KR100702523B1 - 클로닝된 뉴클레오타이드 서열로부터 약독화된파라인플루엔자 바이러스를 제조하는 방법 - Google Patents
클로닝된 뉴클레오타이드 서열로부터 약독화된파라인플루엔자 바이러스를 제조하는 방법 Download PDFInfo
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Abstract
분리된 폴리뉴클레오타이드 분자로부터 재조합 PIV 백신 생산을 위한 재조합 PIV 게놈 및 안티게놈이 제공된다. 이 재조합 게놈 또는 안티게놈은 핵단백질 (N), 인단백질 (P), 및 대형(L) 폴리머라제 단백질과 함께 발현되어 분리된 감염성 PIV 입자를 생산할 수 있다. 소망되는 변경이 발생되도록, 예컨대 생물학적으로 유도된 PIV 돌연변이주로부터 약독화 돌인변이를 인코포레이션하거나, 백신 용도를 위해 약독화된 면역원성 바이러스를 생산하기 위해 키메라 PIV 클론을 형성하도록 재조합 PIV 게놈과 안티게놈을 변형시킬 수 있다.
약독화, 파라인플루엔자, 백신
Description
본 출원은 1997년 5월 23일자 미국잠정출원 60/047,575호 및 1997년 9월 19일자 미국잠정출원 60/059,385호의 일부계속출원으로서 35조에 규정에 따라 상기 출원들의 수익을 주장한다. 상기 출원들은 본 발명에 통합되었다.
인간의 파라인플루엔자 바이러스 (HPIV), HPIV1, HPIV2 및 HPIV3는 영아와 아동에서 일어나는 세기관지염, 후두염 및 폐렴의 중요 발병원인이다. Karron 외, J. Infect. Dis. 172: 1445-50 (1995); Collins외 "Parainfluenza Viruses", p.1205-1243. B.N. Fields외, 편. Fields Virology, 3판, vol. 1. Lippincott-Raven Publ., Philadelphia (1996); Murphy외, Virus Res. 11:1-15 (1988). 이들 바이러스에 감염되면 3세 미만의 아동들에게 실질적인 이환을 일으키고, 호흡기 감염으로 인한 유아와 아동의 입원 비율의 약 20%가 이로 인한 것이다.
HPIV에 대한 효과적인 백신요법을 개발하기 위해 많은 노력이 기울여져 왔음에도, HPIV 균주나 HPIV 관련 질환을 완화시키는 인정된 백신 제제는 아직까지 개발되지 못했다. 현재까지, 단 2가지의 살아있는 약독화 PIV 백신 후보가 특히 주목 을 받고 있다. 이들 후보 중 하나는 소의 PIV(BPIV) 균주로서 이 균주는 HPIV3과 항원적으로 연관이 있으며 HPIV3으로부터 동물을 보호해주는 것으로 나타났다. BPIV3은 아동과 유아에 있어서 약독화되어, 유전적으로 안정한 면역원이다 (Karron외, J. Inf. Dis. 171:1107-14 (1995a); Karron외, J. Inf. Dis. 172: 1445-1450, (1995b)). 두번째 PIV3 백신 후보인 JS cp45는 HPIV3의 JS 야생형 (wt)의 감기-적응 돌연변이이다 (Karron외, (1995b), 상기문헌; Belshe 외, J. Med. Virol. 10:235-42 (1982)). 살아있는 이 약독화된 감기-계대 (cp: cold-passaged) PIV3 백신 후보는 감온성 (ts: temperature sensitive), 감기-적응화 (ca: cold-adpatation) 및 약독화 (att: attenuation) 표현형으로서 생체내에서 바이러스 복제후에도 안정하다. cp45 바이러스는 동물 실험에서 인간의 PIV3 챌린지에 대해 방어성을 나타내고 혈청음성 유아 및 아동에 있어서 약독화되고 유전적으로 안정하며 면역원성이다 (Hall외, Virus Res. 22:173-184 (1992); Karron외, (1995b), 상기문헌.
HPIV3은 파라믹소바이러스과 (Paramyxovirus科) 모노네가바이레일즈목 (Mononegavirales目)의 파라믹소바이러스속에 속한다. 이것의 게놈은 음성-센스 RNA 15462 뉴클레오타이드 (nt) 길이의 단일가닥으로서 (Galinski외, Virology 165: 499-510, (1988); Stokes 외, Virus Res. 25:91-103 (1992)) 적어도 8개의 단백질을 코딩한다 (Collins외, 상기문헌, (1996); Galinski, 상기문헌 (1991); Spriggs 및 Collins, J. Gen. Virol. 67:2705-2719, (1986)). 이 단백질들 중 3가지는 RNA 게놈과 연관되어 뉴클레오캡시드를 형성한다; 즉, 뉴클레오캡시드 단백질 N, 인단백질 P, 및 대형 폴리머라제 서브유닛 L이 이들이다. 또 다른 3가지 단백질은 엔벨롭과 연관이 있는 것으로, 바이러스 부착 및 방출을 매개하는 것으로 알려진 매트릭스 단백질 M, 헤마글루티닌-뉴라미니데이즈 단백질 HN, 및 융합단백질 F가 그들이다. 나머지 2가지 단백질 HN 및 F는 PIVs의 무력화 및 보호 항원을 나타낸다 (Collins외, In Fileds Virology, 3판, 1:1205-43 (1996)). 다른 5가지 PIV 중에서도 이들 2가지 보호 항원의 커다란 서열 다양성은 이들 병원균에 대한 보호적인 면역성의 특이성 유형의 기초가 된다.
PIV의 또 다른 단백질인 C 단백질은 P 단백질 mRNA의 중복 오픈 리딩 프레인 (ORF)에 의해 코딩되며, D 단백질은 P 시스트론의 RNA 편집에 의해 생산된다 (Galinski외, Virology 186:543-50 (1992)). P mRNA는 또한 내부 ORF를 함유하는데 이것은 V라 불리우는 시스테인이 풍부한 대역을 코딩할 가능성이 있다. V ORF는 또한 다른 파라믹소바이러스에서도 발견되며 RNA 편집에 의해 종종 접근되지만 PIV의 경우는 그렇지 않다. 현재, PIV V ORF가 발현되는지는 알려져 있지 않다.
PIV의 바이러스 게놈 역시 외부유전자 (extragenic) 리더 및 트레일러 대역을 함유하며, 바이러스의 복제와 전사에 필요한 프로모터를 지닌다. 따라서, PIV 유전자 지도는 3' 리더-N-P/C/D-M-F-HN-L-트레일러로 표시된다. 전사는 3' 말단에서 개시되어 유전자 바운더리에서 발견되는 짧게 보존된 모티프에 의해 가이드되는 서열 개시-종결 메카니즘에 의해 진행된다. 각각의 유전자의 업스트림 말단은 해당 mRNA의 개시를 지시하는 유전자 개시 (GS) 시그날을 함유한다. 각각의 유전자의 다운스트림 말단은 폴리아데닐화 및 종결을 지시하는 유전자-종결 (GE) 모티프를 함 유한다.
cp45 및 기타 PIV3 백신 후보들에 있어서 약독화 변이를 동정하는 것은 여러 이유로 해서 관심을 끌고 있다. 특히, 이들 및 기타 파라믹소바이러스, 그 중에서도 소아환자 입원의 7%를 차지하는 HPIV1 및 HPIV2에 맞서 사용하는데 임상적으로 허용가능한 백신을 제공하는데 있어서는, 약독화된 HPIV3 균주의 분자 바이러스학 및 병원성을 규명하고 약독화의 유전적 기초를 이해하는 것이 유용할 것이다. 이러한 목적 및 관련 목적을 달성하는데 있어서는, cp45 바이러스 중 어떤 돌연변이(들)이 ts, ca 및 att 표현형을 특정하는지, 그리고 BPIV3의 어떤 유전자(들)이 약독화된 표현형을 특정하는지를 결정하기 위해 cDNA로부터 wt 표현형을 갖는 바이러스를 생산하는 것이 필요하다.
프로토타잎 PIV3 균주, 및 JS wt HPIV3 및 cp45 균주의 완전한 뉴클레오타이드 서열이 결정되었다 (Stokes 외, 상기문헌 (1992); Stokes외, Virus Res. 30:43-52 (1993)). 이들 연구결과로부터, cp45 균주는 모균주인 JS 25 HPIV3 균주에 비할 때 적어도 17개의 뉴클레오타이드가 치환된 것으로 나타났는데 이들 중 8개는 바이러스 단백질의 변화와 관련이 있다. 그러나, 이들 동정된 변이 중 어떤 것이 소망되는 표현형, 예컨대 ts, ca 및 att 표현형을 특정하는지는 이제까지 밝혀지지 않았다. 최근, 비허용적인 온도에서의 cp45 성장이 47885 wt PIV3 균주의 L 유전자의 cDNA 클론의 공동 발현에 의해 보완되는 것으로 보고된 바 있는데 (Ray 외, J. Virol. 70:580-584 (1996), 이는 L 유전자가 cp45의 ts 표현형에 기여하는 하나 이상의 변이를 함유하는 것일 수 있음을 시사하는 것이다. 그러나, 이 연구의 결과는 47885 균주가 cp45의 JS 모균주와 동질계가 아니라는 사실과 뒤얽혀있다 (예컨대, 이들 2가지 바이러스는 뉴클레오타이드 수준에서는 4$ 상이하고, 41 아미노산 위치에서 L 단백질이 다르다 (Stokes외, 상기문헌 (1992); Virus Res. 27:96 (1993)에서 오식 보임; Virus Res. 25:91-103). 또한, 이 상보법은 cp45의 전제적인 ts 표현형에 기여하는 L 유전자 변이(들)의 상대적인 기여도를 명확하게 측정해주지 못한다.
PIV3 및 기타 RNA 바이러스에 있어서 약독화 변이의 구제 및 분석에는 목적하는 특정 바이러스에 대한 cDNA를 효과적으로 조작하기 위한 방법이 필요하다. PIV에 대한 cDNA를 동정하는 이전의 진전에도 불구하고, 이들 및 기타 음성-센스 RNA 바이러스의 게놈 RNA를 조작하는 것은 어려운 것으로 밝혀졌다. 이와 관련한 한가지 중요한 문제점은 이 바이러스들의 벗은 (naked) 게놈 RNA가 비감염성이라는 것이다.
비-세그먼트화 음성 스트랜드 RNA 바이러스의 성공적인 유전자 조작 방법은 최근에 들어서야 개발되기 시작했다 (Conzelmann, J. Gen. Virol. 77:381-89 (1996); Palese외, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93:11354-58, (1996)). 게놈성 또는 안티게놈성 RNA와 N, P 및 L 단백질을 코딩하며 T7 RNA 폴리머라제 프로모터를 포함하는 별도로 형질도입된 플라스미드의 세포내 공동발현에 의해 기능적인 뉴클레오캡시드가 성공적으로 제조되었다. 세포내 cDNA 발현은 백시니아 재조합 바이러스에 의한 공동-감염에 의해 생산된 T7 폴리머라제에 의해 추진된다. 이러한 접근방식은 cDNA-코딩된 미니레플리콘의 전사 및 복제 요구인자를 결정하는데 처음으로 이용되었다. 이들 일반적인 방법을 적용하여, 뉴클레오캡시드 N, 인단백질 P, 및 대형 폴리머라제 서브유닛 L의 존재 하에 cDNA-코딩된 항게놈성 RNA로부터 감염성 광견병 바이러스, 수포성 구내염 바이러스 (VSV), 홍역 바이러스 및 Sendai 바이러스를 구제하는 것이 성공된 바 있다 (Garcin 외, EMBO J. 14:6087-6094 (1995); Lawson 외, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92:4477-81 (1995); Radecke 외, EMBO J. 14:5773-5784 (1995); Schnell 외, EMBO J. 13:4195-203 (1994); Whelan 외 Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92:8388-92 (1995)). 호흡기 융합 바이러스 (RSV: respiratory synctial virus) 역시 cDNA 코딩된 안티게놈으로부터 복원된 바 있지만 이것은 M2 ORF 1 전사 연장 인자를 코딩하는 부가적인 플라스미드의 형질도입을 요한다 (Collins 외, 1995).
감염성 PIV 바이러스 및 그 밖의 모노네가바이레일즈의 구제는 이들의 비-세그먼트화된 음성-스트랜드 RNA 게놈으로 인해 복잡화된다. 인플루엔자와 같은 세그먼트화된 게놈 바이러스의 게놈 리보핵단백질 복합체 (RNPs)는 일반적으로 크기가 작고 성긴 구조를 가지며 RNA로부터 생체외에서 조립가능하고 바이러스 단백질을 필요로 한다. 그러나, PIV 및 기타 모노네가바이레일즈들은 훨씬 크고 보다 밀집된 RNPs 구조를 가지며, 이는 생체외에서의 기능적 연관을 다루기 어렵게 한다. 뿐만 아니라, HPIV3 P mRNA의 코딩 포텐셜은 공동전사 "RNA 편집"에 의해 복잡해진다 (Galinsky외, Virology 186: 543-50 (1992)). 결과적인 리딩 프레임의 이동은 P의 N-말단부에 융합된 키메라로서 발현된 내부 ORFs에 접근할 수 있다. 또한, HPIV3는 상기한 바와 같이 키메라 V 단백질을 발현시키는 대부분의 다른 파라믹소바이러스와는 다른 것으로 나타났다. HPIV3 편집으로부터의 해당 단백질 세트는 이제까지 동정되지 않았으며, HPIV3의 내부 V ORF가 수많은 번역 종결 코돈에 의해 편집 부위로부터 분리된다 (Galinski외, 1992 상기문헌). 또 다른 복잡한 인자는 BPIV3 및 HPIV3에 의한 편집으로 인해, P의 업스트림 절반이 제 2의 내부 ORF에 의해 코딩된 대역에 융합된 새로운 키메라 단백질 D를 생산된다는 것이다 (Pelet외, EMBO J. 10:443-448 (1991); Galinski외 상기문헌 (1992)). D 단백질은 다른 파라믹소바이러스에서 카운터파트부분을 갖지 않는다.
전기 설명에 비추어 볼 때, PIV에 기인하는 심각한 건강상의 문제, 특히, HPIV3에 기인하는 유아 및 아동의 질환을 경감시키기 위한 안전하고도 효과적인 백신을 제조하기 위한 도구 및 방법을 개발할 것이 시급하게 요청되고 있다. 놀랍게도, 본 발명은 이러한 요구사항 및 관련된 기타의 필요성을 충족시킨다.
발명의 요약
본 발명은 감염성 PIV 내에 정의된, 소정의 구조적 및 표현형 변화를 도입하기 위한 새로운 도구 및 방법을 제공한다. 본 발명의 한가지 구체예에 따라 작동적으로 연결된 전사 프로모터, PIV 게놈 또는 안티게놈을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열 및 전사 터미네이터를 포함하는 분리된 폴리뉴클레오타이드 분자가 제공된다.
PIV 게놈 또는 안티게놈은 인간 또는 비인간 PIV 서열 또는 그의 재조합적으로 변형된 변형체일 수 있다. 한가지 구체예에서, 폴리뉴클레오타이드 서열은 소의 PIV(BPIV)로부터의 유전자 또는 유전자 세그먼트와 같은 비인간 PIV 서열과 재조합적으로 연결된 인간의 PIV 서열을 포함하는 키메라 게놈 또는 안티게놈을 코딩한다. 또 다른 예에서, 폴리뉴클레오타이드는 비인간 PIV로부터의 서열과 인간 또는 비인간 기원의 하나 이상의 다른 PIV와의 키메라를 코딩한다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 재조합 PIV (rPIV) 게놈 또는 안티게놈을 포함하는 분리된 감염성 PIV 입자를 제공한다. 분리된 감염성 PIV 입자는 바이러스 또는 서브바이러스성 입자일 수 있다. 본문에서 서브바이러스성 입자란 예컨대 유전자 세그먼트, 유전자, 단백질, 또는 단백질 기능 대역 등과 같이 완전한 바이러스내에는 존재하는 구조 요소가 결핍된 모든 감염성 PIV 입자를 가리키는 것이다 (예컨대 완전한 게놈 또는 안티게놈, 뉴클레오캡시드 및 엔벨롭을 비롯한 조립된 비리온). 따라서, 본 발명의 서브바이러스성 입자의 한가지 예는 게놈 또는 안티게놈, 및 N, P, 및 L 유전자를 함유하는 감염성 뉴클레오캡시드이다. 다른 서브바이러스성 입자들은 비-필수 구조 요소 중에서도 비-필수 유전자 및/또는 그들의 산물 (예컨대 F, HN, M, 또는 C)의 부분 또는 완전한 결실 또는 치환에 의해 생산된다.
분리된 감염성 PIV 입자는 인간의 PIV인 것이 바람직하고 더욱 바람직하게는 인간의 PIV3 (HPIV3)인 것이 좋다. 본 발명은 또한 소 또는 쥐의 PIV (BPIV 또는 MPIV)로부터 분리된, 감염성 입자 뿐만 아니라, 예컨대 HPIV3 및 HPIV1로부터의 서열, HPIV3 및 HPIV2 서열로부터의 서열, 또는 HPIV3 및 BPIV 서열을 함유하는 2가지 이상의 상이한 PIV 게놈으로부터의 키메라 서열을 함유하는 입자도 제공한다.
본 발명과 관련된 측면들에서, HPIV1, HPIV2, BPIV 또는 MPIV와 같은 이질적인 PIV로부터의 한가지 이상의 서열에 연결된 HPIV3으로부터의 뉴클레오타이드 서열이 합쳐진 분리된 감염성 PIV 입자가 제공된다. 예컨대, HPIV3의 유전자 전체는 PIV1 또는 PIV2의 HN 및/또는 F 당단백질 유전자와 같은 다른 형태의 PIV로부터의 카운터파트 유전자에 의해 치환될 수 있다. 다른 한편, 선별된 유전자 세그먼트, 예컨대 HPIV1 또는 HPIV2의 HN 또는 F의 세포질 테일, 투과막 대역 또는 엑토도메인과 같은, 선택된 유전자 세그먼트는 상응하는 HPIV3 유전자 중 대응하는 유전자 세그먼트를 대체하여 예컨대 PIV1 또는 PIV2의 엑토도메인에 융합된 PIV3의 세포질 테일 및/또는 투과막 대역을 갖는 융합단백질을 코딩하는 구축물을 생산할 수 있다. 다른 한편, 결과적인 클론 내에 신규한 면역원성 특성을 창조하기 위해 이질적인 PIV 백그라운드 내에서 하나의 PIV로부터의 유전자 또는 유전자 세그먼트가 부가되리 수 있다 (즉, 치환없이).
PIV 게놈 또는 안티게놈 내로 약독화, 감온성, 감기-적응, 작은 플라크 크기, 숙주 범위 제한, 향상된 생체외 성장 또는 PIV의 면역원성 에피토프의 변화를 야기하는 것과 같이 소망되는 표현형 변형을 코딩하도록 선택된 뉴클레오타이드 삽입, 재배치, 결실 또는 치환을 도입함으로써 다른 변형을 일으킬 수 있다. 본 발명의 한가지 측면에서, 생물학적으로 유도된, 약독화된 PIV 내에서 일어나는 돌연변이들이 동정되어 완전한 길이의 PIV 클론 내로 단독으로 또는 조합되어 도입된다. 일반적으로 이러한 돌연변이들은 예컨대 ts, ca 또는 att 표현형을 갖는 PIV 변이주에 의해 나타나는 변경과 같이, 야생형 PIV에 대한 생물학적으로 유도된 변이 바이러스에 의해 나타나는 단일 아미노산 변경이다. 생물학적으로 유도된 변이주 PIV로부터의 이러한 변경은 재조합 PIV 클론내로 인코포레이션되어 결과적인 바이러스에서 소망되는 특성을 지정하게 된다. 대표적인 돌연변이에는 HPIV3 균주 JS cp45에서 약독화된 표현형을 특정하는 아미노산 변화가 포함된다. 이러한 예시적인 변이들 중에서도, JS 야생형 PIV 균주의 Tyr942, Leu992 및/또는 Thr1558에서 일어나는 아미노산 치환과 같은, ts, ca 또는 att 표현형을 특정하는 PIV 폴리머라제 유전자 L내에서 발생하는 변이를 들 수 있다. 보다 구체적인 측면에서, 약독화된 PIV 재조합체가 설명된다. 여기서 Tyr942는 His에 의해, Leu992는 Phe에 의해/ 또는 Thr1558은 Ile에 의해 치환된다.
또한, 본 발명에 따라, 약독화, 온도감응성, 감기-적응성, 작은 플라크 크기, 숙주 범위 한정 등을 포함하는 소망되는 특성을 나타낼 수 있도록 감염성 클론의 게놈 또는 안티게놈 내로 선택된 조합으로 도입된 복수의 표현형-특이적인 돌연변이를 갖는 재조합 PIV도 제공된다. 예컨대, HPIV3 JS cp45로부터의 2가지 ts 변이와 같이, 생물학적으로 유도된 PIV 돌연변이주로부터 채택된 2개 이상의 별개의 돌연변이를 포함하는 PIV 클론이 제공된다. 따라서 동정된 병변의 "메뉴"로부터 돌연변이를 선택하여 이러한 돌연변이를 여러가지로 조합하여 도입함으로써 백신 바이러스의 약독화, 면역원성 및 안정성의 선택된 수준으로 보정함으로써 다중적으로 약독화된 바이러스가 얻어지는 것이다.
부가적인 구체예에서, 본 발명은 예컨대 ts, ca 또는 att 돌연변이와 같이 생물학적으로 유도된 PIV로부터 채택된 한가지 이상의 변이를 보강하기 위해, 같거나 다른 유전자와 관련된 부가적인 유형의 돌연변이를 제공한다. 이 맥락에서 돌연변이의 표적 유전자에는 뉴클레오캡시드 단백질 N, 인단백질 P, 대형 폴리머라제 서브유닛 L, 매트릭스 단백질 M, 헤마글루티닌-뉴라미니데이즈 단백질 HN, 융합 단백질 F 및 C, D 및 V ORF 산물이 포함된다. 바람직한 측면에서, 생물학적으로 유도된 PIV로부터 채택된 약독 돌연변이는 예컨대 HPIV3 및 HPIV1의 두가지 모두, 또는 PIV와 BPIV 바이러스의 두가지 모두로부터의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 PIV 재조합체와 같은 키메라 PIV 재조합체에 인코포레이션된다.
다른 구체예에서, 본 발명은 예컨대 PIV 게놈 또는 안티게놈을 코딩하는 하나 이상의 분리된 폴리뉴클레오타이드 분자로부터 바이러스성 또는 서브바이러스성 입자와 같은 감염성 PIV 입자를 생산하기 위한 방법을 제공한다 (1997년 5월 23일자 미국잠정특허출원 60/047575호, 본 발명에 참조됨). 이 방법에 따라 감염성 PIV 입자를 제조하기 위해, PIV 게놈 또는 안티게놈을 코딩하는 분리된 폴리뉴클레오타이드 분자를 포함하는 발현 벡터를 PIV의 N, P, 및 L 단백질을 코딩하는 한가지 이상의 분리된 폴리뉴클레오타이드 분자를 포함하는 발현 벡터를 이용하여 세포계 또는 무세포계에서 공동발현시킴으로써, 감염성 PIV 입자를 제조한다.
PIV 게놈 또는 안티게놈과 N, P, 및 L 단백질은 단일 발현 벡터, 또는 개별적인 발현 벡터들에 의해 공동발현될 수 있다. 또 다른 구체예에서, N, P 및 L 단백질은 개별적인 발현 벡터들 상에 각각 코딩된다.
전술한 방법들 중, PIV 게놈 또는 안티게놈을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 분자는 인간, 소 또는 쥐의 PIV의 게놈 또는 안티게놈 서열에 대응할 수 있다. 다른 한편, PIV 코딩 폴리뉴클레오타이드는 인간의 PIV 게놈 또는 안티게놈 서열의 키메라 및 하나 이상의 인간의 PIV 게놈 또는 안티게놈 서열의 키메라일 수 있다. 감염성 PIV를 제조하는 부가적인 방법에서, PIV 게놈 또는 안티게놈을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 예컨대 인간의 PIV1 또는 인간의 PIV2와 같은 인간의 PIV의 한가지 이상의 관련된 형태로부터의 서열에 결합된 HPIV3으로부터의 서열을 함유하는 폴리뉴클레오타이드이다. 인간의 PIV3의 개별적인 유전자들은 PIV1 또는 PIV2의 HN 및 F 당단백질 유전자와 같은 이종의 PIV로부터의 카운터파트 유전자에 의해 치환됨으로 해서 키메라 PIV를 코딩하는 변형된 게놈 또는 안티게놈을 생산할 수 있다. 다른 한편, HPIV1 또는 HPIV2의 HN 또는 F의 세포질 테일, 막투과 대역 또는 엑토도메인과 같은 선택된 이질적 유전자 세그먼트는 예컨대 HPIV3의 HN 또는 F와 같은 상이한 PIV 유형 또는 상이한 유전자 중의 카운터파트 유전자 세그먼트를 치환하여 예컨대 PIV1 또는 PIV2의 엑토도메인에 융합된 PIV3의 세포질 테일 및/또는 막투과 대역을 갖는 융합단백질과 같은 키메라 단백질 코딩하는 구축물을 생산할 수 있다.
감염성 PIV을 제조하기 위한 또 다른 부가적인 방법에서는 PIV 게놈 또는 안티게놈을 변형시켜, 인간 및 소의 두가지 모두의 PIV로부터의 서열을 함유하는 폴리뉴클레오타이드와 같은 한가지 이상의 비-인간 PIV 서열 및 인간의 PIV 게놈 또는 안티게놈 서열의 키메라를 생산할 수 있다.
감염성 PIV를 제조하기 위한 또 다른 방법에서는, PIV의 면역원성 에피토프의 변화, 약독화, 온도-감응성, 감기-적응, 작은 플라크 크기, 또는 숙주 범위 한정 등을 일으키는 것과 같은 소망되는 표현형 변경을 코딩하도록 선택된 뉴클레오타이드 삽입, 재배열, 결실 또는 치환에 의해 PIV 게놈 또는 안티게놈을 변형시킨 다. 다른 한편, PIV 게놈 또는 안티게놈을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 분자는 목적 숙주에서 보호성 면역 응답을 이끌어낼 수 있는 상이한 미생물 병원균 (예컨대 바이러스, 세균 또는 진균)의 시토카인, T-헬퍼 에피토프, 제한 효소 부위 마커, 또는 단백질과 같은 비-PIV 분자를 코딩하도록, PIV 게놈 또는 안티게놈을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 분자를 변형시킬 수 있다. 한가지 구체예에서, PIV 게놈 또는 안티게놈을, 인간의 RSV 또는 홍역 바이러스로부터의 단백질을 코딩하도록 변형시킨다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, PIV 게놈 또는 안티게놈을 코딩하는 분리된 폴리뉴클레오타이드 분자를 함유하는 발현 벡터, 및 PIV의 N, P, 및 L 단백질을 코딩하는 한가지 이상의 분리된 폴리뉴클레오타이드 분자를 포함하는 발현 벡터를 인코포레이션하는 세포계 또는 무세포계 발현계 (예컨대 무세포 라이세이트)가 제공된다. 발현시, 게놈 또는 안티게놈 및 N, P, 및 L 단백질은 서로 결합하여 바이러스 또는 서브바이러스성 입자와 가은 감염성 PIV 입자를 생산한다. PIV 게놈 또는 안티게놈 및 PIV의 N, P 및 L 단백질을 코딩하는 하나 이상의 분리된 폴리뉴클레오타이드 분자를 코딩하는 분리된폴리뉴클레오타이드 분자는 단일 벡터에 의해 발현될 수 있으며, 또는 게놈 및 하나 이상의 N, P 및 L 단백질은 2가지 이상의 분리된 벡터내로 인코포레이션될 수 있다.
특정 구체예의 설명
본 발명은 분리된 폴리뉴클레오타이드 분자, 바람직하게는 cDNA로부터, 감염 성 PIV를 제조 빛 변형시키기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 감염성 PIV 입자는 감염성 PIV 내로 소정의 변경을 도입시킬 수 있는 재조합 공동발현계에 의해 생산한다. 이러한 변형은 소정의 약독화 돌연변이를 나타내는 살아있는 약독화 백신 균주의 개발을 비롯한 광범위한 응용분야에 유용하다.
본 발명의 감염성 PIV는 PIV 게놈 또는 안티게놈 RNA를 코딩하는 하나 이상의 분리된 폴리뉴클레오타이드와 전사, 복제 뉴클레오캡시드를 생산하는데 필요한 바이러스 단백질을 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 함께 세포내 또는 무세포 공동발현시킴으로써 제조한다. 감염성 PIV를 생산하기 위한 공동발현에 유용한 바이러스 단백질로는 주요 뉴클레오캡시드 단백질 (N) 단백질, 뉴클레오캡시드 인단백질 (P), 대형 (L) 폴리머라제 단백질, 융합 단백질 (F), 헤마글루티닌-뉴라미니데이즈 당단백질 (HN), 및 매트릭스 (M) 단백질이 있다. 또한 PIV의 C, D 및 V ORFs의 산물도 유용하다.
PIV 게놈 또는 안티게놈을 코딩하는 cDNA를 필요한 바이러스 단백질과 함께 세포내 또는 생체외에서 공동발현시켜 감염성 PIV를 형성시킨다. "PIV 안티게놈"이란 후대개체 (progeny) PIV 게놈을 합성하는데 있어서 템플레이트 역할을 하는 분리된 양성-센스 폴리뉴클레오타이드 분자를 가리킨다. 바람직하게는 전사, 복제 뉴클레오캡시드를 생산하는데 필요한 단백질을 코딩하는 상보적인 서열의 양성-센스 전사체와의 하이브리다이제이션 가능성을 최소화하기 위해 복제 매개물 RNA, 또는 안티게놈에 상응하는 PIV 게놈의 양성-센스 버젼인 cDNA를 구축하는 것이 바람직하다.
본 발명의 몇가지 구체예에서 재조합 PIV (rPIV)의 게놈 또는 안티게놈은 바이러스 또는 서브바이러스 입자로 하여금 감염성을 갖도록 코딩되도록 할 유전자 또는 그의 일부 유전자를 함유하기만 하면 된다. 또한, 상기 유전자 또는 그의 일부는 한가지를 초과하는 폴리뉴클레오타이드 분자에 의해 제공될 수 있다. 즉, 별도의 뉴클레오타이드 분자로부터 상보 또는 그와 유사한 수단에 의해 유전자가 제공될 수 있다. 다른 구체예에서는, PIV 게놈 또는 안티게놈은 플라스미드 또는 헬퍼 세포주에 의해 제공되는 헬퍼 바이러스 또는 바이러스의 작용의 참여 없이 바이러스 성장, 복제 및 감염에 필요한 모든 기능을 코딩할 수 있다.
"재조합 PIV"라 함은 재조합 발현계로부터 직접 또는 간접적으로 유도되거나 또는 그에 의해 생산된 바이러스 또는 서브바이러스 입자로부터 전파된 PIV 또는 PIV-유사 바이러스 또는 서브바이러스 입자를 가리킨다. 재조합 발현계는 예컨대 PIV RNA로 전사되는 구조 또는 코딩 서열, 프로모터, 및 적절한 전사 개시 및 종결 서열과 같이, 적어도, PIV 유전자 발현에 있어서 조절 기능을 갖는 유전적 요소 또는 요소들의 조립체로 이루어진 작동적으로 연결된 전사 단위를 포함하는 재조합 발현 벡터를 이용하게된다.
cDNA-발현된 PIV 게놈 또는 안티게놈으로부터 감염성 PIV를 제조하기 위해, 게놈 또는 안티게놈을 (i) RNA 복제가능한 뉴클레오캡시드의 제조, 및 (ii)RNA 복제와 전사의 두가지 모두를 수행할 수 있는 자손 뉴클레오캡시드를 제공하는데 필요한 PIV N, P 및 L 단백질과 함께 공동발현시킨다. 게놈 뉴클레오캡시드에 의한 전사에 의해 다른 PIV 단백질이 제공되고 생산적인 감염 (productive infection)이 개시된다. 다른 한편, 생산적 감염에 필요한 부가적인 PIV는 공동발현에 의해 공급되리 수 있다.
예컨대, 전사-번역 결합 반응에 이어 세포내로 형질도입시킴으로써 상기 바이러스 단백질과 PIV 안티게놈 또는 게놈을 함께 합성하는 것 역시 생체외 (무세포)에서 가능하다. 다른 한편, 안티게놈 또는 게놈 RNA는 생체외 합성가능하며 PIV 단백질을 발현하는 세포 내로 형질도입가능하다.
본 발명의 특정 구체예에서, 한가지 이상의 헬퍼 바이러스에 의해 전사, 복제 PIV 뉴클레오캡시드를 생산하는데 필요한 단백질을 코딩하는 상보적인 서열이 제공된다. 이러한 헬퍼 바이러스들은 야생형 또는 돌연변이일 수 있다. 바람직하게는, 헬퍼 바이러스가 PIV cDNA에 의해 코딩된 바이러스로부터 표현형적으로 구별될 수 있다. 예컨대, 헬퍼 바이러스와는 면역학적으로 반응하나 PIV cDNA에 의해 코딩된 바이러스와는 반응하지 않는 모노클로날 항체를 제공하는 것이 바람직하다. 이러한 항체는 무력화 항체일 수 있다. 몇몇 구체예에서, 재조합 바이러스로부터 헬퍼 바이러스를 분리하기 위한 친화 크로마토그래피에 이 항체들을 이용할 수 있다. 이러한 항체들의 확보를 돕기 위해, PIV cDNA내로 돌연변이를 도입하여 HN 또는 F 당단백질 유전자와 같은 헬퍼 바이러스로부터 항원 다양성을 제공할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, N, P, L 및 기타의 소망되는 PIV 단백질들이 게놈 또는 안티게놈을 코딩하는 것과 같거나 다를 수 있는, 한가지 이상의 비-바이러스성 발현 벡터에 의해 코딩될 수 있다. 소망되는 경우 그 밖의 다른 단백질들 역시, 그 자신의 벡터 또는 한가지 이상의 N, P, L 및 기타 소망되는 PIV 단백질 또는 완전한 게놈 또는 안티게놈을 코딩하는 벡터에 의해 각각 코딩될 수 있다. 형질도입된 플라스미드로부터 게놈 또는 안티게놈 및 단백질의 발현은, 예컨대 T7 RNA 폴리머라제를 발현하는 예컨대 백시니아 바이러스 MVA 균주 재조합체와 같은 T7 RNA 폴리머라제에 대한 발현계에 의한 감염, 형질도입 또는 트랜스덕션에 의해 공급된 T7 RNA 폴리머라제를 위한 프로모터의 통제하에 각각의 cDNA에 의해 달성될 수 있다 (Wyatt 외, Virology, 210:202-205 (1995), 본 발명에 참조됨). 바이러스 단백질, 및/또는 T7 RNA 폴리머라제 역시 형질전환된 포유류 세포 또는 수행된 mRNA 또는 단백질의 형질도입에 의해 제공될 수 있다.
PIV mRNA 또는 게놈 RNA의 역전사 복제물의 클로닝된 cDNA 세그먼트를 조립하고, 완전한 안티게놈을 폴리머라제 연쇄반응 등 (PCR; 예컨대 미국특허 4,683,195 및 4,683,202, 및 PCR Protocols: A guide to Methods and Applications, Innis 외, 편, Academic Press, San Diego (1990), 모두 본 발명에 참조됨)에 의해 응집체로서 제공하는 등에 의해 PIV 안티게놈을 구축하여 본 발명에 이용할 수 있다. 예컨대, 안티게놈의 좌측 말단을 함유하는 cDNA를 포함하고, 적절한 프로모터 (예컨대 T7 RNA 폴리머라제 프로모터)를 함유하며 플라스미드, 코스미드, 파지 또는 DNA 바이러스 벡터와 같은 적절한 발현 벡터 내에 조립된 제 1 구축물을 제조한다. 이 벡터는 용이한 조립을 위해 고안된 독특한 제한효소 부위를 함유하는 합성 폴리링커의 돌연변이 및/또는 삽입에 의해 변형될 수 있다. 용이한 제조를 위해 N, P, L 및 기타 소망되는 PIV 단백질들을 한가지 이상의 개별적인 벡터 내에서 조립할 수 있다. 안티게놈 플라스미드의 우측 말단에는 소망에 따라 플 랭킹 리보자임 및 탠덤 T7 전사 터미네이터과 같은 부가적인 서열이 함유될 수 있다. 리보자임은 단일의 비바이러스 뉴클레오타이드를 함유하는 3' 말단을 생산하는 망치머리형 (hammerhead type) (예컨대, Grosfeld 외, (1995), 상기문헌), 또는 비-PIV 뉴클레오타이드의 3' 말단이 없는 간염 델타 바이러스의 리보자임과 같은 기타 적절한 리보자임일 수 있다 (Perrotta외, nature 350:434-436 (1991). 본 발명에 참조됨. 이어서 좌측 및 우측 말단을 통상적인 제한효소 위치를 통해 결합시킨다. 여러가지 뉴클레오타이드 삽입, 결실 및 재배열은 cDNA의 구축중 또는 구축 후에 PIV 게놈 또는 안티게놈 내에서 수행할 수 있다. 예컨대, 특정한 소망 뉴클레오타이드 서열을 합성하여 간편한 제한효소 부위를 이용함으로써 cDNA내의 적절한 대역에 삽입할 수 있다. 다른 한편, 위치-특이적인 돌연변이, 알라닌 스캐닝, PCR 돌연변이 또는 기타 기술분야에 잘 알려진 그러한 기술을 이용하여 cDNA에 돌연변이를 도입할 수 있다.
게놈 또는 안티게놈을 코딩하는 cDNA를 구축하는 또 다른 방법에는 서브유닛 cDNA 성분의 수를 하나 또는 2 조각정도로 작은 수로 감소시키기 위해 향상된 PCR 조건을 이용한 역전사-PCR이 포함된다 (예컨대 Cheng 외, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:5695-5699 (1994)에 설명됨. 본 발명에 참조됨). 다른 구체예에서는 보다 큰 크기의 게놈 또는 안티게놈에 잘 적용시키기 위해 상이한 프로모터를 사용하거나 (예컨대 T3, SP6), 또는 상이한 리보자임 (예컨대 간염 델타 바이러스), 상이한 DNA 벡터 (예컨대 코스미드)를 사용하여 전파시킬 수 있다.
게놈 또는 안티게놈을 코딩하는 분리된 폴리뉴클레오타이드 (예컨대 cDNA)를 예컨대 HEp-2, FRhL-DBS2, LLC-MK2, MRC-5, 및 Vero 세포와 같이, 생산적인 PIV 감염을 뒷받침할 수 있는 적절한 숙주세포 내로 형질도입, 일렉트로포레이션, 기계적 삽입, 트랜스덕션 등에 의해 삽입시킬 수 있다. 분리된 폴리뉴클레오타이드 서열의 형질도입은 예컨대 칼슘 포스페이트-매개된 형질도입 (Wigler외, Cell 14:725 (1978); Corsaro 및 Pearson, Somatic Cell Genetics 7:603 (1981); Graham and Van der Eb, Virology 52: 456 (1973)), 일렉트로포레이션 (Neumann외, EMBO J. 1:841-845 (1982)), DEAE-덱스트란 매개된 형질도입 (Ausubel외, (편). Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc., NY (1987), 양이온성 지질-매개된 형질도입 (Hawley-Nelson외, Focus 15: 73-79 (1993)) 또는 시판되는 형질도입 시약, 예컨대 LipofectACE
(Life Technoligies, Gaithersburg, MD) 등 (전술한 문헌은 모두 본 발명에 참조됨)에 의해 배양된 세포 내로 도입될 수 있다.
전술한 바와 같이, 본 발명의 몇몇 구체예에서, N, P, L 및 다른 소망되는 PIV 단백질들은 게놈 또는 안티게놈을 코딩하는 것들과는 표형형질적으로 구별되는 하나 이상의 헬퍼 바이러스에 의해 코딩된다. N, P, L 및 기타 소망되는 PIV 단백질 역시 게놈 또는 안티게놈 및 이들의 다양한 조합을 코딩하는 것들과 같거나 다를 수 있는 한가지 이상의 발현 벡터들에 의해 코딩될 수 있다. 부가적인 단백질들은 한가지 이상의 N, P, L 및 다른 소망되는 PIV 단백질들, 또는 완전한 게놈 또는 안티게놈을 코딩하는 벡터에 의해 또는 그 자신의 벡터에 의해 코딩될 수 있다.
본 발명의 조성물 및 방법은 선택된 PIV 단백질의 기능 또는 발현을 변경시 키기 위한 소정의 돌연변이를 이용한 PIV 분자 생물학 및 병원성 메카니즘의 분석 및 조작을 가능케한다. 이들 방법 및 조성물을 이용하여, 침묵하는 부수적인 돌연변이 (silent incidental mutations)로부터 소망되는 표현형 변경의 원인이 되는 돌연변이를 구별할 수 있고 백신 제조를 위하 재조합 PIV 게놈 또는 안티게놈내로 인코포레이션을 위한 표현형-특이적인 돌연변이를 선택할 수 있다.
