CN102946900A - 用于大流行流感的疫苗 - Google Patents

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Abstract

药物和疫苗组合物包含来自大流行前或大流行性流感病毒的重组血凝素和含有GLA的佐剂。特别相关的大流行前流感病毒为H5N1。还提供了使用组合物的试剂盒和方法。

Description

用于大流行流感的疫苗
关于联邦资助的研究的声明
本发明是在由国家过敏症和传染病研究所授予的5R43AI081383-02下利用政府资助进行的。政府可具有本发明的某些权利。
技术领域
本专利申请总体上涉及用作大流行前或大流行流感例如禽流感(例如，H5N1)、猪流感(例如，H1N1)、H7N7和H9N2的疫苗的组合物。组合物通常包含来自候选流感病毒的重组血凝素和佐剂。
背景技术
大流行是当新疾病出现时保留下来，感染人(从而引起严重疾病)并且迅速地在人之间传播的传染病的全球性大流行。当流感病毒的新株系或亚型从另一种动物物种(例如鸟类或猪)传播至缺乏因先前暴露于相关病毒而产生的免疫的人群中时，流感大流行可发生。流感大流行早在16世纪后期已有记载并且自那以来定期发生，最近的有1957的“亚洲型流感”(H2N2)、1968的“香港流感”(H3N2)和2009年的“猪流感”(H1N1)。20世纪90年代出现的H5N1“亚洲型流感”已感染了人但到目前为止因无效的人与人之间的传播而还未引起大流行。随着全球旅游和城市化增加，预计由新型病毒引起的流感流行的传播可极快地变成大流行(WHO，“大流行防备”)。
禽流感由包含分段的RNA基因组的正粘病毒引起。感染通过病毒血凝素(HA)蛋白与宿主细胞上的唾液酸连接的糖蛋白的结合起始。可基于抗原性和序列特征将血凝素蛋白分成16个亚型。除了HA外，流感病毒还包含另外的表面蛋白神经氨酸酶(NA)，其参与病毒在感染后从细胞的释放。神经氨酸酶蛋白目前被分成9个亚型。16个HA与9个NA亚型的所有可能的组合据认为存在于自然界中，其中野生禽类(例如鸭)用作无症状病毒贮主(asymptomatic virusreservoir)。偶尔地，流感病毒从野生禽类传播至家禽中，其中已描述了疾病的两种形式。一种形式为常见但轻度的，另一种形式为罕见但高度致命的。禽类的高致病性禽流感病毒(HPAI)感染通常由H5和H7亚型引起。HPAI病毒的HA蛋白与其它不太致病的H5和H7亚型HA蛋白区别在于HA切割位点中的一组碱性氨基酸。
禽类被某些HPAI病毒的持续感染以及禽类与人的相对亲近度已导致4个禽流感亚型(H5N1、H7N3、H7N7和H9N2)至人的传播。H7或H9亚型病毒对人的感染通常导致轻度的非致命性疾病。相反地，H5亚型病毒对人的感染导致严重的通常致命的疾病(“Cumulative number of Confirmed Human Cases ofAvian Influenza A/(H5N1)Reported to WHO,2010年2月17日,www.who.int)。
H5N1病毒对人的持续感染加上病毒在野生禽类和家禽中的地理扩张已导致H5N1病毒的遗传进化，现可将所述遗传进化在遗传上和抗原性分类至不同的进化枝和子分枝(subclade)(世界卫生组织全球流感监测网络程序(WHOGlobal Influenza Program Surveillance Network),Emerging Infectious Dis11:1515-1521,2005)。如果这类新型病毒的任一种获得迅速地在人之间传播的能力，则H5N1流感大流行的可能性较高。鉴于与H5N1感染相关的高死亡率，与这样的大流行相关的潜在全球性影响可以是相当严重的。因此，WHO已起始了大流行警告的程序。
抗击破流感大流行的疫苗的开发是WHO和许多政府进行流感大流行防备的基石。需要大量安全有效剂量的大流行疫苗来满足美国和世界其它地方的潜在需要。抗当前循环大流行前株的疫苗的贮存是目前大流性预防策略的关键组成部分。预期可能将与新出现的大流行病毒不完全相同的这些疫苗可提供足够的保护，同时正在产生更专一的株系匹配的疫苗。迄今为止，3种H5N1疫苗(两种裂解病毒体(split-virion)和一种全病毒体(whole-virion))已获得监管机构的批准并且几种其它疫苗正处于后期开发。
许多国家现正在贮存这些疫苗，近期美国目标是收集足够的疫苗来治疗2000万人。然而，许多科学、技术和经济挑战使得全球性流感大流行的防备变得复杂。重要地，通过常规基于鸡蛋的方法进行的大流行前或大流行疫苗的制造是非常耗时的、昂贵的，并且需要数十亿鸡蛋来制造足够的疫苗剂量以免疫全世界的高危个体。产生减毒病毒的基于细胞的替代策略正在开发中，但这类再装配病毒通常包含相对低水平的疫苗抗原。该低抗原产率在H5N1疫苗的背景中是值得特别关注的，因为禽H5血凝素固有地在人中表现出比来自其它亚型的HA更低的免疫原性。因此，相对于季节性流感疫苗，需要更大的抗原剂量来诱导抗体反应。此外，鉴于人对于H5血凝素具有特异性免疫力(immunologically naive)，一个剂量的免疫计划可能不具有保护作用。为了举例说明这些观点，最早由FDA批准的基于H5进化枝1病毒(A/Vietnam/1203/2004)的疫苗仅在54%的研究参与者中诱导“保护性”中和滴度并且在90μg的HA上需要两个剂量，为季节性疫苗的HA含量的12倍(Treanor等人New Engl J Med354:1343-1351,2006)。
需要可显著提高疫苗生产能力同时增强H5N1免疫原性的其它技术。大流行前疫苗的理想特征是其可被容易且便宜地制造并且具有长贮存期限。重要地，其应当使用最小限量的抗原产生强劲的保护性免疫反应，并且提供抗遗传上不同的病毒，理想地来自不同进化枝的病毒的交叉保护。此外，疫苗还必须是安全的。
发明内容
本发明涉及用作疫苗的组合物和利用所述疫苗免疫受试者的方法，其中疫苗包含来自大流行前或大流行性流感病毒的重组血凝素和佐剂。在一个实施方案中，佐剂为被描述为具有各自独立地选自葡糖基和氨基取代的葡糖基的还原端和非还原端的二糖的化合物(DSLP化合物)，其中非还原端的1位上的碳通过醚(-O-)或氨基(-NH-)基团连接于还原端的6’位上的碳，二糖通过非还原端的4’碳键合于磷酸基团以及通过酰胺(-NH-C(O)-)和/或酯(-O-C(O)-)键键合于多个脂质基团，其中酯或酰胺键的羰基(-C(O)-)基团直接连接于脂质基团，且每一个脂质基团包含至少8个碳。在具体的组合物和方法中，佐剂为GLA(参见，例如，美国专利申请公布2008/0131466)，其在不同的实施方案中可以不含油，被配制为水包油乳剂或利用其它佐剂例如明矾、铝盐来进行配制。特别感兴趣的血凝素包括来自高致病性H5N1病毒的H5和来自H1N1(“猪流感”)大流行性流感病毒的H1。组合物可以是节省药量的(dosage-sparing)和/或重组血凝素可以以节省剂量的量存在。方法可包括用组合物的单次注射即非多次注射来免疫受试者。例如，组合物可通过下列的一项或多项(即，其任何组合)来进行定义：rHA以节省剂量的量存在；rHA以在佐剂不存在的情况下不提供保护性免疫的浓度存在；rHA来自禽流感的致病株；rHA来自H5N1流感的致病株；rHA来自进化枝1或进化枝2；rHA来自大流行猪流感病毒株；rHA来自大流行H1N1株；组合物包含单种，即不超过一种不同的重组蛋白；每剂rHA的量在约15μg至约0.1μg的范围内；rHA从昆虫或哺乳动物细胞表达以获得优选水平的糖基化；rHA被表达为融合蛋白；佐剂仅为GLA或包括GLA；佐剂仅为3D-MPL或包括3D-MPL，组合物不含油；组合物包含低于约1%v/v的油或低于约0.1%v/v的油；佐剂在与抗原组合之前被配制为水溶液；佐剂在与抗原组合之前被配制为包含脂质体的组合物；组合物还包含铝盐或皂苷。
在一个实施方案中，本发明提供了免疫有此需要的受试者抗大流行前或大流行性流感病毒的方法，包括施用单次注射的药物组合物，所述药物组合物包含(a)来自大流行前或大流行性流感病毒的重组血凝素(rHA)和(b)佐剂，其中佐剂包含具有各自独立地选自葡糖基和氨基取代的葡糖基的还原端和非还原端的二糖，其中非还原端的1位上的碳通过醚(-O-)或氨基(-NH-)基团连接于还原端的6’位上的碳，二糖通过非还原端的4’碳键合于磷酸基团以及通过酰胺(-NH-C(O)-)和/或酯(-O-C(O)-)键键合于多个脂质基团，其中酯或酰胺键的羰基(-C(O)-)基团直接连接于脂质基团，且每一个脂质基团包含至少8个碳，其中在单次注射后施用实现血清转换(seroconversion)。在各种实施方案中，其可单独地或以任何组合进一步定义本发明：组合物不包括乳剂；佐剂为GLA，佐剂为3D-MPL。
例如，本发明在一个实施方案中提供了用于通过单次注射药物组合物免疫有此需要的受试者抗大流行前或大流行性流感病毒的方法的药物组合物，所述药物组合物包含：(a)来自大流行前或大流行性流感病毒的重组血凝素(rHA)和(b)佐剂，其中佐剂包含具有各自独立地选自葡糖基和氨基取代的葡糖基的还原端和非还原端的二糖，其中非还原端的1位上的碳通过醚(-O-)或氨基(-NH-)基团连接于还原端的6’位上的碳，二糖通过非还原端的4’碳键合于磷酸基团以及通过酰胺(-NH-C(O)-)和/或酯(-O-C(O)-)键键合于多个脂质基团，其中酯或酰胺键的羰基(-C(O)-)基团直接连接于脂质基团，且每一个脂质基团包含至少8个碳。药物组合物可用于免疫群体抗大流行前或大流行性流感病毒的方法，其中组合物的施用在单次注射后在至少50%、或至少60%或更多的群体中实现血清转换。在一个方面，药物组合物不包括任何油，即不含油，或包含不影响组合物的血清转换效率的最少量的油，并且不包括任何含油乳剂。与这些实施方案的任何实施方案组合，本发明的一个方面是将GLA用作佐剂。在另一个方面，3D-MPL可用作佐剂。
