JP2000517194A - モノネガビラレス（Ｍｏｎｏｎｅｇａｖｉｒａｌｅｓ）と称される目のウイルスにおける弱毒化の原因となる３’ゲノムプロモーター領域およびポリメラーゼ遺伝子の突然変異 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ３’ゲノムプロモーター領域内に少なくとも一つの弱毒性突然変異を有し、かつＲＮＡポリメラーゼ遺伝子内に少なくとも一つの弱毒性突然変異を有する目（Ｏｒｄｅｒ）モノネガビラレス（Ｍｏｎｏｎｅｇａｖｉｒａｌｅｓ）の単離され、組換え法により作成され、弱毒化された、非分節、マイナス鎖−センス、一本鎖ＲＮＡウイルスが記載される。そのようなウイルスおよび生理学的に許容される担体を含むワクチンが製剤される。これらのワクチンを用いて個体を免疫化して、目（Ｏｒｄｅｒ）モノネガビラレス（Ｍｏｎｏｎｅｇａｖｉｒａｌｅｓ）の非分節、マイナス鎖−センス、一本鎖ＲＮＡウイルスに対する防御を誘導する。

Description

【発明の詳細な説明】 モノネガビラレス（Ｍｏｎｏｎｅｇａｖｉｒａｌｅｓ）と称される目のウイルス における弱毒化の原因となる３’ゲノムプロモーター領域およびポリメラーゼ遺 伝子の突然変異 発明の分野 本発明は、３’ゲノムプロモーター領域内に少なくとも一つの弱毒性突然変異 を有し、かつＲＮＡポリメラーゼ遺伝子内に少なくとも一つの弱毒性突然変異を 有する、モノネガビラレス（Ｍｏｎｏｎｅｇａｖｉｒａｌｅｓ）と称される目（ Ｏｒｄｅｒ）の、単離され、組換え法により作成される、弱毒化、非分節、マイ ナス鎖−センス、一本鎖ＤＮＡウイルスに関する。本発明は、米国公衆衛生総局 （ｔｈｅ ＰｕｂｌｉｃＨｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ）により授与された助成 金に基づく米国政府の支援により作成された。米国政府は本発明の所定の権利を 有する。 発明の背景 外被に覆われた、マイナス鎖−センス、一本鎖ＲＮＡウイルスは独特な様式で 構成されており、そして発現される。マイナス鎖−センス、一本鎖ウイルスのゲ ノムＲＮＡは、ヌクレオカプシドという状況では２つの鋳型機能を提供し、それ は：メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の合成のための鋳型として、およびアン チゲノム（ａｎｔｉｇｅｎｏｍｅ）（＋）鎖の合成のための鋳型としてである。 マイナス鎖−センス、一本鎖ＲＮＡウイルスはそれ自体のＲＮＡ依存性ＲＮＡポ リメラーゼをコードおよびパッケージングする。メッセンジャーＲＮＡは、ウイ ルスが感染細胞中で一旦外被がはずれた状態になって（ｕｎｃｏａｔｅｄ）初め て合成される。ウイルス複製はｍＲＮＡの合成後に生じ、そしてウイルス蛋白質 の継続合成を必要とする。新規に合成されたアンチゲノム（＋）鎖は（−）鎖ゲ ノムＲＮＡの更に別のコピーを生じるための鋳型として作用する。 ポリメラーゼ複合体は、ゲノムの３’末端、特にプロモーター領域でシス−作 用性シグナルに関与することにより転写および複製の作動および達成を行う。ウ イルス遺伝子はその後には、その３’末端から５’末端への単一方向で、ゲノム 鋳型から転写される。上流の近郊（すなわち核蛋白質遺伝子（Ｎ））に比較して 下流遺伝子（例えば、ポリメラーゼ遺伝子（Ｌ））から作られるｍＲＮＡは常に 数が少なくなる。従って、ゲノムの３’−末端に対する相対的な遺伝子の位置に 従うｍＲＮＡ量の勾配が常に存在する。 ウイルスの命名法における国際委員会（ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｎ ｔｈｅ Ｔａｘｏｎｏｍｙ ｏｆ Ｖｉｒｕｓｅ ｓ）による１９９３年の改定された再分類法に基づくと、モノネガビラレス（Ｍ ｏｎｏｎｅｇａｖｉｒａｌｅｓ）と称される目が確立されている。この目は、マ イナス極性（マイナス鎖−センス）の一本鎖、非分節ＲＮＡゲノムをもつ外被に 覆われたウイルスについて３つの科を含む。これらの科は、パラミクソウイルス 科（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）、ラブドウイルス科（Ｒｈａｂｄｏｖｉ ｒｉｄａｅ）、およびフィロウイルス科（Ｆｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ）である。科 パラミクソウイルス科（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）は更には２つの亜科 、パラミクソビリナエ（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｎａｅ）およびニューモビリ ナエ（Ｐｎｅｕｍｏｖｉｒｉｎａｅ）に分類されてい る。亜科パラミクソビリナエ（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｎａｅ）は３つの属、 パラミクソウイルス（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｕｓ）、ルブラウイルス（Ｒｕｂ ｕｌａｖｉｒｕｓ）、およびモルビリウイルス（Ｍｏｒｂｉｌｌｉｖｉｒｕｓ） を含む。亜科ニューモビリナエ（Ｐｎｅｕｍｏｖｉｒｉｎａｅ）は属ニューモウ イルス（Ｎｅｕｍｏｖｉｒｕｓ）を含む。 この新規分類法は形態学的基準、ウイルスゲノムの機構、生物学的活性、およ び蛋白質の配列関係に基づく。亜科パラミクソビリナエ（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉ ｒｉｎａｅ）については、外被に覆われたウイルス間での形態学的に際立った特 徴はヌクレオカプシドのサイズと形状（直径１８ｍｍ、長さ１ｍｍ、５．５ｎｍ のピッチ）であり、これは左巻きらせん対称性を有する。生物学的基準は：１） 属のメンバーの間での抗原の交差反応性、および２）属パラミクソウイルス（Ｐ ａｒａｍｙｘｏｖｉｒｕｓ）、ルブラウイルス（Ｒｕｂｕｌａｖｉｒｕｓ）にお けるノイラミニダーゼ活性の存在、ならびに属モルビリウイルス（Ｍｏｒｂｉｌ ｌｉｖｉｒｕｓ）におけるその活性の非存在、である。それに加え、Ｐ遺伝子の コーディング能力の変異物が考えられ、同様にルブラウイルス（Ｒｕｂｕｌａｖ ｉｒｕｓ）における余分な遺伝子（ＳＨ）の存在も考えられる。 ニューモウイルス（Ｐｎｅｕｍｏｖｉｒｕｓ）は形態学的にはパラミクソビリ ナエ（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｎａｅ）から識別することができ、なぜならそ れらは細長いヌクレオカプシドを含むためである。それに加えニューモウイルス （Ｎｅｕｍｏｖｉｒｕｓ）は、蛋白質をコードするシストロンの数（ニューモウ イルスでは１０であるのに対し、パ ラミクソビリナエ（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｎａｅ）では６である）、ならび にパラミクソビリナエ（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｎａｅ）のものとは非常に異 なる付着蛋白質（Ｇ）に主な違いがある。パラミクソウイルスとニューモウイル スとは、機能において対応するように見える６つの蛋白質（Ｎ、Ｐ、Ｍ、Ｇ／Ｈ ／ＨＮ、Ｆ、およびＬ）を有するものの、後の２つの蛋白質のみが、その２つの 亜科の間の有意な配列関係を示す。幾つものニューモウイルス性蛋白質がパラミ クソウイルスの大半における相対物、すなわち非構造蛋白質ＮＳＩおよびＮＳ２ 、小さな疎水性蛋白質ＳＨ、および第二蛋白質Ｍ２を欠いている。幾つかのパラ ミクソウイルス性蛋白質はニューモウイルスにおける相対物、すなわちＣおよび Ｖを欠いている。しかしながらニューモウイルスとパラミクソウイルスの基本的 ゲノム機構は同一である。この同一性はラブドウイルスとフィロウイルスにおい ても言える。表１はこれらのウイルスの最近の命名法による分類法と共に各属の 例を示す。 表１ 目モノネガビラリス（ｔｈｅ Ｏｒｄｅｒ Ｍｏｎｏｎｅｇａｖｉｒａｌｅｓ） の非分節、マイナス鎖−センス、一本鎖ＲＮＡウイルス（Ｖｉｒｕｓ）の分類科パラミクソウイルス科（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ） 亜科パラミクソビリナエ（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｎａｅ） 属パラミクソウイルス（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｕｓ） センダイウイルス（Ｓｅｎｄａｉ ｖｉｒｕｓ）（マウスのパラ インフルエンザウイルス タイプ１） ヒトパラインフルエンザウイルス（Ｈｕｍａｎ ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎ ｚａ ｖｉｒｕｓ）（ＰＩＶ）タイプ１および３ ウシパラインフルエンザウイルス（Ｂｏｖｉｎｅ ｐａｒａｉｎｆｌｕｅ ｎｚａ ｖｉｒｕｓ）（ＢＰＶ）タイプ３ 属ルブラウイルス（Ｒｕｂｕｌａｖｉｒｕｓ） シミアンウイルス（Ｓｉｍｉａｎ ｖｉｒｕｓ）５（ＳＶ）（イヌパライ ンフルエンザウイルス（Ｃａｎｉｎｅ ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕ ｓ）タイプ２） お多福風邪ウイルス（Ｍｕｍｐｓ ｖｉｒｕｓ） ニューキャッスル病ウイルス（Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ ｄｉｓｅａｓｅ ｖ ｉｒｕｓ）（ＮＤＶ）（鳥類のパラミクソウイルス（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｕ ｓ）１） ヒトパラインフルエンザウイルス（Ｈｕｍａｎ ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎ ｚａ ｖｉｒｕｓ）タイプ２、４ａ、および４ｂ 属モルビリウイルス（Ｍｏｒｂｉｌｌｉｖｉｒｕｓ） 麻疹ウイルス（Ｍｅａｓｌｅｓ ｖｉｒｕｓ）（ＭＶ） イルカモルビリウイルス（Ｄｏｒｐｈｉｎｅ ｍｏｒｂｉｌｌｉｖｉｒｕ ｓ） イヌジステンパーウイルス（Ｃａｎｉｎｅ ｄｉｓｔｅｍｐｅｒｖｉｒｕ ｓ）（ＣＤＶ） ペステ−デス−ペティツールミナンツウイルス（Ｐｅｓｔｅ−ｄｅｓ−ｐ ｅｔｉｔｓ−ｒｕｍｉｎａｎｔｓ ｖｉｒｕｓ） アザラシジステンパーウイルス（Ｐｈｏｃｉｎｅ ｄｉｓｔｅｍ ｐｅｒ ｖｉｒｕｓ） 牛疫ウイルス（Ｒｉｎｄｅｒｐｅｓｔ ｖｉｒｕｓ） 亜科ニューモビリナエ（Ｐｎｅｕｍｏｖｉｒｉｎａｅ） 属ニューモウイルス（Ｐｎｅｕｍｏｖｉｒｕｓ） ヒトＲＳウイルス（Ｈｕｍａｎ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｃｙｔ ｉａｌ ｖｉｒｕｓ）（ＲＳＶ） ウシＲＳウイルス（Ｂｏｖｉｎｅ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｃｙ ｔｉａｌ ｖｉｒｕｓ） マウスの肺炎ウイルス（Ｐｎｅｕｍｏｎｉａ ｖｉｒｕｓ ｏｆｍｉｃｅ ） シチメンチョウ鼻気管炎ウイルス（Ｔｕｒｋｅｙ ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈ ｅｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ）科ラブドウイルス科（Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ） 属リッサウイルス（Ｌｙｓｓａｖｉｒｕｓ） 狂犬病ウイルス（Ｒａｂｉｅｓ ｖｉｒｕｓ） 属ベシクロウイルス（Ｖｅｓｉｃｕｌｏｖｉｒｕｓ） 水泡性口内炎ウイルス（Ｖｅｓｉｃｕｌａｒ ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ ｖ ｉｒｕｓ） 属エフェメロウイルス（Ｅｐｈｅｍｅｒｏｖｉｒｕｓ） ウシ流行熱ウイルス（Ｂｏｖｉｎｅ ｅｐｈｅｍｅｒａｌ ｆｅｖｅｒ ｖｉｒｕｓ）科フィロウイルス科（Ｆｉｌｏｖｉｒｄａｅ） 属フィロウイルス（Ｆｉｌｏｖｉｒｕｓ） マールブルグウイルス（Ｍａｒｂｕｒｇ ｖｉｒｕｓ） これらのウイルスの内の多くのものについては、いずれの種類のワクチンは全 く利用できない。従って、ヒトおよび動物のこのような病原体に対するワクチン を開発する必要性が存在する。このようなワクチンはレシピエントにおける防御 免疫応答を誘導しなければならない。このような好ましい応答の質的および量的 特徴は、ウイルスの自然感染の生存者において見られるものから推定され、その ような生存者は一般的には感染後の幾分かの有意な期間、同一もしくはかなり関 連性の高いウイルスによる再感染から保護されている。 そのようなワクチンを開発するための調査の際には多種多様なアプローチが考 慮され得、それらは：（１）精製された個別のウイルス蛋白質ワクチン（サブユ ニットワクチン）；（２）不活化された全ウイルス調製物；および（３）生の弱 毒化ウイルス、の使用を含む。 サブユニットワクチンは、純粋であり、特定可能であり、そして組換えＤＮＡ 発現法を初めとする様々な手段により比較的簡単に大量生産されるという所望さ れる特徴を有する。今日までにはＢ型肝炎の表面抗原という著名な例外を別にす ると、ウイルスのサブユニットワクチンは一般的には短命、そして／または不十 分な免疫のみを、特にナイーブなレシピエントにおいて誘導するに過ぎない。 ポリオ（ＩＰＶ）およびＡ型肝炎のホルマリン不活化全ウイルス調製物は安全 かつ効果的であることが証明されている。それとは対照的に、例えばＲＳウイル スや麻疹ウイルスのような、同様に不活化させた全ウイルスワクチンでの免疫化 は、天然もしくは「野生型」ウイルスにその後に直面した際にはワクチン接種者 が悪化したもしくは常軌を逸脱した疾患にかかりやすくさせてしまう好ましくな い免疫応答および／または 応答プロフィールを誘導した。 初期の試み（１９６６年）は、非経口的に投与されたホルマリン不活化ＲＳＶ ワクチンを用いて年少の小児にワクチン接種を施すことであった。残念なことに 、このワクチンの数々のフィールド試験により重篤で不利な反応が明らかになり 、それはつまり後に受けるＲＳＶでの自然感染の際の普通にはない特徴をもつ重 篤な疾患の発症であった（参考文献、見出し番号１、２）。このホルマリン処理 されたＲＳＶ抗原が、異常もしくは不均衡な免疫応答プロフィールを誘導し、ワ クチン接種患者をＲＳＶ疾患にかかりやすくさせることが示唆されている（３、 ４）。 その後には、生の弱毒化されたＲＳＶワクチン候補物が低温継代もしくは化学 的突然変異誘発により作成された。これらのＲＳＶ株は、血清陽性の成人におい て菌力が低下していることが見いだされた。残念なことにこれらの株は、血清陰 性の乳児に投与された場合には弱毒化過剰もしくは不足のいずれかであることが 見いだされ；幾つかの症例では、それらの株は遺伝子の安定性を欠くことも見い だされた（５、６）。生ウイルスの非経口投与を用いる別のワクチン接種アプロ ーチは不十分であり、かつこの方向に沿った作業は中断された（７）。特筆に値 するが、これらの生ＲＳＶワクチンは、先に記載されるホルマリン不活化ＲＳＶ ワクチンについて観察された疾患増強には全く関係しなかった。最近では、低温 継代を施し、化学的に突然変異誘発させ、Ａ２およびＢ−１と表示されるＲＳＶ の株についての臨床試験が現在進行中であるものの、ヒトに対する投与について 承認されたＲＳＶワクチンは全く存在しない。 野生型ウイルスの、適切に弱毒化された生の誘導体は、ワクチン候補物として の際立った利点を提供する。生の複製可能な作用試薬として、 そのような誘導体はレシピエント内で感染を開始し、その際、ウイルス遺伝子産 物が発現され、処理され、そしてワクチン特異的ＭＨＣクラスＩおよびＩＩ分子 の状態で提示され、液性および細胞媒介免疫応答、ならびに自然感染の生存者の 防御免疫プロフィールに匹敵する、調和しあったサイトカインパターンを誘導す る。 この好ましい免疫応答パターンは、典型的には主に液性免疫監視機構に制限さ れる、不活化ワクチンもしくはサブユニットワクチンにより誘発される限定され た応答とはよい対比をなす。それに加え、例えば１９６０年代に開発された麻疹 ウイルスワクチンおよびＲＳウイルスワクチンのような幾つかのホルマリン不活 化全ウイルスワクチンは持続的防御を提供しないばかりでなく、ワクチンのレシ ピエントが後に野生型ウイルスに直面する際には、実際に常軌を逸脱して悪化し 、さらには致死的ともなりさえする疾患に対する疾病素因をもたらしもする。 生の弱毒化ウイルスはワクチン候補物としての高く所望される特徴を有すると 同時に、それらは開発が難しいことが判明している。難しさの関門は、疾患をも たらす能力（すなわち菌力）を失っていながらも、レシピエントに感染し、かつ 適切な量で所望される免疫応答プロフィールを誘導するのに十分な複製能力を保 持する野生型ウイルスの誘導体を単離する必要性である。 