CN1298738C

CN1298738C - 修饰的麻疹病毒v蛋白

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Publication number: CN1298738C
Application number: CNB018116426A
Authority: CN
Inventors: C·L·帕克斯
Original assignee: Wyeth Holdings LLC
Current assignee: Wyeth Holdings LLC; Wyeth LLC
Priority date: 2000-06-23
Filing date: 2001-06-21
Publication date: 2007-02-07
Anticipated expiration: 2021-06-21
Also published as: BR0111827A; ATE343589T1; US6664066B2; EP1292615A2; CA2409432C; DK1292615T3; ES2273852T3; IL153004A0; KR20030032971A; DE60124098D1; CN1437613A; JP2004513616A; EP1292615B1; WO2002000694A3; MXPA02012256A; KR100885325B1; WO2002000694A2; PT1292615E; AU2001267014B2; CA2409432A1

Abstract

描述了在对应于麻疹病毒V蛋白的氨基酸112-134区域中具有至少一个突变的修饰的麻疹病毒，其中氨基酸113或114之一或都突变。这种修饰的麻疹病毒显示基因表达减少的抑制。可能包括在基因组其它区域的突变或缺失，包括羧基末端区域。

Description

修饰的麻疹病毒V蛋白

发明领域

本发明涉及麻疹病毒属的分离的、重组产生的、反义单链RNA病毒，具有一个或多个突变和/或缺失，它减少V蛋白通常导致的抑制。

发明背景

有包膜、负义单链RNA病毒是独特组成和表达的。负义单链病毒的基因组RNA对核衣壳起着两种模板作用：作为信使RNA(mRNA)的合成模板和作为反基因组(+)链的合成模板。病毒复制在mRNA合成后发生，而且需要病毒蛋白质的不断合成。新合成的反基因组(+)链作为产生(-)链基因组RNA其余拷贝的模板。

依赖于RNA的RNA聚合酶复合物通过结合基因组3’末端，特别是启动子区的顺式激活信号，促使并实现转录和复制。然后病毒基因从基因组模板从其3’到其5’末端单向转录。

根据1993年国际委员会对病毒分类学的重新修订分类，建立了命名为单链反义病毒(Mononegavirales)的一个目。该目包括3科具有负极性(反义)单链不分区段的RNA基因组的包膜病毒。这些科是副粘病毒科(Paramyxoviridae)，弹状病毒科(Rhabdoviridae)和线状病毒科(Filoviridae)。副粘病毒科还分成两个亚科，副粘病毒亚科(Paramyxovirinae)和肺病毒亚科(Pneumovirinae)。副粘病毒亚科含有3个属，呼吸道病毒属(先前的副粘病毒属，Respirovirus)，风疹病毒属(Rubulavirus)和麻疹病毒(Mobillavirus)。肺病毒亚科含有肺病毒属(Pneumovirus)。新分类基于形态学标准、病毒基因组的结构、生物学活性和基因与基因产物的序列相关性。麻疹病毒目前的命名学分类如下：

单链反义病毒目

副粘病毒科

副粘病毒亚科

麻疹病毒属

麻疹病毒

海豚麻疹病毒

犬瘟热病毒

小反刍动物瘟疫病毒

猪瘟病毒

牛瘟病毒

这些病毒中的许多种都没有任何可得到的疫苗。因此，需要开发针对这样的人和动物病原体的疫苗。这样的疫苗应能在受体中诱导保护性免疫应答。这种有益应答的质和量特征可从天然感染的幸存者中见到的那些特征来推测，这些幸存者通常在感染后相当长的时间中受到保护，免受同一病毒或高度相关病毒的再次感染。

在搜寻开发这样的疫苗中可考虑各种方法，包括使用(1)纯化的个体病毒蛋白疫苗(亚基疫苗)；(2)灭活的全病毒制备物；和(3)减毒活病毒。

亚基疫苗具有所需的纯净、明确和容易通过不同方法，包括重组DNA表达方法大量生产的优点。目前，除了B型肝炎表面抗原显著例外，病毒亚基疫苗通常只能诱导短期和/或不充分的免疫力，特别是在原初接种者中。

甲醛灭活的脊髓灰质炎(IPV)和甲型肝炎的全病毒制备物已被证明是安全和有效的。相反，用相似的灭活全病毒，例如呼吸道合胞病毒和麻疹病毒疫苗免疫，诱导了不利的免疫应答和/或反应特征，它们在接种者后来遇到天然或“野生型”病毒时会使接种者易于产生夸张或异常的疾病。

野生型病毒的适当减毒活衍生物作为候选疫苗具有明显的优点。作为活的、复制性物质，它们能引起接种者感染，在此期间病毒基因产物被表达，加工，并与接种者的特异MHCI类和II类分子一起递呈，诱导体液和细胞介导的免疫应答，以及协作的细胞因子和趋化因子模式，它们和天然感染幸存者的保护性免疫情况相同。

这种有益免疫应答模式和灭活或亚基疫苗诱导的有限应答相反，后者通常大多限于体液免疫监督手段。另外，一些甲醛灭活全病毒疫苗，例如60年代开发的麻疹和呼吸道合胞病毒疫苗，诱导的免疫应答不仅不能提供持续保护，而且实际上当接种者后来接触野生型病毒时，还导致易于产生异常、夸张、和甚至致命疾病的倾向。

虽然减毒活病毒作为候选疫苗有很理想的特征，但被证明很难开发。困难症结在于需要分离得到丧失致病能力(即，毒性)同时又保留充分复制能力的野生型病毒衍生株，来感染接种者并诱导足够量的有益免疫应答。

历史上，这种毒性和减毒之间的微妙平衡曾通过将野生型病毒分离物在不同宿主组织或细胞中以不同生长条件(例如温度)系列传代而得到过。该过程大概有利于病毒变体(突变体)生长，其中的一些具有减毒的有益特征。偶尔，也通过化学诱变达到进一步减毒。

该增殖/传代方案通常导致病毒衍生株的出现，它们是温度敏感型，冷适应型和/或宿主范围改变的——其中一种或所有的改变来自野生型致病病毒——例如，和减毒有关的改变。

一些活病毒疫苗，包括预防麻疹和腮腺炎(它们是副粘病毒)，和抵抗脊髓灰质炎和风疹病(它们是正链RNA病毒)的疫苗，已通过这种方法产生，并提供了全世界现行儿童免疫方案的支柱。

然而，产生候选减毒活病毒疫苗的方法过于冗长，而且至少是不可预测的，主要依赖于具有理想减毒特征随机发生的基因组突变体的选择性生长。得到的病毒可能在体外具有理想表型，甚至看来在动物模型中业已减毒。然而，当它们作为人或动物宿主的候选疫苗时常常显示减毒不足或过度。

即使对现今应用的疫苗来说，仍需要更有效的疫苗。例如，现在的麻疹疫苗提供了相当好的保护。然而，近来的麻疹流行提示现有疫苗的效力有缺陷。尽管母亲作了免疫，高比率的急性麻疹感染仍发生在1岁以下的儿童中，反映了疫苗不能诱导与野生型麻疹感染后产生的相当的抗麻疹抗体水平(文献1，2，3)。结果，接种疫苗的母亲不能提供给她们的婴儿足够的胎盘衍生性被动抗体来保护出生后头几个月的新生儿。

先前免疫过的青少年和年轻成人中的急性麻疹感染提出了额外的问题。这些二次接种失败表明现有疫苗在诱导和保持足量和长期抗病毒保护力上的局限性(4，5，6)。近来，揭示了另一个潜在问题。过去15年间分离的野生型麻疹血凝素蛋白显示和疫苗病毒株的不同进行性增加(7)。该“抗原漂移”引起了合理的关注，疫苗病毒株可能不含有提供最适保护所需的理想抗原性组分。因此，需要改进的疫苗。

合理的疫苗设计可从对这些病毒更好的理解得到帮助，特别是，通过鉴别出病毒毒力的编码决定簇，以及导致减毒的那些基因组改变而得到帮助。

由于作为人类发病和死亡的主要原因的重要性，麻疹病毒受到了十分广泛的研究。麻疹病毒是一种相对球形的大包膜颗粒，由两个区室，一层脂蛋白膜和一个核糖核蛋白颗粒核心构成，各具有不同的生物学功能(8)。该病毒颗粒包膜是被三种病毒特异性蛋白修饰的宿主细胞衍生的细胞质膜：血细胞凝集素(H；约80kD)和融合蛋白(F_1，2；约60kD)糖蛋白突出在病毒颗粒表面，赋予病毒颗粒结合和进入宿主细胞的能力(9)。H和/或F的抗体被视为具有保护性，因为它们中和病毒引发感染的能力(10，11，12)。基质(M；约37kD)蛋白是两性蛋白，排列在膜的内表面，被认为是配合病毒颗粒的形态产生，因此完成病毒复制(13)。病毒颗粒核心含有长15,894个核苷酸的基因组RNA，它在与约2600个分子的约60kD长的核衣壳(N)蛋白紧密结合后具有模板作用(14，15，16)。与该1微米长的螺旋形核糖核蛋白颗粒松散结合的是酶水平的病毒RNA依赖性RNA聚合酶(L；约240kD)，它与聚合酶辅助因子(P；约70kD)，以及可能其它病毒特有的和宿主编码的蛋白质一起，转录和复制麻疹病毒基因组序列(17)。

麻疹病毒的6个病毒颗粒结构蛋白是由6个连续的无重叠基因编码的，其顺序如下：3′-N-P-M-F-H-L-5′。还鉴定到两个额外的麻疹病毒基因产物，其功能尚未确定。这两个非结构蛋白，称为C(约20kD)和V(约45kD)都是由P基因编码的。C蛋白是由P mRNA的第二个阅读框编码的。V蛋白是由共转录编辑的P基因衍生的mRNA编码的，该mRNA编码具有P氨基末端序列和锌指蛋白样富含半胱氨酸羧基末端域(在P蛋白中没有)的氨基酸序列的杂交蛋白(9)。

所有麻疹病毒属的病毒产生V蛋白(18)，包括麻疹病毒、牛瘟病毒、犬瘟热病毒和猪瘟病毒(19)。麻疹病毒V蛋白是P基因编码的非结构蛋白(8)。与大多数副粘病毒一样，麻疹病毒编码多种来自P基因的蛋白质，包括V蛋白、P蛋白和C蛋白(9)。P和V蛋白的翻译都从同一甲硫氨酸密码子开始，导致多肽中的开始230个氨基酸相同。V蛋白的羧基末端(C-末端)与P蛋白不同，因为RNA编辑在一些P基因mRNA中发生，导致框架漂移，使得翻译出较短的独特V蛋白C-末端(18)。C蛋白的氨基酸序列与V和P蛋白无关，因为它完全是由不同的阅读框翻译的，该阅读框从下游的翻译起始密码子开始(20)。

麻疹病毒的P和V mRNA具有相同的起始密码子，P和V蛋白开始的230个氨基酸相同。V mRNA含有“G”残基插入，它是从核苷酸2496-2498处的序列“GGG”开始的，包括第4个“G”残基。编码在转录中发生，当一个额外的非模板指导的“G”残基插入核苷酸2495和2499之间，导致阅读框漂移，从而使P蛋白羧基末端的276个氨基酸被V蛋白富含半胱氨酸的羧基末端的68个氨基酸代替。

V蛋白的功能还未被很好理解，但所有麻疹病毒都编码V蛋白。这表明V蛋白执行有益功能，保留合成V蛋白的能力对麻疹病毒来说是有利的。已知V蛋白表达在培养的细胞中对于病毒复制不是必需的(19，21-25)，但是在动物模型系统中V蛋白的表达看来影响感染的严重程度。例如，仙台病毒(非麻疹病毒的副粘病毒)通常在小鼠模型系统中产生肺炎，但是如果用V蛋白表达缺陷型的重组病毒进行感染，毒性较小(22，26)。如果D蛋白表达中的缺陷和V蛋白开放阅读框中的缺陷结合重组人副流感病毒3型(另一种非麻疹病毒的副粘病毒)也在啮齿类和猴中显示一种减毒表型。

类似的，用麻疹病毒对动物模型系统研究的结果也提出V蛋白在致病性中有作用。如果感染的病毒V蛋白表达有缺陷(27)用重组麻疹病毒感染棉鼠肺产生较少的子代病毒。另外，在移植到SCID小鼠的组织中存活的人胸腺细胞对麻疹病毒感染较不敏感，如果该感染性病毒不表达V蛋白(28)。如果麻疹病毒不表达V蛋白(29)最后，用该病毒在颅内接种的CD46转基因小鼠具有更高的存活率，。序列分析也支持了麻疹病毒V蛋白在致病性中起到作用的结论，该分析在致病性较小的变体或疫苗株中发现了V蛋白编码区突变(30，31)。总的说，这些结果支持一种猜想，即V蛋白在决定麻疹病毒和其它几种副粘病毒的毒性中起到了重要作用。

