KR100885325B1 - 변형된 모빌리바이러스 ｖ 단백질 - Google Patents

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Abstract

아미노산 113 또는 114 중 하나, 또는 모두가 돌연변이된, 홍역 바이러스 V 단백질의 아미노산 112-134에 상응하는 영역에 적어도 하나의 돌연변이를 갖는 변형된 모빌리바이러스가 기술된다. 이러한 변형된 모빌리바이러스는 감소된 유전자 발현의 억제를 보인다. 카복시-말단 영역을 포함하는 게놈의 다른 영역에 추가의 돌연변이 또는 결실이 포함될 수 있다.
홍역 바이러스, 돌연변이, 유전자 발현 억제, 카복시-말단

Description

변형된 모빌리바이러스 Ｖ 단백질{MODIFIED MORBILLIVIRUS V PROTEIN}
본 발명은 V 단백질에 의해 보통 유발되는 억제를 감소시키는 1 이상의 돌연변이 및/또는 결실을 갖는 모빌리바이러스(Morbillivirus) 속(genus)의 분리되고, 재조합으로 생성된, 네거티브-센스, 싱글-스트랜드 RNA 바이러스에 관한 것이다.
인벨럽핑된, 네거티브-센스, 싱글-스트랜드 RNA 바이러스는 독특하게 조직되고, 발현된다. 네거티브-센스, 싱글-스트랜드 바이러스의 게놈 RNA는 뉴클레오캡시드의 컨텍스트에서 두 주형으로 기능한다: 메신저 RNA(mRNA)의 합성을 위한 주형 및 안티게놈(+) 스트랜드의 합성을 위한 주형. 바이러스 복제는 mRNA의 합성 후에 일어나고, 바이러스 단백질의 연속적인 합성을 요구한다. 새로 합성된 안티게놈(+) 스트랜드는 (-) 스트랜드 게놈 RNA의 추가 카피를 생성시키기 위한 주형으로서 기여한다.
RNA-의존 RNA 폴리머라제 복합체는 게놈의 3' 말단, 구체적으로, 프로모터 영역에서 시스-작용 시그널을 인게이징함으로써 전사 및 복제를 실시하고 달성한다. 그러면 게놈 주형으로부터 바이러스 유전자가 3'에서 5' 말단을 향해 한쪽 방향으로 전사된다.
바이러스 분류학 국제위원회가 1993년도에 개정한 재분류법에 기초하여, 모 노네가비랄(Mononegavirales)로 지정된 목(order)이 수립되었다. 이 목은 싱글 스트랜드, 마이너스 극성(네거티브-센스)의 비분절 RNA 게놈을 갖는 인벨럽핑된 바이러스의 3 과를 포함한다. 이들 과는 파라믹소비리대(Paramyxoviridae), 랍도비리대(Rhabdoviridae) 및 필로비리대(Filoviridae)이다. 파라믹소비리대 과는 두 개의 아과, 파라믹소비리내(Paramyxovirinae) 및 뉴모비리내(Pneumovirinae)로 추가로 세분된다. 파라믹소비리내 아과는 3 속, 레스피로바이러스(Respirovirus)(이전의 파라믹소바이러스), 루불라바이러스(Rubulavirus) 및 모빌리바이러스(Morbillivirus)를 포함한다. 뉴모비리내 아과는 뉴모바이러스(Pneumovirus) 속을 포함한다. 새로운 분류체계는 형태학적 기준, 바이러스 게놈의 조직, 생물학적 활성 및 유전자와 유전자 산물의 서열 관련성에 기초하였다. 현재의 모빌리바이러스의 계통분류학적 분류는 하기와 같다:
목 모노네가비랄
과 파라믹소비리대
아과 파라믹소비리내
속 모빌리바이러스
홍역 바이러스
돌고래 모빌리바이러스
개 디스템퍼 바이러스
페스트-데-쁘띠-루미넌츠 바이러스
포사인 디스템퍼 바이러스
린더페스트 바이러스
이들 다수의 바이러스에 대해서, 사용가능한 백신은 한 종류도 없다. 따라서, 이러한 인간 및 동물 병원체에 대한 백신을 개발할 필요가 있다. 이러한 백신은 수용자내에서 보호 면역 반응을 이끌어내야 한다. 이러한 바람직한 반응의 양적 및 질적인 특징은 천연 바이러스 감염의 생존자, 즉, 일반적으로 상당한 기간 후에 동일한 또는 매우 많이 관련된 바이러스에 의해 재감염되는 것으로부터 보호된 개체로부터 추정해낸다.
이러한 백신을 개발하고자 하는 탐구에는, (1) 정제된 개개의 바이러스 단백질 백신(서브유닛 백신); (2) 비활성화된 전체 바이러스 제조물; (3) 감쇠된 생 바이러스의 사용을 포함하는 다양한 접근법이 고려될 수 있다.
서브유닛 백신은 순수하고, 한정할 수 있으며, 재조합 DNA 발현 방법을 포함하는 다양한 수단에 의해 비교적 쉽게 풍부하게 생산될 수 있다는 바람직한 특성을 가진다. 오늘날까지, B형 간염 표면 항원을 제외하고는, 바이러스 서브유닛 백신은 특히 나이브 수용자내에서 단기간 및/또는 미숙한 면역만을 일반적으로 유발해 왔다.
포르말린으로 비활성화된 폴리오(IPV) 및 A형 간염의 전체 바이러스 제조물은 안전하고, 효과적인 것으로 증명되어 왔다. 반대로, 호흡기 합포체 바이러스 및 홍역 바이러스 백신과 같은 유사하게 비활성화된 전체 바이러스 백신으로 면역화한 것은, 자연 또는 "야생형" 바이러스에 후속적으로 노출된 경우에, 백신이 심화 또는 이상 질병을 일으키기 쉽다는, 바람직하지 않은 면역 반응 및/또는 반응 프로파일을 일으켰다.
야생형 바이러스의 적절히 감쇠된 생 유도체는 백신 후보로서 특출한 특징을 제공한다. 살아있는 복제체로서, 이들은 백신의 특이적 MHC 클래스 I 및 II 분자의 컨텍스트내에서 바이러스 유전자 산물이 발현되고, 가공되며, 존재하는 동안에 수용자내에서 감염을 개시하여, 체액 및 세포-매개 면역 반응을 일으키고, 사이토카인 및 케모카인 패턴을 조정하는데, 이는 자연 감염 생존자의 보호 면역 프로파일에 필적한다.
이 호적한 면역 반응 패턴은 통상적으로, 체액성 면역 감시군에 대부분 제한되는 비활성화 또는 서브유닛 백신에 의해 유발되는 한정된 반응과 대조된다. 또한, 포르말린으로 비활성화된 전체 바이러스 백신 일부, 예를 들면, 1960년대에 개발된 홍역 및 호흡기 합포체 바이러스 백신에 의해 유발되는 면역 반응 프로파일은 백신 수용자가 야생형 바이러스에 이후에 노출되었을 때, 계속되는 보호를 제공하는 데 실패하였을 뿐만 아니라, 이상, 심화, 및 심지어는 치명적인 질병에 걸리기 쉽도록 유도하였다.
반면, 감쇠된 생 바이러스는 백신 후보로서 매우 바람직한 특징을 가지지만, 이들은 개발하는 데 어려운 것으로 알려져 왔다. 이 난관의 핵심은, 수용자를 감염시킬 충분한 복제 컴피턴스를 보유하고, 목적하는 면역 반응 프로파일을 적절한 분량으로 일으킬 수 있으면서, 이의 질병-발생 잠재성(즉, 유독성)이 손실된 야생형 바이러스의 유도체를 분리해 내야 하는 필요성에 있다.
역사적으로, 이 유독성과 감쇠 간의 미묘한 균형은 다양한 생장 조건(온도와 같은) 하에 상이한 숙주 조직 또는 세포에 야생형 바이러스 분리체를 연속 통과시킴으로써 달성되어 왔다. 이 방법은 아마도 바람직한 감쇠의 특징을 가지는 일부 바이러스 변이체(돌연변이)를 생장시킬 것이다. 때때로, 화학적 돌연변이유발 등을 통해서 추가의 감쇠가 달성된다.
이 증식/통과 전략은 전형적으로 온도 민감성, 저온-적응 및/또는 숙주 범위가 변경된 바이러스 유도체의 증식을 유도한다--1 또는 모든 것은 야생형, 질병-유발 바이러스에서 변화된 것이며--즉, 이것은 감쇠와 관련될 수 있는 변화이다.
홍역 및 이하선염(파라믹소바이러스)의 예방을 위한 것, 및 소아마비 및 루벨라(포지티브 스트랜드 RNA 바이러스)에 대한 보호를 위한 것을 포함하는 몇몇 생 바이러스 백신이 이러한 접근법에 의해 생성되어 왔으며, 전세계를 통해 현재, 어린이 면역화 처방의 주요골자를 제공한다.
그럼에도 불구하고, 감쇠된 생 바이러스 백신 후보를 만들기 위한 이 수단은 장황하고, 잘해 봤자, 예상 불가능하고, 바람직한 감쇠 특징을 가진 게놈 돌연변이체를 무작위로 발생한 것의 선택적인 결과에 주로 의존한다. 생성되는 바이러스는 시험관내(in vitro)에서는 목적하는 표현형을 가질수는 있지만, 동물 모델내에서는 감쇠된 것으로 보인다. 그러나, 이들은 이들이 백신 후보로서 의도되는 인간 또는 동물 숙주내에서 너무나도 자주 과소하게 또는 과도하게 감쇠되어 남아있다.
현재 사용되고 있는 백신에 대해서도 심지어, 더욱 효과적인 백신에 대한 요구가 존재한다. 예를 들면, 기존의 홍역 백신은 적당히 양호한 보호를 제공한다. 그러나, 최근의 홍역 전염병은 기존 백신의 효능면에서 결핍을 제안한다. 모계 면 역화에도 불구하고, 생후 1년 미만의 영아에게서 급성 홍역 감염이 고비율로 발병하고 있으며, 이는 야생형 홍역 감염(인용문헌 1, 2, 3)에 따라 개발된 것과 비교하여 항-홍역 항체 수준을 유도하는 백신의 무능력을 반영하는 것이다. 결과적으로, 백신으로 면역화된 어머니는 생애 채 몇 개월이 지나지 않은 신생아를 보호하기 위한, 태반을 통해 유래하는 충분한 수동 항원을 이들의 유아에게 제공하는 능력이 떨어진다.
이미 면역화된 청소년 및 장년층에서의 급성 홍역 감염은 추가적인 문제를 지적한다. 이들 2차 백신 실패는, 풍부하고 오랜 수명(4, 5, 6)을 가진 항바이러스 보호를 유도하고 유지하는, 기존의 백신 능력의 한계를 지적한다. 최근에는, 또다른 잠재적인 문제가 드러났다. 15세 이상의 개체에서 분리한 야생형 홍역의 헤마토글루티닌 단백질은 백신 스트레인으로부터 점점 단계적으로 거리가 멀어지는 것으로 보인다(7). 이 "항원 드리프트"는 백신 스트레인이 최적의 보호를 제공하기 위해 필요한 이상적인 항원 레퍼토리를 함유하지 않을 수 있는, 본질적인 우려를 제기한다. 따라서, 개선된 백신에 대한 요구가 존재한다.
이론적인 백신 디자인은 이들 바이러스의 더 나은 이해, 특히, 바이러스 암호화된 유독성의 결정기 및 감쇠를 담당하는 게놈의 변화를 동정함으로써 보조될 수 있다.
인간 사망률 및 치사율의 주요 원인으로서 중요하기 때문에, 홍역 바이러스는 꽤 광범위하게 연구되어 왔다. 홍역 바이러스는 크고, 비교적 구형이며, 2개의 구획인, 리포단백질 막 및 리보핵단백질 입자 코어(각각은 구별되는 생물학적 기능 을 갖는다)로 구성된 인벨럽핑된 입자이다(8). 비리온 인벨럽은 3개의 바이러스-특이적 단백질에 의해 변형된 숙주 세포-유래 원형질막이다. 헤마토글루티닌(H; 대략 80 킬로달톤(kD) 및 융합(F1,2; 대략 60 kD) 당단백질은 비리온 표면 위에 나와 있고, 숙주 세포 부착과 바이러스 입자에 들어가는 능력을 제공한다(9). H 및/또는 F에 대한 항원은, 감염을 개시할 수 있는 바이러스의 능력을 무효화하기 때문에 보호성이 있는 것으로 간주된다(10, 11, 12). 매트릭스(M; 대략 37 kD) 단백질은 막의 내면에 덧대어진 친양쪽성 단백질이며, 이는 비리온 형태발생을 편성하고, 따라서, 바이러스 생식을 완성하는 것으로 생각된다(13). 비리온 코어는 15,894 뉴클레오타이드 길이의 게놈 RNA를 함유하며, 여기에서 주형 활성은 대략 60 kD 뉴클레오캡시드(N) 단백질의 대략 2600 분자와 밀접히 결합함으로써 제공된다(14, 15, 16). 이 대략 1 마이크론 길이의 나선형 리보핵단백질 입자와 느슨히 결합한 것은, 폴리머라제 코팩터(P; 대략 70 kD), 및 아마도 다른 바이러스-특정 및 숙주-암호화된 단백질과 함께 홍역 바이러스 게놈 서열을 전사하고 복제하는, 바이러스 RNA-의존 RNA 폴리머라제(L; 대략 240 kD)의 효소 수준이다(17).
홍역 바이러스의 6개의 비리온 구조 단백질은 6개의 연속, 비-중첩 유전자에 의해 암호화되며, 하기와 같이 배열된다: 3'-N-P-M-F-H-L-5'. 아직까지는 불확실한 기능을 가진 2개의 추가 홍역 바이러스 유전자 산물 또한 동정되었다. C(대략 20 kD) 및 V(대략 45 kD)로 알려진 이들 2개의 비구조 단백질은 모두 P 유전자에 의해 암호화된다. C 단백질은 P mRNA내 두 번째 판독 프레임에 의해 암호화된다. V 단백 질은 P의 아미노 말단 서열 및 P 단백질에서 결여된 징크 핑거와 비슷한 시스테인-풍부 카복시 말단 도메인을 갖는 하이브리드 단백질을 암호화하는, 함께 전사되어 에디팅된 P 유전자-유래 mRNA에 의해 암호화된다(9).
홍역 바이러스, 린더페스트 바이러스, 개 디스템퍼 바이러스 및 포사인 디스템퍼 바이러스(19)를 포함하는 모든 모빌리바이러스는 V 단백질을 생산한다(18). 홍역 바이러스 V 단백질은 P 유전자에 의해 암호화되는 비구조 단백질이다(8). 대부분의 파라믹소바이러스와 같이, 홍역 바이러스는 V 단백질, P 단백질, 및 C 단백질을 포함하는 P 유전자로부터 다중 단백질을 암호화한다(9). P 및 V 단백질 모두의 해독은 동일한 메티오닌 코돈에서 시작하고, 처음 230 아미노산에 대해 동일한 폴리펩타이드를 생성한다. V 단백질의 카복시-말단(C-말단)은 P 단백질과 다른데, 왜냐하면, 독특한 V 단백질 C-말단을 더욱 짧게 해독하는 것을 초래하는 프레임쉬프트를 유발하는 RNA 에디팅이 일부 P 유전자 mRNA내에서 발생하기 때문이다(18). C 단백질 아미노산 서열은 V 및 P 단백질과 관련되지 않는데, 왜냐하면 이는 하류의 해독 개시 코돈에서 시작하는 상이한 판독 프레임으로부터 전체적으로 해독되기 때문이다(20).
홍역 바이러스의 P 및 V mRNA는 동일한 개시 코돈을 공유하며, P 및 V 단백질의 처음 230 아미노산은 동일하다. V mRNA는 뉴클레오타이드 2496 내지 2498에 있는 서열 "GGG"에 네 번째 "G" 잔기를 포함시켜 확장되는 "G" 잔기 삽입체를 함유한다. 판독 프레임의 쉬프트를 유발하는, 여분의 비-주형-지시성 "G" 잔기가 뉴클레오타이드 2495 내지 2499에서 삽입되는 경우에 전사 도중에 에디팅이 일어나며, 이로써 P 단백질의 카복시 말단 276 아미노산은 V 단백질의 68 아미노산 시스테인-풍부 카복시-말단으로 대체된다.
V 단백질의 기능은 모든 모빌리바이러스가 V 단백질을 암호화한다는 것을 제외하고는, 아직 잘 알려지지 않았다. 이는 모빌리바이러스에게 유리하도록 하는 유리한 기능을 V 단백질이 수행하여, V 단백질을 합성하기 위한 능력을 보존함을 암시한다. V 단백질 발현은 세포를 배양할 때 바이러스 복제에 필수적인 것은 아니지만(18, 21-15), 동물 모델 시스템에서, V 단백질의 발현은 감염의 심각성에 영향을 주는 것으로 보인다. 예를 들면, 센다이(Sendai) 바이러스(비-모빌리바이러스 파라믹소바이러스)는 보통 마우스 모델 시스템에서 폐렴을 발생시키지만, V 단백질 발현이 결손된 재조합 바이러스로 감염이 수행된 경우, 덜 유독성이다(22, 26). 재조합 인간 파라인플루엔자 바이러스 유형 3(또다른 비-모빌리바이러스 파라믹소바이러스)은 또한, V 단백질 개방 판독 프레임이 결손된 것과 D 단백질 발현이 결손된 것을 조합한 경우, 설치류 및 원숭이에서 감쇠된 표현형을 보였다(23).
마찬가지로, 홍역 바이러스에 대해 사용된 동물 모델 시스템으로의 연구 결과 또한 병원성에서의 V 단백질의 역할을 제안한다. 재조합 홍역 바이러스에 의한 코튼랫 폐의 감염은, 감염 바이러스가 V 단백질 발현에 대해 결손인 경우라면, 자손 바이러스를 덜 생성했다(27). 또한, SCID 마우스에 이식된 조직내 인간 흉선세포 생존은, 감염 바이러스가 V 단백질을 발현하지 못하는 경우 홍역 바이러스로의 감염에 덜 민감했다(28). 마지막으로, 홍역 바이러스로 피하 주사된 CD46 트랜스제닉 마우스는, 바이러스가 V 단백질을 발현하지 못하는 경우에 훨씬 높은 생존율을 가졌다(29). 결론은, 홍역 바이러스 V 단백질은 병원성에 일 역할을 담당하고, 또한, 이는 덜 병원성인 변이체내 또는 백신 스트레인내 V 단백질 코딩 영역 돌연변이를 밝힌 서열 분석에 의해 뒷받침된다(30, 31). 종합하면, 이들 결과는 V 단백질이 홍역 바이러스 및 몇몇 다른 파라믹소바이러스의 유독성을 결정하는 데 중요한 역할을 한다는 가설을 뒷받침한다.