본 발명에 따른 PIV 변형은 바이러스 약독화 및 백신 면역원성의 개선, 바람직하지 못한 면역병원성과 관련된 에피토프의 제거, 항원 드리프트 적응 등을 위한 것과 같으 개선된 백신 바이러스를 제조하는데 그 목적이 있다. 이러한 목적 및 기타 목적을 달성하기 위해, 본 발명의 조성물 및 방법은 감염성, 재조합 PIV 내로의 인코포레이션을 위해 PIV 게놈 또는 안티게놈 내로 광범위한 변형을 일으키도록 한다. 예컨대, 보호적인 항원 또는 에피토프를 코딩하는 외래 유전자 또는 유전자 세그먼트들을 PIV 클론 내에 첨가하여 PIV와 다른 바이러스 또는 보호적인 항원이 유도된 시약 모두에 대해 면역성이 유도될 수 있는 PIV 바이러스 균주를 제조할 수 있다. 다른 한편, 시토카인과 같이 면역계의 모듈레이터를 코딩하는 외래유전자를 부분적으로 또는 전체적으로 삽입하여 백신 바이러스의 면역원성을 향상시킬 수 있다.
본 발명의 PIV 클론에 포함될 수 있는 다른 돌연변이들로는 에컨대 PIV 클론 내에서 이종성 유전자 또는 유전자 세그먼트 (예컨대 당단백질 유전자의 세포질 테일을 코딩하는 유전자 세그먼트)를 그에 대응하는 유전자 또는 유전자 세그먼트로 치환하는 것이 포함된다. 다른 한편, PIV 클론 내의 유전자의 상대적인 순서를 변경할 수 있고, PIV 게놈 프로모터를 그의 안티게놈 카운터파트로 치환시킬수 있으며, 선택된 유전자(들)을 비기능적으로 할 수도 있다 (예컨대 그 유전자의 발현을 방지하기 위해 종결 코돈의 도입과 관련된 기능을 절제함으로써). PIV 클론 내에서의 여러가지 비-코딩 또는 코딩 대역 또는 다른 부위에서의 독특한 제한효소 위치를 삽입하는 등, 조작을 용이하게 하기 위해 PIV 클론 내에서 다른 종류의 변형을 가할 수도 있다. 또한, 미번역 유전자 서열을 제거하여 외래 서열의 삽입가능성을 증가시킬 수 있다.
따라서, PIV의 감염성 클론을 제공함으로써 본 발명은 PIV 게놈 (또는 안티게놈) 내에서 재조합적으로 제조될 광범위한 변경을 가능케하며, 소망되는 표현형 변경을 특정하는 소정의 돌연변이를 일으킬 수 있는 것이다. "감염성 클론(infectious clone)"이라 함은 감염성 바이러스 또는 서브바이러스 입자의 게놈을 제조하기 위한 템플레이트 역할을 할 수 있는 게놈 또는 안티게놈 RNA내로 전사될 수 있는 감염성 비리온 내로 직접 인코포레이션될 수 있는 RNA 또는 cDNA 또는 그의 산물을 의미한다. 상기한 바와 같이, 다양한 종래기술 (예컨대 위치-지향된 돌연변이)에 의해 게놈 또는 안티게놈의 cDNA 복제물 내로 소정의 돌연변이를 도입할 수 있다. 설명된 바와 같이 완전한 게놈 또는 안티게놈 cDNA를 조립하기 위해 게놈 또는 안티게놈 cDNA 서브단편하면 각 대역이 별도로 조작될 수 있어, 작은 cDNA 서브젝트가 큰 cDNA 서브젝트보다 다루기가 더 쉽고 그로 인해 완전한 cDNA로 쉽게 조립될 수 있다는 장점을 누릴 수 있다. 따라서, 완전한 안티게놈 또는 게놈 cDNA, 또는 선택된 그의 서브단편을 올리고뉴클레오타이드-지향된 돌연변이의 템플 레이트로서 사용가능하다. 이는 Bio-Rad Laboratories (Richmond, CA)의 MUTA-gen
키트를 사용하는 것과 같이 단일-가닥 파지미드 형태의 중간체를 통하거나, 또는 Strategene (La Jolla, CA)의 Chameleon
돌연변이 키트와 같은 템플레이트로서 이중-가닥 플라스미드를 직접 사용하는 방법, 또는 목적하는 돌연변이(들)을 함유하는 올리고뉴클레오타이드 프라이머 또는 템플레이트를 사용하는 폴리머라제 연쇄반응을 이용하여 수행할 수 있다. 이어서 돌연변이된 서브단편을 완전한 안티게놈 또는 게놈 cDNA로 조립할 수 있다. 다른 많은 돌연변이 기술이 알려져 있으며 본 발명의 PIV 안티게놈 또는 게놈 cDNA에 목적하는 돌연변이를 일으키는데 사용될 수 있다.
Bio-Rad Laboratories사의 돌연변이발생 키트를 이용하여 생체외에서 MUTA-gene
파지미드에 의해 돌연변이를 일으키는 방법을 예시한다. 간략히 설명하면, PIV 게놈 또는 안티게놈을 코딩하는 cDNA를 플라스미드 pTZ18U내로 클로닝시켜 CJ236 세포 (Life Technologies)를 형질전환시킨다. 파지미드 제제는 제조업자의 지침에 따라 제조한다. 올리고뉴클레오타이드는 게놈 또는 안티게놈의 소망되는 위치로 변경된 뉴클레오타이드를 도입함으로써 돌연변이발생에 알맞게 고안한다. 유전적으로 변경된 게놈 또는 안티게놈을 함유하는 플라스미드를 증폭시킨다.
돌연변이는 단일 뉴클레오타이드 변경부터 하나 이상의 유전자 또는 게놈 세그먼트를 함유하는 커다란 cDNA 세그먼트를 도입, 삽입 또는 치환하는 것에 이르기까지 매우 다양할 수 있다. 게놈 세그먼트는 단백질의 엑토도메인, 세포질, 또는 투과막과 같은 구조 및/또는 기능성 대역, 상이한 단백질과의 결합 또는 기타 생화학적 상호작용을 매개하는 부위와 같은 활성부위, 항체 결합 및/또는 체액성 또는 세포성 매개된 면역응답을 자극하는 부위등과 같은 에피노프 부위등에 상응할 수 있다. 이와 관련해서 유용한 게놈 세그먼트는 약 50, 75, 100, 200-500 및 500-1,500개 또는 그 이상의 뉴클레오타이드에 달하는 에피토프 부위와 같은, 단백질의 작은 기능적 대역을 코딩하는 15 내지 35개의 뉴클레오타이드들이다.
소정의 돌연변이를 감염성 PIV내로 도입할 수 있음으로 해서 PIV 병원성 및 면역원성 메카니즘의 조작을 비롯한 많은 응용이 가능하다. 예컨대, N, P, M, F, HN 및 L단백질 및 C, D 및 V ORF 산물을 비롯한 PIV 단백질의 기능은 단백질 발현의 정도를 제거 또는 감소시키거나 돌연변이 단백질을 생산하는 돌연변이를 도입함으로써 조작할 수 있다. 이러한 한가지 예시적인 변형에서, F단백질의 절단 부위에서의 서열을 변경시키고 조직배양시 성장에 미치는 이 변경의 효과 및 결과적인 PIV의 감염 및 병원성을 동물실험을 통해 일상적으로 측정할 수 있다.
예컨대 프로모터, 인터제닉 대역, 및 전사 시그날과 같은 여러가지 게놈 RNA의 구조적 특성 역시 본 발명의 방법과 조성물을 이용하여 쉽게 조작할 수 있다. 트랜스-작용성 단백질과 시스-작용성 RNA 서열의 효과를 예컨대 PIV 미니게놈을 함께 이용하는 분석에 있어서 완전한 안티게놈 cDNA를 이용하여 쉽게 측정할 수 있는데 (Dimock 외, J. Virol. 67:2772-8 (1993), 본 발명에 참조됨), 이것의 구제-의존 상태는 복제-독립적인 감염성 바이러스에서 복구되기에는 지나치게 억제적일 수 있는 돌연변이주들을 특징화하는데 유용하다.
본 발명은 또한 예컨대 감염성 야생형 PIV의 게놈 또는 안티게놈 내로, 서스펙트 돌연변이를 개별적으로 그리고 여러가지로 조합하여 도입함으로써 침묵 우발적인 돌연변이와 표현형 변화를 일으키는 돌연변이를 쉽게 구별하는 도구 및 방법을 제공한다 (즉, 선택된 숙주에서의 복제, 온도 감응성 등과 같은 한가지 이상의 표현형 특성에 있어서). 이 방법에 의해 약독화, 온도 감응성, 감기-적응, 작은 플라크 크기, 숙주 범위 한정 등과 같은 소망되는 백신 표현형에 기여하는 돌연변이를 동정할 수 있다. 이어서 이들 방법에 의해 동정된 돌연변이를 여러가지 조합으로 도입하여 백신 바이러스를 소망되는 적절한 약독화 수준이 되도록 변형시킨다. 또한, 본 발명은 여러가지 바이러스 균주로부터의 돌연변이를 단일 백신 균주내로 조합시킬 수 있는 가능성을 제시한다.
상기한 바와 같이, 재조합적으로 변경된 PIV 클론에 도입된 돌연변이들은 선택된 단백질의 발현 및/또는 기능을 변경시키고, 목적하는 표현형 변화를 일으키거나, 또는 기타 다양한 목적에 따른 이들의 능력에 기초하여 선택될 수 있다. 소망되는 표현형 변화에는 예컨대 배양시 바이러스 성장 변화, 온도 감응성, 플라크 크기, 약독화, 및 면역원성의 변화 등이 포함된다. 예컨대, 게놈 또는 안티게놈을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 약독화, 온도 감응성, 감기-적응, 작은 플라크 크기, 숙주 범위 한정, 유전자 발현 변경, 또는 면역원성 에피토프의 변화 등을 특정하는 뉴클레오타이드 삽입, 재배열, 결실 또는 치환에 의해 변형시킬 수 있다.
본 발명의 한가지 측면에서, 생물학적으로 유도된 돌연변이, 약독화된 PIV는 완전한 길이의 PIV 클론으로 개별적으로 또는 조합적으로 동정 및 도입하여, 도입 된 돌연변이를 함유하는 구제된 재조합 바이러스의 표현형을 측정한다. 예시적인 구체예에서, ts, ca 또는 att 표현형을 갖는 PIV 돌연변이에 의해 나타나는 변화와 같이, 야생형 PIV에 대해 생물학적으로 유도된 돌연변이 바이러스에 의해 나타나는 아미노산 변화를 재조합 PIV 클론에 도입한다. 생물학적으로 유도된 돌연변이 PIV로부터의 이러한 변화는 HPIV3 돌연변이주 JS cp45로부터 채택된 변이에 의해 특정되는 약독화 표현형과 같이, 결과적인 클론에 소망되는 특성을 특정해준다. 이러한 변화는 상응하는 야생형 또는 생물학적으로 유도된 돌연변이 서열에 비해 2개 또는 3개의 뉴클레오타이드를 변화시켜 재조합 바이러스내로 도입하는 것이 바람직하며, 이로 인해 유전학적인 귀선변이 (reversion)에 대해 돌연변이를 안정화시키는 효과가 있다.
본 발명은 또한 감염성 클론의 게놈 또는 안티게놈 내로 도입된 복수개의 표현형-특정 변이를 선택된 조합으로서 갖는 재조합 PIV를 제공한다. 이 프로세스는, 표현형 평가와 함께, 약독화, 온도 감응성, 감기-적응성, 작은 플라크 크기, 숙주범위 한정등과 같은 소망되는 특성을 갖는 돌연변이 재조합 PIV를 제공한다. 따라서, 본문에 JS cp45와 같이 생물학적으로 유도된 PIV 변이주로부터 채택된 ts, ca 또는 att 변이와 같은 약독화 돌연변이가 하나 이상, 바람직하게는 2개 이상 인코포레이션된 PIV 클론이 개시된다. 이러한 맥락에서 재조합 PIV 중에 생물학적으로 유도된 변이를 채택하기 위한 표적 유전자는 뉴클레오캡시드 단백질 N, 인단백질 P, 대형 폴리머라제 서브유닛 L, 매트릭스 단백질 M, 헤마글루티닌-뉴라미니데이즈 단백질 HN, 융합 단백질 F 및 C, D 및 V ORF 산물을 포함한다. 또한 PIV 게놈의 3' 리더 또는 트레일러 대역의 서열, N 유전자 개시 시그날과 같은 유전자 개시 및 유전자 종결 서열과 같은 시스-작용 요소 중의 서열등, 외래 서열도 표적화된다. 재조합 PIV에 인코포레이션된 예시적인 돌연변이에는 예컨대 Tyr942, Leu992, 및/또는 Thr1558와 같이 폴리머라제 L 유전자에서 아미노산 변화(들)을 특정하는 하나 이상의 뉴클레오타이드 치환이 포함된다. 예컨대, Tyr942가 His에 의해, Leu992가 Phe에 의해, 및/또는 Thr1558이 Ile에 의해 치환된 PIV 재조합체가 개시된다. 이러한 돌연변이는 후술되는 실시예에서 설명된 r942, r992, r1558, r942/992, r992/1558, r942/1558, 또는 r942/992/1558을 비롯한 다양한 PIV 재조합체에서 성공적으로 인코포레이션된 바 있다. 생물학적으로 유도된 PIV 돌연변이주로부터 채택된 다른 예시적인 돌연변이들에는 JS cp45의 Val96 또는 Ser389 잔기에 대응하는 위치에서의 특정 돌연변이를 비롯하여 N 단백질에서 하나 이상의 돌연변이가 포함된다. 보다 구체적으로 이러한 돌연변이들은 Val96에서 Ala 또는 Ser389에서 Ala로서 표시된다. 후술하는 실시예에서는 JS cp45의 Ile96에 대응하는 위치에서의 돌연변이, 바람직하게는 Til96에서 Thr로의 치환으로 표시되는 돌연변이와 같이, C 단백질에서의 아미노산 치환을 코딩하는 재조합 PIV가 개시된다. 생물학적으로 유도된 PIV 돌연변이로부터 채택된 또 다른 예시적인 돌연변이에는 JS cp45의 Ile420 또는 Ala450 잔기, 바람직하게는 Ile420에서 Val 또는 Ala450 에서 Thr의 산치환에 대응하는 위치에서 JS cp45로부터 채택된 돌연변이를 비롯하여, F 단백질에서의 한가지 이상의 돌연변이가 포함된다. 본 발명의 기타 PIV 재조합체는 이하에서 JS cp45의 Val384 잔기에 해당하는 위치에서의 돌연변이, 바람직하게는 Val384에서 Ala로의 치환으로 표시되는 돌연변이가 적용된 재조합 PIV에 의해 예시되는 바와 같이 HN 단백질에서의 한가지 이상의 아미노산 치환을 포함한다. 본 발명의 이러한 측면의 또 다른 구체예에는 외래 서열, 예컨대, 재조합 PIV 게놈 또는 안티게놈의 3' 리더 서열에서 한가지 이상의 돌연변이가 인코포레이션된 재조합 PIV가 포함된다. 이러한 돌연변이의 예로는 JS cp45의 뉴클레오타이드 23, 24, 및/또는 28에 해당하는 하나 이상의 위치에서 일어나는 3' 리더에서의 돌연변이가 포함된다. 예컨대 뉴클레오타이드 23에서 T가 C로 변경되는 것, 뉴클레오타이드 24에서 C가 T로 변경되는 것, 또는 뉴클레오타이드 28에서 G가 T로 변경되는 것이 이에 해당한다. JS cp45의 뉴클레오타이드 62에 해당하는 위치에서 N 유전자 개시 서열 중 돌연변이에 의해, (바람직하게는 A로부터 T로 변화되는 것) 예시되는 바와 같이, N 유전자 개시 서열 중의 한가지 이상의 돌연변이가 부가적인 외래 돌연변이의 한 예이다. 생물학적으로 유도된 돌연변이 PIV로부터 채택된 상기 예시적인 돌연변이를 평가하여 하기 실시예의 재조합 PIV내로 조합시키면 rcp45, rcp45 3'NCMFHN, rcp45 3'NL, rcp45 c'N, 및 rcp45 F와 같은 신규한, 약독화 후보 백신 균주가 개별적으로 및/또는 조합적으로 제조된다. 본 발명의 다른 PIV 재조합체는 하나 이상의 이러한 예시적인 재조합체에 존재하는 돌연변이 뿐만 아니라 본 발명의 내용에 따라 재조합 PIV에서 동정 및 채택된 돌연변이 PIV 균주로부터 생물학적으로 유도된 다른 돌연변이주에서 동정된 돌연변이의 완전한 요소도 복수개 인코포레이션하게 될 것이다.
본 발명에 따른 방법에서 동정된 돌연변이들은 "메뉴"로 컴파일되어 선택된 약독화도, 면역원성 및 안정성을 갖는 백신 바이러스를 보정할 수 있도록 여러가지 조합으로 도입된다. 바람직한 구체예에서, 본 발명은 생물학적으로 유도된 PIV로부터 채택된 한가지 이상의 돌연변이, 예컨대 ts, ca 또는 att 돌연변이들에 더해, 같거나 다른 유전자와 관련된 부가적인 유형의 돌연변이들를 함께 제공한다. 이러한 맥락에서 돌연변이의 표적 유전자 역시 뉴클레오캡시드 단백질 N, 인단백질 P, 대형 폴리머라제 서브유닛 L, 매트릭스 단백질 M, 헤마글루티닌-뉴라미니데이즈 단백질 HN, 융합 단백질 F 및 C, D 및 V ORF 산물도 포함한다. 한가지 측면에서, 적어도 하나의 약독화 변이가 PIV 폴리머라제 유전자 L에서 발생하고 생물학적으로 유도된 돌연변이 PIV 균주, 예컨대 JS cp45로부터 채택된 ts 또는 att 표현형을 특정하는 뉴클레오타이드 치환과 관련된 재조합 PIV가 제공된다. 본 발명에서 개시된 HPIV3 재조합체의 예로는 r942, r992, r1558, r942/992, r992/1558, r942/1558, r942/992/1558 재조합체를 들 수 있다. 이들 예시적인 PIV 클론들은 하나 이상의 뉴클레오타이드 치환을 인코포레이션하여 예컨대 Tyr942, Leu992, 및/또는 Thr1558과 같은 폴리머라제 유전자에서 아미노산 변경을 일으킨다. 예컨대, Tyr942가 His에 의해, Leu992가 Phe에 의해/또는 Thr1558이 Ile에 의해 치환된 PIV 재조합체가 개시된다. 바람직하게는, 2개 또는 3개의 돌연변이를 표현형 리버젼(reversion)에 대해 증가된 안정성을 부여하는 약독화 변이를 특정하는 코돈에 인코포레이션시키는 것이 좋다.
부가적인 측면에서, 단독 또는 생물학적으로 유도된 돌연변이주 PIV로부터 채택된 한가지 이상의 약독화 변이와 함께 감염성 재조합 PIV 내로의 인코포레이션을 위해 재조합 PIV 게놈 또는 안티게놈 내에 다양한 기타 유전적 변경을 일으킬 수 있다. 이종성 유전자 (상이한 PIV 균주 또는 예컨대 RSV 또는 홍역 바이러스와 같은 기타 바이러스와 같은 비-PIV 소스)를 전체 또는 부분적으로 삽입 또는 치환시킬 수 있으며, 유전자 순서를 변경시키거나, 유전자 중복을 제거, PIV 게놈 프로모터를 그의 안티게놈 카운터파트로 치환시키고, 심지어 비-필수적인 유전자 전체를 삭제한다. 한가지 측면에서 선택된 PIV 유전자, 예컨대, C, D, 또는 V ORF를 기능적으로 삭제하여 예컨대 생체외에서의 성장이 향상되고 및/또는 생체내에서 약독화된 새로운 표현형질 특성을 갖는 재조합 PIV를 생산할 수 있다. 본 발명의 감염성 PIV 클론은 또한 그의 면역원성을 증강시켜 자연감염에 의해 제공되는 보호도보다 더 큰 보호도를 유도하고, 또는 바람직하지 못한 면역병원성 반응과 관련된 에피토프를 제거하도록 엔지니어링할 수 있다. 본 발명에 의해 생산되는 백신의 증강된 면역원성은 PIV를 제어하는데 있어서 가장 큰 장애물 중의 하나, 즉, 자연적인 감염에 의해 유도된 면역성의 불완전한 특성을 해소하고자 하는 것이다. 이러한 관점에서, 부가적인 유전자(들) 또는 유전자 세그먼트(들)을 공통적인 또는 독립적인 전사 시그날 세트의 통제 하에 위치시킬 수 있는 PIV 게놈 또는 안티게놈내로 삽입하거나 근사화시킬 수 있다. 표적 유전자들은 T 헬퍼 세포 에피토프에 풍부한 단백질 및 시토카인 (예컨대 IL2 내지 IL-15, 특히 IL2, IL6 및 IL12, 등)을 코딩하는 것들을 포함한다. 부가적인 단백질은 별도의 단백질로서 또는 HN과 같은 어느 하나의 PIV 단백질의 제 2 복제물로부터 엔지니어링된 키메라로서 발현될 수 있다. 이것은 PIV에 대한 면역응답을 정량적으로 그리고 정성적으로 변형 및 향상시키는 능력을 제공한다.
본 발명에서 유용한 다른 돌연변이는 게놈의 3'말단을 안티게놈으로부터의 그의 카운터파트로 치환하는 것을 포함하며 이는 RNA 복제 및 전사 변화와 연관이 있다. 또한, 인터제닉 대역의 서열 내용물을 단축 또는 연장 또는 변경시킬 수 있다. 또 다른 측면에서, 백신 형성에 유용한 PIV를 간편하게 변형시켜 순환 바이러스의 항원성 드리프트를 적응시킬 수 잇다. 일반적으로 변형은 HN 및/또는 F 단백질에서 일어날 것이다. 예컨대, 완전한 HN 또는 F 유전자의 선택된 항원 형태 또는 그의 특정 면역원성 대역을 코딩하는 세그먼트를, 감염성 클론 중에서 대응 대역으로 치환하거나, 또는 몇가지 항원 형태가 결과적인 클론에서 나타날 수 있도록 유전자의 복제물을 하나 이상 첨가함으로써 인코포레이션시킨다. 변형된 PIV cDNA로부터 생산된 자손 바이러스들을 출현 균주들에 대한 백신화 프로토콜에 이용한다.
본 발명의 감염성 PIV에 사용되는 기타 돌연변이에는 PIV 미니게놈의 돌연변이 분석시 동정되는 시스-작용 시그날의 돌연변이가 포함된다. 예컨대, 리더 및 트레일러 및 플랭킹 서열의 삽입 및 결실 분석으로 바이러스 프로모터와 전사 시그날이 동정되며 RNA 복제 또는 전사의 환원도를 달리하는 일련의 돌연변이가 제공된다. 이러한 시스-작용 시그날의 포화 돌연변이 (이로 인해 각각의 위치가 각각 뉴 클레오타이드 대체몰로 변경됨)는 또한 RNA 복제 또는 전사를 감소 또는 증가시키는 변이를 동정한다. 상기한 바와 같이 이들 돌연변이는 모두 완전한 안티게놈 또는 게놈에 삽입될 수 있다.
다양한 인터제닉 대역 또는 그 밖의 위치에서 독특한 제한효소 부위를 삽입하는 등, PIV 클론에 대해 부가적인 변형을 가하여 조작을 용이하게 할 수 있다. 미번역 유전자 서열을 제거하여 외래 서열 삽입 용량을 증가시킬 수 있다.
본 발명의 재조합 PIV 내에서의 유전자 또는 유전자 세그먼트의 특정 치환, 삽입, 결실 또는 재배열 (예컨대 세포질 테일, 투과막 대역 또는 엑토도메인, 에피노프 부위 또는 대역, 결합부위 또는 대역, 활성 부위 또는 활성부위를 포함하는 대역 등과 같이 선택된 단백질 또는 단백질 대역을 코딩하는 유전자 세그먼트의 치환)은 같거나 다른 PIV 또는 다른 소스로부터의 기존의 "카운터파트(counterpart)" 유전자 또는 유전자 세그먼트에 대해 구조적 또는 기능적인 관계에서 행해진다. 이러한 변형으로 인해 야생형 또는 모친 PIV 또는 기타 바이러스 균주에 비해 소망되는 표현형 변화를 갖는 신규한 재조합체가 생산된다. 예컨대, 이러한 유형의 재조합체는 한가지 PIV의 엑토도메인과 다른 PIV의 세포질 테일 및/또는 막투과 대역이 융합된 키메라 단백질을 발현할 수 있다. 이러한 유형의 또 다른 예시적인 재조합체는 이중 면역원성 대역과 같이 중복적인 단백질 대역을 발현한다.
본문에서 "카운터파트(counterpart)" 유전자, 유전자 세그먼트, 단백질 또는 단백질 대역은 일반적으로 이종 소스로부터 유래하는 것이다 (예컨대 상이한 PIV 유전자로부터, 또는 상이한 PIV 유형 또는 균주 중 동일한 (즉 동종적 또는 대립적) 유전자 또는 유전자 세그먼트를 나타냄). 이러한 관점에서 전형적인 카운터파트는 예컨대, 세포질 대역, 투과막 대역, 엑토도메인, 결합 부위 또는 대역, 에피토프 부위 또는 대역 등과 같이 전체적인 구조적 특성은 공유한다. 카운터파트 대역 또는 그들의 코딩 유전자 세그먼트는 대역 또는 유전자 세그먼트 변종 중 공통적인 생물학적 활성에 의해 정의되는 크기 및 서열 다양성 범위를 갖는 종들의 집합을 포함한다. 예컨대, 본 발명에서 카운터파트 유전자 세그먼트에 의해 코딩된 2개의 선택된 단백질 대역은 실제로 질적으로 동일한 활성, 예컨대, 동일한 막 확장(스패닝) 기능, 특이적인 결합활성, 면역학적 인식 부위 등의 활성을 공유한다. 더욱 일반적으로, 카운터파트들, 예컨대 선택된 단백질 세그먼트 또는 단백질 간에 공유되는 특정 생물학적 활성은 정량적으로도 실제로 유사할 것이다. 즉, 이들은 각각의 정량적인 활성수준에 있어서의 차이는 30% 미만, 바람직하게는 20% 미만, 더욱 바람직하게는 5-10 정도에 지나지 않을 것이다.
본 발명에서 재조합 PIV를 생산하기 위한 카운터파트 유전자 및 유전자 세그먼트, 그리고 본 발명에서 설명된 기타 폴리뉴클레오타이드들은 선택된 폴리뉴클레오타이드 "레퍼런스 서열", 예컨대 또 다른 선택된 카운터파트 서열과 실제로 서열 성동성을 갖는 것이 바람직하다. 본문에서 "레퍼런스 서열"이란 예컨대 완전한 길이의 cDNA 또는 유전자, 또는 완전한 cDNA 또는 유전자 서열 세그먼트와 같으 서열 비교의 기초로서 사용된다. 일반적으로, 레퍼런스 서열은 길이가 20 뉴클레오타이드, 종종 적으로 25개 이상의 뉴클레오타이드, 더욱 흔하게는 50개 이상의 뉴클레오타이드의 길이를 갖는다. 2개의 폴리뉴클레오타이드는 각각 (1) 2개의 폴리노클레오타이드간에 유사한 서열 (즉, 완전한 폴리뉴클레오타이드 서열의 일부)를 함유하고, (2) 2개의 폴리뉴클레오타이드 간에 서로 다른 서열을 부가적으로 함유할 수 있을 것이므로, 2개 (또는 그 이상)의 폴리뉴클레오타이드의 서열 비교는 일반적으로 2개의 폴리뉴클레오타이드의 서열을 "비교창"을 통해 비교함으로써 서열 유사성의 위치 대역을 동정 및 비교하게된다. 본문에서 "비교창(comparison window)"라 함은 적어도 20개의 연속적인 뉴클레오타이드 위치로 된 개념적인 세그먼트로서, 여기서 폴리뉴클레오타이드 서열은 적어도 20개의 연속적인 뉴클레오타이드로 된 레퍼런스 서열과 비교되고, 비교창내의 폴리뉴클레오타이드 서열 부분이 레퍼런스 서열 이 두 서열이 최적상태로 정렬되도록 레퍼런스 서열(부가 또는 결실을 포함하지 않음)에 비해 20퍼센트 미만의 부가 또는 결실 (즉 갭)을 포함할 수 있다. 비교창을 정렬하기 위한 서열의 최적 정렬은 Smith & Waterman, Adv. Appl. math. 2:482 (1981)의 국소 상동성 알고리듬, Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970)의 상동성 정렬 알고리듬, Pearson & Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988)의 유사방법 (이들은 본 발명에 참조됨), 이들 알고리듬의 컴퓨터화 설정 (Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0의 GAP, GETFIT, FASTA, 및 TFASTA, Genetics Computer Groups, 575 Science Dr, madison, WI 본 발명에 참조)에 의해 수행될 수 있으며 또는 검사, 및 여러가지 방법에 의해 발생된 최상의 정렬 (즉, 비교창을 통해 최고의 서열 유사 백분율을 초래하는 정렬)이 선택된다. "서열 동일성 (sequence identity)"란 2개의 폴리뉴클레오타이드 서열이 비교창을 통해 동일하다는 의미이다 (즉, 뉴클레오타이드-뉴클레오타이드 기준으로). "서열 동일성의 백분율"은 최적 정렬된 2개의 서열을 비교창과 비교하여, 2가지 모두의 서열에서 동일한 핵산 염기 (예컨대, A, T, C, G, U 또는 I)가 발생하는 위치의 수를 측정하여 매치된 위치의 수를 구하고, 상기 매치된 위치의 수를 비교창의 총 위치수 (즉, 윈도우 크기)로 나눈 다음, 그 결과에 100을 곱함으로써 서열 동일성의 백분율을 구한다. 본문에서 "서열 동일성"이란 폴리뉴클레오타이드 서열의 특성을 가리키며 적어도 20개의 뉴클레오타이드 위치, 종종 적어도 25-50개 뉴클레오타이드 위치의 비교창을 통해 레퍼런스 서열과 비교할 때 그 폴리뉴클레오타이드가 적어도 85 퍼센트 서열 동일성, 바람직하게는 적어도 90 내지 95 퍼센트 서열 동일성, 더욱 일반적으로는 적어도 99퍼센트 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오타이드 서열을 특성을 칭하는 것으로서, 여기서 서열 동일성의 백분율은 비교창에 대해 레퍼런스 서열의 총 20퍼센트 미만을 차지하는 결실 또는 삽입을 포함할 수 있는 폴리뉴클레오타이드 서열과 레퍼런스 서열을 비교함으로써 구한다.
이러한 폴리뉴클레오타이드 서열 관계에 부가하여, 본 발명의 재조합 PIV에 의해 코딩된 단백질 대역 역시 보존적 관계를 갖도록, 즉 선택된 레퍼런스 폴리펩타이드와 실질적인 서열 동일성 또는 서열 유사성을 갖도록 선택된다. 폴리펩타이드에 적용되는 바와 같이, "서열 동일성"이란 펩타이드가 해당 위치에서 동일한 아미노산을 공유함을 의미한다. "서열 유사성"이란 펩타이드가 해당 위치에서 동일 또는 유사한 아미노산 (즉, 보존적 치환)을 가짐을 의미한다. "실질적인 서열 동일성"이란 2개의 펩티드 서열이 최적상태로 정렬될 경우, 예컨대 디폴트 갭 중량을 이용한 프로그램 GAP 또는 BESTFIT에 의해 정렬될 경우, 적어도 80% 서열 동일성, 바람직하게는 적어도 90% 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 적어도 95% 이상의 서열 동일성 (예컨대 99% 서열 동일성)을 공유함을 의미한다. "실절적인 유사성"이란 2개의 펩티드 서열들이 서열 유사성의 해당 백분율을 공유함을 의미한다. 바람직하게는, 동일하지 않은 잔기 위치들은 보존적인 아미노산 치환에 의해 구별된다. 보존적 아미노산 치환은 유사한 측쇄를 갖는 잔기의 상호교환성을 가리킨다. 예컨대, 지방족 측쇄를 갖는 아미노산 그룹은 글라이신, 알라닌, 발린, 류신 및 이소류신이고; 지방족-히드록실 측쇄를 갖는 아미노산 그룹은 세린 및 쓰레오닌이며; 아미드-함유 측쇄를 갖는 아미노산 그룹은 아스파라긴과 글루타민; 방향족 측쇄를 갖는 아미노산 그룹은 페닐알라닌, 티로신 및 트립토판; 염기성 측쇄를 갖는 아미노산 그룹은 라이신, 아르기닌, 및 히드티딘이고; 황-함유 측쇄를 갖는 아ㅣ노산기는 시스테인과 메티오닌이다. 바람직한 보존적 아미노산 치환 그룹은 발린-류신-이소류신, 페닐알라닌-티로신, 라이신-아르기닌, 알라닌-발린, 및 아스파라긴-글루타민이다. 본 발명에서 사용되는 20가지 자연발생적인 아미노산의 약칭은 통칭에 따랐다 (Immunology - A Synthesis (2판, E.S. Golub & D.R. Gren, 편, Sinauer Associates, Sunderland, MA, 1991), 본 발명에 참조됨). 20가지 통상적인 아미노산의 입체이성체 (예컨대 D-아미노산), 비자연적인 아미노산, 예컨대 α,α-이치환 아미노산, N-알킬 아미노산, 락트산, 및 기타 통상적이지 않은 아미노산 역시 보노 발명의 폴리펩타이드의 적절한 성분이 될 수 있다. 비통상적인 아미노산의 예로는: 4-히드록시프롤린, γ-카르복시글루타메이트, ε-N,N,N-트리메틸라이신, ε-N-아세틸라이신, O-포스포세린, N-아세틸세린, N-포르밀메티오닌, 3-메틸히스티딘, 5-히 드록시라이신, ω-N-메틸아르기닌, 및 기타 유사한 아미노산과 이미노산 (예커ㅌ대 4-히드록시프롤린)을 들 수 있다. 또한, 아미노산은 글라이코실화, 포스포릴화 등에 의해 변형될 수 있다.
cDNA-발현된 게놈 또는 안티게놈으로부터 생산된 감염성 PIV는 PIV 또는 PIV-유사 균주, 예컨대 인간, 소, 쥐 등의 균주일 수 있다. 보호적인 면역 응답을 일으키기 위해, PIV 균주는 면역화될 대상에 내재적인 것일 수 있다. 예컨대 인간을 면역화시키기 위해 인간의 PIV를 이용할 수 있다. 그러나 게놈 또는 안티게놈은 이종성 PIV 유전자 또는 유전자 세그먼트, 또는 예컨대 RSV 또는 홍역바이러스와 같은 다른 이종성 소스로부터의 유전자 또는 유전자 세그먼트를 발현시키기 위해 변형될 수 있다. 따라서, 인간에게 투여되도록 의도된 감염성 PIV는 약독화 목적과 같이 소 또는 쥐의 PIV 유형으로부터의 유전자 또는 유전자 세그먼트를 함유하도록 변형된 인간의 PIV일 수 있다. BPIV3은 레수스 (rhesus) 원숭이와 인간에 있어서 그의 복제를 제한하는 숙주 범위 돌연변이를 지닌다 (Karron외, 상기문헌, 1995ㅁ; van Wike Coelingh외, 1988), 각기 본 발명에 참조됨). 예컨대 숙주 범위 한정과 같이 바람직한 표현형을 특정하는 BPIV3의 유전자(들), 돌연변이 및 시스-작용 조절 서열은 본 발명의 rPIV 중의 상응하는 서열에 대한 그들의 치환에 의해 동정될 것이며 한층 더 변형된 rPIV내로 인코포레이션되어 더욱 부가적으로 유용한 백신 제제를 개발하는데 이용될 수 있다. 마찬가지로, 레수스 원숭이에 대해 비-ts 숙주-범위 약독화를 부여하는 것으로 알려진 (Hall외, 상기문헌, (1992)) JS cp45의 변이도 동정되어 본 발명의 변형된 rPIV 백신 제제 내로 인코포레이션될 수 있 다. 다른 한편, 소의 PIV는 인간의 PIV 감염에 대한 보호성을 이끌어내는 단백질 또는 면역원성 에피토프를 코딩하는 유전자를 함유하도록 변형시킬 수 있다. 예컨대, 인간의 PIV 당단백질 유전자는 소의 PIV가 인간의 PIV 균주에 대해 인간에 있어서 보호적인 면역 응답을 이끌어내도록, 대응하는 소의 당단백질 유전자로 치환될 수 있다.
예시적인 구체예에서, 하나의 PIV의 개별적인 유전자, 유전자 세그먼트 또는 단일 또는 복수개의 뉴클레오타이드들을 이종성 PIV 또는 기타 소수로부터의 대응 서열(들)에 의해 치환시킨다. 예컨대, 하나의 PIV로부터의 선택된 단백질의 세포질 테일, 투과막 대역 또는 엑토도메인, 에피토프 부위 또는 대역, 결합 부위 또는 대역, 활성 부위 또는 활성 부위를 함유하는 대역 등을 코딩하는 것과 같은 이종성 유전자 세그먼트를 또 다른 PIV에서 대응하는 유전자 세그먼트로 치환시켜 예컨대 하나의 PIV의 세포질 테일 및/또는 투과막 대역과 다른 PIV의 엑토도메인이 융합된 키메라 단백질을 발현시키는 재조합체와 같은 신규한 재조합체를 제조할 수 있다. 이와 관련하여 바람직한 게놈 세그먼트는 예컨대 에피토프 부위와 같이 단백질의 작은 기능성 대역을 코딩하는 유전자 세그먼트의 경우 약 15 내지 35개 뉴클레오타이드부터, 커다란 대역 또는 단백질 영역을 코딩하는 유전자 세그먼트의 경우 약 50, 75, 100, 200-500, 또는 500-1,500개 이상의 뉴클레오타이드 크기에 달한다.
본 발명의 한가지 측면에서, 한가지 PIV 균주의 HN 및/또는 F 단백질의 선택된 대역을 이종성 PIV 클론으로 치환시켜 면역화된 숙주에서 2가지 모두의 PIV 균주에 대한 교차-보호적인 면역 응답을 자극할 수 있는 재조합 바이러스를 제조한다. 또 다른 측면에서, 예컨대 인간과 소의 PIV 두가지 모두로부터의 서열을 함유하는 폴리뉴클레오타이드와 같이, 적어도 하나의 비-인간 PIV 서열과 인간의 게놈 또는 안티게놈 서열의 키메라를 포함하는 변형된 PIV 클론이 제공된다. 인간의 PIV 코딩 서열 또는 비-코딩 서열 (예컨대, 프로모터, 유전자-말단, 유전자-개시부, 인터제닉 또는 다른 시스-작용성 요소)을 대응하는 소 또는 쥐의 PIV 서열로 치환함으로써 여러가지 가능한 약독화 효과를 갖는 재조합체가 생산된다. 예컨대, 인간 세포에서는 효과적으로 기능하지 않는 이종성 PIV 유전자로부터, 생물학적으로 상호작용성인 인간의 PIV 서열 또는 단백질과 이종성 서열 단백질의 부적합성 (예컨대 바이러스 전사, 번역, 조립 등 치환된 서열 또는 단백질과 보통 협력하는 서열 또는 단백질) 이종성 서열 또는 단백질로부터, 다른 유용한 약독화 효과 중에서도 숙주범위 효과가 종종 발생할 것이다. 본 발명의 또 다른 측면에서, 외래 유전자 또는 유전자 세그먼트의 삽입, 및 몇몇 경우 비코딩 뉴클레오타이드 서열을 PIV 게놈 내로 삽입하면 도 다른 소망되는 표현형 효과를 일으키는 게놈 길이의 소망스런 증가가 초래된다. 게놈 길이가 증가하면, 부분적으로는 삽입 길이에 의존적으로, 결과적인 PIV 클론의 약독화가 초래될 것으로 기대된다. 또한, 재조합체 PIV내로 삽입된 유전자로부터 특정 단백질의 발현에 의해 단백질 작용에 기인한 바이러스의 약독화가 초래될 것이다. 이것은 백시니아 바이러스에서 발현된 IL-2에 대해 이미 설명된 바 있으며 (예컨대 Flexner외, Nature 33:-259-62 (1987)), 감마 인터페론의 경우에도 예상될 수 있다.
본 발명의 재조합 PIV 중 전체적인 바이러스 유전자 또는 유전자 세그먼트의 변화와 관련된 결실, 삽입, 치환 및 기타 변이는 고도로 안정한 백신 후보를 생산하며, 이들은 특히 면역억압된 환자에게 있어서 중요하다. 이들 많은 돌연변이들은 결과된 백신 균주의 약독화를 초래하는 반면, 다른 것들은 소망되는 표현형 변화의 상이한 유형을 특정할 것이다. 예컨대, 인간의 면역성을 특이적으로 간섭하는 단백질을 코딩하는 어떤 바이러스 유전자가 알려진 바 있다 (예컨대 Kato외, EMBO. J. 16:578-87 (1997) 참조). 백신 바이러스에서의 이러한 유전자의 제거는 독성 (virulence) 및 병원성을 감소시키고/또는 면역원성을 개선시킬 것으로 기대된다.
