagc catcgacaat ctgagagcga gcctggaaac 9900
tactaatcag gcaattgaga caatcagaca agcagggcag gagatgatat tggctgttca 9960
gggtgtccaa gactacatca ataatgagct gataccgtct atgaaccaac tatcttgtga 10020
tttaatcggc cagaagctcg ggctcaaatt gctcagatac tatacagaaa tcctgtcatt 10080
atttggcccc agtttacggg accccatatc tgcggagata tctatccagg ctttgagcta 10140
tgcgcttgga ggagacatca ataaggtgtt agaaaagctc ggatacagtg gaggtgattt 10200
actgggcatc ttagagagcg gaggaataaa ggcccggata actcacgtcg acacagagtc 10260
ctacttcatt gtcctcagta tagcctatcc gacgctgtcc gagattaagg gggtgattgt 10320
ccaccggcta gagggggtct cgtacaacat aggctctcaa gagtggtata ccactgtgcc 10380
caagtatgtt gcaacccaag ggtaccttat ctcgaatttt gatgagtcat cgtgtacttt 10440
catgccagag gggactgtgt gcagccaaaa tgccttgtac ccgatgagtc ctctgctcca 10500
agaatgcctc cgggggtaca ccaagtcctg tgctcgtaca ctcgtatccg ggtcttttgg 10560
gaaccggttc attttatcac aagggaacct aatagccaat tgtgcatcaa tcctttgcaa 10620
gtgttacaca acaggaacga tcattaatca agaccctgac aagatcctaa catacattgc 10680
tgccgatcac tgcccggtag tcgaggtgaa cggcgtgacc atccaagtcg ggagcaggag 10740
gtatccagac gctgtgtact tgcacagaat tgacctcggt cctcccatat cattggagag 10800
gttggacgta gggacaaatc tggggaatgc aattgctaag ttggaggatg ccaaggaatt 10860
gttggagtca tcggaccaga tattgaggag tatgaaaggt ttatcgagca ctagcatagt 10920
ctacatcctg attgcagtgt gtcttggagg gttgataggg atccccgctt taatatgttg 10980
ctgcaggggg cgttgtaaca aaaagggaga acaagttggt atgtcaagac caggcctaaa 11040
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tgaaacacaa atgtcccaca agtctcctct tcgtcatcaa gcaaccaccg cacccagcat 11160
caagcccacc tgaaattatc tccggcttcc ctctggccga acaatatcgg tagttaatca 11220
aaacttaggg tgcaagatca tccacaatgt caccacaacg agaccggata aatgccttct 11280
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ttgatagacc ttatgttttg ctggctgttc tgtttgtcat gtttctgagc ttgatcgggt 11400
tgctagccat tgcaggcatt agacttcatc gggcagccat ctacaccgca gagatccata 11460
aaagcctcag caccaatcta gatgtaacta actcaatcga gcatcaggtc aaggacgtgc 11520
tgacaccact cttcaaaatc atcggtgatg aagtgggcct gaggacacct cagagattca 11580
ctgacctagt gaaattaatc tctgacaaga ttaaattcct taatccggat agggagtacg 11640
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aatactgtgc agatgtggct gctgaagagc tcatgaatgc attggtgaac tcaactctac 11760
tggagaccag aacaaccaat cagttcctag ctgtctcaaa gggaaactgc tcagggccca 11820
ctacaatcag aggtcaattc tcaaacatgt cgctgtccct gttagacttg tatttaggtc 11880
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acctagtgga aaagcctaat ctgagcagca aaaggtcaga gttgtcacaa ctgagcatgt 12000
accgagtgtt tgaagtaggt gttatcagaa atccgggttt gggggctccg gtgttccata 12060
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cactctgcga gaatcccgag tgggcaccat tgaaggataa caggattcct tcatacgggg 12480
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ggccattgat cacacacggt tcagggatgg acctatacaa atccaaccac aacaatgtgt 12600
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ccaatctggt gattctacct ggtcaagatc tccaatatgt tttggcaacc tacgatactt 12840
ccagggttga acatgctgtg gtttattacg tttacagccc aagccgctca ttttcttact 12900
tttatccttt taggttgcct ataaaggggg tccccatcga attacaagtg gaatgcttca 12960
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caaaacgggt tttctgatga aggtacttat catgagttaa ctgaagctct agattacatt 14220
ttcataactg atgacataca tctgacaggg gagattttct catttttcag aagtttcggc 14280
caccccagac ttgaagcagt aacggctgct gaaaatgtta ggaaatacat gaatcagcct 14340
aaagtcattg tgtatgagac tctgatgaaa ggtcatgcca tattttgtgg aatcataatc 14400
aacggctatc gtgacaggca cggaggcagt tggccaccgc tgaccctccc cctgcatgct 14460
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cttgtagatg ttttccttaa tgattcgagc tttgacccat atgatgtgat aatgtatgtt 14760
gtaagtggag cttacctcca tgaccctgag ttcaacctgt cttacagcct gaaagaaaag 14820
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gccaaggatg agcacgattt gactaaggca ctccacactc tagctgtctc aggagtcccc 15000
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gtccacacaa gtaccaggaa cgtgagagca gcaaaagggt ttatagggtt ccctcaagta 15120
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gcatttatca cgactgatct caagaagtac tgccttaatt ggagatatga gaccatcagc 15240
ttgtttgcac agaggctaaa tgagatttac ggattgccct catttttcca gtggctgcat 15300
aagaggcttg agacctctgt cctgtatgta agtgaccctc attgcccccc cgaccttgac 15360
gcccatatcc cgttatataa agtccccaat gatcaaatct tcattaagta ccctatggga 15420
ggtatagaag ggtattgtca gaagctgtgg accatcagca ccattcccta tctatacctg 15480
gctgcttatg agagcggagt aaggattgct tcgttagtgc aaggggacaa tcagaccata 15540
gccgtaacaa aaagggtacc cagcacatgg ccctacaacc ttaagaaacg ggaagctgct 15600
agagtaacta gagattactt tgtaattctt aggcaaaggc tacatgatat tggccatcac 15660
ctcaaggcaa atgagacaat tgtttcatca catttttttg tctattcaaa aggaatatat 15720
tatgatgggc tacttgtgtc ccaatcactc aagagcatcg caagatgtgt attctggtca 15780
gagactatag ttgatgaaac aagggcagca tgcagtaata ttgctacaac aatggctaaa 15840
agcatcgaga gaggttatga ccgttacctt gcatattccc tgaacgtcct aaaagtgata 15900
cagcaaattc tgatctctct tggcttcaca atcaattcaa ccatgacccg ggatgtagtc 15960
atacccctcc tcacaaacaa cgacctctta ataaggatgg cactgttgcc cgctcctatt 16020
ggggggatga attatctgaa tatgagcagg ctgtttgtca gaaacatcgg tgatccagta 16080
acatcatcaa ttgctgatct caagagaatg attctcgcct cactaatgcc tgaagagacc 16140
ctccatcaag taatgacaca acaaccgggg gactcttcat tcctagactg ggctagcgac 16200
ccttactcag caaatcttgt atgtgtccag agcatcacta gactcctcaa gaacataact 16260
gcaaggtttg tcctgatcca tagtccaaac ccaatgttaa aaggattatt ccatgatgac 16320
agtaaagaag aggacgaggg actggcggca ttcctcatgg acaggcatat tatagtacct 16380
agggcagctc atgaaatcct ggatcatagt gtcacagggg caagagagtc tattgcaggc 16440
atgctggata ccacaaaagg cttgattcga gccagcatga ggaagggggg gttaacctct 16500
cgagtgataa ccagattgtc caattatgac tatgaacaat tcagagcagg gatggtgcta 16560
ttgacaggaa gaaagagaaa tgtcctcatt gacaaagagt catgttcagt gcagctggcg 16620
agagctctaa gaagccatat gtgggcgagg ctagctcgag gacggcctat ttacggcctt 16680
gaggtccctg atgtactaga atctatgcga ggccacctta ttcggcgtca tgagacatgt 16740
gtcatctgcg agtgtggatc agtcaactac ggatggtttt ttgtcccctc gggttgccaa 16800
