JP2002507408A

JP2002507408A - 麻疹ウイルスもしくはヒト呼吸合胞体ウイルスサブグループｂの弱毒化の原因である突然変異

Info

Publication number: JP2002507408A
Application number: JP2000537978A
Authority: JP
Inventors: ユデム，ステイーブン・エイ; シドウ，モヒンデルジート・エス; ランドルフ，バレリー・ビー; ブオナグリオ，デボラ・エイ
Original assignee: アメリカン・サイアナミド・カンパニー
Priority date: 1998-03-26
Filing date: 1999-03-22
Publication date: 2002-03-12
Also published as: AU767193B2; BR9909076A; EP1064358A2; IL138681A0; WO1999049017A2; KR20010080863A; CN1294628A; AU3109599A; CN1600852A; CN1177927C; WO1999049017A3; CA2323927A1

Abstract

(57)【要約】定義された弱毒化突然変異を有する、単離された組換え的に発生された弱毒化麻疹ウイルスおよびＲＳＶサブグループＢウイルスが記述される。こうしたウイルスおよび生理学的に許容できる担体を含んで成るワクチンが処方される。該ワクチンは、個体を免疫して麻疹ウイルスもしくはＲＳサブグループＢウイルスに対する保護を誘導するために使用される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】（発明の分野）本発明は、特定の弱毒化突然変異を有する単離された組換え的に発生された弱
毒化麻疹ウイルスもしくはヒト呼吸合胞体ウイルスサブグループＢに関する。本
発明は公衆衛生局（ＰｕｂｌｉｃＨｅａｌｔｈＳｅｒｖｉｃｅ）により与え
られる助成金のもとで政府の援助を用いてなされた。政府は本発明においてある
種の権利を有する。

【０００２】

【発明の背景】

エンベロープをもつ(enveloped)負センス(negative-sense)の一本鎖ＲＮＡウイルスは独特に組織化かつ発現される。負センスの一本鎖ウイルスのゲノムＲＮ
Ａは、ヌクレオキャプシドの情況で２種の鋳型機能（メッセンジャーＲＮＡ（ｍ
ＲＮＡ）の合成のための鋳型およびアンチゲノム（＋）鎖の合成のための鋳型と
して）を供する。負センスの一本鎖ＲＮＡウイルスはそれら自身のＲＮＡ依存性
ＲＮＡポリメラーゼをコードしかつパッケージングする。メッセンジャーＲＮＡ
は、ヌクレオキャプシドが感染した細胞の細胞質に進入してのみ合成される。ウ
イルス複製がｍＲＮＡの合成後に起こり、そしてウイルスタンパク質の連続的合
成を必要とする。新たに合成されたアンチゲノム（＋）鎖は（−）鎖のゲノムＲ
ＮＡのさらなるコピーを生じさせるための鋳型としてはたらく。

【０００３】該ポリメラーゼ複合体は、該ゲノムの３’端、とりわけプロモーター領域でシ
スに作用するシグナルを従事させる(engaging)ことにより転写および複製を起動
かつ達成する。ウイルス遺伝子がその後、その３’からその５’端まで一方向的
に該ゲノム鋳型から転写される。常に、それらの上流の隣接物(neighbors)（すなわち核タンパク質遺伝子（Ｎ））に関して下流の遺伝子（例えばポリメラーゼ
遺伝子（Ｌ））から作成されるより少ないｍＲＮＡが存在する。従って、常に、
該ゲノムの３’端に関して該遺伝子の位置に従ってｍＲＮＡの夥しさの勾配が存
在する。

【０００４】ウイルスの分類に関する国際委員会（ｔｈｅＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ
ＣｏｍｍｉｔｔｅｅｏｎｔｈｅＴａｘｏｎｏｍｙｏｆＶｉｒｕｓｅｓ
）による１９９３年の改訂された再分類に基づき、モノネガウイルス（Ｍｏｎｏ
ｎｅｇａｖｉｒａｌｅｓ）と呼称される１種の目が確立された。この目は、負の
極性の一本鎖の非セグメント化(nonsegmented)ＲＮＡゲノム（負センス）をもつ
エンベロープをもつウイルスの３種の科を含有する。これらの科は、パラミクソ
ウイルス科（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）、ラブドウイルス科（Ｒｈａｂ
ｄｏｖｉｒｉｄａｅ）およびフィロウイルス科（Ｆｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ）であ
る。パラミクソウイルス科（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）は２種の亜科す
なわちパラミクソウイルス亜科（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｎａｅ）およびニュ
ーモウイルス亜科（Ｐｎｅｕｍｏｖｉｒｉｎａｅ）にさらに分割されている。パ
ラミクソウイルス亜科（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｎａｅ）は、３種の属すなわ
ちパラミクソウイルス属（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｕｓ）、ルブラウイルス属（
Ｒｕｂｕｌａｖｉｒｕｓ）およびモルビリウイルス属（Ｍｏｒｂｉｌｌｉｖｉｒ
ｕｓ）を含有する。ニューモウイルス亜科（Ｐｎｅｕｍｏｖｉｒｉｎａｅ）はニ
ューモウイルス属（Ｐｎｅｕｍｏｖｉｒｕｓ）を含有する。

【０００５】該新分類は、形態学的基準、ウイルスゲノムの構成、生物学的活性ならびに遺
伝子および遺伝子産物の配列の関係に基づく。パラミクソウイルス亜科（Ｐａｒ
ａｍｙｘｏｖｉｒｉｎａｅ）のエンベロープをもつウイルスのあいだでの形態学
的な顕著な特徴はヌクレオキャプシドの大きさおよび形状（直径１８ｍｍ、長さ
１ｍｍ、５．５ｎｍのピッチ）であり、これは左旋性のらせん状の対称性を有す
る。生物学的基準は、１）ある属のメンバー間での抗原性の交差反応性、および
２）パラミクソウイルス属（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｕｓ）、ルブラウイルス属
（Ｒｕｂｕｌａｖｉｒｕｓ）でのノイラミニダーゼ活性の存在およびモルビリウ
イルス属（Ｍｏｒｂｉｌｌｉｖｉｒｕｓ）でのその非存在である。加えて、Ｐ遺
伝子のコードする潜在能力の変動が、ルブラウイルス（Ｒｕｂｕｌａｖｉｒｕｓ
）での余分の遺伝子（ＳＨ）の存在がそうであるように、考慮される。

【０００６】ニューモウイルスは、それらが幅の狭いヌクレオキャプシドを含有するために
パラミクソウイルス亜科（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｎａｅ）と形態学的に識別
することが可能である。加えて、ニューモウイルスは、タンパク質をコードする
シストロンの数（パラミクソウイルス亜科（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｎａｅ）
での６個に対してニューモウイルスで１０個）、およびパラミクソウイルス亜科
（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｎａｅ）のものと非常に異なる付着タンパク質（Ｇ
）に大きな差異を有する。パラミクソウイルスおよびニューモウイルスは、機能
で対応するようである６個のタンパク質（Ｎ、Ｐ、Ｍ、Ｇ／Ｈ／ＨＮ、Ｆおよび
Ｌ）を有するとは言え、後者の２種のタンパク質のみが該２種の亜科の間の有意
の配列の関連を表わす。いくつかのニューモウイルスのタンパク質はパラミクソ
ウイルスの大部分の対照物すなわち非構造タンパク質ＮＳ１およびＮＳ２、小さ
な疎水性タンパク質ＳＨならびに第二のタンパク質Ｍ２を欠く。いくつかのパラ
ミクソウイルスのタンパク質すなわちＣおよびＶはニューモウイルスの対照物を
欠く。しかしながら、ニューモウイルスおよびパラミクソウイルスの基礎的なゲ
ノム構成は同一である。同じことがラブドウイルスおよびフィロウイルスでも真
実である。表１は各属の例と一緒にこれらのウイルスの現在の分類学的分類を提
示する。表１モノネガウイルス目（ＯｒｄｅｒＭｏｎｏｎｅｇａｖｉｒａｌｅｓ）のセグメ
ントに分けられない負センスの一本鎖ＲＮＡウイルスの分類パラミクソウイルス科（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）パラミクソウイルス亜科（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｎａｅ）パラミクソウイルス属（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｕｓ）センダイウイルス（マウスパラインフルエンザウイルスタイプ１）ヒトパラインフルエンザウイルス（ＰＩＶ）タイプ１および３ウシパラインフルエンザウイルス（ＢＰＶ）タイプ３ルブラウイルス属（Ｒｕｂｕｌａｖｉｒｕｓ）シミアンウイルス５（ＳＶ）（イヌパラインフルエンザタイプ２）ムンプスウイルスニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）（トリパラミクソウイルス１）ヒトパラインフルエンザウイルスタイプ２、４ａおよび４ｂモルビリウイルス属（Ｍｏｒｂｉｌｌｉｖｉｒｕｓ）麻疹ウイルス（ＭＶ）イルカモルビリウイルスイヌジステンパーウイルス（ＣＤＶ）小反芻動物病ウイルスアザラシジステンパーウイルス牛疫ウイルスニューモウイルス亜科（Ｐｎｅｕｍｏｖｉｒｉｎａｅ）ニューモウイルス属（Ｐｎｅｕｍｏｖｉｒｕｓ）ヒト呼吸合胞体ウイルス（ＲＳＶ）ウシ呼吸合胞体ウイルスマウス肺炎ウイルスシチメンチョウ鼻気管炎ウイルスラブドウイルス科（Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ）リッサウイルス属（Ｌｙｓｓａｖｉｒｕｓ）狂犬病ウイルスベシクロウイルス属（Ｖｅｓｉｃｕｌｏｖｉｒｕｓ）水疱性口内炎ウイルスエフェメロウイルス属（Ｅｐｈｅｍｅｒｏｖｉｒｕｓ）ウシ流行熱ウイルスフィロウイルス科（Ｆｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ）フィロウイルス属（Ｆｉｌｏｖｉｒｕｓ）マールブルグウイルスこれらのウイルスの多くについてはいかなる種類のワクチンも入手可能でない
。従って、こうしたヒトおよび動物の病原体に対するワクチンを開発する必要性
が存在する。こうしたワクチンはレシピエントで保護的免疫応答を導き出さなけ
ればならないとみられる。こうした好都合な応答の定性的および定量的特徴は、
天然のウイルス感染症の生存者［彼らは一般にその後若干の有意の期間の間同一
のもしくは高度に関係するウイルスによる再感染から保護される］でみられるも
のから外挿される。

【０００７】（１）精製された個々のウイルスタンパク質のワクチン（サブユニットワクチ
ン）；（２）不活性化全ウイルス製剤；および（３）生弱毒化ウイルスの使用を
包含する多様なアプローチが、こうしたワクチンを開発するための探求で考慮さ
れる可能性がある。

【０００８】サブユニットワクチンは、純粋、限定可能、および、組換えＤＮＡ発現法を包
含する多様な手段により豊富に比較的容易に産生されるという望ましい特徴を有
する。今日まで、Ｂ型肝炎表面抗原の顕著な例を除き、ウイルスサブユニットワ
クチンは、とりわけ免疫を受けたことのないレシピエントにおいて、一般に、導
き出された短命のおよび／もしくは不十分な免疫のみを有する。

【０００９】急性灰白髄炎（ＩＰＶ）およびＡ型肝炎のホルマリン不活性化全ウイルス製剤
は安全かつ有効と判明している。対照的に、呼吸合胞体ウイルスおよび麻疹ウイ
ルスのワクチンのような類似に不活性化された全ウイルスでの免疫感作は、ワク
チン接種を受けた者を天然のもしくは「野生型」ウイルスにその後直面される場
合に誇張されたもしくは異常な疾患に罹りやすくする、不利な免疫応答および／
もしくは応答プロフィルを導き出した。

【００１０】小児にワクチン注射をするための早期の試み（１９６６）は、非経口で投与さ
れるホルマリン不活性化ＲＳＶワクチンを使用した。不幸なことに、このワクチ
ンのいくつかの実地試験は重大な有害反応、すなわちＲＳＶへのその後の天然の
感染後の異常な特徴をもつ重症の疾病の発症（参考書目登録１，２）を示した。
このホルマリン処理されたＲＳＶ抗原が、ワクチン接種を受けた者をＲＳＶ疾患
に罹りやすくする異常なもしくは均衡を欠いた免疫応答プロフィルを導き出した
ことが示唆された（３，４）。

【００１１】その後、生弱毒化ＲＳＶワクチン候補が、寒冷継代(cold passage)もしくは化
学的突然変異誘発により生じられた。これらのＲＳＶ株は血清陽性の成体で低下
された毒性を有することが見出された。不幸なことに、それらは、血清陰性の幼
児に与えられる場合に過剰弱毒化されたかもしくは過小弱毒化されたかのいずれ
かと判明し；いくつかの場合にはそれらは遺伝的安定性を欠くこともまた見出さ
れた（５，６）。生ウイルスの非経口投与を使用する別のワクチン接種のアプロ
ーチは無効であり、そしてこの線に沿った努力は中断された（７）。とりわけ、
これらの生ＲＳＶワクチンは、上述されたホルマリン不活性化ＲＳＶワクチンで
観察されたような疾患の増強を伴わなかった。現在、ヒトへの投与のため承認さ
れたＲＳＶワクチンは存在しないが、とは言え、Ａ２およびＢ−１と呼称される
ＲＳＶの寒冷継代された化学的に突然変異誘発された株を用いる臨床試験が現在
進行中である。

【００１２】野生型ウイルスの適切に弱毒化された生誘導体は、ワクチン候補として明確な
利点を提供する。生存する複製する病原体として、それらはレシピエントでの感
染を開始し、その間、ウイルス遺伝子産物がワクチン接種を受けた者の特異的な
ＭＨＣクラスＩおよびＩＩ分子の情況で発現され、プロセシングされそして提示
され、体液性および細胞媒介性の免疫応答、ならびに天然の感染症の生存者の保
護的免疫プロフィルに近似する同等のサイトカインおよびケモカインパターンを
導き出す。

【００１３】この好都合な免疫応答パターンは、典型的には主に体液性免疫監視アームに制
限される、不活性化もしくはサブユニットワクチンにより導き出される限界を定
められた応答と対比される。さらに、若干のホルマリン不活性化全ウイルスワク
チン、例えば１９６０年代に開発された麻疹および呼吸合胞体ウイルスワクチン
により導き出される免疫応答プロフィルは、持続性の保護を提供することに失敗
したのみならず、しかし実際のところ、ワクチンのレシピエントが後に野生型ウ
イルスに直面された場合に異常な誇張されたそして致死的でさえある疾病に対す
る疾病素因につながった。

【００１４】生弱毒化ウイルスはワクチン候補として高度に望ましい特徴を有する一方、そ
れらは開発するのが困難であることが判明した。その困難の最重要点は、レシピ
エントを感染させそして十分な夥しさで所望の免疫応答プロフィルを導き出すの
に十分な複製能力を保持しつつ、その疾患を生じさせる潜在能力（すなわち毒性
）を喪失した野生型ウイルスの誘導体を単離する必要性に存する。

【００１５】歴史的には、毒性と弱毒化との間のこの扱いにくい均衡は、（温度のような）
変動する成長条件のもとで多様な宿主組織もしくは細胞による野生型ウイルス単
離物の連続的継代により達成されている。この過程が、おそらくウイルス変異体
（突然変異体）の成長に味方し、変異体のいくつかは弱毒化の好都合な特徴を有
する。ときに、さらなる弱毒化が化学的突然変異誘発により同様に達成される。

【００１６】この増殖／継代スキームは、典型的には、温度感受性の寒冷適応され(cold-ad
apted)、そして／もしくはそれらの宿主範囲で変えられるウイルス誘導体の出現
につながり、その１種もしくは全部が野生型の疾患を引き起こすウイルスからの
変化、すなわち弱毒化を伴うかも知れない変化である。

【００１７】麻疹およびおたふくかぜ（パラミクソウイルスである）の予防、ならびに急性
灰白髄炎および風疹（正鎖ＲＮＡウイルスである）に対する保護のためのものを
包含するいくつかの生ウイルスワクチンがこのアプローチにより生じられ、そし
て世界中で現在の小児の免疫感作レジメンの中心となるものを提供する。

【００１８】にもかかわらず、弱毒化生ウイルスワクチン候補を生じさせるためのこの手段
は長たらしく、そしてせいぜい予測不可能であり、主として望ましい弱毒化の特
徴をもつそれらの無作為に発生するゲノム突然変異体の選択的な生成を頼みとす
る。生じるウイルスはインビトロで所望の表現型を有するかも知れず、そして、
動物モデルにおいて弱毒化されるようでさえある。しかしながら、まったく度を
過ごして、それらは、そのためにそれらがワクチン候補として意図されるヒトも
しくは動物宿主で過小弱毒化されたかもしくは過剰弱毒化されたかのいずれかの
ままである。