본 발명의 바람직한 측면에서, 변형된 PIV 클론은 예컨대 HPIV1 및 HPIV2와 같이 한가지 이상의 이종성 인간 PIV의 서열에 연결된 HPIV3으로부터의 폴리뉴클레오타이드 서열을 함유하는 클론과 같이, 2가지 이상의 인간의 PIV 게놈의 키메라를 나타낸다. 따라서, 인간의 PIV3의 개별적인 유전자 또는 유전자 세그먼트는 HPIV1 또는 도 2로부터의 카운터파트 유전자 또는 유전자 서열에 의해 치환 또는 보충될 수 있고 그 역도 마찬가지이다. 후술하는 한가지 실시예에서, 본 발명은 HPIV1의 HN 및 F 당단백질 유전자의 2가지 모두가 HPIV3 백그라운드에서 그들의 카운터파트 유전자에 의해 치환됨으로 해서, 두가지 모균주 모두에 대표적인 면역학적 특성을 갖는 키메라 바이러스를 생산하는, PIV 클론, rPIV3-1을 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면에서, 상술한 바와 같이 유전자 또는 유전자 세그먼트의 기탈 변형을 갖는 키메라 PIV 또는 PIV 클론에 예컨대 HPIV3 JS cp45와 같은 생물학적으로 유도된 변이주 PIV로부터 채택된 한가지 이상의 약독화 변이를 도입시킴으로써, 약독화를 달성함으로써 추가로 변형시키거나, 또는 추가로 약독화시켜, 키메라 돌연변이 유도체를 만들 수 있다. 예컨대, 폴리뉴클레오타이드를 코딩하거나 코딩하지 않는 한가지 이상의 인간의 PIV를 이종성 인간 PIV, 소의 PIV 또는 쥐의 PIV로부터 상기한 바와 가티 카운터파트 서열로 치환할 수 있고, 이러한 치환은 예컨대 생물학적으로 유도된 약독화 PIV 변이주로부터 채택된 ts, ca 또는 att 표현형을 특정하는 한가지 이상의 돌연변이와 조합되어 약독화 또는 추가로 약독화된 (즉 키메라 클론이나 생물학적으로 유도된 모 바이러스에 비해서) 백신 바이러스를 생산할 수 있다. 다른 한편, C, D 또는 V ORF와 같은 비필수적인 유전자 또는 유전자 세그먼트의 기능적인 결실을 생물학적으로 유도된 PIV돌연변이주로부터 ts, ca 또는 att 표현형을 특정하는 한가지 이상의 돌연변이와 재조합 PIV에서 조합시켜 약독화된 백신 균주를 만들 수 있다. 선택된 여러가지 돌연변이의 조합 효과에 의해, 이러한 조합적인 변형에 의해 소망되는 표현형 특성, 예컨대 증가된 바이러스 수율, 개선된 약독화, 및/또는 약독화 표현형으로부터의 리버젼에 대한 유전적 내성을 갖는 재조합 PIV를 만들 수 있다.
한가지 조합적인 돌연변이 디자인에 있어서, 인간의 PIV 게놈 또는 안티게놈 서열과 적어도 한가지의 비-인간 PIV 서열, 예컨대, 인간과 소의 PIV 두가지 모두로부터의 서열을 함유하는 폴리뉴클레오타이드와의 인간의 PIV 게놈의 키메라를 포함하는 변형된 PIV가 제공된다. 이것은 또한 예컨대 하나 이상의 자연발생적인 ts, ca 또는 att 변이와 같이 생물학적으로 유도된 PIV로부터 채택된 한가지 이상의 변이를 인코포레이션한다. 다른 한편, 변형된 PIV는 예컨대 HPIV1 및 HPIV2와 같은 한가지 이상의 이종성 인간의 PIV로부터의 서열에 연결된 HPIV3으로부터의 서열을 함유하는 폴리뉴클레오타이드와 같이 2가지 이상의 인간의 PIV 게놈의 키메라일 수 있으며, 이것은 하나 이상의 ts, ca, att 또는 생물학적으로 유도된 PIV로부터 선택된 기타 돌연변이를 부가적으로 인코포레이션한다 (예컨대 JS cp45와 같이 생물학적으로 유도된 변이주 PIV로부터 채택된 ts, ca 또는 att 표현형을 특정하는 뉴클레오타이드 치환). 보다 구체적인 측면에서, 약독화된 클론, 또는 예컨대 대형 폴리머라제 L 유전자에서 ts 돌연변이를 일으키는 아미노산 치환을 코딩하는 뉴클레오타이드 변경에 의해 추가로 약독화된 클론에서 인간의 PIV3의 개별적인 유전자 또는 유전자 세그먼트들을 HPIV1 또는 HPIV2로부터의 카운터파트 유전자 또는 유전자 세그먼트로 치환 또는 보충하거나 또는 그 역으로 수행할 수 있다. 예컨대, 본 발명은 HPIV3 백그라운드에서 그들의 카운터파트 유전자가 치환된 HPIV1의 HN 및/또는 F 당단백질을 갖는 PIV 클론을 제공한다. 여기서 결과적인 키메라 클론의 표현형은 하나 이상의 N, P, L, M, HN, F, C, D 및 V 유전자에서 코딩된 ts, ca 또는 att 돌연변이(들)에 의해 부가적으로 변형된다. 본 발명에 개시된 가능한 돌연변이 메뉴로부터 여러가지 조합을 만들어서, 예컨대 복수의 PIV 균주의 대표적인 면역학적 특성을 갖는 만족스러울 정도로 약독화된 면역원성, 키메라 바이러스를 만들 수 있도록, 백신 바이러스를 선택된 수준의 약독화, 면역원성 및 안정성을 갖도록 보정할 수 있다. 한가지 측면에서, 키메라 PIV 백그라운드에 인코포레이션된 PIV 폴리머라제 유전자 L에서 적어도 하나 이상의 약독화 돌연변이가 발생된 재조합 PIV가 제공된다 (후술되는 실시예에서 설명되는 바와 같이 재조합체 r942, r992, r1558, r942/992, r942/1558, r992/1558, 또는 r942/992/1558). 예컨대, 본 발명의 이러한 측면의 유용한 키메라 PIV 재조합체는 이종성 백그라운드, 예컨대 HPIV3 클론에서 그의 카운터파트 유전자(들)로 치환된 예컨대 HPIV1로부터의 HN 및/또는 F 당단백질 유전자의 하나 이상의 유전자 또는 유전자 세그먼트를 갖고, 생물학적으로 유도된 PIV 돌연변이체로부터 폴리머라제 유전자의 아미노산 변경 (942 위치에서 예컨대 Tyr로부터 His로의 변경, 992 위치에서 Leu로부터 Phe로의 변경, 및/또는 1558위치에서 Thr로부터 Ile로의 변경등)을 일으키는 뉴클레오타이드 치환과 같이 하나 이상의 부가적인 약독화 변경이 인코포레이션될 수 있다. 다음에 예시되는 이러한 키메라, 약독화 재조합의 하나는 JS cp45로부터 상기 특정된 세가지 L 유전자 변이가 모두 인코포레이션된 rPIV3-1의 유도체인 rPIV3-1.cp45L이다.
백신 균주 개발을 위해 키메라 PIV 백그라운드에서 인코포레이션될 수 있는 또 다른 돌연변이는 다른 유전자에서 생물학적으로 유도된 돌연변이로부터 선택하거나, 또는 표준 위치 지향된 돌연변이 또는 기타 순수한 재조합 돌연변이법에 의해 재조합 게놈에서 de novo 합성하게 된다. 여기서 재조합 PIV 중 생물학적으로 유도된 돌연변를 채택하거나 신규한 돌연변이를 생성하기 위한 표적 유전자에는 뉴클레오타이드 단백질 N, 인단백질 P, 대형 폴리머라제 서브유닛 L, 매트릭스 단백질 M, 헤마글루티닌-뉴라미니데이즈 단백질 HN, 융합 단백질 F 및 C, D 및 V ORF 산물이 포함된다. 또한 PIV 게놈의 3' 리더 또는 트레일러 대역의 서열과 같은 엑스트라젠 서열도 표적화된다. 비-키메라, 재조합 PIV 중에 동정 및 인코포레이션된 상기 예시적인 돌연변이들을 예컨대 rPIV3-1과 같은 키메라 PIV 백그라운드에 쉽게 인코포레이션시킬 수 있다. 이러한 예시적인 돌연변이에는 JS cp45의 Val96 또는 Ser389 잔기에 해당하는 위치에서 특정 돌연변이를 비롯하여 N 단백질 중 하나 이상의 돌연변이가 포함된다. 보다 상세한 측면에서, 이들 돌연변이들은 Val96에서 Ala로 또는 Ser389에서 Ala로서 표시된다. 키메라 PIV 재조합체에 인코포레이션될 것이 소망되는 또 다른 돌연변이는 상술한 바와 같이 JS cp45의 Ile96에 해당하는 위치에서의 돌연변이, 바람직하게는 Ile96에서 Thr로의 치환으로 표시되는 돌연변이와 같이 C 단백질 중의 돌연변이이다. 키메라 PIV 백그라운드에서 인코포레이션되기 위한 또 다른 예시적인 돌연변이에는 F 단백질에서의 하나 이상의 돌연변이가 포함되며 예로서 Ile420에서 Val로, 또는 Ala450에서 Thr로의 치환과 같이 Ile420 또는 Ala450잔기에 해당하는 위치에서 JS cp45로부터 채택된 것을 들 수 있다. 본 발명의 또 다른 키메라 재조합체는 Val384에서 Ala로의 치환과 같이 JS cp45의 Val384 잔기에 해당하는 위치에서의 돌연변이처럼, HN 단백질 중의 한가지 이상의 아미노산 치환을 채택할 것이다. 또 다른 키메라 재조합체는 예컨대 재조합체 게놈 또는 안티게놈의 3' 리더 서열과 같은 엑스트라제닉 서열에서 하나 이상의 돌연변이를 인코포레이션하게 될 것이다. 이러한 돌연변이의 예로는 JS cp45의 뉴클레오타이드 23, 24, 28 및/또는 45에 해당하느 하나 이상의 위치에서 일어나는 3' 리더 돌연변이를 들 수 있고, 예컨대 뉴클레오타이드 23에서 T가 C로, 뉴클레오타이드 24에서 C가 T로, 뉴클레오타이드 28에서 G가 T로, 또는 뉴클레오타이드 45에서 T가 A로 변경되는 것을 들 수 있다. 키메라 PIV 백그라운드에서의 또 다른 엑스트라젠 돌연변이에는 N 유전자 개시 서열에서의 한가지 이상의 돌연변이를 들 수 있는데, 예컨대 JS cp45의 뉴클레오타이드 62에 해당하는 위치에서 N 유전자 개시 서열의 돌연변이가 그것으로서 예컨대 A가 T로 변경되는 것이다. 후술되는 실시예에서 재조합 PIV내로 평가 및 결합될 이러한 예시적인 돌연변이들은 본 발명에 설명된 방법 및 도구를 이용함으로써 키메라 PIV 재조합체 내로 쉽게 인코포레이션될 수 있으며 소망되는 표현형 변화를 개별적으로 및/또는 조합적으로 특정하여 본 발명 범위의 더욱 부가적으로 약독화된 키메라 백신 균주를 생산할 수 있게 한다.
부가적인 조합적 돌연변이 디자인에 있어서, 본 발명의 PIV 클론에서 생물학적으로 유도된 PIV 또는 재조합적으로 발생된 것으로부터 채택된 하나 이상의 외래 ts, ca 또는 att 돌연변이를, 별개의 상이한 다른 돌연변이 (예컨대 PIV N, P, L, M, HN, F, C, D 또는 V유전자 또는 유전자 세그먼트, 또는 RSV 또는 홍역 바이러스와 같은 다른 소스로부터의 유전자 또눈 유전자 세그먼트의 결실, 부가, 또는 재배열)와 조합적으로 인코포레이션하는 변형된 PIV가 제공된다. 이 경우, 본 발명에 설명된 돌연변이 메뉴로부터 다양한 조합을 만들어 백신 바이러스의 약독화, 면역원성 및 안정성을 선택된 수준으로 조정할 수 있다. 따라서, JS cp45에서 발견되는 PIV 폴리머라제 유전자 L에서의 돌연변이와 같이 생물학적으로 유도된 PIV 돌연변이체로부터의 또는 재조합적으로 발생된 돌연변이와 같은 적어도 하나의 약독화 돌연변이를 나타내고, 비-PIV 소스 (예컨대 면역원성 RSV 또는 홍역 유전자 또는 에피토프, 또는 시토카인 코딩 유전자)로부터의 이종성 유전자 또는 유전자 세그먼트의 치환 또는 도입, 발현 수준을 변경시키기 위한 바이러스 유전자스ㅣ 순서 변화, 유전자 중복 제거, PIV 프로모터를 그의 안티게놈 카운터파트로 치환하는 것, 예컨대 외래 서열의 삽입 용량을 증가시키기 위해 인터제닉 대역을 단축, 연장 또는 제거하는 것, RNA 복제 또는 전사를 증가시키거나 감소시키기 위한 시스-작용 시그날에 있어서의 돌연변이, 독특한 제한효소 부위의 삽입, 또는 심지어 비필수 유전자 전체를 결실시키는 것 중에서 선택된 한가지 이상의 부가적인 변경이 인코포레이션된 재조합 PIV가 제공된다.
백신 용도를 위해, 본 발명에 따라 제공된 바이러스는 백신 제제 중에 직접 이용되거나 또는 당업자에게 잘 알려진 동결건조 프로토콜을 이용함으로써 동결건조시켜 이용될 수 있다. 동결건조된 바이러스는 일반적으로 약 4℃에서 유지될 것이다. 사용될 준비가 되면, 동결건조된 바이러스를 예컨대 염수 또는 SPG, Mg++ 및 HEPES를 포함하는 염수 등에 어쥬번트를 첨가하거나 첨가하지 않은 상태로 안정화 용액 중에 재조성시켜 사용한다. 이에 대해서는 다음에 더욱 상세히 설명한다.
본 발명의 PIV 백신은 활성성분으로서 상술한 바와 같이 생성된 PIV을 면역학적으로 유효한 양으로 함유한다. 변형된 바이러스는 생리학적으로 허용가능한 담체 및/또는 어쥬번트와 함께 숙주내로 도입될 수 있다. 유용한 담체는 기술분야에 잘 알려져 있으며 예컨대 물, 완충수, 0.4% 염수, 0.3% 글라이신, 히알루론산 등을 들 수 있다. 얻어진 수용액은 그대로 사용되기 위해 포장되거나 또는 동결건조시키며, 동결건조된 제제는 상기한 바와 같이 투여전에 멸균용액과 합쳐 사용한다. 이 조성물은 생리조건에 알맞게 조정되도록 약학적으로 허용되는 보조물질, 예컨대 pH 조정제, 완충제, 등장성 조정제, 습윤제 등, 예컨대 소듐 아세테이트, 소듐 락테이트, 소듐 클로라이드, 포타슘 클로라이드, 칼슘 클로라이드, 소르비탄 모노라우레이트, 트리에탄올아민 올리에이트, 등을 포함할 수 있다. 허용가능한 어쥬번트로는 특히 불완전 Freund's 보조제, MPLTM (3-o-탈아실화 모노포스포릴 지질 A: RIBI ImmunoChem Research, Inc., Hamilton, MT) 및 IL-12 (Genetics Institute, Cambridge, MA)를 들 수 있다.
상기한 바와 같이 PIV 조성물을 이용한 면역화시 에어로졸, 점적제, 경구, 국소용 또는 기타 경로를 통해 투여하며 숙주의 면역계가 예컨대 F 및 HN 당단백질과 같이 PIV 바이러스 단백질에 특이적인 항체를 생산함으로써 백신에 반응하게 된다. 본 발명에 설명된 바와 같이 생산된 PIV의 면역학적 유효량으로 백신화한 결과, 숙주는 적어도 부분적으로 또는 완전히 PIV 감염에 대해 면역적이거나, 또는 중간 또는 심한 PIV 감염, 특히 하기도의 PIV 감염에 대해 저항성을 갖게된다.
백신이 투여될 숙주는 PIV 또는 그와 밀접히 연관된 바이러스에 의한 감염에 민감한 포유동물이면 어느 것이든 무방하고 그러한 숙주는 백신화 균주의 항원에 대해 보호적인 면역 응답을 일으킬 수 있는 것이다. 따라서, 본 발명은 인간 및 여러가지 수의용 용도를 위한 백신 개발법을 제공한다.
본 발명의 PIV를 함유하는 백신 조성물은 PIV 감염에 민감하거나 감염될 위험이 있는 숙주에게 투여되어 숙주 자신의 면역 응답 능력을 향상시킨다. 이러한 양은 "면역학적 유효량"이라 칭한다. 이러한 용례에서, 유효량 범위내에서 투여될 PIV의 정확한 양은 숙주의 건강상태와 체중, 투여방식, 제제의 특성등에 따라 달라질 수 있으나 일반적으로 숙주 당 약 103 내지 106 플라크 형성 단위 (PFU: plaque forming units)의 바이러스, 더욱 일반적으로는 숙주 당 약 104 내지 106 PFU 바이러스가 될 것이다. 어떠한 경우에도, 백신 제제는 본 발명의 변형된 PIV를 심각하거나 생명을 위협하는 PIV 감염에 대해 숙주 환자를 효과적으로 보호하는데 충분한 양으로 공급하여야 한다.
본 발명에 따라 제조된 PIV는 복수개의 PIV 혈청형 또는 균주에 대한 보호를 획득하기 위해 다른 PIV 혈청형 또는 균주의 바이러스와 결합될 수 있다. 다른 한편, 설명된 바와 같이 하나의 바이러스 내로 엔지니어링된 복수 혈청형 또는 균주들의 보호적인 에피토프를 결합시킴으로써 복수 PIV 혈청형 또는 균주에 대한 보호가 획득될 수 있다. 일반적으로, 상이한 바이러스들이 투여될 경우 이들은 동시에 혼합 및 투여되겠지만, 따로따로 투여해도 된다. 한가지 균주에 의한 면역이 같거나 다른 혈청형의 여러 균주들에 대해 보호작용을 제공할 수 있다.
몇가지 경우에는 본 발명의 PIV 백신을 다른 제제, 특히 다른 아동 바이러스에 대해 보호적인 응답을 유도하는 백신들과 결합시키는 것이 요망될 수 있다. 본 발명의 또 다른 측면에서 PIV를 호흡기 융합 바이러스 (RSV) 또는 홍역 바이러스와 같은 다른 병원균의 보호적인 항원을 코딩하는 서열들을, 감염성 PIV를 생산하는데 사용된 PIV 게놈 또는 안티게놈내로 인코포레이션시킴으로써 다른 병원균의 보호적 인 항원들에 대한 벡터로서 이용할 수도 있다. RSV cDNA의 클로닝 및 본 발명과 관련된 기타 설명이 본 출원인의 공동계류중인 미국특허출원 제 08/534,768, 60/021,773, 08/720,132, 60/046,141, 60/047,634, 및 08/892,403 및 PCT 특허출원 PCT/US97/12269에 설명되어 있으며 이들은 본 발명에 참조되었다.
본 발명의 백신 조성물의 단일 또는 복수 투여를 수행할 수 있다. 신생아 및 유아에 있어서는, 충분한 면역수준을 이끌어내기 위해 여러차례의 투여가 요구될 수 있다. 투여는 생후 첫달 이내에, 그리고 천연 (야생형) PIV 및/또는 기타 바이러스 감염에 대한 충분한 보호수준을 유지하는데 필요하도록, 아동기 내내 예컨대 2개월, 6개월, 1년 및 2년 등의 간격으로 투여하여야 한다. 마찬가지로, 건강관리 직종 종사자, 어린이 보호 직종 종사자, 어린 아동이 있는 가족 구성원, 심폐기능이 떨어진 노인 및 개인등과 같이 반복되거나 심각한 PIV 감염의 위험이 있는 성인들도 보호적인 면역 응답을 수립 및/또는 유지하기 위해 복수회의 면역화가 필요할 수 있다.
본 발명의 백신에 의해 제공되는 유도 면역 수준은 무력화된 분비성 및 혈청 항체의 양을 측정함으로써 모니터할 수 있다. 이러한 측정에 기초해서, 백신 투여량을 조정하거나 요망되는 보호도를 유지하는데 필요한 만큼 백신화를 반복시킬 수 있다. 또한, 여러가지 수용체 그룹에 대해서는 상이한 백신 바이러스들이 유리할 수 있다. 예컨대, T 세포 에피토프에 풍부한 부가적인 단백질을 발현하는 엔지니어링된 PIV 균주들이 유아보다 성인에게 특히 이로울 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면에서는 PIV를 호흡기의 일과성 유전자 요법을 위한 벡터로서 이용한다. 이 구체예에 따라 재조합 PIV 게놈 또는 안티게놈은 목적하는 유전자 산물을 코딩할 수 있는 서열을 인코포레이션한다. 목적하는 유전자 산물은 PIV 발현을 제어하는 것과 같거나 다른 종류의 프로모터의 조절을 받는다. 재조합 PIV 게놈 또는 안티게놈과 N, P, L 및 다른 소망되는 PIV 단백질을 공동발현시킴으로써 생성되고 목적하는 유전자산물을 코딩하는 서열을 함유하는 감염성 PIV를 환자에게 투여한다. 에어로졸, 네불라이저, 또는 기타 국소투여에 의해 환자의 호흡기로 투여한다. 재조합 PIV를 소망되는 유전자 산물을 치료 또는 진단 수준으로 발현시키는데 충분한 양으로 투여한다. 이 방법으로 투여될 수 있는 대표적인 유전자 산물은 예컨대 인터류킨-2, 인터류킨-4, 감마-인터페론, GM-CSF, G-CSF, 에리쓰로포이에틴, 및 기타 시토카인류, 글루코세레브로시데이즈, 페닐알라닌 히드록시레이즈, 시스틱 피브로시스 투과막 콘덕턴스 레귤레이터 (CFTR: cystic fibrosis transmembrane conductance regulator), 하이포잔틴-구아닌 포스포리보실 트랜스퍼레이즈, 시토톡신, 종양억압 유전자, 안티센스 RNAs, 및 백신 항원이다.
다음에 실시예를 들어 본 발명을 더욱 상세히 설명하나 본 발명의 범위가 이들 실시예로 한정되는 것은 아니다.
실시예 I
음성 센스 PIV 게놈 RNA를 코딩하는 플라스미드 p218(131)의 제조
HPIV3 JS 균주의 완전한 15462 nt 게놈 서열을 코딩하는 완전한 cDNA 클론 p218(131 (도 1: 서열 1) (부다페스트 조약에 따라 American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, U.S.A.에 기탁되고 수탁번호 97991로 수탁됨) 제조하였다. 자체-절단에 의해 HPIV3의 3' 말단이 생성되도록 간염 델타 리보자임을 게놈 서열의 3' 말단에 인접하게 위치시켰다 (Perrotta 및 Been, Nature 350:434-436, (1991), 본 발명에 참조됨). 델타 리보자임 다음으로 T7 전사 터미네이터를 위치시켰다. T7 프로모터는 HPIV3 게놈의 5'말단 뉴클레오타이드가 첫번째로 합성된 뉴클레오타이드가 되도록 게놈 서열의 5' 말단에 인접하게 위치시켰다. 이러한 배열에서, cDNA는 어떠한 부가적인 이종성 뉴클레오타이드 없이 정확한 게놈 말단들을 함유하는 PIV3 게놈 RNA의 완전한 음성-센스 복제물을 코딩한다.
cDNA수크로스 구배 원심분리에 의해 정제한 비리온으로부터 분리된 RNA의 역전사 (RT) 및 폴리머라제 연쇄반응 (PCR)에 의해 제조된 14개의 중복 서브클론 (A*-L로 표시, 괄호안의 문자는 개별적인 플라스미드를 나타내는 것으로서 특정 바이러스 유전자를 가리키는 것은 아님)으로부터 HPIV3 cDNA를 조립하였다 (Stokes 외, 상기문헌, 1992; Stokes 외, 상기문헌, 1993, 두가지 모두 본 발명에 참조됨). 서브 클론들은 게놈 RNA의 다음 뉴클레오타이드에 걸쳐있다 (3' 말단을 위치 1로 표시함): 1-2058(A*), 1874-3111(A'), 3086-5140 (C), 4348-5276(C'), 5072-6695(D*), 5904-8532(E), 7806-9898(F), 9632-10740(F'), 9760-10955(G), 10862-11925(H), 11835-12868(I), 12426-13677(J), 13630-14496(K), 및 14467-15462(L). 각각의 단편을 통상적인 클로닝 기술을 이용하여 pBluescript KSII (Strategene, La Jolla, CA)내로 클로닝시켜 완전한 서열을 분석하였다.
이어서 플라스미드 p(L)을 위치-지향 돌연변이시켜 MUTA-GENE 공정 (BioRad, Hercules, CA)에 따라 단일-가닥 DNA 중간체를 경유하여 T7 프로모터를 도입하였다. 음성-센스 돌연변이 프라이머: 5'-AATACGACTCACTAT
A*ACCAAACAAGAGAAG-3' (서열 2; T7 서열은 이탤릭체로 나타내고, HPIV3-특이적인 서열은 밑줄 그었으며, 5'-말단 HPIV3 뉴클레오타이드, 게놈 위치 15462는 꽃표시 함)를 이용하여 HPIV3 게놈의 정확한 5' 말단에서 전사가 개시되도록 T7 프로모터를 위치시켰다. 이렇게 변형된 p(L)을 p(L*)로 표시하였다. 음성-센스 돌연변이 올리고뉴클레오타이드 5'-CCAAGTACTATGAGATGCTTGATT-3' (서열 3)플라스미드 p(E)를 변형시켜 HPIV3 위치 7903, 7913, 7915에서 HN 유전자 내로 3가지 뉴클레오타이드 치환 (밑줄)을 삽입하였다 (도 1). 이들 치환들은 Hga I 부위를 제거하고, Sca I 부위를 삽입하며, 코딩된 HN 단백질의 아미노산 370을 변형시켜 모노클로날 항체 (mAb) 423/6 및 170/7에 의해 인식된 에피토프가 절제되도록 하였다 (van Wyke Coelingh외, J. Virol. 61:1473-1477, (1987), 본 발명에 참조됨). p(E*) 내지 p(K) 서브클론들을 p(L*) 플라스미드로 단계적으로 조립하여 p(E*FF'GHIJKL*)을 얻었다 (도 1A). 이 플라스미드는 게놈의 5' 말단에 뉴클레오타이드 15462에 인접한 T7 프로모터와 함꼐 HPIV3 뉴클레오타이드 5904-15462를 포함한다. 서브클론 p(A*) 내지 p(E)를 HPIV3 뉴클레오타이드 1-8532를 함유한 두번째 중복 서브클론 p(A*A'CC"D*E)로 어셈블시켰다.
p(E*FF'GHIJKL*)과 p(A*A'CC'D*E)의 두가지 서브클론의 서열을 완전히 분석하였다. 상기 도입된 포인트 돌연변이에 더해, 상기 cDNA는 N 유전자 내의 1615 위 치에서 하나의 뉴클레오타이드가 치환되고 코딩된 단백질에서 아미노산 506의 치환을 일으키는 점에서 정통한 JS HPIV3 서열 (Stokes외, 상기문헌 1992)과 달랐다. L 유전자 중의 10355, 11333 및 15242 위치에서 3가지 또 다른 뉴클레오타이드 치환이 발견되었는데 이들은 코딩된 단백질을 변경시키지는 않았다 (도 2). 이들 3가지 비코딩 변경은 cDNA로부터 유도된 재조합 바이러스 (rPIV로 표시)를 동정하기 위한 부가적인 서열 마커로서 유지되었으며 N 유전자 내의 돌연변이는 후술되는 바와 같이 보정되었다.
이어서 간염 델타 바이러스 리보자임과 HPIV3 위치 1에 인접한 T7 터미네이터를 삽입하도록 서브클론 p(A*A'CC'D*E)를 변형시켰다. 플랭킹 간염 델타 바이러스 안티게놈 리보자임 (부분적으로 굵게 표시)의 자체-절단을 통해 HPIV3 게놈의 3'말단 (GGT↓GGG)(밑줄)이 발생된 HPIV3 미니게놈을 먼저 제조하였다 (Dimock and Collins, J. Virol. 67: 2772-2778, (1993); Perrotta and Been, 상기문헌 (1991). 본 발명에 참조됨). 리보자임에 이어 T7 전사 터미네이터가 뒤를 이었다. 리보자임 절단 부위에 인접한 서열을 Sma I 부위 (CCC↓GGG)로 변형시키고 T7 터미네이터의 다운스트림쪽에 ApaI 부위 (GGGCC↓C)를 위치시키는 PCR 반응에서 상기 미니게놈 cDNA를 템플레이트로서 사용하였다. BssHII에 의해 절단되어 충전에 의해 블런트-말단화된 pKSII내로 이 PCR 산물을 클로닝시켜 p218을 만들었다.
블런트-말단 접합에 의해 개방된 Sma I 부위로 모든 서열이 도입될 수 있도록 하고 그의 RNA 전사체가 델타 리보자임 절단 부위 (NNN↓GGG)에서 절단되도록 p218을 디자인하였다. p(A*A'CC'D*E) 서브클론을 Hga I 및 Sal I (8533)으로 절단 하여 HPIV3 cDNA를 방출시키고 dNPTs 및 T4 DNA 폴리머라제로 충전시켜 블런트 말단을 얻었다. Hga I 부위는 HPIV3 위치 1의 10 뉴클레오타이드 업스트림이고 절단 및 충전시, HPIV3 위치 1로부터 시작되는 블런드 말단을 남긴다. 변형된 Hga I-Sal I 단편을 겔 정제시키고 p218의 Sma I 부위로 클로닝시켰다. N 유전자 (nt 1615에서 T)에서의 돌연변이를 Kunkel 돌연변이발생 (Kunkel외, methods Enzymol. 154: 367-382, (1987), 본 발명에 참조됨)을 이용하여 JS wt 서열 (nt 1615에서 A)로 보정하였다 (GenBank accession #Z11575, 본 발명에 참조됨). 이 플라스미드를 p218(A*A'CC'D*E)라 칭하였다 (도 1).
뉴클레오타이드 7438-15462로부터의 HPIV3 cDNA와 T7 프로모터를 함유한 p(E*FF'GHIJKL*)의 Xho I-Ngo MI 단편을 p218(A*A'CC'D*E)의 Xho I-Ngo MI 윈도우내로 클로닝시켰다 (도 1). 이로부터 HPIV3 뉴클레오타이드 7538에서 HPIV3 cDNA의 2개의 단편이 결합되어, L 유전자에서 3가지 부수적인 돌연변이와 HN 유전자에서 3가지 소망되는 돌연변이를 음성-센스 게놈 RNA와 함께 코딩하는 완전한 길이의 HPIV3 cDNA를 함유하는 플라스미드를 생산하였다. 이어서 마지막 구축물, p218(131) (도 1: 서열 1)을 Taq DYE Deoxy Terminator 사이클 서열분석 키트 (ABI, Foster City, CA)를 이용하여 NCI Frederick Cancer Research and Development Center (Frederick, MD)에서 자동화 서열분석에 의해 서열 전체를 분석하였다. 이 분석에 의해 HN 유전자에서의 부가적인 변경, 즉, HN 아미노산 263을 쓰레오닌으로부터 이소류신으로 변경시킨 위치 7593에서의 HN 유전자의 C에서 T로의 변경이 동정되었다 (도 2 참조)
실시예 II
HPIV3의 전사 및 RNA 복제 시스템
이 실시예는 인간의 파라인플루엔자 바이러스 타잎 3 (HPIV3)에 있어서 재구성된 전사 및 RNA 복제 시스템을 생산하기 위한 조성물 및 방법을 설명한다. 이 예시적인 시스템은 백시니아 바이러스 재조합체에 의해 공급된 T7 RNA 폴리머라제에 의해 추진된 형질도입된 플라스미드로부터 세포내 발현된 성분들을 이용함으로써 개발되었다. 이 시스템은 HPIV3 게놈 RNA의 음성-센스 아날로그에 기초한 것으로서 여기서 바이러스 유전자는 결실되고, 세균성 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼레이즈 (CAT)를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드로 치환되었다. N, P 및 L 단백질을 공동형질도입된 플라스미드로부터 발현시켜 효과적인 전사 및 RNA 복제가 가능토록 하였다. 이 실시예에 따른 전사에 의해 서브게놈 폴리아데닐화된 mRNA가 생산되고, 이는 예컨대 올리고 (dT)크로마토그래피에 의해 쉽게 분리되었다 이 실시예에 따른 RNA 복제에 의해 미니-안티게놈과 자손 안티게놈이 생산되며, 이들은 마이크로코컬 뉴클리아제에 의한 절단에 대한 내성에 기초해서 봉입되는 것으로 나타났다.
A) 바이러스 및 세포
Furst등 (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83: 8122-8126, 1986, 본 발명에 참조됨)의 설명에 따라 박테리오파지 T7 RNA 폴리머라제를 발현하는 백시니아 바이러스 재조합체, vTF7-3을 제공하였다. HEp-2 모노레이어 배양체를 37℃에서 5% CO2 중 2% 소의 태아 혈청 (FBS)을, 50μg/ml 겐타마이신 설페이트 및 2mM 글루타민이 보강된 OptiMEM 1 (Life Technologies, Gaithersburg, MD)와 함께 유지시켰다.
B) cDNAs
HPIV3의 JS 균주의 N, P 및 L 유전자의 ORFs에 해당하는 cDNA (GenBank #11575; Stokes외, 1992)를 플라스미드 pTM-1의 Nco I-Sal I 윈도우 내로 클로닝시키고, 여기서 전사는 T7 RNA 폴리머라제에 의해 매개되며 번역은 외래 ORF에 선행되는 내부 리보좀 엔트리 부위에 의해 매개된다 (Elroy-Stien외, Proc.Natl.Acad. Sci. U.S.A. 86:612606130 (1989), 본 발명에 참조됨). 각각의 유전자를 폴리머라제 연쇄반응 (PCR)에 의해 먼저 변형시켜 번역개시 부위에서 Nco I 또는 Nco I-적합부위 및 다운스트림 말단에서 Sal I 위치를 지정하였다.
플라스미드 p(131)은 간염 델타 바이러스 리보자임을 결여하는 것을 제외하고 p218(131)과 마찬가지로 각각의 PCR에 대해 템플레이트로서 이용되었다. N ORF를 증폭시키는데 사용된 프라이머는 CCCTATAATTTCAAC
ATG
TTGAGCCTATTTG (서열 4; 양성-센스에 상대적인 포워드 프라이머) 및 GATTAAAATGTTGGTCGACTTAGTTGCTTCC 였다 (서열 5; 이탤릭체는 제한효소 위치를를 나타내고, 번역 개시 부위는 굵은 글씨로 표함). PCR 산물인 Afl III 및 Sal I 부위에 의해 플랭킹된 1578bp 단편을 pTM-1의 Nco I-Sal I 윈도우 내로 클로닝시켜 pTM(N)을 얻었다.
PIV3 인단백질 (P) ORF를 증폭시키는데 사용된 프라이머는 5-'CCATAGAGAGTCCATGGAAAGCGATGCTAAAAACTATC-3' (서열 6; 포워드 프라이머) 및 5'-CGGTGTCGTTTCTTTGTCGACTCATTGGCAATTGTTG-3' (서열 7; 역프라이머)였다. 게놈 RNA의 완전한 길이의 JS 균주의 cDNA (p311)을 PCR의 템플레이트로서 이용하였다. 얻어진 PCR 산물은 Nco I 및 Sal I 제한효소 위치 (이탤릭체)에 의해 플랭킹된 1851 bp 단편이었다. 이어서 PCR 산물을 pTM-1의 Nco-Sal I 윈도우내로 클로닝시켜 pTM(P)를 생산하였다.
두번째 PCR을 수행하여 C ORF 없이 PIV3 인단백질 P ORF를 증폭시켰다. p131을 다시 템플레이트 cDNA로서 사용하였다. 상이한 포워드 프라이머와 동일한 역프라이머를 이용하여 C 없이 PIV3 P ORF를 증폭시켰다; 5'-CCATAGAGAGTCC ATG
GAAAGCGACGCTAAAAACTATC-3' (서열 74; 포워드 프라이머) 및 5'-CGGTGTCGTTTCTTTGTCGACTCATTGGCAATTGTTG-3' (서열 7: 역프라이머). 얻어진 PCR 산물은 Nco I 및 Sal I 제한효소부위 (이탤릭체로 표시)에 의해 플랭크된 1851 bp 단편이었다. 포워드 프라이머에서 밑줄친 뉴클레오타이드는 P ORF에서는 침묵하나 C ORF의 개시 코돈을 쓰레오닌으로 변경시키는 뉴클레오타이드 치환을 나타낸다. C ORF에 대한 다음 개시 코돈은 400개 이상의 뉴클레오타이드 다운스트림이다. 따라서, P 단백질만이 생산될 것이다. 이어서 PCR 산물을 pTM-1의 Nco I-Sal I 내로 클로닝시켜 두번째 플라스미드, pTM(p no C)를 만들엇다.
HPIV3의 L ORF를 세부분으로 나누어 pTM-1로 클로닝시켰다; 말단은 PCR 산물로부터 유도되고 몸체는 p218(131)로부터의 제한단편이었다. L ORF의 업스트림 말단은 프라이머 GCAAAGCGTGCCCGGGCC
ATG
GACACTGAATCTAACAATGGC (서열 8)과 GAAATTCCTTAATCGATTCTCTAGATTC (서열 9)를 이용하여 증폭시켰다. 이로부터 완전한 길이 게놈의 8625-9645 위치가 업스트림 말단상의 Sma I 및 Nco I 부위 및, 다운스트림 말단상의 Cla I 부위에서 플랭크된 1,020-bp PCR 산물 L1이 생산되었다 (세 부위 모두 이탤릭체). L ORF의 다운스트림 말단을 프라이머 CCCATCAACTGTAACATACGTAAGAAAGAC (서열 10) 및 GGTTAGGATATGTCGACATTGTATTTATG (서열 11)을 이용하여 증폭시켰다. 이로부터 완전한 길이의 게놈의 13,645-15,378 위치가 SnaB I 및 Sal I 위치 (이탤릭체)에 의해 플랭크된 1,733-bp PCR 산물 L2가 생산되었다. 플라스미드 p(131)을 Cla I 및 Pst I으로 절단하여 완전한 길이의 게놈의 9,630-14,120 위치를 함유하는 4,487-bp 단편 L을 생산하였다. L1 및 L 미들을 공통적인 Cla I 부위에서 결합시켜 pBluescript의 Sma I-Pst I 윈도우내로 클로닝시켜 p(L1+L 미들)을 생산하였다. 이어서 L2 단편을 p(L1+L 미들)의 Pst I-Sal I 윈도우내로 클로닝시켜 Nco I 및 Sal I에 의해 플랭크된 완전한 L ORF를 얻었다. 이어서 이것을 pTM-1의 NcoI-SalI 윈도우내로 클로닝시켜 pTM(L)을 얻었다. pTM(L) (서열 20), pTM(P) (서열 21), 및 pTM(L) (서열 22)의 PCR-생산대역의 서열을 디데옥시뉴클레오타이드 서열분석법에 의해 확인하였다.
T7 전사의 효율을 증대시키기 위해, PIV3-CAT(-)라 불리우는 음성-센스 PIV 미니게놈을 코딩하는 cDNA 구축물에 특정 변형을 가하였다 (Dimock 및 Collins, J. Virol. 67:2772-2778 (1993), 본 발명에 참조됨). PIV3-CAT(-)는 CAT ORF의 음성-센스 복제물에 융합된 HPIV3 게놈의 3'-말단 111 뉴클레오타이드 및 5'-말단 115 뉴클레오타이드를 포함한다. 이 cDNA는 HgaI에 의한 선형화 및 T7 RNA 폴리머라제에 의한 전사시 HPIV3 게놈의 정확한 말단을 함유하는 미니게놈을 생산하도록 디자인되었다. cDNA 말단에 연속적인 연장을 부가한 돌연변이 올리고뉴클레오타이드를 이용하여 2개의 연속적인 PCR 라운드를 이용하여 HgaI 부위를 간염 델타 리보자임 (Perotta and Been, Nature 350:434-436(1991) 본 발명에 참조됨)으로 치환하여, 자체-절단에 의해 3'HPIV3 게놈 엔드가 발생토록 하였다. T7 전사 종결 시그날을 리보자임 직후에 삽입하여 (도3) PIV3-CAT-델타를 제조하였다.
PIV-CAT-델타 cDNA를 PCR 돌연변이에 의해 변형시켜 트레일러와 T7 프로모터를 플랭킹하는 제한효소 부위를 이용하여 T7 프로모터와 미니게놈의 5' 말단 사이에 1개, 2개 또는 3개의 G 잔기를 삽입하였다. 이 변형에 의해 T7 전사의 효능이 증가되었다. 예비실험에서, 2개의 G잔기를 함유하는 미니게놈 (PIV3-CAT-GG라 명명)이 후술되는 재구성된 전사 및 번역 시스템에서의 CAT 발현에 가장 활성적이었으며 이후의 모든 유도체에 대해 이를 이용하였다.