ctggatgata ttgacaagga aacatcatcc ttgagagtcc catatattgg ttctaccact 16860
gatgagagaa cagacatgaa gcttgccttc gtaagagccc caagtcgatc cttgcgatct 16920
gctgttagaa tagcaacagt gtactcatgg gcttacggtg atgatgatag ctcttggaac 16980
gaagcctggt tgttggctag gcaaagggcc aatgtgagcc tggaggagct aagggtgatc 17040
actcccatct caacttcgac taatttagcg cataggttga gggatcgtag cactcaagtg 17100
aaatactcag gtacatccct tgtccgagtg gcgaggtata ccacaatctc caacgacaat 17160
ctctcatttg tcatatcaga taagaaggtt gatactaact ttatatacca acaaggaatg 17220
cttctagggt tgggtgtttt agaaacattg tttcgactcg agaaagatac cggatcatct 17280
aacacggtat tacatcttca cgtcgaaaca gattgttgcg tgatcccgat gatagatcat 17340
cccaggatac ccagctcccg caagctagag ctgagggcag agctatgtac caacccattg 17400
atatatgata atgcaccttt aattgacaga gatgcaacaa ggctatacac ccagagccat 17460
aggaggcacc ttgtggaatt tgttacatgg tccacacccc aactatatca cattttagct 17520
aagtccacag cactatctat gattgacctg gtaacaaaat ttgagaagga ccatatgaat 17580
gaaatttcag ctctcatagg ggatgacgat atcaatagtt tcataactga gtttctgctc 17640
atagagccaa gattattcac tatctacttg ggccagtgtg cggccatcaa ttgggcattt 17700
gatgtacatt atcatagacc atcagggaaa tatcagatgg gtgagctgtt gtcatcgttc 17760
ctttctagaa tgagcaaagg agtgtttaag gtgcttgtca atgctctaag ccacccaaag 17820
atctacaaga aattctggca ttgtggtatt atagagccta tccatggtcc ttcacttgat 17880
gctcaaaact tgcacacaac tgtgtgcaac atggtttaca catgctatat gacctacctc 17940
gacctgttgt tgaatgaaga gttagaagag ttcacatttc tcttgtgtga aagcgacgag 18000
gatgtagtac cggacagatt cgacaacatc caggcaaaac acttatgtgt tctggcagat 18060
ttgtactgtc aaccagggac ctgcccacca attcgaggtc taagaccggt agagaaatgt 18120
gcagttctaa ccgaccatat caaggcagag gctatgttat ctccagcagg atcttcgtgg 18180
aacataaatc caattattgt agaccattac tcatgctctc tgacttatct ccggcgagga 18240
tcgatcaaac agataagatt gagagttgat ccaggattca ttttcgacgc cctcgctgag 18300
gtaaatgtca gtcagccaaa gatcggcagc aacaacatct caaatatgag catcaaggct 18360
ttcagacccc cacacgatga tgttgcaaaa ttgctcaaag atatcaacac aagcaagcac 18420
aatcttccca tttcaggggg caatctcgcc aattatgaaa tccatgcttt ccgcagaatc 18480
gggttgaact catctgcttg ctacaaagct gttgagatat caacattaat taggagatgc 18540
cttgagccag gggaggacgg cttgttcttg ggtgagggat cgggttctat gttgatcact 18600
tataaagaga tacttaaact aaacaagtgc ttctataata gtggggtttc cgccaattct 18660
agatctggtc aaagggaatt agcaccctat ccctccgaag ttggccttgt cgaacacaga 18720
atgggagtag gtaatattgt caaagtgctc tttaacggga ggcccgaagt cacgtgggta 18780
ggcagtgtag attgcttcaa tttcatagtt agtaatatcc ctacctctag tgtggggttt 18840
atccattcag atatagagac cttgcctgac aaagatacta tagagaagct agaggaattg 18900
gcagccatct tatcgatggc tctgctcctg ggcaaaatag gatcaatact ggtgattaag 18960
cttatgcctt tcagcgggga ttttgttcag ggatttataa gttatgtagg gtctcattat 19020
agagaagtga accttgtata ccctagatac agcaacttca tctctactga atcttatttg 19080
gttatgacag atctcaaggc taaccggcta atgaatcctg aaaagattaa gcagcagata 19140
attgaatcat ctgtgaggac ttcacctgga cttataggtc acatcctatc cattaagcaa 19200
ctaagctgca tacaagcaat tgtgggagac gcagttagta gaggtgatat caatcctact 19260
ctgaaaaaac ttacacctat agagcaggtg ctgatcaatt gcgggttggc aattaacgga 19320
cctaagctgt gcaaagaatt gatccaccat gatgttgcct cagggcaaga tggattgctt 19380
aattctatac tcatcctcta cagggagttg gcaagattca aagacaacca aagaagtcaa 19440
caagggatgt tccacgctta ccccgtattg gtaagtagca ggcaacgaga acttatatct 19500
aggatcaccc gcaaattctg ggggcacatt cttctttact ccgggaacaa aaagttgata 19560
aataagttta tccagaatct caagtccggc tatctgatac tagacttaca ccagaatatc 19620
ttcgttaaga atctatccaa gtcagagaaa cagattatta tgacgggggg tttgaaacgt 19680
gagtgggttt ttaaggtaac agtcaaggag accaaagaat ggtataagtt agtcggatac 19740
agtgccctga ttaaggacta attggttgaa ctccggaacc ctaatcctgc cctaggtggt 19800
taggcattat ttgcaatata ttaaagaaaa ctttgaaaat acgaagtttc tattcccagc 19860
tttgtctggt ggccggcatg gtcccagcct cctcgctggc gccggctggg caacattccg 19920
aggggaccgt cccctcggta atggcgaatg ggacgcggcc gatccggctg ctaacaaagc 19980
ccgaaaggaa gctgagttgg ctgctgccac cgctgagcaa taactagcat aaccccttgg 20040
ggcctctaaa cgggtcttga ggggtttttt gctgaaagga ggaactatat ccggatgcgg 20100
ccgcgggccc tatggtaccc agcttttgtt ccctttagtg agggttaatt ccgagcttgg 20160
cgtaatcatg gtcatagctg tttcctgtgt gaaattgtta tccgctcaca attccacaca 20220
acataggagc cggaagcata aagtgtaaag cctggggtgc ctaatgagtg aggtaactca 20280
cattaattgc gttgcgctca ctgcccgctt tccagtcggg aaacctgtcg tgccagctgc 20340
attaatgaat cggccaacgc gcggggagag gcggtttgcg tattgggcgc tcttccgctt 20400
cctcgctcac tgactcgctg cgctcggtcg ttcggctgcg gcgagcggta tcagctcact 20460
caaaggcggt aatacggtta tccacagaat caggggataa cgcaggaaag aacatgtgag 20520
caaaaggcca gcaaaaggcc aggaaccgta aaaaggccgc gttgctggcg tttttccata 20580
ggctcggccc ccctgacgag catcacaaaa atcgacgctc aagtcagagg tggcgaaacc 20640
cgacaggact ataaagatac caggcgttcc cccctggaag ctccctcgtg cgctctcctg 20700
ttccgaccct gccgcttacc ggatacctgt ccgcctttct cccttcggga agcgtggcgc 20760
tttctcaatg ctcacgctgt aggtatctca gttcggtgta ggtcgttcgc tccaagctgg 20820
gctgtgtgca cgaacccccc gttcagcccg accgctgcgc cttatccggt aactatcgtc 20880
ttgagtccaa cccggtaaga cacgacttat cgccactggc agcagccact ggtaacagga 20940
ttagcagagc gaggtatgta ggcggtgcta cagagttctt gaagtggtgg cctaactacg 21000
gctacactag aaggacagta tttggtatct gcgctctgct gaagccagtt accttcggaa 21060
aaagagttgg tagctcttga tccggcaaac aaaccaccgc tggtagcggt ggtttttttg 21120
tttgcaagca gcagattacg cgcagaaaaa aaggatctca agaagatcct ttgatctttt 21180
ctacggggtc tgacgctcag tggaacgaaa actcacgtta agggattttg gtcatgagat 21240
tatcaaaaag gatcttcacc tagatccttt taaattaaaa atgaagtttt aaatcaatct 21300
aaagtatata tgagtaaact tggtctgaca gttaccaatg cttaatcagt gaggcaccta 21360
tctcagcgat ctgtctattt cgttcatcca tagttgcctg actgcccgtc gtgtagataa 21420
ctacgatacg ggagggctta ccatctggcc ccagtgctgc aatgataccg cgagacccac 21480
gctcaccggc tccagattta tcagcaataa accagccagc cggaagggcc gagcgcagaa 21540
gtggtcctgc aactttatcc gcctccatcc agtctattaa ttgttgccgg gaagctagag 21600
taagtagttc gccagttaat agtttgcgca acgttgttgc cattgctaca ggcatcgtgg 21660
tgtcacgctc gtcgtttggt atggcttcat tcagctccgg ttcccaacga tcaaggcgag 21720
