ES2377761T3 - Vacuna contra la gripe de emulsión de aceite en agua - Google Patents

Vacuna contra la gripe de emulsión de aceite en agua Download PDF

Info

Publication number
ES2377761T3
ES2377761T3 ES08736288T ES08736288T ES2377761T3 ES 2377761 T3 ES2377761 T3 ES 2377761T3 ES 08736288 T ES08736288 T ES 08736288T ES 08736288 T ES08736288 T ES 08736288T ES 2377761 T3 ES2377761 T3 ES 2377761T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
adjuvant
vaccine
influenza
strain
antigen
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES08736288T
Other languages
English (en)
Inventor
William Ripley Ballou
Emmanuel Jules Hanon
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
GlaxoSmithKline Biologicals SA
Original Assignee
GlaxoSmithKline Biologicals SA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from GB0707697A external-priority patent/GB0707697D0/en
Priority claimed from GB0711357A external-priority patent/GB0711357D0/en
Priority claimed from GB0712062A external-priority patent/GB0712062D0/en
Priority claimed from PCT/EP2007/060743 external-priority patent/WO2008043774A1/en
Priority claimed from GB0724651A external-priority patent/GB0724651D0/en
Application filed by GlaxoSmithKline Biologicals SA filed Critical GlaxoSmithKline Biologicals SA
Application granted granted Critical
Publication of ES2377761T3 publication Critical patent/ES2377761T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/145—Orthomyxoviridae, e.g. influenza virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/39—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the immunostimulating additives, e.g. chemical adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/545—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the dose, timing or administration schedule
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55566—Emulsions, e.g. Freund's adjuvant, MF59
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55577—Saponins; Quil A; QS21; ISCOMS
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/70—Multivalent vaccine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16151—Methods of production or purification of viral material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16211—Influenzavirus B, i.e. influenza B virus
    • C12N2760/16234—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16211—Influenzavirus B, i.e. influenza B virus
    • C12N2760/16251—Methods of production or purification of viral material
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

Una composicion inmunogenica contra la gripe en un volumen de dosis adecuado para uso humano que comprende un antigeno del virus de la gripe o preparacion antigenica en combinacion con un adyuvante de emulsion de aceite en agua, en la que el adyuvante se selecciona del grupo que consiste en: (i) un adyuvante que consiste en 5-6 mg de escualeno, 2-3 mg de agente emulsionante, 5-7 mg de tocol por dosis humana; (ii) un adyuvante que consiste en 2-3 mg de escualeno, 1-1, 5 mg de agente emulsionante, y 2, 5-3, 5 mg de tocol por dosis humana; (iii) un adyuvante que consiste en 0, 5-1, 5 mg de escualeno, 0, 25-0, 75 mg de agente emulsionante y 0, 5-1, 5 mg de tocol por dosis humana.

Description

Vacuna contra la gripe de emulsion de aceite en agua
Campo técnico
La presente invencion se refiere a composiciones inmunogenicas de la gripe y a pautas de vacunacion para
5 inmunizar seres humanos contra la enfermedad de la gripe, a su uso en medicina, en particular a su uso en aumentar respuestas inmunitarias a diversos antigenos, y a procedimientos de preparacion. En particular, la invencion se refiere a vacunas contra la gripe que comprenden un antigeno del virus de la gripe o preparacion antigenica en combinacion con un adyuvante de emulsion de aceite en agua, en las que dicho adyuvante de emulsion de aceite en agua comprende un aceite metabolizable y un agente emulsionante, y opcionalmente un tocol
10 yNo un esterol.
Antecedentes técnicos
Los virus de la gripe son uno de los virus mas ubicuos presentes en el mundo, afectando tanto a seres humanos como a ganado. La gripe produce una carga economica, morbilidad e incluso mortalidad, que son significativos.
El virus de la gripe es un virus envuelto de ARN con un tamano de particula de aproximadamente 125 nm de
15 diametro. Consiste basicamente en una nucleocapside interna o nucleo de acido ribonucleico (ARN) asociado a nucleoproteina, rodeado por una envuelta virica con una estructura de bicapa lipidica y glucoproteinas externas. La capa interna del la envuelta virica esta compuesta predominantemente de proteinas de la matriz y la capa externa principalmente de material lipidico derivado de huesped. El virus de la gripe comprende dos antigenos de superficie, las glucoproteinas neuraminidasa (NA) y hemaglutinina (HA), que aparecen como espiculas, 10 a 12 nm de longitud,
20 en la superficie de las particulas. Son estas proteinas de la superficie, particularmente la hemaglutinina, las que determinan la especificidad antigenica de los subtipos de la gripe. La cepas del virus se clasifican segun especies huesped de origen, sitio geografico y ano de aislamiento, numero de serie y, para la gripe A, por propiedades serologicas de los subtipos de HA y NA. Se han identificado 16 subtipos de HA (H1-H16) y nueve subtipos de NA (N1-N9) para los virus de la gripe A [Webster RG y col. Evolution and ecology of influenza A viruses. Microbiol. Rev.
25 1992;56:152-179; Fouchier RA y col. Characterization of a Novel Influenza A Virus Hemaglutinin Subtype (H16) Obtained from Black-Headed Gulls. J. Virol. 2005;79:2814-2822). Los virus de todos los subtipos de HA y NA se han recuperado de aves acuaticas, pero solo tres subtipos de HA (H1, H2 y H3) y dos subtipos de NA (N1 y N2) han establecido linajes estables en la poblacion humana desde 1918. Solo un subtipo de HA y uno de NA son reconocidos por los virus de la gripe B.
30 Los virus de la gripe A han evolucionado y experimentan continuamente variabilidad antigenica [Wiley D, Skehel J. The structure and the function of the hemaglutinin membrane glycoprotein of influenza virus. Ann. Rev. Biochem. 1987;56:365-394]. Una falta de correccion eficaz por la ARN polimerasa virica conduce a una alta tasa de errores de transcripcion que pueden producir sustituciones de aminoacidos en glucoproteinas de la superficie. Esto se llama "desviacion antigenica". El genoma virico segmentado permite un segundo tipo de variacion antigenica. Si dos virus
35 de la gripe infectan simultaneamente una celula huesped, el reagrupamiento genetico, llamado "desplazamiento antigenico" puede generar un virus novedoso con nuevas proteinas de la superficie o internas. Estos cambios antigenicos, tanto 'desviaciones' como 'desplazamientos', son impredecibles y pueden tener un espectacular impacto desde un punto de vista inmunologico ya que eventualmente conducen a la emergencia de nuevas cepas de la gripe y que permiten que el virus escape del sistema inmunitario causando las bien conocidas (epidemias), casi anuales.
40 Ambas de estas modificaciones geneticas han producido nuevas variantes viricas responsables de pandemias en seres humanos.
La desviacion antigenica del virus de la gripe B es menos frecuente que en las cepas A y el desplazamiento antigenico es desconocido. Aunque linajes antigenicamente distintos (normalmente dos, por ejemplo BNYamagata y BNVictoria) de la gripe B pueden co-circular ocasionalmente, con proporciones variables de ano a ano y pais a pais,
45 es usual que las vacunas contra la gripe contengan solo una cepa de la gripe B.
La HA es el antigeno mas importante en la definicion de la especificidad serologica de las diferentes cepas de la gripe. Esta proteina de 75-80 kD contiene numerosos determinantes antigenicos, varios de los cuales estan en regiones que experimentan cambios de secuencia en diferentes cepas (determinantes especificos de cepa) y otros en regiones que son comunes a muchas moleculas de HA (comunes a determinantes).
50 Los virus de la gripe producen epidemias casi cada invierno, con tasas de infeccion para el virus de tipo A o B de hasta el 40% durante un periodo de seis semanas. La infeccion de la gripe produce diversos estados de enfermedad, desde una infeccion subclinica pasando por una infeccion respiratoria superior leve a neumonia virica grave. Las epidemias de la gripe tipicas producen aumentos en la incidencia de neumonia y enfermedad respiratoria baja como demuestra el aumento de las tasas de hospitalizacion o mortalidad. La gravedad de la enfermedad se
55 determina principalmente por la edad del huesped, su estado inmunitario y el sitio de infeccion.
Las personas mayores, 65 anos de edad y mas, son especialmente vulnerables, representando el 80-90% de todas las muertes relacionadas con la gripe en paises desarrollados. Los individuos con enfermedades cronicas
subyacentes o con una respuesta inmunitaria alterada tambien tienen gran probabilidad de experimentar tales complicaciones. Los lactantes jovenes tambien pueden sufrir enfermedad grave. Por tanto, estos grupos necesitan protegerse en particular. Ademas de estos grupos 'en riesgo', las autoridades sanitarias tambien estan recomendando vacunar al personal sanitario.
La vacunacion desempena una funcion critica en controlar las epidemias de la gripe anuales. Vacunas contra la gripe actualmente disponibles son tanto la vacuna de la gripe inactivada como la atenuada viva. Las vacunas de la gripe inactivadas estan compuestas por tres formas posibles de preparacion de antigeno: virus completo inactivado, subviriones en los que particulas de virus purificadas son rotas con detergentes u otros reactivos para solubilizar la envoltura lipidica (la llamada vacuna "fraccionada") o HA y NA purificadas (vacuna de subunidad). Estas vacunas inactivadas se administran intramuscularmente (i.m.), subcutaneamente (s.c), o intranasalmente (i.n.).
Las vacunas contra la gripe para uso interpandemico, de todos los tipos, son normalmente vacunas trivalentes. Generalmente contienen antigenos derivados de dos cepas del virus de la gripe A y una cepa de la gripe B. Una dosis inyectable estandar de 0,5 ml en la mayoria de los casos contiene (al menos) 15 Ig de componente de antigeno de hemaglutinina de cada cepa, como se mide por inmunodifusion radial simple (SRD) (J.M. Wood y col.: An improved single radial immunodiffusion technique for the assay of influenza hemaglutinin antigen: adaptation for potency determination of inactivated whole virus and subunit vaccines. J. Biol. Stand. 5 (1977) 237-247; J. M. Wood y col., International collaborative study of single radial diffusion and immunoelectrophoresis techniques for the assay of hemaglutinin antigen of influenza virus. J. Biol. Stand. 9 (1981) 317-330). Tambien se ha informado de vacunas tetravalentes que contienen, ademas de las tres cepas clasicas, una cepa de B adicional (Commun Dis Intell 2006, 30, 350-357) o una cepa H3N2 adicional (Vaccine 1992, 10, 506-511).
Las cepas del virus de la gripe interpandemica que van a incorporarse en la vacuna contra la gripe cada temporada son determinadas por la Organizacion mundial de la salud en colaboracion con las autoridades sanitarias nacionales y los fabricantes de vacunas. Las vacunas contra la gripe interpandemica actualmente disponibles se consideran seguras en todos los grupos de edad (De Donato y col. 1999, Vaccine, 17, 3094-3101).
Sin embargo, la eficacia de la vacuna esta afectada por la edad y el estado inmunitario de los receptores y la coincidencia entre vacuna y cepas de la gripe en circulacion. Hay pocas pruebas de que las presentes vacunas contra la gripe funcionen en ninos pequenos de menos de dos anos de edad. Ademas, las tasas informadas de eficacia de la vacuna para la prevencion de enfermedad de la gripe confirmada tipica son del 23-72% para los ancianos, que son significativamente inferiores a las tasas de eficacia del 60-90% informadas para adultos mas jovenes (Govaert, 1994, J. Am. Med. Assoc., 21, 166-1665; Gross, 1995, Ann Intern. Med. 123, 523-527). Se ha mostrado que la eficacia de una vacuna contra la gripe establece una correlacion entre titulos en suero de anticuerpos de inhibicion de la hemaglutinacion (HI) y la cepa virica, y varios estudios han encontrado que adultos mayores presentan menores titulos de HI despues de la inmunizacion contra la gripe que los adultos jovenes (Murasko, 2002, Experimental gerontology, 37, 427-439).
A modo de antecedentes, durante los periodos interpandemicos, los virus de la gripe que circulan estan relacionados con los de la epidemia precedente. Los virus se propagan entre personas con niveles variables de inmunidad de infecciones anteriores en la vida. Tal circulacion, durante un periodo de normalmente 2-3 anos, promueve la seleccion de nuevas cepas que han cambiado suficientemente para producir de nuevo una epidemia entre la poblacion general; este procedimiento se llama 'desviacion antigenica'. Las 'variantes de desviacion' pueden tener diferentes impactos en diferentes comunidades, regiones, paises o continentes en un ano cualquiera, aunque a lo largo de varios anos su impacto global es frecuentemente similar. Las epidemias de la gripe tipicas producen aumentos en la incidencia de neumonia y enfermedad respiratoria baja como demuestra el aumento de las tasas de de hospitalizacion o mortalidad. Los ancianos o aquellos con enfermedades cronicas subyacentes tienen gran probabilidad de experimentar tales complicaciones, pero los lactantes jovenes tambien pueden sufrir enfermedad grave.
A intervalos impredecibles, virus de la gripe novedosos emergen con un antigeno de superficie clave, la hemaglutinina, de un subtipo totalmente diferente de cepas que circularon la estacion anterior. Aqui, los antigenos resultantes pueden variar del 20% al 50% de la proteina correspondiente de cepas que estuvieron previamente circulando en seres humanos. Este fenomeno, llamado "desplazamiento antigenico", puede hacer que el virus escape de la 'inmunidad de grupo' y establezca pandemias. En otras palabras, una pandemia de la gripe se produce cuando aparece un nuevo virus de la gripe contra el que la poblacion humana no tiene inmunidad. Se cree que al menos las pasadas pandemias se han producido cuando un virus de la gripe de una especie diferente, tal como un virus de la gripe aviar o porcina, ha cruzado la barrera de especies. Si tales virus tienen la posibilidad de propagarse de ser humano a ser humano, pueden propagarse mundialmente dentro de unos pocos meses a un ano, produciendo una pandemia. Por ejemplo, en 1957 (pandemia de la gripe asiatica), los virus del subtipo H2N2 sustituyeron a los virus H1N1 que habian estado circulando en la poblacion humana desde al menos 1918 cuando se aislo por primera vez el virus. La HA de H2 y la NA de N2 experimentaron desviacion antigenica entre 1957 y 1968 hasta que la HA fue sustituida en 1968 (pandemia de la gripe de Hong-Kong) por la aparicion del subtipo de la gripe H3N2, despues de lo cual la NA de N2 continuo desviandose junto con la HA de H3 (Nakajima y col., 1991, Epidemiol. Infect. 106, 383-395).
Se han realizado varios estudios clinicos para evaluar la seguridad e inmunogenicidad en poblaciones sin sensibilizar con vacunas candidatas monovalentes que contienen una cepa pandemica tal como las cepas H2N2 o H9N2 no circulantes. Los estudios han investigado formulaciones de virus fraccionados o completos de diversas concentraciones de HA (1,9, 3,8, 7,5 o 15 Ig de HA por dosis), con o sin adyuvantacion de alumbre. Los virus de la gripe del subtipo H2N2 circularon de 1957 hasta 1968 cuando fueron sustituidos por las cepas H3N2 durante la 'pandemia de Hong Kong'. Hoy en dia, los individuos que nacieron despues de 1968 no han recibido tratamiento inmunologico previo a cepas H2N2. Se ha mostrado que estos candidatos a vacuna eran inmunogenicos y bien tolerados. Los resultados se informan en Hehme, N y col. 2002, Med. Microbiol. Immunol. 191, 203-208; en Hehme
N. y col. 2004, Virus Research 103, 163-171; y se informo de dos estudios con H5N1 (Bresson JL y col. The Lancet. 2006:367 (9523):1657-1664; Treanor JJ y col. N Engl J Med. 2006;354:1343-1351). Otros estudios han informado de resultados con vacunas contra la gripe adyuvantadas con MF59. Un estudio ha informado de que dos dosis de una vacuna contra la gripe H5N3 adyuvantada con MF59 estaba reforzando la inmunidad a la gripe H5N1 en una poblacion sensibilizada (Stephenson y col., Vaccine 2003, 21, 1687-1693) y otro estudio ha informado de respuestas de anticuerpos reactivas de forma cruzada a virus H5N1 obtenidos despues de tres dosis de vacuna contra H5N3 de la gripe adyuvantada con MF59 (Stephenson y col., J. Infect. Diseases 2005, 191, 1210-1215).
Las personas en riesgo en caso de una pandemia de la gripe pueden ser diferentes de los grupos de riesgo definidos para complicaciones debidas a la gripe estacional. Segun la OMS, el 50% de los casos humanos producidos por la cepa H5N1 de la gripe aviar se produjeron en personas de menos de 20 anos, el 90% se produjeron entre aquellos de edad < 40. (OMS, parte epidemiologico semanal, 30 de junio de 2006).
Durante una pandemia, los farmacos antiviricos pueden no ser suficientes o eficaces para cubrir las necesidades y el numero de individuos en riesgo de la gripe sera mayor que en periodos interpandemicos, por tanto es esencial el desarrollo de una vacuna adecuada con la posibilidad de producirse en grandes cantidades y con distribucion eficiente y potencial de administracion. Una forma seria liberar rapidamente alguna capacidad de produccion para la produccion de la vacuna contra la gripe pandemica. Sin embargo, ya que la vacunacion colectiva solo empezaria despues de la aparicion de la pandemia, esto produciria de cualquier forma retrasos importantes por el tiempo necesario para identificar la cepa y para producir el primer lote. Ademas, habra una produccion semanal fija y, por tanto, limitada por los fabricantes de vacunas. Esto significa que el presente enfoque dejara casi con seguridad grandes partes de la poblacion globalmente sin proteger cuando ataca la pandemia. La vacuna estaria disponible demasiado tarde para grandes partes de la poblacion y se anticipa que la mortalidad seria demasiado alta con una estimacion de 180-360 millones de muertes globalmente.
Una forma para tratar este presente dilema es generar una vacuna pandemica de antemano a partir de una pandemia y disenar una vacuna monovalente con la "mejor cepa pandemica candidata" en lugar de vacunas trivalentes en un intento por reducir el volumen de vacunas, principalmente ya que dos dosis de vacuna pueden ser necesarias con el fin de lograr niveles de anticuerpos protectores en receptores que no han recibido previamente tratamiento inmunologico (Wood JM y col. Med Microbiol Immunol. 2002;191:197-201. Wood JM y col. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 2001;356:1953-1960). Entonces, esta vacuna se usaria para almacenar o para sensibilizar a la poblacion durante el periodo interpandemico.
Desafortunadamente, como las presentes instalaciones de produccion estan completamente ocupadas todo el ano con la produccion de vacunas trivalentes estacionales para la vacunacion anual en los hemisferios norte y sur, ambos enfoques mencionados anteriormente no son factibles debido a que no hay capacidad de produccion adicional para producir esa "mejor cepa pandemica candidata". Ademas, debe observarse que hay una necesidad urgente de encontrar una solucion que haga frente a las escaseces de vacunas interpandemicas contra la gripe que regularmente se encuentran durante las estaciones de la gripe anuales. Una solucion podria ser construir capacidad de produccion adicional, sin embargo esto requeriria varios anos de construccion, que es de cualquier forma un enfoque inadecuado en caso de un ataque pandemico dentro de los proximos anos.
Actualmente, la unica forma para ganar rapidamente capacidad adicional seria acortar el tiempo de produccion para la vacuna trivalente anual. Las escaseces recurrentes de vacunas contra la gripe se producen cada estacion en la mayoria de los paises que excluyen una cubricion optima de la poblacion considerada como de alto riesgo para desarrollar la grave enfermedad de la gripe y complicaciones. Como la produccion de antigeno es el factor limitante de la velocidad en la produccion de vacunas contra la gripe, tienen que explorarse estrategias de ahorro de antigeno alternativas.
Algunos enfoques se basan en la adyuvantacion, cuyo objetivo es aumentar la inmunogenicidad de la vacuna con el fin poder disminuir el contenido de antigeno (ahorro de antigeno) y, por tanto, aumentar el numero de dosis de vacunas disponibles. El uso de un adyuvante tambien puede reducir la posible inmunogenicidad debil del antigeno en una poblacion sin tratamiento previo. Se han publicado varios enfoques. Se han mostrado ejemplos que usan virus H2N2 o H9N2 inactivado completo adyuvantado con sal de aluminio (N. Hehme y col. Virus Research 2004, 103, 163-171) o que usan una vacuna contra H5N1 de subvirion simple o vacuna contra el virus H5N1 fraccionado adyuvantada con hidroxido de aluminio (Bresson JL y col. The Lancet. 2006:367 (9523):1657-1664; Treanor JJ y col. N Engl J Med. 2006;354:1343-1351). Los resultados de este ultimo ensayo indican que tanto las vacunas contra el virus H5N1 simples como adyuvantadas son seguras hasta una dosis de antigeno de 90 Ig (probada solo como vacuna de subvirion simple). Sin embargo, usando una alta dosis tal de antigeno no es compatible con una
estrategia de ahorro de antigeno que se ha vuelto esencial en el caso de una pandemia. Una vacuna contra la gripe de subunidad adyuvantada con el adyuvante MF59 en forma de una emulsion de aceite en agua esta comercialmente disponible para los ancianos y la poblacion en riesgo, y ha demostrado su capacidad para inducir un mayor titulo de anticuerpos que el obtenido con la vacuna de subunidad no adyuvantada (De Donato y col. 1999, Vaccine, 17, 3094-3101). Sin embargo, en una publicacion posterior, la misma vacuna no ha demostrado su perfil mejorado en comparacion con una vacuna fraccionada no adyuvantada (Puig-Barbera y col., 2004, Vaccine 23, 283289). El documento WO2006N100110 informa de composiciones contra la gripe adyuvantadas con AS03 para su uso en gripe estacional y pandemica.