PIV3-CAT-GG cDNA를 중복 PCT 돌연변이에 의해 더욱 변형시켜 다음과 같이 2개 부위에서 동시에 변형을 일으켰다. 먼저, 백시니아 바이러스 초기단계 RNA 폴리머라제 (T5NT)에 대한 탠덤 전사 종결 모티프를 함유하는 서열 T7CT (Yuen and Moss, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84:6417-6421 (1987), 본 발명에 참조됨)을 델타 리보자임과 T7 전사 터미네이터 사이의 양성 센스 스트랜드 cDNA 스트랜드내로 삽입하였다 (도 1). 이 모티프와 후술될 두번째 모티프를 첨가하여 백시니아 바이러스 초기 RNA 폴리머라제에 의한 CAT 유전자의 혼란스런 전사를 방지하였다. 두번째로, (i) 코딩된 미니게놈에 대해 103-109위치에서 양성-센스 cDNA 스트랜드 내로 두번째 백시니아 바이러스 종결 모티프 (T5AT)를 삽입하고 (ii) 미니게놈 위치 112에서 0 내지 6G 잔기 (음성-센스)를 삽입하기 위해 (도 3) N 미번역 영역과 CAT 유전자 사이의 접합부에서 미니게놈 cDNA 삽입물을 변형시켰다. 3세트의 반응 (PCR 1, 2 및 3)이 관련된 중복 PCR 돌연변이는 다음과 같이 수행하였다. PCR 1은 템플레이트로서 PIV3-CAT-GG cDNA를 사용하고 프라이머로서 다음듸 2가지 돌연변이 올리고뉴클레오타이드를 이용하는 7 세트의 평행 반응이었다 [PCR1(0) 내지 (+6)]: 포워드 프라이머는 -111GGGGTTATGCTACTGCAGGCTTTTTTTCTCCCTTAGCCATCCG-62
(서열 12) 였고 역프라이머는124CTC CAT
TCTAGA(N)TTATAAAAATTATAGAGTTCCC90
(서열 13)이었다. 첫번째 올리고뉴클레오타이드의 굵은 글씨체 서열은 업스트림 탬덤 백시니아 터미네이터이고, 두번째 올리고뉴클레오타이드의 굵은 글씨체 서열은 두번째 터미네이터이다. 이 반응은 리보자임 및 인접하는 리더 대역을 증폭시키고 상기 돌연변이를 삽입시켰다. PCR 2는 템플레이트로서 PIV3-CAT-GG cDNA를 사용하고 독특한 NgoMI 부위의 플라스미드 서열 업스트림에서 하이브리다이즈된 것을 포워드 프라이머로 (도 3), 반응 1의 포워드 프라이머에 상보적인 역프라이머를 사용하는 단일 반응이었다. 따라서, PCR 1 및 2의 산물은 이 후자의 서열에서 중복되었다. PCR 1 (0) 내지 (+6) 및 PCR 2의 산물을 겔 정제시켰다. PCR1 (0) 내지 (+6)의 산물을 각각 PCR 2 산물 분주액과 별도로 혼합하고 PCR 2의 포워드 프라이머 및 PCR 1의 역프라이머를 함유하는 세번째 반응 (PCR3 (0) 내지 (+6))에서 증폭시켰다. PCR3 (0) 내지 (+6)의 산물을 플라스미드-특이 서열을 절단하는 NgoMI, 및 CAT 유전자의 업스트림 말단을 절단하는 XbaI로 절단하고 (도 3), PIV3-CAT-GG의 NgoMI-XbaI 윈도우 내로 클로닝시켰다. 이로부터 삽입된 G 잔기수에 따라 명명된 미니게놈을 코딩하는 cDNA 패널을 얻었다: PIV3-CAT 0 내지 PIV3-CAT +6. PCR로부터 유래한 모든 DNA 대역의 구조를 디데옥시뉴클레오타이드 서열분석에 의해 확인하였다.
c) 형질도입
6웰 플레이트에서 HEp-2 세포를 90% 점성도(confluence)까지 배양시켰다. 6-웰 플레이트 각각의 웰 (1.5 X 106 세포)을 0.4μg pTM(P), 0.4μg pTM(N), 0.05μg pTM(L), 및 0.4μg 미니게놈 플라스미드로 형질도입시켰다. 이 플라스미드들 0.1 ml OptiMEM (Life Technologies)에 첨가하고 LipofectACE (Life Technologies) 12μl를 함유하는 OptiMEM 0.1 ml와 혼합하였다. 실온에서 약 15분간 인큐베이션시킨 후, 2% 송아지 혈청과 vTF7-3 1.5 x 107 pfu를 함유하는 OptiMEM 1 0.8 ml를 각각의 웰에 첨가하였다. 이 플레이트들을 37℃에서 12시간 인큐베이션시킨 다음, 2% 소의 혈청을 함유하는 신선한 OptiMEM 1 으로 배지를 갈아주었다. 이어서 세포를 37℃에서 총 48시간 인큐베이션시킨 다음 RNA 분석과 CAT 분석을 위해 수확하였다. 각각의 미니게놈을 3회 (3웰) 수행하고 배지에서 스크랩하여 모았다.
D) CAT 분석
상기 설명된 바와 같이 수확된 세포의 각각의 샘플 3.33% (1.5 x 105 세포)씩의 분주액을 CAT 분석을 위해 덜어내었다. 분주액을 1,000 rpm에서 5분간 원심분리하고 상등액을 폐기하였다. 세포 현탁액을 40mM Tris 1 ml, pH 7.5, 1mM EDTA, 150mM NaCl로 세척하고 50μl 0.25M Tris, pH 7.5에 재현탁시켰다. 냉동과 해동을 3회 반복하여 용해물(lysate)을 제조하고 8,000 rpm에서 5분간 원심분리하여 청정화하였다. 통상적인 분석법 (Gorman 외 Mol. Cell. Bio. 2:1044-1051 (1982), 본 발명에 참조됨)을 이용하여 용해물 1μl에 대해 D-쓰레오-[디클로로아세틸 1-14C]클로람페니콜 (Amersham)을 아세틸화하는 능력을 분석하였다. 박층 크로마토그래피에 의해 아세틸화를 가시화시키고 포스포이미지 분석 (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA)에 의해 정량하였다.
E) RNA 분석
수집된 각 샘플의 나머지 세포 수확물을 캡시드화 RNA, 총 RNA 및 mRNA의 분리를 위해 3가지 동등부로 나누었다. 이 세가지 분주액을 1,000 rpm에서 5분간 원심분리하고 상등액을 버렸다. 세포 현탁액 분주액 2개를 1% Triton X-100, 0.5% DOC를 함유하는 RSB (10mM NaCl, 10mM Tris, pH 7.5, 1.5mM MgCl2) 50μl에 재현탁시켰다. 이어서 한 분주액에 10mM Tris 7.5, 1mM CaCl2, 및 20μg (1mg/ml 원액)의 마이크로모커스 뉴클리아제를 첨가하고 나머지 분주액에도 마이크로코커스 뉴클리아제를 뺀 동일한 혼합물을 첨가하였다 (Baker & Moyer, J. Virol. 62: 834-838 (1988), 본 발명에 참조됨). 마이크로코커스 뉴클리아제의 첨가목적은 캡시드와되지 않은 RNA를 파괴하여 사용 조건을 예비실험에 최적화시키기 위한 것이었다. 혼합물들을 30μ℃에서 30분간 인큐베이션시키고 공급자 지침에 따라 RNA를 Trizol (Life Technologies)을 이용하여 분리하였다. 세포 현탁액의 세번째 분주액을 Trizol을 이용하여 RNA 정제하고 정제된 RNA를 올리고(dT) 셀룰로스 크로마토그래 피에 의해 폴리아데닐화 및 비폴리아데닐화 분획으로 분리하였다 (Grosfeld외, J. 퍄개ㅣ. 69:5677-5686 (1995), 본 발명에 참조됨). 0.44M 포름알데히드를 함유하는 1.5% 아가로스 겔 상에서 RNA 샘플을 러닝시키고 니트로셀룰로스에 옮기고 (Chomczynski, Anal. Biochem. 201:134-139 (1992), 본 발명에 참조됨), 스트랜드 특이적인 리보프로브를 이용하여 하이브리다이제이션시킨 다음 포스포이미지 분석에 의해 정량하였다.
실시예 III
변형된 PIV3 미니게놈의 제조 및 발현
이 실시예에서는, 단일 뉴클레오타이드 증가분의 길이가 다른 PIV3 미니게놈을 코딩하도록 cDNA 패널을 제조하였다. 이 재구성 시스템에서 전사 및 RNA 복제가 미니게놈에 대해 가장 효과적이었는데 미니게놈의 길이는 6배에 달하였다. 이 맥락에서, Paramyxovirus 및 Morbillivirus 속의 바이러스들은 전형적으로 "6의 규칙", [즉, 게놈 (또는 미니게놈)이 그들의 뉴클레오타이드 길이가 6의 배수인 경우에만 효과적으로 복제되는 것 (캡시드화 NP 단백질에 상대적으로 뉴클레오타이드 잔기의 정확한 공간을 위해 요구되는 것으로 여겨짐)]에 따라 체류한다. 그러나, 본 발명자들은 길이가 6배보다 한 뉴클레오타이드만큼 길거나 짧은 미니게놈도 놀랍게도 활성적임을, 특히 RNA 복제에서 활성적임을 발견하엿다.
단일 뉴클레오타이드 증가분만큼 길이가 차이나는 PIV3-CAT 0 내지 6+로 명명된 7개의 PIV3-CAT 미니게놈을 코딩하도록 7개의 cDNA 패널을 구축하였다 (도3). 각각의 미니게놈은 HPIV3 게놈 RNA의 짧은 음성-센스 동족체로서 여기서 바이러스 유전자들은 CAT ORF의 음성-센스로 치환 및 결실되었다. CAT ORF를 게놈 RNA의 N 및 L 유전자, N GS 및 L GE 전사 모티프, 및 3' 리더 및 5' 트레일러 엑스트라젠 말단의 미번역 세그먼트에 의해 플랭크시킨다. 각각의 PIV3-CAT 미니게놈의 5' 말단은 T7 RNA 폴리머라제의 인접 프로모터에 의해 정의된다. 이 프로모터를 상술한 바와 같이 코딩된 미니게놈의 5' 말단에 2개의 비바이러스성 G잔기를 연장시키도록 구축하였다. T7 프로모터의 미전사 중심에 인접한 부가적인 G잔기가 존재하면 그의 전사 효율이 증가되고 예비실험결과 2개의 G 잔기가 존재함으로 해서 후술되는 재구성 시스템에서 최고도의 활성을 나타낸 것으로 밝혀졌다. 이러한 2개의 G잔기는 미니게놈 길이 계산에 산입하지 않는다. 3' 미니게놈의 말단은 인접 간염 델타 바이러스 리보자임에 의해 자체-절단에 의해 생산하며 이것은 정확한 3'-말단 뉴클레오타이드를 생산게할것이다. 7개의 PIV3-CAT 미니게놈은 N 미번역 대역과 CAT 유전자 사이의 접합부에서 0 내지 6G 잔기의 삽입으로 인해 길이가 증가되며 (도 3), 길이범위는 898 내지 904 뉴클레오타이드이다. PIV3-CAT +2 미니게놈은 6의 짝배수인 유일한 것이다 (각각의 미니게놈은 T7 프로모터로 인해 5' 말단에 2개의 부가적인 비바이러스성 G 잔기를 함유하지만, 이들은 세포내 HPIV3-매개된 RNA 복제에 의해 사라질 것으로 추정된다).
각각의 PIV3-CAT cDNA를 T7 RNA 폴리머라제를 발현하는 백시니아 바이러스 재조합체인 vTF7-3으로 감염된 HEp-2 세포내로 형질도입시켰다. T7 프로모터의 통제하에 N, P 및 L단백질을 코딩하는 플라스미드를 나란히 형질도입하였다. 상기한 바와 같이 C ORF의 번역 개시부를 제거하기 위한 위치-지향 돌연변이에 의해 p cDNA를 변형시켰다. 세포들을 48시간 후-감염후 수확하였다. 세포 현탁액 한 분주액을 CAT 효소 분석을 위해 프로세싱하였다 (도 4). 나머지 세포들을 3개의 동등 분주액으로 나누어 후술하는 바와 같이 RNA 분석을 위해 프로세싱하였다.
PIV3-CAT 삽입물의 양성-센스 플라스미드 스트랜드 업스트림에서 2개의 탠덤 백시니아 바이러스 초기-유전자 전사 종결 모티프 (T7NT), 및 CAT ORF의 동일 스트랜드의 바로 직후의 업스트림 중의 세번째 모티프 (T5AT)를 함유하도록 미니게놈 cDNA를 더 변형시켰다 (도 3). 이들은 백시니아 바이러스 폴리머라제에 의해 CAT ORF의 혼란스런 전사를 최소화하기 위해 고안된 것이다 (Grosfeld 외, (1995) 상기문헌). PIV3-CAT 미니게놈 각각을 N, P 및 L 플라스미드에 의해 상보시키자 CAT 발현이 반복적으로 검색되었으며 CAT 검색은 세가지 모두의 PIV3 단백질에 의존적이었다. 그러나, 발현정도는 뉴클레오타이드 길이가 6의 짝수배인 PIV3-CAT+2에서 훨씬 높았다. 미니게놈과 서포트 플라스미드의 바람직한 비율 및 양을 CAT 효소 발현에 기초하여 측정하였다.
실시예 IV
PIV 미니게놈에 의한 양성-센스 RNA의 합성
PIV 미니게놈의 전사 및 복제를 두가지 공정 모두의 RNA 산물을 검색함으로써 확인하였다. 전기 실시예에서 설명한 바와 같이, RNA 분석을 위해 세포 상등액을 3가지 동등 분주액으로 나누었다. 한 분주액은 후술되는 바와 같이 올리고(dT) 분석을 위해 사용하였다. 나머지 2개의 분주액들은 세제로 용균시키고 마이크로코 커스 뉴클리아제와 함께 인큐베이션시키거나 모방-처리하였다. 이어서 RNA를 분리하고 포름알데히드 아가로스 겔 상에서 전기영동시켜 분리한 다음 니트로셀룰로스로 이동시켜 음성-센스 CAT 리보프로브를 이용하여 하이브리다이제이션에 의해 분석하였다. 마이크로코커스-처리된 용균물 및 모방-처리된 용균물로부터의 RNA를 각각 도 5A에 상부 및 하부 패널로서 나타내었다.
모방-처리된 용균물로부터의 RNA 분석결과 각 미니게놈을 N, P 및 L 플라스미드로 상보시키면 931-뉴클레오타이드 RSV-CAT C2 미니게놈에 의해 발현된 RNA로 구성된 마커와 매우 유사한 크기를 갖는 RNA 밴드가 합성되는 것으로 나타났다 (Grosfeld 외, (1995), 상기문헌). 포스포이미지 분석결과를 도 5B에 나타내었다. N 또는 L 플라스미드가 생략된 경우에는 RNA가 거의 또는 전혀 검색되지 않았는데, 이는 이들 RNA가 재구성된 PIV3 폴리머라제의 산물임을 확인해준다.
각각의 PIV3-CAT 미니게놈은 2개의 양성-센스 RNAs, 즉, 미니-안티게놈과 서브게놈 CAT mRNA를 코딩할 것으로 기대된다. 각각의 미니-안티게놈은 898-904 길이의 뉴클레오타이드인 그의 미니게놈의 정확한 상보물일 것으로 예상된다. 예측된 서브게놈 mRNA를 GS 및 GE 시그날에 의해 정의하고, 길이는 804 뉴클레오타이드, 100 내지 200 뉴클레오타이드의 폴리A 테일을 함유할 것으로 예상된다.
도 5A (하부 패널)의 양성-센스 RNA의 단일 밴드의 검색 결과는 안티게놈과 mRNA가 겔 전기영동에 의해 분해되지 않았음을 시사했다. 따라서, 마이크로코커스 뉴클리아제 처리를 이용하여 안티게놈 RNA를 동정하였는데, 이는, mRNA가 아닌 안티게놈 (및 게놈)이 캡시드와되어 절단되지 않을 것이기 때문이다. 이 목적을 위한 마이크로코커스 뉴클리아제의 이용은 잘 수립되어 있으며 (Baker & Moyer (1988), 상기문헌), 선택된 조건은 RSV 미니레플리콘에 대해 입증되어 잇고 HEp-2 세포 용균물에 함유된 mRNA를 완전히 분해시키는 것으로 나타났다. 나머지 RNA를 음성-센스 리보프로브 (도5A, 상부 패널)를 이용하여 Nothern 블롯 분석에 의해 분석하고 포스포이미지에 의해 정량하였다 (도 5B: 이 분석에서 마이크로코커스-처리 RNA 및 미처리 RNA의 양을 별도로 정상화 하였음을 주목). 이러한 연구결과는 양성-센스 캡시드와된 미니-안티게놈에 해당하는 보호된 RNA 집단이 존재함을 확인해주었다. 몇몇 실험에서, 이것은 양성-센스 RNA의 약 3 내지 15%에 해당하는 RNA를 보호해주었다.
총 RNA 및 마이크로코커스-내성 RNA의 두가지 모두에 있어서 누적은 길이가 900 뉴클레오타이드이고 따라서 6의 배수인 +2 미니게놈의 경우 더 컸다. 그러나, RNA의 실제량은 길이가 6 뉴클레오타이드의 배수가 아닌 미니게놈, 특히, +2 미니게놈보다 하나 더 그커나 작은 +1 및 +3 미니게놈의 경우에도 누적되었다. 사실, +1 및 +3 미니게놈에 의해 생산된 캡시드화된 안티게놈의 양윽 +2 미니게놈의 85% 및 72%에 해당하였다 (도 5B). 효율이 가장 낮은 미니게놈인 +5 미니게놈의 경우에조차, 투적된 캡시드와 RNA의 양을 측정하자 활성이 +2 미니게놈 활성의 20%에 달하였다. 총 양성-센스 RNA를 검색하기 위한 측정시 +1 및 +3 미니게놈은 총 +2 미니게놈의 52% 및 45%에 해당하는 양으로 생산되었다.
서브게놈 mRNA가 존재하는지를 확인하기 위해, 수확된 세포 현탁액의 최종 분주액을 RNA 정제를 위해 프로세싱하였다. 이어서 RNA를 올리고(dT) 크로마토그래 피로 처리하였다. 결합되지 못한 RNAs들과 결합된 RNA 들을 저염도 완충액에서 용출시키고 Northen 블롯 하이브리다이제이션 (도 6A)에 의해 분석한 다음 포스포이미지 분석하였다 (도6B; 이 경우 결합된 것과 되지 않은 것을 +2 미니게놈의 결합 RNA에 상대적으로 정상화시켰다). 이 분석에 의해 서브게놈 mRNA에 대해 기대된 바와 같이 양성-센스 mRNA의 약 64%가 폴리아데닐화된 것으로 밝혀졌다. mRNA의 누적량은 =2 미니게놈의 경우 가장 컸다. 그러나, 실질적인 양의 mRNA가 다른 미니게놈에서도 관찰되었다. +1 및 +3 미니게놈에 의해 합성된 mRNA의 양은 +2 미니게놈에 의해 합성된 양에 비해 각각 30% 및 20%였고, 활성이 가장 작은 미니게놈은 약 13%였다.
실시예 V
PIV 미니게놈에 의한 음성 센스 RNA의 합성
전술한 실시예에 설명된 여러 가지 PIV3-CAT 미니게놈은 mRNA 및 양성-센스 캡시드화 미니-안티게놈의 합성을 지향했으며, 여기서 후자는 RNA 복제의 첫 번째 단계를 나타낸다. RNA 복제의 두 번째 단계는 미니-안티게놈 산물로부터의 캡시드화된 자손 미니게놈의 합성에 관계된다. 이 후자의 프로세스를 평가하기 위해, 전술한 실시예에서 설명된 뉴클리아제-처리된 용균물과 모방-처리된 용균물로부터의 RNA 샘플을 양성-센스 CAT 리보프로브를 이용하여 Northern 블롯 하이브리다이제이션에 의해 분석하고 (도 7A) 포스포이미지에 의해 정량하였다 (도7B).
모방-처리된 용균물로부터의 RNA 분석결과 (도7A, 하부 패널) N 또는 L 서포트 플라스미가 생략된 음성 대조군을 비롯하여, 모든 샘플에서 상당량의 미니게놈 이 세포내 축적된 것으로 나타났다. 도 5A-B 및 도6A-B에 설명된 분석은 양성-센스 RNA가 이러한 조건 하에서는 무의미함을 가리켜주었다. 따라서, N 또는 L의 부재하에 관찰된 미니게놈은 재구성된 HPIV3 폴리머라제에 의해 매개된 RNA 복제의 산물일 리가 없고, 그 대신 형질도입된 플라스미드의 T7 전사산물임이 분명하다.
재구성된 HPIV3 폴리머라제에 의해 생산된 미니게놈은 캡시드와될 것으로 예상되는 반면, T7 RNA 폴리머라제에 의해 생산된 미니게놈의 대부분은 캡시드화되지 않을 것으로 기대된다. 따라서, 도5A-B에 설명된 동일한 마이크로코커스 뉴클리아제-처리된 샘플로부터의 RNA를 이용하여 양성-센스 CAT 리보프로브와 하이브리다이제이션시킨 두 번째 블롯을 제조하였다 (도7A, 상부 패널). 그 결과 N 단백질 부재하에 누적된 모든 미니게놈 RNA가 예상된 바와 같이 분해된 것으로 나타났다 (도 7A, 상부 패널, 레인 1). L 단백질 부재하에 축적된 미니게놈 역시 기본적으로 모두 분해에 민감하였다 (도 7A, 상부 패널, 레인 2). L부재하, 그리고 N과 P 단독의 존재하에 합성된 플라스미드-유도된 미니게놈은 효과적으로 나타나지 않았다.
세가지 서포트 플라스미드의 완전한 세트가 존재할 경우에는, 각각의 미니게놈에 있어서 상당량의 마이크로코커스 뉴클리레이즈-내성 미니게놈 RNA가 누적되었다 (도 7A, 상부 패널). 양성-센스 RNA의 경우와 마찬가지로, +2 미니게놈의 경우 가장 많은 양의 자손 미니게놈이 관찰되었다 +1 및 +3 미니게놈은 그 다음으로 풍부하였다. 이들의 게놈 RNA 수준은 +2 미니게놈의 게놈 RNA 수준에 비해 각각 67% 및 42%였다.
전술한 실시예는 HPIV3 N, P 및 L 단백질들이 효과적인 전사 및 RNA 복제에 필요충분함을 입증해준다. 재구성된 PIV3 폴리머라제에 의해 매개되는 전사 및 RNA 복제의 이러한 강건한 특성은 코딩된 단백질의 기능성을 확인해주었다. 또한, 발현계 내의 부가적인 바이러스 단백질의 포함은 이러한 프로세스를 개시 또는 변형시킬 것으로 기대된다. 본 발명의 조성물 및 방법의 범위 내에서 PIV C, D 및 잠정적으로 V의 공동발현은 예컨대 RNA 복제의 개시 및/또는 변형에 유용할 것이다. 이러한 목적으로 전기 방법에 따라 플라스미드를 제조 및 분석하여 이러한 요소들을 한가지 이상 공동발현시킴으로써 적절한 감염 모델의 PIV 표현형에 대해서 뿐만 아니라 PIV 전사 및 RNA 복제에 미치는 이들의 효과를 측정하였다.
실시예 VI
cDNA로부터 감염성, 재조합 PIV의 제조
다음의 실시예들은 4가지 플라스미드-산생 cDNA로부터 세포내 공동발현에 의한 감염성, 재조합 PIV (rPIV)의 제조방법을 설명한 것이다. 이들 cDNA는 완전한 HPIV3 게놈과 HPIV3 뉴클레오캡시드 단백질 N, 인단백질 P, 및 폴리머라제 단백질 L을 각각 코딩한다.
A) 바이러스 및 세포
박테리오파지 T7 RNA 폴리머라제를 발현하는 백시니아 바이러스 재조합체인 변형 백시니아 균주 Ankara (MVA)를 Wyatt 등, Virol. 210:202-205, 1995 (본 발명에 참조됨)에 따라 제공하엿다. HEp-2 모노레이어 배양체를 2% FBS, 50μg/ml 겐타마이신 설페이트 및 2mM 글루타민이 보강된 OptiMEM 1 (Life Technologies)와 함께 5% CO2 중에서 37℃ 유지시켯다. HPIV3의 JS wt 균주와 그의 약독화 ts 유도체인 JS cp45를 Hall 등, Virus Res. 22:173-184 (1992) (본 발명에 참조됨)에 설명된 바와 같이 LLC-MK2 세포내에서 증식시켰다.
B) cDNAs
HPIV3의 완전한 게놈 서열을 코딩하고 있는 p218(131)로 표시되는 완전한 cDNA 클론 (도 1, 서열 1)을 상기한 바와 같이 제조하였다. 완전한 HPIV3 서열을 코딩하는 두 번째 cDNA 클론 p3/7(131)(서열 14) (부다페스트 조약에 의거하여 ATCC에 기탁하고 수탁번호 97990을 부여받음)를 제조하였다. p3/7(131)은 HPIV3 cDNA 삽입물에 상대적인 T7 프로모터 및 리보자임/T7 터미네이터의 위치가 상호교환되었다는 점에서 p218(131)과 차이가 난다. 따라서, p3/7(131)에서 합성된 첫 번째 뉴클레오타이드는 안티게놈의 5' 말단, 즉, 게놈 위치 1의 양성-센스 상보물이고, 리보자임 절단에 의해 정의되는 3' 안티게놈 말단은 게놈 위치 15462의 상보물이다. p3/7(131)2G (서열 15) (부다페스트 조약에 의해 ATCC에 기탁되고 수탁번호 97989를 부여받음)로 표시되는 세 번째 클론 역시, T7 프로모터와 안티게놈의 5' 말단 사이에 2개의 G잔기가 삽입된 것을 제외하고 p3/7(131)과 동일하게 제조되었다.
p37(131)2G 및 p3/7(131)의 제조를 위해, 2개의 플라스미드 p(A*A'CC'D*E) 및 p(E*FF'GHIJKL*)을 변형시키고 HPIV3의 완전한 양성-센스 안티게놈을 코딩하도록 연결시켰다. 먼저, PCR을 이용하여 p(A*A'CC'D*E)의 3'말단에 인접한 델타 리보 자임과 T7 터미네이터를 T7 프로모터로 치환하였다 (도 8). 양성-센스 프라이머 5'-GGCCCGTCGACGCCG
TAATACGACTCACTATAGGACCAAACAAGAG-3' (서열 18)은 전사 효율을 향상시키기 위해 이들 2개 요소 사이에 2G 잔기가 삽입된 HPIV3의 3'리더 (밑줄친 HPIV3 서열)에 인접한 T7 프로모터를 위치시켰다. 클로닝 목적을 위해 t7 프로모터의 업스트림에 독특한 Mlu I 사이트 (이탤릭체)를 위치시켰다. 음성-센스 프라이머 5'-1224CGGCATCACGTGCTAC1209-3' (서열 19)는 HPIV3 N 유전자의 nt 1209-1224에 스패닝하였고 천연 HPIV3 서열에 존재하는 독특한 Pml I 사이트 (이탤릭체)를 포함하였다. PCR 산물과 모 템플레이트 p218(A*A'CC'D*E)의 두가지를 모두 Mlu I 및 Pml I로 절단하고 PCR 산물을 Mlu I-Pml I 윈도우 내로 클로닝시켰다. HPIV3의 3' 말단과 T7 프로모터 사이에 2G 잔기가 삽입되지 않은 양성-센스 프라이머와 동일한 음성-센스 프라이머를 이용하여 두 번째 PCR 반응을 수행하였다. 이들 플라스미드는 p(Left + 2G) 및 p(Left +)로 명명하였다. p(Left + 2G)의 제조는 도 8에 도시하였으며, p(Left +)도 동일 계획에 따라 제조하였다.
플라스미드 p(E*FF'GHIJKL*)을 PCR에 의해 변형시켜 HPIV3의 5' 말단에 인접한 T7 터미네이터와 델타 리보자임을 위치시켰다 (도 9). 양성-센스 프라이머: 5'-GGATTTGCGCGC
14813
AATTTAAAT
CATCTGG
14828-3' (서열 16)에는 HPIV3의 L 유전자 (HPIV3 특이 서열은 밑줄침) 중 독특한 Swa I 사이트 (이탤릭체, 밑줄침) 바로 업스트림에 BssH II 사이트 (이탤릭체)가 도입되었다. 음성-센스 프라이머: 5'-CCCAGGTCGGACCGCGAGGAGGTGGAGATGCCATGCCAGCCC
1546
2
AAACAAGAGAAGAACTCTGTTTGG
15435- 3' (서열 17)에는 HPIV3 게놈(음성-센스 밑줄침)의 5' 말단에 인접한, 자연발생적인 독특한 Rsr II 사이트 (이탤릭체)를 포함하는 델타 리보자임 (굵은 글씨)의 일부가 위치한다. 플라스미드 p3/7은 델타 리보자임과 T7 터미네이터가 역방향인 것을 제외하고 p218과 동일하다. 상기 삽입물을 함유하는p3/7 플라스미드를 pPIV3-3/7이라 칭하였으며 이것은 HPIV3의 5' 말단 651 뉴클레오타이드에 인접한 T7 터미네이터와 완전한 델타 리보자임을 함유하였다. 이어서 플라스미드 pPIV3-3/7의 SwaI 및 NgoMI 단편을 분리하고 p(E*FF'GHIJKL*)의 SwaI-NgoM I 윈도우내로 클로닝시켯다. 얻어진 플라스미드 p(Right+)는HPIV3의 5' 말단에 인접한 T7 터미네이터와 완전한 델타 리보자임을 포함하였다 (도 9). p(Right+)의 Xho-NgoM I 단편을 p(Left +) 및 p(Left + 2G)의 Xho I - NgoM I 윈도우 내로 클로닝시켜 각각 플라스미드 p3/7(131) (서열 14)와 p3/7(131 2G) (서열 15)를 얻었다. 이들은 각각 HPIV3 안티게놈 RNA의 완전한 양성-센스 동족체를 코딩하며 후자는 전사 효율 향상을 위해 T7 프로모터에 인접한 2개의 G 잔기를 함유하는 cDNA를 코딩한다.
C) 형질도입
6웰 플레이트 중에 HEp-2 세포를 90% 점성도가 되도록 배양하였다. 6-웰 플레이트의 각각의 웰 (1.5 X 106 세포)을 앞서 설명한 3가지 서포트 플라스미드, 즉, 0.4μg pTM(P), 0.4μg pTM(N), 0.05μg pTM(L)과 완전한 길이의 게놈 또는 안티게놈 HPIV3 cDNA 5μg으로 형질도입시켰다. 플라스미드를 LipofectACE (Life Technologies)를 함유하는 0.2 ml OptiMEM1 (Life Technologies)에 첨가하였다. 실 온에서 약 15분간 인큐베이션시킨 후, 2% 소의 태아 혈청과 1.5 x 107 pfu의 MVA-T7을 함유하는 OptiMEM 1 0.8ml를 각각의 웰에 첨가하였다. 배양체들을 32℃에서 12시간 인큐베이션시킨 다음 2% 소의 태아 혈청 함유하는 신선한 OptiMEM 1로 배지를 갈아주었다. 배양체를 32℃에서 다시 3일간 인큐베이션시킨다음 수확하여 신선한 HEp-2 모노레이어상에서 계대시켰다 (1차 계대물이라 칭함). 이 1차 계대 배양체를 32℃에서 5일간 인큐베이션시키고 배양체 중에 존재하는 바이러스를 수확한 다음 LLC-MK2 배지에서 한번 계대시키고 van Wyke Coelin호 등, Virol. 143:569-582 (1985) (본 발명에 참조됨)의 설명에 따라 헤마글루틴화-억제 (HAI)에 의해 특징화하여 이것이 cDNA로부터 회수된 바이러스를 표시하는 모노클로날 항체 내성 변이 (MARM)을 지니는지 결정하였다.
D) 재조합 바이러스의 서열결정
재조합 PIV중 HN 및 L 유전자의 뉴클레오타이드 서열 마커의 존재여부를 회수된 비리온으로부터 분리된 RAN의 RT-PCR에 의해 결정하였다. rPIV (1x 105pfu/ml, 2차 계대) 1ml를 얼음과 함께 1시간 인큐베이션시킴으로써 25% 폴리에틸렌 글리콜 200μl와 함께 침전시키고 12,000 g에서 15분간 원심분리시켰다. RNA를 TRIzol 시약 (Life Technologies)을 이용하여 제조업체의 지침에 따라 정제하였다. 제조업자의 프로토콜에 따라 Superscript 키트 (Life Technologies)를 이용하여 RT-PCR을 수행하였다. PCR 산물이 바이러스 RNA로부터만 유래하고 오염가능성이 있는 cDNA 플라스미드로부터 유래되지 않도록 하기 위해 대조군 반응은 반응에 역전 사가 생략된 것을 제외하고 동일하게 하였다. 4개의 프라이머쌍을 이용하여 nt 7334-8715, 9364-10854, 10939-15392, 및 13623-15392로부터 PCR 산물을 얻었다. 얻어진 PCR 산물을 사이클 디데옥시뉴클레오타이드 서열 분석기 (New England Biolabs, Beverly, MA)을 이용하여 서열분석하였다.
실시예 VII
음성-센스 게놈 RNA를 코딩하는 cDNA로부터 재조합 바이러스의 회수
플라스미드 p218(131)과 3가지 서포트 플라스미드 pTM(N), pTM(P), 및 pTM(L)을 T7 RNA 폴리머라제를 발현하는 MVA를 이용하여 HEp-2 세포내로 형질도입하였다. pTM(N), pTM(P), pTM(L) 및 MVA로 구성된 대조군을 p218(131)없이 HEp-2 세포내로 공동형질도입하였다. 제 4일에, 형질도입체를 수확하고, 신선한 HEp-2 세포 모노레이어상에서 5일간 계대시킨 다음, LLC-MK2 배양체 상에서 다시 5일간 계대시켰다 (2차 계대). 2차 계대 수확물중에 존재하는 바이러스를 HAI에 의해 더욱 자세히 특징화하였다. 완전한 길이의 클론 p218(131) 없이 3가지 서포트 플라스미드만을 받은 형질도임 그룹으로부터의 배양체는 HPIV3을 생산하지 않았다. rPIV 회수 바이러스는 HPIV3에 특이적인 mAbs 77/5, 101/1, 및 454/11과 HAI 분석에서 반응하였기 때문에 HPIV3인 것으로 확인되었다 (표 1). 이것은 mABs 170/7 및 423/6과는 반응하지 못하였기 때문에 cDNA-유도된 것으로 추정되었는데, 이는 cDNA에 도입된 바 있는 MARM 돌연변이와도 일치하는 것이다.
| rJS-NS는p218(131) 완전-길이 음성 센스 cDNA 내로 도입된 MARM 돌연변이를 함유함 | |||||
| 헤마글루티닌-억제 | 항체 적정 | 표시된 mAb의 (역수) | |||
| 바이러스 | 77/51 | 101/11 | 454/111 | 170/12 | 423/62 |
| JS wt3 | 800 | 6400 | 6400 | 25,600 | 25,600 |
| rJS-NS4 | 3200 | 25,600 | 6400 | ≤25 | ≤25 |
1 mAb 77/5는 항체 에피토프 IIB를, mAbs 101/1과 454/11은 HN 당단백질의 항체 에피토프 IIIA를 인식하며, 이들은 모두 p218(131)에서 변형되지 않았다.
2 JSwt의 항체 에피토프 I를 인식하는 mAbs 170/7과 423/6는 두가지 모두 이 부위에서의 MARM 돌연변이 때문에 rJS를 인식하지 못한다.
3 생물학적으로 유도된 야생형 HPIV3 JS.
4 음성-센스 게놈 cDNA로부터 유도된 재조합 JS 바이러스.
도 1은 HPIV3 게놈 RNA의 완전한 복제물을 코딩하는 플라스미드 p218(131)의 구축방법을 도시한 도면이다. p218 (A*A'CC'D*E) (좌상측)의 다이아그램은 HPIV 게놈의 뉴클레오타이드 1에 인접한 델타 리보자임 및 T7 터미네이터의 위치를 도시한다. p(E*FF'GHIJKL*)의 우상측 다이아그램은 7가지 시퀀싱 마커 (꽃표), (다음 도 2 설명 참조), 및 HPIV3의 뉴클레오타이드 15462에 인접한 T7 프로모터를 도시한다. 완전한 길이의 게놈 cDNA를 구축하는데 사용되는 15가지 중복 클론들은 2개의 플라스미드의 외부에 문자로 표시되어 있다. 아래쪽에 도시된 HPIV3의 완전한 음성-센스 게놈 RNA를 코딩하는 p218(131)을 클로닝하기 위해 독특한 제한효소 부 위 NgoMI 및 XHoI를 사용하였다.
도 2는 HPIV3의 HN(1) 및 L(2) 유전자의 cDNA 코딩된 게놈 RNA 중의 마커를 설명한 도면이다. 서열들은 음성 센스이고, 변이부분은 박스안에 표시하였다.
1) 7903에서 비-코딩 nt 치환에 의해 JS wt로부터 Hga I 부위가 제거된다. 7913 및 7915에서의 JS cDNA 중의 뉴클레오타이드 치환에 의해 Sca I 부위가 생성되고 아미노산 370이 프롤린에서 쓰레오닌으로 변경되며, mAb 170/7 및 423/6에 의해 인식된 항체 에피토프가 절제된다. 또한, HN 유전자는 nt7593에서 부가적인 포인트 변이를 함유하는 것으로 밝혀졌는데 이는 이전까지는 인식된 바 없었다. 이로 인해 HN 단백질의 아미노산 위치 263에서 쓰레오닌이 이소류신으로 변경된다.
2) 플라스미드 구축 또는 조립시 발생하는 JS cDNA의 L 유전자에서의 3가지 부수적인 비-코딩 돌연변이를 박스에 표시하였다.
도 3은 PIV3-CAT cDNA (위, 원형 플라스미드로 그려짐) 및 코딩된 미니게놈 RNA (아래, 음성-센스 RNA, 3'에서 5')의 다이아그램이다.
플라스미드: T7 프로모터는 전사 방향을 가리키는 검은색 화살표로 표시되었다. 델타 리보자임, T7 전사 터미네이터, 삽입된 백시니아 바이러스 전사 터미네이터 (T7CT 및 T5AT), 제한효소 부위, 및 코딩된 미니게놈의 여러가지 대역에 해당하는 코딩 서열의 위치를 표시하였다.
미니게놈 RNA: 2개의 비바이러스성 G 잔기를 연장시키는데 기여하는 T7 RNA 폴리머라제에 대한 프로모터에 의해 미니게놈의 5' (오른손쪽) 말단이 정의된다. 이들은 길이를 계산하는데는 산입되지 않았다. 3' 말단은 리보자임에 의해 정의되며 이질적인 뉴클레오타이드는 전혀 없다. PIV3-특이적인 대역은 오픈 박스로서 나타내었다. CAT ORF는 빗금표시하고 번역 개시 (UAC) 및 종결 (AUU) 코돈의 음성-센스 상보서열을 나타냈다. 뉴클레오타이드 위치는 쇼테스트, 898-뉴클레오타이드 미니게놈에 따라 표시하였다. 특정 대역의 뉴클레오타이드 길이를 괄호안에 나타내었다. 위치 90 내지 124의 서열 (3'부터 5', 음성-센스)을 바닥 쪽에 표시하였다; PIV3-특이적인 서열에 밑줄표시하고, 백시니아 바이러스 전사 터미네이터의 보체는 윗줄표시하였으며, XvaI 부위의 보체는 이탤릭체로, CAT ORF에 대한 번역 개시 코돈의 보체는 굵은 글씨체로 나타내었다. PIV3-CAT 0 내지 +6을 초래한 0 내지 6 G 잔기가 삽입된 부분을 표시하였다. 약어: GS, 전사적 유전자-개시 모티프; GE, 전사적 유전자-말단 종결/폴리아데닐화 모티프; NT, 번역되지 않은 유전자 서열.
도 4는 미니게놈 PIV3-CAT 0 내지 +6에 의한 CAT 효소의 발현을 도시한다. 표시된 PIV-3 CAT 미니게놈 및 N, P 및 L 단백질을 코딩하는 플라스미드로 세포들을 형질도입시키고 이와 동시에 T7 RNA 폴리머라제를 발현시키는 백시니아 바이러스 재조합 vTF7-3에 의해 감염시켰다. 용균물을 48시간 동안 포스트-감염시키고, 3000개 세포를 나타내는 샘플을 CAT 활성에 대해 분석하였다. 활성은 6의 배수인 +2 미니게놈에 대해, 100으로서 표시한다. L 플라스미드가 생략된 샘플은 이러한 조건 하에서 검색가능한 CAT 활성을 갖지 않았다.
도 5A 및 5B는 PIV3-3CAT 미니게놈 0 내지 6+에 의한 미니-안티게놈 RNA의 합성을 도시한다. 세포들을 형질도입시키고, 대조군 N 플라스미드 (레인 1) 또는 L 플라스미드 (레인 2)가 생략된 것을 제외하고 도 4에 설명된 바와 같이 감염시켰다. 각각의 경우 형질도입된 PIV3-CAT 미니게놈 플라스미드를 표시하였다. 세포 용해물을 48시간 후-형질도입하여 제조하였다: 1 분주액을 마이크로코커스 뉴클리아제로 처리하고 (처리군), 두번째 것은 모방-처리하였다 (미처리군). 이어서 RNA 정제에 의해 프로세싱하였다. RNAs를 음성-센스 CAT 리보프로브로 Nothern 블롯 하이브리다이제이션에 의해 분석하였다. 뉴클리레이즈 처리를 위한 대조군 및 마커로서 RSV-CAT C2 미니게놈 (Grosfeld외, J. Virol. 69:5677-5686 (1995), 본 발명에 참조됨)을 RSV N, P 및 L 단백질에 의해 상보시키고 나란히 프로세싱하였다 (레인 10). 하이브리다이제이션된 블롯의 오토다이아그램을 도 5A에 나타내었다. 도 5B는 +2 미니게놈에 상대적인 하이브리다이제이션양을 처리된 샘플과 미처리 샘플에 대해 각각 산출한 포스포이미지 분석 결과를 보여준다.
