KR20240001198A - Apmv hn 및 f 단백질을 발현하는 키메라 뉴캐슬병 바이러스 - Google Patents
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Abstract
일 측면에서, 포장된 게놈을 포함하는 재조합 뉴캐슬병 바이러스("NDV")이 본원에 제공되고, 여기서 포장된 게놈은 NDV HN 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열이 NDV 이외의 조류 파라믹소바이러스(APMV)의 HN 단백질 또는 비-NDV-APMV HN 단백질의 변이체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열로 대체되었고, NDV F 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열이 NDV 이외의 APMV의 F 단백질 또는 비-NDV-APMV F 단백질의 변이체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열로 대체된, 뉴캐슬병 바이러스 게놈의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시예에서, 포장된 게놈은 항원을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 이식유전자를 추가로 포함한다. 또한, 이러한 재조합 NDV를 포함하는 조성물 및 대상체에서 면역 반응을 유도하기 위한 이러한 재조합 NDV의 용도가 본원에 기술된다.
Description
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2022년 1월 24일에 출원된 미국 가출원 제63/302,434호, 및 2021년 4월 26일에 출원된 미국 가출원 제63/179,994호의 이익을 주장하며, 이들 각각의 개시는 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다.
연방 후원 연구에 관한 진술문
본 발명은 국립보건원에 의해 수여된 AI097092 하에 정부 지원으로 이루어졌다. 정부는 본 발명에 대한 소정의 권리를 갖는다.
서열 목록
본 출원은 "06923-382-228 SEQ LISTING.txt"라는 제목으로의 텍스트 파일로서 본 출원과 함께 제출된 서열 목록을 참조로서 포함하며, 2022년 4월 22일에 생성되었고, 크기는 147,499 바이트이다.
1.
소개
일 측면에서, 포장된 게놈을 포함하는 재조합 뉴캐슬병 바이러스("NDV")(Newcastle disease virus)이 본원에서 설명되며, 포장된 게놈은, NDV HN 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열이 NDV 이외의 조류 파라믹소바이러스(APMV)의 HN 단백질 또는 비-NDV-APMV HN 단백질의 변이체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열로 대체되었고, NDV F 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열이 NDV 이외의 APMV의 F 단백질 또는 비-NDV-APMV F 단백질의 변이체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열로 대체된, 뉴캐슬병 바이러스 게놈의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시예에서, 포장된 게놈은 항원을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 이식유전자(transgene)를 추가로 포함한다. 또한, 이러한 재조합 NDV를 포함하는 조성물 및 대상체에서 면역 반응을 유도하기 위한 이러한 재조합 NDV의 용도가 본원에 기술된다.
2.
배경
뉴캐슬병 바이러스(NDV)는 파라믹소바이러스 과 중 아불라비리나(Avulavirinae) 아과의 구성원으로, 다수의 조류 종을 감염시키는 것으로 나타났다(Alexander, DJ (1988). Newcastle disease, Newcastle disease virus -- an avian paramyxovirus. Kluwer Academic Publishers: Dordrecht, The Netherlands. pp 1-22). NDV는 음의 센스로 된 단일 가닥 RNA 게놈을 가지며, 숙주 게놈 또는 다른 바이러스와 재조합되지 않는다(Alexander, DJ (1988). Newcastle disease, Newcastle disease virus -- an avian paramyxovirus. Kluwer Academic Publishers: Dordrecht, The Netherlands. pp 1-22). 게놈 RNA는 이하에서 더욱 상세히 설명되는, 3'-NP-P-M-F-HN-L-5' 순서로 유전자를 함유한다. 2개의 추가 단백질, V 및 W는 RNA 편집에 의해 생성되는 대안적인 mRNA에 의해 P 유전자로부터 NDV에 의해 생산된다. 게놈 RNA는 또한 3' 말단에 리더 서열을 함유한다.
비리온의 구조적 요소는 세포 원형질막으로부터 유래된 지질 이중층인 바이러스 외피를 포함한다. 당단백질인, 헤마글루티닌-뉴라미니다아제(HN, hemagglutinin-neuraminidase)가 외피로부터 돌출되어 바이러스가 헤마글루티닌(예를 들어, 수용체 결합 / 융합(fusogenic)) 및 뉴라미니다아제 활성 둘 다를 함유할 수 있게 한다. 바이러스 막과도 상호작용하는, 융합 당단백질(F)은 먼저 비활성 전구체로서 생산된 다음, 번역 후 절단되어 2개의 이황화 결합 폴리펩티드를 생산한다. 활성 F 단백질은 바이러스 외피와 숙주 세포 원형질막의 융합을 용이하게 함으로써 숙주 세포 내로의 NDV의 침투에 관여한다. 매트릭스 단백질(M)은 바이러스 조립에 관여하고, 바이러스 막뿐만 아니라 뉴클레오캡시드 단백질 둘 모두와 상호작용한다.
뉴클레오캡시드의 주요 단백질 서브유닛은 캡시드에 나선형 대칭을 부여하는 뉴클레오캡시드 단백질(NP)이다. 뉴클레오캡시드와 관련하여, P 및 L 단백질이 있다. 인산화를 거치게 되는, 인단백질(P)은 전사에서 조절 역할을 하는 것으로 여겨지며, 또한 메틸화, 인산화 및 폴리아데닐화에 관여할 수 있다. RNA-의존성 RNA 중합효소를 암호화하는, L 유전자는 P 단백질과 함께 바이러스 RNA 합성을 위해 요구된다. 바이러스 게놈의 코딩 용량의 거의 절반을 차지하는, L 단백질은 바이러스 단백질 중 가장 크고, 전사 및 복제 모두에서 중요한 역할을 한다. V 단백질은 인터페론-알파를 억제하고 NDV의 독성에 기여하는 것으로 나타났다 (Huang 등 (2003). Newcastle disease virus V protein is associated with viral pathogenesis and functions as an Alpha Interferon Antagonist. Journal of Virology 77: 8676-8685).
3.
요약
일 측면에서, 뉴캐슬병 바이러스 게놈의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 서열이 본원에 제공되며, 여기서 (1) NDV HN 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 비-NDV APMV HN 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열로 대체되었고, 여기서 NDV 유전자간 영역은 비-NDV APMV HN 단백질 코딩 서열 전후에 있고; (2) NDV F 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 비-NDV APMV F 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열로 대체되었고, 여기서 NDV 유전자간 영역은 상기 비-NDV APMV F 단백질 코딩 서열의 전후에 있다. 특정 실시예에서, 용어 "비-NDV APMV"는 NDV 이외의 APMV를 지칭하는 데 사용된다. 특정 실시예에서, 비-NDV APMV F 단백질 및 비-NDV APMV HN 단백질은 각각 NDF F 단백질 및 NDV HN 단백질과 면역학적으로 구별된다. 일부 실시예에서, 비-NDV APMV F 단백질 및 비-NDV APMV HN 단백질은 NDV와 상이한 속으로부터 유래한다. 일부 실시예에서, 비-NDV APMV F 단백질 및 비-APMV HN 단백질은 아불라비리나 아과의 구성원으로부터의 F 단백질 및 HN 단백질이지만, NDV는 아니다. 일부 실시예에서, 비-NDV APMV F 단백질 및 비-APMV HN 단백질은 아불라비리나 아과 및 메타아불라바이러스 속의 구성원으로부터의 F 단백질 및 HN 단백질이다. 일부 실시예에서, 비-NDV APMV F 단백질 및 비-APMV HN 단백질은 아불라비리나 아과 및 파라아불라바이러스 속의 구성원으로부터의 F 단백질 및 HN 단백질이다. 일부 실시예에서, 비-NDV APMV F 단백질 및 비-APMV HN 단백질은 아불라비리나 아과 및 오소아불라바이러스 속의 구성원으로부터의 F 단백질 및 HN 단백질이지만, NDV는 아니다. 일부 실시예에서, NDV 게놈은 NDV LaSota 균주의 NP 유전자, P 유전자, M 유전자, 및 L 유전자를 포함한다.
일부 실시예에서, 핵산 서열이 본원에 제공되며, 상기 핵산 서열은: (1) NDV 뉴클레오캡시드(N) 단백질을 암호화하는 전사 유닛, (2) NDV 인단백질(P)을 암호화하는 전사 유닛, (3) NDV 매트릭스(M) 단백질을 암호화하는 전사 유닛, (4) NDV 거대(large) 중합효소(L)를 암호화하는 전사 유닛, 및 (5) 서열번호 1-14 중 어느 하나의 뉴클레오티드 서열, 또는 서열번호 1-14 중 어느 하나의 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 98% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시예에서, 핵산 서열이 본원에 제공되며, 상기 핵산 서열은: (1) NDV 뉴클레오캡시드(N) 단백질을 암호화하는 전사 유닛, (2) NDV 인단백질(P)을 암호화하는 전사 유닛, (3) NDV 매트릭스(M) 단백질을 암호화하는 전사 유닛, (4) NDV 거대 중합효소(L)를 암호화하는 전사 유닛, 및 (5) 서열번호 1-14 중 어느 하나의 뉴클레오티드 서열에 상응하는 음-센스 RNA 서열, 또는 서열번호 1-14 중 어느 하나의 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 98% 동일한 뉴클레오티드 서열에 상응하는 음-센스 RNA 서열을 포함한다. 일부 실시예에서, NDV 뉴클레오캡시드 단백질, NDV 인단백질, NDV 매트릭스 단백질, 및 NDV 거대 중합효소는 NDV LaSota 균주이다.
일부 실시예에서, 서열번호 44, 또는 GFP 코딩 서열이 없는 서열번호 44의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 서열이 본원에 제공된다. 일부 실시예에서, 서열번호 44 또는 GFP 코딩 서열이 없는 서열번호 44의 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 98% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 서열이 본원에 제공된다. 일부 실시예에서, 서열번호 45, 또는 GFP 코딩 서열이 없는 서열번호 45의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 서열이 본원에 제공된다. 일부 실시예에서, 서열번호 45 또는 GFP 코딩 서열이 없는 서열번호 45의 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 98% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 서열이 본원에 제공된다.
일부 실시예에서, 서열번호 44, 또는 GFP 코딩 서열이 없는 서열번호 44의 뉴클레오티드 서열에 상응하는 음-센스 RNA 서열을 포함하는 핵산 서열이 본원에 제공된다. 일부 실시예에서, 서열번호 44, 또는 GFP 코딩 서열이 없는 서열번호 44의 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 98% 동일한 뉴클레오티드 서열에 상응하는 음-센스 RNA 서열을 포함하는 핵산 서열이 본원에 제공된다. 일부 실시예에서, 서열번호 45 또는 GFP 코딩 서열이 없는 서열번호 45의 뉴클레오티드 서열에 상응하는 음-센스 RNA 서열을 포함하는 핵산 서열이 본원에 제공된다. 일부 실시예에서, 서열번호 45 또는 GFP 코딩 서열이 없는 서열번호 45의 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 98% 동일한 뉴클레오티드 서열에 상응하는 음-센스 RNA 서열을 포함하는 핵산 서열이 본원에 제공된다.
일부 실시예에서, 핵산 서열은 이식유전자를 추가로 포함한다. 일부 실시예에서, 핵산 서열은 항원을 암호화하는 이식유전자를 추가로 포함한다. 일부 실시예에서, 항원은 바이러스, 박테리아, 진균 또는 원생동물 항원이다. 일부 실시예에서, 항원은 SARS-CoV-2 스파이크 단백질 또는 이의 단편을 포함한다. 일부 실시예에서, 단편은 SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 수용체 결합 도메인을 포함한다. 일부 실시예에서, 단편은 SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 세포외 도메인(ectodomain)을 포함한다. 일부 실시예에서, 항원은 MERS-CoV 항원, 호흡기 세포융합 바이러스(respiratory syncytial virus) 항원, 인간 메타뉴모바이러스(human metapneumovirus) 항원, 라사 바이러스(Lassa virus) 항원, 에볼라 바이러스(Ebola virus) 항원, 또는 니파 바이러스(Nipah virus) 항원을 포함한다. 일부 실시예에서, 항원은 암 또는 종양 항원이다.
일부 실시예에서, 비-NDV APMV F 단백질 및 비-NDV APMV HN 단백질은 각각 NDF F 단백질 및 NDV HN 단백질과 면역학적으로 구별된다. 일부 실시예에서, 비-NDV APMV HN은 APMV4/duck/Hongkong/D3/75, APMV17/Antarctica/107/13, APMV9/duck/New York/22/78, APMV7/Dove/Tennessee/4/75, APMV21/pigeon/Taiwan/AHRI128/17, APMV6/duck/HongKong/18/199/77, APMV11/common_snipe/France/100212/10, APMV15/calidris_fuscicollis/Brazil/RS-1177/12, APMV8/Goose/Delaware/1053/76, APMV2/Chicken/California/Yucaipa/56, APMV3/Turkey/Wisconsin/68, APMV12/Wigeon/Italy/3920_1/05, APMV5/budgerigar/Japan/TI/75, 또는 APMV10/penguin/Falkland Islands/324/07의 HN 단백질이다. 일부 실시예에서, 비-NDV APMV F는 APMV4/duck/Hongkong/D3/75, APMV17/Antarctica/107/13, APMV9/duck/New York/22/78, APMV7/Dove/Tennessee/4/75, APMV21/pigeon/Taiwan/AHRI128/17, APMV6/duck/HongKong/18/199/77, APMV11/common_snipe/France/100212/10, APMV15/calidris_fuscicollis/Brazil/RS-1177/12, APMV8/Goose/Delaware/1053/76, APMV2/Chicken/California/Yucaipa/56, APMV3/Turkey/Wisconsin/68, APMV12/Wigeon/Italy/3920_1/05, APMV5/budgerigar/Japan/TI/75, 또는 APMV10/penguin/Falkland Islands/324/07의 F 단백질이다.
일부 실시예에서, 핵산 서열은 cDNA 서열이다. 일부 실시예에서, 핵산 서열은 음-센스 가닥 RNA 서열이다.
일부 실시예에서, 본원에서 설명되는 핵산 서열을 포함하는 재조합 NDV가 본원에 제공된다. 일부 실시예에서, 본원에서 설명되는 비-APMV F 단백질, 본원에서 설명되는 비-APMV-HN 단백질, 또는 본원에서 설명되는 비-APMV F 단백질, 및 본원에서 설명되는 비-APMV-HN 단백질을 포함하는 재조합 NDV가 본원에 제공된다. 일부 실시예에서, 비-APMV F 단백질은 서열번호 1-14 중 어느 하나의 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된다. 일부 실시예에서, 비-APMV F 단백질은 서열번호 1-14 중 어느 하나의 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된다. 일부 실시예에서, 비-APMV HN 단백질은 서열번호 1-14 중 어느 하나의 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된다. 일부 실시예에서, 비-APMV HN 단백질은 서열번호 1-14 중 어느 하나의 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된다.
또 다른 측면에서, 재조합 뉴캐슬병 바이러스(NDV)가 본원에 제공되며, 상기 재조합 뉴캐슬병 바이러스는 NDV F 단백질에 대한 코딩 서열이 NDV 이외의 조류 파라믹소바이러스(APMV)의 F 단백질(비-NDV APMV F 단백질) 또는 이의 변이체에 대한 코딩 서열로 대체되었고/되었거나 NDV HN 단백질에 대한 코딩 서열이 NDV 이외의 APMV의 HN 단백질(비-NDV APMV HN 단백질) 또는 이의 변이체에 대한 코딩 서열로 대체된 포장된 게놈을 포함한다. 특정 실시예에서, 포장된 게놈을 포함하는 재조합 NDV가 본원에 제공되며, 여기서 상기 포장된 게놈은 (1) NDV HN 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 비-NDV APMV HN 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열로 대체되었고, 여기서 NDV 유전자간 영역은 비-NDV AMPV HN 단백질 코딩 서열의 전후에 있고; (2) NDV F 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 비-NDV APMV F 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열로 대체되었고, 여기서 NDV 유전자간 영역은 비-NDV AMPV F 단백질 코딩 서열의 전후에 있는, 뉴캐슬병 바이러스 게놈의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특정 실시예에서, 비-NDV APMV HN 단백질 코딩 서열 전후의 NDV 유전자간 영역은 NDV HN 유전자간 영역이다. 특정 실시예에서, 비-NDV APMV F 단백질 코딩 서열 전후의 NDV 유전자간 영역은 NDV F 유전자간 영역이다. 특정 실시예에서, 비-NDV APMV F 단백질 및 비-NDV APMV HN 단백질은 각각 NDF F 단백질 및 NDV HN 단백질과 면역학적으로 구별된다. 일부 실시예에서, 비-NDV APMV F 단백질 및 비-NDV APMV HN 단백질은 NDV와 상이한 속으로부터 유래한다. 일부 실시예에서, 비-NDV APMV F 단백질 및 비-APMV HN 단백질은 아불라비리나 아과의 구성원으로부터의 F 단백질 및 HN 단백질이지만, NDV는 아니다. 일부 실시예에서, 비-NDV APMV F 단백질 및 비-APMV HN 단백질은 아불라비리나 아과 및 메타아불라바이러스 속의 구성원으로부터의 F 단백질 및 HN 단백질이다. 일부 실시예에서, 비-NDV APMV F 단백질 및 비-APMV HN 단백질은 아불라비리나 아과 및 파라아불라바이러스 속의 구성원으로부터의 F 단백질 및 HN 단백질이다. 일부 실시예에서, 비-NDV APMV F 단백질 및 비-APMV HN 단백질은 아불라비리나 아과 및 오소아불라바이러스 속의 구성원으로부터의 F 단백질 및 HN 단백질이지만, NDV는 아니다. 특정 실시예에서, NDV 게놈은 NDV LaSota의 NP 유전자, P 유전자, M 유전자, 및 L 유전자를 포함한다. 특정 실시예에서, 포장된 게놈은 이식유전자를 추가로 포함한다. 일부 실시예에서, 이식유전자는 바이러스, 박테리아, 진균 또는 원생동물 항원을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특정 실시예에서, 이식유전자는 SARS-CoV-2 항원을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특정 실시예에서, SARS-CoV-2 항원은 SARS-CoV-2 스파이크 단백질 또는 이의 단편이다. 특정 실시예에서, SARS-CoV-2 항원은 SARS-CoV-2 스파이크 단백질 또는 이의 단편을 포함한다. 특정 실시예에서, 단편은 SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 수용체 결합 도메인을 포함한다. 일부 실시예에서, SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 단편은 SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 세포외 도메인이다. 특정 실시예에서, 이식유전자는 MERS-CoV 항원을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특정 실시예에서, 이식유전자는 호흡기 세포융합 바이러스 항원 또는 인간 메타뉴모바이러스 항원을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특정 실시예에서, 이식유전자는 라사 바이러스 항원, 에볼라 바이러스 항원 또는 니파 바이러스 항원을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특정 실시예에서, 이식유전자는 암 또는 종양 항원을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
특정 실시예에서, NDV F 단백질에 대한 항체가 비-NDV APMV F 단백질 또는 이의 변이체와 교차 반응하지 않는 경우, 비-NDV APMV F 단백질 또는 이의 변이체는 NDV F 단백질과 면역학적으로 구별된다. 일부 실시예에서, 당해 분야의 숙련자에게 공지되거나 본원에서 설명되는 검정에서 NDV F 단백질에 대한 항체가 NDV F 단백질에 비해 2배, 5배, 10배, 15배, 20배 또는 더 낮은 친화도로 비-NDV APMV F 단백질 또는 이의 변이체에 결합하는 경우, 비-NDV APMV F 단백질 또는 이의 변이체는 NDV F 단백질과 면역학적으로 구별된다. 특정 실시예에서, 당해 분야의 숙련자에게 공지되거나 본원에서 설명되는 검정에서 NDV F 단백질에 대한 항체가 NDV F 단백질에 비해 0.5 log, 1 log, 1.5 log, 2 log, 2.5 log, 3 log 또는 더 낮은 친화도로 비-NDV APMV F 단백질 또는 이의 변이체에 결합하는 경우, 비-NDV APMV F 단백질 또는 이의 변이체는 NDV F 단백질과 면역학적으로 구별된다. 특정 실시예에서, 항-NDV F 항체가 Chumbe 등, 2017, Virology Journal 14: 232 및 Reynolds 등, 1999, Avian Dis. 143:564-71, Sun 등, 2020, EBioMedicine 62: 103132, 또는 Sun 등, 2020, Vaccines 8: 771, 또는 본원에서 설명되는 바와 같은, 바이러스 중성화 검정에 의해 평가되는 바와 같이 비-NDV APMV F 단백질 또는 이의 변이체를 발현하는 NDV의 복제를 유의하게 억제하지 않는 경우, 비-NDV APMV F 단백질 또는 이의 변이체는 NDV F 단백질과 면역학적으로 구별된다. 특정 실시예에서, 항-NDV F 항체가, 예를 들어, Chumbe 등, 2017, Virology Journal 14: 232 및 Reynolds 등, 1999, Avian Dis. 143:564-71, Sun 등, 2020, EBioMedicine 62: 103132, 또는 Sun 등, 2020, Vaccines 8: 771, 또는 본원에서 설명되는 바와 같은, 바이러스 중성화 검정에서, 0.5 log 미만, 1 log 미만, 1.5 log 미만, 또는 2 log 미만 만큼, 비-NDV APMV F 단백질 또는 이의 변이체를 발현하는 NDV의 복제를 억제하는 경우, 비-NDV APMV F 단백질 또는 이의 변이체는 NDV F 단백질과 면역학적으로 구별된다.
특정 실시예에서, NDV HN 단백질에 대한 항체가 비-NDV APMV HN 단백질 또는 이의 변이체와 교차 반응하지 않는 경우, 비-NDV APMV HN 단백질 또는 이의 변이체는 NDV HN 단백질과 면역학적으로 구별된다. 일부 실시예에서, NDV HN 단백질에 관한 항체가 당해 분야의 숙련자에게 공지되거나 본원에서 설명되는 검정에서 NDV HN 단백질에 비해 2배, 5배, 10배, 15배, 20배 또는 더 낮은 친화도로 비-NDV APMV NH 단백질 또는 이의 변이체에 결합하는 경우, 비-NDV APMV HN 단백질 또는 이의 변이체는 NDV NH 단백질과 면역학적으로 구별된다. 특정 실시예에서, 당해 분야의 숙련자에게 공지되거나 본원에서 설명되는 검정에서 NDV HN 단백질에 대한 항체가 NDV HN 단백질에 비해 0.5 log, 1 log, 1.5 log, 2 log, 2.5 log, 3 log 또는 더 낮은 친화도로 비-NDV APMV HN 단백질 또는 이의 변이체에 결합하는 경우, 비-NDV APMV HN 단백질 또는 이의 변이체는 NDV HN 단백질과 면역학적으로 구별된다. 특정 실시예에서, 항-NDV HN 항체가 Chumbe 등, 2017, Virology Journal 14: 232 및 Reynolds 등, 1999, Avian Dis. 143:564-71, Sun 등, 2020, EBioMedicine 62: 103132, 또는 Sun 등, 2020, Vaccines 8: 771, 또는 본원에서 설명되는 바와 같은, 바이러스 중성화 검정에 의해 평가되는 바와 같이 비-NDV APMV HN 단백질 또는 이의 변이체를 발현하는 NDV의 복제를 유의하게 억제하지 않는 경우, 비-NDV APMV HN 단백질 또는 이의 변이체는 NDV HN 단백질과 면역학적으로 구별된다. 특정 실시예에서, 항-NDV HN 항체가, 예를 들어, Chumbe 등, 2017, Virology Journal 14: 232 및 Reynolds 등, 1999, Avian Dis. 143:564-71, Sun 등, 2020, EBioMedicine 62: 103132, 또는 Sun 등, 2020, Vaccines 8: 771, 또는 본원에서 설명되는 바와 같은, 바이러스 중성화 검정에서, 0.5 log 미만, 1 log 미만, 1.5 log 미만, 또는 2 log 미만 만큼, 비-NDV APMV HN 단백질 또는 이의 변이체를 발현하는 NDV의 복제를 억제하는 경우, 비-NDV APMV HN 단백질 또는 이의 변이체는 NDV F 단백질과 면역학적으로 구별된다.
일부 실시예에서, 비-NDV APMV HN 단백질은 NDV와 상이한 속으로부터의 HN 단백질이다. 일부 실시예에서, 비-NDV APMV HN 단백질은 아불라비리나 아과의 구성원으로부터의 HN 단백질이지만, NDV는 아니다. 일부 실시예에서, 비-NDV APMV HN 단백질은 아불라비리나 아과 및 메타아불라바이러스 속의 구성원으로부터의 HN 단백질이다. 일부 실시예에서, 비-NDV APMV HN 단백질은 아불라비리나 아과 및 파라아불라바이러스 속의 구성원으로부터의 HN 단백질이다. 일부 실시예에서, 비-NDV APMV HN 단백질은 아불라비리나 아과 및 오소아불라바이러스 속의 구성원으로부터의 HN 단백질이지만 NDV는 아니다.
특정 실시예에서, 비-NDV APMV HN은 APMV4/duck/Hongkong/D3/75, APMV17/Antarctica/107/13, APMV9/duck/New York/22/78, APMV7/Dove/Tennessee/4/75, APMV21/pigeon/Taiwan/AHRI128/17, APMV6/duck/HongKong/18/199/77, APMV11/common_snipe/France/100212/10, APMV15/calidris_fuscicollis/Brazil/RS-1177/12, APMV8/Goose/Delaware/1053/76, APMV2/Chicken/California/Yucaipa/56, APMV3/Turkey/Wisconsin/68, APMV12/Wigeon/Italy/3920_1/05, APMV5/budgerigar/Japan/TI/75, 또는 APMV10/penguin/Falkland Islands/324/07의 HN 단백질이다. 특정 실시예에서, 비-NDV APMV F는 APMV4/duck/Hongkong/D3/75, APMV17/Antarctica/107/13, APMV9/duck/New York/22/78, APMV7/Dove/Tennessee/4/75, APMV21/pigeon/Taiwan/AHRI128/17, APMV6/duck/HongKong/18/199/77, APMV11/common_snipe/France/100212/10, APMV15/calidris_fuscicollis/Brazil/RS-1177/12, APMV8/Goose/Delaware/1053/76, APMV2/Chicken/California/Yucaipa/56, APMV3/Turkey/Wisconsin/68, APMV12/Wigeon/Italy/3920_1/05, APMV5/budgerigar/Japan/TI/75, 또는 APMV10/penguin/Falkland Islands/324/07의 F 단백질이다. 특정 실시예에서, 비-NDV APMV F 단백질 및 비-NDV AMPV HN 단백질은 동일한 APMV 균주 출처이거나 이로부터 유래된다. 다른 실시예에서, 비-NDV APMV F 단백질 및 비-NDV AMPV HN 단백질은 상이한 APMV 균주 출처이거나 이로부터 유래된다.
특정 실시예에서, 포장된 게놈을 포함하는 재조합 뉴캐슬병 바이러스(NDV)가 본원에 제공되며, 여기서 포장된 게놈은 NDV HN 단백질 및 NDV F 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열이 서열번호 1-14 중 어느 하나에 제시된 cDNA 서열로부터 전사된 음-센스 RNA 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열로 대체되는 뉴캐슬병 바이러스 게놈의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특정 실시예에서, 포장된 게놈을 포함하는 재조합 뉴캐슬병 바이러스(NDV)가 본원에 제공되며, 여기서 포장된 게놈은 NDV HN 단백질 및 NDV F 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열이 서열번호 1-14 중 어느 하나에 제시된 cDNA 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 cDNA 서열로부터 전사된 음-센스 RNA 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열로 대체되는 뉴캐슬병 바이러스 게놈의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특정 실시예에서, NDV 게놈은 NDV LaSota의 NP 유전자, P 유전자, M 유전자, 및 L 유전자를 포함한다. 특정 실시예에서, 포장된 게놈은 이식유전자를 추가로 포함한다. 일부 실시예에서, 이식유전자는 바이러스, 박테리아, 진균 또는 원생동물 항원을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특정 실시예에서, 이식유전자는 SARS-CoV-2 항원을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특정 실시예에서, SARS-CoV-2 항원은 SARS-CoV-2 스파이크 단백질 또는 이의 단편이다. 특정 실시예에서, SARS-CoV-2 항원은 SARS-CoV-2 스파이크 단백질 또는 이의 단편을 포함한다. 특정 실시예에서, 단편은 SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 수용체 결합 도메인을 포함한다. 일부 실시예에서, SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 단편은 SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 세포외 도메인이다. 특정 실시예에서, 이식유전자는 MERS-CoV 항원을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특정 실시예에서, 이식유전자는 호흡기 세포융합 바이러스 항원 또는 인간 메타뉴모바이러스 항원을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특정 실시예에서, 이식유전자는 라사 바이러스 항원, 에볼라 바이러스 항원 또는 니파 바이러스 항원을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특정 실시예에서, 이식유전자는 암 또는 종양 항원을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
다른 측면에서, 본원에서 설명되는 재조합 NDV를 포함하는 면역원성 조성물을 본원에 제공한다. 면역원성 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함할 수 있다. 조성물은 본원에서 설명되는 104 내지 1012 PFU의 재조합 NDV를 포함할 수 있다.
또 다른 측면에서, 항원에 대한 면역 반응을 유도하는 방법이 본원에 제공되며, 방법은 본원에서 설명되는 재조합 NDV 또는 본원에서 설명되는 면역원성 조성물을 대상체(예를 들어, 인간 대상체)에게 투여하는 단계를 포함한다. 다른 측면에서, 감염성 질환을 예방하기 위한 방법이 본원에 제공되며, 방법은 본원에서 설명되는 재조합 NDV 또는 본원에서 설명되는 면역원성 조성물을 대상체(예를 들어, 인간 대상체)에게 투여하는 단계를 포함한다. 또 다른 측면에서, 감염성 질환에 대해 대상체를 면역화하기 위한 방법이 본원에 제공되며, 방법은 본원에서 설명되는 재조합 NDV 또는 본원에서 설명되는 면역원성 조성물을 대상체(예를 들어, 인간 대상체)에게 투여하는 단계를 포함한다. 다른 측면에서, 암을 치료하기 위한 방법이 본원에 제공되며, 방법은 본원에서 설명되는 재조합 NDV 또는 본원에서 설명되는 면역원성 조성물을 대상체(예를 들어, 인간 대상체)에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시예에서, 재조합 NDV 또는 조성물은 대상체에게 비강내 투여된다. 특정 실시예에서, 상기 방법은 포장된 게놈을 포함하는 제2 재조합 NDV를 투여하는 단계를 추가로 포함하고, 여기서 제2 재조합 NDV의 포장된 게놈은 (1) NDV HN 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 비-NDV APMV HN 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열로 대체되었고, 여기서 NDV 유전자간 영역은 비-NDV AMPV HN 단백질 코딩 서열의 전후에 있고; (2) NDV F 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 비-NDV APMV F 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열로 대체되었고, 여기서 NDV 유전자간 영역은 비-NDV AMPV F 단백질 코딩 서열의 전후에 있는, 뉴캐슬병 바이러스 게놈의 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 여기서 제2 재조합 NDV는 대상체에게 투여되는 제1 재조합 NDV와 면역학적으로 구별된다. 특정 실시예에서, 비-NDV APMV HN 단백질 코딩 서열 전후의 NDV 유전자간 영역은 NDV HN 유전자간 영역이다. 특정 실시예에서, 비-NDV APMV F 단백질 코딩 서열 전후의 NDV 유전자간 영역은 NDV F 유전자간 영역이다. 일부 실시예에서, 본원에서 설명되는 재조합 NDV 또는 이의 조성물은 이전에 백신접종을 받았거나 NDV 조성물(예를 들어, 백신)을 투여한 대상체에게 투여된다. 특정 실시예에서, 본원에서 설명되는 재조합 NDV 또는 이의 조성물은 이전에 백신접종을 받았거나 APMV-계 조성물(예를 들어, 백신)을 투여한 대상체에게 투여된다. 일부 실시예에서, 본원에서 설명되는 재조합 NDV 또는 이의 조성물은 이전에 백신접종을 받았거나 NDV 조성물(예를 들어, 백신) 및 APMV-계 조성물(예를 들어, 백신)을 투여한 대상체에게 투여된다.
특정 실시예에서, 제1 재조합 NDV 및 제2 재조합 NDV가, Chumbe 등, 2017, Virology Journal 14: 232 및 Reynolds 등, 1999, Avian Dis. 143:564-71, Sun 등, 2020, EBioMedicine 62: 103132, 또는 Sun 등, 2020, Vaccines 8: 771에서 설명되는 바와 같은, 바이러스 중성화 검정에 의해 평가되는 바와 같이 서로의 복제를 유의하게 억제하는 항체를 유도하지 않는 경우, 제1 재조합 NDV는 제2 재조합 NDV과 면역학적으로 구별된다. 특정 실시예에서, 제1 재조합 NDV 및 제2 재조합 NDV가, 예를 들어, Chumbe 등, 2017, Virology Journal 14: 232 및 Reynolds 등, 1999, Avian Dis. 143:564-71, Sun 등, 2020, EBioMedicine 62: 103132, 또는 Sun 등, 2020, Vaccines 8: 771에서 설명되는 바와 같은, 바이러스 중성화 검정에서, 약 0.5 log 미만, 약 1 log 미만, 약 1.5 log 미만, 또는 약 2 log 미만 만큼, 서로의 복제를 억제하는 항체를 유도하는 경우, 제1 재조합 NDV는 제2 재조합 NDV과 면역학적으로 구별되는 것으로 간주된다.
또 다른 측면에서, 본원에서 설명되는 재조합 NDV를 포함하는 키트가 본원에 제공된다. 또 다른 측면에서, 재조합 NDV를 포함하는 시험관 내 또는 생체 외 세포가 본원에 제공된다. 또 다른 측면에서, 본원에서 설명되는 재조합 NDV를 포함하는 세포주 또는 닭 배아 난자가 본원에 제공된다.
다른 측면에서, (1) NDV HN 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열이 비-NDV APMV HN 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열로 대체되었고, 여기서 NDV 유전자간 영역은 비-NDV APMV HN 단백질 코딩 서열의 전후에 있고; (2) NDV F 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 비-NDV APMV F 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열로 대체되었고, 여기서 NDV 유전자간 영역은 비-NDV APMV F 단백질 코딩 서열의 전후에 있는, 뉴캐슬병 바이러스 게놈의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 서열을 포함하는 키트가 본원에 제공된다. 일부 실시예에서, NDV 게놈은 NDV LaSota 균주의 NP 유전자, P 유전자, M 유전자, 및 L 유전자를 포함한다.
일부 실시예에서, 핵산 서열을 포함하는 키트가 본원에 제공되며, 핵산 서열은: (1) NDV 뉴클레오캡시드(N) 단백질을 암호화하는 전사 유닛, (2) NDV 인단백질(P)을 암호화하는 전사 유닛, (3) NDV 매트릭스(M) 단백질을 암호화하는 전사 유닛, (4) NDV 거대 중합효소(L)를 암호화하는 전사 유닛, 및 (5) 서열번호 1-14 중 어느 하나의 뉴클레오티드 서열, 또는 서열번호 1-14 중 어느 하나의 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 98% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시예에서, 핵산 서열을 포함하는 키트이며, 핵산 서열은: (1) NDV 뉴클레오캡시드(N) 단백질을 암호화하는 전사 유닛, (2) NDV 인단백질(P)을 암호화하는 전사 유닛, (3) NDV 매트릭스(M) 단백질을 암호화하는 전사 유닛, (4) NDV 거대 중합효소(L)를 암호화하는 전사 유닛, 및 (5) 서열번호 1-14 중 어느 하나의 뉴클레오티드 서열에 상응하는 음-센스 RNA 서열, 또는 서열번호 1-14 중 어느 하나의 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 98% 동일한 뉴클레오티드 서열에 상응하는 음-센스 RNA 서열을 포함한다. 일부 실시예에서, NDV 뉴클레오캡시드 단백질, NDV 인단백질, NDV 매트릭스 단백질, 및 NDV 거대 중합효소는 NDV LaSota 균주이다.
또 다른 측면에서, 본원에서 설명되는 재조합 NDV를 전파하기 위한 방법이 본원에 제공되며, 상기 방법은 본원에서 설명되는 재조합 NDV를 포함하는 세포 또는 배아 난자를 배양하는 단계를 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 방법은 난자 또는 배아 난자로부터 재조합 NDV를 단리하는 단계를 추가로 포함한다.
3.1
용어
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "약" 또는 "대략"은 수와 함께 사용될 때 참조된 숫자의 1, 5 또는 10% 이내의 임의의 수를 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "항체" 및 "항체"는 항원 결합 부위, 예를 들어 면역글로불린을 함유하는 분자를 지칭한다. 항체는 이에 한정되지는 않지만, 다음을 포함한다: 단클론 항체, 이중특이적 항체, 다중특이적 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 합성 항체, 키메라 항체, 다클론 항체, 단일 도메인 항체, 낙타화(camelized) 항체, 단쇄 Fv(scFv), 단쇄 항체, Fab 단편, F(ab') 단편, 이황화-결합 이중특이적 Fv(sdFv), 인트라바디, 및 항-이디오타입(항-Id) 항체(예를 들어, 항체에 대한 항-Id 및 항-항-Id 항체), 및 상기 중 어느 하나의 에피토프 결합 단편. 특히, 항체는 면역글로불린 분자 및 면역글로불린 분자의 면역학적 활성 단편을 포함한다. 면역글로불린 분자는 임의의 유형(예를 들어, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA 및 IgY), 부류(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2) 또는 하위 부류일 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, NDV의 맥락에서 용어 "이종"은 자연 발생 NDV와 연관되어(예를 들어, NDV의 게놈에 의해 암호화되거나, 게놈에 의해 발현되거나, 둘 다) 자연에서 발견되지 않는 엔티티를 지칭한다. 특정 실시예에서, 이종 서열은 자연 발생 NDV와 연관되어 발견되지 않은 단백질을 암호화한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 핵산 또는 뉴클레오티드 서열, 또는 아미노산 서열의 맥락에서 용어 "이종"은 제1 핵산 또는 뉴클레오티드 서열, 또는 제1 아미노산 서열과 연관되어 자연에서 발견되지 않은 제2 핵산 또는 뉴클레오티드 서열, 또는 제2 아미노산 서열을 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "IFN 결핍 시스템" 또는 "IFN 결핍 기질"이라는 문구는 시스템, 예를 들어, 세포, 세포주 및 동물, 예를 들어, 마우스, 닭, 칠면조, 토끼, 랫트, 말 등을 지칭하고, 하나, 둘 이상의 유형의 인터페론(IFN)을 생산하지 않거나, 임의의 유형의 IFN을 생산하지 않거나, 낮은 수준의 하나, 둘 이상의 유형의 IFN을 생산하거나, 또는 낮은 수준의 임의의 IFN을 생산하거나 (즉, 동일한 조건 하에서 IFN-적격 시스템과 비교했을 때 5-10%, 10-20%, 20-30%, 30-40%, 40-50%, 50-60%, 60-70%, 70-80%, 80-90% 이상 임의의 IFN 발현 감소), 하나, 둘 이상의 유형의 IFN에 반응하지 않거나 덜 효율적으로 반응하거나, 임의의 유형의 IFN에 반응하지 않거나, 하나, 둘 이상의 유형의 IFN에 지연된 응답을 갖거나, 하나, 둘 이상의 유형의 IFN에 의해 유도되거나, 임의의 유형의 IFN에 의해 유도된 항바이러스 유전자의 활성이 결핍되거나, 이들의 임의의 조합이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "대상체" 또는 "환자"는 상호 교환적으로 사용된다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "대상체" 및 "대상체들"은 동물을 지칭한다. 일부 실시예에서, 대상체는 비영장류(예를 들어, 낙타, 당나귀, 얼룩말, 소, 말, 말, 고양이, 개, 랫트, 및 마우스) 및 영장류(예를 들어, 원숭이, 침팬지, 및 인간)를 포함하는 포유동물이다. 일부 실시예에서, 대상체는 비인간 포유동물이다. 특정 실시예에서, 대상체는 애완동물(예: 개 또는 고양이) 또는 농장 동물(예: 말, 돼지 또는 소)이다. 특정 실시예에서, 대상체는 인간이다. 다른 특정 실시예에서, 대상체는 소이다. 특정 실시예에서, 포유동물(예를 들어, 인간)은 4 내지 6개월, 6 내지 12개월, 1 내지 5세, 5 내지 10세, 10 내지 15세, 15 내지 20세, 20 내지 25세, 25 내지 30세, 30 내지 35세, 35 내지 40세, 40 내지 45세, 45 내지 50세, 50 내지 55세, 55 내지 60세, 60 내지 65세, 65 내지 70세, 70 내지 75세, 75 내지 80세, 80 내지 85세, 85 내지 90세, 90 내지 95세 또는 95 내지 100세이다. 특정 실시예에서, 대상체는 조류가 아닌 동물이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 대상체에게 (a) 요법(들)을 투여하는 맥락에서 용어 "병용"은 하나 초과의 요법의 사용을 지칭한다. 용어 "병용"의 사용은 요법이 대상체에게 투여되는 순서를 제한하지 않는다. 제1 요법은 대상체에 대한 제2 요법의 투여 이전(예를 들어, 5분, 15분, 30분, 45분, 1시간, 2시간, 4시간, 6시간, 12시간, 24시간, 48시간, 72시간, 96시간, 1주, 2주, 3주, 4주, 5주, 6주, 8주, 또는 12주 전), 동시에 또는 이후(예: 5분, 15분, 30분, 45분, 1시간, 2시간, 4시간, 6시간, 12시간, 24시간, 48시간, 72시간, 96시간, 1주, 2주, 3주, 4주, 5주, 6주, 8주, 또는 12주 후)에 투여될 수 있다. 예를 들어, 본원에서 설명되는 재조합 NDV는 다른 요법 투여 이전(예를 들어, 5분, 15분, 30분, 45분, 1시간, 2시간, 4시간, 6시간, 12시간, 24시간, 48시간, 72시간, 96시간, 1주, 2주, 3주, 4주, 5주, 6주, 8주, 또는 12주 전), 동시에 또는 이후(예: 5분, 15분, 30분, 45분, 1시간, 2시간, 4시간, 6시간, 12시간, 24시간, 48시간, 72시간, 96시간, 1주, 2주, 3주, 4주, 5주, 6주, 8주, 또는 12주 후)에 투여될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 바이러스의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열의 맥락에서 용어 "야생형"은 자연에서 발견되는 바이러스 균주의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열을 지칭한다. 특히, 본원에 야생형으로 기술된 서열은 공개 데이터베이스에서 천연 바이러스 단리물의 서열로서 보고된 서열이다.
4. 도면에 대한 간단한 설명
도 1. 재조합 키메라 NDV-APMV 벡터의 구축 전략. 뉴캐슬병 바이러스(NDV 또는 APMV-1)에 상응하는 서열이 백색 상자에 도시되어 있고, 항원적으로 상이한 조류 파라믹소바이러스(예를 들어, APMV-4)에 상응하는 서열이 회색 상자에 도시되어 있다.
도 2a-2c. 수용자 플라스미드 pNDV-F-HNless의 생성. 구제 플라스미드 pNDV-LaSota의 F 및 HN 유전자(도 2a)를 2개의 고유 제한 부위인 Pmel 및 NruI를 함유하는 짧은 서열로 대체하여, 수용자 플라스미드 pNDV-F-HNless를 생성하였다(도 2b). 도 2c는 NDV로부터의 F 및 HN 유전자가 도 2b의 수용자 플라스미드에 재삽입되어 기능적 구제 플라스미드 pNDV-LaSota를 생성시킨 기능적 구조 플라스미드를 보여준다. 도 2a-2c는 축척에 맞게 그려지지 않았다.
도 3a-3b. 가능한 최대 계통발생 트리. 이용 가능한 전장 게놈 서열을 갖는 모든 조류 파라믹소바이러스(NDV 제외)의 F 및 HN 아미노산 서열의 계통발생 트리가 도 3a 및 도 3b에 각각 나타나 있다. 서열 합성을 위해 선택된 14개의 바이러스의 F 및 HN 단백질은 굵은 글씨체로 표시되어 있다.
도 4a-4c. 구제 플라스미드 키메라 NDV-APMV의 구성. 상이한 APMV 및 NDV 논-코딩 측부 영역으로부터의 F 및 HN 코딩 서열을 함유하는 합성 삽입체는 F 및 HN 개방 해독 프레임의 측부에 위치하는 NDV 서열의 원활한 재구성을 위해 설계된 프라이머로 PCR에 의해 증폭된다. 도 4a에서 백색 상자는 NDV 논-코딩 측부 영역을 나타내고, 회색 박스는 상이한 APMV로부터의 F 및 HN 코딩 서열을 나타낸다(축척에 따라 그려지지 않음). 도 4b는 수용자 플라스미드 pNDV-F-HNless를 나타내고 도 4c는 합성 삽입체가 수용자 플라스미드 pNDV-F-HNless의 M 및 L 유전자 사이에 삽입된 구제 플라스미드 키메라 NDV-APMV를 보여준다.
도 5a-5h. qPCR에 의한 바이러스 복제 및 전염증성 유전자의 전사 분석. 암세포를 1의 MOI로 감염시키거나 모의 감염시키고 감염 후 8시간 및 16시간차에 RNA 추출을 수행하였다. 도 5a-5d, N 단백질의 mRNA 발현으로서 측정된 바이러스 복제 수준. 막대는 3개의 독립적인 생물학적 샘플의 평균 ± SD 을 나타내며, LS-L289A, APMV-4, 및 rAPMV-4의 순서로 보여진다. 도 5e-5h, 도 5a 내지 5d에 상응하는 각각의 독립적인 생물학적 샘플(1, 2, 3)에 대한 IFN-b, ISG(STAT1, ISG15, MX, OAS-1) 및 전염증성 사이토카인(IL-6 및 IL-1B)의 유도 수준을 보여주는 히트 맵. 각각의 개별 유전자에 대한 발현 수준을 모의 감염 세포에 대한 배수 유도의 Log10으로서 계산하였다. 양방향 ANOVA 분석: *p <0.05; ***p <0.001; ****p <0.0001; ns: 유의미하지 않음.
도 6a-6b. 도 6a는 조류 파라믹소바이러스의 아불라비리나 아과의 계통발생 나무를 도시한다. 도면은 Rima 등, 2019, J. Gen. Virol. 100(12):1593-1594로부터 구성되었다. 도 6b는 NDV 게놈 서열로부터 NDV F 단백질 및 NDV HN 단백질 코딩 서열의 제거, NDV F 단백질 및 NDV HN 단백질 코딩 서열이 제거된 NDV 게놈 내로 원거리 조류 파라믹소바이러스의 F 단백질 및 HN 단백질 코딩 서열의 삽입, 및 녹색 형광 단백질(GFP)을 암호화하는 이식유전자와 같은 이식유전자의 NDV 게놈 내로의 삽입을 도시하는 개략도이다.
도 7은 계통유전학 트리에서의 APMV-2 및 APMV-3의 위치 및 GFP을 암호화하는 이식유전자를 갖는 NDV 게놈 및 APMV-2 F 단백질 및 HN 단백질 코딩 서열(키메라 NDV-APMV-2-GFP), 또는 APMV-3 F 단백질 및 HN 단백질 코딩 서열(키메라 NDV-APMV-3-GFP) 중 어느 하나로 대체된 NDV F 단백질 및 NDV HN 단백질 코딩 서열의 개략도를 도시한다. 또한, GFP를 암호화하는 이식유전자를 갖는 NDV 게놈의 개략도가 도시되어 있다(NDV-GFP).
도 8a-8b. 도 8a는 키메라 NDV-APMV2-GFP 및 키메라 NDV-APMV3-GFP로 감염된 닭 배아 섬유아세포(CEF) 세포에 의한 GFP의 발현을 보여준다. 도 8b는 야생형(WT) NDV 바이러스에 대해 상승된 토끼 혈청을 사용한 혈구응집 억제(HI) 분석의 결과를 보여준다. 토끼 혈청의 HI 활성은 NDV-GFP에 대한 HI 활성과 비교하여 키메라 NDV-APMV-2-GFP 및 키메라 NDV-APMV-3-GFP 모두에 대해 유의하게 감소하였다.
도 1. 재조합 키메라 NDV-APMV 벡터의 구축 전략. 뉴캐슬병 바이러스(NDV 또는 APMV-1)에 상응하는 서열이 백색 상자에 도시되어 있고, 항원적으로 상이한 조류 파라믹소바이러스(예를 들어, APMV-4)에 상응하는 서열이 회색 상자에 도시되어 있다.
도 2a-2c. 수용자 플라스미드 pNDV-F-HNless의 생성. 구제 플라스미드 pNDV-LaSota의 F 및 HN 유전자(도 2a)를 2개의 고유 제한 부위인 Pmel 및 NruI를 함유하는 짧은 서열로 대체하여, 수용자 플라스미드 pNDV-F-HNless를 생성하였다(도 2b). 도 2c는 NDV로부터의 F 및 HN 유전자가 도 2b의 수용자 플라스미드에 재삽입되어 기능적 구제 플라스미드 pNDV-LaSota를 생성시킨 기능적 구조 플라스미드를 보여준다. 도 2a-2c는 축척에 맞게 그려지지 않았다.
도 3a-3b. 가능한 최대 계통발생 트리. 이용 가능한 전장 게놈 서열을 갖는 모든 조류 파라믹소바이러스(NDV 제외)의 F 및 HN 아미노산 서열의 계통발생 트리가 도 3a 및 도 3b에 각각 나타나 있다. 서열 합성을 위해 선택된 14개의 바이러스의 F 및 HN 단백질은 굵은 글씨체로 표시되어 있다.
도 4a-4c. 구제 플라스미드 키메라 NDV-APMV의 구성. 상이한 APMV 및 NDV 논-코딩 측부 영역으로부터의 F 및 HN 코딩 서열을 함유하는 합성 삽입체는 F 및 HN 개방 해독 프레임의 측부에 위치하는 NDV 서열의 원활한 재구성을 위해 설계된 프라이머로 PCR에 의해 증폭된다. 도 4a에서 백색 상자는 NDV 논-코딩 측부 영역을 나타내고, 회색 박스는 상이한 APMV로부터의 F 및 HN 코딩 서열을 나타낸다(축척에 따라 그려지지 않음). 도 4b는 수용자 플라스미드 pNDV-F-HNless를 나타내고 도 4c는 합성 삽입체가 수용자 플라스미드 pNDV-F-HNless의 M 및 L 유전자 사이에 삽입된 구제 플라스미드 키메라 NDV-APMV를 보여준다.
도 5a-5h. qPCR에 의한 바이러스 복제 및 전염증성 유전자의 전사 분석. 암세포를 1의 MOI로 감염시키거나 모의 감염시키고 감염 후 8시간 및 16시간차에 RNA 추출을 수행하였다. 도 5a-5d, N 단백질의 mRNA 발현으로서 측정된 바이러스 복제 수준. 막대는 3개의 독립적인 생물학적 샘플의 평균 ± SD 을 나타내며, LS-L289A, APMV-4, 및 rAPMV-4의 순서로 보여진다. 도 5e-5h, 도 5a 내지 5d에 상응하는 각각의 독립적인 생물학적 샘플(1, 2, 3)에 대한 IFN-b, ISG(STAT1, ISG15, MX, OAS-1) 및 전염증성 사이토카인(IL-6 및 IL-1B)의 유도 수준을 보여주는 히트 맵. 각각의 개별 유전자에 대한 발현 수준을 모의 감염 세포에 대한 배수 유도의 Log10으로서 계산하였다. 양방향 ANOVA 분석: *p <0.05; ***p <0.001; ****p <0.0001; ns: 유의미하지 않음.
도 6a-6b. 도 6a는 조류 파라믹소바이러스의 아불라비리나 아과의 계통발생 나무를 도시한다. 도면은 Rima 등, 2019, J. Gen. Virol. 100(12):1593-1594로부터 구성되었다. 도 6b는 NDV 게놈 서열로부터 NDV F 단백질 및 NDV HN 단백질 코딩 서열의 제거, NDV F 단백질 및 NDV HN 단백질 코딩 서열이 제거된 NDV 게놈 내로 원거리 조류 파라믹소바이러스의 F 단백질 및 HN 단백질 코딩 서열의 삽입, 및 녹색 형광 단백질(GFP)을 암호화하는 이식유전자와 같은 이식유전자의 NDV 게놈 내로의 삽입을 도시하는 개략도이다.
도 7은 계통유전학 트리에서의 APMV-2 및 APMV-3의 위치 및 GFP을 암호화하는 이식유전자를 갖는 NDV 게놈 및 APMV-2 F 단백질 및 HN 단백질 코딩 서열(키메라 NDV-APMV-2-GFP), 또는 APMV-3 F 단백질 및 HN 단백질 코딩 서열(키메라 NDV-APMV-3-GFP) 중 어느 하나로 대체된 NDV F 단백질 및 NDV HN 단백질 코딩 서열의 개략도를 도시한다. 또한, GFP를 암호화하는 이식유전자를 갖는 NDV 게놈의 개략도가 도시되어 있다(NDV-GFP).
도 8a-8b. 도 8a는 키메라 NDV-APMV2-GFP 및 키메라 NDV-APMV3-GFP로 감염된 닭 배아 섬유아세포(CEF) 세포에 의한 GFP의 발현을 보여준다. 도 8b는 야생형(WT) NDV 바이러스에 대해 상승된 토끼 혈청을 사용한 혈구응집 억제(HI) 분석의 결과를 보여준다. 토끼 혈청의 HI 활성은 NDV-GFP에 대한 HI 활성과 비교하여 키메라 NDV-APMV-2-GFP 및 키메라 NDV-APMV-3-GFP 모두에 대해 유의하게 감소하였다.
5.
상세한 설명
5.1
재조합 뉴캐슬병 바이러스
일 측면에서, 재조합 NDV 포장된 게놈이 본원에 제공되며, 여기서 포장된 게놈은 섹션 5.1.1에 기술된 핵산 서열을 포함한다. 특정 실시예에서, 섹션 5.1.1에 기술된 핵산 서열을 포함하는 재조합 NDV가 본원에 제공된다.
다른 측면에서, 포장된 게놈을 포함하는 재조합 NDV가 본원에 제공되며, 여기서 상기 포장된 게놈은 NDV HN 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열이 NDV 이외의 조류 파라믹소바이러스(APMV)의 HN 단백질 또는 비-NDV-APMV HN 단백질의 변이체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열로 대체되거나, NDV F 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열이 NDV 이외의 APMV의 F 단백질 또는 비-NDV-APMV F 단백질의 변이체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열로 대체된 뉴캐슬병 바이러스 게놈의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 본원의 특정 예에서, 용어 "비-NDV APMV"는 NDV 이외의 APMV를 지칭하는 데 사용된다. 일 실시예에서, 포장된 게놈을 포함하는 재조합 NDV가 본원에 제공되며, 여기서 상기 포장된 게놈은 (1) NDV HN 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열이 비-NDV APMV HN 단백질 또는 이의 변이체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열로 대체되었고, 여기서 NDV 유전자간 영역은 비-NDV APMV HN 단백질 코딩 서열 또는 변이체 HN 단백질 코딩 서열의 전후에 있고; 또는 (2) NDV F 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열이 비-NDV APMV F 단백질 또는 이의 변이체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열로 대체되었고, 여기서 NDV 유전자간 영역은 비-NDV AMPV F 단백질 코딩 서열 또는 변이체 F 단백질 코딩 서열의 전후에 있는, 뉴캐슬병 바이러스 게놈의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특정 실시예에서, 비-NDV APMV HN 단백질 코딩 서열 전후의 NDV 유전자간 영역은 NDV HN 유전자간 영역이다. 특정 실시예에서, 비-NDV APMV F 단백질 코딩 서열 전후의 NDV 유전자간 영역은 NDV F 유전자간 영역이다. 다른 실시예에서, 포장된 게놈을 포함하는 재조합 NDV가 본원에 제공되며, 여기서 상기 포장된 게놈은 (1) NDV HN 단백질을 암호화하는 전사 유닛이 비-NDV APMV HN 단백질 또는 이의 변이체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 전사 유닛으로 대체되었고; 또는 (2) NDV F 단백질을 암호화하는 전사 유닛이 비-NDV APMV F 단백질 또는 이의 변이체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 전사 유닛으로 대체된, 뉴캐슬병 바이러스 게놈의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특정 실시예에서, 비-NDV APMV F 단백질 또는 이의 변이체는 NDV가 시험관 내, 생체 내 또는 모두에서 복제하는 데 필요한 NDV F 단백질의 하나 이상, 또는 모든 기능을 갖는다. 특정 실시예에서, 비-NDV APMV HN 단백질 또는 이의 변이체는 NDV가 시험관 내, 생체 내 또는 모두에서 복제하는 데 필요한 NDV HN 단백질의 하나 이상, 또는 모든 기능을 갖는다. NDV 게놈은 일반적으로 N 유전자, P 유전자, L 유전자, M 유전자, HN 유전자, 및 F 유전자를 포함한다.
다른 실시예에서, 포장된 게놈을 포함하는 재조합 NDV가 본원에 제공되며, 여기서 상기 포장된 게놈은 (1) NDV HN 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열이 비-NDV APMV HN 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열로 대체되었고, 여기서 NDV 유전자간 영역은 비-NDV APMV HN 단백질 코딩 서열의 전후에 있고; 또는 (2) NDV F 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열이 비-NDV APMV F 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열로 대체되었고, 여기서 NDV 유전자간 영역은 상기 비-NDV APMV F 단백질 코딩 서열의 전후에 있는, 뉴캐슬병 바이러스 게놈의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특정 실시예에서, 비-NDV APMV HN 단백질 코딩 서열 전후의 NDV 유전자간 영역은 NDV HN 유전자간 영역이다. 특정 실시예에서, 비-NDV APMV F 단백질 코딩 서열 전후의 NDV 유전자간 영역은 NDV F 유전자간 영역이다. 다른 실시예에서, 포장된 게놈을 포함하는 재조합 NDV가 본원에 제공되며, 여기서 상기 포장된 게놈은 (1) NDV HN 단백질을 암호화하는 전사 유닛이 비-NDV APMV HN 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 전사 유닛으로 대체되었고; 또는 (2) NDV F 단백질을 암호화하는 전사 유닛은 비-NDV APMV F 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 전사 유닛으로 대체된, 뉴캐슬병 바이러스 게놈의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특정 실시예에서, 비-NDV APMV F 단백질은 NDV가 시험관 내, 생체 내 또는 모두에서 복제하는 데 필요한 NDV F 단백질의 하나 이상, 또는 모든 기능을 갖는다. 특정 실시예에서, 비-NDV APMV HN 단백질은 NDV가 시험관 내, 생체 내 또는 모두에서 복제하는 데 필요한 NDV HN 단백질의 하나 이상, 또는 모든 기능을 갖는다.
다른 실시예에서, 포장된 게놈을 포함하는 재조합 NDV가 본원에 제공되며, 여기서 상기 포장된 게놈은 (1) NDV HN 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열이 비-NDV APMV HN 단백질의 변이체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열로 대체되었고, 여기서 NDV 유전자간 영역은 변이체 HN 단백질 코딩 서열의 전후에 있고; 또는 (2) NDV F 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열이 비-NDV APMV F 단백질의 변이체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열로 대체되었고, 여기서 NDV 유전자간 영역은 변이체 F 단백질 코딩 서열 전과 후에 있는, 뉴캐슬병 바이러스 게놈의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특정 실시예에서, 비-NDV APMV HN 단백질 코딩 서열의 변이체 전후의 NDV 유전자간 영역은 NDV HN 유전자간 영역이다. 특정 실시예에서, 비-NDV APMV F 단백질 코딩 서열의 변이체 전후의 NDV 유전자간 영역은 NDV F 유전자간 영역이다. 다른 실시예에서, 포장된 게놈을 포함하는 재조합 NDV가 본원에 제공되며, 여기서 상기 포장된 게놈은 (1) NDV HN 단백질을 암호화하는 전사 유닛이 비-NDV APMV HN 단백질의 변이체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 전사 유닛으로 대체되었고; 또는 (2) NDV F 단백질을 암호화하는 전사 유닛이 비-NDV APMV F 단백질의 변이체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 전사 유닛으로 대체된, 뉴캐슬병 바이러스 게놈의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특정 실시예에서, 비-NDV F 단백질의 변이체는 NDV가 시험관 내, 생체 내 또는 모두에서 복제하는 데 필요한 NDV F 단백질의 하나 이상, 또는 모든 기능을 갖는다. 특정 실시예에서, 비-NDV HN 단백질의 변이체는 NDV가 시험관 내, 생체 내 또는 모두에서 복제하는 데 필요한 NDV HN 단백질의 하나 이상, 또는 모든 기능을 갖는다.
다른 측면에서, 포장된 게놈을 포함하는 재조합 NDV가 본원에 제공되며, 여기서 상기 포장된 게놈은 NDV HN 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열이 NDV 이외의 조류 파라믹소바이러스(APMV)의 HN 단백질 또는 비-NDV-APMV HN 단백질의 변이체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열로 대체되었고, 또는 NDV F 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 NDV 이외의 APMV의 F 단백질 또는 비-NDV-APMV F 단백질의 변이체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열로 대체된, 된 뉴캐슬병 바이러스 게놈의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일 실시예에서, 포장된 게놈을 포함하는 재조합 NDV가 본원에 제공되며, 여기서 상기 포장된 게놈은 (1) NDV HN 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열이 비-NDV APMV HN 단백질 또는 이의 변이체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열로 대체되었고; 및 (2) NDV F 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열이 비-NDV APMV F 단백질 또는 이의 변이체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열로 대체되었고, 여기서 NDV 유전자간 영역은 비-NDV APMV HN 및 F 단백질 코딩 서열 또는 변이체 HN 및 F 단백질 코딩 서열 이전, 사이 및 이후에 있는, 뉴캐슬병 바이러스 게놈의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특정 실시예에서, 비-NDV APMV HN 단백질 또는 이의 변이체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열 전후의 NDV 유전자간 영역은 NDV HN 유전자간 영역이다. 특정 실시예에서, 비-NDV APMV F 단백질 또는 이의 변이체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열 전후의 NDV 유전자간 영역은 NDV F 유전자간 영역이다. 다른 실시예에서, 포장된 게놈을 포함하는 재조합 NDV가 본원에 제공되며, 여기서 상기 포장된 게놈은 (1) NDV HN 단백질을 암호화하는 전사 유닛이 비-NDV APMV HN 단백질 또는 이의 변이체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 전사 유닛으로 대체되었고; 및 (2) NDV F 단백질을 암호화하는 전사 유닛이 비-NDV APMV F 단백질 또는 이의 변이체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 전사 유닛으로 대체된, 뉴캐슬병 바이러스 게놈의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특정 실시예에서, 비-NDV F 단백질 또는 이의 변이체는 NDV가 시험관 내, 생체 내 또는 모두에서 복제하는 데 필요한 NDV F 단백질의 하나 이상, 또는 모든 기능을 갖는다. 특정 실시예에서, 비-NDV HN 단백질 또는 이의 변이체는 NDV가 시험관 내, 생체 내 또는 모두에서 복제하는 데 필요한 NDV HN 단백질의 하나 이상, 또는 모든 기능을 갖는다.
다른 실시예에서, 포장된 게놈을 포함하는 재조합 NDV가 본원에 제공되며, 여기서 상기 포장된 게놈은 (1) NDV HN 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열이 비-NDV APMV HN 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열로 대체되었고; (2) NDV F 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열이 비-NDV APMV F 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열로 대체되었고, 여기서 NDV 유전자간 영역은 비-NDV APMV HN 및 F 단백질 코딩 서열 이전, 사이 및 이후에 있는, 뉴캐슬병 바이러스 게놈의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특정 실시예에서, 비-NDV APMV HN 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열 전후의 NDV 유전자간 영역은 NDV HN 유전자간 영역이다. 특정 실시예에서, 비-NDV APMV F 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열 전후의 NDV 유전자간 영역은 NDV F 유전자간 영역이다. 다른 실시예에서, 포장된 게놈을 포함하는 재조합 NDV가 본원에 제공되며, 여기서 상기 포장된 게놈은 (1) NDV HN 단백질을 암호화하는 전사 유닛이 비-NDV APMV HN 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 전사 유닛으로 대체되었고; (2) NDV F 단백질을 암호화하는 전사 유닛이 비-NDV APMV F 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 전사 유닛으로 대체된 뉴캐슬병 바이러스 게놈의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특정 실시예에서, 비-NDV APMV HN 및 F 단백질은 동일한 균주의 APMV에서 자연에서 발견된다. 예를 들어, 비-NDV APMV HN 및 F 단백질은 모두 동일한 APMV-15 균주에서 자연에서 발견될 수 있다. 다른 실시예에서, 비-NDV APMV HN 및 F 단백질은 상이한 균주의 APMV에서 자연에서 발견된다. 특정 실시예에서, 비-NDV F 단백질은 NDV가 시험관 내, 생체 내 또는 모두에서 복제하는 데 필요한 NDV F 단백질의 하나 이상, 또는 모든 기능을 갖는다. 특정 실시예에서, 비-NDV HN 단백질은 NDV가 시험관 내, 생체 내 또는 모두에서 복제하는 데 필요한 NDV HN 단백질의 하나 이상, 또는 모든 기능을 갖는다.
다른 실시예에서, 포장된 게놈을 포함하는 재조합 NDV가 본원에 제공되며, 여기서 상기 포장된 게놈은 (1) NDV HN 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열이 비-NDV APMV HN 단백질의 변이체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열로 대체되었고; (2) NDV F 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열이 비-NDV APMV F 단백질의 변이체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열로 대체되었고, 여기서 NDV 유전자간 영역은 변이체 HN 및 F 단백질 코딩 서열 이전, 사이 및 이후에 있는, 뉴캐슬병 바이러스 게놈의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특정 실시예에서, 비-NDV APMV HN 단백질의 변이체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열 전후의 NDV 유전자간 영역은 NDV HN 유전자간 영역이다. 특정 실시예에서, 비-NDV APMV F 단백질의 변이체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열 전후의 NDV 유전자간 영역은 NDV F 유전자간 영역이다. 다른 실시예에서, 포장된 게놈을 포함하는 재조합 NDV가 본원에 제공되며, 여기서 상기 포장된 게놈은 (1) NDV HN 단백질을 암호화하는 전사 유닛이 비-NDV APMV HN 단백질의 변이체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 전사 유닛으로 대체되었고; (2) NDV F 단백질을 암호화하는 전사 유닛이 비-NDV APMV F 단백질의 변이체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 전사 유닛으로 대체된, 뉴캐슬병 바이러스 게놈의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특정 실시예에서, 변이체 HN 및 F 단백질은 동일한 균주의 APMV로부터 유래된다. 예를 들어, 변이체 HN 및 F 단백질은 모두 동일한 APMV-15 균주로부터 유래될 수 있다. 다른 실시예에서, 변이체 HN 및 F 단백질은 상이한 균주의 APMV로부터 유래된다. 특정 실시예에서, 비-NDV F 단백질의 변이체는 NDV가 시험관 내, 생체 내 또는 모두에서 복제하는 데 필요한 NDV F 단백질의 하나 이상, 또는 모든 기능을 갖는다. 특정 실시예에서, 비-NDV HN 단백질의 변이체는 NDV가 시험관 내, 생체 내 또는 모두에서 복제하는 데 필요한 NDV HN 단백질의 하나 이상, 또는 모든 기능을 갖는다.