歴史的に菌力と弱毒化との間のこの微妙なバランスは、成長条件（例えば、温 度）を変化させた状態での様々な宿主組織もしくは細胞を介する野生型ウイルス 単離物の連続継代により達成されている。この過程は恐らくウイルス変化物（突 然変異体）の成長に都合がよく、そのような突然変異体の内の幾つかのものは弱 毒化の好ましい特徴を備えている。 場合によってはさらに別の弱毒化が化学的突然変異誘発によっても達成される。 この増殖／継代計画は典型的には、温度感受性であり、低温適用させ（ｃｏｌ ｄ−ａｄａｐｔｅｄ）そして／または宿主範囲が変化している（すなわち、宿主 範囲の内の一つもしくは全てが野生型で疾患を引き起こすウイルスとは異なって おり、この変化はすなわち弱毒化に関連してよい）ウイルス誘導体の出現をもた らす。 麻疹およびお多福風邪（これらはパラミクソウイルスである）の予防のため、 ならびにポリオおよび風疹（これらはプラス鎖のＲＮＡウイルスである）に対す る防御のためのものを含む数々の生ウイルスワクチンがこのアプローチにより作 成されており、そして世界中での現在の小児期の免疫化療法の大黒柱となってい る。 それにもかかわらず、弱毒生ウイルスワクチン候補物を作成するための手法は 時間がかかり、そしてよくても予想が立たず、主には所望される弱毒化特性を有 するランダムに生じるゲノム突然変異体の選択的成長を頼みとしている。得られ るウイルスはインビトロでは所望される表現型を有してよく、そして動物モデル においてさえも弱毒化されているとみなしてよい。しかしながらあまりにしばし ば、それらのウイルスは、それらがワクチン候補物として意図されるヒトもしく は動物宿主内では弱毒化過剰もしくは不足のいずれかとなっているままである。 現在使用されているワクチンについてでさえも、一層効力の高いワクチンに対 する必要性が存在する。例えば、現在の麻疹ワクチンはそれなりに優秀な防御を 提供する。しかしながら最近の麻疹の流行により、現在のワクチンの効力不足が 示唆される。母親由来の免疫化にもかかわら ず、高い率での急性麻疹感染が１歳以下の小児に発症しており、これはそのワク チンが、野生型麻疹感染の後に発達するものに匹敵する抗−麻疹抗体レベルを誘 導することができないことを反映している（８、９、１０）。結果として、ワク チンによる免疫化を受けた母親は、一生涯の内の最初の数カ月よりも先の時期ま で新生児を防御するに十分な胎盤通過性（ｔｒａｎｓｐｌａｃｅｎｔａｌｌｙ− ｄｅｒｉｖｅｄ）の受動抗体を自分の乳児に提供することはほとんど不可能なの である。 以前に免疫化を受けた青年および若年成人における急性麻疹感染は追加的な問 題の証拠となる。これらの続発性ワクチン効力低下により、大量かつ長命の両方 である抗ウイルス防御を誘導および維持する現在のワクチンの能力の限界が示さ れる（１１、１２、１３）。最近ではさらに別の潜在的問題が明らかになった。 過去１５年にわたって単離された野生型麻疹のヘマグルチニン蛋白質がワクチン 株からのものとはだんだん違ってきていることが示されている（１４）。この「 抗原変異（ａｎｔｉｇｅｎｉｃ ｄｒｉｆｔ）」は、ワクチン株は至適な防御を 提供するのに必要とされる理想的な抗原レパートリーを含んでいないかもしれな いという論理的な懸念を生み出した。従って改善されたワクチンについての必要 性が存在する。 合理的なワクチン設計は、これらのウイルスをより良く理解すること、特にウ イルスによりコードされる菌力の決定因子ならびに弱毒化の原因となるゲノム変 化の同定により助けられるであろう。 発明の要約 従って本発明の目的は、目モノネガビラレス（Ｍｏｎｏｎｅｇａｖｉｒａｌｅ ｓ）のＲＮＡウイルスのゲノムの領域であって、突然変異がそ れらのウイルスの弱毒化をもたらす領域を同定することである。 本発明のさらに別の目的は、ゲノム内にそのような弱毒性突然変異を取り込む 組換え法により作成されたウイルスを産生することである。 本発明のさらに別の目的は、そのような弱毒化ウイルスを含むワクチンを製剤 することである。 本発明のこれらの目的およびこれ以降に論議される本発明の他の目的は、３’ ゲノムプロモーター領域内に少なくとも一つの弱毒性突然変異を有し、かつＲＮ Ａポリメラーゼ遺伝子内に少なくとも一つの弱毒性突然変異を有する目モノネガ ビラレス（Ｍｏｎｏｎｅｇａｖｉｒａｌｅｓ）の、組換え的に作成され、弱毒化 される、非分節、マイナス鎖−センス、一本鎖ＲＮＡウイルスの作成および単離 により達成される。 麻疹ウイルスの場合には、３’ゲノムプロモーター領域内の少なくとも一つの 弱毒性突然変異は、ヌクレオチド２６（Ａ→Ｔ）、ヌクレオチド４２（Ａ→Ｔも しくはＡ→Ｃ）、およびヌクレオチド９６（Ｇ→Ａ）からなる群より選択され、 この場合、これらのヌクレオチド、ならびに本出願内で詳細に記載される他のヌ クレオチド（他に特別な記載がない限り）はプラス鎖で表され、アンチゲノム（ ａｎｔｉｇｅｎｏｍｉｃ）、すなわちメッセージ（コーディング）センスであり 、そしてＲＮＡポリメラーゼ遺伝子内の少なくとも一つの弱毒性突然変異は、残 基３３１（イソロイシン→スレオニン）、１４０９（アラニン→スレオニン）、 １６２４（スレオニン→アラニン）、１６４９（アルギニン→メチオニン）、１ ７１７（アスパラギン酸→アラニン）、１９３６（ヒスチジン→チロシン）、２ ０７４（グルタミン→アルギニン）、および２１１４（アルギニン→リシン）か らなる群より選択されるアミノ酸の変化をもたらす ヌクレオチド変化からなる群より選択される。 ヒトパラインフルエンザウイルス タイプ３の場合には、３’ゲノムプロモー ター領域内の少なくとも一つの弱毒性突然変異は、ヌクレオチド２３（Ｔ→Ｃ） 、ヌクレオチド２４（Ｃ→Ｔ）、ヌクレオチド２８（Ｇ→Ｔ）、およびヌクレオ チド４５（Ｔ→Ａ）からなる群より選択され、そしてＲＮＡポリメラーゼ遺伝子 中の少なくとも一つの弱毒性突然変異は、残基９４２（チロシン→ヒスチジン） 、９９２（ロイシン→フェニルアラニン）、および１５５８（スレオニン→イソ ロイシン）からなる群より選択されるアミノ酸の変化をもたらすヌクレオチド変 化からなる群より選択される。 ヒトＲＳウイルス亜群Ｂの場合には、３’ゲノムプロモーター領域内の少なく とも一つの弱毒性突然変異は、ヌクレオチド４（Ｃ→Ｇ）、およびヌクレオチド ６〜１１で複数のＡの配列（ｓｔｒｅｔｃｈ）内での追加的Ａの挿入からなる群 より選択され、そしてＲＮＡポリメラーゼ遺伝子内の少なくとも一つの弱毒性突 然変異が、残基３５３（アルギニン→リンン）、４５１（リシン→アルギニン） 、１２２９（アスパラギン酸→アスパラギン）、２０２９（スレオニン→イソロ イシン）、および２０５０（アスパラギン→アスパラギン酸）からなる群より選 択されるアミノ酸の変化をもたらすヌクレオチド変化からなる群より選択される 。 本発明の別の態様では、弱毒化ウイルスがそのウイルスの野生型形態に対する 防御免疫応答を誘導するワクチンを調製するのに用いられる。 本発明のさらに別の態様では、完全なウイルス性ヌクレオチド配列（野生型ウ イルスか、もしくは非組換え手法により弱毒化されたウイルスのものかのいずれ か）を有する、単離されたプラス鎖、アンチゲノム、メッ セージ（ａｎｔｉｇｅｎｏｍｉｃ ｍｅｓｓａｇｅ）センス核酸分子(もしくは 単離された、マイナス鎖、ゲノムセンス核酸分子)が、単離された、組換え法に より作成された弱毒化ウイルスを作成するために、本出願中に記載される一つも しくは複数の弱毒性突然変異を導入することにより処理される。 本発明のさらに別の態様では、このような完全な野生型核酸配列もしくはワク チンウイルスの核酸配列は：（１）試料中の対応ウイルスの存在を検出するため のＰＣＲアッセイ内での使用のためのＰＣＲプライマーを設計するため；もしく は（２）試料中の対応ウイルスの存在を検出するためのＥＬＩＳＡにおける使用 のためのペプチドを設計および選択するため、に用いられる。 図面の簡単な説明 図１は、エドモンストン（Ｅｄｍｏｎｓｔｏｎ）麻疹ウイルスの継代歴を示す （１５）。略語は以下の意味を有する：ＨＫ − ヒトの腎臓；ＨＡ − ヒト の羊膜；ＣＥ（ａｍ） − ニワトリ胚；ＣＥＦ − ニワトリ胎仔繊維芽細胞 ；ＤＫ−イヌの腎臓；ＷＩ−３８ − ヒト二倍体細胞；ＳＫ − ヒツジの腎 臓；＊ − プラーククローニング。各略語の後に付く数字は継代数を表す。 図２は、ゲノムおよびアンチゲノム末端および末端付近の仮想的シス−作用性 調節因子を示す麻疹ウイルスゲノムのマップを示す。上段−リーダー配列（ｌ） の５２ヌクレオチドを含む３’末端で始まり、そしてトレーラー配列（ｔ）の３ ７ヌクレオチドを含む５’末端で終了する麻疹ウイルスゲノムの概略的な地図。 遺伝子の境界は縦線により表され；各遺伝子の下にはシストロンヌクレオチドの 数が示される。下段−２つ のかなり保存率の高いドメイン、ＡおよびＢの位置および配列を示す、ゲノムお よびアンチゲノムの３’拡張ゲノムプロモーター領域の拡大された概略図。Ａ’ 〜Ｂ’領域を包含する未完成５’ＲＮＡは、Ｎプロテインのカプシドによる被包 化（ｅｎｃａｐｓｉｄａｔｉｏｎ）が開始する調節配列を含むと推定される。 図３は、２Ｂおよび１８５３７として表示されるＲＳＶ亜群Ｂ野生型株の遺伝 子地図（上部）、これらの株の遺伝子間配列（中間部）、ならびにＭ２とＬ遺伝 子との間に重複する６８ヌクレオチド（下部）を表す。ＲＳＶ ２Ｂ株は、１８ ５３７株と比較する場合には、Ｇ遺伝子内では６つ分のヌクレオチドが少なく、 このＧ遺伝子はＧプロテイン内では２つ分少ないアミノ酸残基をコードする。こ の２Ｂ株は５’トレーラー領域内に１４５ヌクレオチドを有し、これは１８５３ ７株内の１４９ヌクレオチドと比較される。この２Ｂ株は、ＮＳ−１、ＮＳ−２ 、およびＮ遺伝子の各々の中に一つもしくは複数のヌクレオチドを有し、そして １８５３７株と比較するとＭおよびＦ遺伝子の各々ではヌクレオチドが一つ少な くなっている。 発明の詳細な記述 マイナス鎖−センス、一本鎖ＲＮＡウイルスゲノムの転写および複製が、リボ 核酸蛋白質コア（ヌクレオカプシド）上で作用するマルチマー蛋白質の酵素活性 を通して達成される。裸のゲノムＲＮＡは鋳型として作用することができない。 その代わり、これらのゲノム配列は、それらがＮプロテインによる完全なカプシ ド形成によってヌクレオカプシド構造内に取り込まれて初めて認識される。この 状況になって初めて、ゲノムおよびアンチゲノムの末端プロモーター配列が認識 されて転写もしく は複製経路が開始する。 全てのパラミクソウイルスは２つのウイルス性蛋白質、ＬおよびＰを、それら のポリメラーゼ経路が進行するために必要とする。ＲＳＶを初めとするニューモ ウイルスも、その転写経路が効率よく進行するためには転写伸長因子Ｍ２を必要 とする。追加的補助因子も、ある役割を担っていてよく、それら補助因子には恐 らくウイルスによりコードされるＮＳ１およびＮＳ２プロテイン、ならびに恐ら く宿主細胞びよりコードされる蛋白質が含まれる。 しかしながら、相当数の証拠により、リボヌクレオチド重合の開始および停止 、ｍＲＮＡ転写物のキャッピングおよびポリアデニル化、Ｐプロテインのメチル 化および恐らくは特異的リン酸化を初めとする転写および複製に関連する全てで はないにせよ大半の酵素的過程を行うのはＬプロテインであることが示される。 このＬプロテインのゲノム転写および複製における中心的役割は、その大きなサ イズ、突然変異に対する感受性、ならびに転写の際に活性なウイルス複合体とし ての酵素レベルの量により支持される（１６）。 これらを考慮することにより、Ｌプロテインは、その鎖状につながれた構造が 個別の機能を統合する直線上の一連のドメインからできているという提案がもた らされた（１７）。事実、マイナス鎖−センスウイルスＬプロテイン内では、領 域が限定されたそのような個別の３つの因子が、他のよく特徴が決定されている 蛋白質の特定された機能性ドメインに対するそれらの関連性に基づいて同定され ている。これらには：（１）仮想的ＲＮＡ鋳型認識および／またはホスホジエス テル結合形成ドメイン；（２）ＲＮＡ結合性因子；ならびに（３）ＡＴＰ結合性 ドメインが 含まれる。非分節、マイナス鎖−センス、一本鎖ＲＮＡウイルスのＬプロテイン の従来の研究全てによりこれらの仮想的機能因子が明らかにされている（１７） 。 以下のことに限定されるわけではないが、これらの非蛋白質コーディングプロ モーターおよび他のシス−作用性ゲノム調節ドメインが、麻疹ウイルス（ＭＶ） および目モノネガビラレス（Ｍｏｎｏｎｅｇａｖｉｒａｌｅｓ）の他のウイルス による転写および複製がＬプロテインと関連して実現する効力の重要な決定因子 であること、そして従ってそれらも同様に先のウイルスの菌力決定因子である可 能性があるということを仮定するのはもっともなことである。 総括すると、本発明は、シス作用性調節シグナル（３’ゲノムプロモーター領 域）とポリメラーゼ遺伝子（Ｌ）との間に調和しあった一連の変化を含むと考え られ、そのことにより、ウイルスが複製するのに十分な能力を保持させながらも ウイルスの弱毒化がもたらされる。弱毒化は３’ゲノムプロモーター領域および ポリメラーゼ遺伝子の合理的突然変異により至適化され、このことにより複製効 率の所望されるバランスが提供され：そのためこのウイルスワクチンはもはや疾 患を引き起こすことはできないが、それでもワクチン接種患者の細胞を感染する 能力、所望される免疫応答の完全なスペクトラムおよび特徴を誘導するのに十分 な量の遺伝子産物を発現する能力、ならびに誘導される免疫応答の量を最大限に するのに十分な生殖および分散を行う能力を保持してはいる。 以下のことに拘束されるものではないが、延長されたプロモーター（３’ゲノ ムプロモーター領域）内およびポリメラーゼ遺伝子内の弱毒性突然変異は、シス 一作用性シグナルの提示、およびそれらのシグナル に関与するポリメラーゼ複合体の構造に影響を与えると考えられる。例えば、カ プシド形成が行われる際にはプロモーターＲＮＡはらせん的に整列した状態でコ イル状に巻かれる。プロモーター配列の変化は、保存されたシグナルが一つ一つ に関連して提示される相対的位置に影響を及ぼしてよい。具体的には麻疹の野生 型３’ゲノムプロモーター領域は、位置２６および４２ではピリミジン（ウラシ ル）を有する（アンチゲノム、メッセージセンス配列はプリンであるアデニンを 有する）。ワクチン株はこれらの位置にはプリンを有する（アンチゲノム、メッ セージセンス配列は対応するピリミジンを有する；以下の実施例１の表３を参照 されたい）。大きめのプリンは、プロモーターの保存ドメイン間（例えば、麻疹 の場合には、位置１〜１１および８７〜９８）の距離および／または角度表示（ ａｎｇｕｌａｒ ｄｉｓｐｌａｙ）を変化させてよく、このことによりポリメラ ーゼに対するシス−作用性シグナルの空間的位置関係が変化する。 動物実験により、疾患を回避させるには十分でありながら所望される免疫応答 を誘導するに足るウイルス複製の低下が示されている。このことは転写の低下、 ウイルスによりコードされる蛋白質の遺伝子発現の低下、アンチセンス鋳型の低 下、および従って数は少ないが新規のゲノムの産生、を表すように思われる。得 られる弱毒化ウイルスは野生型と比較するとその菌力が有意に低下している。 本明細書に記載される弱毒性突然変異は２つの方法によりウイルス株内に導入 されてよく、それらの方法は： （１）化学的突然変異誘発物質が添加してある細胞培養物内でのウイルス成長 中の化学的突然変異誘発、温度感受性および／または低温に適 応性突然変異を選択する目的で至適下温度での継代に供されるウイルスの選択、 細胞培養物中で小プラークを産生する突然変異体ウイルスの同定、ならびに宿主 範囲突然変異についての選択を行うための異種宿主を介する継代のような通常の 方法。その後にこれらのウイルスは動物モデル内でのそれらの生物学的活性の弱 毒化についてスクリーニングされる。弱毒化されたウイルスは、弱毒性突然変異 の部位の位置決定を行うためにそれらの３’ゲノムプロモーター領域およびポリ メラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列決定に供される。これが一旦行われたら、方 法（２）をその後に実施する。 （２）弱毒性突然変異を導入する好ましい方法は、部位特異的突然変異誘発を 用いる、予め決定された突然変異を作成することを含む。これらの突然変異は方 法（１）によるか、もしくその弱毒性突然変異が既に知られている密接に関連す るウイルスとの照合によるかのいずれかにより同定される。一つもしくは複数の 突然変異が、３’ゲノムプロモーター領域およびポリメラーゼ遺伝子の各々の中 に導入される。コーディングおよび非コーディング変化の異なる組み合わせ物の 累積効果も評価することができる。 ３’ゲノムプロモーター領域およびポリメラーゼ遺伝子に対する突然変異は標 準的な組換えＤＮＡ方法によりウイルスゲノムのＤＮＡコピー内に導入される。 これは、野生型もしくは改変されたウイルスのゲノムバックグラウンド（例えば 方法（１）により改変されたウイルス）であり、そのことにより新規のウイルス が作成されてよい。