ES2552774T3 - Virus de la gripe porcina modificado por ingeniería genética y usos de los mismos - Google Patents

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Abstract

Un virus de la gripe porcina atenuado modificado por ingeniería genética que tiene un fenotipo antagonista de interferón alterado, en donde dicho virus comprende un gen de NS1 de virus de la gripe porcina A/Porcino/Texas/4199-2/98 con una mutación que produce una proteína NS1 con una deleción de todos los restos de aminoácido de NS1 excepto los restos de aminoácido 1-126, en donde el aminoácido amino-terminal es el número 1 y la mutación en el gen de NS1 confiere un fenotipo antagonista de interferón alterado.

Description

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DESCRIPCION
Virus de la gripe porcina modificado por ingeniena genetica y usos de los mismos
1. Campo de la invencion
La presente invencion se refiere, en general, a virus de la gripe porcina atenuados modificados por ingeniena genetica que tienen una capacidad alterada de antagonizar la respuesta del interferon (IFN) celular, y al uso de dichos virus atenuados en formulaciones de vacuna y farmaceuticas. En particular, la invencion se refiere a virus de la gripe porcina atenuados modificados por ingeniena genetica que tienen modificaciones en un gen de NS1 de virus de la gripe A/porcino/Texas/4199-2/98 que disminuyen o eliminan la capacidad del producto genico NS1 de antagonizar la respuesta del IFN celular. Estos virus se replican in vivo, pero muestran virulencia disminuida y atenuacion aumentada, y por lo tanto son muy adecuados para su uso en vacunas de virus vivos, y en formulaciones farmaceuticas.
2. Antecedentes
2.1 Virus de la gripe
Las familias de virus que contienen ARN monocatenario con envuelta del genoma con sentido negativo se clasifican en grupos que tienen genomas no segmentados (Paramyxoviridae, Rhabdoviridae, Filoviridae y virus de la enfermedad de Borna) o aquellos que tienen genomas segmentados (Orthomyxoviridae, Bunyaviridae y Arenaviridae). La familia Orthomyxoviridae, descrita mas adelante con detalle, y usada en los ejemplos de la presente memoria, incluye los virus de la gripe de tipo A, B y C, asf como los virus Thogoto y Dhori y virus de la anemia infecciosa del salmon.
Los viriones de la gripe consisten en un nucleo ribonucleoproteico interno (una nucleocapside helicoidal) que contiene el genoma de ARN monocatenario, y una envuelta lipoproteica externa revestida en el interior por una protema de la matriz (M1). El genoma segmentado del virus de la gripe A consiste en ocho moleculas (siete para la gripe C) de ARN monocatenarios, lineales, de polaridad negativa que codifican once polipeptidos, incluyendo: la protema ARN polimerasa dependiente de ARN (PB2, PB1 y PA) y la nucleo protema (NP) que forma la nucleocapside; las protemas de membrana de la matriz (M1, M2); dos glucoprotemas de superficie que protegen la envuelta que contiene lfpidos: hemaglutinina (HA) y neuraminidasa (NA); la protema no estructural (NS1), la protema de exportacion nuclear (NEP); y el factor pro-apoptotico PB1-F2. La transcripcion y replicacion del genoma tiene lugar en el nucleo y el ensamblaje se produce mediante gemacion en la membrana plasmatica. Los virus pueden redistribuir los genes durante infecciones mixtas.
El virus de la gripe se adsorbe mediante HA a sialiloligosacaridos en glucoprotemas y glucolfpidos de la membrana celular. Despues de la endocitosis del virion se produce un cambio conformacional en la molecula HA dentro del endosoma celular que facilita la fusion de la membrana, desencadenando de este modo el desrecubrimiento. La nucleocapside migra hasta el nucleo donde se transcribe el ARNm viral. El ARNm viral se transcribe mediante un mecanismo unico en el cual la endonucleasa viral escinde el extremo 5' protegido de los ARNm heterologos celulares que despues sirven como cebadores para la transcripcion de moldes de ARN viral por la transcriptasa viral. Los transcritos terminan en sitios de 15 a 22 bases desde los extremos de sus moldes, donde secuencias oligo (U) actuan como senales para la adicion de tramos de poli (A). De las ocho moleculas de ARN viral asf producidas, seis son mensajes monocistronicos que se traducen directamente en las protemas que representas hA, NA, NP y las protemas de polimerasa viral, pB2, PB1 y PA. Los otros dos transcritos experimentan corte y ayuste, produciendo cada uno dos ARNm que se traducen en diferentes fases de lectura para producir M1, M2, NS1 y NEP. El segmento PB1 codifica una segunda protema, la protema PB1-F2 no estructural, usando un ATG alternativo. En otras palabras, los ocho segmentos de ARN viral codifican once protemas: nueve estructurales y dos no estructurales. Se muestra un resumen de los genes del virus de la gripe y sus productos proteicos en la siguiente tabla I.
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TABLA I: SEGMENTOS DE ARN DEL GENOMA DEL VIRUS DE LA GRIPE Y ASIGNACIONES CODIFICANTESa
Segmento
Longitudb Polipeptidosc Longitudd Molelulas Comentarios
(Nucleotidos) Codificados (Aminoacidos) por Virion
1
2341 PB2 759 30-60 Componente de ARN transcriptasa; componente de ARN trancriptasa de union a capuchon de ARN de celula hospedadora;
2
2341 PB1 757 30-60 Inicio de la transcripcion
3
2233 PB1-F2 87 Factor proapoptotico
PA 716 30-60 componente ARN transcriptasa
4
1778 HA 566 500 Hemaglutinina; tnmero; glucoprotema de envuelta; media la adhesion a
celulas
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1565 NP 498 1000 Nucleoprotema; asociada con ARN; componente estructural de ARN transcriptasa
6
1413 NA 454 100 Neuraminidasa; tetramero; glucoprotema de envuelta
7
1027 M1 252 3000 Protema de matriz; reviste el interior de la envuelta
M2 96 ? Protema estructural en membrana plasmatica; ARNm con corte y ayuste
8
890 NS1 230 Protema no estructural; funcion desconocida
NEP 121 ? Protema de exportacion nuclear; ARNm con corte y ayuste
a Adaptado de Lamb y P. W. Choppin (1983), Annual Review of Biochemistry, Volumen 52, 467-506.
b Para la cepa A/PR/8/34
c Determinado por enfoques bioqmmicos y geneticos
d Determinado por analisis de secuencia de nucleotidos y secuenciacion de protemas
La patogenicidad de los virus de la gripe esta modulada por multiples factores del virus y el hospedador. Entre los factores del hospedador que combaten las infecciones vmcas, el sistema de interferon tipo I (IFNa/p) representan un mecanismo de defensa innata antiviral poderoso que se establecio relativamente temprano en la evolucion de organismos eucariotas (Garda-Sastre, 2002, Microbes Infect 4:647-55). El sistema IFNa/p antiviral implica tres etapas principales: (i) deteccion de infeccion vmca y secrecion de IFNa/p, (ii) union de IFNa/p a sus receptores e induccion transcripcional de genes estimulados por IFNa/p, y (iii) smtesis de encimas y protemas antivirales. La mayona de los virus, sin embargo, han adquirido informacion genetica espedfica que codifica moleculas antagonistas IFNa/p, que bloquean de forma eficaz una o mas etapas del sistema IFNa/p anti viral. Los virus de la gripe A expresan una protema no estructural en celulas infectadas, la protema NS1 (descrita en detalle, infra), que contrarresta la respuesta IFNa/p celular (Garda-Sastre et al., 1998, Virology 252:324.; 30).
El genoma del virus de la gripe A contiene ocho segmentos de ARN monocatenario de polaridad negativa, que codifica dos protemas no estructurales y nueve estructurales. La protema no estructural NS1 es abundante en celulas infectadas por virus de la gripe, pero no se ha detectado en viriones. NS1 es una fosfoprotema encontrada en el nucleo de forma prematura durante infecciones y tambien en el citoplasma en momentos posteriores del ciclo viral (King et al., 1975, Virology 64:378). Estudios con mutantes de gripe sensibles a temperatura (ts) que portan lesiones en el gen NS sugirieron que la protema NS1 es un regulador transcripcional y post transcripcional de mecanismos por los cuales el virus es capaz de inhibir la expresion genica de la celula huesped y de estimular las smtesis de protema viral. Como muchas otras protemas que regulan procesos post transcripcionales, la protema NS1 interacciona con secuencias y estructuras espedficas de ARN. Se ha informado de que la protema NS1 se une a diferentes especies de ARN incluyendo: ARNv, poli A, ARNsn U6, region 5' no traducida de ARNm virales y
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ARNbc (Qiu et al, 1995, RNA 1: 304; Qiu et al, 1994, J. Virol. 68:2425; HatadaFukuda 1992, J Gen Virol. 73:3325-9). La expresion de la protema NS1 a partir de ADNc en celulas transfectadas se ha asociado con varios efectos: inhibicion del transporte nucleo citoplasmatico de ARNm, inhibicion de corte y ayuste de pre-ARNm, inhibicion de la poliadenilacion del ARNm del hospedador y estimulacion de la traduccion de ARNm viral (Fortes, et al, 1994, EMBO J. 13: 704; Enami et al, 1994, J. Virol; 68:1432; de la Luna et al., 1995, J. Virol. 69:2427; Lu et al, 1994, Genes Dev. 8:1817; Park et al, 1995, J. Biol Chem. 270,28433; Nemeroff et al, 1998, Mol. Cell. 1:1991; Chen et al, 1994, EMBO J. 18:2273-83). En particular, la protema NS1 tiene tres dominios que se ha informado que tienen varias funciones reguladoras durante la infeccion por virus de la gripe. Los 73 amino acidos amino terminales son responsables de la union a ARN (Qian et al, 1995, RNA 1:948-956), particularmente ARN bicatenarios, que confieren al virus la capacidad de escapar de la respuesta de interferon a/p (Donelan et al, 2003, J. Virol. 77:13257-66). La parte central de la protema interacciona con el factor de inicio de la traduccion eucariota 4GI que facilita la traduccion preferente de ARNm virales sobre los ARNm del hospedador (Arag6n et al, 2000, Mol. Cell Biol. 20:6259-6268). El dominio carboxy-terminal o efector ha demostrado inhibir el procesamiento de ARNm del hospedador, espedficamente, la inhibicion de la poliadenilacion del ARNm del hospedador (Nemeroff et al, 1998, Mol. Cell 1 -.991-1000), la union de colas poli (A) de exportacion ARNm que inhibe la exportacion nuclear y (Qiu y Krug, 1994, J. Virol. 68:2425-2432) y la inhibicion de corte y ayuste de pre-ARNm (Lu et al, 1994, Genes Dev. 8:1817-1828).
Estudios de virus de la gripe recombinante humano que carece del gen de NS1 (delNS1) mostraron que este virus podna replicarse solamente en sistemas IFN incompetentes tales como ratones STAT1-/- o celulas Vero; por tanto la protema NS1 es responsable de la actividad antagonista de IFN (Garcia-Sastre et al, 1998, Virology 252:324-330). Ademas, se ha demostrado que los virus de la gripe humana con protemas NS1 truncadas estan atenuados en ratones (Egorov et al, 1998, J. Virol. 72:6437-6441) y proporcionan proteccion contra exposicion a tipo silvestre (Talon et al, 2000, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:4309-4314).
2.2 Virus de la gripe porcina
La gripe porcina (SI) es una enfermedad respiratoria aguda de los cerdos, causada por virus de la gripe tipo A. Su severidad depende de muchos factores, incluyendo la edad del hospedador, la cepa del virus, e infecciones secundarias (Easterday, 1980, Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci 288:433-7). Los virus de la gripe A son virus ARN de hebra negativa segmentados y pueden aislarse de otras varias especies hospedadoras animales, incluyendo aves, seres humanos, caballos, ballenas, y vison. Aunque los virus de la gripe completos raramente cruzan la barrera de especies, los segmentos genicos pueden cruzar esta barrera a traves de los procesos de redistribucion genetica o desplazamiento genetico. Como los cerdos soportan la replicacion de virus de la gripe A tanto humanos como aviares (Kida et al, 1994, J Gen Virol 75:2183-8), se ha postulado que desempenan un papel importante en la transmision inter especie actuando como "recipiente de mezcla" para redistribucion entre virus espedficos para diferentes especies hospedadoras (Scholtissek, 1994, Eur J Epidemiol 10:455-8). Esto puede conducir a la generacion de nuevos virus de la gripe capaces de cruzar la barrera de especies hasta los seres humanos. Existen tres subtipos de virus SI (SIV) actualmente en circulacion en cerdos en los Estados Unidos. H1N1, H3N2, y H1N2 (Olsen, 2002, Virus Res 85:199-210; Karasin et al, 2002, J Clin Microbiol 40:1073-9; Karasin et al, 2000, Virus Res 68:71-85; Olsen et al, 2000, Arch Virol 145:1399-419; Webby et al., 2000, J Virol 74:8243-51; Webby et al., 2001, Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci 356:1817-28; Zhou, 2000, Vet Microbiol 74:47-58). Antes de 1998, se aislaron SIV H1N1 principalmente "clasicos" de cerdos en los Estados Unidos (Kida et al, 1994, J Gen Virol 75:2183-8; Scholtissek, 1994, Eur J Epidemiol 10:455-8; Olsen et al, 2000, Arch Virol. 145:1399-419). En 1998, se aislaron SIV del subtipo H3N2 en multiples estados en los Estados Unidos. Estos virus se generaron por redistribucion entre virus humanos, aviares y porcinos clasicos, estan experimentando una rapida evolucion y en general causan enfermedad mas severa que SIV H1N1 clasico.
La patogenicidad de los virus de la gripe esta modulada por multiples factores vmcos y hospedadores. Entre los factores hospedadores que combaten las infecciones vmcas, el sistema de interferon tipo I (FNa/p) representa un mecanismo de defensa innata antiviral poderoso que se establecio relativamente temprano en la evolucion de organismos eucariotas (Garcia-Sastre, 2002, Microbes Infect 4:647-55). El sistema IFNa/p antiviral implica tres etapas principales: (i) deteccion de infeccion vmca y secrecion de IFNa/p, (ii) union de IFNa/p a sus receptores e induccion transcripcional de genes estimulados por IFNa/p, y (iii) smtesis de encimas y protemas antivirales. La mayona de los virus, sin embargo, han adquirido informacion genetica espedfica que codifica moleculas antagonistas IFNa/p, que bloquean de forma eficaz una o mas etapas del sistema y IFNa/p anti viral. Los virus de la gripe A expresan una protema no estructural en celulas infectadas, la protema nS1, que contrarresta la respuesta IFNa/p celular (Garda-Sastre et al., 1998, Virology 252:324.; 30).
La infeccion por gripe en cerdos se informo por primera vez en 1918 y los primeros virus de la gripe porcina se aislaron de cerdos en 1930 (Shope, R.E., 1931, J. Exp. Med. 54:373-385). Estos primeros aislados fueron los progenitores de lo que se reconoce como el linaje H1N1 de los virus de la gripe A porcinos. Desde 1930 hasta la decada de 1990, la gripe en cerdos de America del Norte estuvo causada casi exclusivamente por infeccion con virus porcinos H1N1. Comenzo un drastico desplazamiento en el patron de la gripe porcina alrededor de 1997, cuando se detecto un aumento inesperado y sustancial en la seropositividad H3 (8%), y comenzaron a aislarse virus H3N2 de cerdos tanto en los Estados Unidos como en Canada (Olsen et al, 2000, Arch. Virol. 134:1399-1419). Ademas, la redistribucion entre virus H3N2 y virus porcinos H1N1 provoco la deteccion de virus de redistribucion H1N2 de segunda generacion (Karasin et al, 2000, J. Clin. Microbiol 38:2453-2456; Karasin et al, 2002, J. Clin
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Microbiol. 40:1073-1079). Ademas, se han aislado de cerdos virus H4N6 aviares de origen de pato en Canada (Karasin et al, 2000, J. Virol 74:9322-9327). La generacion de estos nuevos virus ademas de las variantes de arrastre antigenico descritas de virus de la gripe porcina H1N1, introduce implicaciones potenciales para la salud publica humana y veterinaria.
En 1998, una nueva cepa de virus de la gripe porcina para la cual los cerdos teman poca inmunidad enfermo a todos los cerdos en una operacion de 2.400 animales. Aunque ha habido solamente un subtipo de gripe que ha enfermado a los cerdos de America del Norte desde 1930, en los ultimos pocos anos se ha habido una rapida sucesion arrolladora de nuevos virus gripales a traves de los 100 millones de cerdos de America del Norte. Despues de anos de estabilidad, el virus gripal porcino de America del Norte ha saltado a una rapida trayectoria evolutiva, creando variantes cada ano. Esto no solo ha tenido un efecto indeseado sobre la industria granjera y un impacto economico negativo, sino que los expertos tambien estan preocupados sobre que la evolucion del virus gripal porcino aumente la probabilidad de que surja un nuevo virus que sea transmisible entre los seres humanos. Afortunadamente, las nuevas cepas porcinas que han aparecido en America del Norte hasta ahora no parecen infectar facilmente a los seres humanos.
2.3 Virus atenuados
Las vacunas de virus inactivados se preparan "eliminando" el patogeno viral, por ejemplo, por tratamiento termico o con formalina, de modo que no tenga capacidad de replicacion. Las vacunas inactivadas tienen utilidad limitada porque no proporcionan inmunidad de larga duracion y, por lo tanto, producen proteccion limitada. Un enfoque alternativo para producir vacunas contra virus implica el uso de vacunas de virus vivo atenuado. Los virus atenuados tienen capacidad de replicacion pero no son patogenicos y, por lo tanto, proporcionan inmunidad de duracion mas larga y producen mayor proteccion. Sin embargo, los metodos convencionales para producir virus atenuados implican la posibilidad de aislamiento de mutantes de rango de hospedador, muchos de los cuales son sensibles a la temperatura; por ejemplo, el virus se pasa a traves de hospedadores no naturales, y se seleccionan virus descendientes que son inmunogenicos, pero no patogenicos.
Un sustrato convencional para aislar y cultivar virus de la gripe con fines de vacuna son huevos embrionados de gallina. Los virus de la gripe se cultivan tfpicamente durante 2-4 dfas a 37 °C en huevos de 10-12 dfas de vida. Aunque la mayona de los aislados primarios humanos de virus de la gripe A y B se cultivan mejor en el saco amniotico de los embriones, despues de 2 a 3 pases los virus llegan a adaptarse al cultivo en las celulas de la cavidad alantoidea, que es accesible desde el exterior del huevo (Murphy, B.R., y R.G. Webster, 1996. Orthomyxoviruses pag. 1397-1445. In Fields Virology. Lippincott-Raven P.A.).
La tecnologfa de ADN recombinante y las tecnicas de ingeniena genetica, en teona, producinan un enfoque superior para producir un virus atenuado ya que podnan disenarse deliberadamente mutaciones espedficas en el genoma viral. Sin embargo, las alteraciones geneticas necesarias para la atenuacion de virus no son conocidas o predecibles. En general, los intentos de usar la tecnologfa de ADN recombinante para disenar vacunas virales se han dirigido principalmente a la produccion de vacunas de subunidad que contienen solamente las subunidades de protema del patogeno implicadas en la respuesta inmunitaria, expresadas en vectores virales recombinantes tales como virus vaccinia o baculovirus. Mas recientemente, las tecnicas de ADN recombinante se han utilizado en un intento por producir mutantes de delecion de herpesvirus o poliomavirus que imitan virus atenuados encontrados en la naturaleza o mutantes de rango de hospedador conocido. Hasta 1990, los virus ARN de hebra negativa no eran susceptibles a manipulacion espedfica de sitio en absoluto, y por tanto no podfan modificarse por ingeniena genetica.
Aunque estos virus son beneficiosos porque son inmunogenicos y no patogenicos, son diffciles de propagar en sustratos convencionales con el proposito de preparar vacunas. Ademas, los virus atenuados pueden poseer caractensticas de virulencia que son tan leves que no permiten al hospedador montar una respuesta inmunitaria suficiente para cumplir las posteriores exposiciones.
Los virus de la gripe humana no se replican de forma eficaz en aves, y viceversa debido a diferencias en receptores que se unen a los virus. En contraste, los cerdos son susceptibles de forma unica a infeccion con virus humanos y aviares porque poseen tipos de receptor presentes tanto en seres humanos como en virus de la gripe aviar. Como resultado, se ha hipotetizado que los cerdos son los hospedadores de "recipiente de mezcla" para redistribucion de virus humanos-aviares y existe apoyo para esta teona a partir de varios estudios. Vease, por ejemplo Shu et al, 1994, Virology 202:825-33; Scholtissek, 1990, Med, Principles Pract. 2:65-71; Zhou et al, 1999 J Virol. 73:8851-6. Esta mezcla facilita la generacion de nuevas cepas de virus de la gripe humana y el inicio de pandemias de gripe.
Las preparaciones de virus de la gripe inactivado o "eliminado" son las unicas vacunas de gripe actualmente con licencia en los Estados Unidos. Un enfoque alternativo para producir vacunas de virus a las vacunas de virus inactivado en que el patogeno viral esta "eliminado", implica el uso de vacunas de virus vivo atenuado que tienen capacidad de replicacion pero son no patogenicas. Las vacunas vivas que se administran por via intranasal pueden tener ventajas sobre sus equivalentes inactivados. En primer lugar, las vacunas vivas se cree que inducen cito toxicidad mediada por celulas de reactividad cruzada mejorada asf como respuesta de anticuerpos humoral, proporcionando mejor proteccion que las vacunas inactivadas (Gorse y Belshe, 1990, J. Clin. Microbiol. 28:2539-
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2550; y Gorse et al, 1995, J. Infect. Dis. 172:1-10). En segundo lugar, las vacunas vivas tambien tienen la ventaja de administracion intrasanal que evita el hinchamiento y el dolor muscular ocasionalmente asociado con la administracion intramuscular de vacunas inactivadas con adyuvante. Se ha informado que estas vacunas vivas inducen no solamente respuestas humorales contra virus de la gripe homotipicos sino tambien la citotoxicidad mediada por celulas de reactividad cruzada. Las ventajas adicionales de vacunas vivas incluyen la facilidad de administracion intranasal, la induccion de inmunidad en la mucosa, inmunidad de mas larga duracion, y su rentabilidad. Estas son todas consideraciones importantes respecto a las vacunas potenciales de gripe porcina.
Por tanto, se necesitan vacunas nuevas y mas eficaces y formulaciones inmunogenicas para prevenir infecciones por virus de la gripe porcina generadas por dicha tecnologfa.
3. Sumario de la invencion
La presente invencion proporciona un virus de la gripe porcina atenuado modificado por ingeniena genetica que tiene un fenotipo de antagonista de interferon alterado, donde dicho virus comprende un gen de NS1 de virus de la gripe porcina A/Porcino/Texas/4199-2/98 con una mutacion que produce una protema NS1 con una delecion de todos los restos de aminoacido de NS1 exceptos los restos de aminoacido 1-126, donde el aminoacido amino- terminal es el numero 1 y la mutacion en el gen de NS1 confiere un fenotipo de antagonista de interferon alterado.
La presente invencion proporciona adicionalmente una formulacion inmunogenica que comprende el virus de la gripe porcina atenuado modificado por ingeniena genetica, y un excipiente fisiologicamente aceptable. Ademas, la presente invencion proporciona una formulacion farmaceutica que comprende el virus de la gripe porcina atenuado, modificado por ingeniena genetica, de la presente invencion y un vehmulo farmaceuticamente aceptable.
Ademas, la presente invencion proporciona el uso de una cantidad eficaz de la formulacion inmunogenica de la presente invencion en la preparacion de un medicamento para su uso en la inmunizacion o induccion de una respuesta inmunitaria en un cerdo. Ademas, la presente invencion proporciona el uso de una cantidad eficaz del virus de la gripe porcina atenuado modificado por ingeniena genetica de la presente invencion en la preparacion de un medicamento, donde el medicamento es (a) para su uso en la prevencion de una afeccion o un smtoma asociado con virus de la gripe porcina en un cerdo; o (b) para su uso en el tratamiento de una infeccion por virus de la gripe porcina en un cerdo.
La presente invencion tambien proporciona un metodo para la produccion de una formulacion inmunogenica que comprende (a) propagar en un sustrato el virus de la gripe porcina atenuado modificado por ingeniena genetica de la presente invencion y (b) recoger el virus de la descendencia, donde el sustrato es una celula, lmea celular o huevo embrionado.
Ademas, la presente invencion proporciona una celula cultivada que contiene el virus de la gripe porcina atenuado, modificado por ingeniena genetica, de la presente invencion. La presente invencion tambien proporciona un huevo embrionado que contiene el virus de la gripe porcina atenuado modificado por ingeniena genetica de la presente invencion.
En la presente memoria se describen virus de la gripe porcina atenuados que tienen una capacidad alterada de antagonizar la respuesta de interferon celular (IFN), metodos para producir dichos virus de la gripe porcina atenuados y el uso de dichos virus en formulaciones de vacuna y farmaceuticas. Dichos virus son capaces de generar una respuesta inmunitaria y crear inmunidad pero no causar enfermedad o causar fiebre y/o smtomas menos severos, es decir, los virus tienen virulencia disminuida. Por lo tanto, son candidatos ideales para vacunas de virus vivo. Ademas, los virus atenuados pueden inducir una robusta respuesta de IFN que tiene otras consecuencias biologicas in vivo, produciendo proteccion contra posteriores enfermedades infecciosas y/o induciendo respuestas antitumorales. Por lo tanto, los virus atenuados pueden usarse de forma farmaceutica, para la prevencion o tratamiento de otras enfermedades infecciosas y/o enfermedades tratables por IFN.
La invencion se basa, en parte, en el descubrimiento de los solicitantes de que los virus de la gripe porcina modificados por ingeniena para contener o que contienen una o mas deleciones en el gen de NS1 tienen replicacion alterada respecto a virus de la gripe porcina de tipo silvestre como se demuestra por menores lesiones pulmonares tras infeccion de cerdos, tftulos virales reducidos en fluido de lavado bronco alveolar (BALF) y deteccion reducida de virus en frotis nasales. Sorprendentemente, y contrario a los resultados observados con virus de la gripe humana en modelos de raton, la longitud de la protema NS1 no se correlaciona con el nivel de atenuacion del virus de la gripe porcina. Los solicitantes han descubierto que con gripe porcina, un virus mutante con la protema NS1 mas corta es el menos atenuado. En otras palabras, los virus de la gripe porcina que contienen deleciones mas cortas en el gen de NS1 muestran una mayor atenuacion in vivo que los virus de la gripe porcina que contienen deleciones mas largas en su gen NS1, o virus de la gripe porcina de tipo silvestre. Los solicitantes han descubierto adicionalmente que los virus de la gripe porcina recombinantes estan alterados en su capacidad de inhibir la produccion de IFN in vitro, y no se replican tan eficazmente como la cepa recombinante precursora en huevos embrionados de gallina de 10 dfas de vida, en celulas MDCK, en celulas PK-15 o en un modelo de cerdo in vivo. Aunque sin el deseo de limitarse a teona o explicacion alguna para el mecanismo de accion de los mutantes de delecion de NS1 de virus de la gripe porcina in vivo, las caractensticas atenuadas de dichos virus se deben presumiblemente a sus niveles de
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expresion de protema NS1, su capacidad de inducir una robusta respuesta de IFN celular, y su capacidad alterada de antagonizar dicha respuesta. Sin embargo, las caractensticas beneficiosas de dichos virus pueden no ser unicamente atribuibles a su efecto sobre la respuesta de interferon celular. De hecho, las alteraciones en otras actividades asociadas con NS1, tales como, alteracion de corte y ayuste de pre-ARNm, inhibicion de la poliadenilacion del ARNm celular, transporte nucleo citoplasmatico de ARNm que contiene poli (A), y estimulacion de smtesis de protemas virales, pueden contribuir al fenotipo atenuado deseado conseguido por la introduccion de mutaciones en el gen de NS1 del virus de la gripe porcina.
Un virus de la gripe porcina atenuado, descrito en la presente memoria, comprende una mutacion en un gen de NS1 de la gripe porcina que disminuye la capacidad del producto genico NS1 de antagonizar la respuesta de interferon celular. Un virus de la gripe porcina atenuado descrito en la presente memoria puede comprender un genoma que comprende una mutacion en un gen de NS1 del virus de la gripe porcina que disminuye la capacidad del producto genico NS1 de antagonizar una respuesta de interferon celular, y permite que el virus atenuado, a una multiplicidad de infeccion (MOI, por sus siglas en ingles) entre 0,0005 y 0,001, 0,001 y 0,01, 0,01 y 0,1, o 0,1 y 1, o una MOI de 0,0005, 0,0007, 0,001, 0,005, 0,01, 0,05, 0,1, 0,5, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, o 6,0, crezca hasta tftulos entre aproximadamente 1 a aproximadamente 100 veces, aproximadamente 5 a aproximadamente 80 veces, aproximadamente 20 a aproximadamente 80 veces, o aproximadamente 40 a aproximadamente 80 veces,
aproximadamente 1 a aproximadamente 10 veces, aproximadamente 1 a aproximadamente 5 veces,
aproximadamente 1 a aproximadamente 4 veces, aproximadamente 1 a aproximadamente 3 veces,
aproximadamente 1 a aproximadamente 2 veces, aproximadamente 3 a aproximadamente 15 veces, o
aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o 100 veces inferior que el virus de la gripe porcina de tipo silvestre en celulas (por ejemplo, celulas de un ser humano (por ejemplo, PerC6, una lmea celular productora derivada de retinoblastos embrionarios humanos transformados con la region E1 de Adenovirus5), raton, pollo (por ejemplo, fibroblastos embrionarios de pollo), rata, aves, o cerdo (por ejemplo, celulas PK(D1), celulas pK (15), celulas PK13, celulas NSK, celulas LLC-PK1, celulas LLC-PK1A, celulas ESK-4, celulas ST, celulas PT-K75, celulas PK-2a/CL 13 o SJPL)), determinados aproximadamente 2 a 10 dfas, 3 a 7 dfas , 3 a 5 dfas, o 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 dfas post infeccion cuando se propagan en las mismas condiciones. Los tftulos de virus de la gripe porcina atenuados y de tipo silvestre pueden determinarse utilizando cualquier tecnica bien conocida en la tecnica o descrita en la presente memoria (por ejemplo, ensayos de hemaglutinacion, ensayos de placa, dosis infecciosa en cultivo tisular 50 (DICT50), dosis infecciosa en huevo 50 (DIH50), etc.) y los virus pueden propagarse en condiciones descritas en la presente memoria bien conocidas en la tecnica (por ejemplo, en celulas de cerdo, celulas MDCK (por ejemplo, en MEM, suero de ternera fetal (FCS) al 10% v/v, penicilina al 1%/estreptomicina a 37 °C en una incubadora humidificada del 5% de CO2) o huevos embrionados de gallina (por ejemplo, en una incubadora estacionaria a 37 °C con humedad relativa del 55%). Como alternativa, los virus pueden propagarse en celulas (porejemplo, en celulas de cerdo, celulas MDCK, etc.) que se cultivan en medios sin suero o de suero reducido (por ejemplo, TPCK tripsina).
En un aspecto espedfico, un virus de la gripe porcina atenuado descrito en la presente memoria comprende un genoma que comprende una mutacion en un gen de NS1 de virus de la gripe porcina que disminuye la capacidad del producto genico NS1 de antagonizar una respuesta de interferon celular, y permite que el virus atenuado, a una multiplicidad de infeccion (MOI) entre 0,0005 y 0,001, 0,001 y 0,01, 0,01 y 0,1, o 0,1 y 1, o una MOI de 0,0005, 0,0007, 0,001, 0,005, 0,01, 0,05, 0,1, 0,5, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, o 6,0, crezca hasta tftulos entre aproximadamente 1 a aproximadamente 100 veces, aproximadamente 5 a aproximadamente 80 veces, aproximadamente 20 a aproximadamente 80 veces, o aproximadamente 40 a aproximadamente 80 veces,
aproximadamente 1 a aproximadamente 10 veces, aproximadamente 1 a aproximadamente 5 veces,
aproximadamente 1 a aproximadamente 4 veces, aproximadamente 1 a aproximadamente 3 veces,
aproximadamente 1 a aproximadamente 2 veces, aproximadamente 3 a aproximadamente 15 veces, o
aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o 100 veces inferior que el virus de la gripe porcina de tipo silvestre en celulas (por ejemplo, celulas de un ser humano (por ejemplo, PerC6, una lmea celular productora derivada de retinoblastos embrionarios humanos transformados con la region E1 de Adenovirus5), raton, pollo (por ejemplo, fibroblastos embrionarios de pollo), rata, aves, o cerdo (por ejemplo, celulas PK(D1), celulas pK (15), celulas PK13, celulas NSK, celulas LLC-PK1, celulas LLC-PK1A, celulas ESK-4, celulas ST, celulas PT-K75, celulas PK-2a/CL 13 o SJPL)), determinados aproximadamente 2 a 10 dfas, 3 a 7 dfas , 3 a 5 dfas, o 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 dfas post infeccion cuando se propagan en las mismas condiciones. Los tftulos de virus de la gripe porcina atenuados y de tipo silvestre pueden determinarse utilizando cualquier tecnica bien conocida en la tecnica o descrita en la presente memoria (por ejemplo, ensayos de hemaglutinacion, ensayos de placa etc.) y los virus pueden propagarse en condiciones descritas en la presente memoria bien conocidas en la tecnica (por ejemplo, en celulas de cerdo, celulas MDCK (por ejemplo, en mEm, suero de ternera fetal (FCS) al 10% v/v, penicilina al 1%/estreptomicina a 37 °C en una incubadora humidificada del 5% de CO2) o huevos embrionados de gallina (por ejemplo, en una incubadora estacionaria a 37 °C con humedad relativa del 55%).
Los virus de la gripe porcina usados de acuerdo con la presente descripcion pueden seleccionarse entre cepas de origen natural, variantes o mutantes; virus mutagenizados (por ejemplo, virus generados por exposicion a mutagenos, pases repetidos y/o pase en hospedadores no permisivos); redistribuciones; y/o virus modificados por ingeniena genetica (porejemplo, usando las tecnicas de "genetica inversa" y basadas en plasmidos sin auxiliar) que tienen el fenotipo deseado-es dear, una capacidad alterada de antagonizar la respuesta de IFN celular. Las cepas
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de origen natural, variantes o mutantes, redistribucionesy/o virus modificados por ingeniena genetica con el fenotipo antagonista de interferon deseado pueden seleccionarse en base a crecimiento diferencial en celulas (por ejemplo, celulas de un ser humano (porejemplo, PerC6, una lmea celular productora derivada de retinoblastos embrionarios humanos transformados con la region E1 de Adenovirus5), raton, pollo (por ejemplo, fibroblastos embrionarios de pollo), rata, aves, o cerdo (por ejemplo, celulas PK(D1), celulas PK (15), celulas PK13, celulas NSK, celulas LLC- PK1, celulas LLC-PK1A, celulas ESK-4, celulas ST, celulas PT-K75, celulas PK-2a/CL 13 o SJPL)) en otros ensayos descritos a continuacion. Los virus de la gripe porcina de la invencion pueden ser virus modificados por ingeniena genetica. Los virus de la gripe porcina de la invencion pueden ser cepas de origen no natural, variantes o mutantes y/o redistribuciones.
En un aspecto espedfico, un virus de la gripe porcina atenuado descrito en la presente memoria comprende un genoma que comprende una mutacion en un gen SN1 del virus de la gripe porcina que disminuye la capacidad del producto genico NS1 de antagonizar una respuesta de interferon celular, y permite que el virus atenuado, a una multiplicidad de infeccion (MOI) entre 0,0005 y 0,001, 0,001 y 0,01, 0,01 y 0,1, o 0,1 y 1, o una MOI de 0,0005, 0,0007, 0,001, 0,005, 0,01, 0,05, 0,1, 0,5, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, o 6,0, crezca hasta tttulos entre aproximadamente 1 a aproximadamente 100 veces, aproximadamente 5 a aproximadamente 80 veces, aproximadamente 20 a aproximadamente 80 veces, o aproximadamente 40 a aproximadamente 80 veces,
aproximadamente 1 a aproximadamente 10 veces, aproximadamente 1 a aproximadamente 5 veces,
aproximadamente 1 a aproximadamente 4 veces, aproximadamente 1 a aproximadamente 3 veces,
aproximadamente 1 a aproximadamente 2 veces, aproximadamente 3 a aproximadamente 15 veces, o
aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o 100 veces inferior que el virus de la gripe porcina de tipo silvestre en celulas (por ejemplo, celulas de un ser humano (por ejemplo, PerC6, una lmea celular productora derivada de retinoblastos embrionarios humanos transformados con la region E1 de Adenovirus5), raton, pollo (por ejemplo, fibroblastos embrionarios de pollo), rata, aves, o cerdo (por ejemplo, celulas PK(D1), celulas pK (15), celulas PK13, celulas NSK, celulas LLC-PK1, celulas LLC-PK1A, celulas ESK-4, celulas ST, celulas PT-K75, celulas PK-2a/CL 13 o SJPL)) determinados por un ensayo de hemaglutinacion de BALF de cerdos o sobrenadantes de celulas de cerdo aproximadamente de 2 a 10 dfas, 3 a 7 dfas , 3 a 5 dfas, o 2, 3, 5, 6, 7, 8, 9, 10 dfas post infeccion o cuando los virus se siembran en placas en celulas renales caninas Madin- Darby (MDCK). El crecimiento de un virus de la gripe porcina atenuado de la invencion puede compararse con un patron o referencia particular, por ejemplo, virus de la gripe porcina de tipo silvestre A/Porcino/Texas/4199-2/98. El virus atenuado puede modificarse por ingeniena genetica para que contenga o exprese secuencias de acido nucleico de virus de la gripe no porcina tales como, por ejemplo, un epftopo de un patogeno foraneo o un antfgeno tumoral. Preferiblemente, las secuencias de virus de la gripe no porcina no incluyen una secuencia de acido nucleico que altera el fenotipo atenuado del virus. Por consiguiente las secuencias de acido nucleico que codifican protemas, polipeptidos o peptidos con actividad antagonizante de interferon preferiblemente no se modifican por ingeniena en un virus de la gripe porcina.
En la presente memoria se describen virus de la gripe porcina atenuados que comprenden un genoma que comprende al menos dos, al menos tres, al menos cuatro o mas mutaciones en dos, tres, cuatro o mas genes del virus de la gripe porcina, donde al menos una de las mutaciones esta en el gen de NS1 y contribuye a o es responsable (directa o indirectamente) de la atenuacion del virus y/o la capacidad disminuida del virus de antagonizar una respuesta de interferon celular. En un aspecto, un virus de la gripe porcina atenuado descrito en la presente memoria comprende un genoma que comprende al menos dos, al menos tres, al menos cuatro o mas mutaciones en dos, tres, cuatro o mas genes del virus de la gripe porcina, donde al menos una de las mutaciones esta en el gen de NS1 y es responsable de la capacidad disminuida del producto genico NS1 de antagonizar una respuesta de interferon celular, y permite que el virus atenuado, a una MOI entre 0,0005 y 0,001, 0,001 y 0,01, 0,01 y 0,1, o 0,1 y 1, o una MOI de 0,0005, 0,0007, 0,001, 0,005, 0,01, 0,05, 0,1, 0,5, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5 o 6,0, crezca hasta tttulos entre aproximadamente 1 a aproximadamente 100 veces, aproximadamente 5 a aproximadamente 80 veces, aproximadamente 20 a aproximadamente 80 veces, o aproximadamente 40 a aproximadamente 80 veces, aproximadamente 1 a aproximadamente 10 veces, aproximadamente 1 a
aproximadamente 5 veces, aproximadamente 1 a aproximadamente 4 veces, aproximadamente 1 a
aproximadamente 3 veces, aproximadamente 1 a aproximadamente 2 veces, aproximadamente 3 a
aproximadamente 15 veces o aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o 100 veces inferiores que el virus de la gripe porcina de tipo silvestre en celulas (por ejemplo, celulas de un ser humano (por ejemplo, PerC6, una lmea celular productora derivada de retinoblastos embrionarios humanos transformados con la region E1 de Adenovirus 5), raton, pollo (por ejemplo, fibroblastos embrionarios de pollo), rata, aves, o cerdo (por ejemplo, celulas PK(D1), celulas pK(15), celulas PK13, celulas NSK, celulas LLC- PK1, celulas LLC-PK1A, celulas EsK-4, celulas ST, celulas PT-K75, celulas PK-2a/CL 13 o SJPL)), determinados por, por ejemplo, ensayos de hemaglutinacion, aproximadamente 2 a 10 dfas, 3 a 7 dfas, 3 a 5 dfas, o 2, 3, 5, 6, 7, 8, 9,10 dfas post-infeccion cuando los virus se propagan en las mismas condiciones.