V 단백질이 감염 경로에 영향을 줄 수 있다는 것은 명백한 것으로 보이지만, 이 현상의 메커니즘은 아직 알려지지 않았다. 다수 연구 결과는 V 단백질에 잠재적인 기능을 부여하기 시작했다. 예를 들면, V 단백질 및 P 단백질에 의해 공유되는 아미노산 서열은 바이러스 뉴클레오캡시드(N) 단백질과의 상호작용을 매개하는 것으로 증명되어 왔다(27, 32-39). 이 V 단백질 및 N 단백질 간의 상호작용은 N 단백질의 세포내 분포에 영향을 주는 것으로 보이며(27, 40, 41), 아마도 추가적인 미확인 기능을 가질 것이다. 일부 V 단백질은 또한 세포성 단백질과 상호작용하는 것으로 밝혀졌으며(42, 43), 시미안 바이러스 5(SV5)의 경우에, 세포성 단백질과의 상호작용은 감염 동안에 인터페론 신호 전달 경로의 억제를 담당하는 것이 가능하다(44). V 단백질을 포함하는 단백질-단백질 상호작용 외에도, 몇몇 연구는 바이러스 유전자 발현 및 복제를 조절하는 메커니즘을 제어하는 데 연관된 V 단백질을 연구했다. 일시적 발현 시스템에서 센다이 바이러스 V 단백질 발현은 결손-방해(DI) 입자 복제를 억제하고(45), 마찬가지로 시험관내 전사 반응에서의 DI 입자 복제를 억제했다(35). V 단백질을 억제와 관련시키는 이들 관찰과 일맥상통하게, V 단백질 발현에 대해 결손인 몇 바이러스는 감염 동안에 게놈 RNA, mRNA, 및 바이러스 단백 질의 높아진 수준을 생산하는 것이 관찰되었다(21, 26, 27).
방금 기술한 특성 외에도, 모든 바이러스 V 단백질은 시스테인-풍부 C-말단을 함유한다. 파라믹소바이러스 V 단백질은 고도의 아미노산 유사도를 공유하지 않지만, 7개의 동일하게 배치된 시스테인 잔기를 함유한다(46). 이 주요 특징은 V 단백질이 징크-핑거 단백질로 작용할 수 있거나, 적어도 일부 유형의 징크-코디네이티드 2차 구조를 형성할 수 있다는 예상을 하게 했으며(48, 49, 50), 사실, 몇몇 V 단백질은 아연과 결합하는 것으로 밝혀졌다(51, 52, 53). V 단백질이 아연-코디네이티드 구조를 형성할 수 있는 가능성은 상당한 관심을 끄는데, 왜냐하면, 이 유형의 구조는 종종 핵산 상호작용 또는 단백질-단백질 상호작용에 관련되는 단백질을 형성하기 때문이다(48, 49, 50), 또한, 독특한 C-말단 영역이 결손된 절단 V 단백질을 발현하는 재조합 센다이 바이러스가 덜 병원성인 것이 주목되는데, 이는 병원성에서 V 단백질의 역할이 이 도메인을 요구하는 것임을 제안한다(24).
바이러스-특이적 단백질을 암호화하는 서열 외에도, 홍역 바이러스 게놈은 관련 바이러스의 전사 및 복제 경로를 지시하는 것과 닮은 별개의 비-단백질 암호화 도메인을 함유한다(9, 54). 이들 조절 시그널은 홍역 바이러스 게놈의 3' 및 5' 말단 및, 각 시스트론간 경계를 지나는 짧은 내부 영역에 있다. 전자는 유전자 전사, 게놈 및 안티게놈 캡시드화, 및 복제를 지시하는 추정상의 프로모터 및/또는 조절 서열 요소를 암호화한다. 후자는 전사 종결 및 각 모노시스트론 바이러스 mRNA의 폴리아데닐화 및, 그에 이은 다음 유전자의 전사의 재개시를 신호전달한다. 일반적으로, 홍역 바이러스 폴리머라제 복합체는 다른 비-분절 네거티브 스트랜드 RNA 바이러스의 RNA-의존 RNA 폴리머라제로서 이들 시그널에 반응하는 것으로 보인다(9, 54, 55, 56). 홍역 바이러스 게놈의 3' 말단에서, 또는 그 근처에서 전사가 개시되고, 이어서, 모노시스트론 mRNA를 생산하며 5' 방향으로 진행된다(16, 54, 57).
홍역 바이러스는 리더 및 트레일러 암호화 서열의 경계 너머로 이의 연장된 말단 조절 도메인을 가지는 것으로 보인다(54). 홍역 바이러스에 대해서, 이들 영역은 107 3' 게놈 뉴클레오타이드("3' 게놈 프로모터 영역", 또한 "확장된 프로모터"로 언급되기도 하며, 이는 리더 영역을 암호화하는 52 뉴클레오타이드 다음에, 3개의 유전자간 뉴클레오타이드가 따르고, N mRNA의 5' 비해독 영역을 암호화하는 52 뉴클레오타이드를 포함한다) 및 109 5' 말단 뉴클레오타이드(L mRNA의 3' 비해독 영역을 암호화하는 69, 유전자간 트리뉴클레오타이드 및 트레일러를 암호화하는 37 뉴클레오타이드)에 의해 포함된다. 이들 3' 말단내에, 게놈 및 안티게놈의 대략 100 뉴클레오타이드는 공유된 뉴클레오타이드 서열의 2개의 짧은 영역이다: 게놈 및 안티게놈의 완전한 3' 말단에서 16개 뉴클레오타이드 중 14개가 동일했다. 이들 말단의 내부로, 완전히 동일한 서열 12개 뉴클레오타이드의 추가적인 영역이 위치했다. 홍역 바이러스 게놈의 전사가 시작되어야 하고, 안티게놈이 복제가 시작되어야 하는 부위에서, 및 그 근처에서의 이들의 위치는, 이들 짧은 독특한 서열 도메인이 확장된 프로모터 영역에 의해 포함됨을 제안한다.
이들 불연속 서열 요소는 전사 개시의 대안적인 명령 부위일 수 있다-N 유전자 출발 부위에서 전사 개시를 매개하는 내부 도메인, 및 안티게놈 생산을 지시하 는 3' 말단 도메인(54, 58, 59). 전사 및 복제의 시스-작용 결정소로서의 조절 역할 외에도, 이들 3' 확장된 게놈 및 안티게놈 프로모터 영역은 각각 안티게놈 및 게놈 RNA의 초기 5' 말단을 암호화한다. 이들 초기 RNA 잔기 내에서, N 단백질 핵생성을 위한 시그널, 뉴클레오캡시드 주형 형성에 요구되며, 결과적으로 전사 및 복제의 증폭에 요구되는 다른 핵심 조절 요소는 아직까지 동정되지 않았다.
모든 모빌리바이러스에서, 복제, 전사 및 캡시드화를 포함하는 바이러스 기능에 필수적으로 요구되는 시스-작용 시그널이 비-암호화 게놈 말단에 함유된다. 기능을 위한 필수적인 트랜스-작용 요소는 N, P 및 L 유전자에 함유된다. V 및 C 단백질과 같은 추가의 트랜스작용 인자가 기능을 조절할 수 있다. 임의의 이들 영역내 돌연변이는 바이러스 전사/-복제 효율의 감쇠를 포함하는, 생명유지에 필요한 기능의 변경을 초래할 수 있다.
V 단백질 발현과 병원성 간의 명백한 연관, 및 계속되는 백신 감쇠에의 관심은(30, 60), 더욱 자세히 홍역 바이러스 V 단백질 기능을 시험할 필요가 있게 하였다. 특히, V 단백질 억제 활성, V 단백질과 N 단백질의 상호 작용 및 V 단백질의 RNA에 대한 결합능을 포함하는, 몇몇 V 단백질 특성을 연구하기 위해 일시적인 발현 시스템을 사용할 필요가 있다.
발명의 요약
따라서, 본 발명의 목적은 모빌리바이러스의 V 단백질에 의한 유전자 발현의 억제를 담당하는 이들 바이러스의 게놈의 영역을 동정하는 것이다. 본 발명의 다른 목적은, 유전자 발현의 억제가 감소되는 모빌리바이러스의 V 단백질의 돌연변이 버 젼을 생성하는 것이다. 본 발명의 또다른 목적은, 1 이상의 이러한 돌연변이를 함유하는, 재조합으로 생성된 모빌리바이러스를 만드는 것이다. 본 발명의 또다른 목적은, 이러한 재조합으로 생성된 모빌리바이러스를 함유하는 백신 또는 면역원성 조성물을 제형하는 것이다. 본 발명의 일 양태에서, V 단백질은 홍역 바이러스로부터 유래한다.
하기에 기술될 본 발명의 이들 및 다른 목적은 이들 모빌리바이러스의 V 단백질 중 아미노산 112-134(보존 영역 2; 도 2 참조)에 상응하는 영역을 변형시킴으로써 모빌리바이러스에 대해 달성하였으며, 여기에서, 아미노산 113(타이로신) 및 114(아스파르트산) 중 하나, 또는 모두는 돌연변이되었다. 본 발명의 일 양태에서, 이들 아미노산은 알라닌으로 돌연변이되었다.
V 단백질의 추가적인 변형은 홍역 바이러스, 개 디스템퍼 바이러스 및 돌고래 모빌리바이러스의 V 단백질 중 아미노산 231-299에, 또한 린더페스트 바이러스의 아미노산 231-303에 상응하는 모빌리바이러스 V 단백질의 카복시-말단(C-말단)의 적어도 한 부분에서 돌연변이시키거나 또는 결실시켜 만들어질 수 있다.
이들 변형은 미니레플리콘 시스템에서 V 단백질에 의한 유전자 발현의 억제를 감소시키는 효과를 가질 수 있다. 결과는 당해 업계에 알려져 있고, 하기에 기술되는 "레스큐" 시스템을 사용함으로써, 전체-길이 감염성 모빌리바이러스의 회수로 쉽게 달성되었다.
일시적 분석에서, 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제(CAT) 리포터 유전자 활성을 가진 홍역 바이러스 미니레플리콘은 V 단백질에 의해 강하게 억제된다. 억제 활성은, 아미노산 112-134 사이의 아미노 말단 세 번째 단백질에 위치한 영역에 아미노산을 치환함으로써, 또한 V 단백질의 시스테인-풍부 C-말단 영역의 적어도 한 부분(아미노산 231-299)에서 돌연변이시키거나 결실시킴으로써 줄일 수 있다.
홍역 바이러스의 경우에, 전술한 돌연변이는 하기와 같이 감쇠된 돌연변이와 추가로 조합할 수 있다:
(1) 뉴클레오타이드 26(A→T), 뉴클레오타이드 42(A→T 또는 A→C) 및 뉴클레오타이드 96(G→A)으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 3' 게놈 프로모터 영역내 적어도 하나의 감쇠 돌연변이(여기에서, 이들 뉴클레오타이드는 포지티브 스트랜드, 안티게놈, 메시지 센스에 존재한다);
(2) 잔기 331(이소루신→트레오닌), 1409(알라닌→트레오닌), 1624(트레오닌→알라닌), 1649(아르기닌→메티오닌), 1717(아스파르트산→알라닌), 1936(히스티딘→타이로신), 2074(글루타민→아르기닌) 및 2114(아르기닌→라이신)로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 아미노산 내에서 변화를 발생시키는 뉴클레오타이드 변화로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 RNA 폴리머라제 유전자에서의 적어도 하나의 감쇠 돌연변이;
(3) N 유전자에 대해서, 잔기 129(글루타민→라이신), 148(글루타민산→글라이신) 및 479(세린→트레오닌)로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 아미노산내 변화를 발생시키는 뉴클레오타이드 변화로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 적어도 하나의 감쇠 돌연변이;
(4) P 유전자에 대해서, 잔기 225(글루타민산→글라이신), 275(시스테인→타 이로신) 및 439(루신→프롤린)로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 아미노산내 변화를 유발하는 뉴클레오타이드 변화로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 적어도 하나의 감쇠 돌연변이;
(5) C 유전자에 대해서, 잔기 73(알라닌→발린), 104(메티오닌→트레오닌) 및 134(세린→타이로신)로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 아미노산내 변화를 발생시키는 뉴클레오타이드 변화로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 적어도 하나의 감쇠 돌연변이;
(6) F 유전자-말단 시그널(시스-작용 전사 종결 시그널)에 대해서, 뉴클레오타이드 7243에서의 변화(T→C)(여기에서, 뉴클레오타이드는 포지티브 스트랜드, 안티게놈, 즉, 메시지(암호) 센스에 존재한다).
본 발명의 또다른 양태에서, 이들 돌연변이 모빌리바이러스는 각 바이러스의 야생형 형태에 대한 보호 면역 반응을 일으키는 백신 또는 면역원성 조성물을 제조하는 데 사용된다.
본 발명의 또다른 양태에서, 모빌리바이러스 V 단백질의 아미노산 112-134에 상응하는 영역에 적어도 하나의 돌연변이를 삽입하는 것을 포함하는, 모빌리바이러스의 V 단백질에 의해 유발되는 억제를 감소시키는 방법이 기술되며, 여기에서, 모빌리바이러스 V 단백질의 아미노산 112-134에 상응하는 영역내 돌연변이는 아미노산 113 및 114의 돌연변이로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다.
본 발명의 또다른 양태에서, 모빌리바이러스 V 단백질의 아미노산 112-134에 상응하는 영역에 적어도 하나의 돌연변이를 삽입함으로써 변형된 모빌리바이러스 V 단백질을 암호화하는 분리된 뉴클레오타이드 서열이 기술되며, 여기에서, 모빌리바이러스 V 단백질의 아미노산 112-134에 상응하는 영역내 돌연변이는 아미노산 113 및 114의 돌연변이로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다.
본 발명의 또다른 양태에서, 모빌리바이러스의 게놈 또는 안티게놈을 암호화하는 분리된 핵산 분자를 포함하는 전사 벡터(여기에서, V 단백질을 암호화하는 분리된 핵산 분자의 일부는 모빌리바이러스의 V 단백질의 아미노산 112-134에 상응하는 영역내 적어도 하나의 돌연변이를 삽입하기 위해서 변형되었으며, 여기에서, 모빌리바이러스 V 단백질의 아미노산 112-134에 상응하는 영역내 돌연변이는 아미노산 113 및 114의 돌연변이로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다)와 함께, 캡시드화, 전사 및 복제에 필요한 트랜스-작용 단백질 N, P 및 L을 암호화하는 적어도 하나의 분리된 핵산 분자를 포함하고, 이로써 숙주 세포가 이들 벡터로 형질전환되고, 감염되거나 형질감염되며, 이들 벡터의 공-발현을 허용하는 조건 하에 배양되면, 목적하는 모빌로바이러스를 생산하는, 적어도 하나의 발현 벡터를 포함하는 조성물이제공된다. 이러한 각 바이러스를 이어서, 각 바이러스의 야생형에 대해 보호 면역 반응을 일으키는 백신 또는 면역원성 조성물을 제조하는 데 사용한다.
도 1A는 형질감염에 사용된 4개의 플라스미드 발현 벡터를 묘사한다. T7 RNA폴리머라제-의존 발현 벡터(61)를 MVA/T7로 감염된 세포내에서, 에드몬스톤(Edmonston) 야생형 N, P, L, 또는 V 유전자의 발현을 지시하도록 제조했다(62).
도 1B는 pMV107-CAT에서 유래하는 미니레플리콘을 묘사한다(63). pMV107-CAT내 에드몬스톤 홍역 바이러스 백신 리더 서열이 야생형 서열로 전환되었다(60). T7 RNA 폴리머라제에 의한 미니레플리콘 플라스미드 DNA의 전사는 형질감염된 세포내에서 네거티브-센스 RNA 미니레플리콘을 생성했다.
도 1C는 일시적 발현 분석에서, 미니레플리콘 활성에 대한 V 단백질 발현의 효과를 증명하는 CAT 분석을 묘사한다. 레인 1은 미니레플리콘을 발현하는 데 필요한 모든 플라스미드 벡터(N, P 및 L)로 형질감염된 세포로부터 수득한 양성 대조군이었다. 레인 2는 L 폴리머라제 벡터를 제외한 모든 플라스미드로 형질감염된 세포를 제외하고는, 레인 1과 동일하였다. 레인 3 내지 레인 7에서는 V 단백질 발현 벡터의 증가하는 양을 형질감염시 포함시켰다. 형질감염된 DNA의 총 질량은 삽입 없이 벡터 DNA의 적당량을 포함시켜 일정하게 유지하였다. 상대적인 CAT 활성을 레인 1에서의 활성을 100%로 기준을 잡아 계산하였다.
도 2는 4개의 상이한 모빌리바이러스로부터의 V 단백질 아미노산 서열 비교를 묘사한다. 에드몬스톤 야생형 홍역 바이러스 V 단백질 아미노산 서열(Gene Bank 접근 번호 AF266288)(서열번호 1)을 개 디스템퍼 바이러스(AF014953)(서열번호 4), 린더페스트 바이러스(Z30697)(서열번호 2), 및 돌고래 모빌리바이러스(Z47758)(서열번호 3)와 비교하였다. 고수준의 동일성을 함유하는 영역을 빗금친 상자로 위에 표시하였고, 보존 영역(CR1 내지 CR6)으로 나타내었다. 추가의 눈에 띄는 서열은 아래에 검은색 상자로 표시하였다. 이들은 N 단백질과 V 단백질( 및 P)의 상호작용에 관여하는 영역(34), V-N 단백질 복합체의 세포내 위치선정에 관여하는 영역(27, 64), 및 아연-결합 도메인을 함유하는 시스테인-풍부 영역(51)을 포함한다. 다른 흥미로운 서열은 229-235 간의 염기성 영역, 위치 225의 홍역 바이러스 백신 아미노산 치환(글루타민에서 글라이신으로)(30), 및 위치 93-107 사이의 루신 지퍼의 루신 반복 영역 흔적(65, 66)을 포함한다. V 및 P 단백질에 공통인 영역은 아미노산 1-230에서 확장되며, 독특한 V 단백질 서열(굵은 아미노산 문자)은 231-299에서 확장된다. 배열된 서열 위의 아미노산 위치는 홍역 바이러스 V 단백질의 그것과 상응한다.