Por tanto, todavia son una necesidad nuevas vacunas que sean eficaces mientras que tratan las consideraciones de ahorro de antigeno. Estas nuevas vacunas tendran una inmunogenicidad aceptable, si no mejorada, en particular contra cepas pandemicas debilmente o no inmunogenicas o para individuos inmunodeprimidos tales como la poblacion anciana. Estas nuevas vacunas tambien tendran idealmente un potencial de proteccion cruzada, de forma que podrian usarse como vacunas prepandemicas o de reserva para sensibilizar una poblacion que no ha sido tratada previamente inmunologicamente contra una cepa pandemica antes o tras la declaracion de una pandemia.
Exposición de la invención
Los presentes inventores han descubierto que, con el fin de mejorar el suministro de vacunas contra la gripe, podrian desarrollarse novedosas formulaciones contra la gripe inmunogenicas eficaces que contienen un adyuvante, permitiendose asi que se use una menor cantidad del antigeno de la gripe. Por este documento se proporcionan composiciones adyuvantadas novedosas que permiten que una formulacion de ahorro de antigeno proporcione suficiente proteccion de todos los grupos de edad, en terminos de respuesta inmunitaria mediada por celula yNo respuesta humoral.
Los inventores han descubierto en particular que podria basarse en composiciones contra la gripe inmunogenicas caracterizadas porque cada uno o todos los componentes individuales del adyuvante dentro de la composicion inmunogenica estan a un menor nivel que el previamente pensado como util. Esto lleva la ventaja de mantener el nivel de inmunogenicidad contra un antigeno mientras se reduce la reactogenicidad dentro del receptor huesped.
Por consiguiente, en el primer aspecto de la presente invencion se proporciona una composicion contra la gripe inmunogenica, en particular una vacuna, en un volumen de dosis adecuado para uso humano que comprende un antigeno del virus de la gripe o preparacion antigenica en combinacion con un adyuvante de emulsion de aceite en agua, en la que dicho adyuvante de emulsion de aceite en agua se selecciona del grupo que consiste en:
i) un adyuvante que consiste en 5-6 mg de escualeno, 2-3 mg de agente emulsionante, 5-7 mg de tocol por dosis humana ii) un adyuvante que consiste en 2-3 mg de escualeno, 1-1,5 mg de agente emulsionante, 2,5-3,5 mg de tocol por dosis humana iii) un adyuvante que consiste en 0,5-1,5 mg de escualeno, 0,25-0,75 mg de agente emulsionante, 0,5-1,5 mg de tocol por dosis humana
Otros aspectos de la invencion se enumeran en las reivindicaciones adjuntas.
Tambien se proporciona un kit de vacuna que comprende un componente de antigeno del virus de la gripe o un componente de preparacion antigenica del virus de la gripe, opcionalmente un componente de antigeno de baja cantidad, y que comprende ademas para la administracion concomitante o secuencial un adyuvante como se define en este documento.
Tambien se proporciona un procedimiento para la produccion de una composicion inmunogenica contra la gripe para una situacion pandemica, una situacion prepandemica o una situacion interpandemica (estacional), procedimiento que comprende mezclar un antigeno del virus de la gripe o preparacion antigenica del mismo con un adyuvante de emulsion de aceite en agua como se define en este documento. En particular se proporciona un procedimiento para la produccion de una vacuna contra la gripe, procedimiento que comprende una etapa de mezclar la inmunogenica adyuvantada con un excipiente farmaceuticamente aceptable, y proporcionar unidades de vacunas que contienen no mas de 15 Ig de antigeno de hemaglutinina de la gripe por dosis. El virus de la gripe puede derivarse de huevo, derivarse de planta, derivarse de cultivo celular, o puede producirse recombinantemente. Adecuadamente, el antigeno del virus de la gripe se deriva de huevo o se deriva de cultivo celular.
Tambien se proporciona una composicion inmunogenica o una vacuna como se define en este documento para su uso en el tratamiento o prevencion de enfermedad producida por infeccion de la gripe. En un aspecto relacionado se proporciona el uso de un antigeno del virus de la gripe o preparacion antigenica del mismo y una emulsion de aceite en agua como se define en este documento en la preparacion de una composicion inmunogenica. Por ejemplo, una vacuna, para la proteccion contra la infeccion o enfermedad producida por un virus de la gripe.
Tambien se proporciona el uso de (a) una baja cantidad, como se define en este documento, de antigeno del virus de la gripe o preparacion antigenica del mismo de cepa de la gripe, y (b) un adyuvante de emulsion de aceite en agua como se define en este documento, en la preparacion de una composicion inmunogenica, o un kit, para inducir
al menos uno de i) una respuesta inmunitaria de linfocitos T CD4 mejorada, ii) una respuesta de linfocitos B de memoria mejorada, iii) una respuesta humoral mejorada contra dicho antigeno del virus o composicion antigenica en un ser humano, en comparacion con la respuesta obtenida con la composicion no adyuvantada.
Adicionalmente se desvela un procedimiento o uso como se define anteriormente en este documento para la proteccion contra infeccion o enfermedad producida por un virus de la gripe que es una variante del virus del que se deriva el antigeno en la composicion inmunogenica. Adicionalmente se desvela un procedimiento o uso como se define anteriormente en este documento para la proteccion contra infecciones de la gripe o enfermedad producida por un patogeno que comprende un antigeno que es una variante de ese antigeno en la composicion inmunogenica.
Tambien se desvela un procedimiento de vacunacion que comprende administrar un antigeno y un adyuvante de emulsion de aceite en agua como se define en este documento.
Otros aspectos y ventajas de la presente invencion se describen adicionalmente en la siguiente descripcion detallada de las realizaciones preferidas de la misma.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Figura 1: Ensayo clinico: Titulos medios geometricos (GMT) para anticuerpo anti-HA en diferentes momentos de tiempo (cohorte de ATP para inmunogenicidad). Figura 2: Ensayo clinico: Tasa de seroproteccion (SPR) para titulo de anticuerpos de HI con intervalo de confianza del 95% en el dia 0 y dia 21 (cohorte de ATP para inmunogenicidad). Figura 3: Ensayo clinico: Tasa de seroconversion (SCR) para titulo de anticuerpos de HI con intervalo de confianza del 95% en el dia 21 (cohorte de ATP para inmunogenicidad). Figura 4: Ensayo clinico: Factor de seroconversion (SCF) para titulo de anticuerpos de HI con intervalo de confianza del 95% en el dia 21 (cohorte de ATP para inmunogenicidad). Figura 5: Estudio en ratones: Prueba de inhibicion de la hemaglutinina (GMT +N- IC95) en ratones BALBNc sensibilizados con cepas heterosubtipicas (intervalo de dosis de AS03). Figura 5A: titulos de HI para anti-ANNueva CaledoniaN20N99; Figura 5B: titulos de HI para anti-ANPanamaN2007N99. Figura 5C: titulos de HI para anti-BNShandongN7N97. Figura 6: Estudio en ratones: Prueba de inhibicion de la hemaglutinina (GMT +N- IC95) en ratones C57BIN6 sensibilizados con cepas heterosubtipicas (intervalo de dosis de AS03). Figura 7: Estudio en ratones: Respuesta inmunitaria celular (linfocito T CD4+) en PBMC de ratones C57BIN6 sensibilizados con cepas heterosubtipicas (intervalo de dosis de AS03). Figura 8: Estudio en ratones: Respuesta inmunitaria celular (linfocito T CD4+) en PBMC de ratones C57BIN6 sensibilizados con cepas heterosubtipicas e inmunizados con antigeno de dosis baja (0,5 Ig) adyuvantado con intervalo de dosis de AS03. Figura 9: Estudio en ratones: Titulos por ELISA de Ig en suero especifica de H5N1 (A y B) y respuestas isotipicas de IgG1 (C y D) y IgG2b (E y F) contra H5N1 en el dia 14 despues de la inmunizacion (GMT +N-IC95) para dos dosis de antigeno diferentes: 1,5 Ig (A, C y E) o 0,38 Ig (B, D y F) Figura 10: Estudio en ratones: Prueba de inhibicion de la hemaglutinacion (GMT +N- IC95) en el dia 21 despues de la inmunizacion (GMT +N- IC95) para dos dosis de antigeno diferentes: 1,5 Ig (A) o 0,38 Ig (B). Figura 11: Estudio en ratones: Respuesta inmunitaria celular (linfocito T CD4+) en ratones C57BIN6 sin tratamiento previo inmunizados con diferentes dosis de vacuna contra H5N1 (1,5 o 0,38 Ig) adyuvantada con intervalo de dosis de AS03: (A) 1,5 Ig de Ag (antigeno) de HA o (B) 0,38 Ig de Ag de HA (antigeno). Figura 12: Estudio en cerdos: Prueba de inhibicion de la hemaglutinina (GMT +N- IC95) en cerdos sensibilizados con cepas homologas (intervalo de dosis de AS03). Figura 13: Prueba de inhibicion de la hemaglutinina (GMT +N- IC95) en ratones C57BIN6 sin tratamiento previo inmunizados con TIV o QIV simple o adyuvantada con AS03 o AS03N2. Figura 14: Prueba de inhibicion de la hemaglutinina (GMT +N- IC95) en ratones C57BIN6 sensibilizados con un virus similar a BNVictoria e inmunizados con TIV o QIV simple o adyuvantada con AS03 o AS03N2. Figura 15: Ensayo clinico humano (intervalo de dosis de adyuvante): GMT para titulo de anticuerpos de HI en d0 yd21 Figura 16: Ensayo clinico humano (intervalo de dosis de adyuvante en adultos): Tasas de seroproteccion (SPR) para titulo de anticuerpos de HI en D0 y D21. Figura 17: Ensayo clinico humano (intervalo de dosis de adyuvante en adultos): Fig. 17A: Tasa de seroconversion (SCR) para titulo de anticuerpos de HI en PI (DiA 21); Fig. 17B: por categoria de edad. Figura 18: Ensayo clinico humano (intervalo de dosis de adyuvante en adultos): Fig. 18A: Factor de seroconversion (SCF) para titulo de anticuerpos de HI en PI (DiA 21); Fig. 18B: por categoria de edad. Figura 19: Ensayo clinico humano (intervalo de dosis de adyuvante en ancianos): GMT para titulo de anticuerpos de HI en d0 y d21. Figura 20: Ensayo clinico humano (intervalo de dosis de adyuvante en ancianos): Tasas de seroproteccion (SPR) para titulo de anticuerpos de HI con intervalo de confianza del 95% en los dias 0 y 21. Figura 21: Ensayo clinico humano (intervalo de dosis de adyuvante en ancianos): Tasa de seroconversion (SCR) para titulo de anticuerpos de HI en PI (DiA 21). Figura 22: Ensayo clinico humano (intervalo de dosis de adyuvante en ancianos): SCF para titulo de anticuerpos de HI con IC del 95% en el dia 21 (cohorte de ATP para HI por inmunogenicidad)
Figura 23: Ensayo clinico humano (intervalo de dosis de adyuvante en ancianos): Linfocitos T CD4 positivos para citocinas para cepas reunidas en D0 y D21 (cohorte de ATP para CMI). Figura 24: Ensayo clinico humano (intervalo de dosis de adyuvante en ancianos): Porcentaje de sujetos que informan sintomas esperados e inesperados relacionados (todos los grados N grado 3) durante el periodo de 7
5 dias (Dias 0-6) despues de la vacunacion (cohorte vacunada total).
Descripción detallada
Los presentes inventores han descubierto que ciertas composiciones de adyuvante que comprenden un aceite metabolizable, un agente emulsionante y un tocol yNo un esterol, en las que cada componente esta presente a un menor nivel para dosis de vacuna humana que el usado antes, pueden mejorar respuestas inmunitarias a una
10 preparacion contra la gripe, mientras que al mismo tiempo tienen menor reactogenicidad que algunas formulaciones de la tecnica anterior en las que los componentes de adyuvante estaban presentes a mayores niveles (adecuadamente 2 veces mayores o mas) por dosis humana.
Los presentes inventores han encontrado adicionalmente que una formulacion de la gripe que comprende un virus de la gripe o preparacion antigenica del mismo junto con un adyuvante como se define en este documento, y
15 opcionalmente adicionalmente con inmunoestimulantes tales como con un derivado de lipido A tal como 3D-MPL, pudo i) mejorar la respuesta inmunitaria de linfocitos T CD4 yNo la respuesta inmunitaria humoral contra dicho antigeno o composicion antigenica en comparacion con la obtenida con el virus sin adyuvantar o preparacion antigenica del mismo, yNo ii) generar una respuesta inmunitaria de linfocitos T CD4 yNo respuesta inmunitaria humoral contra dicho antigeno o composicion antigenica comparable a la obtenida con la composicion adyuvantada con un
20 adyuvante en la que cada componente esta presente a un mayor nivel (adecuadamente 2 veces mayor o mas). Las formulaciones adyuvantadas con el adyuvante se usan ventajosamente para inducir respuestas de linfocitos T CD4 contra la gripe que pueden detectar epitopes de la gripe presentados por moleculas del MHC de clase II. El presente solicitante ha encontrado que es eficaz elegir como diana el sistema inmunitario mediado por celula con el fin de aumentar la receptividad contra cepas de la gripe homologas y de desviacion (tras la vacunacion e infeccion).
25 Es una realizacion especifica de la presente invencion que las composiciones para su uso en la presente invencion puedan proporcionar en seres humanos cualquiera o ambos de (i) una mejor seroproteccion contra la gripe tras la revacunacion en comparacion con la composicion sin adyuvante, y (ii) una seroproteccion comparable contra la gripe tras la revacunacion en comparacion con una composicion adyuvantada en la que cada componente esta presente a un mayor nivel, como se evalua por el numero de sujetos humanos que cumplen cualquiera, varios o todos los
30 correlatos de la gripe de proteccion (es decir, tasa de seroconversion, factor de conversion, tasa de proteccion). Ademas, es otra realizacion especifica que la composicion para su uso en la presente invencion tambien podra inducir cualquiera o ambos de (i) una mayor respuesta de linfocitos B de memoria tras la primera vacunacion de un sujeto humano, y una mayor respuesta humoral tras la revacunacion, en comparacion con la composicion no adyuvantada, y (ii) una respuesta de linfocitos B de memoria comparable tras la primera vacunacion de un sujeto
35 humano, y una respuesta humoral comparable tras la revacunacion, en comparacion con la composicion adyuvantada en la que cada componente esta presente a un mayor nivel (adecuadamente 2 veces mayor o mas).
Las composiciones contra la gripe adyuvantadas segun la invencion tienen varias ventajas. Estas ventajas pueden evaluarse por comparacion con las composiciones adyuvantadas no equivalentes, o por comparacion con la composicion adyuvantada en la que cada componente de adyuvante esta presente a un mayor nivel:
40 1) una inmunogenicidad mejorada en comparacion con la composicion no adyuvantada, permitiendose asi cualquiera o todas de las siguientes: i) mejorar la respuesta inmunitaria debil a cepas de la gripe menos inmunogenicas a un nivel superior al obtenido con las formulaciones no adyuvantadas; ii) restaurar la respuesta inmunitaria debil en poblaciones especificas tales como en las personas mayores (mas de 50 anos, normalmente mas de 65 anos) a niveles observados en personas jovenes (respuestas de anticuerpos yNo
45 linfocitos T); 2) el uso de adyuvantes puede reducir la posible inmunogenicidad debil del antigeno en una poblacion sin tratamiento previo o en lactantes jovenes (entre 6 meses y 4 anos, en particular ninos de menos de 1 ano) e inducir sensibilizacion y proteccion; 3) ademas de proporcionar una proteccion al menos equivalente contra las cepas de vacuna con respecto a
50 una vacuna clasica (por ejemplo, una vacuna fraccionada comercialmente disponible), pueden conferir una capa de proteccion adicional contra cepas de desviacion conduciendo a un perfil de proteccion cruzada mejorado: aumento de la reactividad cruzada, proteccion cruzada contra cepas de la gripe variantes (desviadas), permitiendo la fijacion de una estrategia de sensibilizacion cruzada; esto es de especial interes cuando puedan usarse como vacunas prepandemicas permitiendo adicionalmente solo una dosis de una
55 vacuna pandemica que va a requerirse para potenciar la proteccion contra la cepa pandemica (en circulacion); esto tambien es de interes ya que puede tratar el problema de desviaciones de H3N2 que tienden a aparecer mas rapidamente que en la otra cepa A interpandemica H1N1; 4) un perfil de reactogenicidad reducido de la composicion adyuvantada en comparacion con el perfil obtenido con una composicion en la que cada componente esta presente a un mayor nivel (adecuadamente 2 veces
60 mayor o mas), mientras que se mantiene un potencial inmunogenico satisfactorio.
Alcanzando adicionalmente cualquiera o todas de estas ventajas con una dosificacion de antigeno reducida (normalmente inferior a 15 IgNcepaNdosis) y una dosificacion de adyuvante reducida se garantizara un aumento de la capacidad en caso de emergencia o para la preparacion de una situacion pandemica (ahorro de antigeno en la situacion pandemica) y ofreciendo una posibilidad de mayor numero de dosis de vacuna disponibles para la poblacion durante la estacion de vacunacion interpandemica.
Basandose en una combinacion de una dosificacion de antigeno reducida yNo una dosificacion de adyuvante reducida permitiran el desarrollo de composiciones contra la gripe mas complejas, tales como una vacuna cuadrivalente, que comprende una cuarta cepa que puede ser una segunda cepa de la gripe B o una cepa de la gripe pandemica que va a anadirse a la vacuna trivalente convencional.
En otro aspecto de la invencion, la composicion inmunogenica adyuvantada como se define en este documento demuestra resultados de inmunogenicidad para tanto la produccion de anticuerpos como la frecuencia despues de la vacunacion de CD4 especificos de la gripe (opcionalmente con reactividad cruzada) que son superiores o equivalentes a aquellos generados con vacuna no adyuvantada o con la vacuna adyuvantada con un adyuvante en el que los componentes de adyuvante estan presentes a un mayor nivel, respectivamente. Este efecto es en particular de valor en la poblacion pediatrica o la poblacion anciana permitiendo mayor eficacia que las vacunas actualmente comerciales, mientras que muestran sintomas de reactogenicidad menores o mas bajos en comparacion con el grupo que recibe la vacuna adyuvantada en la que los componentes de adyuvante estan a una mayor cantidad (adecuadamente 2 veces mayor).
Adyuvantes de emulsión de aceite en agua
Entre los adyuvantes conocidos en la tecnica se encuentran las emulsiones de aceite en agua, que pueden comprender opcionalmente otros inmunoestimulantes. La fase aceitosa de un sistema de emulsion tal comprende un aceite metabolizable. El significado del termino aceite metabolizable es muy conocido en la tecnica. Metabolizable puede definirse como que puede ser transformado por el metabolismo (Dorland's Illustrated Medical Dictionary, W.B. Sanders Company, 25a edicion (1974)). El aceite puede ser cualquier aceite vegetal, aceite de pescado, aceite animal o sintetico, que no sea toxico para el receptor y pueda ser transformado por el metabolismo. Frutos secos, semillas y granos son fuentes comunes de aceites vegetales. Los aceites sinteticos tambien son parte de la presente invencion y pueden incluir aceites comercialmente disponibles tales como NEOBEE® y otros. Un aceite metabolizable particularmente adecuado es el escualeno. El escualeno (2,6,10,15,19,23-hexametil-2,6,10,14,18,22tetracosahexaeno) es un aceite insaturado que se encuentra en grandes cantidades en el aceite de higado de tiburon, y en menores cantidades en el aceite de oliva, aceite de germen de trigo, aceite de salvado de arroz y levadura, y es un aceite para su uso en la presente invencion. El escualeno es un aceite metabolizable en virtud del hecho de que es un producto intermedio en la biosintesis del colesterol (Merck index, 10a edicion, entrada n° 8619).
Las emulsiones de aceite en agua son por si muy conocidas en la tecnica, y se ha sugerido que son utiles como composiciones de adyuvante (documento EP399843B); tambien las combinaciones de emulsiones de aceite en agua y otros agentes activos se han descrito como adyuvantes para vacunas: documentos WO95N17210; WO99N56414; WO99N12565; WO99N11241; WO2006N100109; WO 2006N100110; WO 2006N100111 que desvelan adyuvantes de emulsion basados en escualeno, α-tocoferol y TWEEN 80, opcionalmente formulados con los inmunoestimulantes QS21 yNo 30-MPL. Se han descrito otros adyuvantes basados en emulsion de aceite en agua tales como los desvelados en los documentos WO90N14837; WO00N50006; WO2007N080308; WO2007N006939, formando todos sistemas de emulsion de aceite (en particular cuando se basan en escualeno) para formar adyuvantes y composiciones alternativas.