En un aspecto espedfico, un virus de la gripe porcina atenuado descrito en la presente memoria comprende un genoma que comprende al menos dos, al menos tres, al menos cuatro o mas mutaciones en dos, tres, cuatro o mas genes del virus de la gripe porcina, donde al menos una de las mutaciones esta en el gen de NS1 y es responsable de la capacidad disminuida del producto genico NS1 de antagonizar una respuesta de interferon celular, y permite que el virus atenuado, a una mOi entre 0,0005 y 0,001, 0,001 y 0,01, 0,01 y 0,1, o 0,1 y 1, o una MOI de 0,0005,
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aproximadamente 1 a aproximadamente 100 veces, aproximadamente 5 a aproximadamente 80 veces,
aproximadamente 20 a aproximadamente 80 veces, o aproximadamente 40 a aproximadamente 80 veces, aproximadamente 1 a aproximadamente 10 veces, aproximadamente 1 a aproximadamente 5 veces,
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aproximadamente 1 a aproximadamente 2 veces, aproximadamente 3 a aproximadamente 15 veces o
aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o 100
veces inferiores que el virus de la gripe porcina de tipo silvestre en celulas de cerdo, determinados por, por ejemplo, ensayos de hemaglutinacion, aproximadamente 2 a 10 dfas, 3 a 7 dfas, 3 a 5 dfas, o 2, 3, 5, 6, 7, 8, 9, 10 dfas post- infeccion cuando los virus se propagan en las mismas condiciones (por ejemplo, en celulas MDCK). En otro aspecto, un virus de la gripe porcina atenuado descrito en la presente memoria comprende un genoma que comprende al menos dos, tres, cuatro o mas mutaciones en dos, tres, cuatro o mas genes del virus de la gripe porcina, donde al menos una de las mutaciones esta en el gen de NS1 y es responsable de la atenuacion del virus, y permite que el virus atenuado, a una MOI entre 0,0005 y 0,001, 0,001 y 0,01, 0,01 y 0,1, o 0,1 y 1, o una MOI de 0,0005, 0,0007, 0,001, 0,005, 0,01, 0,05, 0,1, 0,5, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5 o 6,0, crezca hasta tftulos entre aproximadamente 1 a aproximadamente 100 veces, aproximadamente 5 a aproximadamente 80 veces,
aproximadamente 20 a aproximadamente 80 veces, o aproximadamente 40 a aproximadamente 80 veces, aproximadamente 1 a aproximadamente 10 veces, aproximadamente 1 a aproximadamente 5 veces,
aproximadamente 1 a aproximadamente 4 veces, aproximadamente 1 a aproximadamente 3 veces,
aproximadamente 1 a aproximadamente 2 veces, aproximadamente 3 a aproximadamente 15 veces o
aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o 100
veces inferiores que el virus de la gripe porcina de tipo silvestre en celulas de cerdo, determinados por, por ejemplo, ensayos de hemaglutinacion, aproximadamente 2 a 10 dfas, 3 a 7 dfas, 3 a 5 dfas, o 2, 3, 5, 6, 7, 8, 9, 10 dfas post- infeccion cuando los virus se propagan en las mismas condiciones (por ejemplo, en celulas MDCK). DE acuerdo con estos aspectos, el virus atenuado tiene un fenotipo antagonista de interferon alterado y puede modificarse por ingeniena genetica para que contenga o exprese secuencias de acido nucleico de virus de la gripe no porcina tales como, por ejemplo, un epftopo de un patogeno foraneo (por ejemplo, epftopos del virus del smdrome reproductor y respiratorio porcino, citomegalovirus porcino, coronavirus respiratorio porcino, virus de la encefalomiocarditis porcina, diarrea epidemica porcina y determinantes antigenicos de patogenos porcinos no virales tales como bacterias incluyendo, aunque sin limitacion, Brucella suis, y parasitos incluyendo, aunque sin limitacion, ascarides (Ascaris suum), tricocefalos (Trichuris suis), o un antfgeno tumoral tal como antfgeno carcinoembrionario (CEA), antfgeno de cancer de mama tal como EGFR (receptor del factor de crecimiento epidermico), antfgeno HER2 (p185HER2), epftopo HER2, antfgeno canceroso-50 (CA-50), antfgeno canceroso 15-3 (CA15-3) asociado con cancer de mama, antfgeno asociado a carcinoma (CAA), antfgeno de melanoma, y antfgenos asociados a melanoma 100, 25, y 150). Preferiblemente, las secuencias de virus de la gripe no porcina (secuencias heterologas) no incluyen una secuencia de acido nucleico que altera el fenotipo atenuado del virus. Por consiguiente, las secuencias de acido nucleico que codifican protemas, polipeptidos o peptidos con actividad antagonizante de interferon preferiblemente no se modifican por ingeniena en el virus de la gripe porcina.
Las mutaciones en el gen de NS1 del virus de la gripe porcina comprenden (como alternativa, consisten en) cualquier mutacion que produzca el fenotipo deseado (es decir, una capacidad alterada de antagonizar una respuesta de interferon celular). Ejemplos del tipo de mutaciones que pueden incluirse en o introducirse en un gen de NS1 del virus de la gripe porcina incluyen, aunque sin limitacion, deleciones, sustituciones, inserciones y combinaciones de las mismas. Una o mas mutaciones pueden localizarse en cualquier parte en todo el gen de NS1 gene, es decir, en las regiones reguladoras, no codificantes y/o codificantes (por ejemplo, el extremo amino-terminal y/o el carboxi-terminal o cualquier parte entre ellos). En un aspecto espedfico, un virus de la gripe porcina atenuado, descrito en la presente memoria, comprende un genoma que comprende un gen de NS1 del virus de la gripe porcina con una mutacion (por ejemplo, una delecion o sustitucion) en el extremo amino-terminal. En un aspecto preferido, un virus de la gripe porcina atenuado, descrito en la presente memoria, comprende un genoma que comprende un gen de NS1 de la gripe porcina con una mutacion (por ejemplo, una delecion o sustitucion, preferiblemente una delecion) en el extremo carboxi-terminal. En otro aspecto, un virus de la gripe porcina atenuado, descrito en la presente memoria, comprende un genoma que comprende una mutacion en un gen de NS1 del virus de la gripe porcina que produce una delecion que consiste en 5, preferiblemente 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 100, 105, 110, 115, 119, 120, 121, 125, 130, 135, 140, 145, 146, 147, 148, 150, 155, 160, 165, 170 o 175 restos de aminoacido del extremo carboxi-terminal de NS1, o una delecion entre 5170, 25-170, 50-170, 100-170, 90-160, 100-160 o 105-160, 90-150, 5-75, 5-50 o 5-25 restos de aminoacido del extremo carboxi-terminal. En otro aspecto, un virus de la gripe porcina atenuado, descrito en la presente memoria, comprende un genoma que comprende una mutacion en un gen de NS1 del virus de la gripe porcina que produce una delecion de todos los restos de aminoacido del producto genico NS1 excepto los restos de aminoacido 1-126, los restos de aminoacido 1-120, los restos de aminoacido 1-115, los restos de aminoacido 1-110, los restos de aminoacido 1-100, los restos de aminoacido 1-99, los restos de aminoacido 1-95, los restos de aminoacido 1-85, los restos de aminoacido 1-80, los restos de aminoacido 1-75, los restos de aminoacido 1-73, los restos de aminoacido 1-70, los restos de aminoacido 1-65 o los restos de aminoacido 1-60, donde el aminoacido amino-terminal es el numero 1. El virus de la gripe porcina atenuado puede estar modificado por ingeniena genetica. Un virus de la gripe porcina atenuado de la descripcion es TX/98/del 126, TX/98/del 99 o TX/98/del 73.
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El virus de la gripe porcina atenuado de la presente invencion puede ser un virus quimerico que expresa una secuencia heterologa. Preferiblemente, la secuencia heterologa no es una secuencia de acido nucleico que altera el fenotipo atenuado del virus. Por consiguiente, preferiblemente, las secuencias de acido nucleico que codifican protemas, polipeptidos o peptidos con actividad antagonizante de interferon no se modifican por ingeniena en el virus de la gripe porcina. El virus quimerico puede expresar un antfgeno tumoral. El virus quimerico puede expresar un epftopo de un patogeno foraneo.
Un virus de la gripe porcina atenuado que tenga el fenotipo deseado puede usarse en sf mismo como el principio activo en formulaciones de vacuna, farmaceuticas o inmunogenicas. Como alternativa, el virus de la gripe porcina atenuado puede usarse como el vector o "estructura" de vacunas producidas de forma recombinante o formulaciones inmunogenicas. Para este fin, puede usarse la tecnica de "genetica inversa" o el enfoque de plasmido sin auxiliar para disenar mutaciones o introducir epftopos exogenos en el virus de la gripe porcina atenuado, que servina como la cepa "precursora". De este modo, pueden disenarse vacunas para inmunizacion contra variantes de cepa, o como alternativa, contra agentes infecciosos o antfgenos de enfermedad completamente diferentes (por ejemplo, antfgenos tumorales). Por ejemplo, pueden disenarse virus de la gripe porcina atenuados para que expresen epftopos neutralizantes de otras cepas preseleccionadas. Como alternativa, pueden construirse epftopos de otros virus en el virus de la gripe porcina atenuado. Como alternativa, pueden disenarse epftopos de patogenos infecciosos no virales (por ejemplo, parasitos, bacterias, hongos) en el virus de la gripe porcina.
Pueden usarse tecnicas de redistribucion para transferir el fenotipo atenuado desde una cepa precursora de virus de la gripe porcina (un mutante natural, un virus mutagenizado, o un virus modificado por ingeniena genetica) hasta una cepa de virus diferente (un virus de tipo silvestre, un mutante natural, un virus mutagenizado, o un virus modificado por ingeniena genetica). Puede usarse la "tecnica de genetica inversa" o el enfoque de plasmido sin auxiliar, para disenar mutaciones o introducir epftopos exogenos en el virus de la gripe porcina atenuado, que servina como la "cepa precursora".
En la presente memoria, se describen metodos para vacunar a sujetos, que comprenden administrar una formulacion de vacuna que comprende un virus de la gripe porcina atenuado que comprende una mutacion en un gen de NS1 de la gripe porcina que disminuye la capacidad del producto genico NS1 de antagonizar la respuesta de interferon celular, y un excipiente fisiologicamente eficaz. En un aspecto, en la presente memoria se describe un metodo que comprende administrar una cantidad eficaz de una formulacion de vacuna. En ciertos aspectos, la dosis de la formulacion de vacuna administrada es entre aproximadamente 102 a aproximadamente 108, aproximadamente 103 a aproximadamente 107, o aproximadamente 104 a aproximadamente 5x106 ufp. En otros aspectos, la dosis de la formulacion de vacuna administrada es de 102, 5 x 102, 103, 5 x 103, 104, 5 x 104, 105, 5 x 105, 106, 5 x 106, 107, 5 x 107 o 108 ufp. En aspectos espedficos, el sujeto es un burro, cebra, camello, perro, ave (por ejemplo, un pato). En un aspecto preferido, el sujeto es un cerdo.
La presente invencion proporciona formulaciones inmunogenicas que comprenden un virus de la gripe porcina atenuado de la invencion. En la presente memoria se describen metodos para inducir una respuesta inmunitaria para el tratamiento, control o prevencion de una infeccion por virus de la gripe porcina o una afeccion o smtoma asociado con la misma, una infeccion diferente a una infeccion por virus de la gripe porcina, o una afeccion o smtoma asociado con la misma, o una afeccion en que pueden usarse los virus de la gripe porcina atenuados como un vector para inducir una respuesta inmunitaria contra un antfgeno particular asociado con la afeccion, que comprende administrar a un sujeto una formulacion inmunogenica de la invencion. En un aspecto, la presente invencion se refiere a una formulacion inmunogenica para su uso en un metodo para inmunizar o inducir una respuesta inmunitaria, por ejemplo, para el tratamiento, control o prevencion de una infeccion por virus de la gripe porcina o una afeccion o smtoma asociado con la misma, que comprende administrar a un sujeto una cantidad eficaz de una formulacion inmunogenica de la invencion. La dosis de formulacion inmunogenica de la invencion a administrar a un sujeto es entre aproximadamente 102 a aproximadamente 108, aproximadamente 103 a aproximadamente 107, o aproximadamente 104 a aproximadamente 5 x 106 ufp o aproximadamente 104 a aproximadamente 107 ufp. La formulacion inmunologica a administrar a un sujeto puede tener un virus de la gripe porcina atenuado de la presente invencion en una concentracion de aproximadamente 104 a aproximadamente 107 ufp/ml. La dosis de formulacion inmunogenica de la invencion a administrar a un sujeto puede ser 102, 5 x 102, 103, 5 x 103, 104, 5 x 104, 105, 5 x 105, 106, 5 x 106, 107, 5 x 107 o 108 ufp. El sujeto es un burro, cebra, camello, perro, ave (por ejemplo, un pato), y especialmente un cerdo.
Los virus de la gripe porcina atenuados, que inducen contundentes respuestas de IFN en sujetos, tambien pueden usarse en formulaciones farmaceuticas para la profilaxis o el tratamiento de infecciones y enfermedades tratables por IFN tales como cancer. A este respecto, el tropismo del virus de la gripe porcina atenuado puede alterarse para abordar el virus en un organo, tejido o celulas diana deseadas in vivo o ex vivo. Usando este enfoque, la respuesta de IFN puede inducirse de forma local, en el sitio diana, evitando de este modo o minimizando los efectos secundarios de la terapia con IFN sistemico. Para este fin, el virus de la gripe porcina atenuado puede modificarse por ingeniena para que exprese un ligando espedfico para un receptor del organo, tejido o celulas diana.
En la presente memoria se describen metodos para prevenir, controlar o tratar una infeccion, o enfermedad tratable por IFN en un sujeto (por ejemplo, un cerdo), diferente de una infeccion por virus de la gripe porcina, o enfermedad tratable por IFN causada por virus de la gripe porcina, que comprende administrar una formulacion farmaceutica
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descrita en la presente memoria. En un aspecto, se describe en la presente memoria un metodo para prevenir, controlar o tratar una infeccion o enfermedad tratable por IFN en un sujeto, diferente de una infeccion por virus de la gripe porcina o enfermedad tratable por IFN causada por virus de la gripe porcina, que comprende administrar a un sujeto una cantidad eficaz de una formulacion farmaceutica descrita en la presente memoria. En ciertas realizaciones, la dosis de la formulacion farmaceutica a administrar al sujeto es entre aproximadamente 102 a
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aproximadamente 10 , aproximadamente 10 a aproximadamente 10 , aproximadamente 10 a aproximadamente 108, aproximadamente 103 a aproximadamente 109, aproximadamente 103 a aproximadamente 107, aproximadamente 104 a aproximadamente 108, aproximadamente 104 a aproximadamente 5 x 106, aproximadamente 104 a aproximadamente 107, o aproximadamente 104 a aproximadamente 1012 ufp. La formulacion farmaceutica a administrar al sujeto puede tener un virus de la gripe atenuado de la presente invencion a una concentracion de aproximadamente 104 a aproximadamente 1012 ufp/ml. La dosis de la formulacion farmaceutica a administrar puede ser de 102, 5 x 102, 103, 5 x 103, 104, 5 x 104, 105, 5 x 105, 106, 5 x 106, 107, 5 x 107, 108, 5 x 108, 1 x 109, 5 x 109, 1 x 1010, 5 x 1010, 1 x 1011, 5 x 1011 o 1012 ufp. El sujeto puede ser un burro, cebra, camello, perro, ave (por ejemplo, un pato), y especialmente un cerdo.
En la presente memoria se describen metodos para prevenir, controlar o tratar el cancer en un sujeto que comprende administrar una formulacion farmaceutica descrita en la presente memoria. En un aspecto, se describe en la presente memoria un metodo para prevenir, controlar o tratar el cancer en un sujeto que comprende administrar a un sujeto una cantidad eficaz de una formulacion farmaceutica descrita en la presente memoria. La formulacion farmaceutica puede comprender un virus de la gripe porcina que comprende un antigeno tumoral. La
dosis de la formulacion farmaceutica a administrar al sujeto puede ser entre aproximadamente 102 a
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aproximadamente 10
aproximadamente 102 a aproximadamente 1010 108, aproximadamente 103 a aproximadamente 109, aproximadamente aproximadamente 104 a aproximadamente 108, aproximadamente 104 a aproximadamente 5
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aproximadamente 10 a aproximadamente 10 ufp. La dosis de la formulacion farmaceutica a administrar es de 10 ,
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5 x 1011 o 1012 ufp. El sujeto puede ser un burro, cebra, camello, perro, ave (por ejemplo, un pato), y
especialmente un cerdo.
Los solicitantes han demostrado que los virus de la gripe porcina atenuados con actividad antagonista de interferon alterada se replican in vivo generando tftulos que son inferiores que los detectados con virus de la gripe porcina de tipo silvestre, pero que son suficientes para inducir respuestas inmunologicas y de citoquinas. Por tanto, las mutaciones que disminuyen pero no suprimen la actividad antagonista de IFN del virus de la gripe porcina son preferidas para formulaciones de vacuna, inmunologicas, y farmaceuticas. Dichos virus pueden seleccionarse por su crecimiento en sustratos tanto convencionales como no convencionales, y por su virulencia intermedia.
La presente invencion proporciona celulas que contienen (como alternativa, que comprenden) virus de la gripe porcina atenuados de la presente invencion. Una celula puede contener/comprender un virus de la gripe porcina que esta modificado por ingeniena genetica. El virus de la gripe porcina atenuado contenido en la celula puede modificarse para que codifique un epftopo derivado de otro patogeno (por ejemplo, otro virus) o un antfgeno tumoral. El genoma del virus de la gripe porcina atenuado puede comprender al menos un segmento derivado de un virus diferente. Cualquier celula puede infectarse con, contener o comprender un virus de la gripe porcina atenuado de la invencion incluyendo, aunque sin limitacion, celulas MDCK, celulas PK, celulas Vero, celulas endoteliales de vena umbilical humana primaria (HUVEC), lmea celular de epitelio humano H292, celulas HeLa, y celulas renales embrionarias porcinas RES. La celula puede ser una celula de cerdo o una lmea celular de cerdo. La celula (por ejemplo, una celula de cerdo o lmea celular de cerdo) puede ser deficiente en interferon.
Los virus de la gripe porcina de la invencion pueden estar contenidos en huevos embrionados de gallina 10 dfas de vida, 6 a 9 dfas de vida, 6 a 8 dfas de vida, o 6 a 7 dfas de vida. Los virus pueden estar contenidos en la cavidad alantoidea de dichos huevos. Los virus pueden estar contenidos en la cavidad amniotica de dichos huevos.
La invencion abarca el uso de sustratos tales como celulas, lmeas celulares y huevos embrionados, para propagar los virus de la gripe porcina atenuados de la invencion. En una realizacion, la invencion proporciona metodos para la produccion de vacunas. La produccion de formulaciones inmunogenicas y la produccion de agentes farmaceuticos que comprenden propagar en un sustrato un virus de la gripe porcina atenuado de la presente invencion y recoger el virus descendiente, donde el sustrato es una celula, lmea celular o huevo embrionado. En ciertas realizaciones, el sustrato es un sistema IFN-deficiente. Sistemas IFN-deficientes ejemplares incluyen, aunque sin limitacion, huevos embrionados jovenes (por ejemplo, huevos embrionados de 6 a 10 dfas de vida, 6 a 9 dfas de vida, 6 a 8 dfas de vida o 6 a 7 dfas de vida), y lmeas celulares IFN-deficientes (tales como celulas VERO o lmeas celulares modificadas por ingeniena genetica tales como knockouts STAT1). Tambien pueden usarse huevos embrionados o lmeas celulares pretratadas con compuestos que inhiben el sistema IFN (incluyendo farmacos, anticuerpos, antisentido, ribozimas, etc.) como sistema IFN-deficiente. Ademas, pueden usarse huevos deficientes en el sistema IFN, por ejemplo, huevos producidos por aves STAT1 negativas, especialmente aves de corral, incluyendo aunque sin limitacion, pollos, patos o pavos transgenicos, como sistema IFN-deficiente.
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3.1 Terminologia
Como se emplea en esta memoria, el termino "alrededor de" o "aproximadamente" cuando se usa junto con un numero se refiere a cualquier numero dentro del 1, 5 o 10% del numero referenciado.
Como se emplea en esta memoria, la expresion "amino-terminal" de NS1 se refiere a los aminoacidos desde el resto de aminoacido amino-terminal (resto de aminoacido 1) hasta el resto de aminoacido 115, los restos de aminoacido 1 a 100, los restos de aminoacido 1 a 75, los restos de aminoacido 1 a 50, los restos de aminoacido 1 a 25, o los restos de aminoacido 1 a 10 de la protema NS1 del virus de la gripe porcina.
Como se emplea en esta memoria, la expresion "carboxi-terminal" de NS1 se refiere a los restos de aminoacido 116 al resto de aminoacido carboxi-terminal, los restos de aminoacido 101 al resto de aminoacido carboxi-terminal, los restos de aminoacido 76 al resto re aminoacido carboxi-terminal, los restos de aminoacido 51 al resto de aminoacido carboxi-terminal, o los restos de aminoacido 26 al resto de aminoacido carboxi-terminal de la protema NS1 del virus de la gripe porcina, cuando el extremo amino-terminal de NS1 es los restos de aminoacido 1 al resto de aminoacido 115, los restos de aminoacido 1 a 100, los restos de aminoacido 1 a 15, los restos de aminoacido 1 a 50, o los restos de aminoacido 1 a 25, respectivamente, de la protema NS1 del virus de la gripe porcina. Las deleciones del extremo carboxi-terminal pueden incluir deleciones que consisten en 5, preferiblemente 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 73, 75, 80, 85, 90, 95, 99, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 126, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170 o 175 restos de aminoacido desde el extremo carboxi-terminal de NS1.
Como se emplea en esta memoria, la expresion "modulador del receptor de citoquinas" se refiere a un agente que modula fosforilacion de un receptor de citoquinas, la activacion de una ruta de transduccion de senales asociada con un receptor de citoquinas, y/o la expresion de una protema particular tal como una citoquina. Dicho agente puede modular directa o indirectamente la fosforilacion de un receptor de citoquinas, la activacion de una ruta de transduccion de senales asociada con un receptor de citoquinas, y/o la expresion de una protema particular tal como una citoquina. Por tanto, los ejemplos de moduladores de receptores de citoquinas incluyen, aunque sin limitacion, citoquinas, fragmentos de citoquinas, protemas de fusion, y anticuerpos que se unen de forma inmunoespedfica a un receptor de citoquinas o un fragmento del mismo. Ademas, ejemplos de moduladores de receptor de citoquinas incluyen, aunque sin limitacion, peptidos, polipeptidos (por ejemplo, receptores de citoquina soluble), protemas de fusion y anticuerpos que se unen de forma inmunoespedfica a una citoquina o a un fragmento de la misma.
Como se emplea en esta memoria, la expresion "cantidad eficaz" se refiere a la cantidad de una terapia (por ejemplo un agente profilactico o terapeutico) que es suficiente para reducir y/o mejorar la gravedad y/o duracion de una afeccion (por ejemplo, una infeccion por virus de la gripe porcina o una afeccion o smtoma asociado con la misma, otra afeccion (por ejemplo, otra infeccion vmca), una enfermedad tratable por IFN o una afeccion en la que pueden usarse virus atenuados de la gripe porcina como vector para inducir una respuesta inmunitaria contra un antfgeno particular asociado con la afeccion), prevenir el avance de una afeccion (por ejemplo, una infeccion por virus de la gripe porcina o una afeccion o smtoma asociado con la misma, otra infeccion (por ejemplo, otra infeccion vmca), una enfermedad tratable por IFN o una afeccion en que pueden usarse virus atenuados de la gripe porcina como vector para inducir una respuesta inmunitaria contra un antfgeno particular asociado con la afeccion), causar regresion de una afeccion (por ejemplo, una infeccion por virus de la gripe porcina o una afeccion o smtoma asociado con la misma, otra afeccion (por ejemplo, otra infeccion vmca), o una enfermedad tratable por IFN), prevenir la reaparicion, desarrollo, o aparicion de uno o mas smtomas asociados con una afeccion (por ejemplo, una infeccion por virus de la gripe porcina o una afeccion o smtoma asociada con la misma, otra afeccion (por ejemplo, otra infeccion vmca), o una enfermedad tratable por IFN), reducir el tftulo de virus de la gripe porcina o potenciar o mejorar el efecto o efectos profilacticos o terapeuticos de otra terapia (por ejemplo, agente profilactico o terapeutico).
Como se emplea en esta memoria, el termino "epftopos" se refiere a sitios o fragmentos de un polipeptido o protema que tienen actividad antigenica o inmunogenica en un animal, preferiblemente en un mairnfero, y lo mas preferiblemente en un cerdo. Un epftopo que tiene actividad inmunogenica es un sitio o fragmento de un polipeptido o protema que provoca una respuesta de anticuerpos en un animal. Un epftopo que tiene actividad antigenica es un sitio o fragmento de un polipeptido o protema al cual se une un anticuerpo inmunoespedficamente como se determina por cualquier metodo bien conocido para un experto en la materia, por ejemplo por inmunoensayos.
Como se emplea en esta memoria, el termino "fragmento" en el contexto de un agente proteico se refiere a un peptido o polipeptido que comprende una secuencia de aminoacidos de al menos 2 restos de aminoacido contiguos, de al menos 5 restos de aminoacido contiguos, de al menos 10 restos de aminoacido contiguos, de al menos 15 restos de aminoacido contiguos, de al menos 20 restos de aminoacido contiguos, de al menos 25 restos de aminoacido contiguos, de al menos 40 restos de aminoacido contiguos, de al menos 50 restos de aminoacido contiguos, de al menos 60 restos de aminoacido contiguos, de al menos 70 restos de aminoacido contiguos, de al menos 80 restos de aminoacido contiguos, de al menos 90 restos de aminoacido contiguos, de al menos 100 restos de aminoacido contiguos, de al menos 125 restos de aminoacido contiguos, de al menos 150 restos de aminoacido contiguos, de al menos 175 restos de aminoacido contiguos, de al menos 200 restos de aminoacido contiguos, o de al menos 250 restos de aminoacido contiguos de la secuencia de aminoacidos de un peptido, polipeptido o protema. En una realizacion, un fragmento de una protema de longitud completa retiene la actividad de la protema de longitud completa, por ejemplo, actividad antagonista de IFN. En otra realizacion, el fragmento de la protema de longitud
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completa no retiene la actividad de la protema de longitud completa, por ejemplo, actividad antagonista de IFN.
Como se emplea en esta memoria, el termino "fragmento" en el contexto de un acido nucleico se refiere a un acido nucleico que comprende una secuencia de acido nucleico de al menos 2 nucleotidos contiguos, de al menos 5 nucleotidos contiguos, de al menos 10 nucleotidos contiguos, de al menos 15 nucleotidos contiguos, de al menos 20

nucleotidos contiguos, de al menos 25 nucleotidos contiguos, de al menos 30 nucleotidos contiguos, de al menos 35

nucleotidos contiguos, de al menos 40 nucleotidos contiguos, de al menos 50 nucleotidos contiguos, de al menos 60

nucleotidos contiguos, de al menos 70 nucleotidos contiguos, de al menos 80 nucleotidos contiguos, de al menos 90
nucleotidos contiguos, de al menos 100 nucleotidos contiguos, de al menos 125 nucleotidos contiguos, de al menos 150 nucleotidos contiguos, de al menos 175 nucleotidos contiguos, de al menos 200 nucleotidos contiguos, de al menos 250 nucleotidos contiguos, de al menos 300 nucleotidos contiguos, de al menos 350 nucleotidos contiguos, o de al menos 380 nucleotidos contiguos de la secuencia de acido nucleico que codifica un peptido, polipeptido o protema. En una realizacion preferida, un fragmento de un acido nucleico codifica un peptido o polipeptido que retiene actividad de la protema de longitud completa, por ejemplo, actividad antagonista de IFN. En otra realizacion, el fragmento de la protema de longitud completa no retiene la actividad de la protema de longitud completa, por ejemplo, actividad antagonista de IFN.
Como se emplea en esta memoria, la expresion secuencia heterologa" se refiere a cualquier secuencia de acido nucleico o secuencia proteica, polipeptfdica o peptfdica que no se encuentra normalmente o esta asociada de forma natural en la naturaleza con un acido nucleico o secuencia proteica, polipeptfdica o peptfdica de interes. Por ejemplo, una "secuencia heterologa" puede referirse a una secuencia derivada de una especie diferente.
Como se emplea en esta memoria, la expresion "en combinacion" se refiere al uso de mas de una terapia (por ejemplo, mas de un agente profilactico y/o agente terapeutico). El uso de la expresion "en combinacion" no restringe el orden en que se administran las terapias (por ejemplo, agentes profilacticos y/o terapeuticos) a un sujeto con una afeccion (por ejemplo, una infeccion por virus de la gripe porcina o una afeccion o smtoma asociado con la misma, otra infeccion (por ejemplo, otra infeccion vmca) o una enfermedad tratable por IFN). Una primera terapia (por ejemplo, un primer agente profilactico o terapeutico) puede administrarse antes de (por ejemplo, 5 minutos, 15 minutos, 30 minutos, 45 minutos, 1 hora, 2 horas, 4 horas, 6 horas, 12 horas, 24 horas, 48 horas, 72 horas, 96 horas, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas, 6 semanas, 8 semanas, o 12 semanas antes), de forma concomitante con, o posterior a (por ejemplo, 5 minutos, 15 minutos, 30 minutos, 45 minutos, 1 hora, 2 horas, 4 horas, 6 horas, 12 horas, 24 horas, 48 horas, 72 horas, 96 horas, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas, 6 semanas, 8 semanas, o 12 semanas despues) la administracion de una segunda terapia (por ejemplo, un segundo agente profilactico o terapeutico) a un sujeto con una afeccion (por ejemplo, una infeccion por virus de la gripe porcina o una afeccion o smtoma asociado con la misma, otra infeccion (por ejemplo, otra afeccion vmca) o una enfermedad tratable por IFN).
Como se emplea en esta memoria, la expresion "actividad antagonista de interferon" se refiere a una protema o polipeptido, o fragmento, derivado, o analogo del mismo que reduce o inhibe la respuesta inmunitaria de interferon celular. En particular, una protema o polipeptido, o fragmento, derivado o analogo del mismo (por ejemplo, NS1 del virus de la gripe porcina) que tiene actividad antagonista de interferon reduce o inhibe la expresion y/o actividad de interferon. En una realizacion espedfica, la expresion "actividad antagonista de interferon" se refiere a una protema o polipeptido del virus de la gripe porcina, o fragmento, derivado, o analogo del mismo que reduce o inhibe la respuesta inmunitaria de interferon celular. Una protema o polipeptido del virus de la gripe porcina con actividad antagonista de interferon puede afectar de forma preferente a la expresion y/o actividad de uno o dos tipos de interferon (IFN). En una realizacion, esta afectada la expresion y/o actividad de IFN-a. En otra realizacion, esta afectada la expresion y/o actividad de IFN-p. En una realizacion, esta afectada la expresion y/o actividad de IFN-y. En ciertas realizaciones, la expresion y/o actividad de IFN-p y/o IFN-y se reduce en un 5-10%, 10-20%, 20-30%, 3040%, 40-50%, 50-60%, 60-70%, 70-80%, 80-90% o mas por la protema, polipeptido, etc. con una actividad antagonista de interferon en comparacion con un control (por ejemplo, PBS o una protema sin actividad antagonista de interferon) en sistemas IFN competentes, por ejemplo, una celula de tipo silvestre o animal en las mismas condiciones. En ciertas realizaciones, la expresion y/o actividad de IFN-p y/o IFN-y se reduce en aproximadamente 1 a aproximadamente 100 veces, en aproximadamente 5 a aproximadamente 80 veces, en aproximadamente 20 a aproximadamente 80 veces, en aproximadamente 1 a aproximadamente 10 veces, o en aproximadamente 1 a aproximadamente 5 veces, o en aproximadamente 40 a aproximadamente 80 veces, o 1, 2, 3, 4, 5, 7, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o 100 veces por la protema, polipeptido, etc. con una actividad antagonista de interferon en comparacion con un control (por ejemplo, PBS o una protema sin actividad antagonista de interferon) en sistemas IFN competentes en las mismas condiciones.
Como se emplea en esta memoria, las expresiones "sistemas IFN deficientes" o "sustratos IFN deficientes" se refieren a sistemas, por ejemplo, celulas, lmeas celulas y animales, tales como cerdos, ratones, pollos, pavos, conejos, ratas, etc., que no producen IFN o producen niveles bajos de IFN (es decir, una reduccion en la expresion de IFN de un 5-10%, 10-20%, 20-30%, 30-40%, 40-50%, 50-60%, 60-70%, 70-80%, 80-90% o mas en comparacion con sistemas IFN competentes en las mismas condiciones), no responden o responden de forma menos eficaz a IFN, y/o son deficientes en la actividad de uno o mas genes antivirales inducidos por OFN.
Como se emplea en esta memoria, la expresion "fenotipo inductor de IFN" se refiere a un fenotipo por el cual un
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virus muestra una respuesta aumentada de interferon celular en comparacion con un virus de tipo silvestre, que tipicamente inhibe o reduce las respuestas celulares mediadas por interferon.
Como se emplea en esta memoria, las expresiones "trastornos tratables por IFN", "enfermedades tratables por IFN" y expresiones analogas se refieren a afecciones que se pueden prevenir, tratar, controlar o mejorar mediante la administracion de IFN, ya sea IFN-a, p, y o cualquier combinacion de los mismos. Los trastornos tratables por IFN no tienen que estar limitados a cerdos, si el virus de la gripe porcina infecta a otras especies. Ejemplos de trastornos tratables por IFN en cerdos incluyen, aunque sin limitacion, enfermedad de la fiebre aftosa, neumoma Haemophilus porcina (PHP, y otros trastornos causados por infeccion con, por ejemplo, infeccion por A. pleuropneumoniae, P. haemolytica, P. multocida, H. somnus y A. suis).
Como se emplea en esta memoria, la expresion fenotipo "intermedio" con respecto a actividad antagonista de IFN se refiere a un fenotipo que puede estimular una contundente respuesta inmunitaria, estando atenuada al mismo tiempo porque los virus con un fenotipo intermedio no pueden superar la respuesta de IFN del hospedador. En particular, un fenotipo intermedio puede estimular una respuesta inmunitaria e inhibir/reducir IFN solamente al grado en que permite menos rondas de replicacion del virus o menos cantidades de partmulas virales que se producen en comparacion con el virus de tipo silvestre, como se determina por tecnicas bien conocidas en la tecnica (por ejemplo, como se mide por tttulos en placas inferiores o ensayos de hemaglutinacion).
Como se emplea en esta memoria, el termino "asilado", en el contexto de virus, se refiere a un virus que se obtiene de un unico virus precursor. Un virus puede aislarse usando metodos rutinarios conocidos para los expertos en la materia incluyendo, aunque sin limitacion, los basados en purificacion de placa y dilucion limitante.
Como se emplea en esta memoria, los terminos "tratar", "tratamiento", y "controlar" ser refieren a los efectos beneficiosos que un sujeto obtiene de una terapia (por ejemplo, un agente profilactico o terapeutico), que no provoca cura de la enfermedad. En ciertas realizaciones, a un sujeto se administra una o mas terapias (por ejemplo, uno o mas agentes profilacticos o terapeuticos) para "tratar" una enfermedad para prevenir la progresion o empeoramiento de la enfermedad.
Como se emplea en esta memoria, la expresion "multiplicidad de infeccion" o "MOI" es la cantidad promedio de virus por celula infectada. La MOI se determina dividiendo la cantidad de virus anadida (ml anadido por UFP) por el numero de celulas anadidas (ml anadido x celulas/ml).
Como se emplea en esta memoria, la expresion "virus de la gripe no porcina" en el contexto de virus de la gripe no porcina que contienen o que comprenden secuencias de virus de la gripe no porcina se refiere a cualquier cepa o aislado de virus de la gripe que comprende una secuencia (por ejemplo, un acido nucleico o secuencia de aminoacidos) heterologa al virus de la gripe porcina, es decir, la secuencia no se encuentra de forma natural en asociacion con el virus de la gripe porcina.
Como se emplea en esta memoria, la expresion "gen NS1" se refiere al gen que codifica la protema no estructural (NS1) en gripe. NS1 es una de las ocho moleculas codificadas por el genoma segmentado de gripe A y otros virus. Un "gen de NS1 de virus de la gripe porcina" es un gen de NS1 aislado de un virus de la gripe porcina. Los genes NS1 porcinos representativos pueden encontrarse en bases de datos publicas de secuencias tales como GenBank e incluyen, aunque sin limitacion, el numero de acceso a GenBank AJ293939 (A/porcino/Italia/13962/95(H3N2)) y numero de acceso a Genbank AJ344041 (A/porcino/Cotes d'Armor/1121/00(HlNl)). Un "producto genico NS1" se refiere a un producto genico (por ejemplo, un ARN o protema) codificado por un gen NS1. En el caso de una protema, el producto genico NSl es de longitud completa y tiene actividad NS1 de tipo silvestre (por ejemplo, de Gripe A/porcino/Texas/4199-2/98). Un "producto genico NS1 de virus de la gripe porcina" se refiere a un producto genico (por ejemplo, un ARN o protema) codificado por un gen de NS1 de virus de la gripe porcina. En el caso de una protema, el producto genico NS1 de virus de la gripe porcina es de longitud completa y tiene actividad NS1 de virus de la gripe porcina de tipo silvestre, por ejemplo, Gripe A/porcino/Texas/4199-2/98.
Como se emplea en esta memoria, los terminos "prevenir", "que previene" y "prevencion" se refieren a la inhibicion del desarrollo o aparicion de una afeccion (por ejemplo, una infeccion por virus de la gripe porcina o una afeccion asociada con la misma, una infeccion diferente a una infeccion por virus de la gripe porcina o una afeccion asociada con la misma, una enfermedad tratable por IFN o una afeccion en que puede usarse los virus de la gripe porcina atenuados como vector para inducir una respuesta inmunitaria contra un antfgeno particular asociado con la afeccion), o la prevencion de la reaparicion, aparicion, o desarrollo de uno o mas smtomas de una afeccion (por ejemplo, una infeccion por virus de la gripe porcina o una afeccion asociada con la misma, una infeccion diferente a una infeccion por virus de la gripe porcina o una afeccion asociada con la misma, o una enfermedad tratable por IFN), en un sujeto resultante de la administracion de una terapia (por ejemplo, un agente profilactico o terapeutico), o la administracion de una combinacion de terapias (por ejemplo, una combinacion de agentes profilacticos o terapeuticos).