作为另一个实例，本发明提供了用于免疫有此需要的受试者抗大流行前或大流行性流感病毒的方法的药物组合物，其中组合物包含：(a)来自大流行前或大流行性流感病毒的重组血凝素(rHA)和(b)佐剂，其中佐剂包含具有各自独立地选自葡糖基和氨基取代的葡糖基的还原端和非还原端的二糖，其中非还原端的1位上的碳通过醚(-O-)或氨基(-NH-)基团连接于还原端的6’位上的碳，二糖通过非还原端的4’碳键合于磷酸基团以及通过酰胺(-NH-C(O)-)和/或酯(-O-C(O)-)键键合于多个脂质基团，其中酯或酰胺键的羰基(-C(O)-)基团直接连接于脂质基团，且每一个脂质基团包含至少8个碳，并且其中组合物是节省药量的。用于免疫受试者抗大流行前或大流行性流感病毒的方法的药物组合物，其中rHA以节省剂量的量存在。在不同的实施方案中，其可单独地或以任何组合进一步定义本发明：rHA以在佐剂不存在的情况下不提供保护性免疫的浓度存在；组合物包含单种、即不超过一种重组蛋白；每剂量rHA的量在约15μg至约1μg的范围内；并且佐剂为GLA，rH5来自H5N1流感病毒的致病株。
当参考下列详细描述和附图后，这些和其它方面将变得显然。
附图说明
图1A-C。rH5/GLA-SE疫苗的单次注射保护小鼠免受H5N1感染。(A)用在2% v/v SE乳剂或GLA-SE佐剂(20μg GLA)中配制的50、150、450、900或2700 ng rH5(VN)免疫小鼠(5只/组)一次，随后在第14天用H5N1病毒(1000x LD50)进行攻击。在两周的时期中测定每一组的每组体重减轻最大百分比的平均值。测定每一个rH5的剂量的曲线下面积(随时间过去的体重减轻百分比)。(B)在病毒攻击后在连续天数时的小鼠的体重减轻百分比。用利用单独的SE配制的或利用GLA-SE佐剂配制的50ng rH5或在蛋白质不存在的情况下用GLA-SE或SE接种小鼠。每一个数据点代表每组平均体重减轻+/-s.e.m。(C)c57Bl/6小鼠中佐剂介导的rH5保护作用。用单独的GLA-SE或50ng的用2% v/v的单独的SE配制的rH5(VN)、单独的5μg GLA或5μg GLA-SE接种动物(5只/组)一次。在第14天用H5N1 Viet Nam 1203病毒(1000xLD50)攻击(IN)小鼠，监控其存活率和体重减轻。每一个数据点代表每组平均体重减轻+/-s.e.m。
图2。GLA-SE佐剂在用异源H5N1病毒攻击后提高已接种的小鼠的存活率。用50ng利用GLA-SE佐剂配制的同源(VN)rH5、50ng或200ng于GLA-SE佐剂中配制的异源(Indo)rH5或200ng单独的异源rH5或利用SE乳剂配制的rH5接种动物(5只/组)。在第14天用H5N1 Viet Nam 1203病毒(1000xLD50)攻击(IN)小鼠，监控其存活率和体重减轻。每一个数据点代表每组平均体重减轻+/-s.e.m。
图3A-C。GLA-SE加速抗原特异性免疫的诱导和疾病的恢复。(A)作为攻击之前接种的天数的函数的存活率百分比。用50 ng单独的rH5和利用SE或GLA-SE配制的rH5或单独的GLA-SE免疫小鼠，在用H5N1 Viet Nam 1203病毒(1000xLD50)接种后第0、2、4、6、8、10或12天进行攻击。(B)在病毒攻击后第6或14天用50ng单独的rH5或利用SE或GLA-SE配制的rH5接种的小鼠随时间变化的体重减轻百分比。(C)基于观察的评分系统的来自(B)的小鼠的一般健康的变化；0=正常；1=尚未确定的疾病；2=轻度但确定的疾病；3=中度疾病；4=严重的，垂死的。
图4A-C。基于GLA的rH5疫苗在同源和异源病毒攻击后在小鼠中提供了持久的保护性免疫。(A)用50ng单独的或如所指示配制的同源(VN)rH5接种小鼠(5只/组)和46天后用H5N1 Viet Nam 1203病毒(1000xLD50进行攻击。在攻击后每天监控小鼠的体重变化，进行2周。每一个数据点代表每组平均体重减轻+/-s.e.m。(B)用50ng的单独的或如所指示配制的异源(Indo)rH5接种小鼠(5只/组)，46天后用H5N1 Viet Nam 1203病毒(1000xLD50)进行攻击。在攻击后每天监控小鼠的体重变化，进行2周。每一个数据点代表每组平均体重减轻+/-s.e.m。(C)在攻击后第3天或第6天测定用指定的制剂中的同源(VN)或异源(Indo)rH5接种的动物的病毒载量。
图5A-B。利用基于GLA的rH5疫苗的单次注射保护鼬免受H5N1感染。用0.5μg的单独的rH5抗原或指定的制剂中的rH5注射动物(4只/组)一次(IM)，随后在第28天通过H5N1VN1203(0.75x106pfu)的鼻内输注进行攻击。(A)体重的百分比变化。每一个数据点代表4只动物的平均值+/-s.e.m.，除提供分别来自1和2个存活者的结果的GLA-SE和rH5组外。(B)基于观察的评分系统的一般健康的变化；0=正常；1=尚未确定的疾病；2=轻度但确定的疾病；3=中度疾病；4=严重的，垂死的。
具体实施方式
本公开提供了用作疫苗的组合物和利用所述疫苗免疫受试者的方法，其中疫苗包含来自大流行前或大流行性流感病毒的重组血凝素和佐剂。疫苗提供了抗流行前或大流行性流感病毒的保护作用，并且其通常引发体液和细胞免疫，从而导致记忆免疫细胞。
本文中描述的疫苗和药物组合物包含来自大流行前或大流行性流感病毒的血凝素(HA)和DSLP佐剂，例如根据式(1)的佐剂(其可以为GLA)，并且在大流行前和大流行期间用于保护人免受该病毒的侵害。此外，组合物提供了以更少的接种(节省剂量)和/或比在佐剂不存在的情况下所需的更低的剂量的HA(节省药量或抗原)增强抗相关病毒的免疫反应和引发抗相关病毒的交叉反应性的益处。
A.血凝素的制备
1.HA的来源
至少4种不同的甲型流感病毒目前具有大流行前或大流行顾虑：H5N1、H1N1、H7N7和H9N2。
甲型流感病毒H5N1亚型是可引起人和许多其它动物物种的疾病的甲型流感病毒的亚型。H5N1的高致病性株(HPAI H5N1)是“禽流感”或“鸟流感”的原因。其目前是禽病，虽然其可感染人，其大部分或全部与已感染的鸟类具有广泛的身体接触。H5N1被分类为大流行前病毒，因为并非所有大流行的条件都已得到满足，最值得注意地病毒在人之间不能容易且持续性地传播。
H5N1型的禽流感(在本文中称为“H5N1”)首先出现在亚洲并且已全球传播。H5N1病毒不断进化，现可基于它们的HA分子的抗原性和序列特征被分类为不同的进化枝和子分枝。“进化枝”是指从共同祖先传下的相关生物。由于人的H5N1感染在2003年重现，因此已从超过300例人疾病病例分离了几个不同的进化枝。WHO(世界卫生组织)已着手统一高致病性H5N1禽流感病毒的命名系统(Brown等人,Influenza Other Respi Viruses 3:59-62,2009；Donis等人,Emerg Infect Dis.14:e1,2008；也参见www.who.int上的“Continuing progresstowards a unified nomenclature system for the highly pathogenic H5N1 avianinfluenza viruses”)。截至2009年3月，已鉴定了10个不同的病毒进化枝(编号为0-9)。
进化枝1和进化枝2病毒(主要在SE亚洲和亚洲中分离的)最常见地为疫苗开发的主体。最早由FDA批准的H5N1疫苗为基于H5进化枝1病毒的常规疫苗，但仅在约半数研究参与者中诱导保护水平的中和滴度，此外，还需要两个剂量的大量HA。测试中的重组疫苗给出相似的结果(Treanor等人,Vaccine19:1732-1737)。除了保护更多个体外，能够抵抗大流行的疫苗还需要节省剂量和节省药量的改善。
在NCBI的“流感病毒来源”(于2010年1月14日存入的)中存在约1335个特有的全长H5序列。可使用这些H5序列的任何序列。HA序列可来自任何进化枝或子分枝。最常见地，HA可来自进化枝1或2。WHO的参照H5 HA抗原主要在进化枝2中，但也包括进化枝1、4和7中的HA(“Antigenic andgenetic characteristics of H5N1 viruses and candidate vaccine viruses developedfor potential use in human vaccines”，2009年2月,存于www.who.int上)。参照抗原包括下表中显示的抗原。
Figure BDA00002378986400091
*将全部GenBank登录号和参照的序列整体并入本文。
具有大流行顾虑的另一种亚型为H1N1大流行病毒(“猪流感”病毒)，该类型负责2009年的流感大流行和1918年的西班牙流感。引起2009年大流行的株称为大流行H1N1 2009病毒。截至2010年2月18日，超过900个HA的非冗余蛋白质序列可在NCBI和流感研究数据(Influenza ResearchDatabase)(fludb.org)上获得。对于美国，A/California/4/2009(登录号ACP41105，将其整体并入)和A/California/7/2009(登录号ACQ55359，将其整体并入)为用于制造疫苗的株。来自其它株的HA也是合适的。
其它潜在的大流行性流感病毒包括来自荷兰的H7N7和来自中国的H9N2。自2003年以来，荷兰已报导另一种高致病性甲型禽流感病毒(H7N7)在禽类中的爆发。约90个人的确认的感染已在禽工作者和家庭之间发生；针对该病毒的抗体被广泛地发现于未与感染的家禽接触但与感染的个体密切家庭接触的人中，这表明高水平的人与人之间的传播。H9N2为被发现在中国已引起人的疾病的另一种禽流感病毒。国家过敏症和传染病研究所已将H9N2鉴定为潜在的大流行病毒。一些适当的株包括A/HK/1073/99(H9N2)和A/NL/209/07(H7N7)。
用于药物组合物和用于疫苗的血凝素蛋白可以是全长的，但也可以是前体蛋白、片段、融合蛋白的部分或肽。全长蛋白是指成熟蛋白；例如，在血凝素蛋白的情况下，成熟蛋白是在病毒体中发现的形式(例如，缺乏前导肽，并且可被从HA0切割成HA1和HA2)。前体蛋白(前蛋白)是在任何加工发生之前新生的翻译的蛋白质或部分加工的蛋白质。作为融合蛋白的部分，HA蛋白可以以前体或全长蛋白质或蛋白质片段或肽的形式存在。蛋白质的片段或肽必需是具有免疫原性，包含一个或多个引发免疫反应的表位。