虽然似乎V蛋白能影响感染过程是清楚的，但是并不知道该现象背后的机制。许多研究结果开始确定V蛋白的可能功能。例如，已显示V蛋白和P蛋白共有的氨基酸序列介导与病毒核衣壳(N)蛋白的相互作用(27，32-39)。V蛋白和N蛋白之间的相互作用似乎影响N蛋白的细胞分布(27，40，41)，可能具有一些其它未被识别的功能。还已发现一些V蛋白能与细胞蛋白相互作用(42，43)，对于猿病毒5(SV5)，可能与细胞蛋白的相互作用引起在感染中干扰素信号传递途径的抑制(44)。除了与V蛋白有关的蛋白-蛋白相互作用，几个研究还将V蛋白与调节病毒基因表达和复制的控制机制联系起来。在瞬时表达系统中的仙台病毒V蛋白表达抑制缺损干扰(DI)颗粒复制(45)，并类似抑制DI颗粒在体外转录反应中复制(35)。与这些与具有抑制作用的V蛋白有关的观察一致的是，观察到几种V蛋白表达缺陷的病毒在感染过程中产生较高水平的基因组RNA、mRNA和病毒蛋白(21，26，27)。

除了刚刚描述过的性质，所有病毒V蛋白含有富含半胱氨酸的C-末端。副粘病毒V蛋白没有高度的氨基酸相似性，但它们都含有七个位置相同的半胱氨酸残基(46)。该惊人的特征导致推测B蛋白可能实际上是锌指蛋白，或至少形成几类与锌配位的二级结构(48，49，50)，而实际上，发现了几种V蛋白与锌结合(51，52，53)。对V蛋白形成与锌配位的结构的可能性产生了可观的兴趣，因为这类结构通常形成与核酸相互作用或蛋白-蛋白相互作用有关的蛋白结构域(48，49，50)。还值得注意的是，表达缺乏独特C-末端区域的截短的V蛋白的重组仙台病毒致病性也较小，提示V蛋白在致病性中的作用需要该结构域(24)。

除了编码该病毒特有蛋白的序列，麻疹病毒基因组含有不同的非蛋白编码结构域，类似指导相关病毒转录和复制的途径(9，54)。这些调控信号位于麻疹病毒基因组的3′和5′末端和跨越各顺反子间边界的短内部区域。前者编码可能的指导基因组转录、基因组和反基因组衣壳包装和复制的启动子和/或调控序列元件。后者传递各单顺反子病毒mRNA的转录终止和聚腺苷酸化，然后重新引发下一个基因的转录的信号。一般麻疹病毒聚合酶复合物似乎响应这些信号，与其它无节段的负链RNA病毒的RNA依赖性RNA聚合酶相似(9，54，55，56)。转录从麻疹病毒基因组的3′末端处或附近开始，然后朝5′方向进行产生单顺反子mRNA(16，54，57)。

麻疹病毒似乎将其末端调控域延伸超过了前导和后随编码序列边界(54)。对于麻疹病毒，这些区域包括107个3′基因组核苷酸(“3′基因组启动子区”，还称为“延伸的启动子”，它含有编码前导区的52个核苷酸，然后是3个基因间核苷酸，和编码N mRNA 5′非翻译区的52个核苷酸)和109个5′末端核苷酸(69个编码LmRNA的3′非翻译区的核苷酸，基因间三核苷酸和37个编码后随序列的核苷酸)。在这些3′末端中基因组和反基因组的约100个核苷酸是具有共享核苷酸序列的两个短区域：基因组和反基因组的绝对3′末端的16个核苷酸中的14个核苷酸是相同的。在这些末端内部，定位了另外具有绝对序列相同性的12个核苷酸区域。它们的位置在麻疹病毒基因组转录应该开始以及反基因组的复制应该开始的位点处或附近，提示这些短独特序列结构域含有延伸的启动子区。

这些分散的序列元件可指导转录起始的其它位点一内部结构域指导在N基因起始位点开始转录，3′末端结构域指导反基因组产生(54，58，59)。除了其作为转录和复制的顺式激活决定簇的调控作用，这些3′延伸的基因组和反基因组启动子区域分别编码反基因组和基因组RNA的新生5′末端。在这些新生RNA中具有N蛋白集结的未鉴定信号，对于核衣壳模板形成和随后转录和复制放大所需的另一种关键调控元件。

在所有麻疹病毒中，主要病毒功能，包括复制、转录和衣壳包装所需的顺式激活信号包含在非编码基因组末端中。功能性的被动反式激活元件包含在N、P和L基因中。其它反式激活因子，例如V和C蛋白可能调节功能性。任何这些区域内的突变将导致重要功能的改变，包括病毒转录/复制效率的降低。

V蛋白表达和致病性之间的明显关系，和在病毒减毒中的持续兴趣(30，60)导致需要更详细检查麻疹病毒V蛋白功能。特别是需要利用瞬时表达系统来研究几种V蛋白性质，包括V蛋白抑制活性、V蛋白与N蛋白之间的相互作用，以及V蛋白结合RNA的能力。

发明简述

因此，本发明的一个目的是鉴定麻疹病毒基因组中负责这些病毒的V蛋白抑制基因表达的区域。本发明的另一个目的是产生麻疹病毒的V蛋白突变形式，以这种形式中基因表达的抑制下降。本发明的另一个目的是产生含有一个或多个这种突变的重组产生的麻疹病毒。本发明的另一个目的是配制含有这种重组产生的麻疹病毒的疫苗或免疫原性组合物。在本发明的一个实施例中，V蛋白来自麻疹病毒。

下面讨论的本发明的这些和其它目的将通过修饰对应于这些麻疹病毒V蛋白氨基酸112-134(保守区2；见图2)的区域实现，其中氨基酸113(酪氨酸)和114(天冬氨酸)中的一个或两个突变。在本发明的一个实施例中，这些氨基酸突变为丙氨酸。

V蛋白的另一个修饰可以通过麻疹病毒V蛋白的羧基末端(C-末端)区域，对应于麻疹病毒、犬瘟热病毒和海豚麻疹病毒V蛋白的氨基酸231-299和牛瘟病毒的氨基酸231-303中至少一部分的突变或缺失进行。

这些修饰具有减少V蛋白在小复制体系统中抑制基因表达的作用。结果不难延伸到使用本领域已知和下文描述的“拯救”系统恢复全长感染性麻疹病毒。

在瞬时试验中具有氯霉素乙酰转移酶(CAT)报道基因表达的麻疹病毒小复制体被V蛋白强烈抑制。在位于氨基酸112-134之间的蛋白质的氨基末端氨基酸取代，以及通过突变或缺失V蛋白富含半胱氨酸C-末端区域的至少一部分(氨基酸231-299)消除了抑制作用。

就麻疹病毒情况，上述突变还可进一步与减毒的突变结合，如下：

(1)3′基因组启动子区域中的至少一个减毒突变选自核苷酸26(A→T)，核苷酸42(A→T或A→C)和核苷酸96(G→A)，其中这些核苷酸存在于正链、反基因组、信使有义中；

(2)RNA聚合酶基因中的至少一个减毒突变，选自产生氨基酸改变的核苷酸改变，这些氨基酸改变选自残基331(异亮氨酸→苏氨酸)，1409(丙氨酸→苏氨酸)，1624(苏氨酸→丙氨酸)，1649(精氨酸→甲硫氨酸)，1717(天冬氨酸→丙氨酸)，1936(组氨酸→酪氨酸)，2074(谷氨酰胺→精氨酸)和2114(精氨酸→赖氨酸)。

(3)对于N基因，至少一个减毒突变选自产生氨基酸改变的核苷酸改变，这些氨基酸改变选自残基129(谷氨酰胺→赖氨酸)，148(谷氨酸→甘氨酸)，和479(丝氨酸→苏氨酸)；

(4)对于P基因，至少一个减毒突变选自产生氨基酸改变的核苷酸改变，这些氨基酸改变选自残基225(谷氨酸→甘氨酸)，275(半胱氨酸→酪氨酸)，和439(亮氨酸→脯氨酸)；

(5)对于C基因，至少一个减毒突变选自产生氨基酸改变的核苷酸改变，这些氨基酸改变选自残基73(丙氨酸→缬氨酸)，104(甲硫氨酸→苏氨酸)，和134(丝氨酸→酪氨酸)；和

(6)对于F基因末端信号(顺式激活转录终止信号)，核苷酸7243(T→C)的改变，其中这些核苷酸存在于正链、反基因组，即信使(编码)有义中。

在本发明的另一个实施例中，这些突变的麻疹病毒用于制备疫苗或免疫原性组合物，它们引起各病毒的针对野生型的保护性免疫应答。

在本发明的另一个实施例中，描述了一种降低麻疹病毒V蛋白导致的抑制的方法，它包括在对应于麻疹病毒V蛋白氨基酸112-134区域内插入至少一个突变，其中对应于麻疹病毒V蛋白氨基酸112-134区域内的突变选自氨基酸113和114的突变。

在本发明的另一个实施例中，描述了一种分离的核苷酸序列，编码麻疹病毒V蛋白，它已通过在对应于麻疹病毒V蛋白的氨基酸112-134的区域内插入至少一个突变改变，其中对应于麻疹病毒V蛋白的氨基酸112-134的区域中的突变选自氨基酸113和114的突变。

在本发明另一个实施例中，提供了一种组合物，它含有一种转录载体，该载体含有一种编码麻疹病毒基因组或反基因组的分离的核酸分子，其中分离的核酸分子编码V蛋白的部分已被进行修饰，使得在对应于麻疹病毒V蛋白氨基酸112-134的区域内插入至少一个突变，其中对应于麻疹病毒V蛋白的氨基酸112-134的区域中的突变选自氨基酸113和114的突变；和至少一种表达载体，它含有至少一条分离的核酸分子，编码衣壳包装、转录和复制所必需的反式激活蛋白N、P和L，从而用这些载体转化、感染或转染宿主细胞，并在允许这些载体共表达的条件下培养，从而产生所需的麻疹病毒。然后用这些病毒制备引起针对各病毒的野生形式的保护性免疫应答的疫苗或免疫原性组合物。

附图简述

图1A描述了用于转染的4个质粒表达载体。制备了T7RNA聚合酶依赖性表达载体(61)用于指导Edmonston野生型N、P、L或V基因在被MVA/T7感染的细胞中的表达(62)。

图1B描述了衍生自pMV107-CAT的小复制体(63)。pMV107-CAT中的Edmonston麻疹病毒疫苗前导序列被转化成野生型序列(60)。T7RNA聚合酶转录小复制体质粒DNA在转染的细胞中产生反义的RNA小复制体。

图1C描述了一种CAT试验，显示瞬时表达试验中V蛋白表达对小复制体活性的作用。泳道1是从被所有驱动小复制体表达必需的质粒载体(N、P和L)转染的细胞获得的阳性对照。泳道2与泳道1相同，除了细胞被所有质粒，除了L聚合酶载体转染。在泳道3-7中，在转染中包含增量的V蛋白表达载体。通过加入不含插入物的合适量的载体DNA，维持转染DNA的总质量稳定。基于泳道1中的100％活性计算相对CAT活性。

图2描述了4种不同麻疹病毒V蛋白的氨基酸序列比较。Edmonston野生型麻疹病毒V蛋白氨基酸序列(Gene Bank登录号AF266288)(SEQ ID NO：1)与犬瘟热病毒(AF014953)(SEQ ID NO：4)、牛瘟病毒(Z30697)(SEQ ID NO：2)和海豚麻疹病毒(Z47758)(SEQ ID NO：3)比较。含有更高水平的相同性的区域用划斜线的条在上面标出。并称为保守区(CR1-CR6)。其它值得注意的序列在下方用黑色条标出。这些序列包括与V(和P)蛋白与N蛋白的相互作用有关的区域(34)，与V-N蛋白复合物胞内定位有关的区域(27，64)，和含有锌结合结构域的富含半胱氨酸的区域(51)。感兴趣的其它序列包括229-234之间的碱基区域，225处的麻疹病毒疫苗氨基酸取代(谷氨酸到甘氨酸)，和回忆93-107位之间的亮氨酸拉链的亮氨酸重复区(65，66)。V和P蛋白共有的区域从氨基酸1延伸到230，而独特的V蛋白序列(粗体氨基酸字母)从231延伸到299。图中沿列出的序列顶部给出的氨基酸位置对应于麻疹病毒V蛋白的氨基酸的位置。

图3描述了突变麻疹病毒V蛋白表达载体的图。在这些研究中所用的表位标记的V蛋白表达载体如图所示。在表达具有流感病毒HA标记(67)代替V蛋白起始密码子甲硫氨酸的V蛋白的载体质粒骨架中产生突变的V蛋白载体。在图顶部显示了V蛋白图上重要的序列，相对于上面图2的描述更完整。野生型(haV-wt)和突变蛋白质(haV1-11)在V蛋白图下所示。在氨基末端绘出了作为划斜线框的HA标记，剩余的V蛋白序列绘成空心方块。氨基酸取代标为沿氨基酸位置和氨基酸改变的黑点。缺失或截短的突变体用打断的V蛋白图绘制。

图4A描述了在CAT试验形式中，用突变的麻疹病毒V蛋白抑制小复制体，显示测试V蛋白突变体(haV-1到haV-8；见图3的描述)的瞬时表达实验的结果。V蛋白载体量(200或400纳克)和突变体的相同性如图4A中CAT试验下方所示。相对活性计算成泳道2的百分数，它是通过不用任何V蛋白表达载体进行的转染得来的。泳道1是不用L蛋白进行的阴性对照。