【００１９】使用されている現在のワクチンに関してさえ、より有効なワクチンに対する必
要性がなお存在する。例えば、現在の麻疹ワクチンは理にかなって良好な保護を
提供する。しかしながら、最近の麻疹の突発的流行は現在のワクチンの効力の不
足を示唆する。母体の免疫感作にもかかわらず、高率の急性麻疹感染が１歳以下
の小児で発生しており、野生型の麻疹の感染後に発生されるものに匹敵する抗麻
疹抗体レベルを誘導することの該ワクチンの無能力を反映する（８，９，１０）
。結果として、ワクチンで免疫された母親は、人生の最初の数ヶ月を越えて新生
児を保護するための十分な経胎盤的に生じられる受動抗体を彼らの幼児に提供す
ることがより少なく可能である。

【００２０】以前に免疫された青年および若年の成体での急性麻疹感染は付加的な問題を指
摘する。これらの二次的なワクチンの失敗は、豊富かつ持続性の双方である抗ウ
イルス保護を誘導かつ維持する現在のワクチンの能力における限界を示す（１１
，１２，１３）。最近、なお別の潜在的な問題が示された。過去１５年にわたっ
て単離された野生型の麻疹のヘマグルチニンタンパク質はワクチン株からの累進
的に増大する距離を示した（１４）。この「抗原性の移動」は、該ワクチン株が
至適の保護を提供するのに必要とされる理想的な抗原性のレパートリーを含有し
ないかも知れないという道理に合った懸念を提起する。従って、改良されたワク
チンに対する必要性が存在する。

【００２１】理にかなったワクチンの設計は、これらのウイルスのより良好な理解、とりわ
け毒性のウイルスにコードされる決定子ならびに弱毒化の原因であるゲノムの変
化の同定により補助されるとみられる。

【００２２】既に、米国仮出願第６０／０２６，８２３号および国際特許出願第ＰＣＴ／Ｕ
Ｓ９７／１６７１８号［その双方はこれにより引用により組み込まれる］におい
て、３’のゲノムプロモーター領域中に最低１個の弱毒化突然変異を有しかつＲ
ＮＡポリメラーゼ遺伝子中に最低１個の弱毒化突然変異を有するモノネガウイル
ス目（ＯｒｄｅｒＭｏｎｏｎｅｇａｖｉｒａｌｅｓ）の組換え的に発生された
弱毒化されたセグメントに分けられない負センスの一本鎖ＲＮＡウイルスの発生
および単離が開示された。これらのウイルスのゲノムの他の領域中の弱毒化する
変化の同定は理にかなったワクチン設計をさらに補助するとみられる。

【００２３】（発明の要約）従って、突然変異がそれらのウイルスの弱毒化をもたらさす、麻疹ウイルスお
よびヒト呼吸合胞体ウイルスサブグループＢのゲノムの付加的な領域を同定する
ことが、本発明の一目的である。

【００２４】それらのゲノム中にこうした弱毒化突然変異を組み込む組換え的に発生された
ウイルスを製造することが、本発明のさらなる一目的である。

【００２５】こうした弱毒化ウイルスを含有するワクチンを処方することが、本発明のなお
さらなる一目的である。

【００２６】これらおよび以下で論考されるような本発明の他の目的は、特定の弱毒化突然
変異を有する組換え的に発生された弱毒化麻疹ウイルスもしくはヒト呼吸合胞体
ウイルスサブグループＢの発生および単離により達成される。

【００２７】麻疹ウイルスの場合には、１個もしくはそれ以上の弱毒化突然変異が、（１）
Ｎ遺伝子について、残基１２９（グルタミン→リシン）、１４８（グルタミン酸
→グリシン）および４７９（セリン→トレオニン）より成る群から選択されるア
ミノ酸に変化を生じさせるヌクレオチド変化；（２）Ｐ遺伝子について、残基２
２５（グルタミン酸→グリシン）、２７５（システイン→チロシン）および４３
９（ロイシン→プロリン）より成る群から選択されるアミノ酸に変化を生じさせ
るヌクレオチド変化；（３）Ｃ遺伝子について、残基７３（アラニン→バリン）
、１０４（メチオニン→トレオニン）および１３４（セリン→チロシン）より成
る群から選択されるアミノ酸に変化を生じさせるヌクレオチド変化；ならびに（
４）Ｆ遺伝子終了シグナル(gene-end signal)（シスに作用する転写終止シグナル）について、ヌクレオチド７２４３（Ｔ→Ｃ）の変化より成る群から選択され
、ここでこれらのヌクレオチドならびに本出願で詳細に叙述される他者は（別に
述べられない限り）、正鎖のアンチゲノム、すなわちメッセージ（コーディング
）センス中に提示される。

【００２８】ヒト呼吸合胞体ウイルスサブグループＢの場合には、Ｍ遺伝子終了シグナル（
シスに作用する転写終止シグナル）中のヌクレオチド４１９９（Ｔ→Ｃ）に１個
の弱毒化突然変異が存在し、ここでこれらのヌクレオチドは正鎖のアンチゲノム
、すなわちメッセージ（コーディング）センス中に提示される。

【００２９】本発明の別の態様において、これらの弱毒化麻疹もしくはヒトＲＳＶサブグル
ープＢウイルスは、野生型の形態の各ウイルスに対する保護的免疫応答を導き出
すワクチンを製造するのに使用される。

【００３０】本発明のなお別の態様において、完全なウイルスのヌクレオチド配列（野生型
ウイルスのものにしろ非組換え手段により弱毒化されたウイルスのものにしろ）
を有する単離された正鎖のアンチゲノムのメッセージセンス核酸分子（もしくは
単離された負鎖のゲノムのセンス核酸分子）が、単離された組換え的に発生され
た弱毒化麻疹もしくはヒトＲＳＶサブグループＢウイルスを発生させるように本
明細に記述される弱毒化突然変異の１種もしくはそれ以上を導入することにより
操作される。各弱毒化ウイルスはその後野生型の形態の各ウイルスに対する保護
的免疫応答を導き出すワクチンを製造するのに使用される。

【００３１】（発明の詳細な記述）負センスの一本鎖ＲＮＡウイルスゲノムの転写および複製は、リボ核タンパク
質コア（ヌクレオキャプシド）に作用する多量体タンパク質の酵素的活動により
達成される。裸のゲノムＲＮＡは鋳型としてはたらき得ない。代わりに、これら
のゲノムの配列は、それらがＮタンパク質によりヌクレオキャプシド構造に完全
に包膜化される場合にのみ認識される。ゲノムおよびアンチゲノムの末端プロモ
ーター配列が転写もしくは複製の経路を開始するよう認識されるのはその情況に
おいてのみである。

【００３２】全部のパラミクソウイルスは、これらのポリメラーゼ経路が進行するために２
種のウイルスタンパク質ＬおよびＰを必要とする。ＲＳＶを包含するニューモウ
イルスもまた、転写経路が効率的に進行するために転写伸長因子Ｍ２を必要とす
る。おそらくウイルスにコードされるＮＳ１およびＮＳ２タンパク質、ならびに
おそらく宿主細胞にコードされるタンパク質を包含する付加的な補助因子もまた
ある役割を演じているかも知れない。

【００３３】しかしながら、かなりの証拠が、リボヌクレオチドの重合、ｍＲＮＡ転写物の
キャッピングおよびポリアデニル酸化、Ｐタンパク質のメチル化およびおそらく
特定のホスホリル化の開始および終了を包含する転写および複製に関連する全部
でない場合は大部分の酵素的過程を実施するのはＬタンパク質であることを示す
。ゲノムの転写および複製におけるＬタンパク質の中心的役割は、その大きな大
きさ、突然変異に対する感受性および転写的に活性のウイルス複合体におけるそ
の触媒レベルの夥しさにより援助される（１６）。

【００３４】これらの考慮は、Ｌタンパク質が、その連鎖状構造が別々の機能を統合する直
線状の一列のドメインより成る（１７）という提案につながった。事実、負セン
スのウイルスのＬタンパク質内の３種のこうした限界を定められた別々の要素が
、他の十分に特徴づけられたタンパク質の定義された機能的ドメインに対するそ
れらの関連に基づいて同定されている。これらは、（１）推定のＲＮＡの鋳型の
認識および／もしくはホスホジエステル結合形成ドメイン；（２）ＲＮＡ結合要
素；ならびに（３）ＡＴＰ結合ドメインを包含する。セグメントに分けられない
負センスの一本鎖ＲＮＡウイルスのＬタンパク質の全部の以前の研究はこれらの
推定の機能的要素を示した（１７）。

【００３５】以下により束縛されることなく、これらのタンパク質をコードしないプロモー
ターおよび他のシスに作用するゲノムの調節ドメインが、麻疹ウイルス（ＭＶ）
およびモノネガウイルス目（ＯｒｄｅｒＭｏｎｏｎｅｇａｖｉｒａｌｅｓ）の
他のウイルスによる転写および複製がＬタンパク質と共同して実現される効率の
重要な決定子であること、また、それらは従って同様にこれらのウイルスの毒性
の決定子であるかも知れないことを推定することは道理に合っている。

【００３６】要するに、本発明は、該ウイルスの複製する十分な能力を保持しつつ各ウイル
スの弱毒化をもたらす、いくつかの麻疹ウイルス遺伝子および１個のシスに作用
する調節ドメイン中の一組の変化、ならびにＲＳＶサブグループＢのシスに作用
する調節ドメイン中の１個の変化を包含すると考えられる。従って、理にかなっ
たワクチン設計の一部として、こうした突然変異は、複製効率および免疫原性の
所望の均衡を提供するよう導入され、その結果該ウイルスワクチンはもはや疾患
を生じさせることは可能でなく、それでもなおワクチン接種を受けた者の細胞を
感染させて望ましい免疫応答の完全なスペクトルおよびプロフィルを導き出すの
に十分に豊富な遺伝子産物を発現しそして導き出された免疫応答の夥しさを最大
化するのに十分に繁殖かつ播種するその能力を保持する。

【００３７】動物研究は、疾病を回避するのに十分だがしかし所望の免疫応答を導き出すの
に十分なウイルス複製の減少を立証した。これはおそらく、転写の減少、ウイル
スにコードされるタンパク質の遺伝子発現の減少および／もしくはアンチセンス
の鋳型の減少、そして従ってより少ない新たなゲノムの産生を表わす。生じる弱
毒化ウイルスは野生型より有意により小さく毒性である。

【００３８】本明細書に記述される弱毒化突然変異は、２個の方法、すなわち（１）化学的突然変異誘発物質が添加されている細胞培養物中でのウイルスの
成長の間の化学的突然変異誘発、温度感受性および／もしくは寒冷適応(cold ad
apted)突然変異を選択するために至適に及ばない温度で継代にかけられたウイル
スの選択、細胞培養物中で小さなプラークを産生する突然変異体ウイルスの同定
、ならびに宿主範囲の突然変異について選択するための異種宿主を通じての継代
のような慣習的手段。これらのウイルスをその後、動物モデルでのそれらの生物
学的活性の減弱についてスクリーニングする。弱毒化ウイルスをそれらのコーデ
ィング領域および遺伝子間領域のヌクレオチド配列決定にかけて弱毒化突然変異
の部位の位置をつきとめる。これがなされれば方法（２）をその後実施する。

【００３９】（２）弱毒化突然変異の導入の好ましい一手段は、予め決められた突然変異を
、部位特異的突然変異誘発を使用して作成することを含んで成る。これらの突然
変異を、方法（１）もしくはその弱毒化突然変異が既に知られている緊密に関係
したウイルスへの参照のいずれかにより同定する。本明細書で定義されるような
１個もしくはそれ以上の突然変異を麻疹ウイルスもしくはＲＳＶサブグループＢ
株に導入する。コーディングおよび非コーディングの変化の多様な組み合わせの
累積的効果もまた評価し得る。によりウイルス株中に導入されてよい。

【００４０】麻疹ウイルスのＮ、Ｐおよび／もしくはＣ遺伝子、ならびに／またはＦ遺伝子
終了シグナル、あるいはＲＳＶサブグループＢのＭ遺伝子終了シグナルへの突然
変異を、標準的組換えＤＮＡ法によりウイルスゲノムの１個のＤＮＡコピー中に
導入する。これは、野生型もしくは（方法（１）により改変されたウイルスのよ
うな）改変ウイルスゲノムの背景であることができ、それにより新たなウイルス
を生じさせる。これらの弱毒化突然変異を含有する感染性のクローンもしくは粒
子が、センダイウイルス（１８）；麻疹ウイルス（１９）；呼吸合胞体ウイルス
（２０）；ＰＩＶ−３（２１）；狂犬病（２２）；水疱性口内炎ウイルス（ＶＳ
Ｖ）（１５）；および牛疫ウイルス（２３）［これらの参考文献はこれにより引
用により組み込まれる］を包含する多様なウイルスに適用されているｃＤＮＡの
「レスキュー」系を使用して生じられる。麻疹ウイルスのレスキューについては
、米国を指定する公開国際特許出願第ＷＯ９７／０６２７０号（２４）；ＲＳＶ
のレスキューについては、米国を指定する公開国際特許出願第ＷＯ９７／１２０
３２号（２５）を参照されたい；これらの出願はこれにより引用により組み込ま
れる。

【００４１】簡潔には、全部のモノネガウイルス（Ｍｏｎｏｎｅｇａｖｉｒａｌｅｓ）のレ
スキュー系は以下のとおり要約し得る。すなわち、それぞれは、適するＤＮＡ依
存性ＲＮＡポリメラーゼプロモーター（例えばＴ７ＲＮＡポリメラーゼプロモ
ーター）と、増殖可能な細菌プラスミド中に挿入される自己切断型リボザイム配
列（例えば肝炎デルタリボザイム）との間に置かれるウイルスゲノム全体のクロ
ーニングされたＤＮＡ同等物を必要とする。この転写ベクターは、それから該Ｒ
ＮＡポリメラーゼ（例えばＴ７ＲＮＡポリメラーゼ）が正確なもしくはほぼ正
確な５’および３’末端をもつウイルスアンチゲノム（もしくはゲノム）の一本
鎖ＲＮＡの１個のコピーを忠実に転写し得る、容易に操作可能なＤＮＡ鋳型を提
供する。該ウイルスゲノムのＤＮＡのコピーならびに隣接するプロモーターおよ
びリボザイム配列の向きが、アンチゲノムのＲＮＡ同等物が転写されるかもしく
はゲノムのＲＮＡ同等物が転写されるかどちらかを決定する。裸の一本鎖のウイ
ルスのアンチゲノムもしくはゲノムのＲＮＡ転写物を機能的なヌクレオキャプシ
ドの鋳型中に包膜化するのに必要とされるウイルス特異的なトランスに作用する
タンパク質、すなわちウイルスヌクレオキャプシド（ＮもしくはＮＰ）タンパク
質、ポリメラーゼ会合リンタンパク質（Ｐ）およびポリメラーゼ（Ｌ）タンパク
質もまた、新たなウイルス子孫のレスキューに必要とされる。これらのタンパク
質は活性のウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを含んで成り、それはこの
ヌクレオキャプシドの鋳型を転写および複製を達成するよう従事させなければな
らない。

【００４２】麻疹ウイルスのレスキューに必要とされるトランスに作用するタンパク質は、
包膜化タンパク質Ｎならびにポリメラーゼ複合体タンパク質ＰおよびＬである。
ＲＳＶについては、ウイルス特異的なトランスに作用するタンパク質はＮ、Ｐお
よびＬ、ならびに付加的な１タンパク質Ｍ２（ＲＳＶにコードされる転写伸長因
子）を包含する。

【００４３】典型的には、これらのウイルスのトランスに作用するタンパク質は、必要とさ
れるタンパク質をコードする１種もしくはそれ以上のプラスミド発現ベクターか
ら生じられるとは言え、必要とされるトランスに作用するタンパク質のいくつか
もしくは全部が、安定な形質転換体としてこれらのウイルス特異的遺伝子および
遺伝子産物を含有かつ発現するよう工作された哺乳動物細胞内で産生されてよい
。