도 6A 및 6B는 PIV-CAT 미니게놈 0 내지 +6에 의한 폴리아데닐화된 mRNA의 합성을 도시한다. 도 5A및 5B에 도시된 바와 같이 동 실험으로부터의 세포 분주액을 이용하여, 48시간 후-형질도입시에 총 세포내 RNA를 수확하고 올리고(dT) 크로마토그래피에 의해 결합된 분획 및 미결합 분획으로 분획화시키고, 이를 음성-센스 CAT 리보프로브를 이용하여 Nothern 블롯 하이브리다이제이션에 의해 분석하였다. 도 6A는 하이브리다이제이션된 블롯의 오토라디오그램을 나타낸다. 도 6B는 +2 미니게놈의 결합된 RNA 분획에 대해 상대적으로 하이브리다이제이션 양이 정상화된 포스포이미지 분석 결과를 나타내며, 이를 결합 분획과 미결합 분획에 대해 별도로 산출하였다.
도 7A 및 7B는 PIV-CAT 미니게놈 0 내지 +6을 코딩하는 플라스미드에 대한 세포내 미니게놈의 축적을 도시한다. 이것은 도 5A 및 5B에 도시된 실험의 연속실험이다. 따라서, 미니게놈과 N, P 및 L 단백질을 코딩하는 플라스미드로 형질도입되어 vTF7-3으로 감염된 세포들을 48시간 후-형질도입 수확하고 세포 용해물을 제조하였다. 용해물의 1 분주액을 마이크로코커스 뉴클리레이드로 처리하고 (처리군) 다른 하나는 모방-처리하였다 (미처리군). 이어서, RNA 정제에 의해 프로세싱하였다. 도 5A에서는 리보프로브가 음성-센스였던 반면, 이 실험에서는 양성-센스 CAT 리보프로브를 이용하여 RNA를 Northern 블롯 하이브리다이제이션에 의해 분석하였다. 도 7A는 하이브리다이제이션된 블롯의 오토라디오그램을 도시한다. 도 7B는 +2 미니게놈에 상대적으로 하이브리다이제이션 양을 처리 및 미처리 샘플에 대해 개별적으로 산출한 포스포이미지 분석결과를 도시한다.
도 8-10은 p3/7(131)2G의 구축을 도시한 것이다. p3/7(131)2G는 완전한 양성-센스 HPIV3 안티게놈을 코딩하며 안티게놈의 뉴클레오타이드 1과 T7 프로모터 사이에 2개의 G 잔기를 함유한다. 음성-센스 게놈을 코딩하는 cDNA 218(131)의 왼쪽 절반과 오른쪽 절반을 별도로 변형시켜 구축하였다. 동일한 계획에 따라, 두번째 cDNA, p3/7(131)을 구축하였으며 이것은 2개의 G 잔기가 생략되니 것을 제외하고 p3/7(131)2G와 동일하다.
도 8은 p218(A*A'CC'D*E)의 T7 전사 터미네이터 및 리보자임을 2개의 G 잔기를 포함하는 T7 프로모터로 치환함으로써 p(Left+2G)를 구축하는 방법을 도시한 것이다. T7 프로모터를 도입한 좌측 PCR 프라이머를 이용하여 HPIV3 게놈 ("PIV3seq" 로 표시된 검은 사각형)의 좌측 1224 뉴클레오타이드를 증폭시키는 PCR에서 p218(A*A'CC'D*E)을 템플레이트로서 사용하였다. 이 PCR 단편을 p218(A*A'CC'D*E)의 MluI-PmlI 윈도우내로 클로닝시켜 p(Left+2G)를 얻었다.
도 9는 양성-센스(안티게놈) 스트랜드 내에 PIV3 뉴클레오타이드 15462에 인접하여 위치한 T7 터키메이터와 리보자임으로 p(E*FF'GHIHKL*)의 프로모터를 치환함으로써 p(Right+)를 구축하는 것을 도시한다. p(E*FF'GHIHKL*)을 PCR에서 템플레이트로서, 델타 리보자임 (자연발생적인 RsrII 위치)의 일부를 부가한 돌연변이 올리고뉴클레오타이드를 이용하여 HPIV3 게놈 ("PIV3 seq"로 표시된 검은 사각형)의 우측 649 뉴클레오타이드를 증폭시켰다. 이 PCR 산물을 p3/7의 RsrII-BssHII 윈도우내로 클로닝시켜 pPIV3-3/7을 생산하고, T7 터미네이터에 의해 플랭크된 완전한 리보자임을 재구축하였다. pPIV3-3/7의 SwaI-NgoMI 단편을 p(E*FF'GHIHKL*)의 SwaI-NgoMI 윈도우내로 클로닝시켜, p(Right+)를 얻었다. 7개의 서열 마커의 위치를 꽃표(*)로 표시하였다.
도 10은 p3/7(131)2G의 구축을 도시한다. p(Right+)의 NgoMI-XhoI 단편을 p(Left+2G)의 NgoMI-XhoI 윈도우 내로 클로닝시켜 p3/7(131)2G를 얻었다. HPIV3 유전자의 위치를 표시하였다 (not to scale). 서열 마커의 위치를 꽃표로 표시하였다.
도 11은 음성 센스 재조합 PIV3의 서열 확인도이다. 7903, 7913, 및 7915에서의 돌연변이를 포함하는 1379 bp 단편(뉴클레오타이드 7334-8713)을 감염된 세포로부터의 RNA의 RT-PCR에 의해 제조한 다음 사이클-시퀀싱에 의해 분석하였다. JS 와 구별되는 재조합 PIV의 돌연변이를 화살표로 표시하였다. nt7897 내지 7922에 걸친 완전한 서열을 각각의 겔 옆의 여백에 나타내고, 3개의 상이한 뉴클레오타이드는 굵게 표시하였다.
도 12는 L 단백질 서열 중 942, 992, 및 1558 위치에서 아미노산 치환된 PIV3 L cDNA를 함유하는 플라스미드 pTM(L)942/992/1558의 지도를 도시한다. 각각의 코딩 변경의 상대적인 위치를 aa 위치와 함께 표시하고, 마커로서 고의로 절제시킨 자연발생적인 제한효소 위치를 함께 표시하였다. 클로닝에 사용된 제한효소 위치 (SphI, PinAI, BamHI 및 NheI)를 표시하였다. 화살표는 L 단백질 코딩 서열의 방향을 나타내며 아미노산 위치에 따라 번호를 매겼다.
도 13은 본 발명 범위에서 대표적인 변이를 나타내는 재조합 PIV3 바이러스의 대표적인 도면이다.
도 14A 및 14B는 PIV3 HN 및 F ORF가 PIV1에 의해 치환된 키메라 PIV3-PIV1 안티게놈을 코딩하는 cDNA의 구축을 도시한 도면이다. 먼저 (좌하측부터 시작) 완전한 길이의 PIV3 cDNA 클론 p3/7(131)2G (패널 A)로부터 PIV3 F 및 HN 유전자를 서브클로닝시켜 (BspE-II-Xho I 및 Ecor I-Spe I 단편으로서) 각각 pLit.PIV3.F3a 및 pLit.PIV3.HN4를 제조하였다 (패널 B). PCR 돌연변이 (패널 C)를 수행하여 PIV3 F 및 HN 유전자의 완전한 코딩 대역을 삭제하고 새로운 제한효소 부위 (박스 표시)를 도입하였다. PIV1 F 및 HN cDNA를 RT-PCR에 의해 감염된- 세포 RNA로부터 제조하고 pLITMUS28 내로 클로닝시켰다 (패널 D). 이 클론들, pLIt.1Fwt 및 pLit.1HNwt을 이들의 개시코돈 및 종결코돈에서 PIV1 F 및 HN 유전자의 변형을 위해 템플레이트로서 사용하여 PIV3 결실에 이들이 도입된 것과 적합성을 갖는 새로운 제한효소 부위를 도입하였다 (패널 E). 키메라 F 및 HN 유전자를 함께 조립하여 pSE.PIV3-1.hc를 제조하였다 (패널 G). BspE I-Sph I 단편을 치환함으로써 완전한 길이의 PIV3 클론 p3/7(131)2G 내로 F 및 HN 키메라 세그먼트를 도입하여 pFLC.2G+.hc를 제조하였다 (패널 H). 유전자들 사이의 작은 박스는 유전자 말단, 유전자내부, 및 유전자 개시 대역을 나타내며, 선은 비-코딩 대역을 나타낸다. 빗금친 부분은 PIV1으로부터, 오픈 박스는 PIV3으로부터 유리한다. 검은색 화살표는 T7 프로모터를, 검은색 박스는 간염 델타 바이러스 (HDV) 리보자임을 가리킨다.
도 15A는 키메라 rPIV3-1 (중간)의 키메라 HN 및 F 유전자와 함께 rPIV3/JS (위; rJS 및 JS wt rPIV3이라고도 칭함) 및 PIV1/Wash64 (아래)의 다이아그램이다. PIV3으로부터 PIV1까지의 서열 이동을 함유하는 4개의 접합 대역을 박스로 표시하고 I 내지 IV료 표시하였다. 유전자들 사이의 각각의 작은 박스는 유전자 말단, 유전자 내부, 및 유전자 개시 대역을 나타내며 선은 비-코딩 대역을 나타낸다. PIV3 M 및 L 유전자 (위쪽 프라이머쌍 A)에 특이적이거나, 또는 PIV1 M 및 HN 유전자 (아래쪽 프라이머쌍 B)에 특이적인 RT-PCR 프라이머를 사용하였다. 도 14A 및 14B는 화살표로 나타내었다.
도 15B는 도 14A 및 14B에 설명된 PIV3- 또는 PIV1-특이적인 프라이머쌍 및 템플레이트로서 비리온 RNA (vRNA)를 이용하여 제조된 RT-PCR 산물을 평가한 도면이다. 표시된 바와 같이, 각각의 템플레이트에서 역전사 단계를 중복 생략하여 PCR 산물이 RNA로부터 유래됨을 확인하였다. rPIV3-1의 경우, PIV3-특이적인 프라이머쌍 A는 예상됐던 4.6 kb 산물을 얻게한 반면, rPIV3-1에 존재하지 않는 PIV-1 서열에 특이적인, 프라이머쌍 B는 생성물을 형성하지 않았다. rPIV3/JS (rPIV3으로 표시) 또는 PIV1/Wash64 (PIV1으로 표시)를 이용한 양성 대조군을 함께 나타내었다.
도 16은 도 14A 및 14B에 도시된 rPIV3-1의 RT-PCR 산물 중 PIV3-PIV1 접합 서열을 나타낸다. 4개의 접합 대역 (대역 I-IV) 각각의 서열을 제시하였으며, RT-PCR 산물로부터 나랄히 시퀀싱된 상응하는 rPIV3/JS (위쪽의 선)과 PIV1/Wash64 (아래쪽 선)에 해당하는 대역과 정렬시켰다. 수직 막대는 서열 동일성을 가리키며, 박스표시한 대역은 도입된 돌연변이 및 제한효소 부위를 가리킨다. 키메라 F 유전자 중의 Gln에서 Glu로의 코돈 변화를 빅금친 박스 안에 나타내었다. 개시 코돈과 종결 코돈에는 밑줄을 그었다.
도 17A 및 17B는 rPIV3 (좌측) 또는 PIV1 (우측)과 비교한 rPIV3-1의 RT-PCR 산물의 대역 III (좌측) 및 IV(우측)의 시퀀싱 겔을 도시한다. 개시 코돈과 종결 코돈을 박스로 표시하고, 제한효소 위치는 화살표로 표시하였다.
도 18은 조직 배양액 중 모친 및 키메라 PIVs의 멀티사이클 성장을 도시한 것이다. LLC-MK2 세포 단층에 바이러스를 0.01 MOI로 접종하고, 바이러스-감염된 세포를 32℃에서 트립신 존재 하에 인큐베이션시켰다. 조직 배양 상등액을 24시간 간격으로 수확, 냉동하고 혈액흡착을 이용한 동 TCID50 분석에 의해 바이러스-감염된 배양체를 동정하였다. 각각의 점(포인트)은 세가지 별도 배양체의 평균 적정치를 나타낸다. S.E. 표시함. 점선으로 표시한 수평선은 바이러스 검색 하한치를 가리킨다.
도 19는 cp45의 세가지 L 유전자 돌연변이를 키메라 바이러스 rPIV3-1의 안티게놈 cDNA 클론인 pFLC.2G+hc내에 도입하는 것을 도시한다. pTM(L)942/992/1558 (A)는 cp45에서 발견된 3가지 돌연변이를 갖는 L 유전자의 플라스미드 클론이다. PIV3 L 단백질 중 아미노산 위치 942에서의 돌연변이는 tyr(wt)를 his(cp45)로 치환한 것이고 그 옆의 Eae I 위치는 이 위치를 표시하기 위해 개열시켰다. 마찬가지로, 992 돌연변이는 leu를 phe로 변경한 것이고 (Bsr I 위치를 개열) 1558 돌연변이는 thr을 ile로 변경한 것으로 Ava II 위치가 개열된 것이다. pTM(L)942/992/11558에 존재하는 2.9kb SphI-NheI 단편을, rPIV3-1의 완전한 길이의 cDNA 클론을 갖는 플라스미드인 pFLC.2G+hc(B) 내로 도입하여 pFLC+hc.cp45L(C)를 제조하였다. (B) 및 (C)의 구축에 있어서, 검은색 박스는 간염 D 바이러스 리보자임의 위치 및 T7 터미네이터의 위치를 나타내고, 빗금친 부분은 PIV1 HN 및 F ORFs를 나타내며, 오픈 박스는 PIV3으로부터 유도된 서열들을 가리킨다. pFLC.2G+.hc.cp45L을 형질도입에 이용하여 rPIV3-1.cp45L로 표시된 약독화 키메라 재조합 바이러스를 생산하였다.
cDNA로부터 rPIV가 회수되었는지를 확인하기 위해서, 7개 삽입된 마커 돌연변이을 둘러싼 4개 프라이머쌍을 이용하는 RT-PCR방법으로 야생형 JS 균주 HPIV3와 함께 그것을 분석하였다. 얻어진 각각의 PCR산물은 RT을 포함여부에 의존적이었으며,이러한 사실은 각각이 오염 cDNA로부터가 아니라 RNA로부터 유래되었음을 나타낸다. 4개 PCR산물의 순환-서열분석(cycle-sequencing)에 의해, rPIV의 서열이 각 각의 7개 마커를 포함함을 확인하였으며, 3가지 마커를 나타내는 서열분석 자료가 도 11에 나타나 있다. 7903, 7913 및 7915 nt를 포함하는 HN 유전자에서 rPIV와 JS wt간의 서열차이가 분명하다. 7593, 10355, 11333, 및 15248 nt위치에서 다른 4개의 마커에 대해서도 유사한 서열분석 실험을 행하였으며, rPIV는 각 돌연변이를 가지고 있었다.
이러한 결과는 (-)센스 게놈 RNA를 코딩하는 cDNA로부터 감염성 rPIV의 회수가 성공적이었음을 나타낸다. 이것은 단편화되지 않은 (-) cDNA사슬 바이러스의 회수에 대한 많은 공지된 보고서와는 다르며, 이러한 보고서에서는 바이러스 회수를 위해 사용된 cDNA는 (+)센스 안티게놈 RNA를 코딩하기 위해 고안되었다(Baron and barrett, 상기문헌, 1997; Collin et al., 상기문헌, 1995; Conzelmann, 상기문헌, 1996; Garcin et al., 상기문헌, 1995; Lawson et al., 상기문헌, 1995; Radcke et al., 상기문헌, 1995; Whelan et al., 상기문헌, 1995). 게놈RNA를 코딩하는 cDNA로부터 감염성 바이러스의 회수는 Sendai 바이러스에 대해서만 이전에 보고되었고 회수율은 안티게놈 RNA를 코딩하는 cDNA에 대한 것보다 훨씬 낮았다(Kato et al., 1996). 대부분의 다른 연구에서, 바이러스의 회수는 게놈cDNA가 아니라 안티게놈 cDNA로 이루어졌다(Lawson et al., 1995; Whelan et al., 1995). 이러한 예상치 못한 결과를 설명하는 많은 잠재적인 문제점이 있는데, 보조 플라스미드에 의해서 생산된 mRNA와 cDNA가 코딩하는 게놈RNA가 접합할 수 있어 불활성 하이브리드를 생성할 수 있다(Conzelmann, 상기문헌, 1996; Lawson et al., 상기문헌, 1995). 또한, T7 RNA폴리머라제는 게놈RNA의 유전자 접합부(junction)에서 우선적으로 종결되며, 이는 아마도 GE 신호의 올리고 U트랙이 T7 RNA폴리머라제에 의한 전사종료를 위한 자연신호와 유사하기 때문일 것이다(Whelan et al., 상기문헌, 1995).
실시예 VII
(+)-센스 안티게놈 RNA을 코딩하는 cDNA로부터 재조합 바이러스의 회수
상술한 바와 같이, 재조합 PIV를 생성하는 (+)센스 안티게놈을 코딩하기 위해서 p3/7(131) 및 p3/7(131)2G를 제조하였다. 플라스미드 p3/7(131)2G는 p3/7(131)와 동일하나, T7프로모터와 안티게놈의 첫번째 뉴클레오타이드사이에 두개의 G잔기를 첨가한 것이 다르다. T7프로모터와 첫번째 HIV3 뉴클레오타이드 p3/7(131)G2 사이에 두개의 G잔기 첨가는 두개의 첨가된 G잔기의 존재로 실질적으로 미니레플리콘(minireplicon)의 복제가 증가됨을 설명하는 이전의 실시예에 기초한 것이다.
N, P 및 L 보조 플라스미드와 함께, 두 안티게놈 cDNA {p3/7(131) 및 p3/7(131)2G}로서 별도로 세포를 형질감염시키고, p218(131)에 대해 이전에 기술한 동일한 절차로 MVA-7 재조합 바이러스를 동시에 감염시켰다. 각 안티게놈 cDNA로부터 감염성 바이러스가 회수되고 아마도 mAbs423/6 및 170/7과 반응할 수 있는 그의 능력에 기초하여 cDNA유도가 확인되었다.
게놈 cDNAp218(131)에 대하여 각각의 안티게놈 cDNA에 대해 바이러스 회수율을 측정하였다. 두 cDNA로부터의 바이러스 회수율을 비교하기 위해서, (+)센스 안티게놈 cDNA p3/7(131)2G(SEQ ID NO: 15)를 사용하여 12회 형질감염과 병행하여, (-)센스 게놈 cDNA p218(131)(SEQ ID NO: 1)를 사용하여 12회 형질전환을 수행하였 다. 각 웰로부터 1ml의 형질감염 수확물을 LLC-MK2 세포에 떨어뜨리고 나머지 2ml를 신선한 LLC-MK2세포로 계대배양하였다(계대배양 1). 5일째에, 계대배양 1을 수확하고 상술한 바와 같이 농도를 측정하였다. 재조합 바이러스를 p3/7(131)2로 형질감염된 12/12웰과 p218(131)로 감염된 4/12웰로부터 회수하였다. (+)센스 안티게놈으로부터 계대배양한 바이러스의 배양물에 존재하는 바이러스의 평균 농도는 105.0이며, 이는 (-)센스 게놈에 대한 농도(104.1)보다 거의 10배가 높았다. 그러나, 한번의 추가 증폭으로 농도가 동일하게 되었다.
(1) 재조합 바이러스를 생산함에 있어서 게놈 cDNA 또는 안티게놈 cDNA중 어느 것이 더 효율적인지를 결정하기 위해서, (2) 두개의 추가 5' G잔기가 재조합 바이러스의 수율에 미치는 영향을 결정하기 위해서, HPIV3 RNA 게놈 및 안티게놈를 코딩하는 3가지 완전한 길이의 플라스미드로부터 재조합 바이러스의 회수율을 조사하였다(표 2). 불행하게도, 나머지 MVA-T7이 LLC-MK2 단층배양에서 rJS의 플라크 형성을 방해하기 때문에, 플라크 농도측정에 의해서 혈질감염 수확물에 대해서 직접적으로 농도를 측정할 수 없다. 따라서, 먼저, 우리는 다수의 독립적인 형질감염으로부터 rJS의 회수율을 비교하였으며, 다른 실험에서 알 수 있는 바와 같이, rJS는 p218(131)로 형질감염시킨 배양물로부터의 회수보다 p3/7(131)로 형질감염시킨 배양물로부터 더 빈번히 회수되었다. p218(131)로 감염된 것을 포함하는 각각의 형질전환 수확물 다른 실험에서 rJS를 생산하기 때문에, 재조합 바이러스의 상대적인 생산율을 비교하기 위해서 이러한 분석방법을 사용할 수 없다. 따라서, 우리는 형질감염 수확물의 1 대 계대배양을 콩해 바이러스의 양을 정량화함으로써 형질감염 수확물에 존재하는 바이러스의 상대적인 양을 측정하였다(표 2). 동일한 바이러스(rJS)를 생산하기 위해서 각 플라스미드를 고안하였기 때문에, 계대배양된 바이러스의 농도차이는 형질감염 수확물에 존재하는 바이러스 농도의 차이를 반영하는 것으로 간주된다. 상기 실험에서, 5' 말단 G잔기를 갖는 구조물이 rJS를 생산하는데 가장 효과적이었다. 이것은 첨가된 두 잔기가 회수율을 증가시킴을 나타내나, 이러한 약간의 효율증가의 기작은 모른다. 이러한 발견은 HPIV3 cDNA로 돌연변이를 도입하기 위해서 고안된 미래의 실험의 기질로서 p3/7(131)을 사용할 수 있다. 이는 작지만 측정할 수 있는 장점을 제공한다. 5' 말단에 3개의 G잔기를 포함하는 안티게놈 cDNA로부터 VSV가 회수되었을 지라도, 이 구조물로부터 바이러스의 회수율을 여분의 잔기가 없는 동일한 구조물로부터 회수와 구별할 수 없다(Whelan, et al., Proc, Natl. Acad. Sci. USA 92:3238-8392 (1995). 본문헌은 본명세서에 참고문헌으로 병합됨. 센다이(Sendai) 바이러스와 홍역(measles) 바이러스로 행한 실험과 대조적으로, 안티게놈의 5' 말단에서 여분의 바이러스 G잔기는 재조합 바이러스의 회수에 유해하지 않으며, 사실상 유리한 것 같다(Garcin et al., 상기문헌. 1995; Radecke et al., 상기문헌, 1995; Kato et al., 1996).
상술한 실험과 유사한 실험에서, p3/7(131)(SEQ ID NO: 14)로부터 바이러스 회수율을 p3/7(131)2G(SEQ ID NO: 15) 및 p128(131) (SEQ ID NO: 1)의 바이러스 회수율과 비교하였다. p3/7(131)으로부터 회수는 p217 (131)의 회수율과 비슷해다. 회수는 여분의 G들을 포함하는 안티게놈 cDNA 둘다 일정하고 효율적으로 회수하였다(표 2).
실시예 VII
허용온도 및 제한 온도에서 rPIV의 플라크형성율
상술한 바와 같으나 다음과 같은 변형으로, LLC-MK2 단층 배양물에서 두 p128(131) 및 p3/7(131)2G로부터 유래된 rPIV와 대조 바이러스의 생체외 복제의 온도민감성 정도를 32℃, 37℃, 39℃ 및 40℃에서 결정하였다(Hall et al., Virus Res. 22: 173-184, 1992). 본 문헌은 본명세서에 참고문헌으로 병합됨. 24-웰 플레이트상의 LLC-MK2 단층에서 10배 희석 시리즈로 바이러스를 배야하였다. 그런후, 2mM 글루타민 및 0.8%의 메틸셀룰로스가 보충된 L-15 1ml를 상기 배양물위에 중층하고, 상기 플레이트를 5일간 지시 온도에서 배양하였다. 메틸셀룰로스 중층을 제거하고 1시간동안 4℃에서 80%의 메탄올로 상기 단층을 고정하였다. 이전에 기술한(Murphy et al., Vaccine 8: 497-502 (1990), 본문헌은 본명세서에서 참고문헌으로 병합됨) 쥐의 항체에 대해 특이적인 면역퍼옥시다제 염색법을 사용하여, 1:500희석으로 아시테스 용액으로서 HPIV3-특이적 안티-HN 쥐의 mAbs 101/1 및 66/4의 혼합물로 단층에 존재하는 바이러스 플라크를 세었다.
(+) 또는 (-) 센스 cDNA 둘중 어느 하나로부터 유래된 재조합 바이러스가 JS wt바이러스와 유사한 표현형을 가지는 지를 결정하기 위해서, 상기 바이러스의 특성을 32℃, 37℃, 39℃, 및 40℃플라크 분석으로 분석하였다. (+) 또는 (-) 센스 rPIV 둘다는 39℃ 및 40℃의 증가된 온도에서 복제의 수준이 JS wt 바이러스와 유사하였다(표 3). 이것은 37℃에서 30배 농도 감소를 나타내나, 39℃ 또는 40℃에서 플라크를 형성하기 못하는 변이체 JS cp45와 대조적이다.
JS cp45서열을 완전히 결정하고 리더, N, P, M, F, HN 및 L 유전자에서 돌연변이를 확인하였다. 그러나, 돌연변이가 ca, att, 또는 ts 표현형의 원인인지는 모른다. 발명의 전형적인 rPIV는 모 JS wt와 같은 ts 표현형을 설명하기 때문에, 각각의 돌연변이 또는 이들의 결합 효과를 정확히 나타내기 위해서, 예를 들면 증가된 온도에서 관심있는 돌연변이을 포함하는 재조합 바이러스의 복제를 측정함으로써, 다른 알려지거나 이제까지 발견된 PIV에 대한 cp45 돌연변이를 단독으로 또는 공동으로 완전한 길이의 cDNA로 도입할 수 있다. 따라서 다음에 기술하는 바와 같이, 확인된 돌연변이를 효과적이로 약독화시킨 백신제에 포함시킬 수 있다. 코돈당 2이상의 뉴클레오타이드를 치환시켜 생물학적으로 유도된 돌연변이 균주에 비해 재조합 바이러스가 유전적으로 더욱 안정하도록, 예를 들면, 돌연변이야기와 같은 방법으로 재조합 PIV에 포함된 이러한 돌연변이 및 다른 돌연변이를 추가로 최적화할 수 있다.
실시예 VIII
햄스터에서 rPIV의 복제
36 내지 16-주령 골든 시리안 햄스터를 9마리씩 4그룹으로 나누고, (-)센스 cDNA로부터 회수된 rPIV, (+)센스 cDNA로부터 회수된 rPIV인 JS cp45, 또는 JS wt 바이러ㅅ스중 어느 하나를 105.5 pfu를 함유하는 액 0.1ml를 비강으로 접종하였다. 4일째, 상기 햄스터를 희생하고 폐와 코의 갑개골을 수확하였다. 2.5㎍/ml 암포테리신 B (Quality Biologicals, Gaithersburg, MD), 200㎍/ml 피페리실린(Lederle Laboratories, Pearl River, NY), 및 50㎍/ml 젠타미신(Quality Biologicals)을 함유하는 20% w/v L-5 현탁액에서 상기 폐를 균질화하였다. 유사하게 상기 코갑개골을 10% w/v L-5현탁액에서 균질화하였다. 그런 후에, 상기 샘플을 나누고 드라이아이스-에탄올 베쓰에서 급속하게 냉동시켰다. 접종후 5 및 7일에 CPE를 세어서 32℃에서 LLC-MK2세포를 갖는 96웰상에서 상기 샘플에 존재하는 바이러스의 농도를 측정하였다. 각 그룹의 9마리 햄스터에 대해서 평균 log10TCID50/gm를 계산하였다.
표 4는 (-)센스 cDNA로부터 회수된 rPIV, (+)센스 cDNA로부터 회수된 rPIV가 햄스터의 상부 및 하부 호흡관에서 JS wt와 실질적으로 같은 수준으로 복제함을 나타낸다. 이것은 각 위치에서 약독화되는 JS cp45바이러스와 상반된다.
따라서, 본발명의 전형적인 rPIV가 생물학적으로 유래된 JS wt 모균주가 햄스터에서 나타내는 복제능을 보유할 수 있으며, 인간이 아닌 영장류 및 사람을 포함하는 다른 숙주 및 햄스터에서 복제가 제한되는 JS cp45 백신후보에 존재하는 것과 같은 돌연변이를 확인할 수 있으며, 아래의 실시예에서 기술한 바와 같이 본발명의 변형된 rPIV 균주내에 포함된다.
실시예 IX
약독화 표현형을 구체화하는 HPIV3에서 아미노산 치환의 동정, 및 감염, 약독화된 PIV클론으로 약독화 독연변이의 도입
cDNA로부터 감염성 PIV를 생성하는 능력이 살아있는-약독화된 파라인플루엔 자 바이러스 백신의 개발을 용이하게 한다. 더욱 구체적으로는, 본명세서에서 기술된 방법과 도구를 사용함으로써 PIV 백신후보의 약독화의 유전적 근거을 용이하게 결정할 수 있고, cDNA로부터 얻은 감염성 PIV백신을 고안하여 약독화정도 및 면역원성을 미세하게 조절된 수준으로 달성할 수 있다.
추가로, 본발명의 방법과 도구는 사람의 질병에 있어서 가장 중요한 모든 3가지 사람의 파라인플루엔자 바이러스, HPIV1, HPIV2, 및 HPIV3 바이러스에 대한 백신개발을 위해서도 제공된다. 예를 들면, 본발명내에서 효과적인 HPIV3백시제를 제조하고 선택하기 위해서, 생물학적 유로 유래된 HPIV3 백신후보 또는 약독화된 BPIV3 바이러스의 원화는 표현형과 관련된 돌연변이, 예를 들면 약독화 돌연변이를 동정하고 rPIV로 병합할 수 있다. 이러한 방법을 적용함으로써, 약독화와 면역원성간에 바람직한 균형을 갖는 rPIV, 즉 사람에서 복제하고 약독화 표현형을 가진 것을 제조하기 위해서, 다수의 후보중에서 얻은 약독화 돌연변이를 선택하고 결합한다.
본 실시예에서, 살아있는 약독화 바이러스인 PIV3 JS cp45의 온도민감성(ts)와 생체내 약독화(att)표현형에 대한 유전적 근거를 기술하고 있다. 완전한 길이으의 안티게놈 cDNA로부터 7가지 전형적인 재조합 PIV3 바이러스(한군데 손상된 3가지 바이러스, 두군데 손상된 3가지 바이러스 및 세군데 손상된 한가지 바이러스)를 회수하고 이들의 ts 및 att 표현형을 분석하였다. 이들 재조합체는 JS wt 모바이러스의 cDNA클론내에서 채택된, JS cp45(혹은 본명세서에서 cp45라고 함)의 L유전자에 존재하는 하나 이상의 아미노산 치환을 가지고 있었다. 이들 3가지 전형적인 생물학적으로 유래된 돌연변이는 모두 Vero 세포에서 배양된 JS cp45의 대표적인 균주에 존재하며, 이를 JS cp45 Vero라고 지정하며, 부다페스트 조약에 따라 미국 매릴랜드 20852, 록빌, 파크론 드라이드 12301에 위치한 ATCC에 1997년 8월 21에 기탁되었으며, 기탁번호 ATCC VR 2588 를 받았다.
다음에서 제시된 전형적인 PIV 재조합체의 분석은 L에 있는 3가지 전형적인 돌연변이 (Tyr942을 His로, Leu992를 Phe로, Thr1558를 Ile로)는 cp45의 ts 및 att 표현형에 기여하고, 재조합 백신 바이러스의 생산에 유용하다.
바이러스 및 세포
이전에 기술된 대로(Hall et al., Virus Res 22:173-184 (1992)), PIV3 JS wt 및 cp45 바이러스를 LLC-MK2세포에서 배양하였다. vTF7-3 재조합 백신 바이러스는 Fuerst등의 virology 225:419-422 (1996)에 기재되어 있고, T7 폴리머라제를 발현하는 변형된 백시니아 바이러스 안카라(Ankara)(MVA)는 Wyatt등의 Virology 210: 202-205 (1995)에 기재되어 있다(각 문헌은 본명세서에 참고문헌으로 병합되어 있음). HEp-2 세포(ATCC CCL 23)과 LLC-MK2 (ATCC CCL 7.1)세포를 2%의 FBS 및 젠타미신 설페이트(㎍/ml)가 보충된 OptiMEM(Life Technologies)에서 유지시켰다.
PIV3의 L유전자에서 점돌연변이의 제조
부위 특이적 돌연변이에 의해서 L유전자에 점돌연변이를 도입하기 위해서, pUC19를 변형하여 JS wt PIV3 L 유전자의 단편을 포함하도록 하였다. 첫째, pUC 19(N)을 제조하기 위해서, Nhe I제한효소자리를 포함하는 상보적 올리고뉴클레오타 이드(5'GATCGATGCTAGCCC3')(SEQ ID NO: 23) 및 5' GATCGGGCTAGCATC 3'(SEQ ID NO: 24)쌍을 pUC19 Hind III접합함으로써 유일한 제한 효소자리인 Nhe I을 pUC19에 도입하였다. cp45에서 3개의 코딩 변화가 일어나는 위치를 포함하고 직접적으로 완전한 길이의 PIV3 cDNA(아래를 참조)에 도입될 수 있는, pTM(L)의 Sph I(PIV3 net 11317)내지 Nhe I (PIV3 nt 14087) 단편을 pUC19 (N)의 Sph I 및 Nhe I 자리로 클로닝하여 pUCL(N-S)를 만들었다. (1) L 단백질의 942, 992, 1558위치에서 전형적인 아미노산 치환을 제조하고, (2) 마커로서 각 코돈 치환에 인접한 자연적으로 일어날 수 있는 하나의 특이적 제한효소자리를 삭제하기 위해서, Transformer mutagenesis kit(Clontech, Palo Alto, CA)으로 변이형성 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 pUCL (N-S)로 점돌연변이를 도입하였다.(표 5를 참조)
플라스미드 DNA의 다이데옥시뉴클레오타이드 서열분석을 함으로써 pUCL (N- S) 유도체에 도입된 돌연변이를 증명하였다. cp45 개별 L 유전자 변이를 포함하는 pUCL(N-S)의 Sph I 내지 BamHI(nt 13733) 단편을 pTM(L)의 Sph I내지 BamHI 자리로 서브클로닝하여 pTM(L) -942, -992, -942/992 및 -1558를 만들었다; pin AI 및 Nhe I자리를 사용하여 다른 이중 돌연변이 및 삼중 돌연변이를 모았다(도 12).플라스미드가 코딩하는 미니게놈 RNA 및 N, P, 및 L단백질로 이루어지는 미니레플리콘 시스템에서, 클로로암페니콜 아세틸 트랜스퍼라제의 발현을 지시하는 능력에 대해서, 허용온도(32℃)에서 돌연변이체 pTM(L) 플라스미드를 각각 테스트하였다(Durbin et al., Virology 234: 74-78 (1997), 본문헌은 명세서에 참고문헌으로 병합됨). 여러가지 변이 L 플라스미드가 마커 유전자 발현을 wt L의 75-106%수준으로 지지하였으며, 이는 각각의 가공된 cDNA가 상당한 가짜 변이가 아님을 나타냈다(결과를 나타내지 않음). 각 변이 pTM(L) 플라스미드의 Sph I 내지 Nhe I 단편을 완전한 길이의 PIV3 JS 안티게놈 cDNA p3/7(131)의 Sph I 내지 Nhe I 윈도우로 서브클로닝하여 3가지 치환의 모든 가능한 조합을 나타내는 7가지 완전한 길이의 PIV3 cDNA 클론을 제조하였다.
cp45 L 단백질의 하나, 둘, 또는 세개의 치환을 포함하는 재조합 PIV3(rPIV3)의 회수
위에서 상술한 바와 같이, LipofectACE(Life Technologies) 및 MVA-T7을 사용하여 6웰 플레이트(Costar, Cambridge,MA)상의 HEp-2 세포로, 3가지 보조 플라스미드, pTM(N), pTM(P), pTM(L)과 함께, 하나 이상의 cp45 L 유전자 변이를 포함하는 각각의 완전한 길이의 안티게놈 cDNA을 형질감염시켰다. 32℃에서 4시간동안 배야양한후에, 6웰 플레이트상의 HEp-2세포로 형질감염 수확물을 계대배양하고, 이를 32℃에서 4일간 배양하였다. 각각의 계대배양 1 상등액을 취하여 LLC-MK세포의 T-25 플라스크로 계대배양하였다. 제 2 계대배양 상등액을 수확하고, 바이러스 플라크를 안티-HN 단클론 항체(mab) 77/5로 면역퍼옥시다제 염색을 함으로써 최초로 재조합 바이러스의 존재를 확인하였다. 상기 단클론 항체 77/5는 생물학적 유래 및 재조합 JS PIV3 모두에 결합할 수 있으나, 그의 에피토프가 제거되어 마커로서 작용하므로 cDNA유도 바이러스에는 결합할 수 없다. 이전에 기술된 바와 같이, 계대배양 1에 존재하는 바이러스를 LLC-MK2세포상에서 2회 또는 3회 플라크 정제를 수행하였다. LLC-MK2 세포, 32℃에서 생물학적으로 클로닝된 각 재조합 바이러스를 2회 증폭하여 추가로 특성화하기 위한 바이러스를 생산하였다. 폴리에틸렌 글리콜 침전으로 분리된 매질로 부터 바이러스를 농축하고, 트리졸 시약(Life Technology)으로 바이러스의 RNA(vRNA)를 추출하였다. 임의의 헥사머 프라이머로 Superscript II kit(Life Technologies)를 사용하여 vRNA에서 역전사를 행하였다. Advantge cDNA PCR kit (Clontech, Palo Alto, CA)와, PIV3 L유전자에 특이적인 센스 프라이머 (5' nt 1190-GCATTATCTAGATGTGTCTTCTGGTCAGAG 3' nt-1219)(SEQ ID NO: 31) 및 안티센스 프라이머(5' net-14140 CCTGAATATAATAATTAACTGCAGGTCCT 3' nt-14111)(SEQ ID NO: 32)를 사용하여 Sph I 내지 Nhe I 단편 영역을 증폭하였다. L유전자에서 3개 cp45 변이의 삽입도중에 제한효소자리가 제거된 각각의 제한효소로 분해함으로써, 상기 PCR 단편을 분석하였다(표 5를 참조).
하나, 둘,또는 세가지 cp45 L 단백질 아미노산 치환을 가지는 rPIV3의 허용온도 및 제한 온도에서의 플라크형성율
LLC-MK2 단층 배양물에서 재조합 바이러스와 대조구 바이러스의 생체외 복제의 온도민감성 정도를 32℃, 37℃, 39℃, 40℃ 및 41℃에서 결정하였고, 메틸셀룰로스 중층을 제거한 후에 기니아피그 적혈구로 혈액흡착함으로써 플라크를 결정하였다. 혹은, 두가지 PIV3 특이적 안티-HN 쥐의 mAbs 101/1 및 454/11을 1:500으로 희석된 혼합물로 면역퍼옥시다제 염색법으로 단층에 존재하는 바이러스 플라크를 확인하였다(Murphy et al., 상기문헌, 1990).
햄스터 연구
4내지 16주령 골든 시리안 햄스터로 이루어진 6그룹에게 비강으로 하나 이상의 cp45 L 단백질 치환을 포함하는 하나의 rPIV3, PIV3 cp45 바이러스, rPIV3 JS wt를 105.5 pfu를 함유하는 액을 동물당 0.1ml OPtiMEM 1으로 비강으로 접종하였다. 4일째, 상기 햄스터를 희생하고 폐와 코의 갑개골을 수확하였다. 상술한 방법으로 바이러스를 정량하였다. 각군의 6마리 햄스터에 대해서 평균log10TCID50/g를 계산하였다.
결과
wt JS rPIV3로 PIV3 cp45 L 단백질 아미노산 치환의 도입
위에서 주목한 바와 같이, cp45의 L단백질에 3개 아미노산 치환을 각각 또는 선택된 조합으로 그의 wt 모바이러스, PIV3 JS균주를 코딩하는 안티게놈 cDNA로 도입하였다. 각각의 도입된 돌연변이를 가공하여 회수된 rPIV3에서 돌연변이의 조절 을 용이하게 하는, 근처의 자연적으로 존재하는 제한효소자리가 제거된 표현형이 나타나지 않는(silent) 변이로 표시했다(표 5, 도 12). cp45에서의 하나의 뉴클레오타이드치환에 비해 생체외 또는 생체내 복제동안 그 자리에서 복귀기회를 감소시키기 위해서, 서아미노산 1558자리에서의 코돈 변화를 고안하여 r1558에서 두 뉴클레오타이드 변화를 포함하였다.
백신 바이러스 MVA/T7 폴리머라제 재조합의 동시감염과, pTM(N), pTM(P) 및 pTM(L) 보조플라스미드와 함께 각각의 안티게놈 cDNA의 형질감염에 의한 조직배양물에서 cp45로부터 하나, 둘 또는 세가지 아미노산 치환을 갖는 7개 rPIV3를 회수하였다(Wyatt et al., 상기문헌, (1995)). 각 rPIV3는 안티게놈 cDNA을 가공함으로써 HN유전자에 도입된 Mab저항성 마커를 가진다. 각각의 바이러스 제제가 유전적으로 균질함을 보장하기 위해서, rPIV3를 생물적으로 클로닝하여 2주기 또는 3주기 플라크 계대배양을 하였다. 이러한 예비주의가 필요한 이유는 백신 바이러스가 안티게놈 cDNA와 보조플라스미드간에 재조합을 매개하기 때문이다.