图4B描述了蛋白质印迹分析，用于监测瞬时表达实验中V蛋白表达。泳道1和2是衍生自在V蛋白载体不存在下转染的(泳道1)或用表达不含标记的V蛋白的V蛋白载体转染的阴性对照。用抗-HA抗体探测蛋白质印迹。

图4C描述了用增量的表达载体(100ng-1微克)的haV-1抑制小复制体的分析。

图5描述了与麻疹病毒V蛋白有关的RNA结合活性。从转染的细胞通过NP40裂解制备粗细胞质抽提物，用与多核糖核苷酸同聚物连接的琼脂糖珠分析RNA结合活性。说明过程的流程图如图5A所示。图5B描述了用于检测捕获在多核糖核苷酸树脂上的蛋白质的蛋白质印迹分析。用小复制体实验所用的相同条件转染细胞(泳道1-8)，除了在一些转染中细胞仅用haV表达载体转染(泳道9-12)。泳道1-4描述了与4种不同多核苷酸树脂结合的N蛋白的分析。泳道5-12描述了对于haV蛋白片段的结合片段的分析。类似的，泳道9-16描述了在EGTA(EG)、EDTA(ED)或酵母RNA(RNA)存在下与poly(G)结合的V蛋白分析。

图6描述了用突变麻疹病毒V蛋白结合RNA。图5中描述的多核糖核苷酸同聚物结合试验用于分析突变麻疹病毒V蛋白(haV1-11，泳道3-13；见图3的描述)。在该实验中，仅用V表达载体转染细胞。在泳道1中检测的细胞提取物是一种阴性对照，含有不含表位标记的V蛋白。poly(G)用于测试所有突变的蛋白质。

图7描述了野生型麻疹病毒V蛋白的CR2(氨基酸100-140)中的氨基酸序列的比较，称为haV(SEQ ID NO：7)；一种突变体，其中氨基酸113位的酪氨酸和氨基酸114位的天冬氨酸被丙氨酸取代，称为haV-5(SEQ ID NO：8)；一种突变体，其中氨基酸112-134缺失，称为haV-23(SEQ ID NO：9)；一种突变体，其中氨基酸114位的天冬氨酸和氨基酸115位的组氨酸被丙氨酸取代，称为haV-24(SEQ IDNO：10)；和一种突变体，其中氨基酸113位的酪氨酸、氨基酸114位的天冬氨酸和氨基酸115位的组氨酸被丙氨酸取代，称为haV-25(SEQ ID NO：11)。

图8描述了图7中所述的CR2突变在CAT实验中的效果，显示在瞬时表达实验中V蛋白表达对小复制体活性的影响。条1是从被所有驱动小复制体表达必需的质粒载体(N、P和L)转染的细胞获得的阳性对照。条2与条1相同，除了细胞还被编码haV的表达载体转染；在条3-6中，细胞被编码指定的CR2突变的表达载体转染。基于条1的100％活性计算相对CAT活性。

图9描述了野生型麻疹病毒V蛋白的C末端(氨基酸220-299)的氨基酸序列比较，称为haV(SEQ ID NO：12)；突变体，其中氨基酸232-299缺失，称为haV-1(SEQID NO：13)；突变体，其中氨基酸251和255处的半胱氨酸被丙氨酸取代，称为haV-12(SEQ ID NO：14)；突变体，其中氨基酸269和272处的半胱氨酸被丙氨酸取代，称为haV-13(SEQ ID NO：15)；突变体，其中氨基酸279-299缺失，称为haV-14(SEQ ID NO：16)；突变体，其中氨基酸267-299缺失，称为haV-15(SEQ IDNO：17)；突变体，其中氨基酸250-299缺失，称为haV-16(SEQ ID NO：18)；突变体，其中氨基酸243-299缺失，称为haV-17(SEQ ID NO：19)；突变体，其中氨基酸236-299缺失，称为haV-18(SEQ ID NO：20)；突变体，其中氨基酸229-299缺失，称为haV-19(SEQ ID NO：21)；突变体，其中氨基酸233和234处的精氨酸被丙氨酸取代，称为haV-20(SEQ ID NO：22)；突变体，其中氨基酸233和234处的精氨酸分别被天冬氨酸取代，称为haV-21(SEQ ID NO：23)；和突变体，其中氨基酸229-237缺失，称为haV-22(SEQ ID NO：24)。

图10描述了图9中所述的c末端突变在CAT试验中的作用，显示瞬时表达试验中V蛋白表达对小复制体活性的效果。条1是从被驱动小复制体表达所需的所有质粒载体(N、P和L)转染的细胞获得的阳性对照。除了细胞还被编码haV的表达载体转染，条2与条1相同；在条3-14中，细胞被编码指定的C-末端突变的表达载体转染。基于条1的100％活性计算相对CAT活性。

发明详述

虽然用麻疹病毒举例，本发明还可用于其它麻疹病毒属，包括但不限于犬瘟热病毒和牛瘟病毒。

考虑对于麻疹病毒减毒和与基因表达和复制有关的机制之间的可能联系(30，60)，导致分析V蛋白。V蛋白表达已与病毒致病性(22，23，26-29)联系还与基因表达和复制的控制联系(21，26，27，35，45)。目标是进一步分析V蛋白对麻疹病毒基因表达的作用。

在构建突变V蛋白表达载体之前，检测了几种不同麻疹病毒的V蛋白的氨基酸相似性(图2)。高氨基酸相同性的区域可能含有重要的功能域，这些保守区(CR)中的一个或多个可能参与小复制体抑制。Edmonston野生型麻疹病毒、牛瘟病毒、海豚麻疹病毒和犬瘟热病毒的V蛋白排列揭示了具有值得注意的序列相同性的几个保守区，称为CR1-6(如图2所示)，除了确认更早的观察结果(46)，即在麻疹病毒中C-末端含有位置相同的含有7个半胱氨酸残基。当产生突变的V蛋白载体时，针对几个CR。

除了鉴定含有高水平相同性的区域，用计算机分析检索可能的功能性基序，并检测文献中有关可能的麻疹病毒V蛋白功能域的可能位置的额外线索。这些分析的结果在图2的排列上标出。几个研究确定了V和P蛋白影响与N蛋白的相互作用的区域的位置。V和P蛋白的氨基酸最末端(N-末端)位于CR1内，含有在双杂交试验中介导与N蛋白相互作用的序列(34)(图2)。其它与V-N蛋白-蛋白相互作用有关的序列被定位在氨基酸204-230(27，64)之间，跨越CR4。麻疹病毒V蛋白锌-结合域(51)在C末端，可能至少需要在CR5和CR6中发现的几个半胱氨酸残基。在富含半胱氨酸结构域的N-末端，有含有碱性氨基酸(229-234)的非常保守的区域，是CR5的一部分。在麻疹病毒V蛋白中靠近相同区域(氨基酸225)的是在Edmonston疫苗株中发现的氨基酸取代(野生型谷氨酸到甘氨酸(30))。最后，在麻疹病毒V蛋白中有亮氨酸重复(氨基酸93-107)，它回忆亮氨酸拉链基序(65，66)。许多这些结构域和基序是吸引人的候选物，用于小复制体系统和V蛋白突变表达载体的进一步研究。

除了制备V蛋白表达载体(图1A)，制备了T7表达质粒用于三个基础复制工具成分，包括Edmonston野生型N、P和L蛋白。为了消除任何由于从P和V蛋白载体中的下游翻译起始密码子表达C蛋白引起的可能融合，修饰C蛋白开放阅读框防止C蛋白翻译。C蛋白ATG密码子被转化成ACG，C蛋白开放阅读框中的第二个密码子被转化成终止密码子(TCA到TAA)。这些修饰对于P和V蛋白是沉默的。

V蛋白可能与调控麻疹病毒mRNA转录和基因组复制有关的迹象(21，26，27，35，45)提出了测试小复制体系统是否对V蛋白表达反应的实验。小复制体系统由Edmonston野生型成分构成，使得能够评估影响野生型V基因功能的V基因突变，并可能将这些发现用于使用重组野生型病毒进一步遗传研究病毒减毒。通过将pMV107-CAT中的疫苗前导序列转化成Edmonston野生型前导序列(60)，从p107MV-CAT小复制体(63)衍生出Edmonston野生型麻疹病毒-小复制体(图1B，pMVwt107-CAT)。

为了确定野生型成分是否能驱动可检测的小复制体表达，用小复制体DNA和N、P和L蛋白表达载体转染HEp2细胞，同时用MVA/T7(62)感染，提供T7RNA聚合酶。在转染48小时后，收集细胞并分析细胞提取物的CAT活性。Edmonston野生型小复制体系统不难产生高于在阴性对照中产生的背景水平的CAT活性，该阴性对照是用所有DNA，除了L聚合酶蛋白表达载体转染的(图1C，泳道1和2，数据未显示)。这表示在瞬时表达试验中产生的CAT活性是特异性的，依赖于完整的麻疹病毒复制元件。

然后用小复制体系统确定V蛋白表达在瞬时表达试验中是否对小复制体表达具有可检测的作用。小复制体试验转染是用增量的V蛋白表达载体进行的。感染的DNA总质量通过加入合适量的缺乏插入物的表达载体保持稳定。图1C显示了V蛋白表达载体量从0增加到400ng的效果。泳道1中的阳性对照显示在V蛋白表达不存在的情况下获得的CAT活性量(图1C，泳道1)。泳道2是阴性对照，显示当缺少L蛋白表达载体时，CAT活性是不可检测的。泳道3-7显示V蛋白表达量增加的负效果。甚至在最低的V蛋白表达载体量(泳道3和4)CAT活性的抑制也是明显的，在更高量CAT活性的抑制非常强，事实上当转染400ng V蛋白表达质粒时，消除了可检测的小复制体表达(泳道7)。泳道3-7中所用的V蛋白表达载体两倍增加与观察到的相对CAT活性的减少密切相关。这些结果清楚的表明可用小复制体试验观察到V蛋白功能的一个方面。在小复制体试验中V蛋白表达该轻易检测的负效果提供了进一步检测V蛋白突变体小复制体抑制表型的便利形式。

为了开始分析V蛋白突变体，修饰V蛋白表达载体(图1A)，以在V蛋白的氨基末端加入表位标记(pMV-haV-wt；图3)。这是为了方便在转染细胞的裂解物中进行蛋白质印迹检测，并允许突变V蛋白的稳定性和稳态水平的相对比较。用流感血凝素(HA)表位标记替换野生型V蛋白表达载体的起始甲硫氨酸密码子(67)。该修饰的V蛋白载体(pMV-haV-wt)还维持了防止c蛋白表达的基本取代。在小复制体实验中测试pMV-haV-wt揭示N-末端HA标记的存在对V蛋白抑制小复制体的活性没有可检测的影响(图4，泳道1-4，数据未显示)。

第一个系列的引入pMV-haV-wt的突变针对图2所示的一些序列基序部分。这些突变之一得到截短的V蛋白，它缺乏含有半胱氨酸残基的独特的V蛋白C末端(氨基酸231-299缺失)(图3，pMV-haV-1)。质粒pMV-haV-2将野生型V编码序列转化成Edmonston疫苗序列(氨基酸密码子225；谷氨酸到甘氨酸)。剩余的6个突变(pMV-haV数目3-8)是针对CR中的一些的氨基酸取代。最初，引入氨基酸取代是尝试改变V蛋白中特定结构域的功能，而不完全改变蛋白质结构。用丙氨酸带电法提出的策略(68，69，70)，引入主要针对两个连续的氨基酸密码子的突变，这两个密码子是带电或极性的氨基酸残基，将它们转化成编码丙氨酸的密码子。

虽然用具有丙氨酸而不是野生型残基的突变体举例说明了本发明，其它野生型残基的非保守突变也在本发明的范围内。例如，天冬氨酸是酸性(带负电)分子。因此，非保守突变应该是用除了谷氨酸(也是酸性分子)外的氨基酸取代。合适的另选氨基酸包括赖氨酸、组氨酸和精氨酸，它们是碱性(带正电)分子。合适的另选氨基酸还包括具有非极性官能团的氨基酸，例如丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸和缬氨酸，和具有不带电的极性官能团的氨基酸，例如天冬酰胺、半胱氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸。

类似的，酪氨酸是不带电的极性分子。因此，不保守的突变应该是除了也是不带电的极性分子的天冬酰胺、半胱氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸外的氨基酸取代。合适的另选氨基酸包括赖氨酸、组氨酸和精氨酸，它们是碱性(带正电的)分子。合适的另选氨基酸还包括具有非极性官能团的氨基酸，例如丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸和缬氨酸，和具有酸性(带负电的)官能团的氨基酸例如天冬氨酸和谷氨酸。

图4A显示了小复制体试验中对于突变V蛋白载体1-8的分析。结果表明两个载体(pMV-haV-1和pMV-haV-5)抑制小复制体活性的能力减弱。一个突变体(haV-1)具有缺失突变，它缺乏V蛋白独特的C-末端(氨基酸232-299)；第二个突变体(haV-5)含有在氨基酸113和114位的取代突变(位于CR2；见图2)。这提示该功能可能部分是由CR2和C-末端独立介导的。与C-末端截短的突变体相似，CR2突变体也维持残余的抑制活性。