【００４４】レスキューのための典型的な（とは言え必ずしも限定的でない）環境は、その
中にＴ７ポリメラーゼがウイルスゲノムのｃＤＮＡを含有する転写ベクターから
アンチゲノム（もしくはゲノム）の一本鎖ＲＮＡの転写を駆動するために存在す
る適切な哺乳動物細胞環境を包含する。その後、共転写的にもしくは短くのいず
れかで、このウイルスアンチゲノム（もしくはゲノム）ＲＮＡ転写物はヌクレオ
キャプシドタンパク質により機能的鋳型中に包膜化され、そして、必要とされる
ウイルス特異的なトランスに作用するタンパク質をコードするコトランスフェク
ションされた発現プラスミドから付随して産生される必要とされるポリメラーゼ
成分により束縛される。これらの事象および過程は、ウイルスのｍＲＮＡの前も
って必要な転写、新たなゲノムの複製および増幅、ならびにそれにより新規ウイ
ルス子孫の産生すなわちレスキューにつながる。

【００４５】狂犬病、ＶＳＶおよびセンダイのレスキューのためには、Ｔ７ポリメラーゼが
組換えワクシニアウイルスＶＴＦ７−３により提供される。この系は、しかしな
がら、レスキューされたウイルスが、物理的もしくは生化学的手段、またはポッ
クスウイルスにとって良好な宿主でない細胞もしくは組織での反復される継代に
より、ワクシニアウイルスから分離されることを必要とする。ＭＶのｃＤＮＡの
レスキューのためには、この要件はＴ７ポリメラーゼならびにウイルスのＮおよ
びＰタンパク質を発現する細胞系を創製することにより回避される。レスキュー
は、ゲノム発現ベクターおよびＬ遺伝子発現ベクターをヘルパー細胞系にトラン
スフェクションすることにより達成される。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを発現す
るがしかし哺乳動物細胞中でほとんどもしくは全く感染性の子孫を生じさせない
ワクシニアウイルスの宿主範囲の突然変異体ＭＶＡ−Ｔ７の利点が、ＲＳＶ、牛
疫ウイルスおよびＭＶをレスキューするために活用される。必要な包膜化タンパ
ク質の同時発現の後に、合成の完全長のアンチゲノムのウイルスＲＮＡが包膜化
され、複製されかつウイルスのポリメラーゼタンパク質により転写され、そして
複製されたゲノムが感染性のビリオン中にパッケージングされる。こうしたアン
チゲノムに加えて、ゲノム類似物が今やセンダイおよびＰＩＶ−３について成功
裏にレスキューされている（２１，２６）。

【００４６】該レスキュー系は、かように、包膜化、転写および複製に必要なトランスに作
用するタンパク質（例えば、麻疹ウイルスについてＮ、ＰおよびＬ；ＲＳＶにつ
いてＮ、Ｐ、ＬおよびＭ２）をコードする最低１種の単離された核酸分子を含ん
で成る最低１種の発現ベクターと一緒に、（ａ）麻疹ウイルスについてはＮ、Ｐ
もしくはＣ遺伝子またはＦ遺伝子終了シグナル中の最低１個の弱毒化突然変異；
および（ｂ）ＲＳＶサブグループＢについてはＭ遺伝子終了シグナル中の最低１
個の弱毒化突然変異を有する、モノネガウイルス目（ＯｒｄｅｒＭｏｎｏｎｅ
ｇａｖｉｒａｌｅｓ）のセグメントに分けられない負センスの一本鎖ＲＮＡウイ
ルスのゲノムもしくはアンチゲノムをコードする単離された核酸分子を含んで成
る転写ベクターを含んで成る組成物を提供する。宿主細胞をその後、ちょうど記
述された最低２種の発現ベクターで形質転換もしくはトランスフェクションする
。該宿主細胞を、感染性の弱毒化ウイルスを産生するようにこれらのベクターの
共発現を可能にする条件下で培養する。

【００４７】レスキューされた感染性ウイルスをその後、最初にインビトロ手段によりその
所望の表現型（温度感受性、寒冷適応、プラークの形態、ならびに転写および複
製の減弱）について試験する。麻疹ウイルスのＮ、ＰもしくはＣ遺伝子またはＦ
遺伝子終了シグナル中、およびＲＳＶサブグループＢのＭ遺伝子終了シグナル中
の突然変異もまた、必要とされるトランスに作用する包膜化およびポリメラーゼ
活性が野生型もしくはワクチンヘルパーウイルス、または遺伝子特異的弱毒化突
然変異をもつＮ、Ｐおよび多様なＬ遺伝子を発現するプラスミドにより提供され
る、ミニレプリコン系を使用して試験する（１９，２７，８３）。

【００４８】レスキューされたウイルスの弱毒化された表現型が存在する場合、攻撃実験を
適切な動物モデルを用いて実施する。非ヒトの霊長類はヒト疾患の病因論のため
の好ましい動物モデルを提供する。これらの霊長類を、最初に、弱毒化された組
換え的に発生されたウイルスを用いて免疫し、その後野生型の形態の該ウイルス
を用いて攻撃する。サルを、接種の鼻内、気管内もしくは皮下経路を包含するが
しかしこれらに制限されない多様な経路により感染させる（２８）。実験的に感
染したアカゲザルおよびカニクイザルは、麻疹に対するワクチン誘導性の保護の
研究のための動物モデルとしてもまたはたらいている（２９）。ＲＳＶ突然変異
体の弱毒化レベルを評価するため、コトンラットもしくはマウスモデルもまた使
用してよい（３０，３１）。保護を、疾患の兆候および症状、生存、ウイルスの
発散(shedding)および抗体力価のような基準により測定する。所望の基準が合致
される場合は、該弱毒化された組換え的に発生されたウイルスはヒトでの試験の
ための実現可能なワクチン候補と考えられる。「レスキューされた」ウイルスは
、それもまた弱毒化突然変異を組み込む該ウイルスの子孫および後の世代がそう
であるように「組換え的に発生される」と考えられる。

【００４９】「レスキューされた」ウイルスがワクチンの使用のための至適のレベルに関し
て過小弱毒化もしくは過剰弱毒化される場合でさえ、これはこうした至適の株を
開発するために貴重である情報である。

【００５０】至適には、弱毒化点突然変異を含有するコドンを、該弱毒化点突然変異のみを
もつコドンによりコードされるアミノ酸を変えることなく該コドン中に第二のも
しくは第二および第三の突然変異を導入することにより安定化してよい。弱毒化
および安定化突然変異を含有する感染性ウイルスクローンもまた、上述されたｃ
ＤＮＡの「レスキュー」系を使用して生じられる。

【００５１】本発明の一態様においては麻疹ウイルスの突然変異が評価される。なぜなら、
配列データが、疾患を引き起こす野生型ウイルスおよび有効性の立証された歴史
を有する疾患を予防するワクチンについて本明細書で記述されるとおり現在入手
可能であるからである。

【００５２】麻疹ウイルスは、最初、デイヴィッド・エドモンストン（ＤａｖｉｄＥｄｍ
ｏｎｓｔｏｎ）と命名された感染患者から１９５４年に組織培養物中で単離され
た（３２）。麻疹のこのエドモンストン（Ｅｄｍｏｎｓｔｏｎ）株は、米国の現
在のワクチン（アテニュヴァックス［Ａｔｔｅｎｕｖａｘ］（商標）；メルク
シャープアンドドーム（ＭｅｒｃｈＳｈａｒｐ＆Ｄｏｈｍｅ）、フィ
ラデルフィア州ウェストポイント）でありかつ１９６８年に認可されそして有効
であることが判明しているモラテン（Ｍｏｒａｔｅｎ）を包含する多くの生弱毒
化麻疹ワクチンの先祖となった。

【００５３】１９６０年代半ばから後期に制定された攻撃的免疫感作プログラムは、報告さ
れた麻疹の症例の１９６５年の７００，０００近くから１９８３年の１５００ま
での急勾配の落下をもたらした。同時に、他のワクチン株、シュワルツ（Ｓｃｈ
ｗａｒｚ）（インスティテュートメリュー（ＩｎｓｔｉｔｕｔＭｅｒｉｅｕ
ｘ）、フランス・リヨン）、ザグレブ（Ｚａｇｒｅｂ）（ユーゴスラビア・ザグ
レブ）およびＡＩＫ−Ｃ（日本）もまたエドモンストン（Ｅｄｍｏｎｓｔｏｎ）
株から開発された（図１を参照されたい）。これらの他のワクチンもまた有効で
あることが判明しておりそして広範囲に使用されている。初期の反応原性の過小
弱毒化ワクチン株（ルベオヴァックス［Ｒｕｂｅｏｖａｘ］（商標）：メルク
シャープアンドドーム（ＭｅｒｃｈＳｈａｒｐ＆Ｄｏｈｍｅ）；これ
はエドモンストン（Ｅｄｍｏｎｓｔｏｎ）Ｂ株と同一であるかも知れない）が小
児で麻疹様疾病を生じさせ、そしてその使用は従って中断された。そかしながら
、それがさらに成功裏に弱毒化されてモラテン（Ｍｏｒａｔｅｎ）ワクチン株を
製造した（図１を参照されたい）（３３）。生麻疹ウイルスワクチンは、有効な
ワクチンの開発の成功物語を提供し、また、セグメントに分けられない負センス
の一本鎖ＲＮＡウイルスのあいだのウイルスワクチンの弱毒化の分子機構を理解
するためのモデルを提供する。

【００５４】ヒトの罹患率および死亡率の一主要原因としてのその重大性のため、麻疹ウイ
ルス（ＭＶ）は極めて広範囲に研究されている。ＭＶは、それぞれ別個の生物学
的機能を有する２区画、すなわちリポタンパク質膜およびリボ核タンパク質粒子
コアから構成される大型の比較的球状のエンベロープをもつ粒子である（３４）
。該ビリオンのエンベロープは、３種のウイルスに特定の(virus-specified)タンパク質により修飾された宿主細胞由来の血漿膜である。すなわち、ヘマグルチ
ニン（Ｈ；およそ８０キロダルトン（ｋＤ））および融合（Ｆ₁,₂；およそ６０ｋＤ）糖タンパク質がビリオン表面上で突出し、そしてウイルス粒子に宿主細胞
付着および進入の能力を与える（１６）。Ｈおよび／もしくはＦに対する抗体は
、それらが感染を開始するウイルスの能力を中和するため、保護的と考えられる
（３５，３６，３７）。マトリックス（Ｍ；およそ３７ｋＤ）タンパク質は該膜
の内表面を内張りする両親媒性タンパク質であり、これはビリオンの形態形成を
編成しそして従ってウイルスの繁殖(reproduction)を完成すると考えられる（３
８）。該ビリオンのコアは１５，８９４ヌクレオチド長のゲノムＲＮＡを含有し
、それに、鋳型活性が、およそ２６００分子のおよそ６０ｋＤのヌクレオキャプ
シド（Ｎ）タンパク質とのその緊密な会合により与えられる（３９，４０，４１
）。ポリメラーゼ補助因子（Ｐ；およそ７０ｋＤ）、およびおそらくなお他のウ
イルスに特定のタンパク質ならびに宿主にコードされたタンパク質と協力してＭ
Ｖゲノム配列を転写かつ複製する、酵素的レベルのウイルスのＲＮＡ依存性ＲＮ
Ａポリメラーゼ（Ｌ；およそ２４０ｋＤ）が、このおよそ１ミクロン長さのらせ
ん状のリボ核タンパク質粒子とゆるく会合される（４２）。

【００５５】国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ９７／１６７１８号に先立ち、ＭＶゲノムの全ヌ
クレオチド配列（エドモンストン（Ｅｄｍｏｎｓｔｏｎ）Ｂ実験室株およびＡＩ
Ｋ−Ｃワクチン株についてのみ）、コーディング能力ならびに構成が報告された
（３４）。６種のビリオンの構造タンパク質が６種の連続的な重なり合わない遺
伝子によりコードされ、これらは以下、すなわち３’−Ｎ−Ｐ−Ｍ−Ｆ−Ｈ−Ｌ
−５’のように整列される。今までのところは不確実な機能の２種の付加的なＭ
Ｖ遺伝子産物もまた同定された。Ｃ（およそ２０ｋＤ）およびＶ（およそ４５ｋ
Ｄ）として知られるこれらの２種の非構造タンパク質は、双方ともＰ遺伝子によ
り［前者はＰのｍＲＮＡ内の第二の読み枠により；後者はＰのアミノ末端配列お
よび新たなＺｎフィンガー様のシステイン豊富なカルボキシ末端ドメインを有す
るハイブリッドタンパク質をコードする共転写的にエディティングされたＰ遺伝
子由来のｍＲＮＡにより］コードされる（１６）。

【００５６】ウイルスに特定のタンパク質をコードする配列に加え、ＭＶゲノムは、関連す
るウイルスの転写および複製経路を指図するものに似た特徴的なタンパク質をコ
ードしないドメインを含有する（１６，４３）。これらの調節シグナルは、ＭＶ
ゲノムの３’および５’端、ならびに各シストロン間の境界にわたる短い内的領
域中に存する。前者は、ゲノムの転写、ゲノムおよびアンチゲノムの包膜化なら
びに複製を指図する推定のプロモーターおよび／もしくは調節配列要素をコード
する。後者は、各一シストロンのウイルスｍＲＮＡの転写終止およびポリアデニ
ル酸化、そしてその後次の遺伝子の転写の再開始の合図をする。一般に、ＭＶポ
リメラーゼ複合体は、他のセグメントに分けられない負鎖のＲＮＡウイルスのＲ
ＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼとほぼ同じようにこれらのシグナルに応答するよ
うである（１６，４３，４４，４５）。

【００５７】転写はＭＶゲノムの３’端もしくはその近くで開始し、そしてその後５’の方
向に進行して一シストロンのｍＲＮＡを生じさせる（４１，４３，４６）。ポリ
メラーゼがＭＶのゲノムの鋳型を横断する際に、それは推定の終止／開始シグナ
ルに遭遇し、それは、３’から５’の順序で、半保存された転写終止／ポリアデ
ニル酸化シグナル（Ａ／ＧＵ／ＣＵＡＡ／ＵＮＮＡ₄、ここでＮは４種の塩基のいずれであってもよい）［ここで各一シストロンのＲＮＡが完成される
］；転写されない遺伝子間の三ヌクレオチドの句読点(punctuation mark)（ＣＵ
Ｕ；それがＣＧＵであるＨ：Ｌ境界でを除く）；および次の遺伝子の転写開始の
ための半保存された開始シグナル（ＡＧＧＡ／ＧＮＮＣ／ＡＡＡ／Ｇ
ＧＡ／Ｕ、ここでＮは４種の塩基のいずれであってもよい）である（４６，
４７）。いくつかのポリメラーゼ複合体は再開始することに失敗するため、各Ｍ
ＶのｍＲＮＡの夥しさは、ゲノムの３’端からのコードする遺伝子の距離と平行
して減少する。このｍＲＮＡの勾配は各ウイルスに特定のタンパク質の相対的夥
しさに直接対応する。これは、ＭＶタンパク質の発現が最終的には転写レベルで
制御されることを示す（４５）。

【００５８】３’および５’のＭＶゲノムの末端は、ＶＳＶのリーダーおよびトレーラー(t
railer)ＲＮＡをコードする領域への別個の平行するもの(parallels)を伴うタン
パク質をコードしない配列を含有する（４３）。ヌクレオチド１〜５５はゲノム
の３’末端とＮ遺伝子の始まりとの間の領域を規定する一方、３７の付加的ヌク
レオチドをＬ遺伝子の端と該ゲノムの５’末端との間に見出し得る。しかしなが
ら、ＶＳＶ、もしくはパラミクソウイルス（ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｕｓｅｓ）
のセンダイおよびＮＤＶさえと異なり、ＭＶはこれらの末端領域を短い改変され
ない（＋）もしくは（−）のセンスのリーダーＲＮＡに転写しない（４８，４９
，５０）。代わりに、完全長のポリアデニル酸化されたリーダー：Ｎ、リーダー
：Ｎ：Ｐ、リーダー：Ｎ：Ｐ：Ｍおよびもちろん完全長のアンチゲノムのＭＶの
ＲＮＡを包含するリーダーの読み合わせ(readthrough)転写物が転写される（４９，５０）。従って、ＶＳＶの一本鎖の負の極性のゲノムの転写から複製への切
り替えを決定する重要な操作上の要素であるこの短いリーダー転写物（５１，５
２，５３）がＭＶで非存在のようである。これは、この決定的な繁殖事象につい
ての代替モデルの考慮および探究につながる（４３）。