これらの弱毒性突然変異を含む感染性クローンもしくは粒子 は、ｃＤＮＡ「救済（ｒｅｓｃｕｅ）」系を用いて作成され、この系は、センダ イウイルス（Ｓｅ ｎｄａｉ ｖｉｒｕｓ）（１８）；麻疹ウイルス（１９）；ＲＳウイルス（２０ ）；狂犬病（２１）；水泡性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）（１５）；および牛疫ウ イルス（２３）を初めとする多種多様のウイルスに適用されており；これらの引 用文献は引用により本明細書に取り込まれる。麻疹ウイルスの救済については、 米国を指定する公開された国際特許出願ＷＯ第９７／０６２７０号（２４）を； ＰＩＶ−３の救済については、米国仮特許出願第６０／０４７５７５号（２５） を；ＲＳＶの救済については、米国を指定する公開された国際公開出願ＷＯ第９ ７／１２０３２号（２６）を参照されたく；これらの出願は引用により本明細書 に取り込まれる。 簡潔に述べると、全てのモノゲガビラレス（Ｍｏｎｏｎｅｇａｖｉｒａｌｅｓ ）救済系は以下のように総括することができる：各系は、適切なＤＮＡ依存性Ｒ ＮＡポリメラーゼプロモーター（例えば、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモータ ー）と自己開裂性リボザイム配列（例えば、デルタ型肝炎リボザイム）との間に 位置する全ウイルスゲノムのクローン化されたＤＮＡ等価物を必要とし、これが 繁殖可能な細菌性プラスミド内に挿入される。この転写ベクターは、そこからは ＲＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ）が忠実に、正確もし くはほぼ正確な５’および３’末端を有するウイルス性アンチゲノム（もしくは ゲノム）の一本鎖ＲＮＡコピーを転写することができる、容易に操作可能なＤＮ Ａ鋳型を提供する。そのウイルス性ゲノムＤＮＡコピー、ならびにフランクプロ モーターおよびリボザイム配列の方向が、アンチゲノムもしくはゲノムＲＮＡ等 価物のいずれが転写されるかを決定する。新規のウイルス子孫の救済のためには 更に、裸の一本鎖ウイルス性アンチ ゲノムもしくはゲノムＲＮＡ転写物を機能性ヌクレオカプシド鋳型内にカプシド 形成により被包するのに必要とされるウイルス特異的トランス−作用性蛋白質： ウイルス性ヌクレオカプシド（ＮもしくはＮＰ）プロテイン、ポリメラーゼと会 合するホスホプロテイン（Ｐ）、ならびにポリメラーゼ（Ｌ）蛋白質も必要とさ れる。これらの蛋白質は、転写および複製を達成させるためにこのヌクレオカプ シド鋳型を埋め込まなければならない活性なウイルス性ＲＮＡ−依存性ＲＮＡポ リメラーゼを含む。 麻疹ウイルスの救済のために必要とされるトランス−作用性蛋白質は、カプシ ド形成性蛋白質Ｎ、ならびにポリメラーゼ複合体蛋白質ＰおよびＬである。ＲＩ Ｖ−３についてはカプシド形成性蛋白質はＮＰと表示され、そしてポリメラーゼ 複合体蛋白質はやはりＰおよびＬとして引用される。ＲＳＶについてはウイルス 特異的トランス−作用性蛋白質はＮ、Ｐ、およびＬを含み、そしてそれに加えて 追加的な蛋白質Ｍ２、すなわちＲＳＶによりコードされる転写伸長因子を含む。 典型的にはこれらのウイルス性トランス−作用性蛋白質は、必要とされる蛋白 質をコードする一つもしくは複数のプラスミド発現ベクターから作成されるもの の、必要とされるトランス−作用性蛋白質の内の幾つかもしくは全ては、適切な 形質転換体として、これらのウイルス特異的遺伝子および遺伝子産物を含みかつ 発現するように工学的に作成された哺乳類細胞内で産生されてよい。 救済のための典型的な（ただし必ずしも全面的である必要はない）状況は、Ｔ ７ポリメラーゼが存在して、ウイルス性ゲノムｃＤＮＡに含有される転写ベクタ ーからのアンチゲノム（もしくはゲノム）一本鎖ＲＮＡの転写を稼働させる適切 な哺乳類細胞環境を含む。同時転写によるか そのすぐ後によるかのいずれかで、このウイルス性アンチゲノム（もしくはゲノ ム）ＲＮＡ転写物はヌクレオカプシド蛋白質により機能的鋳型内にカプシド形成 をへて挿入され、そして必須なウイルス特異的トランス−作用性蛋白質をコード する同時トランスフェクトを受けた発現プラスミドから同時に産生される必須な ポリメラーゼ構成成分による会合が行われる。これらの現象および過程によりウ イルスｍＲＮＡの必須条件となる転写、新規ゲノムの複製および増幅、そしてそ れによる新規ウイルス子孫の産生、すなわち救済がもたらされる。 狂犬病、ＶＳＶ、およびセンダイ（Ｓｅｎｄａｉ）ウイルスの救済のためには 、Ｔ７ポリメラーゼが組換えワクシニアウイルスＶＹＦ７−３により提供される 。しかしながらこの系は、物理学的もしくは化学的手法によるか、またはポック スウイルスにとっては良い宿主ではない細胞もしくは組織内での反復継代により 、救済されたウイルスがワクシニアウイルスから分離されなければならないこと を必要とする。ＭＶ ｃＤＮＡの救済については、この必須要件は、Ｔ７ポリメ ラーゼ、ならびにウイルス性ＮおよびＰプロテインを発現する細胞株を作成する ことにより回避される。救済は、ゲノム発現ベクターおよびＬ遺伝子発現ベクタ ーをヘルパー細胞株内にトランスフェクトすることにより達成される。Ｔ７ Ｒ ＮＡポリメラーゼを発現するが哺乳類細胞内では複製しないワクシニアウイルス ＭＶＡ−Ｔ７の宿主範囲突然変異体の利点を利用してＲＳＶ、牛疫（Ｒｉｎｄｅ ｒｐｅｓｔ）ウイルス、およびＭＶを救済する。必要なカプシド形成性蛋白質の 同時発現の後には、合成の全長アンチゲノムウイルスＲＮＡのカプシド形成によ る被包化、複製、および転写がウイルス性ポリメラーゼ蛋白質により行われ、そ して複製されたゲ ノムは感染を受けたビリオン内にパッケージングされる。そのようなアンチゲノ ムに加え、ゲノム類似物が現在センダイ（Ｓｅｎｄａｉ）ウイルスおよびＰＩＶ −３について成功裏の内に救済されている（２５、２７）。 この救済系は従って、３’ゲノムプロモーター領域内に少なくとも一つの弱毒 性突然変異を有し、そしてＲＮＡポリメラーゼ遺伝子内に少なくとも一つの弱毒 性突然変異を有する目モノネガビラレス（Ｍｏｎｏｎｅｇａｖｉｒａｌｅｓ）の 非分節、マイナス鎖−センス、一本鎖ＲＮＡウイルスのゲノムもしくはアンチゲ ンノムをコードする単離された核酸分子を含む転写ベクターを、カプシド形成、 転写、および複製に必要なトランス−作用性蛋白質（例えば、麻疹ウイルスにつ いてはＮ、Ｐ、およびＬ；ＰＩＶ−３についてはＮＰ、Ｐ、およびＬ；ＲＳＶに ついてはＮ、Ｐ、Ｌ、およびＭ２）をコードする少なくとも一つの単離された核 酸分子を含む少なくとも一つの発現ベクターと共に含む組成物を提供する。その ため宿主細胞は、直前に記載された少なくとも２つの発現ベクターでの形質転換 もしくはトランスフェクトを受ける。この宿主細胞を、感染性弱毒化ウイルスを 産生させるようなこれらのベクターの同時発現を可能にする条件下で培養する。 その後には、救済された感染性ウイルスを、その所望される表現型（温度感受 性、冷温適応、プラーク形態、ならびに転写および複製弱毒）について、まずは インビトロの手段で検査する。シス−作用性３’ゲノムプロモーター領域での突 然変異も、必要とされるトランス−作用性カプシド形成およびポリメラーゼ活性 が野生型もしくはワクチンヘルパーウイルスによるか、あるいはＮ遺伝子、Ｐ遺 伝子、および遺伝子特異的弱 毒性突然変異を有する異なるＬ遺伝子を発現するプラスミドにより提供されるミ ニレプリコン系を用いて検査される（１９、２８）。 救済されたウイルスの弱毒化表現型が存在する場合には、刺激誘発実験を適切 な動物モデルで実施する。非ヒト霊長類は、ヒト疾患の病原性についての好まし い動物モデルを提供する。これらの霊長類をまず、弱毒化され、組換え法により 作成されたウイルスで免疫し、その後にはそのウイルスの野生型形態で刺激誘発 する。限定されるものではないが、経鼻、気管内、もしくは皮下経路を含む多種 多様の経路の接種によりサルを感染させる（２９）。実験的に感染させたアカゲ ザル（ｒｈｅｓｕｓ）およびカニクイザル（ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ ｍａｃａｑ ｕｅｓ）も、麻疹に対してワクチンにより誘導される防御の研究のための動物モ デルとして役立つ（３０）。防御は、疾患の徴候および症状、生存率（ｓｕｒｖ ｉｖａｌ）、ウイルスの抜け殻（ｖｉｒｕｓ ｓｈｅｄｄｉｎｇ）、および抗体 力価のような基準により測定する。所望される基準が満たされる際には、弱毒化 された組換え法により作成されたウイルスはヒトにおける検査のための生存可能 なワクチン候補物であると見なされる。「救済された」ウイルスは「組換え法に より作成された」と見なされ、そして、やはり弱毒性突然変異を取り込んでいる そのウイルスの子孫および後の世代も同様である。 例え「救済された」ウイルスがワクチン使用の至適レベルと比較すると弱毒化 が不十分もしくは過剰であったとしても、これはそのような至適株を開発するた めの貴重な情報である。 至適状態では、弱毒性点突然変異を含むコドンは第二、もしくは第二および第 三の突然変異をそのコドン内に、弱毒性点突然変異のみを含む コドンによりコードされるアミノ酸を変化させることなく取り込ませることによ り安定化されてよい。弱毒性かつ安定性突然変異を含む感染性ウイルスクローン もやはり、先に記載されるｃＤＮＡ「救済」系を用いて作成される。 麻疹ウイルスは本発明にとっては有用なモデルであり、なぜなら配列データが 現在では疾患発症性野生型ウイルスについて、そして証明された効力の履歴を有 する疾患予防性ワクチンについては、本明細書に記載されるものが利用可能であ るためである。 麻疹ウイルスは最初には、デビッド エドモンストン（Ｄｅｖｉｄ Ｅｄｒｎ ｏｎｓｔｏｎ）と称する感染患者から、１９５４年に組織培養物中で単離された （３１）。麻疹のこのエドモンストン（Ｅｄｍｏｎｓｔｏｎ）株は、多くの弱毒 生麻疹ウイルスのための原種となり、それらのワクチンには米国内における現在 のワクチンでありかつ１９６８年に認可を受け、そして効力があることが判明し ているモラテン（Ｍｏｒａｔｅｎ）［（Ａｔｔｅｎｕｖａｘ（商標）；Ｍｅｒｃ ｋ Ｓｈａｒｐ ＆ Ｄｏｈｍｅ社、Ｗｅｓｔ Ｐｏｉｎｔ、ＰＡ）が含まれる 。 １９６０年台中期から後半に制定された積極的な免疫化プログラムにより、１ ９６５年のほぼ７００，０００人から１９８３年の１５００人へと、報告された 麻疹症例に急激な症例数減少がもたらされた。それと並行して他のワクチン株も エドモンストン（Ｅｄｍｏｎｓｔｏｎ）株から開発され（図１を参照されたい） 、それらは、シュワルツ（Ｓｃｈｗａｒｚ）（Ｉｎｓｔｉｔｕｔ Ｍｅｒｉｅｕ ｘ、Ｌｙｏｎ、Ｆｒａｎｃｅ）、ザグレブ（Ｚａｇｒｅｂ）（Ｚａｇｒｅｂ、Ｙ ｕｇｏｓｌａｖｉａ）、およびＡＩＫ−Ｃ（Ｊａｐａｎ）である。これら他のワ クチンも やはり効力があることが証明されており、かつ広範囲にわたり利用されている。 初期の反応原性で（ｒｅａｃｔｏｇｅｎｉｃ）、弱毒化不十分なワクチン株（Ｒ ｕｂｅｏｖａｘ（商標）：Ｍｅｒｃｋ Ｓｈａｒｐ ＆ Ｄｏｈｍｅ）は小児に 麻疹様疾患をもたらし、そしてその使用はそのため停止された。しかしながらこ れが更にうまく弱毒化されてモラテン（Ｍｏｒａｔｅｎ）ワクチン株をもたらし た（図１を参照されたい）（３２）。生の麻疹ウイルスワクチンは効力のあるワ クチンの開発の成功談を提供し、そして非分節、マイナス鎖−センス、一本鎖Ｒ ＮＡウイルスでのウイルス性ワクチン弱毒の分子メカニズムの理解のためのモデ ルを提供する。 ヒトの罹患率および死亡率の主な原因として重要であるため、麻疹ウイルス（ ＭＶ）は非常に広域にわたり研究されている。ＭＶは、２つの区画、すなわちリ ポ蛋白質膜とリボ核蛋白質粒子コア（各々は異なる生物学的機能を有する）から なる大きく、比較的球状で外被に被覆された粒子である（３３）。ビリオン外被 は３つのウイルス特異的蛋白質により改変される宿主細胞由来の原形質膜であり 、それらの蛋白質：ヘマグルチニュン（Ｈ；約８０キロダルトン（ｋＤ））およ び融合（ｆｕｓｉｏｎ）（Ｆ₁，₂；約６０ｋＤ）糖蛋白質はビリオン表面に突出 し、そして宿主細胞接着およびウイルス粒子内への侵入能力を付与する（１６） 。Ｈおよび／またはＦに対する抗体は防御性と見なされ、なぜならそれらはウイ ルスが感染を開始する能力を中和するためである（３４、３５、３６）。マトリ ックス（Ｍ；約３７ｋＤ）蛋白質は膜の内部表面に並ぶ両親媒性蛋白質であり、 これがビリオン形態形成を組織化し、そしてそのためウイルス複製を完了させる と考えられている（３７）。ビリオン コアは１５，８９４ヌクレオチド長のゲノムＲＮＡを含み、このゲノムＲＮＡが 約６０ｋＤのヌクレオカプシド（Ｎ）蛋白質の内の約２６００分子と密接な会合 を行うことによりこのゲノムＲＮＡに鋳型活性が付与される（３８、３９、４０ ）。この、酵素レベルのウイルス性ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（Ｌ；約２ ４０ｋＤ）は、おおよそ１ミクロンの長さのこのらせん状リボ核蛋白質粒子と緩 い会合を行い、そして、ポリメラーゼ補助因子（Ｐ；約７０ｋＤ）および恐らく は更に別のウイルス特異的蛋白質ならびに宿主によりコードされる蛋白質と協力 してＭＶゲノム配列を転写および複製する（４１）。 今日までには、全ヌクレオチド配列（エドモンストン（Ｅｄｍｏｎｓｔｏｎ） Ｂ 研究室用株およびＡＩＫ−Ｃワクチン株についてのみ）、コーディング能（ ｃｏｄｉｎｇ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）、およびＭＶゲノムの構成が報告されてい る（３３）。６つのビリオン構造蛋白質は、以下のよう、すなわち：３’−Ｎ− Ｐ−Ｍ−Ｆ−Ｈ−Ｌ−５’として並べられる６つの連続的な非重複遺伝子により コードされる。機能が未だに不確定である２つの追加的ＭＶ遺伝子産物も同定さ れている。これら２つの非構造蛋白質はＣ（約２０ｋＤ）およびＶ（約４５ｋＤ ）として知られており、この両方ともがＰ遺伝子によりコードされており、前者 はそのＰ ｍＲＮＡ内の第二読み取り枠により；後者は、Ｐのアミノ末端配列お よび新規ジンクフィンガー様のシステインに富むカルボキシ末端ドメインを有す るハイブリッド蛋白質をコードする同時転写の際にエディットされたＰ遺伝子由 来のｍＲＮＡによりコードされる（１６）。 ウイルス特異的蛋白質をコードする配列に加え、ＭＶ遺伝子は、関連するウイ ルスの転写および複製経路を指令するものに類似する特有の非 蛋白質コーディングドメインを含む（１６、４２）。これらの調節シグナルは、 ＭＶゲノムの３’および５’末端、ならびに各シストロン間の境界にわたって伸 びる短い内部領域内に存在する。前者は仮想的プロモーター、および／またはゲ ノム転写、ゲノムおよびアンチゲノムカプシド形成、および複製を指令する調節 配列因子をコードする。後者は転写停止および各モノシストロン性ウイルスｍＲ ＮＡのポリアデニル化、およびそのため次の遺伝子の転写の再開始のシグナリン グを行う。一般的にはＭＶポリメラーゼ複合体は、他の非分節マイナス鎖ＲＮＡ ウイルスのＲＮＡ−依存性ＲＮＡポリメラーゼと同等にこれらのシグナルに応答 するように思われる（１６、４２、４３、４４）。 転写はＭＶゲノムの３’末端もしくはその付近で開始し、そしてその後に５’ 方向に進行してモノシストロン性ｍＲＮＡを産生する（４０、４２、４５）。ポ リメラーゼはＭＶゲノム鋳型を横切るため、ポリメラーゼは仮想的停止／開始シ グナルに遭遇し、それは３’〜５’の順では：各々のモノシストロン性ｍＲＮＡ が完了する半保存転写停止／ポリアデニル化シグナル（Ａ／Ｇ Ｕ／Ｃ ＵＡ Ａ／Ｕ ＮＮ Ａ₄、この場合Ｎは４つの塩基の内のいずれかであってよい）； 転写されない遺伝子間トリヌクレオチド句読点（ＣＵＵ；Ｈ：Ｌ境界を例外とす る（ここではその句読点はＣＧＵとなる））；ならびに次の遺伝子の転写開始の ための半保存開始シグナル（ＡＧＧ Ａ／Ｇ ＮＮ Ｃ／Ａ Ａ Ａ／Ｇ Ｇ Ａ／Ｕ、この場合、Ｎは４つの塩基の内のいずれかであってよい）（４５、４６ ）、となる。幾つかのポリメラーゼ複合体は再開始しないため、各ＭＶ ｍＲＮ Ａの量は、ゲノム３’末端からの、コードされる遺伝子の距離と並行して減衰す る。このｍＲＮＡ勾配は直接、各ウ イルスにより特定される蛋白質の相対量に対応する。このことにより、ＭＶ蛋白 質発現が最終的には転写レベルで調節されることが示される（４４）。 ３’および５’ＭＶゲノム末端は非蛋白質コーディング配列を含み、これはＶ ＳＶのリーダーおよびテイラーＲＮＡによりコードされる領域と明らかに相似す る（４２）。ヌクレオチド１〜５５は、ゲノム３’末端とＮ遺伝子の始まりとの 間の領域を特定する一方で、３７の追加的ヌクレオチドがＬ遺伝子の終わりとゲ ノムの５’末端との間に見いだされ得る。しかしながらＶＳＶとは異なり、ある いはパラミクソウイルス（ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｕｓｅｓ）であるセンダイ（ Ｓｅｎｄａｉ）ウイルスやＮＤＶとさえも異なり、ＭＶはこれらの末端領域を、 短く、修飾されない（＋）もしくは（−）センスリーダーＲＮＡには転写しない （４７、４８、４９）。