图4A上的泳道1和2含有对照的样品。泳道1中分析的转染缺乏L蛋白表达载体并揭示了低水平的背景CAT活性。泳道2中的阳性对照显示了V蛋白不存在下观察到的最大活性。泳道3和4中显示了含有HA标记的200和400ng野生型V蛋白载体(pMV-haV-wt)介导的抑制。如上所述，N-末端HA标记几乎对V蛋白抑制小复制体的能力没有作用，在该实验中，200和400nghaV-wt载体分别抑制小复制体活性约7和16倍。当转染200ng V蛋白载体时，大部分突变体抑制CAT活性的作用几乎与haV-wt载体相同，将CAT活性减少到对照活性(泳道2)的20％或更低(泳道3，7，9，11，15，17，19)。两个V蛋白载体(pMV-haV-1，泳道5和6；pMV-haV-5，泳道13和14)在该实验和重复的实验中抑制小复制体活性的作用非常小。质粒pMV-haV-1缺乏富含半胱氨酸的V蛋白C-末端，而pMV-haV-5在CR2(氨基酸113-114)中含有双丙氨酸取代。

抑制中有关的两个功能域具有感兴趣的特征。C-末端包括锌结合域，还含有RNA结合域(图5)。CR2的一级氨基酸序列是值得注意的，因为计算机模型预测，一小簇的带电残基可能位于一个假设的α螺旋的一面(残基114D、118E、121K、125D)。因此，CR2可能是与在一些转录因子中观察到的序列相似的两性α螺旋(71)。

与CR2有关的抑制活性是有趣的，因为该氨基酸序列同时存在于V和P蛋白中。P蛋白起到的作为聚合酶亚基和核衣壳装配因子(72)的主要作用与V蛋白在抑制中的非必需作用是非常不同的。但是，这两种蛋白共有相当量的氨基酸序列。CR2可以是一个蛋白-蛋白相互作用位点，其功能在V和P中是不同的。不被理论所限，还可能V蛋白的独特C-末端给予接触CR2的V蛋白一种三级结构，相反使其起到抑制蛋白结构域的功能，而P蛋白中该功能域是隔绝的。

为了确定突变体haV-1或haV-5导致的抑制中的减少是否简单与蛋白质表达少有关，用抗-HA抗体进行了蛋白质印迹分析来估计V蛋白在转染的细胞中的相对丰度(图4B)。该实验中的细胞恰如在小复制体实验过程中进行的一样转染，从而使细胞含有n、P和L蛋白和V蛋白。除了在两个阴性对照中，加有标记的V蛋白可以在全部转染的细胞提取物中检测到。用于制备在泳道1和2中分析的提取物的细胞中没有转染V蛋白载体，用编码不含表位标记的V蛋白的载体转染细胞。泳道3中检测的蛋白质是HA-标记的野生型V蛋白。泳道4中的蛋白质是截短的突变体，它缺乏C-末端，迁移率显著改变。剩余的蛋白质是含有氨基酸取代的突变体(如上所述，图4B，泳道5-11)。这些蛋白质中的几种在该12％聚丙烯酰胺凝胶中具有小而值得注意的迁移率改变(例如泳道10和11)。然而这不是不可预料的，因为在这些蛋白质中带电和极性的残基被丙氨酸取代。判断所有蛋白质的相对丰度十分相似，除了haV-1(泳道4)在该实验中较低，这是可在重复实验中复制的。这提示haV-1降低的抑制活性是由于较低的蛋白质水平，虽然haV-5降低的抑制活性不是由于不稳定的蛋白导致的。

为了进一步检测haV-1抑制的效果差是简单的由于它不稳定的可能性，用增量的V蛋白进行了小复制体试验，从而帮助补充胞内haV-1蛋白质的量(图4C)。该小复制体实验如上所述进行，除了V蛋白载体的最大量从400ng上升到1微克。通过加入合适量的载体骨架DNA(缺乏插入物)，使DNA的质量在所有转染物中保持稳定。图4C，泳道1是不加入V蛋白载体进行的阳性对照。泳道2和3显示了以100(泳道2)和400(泳道3)ng加入野生型haV载体的效果，其活性在该实验中分别降低到58％和26％。加入增量的haV-1对MV-CAT的活性几乎没有作用，将增量的haV-1载体和较高水平的抑制相关联也没有观察到明显的倾向。这提示haV-1减弱的抑制活性不是简单的由于减少胞内蛋白质水平，相反是由于缺乏C-末端。

SV5V蛋白第三个N末端中含有高含量的碱性氨基酸的区域介导RNA结合(73)。同源区域在麻疹病毒V蛋白中不明显(73)，但检测了麻疹病毒V蛋白也可能通过C-末端锌指蛋白样的序列结合RNA的可能性(图5)。

为了评估V蛋白的RNA结合活性，使用了多核糖核苷酸同聚物结合试验(图5A)，它已被成功的用于研究几种细胞RNA结合蛋白(74-77)。许多RNA结合蛋白显示了多核糖核苷酸同聚物的特征性亲和力。例如，细胞hnRNP U蛋白质与poly(G)和poly(U)结合的亲和力较高，但几乎不与poly(A)或poly(C)结合(75)。用该概念确定在转染细胞提取物中的V蛋白是否能被同聚物树脂捕获。用全部表达载体(N、P、L、V和小复制体)转染细胞，并用于小复制体转染，然后用MVA/T7感染。48小时后制备胞质细胞裂解物，在4℃和与4种多核糖核苷酸同聚物之一连接的琼脂糖珠一起保温30-60分钟。离心收集珠，然后重悬浮并用细胞裂解缓冲液洗涤三次。通过在SDS-凝胶上样缓冲液中煮沸从珠上洗脱结合的蛋白质。

开始为了进行试验，检测了捕获一种从转染的质粒表达的已知RNA结合蛋白质的能力。因此，用对N蛋白特异性的单克隆抗体通过蛋白质印迹分析从4种不同的树脂上洗脱出蛋白质(图5B)。在与poly(G)和poly(U)结合的样品中轻易检测N蛋白(泳道2和4)。与poly(G)结合的N蛋白量在该试验和几个重复试验中普遍较高。poly(A)或poly(C)几乎未或未捕获N蛋白。

如上所述重复实验，以分析haV蛋白与同聚物树脂相互作用的能力(图5B，泳道5-8)。用抗-HA抗体进行蛋白质印迹分析揭示了与分析N蛋白获得的结果相似的结果(图5B，泳道1-4)。poly(G)和poly(U)树脂都显示了对于haV的亲和力(泳道6和8)。V蛋白与poly(G)的结合最好，和poly(U)弱得多，而与poly(A)或poly(C)的结合非常少。在一些实验中，见到一条非常弱的条带，表明与poly(A)的低亲和力相互作用；然而，通常该相互作用不可检测。

V蛋白容易与poly(G)和poly(U)结合，而与poly(A)和poly(C)结合不好的事实表明，该试验不能简单的测量聚阴离子树脂的亲和力，也显示V蛋白显示对于两种多核苷酸的倾向性。V蛋白和N蛋白都优选poly(G)和poly(U)(图5)；这是由许多细胞RNA结合蛋白显示的特征(74，76，77)。

haV蛋白质结合性质与N蛋白十分相似的事实提出了V蛋白是通过与N蛋白相互作用，而间接被poly(G)和poly(U)树脂捕获，而不是直接和RNA相互作用的可能性。为了检测这种可能，仅用haV蛋白质表达载体转染细胞，制备细胞提取物并如上处理。用蛋白质印迹分析显示，haV蛋白(图5B，泳道9-12)也与poly(G)和poly(U)结合。这表明V蛋白与同聚物树脂的反应不需要其它病毒蛋白质。事实上，在不存在其它病毒蛋白质的情况下，与poly(G)和poly(U)结合的V蛋白量大得多(比较泳道6-10和8-12)。这提示其它病毒蛋白质之一可以轻微影响与V蛋白和多核糖核苷酸之间的相互作用。

还进行了对于影响haV与poly(G)结合的条件的有限分析(图5B，泳道13-16)。在结合反应中加入10mM EGTA或EDTA(泳道14-15)减少了V蛋白与poly(G)的结合量。在结合反应中加入酵母RNA竞争物(泳道16)(25微克/毫升)对结合几乎没有作用。然而，这并不太令人惊奇，因为胞质提取物已含有显著量的细胞RNA，加入酵母RNA等几乎没有影响。这些结果提示V蛋白与poly(G)的结合受到二价阳离子的刺激，并且是相对特异性的相互作用，因为加入非特异性RNA(酵母RNA)似乎不减少与树脂结合的V蛋白量。

为了确定RNA结合是否能与抑制小复制体活性的能力关联起来，接着用poly(G)结合试验分析haV蛋白突变体的RNA结合活性。haV蛋白突变体(图3)在不含任何其它病毒蛋白质的细胞中表达。制备粗胞质提取物，并与上述poly(G)树脂结合，用蛋白质印迹分析结合的蛋白质(图6)。如前所述，haV被poly(G)捕获，并且在蛋白质印迹分析中用抗-HA抗体检测(泳道2)，而含不具有HA-标记的V蛋白的样品(泳道1)不产生背景信号。突变蛋白质的分析揭示了大部分V蛋白(泳道4-13)的poly(G)结合活性水平相似，除了突变的haV-1，该突变蛋白质与poly(G)结合的水平非常低。这清楚的表明蛋白质对于结合是有缺陷的(泳道3)。haV-1低但是可检测的结合水平表明RNA结合活性大大下降，但是没有完全消失。这些结果证明大部分突变体维持接近野生型haV的RNA结合活性。两种有小复制体抑制缺陷的突变体之一(haV-5)与poly(G)的结合与野生型haV相同，而另一种突变体(haV-1)显示显著下降的poly(G)结合活性。这提示小复制体抑制和V蛋白的独特C末端介导的RNA结合活性之间可能有联系。相反，这提示V蛋白RNA结合活性可能在麻疹病毒基因表达和复制中起到了调节作用。

与V蛋白有关的RNA结合活性和小复制体抑制之间的可能联系可以从缺乏C-末端富含半胱氨酸区的V蛋白突变体结合RNA少，而且是效果较差的小复制体抑制子的结果得出。

在另一个实验中，显示小复制体抑制与V蛋白结合N蛋白的能力无关。V-N蛋白复合物的形成不是V蛋白介导的小复制体抑制必需的；V蛋白突变体haV-9和haV-11(图3)不能与N蛋白相互作用，但维持完全的抑制活性(数据未显示)。

V蛋白突变体的分析提示，C-末端是高亲和力RNA结合必需的。除去包含锌结合域的该区域(51)大大减少了可在poly(G)树脂上收集的蛋白质量，但没有完全消除结合。这可以提示在V蛋白中具有第二个弱RNA结合域。不被下列所限，一种吸引人的可能性是C-末端中的锌指蛋白样结构域形成核酸结合域的一个重要部分，V蛋白中的第二个结构域与C-末端合作产生具有更高亲和力的结合位点。

这些RNA结合的研究还显示V蛋白在粗细胞提取物中，可以与RNA相互作用，而不与任何其它病毒蛋白质作用。这提示V蛋白直接与RNA结合。该结论不是绝对的，因为仍可能V蛋白与细胞蛋白质相互作用，从而引起与RNA的结合。如果该模型是真实的，数据表明C-末端可能介导负责与细胞因子相互作用的蛋白-蛋白相互作用。纯化的重组V蛋白对于进一步检测V蛋白是否直接与RNA结合是重要的。

虽然突变的haV-5蛋白对于小复制体抑制是有缺陷的(图4)，它和野生型蛋白质一样与RNA(图6)结合。因此，与CR2有关的小复制体抑制活性不能简单与其它两利分析的活性(RNA结合和与N蛋白作用)联系起来。为了CR2能有效作为抑制基序，可能需要在V蛋白的C-末端中具有完整的RNA结合域。V蛋白可能与一些RNA聚合酶II转录因子类似，具有模式结构(78)。

为了完全测试CR2可直接参与抑制的可能性，除去该结构域(氨基酸112-134)，产生haV-23(图7；SEQ ID NO：9)。惊人的是，该缺失对抑制活性的影响不大(图8)。可除去CR2，而不影响抑制的事实证明CR2不含活跃参与抑制的结构域。相反，似乎haV-5中发现的氨基酸113和114的取代导致的缺陷(图7和8)产生显性阴性效果(先前的蛋白质印迹分析表明抑制中的缺陷不是由于haV-5不稳定性导致的)。

不受理论所限，haV-5中的YD-AA取代在V蛋白的三级结构中产生了微小的改变，部分封闭了抑制活性。另外，V蛋白和其它病毒蛋白质或细胞蛋白质之间可能有相互作用。双丙氨酸取代可能倾向于抑制抑制活性，或隔断无活性蛋白质复合物中的V蛋白的蛋白-蛋白相互作用。

进一步用产生与haV-5中的突变非常相似但不同的氨基酸取代，测试了弱抑制表型是由双丙氨酸取代造成的显性阴性效果导致的概念(图7)。haV-5中的原始YD-AA取代工程改造成非常保守的基序，由位于CR2氨基酸边界的VYDH组成(图2)。该基序在麻疹病毒、犬瘟热病毒、牛瘟病毒和海豚麻疹病毒的V蛋白序列中是相同的。在突变体haV-24(SEQ ID NO：10)中，VYDH序列被转化成VYAA。在突变体haV-25(SEQ ID NO：11)中VYDH被转化成VAAA。这两个突变体都和野生型haV蛋白一样抑制MV小复制体基因表达(图8)。这暗示haV-5缺陷非常专一的从VYDH到VAAH取代。