Los tocoles (por ejemplo, la vitamina E) tambien se usan frecuentemente en adyuvantes de emulsion de aceite (documentos EP0382271B1; US5667784; WO95N17210). Los tocoles usados en las emulsiones de aceite (opcionalmente emulsiones de aceite en agua) de la invencion pueden formularse como se describe en el documento EP038227181, en el que los tocoles pueden ser dispersiones de gotitas de tocol, que opcionalmente comprenden una emulsionante, de opcionalmente menos de 1 micrometro de diametro. Alternativamente, los tocoles pueden usarse en combinacion con otro aceite para formar la fase aceitosa de una emulsion de aceite. Ejemplos de emulsiones de aceite que pueden usarse en combinacion con el tocol se describen en este documento, tales como los aceites metabolizables descritos anteriormente.
El procedimiento de producir emulsiones de aceite en agua es muy conocido para el experto en la materia. Comunmente, el procedimiento comprende mezclar la fase aceitosa con un tensioactivo tal como una disolucion de PBSNTWEEN80™, seguido de la homogeneizacion usando un homogeneizador, seria evidente para un experto en la materia que un procedimiento que comprende pasar la mezcla dos veces por una aguja de jeringuilla seria adecuado para homogeneizar pequenos volumenes de liquido. Igualmente, el procedimiento de emulsion en microfluidizador (maquina M110S Microfluidics, maximo de 50 pases, durante un periodo de 2 minutos a la entrada de presion maxima de 6 bar (0,6 MPa) (presion de salida de aproximadamente 850 bar (8,5 MPa))) podria ser adaptado por el experto en la materia para producir volumenes mas pequenos o mas grandes de emulsion. La adaptacion podria lograrse por experimentacion rutinaria que comprende la medicion de la emulsion resultante hasta que se logre una preparacion con gotitas de aceite del diametro requerido.
En una emulsion de aceite en agua, el aceite y el emulsionante deberian estar en un vehiculo acuoso. El vehiculo acuoso puede ser, por ejemplo, solucion salina tamponada con fosfato.
El tamano de las gotitas de aceite encontradas dentro de la emulsion de aceite en agua estable es opcionalmente inferior a 1 micrometro, puede estar en el intervalo de sustancialmente 30-600 nm, opcionalmente sustancialmente aproximadamente 30-500 nm de diametro, y opcionalmente sustancialmente 150-500 nm de diametro, y en particular aproximadamente 150 nm de diametro como se mide por espectroscopia de correlacion de fotones. A este respecto, el 80% de las gotitas de aceite por numero deberia estar dentro de los intervalos, opcionalmente mas del 90% y opcionalmente mas del 95% de las gotitas de aceite por numero estan dentro de los intervalos de tamano definidos.
El adyuvante de la invencion
El adyuvante de la invencion es una emulsion de aceite en agua que comprende:
-
como aceite metabolizable no toxico, escualeno;
-
un tocol tal como tocoferol, y en particular alfa-tocoferol;
-
un emulsionante (o tensioactivo) tal como el tensioactivo no ionico TWEEN 80TM o polisorbato 80.
Opcionalmente, la emulsion de aceite comprende ademas un esterol tal como colesterol.
Un aspecto clave de la presente invencion es el hecho de que los componentes presentes en el adyuvante de las composiciones inmunogenicas esten a cantidades menores a las que previamente se habian creido utiles, adecuadamente a menos de 11 mg de aceite metabolizable (tal como escualeno), por ejemplo, entre 0,5-11 mg, 0,510 mg o 0,5-9 mg, y a menos de 5 mg de agente emulsionante (adecuadamente tal como monooleato de polioxietilensorbitano), por ejemplo, entre 0,1-5 mg, por dosis humana de la composicion inmunogenica. Adecuadamente, el tocol (por ejemplo, alfa-tocoferol), si esta presente, esta a menos de 12 mg, por ejemplo, entre 0,5-12 mg. La composicion de adyuvante de la invencion es una emulsion de aceite en agua seleccionada del grupo que consiste en:
i) un adyuvante que consiste en 5-6 mg de escualeno, 2-3 mg de agente emulsionante y 5-7 mg de tocol por dosis humana; ii) un adyuvante que consiste en 2-3 mg de escualeno, 1-1,5 mg de agente emulsionante y 2,5-3,5 mg de tocol por dosis humana; iii) un adyuvante que consiste en 0,5-1,5 mg de escualeno, 0,25-0,75 mg de agente emulsionante y 0,5-1,5 mg de tocol por dosis humana.
En algunos casos puede ser ventajoso que las composiciones inmunogenicas y las vacunas de la presente invencion contengan adicionalmente un estabilizador, por ejemplo, otros emulsionantesNtensioactivos, que incluyen acido caprilico (Merck index, 10a edicion, entrada n° 1739), por ejemplo, tricaprilina.
Adecuadamente, dicha emulsion tiene gotitas de aceite de las que al menos el 70%, adecuadamente al menos el 80% por intensidad tienen diametros inferiores a 1 micrometro.
Se proporciona adicionalmente una dosis humana de una composicion inmunogenica y un adyuvante de la invencion.
Por el termino "dosis humana" se indica una dosis de composicion contra la gripe (despues de mezclar los componentes de adyuvante y de antigeno) que se administra en un volumen adecuado para uso humano. Generalmente, esta es entre 0,25 y 1,5 ml. En una realizacion, una dosis humana es aproximadamente 0,5 ml. En otra realizacion, una dosis humana es superior a 0,5 ml, por ejemplo, aproximadamente 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 o aproximadamente 1 ml. En otra realizacion, una dosis humana esta entre 1 ml y 1,5 ml. En otra realizacion, en particular cuando la composicion inmunogenica es para la poblacion pediatrica, una dosis humana puede ser inferior a 0,5 ml, por ejemplo, entre 0,25 y 0,5 ml o exactamente 0,1 ml, 0,2 ml, 0,25 ml, 0,3 ml o 0,4 ml. La invencion se caracteriza porque cada uno o todos los componentes individuales del adyuvante dentro de la composicion inmunogenica estan a un menor nivel que el que previamente se creia util y normalmente estan como se ha enumerado anteriormente. Composiciones particularmente adecuadas comprenden los siguientes componentes de adyuvante de oNw en las siguientes cantidades en el volumen final de dosis humana (adecuadamente de aproximadamente 0,5 ml o aproximadamente 0,7 ml) (Tabla 1):
Tabla 1A - Adyuvantes basados en emulsión o/w específicos según la invención
Adyuvante A
Adyuvante B Adyuvante E Adyuvante F Adyuvante C Adyuvante H Adyuvante G Adyuvante D
Emulsion oNw�
125 Il 100 Il 83,33 Il 62,5 Il 50 Il 41,67 Il 31,25 Il 25 Il
Componentes:
Tocoferol (mg)
5,94(5,6-6,2) 4,75(4,5-5,0) 3,96(3,8-4,2) 2,97(2,8-3,1) 2,38(2,3-2,5) 1,98(1,9-2,1) 1,49(1,4-1,6) 1,19(1,1-1,25)
Escualeno (mg)
5,35(5,1-5,6) 4,28(4,1-4,5) 3,57(3,4-3,75) 2,68(2,5-2,8) 2,14(2,0-2,25) 1,78(1,7-1,9) 1,34(1,3-1,4) 1,07(1,0-1,1)
Polisorbato 80 o Tween 80 (mg)
2,43(2,3-2,6) 1,94(1,8-2,0) 1,62(1,5-1,7) 1,21(1,1-1,3) 0,97(0,9-1,0) 0,81 0,61 0,49 (0,8-0,9) (0,58-0,64) (0,47-0,51)
� se facilitan volumenes de oNw adecuados para ilustracion, pero no son limitantes() entre parentesis estan intervalos adecuados (+N- 5%) alrededor del valor anterior
Tabla 1B - Adyuvantes basados en emulsión o/w específicos según la invención
Adyuvante I
Adyuvante J Adyuvante K Adyuvante L Adyuvante M Adyuvante N Adyuvante O Adyuvante P
Componentes:
Span 85 (mg)
0,59 0,47 0,39 0,29 0,24 0,2 0,15 0,12
(0,56-0,62)
(0,45-0,49) (0,37-0,41) (0,28-0,3) (0,23-0,25) (0,19-0,21) (0,14-0,16) (0,11-0,13)
Escualeno (mg)
4,88 3,9 3,25 2,44 1,95 1,63 1,22 0,98
(4,6-5,1)
(3,7-4,1) (3,1-3,4) (2,3-2,6) (1,85-2,05) (1,55-1,7) (1,2-1,3) (0,9-1,1)
Polisorbato 80 o
0,59 0,47 0,39 0,29 0,24 0,2 0,15 0,12
Tween 80 (mg)
(0,56-0,62) (0,45-0,49) (0,37-0,41) (0,28-0,3) (0,23-0,25) (0,19-0,21) (0,14-0,16) (0,11-0,13)
Adyuvante Q
Adyuvante R Adyuvante S Adyuvante T Adyuvante U Adyuvante V Adyuvante W Adyuvante X
Componentes:
Span 85 (mg)
0,84 (0,8-0,9) 0,67 (0,64-0,7) 0,56 (0,53-0,6) 0,42 (0,4-0,44) 0,34 (0,32-0,36) 0,28 (0,27-0,3) 0,21 (0,2-0,22) 0,17 (0,16-0,18)
Escualeno (mg)
4,88 (4,6-5,1) 3,9 (3,7-4,1) 3,25 (3,1-3,4) 2,44 (2,3-2,6) 1,95 (1,85-2,05) 1,63 (1,55-1,7) 1,22 (1,2-1,3) 0,98 (0,9-1,1)
Polisorbato 80 o Tween 80 (mg)
0,84 (0,8-0,9) 0,67 (0,64-0,7) 0,56 (0,53-0,6) 0,42 (0,4-0,44) 0,34 (0,32-0,36) 0,28 (0,27-0,3) 0,21 (0,2-0,22) 0,17 (0,16-0,18)
() entre parentesis estan intervalos adecuados (+N- 5%) alrededor del valor anterior (+N- 5%)
Todos los valores numericos facilitados (por ejemplo, en % o en mg), incluyendo aquellos en la Tabla 1, deberian 5 entenderse que permiten un 5% de variacion, es decir, 4,88 mg de escualeno deberia entenderse que significa entre 4,64-5,12 mg.
Puede realizarse una predilucion de cada componente (emulsion oNw y antigeno) para producir una vacuna adyuvantada que administra la cantidad de HA requerida y la cantidad de componente de adyuvante requerida.
La emulsion oNw de la vacuna adyuvantada (tanto prediluida como no) puede anadirse a un volumen que no supera,
10 o adecuadamente inferior a, la mitad del volumen de dosis total. A modo de ilustracion se facilitan volumenes adecuados (por ejemplo, que oscilan de 125 Il a 25 Il) para el componente de emulsion de las formulaciones A-H ilustradas en la Tabla 1A. Por consiguiente, se proporciona un procedimiento para preparar una vacuna contra la gripe adyuvantada que comprende una etapa de mezclar un primer volumen de una emulsion de aceite en agua y un segundo volumen de una suspension acuosa que comprende un virus de la gripe o preparacion antigenica del
15 mismo, en el que el segundo volumen es mayor que el segundo volumen. Adecuadamente, el primer volumen de emulsion oNw se obtiene despues de la dilucion de una emulsion concentrada.
Alternativamente, volumenes sustancialmente iguales (tanto despues de la predilucion como no) de la emulsion oNw y la suspension de antigeno se mezclan para producir las composiciones de vacuna adyuvantada de la invencion. Entonces, el volumen respectivo de cada componente estara normalmente a un exceso maximo del 10% del otro 20 componente (es decir, relacion de emulsion de adyuvante:suspension de antigeno de 1:1,1 a 1,1:1), adecuadamente a un exceso maximo del 5% (es decir, relacion de emulsion oNw:suspension de antigeno de 1:1,05 a 1,05:1), adecuadamente a un exceso maximo del 2,5% (es decir, relacion de emulsion de adyuvante:suspension de antigeno de 1:1,025 a 1,025:1). Por consiguiente, en otro aspecto se proporciona un procedimiento para preparar una vacuna contra la gripe adyuvantada que comprende una etapa de mezclar volumenes sustancialmente iguales de una
25 emulsion de aceite en agua y de una suspension acuosa que comprende un virus de la gripe o preparacion antigenica del mismo. Adecuadamente, el primer volumen de emulsion oNw se obtiene despues de la dilucion de una emulsion concentrada.
Todavia en otra realizacion, el adyuvante de emulsion oNw de la vacuna adyuvantada de la invencion se anade a un volumen que supera la mitad del volumen de dosis total. Por consiguiente, en otro aspecto de la invencion se proporciona un procedimiento para preparar una vacuna contra la gripe adyuvantada que comprende una etapa de mezclar un primer volumen de una emulsion de aceite en agua y un segundo volumen de una suspension acuosa que comprende un virus de la gripe o preparacion antigenica del mismo, en el que el primer volumen es mayor que el segundo volumen. Adecuadamente, el primer volumen de emulsion oNw se obtiene despues de la dilucion de una emulsion concentrada.
En los tres procedimientos, las cantidades de componentes de emulsion y opcionalmente HA en el volumen de dosis humano final son inferiores a las que se creia previamente utiles y son como se reivindican. Adecuadamente, estan en las cantidades especificas que se reivindican en este documento.
La cantidad de cada componente individual dentro de la vacuna puede expresarse como un porcentaje de la composicion de vacuna total, es decir, en % (volumenNvolumen) o en % (pesoNvolumen). Las siguientes cifras de conversion seran conocidas por el experto y pueden aplicarse: escualeno 0,855 gNml, alfa-tocoferol 0,949 gNml, polisorbato 80 1,080 gNml y Span 85 0,94 gNml.
Las cifras de conversion se calcularan basandose en que un volumen de dosis de vacuna puede ser, en realizaciones especificas, 0,5 ml o 0,7 ml.
La invencion proporciona ademas una composicion de adyuvante que comprende los componentes individuales como se definen en este documento anteriormente y en la cantidad definida anteriormente, por ejemplo, pero no exclusivamente como se ilustra en la Tabla 1. Normalmente, una composicion de adyuvante tal estara en un volumen adecuado de dosis humana. Si el adyuvante esta en una forma liquida que va a combinarse con una forma liquida de una composicion antigenica, la composicion de adyuvante estara en un volumen adecuado de dosis humana que es una fraccion del volumen final previsto de la dosis humana tal como, por ejemplo, aproximadamente la mitad del volumen final previsto de la dosis humana, por ejemplo, un volumen de 360 Il para una dosis humana prevista de 0,7 ml, o un volumen de 250 Il para una dosis humana prevista de 0,5 ml. Si la dosis de vacuna humana se aumenta se pretende que la cantidad (en mg) de los componentes de adyuvante permanezcan invariables por este aumento del volumen de dosis, estando simplemente mas diluidos. La composicion de adyuvante se diluye segun se necesite cuando se combina con la composicion de antigeno para proporcionar la dosis humana final de vacuna. El volumen final de tal dosis variara por supuesto dependiendo del volumen inicial de la composicion de adyuvante y el volumen de composicion de antigeno anadido a la composicion de adyuvante.
En una realizacion alternativa se usa adyuvante liquido para reconstituir una composicion de antigeno liofilizada. En esta realizacion, el volumen adecuado de dosis humana de la composicion de adyuvante es aproximadamente igual al volumen final de la dosis humana. La composicion de adyuvante liquido se anade al vial que contiene la composicion de antigeno liofilizado. La dosis humana final puede variar entre 0,5 y 1,5 ml. En una realizacion particular, la dosis humana es aproximadamente 0,5 ml o aproximadamente 0,7 ml, en esta realizacion la composicion de vacuna comprendera menos de 11 mg de aceite metabolizable, 5 mg de agente emulsionante y 23 mg de tocol por dosis humana, y especificamente en las cantidades especificadas anteriormente y reivindicadas. La concentracion exacta de los componentes de adyuvante depende de si la composicion de adyuvante pretende combinarse con una composicion de antigeno liquido o liofilizado.
Opcionalmente, la relacion de aceite (por ejemplo, escualeno):tocol (por ejemplo, α-tocoferol) es igual o inferior a 1 ya que esto proporciona una emulsion mas estable.
En algunos casos puede ser ventajoso que las vacunas contengan adicionalmente un estabilizador.
La dosis de los componentes a la que opera el adyuvante en la composicion inmunogenica es adecuadamente capaz de potenciar una respuesta inmunitaria a un antigeno en un ser humano. En particular, una cantidad adecuada de aceite metabolizable, tocol y monooleato de polioxietilensorbitano es la que mejora el potencial inmunologico de la composicion en comparacion con la composicion no adyuvantada, o es la que da un potencial inmunologico similar al obtenido con la composicion adyuvantada con un adyuvante que comprende otra cantidad mayor -de dichos componentes, en una poblacion humana diana, mientras que sea aceptable desde un perfil de reactogenicidad.
Inmunoestimulantes opcionales
En una realizacion especifica segun la invencion, el adyuvante no contiene ningun inmunoestimulante adicional, en particular no contiene un derivado de lipido A no toxico (tal como 3D-MPL) o una saponina (tal como QS21).
En otra realizacion se proporciona una composicion de vacuna que comprende un antigeno o composicion de antigeno y una composicion de adyuvante de la invencion y opcionalmente uno o mas inmunoestimulantes adicionales.
En una realizacion especifica, el adyuvante de emulsion de aceite en agua comprende opcionalmente uno o mas adyuvantes o inmunoestimulantes adicionales distintos de QS21 yNo MPL.
En otra realizacion especifica, el adyuvante de emulsion de aceite en agua y la composicion inmunogenica comprenden ademas un inmunoestimulante adicional que es un lipopolisacarido, adecuadamente un derivado de lipido A no toxico, particularmente monofosforil lipido A, o mas particularmente monofosforil lipido A 3-desacilado (3D-MPL). 3D-MPL se comercializa bajo el nombre MPL por GlaxoSmithKline Biologicals N.A. y se denomina en todo el documento MPL o 3D-MPL. Veanse, por ejemplo, las patentes de EE.UU. n° 4.436.727; 4.877.611; 4.866.034 y 4.912.094. 3D-MPL promueve principalmente respuestas de linfocitos T CD4+ con un fenotipo IFN-g (Th1). 3D-MPL puede producirse segun los procedimientos desvelados en el documento GB2220211 A. Quimicamente, es una mezcla de monofosforil lipido A 3-desacilado con 3, 4, 5 o 6 cadenas aciladas. En las composiciones de la presente invencion puede usarse 3D-MPL de particulas pequenas. El 3D-MPL de particulas pequenas tiene un tamano de particula de forma que pueda esterilizarse por filtracion a traves de un filtro de 0,22 Im. Tales preparaciones se describen en el documento WO94N21292.
Dicho lipopolisacarido, tal como 3D-MPL, puede usarse en cantidades entre 1 y 50 Ig por dosis humana de la composicion inmunogenica. Tal 3D-MPL puede usarse a un nivel de aproximadamente 25 Ig, por ejemplo, entre 20 30 Ig, adecuadamente entre 21 - 29 Ig o entre 22 y 28 Ig o entre 23 y 27 Ig o entre 24 y 26 Ig, o 25 Ig. En otra realizacion, la dosis humana de la composicion inmunogenica comprende 3D-MPL a un nivel de aproximadamente 10 Ig, por ejemplo, entre 5 y 15 Ig, adecuadamente entre 6 y 14 Ig, por ejemplo, entre 7 y 13 Ig o entre 8 y 12 Ig o entre 9 y 11 Ig, o 10 Ig. En otra realizacion, la dosis humana de la composicion inmunogenica comprende 3D-MPL a un nivel de aproximadamente 5 Ig, por ejemplo, entre 1 y 9 Ig, o entre 2 y 8 Ig, o adecuadamente entre 3 y 7 Ig
o 4 y6 Ig, o 5 Ig.