7개 rPIV3 각각은 L유전자에 가공된 돌연변이를 함유하는지를 확인하기 위해서, 침전된 비리온으로부터 RNA를 정제하고 RT-PCR법에 의해서 cDNA로 역전사하고 증폭하였다. RT-PCR산물의 생성을 위해서는 RT단계가 필요하다는 대조구 반응은 오염된 cDNA가 아니라 RNA 주형이 RT-PCR 산물의 생성에 필요함을 나타낸다. 삽입된 코딩변화에 대한 마커로서 제한효소의 인식자리가 삭제된 그 3가지 제한효소로 RT-PCR산물을 분해하였다. 예상된 대로, 각각의 세가지 효소에 희새서 JS wt rPIV3의 RT-PCR은 적절한 회수로 절단되었으나, r942/992/1558은 각각의 cp45 코딩변화의 제조중에 각각의 세가지 자리가 절단되어 없다. 다른 rPIV3는 적절한 제한효소자리가 없으며, 이는 돌연변이가 도입되었음을 나타낸다.
cp45 L 변이를 갖는 rPIV3의 32℃, 37℃, 38℃, 39℃, 40℃ 및 41℃에서의 플라크형성율
다양한 조합의 cp45 L 아미노산 치환을 갖는 7가지 rPIV3에 대해, 32℃, 37℃, 38℃, 39℃, 40℃ 및 41℃에서 LLC-MK2단층상에서 이들의 플라크형성물을 분석하였다. 표 6에서 알 수 있는 바와 같이, JS wt rPIV3 모바이러스가 테스트한 어떤 온도에서 플라크형성이 제한된데 반해, cp45 aa치환을 갖는 rPIV3는 ts이었다. r942, r992 및 r1558의 플라크형성의 셧오프(shut-off) 온도는 40℃이었다. r942는 40℃에서 플라크형성율이 700배나 감소하였으며, 이는 r942의 복제가 이 제한온도에서 크게 감소하였음을 나타낸다. 그러나, 40℃에서 r942의 플라크 크기도 또한 크게 감소하였으며, 이는 또한 그의 복제가 JS wt에 비해서 이온도에서 크게 감소하였음을 나타낸다. 41℃에서 r942의 복제는 완전히 제한되었다(자료는 나타내지 않음). r942 및 r1558는 40℃에서 플라크형성이 크게 감소하였다(1,000,000배 이상의 감소). 이러한 결과는 비록 r942변이가 덜 제한적이기는 하지만, 각각의 세 cp45 L유전자 변이가 별개로 ts 표현형을 특정한다는 것을 나타낸다. 이중 변이 바이러스 r942/r1558 과 삼중 변이 r942/r992/1558은 셧오프 온도가 39℃이나, r942/992 및 cp45는 38℃이다. 이중 변이, r942/1588은 r942 단일변이보다 온도민감성이 적다. r942와 같이, r942/1588은 41℃에서 완전히 플라크형성이 제한된다. 이중 또는 삼중 변이의 온도민감성 수준은 각 단독변이에 의한 온도민감성으로부터 예측할 수 없는 세가지 rPIV 변이의 복잡한 상호작용에 기인한다. 또한, r942/992/1885는 cp45보다 온도민감성이 적으며, L유전자의 바깥 다른 돌연변이도 또한 cp45의 온도민감성 표현형에 기여할 것이기 때문에, 본발명의 범위내에서 추가의 변이를 대표한다.
햄스터에서의 성장
JS wt rPIV3, 생물학적 유래 cp45, 또는 하나 이상의 cp45 L 단백질 아미노산 치환을 함유하는 rPIV를 6마리 골든 시리안 햄스터의 그룹들에게 비강으로 접종하였다. 폐 및 코갑개골에서 바이러스의 복제를 결정하였다. 이 실험에서(표 7), 단일 아미노산 치환을 포함하는 rPIV3는 상부 및 하부 호흡관에서 복제가 제한되었다(표 7). 그러나, 온도 민감성이 가장 적은 r942은 두번째 실험에서 상부 및 하부 호흡관에서 복제가 최소한으로 억제되었다. 이러한 자료는 3개 아미노산 치환중 2개가 단일손상 재조합 바이러스에 존재하는 att표현형에 기여함을 설명한다(예, r942/992는 r942 단독변이보다 더욱 약독화되었다). 따라서, L유전자에서 각각의 아미노산 치환은 단독으로 작용하거나 다른 L 아미노산 변이와 함께 작용하여 att 표현형에 기여한다. 이중 변이의 약독화는 생체내 복제후 L유전자의 세개 아미노산 치환중 어느 것이 손실되어 여전히 약독화 바이러스로 남는다. 이것은 생이전에 설명한 체내 복제후에 cp45의 ts표현형의 높은 안정성에 대한 부분적인 설명이다. 삼중변이 r942/992/1588은 상부 및 하부 호흡관에서 cp45만큼 복제가 제한된다는 사실은 L유전자의 세개 아미노산 치환이 cp45의 att 표현형의 주요원인이다.
상기 결과를 요약하면, L 단백질 아미노산 992와 1558의 치환은 40℃에서 세포배양물에서 각각 플라크형성율이 1,000,000배 감소했다. 따라서, 각각의 세개 변이가 별개로 ts 표현형에 기여한다. 3개 L 돌연변이 모두를 가지는 삼중 재조합체는 cp45보다 온도민감성이 약간 적으며, 이러한 사실은 cp45의 L유전자의 바깥에서 일어난 변이가 또한 온도민감성 표현형에 기여할 것임을 제시한다. L에서 세개 각각의 변이중 두개가 햄스터의 상부 또는 하부 호흡관에서 제한된 복제에 기여하였고, 이것은 생체내 복제동안 cp45의 ts 및 att표현형의 안정성이 관찰됨을 설명한다. 중요하게도, 재조합 백신균주의 생체외에서의 온도 민감성 수준은 생체내의 약독화를 근접하게 예측할 수 있다. 세가지 변이를 모두 갖는 재조합 바이러스는 햄스터의 상부 및 하부 호흡관 모두에서 cp45 변이만큼 복제가 제한되었으며, 이러한 사실은 cp45 바이러스의 L유전자가 후보 백신균주의 주요한 약독화 성분임을 나타낸다. 반면에 각각의 변이는 그자체로 ts 표현형을 특성화하지만, 그들은 함께 존재할 때 단지 축적적이 아니라 서로 영향을 미친다. 삼중 변이체에서 세가지 변이의 공동효과는 측정된 두 이중 변이체에서 관찰된 온도민감성의 수준을 증가시키기 보다는 감소시키는 것 같다. 흥미롭게도, 992 또는 1558 치환중 어느 하나의 복귀에 의한 손실은 온도민감성 수준을 감소시키기 보다는 증가시킬 것이다. 이는 적어도 몇몇의 cp45 L변이를 유지하기 위한 예상치못한 선택압을 제공해야 한다. 함께 고려될 때, 이러한 발견은 cp45 바이러스의 ts 및 att 표현형의 높은 안정성 수준은 L유전자의 다중 ts변이가 att표현형에 기여하는 것에 기인하는 것을 나타낸다. cp45 바이러스의 주요한 약독화 변이는 제조와 사람에서의 복제의 모든 단계동안 조절바이러스에 대한 기초를 제공한다.
추가로, 942에서 티론신에서 히스티딘으로의 변이는 세개 변이중 가장 보존 적인 치환이며, 이는 온도민감성이 최소이다. PIV3의 L폴리머라제는 2233 아미노산 길이의 큰 폴리펩타이드이며, P 단백질과 복합체 형성, RNA 결합, RNA 폴리아데닐화, RNA전사 및 RNA복제에 요구되는 것을 포함하는 다수의 도메인를 코딩하는 다기능 단백질이라고 여겨진다(Collins et al., 상기문헌, (1996)). 942와 992위치에서 L유전자의 아미노산 치환은 다른 파라믹소바이러스 패밀리중 잘 보존된 영역 근처에 존재한다(Blumberg et al, Virology 164: 487-497 (1982); Galinski et al., Virology 165:499-510 (1988)). 1588위치에서의 변이는 다른 L폴리머라제와 서열동일성을 덜 공유하는 폴리머라제 영역이다. 비록 L유전자에서 삼중 아미노산 치환에 의해 부여되는 ts 표현형의 기작은 모르지만, 다중 L 단백질 및 활성은 영향을 박거나, L의 다양한 활성이 관련되는 기작은 영향을 받는다.
실시예 X
온도민감성, 저온적응성 및 약독화 표현형을 특정하는, 생물학적 유래 생-약독화 HPIV 유형 3 바이러스(cp 45)에서의 변이를 직접 동정, 및 재조합 백신 바이러스로 재구성
상기 실시예는 cp 45의 L폴리머라제 단백질에서 각각의 3 아미노산 치환이 온도민감성(ts)과 약독화 표현형(att)을 부여하지만, 저온적응성 표현형(ca)을 부여하지 않는다(Skiadopoulos et al., J. Virol 72(3): 1762-8, 1998). cp45는 다른 단백질(N, C, M, F 및 HN), 또는 잠재적인 시스-작용 서열(리더 영역 및 N유전자의 전사유전자 개시(GS)신호)에 추가의 12 변이를 포함하며, 상기 표현형에 이들이 기여함은 이전에 정의되지 않았다. 추가로 본실시예는 사람 또는 사람을 제외한 영장류에서 cp45의 복제이후에 이들 표현형의 높은 안정성의 관찰에 대한 기초와 관련한 추가의 정보를 제공하기 위해서, cp 45의 ts, ca 및 att표현형에 대한 유전적 근거를 특성화한다. 이 연구의 한가지 측면에서, 15 cp45-특이적 변이를 모두 포함하는 재조합 cp45 (rcp45)를 역유전적 시스템을 이용하여 제조하였고, 생물학적으로 유래된 바이러스와는 플라크 크기, 온도민감성, 저온적응성의 수준 및 햄스터의 상부 및 하부 호흡관에서의 복제수준에 근거하여 본질적으로 구별된다. 또한, (1) CC, M, F 또는 HN 단백질상에서 cp45-특이적 변화, (2) 결합된 리더 및 N유전자 변이, (3) cp45변이의 수개의 조합을 포함하는 재조합 바이러스를 제조하였다. 이들 재조합 바이러스의 분석에 의하면, 게놈에 분산되어 있는 다수의 cp45 변이가 ts, ca, 및 att 표현형에 기여함을 보여주었다. C 및 F 유전자에서 변이는 40℃에서 온도민감성이 없었으나, 그럼에도 불구하고 att 표현형을 나타냈다. 따라서 이들은 온도민감성은 아니나 att 표현형이다. HN 변이는 ca, ts, att 표현형을 부여하지 않았다. 3' 리더 및 N 변이를 갖는 바이러스는 ts이나, 햄스터의 하부 호흡관에서 약간의 약독화만을 나타냈다. 수개의 변이의 조합을 갖는 재조합체는 cp45 보다 높은 온도민감성을 나타냈으나, 증가된 온도민감성의 수준은 생체내에서 약독화 증가에 반영되지 않았다. 이들 후자의 발견은 cp45에서 동정된 다중 변이는 생체외의 복제에 상호작용하여 영향을 미친다. cp 45에서 다중 ts 및 비-ts 약독화 변이는 높은 수준의 약독화와 표현형의 안정성에 기여할 것이다. 본명세서에서 제공된 cp45의 다양한 변이와 관련된 표현형을 아는 것은 본발명의 범위내에서 유용한 백신 재조합체의 큰 조합체를 달성하기 위해서 생물학적 유래 PIV바이러스의 정확한 조절 및 재조합 바이러스의 용이한 조작을 가능하게 한다.
바이러스 및 세포
상술한 바와 같이, 시미안 LLC-MK2세포에서 본실시예에서 기술된 rPIV3s, PIV3 JS wt 및 cp45 바이러스를 배야하였다(Durbin et al., Virology 235:323-332, 1997a; Hall et al., Virus Res. 22(3): 173-184, 1992; Skiadopoulos et al., J. Virol 72(3): 1762-8, 1998). 상술한 대로, 변형된 백신 바이러스를 제공한다. 2% FBS 및 젠타미신 설페이트(50㎍/mL)이 보충된 OPtiMEM I(Life Technologies, Gaithersburg, MD) 또는 10% FBS 및 젠타미신 설페이트(㎍/mL) 및 2mM 글루타민이 보충된 EMEM에서 HEp-2(ATCC CCL 23)과 LLC-MK2 세포를 유지하였다. 10% FBS, 2mM 글루타민, 20mM 헤페스, 1mM 비필수 아미노산 및 100 유니트 스트렙토마이신-네오마이신/ml이 보충된 Earl's MEM(Life Technologies)에서 L-132 세포(ATCC CCL 5)를 배양하였다.
PIV3에서 점돌연변이 야기
다음의 단편을 흡수하도록 변형된 pUC19벡터에 표준 분자클로닝 방법을 사용하여 상기에서 감염성 바이러스를 회수하기 위해 사용된 PIV3 JS wt의 안티게놈 cDNA인 p3/7(131)2G의 서브게놈 단편을(Durbin et al., Virology 235:323-332, 1997a; Skiadopoulos et al., J. Virol. 72(3): 1762-8, 1998) 클로닝하였다. 이전에 기술된 대로, Transformer Mutagenesis Kit(Clotech, Palo Alto, CA)를 사용하여, 표현형으로 나타나지 않는 제한효소인식서열을 제거 또는 생성하기 위한 변이 뿐만 아니라 cp45에서 확인된 변이에 대응하는 점돌연변이를 도입하였다(표 8).
돌연변이를 약기한 후에, 제한효소 단편의 서열을 완전히 분석하고 완전한 길이의 클론인 p3/7(131)2G로 다시 클로닝하였다. PIV3 cp45 비리온 RNA로부터 직접 RT-PCR법을 사용하여 3'리더와 N변이를 증폭하고 pLeft+20(위를 참조) 또는 추가의 조작을 위해서 변형된 pUC19에 클로닝하였다. 표준 분자 클로닝법으로 돌연변이의 조합을 만들었다. cp45변이를 포함하는 완전한 길이의 플라스미드 클론, pFLCcp45의 서열을 완전히 분석하여 클로닝과정동안 외부 변이가 도입되었으나 나타내지 않는지를 결정하였다.
재조합 PIV3(rPIV3)의 회수
세가지 보조 플라스미드, pTM(N), pTM(P, C아님), pTM(L)과 함께, cp45 변이를 포함하는 각각의 완전한 길이의 안티게놈 cDNA로 상술한 LipofectACE(Life Technologies, 케티스버그, MD) 및 MVA-T7을 사용하여 6웰 플레이트상의 HEp-2세포(Costar, Cambridge, MA)를 형질감염시켰다. 32℃에서 4일간 배양한 후에, 형질감염 수확물을 T-25플라스크에 있는 LLC-MK2으로 1차 계대배양을 하였으며, 4내지 8일간 32℃에서 배양하였다. 이 수확된 바이러스를 1차 계대배양이라 하고, 상술한 바대로 LLC-MK2에서 3회 플라크 정제를 하였다. 각각의 생물학적으로 클로닝된 재조합 바이러스를 32℃에서 LLC-MK2세포에서 2회 증폭하여 추가의 특성화를 위한 바이러스를 제조하였다. 폴리에틸렌 글리콜 침전(Mbiguino and Menezes, J. Virol Methods 31:2-3, 1991, 본문헌 전체가 본명세서에 참고문헌으로 병합됨)으로 분획화된 매질로부터 바이러스를 농축하고, 바이러스 RNA(vRNA)를 트리졸 시약(Life Technologies)으로 추출하였다. 임의의 헥사머 프라이머로 Super script II Preamplification System(Life Technologies)를 사용하여 vRNA상에서 역전사를 수행하였다. Advantage cDNA PCR 키트(Clontech) 및 PIV3 게놈의 다양한 부분에 특이적인 센스와 안티센스 프라이머를 사용하여 제한효소 분석을 위한 단편을 증폭하였다. 변이중 제한효소자리를 제거하거나 생성시킨것에 대한 각각의 제한효소로 분해하여 상기 PCR 단편을 분석하였다(표 8).
허용온도 및 제한온도에서 cp45변이를 가진 rPIV3의 플라크형성율(EOP)
상술한 LLC-MK2 단층배양물에서 32℃, 35℃, 36℃, 37℃, 38℃, 39℃, 40℃, 41℃에서 대조구 바이러스 또는 재조합 바이러스의 생체외 플라크형성의 온도민감성을 결정하였다(Hall et al., Virus Res. 22(3) : 173-184, 1992, 본문헌은 그 전체로서 본명세서의 참고문헌으로 병합됨). 메틸셀룰로스 중층을 제거하고 기나아 피그 적혈구를 사용하는 혈액흡수법으로 플라크를 세었다. 또는, 1:250으로 희석한 2 PIV3-특이적 안티-HN 쥐의 mAb 101/1 및 454/11의 혼합물로 면역퍼옥시다제 염색법으로 단층에 존재하는 바이러스를 확인하였다(Murphy et al. Vaccine 8(5) :497-502, 1990; van Wyke Coelingh et al., Virology 143 (2): 569-582, 1985).
rPIV3 변이바이러스에 대한 저온 적응성 표현형의 평가
24웰 조직배양 플레이트상에 준비된 풍부한 L-132 세포단층에 32℃ 및 20℃에서 wt rPIV3 및 변이 rPIV3의 성장을 측정하였다. 각각의 2 플레이트의 이중 웰에 0.2ml의 변이체나 wt rPIV3 바이러스를 MOI 0.01로 접종하였다. 실온에서 한시간동안 흡착시킨 후에, 상기 접종원을 흡수하고 단층을 웰당 1ml의 PBS로 세척하였다. 상기 접종된 배양물에 10% FBS, 2mM 글루타민, 20mM 헤페스, 1mM 비필 수 아미노산 및 100 유니트의 스테렙토마이신-네오마이신/ml을 보충한 Earl's MEM 0.5ml을 중층하였다. 방수 파우치(Kapak)로 플레이트 하나를 밀봉하여 13일간 20℃배쓰에 잠가 두었다. 32℃에서 3일간 CO2배양기에 이중 플레이트를 두었다. 배양기간 말기에, 냉동/해동으로 바이러스를 수확하였다. 플라크를 보는 기니아피그 적혈구르 사용하는 혈액흡수로 32℃에서 LLC-MK2세포상에서 플라크분석을 통해, 각 웰에서 회수한 바이러스 농도를 결정하였다. wt 및 두 cp45 참조 스톡을 대조구로 사용하였다.
햄스터 연구
JS wt rPIV3, PIV3 cp 45 바이러스, 또는 하나 이상의 변이체 rPIV3를 106.0pfu함유하는 0.1ml OptiMEM I를 비강으로 5주령 골든 시리안 햄스터 5마리로 이루어진 그룹에게 접종하였다. 감염성 4일째, 상기 햄스터를 희생하고, 폐와 코갑개골을 수확하고, 상기한 대로 바이러스를 정량화하였다. 32℃에서 평균 log10TCID50/그램을 각 햄스터 그룹에 대해서 계산화였다.
결과
JS wt rPIV3로 PIV3 cp45 변이체를 도입
부위특이적 돌연변이, 또는 원하는 변이를 갖는 cp24 cDNA의 단편을 직접 PCR증폭을 함으로써, cp45의 3'리더, N GS 신호, 및 N, C, M, F, HN 및 L단백질에서 15개 돌연변이를 완전한 PIV3안티게놈 cDNA에 도입하였다(표 8). 다음의 안티게놈 cDNA를 만들었다(도 13 참조): (i) 리더영역의 4개 점돌연변이, N GS 신호에서의 점돌연변이, 및 N단백질에서 두 아미노산 치환을 포함하는 rcp45 3'N; (ii) C 단백질에서 단일 아미노산변화를 포함하는 rcp45 C; (iii) M에서 단일 아미노산 변화를 포함하는 rcp45 M; (iv) F에서 두 아미노산 변화를 포함하는 rcp45F;(v) 상기대로 HN에서 단일아미노산 변화를 포함하는 rcp45HN; (vi) 상기한 대로 L에서 3개 아미노산 변화를 포함하는 rcp45 L; (vii) 상기 i, vi로부터의 변이를 포함하는 rcp45 3'NL; (viii) L에서 3개를 제외하고는 모든 변이를 함유하는 rcp45 3'NCMFHN; 및 (ix) 표 8에 표시한 모든 15개 cp45변이를 포함하는 cp45. 각각의 cp45 변이를 가공하여 대부분의 경우에, 제한효소자리가 제거되거나 도입되어 하나 이상의 근처 발현되지 않은 변화가 수반된다(표 8). 이들은 회수된 바이러스 및 cDNA에서 변이의 존재를 확인하기 위한 마커로 작용한다. 또한, 두 아미노산 코딩변화(표 8에서 변이 번호 10 및 15)cp45에서 발견된 단일 뉴클레오타이드 변화가 아니라 2 뉴클레오타이드 변화에 의해서 제조하며, 이는 wt로 같은 자리 복귀의 가능성을 감소시킨다. 표 8에 나타난 모든 15개 cp45 변화를 포함하는 cp45 cDNA를 사용하여 다른 안티게놈 cDNA에 cp45를 도입한다; 그것 전체로서 서열을 분석하고 단지 목적한 변이만을 함유하도록 확인하였다. 이것은, 돌연변이나 PCR을 하고 클로닝으로 조작한 모든 여역이 바람직한 서열을 가지며 다른 바람직하지 않은 변이를 포함하지 않음을 나타낸다. 상기한 대로 재조합 PIV3를 제조하기 위해서 보조 플라스미드 및 MVA-T7과 함께 하나 이상의 cp45 변이를 갖는 각각의 완전한 길이의 플라스미드로 HEp-2 세포를 형질감염시켰다. 표 8에 나타낸 돌연변이를 포함하는 RP-PCR 단편의 분석을 도 13에 나타난 다양한 재조합 바이러스의 비리온 RNA로부터 증폭하였으며 이는 도입된 변이의존재를 확인하며, 다른 목적하지 않은 변이가 발견되지 않았다.
플라크형태
LLC-MK2세포에서 테스트한 경우에, 수가지 재조합 바이러스는 다양한 바이러스 플라크형태를 나타냈다. JS wt rPIV3 플라크는 1mm 평균크기이었고, 생물학적 유래 JS wt PIV3아 크기면에서 구별되지 않는다. 이는 생물학적 유래 및 재조합 cp45바이러스가 이러한 표현형에 대해 유사함을 설명한다.
허용온도 및 제한온도, LLC-MK2상에서 cp45변이를 가진 rPIV3의 플라크형성율
32℃ 내지 41℃ 범위의 제한온도 및 허용온도에서 rPIV3가 플라크를 형성하는 능력에 대해 rPIV3를 분석하였다(표 9). 각 성분의 cp45를 갖는 ts 표현형 바이러스는 rcp45 3'N 및 rcp45 M 바이러스가 40`의 셧오프 온도를 가지고, rcp45 C변이는 41℃의 셧오프 온도를 가지는 것을 나타낸다. rcp45 F 및 rcp45 HN 변이의 셧오프 온도는 41℃이상이었다. 상기 결과에 일치되게, rcp45 L바이러스의 셧오프 온도는 39℃이다. 예를 들면, 40℃에서 바이러스의 복제감소(즉, 32℃ 농도에서 40℃ 농도를 빼기)가 40℃의 wt 바이러스의 복제감소의 약 100배이상인 경우에 이 바이러스는 ts 표현형을 가지는 것으로 간주된다. 이 정의를 적용하면, 현재의 결과는 cp45의 적어도 두 영역(3'N 및 L)이 ts 표현형에 기여하게 된다.
표 9에서 나타낸 바와 같이, 모든 cp45 변이를 포함하는 rcp45의 셧오프 온 도는 38℃이며, 이는 생물학적 유래 cp45와 동일한다. 이 결과는 cp45의 ts 표현형이 rcp45에서 성공적으로 재현됨을 나타낸다. 추가로, 이러한 결과는 cp45의 서열분석과 후속적으로 재조합 바이러스로 변이를 재구성하는 것을 유효하게 한다.
rcp45 3'NCMFHN 바이러스는 3 개의 L 변이가 없다는 것을 제외하고는 rcp45와 동일하며, 셧오프 온도가 36℃이다. L변이가 단독으로 그리고 합동으로 온도민감성을 부여하는 것으로 알려져 있기 때문에, rcp45 3'NCMFHN이 cp45보다 온도민감성이 크다는 것은 역설적이다. 이는 cp45의 변이간에 상호작용에 의해서 각각 변이의 합보다 온도민감성이 낮게 된다.
이들 요소 모두가 RNA합성도중에 상호작용하는 것으로 믿어지기 때문에, L 변이가 리더 및/또는 N 변이와 상호작용하는지를 결정하기 위해서 바이러스 rcp45 3'NL을 구성하였다. rcp45 3'N 및 rcp45 L의 셧오프 온도가 각각 40℃ 및 39℃인데 비해, 이 바이러스의 셧오프 온도는 36℃이다. 이러한 결과는 3'N과 L변이의 상호작용이 있으며 이 결과 온도민감성이 증가함을 제시하고 있다. 또한 이결과는 완전한 세트의 변이를 갖는 cp45보다 cp45변이의 서브셋이 온도민감성이 크다는 다른 실시예를 제공하고 있다.
cp45변이를 갖는 rPIV3의 ca 표현형
cp45의 어떤 요소가 ca 표현형을 특정하는지를 알아보기 위해서 rPIV3를 분석하였다(표10). rcp45 L이 ts 및 att이나 ca는 아님을 위에서 설명하였다. 이는 ca표현형의 더 큰 부분을 특정하는 유전적 요소가 L유전자 밖에 존재함을 나타낸다. 중간표현형을 나타내는 rcp45 3'NCMFHN을 제외하고는, 3'리더 및 N변이를 갖는 각각의 rPIV는 ca이다. 이는 ca 표현형이 대부분 3'N영역내에 특정되었다는 것을 보여준다. 3'N단편을 갖는 바이러스의 ca수준이 cp45 또는 rcp45의 단편보다 더 적다는 발견은, 비록 다른 각각의 영역의 분석으로부터 명백하지는 않지만 cp45의 다른 영역이 ca 표현형에 기여함을 나타낸다. rcp45 3'NL바이러스의 ca가 rcp45 3'N바이러스보다 크다는 것은, L변이가 약간의 기여를 할 것이다는 것을 제시한다. 생물학적 유래 cp45와 rcp45 바이러스가 동등한 수준의 ca를 나타낸다는 것은, 플라크 크기 및 ts표현형과 마찬가지로, 이러한 표현형이 본명세서에 제공된 재조합 cp45바이러스에서 성공적으로 재생성된다는 것을 의미한다. 따라서, ts표현형과 마찬가지로, ca표현형은 유전적 요소가의 상호작용에 의한 기여뿐만 아니라 각각의 전체 표현형에 기여를 반영하는 복합 표현형이다.
햄스터에서 rcp45 변이 바이러스의 성장
5마리 골든 시리안 햄스터 그룹에게 재조합 또는 생물학적 유래 바이러스를 106LCID50을 비강으로 투여하고, 폐 및 코갑개골에서 바이러스 복제수준을 4일후에 측정하였다(표 11). 접종후 4일째에 wt 및 cp45 바이러스는 햄스터에서 바이러스 복제가 최대가 됨을 이전에 기술하였다(Crookshanks and Belshe, J. Med. Virol. 13(3): 243-9, 1984, 본문헌을 본명세서에 참고문헌으로 병합됨). rcp45바이러스의 복제는 코갑개골에서 약 40배 감소하였고, 폐에서는 1000배 감소하였으며, 따라서 생물학적 유래 cp45바이러스 만큼 약독화되었다. 이러한 결과는, cp45의 약독화 표현형이 재조합체로서 성공적으로 재생산되었음을 나타낸다. cp45의 각각의 표현형이 rcp45에서 완전히 재생되었으므로, 본실시예에서는 포함되지 않았으나 cp45에서 추가의 5개 변이가 cp45의 특성에 약간 기여할 것이다.
상기한 바와 같이, cp45의 L유전자에서의 변이가 이 바이러스의 대부분의 약독화 표현형을 특정하는 것이다. 본 실시예에서, 한 그룹으로서 L의 바깥 cp45변이을 조사하였다. rcp45 3'NCMFHN 변이체만이 코갑개골에서 복제가 약간 감소하였으마, 폐에서는 100배 이상이 감소하였다. 이러한 사실은 추가 약독화 변이가 L단백질의 바깥쪽에 존재함을 나타낸다. 중요하게도, rcp45의 L유전자상의 각기 3개 변이가 야생형 서열로 복귀하는 경우에, 얻어진 바이러스, rcp45 3'NCMFHN은 여젼히 약독화 표현형을 가질 것이다. rcp45 M 및 PIV3 HN 변이 바이러스는 햄스터의 호흡관에서 복제능이 있으며, PIV3 3'N바이러스는 하부호흡관에서 단지 약간의 복제감소를 나타낸다. 이는 3'리더, N유전자 개시 자리, 및 N, M 및 HN 단댁질에 존재하 는 변이가 그자체로는 약독화되지 않음을 나타낸다. 그런, 이러한 변이는 다른 cp45내에서 cp45의 전체 약독황 기여할 수 있을 것이다. 또한, 3' N 영역내의 다른 개별 변이가 함께 변이 세트를 분석한 경우에 분명하지는 않지만 영향을 미칠 수 있으며, 이는 본명세서에 따라 용이하게 결정할 수 있을 것이다.
PIV3 C 및 PIV3 F 변이체의 복제는 코갑개골 및 폐에서 약 100배 감소하였으며, 이는 cp45의 C 및 F단백질내의 변이가 비록 약독화 수준이 cp45 L 변이에 의한 것만큼 크지 않지만, 햄스터에서 약독화표현형에 기여한다는 것을 설명한다. 상기한 바와 같이, PIV3 C 및 PIV3 F 변이 바이러스는 ts표현형을 가지지 않으므로, C 및 F단백질에서 일어난 변이는 온도민감성이 아닌 약독화 변이라고 여겨진다.
실시예 XI
헤마글루티닌 및 융합 당단백질이 PIV 1에서 유래된 대응 당단백질로 치환된 재조합 키메라 PIV3의 회수
본실시예내에서, PIV유래 이종 유전자 또는 큰 폴리뉴클레오타이드 서열이 다른 rPIV 환경으로 도입된 키메라 rPIV 바이러스를 제조하고 선택한다. 본발명의 범위내에서, PIV의 각 유전자들 또는 유전자 단편들을 이종 PIV 또는 다른 출처의 카운터파트 서열로서 치환하였다. 본실시예에 기술된 한 구체에에서, 치환, 예를 들면, HPIV1및 HPIV2의 HN 및/또는 F을 재조합 HPIV3로 도입하여 살아있는 약독화 바이러스를 개발에 적합한 키메라 재조합체를 생산하는 도구와 방법을 제공한다.
바이러스와 세포
본 연구에서 사용된 PIV1 균주, PIV1/Washington/20993/1964 (PIV1/Wash64) 를 1964년 워싱턴 디.씨.에서 분리하였으며, 성인 지원자에 대한 임상연구에서 병원성 야생형 바이러스임을 확인하였다(Murphy et al. Infect. Immun. 12:62-8(1975), 본문헌은 본명세서에 참고문헌으로 병합됨). 50 ㎍/ml 젠타미신 설페이트, 2 mM 글루타민 및 0.75 ㎍/ml 트립신이 보충된 Opti-MEM I(Life Technologies)에서 LLC-MK2(ATCC CCL 7.1)세포상에서 증식되었다(카탈로그 번호 3741, Worthington Biochemical Corp., Freehol, NJ). 헤마글루틴-저해 분석(HAI)에 사용된 사람 PIV2의 그리어(Greer)균주(카탈로그 번호 v-322-001-020, NIAID Respository, Rockville, MD)을 동일한 방식으로 증식하였다. 사람 PIV3의 JS균주 및 cDNA로부터 유래된 이의 재조합 유도체를 야생형과 함께 상기한 바와 같이 증식하였다. 박테로오파지 T7 RNA 폴리머라제를 발현하는 변형된 백시니아 안카라(Ankara)(MVA) 재조합체가 Wyatt등의 Virology 210:202-205 (1995)에 기재되어 있다(본문헌은 본명세서의 참고문헌으로 병합함). HEp-2세포는 ATCC로부터 받았으며, 50 ㎍/ml 젠타미신 설페이트, 2 mM 글루타민 및 소 태아의 혈청 2%를 포함하는 Opti-MEM I(Life Technologies)에서 유지하였다.
완전한 키메라 PIV3-PIV 1안티게놈을 코딩하는 cDNA의 제조
PIV3 HN 및 F가 PIV1의 카운터파트부로 치환된 완전한 길이의 안티게놈 RNA을 코딩하는 cDNA를 도 14A 및 14B에서와 같이 제조하였다. PIV1/Wash 64의 HN 및 F 유전자의 cDNA클론을 PIV1/Wash 64 야생형 바이러스로 감염시킨 LLC-MK2세포로부터 추출된 RNA로 제조하였다. 임의의 헥사머를 사용하는 Superscript Preamplification System(Life Technologies)를 사용하여 cDNA를 제조하였다. GeneBank에 있는 공통 서열에 기초한 유전자 특이적 프라이머쌍을 사용하여 Vent DNA 폴리머라제(New England Biolabs, Beverly, MA)로 PIV1 F 및 HN cDNA를 증폭하였다. 아래에 기술된 모든 프라이머는 주석을 붙여 PIV3특이적 서열은 밑줄을 그었으며, 제한효소자리는 이탤릭체로 표시하였고, 야생형에서 변형된 뉴클레오타이드는 더 낮게 표시하였고, 개시 및 종료코돈은 진하게 표시하였다. 개시코돈의 상부 69-97과 혼성화하는 (+)센스 PIV1 F프라이머는 5'-GGGAAAGAAtCCAGAGACAAGAACGG-3' (SEQ ID NO: 34)이다. F 종료코돈의 하류 36-61 뉴클레오타이드 서열과 혼성화하는 (-)센스 PIV1 F 프라이머는 5'-GGTGAAGTTGTGGATccATTGATTG-3'(SEQ ID NO:34)이다. 이것은 BamH I 자리를 가지고 있다. PIV1 HN에 대한 (+) 센스 프라이머는 5'-CAACCTGTAAGGtAcCAGCATCCG-3'(SEQ ID NO: 35)이다. 이는 HN 개시코돈의 상류 13-36 뉴클레오타이드와 혼성화하며, Kpn I자리를 가진다. (-)센스 PIV 1 HN프라이머는 5'-GATATGGTGTTaGGcCTTGATCTGTTC-3'(SEQ ID NO:36). 이는 종료코돈의 마지막 2 뉴클레오타이드서열 및 추가의 하류 25 뉴클레오타이드와 혼성화하며, Stu I 자리를 가진다. BamH I 및 블런트-말단 단편을 BamH I-EcoR으로 절단한 pLITMUS28(New England Biolabs)으로 PIV1 F cDNA를 클로닝하였으며, Kpn I-Stu I 단편으로 동일한 벡터에 PIV 1 HN을 클로닝하였다. pLit.1Hwt pLit.1Fwt(GeneBank 수탁번호: AF016280, AF016279)로 명명한 얻어진 플라스미드의 뉴클레오타이드 서열을 Circumvent Sequencing Kit(New England Biolabs)로 분석하였다. 변이형성 PCR 프라이머를 사용하여 이들 두 클론을 변형시켜, 키메라 HN및 F유전자를 제조하기 위해서 이들의 비코딩 영역을 제거하고 개시 및 종료코돈을 둘러싼 새로운 제한효소자리를 도입하였다. (+) 및 (-)센스 PIV1 F 변이형성 프라이머의 서열은 5'-CgccATGgAAAAATCAGAGATCCTCTTCT-3' (SEQ ID NO: 37) 5'-Ctggatcct
A
ATTGGAGTTGTTACCCATGTA-3' (SEQ ID NO: 38)이다. 도입된 제한효소자리는 Nco I 및 BamH I이다. (+)및 (-)센스 PIV1 HN 변이형성 프라이머의 서열은 5'-AACcATGGCTGAAAAAGGGAAAA-3' (SEQ ID NO: 39) 및 5'-GGTGAaGCTt
A
AGATGTGATTTTATATTTTA-3'(SEQ ID NO: 40 )이고, 도입된 제한효소자리는 Nco I 및 Hind III이다.
두번째 단계는, 위에서 제조된 PIV1 코딩영역의 수용체로 작용하는 PIV3 HN및 F유전자의 변형이 관련된다. 완전한 길이의 클론 PIV3/JS, P3/7(131)2G로부터 수단계로 PIV3 F 및 HN유전자를 서브클로닝하여 pLit.HN.4 및 pLit.PIV3.F.3a(도 14A 및 14B)를 제조하였다. PIV3 F 및 HN 코딩영역을 PCR 변이로 제거하고 상기한 PIV1 HN 및 F cDNA를 받아들이기에 적합하도록 제한효소자라로 치환하였다. PIV3 F (+)센스 및 (-)센스 변이형성 프라이머의 서열은 5'-AAATAggatccCTACAGATCATTAGATATTAAAAT-3' (SEQ ID NO:41) 및 5'-CgcCATgGTGTTCAGTGCTTGTTG-3'(SEQ ID NO: 42)이며, 도입된 제한효소자리는 BamH I 및 Nco I이다. PIV3 HN (+) 및 (-) 센스 변이형성 프라이머의서열은 5'-CCACAAgCtTAATTAACCATAATATGCATCA-3' (SEQ ID NO:43) 및 5'-TTCCATggATTTGGATTTGTCTATTGGGT-3'(SEQ ID NO: 44)이며, 도입된 제한효소자리는 Hind III 및 Nco I이다. 키메라 HN에 대한 종료코돈은 변이된 PIV1 HN카세트에 접합하여 제조하였다. 상기 PIV1 HN 및 F cDNA를 HN에 대해서는 Nco I-Hind III단편으로서, F에 대해서는 Nco I-BamH I 단편으로서 도입하여, pLit.PIV3-1.HNhc 및 pSE.PIV3-1.Fhc를 제조하였다. 이들 두 cDNA를 pSE.PIV3-1.Fhc로 함께 넣은 후에, 완전하게 서열분석하였다. 그런 후에, p3/7(131)2G에 BspE I-Sph I단편을 삽입하여 pFLC.2G+.hc(도 14A 및 14B)를 제조하였다. 키메라 F 및 HN유전자를 포함하는 BspE I-Sph I단편의 뉴클레오타이드 서열은 GeneBank에 있다(수탁번호 AF016281). 중요하게도, cDNA가공은 최종 rPIV3-1 안티게놈이 6배 규칙(Durbin et al. Virology 234: 74-78 (1997), 본명세서에 참고문헌으로 병합됨)에 일치하도록 고안하였다. rPIV3-1 키메라를 코딩하는 플라스미드 pFLC.2G+.hc를 부다페스트조약에 따라 1997년 9월 17일에 미국 메릴랜드 20852, 록빌, 12301 파크론에 위치한 Amerian Type Culture Collection (ATCC)에 기탁하였다.
형질감염
6웰 플레이트(Costar Corp, Cambridge, MA)에서 HEp-2 단층세포를 풍부히 성장시키고, 상기한 바와 같이 형질감염시킨다. 50 ㎍/ml 젠타미신, 2mM 글루타민을 함유하는 혈청이 없는 Opti-MEM I의 0.8ml에서 3moi로 MVA-T7으로 상기 단층세포를 감염시키고, 세가지 보조플라스미드, 즉 0.4 ㎍의 pTM(N), 0.4 ㎍의 pTM(P), 0.4 ㎍의 pTM(L) 및 5 ㎍의 PIV3-1 안티게놈 cDNA로 형질감염시켰다. 상기 플라스미드를 12㎕ LipofectACE (Life Technologies)을 함유하는 Opti-MEM I의 0.2ml에서 혼합하고, 각웰에 첨가하였다. PIV3/JS cDNA 플라스미드, p3/7(131)2G는 야생형 PIV3/JS 안티게놈 RNA을 코딩하며, 이를 (+)대조구로서 동일하게 형질감염시켰다. 12시간동안 32℃에서 배양한 후에, 형질감염된 배지를 50㎍/ml의 젠타미신을 함유하는 신선한 Opti-MEM I으로 바꾸어 배양물을 32℃에서 추가로 2일동안 배양하였 다. 형질감염후 3일째에 최종농도 0.75㎍/ml로 트립신을 첨가하였다. 4일째에 세포배양물의 상징액을 수확하여, 신선한 LLC-MK2 단층세포로 계대배양하였다(1차 계대배양이라고 함). 하룻밤 흡착후에, 0.75㎍/ml 트립신 함유한 신선한 Opti-MEM I으로 배지를 바꾸었다. 32℃에서 4일간 계대배양 1은 배양하고, 증폭된 바이러스를 수확하여 LLC-MK2배지로 계대배양하고(계대배양 2로 함), 0.75㎍/ml 트립신 존재하에서 32℃에서 또다시 4일간 배양하였다. PIV1 HN당단백질을 갖는 바이러스에 대해 닭 적혈구를 사용하였으나 대신에 PIV3에 대해 기니아피그 적혈구를 사용하였다는 점에르 제외하고는 이전에 기술된 헤마글루틴-저해 분석(HAI)법(van Wyke Coelingh et al., 상기문헌, (1985))에서 토끼 PIV1 항혈청, 기니아피그 PIV2 항혈청, 및 두 PIV3 HN 단클론항체와 반응으로 회수된 바이러스의 특성을 분석하였다. rPIV3가 cDNA로부터 회수된 바이러스를 표시하는 변이에 내성이 있는 단클론항체(MARM)을 가지는지, 또는 rPIV3-1이 PIV1 HN을 가지는지를 결정하기 위해서 HAI를 수행하였다.