또 다른 측면에서, 포장된 게놈을 포함하는 재조합 NDV가 본원에 제공되며, 여기서 포장된 게놈은 NDV HN 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열이 키메라 HN 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열로 대체되거나, NDV F 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열이 키메라 F 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열로 대체된, 뉴캐슬병 바이러스 게놈의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 키메라 F 또는 키메라 HN 단백질을 생산하기 위한 방법에 관한, 예를 들어, Park 등, 2006, PNAS May 23, 2006 103 (21) 8203-8208, 국제 특허 출원 번호 WO 2007/064802, 및 미국 특허 번호 9,387,242 B2를 참조한다. 일 실시예에서, 포장된 게놈을 포함하는 재조합 NDV가 본원에 제공되며, 여기서 상기 포장된 게놈은 (1) NDV HN 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열이 키메라 HN 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열로 대체되었고, 여기서 NDV 유전자간 영역은 키메라 HN 단백질 코딩 서열의 전후에 있고; 또는 (2) NDV F 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열이 키메라 F 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열로 대체되었고, 여기서 NDV 유전자간 영역은 키메라 F 단백질 코딩 서열 전후에 있는, 뉴캐슬병 바이러스 게놈의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특정 실시예에서, 키메라 HN 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열 전후의 NDV 유전자간 영역은 NDV HN 유전자간 영역이다. 특정 실시예에서, 키메라 F 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열 전후의 NDV 유전자간 영역은 NDV F 유전자간 영역이다. 다른 실시예에서, 포장된 게놈을 포함하는 재조합 NDV가 본원에 제공되며, 여기서 상기 포장된 게놈은 (1) NDV HN 단백질을 암호화하는 전사 유닛이 키메라 HN 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 전사 유닛으로 대체되었고; 또는 (2) NDV F 단백질을 암호화하는 전사 유닛은 키메라 F 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 전사 유닛으로 대체된, 뉴캐슬병 바이러스 게놈의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특정 실시예에서, 키메라 HN 단백질은 비-NDV APMV HN 단백질 세포외 도메인(ectodomain) 및 NDV HN 단백질 막관통 및 세포질 도메인을 포함한다. 즉, NDV HN 단백질 막관통 및 세포질 도메인은 키메라 HN 단백질이 비-NDV APMV HN 단백질 막관통 및 세포질 도메인을 포함하지 않도록 비-NDV APMV HN 단백질 막관통 및 세포질 도메인을 대체한다. 비-NDV APMV HN 단백질 및 NDV HN 단백질의 세포외 도메인, 막관통 및 세포질 도메인은 당해 분야의 숙련자에게 공지된 기술을 사용하여 결정될 수 있다. 예를 들어, 공개된 정보, GenBank 또는 VIPR 바이러스 병원균 웹사이트(www.viprbrc.org), DTU 생물정보학 도메인 웹사이트(www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)와 같은 웹사이트, 또는 막관통 도메인을 결정하는 데 이용 가능한 프로그램이 비-NDV HN 단백질 및 NDV HN 단백질의 세포외 도메인, 막관통 및 세포질 도메인을 결정하는 데 사용될 수 있다. 특정 실시예에서, 키메라 HN 단백질은 비-NDV APMV HN 단백질의 변이체의 세포외 도메인 및 NDV HN 단백질 막관통 및 세포질 도메인을 포함한다. 특정 실시예에서, 키메라 HN 단백질은 NDV가 시험관 내, 생체 내 또는 모두에서 복제하는 데 필요한 NDV HN의 하나 이상, 또는 모든 기능을 갖는다. 특정 실시예에서, 키메라 F 단백질은 비-NDV APMV F 단백질 세포외 도메인 및 NDV F 단백질 막관통 및 세포질 도메인을 포함한다. 즉, NDV F 단백질 막관통 및 세포질 도메인은 키메라 F 단백질이 비-NDV APMV F 단백질 막관통 및 세포질 도메인을 포함하지 않도록 비-NDV APMV F 단백질 막관통 및 세포질 도메인을 대체한다. 비-NDV APMV F 단백질 및 NDV F 단백질의 세포외 도메인, 막관통 및 세포질 도메인은 당해 분야의 숙련자에게 공지된 기술을 사용하여 결정될 수 있다. 예를 들어, 공개된 정보, GenBank 또는 VIPR 바이러스 병원균 웹사이트(www.viprbrc.org), DTU 생물정보학 도메인 웹사이트(www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)와 같은 웹사이트, 또는 막관통 도메인을 결정하는 데 이용 가능한 프로그램이 비-NDV F 단백질 및 NDV F 단백질의 세포외 도메인, 막관통 및 세포질 도메인을 결정하는 데 사용될 수 있다. 특정 실시예에서, 키메라 F 단백질은 비-NDV APMV F 단백질의 변이체의 세포외 도메인 및 NDV F 단백질 막관통 및 세포질 도메인을 포함한다. 특정 실시예에서, 키메라 F 단백질은 NDV가 시험관 내, 생체 내 또는 모두에서 복제하는 데 필요한 NDV F 단백질의 하나 이상, 또는 모든 기능을 갖는다.
또 다른 측면에서, 포장된 게놈을 포함하는 재조합 NDV가 본원에 제공되며, 여기서 포장된 게놈은 NDV HN 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열이 키메라 HN 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열로 대체되었고, NDV F 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 키메라 F 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열로 대체된 뉴캐슬병 바이러스 게놈의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일 실시예에서, 포장된 게놈을 포함하는 재조합 NDV가 본원에 제공되며, 여기서 상기 포장된 게놈은 (1) NDV HN 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열이 키메라 HN 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열로 대체되었고, 여기서 NDV 유전자간 영역은 키메라 HN 단백질 코딩 서열의 전후에 있고; (2) NDV F 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 키메라 F 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열로 대체되었고, 여기서 NDV 유전자간 영역은 키메라 F 단백질 코딩 서열의 전후에 있는, 뉴캐슬병 바이러스 게놈의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특정 실시예에서, 키메라 HN 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열 전후의 NDV 유전자간 영역은 NDV HN 유전자간 영역이다. 특정 실시예에서, 키메라 F 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열 전후의 NDV 유전자간 영역은 NDV F 유전자간 영역이다. 다른 실시예에서, 포장된 게놈을 포함하는 재조합 NDV가 본원에 제공되며, 여기서 상기 포장된 게놈은 (1) NDV HN 단백질을 암호화하는 전사 유닛이 키메라 HN 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 전사 유닛으로 대체되었고; (2) NDV F 단백질을 암호화하는 전사 유닛은 키메라 F 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 전사 유닛으로 대체된, 뉴캐슬병 바이러스 게놈의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특정 실시예에서, 키메라 HN 단백질은 비-NDV APMV HN 단백질 세포외 도메인 및 NDV HN 단백질 막관통 및 세포질 도메인을 포함한다. 즉, NDV HN 단백질 막관통 및 세포질 도메인은 키메라 HN 단백질이 비-NDV APMV HN 단백질 막관통 및 세포질 도메인을 포함하지 않도록 비-NDV APMV HN 단백질 막관통 및 세포질 도메인을 대체한다. 비-NDV APMV HN 단백질 및 NDV HN 단백질의 세포외 도메인, 막관통 및 세포질 도메인은 당해 분야의 숙련자에게 공지되거나 본원에서 설명되는 기술을 사용하여 결정될 수 있다. 특정 실시예에서, 키메라 HN 단백질은 비-NDV APMV HN 단백질의 변이체의 세포외 도메인 및 NDV HN 단백질 막관통 및 세포질 도메인을 포함한다. 특정 실시예에서, 키메라 HN 단백질은 NDV가 시험관 내, 생체 내 또는 모두에서 복제하는 데 필요한 NDV HN의 하나 이상, 또는 모든 기능을 갖는다. 특정 실시예에서, 키메라 F 단백질은 비-NDV APMV F 단백질 세포외 도메인 및 NDV F 단백질 막관통 및 세포질 도메인을 포함한다. 즉, NDV F 단백질 막관통 및 세포질 도메인은 키메라 F 단백질이 비-NDV APMV F 단백질 막관통 및 세포질 도메인을 포함하지 않도록 비-NDV APMV F 단백질 막관통 및 세포질 도메인을 대체한다. 비-NDV APMV F 단백질 및 NDV F 단백질의 세포외 도메인, 막관통 및 세포질 도메인은 당해 분야의 숙련자에게 공지되거나 본원에서 설명되는 기술을 사용하여 결정될 수 있다. 특정 실시예에서, 키메라 F 단백질은 비-NDV APMV F 단백질의 변이체의 세포외 도메인 및 NDV F 단백질 막관통 및 세포질 도메인을 포함한다. 특정 실시예에서, 키메라 F 단백질은 NDV가 시험관 내, 생체 내 또는 모두에서 복제하는 데 필요한 NDV F 단백질의 하나 이상, 또는 모든 기능을 갖는다. 특정 실시예에서, 비-NDV APMV HN 및 F 단백질의 세포외 도메인은 동일한 균주의 APMV에서 자연에서 발견된다. 예를 들어, 비-NDV APMV HN 및 F 단백질의 세포외 도메인은 모두 동일한 APMV-15 균주에서 자연에서 발견될 수 있다. 다른 실시예에서, 비-NDV APMV HN 및 F 단백질의 세포외 도메인은 상이한 균주의 APMV에서 자연에서 발견된다.
다른 측면에서, 포장된 게놈을 포함하는 재조합 NDV가 본원에 제공되며, 상기 포장된 게놈은: (1) NDV 뉴클레오캡시드(N) 단백질을 암호화하는 전사 유닛, (2) NDV 인단백질(P)을 암호화하는 전사 유닛, (3) NDV 매트릭스(M) 단백질을 암호화하는 전사 유닛, (4) NDV 융합(F) 단백질을 암호화하는 전사 유닛, (5) 비-NDV APMV 헤마글루티닌-뉴라미니다아제(HN) 또는 이의 변이체를 암호화하는 전사 유닛, 및 (6) NDV 거대 중합효소(L)를 암호화하는 전사 유닛을 포함한다. 다른 측면에서, 포장된 게놈을 포함하는 재조합 NDV가 본원에 제공되며, 상기 포장된 게놈은: (1) NDV 뉴클레오캡시드(N) 단백질을 암호화하는 전사 유닛, (2) NDV 인단백질(P)을 암호화하는 전사 유닛, (3) NDV 매트릭스(M) 단백질을 암호화하는 전사 유닛, (4) 비-NDV APMV 융합(F) 단백질 또는 이의 변이체를 암호화하는 전사 유닛, (5) NDV 헤마글루티닌-뉴라미니다아제(HN)를 암호화하는 전사 유닛, 및 (6) NDV 거대 중합효소(L)를 암호화하는 전사 유닛을 포함한다. 특정 실시예에서, 비-NDV F 단백질 또는 이의 변이체는 NDV가 시험관 내, 생체 내 또는 모두에서 복제하는 데 필요한 NDV F 단백질의 하나 이상, 또는 모든 기능을 갖는다. 특정 실시예에서, 비-NDV HN 단백질 또는 이의 변이체는 NDV가 시험관 내, 생체 내 또는 모두에서 복제하는 데 필요한 NDV HN 단백질의 하나 이상, 또는 모든 기능을 갖는다.
다른 측면에서, 포장된 게놈을 포함하는 재조합 NDV가 본원에 제공되며, 상기 포장된 게놈은: (1) NDV 뉴클레오캡시드(N) 단백질을 암호화하는 전사 유닛, (2) NDV 인단백질(P)을 암호화하는 전사 유닛, (3) NDV 매트릭스(M) 단백질을 암호화하는 전사 유닛, (4) 비-NDV APMV 융합(F) 단백질 또는 이의 변이체를 암호화하는 전사 유닛, (5) 비-NDV APMV 헤마글루티닌-뉴라미니다아제(HN) 또는 이의 변이체를 암호화하는 전사 유닛, 및 (6) NDV 거대 중합효소(L)를 암호화하는 전사 유닛을 포함한다. 특정 실시예에서, 비-NDV F 단백질 또는 이의 변이체는 NDV가 시험관 내, 생체 내 또는 모두에서 복제하는 데 필요한 NDV F 단백질의 하나 이상, 또는 모든 기능을 갖는다. 특정 실시예에서, 비-NDV HN 단백질 또는 이의 변이체는 NDV가 시험관 내, 생체 내 또는 모두에서 복제하는 데 필요한 NDV HN 단백질의 하나 이상, 또는 모든 기능을 갖는다.
일 실시예에서, 포장된 게놈을 포함하는 재조합 NDV가 본원에 제공되며, 상기 포장된 게놈은: (1) NDV 뉴클레오캡시드(N) 단백질을 암호화하는 전사 유닛, (2) NDV 인단백질(P)을 암호화하는 전사 유닛, (3) NDV 매트릭스(M) 단백질을 암호화하는 전사 유닛, (4) 비-NDV APMV 융합(F) 단백질을 암호화하는 전사 유닛, (5) 비-NDV APMV 헤마글루티닌-뉴라미니다아제(HN)를 암호화하는 전사 유닛, 및 (6) NDV 거대 중합효소(L)를 암호화하는 전사 유닛을 포함한다. 특정 실시예에서, 비-NDV APMV HN 및 F 단백질은 동일한 균주의 APMV에서 자연에서 발견된다. 예를 들어, 비-NDV APMV HN 및 F 단백질은 모두 동일한 APMV-15 균주에서 자연에서 발견될 수 있다. 다른 실시예에서, 비-NDV APMV HN 및 F 단백질은 상이한 균주의 APMV에서 자연에서 발견된다. 특정 실시예에서, 비-NDV F 단백질은 NDV가 시험관 내, 생체 내 또는 모두에서 복제하는 데 필요한 NDV F 단백질의 하나 이상, 또는 모든 기능을 갖는다. 특정 실시예에서, 비-NDV HN 단백질은 NDV가 시험관 내, 생체 내 또는 모두에서 복제하는 데 필요한 NDV HN 단백질의 하나 이상, 또는 모든 기능을 갖는다.
다른 실시예에서, 포장된 게놈을 포함하는 재조합 NDV가 본원에 제공되며, 상기 포장된 게놈은: (1) NDV 뉴클레오캡시드(N) 단백질을 암호화하는 전사 유닛, (2) NDV 인단백질(P)을 암호화하는 전사 유닛, (3) NDV 매트릭스(M) 단백질을 암호화하는 전사 유닛, (4) 비-NDV APMV 융합(F) 단백질의 변이체를 암호화하는 전사 유닛, (5) 비-NDV APMV 헤마글루티닌-뉴라미니다아제(HN)의 변이체를 암호화하는 전사 유닛, 및 (6) NDV 거대 중합효소(L)를 암호화하는 전사 유닛을 포함한다. 특정 실시예에서, 비-NDV APMV HN 및 F 단백질의 변이체는 동일한 균주의 APMV로부터 유래된다. 예를 들어, 비-NDV APMV HN 및 F 단백질의 변이체는 모두 동일한 APMV-15 균주로부터 유래될 수 있다. 다른 실시예에서, 비-NDV APMV HN 및 F 단백질의 변이체는 상이한 균주의 APMV로부터 유래된다. 특정 실시예에서, 비-NDV F 단백질의 변이체는 NDV가 시험관 내, 생체 내 또는 모두에서 복제하는 데 필요한 NDV F 단백질의 하나 이상, 또는 모든 기능을 갖는다. 특정 실시예에서, 비-NDV HN 단백질의 변이체는 NDV가 시험관 내, 생체 내 또는 모두에서 복제하는 데 필요한 NDV HN 단백질의 하나 이상, 또는 모든 기능을 갖는다.
다른 측면에서, 포장된 게놈을 포함하는 재조합 NDV가 본원에 제공되며, 상기 포장된 게놈은: (1) NDV 뉴클레오캡시드(N) 단백질을 암호화하는 전사 유닛, (2) NDV 인단백질(P)을 암호화하는 전사 유닛, (3) NDV 매트릭스(M) 단백질을 암호화하는 전사 유닛, (4) NDV 융합(F) 단백질을 암호화하는 전사 유닛, (5) 키메라 헤마글루티닌-뉴라미니다아제(HN)를 암호화하는 전사 유닛, 및 (6) NDV 거대 중합효소(L)를 암호화하는 전사 유닛을 포함한다. 다른 측면에서, 포장된 게놈을 포함하는 재조합 NDV가 본원에 제공되며, 상기 포장된 게놈은: (1) NDV 뉴클레오캡시드(N) 단백질을 암호화하는 전사 유닛, (2) NDV 인단백질(P)을 암호화하는 전사 유닛, (3) NDV 매트릭스(M) 단백질을 암호화하는 전사 유닛, (4) 키메라 융합(F) 단백질을 암호화하는 전사 유닛, (5) NDV 헤마글루티닌-뉴라미니다아제(HN)를 암호화하는 전사 유닛, 및 (6) NDV 거대 중합효소(L)를 암호화하는 전사 유닛을 포함한다. 다른 측면에서, 포장된 게놈을 포함하는 재조합 NDV가 본원에 제공되며, 상기 포장된 게놈은: (1) NDV 뉴클레오캡시드(N) 단백질을 암호화하는 전사 유닛, (2) NDV 인단백질(P)을 암호화하는 전사 유닛, (3) NDV 매트릭스(M) 단백질을 암호화하는 전사 유닛, (4) 키메라 융합(F) 단백질을 암호화하는 전사 유닛, (5) 키메라 헤마글루티닌-뉴라미니다아제(HN)를 암호화하는 전사 유닛, 및 (6) NDV 거대 중합효소(L)를 암호화하는 전사 유닛을 포함한다. 특정 실시예에서, 키메라 HN 단백질은 비-NDV APMV HN 단백질 세포외 도메인 및 NDV HN 단백질 막관통 및 세포질 도메인을 포함한다. 즉, NDV HN 단백질 막관통 및 세포질 도메인은 키메라 HN 단백질이 비-NDV APMV HN 단백질 막관통 및 세포질 도메인을 포함하지 않도록 비-NDV APMV HN 단백질 막관통 및 세포질 도메인을 대체한다. 비-NDV APMV HN 단백질 및 NDV HN 단백질의 세포외 도메인, 막관통 및 세포질 도메인은 당해 분야의 숙련자에게 공지된 기술을 사용하여 결정될 수 있다. 예를 들어, 공개된 정보, GenBank 또는 VIPR 바이러스 병원균 웹사이트(www.viprbrc.org), DTU 생물정보학 도메인 웹사이트(www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)와 같은 웹사이트, 또는 막관통 도메인을 결정하는 데 이용 가능한 프로그램이 비-NDV HN 단백질 및 NDV HN 단백질의 세포외 도메인, 막관통 및 세포질 도메인을 결정하는 데 사용될 수 있다. 특정 실시예에서, 키메라 HN 단백질은 NDV가 시험관 내, 생체 내 또는 모두에서 복제하는 데 필요한 NDV HN의 하나 이상, 또는 모든 기능을 갖는다. 특정 실시예에서, 키메라 F 단백질은 비-NDV APMV F 단백질 세포외 도메인 및 NDV F 단백질 막관통 및 세포질 도메인을 포함한다. 즉, NDV F 단백질 막관통 및 세포질 도메인은 키메라 F 단백질이 비-NDV APMV F 단백질 막관통 및 세포질 도메인을 포함하지 않도록 비-NDV APMV F 단백질 막관통 및 세포질 도메인을 대체한다. 비-NDV APMV F 단백질 및 NDV F 단백질의 세포외 도메인, 막관통 및 세포질 도메인은 당해 분야의 숙련자에게 공지된 기술을 사용하여 결정될 수 있다. 예를 들어, 공개된 정보, GenBank 또는 VIPR 바이러스 병원균 웹사이트(www.viprbrc.org), DTU 생물정보학 도메인 웹사이트(www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)와 같은 웹사이트, 또는 막관통 도메인을 결정하는 데 이용 가능한 프로그램이 비-NDV F 단백질 및 NDV F 단백질의 세포외 도메인, 막관통 및 세포질 도메인을 결정하는 데 사용될 수 있다. 특정 실시예에서, 키메라 F 단백질은 NDV가 시험관 내, 생체 내 또는 모두에서 복제하는 데 필요한 NDV F 단백질의 하나 이상, 또는 모든 기능을 갖는다. 특정 실시예에서, 비-NDV APMV HN 및 F 단백질의 세포외 도메인은 동일한 균주의 APMV에서 자연에서 발견된다. 예를 들어, 비-NDV APMV HN 및 F 단백질의 세포외 도메인은 모두 동일한 APMV-15 균주에서 자연에서 발견될 수 있다. 다른 실시예에서, 비-NDV APMV HN 및 F 단백질의 세포외 도메인은 상이한 균주의 APMV에서 자연에서 발견된다.
특정 실시예에서, 비-NDV APMV는 NDV와 면역학적으로 구별된다. 특정 실시예에서, 비-NDV APMV 및 NDV가, Chumbe 등, 2017, Virology Journal 14: 232 및 Reynolds 등, 1999, Avian Dis. 143:564-71, Sun 등, 2020, EBioMedicine 62: 103132, 또는 Sun 등, 2020, Vaccines 8: 771, 또는 본원에서 설명되는 바와 같은, 바이러스 중성화 검정에 의해 평가되는 바와 같이 서로의 복제를 유의하게 억제하는 항체를 유도하지 않는 경우, 비-NDV APMV는 NDV과 면역학적으로 구별된다. 특정 실시예에서, 비-NDV APMV 및 NDV가, 예를 들어, Chumbe 등, 2017, Virology Journal 14: 232 및 Reynolds 등, 1999, Avian Dis. 143:564-71, Sun 등, 2020, EBioMedicine 62: 103132, 또는 Sun 등, 2020, Vaccines 8: 771, 또는 본원에서 설명되는 바와 같은, 바이러스 중성화 검정에서, 약 0.5 log 미만, 약 1 log 미만, 약 1.5 log 미만, 또는 약 2 log 미만 만큼, 서로의 복제를 억제하는 항체를 유도하는 경우, 비-NDV NDV는 NDV과 면역학적으로 구별되는 것으로 간주된다. 특정 실시예에서, NDV 항혈청 HI 활성이 아래에 기술된 바와 같은(예를 들어, 예 3에서) HI 검정에서 비-NDV APMV에 대해 상당히 감소되는 경우, 비-NDV APMV는 NDV와 면역학적으로 구별되는 것으로 간주된다. 특정 실시예에서, NDV 항혈청 HI 활성이 NDV에 대한 NDV 항혈청 HI 활성에 비해, 아래에 기술된 바와 같은(예를 들어, 예 3에서) HI 검정에서 비-NDV APMV에 대해 적어도 2배, 3배, 4배, 5배, 10배, 또는 그 이상 감소되는 경우, 비-NDV APMV는 NDV와 면역학적으로 구별되는 것으로 간주된다. 특정 실시예에서, 비-NDV APMV는 AMPV-2, AMPV-3, AMPV-4, AMPV-5, AMPV-6, AMPV-7, AMPV-8, AMPV-9, AMPV-10, AMPV-11, AMPV-12, AMPV-13, AMPV-14, AMPV-15, AMPV-16, AMPV-17, AMPV-18, AMPV-19, AMPV-20, 또는 AMPV-21이다. 일부 실시예에서, 비-NDV APMV는 APMV-2, 예컨대, 예를 들어, Chicken/California/Yucaipa/56(수탁 번호 EU338414)이다. 특정 실시예에서, 비-NDV APMV는 APMV-3, 예컨대, 예를 들어, APMV3/Turkey/Wisconsin/68(수탁 번호 EU782025)이다. 일부 실시예에서, 비-NDV APMV는 APMV-4, 예컨대, 예를 들어, APMV4/duck/Hongkong/D3/75(수탁 번호 FJ177514), APMV4/Duck/China/G302/2012(수탁 번호 KC439346.1), APMV4/mallard/Belgium/15129/07(수탁 번호 JN571485), APMV4/Uriah_aalge/Russia/Tyuleniy_Island/115/2015(수탁 번호 KU601399.1) APMV-4/Egyptian goose/South Africa/N1468/2010 (수탁 번호 JX133079.1), 또는 APMV4/duck/Delaware/549227/2010 (수탁 번호 JX987283.1)이다. 특정 실시예에서, 비-NDV APMV는 APMV-5, 예컨대, 예를 들어, APMV-5 budgerigar/Kunitachi/74 (수탁 번호 GU206351) 또는 APMV5/budgerigar/Japan/TI/75 (수탁 번호 LC168750)이다. 일부 실시예에서, 비-NDV APMV는 APMV-6, 예컨대, 예를 들어, APMV-6 Goose/FarEast/4440/2003(수탁 번호 EF569970) 또는 APMV6/duck/HongKong/18/199/77(수탁 번호 EU622637)이다. 특정 실시예에서, 비-NDV APMV는 APMV-7, 예컨대, 예를 들어, APMV-7 dove/Tennessee/4/75(수탁 번호 FJ231524)이다. 일부 실시예에서, 비-NDV APMV는 APMV-8, 예컨대, 예를 들어, APMV-8 goose/Delaware/1053/76(수탁 번호 FJ215863)이다. 특정 실시예에서, 비-NDV APMV는 APMV-9, 예컨대, 예를 들어, APMV9/duck/New York/22/78(수탁 번호 EU910942)이다. 일부 실시예에서, 비-NDV APMV는 APMV-10, 예컨대, 예를 들어, APMV-10 penguin/Falkland Islands/324/2007(수탁 번호 HM147142 또는 NC_025349)이다. 특정 실시예에서, 비-NDV APMV는 APMV-11, 예컨대, 예를 들어, APMV-11 common_snipe/France/100212/2010(수탁 번호 JQ886184)이다. 일부 실시예에서, 비-NDV APMV는 APMV-12, 예컨대, 예를 들어 APMV12/Wigeon/Italy/3920_1/05(수탁 번호 KC333050)이다. 일부 실시예에서, 비-NDV APMV는 APMV-14, 예컨대, 예를 들어, APMV-14 duck/Japan/11OG0352/2011(수탁 번호 KX258200)이다. 특정 실시예에서, 비-NDV APMV는 APMV-15, 예컨대, 예를 들어, APMV-15 calidris_fuscicollis/Brazil/RS-1177/2012(수탁 번호 KX932454)이다. 일부 실시예에서, 비-NDV APMV는, APMV-17, 예컨대, 예를 들어, APMV17/Antarctica/107/13(수탁 번호 MK167211)이다. 일부 실시예에서, 비-NDV APMV는 APMV-20, 예컨대, 예를 들어, APMV-20 Gull/Kazakhstan/2014(수탁 번호 MF033136)이다. 특정 실시예에서, 비-NDV APMV는 APMV-21, 예컨대, 예를 들어, APMV21/pigeon/Taiwan/AHRI128/17(수탁 번호 MK67743)이다.
특정 실시예에서, 비-NDV APMV는 APMV4/duck/Hongkong/D3/75(수탁 번호 FJ177514)이다. 다른 특정 실시예에서, 비-NDV APMV는 APMV17/Antarctica/107/13(수탁 번호 MK167211)이다. 다른 특정 실시예에서, 비-NDV APMV는 APMV9/duck/New York/22/78(수탁 번호 EU910942)이다. 다른 특정 실시예에서, 비-NDV는 APMV7/ dove/Tennessee/4/75(수탁 번호 FJ231524)이다. 다른 특정 실시예에서, 비-NDV APMV는 APMV21/pigeon/Taiwan/AHRI128/17(수탁 번호 MK67743)이다. 다른 특정 실시예에서, 비-NDV APMV는 APMV6/duck/HongKong/18/199/77(수탁 번호 EU622637)이다. 다른 특정 실시예에서, 비-NDV APMV는 APMV11/common_snipe/France/100212/10(수탁 번호 JQ886184)이다. 다른 특정 실시예에서, 비-NDV APMV는 APMV15/calidris_fuscicollis/Brazil/RS-1177/12(수탁 번호 NC_034968)이다. 다른 특정 실시예에서, 비-NDV APMV는 APMV8/Goose/Delaware/1053/76(수탁 번호 FJ215863)이다. 다른 특정 실시예에서, 비-NDV APMV는 APMV2/Chicken/California/Yucaipa/56(수탁 번호 EU338414)이다. 다른 특정 실시예에서, 비-NDV APMV는 APMV3/Turkey/Wisconsin/68(수탁 번호 EU782025)이다. 다른 특정 실시예에서, 비-NDV APMV는 APMV12/Wigeon/Italy/3920_1/05(수탁 번호 KC333050)이다. 다른 특정 실시예에서, 비-NDV APMV는 APMV5/budgerigar/Japan/TI/75(수탁 번호 LC168750)이다. 다른 특정 실시예에서, 비-NDV APMV는 APMV10/penguin/Falkland Islands/324/07(수탁 번호 NC_025349)이다.
일부 실시예에서, 비-NDV APMV는 NDV와 상이한 속으로부터의 아불라비리나 아과의 구성원이다. 일부 실시예에서, 비-NDV APMV는 아불라비리나 아과의 구성원이지만, NDV는 아니다. 일부 실시예에서, 비-NDV APMV는 아불라비리나 아과 및 메타아불라바이러스 속의 구성원이다. 일부 실시예에서, 비-NDV APMV는 아불라비리나 아과 및 파라아불라바이러스 속의 구성원이다. 일부 실시예에서, 비-NDV APMV는 아불라비리나 아과 및 오소아불라바이러스의 구성원이지만, NDV는 아니다.
특정 실시예에서, 비-NDV APMV F 단백질은 NDV F 단백질과 면역학적으로 구별된다. 특정 실시예에서, 비-NDV APMV F 단백질의 변이체는 NDV F 단백질과 면역학적으로 구별된다. 특정 실시예에서, NDV F 단백질에 대한 항체가 비-NDV APMV F 단백질 또는 이의 변이체와 교차 반응하지 않는 경우, 비-NDV APMV F 단백질 또는 이의 변이체는 NDV F 단백질과 면역학적으로 구별된다. 일부 실시예에서, 당해 분야의 숙련자에게 공지되거나 본원에서 설명되는 검정에서 NDV F 단백질에 대한 항체가 NDV F 단백질에 비해 2배, 5배, 10배, 15배, 20배 또는 더 낮은 친화도로 비-NDV APMV F 단백질 또는 이의 변이체에 결합하는 경우, 비-NDV APMV F 단백질 또는 이의 변이체는 NDV F 단백질과 면역학적으로 구별된다. 특정 실시예에서, 당해 분야의 숙련자에게 공지되거나 본원에서 설명되는 검정에서 NDV F 단백질에 대한 항체가 NDV F 단백질에 비해 0.5 log, 1 log, 1.5 log, 2 log, 2.5 log, 3 log 또는 더 낮은 친화도로 비-NDV APMV F 단백질 또는 이의 변이체에 결합하는 경우, 비-NDV APMV F 단백질 또는 이의 변이체는 NDV F 단백질과 면역학적으로 구별된다. 특정 실시예에서, 항-NDV F 항체가, Chumbe 등, 2017, Virology Journal 14: 232 및 Reynolds 등, 1999, Avian Dis. 143:564-71, Sun 등, 2020, EBioMedicine 62: 103132, 또는 Sun 등, 2020, Vaccines 8: 771, 또는 본원에서 설명되는 바와 같은, 바이러스 중성화 검정에 의해 평가되는 바와 같이 비-NDV APMV F 단백질 또는 이의 변이체를 발현하는 NDV의 복제를 유의하게 억제하지 않는 경우, 비-NDV APMV F 단백질 또는 이의 변이체는 NDV F 단백질과 면역학적으로 구별된다. 특정 실시예에서, 항-NDV F 항체가, 예를 들어, Chumbe 등, 2017, Virology Journal 14: 232 및 Reynolds 등, 1999, Avian Dis. 143:564-71, Sun 등, 2020, EBioMedicine 62: 103132, 또는 Sun 등, 2020, Vaccines 8: 771, 또는 본원에서 설명되는 바와 같은, 바이러스 중성화 검정에서, 약 0.5 log 미만, 약 1 log 미만, 약 1.5 log 미만, 또는 약 2 log 미만 만큼, 비-NDV APMV F 단백질 또는 이의 변이체를 발현하는 NDV의 복제를 억제하는 경우, 비-NDV APMV F 단백질 또는 이의 변이체는 NDV F 단백질과 면역학적으로 구별된다. 일부 실시예에서, 비-NDV APMV F 단백질은 NDV와 상이한 속으로부터의 F 단백질이다. 일부 실시예에서, 비-NDV APMV F 단백질은 NDV와 상이한 속의 아불라비리나 아과의 구성원으로부터의 F 단백질이다. 일부 실시예에서, 비-NDV APMV F 단백질은 아불라비리나 아과의 구성원으로부터의 F 단백질이지만, NDV는 아니다. 일부 실시예에서, 비-NDV APMV F 단백질은 아불라비리나 아과 및 메타아불라바이러스 속의 구성원으로부터의 F 단백질이다. 일부 실시예에서, 비-NDV APMV F 단백질은 아불라비리나 아과 및 파라아불라바이러스 속의 구성원으로부터의 F 단백질이다. 일부 실시예에서, 비-NDV APMV F 단백질은 아불라비리나 아과 및 오소아불라바이러스의 구성원으로부터의 F 단백질이지만, NDV는 아니다.
특정 실시예에서, 키메라 F 단백질은 NDV F 단백질과 면역학적으로 구별된다. 특정 실시예에서, 키메라 F 단백질은 NDV F 단백질에 대한 항체가 키메라 F 단백질과 교차 반응하지 않는 경우 NDV F 단백질과 면역학적으로 구별된다. 일부 실시예에서, NDV F 단백질에 대한 항체가 당해 분야의 숙련자에게 공지되거나 본원에서 설명되는 검정에서 NDV F 단백질에 비해 2배, 5배, 10배, 15배, 20배 또는 더 낮은 친화도로 키메라 F 단백질에 결합하는 경우, 키메라 F 단백질은 NDV F 단백질과 면역학적으로 구별된다. 특정 실시예에서, NDV F 단백질에 대한 항체가 당해 분야의 숙련자에게 공지되거나 본원에서 설명되는 검정에서 NDV F 단백질보다 0.5 log, 1 log, 1.5 log, 2 log, 2.5 log, 3 log 또는 더 낮은 친화도로 키메라 F 단백질에 결합하는 경우, 키메라 F 단백질은 NDV F 단백질과 면역학적으로 구별된다. 특정 실시예에서, 항-NDV F 항체가, Chumbe 등, 2017, Virology Journal 14: 232 및 Reynolds 등, 1999, Avian Dis. 143:564-71, Sun 등, 2020, EBioMedicine 62: 103132, 또는 Sun 등, 2020, Vaccines 8: 771, 또는 본원에서 설명되는 바와 같은, 바이러스 중성화 검정에 의해 평가되는 바와 같이 비-NDV APMV F 단백질 또는 이의 변이체를 발현하는 NDV의 복제를 유의하게 억제하지 않는 경우, 키메라 F 단백질은 NDV F 단백질과 면역학적으로 구별된다. 특정 실시예에서, 항-NDV F 항체가, 예를 들어, Chumbe 등, 2017, Virology Journal 14: 232 및 Reynolds 등, 1999, Avian Dis. 143:564-71, Sun 등, 2020, EBioMedicine 62: 103132, 또는 Sun 등, 2020, Vaccines 8: 771, 또는 본원에서 설명되는 바와 같은, 바이러스 중성화 검정에서, 약 0.5 log 미만, 약 1 log 미만, 약 1.5 log 미만, 또는 약 2 log 미만 만큼, 비-NDV APMV F 단백질 또는 이의 변이체를 발현하는 NDV의 복제를 억제하는 경우, 키메라 F 단백질은 NDV F 단백질과 면역학적으로 구별된다.
특정 실시예에서, 비-NDV APMV F 단백질은 다염기 절단 부위를 함유하지 않는다. 특정 실시예에서, 비-NDV APMV F 단백질은, 예를 들어, 하나 이상의 아미노산 치환에 의해 변형되어, 비-NDV APMV F 단백질은 더 이상 다-염기 절단을 함유하지 않는다. 일부 실시예에서, 비-NDV APMV F 단백질의 절단 부위의 원래 서열은 예를 들어, 하나 이상의 아미노산 치환에 의해 변형된다. 예를 들어, NDV F 단백질의 아미노산 위치 289에 상응하는 (LaSota 균주 F 단백질에 의해 계수된) 비-NDV APMV F 단백질의 아미노산 위치에서의 류신은 다염기 절단 부위를 제거하기 위해 알라닌으로 치환될 수 있다.
특정 실시예에서, 비-NDV APMV F 단백질의 변이체는 다염기 절단 부위를 함유하지 않는다. 특정 실시예에서, 비-NDV APMV F 단백질의 변이체는 비-NDV APMV F 단백질이 더 이상 다-염기 절단을 함유하지 않도록 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시예에서, 비-NDV APMV F 단백질의 변이체의 절단 부위의 원래 서열은, 예를 들어 하나 이상의 아미노산 치환에 의해 변형된다. 예를 들어, 비-NDV APMV F 단백질의 변이체는 NDV F 단백질의 아미노산 위치 289에 상응하는 (LaSota 균주 F 단백질에 의해 계수된) 비-NDV APMV F 단백질의 아미노산 위치에서 류신에 대한 알라닌의 아미노산 치환을 포함한다.
특정 실시예에서, 키메라 F 단백질은 다염기 절단 부위를 함유하지 않는다. 특정 실시예에서, 키메라 F 단백질은 비-NDV APMV F 단백질의 세포외 도메인이 더 이상 다-염기 절단을 함유하지 않도록 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시예에서, 비-NDV APMV F 단백질의 세포외 도메인의 절단 부위의 원래 서열은, 예를 들어 하나 이상의 아미노산 치환에 의해 변형된다. 예를 들어, 키메라 단백질은 NDV F 단백질의 아미노산 위치 289에 상응하는 (LaSota 균주 F 단백질에 의해 계수된) 비-NDV APMV F 단백질의 세포외 도메인의 아미노산 위치에서 류신에 대한 알라닌의 아미노산 치환을 포함한다.
특정 실시예에서, 비-NDV APMV F 단백질의 변이체는 비-NDV APMV F 단백질의 하나 이상의 기능을 보유한다.
특정 실시예에서, 비-NDV APMV F 단백질의 변이체는 비-NDV AMPV F 단백질과 적어도 75%, 적어도 80%, 또는 적어도 85% 동일하다. 일부 실시예에서, 비-NDV APMV F 단백질의 변이체는 비-NDV APMV F 단백질과 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 동일하다. 특정 실시예에서, 비-NDV APMV F 단백질의 변이체는 비-NDV AMPV F 단백질과 75% 내지 90%, 80% 내지 95%, 또는 90% 내지 99.5% 동일하다.
특정 실시예에서, 비-NDV APMV F 단백질의 변이체는 비-NDV APMV F 단백질에 비해 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 이상, 또는 2 내지 5, 2 내지 10, 5 내지 10, 5 내지 15, 5 내지 20, 10 내지 15, 또는 15 내지 20개 아미노산 돌연변이(즉, 첨가, 결실, 치환 또는 이들의 임의의 조합)를 함유한다. 일부 실시예에서, 비-NDV APMV F 단백질의 변이체는 다른 아미노산으로 치환된(예를 들어, 보존적으로 치환된) 비-NDV APMV F 단백질의 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개의 아미노산 잔기를 갖는 비-NDV APMV F 단백질의 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시예에서, 비-NDV APMV F 단백질의 변이체는 최대 약 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개의 보존적으로 치환된 아미노산을 갖는 비-NDV APMV F 단백질의 아미노산 서열을 포함한다. 보존적 아미노산 치환의 예는, 예를 들어, 하나의 부류의 아미노산을 동일한 부류의 다른 아미노산으로 대체하는 것을 포함한다. 특정 실시예에서, 보존적 치환은 폴리펩티드의 구조 또는 기능, 또는 둘 다를 변경시키지 않는다. 아미노산의 부류는 소수성(Met, Ala, Val, Leu, Ile), 중성 친수성(Cys, Ser, Thr), 산성(Asp, Glu), 염기성(Asn, Gln, His, Lys, Arg), 형태 파괴자(Gly, Pro), 및 방향족(Trp, Tyr, Phe)을 포함할 수 있다.
일부 실시예에서, 비-NDV APMV F 단백질의 변이체는 고, 중간 또는 전형적인 엄중도 혼성화 조건 하에서 비-NDV APMV F 단백질을 암호화하는 핵산 서열에 혼성화될 수 있는 핵산 서열에 의해 암호화된 폴리펩티드이다. 혼성화 조건은 당해 분야의 숙련자에게 공지되어 있다(미국 특허 출원 제2005/0048549호, 예를 들어, 단락 72 및 73 참조).
특정 실시예에서, 비-NDV APMV F 단백질은 NDV F 단백질과 면역학적으로 구별되는 임의의 비-NDV AMPV F 단백질이다. 일부 실시예에서, 비-NDV APMV F 단백질은 도 3a에 도시된 APMV의 F 단백질이다. 일부 실시예에서, 비-NDV APMV F 단백질은 도 3a 또는 도 6a에 도시된 속의 구성원의 F 단백질이다. 특정 실시예에서, 비-NDV APMV F 단백질은 AMPV-2, AMPV-3, AMPV-4, AMPV-5, AMPV-6, AMPV-7, AMPV-8, AMPV-9, AMPV-10, AMPV-11, AMPV-12, AMPV-13, AMPV-14, AMPV-15, AMPV-16, AMPV-17, AMPV-18, AMPV-19, AMPV-20, 또는 AMPV-21의 F 단백질이다. 일부 실시예에서, 비-NDV APMV F 단백질은 APMV-2, 예컨대, 예를 들어, Chicken/California/Yucaipa/56(수탁 번호 EU338414)의 F 단백질이다. 특정 실시예에서, 비-NDV APMV F 단백질은 APMV-2 Yucaipa의 F 단백질이다. 다른 실시예에서, 비-NDV APMV F 단백질은 APMV-2 Yucaipa의 F 단백질이 아니다. 특정 실시예에서, 비-NDV APMV F 단백질은 APMV-3, 예컨대, 예를 들어, APMV3/Turkey/Wisconsin/68(수탁 번호 EU782025)의 F 단백질이다. 일부 실시예에서, 비-NDV APMV F 단백질은 APMV-4, 예컨대, 예를 들어, APMV4/duck/Hongkong/D3/75(수탁 번호 FJ177514), APMV4/Duck/China/G302/2012(수탁 번호 KC439346.1), APMV4/mallard/Belgium/15129/07(수탁 번호 JN571485), APMV4/Uriah_aalge/Russia/Tyuleniy_Island/115/2015(수탁 번호 KU601399.1) APMV-4/Egyptian goose/South Africa/N1468/2010 (수탁 번호 JX133079.1), 또는 APMV4/duck/Delaware/549227/2010 (수탁 번호 JX987283.1)의 F 단백질이다. 특정 실시예에서, 비-NDV APMV F 단백질은 APMV-5, 예컨대, 예를 들어, APMV-5 budgerigar/Kunitachi/74 (수탁 번호 GU206351) 또는 APMV5/budgerigar/Japan/TI/75 (수탁 번호 LC168750)의 F 단백질이다. 일부 실시예에서, 비-NDV APMV F 단백질은 APMV-6, 예컨대, 예를 들어, APMV-6 Goose/FarEast/4440/2003(수탁 번호 EF569970) 또는 APMV6/duck/HongKong/18/199/77(수탁 번호 EU622637)의 F 단백질이다. 특정 실시예에서, 비-NDV APMV F 단백질은 APMV-7, 예컨대, 예를 들어, APMV-7 dove/Tennessee/4/75(수탁 번호 FJ231524)의 F 단백질이다. 일부 실시예에서, 비-NDV APMV F 단백질은 APMV-8, 예컨대, 예를 들어, APMV-8 goose/Delaware/1053/76(수탁 번호 FJ215863)의 F 단백질이다. 특정 실시예에서, 비-NDV APMV F 단백질은 APMV-9, 예컨대, 예를 들어, APMV9/duck/New York/22/78(수탁 번호 EU910942)의 F 단백질이다. 일부 실시예에서, 비-NDV APMV F 단백질은 APMV-10, 예컨대, 예를 들어, APMV-10 penguin/Falkland Islands/324/2007(수탁 번호 HM147142 또는 NC_025349)의 F 단백질이다. 특정 실시예에서, 비-NDV APMV F 단백질은 APMV-11, 예컨대, 예를 들어, APMV-11 common_snipe/France/100212/2010(수탁 번호 JQ886184)의 F 단백질이다. 일부 실시예에서, 비-NDV APMV F 단백질은 APMV-12, 예컨대, 예를 들어 APMV12/Wigeon/Italy/3920_1/05(수탁 번호 KC333050)의 F 단백질이다. 일부 실시예에서, 비-NDV APMV F 단백질은 APMV-14, 예컨대, 예를 들어, APMV-14 duck/Japan/11OG0352/2011(수탁 번호 KX258200)의 F 단백질이다. 특정 실시예에서, 비-NDV APMV F 단백질은 APMV-15, 예컨대, 예를 들어, APMV-15 calidris_fuscicollis/Brazil/RS-1177/2012(수탁 번호 KX932454)의 F 단백질이다. 일부 실시예에서, 비-NDV APMV F 단백질은 APMV-17, 예컨대, 예를 들어, APMV17/Antarctica/107/13(수탁 번호 MK167211)의 F 단백질이다. 일부 실시예에서, 비-NDV APMV F 단백질은 APMV-20, 예컨대, 예를 들어, APMV-20 Gull/Kazakhstan/2014(수탁 번호 MF033136)의 F 단백질이다. 특정 실시예에서, 비-NDV APMV F 단백질은 APMV-21, 예컨대, 예를 들어, APMV21/pigeon/Taiwan/AHRI128/17(수탁 번호 MK67743)의 F 단백질이다.
특정 실시예에서, 비-NDV APMV F 단백질의 변이체는 AMPV-2, AMPV-3, AMPV-4, AMPV-5, AMPV-6, AMPV-7, AMPV-8, AMPV-9, AMPV-10, AMPV-11, AMPV-12, AMPV-13, AMPV-14, AMPV-15, AMPV-16, AMPV-17, AMPV-18, AMPV-19, AMPV-20, 또는 AMPV-21의 F 단백질의 변이체이다. 일부 실시예에서, 비-NDV APMV F 단백질의 변이체는 APMV-2, 예컨대, 예를 들어, Chicken/California/Yucaipa/56(수탁 번호 EU338414)의 F 단백질의 변이체이다. 특정 실시예에서, 비-NDV APMV F 단백질의 변이체는 APMV-3, 예컨대, 예를 들어, APMV3/Turkey/Wisconsin/68(수탁 번호 EU782025)의 F 단백질의 변이체이다. 일부 실시예에서, 비-NDV APMV F 단백질의 변이체는 APMV-4, 예컨대, 예를 들어, APMV4/duck/Hongkong/D3/75(수탁 번호 FJ177514), APMV4/Duck/China/G302/2012(수탁 번호 KC439346.1), APMV4/mallard/Belgium/15129/07(수탁 번호 JN571485), APMV4/Uriah_aalge/Russia/Tyuleniy_Island/115/2015(수탁 번호 KU601399.1) APMV-4/Egyptian goose/South Africa/N1468/2010 (수탁 번호 JX133079.1), 또는 APMV4/duck/Delaware/549227/2010 (수탁 번호 JX987283.1)의 F 단백질의 변이체이다. 특정 실시예에서, 비-NDV APMV F 단백질의 변이체는 APMV-5, 예컨대, 예를 들어, APMV-5 budgerigar/Kunitachi/74 (수탁 번호 GU206351) 또는 APMV5/budgerigar/Japan/TI/75 (수탁 번호 LC168750)의 F 단백질의 변이체이다. 일부 실시예에서, 비-NDV APMV F 단백질의 변이체는 APMV-6, 예컨대, 예를 들어, APMV-6 Goose/FarEast/4440/2003(수탁 번호 EF569970) 또는 APMV6/duck/HongKong/18/199/77(수탁 번호 EU622637)의 F 단백질의 변이체이다. 특정 실시예에서, 비-NDV APMV F 단백질의 변이체는 APMV-7, 예컨대, 예를 들어, APMV-7 dove/Tennessee/4/75(수탁 번호 FJ231524)의 F 단백질의 변이체이다. 일부 실시예에서, 비-NDV APMV F 단백질의 변이체는 APMV-8, 예컨대, 예를 들어, APMV-8 goose/Delaware/1053/76(수탁 번호 FJ215863)의 F 단백질의 변이체이다. 특정 실시예에서, 비-NDV APMV F 단백질의 변이체는 APMV-9, 예컨대, 예를 들어, APMV9/duck/New York/22/78(수탁 번호 EU910942)의 F 단백질의 변이체이다. 일부 실시예에서, 비-NDV APMV F 단백질의 변이체는 APMV-10, 예컨대, 예를 들어, APMV-10 penguin/Falkland Islands/324/2007(수탁 번호 HM147142 또는 NC_025349)의 F 단백질의 변이체이다. 특정 실시예에서, 비-NDV APMV F 단백질의 변이체는 APMV-11, 예컨대, 예를 들어, APMV-11 common_snipe/France/100212/2010(수탁 번호 JQ886184)의 F 단백질의 변이체이다. 일부 실시예에서, 비-NDV APMV F 단백질의 변이체는 APMV-12, 예컨대, 예를 들어 APMV12/Wigeon/Italy/3920_1/05(수탁 번호 KC333050)의 F 단백질의 변이체이다. 일부 실시예에서, 비-NDV APMV F 단백질의 변이체는 APMV-14, 예컨대, 예를 들어, APMV-14 duck/Japan/11OG0352/2011(수탁 번호 KX258200)의 F 단백질의 변이체이다. 특정 실시예에서, 비-NDV APMV F 단백질의 변이체는 APMV-15, 예컨대, 예를 들어, APMV-15 calidris_fuscicollis/Brazil/RS-1177/2012(수탁 번호 KX932454)의 F 단백질의 변이체이다. 일부 실시예에서, 비-NDV APMV F 단백질의 변이체는 APMV-17, 예컨대, 예를 들어, APMV17/Antarctica/107/13(수탁 번호 MK167211)의 F 단백질의 변이체이다. 일부 실시예에서, 비-NDV APMV F 단백질의 변이체는 APMV-20, 예컨대, 예를 들어, APMV-20 Gull/Kazakhstan/2014(수탁 번호 MF033136)의 F 단백질의 변이체이다. 특정 실시예에서, 비-NDV APMV F 단백질의 변이체는 APMV-21, 예컨대, 예를 들어, APMV21/pigeon/Taiwan/AHRI128/17(수탁 번호 MK67743)의 F 단백질의 변이체이다.
일부 실시예에서, 비-NDV APMV F 단백질은 NDV F 단백질과 65% 미만의 동일성을 갖는다. 일부 실시예에서, 비-NDV APMV F 단백질은 NDV F 단백질과 60% 미만의 동일성을 갖는다. 일부 실시예에서, 비-NDV APMV F 단백질은 NDV F 단백질과 50% 미만의 동일성을 갖는다. 일부 실시예에서, 비-NDV APMV F 단백질은 NDV F 단백질과 55% 미만의 동일성을 갖는다. 일부 실시예에서, 비-NDV APMV F 단백질은 NDV F 단백질과 50% 미만의 동일성을 갖는다. 일부 실시예에서, 비-NDV APMV F 단백질은 NDV F 단백질과 45% 미만의 동일성을 갖는다. 일부 실시예에서, 비-NDV APMV F 단백질은 NDV F 단백질과 40% 미만의 동일성을 갖는다. 일부 실시예에서, 비-NDV APMV F 단백질은 NDV F 단백질과 35% 미만의 동일성을 갖는다. 일부 실시예에서, 비-NDV APMV F 단백질은 NDV F 단백질과 적어도 20% 또는 적어도 25%의 동일성을 갖지만, 65% 미만, 60% 미만, 55% 미만, 50% 미만, 또는 45% 미만의 동일성을 갖는다. 일부 실시예에서, NDV F 단백질은 NDV LaSota F 단백질이다.
특정 실시예에서, 비-NDV APMV HN 단백질은 NDV HN 단백질과 면역학적으로 구별된다. 일부 실시예에서, 비-NDV APMV HN 단백질의 변이체는 NDV HN 단백질과 면역학적으로 구별된다. 특정 실시예에서, NDV HN 단백질에 대한 항체가 비-NDV APMV HN 단백질 또는 이의 변이체와 교차 반응하지 않는 경우, 비-NDV APMV HN 단백질 또는 이의 변이체는 NDV HN 단백질과 면역학적으로 구별된다. 일부 실시예에서, NDV HN 단백질에 대한 항체가 당해 분야의 숙련자에게 공지되거나 본원에서 설명되는 검정에서 비-NDV APMV HN 단백질 또는 이의 변이체보다 2배, 5배, 10배, 15배, 20배 또는 더 낮은 친화도로 변이체에 결합하면, 비-NDV APMV HN 단백질 또는 이의 변이체는 NDV HN 단백질과 면역학적으로 구별된다. 특정 실시예에서, 당해 분야의 숙련자에게 공지되거나 본원에서 설명되는 검정에서 NDV HN 단백질에 대한 항체가 NDV HN 단백질에 비해 0.5 log, 1 log, 1.5 log, 2 log, 2.5 log, 3 log 또는 더 낮은 친화도로 비-NDV APMV HN 단백질 또는 이의 변이체에 결합하는 경우, 비-NDV APMV HN 단백질 또는 이의 변이체는 NDV HN 단백질과 면역학적으로 구별된다. 특정 실시예에서, 항-NDV HN 항체가, Chumbe 등, 2017, Virology Journal 14: 232 및 Reynolds 등, 1999, Avian Dis. 143:564-71, Sun 등, 2020, EBioMedicine 62: 103132, 또는 Sun 등, 2020, Vaccines 8: 771, 또는 본원에서 설명되는 바와 같은, 바이러스 중성화 검정에 의해 평가되는 바와 같이 비-NDV APMV HN 단백질 또는 이의 변이체를 발현하는 NDV의 복제를 유의하게 억제하지 않는 경우, 비-NDV APMV HN 단백질 또는 이의 변이체는 NDV HN 단백질과 면역학적으로 구별된다. 특정 실시예에서, 항-NDV HN 항체가, 예를 들어, Chumbe 등, 2017, Virology Journal 14: 232 및 Reynolds 등, 1999, Avian Dis. 143:564-71, Sun 등, 2020, EBioMedicine 62: 103132, 또는 Sun 등, 2020, Vaccines 8: 771, 또는 본원에서 설명되는 바와 같은, 바이러스 중성화 검정에서, 약 0.5 log 미만, 약 1 log 미만, 약 1.5 log 미만, 또는 약 2 log 미만 만큼, 비-NDV APMV HN 단백질 또는 이의 변이체를 발현하는 NDV의 복제를 억제하는 경우, 비-NDV APMV HN 단백질 또는 이의 변이체는 NDV HN 단백질과 면역학적으로 구별된다. 일부 실시예에서, 비-NDV APMV HN 단백질은 NDV와 상이한 속의 아불라비리나 아과의 구성원으로부터의 HN 단백질이다. 일부 실시예에서, 비-NDV APMV HN 단백질은 아불라비리나 아과의 구성원으로부터의 HN 단백질이지만, NDV는 아니다. 일부 실시예에서, 비-NDV APMV HN 단백질은 아불라비리나 아과 및 메타아불라바이러스 속의 구성원으로부터의 HN 단백질이다. 일부 실시예에서, 비-NDV APMV HN 단백질은 아불라비리나 아과 및 파라아불라바이러스 속의 구성원으로부터의 HN 단백질이다. 일부 실시예에서, 비-NDV APMV HN 단백질은 아불라비리나 아과 및 오소아불라바이러스 속의 구성원으로부터의 HN 단백질이지만 NDV는 아니다.
특정 실시예에서, 키메라 HN 단백질은 NDV HN 단백질과 면역학적으로 구별된다. 특정 실시예에서, 키메라 HN 단백질은 NDV HN 단백질에 대한 항체가 키메라 HN 단백질과 교차 반응하지 않는 경우 NDV HN 단백질과 면역학적으로 구별된다. 일부 실시예에서, NDV HN 단백질에 대한 항체가 당해 분야의 숙련자에게 공지되거나 본원에서 설명되는 검정에서 NDV HN 단백질에 비해 2배, 5배, 10배, 15배, 20배 또는 더 낮은 친화도로 키메라 HN 단백질에 결합하는 경우, 키메라 HN 단백질은 NDV HN 단백질과 면역학적으로 구별된다. 특정 실시예에서, NDV HN 단백질에 대한 항체가 당해 분야의 숙련자에게 공지되거나 본원에서 설명되는 검정에서 NDV HN 단백질에 비해 0.5 log, 1 log, 1.5 log, 2 log, 2.5 log, 3 log 또는 더 낮은 친화도로 키메라 HN 단백질에 결합하는 경우, 키메라 HN 단백질은 NDV HN 단백질과 면역학적으로 구별된다. 특정 실시예에서, 항-NDV HN 항체가, Chumbe 등, 2017, Virology Journal 14: 232 및 Reynolds 등, 1999, Avian Dis. 143:564-71, Sun 등, 2020, EBioMedicine 62: 103132, 또는 Sun 등, 2020, Vaccines 8: 771, 또는 본원에서 설명되는 바와 같은, 바이러스 중성화 검정에 의해 평가되는 바와 같이 비-NDV APMV F 단백질 또는 이의 변이체를 발현하는 NDV의 복제를 유의하게 억제하지 않는 경우, 키메라 HN 단백질은 NDV HN 단백질과 면역학적으로 구별된다. 특정 실시예에서, 항-NDV HN 항체가, 예를 들어, Chumbe 등, 2017, Virology Journal 14: 232 및 Reynolds 등, 1999, Avian Dis. 143:564-71, Sun 등, 2020, EBioMedicine 62: 103132, 또는 Sun 등, 2020, Vaccines 8: 771, 또는 본원에서 설명되는 바와 같은, 바이러스 중성화 검정에서, 약 0.5 log 미만, 약 1 log 미만, 약 1.5 log 미만, 또는 약 2 log 미만 만큼, 비-NDV APMV HN 단백질 또는 이의 변이체를 발현하는 NDV의 복제를 억제하는 경우, 키메라 HN 단백질은 NDV HN 단백질과 면역학적으로 구별된다.
특정 실시예에서, 비-NDV APMV HN 단백질의 변이체는 비-NDV APMV HN 단백질의 하나 이상의 기능을 보유한다.
특정 실시예에서, 비-NDV APMV HN 단백질의 변이체는 비-NDV AMPV HN 단백질과 적어도 75%, 적어도 80%, 또는 적어도 85% 동일하다. 일부 실시예에서, 비-NDV HN 단백질의 변이체는 비-NDV APMV HN 단백질과 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 동일하다. 특정 실시예에서, 비-NDV APMV HN 단백질의 변이체는 비-NDV AMPV HN 단백질과 75% 내지 90%, 80% 내지 95%, 또는 90% 내지 99.5% 동일하다.
특정 실시예에서, 비-NDV APMV HN 단백질의 변이체는 비-NDV APMV HN 단백질에 비해 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 이상, 또는 2 내지 5, 2 내지 10, 5 내지 10, 5 내지 15, 5 내지 20, 10 내지 15, 또는 15 내지 20개의 아미노산 돌연변이(즉, 첨가, 결실, 치환 또는 이들의 임의의 조합)를 함유한다. 일부 실시예에서, 비-NDV APMV HN 단백질의 변이체는 다른 아미노산으로 치환된(예를 들어, 보존적으로 치환된) 비-NDV APMV HN 단백질의 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개의 아미노산 잔기를 갖는 비-NDV APMV HN 단백질의 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시예에서, 비-NDV APMV HN 단백질의 변이체는 최대 약 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개의 보존적으로 치환된 아미노산을 갖는 비-NDV APMV HN 단백질의 아미노산 서열을 포함한다. 보존적 아미노산 치환의 예는, 예를 들어, 하나의 부류의 아미노산을 동일한 부류의 다른 아미노산으로 대체하는 것을 포함한다. 특정 실시예에서, 보존적 치환은 폴리펩티드의 구조 또는 기능, 또는 둘 다를 변경시키지 않는다. 아미노산의 부류는 소수성(Met, Ala, Val, Leu, Ile), 중성 친수성(Cys, Ser, Thr), 산성(Asp, Glu), 염기성(Asn, Gln, His, Lys, Arg), 형태 파괴자(Gly, Pro), 및 방향족(Trp, Tyr, Phe)을 포함할 수 있다.
일부 실시예에서, 비-NDV APMV HN 단백질의 변이체는 고, 중간 또는 전형적인 엄중도 혼성화 조건 하에서 비-NDV APMV HN 단백질을 암호화하는 핵산 서열에 혼성화될 수 있는 핵산 서열에 의해 암호화된 폴리펩티드이다. 혼성화 조건은 당해 분야의 숙련자에게 공지되어 있다(미국 특허 출원 제2005/0048549호, 예를 들어, 단락 72 및 73 참조).
특정 실시예에서, 비-NDV APMV HN 단백질은 NDV HN 단백질과 면역학적으로 구별되는 임의의 비-NDV AMPV HN 단백질이다. 일부 실시예에서, 비-NDV APMV HN 단백질은 도 3b에 도시된 APMV의 HN 단백질이다. 일부 실시예에서, 비-NDV APMV HN 단백질은 도 3b 또는 도 6a에 도시된 속의 구성원의 HN 단백질이다. 특정 실시예에서, 비-NDV APMV HN 단백질은 AMPV-2, AMPV-3, AMPV-4, AMPV-5, AMPV-6, AMPV-7, AMPV-8, AMPV-9, AMPV-10, AMPV-11, AMPV-12, AMPV-13, AMPV-14, AMPV-15, AMPV-16, AMPV-17, AMPV-18, AMPV-19, AMPV-20, 또는 AMPV-21의 HN 단백질이다. 일부 실시예에서, 비-NDV APMV HN 단백질은 APMV-2, 예컨대, 예를 들어, Chicken/California/Yucaipa/56(수탁 번호 EU338414)의 HN 단백질이다. 특정 실시예에서, 비-NDV APMV HN 단백질은 APMV-2 Yucaipa의 HN 단백질이다. 다른 실시예에서, 비-NDV APMV HN 단백질은 APMV-2 Yucaipa의 HN 단백질이 아니다. 특정 실시예에서, 비-NDV APMV HN 단백질은 APMV-3, 예컨대, 예를 들어, APMV3/Turkey/Wisconsin/68(수탁 번호 EU782025)의 HN 단백질이다. 일부 실시예에서, 비-NDV APMV HN 단백질은 APMV-4, 예컨대, 예를 들어, APMV4/duck/Hongkong/D3/75(수탁 번호 FJ177514), APMV4/Duck/China/G302/2012(수탁 번호 KC439346.1), APMV4/mallard/Belgium/15129/07(수탁 번호 JN571485), APMV4/Uriah_aalge/Russia/Tyuleniy_Island/115/2015(수탁 번호 KU601399.1) APMV-4/Egyptian goose/South Africa/N1468/2010 (수탁 번호 JX133079.1), 또는 APMV4/duck/Delaware/549227/2010 (수탁 번호 JX987283.1)의 HN 단백질이다. 특정 실시예에서, 비-NDV APMV HN 단백질은 APMV-5, 예컨대, 예를 들어, APMV-5 budgerigar/Kunitachi/74 (수탁 번호 GU206351) 또는 APMV5/budgerigar/Japan/TI/75 (수탁 번호 LC168750)의 HN 단백질이다. 일부 실시예에서, 비-NDV APMV HN 단백질은 APMV-6, 예컨대, 예를 들어, APMV-6 Goose/FarEast/4440/2003(수탁 번호 EF569970) 또는 APMV6/duck/HongKong/18/199/77(수탁 번호 EU622637)의 HN 단백질이다. 특정 실시예에서, 비-NDV APMV HN 단백질은 APMV-7, 예컨대, 예를 들어, APMV-7 dove/Tennessee/4/75(수탁 번호 FJ231524)의 HN 단백질이다. 일부 실시예에서, 비-NDV APMV HN 단백질은 APMV-8, 예컨대, 예를 들어, APMV-8 goose/Delaware/1053/76(수탁 번호 FJ215863)의 HN 단백질이다. 특정 실시예에서, 비-NDV APMV HN 단백질은 APMV-9, 예컨대, 예를 들어, APMV9/duck/New York/22/78(수탁 번호 EU910942)의 HN 단백질이다. 일부 실시예에서, 비-NDV APMV HN 단백질은 APMV-10, 예컨대, 예를 들어, APMV-10 penguin/Falkland Islands/324/2007(수탁 번호 HM147142 또는 NC_025349)의 HN 단백질이다. 특정 실시예에서, 비-NDV APMV HN 단백질은 APMV-11, 예컨대, 예를 들어, APMV-11 common_snipe/France/100212/2010(수탁 번호 JQ886184)의 HN 단백질이다. 일부 실시예에서, 비-NDV APMV HN 단백질은 APMV-12, 예컨대, 예를 들어 APMV12/Wigeon/Italy/3920_1/05(수탁 번호 KC333050)의 HN 단백질이다. 일부 실시예에서, 비-NDV APMV HN 단백질은 APMV-14, 예컨대, 예를 들어, APMV-14 duck/Japan/11OG0352/2011(수탁 번호 KX258200)의 HN 단백질이다. 특정 실시예에서, 비-NDV APMV HN 단백질은 APMV-15, 예컨대, 예를 들어, APMV-15 calidris_fuscicollis/Brazil/RS-1177/2012(수탁 번호 KX932454)의 HN 단백질이다. 일부 실시예에서, 비-NDV APMV HN 단백질은 APMV-17, 예컨대, 예를 들어, APMV17/Antarctica/107/13(수탁 번호 MK167211)의 HN 단백질이다. 일부 실시예에서, 비-NDV APMV HN 단백질은 APMV-20, 예컨대, 예를 들어, APMV-20 Gull/Kazakhstan/2014(수탁 번호 MF033136)의 HN 단백질이다. 특정 실시예에서, 비-NDV APMV HN 단백질은 APMV-21, 예컨대, 예를 들어, APMV21/pigeon/Taiwan/AHRI128/17(수탁 번호 MK67743)의 HN 단백질이다.
특정 실시예에서, 비-NDV APMV HN 단백질의 변이체는 AMPV-2, AMPV-3, AMPV-4, AMPV-5, AMPV-6, AMPV-7, AMPV-8, AMPV-9, AMPV-10, AMPV-11, AMPV-12, AMPV-13, AMPV-14, AMPV-15, AMPV-16, AMPV-17, AMPV-18, AMPV-19, AMPV-20, 또는 AMPV-21의 HN 단백질의 변이체이다. 일부 실시예에서, 비-NDV APMV HN 단백질의 변이체는 APMV-2, 예컨대, 예를 들어, Chicken/California/Yucaipa/56(수탁 번호 EU338414)의 HN 단백질의 변이체이다. 특정 실시예에서, 비-NDV APMV HN 단백질의 변이체는 APMV-3, 예컨대, 예를 들어, APMV3/Turkey/Wisconsin/68(수탁 번호 EU782025)의 HN 단백질의 변이체이다. 일부 실시예에서, 비-NDV APMV HN 단백질의 변이체는 APMV-4, 예컨대, 예를 들어, APMV4/duck/Hongkong/D3/75(수탁 번호 FJ177514), APMV4/Duck/China/G302/2012(수탁 번호 KC439346.1), APMV4/mallard/Belgium/15129/07(수탁 번호 JN571485), APMV4/Uriah_aalge/Russia/Tyuleniy_Island/115/2015(수탁 번호 KU601399.1) APMV-4/Egyptian goose/South Africa/N1468/2010 (수탁 번호 JX133079.1), 또는 APMV4/duck/Delaware/549227/2010 (수탁 번호 JX987283.1)의 HN 단백질의 변이체이다. 특정 실시예에서, 비-NDV APMV HN 단백질의 변이체는 APMV-5, 예컨대, 예를 들어, APMV-5 budgerigar/Kunitachi/74 (수탁 번호 GU206351) 또는 APMV5/budgerigar/Japan/TI/75 (수탁 번호 LC168750)의 HN 단백질의 변이체이다. 일부 실시예에서, 비-NDV APMV HN 단백질의 변이체는 APMV-6, 예컨대, 예를 들어, APMV-6 Goose/FarEast/4440/2003(수탁 번호 EF569970) 또는 APMV6/duck/HongKong/18/199/77(수탁 번호 EU622637)의 HN 단백질의 변이체이다. 특정 실시예에서, 비-NDV APMV HN 단백질의 변이체는 APMV-7, 예컨대, 예를 들어, APMV-7 dove/Tennessee/4/75(수탁 번호 FJ231524)의 HN 단백질의 변이체이다. 일부 실시예에서, 비-NDV APMV HN 단백질의 변이체는 APMV-8, 예컨대, 예를 들어, APMV-8 goose/Delaware/1053/76(수탁 번호 FJ215863)의 HN 단백질의 변이체이다. 특정 실시예에서, 비-NDV APMV HN 단백질의 변이체는 APMV-9, 예컨대, 예를 들어, APMV9/duck/New York/22/78(수탁 번호 EU910942)의 HN 단백질의 변이체이다. 일부 실시예에서, 비-NDV APMV HN 단백질의 변이체는 APMV-10, 예컨대, 예를 들어, APMV-10 penguin/Falkland Islands/324/2007(수탁 번호 HM147142 또는 NC_025349)의 HN 단백질의 변이체이다. 특정 실시예에서, 비-NDV APMV HN 단백질의 변이체는 APMV-11, 예컨대, 예를 들어, APMV-11 common_snipe/France/100212/2010(수탁 번호 JQ886184)의 HN 단백질의 변이체이다. 일부 실시예에서, 비-NDV APMV HN 단백질의 변이체는 APMV-12, 예컨대, 예를 들어 APMV12/Wigeon/Italy/3920_1/05(수탁 번호 KC333050)의 HN 단백질의 변이체이다. 일부 실시예에서, 비-NDV APMV HN 단백질의 변이체는 APMV-14, 예컨대, 예를 들어, APMV-14 duck/Japan/11OG0352/2011(수탁 번호 KX258200)의 HN 단백질의 변이체이다. 특정 실시예에서, 비-NDV APMV HN 단백질의 변이체는 APMV-15, 예컨대, 예를 들어, APMV-15 calidris_fuscicollis/Brazil/RS-1177/2012(수탁 번호 KX932454)의 HN 단백질의 변이체이다. 일부 실시예에서, 비-NDV APMV HN 단백질의 변이체는 APMV-17, 예컨대, 예를 들어, APMV17/Antarctica/107/13(수탁 번호 MK167211)의 HN 단백질의 변이체이다. 일부 실시예에서, 비-NDV APMV HN 단백질의 변이체는 APMV-20, 예컨대, 예를 들어, APMV-20 Gull/Kazakhstan/2014(수탁 번호 MF033136)의 HN 단백질의 변이체이다. 특정 실시예에서, 비-NDV APMV HN 단백질의 변이체는 APMV-21, 예컨대, 예를 들어, APMV21/pigeon/Taiwan/AHRI128/17(수탁 번호 MK67743)의 HN 단백질의 변이체이다.
일부 실시예에서, 비-NDV APMV HN 단백질은 NDV HN 단백질과 65% 미만의 동일성을 갖는다. 일부 실시예에서, 비-NDV APMV HN 단백질은 NDV HN 단백질과 60% 미만의 동일성을 갖는다. 일부 실시예에서, 비-NDV APMV HN 단백질은 NDV HN 단백질과 50% 미만의 동일성을 갖는다. 일부 실시예에서, 비-NDV APMV HN 단백질은 NDV HN 단백질과 55% 미만의 동일성을 갖는다. 일부 실시예에서, 비-NDV APMV HN 단백질은 NDV HN 단백질과 50% 미만의 동일성을 갖는다. 일부 실시예에서, 비-NDV APMV HN 단백질은 NDV HN 단백질과 45% 미만의 동일성을 갖는다. 일부 실시예에서, 비-NDV APMV HN 단백질은 NDV HN 단백질과 40% 미만의 동일성을 갖는다. 일부 실시예에서, 비-NDV APMV HN 단백질은 NDV HN 단백질과 35% 미만의 동일성을 갖는다. 일부 실시예에서, 비-NDV APMV HN 단백질은 NDV HN 단백질과 적어도 20% 또는 적어도 25% 동일성을 갖지만 65% 미만, 60% 미만, 55% 미만, 50% 미만, 또는 45% 미만 동일성을 갖는다. 일부 실시예에서, NDV HN 단백질은 NDV LaSota HN 단백질이다.