肽被选择来与MHC分子复合以结合T细胞受体并且通常达到约30个氨基酸长，或达到约25个氨基酸，或达到约20个氨基酸长，或达到约1 5个氨基酸长，达到约12个氨基酸长，达到约9个氨基酸长，达到约8个氨基酸长。一般而言，更短的肽结合MHC I类分子或与其缔合，更长的肽结合MHC II类分子或与其缔合。可使用许多生物信息学程序的任何程序预测适当的肽，以及使用公知的方法进行测试。
如本文中所公开的，适当的蛋白质包括前体蛋白、成熟蛋白、片段、融合蛋白和肽。组合物中可存在超过一种HA。如果使用多种HA蛋白，则HA蛋白可来自相同病毒或来自不同病毒。此外，多种蛋白质可以相同形式存在或以这些形式的混合物存在。例如，HA蛋白可以以成熟蛋白质的形式和以片段的形式存在。
通常，药物或疫苗组合物中的HA与前体蛋白不同，因为具有前导序列的糖蛋白在真核生物中的表达通常导致成熟蛋白，缺乏前导序列(也称为信号肽)。HA的疏水性前导序列的长度在分离株之间可发生些许变化，但通常为约18个氨基酸长。然而，对于重组表达，信号肽可以为前体蛋白的部分。信号肽包括HA天然序列或本领域已知的序列。
蛋白质片段应当具有免疫原性。在一些情况下，片段包含免疫显性肽。免疫原性肽序列为被B或T细胞(例如，CD4或CD8 T细胞)识别的序列。肽序列可通过筛选来源于全序列的肽来鉴定；通常使用一系列重叠肽。可使用多种测定法来确定B或T细胞是否识别肽和对其起反应。例如，铬释放细胞毒性测定(Kim等人,J Immunol 181:6604-6615,2008，在测定方案方面被并入)、ELISPOT测定、细胞内细胞因子染色测定和MHC多聚体染色(Novak等人JClin Invest 104:R63-R67,1999；Altman等人,Science 274:94-96,1996)、ELISA测定、在用偶联至载体的肽免疫小鼠后其它类型的抗体的测量属于适当的测定。免疫源性肽还可利用生物信息学软件(Molecular Biology第409卷,2007中的“免疫信息学(Immunoinformatics)：在芯片中预测免疫原性”法)来预测。一些示例性程序和数据库包括FRED(Feldhahn等人Bioinformatics 15:2758-9,2009)、SVMHC(
Figure BDA00002378986400101
和Kohlbacher,Nucleic Acids Res 34:W1940197,2006)、AntigenDB(Ansari等人,Nucleic Acids Res 38:D847-853,2010)、TEPITOPE(Bianand Hammer Methods 34:468-475,2004)。
还可以以融合蛋白的部分包含HA。其它融合伴侣可以是另一种HA蛋白或非HA蛋白，例如流感病毒神经氨酸酶。使用融合蛋白的一些常见原因是提高所得蛋白质的表达或帮助其纯化。例如，可将被定制用于表达系统的宿主细胞的信号肽序列连接于HA蛋白或可连接用于蛋白质纯化的标签序列，如果还包含了切割序列，随后可进行切割。可融合来自一种或多种蛋白质的多个肽表位，或可融合来自一种或多种蛋白质的片段。多个肽表位可以以任何顺序存在。
组合物中的HA的其它适当来源包括包含HA(U.S.2005009008，以其整体并入的)、编码HA的核酸(U.S.2003045492；U.S.7537768；WO 09092038；Smith等人Vaccine Jan 29,2010，将所有上述文献整体并入本文)的病毒样颗粒(VLP)以及减毒和灭活病毒(U.S.6022726；U.S.7316813；U.S.2009010962；WO 99/57284,U.S.2008254060；将所有上述文献整体并入本文)。
2.重组系统–载体构建
可在培养的细胞中产生或化学合成HA蛋白，包括前体蛋白、片段、融合蛋白和肽。(“HA蛋白”据此在本文中用于包括所有这些形式)。具体地，可以使用机器(许多是商购可得的)或手工方便地化学合成肽。或者，多种适当的表达系统(原核和真核系统)是公知的，并且可使用所述表达系统。常用的并且适合蛋白质的生产的宿主细胞包括大肠杆菌(E.coli)、酵母、昆虫和哺乳动物。表达载体和宿主细胞是商购可得的(例如，Invitrogen Corp.,Carlsbad,CA,USA)或可被构建。示例性载体包括启动子和用于编码目标蛋白质的序列的克隆位点，以便启动子与序列有效连接。其它元件也可存在，例如分泌信号序列(有时称为前导序列)、标签序列(例如，六-His)、转录终止信号、复制起点(特别地当染色体外复制载体时)和编码可选择的产物的序列。根据它们的目的将任选元件排列在载体中。转染宿主细胞的方法和步骤也是公知的。
因为HA为糖基化蛋白，最常见地选择的表达系统为糖基化蛋白质的真核系统，例如酵母(例如，U.S.5856123；U.S.RE35749；U.S.4925791；也为商业系统例如PichiaPinkTM Invitrogen,CA USA,K.lactis蛋白表达试剂盒,NEB,MA,USA)、哺乳动物细胞和杆状病毒(U.S.4745051；U.S.5762939；U.S.5858368；U.S.6103526；其中将本文中的所有美国专利参考文献通过引用整体并入本文)。
其中包含HA的编码序列的杆状病毒感染昆虫细胞(其随后表达HA)的昆虫表达系统是特别适当的表达系统。昆虫细胞中的表达通常产生高浓度和量的蛋白质，产生具有真核生物翻译后修饰(例如，糖基化)的蛋白质并且可按比例放大至产生足够用于大流行前疫苗的蛋白质的生产水平。表达系统和方法在本领域是公知的；例如，存在许多商购可得的系统和服务提供商(例如，Invitrogen,Carlsbad CA；Protein Sciences Meriden,CT；Clontech,Mountain View，CA；也参见baculovirus.com上的提供商和服务提供商的列表)。
在示例性昆虫表达系统中，初级基因产物未被加工，例如全长血凝素，并且不被分泌但保持与感染的细胞的外周膜缔合(U.S.5762939)。感染后数天，可从外周膜提取重组HA(rHA)(U.S.5858368，在rHA的提取和纯化方面通过引用并入本文)。一个适当的提取法必需使用非变性、非离子型去垢剂或其它公知的技术。可“原样(as-is)”使用表达的蛋白质，对其进行分析和进一步纯化。可通过例如亲和层析、凝胶层析、离子交换层析或本领域技术人员已知的其它等同方法进行进一步纯化。将rHA纯化至至少80%、85%、90%、95%、98%或99%的纯度。
用于测定纯度或量的常用方法包括凝胶电泳、Western印迹、质谱法和ELISA。通常在生物测定例如实施例中描述的测定中评估蛋白质的活性。必要时或需要时，可进一步纯化蛋白质。许多纯化方法是公知的，包括大小层析、阴离子或阳离子交换层析、亲和层析、沉淀、免疫沉淀等。蛋白质的期望用途通常决定纯化的程度，人中的使用可能需要最高水平的纯度。
B.佐剂
本发明提供了包括和/或利用佐剂的组合物、试剂盒、方法等。佐剂为一种或多种选自表示为DSLP的化合物。DSLP化合物共有这样的特征，即它们包含通过将两个选自葡萄糖和氨基取代的葡萄糖的单糖基团连接在一起形成的二糖(DS)基团，其中将二糖与磷酸(P)基团和多个脂质(L)基团化学结合。更具体地，可将二糖视为从两个单糖单位(每一个具有6个碳)形成的。在二糖中，单糖之一将形成还原端，另一个单糖将形成非还原端。为方便起见，按照常规碳水化合物编号命名法，形成还原端的单糖的碳经指示位于位1、2、3、4、5和6上，然而形成非还原端的单糖的相应的碳经指示位于位1’、2’、3’、4’、5’和6’上。在DSLP中，非还原端的1位上的碳通过醚(-O-)或氨基(-NH-)基团连接于还原端的6’位上的碳。磷酸基团优选通过非还原端的4’碳连接于二糖。每一个脂质基团通过酰胺(-NH-C(O)-)或酯(-O-C(O)-)键与二糖连接，其中羰基连接于脂质基团。二糖可具有可连接于酰胺或酯基团的7个位置，即非还原端的位2’、3’和6’以及还原端的位1、2、3和4。
脂质基团具有至少6个碳，优选至少8个碳，更优选至少10个碳，其中在每一种情况下，脂质基团优选具有不超过24个碳，优选不超过22个碳，更优选不超过20个碳。在一个方面，脂质基团一起提供60-100个碳，优选70-90个碳。脂质基团可仅由碳和氢原子组成，即，其可以是烃基脂质基团，或其可包含一个羟基，即其可以是羟基取代的脂质基团，或其可包含酯基团，所述酯基团反过来通过酯基团的羰基(-C(O)-)连接于烃基脂质或羟基取代的脂质基团，即酯取代的脂质。烃基脂质基团可以是饱和的或不饱和的，其中不饱和烃基脂质基团在相邻碳原子之间具有一个双键。
DSLP包含3或4或5或6或7个脂质。在一个方面，DSLP包含3至7个脂质，然而在另一个方面，DSLP包含4-6个脂质。在一个方面，脂质独立地选自烃基脂质、羟基取代的脂质和酯取代的脂质。在一个方面，1、4’和6’位被羟基取代。在一个方面，单糖单位各自为葡糖胺。DSLP可以以游离酸的形式存在，或以盐形式例如铝盐存在。
在一个方面，通过如下方面描述DSLP上的脂质：3’位被-O-(CO)-CH2-CH(Ra)(-O-C(O)-Rb)取代；2’位被-NH-(CO)-CH2-CH(Ra)(-O-C(O)-Rb)取代；3位被-O-(CO)-CH2-CH(OH)(Ra)取代；2位被-NH-(CO)-CH2-CH(OH)(Ra)取代；其中Ra和Rb的每一个选自癸基、十一烷基、十二烷基、十三烷基、十四烷基，其中这些术语中的每一个是指饱和烃基基团。在一个实施方案中，Ra为十一烷基并且Rb为十三烷基，其中该佐剂在例如美国专利申请公布2008/0131466中被描述的为“GLA”。其中Ra为十一烷基并且Rb为十三烷基的化合物可以以立体化学上确定的形式如可从例如Avanti Polar Lipid获得的形式(如PHADTM佐剂)使用。
在另一个方面，DSLP为称为3D-MPL的天然来源的化合物的混合物。可由GlaxoSmithKline公司商业产生以药物级形式存在的3D-MPL佐剂，如它们的MPLTM佐剂。3D-MPL在科学和专利文献中已得到详尽描述，参见，例如，Ulrich,J.T.和Myers的Vaccine Design:the subunit and adjuvant approach,Powell M.F和Newman,M.J.编著,第21章Monophosphoryl Lipid A as anadjuvant:past experiences and new directions,K.R.,Plenum Press,NewYork(1995)和美国专利4,912,094。