Como se emplea en esta memoria, las expresiones "agente profilactico" y "agentes profilacticos" se refieren a cualquier agente o agentes que pueden usarse en la prevencion de una afeccion o un smtoma de la misma (por ejemplo, una infeccion por virus de la gripe porcina o una afeccion asociada con la misma, una infeccion diferente a
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una infeccion por virus de la gripe porcina o una afeccion o smtoma asociada con la misma, una enfermedad tratable por IFN o una afeccion en que pueden usarse los virus de la gripe porcina atenuados como un vector para inducir una respuesta inmunitaria contra un antigeno particular asociado con la afeccion). Preferiblemente, un agente profilactico es un agente que se sabe que es util para o se ha usado o se esta usando actualmente para prevenir o impedir la aparicion, desarrollo, progresion y/o gravedad de una infeccion por virus de la gripe porcina o una afeccion o smtoma asociado con la misma, una infeccion diferente a una infeccion por virus de la gripe porcina o una afeccion o smtoma asociado con la misma, una enfermedad tratable por IFN o una afeccion en que pueden usarse los virus de la gripe porcina atenuados como un vector para inducir una respuesta inmunitaria contra un antfgeno particular asociado con la afeccion.
Como se emplea en esta memoria, la expresion "cantidad profilacticamente eficaz" se refiere a la cantidad de una terapia (por ejemplo, agente profilactico) que es suficiente para provocar la prevencion del desarrollo, reaparicion, o aparicion de una afeccion o un smtoma de la misma (por ejemplo, una infeccion por virus de la gripe porcina o una afeccion asociada con la misma, una infeccion diferente a una infeccion por virus de la gripe porcina o una afeccion o smtoma asociada con la misma, una enfermedad tratable por IFN o una afeccion en que pueden usarse los virus de la gripe porcina atenuados como un vector para inducir una respuesta inmunitaria contra un antfgeno particular asociado con la afeccion) o para potenciar o mejorar el efecto o efectos profilacticos de otra terapia (por ejemplo, un agente profilactico).
Como se emplea en esta memoria, el termino "purificado" en el contexto de virus se refiere a un virus que esta sustancialmente libre de material celular y medio de cultivo de la fuente celular o tisular de la cual se deriva el virus. La expresion "sustancialmente libre de material celular" incluye preparaciones de virus en que el virus esta separado de componentes celulares de las celulas de las cuales se afsla o produce de forma recombinante. Por tanto, un virus que esta sustancialmente libre de material celular incluye preparaciones de protema que tienen menos de aproximadamente el 30%, 20%, 10%, o 5% (en peso seco) de protemas celulares (tambien mencionadas en esta memoria como "protemas contaminantes"). El virus tambien esta sustancialmente libre de medio de cultivo, es decir, el medio de cultivo representa menos de aproximadamente el 20%, 10%, o 5% del volumen de la preparacion de virus. Un virus puede purificarse usando metodos rutinarios conocidos para los expertos en la materia incluyendo, aunque sin limitacion, cromatograffa y centrifugacion.
Como se emplea en esta memoria, los terminos "sujeto" o "paciente" se usan de forma intercambiable. Como se
emplea en esta memoria, los terminos "sujeto" y "sujetos" se refieren a un animal (por ejemplo, aves, reptiles, y
marnfferos), preferiblemente un mairnfero incluyendo un no primate (por ejemplo, un camello, burro, cebra, vaca, cerdo, caballo, gato, perro, rata, y raton) y un primate (por ejemplo, un mono, chimpance, y un ser humano). El sujeto o paciente puede tener una infeccion por virus de la gripe porcina. El mam^era puede tener de 0 a 6 meses de edad, de 6 a l2 meses de edad, de 1 a 5 anos de edad, de 5 a 10 anos de edad, de 10 a 15 anos de edad, de 15 a 20 anos de edad, de 20 a 25 anos de edad, de 25 a 30 anos de edad, de 30 a 35 anos de edad, de 35 a 40 anos de edad, de 40 a 45 anos de edad, de 45 a 50 anos de edad, de 50 a 55 anos de edad, de 55 a 60 anos de edad, de 60 a 65 anos de edad, de 65 a 70 anos de edad, de 70 a 75 anos de edad, de 75 a 80 anos de edad, de 80 a 85 anos de edad, de 85 a 90 anos de edad, de 90 a 95 anos de edad o de 95 a 100. El sujeto o paciente puede ser un cerdo. El cerdo puede ser de 0 a 6 meses de edad, de 6 a 12 meses de edad, de 1 a 5 anos de edad, de 5 a 10
anos de edad o de 10 a 15 anos de edad. La longevidad natural de un cerdo es de 10-15 anos.
Como se emplea en esta memoria, "virus de la gripe porcina" se refiere a un virus de la gripe tipo A o tipo C de la familia Orthomyxovirus que causa gripe porcina. Aunque los Orthomyxovirus tienen tres grupos: tipo A, tipo B y tipo C, solamente los virus de la gripe tipo A y tipo C infectan a los cerdos. Los subtipos de virus de la gripe porcina incluyen H1N1, H1N2, H3N2, y H3N1. H9N2 yH5N1 tambien pueden encontrarse en cerdos. Un virus de la gripe porcina puede ser un virus de la gripe que se ha aislado de cerdos. Un virus de la gripe porcina puede contener un gen de NS1 porcino. Los genes NS1 porcinos representativos pueden encontrarse en bases de datos publicas de secuencias tales como GenBank, e incluyen, aunque sin limitacion, el numero de acceso a GenBank No. AJ293939 (A/porcino/Italia/13962/95(H3N2)) y numero de acceso a GenBank AJ344041 (A/porcino/Cotes d'Armor/1121/00(H1N1)). Ejemplos de variantes de virus de la gripe porcina incluyen, aunque sin limitacion, A/Porcino/Colorado/1/77, A/Porcino/Colorado/23619/99, A/Porcino/Cote d'Armor/3633/84, A/Porcino/Cote d'Armor/ 3633/84, A/Porcino/Inglaterra/195852/92, A/Porcino/Finisterre/2899/82, A/Porcino/Hong Kong/10/98, A/Porcino/Hong Kong/9/98, A/Porcino/Hong Kong/81/78, A/Porcino/Illinois/100084/01, A/Porcino/Illinois/100085A/01, A/Porcino/Illinois/21587/99, A/Porcino/Indiana/1726/88, A/Porcino/Indiana/9K035/99, A/Porcino/Indiana/P12439/00, A/Porcino/Iowa/30, A/Porcino/Iowa/15/30, A/Porcino/Iowa/533/99, A/Porcino/Iowa/569/99, A/Porcino/Iowa/3421/90, A/Porcino/Iowa/8548-1/98, A/Porcino/Iowa/930/01, A/Porcino/Iowa/17672/88, A/Porcino/Italia/1513-1/98, A/Porcino/Italia/1523/98, A/Porcino/Corea/CY02/02, A/Porcino/Minnesota/55551/00, A/Porcino/Minnesota/593/99, A/Porcino/Minnesota/9088-2/98, A/Porcino/Nebraska/1/92, A/Porcino/Nebraska/209/98, A/Porcino/Pafses Bajos/12/85, A/Porcino/Carolina del Norte/16497/99, A/Porcino/Carolina del Norte/35922/98, A/Porcino/Carolina del Norte/93523/01, A/Porcino/Carolina del Norte/98225/01, A/Porcino/Oedenrode/7C/96, A/Porcino/Ohio/891/01, A/Porcino/Oklahoma/18717/99, A/Porcino/Oklahoma/18089/99, A/Porcino/Ontario/01911-1/99, A/Porcino/Ontario/ 01911-2/99, A/porcino/Ontario/41848/97, A/Porcino/Ontario/97, A/Porcino/Quebec/192/81, A/Porcino/Quebec/ 192/91, A/Porcino/Quebec/5393/91, A/Porcino/Taiwan/7310/70, A/Porcino/Tennessee/24/77, A/Porcino/Texas/ 41992/98, A/Porcino/Wisconsin/125/97, A/Porcino/Wisconsin/136/97, A/Porcino/Wisconsin/163/97, A/Porcino/Wisconsin/164/97, A/Porcino/Wisconsin/166/97, A/Porcino/Wisconsin/168/97,
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A/Porcino/Wisconsin/235/97, A/Porcino/Wisconsin/238/97, A/Porcino/Wisconsin/457/98, A/Porcino/Wisconsin/ 458/98, A/Porcino/Wisconsin/464/98 y A/Porcino/Wisconsin/14094/99.
Como se emplea en esta memoria, el termino "sinergico" se refiere a una combinacion de terapias (por ejemplo, agentes profilacticos o terapeuticos) que es mas eficaz que los efectos aditivos de dos terapias individuales cualesquiera o mas (por ejemplo, uno o mas agentes profilacticos o terapeuticos). Un efecto sinergico de una combinacion de terapias (por ejemplo, una combinacion de agentes profilacticos o terapeuticos) permite el uso de dosificaciones inferiores de una o mas terapias (por ejemplo, uno o mas agentes profilacticos o terapeuticos) y/o administracion menos frecuentes de dichas terapias a un sujeto con una afeccion (por ejemplo, una infeccion por virus de la gripe porcina o una afeccion o smtomas asociada con la misma, una infeccion diferente a una infeccion por virus de la gripe porcina o una afeccion o smtoma asociada con la misma, una enfermedad tratable por IFN o una afeccion en que pueden usarse los virus de la gripe porcina atenuados como un vector para inducir una respuesta inmunitaria contra un antfgeno particular asociado con la afeccion). La capacidad de utilizar dosificaciones inferiores de terapias (por ejemplo, agentes profilacticos o terapeuticos) y/o de administrar dichas terapias de forma menos frecuente reduce la toxicidad asociada con la administracion de dichas terapias a un sujeto sin reducir la eficacia de dichas terapias en la prevencion o tratamiento de una afeccion (por ejemplo, una infeccion por virus de la gripe porcina o una afeccion o smtoma asociada con la misma, una infeccion diferente a una infeccion por virus de la gripe porcina o una afeccion o smtoma asociada con la misma, una enfermedad tratable por IFN o una afeccion en que pueden usarse los virus de la gripe porcina atenuados como un vector para inducir una respuesta inmunitaria contra un antfgeno particular asociado con la afeccion). Ademas, un efecto sinergico puede producir eficacia mejorada de terapias (por ejemplo, agentes profilacticos o terapeuticos) en la prevencion o tratamiento de una afeccion (por ejemplo, una infeccion por virus de la gripe porcina o una afeccion o smtoma asociada con la misma, una infeccion diferente a una infeccion por virus de la gripe porcina o una afeccion o smtoma asociada con la misma, una enfermedad tratable por IFN o una afeccion en que pueden usarse los virus de la gripe porcina atenuados como un vector para inducir una respuesta inmunitaria contra un antfgeno particular asociado con la afeccion). Finalmente, un efecto sinergico de una combinacion de terapias (por ejemplo, agentes profilacticos o terapeuticos) puede evitar o reducir efectos secundarios adversos o indeseados asociados con el uso de cualquier terapia individual.
Como se emplea en esta memoria, la expresion "modulador de receptor de celulas T" se refiere a un agente que modula la fosforilacion de un receptor de celulas T, la activacion de una ruta de transduccion de senales asociada con un receptor de celulas T y/o la expresion de una protema particular tal como una citoquina. Dicho agente puede modular de forma directa o indirecta la fosforilacion de un receptor de celulas T, la activacion de una ruta de transduccion de senales asociada con un receptor de celulas T, y/o la expresion de una protema particular tal como una citoquina. Ejemplos de moduladores de receptores de celulas T incluyen, aunque sin limitacion, peptidos, polipeptidos, protemas, protemas de fusion y anticuerpos que se unen de forma inmunoespedfica a un receptor de celulas T o un fragmento del mismo. Ademas, ejemplos de moduladores de receptores de celulas T incluyen, aunque sin limitacion, protemas, peptidos, polipeptidos (por ejemplo, receptores de celulas T solubles), protemas de fusion y anticuerpos que se unen de forma inmunoespedfica a un ligando para un receptor de celulas T o un fragmento del mismo.
Como se emplea en esta memoria, la expresion "cantidad terapeuticamente eficaz" se refiere a la cantidad de una terapia, que es suficiente para reducir la gravedad de una afeccion (por ejemplo, una infeccion por virus de la gripe porcina o una afeccion o asociada con la misma (por ejemplo, abortos, depresion, inapetencia, anorexia, disnea, mialgia, o ganglios linfaticos submandibulares agrandados inducidos por gripe), una infeccion diferente a una infeccion por virus de la gripe porcina o una afeccion o smtoma asociado con la misma, una enfermedad tratable por IFN o una afeccion en que pueden usarse los virus de la gripe porcina atenuados como un vector para inducir una respuesta inmunitaria contra un antfgeno particular asociado con la afeccion), reducir la duracion de una afeccion (por ejemplo, infeccion por virus de la gripe porcina o una afeccion asociada con la misma, una infeccion diferente a una infeccion por virus de la gripe porcina o una afeccion o smtoma asociado con la misma, una enfermedad tratable por IFN o una afeccion en que pueden usarse los virus de la gripe porcina atenuados como un vector para inducir una respuesta inmunitaria contra un antfgeno particular asociado con la afeccion), reducir el tttulo de virus de la gripe porcina u otro virus, reducir la cantidad de otros patogenos, mejorar uno o mas smtomas de una afeccion (por ejemplo, una infeccion por virus de la gripe porcina o una afeccion asociada con la misma, una infeccion diferente a una infeccion por virus de la gripe porcina o una afeccion o smtoma asociado con la misma, una enfermedad tratable por IFN o una afeccion en que pueden usarse los virus de la gripe porcina atenuados como un vector para inducir una respuesta inmunitaria contra un antfgeno particular asociado con la afeccion), prevenir el avance de una infeccion (por ejemplo, infeccion por virus de la gripe porcina o una afeccion asociada con la misma, una infeccion diferente a una infeccion por virus de la gripe porcina o una afeccion o smtoma asociado con la misma, una enfermedad tratable por IFN o una afeccion en que pueden usarse los virus de la gripe porcina atenuados como un vector para inducir una respuesta inmunitaria contra un antfgeno particular asociado con la afeccion), causar regresion de una afeccion (por ejemplo, infeccion por virus de la gripe porcina o una afeccion asociada con la misma, una infeccion diferente a una infeccion por virus de la gripe porcina o una afeccion o smtoma asociado con la misma, una enfermedad tratable por IFN o una afeccion en que pueden usarse los virus de la gripe porcina atenuados como un vector para inducir una respuesta inmunitaria contra un antfgeno particular asociado con la afeccion), o potenciar o mejorar el efecto o efectos terapeuticos de otra terapia.
Como se emplea en esta memoria, los terminos "terapias" y "terapia" pueden referirse a cualquier protocolo o
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protocolos, metodo o metodos, composiciones, formulaciones, y/o agente o agentes que pueden usarse en la prevencion, tratamiento, control, o mejora de una afeccion (por ejemplo, infeccion por virus de la gripe porcina o una afeccion o smtoma asociado con la misma, una infeccion diferente a una infeccion por virus de la gripe porcina o una afeccion o smtoma asociado con la misma, una enfermedad tratable por IFN o una afeccion en que pueden usarse los virus de la gripe porcina atenuados como un vector para inducir una respuesta inmunitaria contra un antigeno particular asociado con la afeccion). En ciertas realizaciones, los terminos "terapias" y "terapia" se refieren a terapia biologica, terapia de apoyo, y/u otras terapias utiles en tratamiento, control, prevencion, o mejora de una infeccion por virus de la gripe porcina o una afeccion o smtoma asociado con la misma, una afeccion diferente a una infeccion por virus de la gripe porcina o una afeccion o smtoma asociado con la misma, una enfermedad tratable por IFN o una afeccion en que pueden usarse los virus de la gripe porcina atenuados como un vector para inducir una respuesta inmunitaria contra un antfgeno particular asociado con la afeccion, conocidas para los expertos en la materia.
Como se emplea en esta memoria, las expresiones "agente terapeutico" y "agentes terapeuticos" se refieren a cualquier agente o agentes que pueden usarse en la prevencion, tratamiento, control, o mejora de una afeccion o un smtoma de la misma (por ejemplo, infeccion por gripe porcina o una afeccion o smtoma asociado con la misma, una infeccion diferente a una infeccion por virus de la gripe porcina o una afeccion o smtoma asociado con la misma, una enfermedad tratable por IFN o una afeccion en que pueden usarse los virus de la gripe porcina atenuados como un vector para inducir una respuesta inmunitaria contra un antfgeno particular asociado con la afeccion). Preferiblemente, un agente terapeutico es un agente que se sabe que es util para, o se ha usado o se esta usando actualmente para la prevencion, tratamiento, control, o mejora de una infeccion por virus de la gripe porcina o una afeccion o smtomas asociados con la misma, una infeccion diferente a una infeccion por virus de la gripe porcina o una afeccion o smtoma asociado con la misma, una enfermedad tratable por IFN o una afeccion en que pueden usarse los virus de la gripe porcina atenuados como un vector para inducir una respuesta inmunitaria contra un antfgeno particular asociado con la afeccion.
Como se emplea en esta memoria, los terminos "tratar", "tratamiento", y "que trata" se refieren a la erradicacion o control de la replicacion del virus de la gripe porcina o la replicacion de un patogeno (por ejemplo, un virus) diferente al virus de la gripe porcina, la reduccion en el tttulo del virus de la gripe porcina o virus diferente al virus de la gripe porcina, la reduccion en las cantidades de un patogeno, la reduccion o mejora de la progresion, gravedad, y/o duracion de una afeccion (por ejemplo, una infeccion por virus de la gripe porcina o una afeccion asociada con la misma, una infeccion diferente a una infeccion por virus de la gripe porcina o una afeccion o smtoma asociado con la misma, una enfermedad tratable por IFN o una afeccion en que pueden usarse los virus de la gripe porcina atenuados como un vector para inducir una respuesta inmunitaria contra un antfgeno particular asociado con la afeccion), o la mejora de uno o mas smtomas como resultado de la administracion de una o mas terapias (incluyendo, aunque sin limitacion, la administracion de uno o mas agentes profilacticos o terapeuticos).
La expresion "antfgeno tumoral" como se emplea en esta memoria se refiere a una molecula en una celula tumoral que puede reconocerse espedficamente por celulas T inmunitarias o anticuerpos. Un antfgeno tumoral incluye antfgenos presentes solamente en celulas tumorales (antfgenos espedficos de tumor) asf como aquellos presentes en celulas normales pero expresados, de forma preferente o aberrante, en celulas tumorales (antfgenos asociados a tumor). Los ejemplos de antfgenos tumorales incluyen, aunque sin limitacion, antfgenos de sarcoidosis, cancer de prostata, fibrosarcoma, antfgenos de auto-diferenciacion tales como oncofetal, o diferenciacion, antfgenos que se expresan por celulas malignas, incluyendo aunque sin limitacion, antfgenos oncofetales tales como antfgenos carcinoembrionarios (CEA) del colon, alfa-fetoprotema, la contraparte antigenica o equivalente funcional humano del antfgeno murino de 175 kDa de carcinomas de vejiga de celulas transicionales, el antfgeno p97 o GD3 asociado a melanoma, y antfgenos de diferenciacion de carcinomas pulmonares humanos tales como L6 y L20.
Como se emplea en esta memoria, la expresion "virus de la gripe porcina de tipo silvestre" se refiere a los tipos de un virus porcino que son prevalentes, de circulacion natural y producen brotes tfpicos de enfermedad. Ejemplos de virus de la gripe porcina de tipo silvestre incluyen, aunque sin limitacion, A/Porcino/Colorado/1/77, A/Porcino/Colorado/236l9/99, A/Porcino/Cote d'Armor/3633/84, A/Porcino/Cote d'Armor/ 3633/84, A/Porcino/Inglaterra/195852/92, A/Porcino/Finisterre/2899/82, A/Porcino/Hong Kong/10/98, A/Porcino/Hong Kong/9/98, A/Porcino/Hong Kong/81/78, A/Porcino/Illinois/100084/01, A/Porcino/Illinois/100085A/01, A/Porcino/Illinois/21587/99, A/Porcino/Indiana/1726/88, A/Porcino/Indiana/9K035/99, A/Porcino/Indiana/P12439/00, A/Porcino/Iowa/30, A/Porcino/Iowa/15/30, A/Porcino/Iowa/533/99, A/Porcino/Iowa/569/99, A/Porcino/Iowa/3421/90, A/Porcino/Iowa/8548-1/98, A/Porcino/Iowa/930/01, A/Porcino/Iowa/17672/88, A/Porcino/Italia/1513-1/98, A/Porcino/Italia/1523/98, A/Porcino/Corea/CY02/02, A/Porcino/Minnesota/55551/00, A/Porcino/Minnesota/593/99, A/Porcino/Minnesota/9088-2/98, A/Porcino/Nebraska/1/92, A/Porcino/Nebraska/209/98, A/Porcino/Pafses Bajos/12/85, A/Porcino/Carolina del Norte/16497/99, A/Porcino/Carolina del Norte/35922/98, A/Porcino/Carolina del Norte/93523/01, A/Porcino/Carolina del Norte/98225/01, A/Porcino/Oedenrode/7C/96, A/Porcino/Ohio/891/01, A/Porcino/Oklahoma/18717/99, A/Porcino/Oklahoma/18089/99, A/Porcino/Ontario/01911-1/99, A/Porcino/Ontario/ 01911-2/99, A/porcino/Ontario/41848/97, A/Porcino/Ontario/97, A/Porcino/Quebec/192/81, A/Porcino/Quebec/ 192/91, A/Porcino/Quebec/5393/91, A/Porcino/Taiwan/7310/70, A/Porcino/Tennessee/24/77, A/Porcino/Texas/ 41992/98, A/Porcino/Wisconsin/125/97, A/Porcino/Wisconsin/136/97, A/Porcino/Wisconsin/163/97, A/Porcino/Wisconsin/164/97, A/Porcino/Wisconsin/166/97, A/Porcino/Wisconsin/168/97,
A/Porcino/Wisconsin/235/97, A/Porcino/Wisconsin/238/97, A/Porcino/Wisconsin/457/98, A/Porcino/Wisconsin/
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458/98, A/Porcino/Wisconsin/464/98 y A/Porcino/Wisconsin/14094/99.
4. Descripcion de las figuras
Figuras 1A-1B. Generacion de virus de la gripe Sw/Tx/98 derivados de plasmido con proteinas mutadas NS1.
La Figura 1A representa un diagrama esquematico de los segmentos genicos de NS de gripe de tipo silvestre y mutada. El segmento genico NS se modifico para crear genes NS1 mutados que codifican 73, 99 y 126 aa, respectivamente. Las mutaciones de NS1 no afectaron a la secuencia de la protema NEP. Las secuencias subrayadas se introdujeron para generar codones de parada (en negrita). La Figura 1B representa el analisis de RT- PCR de los virus mutantes de delecion rWT y NS1. Los segmentos de ARN viral de gripe se amplificaron usando cebadores espedficos para las regiones no codificantes de los 8 segmentos virales de gripe. Las flechas indican el tamano decreciente del segmento NS. Los puntos indican un producto correspondiente al extremo 3' del segmento genico HA debido a la union interna del cebador directo.
Figuras 2A-2D. Caracterizacion de virus Sw/TX/98 de tipo silvestre y NS1 mutantes derivados de plasmido en cultivo tisular. La Figura 2A muestra curvas de crecimiento multi-ciclo de mutantes de tipo silvestre y de delecion NS1 en celulas PK-15. La Figura 2B muestra curvas de crecimiento de un unico ciclo de mutantes de tipo silvestre y de delecion NS1 en celulas PK-15. La Figura 2C muestra el tamano de placas en celulas MDCK a los 3 dfas post infeccion. La Figura 2D muestra un curso de tiempo de la expresion de proteinas virales. Las celulas PK-15 se infectaron con virus mutantes rWT y NS1 (MOI=2) y marcados con [35S]Met-Cys a los tiempos indicados p.i. Los extractos celulares se sometieron a SDS-PAGE y se analizaron por auiorradiograffa.
Figuras 3A-3C. Induccion de IFN tipo I en celulas PK-15 infectadas con virus Sw/TX/98 de tipo silvestre y mutantes NS1 derivados de plasmido. La Figura 3A muestra una representacion esquematica de los niveles de IFN en bioensayo de IFN secretados por celulas infectadas por virus en un ensayo fluorescente. La Figura 3B muestra un curso de tiempo de la smtesis de IFN tipo I. Se trataron celulas PK-15 recientes durante 24 horas con sobrenadantes inactivados por UV (recogidos a diferentes tiempos p.i.) de celulas PK-15 que se infectaron con los virus indicados, seguido por infeccion por VSV-GFP. Dieciseis horas post infeccion, las celulas que expresan GFP se visualizaron por microscopia de fluorescencia. La Figura 3C muestra un analisis RT-PCR de ARNm de TNF-a, IFN-p y espedficos de actina-p en celulas PK-15 infectadas con virus.
Figuras 4A-4C. Infeccion de cerdos de 4 semanas de edad con virus Sw/TX/98 de tipo silvestre y mutantes NS1 derivados de plasmido. La Figura 4A muestra un diagrama de barras que representa los valores histopatologicos de pulmones de cerdos infectados con virus de delecion TX/98 derivados de plasmido. Porcentaje medio (±ETM) de la superficie pulmonar con lesiones macroscopicas en el dfa 5 p.i. La Figura 4B muestra lesiones microscopicas en los bronquiolos medios en el dfa 5 p.i. La Figura 4C muestra los tttulos de virus en el fluido de lavado broncoalveolar en el dfa 5 p.i.
Figuras 5A-5D. Examen histopatologico de pulmones de cerdos infectados con virus Sw/TX/98 de tipo silvestre y mutantes NS1 derivados de plasmido, aumento 200x. La Figura 5A muestra los bronquiolos de tamano medio del pulmon de un cerdo de control no infectado. El revestimiento epitelial esta intacto, y los alveolos adyacentes son normales. La Figura 5B muestra bronquiolitis necrotizante aguda severa y neumoma intersticial caractenstica de la lesion extendida inducida por infeccion con virus rWT TX/98. La Figura 5C muestra un bronquiolo normal y un bronquiolo afectado en recuperacion temprana de infeccion con virus mutante de delecion 1-99, representativo de la lesion menos extensiva inducida por infeccion con este virus. La Figura 5D muestra bronquiolos normales y alveolos adyacentes del pulmon de un cerdo inoculado con virus 1-126. No se indujeron lesiones por este virus.
Figuras 6A-D. Examen histopatologico de pulmones de cerdos infectados con virus Sw/TX/98 de tipo silvestre y mutantes NS1 derivados de plasmido, aumento 200x. La Figura 6A muestra el revestimiento epitelial de un bronquiolo mas grande del pulmon de un cerdo de control no infectado. Las celulas epiteliales son altas columnares con nucleos basales pseudo-estratificados y cilios superficiales prominentes. La Figura 6B muestra el revestimiento epitelial de un bronquiolo mas grande del pulmon de un cerdo infectado con virus TX/98 rWT. El revestimiento epitelial esta en total desorganizacion debido a necrosis y proliferacion regenerativa de las celulas epiteliales. La Figura 6C muestra un bronquiolo mas grande y ramificacion mas pequena de las vfas aereas del pulmon de un cerdo infectado con virus mutante de delecion 1-99, representativo de la lesion menos extensiva inducida por este virus. La Figura 6D muestra un revestimiento epitelial normal del pulmon de un cerdo inoculado con virus 1-126. No se produjo lesion bronquiolar.
Figura 7. Histopatologia de cerdos vacunados con TX/98/del 126. La Figura 7 muestra un diagrama de barras que representa los valores histopatologicos de pulmones de cerdos vacunados con TX/98/del 126. Simulado = cerdos inoculados de forma simulada, no vacunados; H3N2 = cerdos no vacunados inoculados con 2x105 UFP por cerdo con A/Porcino/Texas/4199-2/98; H1N1= cerdos no vacunados inoculados con 2x105 UFP por cerdo con A/Porcino/MN/37866/99; MLV + Simulado = cerdos inoculados de forma simulada, vacunados con TX/98/del 126; MLV + H3N2 = cerdos vacunados con TX/98/del 126 inoculados con 2x105 UFP por cerdo con A/Porcino/Texas/4199-2/98; MLV+ H1N1= cerdos vacunados con TX/98/del 126 inoculados con 2x105 UFP por cerdo con A/Porcino/MN/37866/99.
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Figura 8: Inmunohistoquimica para antigeno SIV en cerdos vacunados con TX/98/del 126. La Figura 8 muestra un diagrama de barras que representa los valores inmunohistologicos para cerdos vacunados con TX/98/del126. Simulado = cerdos inoculados de forma simulada, no vacunados; H3N2 = cerdos no vacunados inoculados con 2x 105 UFP por cerdo con A/Porcino/Texas/4199-2/98; H1N1 = cerdos no vacunados inoculados con 2x105 UFP por cerdo con A/Porcino/MN/37866/99; MLV + Simulado = cerdos inoculados de forma simulada, vacunados con TX/98/del 126; MLV + H3N2 = cerdos vacunados con TX/98/del 126 inoculados con 2x105 UFP por cerdo con A/Porcino/Texas/4199-2/98; MLV + H1N1= cerdos vacunados con TX/98/del 126 inoculados con 2x105 UFP por cerdo con A/Porcino/MN/37866/99.
Figura 9: Tftulos de virus en lavado pulmonar de cerdos inmunizados con TX/98/del 126 expuestos con SIV H3N2 y H1N1. La Figura 9 muestra un diagrama de barras que representa los tftulos virales en lavado pulmonar de cerdos vacunados con TX/98/del126. Simulado = cerdos inoculados de forma simulada, no vacunados; H3N2 = cerdos no vacunados inoculados con 2x105 UFP por cerdo A/Porcino/Texas/4199-2/98; H1N1 = cerdos no vacunados inoculados con 2x105 UFP por cerdo con A/Porcino/MN/37866/99; MLV + Simulado = cerdos inoculados de forma simulada, vacunados con TX/98/del 126; MLV + H3N2 = cerdos vacunados con TX/98/del 126 inoculados con 2x105 UFP por cerdo con A/Porcino/Texas/4199-2/98; MLV + H1N1= cerdos vacunados con TX/98/del 126 inoculados con 2x105 UFP por cerdo con A/Porcino/MN/37866/99. El ftmite de deteccion de virus fue 101,5 DICT5o/ml.
5. Descripcion detallada de la invencion
La presente invencion proporciona un virus de la gripe porcina atenuado modificado por ingeniena genetica que tiene un fenotipo antagonista de interferon alterado, donde dicho virus comprende un gen de NS1 del virus de la gripe porcina A/Porcino/Texas/4199-2/98 con una mutacion que produce una protema NS1 con una delecion de todos los restos de aminoacido de NS1 excepto los restos de aminoacido 1-126, donde el aminoacido amino- terminal es el numero 1 y la mutacion en el gen de NS1 confiere un fenotipo antagonista de interferon alterado.
La presente invencion proporciona adicionalmente una formulacion inmunogenica que comprende el virus de la gripe porcina atenuado, modificado por ingeniena genetica, y un excipiente fisiologicamente aceptable. Ademas, la presente invencion proporciona una formulacion farmaceutica que comprende el virus de la gripe porcina atenuado, modificado por ingeniena genetica, de la presente invencion y un vehmulo farmaceuticamente aceptable.
Ademas, la presente invencion proporciona el uso de una cantidad eficaz de la formulacion inmunogenica de la presente invencion en la preparacion de un medicamento para su uso en la inmunizacion o induccion de una respuesta inmunitaria en un cerdo. Ademas, la presente invencion proporciona el uso de una cantidad eficaz del virus de la gripe porcina atenuado modificado por ingeniena genetica de la presente invencion en la preparacion de un medicamento, donde el medicamento es (a) para su uso en la prevencion de una afeccion o un smtoma asociado con virus de la gripe porcina en un cerdo; o (b) para su uso en el tratamiento de una infeccion por virus de la gripe porcina en un cerdo.
La presente invencion tambien proporciona un metodo para la produccion de una formulacion inmunogenica que comprende (a) propagar en un sustrato el virus de la gripe porcina atenuado modificado por ingeniena genetica de la presente invencion y (b) recoger el virus de la descendencia, donde el sustrato es una celula, lmea celular o huevo embrionado.
Ademas, la presente invencion proporciona una celula cultivada que contiene el virus de la gripe porcina atenuado, modificado por ingeniena genetica, de la presente invencion. La presente invencion tambien proporciona un huevo embrionado que contiene el virus de la gripe porcina atenuado modificado por ingeniena genetica de la presente invencion.
En la presente memoria se describen virus de la gripe porcina atenuados que tienen una capacidad alterada de antagonizar la respuesta de interferon (IFN) celular, metodos para producir dichos virus de la gripe porcina atenuados, y el uso de dichos virus en formulaciones de vacuna y farmaceuticas. Dichos virus son capaces de generar una respuesta inmunitaria y crear inmunidad pero sin causar enfermedad, o de causar menos smtomas y/o smtomas menos severos, es decir, los virus tienen virulencia disminuida. Por lo tanto, son candidatos ideales para vacunas de virus vivo. Ademas, los virus de la gripe porcina atenuados pueden inducir una contundente respuesta de IFN que tiene otras consecuencias biologicas in vivo, produciendo proteccion contra posteriores enfermedades infecciosas y/o induciendo respuestas antitumorales. Por lo tanto, los virus de la gripe porcina atenuados pueden usarse de forma farmaceutica para la prevencion o tratamiento de otras enfermedades infecciosas y/o enfermedades tratables por IFN.
La invencion se basa, en parte, en el descubrimiento de los solicitantes de que los virus de la gripe porcina modificados por ingeniena para que contengan o que contienen una o mas deleciones en el gen de NS1 tienen replicacion alterada respecto a virus de la gripe porcina de tipo silvestre como se demuestra por menos lesiones pulmonares tras infeccion de los cerdos, tftulos virales reducidos en fluido de lavado broncoalveolar (BALF) y deteccion reducida de virus en frotis nasales. Sorprendentemente, y contrario a los resultados observados con virus de la gripe humana en modelos de raton, la longitud de la protema NS1 no se correlaciona con el nivel de atenuacion del virus de la gripe porcina. Los solicitantes han descubierto que con gripe porcina, un virus mutante con
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la protema NS1 mas corta es el menos atenuado. En otras palabras, virus de la gripe porcina que contienen deleciones mas cortas en el gen de NS1 muestran mayor atenuacion in vivo que virus de la gripe porcina que contienen deleciones mas largas en su gen NS1, o virus de la gripe porcina de tipo silvestre. Los solicitantes han descubierto adicionalmente que los virus de la gripe porcina recombinantes estan alterados en su capacidad de inhibir la produccion de IFN in vitro, y no se replican de forma tan eficaz como la cepa recombinante precursora en huevos embrionados de gallina de l0 dfas de vida, en celulas MDCK, en celulas PK-15 o en un modelo de cerdo in vivo. Aunque sin el deseo de limitarse a teona o explicacion alguna para el mecanismo de accion de los mutantes de delecion de NS1 del virus de la gripe porcina in vivo, las caractensticas atenuadas de dichos virus se deben presumiblemente a sus niveles de expresion de protema NS1, su capacidad de inducir una contundente respuesta de IFN celular, y su capacidad alterada de antagonizar dicha respuesta. Sin embargo, las caractensticas beneficiosas de dichos virus pueden no ser unicamente atribuibles a su efecto sobre la respuesta de interferon celular. De hecho, alteraciones en otras actividades asociadas con NS1, tales como, la alteracion del corte y ayuste del pre-ARNm, la inhibicion de la poliadenilacion del ARNm celular, el transporte nucleocitoplasmatico del ARNm que contiene poli(A), y la estimulacion de la smtesis de protemas virales, pueden contribuir al fenotipo atenuado deseado conseguido mediante la introduccion de mutaciones en el gen de NS1 del virus de la gripe porcina.
Un virus de la gripe porcina atenuado, descrito en la presente memoria, comprende una mutacion en un gen de NS1 de la gripe porcina que disminuye la capacidad del producto genico NS1 de antagonizar la respuesta de interferon celular. En un aspecto, un virus de la gripe porcina atenuado descrito en la presente memoria comprende un genoma que comprende una mutacion en un gen de NS1 de virus gripe porcina que disminuye la capacidad del producto genico NS1 de antagonizar una respuesta de interferon celular, y permite que el virus atenuado, a una multiplicidad de infeccion (MOI) entre 0,0005 y 0.001, 0,001 y 0,01, 0,01 y 0,1, o 0,1 y 1, o una MOI de 0,0005, 0,0007, 0,001, 0,005, 0,01, 0,05, 0,1, 0,5, 1, 0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, o 6,0, crezca hasta tftulos entre aproximadamente 1 a aproximadamente 100 veces, aproximadamente 5 a aproximadamente 80 veces, aproximadamente 20 a aproximadamente 80 veces, o aproximadamente 40 a aproximadamente 80 veces, aproximadamente 1 a aproximadamente 10 veces, aproximadamente 1 a aproximadamente 5 veces, aproximadamente 1 a aproximadamente 4 veces, aproximadamente 1 a aproximadamente 3 veces, aproximadamente 1 a aproximadamente 2 veces, o aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o 100 veces inferiores que el virus de la gripe porcina de tipo silvestre en celulas (por ejemplo, celulas de un ser humano (por ejemplo, PerC6, una lmea celular productora derivada de retinoblastos embrionarios humanos transformados con la region E1 de adenovirus 5), raton, pollo (por ejemplo, fibroblastos embrionarios de pollo), rata, aves, o cerdo (por ejemplo, celulas PK(D1), celulas PK(15), celulas PK13, celulas NSK, celulas LLC-PK1, celulas LLC-PK1A, celulas ESK-4, celulas ST, celulas PT-K75, celulas PK-2a/CL 13 o SJPL)), determinados aproximadamente 2 a 10 dfas, 3 a 7 dfas, 3 a 5 dfas, o 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 dfas post- infeccion cuando se propagan en las mismas condiciones. Los tftulos de virus de la gripe porcina atenuados y de tipo silvestre pueden determinarse utilizando cualquier tecnica bien conocida en la tecnica o descrita en la presente memoria (por ejemplo, ensayos de hemaglutinacion, ensayos de placa, dosis infecciosas en huevo (DIH50), dosis infecciosas en cultivo tisular (DICT50), etc.) y los virus pueden propagarse en condiciones descritas en la presente memoria o bien conocidas en la tecnica (por ejemplo, en celulas de cerdo, celulas MDCK (por ejemplo, en MEM, suero fetal de ternera (FCS) al 10% v/v, penicilina al 1%/estreptomicina a 37 °C en una incubadora humidificada al 5% de CO2) o huevos embrionados de gallina (por ejemplo, en una incubadora estacionaria a 37 °C con humedad relativa del 55%). Como alternativa, los virus pueden propagarse en celulas (por ejemplo, en celulas de cerdo, celulas MDCK, etc.) que se cultivan en medio sin suero o de suero reducido (por ejemplo, TPCK tripsina). El crecimiento de un virus de la gripe porcina atenuado de la invencion puede compararse con un patron o referencia particular, por ejemplo, virus de la gripe porcina de tipo silvestre A/porcino/Texas/4199-2/98.