【００５９】麻疹ウイルス、ならびにラブドウイルスを除く全部の他のモノネガウイルス（
Ｍｏｎｏｎｅｇａｖｉｒａｌｅｓ）は、リーダーおよびトレーラーをコードする
配列の限界を越えてその末端の調節ドメインを伸長しているようである（４３）
。麻疹に関しては、これらの領域は、１０７個の３’のゲノムのヌクレオチド（
「伸長されたプロモーター」ともまた称される「３’のゲノムプロモーター領域
」、これはリーダー領域をコードする５２ヌクレオチド、次いで３個の遺伝子間
ヌクレオチド、およびＮのｍＲＮＡの５’非翻訳領域をコードする５２ヌクレオ
チドを含んで成る）、ならびに１０９個の５’端のヌクレオチド（ＬのｍＲＮＡ
の３’非翻訳領域をコードする６９個、遺伝子間の三ヌクレオチド、およびトレ
ーラーをコードする３７ヌクレオチド）を包含する。これらの３’末端内で、ゲ
ノムおよびアンチゲノム双方のおよそ１００ヌクレオチドが、共有されるヌクレ
オチド配列の２個の短い領域である：すなわち、ゲノムおよびアンチゲノムの絶
対的３’端の１６ヌクレオチドのうち１４個が同一である。それらの末端に対し
内的な、絶対配列の同一性の１２ヌクレオチドの付加的な一領域が位置を突き止
められている。ＭＶゲノムの転写が開始しなければならずかつ該アンチゲノムの
複製が開始しなければならない部位およびその近くのそれらの位置は、これらの
短い独特の配列のドメインが伸長されたプロモーター領域を包含することを示唆
する。

【００６０】これらの別個の配列要素が、転写開始の代替の部位、すなわちＮ遺伝子の開始
部位で転写開始を指令する内的ドメインおよびアンチゲノム産生を指図する３’
末端ドメインを命令するのかも知れない（４３，４９，５１）。転写および複製
のシスに作用する決定子としてのそれらの調節の役割に加え、これらの３’の伸
長されたゲノムおよびアンチゲノムのプロモーター領域は、それぞれアンチゲノ
ムおよびゲノムのＲＮＡの発生期の５’端をコードする。これらの発生期のＲＮ
Ａ内に、Ｎタンパク質の凝集(nucleation)のための今までのところは同定されな
いシグナル、すなわちヌクレオキャプシドの鋳型の形成にそしてその後転写の増
幅および複製に必要とされる別の重要な調節要素が存する。図２は、これらの高
度に保存された推定のシスに作用する調節ドメインの位置および配列を図解で示
す。

【００６１】位置、大きさおよび間隔が類似の末端のタンパク質をコードしない領域が、パ
ラミクソウイルス属（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）の他のメンバーのゲノ
ム中に存在するとは言え、それらの絶対的末端のヌクレオチドの８〜１１個のみ
がＭＶにより共有される（４３，５５）。モルビリウイルス属（Ｍｏｒｂｉｌｌ
ｉｖｉｒｕｓ）のイヌジステンパーウイルス（ＣＤＶ）のゲノムの末端は、その
ＭＶの関係物(relatives)とのより大きな程度の相同性を表わす。すなわち、絶対的３’末端の１８個のうち１６個、およびそれらの５’端の１８個のうち１７
個を包含する、これら２種のウイルスのリーダーおよびトレーラー配列のヌクレ
オチドの７３％が同一である（５６）。ＭＶの伸長されたプロモーターのものに
対する付属の内的ＣＤＶゲノムのドメインを共有する相同性は見出されていない
。しかしながら、ＣＤＶのゲノムのヌクレオチド８５と１０４、および１５，５
８７と１５，６０６との間に存する２０ヌクレオチド長の伸長が存在し、ここで
２０ヌクレオチドのうち１５個は相補的である（ジーンバンク（ＧｅｎｅＢａ
ｎｋ）受託番号ＡＦ１４９５３）。これは、ＣＤＶが、ＭＶと同様、その非コー
ディングの３’のゲノムおよびアンチゲノムの端内に付加的領域を含有し、これ
は、重要なシスに作用するプロモーターおよび／もしくは調節シグナルを提供し
ているかも知れない（５６）ことを示す。

【００６２】加えて、３’のリーダー領域の正確な長さ（５５ヌクレオチド）は、パラミク
ソウイルス科（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）のいくつかのメンバー（ＭＶ
、ＣＤＶ、ＰＩＶ−３、ＢＰＶ−３、ＳＶおよびＮＤＶ）のあいだで同一である。これらの伸長されたタンパク質をコードしない領域の重要性についてのさら
なる証拠は、亜急性硬化性全脳炎（ＳＳＰＥ）の脳組織から最近クローン化され
た多数の別個の戻しコピー(copy-back)の不完全妨害（ＤｅｆｅｃｔｉｖｅＩｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ）ゲノム（ＤＩ）の分析から生じる。９５個の５’末端の
ゲノムのヌクレオチドより短い幹をもつＤＩは見出されなかった。これは、ＭＶ
のＤＩのＲＮＡの複製および包膜化に必要とされる最小のシグナルが、付加的な
内的な推定の調節ドメインを包含するように３７ヌクレオチド長のトレーラー配
列を十分に越えて伸長することを示す（５７）。

【００６３】全部のパラミクソウイルス（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｕｓ）で、複製、転写お
よび包膜化を包含する必須のウイルス機能に必要とされるシスに作用するシグナ
ルが、非コーディングゲノム末端に含有される。機能性のための拘束力のあるト
ランスに作用する要素はＮ、ＰおよびＬ遺伝子中に含有される。これらの領域の
いずれかにおける突然変異は、ウイルスの転写／複製の効率の減弱を包含する生
命機能の変化をもたらすかも知れない。

【００６４】シスに作用する配列要素およびトランスに作用するタンパク質遺伝子中の弱毒
化能力が、それらのゲノムの配列分析によりいくつかのウイルス系で立証された
（５８，５９）。

【００６５】本発明の麻疹の態様は、先祖のエドモンストン（Ｅｄｍｏｎｓｔｏｎ）の野生
型ＭＶ単離物由来の入手可能な麻疹ワクチン株と一緒にこの単離物のヌクレオチ
ド配列の分析を必要とした（図１を参照されたい）。独立した他の野生型単離物
を同様に比較の目的上検査した。とりわけ、３’のゲノムプロモーター領域およ
びＬ遺伝子以外の領域が強調され；それらの領域は国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ
９７／１６７１８号の焦点であった。

【００６６】４種の野生型および５種のワクチンの麻疹株の（正鎖のアンチゲノムのメッセ
ージセンスにおける）ヌクレオチド配列を、本明細書に含有される適切な配列番
号への言及とともに以下のとおり示す。すなわち、ウイルスヌクレオチド配列野生型エドモンストン（Ｅｄｍｏｎｓｔｏｎ）配列番号１１９７７配列番号２１９８３配列番号３モンティフィオーレ（Ｍｏｎｔｅｆｉｏｒｅ）配列番号４ワクチンルベオヴァックス［Ｒｕｂｅｏｖａｘ］（商標）配列番号５モラテン（Ｍｏｒａｔｅｎ）配列番号６ザグレブ（Ｚａｇｒｅｂ）配列番号７ＡＩＫ−Ｃ配列番号８上に列挙された各麻疹ウイルスゲノムは長さ１５，８９４ヌクレオチドである
。Ｎ遺伝子の翻訳はヌクレオチド１０８−１１０のコドンで開始し；翻訳終止コ
ドンはヌクレオチド１６８３−１６８５にある。翻訳されたＮタンパク質は５２
５アミノ酸長である。Ｐ遺伝子の翻訳はヌクレオチド１８０７−１８０９のコド
ンで開始し；翻訳終止コドンはヌクレオチド３３２８−３３３０にある。翻訳さ
れたＰタンパク質は５０６アミノ酸長である。Ｃ遺伝子の翻訳はヌクレオチド１
８２９−１８３１のコドンで開始し；翻訳終止コドンはヌクレオチド２３８７−
２３８９にある。翻訳されたＣタンパク質は１８９アミノ酸長である。Ｆ遺伝子
の翻訳はヌクレオチド５４４９−５４５１のコドンで開始し；翻訳終止コドンは
ヌクレオチド７１０８−７１１０にある。翻訳されたＦタンパク質は５５３アミ
ノ酸長である。Ｆ遺伝子の終止／ポリアデニル酸化シグナルはヌクレオチド７２
３７−７２４７の１１ヌクレオチドの遺伝子終了シグナル、次いでヌクレオチド
７２４８−７２５０の遺伝子間領域およびヌクレオチド７２５１−７２６０のＨ
遺伝子開始シグナルを包含する。

【００６７】１９８３野生型麻疹ウイルスのヌクレオチド２４９９が配列番号３で「Ｇ」と
して示されることに注目されたい。事実、該塩基は実際には「Ｇ」および「Ｃ」
の混合物である。ルベオヴァックス［Ｒｕｂｅｏｖａｘ］（商標）ワクチンウイ
ルスのヌクレオチド２１４３が配列番号５で「Ｔ」として示されることにもまた
注目されたい。配列決定された９クローンでは、この塩基は７種で「Ｔ」および
２種で「Ｃ」であり；従って、この塩基は「Ｔ」もしくは「Ｃ」である可能性が
ある。

【００６８】加えて、シュワルツ（Ｓｃｈｗａｒｚ）ワクチンウイルスゲノムはモラテン（
Ｍｏｒａｔｅｎ）ワクチンウイルスゲノムのもの（配列番号６）に同一である。

【００６９】ＭＶゲノムのコーディングおよび非コーディング（シストロン間）領域の分析
を実施した。エドモンストン（Ｅｄｍｏｎｓｔｏｎ）野生型単離物、ワクチン株
、および他の独立に単離された野生型ウイルスのＮ、ＰおよびＣの遺伝子および
タンパク質配列を識別するヌクレオチドおよびアミノ酸の差異ならびにＦ／Ｈシ
ストロン間領域中のＦ遺伝子終了シグナルを識別するヌクレオチドの差異を比較
かつ整列した（以下の実施例１の表３〜５を参照されたい）。

【００７０】表３に示されるとおり、先祖のエドモンストン（Ｅｄｍｏｎｓｔｏｎ）野生型
単離物に比較してＭＶワクチン株のＮ遺伝子中に５個のヌクレオチド変化が存在
する。これらの変化のうちヌクレオチド２７５および６２３の２個はアミノ酸配
列に対する変化をもたらさなかった保存的変化であった。ヌクレオチド４９２、
５５０および１５４２の３個の変化は、ワクチン株のあるもののアミノ酸配列に
対する変化をもたらした。すなわち（１）ヌクレオチド４９２の「Ｃ」から「Ａ
」への変化は、ＡＩＫ−Ｃワクチン株のアミノ酸１２９のグルタミンからリシン
への突然変異をもたらし；（２）ヌクレオチド５５０の「Ａ」から「Ｇ」への変
化はモラテン（Ｍｏｒａｔｅｎ）およびシュワルツ（Ｓｃｈｗａｒｚ）ワクチン
株のアミノ酸１４８のグルタミン酸からグリシンへの突然変異をもたらし；そし
て（３）ヌクレオチド１５４２の「Ｔ」から「Ａ」への変化はルベオヴァックス
［Ｒｕｂｅｏｖａｘ］（商標）、モラテン（Ｍｏｒａｔｅｎ）およびシュワルツ
（Ｓｃｈｗａｒｚ）ワクチン株のアミノ酸４７９のセリンからトレオニンへの突
然変異をもたらした。これら３種の突然変異のいずれも後の野生型単離物のいず
れにも存在しなかったため、これら３種のＮ遺伝子の突然変異は該ワクチン株中
で潜在的に弱毒化している。

【００７１】理論により束縛されることなく、これら３種のＮ遺伝子の突然変異の弱毒化表
現型は以下の論考に基づくかも知れない。Ｎタンパク質は麻疹ウイルスの生命環
中で多数の機能を果たさなければならない。それは該ウイルスのゲノムＲＮＡお
よびＮの他のコピーと相互作用してＭＶゲノムが常に見出されるヌクレオキャプ
シド複合体を形成することが可能でなければならない。それはポリメラーゼ複合
体と相互作用して転写および複製を可能にする。それが複製複合体から離れたＰ
タンパク質と相互作用することもまた見出されている。これらの機能の全部が、
突然変異が該ウイルスの複製効率に影響を及ぼすことにより弱毒化をもたらすこ
とができる点である可能性がある。

【００７２】バンカンプ（Ｂａｎｋａｍｐ）らの欠失分析（６０）に基づけば、エドモンス
トン（Ｅｄｍｏｎｓｔｏｎ）ワクチンの系統で観察される変化は以下に概説され
るようなＮタンパク質の機能性に影響を及ぼす領域にある。すなわち（１）アミノ酸１２９（ＡＩＫ−Ｃ中のグルタミンからリシン）およびアミノ
酸１４８（モラテン（Ｍｏｒａｔｅｎ）およびシュワルツ（Ｓｃｈｗａｒｚ）中
のグルタミン酸からグリシン）の変化は、双方とも、溶液中のＮおよびＰタンパ
ク質の相互作用に必要な領域にある。この相互作用は、Ｎタンパク質が非ヌクレ
オキャプシド特異的様式で凝集しないようにするのを助ける。Ｐタンパク質はま
た、包膜化での使用のため複製するゲノムにＮタンパク質を送達するシャペロン
としてはたらくとも思われる。センダイウイルスにおいては、最初の４００アミ
ノ酸はＲＮＡを包膜化する能力にもまた関与するドメインを含んで成り、この領
域の少なくともいくつかの部分がＲＮＡと相互作用することを示唆する。

【００７３】（２）アミノ酸４７９での変化（ルベオヴァックス［Ｒｕｂｅｏｖａｘ］（商
標）、モラテン（Ｍｏｒａｔｅｎ）およびシュワルツ（Ｓｃｈｗａｒｚ）でのセ
リンからトレオニン）は、欠失される場合に構造化されていない凝集物の形成を
もたらす領域内にあり；これは、それがＮ：Ｎ相互作用の領域であることを示唆
する。Ｎタンパク質のこのカルボキシ末端領域はまた、センダイウイルスでヌク
レオキャプシドに集成される場合にＰタンパク質と相互作用することも示されて
いる。加えて、アミノ酸４００からカルボキシ末端（アミノ酸５２５）までの配
列は、該タンパク質の残部に比較して野生型のＭＶのＮタンパク質のあいだで顕
著により高レベルの変動を示す。

【００７４】表４に示されるとおり、先祖のエドモンストン（Ｅｄｍｏｎｓｔｏｎ）野生型
単離物に比較して、ＭＶワクチン株のＰ遺伝子中の３ヌクレオチドの変化および
Ｃ遺伝子中の３ヌクレオチドの変化が存在する。ヌクレオチド２４８０での「Ａ
」から「Ｇ」へのＰ遺伝子中の第一の変化は、全部のワクチン株のアミノ酸２２
５でのグルタミン酸からグリシンへの突然変異をもたらしたが；しかしながら、
この変化は後の野生型単離物のいずれにも存在しなかった。Ｐタンパク質中のこ
の独特の突然変異は、より少なく保存されたモルビリウイルス属（Ｍｏｒｂｉｌ
ｌｉｖｉｒｕｓ）のアミノ酸の一にある。すなわち、それは牛疫ウイルスの野生
型およびワクチンの双方の株でグルタミン酸、また、イヌジステンパーウイルス
およびアザラシジステンパーウイルス株でシステインである（５８）。しかしな
がら、この独特の突然変異は検査された全部のＭＶワクチン株に共通であるがし
かし後の野生型単離物中に存在しなかったため、それは潜在的に弱毒化する突然
変異とみられる。

【００７５】ＰおよびＶのｍＲＮＡは同一の開始コドンを共有し、そしてＰおよびＶタンパ
ク質の最初の２３１アミノ酸は同一である。ＶのｍＲＮＡはＰのｍＲＮＡのヌク
レオチド２４９８と２４９９との間に余分の「Ｇ」を有する。エディティングが
、余分の鋳型に指図されない「Ｇ」残基がヌクレオチド２４９８と２４９９との
間に挿入される場合に転写の間に起こり、読み枠のシフトを引き起こし、それに
よりＰタンパク質のカルボキシ末端の２７６アミノ酸がＶタンパク質の６８アミ
ノ酸のシステイン豊富なカルボキシ末端で置き換えられる。しかしながら、アミ
ノ酸２２５をコードする突然変異は余分な「Ｇ」の前に配置され、その結果突然変異はＰおよびＶタンパク質双方にとって潜在的に弱毒化している。現時点で
はＶタンパク質の機能は未知である。

【００７６】ヌクレオチド２６３０の「Ｇ」から「Ａ」へのＰ遺伝子中の第二の変化は、ア
ミノ酸２７５のシステインからチロシンへの突然変異をもたらした。ヌクレオチ
ド３１２２の「Ｔ」から「Ｃ」へのＰ遺伝子中の第三の変化はアミノ酸４３９の
ロイシンからプロリンへの突然変異をもたらした。これら２種の突然変異はＡＩ
Ｋ−Ｃワクチン株に独特であり（それらは他のワクチン株もしくは野生型単離物
のいずれにも存在しなかった）、そして従ってそれらは潜在的に弱毒化するとみ
られる。