その代わりにリーダーは、全長のポリアデニル化された リーダー：Ｎ、リーダー：Ｎ：Ｐ、リーダー：Ｎ：Ｐ：Ｍ、を含む転写物を読み 過ごし、そして当然のことながら全長のアンチゲノムＭＶ ＲＮＡは転写される （４８、４９）。従って、短いリーダー転写物、すなわちＶＳＶの一本鎖、マイ ナス極性のゲノムの転写から複製へのスイッチ切り替えを決定する重要な作動用 因子（５０、５１、５２）がＭＶには存在しないようである。このことにより、 この重要な複製現象についての別のモデルが考慮および探索される（４２）。 麻疹ウイルス、ならびに全ての他のモノネガビラレス（Ｍｏｎｏｎｅｇａｖｉ ｒａｌｅｓ）（ただしラブドウイルス始まり除外する）では、リーダーおよびテ イラーをコードする配列の境界を越えて、その末端調節ドメインが伸長している ように思われる（４２）。麻疹については、 これらの領域は１０７の３’ゲノムヌクレオチド（「３’ゲノムプロモーター領 域」、これは「伸長されたプロモーター」としても引用され、これは、リーダー 領域をコードする５２ヌクレオチド、その後に続く３つの遺伝子間ヌクレオチド 、およびＮ ｍＲＮＡの５’非転写領域をコードする５２ヌクレオチドを含む） 、ならびに１０９の５’末端ヌクレオチド（６９はＬ ｍＲＮＡの３’非転写領 域をコードし、遺伝子間トリヌクレオチド、およびテイラーをコードする３７ヌ クレオチドと続く）を包含する。これらの３’末端内では、ゲノムおよびアンチ ゲノムの両方の内の約１００ヌクレオチドは、共有されるヌクレオチド配列から なる２本の短い領域であり：そのゲノムおよびアンチゲノムの絶対３’末端の１ ６ヌクレオチドの内の１４は同一である。これらの末端の内側では、絶対配列同 一性を持つ１２ヌクレオチドからなる追加的領域の位置が決定されている。ＭＶ ゲノムの転写が開始されなければならず、かつアンチゲノムの複製が始まらなけ ればならない部位およびその部位付近の位置により、これらの短い非反復配列ド メインが伸長プロモーター領域を含むことが示唆される。 これらの不連続な配列因子は、転写開始の別の部位を読み取ってよく、 −−それはすなわち、Ｎ遺伝子開始部位での転写開始を指令する内部ドメインお よびアンチゲノム産生を指示する３’末端ドメインである（４２、４８、５３） 。転写および複製のシス−作用性決定基としてのそれらの調節的役割に加え、こ れらの３’伸長ゲノムおよびアンチゲノムプロモーター領域は、各々アンチゲノ ムおよびゲノムＲＮＡの未完成の５’末端をコードする。これらの未完成ＲＮＡ 内にはＮプロテイン核形成のための未だ特定されていないシグナルと同様に、ヌ クレオカプシド 鋳型形成のため、そしてその結果転写および複製の増幅のために必要とされる別 の重要な調節因子が存在する。図２は、これらの高度に保存される仮想的シス− 作用性調節ドメインの位置および配列を概略的に示す。 位置、サイズ、および空間特性（ｓｐａｃｉｎｇ）が類似する末端非蛋白質コ ーディング領域が、属パラミクロビリダエ（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ） の他のメンバーのゲノム内に存在するものの、それらの絶対末端ヌクレオチドの 内のわずか８〜１１のみがＭＶと共有されるに過ぎない（４２、５４）。モルビ リウイルス（Ｍｏｒｂｉｌｌｉｖｉｒｕｓ）であるイヌジステンパーウイルス（ ＣＤＶ）のゲノム末端は、そのＭＶ関係物とは非常に高い相同性を示し：これら ２つのウイルスのリーダーおよびテイラー配列のヌクレオチドの内の７３％が同 一であり、それには絶対３’末端の１８の内の１６、および５’末端の１８の内 の１７が含まれる（５５）。ＭＶ伸長プロモーターのものに対し、アクセサリー （ａｃｃｓｓｏｒｙ）内部ＣＤＶゲノムドメインが共有する相同性は全く見いだ されなかった。しかしながら、ＣＤＶゲノムヌクレオチド８５と１０４、ならび に１５，５８７と１５，６０６の間に存在する２０ヌクレオチド長の配列（ｓｔ ｒｅｔｃｈ）が存在し、これらの場合には２０ヌクレオチドの内の１５が相補的 となる（Ｇｅｎｅ Ｂａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒＡＦ １４９ ５３）。このことによりＣＤＶはＭＶと同様に、非コーディング３’ゲノムおよ びアンチコドン末端内に重要なシス−作用性プロモーターおよび／または調節シ グナルを提供してよい追加的領域を含むことが示される（５５）。 追加的に、３’−リーダー領域の厳密な長さ（５５ヌクレオチド）は、科（Ｆ ａｍｉｌｙ）パラミクソウイルス科（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉ ｄａｅ）の数々のメンバーの間（ＭＶ、ＣＤＶ、ＰＩＶ−３、ＢＰＶ−３、ＳＶ 、およびＮＤＶ）では同一である。これらの伸長非蛋白質コーディング領域の重 要性の更に別の証拠は、亜急性硬化性全脳炎（ＳＳＰＥ）の脳組織から最近クロ ーン化された大多数の独特なコピーバック（ｃｏｐｙ−ｂａｃｋ）不完全干渉性 ウイルス（Ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ Ｖｉｒｕｓｅｓ）（ ＤＩ）の分析により得られる。９５の５’末端ゲノムヌクレオチドを下回る長さ のステムを有するＤＩは全く見いだされなかった。このことにより、ＭＶ ＤＩ ＲＮＡ複製およびカプシド形成に必要とされる最小限のシグナルは、３７ヌク レオチド長のテイラー配列をゆうに上回って伸長して、追加的内部仮想的調節ド メインを包含することが示される（５６）。 部分的にはお多福風邪ウイルスにより例示されるように本発明は、重要な菌力 ／弱毒決定基が、ウイルス性ゲノム非蛋白質コーディング調節領域内、およびこ れらのシス−作用性因子が相互作用を行わなければならないトランス−作用性転 写／複製酵素内に存在するという理念に関する。このシス−作用性ドメインはＭ Ｖゲノムの３’および５’末端の両方に見いだされ、ウイルス性構造蛋白質をコ ードする６つの連続する遺伝子をフランクし；そしてＭＶゲノム領域内では短い 領域として内部遺伝子間領域を包含する。前者はゲノム転写、ゲノムおよびアン チゲノムのカプシド形成、ならびに複製からなるウイルス性過程を指令する仮想 的プロモーターおよび／または調節配列因子をコードする。後者は転写停止およ び各モノシストロンウイルスｍＲＮＡのポリアデニル化、ならびにそのため次の 遺伝子の転写の再開始のシグナリングを行う。転写／複製酵素であるＲＮＡ依存 性ＲＮＡポリメラーゼ分子は転写および／ま たは複製効率を調節することができ、そのことにより細胞変性ウイルス遺伝子産 物および／またはビリオンの子孫の量を決定する。 麻疹ウイルスのための本発明の概念の確証は、まず原種であるエドモンストン （Ｅｄｍｏｎｓｔｏｎ）野生型ＭＶ単離物と共に、この単離物から得られた入手 可能な麻疹ワクチン株の非コーディング調節領域(３’ゲノムプロモーター領域) のヌクレオチド配列およびＬ遺伝子のコーディング領域のヌクレオチド配列（お よび予想アミノ酸配列）を決定することにより得られる（図１を参照されたい） 。独立の他の野生型単離物も比較目的で洞様に調査した。 ４つの野生型および５つのワクチン麻疹株のヌクレオチド配列（プラス鎖、ア ンチゲノム、メッセージセンスにおけるもの）、ならびにこれらの麻疹ウイルス のＲＮＡポリメラーゼ（Ｌプロテイン）の演繹されるアミノ酸配列が以下に、本 件に含まれる適切な配列番号を参照として記載される：ウイルス ヌクレオチド配列 Ｌプロテイン配列 野生型 エドモンストン(Edmonston) 配列番号１ 配列番号２ １９７７ 配列番号３ 配列番号４ １９８３ 配列番号５ 配列番号６ モンテフィオレ(Montefiore) 配列番号７ 配列番号８ワクチン Rubeovax^TM 配列番号９ 配列番号１０ モラテン(Moraten) 配列番号１１ 配列番号１２ ザグレブ(Zagreb) 配列番号１３ 配列番号１４ ＡＩＫ−Ｃ 配列番号１５ 配列番号１６ 先に列挙される各麻疹ウイルスゲノムは１５，８９４ヌクレオチド分の長さで ある。Ｌ遺伝子の翻訳はヌクレオチド９２３４−９２３６のコドンで開始し；翻 訳停止コドンはヌクレオチド１５７８３−１５７８５である。翻訳されたＬプロ テインは２，１８３アミノ酸分の長さである。 １９８３野生型麻疹ウイルスのヌクレオチド２４９９は配列番号５では「Ｇ」 として示されることに注目せよ。実際、この塩基は事実「Ｇ」と「Ｃ」との混合 物である。更に、Ｒｕｂｅｏｖａｘ（商標）ワクチンウイルスのヌクレオチド２ １４３は配列番号９内では「Ｔ」として示されることに注意せよ。配列が決定さ れた９つのクローンでは、この塩基は７つのクローンでは「Ｔ」であり、そして ２つのクローンでは「Ｃ」であり；従ってこの塩基は「Ｔ」もしくは「Ｃ」であ ることができる。 それに加え、シュワルツ（Ｓｃｈｗａｒｚ）ワクチンウイルスゲノムはモラテ ン（Ｍｏｒａｔｅｎ）ワクチンウイルスゲノムのもの（配列番号１１）に相同で あり、例外はヌクレオチド４９１７および４９２４ではシュワルツ（Ｓｃｈｗａ ｒｚ）が「Ｔ」の代わりに「Ｃ」を有することである。 エドモンストン（Ｅｄｏｍｏｎｓｔｏｎ）野生型単離物、ワクチン株、および 他の独立に単離された野生型ウイルスについて、それらの３’ゲノムプロモータ ー領域を識別するヌクレオチドの違い、ならびにそれらのＬ遺伝子およびＬ蛋白 質配列を識別するヌクレオチドおよびアミノ酸の違いをその後に比較し、そして 整列させた（以下の実施例１の中の表 ３〜５を参照されたい）。 表３に示されるように、原種である野生型ＭＶ単離物と誘導体であるワクチン 株の３’ゲノムプロモーター領域（アンチゲノム、メッセージセンスにおけるも の）からの３つの突然変異が存在し、それらは：ヌクレオチド位置２６では「Ａ 」から「Ｔ」へ；位置４２では「Ａ」から「Ｃ」もしくは「Ａ」から「Ｔ」へ； そしてザグレブ（Ｚａｇｒｅｂ）に限っての場合にのみ、位置９６で「Ｇ」から 「Ａ」へ、であった。それに加え、調査を行った他の野生型単離物は、原種であ る野生型単離物およびワクチン株の両方とは位置５０で「Ｇ」の代わりに「Ａ」 を有する点で異なっていた。 麻疹ワクチン株（Ｒｕｂｅｏｖａｘ（商標）、モラテン（Ｍｏｒａｔｅｎ）、 シュワルツ（Ｓｃｈｗａｒｚ）、ＡＩＫ−Ｃ、およびザグレブ（Ｚａｇｒｅｂ） ）ならびに野生型単離物（１９７７、１９８３、およびＭｏｎｔｅｆｉｏｒｅ） の予想アミノ酸配列は、原種株（エドモンストン（Ｅｄｏｍｏｎｓｔｏｎ））と は、２１８３アミノ酸分の長さの読み取り枠内の４９の位置が異なっている（以 下の実施例１中の表４および５を参照されたい）。 これらのアミノ酸の違いは４つの部類に分類することができる： （１）あるワクチン株が原種、ならびに他のワクチンおよび野生型株とは異な る位置（これにより潜在的弱毒化部位が示唆される）。 （２）全ての野生型配列と全てのワクチン配列との間の特異的違い； これらも重要な弱毒化部位を構築してよい。 （３）年代的に新しい方の野生型が、古い方の野生型と異なる残基； これは遺伝的浮動に帰属されてよい。 （４）一つもしくは複数のワクチン株および／または野生型株が全ての他の株 とコンセンサスのアミノ酸を有する、そしてそれらとは異なる位置；これらの変 化はそれぞれ、ワクチン株内での系列特異的な潜在的弱毒性変化、および野生型 単離物間の関係を示してよい。 ４つの部類（１）の変化が存在し、この場合、一つのワクチンが他のワクチン 、ならびに野生型株とは異なる。これらの内の２つはモラテン（Ｍｏｒａｔｅｎ ）およびシュワルツ（Ｓｃｈｗａｒｚ）内に存在し（アミノ酸３３１および２１ １４）、そして２つはＡＩＫ−Ｃ（１６２４および２０７４）内に存在した。こ れらの突然変異は特に重大なもので、なぜならこれら全てのワクチンは良好なワ クチンであるためである。従って、これらの位置は弱毒化用の部位である。 唯一の位置である１７１７が部類（２）に該当し、この際全ての野生型はアス パラギン酸を有し、そして全てのワクチンはアラニンを有する。興味深いことに この位置は、麻疹のＬ遺伝子およびイヌのジステンパーウイルス（これらは別の ことに関しては非常に相同性が高い）が例外的に保存を示さない２つの領域の内 の一つのものの中に存在する。この違いにより、１７１７が麻疹における弱毒化 突然変異のための重要な位置である可能性が一層高くなるように思われる。 年代的に新しい方の両方の野生型（１９８３およびモンテフィオーレ（Ｍｏｎ ｔｅｆｉｏｒｅ））が古い方の野生型（エドモンストン（Ｅｄｏｍｏｎｓｔｏｎ ）および１９７７）とは異なる５つの位置、１４９、６３６、７２０、２０１７ 、および２１１９が存在し、これらは従って部類（３）に当てはまる。これらの 違いによっては、弱毒性突然変異として示される部位よりはむしろ遺伝的浮動が 示唆される。この総計数に 含まれないのは１６の位置で、これらの位置ではモンテフィオーレ（Ｍｏｎｌｅ ｆｉｏｒｅ）（１９８９単離物）が残りのものとは異なっている（表５を参照さ れたい）。これらは遺伝的浮動（部類（３））もしくはランダム変化（部類（４ ））のいずれかであり得る。残りの２３の位置は部類（４）であり、この場合一 つもしくは複数のウイルスがそのコンセンサス（ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ）とは異な っている。 ３つのこのような位置（１４０９、１６４９、１９３６）は潜在的には弱毒性 部類（４）の突然変異である。これらは、２つのワクチン株がその原種である野 生株とは異なるコンセンサスの変化を有するという変化である。これらの変化は 、Ｒｕｂｅｏｖａｘ（商標）およびモラテン（Ｍｏｒａｔｅｎ）ワクチンに至る ワクチン系統に関連してよい(図１)。 本出願人は、我々のＡＩＫ−Ｃワクチン株のヌクレオチド配列が発表された配 列（３３）とは２１の位置で異なっており、それらの位置には一つの挿入および 一つの欠失が含まれることを発見した。これらの違いの内の幾つかのものは、Ｌ 遺伝子内の２つ（アミノ酸１４７７および２０８８におけるもの）を含むコーデ ィング変化をもたらす。 従って、生ワクチンの目的のために至適化させた複製能を達成するために麻疹 原種株を累進的に弱毒化している際にＬ遺伝子配列内に生じた追加的変化は制約 を受け、かつその範囲が限定されているように思われる。恐らく、Ｌ遺伝子変化 の数および位置における制約寛容が、ポリメラーゼの多機能性能力を保存する必 要性によるばかりでなく、進化を遂げつつあるＬプロテインが転写および複製を 達成するために相互作用を行う必要がある既存の３’プロモーター変化によって も強制されるのであろう。すなわち、至適ウイルス弱毒化には、ポリメラーゼ蛋 白質およ びそれが作用するシス−作用性調節因子において調和が保たれた（すなわち関連 する）変化が必要とされる。 ３’−リーダーは変化については最少の寛容を示し、このことにより、ヌクレ オチドの位置２６（常に「Ａ」から「Ｔ」への変化）および位置４２（「Ａ」か ら「Ｃ」へ、もしくは「Ａ」から「Ｔ」への変化）での（アンチゲム、メッセー ジセンスにおけるもの）弱毒化過程の間の高度に選択された変化が可能になる。 ザグレブ（Ｚａｇｒｅｂ）のみに関する場合では、位置９６での「Ｇ」から「Ａ 」への唯一別の変化が存在し、これはザグレブ（Ｚａｇｒｅｂ）のＬ遺伝子特異 的変化と組合わされる場合には重要になってよい。３’−リーダー領域は、位置 ５０での「Ｇ」から「Ａ」への変化を伴う、１９５４以来の遺伝的浮遊の唯一の 実例を受けでいるように思われる（表３を参照されたい）。 弱毒化過程中の３’ゲノムプロモーター領域内での最終変化は、全てのＭＶワ クチン株におけるゲノムセンスでの２つのプリンによる２つのピリミジンの置換 である。これらの弱毒化過程の間のＬ遺伝子の同時進化は、異なる宿主細胞内で のウイルスの複製に有利となる適切な変化の選択を反映していると考えられる。 全てのワクチン株はニワトリ胚（ＣＥ）もしくはニワトリ胚繊維芽細胞（ＣＥＦ ）細胞内でそれらの弱毒性過程中生育させた（図１）。それに加え、幾つかのワ クチン株を独特な宿主細胞に露出させ；すなわち、ザグレブ（Ｚａｇｒｅｂ）ワ クチンをイヌの腎細胞およびヒトの二倍体細胞中で生育させた一方で、ＡＩＫ− Ｃワクチンをヒツジの腎細胞に適用させた。モラテンン（Ｍｏｒａｔｅｎ）およ びＲｕｂｅｏｖａｘ（商標）はもっぱらＣＥおよびＣＥＦ内に限って成長させた 。 系列特異的Ｌ遺伝子変化の内の幾つかのもの（Ｒｕｂｅｏｖａｘ（商標）、モ ラテン（Ｍｏｒａｔｅｎ）、およびシュワルツ（Ｓｃｈｗａｒｚ）ワクチンにお ける位置１６４９、ならびに全てのワクチンにおける位置１７１７での変化）は 、ワクチン弱毒化について転写／複製過程を調節するための３’−リーダーへの Ｌ遺伝子の適用法のサブセットを表す。それに加え、個々のワクチン特異的変化 （部類（１））は各ワクチン株についてのウイルス転写／複製の追加的な微調整 を提供してよい。 表３およびこれまでの論議に基づくと、ＭＶ ３’ゲノムプロモーター領域の ための最重要弱毒性突然変異は、ヌクレオチド２６（Ａ→Ｔ）、ヌクレオチド４ ２（Ａ→ＴもしくはＡ→Ｃ）、ならびにヌクレオチド９６（Ｇ→Ａ）である（ア ンチゲノム、メッセージセンスの際）。 