通过在C-末端中引入成对的半胱氨酸残基的氨基酸取代，进一步检测C-末端锌指蛋白样结构域在抑制中起到作用的可能性(图9)。突变体haV-12(SEQ IDNO：14)是由半胱氨酸残基1和2转化成丙氨酸产生的(氨基酸251和255)。类似的，突变体haV-13(SEQ ID NO：15)是由C-末端半胱氨酸残基4和5(氨基酸269和272)被丙氨酸替换产生的。半胱氨酸残基成对突变，预计这可能显著改变C-末端中的锌指蛋白样结构，并在抑制活性中产生容易检测的改变。

惊人的是，这些突变体的CAT表达研究(图10)揭示了它们仅受到半胱氨酸取代的轻微影响；haV-12和haV-13维持了显著比例的野生型haV的蛋白质抑制活性(野生型的约65％)。该结果有些出乎意料；预测锌-协同的半胱氨酸残基取代应停止抑制。可能仅取代7个半胱氨酸残基中的2个不完全破坏推定的锌指蛋白核酸结合结构。另外，可能推测的锌指蛋白基序在抑制中起的作用比先前预测的要小。因此，制备了两个额外系列的突变，来进一步检测C末端在抑制中的作用。

在一组突变中，从C-末端(haV-14到haV-19；SEQ ID NO：16-21)开始制备了小增量缺失。最小的缺失(haV-14)从C-末端除去21个氨基酸，而最大的缺失(haV-19)除去了71个氨基酸残基。构建了突变体haV-19，即使它接近于与haV-1相同(图9；SEQ ID NO：13)，因为haV-19中的缺失除去了作为位于氨基酸229-234之间的小碱性基序的部分的几个额外的氨基酸，可用haV-19的表型来证实haV-1中所示的突变表型。

在小复制体试验中的C-末端突变体分析揭示了大缺失突变体(haV-1和haV-19)行为相似；它们抑制小复制体基因表达仅为2倍或更低，而野生型haV诱导5-8倍的抑制(图10)。有趣的是，大缺失显示的抑制活性消失由所有较小的截短突变体再现。甚至最小的C-末端缺失(haV-14)也导致仅约2倍的抑制。该结果提示最C-末端的完整性对于完全的抑制活性是必需的。

除了分析C末端缺失突变的作用，产生了几个额外的突变，以检测独特的V蛋白C-末端开始处，碱性基序(KKGHRR；氨基酸229-237，SEQ ID NO：12)在抑制中起到了一些作用的可能性。将两个精氨酸残基转化为丙氨酸(haV-20；SEQ IDNO：22)或天冬氨酸(haV-21；SEQ ID NO：23)具有类似于C-末端缺失突变的效果。两个取代的突变体抑制小复制体表达平均仅1.5-3倍，而野生型V蛋白抑制通常范围是5-8倍(图10)。这些结果暗示，碱性基序的干扰还中断了正常V蛋白抑制功能。

进一步通过除去该碱性基序检测了该结果(图9，haV-22；SEQ ID NO：24)，而留下完整的剩余C-末端。惊人的是，一个初步实验表明碱性基序的缺失对抑制活性没有可分辨的效果；haV-22抑制CAT活性约9倍(图10)。合起来，这些结果提示碱性基序中的氨基酸取代对抑制活性产生显性阴性效果，可能是由于在蛋白质三级结构中产生不良改变。另一方面，碱性基序的缺失对于V蛋白抑制小复制体基因表达的能力几乎不产生改变。

尚不了解麻疹病毒V蛋白小复制体抑制的机制。结果提示该机制不需要与N蛋白的相互作用，但确实涉及与RNA的相互作用。RNA结合可能导致通过许多不同机制降低小复制体试验中的CAT水平。例如，如果V蛋白与病毒mRNA结合，RNA结合活性可抑制翻译。V蛋白还可以影响衣壳包装的比率，如果它与新生的病毒RNA结合，并防止RNA与N蛋白结合。相反，它也能在某种程度上刺激核衣壳装配，从而促使小复制体系统过度产生基因组长度的RNA，消耗mRNA。V蛋白还可以被视为与转录因子类似，它在启动子处或邻近结合，抑制转录。如果V蛋白类似于转录因子，它可能是平衡基因组合成和mRNA合成开关的调节因子。

分析V蛋白功能提供了在候选麻疹病毒株中引入减毒突变，用于免疫原性组合物的基础。出版的研究显示了消除V蛋白表达导致减毒的病毒复制(19，22，23，26-29)。通过将氨基酸取代靶向特定的V蛋白结构域，而不是消除表达，引入不同减毒的程度。例如，通过使独特C-末端中一个或多个半胱氨酸残基的突变实现V蛋白抑制功能的部分丧失。P和V共有区域中的取代是合适的，例如CR2中的丙氨酸取代，如果它对V蛋白功能具有影响，而对P蛋白没有很大的影响。如领域中所述使用用于“拯救”的反向遗传系统评估了这些突变(19，79，80，81)。

必须使用反向遗传系统产生含有本发明突变的感染性麻疹病毒，因为裸露的基因组RNA不能作为转录和复制的模板。相反，这些基因组序列仅在它们完全被N蛋白包装入核衣壳结构中时才被识别。在该情况下，仅识别基因组和反基因组末端启动子序列，来引发转录或复制途径。

反义单链RNA病毒基因组的转录和复制是通过多聚蛋白质对于核糖核蛋白核心(核衣壳)的酶活性实现的。所有麻疹病毒需要三种病毒蛋白质：N、P和L，使这些途径进行下去。

用定点诱变在麻疹病毒株中引入本文所述的突变。本文所述的一种或多种突变被引入麻疹病毒株。可评估不同突变组合中的累积效应。

用小复制体系统举例说明本发明。可用本领域已知的技术在全长病毒中轻易插入编码麻疹病毒V蛋白的CR2和C-末端(和麻疹病毒的启动子区和L蛋白，N、P和/或C蛋白和/或F基因末端信号)的核苷酸序列中的改变的突变。用标准重组DNA方法将突变引入病毒基因组的DNA拷贝。这可能是野生型或改良的病毒基因组的背景，从而产生新病毒。用cDNA拯救系统产生含有这些突变的感染性克隆或颗粒，该系统被用于各种反义RNA病毒，包括仙台病毒(82)；麻疹病毒(83，88)；呼吸道合胞病毒(84)；PIV-3(85)；狂犬病(86)；水疱性口炎病毒(VSV)(87)；和牛瘟病毒(89)；这些文献在此引入以供参考。

简单说，所有麻疹病毒拯救系统可总结如下：每种系统需要将全长病毒基因组的克隆DNA等价物，置于合适的DNA-依赖性RNA聚合酶启动子(例如，T7RNA聚合酶启动子)和自身切开核酶序列(例如，肝炎δ核酶)之间，将其插入可增殖细菌质粒中。该转录载体提供了容易操纵的DNA模板，从该模板RNA聚合酶可忠实的转录出具有精确或近乎精确的5′和3′末端的病毒反义基因组(或基因组)的单链RNA拷贝。病毒基因组DNA拷贝的方向和侧接的启动子以及核酶序列决定了反基因组和基因组RNA等价物是否转录。拯救新病毒子代还需要病毒特异性反式激活蛋白，用来将裸露单链病毒反基因组或基因组RNA转录物包装入功能性核衣壳模板：病毒核衣壳(N)蛋白，聚合酶相关的磷蛋白(P)和聚合酶(L)蛋白中。这些蛋白包括活性病毒RNA依赖性RNA聚合酶，它必须结合核衣壳模板来完成转录和复制。

通常，这些病毒反式激活蛋白产生自一或多个编码所需蛋白的质粒表达载体，虽然某些或所有所需反式激活蛋白可以在如下哺乳动物细胞中产生：这些哺乳动物细胞用基因工程改造，而含有并表达这些病毒特异性基因和作为稳定转化体的基因产物。

拯救的典型(尽管不是唯一必须的)环境包括合适的哺乳动物细胞环境，在其中存在T7聚合酶来驱动反基因组(或基因组)单链RNA的转录，该RNA来自含病毒基因组cDNA的转录载体。共转录或在那之后不久，该病毒反基因组(或基因组)RNA转录物被核衣壳蛋白包装入功能性模板中，并被所需聚合酶组分结合，该组分同时产生于编码所需病毒特异性反式激活蛋白的共转染表达质粒。这些事件和过程导致病毒mRNA的优先转录，新基因组的复制和扩增以及，因此产生新病毒子代，亦即，拯救。

对于非麻疹病毒属的狂犬病病毒，VSV和仙台病毒的拯救，通过重组牛痘病毒VTF7-3提供T7聚合酶。然而该系统需要将拯救病毒和牛痘病毒分离，可通过物理或化学方法，或通过在对于牛痘病毒不是良好宿主的细胞或组织中重复传代。对于麻疹病毒cDNA拯救(和可能其它麻疹病毒)，通过建立表达T7聚合酶，以及N和P蛋白的细胞系而避开了该要求。拯救通过将基因组表达载体和L基因表达载体转染入辅助细胞系来实现。痘病毒宿主范围突变株，MVA-T7的优点是在哺乳动物细胞中表达T7RNA聚合酶，但几乎不或不产生感染性子代。它被利用来拯救麻疹病毒和其它麻疹病毒属的病毒。同时表达必需的衣壳包装蛋白后，合成的全长反基因组病毒RNA被包装，复制并通过病毒聚合酶蛋白转录，而复制的基因组被包装入感染性病毒粒子中。除了这样的反基因组，仙台病毒和PIV-3的基因组类似物现已被成功拯救(85，90)。

该拯救系统因而提供一种组合物，该组合物包括一转录载体，该转录载体包括分离的核酸分子，它编码麻疹病毒基因组或反基因组。该核酸分子包含在应对于麻疹病毒V蛋白的氨基酸112-134的区域内至少一个突变(和随意的，这里描述的其它突变)，以及至少一个表达载体，它包括至少一个分离的核酸分子，其编码衣壳包装，转录和复制所需的反式激活蛋白(例如，对于麻疹病毒是N，P和L)。然后宿主细胞用刚才描述的至少两种表达载体转化、感染或转染。宿主细胞在允许这些载体共表达的条件下培养，以产生感染性的修饰病毒。

然后首先通过体外方法测试被拯救的感染性病毒有无所需表型(V蛋白减少抑制，温度敏感型，冷适应型，噬斑形态学，和转录与复制减弱型)。麻疹病毒N，P或C基因或F基因终止信号中的突变也可用小复制体系统测试，其中所需反式激活衣壳包装和聚合酶活性由野生型或疫苗辅助病毒提供，或由表达含有基因特异性减毒突变的N，P和不同L基因的质粒提供(63，83)。

如果存在拯救病毒的减毒表型，可用合适的动物模型进行攻击实验。非人灵长类提供了人疾病致病机理的优选动物模型。这些灵长类先用减毒的重组产生的病毒免疫，然后用野生型病毒攻击。猴用不同途径感染，包括但不限于鼻内，气管内或皮下接种(91)。实验性感染的恒河猴和猕猴短尾猿也作为研究疫苗诱导的抗麻疹保护的动物模型(92)。

保护力用例如疾病体症和症状、存活、病毒散布和抗体滴度等标准衡量。如果符合所要的标准，重组产生的病毒可考虑作为人体试验的候选活疫苗或免疫原性的组合物。“被拯救的”病毒被认为是“重组产生的”，子代和病毒后代也相同，它们也掺入了减毒突变。

即使“被拯救”病毒和使用疫苗的最适水平相比过度减毒或减毒不足，这也是对研发这样的最适病毒株的有价值的信息。

最适的，含有减毒点突变的密码子可通过在该密码子中引入第二个或第二个加上第三个突变来稳定，而不改变仅带有减毒点突变的密码子编码的氨基酸。含有稳定性突变的感染性病毒克隆也可用如上所述的cDNA“拯救”系统产生。

先前在出版的国际专利申请WO98/13501(93)(在此引入以供参考)中，公开了单链反义病毒目的重组产生的减毒无节段反义单链RNA病毒(例如麻疹病毒)的产生和分离，该病毒在3′基因组启动子区具有至少一个减毒突变，和在RNA聚合酶基因具有至少一个减毒突变。

特别是这些突变包括：

(1)在3’基因组启动子区至少一个减毒的突变选自核苷酸26(A→T)，核苷酸42(A→T或A→C)和核苷酸96(G→A)，其中这些核苷酸存在于正链反基因组的信使链中；和

(2)RNA聚合酶基因中的至少一个减毒突变，选自产生氨基酸改变的核苷酸改变。这些氨基酸改变选自残基331(异亮氨酸→苏氨酸)，1409(丙氨酸→苏氨酸)，1624(苏氨酸→丙氨酸)，1649(精氨酸→甲硫氨酸)，1717(天门冬氨酸→丙氨酸)，1936(组氨酸→酪氨酸)，2074(谷氨酰胺→精氨酸)和2114(精氨酸→赖氨酸)。

另外，在出版的国际专利申请WO99/49017(94)(在此引入以供参考)中，公开了重组产生的减毒麻疹病毒的产生和分离，其中N、P或C基因或F基因末端信号中具有至少一个减毒突变。