En un aspecto espedfico, un virus de la gripe porcina atenuado descrito en la presente memoria comprende un genoma que comprende una mutacion en un gen de NS1 del virus de la gripe porcina que disminuye la capacidad del producto genico NS1 de antagonizar una respuesta de interferon celular, y permite que el virus atenuado, a una multiplicidad de infeccion (MOI) entre 0,0005 y 0.001, 0,001 y 0,01, 0,01 y 0,1, o 0,1 y 1, o una MOI de 0,0005, 0,0007, 0,001, 0,005, 0,01, 0,05, 0,1, 0,5, 1, 0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, o 6,0, crezca hasta tftulos entre aproximadamente 1 a aproximadamente 100 veces, aproximadamente 5 a aproximadamente 80 veces,
aproximadamente 20 a aproximadamente 80 veces, o aproximadamente 40 a aproximadamente 80 veces,
aproximadamente 1 a aproximadamente 10 veces, aproximadamente 1 a aproximadamente 5 veces,
aproximadamente 1 a aproximadamente 4 veces, aproximadamente 1 a aproximadamente 3 veces,
aproximadamente 1 a aproximadamente 2 veces, o aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o 100 veces inferiores que el virus de la gripe porcina de tipo silvestre en celulas de cerdo, determinados aproximadamente 2 a 10 dfas, 3 a 7 dfas, 3 a 5 dfas, o 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 dfas post-infeccion cuando se propagan en las mismas condiciones. Los tftulos de virus de la gripe porcina atenuados y de tipo silvestre pueden determinarse utilizando cualquier tecnica bien conocida en la tecnica o descrita en la presente memoria (por ejemplo, ensayos de hemaglutinacion, ensayos de placa, dosis infecciosas en huevo (DIH50), dosis infecciosas en cultivo tisular (DICT50), etc.) y los virus pueden propagarse en condiciones descritas en la presente memoria o bien conocidas en la tecnica (por ejemplo, en celulas de cerdo, celulas MDCK (por ejemplo, en MEM, suero fetal de ternera (FCS) al 10% v/v, penicilina al 1%/estreptomicina a 37 °C en una incubadora humidificada al 5% de CO2) o huevos embrionados de gallina (por ejemplo, en una incubadora estacionaria a 37 °C con humedad relativa del 55%). Como alternativa, los virus pueden propagarse en celulas (por
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ejemplo, en celulas de cerdo, celulas MDCK, etc.) que se cultivan en medio sin suero o de suero reducido (por ejemplo, TPCK tripsina).
Un virus de la gripe porcina atenuado que tiene el fenotipo deseado puede en s^ mismo usarse como principio activo en formulaciones de vacuna, farmaceuticas o inmunogenicas. Como alternativa, el virus de la gripe porcina atenuado puede usarse como el vector o "estructura" de vacunas producidas de forma recombinante o formulaciones inmunogenicas. Para este fin, puede usarse la tecnica de "genetica inversa" para disenar mutaciones o introducir epttopos exogenos en el virus de la gripe porcina atenuado, que servina como la cepa "precursora". De este modo, pueden disenarse vacunas para inmunizacion contra variantes de cepa, o como alternativa, contra agentes infecciosos o antfgenos de enfermedad completamente diferentes (por ejemplo, antfgenos tumorales). Por ejemplo, el virus atenuado puede disenarse para que exprese epttopos neutralizantes de otras cepas preseleccionadas. Como alternativa, epftopos de otros virus pueden construirse en el virus de la gripe porcina atenuado. Como alternativa, pueden disenarse epftopos de patogenos infeccioso no virales (por ejemplo, parasitos, bacterias, hongos) en el virus de la gripe porcina atenuado.
En la presente memoria se describen metodos para vacunar a un sujeto que comprende administrar las formulaciones de vacuna descritas en la presente memoria. En un aspecto, se describe en la presente memoria un metodo que comprende administrar a un sujeto una cantidad eficaz de una formulacion de vacuna descrita en la presente memoria. En ciertos aspectos, la dosis de la formulacion de vacuna administrada al sujeto es entre aproximadamente 102 a aproximadamente 108, de aproximadamente 103 a aproximadamente 107, o de
aproximadamente 104 a aproximadamente 5 x 106 ufp. En otros aspectos, la dosis de la formulacion de vacuna
administrada es 102, 5 x 102, 103, 5 x 103, 104, 5 x 104, 105, 5 x 105, 106,5 x 106, 10 ,5 x 10 o 10 ufp. En otros
aspectos, la dosis de una formulacion inmunogenica de la invencion administrada a un sujeto es 102 a
aproximadamente 108, de aproximadamente 103 a aproximadamente 107, o de aproximadamente 104 a
aproximadamente 5 x 106 ufp. En otros aspectos mas, la dosis de una formulacion inmunogenica de la invencion administrada a un sujeto es 102, 5 x 102, 103, 5 x 103, 104, 5 x 104, 105, 5 x 105, 106, 5 x 106, 107, 5 x 107 o 108 ufp. En aspectos espedficos, el sujeto es un burro, cebra, camello, perro, ave (por ejemplo, un pato). En un aspecto preferido, el sujeto es un cerdo.
La presente invencion proporciona formulaciones inmunogenicas que comprenden un virus de la gripe porcina atenuado de la invencion. Tambien en la presente memoria se describen metodos para inducir una respuesta inmunitaria para el tratamiento, control o prevencion de una infeccion por virus de la gripe porcina o una afeccion o smtoma asociado con la misma, una infeccion diferente a una infeccion por virus de la gripe porcina o una afeccion o smtoma asociado con la misma, o una afeccion en que pueden usarse los virus de la gripe porcina atenuados como un vector para inducir una respuesta inmunitaria contra un antfgeno particular asociado con la afeccion, que comprende administrar a un sujeto una formulacion inmunogenica de la invencion. La presente invencion se refiere a una formulacion inmunogenica para su uso en un metodo para inmunizar o inducir una respuesta inmunitaria, por ejemplo, para el tratamiento, control o prevencion de una infeccion por virus de la gripe porcina o una afeccion o smtoma asociado con la misma, que comprende administrar a un sujeto una cantidad eficaz de una formulacion inmunogenica de la invencion. La dosis de la formulacion inmunogenica a administrar al sujeto puede ser entre aproximadamente 102 a aproximadamente 108, de aproximadamente 103 a aproximadamente 107, de aproximadamente 104 a aproximadamente 5 x 106 ufp o de aproximadamente 104 a aproximadamente 107 ufp. La dosis de la formulacion inmunogenica de la invencion a administrar a un sujeto puede ser de 102, 5 x 102, 103, 5 x 103, 104, 5 x 104, 105, 5 x 105, 106, 5 x 106, 107, 5 x 107 o 108 ufp. El sujeto puede ser un burro, cebra, camello, pero, ave (por ejemplo, un pato), y especialmente un cerdo.
Los virus de la gripe porcina atenuados, que inducen contundentes respuestas de IFN en sujetos, tambien pueden usarse en formulaciones farmaceuticas para la profilaxis o tratamiento de otras infecciones, o enfermedades tratables por IFN tales como cancer. A este respecto, el tropismo del virus de la gripe porcina atenuado puede alterarse para abordar el virus en un organo, tejido o celulas diana deseadas in vivo o ex vivo. Usando este enfoque, la respuesta de IFN puede inducirse de forma local, en el sitio diana, evitando de este modo o minimizando los efectos secundarios de tratamientos sistemicos de IFN. Para este fin, el virus de la gripe porcina atenuado puede modificarse para expresar un ligando espedfico para un receptor del organo, tejido o celulas diana.
En la presente memoria se describen metodos para prevenir, controlar o tratar una infeccion o enfermedad tratable por IFN en un sujeto, diferente a una infeccion viral de la gripe porcina o enfermedad tratable por IFN causada por virus de la gripe porcina, que comprende administrar una formulacion farmaceutica de la invencion. En un aspecto, se describe en la presente memoria un metodo para prevenir, controlar o tratar una infeccion o enfermedad tratable por IFN en un sujeto, diferente a una infeccion viral de la gripe porcina o enfermedad tratable por IFN causada por virus de la gripe porcina, que comprende administrar una cantidad eficaz de una formulacion farmaceutica de la invencion. La dosis de la formulacion farmaceutica a administrar al sujeto puede ser entre aproximadamente 102 a aproximadamente 108, de aproximadamente 103 a aproximadamente 107, de aproximadamente 104 a aproximadamente 5 x 106 ufp o de aproximadamente 104 a aproximadamente 1012 ufp. La dosis de la formulacion farmaceutica a administrar al sujeto puede ser de 102, 5 x 102, 103, 5 x 103, 104, 5 x 104, 105, 5 x 10s, 106, 5 x 106, 107, 5 x 107, 105, 5 x 108, 1 x 109, 5 x 109, 1 x 1010, 5 x 1010, 1 x 1011, 5 x 1011 o 1012 ufp. El sujeto puede ser un burro, cebra, camello, pero, ave (por ejemplo, un pato), y especialmente un cerdo.
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En la presente memoria se describen metodos para prevenir, controlar o tratar el cancer en un sujeto que comprende administrar una composicion farmaceutica de la invencion. En un aspecto, se describe en la presente memoria un metodo para prevenir, controlar o tratar el cancer en un sujeto que comprende administrar una cantidad eficaz de una composicion farmaceutica de la invencion. La dosis de la formulacion farmaceutica a administrar al sujeto puede ser entre aproximadamente 102 a aproximadamente 108, de aproximadamente 103 a aproximadamente 10, de aproximadamente 104 a aproximadamente 5 x 106 ufp o de aproximadamente 104 a aproximadamente 1012 ufp. La dosis de la formulacion farmaceutica a administrar al sujeto puede ser de 102, 5 x 102, 103, 5 x 103, 104, 5 x 104, 105, 5 x 10s, 106, 5 x 106, 107, 5 x 107, 105, 5 x 108, 1 x 109, 5 x 109, 1 x 1010, 5 x 1010, 1 x 1011, 5 x 1011 o 1012 ufp.
Los solicitantes demostraron que virus de la gripe porcina atenuados con actividad antagonista de interferon alterada demostraron replicarse en tttulos de generacion in vivo que son inferiores que los detectados con virus de la gripe porcina de tipo silvestre, pero que son suficientes para inducir respuestas inmunologicas y de citoquinas. Por tanto, las mutaciones que disminuyen pero no eliminan la actividad antagonista de IFN del virus de la gripe porcina son preferidas para formulaciones de vacuna. Dichos virus pueden seleccionarse por su crecimiento en sustratos tanto convencionales como no convencionales, y por virulencia intermedia.
La presente invencion proporciona celulas que contienen (como alternativa, que comprenden) virus de la gripe porcina de la presente invencion. Una celula puede contener/comprender un virus de la gripe porcina que esta modificado pro ingeniena genetica. El virus de la gripe porcina atenuado contenido en la celula puede estar modificado por ingeniena para codificar un epftopo derivado de otro virus o un antfgeno tumoral. El genoma del virus de la gripe porcina atenuado puede comprender al menos un segmento derivado de un virus diferente. Las celulas que pueden infectarse con, contener o comprender un virus de la gripe porcina atenuado de la invencion incluyen, aunque sin limitacion, celulas MDCK, celulas PK, celulas Vero, celulas endoteliales de vena umbilical humana primaria (HUVEC), lmea celular de epitelio humano H292, celulas HeLa, y celulas renales embrionarias porcinas RES. La celula puede ser una celula de cerdo o una lmea celular de cerdo. La celula (por ejemplo, una celula de cerdo o lmea celular de cerdo) puede ser deficiente en interferon.
La invencion abarca el uso de sustratos tales como celulas, lmeas celulares y huevos embrionados, para propagar los virus de la gripe porcina atenuados de la invencion. En una realizacion, la invencion proporciona metodos para la produccion de vacunas, la produccion de formulaciones inmunogenicas y la produccion de agentes farmaceuticos que comprenden propagar en un sustrato un virus de la gripe porcina atenuado de la presente invencion y recoger el virus de la descendencia, donde el sustrato es una celula, lmea celular o huevo embrionado. El sustrato puede ser un sistema IFN-deficiente. Sistemas IFN-deficientes ejemplares incluyen, aunque sin limitacion, huevos embrionados jovenes (por ejemplo, huevos embrionados de 6 a 10 dfas de vida, de 6 a 9 dfas de vida, de 6 a 8 dfas de vida o de 6 a 7 dfas de vida), lmeas celulares IFN-deficientes (tales como celulas VERO o lmeas celulares modificadas por ingeniena genetica tales como knockouts STAT1). Los huevos embrionados o lmeas celulares pre-tratadas con compuestos que inhiben el sistema IFN (incluyendo farmacos, anticuerpos, antisentido, ribozimas, etc.) tambien pueden usarse como sistema IFN-deficiente. Ademas, los huevos deficientes en el sistema IFN, por ejemplo, huevos producidos por aves STAT1 negativas, especialmente aves de corral, incluyendo aunque sin limitacion pollos, patos o pavos transgenicos, pueden usarse como sistemas IFN-deficiente.
5.1 Generacion de mutantes con actividad antagonista de IFN alterada
Cualquier virus o cepa de la gripe porcina mutante que tenga una actividad antagonista de IFN disminuida puede seleccionarse y usarse de acuerdo con la presente descripcion. En un aspecto, pueden seleccionarse mutantes o variantes de origen natural, o mutantes espontaneos de la gripe porcina que tengan una capacidad alterada de antagonizar la respuesta de IFN celular. En otro aspecto, los virus de la gripe porcina mutantes pueden generarse exponiendo el virus a mutagenos, tales como irradiacion ultravioleta o mutagenos qmmicos, o por multiples pases y/o pase en hospedadores no permisivos. Puede usarse seleccion en un sistema de cultivo diferencial para aquellos mutantes que tienen funcion antagonista de IFN alterada. Como el virus de la gripe porcina A tiene un genoma segmentado, el fenotipo atenuado puede transferirse a otra cepa que tenga un antfgeno deseado por redistribucion, (es decir, por coinfeccion del virus atenuado y la cepa deseada, y seleccion de las redistribuciones que presentan ambos fenotipos). Los virus de la gripe porcina de la invencion no son virus de origen natural. Los virus de la gripe porcina de la invencion pueden ser virus modificados por ingeniena genetica. Un virus de la gripe porcina con mutaciones de origen natural en el gen de NS1 puede no estar abarcado por la invencion. En ciertos aspectos, los virus de la gripe porcina conocidos con mutaciones en el gen de NS1 gene no estan abarcados por la invencion. En aspectos espedficos, los virus de la gripe porcina descritos en la presente memoria contienen todo o una parte del gen de NS1 derivado de virus de la gripe humana.
Puede disenarse mutaciones en el virus de la gripe porcina usando enfoques de "genetica inversa". De este modo, pueden disenarse mutaciones naturales u otras mutaciones que confieren el fenotipo atenuado en cepas de vacuna. Por ejemplo, pueden disenarse deleciones, inserciones o sustituciones de la region codificante del gen del virus de la gripe porcina para la actividad antagonista de IFN (es decir, el NS1 del virus de la gripe porcina). Tambien se contemplan deleciones, sustituciones o inserciones en la region no codificante del gen del virus de la gripe porcina responsable de la actividad antagonista de IFN. Para este fin, pueden disenarse mutaciones en las senales responsables de la transcripcion, replicacion, poliadenilacion y/o empaquetado del gen responsable de la actividad
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antagonista de IFN. Dichas mutaciones, por ejemplo en el promotor, podnan regular negativamente la expresion del gen del virus de la gripe porcina responsable de la actividad antagonista de IFN. Pueden hacerse mutaciones en el promotor, por ejemplo, por combinacion del promotor (por ejemplo, del promotor del virus de la gripe B), o en las regiones no codificantes del gen NS1. Las mutaciones en los genes del virus de la gripe porcina que pueden regular la expresion del gen del virus de la gripe porcina responsable de la actividad antagonista de IFN (es decir, el gen de NS1 del virus de la gripe porcina) tambien estan dentro del alcance de los virus que pueden usarse de acuerdo con la invencion.
Tambien en la presente memoria se describen virus de la gripe porcina que comprenden genomas que comprenden mutaciones en el segmento genico NS1 que pueden no provocar una actividad antagonista de IFN alterada o un fenotipo inductor de IFN sino que provocan funciones virales alteradas y un fenotipo atenuado, por ejemplo, inhibicion alterada de la exportacion nuclear de ARNm que contiene poli(A), inhibicion alterada del corte y Yuste de pre-ARNm, inhibicion alterada de la activacion de PKR por secuestro de ARNbc, efecto alterado sobre la traduccion de ARN viral e inhibicion alterada de la poliadenilacion del ARNm del hospedador (por ejemplo, vease Krug en Textbook of Gripe, Nicholson et al. Ed. 1998, 82-92, y referencias citadas en ese documento).
La tecnica de genetica inversa implica la preparacion de ARN virales recombinantes sinteticos que contienen las regiones no codificantes del ARN del virus de la gripe porcina que son esenciales para el reconocimiento por polimerasas virales y para senales de empaquetado necesarias para generar un virion maduro. Los ARN recombinantes se sintetizan a partir de un molde de ADN recombinante y se reconstituyen in vitro con complejo de polimerasa viral purificado para formar ribonucleoprotemas (RNP) recombinantes que pueden usarse para transfectar celulas. Se consigue una transfeccion mas eficaz si las protemas de polimerasa viral estan presentes durante la transcripcion de los ARN sinteticos in vitro o in vivo. Los RNP recombinantes sinteticos pueden rescatarse en partfculas virales infecciosas. Las tecnicas anteriores se describen en la patente de Estados Unidos N° 5.166.057 expedida el 24 de noviembre de 1992; en la patente de Estados Unidos N° 5.854.037 expedida el 29 de diciembre de 1998; en la publicacion de patente europea EP 0702085A1, publicada el 20 de febrero de 1996; en la solicitud de patente de Estados Unidos N° de serie 09/152.845; en las publicaciones de patente internacional PCT W097/12032 publicada el 3 de abril de 1997; W096/34625 publicada el 7 de noviembre de 1996; en la publicacion de patente europea EP-A780475; el documento WO 99/02657 publicado el 21 de enero de 1999; el documento WO 98/53078 publicado el 26 de noviembre de 1998; el documento WO 98/02530 publicado el 22 de enero de 1998; el documento WO 99/15672 publicado el 1 de abril de 1999; el documento WO 98/13501 publicado el 2 de abril de 1998; el documento WO 97/06270 publicado el 20 de febrero de 1997; y el documento EPO 780 475A1 publicado el 25 de junio de 1997.
Tambien puede utilizarse la tecnologfa de plasmidos sin auxiliar para disenar un virus de la gripe porcina atenuado. Para una descripcion de la tecnologfa de plasmidos sin auxiliar vease, por ejemplo, la publicacion internacional N° WO 01/04333; la patente de Estados Unidos N° 6.649.372; Fodor et al., 1999, J. Virol. 73:9679-9682; Hoffmann et al., 2000, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:6108-6113; y Neumann et al., 1999, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:93459350.
Los virus atenuados generados por el enfoque de genetica inversa o tecnologfa de plasmidos sin auxiliar pueden usarse en las formulaciones de vacuna, inmunogenicas y farmaceuticas descritas en la presente memoria. Las tecnicas de genetica inversa o la tecnologfa de plasmidos sin auxiliar tambien pueden usarse para disenar mutaciones adicionales en otros genes virales importantes para la produccion de formulaciones de vacuna, inmunogenicas y farmaceuticas - es decir, los epftopos de cepas de vacuna utiles variantes pueden modificarse en un virus de la gripe porcina atenuado. Como alternativa, pueden disenarse epftopos completamente exogenos, incluyendo antfgenos derivados de otros patogenos virales o no virales en la una cepa atenuada. Por ejemplo, puede modificarse antfgenos de virus no relacionados, antfgenos de parasitos, antfgenos bacterianos o fungicos o antfgenos tumorales en una cepa atenuada (por ejemplo, epftopos de virus del smdrome reproductor y respiratorio porcino, citomegalovirus porcino, coronavirus respiratorio porcino, virus de encefalomiocarditis porcina, diarrea epidemica porcina y determinantes antigenicos de patogenos porcinos no virales tales como bacterias, incluyendo, aunque sin limitacion, Brucella suis, y parasitos incluyendo, aunque sin limitacion, ascarides (Ascaris suum), tricocefalos (Trichuris suis), o un antfgeno tumoral tal como el antfgeno carcinoembrionario (CEA), antfgeno de cancer de mama tal como EGFR (receptor del factor de crecimiento epidermico), antfgeno HER2 (p185HER2), epftopo HER2 neu, antfgeno canceroso-50 (CA-50), antfgeno canceroso 15-3 (CA15-3) asociado con cancer de mama, antfgeno asociado a carcinoma (CAA), antfgeno de melanoma, y antfgenos asociados a melanoma 100, 25, y 150). Como alternativa, pueden disenarse epftopos que alteren el tropismo del virus in vivo en los virus atenuados quimericos descritos en la presente memoria.
En un aspecto espedfico, puede usarse una combinacion de tecnicas de genetica inversa o tecnologfa sin auxiliar y tecnicas de redistribucion para disenar virus atenuados que tengan los epftopos deseados en virus de la gripe porcina. Por ejemplo, puede co-infectarse un virus de la gripe porcina atenuado (generado por, por ejemplo, tecnicas de genetica inversa, tecnologfa de plasmidos sin auxiliar o una combinacion de las mismas) y una cepa que porta el epftopo de vacuna deseado (generada por, por ejemplo, seleccion natural, mutagenesis, por tecnicas de genetica inversa, tecnologfa de plasmidos sin auxiliar o una combinacion de las mismas) en hospedadores que permiten la redistribucion de los genomas segmentados. Entonces pueden seleccionarse las redistribuciones que presentan tanto el fenotipo atenuado como el epftopo deseado. Pueden usarse tecnicas de redistribucion para transferir el
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fenotipo atenuado desde una cepa precursora de virus de la gripe porcina (un mutante natural, un virus mutagenizado, o un virus modificado por ingeniena genetica) a una cepa de virus diferente (un virus de tipo silvestre, un mutante natural, un virus mutagenizado, o un virus modificado por ingeniena genetica).
En un aspecto espedfico, se describe en la presente memoria un virus de la gripe porcina atenuado que comprende un genoma que comprende una mutacion en el gen de NS1 del virus de la gripe porcina que disminuye la capacidad del producto genico NS1 de antagonizar una respuesta de interferon celular. DE acuerdo con este aspecto, el virus de la gripe porcina atenuado esta preferiblemente modificado por ingeniena genetica.
Los virus de la gripe porcina atenuados de la invencion pueden tener una o mas o una combinacion de cualquiera de las siguientes caractensticas: la capacidad de inducir actividad de interferon a un nivel menor que (por ejemplo, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o 98% menor que) el del virus de la gripe porcina de tipo silvestre, por ejemplo, A/Porcino/Texas/4199-2/98, medido por ensayos convencionales de interferon; un tftulo viral 1 a 50, 2 a 25, 2 a 10 o 3 a 7 veces menor que el virus de la gripe porcina de tipo silvestre, por ejemplo, A/Porcino/Texas/4199-2/98, cuando se cultivan en la mismas condiciones (por ejemplo, inoculados a una MOI de 0,0001, 0,0005, 0,001, 0,005, 0,01, 0,05, 0,1, 0,5, 1, 5 o 10 y cultivados en celulas PK, celulas PK(D1), celulas PK(15), celulas PK13, celulas NSK, celulas LLC-PK1, celulas LLC-PK1A, celulas ESK-4, celulas ST, celulas PT-K75, celulas PK-2a/CL 13 o celulas SJPL y ensayados en celulas MDCK); un tftulo viral 1 a 10 veces, 1 a 5 veces, 5-10 veces, 10 a 500, 20 a 250, 20 a 100 o 40 a 80 veces menos que el virus de la gripe porcina de tipo silvestre, por ejemplo, A/Porcino/Texas/4199-2/98, cuando se afslan de BALF de cerdos infectados ensayados en un ensayo de placa realizado en celulas MDCK; o una capacidad reducida de causar lesiones pulmonares en cerdos infectados.
En un aspecto espedfico, un virus de la gripe porcina atenuado descrito en la presente memoria tiene un genoma que comprende una mutacion en un gen de NS1 del virus de la gripe porcina que disminuye la capacidad del producto genico NS1 de antagonizar una respuesta de interferon celular, y permite que el virus atenuado, a una multiplicidad de infeccion (MOI) entre 0,0005 y 0,001, 0,001 y 0,01, 0,01 y 0,1, 0,1 y 1, o 0,1 y 1, o una MOI de 0,0005, 0,0007, 0,001, 0,005, 0,01, 0,05, 0,1, 0,5, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5 o 6,0, crezca hasta tftulos entre aproximadamente 1 a aproximadamente 100 veces, aproximadamente 5 a 10 aproximadamente 80 veces, aproximadamente 20 a aproximadamente 80 veces, o aproximadamente 40 a aproximadamente 80 veces, aproximadamente 1 a aproximadamente 10 veces, aproximadamente 1 a aproximadamente 5 veces,
aproximadamente 1 a aproximadamente 4 veces, aproximadamente 1 a aproximadamente 3 veces,
aproximadamente 1 a aproximadamente 2 veces, o aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, o aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 7, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o 100 veces inferiores que el virus de la gripe porcina de tipo silvestre en celulas (por ejemplo, celulas de un ser humano (por ejemplo, PerC6, una lrnea celular productora derivada de retinoblastos embrionarios humanos transformados con la region E1 de Adenovirus 5), raton, pollo (por ejemplo, fibroblastos embrionarios de pollo), rata, aves, o cerdo (por ejemplo, celulas PK(D1), celulas pK(15), celulas PK13, celulas NSK, celulas LLC-PK1, celulas LLC-PK1A, celulas ESK-4, celulas ST, celulas PT-K75, celulas PK-2a/CL 13 o SJPL)) determinados por un ensayo de hemaglutinacion de BALF obtenido de cerdos o sobrenadantes de celulas de cerdo aproximadamente 2 a 10 dfas, 3 a 7 dfas, 3 a 5 dfas o 2, 3, 5, 6, 7, 8, 9, 10 dfas post-infeccion o cuando los virus se siembran en placa en celulas MDCK. El crecimiento de un virus de la gripe porcina atenuado puede compararse con un patron o referencia particular, por ejemplo, virus de la gripe porcina de tipo silvestre A/Porcino/Texas/4199-2/98. El virus atenuado puede modificarse por ingeniena genetica para que contenga o exprese secuencias de acido nucleico de virus de la gripe no porcina tales como, por ejemplo, un epftopo de un patogeno foraneo o un antfgeno tumoral. Preferiblemente, las secuencias de virus de la gripe no porcina no incluyen una secuencia de acido nucleico que alterar el fenotipo atenuado del virus. Por consiguiente, las secuencias de acido nucleico que codifican protemas, polipeptidos o peptidos con actividad antagonizante de interferon preferiblemente no se modifican por ingeniena en virus de la gripe porcina.
En la presente memoria se describen virus de la gripe porcina atenuados que comprende un genoma que comprende al menos dos, al menos tres, al menos cuatro o mas mutaciones en dos, tres, cuatro o mas genes del virus de la gripe porcina, donde al menos una de las mutaciones esta en el gen de NS1 y contribuye a o es responsable (directa o indirectamente) de la atenuacion del virus y/o la capacidad disminuida del virus de antagonizar una respuesta de interferon celular. En un aspecto espedfico, un virus de la gripe porcina atenuado comprende un genoma que comprende al menos dos, al menos tres, al menos cuatro o mas mutaciones en dos, tres, cuatro o mas genes del virus de la gripe porcina, donde al menos una de las mutaciones esta en el gen de NS1 y es responsable de la capacidad disminuida del producto genico NS1 de antagonizar una respuesta de interferon celular, y permite que el virus atenuado, a una mOi entre 0,0005 y 0,001, 0,001 y 0,01, 0,01 y 0,1, o 0,1 y 1, o una MOI de 0,0005, 0,0007, 0,001, 0,005, 0,01, 0,05, 0,1, 0,5, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5 o 6,0, crezca hasta tftulos entre aproximadamente 1 a aproximadamente 100 veces, aproximadamente 5 a aproximadamente 80 veces, aproximadamente 20 a aproximadamente 80 veces, o aproximadamente 40 a aproximadamente 80 veces, aproximadamente 1 a aproximadamente 10 veces, aproximadamente 1 a aproximadamente 5 veces, aproximadamente 1 a aproximadamente 4 veces, aproximadamente 1 a aproximadamente 3 veces, aproximadamente 1 a aproximadamente 2 veces, o aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o 100 veces inferiores que el virus de la gripe porcina de tipo silvestre, por ejemplo, A/Porcino/Texas/4199-2/98, en celulas de cerdo, determinados por, por ejemplo, ensayos de hemaglutinacion, aproximadamente 2 a 10 dfas, 3 a 7 dfas, o 2, 3, 5, 6, 7, 8, 9, 10 dfas post-infeccion cuando los
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virus se propagan en las mismas condiciones. En otro aspecto, un virus de la gripe porcina atenuado descrito en la presente memoria comprende un genoma que comprende al menos dos, tres, cuatro o mas mutaciones en dos, tres, cuatro o mas genes del virus de la gripe porcina, donde al menos una de las mutaciones esta en el gen de NS1 y es responsable de la atenuacion del virus, y permite que el virus atenuado, a una MOI entre 0,0005 y 0,001, O,o0l y 0,01, 0,01 y 0,1, o 0,1 y 1, o a una MOI de 0,0005, 0,0007, 0,001, 0,005, 0,01, 0,05, 0,1, 0,5, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5 o 6,0, crezca hasta tftulos entre aproximadamente 1 a aproximadamente 100 veces,
aproximadamente 5 a aproximadamente 80 veces, aproximadamente 20 a aproximadamente 80 veces, o
aproximadamente 40 a aproximadamente 80 veces, aproximadamente 1 a aproximadamente 10 veces, aproximadamente 1 a aproximadamente 5 veces, aproximadamente 1 a aproximadamente 4 veces, aproximadamente 1 a aproximadamente 3 veces, aproximadamente 1 a aproximadamente 2 veces, o
aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o 100
veces inferiores que el virus de la gripe porcina de tipo silvestre, por ejemplo, A/Porcino/Texas/4199-2/98, en celulas de cerdo, determinados por, por ejemplo, ensayos de hemaglutinacion, aproximadamente 2 a 10 dfas, 3 a 7 dfas, 3 a 5 dfas, o 2, 3, 5, 6, 7, 8, 9, 10 dfas post-infeccion cuando los virus se propagan en las mismas condiciones (por ejemplo, en celulas MDCK). DE acuerdo con estos aspectos, el virus atenuado tiene un fenotipo antagonista de interferon alterado y los virus pueden modificarse por ingeniena genetica para que contengan o expresen secuencias de acido nucleico de virus de la gripe no porcina tales como, por ejemplo, un epttopo de un patogeno foraneo (por ejemplo, epftopos del virus del smdrome reproductor y respiratorio porcino, citomegalovirus porcino, coronavirus respiratorio porcino, virus de la encefalomiocarditis porcina, diarrea epidemica porcina y determinantes antigenicos de patogenos no virales tales como bacterias y parasitos, por nombrar solo unos pocos) o un antfgeno tumoral. Preferiblemente, las secuencias de virus de la gripe no porcina (secuencias heterologas) no incluyen una secuencia de acido nucleico que altera el fenotipo atenuado del virus. Por consiguiente, las secuencias de acido nucleico que codifican protemas, polipeptidos o peptidos con actividad antagonizante de interferon preferiblemente no se modifican por ingeniena en el virus de la gripe porcina.
Puede introducirse cualquier mutacion que produzca el fenotipo deseado (preferiblemente, una capacidad alterada de antagonizar una respuesta de interferon celular) en el gen de NS1 del virus de la gripe porcina. Ejemplos de los tipos de mutaciones que pueden incluirse en o introducirse en el gen de NS1 del virus de la gripe porcina incluyen, aunque sin limitacion, deleciones, sustituciones, inserciones y combinaciones de las mismas. Una o mas mutaciones puede localizarse en cualquier lugar en todo el gen de NS1 (por ejemplo, el extremo amino-terminal, el extremo carboxi-terminal o cualquier parte entre ellos) y/o el elemento regulador del gen NS1. En un aspecto espedfico, un virus de la gripe porcina atenuado, descrito en la presente memoria, comprende un genoma que comprende un gen de NS1 del virus de la gripe porcina con una mutacion (por ejemplo, una delecion o sustitucion) en el extremo amino- terminal. En un aspecto preferido, un virus de la gripe porcina atenuado, descrito en la presente memoria, comprende un genoma que comprende un virus de la gripe porcina con una mutacion (por ejemplo, una delecion o sustitucion, preferiblemente una delecion) en el extremo carboxi-terminal. En otro aspecto, un virus de la gripe porcina atenuado descrito en la presente memoria comprende un genoma que comprende una mutacion en un gen de NS1 del virus de la gripe porcina que provoca una delecion que consiste en 5, preferiblemente 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 73, 75, 80, 85, 90, 95, 99, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 126, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170 o 175 restos de aminoacido del extremo carboxi terminal de NS1, o una delecion entre 5-170, 25170, 50-170, 100-170, 100-160 o 105-160 restos de aminoacido del extremo carboxi-terminal. En otro aspecto, un virus de la gripe porcina atenuado descrito en la presente memoria comprende un genoma que comprende una mutacion en un gen de NS1 del virus de la gripe porcina que provoca una delecion de todos los restos de aminoacido excepto los restos de aminoacido 1-126, los restos de aminoacido 1-120, los restos de aminoacido 1115, los restos de aminoacido 1-110, los restos de aminoacido 1-100, los restos de aminoacido 1-99, los restos de aminoacido 1-95, los restos de aminoacido 1-85, los restos de aminoacido 1-80, los restos de aminoacido 1-75, los restos de aminoacido 1-73, los restos de aminoacido 1-70, los restos de aminoacido 1-65 o los restos de aminoacido 1-60, donde el resto de aminoacido amino-terminal es el numero 1. De acuerdo con estos aspectos, el virus de la gripe porcina atenuado esta preferiblemente modificado por ingeniena genetica. Un virus de la gripe porcina atenuado de la descripcion puede ser TX/98/del 126, TX/98/del 99 o TX/98/del 73.
El virus de la gripe porcina atenuado de la presente invencion puede ser un virus quimerico que expresa una secuencia heterologa, por ejemplo, antfgenos de otras cepas de vacuna (por ejemplo, usando genetica inversa, redistribucion o tecnologfa de plasmidos sin auxiliar). Como alternativa, los virus de la gripe atenuados pueden disenarse, usando genetica inversa, redistribucion o tecnologfa de plasmidos sin auxiliar con virus modificados por ingeniena genetica, para que expresen epftopos completamente exogenos, por ejemplo, antfgenos de otros patogenos infecciosos, antfgenos tumorales, o antfgenos de direccionamiento, Los virus de la gripe porcina atenuados pueden expresar una secuencia heterologa derivada de otros agentes infecciosos porcinos, agentes infecciosos no porcinos, tipos porcinos u otros tipos de antfgenos tumorales (por ejemplo, antfgeno carcinoembrionario (CEA), antfgeno de cancer de mama tal como EGFR (receptor del factor de crecimiento epidermico), antfgeno HER2 (pi85HER2), epftopo HER2 neu, antfgeno canceroso-50 (CA-50), antfgeno canceroso 15-3 (CA15-3) asociado con cancer de mama, antfgeno asociado a carcinoma (CAA), antfgeno de melanoma, y antfgenos asociados a melanoma 100, 25, y 150). El virus de la gripe porcina atenuado puede contener un segmento derivado de otro virus. Como el segmento de ARN de NS es el mas corto entre los ocho ARN virales, es posible que el ARN de NS tolere inserciones mas largas de secuencias heterologas que otros genes virales. Ademas, el segmento de ARN de NS dirige la smtesis de altos niveles de protema en celulas infectadas, lo que
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sugiere que sena un segmento ideal para inserciones de antigenos exogenos. Secuencias ejemplares incluyen epftopos del virus del smdrome reproductor y respiratorio porcino, citomegalovirus porcino, coronavirus respiratorio porcino, virus de la encefalomiocarditis porcina, diarrea epidemica porcina y determinantes antigenicos de patogenos porcinos no virales tales como bacterias incluyendo, aunque sin limitacion, Brucella suis, y parasitos, incluyendo, aunque sin limitacion, ascarides (Ascarii suum), tricocefalos (Trichuris suis).
Preferiblemente, la secuencia heterologa no es una secuencia de acido nucleico que altera el fenotipo atenuado del virus. Por consiguiente, preferiblemente, las secuencias de acido nucleico que codifican protemas, polipeptidos o peptidos con actividad antagonizante de interferon no se modifican por ingeniena en el virus de la gripe porcina. El virus quimerico puede expresar un antfgeno tumoral. El virus quimerico, puede expresar un epttopo de un patogeno foraneo.
5.2 Seleccion de virus de la gripe porcina atenuados
En la presente memoria se describen metodos para seleccionar virus de la gripe porcina que tengan el fenotipo deseado, es decir, virus de la gripe porcina atenuados o virus de la gripe porcina que tengan baja actividad IFN (es decir, una reduccion del 5-10%, 10-20%, 20-30%, 30-40%, 40-50%, 50-60%, 60-70%, 70-80%, 80-90% o mas en comparacion con virus de la gripe porcina de tipo silvestre, por ejemplo, A/Porcino/Texas/4199-2/98, en las mismas condiciones) o ausencia de actividad antagonista de IFN si se obtiene de variantes naturales, variantes espontaneas (es decir, variantes que evolucionan durante la propagacion del virus), variantes naturales mutagenizadas, virus de redistribucion y/o modificados por ingeniena genetica (vease, por ejemplo, la patente de Estados Unidos N° 6.635.416). Dichos virus pueden seleccionarse mejor en ensayos de crecimiento diferencial que comparan el crecimiento en sistemas hospedadores IFN-deficientes frente a IFN-competentes. Se seleccionan los virus que muestran mejor crecimiento en los sistemas IFN-deficientes frente a los sistemas IFN-competentes; preferiblemente, se seleccionan los virus que crecen hasta tftulos al menos un log, al menos dos log, tres log, o 1 a 50, 1 a 25, 1 a 20, 1 a 10 o 1 a 5 log mayores en sistemas IFN-deficientes en comparacion con un sistema IFN-competente. Los sistemas IFN-deficientes ejemplares incluyen, aunque sin limitacion, huevos embrionados jovenes (por ejemplo, huevos embrionados de 6 a 10 dfas de vida, 6 a 9 dfas de vida, 6 a 8 dfas de vida o 6 a 7 dfas de vida), lmeas celulares IFN-deficientes (tales como celulas VERO o lmeas celulares modificadas por ingeniena genetica tales como knockouts STAT1, knockouts PKR, etc.). Tambien pueden usarse huevos embrionados o lmeas celulares pretratadas con compuestos que inhiben el sistema IFN (incluyendo farmacos, anticuerpos, antisentido, ribozimas, etc.) como sistema IFN-deficiente. Ademas, pueden usarse huevos deficientes en el sistema IFN, por ejemplo, huevos producidos por aves STAT1 negativas, especialmente aves de corral, incluyendo aunque sin limitacion pollos transgenicos, patos o pavos, como sistema IFN-deficiente. Los virus de la gripe porcina atenuados que muestran tftulos al menos 1 a 50, 1 a 25, 1 a 20, 1 a 10 o 1a 5 log inferiores en huevos de 10 dfas de vida frente a huevos de 6-7, 6-8, o 6-9 dfas de vida se consideraran alterados en su capacidad para inhibir la respuesta de IFN.
Con propositos de seleccion, pueden usarse sistemas transitorios IFN-deficientes en vez de sistemas manipulados geneticamente. Por ejemplo, el sistema hospedador puede tratarse con compuestos que inhiben la produccion de IFN y/o componentes de la respuesta de IFN (por ejemplo, farmacos, anticuerpos contra IFN, anticuerpos contra el receptor de IFN, inhibidores de PKR, moleculas antisentido y ribozimas, etc.). El crecimiento del virus de la gripe porcina atenuado puede compararse en controles no tratados IFN-competentes frente a sistemas tratados IFN- deficientes.