表４およびこれまでの論議に基づくと、Ｌ蛋白質のための最重要弱毒性部位は 以下のとうりである：アミノ酸残基３３１（イソロイシン→スレオニン）、１４ ０９（アラニン→スレオニン）、１６２４（スレオニン→アラニン）、１６４９ （アルギニン→メチオニン）、１７１７（アスパラギン酸→アラニン）、１９３ ６（ヒスチジン→チロシン）、２０７４（グルタミン→アルギニン）、および２ １１４（アルギニン→リシン）。これらのアミノ酸変化の原因となるヌクレオチ ド変化は表４および以下の実施例１に記載されるものには限定されず；これらの アミノ酸に翻訳されるコドンにもたらされるヌクレオチドの全ての変化が本発明 の範囲内に含まれる。 ヒトパラインフルエンザウイルス タイプ３（ＨＰＩＶ−３）は別の非分節、 マイナス鎖−センス、一本鎖の、外被に覆われるＲＮＡウイルスである。ＨＰＩ Ｖ−３は科パラミクソウイルス科（Ｐａｒａｍｙｘｏ ｖｉｒｉｄａｅ）に属する（表１を参照されたい）。ＨＰＩＶ−３のゲノムは１ ５，４６２ヌクレオチド長であり、そして６つの非重複蛋白質コーディング遺伝 子をコードする（５７）。これらの遺伝子の内の５つが各一つの単一ビリオン構 造蛋白質をコードし、この構造蛋白質はＮＰ（ＭＶのＮプロテインに相当する） 、Ｍ、Ｆ、ＨＮ（ヘマグルチニン−ノイラミニダーゼ）、およびＬと表示される 。第６番目のｍＲＮＡはＰプロテインをコードし、そして重複性５’近位読み取 り枠（ＯＲＦ）によりＣプロテインをコードし、かつＲＮＡエディティングメカ ニズムにより更にはＤプロテインをコードする。 ＭＶと同様、ＨＰＩＶ−３は５５ヌクレオチドの３’−非蛋白質コーディング リーダー領域でできているが、しかし麻疹とは異なり（この場合、３７ヌクレオ チドとなる）、ＨＰＩＶ−３７は４４ヌクレオチド長の５’−テイラー領域を有 する。ポリメラーゼは、ＲＮＡ鋳型内の転写シグナルにより導かれる線形、連続 、開始−終了様式でゲノムを転写する。 野生型ウイルスＪＳ株を至適下温度での細胞培養を通して継代することによる 生の弱毒化ＨＰＩＶ−３ワクチンを開発する試みにより将来性のある結論が得ら れている（７、５７）。幾つかの「コールドパッセージ（ｃｏｌｄ ｐａｓｓａ ｇｅ）」（ｃｐ）突然変異体がＪＳ株の異なる継代レベルから、評価のために単 離された。一つのこのような突然変異体が４５回の連続継代によりもたらされ、 そしてｃｐ４５と表示された。 このウイルスは３つの興味深い特徴を示す：（１）冷温適用性（ｃａ）：２０ ℃という至適下温度で効率よく複製する能力；（２）温度感受性 （ｔｓ）：３９℃を上回る温度もしくは３９℃に等しい温度ではインビトロで複 製不可能であること；および（３）小プラーク形態。この突然変異体は将来有望 なワクチン候補物であるように思われ、なぜなら： （ａ）そのｃａ、ｔｓ、および小プラーク表現型は細胞培養物内での継代の後に 安定であり；（ｂ）その複製がハムスターの上気道および下気道の両方において 制約され；そして（ｃ）野生型ＨＰＩＶ−３での後の攻撃誘発に対してハムスタ ー内に有意な防御を誘導する、ためである（５８、５９）。 アカゲザル（ｒｈｅｓｕｓ ｍｏｎｋｅｙ）におけるこの株の評価により、ｃ ｐ４５内での弱毒突然変異がｔｓと非−ｔｓ突然変異との組み合わせであること が示された（６０）。チンパンジー内でのその後の評価により、ｃｐ４５は十分 に弱毒化されている一方で、依然として野生型ウイルス攻撃誘発に対しては高レ ベルの防御を誘導することができるように思われる（６１）。血清陰性のヒト乳 児および小児におけるｃｐ４５の、後に行われた予備臨床評価により、この候補 物ワクチン株は適切な感染性を示し、かつ適切に弱毒化され、それと同時にほど よい免疫原性を示すことが示唆された（６１）。 ｃｐ４５株をアカゲザル胎仔の肺（ＦＲｈＬ）およびベロ（Ｖｅｒｏ）細胞の 両方の中で以下の要領で生育させた：ＦＲｈＬ細胞内で生育させたＰＩＶ−３ ｃｐ４５ウイルスを、ＭＯＩ ０．１〜１．０で組織培養用フラスコ内で融合Ｆ ＲｈＬ細胞単層を接種することにより調製した。この感染細胞培養物にはＥＭＥ Ｍ培地を与え、そして３２℃でインキュベートした。約７日後に、最高の細胞変 性効果（シンシチウム）が観察された時点で、一回の凍結−解凍周期にその培養 物を供し、液体をプー ルし、そしてその後にウイルスを−７０℃に保存することによりウイルスを回収 した。 ベロ（Ｖｅｒｏ）細胞内で生育させたＰＩＶ−３ ｃｐ４５ウイルスは、継続 的に撹拌させた微小担体ビーズ上でのベロ（Ｖｅｒｏ）細胞の融合単層の生物反 応器培養物にウイルスを接種することにより調製した。感染した生物反応器培養 物は３０℃に維持した。このウイルスを４〜５日後に回収し、その際にはシンシ チウムＣＰＥ（細胞変性効果；ｃｙｔｏｐａｔｈｉｃ ｅｆｆｅｃｔ）が観察さ れた。ウイルスを含む培養物液を−７０℃に保存した。 ＦＲｈＬおよびベロ（Ｖｅｒｏ）細胞中で生育させたＨＰＩＶ−３ＪＳ野生型 株（８９）およびｃｐ４５ワクチン株のヌクレオチド配列（プラス鎖、アンチゲ ノム、メッセージセンスの場合）、ならびにこれらのＨＰＩＶ−３ウイルスのＲ ＮＡポリメラーゼ（Ｌプロテイン）の演繹されるアミノ酸配列が、本件に含まれ る適切な配列番号に関して以下に示される：ウイルス ヌクレオチド配列 Ｌプロテイン配列 野生型 ＪＳ 配列番号１７ 配列番号１８ワクチン FRhL cp45 配列番号１９ 配列番号２０ ベロ(Vero)cp45 配列番号２１ 配列番号２２ 先に列挙される各ＰＩＶ−３ウイルスゲノムは長さが１５，４６２ヌ クレオチド分である。Ｌ遺伝子の翻訳はヌクレオチド８６４６−８６４８のコド ンで開始し；翻訳停止コドンはヌクレオチド１５３４５−１５３４７に存在する 。翻訳されたＬプロテインは長さが２，２３３アミノ酸分である。 本件のこれ以降の実施例２および表６に詳細が記載されるとうり、野生型ＪＳ 株とＦＲｈＬで生育させたｃｐ４５突然変異ワクチン株との間の違いに基づくと 、ＨＰＩＶ−３ ３’ゲノムプロモーター領域のための最重要弱毒性突然変異は 、ヌクレオチド２３（Ｔ→Ｃ）、ヌクレオチド２４（Ｃ→Ｔ）、ヌクレオチド２ ８（Ｇ→Ｔ）、およびヌクレオチド４５（Ｔ→Ａ）（アンチゲノム、メッセージ センスの場合）である。本件のこれ以降の実施例２および表６に詳細が記載され るように、ＨＰＩＶ−３のＬプロテインのための最重要弱毒化部位は以下のもの を含む：アミノ酸残基９４２（チロシン→ヒスチジン）、９９２（ロイシン→フ ェニルアラニン）、および１５５８（スレオニン→イソロイシン）。 これらのアミノ酸変化の原因となるヌクレオチド変化は以下の実施例２に記載 されるものには限定されないことが理解され；これらのアミノ酸に翻訳されるコ ドンにもたらされるヌクレオチドの全ての変化は本発明の範囲に含まれる。 ヒトＲＳウイルス（ＲＳＶ）は更に別の非分節、マイナス鎖−センス、一本鎖 の、外被に覆われたＲＮＡウイルスである。ＲＳＶは亜科ニューモビリナエ（Ｐ ｎｅｕｍｏｖｉｒｉｎａｅ）および属ニューモウイルス（Ｐｎｅｕｍｏｖｉｒｕ ｓ ）に属する（表１を参照されたい）。 ＡおよびＢと表示されるヒトＲＳＶの２つの主要な亜科が、モノクローナル抗 体とのＦおよびＧ表面糖蛋白質の反応性に基づき同定されてい る（６２）。より最近になって、ＲＳＶ株のＡおよびＢ系統が配列分析により確 認された（６３、６４）。このウイルスのウシ、ヒツジ、およびヤギの株も同定 されている。このウイルスの宿主特異性はＧ接着蛋白質と最も密接に関連してお り、このＧ接着蛋白質はヒトとウシ／ヒツジ株との間ではかなり大きく異なって おり（６５、６６）、そして少なくとも部分的にはレセプター結合により影響を 受けてよい。 ＲＳＶは、乳児および幼児における重篤なウイルス性肺炎および細気管支炎の 主な原因である。重篤な疾患、すなわち下気道疾患（ＬＲＤ）は６カ月の年齢を 下回る乳児では最も優勢である。この疾患は、非免疫乳児のＲＳＶに対する初回 露出の際に最も一般的に生じる。それに加え、ＲＳＶは喘息および気道反応過敏 に関連しており、そして気管支肺異形成症および先天性心臓疾患（ＣＨＤ）を患 う「ハイリスク」小児における死亡率の有意な原因である。これはまた、小児に おける、中耳炎に罹患しやすくする一般的なウイルス性呼吸器感染症の内の一つ でもある。成人ではＲＳＶは一般的には併発症を伴わない上気道疾患として表さ れるが；しかしながら高齢者の場合には、重篤なＬＲＤ、特に細菌性気管支炎お よび肺炎の発症における素因としてはインフルエンザに匹敵する。疾患は常に気 道に制約され、例外は重篤な免疫無防備状態であり、この場合には他の臓器への 播種が起こり得る。ウイルスは、ウイルス含有性気道分泌物による汚染を受けて いる媒介物により他者に広がり、そして感染は鼻、口、もしくは結膜の粘膜を介 して開始する。 ＲＳＶ疾患は季節性であり、そしてウイルスは通常は北半球（ｎｏｒｔｈｅｒ ｎ ｌａｔｉｔｕｄｅ）では例えば１１月から４月のような冬季においてのみ単 離される。このウイルスは汎存性であり、そして小児 の内の９０％以上が２歳の年齢までには少なくとも一回の感染を受けている。複 数の株が同時に流行する。抗原ドリフト（例えばＡ型インフルエンザウイルスに 関して見られるもの）の直接的証拠は存在しないが、ＧプロテインおよびＳＨプ ロテインの超可変領域におけるアミノ酸変化の蓄積を示す配列研究により、免疫 圧力（ｉｍｍｕｎｏ ｐｒｅｓｓｕｒｅ）がウイルス進化を駆り立ててよいこと が示唆される。 マウスおよびコットンラットモデルでは、ＲＳＶのＦおよびＧプロテインの両 方が中和性抗体を誘導し、そしてこれらの蛋白質のみでの免疫化により再感染に 対する長期防御が提供される（６７、６８）。 ヒトではＲＳＶに対する完全な免疫化は生じず、そして再感染が一生涯にわた って起こるが（６９、７０）；しかしながら、免疫因子が重篤な疾患を防御する であろう証拠が存在する。疾患の重篤度の減少は、２回もしくはそれを上回る回 数の以前の感染に関連しており、そして２つの主要なＲＳＶ亜型の内の一つに感 染した小児は相同の亜型での再感染に対して幾分防御されてよく（７１）、この 所見により、生の弱毒化ウイルスワクチンが重篤な罹患率および死亡率を予防す るのに十分な防御を提供してよいことが示唆される。ＲＳＶでの感染は抗体およ び細胞介在性免疫の両方を誘導する。ＦおよびＧプロテインに対する血清中和性 抗体は幾つかの研究ではＬＲＤ（下気道疾患）からの防御に関係づけられている ものの、上気道疾患（ＵＲＤ）の減少は示されていない。乳児における高レベル の血清抗体はＬＲＤ（下気道疾患）に対する防御に関連し、そして高力価のＲＳ Ｖ中和抗体を用いる免疫グロブリンの静脈内投与はハイリスク小児での重篤な疾 患を防御することが示されている（７０、７２、７３）。局所免疫、そして特に 鼻での抗体の役割が現在調査 されつつある。 ＲＳＶビリオンは、リポ蛋白質外被内に含まれるリボ核蛋白質コアからできて いる。ニューモウイルスのビリオンは、サイズおよび形状が他の全でのパラミク ソウイルスのものに似ている。ネガティブ染色および電子顕微鏡により肉眼視す る際には、ビリオンの形状は不規則であり、１５０〜３００ｎｍの直径の範囲が 存在する（７４）。このウイルスのヌクレオカプシドは他のパラミクソウイルス のものに類似する対称らせんであるが、例外はそのらせん直径が１８ｎｍよりは むしろ１２〜１５ｎｍとなっていることである。この外被は、宿主膜に由来し、 かつウイルスによりコードされる膜貫通表面糖蛋白質を含む脂質二重層でできて いる。ウイルス糖蛋白質は接着および貫通を媒介し、そしてビリオンスパイク内 に個別に構成される。パラミクソウイルス亜科の全てのメンバーは赤血球凝集活 性を活性を有するが、しかしこの機能はニューモウイルスについての特定な性質 ではなく、ＲＳＶでは非存在であるがＰＶＭには存在している（７５）。ノイラ ミニダーゼ活性が属パラミクロウイルス（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｕｓ）、ルブ ラウイルス（Ｒｕｂｕｌａｖｉｒｕｓ）のメンバーには存在し、そしてマウスの モルビリウイルス（Ｍｏｒｂｉｌｌｉｖｉｒｕｓ）およびニューモウイルス（Ｐ ｎｅｕｍｏｖｉｒｕｓ）（ＰＶＭ）には存在しない（７５）。 ＲＳＶは２つの亜型を有し、ＡおよびＢと表示される。野生型ＲＳＶ（株２Ｂ ）ゲノムは１５，２１８ヌクレオチドの一本鎖、マイナス鎖−センスＲＮＡ（配 列番号２３）であり、これが主なサブゲノムｍＲＮＡに転写される。１０のｍＲ ＮＡの各々が主要なポリペプチド鎖をコードし：３つは膜貫通表面蛋白質（Ｇ、 Ｆ、およびＳＨ）であり；３つはウ イルス性ヌクレオカプシドを形成するためのゲノムＲＮＡに関連する蛋白質（Ｎ 、Ｐ、およびＬ）であり；２つは、感染細胞内に蓄積するが微量がビリオン内に も存在し、かつ転写および複製を調節する役割をになってよい非構造蛋白質（Ｎ Ｓ１およびＮＳ２）であり；一つはグリコシル化を受けないビリオンマトリック ス蛋白質（Ｍ）であり；そして最後のものは、最近になってＲＳＶに特異的な転 写伸長因子であることが示されたグリコシル化を受けない別の蛋白質Ｍ２である （図３を参照されたい）。これら１０のウイルス蛋白質がほぼ全てのウイルスコ ーディング能力を占める。 ウイルスゲノムは主なヌクレオカプシド蛋白質（Ｎ）の外被で覆われており、 そしてリポ蛋白質（Ｐ）および巨大（Ｌ）ポリメラーゼ蛋白質と会合する。これ ら３つの蛋白質は、ＲＳＶミニゲノムをコードするｃＤＮＡのＲＮＡ複製を指示 するのに必須かつ十分であることが示されている（７６）。更に進んだ研究によ り、完全な過程を続行するための転写にはＭ２プロテイン（ＯＲＦ１）が必要と されることが判明している（７４）。Ｍ２プロテインが喪失している際には、切 断された転写物が優勢となり、そして全長ゲノムの救済は生じない（７４）。 Ｍ（マトリックス蛋白質）およびＭ２プロテインの両方は、ヌクレオカプシド 構造内には存在しない内部ビリオン会合性蛋白質である。他の非分節、マイナス 鎖ＲＮＡウイルスとの類似性により、このＭプロテインはパッケージング以前に ヌクレオカプシドを転写の上で不活化し、そしてウイルス外被との会合を媒介す ると考えられる。ＮＳ１およびＮＳ２プロテインは精製されたビリオン内には非 常に少量が検出されているに過ぎず、そして現時点では非構造的と考えられてい る。それらの機能 は不確定であるものの、それらの蛋白質は転写および複製の調節因子であっでよ い。３つの膜貫通表面糖蛋白質がビリオン内に存在し、それらは：Ｇ、Ｆ、およ びＳＨである。ＧおよびＦ（フュージョン）は、ウイルスの宿主細胞への接着お よびその中への貫通を媒介することが知られている外被糖蛋白質である。それに 加え、これらの糖蛋白質は主要な非依存性免疫原でもある（７７）。ＳＨプロテ インの機能は未知であるものの、最近の報告では、それがウイルスの融合機能に かかわっていることが暗示されている（７８）。 ２つの野生型ＲＳＶ亜型Ｂ株（２Ｂおよび１８５３７）のゲノムがその全体に わたって配列決定されている（以下に示される配列番号２３および２５）。ゲノ ムＲＮＡはキャッピングおよびポリアデニル化のいずれもがなされていない（７ ９）。ビリオンおよび細胞内の両方の場合にも、ゲノムＲＮＡはＮプロテインと しっかりと会合している。 ゲノムＲＮＡの３’末端は、主要ウイルスプロモーターを含むと推定される４ ４−ヌクレオチド遺伝子外リーダー領域でできている（図３）。３’ゲノムプロ モーター領域の次には１０のウイルス性遺伝子が、以下の順３’−ＮＳ１−ＮＳ ２−Ｎ−Ｐ−Ｍ−ＳＨ−Ｇ−Ｆ−Ｍ２−Ｌ−５’で続く（図３）。このＬプロテ インの次には１４５〜１４９ヌクレオチドの遺伝子外トレイラー領域が続く（図 ３を参照されたい）。各遺伝子は保存される９−ヌクレオチド遺伝子開始シグナ ル３’−ＧＧＧＧＣＡＡＡＵで始まる（例外はＬ遺伝子の１０−ヌクレオチド遺 伝子開始シグナルであり、これは３’−ＧＧＧＡＣＡＡＡＡＵであり；下線を施 した部分が異なる）。各遺伝子について、転写はそのシグナルの最初のヌクレオ チドで開始する。各遺伝子は、転写終了およびポリアデニル化 を指令する半保存１２〜１４ヌクレオチド遺伝子末端で終了する（３’−Ａ Ｇ Ｕ／Ｇ Ｕ／Ａ ＡＮＮＮ Ｕ／Ａ Ａ_3-5）（この場合、ＮＳは４つの塩基 の内のいずれかであることができる）（図３）。ＲＳＶ Ｂ株については最初の ９つの遺伝子は非重複性であり、そして３〜５６ヌクレオチドのサイズの範囲に わたる遺伝子内領域により分断されている（図３）。この遺伝子内領域はいずれ かの保存モチーフもしくは二次構造のいずれかの明らかな特徴は含まず、そして ミニレプリコン系内での手前および後続の遺伝子発現には全く影響を及ぼさない ことが示されでいる（図３）。最後の２つのＲＳＶ遺伝子は６８ヌクレオチドが 重複している（図３）。Ｌ遺伝子の遺伝子−開始シグナルはＭ２遺伝子の後ろと いうよりはむしろＭ２遺伝子内に位置する。この６８ヌクレオチドの重複配列は Ｍ２ ｍＲＮＡの最後の６８ヌクレオチド（ポリ−Ａテイル専用のもの）、なら びにＬ ｍＲＮＡの最初の６８ヌクレオチドをコードする。 １０の異なる種のポリアデニル化されたサブゲノムｍＲＮＡおよび多数のポリ アデニル化されたポリシストロン性読み過ごし転写物はゲノム転写の産物である （７４）。