뉴클레오타이드 서열 분석
완전한 클론인 pFLC.2G+.hc에 최종 조합을 하기전에, Circumvnet Sequencing Kit (New England Biolabs)를 사용하여 키메라 cDNA 구조물인 pSE.PIV3.hc의 서열을 분석하였다. RNA분석을 위해서, T75플라스크의 LLC-MK2세포상에서 적합한 PIV를 증폭하였다. 감염후 5일째 바이러스를 수확하고 폴리에틸렌 글리콜 침전을 사용하여 농축하였다(Mbiguino et al., J. Virol. Methods 31:161-70(1991)). 바이러스 RNA를 바이러스 펠렛으로부터 추출하고, Superscript Preamplification System(Life Tchnologies)를 사용한 역전사에 사용되었다. Advantage cDNA systhesis kit(Clotech) 및 PIV1와 PIV3 특이적 프라이머쌍을 사용하여 RT-PCR를 수행하였다. 전기영동법으로 RT-PCR 산물을 겔정제하고, NA 45 DEAE-니트로셀룰로스 막(Schleicher & Schnuell, Keene, NH)으로부터 용출, 분리하고, 서열을 분석하였다.
LLC-MK2세포에서 PIV의 복제
PIV1 및 PIV3-1 바이러스의 경우에 트립신을 첨가하는 것을 제외하고는 이전에 기술된 것과 같이 LLC-MK2단층상의 플라크를 계산하였다(Hall et al., Virus Res. 22:173-84, (1992)). 요컨대, 6웰 플레이트의 LLC-MK2세포위에 일련의 희석된 바이러스를 접종하였다; 바이러스는 32℃에서 1시간동안 흡착하였다; 첨가된 트립신을 포함하거나 포함하지 않으며 0.8%의 아가로스을 함유하는 L-15배지(Life Technologies)에 배양물을 중층하였다; 그리고, 기니아피그 적혈구로 혈액흡수(HAD)시킨후에 아가로스 중층을 제거함으로써 플라크를 확인하였다.
바이러스를 moi 0.01로 12웰 플레이트의 풍부한 LLC-MK2 단층을 감염시킴으로써 조직배양물에서 PIV바이러스의 성장을 측정하였다.32℃에서 1시간동안 흡착한후에, 상기 접종원을 젠타미신(50 ㎍/ml 및 트립신(0.75㎍/ml)이 보충된 1.5ml/웰의 Opti-MEM I으로 바꾸고 추가로 32℃에서 6시간동안 배양하였다. 24시간 간격으로, 0.3ml의 배지를 각각의 웰에서 제거하고 트립신이 포함된 신선한 배지 0.3ml를 첨가한다. 이전에 기술된 액상 중충법을 사용하여 LLC-MK2단층세포위에서 혈액흡착법으로 32℃에서 바이러스 농도를 결정하였고(Hall et al., Virus Res. 22:173-84 (1992)), 농도를 log10TCID50/ml로 표시하였다.
햄스터의 호흡관에서 PIV의 복제
rPIV3/JS, rPIV3-1, PIV1/Wash64를 105 pfu로 포함하는 L-15배지 0.1ml를 비강으로 12마리의 골든 시리안 햄스터 그룹에게 각각 접종하였다. 접종후 4일 및 5일째에, 각 그룹에서 6마리의 햄스터를 희생시키고, 이들의 폐 및 코갑개골을 수확하여 균질화하고, 샘플에 존재하는 바이러스를 32℃ LLC-MK2 단층세포상에서 농도를 측정하였다. 상기 농도를 각 그룹의 6마리 햄스터에 대해서 평균log10TCID50/ml로 표시하였다.
결과
키메라 바이러스 rPIV3-1로부터 회수된 완전한 길이의 키메라 PIV3-1 안티게놈 RNA을 코딩하는 cDNA의 구조물
위에서 언급한 바와 같이, JS 야생형 PIV3 HN 및 F 당단백질 유전자의 ORF가 PIV1/Wash64의 코딩 서열의 것으로 대체된 PIV3 및 PIV1 키메라 cDNA의 최종 구조물(도 14A 및 14B)은 15,516nt의 PIV3-1 키메라 안티게놈 RNA 을 코딩하며, 이는 6배 규칙과 일치한다(Durbin et al., Virology 234:74-78 (1997)). 키메라 PIV3-1 안티게놈을 코딩하는 pFLC.2G+.hc cDNA로 HEp-2세포를 N, P, 및 L 보조플라스미드와 함께 감염시켰다. 키메라 PIV3-1 안티게놈을 코딩하는 pFLC.2G+.hc cDNA로 HEp-2세포를 N, P, 및 L 보조플라스미드와 함께 감염시켰다. JS wt rPIV3 안티게놈을 코딩하는 p3/7(131)2G cDNA로 동일하게 감염시켜 rPIV3대조구 모바이러스를 제조하였다. 각 형질감염으로부터 회수하고 이어서 LLC-MK2에서 두번째 증폭을 하였고, 각 재조합 바이러스가 cDNA로부터 유래된 것인지를 확인하기 위한 연구를 개시하였다.
혈청형-특이적 항-HN 단클론항체 및 다클론항체를 사용하여 HAI 분석으로 PIV1 또는 PIV3 HN당단백질의 존재를 먼저 분석하였다. 표 12에 나타낸 바와 같이, 예상한 대로 rPIV3는 단지 두 PIV3 mAb중 하나와만 반응하였으나, 그의 생물학적 유래 모 PIV3/JS는 둘다와 반응하였다. 이것은 rPIV3가 cDNA로부터 유래된 것임을 표시하는 도입된 MARM변이를 함유하고 있음을 확인하는 것이다. rPIV3-1 바이러스는 PIV1 HN 당단백질에 특이적인 항체와 반응하였으나, PIV3 또는 PIV2의 HN에 특이적인 항체와는 반응하지 않았다는 사실은, 상기 바이러스가 예상한대로 PIV1 HN유전자를 가짐을 나타낸다.
다음으로, rPIV3-1 바이러스는 가공된 키메라 PIV3-1 HN 및 F유전자를 함유함을 확이하였다. 고안된 대로, rPIV3-1의 유전적 구조는 그의 모바이러스 PIV1/Wash64,또는 rPIV3/JS중 어느 것에 비하여 4개 접합부분에서 유일하다(도 15A의 박스). 이 영역은, 서열이 PIV3 비코딩영역에서 PIV1코딩으로 영역으로, 그다음 PIV1코딩영역에서 PIV3 비코딩영역으로 변환되는 전이점이다. PIV3 M 및 L에 특이적인 프라이머쌍 A, 또는 PIV1 M에 특이적인 프라이머쌍 B 및 HN 유전자의 3'말단을 사용하여, rPIV3-1, rPIV3/JS, PIV1/Wash64로부터 비리온-유래 RNA을 위한, RT-PCR산물을 제조하였다. 대조반응은, RT-PCR산물의 생성에 RT단계가 필요하다는 것을 나타내며, 이는 오염 DNA가 아니라 RNA주형이 RT-PCR산물의 제조에 필요하다는 것이다. rPIV3-1이 키메라 바이러스라는 초기 제시는, 단지 PIV3-특이적 프라이머쌍 A만이 F 및 HN유전자에 걸치는 예상된 4.6kb cDNA상물을 생성한다는 발견에서 얻는다(도 15B). 따라서, rPIV3-1 바이러스는 단지 HPIV1-특이적 HN당단백질만을 포함하는 반면에(표 12), 비코딩영역은 PIV3에 특이적이다. 역으로, PIV1 특이적 프라이머쌍 B는 PIV1 대조구로부터 적절한 크기로 증폭되나, rPIV3-1로부터는 아니다. 제한효소분해 분석법은, rPIV3-1 RT-PCR 산물은 rPIV3/JS PIV1/Wash64와는 다른 제한효소 패턴을 가지며, 그의 예상된 서열에 적합하다.
rPIV3-1의 4.6kb RT-PCR산물의 뉴클레오타이드 서열을 4영역에서 결정하고(도 15A), rPIV3/JS 및 PIV1/Wash64와 비교하였다(도 16). rPIV3-1 서열은 이에서 유래된 cDNA와 완전히 일치하였다. 세가지 RT-PCR 산물에 대한 영역 I-IV의 서열배영의 조사는, rPIV3-1은 변형된 개시 및 종료코돈을 가지고 PIV3의 5'및 3'비코딩영역으로 둘러싸인 rPIV1 F 및 HN 당단백질 ORF을 가진다는 것을 설명한다. rPIV3/JS 또는 PIV1/Wash64와 나란히 비교하여, rPIV3-1의 영역 III 및 IV에 걸치는 서열 래더(ladder)의 예를 측정하였다(도 17A 및 17B). 이러한 분석은, rPIV3-1이 유래된 cDNA와 그 구조가 완전히 일치하는 재조합 키메라 바이러스임을 확인하였다.
생체외에서 rPIV3-1의 트립신-의존성 및 세포변성(cytopathicity)
센다이 바이러스와 유사하나 PIV3와 대조적으로, PIV1은 계속적인 조직세포주상에서 다수의 주기로 복제하기 위해서, 그의 F 당단백질의 절단에 트립신이 요구된다(Frank et al., J.Clin. Microbiol. 10:32-6 (1979)). 추가로, PIV3가 쉽게 광범위한 CPE를 생성함에 비해, PIV1은 비세포변성 바이러스이다(Collins et al., In fields Virology, 3rd ed., 1:1205-43 (1996)). 이러한 특성에 기초하여 rPIV3-1, rPIV3, PIV1/Wash64를 비교하였다. PIV1/Wash64와 마찬가지로, rPIV3-1은 기니아피그가 아니라 닭의 적혈구를 이용하여 분석하면 더 높은 HA농도를 가진다(표 13). PIV1/Wash64 모바이러스와 마찬가지로, rPIV3-1은 효과적인 플라크형성뿐만 아니라 액상중층의 배양물에서 효과적인 복제를 위해서는 트립신을 요구한다. rPIV3-1은 32, 37, 또는 40℃에서 비슷한 효율로 플라크를 형성한다. 따라서, rPIV3-1이 PIV1 모바이러스의 F당단백질을 가지나 온도민감성이 아님은 분명하다. 다른 한편, 세포주기 및 바이러스 감염 다층에서 분리로 나타난 바와 같이, rPIV3-1가 그의 PIV3 모바이러스와 같은 정도로 CPE를 생산한다는 것은 이 생물학적 특성이 HN 및 F 코딩영역의 바깥에 존재하는 그의 PIV3유전자의 기능임을 제시한다. 따라서, rPIV3-1은 두 모바이러스로부터 유래된 생물학적 특성을 지니며, 이러한 사실은 이것이 키메라 바이러스라는 발견과 일치한다. 본발명의 범위내인 이 전형적인 재조합, 키메라 바이러스를 부다페스트 조약에 따라 미국 매릴랜드 20852, 록빌, 파크론 드라이드 12301에 위치한 ATCC에 1998년 5월 21에 기탁하였다.
LLC-MK2세포 및 햄스터에서 rPIV3-1과 이의 모바이러스의 복제비교
LLC-MK2 조직배양물 세포위에 moi 0.01로 접종하고 rPIV3, rPIV3-1, PIV1 Wash64의 복제 다중주기를 관찰하였다(도 18).상기 세 바이러스의 복제수준의 크기 및 동역학이 유사함을 알 수 있다. 이는 PIV3의 HN 및 F유전자에 대해 PIV1의 HN 및 F유전자의치혼이 생체외에서 바이러스를 약독화시키지 않음을 나타낸다. 다음으로, rPIV3-1이 생체내의 약독화, 특히 햄스터의 상부 및 하부 호흡관에서 복제를 측정하였다(표 14). rPIV3-1의 관찰된 복제수준은 약간 크지 않다면, 햄스터의 상부 및 하부 호흡관에서의 모바이러스와 동일하였다.
요약하면, 본 실시예는 rPIV1의 HN 및 F가 PIV3의 HN및 F유전자로 치환된 rPIV3-1 키메라 바이러스의 회수가 성공적임을 설명한다. 이 키메라 바이러스는 그의 야생형 PIV1 및 PIV3 모바이러스와 마찬가지로 생체외 및 생체내에서 복제하였으며, 이러한 사실은 당단백질 ORF의 치환이 rPIV3-1을 약독화시키지 않음을 나타낸다. PIV1의 HN및 F당단백질을 갖는 재조합 PIV3의 성공적인 회수는 놀라운 것이다. 왜냐하면, 다른 혈청형(serotype)을 나타내는 두 바이러스가 밀접하게 연결되어 있지 않기 때문이다. 특히, 두 모바이러스 뿐만 아니라 키메라 재조합 바이러스가 성장한다는 것은 주목할 만하다. 주목할만하게도, 당단백질 유전자상의 치환을 갖는 키메라 재조합 바이러스는 또한 소포 구내염 바이러스(vesicular stomatitis virus)에 대새서도 회수된다(Lawson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:4477-81 (1995)). 구체적으로, 인디아나 혈청형의 VSV G당단백질을 단지 50%의 아미노산 동일성을 가지는 뉴저지 혈청형으로 치환하였다. rPIV3-1과 대조적으로, 키메라 재조합 VSVI/NJ는 재조합 VSVI 또는 생물학적 유래 VSV의 수준의 10%로 복제된다.
본실시예에서, HN 및 F당단백질은 PIV1과 PIV3사이에 43% 및 47%의 서열동일성을 가진다. 두 당단백질을 함께 전달하는 것은 당단백질-대-당단백질의 비호환성을 제거할 것이다(Tanabayashi, K. and Compans, R.W. J. Virol. 70:6 112-18 (1996)). 다른 한편, 당단백질은 이들의 세포질쪽 도메인(CT) 또는 막관통(TM) 도메인을 통해 M당백질(PIV1 와 PIV3간에 63% 서열동일성이 있음)과 상호작용하며, 이러한 상호작용이 비리온 형태생성에 중요함은 일반적으로 알려져 있다. 이러한 점에서, TM 및 CT도메인에서 두 혈청형의 HN 및 F당단백질간의 서열동일성의 정도는 낮다: TM 도메인에 대해서 각각 30%와 20%이고, CT도메인에 대해서 각각 9%와 11%이다. 이런 낮은 수준의 서열 관련성에 비추어, 각 당단백질의 PIV1 외부 도메인이 PIV3 TM 및 CT 도메인에 융합된 키메라 당단백질을 제조하는 동일한 전략을 추구할 수 있다. M 단백질과 다른 내부 단백질과의 가능한 상호작용과 관련하여, 전하띤 아미노산의 배열과 같은 보존된 구조가 보존된 서열보다 중요하다. 또는, 당단백질의 TM 및 CT 도메인과 내부 단백질간의 상호작용이 이전에 생각된 것보다 훨씬 중요할 거이다. 본명세서에서 제ㅈ공된 도구와 방법을 사용하여 이러한 인자들을 더욱 자세히 조사할 수 있을 것이다. 예를 들면, 이러한 인자들은 PIV2의 HN 및 F를 갖는 PIV3 를 제조하기 위하여 상기 기술된 방법을 적용함에 의해서 추가로 명백해질 것이다.
rPIV3-1은 PIV1 F당단백질에 의해 부여되는 특성때문에 효과적인 복제를위해 는 트립신이 필요할 것임을 예상할 수 있으며, 이러한 것은 흔히 발견되는 것이다. 그러나, PIV3 모바이러스와 더욱 유사하게도 rPIV3-1이 CPE를 초래한다는 것을 흥미롭다. 이러한 사실은 HN 또는 F이외에 PIV3의 유전자가 이러한 표현형을 특정함을 나타낸다. 비세포변성 PIV1 및 세포변성 PIV3간에 추가적인 유전자의 교환으 위해서 본명세서에서 제공된 방법과 도구를 사용함으로써, 이러한 역할은 또한 추가로 밝혀질 것이다.
실시예 XII
PIV3 유형의 내부 단백질과 PIV 1유형의 표면 당단백질을 코딩하는 살아있는-약독화 키메라 재조합 PIV의 회수
본 실시예에서, 살아있는-약독화 cp45 PIV3 백신후보 바이러스(rPIV3-1.cp45L이라함)의 L유전자에서 발견된 3개의 온도 민감성 및 약독화 아미노산 코딩변화를 갖는 rPIV3-1 유도체는 동일한 3개 변이를 갖는 재조합 rPIV3-1.cp45L의 것과 유사하게, 38℃의 셧오프온도를 갖는 온도민감성 표현형을 나타내는 것으로 보여준다. rPIV3.cp45L과 같은 정도로, rPIV3-1.cp45L이 햄스터으 호흡관에서 약독화되었다. rPIV3-1.cp45L로 햄스터의 감염으로 wt PIV1에 대해 헤마글루티닌-저해 항체의 중간수준을 나타냈으며, 야생형 PIV1로 자극에 대한 완전한 내성을 유도하였다. 이것은 본발명이 약독화 키메라 PIV는 PIV1에 대해서 매우 효과적인 면역반응을 유도할 수 있는 것이다. 이러한 기재는 또한 파라인클루엔자 바이러스의 표면 당단백질이 동질 바이러스 자극에 대한 높은 수준의 내성을 유도하는데 충분하다는 것을 나타내는 상기 자료를 확인한다. 예기치 못하게도, PIV1의 표면 당단백질 및 PIV3의 내부 유전자을 가지는 재조합 키메라 바이러스 rPIV3-1.cp45L 또는 rPIV3-1도 또한 PIV3자극 바이러스의 복제에 대하여 중간수준의 내성을 유도한다. 이는 PIV3의 내부 유전자가 독립적으로 설치류에서 PIV3 에 대한 보호면역을 유도할 수 있음을 나타낸다. 따라서 본명세서에 기술된 대로, PIV3에 대한 역 유전적 시스템은 받아들여진 모델 대상에서 약독화되고 보호되는 살아있는 약독화 PIV1백신호부를 제조한다.
바이러스 및 세포
본연구에서 사용된 wt PIV1은 PIV1/Washinton/20993/1964 (Murphy et al. Infect. Immun. 12:62, 1975, 본문헌은 본명세서에 참고문헌으로 병합됨)이다. PIV3 HN 및 F ORF가 상기한 바대로 및 Tao등의 J. Virol 72:2955-1998(본문헌을 본명세서에 참고문헌으로 병합됨)에 기재된 대로 PIV1/Wash64로 치환된 키메라 PIV3 cDNA로부터 키메라 rPIV3-1을 회수된다. 50 ㎍/ml 젠타미신 설페이트 및 0.75㎍/ml 트립신(카탈로그 번호 3741, Worthington Biochemical Corp., Freehold. NJ)이 보충된 Opti-MEM (Life Technologies)에서 LLC-MK2 세포(ATCC CCL 7.1)에서 상기 바이러스를 증식하였다. 이러한 조건에서 성장시킬 때 PIV3가 아닌 PIV1의 F당단배질은 절단을 위해 외부 트립신에 의존적이기 때문에, 트립신이 포함된다. 사람 PIV3 바이러스의 wt JS 균주 및 cDNA로부터 유래된 이의 재조합 유도체(rPIV3/JS)를 상기한 대로 및 Durbin등의 Virology 235:323, 1997 (본문헌을 본명세서에 참고문헌으로 병합됨)에 기재된 대로 증폭하였다. cp45, wt PIV3/JS의 약독화 유도체(Karron et al., J. Infect. Dis 171:1107, 1995(본문헌을 본명세서의 참고문헌으로 병합됨), 및 cp45의 L유전자에서 발견된 세개의 ts 변이를 가지는 재조합 PIV3인 rPIV3cp45L을 상기한 대로 및 Skiadopoulos 등의 J. Virol. 72:1762, 1998(본문헌을 그 전체로서 본명세서의 참고문헌으로 병합됨)에 기술된 대로 증폭하였다. 박테리오파지 T7 RNA폴리머라제를 발현하는 변형된 백시니아 안카라(MVA)는 Virology 210:1995에 기술되어 있다(본 문헌 전체를 참고문헌으로 본명세서에 병합함).
형질감염에 사용된 HEp-2세포는 ATCC(ATCC CCL 23)에서 얻어서 50㎍/ml 젠타미신 설페이트, 및 2%의 소태아 혈청(FBS)를 포함하는 Opti-MEM I에서 유지하였다.
L변이를 안티게놈 cDNA로 도입
상기한 대로(Skiadopoulos et al., J Virol 72:1762, 1998), pTM(L)942/992/1558 플라스미드에 존재하는 cp45의 세개 L변이를 2.8kb Sph I-Nhe I 단편(PIV3 안티게놈 cDNA에서 11313 nt 내지 14092 nt)로서 키메라 cDNA pFLC.2G+.hc(Tao et al., J Virol 72:2955, 1998)로 도입하여 PIV1 F 및 HN ORF, 및 cp45 L의 세개 변이을 가진 완전한 길이의 pFLC.2G+.hc.cp45 L을 제조한다(도 29). pTM(L)942/992/1558에 존재하는 구체적 변이를 도 19에서 설명으로 나타낸다.
형질감염
6웰 플레이트에서 HEp-2 단층세포를 풍부하게 성장하였으며, 상기한 대로(Tao et al., J Virol 72:2955, 1998) 형질감염을 수행하였다. 4일째 수확하기전에 형질감염후 3일째에 최종농도 0.75㎍/ml가 되도록 트립신을 첨가하였다. 세포배양물 상징액을 분획하고 신선한 LLC-MK2세포단층에 계대배양하였다(계대배양 1이 라 함). 하룻밤 흡착한 후에, 배지를 0.75 ㎍/ml 트립신을 함유한 신선한 Opti-MEM I으로 바꾸었다. 계대배양 1 배양물을 32℃에서 4시간동안 배양하고, 상등액에 존재하는 바이러스를 수확하고 동일한 조건에서 계대배양하였다(계대배양 2라 함). 상기에 기재된 대로(Tao et al., J Virol 72:2955, 1998), 헤마글루티닌-저해 (HAI)분석법으로 PIV1 HN단백질의 존재에 대해서 계대배양 2의 수확물에 존재하는 바이러스를 테스트하였다.
다양한 온도에서 LLC-MK2에서 PIV의 복제
PIV1, rPIV3-1 rPIV3-1.cp45L의 경우에 아가로스 중층에 0.75㎍/ml의 트립신이 첨가된 LLC-MK2 단층에서 플라크계산을 상기한 대로 수행하였다(Tao et al., J Virol 72: 2955, 1998). 6일간 다양한 온도에서 배양한 후에, 아가로스 중충을 제거하고 기니아피그 적혈구를 사용한 혈액 흡착법으로 플라크를 확인하였다.
햄스터의 호흡관에서 PIV의 복제
rPIV3/JS, rPIV3.cp45L, cp45, PIV1/Wash64, rPIV3-1 또는 rPIV3-1.cp45L을 105 pfu로 포함하는 L-15배지 0.1ml를 비강으로 5마리의 골든 시리안 햄스터 그룹에게 각각 접종하였다. 접종후 4일째에 햄스터를 희생하고, 이들의 폐 및 코갑개골을 수확하여 균질화하고, 상기한 대로 및 Tao등의 J Virol 72:2955, 1998에 기재된 대로 샘플에 존재하는 바이러스를 32℃ LLC-MK2 단층세포상에서 농도를 측정하였다. 상기 농도를 각 그룹의 6마리 햄스터에 대해서 평균log10TCID50/각 그룹의 조직 그램으로 표시하였다.
햄스터에서 면역 및 자극연구
상기한 대로, 햄스터당 105 pfu 바이러스로 10마리 햄스터 그룹에게 비강으로 면역화하였다. 감염전 및 33일째에 HAI분석을 위한 혈청을 수집하였다. 항체로서 PIV1/Wash64 및 PIV3/JS10를 사용하여, 마리 햄스터의 각 그룹의 혈청에 존재하는 HAI항체 수준을 결정하고, 결정된 HAI 농도를 평균 log2로 표시하였다(Tao et al., J Virol 72:2955, 1998).
면역후 35일째, 각 그룹에서 5마리의 햄스터를 PIV1/Wash64 또는 rPIV3/JS로 105 pfu로 비강으로 자극하였다. 이들 자극된 햄스터의 코갑개골 및 폐을 자극후 4일 째에 수확하였다. 상기한 대로 및 Tao등의 J. Virol 72:2955, 1998에 기재된 대로, LLC-MK2세포에서 조직 샘플에 존재하는 바이러스 농도를 결정하고, 농도는 평균log10TCID50/조직그램으로 표시하였다.
결과
재조합 키메라 바이러스 rPIV3-1.cp45L의 회수 및 특성화
상기한 바와 같이, PIV3의 F 및 HN를 코딩하는 ORF를 PIV1의 것으로 치환한, PIV3의 완전한 길이의 안티게놈 cDNA인, cDNA 클론 pFLC.2G+.hc를 cp45의 L단백질에서확인된 세개 아미노산 코딩변화를 도입함으로써(L단백질상의 아미노산 위치에 따라서 942, 992, 1558로 지정함) 변형시켰으며, 독립적인 ts 및 att변이를 나타낸다(eh19; Skidopouls et al., J. Virol 72:1762, 1998). 자연적으로 존재하는 제한효소자리를 제거하는 연속적으로 번역하는 발현되지 않는 뉴클레오타이드 치환을 함께 도입함으로써 각 코딩변화를 표시하였다(도 19; 표 8). 최종 완전한 기링의 플라스미드 구조물, pFLC.2G+.cp45L(도 19)는 15516 뉴클레오타이드 길이를 가진 PIV3-1 키메라 재조합 RNA를 코딩하며, 6배 규칙과 일치한다(Durbin et al., Virology 234:74, 1997, 본문헌을 그 전체로서 본명세서에 참고문헌으로 병합됨). 적합한 제한효소의 분해로 pFLC.2G+.cp45L의 존재를 확인하였다. 상기한 대로 및 Tao등의 J. Virol 72:2955, 1998에 기재된 대로, pFLC.2G+.cp45L cDNA로 HEp-2세포를 PIV3 N, P 및 L 보조플라스미드와 함께 감염시키고, MVA-T7에 감염시켰다. LLC-MK2 세포에서 2회 계대배양한 후에 회수된 바이러슨, rPIV3-1.cp45L를 플라크-대-플라크-대-플라크 계대배양으로 생물학적으로 클로닝하였고, 상기 바이러스가 PIV1당단백질 및 L유전자에 도입된 세개의 변이를 가지는 지를 확인하기 위해서 증폭된 바이러스를 분석하였다. 먼저, 상기한 대로 및 Tao등의 J. Virol 72:2955, 1998에 기재된 대로, HAI 분석에서 PIV1 특이적 항체와의 반응성으로 rPIV3-1.cp45L에서 PIV1 HN 단백질의 존재를 확인하였다. 상기한 대로 및 Tao등의 J. Virol 72:2955, 1998에 기재된 대로, 비리온 RNA에서 생성된 RT-PCR 산물의 제한효소분해 또는 뉴클레오타이드 서열분석으로 rPIV3-1.cp45L 게놈 RNA에서 도입된 L유전자 변이뿐만 아니라 키메라 PIV3-1 HN 및 F 유전자의 존재를 확인하였다. 이러한 자료는 rPIV3-1.cp45L이 cp45의 L유전자의 3개 코돈치환을 갖는 재조합 키메라 바이러스임을 확인하였다.
rPIV3-1.cp45L는 온도민감성이다.
cp45의 세개 L 유전자 변이가 wt PIV3로 도입된 경우에 ts 표현형에 기여함이 상기에서 나타나고 있다(Skiadopoulos et al. J. Virol 72:1762, 1998). 키메라 바이러스에서 이들의 존재가 동일한 효과를 가지는지를 확인하기 위해서, rPIV3-1.cp45L의 플라크형성율을 다양한 온도에서 결정하였다. 표 15에서 나타난 바와 같이, 세개의 L유전자 변이가 키메라 바이러스에 ts 표현형을 부여하였다. 재조합 바이러스 rPIV3-1.cp45L 및 rPIV3.cp45L에서 cp45 L변이에 의한 구체화되는 온도민감성의 수준은 동일하며(표 15), 이는 변이의 효과가 PIV3 또는 PIV1의 HN 및 F 당단백질에 독립적임을 나타낸다. 비록 rPIV3-1.cp45L이 L유전자의 바깥에 변이를 가지고 있을 지라도, rPIV3-1.cp45L 및 rPIV3.cp45L의 온도민감성 수준이 생물학적 유래 cp45바이러스의 것과 동등하다(Strokes et al., Virus Res 30:43, 1993,본문헌을 본명세서의 참고문헌으로 병합됨).
햄스터에서 rPIV3-1.cp45L의 복제수준
cp45의 세개 L유전자 변이가 wt PIV3에 도입된 경우에 햄스터의 상부 및 하부 호흡관에서 바이러스 복제의 약독화에 기여함으로 앞에서 나타냈다(Skiadopouls et al., J. Virol 72:1762, 1998). 표 16에서 나타낸 바와 같이, 햄스터에 비강감염에 의해서 키메라 바이러스에 대한 이러한 효과를 측정하였다. 이러한 발견은 rPIV3-1.cp45L가 두자리 모두에서 약독화되고, 더구나 그 약독화 수준이 rPIV3.cp45L와 동등하다는 것을 나타낸다. 따라서, 온도 민감성과 마찬가지로, cp 45 L변이가 약독화에 기여하는 능력은 표면 당단백질의 항원특이성과 독립적이다.
PIV3의 내부 단백질 및 PIV1의 당단백질을 포함하는, rPIV3-1.cp45L 또는 rPIV3-1의 감염은 햄스터에서 PIV1자극에 대한 내성을 부여한다.
햄스터에서 면역원성과 보호효율성에 대해 키메라 rPIV3-1 및 이의 약독화 바이러스 rPIV3-1.cp45L 유도체를 측정하였다. 표 17에 나타낸 바와 같이, 둘중 어느 하나의 감염으로 PIV3가아니라 PIV1에 대한 HAI항체를 유도하며, 이러한 사실은 이들 키메라 바이러스가 PIV1 HN 당단백질을 가지며 매우 면역원성이 크다는 것을 확인하였다. rPIV3-1.cp45L에 의해 유도되는 HAI 항체의 수준은 rPIV3-1의 것보다 2배 낮다는 사실은, 그의 약독화가 중간 수준의 면역원성 감소를 초래한다는 것을 나타낸다. 유사하게, rPIV3 alc rPIV3.cp45L는 PIV1이 아니라 PIV3에 대한 HAI항체를 유도하며, 약독화 바이러스에 의해 유도되는 수준는 약 2배 더 낮다. cp45 L변이를 갖는 재조합 바이러스의 햄스터에서의 복제가 제한될 지라도, rPIV3.cp45L 또는 rPIV3-1.cp45L의 감염이 동종 당단백질을 갖는 자극 바이러스의 복제에 대하여 완전한 내성을 유도한다.
또한 rPIV3-1.cp45L감염이 PIV3에 대한 내성을 부여한다.
내성면에서 PIV의 비NH 또는 F당단백질(내부 단배질)의 역활에 관한 정보는 제한되어 있다. 면역화 및 자극 바이러스의 복제가 공유한 유일한 유전자들이 내부 단배질 유전자이기 때문에, 본명세서에서 rPIV3-1 및 rPIV3-1.cp45L의 기재 및 용도는 PIV3의 자극에 대한 내성에 있어서 내부단백질의 역할을 조사하는 기회를 제공한다. PIV3 자극 바이러스의 복제는 rPIV3-1 또는 rPIV3-1.cp45L로 햄스터를 감염시킴으로써 상부 및 하부 호흡관 모두에서 상당히 제한되었다(표 17). 따라서 이러한 자료는 HN 및 F단백질과 마찬가지로, PIV3의 내부 단백질이 자극 PIV3의 복제에 대한 부분적인 내성을 유도할 수 있다.
상기의 면역원성 및 효율 연구에 의해서 설명되는 발견중에서, 특히 예상치 못한 발견은 wt 및 att rPIV3의 감염이 폐에서 PIV1 자극 바이러스의 복제가 100배 감소한다는 것이다. 따라스, 하나의 혈청형 PIV로 감염시킴으로써 이종 혈청형에 대한 상당한 보호를 할 수 있다. 이전의 연구는 한가지 유형의 사람 PIV로 동물을 감염시킴으로써 다른 사람 혈청형에 속하는 PIV에 대한 상당한 이종보호를 유도할 수 없으며, 이는 사람 PIV감염에 대한 면역은 주로 유형특이적이다는 것과 일치하기 때문에, 이러한 발겨은 부분적으로 예기치 못한 것이다(e.g., Cook et al., Amer. Jour. Hyg. 77:150, 1963; Ray et al. J. Infect. Dis. 162:746, 1990, 각각의 문헌은 그 전체로서 본명세서에 참고문헌으로 병합됨).
본실시예는 PIV1에 대한 살아있는 약독화 바이러스 백신후보의 빠리고 합리적인 개발을 추가로 제공하기 위해, PIV3 백신의 생산을 위해 개발된 시약 및 새로운 개발 방법을 설명하는 것이다. 이들의 PIV3카운터파트부에 대한 PIV3 HN 및 F 보호항원을 코딩하는 ORF의 치환함으로써 감염성 PIV3를 코딩하는 cDNA를 변형시켰다. 이어서, 예를 들면, cp45 PIV3의 L유전자에 있는 세개 약독화 변이와 같은 약독화 변이를 이들 변형된 키메라 PIV3-PIV1 cDNA내로 도입하였다. cDNA로부터 PIV1의 HN 및 F유전자, PIV3의 내부 단백질 및 PIV3 cp45 L유전자 변이를 갖는 재조합 바이러스를 회수하였다. 이 재조합체, 즉 PIV3-1.cp45L는 온도민감성이며, 햄스터에서 매우 약독화되었으며, 햄스터에서 PIV1의 자극에 대해 큰 내성이 있었다. PIV3-1.cp45L의 온도민감성, 약독화, 및 면역원성의 수준은 cp45 PIV3와 유사하였으며, 이는 cp45 L유전자변이의 셋에 의한 표현형이 HN 및 F 표면 당단백질과 독립적임을 나타낸다. 이러한 발견은 역유전학에 의해서 생성된 첫번째 살아있는 약독화 PIV1 백신 후보를 나타내며, PIV1에 대한 백신의 개발에 일반적으로 성공적인 방법을 제공한다.
파라인플루엔자 바이러스의 내부 단백질이 이종 바이러스의 재감염에 대한 내성을 가지는 역할에 관한 정보가 거의 없다. N, N내에 에페토프, 또는 M을 발현하는 백시니아 재조합체로 감염시킴으로써 자극 바이러스의 복제에 대한 내성이 유도된다고 보고되나, 그 내성의 크기는 HN 또는 F당단백질을 갖는 백시니아 재조합체에 의한 것보다 적다(Kast et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:2283, 1991; Thomson et al., J. Immunol. 157:822, 1996, 각 문헌은 그 전체로서 본명세서에 참고문헌으로 병합됨). 이들 연구는, 내부 단백질이 단지 재감염에 대한 내성에 부수적인 기여을 한다는 것을 제시하고 있다. 따라서, 본명세서는, rPIV3-1.c45L, 또는 rPIV3-1로 햄스터를 전게 감염시킴으로써 폐 및 코갑개골에서 PIV3의 복제가 250 배 내지 4000배 감소함을 보임으로써 예기치 못한 결과를 제시한다. 이들 두 키메라 재조합 바이러스는 PIV3가 아니라 PIV1의 HN 및 F당단백질을 가지나 자극바이러스와 모든 다른 유전자를 공유한다는 점에서, PIV3 자극 바이러스와 다르다. PIV3가 아닌 PIV1의 HN 및 F당단배질은 PIV3의 것과 각각 47% 및 43%의 서열동일성을 공유한다. 공유된 내부 단백질이 관찰된 내성을 매개하는 것같을 지라도, 또한 PIV1 및 PIV3의 HN 및 F당단배질간에 공유한 단백질 서열이 관찰된 면역성에 기여할 수도 있다. 예를 들면, PIV1및 PIV3사이에 공유된, 적어도 9개 아미노산잔기로 걸쳐있는 HN에 5스트레치 및 F에 2개 스트레치(strech)가 있어 보호 CTL에피토프로서 작용할 잠재력이 있다. 공유된 내부 단백질이 wt PIV3 자극 바이러스의 복제제한에 기여한다로 여기는 것인 합리적일 수 있다. 왜냐하면 이러한 수준의 교차면역성은 이전 연구에서는 없었던 것이기 때문이다(Cook et al., Amer Jour. Hyg. 77:150, 1963, 본문헌은 그 전체로서 본명세서에 참고문헌으로 병합됨).
rPIV3-1,및 PIV3-1.cp45L 키메라의 내부 PIV3 단백질이 PIV3 자극 바이러스에 대한 내성을 부여한다는 발견은 PIV3의 약독화 유도체가 PIV1 및 PIV2 보호항원에대한 벡터로 작용할 수 있다는 것을 나타낸다. 본발명의 개시에 따르면, 하나의 PIV3-기초한 살아있는-약독화 백시니아 바이러스로 면역화함으로써 후속적으로 투여한 다른 PIV3-기초한 백신 바이러스의 복제를 제한함으로써 두번째 바이러스의 면역원성을 감소시킬 수 있다. RSV와 같이, PIV3는 영아에 있어서 상당한 질병을 유도하기 때문에, 2-4주 유아에게 사용하기 위한 RSV-PIV3 복합 백신이 본발명의 주요한 점이다(Collins et al., Fields Virology 3rd ed. Philadelphia: Lipponcott-Raven Publishers, 1204(1), 1996; Reed et al., J. Infect. Dis. 175L807, 1997, 상기 각문헌을 그 전체로서 본명세서에 참고문헌으로 병합됨). 본발명의 이러한 점에 따르면, 대부분의 PIV1 및 PIV2 질병은 6개월이후에 발생하기 때문에, PIV1-PIV2 백신의 면역화는 약 생후 6개월에 시작하는 것이 바람직하다. rPIV3cp45에 의한 면역으로 이것이 내부 단백질 유전자를 공유하는 키메라 재조합 PIV3-1 백신 바이러스의 복제를 상당히 저해가능한 조건에서, 재조합 PIV3-1 백신의 성공적인 면역화를 이룰 수 있다. 이러한 경우에, 삼중 PIV백신을 순차적이 아니라 동싱에 투여함으로써, 상기 언급한 저해를 방지할 수 있을 것이다. 백신 또는 wt PIV3의 감염이 이종 wt PIV1의 폐 바이러스 복제를 100배 감소시킬 것이라는 본명세서의 기재는, 분명히 예기치 못한 것이다. 그 이유는 부분적으로 사람의 PIV바이러스는 혈청학적으로 무력화분석에 의한 것과 다르며, 햄스터에서 이전연구는 한가지 유형의 PIV의 이전 감염이 다른 PIV 유형을 높은 투여량의 자극에 대하여 내성을 유도하지 못하였기 때문이다(Cook et al., Amer. Jour. Hyg. 77:150, 1963; Ray et al., J. Infect. Dis. 162: 746, 1990; Cook et al., Amer, Jour, Hyg, 69:250, 1959). 더욱이, 한 PIV의 이전감염은 이종유형의 PIV의 후속적인 감염을 상당히 변형시킨다는 약간의 전염병 자료가 있다.
요약하면, 본발명의 실시예는 F 및 HN당단백질을 코딩하는 ORF를 치환함으로써, 알려진 약독화 변이를 PIV3 내부 유전자에 도입함으로써, rPIV3를 PIV1에 대한 백신으로 성공적로 변환시킨 것을 보여준다. 따라서 본명세서에서 제공된 다양한 방법과 도구는 직접적으로 및 예측하건데 살아있는-약독화 PIV2 백신 바이러스의 생성뿐만 아니라, rPIV3-1키메라 바이러스의 PIV3 골격을 약독화시키는데 적용할 수 있다.
상기 개시를 통해, 본명세서에서 PIV 및 관련 백신의 광범위한 조합을 위한 개발방법 및 도구를 제공한다. 이러한 맥락에서, PIV3 및 PIV2사이에 살아있는 면역원성 키메라는 백신용 재조합 PIV 바이러스를 개발하는 강력하고 새로운 도구를 제공한다. 이러한 연구와 관련하여, 자연적으로 일어나는 PIV변이, 예를 들면 cp45 및 BPIV3백신 후보의 약독화에 대한 본발명에 기재한 기술에 따른 유전적 기초의 동정과 특성화도 재조합 백신후보의 다양한 숙주와 서브바이러스 입자의 개발을 가능하게 한다. 특히, 상기한 바와 같이, 생물학적 유래 변이 바이러스에 존재하는 바람직한 변이를 단독으로 또는 공동으로 야생형, 부분적으로 약독화된 또는 키메라 PIV환경으로 도입함으로써 용이하게 확인하고 선택할 수 있을 것이다. 이러한 발견은, 본발명의 범위내에서 백신 재조합체에서 약독화 및 면역원성을 조절하기 위해 PIV클론으로 도입될 수 있는 전형적인 약독화 변이의 메뉴를 확장할 것이다. 또한, 생물학적 유래 변이를 다른 유형의 변이를 갖는, 예를 들면 유전자 또는 유전자 단편의 삭제, 치환, 또는 변형에 관련된 변이를 갖는 PIV클론내로 도입할 수 있다. 본발명의 이러한 점내에서, C, D V ORF이 결실된 rPIV와 같은 선택된 유전자의 삭제, 첨가 또는 치환을 갖는 재조합 PIV를 제공한다. 본명세서에 따라, 생물학적으로 유래된 변이 PIV로부터 채택된 ts, ca 또는 att표현형중 하나 이상의 변이, 예를 들면, r942, r992, r1558, r942/992, r992/1558 r942/1558, r942/992/1558을 도입함으로써 상기 택일적으로 변이된 클론를 추가로 변형시킬 수 있다. 본 발명의 추가의 양상에서, 생물학적으로 유래된 변이를 자연에 존재하지 않는 원시적 약독화 변이, 예컨대 유전자, C, D 또는 V ORF의 결실과 결합할 수 있다. 1997년 7월 15일에 출원된 미국 특허출원 제 08/892, 403호(본문헌은 본명세서에 참고문헌으로 병합됨)에 기재된 재조합 RSV 백신 균주에 대해 기술된 조합변이의 범위와 유사하게, 원하는 표현형적 특징을 부여하는 본명세서에 기재된 다른 유형의 변이도 또한 생물학적으로 유래된, 약독화 변이와 결합될 수 있다. 유사한 변이를 예를 들면, 키메라 바이러스로 도입하여 키메라 백신 균주에서 바람직한 수준의 약독화 및 면역원성을 달성할 수 있다. 이같은 방식으로, 본발명의 범위내에서 다른 원하는 표현형 특성과 함께 원하는 균형의 약독화와 면역원성을 갖는 다양한 조합의 살아있는 약독화 rPIV백신을 가공하는데 유용한 다양한 메뉴의 변이를 제공한다.