El crecimiento del virus de la gripe porcina (medido por el tttulo) puede compararse, por ejemplo, en una diversidad de celulas, lmeas celulares, o sistemas de modelo animal que expresan IFN y los componentes de la respuesta de IFN, frente a celulas, lmeas celulares, o sistemas de modelo animal deficientes para IFN o componentes de la respuesta de IFN. Pueden usarse tecnicas que son bien conocidas en la tecnica para la propagacion de virus en lmeas celulares (vease, por ejemplo, los ejemplos de trabajo infra). Puede compararse el crecimiento del virus de la gripe porcina en una lmea celular IFN-competente frente a una lmea celular modificada por ingeniena genetica IFN- deficiente.
Los virus de la gripe porcina puede seleccionarse usando sistemas de ensayo de IFN por ejemplo, sistemas de ensayo basados en transcripcion en que la expresion de un gen indicador esta controlada por un promotor sensible a IFN. Puede medirse la expresion del gen indicador en celulas infectadas frente a no infectadas para identificar virus que induzcan de forma eficaz una respuesta de IFN, pero que sean incapaces de antagonizar la respuesta de IFN. Por ejemplo, pueden disenarse celulas de ensayo para que expresen de forma transitoria o constitutiva genes indicadores tales como el gen indicador de luciferasa o el gen indicador de cloranfenicol transferasa (CAT) bajo el control de un elemento de respuesta estimulado por interferon, tal como el promotor estimulado por IFN del gen ISG- 54K (Bluyssen et al., 1994, Eur. J. Biochem. 220:395-402). Las celulas se infectan con el virus de la gripe porcina de ensayo y se compara el nivel de expresion del gen indicador con el de celulas no infectadas o celulas infectadas con virus de la gripe porcina de tipo silvestre. Un aumento en el nivel de expresion del gen indicador despues de la infeccion con el virus de la gripe porcina atenuado de ensayo indicana que el virus de la gripe porcina de ensayo esta induciendo una respuesta de IFN. Como alternativa, la induccion de respuestas de IFN puede determinarse midiendo la activacion transcripcional dependiente de IFN despues de la infeccion con el virus de la gripe porcina atenuado del ensayo. Puede analizarse la expresion de genes que se sabe que se inducen por IFN, por ejemplo, Mx, PKR, 2-5-oligoadenilatosintetasa, el complejo principal de histocompatibilidad (MHC) clase I, etc., por tecnicas
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conocidas para los expertos en la materia (por ejemplo, transferencias de Northern, transferencias de Western, PCR, etc.). La induccion de respuestas de IFN tambien puede determinarse midiendo la estado fosforilado de componentes de la ruta de IFN despues de la infeccion con un virus de la gripe porcina de ensayo, por ejemplo, IRF- 3, que se fosforila en respuesta a ARN bicatenario. En respuesta a IFN tipo I, la quinasa Jakl y la quinasa TyK2, las subunidades del receptor de IFN, STAT1, y STAT2 se fosforilan rapidamente en la tirosina. Por tanto, para determinar si el virus de la gripe porcina induce respuestas de IFN, se infectan celulas, tales como celulas 293, con el virus mutante de ensayo y despues de la infeccion, se lisan las celulas. Los componentes de la ruta IFN, tales como la quinasa Jakl o la quinasa TyK2, se inmunoprecipitan de los lisados celulares infectados, usando sueros o anticuerpos policlonales espedficos, y se determina el estado fosforilado de la tirosina de la quinasa por ensayos de inmunotransferencia con un anticuerpo anti-fosfotirosina (por ejemplo, vease Krishnan et al. 1997, Eur. J, Biochem. 247: 298-305). Un estado fosforilado potenciado de cualquiera de los componentes de la ruta IFN despues de la infeccion con el virus de la gripe porcina indicana la induccion de respuestas de IFN por el virus de la gripe porcina.
Ademas, la induccion de respuestas de IFN despues de la infeccion con un virus de la gripe porcina de ensayo puede determinarse midiendo la capacidad de unirse a secuencias de ADN espedficas o la translocacion de factores de transcripcion inducida en respuesta a infeccion viral, por ejemplo, IRF3, STAT1, STAT2, etc. En particular, STAT1 y STAT2 se fosforilan y translocan desde el citoplasma hasta el nucleo en respuesta a IFN tipo I. La capacidad de unirse a secuencias de ADN espedficas o la translocacion de factores de transcripcion puede medirse por tecnicas conocidas para los expertos en la materia, por ejemplo, ensayos de desplazamiento en gel por electromovilidad, tincion celular, etc. Otros ensayos que pueden usarse se describen en la solicitud de patente de Estados Unidos N° 09/829,711. En un aspecto preferido, sin embargo, se usan ensayos de crecimiento diferencial para seleccionar virus que tienen el fenotipo deseado, ya que el sistema hospedador usado (IFN-competente frente a IFN-deficiente) aplica la presion de seleccion apropiada.
Los virus de la gripe porcina atenuados de la presente invencion se seleccionan de forma optima en celulas de cerdo, incluyendo celulas de cerdo primarias, secundarias y lmeas celulares de cerdo. Puede usarse cualquier celula de cerdo que sea capaz de cultivar el virus de la gripe porcina. Las celulas de cerdo preferidas incluyen lmeas celulares renales porcinas, lmeas celulares de testmulo porcino y pulmon porcino. Las celulas de cerdo representativas incluyen, aunque sin limitacion, celulas PK(D1), celulas PK(15), celulas PK13, celulas NSK, celulas LLC-PK1, celulas LLC-PK1A, celulas ESK-4, celulas ST, celulas PT-K75, celulas PK-2a/CL 13 o celulas SJPL.
Los virus de la gripe porcina de la invencion pueden seleccionarse en celulas de cerdo por comparacion con virus de la gripe porcina de tipo silvestre, por ejemplo, A/Porcino/Texas/4199-2/98, en las mismas condiciones de cultivo. Los virus de la gripe porcina atenuados se seleccionan en base a caractensticas tales como tasas mas lentas de crecimiento, menores lesiones pulmonares tras infeccion de los cerdos, tftulos virales reducidos en fluido de lavado broncoalveolar (BALF) y deteccion reducida del virus en frotis nasales en comparacion con virus de la gripe porcina de tipo silvestre. Dichos virus de la gripe porcina atenuados tienen virulencia disminuida porque tienen una capacidad reducida de replicarse en sistemas competentes de interferon en comparacion con virus de la gripe porcina de tipo silvestre pero pueden generar una respuesta inmunitaria.
Las celulas de cerdo pueden infectarse con virus de la gripe porcina de tipo silvestre, por ejemplo, A/Porcino/Texas/4199-2/98, y mutantes de NS1 a una MOI espedfica y los tftulos virales en el sobrenadante pueden determinarse en momento espedficos post-infeccion. Puede usarse infeccion de las celulas de cerdo a mOi entre 0,0005 y 0,001, 0,001 y 0,01, 0,01 y 0,1, 0,1 y 1, o 1 y 10, o una MOI de 0,0005, 0,001, 0,005, 0,01, 0,05, 0,1, 0,5, 1,5 o 10. En una realizacion, se usa una MOI de 0,001. Los tftulos virales pueden determinarse de aproximadamente 2 a 10 dfas, 3 a 7 dfas, 3 a 5 dfas o 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 dfas post-infeccion. En un aspecto espedfico, los tftulos virales se determinan 5 dfas post-infeccion. Despues de cultivar el virus en celulas de cerdo, pueden ensayarse los tftulos virales en el sobrenadante. Puede usarse cualquier sistema para medir tftulos de virus de la gripe. Se describen sistemas representativos en la Seccion 5.7. En un aspecto particular, los tftulos virales en el sobrenadante se determinan por formacion de placas en diversos puntos temporales en celulas MDCK.
Los sistemas de seleccion descritos en la presente memoria abarcan medir la induccion de IFN determinando si un extracto de la celula o huevo infectado con el virus de la gripe porcina atenuado de ensayo es capaz de conferir actividad protectora contra infeccion viral. Mas espedficamente, se infectan grupos de huevos embrionados de gallina de 10 dfas edad con el virus de la gripe porcina mutante de ensayo o el virus de la gripe porcina de tipo silvestre. Aproximadamente 15 a 20 horas post-infeccion, se recoge el fluido alantoideo y se ensaya para la actividad IFN determinando la dilucion mas alta con actividad protectora contra infeccion por virus de la gripe porcina en celulas de cultivo tisular.
La patogenesis de virus de la gripe porcina mutantes de la invencion tambien puede evaluarse en cerdos in vivo. Los ensayos utiles incluyen evaluar lesiones pulmonares en lobulos pulmonares, frotis nasales y determinacion de tftulos virales en fluido de lavado broncoalveolar (BALF) por cualquier metodo conocido en la tecnica.
5.3 Propagacion de virus de la gripe porcina atenuado
En la presente memoria se describenmetodos para propagar virus de la gripe porcina atenuados en celulas (por ejemplo, celulas de cerdo), huevos embrionados, y animales. Los virus de la gripe porcina atenuados de la presente
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invencion pueden propagarse en cualquier sustrato que permita que el virus crezca hasta tftulos que permitan un uso del virus de la gripe porcina atenuado, descrito en la presente memoria. Los virus de la gripe porcina atenuados de la presente invencion pueden propagarse en cualquier sustrato que permita que el virus crezca hasta tftulos comparables a los determinados para cepas de virus de la gripe porcina de tipo silvestre en sustratos IFN- competentes. Los virus de la gripe porcina atenuados de la invencion pueden propagarse en sustratos IFN- deficientes. Los sustratos que son utiles para la seleccion de los virus de la gripe porcina atenuados de la invencion no tienen que usarse para la propagacion y viceversa.
De acuerdo con los metodos descritos en la presente memoria, los virus de la gripe porcina atenuados que pueden cultivarse en celulas (por ejemplo, celulas de cerdo), huevos embrionados, y animales se seleccionan entre cepas de origen natural, variantes o mutantes, virus mutagenizados, virus de redistribucion y/o modificados por ingeniena genetica. Los metodos descrito en la presente memoria abarcan el cultivo de los virus de la gripe porcina atenuados, preferiblemente usando condiciones de cultivo apropiadas (veanse por ejemplo, las condiciones de cultivo expuestas en la siguiente Seccion 6), y recogiendo el virus descendiente.
Los virus de la gripe porcina atenuados de la invencion pueden propagarse en celulas de cerdo. Las celulas de cerdo puede ser o no IFN-deficientes o producir niveles inferiores de IFN. Las celulas de cerdo preferidas incluyen lmeas celulares renales porcinas, lmeas celulares de testmulo porcino y lmeas celulares pulmonares porcinas. Las celulas de cerdo representativas incluyen, aunque sin limitacion, celulas PK(D1), celulas PK(15), celulas PK13, celulas SJPL, celulas NSK, celulas lLc-PK1, celulas LLC-PK1A, celulas ESK-4, celulas ST, celulas PT-K75, y celulas PK-2a/GL 13. En otro aspecto espedfico, los virus de la gripe porcina atenuados se propagan en celulas de pollo, por ejemplo, fibroblastos embrionarios de pollo derivados de huevos embrionados de 6 dfas de vida.
En ciertos aspectos, en la presente memoria se describen metodos para propagar los virus de la gripe porcina atenuados descritos en la presente memoria en huevos embrionados, por ejemplo, de 6 a 14 dfas de vida. En otros aspectos, pueden usarse huevos embrionados jovenes o inmaduros para propagar los virus de la gripe porcina atenuados de la invencion. Los huevos embrionados inmaduros abarcan huevos que son huevos de menos de diez dfas de vida, preferiblemente huevos de seis a nueve dfas de vida, huevos de seis a ocho dfas de vida, huevos de seis a siete dfas de vida o huevos de seis dfas de vida. Los huevos embrionados inmaduros tambien abarcan huevos que imitan de forma artificial huevos de hasta, pero de menor de diez dfas de vida, como resultado de alteraciones en las condiciones de cultivo, por ejemplo, cambios en las temperaturas de incubacion; tratamiento con farmacos; o cualquier otra alteracion que produzca un huevo con un desarrollo retardado, de modo que el sistema IFN no este completamente desarrollado en comparacion con huevos de diez a doce dfas de vida. Los virus de la gripe porcina pueden propagarse en diferentes localizaciones del huevo embrionado, por ejemplo, la cavidad alantoidea. Los huevos embrionados pueden ser huevos de gallina.
La descripcion abarca metodos y sustratos IFN-deficientes para el cultivo y aislamiento de virus de la gripe porcina atenuados. Vease, por ejemplo, la patente de Estados Unidos N° 6.573.079. Los sustratos IFN-deficientes que pueden usarse para apoyar el crecimiento de virus de la gripe porcina atenuados incluyen, aunque sin limitacion, celulas de origen natural, lmeas celulares, huevos embrionados, y sistemas IFN-deficientes, por ejemplo, celulas Vero, huevos embrionados jovenes; celulas recombinantes o lmeas celulares que se modifican para ser IFN- deficientes, por ejemplo, lmeas celulares IFN-deficientes derivadas de knockouts STAT1, knockouts IRF3, knockouts IRF7, knockouts PKR, etc.; huevos embrionados obtenidos de aves IFN-deficientes, especialmente aves de corral (por ejemplo, pollos, patos, pavos) incluyendo bandadas que se cnan para ser IFN-deficientes o aves transgenicas (por ejemplo, knockouts STAT1). En ciertos aspectos, el sustrato IFN-deficiente no es celulas Vero y/o no una lmea celular STAT1-deficiente.
El sistema, celulas, lmeas celulares, huevos o animales hospedadores pueden modificarse por ingeniena genetica para que expresen transgenes que codifican inhibidores del sistema IFN, por ejemplo, mutantes dominantes- negativos, tales como STAT1 que carece del dominio de union a ADN, ARN antisentido, ribozimas, inhibidores de la produccion de IFN, inhibidores de la senalizacion de IFN, y/o inhibidores de genes antivirales inducidos por IFN. Debe reconocerse que los animales que se cnan o se modifican por ingeniena genetica para que sean IFN- deficientes estaran algo inmunocomprometidos, y deben mantenerse en un entorno controlado sin enfermedad. Por tanto, deben tomarse medidas apropiadas (incluyendo el uso de antibioticos en la dieta) para limitar el riesgo de exposicion a agentes infecciosos de animales IFN-deficientes transgenicos, tales como ratones, bandadas de gallinas reproductoras, patos, pavos etc. Como alternativa, el sistema hospedador, por ejemplo, celulas, lmeas celulares, huevos o animales puede tratarse con un compuesto que inhibe la produccion de IFN y/o la ruta de IFN por ejemplo, farmacos, anticuerpos, moleculas antisentido, moleculas de ribozima que abordan el gen STAT1, y/o genes antivirales inducidos por IFN.
Adjunto se describen metodos para cultivar y aislar virus de la gripe porcina que tienen actividad antagonista de IFN alterada en celulas y lmeas celulares que no tienen de forma natural una ruta IFN o tienen una ruta IFN deficiente o tienen una deficiencia en el sistema IFN, por ejemplo, niveles bajos de expresion de IFN en comparacion con celulas de tipo silvestre. En un aspecto particular, en la presente memoria se describen metodos para cultivar virus de la gripe porcina atenuados de la invencion en fibroblastos embrionarios de pollo derivados de huevos embrionados de 6 dfas de edad, o celulas Vero, o huevos embrionados IFN-comprometidos (por ejemplo, huevos embrionados inmaduros tales como huevos embrionados de 6, 7 u 8 dfas de vida). En otro aspecto, en la presente memoria se
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describen metodos para cultivar virus de la gripe porcina atenuados en celulas donde las celulas no son celulas Vero.
En la presente memoria se describen metodos para cultivar y aislar virus de la gripe porcina a partir de un sustrato IFN-deficiente modificado por ingeniena genetica. En la presente memoria se describen cerdos y aves transgenicas en que esta mutado un gen esencial para el sistema IFN, por ejemplo, STAT1, que pondnan huevos que son IFN deficientes. Adicionalmente, en la presente memoria se describen transgenicos de ave que expresan factores de transcripcion dominantes-negativos, por ejemplo, STAT1 que carece del dominio de union a ADN, ribozimas, ARN antisentido, inhibidores de la produccion de IFN, inhibidores de la senalizacion de IFN, e inhibidores de genes antivirales inducidos en respuesta a IFN.
En la presente memoria se describen lmeas celulares o animales recombinantes, en particular cerdos y aves, en que se ha mutado (por ejemplo, interrumpido, es decir, es un "knockout") uno o mas genes esenciales para la smtesis de IFN, la ruta de IFN, y/o un gen antiviral inducido por IFN, por ejemplo, receptor de interferon, STAT1, PKR, ERF3, ERF7, etc. El animal recombinante puede ser cualquier animal (tal como un raton, un cerdo o una ave, por ejemplo, pollo, pavo, gallina, pato, etc. (vease, por ejemplo, Sang, 1994, Trends Biotechnol. 12:415; Perry, et al., 1993, Transgenic Res. 2:125; Stern, CD., 1996, Curr Top Microbiol Immunol 212:195-206; y Shuman, 1991, Experientia 47:897 para revisiones respecto a la produccion de transgenicos de ave)). En un aspecto espedfico, el animal recombinante es un cerdo. Dicha lmea celular o animal puede generarse por cualquier metodo conocido en la tecnica para alterar un gen en el cromosoma de la celula o animal. Dichas tecnicas incluyen, aunque sin limitacion, microinyeccion pronuclear (Hoppe y Wagner, 1989, Patente de Estados Unidos N° 4.873.191); transferencia genica mediada por retrovirus en lmeas germinales (Van der Putten et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 82:6148-6152); direccionamiento genico en celulas madre embrionarias (Thompson et al., 1989, Cell 56:313); electroporacion de embriones (Lo, 1983, Mol Cell. Biol. 3:1803); y transferencia genica mediada por esperma (Lavitrano et al.; 1989, Cell 57:717); etc. Para una revision de dichas tecnicas, vease Gordon, 1989, Transgenic Animals, Intl. Rev. Cytol. 115:171.
En particular, puede producirse un animal genosuprimido (knockout) STAT1 promoviendo la recombinacion homologa entre un gen STAT1 en su cromosoma y un gen STAT1 exogeno que se ha vuelto biologicamente inactivo (preferiblemente por insercion de una secuencia heterologa, por ejemplo, un gen de resistencia a antibiotico). Se describen metodos de recombinacion homologa para alterar genes en el genoma de raton, por ejemplo, en Capecchi (1989, Science 244:1288) y Mansour et al. (1988, Nature 336:348-352).
En resumen, todo o una parte de un clon genomico de STAT1 se afsla del ADN genomico de la misma especie que la celula o animal knockout. El clon genomico de STAT1 puede aislarse mediante cualquier metodo conocido en la tecnica para el aislamiento de clones genomicos (por ejemplo, sondeando una biblioteca genomica con una sonda derivada de una secuencia STAT1 tal como STAT1 de cerdo (N° de acceso a Genbank ABl 16564 y NM_213769) y aquellas secuencias proporcionadas en, vease, Meraz et al. 1996, Cell 84: 431-442; Durbin et al. 1996, Cell 84: 443450, y referencias citadas en ese documento). Una vez aislado el clon genomico, se introduce todo o una parte del clon en un vector recombinante. Preferiblemente, la parte del clon introducida en el vector contiene al menos una parte de un exon del gen STAT1, es decir, contiene una secuencia codificante de la protema STAT1. Despues se introduce una secuencia no homologa a la secuencia STAT1, preferiblemente un marcador de seleccion positiva, tal como un gen que codifica un gen de resistencia antibiotico, en el exon del gen STAT1. El marcador de seleccion se une preferiblemente de forma funcional a un promotor, mas preferiblemente un promotor constitutivo. La secuencia no homologa se introduce en cualquier parte en la secuencia codificante de STAT1 que alterara la actividad STAT1, por ejemplo, en una posicion donde se ha demostrado que mutaciones puntuales u otras mutaciones inactivan la funcion proteica STAT1. Por ejemplo, pero no a modo de limitacion, la secuencia no homologa puede insertarse en la secuencia codificante para la parte de la protema STAT1 que contiene todo o una parte del dominio quinasa (por ejemplo, la secuencia de nucleotidos que codifica al menos 50, 100, 150, 200 o 250 aminoacidos del dominio quinasa).
El marcador de seleccion positiva es preferiblemente un gen de resistencia a neomicina (gen neo) o un gen de resistencia a higromicina (gen hygro). El promotor puede ser cualquier promotor conocido en la tecnica; a modo de ejemplo el promotor puede ser el promotor de la fosfoglicerato quinasa (PGK) (Adra et al., 1987, Gene 60:65-74), el promotor Polll (Soriano et al., 1991, Cell 64:693-701), o el promotor MCI, que es un promotor sintetico disenado para la expresion en celulas madre derivadas de embrion (Thomas y Capecchi, 1987, Cell 51:503-512). El uso de un marcador de seleccion, tal como un gen de resistencia a antibiotico, permite la seleccion de celulas que han incorporado el vector de direccionamiento (por ejemplo, la expresion del producto genico neo confiere resistencia a G418, y la expresion del producto genico hygro confiere resistencia a higromicina).
Un marcador de seleccion negativa para una etapa de contraseleccion para recombinacion homologa, en oposicion a no homologa, del vector puede insertarse fuera del inserto del clon genomico de STAT1. Por ejemplo, dicho marcador de seleccion negativa es el gen de la timidina quinasa de HSV (HSV-tk), cuya expresion hace a las celulas sensibles a ganciclovir. El marcador de seleccion negativa esta preferiblemente bajo el control de un promotor tal como, aunque sin limitacion el promotor de PGK, el promotor PolII o el promotor MCI.
Cuando sucede recombinacion homologa, las partes del vector que son homologas al gen STAT1, asf como el
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inserto no homologo dentro de las secuencias genicas de STAT1, se incorporan en el gen STAT1 en el cromosoma, y el resto del vector se pierde. Por tanto, como el marcador de seleccion negativa esta fuera de la region de homologfa con el gen STAT1, las celulas en que ha sucedido recombinacion homologa (o su descendencia), no contendran el marcador de seleccion negativa. Por ejemplo, si el marcador de seleccion negativa es el gen HSV-M, las celulas en que ha sucedido recombinacion homologa no expresaran la timidina quinasa y sobreviviran a la exposicion a ganciclovir. Este procedimiento permite la seleccion de celulas en que ha sucedido recombinacion homologa, en comparacion con la recombinacion no homologa en que es probable que el marcador de seleccion negativa tambien este incorporado en el genoma junto con las secuencias de STAT1 y el marcador de seleccion positiva. Por tanto, las celulas en que ha sucedido recombinacion no homologa muy probablemente expresanan la timidina quinasa y senan sensibles a ganciclovir.
Una vez preparado el vector de direccionamiento, se linealiza con una enzima de restriccion para la cual existe un sitio unico en el vector de direccionamiento, y el vector linealizado se introduce en celulas madre derivadas de embrion (ES) (Gossler et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:9065-9069) por cualquier metodo conocido en la tecnica, por ejemplo por electroporacion. Si el vector de direccionamiento incluye un marcador de seleccion positiva y un marcador de contraseleccion negativa, las celulas ES en que ha sucedido recombinacion homologa pueden seleccionarse por incubacion en medio selectivo. Por ejemplo, si los marcadores de seleccion son el gen de resistencia neo y el gen HSV-tk, las celulas se exponen a G418 (por ejemplo, aproximadamente 300 |ig/ml) y ganciclovir (por ejemplo, aproximadamente 2 |iM).
Puede usarse cualquier tecnica conocida en la tecnica para genotipado, por ejemplo aunque sin limitacion analisis de transferencia de Southern o la reaccion en cadena de la polimerasa, para confirmar que las secuencias de STAT1 alteradas se han recombinado de forma homologa en el gen STAT1 en el genoma de las celulas ES. Como el mapa de restriccion del clon genomico de STAT1 es conocido y la secuencia de la secuencia codificante de STAT1 es conocida (vease Meraz et al. 1996, Cell 84:431, Durbin et al. 1996, Cell 84:443-450, y todas las referencias citadas en esos documentos), puede determinarse el tamano de un fragmento de restriccion o producto de amplificacion por PCR particular generado a partir de ADN de alelos tanto alterados como no alterados. Por tanto, ensayando un fragmento de restriccion o producto de PCR, se puede determinar el tamano del cual difiere entre el gen STAT1 alterado y no alterado, si ha sucedido recombinacion homologa para alterar el gen STAT1.
Despues, celulas ES con el locus STAT1 alterado pueden introducirse en blastocitos por microinyeccion y despues los blastocitos pueden implantarse en los uteros de ratonas pseudoprenadas usando tecnicas habituales. El animal que se desarrolla a partir de los blastocitos implantados es quimerico para el alelo alterado. Los machos quimericos pueden cruzarse con hembras, y este cruce puede disenarse de tal modo que la transmision de la lmea germinal del alelo este ligada a la transmision de un cierto color de pelaje. La transmision de la lmea germinal del alelo puede confirmarse por transferencia de Southern o analisis de PCR, como se ha descrito anteriormente, del ADN genomico aislado de muestras tisulares.
Puede usarse cualquier gen cuyo producto sea importante para la regulacion de interferones. Otras mutaciones en la ruta de interferon que pueden usarse de acuerdo con la presente descripcion incluyen versiones deficientes en quinasa de Jakl, TyK2 o factores de transcripcion que carecen de los dominios de union a ADN STAT1, y STAT2 (vease, por ejemplo, Krishnan et al., 1997, Eur. J. Biochem. 247: 298-305).
Para la purificacion de virus, el virus de la gripe porcina atenuado se retira del cultivo celular y se separa de los componentes celulares, tfpicamente mediante procedimientos de aclarado bien conocidos, por ejemplo, tales como centrifugacion en gradiente y cromatograffa en columna, y puede aislarse adicionalmente segun se desee usando procedimientos bien conocidos para los expertos en la materia, por ejemplo, ensayos de placa.
5.4 Usos de virus atenuados
Pueden usarse virus de la gripe porcina atenuados de la invencion como vectores virales para la produccion de protemas heterologas como se describe en la patente de Estados Unidos N° 5.820.871.
Pueden usarse virus de la gripe porcina atenuados de la invencion en ensayos de seleccion para identificar protemas virales con funcion antagonizante de interferon, para identificar protemas virales que tengan capacidad de replicacion del complemento de un virus atenuado con capacidad alterada de antagonizar respuestas de interferon celular y ensayos de seleccion para identificar agentes anti-virales que inhiban la actividad antagonista de interferon e inhiban la replicacion viral como se describe en la patente de Estados Unidos N° 6.635.416.
Pueden usarse virus de la gripe porcina atenuados de la invencion para producir anticuerpos que pueden usarse en inmunoensayos de diagnostico, inmunoterapia pasiva, y generacion de anticuerpos antiidiotipo. Por ejemplo, puede administrarse un virus de la gripe porcina atenuado que comprende un genoma que comprende una mutacion en el gen de NS1 y una secuencia heterologa (por ejemplo, un antfgeno tumoral) a un sujeto (por ejemplo, un cerdo) para generar anticuerpos que despues pueden aislarse y usarse en ensayos de diagnostico, inmunoterapia pasiva y generacion de anticuerpos antiidiotipo. Los anticuerpos generados pueden aislarse mediante tecnicas convencionales conocidas en la tecnica (por ejemplo, cromatograffa de inmunoafinidad, centrifugacion, precipitacion, etc.) y usarse en inmunoensayos de diagnostico, inmunoterapia pasiva y generacion de anticuerpos antiidiotipo. Los
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anticuerpos aislados, antes de usarse en inmunoterapia pasiva, pueden modificarse, por ejemplo, los anticuerpos pueden quimerizarse o humanizarse. Veanse, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos N° 4.444.887 y 4.716.111; y las publicaciones internacionales N° WO 98/46645, WO 98/50433, WO 98/24893, WO98/16654, WO96/34096, WO 96/33735, y WO 91/10741, para revisiones sobre la generacion de anticuerpos quimericos y humanizados.
Los anticuerpos aislados de sujetos a los que se ha administrado un virus de la gripe porcina atenuado de la invencion tambien pueden usarse para controlar el tratamiento y/o el progreso de la enfermedad. Puede usarse cualquier sistema de inmunoensayo conocido en la tecnica para este proposito incluyendo, aunque sin limitacion, sistemas de ensayo competitivo y no competitivo usando tecnicas tales como radioinmunoensayo, ELISA (ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas), inmunoensayos tipo "sandwich", reacciones de precipitina, reacciones de precipitina por difusion en gel, ensayos de inmunodifusion, ensayos de aglutinacion, ensayos de fijacion del complemento, ensayos inmuno-radiometricos, inmunoensayos fluorescentes, inmunoensayos de proterna A y ensayos de inmunoelectroforesis, por nombras unos pocos.
Los anticuerpos generados por los virus de la gripe porcina atenuados de la invencion tambien pueden usarse en la produccion de anticuerpos antiidiotipo. El anticuerpo antiidiotipo despues puede, a su vez, usarse para inmunizacion, para producir una subpoblacion de anticuerpos que se unan al antfgeno inicial del microorganismo patogenico (Jerne, 1974, Ann. Immunol. (Paris) 125c:373; Jerne et al., 1982, EMBO J. 1:234).
En procedimientos de inmunizacion, la cantidad de inmunogeno a usar y el programa de inmunizacion se determinaran por el medico experto en la materia y se administraran por referencia a la respuesta inmunitaria y los tftulos de anticuerpo del sujeto.
5.5 Formulaciones de vacuna/formulaciones inmunogenicas
En la presente memoria se describen formulaciones de vacuna y formulaciones inmunogenicas que comprenden un virus de la gripe porcina atenuado que tiene una capacidad alterada de antagonizar la respuesta IFN celular (es decir, virus de la gripe porcina con mutaciones en el gen de NS1 que alteran la capacidad del virus de inducir una respuesta de IFN celular), y un excipiente adecuado. El virus de la gripe porcina atenuado, usado en la formulacion de vacuna o formulacion inmunogenica, puede seleccionarse entre mutantes o variantes de origen natural, virus mutagenizados o virus modificados por ingeniena genetica. El virus de la gripe porcina atenuado puede estar modificado por ingeniena genetica. El virus de la gripe porcina atenuado puede estar aislado o purificado. Las cepas atenuadas de virus de la gripe porcina tambien pueden generarse mediante tecnicas de redistribucion, tecnologfa de plasmidos sin auxiliar o usando una combinacion del enfoque de genetica inversa o tecnologfa de plasmidos sin auxiliary tecnicas de redistribucion. Las variantes de origen natural incluyen virus aislados de la naturaleza asf como variantes que suceden de forma espontanea generadas durante la propagacion del virus, que tienen una capacidad alterada de antagonizar la respuesta de IFN celular. El virus de la gripe porcina atenuado puede usarse en sf mismo como el principio activo en la formulacion de vacuna o formulacion inmunogenica. Como alternativa, el virus de la gripe porcina atenuado puede usarse como el vector o "estructura" de vacunas o formulaciones inmunogenicas producidas de forma recombinante. Para este fin, pueden usarse tecnicas recombinantes tales como genetica inversa (o, para virus segmentados, combinaciones de las tecnicas de genetica inversa y redistribucion) para disenar mutaciones o introducir antfgenos exogenos en el virus de la gripe porcina atenuado usado en la formulacion de vacuna o formulacion inmunogenica. De este modo, pueden disenarse vacunas para inmunizacion contra variantes de cepa, o como alternativa, contra agentes infecciosos o antfgenos de enfermedad completamente diferentes.
Puede construirse casi cualquier secuencia genica heterologa en los virus de la gripe porcina atenuados de la invencion para su uso en vacunas o formulaciones inmunogenicas. Preferiblemente, pueden expresarse epftopos que inducen una respuesta inmunitaria protectora contra cualquiera de una diversidad de patogenos, o antfgenos que se unen a anticuerpos neutralizantes por o como parte de los virus. Por ejemplo, las secuencias genicas heterologas que pueden construirse en los virus de la invencion para su uso en vacunas y formulaciones inmunogenicas incluyen, aunque sin limitacion, determinantes antigenicos de patogenos no virales tales como bacterias y parasitos. Puede expresarse todo o partes de los genes de inmunoglobulina. Por ejemplo, pueden construirse regiones variables de inmunoglobulinas anti-idiotipo que imitan dichos epftopos en los virus de la invencion. Pueden expresarse antfgenos asociados a tumor. Ejemplos de antfgenos tumorales incluyen, aunque sin limitacion, antfgeno de pan-carcinoma KS 1/4, antfgeno de carcinoma de ovario (CA125), fosfato acido prostatico, antfgeno espedfico de prostata, antfgeno asociado a melanoma p97, antfgeno de melanoma gp75, antfgeno de melanoma de alto peso molecular (HMW-MAA), antfgeno de membrana espedfico de prostata, antfgeno carcinoembrionario (CEA), antfgeno de mucina epitelial polimorfica, antfgeno globular de la grasa de la leche, antfgenos asociados a tumor colorrectal (tales como: CEA, TAG-72, CO17-1A; GICA 19-9, CTA-1 y LEA), antfgeno de linfoma de Burkitt-38.13, CD19, antfgeno-CD20 de linfoma B, CD33, antfgenos espedficos de melanoma (tales como gangliosido GD2, gangliosido GD3, gangliosido GM2, gangliosido GM3), tipo de trasplante espedfico de tumor del antfgeno de superficie celular (TSTA) (tal como antfgenos tumorales inducidos por virus incluyendo virus tumorales de ADN e antfgeno T y antfgenos de envuelta de virus tumorales de ARN), antfgeno oncofetal-alfa- fetoprotema tal como CEA de colon, antfgeno oncofetal de tumor de vejiga, antfgeno de diferenciacion (tal como human antfgeno de carcinoma pulmonar L6 y L20), antfgenos de fibrosarcoma, antfgeno-Gp37 de celulas T de leucemia, neoglucoprotema, esfingoftpidos, antfgenos de cancer de mama (tales como EGFR (receptor del factor de
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crecimiento epidermico), antigeno HER2 (p185 ) y epftopo HER2 neu), mucina epitelial polimorfica (PEM),
antigeno-APO-1 de linfocitos humanos malignos, antigeno de diferenciacion (tal como antigeno I encontrado en eritrocitos fetales, endodermo primario, antigeno I encontrado en eritrocitos adultos, embriones preimplante, I(Ma) encontrado en adenocarcinomas gastricos, M18, M39 encontrados en epitelio de mama, SSEA-1 encontrado en celulas mieloides, VEP8, VEP9, Myl, VTM-D5, Di56-22 encontrados en cancer colorrectal, TRA-1-85 (grupos sangumeo H), C14 encontrado en adenocarcinoma de colon, F3 encontrado en adenocarcinoma pulmonar, AH6 encontrado en cancer gastrico, hapteno Y, Ley encontrado en celulas de carcinoma embrionario, TL5 (grupos sangumeo A), receptor de EGF encontrado en celulas A431, serie Ei (grupos sangumeo B) encontrada en cancer pancreatico, FC10.2 encontrado en celulas de carcinoma embrionario, antfgeno de adenocarcinoma gastrico, CO- 514 (grupos sangumeo Lea) encontrado en adenocarcinoma, NS-10 encontrado en adenocarcinomas, CO-43 (grupo sangumeo Leb), G49 encontrado en el receptor de EGF de celulas A431, MH2 (grupo sangumeo ALeb/Ley) encontrado en adenocarcinoma de colon, 19.9 encontrado en cancer de colon, mucinas de cancer gastrico, T5A7 encontrado en celulas mieloides, R24 encontrado en melanoma, 4.2, Gd3, D1.1, OFA-1, Gm2, OFA-2, Gd2 y Ml:22:25:8 encontrados en celulas de carcinoma embrionario, y SSEA-3 y SSEA-4 encontrados en embriones en fase de 4 a 8 celulas), peptido derivado del receptor de celulas T de un linfoma cutaneo de celulas T, protema C-reactiva (CRP), antfgeno canceroso-50 (CA-50), antfgeno canceroso 15-3 (CA15-3) asociado con cancer de mama, antfgeno canceroso-19 (CA-19) y antfgeno canceroso-242 asociados con canceres gastrointestinales, antfgeno asociado a carcinoma (CAA), cromogranina A, antfgeno de mucina epitelial (MC5), antfgeno espedfico de epitelio humano (HEA), antfgeno de Lewis(a), antigeno de melanoma, antfgenos asociados a melanoma 100, 25, y 150, antfgeno asociado a carcinoma tipo mucina, protema relacionada con resistencia a multiples farmacos (MRPm6), protema relacionada con resistencia a multiples farmacos (MRP41), protema del oncogen Neu (C-erbB-2), enolasa espedfica de neuronas (NSE), P-glucoprotema (producto genico mdr1), antfgeno relacionado con resistencia a multiples farmacos, pI70, antigeno relacionado con resistencia a multiples farmacos, antfgeno espedfico de prostata (PSA), CD56, y NCAM.
Puede formularse una vacuna o formulacion inmunogenica de virus de la gripe porcina recombinante vivo o una vacuna o formulacion inmunogenica de virus de la gripe porcina recombinante inactivado. Un virus de la gripe porcina puede inactivarse por metodos bien conocidos para los expertos en la materia. Los metodos habituales usan formalina y calor para la inactivacion. Vease, por ejemplo, la patente de Estados Unidos N° 6.635.246. Otros metodos incluyen los descritos en las patentes de Estados Unidos N° 5.891.705; 5.106.619 y 4.693.981.
Puede preferirse una vacuna o formulacion inmunogenica viva porque la multiplicacion en el hospedador conduce a un estfmulo prolongado de tipo y magnitud similares a lo que sucede en infecciones naturales, y por lo tanto, confiere inmunidad sustancial de larga duracion. La produccion de dichas formulaciones de vacuna y formulaciones inmunogenicas de virus de la gripe porcina recombinante vivo puede conseguirse usando metodos convencionales que implican la propagacion de virus de la gripe porcina en cultivo celular o en el alantoides del embrion de pollo seguida de purificacion. Ademas, los virus de la gripe porcina atenuados pueden inducir una contundente respuesta de IFN que tiene otras consecuencias biologicas in vivo, produciendo proteccion contra posteriores enfermedades infecciosas y/o induciendo respuestas antitumorales.
Las formulaciones de vacuna y formulaciones inmunogenicas pueden incluir virus de la gripe porcina modificados por ingeniena genetica que tienen mutaciones en el gen de NS1 incluyendo, aunque sin limitacion, los mutantes de gripe de NS1 truncado descritos en los ejemplos de trabajo, infra. Tambien pueden formularse usando variantes naturales. Cuando se formulan como una vacuna de virus vivo, puede usarse un intervalo de aproximadamente 102 a 108, preferiblemente de aproximadamente 103 a 107, mas preferiblemente de 104 ufp a aproximadamente 5 x 106, y lo mas preferiblemente debe usarse de 104 a 107 ufp por dosis.
El virus de la gripe porcina puede contener mutaciones en el segmento genico NS1 que pueden no provocar una actividad antagonista de IFN alterada o un fenotipo inductor de IFN sino que mas bien provocan funciones virales alteradas y un fenotipo atenuado por ejemplo, inhibicion alterada de la exportacion nuclear de ARNm que contiene poli(A), inhibicion alterada de corte y ayuste de pre-ARNm, inhibicion alterada de la activacion de PKR mediante el secuestro de ARNbc, efecto alterado sobre la traduccion del ARN viral e inhibicion alterada de la poliadenilacion del ARNm del hospedador (por ejemplo, vease Krug en Textbook of Gripe, Nicholson et al. Ed. 1998, 82-92, y referencias citadas en ese documento).