特别是这些突变包括：

(1)对于N基因，至少一个减毒突变选自产生氨基酸改变的核苷酸改变，这些氨基改变酸选自残基129(谷氨酰胺→赖氨酸)，148(谷氨酸→甘氨酸)，和479(丝氨酸→苏氨酸)；

(2)对于P基因，至少一个减毒突变选自产生氨基酸改变的核苷酸改变，这些氨基酸改变选自残基225(谷氨酸→甘氨酸)，275(半胱氨酸→酪氨酸)，和439(亮氨酸→脯氨酸)；

(3)对于C基因，至少一个减毒突变选自产生氨基酸改变的核苷酸改变，这些氨基酸改变选自残基73(丙氨酸→缬氨酸)，104(甲硫氨酸→苏氨酸)，和134(丝氨酸→酪氨酸)；和

(4)对于F基因末端信号(顺式激活转录终止信号)，核苷酸7243(T→C)的改变，其中这些核苷酸存在于正链、反基因组，即信使(编码)有义中。

可在本发明的麻疹病毒中掺入这些突变组之一或全部的单个或减毒突变的组合，特别包括那些在对应于V蛋白氨基酸112-134的区域中具有至少一个突变的，和那些同时含有氨基酸112-134中的突变和至少一部分从氨基酸231开始的C-末端区域的突变和缺失。

本发明的减毒病毒可用来配制疫苗或免疫原性组合物。要这样做，将减毒病毒调节到合适的浓度，并和任何合适的疫苗佐剂，稀释剂或载体一起配方。生理学可接受的培养基可被用作载体和/或稀释剂。这些培养基包括但不限于：水、合适的等渗培养基、甘油、乙醇和其它常规溶剂、磷酸盐缓冲液等。合适的佐剂包括但不限于磷酸铝、氢氧化铝、MPL^TM(3-O-去乙酰基一磷酸脂A；RIBIImmunoChem Research，Inc.，Hamilton，MT现在是Corixa)、合成的脂类A类似物，例如529(Corixa)、Stimulon^TM QS-21(Aquila Biopharmaceuticals，Framingham，MA)和IL-12(Genestics Institute，Cambrige，MA)。

在本发明的一个实施例中，将含有麻疹病毒的配方用作疫苗或免疫原性组合物。减毒病毒可以和低温保护添加剂或稳定剂例如蛋白(例如清蛋白，明胶)，糖类(例如蔗糖，乳糖，山梨醇)，氨基酸(例如，谷氨酸钠)，盐，或其它保护性试剂混合。该混合物保存在液态，或然后干燥或冻干以运输和储藏并在施用前夕和水混合。

含有本发明的麻疹病毒的配方可用于免疫人或其它脊椎动物个体，来诱导保护力抵抗减毒病毒相对应的野生型病毒的感染。因此，本发明还提供免疫个体以诱导针对麻疹病毒感染的保护的方法，即通过施给个体有效免疫量的含有本文上述病毒产生形式的疫苗或免疫原性组合物配方。

必须施用给个体剂量数合适和充足量的疫苗或免疫原性组合物以诱导免疫应答。本领域技术人员可容易的确定用量和剂量。施用可以通过任何常规有效形式，例如鼻内，肠胃外，口内，或局部施用于任何粘膜表面，例如鼻内，口，眼，肺，阴道内或直肠表面，例如通过气雾剂喷洒。施用的优选途径是鼻内施用。

本文所引用的所有专利和出版物在此引入以供参考。

为了能更好的理解本发明，列出下文的实施例。这些实施例仅用来阐述而不是用来限制本发明的范围。

实施例

实施例1细胞和病毒

HEp2细胞在补充有10％胎牛血清的Dulbecco的改良Eagles培养基(DMEM)中生长。鸡胚成纤维细胞(CEF；SPAFAS，Inc)维持在相同培养基中。表达噬菌体T7RNA聚合酶(MVA/T7；62)的痘病毒减毒株在CEF中生长。噬菌斑测定也在CEF上进行。

实施例2

重组DNA

分别从感染的细胞总RNA中，通过反转录和用基因特异性引物PCR扩增(RT/PCR)，然后克隆入合适的T7RNA聚合酶依赖性表达载体(61)，制备麻疹病毒N、P和L蛋白质表达克隆(图1A)。用麻疹病毒的Edmonston野生型病毒株感染Vero细胞，当约70％或以上的细胞显示细胞病变作用时，通过 -苯酚提取法(95)制备RNA。用一试管Titan扩增试剂盒(Roche Molecular Biology)所含的禽成肌病毒RT和Pwo聚合酶进行RT/PCR。RT步骤在47℃进行30-60分钟，然后进行30-35轮PCR扩增。扩增的DNA片段克隆入在载体NcoI位点具有翻译起始密码子的T7表达质粒(图1；(61，83))。用循环测序(96)检查克隆的DNA，并用寡核苷酸诱变，使用Morph试剂盒(5prime-3prime，Inc.)，或通过用如前所述的新扩增的DNA片段替换亚片段纠正核苷酸取代错误(96)。

用侧接V蛋白编码区的引物，从Edmonston野生型全长cDNA克隆通过PCR扩增制备了原始V蛋白的表达克隆。将扩增的DNA克隆入T7表达载体，在编辑位点(18)通过寡核苷酸定向诱变加入产生V基因阅读框漂移必须的其它G核苷酸残基。还在氨基末端用流感病毒血凝素表位标记(HA标记；(67))制备野生型和突变的V蛋白表达载体。修饰T7载体质粒，以包含包括起始密码子和编码HA表位标记，，然后是多接头(质粒pT7/HA)的序列(CG ATG GCT TAT CCT TAT GACGTG CCT GAC TAT GCC)(SEQ ID NO：5)。在氨基末端用HA标记克隆V蛋白编码区。这用来替换V蛋白引发因子的甲硫氨酸密码子，产生称为pMV-haV-wt质粒。在pMV-haV-wt骨架中，通过寡核苷酸指导或缺失诱变制备V蛋白突变体。

设计用于扩增P和V编码区的5′末端的引物

(CGGCCATGGCAGAAGAGACAGGCACGCC ACGT AAAAAACGGAC)(SEQ IDNO：6)含有两个碱基改变(下划线)，来中断下游C蛋白开放阅读框。这些改变对于P和V开放阅读框是沉默的。相同的核苷酸改变对于pT7MV-haV构建物进行。

对于全部蛋白质表达构建物，cDNA插入物被克隆到内部核糖体进入位点(IRES)的3′，以促使T7RNA聚合酶转录物的翻译。在3′末端有50个腺苷酸残基的延伸，然后是T7RNA聚合酶终止子。P和V表达载体含有设计用于从下游C蛋白开放阅读框开始中断翻译开始的碱基取代。

麻疹病毒小复制体(pMVwt107-CAT，图1B)是一种pMV107-CAT(63)的衍生物。质粒pMV107-CAT含有在麻疹病毒疫苗株(60)中发现的前导序列，用寡核苷酸定向诱变转化成质粒pMV107wt-CAT(它含有野生型前导序列)。

实施例3

瞬时表达实验

如前所述(96)主要用不同量的病毒蛋白质表达载体(图1B)和含有CAT报道基因的麻疹病毒小复制体(图1B)进行了瞬时小复制体表达分析。

麻疹病毒小复制体是含有CAT报道基因和来自麻疹病毒Edmonston野生型株的麻疹前导序列(60)的pMV107-CAT(63)的衍生物。当细胞约70-90％汇合时，用6孔板中的HEp2细胞转染。通过混合小复制体DNA(50-200ng pMVwt107-CAT)和表达质粒(400ng pMVwt-N，300ng pMVwt-P[C-]，100ng pMVwt-L)在200微升无血清OptiMEM中制备转染混合物。在该混合物中根据25-400ng的量，如图1C中所述加入V蛋白表达质粒。在DNA-培养液混合物中加入Lipofectace(12-15微升；Invitrogen/Life Technologies)，并在室温下培育20-30分钟。制备足量的单独MVA/T7混合物，以提供含有足量MVA/T7的0.8ml无血清OptiMEM，以2pfu/细胞感染各孔要转染的细胞。在开始转染前，将DNA-培养基-Lipofectace转染混合物与800微升MVA/T7-培养基混合物混合，并通过吹洗温和混合。接着，从细胞单层中除去培养基，在细胞中加入混合的1ml转染混合物。

过夜培养后，用补充有10％FBS的DMEM替换转染混合物和培养基，细胞再培养1天。转染开始约48小时后，收集细胞，如前所述制备提取物用于分析CAT活性(96)。CAT的表达如图1C所示。在一些实验中，粗细胞提取物中的蛋白质用蛋白质印迹分析，来监测蛋白质表达(97)。用补充有0.2％NP40的TN缓冲液(50mM Tris[pH7.4]，150mM NaCl)裂解转染的细胞。离心澄清细胞提取物，以除去核，在胞质提取物中加入等体积的Laemmli样品缓冲液(62.5mm Tris[pH6.8]，25％甘油，2％SDS，0.01％溴酚蓝)。调节样品，使其含有约2.5％β-巯基乙醇，然后煮沸。用标准方法(97)进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳和电印迹。用小鼠单克隆抗体12CA5(Roche Molecular Biology)或大鼠单克隆抗体3F10(Roche MolecularBiology)检测表位标记的V蛋白。用过氧化物酶-偶联的二抗(Sigma)和化学发光试剂(Roche Molecular Biology或New England Nuclear)进行了检测。

实施例4

通过突变的麻疹病毒V蛋白抑制小复制体表达

用不同量的麻疹病毒V蛋白突变体haV-1到haV-8重复实施例3所述的瞬时小复制体表达CAT试验，它们与野生型序列(haV-wt)具有下列不同(见图3)：

haV-1 氨基酸232-299缺失

haV-2 氨基酸225的谷氨酸到甘氨酸突变

haV-3 氨基酸229和230赖氨酸到丙氨酸突变

haV-4 氨基酸204和209的赖氨酸和苏氨酸到丙氨酸突变

haV-5 氨基酸113和114的酪氨酸和天冬氨酸到丙氨酸突变

haV-6 氨基酸100和101的亮氨酸和谷氨酰胺到丙氨酸突变

haV-7 氨基酸14和15的谷氨酸和半胱氨酸到丙氨酸突变

haV-8 氨基酸3和4的谷氨酸到丙氨酸突变

使用200或400ng各V质粒(编码野生型或haV-1到haV-8蛋白)，测量相对CAT活性，作为不用任何V蛋白表达载体进行的转染(泳道2)获得的活性百分数。图4A表示了结果。减低的百分数与较高程度的CAT表达抑制相关。用抗-HA抗体分析的蛋白质印迹监测V蛋白表达(图4B)。

用增量(100ng到1微克)编码haV-1的V质粒重复CAT试验，图4C描述了相对活性。

实施例5

RNA结合试验

进行了RNA结合试验(74，76，77)评估麻疹病毒V蛋白对RNA的结合，使用与多核糖核苷酸(Sigma)偶联的琼脂糖树脂。如上所述用补充有0.5％NP40、5％甘油、1mg MgCl₂、1mm ZnCl₂和蛋白酶抑制剂混合物(Roche Molecular Biology)的TN缓冲液裂解转染的细胞。在澄清的细胞裂解物中加入含有多核糖核苷酸的琼脂糖树脂(约25-50微升固定量的珠)，4℃振摇保温60分钟。保温后，洗涤树脂三次除去未结合的蛋白质。通过在补充有2.5％β-巯基乙醇的Laemmli缓冲液中煮沸从树脂上洗脱下蛋白质。用图5A的流程图总结该过程。用蛋白质印迹分析如上所述分析多核苷酸树脂捕获的蛋白质。首先用野生型V蛋白进行该试验，然后用haV-1到haV-11进行试验。突变体haV-1到haV-8如上所述；haV-9到haV-11与野生型序列(haV-wt)具有下列区别(见图3)：

haV-9氨基酸1-20缺失

haV-10氨基酸208-230缺失

haV-11氨基酸1-20和208-230缺失

结果描述于图5B(野生型)和6(突变体)。

实施例6

其它CR2突变体麻疹病毒V蛋白质对小复制体表达的抑制

用麻疹病毒V蛋白CR2突变体haV-5和haV-23到haV-25重复实施例3和4中所述的瞬时小复制体表达CAT试验，它与CR2(氨基酸100-140；见图7)中的野生型序列(haV)(SEQ ID NO：7)具有下列不同。

haV-5 氨基酸113和114位的酪氨酸和天冬氨酸到丙氨酸的突变(SEQ IDNO：8)

haV-23 氨基酸112到134的缺失(SEQ ID NO：9)

haV-24 氨基酸114和115处的天冬氨酸和组氨酸到丙氨酸的突变(SEQID NO：10)

haV-25 氨基酸113处的酪氨酸、天冬氨酸和组氨酸到155处的突变(SEQID NO：11)

使用400ng的各V质粒(编码野生型、haV-5或haV-23到haV-25V蛋白)，测定相对CAT活性，作为不用任何V蛋白表达载体进行的转染的活性百分数(条1)。结果如图8所述。较低百分数与较高程度的CAT表达抑制有关。