En otra realizacion se usan derivados de lipido A sinteticos como inmunoestimulante adicional opcional, describiendose algunos como agonistas de TLR-4 e incluyen, pero no se limitan a:
OM174 (dihidrogenofosfato de 2-desoxi-6-o-[2-desoxi-2-[(R)-3-dodecanoiloxitetra-decanoilamino]-4-ofosfono-�-D-glucopiranosil]-2-[(R)-3-hidroxitetradecanoilamino]-α-D-glucopiranosilo) (documento WO 95N14026)
OM 294 DP 1,10-bis(dihidrogenofosfato) de (3S,9R)-3-[(R)-dodecanoiloxitetradecanoilamino]-4-oxo-5-aza9(R)-[(R)-3-hidroxitetradecanoilamino]decano-1,10-diol (documentos WO99N64301 y WO 00N0462)
OM 197 MP-Ac DP 1-dihidrogenofosfato-10-(6-aminohexanoato) de (3S-,9R)-3-[(R)dodecanoiloxitetradecanoilamino]-4-oxo-5-aza-9-[(R)-3-hidroxitetradecanoilamino]decano-1,10-diol (documento WO 01N46127)
Otros ligandos TLR4 que pueden usarse son fosfatos de alquilglucosaminida (AGP) tales como los desvelados en los documentos WO9850399 o US6303347 (tambien se desvelan procedimientos para la preparacion de AGP), adecuadamente RC527 o RC529, o sales farmaceuticamente aceptables de AGP como se han desvelado en el documento US6764840. Algunos AGP son agonistas de TLR4, y algunos son antagonistas de TLR4. Se cree que ambos son utiles como adyuvantes.
Otros ligandos TLR4 adecuados que pueden producir una respuesta de senalizacion por TLR-4 (Sabroe y col., JI 2003 p1630-5) son, por ejemplo, lipopolisacarido de bacterias Gram-negativas y sus derivados, o fragmentos de los mismos, en particular un derivado de LPS no toxico (tal como 3D-MPL). Otros agonistas de TLR adecuados son: proteina de choque termico (HSP) 10, 60, 65, 70, 75 o 90; proteina A de tensioactivo, oligosacaridos de hialuronano, fragmentos de sulfato de heparano, fragmentos de fibronectina, peptidos de fibrinogeno y b-defensina 2, muramildipeptido (MDP) o proteina F del virus respiratorio sincitial. En una realizacion, el agonista de TLR es HSP 60, 70 o 90. Otros ligandos TLR-4 adecuados son como se describen en el documento WO 2003N011223 y en el documento WO 2003N099195 tales como el compuesto I, compuesto II y compuesto III desvelados en las paginas 45 del documento WO2003N011223 o en las paginas 3-4 del documento WO2003N099195, y en particular aquellos compuestos desvelados en el documento WO2003N011223 como ER803022, ER803058, ER803732, ER804053, ER804057, ER804058, ER804059, ER804442, ER804680 y ER804764. Adecuadamente, dicho ligando TLR-4 es ER804057.
Los receptores similares a Toll (TLR) son receptores transmembrana de tipo I, evolutivamente conservados entre insectos y seres humanos. Hasta la fecha se han establecido diez TLR (TLR 1-10) (Sabroe y col., JI 2003 p1630-5). Los miembros de la familia de los TLR tienen dominios extracelulares e intracelulares similares; se ha mostrado que sus dominios extracelulares tienen secuencias de repeticion ricas en leucina, y sus dominios intracelulares son similares a la region intracelular del receptor de la interleucina 1 (IL-1R). Las celulas de TLR se expresan de forma diferente entre celulas inmunitarias y otras celulas (incluyendo celulas epiteliales vasculares, adipocitos, miocitos cardiacos y celulas epiteliales intestinales). El dominio intracelular de los TLR puede interactuar con la proteina adaptadora Myd88, que tambien lleva el dominio de IL-1R en su region citoplasmica, conduciendo a la activacion de NF-KB de citocinas; esta ruta de Myd88 es una ruta por la que la liberacion de citocinas se efectua por la activacion de TLR. La expresion principal de TLR es en tipos de celulas tales como celulas presentadoras de antigeno (por ejemplo, celulas dendriticas, macrofagos, etc.).
La activacion de celulas dendriticas por estimulacion mediante los TLR conduce a la maduracion de celulas
dendriticas, y a la produccion de citocinas inflamatorias tales como IL-12. La investigacion llevada a cabo hasta la fecha ha encontrado que los TLR reconocen diferentes tipos de agonistas, aunque algunos agonistas son comunes a varios TLR. Los agonistas de TLR se derivan predominantemente de bacterias o virus, e incluyen moleculas tales como flagelina o lipopolisacarido bacteriano (LPS). Por "agonista de TLR" se indica un componente que puede provocar una respuesta de senalizacion mediante una ruta de senalizacion de TLR, tanto como un ligando directo como indirectamente mediante la generacion de ligando endogeno o exogeno (Sabroe y col., JI 2003 p1630-5).
En otra realizacion, otras moleculas de agonistas de TLR naturales o sinteticas se usan como inmunoestimulantesadicionales opcionales. Estos podrian incluir, pero no se limitan a, agonistas para TLR2, TLR3, TLR7, TLR8 y TLR9.
Por consiguiente, en una realizacion, la composicion de adyuvante e inmunogenica comprende ademas un inmunoestimulante adicional que se selecciona del grupo que consiste en: un agonista de TLR-1, un agonista de TLR-2, un agonista de TLR-3, un agonista de TLR-4, un agonista de TLR-5, un agonista de TLR-6, un agonista de TLR-7, un agonista de TLR-8, un agonista de TLR-9, o una combinacion de los mismos.
En una realizacion se usa un agonista de TLR que puede provocar una respuesta de senalizacion por TLR-1 (Sabroe y col., JI 2003 p1630-5). Adecuadamente, el agonista de TLR que puede provocar una respuesta de senalizacion por TLR-1 se selecciona de: lipopeptidos tri-acilados (LP); modulina soluble en fenol; LP de Mycobacterium tuberculosis; S-(2,3-bis(palmitoiloxi)-(2-RS)-propil)-N-palmitoil-(R)-Cys-(S)-Ser-(S)-Lys(4)-OH, LP de triclorhidrato (Pam3Cys) que imita el extremo amino acetilado de una lipoproteina bacteriana y OspA LP de Borrelia burgdorferi.
En una realizacion alternativa se usa un agonista de TLR que puede provocar una respuesta de senalizacion por TLR-2 (Sabroe y col., JI 2003 p1630-5). Adecuadamente, el agonista de TLR que puede provocar una respuesta de senalizacion por TLR-2 es uno o mas de una lipoproteina, un peptidoglicano, un polipeptido bacteriano de M. tuberculosis, B. burgdorferi. T. pallidum; peptidoglicanos de especies que incluyen Staphylococcus aureus; acidos lipoteicoicos, acidos manuronicos, porinas de Neisseria, fimbrias bacterianas, factores de virulencia de Yersina, viriones del CMV, hemaglutinina de sarampion y zimosano de levadura.
En una realizacion alternativa se usa un agonista de TLR que puede provocar una respuesta de senalizacion por TLR-3 (Sabroe y col., JI 2003 p1630-5). Adecuadamente, el agonista de TLR que puede provocar una respuesta de senalizacion por TLR-3 es ARN bicatenario (ARNbc), o acido poliinosinico-policitidilico (poli IC), un patron de acido nucleico molecular asociado a infeccion virica.
En una realizacion alternativa se usa un agonista de TLR que puede provocar una respuesta de senalizacion por TLR-5 (Sabroe y col., JI 2003 p1630-5). Adecuadamente, el agonista de TLR que puede provocar una respuesta de senalizacion por TLR-5 es flagelina bacteriana.
En una realizacion alternativa se usa un agonista de TLR que puede provocar una respuesta de senalizacion por TLR-6 (Sabroe y col., JI 2003 p1630-5). Adecuadamente, el agonista de TLR que puede provocar una respuesta de senalizacion por TLR-6 es lipoproteina micobacteriana, LP di-acilado y modulina soluble en fenol. Otros agonistas de TLR6 se describen en el documento W02003043572.
En una realizacion alternativa se usa un agonista de TLR que puede provocar una respuesta de senalizacion por TLR-7 (Sabroe y col., JI 2003 p1630-5). Adecuadamente, el agonista de TLR que puede provocar una respuesta de senalizacion por TLR-7 es un ARN monocatenario (ARNmc), loxoribina, un analogo de guanosina en las posiciones N7 y C8, o un compuesto de imidazoquinolina, o derivado del mismo. En una realizacion, el agonista de TLR es imiquimod. Otros agonistas de TLR7 se describen en el documento W002085905.
En una realizacion alternativa se usa un agonista de TLR que puede provocar una respuesta de senalizacion por TLR-8 (Sabroe y col., JI 2003 p1630-5). Adecuadamente, el agonista de TLR que puede provocar una respuesta de senalizacion por TLR-8 es un ARN monocatenario (ARNmc), molecula de imidazoquinolina con actividad antivirica, por ejemplo, resiquimod (R848); resiquimod tambien puede reconocerse por TLR-7. Otros agonistas de TLR-8 que puede usarse incluyen aquellos descritos en el documento W02004071459.
En una realizacion alternativa se usa un agonista de TLR que puede provocar una respuesta de senalizacion por TLR-9 (Sabroe y col., JI 2003 p1630-5). En una realizacion, el agonista de TLR que puede provocar una respuesta de senalizacion por TLR-9 es HSP90.
Alternativamente, el agonista de TLR que puede provocar una respuesta de senalizacion por TLR-9 es ADN bacteriano o virico, ADN que contiene nucleotidos de CpG sin metilar, en particular contextos de secuencia conocidos como motivos de CpG. Los oligonucleotidos que contienen CpG inducen una respuesta de predominantemente Th1. Tales oligonucleotidos son muy conocidos y se describen, por ejemplo, en los documentos WO 96N02555, WO 99N33488 y las patentes de EE.UU. n° 6.008.200 y 5.856.462. Adecuadamente, los nucleotidos de CpG son oligonucleotidos de CpG. Oligonucleotidos adecuados para su uso en las composiciones inmunogenicas de la presente invencion son oligonucleotidos que contienen CpG, opcionalmente que contienen dos
o mas motivos de CpG de dinucleotidos separados por al menos tres, adecuadamente al menos seis o mas nucleotidos. Un motivo de CpG es un nucleotido citosina seguido de un nucleotido guanina. Los oligonucleotidos de
CpG de la presente invencion son normalmente desoxinucleotidos. En una realizacion especifica, el internucleotido en el oligonucleotido es fosforoditioato, o adecuadamente un enlace fosforotioato, aunque el fosfodiester y otros enlaces internucleotidicos esten dentro del alcance de la invencion. Dentro del alcance de la invencion tambien estan incluidos oligonucleotidos con enlaces internucleotidicos mixtos. Los procedimientos para producir oligonucleotidos de fosforotioato o fosforoditioato se describen en los documentos US5.666.153, US5.278.302 y WO95N26204. Ejemplos de oligonucleotidos preferidos tienen las siguientes secuencias. Las secuencias pueden contener enlaces internucleotidicos modificados con fosforotioato.
OLIGO 1 (SEC ID N°:1): TCC ATG ACG TTC CTG ACG TT (CpG 1826) OLIGO 2 (SEC ID N°:2): TCT CCC AGC GTG CGC CAT (CpG 1758) OLIGO 3 (SEC ID N°:3): ACC GAT GAC GTC GCC GGT GAC GGC ACC ACG OLIGO 4 (SEC ID N°:4): TCG TCG TTT TGT CGT TTT GTC GTT (CpG 2006 o 7909) OLIGO 5 (SEC ID N°:5): TCC ATG ACG TTC CTG ATG CT (CpG 1668) OLIGO 6 (SEC ID N°:6): TCG ACG TTT TCG GCG CGC GCC G (CpG 5456)
Adecuadamente se usa el esqueleto de fosforotioato CpG7909 (SEC ID N°:4). Oligonucleotidos de CpG alternativos pueden comprender las secuencias anteriormente especificadas en las que tienen deleciones sin importancia o adiciones a las mismas. Los oligonucleotidos de CpG utilizados en la presente invencion pueden sintetizarse mediante cualquier procedimiento conocido en la tecnica (por ejemplo, vease el documento EP 468520). Convenientemente, tales oligonucleotidos pueden sintetizarse utilizando un sintetizador automatizado.
La composicion de adyuvante e inmunogenica puede comprender adicionalmente un adyuvante de saponina. Una saponina particularmente adecuada para su uso en la presente invencion es Quil A y sus derivados. Quil A es una preparacion de saponina aislada del arbol sudamericano Quillaja Saponaria Molina y fue descrito por primera vez por Dalsgaard y col. en 1974 ("Saponin adjuvants", Archiv. ffr die gesamte Virusforschung, vol. 44, Springer Verlag, Berlin, pag. 243-254) por tener actividad de adyuvante. Los fragmentos purificados de Quil A han sido aislados por HPLC que retienen actividad de adyuvante sin la toxicidad asociada a Quil A (documento EP 0 362 278), por ejemplo, QS7 y QS21 (tambien conocidas como QA7 y QA21). QS-21 es una saponina natural derivada de la corteza de Quillaja saponaria Molina que induce linfocitos T CD8+ citotoxicos (CTL), celulas Th1 y una respuesta de anticuerpos IgG2a predominante y es una saponina preferida en el contexto de la presente invencion. En una forma adecuada de la presente invencion, el adyuvante de saponina dentro de la composicion inmunogenica es un derivado de saponaria molina quil A, tal como una fraccion inmunologicamente activa de Quil A, tal como QS-17 o QS-21, adecuadamente QS-21. En una realizacion, las composiciones de la invencion contienen la fraccion de saponina inmunologicamente activa en forma sustancialmente pura. En una realizacion, las composiciones de la invencion contienen QS21 en forma sustancialmente pura, es decir, QS21 tiene al menos el 90% de pureza, por ejemplo, al menos el 95% de pureza, o al menos el 98% de pureza.
Otras saponinas utiles se derivan de las plantas Aesculus hippocastanum o Gyophilla struthium. Otras saponinas que se han descrito en la bibliografia incluyen escina, que se ha descrito en the Merck index (12a ed: entrada 3737) como una mezcla de saponinas que se producen en la semilla del arbol del castano de Indias, Lat: Aesculus hippocastanum. Su aislamiento se describe por cromatografia y purificacion (Fiedler, Arzneimittel-Forsch. 4, 213 (1953)), y por resinas de intercambio ionico (Erbring y col., documento US 3.238.190). Las fracciones de escina se han purificado y se ha mostrado que son biologicamente activas (Yoshikawa M, y col. (Chem Pharm Bull (Tokyo) 1996 Aug;44(8):1454-1464)). La sapoalbina de Gypsophila struthium (R. Vochten y col., 1968, J. Pharm.Belg., 42, 213-226) tambien es una opcion.
Dicha saponina inmunologicamente activa, tal como QS21, puede usarse en cantidades de entre 1 y 50 Ig, por dosis humana de la composicion inmunogenica. Ventajosamente, la QS21 se usa a un nivel de aproximadamente 25 Ig, por ejemplo, entre 20-30 Ig, adecuadamente entre 21-29 Ig o entre 22-28 Ig o entre 23-27 Ig o entre 24-26 Ig,
o 25 Ig. En otra realizacion, la dosis humana de la composicion inmunogenica comprende QS21 a un nivel de aproximadamente 10 Ig, por ejemplo, entre 5 y 15 Ig, adecuadamente entre 6-14 Ig, por ejemplo, entre 7-13 Ig o entre 8-12 Ig o entre 9-11 Ig, o 10 Ig. En otra realizacion, la dosis humana de la composicion inmunogenica comprende QS21 a un nivel de aproximadamente 5 Ig, por ejemplo, entre 1-9 Ig, o entre 2-8 Ig o adecuadamente entre 3-7 Ig o 4-6 Ig, o 5 Ig.
La dosis de 3D-MPL yNo QS21 puede potenciar adecuadamente una respuesta inmunitaria a un antigeno en un ser humano. En particular, una cantidad de 3D-MPL yNo QS21 adecuada es la que mejora el potencial inmunologico de la composicion en comparacion con la composicion no adyuvantada, o en comparacion con la composicion adyuvantada con otra cantidad de 3D-MPL o QS21, mientras que sea aceptable desde un perfil de reactogenicidad. Normalmente para administracion humana, la saponina (por ejemplo, QS21) yNo el derivado de LPS (por ejemplo, 3D-MPL) estaran presentes a una dosis humana de composicion inmunogenica en el intervalo de 1 Ig -200 Ig, tal como 10-50 Ig, o 1 Ig-25 Ig por dosis.
En una realizacion especifica, el adyuvante y las composiciones inmunogenicas comprenden una saponina (por ejemplo, QS21) yNo un derivado de LPS (por ejemplo, 3D-MPL) en una emulsion de aceite descrita anteriormente, junto con un esterol (por ejemplo, colesterol). Estos esteroles son muy conocidos en la tecnica, por ejemplo, el colesterol se desvela en the Merck Index, 11a ed., pagina 341, como un esterol que se produce naturalmente
encontrado en grasa animal. Adicionalmente, la emulsion de aceite (en particular la emulsion de aceite en agua) puede contener Span 85 yNo lecitina yNo tricaprilina. Adyuvantes que comprenden una emulsion de aceite en agua, un esterol y una saponina se describen en el documento WO 99N12565. Ejemplos de otros inmunoestimulantes se describen en este documento y en "Vaccine Design -The Subunit and Adjuvant Approach" 1995, Pharmaceutical Biotechnology, volumen 6, Eds. Powell, M.F., y Newman, M.J., Plenum Press, Nueva York y Londres, ISBN 0-30644867-X.
Si el escualeno y una saponina (opcionalmente QS21) estan incluidos, tambien es beneficioso incluir un esterol (opcionalmente colesterol) en la formulacion ya que este permite una reduccion en el nivel de aceite total en la emulsion. Esto conduce a un coste reducido de fabricacion, mejora de la comodidad global de la vacunacion y tambien mejoras cualitativas y cuantitativas de las respuestas inmunitarias resultantes tales como produccion de IFN-γ mejorada. Por consiguiente, el sistema de adyuvante normalmente comprende una relacion de aceite metabolizable:saponina (pesoNpeso) en el intervalo de 200:1 a 300:1, por tanto la presente invencion puede usarse en una forma de "bajo aceite" cuyo intervalo opcional es 1:1 a 200:1, opcionalmente 20:1 a 100:1, o sustancialmente 48:1, esta vacuna retiene las propiedades de adyuvante beneficiosas de todos los componentes, con un perfil de reactogenicidad muy reducido. Por consiguiente, algunas realizaciones tienen una relacion de escualeno:QS21 (pesoNpeso) en el intervalo de 1:1 a 250:1, o 20:1 a 200:1, o 20:1 a 100:1, o sustancialmente 48:1. Opcionalmente tambien se incluye un esterol (por ejemplo, colesterol) presente a una relacion de saponina:esterol como se describe en este documento. Los adyuvantes en los que opcionalmente esta incluido un inmunoestimulante adicional son particularmente adecuados para formulaciones de vacuna para lactantes yNo ancianos.
Por tanto, el adyuvante de emulsion de aceite en agua puede comprender opcionalmente ademas 5-60, 10-50 o 2030 Ig (por ejemplo, 5-15, 40-50, 10, 20, 30, 40 o 50 Ig) de derivado de lipido A (por ejemplo, 3D-MPL). El adyuvante de aceite en agua puede contener opcionalmente 0,025-2,5, 0,05-1,5, 0,075-0,75, 0,1-0,3 o 0,125-0,25 mg (por ejemplo, 0,2-0,3, 0,1-0,15, 0,25 o 0,125 mg) de esterol (por ejemplo, colesterol), 1-60, 10-50 o 20-30 Ig (por ejemplo, 1-10, 5-15, 40-50, 10, 20, 30, 40 o 50 Ig) de derivado de lipido A (por ejemplo, 3D-MPL o cualquier derivado de lipido A sintetico) y 1-60, 10-50 o 20-30 Ig (por ejemplo, 1-10, 5-15, 40-50, 10, 20, 30, 40 o 50 Ig) de saponina (por ejemplo, QS21).
Cepas víricas de la gripe y antígenos de la gripe, pautas de vacunación, dosificación y criterios de eficacia
Dicho virus de la gripe o preparacion antigenica del mismo puede derivarse de huevo o derivarse de cultivo celular. Por ejemplo, el antigeno del virus de la gripe o las preparaciones antigenicas del mismo segun la invencion pueden derivarse del procedimiento de huevos embrionados convencional cultivando el virus de la gripe en huevos y purificando el fluido alantoideo recogido. Los huevos pueden acumularse en grandes numeros a corto plazo. Alternativamente, pueden derivarse de cualquiera de los nuevos procedimientos de generacion usando celula o cultivo celular para cultivar el virus o expresar antigenos de superficie del virus de la gripe recombinantes. Sustratos de celulas adecuados para cultivar el virus incluyen, por ejemplo, celulas de rinon de perro tales como MDCK o celulas de un clon de MDCK, celulas similares a MDCK, celulas de rinon de mono tales como celulas AGMK que incluyen celulas Vero, lineas celulares de cerdo adecuadas, o cualquier otro tipo de celula de mamifero adecuado para la produccion del virus de la gripe para fines de vacuna. Sustratos de celula adecuados tambien incluyen celulas humanas, por ejemplo, celulas MRC-5 o la linea celular Per.C6. Los sustratos de celulas adecuados no se limitan a lineas celulares; por ejemplo, tambien estan incluidas celulas primarias tales como fibroblastos de embrion de pollo y lineas celulares aviares tales como lineas celulares de pollo o pato (por ejemplo, linea celular EBx tal como EB14 o EB24 derivada de citoblastos embrionarios de pollo o pato, respectivamente). Celulas de insecto adecuadas son Sf9 o Hi5.