Pueden usarse muchos metodos para introducir las formulaciones de vacuna y formulaciones inmunogenicas descritas anteriormente, estos incluyen, aunque sin limitacion, las vfas intranasal, intratraqueal, oral, intradermica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, y subcutanea. Puede ser preferible introducir la formulacion de vacuna o formulacion inmunogenica del virus de la gripe porcina mediante la via natural de infeccion del patogeno para el cual esta disenada la vacuna, o mediante la via natural de infeccion del virus de tipo silvestre. Cuando se usa una preparacion de vacuna o formulacion inmunogenica de virus de la gripe porcina atenuado vivo, puede ser preferible introducir la formulacion mediante la via natural de infeccion para el virus de la gripe. Puede usarse la capacidad del virus de la gripe de inducir una vigorosa respuesta inmunitaria secretora y celular de forma ventajosa. Por ejemplo, la infeccion del tracto respiratorio por virus de la gripe porcina atenuados puede inducir una fuerte respuesta inmunitaria secretora, por ejemplo en el sistema urogenital, con proteccion concomitante contra un agente causante de enfermedad particular.
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En un aspecto espedfico, puede ser deseable administrar las composiciones descritas en la presente memoria de forma local al area que necesita tratamiento; esto puede conseguirse por, por ejemplo, y no a modo de limitacion, infusion local durante cirugfa, por inyeccion, mediante un cateter, o mediante un implante, siendo dicho implante de un material poroso, no poroso, o gelatinoso, incluyendo membranas, tales como membranas sialasticas, o fibras. En un aspecto, la administracion puede ser por inyeccion directa en el sitio (o sitio anterior) de infeccion.
Podna administrarse una vacuna o formulacion inmunogenica descrita en la presente memoria, que comprende de 102 a 108 ufp, preferiblemente de aproximadamente 103 a 107, mas preferiblemente de 104 ufp a aproximadamente 5 x 106 ufp de virus de la gripe porcina atenuado con actividad antagonista de IFN alterada, una vez a un sujeto. Como alternativa, podna administrarse una vacuna o formulacion inmunogenica descrita en la presente memoria, que comprende de 102 a 108, preferiblemente de aproximadamente 103 a 107, mas preferiblemente de 104 a aproximadamente 5 x 106 ufp de virus mutantes con actividad antagonista de IFN alterada, dos veces, tres veces, cuatro veces, cinco veces, seis veces, siete veces, ocho veces, nueve veces, o diez veces a un sujeto con un intervalo de 2 a 6 meses, 2 a 8 meses, 2 a 10 meses, o 2 a 12 meses entre dosis. Como alternativa, podna administrarse una vacuna o formulacion inmunogenica descrita en la presente memoria, que comprende de 102 a 108, preferiblemente de aproximadamente 103a 107, mas preferiblemente de 104 ufp a aproximadamente 5 x 106 ufp de virus mutantes con actividad antagonista de IFN alterada, tan a menudo como fuera necesario a un sujeto. El sujeto puede ser un cerdo.
Una formulacion de vacuna o una formulacion inmunogenica puede no provocar proteccion completa de una infeccion (por ejemplo, una infeccion viral), pero provoca un tttulo inferior o cantidad reducida del patogeno (por ejemplo, un virus) en comparacion con un sujeto no tratado. Los beneficios incluyen, aunque sin limitacion, menor gravedad de los smtomas de la infeccion y una reduccion en la duracion de la enfermedad o afeccion asociada con la infeccion.
La formulacion de vacuna o formulacion inmunogenica de la invencion puede usarse para proteger contra infecciones por virus de la gripe porcina. En otros aspectos, se usa una formulacion de vacuna descrita en la presente memoria para proteger contra infeccion por otro virus porcino incluyendo, aunque sin limitacion, el virus del smdrome reproductor y respiratorio porcino, citomegalovirus porcino, coronavirus respiratorio porcino, virus de la encefalomiocarditis porcina, diarrea epidemica porcina. La formulacion de vacuna o formulacion inmunogenica de la invencion puede usarse para proteger contra infecciones por patogenos diferentes a un virus porcino.
Una formulacion inmunogenica de la invencion puede usarse para prevenir, tratar, controlar o mejorar afecciones en que es beneficiosa la induccion de una respuesta inmunitaria contra un antfgeno particular.
5.6 Formulaciones farmaceuticas
La presente invencion abarca formulaciones farmaceuticas que comprenden virus de la gripe porcina de la presente invencion con actividad antagonista de IFN alterada a usarse como agentes anti-virales o agentes anti-tumorales o como agentes contra enfermedades tratables por IFN. Las formulaciones farmaceuticas pueden tener utilizada como un profilactico anti-viral y pueden administrarse a un cerdo en riesgo de quedar infectado o se espera que este expuesto a un virus, por ejemplo, virus de la gripe porcina. Las formulaciones farmaceuticas pueden tener utilidad como agente terapeutico o profilactico para una enfermedad tratable por IFN y por tanto, pueden usarse para tratar, prevenir, controlar o mejorar trastornos tratables por IFN. Las formulaciones farmaceuticas pueden tener utilidad como un agente terapeutico o profilactico para una enfermedad porcina tratable por IFN y por tanto, pueden usarse para tratar, prevenir, controlar o mejorar trastornos porcinos tratables por IFN. En aspectos espedficos, las formulaciones farmaceuticas descritas en la presente memoria tienen utilidad como un agente terapeutico o profilactico para una enfermedad tratable por IFN y por tanto, pueden usarse para tratar, prevenir, controlar o mejorar trastornos tratables por IFN en burros, cebras, camellos, perros, aves (por ejemplo, patos). Las formulaciones farmaceuticas de la invencion pueden tener utilidad como un agente terapeutico o profilactico para una enfermedad tratable por IFN y por tanto, pueden usarse para tratar, prevenir, controlar o mejorar trastornos tratables por IFN en cerdos.
Una formulacion farmaceutica de la invencion puede comprender un virus de la gripe porcina atenuado quimerico de la presente invencion que comprende una secuencia heterologa. La secuencia heterologa puede codificar un epftopo de un antfgeno foraneo o tumoral. Puede seleccionarse un antfgeno foraneo de otro virus, una bacteria o un parasito. Las formulaciones farmaceuticas pueden usarse para tratar tumores o prevenir la formacion de tumores, por ejemplo, en cerdos que tienen cancer o en aquellos que estan en alto riesgo de desarrollar neoplasias o cancer. Por ejemplo, puede tratarse a un sujeto (por ejemplo, un cerdo, burro, u otro animal que pueda infectarse con virus de la gripe porcina o en que pueda replicarse el virus de la gripe porcina) con cancer para prevenir la tumorigenesis adicional. Como alternativa, puede tratarse a cerdos que estan o se espera que esten expuestos a carcinogenos. Como alternativa, puede tratarse a cerdos que tienen que estar expuestos a radiacion antes de la exposicion y despues de ello. Los canceres espedficos que pueden tratarse con las composiciones de la presente invencion incluyen, aunque sin limitacion, canceres del utero, glandula mamaria, pancreas, piel, ganglio linfatico, vulva y testfculo.
Las propiedades antitumorales de los virus y formulaciones de la invencion pueden estar al menos parcialmente
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relacionadas con su capacidad de inducir IFN y respuestas de IFN. Como alternativa, las propiedades antitumorales de los virus de la gripe porcina atenuados de la invencion pueden estar relacionadas con su capacidad de crecer espedficamente en y eliminar celulas tumorales, muchas de las cuales se sabe que tienen deficiencias en el sistema IFN. Independientemente del mecanismo o mecanismos moleculares responsables de las propiedades antitumorales, los virus de la gripe porcina atenuados de la invencion pueden usarse para tratar tumores o para prevenir la formacion de tumores.
En la presente memoria se describen los virus de la gripe porcina con un fenotipo antagonista de IFN alterado que estan dirigidos a organos, tejidos y/o celulas espedficas en el cuerpo para inducir efectos terapeuticos o profilacticos de forma local. Una ventaja de dicho enfoque es que los virus de la gripe porcina que inducen IFN descritos en la presente memoria estan dirigidos a sitios espedficos, por ejemplo la localizacion de un tumor, para inducir IFN en de un modo espedfico de sitio para un efecto terapeutico en lugar de inducir IFN de forma sistemica, que puede tener efectos toxicos.
Los virus de la gripe porcina que inducen IFN descritos en la presente memoria pueden modificarse por ingeniena usando los metodos descritos en la presente memoria para expresar protemas o peptidos que diriginan los virus a un sitio particular. En un aspecto espedfico, los virus de la gripe porcina que inducen IFN estanan dirigidos a sitios de tumores. En dicho aspecto, los virus de la gripe porcina pueden modificarse por ingeniena para expresar el sitio de combinacion con antfgeno de un anticuerpo que reconoce un antfgeno espedfico de tumor, dirigiendo de este modo al virus de la gripe porcina que induce IFN al tumor. En otro aspecto, cuando el tumor a abordar expresa un receptor de hormonas, tal como tumores de mama u ovario que expresan receptores de estrogenos, el virus de la gripe porcina que induce IFN puede modificarse por ingeniena para expresar la hormona apropiada. En otro aspecto mas, cuando el tumor a abordar expresa un receptor para un factor de crecimiento, por ejemplo VEGF, eGf, o PDGF, el virus que induce IFN puede modificarse por ingeniena para expresar el factor de crecimiento apropiado o fragmento del mismo. Por tanto, de acuerdo con la descripcion, los virus de la gripe porcina que inducen iFn pueden modificarse por ingeniena para expresar cualquier producto genico diana, incluyendo peptidos, protemas, tales como enzimas, hormonas, factores de crecimiento, antfgenos o anticuerpos, que funcionaran dirigiendo el virus de la gripe porcina al sitio que necesita tratamiento (por ejemplo, terapia anti-viral, antibacteriana, anti-microbiana o anti- cancerosa).
Los metodos de introduccion incluyen, aunque sin limitacion, las vfas intradermica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutanea, intranasal, epidural, y oral. Las formulaciones farmaceuticas de la presente invencion pueden administrarse por cualquier via conveniente, por ejemplo por infusion o inyeccion en embolada, por absorcion a traves de revestimientos epiteliales o mucocutaneos (por ejemplo, mucosa oral, mucosa rectal e intestinal, etc.) y pueden administrarse junto con otros agentes biologicamente activos. La administracion puede ser sistemica o local. Ademas, en un aspecto preferido, puede ser deseable introducir las formulaciones farmaceuticas de la invencion en los pulmones mediante cualquier via adecuada. Tambien puede emplearse administracion pulmonar, por ejemplo, mediante el uso de un inhalado o nebulizador, y formulacion con un agente que forma aerosol.
En un aspecto espedfico, puede ser deseable administrar las formulaciones farmaceuticas de la invencion de forma local al area que necesita tratamiento; esto puede conseguirse por, por ejemplo, y no a modo de limitacion, infusion local durante cirugfa, aplicacion topica, por ejemplo, junto con un vendaje para heridas despues de cirugfa, por inyeccion, mediante un cateter, mediante un supositorio, o mediante un implante, siendo dicho implante de un material poroso, no poroso, o gelatinoso, incluyendo membranas, tales como membranas sialasticas, o fibras. En un aspecto, la administracion puede ser por inyeccion en el sitio (o sitio anterior) de un tumor maligno o tejido neoplasico o pre-neoplasico.
En otro aspecto, la formulacion farmaceutica puede suministrarse en una matriz biologica. Se describe un ejemplo de una matriz biologica en la patente de Estados Unidos N° 5.962.427, y la publicacion de solicitud de patente de Estados Unidos U.S. 2002/0193338.
En otro aspecto mas, la formulacion farmaceutica puede suministrarse en un sistema de liberacion controlada. En una realizacion, puede usarse una bomba (vease Langer, supra; Sefton, 1987, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201; Buchwald et al., 1980, Surgery 88:507; Saudek et al., 1989, N. Engl. J. Med. 321:574). En otro aspecto, pueden usarse materiales polimericos (vease Medical Applications of Controlled Release, Langer y Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Florida (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen y Ball (eds.), Wiley, Nueva York (1984); Ranger y Peppas, 1983, J. Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61; vease tambien Levy et al., 1985, Science 228:190; During et al., 1989, Ann. Neurol. 25:351 (1989); Howard et al., 1989, J. Neurosurg. 71:105). En otro aspecto mas, puede colocarse un sistema de liberacion controlada en proximidad de la diana de la composicion, es decir, el pulmon, lo que requiere por tanto solamente una fraccion de la dosis sistemica (vease, por ejemplo, Goodson, 1984, en Medical Applications of Controlled Release, supra, vol. 2, pag. 115-138). Se analizan otros sistemas de liberacion controlada en la revision de Langer (1990, Science 249:1527-1533).
Las formulaciones farmaceuticas de la presente invencion comprenden una cantidad eficaz de un virus de la gripe porcina atenuado de la invencion, y un veldculo farmaceuticamente aceptable. La expresion "farmaceuticamente aceptable" significa aprobado por una agencia reguladora del gobierno federal o estatal o enumerado en la
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farmacopea de Estados Unidos u otras farmacopeas generalmente reconocidas para su uso en animales, y mas particularmente en seres humanos. El termino "vehmulo" se refiere a un diluyente, adyuvante, excipiente, o medio con que se administra la formulacion farmaceutica. Tambien pueden emplearse soluciones salinas y soluciones acuosas de dextrosa y glicerol como vehmulos lfquidos, particularmente para soluciones inyectables. Los excipientes farmaceuticos adecuados incluyen almidon, glucosa, lactosa, sacarosa, gelatina, malta, arroz, harina, tiza, gel de sflice, estearato sodico, monoestearato de glicerol, talco, cloruro sodico, leche desnatada en polvo, glicerol, propilenglicol, agua, etanol y similares. Estas composiciones puede adoptar la forma de soluciones, suspensiones, emulsiones, comprimidos, pfldoras, capsulas, polvos, formulaciones de liberacion sostenida y similares. La composicion puede formularse como un supositorio. La formulacion oral puede incluir vehmulos convencionales tales como calidades farmaceuticas de manitol, lactosa, almidon, estearato de magnesio, sacarina sodica, celulosa, carbonato de magnesio, etc. Se describen ejemplos de vehmulos farmaceuticos adecuados en "Remington's Pharmaceutical Sciences" por E.W.Martin. Dichas composiciones contendran una cantidad eficaz de la terapia, preferiblemente en forma purificada, junto con una cantidad adecuada de vehmulo para proporcionar la forma para administracion apropiada al paciente. La formulacion debe adecuarse al modo de administracion. La formulacion particular tambien puede depender de si el virus de la gripe porcina esta vivo o inactivado.
La cantidad de la formulacion farmaceutica de la invencion que sera eficaz en el tratamiento, prevencion, control o mejora de un trastorno o afeccion particular dependera de la naturaleza del trastorno o afeccion, y puede determinarse por tecnicas clmicas convencionales. Ademas, pueden emplearse opcionalmente ensayos in vitro para ayudar a identificar intervalos optimos de dosificacion. La dosis precisa a emplear en la formulacion tambien dependera de la via de administracion, y la gravedad de la enfermedad o trastorno, y debe decidirse de acuerdo con el criterio del medico y las circunstancias de cada paciente. Sin embargo, intervalos adecuados de dosificacion para administracion son generalmente de aproximadamente 102, 5 x 102, 103, 5 x 103, 104, 5 x 104, 105, 5 x 105, 106, 5 x 106, 107, 5 x 107, 108, 5 x 108, 1 x 109, 5 x 109, 1 x 1010, 5 x 1010, 1 x 1011, 5 x 1011 o 1012 ufp, y lo mas preferiblemente de aproximadamente 10 a aproximadamente 10 ufp, y puede administrarse a un sujeto una vez, dos veces, tres o mas veces con intervalos tan frecuentes como sea necesario. Las formulaciones farmaceuticas de la presente invencion que comprenden 102, 5 x 102,103, 5 x 103, 104, 5 x 104, 105, 5 x 105, 106, 5 x 106, 107, 5 x 107, 108, 5 x 108, 1 x 109, 5 x 109, 1 x 1010, 5 x 10, 1 x 1011, 5 x 1011 o 1012 ufp, y los mas preferiblemente de aproximadamente 104 a aproximadamente 1012 ufp de un virus de la gripe porcina atenuado de la presente invencion con actividad antagonista de IFN alterada, pueden administrarse a un sujeto por via intranasal, intratraqueal, intramuscular o subcutanea. Las dosis eficaces pueden extrapolarse de las curvas de respuesta a dosis obtenidas de sistemas de ensayo in vitro o en modelo animal.
La formulacion farmaceutica de la invencion puede usarse para prevenir, controlar, tratar o mejorar infecciones por virus, bacterias o parasitos. La formulacion farmaceutica de la invencion puede usarse para prevenir, controlar, tratar o mejorar el cancer en un cerdo. La formulacion farmaceutica de la invencion puede usarse para prevenir, controlar, tratar o mejorar otras enfermedades tratables por IFN.
5.7 Terapias utiles en combinacion con virus de la gripe porcina
En la presente memoria se describen metodos para prevenir, controlar, tratar, y/o mejorar enfermedades y trastornos incluyendo, aunque sin limitacion, infecciones por virus de la gripe porcina, afecciones asociadas con infeccion por virus de la gripe porcina, infecciones diferentes a infecciones por virus de la gripe porcina, afecciones asociadas con infecciones diferentes a infecciones por virus de la gripe porcina, trastornos tratables por IFN (por ejemplo, cancer) y afecciones en que se usa un virus de la gripe porcina atenuado de la invencion como un vector para inducir una respuesta inmunitaria contra un antfgeno asociado con la afeccion, que comprende administrar to un sujeto que lo necesita una cantidad eficaz de uno o mas virus de la gripe porcina atenuados descritos en la presente memoria y una cantidad eficaz de una o mas terapias (por ejemplo, agentes profilacticos o terapeuticos) diferentes a virus de la gripe porcina atenuados. Las terapias incluyen, aunque sin limitacion, moleculas pequenas, farmacos sinteticos, peptidos, polipeptidos, protemas, acidos nucleicos (por ejemplo, nucleotidos de ADN y ARN incluyendo, aunque sin limitacion, secuencias de nucleotidos antisentido, triples helices, iARN, y secuencias de nucleotidos que codifican protemas, polipeptidos o peptidos biologicamente activos), anticuerpos, moleculas inorganicas sinteticas o naturales, agentes mimeticos, y moleculas organicas sinteticas o naturales.
Puede usarse cualquier terapia (por ejemplo, agentes profilacticos o terapeuticos) que se sabe que es util, o que se ha usado o se esta usando actualmente para la prevencion, control, tratamiento, o mejora de una infeccion por virus de la gripe porcina, infecciones diferentes a infecciones por virus de la gripe porcina, afecciones asociadas con infecciones diferentes a infecciones por virus de la gripe porcina, trastornos tratables por IFN, afecciones en que se usa un virus de la gripe porcina atenuado de la invencion como un vector para inducir una respuesta inmunitaria contra un antfgeno asociado con la afeccion, o cualquier otra enfermedad porcina, en combinacion con un virus de la gripe porcina atenuado de acuerdo con la presente descripcion. Vease, por ejemplo, Taylor, Pig Diseases, 6a Ed., Diamond Farm Book Pubns, 1995; Straw et al., Diseases of Swine, 8a Ed., Iowa State University Press, 1999, para informacion respecto a terapias, en particular agentes profilacticos o terapeuticos, que se han usado o se estan usando actualmente para prevenir, tratar, controlar, y/o mejorar enfermedades porcinas. Ejemplos de agentes profilacticos y terapeuticos incluyen, aunque sin limitacion, agentes anti-neoplasicos; agentes anti-virales, agentes anti-inflamatorios (por ejemplo, adrenocorticoides, corticosteroides (por ejemplo, beclometasona, budesonida, flunisolida, fluticasona, triamcinolona, metilprednisolona, prednisolona, prednisona, hidrocortisona)) y antibioticos
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(por ejemplo, dactinomicina (antiguamente actinomicina), bleomicina, eritomicina, penicilina, mitramicina, y antramicina (AMC)).
5.7.1 Terapias anti-neoplasicas
Puede usarse cualquier terapia (por ejemplo, agente terapeutico o profilactico) que se sane que es util, se ha usado, o se esta usando actualmente para la prevencion, tratamiento, control, o mejora del cancer o uno o mas smtomas del mismo, en composiciones y metodos descritos en la presente memoria. Las terapias (por ejemplo, agentes terapeuticos o profilacticos) incluyen, aunque sin limitacion, peptidos, polipeptidos, protemas de fusion, moleculas de acido nucleico, moleculas pequenas, agentes mimeticos, farmacos sinteticos, moleculas inorganicas, y moleculas organicas. Ejemplos no limitantes de terapias para el cancer incluyen quimioterapias, radioterapias, terapias hormonales, y/o terapias biologicas/inmunoterapias.
En aspectos particulares, el agente anti-neoplasico puede ser, aunque sin limitacion: un agente quimioterapeutico (por ejemplo, acivicina, aclarrubicina, clorhidrato de acodazol, acronina, adozelesina, aldesleukina, altretamina, ambomicina, acetato de ametantrona, aminoglutetimida, amsacrina, anastrozol, antramicina, asparaginasa, azacitidina, azetepa, batimastat, bleomicina, benzodepa, bicalutamida, clorhidrato de bisantreno, dimesilato de bisnafide, bizelesina, sulfato de bleomicina, brequinar sodio, bropirimina, busulfan, cactinomicina, calusterona, campatecina, caracemida, carbetimer, carboplatino, carmustina, clorhidrato de carrubicina, carzelesina, cedefingol, clorambucilo, cirolemicina, cisplatino, cladribina, mesilato de crisnatol, ciclofosfamida, citarabina, ciclosporina A, combretastatina A4, analogo de combretastatina, factor citolttico, citostatina, dacliximab, docetaxel, dacarbazina, dactinomicina, clorhidrato de daunorrubicina, docetaxel, doxorrubicina, droloxifeno, propionato de dromostanolona, duazomicina, edatrexato, clorhidrato de eflomitina, elsamitrucina, enloplatino, enpromato, epipropidina, clorhidrato de epirrubicina, erbulozol, clorhidrato de esorrubicina, estramustina, etanidazol, etoposido, fazarabina, fenretinida, floxuridina, fluorouracilo, flurocitabina, fosquidona, gemcitabina, hidroxiurea, idarrubicina, clorhidrato de idarrubicina, ifosfamida, ilmofosina, iproplatino, ifosfamida, clorhidrato de irinotecano, acetato de lanreotida, letrozol, acetato de leuprolida, clorhidrato de liarozol, lometrexol sodio, lomustina, clorhidrato de losoxantrona, masoprocol, mercaptopurina, metotrexato, metoprina, meturedepa, mitindomida, raitocarcina, mitocromina, mitomicina, mitoxantrona, acido micofenolico, nitrosoureas, nocodazol, nogalamicina, ormaplatino, oxisurano, paclitaxel, plicamicina, complejo de platino, compuestos de platino, complejo de platino-triamina, procarbizina, puromicina, taxol, tioguanina, talisomicina, tecogalano sodio, tegafur, clorhidrato de teloxantrona, vapreotida, verteporfina, sulfato de vinblastina, sulfato de vincristina, vindesina, sulfato de vindesina, sulfato de vinepidina, sulfato de vinglicinato, sulfato de vinleurosina, tartrato de vinorelbina, sulfato de vinrrosidisina, sulfato de vinzolidina, vorozol, zeniplatino, y zinostatina),inhibidores de metaloproteinasa de matriz, inhibidores de tirosina quinasa, tirfostinas, antagonistas del receptor de uroquinasa, inhibidor del gen de resistencia a multiples farmacos, terapia basada en el supresor tumoral multiple 1, inhibidor del activado de plasminogeno, bisfosfonatos (por ejemplo, pamidronato (Aredria), clondronato sodio (Bonefos), acido zoledronico (Zometa), alendronato (Fosamax), etidronato, ibandronato, cimadronato, risedromato, y tiludromato), una citoquina (por ejemplo, IL-2, IFN-a, IFN-p, EFN-y, factor inhibidor de leucemia, interferon alfa de leucocitos, gonadotropina corionica humana, y trombopoyetina), una hormona (por ejemplo, hormona estimuladora de tiroides), un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo anti-CD2, un anticuerpo anti-CD20, y un anticuerpo inmunoespedfico para uno o mas receptores de galanina), vitamina D (por ejemplo, 20-epi-1,25 dihidroxivitamina D3), un inhibidor de angioganesis, un oligonucleotido antisentido, un modulador genico de apoptosis, un regulador de apoptosis, un antagonista de BCR/ABL, un inhibidor derivado de cartflago, un agonista de estrogeno, un antagonista de estrogeno, un inhibidor de gelatinasa, un inhibidor de glutation, un inhibidor de la HMG CoA reductasa (por ejemplo, atorvastatina, cerivastatina, fluvastatina, lescol, lupitor, lovastatina, rosuvastatina, y simvastatina), un peptido inmunoestimulador, un inhibidor del receptor del factor-1 de crecimiento tipo insulina, un agonista de interferon, leuprolida+estrogeno+progesterona, leuprorelina, un ARN bicatenario desapareado, un inhibidor del proteasoma, un modulador inmunitario basado en protema A, un inhibidor de protema quinasa C, un inhibidor de protema tirosina fosfatasa, un antagonista de raf, un inhibidor de la ras farnesil protema transferasa, una ribozima, iARN, un modulador de la transduccion de senales, un inhibidor de celulas madre, un inhibidor de la division de celulas madre, un inhibidor de telomerasa, un agonista del receptor de timopoyetina, y un inhibidor de la traduccion.
En aspectos espedficos, se usa la radioterapia que comprende el uso de rayos x, rayos gamma y otras fuentes de radiacion para destruir las celulas cancerosas, en combinacion con los virus de la gripe porcina atenuados descritos en la presente memoria. En aspectos preferidos, el tratamiento de radiacion se administra como radiacion con rayos externos o teleterapia, donde la radiacion esta dirigida desde una fuente remota. En otros aspectos preferidos, el tratamiento de radiacion se administra como terapia interna o braquiterapia, donde se coloca una fuente radiactiva dentro del cuerpo cerca de las celulas cancerosas o una masa tumoral.
Las terapias contra el cancer y sus dosificaciones, vfas de administracion y uso recomendado son conocidas en la tecnica y se ha descrito en documentacion tal como Physicians' Desk Reference (58a ed., 2004) y Merck Veterinary Manual (8a ed., 1998).
5.7.2 Terapias anti-angiogenesis
Puede usarse cualquier agente anti-angiogenico bien conocido para los expertos en la materia en las composiciones
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y metodos descritos en la presente memoria. Ejemplos no limitantes de agentes anti-angiogenicos incluyen protemas, polipeptidos, peptidos, protemas de fusion, anticuerpos (por ejemplo, quimericos, monoclonales, policlonales, Fv, ScFv, fragmentos Fab, fragmentos F(ab)2, y fragmentos de union a antigeno de los mismos) tales como anticuerpos que se unen inmunoespedficamente a TNFa, moleculas de acido nucleico (por ejemplo, moleculas antisentido o triples helices), moleculas organicas, moleculas inorganicas, y moleculas pequenas que reducen o inhiben o neutralizan la angiogenesis. En particular, ejemplos de agentes anti-angiogenicos incluyen, aunque sin limitacion, endostatina, angiostatina, apomigren, antitrombina III anti-angiogenica, los fragmentos proteoltticos de 29 kba N-terminal y de 40 kDa C-terminal de fibronectina, un antagonista del receptor uPA, el fragmento proteolftico de 16 kDa de prolactina, el fragmento proteolftico de 7,8 kDa del factor plaquetario-4, el fragmento anti-angiogenico de 24 aminoacidos del factor plaquetario-4, el factor anti-angiogenico denominado 13.40, el fragmento anti-angiogenico de 22 aminoacidos de trombospondina I, el fragmento anti-angiogenico de 20 aminoacidos de peptidos que contienen SPARC, ROD y NGR, los peptidos anti-angiogenicos pequenos de laminina, fibronectina, procolageno y EGF, antagonistas de integrina avP3 (por ejemplo, anticuerpos anti-integrina avP3), antagonistas del factor de crecimiento de fibroblastos acido (aFGF), antagonistas del factor de crecimiento de fibroblastos basico (bFGF), antagonistas del factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF) (por ejemplo, anticuerpos anti-VEGF), y antagonistas del receptor de VEGF (VEGFR) (por ejemplo, anticuerpos anti-VEGFR).
5.7.3 Terapias anti-virales
Puede usarse cualquier agente anti-viral bien conocido para los expertos en la materia en las composiciones y los metodos descritos en la presente memoria. Ejemplos no limitantes de agentes anti-virales incluyen protemas, polipeptidos, peptidos, protemas de fusion, anticuerpo, moleculas de acido nucleico, moleculas organicas, moleculas inorganicas, y moleculas pequenas que inhiben y/o reducen la adhesion de un virus a su receptor, la internalizacion de un virus en una celula, la replicacion de un virus, o la liberacion de virus desde una celula. En particular, los agentes anti-virales incluyen, aunque sin limitacion, analogos nucleosfdicos (por ejemplo, zidovudina, aciclovir, gangciclovir, vidarabina, idoxuridina, trifluridina, y ribavirina), foscarnet, amantadina, rimantadina, saquinavir, indinavir, ritonavir, alfa-interferones y otros interferones, y AZT.
En aspectos espedficos, el agente anti-viral es un agente inmunomodulador que es inmunoespedfico para un antfgeno viral. Como se emplea en esta memoria, la expresion "antfgeno viral" incluye, aunque sin limitacion, cualquier peptido, polipeptido y protema viral (por ejemplo, 3AB, 3ABC del virus de la fiebre aftosa, GP5 del virus del smdrome reproductor y respiratorio porcino, gE del virus de la pseudorrabia, nucleoprotema del virus de la transmisible porcina, neuraminidasa del virus de la gripe, hemaglutinina del virus de la gripe, glucoprotema del virus del herpes simple (por ejemplo, gB, gC, gD, y gE) y antfgeno superficial de hepatitis B) que es capaz de provocar una respuesta inmunitaria. Los anticuerpos utiles en este aspecto para el tratamiento de una enfermedad infecciosa viral incluyen, aunque sin limitacion, anticuerpos contra antfgenos de virus patogenicos, incluyendo como ejemplos y sin limitacion: adenoviridae (por ejemplo, mastadenovirus y aviadenovirus), herpesviridae (por ejemplo, virus del herpes simple 1, virus del herpes simple 2, virus del herpes simple 5, y virus del herpes simple 6), leviviridae (por ejemplo, levivirus, fase MS2 de enterobacterias, allolevirus), poxviridae (por ejemplo, chordopoxvirinae, parapoxvirus, avipoxvirus, capripoxvirus, leporiipoxvirus, suipoxvirus, molluscipoxvirus, y entomopoxvirinae), papovaviridae (por ejemplo, poliomavirus y papilomavirus), paramyxoviridae (por ejemplo, paramixovirus, virus de paragripe 1, mobilivirus (por ejemplo, virus del sarampion), rubulavirus (por ejemplo, virus de las paperas), pneumonovirinae (por ejemplo, pneumovirus, virus sincitial respiratorio humano), y metapneumovirus (por ejemplo, pneumovirus aviar y metapneumovirus humano)), picornaviridae (por ejemplo, enterovirus, rinovirus, hepatovirus (por ejemplo, virus de la hepatitis A humana), cardiovirus, y aftovirus), reoviridae (por ejemplo, ortoreovirus, orbivirus, rotavirus, cipovirus, fijivirus, fitoreovirus, y orizavirus), retroviridae (por ejemplo, retrovirus tipo B de mamfero, retrovirus tipo C de mamfero, retrovirus tipo C de aves, grupo de retrovirus tipo D, retrovirus BLV-HTLV, lentivirus (por ejemplo, virus de la inmunodeficiencia humana 1 y virus de la inmunodeficiencia humana 2), espumavirus), flaviviridae (por ejemplo, virus de hepatitis C), hepadnaviridae (por ejemplo, virus de hepatitis B), togaviridae (por ejemplo, alfavirus (por ejemplo, virus sindbis) y rubivirus (por ejemplo, virus de la rubeola)), rhabdoviridae (por ejemplo, vesiculovirus, lyssavirus, ephemerovirus, citorhabdovirus, y necleorhabdovirus), arenaviridae (por ejemplo, arenavirus, virus de la coriomeningitis linfodtica, virus Ippy, y virus lassa), y coronaviridae (por ejemplo, coronavirus y torovirus).
Ejemplos espedficos de anticuerpos disponibles utiles para el tratamiento de una enfermedad infecciosa viral incluyen, aunque sin limitacion, PRO542 (Progenies) que es un anticuerpo de fusion con CD4 util para el tratamiento de infeccion por VIH; Ostavir (Protein Design Labs, Inc., CA) que es un anticuerpo humano util para el tratamiento de virus de la hepatitis B; y Protovir (Protein Design Labs, Inc., CA) que es un anticuerpo IgG1 humanizado util para el tratamiento de citomegalovirus (CMV).
Las terapias anti-virales y sus dosificaciones, vfas de administracion y uso recomendado son conocidas en la tecnica y se han descrito en documentacion tal como Physicians' Desk Reference (58a ed., 2004) y Merck Veterinary Manual (8a ed., 1998). Esta disponible informacion adicional sobre infecciones virales en Cecil Textbook of Medicine (18a ed., 1988).
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5.7.4 Terapias con antibiotico
Puede usarse cualquier agente antibiotico bien conocido para los expertos en la materia en las composiciones y los metodos descritos en la presente memoria. Los agentes antibacterianos o antibioticos que pueden usarse en combinacion con los complejos descritos en la presente memoria incluyen, aunque sin limitacion: antibioticos aminoglucosfdicos (por ejemplo, apramicina, arbekacina, bambermicinas, butirosina, dibekacina, neomicina, neomicina, undecilenato, netilmicina, pafomomicina, ribostamicina, sisomicina, y espectinomicina), antibioticos de anfenicol (por ejemplo, azidanfenicol, cloranfenicol, florfeniicol, y tianfenicol), antibioticos de ansamicina (por ejemplo, rifamida y rifampina), carbacefems (por ejemplo, loracarbef), carbapenems (por ejemplo, biapenem e imipenem), cefalosporinas (por ejemplo, cefaclor, cefadroxil, cefamandol, cefatrizina, cefazedona, cefozoprano, cefpimizol, cefpiramida, y cefpirome), cefamicinas (por ejemplo, cefbuperazona, cefinetazol, y cefminox), monobactamas (por ejemplo, aztreonam, carumonam, y tigemonam), oxacefems (por ejemplo, flomoxef, y moxalactama), penicilinas (por ejemplo, amdinocilina, amdinocilina pivoxil, amoxicilina, bacampicilina, acido bencilpenicilmico, bencilpenicilina sodio, epicilina, fenbenicilina, floxacilina, penamicilina, yodhidrato de penetamato, penicilina o-benetamina, penicilina 0, penicilina V, penicilina V benzatina, penicilina V hidlrabamina, penimepiciclina, y fencihicilina potasio), lincosamidas (por ejemplo, clindamicina, y lincomicina), macrolidos (por ejemplo, azitromicina, carbomicina, claritomicina, diritromicina, eritromicina, y acistrato de eritromicina), anfomicina, bacitracina, capreomicina, colistut, enduracidina, enviomicina, tetraciclinas (por ejemplo, apiciclina, clortetraciclina, clomociclina, y demeclociclina), 2,4-diaminopirimidinas (por ejemplo, brodimoprim), nitrofuranos (por ejemplo, furaltadona, y cloruro de furazolio), quinolonas y analogos de las mismas (por ejemplo, cinoxacina, ciprofloxacina, clinafloxacina, flumequina, y grepagloxacina), sulfonamidas (por ejemplo, acetil sulfametoxipirazina, bencilsulfamida, noprilsulfamida, ftalilsulfacetamida, sulfacrisoidina, y sulfacitina), sulfonas (por ejemplo, diatimosulfona, glucosulfona sodio, y solasulfona), cicloserina, mupirocina y tuberina.