특정 실시예에서, 포장된 게놈을 포함하는 재조합 NDV가 본원에 제공되며, 여기서 포장된 게놈은 NDV HN 단백질 및 NDV F 단백질의 코딩 서열이 서열번호 1에 제시된 cDNA 서열의 코딩 서열의 음-센스에 상응하는 RNA 서열로 대체된 뉴캐슬병 바이러스 게놈의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특정 실시예에서, 포장된 게놈을 포함하는 재조합 NDV가 본원에 제공되며, 여기서 포장된 게놈은 NDV HN 단백질 및 NDV F 단백질의 코딩 서열이 서열번호 2에 제시된 cDNA 서열의 코딩 서열의 음-센스에 상응하는 RNA 서열로 대체된 뉴캐슬병 바이러스 게놈의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특정 실시예에서, 포장된 게놈을 포함하는 재조합 NDV가 본원에 제공되며, 여기서 포장된 게놈은 NDV HN 단백질 및 NDV F 단백질의 코딩 서열이 서열번호 3에 제시된 cDNA 서열의 코딩 서열의 음-센스에 상응하는 RNA 서열로 대체된 뉴캐슬병 바이러스 게놈의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특정 실시예에서, 포장된 게놈을 포함하는 재조합 NDV가 본원에 제공되며, 여기서 포장된 게놈은 NDV HN 단백질 및 NDV F 단백질의 코딩 서열이 서열번호 4에 제시된 cDNA 서열의 코딩 서열의 음-센스에 상응하는 RNA 서열로 대체된 뉴캐슬병 바이러스 게놈의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특정 실시예에서, 포장된 게놈을 포함하는 재조합 NDV가 본원에 제공되며, 여기서 포장된 게놈은 NDV HN 단백질 및 NDV F 단백질의 코딩 서열이 서열번호 5에 제시된 cDNA 서열의 코딩 서열의 음-센스에 상응하는 RNA 서열로 대체된 뉴캐슬병 바이러스 게놈의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특정 실시예에서, 포장된 게놈을 포함하는 재조합 NDV가 본원에 제공되며, 여기서 포장된 게놈은 NDV HN 단백질 및 NDV F 단백질의 코딩 서열이 서열번호 6에 제시된 cDNA 서열의 코딩 서열의 음-센스에 상응하는 RNA 서열로 대체된 뉴캐슬병 바이러스 게놈의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특정 실시예에서, 포장된 게놈을 포함하는 재조합 NDV가 본원에 제공되며, 여기서 포장된 게놈은 NDV HN 단백질 및 NDV F 단백질의 코딩 서열이 서열번호 7에 제시된 cDNA 서열의 코딩 서열의 음-센스에 상응하는 RNA 서열로 대체된 뉴캐슬병 바이러스 게놈의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특정 실시예에서, 포장된 게놈을 포함하는 재조합 NDV가 본원에 제공되며, 여기서 포장된 게놈은 NDV HN 단백질 및 NDV F 단백질의 코딩 서열이 서열번호 8에 제시된 cDNA 서열의 코딩 서열의 음-센스에 상응하는 RNA 서열로 대체된 뉴캐슬병 바이러스 게놈의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특정 실시예에서, 포장된 게놈을 포함하는 재조합 NDV가 본원에 제공되며, 여기서 포장된 게놈은 NDV HN 단백질 및 NDV F 단백질의 코딩 서열이 서열번호 9에 제시된 cDNA 서열의 코딩 서열의 음-센스에 상응하는 RNA 서열로 대체된 뉴캐슬병 바이러스 게놈의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특정 실시예에서, 포장된 게놈을 포함하는 재조합 NDV가 본원에 제공되며, 여기서 포장된 게놈은 NDV HN 단백질 및 NDV F 단백질의 코딩 서열이 서열번호 10에 제시된 cDNA 서열의 코딩 서열의 음-센스에 상응하는 RNA 서열로 대체된 뉴캐슬병 바이러스 게놈의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특정 실시예에서, 포장된 게놈을 포함하는 재조합 NDV가 본원에 제공되며, 여기서 포장된 게놈은 NDV HN 단백질 및 NDV F 단백질의 코딩 서열이 서열번호 11에 제시된 cDNA 서열의 코딩 서열의 음-센스에 상응하는 RNA 서열로 대체된 뉴캐슬병 바이러스 게놈의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특정 실시예에서, 포장된 게놈을 포함하는 재조합 NDV가 본원에 제공되며, 여기서 포장된 게놈은 NDV HN 단백질 및 NDV F 단백질의 코딩 서열이 서열번호 12에 제시된 cDNA 서열의 코딩 서열의 음-센스에 상응하는 RNA 서열로 대체된 뉴캐슬병 바이러스 게놈의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특정 실시예에서, 포장된 게놈을 포함하는 재조합 NDV가 본원에 제공되며, 여기서 포장된 게놈은 NDV HN 단백질 및 NDV F 단백질의 코딩 서열이 서열번호 13에 제시된 cDNA 서열의 코딩 서열의 음-센스에 상응하는 RNA 서열로 대체된 뉴캐슬병 바이러스 게놈의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특정 실시예에서, 포장된 게놈을 포함하는 재조합 NDV가 본원에 제공되며, 여기서 포장된 게놈은 NDV HN 단백질 및 NDV F 단백질의 코딩 서열이 서열번호 14에 제시된 cDNA 서열의 코딩 서열의 음-센스에 상응하는 RNA 서열로 대체된 뉴캐슬병 바이러스 게놈의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특정 실시예에서, NDV 게놈은 대체된 NDV HN 및 F 단백질 코딩 서열뿐만 아니라 (1) NDV 뉴클레오캡시드(N) 단백질을 암호화하는 전사 유닛, (2) NDV 인단백질(P)을 암호화하는 전사 유닛, (3) NDV 매트릭스(M) 단백질을 암호화하는 전사 유닛, 및 (4) NDV 대형 중합효소(L)를 암호화하는 전사 유닛을 포함한다.
특정 실시예에서, 포장된 게놈을 포함하는 재조합 NDV가 본원에 제공되며, 여기서 상기 포장된 게놈은 NDV HN 단백질 및 NDV F 단백질의 코딩 서열이 서열번호 1에 제시된 cDNA 서열의 코딩 서열과 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 98% 동일한 뉴클레오티드 서열 코딩 서열의 음-센스에 상응하는 RNA 서열로 대체된 뉴캐슬병 바이러스 게놈의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특정 실시예에서, 포장된 게놈을 포함하는 재조합 NDV가 본원에 제공되며, 여기서 상기 포장된 게놈은 NDV HN 단백질 및 NDV F 단백질의 코딩 서열이 서열번호 2에 제시된 cDNA 서열의 코딩 서열과 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 98% 동일한 뉴클레오티드 서열 코딩 서열의 음-센스에 상응하는 RNA 서열로 대체된 뉴캐슬병 바이러스 게놈의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특정 실시예에서, 포장된 게놈을 포함하는 재조합 NDV가 본원에 제공되며, 여기서 상기 포장된 게놈은 NDV HN 단백질 및 NDV F 단백질의 코딩 서열이 서열번호 3에 제시된 cDNA 서열의 코딩 서열과 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 98% 동일한 뉴클레오티드 서열 코딩 서열의 음-센스에 상응하는 RNA 서열로 대체된 뉴캐슬병 바이러스 게놈의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특정 실시예에서, 포장된 게놈을 포함하는 재조합 NDV가 본원에 제공되며, 여기서 상기 포장된 게놈은 NDV HN 단백질 및 NDV F 단백질의 코딩 서열이 서열번호 4에 제시된 cDNA 서열의 코딩 서열과 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 98% 동일한 뉴클레오티드 서열 코딩 서열의 음-센스에 상응하는 RNA 서열로 대체된 뉴캐슬병 바이러스 게놈의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특정 실시예에서, 포장된 게놈을 포함하는 재조합 NDV가 본원에 제공되며, 여기서 상기 포장된 게놈은 NDV HN 단백질 및 NDV F 단백질의 코딩 서열이 서열번호 5에 제시된 cDNA 서열의 코딩 서열과 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 98% 동일한 뉴클레오티드 서열 코딩 서열의 음-센스에 상응하는 RNA 서열로 대체된 뉴캐슬병 바이러스 게놈의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특정 실시예에서, 포장된 게놈을 포함하는 재조합 NDV가 본원에 제공되며, 여기서 상기 포장된 게놈은 NDV HN 단백질 및 NDV F 단백질의 코딩 서열이 서열번호 6에 제시된 cDNA 서열의 코딩 서열과 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 98% 동일한 뉴클레오티드 서열 코딩 서열의 음-센스에 상응하는 RNA 서열로 대체된 뉴캐슬병 바이러스 게놈의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특정 실시예에서, 포장된 게놈을 포함하는 재조합 NDV가 본원에 제공되며, 여기서 상기 포장된 게놈은 NDV HN 단백질 및 NDV F 단백질의 코딩 서열이 서열번호 7에 제시된 cDNA 서열의 코딩 서열과 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 98% 동일한 뉴클레오티드 서열 코딩 서열의 음-센스에 상응하는 RNA 서열로 대체된 뉴캐슬병 바이러스 게놈의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특정 실시예에서, 포장된 게놈을 포함하는 재조합 NDV가 본원에 제공되며, 여기서 상기 포장된 게놈은 NDV HN 단백질 및 NDV F 단백질의 코딩 서열이 서열번호 8에 제시된 cDNA 서열의 코딩 서열과 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 98% 동일한 뉴클레오티드 서열 코딩 서열의 음-센스에 상응하는 RNA 서열로 대체된 뉴캐슬병 바이러스 게놈의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특정 실시예에서, 포장된 게놈을 포함하는 재조합 NDV가 본원에 제공되며, 여기서 상기 포장된 게놈은 NDV HN 단백질 및 NDV F 단백질의 코딩 서열이 서열번호 9에 제시된 cDNA 서열의 코딩 서열과 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 98% 동일한 뉴클레오티드 서열 코딩 서열의 음-센스에 상응하는 RNA 서열로 대체된 뉴캐슬병 바이러스 게놈의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특정 실시예에서, 포장된 게놈을 포함하는 재조합 NDV가 본원에 제공되며, 여기서 상기 포장된 게놈은 NDV HN 단백질 및 NDV F 단백질의 코딩 서열이 서열번호 10에 제시된 cDNA 서열의 코딩 서열과 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 98% 동일한 뉴클레오티드 서열 코딩 서열의 음-센스에 상응하는 RNA 서열로 대체된 뉴캐슬병 바이러스 게놈의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특정 실시예에서, 포장된 게놈을 포함하는 재조합 NDV가 본원에 제공되며, 여기서 상기 포장된 게놈은 NDV HN 단백질 및 NDV F 단백질의 코딩 서열이 서열번호 11에 제시된 cDNA 서열의 코딩 서열과 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 98% 동일한 뉴클레오티드 서열 코딩 서열의 음-센스에 상응하는 RNA 서열로 대체된 뉴캐슬병 바이러스 게놈의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특정 실시예에서, 포장된 게놈을 포함하는 재조합 NDV가 본원에 제공되며, 여기서 상기 포장된 게놈은 NDV HN 단백질 및 NDV F 단백질의 코딩 서열이 서열번호 12에 제시된 cDNA 서열의 코딩 서열과 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 98% 동일한 뉴클레오티드 서열 코딩 서열의 음-센스에 상응하는 RNA 서열로 대체된 뉴캐슬병 바이러스 게놈의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특정 실시예에서, 포장된 게놈을 포함하는 재조합 NDV가 본원에 제공되며, 여기서 상기 포장된 게놈은 NDV HN 단백질 및 NDV F 단백질의 코딩 서열이 서열번호 13에 제시된 cDNA 서열의 코딩 서열과 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 98% 동일한 뉴클레오티드 서열 코딩 서열의 음-센스에 상응하는 RNA 서열로 대체된 뉴캐슬병 바이러스 게놈의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특정 실시예에서, 포장된 게놈을 포함하는 재조합 NDV가 본원에 제공되며, 여기서 상기 포장된 게놈은 NDV HN 단백질 및 NDV F 단백질의 코딩 서열이 서열번호 14에 제시된 cDNA 서열의 코딩 서열과 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 98% 동일한 뉴클레오티드 서열 코딩 서열의 음-센스에 상응하는 RNA 서열로 대체된 뉴캐슬병 바이러스 게놈의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특정 실시예에서, NDV 게놈은 대체된 NDV HN 및 F 단백질 코딩 서열뿐만 아니라 (1) NDV 뉴클레오캡시드(N) 단백질을 암호화하는 전사 유닛, (2) NDV 인단백질(P)을 암호화하는 전사 유닛, (3) NDV 매트릭스(M) 단백질을 암호화하는 전사 유닛, 및 (4) NDV 대형 중합효소(L)를 암호화하는 전사 유닛을 포함한다.
당해 분야의 숙련자에게 공지된 기술은 2개의 아미노산 서열 사이 또는 2개의 뉴클레오티드 서열 사이의 동일성 백분율을 결정하는 데 사용될 수 있다. 일반적으로, 2개의 아미노산 서열 또는 2개의 핵산 서열의 동일성 백분율을 결정하기 위해, 서열은 최적의 비교 목적을 위해 정렬된다(예를 들어, 제2 아미노산 또는 핵산 서열과 최적의 정렬을 위해 제1 아미노산 또는 핵산 서열의 서열에 갭이 도입될 수 있음). 그런 다음, 상응하는 아미노산 위치 또는 뉴클레오티드 위치에서의 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드를 비교한다. 제1 서열에서의 위치가 제2 서열에서의 상응하는 위치와 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드에 의해 점유되는 경우, 분자는 그 위치에서 동일하다. 두 서열 간의 동일성 백분율은 서열들이 공유한 동일한 위치의 수의 함수이다(즉, 동일성 % = 동일한 중첩 위치의 수/위치의 총 수 X 100%). 일 실시예에서, 2개의 서열은 동일한 길이이다. 특정 실시예에서, 동일성 백분율은 아미노산 서열 또는 뉴클레오티드 서열의 전체 길이에 걸쳐 결정된다. 일부 실시예에서, 서열 동일성 비교의 길이는 비교되는 2개의 서열의 전장(예를 들어, 유전자 코딩 서열의 전장, 또는 이의 단편)에 걸쳐 있을 수 있다. 일부 실시예에서, 뉴클레오티드 서열의 단편은 적어도 25개, 적어도 50개, 적어도 75개, 또는 적어도 100개의 뉴클레오티드이다. 유사하게, "서열 동일성 백분율"은 단백질 또는 이의 단편의 전장에 걸쳐 아미노산 서열에 대해 쉽게 결정될 수 있다. 일부 실시예에서, 단백질의 단편은 단백질의 적어도 20개, 적어도 30개, 적어도 40개, 적어도 50개 또는 그 이상의 연속 아미노산을 포함한다. 특정 실시예에서, 단백질의 단편은 단백질의 적어도 75개, 적어도 100개, 적어도 125개, 적어도 150개 이상의 연속 아미노산을 포함한다.
2개의 서열(예를 들어, 아미노산 서열 또는 핵산 서열) 사이의 동일성 백분율의 결정은 수학적 알고리즘을 사용하여 달성될 수 있다. 2개의 서열의 비교에 이용되는 수학적 알고리즘의 바람직한 비제한적인 예는 Karlin and Altschul, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87:2264 2268 (Karlin and Altschul, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:5873 5877에서와 같이 변형됨)의 알고리즘이다. 이러한 알고리즘은 Altschul 등, 1990, J. Mol. Biol. 215:403의 NBLAST 및 XBLAST 프로그램에 통합된다. BLAST 뉴클레오티드 검색은 예를 들어 점수=100, 단어 길이=12로 설정된 NBLAST 뉴클레오티드 프로그램 파라미터로 수행하여 본원에서 설명되는 핵산 분자와 상동인 뉴클레오티드 서열을 수득할 수 있다. BLAST 단백질 검색은 예를 들어, 점수 50, 단어 길이 = 3로 설정된 XBLAST 프로그램 파라미터로 수행하여 본원에서 설명되는 단백질 분자와 상동인 아미노산 서열을 수득할 수 있다. 비교 목적을 위한 갭 정렬을 얻기 위해, Gapped BLAST를 Altschul 등, 1997, Nucleic Acids Res. 25:3389 3402에 기술된 바와 같이 사용할 수 있다. 대안적으로, PSI BLAST는 분자(Id.) 사이의 먼 관계를 검출하는 반복된 검색을 수행하는 데 사용될 수 있다. BLAST, Gapped BLAST, 및 PSI Blast 프로그램을 이용할 때, 각각의 프로그램(예를 들어, XBLAST 및 NBLAST)의 기본 파라미터가 사용될 수 있다(예를 들어, National Center for Biotechnology Information (NCBI) on the worldwide web, ncbi.nlm.nih.gov 참조). 서열의 비교에 사용되는 수학적 알고리즘의 다른 바람직한 비제한적인 예는 Myers and Miller, 1988, CABIOS 4:11 17의 알고리즘이다. 이러한 알고리즘은 GCG 서열 정렬 소프트웨어 패키지의 일부인 ALIGN 프로그램(버전 2.0)에 통합된다. 아미노산 서열을 비교하기 위해 ALIGN 프로그램을 이용할 때, PAM120 가중 잔기 표, 12의 갭 길이 페널티, 및 4의 갭 페널티가 사용될 수 있다.
2개의 서열 사이의 동일성 백분율은 갭을 허용하거나 허용하지 않고 전술한 것과 유사한 기술을 사용하여 결정될 수 있다. 동일성 백분율을 계산할 때, 통상적으로 정확한 일치만 계수된다.
또 다른 특정 실시예에서, 포장된 게놈을 포함하는 재조합 NDV가 본원에 제공되며, 여기서 포장된 게놈은 NDV HN 단백질 및 NDV F 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열이 서열번호 1에 제시된 cDNA 서열의 음-센스에 상응하는 RNA 서열로 대체된 뉴캐슬병 바이러스 게놈의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 또 다른 특정 실시예에서, 포장된 게놈을 포함하는 재조합 NDV가 본원에 제공되며, 여기서 포장된 게놈은 NDV HN 단백질 및 NDV F 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열이 서열번호 2에 제시된 cDNA 서열의 음-센스에 상응하는 RNA 서열로 대체된 뉴캐슬병 바이러스 게놈의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 또 다른 특정 실시예에서, 포장된 게놈을 포함하는 재조합 NDV가 본원에 제공되며, 여기서 포장된 게놈은 NDV HN 단백질 및 NDV F 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열이 서열번호 3에 제시된 cDNA 서열의 음-센스에 상응하는 RNA 서열로 대체된 뉴캐슬병 바이러스 게놈의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 또 다른 특정 실시예에서, 포장된 게놈을 포함하는 재조합 NDV가 본원에 제공되며, 여기서 포장된 게놈은 NDV HN 단백질 및 NDV F 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열이 서열번호 4에 제시된 cDNA 서열의 음-센스에 상응하는 RNA 서열로 대체된 뉴캐슬병 바이러스 게놈의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 또 다른 특정 실시예에서, 포장된 게놈을 포함하는 재조합 NDV가 본원에 제공되며, 여기서 포장된 게놈은 NDV HN 단백질 및 NDV F 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열이 서열번호 5에 제시된 cDNA 서열의 음-센스에 상응하는 RNA 서열로 대체된 뉴캐슬병 바이러스 게놈의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 또 다른 특정 실시예에서, 포장된 게놈을 포함하는 재조합 NDV가 본원에 제공되며, 여기서 포장된 게놈은 NDV HN 단백질 및 NDV F 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열이 서열번호 6에 제시된 cDNA 서열의 음-센스에 상응하는 RNA 서열로 대체된 뉴캐슬병 바이러스 게놈의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 또 다른 특정 실시예에서, 포장된 게놈을 포함하는 재조합 NDV가 본원에 제공되며, 여기서 포장된 게놈은 NDV HN 단백질 및 NDV F 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열이 서열번호 7에 제시된 cDNA 서열의 음-센스에 상응하는 RNA 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열로 대체된 뉴캐슬병 바이러스 게놈의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 또 다른 특정 실시예에서, 포장된 게놈을 포함하는 재조합 NDV가 본원에 제공되며, 여기서 포장된 게놈은 NDV HN 단백질 및 NDV F 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열이 서열번호 8에 제시된 cDNA 서열의 음-센스에 상응하는 RNA 서열로 대체된 뉴캐슬병 바이러스 게놈의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 또 다른 특정 실시예에서, 포장된 게놈을 포함하는 재조합 NDV가 본원에 제공되며, 여기서 포장된 게놈은 NDV HN 단백질 및 NDV F 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열이 서열번호 9에 제시된 cDNA 서열의 음-센스에 상응하는 RNA 서열로 대체된 뉴캐슬병 바이러스 게놈의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 또 다른 특정 실시예에서, 포장된 게놈을 포함하는 재조합 NDV가 본원에 제공되며, 여기서 포장된 게놈은 NDV HN 단백질 및 NDV F 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열이 서열번호 10에 제시된 cDNA 서열의 음-센스에 상응하는 RNA 서열로 대체된 뉴캐슬병 바이러스 게놈의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 또 다른 특정 실시예에서, 포장된 게놈을 포함하는 재조합 NDV가 본원에 제공되며, 여기서 포장된 게놈은 NDV HN 단백질 및 NDV F 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열이 서열번호 11에 제시된 cDNA 서열의 음-센스에 상응하는 RNA 서열로 대체된 뉴캐슬병 바이러스 게놈의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 또 다른 특정 실시예에서, 포장된 게놈을 포함하는 재조합 NDV가 본원에 제공되며, 여기서 포장된 게놈은 NDV HN 단백질 및 NDV F 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열이 서열번호 12에 제시된 cDNA 서열의 음-센스에 상응하는 RNA 서열로 대체된 뉴캐슬병 바이러스 게놈의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 또 다른 특정 실시예에서, 포장된 게놈을 포함하는 재조합 NDV가 본원에 제공되며, 여기서 포장된 게놈은 NDV HN 단백질 및 NDV F 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열이 서열번호 13에 제시된 cDNA 서열의 음-센스에 상응하는 RNA 서열로 대체된 뉴캐슬병 바이러스 게놈의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 또 다른 특정 실시예에서, 포장된 게놈을 포함하는 재조합 NDV가 본원에 제공되며, 여기서 포장된 게놈은 NDV HN 단백질 및 NDV F 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열이 서열번호 14에 제시된 cDNA 서열의 음-센스에 상응하는 RNA 서열로 대체된 뉴캐슬병 바이러스 게놈의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특정 실시예에서, NDV 게놈은 대체된 NDV HN 및 F 단백질 코딩 서열뿐만 아니라 (1) NDV 뉴클레오캡시드(N) 단백질을 암호화하는 전사 유닛, (2) NDV 인단백질(P)을 암호화하는 전사 유닛, (3) NDV 매트릭스(M) 단백질을 암호화하는 전사 유닛, 및 (4) NDV 대형 중합효소(L)를 암호화하는 전사 유닛을 포함한다.
당해 분야의 숙련자라면 NDV 게놈 RNA 서열이 NDV 게놈을 암호화하는 cDNA 서열의 음-센스에 상응하는 RNA 서열임을 이해할 것이다. 따라서, 뉴클레오티드 서열을 그의 역상보체 서열로 변환하는 임의의 프로그램을 사용하여 NDV 게놈을 암호화하는 cDNA 서열을 게놈 RNA 서열로 변환할 수 있다(예를 들어, www.bioinformatics.org/sms/rev_comp.html, www.fr33.net/seqedit.php, 및 DNAStar 참조). 따라서, 아래 표 1 및 표 3에 제공된 뉴클레오티드 서열은 당해 분야의 숙련자에 의해 NDV 게놈의 음성-센스 RNA 서열로 쉽게 변환될 수 있다.
일부 실시예에서, NDV 게놈의 뉴클레오티드 서열은 당해 분야의 숙련자에게 공지된 임의의 균주의 NDV이다. 예시적인 균주는, 예를 들어, 섹션 5.1.2 를 참조한다. 특정 실시예에서, NDV 게놈의 뉴클레오티드 서열은 LaSota 균주이다. 일부 실시예에서, NDV 게놈의 뉴클레오티드 서열은 서열번호 15에 제시된 cDNA 서열에 상응하는 RNA 서열을 포함한다. 특정 실시예에서, NDV 게놈의 뉴클레오티드 서열은 약독형 균주(lentogenic strain)이다. 일부 실시예에서, NDV 게놈의 뉴클레오티드 서열은 중간독형 균주(mesogenic strain)이다. 특정 실시예에서, NDV 게놈의 뉴클레오티드 서열은 강독형 균주(velogenic)이다. NDV 게놈의 뉴클레오티드 서열은 cDNA 서열 또는 RNA 서열(예를 들어, 음 센스 RNA 또는 양 센스 RNA)일 수 있다.
일부 실시예에서, 포장된 게놈을 포함하는 재조합 NDV가 본원에 제공되며, 여기서 포장된 게놈은 서열번호 44의 cDNA 서열에 상응하는 음-센스 RNA 서열을 포함한다. 일부 실시예에서, 포장된 게놈을 포함하는 재조합 NDV가 본원에 제공되며, 여기서 포장된 게놈은 GFP 코딩 서열이 없는 서열번호 44의 cDNA 서열에 상응하는 음-센스 RNA 서열을 포함한다. 일부 실시예에서, 포장된 게놈을 포함하는 재조합 NDV가 본원에 제공되며, 여기서 포장된 게놈은 서열번호 44의 cDNA 서열과 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 뉴클레오티드 서열에 상응하는 음-센스 RNA 서열을 포함한다. 일부 실시예에서, 포장된 게놈을 포함하는 재조합 NDV가 본원에 제공되며, 여기서 포장된 게놈은 GFP 코딩 서열이 없는 서열번호 44의 cDNA 서열과 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 뉴클레오티드 서열에 상응하는 음-센스 RNA 서열을 포함한다.
일부 실시예에서, 포장된 게놈을 포함하는 재조합 NDV가 본원에 제공되며, 여기서 포장된 게놈은 서열번호 45의 cDNA 서열에 상응하는 음-센스 RNA 서열을 포함한다. 일부 실시예에서, 포장된 게놈을 포함하는 재조합 NDV가 본원에 제공되며, 여기서 포장된 게놈은 GFP 코딩 서열이 없는 서열번호 45의 cDNA 서열에 상응하는 음-센스 RNA 서열을 포함한다. 일부 실시예에서, 포장된 게놈을 포함하는 재조합 NDV가 본원에 제공되며, 여기서 포장된 게놈은 서열번호 45의 cDNA 서열과 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 뉴클레오티드 서열에 상응하는 음-센스 RNA 서열을 포함한다. 일부 실시예에서, 포장된 게놈을 포함하는 재조합 NDV가 본원에 제공되며, 여기서 포장된 게놈은 GFP 코딩 서열이 없는 서열번호 45의 cDNA 서열과 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 뉴클레오티드 서열에 상응하는 음-센스 RNA 서열을 포함한다.
일부 실시예에서, 본원에서 설명되는 뉴클레오티드 서열은 코돈 최적화된 것이다. 코돈 최적화 정보 및 기술에 대한 설명은 섹션 5.1.4를 참조한다.
특정 실시예에서, 재조합 NDV는 섹션 6에 기술된 것이다.
특정 실시예에서, 본원에서 설명되는 포장된 게놈은 비-NDV APMV HN 단백질 또는 이의 변이체 이외의 이종 단백질을 암호화하는 이종 서열을 포함하지 않는다. 특정 실시예에서, 본원에서 설명되는 포장된 게놈은 비-NDV APMV F 단백질 또는 이의 변이체 이외의 이종 단백질을 암호화하는 이종 서열을 포함하지 않는다. 특정 실시예에서, 본원에서 설명되는 포장된 게놈은 비-NDV APMV HN 단백질 또는 이의 변이체 및 비-NDV APMV F 단백질 또는 이의 변이체 이외의 이종 단백질을 암호화하는 이종 서열을 포함하지 않는다.
특정 실시예에서, 본원에서 설명되는 포장된 게놈은 이종 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 이식유전자를 추가로 포함한다. 특정 실시예에서, 본원에서 설명되는 포장된 게놈은 항원을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 이식유전자를 추가로 포함한다. 일부 실시예에서, 본원에서 설명되는 포장된 게놈은 2개 이상의 이식유전자를 추가로 포함하고, 각각의 이식유전자는 항원을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 본원에서 설명되는 포장된 게놈에 통합될 수 있는 이식유전자에대한 설명은 섹션 5.1.3을 참조한다. 일부 실시예에서, 항원은 아래 섹션 5.1.3에 기술된 것과 같은 키메라 단백질이다. 특정 실시예에서, 본원에서 설명되는 재조합 NDV의 비리온은 본원에서 설명되는 이식유전자에 의해 암호화된 항원을 포함한다.
일부 실시예에서, 본원에서 설명되는 재조합 NDV의 비리온은 비-NDV APMV F 단백질 또는 이의 변이체를 포함한다. 특정 실시예에서, 본원에서 설명되는 재조합 NDV의 비리온은 비-NDV APMV HN 단백질 또는 이의 변이체를 포함한다. 특정 실시예에서, 본원에서 설명되는 재조합 NDV의 비리온은 비-NDV APMV F 단백질 또는 이의 변이체 및 비-NDV APMV HN 단백질 또는 이의 변이체를 포함한다. 일부 실시예에서, 본원에서 설명되는 재조합 NDV의 비리온은 본원에서 설명되는 키메라 F 단백질을 포함한다. 특정 실시예에서, 본원에서 설명되는 재조합 NDV의 비리온은 본원에서 설명되는 키메라 HN 단백질을 포함한다. 특정 실시예에서, 본원에서 설명되는 재조합 NDV의 비리온은 본원에서 설명되는 키메라 F 단백질 및 본원에서 설명되는 키메라 HN 단백질을 포함한다.
일부 실시예에서, 재조합 NDV의 비리온에서 비-NDV APMV F 단백질 또는 이의 변이체(예를 들어, APMV-4 F 단백질) 및/또는 비-NDV APMV HN 단백질(예를 들어, APMV-4 HN 단백질)의 존재는, 비-NDV APMV F 단백질 또는 이의 변이체 및/또는 비-NDV APMV HN 단백질이 없는 NDV(예를 들어, 하기 섹션 6에 기술된 NDV 균주)에 비해 바이러스로 감염된 세포에서 증가된 인터페론(1형 인터페론) 유도와 같은, 기능적 이점을 부여한다. 일부 실시예에서, 재조합 NDV의 비리온에서 APMV-4 F 단백질 및 APMV-4 HN 단백질의 존재는, APMV-4 F 단백질 및/또는 APMV-4 HN 단백질이 없는 NDV(예를 들어, 하기 섹션 6에 기술된 NDV 균주)에 비해 바이러스에 감염된 세포에서 인터페론(1형 인터페론) 유도의 증가와 같은 기능적 이점을 부여한다 . 특정 실시예에서, 인터페론 유도는 본원에서 설명되는 바와 같은 검정(예를 들어, 하기 섹션 6 내)에서 시험관 내에서 평가되거나 당해 분야의 숙련자에게 공지된다.
5.1.1
재조합 핵산 서열
일 측면에서, NDV HN 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열이 NDV 이외의 조류 파라믹소바이러스(APMV)의 HN 단백질 또는 비-NDV-APMV HN 단백질의 변이체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열로 대체되었거나, NDV F 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열이 NDV 이외의 APMV의 F 단백질 또는 비-NDV-APMV F 단백질의 변이체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열로 대체된 뉴캐슬병 바이러스 게놈의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 서열이 본원에 제공된다. 본원의 특정 예에서, 용어 "비-NDV APMV"는 NDV 이외의 APMV를 지칭하는 데 사용된다. 일 실시예에서, (1) NDV HN 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열이 비-NDV APMV HN 단백질 또는 이의 변이체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열로 대체되었고, 여기서 NDV 유전자간 영역은 비-NDV APMV HN 단백질 코딩 서열 또는 변이체 HN 단백질 코딩 서열의 전후에 있고; 또는 (2) NDV F 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열이 비-NDV APMV F 단백질 또는 이의 변이체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열로 대체되었고, 여기서 NDV 유전자간 영역은 비-NDV APMV F 단백질 코딩 서열 또는 변이체 F 단백질 코딩 서열의 전후에 있는, 뉴캐슬병 바이러스 게놈의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 서열이 본원에 제공된다. 특정 실시예에서, 비-NDV APMV HN 단백질 코딩 서열 또는 변이체 비-NDV APMV HN 단백질 코딩 서열 전후의 NDV 유전자간 영역은 NDV HN 유전자간 영역이다. 특정 실시예에서, 비-NDV APMV F 단백질 코딩 서열 또는 변이체 비-NDV APMV F 단백질 코딩 서열 전후의 NDV 유전자간 영역은 NDV F 유전자간 영역이다. 다른 실시예에서, (1) NDV HN 단백질을 암호화하는 전사 유닛은 비-NDV APMV HN 단백질 또는 이의 변이체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 전사 유닛으로 대체되었고; 또는 (2) NDV F 단백질을 암호화하는 전사 유닛은 비-NDV APMV F 단백질 또는 이의 변이체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 전사 유닛으로 대체된 뉴캐슬병 바이러스 게놈의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 서열이 본원에 제공된다. 특정 실시예에서, 비-NDV APMV F 단백질 또는 이의 변이체는 NDV가 시험관 내, 생체 내 또는 모두에서 복제하는 데 필요한 NDV F 단백질의 하나 이상, 또는 모든 기능을 갖는다. 특정 실시예에서, 비-NDV APMV HN 단백질 또는 이의 변이체는 NDV가 시험관 내, 생체 내 또는 모두에서 복제하는 데 필요한 NDV HN 단백질의 하나 이상, 또는 모든 기능을 갖는다. NDV 게놈은 일반적으로 N 유전자, P 유전자, L 유전자, M 유전자, HN 유전자, 및 F 유전자를 포함한다.
다른 실시예에서, (1) NDV HN 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 비-NDV APMV HN 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열로 대체되었고, 여기서 NDV 유전자간 영역은 비-NDV APMV HN 단백질 코딩 서열의 전후에 있고; 또는 (2) NDV F 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열이 비-NDV APMV F 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열로 대체되었고, 여기서 NDV 유전자간 영역은 상기 비-NDV APMV F 단백질 코딩 서열의 전후에 있는, 뉴캐슬병 바이러스 게놈의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 서열이 본원에 제공된다. 특정 실시예에서, 비-NDV APMV HN 단백질 코딩 서열 전후의 NDV 유전자간 영역은 NDV HN 유전자간 영역이다. 특정 실시예에서, 비-NDV APMV F 단백질 코딩 서열 전후의 NDV 유전자간 영역은 NDV F 유전자간 영역이다. 다른 실시예에서, (1) NDV HN 단백질을 암호화하는 전사 유닛은 비-NDV APMV HN 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 전사 유닛으로 대체되었거나; (2) NDV F 단백질을 암호화하는 전사 유닛은 비-NDV APMV F 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 전사 유닛으로 대체된, 뉴캐슬병 바이러스 게놈의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 서열이 본원에 제공된다. 특정 실시예에서, 비-NDV APMV F 단백질은 NDV가 시험관 내, 생체 내 또는 모두에서 복제하는 데 필요한 NDV F 단백질의 하나 이상, 또는 모든 기능을 갖는다. 특정 실시예에서, 비-NDV APMV HN 단백질은 NDV가 시험관 내, 생체 내 또는 모두에서 복제하는 데 필요한 NDV HN 단백질의 하나 이상, 또는 모든 기능을 갖는다.
다른 실시예에서, (1) NDV HN 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열이 비-NDV APMV HN 단백질의 변이체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열로 대체되었고, 여기서 NDV 유전자간 영역은 변이체 HN 단백질 코딩 서열의 전후에 있고; 또는 (2) NDV F 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 비-NDV APMV F 단백질의 변이체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열로 대체되었고, 여기서 NDV 유전자간 영역은 변이체 F 단백질 코딩 서열의 전후에 있는, 뉴캐슬병 바이러스 게놈의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 서열이 본원에 제공된다. 특정 실시예에서, 비-NDV APMV HN 단백질 코딩 서열의 변이체 전후의 NDV 유전자간 영역은 NDV HN 유전자간 영역이다. 특정 실시예에서, 비-NDV APMV F 단백질 코딩 서열의 변이체 전후의 NDV 유전자간 영역은 NDV F 유전자간 영역이다. 다른 실시예에서, (1) NDV HN 단백질을 암호화하는 전사 유닛이 비-NDV APMV HN 단백질의 변이체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 전사 유닛으로 대체되었거나; (2) NDV F 단백질을 암호화하는 전사 유닛은 비-NDV APMV F 단백질의 변이체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 전사 유닛으로 대체된 뉴캐슬병 바이러스 게놈의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 서열이 본원에 제공된다. 특정 실시예에서, 비-NDV APMV F 단백질의 변이체는 NDV가 시험관 내, 생체 내 또는 모두에서 복제하는 데 필요한 NDV F 단백질의 하나 이상, 또는 모든 기능을 갖는다. 특정 실시예에서, 비-NDV APMV HN 단백질의 변이체는 NDV가 시험관 내, 생체 내 또는 모두에서 복제하는 데 필요한 NDV HN 단백질의 하나 이상, 또는 모든 기능을 갖는다.
다른 측면에서, NDV HN 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열이 NDV 이외의 조류 파라믹소바이러스(APMV)의 HN 단백질 또는 비-NDV-APMV HN 단백질의 변이체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열로 대체되었거나, NDV F 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열이 NDV 이외의 APMV의 F 단백질 또는 비-NDV-APMV F 단백질의 변이체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열로 대체된 뉴캐슬병 바이러스 게놈의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 서열이 본원에 제공된다. 일 실시예에서, (1) NDV HN 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열이 비-NDV APMV HN 단백질 또는 이의 변이체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열로 대체되었고; (2) NDV F 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 비-NDV APMV F 단백질 또는 이의 변이체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열로 대체되었고, 여기서 NDV 유전자간 영역은 비-NDV APMV HN 및 F 단백질 코딩 서열 또는 변이체 HN 및 F 단백질 코딩 서열 이전, 사이 및 이후에 있는, 뉴캐슬병 바이러스 게놈의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특정 실시예에서, 비-NDV APMV HN 단백질 코딩 서열 또는 변이체 비-NDV APMV HN 단백질 코딩 서열 전후의 NDV 유전자간 영역은 NDV HN 유전자간 영역이다. 특정 실시예에서, 비-NDV APMV F 단백질 코딩 서열 또는 변이체 비-NDV APMV F 단백질 코딩 서열 전후의 NDV 유전자간 영역은 NDV F 유전자간 영역이다. 다른 실시예에서, (1) NDV HN 단백질을 암호화하는 전사 유닛이 비-NDV APMV HN 단백질 또는 이의 변이체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 전사 유닛으로 대체되었고; 및 (2) NDV F 단백질을 암호화하는 전사 유닛이 비-NDV APMV F 단백질 또는 이의 변이체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 전사 유닛으로 대체된 뉴캐슬병 바이러스 게놈의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 서열이 본원에 제공된다. 특정 실시예에서, 비-NDV APMV F 단백질 또는 이의 변이체는 NDV가 시험관 내, 생체 내 또는 모두에서 복제하는 데 필요한 NDV F 단백질의 하나 이상, 또는 모든 기능을 갖는다. 특정 실시예에서, 비-NDV APMV HN 단백질 또는 이의 변이체는 NDV가 시험관 내, 생체 내 또는 모두에서 복제하는 데 필요한 NDV HN 단백질의 하나 이상, 또는 모든 기능을 갖는다.
다른 실시예에서, (1) NDV HN 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 비-NDV APMV HN 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열로 대체되었고; (2) NDV F 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열이 비-NDV APMV F 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열로 대체되었고, 여기서 NDV 유전자간 영역은 비-NDV APMV HN 및 F 단백질 코딩 서열 이전, 사이 및 이후에 있는, 뉴캐슬병 바이러스 게놈의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특정 실시예에서, 비-NDV APMV HN 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열 전후의 NDV 유전자간 영역은 NDV HN 유전자간 영역이다. 특정 실시예에서, 비-NDV APMV F 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열 전후의 NDV 유전자간 영역은 NDV F 유전자간 영역이다. 다른 실시예에서, (1) NDV HN 단백질을 암호화하는 전사 유닛이 비-NDV APMV HN 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 전사 유닛으로 대체되었고; (2) NDV F 단백질을 암호화하는 전사 유닛이 비-NDV APMV F 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 전사 유닛으로 대체된 뉴캐슬병 바이러스 게놈의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 서열이 본원에 제공된다. 특정 실시예에서, 비-NDV APMV HN 및 F 단백질은 동일한 균주의 APMV에서 자연에서 발견된다. 예를 들어, 비-NDV APMV HN 및 F 단백질은 모두 동일한 APMV-15 균주에서 자연에서 발견될 수 있다. 다른 실시예에서, 비-NDV APMV HN 및 F 단백질은 상이한 균주의 APMV에서 자연에서 발견된다. 특정 실시예에서, 비-NDV AMPV F 단백질은 NDV가 시험관 내, 생체 내 또는 모두에서 복제하는 데 필요한 NDV F 단백질의 하나 이상, 또는 모든 기능을 갖는다. 특정 실시예에서, 비-NDV AMPV HN 단백질은 NDV가 시험관 내, 생체 내 또는 모두에서 복제하는 데 필요한 NDV HN 단백질의 하나 이상, 또는 모든 기능을 갖는다.
다른 실시예에서, (1) NDV HN 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열이 비-NDV APMV HN 단백질의 변이체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열로 대체되었고; (2) NDV F 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열이 비-NDV APMV F 단백질의 변이체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열로 대체되었고, 여기서 NDV 유전자간 영역은 변이체 HN 및 F 단백질 코딩 서열 이전, 사이 및 이후에 있는, 뉴캐슬병 바이러스 게놈의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특정 실시예에서, 비-NDV APMV HN 단백질의 변이체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열 전후의 NDV 유전자간 영역은 NDV HN 유전자간 영역이다. 특정 실시예에서, 비-NDV APMV F 단백질의 변이체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열 전후의 NDV 유전자간 영역은 NDV F 유전자간 영역이다. 다른 실시예에서, (1) NDV HN 단백질을 암호화하는 전사 유닛이 비-NDV APMV HN 단백질의 변이체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 전사 유닛으로 대체되었고; 및 (2) NDV F 단백질을 암호화하는 전사 유닛은 비-NDV APMV F 단백질의 변이체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 전사 유닛으로 대체된 뉴캐슬병 바이러스 게놈의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 서열이 본원에 제공된다. 특정 실시예에서, 변이체 HN 및 F 단백질은 동일한 균주의 APMV로부터 유래된다. 예를 들어, 변이체 HN 및 F 단백질은 모두 동일한 APMV-15 균주로부터 유래될 수 있다. 다른 실시예에서, 변이체 HN 및 F 단백질은 상이한 균주의 APMV로부터 유래된다. 특정 실시예에서, 비-NDV APMV F 단백질의 변이체는 NDV가 시험관 내, 생체 내 또는 모두에서 복제하는 데 필요한 NDV F 단백질의 하나 이상, 또는 모든 기능을 갖는다. 특정 실시예에서, 비-NDV APMV HN 단백질의 변이체는 NDV가 시험관 내, 생체 내 또는 모두에서 복제하는 데 필요한 NDV HN 단백질의 하나 이상, 또는 모든 기능을 갖는다.
또 다른 측면에서, NDV HN 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열이 키메라 HN 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열로 대체되었거나, NDV F 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열이 키메라 F 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열로 대체된 뉴캐슬병 바이러스 게놈의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 서열이 본원에 제공된다. 일 실시예에서, (1) NDV HN 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열이 키메라 HN 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열로 대체되었고, 여기서 NDV 유전자간 영역은 키메라 HN 단백질 코딩 서열의 전후에 있고; 또는 (2) NDV F 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열이 키메라 F 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열로 대체되었고, 여기서 NDV 유전자간 영역은 키메라 F 단백질 코딩 서열 전후에 있는, 뉴캐슬병 바이러스 게놈의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특정 실시예에서, 키메라 HN 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열 전후의 NDV 유전자간 영역은 NDV HN 유전자간 영역이다. 특정 실시예에서, 키메라 F 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열 전후의 NDV 유전자간 영역은 NDV F 유전자간 영역이다. 다른 실시예에서, (1) NDV HN 단백질을 암호화하는 전사 유닛이 키메라 HN 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 전사 유닛으로 대체되었거나; (2) NDV F 단백질을 암호화하는 전사 유닛이 키메라 F 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 전사 유닛으로 대체된 뉴캐슬병 바이러스 게놈의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 서열이 본원에 제공된다. 특정 실시예에서, 키메라 HN 단백질은 비-NDV APMV HN 단백질 세포외 도메인 및 NDV HN 단백질 막관통 및 세포질 도메인을 포함한다. 즉, NDV HN 단백질 막관통 및 세포질 도메인은 키메라 HN 단백질이 비-NDV APMV HN 단백질 막관통 및 세포질 도메인을 포함하지 않도록 비-NDV APMV HN 단백질 막관통 및 세포질 도메인을 대체한다. 비-NDV APMV HN 단백질 및 NDV HN 단백질의 세포외 도메인, 막관통 및 세포질 도메인은 당해 분야의 숙련자에게 공지된 기술을 사용하여 결정될 수 있다. 예를 들어, 공개된 정보, GenBank 또는 VIPR 바이러스 병원균 웹사이트(www.viprbrc.org), DTU 생물정보학 도메인 웹사이트(www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)와 같은 웹사이트 또는 막관통 도메인을 결정하는 데 이용 가능한 프로그램이 비-NDV APMV HN 단백질 및 NDV HN 단백질의 세포외 도메인, 막관통 및 세포질 도메인을 결정하는 데 사용될 수 있다. 특정 실시예에서, 키메라 HN 단백질은 비-NDV APMV HN 단백질의 변이체의 세포외 도메인 및 NDV HN 단백질 막관통 및 세포질 도메인을 포함한다. 특정 실시예에서, 키메라 HN 단백질은 NDV가 시험관 내, 생체 내 또는 모두에서 복제하는 데 필요한 NDV HN의 하나 이상, 또는 모든 기능을 갖는다. 특정 실시예에서, 키메라 F 단백질은 비-NDV APMV F 단백질 세포외 도메인 및 NDV F 단백질 막관통 및 세포질 도메인을 포함한다. 즉, NDV F 단백질 막관통 및 세포질 도메인은 키메라 F 단백질이 비-NDV APMV F 단백질 막관통 및 세포질 도메인을 포함하지 않도록 비-NDV APMV F 단백질 막관통 및 세포질 도메인을 대체한다. 비-NDV APMV F 단백질 및 NDV F 단백질의 세포외 도메인, 막관통 및 세포질 도메인은 당해 분야의 숙련자에게 공지된 기술을 사용하여 결정될 수 있다. 예를 들어, 공개된 정보, GenBank 또는 VIPR 바이러스 병원균 웹사이트(www.viprbrc.org), DTU 생물정보학 도메인 웹사이트(www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)와 같은 웹사이트 또는 막관통 도메인을 결정하는 데 이용 가능한 프로그램이 비-NDV APMV F 단백질 및 NDV F 단백질의 세포외 도메인, 막관통 및 세포질 도메인을 결정하는 데 사용될 수 있다. 특정 실시예에서, 키메라 F 단백질은 비-NDV APMV F 단백질의 변이체의 세포외 도메인 및 NDV F 단백질 막관통 및 세포질 도메인을 포함한다. 특정 실시예에서, 키메라 F 단백질은 NDV가 시험관 내, 생체 내 또는 모두에서 복제하는 데 필요한 NDV F 단백질의 하나 이상, 또는 모든 기능을 갖는다.
또 다른 측면에서, NDV HN 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열이 키메라 HN 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열로 대체되었고, NDV F 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열이 키메라 F 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열로 대체된 뉴캐슬병 바이러스 게놈의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 서열이 본원에 제공된다. 일 실시예에서, (1) NDV HN 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열이 키메라 HN 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열로 대체되었고, 여기서 NDV 유전자간 영역은 키메라 HN 단백질 코딩 서열의 전후에 있고; 및 (2) NDV F 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열이 키메라 F 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열로 대체되었고, 여기서 NDV 유전자간 영역은 키메라 F 단백질 코딩 서열의 전후에 있는 뉴캐슬병 바이러스 게놈의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특정 실시예에서, 키메라 HN 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열 전후의 NDV 유전자간 영역은 NDV HN 유전자간 영역이다. 특정 실시예에서, 키메라 F 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열 전후의 NDV 유전자간 영역은 NDV F 유전자간 영역이다. 다른 실시예에서, (1) NDV HN 단백질을 암호화하는 전사 유닛이 키메라 HN 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 전사 유닛으로 대체되었고; (2) NDV F 단백질을 암호화하는 전사 유닛은 키메라 F 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 전사 유닛으로 대체된 뉴캐슬병 바이러스 게놈의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 서열이 본원에 제공된다. 특정 실시예에서, 키메라 HN 단백질은 비-NDV APMV HN 단백질 세포외 도메인 및 NDV HN 단백질 막관통 및 세포질 도메인을 포함한다. 즉, NDV HN 단백질 막관통 및 세포질 도메인은 키메라 HN 단백질이 비-NDV APMV HN 단백질 막관통 및 세포질 도메인을 포함하지 않도록 비-NDV APMV HN 단백질 막관통 및 세포질 도메인을 대체한다. 비-NDV APMV HN 단백질 및 NDV HN 단백질의 세포외 도메인, 막관통 및 세포질 도메인은 당해 분야의 숙련자에게 공지되거나 본원에서 설명되는 기술을 사용하여 결정될 수 있다. 특정 실시예에서, 키메라 HN 단백질은 NDV가 시험관 내, 생체 내 또는 모두에서 복제하는 데 필요한 NDV HN의 하나 이상, 또는 모든 기능을 갖는다. 특정 실시예에서, 키메라 HN 단백질은 비-NDV APMV HN 단백질의 변이체의 세포외 도메인 및 NDV HN 단백질 막관통 및 세포질 도메인을 포함한다. 특정 실시예에서, 키메라 F 단백질은 비-NDV APMV F 단백질 세포외 도메인 및 NDV F 단백질 막관통 및 세포질 도메인을 포함한다. 즉, NDV F 단백질 막관통 및 세포질 도메인은 키메라 F 단백질이 비-NDV APMV F 단백질 막관통 및 세포질 도메인을 포함하지 않도록 비-NDV APMV F 단백질 막관통 및 세포질 도메인을 대체한다. 비-NDV APMV F 단백질 및 NDV F 단백질의 세포외 도메인, 막관통 및 세포질 도메인은 당해 분야의 숙련자에게 공지되거나 본원에서 설명되는 기술을 사용하여 결정될 수 있다. 특정 실시예에서, 키메라 F 단백질은 비-NDV APMV F 단백질의 변이체의 세포외 도메인 및 NDV F 단백질 막관통 및 세포질 도메인을 포함한다. 특정 실시예에서, 키메라 F 단백질은 NDV가 시험관 내, 생체 내 또는 모두에서 복제하는 데 필요한 NDV F 단백질의 하나 이상, 또는 모든 기능을 갖는다. 특정 실시예에서, 비-NDV APMV HN 및 F 단백질의 세포외 도메인은 동일한 균주의 APMV에서 자연에서 발견된다. 예를 들어, 비-NDV APMV HN 및 F 단백질의 세포외 도메인은 모두 동일한 APMV-15 균주에서 자연에서 발견될 수 있다. 다른 실시예에서, 비-NDV APMV HN 및 F 단백질의 세포외 도메인은 상이한 균주의 APMV에서 자연에서 발견된다.
또 다른 측면에서, 핵산 서열이 본원에 제공되며, 상기 핵산 서열은: (1) NDV 뉴클레오캡시드(N) 단백질을 암호화하는 전사 유닛, (2) NDV 인단백질(P)을 암호화하는 전사 유닛, (3) NDV 매트릭스(M) 단백질을 암호화하는 전사 유닛, (4) NDV 융합(F) 단백질을 암호화하는 전사 유닛, (5) 비-NDV APMV 헤마글루틴-뉴라미니다아제(HN) 또는 이의 변이체를 암호화하는 전사 유닛, 및 (6) NDV 대형 중합효소(L)를 암호화하는 전사 유닛을 포함한다. 또 다른 측면에서, 핵산 서열이 본원에 제공되며, 상기 핵산 서열은: (1) NDV 뉴클레오캡시드(N) 단백질을 암호화하는 전사 유닛, (2) NDV 인단백질(P)을 암호화하는 전사 유닛, (3) NDV 매트릭스(M) 단백질을 암호화하는 전사 유닛, (4) 비-NDV APMV 융합(F) 단백질 또는 이의 변이체를 암호화하는 전사 유닛, (5) NDV 헤마글루티닌-뉴라미니다아제(HN)를 암호화하는 전사 유닛, 및 (6) NDV 대형 중합효소(L)를 암호화하는 전사 유닛을 포함한다. 특정 실시예에서, 비-NDV AMPV F 단백질 또는 이의 변이체는 NDV가 시험관 내, 생체 내 또는 모두에서 복제하는 데 필요한 NDV F 단백질의 하나 이상, 또는 모든 기능을 갖는다. 특정 실시예에서, 비-NDV APMV HN 단백질 또는 이의 변이체는 NDV가 시험관 내, 생체 내 또는 모두에서 복제하는 데 필요한 NDV HN 단백질의 하나 이상, 또는 모든 기능을 갖는다.
다른 측면에서, 핵산 서열이 본원에 제공되며, 상기 핵산 서열은: (1) NDV 뉴클레오캡시드(N) 단백질을 암호화하는 전사 유닛, (2) NDV 인단백질(P)을 암호화하는 전사 유닛, (3) NDV 매트릭스(M) 단백질을 암호화하는 전사 유닛, (4) 비-NDV APMV 융합(F) 단백질 또는 이의 변이체를 암호화하는 전사 유닛, (5) 비-NDV APMV 헤마글루티닌-뉴라미니다아제(HN) 또는 이의 변이체를 암호화하는 전사 유닛, 및 (6) NDV 거대 중합효소(L)를 암호화하는 전사 유닛. 특정 실시예에서, 비-NDV AMPV F 단백질 또는 이의 변이체는 NDV가 시험관 내, 생체 내 또는 모두에서 복제하는 데 필요한 NDV F 단백질의 하나 이상, 또는 모든 기능을 갖는다. 특정 실시예에서, 비-NDV APMV HN 단백질 또는 이의 변이체는 NDV가 시험관 내, 생체 내 또는 모두에서 복제하는 데 필요한 NDV HN 단백질의 하나 이상, 또는 모든 기능을 갖는다.
일 실시예에서, (1) NDV 뉴클레오캡시드(N) 단백질을 암호화하는 전사 유닛, (2) NDV 인단백질(P)을 암호화하는 전사 유닛, (3) NDV 매트릭스(M) 단백질을 암호화하는 전사 유닛, (4) 비-NDV APMV 융합(F) 단백질을 암호화하는 전사 유닛, (5) 비-NDV APMV 헤마글루티닌-뉴라미니다아제(HN)를 암호화하는 전사 유닛, 및 (6) NDV 대형 중합효소(L)를 암호화하는 전사 유닛을 포함하는 핵산 서열이 본원에 제공된다. 특정 실시예에서, 비-NDV APMV HN 및 F 단백질은 동일한 균주의 APMV에서 자연에서 발견된다. 예를 들어, 비-NDV APMV HN 및 F 단백질은 모두 동일한 APMV-15 균주에서 자연에서 발견될 수 있다. 다른 실시예에서, 비-NDV APMV HN 및 F 단백질은 상이한 균주의 APMV에서 자연에서 발견된다. 특정 실시예에서, 비-NDV APMV F 단백질은 NDV가 시험관 내, 생체 내 또는 모두에서 복제하는 데 필요한 NDV F 단백질의 하나 이상, 또는 모든 기능을 갖는다. 특정 실시예에서, 비-NDV APMV HN 단백질은 NDV가 시험관 내, 생체 내 또는 모두에서 복제하는 데 필요한 NDV HN 단백질의 하나 이상, 또는 모든 기능을 갖는다.
다른 실시예에서, 핵산 서열이 본원에 제공되며, 상기 핵산 서열은: (1) NDV 뉴클레오캡시드(N) 단백질을 암호화하는 전사 유닛, (2) NDV 인단백질(P)을 암호화하는 전사 유닛, (3) NDV 매트릭스(M) 단백질을 암호화하는 전사 유닛, (4) 비-NDV APMV 융합(F) 단백질의 변이체를 암호화하는 전사 유닛, (5) 비-NDV APMV 헤마글루티닌-뉴라미니다아제(HN)의 변이체를 암호화하는 전사 유닛, 및 (6) NDV 거대 중합효소(L)를 암호화하는 전사 유닛을 포함한다. 특정 실시예에서, 비-NDV APMV HN 및 F 단백질의 변이체는 동일한 균주의 APMV로부터 유래된다. 예를 들어, 비-NDV APMV HN 및 F 단백질의 변이체는 모두 동일한 APMV-15 균주로부터 유래될 수 있다. 다른 실시예에서, 비-NDV APMV HN 및 F 단백질의 변이체는 상이한 균주의 APMV로부터 유래된다. 특정 실시예에서, 비-NDV APMV F 단백질의 변이체는 NDV가 시험관 내, 생체 내 또는 모두에서 복제하는 데 필요한 NDV F 단백질의 하나 이상, 또는 모든 기능을 갖는다. 특정 실시예에서, 비-NDV APMV HN 단백질의 변이체는 NDV가 시험관 내, 생체 내 또는 모두에서 복제하는 데 필요한 NDV HN 단백질의 하나 이상, 또는 모든 기능을 갖는다.
또 다른 측면에서, 핵산 서열이 본원에 제공되며, 상기 핵산 서열은 (1) NDV 뉴클레오캡시드(N) 단백질을 암호화하는 전사 유닛, (2) NDV 인단백질(P)을 암호화하는 전사 유닛, (3) NDV 매트릭스(M) 단백질을 암호화하는 전사 유닛, (4) NDV 융합(F) 단백질을 암호화하는 전사 유닛, (5) 키메라 헤마글루티닌-뉴라미니다아제(HN)를 암호화하는 전사 유닛, 및 (6) NDV 대형 중합효소(L)를 암호화하는 전사 유닛을 포함한다. 또 다른 측면에서, 핵산 서열이 본원에 제공되며, 상기 핵산 서열은 (1) NDV 뉴클레오캡시드(N) 단백질을 암호화하는 전사 유닛, (2) NDV 인단백질(P)을 암호화하는 전사 유닛, (3) NDV 매트릭스(M) 단백질을 암호화하는 전사 유닛, (4) 키메라 융합(F) 단백질을 암호화하는 전사 유닛, (5) NDV 헤마글루티닌-뉴라미니다아제(HN)를 암호화하는 전사 유닛, 및 (6) NDV 대형 중합효소(L)를 암호화하는 전사 유닛을 포함한다. 또 다른 측면에서, 핵산 서열이 본원에 제공되며, 상기 핵산 서열은 (1) NDV 뉴클레오캡시드(N) 단백질을 암호화하는 전사 유닛, (2) NDV 인단백질(P)을 암호화하는 전사 유닛, (3) NDV 매트릭스(M) 단백질을 암호화하는 전사 유닛, (4) 키메라 융합(F) 단백질을 암호화하는 전사 유닛, (5) 키메라 헤마글루티닌-뉴라미니다아제(HN)를 암호화하는 전사 유닛, 및 (6) NDV 대형 중합효소(L)를 암호화하는 전사 유닛을 포함한다. 특정 실시예에서, 키메라 HN 단백질은 비-NDV APMV HN 단백질 세포외 도메인 및 NDV HN 단백질 막관통 및 세포질 도메인을 포함한다. 즉, NDV HN 단백질 막관통 및 세포질 도메인은 키메라 HN 단백질이 비-NDV APMV HN 단백질 막관통 및 세포질 도메인을 포함하지 않도록 비-NDV APMV HN 단백질 막관통 및 세포질 도메인을 대체한다. 비-NDV APMV HN 단백질 및 NDV HN 단백질의 세포외 도메인, 막관통 및 세포질 도메인은 당해 분야의 숙련자에게 공지된 기술을 사용하여 결정될 수 있다. 예를 들어, 공개된 정보, GenBank 또는 VIPR 바이러스 병원균 웹사이트(www.viprbrc.org), DTU 생물정보학 도메인 웹사이트(www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)와 같은 웹사이트 또는 막관통 도메인을 결정하는 데 이용 가능한 프로그램이 비-NDV APMV HN 단백질 및 NDV HN 단백질의 세포외 도메인, 막관통 및 세포질 도메인을 결정하는 데 사용될 수 있다. 특정 실시예에서, 키메라 HN 단백질은 NDV가 시험관 내, 생체 내 또는 모두에서 복제하는 데 필요한 NDV HN의 하나 이상, 또는 모든 기능을 갖는다. 특정 실시예에서, 키메라 F 단백질은 비-NDV APMV F 단백질 세포외 도메인 및 NDV F 단백질 막관통 및 세포질 도메인을 포함한다. 즉, NDV F 단백질 막관통 및 세포질 도메인은 키메라 F 단백질이 비-NDV APMV F 단백질 막관통 및 세포질 도메인을 포함하지 않도록 비-NDV APMV F 단백질 막관통 및 세포질 도메인을 대체한다. 비-NDV APMV F 단백질 및 NDV F 단백질의 세포외 도메인, 막관통 및 세포질 도메인은 당해 분야의 숙련자에게 공지된 기술을 사용하여 결정될 수 있다. 예를 들어, 공개된 정보, GenBank 또는 VIPR 바이러스 병원균 웹사이트(www.viprbrc.org), DTU 생물정보학 도메인 웹사이트(www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)와 같은 웹사이트 또는 막관통 도메인을 결정하는 데 이용 가능한 프로그램이 비-NDV APMV F 단백질 및 NDV F 단백질의 세포외 도메인, 막관통 및 세포질 도메인을 결정하는 데 사용될 수 있다. 특정 실시예에서, 키메라 F 단백질은 NDV가 시험관 내, 생체 내 또는 모두에서 복제하는 데 필요한 NDV F 단백질의 하나 이상, 또는 모든 기능을 갖는다. 특정 실시예에서, 비-NDV APMV HN 및 F 단백질의 세포외 도메인은 동일한 균주의 APMV에서 자연에서 발견된다. 예를 들어, 비-NDV APMV HN 및 F 단백질의 세포외 도메인은 모두 동일한 APMV-15 균주에서 자연에서 발견될 수 있다. 다른 실시예에서, 비-NDV APMV HN 및 F 단백질의 세포외 도메인은 상이한 균주의 APMV에서 자연에서 발견된다.
특정 실시예에서, 비-NDV APMV는 NDV와 면역학적으로 구별된다. 특정 실시예에서, 비-NDV APMV 및 NDV가, Chumbe 등, 2017, Virology Journal 14: 232 및 Reynolds 등, 1999, Avian Dis. 143:564-71, Sun 등, 2020, EBioMedicine 62: 103132, 또는 Sun 등, 2020, Vaccines 8: 771, 또는 본원에서 설명되는 바와 같은, 바이러스 중성화 검정에 의해 평가되는 바와 같이 서로의 복제를 유의하게 억제하는 항체를 유도하지 않는 경우, 비-NDV APMV는 NDV과 면역학적으로 구별된다. 특정 실시예에서, 비-NDV APMV 및 NDV가, 예를 들어, Chumbe 등, 2017, Virology Journal 14: 232 및 Reynolds 등, 1999, Avian Dis. 143:564-71, Sun 등, 2020, EBioMedicine 62: 103132, 또는 Sun 등, 2020, Vaccines 8: 771, 또는 본원에서 설명되는 바와 같은, 바이러스 중성화 검정에서, 약 0.5 log 미만, 약 1 log 미만, 약 1.5 log 미만, 또는 약 2 log 미만 만큼, 서로의 복제를 억제하는 항체를 유도하는 경우, 비-NDV APMV는 NDV과 면역학적으로 구별되는 것으로 간주된다. 특정 실시예에서, NDV 항혈청 HI 활성이 아래에 기술된 바와 같은(예를 들어, 예 3에서) HI 검정에서 비-NDV APMV에 대해 상당히 감소되는 경우, 비-NDV APMV는 NDV와 면역학적으로 구별되는 것으로 간주된다. 특정 실시예에서, NDV 항혈청 HI 활성이 NDV에 대한 NDV 항혈청 HI 활성에 비해, 아래에 기술된 바와 같은(예를 들어, 예 3에서) HI 검정에서 비-NDV APMV에 대해 적어도 2배, 3배, 4배, 5배, 10배, 또는 그 이상 감소되는 경우, 비-NDV APMV는 NDV와 면역학적으로 구별되는 것으로 간주된다. 특정 실시예에서, 비-NDV APMV는 AMPV-2, AMPV-3, AMPV-4, AMPV-5, AMPV-6, AMPV-7, AMPV-8, AMPV-9, AMPV-10, AMPV-11, AMPV-12, AMPV-13, AMPV-14, AMPV-15, AMPV-16, AMPV-17, AMPV-18, AMPV-19, AMPV-20, 또는 AMPV-21이다. 일부 실시예에서, 비-NDV APMV는 APMV-2, 예컨대, 예를 들어, Chicken/California/Yucaipa/56(수탁 번호 EU338414)이다. 특정 실시예에서, 비-NDV APMV는 APMV-3, 예컨대, 예를 들어, APMV3/Turkey/Wisconsin/68(수탁 번호 EU782025)이다. 일부 실시예에서, 비-NDV APMV는 APMV-4, 예컨대, 예를 들어, APMV4/duck/Hongkong/D3/75(수탁 번호 FJ177514), APMV4/Duck/China/G302/2012(수탁 번호 KC439346.1), APMV4/mallard/Belgium/15129/07(수탁 번호 JN571485), APMV4/Uriah_aalge/Russia/Tyuleniy_Island/115/2015(수탁 번호 KU601399.1) APMV-4/Egyptian goose/South Africa/N1468/2010 (수탁 번호 JX133079.1), 또는 APMV4/duck/Delaware/549227/2010 (수탁 번호 JX987283.1)이다. 특정 실시예에서, 비-NDV APMV는 APMV-5, 예컨대, 예를 들어, APMV-5 budgerigar/Kunitachi/74 (수탁 번호 GU206351) 또는 APMV5/budgerigar/Japan/TI/75 (수탁 번호 LC168750)이다. 일부 실시예에서, 비-NDV APMV는 APMV-6, 예컨대, 예를 들어, APMV-6 Goose/FarEast/4440/2003(수탁 번호 EF569970) 또는 APMV6/duck/HongKong/18/199/77(수탁 번호 EU622637)이다. 특정 실시예에서, 비-NDV APMV는 APMV-7, 예컨대, 예를 들어, APMV-7 dove/Tennessee/4/75(수탁 번호 FJ231524)이다. 일부 실시예에서, 비-NDV APMV는 APMV-8, 예컨대, 예를 들어, APMV-8 goose/Delaware/1053/76(수탁 번호 FJ215863)이다. 특정 실시예에서, 비-NDV APMV는 APMV-9, 예컨대, 예를 들어, APMV9/duck/New York/22/78(수탁 번호 EU910942)이다. 일부 실시예에서, 비-NDV APMV는 APMV-10, 예컨대, 예를 들어, APMV-10 penguin/Falkland Islands/324/2007(수탁 번호 HM147142 또는 NC_025349)이다. 특정 실시예에서, 비-NDV APMV는 APMV-11, 예컨대, 예를 들어, APMV-11 common_snipe/France/100212/2010(수탁 번호 JQ886184)이다. 일부 실시예에서, 비-NDV APMV는 APMV-12, 예컨대, 예를 들어 APMV12/Wigeon/Italy/3920_1/05(수탁 번호 KC333050)이다. 일부 실시예에서, 비-NDV APMV는 APMV-14, 예컨대, 예를 들어, APMV-14 duck/Japan/11OG0352/2011(수탁 번호 KX258200)이다. 특정 실시예에서, 비-NDV APMV는 APMV-15, 예컨대, 예를 들어, APMV-15 calidris_fuscicollis/Brazil/RS-1177/2012(수탁 번호 KX932454)이다. 일부 실시예에서, 비-NDV APMV는, APMV-17, 예컨대, 예를 들어, APMV17/Antarctica/107/13(수탁 번호 MK167211)이다. 일부 실시예에서, 비-NDV APMV는 APMV-20, 예컨대, 예를 들어, APMV-20 Gull/Kazakhstan/2014(수탁 번호 MF033136)이다. 특정 실시예에서, 비-NDV APMV는 APMV-21, 예컨대, 예를 들어, APMV21/pigeon/Taiwan/AHRI128/17(수탁 번호 MK67743)이다.