En una realizacion, un virus de la gripe o preparacion antigenica del mismo para su uso segun la presente invencion puede ser un virus de la gripe fraccionado o preparacion antigenica del virus fraccionado del mismo. En una realizacion alternativa, la preparacion contra la gripe puede contener otro tipo de antigeno de la gripe inactivado tal como virus completo inactivado o HA y NA purificadas (vacuna de subunidad), o un virosoma de la gripe. En todavia otra realizacion, el virus de la gripe puede ser una preparacion contra la gripe atenuada viva.
Un virus de la gripe fraccionado o preparacion antigenica de virus fraccionado del mismo para su uso segun la presente invencion es adecuadamente una preparacion de virus inactivado en la que las particulas de virus se rompen con detergentes u otros reactivos para solubilizar la envoltura lipidica. El virus fraccionado o las preparaciones antigenicas de virus fraccionado del mismo se preparan adecuadamente por fragmentacion de virus de la gripe completos, tanto infecciosos como inactivados, con concentraciones solubilizantes de disolventes organicos o detergentes y posterior eliminacion de todo o la mayoria del agente solubilizante y algo o la mayoria del material de lipidos viricos. Por preparacion antigenica de virus fraccionado del mismo se indica una preparacion de virus fraccionado que puede haberse sometido a algun grado de purificacion en comparacion con el virus fraccionado, mientras que retiene la mayoria de las propiedades antigenicas de los componentes del virus fraccionado. Por ejemplo, si se produce en huevos, el virus fraccionado puede estar agotado en proteinas contaminantes del huevo, o si se produce en cultivo celular, el virus fraccionado puede estar agotado en contaminantes de celulas huesped. Una preparacion antigenica de virus fraccionado puede comprender componentes antigenicos de virus fraccionado de mas de una cepa virica. Las vacunas que contienen virus fraccionado (llamadas 'vacuna fraccionada de la gripe') o preparaciones antigenicas de virus fraccionado
generalmente contienen proteina de la matriz residual y nucleoproteina y algunas veces lipido, ademas de las proteinas de la envuelta de membrana. Tales vacunas de virus fraccionado normalmente contendran todas o la mayoria de las proteinas estructurales del virus, aunque no necesariamente en las mismas proporciones que se producen en el virus completo. Ejemplos de vacunas fraccionadas comercialmente disponibles son, por ejemplo, FLUARIX™, FLUSHIELD™ o FLUZONE™.
Alternativamente, el virus de la gripe puede estar en forma de una vacuna de virus completo. Esto puede demostrar ser una ventaja con respecto a una vacuna de virus fraccionado para una situacion pandemica ya que evita la incertidumbre de si puede producirse o no satisfactoriamente una vacuna de virus fraccionado para una nueva cepa de virus de la gripe. Para algunas cepas, los detergentes convencionales usados para producir el virus fraccionado pueden danar el virus y hacerlo inservible. Aunque siempre existe la posibilidad de usar diferentes detergentes yNo desarrollar un procedimiento diferente para producir una vacuna fraccionada, esto llevaria tiempo, que puede no estar disponible en una situacion pandemica. Ademas del mayor grado de certeza con un enfoque de virus completo, tambien hay una mayor capacidad de produccion de vacunas que para virus fraccionado ya que se pierden cantidades considerables de antigeno durante las etapas de purificacion adicionales necesarias para preparar una vacuna fraccionada adecuada.
En otra realizacion, la preparacion del virus de la gripe esta en forma de una vacuna contra la gripe de subunidad purificada. Las vacunas contra la gripe de subunidad generalmente contienen las dos principales proteinas de la envuelta, HA y NA, y pueden tener una ventaja adicional con respecto a las vacunas de virion completo ya que son generalmente menos reactogenicas, particularmente en vacunados jovenes. Las vacunas de subunidad pueden producirse tanto recombinantemente como purificarse a partir de particulas viricas rotas. Ejemplos de vacunas de subunidad comercialmente disponibles son, por ejemplo, AGRIPPAL™ o FLUVIRIN™. En una realizacion especifica, las vacunas de subunidad se preparan a partir de al menos un componente de la envuelta principal tal como a partir de hemaglutinina (HA), neuraminidasa (NA), o M2, adecuadamente a partir de HA. Adecuadamente comprenden combinaciones de dos antigenos o mas, tales como una combinacion de al menos dos de las proteinas estructurales de la gripe HA, NA, matriz 1 (M1) y M2, adecuadamente una combinacion de tanto HA como NA, que opcionalmente comprende M1. Adecuadamente, los componentes contra la gripe se producen por tecnologia de ADN recombinante, es decir, resultan de, o se expresa en, un acido nucleico resultante de manipulaciones de ADN recombinante, que incluyen vector recombinante vivo (variolovacuna) o proteina de subunidad recombinante (baculovirusNcelulas de insecto, celulas de mamifero, celulas aviares, levadura, plantas o bacterias). Celulas de insecto adecuadas son celulas de insecto de Spodoptera frugiperda (Sf9) o celulas de insecto High Five (Hi5) desarrolladas de Trichoplusia ni (Invitrogen) y baculovirus adecuados son virus de la poliedrosis nuclear Autographa californica (AcNPV) (Baculogold, Becton Dickinson, PharMingen) o el llamado sistema Bacmid.
En una realizacion, la preparacion del virus de la gripe esta en forma de un virosoma. Los virosomas son vesiculas unilaminares esfericas que retienen las glucoproteinas de la envoltura virica funcionales HA y NA en conformacion autentica, intercalada en la membrana de bicapa de los fosfolipidos de virosomas. Ejemplos de vacunas virosomicas comercialmente disponibles son, por ejemplo, INFLEXAL V™ o INVAVAC™.
En otra realizacion, los componentes contra la gripe de subunidad se expresan en forma de particulas similares a virus (VLP) o capsomeros, adecuadamente VLP preparadas a partir de plantas o preparadas a partir de celulas de insecto. Las VLP presentan los antigenos en su forma nativa. La tecnologia de subunidad de VLP puede basarse completamente en proteinas de la gripe, o puede basarse en otros virus tales como el virus de la leucemia murina (MLV) y, por tanto, pueden comprender un antigeno no de la gripe tal como la proteina MLV gag. Una VLP adecuada comprende al menos una, adecuadamente al menos dos proteinas de la gripe, opcionalmente con otras proteinas de la gripe o no de la gripe tales como M1 y HA, HA y NA, HA, NA y M1 o HA, NA y MLV gag. Pueden producirse tanto en celulas vegetales como en celulas de insecto. Las VLP tambien pueden llevar antigenos de mas de una cepa de la gripe, tales como VLP preparadas a partir de dos cepas estacionales (por ejemplo, H1N1 y H3N2) o, por ejemplo, de una cepa estacional y una pandemica (por ejemplo, H3N2 y H5N1).
Por consiguiente, en una realizacion, la composicion inmunogenica de la invencion comprende un antigeno del virus de la gripe o preparacion antigenica del mismo a partir de virus de la gripe cultivado en huevos o en cultivo celular. En otra realizacion, dicho antigeno del virus de la gripe o preparacion antigenica del mismo comprende un virus completo, un virus fraccionado, un virosoma o uno o mas antigenos purificados elegidos de: HA, NA, M1, M2. En otra realizacion, dicho(s) antigeno(s) purificado(s) se prepara(n) a partir del virus de la gripe cultivado en celulas de mamifero, aviares o de insecto. Especificamente, dicho(s) antigeno(s) purificado(s) se produce(n) recombinantemente. Pueden estar en forma de una particula similar a virus.
El antigeno del virus de la gripe o preparacion antigenica del mismo puede producirse por distintos procedimientos comercialmente aplicables, por ejemplo, el procedimiento de la gripe fraccionada descrito en las patentes n° DD 300 833 y DD 211 444. Tradicionalmente, la gripe fraccionada se produjo usando un tratamiento con disolventeNdetergente, tal como fosfato de tri-n-butilo o eter dietilico en combinacion con Tween™ (conocido como fraccionamiento con "Tween-eter") y este procedimiento se usa todavia en algunas instalaciones de produccion. Otros agentes de fraccionamiento ahora empleados incluyen detergentes o enzimas proteoliticas o sales biliares, por ejemplo, desoxicolato de sodio como se describe en la patente n° DD 155 875. Detergentes que pueden usarse como agentes de fraccionamiento incluyen detergentes cationicos, por ejemplo, bromuro de cetiltrimetilamonio
(CTAB), otros detergentes ionicos, por ejemplo, laurilsulfato, taurodesoxicolato, o detergentes no ionicos tales como los descritos anteriormente que incluyen Triton X-100 (por ejemplo, en un procedimiento descrito en Lina y col., 2000, Biologicals 28, 95-103) y Triton N-101, o combinaciones de dos cualquiera o mas detergentes.
El procedimiento de preparacion para una vacuna fraccionada puede incluir varias etapas de filtracion yNu otras de separacion diferentes tales como etapas de ultracentrifugacion, ultrafiltracion, centrifugacion zonal y cromatografia (por ejemplo, intercambio ionico) en una variedad de combinaciones, y opcionalmente una etapa de inactivacion, por ejemplo, con calor, formaldehido o -propiolactona o UV, que puede llevarse a cabo antes o despues del fraccionamiento. El procedimiento de fraccionamiento puede llevarse a cabo como un procedimiento discontinuo, continuo o semicontinuo. Un procedimiento de fraccionamiento y purificacion preferido para una composicion inmunogenica fraccionada se describe en el documento WO 02N097072.
Preparaciones de antigeno de la vacuna de la gripe fraccionado preferidas segun la invencion comprenden una cantidad residual de Tween 80 yNo Triton X-100 que queda del procedimiento de produccion, aunque esta puede anadirse o sus concentraciones ajustarse despues de la preparacion del antigeno fraccionado. En una realizacion, tanto Tween 80 como Triton X-100 estan presentes. Los intervalos preferidos para las concentraciones finales de estos tensioactivos no ionicos en la dosis de vacuna, que surgen de la preparacion antigenica, son:
Tween 80: 0,01 al 1%, o aproximadamente 0,1% (volumenNvolumen) Triton X-1 00: 0,001 al 0,1 (% pesoNvolumen), o 0,005 al 0,02% (pesoNvolumen).
En una realizacion especifica, la concentracion final de Tween 80 que surge de la preparacion antigenica oscila del 0,025%-0,09% pesoNvolumen. En otra realizacion especifica, el antigeno se proporciona como una mezcla 2 veces concentrada que tiene una concentracion de Tween 80 que oscila del 0,025%-0,2% (pesoNvolumen) y tiene que diluirse dos veces tras la formulacion final con el adyuvante (o el tampon en la formulacion de control).
En otra realizacion especifica, la concentracion final de Triton X-100 oscila del 0,004%-0,017% pesoNvolumen. En otra realizacion especifica, el antigeno se proporciona como una mezcla 2 veces concentrada que tiene una concentracion de Triton X-100 que oscila del 0,005%-0,034% (pesoNvolumen) y tiene que diluirse dos veces tras la formulacion final con el adyuvante (o el tampon en la formulacion de control).
En una realizacion, la preparacion contra la gripe se prepara en presencia de bajo nivel de tiomersal, o en ausencia de tiomersal. En otra realizacion, la preparacion contra la gripe resultante es estable en ausencia de conservantes organomercuriales, en particular la preparacion no contiene tiomersal residual. En particular, la preparacion del virus de la gripe comprende un antigeno de hemaglutinina estabilizado en ausencia de tiomersal, o a bajos niveles de tiomersal (generalmente 5 IgNml o menos). Especificamente, la estabilizacion de la cepa de la gripe B se realiza por un derivado de alfa-tocoferol, tal como succinato de alfa-tocoferol (tambien conocido como succinato de vitamina E, es decir, VES). Tales preparaciones y procedimientos para prepararlas se desvelan en el documento WO 02N097072.
Una composicion preferida contiene tres antigenos de virion fraccionados inactivados preparados a partir de las cepas recomendadas por la OMS de la estacion de la gripe apropiada.
En una realizacion, el virus de la gripe o preparacion antigenica del mismo y el adyuvante segun la invencion estan contenidos en el mismo recipiente. Se denomina en lo sucesivo 'enfoque de un vial'. En otra realizacion, el vial es una jeringuilla precargada. En una realizacion alternativa, el virus de la gripe o preparacion antigenica del mismo y adyuvante segun la invencion estan contenidos en recipientes o viales separados y se mezclan poco antes o con la administracion al sujeto. Se denomina en lo sucesivo 'enfoque de dos viales'. Adecuadamente, la vacuna de 2 componentes consiste en 0,5 ml de antigenos de virion fraccionados inactivados concentrados presentados en un vial de vidrio de tipo I (recipiente de antigeno) y de una jeringuilla de vidrio de tipo I precargada que contiene 0,5 ml del adyuvante (recipiente de adyuvante). Alternativamente, la vacuna es una vacuna de 2 componentes presentada en 2 viales (uno para el antigeno, uno para adyuvante, de 10 dosis cada uno) para la mezcla antes de la administracion al primer paciente en el plazo de 24 horas a temperatura ambiente y posterior almacenamiento a 4°C durante un breve periodo de tiempo (por ejemplo, hasta una semana) para la posterior administracion. En el momento de la inyeccion, el contenido del vial multidosis o la jeringuilla que contiene el adyuvante se inyecta en el vial que contiene el antigeno de virion fraccionado concentrado. Despues de mezclar el contenido se saca en la jeringuilla y la aguja se sustituye por una aguja intramuscular. Una dosis de la vacuna candidata contra la gripe adyuvantada reconstituida se corresponde con 0,5 ml.
En una realizacion, cada dosis humana de la composicion inmunogenica contiene 15 Ig de HA por cepa de la gripe por dosis, como se ha determinado por SRID. Esto es particularmente util para la poblacion anciana.
Un aspecto importante de la presente invencion es el hecho de que el (los) antigeno(s) de la gripe pueda(n) usarse a menores cantidades a las que previamente se habia creido que eran utiles, adecuadamente a un nivel de menos de 15 Ig HA por cepa de virus, por ejemplo, entre 1 y 10 Ig HA por cepa, por dosis humana de la composicion inmunogenica.
Por consiguiente, en una realizacion, cada dosis humana de la composicion inmunogenica contiene una dosis baja
de hemaglutinina (HA), definida como una cantidad inferior a 15 Ig de HA por dosis, adecuadamente inferior a 10 Ig, como se mide por inmunodifusion radial simple (SRD) (J.M. Wood y col.; J. Biol. Stand 5 (1977) 237-247; J. M. Wood y col.. J. Biol. Stand. 9 (1981) 317-330). En una realizacion mas especifica de la composicion inmunogenica de la invencion, el antigeno del virus o preparacion antigenica es inferior a 10 ug, o inferior a 8 ug, o inferior a 4 ug, o inferior a 2 ug, o inferior a 1 ug, o inferior a 0,5 ug, o inferior a 0,1 ug HA por dosis humana por cepa de la gripe. Dicha baja cantidad de HA puede ser tan baja como sea practicamente factible que permita formular una vacuna que cumpla los criterios internacionales, por ejemplo, EU o FDA, para eficacia, como se detalla mas adelante (vease la Tabla 2 y los parametros especificos que se exponen).
Una dosis de vacuna de 0,5 ml se usa adecuadamente. Tambien es adecuada una dosis de vacuna de 1 ml (0,5 ml de adyuvante mas 0,5 ml de preparacion de antigeno). Ventajosamente, una dosis de vacuna segun la invencion, en particular un baja cantidad de vacuna de HA, puede proporcionarse en un volumen mas pequeno que las vacunas de la gripe fraccionadas inyectadas convencionales, que son generalmente aproximadamente 0,5, 0,7 o 1 ml por dosis. Las dosis de bajo volumen segun la invencion son adecuadamente inferiores a 500 Il, normalmente inferiores a 300 Il y adecuadamente no superiores a aproximadamente 200 Il o menos por dosis. La ligera adaptacion del volumen de dosis se hara rutinariamente dependiendo de la concentracion de HA en la muestra a granel original, o dependiendo de la via de administracion con dosis mas pequenas que se administran por via intranasal o intradermica, o dependiendo de la poblacion diana (por ejemplo, los lactantes pueden recibir la mitad de una dosis humana de adulto).
Adecuadamente, la cepa o cepas del virus de la gripe que van a incluirse en la composicion inmunogenica o de vacuna esNson cepa(s) (estacional(es)) interpandemica(s), o cepa(s) que estan(n) asociada(s) a un brote pandemico
o que tiene(n) la posibilidad de asociarse a un brote pandemico, o adecuadamente, en una composicion multivalente, una mezcla de estas cepas.
Las cepas interpandemicas son, por ejemplo, cepas que circulan globalmente durante periodos interpandemicos tales como, pero no se limitan a: H1N1, H1N2, H3N2 o B. Las vacunas contra la gripe comercialmente disponibles son una combinacion trivalente que incluye una cepa de la gripe B y dos cepas de la gripe A (H1N1, H3N2).
Las caracteristicas de una cepa del virus de la gripe que tienen el potencial de producir una pandemia o un brote de la enfermedad de la gripe asociada a cepas pandemicas de la gripe son: contiene una nueva hemaglutinina en comparacion con la hemaglutinina en las cepas actualmente en circulacion y, por tanto, casi todas las personas estan sin tratamiento inmunologico previo; puede transmitirse horizontalmente en la poblacion humana; y es patogena para seres humanos. Una hemaglutinina puede ser una que no haya sido evidente en la poblacion humana durante un periodo de tiempo prolongado, probablemente varias decadas, tal como H2, o puede ser una hemaglutinina que no ha estado en circulacion en la poblacion humana antes, por ejemplo, H5, H9, H7 o H6 que se encuentran en especies aviares (aves). En cualquier caso, la mayoria, o al menos una gran proporcion de, o incluso toda la poblacion, no se ha encontrado previamente con el antigeno y no ha recibido previamente tratamiento inmunologico a el. Actualmente, el virus de la gripe A que se ha identificado por la OMS como uno que posiblemente podria producir una pandemia en seres humanos es el virus de la gripe aviar H5N1 altamente patogeno. Por tanto, la vacuna pandemica segun la invencion comprendera adecuadamente el virus H5N1. Dos otras cepas adecuadas para inclusion en la composicion reivindicada son H9N2 o H7N1.
Ciertas partes estan generalmente a un mayor riesgo de ser infectadas por la gripe en una situacion pandemica. Los ancianos, los ninos cronicamente enfermos y pequenos son particularmente susceptibles, pero muchas personas jovenes y aparentemente sanas tambien estan en riesgo. Para la gripe H2, la parte de la poblacion nacida despues de 1968 tiene un riesgo elevado. Es importante que estos grupos se protejan eficazmente tan pronto como sea posible y de una forma sencilla.
Otro grupo de personas que tienen un riesgo elevado son los viajeros. Las personas viajan ahora mucho mas que antes y las regiones en las que emergen la mayoria de los nuevos virus, China y el sudeste asiatico, se han convertido en destinos de viaje populares en los ultimos anos. Este cambio en los patrones de viajar permite que nuevos virus alcancen todo el globo en cuestion de semanas en vez de meses o anos.
Por tanto, para estos grupos de personas hay una necesidad particular de vacunacion para proteger contra la gripe en una situacion pandemica o una posible situacion pandemica. Cepas adecuadas son, pero no se limitan a: H5N1, H5N8, H5N9, H7N4, H9N2, H7N7, H7N3, H2N2 y H7N1. Otras cepas pandemicas en seres humanos: H7N3 (2 casos informados en Canada), H10N7 (2 casos informados en Egipto) y H5N2 (1 caso informado en Japon) y H7N2. Una cepa de la gripe que es una cepa pandemica o una cepa susceptible a asociarse a una pandemia se denominara resumidamente en este documento una "cepa pandemica".
El medicamento contra la gripe de la invencion cumple adecuadamente ciertos criterios internacionales para vacunas. Los patrones se aplican internacionalmente para medir la eficacia de las vacunas contra la gripe. Las variables serologicas se evaluan segun criterios de la Agencia europea de evaluacion de los medicamentos para uso humano (CHMPNBWPN214N96, Comite de especialidades farmaceuticas (CEF). Nota para la armonización de requisitos para vacunas contra la gripe, 1997. Circular de CHMPNBWPN214N96 n° 96-0666:1-22) para ensayos clinicos relacionados con los procedimientos para el tramite de licencias anuales de vacunas contra la gripe (Tabla
2). Los requisitos son diferentes para poblaciones adultas (18-60 anos) y poblaciones ancianas (�60 anos) (Tabla 2). Para las vacunas contra la gripe interpandemicas, al menos una de las evaluaciones (factor de seroconversion, tasa de seroconversion, tasa de seroproteccion) deberia cumplir los requisitos europeos para todas las cepas de la gripe incluidas en la vacuna. La proporcion de titulos iguales o superiores a 1:40 se considera lo mas relevante debido a que se espera que estos titulos sean los que mejor establezcan una correlacion con la proteccion [Beyer W y col. 1998. Clin Drug Invest.;15:1-12].