Ejemplos adicionales de agentes antibacterianos incluyen aunque sin limitacion Acedapsona; Acetosulfona Sodio; Alamecina; Alexidina; Amdinocilina; Amdinocilina Pivoxil; Amiciclina; Amifloxacina; Mesilato de Amifloxacina; Amikacina; Sulfato de Amikacina; acido Aminosalidlico; Aminosalicilato sodio; Amoxicilina; Anfomicina; Ampicilina; Ampicilina Sodio; Apalcilina Sodio; Apramicina; Aspartocina; Sulfato de Astromicina; Avilamicina; Avoparcina; Azitromicina; Azlocilina; Azlocilina Sodio; Clorhidrato de Bacampicilina; Bacitracina; Metileno Disalicilato de Bacitracina; Bacitracina Zinc; Bambermicinas; Benzoilpas Calcio; Beritromicina; Sulfato de Betamicina; Biapenem; Biniramicina; Clorhidrato de Bifenamina; Bispiritiona Magsulfex; Butikacina; Sulfato de Butirosina; Sulfato de Capreomicina; Carbadox; Carbenicilina Disodio; Carbenicilina Indanil Sodio; Carbenicilina Fenil Sodio; Carbenicilina Potasio; Carumonam Sodio; Cefaclor; Cefadroxil; Cefamandol; Nafato de Cefamandol; Cefamandol Sodio; Cefaparol; Cefatrizina; Cefazaflur Sodio; Cefazolina; Cefazolina Sodio; Cefbuperazona; Cefdinir; Cefepima; Clorhidato de Cefepima; Cefetecol; Cefixima; Clorhidrato de Cefmnenoxima; Cefmetazol; Cefmetazol Sodio; Cefonicid Monosodio; Cefonicid Sodio; Cefoperazona Sodio; Ceforanida; Cefotaxima Sodio; Cefotetano; Cefotetano Disodio; Clorhidrato de Cefotiam; Cefoxitina; Cefoxitina Sodio; Cefpimizol; Cefpimizol Sodio; Cefpiramida; Cefpiramida Sodio; Sulfato de Cefpiroma; Cefpodoxima Proxetil; Cefprozil; Cefroxadina; Cefsulodina Sodio; Ceftazidima; Ceftibuteno; Ceftizoxima Sodio; Ceftriaxona Sodio; Cefuroxima; Cefuroxima Axetil; Cefuroxima Pivoxetil; Cefuroxima Sodio; Cefacetril Sodio; Cefalexina; Clorhidrato de Cefalexina; Cefaloglicina; Cefaloridina; Cefalotina Sodio; Cefapirina Sodio; Cefradina; Clorhidrato de Cetociclina; Cetofenicol; Cloranfenicol; Palmitato de Cloranfenicol; Complejo de Pantotenato de Cloranfenicol; Succinato de Cloranfenicol Sodio; Fosfanilato de Clorhexidina; Cloroxilenol; Bisulfato de Clortetraciclina; Clorhidrato de Clortetraciclina; Cinoxacina; Ciprofloxacina; Clorhidrato de Ciprofloxacina; Cirolemicina; Claritromicina; Clorhidrato de Clinafloxacina; Clindamicina; Clorhidrato de Clindamicina; clorhidrato de Palmitato de Clindamicina; Fosfato de Clindamicina; Clofazimina; Cloxacilina Benzatina; Cloxacilina Sodio; Cloxiquina; Colistimetato Sodio; Sulfato de Colistina; Coumermicina; Coumermicina Sodio; Ciclacilina; Cicloserina; Dalfopristina; Dapsona; Daptomicina; Demeclociclina; Clorhidrato de Demeclociclina; Demeciclina; Denofungina; Diaveridina; Dicloxacilina; Dicloxacilina Sodio; Sulfato de Dihidroestreptomicina; Dipiritiona; Diritromicina; Doxiciclina; Doxiciclina Calcio; Doxiciclina Fosfatex; Doxiciclina Hiclato; Droxacina Sodio; Enoxacina; Epicilina; Clorhidrato de Epitetraciclina; Eritromicina; Acistrato de Eritromicina; Estolato de Eritromicina; Etilsuccinato de Eritromicina; Gluceptato de Eritromicina; Lactobionato de Eritromicina; Propionato de Eritromicina; Estearato de Eritromicina; Clorhidrato de Etambutol; Etionamida; Fleroxacina; Floxacilina; Fludalanina; Flumequina; Fosfomicina; Fosfomicina Trometamina; Fumoxicilina; Cloruro de Furazolio; Tartrato de Furazolio; Fusidato Sodio; Acido Fusfdico; Sulfato de Gentamicina; Gloximonam; Gramicidina; Haloprogina; Hetacilina; Hetacilina Potasio; Hexedina; Ibafloxacina; Imipenem; Isoconazol; Isepamicina; Isoniazid; Josamicina; Sulfato de Kanamicina; Kitasamicina; Levofuraltadona; Levopropilcilina Potasio; Lexitromicina; Lincomicina; Clorhidrato de Lincomicina; Lomefloxacina; Clorhidrato de Lomefloxacina; Mesilato de Lomefloxacina; Loracarbef; Mafenida; Meclociclina; Sulfosalicilato de Meclociclina; Fosfato de Megalomicina Potasio; Mequidox; Meropenem; Metaciclina; Clorhidrato de Metaciclina; Metenamina; Hippurato de Metenamina; Mandelato de Metenamina; Meticilina Sodio; Metioprim; Clorhidrato de Metronidazol; Fosfato de Metronidazol; Mezlocilina; Mezlocilina Sodio; Minociclina; Clorhidrato de Minociclina; Clorhidrato de Mirincamicina; Monensina; Monensina Sodio; Nafcilina Sodio; Nalidixato Sodio; Acido Nalidfxico; Natamicina; Nebrabracina; Palmitato de Neomicina; Sulfato de Neomicina; Undecilenato de Neomicina; Sulfato de Netilmicina; Neutramicina; Nifuradeno; Nifuraldezona; Nifuratel; Nifuratrona; Nifurdazil; Nifurimida; Nifurpirinol; Niturquinazol; Nifurtiazol; Nitrociclina; Nitrofurantoina; Nitromida; Norfloxacina; Novobiocina Sodio; Ofloxacina; Ormetoprim; Oxacilina Sodio; Oximonam; Oximonam Sodio; Acido Oxolmico; Oxitetraciclina; Oxitetraciclina Calcio; Clorhidrato de Oxitetraciclina; Paldimicina; Paraclorofenol; Paulomicina; Pefloxacina; Mesilato
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de Pefloxacina; Penamecilina; Penicilina G Benzatina; Penicilina G Potasio; Penicilina G Procama; Penicilina G Sodio; Penicilina V; Penicilina V Benzatina; Penicilina V Hidrabamina; Penicilina V Potasio; Pentizidona Sodio; Aminosalicilato de Fenilo; Piperacilina Sodio; Pirbenicilina Sodio; Piridicilina Sodio; Clorhidrato de Pirlimicina; Clorhidrato de Pivampicilina; Pamoato de de Pivampicilina; Probenato de Pivampicilina; Sulfato de Polimixina B; Porfiromicina; Propikacina; Pirazinamida; Piritiona Zinc; Acetato de Quindecamina; Quinupristina; Racefenicol; Ramoplanina; Ranimicina; Relomicina; Repromicina; Rifabutina; Rifametano; Rifamexil; Rifamida; Rifampina; Rifapentina; Rifaximina; Rolitetraciclina; Nitrato de Rolitetraciclina; Rosaramicina; Butirato de Rosaramicina; Propionato de Rosaramicina; Fosfato de Rosaramicina Sodio; Estearato de Rosaramicina; Rosoxacina; Roxarsona; Roxitromicina; Sanciclina; Sanfetrinem Sodio; Sarmoxicilina; Sarpicilina; Scopafingina; Sisomicina; Sulfato de Sisomicina; Esparfloxacina; Clorhidrato de Espectinomicina; Espiramicina; Clorhidrato de Estalimicina; Esteffimicina; Sulfato de Estreptomicina; Estreptonicozid; Sulfabenz; Sulfabenzamida; Sulfacetamida; Sulfacetamida Sodio; Sulfacitina; Sulfadiazina; Sulfadiazina Sodio; Sulfadoxina; Sulfaleno; Sulfamerazina; Sulfameter; Sulfametazina; Sulfametizol; Sulfametoxazol; Sulfamonometoxina; Sulfamoxol; Sulfanilato Zinc; Sulfanitrano; Sulfasalazina; Sulfasomizol; Sulfatiazol; Sulfazamet; Sulfisoxazol; Sulfisoxazol Acetilo; Sulfisoxazol Diolamina; Sulfomixina; Sulopenem; Sultamicilina; Suncilina Sodio; clorhidrato de Talampicilina; Teicoplanina; Clorhidrato de Temafloxacina; Temocilina; Tetraciclina; Clorhidrato de Tetraciclina; Complejo de Fosfato de Tetraciclina; Tetroxoprim; Tianfenicol; Tifencilina Potasio; Ticarcilina Cresil Sodio; Ticarcilina Disodio; Ticarcilina Monosodio; Ticlatona; Cloruro de Tiodonio; Tobramicina; Sulfato de Tobramicina; Tosufloxacina; Trimetoprim; Sulfato de Trimetoprim; Trisulfapirimidinas; Troleandomicina; Sulfato de Trospectomicina; Tirotricina; Vancomicina; Clorhidrato de Vancomicina; Virginiamicina; Zorbamicina.
Las terapias con antibiotico y sus dosificaciones, vfas de administracion y uso recomendado son conocidas en la tecnica y se han descrito en documentacion tal como Physicians' Desk Reference (58a ed., 2004) y Merck Veterinary Manual (8a ed:, 1998).
5.7.5 Terapias inmunomoduladoras
Puede usarse cualquier agente inmunomodulador bien conocido para los expertos en la materia en los metodos y composiciones descritas en la presente memoria. Los agentes inmunomoduladores puede afectar a uno o mas o todos los aspectos de la respuesta inmunitaria en un sujeto. Los aspectos de la respuesta inmunitaria incluyen, aunque sin limitacion, la respuesta inflamatoria, la cascada del complemento, la diferenciacion de leucocitos y linfocitos, la proliferacion, y/o la funcion efectora, los recuentos de monocitos y/o basofilos, y la comunicacion celular entre celulas del sistema inmunitario. En ciertos aspectos descritos en la presente memoria, un agente inmunomodulador modula un aspecto de la respuesta inmunitaria. En otros aspectos, un agente inmunomodulador modula mas de un aspecto de la respuesta inmunitaria. En un aspecto, la administracion de un agente inmunomodulador a un sujeto inhibe o reduce uno o mas aspectos de las capacidades de respuesta inmunitaria del sujeto. En ciertos aspectos, un agente inmunomodulador no es un agente anti-inflamatorio. En ciertos aspectos, un agente inmunomodulador no es un agente anti-angiogenico. En ciertos aspectos, un agente inmunomodulador es un agente quimioterapeutico. En ciertos aspectos, un agente inmunomodulador no es un agente quimioterapeutico.
Ejemplos de agentes inmunomoduladores incluyen, aunque sin limitacion, agentes proteicos tales como citoquinas, peptido mimeticos, y anticuerpos (por ejemplo, humanos, humanizados, quimericos, monoclonales, policlonales, Fv, ScFv, fragmentos Fab o F(ab)2 o fragmentos de union a epttopo), moleculas de acido nucleico (por ejemplo, moleculas de acido nucleico antisentido y triples helices), moleculas pequenas, compuestos organicos, y compuestos inorganicos. En particular, los agentes inmunomoduladores incluyen, aunque sin limitacion, metotrexato, leflunomida, ciclofosfamida, citoxano, Immuran, ciclosporina A, minociclina, azatioprina, antibioticos (por ejemplo, FK506 (tacrolimus)), metilprednisolona (MP), corticosteroides, esteroides, micofenolato mofetil, rapamicina (sirolimus), mizoribina, desoxiespergualina, brequinar, malononitriloamindas (por ejemplo, leflunamida), moduladores del receptor de celulas T, y moduladores del receptor de citoquinas.
Ejemplos de moduladores del receptor de celulas T incluyen, aunque sin limitacion, anticuerpos anti-receptor de celulas T (por ejemplo, anticuerpos anti-CD4 (por ejemplo, cM-T412 (Boeringer), IDEC-CE9,1® (IDEC y SKB), mAB 4162W94, Orthoclone y OKTcdr4a (Janssen-Cilag)), anticuerpos anti-CD2, anticuerpos anti-CD3 (por ejemplo, Nuvion (Product Design Labs), OKT3 (Johnson & Johnson), o Rituxan (IDEC)), anticuerpos anti-CD5 (por ejemplo, un inmunoconjugado anti-CD5 ligado a ricina), anticuerpos anti-CD7 (por ejemplo, CHH-380 (Novartis)), anticuerpos anti-CD8, anticuerpos monoclonales anti-ligando de CD40 (por ejemplo, EDEC-131 (IDEC)), anticuerpos anti-CD52 (por ejemplo, cAmPATH 1H (Ilex)), anticuerpos anti-CD2, anticuerpos anti-CD11a (por ejemplo, Xanelim (Genentech)), y anticuerpos anti-B7 (por ejemplo, IDEC-114) (IDEC))), CTLA4-immunoglobulin, y LFA-3TIP (Biogen, publicacion internacional N° WO 93/08656 y patente de Estados Unidos N° 6.162.432).
Ejemplos de moduladores del receptor de citoquinas incluyen, aunque sin limitacion, receptores solubles de citoquinas (por ejemplo, el dominio extracelular de un receptor de TNF-a o un fragmento del mismo, el dominio extracelular de un receptor de IL-ip o un fragmento del mismo, y el dominio extracelular de un receptor de IL-6 o un fragmento del mismo), citoquinas o fragmentos de las mismas (por ejemplo, interleuquina IL-2, IL-3, DL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-15, IL-23, TNF-a, TNF-p, interferon (IFN)-a, IFN-p, IFN-y, y GM-CSF), anticuerpos anti-receptor de citoquinas (por ejemplo, anticuerpos anti-receptor de IFN, anticuerpos anti-receptor de IL-2 (por ejemplo, Zenapax (Protein Design Labs)), anticuerpos anti-receptor de IL-3, anticuerpos anti-receptor de IL-
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4, anticuerpos anti-receptor de IL-6, anticuerpos anti-receptor de IL-9, anticuerpos anti-receptor de IL-10, anticuerpos anti-receptor de IL-12, anticuerpos anti-receptor de IL-13, anticuerpos anti-receptor de IL-15, y anticuerpos antireceptor de IL-23), anticuerpos anti-citoquina (por ejemplo, anticuerpos anti-IFN, anticuerpos anti-TNF-a, anticuerpos anti-IL-ip, anticuerpos anti-IL-3, anticuerpos anti-IL-6, anticuerpos anti-IL-8 (por ejemplo, ABX-lL-8 (Abgenix)), anticuerpos anti-IL-9, anticuerpos anti-IL-12, anticuerpos anti-IL-13, anticuerpos anti-IL-15, y anticuerpos anti-IL-23).
En un aspecto espedfico, un modulador del receptor de citoquinas es IL-3, IL-4, IL-10, o un fragmento de las mismas. En otro aspecto, un modular del receptor de citoquinas es un anticuerpo anti-IL-1 p, anticuerpo anti-IL-6, anticuerpo anti-receptor de IL-12, o anticuerpo anti-TNF-a. En otro aspecto, un modulador del receptor de citoquinas es el dominio extracelular de un receptor de TNF-a o un fragmento del mismo.
En cierto aspectos, un agente inmunomodulador es un modulador del receptor de celulas B. Ejemplos de moduladores del receptor de celulas B incluyen, aunque sin limitacion, CD19. El direccionamiento a receptores de celulas B proporciona un medio para modular las celulas B.
En un aspecto preferido, las protemas, polipeptidos o peptidos (incluyendo anticuerpos) que se utilizan como agentes inmunomoduladores se obtienen de la misma especie que el destinatario de las protemas, polipeptidos o peptidos para reducir la probabilidad de una respuesta inmunitaria contra esas protemas, polipeptidos o peptidos. En otro aspecto preferido, cuando el sujeto es un cerdo, las protemas, polipeptidos, o peptidos que se utilizan como agentes inmunomoduladores se obtienen de cerdo.
De acuerdo con los aspectos descritos en la presente memoria, se administra uno o mas agentes inmunomoduladores a un sujeto antes de, despues de, o de forma concomitante con un virus de la gripe porcina atenuado. Puede usarse cualquier tecnica bien conocida para los expertos en la materia para medir uno o mas aspectos de la respuesta inmunitaria en un sujeto particular, y de ese modo determinar cuando es necesario administrar un agente inmunomodulador a dicho sujeto. En un aspecto preferido, se mantiene un recuento absoluto medio de linfocitos de aproximadamente 500 celulas/mm3, preferiblemente 600 celulas/mm3, 650 celulas/mm3, 700 celulas/mm3, 750 celulas/mm3, 800 celulas/mm3, 900 celulas/mm3, 1000 celulas/mm3, 1100 celulas/mm3, o 1200 celulas/mm3 en un sujeto.
Preferiblemente, se usan agentes que estan disponibles en el mercado y son conocidos por funcionar como agentes inmunomoduladores, de acuerdo con los metodos descritos en la presente memoria. La actividad inmunomoduladora de un agente puede determinarse in vitro y/o in vivo mediante cualquier tecnica bien conocida para los expertos en la materia incluyendo, por ejemplo, por ensayos CTL, ensayos de proliferacion, e inmunoensayos (por ejemplo, ELISA) para la expresion de protemas particulares tales como moleculas co- estimuladoras y citoquinas.
5.8 Dosificacion y frecuencia de administracion
La cantidad de un agente profilactico o terapeutico o una composicion descrita en la presente memoria que sera eficaz en la prevencion, tratamiento, control, y/o mejora de una infeccion por virus de la gripe porcina o una afeccion asociada con la misma, una infeccion diferente de una infeccion por virus de la gripe porcina o una afeccion asociada con la misma, una enfermedad tratable por IFN o una afeccion en que se usa un virus de la gripe porcina atenuado como un vector para inducir una respuesta inmunitaria contra un antfgeno asociado con la afeccion, o la prevencion de la reaparicion, aparicion, o desarrollo de uno o mas smtomas de una infeccion por virus de la gripe porcina o una afeccion asociada con la misma, una infeccion diferente de una infeccion por virus de la gripe porcina o una afeccion asociada con la misma, una enfermedad tratable por IFN, o una infeccion en que se usa un virus de la gripe porcina atenuado como un vector para inducir una respuesta inmunitaria contra un antfgeno asociado con la afeccion, puede determinarse por metodos clmicos convencionales. La frecuencia y dosificacion tambien variaran de acuerdo con factores espedficos para cada paciente dependiendo de las terapias espedficas (por ejemplo, el agente o agentes terapeuticos o profilacticos espedficos) administradas, la gravedad de trastorno, enfermedad, o afeccion, la via de administracion, asf como la edad, peso corporal, respuesta, y el historial medico pasado del paciente. Por ejemplo, la dosificacion de un agente profilactico o terapeutico o una composicion que sera eficaz en el tratamiento, prevencion, control, y/o mejora de una infeccion por virus de la gripe porcina o una afeccion asociada con la misma, una infeccion viral diferente de una infeccion por virus de la gripe porcina o una afeccion asociada con la misma, o una enfermedad tratable por IFN, o la prevencion de la reaparicion, aparicion, o desarrollo de uno o mas smtomas de una infeccion por virus de la gripe porcina o una afeccion asociada con la misma, una infeccion viral diferente de una infeccion por virus de la gripe porcina o una afeccion asociada con la misma, o una enfermedad tratable por IFN, puede determinarse mediante modelos animales tales como los conocidos para los expertos en la materia. Ademas, pueden emplearse opcionalmente ensayos in vitro para ayudar a identificar los intervalos optimos de dosificacion. Los regfmenes adecuados pueden seleccionarse por los expertos en la materia considerando dichos factores y siguiendo, por ejemplo, dosificaciones presentadas en la bibliograffa y recomendadas en Physician's Desk Reference (58a ed., 2004), Merck Veterinary Manual (8a ed., 1998), o Straw et al., Diseases of the Swine, Iowa State University Press (1999).
Dosis ejemplares de una vacuna o formulacion inmunogenica incluyen de 102 a 108, de aproximadamente 103 a aproximadamente 107, de aproximadamente 104 a aproximadamente 5 x 106 ufp o de 104 a aproximadamente 107
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ufp. En otros aspectos, la dosis de una vacuna o formulacion inmunogenica descrita en la presente
„ 1. I ____ <n? c „
memoria
5 x 104, 105, 5 x 105, 106, 5 x 106, 10', 5 x 10' o 10° - ',n2 c” ',n2 ',n3 c” ',n3 ',n4 c” ',n4 105, 5 x 105,
administrada a un sujeto es de 10 , 5 x 10 , 10 , 5 x 10,10',
ufp. Dosos ejemplares de una formulacion farmaceutica incluyen 102, 5 x 102, 103, 5 x 103, 104, 5 x 10 106, 5 x 106, 107, 5 x 107, 10°, 5 x 10°, 1 x 109, 5 x 109, 1 x 1010, 5 x 1010, 1 x 1011, 5 x 1011 o 1012 ufp. En ciertos aspectos, la dosis de la formulacion farmaceutica administrada al sujeto es entre aproximadamente 102 a
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aproximadamente 10 , aproximadamente 10 a aproximadamente 10 , aproximadamente 10 a aproximadamente 10°, aproximadamente 103 a aproximadamente 109, aproximadamente 103 a aproximadamente 107, aproximadamente 104 a aproximadamente 10°, aproximadamente 104 a aproximadamente 5 x 106 ufp o aproximadamente 104 a aproximadamente 1012 ufp.
Las dosis ejemplares de una molecula pequena incluyen cantidades de miligramos o microgramos de la molecula pequena por kilogramo de sujeto o peso de la muestra (por ejemplo, aproximadamente 1 microgramo por kilogramo a aproximadamente 500 miligramos por kilogramo, aproximadamente 100 microgramos por kilogramo a aproximadamente 5 miligramos por kilogramo, o aproximadamente 1 microgramo por kilogramo a aproximadamente 50 microgramos por kilogramo).
Para anticuerpos, protemas, polipeptidos, peptidos y protemas de fusion descritas en la presente memoria, la dosificacion administrada a un paciente es tfpicamente de 0,0001 mg/kg a 100 mg/kg del peso corporal del paciente. Preferiblemente, la dosificacion administrada a un paciente es entre 0,0001 mg/kg y 20 mg/kg, 0,0001 mg/kg y 10 mg/kg, 0,0001 mg/kg y 5 mg/kg, 0,0001 y 2 mg/kg, 0,0001 y 1 mg/kg, 0,0001 mg/kg y 0,75 mg/kg, 0,0001 mg/kg y 0,5 mg/kg, 0,0001 mg/kg a 0,25 mg/kg, 0,0001 a 0,15 mg/kg, 0,0001 a 0,10 mg/kg, 0,001 a 0,5 mg/kg, 0,01 a 0,25 mg/kg o 0,01 a 0,10 mg/kg del peso corporal del paciente. Generalmente, los anticuerpos de cerdo tienen una semivida mas larga dentro del cerdo que anticuerpos de otra especie debido a la respuesta inmunitaria contra los polipeptidos exogenos. Por tanto, a menudo son posibles dosificaciones inferiores de anticuerpos de cerdo y administracion menos frecuente a los cerdos. Ademas, la dosificacion y frecuencia de administracion de anticuerpos o fragmentos de los mismos pueden reducirse potenciando la captacion y penetracion tisular de los anticuerpos mediante modificaciones tales como, por ejemplo, lipidacion.
Preferiblemente, las dosificaciones de agentes profilacticos o terapeuticos usados en las terapias de combinacion descritas en la presente memoria son inferiores que aquellas que se han usado o se estan usando actualmente para prevenir, tratar, controlar, y/o mejorar una infeccion por virus de la gripe porcina o una afeccion o smtomas asociados con la misma, una infeccion diferente a una infeccion por virus de la gripe porcina o una afeccion o smtoma asociado con la misma, una enfermedad tratable por IFN, o una afeccion en que se usa un virus de la gripe porcina atenuado como un vector para inducir una respuesta inmunitaria contra un antfgeno asociado con la afeccion. Las dosificaciones recomendadas de agentes actualmente usados para la prevencion, tratamiento, control, o mejora de una infeccion por virus de la gripe porcina o una afeccion o smtomas asociados con la misma, una infeccion diferente a una infeccion por virus de la gripe porcina o una afeccion o smtoma asociado con la misma, una enfermedad tratable por IFN, o una afeccion en que se usa un virus de la gripe porcina atenuado como un vector para inducir una respuesta inmunitaria contra un antfgeno asociado con la afeccion, puede obtenerse de cualquier referencia en la tecnica incluyendo, aunque sin limitacion, Hardman et al. eds., 2001, Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis Of Basis Of Therapeutics, 10a ed., Mc-Graw-Hill, Nueva York; Physicians' Desk Reference (PDR) 5°a ed., 2004, Medical Economics Co., Inc., Montvale, NJ, y Merck Veterinary Manual (°a ed., 199°); Taylor, Pig Diseases, 6a Ed., Diamond Farm Book Pubns, 1995; y Straw et al., Diseases of Swine, °a Ed., Iowa State University Press, 1999.
En diversos aspectos, las terapias (por ejemplo, agentes profilacticos o terapeuticos) se administran menos de 5 minutos separadas, menos de 30 minutos separadas, 1 hora separadas, a aproximadamente 1 hora separadas, a aproximadamente 1 a aproximadamente 2 horas separadas, a aproximadamente 2 horas a aproximadamente 3 horas separadas, a aproximadamente 3 horas a aproximadamente 4 horas separadas, a aproximadamente 4 horas a aproximadamente 5 horas separadas, a aproximadamente 5 horas a aproximadamente 6 horas separadas, a aproximadamente 6 horas a aproximadamente 7 horas separadas, a aproximadamente 7 horas a aproximadamente ° horas separadas, a aproximadamente ° horas a aproximadamente 9 horas separadas, a aproximadamente 9 horas a aproximadamente 10 horas separadas, a aproximadamente 10 horas a aproximadamente 11 horas separadas, a aproximadamente 11 horas a aproximadamente 12 horas separadas, a aproximadamente 12 horas a aproximadamente 1° horas separadas, 1° horas a 24 horas separadas, 24 horas a 36 horas separadas, 36 horas a 4° horas separadas, 4° horas a 52 horas separadas, 52 horas a 60 horas separadas, 60 horas a 72 horas separadas, 72 horas a °4 horas separadas, °4 horas a 96 horas separadas, o 96 horas a 120 horas separadas. En aspectos preferidos, se administran dos o mas terapias en la misma visita del paciente.
En ciertos aspectos, se administran dclicamente una o mas composiciones descritas en la presente memoria y una o mas terapias (por ejemplo, agentes profilacticos o terapeuticos). La terapia dclica implica la administracion de una primera terapia (por ejemplo, un primer agente profilactico o terapeutico) durante un periodo de tiempo, seguida de la administracion de una segunda terapia (por ejemplo, un segundo atente profilactico o terapeutico) durante un periodo de tiempo, opcionalmente seguida de la administracion de una tercera terapia (por ejemplo, agente profilactico o terapeutico) durante un periodo de tiempo y asf sucesivamente, y la repeticion de esta administracion secuencial, es decir, el ciclo para reducir el desarrollo de resistencia contra una de las terapias, para evitar o reducir los efectos secundarios de una de las terapias, y/o para mejorar la eficacia de las terapias.
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Una vacuna o composicion inmunogenica de la invencion puede administrarse a un sujeto en una unica dosis seguida de una segunda dosis de 3 a 6 semanas despues. Pueden administrarse vacunaciones de refuerzo al sujeto a intervalos de 6 a 12 meses despues de la segunda vacunacion. El sujeto puede ser un mamftero. El sujeto puede ser un cerdo con infeccion por gripe porcina A.
La administracion de las mismas composiciones de la invencion puede repetirse y las administraciones pueden separarse en al menos 1 dfa, 2 dfas, 3 dfas, 5 dfas, 10 dfas, 15 dfas, 30 dfas, 45 dfas, 2 meses, 75 dfas, 3 meses, o al menos 6 meses. La administracion de la misma terapia (por ejemplo, agente profilactico o terapeutico) diferente de una composicion de la invencion puede repetirse y la administracion puede separarse por al menos 1 dfa, 2 dfas, 3 dfas, 5 dfas, 10 dfas, 15 dfas, 30 dfas, 45 dfas, 2 meses, 75 dfas, 3 meses, o al menos 6 meses.
5.9 Ensayos biologicos
5.9.1 Ensayos in vitro
El crecimiento de los virus de la gripe porcina atenuados de la presente invencion puede evaluarse en celulas de cerdo, por ejemplo, celulas PK, otras celulas de cerdo como se describe en la presente memoria, y otras celulas IFN-competente e IFN-deficientes. En un aspecto espedfico, se infectan celulas PK a una MOI de 0,0005 y 0,001, 0,001 y 0,01, 0,01 y 0,1,0,1 y 1, o 1 y 10, o una MOI de 0,0005, 0,001, 0,005, 0,01, 0,05, 0,1, 0,5, 1,5 o 10 y se incuban con medio sin suero suplementado con fluido alantoideo al 5% (F. Cook, University of Kentucky, Lexington, KY). Los tftulos virales se determinan en el sobrenadante por placas HA en celulas MDCK como se describe a continuacion. Otras celulas en que pueden evaluarse los tftulos virales incluyen, aunque sin limitacion, celulas PK, celulas Vero, celulas endoteliales de vena umbilical humana primarias (HUVEC), lrnea celular de epitelio humano H292, celulas HeLa, y celulas renales embrionarias porcinas rEs.
Los ensayos virales incluyen aquellos que miden la replicacion viral alterada (determinada, por ejemplo, por formacion de placas) o la produccion de protemas virales (determinada, por ejemplo, por analisis de transferencia de western) o aRn virales (determinada, por ejemplo, por RT-PCR o analisis de transferencia de northern) en celulas cultivadas in vitro usando metodos que son bien conocidos en la tecnica.
La induccion de respuestas de IFN puede determinarse midiendo el estado fosforilado de componentes de la ruta de IFN despues de infeccion con el virus mutante de ensayo, por ejemplo, ERF-3, que se fosforila en respuesta a ARN bicatenario. En respuesta a IFN tipo I, quinasa Jak1 y quinasas TyK2, las subunidades del receptor de IFN, STAT1, y STAT2 se fosforilan rapidamente en la tirosina. Por tanto, para determinar si el virus de la gripe porcina atenuado induce respuestas de IFN, se infectan celulas, tales como celulas 293, con el virus mutante de ensayo y despues de la infeccion, se lisan las celulas. Los componentes de la ruta de IFN, tales como la quinasa Jak1 o la quinasa TyK2, se inmunoprecipitan de los lisados celulares infectados, usando sueros o anticuerpos policlonales espedficos, y se determina el estado de tirosina fosforilada de la quinasa por ensayos de inmunotransferencia con un anticuerpo anti- fosfotirosina (por ejemplo, vease Krishnan et al. 1997, Eur. J. Biochem. 247: 298-305). Un estado fosforilado potenciado de cualquiera de los componentes de la ruta de IFN despues de infeccion con el virus de la gripe porcina atenuado indicana induccion de respuestas de IFN por el virus de la gripe porcina atenuado.
La induccion de respuestas de IFN puede determinarse midiendo la activacion transcripcional dependiente de IFN despues de infeccion con el virus de la gripe porcina atenuado de ensayo. En esta realizacion, puede analizarse la expresion de genes que se sabe que se inducen por IFN, por ejemplo, Mx, PKR, 2-5-oligoadenilatosintetasa, complejo principal de histocompatibilidad (MHC) clase I, etc., por tecnicas conocidas para los expertos en la materia (por ejemplo, transferencias de northern, transferencias de western, PCR, etc.). Como alternativa, las celulas de ensayo tales como celulas renales embrionarias o celulas de sarcoma osteogenico, se modifican para expresar de forma transitoria o constitutiva genes indicadores tales como el gen indicador de luciferasa o gen indicador de cloranfenicol transferasa (CAT) bajo el control de un elemento de respuesta estimulado por interferon, tal como el promotor estimulado por IFN del gen ISG-54K (Bluyssen et al., 1994, Eur. J. Biochem. 220:395-402). Las celulas se infectan con el virus de la gripe porcina atenuado de ensayo y el nivel de expresion del gen indicador se compara con el de celulas no infectadas o celulas infectadas con virus de tipo silvestre. Un aumento en el nivel de expresion del gen indicador despues de infeccion con el virus de ensayo indicana que el virus de la gripe porcina atenuado de ensayo esta induciendo una respuesta de IFN.
La medicion de la induccion de IFN tambien puede evaluarse determinando si un extracto de la celula o huevo infectado con el virus de la gripe porcina atenuado de ensayo es capaz de conferir actividad protectora contra infeccion viral. Mas espedficamente, se infectan grupos de huevos embrionados de gallina de 10-12 dfas de vida o huevos embrionados de gallina de 10 dfas de vida con el virus de la gripe porcina atenuado de ensayo o el virus de tipo silvestre. Aproximadamente de 15 a 20 horas post-infeccion, se recoge el fluido alantoideo y se ensaya para la actividad IFN determinan la dilucion mas alta con actividad protectora contra infeccion por virus de la gripe porcina en celulas de cultivo tisular, tales como celulas MDCK.
5.9.2 Ensayos in vivo
La virulencia disminuida de los virus de la gripe porcina atenuados de la presente invencion puede evaluarse en un sujeto, en particular, cerdos. En un ejemplo, se compara la capacidad de inducir lesiones pulmonares y causar
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infeccion en cerdos con virus de la gripe porcina de tipo silvestre y virus simulado. Las lesiones pulmonares pueden evaluarse como un porcentaje de lobulos pulmonares que estan sanos por inspeccion visual. Los animales se sacrifican 5 d^as p.i. por administracion intravenosa de pentobarbital, y se retiran sus pulmones en su totalidad. El porcentaje de la superficie de cada lobulo pulmonar que esta afectado por lesiones macroscopicas se estima visualmente. Los porcentajes se promedian para obtener un valor medio para los 7 lobulos pulmonares de cada animal.
En otros ensayos, pueden ensayarse frotis nasales y BALF para determinar la carga o el tftulo de virus. Los frotis nasales pueden tomarse durante la necropsia para determinar la carga viral post-infeccion. Las muestras tambien pueden tomarse con cuidado de cerdos vivos para determinar la carga viral post-infeccion. El BALF puede obtenerse despues de retirar los pulmones de la cavidad toracica aclarando los pulmones (mediante la traquea) con aproximadamente 30 ml de medio de McCoy sin suero.
Para la cuantificacion del virus en muestras tisulares, se homogenizan las muestras tisulares en solucion salina tamponada con fosfato (PBS), y se adsorben los homogenados aclarados durante 1 h a 37 °C en monocapas de celulas MDCK. Las monocapas infectadas despues se recubren con una solucion de medio esencial mmimo que contiene albumina de suero bovino (BSA) al 0,1%, DEAE-dextrano al 0,01%, NaHCO3 al 0,1%, y agar al 1%. Las placas se incuban de 2 a 3 dfas hasta que puedan visualizarse placas. Se realizan ensayos de dosis infecciosa en cultivo tisular (DICT) para titular el virus de muestras infectadas con PR8 del siguiente modo. Se incuban monocapas confluyentes de celulas MDCK en placas de 96 pocillos con diluciones log de homogenados tisulares aclarados en medio. De dos a tres dfas despues de la inoculacion, se evaluan aftcuotas de 0,05 ml de cada pocillo para el crecimiento viral por ensayo de hemaglutinacion (ensayo HA).
En otros ensayos mas, se realizan evaluaciones histopatologicas despues de infeccion. Se examinan los cornetes nasales y la traquea para cambios epiteliales e inflamacion subepitelial. Se examinan los pulmones para cambios epiteliales bronquiolares e inflamacion peribronquiolar en bronquiolos grandes, medianos, y pequenos o terminales. Los alveolos tambien se evaluan para cambios inflamatorios. Los bronquiolos medianos se clasifican en una escala de 0 a 3+ del siguiente modo: 0 (normal: revestido por celulas epiteliales columnares medianas a altas con ftmites apicales ciliados y nucleos pseudoestratificados basales; inflamacion minima); 1+ (capa epitelial columnar e incluso en contorno con proliferacion ligeramente aumentada; cilios aun visibles en muchas celulas); 2+ (cambios prominentes en la capa epitelial que vanan desde atenuacion a marcada proliferacion; celulas desorganizadas y contorno de capa irregular en el ftmite luminal); 3+ (capa epitelial marcadamente alterada y desorganizada con celulas necroticas visible en el lumen; algunos bronquiolos atenuados y otros en marcada proliferacion reactiva).
La traquea se clasifica en una escala de 0 a 2,5+ del siguiente modo: 0 (normal: revestida por celulas epiteliales columnares medianas a altas con ftmite apical ciliado, nucleos basales y pseudoestratificados. Citoplasma evidente entre el ftmite apical y el nucleo. Pequeno foco ocasional con celulas escamosas); 1+ (metaplasia escamosa focal de la capa epitelial); 2+ (metaplasia escamosa difusa de la gran parte de la capa epitelial, los cilios pueden ser evidentes de forma focal); 2,5+ (metaplasia escamosa difusa con muy pocos cilios evidentes).
La inmunohistoqmmica del virus de la gripe porcina se realiza usando un anticuerpo monoclonal espedfico para NP. La tincion se clasifica de 0 a 3+ del siguiente modo: 0 (sin celulas infectadas); 0,5+ (pocas celulas infectadas); 1 + (pocas celulas infectadas, como celulas individuales ampliamente separadas); 1,5+ (pocas celulas infectadas, en forma individual ampliamente separadas y en pequenos grupos); 2+ (cantidades moderadas de celulas infectadas, que afectan habitualmente a grupos de celulas adyacentes en partes de la capa epitelial que reviste los bronquiolos, o en pequenos focos sublobulares en los alveolos); 3+ (numerosas celulas infectadas, que afectan a la mayor parte de la capa epitelial en los bronquiolos, o extendidas en focos sublobulares grandes en los alveolos).
5.9.3 Determinacion del tftulo viral
El tftulo viral se determina inoculando diluciones en serie de virus de la gripe porcina en cultivos celulares (por ejemplo, cultivos de cerdo), embriones de pollo, o animales vivos (por ejemplo, cerdos). Despues de incubacion del virus durante un tiempo espedfico, el virus se afsla usando metodos convencionales.
La cuantificacion ffsica del tftulo del virus puede realizarse usando PCR aplicada a sobrenadantes virales (Quinn y Trevor, 1997; Morgan et al, 1990), ensayos de hemaglutinacion, dosis infecciosas en cultivo tisular (DICT50) o dosis infecciosas en huevo (DIH50).
El ensayo HA se realiza en placas de 96 pocillos con fondo en V. Se incubaron diluciones en serie de factor dos de cada muestra en PBS durante 1 h en hielo con un volumen igual de una suspension al 0,5% de eritrocitos de pollo en PBS. Los pocillos positivos conteman una capa homogenea adherente de eritrocitos; los pocillos negativos conteman un sedimento no adherente.
5.9.4 Determinacion de los titulos de anticuerpo inhibidores de hemaglutinacion
En un metodo, el ensayo de inhibicion de HA, se determinan los niveles de anticuerpos que inhiben (HI) la hemaglutinacion (HA) en muestras como se ha descrito previamente (Palmer et al., 1975, Advanced laboratory techniques for gripe diagnosis. U.S. Department of Health, Education and Welfare Immunology Series. U.S.
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Department of Health, Education and Welfare, Washington, D.C.). En resumen, se incuban muestras durante una noche a 37 °C con 4 volumenes de enzima que destruye el receptor (Denka Seikett Go., Tokio, Japon) preparada a partir de Vibrio cholerae. Despues de la inactivacion de la enzima que destruye el receptor por incubacion de las muestras a 56 °C durante 60 min, se mezclan diluciones en serie de factor dos de suero con 4 unidades HA de virus de la gripe porcina. Los ensayos se revelan anadiendo globulos rojos de pollo al 0,5% (vol/vol), y los tttulos de anticuerpo HI se definen como el redproco de la dilucion mas alta que causa inhibicion completa de la aglutinacion.
5.9.5 Estudios de toxicidad
La toxicidad y/o eficacia de las composiciones de la presente invencion puede determinarse por procedimientos farmaceuticos convencionales en cultivos celulares o animales experimentales, por ejemplo, para determinar la DL50 (dosis letal para el 50% de la poblacion) y la DE50 (dosis terapeuticamente eficaz en el 50% de la poblacion). La proporcion de dosis entre efectos toxicos y terapeuticos es el mdice terapeutico y puede expresarse como la proporcion DL50/DE50. Se prefieren terapias que muestran grandes indices terapeuticos. Aunque pueden usarse terapias que muestras efectos secundarios toxicos, debe tenerse cuidado de disenar un sistema de suministro que dirija dichos agentes al sitio de tejido afectado para minimizar el dano potencial a celulas no infectadas y, de ese modo, reducir los efectos secundarios.
Los datos obtenidos de los ensayos de cultivo celular y estudios en animales pueden usarse en la formulacion de un intervalo de dosificacion de las terapias para su uso en sujetos (por ejemplo, cerdos). La dosificacion de dichos agentes esta preferiblemente dentro de un intervalo de concentraciones en circulacion que incluyen la DE50 con poca o ninguna toxicidad. La dosificacion puede variar dentro de este intervalo dependiendo de la dosificacion empleada y la via de administracion utilizada. Para cualquier terapia usada en el metodo descrito en la presente memoria, la dosis terapeuticamente eficaz puede estimarse inicialmente a partir de ensayos de cultivo celular. Puede formularse una dosis en modelos animales para conseguir un intervalo de concentracion plasmatica en circulacion que incluya la CI50 (es decir, la concentracion del compuesto de ensayo que consigue una inhibicion la mitad de la maxima de los smtomas) determinada en cultivo celular. Dichas informacion puede usarse para determinar de forma mas precisa las dosis utiles en sujetos (por ejemplo, cerdos). Los niveles en plasma pueden medirse, por ejemplo, por cromatograffa lfquida de alto rendimiento.
Ademas, puede usarse cualquier ensayo conocido para los expertos en la materia para evaluar la utilidad profilactica y/o terapeutica de una composicion, una terapia de combinacion descrita en la presente memoria para infeccion por virus de la gripe porcina o una afeccion o smtomas asociados con la misma, una infeccion diferente a una infeccion por virus de la gripe porcina o una afeccion o smtoma asociado con la misma, una enfermedad tratable por IFN, o una afeccion en que se usa un virus de la gripe porcina atenuado como un vector para inducir una respuesta inmunitaria contra un antfgeno asociado con la afeccion.
Los siguientes ejemplos se proporcionan para ilustrar adicionalmente la presente invencion pero no se proporcionan para limitar de ningun modo el alcance de la presente invencion.
6. Ejemplos
6.1 Ejemplo 1: Generacion de virus Sw/Tx98 derivados de plasmido que codifican NS1 truncada
Se uso mutagenesis dirigida al sitio para generar diferentes deleciones en el segmento NS del virus de la gripe porcina de tal modo que se expresara NEP sin ninguna alteracion mientras la NS1 estaba parcialmente delecionada. Esto se consiguio insertando un codon de parada en la ORF de NS1 seguido de una delecion en la ORF de NS1 que abarca nucleotidos no implicados en la expresion de NEP.