ＵＶ光により媒介されるゲノム不活化を用いる転写マッピング研究に より、ＲＳＶ遺伝子は３’末端付近の単一プロモーターから３’〜５’の順で転 写されることが示された（８０）。従ってＲＳＶ合成は、全てのモノネガビラレ ス（Ｍｏｎｏｎｅｇａｖｉｒａｌｅｓ）について提唱されている単一エントリー （ｅｎｔｒｙ）、連続転写モデルに従うように思われる（１６、８１）。このモ デルに従うと、ポリメラーゼ（Ｌ）は３’ゲノムプロモーター領域でヌクレオカ プシド形態内のゲノムＲＮＡに接触し、そして最初のヌクレオチドで転 写を開始する。ＲＳＶ ｍＲＮＡはその遺伝子の同一線形順に並ぶ（ｃｏ−ｌｉ ｎｅａｒ）コピーであり、ｍＲＮＡエディティングもしくはスプライシングの証 拠は全く得られていない。 細胞内ＲＳＶ ｍＲＮＡの配列分析により、各転写物の合成は遺伝子開始シグ ナルの第一ヌクレオチドで始まることが示された（７４）。ｍＲＮＡの５’末端 は、構造ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇｐ（この場合、下線が施されたＧがこ のｍＲＮＡの第一鋳型ヌクレオチドである）でキャッピングされ、そしてこのｍ ＲＮＡは３’末端でポリアデニル化を受ける（８２）。これらの改変の両方とも がウイルスポリメラーゼにより同時転写の際に作成されると考えられる。ＲＳＶ ３’ゲノムプロモーターの３つの領域がシス−作用性因子として重要であるこ とが見いだされている（８３）。これらの領域は最初の１０ヌクレオチド（恐ら くプロモーターとして作用すると思われる）、ヌクレオチド２１〜２５、および ヌクレオチド４５〜５３に位置する遺伝子開始シグナルである（８３）。例えば 麻疹、センダイ（Ｓｅｎｄａｉ）、およびＰＩＶ−３のような他のパラミクソビ リナエ（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｎａｅ）とは異なり、ＲＳＶのＮＳＩ遺伝子 のリーダーおよび非コーディング領域の残りの部分は、挿入、欠失、および置換 に対してかなり寛容であることが見いだされている（８３）。 それに加え、３’ゲノムプロモーター領域の最初の１２ヌクレオチド内での飽 和突然変異誘発（この場合、各塩基は独立に他の３つの塩基の内のいずれかによ り置換され、そして転写および複製効率について比較される）により、ヌクレオ チド６〜１０に位置するＵ−トラクト（ｔｒａｃｔ）が置換に対してはかなり阻 害的であることが示された（８３）。 それとは対称的に、最初の５ヌクレオチドは多数の置換に対して比較的寛容であ り、そして位置４にあるものの内の２つは正の方向の調節を行う突然変異であり 、このことによりＲＳＶ−ＣＡＴ ＲＮＡ複製および転写の４〜２０倍の増加が もたらされる。二元−シストロン性ミニレプリコン系を用いると、遺伝子−開始 および遺伝子−終了モチーフはｍＲＮＡ合成のためのシグナルであることが示さ れ、そして自己組込み型であり、かつ隣接する配列の性質とはかなり無関係であ るように思われる（８４）。 Ｌ遺伝子開始シグナルはＭ２遺伝子−終了シグナルの６８ヌクレオチド上流に 位置し、そのことにより遺伝子重複がもたらされる（図３）（７４）。Ｌ遺伝子 内のＭ２遺伝子−終了シグナルの存在によりＬ遺伝子転写物の未成熟な停止が高 頻度でもたらされる。全長を持つＬ ｍＲＮＡは量としては更に少なく、そして ポリメラーゼがＭ２遺伝子−停止モチーフを認識しそこなった際に作成される。 このことによりＬ ｍＲＮＡの転写の頻度は一層少なくなる。遺伝子重複は線形 連続的転写のモデルと矛盾するように思われる。Ｍ２遺伝子から退出したポリメ ラーゼは逆向きにジャンプしてＬ遺伝子−開始シグナルに向かうのかどうか、あ るいはＬ遺伝子転写のための第二の内部プロモーターが存在するのかどうかは分 かっていない（７４）。また、Ｍ２遺伝子−開始シグナルで転写を開始させそこ ない、そしてＭ２遺伝子を滑り抜けてＬ遺伝子−開始シグナルに至った少数部分 のポリメラーゼがＬ遺伝子に接近することも可能である。 各ＲＳＶ ｍＲＮＡの相対量はプロモーターからの遺伝子への距離とともに減 少し、これは恐らく連続転写中のポリメラーゼの量の減少に起 因すると思われる（８０）。遺伝子重複は、全長Ｌ ｍＲＮＡの合成を減少させ る第二のメカニズムである。そしてまた、所定のｍＲＮＡは転写の効率を減少さ せてよい特性を有する。ＳＨ ｍＲＮＡのための開始コドンは至適下であるコザ ック（Ｋｏｚａｋ）配列という条件中に存在する一方で、Ｇ ＯＲＦはそのｍＲ ＮＡ中の第二のメチオニルコドンで開始する。 ＲＳＶ ＲＮＡ複製は、水泡性口内炎ウイルスおよびセンダイ（Ｓｅｎｄａｉ ）ウイルスに関する研究から提案されたモデル（１６、８１）に従うと考えられ る（７４）。このモデルは、ｍＲＮＡ合成の停止−開始モードからアンチターミ ネーター読み過ごしモードへのスイッチを必要とする。このことにより、ゲノム ＲＮＡの正確な相補的コピーであるプラス鎖−センス複製−中間体（ＲＩ）の合 成がもたらされる。これは次には子孫ゲノムの合成のための鋳型として役立つ。 アンチターミネーターモードへのスイッチにかかわるメカニズムは、Ｎプロテイ ンによる未完成ＲＮＡの同時転写の際のカプシド形成を必要とすることが提唱さ れている（１６、８１）。他の非分節マイナス鎖−ＲＮＡウイルスと同様にＲＳ Ｖ内でのＲＮＡ複製は進行中の蛋白質合成に依存する（８５）。予想されるＲＩ ＲＮＡが標準ウイルス、ならびにＲＳＶ−ＣＡＴミニゲノムについて検出され ている（７４、８５）。ＲＩ ＲＮＡは、標準およびミニゲノム系の両方につい ては、子孫ゲノムと比較すると細胞内での量が１０〜２０倍少なくなる。様々な 野生型、ワクチン、および復帰突然変異体ＲＳＶ株のヌクレオチド配列（プラス 鎖、アンチゲノム、メッセージセンスの場合）、ならびにこれらのＲＳＶウイル スのＲＮＡポリメラーゼ（Ｌプロテイン）の演繹されるアミノ酸配列が以下に、 本 件に含まれる適切な配列番号に関して示される：ウイルス ヌクレオチド配列 Ｌプロテイン配列 野生型 ２Ｂ 配列番号２３ 配列番号２４ １８５３７ 配列番号２５ 配列番号２６ワクチン ２Ｂ３３Ｆ 配列番号２７ 配列番号２８ ２Ｂ２０Ｌ 配列番号２９ 配列番号３０復帰突然変異株 ２Ｂ３３Ｆ ＴＳ（＋） 配列番号３１ 配列番号３２ ２Ｂ２０Ｌ ＴＳ（＋） 配列番号３３ 配列番号３４ 各ＲＳＶウイルスゲノムは、長さが２，１６６アミノ酸分であるＬプロテイン をコードする。ゲノム長および他のヌクレオチド情報は以下のとうりである：ウイルス ゲノム 野生型 長さ Ｌ開始コドン Ｌ終止コドン ２Ｂ 15218 8502-8504 15000-15002 １８５３７ 15229 8509-8511 15007-15009 ワクチン ２Ｂ３３Ｆ 15219 8503-8505 15001-15003 ２Ｂ２０Ｌ 15219 8503-8505 15001-15003復帰突然変異株 ２Ｂ３３Ｆ ＴＳ（＋） 15219 8503-8505 15001-15003 ２Ｂ２０Ｌ ＴＳ（＋） 15219 8503-8505 15001-15003 以下の実施例３（特に表７および８）に詳細が記載されるように、ＲＳＶ亜群 Ｂ ３’ゲノムプロモーター領域のための最重要弱毒性突然変異はヌクレオチド ４（Ｃ→Ｇ）、およびヌクレオチド６−１１の複数のＡからなる配列（ｓｔｒｅ ｔｃｈ）内への追加的Ａの挿入である（アンチゲノム、メッセージセンスの場合 ）。以下の実施例３にも詳細が記載されるように、ＲＳＶのＬプロテインのため の最重要な潜在的弱毒性部分は以下のとうりである：アミノ酸残基３５３（アル ギニン→リシン）、４５１（リシン→アルギニン）、１２２９（アスパラギン酸 →アスパラギン）、２０２９（スレオニン→イソロイシン）、および２０５０（ アスパラギン→アスパラギン酸）。これらのアミノ酸変化の原因となるヌクレオ チド変化は以下の実施例３に記載されるものに限定されないことが理解され；こ れらのアミノ酸に翻訳されるコドン内に生じる全てのヌクレオチド変化は本発明 の範囲に含まれる。 本発明の弱毒化ウイルスは、ヒトおよび動物宿主を感染する野生型ウイルスと 比較すると菌力の有意な低下を示す。弱毒化の程度は、感染症の症状が免疫化を 受けた個体の内の大半には生じることはないが、ただ しそのウイルスはワクチン接種患者内では感染性を示すのに十分な複製能力を保 持し、かつワクチン接種患者内で所望される免疫応答プロフィールを誘導するで あろうものである。 本発明の弱毒化ウイルスはワクチンを製剤するのに用いられてよい。そのため には弱毒化ウイルスを適切な濃度に調節し、そしていずれかの適切なワクチンア ジュバント、稀釈剤、もしくは担体とともに製剤される。生理学的に許容される 培地が担体として用いられてよい。限定されるものではないが、これらは：適切 な等張培地、およびリン酸緩衝化食塩水などを含む。限定されるものではないが 、適切なアジュバントは、ＭＰＬ（商標）（３−Ｏ−デアシル化されたモノホス ホリルリピドＡ；ＲＩＢＩ ＩｍｍｕｎｏＣｈｅｍ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ ．社、Ｈａｍｉｌｔｏｎ、ＭＴ）、およびＩＬ−１２（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｉｎ ｓｔｉｔｕｔｅ社、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）を含む。 本発明の、ある態様では、弱毒化ウイルスを含む製剤はワクチンとしての使用 が意図される。弱毒化ウイルスは、例えば蛋白質（一例では、アルブミン、ゼラ チン）、糖（一例では、スクロース、ラクトース、ソルビトール）、アミノ酸（ 一例では、グルタミン酸ナトリウム）、食塩水、もしくは他の保護剤のような凍 結防止用添加剤もしくは安定化剤と混合されてよい。この混合物は液体状態に維 持されるか、あるいはその後に輸送および保存のため完全に乾燥させるかもしく は凍結乾燥させ、そしで投与直前に水と混合する。 本発明の弱毒化ウイルスを含む製剤は、弱毒化ウイルスの野生型相対物による 感染に対する防御を誘導するようにヒトもしくは動物被検体を免疫化するのに有 用である。従って本発明は更に、本件のこれ以前に記 載されるウイルスの弱毒化版を取り込ませたワクチン製剤の有効免疫化量を、あ る被検体に投与することにより、目（Ｏｒｄｅｒ）モノネガビラレス（Ｍｏｎｏ ｎｅｇａｖｉｒａｌｅｓ）のＲＮＡウイルスによる感染に対する防御を誘導する ために、その被検体を免疫化する方法を提供する。 適切な数の投与剤中のワクチンの十分量をその被検体に投与して免疫応答が誘 発されなければならない。当業者はそのような量および用量を容易に決定するこ とができるであろう。投与はいずれかの通常の有効な形態によってよく、それは 例えば鼻内、口内、眼、膣、もしくは直腸表面のようないずれかの粘膜表面に、 例えば鼻内的、非経口的、経口的、もしくは局所的に、例えばエアロゾルスプレ ーにより局所的に適用される。好ましい投与法は鼻内投与によるものである。 本発明の更に別の態様では、本件に記載される野生型ウイルスもしくはワクチ ンウイルスのいずれかの完全なウイルス性ヌクレオチド配列を有する単離された 核酸分子が、体液および体組織の試料中のそれらの野生型ウイルスおよび／また はワクチン株の存在を検出するために用いられるオリゴヌクレオチドプローブ（ プラス鎖 アンチゲノム メッセージセンスもしくはマイナス鎖 相補的ゲノム センスのいずれか）を作成するため、およびペプチドを発現させる（プラス鎖 アンチゲノム メッセージプラスのみから）ために用いられる。これらのヌクレ オチド配列を用いて、ある試料中のウイルスの存在を検出するための特異性およ び感受性が非常に高い診断用検査法が設計される。 ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プライマーが、本件に記載される野生型ウイ ルス配列もしくはワクチン配列に基づく配列を用いて合成され る。試験用試料をＲＮＡの逆転写に供し、その後に、ウイルスの特定された株に 特徴的なヌクレオチドを有する、本件に記載されるヌクレオチド配列に対応する 選択されたｃＤＮＡのＰＣＲ増幅を行う。増幅されたＰＣＲ産物をゲル上で同定 し、そしてそれらの特異性を特異的ヌクレオチドプローブとのハイブリダイゼー ションにより確認する。 ＥＬＩＳＡ検査を用いて、野生型もしくはワクチンウイルス株の抗原の存在を 検出する。ペプチドは、本件に記載される野生型もしくはワクチン配列に基づく 一つもしくは複数の独特な残基を含むように設計および選択される。これらのペ プチドをその後にハプテン（例えば、スカシガイのヘモシアニン（ＫＬＨ））に 結合させ、そして単一特異性ポリクローナル抗体の産生のために動物（例えば、 ウサギ）を免疫するのに用いる。これらのポリクローナル抗体の選択物、もしく はポリクローナル抗体とモノクローナル抗体との組み合わせ物をその後、それら のウイルスにより産生される抗原を検出するための「捕捉用ＥＬＩＳＡ」で用い るこどができる。 モラテン（Ｍｏｒａｔｅｎ）麻疹ウイルスワクチン株の試料は出願人により、 特許出願手続きの目的のための微生物の寄託についてのブダペスト条約（「ブダ ペスト条約」）の規定に基づき、ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌ ｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、１２３０１ Ｐａｒｋｌａｗｎ Ｄｒｉｖｅ 、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌ ａｎｄ ２０８５２、Ｕ．Ｓ．Ａ．に寄託 し、そしてＡＴＣＣ受託番号ＶＲ２５８７が割り当てれている。ＨＰＩＶ−３ウ イルス ベロ（Ｖｅｒｏ）で成長させたｃｐ４５ワクチン株の試料は、ブダペス ト条約の規定に基づき、ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、１２３０１ Ｐａｒｋｌａｗｎ Ｄｒｉｖｅ、Ｒｏｃｋ ｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ ２Ｏ８５２、Ｕ．Ｓ．Ａ．に寄託し、そしてＡ ＴＣＣ受託番号ＶＲ２５８８が割り当てれている。２Ｂ 野生型ＲＳＶウイルス の試料は、ブダペスト条約の規定に基づき、ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐ ｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、１２３０１ Ｐａｒｋｌａｗｎ Ｄｒｉｖｅ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ ２０８５２、Ｕ．Ｓ．Ａ ．に寄託し、そしてＡＴＣＣ受託番号ＶＲ２５８６が割り当てれている。 これら３つの寄託株、ならびに本件に提供されるこれらの株および他の株につ いての配列情報が与えられれば、先に記載される部位特異的突然変異誘発および 救済技術を用いて本件に記載される全ての株の突然変異を導入することができ（ もしくは野生型遺伝子型を復元することができ、それに加えてこれらの株を取得 し、そして以下の表３、４、および６〜８に記載される突然変異の一覧表から追 加的な突然変異を作成することができる。 本発明が一層理解されることを目的として以下の実施例が記載される。これら の実施例は詳細な説明のみの目的とし、そして本発明の範囲を制限するものと解 釈されるものではない。 実施例 標準的分子生物学技術は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（８６）に記載されるプロトコ ールに従って利用される。 実施例１ 麻疹 モラテン（Ｍｏｒａｔｅｎ）ＭＶワクチンウイルスをいったん、Ａｔ ｔｅｎｕｖａｘ（商標）ワクチンバイアル（Ｌｏｔ ♯０７１６Ｂ）から直接生 育させ、シュワルツ（Ｓｃｈｗａｒｚ）ワクチンウイルスをいったん生育させ（ Ｌｏｔ ９６Ｇ０４／Ｍ１７９ Ｇ４１Ｄ）、一方でザグレブ（Ｚａｇｒｅｂ） およびＲｕｂｅｏｖａｘ（商標）ワクチンウイルスを各々２度、ベロ（Ｖｅｒｏ ）細胞内で生育させてからＲＮＡを配列分析用に作成した。ＭＶ野生型単離物で あるモンテフィオレ（Ｍｏｎｔｅｆｉｏｒｅ）（５６）をベロ（Ｖｅｒｏ）細胞 内で５〜６回継代させてからＲＮＡ物質を抽出し、そして同様にしてＭＶ野生型 単離物１９７７、１９８３（１４）を５〜７回生育させてから分析用物質の抽出 を行った。Ｊ．Ｂｅｅｌｅｒ博士（ＣＢＥＲ）から供与されたエドモンストン（ Ｅｄｍｏｎｓｔｏｎ）野生型単離物（図１）は受け取る以前にヒト腎細胞内で既 に７回継代され、そしてベロ（Ｖｅｒｏ）細胞内で３回継代されたもともとのエ ドモンストン（Ｅｄｍｏｎｓｔｏｎ）単離物であり、そしてこれをその後にベロ （Ｖｅｒｏ）細胞内で一回さらに継代させでから配列分析用に用いた。 ＲＮＡは、０．１〜１．０の感染多重度（ｍ．ｏ．ｉ．）でベロ（Ｖｅｒｏ） 細胞を感染し、そして最高の細胞病理状態に到達させてから回収することにより 調製した。