【００７７】ヌクレオチド２０４６の「Ｃ」から「Ｔ」へのＣ遺伝子中の第一の変化は、全
部の後の野生型単離物ならびに全部のワクチン株のアミノ酸７３のアラニンから
バリンへの突然変異をもたらした。ワクチン株での（しかし先祖の野生型株でで
はない）この突然変異の存在のため、この突然変異は潜在的に弱毒化するとみら
れる。

【００７８】ヌクレオチド２１３９の「Ｔ」から「Ｃ」へのＣ遺伝子中の次の変化は、ルベ
オヴァックス［Ｒｕｂｅｏｖａｘ］（商標）、モラテン（Ｍｏｒａｔｅｎ）およ
びシュワルツ（Ｓｃｈｗａｒｚ）ワクチン株のアミノ酸１０４のメチオニンから
トレオニンへの突然変異をもたらした。この突然変異は後の野生型単離物のいず
れにも存在しなかったため、このＣ遺伝子の突然変異はワクチン株で潜在的に弱
毒化している。

【００７９】ヌクレオチド２２２９の「Ｃ」から「Ａ」へのＣ遺伝子の第三の変化は、アミ
ノ酸１３４のセリンからチロシンへの突然変異をもたらした。この突然変異はＡ
ＩＫ−Ｃワクチン株に独特であり（それは他のワクチン株もしくは他の野生型株
のいずれにも存在しなかった）、そして従ってそれは潜在的に弱毒化するとみら
れる。

【００８０】各ＭＶ遺伝子の転写の開始および終止を制御するシスに作用する要素を含んで
成る領域は、検査された全部の麻疹ウイルスのあいだで高度に保存されることが
見出された。１例を除き、遺伝子開始および遺伝子終了シグナルの配列は分析さ
れた全部のウイルスについて同一であった。

【００８１】しかしながら、表５に示されるとおり、先祖の野生型ＭＶ単離物、他の誘導体
ワクチン株および他の野生型単離物と比較して、ワクチン株の２種（モラテン（
Ｍｏｒａｔｅｎ）およびシュワルツ（Ｓｃｈｗａｒｚ））で（アンチゲノムのメ
ッセージセンスの）ヌクレオチド７２３７−７２４７にわたるＦ遺伝子終了シグ
ナル中に１個の突然変異が存在した。すなわち、ヌクレオチド位置７２４３で、
モラテン（Ｍｏｒａｔｅｎ）およびシュワルツ（Ｓｃｈｗａｒｚ）は「Ａ」を有
した一方、野生型単離物および他のワクチン株は「Ｔ」を有した。

【００８２】このＦ遺伝子終了シグナルの突然変異は転写終止の効率に影響を及ぼすと思わ
れ、それは順にＦ遺伝子発現、ならびに下流のＨ遺伝子発現のレベルに影響を及
ぼす可能性がある。ＦおよびＨ遺伝子発現の減少は、潜在的に、モラテン（Ｍｏ
ｒａｔｅｎ）およびシュワルツ（Ｓｃｈｗａｒｚ）ワクチン株の弱毒化の部分的
原因である。これはＭＶのＦ遺伝子発現の減少が弱毒化の一要因であるかもしれ
ない（６１）という示唆と矛盾しない。遺伝子開始および遺伝子終了シグナル中
の突然変異の重要性は、ＲＳＶのＭ２遺伝子開始シグナル中の変化が該ウイルス
に対し甚大な弱毒化効果を有し、そして該ウイルスのｔｓ表現型を伴った（６２
）という観察結果により例示された。

【００８３】表３および前述の論考に基づけば、ＭＶのＮタンパク質の重要な弱毒化部位は
以下のとおり、すなわちアミノ酸残基１２９（グルタミン→リシン）、１４８（
グルタミン酸→グリシン）および４７９（セリン→トレオニン）である。表４お
よび前述の論考に基づけば、ＰおよびＣタンパク質の重要な弱毒化部位は以下の
とおり、すなわちＰタンパク質についてアミノ酸残基２２５（グルタミン酸→グ
リシン）、２７５（システイン→チロシン）および４３９（ロイシン→プロリン
）、またＣタンパク質についてアミノ酸残基７３（アラニン→バリン）、１０４
（メチオニン→トレオニン）および１３４（セリン→チロシン）である。

【００８４】これらのアミノ酸変化の原因であるヌクレオチド変化が下の実施例１の表３お
よび４に示されるものに制限されないことが理解され；これらのアミノ酸に翻訳
されるコドンをもたらすヌクレオチド中の全部の変化が本発明の範囲内にある。

【００８５】加えて、表５および前述の論考にもしくは基づけば、Ｆ遺伝子終了シグナルの
重要な弱毒化突然変異は（アンチゲノムのメッセージセンス中の）ヌクレオチド
７２４３（Ｔ→Ｃ）である。

【００８６】本発明のさらなる一態様において、麻疹ウイルスの表現型は、上に言及された
Ｎ、ＰもしくはＣ遺伝子またはＦ遺伝子終了シグナルの突然変異の１個もしくは
それ以上を、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ９７／１６７１８号に記述される同等
の３’のゲノムプロモーター領域およびＬ遺伝子の突然変異のそれぞれの１種も
しくはそれ以上と組み合わせることによりさらに弱毒化され、それらは以下のと
おりである。すなわち、ＭＶの３’のゲノムプロモーター領域について、突然変
異は、（アンチゲノムのメッセージセンス中の）ヌクレオチド２６（Ａ→Ｔ）、
ヌクレオチド４２（Ａ→ＴもしくはＡ→Ｃ）およびヌクレオチド９６（Ｇ→Ａ）
である一方、Ｌタンパク質については、突然変異はアミノ酸残基３３１（イソロ
イシン→トレオニン）、１４０９（アラニン→トレオニン）、１６２４（トレオ
ニン→アラニン）、１６４９（アルギニン→メチオニン）、１７１７（アスパラ
ギン酸→アラニン）、１９３６（ヒスチジン→チロシン）、２０７４（グルタミ
ン→アルギニン）および２１１４（アルギニン→リシン）である。再度、これら
のアミノ酸に翻訳されるコドンをもたらすヌクレオチド中の全部の変化が本発明
の範囲内にあることが理解される。

【００８７】ヒト呼吸合胞体ウイルス（ＲＳＶ）は別のセグメントに分けられない負センス
の一本鎖のエンベロープをもつＲＮＡウイルスである。ＲＳＶはニューモウイル
ス亜科（Ｐｎｅｕｍｏｖｉｒｉｎａｅ）およびニューモウイルス属（Ｐｎｅｕｍ
ｏｖｉｒｕｓ）に属する（表１を参照されたい）。

【００８８】ＡおよびＢと呼称されるヒトＲＳＶの２種の主要なサブグループが、モノクロ
ーナル抗体を用いてＦおよびＧ表面糖タンパク質の反応性に基づいて同定された
（６３）。より最近、ＲＳＶ株のＡおよびＢの系統が配列分析により確認された
（６４，６５）。このウイルスのウシ、ヒツジおよびヤギの株もまた単離された
。該ウイルスの宿主特異性はＧ付着タンパク質と最も明瞭に関連し、これはヒト
とウシ／ヒツジ株との間で高度に不一致であり（６６，６７）、そして少なくと
も部分的にレセプター結合により影響されることができる。

【００８９】ＲＳＶは幼児および小児での重大なウイルス性肺炎および気管支炎の主原因で
ある。重大な疾患、すなわち下部呼吸器系疾患（ＬＲＤ）は生後６ヶ月未満の幼
児で最も流行している。それは、最も普遍的には、未免疫の幼児のＲＳＶへの最
初の曝露で起こる。ＲＳＶは付加的に喘息および過活動性気道と関連し、また、
それは気管支肺異形成および先天性心疾患（ＣＨＤ）の「高リスク」の小児での
死亡率の重大な一原因である。それはまた、小児で中耳炎に罹りやすくする普遍
的なウイルスの呼吸器感染症の一でもある。成人では、ＲＳＶは一般に合併症を
伴わない上気道の疾病として現われるが；しかしながら、高齢者では、それは重
大なＬＲＤ、とりわけ細菌性の気管支炎および肺炎の発症における罹りやすくす
る一要因としてインフルエンザと比肩しうる。疾患は、常に、重症の免疫無防備
状態（他の器官への播種が起こる可能性がある）を除き呼吸器系に限定される。
ウイルスは、ウイルスを含有する呼吸器の分泌物で汚染された媒介物により他者
に広げられ、また、感染は、鼻、口もしくは結膜の粘膜を通じて開始する。

【００９０】ＲＳＶ疾患は季節性であり、そしてウイルスは通常冬の月、例えば北緯で１１
月から４月までにのみ単離される。該ウイルスは遍在性であり、そして小児の９
０％以上が２歳までに最低１回は感染している。複数の株が共流布する。（イン
フルエンザＡウイルスでみられるもののような）抗原性の変動の直接の証拠は存
在しないが、しかし、Ｇタンパク質およびＳＨタンパク質の超可変領域中のアミ
ノ酸変化の蓄積を立証する配列研究が、免疫圧がウイルス進化を駆動するかも知
れないことを示唆する。

【００９１】マウスおよびコトンラットモデルにおいては、ＲＳＶのＦおよびＧタンパク質
の双方が中和抗体を導き出し、そして、これらのタンパク質単独での免疫感作は
再感染に対する長期の保護を提供する（６８，６９）。

【００９２】ヒトにおいては、ＲＳＶに対する完全な免疫は発生せず、そして一生を通じて
再感染が発生するが（７０，７１）；しかしながら、免疫因子が重症の疾患に対
し保護することができるという証拠が存在する。疾患の重症度の減少は２回もし
くはそれ以上の以前の感染に関連し、また、２種の主要なＲＳＶサブグループの
１種に感染した小児は相同なサブグループへの再感染に対していくぶん保護され
るかも知れない（７２）という証拠が存在し、生弱毒化ウイルスワクチンが重大
な罹患率および死亡率を予防するのに十分な保護を提供するかも知れないことを
示唆する観察結果である。ＲＳＶへの感染は抗体および細胞媒介性双方の免疫を
導き出す。ＦおよびＧタンパク質に対する血清中和抗体は、いくつかの研究では
ＬＲＤからの保護を伴ったが、とは言え上気道疾患（ＵＲＤ）の減少は立証され
ていない。幼児での高レベルの血清抗体はＬＲＤに対する保護を伴い、また、高
いＲＳＶ中和抗体力価をもつ静脈内免疫グロブリンの投与が高リスクの小児で重
症の疾患に対し保護することが示された（７１，７３，７４）。局所免疫、およ
びとりわけ鼻の抗体の役割が検討されている。

【００９３】ＲＳＶのビリオンはリポタンパク質のエンベロープ内に含有されるリボ核タン
パク質コアより成る。ニューモウイルスのビリオンは全部の他のパラミクソウイ
ルスのものに大きさおよび形状が類似である。陰性染色および電子顕微鏡検査に
より可視化される場合、ビリオンは形状が不規則であり、かつ直径が１５０から
３００ｎｍの範囲にわたる（７５）。このウイルスのヌクレオキャプシドは、そ
のらせんの直径が１８ｎｍよりはむしろ１２〜１５ｎｍであることを除いて他の
パラミクソウイルスのものに類似の対称的ならせんである。該エンベロープは、
宿主の膜由来である脂質二重層より成り、そしてウイルスにコードされた膜貫通
表面糖タンパク質を含有する。このウイルスの糖タンパク質は付着および浸透を
媒介し、そしてビリオンの突起に別個に組織される。パラミクソウイルスの亜科
の全メンバーは血球凝集活性を有するが、しかしこの機能はニューモウイルスの
規定する特徴でなく、ＲＳＶに非存在だがしかしマウスニューモウイルス（ＰＶ
Ｍ）に存在する（７６）。ノイラミニダーゼ活性は、パラミクソウイルス属（Ｐ
ａｒａｍｙｘｏｖｉｒｕｓ）、ルブラウイルス属（Ｒｕｂｕｌａｖｉｒｕｓ）の
メンバーに存在し、そしてモルビリウイルス属（Ｍｏｒｂｉｌｌｉｖｉｒｕｓ）
およびニューモウイルス属（Ｐｎｅｕｍｏｖｉｒｕｓ）に非存在である（７６）
。

【００９４】ＲＳＶはＡおよびＢと呼称される２種のサブグループを保有する。野生型ＲＳ
Ｖ（株２Ｂ）のゲノムは１５，２１８ヌクレオチドの負センスのＲＮＡ（配列番
号９）の一本鎖であり、それは１１種の遺伝子産物をコードする１０種の主要な
サブゲノム(subgenomic)ｍＲＮＡに転写される。該１０種のｍＲＮＡのそれぞれ
は１個の主要なポリペプチド鎖をコードする。すなわち、３種は膜貫通表面タン
パク質（Ｇ、ＦおよびＳＨ）であり；３種は該ウイルスのヌクレオキャプシドを
形成するようにゲノムＲＮＡと会合されるタンパク質（Ｎ、ＰおよびＬ）であり
；２種は感染した細胞中で蓄積するがしかし極微量でビリオン中にもまた存在し
そして転写および複製の調節である役割を演じるかも知れない非構造タンパク質
（ＮＳ１およびＮＳ２）であり；１種はグリコシル化されないビリオンマトリッ
クスタンパク質（Ｍ）であり；そして最後が、ＲＳＶに特定の転写伸長因子であ
ることが最近示された別のグリコシル化されないタンパク質、Ｍ２である（図３
を参照されたい）（別の遺伝子産物もまたＭ２遺伝子によりコードされる）。こ
れらの１０種のウイルスタンパク質は該ウイルスのコーディング能力のほぼ全部
の原因である。

【００９５】該ウイルスゲノムは主要なヌクレオキャプシドタンパク質（Ｎ）で包膜化され
、そしてリンタンパク質（Ｐ）および大型の（Ｌ）ポリメラーゼタンパク質を伴
う。これら３種のタンパク質は、ｃＤＮＡにコードされるＲＳＶミニゲノムのＲ
ＮＡ複製を指図するのに必要かつ十分であることが示された（７７）。さらなる
研究は、転写が十分なプロセシングを伴い進行するためにはＭ２タンパク質（Ｏ
ＲＦ１）が必要とされることを示した（７５）。Ｍ２タンパク質が欠けている
場合、短縮された転写物が支配力をもち、そして完全長のゲノムのレスキューが
起こらない（７５）。

【００９６】Ｍ（マトリックスタンパク質）およびＭ２タンパク質の双方が、ヌクレオキャ
プシド構造中に存在しない内的なビリオンに会合されるタンパク質である。他の
セグメントに分けられない負鎖のＲＮＡウイルスとの類似性により、Ｍタンパク
質は、パッケージングの前にヌクレオキャプシドを転写的に不活性にさせそして
ウイルスエンベロープとのその会合を媒介すると思われる。ＮＳ１およびＮＳ２
タンパク質は精製されたビリオン中で非常に少量で検出されるのみあり、そして
この時点で非構造的と考えられる。それらの機能は不確実であるとは言え、それ
らは転写および複製の調節物質であるかも知れない。３種の膜貫通表面糖タンパ
ク質、すなわちＧ、ＦおよびＳＨがビリオン中に存在する。ＧおよびＦ（融合）
は、ウイルスの宿主細胞への付着および浸透を媒介することが知られているエン
ベロープ糖タンパク質である。加えて、これらの糖タンパク質は主要な独立した
免疫原を表わす（７８）。ＳＨタンパク質の機能は未知であるとは言え、最近の
報告は該ウイルスの融合機能におけるその関与を巻き込んでいる（７９）。

【００９７】以下に論考されるとおり、２種の野生型のＲＳＶサブグループＢ株（２Ｂおよ
び１８５３７）のゲノムが、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ９７１６７１８号に記
述されるとおりそっくりそのまま配列決定された（配列番号９および１０を参照
されたい）。ゲノムＲＮＡはキャッピングもまたポリアデニル酸化もされない（
８０）。ビリオンでおよび細胞内の双方で、ゲノムＲＮＡはＮタンパク質と密に
会合する。