도 3은 돌연변이 홍역 바이러스 V 단백질 발현 벡터의 맵을 묘사한다. 이 연구에 사용된 에피토프-태깅된 V 단백질 발현 벡터를 다이어그램으로 나타내었다. 돌연변이 V 단백질 벡터는 V 단백질 개시자 메티오닌의 위치에 인플루엔자 바이러스 HA 태그(67)를 가진 V 단백질을 발현하는 벡터 플라스미드 백본에서 발생되었다. 도면의 상부에 있는 V 단백질 맵 상에 서열 하이라이트가 보여지며, 상기 도 2의 설명과 관련하여 좀 더 자세히 묘사된다. 야생형(haV-wt) 및 돌연변이 단백질 (haV1-11)을 V 단백질 맵 아래에 도해하였다. HA 태그는 아미노-말단에서 빗금친 상자로 나타내었으며, 남아있는 V 단백질 서열은 빈 박스로서 나타내었다. 아미노산 치환은 아미노산 위치와 아미노산 변화와 함께 검은점으로서 표시하였다. 결실 또는 절단 돌연변이는 절단된 V 단백질 맵으로 나타내었다.
도 4A는 V 단백질 돌연변이(haV-1 내지 haV-8; 도 3에 대한 설명 참조)의 활성을 실험하는 일시적 발현 실험의 결과를 보여주는 CAT 분석 형태인, 돌연변이 홍역 바이러스 V 단백질에 의한 미니레플리콘 억제를 묘사한다. V 단백질 벡터의 양(200 또는 400 ng) 및 돌연변이의 동정은 CAT 분석 아래에 도 4A에서 보여진다. 상대적 활성은 V 단백질 활성 벡터 하나도 없이 수행된 형질감염으로부터 유래하는 레인 2의 %로서 계산하였다. 레인 1은 L 단백질 없이 수행한 음성 대조군이었다.
도 4B는 일시적 발현 실험내에서 V 단백질 발현을 모니터링하기 위하여 수행된 웨스턴 블롯을 묘사한다. 레인 1 및 2는 V 단백질 벡터의 부재 하에 형질감염된 세포, 또는 태그 없이 V 단백질을 발현하는 V 단백질 벡터로 형질감염된 세포에서 유래하는 음성 대조군이다. 웨스턴 블롯은 항-HA 항체로 탐침되었다.
도 4C는 발현 벡터의 증가하는 양(100 ng 내지 1 ㎍)을 사용하는 haV-1에 의한 미니레플리콘 억제의 분석을 묘사한다.
도 5는 홍역 바이러스 V 단백질과 RNA 결합 활성을 묘사한다. NP40을 용해시킴으로써 형질감염된 세포로부터 제조한 조 세포질 추출물을 폴리리보뉴클레오타이드 공중합체에 연결된 아가로스 비드를 사용하여 RNA 결합 활성에 대해 분석했다. 흐름도는 도 5A에 보여진 절차를 도해한다. 도 5B는 폴리리보뉴클레오타이드 수지 위에 포획된 단백질을 시험하는 데 사용된 웨스턴 블롯을 묘사한다. 일부 형질감염에서, 세포를 haV 발현 벡터(레인 9 내지 12)로만 형질감염한 것을 제외하고, 미니레플리콘 실험(레인 1 내지 8)에 사용된 것과 동일한 조건을 사용하여 세포를 형질감염했다. 레인 1-4는 4개의 상이한 폴리뉴클레오타이드 수지에의 N 단백질 결합의 분석을 묘사한다. 레인 5-12는 haV 단백질에 결합한 분획의 분석을 묘사한다. 마찬가지로, 레인 9-16은 EGTA(EG), EDTA(ED), 또는 효모 RNA(RNA)의 존재하에 폴리(G)에 결합한 V 단백질의 분석을 묘사한다.
도 6은 돌연변이 홍역 바이러스 V 단백질에 의한 RNA 결합을 묘사한다. 도 5에 기술된 폴리리보뉴클레오타이드 공중합체 결합 분석은 돌연변이 홍역 바이러스 V 단백질(haV 1-11, 레인 3-13; 도 3에 대한 설명 참조)의 분석을 위해 사용된다. 이 실험에서, 세포는 오로지 V 발현 벡터로만 형질감염되었다. 레인 1에서 시험된 세포 추출물은 에피토프 태그를 함유하지 않고 V 단백질을 함유한 음성 대조군이었다. 폴리(G)를 모든 돌연변이 단백질을 시험하기 위하여 사용하였다.
도 7은 haV(서열번호 7)로 표시한 야생형 홍역 바이러스 V 단백질에 대한 CR2(아미노산 100-140)에서의 하기와의 아미노산 서열 비교를 묘사한다; 아미노산 113에서 타이로신 및 아미노산 114에서 아스파르트산이 알라닌으로 치환된 돌연변이, haV-5로 표시(서열번호 8); 아미노산 112-134가 결실된 돌연변이, haV-23으로 표시(서열번호 9); 아미노산 114에서 아스파르트산 및 아미노산 115의 히스티딘이 알라닌으로 치환된 돌연변이, haV-24로 표시(서열번호 10); 아미노산 113에서 타이로신, 아미노산 114에서 아스파르트산 및 아미노산 115에서 히스티딘이 알라닌으로 치환된 돌연변이, haV-25으로 표시(서열번호 11).
도 8은 일시적 발현 분석에서 미니레플리콘 활성에 대한 V 단백질 발현의 효과를 증명하는 CAT 분석에서, 도 7에 묘사된 CR2 돌연변이의 효과를 묘사한다. 바 1은 미니레플리콘 발현을 위해 필요한 모든 플라스미드 벡터(N, P 및 L)로 형질감염된 세포로부터 수득한 양성 대조군이었다. 바 2는 세포가 haV를 암호화하는 발현 벡터로 형질감염된 것을 제외하고, 바 1과 동일했다; 바 3-6에서는, 세포는 표시한 CR2 돌연변이를 암호화하는 발현 벡터로 형질감염되었다. 상대적인 CAT 활성은 바 1에서의 활성을 100%로 기준잡아 계산하였다.
도 9는 haV로 표시(서열번호 12)한 야생형 홍역 바이러스 V 단백질에 대한 C-말단에서의 아미노산 서열(아미노산 220-299)과 하기와의 비교를 묘사한다; 아미노산 232-299가 결실된 돌연변이, haV-1로 표시(서열번호 13); 아미노산 251 및 255에서의 시스테인이 알라닌으로 치환된 돌연변이, haV-12로 표시(서열번호 14); 아미노산 269 및 272에서의 시스테인이 알라닌으로 치환된 돌연변이, haV-13으로 표시(서열번호 15); 아미노산 279-299가 결실된 돌연변이, haV-14로 표시(서열번호 16); 아미노산 267-299가 결실된 돌연변이, haV-15로 표시(서열번호 17); 아미노산 250-299가 결실된 돌연변이, haV-16으로 표시(서열번호 18); 아미노산 243-299가 결실된 돌연변이, haV-17로 표시(서열번호 19); 아미노산 236-299가 결실된 돌연변이, haV-18로 표시(서열번호 20); 아미노산 229-299가 결실된 돌연변이, haV-19로 표시(서열번호 21); 아미노산 233 및 234에서의 아르기닌이 알라닌으로 치환된 돌연변이, haV-20으로 표시(서열번호 22); 아미노산 233 및 234에서의 아르기닌이 각각 아스파르트산으로 치환된 돌연변이, haV-21로 표시(서열번호 23); 아미노산 229-237이 결실된 돌연변이, haV-22로 표시(서열번호 24).
도 10은 일시적 발현 분석에서, 미니레플리콘 활성에 대한 V 단백질 발현의 효과를 증명하는, CAT 분석에서의 도 9에 설명된 C-말단 돌연변이의 효과를 묘사한다. 바 1은 미니레플리콘을 발현시키기 위해 필요한 모든 플라스미드 벡터(N, P 및 L)로 형질감염된 세포로부터 수득된 양성 대조군이었다. 바 2는 세포가 haV를 암호화하는 발현 벡터로 형질감염된 것을 제외하고, 바 1과 동일하였으며; 바 3-14는 표시한 C-말단 돌연변이를 암호화하는 발현 벡터로 형질감염된 세포였다. 상대적인 CAT 활성을 바 1에서의 활성을 100%로 기준을 잡아 계산하였다.
홍역 바이러스로 예시하였지만, 본 발명은 개 디스템퍼 바이러스 및 린더페스트 바이러스를 포함하나, 이에 한정되지는 않는 다른 모빌리바이러스에 또한 적용가능하다.
홍역 바이러스 감쇠와 유전자 발현 및 복제의 조절에 관련된 메커니즘 간의 잠재적인 연관의 고려는(30, 60), V 단백질의 분석을 유도하였다. V 단백질 발현은 바이러스 병원성에 관련되어 왔으며(22, 23, 26-29), 또한 유전자 발현 및 복제의 조절에 관련되어 왔다(21, 26, 27, 35, 45). 목표는 홍역 바이러스 유전자 발현에 대한 V 단백질의 효과를 추가로 분석하는 것이다.
돌연변이 V 단백질 발현 벡터를 작제하기 전에, 몇 개의 상이한 모빌리바이러스로부터의 V 단백질 간의 아미노산 유사도를 시험했다(도 2). 고도의 아미노산 동일성 영역은, 중요한 기능성 도메인을 함유할 수 있으며, 1 이상의 이들 보존 영역(CR)은 미니레플리콘 억제에 참여할 수 있다. 에드몬스톤 야생형 홍역 바이러스, 린더페스트 바이러스, 돌고래 모빌리바이러스, 및 개 디스펨퍼 바이러스로부터의 V 단백질의 배열은 CR1-6으로 표시되는 현저한 서열 동일성을 갖는 몇 개 보존된 영역(도 2에 보여짐)을 드러내었을 뿐만 아니라, C-말단이 모빌리바이러스 중에 동일하게 배치된 7개의 시스테인 잔기를 함유한다는 이전의 관찰(46)을 확증했다. 돌연변이 V 단백질 벡터를 생성하는 동안에 CR 중 몇 개가 표적화되었다.
고수준의 동일성을 함유하는 영역을 동정하는 것 이외에도, 잠재적인 기능성 모티프를 탐색하기 위하여 컴퓨터 분석이 사용되었으며, 잠재적인 홍역 바이러스 V 단백질 기능성 도메인의 가능한 위치에 관한 추가적인 증거를 위해 문헌을 조사하였다. 이들 분석의 결과는 도 2에서의 배열 상에서 설명된다. 몇몇 연구는 N 단백질과의 상호작용에 영향을 주는 V 및 P 단백질의 영역을 위치분석하였다. CR1에 위치한 V 및 P 단백질의 끝쪽 아미노 말단(N-말단)은 투-하이브리드 분석에서 N 단백질(도 2)과 상호작용을 매개하는 서열을 함유한다(34). V-N 단백질-단백질 상호작용에 관여하는 추가의 서열은 CR4에 의해 포함되는 아미노산 204 내지 230(27, 64) 사이에서 위치분석되었다. 홍역 바이러스 V 단백질 아연-결합 도메인(51)은 C-말단에 있고, 아마도, 이는 CR5 및 CR6에서 발견된 적어도 몇 개의 시스테인 잔기를 요구할 것이다. 시스테인-풍부 도메인의 N-말단에, CR5의 일부인 염기성 아미노산(229-234)을 함유하는 잘 보존된 영역이 있다. 홍역 바이러스 V 단백질내 동일 영역(아미노산 225) 근처에는 에드몬스톤 백신 스트레인에서 발견된 아미노산 치환이 존재한다(야생형 글루타민산에서 글라이신으로(30)). 최종적으로, 홍역 바이러스 V 단백질에서는, 루신 지퍼 모티프의 흔적인 루신 반복단위(아미노산 93-107)가 있었다(65, 66). 이들 도메인 및 모티프의 수는 미니레플리콘 시스템 및 V 단백질 돌연변이 발현 벡터를 사용하는 추가의 연구를 위한 매력적인 후보들이었다.
V 단백질 발현 벡터의 제조(도 1A) 외에도, 에드몬스톤 야생형 N, P 및 L 단백질을 포함하는 기본 복제 기구 성분 3가지에 대한 T7 발현 플라스미드를 제조했 다. P 및 V 단백질 벡터내 하류 해독 개시 코돈으로부터의 C 단백질 발현에 기인한 잠재적인 임의의 혼란을 제거하기 위하여, C 단백질 개방 판독 프레임을 C 단백질의 해독을 막기 위해 변형했다. C 단백질 ATG 코돈을 ACG로 전환하고, C 단백질 개방 판독 프레임내 두 번째 코돈을 정지 코돈으로(TCA를 TAA로) 전환하였다. 이들 변형은 P 및 V 단백질에 대해 사일런트하였다.
V 단백질이 홍역 바이러스 mRNA 전사 및 게놈 복제를 조절하는 데 관여할 수 있다는 것은(21, 26, 27, 35, 45) V 단백질 발현에 미니레플리콘 시스템이 반응하는지를 시험하기 위한 실험을 제안하였다. 야생형 V 단백질 기능에 영향을 주는 V 유전자 돌연변이가 평가될 수 있도록, 또한, 재조합 야생형 바이러스를 사용하는 바이러스 감쇠의 미래의 유전적 연구에 이들 발견을 잠재적으로 적용하도록, 에드몬스톤 야생형 성분으로 미니레플리콘 시스템을 만들었다. 에드몬스톤 야생형 홍역 바이러스-레플리콘(도 1B, pMVwt107-CAT)은 pMV107-CAT내 백신 리더 서열을 에드몬스톤 야생형 리더 서열(60)로 전환시킴으로써 p107MV-CAT 미니레플리콘(63)에서 유래하였다.
야생형 성분이 검출가능한 미니레플리콘 발현을 이끌 수 있는지 측정하기 위하여, HEp2 세포를 미니레플리콘 DNA, N, P 및 L 단백질 발현 벡터로 형질감염시키고, 동시에 MVA/T7(62)로 감염시켜 T7 RNA 폴리머라제를 제공했다. 감염 48시간 후에, 세포를 수확하고, 세포 추출물을 CAT 활성에 대해 분석했다. 에드몬스톤야생형 미니레플리콘 시스템은 L 폴리머라제 단백질 발현 벡터를 제외한 모든 DNA로 형질감염된 음성 대조군에서 생성된 백그라운드 수준 이상으로 CAT 활성을 쉽게 생성했 다(도 1C, 레인 1 및 2, 데이터는 나타내지 않음). 이는 일시적 발현 분석 동안에 생성된 CAT 활성은 특이적이며, 완전한 홍역 바이러스 복제 기구에 의존함을 암시한다.
이어서 미니레플리콘 시스템을 V 단백질이 일시적 발현 분석에서 미니레플리콘 발현에 검출가능한 영향을 주는 지에 대해 측정하는 데 사용하였다. 미니레플리콘 분석 형질감염은 증가하는 양의 V 단백질 발현 벡터로 수행하였다. 형질감염된 DNA의 전체적 질량은 삽입체가 결여된 적당량의 발현 벡터를 포함시킴으로써 일정하게 유지하였다. 0 내지 400 ng으로 증가하는 V 단백질 발현 벡터 양의 효과는 도 1C에 보여진다. 레인 1의 양성 대조군은 V 단백질 발현의 부재하에 수득된 CAT 활성의 양을 보인다(도 1C, 레인 1). 레인 2는 L 단백질 발현 벡터가 생략되었을 때, CAT 활성이 검출가능하지 않다는 것을 보여주는 음성 대조군이다. 레인 3-7은 증가하는 양의 V 단백질 발현의 음성 효과를 설명한다. CAT 활성의 억제는, 가장 적은 양의 V 단백질 발현 벡터(레인 3 및 4)에서 명백하였으며, 가장 많은 양에서 가장 강했고, 400 ng의 V 단백질 발현 플라스미드가 형질감염되었을 때(레인 7) 검출가능한 미니레플리콘 발현을 실질적으로 제거한다. 레인 3-7에 사용된 V 단백질 발현 벡터의 2배 증가는 또한, 관련 CAT 활성에서의 관찰된 감소와 잘 상응한다. 이들 결과는, V 단백질 기능의 일면이 미니레플리콘 분석으로 관찰될 수 있다는 것을 명백히 보여준다. 미니레플리콘 분석에서 이러한 쉽게 검출가능한 V 단백질 발현의 음성 효과는 V 단백질 돌연변이의 미니레플리콘 억제 표현형을 추가로 시험하기 위한 편리한 포맷을 제공한다.
V 단백질 돌연변이 분석을 시작하기 위하여, V 단백질 발현 벡터(도 1A)를 변형시켜, V 단백질의 아미노-말단에 에피토트 태그를 붙였다(pMV-haV-wt; 도 3). 이는 형질감염된 세포의 용해물에 있는 단백질의 웨스턴 블롯 검출을 용이하게 하기 위한 것이며, 돌연변이 V 단백질의 일정한 수준 및 안정성을 상대적으로 비교하기 위한 것이다. 야생형 V 단백질 발현 벡터의 개시자 메티오닌 코돈은 인플루엔자 헤마토글루티닌(HA) 에피토프 태그로 치환되었다(67). 이 변형된 V 단백질 벡터(pMV-haV-wt)는 또한 C 단백질의 발현을 방지하는 염기 치환체를 보유한다. 미니레플리콘 실험에서 pMV-haV-wt를 시험하였더니, N-말단 HA 태그는 미니레플리콘 활성을 억제하기 위한 V 단백질의 능력에 아무런 검출가능한 영향을 주지 못함이 드러났다(도 4, 레인 1-4, 데이터 비도시).
도 2에 도해되는 서열 모티프의 일부에 pMV-haV-wt로 제 1 시리즈의 돌연변이를 도입한다. 이들 돌연변이 중 하나는, 시스테인 잔기를 함유하는 독특한 V-단백질 C-말단이 결여된 절단된 V 단백질을 초래하였다(아미노산 231-299가 결실됨)(도 3, pMV-haV-1). 플라스미드 pMV-haV-2는 야생형 V 암호화 서열을 에드몬스톤 백신 서열로 전환하였다(아미노산 코돈 225; 글루타민산을 글라이신으로). 남아있는 6개 돌연변이(pMV-haV 3-8)를 CR의 일부에서 아미노산 치환하였다. 초기에, 아미노산 치환은 단백질 구조를 양적으로 변경하지 않고, V 단백질내 특정 도메인의 기능을 변경시키고자 도입되었다. 전하-대-알라닌 접근법(68, 69, 70)에 의해 제안되는 전략을 사용하여, 특정 전하를 띤 또는 극성인 아미노산 잔기인 두 개의 연속적 아미노산 코돈을 주요 표적으로 하여 알라닌을 암호화하는 코돈으로 전환시켜, 돌연 변이를 도입하였다.