在另一个方面，DSLP佐剂可被描述为包含(i)具有通过非还原端葡糖胺的己糖胺位1与还原端葡糖胺的己糖胺位6之间的醚键连接于非还原端葡糖胺的还原端葡糖胺的二葡萄糖主链；(ii)连接于非还原端葡糖胺的糖胺位4的O-磷酰基；和(iii)达到6个脂肪酰基链；其中脂肪酰基链之一通过酯键连接于还原端葡糖胺的3-羟基，其中脂肪酰基链之一通过酰胺键连接于非还原端葡糖胺的2-氨基并且包含通过酯键连接于超过12个碳原子的烷酰基链的十四酰基链，并且其中脂肪酰基链之一通过酯键连接于非还原端葡糖胺的3-羟基并且包含通过酯键连接于超过12个碳原子的烷酰基链的十四酰基链。参见，例如，美国专利申请公布2008/0131466。
在另一个方面，佐剂可以是如美国专利申请公布2010/0310602中描述的具有6个脂质基团的合成二糖。
在另一个方面，本发明中使用的佐剂可通过化学式(1)来鉴定:
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在化学式(1)中，部分A1和A2独立地选自氢、磷酸和磷酸盐。钠和钾是磷酸盐的示例性抗衡离子。A1O-基团(其优选为磷酸基团)在非还原端的4’位上键合二糖。非还原端通过其1位结合于醚基，所述醚基反过来键合于还原端的6’位。化学式(1)的化合物具有各自包含部分R1、R2、R3、R4、R5和R6之一的6个脂质基团，其中这些R基独立地选自具有3至23个碳(由C3-C23表示)的烃基。为了更加清楚，可被解释为当部分“独立地选自”具有多个成员的指定基团时，应当理解被选择用于第一部分的成员在任何情况下都不影响或限制被选择用于第二部分的成员的选择。与R1、R3、R5和R6连接的碳原子是不对称的，从而可以以R或S立体化学形式存在。在一个实施方案中，所有这类碳原子以R立体化学形式存在，然而在另一个实施方案中，所有此类碳原子以S立体化学形式存在。
“烃基”是指完全由氢和碳形成的化学部分，其中碳原子的排布可以是直链或支链、非环状或环状的，并且相邻碳原子之间的键合可能完全是单键，即，提供饱和烃基，或在任何两个相邻碳原子之间可存在双键或三键，即，提供不饱和烃基，以及烃基中的碳原子的数目为3至24个碳原子。烃基可以为烷基，其中代表性直链烷基包括甲基、乙基、正丙基、正丁基、正戊基、正己基等，包括十一烷基、十二烷基、十三烷基、十四烷基、十五烷基、十六烷基、十七烷基、十八烷基等；然而支链烷基包括异丙基、仲丁基、异丁基、叔丁基、异戊基等。代表性饱和环状烃基包括环丙基、环丁基、环戊基、环己基等；然而不饱和环状烃基包括环戊烯基和环己烯基等。不饱和烃基在相邻碳原子之间包含至少一个双键或三键(如果烃基为非环状的，则分别称为“烯基”或“炔基”，如果烃基为至少部分环状的，则分别称为环烯基和环炔基)。代表性直链和支链烯基包括乙烯基、丙烯基、1-丁烯基、2-丁烯基、异丁烯基、1-戊烯基、2-戊烯基、3-甲基-1-丁烯基、2-甲基-2-丁烯基、2,3-二甲基-2-丁烯基等；而代表性直链和支链炔基包括乙炔基、丙炔基、1-丁炔基、2-丁炔基、1-戊炔基、2-2-戊炔基、3-甲基-1-丁炔基等。
DSLP佐剂可通过本领域已知的合成方法例如PCT国际公布No.WO2009/035528(将其通过引用并入本文)以及WO 2009/035528中确定的出版物(其中将这些出版物中的每一个通过引用并入本文)中公开的合成方法来获得。可以以大体上均一的形式制备化学合成的DSLP佐剂，例如式(1)的佐剂，所述大体上均一的形式是指相对于提供的DSLP分子例如式(1)的化合物具有至少80%，优选至少85%，更优选至少90%，更优选至少95%和更优选至少96%、97%、98%或99%的纯度的制剂。可以由例如熟悉适当的分析化学方法学的技术人员，例如利用气相色谱法、液相色谱法、质谱法和/或核磁共振分析来进行给定的佐剂制剂的纯度的程度测定。从天然来源获得的DSLP佐剂通常不容易以化学纯的形式制备，从而合成制备的佐剂是本发明的优选佐剂。如先前所述，某些佐剂可商购获得。优选佐剂为如Avanti Polar Lipids,Alabaster AL的目录中确定的产品No.699800，参见下面与E10组合的E1。
在本发明的各种实施方案中，佐剂具有式(1)的化学结构但部分A1、A2、R1、R2、R3、R4、R5和R6选自先前被提供用于这些部分的选择的亚组，其中这些亚组在下面通过E1、E2等确定。
E1: A1为磷酸或磷酸盐并且A2为氢。
E2: R1、R3、R5和R6为C3-C21烷基；并且R2和R4为C5-C23烃基。
E3: R1、R3、R5和R6为C5-C17烷基；并且R2和R4为C7-C19烃基。
E4: R1、R3、R5和R6为C7-C15烷基；并且R2和R4为C9-C17烃基。
E5: R1、R3、R5和R6为C9-C13烷基；并且R2和R4为C11-C15烃基。
E6: R1、R3、R5和R6为C9-C15烷基；并且R2和R4为C11-C17烃基。
E7: R1、R3、R5和R6为C7-C13烷基；并且R2和R4为C9-C15烃基。
E8: R1、R3、R5和R6为C11-C20烷基；并且R2和R4为C12-C20烃基。
E9: R1、R3、R5和R6为C11烷基；并且R2和R4为C13烃基。
E10:R1、R3、R5和R6为十一烷基并且R2和R4为十三烷基。
在某些选择中，将E2至E10的每一个与实施方案E1组合，和/或E2至E9的烃基为烷基，优选直链烷基。
可任选地用辅佐剂(co-adjuvant)(如下所述的每一种)将DSLP佐剂，例如式(1)的佐剂配制为药物组合物。在这方面，参考美国专利公布No.2008/0131466，其为GLA佐剂提供制剂，例如含水制剂(AF)和稳定的乳液制剂(SE)，其中这些制剂可被用于任何DSLP佐剂，包括式(1)的佐剂。
本发明提供了可将DSLP佐剂例如式(1)的佐剂与第二佐剂(在本文中称为辅佐剂)组合使用。在本发明的3个实施方案中，辅佐剂可以是递送系统，或其可以是免疫增强剂，或其可以是用作递送系统和免疫增强剂的组合物，参见，例如，O’Hagan DT和Rappuoli R.,Novel approaches to vaccine delivery,Pharm.Res.21(9):1519-30(2004)。辅佐剂可以是通过Toll-样受体家族生物分子的成员起作用的免疫增强剂。例如，可选择辅佐剂的主要作用模式，如TLR4激动剂或TLR8激动剂或TLR9激动剂。或者，或补充地，可选择辅佐剂的载体性质，例如，其可以是乳剂、脂质体、微粒或明矾。
在一个方面，辅佐剂为明矾，其中该术语是指铝盐，例如磷酸铝(AlPO4)和氢氧化铝(Al(OH)3)。当明矾被用作辅佐剂时，明矾可以以约100至1,000μg，或200至800μg，或300至700μg或400至600μg的量存在于一剂疫苗中。DSLP佐剂，例如式(1)的佐剂通常以低于明矾的量的量存在，在不同方面，DSLP佐剂例如式(1)的佐剂以重量计相对于明矾的重量以0.1-1%、或1-5%、或1-10%、或1-100%的量存在。
在一个方面，辅佐剂为具有疫苗佐剂性能的乳剂。此类乳剂包括水包油乳剂。弗氏不完全佐剂(IFA)为一种这样的佐剂。另一种适当的水包油乳剂为MF-59TM佐剂，其包含角鲨烯、聚氧乙烯失水山梨糖醇单油酸酯(也称为TweenTM 80表面活性剂)和失水山梨糖醇三油酸酯。角鲨烯为最初获自鲨鱼肝油的天然有机化合物，虽然其也可获自植物来源(主要地植物油)，包括苋属植物种子、水稻米糠、小麦胚和橄榄。其它适当的佐剂为MontanideTM佐剂(SeppicInc.,Fairfield NJ)，包括为基于矿物油的佐剂的MontanideTM ISA 50V、MontanideTM ISA 206和MontanideTM IMS 1312。虽然矿物油可存在于佐剂中，但在一个实施方案中，本发明的疫苗组合物的油组分全部为可代谢油。
可用于本发明的实施的免疫增强剂如辅佐剂的实例包括：3D-MPL或MPLTM佐剂、MDP及衍生物、寡核苷酸、双链RNA、可选择的病原相关分子模式(PAMPS)；皂苷类、小分子免疫增强剂(SMIP)、细胞因子和趋化因子。
在一个实施方案中，辅佐剂为3D-MPL或MPLTM佐剂，其中后者可从GlaxoSmithKline商购获得，虽然其最初由Ribi ImmunoChem Research,Inc.Hamilton,Montana开发。参见，例如，Ulrich和Myers,来自Vaccine Design:The Subunit and Adjuvant Approach,Powell和Newman,编著Plenum Press,New York(1995)的第21章。与MPLTM佐剂相关并且在本发明中也适合用作辅佐剂的是AS02TM佐剂和AS04TM佐剂。AS02TM佐剂为包含MPLTM佐剂和QS-21TM佐剂(本文中其它地方论述的皂苷佐剂)的水包油乳剂。AS04TM佐剂包含MPLTM佐剂和明矾。MPLTM佐剂通过用弱酸和碱水解，然后通过纯化修饰的LPS来从Salmonella Minnesota R595的脂多糖(LPS)制备，如在Ulrich和Myers的论文中更全面描述的。
在一个实施方案中，辅佐剂为皂苷例如来源于皂皮树(Quillaja saponaria)树物种的树皮的皂苷或经修饰的皂苷，参见，例如，美国专利No.5,057,540；5,273,965；5,352,449；5,443,829和5,560,398。由Antigenics,Inc.Lexington,MA销售的产品QS-21TM佐剂为示例性含皂苷辅佐剂，可将其与DSLP佐剂例如式(1)的佐剂一起使用。与皂苷相关的是最初由Iscotec(Sweden)开发和通常从来源于皂皮树的皂苷或合成类似物、胆固醇和磷脂形成的佐剂的ISCOMTM家族，其全都形成蜂窝样结构。