특정 실시예에서, 비-NDV APMV는 APMV4/duck/Hongkong/D3/75(수탁 번호 FJ177514)이다. 다른 특정 실시예에서, 비-NDV APMV는 APMV17/Antarctica/107/13(수탁 번호 MK167211)이다. 다른 특정 실시예에서, 비-NDV APMV는 APMV9/duck/New York/22/78(수탁 번호 EU910942)이다. 다른 특정 실시예에서, 비-NDV는 APMV7/ dove/Tennessee/4/75(수탁 번호 FJ231524)이다. 다른 특정 실시예에서, 비-NDV APMV는 APMV21/pigeon/Taiwan/AHRI128/17(수탁 번호 MK67743)이다. 다른 특정 실시예에서, 비-NDV APMV는 APMV6/duck/HongKong/18/199/77(수탁 번호 EU622637)이다. 다른 특정 실시예에서, 비-NDV APMV는 APMV11/common_snipe/France/100212/10(수탁 번호 JQ886184)이다. 다른 특정 실시예에서, 비-NDV APMV는 APMV15/calidris_fuscicollis/Brazil/RS-1177/12(수탁 번호 NC_034968)이다. 다른 특정 실시예에서, 비-NDV APMV는 APMV8/Goose/Delaware/1053/76(수탁 번호 FJ215863)이다. 다른 특정 실시예에서, 비-NDV APMV는 APMV2/Chicken/California/Yucaipa/56(수탁 번호 EU338414)이다. 다른 특정 실시예에서, 비-NDV APMV는 APMV3/Turkey/Wisconsin/68(수탁 번호 EU782025)이다. 다른 특정 실시예에서, 비-NDV APMV는 APMV12/Wigeon/Italy/3920_1/05(수탁 번호 KC333050)이다. 다른 특정 실시예에서, 비-NDV APMV는 APMV5/budgerigar/Japan/TI/75(수탁 번호 LC168750)이다. 다른 특정 실시예에서, 비-NDV APMV는 APMV10/penguin/Falkland Islands/324/07(수탁 번호 NC_025349)이다.
일부 실시예에서, 비-NDV APMV는 NDV와 상이한 속으로부터의 아불라비리나 아과의 구성원이다. 일부 실시예에서, 비-NDV APMV는 아불라비리나 아과의 구성원이지만, NDV는 아니다. 일부 실시예에서, 비-NDV APMV는 아불라비리나 아과 및 메타아불라바이러스 속의 구성원이다. 일부 실시예에서, 비-NDV APMV는 아불라비리나 아과 및 파라아불라바이러스 속의 구성원이다. 일부 실시예에서, 비-NDV APMV는 아불라비리나 아과 및 오소아불라바이러스의 구성원이지만, NDV는 아니다.
특정 실시예에서, 비-NDV APMV F 단백질은 NDV F 단백질과 면역학적으로 구별된다. 특정 실시예에서, 비-NDV APMV F 단백질의 변이체는 NDV F 단백질과 면역학적으로 구별된다. 특정 실시예에서, NDV F 단백질에 대한 항체가 비-NDV APMV F 단백질 또는 이의 변이체와 교차 반응하지 않는 경우, 비-NDV APMV F 단백질 또는 이의 변이체는 NDV F 단백질과 면역학적으로 구별된다. 일부 실시예에서, 당해 분야의 숙련자에게 공지되거나 본원에서 설명되는 검정에서 NDV F 단백질에 대한 항체가 NDV F 단백질에 비해 2배, 5배, 10배, 15배, 20배 또는 더 낮은 친화도로 비-NDV APMV F 단백질 또는 이의 변이체에 결합하는 경우, 비-NDV APMV F 단백질 또는 이의 변이체는 NDV F 단백질과 면역학적으로 구별된다. 특정 실시예에서, 당해 분야의 숙련자에게 공지되거나 본원에서 설명되는 검정에서 NDV F 단백질에 대한 항체가 NDV F 단백질에 비해 0.5 log, 1 log, 1.5 log, 2 log, 2.5 log, 3 log 또는 더 낮은 친화도로 비-NDV APMV F 단백질 또는 이의 변이체에 결합하는 경우, 비-NDV APMV F 단백질 또는 이의 변이체는 NDV F 단백질과 면역학적으로 구별된다. 특정 실시예에서, 항-NDV F 항체가, Chumbe 등, 2017, Virology Journal 14: 232 및 Reynolds 등, 1999, Avian Dis. 143:564-71, Sun 등, 2020, EBioMedicine 62: 103132, 또는 Sun 등, 2020, Vaccines 8: 771, 또는 본원에서 설명되는 바와 같은, 바이러스 중성화 검정에 의해 평가되는 바와 같이 비-NDV APMV F 단백질 또는 이의 변이체를 발현하는 NDV의 복제를 유의하게 억제하지 않는 경우, 비-NDV APMV F 단백질 또는 이의 변이체는 NDV F 단백질과 면역학적으로 구별된다. 특정 실시예에서, 항-NDV F 항체가, 예를 들어, Chumbe 등, 2017, Virology Journal 14: 232 및 Reynolds 등, 1999, Avian Dis. 143:564-71, Sun 등, 2020, EBioMedicine 62: 103132, 또는 Sun 등, 2020, Vaccines 8: 771, 또는 본원에서 설명되는 바와 같은, 바이러스 중성화 검정에서, 약 0.5 log 미만, 약 1 log 미만, 약 1.5 log 미만, 또는 약 2 log 미만 만큼, 비-NDV APMV F 단백질 또는 이의 변이체를 발현하는 NDV의 복제를 억제하는 경우, 비-NDV APMV F 단백질 또는 이의 변이체는 NDV F 단백질과 면역학적으로 구별된다.
일부 실시예에서, 비-NDV APMV F 단백질은 아불라비리나 아과의 구성원으로부터의 F 단백질이지만, NDV는 아니다. 일부 실시예에서, 비-NDV APMV F 단백질은 아불라비리나 아과 및 메타아불라바이러스 속의 구성원으로부터의 F 단백질이다. 일부 실시예에서, 비-NDV APMV F 단백질은 아불라비리나 아과 및 파라아불라바이러스 속의 구성원으로부터의 F 단백질이다. 일부 실시예에서, 비-NDV APMV F 단백질은 아불라비리나 아과 및 오소아불라바이러스의 구성원으로부터의 F 단백질이지만, NDV는 아니다.
특정 실시예에서, 키메라 F 단백질은 NDV F 단백질과 면역학적으로 구별된다. 특정 실시예에서, 키메라 F 단백질은 NDV F 단백질에 대한 항체가 키메라 F 단백질과 교차 반응하지 않는 경우 NDV F 단백질과 면역학적으로 구별된다. 일부 실시예에서, NDV F 단백질에 대한 항체가 당해 분야의 숙련자에게 공지되거나 본원에서 설명되는 검정에서 NDV F 단백질에 비해 2배, 5배, 10배, 15배, 20배 또는 더 낮은 친화도로 키메라 F 단백질에 결합하는 경우, 키메라 F 단백질은 NDV F 단백질과 면역학적으로 구별된다. 특정 실시예에서, NDV F 단백질에 대한 항체가 당해 분야의 숙련자에게 공지되거나 본원에서 설명되는 검정에서 NDV F 단백질보다 0.5 log, 1 log, 1.5 log, 2 log, 2.5 log, 3 log 또는 더 낮은 친화도로 키메라 F 단백질에 결합하는 경우, 키메라 F 단백질은 NDV F 단백질과 면역학적으로 구별된다. 특정 실시예에서, 항-NDV F 항체가, Chumbe 등, 2017, Virology Journal 14: 232 및 Reynolds 등, 1999, Avian Dis. 143:564-71, Sun 등, 2020, EBioMedicine 62: 103132, 또는 Sun 등, 2020, Vaccines 8: 771에서 설명되는 바와 같은, 바이러스 중성화 검정에 의해 평가되는 바와 같이 비-NDV APMV F 단백질 또는 이의 변이체를 발현하는 NDV의 복제를 유의하게 억제하지 않는 경우, 키메라 F 단백질은 NDV F 단백질과 면역학적으로 구별된다. 특정 실시예에서, 항-NDV F 항체가, 예를 들어, Chumbe 등, 2017, Virology Journal 14: 232 및 Reynolds 등, 1999, Avian Dis. 143:564-71, Sun 등, 2020, EBioMedicine 62: 103132, 또는 Sun 등, 2020, Vaccines 8: 771, 또는 본원에서 설명되는 바와 같은, 바이러스 중성화 검정에서, 약 0.5 log 미만, 약 1 log 미만, 약 1.5 log 미만, 또는 약 2 log 미만 만큼, 비-NDV APMV F 단백질 또는 이의 변이체를 발현하는 NDV의 복제를 억제하는 경우, 키메라 F 단백질은 NDV F 단백질과 면역학적으로 구별된다.
특정 실시예에서, 비-NDV APMV F 단백질은 다염기 절단 부위를 함유하지 않는다. 특정 실시예에서, 비-NDV APMV F 단백질은, 예를 들어, 하나 이상의 아미노산 치환에 의해 변형되어, 비-NDV APMV F 단백질은 더 이상 다-염기 절단을 함유하지 않는다. 일부 실시예에서, 비-NDV APMV F 단백질의 절단 부위의 원래 서열은 예를 들어, 하나 이상의 아미노산 치환에 의해 변형된다. 예를 들어, NDV F 단백질의 아미노산 위치 289에 상응하는 (LaSota 균주 F 단백질에 의해 계수된) 비-NDV APMV F 단백질의 아미노산 위치에서의 류신은 다염기 절단 부위를 제거하기 위해 알라닌으로 치환될 수 있다.
특정 실시예에서, 비-NDV APMV F 단백질의 변이체는 다염기 절단 부위를 함유하지 않는다. 특정 실시예에서, 비-NDV APMV F 단백질의 변이체는 비-NDV APMV F 단백질이 더 이상 다-염기 절단을 함유하지 않도록 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시예에서, 비-NDV APMV F 단백질의 변이체의 절단 부위의 원래 서열은, 예를 들어 하나 이상의 아미노산 치환에 의해 변형된다. 예를 들어, 비-NDV APMV F 단백질의 변이체는 NDV F 단백질의 아미노산 위치 289에 상응하는 (LaSota 균주 F 단백질에 의해 계수된) 비-NDV APMV F 단백질의 아미노산 위치에서 류신에 대한 알라닌의 아미노산 치환을 포함한다.
특정 실시예에서, 키메라 F 단백질은 다염기 절단 부위를 함유하지 않는다. 특정 실시예에서, 키메라 F 단백질은 비-NDV APMV F 단백질의 세포외 도메인이 더 이상 다-염기 절단을 함유하지 않도록 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시예에서, 비-NDV APMV F 단백질의 세포외 도메인의 절단 부위의 원래 서열은, 예를 들어 하나 이상의 아미노산 치환에 의해 변형된다. 예를 들어, 키메라 단백질은 NDV F 단백질의 아미노산 위치 289에 상응하는 (LaSota 균주 F 단백질에 의해 계수된) 비-NDV APMV F 단백질의 세포외 도메인의 아미노산 위치에서 류신에 대한 알라닌의 아미노산 치환을 포함한다.
특정 실시예에서, 비-NDV APMV F 단백질의 변이체는 비-NDV APMV F 단백질의 하나 이상의 기능을 보유한다.
특정 실시예에서, 비-NDV APMV F 단백질의 변이체는 비-NDV AMPV F 단백질과 적어도 75%, 적어도 80%, 또는 적어도 85% 동일하다. 일부 실시예에서, 비-NDV APMV F 단백질의 변이체는 비-NDV APMV F 단백질과 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 동일하다. 특정 실시예에서, 비-NDV APMV F 단백질의 변이체는 비-NDV AMPV F 단백질과 75% 내지 90%, 80% 내지 95%, 또는 90% 내지 99.5% 동일하다.
특정 실시예에서, 비-NDV APMV F 단백질의 변이체는 비-NDV APMV F 단백질에 비해 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 이상, 또는 2 내지 5, 2 내지 10, 5 내지 10, 5 내지 15, 5 내지 20, 10 내지 15, 또는 15 내지 20개 아미노산 돌연변이(즉, 첨가, 결실, 치환 또는 이들의 임의의 조합)를 함유한다. 일부 실시예에서, 비-NDV APMV F 단백질의 변이체는 다른 아미노산으로 치환된(예를 들어, 보존적으로 치환된) 비-NDV APMV F 단백질의 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개의 아미노산 잔기를 갖는 비-NDV APMV F 단백질의 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시예에서, 비-NDV APMV F 단백질의 변이체는 최대 약 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개의 보존적으로 치환된 아미노산을 갖는 비-NDV APMV F 단백질의 아미노산 서열을 포함한다. 보존적 아미노산 치환의 예는, 예를 들어, 하나의 부류의 아미노산을 동일한 부류의 다른 아미노산으로 대체하는 것을 포함한다. 특정 실시예에서, 보존적 치환은 폴리펩티드의 구조 또는 기능, 또는 둘 다를 변경시키지 않는다. 아미노산의 부류는 소수성(Met, Ala, Val, Leu, Ile), 중성 친수성(Cys, Ser, Thr), 산성(Asp, Glu), 염기성(Asn, Gln, His, Lys, Arg), 형태 파괴자(Gly, Pro), 및 방향족(Trp, Tyr, Phe)을 포함할 수 있다.
일부 실시예에서, 비-NDV APMV F 단백질의 변이체는 고, 중간 또는 전형적인 엄중도 혼성화 조건 하에서 비-NDV APMV F 단백질을 암호화하는 핵산 서열에 혼성화될 수 있는 핵산 서열에 의해 암호화된 폴리펩티드이다. 혼성화 조건은 당해 분야의 숙련자에게 공지되어 있다(미국 특허 출원 제2005/0048549호, 예를 들어, 단락 72 및 73 참조).
일부 실시예에서, 비-NDV APMV F 단백질은 도 3a에 도시된 APMV의 F 단백질이다. 일부 실시예에서, 비-NDV APMV F 단백질은 도 3a 또는 도 6a에 도시된 속의 구성원의 F 단백질이다. 특정 실시예에서, 비-NDV APMV F 단백질은 AMPV-2, AMPV-3, AMPV-4, AMPV-5, AMPV-6, AMPV-7, AMPV-8, AMPV-9, AMPV-10, AMPV-11, AMPV-12, AMPV-13, AMPV-14, AMPV-15, AMPV-16, AMPV-17, AMPV-18, AMPV-19, AMPV-20, 또는 AMPV-21의 F 단백질이다. 일부 실시예에서, 비-NDV APMV F 단백질은 APMV-2, 예컨대, 예를 들어, Chicken/California/Yucaipa/56(수탁 번호 EU338414)의 F 단백질이다. 특정 실시예에서, 비-NDV APMV F 단백질은 APMV-2 Yucaipa의 F 단백질이다. 다른 실시예에서, 비-NDV APMV F 단백질은 APMV-2 Yucaipa의 F 단백질이 아니다. 특정 실시예에서, 비-NDV APMV F 단백질은 APMV-3, 예컨대, 예를 들어, APMV3/Turkey/Wisconsin/68(수탁 번호 EU782025)의 F 단백질이다. 일부 실시예에서, 비-NDV APMV F 단백질은 APMV-4, 예컨대, 예를 들어, APMV4/duck/Hongkong/D3/75(수탁 번호 FJ177514), APMV4/Duck/China/G302/2012(수탁 번호 KC439346.1), APMV4/mallard/Belgium/15129/07(수탁 번호 JN571485), APMV4/Uriah_aalge/Russia/Tyuleniy_Island/115/2015(수탁 번호 KU601399.1) APMV-4/Egyptian goose/South Africa/N1468/2010 (수탁 번호 JX133079.1), 또는 APMV4/duck/Delaware/549227/2010 (수탁 번호 JX987283.1)의 F 단백질이다. 특정 실시예에서, 비-NDV APMV F 단백질은 APMV-5, 예컨대, 예를 들어, APMV-5 budgerigar/Kunitachi/74 (수탁 번호 GU206351) 또는 APMV5/budgerigar/Japan/TI/75 (수탁 번호 LC168750)의 F 단백질이다. 일부 실시예에서, 비-NDV APMV F 단백질은 APMV-6, 예컨대, 예를 들어, APMV-6 Goose/FarEast/4440/2003(수탁 번호 EF569970) 또는 APMV6/duck/HongKong/18/199/77(수탁 번호 EU622637)의 F 단백질이다. 특정 실시예에서, 비-NDV APMV F 단백질은 APMV-7, 예컨대, 예를 들어, APMV-7 dove/Tennessee/4/75(수탁 번호 FJ231524)의 F 단백질이다. 일부 실시예에서, 비-NDV APMV F 단백질은 APMV-8, 예컨대, 예를 들어, APMV-8 goose/Delaware/1053/76(수탁 번호 FJ215863)의 F 단백질이다. 특정 실시예에서, 비-NDV APMV F 단백질은 APMV-9, 예컨대, 예를 들어, APMV9/duck/New York/22/78(수탁 번호 EU910942)의 F 단백질이다. 일부 실시예에서, 비-NDV APMV F 단백질은 APMV-10, 예컨대, 예를 들어, APMV-10 penguin/Falkland Islands/324/2007(수탁 번호 HM147142 또는 NC_025349)의 F 단백질이다. 특정 실시예에서, 비-NDV APMV F 단백질은 APMV-11, 예컨대, 예를 들어, APMV-11 common_snipe/France/100212/2010(수탁 번호 JQ886184)의 F 단백질이다. 일부 실시예에서, 비-NDV APMV F 단백질은 APMV-12, 예컨대, 예를 들어 APMV12/Wigeon/Italy/3920_1/05(수탁 번호 KC333050)의 F 단백질이다. 일부 실시예에서, 비-NDV APMV F 단백질은 APMV-14, 예컨대, 예를 들어, APMV-14 duck/Japan/11OG0352/2011(수탁 번호 KX258200)의 F 단백질이다. 특정 실시예에서, 비-NDV APMV F 단백질은 APMV-15, 예컨대, 예를 들어, APMV-15 calidris_fuscicollis/Brazil/RS-1177/2012(수탁 번호 KX932454)의 F 단백질이다. 일부 실시예에서, 비-NDV APMV F 단백질은 APMV-17, 예컨대, 예를 들어, APMV17/Antarctica/107/13(수탁 번호 MK167211)의 F 단백질이다. 일부 실시예에서, 비-NDV APMV F 단백질은 APMV-20, 예컨대, 예를 들어, APMV-20 Gull/Kazakhstan/2014(수탁 번호 MF033136)의 F 단백질이다. 특정 실시예에서, 비-NDV APMV F 단백질은 APMV-21, 예컨대, 예를 들어, APMV21/pigeon/Taiwan/AHRI128/17(수탁 번호 MK67743)의 F 단백질이다.
특정 실시예에서, 비-NDV APMV F 단백질의 변이체는 AMPV-2, AMPV-3, AMPV-4, AMPV-5, AMPV-6, AMPV-7, AMPV-8, AMPV-9, AMPV-10, AMPV-11, AMPV-12, AMPV-13, AMPV-14, AMPV-15, AMPV-16, AMPV-17, AMPV-18, AMPV-19, AMPV-20, 또는 AMPV-21의 F 단백질의 변이체이다. 일부 실시예에서, 비-NDV APMV F 단백질의 변이체는 APMV-2, 예컨대, 예를 들어, Chicken/California/Yucaipa/56(수탁 번호 EU338414)의 F 단백질의 변이체이다. 특정 실시예에서, 비-NDV APMV F 단백질의 변이체는 APMV-3, 예컨대, 예를 들어, APMV3/Turkey/Wisconsin/68(수탁 번호 EU782025)의 F 단백질의 변이체이다. 일부 실시예에서, 비-NDV APMV F 단백질의 변이체는 APMV-4, 예컨대, 예를 들어, APMV4/duck/Hongkong/D3/75(수탁 번호 FJ177514), APMV4/Duck/China/G302/2012(수탁 번호 KC439346.1), APMV4/mallard/Belgium/15129/07(수탁 번호 JN571485), APMV4/Uriah_aalge/Russia/Tyuleniy_Island/115/2015(수탁 번호 KU601399.1) APMV-4/Egyptian goose/South Africa/N1468/2010 (수탁 번호 JX133079.1), 또는 APMV4/duck/Delaware/549227/2010 (수탁 번호 JX987283.1)의 F 단백질의 변이체이다. 특정 실시예에서, 비-NDV APMV F 단백질의 변이체는 APMV-5, 예컨대, 예를 들어, APMV-5 budgerigar/Kunitachi/74 (수탁 번호 GU206351) 또는 APMV5/budgerigar/Japan/TI/75 (수탁 번호 LC168750)의 F 단백질의 변이체이다. 일부 실시예에서, 비-NDV APMV F 단백질의 변이체는 APMV-6, 예컨대, 예를 들어, APMV-6 Goose/FarEast/4440/2003(수탁 번호 EF569970) 또는 APMV6/duck/HongKong/18/199/77(수탁 번호 EU622637)의 F 단백질의 변이체이다. 특정 실시예에서, 비-NDV APMV F 단백질의 변이체는 APMV-7, 예컨대, 예를 들어, APMV-7 dove/Tennessee/4/75(수탁 번호 FJ231524)의 F 단백질의 변이체이다. 일부 실시예에서, 비-NDV APMV F 단백질의 변이체는 APMV-8, 예컨대, 예를 들어, APMV-8 goose/Delaware/1053/76(수탁 번호 FJ215863)의 F 단백질의 변이체이다. 특정 실시예에서, 비-NDV APMV F 단백질의 변이체는 APMV-9, 예컨대, 예를 들어, APMV9/duck/New York/22/78(수탁 번호 EU910942)의 F 단백질의 변이체이다. 일부 실시예에서, 비-NDV APMV F 단백질의 변이체는 APMV-10, 예컨대, 예를 들어, APMV-10 penguin/Falkland Islands/324/2007(수탁 번호 HM147142 또는 NC_025349)의 F 단백질의 변이체이다. 특정 실시예에서, 비-NDV APMV F 단백질의 변이체는 APMV-11, 예컨대, 예를 들어, APMV-11 common_snipe/France/100212/2010(수탁 번호 JQ886184)의 F 단백질의 변이체이다. 일부 실시예에서, 비-NDV APMV F 단백질의 변이체는 APMV-12, 예컨대, 예를 들어 APMV12/Wigeon/Italy/3920_1/05(수탁 번호 KC333050)의 F 단백질의 변이체이다. 일부 실시예에서, 비-NDV APMV F 단백질의 변이체는 APMV-14, 예컨대, 예를 들어, APMV-14 duck/Japan/11OG0352/2011(수탁 번호 KX258200)의 F 단백질의 변이체이다. 특정 실시예에서, 비-NDV APMV F 단백질의 변이체는 APMV-15, 예컨대, 예를 들어, APMV-15 calidris_fuscicollis/Brazil/RS-1177/2012(수탁 번호 KX932454)의 F 단백질의 변이체이다. 일부 실시예에서, 비-NDV APMV F 단백질의 변이체는 APMV-17, 예컨대, 예를 들어, APMV17/Antarctica/107/13(수탁 번호 MK167211)의 F 단백질의 변이체이다. 일부 실시예에서, 비-NDV APMV F 단백질의 변이체는 APMV-20, 예컨대, 예를 들어, APMV-20 Gull/Kazakhstan/2014(수탁 번호 MF033136)의 F 단백질의 변이체이다. 특정 실시예에서, 비-NDV APMV F 단백질의 변이체는 APMV-21, 예컨대, 예를 들어, APMV21/pigeon/Taiwan/AHRI128/17(수탁 번호 MK67743)의 F 단백질의 변이체이다.
일부 실시예에서, 비-NDV APMV F 단백질은 NDV F 단백질과 65% 미만의 동일성을 갖는다. 일부 실시예에서, 비-NDV APMV F 단백질은 NDV F 단백질과 60% 미만의 동일성을 갖는다. 일부 실시예에서, 비-NDV APMV F 단백질은 NDV F 단백질과 50% 미만의 동일성을 갖는다. 일부 실시예에서, 비-NDV APMV F 단백질은 NDV F 단백질과 55% 미만의 동일성을 갖는다. 일부 실시예에서, 비-NDV APMV F 단백질은 NDV F 단백질과 50% 미만의 동일성을 갖는다. 일부 실시예에서, 비-NDV APMV F 단백질은 NDV F 단백질과 45% 미만의 동일성을 갖는다. 일부 실시예에서, 비-NDV APMV F 단백질은 NDV F 단백질과 40% 미만의 동일성을 갖는다. 일부 실시예에서, 비-NDV APMV F 단백질은 NDV F 단백질과 35% 미만의 동일성을 갖는다. 일부 실시예에서, 비-NDV APMV F 단백질은 NDV F 단백질과 적어도 20% 또는 적어도 25%의 동일성을 갖지만, 65% 미만, 60% 미만, 55% 미만, 50% 미만, 또는 45% 미만의 동일성을 갖는다. 일부 실시예에서, NDV F 단백질은 NDV LaSota HN 단백질이다.
특정 실시예에서, 비-NDV APMV HN 단백질 또는 이의 변이체는 NDV HN 단백질과 면역학적으로 구별된다. 특정 실시예에서, NDV HN 단백질에 대한 항체가 비-NDV APMV HN 단백질 또는 이의 변이체와 교차 반응하지 않는 경우, 비-NDV APMV HN 단백질 또는 이의 변이체는 NDV HN 단백질과 면역학적으로 구별된다. 일부 실시예에서, NDV HN 단백질에 대한 항체가 당해 분야의 숙련자에게 공지되거나 본원에서 설명되는 검정에서 비-NDV APMV HN 단백질 또는 이의 변이체보다 2배, 5배, 10배, 15배, 20배 또는 더 낮은 친화도로 변이체에 결합하면, 비-NDV APMV HN 단백질 또는 이의 변이체는 NDV HN 단백질과 면역학적으로 구별된다. 특정 실시예에서, 당해 분야의 숙련자에게 공지되거나 본원에서 설명되는 검정에서 NDV HN 단백질에 대한 항체가 NDV HN 단백질에 비해 0.5 log, 1 log, 1.5 log, 2 log, 2.5 log, 3 log 또는 더 낮은 친화도로 비-NDV APMV HN 단백질 또는 이의 변이체에 결합하는 경우, 비-NDV APMV HN 단백질 또는 이의 변이체는 NDV HN 단백질과 면역학적으로 구별된다. 특정 실시예에서, 항-NDV HN 항체가, Chumbe 등, 2017, Virology Journal 14: 232 및 Reynolds 등, 1999, Avian Dis. 143:564-71, Sun 등, 2020, EBioMedicine 62: 103132, 또는 Sun 등, 2020, Vaccines 8: 771, 또는 본원에서 설명되는 바와 같은, 바이러스 중성화 검정에 의해 평가되는 바와 같이 비-NDV APMV HN 단백질 또는 이의 변이체를 발현하는 NDV의 복제를 유의하게 억제하지 않는 경우, 비-NDV APMV HN 단백질 또는 이의 변이체는 NDV HN 단백질과 면역학적으로 구별된다. 특정 실시예에서, 항-NDV HN 항체가, 예를 들어, Chumbe 등, 2017, Virology Journal 14: 232 및 Reynolds 등, 1999, Avian Dis. 143:564-71, Sun 등, 2020, EBioMedicine 62: 103132, 또는 Sun 등, 2020, Vaccines 8: 771, 또는 본원에서 설명되는 바와 같은, 바이러스 중성화 검정에서, 약 0.5 log 미만, 약 1 log 미만, 약 1.5 log 미만, 또는 약 2 log 미만 만큼, 비-NDV APMV HN 단백질 또는 이의 변이체를 발현하는 NDV의 복제를 억제하는 경우, 비-NDV APMV HN 단백질 또는 이의 변이체는 NDV HN 단백질과 면역학적으로 구별된다.
일부 실시예에서, 비-NDV APMV HN 단백질은 아불라비리나 아과의 구성원으로부터의 HN 단백질이지만, NDV는 아니다. 일부 실시예에서, 비-NDV APMV HN 단백질은 아불라비리나 아과 및 메타아불라바이러스 속의 구성원으로부터의 HN 단백질이다. 일부 실시예에서, 비-NDV APMV HN 단백질은 아불라비리나 아과 및 파라아불라바이러스 속의 구성원으로부터의 HN 단백질이다. 일부 실시예에서, 비-NDV APMV HN 단백질은 아불라비리나 아과 및 오소아불라바이러스 속의 구성원으로부터의 HN 단백질이지만 NDV는 아니다.
특정 실시예에서, 키메라 HN 단백질은 NDV HN 단백질과 면역학적으로 구별된다. 특정 실시예에서, 키메라 HN 단백질은 NDV HN 단백질에 대한 항체가 키메라 HN 단백질과 교차 반응하지 않는 경우 NDV HN 단백질과 면역학적으로 구별된다. 일부 실시예에서, NDV HN 단백질에 대한 항체가 당해 분야의 숙련자에게 공지되거나 본원에서 설명되는 검정에서 NDV HN 단백질에 비해 2배, 5배, 10배, 15배, 20배 또는 더 낮은 친화도로 키메라 HN 단백질에 결합하는 경우, 키메라 HN 단백질은 NDV HN 단백질과 면역학적으로 구별된다. 특정 실시예에서, NDV HN 단백질에 대한 항체가 당해 분야의 숙련자에게 공지되거나 본원에서 설명되는 검정에서 NDV HN 단백질에 비해 0.5 log, 1 log, 1.5 log, 2 log, 2.5 log, 3 log 또는 더 낮은 친화도로 키메라 HN 단백질에 결합하는 경우, 키메라 HN 단백질은 NDV HN 단백질과 면역학적으로 구별된다. 특정 실시예에서, 항-NDV HN 항체가, Chumbe 등, 2017, Virology Journal 14: 232 및 Reynolds 등, 1999, Avian Dis. 143:564-71, Sun 등, 2020, EBioMedicine 62: 103132, 또는 Sun 등, 2020, Vaccines 8: 771, 또는 본원에서 설명되는 바와 같은, 바이러스 중성화 검정에 의해 평가되는 바와 같이 비-NDV APMV F 단백질 또는 이의 변이체를 발현하는 NDV의 복제를 유의하게 억제하지 않는 경우, 키메라 HN 단백질은 NDV HN 단백질과 면역학적으로 구별된다. 특정 실시예에서, 항-NDV HN 항체가, 예를 들어, Chumbe 등, 2017, Virology Journal 14: 232 및 Reynolds 등, 1999, Avian Dis. 143:564-71, Sun 등, 2020, EBioMedicine 62: 103132, 또는 Sun 등, 2020, Vaccines 8: 771, 또는 본원에서 설명되는 바와 같은, 바이러스 중성화 검정에서, 약 0.5 log 미만, 약 1 log 미만, 약 1.5 log 미만, 또는 약 2 log 미만 만큼, 비-NDV APMV HN 단백질 또는 이의 변이체를 발현하는 NDV의 복제를 억제하는 경우, 키메라 HN 단백질은 NDV HN 단백질과 면역학적으로 구별된다.
특정 실시예에서, 비-NDV APMV HN 단백질의 변이체는 비-NDV APMV HN 단백질의 하나 이상의 기능을 보유한다.
특정 실시예에서, 비-NDV APMV HN 단백질의 변이체는 비-NDV AMPV HN 단백질과 적어도 75%, 적어도 80%, 또는 적어도 85% 동일하다. 일부 실시예에서, 비-NDV HN 단백질의 변이체는 비-NDV APMV HN 단백질과 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 동일하다. 특정 실시예에서, 비-NDV APMV HN 단백질의 변이체는 비-NDV AMPV HN 단백질과 75% 내지 90%, 80% 내지 95%, 또는 90% 내지 99.5% 동일하다.
특정 실시예에서, 비-NDV APMV HN 단백질의 변이체는 비-NDV APMV HN 단백질에 비해 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 이상, 또는 2 내지 5, 2 내지 10, 5 내지 10, 5 내지 15, 5 내지 20, 10 내지 15, 또는 15 내지 20개의 아미노산 돌연변이(즉, 첨가, 결실, 치환 또는 이들의 임의의 조합)를 함유한다. 일부 실시예에서, 비-NDV APMV HN 단백질의 변이체는 다른 아미노산으로 치환된(예를 들어, 보존적으로 치환된) 비-NDV APMV HN 단백질의 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개의 아미노산 잔기를 갖는 비-NDV APMV HN 단백질의 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시예에서, 비-NDV APMV HN 단백질의 변이체는 최대 약 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개의 보존적으로 치환된 아미노산을 갖는 비-NDV APMV HN 단백질의 아미노산 서열을 포함한다. 보존적 아미노산 치환의 예는, 예를 들어, 하나의 부류의 아미노산을 동일한 부류의 다른 아미노산으로 대체하는 것을 포함한다. 특정 실시예에서, 보존적 치환은 폴리펩티드의 구조 또는 기능, 또는 둘 다를 변경시키지 않는다. 아미노산의 부류는 소수성(Met, Ala, Val, Leu, Ile), 중성 친수성(Cys, Ser, Thr), 산성(Asp, Glu), 염기성(Asn, Gln, His, Lys, Arg), 형태 파괴자(Gly, Pro), 및 방향족(Trp, Tyr, Phe)을 포함할 수 있다.
일부 실시예에서, 비-NDV APMV HN 단백질의 변이체는 고, 중간 또는 전형적인 엄중도 혼성화 조건 하에서 비-NDV APMV HN 단백질을 암호화하는 핵산 서열에 혼성화될 수 있는 핵산 서열에 의해 암호화된 폴리펩티드이다. 혼성화 조건은 당해 분야의 숙련자에게 공지되어 있다(미국 특허 출원 제2005/0048549호, 예를 들어, 단락 72 및 73 참조).
일부 실시예에서, 비-NDV APMV HN 단백질은 도 3b에 도시된 APMV의 HN 단백질이다. 일부 실시예에서, 비-NDV APMV HN 단백질은 도 3b 또는 도 6a에 도시된 속의 구성원의 F 단백질이다. 특정 실시예에서, 비-NDV APMV HN 단백질은 AMPV-2, AMPV-3, AMPV-4, AMPV-5, AMPV-6, AMPV-7, AMPV-8, AMPV-9, AMPV-10, AMPV-11, AMPV-12, AMPV-13, AMPV-14, AMPV-15, AMPV-16, AMPV-17, AMPV-18, AMPV-19, AMPV-20, 또는 AMPV-21의 HN 단백질이다. 일부 실시예에서, 비-NDV APMV HN 단백질은 APMV-2, 예컨대, 예를 들어, Chicken/California/Yucaipa/56(수탁 번호 EU338414)의 HN 단백질이다. 특정 실시예에서, 비-NDV APMV HN 단백질은 APMV-2 Yucaipa의 HN 단백질이다. 다른 실시예에서, 비-NDV APMV HN 단백질은 APMV-2 Yucaipa의 HN 단백질이 아니다. 특정 실시예에서, 비-NDV APMV HN 단백질은 APMV-3, 예컨대, 예를 들어, APMV3/Turkey/Wisconsin/68(수탁 번호 EU782025)의 HN 단백질이다. 일부 실시예에서, 비-NDV APMV HN 단백질은 APMV-4, 예컨대, 예를 들어, APMV4/duck/Hongkong/D3/75(수탁 번호 FJ177514), APMV4/Duck/China/G302/2012(수탁 번호 KC439346.1), APMV4/mallard/Belgium/15129/07(수탁 번호 JN571485), APMV4/Uriah_aalge/Russia/Tyuleniy_Island/115/2015(수탁 번호 KU601399.1) APMV-4/Egyptian goose/South Africa/N1468/2010 (수탁 번호 JX133079.1), 또는 APMV4/duck/Delaware/549227/2010 (수탁 번호 JX987283.1)의 HN 단백질이다. 특정 실시예에서, 비-NDV APMV HN 단백질은 APMV-5, 예컨대, 예를 들어, APMV-5 budgerigar/Kunitachi/74 (수탁 번호 GU206351) 또는 APMV5/budgerigar/Japan/TI/75 (수탁 번호 LC168750)의 HN 단백질이다. 일부 실시예에서, 비-NDV APMV HN 단백질은 APMV-6, 예컨대, 예를 들어, APMV-6 Goose/FarEast/4440/2003(수탁 번호 EF569970) 또는 APMV6/duck/HongKong/18/199/77(수탁 번호 EU622637)의 HN 단백질이다. 특정 실시예에서, 비-NDV APMV HN 단백질은 APMV-7, 예컨대, 예를 들어, APMV-7 dove/Tennessee/4/75(수탁 번호 FJ231524)의 HN 단백질이다. 일부 실시예에서, 비-NDV APMV HN 단백질은 APMV-8, 예컨대, 예를 들어, APMV-8 goose/Delaware/1053/76(수탁 번호 FJ215863)의 HN 단백질이다. 특정 실시예에서, 비-NDV APMV HN 단백질은 APMV-9, 예컨대, 예를 들어, APMV9/duck/New York/22/78(수탁 번호 EU910942)의 HN 단백질이다. 일부 실시예에서, 비-NDV APMV HN 단백질은 APMV-10, 예컨대, 예를 들어, APMV-10 penguin/Falkland Islands/324/2007(수탁 번호 HM147142 또는 NC_025349)의 HN 단백질이다. 특정 실시예에서, 비-NDV APMV HN 단백질은 APMV-11, 예컨대, 예를 들어, APMV-11 common_snipe/France/100212/2010(수탁 번호 JQ886184)의 HN 단백질이다. 일부 실시예에서, 비-NDV APMV HN 단백질은 APMV-12, 예컨대, 예를 들어, APMV12/Wigeon/Italy/3920_1/05(수탁 번호 KC333050)의 HN 단백질이다. 일부 실시예에서, 비-NDV APMV HN 단백질은 APMV-14, 예컨대, 예를 들어, APMV-14 duck/Japan/11OG0352/2011(수탁 번호 KX258200)의 HN 단백질이다. 특정 실시예에서, 비-NDV APMV HN 단백질은 APMV-15, 예컨대, 예를 들어, APMV-15 calidris_fuscicollis/Brazil/RS-1177/2012(수탁 번호 KX932454)의 HN 단백질이다. 일부 실시예에서, 비-NDV APMV HN 단백질은 APMV-17, 예컨대, 예를 들어, APMV17/Antarctica/107/13(수탁 번호 MK167211)의 HN 단백질이다. 일부 실시예에서, 비-NDV APMV HN 단백질은 APMV-20, 예컨대, 예를 들어, APMV-20 Gull/Kazakhstan/2014(수탁 번호 MF033136)의 HN 단백질이다. 특정 실시예에서, 비-NDV APMV HN 단백질은 APMV-21, 예컨대, 예를 들어, APMV21/pigeon/Taiwan/AHRI128/17(수탁 번호 MK67743)의 HN 단백질이다.
특정 실시예에서, 비-NDV APMV HN 단백질의 변이체는 AMPV-2, AMPV-3, AMPV-4, AMPV-5, AMPV-6, AMPV-7, AMPV-8, AMPV-9, AMPV-10, AMPV-11, AMPV-12, AMPV-13, AMPV-14, AMPV-15, AMPV-16, AMPV-17, AMPV-18, AMPV-19, AMPV-20, 또는 AMPV-21의 HN 단백질의 변이체이다. 일부 실시예에서, 비-NDV APMV HN 단백질의 변이체는 APMV-2, 예컨대, 예를 들어, Chicken/California/Yucaipa/56(수탁 번호 EU338414)의 HN 단백질의 변이체이다. 특정 실시예에서, 비-NDV APMV HN 단백질의 변이체는 APMV-3, 예컨대, 예를 들어, APMV3/Turkey/Wisconsin/68(수탁 번호 EU782025)의 HN 단백질의 변이체이다. 일부 실시예에서, 비-NDV APMV HN 단백질의 변이체는 APMV-4, 예컨대, 예를 들어, APMV4/duck/Hongkong/D3/75(수탁 번호 FJ177514), APMV4/Duck/China/G302/2012(수탁 번호 KC439346.1), APMV4/mallard/Belgium/15129/07(수탁 번호 JN571485), APMV4/Uriah_aalge/Russia/Tyuleniy_Island/115/2015(수탁 번호 KU601399.1) APMV-4/Egyptian goose/South Africa/N1468/2010 (수탁 번호 JX133079.1), 또는 APMV4/duck/Delaware/549227/2010 (수탁 번호 JX987283.1)의 HN 단백질의 변이체이다. 특정 실시예에서, 비-NDV APMV HN 단백질의 변이체는 APMV-5, 예컨대, 예를 들어, APMV-5 budgerigar/Kunitachi/74 (수탁 번호 GU206351) 또는 APMV5/budgerigar/Japan/TI/75 (수탁 번호 LC168750)의 HN 단백질의 변이체이다. 일부 실시예에서, 비-NDV APMV HN 단백질의 변이체는 APMV-6, 예컨대, 예를 들어, APMV-6 Goose/FarEast/4440/2003(수탁 번호 EF569970) 또는 APMV6/duck/HongKong/18/199/77(수탁 번호 EU622637)의 HN 단백질의 변이체이다. 특정 실시예에서, 비-NDV APMV HN 단백질의 변이체는 APMV-7, 예컨대, 예를 들어, APMV-7 dove/Tennessee/4/75(수탁 번호 FJ231524)의 HN 단백질의 변이체이다. 일부 실시예에서, 비-NDV APMV HN 단백질의 변이체는 APMV-8, 예컨대, 예를 들어, APMV-8 goose/Delaware/1053/76(수탁 번호 FJ215863)의 HN 단백질의 변이체이다. 특정 실시예에서, 비-NDV APMV HN 단백질의 변이체는 APMV-9, 예컨대, 예를 들어, APMV9/duck/New York/22/78(수탁 번호 EU910942)의 HN 단백질의 변이체이다. 일부 실시예에서, 비-NDV APMV HN 단백질의 변이체는 APMV-10, 예컨대, 예를 들어, APMV-10 penguin/Falkland Islands/324/2007(수탁 번호 HM147142 또는 NC_025349)의 HN 단백질의 변이체이다. 특정 실시예에서, 비-NDV APMV HN 단백질의 변이체는 APMV-11, 예컨대, 예를 들어, APMV-11 common_snipe/France/100212/2010(수탁 번호 JQ886184)의 HN 단백질의 변이체이다. 일부 실시예에서, 비-NDV APMV HN 단백질의 변이체는 APMV-12, 예컨대, 예를 들어 APMV12/Wigeon/Italy/3920_1/05(수탁 번호 KC333050)의 HN 단백질의 변이체이다. 일부 실시예에서, 비-NDV APMV HN 단백질의 변이체는 APMV-14, 예컨대, 예를 들어, APMV-14 duck/Japan/11OG0352/2011(수탁 번호 KX258200)의 HN 단백질의 변이체이다. 특정 실시예에서, 비-NDV APMV HN 단백질의 변이체는 APMV-15, 예컨대, 예를 들어, APMV-15 calidris_fuscicollis/Brazil/RS-1177/2012(수탁 번호 KX932454)의 HN 단백질의 변이체이다. 일부 실시예에서, 비-NDV APMV HN 단백질의 변이체는 APMV-17, 예컨대, 예를 들어, APMV17/Antarctica/107/13(수탁 번호 MK167211)의 HN 단백질의 변이체이다. 일부 실시예에서, 비-NDV APMV HN 단백질의 변이체는 APMV-20, 예컨대, 예를 들어, APMV-20 Gull/Kazakhstan/2014(수탁 번호 MF033136)의 HN 단백질의 변이체이다. 특정 실시예에서, 비-NDV APMV HN 단백질의 변이체는 APMV-21, 예컨대, 예를 들어, APMV21/pigeon/Taiwan/AHRI128/17(수탁 번호 MK67743)의 HN 단백질의 변이체이다.
일부 실시예에서, 비-NDV APMV HN 단백질은 NDV HN 단백질과 65% 미만의 동일성을 갖는다. 일부 실시예에서, 비-NDV APMV HN 단백질은 NDV HN 단백질과 60% 미만의 동일성을 갖는다. 일부 실시예에서, 비-NDV APMV HN 단백질은 NDV HN 단백질과 50% 미만의 동일성을 갖는다. 일부 실시예에서, 비-NDV APMV HN 단백질은 NDV HN 단백질과 55% 미만의 동일성을 갖는다. 일부 실시예에서, 비-NDV APMV HN 단백질은 NDV HN 단백질과 50% 미만의 동일성을 갖는다. 일부 실시예에서, 비-NDV APMV HN 단백질은 NDV HN 단백질과 45% 미만의 동일성을 갖는다. 일부 실시예에서, 비-NDV APMV HN 단백질은 NDV HN 단백질과 40% 미만의 동일성을 갖는다. 일부 실시예에서, 비-NDV APMV HN 단백질은 NDV HN 단백질과 35% 미만의 동일성을 갖는다. 일부 실시예에서, 비-NDV APMV HN 단백질은 NDV HN 단백질과 적어도 20% 또는 적어도 25% 동일성을 갖지만 65% 미만, 60% 미만, 55% 미만, 50% 미만, 또는 45% 미만 동일성을 갖는다. 일부 실시예에서, NDV HN 단백질은 NDV LaSota HN 단백질이다.
특정 실시예에서, NDV HN 단백질 및 NDV F 단백질의 코딩 서열이 서열번호 1에 제시된 코딩 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열로 대체된 뉴캐슬병 바이러스 게놈의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 서열이 본원에 제공된다. 특정 실시예에서, NDV HN 단백질 및 NDV F 단백질의 코딩 서열이 서열번호 2에 제시된 코딩 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열로 대체된 뉴캐슬병 바이러스 게놈의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 서열이 본원에 제공된다. 특정 실시예에서, NDV HN 단백질 및 NDV F 단백질의 코딩 서열이 서열번호 3에 제시된 코딩 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열로 대체된 뉴캐슬병 바이러스 게놈의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 서열이 본원에 제공된다. 특정 실시예에서, NDV HN 단백질 및 NDV F 단백질의 코딩 서열이 서열번호 4에 제시된 코딩 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열로 대체된 뉴캐슬병 바이러스 게놈의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 서열이 본원에 제공된다. 특정 실시예에서, NDV HN 단백질 및 NDV F 단백질의 코딩 서열이 서열번호 5에 제시된 코딩 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열로 대체된 뉴캐슬병 바이러스 게놈의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 서열이 본원에 제공된다. 특정 실시예에서, NDV HN 단백질 및 NDV F 단백질의 코딩 서열이 서열번호 6에 제시된 코딩 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열로 대체된 뉴캐슬병 바이러스 게놈의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 서열이 본원에 제공된다. 특정 실시예에서, NDV HN 단백질 및 NDV F 단백질의 코딩 서열이 서열번호 7에 제시된 코딩 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열로 대체된 뉴캐슬병 바이러스 게놈의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 서열이 본원에 제공된다. 특정 실시예에서, NDV HN 단백질 및 NDV F 단백질의 코딩 서열이 서열번호 8에 제시된 코딩 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열로 대체된 뉴캐슬병 바이러스 게놈의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 서열이 본원에 제공된다. 특정 실시예에서, NDV HN 단백질 및 NDV F 단백질의 코딩 서열이 서열번호 9에 제시된 코딩 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열로 대체된 뉴캐슬병 바이러스 게놈의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 서열이 본원에 제공된다. 특정 실시예에서, NDV HN 단백질 및 NDV F 단백질의 코딩 서열이 서열번호 10에 제시된 코딩 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열로 대체된 뉴캐슬병 바이러스 게놈의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 서열이 본원에 제공된다. 특정 실시예에서, NDV HN 단백질 및 NDV F 단백질의 코딩 서열이 서열번호 11에 제시된 코딩 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열로 대체된 뉴캐슬병 바이러스 게놈의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 서열이 본원에 제공된다. 특정 실시예에서, NDV HN 단백질 및 NDV F 단백질의 코딩 서열이 서열번호 12에 제시된 코딩 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열로 대체된 뉴캐슬병 바이러스 게놈의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 서열이 본원에 제공된다. 특정 실시예에서, NDV HN 단백질 및 NDV F 단백질의 코딩 서열이 서열번호 13에 제시된 코딩 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열로 대체된 뉴캐슬병 바이러스 게놈의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 서열이 본원에 제공된다. 특정 실시예에서, NDV HN 단백질 및 NDV F 단백질의 코딩 서열이 서열번호 14에 제시된 코딩 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열로 대체된 뉴캐슬병 바이러스 게놈의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 서열이 본원에 제공된다. 특정 실시예에서, NDV 게놈은 대체된 NDV HN 및 F 단백질 코딩 서열뿐만 아니라 (1) NDV 뉴클레오캡시드(N) 단백질을 암호화하는 전사 유닛, (2) NDV 인단백질(P)을 암호화하는 전사 유닛, (3) NDV 매트릭스(M) 단백질을 암호화하는 전사 유닛, 및 (4) NDV 대형 중합효소(L)를 암호화하는 전사 유닛을 포함한다.
특정 실시예에서, NDV HN 단백질 및 NDV F 단백질의 코딩 서열이 서열번호 1에 제시된 코딩 서열과 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 98% 동일한 코딩 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열로 대체된 뉴캐슬병 바이러스 게놈의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 서열이 본원에 제공된다. 특정 실시예에서, NDV HN 단백질 및 NDV F 단백질의 코딩 서열이 서열번호 2에 제시된 코딩 서열과 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 98% 동일한 코딩 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열로 대체된 뉴캐슬병 바이러스 게놈의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 서열이 본원에 제공된다. 특정 실시예에서, NDV HN 단백질 및 NDV F 단백질의 코딩 서열이 서열번호 3에 제시된 코딩 서열과 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 98% 동일한 코딩 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열로 대체된 뉴캐슬병 바이러스 게놈의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 서열이 본원에 제공된다. 특정 실시예에서, NDV HN 단백질 및 NDV F 단백질의 코딩 서열이 서열번호 4에 제시된 코딩 서열과 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 98% 동일한 코딩 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열로 대체된 뉴캐슬병 바이러스 게놈의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 서열이 본원에 제공된다. 특정 실시예에서, NDV HN 단백질 및 NDV F 단백질의 코딩 서열이 서열번호 5에 제시된 코딩 서열과 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 98% 동일한 코딩 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열로 대체된 뉴캐슬병 바이러스 게놈의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 서열이 본원에 제공된다. 특정 실시예에서, NDV HN 단백질 및 NDV F 단백질의 코딩 서열이 서열번호 6에 제시된 코딩 서열과 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 98% 동일한 코딩 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열로 대체된 뉴캐슬병 바이러스 게놈의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 서열이 본원에 제공된다. 특정 실시예에서, NDV HN 단백질 및 NDV F 단백질의 코딩 서열이 서열번호 7에 제시된 코딩 서열과 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 98% 동일한 코딩 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열로 대체된 뉴캐슬병 바이러스 게놈의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 서열이 본원에 제공된다. 특정 실시예에서, NDV HN 단백질 및 NDV F 단백질의 코딩 서열이 서열번호 8에 제시된 코딩 서열과 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 98% 동일한 코딩 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열로 대체된 뉴캐슬병 바이러스 게놈의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 서열이 본원에 제공된다. 특정 실시예에서, NDV HN 단백질 및 NDV F 단백질의 코딩 서열이 서열번호 9에 제시된 코딩 서열과 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 98% 동일한 코딩 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열로 대체된 뉴캐슬병 바이러스 게놈의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 서열이 본원에 제공된다. 특정 실시예에서, NDV HN 단백질 및 NDV F 단백질의 코딩 서열이 서열번호 10에 제시된 코딩 서열과 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 98% 동일한 코딩 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열로 대체된 뉴캐슬병 바이러스 게놈의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 서열이 본원에 제공된다. 특정 실시예에서, NDV HN 단백질 및 NDV F 단백질의 코딩 서열이 서열번호 11에 제시된 코딩 서열과 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 98% 동일한 코딩 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열로 대체된 뉴캐슬병 바이러스 게놈의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 서열이 본원에 제공된다. 특정 실시예에서, NDV HN 단백질 및 NDV F 단백질의 코딩 서열이 서열번호 12에 제시된 코딩 서열과 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 98% 동일한 코딩 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열로 대체된 뉴캐슬병 바이러스 게놈의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 서열이 본원에 제공된다. 특정 실시예에서, NDV HN 단백질 및 NDV F 단백질의 코딩 서열이 서열번호 13에 제시된 코딩 서열과 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 98% 동일한 코딩 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열로 대체된 뉴캐슬병 바이러스 게놈의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 서열이 본원에 제공된다. 특정 실시예에서, NDV HN 단백질 및 NDV F 단백질의 코딩 서열이 서열번호 14에 제시된 코딩 서열과 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 98% 동일한 코딩 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열로 대체된 뉴캐슬병 바이러스 게놈의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 서열이 본원에 제공된다. 특정 실시예에서, NDV 게놈은 대체된 NDV HN 및 F 단백질 코딩 서열뿐만 아니라 (1) NDV 뉴클레오캡시드(N) 단백질을 암호화하는 전사 유닛, (2) NDV 인단백질(P)을 암호화하는 전사 유닛, (3) NDV 매트릭스(M) 단백질을 암호화하는 전사 유닛, 및 (4) NDV 대형 중합효소(L)를 암호화하는 전사 유닛을 포함한다.
또 다른 특정 실시예에서, NDV HN 단백질 및 NDV F 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열이 서열번호 1에 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열로 대체된 뉴캐슬병 바이러스 게놈의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 서열이 본원에 제공된다. 또 다른 특정 실시예에서, NDV HN 단백질 및 NDV F 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열이 서열번호 2에 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열로 대체된 뉴캐슬병 바이러스 게놈의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 서열이 본원에 제공된다. 또 다른 특정 실시예에서, NDV HN 단백질 및 NDV F 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열이 서열번호 3에 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열로 대체된 뉴캐슬병 바이러스 게놈의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 서열이 본원에 제공된다. 또 다른 특정 실시예에서, NDV HN 단백질 및 NDV F 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열이 서열번호 4에 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열로 대체된 뉴캐슬병 바이러스 게놈의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 서열이 본원에 제공된다. 또 다른 특정 실시예에서, NDV HN 단백질 및 NDV F 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열이 서열번호 5에 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열로 대체된 뉴캐슬병 바이러스 게놈의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 서열이 본원에 제공된다. 또 다른 특정 실시예에서, NDV HN 단백질 및 NDV F 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열이 서열번호 6에 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열로 대체된 뉴캐슬병 바이러스 게놈의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 서열이 본원에 제공된다. 또 다른 특정 실시예에서, NDV HN 단백질 및 NDV F 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열이 서열번호 7에 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열로 대체된 뉴캐슬병 바이러스 게놈의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 서열이 본원에 제공된다. 또 다른 특정 실시예에서, NDV HN 단백질 및 NDV F 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열이 서열번호 8에 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열로 대체된 뉴캐슬병 바이러스 게놈의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 서열이 본원에 제공된다. 또 다른 특정 실시예에서, NDV HN 단백질 및 NDV F 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열이 서열번호 9에 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열로 대체된 뉴캐슬병 바이러스 게놈의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 서열이 본원에 제공된다. 또 다른 특정 실시예에서, NDV HN 단백질 및 NDV F 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열이 서열번호 10에 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열로 대체된 뉴캐슬병 바이러스 게놈의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 서열이 본원에 제공된다. 또 다른 특정 실시예에서, NDV HN 단백질 및 NDV F 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열이 서열번호 11에 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열로 대체된 뉴캐슬병 바이러스 게놈의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 서열이 본원에 제공된다. 또 다른 특정 실시예에서, NDV HN 단백질 및 NDV F 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열이 서열번호 12에 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열로 대체된 뉴캐슬병 바이러스 게놈의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 서열이 본원에 제공된다. 또 다른 특정 실시예에서, NDV HN 단백질 및 NDV F 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열이 서열번호 13에 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열로 대체된 뉴캐슬병 바이러스 게놈의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 서열이 본원에 제공된다. 또 다른 특정 실시예에서, NDV HN 단백질 및 NDV F 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열이 서열번호 14에 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열로 대체된 뉴캐슬병 바이러스 게놈의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 서열이 본원에 제공된다. 특정 실시예에서, NDV 게놈은 대체된 NDV HN 및 F 단백질 코딩 서열뿐만 아니라 (1) NDV 뉴클레오캡시드(N) 단백질을 암호화하는 전사 유닛, (2) NDV 인단백질(P)을 암호화하는 전사 유닛, (3) NDV 매트릭스(M) 단백질을 암호화하는 전사 유닛, 및 (4) NDV 대형 중합효소(L)를 암호화하는 전사 유닛을 포함한다.
당해 분야의 숙련자라면 NDV 게놈 RNA 서열이 NDV 게놈을 암호화하는 cDNA 서열의 음-센스에 상응하는 RNA 서열임을 이해할 것이다. 따라서, 뉴클레오티드 서열을 그의 역상보체 서열로 변환하는 임의의 프로그램을 사용하여 NDV 게놈을 암호화하는 cDNA 서열을 게놈 RNA 서열로 변환할 수 있다(예를 들어, www.bioinformatics.org/sms/rev_comp.html, www.fr33.net/seqedit.php, 및 DNAStar 참조). 따라서, 아래 표 1 및 표 3에 제공된 뉴클레오티드 서열은 당해 분야의 숙련자에 의해 NDV 게놈의 음-센스 RNA 서열로 쉽게 변환될 수 있다. 일부 실시예에서, NDV 게놈의 뉴클레오티드 서열은 당해 분야의 숙련자에게 공지된 임의의 균주의 NDV이다. 예시적인 균주는, 예를 들어, 섹션 5.1.2를 참조한다. 특정 실시예에서, NDV 게놈의 뉴클레오티드 서열은 LaSota 균주이다. 특정 실시예에서, NDV 게놈의 뉴클레오티드 서열은 약독형 균주(lentogenic strain)이다. 일부 실시예에서, NDV 게놈의 뉴클레오티드 서열은 중간독형 균주(mesogenic strain)이다. 특정 실시예에서, NDV 게놈의 뉴클레오티드 서열은 강독형 균주(velogenic)이다. NDV 게놈의 뉴클레오티드 서열은 cDNA 서열 또는 RNA 서열(예를 들어, 음 센스 RNA 또는 양 센스 RNA)일 수 있다.
일부 실시예에서, 서열번호 44의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 서열이 본원에 제공된다. 일부 실시예에서, GFP 코딩 서열이 없는 서열번호 44의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 서열이 본원에 제공된다. 일부 실시예에서, 서열번호 44의 뉴클레오티드 서열과 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 서열이 본원에 제공된다. 일부 실시예에서, GFP 코딩 서열이 없는 서열번호 44의 뉴클레오티드 서열과 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 서열이 본원에 제공된다. 일부 실시예에서, GFP 코딩 서열이 없는 서열번호 44의 뉴클레오티드 서열 및 항원과 같은 이종 서열을 암호화하는 이식유전자를 포함하는 핵산 서열이 본원에 제공된다.
일부 실시예에서, 서열번호 45의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 서열이 본원에 제공된다. 일부 실시예에서, GFP 코딩 서열이 없는 서열번호 45의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 서열이 본원에 제공된다. 일부 실시예에서, 서열번호 45의 뉴클레오티드 서열과 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 서열이 본원에 제공된다. 일부 실시예에서, GFP 코딩 서열이 없는 서열번호 45의 뉴클레오티드 서열과 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 서열이 본원에 제공된다. 일부 실시예에서, GFP 코딩 서열이 없는 서열번호 45의 뉴클레오티드 서열 및 항원과 같은 이종 서열을 암호화하는 이식유전자를 포함하는 핵산 서열이 본원에 제공된다.
일부 실시예에서, 본원에서 설명되는 핵산 서열 또는 뉴클레오티드 서열은 코돈 최적화된 것이다. 코돈 최적화 정보 및 기술에 대한 설명은 섹션 5.1.4를 참조한다.
특정 실시예에서, 본원에서 설명되는 핵산 서열은 비-NDV APMV HN 단백질 또는 이의 변이체 이외의 이종 단백질을 암호화하는 이종 서열을 포함하지 않는다. 특정 실시예에서, 본원에서 설명되는 핵산 서열은 비-NDV APMV F 단백질 또는 이의 변이체 이외의 이종 단백질을 암호화하는 이종 서열을 포함하지 않는다. 특정 실시예에서, 본원에서 설명되는 핵산 서열은 비-NDV APMV HN 단백질 또는 이의 변이체 및 비-NDV APMV F 단백질 또는 이의 변이체 이외의 이종 단백질을 암호화하는 이종 서열을 포함하지 않는다.
특정 실시예에서, 본원에서 설명되는 핵산 서열은 이종 서열(예를 들어, 이종 단백질)을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 이식유전자를 추가로 포함한다. 특정 실시예에서, 본원에서 설명되는 핵산 서열은 항원을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 이식유전자를 추가로 포함한다. 본원에서 설명되는 핵산 서열에 통합될 수 있는 이식유전자에 대한 설명은 섹션 5.1.3을 참조한다.
특정 실시예에서, 본원에서 설명되는 핵산 서열은 본원에서 설명되는 재조합 NDV의 생산에 사용된다. 특정 실시예에서, 본원에서 설명되는 핵산 서열은 본원에서 설명되는 재조합 NDV의 일부이다.
특정 실시예에서, 본원에서 설명되는 핵산 서열 또는 뉴클레오티드 서열은 재조합 핵산 서열 또는 재조합 뉴클레오티드 서열이다. 특정 실시예에서, 본원에서 설명되는 뉴클레오티드 서열 또는 핵산 서열은 DNA 분자(예를 들어, cDNA), RNA 분자, 또는 DNA와 RNA 분자의 조합일 수 있다. 일부 실시예에서, 본원에서 설명되는 뉴클레오티드 서열 또는 핵산 서열은 DNA 또는 RNA 분자의 유사체를 포함할 수 있다. 이러한 유사체는, 예를 들어 이노신, 메틸시토신, 슈도우리딘, 또는 트리틸화 염기를 포함하지만 이에 한정되지 않는, 뉴클레오티드 유사체를 사용하여 생성될 수 있다. 이러한 유사체는 또한, 예를 들어 뉴클레아제 내성 또는 세포막을 가로지르는 능력 증가와 같은 분자에 유익한 속성을 제공하는 변형된 백본을 포함하는 DNA 또는 RNA 분자를 포함할 수 있다. 핵산 또는 뉴클레오티드 서열은 단일 가닥, 이중 가닥일 수 있고, 단일 가닥 및 이중 가닥 부분 둘 다를 함유할 수 있고, 삼중 가닥 부분을 함유할 수 있다. 특정 실시예에서, 본원에서 설명되는 뉴클레오티드 서열 또는 핵산 서열은 음-센스 단일 가닥 RNA이다. 또 다른 특정 실시예에서, 본원에서 설명되는 뉴클레오티드 서열 또는 핵산 서열은 양-센스 단일 가닥 RNA이다. 또 다른 특정 실시예에서, 본원에서 설명되는 뉴클레오티드 서열 또는 핵산 서열은 cDNA이다.
특정 실시예에서, 핵산 서열이 단리된다. 특정 실시예에서, "단리된" 핵산 서열은 핵산의 천연 공급원에 존재하는 다른 핵산 분자로부터 분리되는 핵산 분자를 지칭한다. 즉, 단리된 핵산 서열은 자연에서는 이와 연관되지 않은 이종 핵산을 포함할 수 있다. 다른 실시예에서, cDNA 또는 RNA 서열과 같은 "단리된" 핵산 서열은 재조합 기술에 의해 생산될 때 다른 세포 물질 또는 배양 배지가 실질적으로 없거나, 화학적으로 합성될 때 화학적 전구체 또는 다른 화학물질이 실질적으로 없을 수 있다. 용어 "세포 물질이 실질적으로 없는"은 핵산 서열이 단리되거나 재조합적으로 생산되는 세포의 세포 성분으로부터 핵산 서열이 분리되는 핵산 서열의 제제를 포함한다. 따라서, 세포 물질이 실질적으로 없는 핵산 서열은 (건조 중량 기준으로) 약 30%, 20%, 10%, 또는 5% 미만의 다른 핵산을 갖는 핵산 서열의 제제를 포함한다. 용어 "배양 배지가 실질적으로 없는"은 배양 배지가 제제 부피의 약 50%, 20%, 10%, 또는 5% 미만을 나타내는 핵산 서열의 제제를 포함한다. 용어 "화학 전구체 또는 다른 화학물질이 실질적으로 없는"은 핵산 서열의 합성에 관여하는 화학물질 전구체 또는 다른 화학물질로부터 핵산 서열이 분리되는 제제를 포함한다. 특정 실시예에서, 핵산 서열의 이러한 제제는 관심 핵산 서열 이외의 화학적 전구체 또는 화합물의 약 50%, 30%, 20%, 10%, 5%(건조 중량 기준) 미만을 갖는다.
5.1.2
NDV 백본
임의의 NDV 유형 또는 균주는 NDV F 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열 및/또는 NDV HN 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열이 비-NDV APMV F 단백질 코딩 서열 또는 이의 변이체 및/또는 비-NDV HN 코딩 서열 또는 이의 변이체로 각각 대체되는 "백본"으로서 기능할 수 있다. 또한, 임의의 NDV 유형 또는 균주는 NDV F 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열 및/또는 NDV HN 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열이 키메라 F 단백질 코딩 서열 및/또는 키메라 HN 코딩 서열로 각각 대체되는 "백본"으로서 기능할 수 있다. 예를 들어, NDV는 자연 발생 균주, 변이체, 돌연변이체, 돌연변이 바이러스, 및/또는 유전자 조작 바이러스일 수 있다. 특정 실시예에서, NDV 백본은 약독형 NDV이다. 다른 특정 실시예에서, NDV 백본은 균주 LaSota이다. NDV 백본으로서 사용될 수 있는 NDV 균주의 다른 예는 NDV Fuller, NDV Ulster 균주 또는 NDV Hitchner B1 균주를 포함한다. 일부 실시예에서, NDV Hitchner B1 균주 이외의 약독형 균주가 백본으로서 사용된다. 특정 실시예에서, NDV 백본은 자연 발생 균주이다. 특정 실시예에서, NDV 백본은 용균 균주이다. 다른 실시예에서, NDV 백본은 비-용균 균주이다. 특정 실시예에서, NDV 백본은 약독형 균주이다. 일부 실시예에서, NDV 백본은 중간독형 균주이다. 다른 실시예에서, NDV 백본은 강독형 균주이다. NDV 균주의 특정 예는 73-T 균주, NDV HUJ 균주, Ulster 균주(예를 들어, 수탁 번호 U25837 참조), Fuller 균주, MTH-68 균주, 이탈리엔 균주(예를 들어, 수탁 번호 EU293914 참조), Hickman 균주(예를 들어, 수탁 번호 AF309418 참조), PV701 균주, Hitchner B1 균주(예를 들어, 수탁 번호 AF309418 또는 NC_002617 참조), La Sota 균주(예를 들어, 수탁 번호 AY845400, AF07761.1 및 JF950510.1 및 GI 번호 56799463 참조), YG97 균주(예를 들어, 수탁 번호 AY351959 또는 AY390310 참조), MET95 균주(예를 들어, 수탁 번호 AY143159 참조), Roakin 균주(예를 들어, 수탁 번호 AF124443 참조), 및 F48E9 균주(예를 들어, 수탁 번호 AF163440 및 U25837 참조)를 포함하지만, 이들에만 한정되는 것은 아니다. 특정 실시예에서, NDV 백본은 Hitchner B1 균주이다. 다른 실시예에서, NDV 백본은 수탁 번호 AF309418 또는 NC_002617에 의해 식별된 B1 균주이다. 다른 특정 실시예에서, NDV 백본은 La Sota 균주이다. 특정 실시예에서, La Sota 게놈의 뉴클레오티드 서열은 서열번호 15에 제시된 cDNA 서열의 음-센스에 상응하는 RNA 서열을 포함한다. 다른 실시예에서, NDV 백본은 수탁 번호 AY845400, AF07761.1 또는 JF950510.1에 의해 식별된 LaSota 균주이다.
당해 분야의 숙련자라면 NDV 게놈 RNA 서열이 NDV 게놈을 암호화하는 cDNA 서열의 음-센스에 상응하는 RNA 서열임을 이해할 것이다. 따라서, 뉴클레오티드 서열을 그의 역상보체 서열로 변환하는 임의의 프로그램을 사용하여 NDV 게놈을 암호화하는 cDNA 서열을 게놈 RNA 서열로 변환할 수 있다(예를 들어, www.bioinformatics.org/sms/rev_comp.html, www.fr33.net/seqedit.php, 및 DNAStar 참조).
특정 실시예에서, NDV 백본은 당해 분야의 숙련자에게 공지된 기술에 의해 평가했을 때 조류에서 병원성이 아니다. 특정 실시예에서, NDV 백본은 바이러스를 1-일령의 이두근에게 두개내 주사하여 평가했을 때 병원성이 아니며, 8일 동안 점수를 매긴 질병 발생 및 사망에 의해 평가될 때 병원성이 아니다. 일부 실시예에서, NDV 백본은 0.7 미만, 0.6 미만, 0.5 미만, 0.4 미만, 0.3 미만, 0.2 미만 또는 0.1 미만의 두개내 병원성 지수를 갖는다. 특정 실시예에서, NDV 백본은 0의 두개내 병원성 지수를 갖는다. 이러한 검정에 대한 설명은, 예를 들어, "뉴캐슬병(뉴캐슬병 바이러스 감염)"이라는 명칭의 OIE Terrestrial Manual 2012, Chapter 2.3.14을 참조하고, 이는 다음의 웹사이트 www.oie.int/fileadmin/Home/eng/Health_standards/tahm/2.03.14_NEWCASTLE_DIS.pdf 찾을 수 있으며, 이는 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다.