본 발명이 야생형 잔기보다는 알라닌을 가진 돌연변이를 예시하였지만, 야생형 잔기의 다른 비보존 돌연변이 또한, 본 발명의 범위이다. 예를 들면, 아스파르트산은 산성(음전하를 띤) 분자이다. 따라서, 비보존 돌연변이는, 마찬가지로 산성 분자인 글루타민산보다는 다른 아미노산으로 치환되는 것일 것이다. 적당한 대안적 아미노산은 염기성(양전하를 띤) 분자인 아미노산 라이신, 히스티딘 및 아르기닌을 포함한다. 적당한 대안적 아미노산은 알라닌, 이소루신, 루신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 트립토판 및 발린과 같은 비극성 작용기를 가진 아미노산, 및 아스파라진, 시스테인, 글루타민, 글라이신, 세린, 트레오닌 및 타이로신과 같은 전하를 띠지 않은 극성 작용기를 가진 아미노산을 추가로 포함한다.
마찬가지로, 타이로신은 전하를 띠지 않은 극성 분자이다. 따라서, 비보존 돌연변이는 마찬가지로 비전하 극성 물질인, 아스파라진, 시스테인, 글루타민, 글라이신, 세린 및 트레오닌보다는 다른 아미노산으로 치환되는 것일 것이다. 적당한 대안적 아미노산은 염기성(양전하를 띤) 분자인 아미노산 라이신, 히스티딘 및 아르기닌을 포함한다. 적당한 대안적인 아미노산은 알라닌, 이소루신, 루신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 트립토판 및 발린과 같은 비전하 작용기를 가진 아미노산, 및 아스파르트산 및 글루타민산과 같은 산성(음전하를 띤) 작용기를 가진 아미노산을 추가로 포함한다.
미니레플리콘 분석에서 1 내지 8의 돌연변이 V 단백질 벡터를 분석하는 것이 도 4A에 보인다. 결과는 두 벡터(pMV-haV-1 및 pMV-haV-5)가 미니레플리콘 활성을 억제하는 데 감소된 능력을 가짐을 암시한다. 하나의 돌연변이(haV-1)는 V 단백질의 독특한 C-말단(아미노산 231-299)이 결여된 결실 돌연변이였다; 다른 하나의 돌연변이(haV-5)는 아미노산 113 및 114에서 치환된 돌연변이를 함유했다(CR2에 위치, 도 2 참조). 이는 이러한 기능이 CR2 및 C-말단에 의해 독립적으로 부분적 매개될 수 있음을 제안한다. C-말단 절단 돌연변이와 같이, CR2 돌연변이 또한 잔기 억제 활성을 보유했다.
도 4A에 있는 레인 1 및 2는 대조군 샘플을 함유했다. 레인 1에서 분석된 형질감염은 L 단백질 발현 벡터가 결여되었으며, 저수준의 백그라운드 CAT 활성을 드러내었다. 레인 2의 양성 대조군은 V 단백질의 부재하에 관찰된 최대 활성을 보여주었다. HA 태그(pMV-haV-wt)를 함유하는 200 내지 400 ng의 야생형 V 단백질 벡터에 의해 매개되는 억제가 레인 3 및 4에 보여진다. 상기 기술된 바와 같이, N-말단 HA 태그는 미니레플리콘을 억제하는 V 단백질의 능력에 거의 영향을 주지 않았으며, 이 실험에서는, 200 내지 400 ng의 haV-wt 벡터가 각각 약 7 내지 16배로 미니레플리콘 활성을 억제하였다. 200 ng의 V 단백질 벡터가 형질감염된 경우, 대부분의 돌연변이는 대조군 활성(레인 2)의 20% 미만(레인 3, 7, 9, 11, 15, 17, 19)으로 CAT 활성이 감소됨으로써, haV-wt 벡터만큼 효과적으로 CAT 활성을 억제하였다. 두 개의 V 단백질 벡터(pMV-haV-1, 레인 5 및 6; pMV-haV-5, 레인 13 및 14)는 이 실험 및 반복되는 실험에서 미니레플리콘 활성을 억제하는 데 있어 눈에 띄게 덜 효과적이었다. 플라스미드 pMA-haV-1은 시스테인-풍부 V 단백질 C-말단을 결여하였으며, 반면 pMV-haV-5은 CR2에 이중 알라닌 치환체를 함유했다(아미노산 113-114).
억제에 사용된 두 도메인은 흥미로운 특징을 가진다. C-말단은 아연-결합 도메인을 포함하고, 또한 RNA 결합 도메인을 함유한다(도 5). CR2의 아미노산 1차 구조는 컴퓨터 모델이, 전하를 띤 잔기의 작은 클러스터가 제안되는 알파 나선(잔기 114 D, 118 E, 121 K, 125 D)의 한쪽 면을 따라 배치될 수 있는지 예상하기 때문에 주목할 만 하다. 따라서, CR2는 일부 전사 인자에서 관찰되는 서열과 유사한, 잠재적인 친양쪽성 알파 나선이다(71).
CR2에 관련된 억제 활성은 또한, 이 아미노산 서열이 V 및 P 단백질 모두에 존재하기 때문에 흥미롭다. 폴리머라제 서브유닛으로서 P 단백질에 의해 필수적인 역할을 하고, 뉴클레오캡시드 조립 인자(72)는 억제에서 V 단백질의 불필수적인 역할로부터 꽤 멀다. 아직도, 이들 두 단백질은 아미노산 서열의 상당부를 공유한다. CR2는 V 및 P의 컨텍스트에서 상이하게 작용하는 단백질-단백질 상호작용의 부위일 수 있다. 이 이론에 구속되지 않고, 독특한 V 단백질의 C-말단은 V 단백질에 CR2를 노출시키는 3차 구조를 부여하는 것이 또한 가능할 수 있으며, 또한 억제 도메인(P 단백질에서 이 도메인은 격리된다)으로서 작용하도록 허용할 수도 있다.
돌연변이 haV-1 또는 haV-5에 의해 유발되는 억제의 감소가 간단히 불충분한 단백질 발현과 관련 있는지를 측정하기 위하여, 항-HA 항체를 사용하여 웨스턴 블롯을 수행하여, 형질감염된 세포내 V 단백질의 상대적인 풍부도를 측정하였다(도 4B). 이 실험을 위한 세포를 미니레플리콘 실험에서 수행한 것과 같이 정확하게 형질감염하여, 세포가 N, P 및 L 단백질 및 V 단백질을 함유하게 하였다. 태깅된 V 단백질은 2개의 음성 대조군을 제외하고 모든 형질감염된-세포 추출물에서 검출가 능하였다. 레인 1에서 분석된 추출물을 만드는 데 사용한 세포내에 V 단백질 벡터는 형질감염되지 않았으며, 레인 2에서는, 세포는 에피토프 태그를 포함하지 않는 V 단백질을 암호화하는 벡터로 형질감염되었다. 레인 3에서 검출된 단백질은 HA-태깅된 야생형 V 단백질이었다. 레인 4의 단백질은 C-말단이 결여되고, 이의 이동성이 현저하게 변경된 절단 돌연변이였다. 남아있는 단백질은 아미노산 치환체가 함유된 돌연변이(하기에 설명됨)였다(도 4B, 레인 5-11). 이들 단백질 중 몇몇은 이 12% 폴리아크릴아미드 겔에서 작지만, 눈에 띄는 이동성 변화를 가졌다(예를 들면, 레인 10 및 11). 그러나, 이는 예상가능하지 않은데, 왜냐하면 전하를 띠고 극성인 잔기를 이들 단백질내에서 알라닌으로 치환하였기 때문이다. 이 실험에서 haV-1(레인 4)가 낮은 것을 제외하고는, 모든 단백질의 상대적인 풍부도는 상당히 유사한 것으로 판단되었으며, 이는 반복되는 실험에서 재현가능하였다. 이는, haV-1의 감소된 억제 활성은 낮은 단백질 수준으로부터 유래할 수 있으며, haV-5의 감소된 억제 활성은 불안정한 단백질에 의해 유발되는 것이 아님을 제안한다.
haV-1이 단순히 불안정하기 때문에 낮은 정도로 억제되는지에 대한 가능성을 추가로 시험하기 위하여, haV-1 단백질의 세포내 양을 보충하는 것을 돕기 위해, V 단백질 벡터의 증가하는 양으로 미니레플리콘 분석을 수행하였다(도 4C). V 단백질 벡터의 최대량을 400 ng 내지 1 ㎍으로 증가시킨 것을 제외하고, 상기 언급된 바와 같이 이 미니레플리콘 실험을 수행했다. DNA의 질량은 벡터 백본 DNA(삽입체 결여)의 적당량을 포함시킴으로써, 모든 형질감염에서 일정하게 유지되었다. 도 4C, 레인 1은 V 단백질 벡터를 첨가하지 않고 수행된 양성 대조군이었다. 레인 2 및 3은 100(레인 2) 및 400(레인 3) ng에서 야생형 ha-V 벡터를 첨가하는 효과를 보이며, 이 실험에서, 이는 각각 58 내지 26% 활성을 감소시켰다. 증가하는 양의 haV-1의 첨가는 MV-CAT의 활성에 거의 영향을 주지 않으며, 억제의 증가되는 수준과 haV-1의 증가하는 질량에 대한 상관관계에 대한 뚜렷한 성향은 관찰되지 않았다. 이는, haV-1의 감소된 억제 활성이 단순히 감소되는 세포내 단백질 수준에 기인하지 않으며, 대신에 C-말단의 손실의 효과에 기인함을 제안한다.
SV5 V 단백질의 N-말단 세 번째 염기성 아미노산의 고함량을 함유하는 영역은 RNA 결합을 매개한다(73). 상동성인 영역은 홍역 바이러스 V 단백질내에서는 명확하지 않으나(73), 홍역 바이러스 V 단백질이 또한, C-말단에 징크 핑거와 피슷한 서열을 통해 RNA와 결합할 수 있는지에 대한 가능성을 시험하였다(도 5).
V 단백질의 RNA 결합 활성을 평가하기 위하여, 폴리리보뉴클레오타이드 단일중합체 결합 분석을 사용하였으며(도 5), 이는 세포성 RNA 결합 단백질 일부를 연구하는 데 성공적으로 사용된 바 있다(74-77). 다수의 RNA 결합 단백질은 폴리리보뉴클레오타이드 단일중합체에 친화적인 특징을 보인다. 예를 들면, 세포성 hnRNP U 단백질은 폴리(G) 및 폴리(U)에 비교적 강한 친화성으로 결합하지만, 폴리(A) 또는 폴리(C)에 대해서는 거의 결합하지 않는다. 이 개념은 형질감염된 세포 추출물에서의 V 단백질이 단일중합체 수지 상에 포획될 수 있는지를 측정하는 데 사용된다. 세포를 미니레플리콘 형질감염에 사용된 모든 발현 벡터(N, P, L, V 및 미니레플리콘)로 형질감염시킨 다음, MVA/T7로 감염시킨다. 세포질 세포 용해물을 48시간 후에 제조하고, 30-60분간 4℃에서 4개의 폴리뉴클레오타이드 단일중합체 중 하나와 연결된 아가로스 비드와 함께 배양한다. 비드를 원심분리하여 수집한 다음, 재현탁하고, 세포 용해 완충액으로 3회 세척한다. 결합된 단백질을 SDS-겔 로딩 완충액으로 끓여서 비드로부터 용리시킨다.
초기에, 분석을 위하여, 형질감염된 플라스미드로부터 발현된 알려진 RNA 결합 단백질의 포획능을 시험하였다. 따라서, 4개의 상이한 수지로부터 용리된 단백질을 N 단백질에 특이적인 모노클로날 항원을 사용하여 웨스턴 블롯으로 분석하였다(도 5B). 폴리(G) 및 폴리(U)에 결합한 샘플내 N 단백질은 쉽게 검출가능하였다(레인 2 및 4). 폴리(G)에 결합한 N 단백질의 양은 이 분석 및 몇 가지 반복되는 실험에서 일반적으로 증가하였다. 폴리(A) 또는 폴리(G)로는 N 단백질은 거의 포획되지 않거나, 아예 포획되지 않았다.
단일중합체 수지와 상호작용하는 haV의 능력을 분석하기 위하여 상기 기술된바와 같이 실험을 반복하였다(도 5B, 레인 5-8). 항-HA 항체로 웨스턴 블롯 분석한 것은 N 단백질의 분석 후에 수득된 결과와 유사하였다(도 5B, 레인 1-4). 폴리(G) 및 폴리(U) 수지 모두는 haV에 친화성을 보였다(레인 6 및 8). 폴리(G)에 가장 잘 결합한 V 단백질은 폴리(U)에 대해서는 더욱 약하게 결합한 반면, 폴리(A) 또는 폴리(C)에 대해서는 잘 결합하지 못했다. 일부 실험에서는, 매우 약한 밴드가 관찰되었는데, 이는 폴리(A)와의 낮은 친화도를 의미하는 것이나, 이 상호작용은 보통 검출 불가능하다.
V 단백질이 폴리(G) 및 폴리(U)에 쉽게 결합하고, 폴리(A) 및 폴리(C)에 대해서는 그렇지 못하는 사실은, 분석이 단순히 다중음이온 수지에 대한 친화성을 측 정하는 것뿐만 아니라, 또한, V 단백질의 2개의 폴리뉴클레오타이드에 대한 선호도를 증명하는 것을 나타내기도 한다. V 및 N 단백질 모두는 폴리(G) 및 폴리(U)를 선호하며; 이는 세포성 RNA 결합 단백질의 수에 의해 보여지는 특징이다(74, 76, 77).
haV 단백질의 결합 프로파일은 V 단백질이 N 단백질과의 상호작용을 통해 폴리(G) 및 폴리(U) 수지에 간접적으로 포획되는 가능성을 증가시키는 N 단백질과 꽤 유사하다는 사실은, RNA와의 상호작용을 지시한다. 이 가능성을 시험하기 위하여, 세포를 haV 단백질 발현 벡터로 형질감염시키고, 세포 추출물울 제조하며 상기 제조된 바와 같이 처리했다. 웨스턴 블롯에 의한 분석은 haV 단백질(도 5B, 레인 9-12)이 다시 폴리(G) 및 폴리(U)에 결합했음을 보여주었다. 이는 단일중합체 수지와 V 단백질의 상호작용은 다른 바이러스 단백질을 필요로 하지 않는다는 것을 의미한다. 사실, 다른 바이러스 단백질의 부재시에는, V 단백질의 훨씬 많은 양이 보통 폴리(G) 및 폴리(U)에 결합한다(레인 6 내지 10 및 8 내지 12에 비해). 이는 다른 바이러스 단백질 중 하나가 V 단백질과 폴리리보뉴클레오타이드 간의 상호작용을 약간 방해할 수도 있다는 것을 제안한다.
haV의 폴리(G) 결합에 영향을 미치는 조건의 한정된 분석을 또한 수행하였다(도 5B, 레인 13-16). 결합 반응에 10 mM EGTA나 EDTA를 첨가하면(레인 14 및 15), 폴리(G)에 결합하는 V 단백질의 양이 줄어든다. 효모 RNA 경쟁자(레인 16)를 결합 반응에 첨가하면(25 ㎍/ml), 결합에는 거의 영향을 미치지 않는다. 그러나, 이는 특별히 놀랍지 않은데, 왜냐하면 체포질 추출물이 이미 상당한 양의 세 포질 RNA를 함유하고 있으며, 효모 RNA의 첨가는 유사하게 거의 영향을 주지 않기 때문이다. 이들 결과는 폴리(G)에 대한 V 단백질의 결합은 2가 양이온에 의해 자극되고, 또한 비특이적 RNA(효모 RNA)는 수지에 결합된 V 단백질의 양을 감소시키지 않는 것으로 보아, 비교적 특이적인 상호작용이라는 것을 제안한다.
RNA 결합이 미니레플리콘 활성을 억제할 수 있는 능력과 관련있는지를 측정하기 위하여, haV 단백질 돌연변이의 RNA 결합 활성을 분석하는 데 폴리(G) 결합분석이 다음에 사용되었다. haV 단백질 돌연변이(도 3)는 다른 바이러스 단백질 없이도 세포내에서 발현되었다. 조 세포질 추출물을 제조하고, 상기와 같이 폴리(G) 수지에 결합시켰으며, 결합된 단백질을 웨스턴 블롯으로 분석하였다(도 6). 이미 보인 바와 같이, haV는 폴리(G)에 의해 포획되고, 웨스턴 블롯(레인 2) 상의 항-HA 항체에 의해 검출되며(레인 2), 반면 HA-태그 없이 V 단백질을 함유하는 샘플(레인 1)은 백그라운드 시그널을 생성하지 않았다. 돌연변이 단백질의 분석은, 대부분의 V 단백질(레인 4-13)에 대한 폴리(G) 결합 활성과 유사한 수준을 드러내었다. 돌연변이 haV1-은 제외되었다. 이 돌연변이 단백질의 매우 낮은 수준만이 폴리(G)에 결합하였다. 이는, 이 단백질이 결합에 결손임을 명백히 나타내었다(레인 3). haV-1에 의한 결합의 낮지만, 검출가능한 수준은, RNA 결합 활성이 실질적으로 감소되었지만, 전체적으로 제거된 것은 아니라는 것을 말한다. 이들 결과는, RNA 결합 활성을 보유한 돌연변이 대부분은 거의 야생형 haV와 동등함을 증명한다. 미니레플리콘 억제(haV-5)에 결손인 2개 돌연변이 중 하나는 폴리(G) 및 야생형 haV에 결합한 반면, 다른 돌연변이(haV-1)는 상당히 감소된 폴리(G) 결합 활성을 보였다. 이는, 미 니레플리콘 억제와 V 단백질의 독특한 C-말단에 의해 매개되는 RNA 결합 활성 간에는 상관관계가 있을 수 있음을 제안한다. 다시, 이는 홍역 바이러스 유전자 발현 및 복제에서 V 단백질 RNA 결합 활성이 조절 역할을 담당함을 제안한다.
V 단백질과 관련된 RNA 결합 활성과 미니레플리콘 억제 간의 잠재적인 연관은, C-말단 시스테인-풍부 영역이 결여된 V 단백질 돌연변이가 RNA와 잘 결합하지 않고, 덜 효과적인 미니레플리콘 억제자였다는 결과로부터 추론해낼 수 있다.
다른 실험에서, 미니레플리콘 억제는 V 단백질이 N 단백질과 결합할 수 있는 능력과 관련있지 않음을 보여주었다. V-N 단백질 복합체의 형성은 V-단백질-매개 미니레플리콘 억제에 필수적이지는 않다; V 단백질 돌연변이 haV-9 및 haV-11(도 3)은 N 단백질과 상호작용하는 데는 실패하였으나, 완전한 억제 활성을 보유했다(데이터는 비도시).