在一个实施方案中，辅佐剂为用作辅佐剂的细胞因子，参见，例如，Lin R.等人Clin.Infec.Dis.21(6):1439-1449(1995)；Taylor,C.E.,Infect.Immun.63(9):3241-3244(1995)；和Egilmez,N.K.,Vaccine Adjuvants and DeliverySystems,John Wiley & Sons,Inc.(2007)中第14章。在各种实施方案中，细胞因子可以为例如粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)；参见例如，Change D.Z.等人Hematology 9(3):207-215(2004),Dranoff，G.Immunol.Rev.188:147-154(2002)和美国专利5,679,356；或干扰素，例如I型干扰素，例如干扰素-α(IFN-α)或干扰素-β(IFN-β)，或II型干扰素，例如干扰素-γ(IFN-γ)，参见，例如，Boehm,U.等人Ann.Rev.Immunol.15:749-795(1997)；和Theofilopoulos,A.N.等人Ann.Rev.Immunol.23:307-336(2005)；白细胞介素，具体地包括白细胞介素-1α(IL-1α)、白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-2(IL-2)；参见人，例如，Nelson,B.H.,J.Immunol.172(7):3983-3988(2004)；白细胞介素-4(IL-4)、白细胞介素-7(IL-7)、白细胞介素-12(IL-12)；参见，例如，Portielje,J.E等人,CancerImmunol.Immunother.52(3):133-144(2003)和Trinchieri.G.Nat.Rev.Immunol.3(2):133-146(2003)；白细胞介素-15(Il-15)、白细胞介素-18(IL-18)；胎儿肝酪氨酸激酶3配体(Flt3L)或肿瘤坏死因子α(TNFα)。可在与疫苗抗原组合之前用细胞因子共配制DSLP佐剂，例如式(1)的佐剂，或可单独配制抗原、DSLP佐剂例如式(1)的佐剂和细胞因子辅佐剂，然后将其组合。
在一个实施方案中，辅佐剂为未甲基化的CpG二核苷酸(任选地缀合于本文中描述的流感病毒抗原)。
当将辅佐剂与DSLP佐剂例如式(1)的佐剂组合使用时，可选择两种佐剂的相对量来获得相对于单独的抗原，包含佐剂的疫苗组合物的期望的性能特征。例如，可选择佐剂组合物来增强抗原的抗体的反应，和/或增强受试者的先天性免疫系统反应。激活先天性免疫系统导致趋化因子和细胞因子的产生，这反过来地激活适应性(获得性)免疫反应。激活适应性免疫反应的重要后果是记忆免疫细胞的形成，以便当宿主再遭遇所述抗原时，免疫反应可更快地并且通常以更好的质量发生。
可策略性使用疫苗佐剂的组合来调节控制大流行前和大流行流感所需的免疫反应的数量和质量。基于水和油乳剂的佐剂诱导Th2 T细胞免疫。它们的使用对于驱动保护免受病毒感染的中和抗体的产生是非常重要的，然而，此类乳剂在刺激细胞介导的免疫中是无效的。假定大流性爆发，Th1 T细胞的诱导对于限制宿主内的疾病进展和减少群体内的病毒传播是至关重要的。Th1 T细胞通过产生IFN-γ和TNFα起着抗人流感病毒的直接抗病毒作用(Kannaganat等人,I81:8468-8476,2007)。它们还调节对于病毒是至关重要的抗病毒CD8细胞毒性T淋巴细胞的扩增、维持和回忆(recall)以及刺激具有免受流感感染的保护作用(即使在高病毒中和活性不存在的情况下)的抗体(小鼠中的IgG2a)的亚类的产生(Huber等人Clin Vaccine Immunol 13:981-990,2006)。用于诱导Th1反应的最直接方法包括激活识别并且结合病原体来源的糖、蛋白质、脂质和核酸的Toll样受体(TLR)。Toll样受体刺激树突细胞的成熟并且是正常先天性和适应性免疫所必需的。虽然单独的DSLP佐剂例如式(1)的佐剂可获得这些不同目标的每一个目标，但本发明在一个实施方案中提供了可将佐剂组合物与大流行流感抗原组合使用来实现这些目标。然而，在单独的实施方案中，存在于疫苗中的唯一佐剂为DSLP佐剂，例如式(1)的佐剂，包括其各种实施方案，其中GLA为优选的式(1)的DSLP佐剂。
此外，水包油乳剂中的GLA显著增强了Fluzone疫苗在小鼠中的免疫原性，如通过抗原特异性抗体和HAI滴度的增加、剂量节省以及对流感病毒的抗原漂移株的扩大的交叉反应性测量的。在这些相同的实验中，通过GLA诱导Th1 T细胞反应，如通过抗原特异性IgG2a滴度和IFNγ产量的显著增加指示的。
C.药物组合物、疫苗及其使用
1.制剂
药物组合物包含来自大流行前或大流行性流感病毒的重组血凝素(HA)和DSLP佐剂例如式(1)的佐剂，例如GLA。作为3个实例，可将DSLP佐剂例如式(1)的佐剂配制于水包油乳剂中，配制为水溶液，或配制于脂质体中。组合物可任选地包含其它蛋白质例如大流行前或大流行性流感病毒的神经氨酸酶、其它佐剂例如铝盐(例如，明矾)或皂苷和皂苷衍生物、赋形剂例如α-生育酚或衍生物、载体、缓冲剂、稳定剂、粘合剂、防腐剂例如硫柳汞、表面活性剂等。
作为两个选择，可单独使用DSLP佐剂例如式(1)的佐剂或可将其配制于其中将佐剂掺入油相的水包油乳剂中。当单独使用时，即在不存在与乳剂组合的益处的情况下，佐剂通常完全不含油或存在于包含低于约1%v/v的油的组合物中。为了制备不含油的组合物，可组合水、佐剂(例如，GLA为优选的佐剂)和表面活性剂例如磷脂，例如1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(POPC)。可通过将乙醇和POPC的溶液添加至预先称重的量的GLA中来制备组合物。对该浸湿的GLA超声处理10分钟以尽可能分散GLA。随后在氮气下干燥GLA。用WFI(注射用水)将干燥的GLA和POPC重建至正确的体积。将该溶液在60°C下超声处理15-30分钟直至全部GLA和POPC溶解。为了进行长期贮存，必须对GLA-AF制剂进行冷冻干燥。冷冻干燥过程由向溶液中添加甘油(直至其为2%的总体积)组成。随后将溶液以1-10mL的量置于小瓶中。将小瓶经历冷冻干燥过程，该过程由冷冻溶液和随后将其置于真空下(以通过升华脱去冷冻的水)组成。
当将佐剂与油组合，随后用于人时，油优选是可代谢的。油可以是任何植物油、鱼油、动物油或合成油；油应当对受者无毒并且能够被代谢转化。坚果(例如花生油)、种子和谷物是常用植物油来源。特别适合的可代谢油包括角鲨烯(2,6,10,15,19,23-六甲基-2,6,10,14,18,22-二十四碳己烯)，在许多不同油中发现的并且大量存在于鲨鱼肝油中的不饱和油。角鲨烯为胆固醇生物代谢的中间产物。此外，水包油乳剂通常包含抗氧化剂，例如α-生育酚(维生素E，U.S.5,650,155,U.S.6,623,739)。可添加稳定剂例如甘油三酯、赋予等渗性的成分以及其它成分。
油滴的平均粒度通常小于1微米，可在30-600nm，通常约80至约120nm的范围内或小于约150nm。油滴粒度可利用光子相关光谱学来测量。通常地，至少约80%的油滴应当在期望的范围内，或至少约90%或至少约95%。乳剂中油的分数通常在2至10%的范围内(例如，约2%、约3%、约4%、约5%、约6%、约7%、约8%、约9%和约10%)；抗氧化剂例如α-生育酚的分数为约2至约10%，以及表面活性剂的分数为约0.3至3%。优选地，油:α-生育酚的比率等于或小于1，因为这提供了更稳定的乳剂。α-生育酚(例如，
Figure BDA00002378986400211
85)还可以以约1%的水平存在。在一些情况下，本发明的疫苗可以有利地还包含稳定剂。
产生水包油乳剂的方法对于本领域技术人员来说是公知的。通常地，该方法包括将油相与表面活性剂例如磷脂酰胆碱、嵌段共聚物或
Figure BDA00002378986400212
溶液混合，然后使用匀浆器进行匀浆。例如，包括将混合物通过注射器针头一次、2次或更多次的方法可适用于匀浆小体积的液体。同样地，可在微乳化仪(microfluidiser)中使乳化过程(M110S微流体机器(microfluidics machine)，最多50次通过，以6巴的最大输入压(约850巴的输出压)进行2分钟的时间)适合产生更小或更大体积的乳剂。该改造可通过常规实验来实现，包括测量所得乳剂直至获得具有所需直径的油滴的制剂。还可使用产生乳剂的其它设备或参数。
使用角鲨烯的示例性水包油乳剂被称为“SE”，其在具有α-生育酚的磷酸铵缓冲液pH 5.1中包含角鲨烯、甘油、磷脂酰胆碱或卵磷脂或其它嵌段共聚物作为表面活性剂。当GLA用作DSLP时，所得的组合物在本文中被称为GLA-SE。为了制备这样的组合物，利用25毫摩尔磷酸铵缓冲液(pH=5.1)中的甘油(22.7mg)、磷脂酰胆碱或卵磷脂(7.64mg)、
Figure BDA00002378986400213
F-68(BASF Corp.,Mount Olive,NJ)或相似的嵌段共聚物(0.364mg)在角鲨烯(34.3mg)乳化GLA(100微克；Avanti Polar Lipids,Inc.,Alabaster,AL；产品编号699800)，任选地使用0.5mg D,L-α-生育酚作为抗氧化剂。在高压下处理混合物直至形成不分离并且具有小于180nm的平均粒度的乳剂。随后将乳剂无菌过滤至玻璃单剂量小瓶中，加盖以进行长期贮存。当在2-8°C下贮存时，该制剂可使用至少3年。可类似将包括本文中所述的DSLP和蛋白质的其它含油组合物制备成如美国专利5,650,155；5,667,784；5,718,904；5,961,970；5,976,538；6,630,161和6,572,861中所述制备的那些组合物。
一些特定的组合物和疫苗包含来自大流行前H5N1病毒的rH5。上文中描述了适用于疫苗的rHA的不同形式；简而言之，此类形式包括全长rHA、rHA的片段、包含rHA的融合蛋白或肽。此外，可将超过一种rHA与其它蛋白质例如神经氨酸酶一起使用，在组合物和疫苗中可存在超过一种rHA。可将超过一种的rHA形式或rHA序列或两者组合在本发明的组合物中。