ttacatgatc ccccatgttg tgaaaaaaag cggttagctc cttcggtcct ccgatcgttg 21780
tcagaagtaa gttggccgca gtgttatcac tcatgcttat ggcagcactg cataattctc 21840
ttactgtcat gccatccgta agatgctttt ctgtgactgg tgagtactca accaagtcat 21900
tctgagaata gtgtatgcgg cgaccgagtt gctcttgccc ggcgtcaata cgggataata 21960
ccgcgccaca tagcagaact ttaaaagtgc tcatcattgg aaaacgttct tcggggcgaa 22020
aactctcaag gatcttaccg ctgttgagat ccagttcgat gtaacccact cgtgcaccca 22080
actgatcttc agcatctttt actttcacca gcgtttctgg gtgagcaaaa acaggaaggc 22140
aaaatgccgc aaaaaaggga ataagggcga cacggaaatg ttgaatactc atactcttcc 22200
tttttcaata ttattgaagc atttatcagg gttattgtct catgagcgga tacatatttg 22260
aatgtattta gaaaaataaa caaatagggg ttccgcgcac atttccccga aaagtgccac 22320
ctgaaattgt aaacgttaat attttgttaa aattcgcgtt aaatttttgt taaatcagct 22380
cattttttaa ccaataggcc gaaatcggca aaatccctta taaatcaaaa gaatagaccg 22440
agatagggtt gagtgttgtt ccagtttgga acaagagtcc actattaaag aacgtggact 22500
ccaacgtcaa agggcgaaaa accgtctatc agggcgatgg cccactacgt gaaccatcac 22560
cctaatcaag ttttttgggg tcgaggtgcc gtaaagcact aaatcggaac cctaaaggga 22620
gcccccgatt tagagcttga cggggaaagc cggcgaacgt ggcgagaaag gaagggaaga 22680
aagcgaaagg agcgggcgct agggcgctgg caagtgtagc ggtcacgctg cgcgtaacca 22740
ccacacccgc cgcgcttaat gcgccgctac agggcgcgtc ccattcgcca ttcaggctgc 22800
gcaactgttg ggaagggcga tcggtgcggg cctcttcgct attacgccag ccaccgcggt 22860
g 22861
<210> 14
<211> 22861
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 质粒MeV-Z+mNP+GPC
<400> 14
gcggccgcta atacgactca ctatagggcc aactttgttt ggtctgatga gtccgtgagg 60
acgaaacccg gagtcccggg tcaccaaaca aagttgggta aggatagttc aatcaatgat 120
catcttctag tgcacttagg attcaagatc ctattatcag ggacaagagc aggattaggg 180
atatccgaga cgcgtacgat gggcaataag caggcaaagg cacccgaaag caaggattca 240
cctagagcat cactgattcc cgacgcaact catctggggc cacagttctg caaatcctgt 300
tggttcgaga acaaaggcct ggtggagtgc aataaccact acctgtgcct gaactgtctg 360
acactgctgc tgagtgtgag caacagatgc ccaatctgca agatgcctct gccaacaaag 420
ctgaggcctt ctgctgcacc caccgcacca ccaactggag ccgcagacag cattagaccc 480
cccccatact caccataagc gcgcagcgct tagacgtctc gcgatcgatt agtgcgagag 540
gccgagggcc agaacaacat ccgcctacca tccatcattg ttataaaaaa cttaggattc 600
aagatcctat tatcagggac aagagcagga ttagggatat ccgagatggc cacactttta 660
aggagcttag cattgttcaa aagaaacaag gacaaaccac ccattacatc aggatccggt 720
ggagccatca gaggaatcaa acacattatt atagtaccaa tccctggaga ttcctcaatt 780
accactcgat ccagacttct ggaccggttg gtgaggttaa ttggaaaccc ggatgtgagc 840
gggcccaaac taacaggggc actaataggt atattatcct tatttgtgga gtctccaggt 900
caattgattc agaggatcac cgatgaccct gacgttagca taaggctgtt agaggttgtc 960
cagagtgacc agtcacaatc tggccttacc ttcgcatcaa gaggtaccaa catggaggat 1020
gaggcggacc aatacttttc acatgatgat ccaattagta gtgatcaatc caggttcgga 1080
tggttcggga acaaggaaat ctcagatatt gaagtgcaag accctgaggg attcaacatg 1140
attctgggta ccatcctagc ccaaatttgg gtcttgctcg caaaggcggt tacggcccca 1200
gacacggcag ctgattcgga gctaagaagg tggataaagt acacccaaca aagaagggta 1260
gttggtgaat ttagattgga gagaaaatgg ttggatgtgg tgaggaacag gattgccgag 1320
gacctctcct tacgccgatt catggtcgct ctaatcctgg atatcaagag aacacccgga 1380
aacaaaccca ggattgctga aatgatatgt gacattgata catatatcgt agaggcagga 1440
ttagccagtt ttatcctgac tattaagttt gggatagaaa ctatgtatcc tgctcttgga 1500
ctgcatgaat ttgctggtga gttatccaca cttgagtcct tgatgaacct ttaccagcaa 1560
atgggggaaa ctgcacccta catggtaatc ctggagaact caattcagaa caagttcagt 1620
gcaggatcat accctctgct ctggagctat gccatgggag taggagtgga acttgaaaac 1680
tccatgggag gtttgaactt tggccgatct tactttgatc cagcatattt tagattaggg 1740
caagagatgg taaggaggtc agctggaaag gtcagttcca cattggcatc tgaactcggt 1800
atcactgccg aggatgcaag gcttgtttca gagattgcaa tgcatactac tgaggacaag 1860
atcagtagag cggttggacc cagacaagcc caagtatcat ttctacacgg tgatcaaagt 1920
gagaatgagc taccgagatt ggggggcaag gaagatagga gggtcaaaca gagtcgagga 1980
gaagccaggg agagctacag agaaaccggg cccagcagag caagtgatgc gagagctgcc 2040
catcttccaa ccggcacacc cctagacatt gacactgcaa cggagtccag ccaagatccg 2100
caggacagtc gaaggtcagc tgacgccctg cttaggctgc aagccatggc aggaatctcg 2160
gaagaacaag gctcagacac ggacacccct atagtgtaca atgacagaaa tcttctagac 2220
taggtgcgag aggccgaggg ccagaacaac atccgcctac catccatcat tgttataaaa 2280
aacttaggaa ccaggtccac acagccgcca gcccatcaac catccactcc cacgattgga 2340
gccaatggca gaagagcagg cacgccatgt caaaaacgga ctggaatgca tccgggctct 2400
caaggccgag cccatcggct cactggccat cgaggaagct atggcagcat ggtcagaaat 2460
atcagacaac ccaggacagg agcgagccac ctgcagggaa gagaaggcag gcagttcggg 2520
tctcagcaaa ccatgcctct cagcaattgg atcaactgaa ggcggtgcac ctcgcatccg 2580
cggtcaggga cctggagaga gcgatgacga cgctgaaact ttgggaatcc ccccaagaaa 2640
tctccaggca tcaagcactg ggttacagtg ttattacgtt tatgatcaca gcggtgaagc 2700
ggttaaggga atccaagatg ctgactctat catggttcaa tcaggccttg atggtgatag 2760
caccctctca ggaggagaca atgaatctga aaacagcgat gtggatattg gcgaacctga 2820
taccgaggga tatgctatca ctgaccgggg atctgctccc atctctatgg ggttcagggc 2880
ttctgatgtt gaaactgcag aaggagggga gatccacgag ctcctgagac tccaatccag 2940
aggcaacaac tttccgaagc ttgggaaaac tctcaatgtt cctccgcccc cggaccccgg 3000
tagggccagc acttccggga cacccattaa aaagggcaca gacgcgagat tagcctcatt 3060
tggaacggag atcgcgtctt tattgacagg tggtgcaacc caatgtgctc gaaagtcacc 3120
ctcggaacca tcagggccag gtgcacctgc ggggaatgtc cccgagtgtg tgagcaatgc 3180
cgcactgata caggagtgga cacccgaatc tggtaccaca atctccccga gatcccagaa 3240
taatgaagaa gggggagact attatgatga tgagctgttc tctgatgtcc aagatattaa 3300
aacagccttg gccaaaatac acgaggataa tcagaagata atctccaagc tagaatcact 3360
gctgttattg aagggagaag ttgagtcaat taagaagcag atcaacaggc aaaatatcag 3420
catatccacc ctggaaggac acctctcaag catcatgatc gccattcctg gacttgggaa 3480
ggatcccaac gaccccactg cagatgtcga aatcaatccc gacttgaaac ccatcatagg 3540
cagagattca ggccgagcac tggccgaagt tctcaagaaa cccgttgcca gccgacaact 3600
ccaaggaatg acaaatggac ggaccagttc cagaggacag ctgctgaagg aatttcagct 3660
aaagccgatc gggaaaaaga tgagctcagc cgtcgggttt gttcctgaca ccggccctgc 3720
atcacgcagt gtaatccgct ccattataaa atccagccgg ctagaggagg atcggaagcg 3780