Como se especifica en "Guideline on dossier structure and content for pandemic influenza vaccine marketing authorisacion application" (CHMPNVEGN4717N03, 5 de abril de 2004, o mas recientemente EMEANCHMPNVWPN263499N2006 de 24 de enero de 2007 titulada 'Guidelines on flu vaccines prepared from viruses with a potencial to cause a pandemic', disponible en www.emea.eu.int), en ausencia de criterios especificos para vacunas contra la gripe derivadas de cepas no circulantes se tiene previsto que una vacuna candidata pandemica deba (al menos) poder provocar suficientes respuestas inmunologicas para cumplir adecuadamente los tres presentes patrones fijados para vacunas existentes en sujetos adultos o ancianos sin sensibilizar, despues de dos dosis de vacuna. La directriz de la EMEA describe la situacion de que en caso de una pandemia la poblacion estara inmunologicamente sin tratamiento previo y, por tanto, se asume que los tres criterios del CHMP para vacunas estacionales se cumpliran por vacunas candidatas pandemicas. No se requiere requisito explicito para demostrarlo en sujetos seronegativos antes de la vacunacion.
Las composiciones de la presente invencion cumplen adecuadamente al menos uno de tales criterios para la cepa pandemica incluida en la composicion (un criterio es suficiente para obtener la autorizacion), adecuadamente al menos dos, o normalmente al menos los tres criterios para la proteccion como se expone en la Tabla 2A.
Tabla 2A (criterios del CHMP)
18 - 60 anos
� 60 anos
Tasa de seroconversion
�40% �30%
Factor de conversion
�2,5 �2,0
Tasa de proteccion�
�70% �60%
La tasa de seroconversion se define como la proporcion de sujetos en cada grupo que tiene un titulo protector despues de la vacunacion � 1:40. La tasa de seroconversion puesta simplemente es el % de sujetos que tienen un titulo de HI antes de la vacunacion de <1:10 y �1:40 despues de la vacunacion. Sin embargo, si el titulo inicial es �1:10, entonces necesita haber al menos un aumento de cuatro veces en la cantidad de anticuerpo despues de la vacunacion. El factor de conversion se define como el aumento en veces en los titulos medios geometricos (GMT) de HI en suero despues de la vacunacion, para cada cepa de vacuna. La tasa de proteccion se define como la proporcion de sujetos que tanto fueron seronegativos antes de la vacunacion y tienen un titulo de HI despues de la vacunacion (protector) de � 1:40 como que fueron seropositivos antes de la vacunacion y tienen un aumento significativo de 4 veces en el titulo despues de la vacunacion; esta normalmente aceptado como que indica proteccion.
Una tasa de seroproteccion del 70% definida por la autoridad reguladora de la salud europea (CHMP - Comite de medicamentos de uso humano) es uno de los tres criterios normalmente requeridos que sean cumplidos por una vacuna contra la gripe estacional anual y que el CHMP tambien esta esperando que cumpla una vacuna candidata pandemica. Sin embargo, el modelado matematico ha indicado que una vacuna que, al nivel de poblacion, solo es eficaz el 30% contra ciertas cepas desviadas tambien pueden ser beneficioso en ayudar a reducir la magnitud de una pandemia y que una campana de vacunacion pandemica usando una vacuna (prepandemica) con un 30% de eficacia contra la cepa pandemica (proteccion cruzada del 30%) podria reducir eficazmente el 75% la tasa de ataque clinico y, por consiguiente, la morbilidadNmortalidad dentro de la poblacion (Ferguson y col., Nature 2006).
La FDA ha publicado un borrador orientativo (borrador de criterios del CBER) (disponible de la Oficina de comunicacion, capacitacion y asistencia a fabricantes (HFM-40), 1401 Rockville Pike, Suite 200N, Rockville, MD 20852-1448, o llamando al 1-800-835-4709 o 301-827-1800, o de internet en http:NNwww.fda.govNcberNguidelines.htm) sobre datos clinicos necesarios para apoyar la licencia de vacunas contra la gripe pandemicas, y los criterios propuestos tambien se basan en los criterios del CHMP. La FDA usa puntos de corte de edad ligeramente diferentes. Los puntos finales apropiados incluyen similarmente: 1) el porcentaje de sujetos que consiguen un titulo de anticuerpos de HI � 1:40, y 2) tasas de seroconversion, definidas como un aumento de cuatro veces en el titulo de anticuerpos de HI despues de la vacunacion. El titulo medio geometrico (GMT) deberia incluirse en los resultados, pero los datos deben incluir no solo la estimacion puntual, sino tambien el limite inferior del intervalo de confianza del 95% de la tasa de incidencia de seroconversion, y la tasa de incidencia del dia 42 de titulos de HI �
1:40 debe exceder el valor diana. Por tanto, deben proporcionarse estos datos y los intervalos de confianza del 95% (Cl) de las estimaciones puntuales de estas evaluaciones. El borrador orientativo de la FDA requiere que se cumplan ambos objetivos. Esto se resume en la Tabla 2B.
Tabla 2B (borrador de criterios del CBER)
18 - 64 anos
� 64 anos
Tasa de seroconversion
�40% �30%
Tasa de titulos de HI � 1:40
�70% �60%
La tasa de seroconversion se define como: a) para sujetos con un titulo inicial � 1:10, un aumento de 4 veces o mayor; o b) para sujetos con un titulo inicial < 1:10, un aumento a � 1:40. Estos criterios deben cumplirse en el intervalo inferior del IC del 95% para el valor real.
Por consiguiente, se proporciona una composicion, procedimiento o uso como se reivindica en este documento en el que dicha respuesta inmunitaria o proteccion inducida por la administracion de la composicion contra la gripe contemplada cumple los tres criterios reguladores de la UE para la eficacia de vacunas contra la gripe. Adecuadamente al menos uno, adecuadamente dos, o tres de los siguientes criterios se cumplen para la cepa o cada cepa de la composicion:
-
una tasa de seroconversion de �50%, de �60%, de �70%, adecuadamente de �80% o �90% en la poblacion adulta (18-60 anos), yNo adecuadamente tambien en la poblacion anciana (�60 anos);
-
una tasa de proteccion de �75%, de �80%, de �85%, adecuadamente de �90% en la poblacion adulta (1860 anos), yNo adecuadamente tambien en la poblacion anciana (�60 anos);
-
un factor de conversion de �4,0, de �5,0, de �6,0, de �7,0, de �8,0, de �9,0 o de 10 o por encima de 10 en la poblacion adulta (18-60 anos), yNo adecuadamente tambien en la poblacion anciana (�60 anos).
En una realizacion especifica, la composicion cumplira tanto una tasa de seroconversion de �60%, o �70% o adecuadamente �80%, como una tasa de proteccion de �75%, adecuadamente de �80% en la poblacion adulta. En otra realizacion especifica, la composicion segun la invencion cumplira tanto un factor de conversion de �5,0, o �7,0
o adecuadamente �10,0 como una tasa de seroconversion de �60%, o �70%, o adecuadamente �80% en la poblacion adulta. En otra realizacion especifica, la composicion segun la invencion cumplira tanto un factor de conversion de �5,0, o �7,0 o adecuadamente �10,0 como una tasa de proteccion de �75%, adecuadamente �80% en la poblacion adulta. En otra realizacion especifica adicional, la composicion segun la invencion cumplira tanto un factor de conversion de 10,0 o superior, una tasa de seroconversion del 80% o superior, como una tasa de proteccion del 80% o superior.
En otra realizacion, la vacuna reivindicada, adecuadamente una vacuna prepandemica que contiene una cepa pandemica o una cepa susceptible a asociarse a una pandemia, tendra 30% de eficacia contra la cepa pandemica en circulacion (proteccion cruzada del 30%). En particular, la vacuna reivindicada cumplira una tasa de seroproteccion de al menos el 30% contra cepas desviadas, adecuadamente de al menos el 40%, o �50% o �60% contra cepas desviadas. Adecuadamente, la tasa de seroproteccion sera �70%, o adecuadamente �80% contra cepas de desviacion. Dicha vacuna prepandemica, que puede conferir proteccion cruzada, podra reducir sustancialmente la tasa de ataque por infeccion global, al menos el 50%, o adecuadamente al menos el 75%, y por consiguiente la morbilidadNmortalidad dentro de la poblacion.
En todavia otra realizacion, la vacuna adyuvantada reivindicada puede inducir anticuerpos neutralizantes en al menos el 50% de los sujetos, al menos el 60%, adecuadamente al menos el 70%, o adecuadamente mas del 75% de los sujetos contra una cepa desviada o una cepa de un subtipo diferente. Adecuadamente, este efecto se logra con una dosis baja de antigeno, tal como con 7,5 Ig de HA o incluso una dosis menor de antigeno tal como 3,8 Ig o 1,9 Ig de HA.
Adecuadamente, cualquiera o todos de tales criterios tambien se cumplen para otras poblaciones, tales como en ninos y en cualquier poblacion inmunodeprimida.
En un aspecto, la dosis humana de la composicion inmunogenica contiene una hemaglutinina (HA) de una unica cepa de la gripe, y se denomina en lo sucesivo una composicion contra la gripe "monovalente". En otro aspecto de la invencion, la dosis humana de la composicion inmunogenica comprende hemaglutinina (HA) de mas de una cepa de la gripe, y se denomina en lo sucesivo una composicion contra la gripe "multivalente". Una composicion multivalente adecuada segun la invencion es una composicion bivalente (que comprende hemaglutinina (HA) de dos cepas del virus de la gripe tales como, pero no exclusivamente, dos cepas asociadas a una pandemia o susceptibles a
asociarse a una pandemia, por ejemplo, H5+H2), una composicion trivalente (que comprende hemaglutinina (HA) de tres cepas del virus de la gripe, opcionalmente de dos cepas A y una cepa B tal como, pero no se limitan a, BNYamagata o BNVictoria), una composicion cuadrivalente (que comprende hemaglutinina (HA) de cuatro cepas del virus de la gripe) o una composicion pentavalente (que comprende hemaglutinina (HA) de cinco cepas del virus de la gripe). Una composicion cuadrivalente adecuada comprende hemaglutinina de dos cepas A y dos cepas B de diferente linaje (tal como BNYamagata o BNVictoria). Alternativamente, una composicion cuadrivalente comprende hemaglutinina de tres cepas A (opcionalmente H1N1, H3N2, y una cepa A asociada a una pandemia o susceptible a asociarse a una pandemia) y una cepa B (tal como BNYamagata o BNVictoria). Otra composicion cuadrivalente alternativa comprende hemaglutinina de cuatro cepas A de una cepa asociada a una pandemia o susceptible a asociarse a una pandemia, tal como cepas aviares tales como H5 + H2 + H7 + H9. Especificamente, una composicion pandemica adyuvantada multivalente tal como una bivalente (por ejemplo, H5+H2) o trivalente o cuadrivalente pandemica (por ejemplo, H5 + H2 + H7 + H9) ofrece la ventaja de una inmunizacion de anticipacion contra subtipos de amenazas de la gripe A pandemica pandemico de la gripe A y sensibilizacion duradera contra subtipos de amenazas. Normalmente se administran dos dosis a partir de las 6 semanas de edad usando un programa conveniente (por ejemplo, separadas 6-12 meses), y opcionalmente un refuerzo periodico previsto (por ejemplo, 10 anos). Opcionalmente, una vacuna pandemica tal puede combinarse con una vacuna estacional.
Una composicion multivalente tambien puede comprender mas de 5 cepas de la gripe tales como 6, 7, 8, 9 o 10 cepas de la gripe.
Si se usan dos cepas B en una composicion estacional multivalente, pueden ser de dos linajes diferentes (opcionalmente de BNVictoria y BNYamagata). Al menos una de dicha cepa B, adecuadamente ambas cepas B, seran de un linaje en circulacion. Una composicion tal es particularmente adecuada para ninos. Adecuadamente, si la composicion multivalente para su uso en ninos incluye dos cepas B, la cantidad de antigeno normalmente asignada a la cepa B se divide entre las dos cepas B. Especificamente, la vacuna contra la gripe cuadrivalente adyuvantada (H1+H3+ambos linajes B) ofrece la ventaja de profilaxis potenciada para ninos sin tratamiento previo y su eficacia superior en comparacion con vacunas sin adyuvante (en terminos de tanto proteccion homologa como desviada, y su eficacia contra los dos linajes B en circulacion) y de posible inmunizacion todo el ano basandose en la edad. Una dosis o dos dosis se administran adecuadamente ya desde la edad de 6 semanas, o entre 6 y 35 meses.
En una realizacion especifica, la dosis humana de la composicion inmunogenica es una composicion inmunogenica
o de vacuna trivalente que comprende hemaglutinina (HA) de dos cepas A (opcionalmente H1N1, H3N2) y una cepa
B.
Adecuadamente, la HA por cepa es una baja cantidad de HA (opcionalmente 10 Ig de HA por cepa o inferior) y es como se define anteriormente. Adecuadamente, la HA por cepa es aproximadamente o inferior a 5 Ig, aproximadamente 2,5 Ig o inferior. El adyuvante es como se define en este documento y en particular como se define en la Tabla 1. Adecuadamente, la composicion de adyuvante es una emulsion de aceite en agua que comprende escualeno, alfa-tocoferol y polisorbato 80 en una cantidad de entre 5-6 mg, entre 5-6 mg y entre 2-3 mg por dosis, respectivamente. Alternativamente, las composiciones de adyuvante son una emulsion de aceite en agua que comprende escualeno, alfa-tocoferol y polisorbato 80 en una cantidad de entre 2,5-3,5 mg, entre 2-3 mg y entre 1-2 mg por dosis, respectivamente. Estas composiciones adyuvantadas inmunogenicas o vacunas son particularmente adecuadas para la poblacion adulta (18-60 anos) o de ninos mayores (3-17 anos) y puede proporcionar proteccion cruzada contra variantes de desviacion de H3N2 y contra cepa B de un linaje diferente.
En otra realizacion especifica, la dosis humana de la composicion inmunogenica es una composicion inmunogenica
o de vacuna cuadrivalente que comprende hemaglutinina (HA) de dos cepas A (opcionalmente H1N1, H3N2) y dos cepas B (opcionalmente de un linaje diferente, tal como de BNVictoria y BNYamagata). Adecuadamente, la HA por cepa por dosis es aproximadamente 15 Ig. Adecuadamente, la HA por cepa es una baja cantidad de HA (opcionalmente de aproximadamente 10 Ig de HA por cepa por dosis o inferior, de forma que se logre un maximo de 40-45 Ig de HA por dosis) y es como se define anteriormente. Adecuadamente, la HA por cepa es aproximadamente
o inferior 5 Ig, aproximadamente 2,5 Ig o inferior. El adyuvante es como se define en este documento y en particular como se define en la Tabla 1. Adecuadamente, la composicion de adyuvante es una emulsion de aceite en agua que comprende escualeno, alfa-tocoferol y polisorbato 80 en una cantidad de entre 5-6 mg, entre 5-6 mg y entre 2-3 mg por dosis, respectivamente. Alternativamente, la composicion de adyuvante es una emulsion de aceite en agua que comprende escualeno, alfa-tocoferol y polisorbato 80 en una cantidad de entre 2,5-3,5 mg, entre 2-3 mg y entre 1-2 mg por dosis, respectivamente. Una composicion tal que comprende una segunda cepa B es particularmente adecuada para ninos muy jovenes, especialmente cuando la exposicion previa o sensibilizacion es importante. El adyuvante proporcionara la ventaja de administrar a esta poblacion un aumento de proteccion. La dosis humana de la composicion inmunogenica para la poblacion de ninos es adecuadamente la mitad de una dosis humana adulta, y comprendera adecuadamente 2,5 Ig de HA por cepa, y una emulsion de aceite en agua que comprende escualeno, alfa-tocoferol y polisorbato 80 en una cantidad de entre 2,5-3,5 mg, entre 2-3 mg y entre 1-2 mg por dosis.
Alternativamente, dicha cepa B adicional, adecuadamente con las caracteristicas y a la cantidad definida anteriormente con respecto a la composicion cuadrivalente, puede anadirse en forma de una composicion monovalente a una composicion trivalente como se ha descrito anteriormente. El uso de una baja cantidad de HA tal como de o inferior a 10 Ig, o de o inferior a 5 Ig, u opcionalmente para ninos jovenes de o inferior a 2,5 Ig, tendria la ventaja de limitar el impacto de una adicion de cepa de la gripe sobre el suministro de vacuna global.
Adecuadamente, cuando dos cepas B estan incluidas en la composicion de vacuna, la cantidad de antigeno normalmente asignada a la cepa B se divide entre las dos cepas B.
En otra realizacion especifica, la dosis humana de la composicion inmunogenica es una composicion inmunogenica
o de vacuna cuadrivalente que comprende hemaglutinina (HA) de dos cepas A interpandemicas (opcionalmente H1N1, H3N2), una cepa B y una cepa A asociada a una pandemia o susceptible a asociarse a una pandemia (opcionalmente H5N1, H9N2, H7N7, H5N8, H5N9, H7N4, H7N3, H2N2, H10N7, H5N2, H7N2 y H7N1). Adecuadamente, la HA por cepa es una baja cantidad de HA (opcionalmente 10 Ig de HA por cepa o inferior) y es como se define anteriormente. Adecuadamente, la HA por cepa es aproximadamente o inferior a 5 Ig, aproximadamente 2,5 Ig o inferior. El adyuvante de la invencion es como se define en este documento y en particular como se define en la Tabla 1.
En otra realizacion especifica, la dosis humana de la composicion inmunogenica es una composicion inmunogenica
o de vacuna cuadrivalente que comprende hemaglutinina (HA) de tres cepas A interpandemicas (opcionalmente H1N1, y dos cepas H3N2) y una cepa B. Adecuadamente, la HA por cepa es una baja cantidad de HA (opcionalmente 10 Ig de HA por cepa o inferior) y es como se define anteriormente. Adecuadamente, la HA por cepa es aproximadamente o inferior a 5 Ig, aproximadamente 2,5 Ig o inferior. El adyuvante es como se define en este documento y en particular como se define en la Tabla 1. Una composicion tal que comprende una tercera cepa A estacional es particularmente adecuada para ninos muy jovenes. Adecuadamente, dos de las tres cepas interpandemicas son la cepa H3N2, siendo la segunda cepa H3N2 de un subtipo proximo, o distante, en comparacion con la primera cepa H3N2. El adyuvante proporcionara la ventaja de proporcionar a esta poblacion un aumento de proteccion. La dosis humana de la composicion inmunogenica para la poblacion de ninos es adecuadamente la mitad de una dosis humana adulta.
En otra realizacion especifica, la dosis humana de la composicion inmunogenica es una composicion inmunogenica
o de vacuna pentavalente que comprende hemaglutinina (HA) de dos cepas A interpandemicas (opcionalmente H1N1, H3N2), dos cepas B (opcionalmente de un linaje diferente, tal como de BNVictoria y BNYamagata) y una cepa A asociada a una pandemia o susceptible a asociarse a una pandemia (opcionalmente H5N1, H9N2, H5N8, H5N9, H7N4, H7N7, H7N3, H2N2, H10N7, H5N2 y H7N1). Adecuadamente, la HA por cepa por dosis es aproximadamente 15 Ig. Adecuadamente, la HA por cepa es una baja cantidad de HA (opcionalmente de aproximadamente 10 Ig de HA por cepa por dosis o inferior, de forma que se logre un maximo de 40-45 Ig de HA por dosis) y es como se define anteriormente. Adecuadamente, la HA por cepa es aproximadamente o inferior a 5 Ig, aproximadamente 2,5 Ig o inferior. El adyuvante es como se define en este documento y en particular como se define en la Tabla 1.
En otra realizacion especifica, la dosis humana de la composicion inmunogenica es una composicion inmunogenica
o de vacuna pentavalente que comprende hemaglutinina (HA) de tres cepas A interpandemicas (opcionalmente H1N1, y dos cepas H3N2) y dos cepas B (opcionalmente de un linaje diferente, tal como de BNVictoria y BNYamagata). Adecuadamente, la HA por cepa es una baja cantidad de HA (opcionalmente 10 Ig de HA por cepa o inferior) y es como se define anteriormente. Adecuadamente, la HA por cepa es aproximadamente o inferior a 5 Ig, aproximadamente 2,5 Ig o inferior. El adyuvante es como se define en este documento y en particular como se define en la Tabla 1.