rHA蛋白在疫苗中的量通常是例如约0.1μg至约15μg的低剂量。较低的量可以为0.1、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15μg的rHA蛋白的任何量。较低量的rHA蛋白可以低至实际上可行的量，只要其允许配制满足功效的国际(例如EU或FDA)标准的疫苗，如下文中描述的。剂量通常通过活性、期望的施用次数和受试者的大小和状况来测定。
蛋白质可以以溶液的形式提供，但还可以干燥的形式(例如，烘干的)提供，在该情况下，用户添加任何必需的液体。通常，还可提供添加剂例如缓冲剂、稳定剂、防腐剂、赋形剂、载体和其它无活性成分。添加剂通常是药学上可接受的和生物相容性的。
可以以溶液、烘干的或乳化的形式，以及可方便地以稳定的水包油乳剂形式提供DSLP佐剂例如式(1)的佐剂。除了DSLP佐剂例如式(1)的佐剂外，含佐剂组合物还可包含缓冲剂、稳定剂、赋形剂、防腐剂、载体或其它无活性成分。添加剂通常是药学上可接受的和生物相容性的。可存在其它佐剂，如在本文中其它地方更详细描述的。此类辅佐剂包括2’-5’寡聚A、细菌内毒素、RNA双链体、单链RNA、脂蛋白、肽聚糖、鞭毛蛋白、CpG DNA、脂多糖、MPA(单磷酰脂质A)、3-O-脱酰基MPL、脂多糖、QS21(皂苷)、氢氧化铝(“明矾”)和其它矿物盐、油乳剂(例如，MF59TM、R848和其它咪唑并喹啉、病毒体和其它微粒佐剂(参见，Vogel和Powell,“A compendium of vaccine adjuvants andexcipients”Pharm Biotechnol 6:141-228,1995；将其整体并入本文)。
用于一剂本发明的组合物(其还包含用作疫苗的抗原)的DSLP佐剂例如式(1)的佐剂、例如GLA的量(其中一剂为给有此需要的受试者施用的组合物的量)在一个实施方案中为约0.5μg至约50μg，在另一个实施方案中为约1.0μg至25μg，在本发明不同的其它实施方案中，可以为约约1μg、约2μg、约2.5μg、约5μg、约7.5μg、约10μg、约15μg、约20μg或约25μg。剂量中的组合物总体积通常在0.5mL至1.0mL的范围内。乳剂例如SE可存在于组合物中，其中乳剂的油组分在各种实施方案中构成约0.1%、约0.5%、约1.0%、约1.5%、约2%、约2.5%、约3%、约4%、约5%、约7.5%或约10%的组合物的总体积。
可在分开的容器中提供DSLP佐剂例如式(1)的佐剂和蛋白质，然后将其现场混合或预混合。此外，可在分开的容器中提供蛋白质，或将其组合在单个容器中。容器可以为小瓶、安瓿、试管或多孔板装置的孔、储液池、注射器或任何其它类型的容器。可以以试剂盒的形式提供容器。如果一个或多个容器包含烘干成分，则同样地可在试剂盒中提供用于重建的液体或由用户提供所述液体。每一个容器中的液体的量或添加至每一个容器的溶液的量与施用途径和每一个容器包含的剂量数相称。通过注射施予的疫苗通常为约0.1ml至约1.0ml，然而口服施予的疫苗可具有更大的体积，例如约1ml至约10ml。适当的体积可视受试者的大小和年龄而改变。
通常无菌地提供组合物。常用灭菌法包括过滤、辐照和气体净化(gastreatment)。
2.施用
可利用任何适当的递送途径例如真皮内、粘膜(例如，鼻内、口服)、肌内、皮下、舌下、经直肠、经阴道施用疫苗。其它递送途径在本领域是公知的。
肌内途径是适用于疫苗组合物的一个适当途径。适当的肌内递送途径包括针头和注射器、无针注射装置(例如Biojector,Bioject,OR USA)或笔式注射装置例如用于在家中自我注射以递送胰岛素或肾上腺素的那些笔式注射装置。真皮内和皮下递送是其它适当的途径。适当的装置包括注射器和针头、具有短针头的注射器以及快速注射装置。
可通过粘膜途径例如鼻内途径施用疫苗。许多鼻内递送系统是可获得的并且在本领域是公知的。喷雾装置是一种这样的装置。口服施用简单至给受试者提供溶液以吞咽。
可在单个位置或多个位置上施用疫苗。如果在多个位置上，施用途径在每一个位置上是相同的，例如在不同肌肉处的注射，或可以是不同的，例如肌肉的注射和鼻内喷雾。此外，可在单个时间点或多个时间点上施用疫苗。通常如果在多个时间点上施用，则剂量之间的时间已被确定来提高免疫反应。
以足以实现有益的免疫反应以预防或减轻疾病或感染的症状的剂量施用疫苗。有益反应的一个指标是针对大流行前或大流行性流感病毒的抗体的产生，以及特别地中和抗体的产生。其它指标包括对病毒起反应的CD8或CD4 T细胞的增加的量或功能或频率以及病毒传播的减少。
许多公知的方法可获得用以检测和定量抗体，包括ELISA和病毒感染的抑制(中和)测定。在一个实现中，通过用HA蛋白涂覆多孔板的孔，将来自血清的HA特异性抗体捕获至板上，利用标记的抗人抗体检测HA特异性抗体，然后进行标记的读出来进行ELISA。标记物可以是放射性的，但更常见地为酶例如辣根过氧化物酶，其可将底物转化成可通过比色法检测的物质。
示例性流感中和测定基于噬菌斑测定(plaque assay)，其中通过传染性的抑制来检测中和抗体。病毒中和测试是用于鉴定动物和人中的流感病毒特异性抗体的高灵敏性和特异性测定。以两个阶段进行中和测试：(1)病毒-抗体反应步骤，其中将病毒与血清的稀释物混合，然后温育以使抗体结合病毒，和(2)接种步骤，其中将混合物接种于适当的宿主系统(例如，细胞培养物例如MDCK细胞、胚胎蛋白(embryonated egg)或动物)中。当使用细胞时，第二天在微量中和测定中检测实际感染的细胞。固定细胞，通过ELISA检测甲型流感病毒核蛋白(NP)在感染的细胞中的存在。NP的检测表明中和抗体不存在于该血清稀释物中。传染性的不存在构成了阳性中和反应并且表明病毒特异性抗体在血清样品中的存在。(“Influenza Virus Microneutralization Assay”,CDC publication,LP-004,R-2(K Hancock)，2009年10月19日生效的)。用于流感病毒的其它中和测试基于MDCK细胞培养物中致细胞病变效应(CPE)形成的抑制(参见，Sidwell和Smee,Antiviral Res.48:1-16,2000)。
另一个公知的测定为血凝抑制测定(hemagglutination-inhibition assay)，该测定评估针对流感病毒HA的免疫反应。病毒表面上的HA蛋白凝集红细胞(红血球，RBC)。当针对HA的抗体结合HA时，凝集被抑制。一般地，将标准量的HA抗原与已进行了系列稀释的血清样品混合，加入红细胞，然后评估凝集的程度。首先通过在RBC上吸收血清除去血清中凝集的非特异性抑制剂(“Serologic Detection of Human Influenza Virus Infections byHemagglutination-Inhibition Assay Using Turkey RBCs”,CDC publication,LP-003,R-1(K Hancock)，于2009年10月2日生效的)。
还可测定所产生的抗体的类型和亚型。用于确定IgM、IgG和IgG亚型的测定法在本领域是公知的。一个常用测定法为ELISA。简而言之，用抗原例如rHA或灭活的全病毒涂覆微量滴定板。在于含有蛋白质(例如，1%牛血清白蛋白)的溶液中封闭后，将血清样品的系列稀释物添加至孔中，然后用免疫球蛋白同种型特异性第二抗体进行处理。标记两种抗-同种型抗体或添加标记的抗体结合分子。测定标记的量。
大流行前疫苗的FDA标准是诱导具有交叉反应性的免疫的能力，意指疫苗诱导针对来自不同进化枝和子分枝的遗传上不同的病毒的免疫。可利用本文中描述的任何抗体测定或通过本领域已知的其它测定测试交叉反应性。在示例性测定中，测试血清的针对来自多种病毒(包括包含致免疫HA的病毒)的HA的抗体。对于此类测定，可使用HA蛋白或全病毒(优选地灭活的)。
T细胞功能的测试包括IFN-γ ELISPOT和ICS(细胞内细胞因子染色)。通过测量几种细胞因子的细胞因子产量，可建立Th1/Th2表达谱(profile)。具体地，期望的模式是In IFN-γ和IL-2的产量的增加和减少的IL-5和IL-4产量。检测干扰素-γ的ELISPOT测定被广泛用于定量对候选疫苗的CD4和CD8 T细胞反应。ELISPOT测定基于ELISA的原理，所述ELISA检测抗原诱导的细胞因子(被固定抗体捕获和通过酶偶联的第二抗体显现的)的分泌。ICS为通过在用激动剂刺激后细胞因子(例如针对结合MHC类分子的T细胞表面分子或肽的抗体)的表达定量细胞毒性T细胞的常规使用的方法。ICS和ELISPOT的示例性方法描述于下列实施例中。
还可测量抗原特异性T细胞功能。共表达IFNγ、IL-2和TNF的流感病毒特异性-CD4+T细胞相对于产生单种细胞因子的细胞具有更好的功能活性和共刺激潜能。因此，期望诱导产生多种细胞因子的CD4+T细胞。抗原特异性T细胞刺激测定可用于通过流式细胞术评估产生IFNγ、IL-2、TNFα及其组合的CD4 T细胞的频率。IL-5至该测定的添加可用于区分Th1与Th2 CD4+细胞。在免疫后第3、6、12和24周进行时间曲线实验以测定长效T细胞反应。流式细胞术还可用于测量和区分效应记忆CD4+T细胞(TEM:CD4+CD62L-CCR7-IFNγ+)和中央记忆CD4 T(TCM:CD4+CD62L+CCR7+IL2+IFNγ+/-)细胞的产生。诱导IFNγ、TNF和IL-2的产生和增加CD4CM的疫苗制剂是想要的。细胞毒性CD8+T细胞还在清除病毒载量和限制疾病进展中起着重要作用。引发抗原特异性CD8+T细胞的疫苗是想要的。