특정 실시예에서, NDV 백본은 당해 분야의 숙련자에게 공지된 기술에 의해 평가했을 때 조류에서 병원성으로 간주되지 않도록 유전적으로 조작된 중간독형 균주이다. 특정 실시예에서, NDV 백본은 당해 분야의 숙련자에게 공지된 기술에 의해 평가했을 때 조류에서 병원성으로 간주되지 않도록 유전적으로 조작된 약독형 균주이다.
바람직한 실시예에서, NDV 백본은 인간 또는 소에서 비병원성이다. 바람직한 실시예에서, NDV 백본은 인간, 소 및 조류에서 비병원성이다. 특정 실시예에서, NDV 백본은 NDV가 적어도 부분적으로, 감염성으로 유지되고 생체 내에서 복제될 수 있도록 약독화되지만, 단지 낮은 역가를 생성하여 비병원성인 준임상적 수준의 감염을 초래한다(예를 들어, Khattar 등, 2009, J. Virol. 83:7779-7782 참조). 이러한 약독화된 NDV는 면역원, 예를 들어 생백신으로서 작용하기 위해 바이러스가 대상체에게 투여되는 실시예에 특히 적합할 수 있다. 바이러스는 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 약독화될 수 있다. 특정 실시예에서, NDV 게놈은 약독화 바이러스의 감염 및 복제에 필요한 서열을 포함하여 자손이 생산되고 감염 수준이 준임상적이다.
5.1.3
이식유전자(TRANSGENE)
특정 실시예에서, 항원을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 이식유전자는 본원에서 설명되는 핵산 서열(예를 들어, 섹션 5.1.1 또는 섹션 6)에 혼입되며, NDV F 단백질 코딩 서열 및/또는 NDV HN 단백질 코딩 서열이 본원에서 설명되는 바와 같이 대체된 NDV 게놈의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 이식유전자는 NDV F 단백질 코딩 서열 및/또는 NDV HN 단백질 코딩 서열이 본원에서 설명되는 바와 같이 대체된 임의의 NDV 유형 또는 균주(예를 들어, NDV LaSota 균주)의 NDV 게놈의 뉴클레오티드 서열에 삽입될 수 있다. 당해 분야의 숙련자는 항원의 서열 정보를 사용하여 NDV F 단백질 코딩 서열 및/또는 NDV HN 단백질 코딩 서열이 본원에서 설명되는 바와 같이 대체된 임의의 NDV 유형 또는 균주의 NDV 게놈의 뉴클레오티드 서열에 혼입하기 위한 이식유전자를 생산할 수 있을 것이다. 핵산 코드의 퇴행성을 고려하면, 동일한 항원을 암호화할 수 있는 다수의 상이한 핵산 서열이 존재한다. 특정 실시예에서, 항원을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 이식 유전자는 코돈 최적화된 것이다. 특정 실시예에서, 항원의 코딩 서열은 코돈 최적화된 것이다. 코돈 최적화에 관한 논의는, 예를 들어, 아래 섹션 5.1.4를 참조한다. 항원을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 이식유전자는 임의의 2개의 NDV 전사 유닛 사이에 (예를 들어, NDV P와 M 전사 유닛 사이에, 또는 HN과 L 전사 유닛 사이에) 혼입될 수 있다. NDV의 게놈에 혼입되는 본원에서 설명되는 이식유전자는 본원에서 설명되는 재조합 NDV로 감염된 세포(들)에 의해 이식유전자에 의해 암호화된 항원의 발현을 초래한다.
다른 실시예에서, 키메라 항원을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 이식유전자가 본원에 기술되며, 여기서 키메라 항원은 항원 세포외 도메인 및 NDV F 단백질 막관통 및 세포질 도메인을 포함한다. 즉, NDV F 단백질 막관통 및 세포질 도메인은 키메라 단백질이 항원 막관통 및 세포질 도메인을 포함하지 않도록 항원의 막관통 및 세포질 도메인을 대체한다. 특정 실시예에서, 항원의 막관통 도메인의 1개, 2개 또는 그 이상의 아미노산 잔기이지만 항원의 막관통 도메인의 10개 미만의 아미노산 잔기는 키메라 항원의 일부이다. 항원 및 NDV F 단백질의 세포외 도메인, 막관통 및 세포질 도메인은 당해 분야의 숙련자에게 공지된 기술을 사용하여 결정될 수 있다. 예를 들어, 공개된 정보, GenBank 또는 VIPR 바이러스 병원균 웹사이트(www.viprbrc.org), DTU 생물정보학 도메인 웹사이트(www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)와 같은 웹사이트 또는 막관통 도메인을 결정하는 데 이용 가능한 프로그램이 항원 및 NDV F 단백질의 세포외 도메인, 막관통 및 세포질 도메인을 결정하는 데 사용될 수 있다. 키메라 항원을 생산하기 위한 방법은, 예를 들어 Park 등, 2006, PNAS May 23, 2006 103 (21) 8203-8208, 국제 특허 출원 번호 WO2007/064802, 및 미국 특허 제9,387,242 B2호를 참조한다. 특정 실시예에서, 키메라 항원을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 이식유전자가 본원에 기술되며, 여기서 키메라 항원은 클래스 I 단백질 항원의 세포외 도메인 및 NDV F 단백질 막관통 및 세포질 도메인을 포함한다.
다른 실시예에서, 키메라 항원을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 이식유전자가 본원에 기술되며, 여기서 키메라 항원은 항원 세포외 도메인 및 NDV HN 단백질 막관통 및 세포질 도메인을 포함한다. 즉, NDV HN 단백질 막관통 및 세포질 도메인은 키메라 단백질이 항원 막관통 및 세포질 도메인을 포함하지 않도록 항원의 막관통 및 세포질 도메인을 대체한다. 특정 실시예에서, 항원의 막관통 도메인의 1개, 2개 또는 그 이상의 아미노산 잔기이지만 항원의 막관통 도메인의 10개 미만의 아미노산 잔기는 키메라 항원의 일부이다. 항원 및 NDV HN 단백질의 세포외 도메인, 막관통 및 세포질 도메인은 당해 분야의 숙련자에게 공지된 기술을 사용하여 결정될 수 있다. 예를 들어, 공개된 정보, GenBank 또는 VIPR 바이러스 병원균 웹사이트(www.viprbrc.org), DTU 생물정보학 도메인 웹사이트(www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)와 같은 웹사이트 또는 막관통 도메인을 결정하는 데 이용 가능한 프로그램이 항원 및 NDV HN 단백질의 세포외 도메인, 막관통 및 세포질 도메인을 결정하는 데 사용될 수 있다. 키메라 항원을 생산하기 위한 방법은, 예를 들어 Park 등, 2006, PNAS May 23, 2006 103 (21) 8203-8208, 국제 특허 출원 번호 WO2007/064802, 및 미국 특허 제9,387,242 B2호를 참조한다. 특정 실시예에서, 키메라 항원을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 이식유전자가 본원에 기술되며, 여기서 키메라 항원은 클래스 II 단백질 항원의 세포외 도메인 및 NDV HN 단백질 막관통 및 세포질 도메인을 포함한다.
특정 실시예에서, 이식유전자는 키메라 항원을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하되, 키메라 항원은 SARS-CoV-2 스파이크 단백질 세포외 도메인 또는 이의 단편(예를 들어, 수용체 결합 도메인을 포함하는 단편) 및 NDV F 단백질 막관통 및 세포질 도메인을 포함한다. 일부 실시예에서, 이식유전자는 키메라 항원을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하되, 키메라 항원은 hMPV F 단백질 세포외 도메인 또는 이의 단편 및 NDV F 단백질 막관통 및 세포질 도메인을 포함한다. 특정 실시예에서, 이식유전자는 키메라 항원을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하되, 키메라 항원은 RSV F 단백질 세포외 도메인 또는 이의 단편 및 NDV F 단백질 막관통 및 세포질 도메인을 포함한다.
이식유전자는 NDV F 단백질 코딩 서열 및/또는 NDV HN 단백질 코딩 서열이 본원에서 설명되는 바와 같이 대체된 임의의 NDV 유형 또는 균주(예를 들어, NDV LaSota 균주)의 NDV 게놈의 뉴클레오티드 서열에 삽입될 수 있다. 당해 분야의 숙련자는 키메라 항원의 서열 정보를 사용하여 NDV F 단백질 코딩 서열 및/또는 NDV HN 단백질 코딩 서열이 본원에서 설명되는 바와 같이 대체된 임의의 NDV 유형 또는 균주의 NDV 게놈의 뉴클레오티드 서열에 혼입하기 위한 이식유전자를 생산할 수 있을 것이다. 핵산 코드의 퇴화성을 고려하면, 동일한 키메라 항원을 암호화할 수 있는 다수의 상이한 핵산 서열이 존재한다. 특정 실시예에서, 키메라 항원을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 이식 유전자는 코돈 최적화된 것이다. 특정 실시예에서, 키메라 항원을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 이식유전자가 본원에 기술되며, 여기서 키메라 항원은 항원 세포외 도메인 및 NDV F 단백질 막관통 및 세포질 도메인을 포함하고, 항원의 세포외 도메인은 코돈 최적화된 핵산 서열에 의해 암호화된다. 코돈 최적화에 관한 논의는, 예를 들어, 아래 섹션 5.1.4을 참조한다. 키메라 항원을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 암호화하는 이식유전자는 임의의 2개의 NDV 전사 유닛 사이에 (예를 들어, NDV P와 M 전사 유닛 사이에, 또는 HN과 L 전사 유닛 사이에) 혼입될 수 있다.
특정 실시예에서, 항원 또는 키메라 항원을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 이식유전자는 NDV 조절 신호(예를 들어, 유전자 말단, 유전자간 및 유전자 시작 서열) 및 Kozak 서열을 포함한다. 일부 실시예에서, 항원 또는 키메라 항원을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 이식유전자는 NDV 조절 신호(예를 들어, 유전자 말단, 유전자간 및 유전자 시작 서열), Kozak 서열 및 클로닝을 용이하게 하기 위한 제한 부위를 포함한다. 특정 실시예에서, 항원 또는 키메라 항원을 암호화하는 이식유전자는 NDV 조절 신호(유전자 말단, 유전자간 및 유전자 시작 서열), Kozak 서열, 클로닝을 용이하게 하는 제한 부위, 및 6의 규칙 준수를 보장하기 위해 비암호화 영역에서의 추가 뉴클레오티드를 포함한다. 바람직한 실시예에서, 이식유전자는 6의 규칙을 준수한다.
특정 실시예에서, 항원은 감염성 질환 항원이다. 감염성 질환은 바이러스, 박테리아, 곰팡이 및 원생동물에 의해 야기되는 질환을 포함한다. 일부 실시예에서, 항원은 병원균의 항원이다. 특정 실시예에서, 항원은 바이러스, 박테리아, 진균 또는 원생동물 항원이다. 항원은 바이러스, 박테리아, 진균, 원생동물 또는 다른 병원균에 의해 발현된 단백질의 단편일 수 있다. 특정 실시예에서, 항원은 바이러스 항원이다. 바이러스 항원은 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스 2(SARS-CoV-2) 항원, 인간 메타뉴모바이러스 항원, 호흡기 세포융합 바이러스 항원, 에볼라 항원, 라사 바이러스 항원, 니파 바이러스 항원, 또는 중동 호흡기 증후군 코로나바이러스(MERS-CoV) 항원일 수 있다. 일부 실시예에서, 바이러스 항원은 표면 당단백질이다. 바이러스 항원은 표면 당단백질 또는 외피 단백질의 단편일 수 있다. 일부 실시예에서, 본원에서 사용되는 항원은 자연에서 발견되는 항원과 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 98%의 동일성을 갖는다. 예를 들어, 항원은 자연 발생 바이러스 항원(예를 들어, SARS-CoV-2 항원, RSV 항원, 에볼라 바이러스 항원, MERS-CoV 항원, hMPV 항원, 라사 바이러스 항원 또는 니파 바이러스 항원)과 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 98%의 동일성을 가질 수 있다. 특정 실시예에서, 항원은 팬데믹 또는 전염병을 유발하는 병원균(예를 들어, 바이러스, 박테리아 등) 출처이거나 이로부터 유래된 항원이다.
일 실시예에서, 바이러스 항원은 SARS-CoV-2 항원이다. 또 다른 실시예에서, 바이러스 항원은 SARS-CoV-2 뉴클레오캡시드 단백질 또는 이의 단편이다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "SARS-CoV-2 뉴클레오캡시드"는 당해 분야의 숙련자에게 공지된 SARS-CoV-2 뉴클레오캡시드를 지칭한다. 특정 실시예에서, 뉴클레오캡시드 단백질은 GenBank 수탁 번호 MT081068.1, MT081066.1 또는 MN908947.3에서 발견되는 아미노산 또는 핵산 서열을 포함한다. 또한, 예를 들어, SARS-CoV-2 뉴클레오캡시드 단백질의 아미노산 서열 및 SARS-CoV-2 뉴클레오캡시드 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 예에 대해 GenBank 수탁 번호 MN908947.3, MT447160, MT44636, MT446360, MT444593, MT444529, MT370887, 및 MT334558를 참조한다.
또 다른 실시예에서, 바이러스 항원은 SARS-CoV-2 스파이크 단백질 또는 이의 단편이다. 일부 실시예에서, SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 단편은 단백질의 수용체 결합 도메인을 포함한다(또는 이로 이루어진다). 특정 실시예에서, SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 단편은 단백질의 S1 또는 S2 도메인을 포함한다(또는 이로 이루어진다). 일부 실시예에서, SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 단편은 단백질의 세포외 도메인을 포함한다(또는 이로 이루어진다). 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "SARS-CoV-2 스파이크 단백질" 및 "SARS-CoV-2의 스파이크 단백질"은 당해 분야의 숙련자에게 공지된 SARS-CoV-2 스파이크 단백질을 지칭한다. 예를 들어, SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 아미노산 서열 및 SARS-CoV-2 스파이크 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 예에 대해 GenBank 수탁 번호 MN908947.3, MT447160, MT44636, MT446360, MT444593, MT444529, MT370887, 및 MT334558를 참조한다. 특정 실시예에서, 스파이크 단백질은 GenBank 수탁 번호 MN908947.3에서 발견되는 아미노산 또는 핵산 서열을 포함한다. 특정 실시예에서, 스파이크 단백질은 SARS-CoV-2의 변이체의 아미노산 또는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시예에서, 스파이크 단백질은 B.1.1.7의 아미노산 또는 핵산 서열을 포함한다. 특정 실시예에서, 스파이크 단백질은 20I/501Y.V1(BEI 기준 단리체 NR-54000)의 아미노산 또는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시예에서, 스파이크 단백질은 P.1의 아미노산 또는 핵산 서열을 포함한다. 특정 실시예에서, 스파이크 단백질은 20J/501Y.V3(BEI 기준 단리체 NR-54982)의 아미노산 또는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시예에서, 스파이크 단백질은 B.1.351의 아미노산 또는 핵산 서열을 포함한다. 특정 실시예에서, 스파이크 단백질은 20H/501.V2(BEI 기준 단리체 NR-54009)의 아미노산 또는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시예에서, 스파이크 단백질은 B.1.4271의 아미노산 또는 핵산 서열을 포함한다. 특정 실시예에서, 스파이크 단백질은 20C/S:452R의 아미노산 또는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시예에서, 스파이크 단백질은 B.1.429의 아미노산 또는 핵산 서열을 포함한다. 특정 실시예에서, 스파이크 단백질은 20C/S:452R의 아미노산 또는 핵산 서열을 포함한다. 전형적인 스파이크 단백질은 S1 도메인, 수용체 결합 도메인, S2 도메인, 막관통 도메인 및 세포질 도메인을 포함하는 당해 분야의 숙련자에게 공지된 도메인을 포함한다. SARS-CoV-2 스파이크 단백질(특히, 이러한 단백질의 구조)에 대한 설명은, 예를 들어, Wrapp 등, 2020, Science 367: 1260-1263을 참조한다. 스파이크 단백질은 신호 펩티드(예: GenBank 수탁 번호 MN908947.3의 아미노산 서열의 1-14개 아미노산 잔기의 신호 펩티드), 수용체 결합 도메인(예를 들어, GenBank 수탁 번호 MN908947.3의 319-541개 아미노산 잔기의 수용체 결합 도메인), 세포외 도메인(예를 들어, GenBank 수탁 번호 MN908947.3의 15-1213개 아미노산 잔기의 세포외 도메인), 및 막관통 및 세포내 도메인(예를 들어, GenBank 수탁 번호 MN908947.3의 1214-1273개 아미노산 잔기의 막관통 및 세포내 도메인)를 갖는 것으로 특징지어질 수 있다. 특정 실시예에서, 바이러스 항원은 SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 단편이다. 단편은 SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 수용체 결합 도메인을 포함할 수 있다. 단편은 SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 S1 도메인, S2 도메인 또는 세포외 도메인을 포함할 수 있다. 용어 "SARS-CoV-2 스파이크 단백질"은 신호 펩티드 절단, 이황화 결합 형성, 당질화(예: N-결합 당질화), 프로테아제 절단 및 지질 변형(예: S-팔미토일화)과 같은 번역 후 가공에 의해 변형된 SARS-CoV-2 스파이크 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시예에서, SARS-CoV-2 스파이크 단백질은 신호 서열을 포함한다. 다른 실시예에서, SARS-CoV-2 스파이크 단백질은 신호 서열을 포함하지 않는다. 신호 서열은 자연 발생 신호 펩티드 서열 또는 이의 변이체일 수 있다. 일부 실시예에서, 신호 펩티드는 SARS-CoV-2 스파이크 단백질 신호 펩티드이다. 일부 실시예에서, 신호 펩티드는 SARS-CoV-2 스파이크 단백질 신호 펩티드에 대해 이종이다.
일부 실시예에서, 유도체 SARS-CoV-2 스파이크 단백질 세포외 도메인 및 NDV F 단백질 막관통 및 세포질 도메인을 포함하는 SARS-CoV-2 항원이 본원에 제공되며, 여기서 유도체는 (1) GenBank 수탁 번호 MN908947.3에서 발견되는 SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 아미노산 잔기 817, 892, 899, 942, 986, 및 987에 상응하는 아미노산 잔기가 프롤린으로 치환되고, 및 (2) 아미노산 잔기 682 내지 685에 상응하는 아미노산 잔기가 다염기 절단 부위가 불활성화되도록 치환되는, SARS-CoV-2 스파이크 단백질 세포외 도메인을 포함한다. 특정 실시예에서, 다염기 절단 부위는 그 부위가 예를 들어 퓨린에 의해 절단될 수 없는 경우 불활성화된다. 특정 실시예에서, GenBank 수탁 번호 MN908947.3에서 발견되는 SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 다염기 절단 부위의 아미노산 잔기 682내지 685에 상응하는 아미노산 잔기는 단일 알라닌으로 치환된다. 특정 실시예에서, NDV F 단백질 막관통 및 세포질 도메인은 링커 서열(예: GGGGS(서열번호 46))을 통해 SARS-CoV-2 스파이크 단백질 세포외 도메인의 유도체에 융합된다. 일부 실시예에서, 링커는 글리신(G) 링커 또는 글리신 및 세린(GS) 링커이다. 예를 들어, 링커는 (GGGGS)n의 서열을 포함할 수 있으며, 여기서 n은 1, 2, 3, 4, 5 이상이다(서열번호 47). 다른 예에서, 링커는 (G)n을 포함할 수 있으며, 여기서 n은 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 이상이다. 특정 실시예에서, 링커는 서열 GGGGS(서열번호 46)를 포함한다. 일부 실시예에서, NDV F 단백질 막관통 및 세포질 도메인은 SARS-CoV-2 스파이크 단백질 세포외 도메인의 유도체에 직접 융합된다. 특정 실시예에서, NDV F 단백질 및 키메라 F 단백질은 NDV 비리온에 혼입된다.
일 실시예에서, 바이러스 항원은 인간 메타뉴모바이러스 항원이다. 다른 실시예에서, 바이러스 항원은 인간 메타뉴모바이러스 G 단백질 또는 이의 단편이다. "인간 메타뉴모바이러스 G 단백질" 및 "hMPV G 단백질"은 당해 분야의 숙련자에게 공지된 임의의 인간 메타뉴모바이러스 G 단백질을 지칭한다. 다른 실시예에서, 바이러스 항원은 인간 메타뉴모바이러스 F 단백질 또는 이의 단편이다. "인간 메타뉴모바이러스 F 단백질" 및 "hMPV F 단백질"은 당해 분야의 숙련자에게 공지된 임의의 인간 메타뉴모바이러스 F 단백질을 지칭한다. hMPV F 단백질은 F0 비활성 전구체로서 합성된다. F0 비활성 전구체는 세포내 성숙 동안 절단을 필요로 한다. hMPV F를 절단하여 F1 및 F2를 형성한다. hMPV F 단백질은 2개의 형태, 즉 융합 전 및 융합 후에 존재한다. GenBank™ 수탁 번호 AY145301.1 및 KJ627437.1은 hMPV F 단백질을 암호화하는 예시적인 핵산 서열을 제공한다. GenBank™ 수탁 번호 AAN52915.1, AHV79975.1, AGJ74035.1, 및 AGZ48845.1은 예시적인 hMPV F 단백질 아미노산 서열을 제공한다. 용어 "hMPV F 단백질" 및 "인간 메타뉴모바이러스 F 단백질"은 신호 펩티드 절단, 이황화 결합 형성, 당질화(예: N-결합 당질화), 프로테아제 절단 및 지질 변형(예: S-팔미토일화)과 같은 번역 후 가공에 의해 변형된 hMPV F 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시예에서, hMPV F 단백질은 신호 서열을 포함한다. 다른 실시예에서, hMPV F 단백질은 신호 서열을 포함하지 않는다. 신호 서열은 자연 발생 신호 펩티드 서열 또는 이의 변이체일 수 있다. hMPV F 단백질 신호 서열은 일반적으로 18개 아미노산의 길이이다. 일부 실시예에서, 신호 펩티드는 hMPV F 단백질 신호 펩티드이다. 일부 실시예에서, 신호 펩티드는 hMPV F 단백질 신호 펩티드에 대해 이종이다.
일 실시예에서, 바이러스 항원은 RSV G 단백질 또는 이의 단편이다. "RSV G 단백질" 및 "호흡기 세포융합 바이러스 G 단백질"은 당해 분야의 숙련자에게 공지된 임의의 호흡기 세포융합 G 단백질을 지칭한다. 일 실시예에서, 바이러스 항원은 RSV F 단백질 또는 이의 단편이다. "RSV F 단백질" 및 "호흡기 세포융합 바이러스 F 단백질"은 당해 분야의 숙련자에게 공지된 임의의 호흡기 세포융합 F 단백질을 지칭한다. RSV F 단백질은 일반적으로 동종삼량체로서 존재한다. RSV F 단백질은 상당히 N-당질화된 F0 비활성 전구체로서 합성된다. F0 비활성 전구체는 퓨린-유사 프로테아제에 의한 세포내 성숙 동안 절단을 필요로 한다. RSV F는 2개의 퓨린 부위를 함유하고, 퓨린-유사 프로테아제에 의한 절단은 3개의 폴리펩티드를 생성한다: F2, p27 및 F1, 후자는 이의 N 말단에서 소수성 융합 펩티드를 함유한다. RSV F 단백질은 2개의 형태, 즉 융합 전 및 융합 후로 존재한다. RSV F 단백질은 인간 RSV F 단백질 또는 소 F 단백질일 수 있다. GenBank™ 수탁번호 KJ155694.1, KU950686.1, KJ672481.1, KP119747, 및 AF035006.1은 인간 RSV F 단백질을 암호화하는 예시적인 핵산 서열을 제공한다. GenBank™ 수탁번호 AHL84194.1, AMT79817.1, AHX57603.1, AIY70220.1 및 AAC14902.1은 예시적인 인간 RSV F 단백질 아미노산 서열을 제공한다. GenBank™ 수탁번호 AF295543.1, AF092942.1, 및 Y17970.1은 소의 RSV F 단백질을 암호화하는 예시적인 핵산 서열을 제공한다. GenBank™ 수탁번호 AAL49399.1, NP_048055.1, AAC96308.1, 및 CAA76980.1은 예시적인 소 RSV F 단백질 아미노산 서열을 제공한다. 용어 "RSV F 단백질" 및 "호흡기 세포융합 바이러스 F 단백질"은 신호 펩티드 절단, 이황화 결합 형성, 당질화(예: N-결합 당질화), 프로테아제 절단 및 지질 변형(예: S-팔미토일화)와 같은 번역 후 가공에 의해 변형된 RSV F 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시예에서, RSV F 단백질은 신호 서열을 포함한다. 다른 실시예에서, RSV F 단백질은 신호 서열을 포함하지 않는다. 신호 서열은 자연 발생 신호 펩티드 서열 또는 이의 변이체일 수 있다. RSV F 단백질 신호 서열은 일반적으로 25개 아미노산의 길이이다. 일부 실시예에서, 신호 펩티드는 RSV F 단백질 신호 펩티드이다. 일부 실시예에서, 신호 펩티드는 RSV F 단백질 신호 펩티드에 대해 이종이다.
일 실시예에서, 항원은 에볼라 바이러스 항원(예를 들어, 에볼라 바이러스 당단백질 GP 또는 이의 단편, 또는 에볼라 바이러스 뉴클레오캡시드 또는 이의 단편)이다. 다른 실시예에서, 항원은 라사 바이러스 항원(예를 들어, 라사 바이러스 외피 당단백질 GP1 또는 이의 단편, 또는 라사 바이러스 외피 당단백질 GP2 또는 이의 단편)이다. 다른 실시예에서, 항원은 니파 바이러스 항원(예를 들어, 니파 바이러스 F 또는 이의 단편, 또는 니파 바이러스 G 단백질 또는 이의 단편)이다. 다른 실시예에서, 항원은 MERS-CoV 항원(예를 들어, MERS-CoV 스파이크 단백질 또는 이의 단편, 또는 뉴클레오캡시드 단백질 또는 이의 단편)이다.
특정 실시예에서, 단백질의 단편은 단백질의 적어도 8개, 적어도 10개, 적어도 12개, 적어도 15개 이상의 연속 아미노산을 포함한다. 일부 실시예에서, 단백질의 단편은 단백질의 적어도 20개, 적어도 30개, 적어도 40개, 적어도 50개 또는 그 이상의 연속 아미노산을 포함한다. 특정 실시예에서, 단백질의 단편은 단백질의 적어도 75개, 적어도 100개, 적어도 125개, 적어도 150개 이상의 연속 아미노산을 포함한다. 일부 실시예에서, 단백질의 단편은 단백질의 적어도 175개, 적어도 200개, 적어도 250개, 적어도 300개, 적어도 350개 또는 그 이상의 연속 아미노산을 포함한다.
일부 실시예에서, 항원은 암 또는 종양 항원 또는 종양 항원(예를 들어, 종양-연관 항원 및 종양-특이적 항원)이다. 종양 항원의 특징인 항원은 종양 조직의 세포의 세포 표면, 세포질, 핵, 소기관 등으로부터 유래될 수 있다. 예로는 돌연변이된 종양유전자에 의해 암호화된 단백질, 종양과 연관된 바이러스 단백질, 및 당단백질을 포함하는, 종양 단백질의 특징적인 항원을 포함한다. 종양은 다음의 암 유형으로부터 유래된 것들을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다: 입술, 비인두, 인두 및 구강, 식도, 위, 결장, 직장, 간, 담낭, 췌장, 후두, 폐 및 기관지, 피부의 흑색종, 유방, 자궁경부, 자궁내, 난소, 방광, 신장, 자궁, 뇌 및 신경계의 다른 부위, 갑상선, 전립선, 고환, 호지킨병, 비호지킨 림프종, 다발성 골수종 및 백혈병. 일부 실시예에서, 암 항원 또는 종양 항원은 HER2, EGFR, VEGF, CD33, CD20, ErbB2, 전립선 특이적 막 항원(PSMA), APO-1, 또는 MUC-1이다.
5.1.4
코돈 최적화
당해 분야의 숙련자에게 공지된 임의의 코돈 최적화 기술이 본원에서 설명되는 핵산 서열 또는 뉴클레오티드 서열을 코돈 최적화하는 데 사용될 수 있다. 코돈 최적화 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어, OptimumGene™(GenScript®) 프로토콜 및 Genewiz® 프로토콜은 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다. 코돈 최적화 방법은 미국 특허 제8,326,547호를 또한 참조하며, 이는 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다.
코돈 최적화를 위한 예시적인 방법으로서, 본원에서 설명되는 핵산 서열 또는 뉴클레오티드 서열의 개방 프레임 내의 각각의 코돈)은 포유류 단백질에 가장 빈번하게 사용되는 코돈으로 대체된다. 이는 일본 Kazusa에 있는 식물 유전자 연구부가 관리하는 코돈 활용 데이터베이스를 사용하는 웹 기반 프로그램(www.encorbio.com/protocols/Codon.htm)을 사용하여 수행될 수 있다. 포유류 발현에 최적화된 핵산 서열 또는 뉴클레오티드 서열은 (1) 전사 종결자로서 작용할 수 있는 5xA 이상의 스트레치의 존재; (2) 서브클로닝을 방해할 수 있는 제한 부위의 존재; (3) 6의 규칙 준수에 대해 검사될 수 있다. 검사 후, (1) 전사 종결자로서 작용할 수 있는 5xA 이상의 스트레치가 동의 돌연변이(synonymous mutation)로 대체될 수 있고; (2) 서브클로닝을 방해할 수 있는 제한 부위는 동의 돌연변이로 대체될 수 있고; (3) 최적의 단백질 발현을 위한 NDV 조절 신호(유전자 말단, 유전자간 및 유전자 시작 서열) 및 Kozak 서열이 첨가될 수 있고; (4) 뉴클레오티드가 비암호화 영역에 첨가되어 6의 규칙 준수를 보장할 수 있다. 동의 돌연변이는 일반적으로 암호화된 아미노산을 변화시키지 않는 뉴클레오티드 변화이다. 예를 들어, Lys-Lys를 암호화하는 서열인 6 As(AAAAAA)의 스트레치의 경우, 동의 서열은 Lys-Lys를 암호화하는 서열인 AAGAAG일 것이다.
5.2
NDV의 구축
본원에서 설명되는 재조합 NDV(예를 들어, 섹션 5.1 및 6 참조)는 역유전학 기술을 사용하여 생성될 수 있다. 역유전학 기술은 바이러스 중합효소에 의한 인식 및 성숙한 비리온을 생성하는 데 필요한 신호의 패키징에 필수적인 음성 가닥의 비암호화 영역을 함유하는 합성 재조합 바이러스 RNA의 제조를 포함한다. 재조합 RNA는 재조합 DNA 템플릿으로부터 합성되고 정제된 바이러스 중합효소 복합체로 시험관 내에서 재구성되어 세포를 형질감염시키는 데 사용될 수 있는 재조합 리보핵단백질(RNP)을 형성한다. 시험관 내 또는 생체 내에서 합성 RNA의 전사 동안 바이러스 중합효소 단백질이 존재하는 경우, 보다 효율적인 형질감염이 달성된다. 합성 재조합 RNP는 감염성 바이러스 입자로 구제될 수 있다. 전술한 기술은 1992년 11월 24일에 발행된 미국 특허 제5,166,057호; 1998년 12월 29일에 발행된 미국 특허 제5,854,037호; 2000년 11월 14일에 발행된 미국 특허 제6,146,642호; 1996년 2월 20일에 공개된 유럽 특허 공개 EP 0702085A1; 미국 특허 출원 제09/152,845호; 1997년 4월 3일에 공개된 국제 특허 공개 PCT WO97/12032; 1996년 11월 7일에 공개된 WO96/34625; 유럽 특허 공개 EP A780475; 1999년 1월 21일에 공개된 WO 99/02657; 1998년 11월 26일에 공개된 WO 98/53078; 1998년 1월 22일에 공개된 WO 98/02530; 1999년 4월 1일에 공개된 WO 99/15672; 1998년 4월 2일에 공개된 WO 98/13501; 1997년 2월 20일에 공개된 WO 97/06270; 및 1997년 6월 25일에 공개된 EPO 780 475A1호에 설명되어 있으며며, 이들 각각은 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다.
헬퍼-프리 플라스미드 기술 또한 본원에서 설명되는 NDV를 조작하는 데 사용될 수 있다. 간략하게, NDV(예를 들어, Hitchner B1 균주 또는 LaSota 균주)의 완전한 cDNA를 구축하고, 플라스미드 벡터 내에 삽입하고, 2개의 전사 유닛(예를 들어, NDV P 및 M 유전자; 또는 NDV HN 및 L 유전자) 사이에 고유한 제한 부위를 함유하도록 조작한다. 이종 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 본원에서 설명되는 이식유전자 또는 다른 서열, 예컨대 SARS-CoV-2 스파이크 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열, RSV F 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열, 키메라 F 단백질, hMPV F 단백질)이 고유한 제한 부위에서 바이러스 게놈 내에 삽입될 수 있다. 대안적으로, 이종 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열(예를 들어, SARS-CoV-2 스파이크 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열, RSV F 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열, 키메라 F 단백질, hMPV F 단백질과 같은 본원에서 설명되는 이식유전자 또는 다른 서열)은 삽입이 바이러스의 감염 및 복제 능력에 영향을 미치지 않는 한 NDV 전사 유닛으로 조작될 수 있다. 단일 분절은 T7 프로모터와 간염 델타 바이러스 리보자임 사이에 위치하여 T7 중합효소로부터 정확한 음성 또는 양성 전사체를 생성한다. 필요한 바이러스 단백질을 포함하는 플라스미드 벡터 및 발현 벡터는 재조합 바이러스 입자의 생산을 유도하는 세포 내로 형질감염된다(예를 들어, 국제 공개 번호 WO 01/04333; 미국 특허 제7,442,379호, 제6,146,642호, 제6,649,372호, 제6,544,785호 및 제7,384,774호; Swayne 등 (2003). Avian Dis. 47:1047-1050; 및 Swayne 등 (2001). J. Virol. 11868-11873을 참조하고, 이들 각각은 그 전체가 참조로서 통합됨).
단일 mRNA로부터 다수의 단백질을 생산하는 바이시스트론(Bicistronic) 기술은 당해 분야의 숙련자에게 공지되어 있다. 바이시스트론 기술은 IRES 서열을 사용하여 다수의 단백질의 코딩 서열을 단일 mRNA로 조작할 수 있게 한다. IRES 서열은 리보솜의 내부 동원을 RNA 분자로 유도하고, 캡 독립적인 방식으로 하류 번역을 허용한다. 간략하게, 하나의 단백질의 코딩 영역은 제2 단백질의 ORF의 하류에 삽입된다. 삽입은 IRES 및 적절한 발현 및/또는 기능에 필요한 임의의 미번역 신호 서열이 측면에 위치한다. 삽입은 제2 단백질의 개방 해독 프레임, 폴리아데닐화 또는 전사 프로모터를 파괴해서는 안 된다(예를 들어, Garc
a-Sastre 등, 1994, J. Virol. 68:6254-6261 및 Garc
a-Sastre 등, 1994 Dev. Biol. Stand. 82:237-246을 참조하고, 이들 각각은 그 전체가 참조로서 본원에 통합됨).
이식유전자를 암호화하고 이식유전자에 의해 암호화된 이종 단백질(예를 들어, SARS-CoV-2 스파이크 단백질을 암호화하는 이식유전자, RSV F 단백질, 키메라 F 단백질, hMPV F 단백질)은 당해 분야의 숙련자에게 공지되어 있고, 예컨대, 예를 들어, NDV 게놈 내로 조작된 제한 부위 내로 이식유전자의 삽입, NDV RNA-의존성-RNA 중합효소에 의한 인식을 위해 이식유전자에 적절한 신호를 포함시킴(예를 들어, NDV 중합효소가 이전 유전자의 말단 및 이식유전자의 시작을 인식할 수 있게 하는 이식유전자의 개방 해독 프레임의 상류 서열, 이는 예를 들어, 단일 뉴클레오티드 유전자간 서열에 의해 이격될 수 있음), 유효한 Kozak 서열의 포함(예: 진핵생물 리보솜 번역을 개선하기 위함); NDV 클로닝을 위한 "6의 규칙"을 충족시키는 이식유전자의 혼입; 및 이식유전자 내에서 외인성 유전자 말단 및/또는 유전자 시작 서열을 제거하기 위한 침묵 돌연변이를 포함시키는 것이다. 6의 규칙과 관련하여, 당해 분야의 숙련자라면 NDV(및 보다 일반적으로, 파라믹소바이러스 과의 대부분의 구성원)의 효율적인 복제가 게놈 길이가 6의 배수인 "6의 규칙"으로 알려진 6의 배수에 의존한다는 것을 이해할 것이다(예를 들어, Calain, P. & Roux, L. The rule of six, a basic feature of efficient replication of Sendai virus defective interfering RNA. J. Virol. 67, 4822-4830 (1993) 참조). 따라서, 본원에서 설명되는 재조합 NDV를 구축할 때, NDV 클로닝에 대한 "6의 규칙"을 충족시키도록 주의를 기울여야 한다. NDV 클로닝에 대한 6의 규칙을 충족시키기 위해 당해 분야의 숙련자에게 공지된 방법, 예컨대 이식유전자의 하류에 뉴클레오티드를 첨가하는 방법이 사용될 수 있다. 예를 들어, Ayllon 등, Rescue of Recombinant Newcastle Disease Virus from cDNA. J. Vis. Exp. (80), e50830, doi:10.3791/50830 (2013)을 참조하며 (NDV(예를 들어, 재조합 NDV)의 클로닝 및 구제 방법에 대한 논의를 위함), 이는 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다.
특정 실시예에서, 본원에서 설명되는 NDV(예를 들어, 섹션 5.1 및 6 참조)는 아래 섹션 6에 기술된 방법에 따라 생성될 수 있다.
5.3
NDV의 전파
본원에서 설명되는 재조합 NDV(예를 들어, 섹션 5.1 및 6)는 본원에서 설명되는 바이러스의 사용을 허용하는 역가로 바이러스가 성장할 수 있게 하는 임의의 기질에서 전파될 수 있다. 일 실시예에서, 기질은 본원에서 설명되는 재조합 NDV가 상응하는 야생형 바이러스에 대해 결정된 것과 유사한 역가로 성장할 수 있게 한다.
본원에서 설명되는 재조합 NDV(예를 들어, 섹션 5.1 및 6)는 바이러스, 배아 난자(예를 들어, 닭 알 또는 메추리 알) 또는 동물(예를 들어, 조류)에 의한 감염에 민감한 세포(예를 들어, 조류 세포, 닭 세포 등)에서 성장될 수 있다. 이러한 방법은 당해 분야의 숙련자에게 잘 알려져 있다. 특정 실시예에서, 본원에서 설명되는 재조합 NDV는 암 세포, 예를 들어, 암종 세포(예를 들어, 유방암 세포 및 전립선암 세포), 육종 세포, 백혈병 세포, 림프종 세포, 및 생식 세포 종양 세포(예를 들어, 고환암 세포 및 난소암 세포)에서 전파될 수 있다. 또 다른 특정 실시예에서, 본원에서 설명되는 재조합 NDV는 세포주, 예를 들어 HeLa 세포, MCF7 세포, THP-1 세포, U87 세포, DU145 세포, Lncap 세포, 및 T47D 세포와 같은 암 세포주에서 전파될 수 있다. 특정 실시예에서, 세포 또는 세포주(예를 들어, 암세포 또는 암세포주)는 인간(들)으로부터 수득되거나, 유래되거나, 또는 수득되고 유래된다. 또 다른 실시예에서, 본원에서 설명되는 재조합 NDV는 인터페론 결핍 시스템 또는 인터페론(IFN) 결핍 기질, 예컨대 예를 들어, IFN 결핍 세포(예를 들어, IFN 결핍 세포주) 또는 IFN 결핍 배아 난자에서 전파된다. 또 다른 실시예에서, 본원에서 설명되는 재조합 NDV는 닭 세포 또는 배아 닭 난자에서 전파된다. 대표적인 닭 세포는 닭 배아 섬유아세포 및 닭 배아 신장 세포를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 특정 실시예에서, 본원에서 설명되는 재조합 NDV는 Vero 세포에서 전파된다. 또 다른 특정 실시예에서, 본원에서 설명되는 재조합 NDV는 닭 달걀 또는 메추리알에서 전파된다. 특정 실시예에서, 본원에서 설명되는 재조합 NDV 바이러스는 먼저 배아 난자에서 전파된 다음 세포(예를 들어, 세포주)에서 증식된다.
본원에서 설명되는 재조합 NDV는 배아 난자, 예를 들어, 6 내지 14일령, 6 내지 12일령, 6 내지 10일령, 6 내지 9일령, 6 내지 8일령, 8 내지 10일령, 또는 10 내지 12일령에서 전파될 수 있다. 특정 실시예에서, 10일령의 배아 난자가 본원에서 설명되는 재조합 NDV를 전파하는 데 사용된다. 영 또는 미성숙 배아 난자가 본원에서 설명되는 재조합 NDV를 전파하는 데 사용될 수 있다. 미성숙 배아 난자는 10일령 난자 미만인 난자, 예를 들어 IFN-결핍성인 6 내지 9일령 또는 6 내지 8일령 난자를 포함한다. 미성숙 배아 난자는 또한 성장 조건의 변화, 예를 들어, 인큐베이션 온도의 변화; 약물로 처리; 또는 지연된 발생을 갖는 난자를 초래하는 임의의 다른 변화의 결과로서, 최대 10일 내지 12일령 난자와 비교하여 IFN 시스템이 완전히 발생되지 않도록, 미성숙 난자를 인공적으로 모방하는 난자를 포함한다. 본원에서 설명되는 재조합 NDV는 배아 난자의 상이한 위치, 예를 들어 요막강에서 전파될 수 있다. 성장 및 전파 바이러스에 대한 상세한 논의는, 예를 들어 미국 특허 제6,852,522호 및 미국 특허 제7,494,808호를 참조하며, 이들 모두는 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다.
바이러스 단리를 위해, 본원에서 설명되는 재조합 NDV는 배아 난자 또는 세포 배양물로부터 제거될 수 있고, 일반적으로 원심분리, 심층 여과, 및 미세여과와 같은 잘 알려진 정화 절차에 의해 세포 성분으로부터 분리될 수 있고, 당해 분야의 숙련자에게 잘 알려진 절차, 예를 들어 접선 유동 여과(TFF), 밀도 구배 원심분리, 차등 추출, 또는 크로마토그래피를 사용하여 원하는 대로 추가로 정제될 수 있다.
특정 실시예에서, 감염된 난자(예를 들어, 닭 난자)의 요막 유체로부터의 바이러스 단리는 요막 유체를 수확하는 것으로 시작되며, 이는 세포 및 다른 큰 파편을 제거하기 위해 여과 시스템을 사용하여 정화되며, 구체적으로는 숙주 세포 DNA의 측정 가능한 감소가 있도록 순 양전하를 갖는 막을 포함한다. 이어서, 정화된 벌크를 접선 유동 여과에 의해 처리한다. 그런 다음, 농축된 정화된 벌크를 고염 완충액의 4 투석부피에 대해 정용여과한 다음, 저염 제형화 완충액의 4 투석부피에 이어서 약 10배 농축시킨다. 따라서, 잔류 난자 단백질, 예를 들어 주로 난알부민, 및 잔류 DNA는 허용 가능한 수준으로 감소되고, 완충액은 대상체에게 투여될 조성물에 대해 재조합 NDV의 제형과 양립 가능한 완충액으로 교환된다. 그런 다음, 생성된 생성물을 필터, 예를 들어, 0.2 μm 필터를 통해 멸균 여과하고, 적절한 멸균 보관 용기에 분배하고, 냉동시키고, -70°C에서 보관한다.
특정 실시예에서, 본원에서 설명되는 재조합 NDV(예를 들어, 섹션 5.1 및 6 참조)는 섹션 6에 기술된 방법에 따라 전파, 단리 및/또는 정제된다. 특정 실시예에서, 본원에서 설명되는 재조합 NDV(예를 들어, 섹션 5.1 및 6 참조)는 전파되거나, 단리되거나, 정제되거나, 전술한 것 중 임의의 2개 또는 전부이다.
특정 실시예에서, 본원에서 설명되는 재조합 NDV를 포함하는 세포(예를 들어, 세포주) 또는 배아 난자(예를 들어, 닭 배아 난자)가 본원에 제공된다. 일부 실시예에서, 세포는 시험관 내 또는 생체 외이다. 셀은 일차 셀 또는 세포주일 수 있다. 세포는 포유류(예를 들어, 인간) 세포 또는 세포주일 수 있다. 일부 실시예에서, 세포는 본원에 인용된 세포 또는 세포주이다. 일부 실시예에서, 배아 난자는 IFN-결핍성 기질이다. 일부 실시예에서, 배아 난자는 본원에서 설명되는 것이다. 또 다른 특정 실시예에서, 본원에서 설명되는 재조합 NDV를 전파하기 위한 방법이 본원에 제공되며, 상기 방법은 재조합 NDV로 감염된 세포(예를 들어, 세포주) 또는 배아 난자(예를 들어, 닭 배아 난자)를 배양하는 단계를 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 방법은 세포 또는 배아 난자로부터 재조합 NDV를 단리하거나 정제하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 특정 실시예에서, 본원에서 설명되는 재조합 NDV를 전파하기 위한 방법이 본원에 제공되며, 상기 방법은 (a) 본원에서 설명되는 재조합 NDV로 감염된 세포(예를 들어, 세포주) 또는 배아 난자를 배양하는 단계; 및 (b) 세포 또는 배아 난자로부터 재조합 NDV를 단리하는 단계를 포함한다. 세포 또는 배아 난자는 본원에 기술되거나 당해 분야의 숙련자에게 공지된 것일 수 있다. 일부 실시예에서, 세포 또는 배아 난자는 IFN 결핍성이다.
특정 실시예에서, 본원에서 설명되는 재조합 NDV를 포함하는 약학적 조성물(예를 들어, 면역원성 조성물)을 생산하기 위한 방법이 본원에 제공되며, 상기 방법은 (a) 본원에서 설명되는 재조합 NDV를 세포(예를 들어, 세포주) 또는 배아 난자로부터 전파하는 단계; 및 (b) 재조합 NDV를 세포 또는 배아 난자로부터 단리하는 단계를 포함한다. 상기 방법은 재조합 NDV를 약학적으로 허용 가능한 담체와 함께 용기에 첨가하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
5.4
조성물 및 투여 경로
본원에서 설명되는 재조합 NDV(예를 들어, 섹션 5.1 또는 6)를 포함하는 조성물이 본원에 제공된다. 특정 실시예에서, 조성물은 면역원성 조성물(예를 들어, 백신 조성물)과 같은 약학적 조성물이다. 특정 실시예에서, 본원에서 설명되는 재조합 NDV(예를 들어, 섹션 5.1 또는 6)를 포함하는 면역원성 조성물이 본원에 제공된다. 조성물은 본원에서 설명되는 것과 같은 항원(예를 들어, 섹션 5.1.3)에 대한 면역 반응을 유도하는 방법에 사용될 수 있다. 조성물은 항원(예를 들어, 본원에서 설명되는 항원(예를 들어, 섹션 5.1.3))에 대해 면역화하는 방법에 사용될 수 있다. 조성물은 항원과 연관된 질환(예를 들어, 본원에서 설명되는 항원(예를 들어, 섹션 5.1.3))에 대한 면역화 방법에 사용될 수 있다. 조성물은 본원에서 설명되는 항원과 같은 항원이 연관된 질환을 예방하기 위한 방법에 사용될 수 있다.
일 실시예에서, 약학적 조성물(예를 들어, 면역원성 조성물)은 약학적으로 허용 가능한 담체와 혼합된 본원에서 설명되는 재조합 NDV(예: 섹션 5.1 또는 6)를 포함한다. 조성물은 본원에서 설명되는 104 내지 1012 PFU의 재조합 NDV를 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 약학적 조성물은 아래 섹션 5.5.2에 기술된 것과 같은 하나 이상의 추가 예방제 또는 치료제를 추가로 포함한다. 특정 실시예에서, 약학적 조성물은 본원에서 설명되는 재조합 NDV의 유효량(예를 들어, 섹션 5.1 또는 6), 및 선택적으로 하나 이상의 추가 예방제 또는 치료제를 약학적으로 허용 가능한 담체에 포함한다. 특정 실시예에서, 본원에서 설명되는 약학적 조성물은 본원에서 설명되는 2개의 재조합 NDV를 포함하되, 본원에서 설명되는 2개의 재조합 NDV는 서로 면역학적으로 구별된다. 일부 실시예에서, 재조합 NDV(예를 들어, 섹션 5.1 또는 6)는 약학적 조성물에 포함된 유일한 활성 성분이다. 특정 실시예에서, 2개 이상의 재조합 NDV가 약학적 조성물에 포함된다. 특정 실시예에서, 약학적 조성물은 면역원성 조성물이다.
특정 실시예에서, 본원에서 설명되는 약학적 조성물에 포함된 재조합 NDV는 생바이러스이다. 특히, 실시예에서, 본원에서 설명되는 약학적 조성물에 포함된 재조합 NDV는 약독화 생바이러스이다. 일부 실시예에서, 본원에서 설명되는 약학적 조성물에 포함된 재조합 NDV는 불활성화된다. 당해 분야의 숙련자에게 공지된 기술은 재조합 NDV를 불활성화시키는 데 사용될 수 있다.
본원에 제공된 약학적 조성물은 조성물이 대상체에게 투여될 수 있게 하는 임의의 형태일 수 있다. 특정 실시예에서, 약학적 조성물은 수의학적 투여, 인간 투여, 또는 둘 모두에 적합하다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "약학적으로 허용 가능한"은 연방 또는 주 정부의 규제 기관에 의해 승인되거나, 동물에서, 보다 구체적으로는 인간에서 사용하기 위해 미국 약전 또는 기타 일반적으로 인정되는 약전에 열거된 것을 의미한다. 용어 "담체"는 약학적 조성물이 함께 투여되는 희석제, 보조제, 부형제, 또는 비히클을 지칭한다. 식염수 용액 및 수성 덱스트로스 및 글리세롤 용액은 또한 액체 담체로서, 특히 주사 가능한 용액으로서 사용될 수 있다. 적절한 부형제는 전분, 글루코오스, 락토오스, 수크로오스, 젤라틴, 맥아, 쌀, 밀가루, 초크, 실리카 겔, 스테아르산 나트륨, 글리세롤 모노스테아레이트, 탈크, 염화나트륨, 건조 탈지유, 글리세롤, 프로필렌, 글리콜, 물, 에탄올 등을 포함한다. 적절한 약학적 담체의 예는 E.W. Martin의 "Remington's Pharmaceutical Sciences"에 기술되어 있다. 제형은 투여 모드에 적합해야 한다.
특정 실시예에서, 약학적 조성물은 대상체에게 의도된 투여 경로에 적합하도록 제형화된다. 예를 들어, 약학적 조성물은 비경구, 정맥내, 동맥내, 흉막내, 흡입, 비강내, 복강내, 경구, 피내, 결장직장, 복강내, 두개내, 및 종양내 투여에 적합하도록 제형화될 수 있다. 일 실시예에서, 약학적 조성물은 정맥내, 동맥내, 경구, 복강내, 비강내, 기관내, 흉막내, 두개내, 피하, 근육내, 국소, 폐, 또는 종양내 투여용으로 제형화될 수 있다. 특정 실시예에서, 약학적 조성물은 비강내 투여용으로 제형화될 수 있다.
특정 실시예에서, 본원에서 설명되는 재조합 NDV(예를 들어, 섹션 5.1 또는 6 참조)를 포함하는 약학적 조성물은 대상체(예를 들어, 인간 대상체)에게 비강내 투여에 적합하도록 제형화된다.
5.5
재조합 NDV의 용도
또 다른 측면에서, 대상체(예를 들어, 인간 대상체)에서 면역 반응을 유도하는 방법이 본원에 제공되며, 상기 방법은 본원에서 설명되는 재조합 NDV 또는 이의 조성물을 대상체(예를 들어, 인간 대상체)에게 투여하는 단계를 포함한다. 일 실시예에서, 대상체(예를 들어, 인간 대상체)에서 면역 반응을 유도하는 방법이 본원에 제공되며, 상기 방법은 본원에서 설명되는 재조합 NDV의 유효량을 대상체(예를 들어, 인간 대상체)에게 투여하는 단계를 포함한다. 재조합 NDV에 대해서는, 예를 들어, 섹션 5.1 및 6을 참조한다. 특정 실시예에서, 유도된 면역 반응은 항원(예를 들어, 감염성 질환 항원, 또는 암 또는 종양 항원)에 대한 면역 반응이다. 재조합 NDV는 임의의 투여 경로에 의해 대상체에게 투여될 수 있다. 또 다른 특정 실시예에서, 재조합 NDV는 대상체에게 비강내 투여된다. 일부 실시예에서, 재조합 NDV는 대상체에게 근육내 투여된다.
일부 실시예에서, 대상체에서 항체를 유도하는 방법이 본원에 제공된다. 일부 실시예에서, 대상체에서 항체를 유도하는 방법이 본원에 제공되며, 상기 방법은 본원에서 설명되는 재조합 NDV, 또는 본원에서 설명되는 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 특정 실시예에서, 대상체는 비인간 대상체(예를 들어, 마우스, 기니피그, 개, 고양이, 토끼, 원숭이, 침팬지 등)이다. 다른 실시예에서, 대상체는 인간이다. 생산된 항체는 단리되고 클로닝될 뿐만 아니라, 예를 들어 항체의 특성 중 하나 이상을 개선하기 위해 재조합적으로 조작될 수 있다. 일부 실시예에서, 유도된 항체는 재조합 NDV에 의해 발현된 항원에 결합한다.
다른 측면에서, 항원과 연관된 질환(예를 들어, 감염성 질환 항원, 또는 암 또는 종양 항원)에 대한 면역화 방법이 본원에 제공되며, 상기 방법은 대상체에게 (예를 들어, 인간 대상체) 본원에서 설명되는 재조합 NDV 또는 이의 조성물을 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 재조합 NDV는 이식유전자를 포함하는 포장된 게놈을 포함하고, 이식유전자는 질환과 연관된 항원(예를 들어, 감염성 질환 항원, 또는 암 또는 종양 항원)을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일 실시예에서, 대상체에서(예를 들어, 인간 대상체) 항원과 연관된 질환(예를 들어, 감염성 질환 항원, 또는 암 또는 종양 항원)에 대한 면역화 방법이 본원에 제공되며, 상기 방법은 대상체에게(예: 인간 대상체) 본원에서 설명되는 재조합 NDV의 유효량을 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 재조합 NDV는 질환과 연관된 항원(예를 들어, 감염성 질환 항원, 또는 암 또는 종양 항원)을 암호화하는 이식유전자를 포함하는 포장된 게놈을 포함한다. 재조합 NDV에 대해서는, 예를 들어, 섹션 5.1 및 6을 참조한다. 특정 실시예에서, 항원은 재조합 NDV로 감염된 세포에 의해 발현된다. 재조합 NDV는 임의의 투여 경로에 의해 대상체에게 투여될 수 있다. 또 다른 특정 실시예에서, 재조합 NDV는 대상체에게 비강내 투여된다. 일부 실시예에서, 재조합 NDV는 대상체에게 근육내 투여된다.
특정 실시예에서, 대상체(예: 인간 대상체)에게 본원에서 설명되는 재조합 NDV 또는 이의 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 SARS-CoV-2 질환(예: COVID-19)에 대한 면역화 방법이 본원에 제공되며, 여기서 재조합 NDV는 이식유전자를 포함하는 포장된 게놈을 포함하고, 이식유전자는 SARS-CoV-2 항원(예를 들어, SARS-CoV-2 스파이크 단백질 또는 이의 단편, 예를 들어, 수용체 결합 도메인을 포함하는 단편)을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특정 실시예에서, SARS-CoV-2 항원은 재조합 NDV로 감염된 세포에 의해 발현된다. 재조합 NDV는 임의의 투여 경로에 의해 대상체에게 투여될 수 있다. 또 다른 특정 실시예에서, 재조합 NDV는 대상체에게 비강내 투여된다. 일부 실시예에서, 재조합 NDV는 대상체에게 근육내 투여된다.
특정 실시예에서, 대상체(예를 들어, 인간 대상체)에게 본원에서 설명되는 재조합 NDV 또는 이의 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 에볼라 바이러스 질환에 대한 면역화 방법이 본원에 제공되며, 여기서 재조합 NDV는 이식유전자를 포함하는 포장된 게놈을 포함하고, 이식유전자는 에볼라 바이러스 질환 항원을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특정 실시예에서, 에볼라 바이러스 항원은 재조합 NDV로 감염된 세포에 의해 발현된다. 재조합 NDV는 임의의 투여 경로에 의해 대상체에게 투여될 수 있다. 또 다른 특정 실시예에서, 재조합 NDV는 대상체에게 비강내 투여된다. 일부 실시예에서, 재조합 NDV는 대상체에게 근육내 투여된다.
특정 실시예에서, 대상체(예를 들어, 인간 대상체)에게 본원에서 설명되는 재조합 NDV 또는 이의 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 니파 바이러스 질환에 대한 면역화 방법이 본원에 제공되며, 여기서 재조합 NDV는 이식유전자를 포함하는 포장된 게놈을 포함하고, 이식유전자는 니파 바이러스 질환 항원을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특정 실시예에서, 니파 바이러스 항원은 재조합 NDV로 감염된 세포에 의해 발현된다. 재조합 NDV는 임의의 투여 경로에 의해 대상체에게 투여될 수 있다. 또 다른 특정 실시예에서, 재조합 NDV는 대상체에게 비강내 투여된다. 일부 실시예에서, 재조합 NDV는 대상체에게 근육내 투여된다.
특정 실시예에서, 대상체(예를 들어, 인간 대상체)에게 본원에서 설명되는 재조합 NDV 또는 이의 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 MERS-CoV 질환에 대한 면역화 방법이 본원에 제공되며, 여기서 재조합 NDV는 이식유전자를 포함하는 포장된 게놈을 포함하고, 이식유전자는 MERS-CoV 질환 항원을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특정 실시예에서, MERS-CoV 항원은 재조합 NDV로 감염된 세포에 의해 발현된다. 재조합 NDV는 임의의 투여 경로에 의해 대상체에게 투여될 수 있다. 또 다른 특정 실시예에서, 재조합 NDV는 대상체에게 비강내 투여된다. 일부 실시예에서, 재조합 NDV는 대상체에게 근육내 투여된다.
특정 실시예에서, 대상체(예를 들어, 인간 대상체)에게 본원에서 설명되는 재조합 NDV 또는 이의 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 라사 바이러스 질환에 대한 면역화 방법이 본원에 제공되며, 여기서 재조합 NDV는 이식유전자를 포함하는 포장된 게놈을 포함하고, 이식유전자는 라사 바이러스 질환 항원을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특정 실시예에서, 라사 바이러스 항원은 재조합 NDV로 감염된 세포에 의해 발현된다. 재조합 NDV는 임의의 투여 경로에 의해 대상체에게 투여될 수 있다. 또 다른 특정 실시예에서, 재조합 NDV는 대상체에게 비강내 투여된다. 일부 실시예에서, 재조합 NDV는 대상체에게 근육내 투여된다.
또 다른 측면에서, 대상체에게 제1 재조합 NDV 또는 이의 조성물을 투여하는 단계 및 대상체에게 제2 재조합 NDV 또는 이의 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 감염성 질환에 대해 대상체(예를 들어, 인간 대상체)를 면역화하는 방법이 본원에 제공되며, 여기서 제1 및 제2 재조합 NDV는 서로 면역학적으로 구별된다. 일 실시예에서, 대상체에게 제1 재조합 NDV 또는 이의 조성물을 투여하는 단계 및 대상체에게 제2 재조합 NDV 또는 이의 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 감염성 질환에 대해 대상체(예를 들어, 인간 대상체)를 순차적으로 면역화하는 방법이 본원에 제공되며, 여기서 제1 및 제2 재조합 NDV는 서로 면역학적으로 구별된다. 특정 실시예에서, 제1 및 제2 재조합 NDV는 2주, 3주, 4주, 6주, 1개월, 3개월, 6개월, 9개월 또는 1년 간격으로 투여될 수 있다. 일부 실시예에서, 제1 및 제2 재조합 NDV는 2 내지 4주, 4 내지 6주, 1 내지 3개월, 3 내지 6개월, 3 내지 9개월, 6개월 내지 1년, 또는 1 내지 2년 간격으로 투여될 수 있다. 제1 및 제2 재조합 NDV 또는 이의 조성물은 동일한 투여 경로 또는 상이한 투여 경로에 의해 투여될 수 있다. 특정 실시예에서, 제1 및 제2 재조합 NDV는 NDV F 단백질 및/또는 HN 단백질을 상이한 비-NDV APMV F 단백질 및/또는 상이한 비-NDV APMV HN 단백질로 대체함으로써 서로 면역학적으로 구별된다. 예를 들어, 제1 재조합 NDV는 APMV-15의 F 및 HN 단백질을 포함할 수 있고, 제2 재조합 NDV는 APMV-21의 F 및 HN 단백질을 포함할 수 있다. 특정 실시예에서, 제1 재조합 NDV 및 제2 재조합 NDV가, Chumbe 등, 2017, Virology Journal 14: 232 및 Reynolds 등, 1999, Avian Dis. 143:564-71, Sun 등, 2020, EBioMedicine 62: 103132, 또는 Sun 등, 2020, Vaccines 8: 771, 또는 본원에서 설명되는 바와 같은, 바이러스 중성화 검정에 의해 평가되는 바와 같이 서로의 복제를 유의하게 억제하는 항체를 유도하지 않는 경우, 제1 재조합 NDV는 제2 재조합 NDV와 면역학적으로 구별된다. 특정 실시예에서, 제1 재조합 NDV 및 제2 재조합 NDV가, 예를 들어, Chumbe 등, 2017, Virology Journal 14: 232 및 Reynolds 등, 1999, Avian Dis. 143:564-71, Sun 등, 2020, EBioMedicine 62: 103132, 또는 Sun 등, 2020, Vaccines 8: 771, 또는 본원에서 설명되는 바와 같은, 바이러스 중성화 검정에서, 약 0.5 log 미만, 약 1 log 미만, 약 1.5 log 미만, 또는 약 2 log 미만 만큼, 서로의 복제를 억제하는 항체를 유도하는 경우, 제1 재조합 NDV는 제2 재조합 NDV와 면역학적으로 구별되는 것으로 간주된다. 일부 실시예에서, 상기 방법은 제3 재조합 NDV 또는 이의 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함하고, 여기서 제3 재조합 NDV는 제1 재조합 NDV, 제2 재조합 NDV, 또는 제1 및 제2 재조합 NDV 둘 모두와 면역학적으로 구별된다. 특정 실시예에서, 상기 방법은 제3 재조합 NDV 또는 이의 조성물 및 제4 재조합 NDV 또는 이의 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함하고, 여기서 제3 재조합 NDV 및 제4 재조합 NDV는 서로 면역학적으로 구별되고, 제3 및 제4 재조합 NDV는 제1 재조합 NDV, 제2 재조합 NDV, 또는 제1 및 제2 재조합 NDV 둘 모두와 면역학적으로 구별된다. 특정 실시예에서, 재조합 NDV가, 예를 들어, Chumbe 등, 2017, Virology Journal 14: 232 및 Reynolds 등, 1999, Avian Dis. 143:564-71, Sun 등, 2020, EBioMedicine 62: 103132, 또는 Sun 등, 2020, Vaccines 8: 771, 또는 본원에서 설명되는 바와 같은, 바이러스 중성화 검정에서, 약 0.5 log 미만, 약 1 log 미만, 약 1.5 log 미만, 또는 약 2 log 미만 만큼, 다른 재조합 NDV의 복제를 억제하는 항체를 유도하는 경우, 재조합 NDV는 다른 재조합 NDV와 면역학적으로 구별되는 것으로 간주된다.
일 실시예에서, 제1 재조합 NDV를 대상체에게 투여하는 단계, 제2 재조합 NDV를 대상체에게 투여하는 단계, 및 제3 재조합 NDV를 대상체에게 투여하는 단계를 단계를 포함하는 감염성 질환에 대해 대상체(예를 들어, 인간 대상체)를 순차적으로 면역화하는 방법이 본원에 제공되며, 여기서 제1 재조합 NDV, 제2 재조합 NDV, 및 제3 재조합 NDV는 서로 면역학적으로 구별된다. 특정 실시예에서, 제1 및 제2 재조합 NDV는 2주, 3주, 4주, 6주, 1개월, 3개월, 6개월, 9개월 또는 1년 간격으로 투여될 수 있다. 일부 실시예에서, 제1 및 제2 재조합 NDV는 2 내지 4주, 4 내지 6주, 1 내지 3개월, 3 내지 6개월, 3 내지 9개월, 6개월 내지 1년, 또는 1 내지 2년 간격으로 투여될 수 있다. 특정 실시예에서, 제1, 제2 및 제3 재조합 NDV는 NDV F 단백질 및/또는 HN 단백질을 서로 상이한 비-NDV APMV F 단백질 및/또는 상이한 비-NDV APMV HN 단백질로 대체함으로써 서로 면역학적으로 구별된다. 예를 들어, 제1 재조합 NDV는 APMV-15의 F 및 HN 단백질을 포함할 수 있고, 제2 재조합 NDV는 APMV-21의 F 및 HN 단백질을 포함할 수 있고, 제3 재조합 NDV는 APMV-10의 F 및 HN 단백질을 포함할 수 있다.
특정 실시예에서, 서로 면역학적으로 구별되는 본원에서 설명되는 둘 이상의 재조합 NDV는 감염성 질환에 대해 대상체(예를 들어, 인간)를 면역화하는 데 사용될 수 있다. 다른 특정 실시예에서, 서로 면역학적으로 구별되는 본원에서 설명되는 둘 이상의 재조합 NDV는 암에 대해 대상체(예를 들어, 인간)를 면역화하는 데 사용될 수 있다. 특정 실시예에서, NDV F 단백질 및/또는 NDV HN 단백질이 상이한 비-NDV APMV F 단백질 또는 이의 변이체 및/또는 서로 상이한 비-NDV APMV HN 단백질 또는 이의 변이체로 대체된 2개 이상의 재조합 NDV의 사용은 항원(들)에 대한 강력한 면역 반응을 유도하기 위해 항원(들)을 대상체(예를 들어, 인간)에게 다회 투여할 수 있게 한다.
또 다른 측면에서, 제1 재조합 NDV 또는 이의 조성물을 대상체에게 투여하는 단계 및 제2 재조합 NDV 또는 이의 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 대상체(예를 들어, 인간 대상체)에서 감염성 질환 항원에 대한 면역 반응을 유도하는 방법이 본원에 제공되며, 여기서 제1 및 제2 재조합 NDV는 서로 면역학적으로 구별된다. 특정 실시예에서, 제1 및 제2 재조합 NDV는 2주, 3주, 4주, 6주, 1개월, 3개월, 6개월, 9개월 또는 1년 간격으로 투여될 수 있다. 일부 실시예에서, 제1 및 제2 재조합 NDV는 2 내지 4주, 4 내지 6주, 1 내지 3개월, 3 내지 6개월, 3 내지 9개월, 6개월 내지 1년, 또는 1 내지 2년 간격으로 투여될 수 있다. 제1 및 제2 재조합 NDV 또는 이의 조성물은 동일한 투여 경로 또는 상이한 투여 경로에 의해 투여될 수 있다. 일부 실시예에서, 제1 재조합 NDV에 의해 발현된 항원 및 제2 재조합 NDV에 의해 발현된 항원은 상이한 병원균 출처이거나 이로부터 유래된다. 다른 실시예에서, 제1 재조합 NDV에 의해 발현된 항원 및 제2 재조합 NDV에 의해 발현된 항원은 동일한 병원균 출처이거나 이로부터 유래된다. 제1 및 제2 재조합 NDV에 의해 발현된 항원은 동일할 수 있거나, 제2 재조합 NDV에 의해 발현된 항원은 이의 변이체일 수 있다. 예를 들어, 제1 재조합 NDV에 의해 발현된 항원은 하나의 균주로부터의 SARS-CoV-2 스파이크 단백질 또는 이의 단편(예를 들어, 수용체 결합 도메인을 포함하는 단편)일 수 있고, 제2 재조합 NDV에 의해 발현된 항원은 SARS-CoV-2의 변이체 균주로부터의 SARS-CoV-2 스파이크 단백질 또는 이의 단편(예를 들어, 수용체 결합 도메인을 포함하는 단편)일 수 있다. 특정 실시예에서, 제1 및 제2 재조합 NDV는 NDV F 단백질 및/또는 HN 단백질을 상이한 비-NDV APMV F 단백질 및/또는 상이한 비-NDV APMV HN 단백질로 대체함으로써 서로 면역학적으로 구별된다. 예를 들어, 제1 재조합 NDV는 APMV-15의 F 및 HN 단백질을 포함할 수 있고, 제2 재조합 NDV는 APMV-21의 F 및 HN 단백질을 포함할 수 있다. 특정 실시예에서, 제1 재조합 NDV 및 제2 재조합 NDV가 Chumbe 등, 2017, Virology Journal 14: 232 및 Reynolds 등, 1999, Avian Dis. 143:564-71, Sun 등, 2020, EBioMedicine 62: 103132, 또는 Sun 등, 2020, Vaccines 8: 771, 또는 본원에서 설명되는 바와 같은, 바이러스 중성화 검정에 의해 평가되는 바와 같이 서로의 복제를 유의하게 억제하는 항체를 유도하지 않는 경우, 제1 재조합 NDV는 제2 재조합 NDV와 면역학적으로 구별된다. 특정 실시예에서, 제1 재조합 NDV 및 제2 재조합 NDV가, 예를 들어, Chumbe 등, 2017, Virology Journal 14: 232 및 Reynolds 등, 1999, Avian Dis. 143:564-71, Sun 등, 2020, EBioMedicine 62: 103132, 또는 Sun 등, 2020, Vaccines 8: 771, 또는 본원에서 설명되는 바와 같은, 바이러스 중성화 검정에서, 약 0.5 log 미만, 약 1 log 미만, 약 1.5 log 미만, 또는 약 2 log 미만 만큼, 서로의 복제를 억제하는 항체를 유도하는 경우, 제1 재조합 NDV는 제2 재조합 NDV와 면역학적으로 구별되는 것으로 간주된다. 일부 실시예에서, 상기 방법은 제3 재조합 NDV 또는 이의 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함하고, 여기서 제3 재조합 NDV는 제1 재조합 NDV, 제2 재조합 NDV, 또는 제1 및 제2 재조합 NDV 둘 모두와 면역학적으로 구별된다. 특정 실시예에서, 상기 방법은 제3 재조합 NDV 또는 이의 조성물 및 제4 재조합 NDV 또는 이의 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함하고, 여기서 제3 재조합 NDV 및 제4 재조합 NDV는 서로 면역학적으로 구별되고, 제3 및 제4 재조합 NDV는 제1 재조합 NDV, 제2 재조합 NDV, 또는 제1 및 제2 재조합 NDV 둘 모두와 면역학적으로 구별된다.