ttacctgatg actctccttg atgatatcaa aggagccaat gatcttgcca agttccacca 3840
gatgctgatg aagataataa tgaagtagct acagctcaac ttacctgcca accccatgcc 3900
agtcgaccca actagcctac cctccatcat tgttataaaa aacttaggaa ccaggtccac 3960
acagccgcca gcccatcaac gcgtacgatg agtgccagca aagaaatcaa gagcttcctg 4020
tggacccaga gtctgcggag ggaactgagc ggatactgta gcaacatcaa actgcaggtg 4080
gtcaaggacg ctcaggcact gctgcatggg ctggacttct ccgaggtgtc taatgtgcag 4140
cggctgatgc ggaaagaacg gagggacgat aatgacctga agcgactgcg cgacctgaac 4200
caggcagtga acaatctggt cgagctgaag agcacccagc agaaatcaat cctgcgggtc 4260
gggacactga catctgacga cctgctgatc ctggctgcag acctggagaa gctgaaatcg 4320
aaagtgatcc gcaccgaaag gccactgtcc gccggggtct acatgggcaa tctgtcttcc 4380
cagcagctgg accagaggcg ggctctgctg aacatgattg ggatgtccgg aggaaatcag 4440
ggagctagag ccgggaggga cggagtcgtg cgggtctggg acgtgaagaa tgccgaactg 4500
ctgaacaacc agttcgggac catgccaagt ctgacactgg catgcctgac taaacagggc 4560
caggtggatc tgaatgatgc agtccaggct ctgaccgacc tgggcctgat ctacaccgcc 4620
aagtacccca atactagcga cctggataga ctgacccaga gccaccccat cctgaacatg 4680
atcgacacta agaagtcctc actgaacatc agtggctata atttctccct gggggcagca 4740
gtcaaggctg gcgcatgcat gctggacggc gggaatatgc tggaaaccat caaagtgtct 4800
ccccagacca tggatggcat cctgaaatct attctgaaag tcaagaaggc cctgggaatg 4860
tttatttcag acacccccgg cgagaggaat ccatatgaga acattctgta taagatttgc 4920
ctgagtggcg acgggtggcc atacattgca agccggacat caattaccgg aagagcttgg 4980
gagaatacag tcgtggacct ggaaagcgac ggcaagcccc agaaggccga ctcaaacaac 5040
tcctcaaaga gtctgcagtc agctggcttc acagcagggc tgacttactc ccagctgatg 5100
acactgaagg acgcaatgct gcagctggac ccaaacgcta agacatggat ggccatcgag 5160
gcccggccag aagatccagt ggaaatcgca ctgtatcagc catcatccgg atgctatatc 5220
catttcttcc gggaaccaac tgatctgaag cagttcaagc aggatgcaaa gtactcccac 5280
ggaatcgatg tcaccgatct gttcgcaacc cagccaggac tgacatcagc cgtcatcgat 5340
gccctgccta ggaacatggt cattacttgc cagggctccg acgatattag gaagctgctg 5400
gagagccagg gacggaagga tatcaaactg atcgatattg ccctgtctaa gactgatagc 5460
cggaaatatg agaatgcagt ctgggatcag tacaaggacc tgtgccatat gcataccgga 5520
gtggtcgtcg agaagaagaa gaggggcgga aaggaagaga tcacacccca ctgtgccctg 5580
atggattgca tcatgttcga cgcagccgtg tccgggggcc tgaacacctc agtcctgagg 5640
gctgtcctgc caagagatat ggtgtttaga acttcaaccc caagagtcgt cctgtaattc 5700
gaactacagc tcaacttacc tgccaacccc atgccagtcg acccaactag tacaacctaa 5760
atccattata aaaaacttag gaaccaggtc cacacagccg ccagcccatc aaccatccac 5820
tcccacgatt ggaggccggc catgggccag attgtcacat tctttcagga agtgccacac 5880
gtcattgagg aggtcatgaa catcgtgctg attgctctgt cagtgctggc agtgctgaaa 5940
ggactgtaca acttcgctac ctgtggactg gtgggactgg tcacattcct gctgctgtgc 6000
ggcagaagtt gcactacctc actgtacaaa ggagtgtacg agctgcagac tctggaactg 6060
aacatggaga cactgaatat gacaatgcct ctgagctgca ccaagaataa tagccaccac 6120
tatatcatgg tcgggaacga aaccggcctg gaactgaccc tgacaaacac cagcatcatt 6180
aaccacaagt tctgcaatct gagcgacgct cacaagaaga acctgtatga ccacgctctg 6240
atgtccatca tcagtacctt tcacctgtcc atccccaatt tcaaccagta cgaggcaatg 6300
tcatgcgact tcaacggggg caagatcagt gtccagtaca acctgagcca ctcctacgcc 6360
ggcgacgcag ccaaccactg cggaactgtc gccaatggcg tgctgcagac attcatgagg 6420
atggcatggg ggggatctta catcgcactg gatagcggca ggggcaattg ggattgcatc 6480
atgacttcct atcagtatct gattatccag aatactacat gggaggatca ttgccagttc 6540
agtcggccca gccctattgg atatctgggg ctgctgtcac agagaacacg ggatatctat 6600
atttcaagac gcctgctggg cacattcact tggacactgt cagacagtga gggcaaggat 6660
actccagggg gctactgcct gacacgatgg atgctgatcg aagcagagct gaaatgcttc 6720
ggcaataccg cagtggccaa gtgcaacgag aaacacgacg aggagttctg cgacatgctg 6780
aggctgttcg acttcaacaa acaggctatc cagagactga aggcagaagc ccagatgtca 6840
atccagctga tcaacaaggc agtgaacgcc ctgatcaacg accagctgat catgaagaac 6900
cacctgagag acattatggg catcccctac tgtaattaca gcaagtattg gtacctgaac 6960
cacactacaa ccgggagaac atccctgccc aagtgctggc tggtcagcaa tgggagttat 7020
ctgaatgaaa cccatttcag cgacgatatc gaacagcagg ctgacaacat gatcacagag 7080
atgctgcaga aagagtacat ggaaagacag ggcaagacac cactgggact ggtcgatctg 7140
ttcgtcttct ccactagctt ctatctgatt tccatcttcc tgcacctggt gaagatcccc 7200
actcataggc acattgtcgg caagagttgc cctaaacccc ataggctgaa tcacatgggg 7260
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tcggcatggg acatcaaagg gtcgatcgct ccgatacaac ccaccaccta cagtgatggc 7500
aggctggtgc cccaggtcag agtcatagat cctggtctag gcgacaggaa ggatgaatgc 7560
tttatgtaca tgtttctgct gggggttgtt gaggacagcg attccctagg gcctccaatc 7620
gggcgagcat ttgggttcct gcccttaggt gttggcagat ccacagcaaa gcccgaaaaa 7680
ctcctcaaag aggccactga gcttgacata gttgttagac gtacagcagg gctcaatgaa 7740
aaactggtgt tctacaacaa caccccacta actctcctca caccttggag aaaggtccta 7800
acaacaggga gtgtcttcaa cgcaaaccaa gtgtgcaatg cggttaatct gataccgctc 7860
gataccccgc agaggttccg tgttgtttat atgagcatca cccgtctttc ggataacggg 7920
tattacaccg ttcctagaag aatgctggaa ttcagatcgg tcaatgcagt ggccttcaac 7980
ctgctggtga cccttaggat tgacaaggcg ataggccctg ggaagatcat cgacaataca 8040
gagcaacttc ctgaggcaac atttatggtc cacatcggga acttcaggag aaagaagagt 8100
gaagtctact ctgccgatta ttgcaaaatg aaaatcgaaa agatgggcct ggtttttgca 8160
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cagccatcag ttcctcaaga attccgcatt tacgacgacg tgatcataaa tgatgaccaa 8400
ggactattca aagttctgta gaccgtagtg cccagcaatg cccgaaaacg acccccctca 8460
caatgacagc cagaaggccc ggacaaaaaa gccccctccg aaagactcca cggaccaagc 8520
gagaggccag ccagcagccg acggcaagcg cgaacaccag gcggccccag cacagaacag 8580
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ccaatcccgc cggctccccc ggtgcccaca ggcagggaca ccaacccccg aacagaccca 9000
gcacccaacc atcgacaatc caagacgggg gggccccccc aaaaaaaggc ccccaggggc 9060
cgacagccag caccgcgagg aagcccaccc accccacaca cgaccacggc aaccaaacca 9120
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aggccacaac ccgcgcaccc cagccccgat ccggcgggga gccacccaac ccgaaccagc 9240
acccaagagc gatccccgaa ggacccccga accgcaaagg acatcagtat cccacagcct 9300
ctccaagtcc cccggtctcc tcctcttctc gaagggacca aaagatcaat ccaccacacc 9360