V 단백질 돌연변이의 분석은, 고친화성 RNA 결합을 위해 C-말단이 요구됨을 제안하였다. 아연-결합 도메인(51)을 포함하는 이 영역의 결실은, 폴리(G) 수지 상에 수집될 수 있는 단백질을 양을 크게 감소시키나, 모든 결합을 완전히 제거하지는 않는다. 이는, V 단백질내에 제 2의 약한 RNA 결합 도메인이 있음을 추측케 한다. 하기에 구속되지 않고, C-말단내 징크 핑거와 비슷한 도메인이 핵산 결합 도메인의 중요한 일 성분을 형성하고, V 단백질내 제 2 도메인이 C-말단과 협동하여, 고친화 결합 부위를 만들어내는 매력적인 가능성이 있다.
이들 RNA 결합 연구는 또한, V 단백질이 조 세포 추출물에 존재하는 추가의 바이러스 단백질 없이 RNA와 상호작용할 수 있음을 보여주었다. 이는 V 단백질이 직접적으로 RNA에 결합함을 제안한다. 이 결론은 완벽하지 않은데, 왜냐하면 여전히 V 단백질이 RNA에의 결합을 담당하는 세포 단백질과 상호작용할 수 있는 가능성이 남아있기 때문이다. 만약 이 모델이 사실이라면, 데이터는, C-말단이 세포내 인자와 상호작용을 담당하는 단백질-단백질 상호작용을 매개할 수 있음을 지적한다. 정제된 재조합 V 단백질은 V 단백질이 직접적으로 RNA에 결합하는 지 아닌지 추가로 시험하기 위하여 중요할 수 있다.
돌연변이 haV-5 단백질이 미니레플리콘 억제에 결손이긴 하지만(도 4), 이는 RNA(도 6) 및 야생형 단백질에 결합할 수 있다. 따라서, CR2에 관련된 미니레플리콘 억제 활성은 다른 2개의 분석된 활성과 쉽게 관련지을 수 없다(RNA 결합 및 N 단백질과의 상호작용). CR2에 대해서, 억제 모티프로서 효과적으로 기능하기 위하여, V 단백질의 C-말단내에 완전한 RNA 결합 도메인을 요구할 것이다. V 단백질은 일부 RNA 폴리머라제 II 전사 인자와 유사할 수 있고, 모듈 구조를 가진다(78).
CR2가 억제에 직접적으로 관여하는 가능성을 더욱 자세히 시험하기 위하여, 이 도메인(아미노산 112-134)을 결실시켜 haV-23(도 7; 서열번호 9)을 만들었다. 놀랍게도, 이 결실은 억제 활성에 매우 영향을 미치지 못하였다(도 8). CR2가 결실되었지만 억제를 달성하지 않았다는 사실은 CR2가 억제에 활성적으로 참여하는 도메인을 함유하지 않는다는 것에 반대이다. 대신, haV-5에서 발견되는 아미노산 113+114의 치환에 의해 유발된 결손은(도 7 및 8) 지배적-음성 효과를 만들어낸다(이전의 웨스턴 블롯 분석은, 억제의 결손은 haV-5에 의해 즉시 유발되지 않음을 나타낸다).
이론에 구속되지 않고, haV-5내 YD 내지 AA 치환은 부분적으로 억제 활성을 방해하는 V 단백질의 3차 구조내 포착하기 힘든 변경을 생성시킨다. 대안적으로, V 단백질 및 다른 바이러스 단백질 또는 세포질 단백질 간의 상호작용이 일어날 수 있다. 이중 알라닌 치환은 억제 활성을 억제하거나, 비활성 단백질 복합체에서의 V 단백질을 격리시키는 단백질-단백질 상호작용을 일으킬 수 있다.
약한 억제 표현형이 이중 알라닌 치환에 의해 발생하는 지배적-음성 효과에 의해 유발된다는 개념을 haV-5(도 7)에서 발견되는 돌연변이와 매우 유사하지만 동떨어진 추가의 아미노산 치환을 만들어서, 추가로 시험하였다. haV-5내 본래 YD를 AA로 치환하는 것은 CR2의 아미노 경계에 위치한 VYDH로 이루어지는 잘 보존된 모티프에서 공학처리 하였다(도 2). 이 모티프는 홍역 바이러스, 개 디스템퍼 바이러스, 린더페스트 바이러스 및 돌고래 모빌리바이러스로부터의 V 단백질 서열과 동일했다. 돌연변이 haV-24(서열번호 10)에서, VYDH 서열은 VYAA로 전환되었으며, 돌연변이 haV-25(서열번호 11)에서, VYDH는 VAAA로 전환되었다. 이들 돌연변이 모두는 MV 미니레플리콘 유전자 발현을 억제하였으며, 야생형 haV 단백질도 억제하였다(도 8). 이는 haV-5 결손이 VYDH 및 VAAH 치환에 매우 특이적임을 암시한다.
C-말단 징크-핑거와 같은 도메인이 억제의 역할을 담당하는 가능성을 C-말단에 한 쌍의 시스테인 잔기로 아미노산 치환을 도입함으로써 추가로 시험하였다(도 9). 돌연변이 haV-12(서열번호 14)는 시스테인 잔기 1 및 2(아미노산 251 및 255)가 알라닌으로 전환되어 생성되었다. 유사하게, 돌연변이 haV-13(서열번호 15)은 C-말단 시스테인 잔기 4 및 5(아미노산 269 및 272)를 알라닌으로 치환하여 생성되 었다. C-말단에서의 징크-핑거와 같은 구조를 상당히 바꾸고, 억제 활성에서의 쉽게 검출가능한 변경을 생성할 것으로 예상되는 한 쌍으로 시스테인 잔기를 돌연변이시켰다.
놀랍게도, 이들 돌연변이체의 CAT 활성 연구(도 10)는 시스테인 치환체에 의해 단지 약간만 영향받았음을 보여주었다; haV-12 및 haV-13 모두는 야생형 haV 단백질 억제 활성의 상당한 비율을 보유하였다(야생형의 약 65%). 이 결과는 다소 예상외였다; 아연-코디네이팅 시스테인 잔기의 치환은 억제를 파괴할 것이라고 예상되었기 때문이다. 가능하게는, 7개 시스테인 잔기 중 단지 2개의 치환은 추정상의 징크-핑거 핵산 결합 구조를 완전히 방해하지 못한다. 대안적으로, 추정상의 징크-핑거 모티프는 이전에 예상되었던 것보다 억제에서 덜 주도적인 역할을 하는 것이 가능하다. 따라서, 2개의 추가 시리즈의 돌연변이를 억제에서의 C-말단의 역할을 추가로 시험하기 위해서 제조하였다.
한 세트의 돌연변이에서, 점점 커지는 결실을 C-말단의 시작부터 만들었다(haV-14 내지 haV-19; 서열번호 16-21). 가장 작은 결실(haV-14)은 C-말단으로부터 21개 아미노산을 제거한 반면에, 가장 큰 결실(haV-19)은 71 아미노산 잔기를 제거하였다. 돌연변이 haV-19는 haV-1과 거의 동일하더라도 작제하였는데(도 9; 서열번호 13), 왜냐하면, haV-19에서의 결실은 아미노산 229-234 사이에 위치한 작은 염기성 모티프의 일부인 몇개의 추가의 아미노산을 제거하였기 때문이며, haV-19의 표현형은 haV-1으로 나타내어지는 돌연변이 표현형의 확인에 의해 가시화될 수 있다.
미니레플리콘 분석에서 C-말단 돌연변이의 분석은, 큰 결실 돌연변이(haV-1 및 haV-19)는 유사하게 행동한다는 것을 드러냈다; 이들은 야생형 haV에 의해 유도되는 5-8배 억제 대신에, 단지 약 2 미만의 미니레플리콘 유전자 활성을 억제한다(도 10). 흥미롭게도, 큰 결실에 의해 보여지는 감소된 억제 활성은 더욱 작은 절단 돌연변이 모두에 의해 재현된다. 가장 작은 C-말단 결실(haV-14) 조차도 약 2배로 억제된 V 단백질을 초래하였다. 이 결과는 끝쪽 C-말단의 완전한 상태는 완전한 억제 활성에 필수적임을 의미한다.
C-말단 결실 돌연변이의 효과를 분석하는 것 이외에도, 독특한 V 단백질 C-말단의 시작에 있는 염기성 모티프(KKGHRR; 아미노산 229-237, 서열번호 12)가 억제에서 동일한 역할을 하는 가능성을 시험하기 위하여, 몇 개의 추가 돌연변이를 만들었다. 두 개의 아르기닌 잔기를 알라닌(haV-20, 서열번호 22) 또는 아스파르트산(haV-21; 서열번호 23)으로 전환한 것은, C-말단 결실 돌연변이와 유사한 효과를 가졌다. 두개의 치환 돌연변이는 평균 약 1.5 내지 3배로 미니레플리콘 발현을 억제한 반면, 야생형 V 단백질 억제는 보통 5 내지 8배 범위였다(도 10). 이들 결과는 추정상의 염기성 모티프 또한 정상적인 V 단백질 억제 기능을 방해함을 의미한다.
이 결과를 C-말단 전체의 잔여분을 남기고, 염기성 모티프를 결실시켜(도 9, haV-22, 서열번호 24) 추가로 시험하였다. 놀랍게도, 하나의 예비 실험은, 염기성 모티프의 결실은 억제 활성에 그다지 영향을 주지 않음을 나타내었다; haV-22는 약 9배로 CAT 활성을 억제하였다(도 10). 종합하면, 이들 결과는 염기성 모티프내 아 미노산 치환은 단백질 3차 구조의 바람직하지 않은 변화를 유발함으로써 가능하게는 억제 활성에 지배적-음성 효과를 줌을 제안한다. 반면, 염기성 모티프의 결실은 미니레플리콘 유전자 활성을 억제하기 위한 V 단백질의 능력을 거의 변화시키지 않는다.
홍역 바이러스 V 단백질 레플리콘 억제의 메커니즘은 알려져 있지 않다. 결과는, 메커니즘이 N 단백질과의 상호작용을 요구하지는 않지만, RNA와의 상호작용은 포함함을 제안한다. RNA 결합은 다수의 상이한 메커니즘을 통해 미니레플리콘 분석에서 감소된 CAT 수준을 초래할 수 있다. 예를 들면, RNA 결합 활성은 V 단백질이 바이러스 mRNA에 결합하는 경우 해독을 억제할 수 있다. V 단백질은 또한 이것이 초기 바이러스 RNA와 결합하는 경우에 캡시드화의 속도에 영향을 줄 수 있으며, N 단백질과 RNA의 결합을 방지할 수 있다. 역으로, 이는 뉴클레오캡시드 조립을 다소간 자극할 수 있어서, mRNA의 소비에서 게놈-길이 RNA를 과다생산할 수 있도록 미니레플리콘 시스템을 강제할 수 있다. V 단백질은 또한 프로모터에서 또는 그 근처에서 결합하여 전사를 억제하는 전사 인자에 대한 유사체로서 기대될 수 있다. V 단백질이 전사 인자의 유사체인 경우, 이는 게놈 합성 및 mRNA 합성의 균형을 스위칭하는 조절자일 수 있다.
V 단백질 기능의 분석은 면역원성 조성물에 사용되기 위한 후보 모빌리바이러스 스트레인에 감쇠 돌연변이를 도입하기 위한 기초를 제공한다. 공개된 연구들은, V 단백질 발현의 제거가 감쇠된 바이러스 복제를 초래함을 보여왔다(19, 22, 23, 26-29). 감쇠의 정도를 다양화하는 것은 발현을 제거한다기 보다는, V 단백질 의 특이적 도메인에 아미노산 치환을 표적화함으로써 도입할 수 있다. 예를 들면, V 단백질 억제 기능의 부분적인 손실은 독특한 C-말단내 1 이상의 시스테인 잔기의 돌연변이에 의해 달성된다. P 단백질에 대해 많은 영향을 끼치지 않고, V 단백질에 영향을 주는 경우에, CR2내 알라닌 치환과 같은, P 및 V에 의해 공유되는 영역내 치환이 적당하다. 이들 돌연변이는 당해 업계에 기술된 바와 같이(18, 79, 80, 81), "레스큐"에 대한 역 유전자 시스템을 사용하여 평가된다.
네이키드 게놈 RNA는 전사 및 복제를 위한 주형으로서 작용할 수 없기 때문에, 본 발명의 돌연변이를 함유하는 감염성 모빌리바이러스를 생성하는 데는 역 유전자 시스템을 사용하여야 한다. 대신에, 이들 게놈 서열은, 뉴클레오캡시드 구조로 N 단백질이 완전히 캡슐화되는 경우에만 오직 인지된다. 이는 게놈 및 안티게놈 말단 프로모터 서열은 전사 또는 복제 경로를 개시하기 위해 인지된다는 맥락에서만 오직 그러하다.
네거티브-센스, 싱글-스트랜드 RNA 바이러스 게놈의 전사 및 복제는 리보핵단백질 코어(뉴클레오캡시드) 상에 작용하는 다량체 단백질의 효소 활성을 통해 달성된다. 모든 모빌리바이러스는 이들 경로로 진행되기 위해, 3개의 바이러스 단백질, N, P 및 L을 요구한다.
본원에 기술된 돌연변이는 부위-지향성 돌연변이유발을 사용하여 모빌리바이러스 스트레인에 도입된다. 본원에 기술된 바와 같이, 1 이상의 돌연변이가 모빌리바이러스 스트레인에 도입된다. 상이한 돌연변이의 조합의 누적 효과가 평가될 수 있다.
본 발명은 미니레플리콘 시스템으로 예시되었다. CR2 및 모빌리바이러스의 V 단백질의 C-말단을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열(및 홍역 바이러스의 프로모터 영역 및 L 단백질, N, P 및/또는 C 단백질 및/또는 F 유전자-말단 시그널)의 변화는, 당해 업계에 알려진 기술을 사용하여 전체 길이 바이러스에 쉽게 삽입할 수 있다. 돌연변이는 표준 재조합 DNA 방법에 의해 바이러스 게놈의 DNA 카피에 도입된다. 이는 야생형 또는 변형된 바이러스 게놈 백그라운드일 수 있으며, 그리하여 새로운 바이러스를 만들어낸다. 이들 돌연변이를 함유하는 감염성 클론 또는 입자를 cDNA 레스큐 시스템을 사용하여 만들었으며, 이는 센다이 바이러스(82); 홍역 바이러스(83, 88); 호흡기 합포체 바이러스(84); PIV-3(85); 광견병(86); 소수포성구내염 바이러스(VSV)(87); 및 린더페스트 바이러스(89)를 포함하는 다양한 네거티브-센스 RNA 바이러스에 적용되어 왔다(이들 참조문헌은 본원에 참조로 인용된다).
간단하게 말해서, 모든 모빌리바이러스 레스큐 시스템은 하기와 같이 요약할 수 있다: 각각은 적당한 DNA-의존 RNA 폴리머라제 프로모터(예를 들면, T7 RNA 폴리머라제 프로모터) 및 자가-절단 리보자임 서열(예를 들면, 간염 델타 리보자임) 사이에 위치한 전체 바이러스 게놈의 클로닝된 DNA 등가물을 요구하며, 이는 적당한 박테리아 플라스미드에 삽입된다. 이 전사 벡터는 RNA 폴리머라제(예를 들면, T7 RNA 폴리머라제)가 정확히, 또는 거의 정확히 5' 및 3' 말단으로 바이러스 안티게놈(또는 게놈)의 싱글-스트랜드 RNA 카피를 그대로 전사할 수 있는, 쉽게 다룰 수 있는 DNA 주형을 제공한다. 바이러스 게놈 DNA 카피 및 플랭킹 프로모터 및 리보자임 서열의 방향은 안티게놈 RNA 등가물이 전사될 것인지, 아니면 게놈 RNA 등 가물이 전사될 것인지를 결정한다. 또한, 새로운 바이러스 자손의 레스큐에 요구되는 것은, 네이키드, 싱글-스트랜드 바이러스 안티게놈 또는 게놈 RNA 전사체를 기능적인 뉴클레오캡시드 주형으로 캡시드화하는 데 필요한 바이러스-특이적 트랜스-작용 단백질이다: 바이러스 뉴클레오캡시드(N) 단백질, 폴리머라제-관련 인단백질(P) 및 폴리머라제(L) 단백질. 이들 단백질은 전사 및 복제를 달성하기 위하여 이 뉴클레오캡시드 주형을 인게이징 해야 하는 활성 바이러스 RNA-의존 RNA 폴리머라제를 포함한다.
일부 또는 모두의 요구되는 트랜스-작용 단백질은 이들 바이러스-특이적 유전자 및 유전자 산물이 안정한 전사체로서 함유되고 발현되도록, 엔지니어링된 포유류 세포에서 생산될 수 있지만, 전형적으로, 이들 바이러스 트랜스-작용 단백질은 요구되는 단백질을 암호화하는 1 이상의 플라스미드 발현 벡터로부터 만들어진다.
레스큐를 위한 전형적인(반드시 배제하지는 않는다) 환경은 T7 폴리머라제가 바이러스 게놈 cDNA-함유 전사 벡터로부터 안티게놈(또는 게놈) 싱글-스트랜드 RNA를 전사하도록, 존재하는 적당한 포유류 세포를 포함한다. 동시에 전사되거나 또는 잠시 후에, 이 바이러스 안티게놈(또는 게놈) RNA 전사체는 뉴클레오캡시드 단백질에 의해 기능성 주형으로 캡시드화되고, 요구되는 바이러스-특이적 트랜스-작용 단백질을 암호화하는 공-형질감염된 발현 플라스미드로부터 동시에 생산되는 폴리머라제 성분에 의해 인게이징된다. 이들 사건 및 과정은 바이러스 mRNA의 필수적인 전사, 새로운 게놈의 복제 및 증폭 및, 따라서, 새로운 바이러스 자손, 즉, 레스큐 의 생산을 유도한다.