또 다른 측면에서, 제1 재조합 NDV 또는 이의 조성물을 대상체에게 투여하는 단계 및 제2 재조합 NDV 또는 이의 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 암에 대해 대상체(예를 들어, 인간 대상체)를 면역화하는 방법이 본원에 제공되며, 여기서 제1 및 제2 재조합 NDV는 서로 면역학적으로 구별된다. 일 실시예에서, 제1 재조합 NDV 또는 이의 조성물을 대상체에게 투여하는 단계 및 제2 재조합 NDV 또는 이의 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 암에 대해 대상체(예를 들어, 인간 대상체)를 순차적으로 면역화하는 방법이 본원에 제공되며, 여기서 제1 및 제2 재조합 NDV는 서로 면역학적으로 구별된다. 특정 실시예에서, 제1 및 제2 재조합 NDV는 2주, 3주, 4주, 6주, 1개월, 3개월, 6개월, 9개월 또는 1년 간격으로 투여될 수 있다. 일부 실시예에서, 제1 및 제2 재조합 NDV는 2 내지 4주, 4 내지 6주, 1 내지 3개월, 3 내지 6개월, 3 내지 9개월, 6개월 내지 1년, 또는 1 내지 2년 간격으로 투여될 수 있다. 제1 및 제2 재조합 NDV 또는 이의 조성물은 동일한 투여 경로 또는 상이한 투여 경로에 의해 투여될 수 있다. 특정 실시예에서, 제1 및 제2 재조합 NDV는 NDV F 단백질 및/또는 HN 단백질을 상이한 비-NDV APMV F 단백질 및/또는 상이한 비-NDV APMV HN 단백질로 대체함으로써 서로 면역학적으로 구별된다. 예를 들어, 제1 재조합 NDV는 APMV-15의 F 및 HN 단백질을 포함할 수 있고, 제2 재조합 NDV는 APMV-21의 F 및 HN 단백질을 포함할 수 있다. 특정 실시예에서, 제1 재조합 NDV 및 제2 재조합 NDV가 Chumbe 등, 2017, Virology Journal 14: 232 및 Reynolds 등, 1999, Avian Dis. 143:564-71, Sun 등, 2020, EBioMedicine 62: 103132, 또는 Sun 등, 2020, Vaccines 8: 771, 또는 본원에서 설명되는 바와 같은, 바이러스 중성화 검정에 의해 평가되는 바와 같이 서로의 복제를 유의하게 억제하는 항체를 유도하지 않는 경우, 제1 재조합 NDV는 제2 재조합 NDV와 면역학적으로 구별된다. 특정 실시예에서, 제1 재조합 NDV 및 제2 재조합 NDV가, 예를 들어, Chumbe 등, 2017, Virology Journal 14: 232 및 Reynolds 등, 1999, Avian Dis. 143:564-71, Sun 등, 2020, EBioMedicine 62: 103132, 또는 Sun 등, 2020, Vaccines 8: 771, 또는 본원에서 설명되는 바와 같은, 바이러스 중성화 검정에서, 약 0.5 log 미만, 약 1 log 미만, 약 1.5 log 미만, 또는 약 2 log 미만 만큼, 서로의 복제를 억제하는 항체를 유도하는 경우, 제1 재조합 NDV는 제2 재조합 NDV와 면역학적으로 구별되는 것으로 간주된다. 일부 실시예에서, 상기 방법은 제3 재조합 NDV 또는 이의 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함하고, 여기서 제3 재조합 NDV는 제1 재조합 NDV, 제2 재조합 NDV, 또는 제1 및 제2 재조합 NDV 둘 모두와 면역학적으로 구별된다. 특정 실시예에서, 상기 방법은 제3 재조합 NDV 또는 이의 조성물 및 제4 재조합 NDV 또는 이의 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함하고, 여기서 제3 재조합 NDV 및 제4 재조합 NDV는 서로 면역학적으로 구별되고, 제3 및 제4 재조합 NDV는 제1 재조합 NDV, 제2 재조합 NDV, 또는 제1 및 제2 재조합 NDV 둘 모두와 면역학적으로 구별된다.
또 다른 측면에서, 대상체에게 제1 재조합 NDV 또는 이의 조성물을 투여하는 단계 및 대상체에게 제2 재조합 NDV 또는 이의 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 대상체(예를 들어, 인간 대상체)에서 암 또는 종양 항원에 대한 면역 반응을 유도하는 방법이 본원에 제공되며, 여기서 제1 및 제2 재조합 NDV는 서로 면역학적으로 구별된다. 특정 실시예에서, 제1 및 제2 재조합 NDV는 2주, 3주, 4주, 6주, 1개월, 3개월, 6개월, 9개월 또는 1년 간격으로 투여될 수 있다. 일부 실시예에서, 제1 및 제2 재조합 NDV는 2 내지 4주, 4 내지 6주, 1 내지 3개월, 3 내지 6개월, 3 내지 9개월, 6개월 내지 1년, 또는 1 내지 2년 간격으로 투여될 수 있다. 일부 실시예에서, 제1 재조합 NDV에 의해 발현된 암 또는 종양 항원 및 제2 재조합 NDV에 의해 발현된 암 또는 종양 항원은 상이하다. 특정 실시예에서, 제1 재조합 NDV에 의해 발현된 암 또는 종양 항원 및 제2 재조합 NDV에 의해 발현된 암 또는 종양 항원은 동일한 유형의 암 또는 종양 출처이거나 이로부터 유래된다. 제1 및 제2 재조합 NDV에 의해 발현된 암 또는 종양 항원은 동일할 수 있거나, 제2 재조합 NDV에 의해 발현된 암 또는 종양 항원은 이의 변이체일 수 있다. 특정 실시예에서, 제1 및 제2 재조합 NDV는 NDV F 단백질 및/또는 HN 단백질을 상이한 비-NDV APMV F 단백질 및/또는 상이한 비-NDV APMV HN 단백질로 대체함으로써 서로 면역학적으로 구별된다. 예를 들어, 제1 재조합 NDV는 APMV-15의 F 및 HN 단백질을 포함할 수 있고, 제2 재조합 NDV는 APMV-21의 F 및 HN 단백질을 포함할 수 있다. 특정 실시예에서, 제1 재조합 NDV 및 제2 재조합 NDV가 Chumbe 등, 2017, Virology Journal 14: 232 및 Reynolds 등, 1999, Avian Dis. 143:564-71, Sun 등, 2020, EBioMedicine 62: 103132, 또는 Sun 등, 2020, Vaccines 8: 771, 또는 본원에서 설명되는 바와 같은, 바이러스 중성화 검정에 의해 평가되는 바와 같이 서로의 복제를 유의하게 억제하는 항체를 유도하지 않는 경우, 제1 재조합 NDV는 제2 재조합 NDV와 면역학적으로 구별된다. 특정 실시예에서, 제1 재조합 NDV 및 제2 재조합 NDV가, 예를 들어, Chumbe 등, 2017, Virology Journal 14: 232 및 Reynolds 등, 1999, Avian Dis. 143:564-71, Sun 등, 2020, EBioMedicine 62: 103132, 또는 Sun 등, 2020, Vaccines 8: 771, 또는 본원에서 설명되는 바와 같은, 바이러스 중성화 검정에서, 약 0.5 log 미만, 약 1 log 미만, 약 1.5 log 미만, 또는 약 2 log 미만 만큼, 서로의 복제를 억제하는 항체를 유도하는 경우, 제1 재조합 NDV는 제2 재조합 NDV와 면역학적으로 구별되는 것으로 간주된다. 일부 실시예에서, 상기 방법은 제3 재조합 NDV 또는 이의 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함하고, 여기서 제3 재조합 NDV는 제1 재조합 NDV, 제2 재조합 NDV, 또는 제1 및 제2 재조합 NDV 둘 모두와 면역학적으로 구별된다. 특정 실시예에서, 상기 방법은 제3 재조합 NDV 또는 이의 조성물 및 제4 재조합 NDV 또는 이의 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함하고, 여기서 제3 재조합 NDV 및 제4 재조합 NDV는 서로 면역학적으로 구별되고, 제3 및 제4 재조합 NDV는 제1 재조합 NDV, 제2 재조합 NDV, 또는 제1 및 제2 재조합 NDV 둘 모두와 면역학적으로 구별된다.
또 다른 측면에서, 본원에서 설명되는 재조합 NDV 또는 이의 조성물을 대상체(예를 들어, 인간 대상체)에게 투여하는 단계를 포함하는 감염성 질환의 예방 방법이 본원에 제공되며, 여기서 재조합 NDV는 감염성 질환과 연관된 항원을 암호화하는 이식유전자를 포함하는 포장된 게놈을 포함한다. 일 실시예에서, 감염성 질환의 예방 방법이 본원에 제공되며, 상기 방법은 본원에서 설명되는 재조합 NDV의 유효량을 대상체(예를 들어, 인간 대상체)에게 투여하는 단계를 포함하고, 재조합 NDV는 감염성 질환과 연관된 항원을 암호화하는 이식유전자를 포함하는 포장된 게놈을 포함한다. 재조합 NDV에 대해서는, 예를 들어, 섹션 5.1 및 6을 참조한다. 재조합 NDV는 임의의 투여 경로에 의해 대상체에게 투여될 수 있다. 또 다른 특정 실시예에서, 재조합 NDV는 대상체에게 비강내 투여된다. 일부 실시예에서, 재조합 NDV는 대상체에게 근육내 투여된다. 일부 실시예에서, 상기 방법은 제2 재조합 NDV 또는 이의 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함하고, 여기서 제2 재조합 NDV는 제1 재조합 NDV와 면역학적으로 구별된다. 특정 실시예에서, 제1 및 제2 재조합 NDV는 2주, 3주, 4주, 6주, 1개월, 3개월, 6개월, 9개월 또는 1년 간격으로 투여될 수 있다. 일부 실시예에서, 제1 및 제2 재조합 NDV는 2 내지 4주, 4 내지 6주, 1 내지 3개월, 3 내지 6개월, 3 내지 9개월, 6개월 내지 1년, 또는 1 내지 2년 간격으로 투여될 수 있다. 제1 및 제2 재조합 NDV 또는 이의 조성물은 동일한 투여 경로 또는 상이한 투여 경로에 의해 투여될 수 있다. 특정 실시예에서, 제1 및 제2 재조합 NDV는 NDV F 단백질 및/또는 HN 단백질을 상이한 비-NDV APMV F 단백질 및/또는 상이한 비-NDV APMV HN 단백질로 대체함으로써 서로 면역학적으로 구별된다. 예를 들어, 제1 재조합 NDV는 APMV-15의 F 및 HN 단백질을 포함할 수 있고, 제2 재조합 NDV는 APMV-21의 F 및 HN 단백질을 포함할 수 있다. 특정 실시예에서, 제1 재조합 NDV 및 제2 재조합 NDV가 Chumbe 등, 2017, Virology Journal 14: 232 및 Reynolds 등, 1999, Avian Dis. 143:564-71, Sun 등, 2020, EBioMedicine 62: 103132, 또는 Sun 등, 2020, Vaccines 8: 771, 또는 본원에서 설명되는 바와 같은, 바이러스 중성화 검정에 의해 평가되는 바와 같이 서로의 복제를 유의하게 억제하는 항체를 유도하지 않는 경우, 제1 재조합 NDV는 제2 재조합 NDV와 면역학적으로 구별된다. 특정 실시예에서, 제1 재조합 NDV 및 제2 재조합 NDV가, 예를 들어, Chumbe 등, 2017, Virology Journal 14: 232 및 Reynolds 등, 1999, Avian Dis. 143:564-71, Sun 등, 2020, EBioMedicine 62: 103132, 또는 Sun 등, 2020, Vaccines 8: 771, 또는 본원에서 설명되는 바와 같은, 바이러스 중성화 검정에서, 약 0.5 log 미만, 약 1 log 미만, 약 1.5 log 미만, 또는 약 2 log 미만 만큼, 서로의 복제를 억제하는 항체를 유도하는 경우, 제1 재조합 NDV는 제2 재조합 NDV와 면역학적으로 구별되는 것으로 간주된다. 일부 실시예에서, 상기 방법은 제3 재조합 NDV 또는 이의 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함하고, 여기서 제3 재조합 NDV는 제1 재조합 NDV, 제2 재조합 NDV, 또는 제1 및 제2 재조합 NDV 둘 모두와 면역학적으로 구별된다. 특정 실시예에서, 상기 방법은 제3 재조합 NDV 또는 이의 조성물 및 제4 재조합 NDV 또는 이의 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함하고, 여기서 제3 재조합 NDV 및 제4 재조합 NDV는 서로 면역학적으로 구별되고, 제3 및 제4 재조합 NDV는 제1 재조합 NDV, 제2 재조합 NDV, 또는 제1 및 제2 재조합 NDV 둘 모두와 면역학적으로 구별된다.
특정 실시예에서, 본원에서 설명되는 재조합 NDV 또는 이의 조성물을 대상체(예를 들어, 인간 대상체)에게 투여하는 단계를 포함하는 RSV 질환을 예방하기 위한 방법이 본원에 제공되며, 여기서 재조합 NDV는 이식유전자를 포함하는 포장된 게놈을 포함하고, 이식유전자는 RSV 항원을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특정 실시예에서, RSV 항원은 재조합 NDV로 감염된 세포에 의해 발현된다. 재조합 NDV는 임의의 투여 경로에 의해 대상체에게 투여될 수 있다. 또 다른 특정 실시예에서, 재조합 NDV는 대상체에게 비강내 투여된다. 일부 실시예에서, 재조합 NDV는 대상체에게 근육내 투여된다. 일부 실시예에서, 상기 방법은 제2 재조합 NDV 또는 이의 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함하고, 여기서 제2 재조합 NDV는 제1 재조합 NDV와 면역학적으로 구별된다. 제2 재조합 NDV는 동일한 RSV 항원 또는 상이한 RSV 항원을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 이식유전자를 포함할 수 있다.
특정 실시예에서, 본원에서 설명되는 재조합 NDV 또는 이의 조성물을 대상체(예를 들어, 인간 대상체)에게 투여하는 단계를 포함하는 인간 메타뉴모바이러스 질환을 예방하는 방법이 본원에 제공되며, 여기서 재조합 NDV는 이식유전자를 포함하는 포장된 게놈을 포함하고, 이식유전자는 인간 메타뉴모바이러스 항원을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특정 실시예에서, 인간 메타뉴모바이러스 항원은 재조합 NDV로 감염된 세포에 의해 발현된다. 재조합 NDV는 임의의 투여 경로에 의해 대상체에게 투여될 수 있다. 또 다른 특정 실시예에서, 재조합 NDV는 대상체에게 비강내 투여된다. 일부 실시예에서, 재조합 NDV는 대상체에게 근육내 투여된다. 일부 실시예에서, 상기 방법은 제2 재조합 NDV 또는 이의 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함하고, 여기서 제2 재조합 NDV는 제1 재조합 NDV와 면역학적으로 구별된다. 제2 재조합 NDV는 동일한 hMPV 항원 또는 상이한 hMPV 항원을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 이식유전자를 포함할 수 있다.
특정 실시예에서, 본원에서 설명되는 재조합 NDV 또는 이의 조성물을 대상체(예를 들어, 인간 대상체)에게 투여하는 단계를 포함하는 COVID-19를 예방하는 방법이 본원에 제공되며, 여기서 재조합 NDV는 이식유전자를 포함하는 포장된 게놈을 포함하고, 이식유전자는 SARS-CoV-2 항원(예를 들어, SARS-CoV-2 스파이크 단백질 또는 이의 단편, 이러한 단편은 수용체 결합 도메인을 포함함)을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특정 실시예에서, SARS-CoV-2 항원은 재조합 NDV로 감염된 세포에 의해 발현된다. 재조합 NDV는 임의의 투여 경로에 의해 대상체에게 투여될 수 있다. 또 다른 특정 실시예에서, 재조합 NDV는 대상체에게 비강내 투여된다. 일부 실시예에서, 재조합 NDV는 대상체에게 근육내 투여된다. 일부 실시예에서, 상기 방법은 제2 재조합 NDV 또는 이의 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함하고, 여기서 제2 재조합 NDV는 제1 재조합 NDV와 면역학적으로 구별된다. 제2 재조합 NDV는 동일한 SARS-CoV-2 항원 또는 상이한 SARS-CoV-2 항원을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 이식유전자를 포함할 수 있다.
특정 실시예에서, 본원에서 설명되는 재조합 NDV 또는 이의 조성물을 대상체(예를 들어, 인간 대상체)에게 투여하는 단계를 포함하는 에볼라 바이러스 질환을 예방하기 위한 방법이 본원에 제공되며, 여기서 재조합 NDV는 이식유전자를 포함하는 포장된 게놈을 포함하고, 이식유전자는 에볼라 바이러스 질환 항원을 포함한다. 특정 실시예에서, 에볼라 바이러스 항원은 재조합 NDV로 감염된 세포에 의해 발현된다. 재조합 NDV는 임의의 투여 경로에 의해 대상체에게 투여될 수 있다. 또 다른 특정 실시예에서, 재조합 NDV는 대상체에게 비강내 투여된다. 일부 실시예에서, 재조합 NDV는 대상체에게 근육내 투여된다. 일부 실시예에서, 상기 방법은 제2 재조합 NDV 또는 이의 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함하고, 여기서 제2 재조합 NDV는 제1 재조합 NDV와 면역학적으로 구별된다. 제2 재조합 NDV는 동일한 에볼라 바이러스 항원 또는 상이한 에볼라 항원을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 이식유전자를 포함할 수 있다.
특정 실시예에서, 본원에서 설명되는 재조합 NDV 또는 이의 조성물을 대상체(예를 들어, 인간 대상체)에게 투여하는 단계를 포함하는 니파 바이러스 질환을 예방하기 위한 방법이 본원에 제공되며, 여기서 재조합 NDV는 이식유전자를 포함하는 포장된 게놈을 포함하고, 이식유전자는 니파 바이러스 질환 항원을 포함한다. 특정 실시예에서, 니파 바이러스 항원은 재조합 NDV로 감염된 세포에 의해 발현된다. 재조합 NDV는 임의의 투여 경로에 의해 대상체에게 투여될 수 있다. 또 다른 특정 실시예에서, 재조합 NDV는 대상체에게 비강내 투여된다. 일부 실시예에서, 재조합 NDV는 대상체에게 근육내 투여된다. 일부 실시예에서, 상기 방법은 제2 재조합 NDV 또는 이의 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함하고, 여기서 제2 재조합 NDV는 제1 재조합 NDV와 면역학적으로 구별된다. 제2 재조합 NDV는 동일한 니파 항원 또는 상이한 니파 항원을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 이식유전자를 포함할 수 있다.
특정 실시예에서, 본원에서 설명되는 재조합 NDV 또는 이의 조성물을 대상체(예를 들어, 인간 대상체)에게 투여하는 단계를 포함하는 MERS-CoV 질환을 예방하는 방법이 본원에 제공되며, 여기서 재조합 NDV는 이식유전자를 포함하는 포장된 게놈을 포함하고, 이식유전자는 MERS-CoV 질환 항원을 포함한다. 특정 실시예에서, MERS-CoV 항원은 재조합 NDV로 감염된 세포에 의해 발현된다. 재조합 NDV는 임의의 투여 경로에 의해 대상체에게 투여될 수 있다. 또 다른 특정 실시예에서, 재조합 NDV는 대상체에게 비강내 투여된다. 일부 실시예에서, 재조합 NDV는 대상체에게 근육내 투여된다. 일부 실시예에서, 상기 방법은 제2 재조합 NDV 또는 이의 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함하고, 여기서 제2 재조합 NDV는 제1 재조합 NDV와 면역학적으로 구별된다. 제2 재조합 NDV는 동일한 MERS-CoV 항원 또는 상이한 MERS-CoV 항원을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 이식유전자를 포함할 수 있다.
특정 실시예에서, 본원에서 설명되는 재조합 NDV 또는 이의 조성물을 대상(예를 들어, 인간 대상)에게 투여하는 단계를 포함하는 라사 바이러스 질환을 예방하는 방법이 본원에 제공되며, 여기서 재조합 NDV는 이식유전자를 포함하는 포장된 게놈을 포함하고, 이식유전자는 라사 바이러스 질환 항원을 포함한다. 특정 실시예에서, 라사 바이러스 항원은 재조합 NDV로 감염된 세포에 의해 발현된다. 재조합 NDV는 임의의 투여 경로에 의해 대상체에게 투여될 수 있다. 또 다른 특정 실시예에서, 재조합 NDV는 대상체에게 비강내 투여된다. 일부 실시예에서, 재조합 NDV는 대상체에게 근육내 투여된다. 일부 실시예에서, 상기 방법은 제2 재조합 NDV 또는 이의 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함하고, 여기서 제2 재조합 NDV는 제1 재조합 NDV와 면역학적으로 구별된다. 제2 재조합 NDV는 동일한 라사 바이러스 항원 또는 상이한 라사 바이러스 항원을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 이식유전자를 포함할 수 있다.
특정 실시예에서, 제1 재조합 NDV 및 제2 재조합 NDV가, 예를 들어, Chumbe 등, 2017, Virology Journal 14: 232 및 Reynolds 등, 1999, Avian Dis. 143:564-71, Sun 등, 2020, EBioMedicine 62: 103132, 또는 Sun 등, 2020, Vaccines 8: 771, 또는 본원에서 설명되는 바와 같은, 바이러스 중성화 검정에서, 약 0.5 log 미만, 약 1 log 미만, 약 1.5 log 미만, 또는 약 2 log 미만 만큼, 서로의 복제를 억제하는 항체를 유도하는 경우, 제1 재조합 NDV는 제2 재조합 NDV와 면역학적으로 구별되는 것으로 간주된다.
또 다른 측면에서, 암을 치료하기 위한 방법이 본원에 제공되며, 상기 방법은 본원에서 설명되는 재조합 NDV 또는 이의 조성물을 대상체(예를 들어, 인간 대상체)에게 투여하는 단계를 포함한다. 재조합 NDV에 대해서는, 예를 들어, 섹션 5.1 및 6을 참조한다. 재조합 NDV는 임의의 투여 경로에 의해 대상체에게 투여될 수 있다. 또 다른 특정 실시예에서, 재조합 NDV는 대상체에게 비강내 투여된다. 일부 실시예에서, 재조합 NDV는 대상체에게 근육내 투여된다. 일부 실시예에서, 상기 방법은 제2 재조합 NDV 또는 이의 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함하고, 여기서 제2 재조합 NDV는 제1 재조합 NDV와 면역학적으로 구별된다. 특정 실시예에서, 제1 및 제2 재조합 NDV는 2주, 3주, 4주, 6주, 1개월, 3개월, 6개월, 9개월 또는 1년 간격으로 투여될 수 있다. 일부 실시예에서, 제1 및 제2 재조합 NDV는 2 내지 4주, 4 내지 6주, 1 내지 3개월, 3 내지 6개월, 3 내지 9개월, 6개월 내지 1년, 또는 1 내지 2년 간격으로 투여될 수 있다. 제1 및 제2 재조합 NDV 또는 이의 조성물은 동일한 투여 경로 또는 상이한 투여 경로에 의해 투여될 수 있다. 특정 실시예에서, 제1 및 제2 재조합 NDV는 NDV F 단백질 및/또는 HN 단백질을 상이한 비-NDV APMV F 단백질 및/또는 상이한 비-NDV APMV HN 단백질로 대체함으로써 서로 면역학적으로 구별된다. 예를 들어, 제1 재조합 NDV는 APMV-15의 F 및 HN 단백질을 포함할 수 있고, 제2 재조합 NDV는 APMV-21의 F 및 HN 단백질을 포함할 수 있다. 특정 실시예에서, 제1 재조합 NDV 및 제2 재조합 NDV가 Chumbe 등, 2017, Virology Journal 14: 232 및 Reynolds 등, 1999, Avian Dis. 143:564-71, Sun 등, 2020, EBioMedicine 62: 103132, 또는 Sun 등, 2020, Vaccines 8: 771, 또는 본원에서 설명되는 바와 같은, 바이러스 중성화 검정에 의해 평가되는 바와 같이 서로의 복제를 유의하게 억제하는 항체를 유도하지 않는 경우, 제1 재조합 NDV는 제2 재조합 NDV와 면역학적으로 구별된다. 특정 실시예에서, 제1 재조합 NDV 및 제2 재조합 NDV가, 예를 들어, Chumbe 등, 2017, Virology Journal 14: 232 및 Reynolds 등, 1999, Avian Dis. 143:564-71, Sun 등, 2020, EBioMedicine 62: 103132, 또는 Sun 등, 2020, Vaccines 8: 771, 또는 본원에서 설명되는 바와 같은, 바이러스 중성화 검정에서, 약 0.5 log 미만, 약 1 log 미만, 약 1.5 log 미만, 또는 약 2 log 미만 만큼, 서로의 복제를 억제하는 항체를 유도하는 경우, 제1 재조합 NDV는 제2 재조합 NDV와 면역학적으로 구별되는 것으로 간주된다. 일부 실시예에서, 상기 방법은 제3 재조합 NDV 또는 이의 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함하고, 여기서 제3 재조합 NDV는 제1 재조합 NDV, 제2 재조합 NDV, 또는 제1 및 제2 재조합 NDV 둘 모두와 면역학적으로 구별된다. 특정 실시예에서, 상기 방법은 제3 재조합 NDV 또는 이의 조성물 및 제4 재조합 NDV 또는 이의 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함하고, 여기서 제3 재조합 NDV 및 제4 재조합 NDV는 서로 면역학적으로 구별되고, 제3 및 제4 재조합 NDV는 제1 재조합 NDV, 제2 재조합 NDV, 또는 제1 및 제2 재조합 NDV 둘 모두와 면역학적으로 구별된다.
또 다른 측면에서, 암을 치료하는 방법이 본원에 제공되며, 상기 방법은 본원에서 설명되는 재조합 NDV 또는 이의 조성물을 대상체(예를 들어, 인간 대상체)에게 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 재조합 NDV는 이식유전자를 포함하는 포장된 게놈을 포함하고, 이식유전자는 암 또는 종양 항원을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일 실시예에서, 암을 치료하기 위한 방법이 본원에 제공되며, 상기 방법은 본원에서 설명되는 재조합 NDV의 유효량을 대상체(예를 들어, 인간 대상체)에게 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 재조합 NDV는 이식유전자를 포함하는 포장된 게놈을 포함하고, 이식유전자는 암 또는 암과 연관된 종양 항원을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 재조합 NDV에 대해서는, 예를 들어, 섹션 5.1 및 6을 참조한다. 재조합 NDV는 임의의 투여 경로에 의해 대상체에게 투여될 수 있다. 또 다른 특정 실시예에서, 재조합 NDV는 대상체에게 비강내 투여된다. 일부 실시예에서, 재조합 NDV는 대상체에게 근육내 투여된다. 일부 실시예에서, 상기 방법은 제2 재조합 NDV 또는 이의 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함하고, 여기서 제2 재조합 NDV는 제1 재조합 NDV와 면역학적으로 구별된다. 특정 실시예에서, 제1 및 제2 재조합 NDV는 2주, 3주, 4주, 6주, 1개월, 3개월, 6개월, 9개월 또는 1년 간격으로 투여될 수 있다. 일부 실시예에서, 제1 및 제2 재조합 NDV는 2 내지 4주, 4 내지 6주, 1 내지 3개월, 3 내지 6개월, 3 내지 9개월, 6개월 내지 1년, 또는 1 내지 2년 간격으로 투여될 수 있다. 제1 재조합 NDV에 의해 발현된 암 또는 종양 항원은 제2 재조합 NDV에 의해 발현된 암 또는 종양 항원과 동일하거나 상이할 수 있다. 제1 및 제2 재조합 NDV 또는 이의 조성물은 동일한 투여 경로 또는 상이한 투여 경로에 의해 투여될 수 있다. 특정 실시예에서, 제1 및 제2 재조합 NDV는 NDV F 단백질 및/또는 HN 단백질을 상이한 비-NDV APMV F 단백질 및/또는 상이한 비-NDV APMV HN 단백질로 대체함으로써 서로 면역학적으로 구별된다. 예를 들어, 제1 재조합 NDV는 APMV-15의 F 및 HN 단백질을 포함할 수 있고, 제2 재조합 NDV는 APMV-21의 F 및 HN 단백질을 포함할 수 있다. 특정 실시예에서, 제1 재조합 NDV 및 제2 재조합 NDV가 Chumbe 등, 2017, Virology Journal 14: 232 및 Reynolds 등, 1999, Avian Dis. 143:564-71, Sun 등, 2020, EBioMedicine 62: 103132, 또는 Sun 등, 2020, Vaccines 8: 771, 또는 본원에서 설명되는 바와 같은, 바이러스 중성화 검정에 의해 평가되는 바와 같이 서로의 복제를 유의하게 억제하는 항체를 유도하지 않는 경우, 제1 재조합 NDV는 제2 재조합 NDV와 면역학적으로 구별된다. 특정 실시예에서, 제1 재조합 NDV 및 제2 재조합 NDV가, 예를 들어, Chumbe 등, 2017, Virology Journal 14: 232 및 Reynolds 등, 1999, Avian Dis. 143:564-71, Sun 등, 2020, EBioMedicine 62: 103132, 또는 Sun 등, 2020, Vaccines 8: 771, 또는 본원에서 설명되는 바와 같은, 바이러스 중성화 검정에서, 약 0.5 log 미만, 약 1 log 미만, 약 1.5 log 미만, 또는 약 2 log 미만 만큼, 서로의 복제를 억제하는 항체를 유도하는 경우, 제1 재조합 NDV는 제2 재조합 NDV와 면역학적으로 구별되는 것으로 간주된다. 일부 실시예에서, 상기 방법은 제3 재조합 NDV 또는 이의 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함하고, 여기서 제3 재조합 NDV는 제1 재조합 NDV, 제2 재조합 NDV, 또는 제1 및 제2 재조합 NDV 둘 모두와 면역학적으로 구별된다. 특정 실시예에서, 상기 방법은 제3 재조합 NDV 또는 이의 조성물 및 제4 재조합 NDV 또는 이의 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함하고, 여기서 제3 재조합 NDV 및 제4 재조합 NDV는 서로 면역학적으로 구별되고, 제3 및 제4 재조합 NDV는 제1 재조합 NDV, 제2 재조합 NDV, 또는 제1 및 제2 재조합 NDV 둘 모두와 면역학적으로 구별된다.
본원에서 설명되는 재조합 NDV는 하나 이상의 다른 요법과 조합하여 대상체에게 투여될 수 있다. 재조합 NDV 및 하나 이상의 다른 요법은 동일하거나 상이한 투여 경로에 의해 대상체에게 투여될 수 있다. 특정 실시예에서, 재조합 NDV는 대상체에게 비강내 투여된다. 재조합 NDV에 관한 정보는 아래, 예를 들어, 섹션 5.1 및 6, 다른 요법에 관한 정보는 아래, 섹션 5.5.2, 조성물 및 투여 경로에 관한 정보는 아래, 섹션 5.4를 참조한다.
재조합 NDV 및 하나 이상의 추가 요법은 대상체에게 동시에 또는 순차적으로 투여될 수 있다. 특정 실시예에서, 재조합 NDV 및 하나 이상의 추가 요법은 동일한 조성물로 투여된다. 다른 실시예에서, 재조합 NDV 및 하나 이상의 추가 요법은 상이한 조성물로 투여된다. 재조합 NDV 및 하나 이상의 다른 요법은 동일하거나 상이한 투여 경로에 의해 대상체에게 투여될 수 있다. 당해 분야의 숙련자에게 공지되거나 본원에서 설명되는 임의의 경로는 재조합 NDV 및 하나 이상의 다른 요법을 투여하는 데 사용될 수 있다. 특정 실시예에서, 재조합 NDV는 비강내 투여되고, 하나 이상의 다른 요법은 정맥내 투여된다.
일부 실시예에서, 본원에서 설명되는 재조합 NDV 또는 이의 조성물, 또는 본원에서 설명되는 병용 요법은 이전에 백신접종을 받았거나 NDV 조성물(예를 들어, 백신)을 투여한 대상체에게 투여된다. 특정 실시예에서, 본원에서 설명되는 재조합 NDV 또는 이의 조성물, 또는 본원에서 설명되는 병용 요법은 이전에 백신접종을 받았거나 APMV-계 조성물(예를 들어, 백신)을 투여받은 대상체에게 투여된다. 일부 실시예에서, 본원에서 설명되는 재조합 NDV 또는 이의 조성물, 또는 본원에서 설명되는 병용 요법은 이전에 NDV 조성물(예를 들어, 백신) 및 APMV-계 조성물(예를 들어, 백신)을 백신접종하거나 투여한 대상체에게 투여된다. 특정 실시예에서, APMV-계 조성물은 비-NDV APMV이다.
일부 실시예에서, 본원에서 설명되는 재조합 NDV 또는 이의 조성물, 또는 본원에서 설명되는 병용 요법은 감염성 질환의 1개, 2개 또는 그 이상의 증상의 발병을 방지하기 위해 환자에게 투여된다(이러한 환자는 감염이 발생할 위험이 있을 수 있음). 특정 실시예에서, 본원에서 설명되는 재조합 NDV 또는 이의 조성물, 또는 본원에서 설명되는 병용 요법을 대상체에게 투여하는 것은 감염성 질환의 하나 이상의 증상의 발병 또는 발생을 방지하고, 감염성 질환의 하나 이상의 증상의 중증도를 감소시키거나, 감염성 질환의 하나 이상의 증상의 발병 또는 발생을 방지하고, 감염성 질환의 하나 이상의 증상의 중증도를 감소시킨다.
일부 실시예에서, 본원에서 설명되는 재조합 NDV 또는 이의 조성물, 또는 본원에서 설명되는 병용 요법은 환자에게 투여되어 하나, 둘 또는 그 이상의 RSV 질환 증상의 발병을 방지한다. 특정 실시예에서, 본원에서 설명되는 재조합 NDV 또는 이의 조성물, 또는 본원에서 설명되는 병용 요법을 대상체에게 투여하면, 하나, 둘 이상의 RSV 질환의 증상의 발병 또는 발생을 예방하거나, 하나, 둘 이상의 RSV 질환의 증상의 중증도를 감소시키거나, 하나, 둘 이상의 RSV 질환의 증상의 발병 또는 발생을 예방하고, 하나, 둘 이상의 RSV 질환의 증상의 중증도를 감소시킨다. RSV 질환의 증상에는 코막힘 또는 콧물, 기침, 발열, 인후통, 두통, 천명, 빠르거나 얕은 호흡 또는 호흡 곤란, 산소 부족으로 인한 피부의 푸르스름한 색, 식욕 부족, 무기력 및 과민성이 포함된다. 또 다른 특정 실시예에서, 본원에서 설명되는 재조합 NDV 또는 이의 조성물, 또는 본원에서 설명되는 병용 요법을 대상체에게 투여하면 RSV 감염에 의해 야기되는 중이염을 예방한다. 또 다른 특정 실시예에서, 본원에서 설명되는 재조합 NDV 또는 이의 조성물, 또는 본원에서 설명되는 병용 요법을 대상체에게 투여하면 RSV 감염에 의해 야기되는 세기관지염을 예방한다. 또 다른 특정 실시예에서, 본원에서 설명되는 재조합 NDV 또는 이의 조성물, 또는 본원에서 설명되는 병용 요법을 대상체에게 투여하면 RSV 감염에 의해 야기되는 폐렴을 예방한다.
일부 실시예에서, 본원에서 설명되는 재조합 NDV 또는 이의 조성물, 또는 본원에서 설명되는 병용 요법은 에볼라 바이러스 질환의 하나, 둘 이상의 증상의 발병을 방지하기 위해 환자에게 투여된다. 특정 실시예에서, 본원에서 설명되는 재조합 NDV 또는 이의 조성물, 또는 본원에서 설명되는 병용 요법을 대상체에게 투여하면 에볼라 바이러스 질환의 하나, 둘 이상의 증상의 발병 또는 발생을 방지하거나, 에볼라 바이러스 질환의 하나, 둘 이상의 증상의 중증도를 감소시키거나, 에볼라 바이러스 질환의 하나, 둘 이상의 증상의 발병 또는 발생을 방지하고, 에볼라 바이러스 질환의 하나, 둘 이상의 증상의 중증도를 감소시킨다. 에볼라 바이러스 질환의 증상은 발열, 통증 및 통증(예를 들어, 중증 두통, 근육 및 관절 통증, 및 복부(위) 통증), 쇠약 및 피로, 위장 증상(예를 들어, 설사 및 구토), 복부(위) 통증, 및 설명할 수 없는 출혈, 출혈 또는 멍을 포함한다.
일부 실시예에서, 본원에서 설명되는 재조합 NDV 또는 이의 조성물, 또는 본원에서 설명되는 병용 요법은 hMPV 질환의 1개, 2개 또는 그 이상의 증상의 발병을 방지하기 위해 환자에게 투여된다(예를 들어, 이러한 환자는 hMPV 감염이 발생할 위험이 있음). 특정 실시예에서, 본원에서 설명되는 재조합 NDV 또는 이의 조성물, 또는 본원에서 설명되는 병용 요법을 대상체에게 투여하면 hMPV 질환의 하나 이상의 증상의 발병 또는 발생을 방지하거나, hMPV 질환의 하나 이상의 증상의 중증도를 감소시키거나, hMPV 질환의 하나 이상의 증상의 발병 또는 발생을 방지하고, hMPV 질환의 하나 이상의 증상의 중증도를 감소시킨다. hMPV 질환의 증상은 비충혈, 콧물, 발열, 기침, 인후통, 천명, 호흡 곤란, 식욕 부진, 무기력, 및 과민성을 포함한다. 또 다른 특정 실시예에서, 본원에서 설명되는 재조합 NDV 또는 이의 조성물, 또는 본원에서 설명되는 병용 요법을 대상체에게 투여하면 hMPV 감염에 의해 야기되는 세기관지염을 예방한다. 다른 특정 실시예에서, 본원에서 설명되는 재조합 NDV 또는 이의 조성물, 또는 본원에서 설명되는 병용 요법을 대상체에게 투여하면 hMPV 감염에 의해 야기되는 폐렴을 예방한다.
일부 실시예에서, 본원에서 설명되는 재조합 NDV 또는 이의 조성물, 또는 본원에서 설명되는 병용 요법은 라사 바이러스 질환의 1개, 2개 또는 그 이상의 증상의 발병을 방지하기 위해 환자에게 투여된다. 특정 실시예에서, 본원에서 설명되는 재조합 NDV 또는 이의 조성물, 또는 본원에서 설명되는 병용 요법을 대상체에게 투여하면 라사 바이러스 질환의 하나, 둘 이상의 증상의 발병 또는 발생을 방지하거나, 라사 바이러스 질환의 하나, 둘 이상의 증상의 중증도를 감소시키거나, 라사 바이러스 질환의 하나, 둘 이상의 증상의 발병 또는 발생을 방지하고, 라사 바이러스 질환의 하나, 둘 이상의 증상의 중증도를 감소시킨다. 라사 바이러스 질환의 증상은 경열, 전신 권태감 및 쇠약, 두통, 출혈, 호흡 곤란, 반복 구토, 얼굴 부종, 가슴, 등 및 복부의 통증, 쇼크, 청력 상실, 진전, 및 뇌염을 포함한다.
일부 실시예에서, 본원에서 설명되는 재조합 NDV 또는 이의 조성물, 또는 본원에서 설명되는 병용 요법은 MERS-CoV 질환의 1개, 2개 또는 그 이상의 증상의 발병을 방지하기 위해 환자에게 투여된다. 특정 실시예에서, 본원에서 설명되는 재조합 NDV 또는 이의 조성물, 또는 본원에서 설명되는 병용 요법을 대상체에게 투여하면 MERS-CoV 질환의 하나 이상의 증상의 발병 또는 발생을 예방하거나, MERS-CoV 질환의 하나 이상의 증상의 중증도를 감소시키거나, MERS-CoV 질환의 하나 이상의 증상의 발병 또는 발생을 예방하고, MERS-CoV 질환의 하나 이상의 증상의 중증도를 감소시킨다. MERS-CoV 질환의 증상은 발열, 기침, 및 호흡 곤란을 포함한다.
일부 실시예에서, 본원에서 설명되는 재조합 NDV 또는 이의 조성물, 또는 본원에서 설명되는 병용 요법은 니파 바이러스 질환의 하나, 둘 이상의 증상의 발병을 방지하기 위해 환자에게 투여된다. 특정 실시예에서, 본원에서 설명되는 재조합 NDV 또는 이의 조성물, 또는 본원에서 설명되는 병용 요법을 대상체에게 투여하면 니파 바이러스 질환의 하나, 둘 이상의 증상의 발병 또는 발생을 방지하거나, 니파 바이러스 질환의 하나, 둘 이상의 증상의 중증도를 감소시키거나, 니파 바이러스 질환의 하나, 둘 이상의 증상의 발병 또는 발생을 방지하고, 니파 바이러스 질환의 하나, 둘 이상의 증상의 중증도를 감소시킨다. 니파 바이러스 질환의 증상은 방향 감각 상실, 졸음, 혼동, 발작, 혼수 및 뇌 부종(뇌염)을 포함한다.
일부 실시예에서, 본원에서 설명되는 재조합 NDV 또는 이의 조성물, 또는 본원에서 설명되는 병용 요법은 COVID-19의 1개, 2개 또는 그 이상의 증상의 발병을 방지하기 위해 환자에게 투여된다. 특정 실시예에서, 본원에서 설명되는 재조합 NDV 또는 이의 조성물, 또는 본원에서 설명되는 병용 요법을 대상체에게 투여하면 COVID-19의 하나 이상의 증상의 발병 또는 발생을 방지하거나, COVID-19의 하나 이상의 증상의 중증도를 감소시키거나, COVID-19의 하나 이상의 증상의 발병 또는 발생을 방지하고 COVID-19의 하나 이상의 증상의 중증도를 감소시킨다. COVID-19의 증상은 코막힘 또는 콧물, 기침, 발열, 인후통, 두통, 천명, 빠르거나 얕은 호흡 또는 호흡 곤란, 산소 부족으로 인한 피부의 푸르스름한 색, 오한, 근육 통증, 미각 및/또는 냄새 상실, 메스꺼움, 구토, 및 설사를 포함한다. 또 다른 특정 실시예에서, 본원에서 설명되는 재조합 NDV 또는 이의 조성물, 또는 본원에서 설명되는 병용 요법을 대상체에게 투여하면 SARS-CoV-2 감염에 의해 야기되는 폐렴을 예방한다.
특정 실시예에서, 본원에서 설명되는 재조합 NDV 또는 이의 조성물, 또는 본원에서 설명되는 병용 요법을 대상체에게 투여하면 감염 확산을 예방한다. 또 다른 특정 실시예에서, 본원에서 설명되는 재조합 NDV 또는 이의 조성물, 또는 본원에서 설명되는 병용 요법을 대상체에게 투여하면 입원을 예방한다. 또 다른 특정 실시예에서, 본원에서 설명되는 재조합 NDV 또는 이의 조성물, 또는 본원에서 설명되는 병용 요법을 대상체에게 투여하면 재발성 감염을 예방한다.
일부 실시예에서, 본원에서 설명되는 재조합 NDV 또는 이의 조성물, 또는 본원에서 설명되는 병용 요법은 감염성 질환을 앓고 있는 대상체에게 투여된다. 다른 실시예에서, 본원에서 설명되는 NDV(예를 들어, 재조합 NDV) 또는 이의 조성물, 또는 본원에서 설명되는 병용 요법은 감염성 질환에 걸리기 쉽거나 걸리기 쉬운 대상체에게 투여된다. 일부 실시예에서, 본원에서 설명되는 재조합 NDV 또는 이의 조성물, 또는 본원에서 설명되는 병용 요법은 감염성 질환을 갖는 것으로 진단된 대상체에게 투여된다. 일부 실시예에서, NDV(예를 들어, 재조합 NDV) 또는 이의 조성물, 또는 본원에서 설명되는 병용 요법은 병원균에 대한 항체(예를 들어, SARS-CoV-2 항원, RSV 항원, 인간 메타뉴모바이러스 항원, 니파 바이러스 항원, MERS-CoV 항원, 라사 바이러스 항원 또는 에볼라 바이러스 항원에 대한 항체)에 대해 혈청 음성인 대상체에게 투여된다. 일부 실시예에서, NDV(예를 들어, 재조합 NDV) 또는 이의 조성물, 또는 본원에서 설명되는 병용 요법은 병원균에 대한 항체(예를 들어, SARS-CoV-2 항원, RSV 항원, 인간 메타뉴모바이러스 항원, 니파 바이러스 항원, MERS-CoV 항원, 라사 바이러스 항원 또는 에볼라 바이러스 항원에 대한 항체)에 대해 혈청 반응 양성인 대상체에게 투여된다. 특정 실시예에서, 대상체는 본원에서 설명되는 재조합 NDV 또는 이의 조성물, 또는 본원에서 설명되는 병용 요법의 투여 전에 항체에 대해 평가된다. 다른 실시예에서, 대상체는 본원에서 설명되는 재조합 NDV 또는 이의 조성물, 또는 본원에서 설명되는 병용 요법의 투여 전에 항체에 대해 평가되지 않는다.
특정 실시예에서, 본원에서 설명되는 암을 치료하는 방법은 암의 발생 또는 진행, 또는 이의 증상의 감소, 축소, 감쇠, 약화, 안정화, 관해, 억제, 저해 또는 정지와 같은, 대상체에게 유익한 효과를 초래할 수 있다. 특정 실시예에서, 본원에서 설명되는 암을 치료하는 방법은 다음 효과 중 적어도 1개, 2개 또는 그 이상을 야기한다: (i) 암의 중증도 및/또는 이와 관련된 증상의 감소 또는 완화; (ii) 암과 연관된 증상의 지속 기간의 감소; (iii) 암과 연관된 증상의 재발 방지; (iv) 암 및/또는 이와 연관된 증상의 퇴행; (v) 대상체의 입원 감소; (vi) 입원 기간의 감소; (vii) 대상체의 생존 증가; (viii) 암 및/또는 이와 연관된 증상의 진행 억제; (ix) 다른 요법의 치료 효과의 향상 또는 개선; (x) 암 세포 집단 감소 또는 제거; (xi) 종양 또는 신생물의 성장 감소; (xii) 종양 크기의 감소; (xiii) 종양 형성의 감소; (xiv) 일차, 국소 및/또는 전이성 암의 근치, 제거, 또는 제어; (xv) 전이의 수 또는 크기의 감소; (xvi) 사망률 감소; (xvii) 환자의 무암 생존율의 증가; (xviii) 무재발 생존 기간의 증가; (xix) 관해 상태의 환자 수의 증가; (xx) 입원율의 감소; (xxi) 종양 크기가 유지되고, 당해 분야의 숙련자가 이용할 수 있는 종래의 방법, 예컨대 MRI, X-선, CT 스캔 및 PET 스캔에 의해 측정했을 때 요법의 투여 후 종양의 크기가 증가하지 않거나 5% 또는 10% 미만 만큼 종양의 크기가 증가됨; (xxii) 암 및/또는 이와 연관된 증상의 발생 또는 발병의 예방; (xxiii) 환자에서 관해 길이의 증가; (xxiv) 암과 연관된 증상의 수의 감소; (xxv) 암 환자의 무증상 생존 기간의 증가; (xxvi) 전이의 제한 또는 감소; (xxvii) 전체적 생존; (xxviii) 무진행 생존 기간(예를 들어, RECIST v1.1.에 의해 평가된 바와 같음); (xxix) 전체적 반응률; 및/또는 (xxx) 응답 지속 시간의 증가. 일부 실시예에서, 대상체가 받는 치료/요법은 암을 치유하지 않지만, 질환의 진행 또는 악화를 방지한다. 특정 실시예에서, 본원에서 설명되는 암을 치료하는 방법은 암의 발병/발생을 예방하지 않지만, 암 증상의 발병을 예방할 수 있다. 당해 분야의 숙련자에게 공지된 임의의 방법을 사용하여 대상체가 받는 치료/요법을 평가할 수 있다. 특정 실시예에서, 치료/요법의 효능은 고형 종양에서의 반응 평가 기준("RECIST") 공개 규칙에 따라 평가된다. 특정 실시예에서, 치료/요법의 효능은 2000년 2월에 공개된 RECIST 규칙(또한 "RECIST 1"로도 지칭됨)에 따라 평가된다(예를 들어, Therasse 등, 2000, Journal of National Cancer Institute, 92(3):205-216 참조, 이는 그 전체가 참조로서 본원에 통합됨). 특정 실시예에서, 치료/요법의 효능은 2009년 1월에 공개된 RECIST 규칙("RECIST 1.1"로도 지칭됨)에 따라 평가된다(예를 들어, Eisenhauer 등, 2009, European Journal of Cancer, 45:228-247 참조, 이는 그 전체가 참조로서 본원에 통합됨). 특정 실시예에서, 치료/요법의 효능은 평가 시점에 당해 분야의 숙련자에 의해 이용되는 RECIST 규칙에 따라 평가된다. 특정 실시예에서, 효능은 면역 관련 RECIST("irRECIST") 공개 규칙에 따라 평가된다(예를 들어, Bohnsack 등, 2014, ESMO Abstract 4958 참조, 이는 그 전체가 참조로서 본원에 통합됨).
일부 실시예에서, 본원에서 설명되는 재조합 NDV 또는 이의 조성물, 또는 본원에서 설명되는 병용 요법의 대상체에게 투여하면 종양 내로 다음 세포 유형 중 하나, 둘 또는 전부의 침윤을 증가시킨다: (i) T 세포, (ii) 자연 살해(NK) 세포, 및 (iii) 수지상 세포. 특정 실시예에서, 본원에서 설명되는 재조합 NDV 또는 이의 조성물, 또는 본원에서 설명되는 병용 요법을 본원에서 설명되는 대상체에게 투여하면 종양 내로의 림프구 침윤이 증가한다. 특정 실시예에서, 본원에서 설명되는 재조합 NDV 또는 이의 조성물, 또는 본원에서 설명되는 병용 요법을 대상체에게 투여하면 종양 내로 T 세포 침윤(CD4+ T 세포 침윤 및/또는 CD8+ T 세포 침윤)을 증가시킨다. 특정 실시예에서, 본원에서 설명되는 재조합 NDV 또는 이의 조성물, 또는 병용 요법을 대상체에게 투여하면 종양에서 사이토카인 생산이 증가한다(예를 들어, INFγ, IL-2, 및/또는 TNF 생산이 증가함).
또 다른 특정 실시예에서, 본원에서 설명되는 재조합 NDV 또는 이의 조성물, 또는 본원에서 설명되는 병용 요법의 투여는 항원(예를 들어, 감염성 질환 항원, 또는 암 또는 종양 항원)에 대한 항체를 유도한다. 또 다른 특정 실시예에서, 본원에서 설명되는 재조합 NDV 또는 이의 조성물, 또는 본원에서 설명되는 병용 요법의 투여는, 예를 들어 중화 항체와 같은 항원(예를 들어, 감염성 질환 항원, 또는 암 또는 종양 항원)에 대한 점막 및 전신 항체 둘 다를 유도한다. 또 다른 특정 실시예에서, 본원에서 설명되는 재조합 NDV 또는 이의 조성물, 또는 본원에서 설명되는 병용 요법을 대상체에게 투여하면 항원(예를 들어, 감염성 질환 항원, 또는 암 또는 종양 항원)에 대한 중화 항체를 유도한다.
일부 실시예에서, 본원에서 설명되는 재조합 NDV 또는 이의 조성물, 또는 본원에서 설명되는 병용 요법은 암을 앓고 있는 대상체에게 투여된다. 다른 실시예에서, 본원에서 설명되는 NDV(예를 들어, 재조합 NDV) 또는 이의 조성물, 또는 본원에서 설명되는 병용 요법은 암에 걸리기 쉽거나 걸리기 쉬운 대상체에게 투여된다. 일부 실시예에서, 본원에서 설명되는 재조합 NDV 또는 이의 조성물, 또는 본원에서 설명되는 병용 요법은 암으로 진단된 대상체에게 투여된다.
특정 실시예에서, 본원에서 설명되는 재조합 NDV 또는 이의 조성물, 또는 본원에서 설명되는 병용 요법은 인간에게 투여된다.
5.5.1
투여 및 빈도
질환의 예방, 병원균에 대한 면역화, 또는 암을 치료하는 데 효과적일, 재조합 NDV 또는 이의 조성물의 양은 투여 경로, 대상체의 전반적인 건강 등에 따라 달라질 것이다. 투여를 위한 재조합 NDV의 적절한 투여 범위는 일반적으로 약 104 내지 약 1012이고, 필요에 따라 간격을 두고 1회, 2회, 3회, 4회 또는 그 이상 대상체에게 투여될 수 있다. 특정 실시예에서, NDV에 대한 임상시험에서 현재 사용되고 있는 것과 유사한 투여량이 대상체에게 투여된다.
특정 실시예에서, 재조합 NDV 또는 이의 조성물은 1회 투여량으로 대상체에게 투여되고, 이어서 1 내지 6주, 1 내지 5주, 1 내지 4주, 1 내지 3주, 1 내지 2주, 6 내지 12주, 3 내지 6개월, 6 내지 9개월, 6 내지 12개월, 또는 6 내지 9개월 후에 2차 투여량으로 투여된다. 이들 실시예에 따라, 추가 접종은 제2 접종 후 3 내지 6개월 또는 6 내지 12개월 간격으로 대상체에게 투여될 수 있다.
특정 실시예에서, 동일한 재조합 NDV 또는 이의 조성물의 투여는 반복될 수 있고, 투여는 적어도 1일, 2일, 3일, 5일, 6일, 7일, 10일, 14일, 15일, 21일, 28일, 30일, 45일, 2개월, 75일, 3개월, 또는 적어도 6개월만큼 분리될 수 있다. 다른 실시예에서, 동일한 재조합 NDV 또는 이의 조성물의 투여가 반복될 수 있고, 투여는 1 내지 14일, 1 내지 7일, 7 내지 14일, 1 내지 30일, 15 내지 30일, 15 내지 45일, 15 내지 75일, 15 내지 90일, 1 내지 3개월, 3 내지 6개월, 3 내지 12개월, 또는 6 내지 12개월만큼 분리될 수 있다. 일부 실시예에서, 제1 재조합 NDV 또는 이의 조성물이 대상체에게 투여되고, 이어서 제2 재조합 NDV 또는 이의 조성물이 투여된다. 일부 실시예에서, 제1 및 제2 재조합 NDV는 서로 상이하다. 예를 들어, 제1 재조합 NDV는 제1 유형의 비-NDV APMV(예: APMV-12)의 F 및 HN 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있고, 제2 재조합 NDV는 제2 유형의 비-NDV APMV(예: APMV-10)의 F 및 HN 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 특정 실시예에서, 제1 및 제2 재조합 NDV는 서로 면역학적으로 구별된다. 특정 실시예에서, 제1 및 제2 재조합 NDV 또는 이의 조성물은 적어도 1일, 2일, 3일, 5일, 6일, 7일, 10일, 14일, 15일, 21일, 28일, 30일, 45일, 2개월, 75일, 3개월, 또는 적어도 6개월만큼 분리될 수 있다. 다른 실시예에서, 제1 및 제2 재조합 NDV 또는 이의 조성물은 1 내지 14일, 1 내지 7일, 7 내지 14일, 1 내지 30일, 15 내지 30일, 15 내지 45일, 15 내지 75일, 15 내지 90일, 1 내지 3개월, 3 내지 6개월, 3 내지 12개월, 또는 6 내지 12개월만큼 분리될 수 있다.
특정 실시예에서, 재조합 NDV 또는 이의 조성물은 하기 섹션 5.5.2에 기술된 요법과 같은 하나 이상의 추가 요법과 조합하여 대상체에게 투여된다. 다른 하나 이상의 추가 요법의 투여량은, 예를 들어 요법, 투여 경로, 대상체의 전반적인 건강 등을 포함하는 다양한 인자에 따라 달라질 것이고, 의사의 판단에 따라 결정되어야 한다. 특정 실시예에서, 다른 요법의 투여량은 단일 제제로서 사용하기 위한 요법에 대해 권장되는 요법의 투여량 및/또는 빈도이며, 본원에 개시된 방법에 따라 사용된다. 승인된 요법에 대한 권장 용량은 의사의 데스크 기준(Physician's Desk Reference)에서 확인할 수 있다.
특정 실시예에서, 재조합 NDV 또는 이의 조성물은 하나 이상의 추가 요법의 투여와 동시에 대상체에게 투여된다. 특정 실시예에서, 재조합 NDV 및/또는 이의 조성물 및 하나 이상의 추가 요법은 서로 1분, 2분, 5분, 10분, 15분, 20분, 30분, 45분, 60분, 1.5시간, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 또는 6시간 이내에 대상체에게 투여된다. 특정 실시예에서, 재조합 NDV 및/또는 이의 조성물 및 하나 이상의 추가 요법은 서로 12시간, 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 2주, 3주, 4주, 5주, 6주, 7주, 8주 또는 12주 이내에 대상체에게 투여된다. 특정 실시예에서, 재조합 NDV 및/또는 이의 조성물 및 하나 이상의 추가 요법은 서로의 3-6개월, 6-9개월, 6-12개월, 또는 3개월, 4개월, 6개월, 9개월, 또는 12개월 이내에 대상체에게 투여된다.
특정 실시예에서, 제1 약학적 조성물은 프라이밍 투여량으로서 대상체에게 투여되고, 특정 기간(예를 들어, 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 또는 1-6개월) 후에 제2 약학적 조성물의 추가 투여량이 투여된다. 일부 실시예에서, 제2 약학적 조성물은 제1 약학적 조성물과 동일한 재조합 NDV를 포함한다. 다른 실시예에서, 제2 약학적 조성물은 제1 약학적 조성물의 재조합 NDV와 면역학적으로 구별되는 재조합 NDV를 포함한다. 특정 실시예에서, 제2 약학적 조성물은 F 단백질 및/또는 HN 단백질이 상이한 비-NDV APMV F 단백질 또는 이의 변이체 및/또는 상이한 비-NDV APMV HN 단백질 또는 이의 변이체로부터 유래한다는 것을 제외하고는 제1 약학적 조성물과 동일한 재조합 NDV를 포함한다.
5.5.2
추가 요법
본원에서 설명되는 재조합 NDV 또는 이의 조성물과 조합하여 사용될 수 있는 추가 요법은 아세트아미노펜, 화학요법제, 관문 억제제, 면역요법, 이부프로펜, 인후 캔디, 기침 억제제, 흡입기, 항생제 및 산소를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 특정 실시예에서, 추가 요법은 본원에서 설명되는 제2 재조합 NDV이다.
5.6
생물학적 검정
특정 실시예에서, 본원에서 설명되는 재조합 NDV, 또는 항원을 특성화하기 위해 당해 분야의 숙련자에게 공지된 생물학적 검정. 특정 실시예에서, 당해 분야의 숙련자에게 알려지거나 본원에서 설명되는 미세중화 검정을 사용하여 본원에서 설명되는 재조합 NDV에 결합하는 항체를 평가한다. 일부 실시예에서, 비-NDV APMV F 단백질 또는 이의 변이체에 결합하는 항-NDV F 항체의 능력은 당해 분야의 숙련자에게 공지된 임의의 방법(예: 면역분석)에 의해 평가될 수 있다. 특정 실시예에서, 비-NDV APMV HN 단백질 또는 이의 변이체에 결합하는 항-NDV HN 항체의 능력은 당해 분야의 숙련자에게 공지된 임의의 방법(예: 면역분석)에 의해 평가될 수 있다. 일부 실시예에서, 당해 분야의 숙련자에게 알려지거나 본원에서 설명되는 헤마글루티닌 억제 검정은 본원에서 설명되는 2개의 재조합 NDV, 또는 NDV 및 비-NDV APMV가 면역학적으로 구별되는지 여부를 평가하는 데 사용될 수 있다.
5.6.1
시험관 내
바이러스 검정
바이러스 검정은 당업계에 주지된 방법을 사용하여 시험관 내에서 배양된 세포에서 바이러스 복제(예를 들어, 플라크 형성에 의해 결정됨) 또는 바이러스 단백질(예를 들어, 웨스턴 블롯 분석에 의해 결정됨) 또는 바이러스 RNA(예를 들어, RT-PCR 또는 노던 블롯 분석에 의해 결정됨)의 생산을 간접적으로 측정하는 것들을 포함한다.
본원에서 설명되는 재조합 NDV의 성장은 당업계에 알려져 있거나 본원에서 설명되는 임의의 방법에 의해(예를 들어, 세포 배양물(예를 들어, 닭 배아 신장 세포의 배양물 또는 닭 배아 섬유아세포(CEF)의 배양물에서) 평가될 수 있다. 바이러스 역가는 본원에서 설명되는 재조합 NDV의 연속 희석물을 세포 배양물(예를 들어, CEF, MDCK, EFK-2 세포, Vero 세포, 일차 인간 제대 정맥 내피 세포(HUVEC), H292 인간 상피 세포주 또는 HeLa 세포), 유색 배아, 또는 살아있는 동물(예를 들어, 조류)에 접종함으로써 결정될 수 있다. 특정 시간 동안 바이러스를 인큐베이션한 후, 표준 방법을 사용하여 바이러스를 단리한다. 바이러스 역가의 물리적 정량화는 바이러스 상청액에 적용된 PCR(Quinn & Trevor, 1997; Morgan 등, 1990), 혈구 응집 분석, 조직 배양 감염성 투여량(TCID50) 또는 난자 감염성 투여량(EID50)을 사용하여 수행될 수 있다.
이종 펩티드 또는 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 혼입(예를 들어, 본원에서 설명되는 재조합 NDV의 게놈 내로의 이식유전자의 혼입은 당업계에 알려져 있거나 본원에서 설명되는 임의의 방법에 의해(예를 들어, 세포 배양, 동물 모델 또는 배아 난자에서의 바이러스 배양에서) 평가될 수 있다). 예를 들어, 배아 난자의 요막 유체의 세포 배양물로부터의 바이러스 입자는 수크로오스 쿠션을 통한 원심분리에 의해 정제될 수 있고, 이어서 당업계에 잘 알려진 방법을 사용하여 웨스턴 블롯에 의해 단백질 발현에 대해 분석될 수 있다. ELISA와 같은 다른 면역분석을 사용하여 단백질 발현을 검출할 수 있다.
면역형광 기반 접근법은 또한 바이러스를 검출하고 바이러스 성장을 평가하는 데 사용될 수 있다. 이러한 접근법은 당해 분야의 숙련자에게 잘 알려져 있으며, 예를 들어 형광 현미경 및 유세포 계측법이다. 형광 활성화 세포 분류(FACS)를 포함하는 유세포 계측 방법이 이용 가능하다(예를 들어, Owens 등 (1994) Flow Cytometry Principles for Clinical Laboratory Practice, John Wiley and Sons, Hoboken, NJ; Givan (2001) Flow Cytometry, 2 nd ed.; Wiley-Liss, Hoboken, NJ; Shapiro (2003) Practical Flow Cytometry, John Wiley and Sons, Hoboken, NJ). 예를 들어, 진단 시약으로서 사용하기 위한 핵산 프라이머 및 프로브, 폴리펩티드, 및 항체를 포함하는 핵산을 변형시키는 데 적합한 형광 시약이 이용 가능하다(Molecular Probesy (2003) Catalogue, Molecular Probes, Inc., Eugene, OR; Sigma-Aldrich (2003) Catalogue, St. Louis, MO).
면역계의 조직학의 표준 방법이 기술된다(예를 들어, Muller-Harmelink (ed.) (1986) Human Thymus: Histopathology and Pathology, Springer Verlag, New York, NY; Hiatt, 등. (2000) Color Atlas of Histology, Lippincott, Williams, and Wilkins, Phila, PA; Louis, 등. (2002) Basic Histology: Text and Atlas, McGraw-Hill, New York, NY).
5.6.2
인터페론 검정
본원에서 설명되는 재조합 NDV에 의한 IFN 유도 및 방출은 당해 분야의 숙련자에게 공지된 기술을 사용하여 결정될 수 있다. 예를 들어, 본원에서 설명되는 재조합 NDV 감염 후 세포에서 유도된 IFN의 양은 면역검정(예를 들어, ELISA 또는 웨스턴 블롯 분석)을 사용하여 결정되어 IFN 발현을 측정하거나 IFN에 의해 발현이 유도되는 단백질의 발현을 측정할 수 있다. 대안적으로, 유도된 IFN의 양은 당해 분야의 숙련자에게 공지된 노던 블롯 및 정량적 RT-PCR과 같은 검정에 의해 RNA 수준에서 측정될 수 있다. 특정 실시예에서, 방출된 IFN의 양은 ELISPOT 검정을 사용하여 측정될 수 있다. 또한, 사이토카인 및/또는 인터페론-자극 유전자의 유도 및 방출은, 예를 들어, 단백질 수준에서의 면역분석 또는 ELISPOT 검정 및/또는 RNA 수준에서의 정량적 RT-PCR 또는 노던 블롯에 의해 결정될 수 있다.
5.6.3
활성화 마커 검정 및 면역 세포 침윤 검정
면역 세포에 의한 T 세포 마커, B 세포 마커, 활성화 마커, 공동자극 분자, 리간드, 또는 억제 분자의 발현을 평가하기 위한 기술은 당해 분야의 숙련자에게 공지되어 있다. 예를 들어, 면역 세포에 의한 T 세포 마커, B 세포 마커, 활성화 마커, 공동자극 분자, 리간드, 또는 억제 분자의 발현은 유세포 계측법에 의해 평가될 수 있다.
5.6.4
독성 연구
일부 실시예에서, 본원에서 설명되는 재조합 NDV 또는 이의 조성물, 또는 본원에서 설명되는 병용 요법은 포유류, 바람직하게는 인간 세포주에서 세포독성에 대해 시험된다. 특정 실시예에서, 세포독성은 세포주의 다음의 비제한적인 예시 중 하나 이상에서 평가된다: U937, 인간 단핵구 세포주; 일차 말초 혈액 단핵 세포(PBMC); Huh7, 인간 간모세포종 세포주; HL60 세포, HT1080, HEK 293T 및 293H, MLPC 세포, 인간 배아 신장 세포주; 인간 흑색종 세포주, 예컨대 SkMel2, SkMel-119 및 SkMel-197; THP-1, 단핵구 세포; HeLa 세포주; 및 신경모세포종 세포주, 예컨대 MC-IXC, SK-N-MC, SK-N-MC, SK-N-DZ, SH-SY5Y, 및 BE(2)-C. 일부 실시예에서, ToxLite 검정이 세포독성을 평가하는 데 사용된다.
당업계에 주지된 많은 검정을 사용하여 본원에서 설명되는 재조합 NDV 또는 이의 조성물로 감염시킨 후 세포 또는 세포주의 생존력을 평가하고, 따라서 재조합 NDV 또는 이의 조성물의 세포독성을 결정할 수 있다. 예를 들어, 세포 증식은 브로모데옥시우리딘(BrdU) 혼입, (3H) 티미딘 혼입을 측정함으로써, 직접 세포 계수에 의해, 또는 원-종양유전자(예를 들어, fos, myc) 또는 세포 주기 마커(Rb, cdc2, 사이클린 A, D1, D2, D3, E 등)와 같은 공지된 유전자의 전사, 번역 또는 활성의 변화를 검출함으로써 분석될 수 있다. 이러한 단백질 및 mRNA의 수준 및 활성은 당업계에 잘 알려진 임의의 방법에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, 단백질은 상업적으로 이용 가능한 항체를 포함하는 항체를 사용하여 ELISA, 웨스턴 블롯 또는 면역침강과 같은 공지된 면역 진단 방법에 의해 정량화될 수 있다. mRNA는 당업계에 주지되어 있고 일상적인 방법을 사용하여, 예를 들어, 역전사와 관련하여 노던 분석, RNase 보호, 또는 중합효소 연쇄 반응을 사용하여 정량화될 수 있다. 세포 생존력은 당업계에 공지된 트립판-블루 염색 또는 다른 세포 사멸 또는 생존력 마커를 사용하여 평가될 수 있다. 특정 실시예에서, 세포 ATP의 수준은 결정된 세포 생존력으로 측정된다. 바람직한 실시예에서, 본원에서 설명되는 재조합 NDV 또는 이의 조성물은 건강한(즉, 비암성) 세포를 사멸시키지 않는다.