Celulas y virus. Se cultivaron celulas renales de cerdo-15 (PK-15), de testmulo porcino (ST) y de rinon canino Madin-Darby (MDCK) tipo II en medio esencial mmimo (MEM) suplementado con suero bovino fetal (FBS) al 10%. Se cultivaron celulas renales de cna de hamster (BHK), 293T y a549 en DMEM con FBS al 10%. Todas las celulas se mantuvieron a 37 °C y 5% de CO2. Se obtuvo el virus de la gripe A/Porcino/Texas/4199-2/98 (TX/98, subtipo H3N2) del registro en el St. Jude Children's Research Hospital, Memphis, TN. Los virus de la gripe se cultivaron en las cavidades alantoideas de huevos embrionados de gallina o en celulas MDCK. Se cultivo el virus de la estomatitis vesicular recombinante que expresa GFP (VSV-GFP) (Stojdl, 2003, Cancer Cell 4:263-75) y se titulo en celulas BHK para su uso en bioensayos de IFN.
Construccion de plasmidos. Se infectaron celulas MDCK con virus TX/98 y se extrajo el ARN total usando reactivo Trizol de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Invitrogen). Los ocho plasmidos de genetica inversa pHW-Sw- PB2, pHW-Sw-PB1, pHW-Sw-PA, pHW-Sw-HA, pHW-Sw-NP, pHW-Sw-NA, pHW-Sw-M y pHW-Sw-NS (correspondientes a los ocho segmentos virales de gripe enumerados en la Tabla 1) se construyeron por amplificacion por RT-PCR de segmentos individuales de aRn viral y clonacion de los ADNc resultantes en el vector pHW2000 (Hoffmann et al., 2000, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:6108-6113). Las secuencias de inserto para pHW- Sw-PB2, pHW-Sw-PBl, pHW-Sw-PA, pHW-Sw-HA, pHW-Sw-NP, pHW-Sw-NA, pHW-Sw-M y pHW-Sw-NS se proporcionan en las SEC ID N° 1-8, respectivamente. En este sistema, se inserta el ADNc viral de gripe entre las secuencias promotoras y terminadoras de la ARN polimerasa I (polI). Esta unidad completa de transcripcion de ARN poll esta flanqueada por un promotor de ARN polimerasa II (polII) y un sitio de poliadenilacion. La orientacion de los
dos promotores permite la smtesis de ARN viral con sentido negativo y ARNm con sentido positivo de un molde de ADNc viral. pHW-Sw-NS-73, pHW-Sw-NS-99 y pHW-Sw-NS-126 son derivados de pHW-Sw-NS. Estos plasmidos mutantes de NS1 se contruyeron mediante ligamiento trimolecular: Se ligaron dos productos de PCR en pHW2000- Sw-NS digerido con Sall/NgolV.
5 El primer producto de PCR era comun a los tres plasmidos mutantes de NS1, y se obtuvo usando oligo pHW-3' (inverso, hibridacion en la estructura del plasmido pHW2000) GGGTCAAGGAAGGCACGGGGGAGGGGC (Sec ID N° 9) y oligo 5'NS-PacI (directo, hibridacion en el gen NS1) GCGCTTAATTAAGAGGGAGCAATCGTTGGAG (SEC ID N° 1o) y pHW2000-Sw-NS como molde. Este producto de PCR se digirio con NgolV y Pacl.
El segundo producto de PCR fue espedfico para cada plasmido mutante de NS1, y se obtuvo usando: un cebador 10 directo comun, CMV5' (hibridacion en el promotor CMV del plasmido pHW2000) GCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTG (SEC ID N° 11), y un cebador inverso espedfico (hibridacion en el gen NS1): NS73-BglN-PacI-3' GCGCTTAATTAATCAAGATCTAGGATTCCTCTTTCAAAATCC (SEC ID N° 12), NS99-BglN-PacI-3' GCTTAATTAATCAAGATCTATGACATTTCCTCGAGGGTCATG (SEC ID N° 13) o NS126-BglII- PacI-3' GCGCTTAATTAATCAAGATCTACTTTTCCATGATCGCCTGGTCC (SEC ID N° 14). Los tres 15 correspondientes productos de PCR se digirieron con SalI y PacI, y se usaron en ligamiento trimolecular junto con el primer producto de PCR digerido con PacI/NgoIV y pHW2000-Sw-NS digerido con Sall/NgolV, para generar: pHW- Sw-Tx-73, pHW-Sw-Tx-99 y pHW-Sw-Tx-126. Estas construcciones contienen una delecion en la secuencia NS1, mas la insercion de 4 codones de parada en las 3 fases despues de esta delecion. Vease la Figura 1A. Aunque la ORF de la protema de exportacion nuclear (NEP) no esta alterada en estas construcciones, la ORF de NS1 codifica 20 solamente los primeros 73, 99 y 126 aminoacidos de la protema NS1 de tipo silvestre (la longitud total de NS1 de tipo silvestre es 219 aminoacidos), respectivamente.
Las cepas virales se describen a continuacion:
Sw/TX/98 wt: contiene el gen de NS1 de tipo silvestre y representa un virus de la gripe porcina de triple- redistribucion H3N2.
25 Sw/TX/98/del126: expresa los 126 aminoacidos N-terminales de la protema NS1 de tipo silvestre.
Sw/TX/98/del99: expresa los 99 aminoacidos N-terminales de la protema NS1 de tipo silvestre.
Sw/TX/98/del73: expresa los 72 aminoacidos N-terminal de la protema NS1 de tipo silvestre.
Recuperacion mediada por transfeccion de SIV recombinante. El rescate de virus de la gripe a partir del ADN plasmfdico se realizo como se describe en Fodor et al. (1999, J Virol 73:9679-82) y Neumann et al. (1999, Proc Natl 30 Acad Sci USA 96:9345-50) usando un sistema de ocho plasmidos (Hoffmann et al., 2000, Proc.Natl. Acad. Sci. USA 97:6108-6113). Para generar el virus de tipo silvestre (rWT) TX/98 recombinante se transfectaron 0,5 |ig de cada uno de los 8 plasmidos pHW en 106 celulas 293T en suspension usando el reactivo Lipofectamina 2000 (Invitrogen). Los virus mutantes truncados de NS1 se generaron del mismo modo pero sustituyendo el plasmido pHW-Sw-NS por el correspondiente mutante para recuperar los mutantes de virus del73, del99 o del126. Los virus resultantes se 35 pasaron y clonaron por purificacion de placas en celulas MDCK. Se cultivaron soluciones madre de virus en huevos embrionados de gallina de 7 dfas de vida. La identidad de los virus recombinantes SIV se verifico por analisis electroforeticos en gel de los productos de RT-PCR derivados del ARN viral usando oligonucleotidos espedficos para las regiones no codificantes comunes. El gen NS de tipo silvestre o las versiones delecionadas se confirmaron adicionalmente por secuenciacion.
40 Resultados. Para generar SIV usando genetica inversa, se clonaron los ocho ARN virales del virus Tx/98 en plasmidos de expresion antisentido para rescate viral (Hoffmann et al., 2000, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:61086113). Tras la transfeccion de estos plasmidos en celulas 293T, se recuperaron los virus infecciosos. Los SIV precursores (WT) y de tipo silvestre derivados de plasmido (rWT) crecieron hasta tttulos similares en celulas MDCK y huevos embrionados. Cuando se inocularon en cerdos, el virus rWT produjo lesiones similares que el virus WT 45 precursor. Se generaron tres mutantes SIV de NS1-truncada que codificaban protemas NS1 de 73, 99 y 126 aminoacidos, en comparacion con la protema NS1 de longitud completa, de 219 aminoacidos de longitud (Fig. 1A). Analisis de RT-PCR y secuenciacion confirmaron la presencia de los genes NS1 truncados en las preparaciones de virus rescatados (Fig. 1B).
6.2 Ejemplo 2; Caracterizacion de los mutantes de delecion de NS1 del virus de la gripe porcina y 50 A/Porcino/Texas/4199-2/98 de tipo silvestre
Para caracterizar el impacto de la delecion del gen de NS1 sobre las propiedades de replicacion del virus de la gripe porcina, se comparo el crecimiento del tipo silvestre y los diferentes mutantes de delecion descritos en la Seccion 6,1. Ademas, se comparo el efecto de estos mutantes sobre la produccion de IFN.
Curvas de crecimiento de virus. Para analizar la replicacion viral, se infectaron celulas PK-15 confluyentes a la 55 multiplicidad de infeccion (MOI) indicada y se incubaron durante diferentes periodos de tiempo a 37°C en MEM que contema albumina bovina al 0,3% (MEM/BA) y fluido alantoideo al 5%. Los tttulos de virus se determinaron por
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ensayo de placa en celulas MDCK en MEM/BA suplementado con 1 |ig/ml de TPCK tripsina. Los tttulos se expresaron como unidades formadoras de placas (UFP) por ml.
Para investigar las propiedades de crecimiento multiciclo de los virus mutantes de NS1 se infectaron celulas epiteliales de cerdo (PK-15) confluyentes a una MOI baja (MOI=0,001). Se titularon los sobrenadantes de las celulas infectadas en diferentes puntos temporales post-infeccion por ensayo de placa en celulas MDCK. La cinetica de crecimiento de los mutantes de delecion de NS1 en celulas PK-15 fue claramente diferente en comparacion con el virus de tipo silvestre. De forma interesante, el virus mutante 1-126 fue el mas comprometido en el crecimiento, seguido de los mutantes 1-99 y 1-73 (Fig. 2A). Los tamanos de placa en celulas MDCK se correlacionaron con las diferencias de crecimiento en celulas PK-15 (Fig. 2C). Estos resultados indican que deleciones en la protema NS1 del virus Sw/TX/98 provocan atenuacion del crecimiento viral, tanto en celulas PK-15 como en celulas MDCK. En contraste, cuando se cultivaban virus mutantes de NS1 a una MOI alta (MOI=2) en celulas PK-15 no se detectaban diferencias importantes en la cinetica de crecimiento (Fig. 2B). Esto muy probablemente indica que la replicacion viral de los virus mutantes de NS1 no esta restringida durante el primer ciclo de replicacion, lo que sugiere que las celulas infectadas secretan citoquinas antivirales, tales como IFN, que inhiben las posteriores rondas de replicacion.
Marcaje metabolico. Celulas PK-15 confluyentes sembradas en placas de 22-mm se infectaron de forma simulada o se infectaron con virus rWT, 1-73,1-99 o 1-126 a una MOI de 2. Las celulas se incubaron en MEM/BA a 37°C durante diversos puntos temporales, y posteriormente se marcaron durante 2 h con 10 |iCi de [3SS]Met-Cys en MEM que careda de Met-Cys. Las celulas se lavaron con solucion salina tamponada con fosfato (PBS) enfriada en hielo, se lisaron y se separaron los extractos celulares totales por electroforesis en gel dodecil sulfato sodico-poliacrilamida (SDS-PAGE). Las protemas se visualizaron por autorradiograffa.
El marcaje metabolico de celulas PK infectadas con virus (MOI=2) con [35S]-Met-Cys, no revelo diferencias en la cinetica de la smtesis de protema NP entre los virus rWT y mutantes 1-73,1-99 y 1-126 (Fig. 2D). Las protemas mutantes NS1 no pudieron detectarse por marcaje.
Bioensayo para medir la produccion de IFN. Se determinaron los niveles de IFN secretada por celulas infectadas con virus como se ha descrito previamente (Park et al., 2003, J. Virol. 70:9522-9532; Donelan, 2003, J Virol 77:13257-66), con algunas variaciones. Se trataron de forma simulada o se infectaron celulas PK-15 confluyentes sembradas en placas de 22-mm con virus rWT, del73, del99 o del126 a una MOI de 2. Despues de la infeccion, las celulas se incubaron con MEM/BA que contema fluido alantoideo al 5%, y en diferentes puntos temporales post- infeccion, se recogieron los sobrenadantes. Los virus presentes en el sobrenadante se inactivaron por UV colocando las muestras en hielo 15,24 cm debajo de una lampara UV de 8-W (Fisher) durante 15 min con agitacion constante. Se sembraron nuevas celulas PK-15 en placas de 96 pocillos el dfa antes y se incubaron con los sobrenadantes inactivados por UV durante 24 h. Despues, las celulas PK-15 preincubadas se infectaron con VSV-GFP (MOI=0,1). Las celulas que expresaban GFP se visualizaron por microscopfa de fluorescencia 16 horas post-infeccion.
Para ver si la atenuacion observada del crecimiento in vitro de los virus de NS1-truncada estaba directamente correlacionado con la capacidad de estos virus de inhibir el sistema IFN-a/p, se investigo la induccion de IFN en celulas infectadas con los virus Sw/Tx/98 recombinantes. Se usaron sobrenadantes de celulas PK-15 infectadas para determinar los niveles de IFN-a/p secretada usando un bioensayo basado en la inhibicion de la replicacion de VSV-GFP (Fig. 3A). Para este proposito, se infectaron celulas PK-15 (MOI=2) con SIV rWT y mutantes de NS1 y se recogieron los sobrenadantes para las determinaciones de IFN cada dos horas durante 10 h. Los resultados se muestran en la Fig. 3B. Los sobrenadantes de celulas infectadas de forma simulada no causaron inhibicion de la expresion de GFP por VSV-GFP en celulas PK-15. En contraste, la replicacion de VSV-GFP estuvo completamente anulada en celulas pretratadas con el sobrenadante de celulas infectadas con virus del 126 a las 10 h post-infeccion. No se detecto IFN-a/p mediante este ensayo en los sobrenadantes de celulas infectadas con virus rWT. Todos los virus de NS1-truncada indujeron niveles detectables de IFN-a/p en 6 h post-infeccion, siendo el virus 1-126 el inductor mas potente de IFN-a/p, seguido de los virus del99 y del73. Se realizaron experimentos similares usando otras lmeas celulares porcinas (ST) y humanas (A549) infectadas con virus con resultados basicamente identicos.
Analisis de ARNm de lFN-p y TNF-a por RT-PCR. Se infectaron celulas PK-15 a una MOI de 2, y a las 24 horas post-infeccion, se extrajo el ARN total usando el kit Absolutely RNA RT-PCR Miniprep (Stratagene). Se realizo RT usando oligodT como cebador. La PCR se hizo usando pares de cebadores espedficos para ARNm porcinos de IFN-p (5-SWIFNB+ GGCCATGGCTAACAAGTGCATCC (SEC ID N° 15), 3-SWIFNB-
CCGGTCAGTTCCGGAGGTAATC (SEC ID N° 16)) y TNF-a (5'SW-TNFA ATGAGCACTGAGAGCATG (SEC ID N° 17), 3'SW-TNFA TCACAGGGCAATGATCCC (SEC ID N° 18)) (numeros de acceso a Genbank M86762 y X57321). Como control, se usaron cebadores espedficos para p-actina (Donelan, 2003 J Virol 77:13257-66) para amplificar un fragmento de 550-pb de p-actina porcina. Los productos se secuenciaron y confirmaron como derivados de los ARNm esperados.
El analisis de RT-PCR de transcritos de IFN-p y TNF-a revelo la induccion de la expresion del ARNm de estas citoquinas en celulas PK-15 infectadas con virus mutantes de NS1, especialmente en celulas infectadas con virus 1126 (Fig. 3C). Estos datos indican que la potencia de inhibicion de la produccion de IFN por los virus Sw/Tx/98 recombinantes es del siguiente modo: rWT>del73>del99>del126.
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6.3 Ejemplo 3: Patogenesis de virus mutantes/delecion TX/98 derivados de plasmido
La patogenesis de los virus de la gripe porcina espedficos descritos en la Seccion 6.1 se evaluo en cerdos. Se determino la capacidad de Sw/Tx/98/del126, Sw/Tx/98/del99, y Sw/Tx/98/del73 de inducir lesiones pulmonares y causar infecciones en cerdos y se compararon con los resultados obtenidos para un virus simulado y el virus Sw/Tx/98 wt de tipo silvestre. Las lesiones pulmonares se evaluaron como el porcentaje de pulmon sano en que sucedieron lesiones usandose un promedio de siete lobulos del pulmon para esta determinacion. Se administraron los virus o el simulado como se describe en detalle a continuacion y se obtuvieron frotis nasales o BALF durante la necropsia para determinar la carga de virus cinco dfas post-infeccion. Se realizo evaluacion histopatologica. Se examinaron los cornetes nasales y la traquea para cambios epiteliales e inflamacion subepitelial. Los alveolos tambien se evaluaron para cambios inflamatorios.
Este ejemplo demuestra que deleciones C-terminales del gen de NS1 provocan un fenotipo atenuado.
6.3.1 Metodos
Infeccion de cerdos. Se obtuvieron cerdos exogamicos libres de patogenos espedficos de una granja porcina comercial en Iowa (EEUU). Se confirmo que los sueros de estos cerdos eran negativos para la presencia de anticuerpos de inhibicion de la hemaglutinacion (Palmer, 1975, (U.S. Department Of Health, Education, and Welfare, Washington, D.C.), pag. 51-52) contra SIV H3n2 (Sw/TX/98 y Sw/CO/99) y H1N1 (Sw/IA/30). Se alojaron grupos de cuatro a cinco cerdos en salas de aislamiento separadas. A la edad de 4 semanas, se anestesio a los cerdos por inyeccion intramuscular con una mezcla de ketamina, xilazina, zolazepam y tiletamina (Mengeling, 1996, Am J Vet Res 57:834-839) antes de inocularse por via intratraqueal (mediante laringoscopio y tubo traqueal) con 1 ml de solucion de virus que contema 1 x 105 UFP. Durante 5 dfas, se controlo a los cerdos para signos clmicos incluyendo letargia, anorexia, tos, hiperpnea/dispnea, descarga nasal y ocular y se registro su temperatura corporal diariamente. En el dfa 5, se sacrifico a los animales por administracion intravenosa de pentobarbital (Fort Dodge Animal Health, Fort Dodge, EEUU), y se retiraron sus pulmones en su totalidad. El porcentaje de la superficie de cada lobulo pulmonar es estaba afectado por lesiones macroscopicas se estimo visualmente. Los porcentajes se promediaron para obtener un valor medio para los 7 lobulos pulmonares de cada animal. Se retiraron los cornetes nasales, la traquea, y el lobulo cardiaco derecho y se fijaron en formalina para evaluacion histopatologica adicional. Tambien se recogio sangre, fluido bronco-alveolar (BALF) y frotis nasales durante la necropsia. El BALF se obtuvo despues de retirar los pulmones de la cavidad toracica aclarando los pulmones (mediante la traquea) con aprox. 30 ml de medio de McCoy sin suero. Todos los experimentos en animales fueron en cumplimiento con el Institutional Animal Care and Use Committee of the National Animal Disease Center.
Observacion clinica y muestreo. Durante 5 dfas, se controlo a los cerdos para signos clmicos incluyendo letargia, anorexia, tos, hiperpnea/dispnea, descarga nasal y ocular y se registro su temperatura corporal diariamente. Se recogio sangre, BaLf, y frotis nasales durante la necropsia. El BALF se obtuvo despues de retirar los pulmones de la cavidad toracica aclarando los pulmones (mediante la traquea) con aprox. 30 ml de medio de McCoy sin suero. Se ensayaron los frotis nasales y el BALF para determinar la carga de virus.
Titulaciones de virus de frotis nasales y BALF. Se ensayaron los frotis nasales y BALF para determinar la carga de virus. Se prepararon diluciones en serie de factor diez en medio de McCoy sin suero, suplementado con 5 |ig/ml de tripsina. Se inocularon celulas MDCK con las diluciones y se incubaron con medio mas tripsina en placas de microtitulacion a 37°C durante 72 h. Las placas se examinaron para los efectos citopaticos despues de 72 horas. Los tttulos de virus se calcularon por el metodo de Reed y Muench (Reed, 1938, Am J Hyg 27:493-497).
Evaluacion histopatologica: Se tineron los cornetes nasales y la traquea con hematoxilina y eosina y se examinaron en el microscopio para cambios epiteliales e inflamacion subepitelial. Los pulmones se examinaron para cambios epiteliales bronquiolares e inflamacion peribronquiolar en bronquiolos grandes, medianos, y pequenos o terminales. Tambien se evaluaron los alveolos para cambios inflamatorios. Como las lesiones se encontraron de forma mas consistente en vfas aereas de tamano medio, se usaron los datos obtenidos de los bronquiolos medianos para las comparaciones. Los bronquiolos medianos se clasificaron en una escala de 0 a 3+ del siguiente modo: 0 (normal: revestido por celulas epiteliales columnares medianas a altas con lfmites apicales ciliados y nucleos pseudoestratificados basales; inflamacion minima); 1+ (capa epitelial columnar e incluso en contorno con proliferacion ligeramente aumentada; cilios aun visibles en muchas celulas); 2+ (cambios prominentes en la capa epitelial que vanan desde atenuacion a marcada proliferacion; celulas desorganizadas y contorno de capa irregular en el lfmite luminal); 3+ (capa epitelial marcadamente alterada y desorganizada con celulas necroticas visibles en el lumen; algunos bronquiolos atenuados y otros en marcada proliferacion reactiva).
La traquea se clasifico en una escala de 0 a 2,5+ del siguiente modo: 0 (normal: revestida por celulas epiteliales columnares medianas a altas con lfmite apical ciliado, nucleos basales y pseudoestratificados. Citoplasma evidente entre el lfmite apical y el nucleo. Pequeno foco ocasional con celulas escamosas); 1+ (metaplasia escamosa focal de la capa epitelial); 2+ (metaplasia escamosa difusa de gran parte de la capa epitelial, los cilios pueden ser evidentes de forma focal); 2,5+ (metaplasia escamosa difusa con muy pocos cilios evidentes).
La inmunohistoqmmica del SIV se realizo usando un anticuerpo monoclonal espedfico para NP HB65 (American
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Type Culture Collection, Manassas, Virginia). El anticuerpo se produjo en forma de fluido ascftico de raton. Se uso una dilucion de 1/1000 de HB65 para la inmunohistoqmmica. El ensayo se realizo usando el sistema Dako Envision IHC. La tincion se clasifico de 0 a 3+ del siguiente modo: 0 (sin celulas infectadas); 0,5+ (pocas celulas infectadas); 1+ (pocas celulas infectadas, como celulas individuales ampliamente separadas); 1,5+ (pocas celulas infectadas, en forma individual ampliamente separadas y en pequenos grupos); 2+ (cantidades moderadas de celulas infectadas, que afectan habitualmente a grupos de celulas adyacentes en partes de la capa epitelial que reviste los bronquiolos, o en pequenos focos sublobulares en los alveolos); 3+ (numerosas celulas infectadas, que afectan a la mayor parte de la capa epitelial en los bronquiolos, o extendidas en focos sublobulares grandes en los alveolos).
Analisis estadistico. Se compararon las temperaturas corporales medias, el grado de cambios grandes e histopatologicos, y la replicacion viral en grupos infectados y de control usando el ensayo t de Student bilateral. Se considero que valores de probabilidad (P) <0,05 indican una diferencia estadfsticamente significatica entre grupos.
6.3.2 Resultados
Se adquirieron cuarenta y siete cerdos exogamicos de 4 semanas de edad de una granja porcina comercial en Iowa. Se infectaron por via intratraqueal grupos de 10 cerdos con 105 ufp de virus rWT y Sw/TX/98 mutantes de NS1. Se infectaron de forma simulada siete animales con medio solamente. La temperatura rectal media de cada grupo infectado aumento hasta >40 °C 1 a 3 dfas p.i. en las cohortes infectadas con virus rWT, 1-73 y 1-99 (datos no mostrados). No todos los animales infectados con el mutante de delecion de NS1 1-126 mostraron temperatura aumentada. Los signos clmicos, que comprendfan dificultad respiratoria, secrecion nasal, conjuntivitis, y tos comenzaron en los dfas 2 a 4 p.i. en el grupo infectado con virus rWT. La prevalencia de los signos clmicos difirio entre los virus respectivos. La mayona de los signos clmicos se observaron de forma constante en los grupos infectados con el virus rWT mientras que algunos signos se observaron en las cohores infectadas con virus 1-99 y 173. Se observo solamente temperatura elevada pero ningun otro signo clmico en los cerdos infectados con virus 1126.
Durante la necropsia en el dfa 5 p.i., se estimo el porcentaje de cada superficie pulmonar con lesiones macroscopicas. Como se muestra en la Fig. 4A, los animales de control infectados de forma simulada no teman lesiones pulmonares macroscopicas. Los cerdos infectados con el virus rWT Sw/Tx/98 mostraron porcentaje significativamente mayor de lesiones pulmonares macroscopicas que cerdos infectados con los virus mutantes de delecion de NS1 1-99 (p=0,006) o 1-126 (p=0,004). Los cerdos infectados con el virus mutante de delecion de NS1 1-73 presentaron lesiones menos graves, sin embargo, esto no fue estadfsticamente significativo (p>0,05). En general, las lesiones grandes observadas eran areas marcadas consolidadas, de color ciruela, en lobulos individuales. Los lobulos diafragmaticos estaban menos implicados que los otros lobulos. Los ganglios linfaticos mediastinales estaban habitualmente hiperemicos y agrandados.
Los bronquiolos medianos se examinaron microscopicamente en secciones tisulares del lobulo pulmonar cardiaco derecho de cerdos infectados de 4 semanas de edad y se valoraron histopatologicamente (Fig. 4B). Los animales infectados de forma simulada asf como los cerdos infectados con virus 1-126, mostraron ausencia de lesiones o lesiones mmimas, mientras que se detectaron lesiones de moderadas a graves en animales infectado con los virus rWT y Sw/TX/98 1-99 y 1-73 (Fig. 5A-D y 6A-D). Todos los animales infectado con el tipo silvestre precursor y algunos infectados con los virus 1-73 y 1-99 obtuvieron altos valores que reflejan alteracion de la capa celular epitelial bronquial (caracterizada por necrosis epitelial aguda o posterior atenuacion o proliferacion reactiva). La mayona de los animales infectados con virus 1-73 o 1-99 obtuvieron un valor moderado que refleja proliferacion ligeramente aumentada de la capa epitelial bronquial. Los pulmones de animales infectados con el virus mutante de delecion de NS1 1-126 estaban casi desprovistos de lesiones. Como en las lesiones pulmonares macroscopicas, los cerdos infectados con 1-126 y 1-99 mostraron dano significativamente menor que cerdos infectados con rWT (1-126: p<0,0001; 1-99: p=0,0002). De forma interesante, las lesiones microscopicas en los bronquiolos de cerdos infectados con el virus mutante 1-73 tambien fueron significativamente menores en comparacion con el virus rWT precursor (p=0,02).
Tambien se analizaron los tttulos de virus en el BALF en el dfa 5 p.i. Como se muestra en la Fig. 4C, todos los virus se replicaron en el tracto respiratorio de los cerdos. Los tttulos de virus en BALF fueron significativamente mayores en animales infectados con virus rWT precursor en comparacion con los mutantes de delecion de NS1. Este hallazgo se correlaciona con enfermedad grande y microscopica significativamente menos extensiva observada en cerdos infectados con mutantes de delecion de NS1 frente a virus Sw/Tx/98 de tipo silvestre.
6.4 Ejemplo 4: Uso de TX/98/del 126 como vacuna
Se ensayo la eficacia del mutante de delecion TX/98/del 126 atenuado en un estudio de vacunacion de cerdos. Los experimentos se realizaron como se ha descrito en el Ejemplo 3, excepto que la vacunacion con TX/98/del 126 se realizo dos veces en los dfas 0 y 21 con 1 x 105 UFP por cerdo por inoculacion intratraqueal. La vacunacion y exposicion se hizo por inoculacion intratraqueal (usando 1 ml de solucion de virus/o medio como control). Los animales se expusieron 9 dfas o 10 dfas despues con las siguientes preparaciones:
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• 2x105 UFP por cerdo con virus H3N2 de tipo silvestre (A/Porcino/Texas/4199-2/98-exposicion homologa)
• 2x105 UFP por cerdo con virus H1N1 de tipo silvestre (A/Porcino/MN/37866/99 clasico H1N1-exposicion heterologa)
• Exposicion simulada con 1 ml de medio
Para la evaluacion histopatologica, se tino el lobulo cardiaco derecho de cada pulmon con hematoxilina y eosina y se examino para cambios epiteliales bronquiolares e inflamacion peribronquiolar en bronquiolos grandes, medianos, y pequenos o terminales. Como las lesiones se encontraron de forma mas consistente en vfas aereas de tamano medio, se usaron los datos obtenidos de los bronquiolos medianos para las comparaciones. Se valoro la gravedad de las lesiones mediante la distribucion o grado de lesiones dentro de las secciones examinadas del siguiente modo: 0 - Ninguna via aerea afectada; 1 - solamente unas pocas vfas aereas aisladas afectadas; 2 - grupo localizado de vfas aereas afectadas, a menudo dentro de uno o dos lobulos; 3 - baja cantidad de vfas aereas afectadas pero por toda la mayona de la seccion; 4 - muchas vfas aereas afectadas, a menudo de forma grave, de todos los tamanos.
Se utilizo un examinador capacitado para la evaluacion de las secciones tisulares. El examinador no era consciente del grupo de animales del que derivaban los tejidos.
La inmmunohistoqmmica se hizo usando un anticuerpo monoclonal espedfico para la nucleoprotema de gripe. El valor de antfgeno fue del siguiente modo:
0 = Ninguna celula positiva a antigeno.
1 = Solamente unas pocas celulas con tincion positiva en una via aerea ocasional.
2 = Solamente unas pocas celulas con tincion positiva en vfas aereas dispersas que pueden estar localizadas.
3 = Cantidades moderadas de celulas con tincion positiva en una via aerea ocasional.
4 = Cantidades moderadas de celulas con tincion positiva en vfas aereas y alveolos dispersos.
El lavado pulmonar se ensayo para determinar la carga de virus. Se prepararon diluciones en serie de factor diez en medio de McCoy sin suero, suplementado con 5 |ig/ml de tripsina. Se inocularon celulas MDCK con las diluciones y se incubaron con medio mas tripsina en placas de microtitulacion a 37°C durante 72 h. Las placas se examinaron para los efectos citopaticos despues de 72 horas. Los tftulos de virus se calcularon por el metodo de Reed y Muench.
Resultados. Se obtuvieron los siguientes resultados 5 dfas despues de la exposicion:
1. Cerdos no vacunados, no expuestos no tuvieron ningun cambio histopatologico y no albergaban antfgeno de virus de la gripe en sus tejidos pulmonares (Fig. 7 y 8). No estaba presente el virus infeccioso o por debajo de los lfmites de deteccion (Fig. 9).
2. Cerdos no vacunados expuestos con virus H3N2 TX/98 de tipo silvestre mostraron dano histopatologico significativo y antfgeno de virus de la gripe en sus tejidos pulmonares (Fig. 7 y 8). Los tftulos de virus en el lavado pulmonar eran >106,25 DICT5o/ml.
3. Cerdos no vacunados expuestos con virus H1N1 MN/99 de tipo silvestre mostraron dano histopatologico significativo y antfgeno de virus de la gripe en sus tejidos pulmonares (Fig. 7 y 8). Los tftulos de virus en el lavado pulmonar fueron >106,0 DICT5o/ml.
4. Cerdos vacunaos, expuestos de forma simulada no tuvieron ningun cambio histopatologico y no albergaban antfgeno de virus de la gripe en sus tejidos pulmonares (Fig. 7 y 8). No estaba presente el virus infeccioso o por debajo de los lfmites de deteccion (Fig. 9).
5. Cerdos vacunados, expuestos con H3N2 no tuvieron ningun cambio histopatologico y no albergaban antfgeno de virus de la gripe en sus tejidos pulmonares (Fig. 7 y 8). No estaba presente el virus infeccioso o por debajo de los lfmites de deteccion (Fig. 9).
6. Cerdos vacunados, expuestos con H1N1 tuvieron significativamente menos cambios histopatologicos en sus tejidos pulmonares en comparacion con cerdos no vacunados, expuestos con H1N1 (p<0,001). Estos cerdos no albergaban antfgeno de virus de la gripe en sus tejidos pulmonares (Fig. 7 y 8). Habfa significativamente menos virus infeccioso (p<0,001) presente en el lavado pulmonar en comparacion con los animales no vacunados, expuestos con h1n1 (Fig. 9).
En resumen, la vacunacion de cerdos con el mutante TX/98/del 126 atenuado produjo inmunidad protectora contra exposicion con un aislado de virus homolog (exposicion con virus H3N2 A/Porcino/Texas/4199-2/98). Cuando los cerdos vacunados se expoman con un virus que pertenece a un subtipo diferente de gripe (exposicion con virus H1N1 A/Porcino/MN/37866/99), esta exposicion con virus heterologo produjo significativamente menos lesiones en tejidos pulmonares y varga de virus en lavado pulmonar en comparacion con los contoles no vacunados en el dfa 5 post-inoculacion.
Estos datos indican que el mutante TX/98/del 126 atenuado tiene utilidad como vacuna de virus vivo modificado que muestra inmunidad protectora contra exposicion homologa/homotfpica y considerable proteccion contra exposicion heterologa/heterotfpica.

Claims (34)

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    REIVINDICACIONES
    1. Un virus de la gripe porcina atenuado modificado por ingeniena genetica que tiene un fenotipo antagonista de interferon alterado, en donde dicho virus comprende un gen de NS1 de virus de la gripe porcina A/Porcino/Texas/4199-2/98 con una mutacion que produce una protema NS1 con una delecion de todos los restos de aminoacido de NS1 excepto los restos de aminoacido 1-126, en donde el aminoacido amino-terminal es el numero 1 y la mutacion en el gen de NS1 confiere un fenotipo antagonista de interferon alterado.
  2. 2. El virus de la gripe porcina atenuado, modificado por ingeniena genetica, de la reivindicacion 1, en donde el virus atenuado es una redistribucion.
  3. 3. El virus de la gripe porcina atenuado modificado por ingeniena genetica de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en donde el virus atenuado es un virus quimerico que expresa una secuencia heterologa.
  4. 4. El virus de la gripe porcina atenuado, modificado por ingeniena genetica, de una cualquiera de las
    reivindicaciones 1 a 3, en donde el virus atenuado es un virus quimerico que expresa un epftopo de un patogeno foraneo.
  5. 5. El virus de la gripe porcina atenuado modificado por ingeniena genetica de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde el virus atenuado esta modificado para codificar un epftopo de otro virus o al menos un segmento derivado de un virus diferente.
  6. 6. El virus de la gripe porcina atenuado, modificado por ingeniena genetica, de una cualquiera de las
    reivindicaciones 1 a 5, en donde el virus atenuado es un virus quimerico que expresa un antfgeno tumoral.
  7. 7. Una formulacion inmunogenica que comprende el virus de la gripe porcina atenuado, modificado por ingeniena genetica, de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, y un excipiente fisiologicamente aceptable.
  8. 8. La formulacion inmunogenica de la reivindicacion 7, en donde la concentracion de virus de la gripe porcina atenuado modificado por ingeniena genetica en la formulacion inmunogenica es de aproximadamente 104 a aproximadamente 107 ufp/ml.
  9. 9. Una formulacion farmaceutica que comprende el virus de la gripe porcina atenuado, modificado por ingeniena genetica, de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, y un vefftculo farmaceuticamente aceptable.
  10. 10. La formulacion farmaceutica de la reivindicacion 9, en donde la concentracion del virus de la gripe porcina atenuado modificado por ingeniena genetica en la formulacion farmaceutica es de aproximadamente 104 a aproximadamente 1012 ufp/ml.
  11. 11. Un virus de la gripe porcina atenuado, modificado por ingeniena genetica, segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 para su uso en inmunizacion o induccion de una respuesta inmunitaria en un cerdo.
  12. 12. Un virus de la gripe porcina atenuado modificado por ingeniena genetica segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 para su uso en la prevencion de una afeccion o un smtoma asociado con infeccion por virus de la gripe porcina en un cerdo.
  13. 13. Un virus de la gripe porcina atenuado, modificado por ingeniena genetica, segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 para su uso en el tratamiento de una infeccion por virus de la gripe porcina en un cerdo.
  14. 14. Una formulacion inmunogenica segun la reivindicacion 7 u 8 para su uso en inmunizacion o induccion de una respuesta inmunitaria en un cerdo.
  15. 15. Una formulacion farmaceutica segun la reivindicacion 9 o 10 para su uso en la prevencion de una afeccion o un smtoma asociado con infeccion por virus de la gripe porcina en un cerdo.
  16. 16. Una formulacion farmaceutica segun la reivindicacion 9 o 10 para su uso en el tratamiento de una infeccion por virus de la gripe porcina en un cerdo.
  17. 17. Uso de una cantidad eficaz de la formulacion inmunogenica de la reivindicacion 7 u 8 en la preparacion de un medicamento para su uso en inmunizacion o induccion de una respuesta inmunitaria en un cerdo.
  18. 18. El uso de la reivindicacion 17, en donde la concentracion del virus de la gripe porcina atenuado, modificado por ingeniena genetica, en la formulacion inmunogenica es de aproximadamente 104 a aproximadamente 107 ufp/ml.
  19. 19. Uso de una cantidad eficaz del virus de la gripe porcina atenuado modificado por ingeniena genetica de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 en la preparacion de un medicamento para su uso en la prevencion de una afeccion o un smtoma asociado con virus de la gripe porcina en un cerdo.
  20. 20. Uso de una cantidad eficaz del virus de la gripe porcina atenuado modificado por ingeniena genetica de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 en la preparacion de un medicamento para su uso en el tratamiento de una
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    infeccion por virus de la gripe porcina en un cerdo.
  21. 21. El uso de la reivindicacion 19 o 20, en donde la concentracion del virus de la gripe porcina atenuado, modificado por ingeniena genetica, es de aproximadamente 104 a aproximadamente 1012 ufp/ml.
  22. 22. Un metodo para la produccion de una vacuna, una formulacion inmunogenica, o una formulacion farmaceutica que comprende:
    (a) propagar en un sustrato el virus de la gripe porcina atenuado, modificado por ingeniena genetica, de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 y
    (b) recoger el virus descendiente,
    en donde el sustrato es una celula, lmea celular o huevo embrionado.
  23. 23. El metodo de la reivindicacion 22, en donde el sustrato es una celula de cerdo o lmea celular de cerdo.
  24. 24. El metodo de la reivindicacion 22, en donde el sustrato es un huevo embrionado o un huevo embrionado de gallina.
  25. 25. El metodo de la reivindicacion 24, en donde el huevo embrionado es de 6, 7 u 8 dfas de vida.
  26. 26. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones 22 a 24, en donde el sustrato es deficiente en interferon.
  27. 27. Una celula cultivada que contiene el virus de la gripe porcina atenuado, modificado por ingeniena genetica, de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.
  28. 28. La celula cultivada de la reivindicacion 27, en donde la celula es una celula de cerdo o una lmea celular de cerdo.
  29. 29. La celula cultivada de la reivindicacion 28, en donde la lmea celular de cerdo es celulas PK(D1), celulas PK( 15), celulas PK13, celulas SJPL, celulas NSK, celulas LLG-PK1, celulas LLC-PK1A, celulas ESK-4, celulas ST, celulas PT-K75 o celulas PK-2a/CL 13.
  30. 30. La celula cultivada de una cualquiera de las reivindicaciones 27 o 28, en donde la celula es deficiente en interferon.
  31. 31. Un huevo embrionado que contiene el virus de la gripe porcina atenuado modificado por ingeniena genetica de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.
  32. 32. El huevo embrionado de la reivindicacion 31 que es de gallina.
  33. 33. El huevo embrionado de la reivindicacion 31 o 32, en donde el huevo embrionado es deficiente en interferon.
  34. 34. El huevo embrionado de una cualquiera de las reivindicaciones 31 a 33, en donde el huevo embrionado tiene 6, 7 u 8 dfas de vida.
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