비-모빌리바이러스인 광견병 바이러스, VSV 및 센다이의 레스큐를 위해, T7 폴리머라제가 재조합 백시니아 바이러스 VTF7-3에 의해 제공된다. 이 시스템은 그러나, 물리적 또는 생화학적 수단에 의해, 또는 폭스바이러스에 대해 좋은 숙주이지 않은 세포 또는 조직내에 반복되는 통과에 의해 백시니아 바이러스로부터 레스큐된 바이러스가 분리되어야 하는 것을 요구한다. 홍역 바이러스 cDNA 레스큐(및 다른 모빌리바이러스에 관해서도 예상됨)를 위해서, T7 폴리머라제 및, 바이러스 N 및 P 단백질을 발현하는 세포주를 생성함으로써 이 요구를 피한다. 레스큐는 게놈 발현 벡터 및 L 유전자 발현 벡터를 헬퍼 세포주로 형질감염시킴으로써 달성된다. T7 RNA 폴리머라제를 발현하지만, 포유류 세포에서는 거의 또는 아예 감염성 자손을 생산하지 않는 백시니아 바이러스, MVA-T7의 숙주-범위 돌연변이의 이점은, 홍역 바이러스 및 다른 모빌리바이러스를 레스큐하는 데 이용할 수 있다는 것이다. 필수적인 캡시드화 단백질의 동시 발현 후에, 합성된 전체 길이 안티게놈 바이러스 RNA는 캡시드화되고, 복제되며 바이러스 폴리머라제 단백질에 의해 전사되며, 복제된 게놈은 감염성 비리온으로 포장된다. 이러한 안티게놈 외에도, 게놈 유사체가 본원에 이르러 성공적으로 센다이 및 PIV-3에 대해 레스큐되었다(85, 90).
레스큐 시스템은 따라서, 모빌리바이러스의 게놈 또는 안티게놈을 암호화하는 분리된 핵산 분자를 포함하는 전사 벡터를 포함하는 조성물을 제공한다. 핵산 분자는 홍역 바이러스 V 단백질의 아미노산 112-134에 상응하는 영역내 적어도 하나의 돌연변이(및, 임의로는, 본원에 기술된 다른 돌연변이)와, 캡시드화, 전사 및 복제에 필요한 트랜스-작용 단백질(예를 들면, 모빌리바이러스에 대해서 N, P 및 L)을 암호화하는 적어도 하나의 분리된 핵산 분자를 포함하는 적어도 하나의 발현 벡터를 함유한다. 이어서 숙주 세포를 방금 기술한 적어도 2개의 발현 벡터로 형질전환, 감염 또는 형질감염시킨다. 감염성인 변형된 바이러스가 생산되도록, 이들 벡터의 공-발현을 허용하는 조건 하에 숙주세포를 배양한다.
레스큐된 감염성 바이러스를 이어서 시험관내 수단에 의해 처음으로, 이의 원하는 표현형에 대해 시험한다(V 단백질에 의해 감소된 억제, 온도 민감성, 저온 적응성, 플라크 형태, 및 전사 및 복제 감쇠). 홍역 바이러스의 N, P 또는 C 유전자 또는 F 유전자-말단 시그널의 돌연변이를 또한, 요구되는 트랜스-작용 캡시드하 및 폴리머라제 활성이 야생형 또는 백신 헬퍼 바이러스에 의해, 또는 유전자-특이적 감쇠 돌연변이를 가지는 N, P 및 상이한 L 유전자를 발현하는 플라스미드에 의해 제공되는 미니레플리콘 시스템을 사용하여 시험했다(63, 83).
레스큐된 바이러스의 감쇠된 표현형이 존재하는 경우, 적당한 동물 모델을 사용하여 챌린지 실험을 수행하였다. 비-인간 영장류는 인간 질병의 병원성에 대한 바람직한 동물 모델을 제공한다. 이들 영장류는 우선 감쇠되고, 재조합으로 만들어진 바이러스로 면역화된 다음, 바이러스의 야생형 형태로 챌린지된다. 원숭이는 비강내, 기관지내 또는 피하 주사의 접종을 포함하지만, 이에 한정되지는 않는 다양한 경로로 감염된다(91). 실험적으로 감염된 붉은털 원숭이 및 시노모거스 마카크는 홍역에 대한 백신-유도 보호의 연구용 동물 모델로서 또한 기여한다(92).
보호는 질병 징후 및 증상, 생존, 바이러스 쉐딩 및 항원 역가와 같은 기준 에 의해 측정된다. 목적하는 기준을 만족하는 경우, 재조합으로 생성된 바이러스는 인간에서 시험하기 위한 유용한 후보 백신 또는 면역원성 조성물로 간주된다. "레스큐된" 바이러스는 "재조합으로 생성된" 것으로 간주되며, 바이러스의 자손 및 후대도 마찬가지로, 또한 돌연변이를 함유한다.
"레스큐된" 바이러스가 백신 용도를 위한 최적 수준에 비해 낮게 감쇠되거나 과도하게 감쇠된 경우에도 심지어, 이는 이러한 최적 스트레인을 개발하기 위해 유용한 정보이다.
최적으로는, 포인트 돌연변이를 함유하는 코돈은 단지 포인트 돌연변이만을 함유하는 코돈에 의해 암호화된 아미노산을 변화시키지 않고 코돈내에서 2차 또는 2차+3차 돌연변이를 도입함으로써 안정화할 수 있다. 안정화된 돌연변이를 함유하는 감염성 바이러스 클론은 또한 상기 기술한 cDNA "레스큐" 시스템을 사용하여 발생된다.
본원에 참조로 인용되는 공개된 국제 특허 출원 WO98/13501(93)에서 이미, 3' 게놈 프로모터 영역에서 적어도 하나의 감소된 돌연변이 및 RNA 폴리머라제내 적어도 하나의 감쇠된 돌연변이를 갖는 다른 모노네가비랄(홍역 바이러스와 같은) 목의 재조합으로 생성되고, 감쇠된, 비분절, 네거티브-센스, 싱글-스트랜드 RNA 바이러스의 생성 및 분리가 기술되었다.
구체적으로, 이 돌연변이는 하기로 구성된다:
(1) 뉴클레오타이드 26(A→T), 뉴클레오타이드 42(A→T 또는 A→C) 및 뉴클레오타이드 96(G→A)으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 3' 게놈 프로모터 영역내 적어도 하나의 감쇠 돌연변이(여기에서 이들 뉴클레오타이드는 포지티브 스트랜드, 안티게놈, 메시지 센스에 존재한다);
(2) 잔기 331(이소루신→트레오닌), 1409(알라닌→트레오닌), 1624(트레오닌→알라닌), 1649(아르기닌→메티오닌), 1717(아스파르트산→알라닌), 1936(히스티딘→타이로신), 2074(글루타민→아르기닌) 및 2114(아르기닌→라이신)으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 아미노산 내에서 변화를 발생시키는 뉴클레오타이드 변화로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 RNA 폴리머라제에서의 적어도 하나의 감쇠 돌연변이.
또한, 본원에 참조로 인용되는 공개된 국제 특허 출원 WO99/49017(94)은 N, P 또는 C 유전자 또는 F 유전자-말단 시그널에서 적어도 하나의 감쇠 돌연변이를 갖는, 재조합으로 생성되고, 감쇠된 홍역 바이러스의 생성 및 분리를 기술하였다.
구체적으로, 이들 돌연변이는 하기로 이루어진다:
(1) N 유전자에 대해서, 잔기 129(글루타민→라이신), 148(글루타민산→글라이신) 및 479(세린→트레오닌)로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 아미노산내 변화를 발생시키는 뉴클레오타이드 변화로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 적어도 하나의 감쇠 돌연변이;
(2) P 유전자에 대해서, 잔기 225(글루타민산→글라이신), 275(시스테인→타이로신) 및 439(루신→프롤린)로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 아미노산내 변화를 발생시키는 뉴클레오타이드 변화로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 적어도 하나의 감쇠 돌연변이;
(3) C 유전자에 대해서, 잔기 73(알라닌→발린), 104(메티오닌→트레오닌) 및 134(세린→타이로신)로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 아미노산내 변화를 발생시키는 뉴클레오타이드 변화로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 적어도 하나의 감쇠 돌연변이;
(4) F 유전자-말단 시그널(시스-작용 전사 말단 시그널)에 대해서, 뉴클레오타이드 7243에서의 변화(T→C)(여기에서, 뉴클레오타이드는 포지티브 스트랜드, 안티게놈, 즉, 메시지(암호) 센스에 존재한다).
V 단백질의 아미노산 112-134에 상응하는 영역내 적어도 하나의 돌연변이, 및 아미노산 112-134에서의 돌연변이 모두를 함유하는 것, 및 아미노산 231에서 시작하는 C-말단 영역의 적어도 일부의 돌연변이 및 결실을 포함하는, 이들 셋트의 돌연변이 중 하나 또는 모두로부터의 감쇠 돌연변이의 개별 또는 조합을 본 발명의 모빌리바이러스에 도입할 수 있다.
본 발명의 바이러스는 백신 또는 면역원성 조성물을 제형하는 데 사용될 수 있다. 이를 위해서, 바이러스를 적절한 농도로 맞추고, 임의의 적당한 보조제, 희석제 또는 담체와 함께 제형한다. 생리학적으로 허용되는 매질은 담체 및/또는 희석제로서 사용될 수 있다. 이들은 물, 적당한 등장성 매질, 글리세롤, 에탄올 및 다른 통상의 용매, 인산 완충 식염수 등을 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. 적당한 보조제는 알루미늄 포스페이트, 알루미늄 하이드록사이드, MPLTM(3-O-탈아실화 모노포스포릴 리피드 A; RIBI ImmunoChem Research, Inc., Hamilton, MT, now Corixa), 529(Corixa)같은 합성 리피드 A 유사체, StimulonTM QS-21(Aquila Biopharmaceuticals, Framingham, MA) 및 IL-12(Genetics Institute, Cambridge, MA)를 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명의 일 양태에서, 모빌리바이러스를 포함하는 제형물은 백신 또는 면역원성 조성물로서 사용되기 위한 것이다. 바이러스는 저온보호 첨가제 또는, 단백질(예를 들면, 알부민, 젤라틴), 당(예를 들면, 수크로스, 락토스, 소르비톨), 아미노산(예를 들면, 나트륨 글루타메이트), 식염수와 같은 안정제, 또는 다른 보호제와 혼합될 수 있다. 이 혼합물은 액체 상태로 유지되거나, 또는 이어서 수송 및 저장을 위해 건조 또는 동결되어 적용 직전에 물과 혼합한다.
본 발명의 모빌리바이러스를 포함하는 제형물은 바이러스의 야생형 카운터파트에 의한 감염에 대한 보호를 유도하기 위해 인간 또는 다른 척추 동물 개체를 면역화하는 데 유용하다. 따라서, 본 발명은, 상기 기술된 바와 같이 생성된 바이러스의 버젼이 혼입된 백신 또는 면역원성 조성물의 제형물의 면역화 유효량을 개체에 적용함으로써 모빌리바이러스에 의한 감염에 대한 보호를 유도하기 위해 개체를 면역화하는 방법을 추가로 제공한다.
적당한 횟수의 백신 또는 면역원성 조성물의 충분량은 개체에 적용되어 면역 반응을 일으킨다. 당업자는 이러한 양 및 용량을 쉽게 결정할 수 있을 것이다. 적용은 비강내, 비경구, 경구와 같은 임의 통상의 효과적 형태에 의해 일어날 수 있으며, 또는 비강, 구강, 눈, 폐, 질 또는 직장 표면과 같은 점막에 에어로졸 스프 레이와 같은 것에 의해 국부에 적용될 수 있다. 바람직한 적용 수단은 비강내 적용이다.
본원에 기재된 모든 특허 및 공개문헌은 본원에 참조로 인용된다.
본 발명을 더욱 이해할 수 있도록, 하기 실시예를 실었다. 실시예는 단지 설명을 목적으로 할 뿐이며, 본 발명의 범위를 한정하고자 하지 않는다.
실시예 1
세포 및 바이러스
HEp2 세포를 10% 송아지 혈청이 보충된 Dulbecco의 변형된 Eagle 배지(DMEM)에서 생장시켰다. 병아리 배 섬유아세포(CEF; SPAFAS, Inc)를 동일한 배지에서 유지했다. 파지 T7 RNA 폴리머라제를 발현하는 백시니아 바이러스의 감쇠된 스트레인(MTA/T7; 62)을 CEF에서 생장시켰다. 플라크 분석을 CEF에서 수행하였다.
실시예 2
재조합 DNA
홍역 바이러스 N, P 및 L 단백질 발현 클론(도 1A)을 감염된 세포의 전체 DNA를 역전사한 후 유전자-특이적 프라이머를 사용하여 PCR 증폭하고(RT/PCR), 적당한 T7 RNA 폴리머라제-의존 발현 벡터에 클로닝함으로써 각각 제조했다(61). 베로 세포를 홍역 바이러스의 에드몬스톤 야생형 스트레인으로 감염시키고, 세포병변 효과가 세포의 약 70% 이상에서 관찰되었을 때, RNA를 구아니듐-페놀 추출법에 의해 제조했다(95). 원-튜브 Titan 증폭 키트(Roche Molecular Biology)에 함유된 조 류 미오블라스토시스 바이러스 RT 및 Pwo 폴리머라제로 RT/PCR을 수행했다. RT 단계를 47℃에서 30 내지 60분 동안 수행한 다음, 30-35 사이클의 PCR을 수행하였다. 증폭된 DNA 단편을 T7 발현 플라스미드(도 1, (61, 83))로 벡터의 NcoI 부위내 위치한 해독 개시 코돈을 사용하여 클로닝하였다. 클로닝된 DNA를 사이클-서열분석(96)으로 확인하고, 뉴클레오타이드 치환 에러를 Morph 키트(5prime-3prime, Inc.)를 사용하여 올리고뉴클레오타이드 돌연변이유발에 의해, 또는 이전에 기술한 바와 같은 새로 증폭된 DNA 단편으로 아단편을 치환함으로써 보정하였다(96).
초기 V 단백질 발현 클론은 V 단백질 암호화 영역을 플랭킹하는 프라이머를 사용하여 에드몬스톤 야생형 전체-길이 cDNA 클론으로부터 PCR 증폭하여 제조하였다. 증폭된 DNA를 T7 발현 벡터에 클로닝하고, V 유전자 프레임쉬프트를 발생시키는 데 필요한 추가의 G 뉴클레오타이드 잔기를 올리고뉴클레오타이드-지향성 돌연변이유발에 의해 에디팅 부위(18)에 첨가하였다. 야생형 및 돌연변이 V 단백질 발현 벡터는 또한, 아미노산 말단에서 인플루엔자 바이러스 헤마토글루티닌 에피토프 태그(HA 태그(67))를 사용하여 제조하였다. T7 벡터 플라스미드를, 시작 코돈을 포함하고 HA 에피토프 태그를 암호화하는 서열(CC ATG GCT TAT CCT TAT GAC GTG CCT GAC TAT GCC(서열번호 5) 다음에, 폴리링커가 포함되도록 변형시켰다(플라스미드 pT7/HA). V 단백질 암호화 영역을 아미노 말단에서 HA 태그를 사용하여 클로닝했다. 이는 V 단백질 개시자 메티오닌 코돈을 치환하는 데 기여하며, pMV-haV-wt로 표시되는 플라스미드의 발생을 초래하였다. V 단백질 돌연변이는 올리고뉴클레오타 이드-지향성 또는 결실 돌연변이유발에 의해 pMV-haV-wt 백본에서 제조하였다.
P 및 V 암호화 영역의 5' 말단을 증폭시키도록 디자인된 프라이머
(CGGCCATGGCAGAAGAGACAGGCACGCCACGTAAAAAACGGAC)(서열번호 6)는 하류 C 단백질 개방 판독 프레임을 방해하기 위해 두 개의 염기 변화(밑줄)를 함유한다. 이들 변화는 P 및 V 개방 판독 프레임에 관해서 사일런트이다. 동일한 뉴클레오타이드 변화가 pT7MV-haV 작제물에 관해 수행되었다.
모든 단백질 발현 작제물에 관해서, cDNA 삽입체는 T7 RNA 폴리머라제 전사물의 해독을 촉진하기 위해서 내부 리보좀 엔트리 부위(IRES)의 3'를 클로닝하였다. 50 아데노신 잔기가 3' 말단에 뻗어 있으며, 이어서 T7 RNA 폴리머라제 터미네이터가 있다. P 및 V 발현 벡터는 하류 C 단백질 개방 판독 프레임으로부터 해독 개시를 방해하기 위해 디자인된 염기 치환을 함유한다.
홍역 바이러스 미니레플리콘(pMVwt107-CAT, 도 1B)은 pMV107-CAT의 유도체였다(63). 플라스미드 pMV107-CAT는 홍역 바이러스의 백신 스트레인에서 발견된 리더 서열(60)을 함유하였고, 올리고뉴클레오타이드-지향성 돌연변이유발을 사용하여 pMV107wt-CAT 플라스미드(이는 야생형 리더를 함유한다)로 전환하였다.
실시예 3
일시적 발현 실험
본질적으로 상기 기술한 바와 같이(96), 다양한 양의 바이러스 단백질 발현 벡터(도 1B) 및 CAT 리포터 유전자를 함유하는 홍역 바이러스 미니레플리콘(도 1B)을 사용하여, 일시적 미니레플리콘 발현 분석을 수행하였다. 홍역 바이러스 미니레 플리콘은 CAT 리포터 유전자 및 홍역 바이러스의 에드몬스톤 야생형 스트레인으로부터의 홍역 리더 서열을 함유하는 pMV107-CAT(63)의 유도체였다(60). 6-웰 플레이트내 HEp2는 세포가 약 70 내지 90% 집중되었을 때 형질감염하는 데 사용하였다. 형질감염 혼합물은 미니레플리콘 DNA(50-200 ng pMVwt107-CAT) 및 발현 플라스미드(400 ng pMVwt-N, 300 ng pMVwt-P[C-], 100 ng pMVwt-L)를 200 ㎕의 무혈청 OptiMEM내에서 배합함으로써 제조했다. V 단백질 발현 플라스미드를 도 1C에 열거한 바와 같이, 25 내지 400 ng 범위의 양에 따라 이 혼합물내에 첨가하였다. 리포펙테이트(12-15 ul, Invitrogen/Life Technologies)를 DNA-배지 혼합물에 첨가하고, 20 내지 30분 동안 실온에서 배양했다. 분리 MVA/T7 혼합물을 2 pfu/세포 없이 형질감염될 세포의 각 웰당 감염시키기에 충분한 MVA/T7을 함유하는 0.8 ml의 무혈청 OptiMEM를 제공하기에 충분한 양으로 제조했다. 형질감염을 시작하기 전에, DNA-배지-리포펙테이트 형질감염 혼합물을 800 ul의 MVA/T7-배지 혼합물과 배합하고, 피펫팅하여 부드럽게 혼합했다. 이어서, 배양 배지를 세포 단일층으로부터 제거하고, 배합된 1 ml 형질감염 혼합물을 세포에 첨가했다.