麻疹ウイルスに感染させた細胞からの全ＲＮＡをＴｒｉｚｏｌ（商標 ）試薬を用いて抽出した（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ社）。 ベロ（Ｖｅｒｏ）細胞継代物質から単離された全ＲＮＡを逆転写酵素（Ｒｅｖ ｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）−ＰＣＲ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ ／Ｃｅｔｕｓ社）法により、３’および５’プロモーター領域に伸びる麻疹（エ ドモンストン（Ｅｄｍｏｎｓｔｏｎ）Ｂ株（１ ９））特異的プライマー対、ならびにウイルスゲノムのＬ遺伝子を用いて増幅さ せた。表２はこれらのプライマー配列を表す。配列番号３５〜５４、７４、７７ 、および７８のプライマーはアンチゲノムメッセージセンスの形態をとる。配列 番号５５〜７３、７５、７６、および７９のプライマーはゲノムマイナス鎖−セ ンスの形態をとる。 完全なウイルスゲノムの重複ＰＣＲ断片は、コンセンサス配列を達成するため のクローニングを行わず、両方の鎖を用いるジデオキシターミネーターサイクル 配列決定法（ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３７７シークエンサーおよびＡＢＩ ＰＲＩ ＳＭ配列決定用キット）により直接配列決定した。絶対末端での配列を決定する ためには、以前に記載される連鎖反応法を用いた（５５）。 この仮説を検査するため、ヌクレオチド配列を、原種エドモンストン（Ｅｄｍ ｏｎｓｔｏｎ）野生型ＭＶ単離物の非蛋白質コーディング調節領域およびＬ遺伝 子について、この単離物に由来する入手可能なワクチン株について、ならびに他 の野生型株について決定した。その後にはヌクレオチド（アンチゲノム、メッセ ージセンスの場合）およびアミノ酸の違いを表３〜５５）に示されるように比較 および整列させた（違う箇所をイタリックで表示した）： 実施例２ ＰＩＶ−３ ＰＩＶ−３ウイルスの野生型ＪＳ親株と、ｃｐ４５突然変異体のＦＲｈＬで成 長させた形態とベロ（Ｖｉｒｏ）で成長させた形態の配列（アンチゲノム メッ セージセンスの場合）の比較が表６に記載される。コドン変化がアミノ酸変化を もたらさない場合には、表６では「なし（ｎｏｎｅ）」と表示され、その後には 変化しなかったアミノ酸の名称が記載される。ＰＩＶ−３ウイルスの野生型ＪＳ親株およびＦＲｈＬで成長させたｃｐ４５突然 変異体の配列分析により、後者が２０ヌクレオチドの変化を含むことが示された 。４つの変化は、ヌクレオチドの位置２３（Ｔ→Ｃ）、２４（Ｃ→Ｔ）、２８（ Ｇ→Ｔ）、および４５（Ｔ→Ａ）での非コーディング３’−リーダー領域内に存 在した（アンチゲノム、メッセージセンスの場合）。ゲノム マイナス鎖センス として考慮する際には、小さなピリミジン（「Ｃ」）から大きなプリン（「Ａ」 ）への位置２８での変化は３’ゲノムプロモーター領域の保存領域によりフラン クされる領域のサイズを変化させてよく、そのことによりシス−作用性シグナル のポリメラーゼに対する空間的配置に変化がもたらされる。 ９つの変化は、ＮＰ、Ｍ、Ｆ、ＨＮ、およびＬ遺伝子内のコーディング変化で あった。他の７つの変化は、ＮＰ、Ｐ、Ｆ、ＨＮ、およびＬ遺伝子か、またはＮ Ｐ非翻訳領域（ＵＴＲ）内での非コーディング変化もしくはサイレント変化であ った。ｃｐ４５突然変異体は、それがｔｓ表現型を持つことに起因して、非許容 温度では乏しい転写活性を有することが示されている（８７）。このｔｓ表現型 は現在ではウイルスＬ遺伝子に対してマッピングされている（８８）。このｃｐ ４ウイルスは、ＨＮおよびＦ糖蛋白質内での突然変異に関連して通常は機能する ことが知られているため（８７）、このことにより、３’−リーダーおよびＬ遺 伝子内での突然変異がこのウイルスの弱毒性表現型に貢献したという見解が支持 される。 従って、ＦＲｈＬで成長させたｃｐ４５内の４つの３’リーダー特異的変化、 ならびにアミノ酸の位置９４２（Ｔｙｒ→Ｈｉｓ）、９９２（Ｌｅｕ→Ｐｈｅ） 、および１５５８（Ｔｈｒ→Ｉｌｅ）でのＬ遺伝子内で の３つのコーディング変化が候補物ｃｐ４５ワクチン株の弱毒表現型に有意に貢 献していた。 Ｌプロテイン内の最初の２つのアミノ酸変化（位置９４２および９９２）は、 全てのパラミクソウイルス（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｕｓ）Ｌ遺伝子間では高度 に保存される領域の内の一つとしてマッピングされる。第三のアミノ酸変化（位 置１５５８でのもの）は、ＨＶワクチン株内のアミノ酸１７１７での変化に対応 する２つの保存ブロックに連結する領域としてマッピングされる。 公開された刊行物（８９）は、ＪＳ株とＦＲｈＬで成長させたｃｐ４５株のア ンチゲノム メッセージ センス配列の間の１８の変化のみを記載するに過ぎな い。これらの変化の内の１６は本出願人により見いだされた。 公開された刊行物は、本出願人により見いだされた以下の４つの変化を報告し ておらず、それらは：３’リーダー内のヌクレオチド４５（Ｔ→Ａ）、ＮＰ Ｕ ＴＲ内のヌクレオチド６２（Ａ→Ｔ）、あるいはアミノ酸変化（Ｖａｌ→Ａｌａ ）をもたらすヌクレオチド３９７（Ｔ→Ｃ）、およびアミノ酸変化（Ｓｅｒ→Ａ ｌａ）をもたらすヌクレオチド１２７５（Ｔ→Ｇ）から生じるＮＰプロテイン内 のアミノ酸内の変化（アンチゲノム メッセージ センスの場合のヌクレオチド 変化）。 実施例３ ＲＳＶ亜群Ｂ 温度感受性（ｔｓ）表現型はインビボでは弱毒化に強く関連し；それに加え、 幾つかの非−ｔｓ突然変異も弱毒性であってよい。ｔｓおよび非−ｔｓ弱毒性突 然変異の同定は、ＲＳＶ突然変異体および復帰突然変 異体のｔｓ、冷温適応化（ｃａ）、およびインビボ成長性表現型の配列分析およ び評価により達成した。 以下の５つのＲＳＶ ２Ｂ株のゲノムは現在では完全に配列決定がなされてい る：２Ｂ親、２Ｂ３３Ｆ、２Ｂ３３Ｆ ＴＳ（＋）と表示される一つの復帰突然 変異体、２Ｂ２０Ｌ、および２Ｂ２０Ｌ ＴＳ（＋）と表示される一つの復帰突 然変異体。２Ｂ３３Ｆおよび２Ｂ２０Ｌ株はｔｓかつｃａであり、そして米国特 許第０８／０５９，４４４号（９０）に記載され、これは引用により本件に取り 込まれる。２Ｂ３３Ｆおよび２Ｂ２０Ｌ内の突然変異の位置を決定した後には、 ３９℃でのインビトロ継代およびアフリカミドリザル（Ａｆｒｉｃａｎ Ｇｒｅ ｅｎ Ｍｏｎｋｅｙｓ）もしくはチンパンジー内でのインビボ継代の後に取得さ れる２Ｂ３３Ｆ「復帰突然変異体」の９つの追加的単離物、ならびに３９℃での インビトロ継代の後に得られる２Ｂ２０Ｌ「復帰突然変異体」の９つの追加的単 離物の配列がこれらの領域において決定されている。ｔｓ、ｃａ、およびこれら の復帰突然変異体の内の多くのものの弱毒表現型の特徴決定および評価が現在で はなされている。表現型ｔｓ、ワクチン弱毒化、および配列変化の間の相関関係 が同定されている。 結果の総括が表７〜１２に示される。 数々の有意な所見を以下のデータから引き出すことができる： ａ． 表７（２Ｂ３３Ｆについて）および８（２Ｂ２０Ｌについて）に示される ように、２つの突然変異株において同定される比較的少数の配列変化が存在し、 すなわち：ＲＳＶ ２Ｂ３３Ｆは親ＲＳＶ ２Ｂとは３’ゲノムプロモーター領 域での２つの変化、Ｍ遺伝子の非コーディング５’−末端での２つの変化、なら びにＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼコーデイングＬ遺伝子内での４つのコーデ ィング変化プラス一つの非コーディング（ポリ（Ａ）モチーフ）変化が異なる。 それに加え、１４ の変化がＳＨ遺伝子のみに対してマッピングされた。ＲＳＶ ２Ｂ２０Ｌは７つ のヌクレオチドの位置でのみＲＳＶ ２Ｂ親株とは異なっており、その７つの内 の３つは２Ｂ３３Ｆウイルスとコンセンサスしており、その内訳として３’ゲノ ムプロモーターでの２つの変化およびＬ遺伝子での一つのコーディング変化を含 む。２Ｂ２０Ｌウイルスの２つの追加的で独特なな変化がＬ遺伝子のコーディン グ領域にマッピングされた。非コーディング３’ゲノムプロモーター領域および ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子での潜在的な弱毒性突然変異が同定され ている。 ｂ． ２つのｔｓ突然変異を、弱毒化ウイルス株２Ｂ３３Ｆおよび２Ｂ２０Ｌの Ｌ遺伝子内に同定することができる： （ｉ） ２Ｂ３３Ｆでは、Ｌ蛋白質内のアミノ酸４５１（Ｌｙｓ→Ａｒｇ）での コーディング変化をもたらすヌクレオチド位置９８５３（Ａ→Ｇ）での突然変異 は明らかにｔｓおよび弱毒表現型と関連している。２Ｂ３３Ｆ ＴＳ（＋）５ａ 株内でのこの部位単独での復位突然変異が３９℃での成長の完全再生（表９）お よび動物における弱毒化の部分復位の原因である。ｔｓと弱毒表現型とのこの関 連性は、細胞培養物およびチンパンジーから単離された６つの追加的「完全なＲ Ｓ復位突然変異」（４ａ、３ｂ、ｐｐ２、３Ａ、５ａ、５Ａ）の部分的配列分析 によっても支持され、この場合にはヌクレオチド９８５３突然変異のみが復位し た（表１０〜１２）（９８５３で復位した一つのＡＧＭ（アフリカミドリザル（ Ａｆｒｉｃａｎ Ｇｒｅｅｎ Ｍｏｎｋｅｙ））単離物はｔｓ表現型では部分的 にのみ復位したに過ぎなかったことに注目されたい）。このアミノ酸４５１突然 変異（Ｌｙｓ→Ａｒｇ）は、そのコドンを安定化させるための第二の突然変異の 導入による、ｃＤＮＡ感染性クローン 構築物内での安定化の影響を受けやすく、そのことによりそのアミノ酸がＬｖｓ に復位するであろう可能性は低くなる。 （ｉｉ） ２Ｂ２０Ｌでは、Ｌプロテイン内でのコーディング変化をもたらす塩 基１４，６４９（Ａ→Ｇ）での突然変異（アミノ酸の位置２，０５０、Ａｓｎ→ Ａｓｐ）は、ｔｓおよび弱毒表現型と関連するように思われる。アミノ酸２０５ ０のアスパラギン酸は、ＴＳ（＋）復位突然変異体内では必ず復位してもとに戻 る（Ａｓｐ→Ａｓｎ）か、あるいは位置１４，６５０でのヌクレオチド置換（Ａ →Ｔ）により異なるアミノ酸（Ａｓｐ→Ｖａｌ）に変化する（表８、１１）。先 の所見は、ＴＳ（＋）復位突然変異体Ｒ１での完全な配列分析、および選択され た領域での幾つかの追加的ＴＳ（＋）復位突然変異（Ｒ２、Ｒ４Ａ、Ｒ７Ａ、Ｒ ８Ａ）の部分配列に基づく（表１１）。追加的突然変異が、先の復位突然変異に 関連するＲ１復位突然変異体のヌクレオチドの位置１３，３１７（アミノ酸１６ １６、Ａｓｎ→Ａｓｐ）に見られる。しかしながら、ｔｓ表現型におけるこの突 然変異の効果は知られておらず；他の復位突然変異体のＬ遺伝子は完全な配列決 定がなされていない。 ｃ． ３つの塩基変化がウイルスの２Ｂ３３Ｆおよび２Ｂ２０Ｌ株にコンセンサ スする： （ｉ） アミノ酸２０２９での対応変化（Ｔｈｒ→Ｉｌｅ）に関する位置１４， ５８７での変化（Ｃ→Ｔ）が、２Ｂ３３Ｆおよび２Ｂ２０Ｌの両方に存在する（ 表７、８）。このヌクレオチド「Ｔ」置換は原種ＲＳＶ２Ｂ株の１０％の亜集団 内に存在することが見いだされており、そして弱毒過程中には好ましくてよい。 野生型塩基「Ｃ」は２Ｂ３３Ｆおよび２Ｂ２０Ｌウイルス中には全く見いだされ なかった。 （ｉｉ） ２つの突然変異が、２Ｂ３３Ｆおよび２Ｂ２０Ｌの３’ゲノムプロモ ーター領域に見られ、それらは：ヌクレオチド４（Ｃ→Ｇ）、および位置６〜１ １の複数のＡの配列（ｓｔｒｅｔｃｈ）内での余分なＡの挿入である（アンチゲ ノム、メッセージセンスの場合）。選択されたＴＳ（＋）復位突然変異体の配列 を分析した際には、これらの突然変異は２Ｂ３３Ｆ ＴＳ（＋）５ａ（表７）お よび２Ｂ２０Ｌ ＴＳ（＋）Ｒ１（表８）復位突然変異体内に保持されているこ とが示されている。これらの非コーディング、シス−作用性突然変異は部分的ウ イルス弱毒化との関連を保っていた。 これらのシス−作用性変化の分析のためにミニレプリコンＲＳＶ−ＣＡＴ系を 用いる発現により、３’ゲノムプロモーターのヌクレオチド４（Ｃ→Ｇ）変化は 、２Ｂ原種ウイルス、または２Ｂ３３Ｆもしくは２Ｂ３３Ｆ ＴＳ（＋）のいず れかがヘルパーＬ遺伝子機能を提供した場合には、このインビトロ系での転写／ 複製の正の方向の調節因子であることが示された（これらのウイルス内ではＮ、 Ｐ、およびＭ２遺伝子が同定される）。 ２Ｂ３３Ｆ ３’ゲノムプロモーター、ならびに原種ＲＳＶ２Ｂウイルスもし くは２Ｂ３３Ｆおよび２Ｂ３３Ｆ ＴＳ（＋）ウイルスにより提供されるヘルパ ー技能の、このＲＳＶ−ＣＡＴミニレプリコン系による相補性分析も実施されて いる。３つ全てのウイルスは２Ｂおよび２Ｂ３３Ｆ ３’ゲノムプロモーターに より媒介される転写／複製機能を支持した。しかしながら、２Ｂ３３Ｆおよび２ Ｂ３３Ｆ ＴＳ（＋）ウイルスは２Ｂ３３Ｆ ３’ゲノムプロモーターを好んだ 。この分析により、ワクチン弱毒過程の間にＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ遺 伝子と同時 に生じる３’ゲノムプロモーター変化という同時進化が明白に示される。配列分 析によると、単−Ｌプロテインアミノ酸４５１（Ａｒｇ→Ｌｙｓ）の復位による ２Ｂ３３Ｆ突然変異体５ａ内でのｔｓ表現型の復位は、３７℃におけるＲＳＶ− ＣＡＴミニレプリコンの転写／複製機能の支持により明白に示された。２Ｂ３３ Ｆウイルスは３７℃ではＲＳＶ−ＣＡＴミニレプリコン（２Ｂもしくは２Ｂ３３ Ｆ ３’ゲノムプロモーターを有するもの）にヘルパー機能を提供しなかった。 ｄ． ２Ｂ３３Ｆに見られるＳＨのバイアス化超突然変異（ｂｉａｓｅｄ ｈｙ ｐｅｒｍｕｔａｔｉｏｎ）は、表現型にかかわらず全ての２Ｂ３３Ｆ復位突然変 異体内に存在し、そしてｔｓ、ｃａ、かつ弱毒化された２Ｂ２０Ｌ内には見られ ない。従って今の時点では、この突然変異をいずれかの生物学的表現型に関連付 けるデータは全く存在しない。 １８５３７と表示される他の野生型ＲＳＶの配列決定も行い、そして野生型Ｒ ＳＶ ２Ｂ株の配列と比較した。一つを例外として、先に記載される全ての重要 な残基では２つの野生型株が同一であった。２Ｂについてはヌクレオチド１４５ ８６〜１４５８８のコドンＡＣＡはＬプロテインのアミノ酸２０２９ではＴｈｒ をコードする一方で、１８５３７についてはヌクレオチド１４５９３〜１４５９ ５のコドンＡＴＴはアミノ酸２０２９ではＩｌｅをコードする（Ｌ遺伝子開始コ ドンは１８５３７においてはヌクレオチド８５０９〜８５１１に存在し、これは ２Ｂにおける８５０２〜８５０４と比較される）。実施例４ 麻疹ウイルスを検出するためのＰＣＲアッセイ 進行性の非湿性咳、息切れ、および発熱を呈する２１歳齢の患者を病 院に入院させた。この患者の症状は７日間のクラリスロマイシンでの治療の後、 もしくはアトバクオン（ａｔｖａｑｕｏｎｅ）での類似の方針での治療の後には 改善しなかった。右上腹部疼痛の随伴性愁訴によりオメプラゾール（ｏｍｅｐｌ ａｚｏｌｅ）および制酸薬に対するレカルシルトラント（ｒｅｃａｌｃｉｌｔｒ ａｎｔ）が判明した。関連する過去の病歴（ｍｅｄｉｃａｌ ｈｉｓｔｏｒｙ） は、因子ＶＩＩＩ欠損症および今回の入院３〜４年前に診断されたＨＩＶ感染症 を含んでいた。一年前にはこの患者は大学入学のために必要とされる麻疹−お多 福風邪−風疹（ＭＭＲ）ワクチンの追加免疫化を受けていた。 この病院への入院２日後に実施された気管支肺胞洗浄および経気管支生検によ り、反応性増殖および最小慢性炎を伴う肺胞被覆細胞剥離が示された。グラム（ Ｇｒａｍ）染色、メテナミン銀染色、およびＰＡＳ染色によっては微生物は全く 示されなかった。胸部ＣＴスキャンにより、左肺底に複数の不明確な融合性結節 が示された。進展ＨＩＶ疾患の肺合併症の一般的原因となる日和見性細菌、微生 物、および真菌類のための経験に基づく抗生物質投与にもかかわらず、この患者 は３９℃の発熱を示し、そしてその状態のままであった。左側胸膜滲出を生じ； 診断用胸腔穿刺により、これは滲出性であることが示されたが、他の全ての点で は疾患症状は示されなかった。３週間後に実施された気管支肺胞洗浄によっては 肺胞組織球が示されたに過ぎず、その内の幾つかはヘモジデリン沈着マクロファ ージ（ｈｅｍｏｓｉｄｅｒｉｎ ｌａｄｅｎ）、少数のリンパ球、および好中球 であった。ＦＩＴＥ、ＡＦＢ、およびメタンアミン銀染色は再び陰性であった。 その後２週間目には左肺の楔状切除をＣＴ誘導による小切開開腹術を 通して実施した。複数の組織切片により、壊死および線維化の領域を含む急性お よび慢性炎症の結節領域が明らかにされた。多数の多核巨細胞が存在し、その内 の幾つかが細胞質内封入体および核内封入体の両方を含み、このことにより麻疹 ウイルス巨細胞性肺炎が示唆された。細菌、真菌類、Ｐ．カリニイ（Ｐ．ｃａｒ ｉｎｉｉ ）、および抗酸菌についての特種染色は再度陰性結果となった。この肺 生検の切片標本の電子顕微鏡調査により、例えば麻疹ウイルスのようなパラミク ソウイルスと形態学的に一致する粒子が示された。固相赤血球吸着（ｈｅｍａｄ ｓｏｒｂａｎｔ）アッセイにより決定された血清抗−麻疹ＩｇＧ力価は陰性であ り、陰性結果は後に行ったＩｇＭ捕獲免疫アッセイでも同様であった。 ２週間後には、患者の肺生検物質を接種したアカゲザル（Ｒｈｅｓｕｓ ｍｏ ｎｋｅｙ）の腎臓（ＲＭＫ）組織培養物細胞により、麻疹ウイルス感染に特徴的 な細胞変性性変化が示された。麻疹ウイルスに対するモノクローナル抗体での免 疫蛍光アッセイを用いて確認を得た。この診断に基づき、１０００ｍｇのリバビ リン（ｒｉｂａｖｉｒｉｎ）を１４日間、１日２回経口投与した。残念なことに 、この患者は徐々に悪化し、結局のところ２カ月後に死亡した。 この患者内に存在する麻疹の性質を確認する目的で、感染を受けた組織から取 得されたウイルスの逆転写およびＰＣＲ増幅を実施し、その後には配列決定を行 った。この患者の肺生検物質を接種したアカゲザル（Ｒｈｅｓｕｓ ｍｏｎｋｅ ｙ）の腎臓細胞から単離された麻疹ウイルスを継続的ベロ（Ｖｅｒｏ）（サルの 腎臓）組織培養物細胞株内での２回連続継代により増殖させた。感染細胞の全Ｒ ＮＡを、製造業者の手順書に従い、ＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏ ｌｏｇｉｅｓ社、Ｇ ｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）を用いて２度目のベロ（Ｖｅｒｏ）細胞継代の 際に抽出した。全ＲＮＡを、患者の肺生検物質から同様に抽出した。３価ＭＭＲ ワクチンの構成成分として米国内で現在用いられている麻疹ウイルスワクチン株 （モラテン（Ｍｏｒａｔｅｎ））は、その１価形態（Ａｔｔｅｎｕｖａｘ（商標 ）、Ｍｅｒｃｋ、Ｓｈａｒｐｅ ＆ Ｄｏｈｍｅ）として取得された。このウイ ルスはいったんベロ（Ｖｅｒｏ）細胞内で継代され、そしてその後には、ワクチ ン感染を受けた細胞の全ＲＮＡを先に記載される要領で抽出した。 これらＲＮＡ調製物の各々を、ランダムヘキサメリックプライマーおよびマロ ニー（Ｍａｌｏｎｅｙ）マウス白血病ウイルス逆転写酵素（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌ ｍｅｒ／Ｃｅｔｕｓ ＲＴ−ＰＣＲキット試薬、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ−Ｃ ｅｔｕｓ社、Ｂｒａｎｃｈｂｕｒｇ、ＮＪ）を用いてｃＤＮＡへと逆転写した（ ＲＴ）。その後に、このｃＤＮＡを、そのデザインが先に記載されるエドモンス トン（Ｅｄｍｏｎｓｔｏｎ）麻疹ウイルス配列に基づく麻疹ウイルス−特異的オ リゴデオキシヌクレオチドプライマー対を用いるＰＣＲにより増幅した。これら のＰＣＲ産物は、１５，８９４ヌクレオチド分の長さの麻疹ゲノム全体をカバー する一連の重複ＤＮＡ断片を含む。ゲノムコンセンサス配列は、クローニングな しで行い、製造業者により確立されたジデオキシターミネーターサイクル−配列 決定法（ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３７７シークエンサーおよびＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ＤＮＡ配列決定用キット；Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ／Ｃｅｔｕｓ社、Ｆｏｓ ｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を用いる各ＰＣＲ産物の直接分析により立証した。こ のＰＣＲ増幅ＤＮＡ産物の両方の鎖を分析して配列決定の際に生じる可能性のあ る不確定性を排除し た。 患者のウイルス性単離物ならびに疾患を患っている肺組織中に存在する麻疹ウ イルスゲノムの選択された領域のヌクレオチド配列を、モラテン（Ｍｏｒａｔｅ ｎ）ワクチンウイルスの配列ならびに他の野生型麻疹ウイルスおよびワクチン株 のヌクレオチド配列と比較した。この配列分析により、過去もしくは現在配布さ れている野生型ウイルスもしくは他の麻疹ワクチン株に対する関連性が示された というよりはむしろ、モラテン（Ｍｏｒａｔｅｎ）ワクチン株との同一性が明ら かにされた。 実施例５ ＲＳＶの検出のためのＥＬＩＳＡ ＥＬＩＳＡ検査を用いてＲＳＶの存在を検出する。ペプチドを消化し、そしで 全ての亜群Ｂ株か、あるいは本件に記載される個々の野生型、ワクチン、もしく は復位突然変異体ＲＳＶ亜群Ｂ株に特異的であることが本件に記載されるＲＳＶ 配列に対する相同性に基づく選択を行う。その後にこれらのペプチドをＫＬＨに 連結させ、そしてこれを用いて単一特異的ポリクローナル抗体の産生のためにウ サギを免疫化する。その後には、これらのポリクローナル抗体の選択物、もしく はポリクローナル抗体とモノクローナル抗体との組み合わせ物を「捕獲ＥＬＩＳ Ａ」内で用いてＲＳＶ抗原の存在を検出する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ０７Ｋ 14/115 Ｃ０７Ｋ 14/115 14/145 14/145 Ｃ１２Ｎ 7/04 Ｃ１２Ｎ 7/04 // Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＵ，Ａ Ｚ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＵ ，ＣＺ，ＥＥ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ， ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，Ｌ Ｓ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＧ，ＳＩ， ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，Ｕ Ｓ，ＵＺ，ＶＮ，ＺＷ (72)発明者 シデユ，モヒンダージト・エス アメリカ合衆国ニユーヨーク州10930ハイ ランドミルズ・アスペンコート３ (72)発明者 テイテム，ジヨアン・エム アメリカ合衆国ニユージヤージイ州07082 トワコ・ダグラスドライブ62 (72)発明者 マーフイー，ブライアン・アール アメリカ合衆国メリーランド州20816ベセ スダ・タスカラワスロード5410 (72)発明者 ランドルフ，バレリー・ビー アメリカ合衆国ニユージヤージイ州07035 リンカーンパーク・パインブルツクロード 535

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． ３’ゲノムプロモーター領域内に少なくとも一つの弱毒性突然変異を有 し、かつＲＮＡポリメラーゼ遺伝子内に少なくとも一つの弱毒性突然変異を有す る目モノネガビラレス（Ｍｏｎｏｎｅｇａｖｉｒａｌｅｓ）の単離され、組換え 法により作成され、弱毒化された、非分節、マイナス鎖−センス、一本鎖ＲＮＡ ウイルス。 ２． ウイルスが科パラミクソウイルス科（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ ）からのものである、請求の範囲１のウイルス。 ３． ウイルスが亜科パラミクソビリナエ（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｎａｅ ）からのものである請求の範囲２のウイルス。 ４． ウイルスが属モルビリウイルス（Ｍｏｒｂｉｌｌｉｖｉｒｕｓ）からの ものである請求の範囲３のウイルス。 ５． ウイルスが麻疹ウイルスである、請求の範囲４のウイルス。 ６． （ａ）３’ゲノムプロモーター領域内の少なくとも一つの弱毒性突然変 異が、ヌクレオチド２６（Ａ→Ｔ）、ヌクレオチド４２（Ａ→ＴもしくはＡ→Ｃ ）、およびヌクレオチド９６（Ｇ→Ａ）からなる群より選択され、この場合これ らのヌクレオチドはプラス鎖、アンチゲノム、メッセージセンスとして表され； そして （ｂ）ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子中の少なくとも一つの弱毒性突然変異 が、残基３３１（イソロイシン→スレオニン）、１４０９（アラニン→スレオニ ン）、１６２４（スレオニン→アラニン）、１６４９（アルギニン→メチオニン ）、１７１７（アスパラギン酸→アラニン）、１９３６（ヒスチジン→チロシン ）、２０７４（グルタミン→アルギニ ン）、および２１１４（アルギニン→リシン）からなる群より選択されるアミノ 酸の変化を生じるヌクレオチド変化からなる群より選択される： 請求の範囲５の麻疹ウイルス。 ７． ウイルスが属パラミクソウイルス（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｕｓ）から のものである、請求の範囲３のウイルス。 ８． ウイルスがヒトパラインフルエンザウイルス タイプ３（ＰＩＶ−３） である、請求の範囲７のウイルス。 ９． （ａ）３’ゲノムプロモーター領域内の少なくとも一つの弱毒性突然変 異が、ヌクレオチド２３（Ｔ→Ｃ）、ヌクレオチド２４（Ｃ→Ｔ）、ヌクレオチ ド２８（Ｇ→Ｔ）、およびヌクレオチド４５（Ｔ→Ａ）からなる群より選択され 、この場合これらのヌクレオチドはプラス鎖、アンヂゲノム、メッセージセンス として表され；そして （ｂ）ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子中の少なくとも一つの弱毒性突然変異 が、残基９４２（チロシン→ヒスチジン）、９９２（ロイシン→フェニルアラニ ン）、および１５５８（スレオニン→イソロイシン）からなる群より選択される アミノ酸の変化を生じるヌクレオチド変化からなる群より選択される： 請求の範囲８のＰＩＶ−３。 １０． ウイルスが属ルブラウイルス（Ｒｕｂｕｌａｖｉｒｕｓ）からのもので ある、請求の範囲３のウイルス。 １１． ウイルスが亜科ニューモビリナエ（Ｐｎｅｕｍｏｖｉｒｉｎａｅ）から のものである、請求の範囲２のウイルス。 １２． ウイルスが属ニューモウイルス（Ｐｎｅｕｍｏｖｉｒｕｓ）か らのものである、請求の範囲１１のウイルス。 １３． ウイルスがヒトＲＳウイルス（ＲＳＶ）亜群Ｂである、請求の範囲１２ のウイルス。 １４． （ａ）３’ゲノムプロモーター領域内の少なくとも一つの弱毒性突然変 異が、ヌクレオチド４（Ｃ→Ｇ）、およびヌクレオチド６〜１１の複数のＡの配 列（ｓｔｒｅｔｃｈ）内の追加的Ａの挿入からなる群より選択され、この場合こ れらのヌクレオチドはプラス鎖、アンチゲノム、メッセージセンスとして表され ；そして （ｂ）ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子中の少なくとも一つの弱毒性突然変異 が、残基３５３（アルギニンン→リシン）、４５１（リシン→アルギニン）、１ ２２９（アスパラギン酸→アスパラギン）、２０２９（スレオニン→イソロイシ ン）、および２０５０（アスパラギン→アスパラギン酸）からなる群より選択さ れるアミノ酸の変化を生じるヌクレオチド変化からなる群より選択される： 請求の範囲１３のウイルス。 １５． ウイルスが科ラブドウイルス科（Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ）からの ものである、請求の範囲１のウイルス。 １６． ウイルスが科フィロウイルス科（Ｆｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ）からのもの である、請求の範囲１のウイルス。 １７． 請求の範囲１に記載の目モノネガビラレス（Ｍｏｎｏｎｅｇａｖｉｒａ ｌｅｓ）の単離され、組換え法により作成され、弱毒化された、非分節、マイナ ス鎖−センス、一本鎖ＲＮＡウイルスおよび生理学的に許容される担体を含むワ クチン。 １８． 請求の範囲５に記載の麻疹ウイルスおよび生理学的に許容され る担体を含む請求の範囲１７のワクチン。 １９． 請求の範囲６に記載の麻疹ウイルスおよび生理学的に許容される担体を 含む請求の範囲１８のワクチン。 ２０． 請求の範囲８に記載のＰＩＶ−３および生理学的に許容される担体を含 む請求の範囲１７のワクチン。 ２１． 請求の範囲９に記載のＰＩＶ−３および生理学的に許容される担体を含 む請求の範囲２０のワクチン。 ２２． 請求の範囲１３に記載のＲＳＶ亜群Ｂおよび生理学的に許容される担体 を含む請求の範囲１７のワクチン。 ２３． 請求の範囲１４に記載のＲＳＶ亜群Ｂおよび生理学的に許容される担体 を含む請求の範囲２２のワクチン。 ２４． 目モノネガビラレス（Ｍｏｎｏｎｅｇａｖｉｒａｌｅｓ）の非分節、マ イナス鎖−センス、一本鎖ＲＮＡウイルスに対する防御を誘導するために、ある 個体を免疫化するための、その個体に請求の範囲１７のワクチンを投与すること を含む方法。 ２５． ワクチンが請求の範囲１８のワクチンである、請求の範囲２４の方法。 ２６． ワクチンが請求の範囲１９のワクチンである、請求の範囲２５の方法。 ２７． ワクチンが請求の範囲２０のワクチンである、請求の範囲２４の方法。 ２８． ワクチンが請求の範囲２１のワクチンである、請求の範囲２７の方法。 ２９． ワクチンが請求の範囲２２のワクチンである、請求の範囲２４ の方法。 ３０． ワクチンが請求の範囲２３のワクチンである、請求の範囲２９の方法。 ３１． １９７７野生型株（配列番号３）、１９８３野生型株（配列番号５）（ この場合、ヌクレオチド２４９９はＧもしくはＣである）、モンテフィオーレ（ Ｍｏｎｔｅｆｉｏｒｅ）野生型株（配列番号７）、Ｒｕｂｅｏｖａｘ（商標）ワ クチン株（配列番号９）（この場合、ヌクレオチド２１４３はＴもしくはＣであ る）、モラテン（Ｍｏｒａｔｅｎ）ワクチン株（配列番号１１）、シュワルツ（ Ｓｃｈｗａｒｚ）ワクチン株（配列番号１１）（この場合、ヌクレオチド４９１ ７はＣであり、そしてヌクレオチド４９２４はＣである）、およびザグレブ（Ｚ ａｇｒｅｂ）ワクチン株（配列番号１３）、ならびにそれらの相補性ゲノム配列 から選択される、プラス鎖、アンチゲノム、メッセージセンスの麻疹ウイルス配 列を含む単離された核酸分子。 ３２． アカゲザル（ｒｈｅｓｕｓ）胎仔肺細胞内で生育させたｃｐ４５ワクチ ン株（配列番号１９）およびベロ（Ｖｅｒｏ）細胞内で生育させたｃｐ４５ワク チン株（配列番号２１）、ならびにそれらの相補性ゲノム配列からなる群より選 択されるプラス鎖、アンチゲノム、メッセージセンスのＰＩＶ−３配列を含む単 離された核酸分子。 ３３． ３’ゲノムプロモーター領域内に少なくとも一つの弱毒性突然変異を有 し、かつＲＮＡポリメラーゼ遺伝子内に少なくとも一つの弱毒性突然変異を有す る目モノネガビラレス（Ｍｏｎｏｎｅｇａｖｉｒａｌｅｓ）の非分節、マイナス 鎖−センス、一本鎖ＲＮＡウイルスのゲノムもしくはアンチゲノムをコードする 単離された核酸分子を含む転写ベク ターを、カプシド形成、転写、および複製に必要なトランス−作用性蛋白質をコ ードし、少なくとも一つの単離された核酸分子を含む少なくとも一つの発現ベク ターと共に含み、発現の際に感染性弱毒化ウイルスが産生される組成物。 ３４． 転写ベクターが、請求の範囲５に記載の麻疹ウイルスをコードする単離 された核酸分子を含み、かつ少なくとも一つの発現ベクターが、トランス−作用 性蛋白質Ｎ、Ｐ、およびＬをコードする少なくとも一つの単離された核酸分子を 含む、請求の範囲３３の組成物。 ３５． 転写ベクターが、請求の範囲６に記載の麻疹ウイルスをコードする単離 された核酸分子を含む、請求の範囲３４の組成物。 ３６． 転写ベクターが、請求の範囲８に記載のＰＩＶ−３をコードする単離さ れた核酸分子を含み、かつ少なくとも一つの発現ベクターが、トランス−作用性 蛋白質ＮＰ、Ｐ、およびＬをコードする少なくとも一つの単離された核酸分子を 含む、請求の範囲３３の組成物。 ３７． 転写ベクターが、請求の範囲９に記載のＰＩＶ−３をコードする単離さ れた核酸分子を含む、請求の範囲３６の組成物。 ３８． 転写ベクターが、請求の範囲１３に記載のＲＳＶ亜群Ｂをコードする単 離された核酸分子を含み、かつ少なくとも一つの発現ベクターが、トランス−作 用性蛋白質Ｎ、Ｐ、Ｌ、およびＭ２をコードする少なくとも一つの単離された核 酸分子を含む、請求の範囲３３の組成物。 ３９． 転写ベクターが、請求の範囲１４に記載のＲＳＶ亜群Ｂをコードする単 離された核酸分子を含む、請求の範囲３８の組成物。 ４０． 目モノネガビラレス（Ｍｏｎｏｎｅｇａｖｉｒａｌｅｓ）の感染性、弱 毒化、非分節、マイナス鎖−センス、一本鎖ＲＮＡウイルスを 産生するための、宿主細胞を、請求の範囲３３の少なくとも２つのベクターで形 質転換もしくはトランスフェクトし、そしてその宿主細胞を、感染性、弱毒化ウ イルスを産生するようにそれらのベクターの同時発現を可能にする条件下で培養 することを含む方法。 ４１． ウイルスが、請求の範囲５の麻疹ウイルスである、請求の範囲４０の方 法。 ４２． ウイルスが、請求の範囲６の麻疹ウイルスである、請求の範囲４１の方 法。 ４３． ウイルスが、請求の範囲８のＰＩＶ−３である、請求の範囲４０の方法 。 ４４． ウイルスが、請求の範囲９のＰＩＶ−３である、請求の範囲４３の方法 。 ４５． ウイルスが、請求の範囲１３のＲＳＶ亜群Ｂである、請求の範囲４０の 方法。 ４６． ウイルスが、請求の範囲１４のＲＳＶ亜群Ｂである、請求の範囲４５の 方法。