특정 실시예에서, 세포 생존력은 세포내 ATP의 수준을 측정하는 CellTiter-Glo 검정 키트(Promega)와 같은 당업계의 검정 표준을 사용하여 3일 및 7일의 기간에 측정될 수 있다. 세포 ATP의 감소는 세포독성 효과를 나타낸다. 또 다른 특정 실시예에서, 세포 생존력은 중성 적색 흡수 검정에서 측정될 수 있다. 다른 실시예에서, 형태학적 변화에 대한 시각적 관찰은 확대, 과립성, 거칠어진 에지를 갖는 세포, 막성 외관, 라운딩, 웰 표면으로부터의 탈리, 또는 다른 변화를 포함할 수 있다.
본원에서 설명되는 재조합 NDV 또는 이의 조성물, 또는 병용 요법은 동물 모델에서 생체 내 독성에 대해 시험될 수 있다. 예를 들어, 화합물이 RSV 감염 또는 hMPV 감염에 미치는 효과를 시험하기 위해 당업계에 공지된 동물 모델은 본원에서 설명되는 재조합 NDV 또는 이의 조성물, 또는 병용 요법의 생체 내 독성을 결정하는 데에도 사용될 수 있다. 예를 들어, 동물에게 본원에서 설명되는 재조합 NDV의 pfu의 범위를 투여하고, 이어서, 예를 들어, 다음 중 둘 이상과 같은 다양한 파라미터에 대해 시간 경과에 따라 동물을 모니터링한다: 치사, 체중 감소 또는 체중 증가 실패, 및 조직 손상을 나타낼 수 있는 혈청 마커 수준(예: 일반적인 조직 손상의 표시자로서의 크레아틴 인산활성효소 수준, 가능한 간 손상의 지표로서 글루탐 옥살산 아미노전이효소 또는 피루브산 아미노전이효소의 수준). 이들 생체 내 검정은 또한 투여량에 더하여 다양한 투여 모드 및 요법의 독성을 시험하도록 조정될 수 있다.
본원에서 설명되는 재조합 NDV 또는 이의 조성물, 또는 본원에서 설명되는 병용 요법의 독성, 효능, 또는 둘 모두는, 예를 들어, LD50(모집단의 50%에 대한 치사량) 및 ED50(모집단의 50%에서 치료적으로 유효한 투여량)을 결정하기 위한 세포 배양물 또는 실험 동물에서의 표준 약학적 절차에 의해 결정될 수 있다. 독성 효과와 치료 효과 사이의 투여량 비율은 치료 지수이며, 이는 LD50/ED50의 비율로 표현될 수 있다. 큰 치료 지수를 나타내는 요법이 바람직하다.
세포 배양 검정 및 동물 연구로부터 수득된 데이터를 사용하여 대상체에서 사용하기 위한 요법의 다양한 투여량을 제형화할 수 있다. 이러한 제제의 투여량은 바람직하게는 독성이 거의 없거나 전혀 없는 ED50을 포함하는 순환 농도의 범위 내에 있다. 투여량은 사용된 투여 형태 및 사용된 투여 경로에 따라 이러한 범위 내에서 달라질 수 있다. 본원에서 설명되는 임의의 요법에 대해, 치료적 유효 투여량은 세포 배양 검정으로부터 초기에 추정될 수 있다.
5.6.5
생물학적 활성 검정
본원에서 설명되는 재조합 NDV 또는 이의 조성물, 또는 본원에서 설명되는 병용 요법은 감염성 질환 또는 암을 억제하기 위한 동물 모델, 재조합 NDV에 대한 항체 반응 등을 사용하여 생물학적 활성에 대해 시험될 수 있다. 이러한 동물 모델 시스템은 랫트, 마우스, 햄스터, 코튼 랫트, 닭, 소, 원숭이(예를 들어, 아프리카 녹색 원숭이), 돼지, 개, 토끼 등을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
특정 실시예에서, 본원에서 설명되는 재조합 NDV 또는 이의 조성물, 또는 본원에서 설명되는 병용 요법은 항원에 결합하는 항체(들)의 특정 기하 평균 역가를 유도하는 능력에 대해 동물 모델을 사용하여 시험될 수 있다. 또 다른 특정 실시예에서, 본원에서 설명되는 재조합 NDV 또는 이의 조성물, 또는 본원에서 설명되는 병용 요법은 미세중화 검정에서 항원에 대한 중화 활성을 갖는 항체를 유도하는 능력에 대한 동물 모델을 사용하여 시험될 수 있다. 일부 실시예에서, 본원에서 설명되는 재조합 NDV 또는 이의 조성물, 또는 본원에서 설명되는 병용 요법은 항원(예를 들어, SARS-CoV-2 항원, 에볼라 바이러스 항원, MERS-CoV 항원, 라사 바이러스 항원, RSV 항원, 또는 인간 메타뉴모바이러스 항원)에 결합하고 미세중화 검정에서 항원과 연관된 바이러스를 중화시키는 항체(들)의 특정 기하 평균 역가를 유도하는 능력에 대한 동물 모델을 사용하여 시험될 수 있다. 특정 실시예에서, 본원에서 설명되는 재조합 NDV 또는 이의 조성물, 또는 본원에서 설명되는 병용 요법은 이러한 항체 사전 면역화의 수준에 비해 본원에서 설명되는 재조합 NDV 또는 이의 조성물로 면역화 후 항원에 결합하는 항체(들)의 수준의 특정 배수 증가를 유도하는 능력에 대한 동물 모델을 사용하여 시험될 수 있다. 예를 들어, 면역화 전 항체(들)의 수준에 비해 본원에서 설명되는 재조합 NDV 또는 이의 조성물로 면역화 후 항원에 결합하는 항체(들)의 수준이 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배 이상 증가한다.
5.6.6
이식유전자의 발현
본원에서 설명되는 재조합 NDV로 감염된 세포에서 비-NDV APMV F 단백질, 비-NDV APMV HN 단백질, 키메라 F 단백질, 키메라 HN 단백질, 항원(키메라 항원 포함)의 발현을 시험하기 위한 검정은 당업계에 공지된 임의의 검정, 예를 들어, 웨스턴 블롯, 면역형광, 및 ELISA, 또는 본원에서 설명되는 임의의 검정을 사용하여 수행될 수 있다.
특정 측면에서, ELISA는 본원에서 설명되는 재조합 NDV로 감염된 세포에서 비-NDV APMV F 단백질, 비-NDV APMV HN 단백질, 키메라 F 단백질, 키메라 HN 단백질, 항원(키메라 항원 포함)의 발현을 검출하는 데 사용된다.
일 실시예에서, 본원에서 설명되는 재조합 NDV의 포장된 게놈에 의해 암호화된 비-NDV APMV F 단백질, 비-NDV APMV HN 단백질, 키메라 F 단백질, 키메라 HN 단백질, 항원(키메라 항원 포함)은 당업계에 공지된 항체-항원 상호작용에 대한 임의의 검정을 사용하여 항체에 특이적으로 결합하는 능력을 시험함으로써 적절한 접힘에 대해 검정된다. 다른 실시예에서, 본원에서 설명되는 재조합 NDV의 포장된 게놈에 의해 암호화된 것은, 당업계에 공지된 임의의 방법, 예를 들어, NMR, X-선 결정학적 방법, 또는 이차 구조 예측 방법, 예를 들어, 원형 이색성을 사용하여 비-NDV APMV F 단백질, 비-NDV APMV HN 단백질, 키메라 F 단백질, 키메라 HN 단백질, 항원(키메라 항원을 포함함)의 구조 또는 형태를 결정함으로써 적절한 접힘에 대해 검정된다. 비-NDV APMV F 단백질, 비-NDV APMV HN 단백질, 키메라 F 단백질, 키메라 HN 단백질, 항원(키메라 항원 포함)의 형태 및 항원성을 평가하는 추가 검정은, 예를 들어, 면역형광 현미경, 유세포 계측법, 웨스턴 블롯, 및 ELISA를 포함할 수 있다. 코튼 랫트 또는 마우스와 같은 동물 모델에서의 생체 내 면역화는 또한 비-NDV APMV F 단백질, 비-NDV APMV HN 단백질, 키메라 F 단백질, 키메라 HN 단백질, 항원(키메라 항원 포함)의 항원성을 평가하는 데 사용될 수 있다.
본원에서 설명되는 재조합 NDV로 감염된 세포에서 비-NDV APMV F 단백질, 비-NDV APMV HN 단백질, 키메라 F 단백질, 키메라 HN 단백질, 항원(키메라 항원 포함)의 기능성을 시험하기 위한 검정은 당업계에 공지된 임의의 검정을 사용하여 수행될 수 있다. 예를 들어, HN 단백질의 수용체 결합 및 뉴라미니다아제 활성이 평가될 수 있다. 숙주 세포에 대한 바이러스의 융합이 또한 평가될 수 있다.
5.7
키트
일 측면에서, 본원에서 설명되는 조성물(예: 약학적 조성물)의 성분 중 하나 이상으로 충진된 하나 이상의 용기를 포함하는 약학적 팩 또는 키트가 본원에 제공된다. 특정 실시예에서, 용기를 포함하는 약학적 팩 또는 키트가 본원에 제공되며, 여기서 용기는 본원에서 설명되는 재조합 NDV, 또는 재조합 NDV를 포함하는 약학적 조성물을 포함한다. 특정 실시예에서, 약학적 팩 또는 키트는 제2 재조합 NDV, 또는 제2 재조합 NDV를 포함하는 약학적 조성물을 추가로 포함한다. 특정 실시예에서, 즉 제2 재조합 NDV는 제1 재조합 NDV와 면역학적으로 구별된다. 일부 실시예에서, 섹션 6에 기술된 pNDV-F-HNless 수용자 플라스미드를 포함하는 약학적 팩 또는 키트가 본원에 제공된다. 특정 실시예에서, 팩 또는 키트는 서열번호 1-14 중 어느 하나의 뉴클레오티드를 포함하는 핵산 서열을 추가로 포함한다. 특정 실시예에서, 서열번호 1-14 중 어느 하나의 뉴클레오티드 서열, 또는 서열번호 1-14 중 어느 하나의 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 98% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 서열을 포함하는 약학적 팩 또는 키트가 본원에 제공된다. 선택적으로, 이러한 용기(들)와 연관된 것은 의약품 또는 생물학적 제품의 제조, 사용 또는 판매를 규제하는 정부 기관이 처방한 형태의 통지일 수 있으며, 이러한 통지는 인간 투여를 위한 제조, 사용 또는 판매 기관의 승인을 반영한다.
일부 실시예에서, 서열번호 1-14 중 어느 하나의 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 98% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 서열을 포함하는 약학적 팩 또는 키트가 본원에 제공된다. 일부 실시예에서, 팩 또는 키트는 다음을 포함하는(또는 이로 구성되는) 핵산 서열을 추가로 포함한다: (1) NDV 뉴클레오캡시드(N) 단백질을 암호화하는 전사 유닛, (2) NDV 인단백질(P)을 암호화하는 전사 유닛, (3) NDV 매트릭스(M) 단백질을 암호화하는 전사 유닛, 및 (4) NDV 대형 중합효소(L)를 암호화하는 전사 유닛. 일부 실시예에서, NDV는 LaSota 균주이다.
일부 실시예에서, 서열번호 44 또는 45를 포함하는 핵산 서열을 포함하는 약학적 팩 또는 키트가 본원에 제공된다. 일부 실시예에서, GFP 코딩 서열 없는 서열번호 44 또는 45를 포함하는 핵산 서열을 포함하는 약학적 팩 또는 키트가 본원에 제공된다. 일부 실시예에서, 팩 또는 키트는 서열번호 1-14 중 어느 하나의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 서열을 추가로 포함한다. 일부 실시예에서, 팩 또는 키트는 서열번호 1-14 중 어느 하나의 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 98% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 서열을 추가로 포함한다. 선택적으로, 이러한 용기(들)와 연관된 것은 의약품 또는 생물학적 제품의 제조, 사용 또는 판매를 규제하는 정부 기관이 처방한 형태의 통지일 수 있으며, 이러한 통지는 인간 투여를 위한 제조, 사용 또는 판매 기관의 승인을 반영한다.
5.8
서열
본 섹션에 개시된 서열은 본원에서 설명되는 재조합 NDV를 생산하는 데 사용될 수 있다.
표 1: 키메라 NDV-APMV 구제 플라스미드의 생성을 위한 합성 서열 및 NDV LaSota 서열
5.9
실시예
예시적인 실시예가 아래에 제공된다.
1.
(1) NDV HN 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열이 비-NDV APMV HN 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열로 대체되었고, 여기서 NDV 유전자간 영역은 비-NDV APMV HN 단백질 코딩 서열의 전후에 있고; (2) NDV F 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열이 비-NDV APMV F 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열로 대체되었고, 여기서 NDV 유전자간 영역은 비-NDV APMV F 단백질 코딩 서열의 전후에 있고, 여기서 상기 비-NDV APMV HN 단백질 및 비-NDV APMV F 단백질은 각각 NDV HN 단백질 및 F 단백질이 아닌, 뉴캐슬병 바이러스 게놈의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 서열.
2.
실시예 1에 있어서, 비-NDV APMV F 단백질 및 비-NDV APMV HN 단백질은 각각 NDF F 단백질 및 NDV HN 단백질과 면역학적으로 구별되는, 핵산 서열.
3.
실시예 1에 있어서, 상기 비-NDV APMV HN은 APMV4/duck/Hongkong/D3/75,APMV17/Antarctica/107/13, APMV9/duck/New York/22/78, APMV7/Dove/Tennessee/4/75, APMV21/pigeon/Taiwan/AHRI128/17, APMV6/duck/HongKong/18/199/77, APMV11/common_snipe/France/100212/10, APMV15/calidris_fuscicollis/Brazil/RS-1177/12, APMV8/Goose/Delaware/1053/76, APMV2/Chicken/California/Yucaipa/56, APMV3/Turkey/Wisconsin/68, APMV12/Wigeon/Italy/3920_1/05, APMV5/budgerigar/Japan/TI/75, 또는 APMV10/penguin/Falkland Islands/324/07의 HN 단백질인, 핵산 서열.
4.
실시예 1 또는 3에 있어서, 상기 비-NDV APMV F는 APMV4/duck/Hongkong/D3/75, APMV17/Antarctica/107/13, APMV9/duck/New York/22/78, APMV7/Dove/Tennessee/4/75, APMV21/pigeon/Taiwan/AHRI128/17, APMV6/duck/HongKong/18/199/77, APMV11/common_snipe/France/100212/10, APMV15/calidris_fuscicollis/Brazil/RS-1177/12, APMV8/Goose/Delaware/1053/76, APMV2/Chicken/California/Yucaipa/56, APMV3/Turkey/Wisconsin/68, APMV12/Wigeon/Italy/3920_1/05, APMV5/budgerigar/Japan/TI/75, 또는 APMV10/penguin/Falkland Islands/324/07의 F 단백질인, 핵산 서열.
5.
실시예 1에 있어서, 비-NDV APMV HN 단백질은 아불라비리나 아과 및 오소아불라바이러스, 메타아불라바이러스, 또는 파라아불라바이러스 속으로부터의 HN 단백질인, 핵산 서열.
6.
실시예 1 또는 5에 있어서, 비-NDV APMV F 단백질은 아불라비리나 아과 및 오소아불라바이러스, 메타아불라바이러스, 또는 파라아불라바이러스 속으로부터의 F 단백질인, 핵산 서열.
7.
실시예 1 내지 6 중 어느 하나에 있어서, NDV 게놈은 NDV LaSota 균주의 NP 유전자, P 유전자, M 유전자, 및 L 유전자를 포함하는, 핵산 서열.
8.
(1) NDV 뉴클레오캡시드(N) 단백질을 암호화하는 전사 유닛, (2) NDV 인단백질(P)을 암호화하는 전사 유닛, (3) NDV 매트릭스(M) 단백질을 암호화하는 전사 유닛, (4) NDV 거대 중합효소(L)를 암호화하는 전사 유닛, 및 (5) 서열번호 1-14 중 어느 하나의 뉴클레오티드 서열, 또는 서열번호 1-14 중 어느 하나의 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 98% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 핵산 서열.
9.
실시예 8에 있어서, NDV 뉴클레오캡시드 단백질, NDV 인단백질, NDV 매트릭스 단백질, 및 NDV 거대 중합효소는 NDV LaSota 균주의 것인, 핵산 서열.
10.
서열번호 44, 또는 GFP 코딩 서열이 없는 서열번호 44의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 서열.
11.
서열번호 44, 또는 GFP 코딩 서열이 없는 서열번호 44의 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 98% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 서열.
12.
서열번호 45, 또는 GFP 코딩 서열이 없는 서열번호 45의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 서열.
13.
서열번호 45, 또는 GFP 코딩 서열이 없는 서열번호 45의 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 98% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 서열.
14.
실시예 1 내지 13 중 어느 하나에 있어서, 이식유전자를 추가로 포함하는, 핵산 서열.
15.
실시예 1 내지 13 중 어느 하나에 있어서, 항원을 암호화하는 이식유전자를 추가로 포함하는, 핵산 서열.
16.
실시예 14에 있어서, 항원은 바이러스, 박테리아, 진균 또는 원생동물 항원인, 핵산 서열.
17.
실시예 14에 있어서, 항원은 SARS-CoV-2 스파이크 단백질 또는 이의 단편을 포함하는, 핵산 서열.
18.
실시예 17에 있어서, 단편은 SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 수용체 결합 도메인을 포함하는, 핵산 서열.
19.
실시예 17에 있어서, 단편은 SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 세포외 도메인을 포함하는, 핵산 서열.
20.
실시예 15에 있어서, 항원은 MERS-CoV 항원, 호흡기 세포융합 바이러스 항원, 인간 메타뉴모바이러스 항원, 라사 바이러스 항원, 에볼라 바이러스 항원, 또는 니파 바이러스 항원인, 핵산 서열.
21.
실시예 15에 있어서, 항원은 암 또는 종양 항원인, 핵산 서열.
22.
포장된 게놈을 포함하는 재조합 뉴캐슬병 바이러스(NDV)로서, 여기서 상기 포장된 게놈은 (1) NDV HN 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 비-NDV APMV HN 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열로 대체되었고, 여기서 NDV 유전자간 영역은 비-NDV AMPV HN 단백질 코딩 서열의 전후에 있고; (2) NDV F 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 비-NDV APMV F 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열로 대체되었고, 여기서 NDV 유전자간 영역은 비-NDV AMPV F 단백질 코딩 서열의 전후에 있고, 여기서 비-NDV APMV HN 단백질 및 비-NDV APMV F 단백질은 각각 NDV HN 단백질 및 F 단백질이 아닌, 뉴캐슬병 바이러스 게놈의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 재조합 NDV.
23.
실시예 22에 있어서, 비-NDV APMV F 단백질 및 비-NDV APMV HN 단백질은 각각 NDF F 단백질 및 NDV HN 단백질과 면역학적으로 구별되는, 재조합 NDV.
24.
실시예 22에 있어서, 비-NDV APMV HN 단백질은 아불라비리나 아과 및 오소아불라바이러스, 메타아불라바이러스, 또는 파라아불라바이러스 속으로부터의 HN 단백질인, 재조합 NDV.
25.
실시예 22 또는 23에 있어서, 비-NDV APMV F 단백질은 아불라비리나 아과 및 오소아불라바이러스, 메타아불라바이러스, 또는 파라아불라바이러스 속으로부터의 F 단백질인, 재조합 NDV.
26.
실시예 22에 있어서, 상기 비-NDV APMV HN은 APMV4/duck/Hongkong/D3/75,APMV17/Antarctica/107/13, APMV9/duck/New York/22/78, APMV7/Dove/Tennessee/4/75, APMV21/pigeon/Taiwan/AHRI128/17, APMV6/duck/HongKong/18/199/77, APMV11/common_snipe/France/100212/10, APMV15/calidris_fuscicollis/Brazil/RS-1177/12, APMV8/Goose/Delaware/1053/76, APMV2/Chicken/California/Yucaipa/56, APMV3/Turkey/Wisconsin/68, APMV12/Wigeon/Italy/3920_1/05, APMV5/budgerigar/Japan/TI/75, 또는 APMV10/penguin/Falkland Islands/324/07의 HN 단백질인, 재조합 NDV.
27.
실시예 22 또는 26에 있어서, 상기 비-NDV APMV F는 APMV4/duck/Hongkong/D3/75, APMV17/Antarctica/107/13, APMV9/duck/New York/22/78, APMV7/Dove/Tennessee/4/75, APMV21/pigeon/Taiwan/AHRI128/17, APMV6/duck/HongKong/18/199/77, APMV11/common_snipe/France/100212/10, APMV15/calidris_fuscicollis/Brazil/RS-1177/12, APMV8/Goose/Delaware/1053/76, APMV2/Chicken/California/Yucaipa/56, APMV3/Turkey/Wisconsin/68, APMV12/Wigeon/Italy/3920_1/05, APMV5/budgerigar/Japan/TI/75, 또는 APMV10/penguin/Falkland Islands/324/07의 F 단백질인, 재조합 NDV.
28.
포장된 게놈을 포함하는 재조합 뉴캐슬병 바이러스(NDV)로서, 상기 포장된 게놈은 NDV HN 단백질 및 NDV F 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열이 서열번호 1-14 중 어느 하나에 제시된 cDNA 서열로부터 전사된 음-센스 RNA 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열로 대체되는, 뉴캐슬병 바이러스 게놈의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 재조합 NDV.
29.
포장된 게놈을 포함하는 재조합 뉴캐슬병 바이러스(NDV)로서, 상기 포장된 게놈은 NDV HN 단백질 및 NDV F 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열이 서열번호 1-14 중 어느 하나의 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 98% 동일한 뉴클레오티드 서열로부터 전사된 음-센스 RNA 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열로 대체되는, 뉴캐슬병 바이러스 게놈의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 재조합 NDV.
30.
실시예 22 내지 29 중 어느 하나에 있어서, NDV 게놈은 NDV LaSota의 NP 유전자, P 유전자, M 유전자, 및 L 유전자를 포함하는, 재조합 NDV.
31.
실시예 22 내지 30 중 어느 하나에 있어서, 포장된 게놈은 이식유전자를 추가로 포함하는, 재조합 NDV.
32.
실시예 31에 있어서, 이식유전자는 바이러스, 박테리아, 진균 또는 원생동물 항원을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 재조합 NDV.
33.
실시예 31에 있어서, 이식유전자는 SARS-CoV-2 항원을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 재조합 NDV.
34.
실시예 33에 있어서, SARS-CoV-2 항원은 SARS-CoV-2 스파이크 단백질 또는 이의 단편을 포함하는, 재조합 NDV.
35.
실시예 34에 있어서, 단편은 SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 수용체 결합 도메인을 포함하는, 재조합 NDV.
36.
실시예 31에 있어서, 이식유전자는 MERS-CoV 항원을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 재조합 NDV.
37.
실시예 31에 있어서, 이식유전자는 호흡기 세포융합 바이러스 항원 또는 인간 메타뉴모바이러스 항원을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 재조합 NDV.
38.
실시예 31에 있어서, 이식유전자는 라사 바이러스 항원, 에볼라 바이러스 항원 또는 니파 바이러스 항원을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 재조합 NDV.
39.
실시예 31에 있어서, 이식유전자는 암 또는 종양 항원을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 재조합 NDV.
40.
실시예 22 내지 31 중 어느 하나의 재조합 NDV인 제1 재조합 NDV를 포함하는 면역원성 조성물.
41.
실시예 32 내지 38 중 어느 하나의 재조합 NDV인 제1 재조합 NDV를 포함하는 면역원성 조성물.
42.
실시예 39의 재조합 NDV인 제1 재조합 NDV를 포함하는 면역원성 조성물.
43.
항원에 대한 면역 반응을 유도하는 방법으로서, 실시예 40, 41 또는 42의 면역원성 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
44.
감염성 질환을 예방하기 위한 방법으로서, 실시예 40 또는 41의 면역원성 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
45.
감염성 질환에 대해 대상체를 면역화하는 방법으로서, 실시예 40 또는 41의 면역원성 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
46.
암을 치료하기 위한 방법으로서, 실시예 40 또는 42의 면역원성 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
47.
실시예 43 내지 46 중 어느 하나에 있어서, 조성물은 대상체에게 비강내 투여되는, 방법.
48.
실시예 43 내지 47 중 어느 하나에 있어서, 상기 방법은 포장된 게놈을 포함하는 제2 재조합 NDV를 투여하는 단계를 더 포함하고, 여기서 제2 재조합 NDV의 포장된 게놈은 (1) NDV HN 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 비-NDV APMV HN 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열로 대체되었고, 여기서 NDV 유전자간 영역은 비-NDV AMPV HN 단백질 코딩 서열의 전후에 있고; (2) NDV F 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 비-NDV APMV F 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열로 대체되었고, 여기서 NDV 유전자간 영역은 비-NDV AMPV F 단백질 코딩 서열의 전후에 있고, 여기서 제2 재조합 NDV는 제1 재조합 NDV와 면역학적으로 구별되는, 뉴캐슬병 바이러스 게놈의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 방법.
49.
실시예 43 내지 48 중 어느 하나에 있어서, 대상체는 인간인, 방법.
50.
실시예 22 내지 39 중 어느 하나의 재조합 NDV를 포함하는 키트.
51.
실시예 1 내지 21 중 어느 하나의 핵산 서열을 포함하는 키트.
52.
실시예 22 내지 39 중 어느 하나의 재조합 NDV를 포함하는 시험관 내 또는 생체 외 세포.
53.
실시예 22 내지 39 중 어느 하나의 재조합 NDV를 포함하는 세포주 또는 닭 배아 난자.
54.
실시예 22 내지 39 중 어느 하나의 재조합 NDV를 전파하는 방법으로서, 상기 방법은 실시예 52 또는 53의 세포 또는 배아 난자를 배양하는 단계를 포함하는, 방법.
55.
실시예 54에 있어서, 상기 방법은 세포 또는 배아 난자로부터 재조합 NDV를 단리하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
6.
예
6.1
예 1: 키메라 뉴캐슬병 바이러스 (NDV)-조류 파라믹소바이러스 (APMV) 작제물
본 예는 키메라 NDV-APMV 작제물의 생산을 기술한다. 본 예에서, NDV(조류 파라믹소바이러스 1)의 바이러스 당단백질 F 및 HN의 코딩 영역을 다른 조류 파라믹소바이러스(APMV)로부터의 상동성 당단백질(즉, F 및 HN)의 코딩 영역으로 대체하여 재조합 키메라 NDV-APMV 벡터를 생성시킨다 (도 1).
6.1.1
재료 및 방법
예를 들어, Ayllon 등의 Rescue of recombinant Newcastle disease virus from cDNA. J Vis Exp. 2013 Oct 11;(80):50830. doi: 10.3791/50830에 기술된 프로토콜을 사용하여 역 유전학에 의해 키메라 NDV-APMV 벡터를 생산한다.
6.1.1.1
수용자 플라스미드 pNDV-F-HNless의 생성
요약하면, T7 RNA 중합효소 프로모터의 제어 하에 NDV 게놈의 전장 cDNA를 함유하는, 구제 플라스미드 pNDV-LaSota에 F 및 HN 코딩 서열을 함유하는 3.7 Kb 영역을 제거하고, 2개의 새로운 고유 제한 부위(Pmel 및 Nrul)를 함유하는 짧은 서열로 대체하여 수용자 플라스미드인 pNDV-F-HNless를 생성시킨다 (도 2a-2b). 그런 다음, 다른 APMV의 F 및 HN 단백질을 암호화하는 합성 삽입물을 수용자 플라스미드 pNDV-F-HNless의 M 및 L 유전자 사이에 삽입한다. F 및 HN 서열을 수용자 플라스미드(pNDV-F-HNless)에 삽입하는 것이 기능적 플라스미드를 초래한다는 것을 보여주기 위해, NDV의 F 및 HN 단백질을 코딩하는 서열을 M 및 L 유전자 사이에서 수용자 플라스미드 pNDV-F-HNless의 cDNA에 삽입하여 도 2c에 보이는 바와 같이 기능적 구제 플라스미드 pNDV-LaSota를 생성시켰다. 이러한 기능적 구제 플라스미드 pNDV-LaSota는 생존 가능한 바이러스를 성공적으로 구제하였다(데이터 미도시).
6.1.1.2
APMV F 및 HN 서열 삽입체 설계
GenBank에서 입수 가능한 모든 APMV 전장 게놈으로부터의 F 및 HN 서열을 사용하는 계통유전학 트리를 사용하여 pNDV-F-HNless 수용자 플라스미드 내로 클로닝될 F 및 HN 서열을 선택하였다 (도 3a 및 3b). 전체 트리의 유전적 다양성을 나타내기 위해 열네 개(14개)의 후보를 계통발생 트리로부터 선택하였다. 예를 들어, GenBank 수탁 번호 FJ177514, MK167211, EU910942, FJ231524, MK677433, EU622637, JQ886184, NC_034968, FJ215863, EU338414, EU782025, KC333050, LC168750, 및 NC_025349를 갖는 AMPV 전장 게놈으로부터의 F 및 HN 서열을 선택하였다.
AMPV F-HN 서열을 합성하기 위해, NDV 유전자간 영역을 F 및 HN 개방 해독 프레임 이전, 사이, 및 이후에 추가하였다. (독성을 표시하는) APMV F 서열은 다염기성 절단 부위에 대해 검사되고, 필요한 경우 이용 가능한 가장 가까운 비독성 절단 부위로 대체된다. 고유한 SacII 제한 부위가 추가 유전자의 클로닝에 사용되기 때문에, APMV-F-HN 서열 내의 임의의 SacII 제한 부위는 침묵 점 돌연변이에 의해 제거한다. 또한, 임의의 파라믹소바이러스 게놈의 완전한 뉴클레오티드 크기는 6의 배수여야 하기 때문에, 이 요건을 준수하기 위해, 6의 규칙을 준수하는지 APMV-F-HN 서열을 확인하고, 필요한 경우, F 개방 해독 프레임 후에 제2 정지 코돈을 첨가하였다.
AMPV F-HN 서열은 Genewiz(www.genewiz.com)에 의해 합성되고, 예를 들어, 서열번호 1-14 중 어느 하나일 수 있다. 표 1 참조. 모든 APMV F 및 HN 서열 삽입체는 양 말단에서 공통 NDV-유래 서열을 갖기 때문에, 이러한 삽입체를 증폭시키고 동일한 프라이머로 클로닝할 수 있다. 간략하게, AMPV F-HN 서열은 F 및 HN 개방 해독 프레임의 측부에 위치하는 NDV 서열의 재구성을 위해 설계된 PCR 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 증폭된다 (도 4a-4c). 그런 다음, 각각의 AMPV F-HN 서열(또는 PCR 산물)을 M 및 L 유전자 사이의 pNDV-F-HNless 수용체 플라스미드에 클로닝하여 키메라 NDV-APMV 플라스미드를 생성시킨다. 표 1의 서열 각각을 M 및 L 유전자 사이의 pNDV-F-HNless 수용자 플라스미드 내로 클로닝하여 키메라 NDV-APMV 플라스미드를 생성시켰다.
6.1.1.3
생존력 평가
구제된 키메라 NDV-APMV의 생존력은, 예를 들어 플라크 검정에 의해 평가된다. 키메라 NDV-APMV는, 예를 들어 미세중화 검정을 사용하여 기존의 NDV-특이적 체액 면역에 의해 중화되지 않음을 확인하기 위해 시험된다.
6.1.2
결과
본 예는 키메라 벡터의 생산을 기술한다. F 및 HN은 중화 항체 반응의 주요 표적이고, 상이한 APMV는 항원적으로 상이하기 때문에, 키메라 벡터는 항원적으로 상이하며, 따라서 기존의 NDV-특이적 체액 면역에 의해 중화되지 않는다. 한편, 성장 특성은 모든 바이러스 단백질의 조합된 기능에 의해 결정되고, 모든 조류 파라믹소바이러스가 공통의 복제 전략을 공유하기 때문에, 키메라 벡터는 완전히 생존 가능하고 부모 NDV 벡터와 유사하게 복제된다.
6.2
예 2: APMV-4
본 예는 APMV-4가 NDV보다 더 강력한 면역 자극제인 것으로 밝혀졌음을 입증하는 데이터를 제공한다.
6.2.1
재료 및 방법
세포주, 항체 및 기타 시약
쥣과 암 세포주 B16-F10(마우스 피부 흑색종 세포; ATCC Cat# CRL-6475) 및 CT26.WT(마우스 결장 암종 세포; ATCC Cat# CRL-2638)를 10% FBS(소태아 혈청) 및 2% 페니실린 및 스트렙토마이신이 보충된 RPMI 배지에서 유지시켰다. 인간 흑색종 SK-MEL-2(ATCC Cat# HTB-68TM) 및 결장 암종 RKO-E6 세포(ATCC Cat#CRL-2578TM)를 ATCC-제형화된 이글의 최소 필수 배지를 사용하여 전파시켰다. 마스터 암 세포-은행이 구매 후에 생성되었고, 조기 계대 세포는 모든 실험 단계에서 해동되었다. 일단 배양되면, 세포를 8주 이하로 유지시켜 유전자형 안정성을 보장하고, 현미경에 의해 일상적으로 모니터링하였다. 생체 내 실험에 관여하는 암세포에 대한 필수 IMPACT 시험은 Mt. Sinai의 Icahn School of Medicine의 비교 의학 및 수술 센터가 수행하였다(Mount Sinai Hospital, 뉴욕주 뉴욕 소재). 감소된 혈청 배지 Opti-MEMTM(GibcoTM)을 시험관 내 바이러스 감염 배지에 사용하였다.
바이러스
변형된 뉴캐슬병 바이러스 LaSota-L289A는 이전에 기술되었다(Vijayakumar G, Palese P, Goff PH. Oncolytic Newcastle disease virus expressing a checkpoint inhibitor as a radioenhancing agent for murine melanoma. EBioMedicine 2019;49:96-105). APMV-4 Duck/Hong Kong/D3/1975(175ADV0601) 분리주를 미국 농무부 소재 National Veterinary Services Laboratories(USDA, 미국 에임스)로부터 수득하였다. 바이러스 스톡을 9일령의 발육된 닭 달걀에서 전파시키고, 재현탁 및 PBS에 보관하기 위한 불연속 수크로오스 밀도 구배 초원심분리에 의해 요막 유체로부터 투명 정제하였다. 바이러스 역가는 Vero 세포에서 간접 면역-형광에 의해 계산하였다.
RT-qPCR에 의한 전사 분석
암세포를 모의 처리하거나 250 μl의 OptiMEM-I 중 1 PFU/세포의 MOI에서 명시된 바이러스로 감염시켰다. 바이러스 흡착을 1시간 동안 허용한 후, 세포를 추가 750 μl의 보충 배지와 함께 인큐베이션하였다. 총 RNA를 감염 후 표시된 시점에 Qiagen RNeasy Minikit(Cat#74106, Qiagen)를 사용하여 단리하였다. RT-qPCR용 Maxima First Strand cDNA 합성 키트(Cat#K1671, Thermo Scientific)를 사용하여 cDNA 합성을 수행하였다. 3개의 개별 생물학적 샘플에서 얻은 cDNA의 평균 n배 발현 수준을 18S rRNA 수준으로 정규화하고 2-ΔΔCT 방법에 따라 모의 처리된 샘플로 보정했다 (Livak KJ, Schmittgen TD. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta C(T)) Method. Methods 2001;25:402-8). Morpheus, https://software.broadinstitute.org/morpheus. 사용하여 히트 맵을 생성하였다. 인간 및 쥣과 프라이머 서열을 표 2에 정리하였다.
표 2: RT-qPCR 프라이머 서열
통계 분석
GraphPad Prism 9를 사용하여 데이터 분석을 수행하였다. 일방향 ANOVA 또는 이방향 ANOVA를 사용하여 다수의 군을 각각 1개 또는 2개의 독립 변수와 비교하였다. 결과는 표시된 바와 같이 평균 값 ± SEM 또는 ± SD로 표현된다. 생존 곡선의 비교는 log 순위(Mantel-Cox) 테스트를 사용하여 수행하였다. > 0.05의 p 값은 통계적으로 유의하지 않은 것으로 간주되었다(ns); * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001, **** p < 0.0001.
6.2.2
결과
NDV 및 다른 파라믹소바이러스에 대해 이미 확립된 시스템을 모델로 한 플라스미드 기반 구제 전략을 설계함으로써, APMV-4(재조합 APMV-4)의 감염성 클론을 생성하였다 (Ayllon J, Garcia-Sastre A, Martinez-Sobrido L. Rescue of recombinant Newcastle disease virus from cDNA. J Vis Exp 2013).
감염 후 8시간 및 16시간차에 APMV-4 또는 재조합 APMV-4(rAPMV-4) 감염된 암에 의해 유발된 전염증성 반응을 평가하였다(도 5e-5h). qPCR에 의한 mRNA 발현 분석은 감염 후 8시간차에 LS-L289A에 의해 유도된 발현 수준과 비교했을 때, APMV-4 감염된 세포에 의한 INF-β, STAT-1, ISG15, OAS1 및 MX1 유전자의 상향조절 증가를 보여주었다. 이러한 더 빠르고 더 강력한 I형 인터페론 시그니처는 그 출처와 무관하게 모든 암 세포주에 의해 나타났고, 이러한 시그니처는 rAPMV-4 감염에 의해 복제되었다. 8시간 또는 16시간차에, ISG-15 및 MX-1의 발현에서 APMV-4 바이러스와 NDV 간의 유의한 차이가 발견되었다. IL-6은 쥣과 암세포에서 특히 상향조절된 반면, OAS1은 인간 암세포에 의해 유의하게 상향조절되었다. 바이러스 핵단백질 N의 mRNA 발현 수준 분석(도 5a-5d)에 의하면 바이러스 복제 활성과 초기 면역 시그니처 사이의 직접적인 연관성을 보여주지 않았으며, B16-F10(도 5a, 5e) 및 SK-MEL-2 흑색종 암세포(도 5c, 5g)는 LS-L289A 바이러스의 N mRNA의 수준이 더 높게 나타났지만, APMV-4 및 rAPMV-4에 반응하여 더 강한 면역 자극을 나타냈다.
6.2.3
논의
APMV-4 Duck/Hong Kong/D3/1975는 처음으로 확인된 APMV-4 바이러스였으며, 조류 파라아불라바이러스 종의 프로토타입 변종으로 간주된다 (Gogoi P, Ganar K, Kumar S. Avian Paramyxovirus: A Brief Review. Transbound Emerg Dis 2017;64:53-67; Shortridge KF, Alexander DJ. Incidence and preliminary characterisation of a hitherto unreported, serologically distinct, avian paramyxovirus isolated in Hong Kong. Res Vet Sci 1978;25:128-30). 이 분리주들은 일반적으로 전 세계 야생 가금류로부터 회수되었고, 때때로 가축 오리, 거위 및 닭으로부터 회수되었지만, 이러한 감염된 동물에서 질병의 임상 징후는 보고된 바가 없다 (Alexander DJ. Newcastle disease and other avian paramyxoviruses. Rev Sci Tech 2000;19:443-62; Warke A, Stallknecht D, Williams SM, Pritchard N, Mundt E. Comparative study on the pathogenicity and immunogenicity of wild bird isolates of avian paramyxovirus 2, 4, and 6 in chickens. Avian Pathol 2008;37:429-34). 이러한 비독성 표현형은 조류 및 포유류의 실험적 접종을 통해 확인되었다 (Samuel AS, Subbiah M, Shive H, Collins PL, Samal SK. Experimental infection of hamsters with avian paramyxovirus serotypes 1 to 9. Vet Res 2011;42:38). 고용량의 APMV-4(107 PFU)의 비강내 투여는 접종된 마우스의 건강을 손상시키지 않았다(데이터 미도시). Duck/Hong Kong/D3/1975 균주의 완전한 게놈 서열 및 분자 특성 분석은 이전에 보고되었다(Nayak B, Kumar S, Collins PL, Samal SK. Molecular characterization and complete genome sequence of avian paramyxovirus type 4 prototype strain duck/Hong Kong/D3/75. Virol J 2008;5:124). APMV-4의 RBP HN 단백질은 헤마글루티닌 및 뉴로아미니다아제 활성을 가지며 시알산을 인식할 것으로 예측된다. 이의 F 단백질은, 비독성 약독형 NDV 균주에서의 것들과 유사하지만, 표준 퓨린 절단 부위를 나타내지 않음에도 불구하고, 시험관 내에서 특정 세포주에서 다중 주기 복제를 위해 APMV-4를 용량화하는 것으로 제안되어 온, 일염기성 절단 부위(DIPQR↓F)를 갖는다. 본 발명자에 의해 수행된 암세포에서의 복제 연구에서, 감염성 배지에 외인성 TPCK-트립신을 첨가한 다중 주기 복제만 이어질 수 있었다. 그러나, APMV-4는 유사한 성장 역학을 나타내면서 LS-L289A 바이러스보다 더 높은 역가에 도달할 수 있는 것으로 관찰되었다(데이터 미도시). 위의 모든 것을 고려할 때, 내인성 또는 분비성 프로테아제에 의한 단백질분해 활성화에 대한 APMV4의 F 단백질의 뚜렷한 의존성은 바이러스 적합도에서 이러한 차이를 뒷받침할 수 있다.
또한, APMV-4는 감염된 암세포에서 전염증성 및 사멸 반응을 유발하는 능력을 입증하였다(도 5a-5h 참조). NDV와 비교했을 때, APMV-4는 보다 강력한 면역 자극제인 것으로 밝혀졌고, 숙주로 이어졌다(Id.). NDV와 비교했을 때, APMV-4는 보다 강력한 면역 자극제인 것으로 밝혀졌고, 이는 I형 인터페론 반응의 보다 빠르고 보다 강력한 상향조절을 유도하였다. 흥미롭게도, 이러한 효과는 시험된 상이한 암세포 사이에서 보존되었으며(도 5e-5h) 바이러스 복제의 수준과 무관하다(도 5a-5d).
6.3
예 3: 키메라 뉴캐슬병 바이러스(NDV)-조류 파라미소바이러스(APMV) 작제물 NDV-APMV2 및 NDV-APMV3
조류 파라믹소바이러스(APMV)는 아불라비리나 아과에 속한다. APMV는 항원적으로 상이한 높은 다양성의 구성원들을 포함한다. APMV는 메타아불라바이러스, 오소아불라바이러스 및 파라아불라바이러스의 속으로 추가로 분류된다. 뉴캐슬병 바이러스(NDV)는 오소아불라바이러스 속에 속하며, AMPV 혈청형-1(APMV-1)로도 알려져 있다(도 6a). 다양한 바이러스 병원균에 대한 백신 벡터로서 NDV의 잠재력을 활용하고 NDV 기반 백신에 의해 도입된 기존의 면역을 극복하기 위해, 본 예에서는 키메라 NDV-APMV2 및 NDV-APMV3 바이러스의 생성을 설명하고 이들 바이러스가 야생형 NDV와 항원적으로 구별됨을 입증하는 데이터를 제공한다. 본 예에서는, NDV(조류 파라믹소바이러스 1)의 바이러스 당단백질 F 및 HN의 코딩 영역을 다른 조류 파라믹소바이러스(APMV)로부터의 상동성 당단백질(즉, F 및 HN)의 코딩 영역으로 대체하여 재조합 키메라 NDV-APMV 바이러스를 생성시켰다(도 6b).
6.3.1
재료 및 방법
바이러스
키메라 NDV-APMV 벡터를 예 1에 설명된 바와 같이 생산하였다. 간략하게, APMV2/Chicken/California/Yucaipa/56으로부터의 F 및 HN 서열을 pNDV-F-HNless 수용체 플라스미드 내로 클로닝하여 키메라 NDV-APMV2 벡터를 만들었다. APMV3/Turkey/Wisconsin/68로부터의 F 및 HN 서열을 pNDV-F-HNless 수용자 플라스미드 내로 클로닝하여 키메라 NDV-APMV3을 만들었다. 계통발생 트리에 도시된 바와 같이(도 6a에 도시한 바와 같이), APMV2는 메타아불라바이러스 속에 속하였고, AMPV3은 파라아불라바이러스 속에 속하였다. APMV2 및 APMV3은 NDV(오소아불라바이러스)와 항원적으로 상이할 뿐만 아니라, 서로 항원적으로 상이하였다(도 7).
바이오마커로서 및 영상화 목적을 위해, 녹색 형광 단백질(GFP)의 유전자를 키메라 NDV-APMV2의 P 및 M 유전자 사이에 삽입하여 키메라 NDV-APMV2-GFP 작제물을 생산하였다. 키메라 NDV-APMV2-GFP의 뉴클레오티드 서열은 서열번호 44를 참조한다. 유사하게, 키메라 NDV-APMV3의 P 및 M 유전자 사이에 GFP 유전자를 삽입하여 키메라 NDV-APMV3-GFP 작제물을 생산하였다(도 7). 키메라 NDV-APMV3의 뉴클레오티드 서열은 서열번호 45를 참조한다. 재조합 바이러스의 구제는 표준 기술을 사용하여 수행하였다(예를 들어, J. Ayllon, A. Garcia-Sastre, L. Martinez-Sobrido, Rescue of recombinant Newcastle disease virus from cDNA. J Vis Exp, (2013) 참조).
이식유전자 발현 및 항원성
이식유전자의 발현을 입증하기 위해, 닭 배아 섬유아세포(CEF) 세포를 키메라 NDV-APMV2-GFP 및 키메라 NDV-APMV3-GFP의 바이러스로 각각 감염시켰다. 형광 현미경을 사용하여 감염 후 18시간차에 GFP 발현을 검사하여 이식유전자의 발현을 확인하였다. 키메라 NDV-APMV2-GFP 및 키메라 NDV-APMV3-GFP 바이러스가 NDV와 항원적으로 다른지 여부를 조사하기 위해, APMV의 HN 단백질이 적혈구를 응집시킬 수 있기 때문에 혈구응집 억제(HI) 검정을 사용하였다. 야생형(WT) NDV 바이러스에 대해 상승된 토끼 혈청에서 HI 분석을 수행하였다.
6.3.2
결과
이식유전자의 발현은 형광 현미경 하에서 관찰된 GFP 발현에 의해 입증되었다. 도 8a에 도시된 바와 같이, 감염 후 18시간차에 키메라 NDV-APMV2-GFP 및 키메라 NDV-APMV3-GFP 바이러스 감염된 CEF 세포 모두에서 GFP 발현의 신호가 관찰되었다. 결과는 키메라 NDV-APMV2-GFP 및 키메라 NDV-APMV3-GFP 바이러스 둘 모두가 이식유전자를 발현할 수 있음을 나타냈다.
키메라 NDV-APMV 바이러스와 WT NDV 간의 항원성 차이를 HI 검정에 의해 평가하였다. 도 8b의 결과는 토끼 혈청의 HI 활성이 NDV-GFP 작제물에 대한 HI 활성과 비교하여 키메라 NDV-APMV-2-GFP 작제물 및 키메라 NDV-APMV-3-GFP 작제물 둘 모두에 대해 유의하게 감소되었음을 보여준다. 결과는 키메라 NDV-APMV 바이러스 둘 모두가 야생형 NDV와 항원적으로 구별된다는 것을 나타낸다.
표 3: NDV-APMV2-GFP의 뉴클레오티드 서열:
APMV2/Chicken/California/Yucaipa/56 및 NDV-APMV3-GFP: APMV3/Turkey/Wisconsin/68
본 발명은 본원에서 설명되는 특정 실시예에 의해 그 범위가 제한되지 않는다. 실제로, 설명된 것들 이외에 본 발명의 다양한 변형은 전술한 설명 및 첨부된 도면으로부터 당해 분야의 숙련자에게 명백해질 것이다. 이러한 변형은 첨부된 청구범위의 범주 내에 속하는 것으로 의도된다.
본원에 인용된 모든 참조 문헌은 그 전체가 참조로서 본원에 통합되고, 각각의 개별 공개 또는 특허 또는 특허 출원이 모든 목적을 위해 그 전체가 참조로서 통합되도록 구체적으로 및 개별적으로 표시된 것과 동일한 정도로 모든 목적을 위해 통합된다.
SEQUENCE LISTING
<110> ICAHN SCHOOL OF MEDICINE AT MOUNT SINAI
<120> CHIMERIC NEWCASTLE DISEASE VIRUS EXPRESSING APMV HN AND F
PROTEINS
<130> 6923-382-228
<140>
<141>
<150> US 63/302,434
<151> 2022-01-24
<150> US 63/179,994
<151> 2021-04-26
<160> 47
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 3774
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> APMV4/duck/Hongkong/D3/75
<400> 1
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cctctgacat tgccaaaatt aacaattcta tcgaggctgc gcgagagcag ctggaactga 1560
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tgatgtacaa gaatcttaag aaagtccaac gagctcaagc tgctatgatg atgcagcaaa 1740
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ggaacgaagg tttccctaat agtaatttgt gtgaaagttc tggtagtctg tcagttcaga 1860
gagttaagaa aaaactaccg gttgtagatg accaaaggac gatatacggg tagaacggta 1920
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acaacagtcc tcaatcatgc agggcgacat ggagggtagc cgtgataacc tcacagtaga 2040
tgatgaatta aagacaacat ggaggttagc ttatagagtt gtatccctcc tattgatggt 2100
gagtgccttg ataatctcta tagtaatcct gacgagagat aacagccaaa gcataatcac 2160
ggcgatcaac cagtcgtatg acgcagactc aaagtggcaa acagggatag aagggaaaat 2220
cacctcaatc atgactgata cgctcgatac caggaatgca gctcttctcc acattccact 2280
ccagctcaat acacttgagg caaacctgtt gtccgccctc ggaggttaca cgggaattgg 2340
ccccggagat ctagagcact gtcgttatcc ggttcatgac tccgcttacc tgcatggagt 2400
caatcgatta ctcatcaatc aaacagctga ctacacagca gaaggccccc tggatcatgt 2460
gaacttcatt ccggcaccag ttacgactac tggatgcaca aggatcccat ccttttctgt 2520
atcatcatcc atttggtgct atacacacaa tgtgattgaa acaggttgca atgaccactc 2580
aggtagtaat caatatatca gtatgggggt gattaagagg gctggcaacg gcttacctta 2640
cttctcaaca gtcgtgagta agtatctgac cgatgggttg aatagaaaaa gctgttccgt 2700
agctgcggga tccgggcatt gttacctcct ttgtagccta gtgtcagagc ccgaacctga 2760
tgactatgtg tcaccagatc ccacaccgat gaggttaggg gtgctaacaa gggatgggtc 2820
ttacactgaa caggtggtac ccgaaagaat atttaagaac atatggagcg caaactaccc 2880
tggggtaggg tcaggtgcta tagcaggaaa taaggtgtta ttcccatttt acggcggagt 2940
gaagaatgga tcaacccctg aggtgatgaa taggggaaga tattactaca tccaggatcc 3000
aaatgactat tgccctgacc cgctgcaaga tcagatctta agggcagaac aatcgtatta 3060
tcctactcga tttggtagga ggatggtaat gcagggagtc ctaacatgtc cagtatccaa 3120
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cggggcggaa tctaggatct attacctcaa tggtaacatt tacctttatc aaagaagctc 3240
gagctggtgg cctcaccccc aaatttacct acttgattcc aggattgcaa gtccgggtac 3300
gcagaacatt gactcaggcg ttaacctcaa gatgttaaat gttactgtca ttacacgacc 3360
atcatctggc ttttgtaata gtcagtcaag atgccctaat gactgcttat tcggggttta 3420
ttcagatgtc tggcctctta gccttacctc agacagcata tttgcattta caatgtactt 3480
acaagggaag acgacacgta ttgacccagc ttgggcgcta ttctccaatc atgtaattgg 3540
gcatgaggct cgtttgttca acaaggaggt tagtgctgct tattctacca ccacttgttt 3600
ttcggacacc atccaaaacc aggtgtattg tctgagtata cttgaagtca gaagtgagct 3660
cttgggggca ttcaagatag tgccattcct ctatcgtgtc ttatagttga gtcaattata 3720
aaggagttgg aaagatggca ttgtatcacc tatcttctgc gacatcaaga atca 3774
<210> 2
<211> 3720
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> APMV17/Antarctica/107/13
<400> 2
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cccggttggc gccctccagg tgcaagatgc aattgtactc agtcctggct ctggccttac 120
tggcagttca agcggagctc ggtataatcc cctccctgag caacacacac tcaatagatg 180
caggatttgt gttccagtct gagcgagcag tcaatatcta caccaattca ttaaccggga 240
gtgtggtagt taaactgctc cctaacttac cagatcacct caaaagctgc caccttgatg 300
tcctaagcag ttacaaccgc acccttacat ctatcttcca accgctaggt gagagtataa 360
agcatatatg gggtaacact acaggagggt cagccgcagg aggaatccag tctcggatag 420
tgggtgccat acttggaggt gtagccttag gtgtagcaac atcagcacag attacagcag 480
gagttgcctt agcacaatcc aggcagaatg cagagaatat cttaaagttg aaacagtcta 540
ttgctgcaac aaatgatgct gtgcaagagg ttattgcagg acaacgagag cttgtgattg 600
caataggtaa aatgcaggat tacatcaatc aagcgcttaa cagcactatc cagcaaatcg 660
actgtgttac tgctgcaaat cggctcggag tggaacttag cttgtatctg actcagctta 720
ccaccgcctt cagtaatcaa atccagaacc ctgcactcac tccgttgtct attcaggcgt 780
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ggctgctcgc atcaaaggca tcaaggatgt gatgaacaca gatgaggaac gaaggtttcc 1740
ctaatagtaa tttgtgtgaa agttctggta gtctgtcagt tcagagagtt aagaaaaaac 1800
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aggcttctgt tctgcagcta gcagatgccc aaacacatgt attacagggg tttacacgga 3360
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caaccatcgt agtgatcgtc aaaatcctag atctgctgtg ttctttgatg tctccatgag 3480
caatgcaact aatgtctcca caccccccgt aggtgctgca tacactacat ccacatgttt 3540
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<210> 3
<211> 3756
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> APMV9/duck/New York/22/78
<400> 3
atttacagtt agtttacctg tctatcaagt tagaaaaaac acgggtagaa gattctggat 60
cccggttggc gccctccagg tgcaagatgg ggtacttcca cctattactt atactaacag 120
cgattgccat atctgcgcac ctctgctata ccacgacatt ggatggtaga aaactgcttg 180
gtgcaggcat agtgataaca gaagagaagc aagttagggt gtacacagct gcgcaatcag 240
gaacaattgt cttaaggtct ttccgtgtgg tctccttaga cagatactcg tgcatggaat 300
ccactattga gtcatataac aagactgtat ataacatact tgcacctctg ggcgatgcaa 360
tccgccgaat acaggcaagt ggtgtatcgg ttgagcgtat ccgagagggc cgcatatttg 420
gtgccatcct tgggggagtt gccttaggtg tagccaccgc agcacagata acagctgcaa 480
ttgctttgat tcaggctaac gagaacgcaa aaaacatcct gcgtattaaa gacagtataa 540
ctaagaccaa cgaggcagtg agagatgtaa ctaatggcgt gtcgcagtta actatcgctg 600
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gtgtacaggc agctcaacaa ttaggtgtgg agctaagcct ctatctgacc gagatcacta 720
cagtcttcgg acctcagata acctctcctg ctttaagcaa attgactatc caagcgctgt 780
ataatttggc gggcgtaagc ttggatgtac tactgggaag gctcggagca gacaattcac 840
agttatcatc tttggttagt agtggtctta ttaccggaca gcccattctc tacgactcgg 900
aatctcaaat attggcactg caagtgtcac taccctccat tagtgactta aggggagtga 960
gagcgacata cttagacacg ttggctgtca acactgcagc aggacttgca tctgctatga 1020
ttccaaaggt agtaatccaa tctaataata tagttgaaga attagatact acagcatgta 1080
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tatcagcctg cattcttggg gatgtatcgc aatgccttta ttcaaagact aatggcgtct 1200
taaccactcc atatgtagca gtaaagggga aaattgtagc caattgtaag catgtcacat 1260
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ttggtgcaca tgctgaccga tcatatatac tccagagtaa gccggctcaa tcgtccacat 1740
gaacacagat gaggaacgaa ggtttcccta atagtaattt gtgtgaaagt tctggtagtc 1800
tgtcagttca gagagttaag aaaaaactac cggttgtaga tgaccaaagg acgatatacg 1860
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accgcttcac cgacaacagt cctcaatcat ggaatcagga atcagccagg catctcttgt 1980
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tcgaccctcc aggttccttg agcatctaaa tttcatcccc gcccctacta cgggaaaagg 2460
ttgcaccaga attccgtcct ttgatctagc tgcaacacat tggtgttata ctcacaatgt 2520
gattcttaat ggttgtaatg atcatgctca atcttatcaa tacatatccc tcgggatact 2580
caaggtgtca gccacgggaa acgtgttctt atctactctc agatctatca acctggatga 2640
tgatgaaaac cggaaatcat gtagcatatc agcaacgcca ctagggtgtg acttactttg 2700
tgctaaagtc actgagagag aagaggcaga ttacaattca gatgcagcga cgagattagt 2760
tcatggcagg ttaggttttg atggggtata ccatgagcag gccctgcctg tagaatcatt 2820
gttcagtgac tgggttgcaa actatccgtc agtcggcgga ggcagttact ttgataatag 2880
ggtatggttt ggcgtgtatg gggggatcag acctggctct cagactgatc tgctccagtc 2940
tgagaagtac gcgatatatc gtaggtacaa taatacctgc cctgataata atcccaccca 3000
gattgagcgg gccaaatcat cttatcgtcc gcagcggttt ggccagcggc ttgtacaaca 3060
agcaattcta tcaattagag tggagccatc tttgggtaat gatcctaaac tatctgtgtt 3120
agataataca gtcgtgttga tgggggcgga agcaaggata atgacatttg gccacgtggc 3180
attaatgtat caaagagggt catcatattt tccttctgca ctattatacc ctctcagttt 3240
aacaaatggt agtgcagcag catccaagcc tttcatattc gagcaatata caaggccagg 3300
tagcccacct tgtcaggcca ctgcaagatg tccaaattca tgtgttactg gtgtctacac 3360
agacgcatac ccgttatttt ggtctgaaga tcataaagtg aatggtgtat atggtatgat 3420
gttagatgac atcacatcac ggttaaaccc ggtagcagct atatttgata ggtatggtag 3480
gagtagagtg actagggtta gcagtagcag cacgaaggca gcttacacta caaatacatg 3540
ctttaaggtt gtcaaaacaa agagagtata ctgcttgagc attgccgaga tagagaatac 3600
actgtttgga gaattcagaa taaccccttt actctccgag ataatatttg acccaaacct 3660
tgaaccctca gacacgagcc gtaactagtt gagtcaatta taaaggagtt ggaaagatgg 3720
cattgtatca cctatcttct gcgacatcaa gaatca 3756
<210> 4
<211> 3690
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> APMV7/Dove/Tennessee/4/75
<400> 4
atttacagtt agtttacctg tctatcaagt tagaaaaaac acgggtagaa gattctggat 60
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ttttagtgtt gctgtggtta aatattctac ccgtaattgg cttagacaat tcaaagattg 180
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<223> APMV8/Goose/Delaware/1053/76
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<213> Artificial Sequence
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<211> 3714
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> APMV3/Turkey/Wisconsin/68
<400> 11
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<223> APMV12/Wigeon/Italy/3920_1/05
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<211> 3720
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> APMV5/budgerigar/Japan/TI/75
<400> 13
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<223> APMV10/penguin/Falkland Islands/324/07
<400> 14
atttacagtt agtttacctg tctatcaagt tagaaaaaac acgggtagaa gattctggat 60
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ccgctctttc cacattatca taccaagccc tttataattt gtgtgggggc aatatggctg 780
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA of genomic sequence of NDV strain LaSota
<400> 15
accaaacaga gaatccgtga gttacgataa aaggcgaagg agcaattgaa gtcgcacggg 60
tagaaggtgt gaatctcgag tgcgagcccg aagcacaaac tcgagaaagc cttctgccaa 120
catgtcttcc gtatttgatg agtacgaaca gctcctcgcg gctcagactc gccccaatgg 180
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cgtgcttgag attgatggct ttgccaacgg cacgccccag ttcaacaata ggagtggagt 480
gtctgaagag agagcacaga gatttgcgat gatagcagga tctctccctc gggcatgcag 540
caacggaacc ccgttcgtca cagccggggc cgaagatgat gcaccagaag acatcaccga 600
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agcccttgca cttagtagcc tctcaggcga catccagaag atgaagcagc tcatgcgttt 1020
gtatcggatg aaaggagata atgcgccgta catgacatta cttggtgata gtgaccagat 1080
gagctttgcg cctgccgagt atgcacaact ttactccttt gccatgggta tggcatcagt 1140
cctagataaa ggtactggga aataccaatt tgccagggac tttatgagca catcattctg 1200
gagacttgga gtagagtacg ctcaggctca gggaagtagc attaacgagg atatggctgc 1260
cgagctaaag ctaaccccag cagcaaggag gggcctggca gctgctgccc aacgggtctc 1320
cgaggagacc agcagcatag acatgcctac tcaacaagtc ggagtcctca ctgggcttag 1380
cgaggggggg tcccaagctc tacaaggcgg atcgaataga tcgcaagggc aaccagaagc 1440
cggggatggg gagacccaat tcctggatct gatgagagcg gtagcaaata gcatgaggga 1500
ggcgccaaac tctgcacagg gcactcccca atcggggcct cccccaactc ctgggccatc 1560
ccaagataac gacaccgact gggggtattg atggacaaaa cccagcctgc ttccacaaaa 1620
acatcccaat gccctcaccc gtagtcgacc cctcgatttg cggctctata tgaccacacc 1680
ctcaaacaaa catccccctc tttcctccct ccccctgctg tacaactacg tacgccctag 1740
ataccacagg cacaatgcgg ctcactaaca atcaaaacag agccgaggga attagaaaaa 1800
agtacgggta gaagagggat attcagagat cagggcaagt ctcccgagtc tctgctctct 1860
cctctacctg atagaccagg acaaacatgg ccacctttac agatgcagag atcgacgagc 1920
tatttgagac aagtggaact gtcattgaca acataattac agcccagggt aaaccagcag 1980
agactgttgg aaggagtgca atcccacaag gcaagaccaa ggtgctgagc gcagcatggg 2040
agaagcatgg gagcatccag ccaccggcca gtcaagacaa ccccgatcga caggacagat 2100
ctgacaaaca accatccaca cccgagcaaa cgaccccgca tgacagcccg ccggccacat 2160
ccgccgacca gccccccacc caggccacag acgaagccgt cgacacacag ctcaggaccg 2220
gagcaagcaa ctctctgctg ttgatgcttg acaagctcag caataaatcg tccaatgcta 2280
aaaagggccc atggtcgagc ccccaagagg ggaatcacca acgtccgact caacagcagg 2340
ggagtcaacc cagtcgcgga aacagtcagg aaagaccgca gaaccaagtc aaggccgccc 2400
ctggaaacca gggcacagac gtgaacacag catatcatgg acaatgggag gagtcacaac 2460
tatcagctgg tgcaacccct catgctctcc gatcaaggca gagccaagac aatacccttg 2520
tatctgcgga tcatgtccag ccacctgtag actttgtgca agcgatgatg tctatgatgg 2580
aggcgatatc acagagagta agtaaggttg actatcagct agatcttgtc ttgaaacaga 2640
catcctccat ccctatgatg cggtccgaaa tccaacagct gaaaacatct gttgcagtca 2700
tggaagccaa cttgggaatg atgaagattc tggatcccgg ttgtgccaac atttcatctc 2760
tgagtgatct acgggcagtt gcccgatctc acccggtttt agtttcaggc cctggagacc 2820
cctctcccta tgtgacacaa ggaggcgaaa tggcacttaa taaactttcg caaccagtgc 2880
cacatccatc tgaattgatt aaacccgcca ctgcatgcgg gcctgatata ggagtggaaa 2940
aggacactgt ccgtgcattg atcatgtcac gcccaatgca cccgagttct tcagccaagc 3000
tcctaagcaa gttagatgca gccgggtcga tcgaggaaat caggaaaatc aagcgccttg 3060
ctctaaatgg ctaattacta ctgccacacg tagcgggtcc ctgtccactc ggcatcacac 3120
ggaatctgca ccgagttccc ccccgcggac ccaaggtcca actctccaag cggcaatcct 3180
ctctcgcttc ctcagcccca ctgaatgatc gcgtaaccgt aattaatcta gctacattta 3240
agattaagaa aaaatacggg tagaattgga gtgccccaat tgtgccaaga tggactcatc 3300
taggacaatt gggctgtact ttgattctgc ccattcttct agcaacctgt tagcatttcc 3360
gatcgtccta caagacacag gagatgggaa gaagcaaatc gccccgcaat ataggatcca 3420
gcgccttgac ttgtggactg atagtaagga ggactcagta ttcatcacca cctatggatt 3480
catctttcaa gttgggaatg aagaagccac cgtcggcatg atcgatgata aacccaagcg 3540
cgagttactt tccgctgcga tgctctgcct aggaagcgtc ccaaataccg gagaccttat 3600
tgagctggca agggcctgtc tcactatgat agtcacatgc aagaagagtg caactaatac 3660
tgagagaatg gttttctcag tagtgcaggc accccaagtg ctgcaaagct gtagggttgt 3720
ggcaaacaaa tactcatcag tgaatgcagt caagcacgtg aaagcgccag agaagattcc 3780
cgggagtgga accctagaat acaaggtgaa ctttgtctcc ttgactgtgg taccgaagag 3840
ggatgtctac aagatcccag ctgcagtatt gaaggtttct ggctcgagtc tgtacaatct 3900
tgcgctcaat gtcactatta atgtggaggt agacccgagg agtcctttgg ttaaatctct 3960
gtctaagtct gacagcggat actatgctaa cctcttcttg catattggac ttatgaccac 4020
tgtagatagg aaggggaaga aagtgacatt tgacaagctg gaaaagaaaa taaggagcct 4080
tgatctatct gtcgggctca gtgatgtgct cgggccttcc gtgttggtaa aagcaagagg 4140
tgcacggact aagcttttgg cacctttctt ctctagcagt gggacagcct gctatcccat 4200
agcaaatgct tctcctcagg tggccaagat actctggagt caaaccgcgt gcctgcggag 4260
cgttaaaatc attatccaag caggtaccca acgcgctgtc gcagtgaccg ccgaccacga 4320
ggttacctct actaagctgg agaaggggca cacccttgcc aaatacaatc cttttaagaa 4380
ataagctgcg tctctgagat tgcgctccgc ccactcaccc agatcatcat gacacaaaaa 4440
actaatctgt cttgattatt tacagttagt ttacctgtct atcaagttag aaaaaacacg 4500
ggtagaagat tctggatccc ggttggcgcc ctccaggtgc aagatgggct ccagaccttc 4560
taccaagaac ccagcaccta tgatgctgac tatccgggtt gcgctggtac tgagttgcat 4620
ctgtccggca aactccattg atggcaggcc tcttgcagct gcaggaattg tggttacagg 4680
agacaaagcc gtcaacatat acacctcatc ccagacagga tcaatcatag ttaagctcct 4740
cccgaatctg cccaaggata aggaggcatg tgcgaaagcc cccttggatg catacaacag 4800
gacattgacc actttgctca ccccccttgg tgactctatc cgtaggatac aagagtctgt 4860
gactacatct ggagggggga gacaggggcg ccttataggc gccattattg gcggtgtggc 4920
tcttggggtt gcaactgccg cacaaataac agcggccgca gctctgatac aagccaaaca 4980
aaatgctgcc aacatcctcc gacttaaaga gagcattgcc gcaaccaatg aggctgtgca 5040
tgaggtcact gacggattat cgcaactagc agtggcagtt gggaagatgc agcagtttgt 5100
taatgaccaa tttaataaaa cagctcagga attagactgc atcaaaattg cacagcaagt 5160
tggtgtagag ctcaacctgt acctaaccga attgactaca gtattcggac cacaaatcac 5220
ttcacctgct ttaaacaagc tgactattca ggcactttac aatctagctg gtggaaatat 5280
ggattactta ttgactaagt taggtgtagg gaacaatcaa ctcagctcat taatcggtag 5340
cggcttaatc accggtaacc ctattctata cgactcacag actcaactct tgggtataca 5400
ggtaactcta ccttcagtcg ggaacctaaa taatatgcgt gccacctact tggaaacctt 5460
atccgtaagc acaaccaggg gatttgcctc ggcacttgtc ccaaaagtgg tgacacaggt 5520
cggttctgtg atagaagaac ttgacacctc atactgtata gaaactgact tagatttata 5580
ttgtacaaga atagtaacgt tccctatgtc ccctggtatt tattcctgct tgagcggcaa 5640
tacgtcggcc tgtatgtact caaagaccga aggcgcactt actacaccat acatgactat 5700
caaaggttca gtcatcgcca actgcaagat gacaacatgt agatgtgtaa accccccggg 5760
tatcatatcg caaaactatg gagaagccgt gtctctaata gataaacaat catgcaatgt 5820
tttatcctta ggcgggataa ctttaaggct cagtggggaa ttcgatgtaa cttatcagaa 5880
gaatatctca atacaagatt ctcaagtaat aataacaggc aatcttgata tctcaactga 5940
gcttgggaat gtcaacaact cgatcagtaa tgctttgaat aagttagagg aaagcaacag 6000
aaaactagac aaagtcaatg tcaaactgac tagcacatct gctctcatta cctatatcgt 6060
tttgactatc atatctcttg tttttggtat acttagcctg attctagcat gctacctaat 6120
gtacaagcaa aaggcgcaac aaaagacctt attatggctt gggaataata ctctagatca 6180
gatgagagcc actacaaaaa tgtgaacaca gatgaggaac gaaggtttcc ctaatagtaa 6240
tttgtgtgaa agttctggta gtctgtcagt tcagagagtt aagaaaaaac taccggttgt 6300
agatgaccaa aggacgatat acgggtagaa cggtaagaga ggccgcccct caattgcgag 6360
ccaggcttca caacctccgt tctaccgctt caccgacaac agtcctcaat catggaccgc 6420
gccgttagcc aagttgcgtt agagaatgat gaaagagagg caaaaaatac atggcgcttg 6480
atattccgga ttgcaatctt attcttaaca gtagtgacct tggctatatc tgtagcctcc 6540
cttttatata gcatgggggc tagcacacct agcgatcttg taggcatacc gactaggatt 6600
tccagggcag aagaaaagat tacatctaca cttggttcca atcaagatgt agtagatagg 6660
atatataagc aagtggccct tgagtctccg ttggcattgt taaatactga gaccacaatt 6720
atgaacgcaa taacatctct ctcttatcag attaatggag ctgcaaacaa cagtgggtgg 6780
ggggcaccta tccatgaccc agattatata ggggggatag gcaaagaact cattgtagat 6840
gatgctagtg atgtcacatc attctatccc tctgcatttc aagaacatct gaattttatc 6900
ccggcgccta ctacaggatc aggttgcact cgaataccct catttgacat gagtgctacc 6960
cattactgct acacccataa tgtaatattg tctggatgca gagatcactc acattcatat 7020
cagtatttag cacttggtgt gctccggaca tctgcaacag ggagggtatt cttttctact 7080
ctgcgttcca tcaacctgga cgacacccaa aatcggaagt cttgcagtgt gagtgcaact 7140
cccctgggtt gtgatatgct gtgctcgaaa gtcacggaga cagaggaaga agattataac 7200
tcagctgtcc ctacgcggat ggtacatggg aggttagggt tcgacggcca gtaccacgaa 7260
aaggacctag atgtcacaac attattcggg gactgggtgg ccaactaccc aggagtaggg 7320
ggtggatctt ttattgacag ccgcgtatgg ttctcagtct acggagggtt aaaacccaat 7380
tcacccagtg acactgtaca ggaagggaaa tatgtgatat acaagcgata caatgacaca 7440
tgcccagatg agcaagacta ccagattcga atggccaagt cttcgtataa gcctggacgg 7500
tttggtggga aacgcataca gcaggctatc ttatctatca aggtgtcaac atccttaggc 7560
gaagacccgg tactgactgt accgcccaac acagtcacac tcatgggggc cgaaggcaga 7620
attctcacag tagggacatc tcatttcttg tatcaacgag ggtcatcata cttctctccc 7680
gcgttattat atcctatgac agtcagcaac aaaacagcca ctcttcatag tccttataca 7740
ttcaatgcct tcactcggcc aggtagtatc ccttgccagg cttcagcaag atgccccaac 7800
tcgtgtgtta ctggagtcta tacagatcca tatcccctaa tcttctatag aaaccacacc 7860
ttgcgagggg tattcgggac aatgcttgat ggtgtacaag caagacttaa ccctgcgtct 7920
gcagtattcg atagcacatc ccgcagtcgc attactcgag tgagttcaag cagtaccaaa 7980
gcagcataca caacatcaac ttgttttaaa gtggtcaaga ctaataagac ctattgtctc 8040
agcattgctg aaatatctaa tactctcttc ggagaattca gaatcgtccc gttactagtt 8100
gagatcctca aagatgacgg ggttagagaa gccaggtctg gctagttgag tcaattataa 8160
aggagttgga aagatggcat tgtatcacct atcttctgcg acatcaagaa tcaaaccgaa 8220
tgccggcgcg tgctcgaatt ccatgttgcc agttgaccac aatcagccag tgctcatgcg 8280
atcagattaa gccttgtcaa tagtctcttg attaagaaaa aatgtaagtg gcaatgagat 8340
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aagggcagag catcagatta tcctaccaga gtcacacctg tcttcaccat tggtcaagca 8460
caaactactc tattactgga aattaactgg gctaccgctt cctgatgaat gtgacttcga 8520
ccacctcatt ctcagccgac aatggaaaaa aatacttgaa tcggcctctc ctgatactga 8580
gagaatgata aaactcggaa gggcagtaca ccaaactctt aaccacaatt ccagaataac 8640
cggagtgctc caccccaggt gtttagaaga actggctaat attgaggtcc cagattcaac 8700
caacaaattt cggaagattg agaagaagat ccaaattcac aacacgagat atggagaact 8760
gttcacaagg ctgtgtacgc atatagagaa gaaactgctg gggtcatctt ggtctaacaa 8820
tgtcccccgg tcagaggagt tcagcagcat tcgtacggat ccggcattct ggtttcactc 8880
aaaatggtcc acagccaagt ttgcatggct ccatataaaa cagatccaga ggcatctgat 8940
ggtggcagct aggacaaggt ctgcggccaa caaattggtg atgctaaccc ataaggtagg 9000
ccaagtcttt gtcactcctg aacttgtcgt tgtgacgcat acgaatgaga acaagttcac 9060
atgtcttacc caggaacttg tattgatgta tgcagatatg atggagggca gagatatggt 9120
caacataata tcaaccacgg cggtgcatct cagaagctta tcagagaaaa ttgatgacat 9180
tttgcggtta atagacgctc tggcaaaaga cttgggtaat caagtctacg atgttgtatc 9240
actaatggag ggatttgcat acggagctgt ccagctactc gagccgtcag gtacatttgc 9300
aggagatttc ttcgcattca acctgcagga gcttaaagac attctaattg gcctcctccc 9360
caatgatata gcagaatccg tgactcatgc aatcgctact gtattctctg gtttagaaca 9420
gaatcaagca gctgagatgt tgtgtctgtt gcgtctgtgg ggtcacccac tgcttgagtc 9480
ccgtattgca gcaaaggcag tcaggagcca aatgtgcgca ccgaaaatgg tagactttga 9540
tatgatcctt caggtactgt ctttcttcaa gggaacaatc atcaacgggt acagaaagaa 9600
gaatgcaggt gtgtggccgc gagtcaaagt ggatacaata tatgggaagg tcattgggca 9660
actacatgca gattcagcag agatttcaca cgatatcatg ttgagagagt ataagagttt 9720
atctgcactt gaatttgagc catgtataga atatgaccct gtcaccaacc tgagcatgtt 9780
cctaaaagac aaggcaatcg cacaccccaa cgataattgg cttgcctcgt ttaggcggaa 9840
ccttctctcc gaagaccaga agaaacatgt aaaagaagca acttcgacta atcgcctctt 9900
gatagagttt ttagagtcaa atgattttga tccatataaa gagatggaat atctgacgac 9960
ccttgagtac cttagagatg acaatgtggc agtatcatac tcgctcaagg agaaggaagt 10020
gaaagttaat ggacggatct tcgctaagct gacaaagaag ttaaggaact gtcaggtgat 10080
ggcggaaggg atcctagccg atcagattgc acctttcttt cagggaaatg gagtcattca 10140
ggatagcata tccttgacca agagtatgct agcgatgagt caactgtctt ttaacagcaa 10200