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tccaatgtcc atcatgggtc tcaaggtgaa cgtctctgcc atattcatgg cagtactgtt 9480
aactctccaa acacccaccg gtcaaatcca ttggggcaat ctctctaaga taggggtggt 9540
aggaatagga agtgcaagct acaaagttat gactcgttcc agccatcaat cattagtcat 9600
aaaattaatg cccaatataa ctctcctcaa taactgcacg agggtagaga ttgcagaata 9660
caggagacta ctgagaacag ttttggaacc aattagagat gcacttaatg caatgaccca 9720
gaatataaga ccggttcaga gtgtagcttc aagtaggaga cacaagagat ttgcgggagt 9780
agtcctggca ggtgcggccc taggcgttgc cacagctgct cagataacag ccggcattgc 9840
acttcaccag tccatgctga actctcaagc catcgacaat ctgagagcga gcctggaaac 9900
tactaatcag gcaattgaga caatcagaca agcagggcag gagatgatat tggctgttca 9960
gggtgtccaa gactacatca ataatgagct gataccgtct atgaaccaac tatcttgtga 10020
tttaatcggc cagaagctcg ggctcaaatt gctcagatac tatacagaaa tcctgtcatt 10080
atttggcccc agtttacggg accccatatc tgcggagata tctatccagg ctttgagcta 10140
tgcgcttgga ggagacatca ataaggtgtt agaaaagctc ggatacagtg gaggtgattt 10200
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ctacttcatt gtcctcagta tagcctatcc gacgctgtcc gagattaagg gggtgattgt 10320
ccaccggcta gagggggtct cgtacaacat aggctctcaa gagtggtata ccactgtgcc 10380
caagtatgtt gcaacccaag ggtaccttat ctcgaatttt gatgagtcat cgtgtacttt 10440
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gaaccggttc attttatcac aagggaacct aatagccaat tgtgcatcaa tcctttgcaa 10620
gtgttacaca acaggaacga tcattaatca agaccctgac aagatcctaa catacattgc 10680
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gttggacgta gggacaaatc tggggaatgc aattgctaag ttggaggatg ccaaggaatt 10860
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ctgacctagt gaaattaatc tctgacaaga ttaaattcct taatccggat agggagtacg 11640
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accgagtgtt tgaagtaggt gttatcagaa atccgggttt gggggctccg gtgttccata 12060
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catctcacag aggtgttatc gctgacaatc aagcaaaatg ggctgtcccg acaacacgaa 12360
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cactctgcga gaatcccgag tgggcaccat tgaaggataa caggattcct tcatacgggg 12480
tcttgtctgt tgatctgagt ctgacagttg agcttaaaat caaaattgct tcgggattcg 12540
ggccattgat cacacacggt tcagggatgg acctatacaa atccaaccac aacaatgtgt 12600
attggctgac tatcccgcca atgaagaacc tagccttagg tgtaatcaac acattggagt 12660
ggataccgag attcaaggtt agtccctacc tcttcactgt cccaattaag gaagcaggcg 12720
aagactgcca tgccccaaca tacctacctg cggaggtgga tggtgatgtc aaactcagtt 12780
ccaatctggt gattctacct ggtcaagatc tccaatatgt tttggcaacc tacgatactt 12840
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tttatccttt taggttgcct ataaaggggg tccccatcga attacaagtg gaatgcttca 12960
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aggcataccc actagtgtga aatagacatc agaattaaga aaaacgtagg gtccaagtgg 13200
ttccccgtta tggactcgct atctgtcaac cagatcttat accctgaagt tcacctagat 13260
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tacagcctgg aggaccctac actgtgtcag aacatcaagc accgcctaaa aaacggattt 13380
tccaaccaaa tgattataaa caatgtggaa gttgggaatg tcatcaagtc caagcttagg 13440
agttatccgg cccactctca tattccatat ccaaattgta atcaggattt atttaacata 13500
gaagacaaag agtcaacgag gaagatccgt gaactcctca aaaaggggaa ttcgctgtac 13560
tccaaagtca gtgataaggt tttccaatgc ttaagggaca ctaactcacg gcttggccta 13620
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gtgattaaat cacaaaccca tacttgccat aggaggagac acacacctgt attcttcact 13800
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gctgcttatg agagcggagt aaggattgct tcgttagtgc aaggggacaa tcagaccata 15540
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caaaaggcca gcaaaaggcc aggaaccgta aaaaggccgc gttgctggcg tttttccata 20580
ggctcggccc ccctgacgag catcacaaaa atcgacgctc aagtcagagg tggcgaaacc 20640
cgacaggact ataaagatac caggcgttcc cccctggaag ctccctcgtg cgctctcctg 20700
ttccgaccct gccgcttacc ggatacctgt ccgcctttct cccttcggga agcgtggcgc 20760
tttctcaatg ctcacgctgt aggtatctca gttcggtgta ggtcgttcgc tccaagctgg 20820
gctgtgtgca cgaacccccc gttcagcccg accgctgcgc cttatccggt aactatcgtc 20880
ttgagtccaa cccggtaaga cacgacttat cgccactggc agcagccact ggtaacagga 20940
ttagcagagc gaggtatgta ggcggtgcta cagagttctt gaagtggtgg cctaactacg 21000
gctacactag aaggacagta tttggtatct gcgctctgct gaagccagtt accttcggaa 21060
aaagagttgg tagctcttga tccggcaaac aaaccaccgc tggtagcggt ggtttttttg 21120
tttgcaagca gcagattacg cgcagaaaaa aaggatctca agaagatcct ttgatctttt 21180
ctacggggtc tgacgctcag tggaacgaaa actcacgtta agggattttg gtcatgagat 21240
tatcaaaaag gatcttcacc tagatccttt taaattaaaa atgaagtttt aaatcaatct 21300
aaagtatata tgagtaaact tggtctgaca gttaccaatg cttaatcagt gaggcaccta 21360
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ctacgatacg ggagggctta ccatctggcc ccagtgctgc aatgataccg cgagacccac 21480
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taagtagttc gccagttaat agtttgcgca acgttgttgc cattgctaca ggcatcgtgg 21660
tgtcacgctc gtcgtttggt atggcttcat tcagctccgg ttcccaacga tcaaggcgag 21720
ttacatgatc ccccatgttg tgaaaaaaag cggttagctc cttcggtcct ccgatcgttg 21780
tcagaagtaa gttggccgca gtgttatcac tcatgcttat ggcagcactg cataattctc 21840
ttactgtcat gccatccgta agatgctttt ctgtgactgg tgagtactca accaagtcat 21900
tctgagaata gtgtatgcgg cgaccgagtt gctcttgccc ggcgtcaata cgggataata 21960
ccgcgccaca tagcagaact ttaaaagtgc tcatcattgg aaaacgttct tcggggcgaa 22020
aactctcaag gatcttaccg ctgttgagat ccagttcgat gtaacccact cgtgcaccca 22080
actgatcttc agcatctttt actttcacca gcgtttctgg gtgagcaaaa acaggaaggc 22140
aaaatgccgc aaaaaaggga ataagggcga cacggaaatg ttgaatactc atactcttcc 22200
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ctgaaattgt aaacgttaat attttgttaa aattcgcgtt aaatttttgt taaatcagct 22380
cattttttaa ccaataggcc gaaatcggca aaatccctta taaatcaaaa gaatagaccg 22440
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ccaacgtcaa agggcgaaaa accgtctatc agggcgatgg cccactacgt gaaccatcac 22560
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ccacacccgc cgcgcttaat gcgccgctac agggcgcgtc ccattcgcca ttcaggctgc 22800
gcaactgttg ggaagggcga tcggtgcggg cctcttcgct attacgccag ccaccgcggt 22860