【００９８】該ゲノムＲＮＡの３’端は、主要なウイルスプロモーターを含有すると仮定さ
れる４４ヌクレオチドの遺伝子外リーダー領域より成る（図３）。該３’のゲノ
ムプロモーター領域は、３’−ＮＳ１−ＮＳ２−Ｎ−Ｐ−Ｍ−ＳＨ−Ｇ−Ｆ−Ｍ
２−Ｌ−５’という順序（図３）で１０種のウイルス遺伝子により後に続かれる
。Ｌ遺伝子は１４５〜１４９ヌクレオチドの遺伝子外トレーラー領域により後に
続かれる（図３を参照されたい）。各遺伝子は保存された９ヌクレオチドの遺伝
子開始シグナル３’−ＧＧＧＧＣＡＡＡＵで開始する（３’−ＧＧＧＡＣＡＡＡＡＵであるＬ遺伝子の１０ヌクレオチドの遺伝子開始シグナル；および３’−Ｇ
ＧＧＧＵＡＡＡＵである２Ｂおよび１８５３７のＳＨ遺伝子の遺伝子開始シグナ
ルを除く；差異が下線を付けられる）。各遺伝子について、転写は該シグナルの
最初のヌクレオチドで開始する。各遺伝子は、転写終止およびポリアデニル酸化
を指図する半保存された１２〜１４ヌクレオチドの遺伝子端（３’−ＡＧＵ
／ＧＵ／ＡＡＮＮＮＵ／ＡＡ_3-5）（ここでＮは４種の塩基のいずれでもあり得る）で終端する（図３）。最初の９遺伝子は重なり合わず、そしてＲＳ
ＶのＢ株について大きさが３から５６ヌクレオチドまでの範囲にわたる遺伝子間
領域により分離される（図３）。該遺伝子間領域は、いかなる保存されたモチー
フもしくは二次構造のいかなる明らかな特徴も含有せず、そして、ミニレプリコ
ン系の先行するおよび続いて起こる遺伝子発現に対する影響を有しないことが示
されている（図３）。最後の２種のＲＳＶ遺伝子は６８ヌクレオチドだけ重なり
合う（図３）。Ｌ遺伝子の遺伝子開始シグナルはＭ２遺伝子の後よりはむしろそ
の内側に配置される。この６８ヌクレオチドのオーバーラップ配列は、Ｍ２のｍ
ＲＮＡの最後の６８ヌクレオチド（ポリ−Ａ尾を除外）、ならびにＬのｍＲＮＡ
の最初の６８ヌクレオチドをコードする。

【００９９】１０種の異なる種のサブゲノムのポリアデニル酸化されたｍＲＮＡ、および多
数のポリシストロンのポリアデニル酸化された読み合わせ転写物は、ゲノム転写
の産物である（７５）。ＵＶ光媒介性のゲノム不活性化を使用する転写マッピン
グ研究は、ＲＳＶ遺伝子が３’端近くの単一のプロモーターからそれらの３’か
ら５’の順序で転写されることを示した（８１）。従って、ＲＳＶ合成は、単一
エントリーすなわち全部のモノネガウイルス（Ｍｏｎｏｎｅｇａｖｉｒａｌｅｓ
）について提案された連続的転写モデルに従うようである（１６，８２）。この
モデルによれば、ポリメラーゼ（Ｌ）は３’のゲノムプロモーター領域でヌクレ
オキャプシドの形態でゲノムＲＮＡを接触し、そして最初のヌクレオチドで転写
を開始する。ＲＳＶのｍＲＮＡは、ｍＲＮＡのエディティングもしくはスプライ
シングの証拠を伴わない該遺伝子の共直線状コピー(co-linear copy)である。

【０１００】細胞内のＲＳＶのｍＲＮＡの配列分析は、各転写物の合成が該遺伝子の開始シ
グナルの第一のヌクレオチドで開始することを示した（７５）。該ｍＲＮＡの５
’端は構造ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇｐ（ここで下線をつけられたＧは該
ｍＲＮＡの第一の鋳型ヌクレオチドである）でキャッピングされ、そして該ｍＲ
ＮＡはそれらの３’端でポリアデニル酸化される（８３）。これらの修飾の双方
がウイルスのポリメラーゼにより共転写的になされると思われる。ＲＳＶの３’
のゲノムプロモーターの３領域がシスに作用する要素として重要であることが見
出された（８４）。これらの領域は、最初の１０ヌクレオチド（おそらくプロモ
ーターとして作用する）、ヌクレオチド２１−２５、およびヌクレオチド４５−
５３に配置された遺伝子開始シグナルである（８４）。麻疹、センダイおよびＰ
ＩＶ−３のような他のパラミクソウイルス科（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｎａｅ
）と異なり、ＲＳＶのＮＳ１遺伝子のリーダーおよび非コーディング領域の残余
は、挿入、欠失および置換に高度に耐性であることが見出された（８４）。

【０１０１】加えて、３’のゲノムプロモーター領域の最初の１２ヌクレオチド内の飽和突
然変異誘発（各塩基を他の３塩基のそれぞれにより独立に置き換え、そして翻訳
および複製効率について比較する）により、ヌクレオチド６−１０に配置された
Ｕ領域(tract)が置換に極めて耐えられないことが示された（８４）。対照的に、最初の５ヌクレオチドは多数の置換に比較的耐性であり、そして位置４のそれ
らのうち２種はアップレギュレーション突然変異であり、ＲＳＶ−ＣＡＴのＲＮ
Ａの複製および転写の４ないし２０倍の増大をもたらした。二シストロンのミニ
レプリコン系を使用して、遺伝子開始および遺伝子終了モチーフがｍＲＮＡ合成
のためのシグナルであり、そして、独立しておりかつ主として隣接した配列の性
質に依存しないようであることが示された（８５）。

【０１０２】Ｌ遺伝子の開始シグナルはＭ２遺伝子終了シグナルの６８ヌクレオチド上流に
存し、遺伝子のオーバーラップをもたらす（図３）（７５）。Ｌ遺伝子内でのＭ
２遺伝子終了シグナルの存在はＬ遺伝子転写物の高頻度の未熟な終止をもたらす
。完全長のＬのｍＲＮＡはずっとより少なく豊富であり、そしてポリメラーゼが
Ｍ２遺伝子終了モチーフを認識することに失敗する場合に作成される。これはＬ
のｍＲＮＡのずっとより少ない転写をもたらす。該遺伝子のオーバーラップは直
線状の連続的転写のモデルと非適合に思われる。Ｍ２遺伝子を出るポリメラーゼ
がＬ遺伝子開始シグナルに後ろ向きに跳ぶかどうか、もしくはＬ遺伝子の転写の
ための第二の内的プロモーターが存在するかどうかは知られていない（７５）。
Ｌ遺伝子が、Ｍ２遺伝子開始シグナルで転写を開始しそしてＬ遺伝子開始シグナ
ルまでＭ２遺伝子を滑走することに失敗するポリメラーゼの小さな画分により接
近可能であることもまた可能である。

【０１０３】各ＲＳＶのｍＲＮＡの相対的夥しさは、おそらく連続的転写の間のポリメラー
ゼの減少により、プロモーターからのその遺伝子の距離とともに減少する（８１
）。遺伝子のオーバーラップは、完全長のＬのｍＲＮＡの合成を低下させる第二
の機構である。また、ある種のｍＲＮＡは翻訳の効率を低下させるかも知れない
特徴を有する。ＳＨのｍＲＮＡの開始コドンは最適に及ばないのコザック（Ｋｏ
ｚａｋ）配列の情況にある一方、ＧのＯＲＦは該ｍＲＮＡ中の第二のメチオニン
のコドンで開始する。

【０１０４】ＲＳＶのＲＮＡの複製は、水疱性口内炎ウイルスおよびセンダイウイルスでの
研究（１６，８２）から提案されたモデルに従うと思われる（７５）。これは、
ｍＲＮＡ合成の停止−開始モードから抗ターミネーターの読み合わせへの切り替
えを必要とし、後者はゲノムＲＮＡの正確な相補的コピーである正のセンスの複
製中間体（ＲＩ）ＲＮＡの合成をもたらす。これは順に子孫のゲノムの合成のた
めの鋳型としてはたらく。抗ターミネーターモードへの切り替えに関与する機構
は、Ｎタンパク質による発生期のＲＮＡの共転写的包膜化を巻き込むことが提案
されている（１６，８２）。ＲＳＶにおけるＲＮＡ複製は、他のセグメントに分
けられない負鎖のＲＮＡウイルスのように、進行中のタンパク質合成に依存する
（８６）。予測されたＲＩのＲＮＡが標準的ウイルスならびにＲＳＶ−ＣＡＴミ
ニゲノムについて検出された（７５，８６）。ＲＩのＲＮＡは、標準的およびミ
ニゲノム双方の系について、子孫のゲノムであったよりも細胞内で１０〜２０倍
より少なく豊富であった。

【０１０５】本発明のＲＳＶサブグループＢの態様は、多様な野生型、ワクチンおよび復帰
変異体のＲＳＶ株のヌクレオチド配列の分析を必要とした。とりわけ、３’のゲ
ノムプロモーター領域およびＬ遺伝子以外の領域が強調され；それらの領域は国
際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ９７／１６７１８号の焦点であった。

【０１０６】多様な野生型、ワクチンおよび復帰変異体のＲＳＶサブグループＢ株の（正鎖
のアンチゲノムのメッセージセンス中の）ヌクレオチド配列を、本明細書に含有
される適切な配列番号への言及を伴い以下のとおり示す：ウイルスヌクレオチド配列ゲノム長野生型２Ｂ配列番号９１５２１８１８５３７配列番号１０１５２２９ワクチン２Ｂ３３Ｆ配列番号１１１５２１９２Ｂ２０Ｌ配列番号１２１５２１９復帰変異体２Ｂ３３ＦＴＳ（＋）配列番号１３１５２１９２Ｂ２０ＬＴＳ（＋）配列番号１４１５２１９Ｍ遺伝子の翻訳はヌクレオチド３２６２−３２６４のコドンで開始し；翻訳終
止コドンはヌクレオチド４０３０−４０３２にある。翻訳されたＭタンパク質は
２５６アミノ酸長である。Ｍ遺伝子の終止／ポリアデニル酸化シグナルは、ヌク
レオチド４１９６−４２０７の１２ヌクレオチドの遺伝子終了シグナル、次いで
ヌクレオチド４２０８−４２１６の遺伝子間領域およびヌクレオチド４２１７−
４２２５のＳＨ遺伝子開始シグナルを包含する。

【０１０７】ＲＳＶサブグループＢのゲノムのコーディングおよび非コーディング（シスト
ロン間）領域の分析を実施した。多様な野生型、ワクチンおよび復帰変異体のＲ
ＳＶ株のＳＨの遺伝子およびタンパク質配列を識別するヌクレオチドおよびアミ
ノ酸の差異、ならびにＭ／ＳＨシストロン間領域中のＭ遺伝子終了シグナルを識
別するヌクレオチドの差異を実施した（以下の実施例２の表６、７および９を参
照されたい）。

【０１０８】各遺伝子の転写終止を制御するシスに作用する要素を含んで成る領域は、検査
された全部のＲＳＶサブグループＢのウイルスのあいだで高度に保存されている
ことが見出された。１例を除き、遺伝子開始および遺伝子終了シグナルの配列は
、分析した全部のウイルスについて同一であった。野生型２Ｂ、ワクチン２Ｂ３
３Ｆおよび復帰変異体２Ｂ３３ＦＴＳ（＋）株のＭ遺伝子終了シグナルの第三
のヌクレオチドはＧであった一方、全部の他のＲＳＶサブグループＢの遺伝子終
了シグナルの第三のヌクレオチドはＴであった。

【０１０９】より重要なことには、表７に示されるとおり、（アンチゲノムのメッセージセ
ンス中の）野生型２Ｂウイルスのヌクレオチド４１９６−４２０７にわたりかつ
２Ｂ３３Ｆワクチン株および２Ｂ３３ＦＴＳ（＋）復帰変異体株のヌクレオチ
ド４１９７−４２０８にわたるＭ遺伝子終了シグナル中に１個の突然変異が存在
した。すなわち、ヌクレオチド位置４１９９で、野生型２Ｂウイルスは「Ｔ」を
有した一方、２Ｂ３３Ｆおよび２Ｂ３３ＦＴＳ（＋）株は対応するヌクレオチ
ド位置４２００に「Ｃ」を有した（これらの株はそれらの３’のゲノムプロモー
ター領域中に１個の余分なヌクレオチドを有する）。この突然変異は、１８５３
７野生型株、２Ｂ２０Ｌワクチン株もしくはそのＴＳ（＋）復帰変異体株のいず
れにも存在しなかった。

【０１１０】表１１および図４〜６に示されるとおり、Ｍ遺伝子終了シグナルの配列はＳＨ
遺伝子発現に強い影響を与える。ＲＳＶサブグループＢの２Ｂ３３Ｆ突然変異体
およびそのＴＳ（＋）復帰変異体は、それらの２Ｂの親株（ヌクレオチド４１９
９に）または分析された他のＲＳＶサブグループＢもしくはＡウイルスのいずれ
でも見出されない、Ｍ遺伝子終了シグナルのこの第四の位置に（突然変異体およ
び復帰変異体でヌクレオチド４２００に）この独特のヌクレオチドを有する。

【０１１１】以下の実施例２に論考されるノーザンブロット分析（図４および６）ならびに
リボヌクレアーゼ保護アッセイ（図５）により示されるとおり、野生型２Ｂ株は
、一シストロンのＭ転写物を上回るわずかな過剰の二シストロンのＭ：ＳＨを産
生した。対照的に、２Ｂ３３Ｆ突然変異体およびその２Ｂ３３ＦＴＳ（＋）復
帰変異体は実際上一シストロンのＭおよびＳＨ転写物を産生せず；代わりに、そ
れらの転写産物の大部分は二シストロンかつより高分子量の読み合わせ転写物で
あった。これらの二シストロンかつ読み合わせ転写物は、ＳＨ遺伝子産物を翻訳
するそれらの能力において抑制されていることがありそうである。従って、この
突然変異を含有する株は２Ｂの親株に比較してＳＨ発現をダウンレギュレーショ
ンし、また、ＳＨタンパク質を産生することを本質的に停止している。二シスト
ロンの転写産物の優勢へのこの移動、および下流の遺伝子産物すなわちＳＨの付
随するダウンレギュレーションは、Ｍ遺伝子終了シグナル中の該突然変異がこれ
らの２株の弱毒化表現型に寄与するという証拠を提供する。

【０１１２】従って、表６〜１１、図４〜６および前述の論考に基づけば、Ｍ遺伝子終了シ
グナルの重要な弱毒化突然変異は（アンチゲノムのメッセージセンス中の）ヌク
レオチド４１９９（Ｔ→Ｃ）である。

【０１１３】２Ｂ３３Ｆ突然変異体のＳＨ遺伝子が２Ｂの親のものに比較してヌクレオチド
変化（偏らされた超突然変異(hypermutation)）で膨れている(blistered)ことに
とくに言及することは興味深く（表６を参照されたい）、そのいくつかはＳＨタ
ンパク質中のアミノ酸置換をもたらすとみられる。２Ｂ３３Ｆのヌクレオチド４
４９８での１変化が予測されるＳＨ翻訳終止コドンをグルタミンに転化する。こ
れは、２Ｂ３３ＦのＳＨタンパク質についての予測される長さをもたらし、それ
は２Ｂの親のものより本質的により長い。

【０１１４】本発明のさらなる一態様においては、ＲＳＶサブグループＢの表現型が、上で
言及されたＭ遺伝子終了シグナルの突然変異を、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ９
７／１６７１８号に記述される同等な３’のゲノムプロモーター領域およびＬ遺
伝子の突然変異のそれぞれの１種もしくはそれ以上と組み合わせることによりさ
らに弱毒化され、それらは以下のとおりである。すなわち、ＲＳＶサブグループ
Ｂの３’のゲノムプロモーター領域については、該突然変異はヌクレオチド４（
Ｃ→Ｇ）および（アンチゲノムのメッセージセンス中の）ヌクレオチド６−１１
のＡの伸長中の１個の付加的なＡの挿入である一方、Ｌタンパク質については、
該突然変異はアミノ酸残基３５３（アルギニン→リシン）、４５１（リシン→ア
ルギニン）、１２２９（アスパラギン酸→アスパラギン）、２０２９（トレオニ
ン→イソロイシン）および２０５０（アスパラギン→アスパラギン酸）である。
再度、これらのアミノ酸に翻訳されるコドンをもたらすヌクレオチド中の全部の
変化が本発明の範囲内にあることが理解される。

【０１１５】３’のゲノムプロモーター領域が、ヌクレオチド６−１１のＡの伸長中の１個
の付加的なＡの挿入により改変される場合は、Ｍ遺伝子終了シグナル中の弱毒化
突然変異がヌクレオチド４１９９よりむしろヌクレオチド４２００でであろうこ
とが理解される。