在一个方面，本发明提供了免疫人群以抗大流行前或大流行性流感病毒的方法，其中这些人将潜在地暴露于病毒。该方法包括施用单次注射的药物组合物，其中该单次注射在至少50%的接受单次注射的群体中实现血清转换。药物组合物包含(a)来自大流行前或大流行性流感病毒的重组血凝素(rHA)和(b)DSLP佐剂，例如其中佐剂包含具有各自独立地选自葡糖基和氨基取代的葡糖基的还原端和非还原端的二糖，其中非还原端的1位上的碳通过醚(-O-)或氨基(-NH-)基团连接于还原端的6’位上的碳，二糖通过非还原端的4’碳键合于磷酸基团以及通过酰胺(-NH-C(O)-)和/或酯(-O-C(O)-)键键合于多个脂质基团，其中酯或酰胺键的羰基(-C(O)-)基团直接连接于脂质基团，且每一个脂质基团包含至少8个碳。在各种实施方案中，组合物不包含乳剂，或不包含任何油例如角鲨烯。不含油的组合物被一些保健专业人员视为倾向于具有更小的副作用。例如，人们越来越关注：乳剂倾向于使疫苗组合物产生致反应性，因为当油存在时，疫苗可对接受注射的受试者引起刺痛和疼痛。不含乳剂的组合物的另一个有利方面是在通常使用中，疫苗组合物由两种组分制备：含抗原组合物和含佐剂组合物，其中混合这两种组合物以制备终疫苗。每一种组合物的稳定性优选在长期过程中较高。关于乳剂作为佐剂或抗原的载体的一个问题是乳剂倾向于在长期过程中是不稳定的，或需要特殊条件或化学药品来维持其稳定性。本发明在一个实施方案中提供了不含油例如不含乳剂的组合物，该组合物展示良好的稳定性和良好的功效。在优选实施方案中，DSLP佐剂为GLA，更优选为不含油载体中的GLA(或其它DSLP佐剂)，可将其以仅由佐剂和表面活性剂例如磷脂组成的冻干形式长期贮存，随后将其与载体和抗原混合以提供有效的疫苗。
疫苗的其它期望方面包括节省剂量和药量的性质。节省药量意指可给人施用比通常更少的剂量但仍然引起期望的或有效的免疫反应。节省剂量意指与在其它情况下所需的量相比需要更低量的抗原来引起期望的或有效的免疫反应。节省剂量和节省药量意指克服与开发抗大流行前或大流行性流感病毒的疫苗相关的技术问题，例如禽类或猪病毒HA在人中引发的弱免疫反应。在先前大流行流感疫苗的开发过程中，大型多中心试验发现相隔28天给予的两次90μgH5的注射仅在54%的人中提供保护作用(Treanor等人,New England Journal ofMedicine 354:1343-1351,2006)。据估计全世界目前能够在期望的时间范围内生产仅7000万个剂量的大流行流感疫苗(以两次90μg的注射施用的)(Poland,G.A.,New England Journal of Medicine,354:1411-1413,2006)。优选疫苗制剂通过节省剂量或节省药量减少接种(即，以实现血清置换)所需的蛋白质的量。
本文中描述的任何测定可用于验证节省剂量和/或节省药量。验证节省剂量和节省药量的示例性测定是测量对接种的血清抗体反应的血凝抑制(HAI)测定。FDA已建立用于大流行流感疫苗评估的指导方针，所述指导方针声明大于或等于40的HAI滴度是用于预测抗天然感染的保护作用的适当的免疫学参数(参见用于工业的食品和药品管理2007年指导方针：支持季节性灭活流感疫苗的许可证所需的临床数据(Food and Drug Administration 2007 Guidance forindustry: clinical data needed to support the licensure of seasonal inactivatedinfluenza vaccines)。如本文中所用，具有大于或等于40的HAI滴度的人被认为是已实现血清转换的人。示例性抗原剂量是疫苗制剂中有效地在50%的用抗原制剂接种一次(即，仅一次)的个体中获得约40的HAI滴度的抗原的量。另一个示例性抗原剂量为疫苗制剂中有效地在约70%的用抗原制剂接种一次的个体中获得约40的HAI滴度的抗原的量。另一个示例性抗原剂量为疫苗制剂中有效地在约80%的用抗原制剂接种一次的个体中获得约40的HAI滴度的抗原的量。
可给个体施用本文中描述的药物组合物、疫苗组合物和试剂盒以预防或保护免受流感病毒感染或在感染后治疗疾病。可在大流行前阶段或在大流行期间进行施用。
接受组合物的受试者包括高风险个体，例如与患病或死亡的动物例如禽类(对于H5N1病毒而言)密切接触或可能将与所述动物接触的个体，选择的群体(以“引发”抗大流行)，儿童，老人，孕妇，具有某些慢性医学或免疫抑制病况的人以及理想地全世界人口。
可通过以单个剂量(例如，注射)或以多个剂量施用组合物来避免流感。当施用多个剂量时，通常在一段时间间隔后施用第二和随后的剂量。通常初始剂量的施用被称为“引发”免疫反应，随后剂量的施用被称为“加强”免疫反应。通常，第一与第二施用之间的时间为至少2周，虽然可使用更短或更长的时期。可在早期施用后至少2-4周施用其它剂量，且在一些情况下，可在早期给药后很久(例如，1年)后施用其它剂量。在流感病毒感染后剂量的施用用于治疗疾病。
因为大流行病毒的HA序列可漂移并且因为在大流行前阶段不知道哪一种潜在病毒会变成大流行，所以期望施用提供抗相关病毒的广覆盖的疫苗。如本文中所示，通过一种rHA蛋白的施用获得针对相关病毒的抗体。获得广泛覆盖的另一种方法可以是利用一种rHA进行引发并且用不同的rHA进行增强。
可将组合物与其它抗病毒剂一起施用。抗病毒剂为直接作用于病毒以使它们停止繁殖的药剂、药物、草药等。一些公知的抗病毒剂包括
Figure BDA00002378986400281
(奥司他韦)、金刚烷胺
Figure BDA00002378986400282
金刚烷胺扎那米韦
Figure BDA00002378986400284
帕拉米韦、拉尼米韦。其它神经氨酸酶抑制剂和M2抑制剂也是可获得的。还可将中草药与组合物一起施用。还可提供其它试剂，包括治疗症状的试剂，例如止咳糖浆、阿斯匹林、NSAID例如布洛芬。
通过举例说明提供下列实施例，所述实施例是非限定性的。
实施例
实施例1
单次注射rH5/GLA-SE流感疫苗在小鼠中的功效
本实施例显示利用重组流感病毒H5(rH5)蛋白的单次接种可有效地引发用高滴度H5N1病毒攻击的小鼠的保护性抗病毒免疫反应。用递增量(0、50、150、450、900或2700ng)的单独的rH5蛋白(来源于H5N1 Viet Nam 1203；可从Protein Sciences,Meriden,CT获得)或利用GLA-SE佐剂配制的rH5蛋白(20μg的2% SE中的GLA)肌内(IM)注射Balb/c小鼠(5只/组)一次。14天后通过H5N1Viet Nam 1203(1000xLD50)的鼻内施用攻击小鼠。每天监控小鼠的体重减轻，如果体重减轻超过20-30%则无痛处死小鼠。利用单独的rH5蛋白的接种未提供保护性免疫，因为所有在佐剂不存在的情况下利用rH5注射的小鼠在病毒攻击后自发地死亡(18只/25只动物)或显示明显的病态并且被无痛处死(7只/25只动物)。然而，即使在施用的rH5蛋白的最低剂量上，所有用rH5+GLA-SE佐剂接种的小鼠都存活(25只/25只动物)。这些结果表明当利用GLA-SE佐剂配制时，重组亚单位流感疫苗的单次注射可赋予小鼠保护性免疫。尽管抗原剂量降低至1/50，仍然观察到该保护性免疫。
通过检查病毒攻击后接种的动物的体重减轻进一步探究向rH5疫苗中添加GLA佐剂的益处。用递增量的单独的rH5蛋白(0、50、150、450、900或2700ng)或利用20μgGLA-SE佐剂或单独的SE乳剂(100μL的2%的溶液)配制的rH5蛋白注射Balb/c小鼠(5只/组)1次。14天后用H5N1 Viet Nam 1203(1000xLD50)攻击小鼠，在病毒攻击后14天测量体重。利用单独的rH5蛋白接种的小鼠，在病毒攻击后体重减轻相当大，并在显示任何恢复之前死亡，即使在施用的疫苗的最高剂量下。相反地，所有用利用GLA-SE佐剂配制的rH5蛋白接种的动物在病毒攻击后存活，并且能够恢复体重。用利用单独的SE乳剂配制的rH5蛋白接种的小鼠也从病毒攻击中恢复并且获得体重。
为了定量这两个组之间恢复的差异，通过测量代表两周的测试期中每天体重变化的曲线下面积来计算所有组的14天测试期中平均百分比体重变化。描绘这些值的条线图示于图1A中，其显示接受利用GLA-SE配制的rH5的动物比接受在单独的SE乳剂中配制的rH5的小鼠丢失显著更少的体重。这些结果证明利用GLA佐剂配制的rH5在所有抗原剂量上诱导优良的保护作用。因此，GLA佐剂至rH5蛋白的添加产生了极大改善的疫苗，所述疫苗当以单次低剂量注射施用时在小鼠中建立保护性免疫。这些结果表明利用GLA佐剂的制剂为一些与开发用于大流行流感的基于重组蛋白的疫苗相关的挑战，即抗原的免疫原性的增强(以便仅需单次疫苗注射来建立保护性免疫)提供了潜在解决方案。疫苗的节省剂量对于公共卫生当局在防备潜在流感大流行中是一个紧迫的优先事项。
通过测量病毒攻击后接种的动物的动力学体重变化来进一步研究由GLA佐剂组成的rH5疫苗的改善的性质。利用于50ng于GLA-SE佐剂或单独的SE乳剂中配制的rH5蛋白注射Balb/小鼠(5只/组)一次，随后在14天后利用H5N1 Viet Nam 1203(1000xLD50)攻击小鼠，如上所述的。作为对照，在rH5蛋白不存在的情况下利用GLA-SE佐剂或单独的SE乳剂接种小鼠。在病毒攻击后每天称取小鼠的重量，测定相对于攻击前动物的体重的体重减轻百分比。在该攻击模型中，未免疫的初次接触实验的小鼠不能从病毒攻击中恢复，如通过观察到的快速体重减轻，随后死亡所证明的。如图1B中所示，在病毒攻击后存活的所有小鼠都显示感染的症状，因为它们的体重最初以与在未免疫的对照组中观察到的相同的速率下降。然而，用利用GLA-SE配制的rH5免疫的小鼠从病毒攻击中恢复，如通过在病毒攻击后10-12天恢复至接种前水平的体重增加所显示的。用利用单独的SE乳剂配制的rH5免疫的小鼠也恢复，然而，它们的恢复速率相对于在用利用GLA-SE佐剂配制的rH5接种的动物中观察到的速率被明显延迟。该保护作用取决于rH5蛋白，因为利用GLA-SE佐剂或单独的SE乳剂免疫的小鼠以与初次接触实验的小鼠的方式相似的方式对病毒攻击作出反应。重要地，这些数据表明单次注射低剂量的rH5疫苗的提高的功效取决于rH5蛋白与GLA佐剂的组合活性。
为了进一步确定于GLA佐剂中配制的rH5疫苗的提高的功效所必需的组分，测量用单独的GLA-SE佐剂、rH5蛋白+单独的SE、rH5+单独的GLA或rH5+GLA-SE接种的动物的体重变化的动力学。如图1C中所示，未免疫的对照小鼠和在rH5蛋白不存在的情况下利用GLA-SE免疫的小鼠体重大大减轻并且在病毒攻击后死亡，如先前观察到的。相反地，利用rH5和GLA-SE的组合免疫的小鼠从病毒攻击中恢复并且恢复完全体重。用利用单独的SE或单独的GLA配制的rH5接种的小鼠也已恢复，然而这两个组中观察到的恢复速率相对于接受rH5+GLA-SE疫苗的小鼠的恢复速率被显著延迟。这些数据表明rH5和SE乳剂中的GLA佐剂的组合相对于任何单独的组分的性质显示更优的性质。