Por consiguiente, en una realizacion especifica, la invencion proporciona una composicion inmunogenica contra la gripe que comprende escualeno y HA en la que la relacion de peso de escualeno:cantidad total de HA (incluidas todas las cepas de la gripe) esta en el intervalo de entre aproximadamente 50-150 o aproximadamente 150-400 (por ejemplo, aproximadamente 200-300). Tales composiciones son adecuadamente, pero no exclusivamente, para su uso en la poblacion anciana y equilibran bien reactogenicidad e inmunogenicidad. En otra realizacion, la invencion proporciona una composicion inmunogenica contra la gripe que comprende escualeno y HA en la que la relacion de peso de escualeno:cantidad total de HA (incluidas todas las cepas de la gripe) esta entre aproximadamente 50-400, por ejemplo, aproximadamente 50-100, 75-150, 75-200, 75-400, 100-200, 100-250 o 200-400. La relacion sera adecuadamente de forma que se cumplan al menos dos, adecuadamente los tres criterios (Tabla 2) para proteccion, para una poblacion especifica. Puede incluirse un agonista de TLR, adecuadamente un agonista de TLR-4 (por ejemplo, elegido de: 3D-MPL, MPL; una molecula de AGP tal como RC527 o RC529 o ER804057) o TLR-9 (adecuadamente un oligonucleotido de CpG, por ejemplo, CpG7909). Relaciones de peso de escualeno:TLR-4 adecuadas son entre aproximadamente 100-450, por ejemplo, 50-250, 50-150, 100-250, 200-250, 350-450. Relaciones de peso de escualeno:TLR-9 adecuadas son entre aproximadamente 50-1000, por ejemplo, 50-500, 1001000, 100-400, 400-600. La HA puede ser de cepas de la gripe estacionales. Tales composiciones son adecuadamente, pero no exclusivamente, para su uso en las poblaciones adultas o pediatricas y equilibran bien reactogenicidad e inmunogenicidad. Adecuadamente, la HA es de al menos tres, al menos cuatro cepas de la gripe. Adecuadamente estan presentes tres cepas estacionales (por ejemplo, H1N1, H3N2, B). Adecuadamente, si estan presentes cuatro cepas, son del grupo de: cuatro cepas estacionales (por ejemplo, H1N1, H3N2, dos cepas B; o H1N1, B, dos cepas H3N2) o el grupo de una cepa pandemica (por ejemplo, aviar) mas tres cepas estacionales (por ejemplo, H1N1, H3N2, B).
Todas las composiciones inmunogenicas adyuvantadas reivindicadas o vacuna pueden basarse ventajosamente en el adyuvante para proporcionar una respuesta inmunitaria persistente durante un periodo de tiempo que supera 6 meses, adecuadamente 12 meses despues de la vacunacion.
Adecuadamente, la(s) respuesta(s) anterior(es) se obtiene(n) despues de una dosis, o normalmente despues de dos dosis administradas durante la misma respuesta inmunitaria primaria continua. Es una ventaja particular de la composicion reivindicada que la respuesta inmunitaria se obtenga despues de solo una dosis de composicion adyuvantada o vacuna. Tambien es adecuado que se administren dos dosis durante la misma respuesta inmunitaria primaria continua, adecuadamente para poblaciones o individuos sin tratamiento previo o inmunodeprimidos. Adecuadamente, dos dosis podrian necesitarse en ninos, en particular de menos de 6 anos de edad o 9-10 anos de edad, no previamente vacunados.
Por consiguiente, se proporciona el uso de una preparacion de antigeno del virus de la gripe pandemico no vivo, en particular un virus de la gripe fraccionado o preparacion antigenica del mismo, en la preparacion de una composicion de vacuna para una vacunacion de una dosis o de dos dosis contra la gripe, en el que la vacunacion de una dosis o de dos dosis genera una respuesta inmunitaria que cumple al menos uno, adecuadamente dos o tres, requisitos reguladores internacionales para vacunas contra la gripe. En otra realizacion particular, dicha vacunacion de una dosis genera tambien o adicionalmente una respuesta inmunitaria de linfocitos T CD4 yNo una respuesta de linfocitos B de memoria que es superior a la obtenida con la vacuna no adyuvantada. En una realizacion particular, dicha respuesta inmunitaria es una respuesta de anticuerpos de reactividad cruzada o una respuesta de linfocitos T CD4 de reactividad cruzada, o ambas. En una realizacion especifica, el paciente humano no ha recibido previamente tratamiento inmunologico (es decir, no tiene inmunidad preexistente) a la cepa de vacunacion. Especificamente, la composicion de vacuna contiene una baja cantidad de antigeno de HA y un adyuvante de emulsion de aceite en agua con componentes a un nivel inferior al que previamente se habia creido util, y cantidades que son como se definen en este documento. Especificamente, la composicion de vacuna es como se define en este documento. En particular, las propiedades inmunogenicas de la composicion de vacuna son como se definen en este documento. Adecuadamente, la vacuna se administra intramuscularmente.
Propiedades inmunogénicas de la composición inmunogénica usada para la vacunación (opcionalmente la primera vacunación) de la presente invención
En la presente invencion, la composicion inmunogenica adyuvantada es capaz de inducir adecuadamente una respuesta inmunitaria de linfocitos T CD4+ mejorada contra el o contra al menos uno de los antigenos del componente o composicion antigenica en comparacion con la respuesta inmunitaria de linfocitos T CD4+ obtenida con la composicion correspondiente que es no adyuvantada, es decir, no contiene ningun adyuvante exogeno (tambien denominada en lo sucesivo "composicion simple"). En una realizacion especifica, si la composicion contra la gripe inmunogenica es de varias cepas de la gripe, siendo una tanto una segunda cepa B, o una tercera cepa A interpandemica, como una cepa pandemica, dicha respuesta inmunitaria de linfocitos T CD4+ mejorada es contra al menos una de estas cepas. En otra realizacion, la composicion inmunogenica adyuvantada, si el (los) componente(s) de adyuvante esta(n) a un menor nivel que el que se creia previamente util y esNson normalmente como se define(n) anteriormente, es adecuadamente capaz de inducir una respuesta inmunitaria de linfocitos T CD4+ contra el o contra al menos uno de los antigenos del componente o composicion antigenica al menos comparable a la que se obtiene con composiciones adyuvantadas con algunos adyuvantes de la tecnica anterior. Esta caracteristica se denominara en lo sucesivo "respuesta inmunitaria de linfocitos T CD4+ comparable" en el texto de mas adelante.
Por "respuesta inmunitaria de linfocitos T CD4+ mejorada" se indica que se obtiene una mayor respuesta de CD4+ en un paciente humano despues de la administracion de la composicion inmunogenica adyuvantada como se define en este documento que la obtenida despues de la administracion de la misma composicion sin adyuvante. Por ejemplo, se obtiene una mayor respuesta de linfocitos T CD4+ en un paciente humano tras la administracion de una composicion inmunogenica que comprende un virus de la gripe o preparacion antigenica del mismo junto con un adyuvante de emulsion de aceite en agua que comprende un aceite metabolizable (opcionalmente escualeno), un tocol (opcionalmente alfa-tocoferol) y un agente emulsionante (opcionalmente un monooleato de polioxietilensorbitano tal como Tween 80™ o Polisorbato 80™) en comparacion con la respuesta inducida despues de la administracion de una composicion inmunogenica que comprende un virus de la gripe o preparacion antigenica del mismo que es no adyuvantada. Tal formulacion adyuvantada se usara ventajosamente para inducir respuesta de linfocitos T CD4+ contra la gripe que puede detectar epitopes de la gripe presentados por moleculas del MHC de clase II.
Adecuadamente, dicha respuesta inmunologica inducida por una composicion contra la gripe fraccionada adyuvantada para su uso en la presente invencion es superior a la respuesta inmunologica inducida por cualquier otra vacuna convencional contra la gripe no adyuvantada, tal como vacuna contra la gripe de subunidad o vacuna contra el virus de la gripe completo.
En particular, pero no exclusivamente, dicha "respuesta inmunitaria de linfocitos T CD4+ mejorada" o "respuesta inmunitaria de linfocitos T CD4+ comparable" se obtiene en un paciente inmunologicamente sin sensibilizar, es decir, un paciente que es seronegativo a dicho virus de la gripe o antigeno. Esta seronegatividad puede ser el resultado de que dicho paciente nunca se haya enfrentado a tal virus o antigeno (llamado paciente 'sin tratamiento previo') o, alternativamente, que haya fracasado en responder a dicho antigeno una vez encontrado. Adecuadamente, dicha respuesta inmunitaria de linfocitos T CD4+ mejorada se obtiene en un sujeto inmunodeprimido tal como un anciano, normalmente de al menos 50 anos de edad, normalmente 65 anos de edad o superior, o un adulto de menos de 65
anos de edad con una afeccion medica de alto riesgo (adulto de 'alto riesgo'), o un nino de menos de dos anos.
La respuesta inmunitaria de linfocitos T CD4+ (mejorada) puede evaluarse midiendo el numero de celulas que produce cualquiera de las siguiente citocinas:
•
celulas que producen al menos dos citocinas diferentes (CD40L, IL-2, IFNγ, TNFα)
•
celulas que producen al menos CD40L y otra citocina (IL-2, TNFα, IFNγ)
•
celulas que producen al menos IL-2 y otra citocina (CD40L, TNFα, IFNγ)
•
celulas que producen al menos IFNγ y otra citocina (IL-2, TNFα, CD40L)
•
celulas que producen al menos TNFα y otra citocina (IL-2, CD40L, IFNγ)
Habra respuesta inmunitaria de linfocitos T CD4+ "mejorada" cuando las celulas que producen cualquiera de las citocinas anteriores esten en una mayor cantidad tras la administracion de la composicion adyuvantada en comparacion con la administracion de la composicion no adyuvantada. Normalmente se satisfaran al menos una, adecuadamente dos de las cinco condiciones mencionadas en este documento anteriormente. En una realizacion particular, las celulas que producen las cuatro citocinas estaran presentes a una mayor cantidad en el grupo adyuvantado en comparacion con el grupo no adyuvantado. Habra una respuesta inmunitaria de linfocitos T CD4+ "comparable" cuando no haya disminucion significativa, opcionalmente no estadisticamente significativa, en la respuesta obtenida con la composicion inmunogenica adyuvantada cuando el (los) componente(s) de adyuvante esta(n) a un menor nivel que el que previamente se creia util y esta(n) normalmente como se define en este documento en comparacion con el obtenido con composiciones adyuvantadas con algunos adyuvantes de la tecnica anterior (es decir, con el (los) mismo(s) componente(s) a un alto nivel).
En una realizacion especifica, una respuesta inmunitaria de linfocitos T CD4 mejorada puede conferirse por la composicion contra la gripe adyuvantada de la presente invencion y puede obtenerse idealmente despues de una unica administracion. El enfoque de dosis unica sera extremadamente relevante, por ejemplo, en una situacion de brote que evoluciona rapidamente. En ciertas circunstancias, especialmente para la poblacion anciana, o en el caso de ninos jovenes (menos de 9 anos de edad) que se han vacunado por primera vez contra la gripe, o en el caso de una pandemia, puede ser beneficioso administrar dos dosis de la misma composicion durante esa estacion. La segunda dosis de dicha misma composicion (todavia considerada como 'composicion para la primera vacunacion') puede administrarse durante la respuesta inmunitaria primaria continua y es adecuadamente separada. Normalmente, la segunda dosis de la composicion se administra algunas semanas, o aproximadamente un mes, por ejemplo, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas, o 6 semanas despues de la primera dosis, para ayudar a sensibilizar el sistema inmunitario en individuos resistentes o poco sensibles. En un aspecto especifico, la primovacunacion va seguida de un ciclo de vacunacion posterior de producto de vacuna adyuvantada que contiene una cepa de la gripe heterologa.
En una realizacion especifica, la administracion de dicha composicion inmunogenica alternativamente o adicionalmente induce una respuesta de linfocitos B de memoria mejorada en pacientes a los que se les administro la composicion inmunogenica adyuvantada en comparacion con la respuesta de linfocitos B de memoria inducida en individuos inmunizados con la composicion sin adyuvante. Una respuesta de linfocitos B de memoria mejorada pretende significar un aumento de la frecuencia de linfocitos B de sangre periferica que pueden diferenciarse en celulas de plasma secretoras de anticuerpos tras el encuentro con el antigeno como se mide por la estimulacion de la diferenciacion in vitro (veanse las secciones de ejemplos, por ejemplo, procedimientos de linfocitos B de memoria Elispot). En otra realizacion, la composicion inmunogenica adyuvantada, si el (los) componente(s) de adyuvante esta(n) a un menor nivel que el que previamente se creia util y esta(n) normalmente como se define anteriormente, es adecuadamente capaz de inducir una respuesta de linfocitos B de memoria contra el o contra al menos uno de los antigenos de componente o composicion antigenica comparable (es decir, no significativamente, u opcionalmente estadisticamente significativamente inferior) a la obtenida con composiciones adyuvantadas con algunos adyuvantes de la tecnica anterior. Esta caracteristica se denominara en lo sucesivo "respuesta de linfocitos B de memoria comparable" en el texto.
En todavia una realizacion especifica adicional, la vacunacion con la composicion para la primera vacunacion, adyuvantada, no tiene impacto medible sobre la respuesta de CD8.
Adecuadamente, la composicion reivindicada que comprende un virus de la gripe o preparacion antigenica del mismo formulada con un adyuvante de emulsion de aceite en agua de la invencion sera eficaz en promover respuestas de linfocitos T en una poblacion humana inmunodeprimida o que no ha recibido previamente tratamiento inmunologico. Adecuadamente, la administracion de una dosis unica de la composicion inmunogenica adyuvantada para la primera vacunacion, como se describe en la invencion, podra proporcionar mejor seroproteccion, como se evalua por las correlaciones de proteccion para vacunas contra la gripe, tras la revacunacion contra la gripe, con vacunacion con una vacuna no adyuvantada contra la gripe. La formulacion adyuvantada reivindicada tambien inducira ventajosamente una respuesta inmunitaria de linfocitos T CD4 mejorada contra el virus de la gripe en comparacion con la obtenida con la formulacion no adyuvantada. Esta propiedad puede asociarse a un aumento de la receptividad tras la vacunacion o infeccion con respecto a la exposicion antigenica a la gripe. Ademas, esto tambien puede asociarse a una receptividad cruzada, es decir, una mayor capacidad para responder a cepas de la
gripe variantes. Esta respuesta cualitativamente yNo cuantitativamente mejorada puede ser beneficiosa en todas las poblaciones en el caso de pandemias, y especialmente en una poblacion humana inmunodeprimida tal como la poblacion anciana (65 anos de edad y superior) y en particular la poblacion anciana de alto riesgo. Esto tambien puede ser de beneficio para la mayoria de la poblacion de lactantes sin tratamiento previo (menos de 5 anos, adecuadamente menos de 2 anos de edad). Si la composicion comprende al menos una cepa pandemica, esta respuesta mejorada sera beneficiosa para uso para sensibilizar, por ejemplo, de vacuna almacenada que contiene una variante desviada, antes o en la aparicion del brote pandemico. Esto puede producir la reduccion de la tasa morbilidad y mortalidad global y prevenir ingresos de emergencia en el hospital por neumonia y otras enfermedades similares a la gripe. Ademas, permite inducir una respuesta de linfocitos T CD4 que es mas persistente con el tiempo, por ejemplo, todavia presente un ano despues de la primera vacunacion, en comparacion con la respuesta inducida con la formulacion no adyuvantada. Todas estas ventajas podrian obtenerse con la composicion de adyuvante reivindicada, a la vez que se reduce la reactogenicidad global en comparacion con adyuvante que tiene mayor cantidad(es) de componente(s).
Adecuadamente, la respuesta inmunitaria de linfocitos T CD4, tal como la respuesta inmunitaria de linfocitos T CD4 "mejorada" o "comparable" obtenida en un sujeto sin sensibilizar, implica la induccion de una respuesta de colaborador T CD4 con reactividad cruzada. En particular, la cantidad de linfocitos T CD4 con reactividad cruzada es elevada. Por respuesta de CD4 'con reactividad cruzada' se indica celulas T CD4 que eligen como diana epitopes compartidos entre cepas de la gripe, opcionalmente de diferentes subtipos o linajes.
Normalmente, las vacunas contra la gripe disponibles son eficaces solo contra cepas infectantes del virus de la gripe que tienen hemaglutinina de caracteristicas antigenicas similares. Si el virus de la gripe infectante (en circulacion) ha experimentado cambios menores (tales como una mutacion puntual o una acumulacion de mutaciones puntuales que producen cambios de aminoacidos en las glucoproteinas de superficie, en particular la hemaglutinina (cepa de virus variante de desviacion antigenica), la vacuna puede todavia proporcionar algo de proteccion, aunque solo puede proporcionar proteccion limitada ya que las variantes recientemente creadas pueden escapar de la inmunidad inducida por la infeccion por la gripe o vacunacion previa. La desviacion antigenica es responsable de epidemias anuales que se producen durante periodos interpandemicos (Wiley & Skehel, 1987, Ann. Rev. Biochem. 56, 365394). La induccion de linfocitos T CD4 con reactividad cruzada proporciona una ventaja adicional a la composicion de la invencion, ya que tambien puede proporcionar proteccion cruzada, en otras palabras, proteccion contra infecciones heterologas, es decir, infecciones producidas por una cepa de la gripe en circulacion que es una variante (por ejemplo, una desviacion) de la cepa de la gripe contenida en la composicion inmunogenica. Esto puede ser ventajoso cuando la cepa en circulacion sea dificil de propagar en huevos o de producir en cultivo celular, convirtiendose el uso de una cepa desviada en una alternativa de trabajo. Esto tambien puede ser ventajoso cuando el sujeto recibio una primera y una segunda vacunacion varios meses o un ano atras, y la cepa de la gripe en la composicion inmunogenica usada para una segunda inmunizacion es una cepa variante desviada de la cepa usada en la composicion usada para la primera vacunacion.
Por tanto, la composicion inmunogenica adyuvantada contra la gripe como se define en este documento tiene una mayor capacidad para inducir seroproteccion y linfocitos T CD4 con reactividad cruzada en ancianos vacunados o sujetos de ninos jovenes. Esta caracteristica puede asociarse a una mayor capacidad para responder a una cepa variante de la cepa presente en la composicion inmunogenica. Esto puede demostrar que es una ventaja importante en una situacion pandemica. Por ejemplo, una composicion contra la gripe inmunogenica que comprende al menos una cepa pandemica, opcionalmente cualquiera de las cepas H5, a H2, a H9, H7 o H6, puede proporcionar una mayor capacidad para responder a una variante pandemica, es decir, una cepa desviada de dicha(s) cepa(s) pandemica(s), tanto tras la posterior vacunacion con como tras la infeccion por dicha cepa desviada. Por ejemplo, la composicion de vacuna adyuvantada comprende una cepa ANIndonesia y puede generar una respuesta inmunitaria de proteccion cruzada yNo reactividad cruzada contra una, adecuadamente mas de una, de las cepas de desviacion, tales como las cepas ANHong Kong, ANTurquia, ANVietnam yNo ANAnhui.
Detección de linfocitos T CD4 con reactividad cruzada tras la vacunación con vacuna contra la gripe
Tras la administracion de la vacuna contra la gripe trivalente clasica (3 semanas), hay un aumento sustancial en la frecuencia de linfocitos T CD4 de sangre periferica que responden a la preparacion de cepa antigenica (virus completo o antigeno fraccionado) que es homologa a la presente en la vacuna (H3N2: ANPanamaN2007N99, H1N1: ANNueva CaledoniaN20N99, B: BNShandongN7N97) (vease el Ejemplo III). Un aumento comparable en la frecuencia puede observarse si los linfocitos T CD4 de sangre periferica son reestimulados con cepas de la gripe clasificadas como cepas desviadas (H3N2: ANSidneyN5N97, H1N1: ANPekinN262N95, B: BNYamanashiN166N98). A diferencia, si los linfocitos T CD4 de sangre periferica son reestimulados con cepas de la gripe clasificada como cepas desplazadas (H2N2: ANSingapurN1N57, H9N2: ANHong KongN1073N99) por el experto en el campo, no hay aumento observable tras la vacunacion.
Los linfocitos T CD4 que pueden reconocen cepas de la gripe tanto homologas como desviadas se han llamado en el presente documento de "reactividad cruzada". Las composiciones contra la gripe adyuvantadas como se describen en este documento han sido capaces de mostrar reactividad cruzada heterosubtipica, ya que hay reactividad cruzada observable contra cepas desviadas de la gripe. Como se ha dicho anteriormente, la capacidad de una formulacion de vacuna que comprende al menos una cepa pandemica para ser eficaz contra cepa(s)
desviada(s) pandemica(s) puede demostrar ser una caracteristica importante en el caso de pandemia.
Coherentemente con las observaciones anteriores, se han identificado epitopes de linfocitos T CD4 compartidos por diferentes cepas de la gripe en seres humanos (Gelder C y col. 1998, Int Immunol. 10(2):211-22; Gelder CM y col. 1996 J Virol. 70(7):4787-90; Gelder CM y col. 1995 J Virol. 1995 69(12):7497-506).