【０１１６】本発明の弱毒化ウイルスは、ヒトおよび動物宿主を感染させる野生型ウイルス
に比較して毒性の本質的な低減を表わす。弱毒化の程度は、感染症の症状が大部
分の免疫された個体で現われることができないが、しかし、該ウイルスは、で感
染性であるために十分な複製能力を保持しかつワクチン中で所望の免疫応答プロ
フィルを導き出すことができるようである。

【０１１７】本発明の弱毒化ウイルスはワクチンを処方するのに使用してよい。そうするた
めには、該弱毒化ウイルスを適切な濃度に調節し、そしていずれかの適するワク
チンアジュバント、希釈剤もしくは担体とともに処方する。生理学的に許容でき
る媒体を担体として使用してよい。これらは、適切な等張媒体、リン酸緩衝生理
的食塩水などを包含するがしかしこれらに制限されない。適するアジュバントは
、ＭＰＬ（商標）（３−Ｏ−デアシル化モノホスホリルリピドＡ；ＲＩＢＩイ
ミュノケムリサーチインク（ＲＩＢＩＩｍｍｕｎｏＣｈｅｍＲｅｓｅａ
ｒｃｈ，Ｉｎｃ．）、モンタナ州ハミルトン）およびＩＬ−１２（ジェネティク
スインスティテュート（ＧｅｎｅｔｉｃｓＩｎｓｔｉｔｕｔｅ、マサチュー
セッツ州ケンブリッジ）を包含するがしかしこれらに制限されない。

【０１１８】本発明の一態様において、該弱毒化ウイルスを包含する製剤がワクチンとして
の使用に意図される。該弱毒化ウイルスは、凍結防止添加物、またはタンパク質
（例えばアルブミン、ゼラチン）、糖類（例えばショ糖、乳糖、ソルビトール）
、アミノ酸（例えばグルタミン酸ナトリウム）、生理的食塩水もしくは他の保護
剤のような安定剤と混合してよい。本混合物は液体状態で維持されるか、または
その後輸送および貯蔵のため乾燥もしくは凍結乾燥され、そして投与の直前に水
と混合される。

【０１１９】本発明の弱毒化ウイルスを含んで成る製剤は、該弱毒化ウイルスの野生型の対
照物による感染に対する保護を誘導するようにヒトもしくは動物の被験体を免疫
するのに有用である。従って、本発明は、上述されたようなモノネガウイルス目
（ＯｒｄｅｒＭｏｎｏｎｅｇａｖｉｒａｌｅｓ）のＲＮＡウイルスの弱毒化さ
れた作り替え物(version)を組み込むワクチン製剤の有効な免疫量を被験体に投与することによる、そのウイルスによる感染症に対する保護を誘導するための被
験体の免疫方法をさらに提供する。

【０１２０】適切な数の用量のワクチンの十分な量を、免疫応答を導き出すために該被験体
に投与しなければならない。当業者はこうした量および投薬量を決定することが
容易に可能であろう。投与は、鼻内に、非経口で、経口で、または、エアゾルス
プレーによるような、鼻内、経口、眼、肺、膣もしくは直腸表面のようないずれ
かの粘膜表面に適用される局所でのようないずれかの慣習的な有効な形態によっ
てよい。好ましい投与手段は鼻内投与による。

【０１２１】国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ９７／１６７１８号とともに、モラテン（Ｍｏｒ
ａｔｅｎ）麻疹ウイルスワクチン株のサンプルが、特許手続きの目的上の微生物
の寄託に関するブダペスト条約（ｔｈｅＢｕｄａｐｅｓｔＴｒｅａｔｙｆ
ｏｒｔｈｅＤｅｐｏｓｉｔｏｆＭｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓｆｏｒ
ｔｈｅＰｕｒｐｏｓｅｓｏｆＰａｔｅｎｔＰｒｏｃｅｄｕｒｅｓ）（
「ブダペスト条約（ＢｕｄａｐｅｓｔＴｒｅａｔｙ）」）の約定のもとに、ア
メリカンタイプカルチャーコレクション（ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅ
ＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）、１２３０１ＰａｒｋｌａｗｎＤ
ｒｉｖｅ、米国メリーランド州ロックヴィル、２０８５２に１９９７年８月２１
日に発明者らにより寄託され、そしてＡＴＣＣ受託番号ＶＲ２５８７を割り当て
られ、また、２Ｂ野生型ＲＳＶウイルスのサンプルが、ブダペスト条約の約定の
もとにアメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡｍｅｒｉｃａｎＴ
ｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）、１２３０１Ｐａｒｋｌａ
ｗｎＤｒｉｖｅ、米国メリーランド州ロックヴィル、２０８５２に１９９７年
８月２１日に発明者らにより寄託され、そしてＡＴＣＣ受託番号ＶＲ２５８６を
割り当てられた。

【０１２２】これら２種の寄託された株、ならびに本明細書に提供されるこれらおよび他の
株についての配列情報を考えれば、本明細書に記述される全部の株の突然変異を
導入する（もしくは野生型遺伝子型を復帰させる）ための部位特異的突然変異誘
発および上述されたレスキュー技術、ならびに、これらの株を採用しそして以下
の表３〜１１に示される一団の突然変異から付加的突然変異を作成することを使
用し得る。

【０１２３】本発明をより良好に理解することができるために以下の実施例を示す。該実施
例は具体的説明のみの目的のためであり、そして本発明の範囲を制限するとして
解釈されるべきでない。

【０１２４】実施例標準的分子生物学的技術を、サンブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら（８７）に
記述されるプロトコルに従って利用する。実施例１麻疹ＲＮＡを配列分析のため作成する前に、モラテン（Ｍｏｒａｔｅｎ）ＭＶワク
チンウイルスを、アテニュヴァックス［Ａｔｔｅｎｕｖａｘ］（商標）ワクチン
バイアル（ロット＃０７１６Ｂ）から直接１回成長させ、シュワルツ（Ｓｃｈｗ
ａｒｚ）ワクチンウイルスを１回成長させた（ロット９６Ｇ０４／Ｍ１７９
Ｇ４１Ｄ）一方、ザグレブ（Ｚａｇｒｅｂ）およびルベオヴァックス［Ｒｕｂｅ
ｏｖａｘ］（商標）ワクチンウイルスは、ベロ（Ｖｅｒｏ）細胞中でそれぞれ２
回成長させた。ＭＶ野生型の単離物モンティフィオーレ（Ｍｏｎｔｅｆｉｏｒｅ
）（５７）を、ＲＮＡ材料の抽出前にベロ（Ｖｅｒｏ）細胞中で５〜６回継代し
、そして、同様に、ＭＶの野生型単離物１９７７、１９８３（１４）を、分析の
ための材料を抽出する前に５〜７回成長させた。ビーラー（Ｊ．Ｂｅｅｌｅｒ）
博士（ＣＢＥＲ）から受領されたエドモンストン（Ｅｄｍｏｎｓｔｏｎ）の野生
型単離物（図１を参照されたい）は、受領前にヒト腎細胞中で７回およびベロ（
Ｖｅｒｏ）細胞中で３回既に継代されたもともとのエドモンストン（Ｅｄｍｏｎ
ｓｔｏｎ）単離物であり、そして配列分析に使用する前にベロ（Ｖｅｒｏ）細胞
中で１回さらに継代した。

【０１２５】ＲＮＡを、０．１ないし１．０の感染多重度（ｍ．ｏ．ｉ．）でベロ（Ｖｅｒ
ｏ）細胞を感染させることにより調製し、そして収穫される前に最大の細胞病変
に達せさせた。麻疹ウイルスに感染した細胞からの全ＲＮＡを、トリゾール［Ｔ
ｏｒｉｚｏｌ］（商標）試薬（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）−ＢＲＬ）を使用して抽出
した。

【０１２６】ベロ（Ｖｅｒｏ）細胞の継代材料から単離された全ＲＮＡを、該ウイルスゲノ
ムの３’および５’プロモーター領域ならびにＬ遺伝子にわたる麻疹（エドモン
ストン（Ｅｄｍｏｎｓｔｏｎ）Ｂ株（１９））特異的なプライマー対を使用する
逆転写酵素ＰＣＲ（パーキン−エルマー／シータス（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ
／Ｃｅｔｕｓ））処置により増幅した。表２はこれらのプライマー配列を提示す
る。配列番号１５〜３４、５４、５７および５８のプライマーはアンチゲノムの
メッセージセンス中にある。配列番号３５〜５３、５５、５６および５９のプラ
イマーはゲノムの負センスにある。

【０１２７】

【表１】

【０１２８】

【表２】

【０１２９】完全なウイルスゲノムの重なり合うＰＣＲフラグメントを、双方の鎖を使用す
るジデオキシターミネーター循環配列決定法（ＡＢＩプリズム（ＰＲＩＳＭ）
３７７シークェンサーおよびＡＢＩプリズム（ＰＲＩＳＭ）配列決定キット）
により、コンセンサス配列を達成するため、クローニングすることなしに直接配
列決定した。絶対的末端の配列を決定するため、既に記述されたライゲーション
手順を使用した（５６）。

【０１３０】該ヌクレオチド配列を、先祖のエドモンストン（Ｅｄｍｏｎｓｔｏｎ）野生型
ＭＶ単離物のゲノムプロモーター領域およびＬ遺伝子以外の領域、この単離物由
来の入手可能なワクチン株、ならびに他の野生型株について決定した。（アンチ
ゲノムのメッセージセンス中の）重要なヌクレオチドおよびアミノ酸の差異をそ
の後比較し、そして表３〜５に示されるとおり整列した（差異は斜体で示す）。

【０１３１】

【表３】

【０１３２】

【表４】

【０１３３】

【表５】

【０１３４】実施例２ＲＳＶサブグループＢ温度感受性（ｔｓ）表現型はインビボでの弱毒化と強く関連し；加えて、いく
つかの非ｔｓ突然変異もまた弱毒化しているかも知れない。ｔｓおよび非ｔｓの
弱毒化突然変異の同定を、配列分析、ならびに、ｔｓ、寒冷適応（ｃａ）、なら
びにＲＳＶ突然変異体および復帰変異体のインビボの成長表現型の評価により達
成した。

【０１３５】以下の３種のＲＳＶ２Ｂ株、すなわち２Ｂの野生型の親、２Ｂ３３Ｆと呼称
されるそのｔｓかつｃａ誘導体、および２Ｂ３３ＦＴＳ（＋）と呼称される１
種のｔｓ（＋）復帰変異体のゲノムは完全に配列決定されている。２Ｂ３３Ｆ株
は米国第０８／０５９，４４４号（８８）に記述され、これはこれにより引用に
より組み込まれる。２Ｂ３３Ｆ中の突然変異が配置される領域を同定した後、３
９℃でのインビトロ継代、およびアフリカミドリザルもしくはチンパンジーでの
インビボ継代の後に得られた２Ｂ３３Ｆの「復帰変異体」の９種の付加的単離物
を、それらの既に同定された突然変異体領域中で配列決定した。これらの復帰変
異体の多くのｔｓ、ｃａおよび弱毒化表現型は今や特徴づけられかつ評価された
。ｔｓ表現型、ウイルス弱毒化と配列の変化との間の相関を同定した。

【０１３６】結果の要約を表６〜１１に提示する。

【０１３７】

【表６】

【０１３８】

【表７】

【０１３９】

【表８】

【０１４０】

【表９】

【０１４１】

【表１０】

【０１４２】

【表１１】

【０１４３】ＲＳＶに感染したベロ（Ｖｅｒｏ）細胞から単離されたポリ（Ａ）＋ＲＮＡの
ノーザンブロット分析を、ＲＳＶサブグループＡおよびＢのウイルスのＭ遺伝子
に特異的な³²Ｐ標識リボプローブの混合物を使用して実施して、Ｍ遺伝子の転写
に対するＭ遺伝子終了シグナル配列の影響を決定した。負センスのハイブリダイ
ゼーションプローブは、Ｔ７プロモーター配列を含有するＰＣＲ産物からインビ
トロで合成されたＴ７ＲＮＡポリメラーゼ転写物であった。図４に示されると
おり、Ｍ遺伝子プローブを使用するノーザンブロット分析は、ＲＳＶサブグルー
プＡのウイルスについて豊富な一シストロンのＭ遺伝子転写物を描いた一方、二
シストロンのＭ：ＳＨ転写物はサブグループＢのウイルスについて優勢であった
。二シストロンのＭ：ＳＨ転写物はＳＨ遺伝子を翻訳するそれらの能力において
抑制され、そして従ってウイルスのＳＨ遺伝子発現を制御するための潜在的な一
手段を表わすことがありそうである。２Ｂ３３Ｆ突然変異体（レーン５）および
２Ｂ３３ＦＴＳ（＋）復帰変異体（レーン６）株は実際上一シストロンのＭ転
写物を産生せず；それらの転写産物の大部分は二シストロンかつより高分子量の
読み合わせ転写物であった。従って、これら２種の株はＳＨタンパク質を産生す
ることを本質的に停止していた。

【０１４４】対照的に、野生型サブグループＢ株２Ｂ、Ｂ１および１８５３７は一シストロ
ンのｍＲＮＡを上回るわずかな過剰の二シストロンのｍＲＮＡを産生した（レー
ン３、４、７）。サブグループＡの３Ａウイルスは比肩するレベルの一シストロ
ンおよび二シストロン産物を示した（レーン１）。２Ｂ突然変異体株について観
察されたものからの他の極端は、Ａ２ウイルスのＭ遺伝子の転写パターンであっ
た（レーン２）。この株について、一シストロンのＭ転写物は豊富に産生された
一方、読み合わせ転写は最小限であった。

【０１４５】ノーザンブロットの結果を、各ＲＳＶサブグループＢのウイルスについての二
シストロンのＭ：ＳＨに対する一シストロンのＭおよびＳＨのｍＲＮＡの比を評
価するため、ノーザンブロットに使用した同一のポリ（Ａ）＋ＲＮＡで実施した
リボヌクレアーゼ保護アッセイにより確認した。Ｍ：ＳＨの遺伝子接合部にわた
った長さ２８４ヌクレオチド（Ｂウイルス）の負センスのウイルス特異的³²Ｐ標
識転写物であったリボプローブを使用した。完全長のプローブは二シストロンの
Ｍ：ＳＨ転写物により主にＲＮアーゼ消化から保護されるはずである。一シスト
ロンのＭおよびＳＨ転写物は、ＲＮアーゼ消化からそれぞれおよそ１６５および
１１０ヌクレオチドのプローブフラグメントを保護することが期待される。

【０１４６】図５に示される２Ｂ、２Ｂ３３Ｆおよび２Ｂ３３ＦＴＳ（＋）ウイルスのＲ
ＮＡについてのアッセイでは、ウイルスのＲＮＡもしくは対照の酵母ＲＮＡを５
×１０⁴ｃｐｍのプローブとハイブリダイズさせ；その後に、ハイブリダイズされたＲＮＡをＲＮアーゼＴ１（１００倍に希釈された）でその後消化し、エタノ
ールで沈殿させ、そして保護されたプローブフラグメントを変性６％ポリアクリ
ルアミドゲル上で分離した。

【０１４７】このリボヌクレアーゼ保護アッセイの結果を図５に描く。このアッセイでは、
各ウイルスについての一シストロンのＭのものに関する二シストロンのＭ：ＳＨ
に対応する保護されたプローブフラグメントのシグナル強度は、Ｍ遺伝子プロー
ブを用いるノーザンブロッティングにより得られた結果（すなわち、２Ｂについ
てより大きな一シストロンのシグナルならびに２Ｂ３３Ｆおよび２Ｂ３３ＦＴ
Ｓ（＋）について実際上一シストロンのシグナルがない）と一致した（図５）。

【０１４８】下流のＳＨ遺伝子の発現に対するＭ遺伝子終了シグナルの影響を評価するため
、ＲＳＶウイルスのポリ（Ａ）＋ＲＮＡのノーザンブロット分析をＲＳＶサブグ
ループＡおよびＢ株のＳＨ遺伝子に特異的な負センスの³²Ｐ標識リボプローブを
使用して実施して、下流のＳＨ遺伝子の発現に対するＭのＧＥシグナルの影響を
評価した（図６を参照されたい）。各ウイルスにより産生されたＳＨ遺伝子転写
物のパターン、すなわち、二シストロンのＭ：ＳＨに対する一シストロンのＳＨ
のレベルは、Ｍ遺伝子転写産物について観察されたものに匹敵した。Ｍ遺伝子終
了シグナルでのＭ遺伝子の転写の終了で無効であったＲＳＶウイルスは、一シス
トロンのＳＨ転写物の合成でもまた欠陥を生じさせられた。２Ｂ３３Ｆ突然変異
体およびそのＴＳ（＋）復帰変異体は一シストロン産物を実際上合成しなかった
が、しかし豊富なＭ：ＳＨ転写物を蓄積した。野生型の３Ａ、２Ｂ、Ｂ１および
１８５３７ウイルスは比肩するレベルの双方の転写産物を蓄積した一方、Ａ２株
はＳＨ遺伝子転写の最も豊富な産物として一シストロンのＳＨのｍＲＮＡを産生
した。ノーザンブロット分析により同定された転写物を、リン光画像形成装置(p
hosphorimager)分析により定量し、そして二シストロンのＭ：ＳＨに対する一シ
ストロンのＳＨの相対比を各ウイルスについて決定した。表１１に示されるとお
り、該比は０．２３から１１．１までの範囲にわたり、最低値はＭ遺伝子終了シ
グナルの第四のヌクレオチドの突然変異（Ｔ→Ｃ）を含有するＲＳＶサブグルー
プＢ株について観察された：