taagaaacgt atcactgact gtaaagaaag agtatcttca aaccgcaatc atgatccgaa 10260
aagcaagaac cgtcggagag ttgcaacctt cataacaact gacctgcaaa agtactgtct 10320
taattggaga tatcagacaa tcaaattgtt cgctcatgcc atcaatcagt tgatgggcct 10380
acctcacttc ttcgaatgga ttcacctaag actgatggac actacgatgt tcgtaggaga 10440
ccctttcaat cctccaagtg accctactga ctgtgacctc tcaagagtcc ctaatgatga 10500
catatatatt gtcagtgcca gagggggtat cgaaggatta tgccagaagc tatggacaat 10560
gatctcaatt gctgcaatcc aacttgctgc agctagatcg cattgtcgtg ttgcctgtat 10620
ggtacagggt gataatcaag taatagcagt aacgagagag gtaagatcag acgactctcc 10680
ggagatggtg ttgacacagt tgcatcaagc cagtgataat ttcttcaagg aattaattca 10740
tgtcaatcat ttgattggcc ataatttgaa ggatcgtgaa accatcaggt cagacacatt 10800
cttcatatac agcaaacgaa tcttcaaaga tggagcaatc ctcagtcaag tcctcaaaaa 10860
ttcatctaaa ttagtgctag tgtcaggtga tctcagtgaa aacaccgtaa tgtcctgtgc 10920
caacattgcc tctactgtag cacggctatg cgagaacggg cttcccaaag acttctgtta 10980
ctatttaaac tatataatga gttgtgtgca gacatacttt gactctgagt tctccatcac 11040
caacaattcg caccccgatc ttaatcagtc gtggattgag gacatctctt ttgtgcactc 11100
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cactagaaat atcggtgacc cggggactac tgcttttgca gagatcaagc gactagaagc 11220
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attgtctgga gtgcacacag aggataatga ggcagaagag aaggcattgg ctgaattctt 11460
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gcttactagg aggccattag gcatcaagag gctgatgcgg atagtcaatt attctagcat 11640
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aatagctcat atgtcgccac atgtaaaggc tgccctaagg gcatcatccg tgttgatctg 12060
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tgcatgtcga ggagatatgg agtgttacct ggtatttgtc atgggttacc tgggcgggcc 14280
tacatttgta catgaggtgg tgaggatggc gaaaactctg gtgcagcggc acggtacgct 14340
tttgtctaaa tcagatgaga tcacactgac caggttattc acctcacagc ggcagcgtgt 14400
gacagacatc ctatccagtc ctttaccaag attaataaag tacttgagga agaatattga 14460
cactgcgctg attgaagccg ggggacagcc cgtccgtcca ttctgtgcgg agagtctggt 14520
gagcacgcta gcgaacataa ctcagataac ccagatcatc gctagtcaca ttgacacagt 14580
tatccggtct gtgatatata tggaagctga gggtgatctc gctgacacag tatttctatt 14640
taccccttac aatctctcta ctgacgggaa aaagaggaca tcacttaaac agtgcacgag 14700
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ttaaaaaaag gttgcgcaca attattcttg agtgtagtct cgtcattcac caaatctttg 15180
tttggt 15186
<210> 16
<211> 21
<212> DNA
<213> Mus
<220>
<223> Mouse IFN-B Forward Primer Sequence
<400> 16
cagctccaag aaaggacgaa c 21
<210> 17
<211> 21
<212> DNA
<213> Mus
<220>
<223> Mouse IFN-B Reverse Primer Sequence
<400> 17
ggcagtgtaa ctcttctgca t 21
<210> 18
<211> 22
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Human IFN-B Forward Primer Sequence
<400> 18
tctggcacaa caggtagtag gc 22
<210> 19
<211> 22
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Human IFN-B Reverse Primer Sequence
<400> 19
gagaagcaca acaggagagc aa 22
<210> 20
<211> 21
<212> DNA
<213> Mus
<220>
<223> Mouse IL-6 Forward Primer Sequence
<400> 20
ctgcaagaga cttccatcca g 21
<210> 21
<211> 23
<212> DNA
<213> Mus
<220>
<223> Mouse IL-6 Reverse Primer Sequence
<400> 21
agtggtatag acaggtctgt tgg 23
<210> 22
<211> 22
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Human IL-6 Forward Primer Sequence
<400> 22
agaggcactg gcagaaaaca ac 22
<210> 23
<211> 23
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Human IL-6 Reverse Primer Sequence
<400> 23
aggcaagtct cctcattgaa tcc 23
<210> 24
<211> 21
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Human IL-1B Forward Primer Sequence
<400> 24
ctcgccagtg aaatgatggc t 21
<210> 25
<211> 21
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Human IL-1B Reverse Primer Sequence
<400> 25
gtcggagatt cgtagctgga t 21
<210> 26
<211> 22
<212> DNA
<213> Mus
<220>
<223> Mouse IL-1B Forward Primer Sequence
<400> 26
tgggctggac tgtttctaat gc 22
<210> 27
<211> 21
<212> DNA
<213> Mus
<220>
<223> Mouse IL-1B Reverse Primer Sequence
<400> 27
tgtcttggcc gaggactaag g 21
<210> 28
<211> 21
<212> DNA
<213> Mus
<220>
<223> Mouse ISG-15 Forward Primer Sequence
<400> 28
ggtgtccgtg actaactcca t 21
<210> 29
<211> 21
<212> DNA
<213> Mus
<220>
<223> Mouse ISG-15 Reverse Primer Sequence
<400> 29
tggaaagggt aagaccgtcc t 21
<210> 30
<211> 22
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Human ISG-15 Forward Primer Sequence
<400> 30
tcctggtgag gaataacaag gg 22
<210> 31
<211> 20
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Human ISG-15 Reverse Primer Sequence
<400> 31
gtcagccaga acaggtcgtc 20
<210> 32
<211> 21
<212> DNA
<213> Mus
<220>
<223> Mouse MX1 Forward Primer Sequence
<400> 32
gaccataggg gtcttgacca a 21
<210> 33
<211> 23
<212> DNA
<213> Mus
<220>
<223> Mouse MX1 Reverse Primer Sequence
<400> 33
agacttgctc tttctgaaaa gcc 23
<210> 34
<211> 21
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Human MX1 Forward Primer Sequence
<400> 34
gtttccgaag tggacatcgc a 21
<210> 35
<211> 20
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Human MX1 Reverse Primer Sequence
<400> 35
gaagggcaac tcctgacagt 20
<210> 36
<211> 21
<212> DNA
<213> Mus
<220>
<223> Mouse STAT-1 Forward Primer Sequence
<400> 36
tcacagtggt tcgagcttca g 21
<210> 37
<211> 21
<212> DNA
<213> Mus
<220>
<223> Mouse STAT-1 Reverse Primer Sequence
<400> 37
gcaaacgaga catcataggc a 21
<210> 38
<211> 23
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Human STAT-1 Forward Primer Sequence
<400> 38
atgtctcagt ggtacgaact tca 23
<210> 39
<211> 21
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Human STAT-1 Reverse Primer Sequence
<400> 39
tgtgccaggt actgtctgat t 21
<210> 40
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> LS-L289A N Forward Primer Sequence
<400> 40
gaaccatgtt gcccttgcag 20
<210> 41
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> LS-L289A N Reverse Primer Sequence
<400> 41
cctctccagg gtatcggtga 20
<210> 42
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> APMV-4 N Forward Primer Sequence
<400> 42
atcggtcctt agcaggagga 20
<210> 43
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> APMV-4 N Reverse Primer Sequence
<400> 43
gggtccagtc gttgacactt 20
<210> 44
<211> 19395
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> NDV-APMV2-GFP: APMV2/Chicken/California/ Yucaipa/56
<400> 44
tcttccgctt cctcgctcac tgactcgctg cgctcggtcg ttcggctgcg gcgagcggta 60
tcagctcact caaaggcggt aatacggtta tccacagaat caggggataa cgcaggaaag 120
aacatgtgag caaaaggcca gcaaaaggcc aggaaccgta aaaaggccgc gttgctggcg 180
tttttccata ggctccgccc ccctgacgag catcacaaaa atcgacgctc aagtcagagg 240
tggcgaaacc cgacaggact ataaagatac caggcgtttc cccctggaag ctccctcgtg 300
cgctctcctg ttccgaccct gccgcttacc ggatacctgt ccgcctttct cccttcggga 360
agcgtggcgc tttctcatag ctcacgctgt aggtatctca gttcggtgta ggtcgttcgc 420
tccaagctgg gctgtgtgca cgaacccccc gttcagcccg accgctgcgc cttatccggt 480
aactatcgtc ttgagtccaa cccggtaaga cacgacttat cgccactggc agcagccact 540
ggtaacagga ttagcagagc gaggtatgta ggcggtgcta cagagttctt gaagtggtgg 600
cctaactacg gctacactag aagaacagta tttggtatct gcgctctgct gaagccagtt 660
accttcggaa aaagagttgg tagctcttga tccggcaaac aaaccaccgc tggtagcggt 720
ggtttttttg tttgcaagca gcagattacg cgcagaaaaa aaggatctca agaagatcct 780
ttgatctttt ctacggggtc tgacgctcag tggaacgaaa actcacgtta agggattttg 840
gtcatgagat tatcaaaaag gatcttcacc tagatccttt taaattaaaa atgaagtttt 900
aaatcaatct aaagtatata tgagtaaact tggtctgaca gttaccaatg cttaatcagt 960
gaggcaccta tctcagcgat ctgtctattt cgttcatcca tagttgcctg actccccgtc 1020
gtgtagataa ctacgatacg ggagggctta ccatctggcc ccagtgctgc aatgataccg 1080
cgagacccac gctcaccggc tccagattta tcagcaataa accagccagc cggaagggcc 1140
gagcgcagaa gtggtcctgc aactttatcc gcctccatcc agtctattaa ttgttgccgg 1200
gaagctagag taagtagttc gccagttaat agtttgcgca acgttgttgc cattgctaca 1260
ggcatcgtgg tgtcacgctc gtcgtttggt atggcttcat tcagctccgg ttcccaacga 1320
tcaaggcgag ttacatgatc ccccatgttg tgcaaaaaag cggttagctc cttcggtcct 1380
ccgatcgttg tcagaagtaa gttggccgca gtgttatcac tcatggttat ggcagcactg 1440
cataattctc ttactgtcat gccatccgta agatgctttt ctgtgactgg tgagtactca 1500
accaagtcat tctgagaata gtgtatgcgg cgaccgagtt gctcttgccc ggcgtcaata 1560
cgggataata ccgcgccaca tagcagaact ttaaaagtgc tcatcattgg aaaacgttct 1620
tcggggcgaa aactctcaag gatcttaccg ctgttgagat ccagttcgat gtaacccact 1680
cgtgcaccca actgatcttc agcatctttt actttcacca gcgtttctgg gtgagcaaaa 1740
acaggaaggc aaaatgccgc aaaaaaggga ataagggcga cacggaaatg ttgaatactc 1800
atactcttcc tttttcaata ttattgaagc atttatcagg gttattgtct catgagcgga 1860
tacatatttg aatgtattta gaaaaataaa caaatagggg ttccgcgcac atttccccga 1920
aaagtgccac ctgacgtcta agaaaccatt attatcatga cattaaccta taaaaatagg 1980
cgtatcacga ggccctttcg tctcgcgcgt ttcggtgatg acggtgaaaa cctctgacac 2040
atgcagctcc cggagacggt cacagcttgt ctgtaagcgg atgccgggag cagacaagcc 2100
cgtcagggcg cgtcagcggg tgttggcggg tgtcggggct ggcttaacta tgcggcatca 2160
gagcagattg tactgagagt gcaccataaa attgtaaacg ttaatatttt gttaaaattc 2220
gcgttaaatt tttgttaaat cagctcattt tttaaccaat aggccgaaat cggcaaaatc 2280
ccttataaat caaaagaata gcccgagata gggttgagtg ttgttccagt ttggaacaag 2340
agtccactat taaagaacgt ggactccaac gtcaaagggc gaaaaaccgt ctatcagggc 2400
gatggcccac tacgtgaacc atcacccaaa tcaagttttt tggggtcgag gtgccgtaaa 2460
gcactaaatc ggaaccctaa agggagcccc cgatttagag cttgacgggg aaagccggcg 2520
aacgtggcga gaaaggaagg gaagaaagcg aaaggagcgg gcgctagggc gctggcaagt 2580
gtagcggtca cgctgcgcgt aaccaccaca cccgccgcgc ttaatgcgcc gctacagggc 2640
gcgtactatg gttgctttga cgtatgcggt gtgaaatacc gcacagatgc gtaaggagaa 2700
aataccgcat caggcgccat tcgccattca ggctgcgcaa ctgttgggaa gggcgatcgg 2760
tgcgggcctc ttcgctatta cgccagctgg cgaaaggggg atgtgctgca aggcgattaa 2820
gttgggtaac gccagggttt tcccagtcac gacgttgtaa aacgacggcc agtgccaagc 2880
tttaatacga ctcactatag ggagattggt ctgatgagtc cgtgaggacg aaacggagtc 2940
tagactccgt caccaaacag agaatccgtg agttacgata aaaggcgaag gagcaattga 3000
agtcgcacgg gtagaaggtg tgaatctcga gtgcgagccc gaagcacaaa ctcgagaaag 3060
ccttctgcca acatgtcttc cgtatttgat gagtacgaac agctcctcgc ggctcagact 3120
cgccccaatg gagctcatgg agggggagaa aaagggagta ccttaaaagt agacgtcccg 3180
gtattcactc ttaacagtga tgacccagaa gatagatgga gctttgtggt attctgcctc 3240
cggattgctg ttagcgaaga tgccaacaaa ccactcaggc aaggtgctct catatctctt 3300
ttatgctccc actcacaggt aatgaggaac catgttgccc ttgcagggaa acagaatgaa 3360
gccacattgg ccgtgcttga gattgatggc tttgccaacg gcacgcccca gttcaacaat 3420
aggagtggag tgtctgaaga gagagcacag agatttgcga tgatagcagg atctctccct 3480
cgggcatgca gcaacggaac cccgttcgtc acagccgggg ccgaagatga tgcaccagaa 3540
gacatcaccg ataccctgga gaggatcctc tctatccagg ctcaagtatg ggtcacagta 3600
gcaaaagcca tgactgcgta tgagactgca gatgagtcgg aaacaaggcg aatcaataag 3660
tatatgcagc aaggcagggt ccaaaagaaa tacatcctct accccgtatg caggagcaca 3720
atccaactca cgatcagaca gtctcttgca gtccgcatct ttttggttag cgagctcaag 3780
agaggccgca acacggcagg tggtacctct acttattata acctggtagg ggacgtagac 3840
tcatacatca ggaataccgg gcttactgca ttcttcttga cactcaagta cggaatcaac 3900
accaagacat cagcccttgc acttagtagc ctctcaggcg acatccagaa gatgaagcag 3960
ctcatgcgtt tgtatcggat gaaaggagat aatgcgccgt acatgacatt acttggtgat 4020
agtgaccaga tgagctttgc gcctgccgag tatgcacaac tttactcctt tgccatgggt 4080
atggcatcag tcctagataa aggtactggg aaataccaat ttgccaggga ctttatgagc 4140
acatcattct ggagacttgg agtagagtac gctcaggctc agggaagtag cattaacgag 4200
gatatggctg ccgagctaaa gctaacccca gcagcaagga ggggcctggc agctgctgcc 4260
caacgggtct ccgaggagac cagcagcata gacatgccta ctcaacaagt cggagtcctc 4320
actgggctta gcgagggggg gtcccaagct ctacaaggcg gatcgaatag atcgcaaggg 4380
caaccagaag ccggggatgg ggagacccaa ttcctggatc tgatgagagc ggtagcaaat 4440
agcatgaggg aggcgccaaa ctctgcacag ggcactcccc aatcggggcc tcccccaact 4500
cctgggccat cccaagataa cgacaccgac tgggggtatt gatggacaaa acccagcctg 4560
cttccacaaa aacatcccaa tgccctcacc cgtagtcgac ccctcgattt gcggctctat 4620
atgaccacac cctcaaacaa acatccccct ctttcctccc tccccctgct gtacaactac 4680
gtacgcccta gataccacag gcacaatgcg gctcactaac aatcaaaaca gagccgaggg 4740
aattagaaaa aagtacgggt agaagaggga tattcagaga tcagggcaag tctcccgagt 4800
ctctgctctc tcctctacct gatagaccag gacaaacatg gccaccttta cagatgcaga 4860
gatcgacgag ctatttgaga caagtggaac tgtcattgac aacataatta cagcccaggg 4920
taaaccagca gagactgttg gaaggagtgc aatcccacaa ggcaagacca aggtgctgag 4980
cgcagcatgg gagaagcatg ggagcatcca gccaccggcc agtcaagaca accccgatcg 5040
acaggacaga tctgacaaac aaccatccac acccgagcaa acgaccccgc atgacagccc 5100
gccggccaca tccgccgacc agccccccac ccaggccaca gacgaagccg tcgacacaca 5160
gctcaggacc ggagcaagca actctctgct gttgatgctt gacaagctca gcaataaatc 5220
gtccaatgct aaaaagggcc catggtcgag cccccaagag gggaatcacc aacgtccgac 5280
tcaacagcag gggagtcaac ccagtcgcgg aaacagtcag gaaagaccgc agaaccaagt 5340
caaggccgcc cctggaaacc agggcacaga cgtgaacaca gcatatcatg gacaatggga 5400
ggagtcacaa ctatcagctg gtgcaacccc tcatgctctc cgatcaaggc agagccaaga 5460
caataccctt gtatctgcgg atcatgtcca gccacctgta gactttgtgc aagcgatgat 5520
gtctatgatg gaggcgatat cacagagagt aagtaaggtt gactatcagc tagatcttgt 5580
cttgaaacag acatcctcca tccctatgat gcggtccgaa atccaacagc tgaaaacatc 5640
tgttgcagtc atggaagcca acttgggaat gatgaagatt ctggatcccg gttgtgccaa 5700
catttcatct ctgagtgatc tacgggcagt tgcccgatct cacccggttt tagtttcagg 5760
ccctggagac ccctctccct atgtgacaca aggaggcgaa atggcactta ataaactttc 5820
gcaaccagtg ccacatccat ctgaattgat taaacccgcc actgcatgcg ggcctgatat 5880
aggagtggaa aaggacactg tccgtgcatt gatcatgtca cgcccaatgc acccgagttc 5940
ttcagccaag ctcctaagca agttagatgc agccgggtcg atcgaggaaa tcaggaaaat 6000
caagcgcctt gctctaaatg gctaattact actgccacac gtagcgggtc cctgtccact 6060
cggcatcaca cggaatctgc accgagttcc cccccgcggt tagaaaaaat acgggtagaa 6120
ccgccaccat ggtgagcaag ggcgaggagc tgttcaccgg ggtggtgccc atcctggtcg 6180
agctggacgg cgacgtaaac ggccacaagt tcagcgtgtc cggcgagggc gagggcgatg 6240
ccacctacgg caagctgacc ctgaagttca tctgcaccac cggcaagctg cccgtgccct 6300
ggcccaccct cgtgaccacc ctgacctacg gcgtgcagtg cttcagccgc taccccgacc 6360
acatgaagca gcacgacttc ttcaagtccg ccatgcccga aggctacgtc caggagcgca 6420
ccatcttctt caaggacgac ggcaactaca agacccgcgc cgaggtgaag ttcgagggcg 6480
acaccctggt gaaccgcatc gagctgaagg gcatcgactt caaggaggac ggcaacatcc 6540
tggggcacaa gctggagtac aactacaaca gccacaacgt ctatatcatg gccgacaagc 6600
agaagaacgg catcaaggtg aacttcaaga tccgccacaa catcgaggac ggcagcgtgc 6660
agctcgccga ccactaccag cagaacaccc ccatcggcga cggccccgtg ctgctgcccg 6720
acaaccacta cctgagcacc cagtccgccc tgagcaaaga ccccaacgag aagcgcgatc 6780
acatggtcct gctggagttc gtgaccgccg ccgggatcac tctcggcatg gacgagctgt 6840
acaagtgacc cgcggaccca aggtccaact ctccaagcgg caatcctctc tcgcttcctc 6900
agccccactg aatgatcgcg taaccgtaat taatctagct acatttaaga ttaagaaaaa 6960
atacgggtag aattggagtg ccccaattgt gccaagatgg actcatctag gacaattggg 7020
ctgtactttg attctgccca ttcttctagc aacctgttag catttccgat cgtcctacaa 7080
gacacaggag atgggaagaa gcaaatcgcc ccgcaatata ggatccagcg ccttgacttg 7140
tggactgata gtaaggagga ctcagtattc atcaccacct atggattcat ctttcaagtt 7200
gggaatgaag aagccaccgt cggcatgatc gatgataaac ccaagcgcga gttactttcc 7260
gctgcgatgc tctgcctagg aagcgtccca aataccggag accttattga gctggcaagg 7320
gcctgtctca ctatgatagt cacatgcaag aagagtgcaa ctaatactga gagaatggtt 7380
ttctcagtag tgcaggcacc ccaagtgctg caaagctgta gggttgtggc aaacaaatac 7440
tcatcagtga atgcagtcaa gcacgtgaaa gcgccagaga agattcccgg gagtggaacc 7500
ctagaataca aggtgaactt tgtctccttg actgtggtac cgaagaggga tgtctacaag 7560
atcccagctg cagtattgaa ggtttctggc tcgagtctgt acaatcttgc gctcaatgtc 7620
actattaatg tggaggtaga cccgaggagt cctttggtta aatctctgtc taagtctgac 7680
agcggatact atgctaacct cttcttgcat attggactta tgaccactgt agataggaag 7740
gggaagaaag tgacatttga caagctggaa aagaaaataa ggagccttga tctatctgtc 7800
gggctcagtg atgtgctcgg gccttccgtg ttggtaaaag caagaggtgc acggactaag 7860
cttttggcac ctttcttctc tagcagtggg acagcctgct atcccatagc aaatgcttct 7920
cctcaggtgg ccaagatact ctggagtcaa accgcgtgcc tgcggagcgt taaaatcatt 7980
atccaagcag gtacccaacg cgctgtcgca gtgaccgccg accacgaggt tacctctact 8040
aagctggaga aggggcacac ccttgccaaa tacaatcctt ttaagaaata agctgcgtct 8100
ctgagattgc gctccgccca ctcacccaga tcatcatgac acaaaaaact aatctgtctt 8160
gattatttac agttagttta cctgtctatc aagttagaaa aaacacgggt agaagattct 8220
ggatcccggt tggcgccctc caggtgcaag atgaatcaag cactcgtgat tttgttggta 8280
tctttccagc tcggcgttgc cttagataac tcagtgttgg ctccaatagg agtagctagc 8340
gcacaggagt ggcaactggc ggcatataca acgaccctca cagggaccat cgcagtgaga 8400
tttatcccgg tcctgcctgg gaacctatca acatgtgcac aggagacgct gcaggaatat 8460
aatagaactg tgactaatat cttaggcccg ttgagagaga acttggatgc tctcctatct 8520
gacttcgata aacctgcatc gaggttcgtg ggcgccatca ttgggtcggt ggccttgggg 8580
gtagcaacag ctgcacaaat cacagccgcc gtggctctca atcaagcaca agagaatgcc 8640
cggaatatat ggcgtctcaa ggaatcgata aagaaaacca atgcggctgt gttggaattg 8700
aaggatggac ttgcaacgac tgctatagct ttggacaaag tgcaaaagtt tatcaatgat 8760
gatattatac cacagattaa ggacattgac tgccaggtag ttgcaaataa attaggcgtc 8820
tacctctcct tatacttaac agagcttaca actgtatttg gttctcagat cactaatcct 8880
gcattatcaa cgctctctta ccaggcgctg tacagcttat gtggagggga tatgggaaag 8940
ctaactgagc tgatcggtgt caatgcaaag gatgtgggat ccctctacga ggctaacctc 9000
ataaccggcc aaatcgttgg atatgaccct gaactacaga taatcctcat acaagtatct 9060
tacccaagtg tgtctgaagt gacaggagtc cgggctactg agttagtcac tgtcagtgtc 9120
actacaccaa aaggagaagg gcaggcaatt gttccgagat atgtggcaca gagtagagtg 9180
ctgacagagg agttggatgt ctcgacttgt aggtttagca aaacaactct ttattgtagg 9240
tcgattctca cacggcccct accaactttg atcgccagct gcctgtcagg gaagtacgac 9300
gattgtcagt acacaacaga gataggagcg ctatcttcga gattcatcac agtcaatggt 9360
ggagtccttg caaactgcag agcaattgtg tgtaagtgtg tctcaccccc gcatataata 9420
ccacaaaacg acattggctc cgtaacagtt attgactcaa gtatatgcaa ggaagttgtc 9480
ttagagagtg tgcagcttag gttagaagga aagctgtcat cccaatactt ctccaacgtg 9540
acaattgacc tttcccaaat cacaacgtca gggtcgctgg atataagcag tgaaattggt 9600
agcattaaca acacagttaa tcgggtcgac gagttaatca aggaatccaa cgagtggctg 9660
aacgctgtga acccccgcct tgtgaacaat acgagcatca tagtcctctg tgtccttgcc 9720
gccctgatta ttgtctggct aatagcgctg acagtatgct tctgttactc cgcaagatac 9780
tcagctaagt caaaacagat gaggggcgct atgacaggga tcgataatcc atatgtaata 9840
cagagtgcaa ctaagatgtg aacacagatg aggaacgaag gtttccctaa tagtaatttg 9900
tgtgaaagtt ctggtagtct gtcagttcag agagttaaga aaaaactacc ggttgtagat 9960
gaccaaagga cgatatacgg gtagaacggt aagagaggcc gcccctcaat tgcgagccag 10020
gcttcacaac ctccgttcta ccgcttcacc gacaacagtc ctcaatcatg gatttcccat 10080
ctagggagaa cctggcagca ggtgacatat cggggcggaa gacttggaga ttactgttcc 10140
ggatcctcac attgagcata ggtgtggtct gtcttgccat caatattgcc acaattgcaa 10200
aattggatca cctggataac atggcttcga acacatggac aacaactgag gctgaccgtg 10260
tgatatctag catcacgact ccgctcaaag tccctgtcaa ccagattaat gacatgtttc 10320
ggattgtagc gcttgaccta cctctgcaga tgacatcatt acagaaagaa ataacatccc 10380
aagtcgggtt cttggctgaa agtatcaaca atgttttatc caagaatgga tctgcaggcc 10440
tggttcttgt taatgaccct gaatatgcag gggggatcgc tgtcagcttg taccaaggag 10500
atgcatctgc aggcctaaat ttccagccca tttctttaat agaacatcca agttttgtcc 10560
ctggtcctac tactgctaag ggctgtataa ggatcccgac cttccatatg ggcccttcac 10620
attggtgtta ctcacataac atcattgcat caggttgcca ggatgcgagc cactccagta 10680
tgtatatctc tctgggggtg ctgaaagcat cgcagaccgg gtcgcctatc ttcttgacaa 10740
cggccagcca tctcgtggat gacaacatca accggaagtc atgcagcatc gtagcctcaa 10800
aatacggttg tgatatccta tgcagtattg tgattgaaac agagaatgag gattataggt 10860
ctgatccggc tactagcatg attataggta ggctgttctt caacgggtca tacacagaga 10920
gcaagattaa cacagggtcc atcttcagtc tattctctgc taactaccct gcggtggggt 10980
cgggtattgt agtcggggat gaagccgcat tcccaatata tggtggggtc aagcagaaca 11040
catggttgtt caaccagctc aaggattttg gttacttcac ccataatgat gtgtacaagt 11100
gcaatcggac tgatatacag caaactatcc tggatgcata caggccacct aaaatctcag 11160
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aagtaggctc aaccgtgtat ctataccaac gctcatcctc atggtgggtg gtaggactga 11340
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tcgttcctca gcttatagag attagaacaa ccaccggtaa atctgagtag ttgagtcaat 11820
tataaaggag ttggaaagat ggcattgtat cacctatctt ctgcgacatc aagaatcaaa 11880
ccgaatgccg gcgcgtgctc gaattccatg ttgccagttg accacaatca gccagtgctc 11940
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gagatacaag gcaaaacagc tcatggttaa caatacgggt aggacatggc gagctccggt 12060
cctgaaaggg cagagcatca gattatccta ccagagtcac acctgtcttc accattggtc 12120
aagcacaaac tactctatta ctggaaatta actgggctac cgcttcctga tgaatgtgac 12180
ttcgaccacc tcattctcag ccgacaatgg aaaaaaatac ttgaatcggc ctctcctgat 12240
actgagagaa tgataaaact cggaagggca gtacaccaaa ctcttaacca caattccaga 12300
ataaccggag tgctccaccc caggtgttta gaagaactgg ctaatattga ggtcccagat 12360
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gaactgttca caaggctgtg tacgcatata gagaagaaac tgctggggtc atcttggtct 12480
aacaatgtcc cccggtcaga ggagttcagc agcattcgta cggatccggc attctggttt 12540
cactcaaaat ggtccacagc caagtttgca tggctccata taaaacagat ccagaggcat 12600
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ttcacatgtc ttacccagga acttgtattg atgtatgcag atatgatgga gggcagagat 12780
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ctccccaatg atatagcaga atccgtgact catgcaatcg ctactgtatt ctctggttta 13080
gaacagaatc aagcagctga gatgttgtgt ctgttgcgtc tgtggggtca cccactgctt 13140
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tttgatatga tccttcaggt actgtctttc ttcaagggaa caatcatcaa cgggtacaga 13260
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atgttcctaa aagacaaggc aatcgcacac cccaacgata attggcttgc ctcgtttagg 13500
cggaaccttc tctccgaaga ccagaagaaa catgtaaaag aagcaacttc gactaatcgc 13560
ctcttgatag agtttttaga gtcaaatgat tttgatccat ataaagagat ggaatatctg 13620
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attcaggata gcatatcctt gaccaagagt atgctagcga tgagtcaact gtcttttaac 13860
agcaataaga aacgtatcac tgactgtaaa gaaagagtat cttcaaaccg caatcatgat 13920
ccgaaaagca agaaccgtcg gagagttgca accttcataa caactgacct gcaaaagtac 13980
tgtcttaatt ggagatatca gacaatcaaa ttgttcgctc atgccatcaa tcagttgatg 14040
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ggagaccctt tcaatcctcc aagtgaccct actgactgtg acctctcaag agtccctaat 14160
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attcatgtca atcatttgat tggccataat ttgaaggatc gtgaaaccat caggtcagac 14460
acattcttca tatacagcaa acgaatcttc aaagatggag caatcctcag tcaagtcctc 14520
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tgttactatt taaactatat aatgagttgt gtgcagacat actttgactc tgagttctcc 14700
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cttcaacata gactagatga tggtataact cagatgacat tcacccctgc atctctctac 15900
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ccattatgga gagaaaatac agaggaaagc gacctgacct cagataaagt agtggggtat 17640
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tttcatctac tcatgaactt gtttgctccg tgttccacaa aaggatatat tctctctaat 17880
ggttatgcat gtcgaggaga tatggagtgt tacctggtat ttgtcatggg ttacctgggc 17940
gggcctacat ttgtacatga ggtggtgagg atggcgaaaa ctctggtgca gcggcacggt 18000
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ctatttaccc cttacaatct ctctactgac gggaaaaaga ggacatcact taaacagtgc 18360
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ggcgatataa tcagcctagt gcttaaaggc atgatctcca tggaggacct tatcccacta 18480
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aaactcaaag aaatgtttac agacacttct gtactgtact tgactcgtgc tcaacaaaaa 18600
ttctacatga aaactatagg caatgcagtc aaaggatatt acagtaactg tgactcttaa 18660
cgaaaatcac atattaatag gctccttttt tggccaattg tattcttgtt gatttaatca 18720
tattatgtta gaaaaaagtt gaaccctgac tccttaggac tcgaattcga actcaaataa 18780
atgtcttaaa aaaaggttgc gcacaattat tcttgagtgt agtctcgtca ttcaccaaat 18840
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gcctctaaac gggtcttgag gggttttttg ctgaaaggag gaactatatg cgcgcagatc 19080
tgtcatgatg atcattgcaa ttggatccat atatagggcc cgggttataa ttacctcagg 19140
tcgacgtccc atggccattc gaattcgtaa tcatggtcat agctgtttcc tgtgtgaaat 19200
tgttatccgc tcacaattcc acacaacata cgagccggaa gcataaagtg taaagcctgg 19260
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tcgggaaacc tgtcgtgcca gctgcattaa tgaatcggcc aacgcgcggg gagaggcggt 19380
ttgcgtattg ggcgc 19395
<210> 45
<211> 19395
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> NDV-APMV3-GFP: APMV3/Turkey/Wisconsin/68
<400> 45
tcttccgctt cctcgctcac tgactcgctg cgctcggtcg ttcggctgcg gcgagcggta 60
tcagctcact caaaggcggt aatacggtta tccacagaat caggggataa cgcaggaaag 120
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tttttccata ggctccgccc ccctgacgag catcacaaaa atcgacgctc aagtcagagg 240
tggcgaaacc cgacaggact ataaagatac caggcgtttc cccctggaag ctccctcgtg 300
cgctctcctg ttccgaccct gccgcttacc ggatacctgt ccgcctttct cccttcggga 360
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tccaagctgg gctgtgtgca cgaacccccc gttcagcccg accgctgcgc cttatccggt 480
aactatcgtc ttgagtccaa cccggtaaga cacgacttat cgccactggc agcagccact 540
ggtaacagga ttagcagagc gaggtatgta ggcggtgcta cagagttctt gaagtggtgg 600
cctaactacg gctacactag aagaacagta tttggtatct gcgctctgct gaagccagtt 660
accttcggaa aaagagttgg tagctcttga tccggcaaac aaaccaccgc tggtagcggt 720
ggtttttttg tttgcaagca gcagattacg cgcagaaaaa aaggatctca agaagatcct 780
ttgatctttt ctacggggtc tgacgctcag tggaacgaaa actcacgtta agggattttg 840
gtcatgagat tatcaaaaag gatcttcacc tagatccttt taaattaaaa atgaagtttt 900
aaatcaatct aaagtatata tgagtaaact tggtctgaca gttaccaatg cttaatcagt 960
gaggcaccta tctcagcgat ctgtctattt cgttcatcca tagttgcctg actccccgtc 1020
gtgtagataa ctacgatacg ggagggctta ccatctggcc ccagtgctgc aatgataccg 1080
cgagacccac gctcaccggc tccagattta tcagcaataa accagccagc cggaagggcc 1140
gagcgcagaa gtggtcctgc aactttatcc gcctccatcc agtctattaa ttgttgccgg 1200
gaagctagag taagtagttc gccagttaat agtttgcgca acgttgttgc cattgctaca 1260
ggcatcgtgg tgtcacgctc gtcgtttggt atggcttcat tcagctccgg ttcccaacga 1320
tcaaggcgag ttacatgatc ccccatgttg tgcaaaaaag cggttagctc cttcggtcct 1380
ccgatcgttg tcagaagtaa gttggccgca gtgttatcac tcatggttat ggcagcactg 1440
cataattctc ttactgtcat gccatccgta agatgctttt ctgtgactgg tgagtactca 1500
accaagtcat tctgagaata gtgtatgcgg cgaccgagtt gctcttgccc ggcgtcaata 1560
cgggataata ccgcgccaca tagcagaact ttaaaagtgc tcatcattgg aaaacgttct 1620
tcggggcgaa aactctcaag gatcttaccg ctgttgagat ccagttcgat gtaacccact 1680
cgtgcaccca actgatcttc agcatctttt actttcacca gcgtttctgg gtgagcaaaa 1740
acaggaaggc aaaatgccgc aaaaaaggga ataagggcga cacggaaatg ttgaatactc 1800
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tacatatttg aatgtattta gaaaaataaa caaatagggg ttccgcgcac atttccccga 1920
aaagtgccac ctgacgtcta agaaaccatt attatcatga cattaaccta taaaaatagg 1980
cgtatcacga ggccctttcg tctcgcgcgt ttcggtgatg acggtgaaaa cctctgacac 2040
atgcagctcc cggagacggt cacagcttgt ctgtaagcgg atgccgggag cagacaagcc 2100
cgtcagggcg cgtcagcggg tgttggcggg tgtcggggct ggcttaacta tgcggcatca 2160
gagcagattg tactgagagt gcaccataaa attgtaaacg ttaatatttt gttaaaattc 2220
gcgttaaatt tttgttaaat cagctcattt tttaaccaat aggccgaaat cggcaaaatc 2280
ccttataaat caaaagaata gcccgagata gggttgagtg ttgttccagt ttggaacaag 2340
agtccactat taaagaacgt ggactccaac gtcaaagggc gaaaaaccgt ctatcagggc 2400
gatggcccac tacgtgaacc atcacccaaa tcaagttttt tggggtcgag gtgccgtaaa 2460
gcactaaatc ggaaccctaa agggagcccc cgatttagag cttgacgggg aaagccggcg 2520
aacgtggcga gaaaggaagg gaagaaagcg aaaggagcgg gcgctagggc gctggcaagt 2580
gtagcggtca cgctgcgcgt aaccaccaca cccgccgcgc ttaatgcgcc gctacagggc 2640
gcgtactatg gttgctttga cgtatgcggt gtgaaatacc gcacagatgc gtaaggagaa 2700
aataccgcat caggcgccat tcgccattca ggctgcgcaa ctgttgggaa gggcgatcgg 2760
tgcgggcctc ttcgctatta cgccagctgg cgaaaggggg atgtgctgca aggcgattaa 2820
gttgggtaac gccagggttt tcccagtcac gacgttgtaa aacgacggcc agtgccaagc 2880
tttaatacga ctcactatag ggagattggt ctgatgagtc cgtgaggacg aaacggagtc 2940
tagactccgt caccaaacag agaatccgtg agttacgata aaaggcgaag gagcaattga 3000
agtcgcacgg gtagaaggtg tgaatctcga gtgcgagccc gaagcacaaa ctcgagaaag 3060
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cgccccaatg gagctcatgg agggggagaa aaagggagta ccttaaaagt agacgtcccg 3180
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aggagtggag tgtctgaaga gagagcacag agatttgcga tgatagcagg atctctccct 3480
cgggcatgca gcaacggaac cccgttcgtc acagccgggg ccgaagatga tgcaccagaa 3540
gacatcaccg ataccctgga gaggatcctc tctatccagg ctcaagtatg ggtcacagta 3600
gcaaaagcca tgactgcgta tgagactgca gatgagtcgg aaacaaggcg aatcaataag 3660
tatatgcagc aaggcagggt ccaaaagaaa tacatcctct accccgtatg caggagcaca 3720
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ctcatgcgtt tgtatcggat gaaaggagat aatgcgccgt acatgacatt acttggtgat 4020
agtgaccaga tgagctttgc gcctgccgag tatgcacaac tttactcctt tgccatgggt 4080
atggcatcag tcctagataa aggtactggg aaataccaat ttgccaggga ctttatgagc 4140
acatcattct ggagacttgg agtagagtac gctcaggctc agggaagtag cattaacgag 4200
gatatggctg ccgagctaaa gctaacccca gcagcaagga ggggcctggc agctgctgcc 4260
caacgggtct ccgaggagac cagcagcata gacatgccta ctcaacaagt cggagtcctc 4320
actgggctta gcgagggggg gtcccaagct ctacaaggcg gatcgaatag atcgcaaggg 4380
caaccagaag ccggggatgg ggagacccaa ttcctggatc tgatgagagc ggtagcaaat 4440
agcatgaggg aggcgccaaa ctctgcacag ggcactcccc aatcggggcc tcccccaact 4500
cctgggccat cccaagataa cgacaccgac tgggggtatt gatggacaaa acccagcctg 4560
cttccacaaa aacatcccaa tgccctcacc cgtagtcgac ccctcgattt gcggctctat 4620
atgaccacac cctcaaacaa acatccccct ctttcctccc tccccctgct gtacaactac 4680
gtacgcccta gataccacag gcacaatgcg gctcactaac aatcaaaaca gagccgaggg 4740
aattagaaaa aagtacgggt agaagaggga tattcagaga tcagggcaag tctcccgagt 4800
ctctgctctc tcctctacct gatagaccag gacaaacatg gccaccttta cagatgcaga 4860
gatcgacgag ctatttgaga caagtggaac tgtcattgac aacataatta cagcccaggg 4920
taaaccagca gagactgttg gaaggagtgc aatcccacaa ggcaagacca aggtgctgag 4980
cgcagcatgg gagaagcatg ggagcatcca gccaccggcc agtcaagaca accccgatcg 5040
acaggacaga tctgacaaac aaccatccac acccgagcaa acgaccccgc atgacagccc 5100
gccggccaca tccgccgacc agccccccac ccaggccaca gacgaagccg tcgacacaca 5160
gctcaggacc ggagcaagca actctctgct gttgatgctt gacaagctca gcaataaatc 5220
gtccaatgct aaaaagggcc catggtcgag cccccaagag gggaatcacc aacgtccgac 5280
tcaacagcag gggagtcaac ccagtcgcgg aaacagtcag gaaagaccgc agaaccaagt 5340
caaggccgcc cctggaaacc agggcacaga cgtgaacaca gcatatcatg gacaatggga 5400
ggagtcacaa ctatcagctg gtgcaacccc tcatgctctc cgatcaaggc agagccaaga 5460
caataccctt gtatctgcgg atcatgtcca gccacctgta gactttgtgc aagcgatgat 5520
gtctatgatg gaggcgatat cacagagagt aagtaaggtt gactatcagc tagatcttgt 5580
cttgaaacag acatcctcca tccctatgat gcggtccgaa atccaacagc tgaaaacatc 5640
tgttgcagtc atggaagcca acttgggaat gatgaagatt ctggatcccg gttgtgccaa 5700
catttcatct ctgagtgatc tacgggcagt tgcccgatct cacccggttt tagtttcagg 5760
ccctggagac ccctctccct atgtgacaca aggaggcgaa atggcactta ataaactttc 5820
gcaaccagtg ccacatccat ctgaattgat taaacccgcc actgcatgcg ggcctgatat 5880
aggagtggaa aaggacactg tccgtgcatt gatcatgtca cgcccaatgc acccgagttc 5940
ttcagccaag ctcctaagca agttagatgc agccgggtcg atcgaggaaa tcaggaaaat 6000
caagcgcctt gctctaaatg gctaattact actgccacac gtagcgggtc cctgtccact 6060
cggcatcaca cggaatctgc accgagttcc cccccgcggt tagaaaaaat acgggtagaa 6120
ccgccaccat ggtgagcaag ggcgaggagc tgttcaccgg ggtggtgccc atcctggtcg 6180
agctggacgg cgacgtaaac ggccacaagt tcagcgtgtc cggcgagggc gagggcgatg 6240
ccacctacgg caagctgacc ctgaagttca tctgcaccac cggcaagctg cccgtgccct 6300
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ccatcttctt caaggacgac ggcaactaca agacccgcgc cgaggtgaag ttcgagggcg 6480
acaccctggt gaaccgcatc gagctgaagg gcatcgactt caaggaggac ggcaacatcc 6540
tggggcacaa gctggagtac aactacaaca gccacaacgt ctatatcatg gccgacaagc 6600
agaagaacgg catcaaggtg aacttcaaga tccgccacaa catcgaggac ggcagcgtgc 6660
agctcgccga ccactaccag cagaacaccc ccatcggcga cggccccgtg ctgctgcccg 6720
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atacgggtag aattggagtg ccccaattgt gccaagatgg actcatctag gacaattggg 7020
ctgtactttg attctgccca ttcttctagc aacctgttag catttccgat cgtcctacaa 7080
gacacaggag atgggaagaa gcaaatcgcc ccgcaatata ggatccagcg ccttgacttg 7140
tggactgata gtaaggagga ctcagtattc atcaccacct atggattcat ctttcaagtt 7200
gggaatgaag aagccaccgt cggcatgatc gatgataaac ccaagcgcga gttactttcc 7260
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gcctgtctca ctatgatagt cacatgcaag aagagtgcaa ctaatactga gagaatggtt 7380
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ctagaataca aggtgaactt tgtctccttg actgtggtac cgaagaggga tgtctacaag 7560
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actattaatg tggaggtaga cccgaggagt cctttggtta aatctctgtc taagtctgac 7680
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gggaagaaag tgacatttga caagctggaa aagaaaataa ggagccttga tctatctgtc 7800
gggctcagtg atgtgctcgg gccttccgtg ttggtaaaag caagaggtgc acggactaag 7860
cttttggcac ctttcttctc tagcagtggg acagcctgct atcccatagc aaatgcttct 7920
cctcaggtgg ccaagatact ctggagtcaa accgcgtgcc tgcggagcgt taaaatcatt 7980
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ctgagattgc gctccgccca ctcacccaga tcatcatgac acaaaaaact aatctgtctt 8160
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gatttgtatc ttagactatt gccagttatc ccttcaaatc tttctcattg ccagagtgaa 8460
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aaccatttgc tacaaccgag accgtctggc aggttatttg gcgctgtaat tggatcgatt 8580
gccttagggg tagctacatc cgcacagatt tcagctgcta tagcattggt ccgtgctcaa 8640
cagaatgcaa acgatatcct cgctcttaaa gctgcaatac aatctagtaa tgaggcaata 8700
aaacaactta cttatggcca agaaaagcaa ctactagcaa tatcaaaaat acaaaaagcc 8760
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ttaaatgatg tattattaca acagactcga tcctctttga gcctaatcca ccttgtctct 9000
aaaggcttat taagtggtca gattatagga tatgaccctt cagtacaagg catcattatc 9060
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tataatggag ttgtaattgc aaattgtgat ttggtatcat gccgatgcat aagaccccct 9420
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aaaaatgatg actcgaccga caaagaacct acaacccaat catcgaaccg aggcattggg 9840
gttggatcta tacaatatat gacatgatga acacagatga ggaacgaagg tttccctaat 9900
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gttgtagatg accaaaggac gatatacggg tagaacggta agagaggccg cccctcaatt 10020
gcgagccagg cttcacaacc tccgttctac cgcttcaccg acaacagtcc tcaatcatgg 10080
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ggattaataa gataaccaaa gggtcgatga tatataggaa tttcagcaat ttgatagaac 10560
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cactatctaa aacacattgg tgttactcgc ataatgtaat atctactggt tgtcaagacc 10680
atgctgcgag ttcacagtat atttccatag gaatagtaga tacaggattg aataatgagc 10740
cctatttgcg tacaatgtct tcacgcttgc taaatgatgg cctaaataga aagagctgct 10800
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gtgattacac tgaatcccct gttcctgcat ctttgttcag cggtcgtttc actgctaatt 10980
accctggagt tggctcagga acccaattaa atgggaccct ttattttcca atatatgggg 11040
gtgttgttaa cgactctgat attgagttat cgaaccgagg gaagtcattc agacctagga 11100
accctacaaa cccatgtcca gatcctgagg tgacccaaag tcagagggct caggcaagtt 11160
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gtgacactac atgcactgat tattatcttc tatactttga taataatcaa gtcatgatgg 11280
gtgcagaagc ccgaatttat tatttaaaca atcagatgta cttatatcaa agatcttcga 11340
gttggtggcc gcatccgctt ttttacagat tctcactgcc tcattgtgaa cctatgtctg 11400
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acagtcccaa ccgcaggatc agtcctacaa ttagcattta cagctacaac cagaagatta 11640
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gcaggacaga cactggggca ctatactgca tcactataat agaagctgta aacacaatct 11760
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tataaaggag ttggaaagat ggcattgtat cacctatctt ctgcgacatc aagaatcaaa 11880
ccgaatgccg gcgcgtgctc gaattccatg ttgccagttg accacaatca gccagtgctc 11940
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cactcaaaat ggtccacagc caagtttgca tggctccata taaaacagat ccagaggcat 12600
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ctccccaatg atatagcaga atccgtgact catgcaatcg ctactgtatt ctctggttta 13080
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tttgatatga tccttcaggt actgtctttc ttcaagggaa caatcatcaa cgggtacaga 13260
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gaggacaggg atactatcct ggcgttgttg ttcccccaag agccattatt agagttccct 17100
tctgtgcaag atattggtgc tcgagtgaaa gatccattca cccgacaacc tgcggcattt 17160
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catcctgaac tcacatctcc aaatccggag gaagactact tagtacgata cttgttcaga 17280
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gtttatagga atctacaggc ggaggtaaca tgcaaagatg gatttgtcca agagttccgt 17580
ccattatgga gagaaaatac agaggaaagc gacctgacct cagataaagt agtggggtat 17640
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acgagacaga tcctagaggt tacaatacta ggtcttagag tcgaaaatct caataaaata 18420
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ttctacatga aaactatagg caatgcagtc aaaggatatt acagtaactg tgactcttaa 18660
cgaaaatcac atattaatag gctccttttt tggccaattg tattcttgtt gatttaatca 18720
tattatgtta gaaaaaagtt gaaccctgac tccttaggac tcgaattcga actcaaataa 18780
atgtcttaaa aaaaggttgc gcacaattat tcttgagtgt agtctcgtca ttcaccaaat 18840
ctttgtttgg tgcgcgcggc cggcatggtc ccagcctcct cgctggcgcc ggctgggcaa 18900
cattccgagg ggaccgtccc ctcggtaatg gcgaatggga cgtcgactgc taacaaagcc 18960
cgaaaggaag ctgagttggc tgctgccacc gctgagcaat aactagcata accccttggg 19020
gcctctaaac gggtcttgag gggttttttg ctgaaaggag gaactatatg cgcgcagatc 19080
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Claims (55)
- (1) NDV HN 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열이 비-NDV APMV HN 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열로 대체되었고, 여기서 NDV 유전자간 영역은 비-NDV APMV HN 단백질 코딩 서열의 전후에 있고; (2) NDV F 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열이 비-NDV APMV F 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열로 대체되었고, 여기서 NDV 유전자간 영역은 비-NDV APMV F 단백질 코딩 서열의 전후에 있고, 여기서 상기 비-NDV APMV HN 단백질 및 비-NDV APMV F 단백질은 각각 NDV HN 단백질 및 F 단백질이 아닌, 뉴캐슬병 바이러스 게놈의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 서열.
- 제1항에 있어서, 상기 비-NDV APMV F 단백질 및 비-NDV APMV HN 단백질은 각각 NDF F 단백질 및 NDV HN 단백질과 면역학적으로 구별되는, 핵산 서열.
- 제1항에 있어서, 상기 비-NDV APMV HN은 APMV4/duck/Hongkong/D3/75,APMV17/Antarctica/107/13, APMV9/duck/New York/22/78, APMV7/Dove/Tennessee/4/75, APMV21/pigeon/Taiwan/AHRI128/17, APMV6/duck/HongKong/18/199/77, APMV11/common_snipe/France/100212/10, APMV15/calidris_fuscicollis/Brazil/RS-1177/12, APMV8/Goose/Delaware/1053/76, APMV2/Chicken/California/Yucaipa/56, APMV3/Turkey/Wisconsin/68, APMV12/Wigeon/Italy/3920_1/05, APMV5/budgerigar/Japan/TI/75, 또는 APMV10/penguin/Falkland Islands/324/07의 HN 단백질인, 핵산 서열.
- 제1항 또는 제3항에 있어서, 상기 비-NDV APMV F는 APMV4/duck/Hongkong/D3/75, APMV17/Antarctica/107/13, APMV9/duck/New York/22/78, APMV7/Dove/Tennessee/4/75, APMV21/pigeon/Taiwan/AHRI128/17, APMV6/duck/HongKong/18/199/77, APMV11/common_snipe/France/100212/10, APMV15/calidris_fuscicollis/Brazil/RS-1177/12, APMV8/Goose/Delaware/1053/76, APMV2/Chicken/California/Yucaipa/56, APMV3/Turkey/Wisconsin/68, APMV12/Wigeon/Italy/3920_1/05, APMV5/budgerigar/Japan/TI/75, 또는 APMV10/penguin/Falkland Islands/324/07의 F 단백질인, 핵산 서열.
- 제1항에 있어서, 상기 비-NDV APMV HN 단백질은 아불라비리나 아과 및 오소아불라바이러스, 메타아불라바이러스, 또는 파라아불라바이러스 속으로부터의 HN 단백질인, 핵산 서열.
- 제1항 또는 제5항에 있어서, 상기 비-NDV APMV F 단백질은 아불라비리나 아과 및 오소아불라바이러스, 메타아불라바이러스, 또는 파라아불라바이러스 속으로부터의 F 단백질인, 핵산 서열.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 NDV 게놈은 NDV LaSota 균주의 NP 유전자, P 유전자, M 유전자, 및 L 유전자를 포함하는, 핵산 서열.
- (1) NDV 뉴클레오캡시드(N) 단백질을 암호화하는 전사 유닛, (2) NDV 인단백질(P)을 암호화하는 전사 유닛, (3) NDV 매트릭스(M) 단백질을 암호화하는 전사 유닛, (4) NDV 거대 중합효소(L)를 암호화하는 전사 유닛, 및 (5) 서열번호 1-14 중 어느 하나의 뉴클레오티드 서열, 또는 서열번호 1-14 중 어느 하나의 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 98% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 핵산 서열.
- 제8항에 있어서, 상기 NDV 뉴클레오캡시드 단백질, NDV 인단백질, NDV 매트릭스 단백질, 및 NDV 거대 중합효소는 NDV LaSota 균주의 것인, 핵산 서열.
- 서열번호 44, 또는 GFP 코딩 서열이 없는 서열번호 44의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 서열.
- 서열번호 44, 또는 GFP 코딩 서열이 없는 서열번호 44의 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 98% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 서열.
- 서열번호 45, 또는 GFP 코딩 서열이 없는 서열번호 45의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 서열.
- 서열번호 45, 또는 GFP 코딩 서열이 없는 서열번호 45의 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 98% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 서열.
- 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 이식유전자를 추가로 포함하는, 핵산 서열.
- 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 항원을 암호화하는 이식유전자를 추가로 포함하는, 핵산 서열.
- 제14항에 있어서, 상기 항원은 바이러스, 박테리아, 진균 또는 원생동물 항원인, 핵산 서열.
- 제14항에 있어서, 상기 항원은 SARS-CoV-2 스파이크 단백질 또는 이의 단편을 포함하는, 핵산 서열.
- 제17항에 있어서, 상기 단편은 SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 수용체 결합 도메인을 포함하는, 핵산 서열.
- 제17항에 있어서, 상기 단편은 SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 세포외 도메인을 포함하는, 핵산 서열.
- 제15항에 있어서, 상기 항원은 MERS-CoV 항원, 호흡기 세포융합 바이러스 항원, 인간 메타뉴모바이러스 항원, 라사 바이러스 항원, 에볼라 바이러스 항원, 또는 니파 바이러스 항원인, 핵산 서열.
- 제15항에 있어서, 상기 항원은 암 또는 종양 항원인, 핵산 서열.
- 포장된 게놈을 포함하는 재조합 뉴캐슬병 바이러스(NDV)로서, 여기서 상기 포장된 게놈은 (1) NDV HN 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 비-NDV APMV HN 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열로 대체되었고, 여기서 NDV 유전자간 영역은 비-NDV AMPV HN 단백질 코딩 서열의 전후에 있고; (2) NDV F 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 비-NDV APMV F 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열로 대체되었고, 여기서 NDV 유전자간 영역은 비-NDV AMPV F 단백질 코딩 서열의 전후에 있고, 여기서 비-NDV APMV HN 단백질 및 비-NDV APMV F 단백질은 각각 NDV HN 단백질 및 F 단백질이 아닌, 뉴캐슬병 바이러스 게놈의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 재조합 NDV.
- 제22항에 있어서, 상기 비-NDV APMV F 단백질 및 비-NDV APMV HN 단백질은 각각 NDF F 단백질 및 NDV HN 단백질과 면역학적으로 구별되는, 재조합 NDV.
- 제22항에 있어서, 상기 비-NDV APMV HN 단백질은 아불라비리나 아과 및 오소아불라바이러스, 메타아불라바이러스, 또는 파라아불라바이러스 속으로부터의 HN 단백질인, 재조합 NDV.
- 제22항 또는 제23항에 있어서, 상기 비-NDV APMV F 단백질은 아불라비리나 아과 및 오소아불라바이러스, 메타아불라바이러스, 또는 파라아불라바이러스 속으로부터의 F 단백질인, 재조합 NDV.
- 제22항에 있어서, 상기 비-NDV APMV HN은 APMV4/duck/Hongkong/D3/75,APMV17/Antarctica/107/13, APMV9/duck/New York/22/78, APMV7/Dove/Tennessee/4/75, APMV21/pigeon/Taiwan/AHRI128/17, APMV6/duck/HongKong/18/199/77, APMV11/common_snipe/France/100212/10, APMV15/calidris_fuscicollis/Brazil/RS-1177/12, APMV8/Goose/Delaware/1053/76, APMV2/Chicken/California/Yucaipa/56, APMV3/Turkey/Wisconsin/68, APMV12/Wigeon/Italy/3920_1/05, APMV5/budgerigar/Japan/TI/75, 또는 APMV10/penguin/Falkland Islands/324/07의 HN 단백질인, 재조합 NDV.
- 제22항 또는 제26항에 있어서, 상기 비-NDV APMV F는 APMV4/duck/Hongkong/D3/75, APMV17/Antarctica/107/13, APMV9/duck/New York/22/78, APMV7/Dove/Tennessee/4/75, APMV21/pigeon/Taiwan/AHRI128/17, APMV6/duck/HongKong/18/199/77, APMV11/common_snipe/France/100212/10, APMV15/calidris_fuscicollis/Brazil/RS-1177/12, APMV8/Goose/Delaware/1053/76, APMV2/Chicken/California/Yucaipa/56, APMV3/Turkey/Wisconsin/68, APMV12/Wigeon/Italy/3920_1/05, APMV5/budgerigar/Japan/TI/75, 또는 APMV10/penguin/Falkland Islands/324/07의 F 단백질인, 재조합 NDV.
- 포장된 게놈을 포함하는 재조합 뉴캐슬병 바이러스(NDV)로서, 상기 포장된 게놈은 NDV HN 단백질 및 NDV F 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열이 서열번호 1-14 중 어느 하나에 제시된 cDNA 서열로부터 전사된 음-센스 RNA 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열로 대체되는, 뉴캐슬병 바이러스 게놈의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 재조합 NDV.
- 포장된 게놈을 포함하는 재조합 뉴캐슬병 바이러스(NDV)로서, 상기 포장된 게놈은 NDV HN 단백질 및 NDV F 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열이 서열번호 1-14 중 어느 하나의 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 98% 동일한 뉴클레오티드 서열로부터 전사된 음-센스 RNA 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열로 대체되는, 뉴캐슬병 바이러스 게놈의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 재조합 NDV.
- 제22항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 NDV 게놈은 NDV LaSota의 NP 유전자, P 유전자, M 유전자, 및 L 유전자를 포함하는, 재조합 NDV.
- 제22항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 포장된 게놈은 이식유전자를 추가로 포함하는, 재조합 NDV.
- 제31항에 있어서, 상기 이식유전자는 바이러스, 박테리아, 진균 또는 원생동물 항원을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 재조합 NDV.
- 제31항에 있어서, 상기 이식유전자는 SARS-CoV-2 항원을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 재조합 NDV.
- 제33항에 있어서, 상기 SARS-CoV-2 항원은 SARS-CoV-2 스파이크 단백질 또는 이의 단편을 포함하는, 재조합 NDV.
- 제34항에 있어서, 상기 단편은 SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 수용체 결합 도메인을 포함하는, 재조합 NDV.
- 제31항에 있어서, 상기 이식유전자는 MERS-CoV 항원을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 재조합 NDV.
- 제31항에 있어서, 상기 이식유전자는 호흡기 세포융합 바이러스 항원 또는 인간 메타뉴모바이러스 항원을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 재조합 NDV.
- 제31항에 있어서, 상기 이식유전자는 라사 바이러스 항원, 에볼라 바이러스 항원 또는 니파 바이러스 항원을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 재조합 NDV.
- 제31항에 있어서, 상기 이식유전자는 암 또는 종양 항원을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 재조합 NDV.
- 제22항 내지 제31항 중 어느 한 항의 재조합 NDV인 제1 재조합 NDV를 포함하는 면역원성 조성물.
- 제32항 내지 제38항 중 어느 한 항의 재조합 NDV인 제1 재조합 NDV를 포함하는 면역원성 조성물.
- 제39항의 재조합 NDV인 제1 재조합 NDV를 포함하는 면역원성 조성물.
- 항원에 대한 면역 반응을 유도하는 방법으로서, 제40항, 제41항, 또는 제42항의 면역원성 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
- 감염성 질환을 예방하기 위한 방법으로서, 제40항 또는 제41항의 면역원성 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
- 감염성 질환에 대해 대상체를 면역화하는 방법으로서, 제40항 또는 제41항의 면역원성 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
- 암을 치료하기 위한 방법으로서, 제40항 또는 제42항의 면역원성 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
- 제43항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 대상체에게 비강내 투여되는, 방법.
- 제43항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 포장된 게놈을 포함하는 제2 재조합 NDV를 투여하는 단계를 더 포함하고, 여기서 제2 재조합 NDV의 포장된 게놈은 (1) NDV HN 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 비-NDV APMV HN 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열로 대체되었고, 여기서 NDV 유전자간 영역은 비-NDV AMPV HN 단백질 코딩 서열의 전후에 있고; (2) NDV F 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 비-NDV APMV F 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열로 대체되었고, 여기서 NDV 유전자간 영역은 비-NDV AMPV F 단백질 코딩 서열의 전후에 있고, 여기서 제2 재조합 NDV는 제1 재조합 NDV와 면역학적으로 구별되는, 뉴캐슬병 바이러스 게놈의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 방법.
- 제43항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체는 인간인, 방법.
- 제22항 내지 제39항 중 어느 한 항의 재조합 NDV를 포함하는 키트.
- 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항의 핵산 서열을 포함하는 키트.
- 제22항 내지 제39항 중 어느 한 항의 재조합 NDV를 포함하는 시험관 내 또는 생체 외 세포.
- 제22항 내지 제39항 중 어느 한 항의 재조합 NDV를 포함하는 세포주 또는 닭 배아 난자.
- 제22항 내지 제39항 중 어느 한 항의 재조합 NDV를 전파하는 방법으로서, 상기 방법은 제52항 또는 제53항의 세포 또는 배아 난자를 배양하는 단계를 포함하는, 방법.
- 제54항에 있어서, 상기 방법은 세포 또는 배아 난자로부터 재조합 NDV를 단리하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
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