밤새 배양한 후에, 형질감염 혼합물 및 배지를 10% FBS가 보충된 DMEM 배지로 교체하고, 세포를 다시 1일 동안 배양했다. 형질감염을 시작한 지 48시간이 지난 후에, 세포를 수확하고, 전술한 바와 같이 CAT 활성 분석을 위해 추출물을 제조했다(96). CAT의 발현은 도 1C에 보여진다. 일부 실험에서, 조 세포 추출물내 단백질을 단백질 발현을 모니터링하기 위하여 웨스턴 블롯으로 분석하였다(97). 형질감 염된 세포를 0.2% NP40이 보충된 TM 완충액(50 mM Tris [pH 7.4], 150 mM NaCl)을 사용하여 용해시켰다. 세포 추출물을 원심분리하여 핵을 제거하고, 동일 용적의 Laemmli 샘플 버퍼(62.5 mM Tris [pH 6.8], 25% 글리세롤, 2% SDS, 0.01% 브로모페놀 블루)를 세포질 추출물에 첨가했다. 샘플을 대략 2.5% β-머캅토에탄올을 함유하도록 조정한 다음, 끓였다. SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 및 일렉트로블롯팅을 표준 프로토콜을 사용하여 수행하였다(97). 에피토프-태깅된 V 단백질을 마우스 모노클로날 항체 12CA5(Roche Molecular Biology) 또는 랫 모노클로날 항체 3F10(Roche Molecular Biology)을 사용하여 검출하였다. 검출은 퍼옥시다제-컨쥬게이트 2차 항체(Sigma)로, 또한, 화학발광 시약(Roche Molecular Biology 또는 New England Nuclear)을 사용하여 수행하였다.
실시예 4
돌연변이 홍역 바이러스 V 단백질에 의한 미니레플리콘 발현의 억제
실시예 3에 기술된 일시적 미니레플리콘 발현 CAT 분석을 홍역 바이러스 V 단백질 돌연변이 haV-1 내지 haV-8의 다양한 양을 사용하여 반복하였으며, 이는 야생형 서열(haV-wt)과 하기와 같은 차이점을 갖는다(도 3 참조):
haV-1 아미노산 231-299의 결실
haV-2 아미노산 225에서 글루타민산이 글라이신으로 돌연변이
haV-3 아미노산 229 및 230에서 라이신이 알라닌으로 돌연변이
haV-4 아미노산 204 및 208에서 라이신 및 트레오닌이 알라닌으로 돌연변이
haV-5 아미노산 113 및 114에서 타이로신 및 아스파르트산이 알라닌으로 돌 연변이
haV-6 아미노산 100 및 101에서 루신 및 글루타민이 알라닌으로 돌연변이
haV-7 아미노산 14 및 15에서 글루타민산 및 시스테인이 알라닌으로 돌연변이
haV-8 아미노산 3 및 4에서 글루타민산이 알라닌으로 돌연변이
200 또는 400 ng의 각 V 플라스미드(야생형 또는 haV-1 내지 haV-8 V 단백질을 암호화하는)가 사용되었으며, 상대적인 CAT 활성은 V 단백질 발현 벡터 없이 수행된 형질감염으로부터의 생성되는 활성의 %로서 측정되었다(레인 2). 결과는 도 4A에 묘사된다. 낮은 %는 CAT 발현의 고도의 억제와 연관있다. V 단백질의 발현은 항-HA 항체를 사용하여 분석되는 웨스턴 블롯으로 모니터링되었다(도 4B).
haV-1을 암호화하는 V 플라스미드의 증가하는 양(100 ng 내지 1㎍)을 사용하여 CAT 분석을 반복하였으며, 상대적인 활성은 도 4C에 묘사된다.
실시예 5
RNA 결합 분석
폴리리보뉴클레오타이드(Sigma)와 아가로스 수지 커플을 사용하여, RNA에 대한 홍역 바이러스 V 단백질의 결합을 평가하기 위하여, RNA 결합 분석(74, 76, 77)을 수행하였다. 상기 기술한 바와 같이, 0.5% NP40, 5% 글리세롤, 1mM MgCl2, 1 mM ZnCl2 및 프로티아제 억제 칵테일(Roche Molecular Biology)이 보충되는 TN 완충액을 사용하여 형질감염된 세포를 용해시켰다. 폴리리보뉴클레오타이드를 함유하는 아가로스 수지(대략 비드의 정치된 용적의 25 내지 50 ul)를 정제한 세포 용해물에 첨가하고 4℃에서 흔들며 30분 내지 60분간 배양했다. 배양한 다음, 수지를 3회 세척하여 비결합 단백질을 제거했다. 단백질을 2.5% β-머캅토에탄올이 보충되는 Laemmli 완충액에서 끓여서 수지로부터 용리시켰다. 절차를 도 5A의 흐름도로 요약하였다. 폴리뉴클레오타이드 수지에 의해 포획된 단백질을 상기 기술된 바와 같이 웨스턴 블롯으로 분석하였다. 처음에는 야생형 V 단백질로 분석을 수행한 다음, haV-1 내지 haV-11로 분석했다. 돌연변이 haV-1 내지 haV-8은 상기와 같고, 돌연변이 haV-9 내지 haV-11은 야생형 서열(haV-wt)과 하기의 차이점을 갖는다(도 3 참조):
haV-9 아미노산 1-20의 결실
haV-10 아미노산 208-230의 결실
haV-11 아미노산 1-20 및 208-230의 결실
결과는 도 5B(야생형) 및 6(돌연변이)에 묘사된다.
실시예 6
추가의 CR2 돌연변이 홍역 바이러스 V 단백질에 의한 미니레플리콘 발현의 억제
실시예 3 및 4에 기술된 일시적 미니레플리콘 발현 CAT 분석을 홍역 바이러스 V 단백질 CR2 돌연변이 haV-5 및 haV-23 내지 haV-25의 다양한 양을 사용하여 반복하였으며, 이는 CR2내 야생형 서열(haV-wt)(서열번호 7)과 하기와 같은 차이를 갖는다(아미노산 100-140; 도 7 참조):
haV-5 아미노산 113 및 114에서 타이로신 및 아스파르트산이 알라닌으로 돌연변이(서열 번호 8)
haV-23 아미노산 112 내지 134의 결실(서열 번호 9)
haV-24 아미노산 114 및 115에서 아스파르트산 및 히스티딘이 알라닌으로 돌연변이(서열번호 10)
haV-25 아미노산 113 내지 155에서 타이로신, 아스파르트산 및 히스티딘의 돌연변이(서열번호 11)
400 ng의 각 V 플라스미드(야생형, haV-5 또는 haV-23 내지 haV-25 V 단백질을 암호화하는)가 사용되었으며, 상대적인 CAT 활성은 V 단백질 발현 벡터 없이 수행된 형질감염으로부터의 생성되는 활성의 %로서 측정되었다(바 1). 결과는 도 8에 묘사된다. 낮은 %는 CAT 발현의 고도의 억제와 연관있다.
실시예 7
추가의 C-말단 돌연변이 홍역 바이러스 V 단백질에 의한 미니레플리콘 발현의 억제
실시예 3 및 4에 기술된 일시적 미니레플리콘 발현 CAT 분석을 홍역 바이러스 V 단백질 돌연변이 haV-1 및 haV-12 내지 haV-22를 사용하여 반복하였으며, 이는 C-말단내 야생형 서열(haV-wt)(서열번호 7)과 하기와 같은 차이를 갖는다(아미노산 220-299; 도 9 참조):
haV-1 아미노산 232 내지 299의 결실(서열 번호 13)
haV-12 아미노산 251 내지 255에서 시스테인이 알라닌으로 돌연변이(서열번 호 14)
haV-13 아미노산 269 및 272에서 시스테인이 알라닌으로 돌연변이(서열번호 15)
haV-14 아미노산 279 내지 299의 결실(서열번호 16)
haV-15 아미노산 267 내지 299의 결실(서열번호 17)
haV-16 아미노산 250 내지 299의 결실(서열번호 18)
haV-17 아미노산 243 내지 299의 결실(서열번호 19)
haV-18 아미노산 236 내지 299의 결실(서열번호 20)
haV-19 아미노산 229 내지 299의 결실(서열번호 21)
haV-20 아미노산 233 및 234에서 아르기닌이 알라닌으로 돌연변이(서열번호 22)
haV-21 아미노산 233 및 234에서 아르기닌이 아스파르트산으로 돌연변이(서열번호 23)
haV-22 아미노산 229 내지 237의 결실(서열번호 24)
400 ng의 각 V 플라스미드(야생형, haV-1 또는 haV-12 내지 haV-22 V 단백질을 암호화하는)가 사용되었으며, 상대적인 CAT 활성은 V 단백질 발현 벡터 없이 수행된 형질감염으로부터의 생성되는 활성의 %로서 측정되었다(바 1). 결과는 도 10에 묘사된다. 낮은 %는 CAT 발현의 고도의 억제와 연관있다.
Figure 112002042350617-pct00001
Figure 112002042350617-pct00002
Figure 112002042350617-pct00003
Figure 112002042350617-pct00004
Figure 112002042350617-pct00005
Figure 112002042350617-pct00006
<110> American Cyanamid Company <120> Modified Morbillivirus V Proteins <130> AM100239PCT <150> US60/213,655 <151> 2000-06-23 <160> 24 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 299 <212> PRT <213> Measles virus <400> 1 Met Ala Glu Glu Gln Ala Arg His Val Lys Asn Gly Leu Glu Cys Ile 1 5 10 15 Arg Ala Leu Lys Ala Glu Pro Ile Gly Ser Leu Ala Ile Glu Glu Ala 20 25 30 Met Ala Ala Trp Ser Glu Ile Ser Asp Asn Pro Gly Gln Glu Arg Ala 35 40 45 Thr Cys Arg Glu Glu Lys Ala Gly Ser Ser Gly Leu Ser Lys Pro Cys 50 55 60 Leu Ser Ala Ile Gly Ser Thr Glu Gly Gly Ala Pro Arg Ile Arg Gly 65 70 75 80 Gln Gly Pro Gly Glu Ser Asp Asp Asp Ala Glu Thr Leu Gly Ile Pro 85 90 95 Pro Arg Asn Leu Gln Ala Ser Ser Thr Gly Leu Gln Cys Tyr Tyr Val 100 105 110 Tyr Asp His Ser Gly Glu Ala Val Lys Gly Ile Gln Asp Ala Asp Ser 115 120 125 Ile Met Val Gln Ser Gly Leu Asp Gly Asp Ser Thr Leu Ser Gly Gly 130 135 140 Asp Asn Glu Ser Glu Asn Ser Asp Val Asp Ile Gly Glu Pro Asp Thr 145 150 155 160 Glu Gly Tyr Ala Ile Thr Asp Arg Gly Ser Ala Pro Ile Ser Met Gly 165 170 175 Phe Arg Ala Ser Asp Val Glu Thr Ala Glu Gly Gly Glu Ile His Glu 180 185 190 Leu Leu Arg Leu Gln Ser Arg Gly Asn Asn Phe Pro Lys Leu Glu Lys 195 200 205 Thr Leu Asn Val Pro Pro Pro Pro Asp Pro Gly Arg Ala Ser Thr Ser 210 215 220 Glu Thr Pro Ile Lys Lys Gly His Arg Arg Glu Ile Ser Leu Ile Trp 225 230 235 240 Asn Gly Asp Arg Val Phe Ile Asp Arg Trp Cys Asn Pro Met Cys Ser 245 250 255 Lys Val Thr Leu Gly Thr Ile Arg Ala Arg Cys Thr Cys Gly Glu Cys 260 265 270 Pro Arg Val Cys Glu Gln Cys Arg Thr Asp Thr Gly Val Asp Thr Arg 275 280 285 Ile Trp Tyr His Asn Leu Pro Glu Ile Pro Glu 290 295 <210> 2 <211> 299 <212> PRT <213> Rinderpest virus <400> 2 Met Ala Glu Glu Gln Ala Tyr His Val Asn Lys Gly Leu Glu Cys Ile 1 5 10 15 Lys Ala Leu Arg Ala Arg Pro Leu Asp Pro Leu Val Val Glu Glu Ala 20 25 30 Leu Ala Ala Trp Val Glu Thr Ser Glu Gly Gln Thr Leu Asp Arg Met 35 40 45 Ser Ser Asp Glu Ala Glu Ala Asp His Gln Asp Ile Ser Lys Pro Cys 50 55 60 Phe Pro Ala Ala Gly Pro Gly Lys Ser Ser Met Ser Arg Cys His Asp 65 70 75 80 Gln Gly Leu Arg Gly Ser Asn Ser Cys Asp Glu Glu Leu Gly Ala Phe 85 90 95 Ile Gly Asp Ser Ser Met His Ser Thr Glu Val Gln His Tyr His Val 100 105 110 Tyr Asp His Ser Gly Glu Lys Val Glu Gly Val Glu Asp Ala Asp Ser 115 120 125 Ile Leu Val Gln Ser Gly Ala Asp Asp Gly Val Glu Val Trp Gly Gly 130 135 140 Asp Glu Glu Ser Glu Asn Ser Asp Val Asp Ser Gly Glu Pro Asp Pro 145 150 155 160 Glu Gly Ser Ala Pro Ala Asp Trp Gly Ser Ser Pro Ile Ser Pro Ala 165 170 175 Thr Arg Ala Ser Asp Val Glu Thr Val Glu Gly Asp Glu Ile Gln Lys 180 185 190 Leu Leu Glu Asp Gln Ser Arg Ile Arg Lys Met Thr Lys Ala Glu Lys 195 200 205 Thr Leu Val Val Pro Pro Ile Pro Ser Gln Glu Arg Pro Thr Ala Ser 210 215 220 Glu Lys Pro Ile Lys Lys Gly His Arg Arg Glu Ile Asp Leu Ile Trp 225 230 235 240 Asn Asp Gly Arg Val Phe Ile Asp Arg Trp Cys Asn Pro Thr Cys Ser 245 250 255 Lys Val Thr Val Gly Thr Val Arg Ala Lys Cys Ile Cys Gly Glu Cys 260 265 270 Pro Arg Val Cys Glu Gln Cys Ile Thr Asp Ser Gly Ile Glu Asn Arg 275 280 285 Ile Trp Tyr His Asn Leu Ala Asp Ile Pro Glu 290 295 <210> 3 <211> 303 <212> PRT <213> Dolphin morbillivirus <400> 3 Met Ala Glu Glu Gln Ala Tyr His Ile Asn Lys Gly Leu Glu Cys Leu 1 5 10 15 Lys Ser Leu Arg Glu Asn Pro Pro Asp Ala Val Glu Ile Lys Glu Ala 20 25 30 Gln Ile Ile Arg Ser Lys Ala Ala Cys Glu Glu Ser Ser Glu Ser His 35 40 45 His Gln Asp Asn Ser Glu Lys Asp Thr Leu Asp Phe Asp Glu Ser Cys 50 55 60 Ser Ser Ala Ile Arg Pro Glu Thr Tyr Arg Met Leu Leu Gly Asp Asp 65 70 75 80 Thr Gly Phe Arg Ala Pro Gly Tyr Ile Pro Asn Glu Gly Glu Pro Glu 85 90 95 Pro Gly Asp Ile Gly Lys Glu Glu Pro Ala Val Arg Cys Tyr His Val 100 105 110 Tyr Asp His Gly Gly Gln Ala Val Glu Gly Val Lys Asp Ala Asp Leu 115 120 125 Leu Val Val Pro Thr Gly Ser Asp Asp Asp Ala Glu Phe Arg Asp Gly 130 135 140 Asp Glu Ser Ser Leu Glu Ser Asp Gly Glu Ser Gly Thr Val Asp Thr 145 150 155 160 Arg Gly Asn Ser Ser Ser Asn Arg Gly Ser Ala Pro Arg Ile Lys Val 165 170 175 Glu Arg Ser Ser Asp Val Glu Thr Ile Ser Ser Glu Glu Leu Gln Gly 180 185 190 Leu Ile Arg Ser Gln Ser Gln Lys His Asn Gly Phe Gly Val Asp Arg 195 200 205 Phe Leu Lys Val Pro Pro Ile Pro Thr Ser Val Pro Leu Asp Pro Ala 210 215 220 Pro Lys Ser Ile Lys Lys Gly His Arg Arg Glu Ile Ser Leu Ile Trp 225 230 235 240 Asp Gly Asp Arg Val Phe Ile Asp Arg Trp Cys Asn Pro Thr Cys Ser 245 250 255 Arg Ile Lys Met Gly Ile Val Arg Val Lys Cys Thr Cys Gly Glu Cys 260 265 270 Pro Pro Val Cys Asp Glu Cys Arg Glu Asp Pro Glu Thr Pro Thr Arg 275 280 285 Ile Trp Tyr His Ser Leu Pro Glu Ile Pro Glu Gln Trp Pro Phe 290 295 300 <210> 4 <211> 299 <212> PRT <213> canine distemper virus <400> 4 Met Ala Glu Glu Gln Ala Tyr His Val Ser Lys Gly Leu Glu Cys Leu 1 5 10 15 Lys Ala Leu Arg Glu Asn Pro Pro Asp Ile Glu Glu Ile Gln Glu Val 20 25 30 Ser Ser Leu Arg Asp Gln Thr Cys Asn Pro Gly Gln Glu Asn Gly Thr 35 40 45 Thr Gly Met Gln Glu Glu Glu Asp Ser Gln Asn Leu Asp Glu Ser His 50 55 60 Glu Pro Thr Lys Gly Ser Asn Tyr Val Gly His Val Pro Gln Asn Asn 65 70 75 80 Pro Gly Cys Gly Glu Arg Asn Thr Ala Leu Val Glu Ala Glu Arg Pro 85 90 95 Pro Arg Glu Asp Ile Gln Pro Gly Pro Gly Ile Arg Cys Asp His Val 100 105 110 Tyr Asp His Ser Gly Glu Glu Val Lys Gly Ile Glu Asp Ala Asp Ser 115 120 125 Leu Val Val Pro Ala Gly Thr Val Gly Asn Arg Gly Phe Glu Arg Gly 130 135 140 Glu Gly Ser Leu Asp Asp Ser Thr Glu Asp Ser Gly Glu Asp Tyr Ser 145 150 155 160 Glu Gly Asn Ala Ser Ser Asn Trp Gly Tyr Ser Phe Gly Leu Lys Pro 165 170 175 Asp Arg Ala Ala Asp Val Ser Met Leu Met Glu Glu Glu Leu Ser Ala 180 185 190 Leu Leu Arg Thr Ser Arg Asn Val Gly Ile Gln Lys Arg Asp Gly Lys 195 200 205 Thr Leu Gln Phe Pro His Asn Pro Glu Gly Lys Thr Arg Asp Pro Glu 210 215 220 Cys Gly Ser Ile Lys Lys Gly His Arg Arg Glu Val Ser Leu Thr Trp 225 230 235 240 Asn Gly Asp Ser Cys Trp Ile Asp Lys Trp Cys Asn Pro Ile Cys Thr 245 250 255 Gln Val Asn Trp Gly