实施例2
rH5/GLA-SE流感疫苗当以单次注射施用时赋予小鼠异源免疫
在本实施例中，证明利用GLA佐剂配制的重组疫苗抗异源病毒攻击的保护性功效。为了进行这些实验，通过单次注射从H5N1 Indonesia(进化枝2.3)分离的rH5蛋白来免疫小鼠，然后用H5N1VN病毒进行攻击，如上文中所描述的。作为阳性对照，用来自H5N1 Vietnam的同源rH5蛋白接种小鼠，而作为阴性对照，利用无关HSV-2病毒蛋白(rG013)接种小鼠。如表1中所示，利用HSV-2接种的小鼠全部死亡，无论什么蛋白质-佐剂制剂。所有用50 ng单独的同源rH5VN蛋白接种的小鼠全都死亡，然而所有用利用GLA-SE佐剂配制的rH5VN接种的小鼠都存活，与先前的发现一致。重要地，所有接受50ng或200ng利用GLA-SE配制的异源rH5 Indo蛋白的小鼠也存活，这证明GLA-SE有效地扩大了交叉-进化枝保护性免疫。有趣地，在施用的最低剂量的rH5 Indo(50ng)上，利用单独的SE配制蛋白质不能保护小鼠免受病毒攻击(无小鼠存活)，然而在SE乳剂不存在的情况下具有GLA的制剂在40%的小鼠(2/5)中显示保护作用。
表1
Figure BDA00002378986400311
当在病毒攻击后监控体重减轻的恢复时，观察到当利用GLA佐剂配制时rH5 Indo疫苗的提高的功效，如图2中显示的。如在先前的实验中观察到的，用单独的rH5蛋白接种的小鼠未从病毒攻击中恢复，然而接受利用GLA-SE佐剂配制的rH5的小鼠显示快速恢复并且使体重恢复至其攻击前的水平。用于GLA-SE佐剂中配制的异源rH5 Indo蛋白接种的小鼠也以取决于重组蛋白的剂量的动力学快速恢复。因此，GLA-SE提高了同源和异源重组流感疫苗的功效。利用节省剂量和药量的疫苗建立交叉-进化枝保护性免疫是候选大流行流感疫苗的特别有利的性质。
实施例3
GLA-SE加速小鼠的抗原特异性免疫的建立
本实施例显示通过在免疫后连续天数时用流感病毒攻击小鼠来在小鼠保护模型中建立免疫所需的时间。通过单次注射低剂量的在单独的SE中或在GLA-SE佐剂中配制的rH5蛋白来接种小鼠，如先前所描述的。作为对照，单独用rH5蛋白或GLA-SE接种小鼠。在接种后在不同天数(第0、2、4、6、8、10或12天)时攻击小鼠，在14天后测定存活率百分比。如图3A中所示，利用GLA佐剂配制的rH5蛋白在接种后4-6天内建立了保护性免疫。如所预期的，该效应取决于重组蛋白和GLA-SE，因为接受不存在这两种组分的任一种的疫苗的小鼠都已死亡。接受在单独的SE中配制的rH5的小鼠也显示了免受病毒攻击的保护作用，虽然该组中保护性免疫的获得相对于在rH5+GLA-SE组中观察到的延迟一天。
在接种后第6天或第14天测量利用病毒攻击的小鼠的体重减轻的动力学，如先前所描述的。如图3B中所示，当在免疫后6天攻击小鼠时，rH5+单独的SE乳剂组与接受rH5+GLA-SE佐剂的组相比较丢失显著更多的体重。组间观察到的该差异在使攻击延迟至接种后第14天后未消失(参见图3B)。这些数据表明利用于GLA佐剂中配制的rH5的接种不仅导致病毒攻击后较少的体重减轻，而且其还使得动物能够显著更快地恢复。通过使用临床评分法，观察到一般健康的类似趋势(参见图3C)。利用rH5+GLA-SE处理的小鼠表现出更少的恶心并且比单独的rH5+SE组更快地恢复，无论接种的时间如何。因此，GLA-SE佐剂相对于单独的SE乳剂加速抗原特异性免疫的建立。节省剂量和药量的重组疫苗快速诱导保护性免疫的能力是大流行流感疫苗的高度期望的性质，所述流感疫苗在抗预料之外的广泛且快速的病毒传播中应当是有效的。
实施例4
利用在GLA-SE中配制的RH5蛋白的接种在小鼠中建立高度持久的保护性免疫
在本实施例中，通过用低剂量的同源(rH5VN)或异源(rH5Indo)抗原免疫小鼠一次，然后在46天后利用H5N1VN进行病毒攻击来评估佐剂依赖性保护作用的持久性。如表2中所示，所有用在GLA佐剂中配制的重组H5抗原接种的小鼠在接种后第46天的病毒攻击后存活，无论利用同源还是异源rH5蛋白进行接种。此外，如图4A和B中所示，该组中的动物从病毒攻击中非常快地恢复并且体重几乎未减轻。图4C显示这些组中的病毒载量也减少。重要地，这些结果表明由低剂量rH5蛋白和GLA佐剂的组合组成的疫苗赋予小鼠对流感病毒的有效持久的交叉-进化枝保护作用。
表2
Figure BDA00002378986400331
实施例5
rH5/GLA-SE流感疫苗的单次注射在鼬中的功效
本实施例中描述的实验阐明了是否可通过低剂量rH5疫苗的单次注射在鼬中建立保护性免疫，所述鼬是适用于流感疫苗开发的适当临床前宿主。将6-12月龄的雄性惠誉鼬(Triple F Farms,Sayre,PA)用于全部实验。在接种之前，利用血凝抑制(HI)测定确认所有动物对于循环季节性流感病毒(甲型流感病毒H1N1、H3N2和乙型流感病毒)是血清学阴性的。对于全部实验，将鼬关养在Duo-Flo Bioclean移动式洁净室中的笼(Lab Products,Seaford,DE)中。在感染之前每天采集基线血清、温度和体重数据，进行约3天。使用皮下可植入温度转发器(BioMedic Data Systems,Seaford DE)测量温度。用0.5μg rH5VN(单独地或与佐剂一起)接种鼬(每组4只)一次，随后在接种后第28天用H5N1VN进行攻击。以1mL总体积利用7.5X105 PFU的A/VN/1203/05(H5N1)病毒鼻内接种鼬。在感染后第1天开始每24小时从所有鼬收集鼻洗剂，持续进行7天。在第0天体重减轻超过其25%，显示神经学症状或被确定为处于垂死状态的任何动物被人道地无痛处死。如表3中所示，所有利用rH5+SE、GLA或GLA-SE注射的动物在病毒攻击后存活，然而利用不存在佐剂的rH5蛋白或不存在流感病毒抗原的GLA-SE佐剂的接种不能保护所有动物免受病毒侵害。当测量病毒攻击后体重减轻的动力学时，观察到利用用GLA佐剂配制的rH5疫苗接种的动物与用单独的rH5或在SE乳剂中配制的rH5接种动物相反，体重几乎未减轻(参见图5A)。在该动物模型中，rH5+GLA疫苗在鼬中的最佳功效表现出不需要SE乳剂。当测定每一组的临床评分时，重现了该倾向，如图5B中显示的。接受在GLA佐剂中配制的rH5的动物基于临床观察表现正常，与接受单独的rH5的动物相反。总体而言，这些结果显示低剂量的包含GLA佐剂的rH5疫苗的单次注射有效地保护鼬免受H5N1感染。因此，已在两个不同的保护性免疫的动物模型中显示了GLA佐剂显著提高单次注射低剂量重组H5疫苗的功效的能力。
表3
Figure BDA00002378986400341
根据上述内容，应理解，虽然为了举例说明在本文中已描述了具体的实施方案，但可在不背离本发明的精神和范围的情况下进行各种变动。因此，本发明仅受所附权利要求限定。

Claims (11)

1.一种药物组合物，其包含：
(a)来自大流行前或大流行性流感病毒的重组血凝素(rHA)和
(b)佐剂，其中所述佐剂包含具有各自独立地选自葡糖基和氨基取代的葡糖基的还原端和非还原端的二糖，其中所述非还原端的1位上的碳通过醚(-O-)或氨基(-NH-)基团连接于所述还原端的6’位上的碳，所述二糖通过非还原端的4’碳键合于磷酸基团以及通过酰胺(-NH-C(O)-)和/或酯(-O-C(O)-)键键合于多个脂质基团，其中所述酯或酰胺键的羰基(-C(O)-)基团直接连接于所述脂质基团，并且每一个脂质基团包含至少8个碳，
所述组合物用于通过单次注射药物组合物来免疫有此需要的受试者以抗大流行前或大流行性流感病毒的方法。
2.权利要求1所述的用于免疫群体以抗大流行前或大流行性流感病毒的方法的药物组合物，其中所述组合物的施用在单次注射后在至少50%的群体中实现血清转换。
3.前述权利要求中任一项所述的其用于免疫群体以抗大流行前或大流行性流感病毒的方法的药物组合物，其中所述组合物不包含乳剂。
4.前述权利要求中任一项所述的用于免疫群体以抗大流行前或大流行性流感病毒的方法的药物组合物，其中所述组合物不包含油。
5.前述权利要求中任一项所述的用于免疫群体以抗大流行前或大流行性流感病毒的方法的药物组合物，其中所述佐剂为GLA。
6.一种用于免疫有此需要的受试者以抗大流行前或大流行性流感病毒的方法的药物组合物，所述组合物包含：
(a)来自大流行前或大流行性流感病毒的重组血凝素(rHA)和
(b)佐剂，其中所述佐剂包含具有各自独立地选自葡糖基和氨基取代的葡糖基的还原端和非还原端的二糖，其中所述非还原端的1位上的碳通过醚(-O-)或氨基(-NH-)基团连接于所述还原端的6’位上的碳，二糖通过非还原端的4’碳键合于磷酸基团以及通过酰胺(-NH-C(O)-)和/或酯(-O-C(O)-)键键合于多个脂质基团，其中酯或酰胺键的羰基(-C(O)-)基团直接连接于所述脂质基团，并且每一个脂质基团包含至少8个碳以及其中所述组合物是节省剂量的。
7.权利要求6所述的用于免疫受试者以抗大流行前或大流行性流感病毒的方法的药物组合物，其中所述rHA以节省剂量的量存在。
8.权利要求6所述的用于免疫受试者以抗大流行前或大流行性流感病毒的方法的药物组合物，其中所诉rHA以在所述佐剂不存在的情况下不提供保护性免疫的浓度存在。
9.权利要求6至8中任一项所述的用于免疫受试者以抗大流行前或大流行性流感病毒的方法的药物组合物，其中所述组合物包含单个重组蛋白。
10.权利要求6所述的用于免疫受试者以抗大流行前或大流行性流感病毒的方法的药物组合物，其中每剂量rHA的量在约15μg至约1μg的范围内。
11.权利要求6所述的用于免疫受试者以抗大流行前或大流行性流感病毒的方法的药物组合物，其中所述佐剂为GLA并且rH5来自H5N1流感病毒的致病株。
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