实施例7

其它C-末端突变的麻疹病毒V蛋白对小复制体表达的抑制

用麻疹病毒V蛋白突变体haV-1和haV-12到haV-22重复实施例3和4中所述的瞬时小复制体表达CAT试验，它与野生型序列(haV)(SEQ ID NO：7)的C-末端(氨基酸220-299；见图9)具有下列不同。

haV-1 氨基酸232到299缺失(SEQ ID NO：13)

haV-12 氨基酸251和255处的半胱氨酸到丙氨酸的突变(SEQ ID NO：14)

haV-13 氨基酸269和272处的半胱氨酸到丙氨酸的突变(SEQ ID NO：15)

haV-14 氨基酸279-299缺失(SEQ ID NO：16)

haV-15 氨基酸267-299缺失(SEQ ID NO：17)

haV-16 氨基酸250-299缺失(SEQ ID NO：18)

haV-17 氨基酸243-299缺失(SEQ ID NO：19)

haV-18 氨基酸236-299缺失(SEQ ID NO：20)

haV-19 氨基酸229-299缺失(SEQ ID NO：21)

haV-20 氨基酸233和234处的精氨酸到丙氨酸的突变(SEQ ID NO：22)

haV-21 氨基酸233和234处的精氨酸到精氨酸的突变(SEQ ID NO：23)

haV-22 氨基酸229-237处的突变体缺失(SEQ ID NO：24)

使用400ng的各V质粒(编码野生型、haV-1或haV-12到haV-22V蛋白)，测定相对CAT活性，作为不用任何V蛋白表达载体进行的转染的活性百分数(条1)。结果如图10所述。较低百分数与较高程度的CAT表达抑制有关。

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序列表

<110>美国氰胺公司(American Cyanamid Company)