Ile Ile Arg Ala Lys Cys Phe Cys Gly Glu Cys 260 265 270 Pro Pro Thr Cys Asn Glu Cys Lys Asp Asp Pro Glu Met Gln Thr Arg 275 280 285 Val Trp His Ala Thr Pro Ser Gln Asp Leu Lys 290 295 <210> 5 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:epitope tag <400> 5 ccatggctta tccttatgac gtgcctgact atgcc 35 <210> 6 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 6 cggccatggc agaagagaca ggcacgccac gtaaaaaacg gac 43 <210> 7 <211> 41 <212> PRT <213> Measles virus <400> 7 Leu Gln Ala Ser Ser Thr Gly Leu Gln Cys Tyr Tyr Val Tyr Asp His 1 5 10 15 Ser Gly Glu Ala Val Lys Gly Ile Gln Asp Ala Asp Ser Ile Met Val 20 25 30 Gln Ser Gly Leu Asp Gly Asp Ser Thr 35 40 <210> 8 <211> 41 <212> PRT <213> Measles virus <400> 8 Leu Gln Ala Ser Ser Thr Gly Leu Gln Cys Tyr Tyr Val Ala Ala His 1 5 10 15 Ser Gly Glu Ala Val Lys Gly Ile Gln Asp Ala Asp Ser Ile Met Val 20 25 30 Gln Ser Gly Leu Asp Gly Asp Ser Thr 35 40 <210> 9 <211> 18 <212> PRT <213> Measles virus <400> 9 Leu Gln Ala Ser Ser Thr Gly Leu Gln Cys Tyr Tyr Leu Asp Gly Asp 1 5 10 15 Ser Thr <210> 10 <211> 41 <212> PRT <213> Measles virus <400> 10 Leu Gln Ala Ser Ser Thr Gly Leu Gln Cys Tyr Tyr Val Tyr Ala Ala 1 5 10 15 Ser Gly Glu Ala Val Lys Gly Ile Gln Asp Ala Asp Ser Ile Met Val 20 25 30 Gln Ser Gly Leu Asp Gly Asp Ser Thr 35 40 <210> 11 <211> 41 <212> PRT <213> Measles virus <400> 11 Leu Gln Ala Ser Ser Thr Gly Leu Gln Cys Tyr Tyr Val Ala Ala Ala 1 5 10 15 Ser Gly Glu Ala Val Lys Gly Ile Gln Asp Ala Asp Ser Ile Met Val 20 25 30 Gln Ser Gly Leu Asp Gly Asp Ser Thr 35 40 <210> 12 <211> 80 <212> PRT <213> Measles virus <400> 12 Arg Ala Ser Thr Ser Glu Thr Pro Ile Lys Lys Gly His Arg Arg Glu 1 5 10 15 Ile Ser Leu Ile Trp Asn Gly Asp Arg Val Phe Ile Asp Arg Trp Cys 20 25 30 Asn Pro Met Cys Ser Lys Val Thr Leu Gly Thr Ile Arg Ala Arg Cys 35 40 45 Thr Cys Gly Glu Cys Pro Arg Val Cys Glu Gln Cys Arg Thr Asp Thr 50 55 60 Gly Val Asp Thr Arg Ile Trp Tyr His Asn Leu Pro Glu Ile Pro Glu 65 70 75 80 <210> 13 <211> 12 <212> PRT <213> Measles virus <400> 13 Arg Ala Ser Thr Ser Glu Thr Pro Ile Lys Lys Gly 1 5 10 <210> 14 <211> 80 <212> PRT <213> Measles virus <400> 14 Arg Ala Ser Thr Ser Glu Thr Pro Ile Lys Lys Gly His Arg Arg Glu 1 5 10 15 Ile Ser Leu Ile Trp Asn Gly Asp Arg Val Phe Ile Asp Arg Trp Ala 20 25 30 Asn Pro Met Ala Ser Lys Val Thr Leu Gly Thr Ile Arg Ala Arg Cys 35 40 45 Thr Cys Gly Glu Cys Pro Arg Val Cys Glu Gln Cys Arg Thr Asp Thr 50 55 60 Gly Val Asp Thr Arg Ile Trp Tyr His Asn Leu Pro Glu Ile Pro Glu 65 70 75 80 <210> 15 <211> 80 <212> PRT <213> Measles virus <400> 15 Arg Ala Ser Thr Ser Glu Thr Pro Ile Lys Lys Gly His Arg Arg Glu 1 5 10 15 Ile Ser Leu Ile Trp Asn Gly Asp Arg Val Phe Ile Asp Arg Trp Cys 20 25 30 Asn Pro Met Cys Ser Lys Val Thr Leu Gly Thr Ile Arg Ala Arg Cys 35 40 45 Thr Ala Gly Glu Ala Pro Arg Val Cys Glu Gln Cys Arg Thr Asp Thr 50 55 60 Gly Val Asp Thr Arg Ile Trp Tyr His Asn Leu Pro Glu Ile Pro Glu 65 70 75 80 <210> 16 <211> 59 <212> PRT <213> Measles virus <400> 16 Arg Ala Ser Thr Ser Glu Thr Pro Ile Lys Lys Gly His Arg Arg Glu 1 5 10 15 Ile Ser Leu Ile Trp Asn Gly Asp Arg Val Phe Ile Asp Arg Trp Cys 20 25 30 Asn Pro Met Cys Ser Lys Val Thr Leu Gly Thr Ile Arg Ala Arg Cys 35 40 45 Thr Cys Gly Glu Cys Pro Arg Val Cys Glu Gln 50 55 <210> 17 <211> 47 <212> PRT <213> Measles virus <400> 17 Arg Ala Ser Thr Ser Glu Thr Pro Ile Lys Lys Gly His Arg Arg Glu 1 5 10 15 Ile Ser Leu Ile Trp Asn Gly Asp Arg Val Phe Ile Asp Arg Trp Cys 20 25 30 Asn Pro Met Cys Ser Lys Val Thr Leu Gly Thr Ile Arg Ala Arg 35 40 45 <210> 18 <211> 30 <212> PRT <213> Measles virus <400> 18 Arg Ala Ser Thr Ser Glu Thr Pro Ile Lys Lys Gly His Arg Arg Glu 1 5 10 15 Ile Ser Leu Ile Trp Asn Gly Asp Arg Val Phe Ile Asp Arg 20 25 30 <210> 19 <211> 23 <212> PRT <213> Measles virus <400> 19 Arg Ala Ser Thr Ser Glu Thr Pro Ile Lys Lys Gly His Arg Arg Glu 1 5 10 15 Ile Ser Leu Ile Trp Asn Gly 20 <210> 20 <211> 16 <212> PRT <213> Measles virus <400> 20 Arg Ala Ser Thr Ser Glu Thr Pro Ile Lys Lys Gly His Arg Arg Glu 1 5 10 15 <210> 21 <211> 9 <212> PRT <213> Measles virus <400> 21 Arg Ala Ser Thr Ser Glu Thr Pro Ile 1 5 <210> 22 <211> 80 <212> PRT <213> Measles virus <400> 22 Arg Ala Ser Thr Ser Glu Thr Pro Ile Lys Lys Gly His Ala Ala Glu 1 5 10 15 Ile Ser Leu Ile Trp Asn Gly Asp Arg Val Phe Ile Asp Arg Trp Cys 20 25 30 Asn Pro Met Cys Ser Lys Val Thr Leu Gly Thr Ile Arg Ala Arg Cys 35 40 45 Thr Cys Gly Glu Cys Pro Arg Val Cys Glu Gln Cys Arg Thr Asp Thr 50 55 60 Gly Val Asp Thr Arg Ile Trp Tyr His Asn Leu Pro Glu Ile Pro Glu 65 70 75 80 <210> 23 <211> 80 <212> PRT <213> Measles virus <400> 23 Arg Ala Ser Thr Ser Glu Thr Pro Ile Lys Lys Gly His Asp Asp Glu 1 5 10 15 Ile Ser Leu Ile Trp Asn Gly Asp Arg Val Phe Ile Asp Arg Trp Cys 20 25 30 Asn Pro Met Cys Ser Lys Val Thr Leu Gly Thr Ile Arg Ala Arg Cys 35 40 45 Thr Cys Gly Glu Cys Pro Arg Val Cys Glu Gln Cys Arg Thr Asp Thr 50 55 60 Gly Val Asp Thr Arg Ile Trp Tyr His Asn Leu Pro Glu Ile Pro Glu 65 70 75 80 <210> 24 <211> 71 <212> PRT <213> Measles virus <400> 24 Arg Ala Ser Thr Ser Glu Thr Pro Ile Leu Ile Trp Asn Gly Asp Arg 1 5 10 15 Val Phe Ile Asp Arg Trp Cys Asn Pro Met Cys Ser Lys Val Thr Leu 20 25 30 Gly Thr Ile Arg Ala Arg Cys Thr Cys Gly Glu Cys Pro Arg Val Cys 35 40 45 Glu Gln Cys Arg Thr Asp Thr Gly Val Asp Thr Arg Ile Trp Tyr His 50 55 60 Asn Leu Pro Glu Ile Pro Glu 65 70

Claims (53)

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  35. 모빌리바이러스 V 단백질 내에 하나 이상의 돌연변이를 포함하는, 재조합으로 생성되고, 비분절 및 네거티브-센스이며, 싱글-스트랜드인, 분리된 모빌리바이러스에 있어서,
    상기 모빌리바이러스 V 단백질 내의 돌연변이는 모빌리바이러스 V 단백질의 아미노산 113 및 114의 돌연변이로 이루어진 그룹에서 선택되는 하나 이상의 돌연변이인 것을 특징으로 하는 모빌리바이러스.
  36. 제 35 항에 있어서, 바이러스가 홍역 바이러스, 개 디스템퍼 바이러스, 린더페스트 바이러스, 페스트-데-쁘띠 루미넌츠 바이러스, 돌고래 모빌리바이러스 및 포사인 디스템퍼 바이러스로 이루어지는 그룹 중에서 선택되는 모빌리바이러스.
  37. 제 35 항에 있어서, 아미노산 113에서의 돌연변이가 티로신에서 알라닌으로 일어나며, 아미노산 114에서의 돌연변이가 아스파르트산에서 알라닌으로 일어나는 모빌리바이러스.
  38. 제 36 항에 있어서, 바이러스가 홍역 바이러스인 모빌리바이러스.
  39. 제 38 항에 있어서, 홍역 바이러스 V 단백질의 아미노산 231-299에 상응하는 카복시-말단(C-말단) 영역의 일부 또는 전부의 결실 또는 돌연변이를 추가로 포함하는 모빌리바이러스.
  40. 제 39 항에 있어서, C-말단 영역에서의 돌연변이가 아미노산 233 및 234의 각각에서 일어나며, 돌연변이가 아르기닌에서 알라닌으로 변화되는 돌연변이인 모빌리바이러스.
  41. 제 39 항에 있어서, 결실이 아미노산 232 내지 299, 279 내지 299, 267 내지 299, 250 내지 299, 243 내지 299 및 236 내지 299의 결실로 이루어지는 그룹 중에서 선택되는 모빌리바이러스.
  42. 제 38 항에 있어서, 하기를 추가로 포함하는 모빌리바이러스:
    (a) 포지티브 스트랜드, 안티게놈, 메시지 센스에 존재하는 뉴클레오타이드 26(A→T), 뉴클레오타이드 42(A→T 또는 A→C) 및 뉴클레오타이드 96(G→A)으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 3' 게놈 프로모터 영역내 적어도 하나의 감쇠 돌연변이; 및
    (b) 잔기 331(이소루신→트레오닌), 1409(알라닌→트레오닌), 1624(트레오닌→알라닌), 1649(아르기닌→메티오닌), 1717(아스파르트산→알라닌), 1936(히스티딘→타이로신), 2074(글루타민→아르기닌) 및 2114(아르기닌→라이신)로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 아미노산 내에서 변화를 발생시키는 뉴클레오타이드 변화로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 RNA 폴리머라제 유전자에서의 적어도 하나의 감쇠 돌연변이.
  43. 제 38 항에 있어서, 하나 이상의 감쇠 돌연변이를 추가로 포함하는 모빌리바이러스로서,
    상기 하나 이상의 감쇠 돌연변이는
    (a) N 유전자에 대해서, 잔기 129(글루타민→라이신), 148(글루타민산→글라이신) 및 479(세린→트레오닌)로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 아미노산내 변화를 발생시키는 뉴클레오타이드 변화;
    (b) P 유전자에 대해서, 잔기 225(글루타민산→글라이신), 275(시스테인→타이로신) 및 439(루신→프롤린)로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 아미노산내 변화를 발생시키는 뉴클레오타이드 변화;
    (c) C 유전자에 대해서, 잔기 73(알라닌→발린), 104(메티오닌→트레오닌) 및 134(세린→타이로신)로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 아미노산내 변화를 발생시키는 뉴클레오타이드 변화; 및
    (d) F 유전자-말단 시그널에 대해서, 뉴클레오타이드 7243에서의 변화(T→C)
    로 이루어진 그룹 중에서 선택되고,
    상기 뉴클레오타이드들은 포지티브 스트랜드, 안티게놈, 메시지(암호) 센스 스트랜드에 존재하는 모빌리바이러스.
  44. 제 39 항에 있어서, 하기를 추가로 포함하는 모빌리바이러스:
    (a) 포지티브 스트랜드, 안티게놈, 메시지 센스에 존재하는 뉴클레오타이드 26(A→T), 뉴클레오타이드 42(A→T 또는 A→C) 및 뉴클레오타이드 96(G→A)으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 3' 게놈 프로모터 영역내 적어도 하나의 감쇠 돌연변이; 및
    (b) 잔기 331(이소루신→트레오닌), 1409(알라닌→트레오닌), 1624(트레오닌→알라닌), 1649(아르기닌→메티오닌), 1717(아스파르트산→알라닌), 1936(히스티딘→타이로신), 2074(글루타민→아르기닌) 및 2114(아르기닌→라이신)로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 아미노산 내에서 변화를 발생시키는 뉴클레오타이드 변화로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 RNA 폴리머라제 유전자에서의 적어도 하나의 감쇠 돌연변이.
  45. 제 39 항에 있어서, 하나 이상의 감쇠 돌연변이를 추가로 포함하는 모빌리바이러스로서,
    상기 하나 이상의 감쇠 돌연변이는
    (a) N 유전자에 대해서, 잔기 129(글루타민→라이신), 148(글루타민산→글라이신) 및 479(세린→트레오닌)로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 아미노산내 변화를 발생시키는 뉴클레오타이드 변화;
    (b) P 유전자에 대해서, 잔기 225(글루타민산→글라이신), 275(시스테인→타이로신) 및 439(루신→프롤린)로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 아미노산내 변화를 발생시키는 뉴클레오타이드 변화;
    (c) C 유전자에 대해서, 잔기 73(알라닌→발린), 104(메티오닌→트레오닌) 및 134(세린→타이로신)로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 아미노산내 변화를 발생시키는 뉴클레오타이드 변화; 및
    (d) F 유전자-말단 시그널에 대해서, 뉴클레오타이드 7243에서의 변화(T→C)
    로 이루어진 그룹 중에서 선택되고,
    상기 뉴클레오타이드들은 포지티브 스트랜드, 안티게놈, 센스 스트랜드에 존재하는 모빌리바이러스.
  46. 제 36 항에 있어서, 바이러스가 개 디스템퍼 바이러스이며, 이러한 바이러스는 개 디스템퍼 바이러스 V 단백질의 아미노산 231-299 영역인 C-말단 영역의 일부 또는 전부에서의 돌연변이 또는 결실을 추가로 포함하는 모빌리바이러스.
  47. 제 36 항에 있어서, 바이러스가 린더페스트 바이러스이며, 이러한 바이러스는 린더페스트 바이러스 V 단백질의 아미노산 231-303 영역인 C-말단 영역의 일부 또는 전부에서의 돌연변이 또는 결실을 추가로 포함하는 모빌리바이러스.
  48. 제 36 항에 있어서, 바이러스가 돌고래 모빌리바이러스이며, 이러한 바이러스는 돌고래 모빌리바이러스 V 단백질의 아미노산 231-299 영역인 C-말단 영역의 일부 또는 전부에서의 돌연변이 또는 결실을 추가로 포함하는 모빌리바이러스.
  49. 삭제
  50. 모빌리바이러스 V 단백질 내로 하나 이상의 돌연변이를 삽입하는 단계를 포함하는, 모빌리바이러스 V 단백질에 의해 유발되는 유전자 발현의 억제를 감소시키는 방법으로서,
    상기 돌연변이는 모빌리바이러스 V 단백질의 아미노산 113 및 114의 돌연변이로 이루어진 그룹에서 선택되는 하나 이상의 돌연변이인, 모빌리바이러스 V 단백질에 의해 유발되는 유전자 발현의 억제를 감소시키는 방법.
  51. 모빌리바이러스 V 단백질 내로 하나 이상의 돌연변이를 삽입함으로써 변형된 모빌리바이러스 V 단백질을 암호화하는 분리된 뉴클레오타이드 서열로서,
    상기 돌연변이는 모빌리바이러스 V 단백질의 아미노산 113 및 114의 돌연변이로 이루어진 그룹에서 선택되는 하나 이상의 돌연변이인, 뉴클레오타이드 서열.
  52. (i) 청구항 제51항에 따른 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 모빌리바이러스의 게놈 또는 안티게놈을 암호화하는 분리된 핵산 분자를 포함하는 전사 벡터; 및
    (ii) 캡시드화, 전사 및 복제에 필요한 트랜스-작용 단백질 N, P 및 L을 암호화하는 하나 이상의 분리된 핵산 분자를 포함하고, 발현시 감염성 모빌리바이러스가 생산되는 발현 벡터
    를 포함하는, 감염성 모빌리바이러스 생산용 조성물.
  53. 청구항 제52항에 기재된 벡터 (i) 및 (ii)로 숙주 세포를 형질전환, 감염 또는 형질감염시키고, 감염성 모빌리바이러스가 생산되도록 이들 벡터의 공-발현을 허용하는 조건 하에 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 감염성 모빌리바이러스의 생산 방법.
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