【０１４９】

【表１２】

【０１５０】いくつかの重要な観察結果をこれらのデータから引き出し得る。すなわち、表
６に示されるとおり、突然変異体株で同定される比較的少ない配列変化が存在す
る。すなわち、ＲＳＶ２Ｂ３３Ｆは、３’のゲノムプロモーター領域の２個の
変化、Ｍ遺伝子終了シグナル中の１個を包含するＭ遺伝子の非コーディング５’
端の２個の変化、およびＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼをコードするＬ遺伝子
中の４個のコードする変化および１個のコードしない（ポリ（Ａ）モチーフ）変
化により、親のＲＳＶ２Ｂと異なる。加えて、１４個の変化がＳＨ遺伝子単独
にマッピングした。

【０１５１】弱毒化突然変異は弱毒化ウイルス株２Ｂ３３ＦのＭ遺伝子終了シグナル中で同
定し得る。すなわち、野生型２Ｂ株での一シストロンのｍＲＮＡを上回るわずか
な過剰の二シストロンのｍＲＮＡから、２Ｂ３３Ｆワクチン株および２Ｂ３３Ｆ
ＴＳ（＋）復帰変異体株での二シストロンの転写産物の優勢への移動は、Ｍ遺
伝子終了シグナル中の突然変異がこれらの後者の２種のウイルス株の弱毒化表現
型に寄与するという証拠を提供する。

【０１５２】

【表１３】

【０１５３】

【表１４】

【０１５４】

【表１５】

【０１５５】

【表１６】

【０１５６】

【表１７】

【０１５７】

【表１８】

【０１５８】

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】発明にかかる、エドモンストン（Ｅｄｍｏｎｓｔｏｎ）麻疹ウイルスの継代歴
を描く（１５）。略語は以下の意味を有する。すなわち、ＨＫ−ヒト腎；ＨＡ−
ヒト羊膜；ＣＥ（ａｍ）−ニワトリ胚；ＣＥＦ−ニワトリ胚線維芽細胞；ＤＫ−
イヌ腎；ＷＩ−３８−ヒト二倍体細胞；ＳＫ−ヒツジ腎；＊−プラーククローニ
ング。各略語の後に続く数字は継代の数を表わす。

【図２】発明にかかる、ゲノムおよびアンチゲノム末端およびその近くの推定のシスに
作用する調節要素を示す麻疹ウイルスゲノムの地図を描く。上−リーダー配列の
５２ヌクレオチドを伴う３’端で開始し（１）そしてトレーラー配列（ｔ）の３
７ヌクレオチドを伴い５’末端で終了する麻疹ウイルスゲノムの図解の地図。遺
伝子境界は垂直の棒により示し；シストロンのヌクレオチドの数が各遺伝子の下
にある。下−２個の高度に保存されたドメインＡおよびＢの位置および配列を示
す、ゲノムおよびアンチゲノムの３’の伸長されたゲノムプロモーター領域の拡
大された図解。介入する遺伝子間の三ヌクレオチドも同様に示す。Ａ’ないしＢ
’領域を包含する発生期の５’ＲＮＡは調節配列［そこでＮタンパク質の包膜化
が開始する］を含有することが想定される。

【図３】発明にかかる、２Ｂおよび１８５３７と呼称されるＲＳＶサブグループＢの野
生型株（上部分）、それらの株の遺伝子間配列（中央部分）ならびにＭ２とＬ遺
伝子との間の６８ヌクレオチドのオーバーラップ（下部分）の遺伝子地図を描く
。ＲＳＶ２Ｂ株は、１８５３７株と比較して、Ｇタンパク質中の２個より少な
いアミノ酸残基をコードするＧ遺伝子中の６個より少ないヌクレオチドを有する
。２Ｂ株は、１８５３７株中の１４９ヌクレオチドに比較して、５’トレーラー
領域中に１４５ヌクレオチドを有する。２Ｂ株は、１８５３７株に比較して、Ｎ
Ｓ−１、ＮＳ−２およびＮ遺伝子のそれぞれ中に１個より多いヌクレオチド、な
らびにＭおよびＦ遺伝子のそれぞれ中に１個より少ないヌクレオチドを有する。

【図４】発明にかかる、ＲＳＶサブグループＡおよびＢウイルスに感染したベロ（Ｖｅ
ｒｏ）細胞から単離されたポリ（Ａ）＋ＲＮＡのノーザンブロット分析を描く。
該ブロットの１．５時間のオートラジオグラフを示す。レーン１−２はＲＳＶサ
ブグループＡ株に感染した細胞から単離されたＲＮＡを含有する（レーン１、３
Ａ；レーン２、Ａ２）。レーン３−７はＲＳＶサブグループＢ株に感染した細胞
から単離されたＲＮＡを含有する。すなわち、レーン３、Ｂ１；レーン４、２Ｂ
；レーン５、２Ｂ３３Ｆ；レーン６、２Ｂ３３ＦＴＳ（＋）；レーン７、１８
５３７。一シストロンのＭ遺伝子および二シストロンのＭ：ＳＨ遺伝子の転写物
を矢印により示す。

【図５】発明にかかる、各ウイルスについて二シストロンのＭ：ＳＨ転写物に対する一
シストロンのＭおよびＳＨのｍＲＮＡの比を評価するためにＲＳＶサブグループ
Ｂの野生型２Ｂ、突然変異体２Ｂ３３Ｆおよび２Ｂ３３ＦＴＳ（＋）復帰変異
体ウイルスに感染したベロ（Ｖｅｒｏ）細胞から抽出されたポリ（Ａ）＋ＲＮＡ
のリボヌクレアーゼ保護アッセイを描く。ゲルの３時間のオートラジオグラフを
示す。保護されたプローブフラグメントを矢印により示す。放射標識されたＲＮ
Ａマーカー（Ｍ）を大きさの標準として包含した。すなわち、レーン１、酵母Ｒ
ＮＡ、ＲＮアーゼなし；レーン２、酵母ＲＮＡ、ＲＮアーゼあり；レーン３、２
ＢＲＮＡ、ＲＮアーゼあり；レーン４、２Ｂ３３ＦＲＮＡ、ＲＮアーゼあり
；レーン５、２Ｂ３３ＦＴＳ＋ＲＮＡ、ＲＮアーゼあり；レーン６、酵母ＲＮ
Ａ、ＲＮアーゼあり；レーン７、酵母ＲＮＡ、ＲＮアーゼなし。ＲＳＶ２Ｂ特
異的プローブをレーン１〜３で使用し、また、２Ｂ３３Ｆ特異的プローブをレー
ン４〜７で使用した。

【図６】発明にかかる、ＲＳＶサブグループＡおよびＢウイルスに感染したベロ（Ｖｅ
ｒｏ）細胞から単離されたポリ（Ａ）＋ＲＮＡのノーザンブロット分析を描く。
該ブロットの１．５時間のオートラジオグラフを示す。レーン１〜２はＲＳＶサ
ブグループＡ株に感染した細胞から単離されたＲＮＡを含有する（レーン１、３
Ａ；レーン２、Ａ２）。レーン３〜７はＲＳＶサブグループＢ株に感染した細胞
から単離されたＲＮＡを含有する（レーン３、Ｂ１；レーン４、２Ｂ；レーン５
、２Ｂ３３Ｆ；レーン６、２Ｂ３３ＦＴＳ（＋）；レーン７、１８５３７）。
一シストロンのＳＨ遺伝子および二シストロンのＭ：ＳＨ遺伝子転写物を矢印に
より示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者シドウ，モヒンデルジート・エスアメリカ合衆国ニユーヨーク州10956ニユーシテイ・ローウエルドライブ35 (72)発明者ランドルフ，バレリー・ビーアメリカ合衆国ニユージヤージイ州07035 リンカーンパーク・パインブルツクロード 535 (72)発明者ブオナグリオ，デボラ・エイアメリカ合衆国ニユーヨーク州10580ライ・パークウエイドライブ60 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA32 CA04 DA02 EA04 GA11 GA18 GA25 HA01 4B065 AA95X AB01 BA02 BA14 BA16 CA45 4C085 AA03 BA58 DD06 DD22 DD23 EE01

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】（ａ）Ｎ遺伝子について、残基１２９（グルタミン→リシン
）、１４８（グルタミン酸→グリシン）および４７９（セリン→トレオニン）よ
り成る群から選択されるアミノ酸に変化を生じさせるヌクレオチド変化；（ｂ）Ｐ遺伝子について、残基２２５（グルタミン酸→グリシン）、２７５（シ
ステイン→チロシン）および４３９（ロイシン→プロリン）より成る群から選択
されるアミノ酸に変化を生じさせるヌクレオチド変化；（ｃ）Ｃ遺伝子について、残基７３（アラニン→バリン）、１０４（メチオニン
→トレオニン）および１３４（セリン→チロシン）より成る群から選択されるア
ミノ酸に変化を生じさせるヌクレオチド変化；ならびに（ｄ）Ｆ遺伝子終了シグナルについて、ヌクレオチド７２４３（Ｔ→Ｃ）の変化
、ここで、これらのヌクレオチドが正鎖のアンチゲノムのメッセージセンス中に提
示される、より成る群から選択される１個もしくはそれ以上の弱毒化突然変異を有する単離
された組換え的に発生された弱毒化麻疹ウイルス。
【請求項２】（ａ）ヌクレオチド２６（Ａ→Ｔ）、ヌクレオチド４２（Ａ
→ＴもしくはＡ→Ｃ）およびヌクレオチド９６（Ｇ→Ａ）より成る群から選択さ
れる３’のゲノムプロモーター領域中の最低１個の弱毒化突然変異であって、こ
れらのヌクレオチドが正鎖のアンチゲノムのメッセージセンス中に提示される；
ならびに（ｂ）残基３３１（イソロイシン→トレオニン）、１４０９（アラニン→トレオ
ニン）、１６２４（トレオニン→アラニン）、１６４９（アルギニン→メチオニ
ン）、１７１７（アスパラギン酸→アラニン）、１９３６（ヒスチジン→チロシ
ン）、２０７４（グルタミン→アルギニン）および２１１４（アルギニン→リシ
ン）より成る群から選択される１アミノ酸に変化を生じさせるヌクレオチド変化
より成る群から選択されるＲＮＡポリメラーゼ遺伝子中の最低１個の弱毒化突然
変異、をさらに含んで成る、請求項１の麻疹ウイルス。
【請求項３】Ｍ遺伝子終了シグナル中のヌクレオチド４１９９（Ｔ→Ｃ）
に１個の弱毒化突然変異を有する単離された組換え的に発生された弱毒化ヒト呼
吸合胞体ウイルス（ＲＳＶ）サブグループＢであって、これらのヌクレオチドが
正鎖のアンチゲノムのメッセージセンス中に提示されるＲＳＶサブグループＢ。
【請求項４】（ａ）ヌクレオチド４（Ｃ→Ｇ）、およびヌクレオチド６−
１１のＡの伸長中の１個の付加的なＡの挿入より成る群から選択される３’のゲ
ノムプロモーター領域中の最低１個の弱毒化突然変異であって、これらのヌクレ
オチドが正鎖のアンチゲノムのメッセージセンス中に提示される；ならびに（ｂ）残基３５３（アルギニン→リシン）、４５１（リシン→アルギニン）、１
２２９（アスパラギン酸→アスパラギン）、２０２９（トレオニン→イソロイシ
ン）および２０５０（アスパラギン→アスパラギン酸）より成る群から選択され
るアミノ酸に変化を生じさせるヌクレオチド変化より成る群から選択されるＲＮ
Ａポリメラーゼ遺伝子中の最低１個の弱毒化突然変異、をさらに含んで成る、請求項３のＲＳＶサブグループＢ。
【請求項５】Ｍ遺伝子終了シグナル中の該弱毒化突然変異（Ｔ→Ｃ）がヌ
クレオチド４２００でであるようにヌクレオチド６−１１のＡの伸長中の１個の
付加的なＡの挿入を包含し、これらのヌクレオチドが正鎖のアンチゲノムのメッ
セージセンス中に提示される、請求項４のＲＳＶサブグループＢ。
【請求項６】請求項１に記載の単離された組換え的に発生された弱毒化麻
疹ウイルスおよび生理学的に許容できる担体を含んで成るワクチン。
【請求項７】請求項２に記載の麻疹ウイルスおよび生理学的に許容できる
担体を含んで成る、請求項６のワクチン。
【請求項８】請求項３に記載の単離された組換え的に発生された弱毒化Ｒ
ＳＶサブグループＢおよび生理学的に許容できる担体を含んで成るワクチン。
【請求項９】請求項４に記載のＲＳＶサブグループＢおよび生理学的に許
容できる担体を含んで成る、請求項８のワクチン。
【請求項１０】請求項５に記載のＲＳＶサブグループＢおよび生理学的に
許容できる担体を含んで成る、請求項８のワクチン。
【請求項１１】請求項６のワクチンを個体に投与することを含んで成る、
麻疹ウイルスに対する保護を誘導するための個体の免疫方法。
【請求項１２】ワクチンが請求項７のワクチンである、請求項１１の方法
。
【請求項１３】請求項８のワクチンを個体に投与することを含んで成る、
ＲＳＶサブグループＢに対する保護を誘導するための個体の免疫方法。
【請求項１４】ワクチンが請求項９のワクチンである、請求項１３の方法
。
【請求項１５】ワクチンが請求項１０のワクチンである、請求項１３の方
法。
【請求項１６】包膜化、転写および複製に必要なトランスに作用するタン
パク質Ｎ、ＰおよびＬをコードする最低１種の単離された核酸分子を含んで成る
最低１種の発現ベクターと一緒に、請求項１に記載の麻疹ウイルスのゲノムもし
くはアンチゲノムをコードする単離された核酸分子を含んで成る１種の転写ベク
ターを含んで成り、それにより発現に際して感染性の弱毒化ウイルスが産生され
る組成物。
【請求項１７】該転写ベクターが、請求項２に記載の麻疹ウイルスをコー
ドする単離された核酸分子を含んで成る、請求項１６の組成物。
【請求項１８】包膜化、転写および複製に必要なトランスに作用するタン
パク質Ｎ、Ｐ、ＬおよびＭ２をコードする最低１種の単離された核酸分子を含ん
で成る最低１種の発現ベクターと一緒に、請求項３に記載のＲＳＶサブグループ
Ｂのゲノムもしくはアンチゲノムをコードする単離された核酸分子を含んで成る
１種の転写ベクターを含んで成り、それにより発現に際して感染性の弱毒化ＲＳ
ＶサブグループＢが産生される組成物。
【請求項１９】該転写ベクターが、請求項４に記載のＲＳＶサブグループ
Ｂをコードする単離された核酸分子を含んで成る、請求項１８の組成物。
【請求項２０】該転写ベクターが、請求項５に記載のＲＳＶサブグループ
Ｂをコードする単離された核酸分子を含んで成る、請求項１８の組成物。
【請求項２１】請求項１６の最低２種のベクターで宿主細胞を形質転換も
しくはトランスフェクションすること、そして、感染性の弱毒化麻疹ウイルスを
産生するようにこれらのベクターの共発現を可能にする条件下で該宿主細胞を培
養することを含んで成る、感染性の弱毒化麻疹ウイルスの製造方法。
【請求項２２】該ウイルスが請求項２の麻疹ウイルスである、請求項２１
の方法。
【請求項２３】請求項１８の最低２種のベクターで宿主細胞を形質転換も
しくはトランスフェクションすること、そして、感染性の弱毒化ＲＳＶサブグル
ープＢを産生するようにこれらのベクターの共発現を可能にする条件下で該宿主
細胞を培養することを含んで成る、感染性の弱毒化ＲＳＶサブグループＢの製造
方法。
【請求項２４】該ウイルスが請求項４のＲＳＶサブグループＢである、請
求項２３の方法。
【請求項２５】該ウイルスが請求項５のＲＳＶサブグループＢである、請
求項２３の方法。