<120>修饰的麻疹病毒V蛋白

<130>AM100239PCT

<140>

<141>

<150>US60/213,655

<151>2000-06-23

<160>24

<170>PatentIn Ver.2.1

<210>1

<211>299

<212>PRT

<213>麻疹病毒

<400>1

Met Ala Glu Glu Gln Ala Arg His Val Lys Asn Gly Leu Glu Cys Ile

1 5 10 15

Arg Ala Leu Lys Ala Glu Pro Ile Gly Ser Leu Ala Ile Glu Glu Ala

20 25 30

Met Ala Ala Trp Ser Glu Ile Ser Asp Asn Pro Gly Gln Glu Arg Ala

35 40 45

Thr Cys Arg Glu Glu Lys Ala Gly Ser Ser Gly Leu Ser Lys Pro Cys

50 55 60

Leu Ser Ala Ile Gly Ser Thr Glu Gly Gly Ala Pro Arg Ile Arg Gly

65 70 75 80

Gln Gly Pro Gly Glu Ser Asp Asp Asp Ala Glu Thr Leu Gly Ile Pro

85 90 95

Pro Arg Asn Leu Gln Ala Ser Ser Thr Gly Leu Gln Cys Tyr Tyr Val

100 105 110

Tyr Asp His Ser Gly Glu Ala Val Lys Gly Ile Gln Asp Ala Asp Ser

115 120 125

Ile Met Val Gln Ser Gly Leu Asp Gly Asp Ser Thr Leu Ser Gly Gly

130 135 140

Asp Asn Glu Ser Glu Asn Ser Asp Val Asp Ile Gly Glu Pro Asp Thr

145 150 155 160

Glu Gly Tyr Ala Ile Thr Asp Arg Gly Ser Ala Pro Ile Ser Met Gly

165 170 175

Phe Arg Ala Ser Asp Val Glu Thr Ala Glu Gly Gly Glu Ile His Glu

180 185 190

Leu Leu Arg Leu Gln Ser Arg Gly Asn Asn Phe Pro Lys Leu Glu Lys

195 200 205

Thr Leu Asn Val Pro Pro Pro Pro Asp Pro Gly Arg Ala Ser Thr Ser

210 215 220

Glu Thr Pro Ile Lys Lys Gly His Arg Arg Glu Ile Ser Leu Ile Trp

225 230 235 240

Asn Gly Asp Arg Val Phe Ile Asp Arg Trp Cys Asn Pro Met Cys Ser

245 250 255

Lys Val Thr Leu Gly Thr Ile Arg Ala Arg Cys Thr Cys Gly Glu Cys

260 265 270

Pro Arg Val Cys Glu Gln Cys Arg Thr Asp Thr Gly Val Asp Thr Arg

275 280 285

Ile Trp Tyr His Asn Leu Pro Glu Ile Pro Glu

290 295

<210>2

<211>299

<212>PRT

<213>牛瘟病毒

<400>2

Met Ala Glu Glu Gln Ala Tyr His Val Asn Lys Gly Leu Glu Cys Ile

1 5 10 15

Lys Ala Leu Arg Ala Arg Pro Leu Asp Pro Leu Val Val Glu Glu Ala

20 25 30

Leu Ala Ala Trp Val Glu Thr Ser Glu Gly Gln Thr Leu Asp Arg Met

35 40 45

Ser Ser Asp Glu Ala Glu Ala Asp His Gln Asp Ile Ser Lys Pro Cys

50 55 60

Phe Pro Ala Ala Gly Pro Gly Lys Ser Ser Met Ser Arg Cys His Asp

65 70 75 80

Gln Gly Leu Arg Gly Ser Asn Ser Cys Asp Glu Glu Leu Gly Ala Phe

85 90 95

Ile Gly Asp Ser Ser Met His Ser Thr Glu Val Gln His Tyr His Val

100 105 110

Tyr Asp His Ser Gly Glu Lys Val Glu Gly Val Glu Asp Ala Asp Ser

115 120 125

Ile Leu Val Gln Ser Gly Ala Asp Asp Gly Val Glu Val Trp Gly Gly

130 135 140

Asp Glu Glu Ser Glu Asn Ser Asp Val Asp Ser Gly Glu Pro Asp Pro

145 150 155 160

Glu Gly Ser Ala Pro Ala Asp Trp Gly Ser Ser Pro Ile Ser Pro Ala

165 170 175

Thr Arg Ala Ser Asp Val Glu Thr Val Glu Gly Asp Glu Ile Gln Lys

180 185 190

Leu Leu Glu Asp Gln Ser Arg Ile Arg Lys Met Thr Lys Ala Glu Lys

195 200 205

Thr Leu Val Val Pro Pro Ile Pro Ser Gln Glu Arg Pro Thr Ala Ser

210 215 220

Glu Lys Pro Ile Lys Lys Gly His Arg Arg Glu Ile Asp Leu Ile Trp

225 230 235 240

Asn Asp Gly Arg Val Phe Ile Asp Arg Trp Cys Asn Pro Thr Cys Ser

245 250 255

Lys Val Thr Val Gly Thr Val Arg Ala Lys Cys Ile Cys Gly Glu Cys

260 265 270

Pro Arg Val Cys Glu Gln Cys Ile Thr Asp Ser Gly Ile Glu Asn Arg

275 280 285

Ile Trp Tyr His Asn Leu Ala Asp Ile Pro Glu

290 295

<210>3

<211>303

<212>PRT

<213>海豚麻疹病毒

<400>3

Met Ala Glu Glu Gln Ala Tyr His Ile Asn Lys Gly Leu Glu Cys Leu

1 5 10 15

Lys Ser Leu Arg Glu Asn Pro Pro Asp Ala Val Glu Ile Lys Glu Ala

20 25 30

Gln Ile Ile Arg Ser Lys Ala Ala Cys Glu Glu Ser Ser Glu Ser His

35 40 45

His Gln Asp Asn Ser Glu Lys Asp Thr Leu Asp Phe Asp Glu Ser Cys

50 55 60

Ser Ser Ala Ile Arg Pro Glu Thr Tyr Arg Met Leu Leu Gly Asp Asp

65 70 75 80

Thr Gly Phe Arg Ala Pro Gly Tyr Ile Pro Asn Glu Gly Glu Pro Glu

85 90 95

Pro Gly Asp Ile Gly Lys Glu Glu Pro Ala Val Arg Cys Tyr His Val

100 105 110

Tyr Asp His Gly Gly Gln Ala Val Glu Gly Val Lys Asp Ala Asp Leu

115 120 125

Leu Val Val Pro Thr Gly Ser Asp Asp Asp Ala Glu Phe Arg Asp Gly

130 135 140

Asp Glu Ser Ser Leu Glu Ser Asp Gly Glu Ser Gly Thr Val Asp Thr

145 150 155 160

Arg Gly Asn Ser Ser Ser Asn Arg Gly Ser Ala Pro Arg Ile Lys Val

165 170 175

Glu Arg Ser Ser Asp Val Glu Thr Ile Ser Ser Glu Glu Leu Gln Gly

180 185 190

Leu Ile Arg Ser Gln Ser Gln Lys His Asn Gly Phe Gly Val Asp Arg

195 200 205

Phe Leu Lys Val Pro Pro Ile Pro Thr Ser Val Pro Leu Asp Pro Ala

210 215 220

Pro Lys Ser Ile Lys Lys Gly His Arg Arg Glu Ile Ser Leu Ile Trp

225 230 235 240

Asp Gly Asp Arg Val Phe Ile Asp Arg Trp Cys Asn Pro Thr Cys Ser

245 250 255

Arg Ile Lys Met Gly Ile Val Arg Val Lys Cys Thr Cys Gly Glu Cys

260 265 270

Pro Pro Val Cys Asp Glu Cys Arg Glu Asp Pro Glu Thr Pro Thr Arg

275 280 285

Ile Trp Tyr His Ser Leu Pro Glu Ile Pro Glu Gln Trp Pro Phe

290 295 300

<210>4

<211>299

<212>PRT

<213>犬瘟热病毒

<400>4

Met Ala Glu Glu Gln Ala Tyr His Val Ser Lys Gly Leu Glu Cys Leu

1 5 10 15

Lys Ala Leu Arg Glu Asn Pro Pro Asp Ile Glu Glu Ile Gln Glu Val

20 25 30

Ser Ser Leu Arg Asp Gln Thr Cys Asn Pro Gly Gln Glu Asn Gly Thr

35 40 45

Thr Gly Met Gln Glu Glu Glu Asp Ser Gln Asn Leu Asp Glu Ser His

50 55 60

Glu Pro Thr Lys Gly Ser Asn Tyr Val Gly His Val Pro Gln Asn Asn

65 70 75 80

Pro Gly Cys Gly Glu Arg Asn Thr Ala Leu Val Glu Ala Glu Arg Pro

85 90 95

Pro Arg Glu Asp Ile Gln Pro Gly Pro Gly Ile Arg Cys Asp His Val

100 105 110

Tyr Asp His Ser Gly Glu Glu Val Lys Gly Ile Glu Asp Ala Asp Ser

115 120 125

Leu Val Val Pro Ala Gly Thr Val Gly Asn Arg Gly Phe Glu Arg Gly

130 135 140

Glu Gly Ser Leu Asp Asp Ser Thr Glu Asp Ser Gly Glu Asp Tyr Ser

145 150 155 160

Glu Gly Asn Ala Ser Ser Asn Trp Gly Tyr Ser Phe Gly Leu Lys Pro

165 170 175

Asp Arg Ala Ala Asp Val Ser Met Leu Met Glu Glu Glu Leu Ser Ala

180 185 190

Leu Leu Arg Thr Ser Arg Asn Val Gly Ile Gln Lys Arg Asp Gly Lys

195 200 205

Thr Leu Gln Phe Pro His Asn Pro Glu Gly Lys Thr Arg Asp Pro Glu

210 215 220

Cys Gly Ser Ile Lys Lys Gly His Arg Arg Glu Val Ser Leu Thr Trp

225 230 235 240

Asn Gly Asp Ser Cys Trp Ile Asp Lys Trp Cys Asn Pro Ile Cys Thr

245 250 255

Gln Val Asn Trp Gly Ile Ile Arg Ala Lys Cys Phe Cys Gly Glu Cys

260 265 270

Pro Pro Thr Cys Asn Glu Cys Lys Asp Asp Pro Glu Met Gln Thr Arg

275 280 285

Val Trp His Ala Thr Pro Ser Gln Asp Leu Lys

290 295

<210>5

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：表位标记

<400>5

ccatggct tatccttatgac gtgcctgact atgcc 35

<210>6

<211>43

<212>DNA

<2L3>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物

<400>6

cggccatggc agaagagaca ggcacgccac gtaaaaaacg gac 43

<210>7

<211>41

<212>PRT

<213>麻疹病毒

<400>7

Leu Gln Ala Ser Ser Thr Gly Leu Gln Cys Tyr Tyr Val Tyr Asp His

1 5 10 15

Ser Gly Glu Ala Val Lys Gly Ile Gln Asp Ala Asp Ser Ile Met Val

20 25 30

Gln Ser Gly Leu Asp Gly Asp Ser Thr

35 40

<210>8

<211>41

<212>PRT

<213>麻疹病毒

<400>8

Leu Gln Ala Ser Ser Thr Gly Leu Gln Cys Tyr Tyr Val Ala Ala His

1 5 10 15

Ser Gly Glu Ala Val Lys Gly Ile Gln Asp Ala Asp Ser Ile Met Val

20 25 30

Gln Ser Gly Leu Asp Gly Asp Ser Thr

35 40

<210>9

<211>18

<212>PRT

<213>麻疹病毒

<400>9

Leu Gln Ala Ser Ser Thr Gly Leu Gln Cys Tyr Tyr Leu Asp Gly Asp

1 5 10 15

Ser Thr

<210>10

<211>41

<212>PRT

<213>麻疹病毒

<400>10

Leu Gln Ala Ser Ser Thr Gly Leu Gln Cys Tyr Tyr Val Tyr Ala Ala

1 5 10 15

Ser Gly Glu Ala Val Lys Gly Ile Gln Asp Ala Asp Ser Ile Met Val

20 25 30

Gln Ser Gly Leu Asp Gly Asp Ser Thr

35 40

<210>11

<211>41

<212>PRT

<213>麻疹病毒

<400>11

Leu Gln Ala Ser Ser Thr Gly Leu Gln Cys Tyr Tyr Val Ala Ala Ala

1 5 10 15

Ser Gly Glu Ala Val Lys Gly Ile Gln Asp Ala Asp Set Ile Met Val

20 25 30

Gln Ser Gly Leu Asp Gly Asp Ser Thr

35 40

<210>12

<211>80

<212>PRT

<213>麻疹病毒

<400>12

Arg Ala Ser Thr Ser Glu Thr Pro Ile Lys Lys Gly His Arg Arg Glu

1 5 10 15

Ile Ser Leu Ile Trp Asn Gly Asp Arg Val Phe Ile Asp Arg Trp Cys

20 25 30

Asn Pro Met Cys Ser Lys Val Thr Leu Gly Thr Ile Arg Ala Arg Cys

35 40 45

Thr Cys Gly Glu Cys Pro Arg Val Cys Glu Gln Cys Arg Thr Asp Thr

50 55 60

Gly Val Asp Thr Arg Ile Trp Tyr His Asn Leu Pro Glu Ile Pro Glu

65 70 75 80

<210>13

<211>12

<212>PRT

<213>麻疹病毒

<400>13

Arg Ala Ser Thr Ser Glu Thr Pro Ile Lys Lys Gly

1 5 10

<210>14

<211>80

<212>PRT

<213>麻疹病毒

<400>14

Arg Ala Ser Thr Ser Glu Thr Pro Ile Lys Lys Gly His Arg Arg Glu

1 5 10 15

Ile Ser Leu Ile Trp Asn Gly Asp Arg Val Phe Ile Asp Arg Trp Ala

20 25 30

Asn Pro Met Ala Ser Lys Val Thr Leu Gly Thr Ile Arg Ala Arg Cys

35 40 45

Thr Cys Gly Glu Cys Pro Arg Val Cys Glu Gln Cys Arg Thr Asp Thr

50 55 60

Gly Val Asp Thr Arg Ile Trp Tyr His Asn Leu Pro Glu Ile Pro Glu

65 70 75 80

<210>15

<211>80

<212>PRT

<213>麻疹病毒

<400>15

Arg Ala Ser Thr Ser Glu Thr Pro Ile Lys Lys Gly His Arg Arg Glu

1 5 10 15

Ile Ser Leu Ile Trp Asn Gly Asp Arg Val Phe Ile Asp Arg Trp Cys

20 25 30

Asn Pro Met Cys Ser Lys Val Thr Leu Gly Thr Ile Arg Ala Arg Cys

35 40 45

Thr Ala Gly Glu Ala Pro Arg Val Cys Glu Gln Cys Arg Thr Asp Thr

50 55 60

Gly Val Asp Thr Arg Ile Trp Tyr His Asn Leu Pro Glu Ile Pro Glu

65 70 75 80

<210>16

<211>59

<212>PRT

<213>麻疹病毒

<400>16

Arg Ala Ser Thr Ser Glu Thr Pro Ile Lys Lys Gly His Arg Arg Glu

1 5 10 15

Ile Ser Leu Ile Trp Asn Gly Asp Arg Val Phe Ile Asp Arg Trp Cys

20 25 30

Asn Pro Met Cys Ser Lys Val Thr Leu Gly Thr Ile Arg Ala Arg Cys

35 40 45

Thr Cys Gly Glu Cys Pro Arg Val Cys Glu Gln

50 55

<210>17

<211>47

<212>PRT

<213>麻疹病毒

<400>17

Arg Ala Ser Thr Ser Glu Thr Pro Ile Lys Lys Gly His Arg Arg Glu

1 5 10 15

Ile Ser Leu Ile Trp Asn Gly Asp Arg Val Phe Ile Asp Arg Trp Cys

20 25 30

Asn Pro Met Cys Ser Lys Val Thr Leu Gly Thr Ile Arg Ala Arg

35 40 45

<210>18

<211>30

<212>PRT

<213>麻疹病毒

<400>18

Arg Ala Ser Thr Ser Glu Thr Pro Ile Lys Lys Gly His Arg Arg Glu

1 5 10 15

Ile Ser Leu Ile Trp Asn Gly Asp Arg Val Phe Ile Asp Arg

20 25 30

<210>19

<211>23

<212>PRT

<213>麻疹病毒

<400>19

Arg Ala Ser Thr Ser Glu Thr Pro Ile Lys Lys Gly His Arg Arg Glu

1 5 10 15

Ile Ser Leu Ile Trp Asn Gly

20

<210>20

<211>16

<212>PRT

<213>麻疹病毒

<400>20

Arg Ala Ser Thr Ser Glu Thr Pro Ile Lys Lys Gly His Arg Arg Glu

1 5 10 15

<210>21

<211>9

<212>PRT

<213>麻疹病毒

<400>21

Arg Ala Ser Thr Ser Glu Thr Pro Ile

1 5

<210>22

<211>80

<212>PRT

<213>麻疹病毒

<400>22

Arg Ala Ser Thr Ser Glu Thr Pro Ile Lys Lys Gly His Ala Ala Glu

1 5 10 15

Ile Ser Leu Ile Trp Asn Gly Asp Arg Val Phe Ile Asp Arg Trp Cys

20 25 30

Asn Pro Met Cys Ser Lys Val Thr Leu Gly Thr Ile Arg Ala Arg Cys

35 40 45

Thr Cys Gly Glu Cys Pro Arg Val Cys Glu Gln Cys Arg Thr Asp Thr

50 55 60

Gly Val Asp Thr Arg Ile Trp Tyr His Asn Leu Pro Glu Ile Pro Glu

65 70 75 80

<210>23

<211>80

<212>PRT

<213>麻疹病毒

<400>23

Arg Ala Ser Thr Ser Glu Thr Pro Ile Lys Lys Gly His Asp Asp Glu

1 5 10 15

Ile Ser Leu Ile Trp Asn Gly Asp Arg Val Phe Ile Asp Arg Trp Cys

20 25 30

Asn Pro Met Cys Ser Lys Val Thr Leu Gly Thr Ile Arg Ala Arg Cys

35 40 45

Thr Cys Gly Glu Cys Pro Arg Val Cys Glu Gln Cys Arg Thr Asp Thr

50 55 60

Gly Val Asp Thr Arg Ile Trp Tyr His Asn Leu Pro Glu Ile Pro Glu

65 70 75 80

<210>24

<211>71

<212>PRT

<213>麻疹病毒

<400>24

Arg Ala Ser Thr Ser Glu Thr Pro Ile Leu Ile Trp Asn Gly Asp Arg

1 5 10 15

Val Phe Ile Asp Arg Trp Cys Asn Pro Met Cys Ser Lys Val Thr Leu

20 25 30

Gly Thr Ile Arg Ala Arg Cys Thr Cys Gly Glu Cys Pro Arg Val Cys

35 40 45

Glu Gln Cys Arg Thr Asp Thr Gly Val Asp Thr Arg Ile Trp Tyr His

50 55 60

Asn Leu Pro Glu Ile Pro Glu

65 70

Claims

1.一种分离的、重组产生的无节段反义单链RNA麻疹病毒属的病毒，所述病毒选自麻疹病毒、犬瘟病毒、牛瘟病毒和海豚麻疹病毒，其特征在于，所述病毒选自麻疹病毒、犬瘟病毒、牛瘟病毒和海豚麻疹病毒的V蛋白氨基酸序列依次为SEQID NO：1、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3，其中在所述麻疹病毒属病毒的V蛋白氨基酸113和114中有至少一个突变，其中氨基酸113的突变是从酪氨酸变为除了天冬酰胺、半胱氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸的其它氨基酸，氨基酸114的突变是从天冬氨酸变为除了谷氨酸以外的其它氨基酸。

2.如权利要求1所述的麻疹病毒属的病毒，其特征在于，所述突变在氨基酸113处。

3.如权利要求2所述的麻疹病毒属的病毒，其特征在于，所述氨基酸113处的突变是从酪氨酸变为丙氨酸。

4.如权利要求1所述的麻疹病毒属的病毒，其特征在于，所述突变在氨基酸114处。

5.如权利要求4所述的麻疹病毒属的病毒，其特征在于，氨基酸114处的突变是从天冬氨酸变为丙氨酸。

6.如权利要求1所述的麻疹病毒属的病毒，其特征在于，在氨基酸113和114处都有突变。

7.如权利要求6所述的麻疹病毒属的病毒，其特征在于，所述氨基酸113处的突变是从酪氨酸变为丙氨酸，而所述氨基酸114处的突变是从天冬氨酸变为丙氨酸。

8.如权利要求2所述的麻疹病毒属的病毒，其特征在于，所述病毒是麻疹病毒。

9.如权利要求8所述的麻疹病毒属的病毒，其特征在于，所述病毒还在麻疹病毒V蛋白的羧基末端区域，即C末端区域的至少一部分中具有突变或缺失，其中突变是在氨基酸233和234处，所述氨基酸233和234上的各突变是从精氨酸变为丙氨酸或天冬氨酸，和

其中所述缺失选自氨基酸232-299、279-299、267-299、250-299、243-299和236-299的缺失。

10.如权利要求8所述的病毒，其特征在于，该病毒还包括：

(a)3′基因组启动子区域中的至少一个减毒突变选自核苷酸26由A到T，核苷酸42由A到T或A到C和核苷酸96由G到A，其中这些核苷酸存在于正链、反基因组、信使有义链中；

(b)RNA聚合酶基因中的至少一个减毒突变，选自产生氨基酸改变的核苷酸改变，这些氨基酸改变选自残基331由异亮氨酸到苏氨酸，1409由丙氨酸到苏氨酸，1624由苏氨酸到丙氨酸，1649由精氨酸到甲硫氨酸，1717由天冬氨酸到丙氨酸，1936由组氨酸到酪氨酸，2074由谷氨酰胺到精氨酸和2114由精氨酸到赖氨酸。

11.如权利要求8所述的病毒，其特征在于，该病毒包括至少一个减毒突变，选自：

(a)对于N基因，产生氨基酸改变的核苷酸改变，所述氨基酸改变选自残基129由谷氨酰胺到赖氨酸，148由谷氨酸到甘氨酸，和479由丝氨酸到苏氨酸；

(b)对于P基因，产生氨基酸改变的核苷酸改变，所述氨基酸改变选自残基225由谷氨酸到甘氨酸，275由半胱氨酸到酪氨酸，和439由亮氨酸到脯氨酸；

(c)对于C基因，产生氨基酸改变的核苷酸改变，所述氨基酸改变选自残基73由丙氨酸到缬氨酸，104由甲硫氨酸到苏氨酸，和134由丝氨酸到酪氨酸；和

(d)对于F基因末端信号，改变是核苷酸7243由T到C，其中这些核苷酸存在于正链、反基因组，信使有义链中。

12.如权利要求9所述的病毒，其特征在于，该病毒还包括：

(a)3′基因组启动子区域中的至少一个减毒突变，选自核苷酸26由A到T，核苷酸42由A到T或A到C和核苷酸96由G到A，其中这些核苷酸存在于正链、反基因组、信使有义链中；和

13.如权利要求9所述的病毒，其特征在于，该病毒还含有至少一种减毒突变，选自：

(d)对于F基因末端信号，核苷酸7243由T到C改变，其中这些核苷酸存在于正链、反基因组，即信使有义链中。

14.一种免疫原性组合物，其特征在于，该组合物含有稀释剂或载体，以及权利要求1所述的分离的、重组产生的无节段反义单链RNA麻疹病毒属的病毒。

15.如权利要求14所述的免疫原性组合物，其特征在于，该组合物还含有佐剂。

16.权利要求14所述的免疫原性组合物的用途，其特征在于，用于制备免疫个体，用于诱导抵抗麻疹病毒属的无节段反义单链RNA病毒的保护的药物。

17.权利要求15所述的免疫原性组合物的用途，其特征在于，用于制备免疫个体，用于诱导抵抗麻疹病毒属的无节段反义单链RNA病毒的保护的药物。

18.一种分离的编码麻疹病毒属V蛋白的核苷酸序列，所述病毒选自麻疹病毒、犬瘟病毒、牛瘟病毒和海豚麻疹病毒，其特征在于，所述病毒选自麻疹病毒、犬瘟病毒、牛瘟病毒和海豚麻疹病毒的V蛋白氨基酸序列依次为SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：4、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3，该序列通过插入至少一个突变而被修饰，所述突变选自氨基酸113和114的突变，其中氨基酸113的突变是从酪氨酸变为除了天冬酰胺、半胱氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸的其它氨基酸，氨基酸114的突变是从天冬氨酸变为除了谷氨酸以外的其它氨基酸。