g 22861
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<211> 18967
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 质粒pTM1-MVSchwarz pTM-MVSchw (GenBank: FW366202.1)
<400> 15
gcggccgcta atacgactca ctatagggcc aactttgttt ggtctgatga gtccgtgagg 60
acgaaacccg gagtcccggg tcaccaaaca aagttgggta aggatagttc aatcaatgat 120
catcttctag tgcacttagg attcaagatc ctattatcag ggacaagagc aggattaggg 180
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ccaatccctg gagattcctc aattaccact cgatccagac ttctggaccg gttggtgagg 360
ttaattggaa acccggatgt gagcgggccc aaactaacag gggcactaat aggtatatta 420
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accatagccg taacaaaaag ggtacccagc acatggccct acaaccttaa gaaacgggaa 11700
gctgctagag taactagaga ttactttgta attcttaggc aaaggctaca tgatattggc 11760
catcacctca aggcaaatga gacaattgtt tcatcacatt tttttgtcta ttcaaaagga 11820
atatattatg atgggctact tgtgtcccaa tcactcaaga gcatcgcaag atgtgtattc 11880
tggtcagaga ctatagttga tgaaacaagg gcagcatgca gtaatattgc tacaacaatg 11940
gctaaaagca tcgagagagg ttatgaccgt taccttgcat attccctgaa cgtcctaaaa 12000
gtgatacagc aaattctgat ctctcttggc ttcacaatca attcaaccat gacccgggat 12060
gtagtcatac ccctcctcac aaacaacgac ctcttaataa ggatggcact gttgcccgct 12120
cctattgggg ggatgaatta tctgaatatg agcaggctgt ttgtcagaaa catcggtgat 12180
ccagtaacat catcaattgc tgatctcaag agaatgattc tcgcctcact aatgcctgaa 12240
gagaccctcc atcaagtaat gacacaacaa ccgggggact cttcattcct agactgggct 12300
agcgaccctt actcagcaaa tcttgtatgt gtccagagca tcactagact cctcaagaac 12360
ataactgcaa ggtttgtcct gatccatagt ccaaacccaa tgttaaaagg attattccat 12420
gatgacagta aagaagagga cgagggactg gcggcattcc tcatggacag gcatattata 12480
gtacctaggg cagctcatga aatcctggat catagtgtca caggggcaag agagtctatt 12540
gcaggcatgc tggataccac aaaaggcttg attcgagcca gcatgaggaa gggggggtta 12600
acctctcgag tgataaccag attgtccaat tatgactatg aacaattcag agcagggatg 12660
gtgctattga caggaagaaa gagaaatgtc ctcattgaca aagagtcatg ttcagtgcag 12720
ctggcgagag ctctaagaag ccatatgtgg gcgaggctag ctcgaggacg gcctatttac 12780
ggccttgagg tccctgatgt actagaatct atgcgaggcc accttattcg gcgtcatgag 12840
acatgtgtca tctgcgagtg tggatcagtc aactacggat ggttttttgt cccctcgggt 12900
tgccaactgg atgatattga caaggaaaca tcatccttga gagtcccata tattggttct 12960
accactgatg agagaacaga catgaagctt gccttcgtaa gagccccaag tcgatccttg 13020
cgatctgctg ttagaatagc aacagtgtac tcatgggctt acggtgatga tgatagctct 13080
tggaacgaag cctggttgtt ggctaggcaa agggccaatg tgagcctgga ggagctaagg 13140
gtgatcactc ccatctcaac ttcgactaat ttagcgcata ggttgaggga tcgtagcact 13200
caagtgaaat actcaggtac atcccttgtc cgagtggcga ggtataccac aatctccaac 13260
gacaatctct catttgtcat atcagataag aaggttgata ctaactttat ataccaacaa 13320
ggaatgcttc tagggttggg tgttttagaa acattgtttc gactcgagaa agataccgga 13380
tcatctaaca cggtattaca tcttcacgtc gaaacagatt gttgcgtgat cccgatgata 13440
gatcatccca ggatacccag ctcccgcaag ctagagctga gggcagagct atgtaccaac 13500
ccattgatat atgataatgc acctttaatt gacagagatg caacaaggct atacacccag 13560
agccatagga ggcaccttgt ggaatttgtt acatggtcca caccccaact atatcacatt 13620
ttagctaagt ccacagcact atctatgatt gacctggtaa caaaatttga gaaggaccat 13680
atgaatgaaa tttcagctct cataggggat gacgatatca atagtttcat aactgagttt 13740
ctgctcatag agccaagatt attcactatc tacttgggcc agtgtgcggc catcaattgg 13800
gcatttgatg tacattatca tagaccatca gggaaatatc agatgggtga gctgttgtca 13860
tcgttccttt ctagaatgag caaaggagtg tttaaggtgc ttgtcaatgc tctaagccac 13920
ccaaagatct acaagaaatt ctggcattgt ggtattatag agcctatcca tggtccttca 13980
cttgatgctc aaaacttgca cacaactgtg tgcaacatgg tttacacatg ctatatgacc 14040
tacctcgacc tgttgttgaa tgaagagtta gaagagttca catttctctt gtgtgaaagc 14100
gacgaggatg tagtaccgga cagattcgac aacatccagg caaaacactt atgtgttctg 14160
gcagatttgt actgtcaacc agggacctgc ccaccaattc gaggtctaag accggtagag 14220
aaatgtgcag ttctaaccga ccatatcaag gcagaggcta tgttatctcc agcaggatct 14280
tcgtggaaca taaatccaat tattgtagac cattactcat gctctctgac ttatctccgg 14340
cgaggatcga tcaaacagat aagattgaga gttgatccag gattcatttt cgacgccctc 14400
gctgaggtaa atgtcagtca gccaaagatc ggcagcaaca acatctcaaa tatgagcatc 14460
aaggctttca gacccccaca cgatgatgtt gcaaaattgc tcaaagatat caacacaagc 14520
aagcacaatc ttcccatttc agggggcaat ctcgccaatt atgaaatcca tgctttccgc 14580
agaatcgggt tgaactcatc tgcttgctac aaagctgttg agatatcaac attaattagg 14640
agatgccttg agccagggga ggacggcttg ttcttgggtg agggatcggg ttctatgttg 14700
atcacttata aagagatact taaactaaac aagtgcttct ataatagtgg ggtttccgcc 14760
aattctagat ctggtcaaag ggaattagca ccctatccct ccgaagttgg ccttgtcgaa 14820
cacagaatgg gagtaggtaa tattgtcaaa gtgctcttta acgggaggcc cgaagtcacg 14880
tgggtaggca gtgtagattg cttcaatttc atagttagta atatccctac ctctagtgtg 14940
gggtttatcc attcagatat agagaccttg cctgacaaag atactataga gaagctagag 15000
gaattggcag ccatcttatc gatggctctg ctcctgggca aaataggatc aatactggtg 15060
attaagctta tgcctttcag cggggatttt gttcagggat ttataagtta tgtagggtct 15120
cattatagag aagtgaacct tgtataccct agatacagca acttcatctc tactgaatct 15180
tatttggtta tgacagatct caaggctaac cggctaatga atcctgaaaa gattaagcag 15240
cagataattg aatcatctgt gaggacttca cctggactta taggtcacat cctatccatt 15300
aagcaactaa gctgcataca agcaattgtg ggagacgcag ttagtagagg tgatatcaat 15360
cctactctga aaaaacttac acctatagag caggtgctga tcaattgcgg gttggcaatt 15420
aacggaccta agctgtgcaa agaattgatc caccatgatg ttgcctcagg gcaagatgga 15480
ttgcttaatt ctatactcat cctctacagg gagttggcaa gattcaaaga caaccaaaga 15540
agtcaacaag ggatgttcca cgcttacccc gtattggtaa gtagcaggca acgagaactt 15600
atatctagga tcacccgcaa attctggggg cacattcttc tttactccgg gaacaaaaag 15660
ttgataaata agtttatcca gaatctcaag tccggctatc tgatactaga cttacaccag 15720
aatatcttcg ttaagaatct atccaagtca gagaaacaga ttattatgac ggggggtttg 15780
aaacgtgagt gggtttttaa ggtaacagtc aaggagacca aagaatggta taagttagtc 15840
ggatacagtg ccctgattaa ggactaattg gttgaactcc ggaaccctaa tcctgcccta 15900
ggtggttagg cattatttgc aatatattaa agaaaacttt gaaaatacga agtttctatt 15960
cccagctttg tctggtggcc ggcatggtcc cagcctcctc gctggcgccg gctgggcaac 16020