상기 발명을 이해의 명확화를 위해 예시 및 실시예로서 자세히 설명되었을 지라도, 어떠한 변화나 변형도 다음에 첨부된 특허청구범위내에서 가능하다는 것은 명백할 것이다.
Claims (133)
- 작동가능하게 연결된 전사 프로모터, 키메라 PIV 게놈 또는 안티게놈을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열, 및 전사 종결인자를 포함하되, 상기 키메라 PIV 게놈 또는 안티게놈을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열이 사람 PIV1(HPIV1), 사람 PIV2(HPIV2), 사람 PIV3(HPIV3), 소 PIV(BPIV) 및 쥐 PIV(MPIV)로 이루어지는 군에서 선택된 이종(heterologous) PIV 서열의 유전자 또는 게놈 단편이 백그라운드 PIV 게놈 또는 안티게놈 내에 삽입되거나 백그라운드 PIV 게놈 또는 안티게놈 내의 대응(counterpart) 유전자 또는 게놈 단편을 치환하는 것을 특징으로 하는 백그라운드 PIV 게놈 또는 안티게놈을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 분리된 폴리뉴클레오타이드 분자.
- 제1항에 있어서, 백그라운드 PIV가 HPIV3이고, 이종 PIV의 유전자 또는 게놈 단편이 상기 HPIV3의 대응 유전자 또는 게놈 단편을 치환하는 분리된 폴리뉴클레오타이드 분자.
- 제2항에 있어서, 이종 PIV의 대응 유전자 또는 게놈 단편이 HPIV1 또는 HPIV2의 HN 또는 F 당단백질 유전자 또는 게놈 단편인 분리된 폴리뉴클레오타이드 분자.
- 삭제
- 제1항에 있어서, 백그라운드 게놈 또는 안티게놈이 HPIV 게놈 또는 안티게놈이고 이종 PIV가 BPIV이거나, 백그라운드 게놈 또는 안티게놈이 BPIV 게놈 또는 안티게놈이고 이종 PIV가 HPIV인 분리된 폴리뉴클레오타이드 분자.
- 제1항에 있어서, RSV의 유전자 또는 게놈 단편이 상기 키메라 게놈 또는 안티게놈 내에 삽입되거나 대응 유전자 또는 게놈 단편을 치환하는 분리된 폴리뉴클레오타이드 분자.
- 제6항에 있어서, RSV의 유전자 또는 게놈 단편이 G 또는 F 유전자 또는 유전자 단편인 분리된 폴리뉴클레오타이드 분자.
- 제1항에 있어서, 홍역(measles) 바이러스의 유전자 또는 게놈 단편이 상기 키메라 게놈 또는 안티게놈 내에 삽입되거나 대응 유전자 또는 게놈 단편을 치환하는 분리된 폴리뉴클레오타이드 분자.
- 제8항에 있어서, 홍역 바이러스의 유전자 또는 게놈 단편이 HA 또는 F 유전자 또는 유전자 단편인 분리된 폴리뉴클레오타이드 분자.
- 작동가능하게 연결된 전사 프로모터, PIV 게놈 또는 안티게놈을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열, 및 전사 종결인자를 포함하되, 상기 PIV 게놈 또는 안티게놈을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열이i) p218(131) (SEQ ID NO: 1);ii) p3/7(131) (SEQ ID NO: 14);iii) p3/7(131)2G (SEQ ID NO: 15); 및iv) HPIV1, HPIV2, BPIV 및 MPIV로 이루어지는 군에서 선택된 이종 PIV 서열의 유전자 또는 게놈 단편이 상기 PIV 게놈 또는 안티게놈 내에 삽입되거나 대응 유전자 또는 게놈 단편을 치환하는, 또는 상기 PIV 게놈 또는 안티게놈이 약독화, 온도 민감성, 저온 적응성 및 작은 플라크 크기로 이루어지는 군에서 선택된 표현형의 변화를 특정하는 하나 이상의 점 돌연변이를 포함하는 i), ii) 또는 iii)의 분리된 폴리뉴클레오타이드로 이루어지는 군에서 선택되는, 분리된 폴리뉴클레오타이드 분자.
- 작동가능하게 연결된 전사 프로모터, PIV 게놈 또는 안티게놈을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열, 및 전사 종결인자를 포함하되, 상기 PIV 게놈 또는 안티게놈을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열이 약독화, 온도 민감성, 저온 적응성 및 작은 플라크 크기로 이루어지는 군에서 선택된 표현형의 변화를 특정하는 하나 이상의 점 돌연변이를 포함하는 분리된 폴리뉴클레오타이드 분자.
- 삭제
- 제11항에 있어서, 상기 PIV 게놈 또는 안티게놈을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열이 ts 표현형을 특정하는 다중 점 돌연변이를 포함하는 분리된 폴리뉴클레오타이드 분자.
- 제11항에 있어서, 상기 PIV 게놈 또는 안티게놈을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열이 비-ts 약독화 표현형을 특정하는 다중 점 돌연변이를 포함하는 분리된 폴리뉴클레오타이드 분자.
- 제11항에 있어서, 상기 PIV 게놈 또는 안티게놈을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열이i) L 단백질의 Tyr942, ii) L 단백질의 Leu992, iii) L 단백질의 Thr1558,iv) N 단백질의 Val96, v) N 단백질의 Ser389, vi) C 단백질의 Ile96,vii) F 단백질의 Ile420, viii) F 단백질의 Ala450 및 ix) HN 단백질의 Val384 로 이루어지는 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 다른 아미노산으로 변화시키거나;x) 3' 리더 서열의 23번 위치 뉴클레오타이드,xi) 3' 리더 서열의 24번 위치 뉴클레오타이드,xii) 3' 리더 서열의 28번 위치 뉴클레오타이드,xiii) 3' 리더 서열의 45번 위치 뉴클레오타이드 및xiv) N 유전자 개시서열의 62번 위치 뉴클레오타이드로 이루어지는 군에서 선택된 하나 이상의 뉴클레오타이드를 다른 뉴클레오타이드로 변화시키는 하나 이상의 점 돌연변이를 포함하는, 분리된 폴리뉴클레오타이드 분자.
- 제15항에 있어서, 상기 PIV 게놈 또는 안티게놈을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열이 L 단백질에서 아미노산 치환을 나타내는 하나 이상의 점 돌연변이를 포함하는 분리된 폴리뉴클레오타이드 분자.
- 삭제
- 제15항에 있어서, 상기 PIV 게놈 또는 안티게놈을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열이 N 단백질에서 아미노산 치환을 나타내는 하나 이상의 점 돌연변이를 포함하는 분리된 폴리뉴클레오타이드 분자.
- 삭제
- 제15항에 있어서, 상기 PIV 게놈 또는 안티게놈을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열이 C 단백질에서 아미노산 치환을 나타내는 하나 이상의 점 돌연변이를 포함하는 분리된 폴리뉴클레오타이드 분자.
- 삭제
- 제15항에 있어서, 상기 PIV 게놈 또는 안티게놈을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열이 F 단백질에서 아미노산 치환을 나타내는 하나 이상의 점 돌연변이를 포함하는 분리된 폴리뉴클레오타이드 분자.
- 삭제
- 제15항에 있어서, 상기 PIV 게놈 또는 안티게놈을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열이 HN 단백질에서 아미노산 치환을 나타내는 하나 이상의 점 돌연변이를 포함하는 분리된 폴리뉴클레오타이드 분자.
- 삭제
- 제15항에 있어서, 상기 PIV 게놈 또는 안티게놈을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열이 3' 리더 서열에서의 하나 이상의 점 돌연변이를 포함하는 분리된 폴리뉴클레오타이드 분자.
- 삭제
- 제15항에 있어서, 상기 PIV 게놈 또는 안티게놈을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열이 N 유전자 개시서열에서의 점 돌연변이를 포함하는 분리된 폴리뉴클레오타이드 분자.
- 삭제
- 삭제
- 제11항에 있어서, 안티게놈 cDNA가 rcp45, rcp45 3'NCMFHN, rcp45 3'NL, rcp45 3'N, rcp45 F, rcp45 M, rcp45 HN, 및 rcp45 C로 이루어지는 군에서 선택되는 분리된 폴리뉴클레오타이드 분자.
- 제11항에 있어서, 상기 점 돌연변이는 이를 특정하는 코돈 내에서 다중 뉴클레오타이드 치환에 의해 안정화되는 것을 특징으로 하는 분리된 폴리뉴클레오타이드 분자.
- 제10항에 있어서, 상기 PIV 게놈 또는 안티게놈을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열이, HPIV1, HPIV2, BPIV 및 MPIV로 이루어지는 군에서 선택된 이종 유전자 또는 게놈 단편이 상기 PIV 게놈 또는 안티게놈 내에 삽입되거나 상기 PIV 게놈 또는 안티게놈의 대응 유전자 또는 게놈 단편을 치환함으로써 키메라 게놈 또는 안티게놈을 형성하는 분리된 폴리뉴클레오타이드 분자.
- 제33항에 있어서, 상기 PIV 키메라 게놈 또는 안티게놈을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열이 ts 표현형을 특정하는 하나 이상의 점 돌연변이를 추가로 포함하는 분리된 폴리뉴클레오타이드 분자.
- 제33항에 있어서, 상기 PIV 키메라 게놈 또는 안티게놈을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열이 비-ts 약독화 표현형을 특정하는 하나 이상의 점 돌연변이를 추가로 포함하는 분리된 폴리뉴클레오타이드 분자.
- 제33항에 있어서, 상기 PIV 키메라 게놈 또는 안티게놈을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열이i) L 단백질의 Tyr942, ii) L 단백질의 Leu992, iii) L 단백질의 Thr1558,iv) N 단백질의 Val96, v) N 단백질의 Ser389, vi) C 단백질의 Ile96,vii) F 단백질의 Ile420, viii) F 단백질의 Ala450 및 ix) HN 단백질의 Val384 로 이루어지는 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 다른 아미노산으로 변화시키거나;x) 3' 리더 서열의 23번 위치 뉴클레오타이드,xi) 3' 리더 서열의 24번 위치 뉴클레오타이드,xii) 3' 리더 서열의 28번 위치 뉴클레오타이드,xiii) 3' 리더 서열의 45번 위치 뉴클레오타이드 및xiv) N 유전자 개시서열의 62번 위치 뉴클레오타이드로 이루어지는 군에서 선택된 하나 이상의 뉴클레오타이드를 다른 뉴클레오타이드로 변화시키는 하나 이상의 점 돌연변이를 추가로 포함하는, 분리된 폴리뉴클레오타이드 분자.
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- 제33항에 있어서, 상기 키메라 게놈 또는 안티게놈은 PIV3의 HN 또는 F 당단백질 유전자 또는 이들 모두가 PIV1 또는 PIV2의 대응 HN 또는 F 당단백질 유전자로 치환된 키메라 PIV 게놈 또는 안티게놈인 분리된 폴리뉴클레오타이드 분자.
- 제33항에 있어서, 약독화, 온도민감성, 저온 적응성, 작은 플라크 크기, 숙주범위제한 및 PIV의 면역원성 에피토프의 변화로 이루어지는 군에서 선택된 표현형의 변화를 특정하는 이종 PIV 서열이 PIV 게놈 또는 안티게놈 내에 삽입되거나 대응 유전자 또는 게놈 단편을 치환하는 분리된 폴리뉴클레오타이드 분자.
- 제11항에 있어서, HPIV1, HPIV2, BPIV 또는 MPIV의 시스-작용 조절서열을 포함하는 분리된 폴리뉴클레오타이드 분자.
- 제11항에 있어서, RSV의 이종서열이 상기 PIV 게놈 또는 안티게놈 내에 삽입되거나 대응 유전자 또는 게놈 단편을 치환하는 분리된 폴리뉴클레오타이드 분자.
- 제43항에 있어서, RSV의 이종서열이 G 또는 F 유전자 또는 유전자 단편인 분리된 폴리뉴클레오타이드 분자.
- 제11항에 있어서, 홍역 바이러스의 이종서열이 상기 PIV 게놈 또는 안티게놈 내에 삽입되거나 대응 유전자 또는 게놈 단편을 치환하는 분리된 폴리뉴클레오타이드 분자.
- 제45항에 있어서, 홍역 바이러스의 이종서열이 HA 또는 F 유전자 또는 유전자 단편인 분리된 폴리뉴클레오타이드 분자.
- 제11항에 있어서, 사이토카인, T-헬퍼 에피토프, 제한효소마커, 또는 포유동물 숙주에서 보호면역반응을 유발할 수 있는 미생물 병원체의 단백질 중에서 선택되는 비PIV 분자를 코딩하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드가 상기 PIV 게놈 또는 안티게놈내에 삽입된 분리된 폴리뉴클레오타이드 분자.
- PIV 게놈 또는 안티게놈을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 분자를 포함하는 발현벡터, 및 PIV의 N, P 및 L 단백질을 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드 분자를 포함하는 발현벡터를 포함하고, 상기 PIV 게놈 또는 안티게놈 및 N, P 및 L 단백질의 발현으로 감염성 PIV 입자를 제조하되,상기 PIV 게놈 또는 안티게놈이 HPIV1, HPIV2, HPIV3, BPIV 및 MPIV로 이루어지는 군에서 선택된 이종 PIV 서열의 유전자 또는 게놈 단편이 백그라운드 PIV 게놈 또는 안티게놈 내에 삽입되거나 백그라운드 PIV 게놈 또는 안티게놈 내의 대응 유전자 또는 게놈 단편을 치환하는 것을 특징으로 하는 키메라 PIV 게놈 또는 안티게놈이거나,상기 PIV 게놈 또는 안티게놈이i) p218(131) (SEQ ID NO: 1);ii) p3/7(131) (SEQ ID NO: 14);iii) p3/7(131)2G (SEQ ID NO: 15); 및iv) HPIV1, HPIV2, BPIV 및 MPIV로 이루어지는 군에서 선택된 이종 PIV 서열의 유전자 또는 게놈 단편이 상기 PIV 게놈 또는 안티게놈 내에 삽입되거나 대응 유전자 또는 게놈 단편을 치환하는 것을 특징으로 하는 i), ii) 또는 iii)의 분리된 폴리뉴클레오타이드로 이루어지는 군에서 선택되는 폴리뉴클레오타이드를 포함하거나,상기 PIV 게놈 또는 안티게놈이 약독화, 온도 민감성, 저온 적응성 및 작은 플라크 크기로 이루어지는 군에서 선택된 표현형의 변화를 특정하는 하나 이상의 점 돌연변이를 포함하는, 세포.
- 제48항에 있어서, 상기 감염성 PIV 입자가 바이러스인 세포.
- 제48항에 있어서, 상기 감염성 PIV 입자가 서브바이러스인 세포.
- 제48항에 있어서, 상기 PIV 게놈 또는 안티게놈을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 및 PIV의 N, P 및 L 단백질을 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드가 하나의 벡터에 도입된 세포.
- PIV 게놈 또는 안티게놈을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 분자를 포함하는 발현벡터, 및 PIV의 N, P 및 L 단백질을 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드 분자를 포함하는 발현벡터를 세포 또는 무세포 시스템에서 함께 발현하여, 감염성 PIV 입자를 제조하되,상기 PIV 게놈 또는 안티게놈이 HPIV1, HPIV2, HPIV3, BPIV 및 MPIV로 이루어지는 군에서 선택된 이종 PIV 서열의 유전자 또는 게놈 단편이 백그라운드 PIV 게놈 또는 안티게놈 내에 삽입되거나 백그라운드 PIV 게놈 또는 안티게놈 내의 대응 유전자 또는 게놈 단편을 치환하는 것을 특징으로 하는 키메라 PIV 게놈 또는 안티게놈이거나,상기 PIV 게놈 또는 안티게놈이i) p218(131) (SEQ ID NO: 1);ii) p3/7(131) (SEQ ID NO: 14);iii) p3/7(131)2G (SEQ ID NO: 15); 및iv) HPIV1, HPIV2, BPIV 및 MPIV로 이루어지는 군에서 선택된 이종 PIV 서열의 유전자 또는 게놈 단편이 상기 PIV 게놈 또는 안티게놈 내에 삽입되거나 대응 유전자 또는 게놈 단편을 치환하는 것을 특징으로 하는 i), ii) 또는 iii)의 분리된 폴리뉴클레오타이드로 이루어지는 군에서 선택되는 폴리뉴클레오타이드를 포함하거나,상기 PIV 게놈 또는 안티게놈이 약독화, 온도 민감성, 저온 적응성 및 작은 플라크 크기로 이루어지는 군에서 선택된 표현형의 변화를 특정하는 하나 이상의 점 돌연변이를 포함하는, PIV를 코딩하는 하나 이상의 분리된 폴리뉴클레오타이드 분자로부터 감염성 PIV 입자를 제조하는 방법.
- 제52항에 있어서, 상기 PIV 게놈 또는 안티게놈과 N, P 및 L 단백질이 동일한 발현벡터에 의해서 발현되는 방법.
- 제52항에 있어서, 상기 N, P 및 L 단백질이 2 이상의 다른 발현벡터 상에서 코딩되는 방법.
- 제52항에 있어서, 하나 이상의 N, P 및 L 단백질이 PIV의 공동감염으로 공급되는 방법.
- 제52항에 있어서, 상기 PIV 게놈 또는 안티게놈을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 분자가 cDNA인 방법.
- 제52항에 있어서, 상기 감염성 PIV 입자가 바이러스인 방법.
- 제52항에 있어서, 상기 감염성 PIV 입자가 서브바이러스 입자인 방법.
- 제52항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드 분자가 사람 또는 소의 백그라운드 PIV 게놈 또는 안티게놈을 포함하는 키메라 PIV 게놈 또는 안티게놈을 코딩하는 방법.
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- 제52항에 있어서, 상기 PIV 게놈 또는 안티게놈을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 분자가 약독화, 온도 민감성, 저온 적응성 및 작은 플라크 크기로 이루어지는 군에서 선택된 표현형의 변화를 특정하는 하나 이상의 점 돌연변이를 포함하는 방법.
- 제52항에 있어서, 상기 PIV 게놈 또는 안티게놈을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 분자가 ts 표현형을 특정하는 하나 이상의 점 돌연변이를 포함하는 방법.
- 제52항에 있어서, 상기 PIV 게놈 또는 안티게놈을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 분자가 비-ts 약독화 표현형을 특정하는 하나 이상의 점 돌연변이를 포함하는 방법.
- 제52항에 있어서, 상기 PIV 게놈 또는 안티게놈을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 분자가i) L 단백질의 Tyr942, ii) L 단백질의 Leu992, iii) L 단백질의 Thr1558,iv) N 단백질의 Val96, v) N 단백질의 Ser389, vi) C 단백질의 Ile96,vii) F 단백질의 Ile420, viii) F 단백질의 Ala450 및 ix) HN 단백질의 Val384 로 이루어지는 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 다른 아미노산으로 변화시키거나;x) 3' 리더 서열의 23번 위치 뉴클레오타이드,xi) 3' 리더 서열의 24번 위치 뉴클레오타이드,xii) 3' 리더 서열의 28번 위치 뉴클레오타이드,xiii) 3' 리더 서열의 45번 위치 뉴클레오타이드 및xiv) N 유전자 개시서열의 62번 위치 뉴클레오타이드로 이루어지는 군에서 선택된 하나 이상의 뉴클레오타이드를 다른 뉴클레오타이드로 변화시키는 하나 이상의 점 돌연변이를 포함하는 방법.
- 제65항에 있어서, 상기 PIV 게놈 또는 안티게놈을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 분자가i) L 단백질의 Tyr942, ii) L 단백질의 Leu992, iii) L 단백질의 Thr1558,iv) N 단백질의 Val96, v) N 단백질의 Ser389, vi) C 단백질의 Ile96,vii) F 단백질의 Ile420, viii) F 단백질의 Ala450 및 ix) HN 단백질의 Val384 로 이루어지는 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 다른 아미노산으로 변화시키거나;x) 3' 리더 서열의 23번 위치 뉴클레오타이드,xi) 3' 리더 서열의 24번 위치 뉴클레오타이드,xii) 3' 리더 서열의 28번 위치 뉴클레오타이드,xiii) 3' 리더 서열의 45번 위치 뉴클레오타이드 및xiv) N 유전자 개시서열의 62번 위치 뉴클레오타이드로 이루어지는 군에서 선택된 하나 이상의 뉴클레오타이드를 다른 뉴클레오타이드로 변화시키는 2 이상의 점 돌연변이를 포함하는 방법.
- 제65항에 있어서, 상기 PIV 게놈 또는 안티게놈을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 분자가 L 단백질에서 하나 이상의 아미노산 치환을 나타내는 점 돌연변이를 포함하는 방법.
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- 제52항에 있어서, 상기 PIV 게놈 또는 안티게놈이 약독화, 온도 민감성, 저온 적응성 및 작은 플라크 크기로 이루어지는 군에서 선택된 표현형의 변화를 특정하는 하나 이상의 점 돌연변이를 포함하되, 상기 점 돌연변이는 이를 특정하는 코돈 내에서 다중 뉴클레오타이드 치환에 의해 안정화되는 것을 특징으로 하는 방법.
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- 제52항에 있어서, 상기 PIV 게놈 또는 안티게놈을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 분자가 rcp45, rcp45 3'NCMFHN, rcp45 3'NL, rcp45 3'N, rcp45 F, rcp45 M, rcp45 HN, 및 rcp45 C로 이루어지는 군에서 선택된 안티게놈 cDNA인 방법.
- 제52항에 있어서, 상기 PIV 게놈 또는 안티게놈이 HPIV1, HPIV2, HPIV3, BPIV 및 MPIV로 이루어지는 군에서 선택된 이종 PIV 서열의 유전자 또는 게놈 단편이 백그라운드 PIV 게놈 또는 안티게놈 내에 삽입되거나 백그라운드 PIV 게놈 또는 안티게놈 내의 대응 유전자 또는 게놈 단편을 치환하는 것을 특징으로 하는 키메라 PIV 게놈 또는 안티게놈인 방법.
- 제73항에 있어서, 상기 PIV 게놈 또는 안티게놈을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 분자가 HPIV3와 HPIV1, HPIV2, BPIV 또는 MPIV의 키메라인 방법.
- 제74항에 있어서, HPIV1 또는 HPIV2의 HN 또는 F 당단백질의 유전자 또는 유전자 단편이 대응 HPIV3의 유전자 또는 유전자 단편을 치환한 것을 특징으로 하는 방법.
- 제73항에 있어서, 상기 키메라 게놈 또는 안티게놈이 ts 표현형을 특정하는 하나 이상의 점 돌연변이를 추가로 포함하는 방법.
- 제73항에 있어서, 상기 키메라 게놈 또는 안티게놈이 비-ts 약독화 표현형을 특정하는 하나 이상의 점 돌연변이를 추가로 포함하는 방법.
- 제73항에 있어서, 상기 키메라 게놈 또는 안티게놈이i) L 단백질의 Tyr942, ii) L 단백질의 Leu992, iii) L 단백질의 Thr1558,iv) N 단백질의 Val96, v) N 단백질의 Ser389, vi) C 단백질의 Ile96,vii) F 단백질의 Ile420, viii) F 단백질의 Ala450 및 ix) HN 단백질의 Val384 로 이루어지는 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 다른 아미노산으로 변화시키거나;x) 3' 리더 서열의 23번 위치 뉴클레오타이드,xi) 3' 리더 서열의 24번 위치 뉴클레오타이드,xii) 3' 리더 서열의 28번 위치 뉴클레오타이드,xiii) 3' 리더 서열의 45번 위치 뉴클레오타이드 및xiv) N 유전자 개시서열의 62번 위치 뉴클레오타이드로 이루어지는 군에서 선택된 하나 이상의 뉴클레오타이드를 다른 뉴클레오타이드로 변화시키는 하나 이상의 점 돌연변이를 포함하는 방법.
- 제73항에 있어서, 상기 키메라 게놈 또는 안티게놈이 약독화, 온도민감성, 저온 적응성 및 작은 플라크 크기로 이루어지는 군에서 선택된 표현형의 변화를 특정하는 다중 점 돌연변이를 추가로 포함하는 방법.
- 제73항에 있어서, 상기 키메라 PIV 게놈 또는 안티게놈이 PIV3 백그라운드 게놈 또는 안티게놈을 포함하되, 상기 PIV3의 HN 또는 F 당단백질 유전자 또는 유전자 단편이 대응 PIV1 또는 PIV2의 HN 또는 F 당단백질 유전자 또는 유전자 단편으로 치환되고, 추가로 약독화, 온도민감성, 저온 적응성 및 작은 플라크 크기로 이루어지는 군에서 선택된 표현형의 변화를 특정하는 하나 이상의 점 돌연변이를 포함하는 방법.
- 제80항에 있어서, 상기 PIV3 게놈 또는 안티게놈은 PIV3의 HN 및 F 당단백질 유전자 모두가 대응 PIV1 또는 PIV2의 HN 및 F 당단백질 유전자로 치환되고, 추가로i) L 단백질의 Tyr942, ii) L 단백질의 Leu992, iii) L 단백질의 Thr1558,iv) N 단백질의 Val96, v) N 단백질의 Ser389, vi) C 단백질의 Ile96,vii) F 단백질의 Ile420, viii) F 단백질의 Ala450 및 ix) HN 단백질의 Val384 로 이루어지는 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 다른 아미노산으로 변화시키거나;x) 3' 리더 서열의 23번 위치 뉴클레오타이드,xi) 3' 리더 서열의 24번 위치 뉴클레오타이드,xii) 3' 리더 서열의 28번 위치 뉴클레오타이드,xiii) 3' 리더 서열의 45번 위치 뉴클레오타이드 및xiv) N 유전자 개시서열의 62번 위치 뉴클레오타이드로 이루어지는 군에서 선택된 하나 이상의 뉴클레오타이드를 다른 뉴클레오타이드로 변화시키는 하나 이상의 점 돌연변이를 포함하는 방법.
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- 제52항에 있어서, 상기 PIV 게놈 또는 안티게놈, 또는 상기 키메라 게놈 또는 안티게놈이 RSV의 이종서열을 추가로 포함하는 방법.
- 제84항에 있어서, 상기 RSV의 이종서열이 G 또는 F 유전자 또는 유전자 단편인 방법.
- 제52항에 있어서, 상기 PIV 게놈 또는 안티게놈, 또는 상기 키메라 게놈 또는 안티게놈이 홍역 바이러스의 이종서열을 추가로 포함하는 방법.
- 제86항에 있어서, 상기 홍역 바이러스의 이종서열이 HA 또는 F 유전자 또는 유전자 단편인 방법.
- 제52항에 있어서, 상기 PIV 게놈 또는 안티게놈이i) p218(131) (SEQ ID NO: 1);ii) p3/7(131) (SEQ ID NO: 14);iii) p3/7(131)2G (SEQ ID NO: 15); 및iv) HPIV1, HPIV2, BPIV 및 MPIV로 이루어지는 군에서 선택된 이종 PIV 서열의 유전자 또는 게놈 단편이 상기 PIV 게놈 또는 안티게놈 내에 삽입되거나 대응 유전자 또는 게놈 단편을 치환하는 것을 특징으로 하는 i), ii) 또는 iii)의 분리된 폴리뉴클레오타이드로 이루어지는 군에서 선택되는 폴리뉴클레오타이드를 포함하거나,상기 PIV 게놈 또는 안티게놈이 약독화, 온도 민감성, 저온 적응성 및 작은 플라크 크기로 이루어지는 군에서 선택된 표현형의 변화를 특정하는 하나 이상의 점 돌연변이를 포함하는 방법.
- 삭제
- 제52항에 있어서, 상기 PIV 게놈 또는 안티게놈이 사이토카인, T-헬퍼 에피토프, 제한효소마커, 또는 포유동물 숙주에서 보호면역반응을 유발할 수 있는 미생물 병원체의 단백질 중에서 선택되는 비PIV 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 추가로 포함하는 방법.
- 키메라 PIV 게놈 또는 안티게놈, N 단백질, P 단백질, 및 L 단백질을 포함하되, 상기 키메라 PIV 게놈 또는 안티게놈은 HPIV1, HPIV2, HPIV3, BPIV 및 MPIV로 이루어지는 군에서 선택된 이종 PIV 서열의 유전자 또는 게놈 단편이 백그라운드 PIV 게놈 또는 안티게놈 내에 삽입되거나 백그라운드 PIV 게놈 또는 안티게놈 내의 대응 유전자 또는 게놈 단편을 치환하는 것을 특징으로 하는 감염성 PIV 입자.
- 제91항에 있어서, 서브바이러스 입자인 감염성 PIV 입자.
- 제91항에 있어서, 바이러스인 감염성 PIV 입자.
- 제91항에 있어서, 상기 키메라 PIV 게놈 또는 안티게놈이 RSV 또는 홍역 바이러스의 이종서열을 추가로 포함하는 감염성 PIV 입자.
- 삭제
- 제91항에 있어서, 상기 백그라운드 PIV 게놈 또는 안티게놈이 사람 PIV 게놈 또는 안티게놈인 감염성 PIV 입자.
- 삭제
- 키메라 게놈 또는 안티게놈, N 단백질, P 단백질, 및 L 단백질을 포함하되, 상기 키메라 게놈 또는 안티게놈은i) p218(131) (SEQ ID NO: 1);ii) p3/7(131) (SEQ ID NO: 14);iii) p3/7(131)2G (SEQ ID NO: 15); 및iv) HPIV1, HPIV2, BPIV 및 MPIV로 이루어지는 군에서 선택된 이종 PIV 서열을 추가로 포함하거나 약독화, 온도 민감성, 저온 적응성 및 작은 플라크 크기로 이루어지는 군에서 선택된 표현형의 변화를 특정하는 점 돌연변이를 추가로 포함하는 상기 i), ii) 또는 iii)의 게놈 또는 안티게놈으로 이루어지는 군에서 선택된 백그라운드 PIV 게놈 또는 안티게놈을 포함하는 감염성 PIV 입자.
- 삭제
- 제91항에 있어서, 상기 백그라운드 PIV 게놈 또는 안티게놈의 HN 또는 F 당단백질 유전자 또는 유전자 단편이 HPIV1 또는 HPIV2의 HN 또는 F 당단백질 유전자 또는 유전자 단편으로 치환된 감염성 PIV 입자.
- 제91항에 있어서, 상기 키메라 PIV 게놈 또는 안티게놈이 RSV 또는 홍역 바이러스의 이종 서열을 추가로 포함하는 감염성 PIV 입자.
- 약독화, 온도 민감성, 저온 적응성 및 작은 플라크 크기로 이루어지는 군에서 선택된 표현형의 변화를 특정하는 하나 이상의 점 돌연변이를 포함하는 PIV 게놈 또는 안티게놈, N 단백질, P 단백질 및 L 단백질을 포함하는 감염성 PIV 입자.
- 제102항에 있어서, 상기 PIV 게놈 또는 안티게놈이 다수의 ts 변이를 포함하는 감염성 PIV 입자.
- 제102항에 있어서, 상기 PIV 게놈 또는 안티게놈이 다수의 비ts 약독화 변이를 포함하는 감염성 PIV 입자.
- 제102항에 있어서, 상기 PIV 게놈 또는 안티게놈이i) L 단백질의 Tyr942, ii) L 단백질의 Leu992, iii) L 단백질의 Thr1558,iv) N 단백질의 Val96, v) N 단백질의 Ser389, vi) C 단백질의 Ile96,vii) F 단백질의 Ile420, viii) F 단백질의 Ala450 및 ix) HN 단백질의 Val384 로 이루어지는 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 다른 아미노산으로 변화시키거나;x) 3' 리더 서열의 23번 위치 뉴클레오타이드,xi) 3' 리더 서열의 24번 위치 뉴클레오타이드,xii) 3' 리더 서열의 28번 위치 뉴클레오타이드,xiii) 3' 리더 서열의 45번 위치 뉴클레오타이드 및xiv) N 유전자 개시서열의 62번 위치 뉴클레오타이드로 이루어지는 군에서 선택된 하나 이상의 뉴클레오타이드를 다른 뉴클레오타이드로 변화시키는 하나 이상의 점 돌연변이를 포함하는 감염성 PIV 입자.
- 제105항에 있어서, 상기 PIV 게놈 또는 안티게놈이 L 단백질에서 아미노산 치환을 특정하는 돌연변이를 포함하는 감염성 PIV 입자.
- 제91항에 있어서, 상기 키메라 게놈 또는 안티게놈이 ts 표현형을 특정하는 하나 이상의 점 돌연변이를 포함하는 감염성 PIV 입자.
- 제91항에 있어서, 상기 키메라 게놈 또는 안티게놈이 비ts 약독화 표현형을 특정하는 하나 이상의 점 돌연변이를 포함하는 감염성 PIV 입자.
- 제91항에 있어서, 상기 키메라 게놈 또는 안티게놈이i) L 단백질의 Tyr942, ii) L 단백질의 Leu992, iii) L 단백질의 Thr1558,iv) N 단백질의 Val96, v) N 단백질의 Ser389, vi) C 단백질의 Ile96,vii) F 단백질의 Ile420, viii) F 단백질의 Ala450 및 ix) HN 단백질의 Val384 로 이루어지는 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 다른 아미노산으로 변화시키거나;x) 3' 리더 서열의 23번 위치 뉴클레오타이드,xi) 3' 리더 서열의 24번 위치 뉴클레오타이드,xii) 3' 리더 서열의 28번 위치 뉴클레오타이드,xiii) 3' 리더 서열의 45번 위치 뉴클레오타이드 및xiv) N 유전자 개시서열의 62번 위치 뉴클레오타이드로 이루어지는 군에서 선택된 하나 이상의 뉴클레오타이드를 다른 뉴클레오타이드로 변화시키는 하나 이상의 점 돌연변이를 포함하는 감염성 PIV 입자.
- 삭제
- 삭제
- 제91항에 있어서, 상기 키메라 PIV 게놈 또는 안티게놈이 PIV3 백그라운드 게놈 또는 안티게놈을 포함하되, 상기 PIV3의 HN 또는 F 당단백질 또는 이들 모두의 유전자 또는 유전자 단편이 대응 PIV1 또는 PIV2의 HN 또는 F 당단백질 유전자 또는 유전자 단편으로 치환되고, 추가로 약독화, 온도민감성, 저온 적응성 및 작은 플라크 크기로 이루어지는 군에서 선택된 표현형의 변화를 특정하는 하나 이상의 점 돌연변이를 포함하는 감염성 PIV 입자.
- 제112항에 있어서, 상기 점 돌연변이가i) L 단백질의 Tyr942, ii) L 단백질의 Leu992, iii) L 단백질의 Thr1558,iv) N 단백질의 Val96, v) N 단백질의 Ser389, vi) C 단백질의 Ile96,vii) F 단백질의 Ile420, viii) F 단백질의 Ala450 및 ix) HN 단백질의 Val384 로 이루어지는 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 다른 아미노산으로 변화시키거나;x) 3' 리더 서열의 23번 위치 뉴클레오타이드,xi) 3' 리더 서열의 24번 위치 뉴클레오타이드,xii) 3' 리더 서열의 28번 위치 뉴클레오타이드,xiii) 3' 리더 서열의 45번 위치 뉴클레오타이드 및xiv) N 유전자 개시서열의 62번 위치 뉴클레오타이드로 이루어지는 군에서 선택된 하나 이상의 뉴클레오타이드를 다른 뉴클레오타이드로 변화시키는 하나 이상의 돌연변이인 감염성 PIV 입자.
- 삭제
- 제91항에 있어서, 상기 키메라 PIV 게놈 또는 안티게놈이 사이토카인, T-헬퍼 에피토프, 제한효소마커, 또는 포유동물 숙주에서 보호면역반응을 유발할 수 있는 미생물 병원체의 단백질 중에서 선택되는 비PIV 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 추가로 포함하는 감염성 PIV 입자.
- 제91항에 있어서, 상기 키메라 PIV 게놈 또는 안티게놈이 면역화된 숙주에서 RSV에 대해 보호면역을 유발하는 RSV 항체 또는 에피토프를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 추가로 포함하는 감염성 PIV 입자.
- 제102항에 있어서, r942, r992, r1558, r942/992, r992/1558, r942/992/1558, rcp45 3'N, rcp45 C, rcp45 M, rcp45 F, rcp45 HN, rcp45 L, rcp45 3'NL, rcp45 3'NCMFHN, 및 rcp45로 이루어지는 군에서 선택되는 감염성 PIV 입자.
- 약제학적으로 허용되는 담체내에 제91항에 따른 감염성 PIV 입자를 면역학적 유효량으로 포함하는 면역원성 조성물.
- 제118항에 있어서, 상기 감염성 PIV 입자가 서브바이러스 입자인 면역원성 조성물.
- 제118항에 있어서, 상기 감염성 PIV 입자가 바이러스인 면역원성 조성물.
- 제118항에 있어서, 상기 PIV 게놈 또는 안티게놈이 RSV 또는 홍역 바이러스의 이종서열을 추가로 포함하는 면역원성 조성물.
- 삭제
- 제118항에 있어서, 상기 PIV 게놈 또는 안티게놈은 그 유전자 또는 유전자 단편이 이종 PIV의 대응 유전자 또는 유전자 단편에 의해 치환된 사람 PIV를 코딩하는 것인 면역원성 조성물.
- 제123항에 있어서, 상기 키메라 PIV 게놈 또는 안티게놈이 HPIV3 게놈 또는 안티게놈을 포함하되, 상기 HPIV3의 HN 또는 F 당단백질 또는 이들 모두의 유전자 또는 유전자 단편이 대응 PIV1의 HN 또는 F 당단백질 유전자 또는 유전자 단편으로 치환된 면역원성 조성물.
- 제124항에 있어서, 상기 키메라 PIV 게놈 또는 안티게놈이 약독화, 온도민감성, 저온 적응성 및 작은 플라크 크기로 이루어지는 군에서 선택된 표현형의 변화를 특정하는 점 돌연변이를 추가로 포함하는 면역원성 조성물.
- 제125항에 있어서, 상기 키메라 PIV 게놈 또는 안티게놈이 ts 또는 비ts 약독화 변이 중에서 선택된 다중 변이를 추가로 포함하는 면역원성 조성물.
- 삭제
- 삭제
- PIV 게놈 또는 안티게놈을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 분자를 포함하는 발현벡터, 및 PIV의 N, P 및 L 단백질을 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드 분자를 포함하는 발현벡터를 포함하고, 상기 PIV 게놈 또는 안티게놈 및 N, P 및 L 단백질의 발현으로 감염성 PIV 입자를 제조하되,상기 PIV 게놈 또는 안티게놈이 HPIV1, HPIV2, HPIV3, BPIV 및 MPIV로 이루어지는 군에서 선택된 이종 PIV 서열의 유전자 또는 게놈 단편이 백그라운드 PIV 게놈 또는 안티게놈 내에 삽입되거나 백그라운드 PIV 게놈 또는 안티게놈 내의 대응 유전자 또는 게놈 단편을 치환하는 것을 특징으로 하는 키메라 PIV 게놈 또는 안티게놈이거나,상기 PIV 게놈 또는 안티게놈이i) p218(131) (SEQ ID NO: 1);ii) p3/7(131) (SEQ ID NO: 14);iii) p3/7(131)2G (SEQ ID NO: 15); 및iv) HPIV1, HPIV2, BPIV 및 MPIV로 이루어지는 군에서 선택된 이종 PIV 서열의 유전자 또는 게놈 단편이 상기 PIV 게놈 또는 안티게놈 내에 삽입되거나 대응 유전자 또는 게놈 단편을 치환하는 것을 특징으로 하는 i), ii) 또는 iii)의 분리된 폴리뉴클레오타이드로 이루어지는 군에서 선택되는 폴리뉴클레오타이드를 포함하거나,상기 PIV 게놈 또는 안티게놈이 약독화, 온도 민감성, 저온 적응성 및 작은 플라크 크기로 이루어지는 군에서 선택된 표현형의 변화를 특정하는 하나 이상의 점 돌연변이를 포함하는, 무세포 조성물.
- 제129항에 있어서, 상기 감염성 PIV 입자가 바이러스인 무세포 조성물.
- 제129항에 있어서, 상기 감염성 PIV 입자가 서브바이러스인 무세포 조성물.
- 제129항에 있어서, 상기 PIV 게놈 또는 안티게놈을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 및 PIV의 N, P 및 L 단백질을 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드가 하나의 벡터에 도입된 무세포 조성물.
- 약제학적으로 허용되는 담체내에 제109항에 따른 감염성 PIV 입자를 면역학적 유효량으로 포함하는 면역원성 조성물.
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