attccgaggg gaccgtcccc tcggtaatgg cgaatgggac gcggccgatc cggctgctaa 16080
caaagcccga aaggaagctg agttggctgc tgccaccgct gagcaataac tagcataacc 16140
ccttggggcc tctaaacggg tcttgagggg ttttttgctg aaaggaggaa ctatatccgg 16200
atgcggccgc gggccctatg gtacccagct tttgttccct ttagtgaggg ttaattccga 16260
gcttggcgta atcatggtca tagctgtttc ctgtgtgaaa ttgttatccg ctcacaattc 16320
cacacaacat aggagccgga agcataaagt gtaaagcctg gggtgcctaa tgagtgaggt 16380
aactcacatt aattgcgttg cgctcactgc ccgctttcca gtcgggaaac ctgtcgtgcc 16440
agctgcatta atgaatcggc caacgcgcgg ggagaggcgg tttgcgtatt gggcgctctt 16500
ccgcttcctc gctcactgac tcgctgcgct cggtcgttcg gctgcggcga gcggtatcag 16560
ctcactcaaa ggcggtaata cggttatcca cagaatcagg ggataacgca ggaaagaaca 16620
tgtgagcaaa aggccagcaa aaggccagga accgtaaaaa ggccgcgttg ctggcgtttt 16680
tccataggct cggcccccct gacgagcatc acaaaaatcg acgctcaagt cagaggtggc 16740
gaaacccgac aggactataa agataccagg cgttcccccc tggaagctcc ctcgtgcgct 16800
ctcctgttcc gaccctgccg cttaccggat acctgtccgc ctttctccct tcgggaagcg 16860
tggcgctttc tcaatgctca cgctgtaggt atctcagttc ggtgtaggtc gttcgctcca 16920
agctgggctg tgtgcacgaa ccccccgttc agcccgaccg ctgcgcctta tccggtaact 16980
atcgtcttga gtccaacccg gtaagacacg acttatcgcc actggcagca gccactggta 17040
acaggattag cagagcgagg tatgtaggcg gtgctacaga gttcttgaag tggtggccta 17100
actacggcta cactagaagg acagtatttg gtatctgcgc tctgctgaag ccagttacct 17160
tcggaaaaag agttggtagc tcttgatccg gcaaacaaac caccgctggt agcggtggtt 17220
tttttgtttg caagcagcag attacgcgca gaaaaaaagg atctcaagaa gatcctttga 17280
tcttttctac ggggtctgac gctcagtgga acgaaaactc acgttaaggg attttggtca 17340
tgagattatc aaaaaggatc ttcacctaga tccttttaaa ttaaaaatga agttttaaat 17400
caatctaaag tatatatgag taaacttggt ctgacagtta ccaatgctta atcagtgagg 17460
cacctatctc agcgatctgt ctatttcgtt catccatagt tgcctgactg cccgtcgtgt 17520
agataactac gatacgggag ggcttaccat ctggccccag tgctgcaatg ataccgcgag 17580
acccacgctc accggctcca gatttatcag caataaacca gccagccgga agggccgagc 17640
gcagaagtgg tcctgcaact ttatccgcct ccatccagtc tattaattgt tgccgggaag 17700
ctagagtaag tagttcgcca gttaatagtt tgcgcaacgt tgttgccatt gctacaggca 17760
tcgtggtgtc acgctcgtcg tttggtatgg cttcattcag ctccggttcc caacgatcaa 17820
ggcgagttac atgatccccc atgttgtgaa aaaaagcggt tagctccttc ggtcctccga 17880
tcgttgtcag aagtaagttg gccgcagtgt tatcactcat gcttatggca gcactgcata 17940
attctcttac tgtcatgcca tccgtaagat gcttttctgt gactggtgag tactcaacca 18000
agtcattctg agaatagtgt atgcggcgac cgagttgctc ttgcccggcg tcaatacggg 18060
ataataccgc gccacatagc agaactttaa aagtgctcat cattggaaaa cgttcttcgg 18120
ggcgaaaact ctcaaggatc ttaccgctgt tgagatccag ttcgatgtaa cccactcgtg 18180
cacccaactg atcttcagca tcttttactt tcaccagcgt ttctgggtga gcaaaaacag 18240
gaaggcaaaa tgccgcaaaa aagggaataa gggcgacacg gaaatgttga atactcatac 18300
tcttcctttt tcaatattat tgaagcattt atcagggtta ttgtctcatg agcggataca 18360
tatttgaatg tatttagaaa aataaacaaa taggggttcc gcgcacattt ccccgaaaag 18420
tgccacctga aattgtaaac gttaatattt tgttaaaatt cgcgttaaat ttttgttaaa 18480
tcagctcatt ttttaaccaa taggccgaaa tcggcaaaat cccttataaa tcaaaagaat 18540
agaccgagat agggttgagt gttgttccag tttggaacaa gagtccacta ttaaagaacg 18600
tggactccaa cgtcaaaggg cgaaaaaccg tctatcaggg cgatggccca ctacgtgaac 18660
catcacccta atcaagtttt ttggggtcga ggtgccgtaa agcactaaat cggaacccta 18720
aagggagccc ccgatttaga gcttgacggg gaaagccggc gaacgtggcg agaaaggaag 18780
ggaagaaagc gaaaggagcg ggcgctaggg cgctggcaag tgtagcggtc acgctgcgcg 18840
taaccaccac acccgccgcg cttaatgcgc cgctacaggg cgcgtcccat tcgccattca 18900
ggctgcgcaa ctgttgggaa gggcgatcgg tgcgggcctc ttcgctatta cgccagccac 18960
cgcggtg 18967
<210> 16
<211> 115
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 无插入的ATU序列
<400> 16
cttaggaacc aggtccacac agccgccagc ccatcaacgc gtacgatgta ggcgcgcagc 60
gcttagacgt ctcgcgatcg atactagtac aacctaaatc cattataaaa aactt 115
<210> 17
<211> 1591
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 具有密码子优化的cDNA GPC插入片段的ATU序列
<400> 17
cttaggaacc aggtccacac agccgccagc ccatcaacgc gtacgatgat gggccagatt 60
gtcacattct ttcaggaagt gccacacgtc attgaggagg tcatgaacat cgtgctgatt 120
gctctgtcag tgctggcagt gctgaaagga ctgtacaact tcgctacctg tggactggtg 180
ggactggtca cattcctgct gctgtgcggc agaagttgca ctacctcact gtacaaagga 240
gtgtacgagc tgcagactct ggaactgaac atggagacac tgaatatgac aatgcctctg 300
agctgcacca agaataatag ccaccactat atcatggtcg ggaacgaaac cggcctggaa 360
ctgaccctga caaacaccag catcattaac cacaagttct gcaatctgag cgacgctcac 420
aagaagaacc tgtatgacca cgctctgatg tccatcatca gtacctttca cctgtccatc 480
cccaatttca accagtacga ggcaatgtca tgcgacttca acgggggcaa gatcagtgtc 540
cagtacaacc tgagccactc ctacgccggc gacgcagcca accactgcgg aactgtcgcc 600
aatggcgtgc tgcagacatt catgaggatg gcatgggggg gatcttacat cgcactggat 660
agcggcaggg gcaattggga ttgcatcatg acttcctatc agtatctgat tatccagaat 720
actacatggg aggatcattg ccagttcagt cggcccagcc ctattggata tctggggctg 780
ctgtcacaga gaacacggga tatctatatt tcaagacgcc tgctgggcac attcacttgg 840
acactgtcag acagtgaggg caaggatact ccagggggct actgcctgac acgatggatg 900
ctgatcgaag cagagctgaa atgcttcggc aataccgcag tggccaagtg caacgagaaa 960
cacgacgagg agttctgcga catgctgagg ctgttcgact tcaacaaaca ggctatccag 1020
agactgaagg cagaagccca gatgtcaatc cagctgatca acaaggcagt gaacgccctg 1080
atcaacgacc agctgatcat gaagaaccac ctgagagaca ttatgggcat cccctactgt 1140
aattacagca agtattggta cctgaaccac actacaaccg ggagaacatc cctgcccaag 1200
tgctggctgg tcagcaatgg gagttatctg aatgaaaccc atttcagcga cgatatcgaa 1260
cagcaggctg acaacatgat cacagagatg ctgcagaaag agtacatgga aagacagggc 1320
aagacaccac tgggactggt cgatctgttc gtcttctcca ctagcttcta tctgatttcc 1380
atcttcctgc acctggtgaa gatccccact cataggcaca ttgtcggcaa gagttgccct 1440
aaaccccata ggctgaatca catggggatt tgtagttgcg gcctgtataa gcagcctggc 1500
gtgcctgtga aatggaagag atgataggcg cgcagcgctt agacgtctcg cgatcgatac 1560
tagtacaacc taaatccatt ataaaaaact t 1591
PCT/RO/134表
Figure QDA0002548019740000011

Claims (30)

1.核酸构建体，其包含：
(1)编码麻疹病毒(MeV)的全长反基因组(+)RNA链的cDNA分子；
(2)编码拉沙病毒(LASV)的至少一种多肽或其抗原性片段的第一异源多核苷酸，所述至少一种多肽选自：核蛋白(NP)、突变核蛋白(mNP)、糖蛋白前体(GPC)和锌结合蛋白(Z)；
其中，所述第一异源多核苷酸可操作地克隆到插入MeV的反基因组(+)RNA的cDNA内的附加转录单元(ATU)内，特别是插入位于MeV的P基因和M基因之间的ATU内，尤其是插入MeV的P基因和M基因之间的ATU2内。
2.根据权利要求1所述的核酸构建体，其中，所述核酸构建体进一步包含第二异源多核苷酸，所述第二异源多核苷酸编码LASV的至少一种多肽或其抗原性片段，所述至少一种多肽选自：GPC蛋白、NP蛋白、mNP蛋白和Z蛋白，所述第二异源多核苷酸可操作地克隆到另一个ATU中，所述另一个ATU位于不同于第一个克隆的异源多核苷酸的位置，优选在MeV的N基因上游，所述另一个ATU特别地为插入到MeV的N基因的上游的ATU1，所述第二异源多核苷酸编码至少一种特别地与第一异源多核苷酸编码的至少一种多肽不同的多肽或其抗原性片段。
3.根据权利要求1或2所述的核酸构建体，其中，所述编码GPC蛋白、NP蛋白、mNP蛋白和/或Z蛋白或其抗原性片段的异源多核苷酸来自LASV菌株Josiah，或衍生自LASV菌株Josiah，特别地，所述异源多核苷酸是由Genbank J04324.1和/或U73034.2的序列产生或衍生的。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的核酸构建体，其中，所述第一异源多核苷酸和/或第二异源多核苷酸编码mNP蛋白或其抗原性片段，所述mNP蛋白具有突变的核酸外切酶结构域，特别地，编码的mNP蛋白的氨基酸序列在氨基酸残基389和/或392上突变，优选所述突变为在SEQ ID No：3的氨基酸残基389和392上的取代，特别地，编码的mNP蛋白是SEQ ID No：5的序列，特别地，编码mNP蛋白的异源多核苷酸包含SEQ ID No：6。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的核酸构建体，其中，所述编码GPC蛋白、NP蛋白、mNP蛋白和/或Z蛋白或其抗原性片段的异源多核苷酸具有密码子优化的开放阅读框(ORF)，特别地，所述异源多核苷酸包含以下序列中的至少一个：
-编码GPC蛋白的SEQ ID No：2；和/或
-编码NP蛋白的SEQ ID No：4；和/或
-编码mNP蛋白的SEQ ID No：6；和/或
-编码Z蛋白的SEQ ID No：8。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的核酸构建体，其中，所述异源多核苷酸编码：
-SEQ ID No：1的GPC蛋白或其抗原性片段；和/或
-SEQ ID No：3的NP蛋白或其抗原性片段；和/或
-SEQ ID No：5的mNP蛋白或其抗原性片段；和/或
-SEQ ID No：7的Z蛋白或其抗原性片段。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的核酸构建体，其中，所述核酸构建体从5'末端至3'末端包含以下多核苷酸：
(a)编码MeV的N蛋白的多核苷酸；
(b)编码MeV的P蛋白的多核苷酸；
(c)第一异源多核苷酸，所述第一异源多核苷酸编码选自LASV的GPC蛋白、NP蛋白、mNP蛋白和Z蛋白的至少一种多肽或其抗原性片段；特别地编码单个多肽，所述单个多肽是GPC蛋白或其抗原性片段；或编码至少两个多肽，所述两个多肽是GPC蛋白或其抗原性片段，和NP蛋白或mNP蛋白或其抗原性片段；特别地编码GPC蛋白和mNP蛋白，其中，第一多核苷酸特别地可操作地克隆在ATU，特别是ATU2中；
(d)编码MeV的M蛋白的多核苷酸；
(e)编码MeV的F蛋白的多核苷酸；
(f)编码MeV的H蛋白的多核苷酸；
(g)编码MeV的L蛋白的多核苷酸；
在病毒复制和转录调节因子如MeV前导序列和尾随序列的控制下，所述多核苷酸在核酸构建体内可操作地连接。
8.根据权利要求2至6中任一项所述的核酸构建体，其中，所述核酸构建体从5’末端至3’末端包含以下多核苷酸：
(a)第二异源多核苷酸，所述第二异源多核苷酸编码选自LASV的GPC蛋白、NP蛋白、mNP蛋白和Z蛋白的至少一种多肽或其抗原性片段；特别地编码Z蛋白或其抗原性片段，其中，所述第二多核苷酸可操作地克隆在位于MeV的N基因上游的ATU中，特别是在ATU1中；
(b)编码MeV的N蛋白的多核苷酸；
(c)编码MeV的P蛋白的多核苷酸；
(d)第一异源多核苷酸，所述第一异源多核苷酸编码选自LASV的GPC蛋白、NP蛋白、mNP蛋白和Z蛋白的至少一种多肽或其抗原性片段；特别地编码单个多肽，所述单个多肽是GPC蛋白或其抗原性片段；或编码至少两个多肽，所述两个多肽是GPC蛋白或其抗原性片段，和NP蛋白或mNP蛋白或其抗原性片段；特别地编码GPC蛋白和mNP蛋白，其中，所述第一多核苷酸特别地可操作地克隆在ATU，特别是ATU2中；
(e)编码MeV的M蛋白的多核苷酸；
(f)编码MeV的F蛋白的多核苷酸；
(g)编码MeV的H蛋白的多核苷酸；
(h)编码MeV的L蛋白的多核苷酸，
在病毒复制和转录调节因子如MeV前导序列和尾随序列的控制下，所述多核苷酸在核酸构建体内可操作地连接。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的核酸构建体，其中，所述第一异源多核苷酸从5’末端至3’末端包含：
(a)编码LASV的NP蛋白或mNP蛋白或其抗原性片段的核酸，特别地，对于NP蛋白，核酸为SEQ ID No：4，或对于mNP蛋白，核酸为SEQ ID No：6；和
(b)编码LASV的GPC蛋白或其抗原性片段的核酸，特别是核酸为SEQ ID No：2；
所述第一异源多核苷酸可操作地克隆在MeV的P基因和M基因之间，特别是在ATU中，尤其是在ATU2中。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的核酸构建体，其中，所述第一异源多核苷酸从5’末端至3’末端包含：
(a)编码mNP蛋白的SEQ ID No：6的核酸；和
(b)编码GPC蛋白的SEQ ID No：2的核酸；
第一异源多核苷酸序列可操作地克隆在MeV的基因P和基因M之间，特别是在ATU中，尤其是在ATU2中。
11.根据权利要求2至10中任一项所述的核酸构建体，其中，所述第二异源多核苷酸编码LASV的Z蛋白或其抗原性片段，所述第一异源多核苷酸编码LASV的GPC蛋白或其抗原性片段，特别地，所述第二异源多核苷酸的序列包含SEQ ID No：8的序列，所述第一异源多核苷酸的序列包含SEQ ID No：2的序列。
12.根据权利要求11所述的核酸构建体，其中，所述第一异源多核苷酸和所述第二异源多核苷酸可操作地克隆在位于MeV的cDNA分子中不同位置的ATU内，特别地，所述第一异源多核苷酸可操作地克隆在ATU2内，所述第二异源多核苷酸可操作地克隆在ATU1内。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的核酸构建体，其中，所述麻疹病毒是选自以下的减毒病毒株：Schwarz菌株、Zagreb菌株、AIK-C菌株、Moraten菌株、Philips菌株、Beckenham 4A菌株、Beckenham 16菌株、Edmonston种子A菌株、Edmonston种子B菌株、CAM-70菌株、TD 97菌株、Leningrad-16菌株、上海191菌株和Belgrade菌株，特别是Schwarz菌株。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的核酸构建体，其中，所述第一异源多核苷酸的序列包含SEQ ID No：2、SEQ ID No：4、SEQ ID No：6和/或SEQ ID No：8中的至少一个，优选至少包含SEQ ID No：2，特别是SEQ ID No：2和SEQ ID No：6。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的核酸构建体，其中，所述核酸构建体的重组cDNA序列选自：
-SEQ ID No：9(构建体MeV-GPC)；
-SEQ ID No：10(构建体MeV-NP-GPC)；
-SEQ ID No：11(构建体MeV-mNP-GPC)；
-SED ID No：12(构建体Z-MeV-GPC)；
-SEQ ID No：13(构建体Z-MeV-NP-GPC)；和
-SEQ ID No：14(构建体Z-MeV-mNP-GPC)。
16.转移质粒载体，其包含权利要求1至15中任一项所述的核酸构建体，特别是包含选自以下的序列或由其组成：
-SEQ ID No：9(质粒MeV-GPC)；
-SEQ ID No：10(质粒MeV-NP-GPC)；
-SEQ ID No：11(质粒MeV-mNP-GPC)；
-SED ID No：12(质粒Z-MeV-GPC)；
-SEQ ID No：13(质粒Z-MeV-NP-GPC)；和
-SEQ ID No：14(质粒Z-MeV-mNP-GPC)。
17.重组麻疹病毒，其中，所述病毒在其基因组中包含权利要求1至15中任一项所述的核酸构建体或权利要求16所述的转移质粒载体，或者所述病毒的基因组由权利要求16所述的转移质粒载体组成。
18.根据权利要求17的重组麻疹病毒，其中，所述重组麻疹病毒表达至少一种选自LASV的GPC蛋白、NP蛋白、mNP蛋白和Z蛋白的多肽或其抗原性片段，特别地，所述重组麻疹病毒表达至少两种选自LASV的GPC蛋白、NP蛋白，mNP蛋白和Z蛋白的多肽或其抗原性片段。
19.根据权利要求17或18所述的重组麻疹病毒，其中，所述重组麻疹病毒表达LASV的GPC蛋白和mNP蛋白，或其抗原性片段。
20.根据权利要求17或18所述的重组麻疹病毒，其中，所述重组麻疹病毒表达LASV的GPC蛋白和Z蛋白，或其抗原性片段。
21.根据权利要求17至20中任一项所述的重组麻疹病毒，其中，所述重组麻疹病毒还表达MeV的N蛋白、P蛋白、M蛋白、F蛋白、H蛋白和L蛋白中的至少一种。
22.根据权利要求17至21中任一项所述的重组麻疹病毒，其中，尤其在单次免疫后，所述重组麻疹病毒引发针对LASV的GPC蛋白、NP蛋白、mNP蛋白和/或Z蛋白的抗原性片段的细胞应答和/或体液应答和细胞应答，特别是针对MeV的N蛋白、P蛋白、M蛋白、F蛋白、H蛋白和/或L蛋白的抗原性片段的细胞应答和/或体液应答和细胞应答，特别是T细胞应答，特别是CD4+和CD8+T细胞应答。
23.宿主细胞，其用权利要求1至15中任一项所述的核酸构建体或权利要求16中所述的转移质粒载体转染，或用权利要求17至22中任一项所述的重组麻疹病毒感染，所述宿主细胞特别是哺乳动物细胞、VERO NK细胞、CEF细胞、人胚胎肾细胞系293或MRC5细胞。
24.重组病毒样颗粒(VLP)，其中，所述重组病毒样颗粒包含LASV的Z蛋白和可选的GPC蛋白和/或NP蛋白和/或mNP蛋白或其抗原性片段，特别地，所述重组病毒样颗粒至少表达Z蛋白和GPC蛋白或其抗原性片段，所述蛋白或其抗原性片段由权利要求1至15所述的核酸构建体的第一异源多核苷酸和/或第二异源多核苷酸编码，或由权利要求16所述的转移质粒载体的第一异源多核苷酸和/或第二异源多核苷酸编码，或由权利要求17至22中任一项所述的重组麻疹病毒编码，或在权利要求23所述的宿主细胞内产生。
25.免疫原性组合物，特别是病毒疫苗组合物，其包含权利要求24所述的重组VLP，或权利要求17至22中任一项所述的重组麻疹病毒，或者权利要求24所述的重组VLP和权利要求17至22中任一项所述的重组麻疹病毒，以及药学上可接受的载体。
26.根据权利要求25所述的组合物，其中，所述组合物用于有需要的宿主，特别是人类宿主，尤其是儿童，通过引发针对LASV蛋白或其抗原性片段的抗体，和/或针对拉沙病毒的细胞应答和/或体液应答和细胞应答，引发针对拉沙病毒的保护性免疫应答以及优选的预防性免疫应答。
27.根据权利要求26所述的组合物，其中，所述组合物用于有需要的宿主，特别是人类宿主，尤其是儿童，通过引发针对麻疹病毒蛋白的抗体和/或针对麻疹病毒的细胞应答和/或体液应答和细胞应答，引发针对麻疹病毒的保护性免疫应答以及优选的预防性免疫应答。
28.拯救重组拉沙病毒样颗粒(VLP)和/或重组麻疹病毒的方法，所述重组拉沙病毒样颗粒(VLP)和/或重组麻疹病毒表达选自LASV的GPC蛋白、NP蛋白、mNP蛋白和Z蛋白的至少一种多肽或其抗原片段，所述方法包含：
(a)用权利要求1-15中任一项所述的核酸构建体或权利要求16所述的转移质粒载体转染稳定表达T7 RNA聚合酶和麻疹病毒N和P蛋白的细胞，特别是辅助细胞，尤其是HEK293辅助细胞；
(b)将转染的细胞维持在适于产生重组麻疹病毒和/或LASV VLP的条件下；
(c)通过与步骤(b)的转染细胞共培养来感染能够使重组麻疹病毒和/或LASV VLP繁殖的细胞；
(d)收获重组麻疹病毒和/或LASV VLP，所述重组麻疹病毒表达LASV的GPC蛋白、NP蛋白、mNP蛋白和/或Z蛋白中的至少一种，特别是至少表达GPC蛋白和另一种LASV蛋白，尤其是表达GPC蛋白和mNP蛋白；所述LASV VLP至少表达LASV的Z蛋白和可选的GPC蛋白、NP蛋白和/或mNP蛋白中的至少一种，特别是表达Z蛋白和GPC蛋白。
29.预防拉沙病毒相关疾病的方法，其中，所述方法包括：通过注射，尤其是皮下注射权利要求24所述的重组拉沙病毒VLP和/或权利要求17至22中任一项所述的麻疹病毒，对哺乳动物，特别是人，尤其是儿童进行免疫接种。
30.治疗拉沙病毒相关疾病的方法，其中，所述方法包括：通过注射，尤其是皮下注射权利要求24所述的重组拉沙病毒VLP和/或权利要求17至22中任一项所述的麻疹病毒，对哺乳动物，特别是人，尤其是儿童进行免疫接种。
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