Debido a sus propiedades inmunogenicas, la composicion reivindicada puede ser capaz de establecer una estrategia de vacunacion proactiva contra la amenaza de una pandemia de la gripe humana, que incluye las reservas de vacuna prepandemica con el fin de prepararse mejor contra la aparicion de una pandemia. Tambien puede ser capaz de establecer una estrategia de vacunacion proactiva contra cepas en circulacion que podrian no coincidir exactamente con la(s) cepa(s) presente(s) en la composicion de vacuna. En una realizacion especifica, la composicion adyuvantada puede ofrecer el beneficio adicional de proporcionar mejor proteccion contra cepas en circulacion que han experimentado un cambio importante (tal como recombinacion de genes, por ejemplo, entre dos especies diferentes) en la hemaglutinina (desplazamiento antigenico) contra las que las vacunas actualmente disponibles no tienen eficacia.
Especificamente, la vacuna prepandemica es una que comprende al menos una cepa pandemica (opcionalmente H5N1 (gripe aviar)) similar a las actualmente en circulacion en la poblacion de aves y se ha producido, por ejemplo, mediante el uso de genetica inversa. La inmunidad desarrollada en respuesta a la vacuna prepandemica puede permitir que el sistema inmunitario se 'sensibilice' o se 'eduque' para la llegada y asi permita un desarrollo mas rapido de respuestas inmunitarias protectoras despues de encontrar la cepa del virus pandemico real que conduce a una disminucion de la susceptibilidad a una cepa pandemica relacionada de la gripe. Una vez la OMS ha declarado una pandemia y se ha identificado la cepa pandemica final (que puede ser o no ser una cepa desviada), la vacuna prepandemica tambien permitira una respuesta inmunitaria mas rapida a la vacuna pandemica cuando esta ultima este disponible.
Revacunación y composición usada para la revacunación (composición de refuerzo)
En un aspecto se proporciona el uso de:
(a)
un virus de la gripe o preparacion antigenica del mismo, de una primera cepa de la gripe, y
(b)
un adyuvante de emulsion de aceite en agua como se define en este documento
en la preparacion de una composicion inmunogenica como se define en este documento para la proteccion contra infecciones de la gripe producidas por una cepa de la gripe que es una variante de dicha primera cepa de la gripe.
Tambien se proporciona una composicion inmunogenica que comprende un virus de la gripe o preparacion antigenica del mismo, de una primera cepa de la gripe, y un adyuvante de emulsion de aceite en agua como se define en este documento para su uso en la proteccion de un ser humano o una poblacion humana contra infecciones de la gripe producidas por una cepa de la gripe que es una variante de dicha primera cepa de la gripe.
En este documento tambien se proporciona el uso de un antigeno de la gripe en la preparacion de una composicion inmunogenica contra la gripe para la revacunacion de seres humanos previamente vacunados (con una o dos dosis) con una composicion contra la gripe adyuvantada como se define en este documento. Tambien se proporciona una composicion inmunogenica que comprende un virus de la gripe o preparacion antigenica del mismo, opcionalmente con un adyuvante de emulsion de aceite en agua como se define en este documento, para su uso en la revacunacion de seres humanos previamente vacunados (con una o dos dosis) con una composicion contra la gripe adyuvantada como se define en este documento.
En una realizacion, la composicion inmunogenica para la revacunacion contiene un virus de la gripe o preparacion antigenica del mismo que comparte epitopes de linfocitos T CD4 comunes con el virus de la gripe o preparacion antigenica del mismo usada para la primera vacunacion. Un epitope de linfocitos T CD4 comun pretende significar peptidosNsecuenciasNepitopes de diferentes antigenos que pueden ser reconocidos por la misma celula CD4 (veanse los ejemplos de epitopes descritos en: Gelder C y col. 1998, Int Immunol. 10(2):211-22; Gelder CM y col. 1996 J Virol. 70(7):4787-90; Gelder CM y col. 1995 J Virol. 1995 69(12):7497-506).
En un aspecto se proporciona el uso de un virus de la gripe o preparacion antigenica del mismo, de una primera cepa de la gripe (opcionalmente una pandemica), en la preparacion de una composicion inmunogenica adyuvantada como se define en este documento para la proteccion contra infecciones de la gripe producidas por una cepa de la gripe que es una variante de dicha primera cepa de la gripe (opcionalmente una pandemica). Tambien se proporciona una composicion inmunogenica adyuvantada que comprende un virus de la gripe o preparacion antigenica del mismo, de una primera cepa de la gripe (opcionalmente una pandemica), y un adyuvante como se define en este documento para su uso en la proteccion contra infecciones de la gripe producidas por una cepa de la gripe que es una variante de dicha primera cepa de la gripe (opcionalmente una pandemica).
En otro aspecto se proporciona el uso de un virus de la gripe o preparacion antigenica del mismo en la preparacion de una composicion inmunogenica contra la gripe para la revacunacion de seres humanos previamente vacunados con una composicion contra la gripe adyuvantada como se reivindica en este documento o con una composicion
contra la gripe adyuvantada que comprende una cepa variante de la gripe, siendo el adyuvante como se define en este documento. Tambien se proporciona una composicion inmunogenica contra la gripe que comprende un virus de la gripe o preparacion antigenica del mismo, opcionalmente con un adyuvante de emulsion de aceite en agua como se define en este documento, para su uso en la revacunacion de seres humanos previamente vacunados con una composicion contra la gripe adyuvantada como se reivindica en este documento o con una composicion contra la gripe adyuvantada que comprende una cepa variante de la gripe, siendo el adyuvante como se define en este documento.
En otro aspecto se desvela un procedimiento de vacunar una poblacion humana o individuo contra una cepa del virus de la gripe, seguido de la revacunacion de dicho ser humano o poblacion contra una cepa del virus de la gripe variante, comprendiendo dicho procedimiento administrar a dicho ser humano (i) una primera composicion que comprende un virus de la gripe o preparacion antigenica del mismo de una primera cepa del virus de la gripe y un adyuvante como se define en este documento, y (ii) una segunda composicion inmunogenica que comprende una cepa del virus de la gripe variante de dicha primera cepa del virus de la gripe. En una realizacion especifica, dicha primera cepa esta asociada a una pandemia o tiene la posibilidad de asociarse a un brote de pandemia. En otra realizacion especifica, dicha cepa variante esta asociada a una pandemia o tiene la posibilidad de asociarse a una pandemia. En particular, la revacunacion se hace con una composicion contra la gripe que comprende al menos una cepa que es una cepa pandemica en circulacion. En otra realizacion, dicha cepa variante es una variante de desviacion, opcionalmente de un subtipo proximo o adecuadamente alejado de H3N2 usado como la primera cepa. En otra realizacion, dicha cepa variante es una cepa B de un linaje diferente al de la primera cepa B (tal como BNYamagata o BNVictoria, que pertenecen a linajes diferentes). Tanto la composicion de sensibilizacion como la composicion de refuerzo pueden ser monovalentes o adecuadamente multivalentes, es decir, pueden contener al menos dos cepas del virus de la gripe, tales como una vacuna bivalente, trivalente, cuadrivalente o pentavalente. Si la(s) composicion (composiciones) es (son) multivalente(s), al menos una cepa se selecciona adecuadamente del grupo que consiste en: una cepa pandemica, una cepa B (tal como BNYamagata o BNVictoria), una cepa H3N2, y es opcionalmente una variante de desviacion de la cepa presente en la vacuna usada para la primera vacunacion.
La primera vacunacion puede comprender adecuadamente dos dosis, administradas en el plazo de algunas semanas durante la misma respuesta inmunitaria continua, como se define anteriormente. Normalmente, la revacunacion se hace varios meses despues de la primera vacunacion, adecuadamente al menos tres meses, o 4 meses despues de la primera vacunacion, adecuadamente 8 a 14 meses despues, adecuadamente de aproximadamente 10 a 12 meses despues o incluso despues. Adecuadamente, la revacunacion se hace al menos 6 meses despues de la(s) primera(s) vacunacion (vacunaciones). Adecuadamente, la revacunacion se hace proxima a
o en la siguiente estacion de la gripe, por ejemplo, aproximadamente un ano despues de la primera composicion inmunogenica. La composicion de refuerzo tambien puede administrarse en cada uno de los anos siguientes (tercera, cuarta, quinta vacunacion, etc.).
Por consiguiente, se desvela un esquema de vacunacion (o una composicion para su uso en dicho esquema) que comprende (i) una vacunacion primaria hecha con una composicion adyuvantada segun la invencion, administrada en una o dos dosis (adecuadamente separadas, por ejemplo, separadas 3 a 6 semanas, o separadas 3-4 semanas), en cualquier momento en el ano (es decir, fuera de la estacion de la gripe), seguido de (ii) una vacunacion de refuerzo administrada al menos de 6 semanas a un ano despues de la primera vacunacion. Si se administran dos dosis en la vacunacion primaria, la primera puede ser con una vacuna estacional trivalente o cuadrivalente adyuvantada, seguida de una segunda dosis de una vacuna adyuvantada pandemica (por ejemplo, monovalente). Adecuadamente, el refuerzo se administra al menos 6 semanas despues de la primera vacunacion y en cualquier momento dentro del calendario de inmunizacion rutinaria (por ejemplo, para ninos), o en la siguiente estacion de la gripe. La composicion de refuerzo puede ser con cualquier vacuna contra la gripe comercialmente autorizada (por ejemplo, una vacuna sin adyuvantar o adyuvantada trivalente clasica tal como FluAd™), o con una composicion adyuvantada segun la invencion (por ejemplo, una composicion trivalente o cuadrivalente adyuvantada). Adecuadamente, la composicion de refuerzo comprende las cepas estacionales en circulacion para esa estacion, que pueden ser variante de desviacion de las cepas presentes en la vacuna primaria. Este esquema de vacunacion es adecuado para la poblacion pediatrica que podria sensibilizarse pronto en la vida (por ejemplo, a una edad de menos de 6 meses, o menos de 2 meses) con la vacuna entonces disponible, y reforzarse con una composicion que comprende las cepas en circulacion, que pueden ser variante de desviacion de las cepas presentes en la composicion primaria.
La composicion inmunogenica para la revacunacion (la composicion de refuerzo) puede contener algun tipo de preparacion de antigeno, tanto inactivado como atenuado vivo. Puede contener el mismo tipo de preparacion de antigeno, por ejemplo, un virus de la gripe fraccionado o preparacion antigenica del mismo, un virion completo, o una vacuna de HA y NA purificada (subunidad), como la composicion inmunogenica usada para la primera vacunacion. La composicion de refuerzo puede contener el mismo subtipo de antigeno(s) de la gripe que el usado para la primera vacunacion. Por ejemplo, si la primera vacunacion se hace en una declaracion de una pandemia y la revacunacion se hace despues, la revacunacion se hace con una vacuna que comprende una cepa de la gripe (por ejemplo, H5N1 Vietnam) que es del mismo subtipo que se uso para la primera vacunacion (por ejemplo, H5N1 Vietnam). Alternativamente, la composicion de refuerzo puede contener una cepa desviada del mismo subtipo de antigeno(s) de la gripe que el usado para la primera vacunacion, por ejemplo, H5N1 Indonesia. En otra realizacion, dicha cepa de la gripe usada para la revacunacion es una cepa de desplazamiento, es decir, es diferente de la que
se uso para la primera vacunacion, por ejemplo, tiene un subtipo de HA o NA diferente, tal como H5N2 (el mismo subtipo de HA que H5N1, pero diferente subtipo de NA) o H7N1 (subtipo de HA diferente de H5N1, pero el mismo subtipo de NA). Por ejemplo, la composicion de vacuna para la primera inmunizacion comprende una cepa ANIndonesia y la composicion de refuerzo comprende cepa(s) ANHong Kong, ANTurquia, ANVietnam yNo ANAnhui.
En una realizacion se usa un virus fraccionado. La composicion de refuerzo puede estar adyuvantada o no adyuvantada. La composicion de refuerzo no adyuvantada puede ser Fluarix™Nα-Rix®NInflusplit® administrada intramuscularmente, que contiene tres antigenos de virion fraccionados inactivados preparados a partir de las cepas recomendadas por la OMS de la estacion de la gripe apropiada. En particular, las cepas viricas de la gripe o preparacion antigenica de las mismas se seleccionan segun el material de referencia distribuido por la Organizacion mundial de la salud de forma que se adapten a la cepa de la gripe que esta en circulacion en el ano de la revacunacion. La composicion de refuerzo adyuvantada puede comprender adecuadamente un adyuvante de emulsion de aceite en agua como se define en este documento, opcionalmente con un inmunoestimulante adicional tal como ligando TLR-4 tal como 3D-MPL o una saponina.
Adecuadamente, la revacunacion hecha con una composicion que comprende un adyuvante como se define en este documento induce cualquiera, adecuadamente dos o todas, de las siguientes: (i) una respuesta inmunitaria de linfocitos T CD4+ mejorada contra el virus de la gripe o preparacion antigenica del mismo, o (ii) una respuesta de linfocitos B de memoria mejorada o (iii) una respuesta humoral mejorada en comparacion con la respuesta equivalente inducida despues de una primera vacunacion con el virus de la gripe no adyuvantado o preparacion antigenica del mismo. Adecuadamente, la revacunacion hecha con una composicion que comprende un adyuvante como se define en este documento induce cualquiera, adecuadamente dos o todas, de las siguientes: (i) una respuesta inmunitaria de linfocitos T CD4+ comparable al virus de la gripe o preparacion antigenica del mismo, o (ii) una respuesta de linfocitos B de memoria comparable o (iii) una respuesta humoral comparable en comparacion con la respuesta equivalente inducida despues de una primera vacunacion con el virus de la gripe o preparacion antigenica del mismo adyuvantada con un adyuvante en la que los componentes estan presentes a un mayor nivel.
La revacunacion de los sujetos con una composicion de refuerzo que comprende un virus de la gripe y un adyuvante de emulsion de aceite en agua de la invencion mostrara mayores titulos de anticuerpos que los valores correspondientes en el grupo de personas vacunado primero con la composicion no adyuvantada y reforzado con la composicion no adyuvantada. El efecto del adyuvante en potenciar la respuesta de anticuerpos a la revacunacion es especialmente de importancia en la poblacion anciana o en ninos jovenes que se sabe que tienen una baja respuesta a la vacunacion o infeccion por el virus de la gripe. En particular, el beneficio asociado a la composicion adyuvantada tambien sera marcado en terminos de mejorar la respuesta de linfocitos T CD4 tras la revacunacion.
La composicion adyuvantada para la revacunacion sera capaz de inducir una mejor receptividad cruzada contra la cepa desviada (la cepa de la gripe de la siguiente estacion de la gripe) en comparacion con la proteccion conferida por la vacuna de control. Dicha receptividad cruzada ha mostrado una mayor persistencia en comparacion con la obtenida con la formulacion no adyuvantada. El efecto del adyuvante en potenciar la receptividad cruzada contra la cepa desviada es importante en una situacion pandemica.
Tambien se ha desvelado una pauta de vacunacion en la que la primera vacunacion se hace con una composicion contra la gripe, adecuadamente una composicion contra la gripe fraccionada, que contiene una cepa de la gripe que posiblemente podria producir una pandemia y la revacunacion se hace con una composicion, tanto monovalente como multivalente, que comprende al menos una cepa en circulacion, tanto una cepa pandemica como una cepa clasica.
En una realizacion especifica, la dosis humana de la composicion inmunogenica para la revacunacion esta adyuvantada con un adyuvante de emulsion de aceite en agua de la invencion. Adecuadamente, la HA por cepa por dosis es aproximadamente 15 Ig. En una realizacion especifica, la HA por cepa es una baja cantidad de HA (opcionalmente de aproximadamente 10 Ig de HA por cepa por dosis o inferior, de forma que se logre un maximo de 40-45 Ig de HA por dosis) y es como se define anteriormente. Adecuadamente, la HA por cepa es aproximadamente
o inferior a 5 Ig, aproximadamente 2,5 Ig o inferior. La dosis humana de la composicion inmunogenica para la revacunacion comprende adecuadamente un adyuvante de emulsion de aceite en agua que comprende la mitad de los componentes presentes en la composicion usada para la vacunacion primaria. Dicha dosis de revacunacion puede administrarse aproximadamente un ano o aproximadamente dos anos despues de la vacunacion primaria.
Epítope de CD4 en HA
Esta desviacion antigenica reside principalmente en regiones de epitopes de las proteinas de la superficie viricas hemaglutinina (HA) y neuraminidasa (NA). Se sabe que cualquier diferencia en los epitopes de linfocitos CD4 y B entre diferentes cepas de la gripe, que son usados por el virus para evadir la respuesta adaptiva del sistema inmunitario huesped, desempenara una funcion importante en la vacunacion contra la gripe.
Se han identificado epitopes de linfocitos T CD4 compartidos por diferentes cepas de la gripe en seres humanos (vease, por ejemplo: Gelder C y col. 1998, Int Immunol. 10(2):211-22; Gelder CM y col. 1996 J Virol. 70(7):4787-90; y Gelder CM y col. 1995 J Virol. 1995 69(12):7497-506).
La revacunacion puede hacerse usando una composicion de refuerzo que contiene un virus de la gripe o preparacion antigenica del mismo que comparte epitopes de linfocitos T CD4 comunes con el antigeno del virus de la gripe o preparacion antigenica del mismo usada para la primera vacunacion. Se proporciona el uso de la composicion inmunogenica que comprende un virus de la gripe pandemico o preparacion antigenica del mismo y un adyuvante de emulsion de aceite en agua de la invencion en la preparacion de un componente de la primera vacunacion de una vacuna multidosis, comprendiendo la vacuna multidosis ademas, como dosis de refuerzo, un virus de la gripe o preparacion antigenica del mismo que comparte epitopes de linfocitos T CD4 comunes con el antigeno del virus de la gripe pandemico o preparacion antigenica del virus del mismo de la dosis administrada en la primera vacunacion.
Medios de vacunación
La composicion de la invencion puede administrarse por cualquier via de administracion adecuada tal como intradermica, mucosa, por ejemplo, intranasal, oral, intramuscular o subcutanea. Otras vias de administracion son muy conocidas en la tecnica.
La via de administracion intramuscular es particularmente adecuada para la composicion contra la gripe adyuvantada. La composicion segun la invencion puede presentarse en un recipiente de monodosis, o alternativamente, un recipiente de multidosis, particularmente adecuado para una vacuna pandemica. En este caso, un conservante antimicrobiano tal como tiomersal esta normalmente presente para prevenir la contaminacion durante el uso. La concentracion de tiomersal puede ser de 25 IgN0,5 ml de dosis (es decir, 50 IgNml). Una concentracion de tiomersal de 5 IgN0,5 ml de dosis (es decir, 10 IgNml) o 10 IgN0,5 ml de dosis (es decir, 20 IgNml) esta adecuadamente presente. Podria usarse un dispositivo de administracion IM adecuado tal como un dispositivo de inyeccion de chorro de liquido sin aguja, por ejemplo, Biojector 2000 (Bioject, Portland, OR). Alternativamente podria usarse un dispositivo de inyector de pluma, tal como se usa para la administracion en casa de epinefrina, para permitir la autoadministracion de la vacuna. El uso de tales dispositivos de administracion puede ser particularmente apto para campanas de inmunizacion a gran escala tales como serian requeridas durante una pandemia.
La administracion intradermica es otra via adecuada. Cualquier dispositivo adecuado puede usarse para administracion intradermica, por ejemplo, un dispositivo de aguja corta. Las vacunas intradermicas tambien pueden administrarse por dispositivos que limitan la longitud de penetracion eficaz de una aguja en la piel, tales como aquellos descritos en los documentos WO99N34850 y EP1092444, y equivalentes funcionales de los mismos. Tambien son adecuados dispositivos de inyeccion de chorro que administran vacunas liquidas a la dermis por un inyector de chorro liquido o por una aguja que perfora el estrato corneo y produce un chorro que alcanza la dermis. Tambien son adecuados dispositivos de administracion de polvoNparticulas balisticas que usan gas comprimido para acelerar la vacuna en forma de polvo por las capas externas de la piel a la dermis. Adicionalmente pueden usarse jeringuillas convencionales en el metodo de Mantoux clasico de administracion intradermica.
Otra via de administracion adecuada es la via subcutanea. Puede usarse cualquier dispositivo adecuado para administracion subcutanea, por ejemplo, aguja clasica. Adecuadamente se usa un dispositivo de inyector de chorro sin aguja. Adecuadamente, dicho dispositivo esta precargado con la formulacion de vacuna liquida.
Alternativamente, la vacuna se administra intranasalmente. Normalmente, la vacuna se administra localmente al area nasofaringea, adecuadamente sin ser inhalada en los pulmones. Se desea usar un dispositivo de administracion intranasal que administre la formulacion de vacuna al area nasofaringea, sin o sustancialmente sin entrar en los pulmones.
Dispositivos adecuados para la administracion intranasal de las vacunas segun la invencion son dispositivos de espray. Dispositivos de espray comercialmente disponibles adecuados incluyen Accuspray™ (Becton Dickinson). Los nebulizadores producen un espray muy fino que puede ser facilmente inhalado en los pulmones y, por tanto, no alcanza eficazmente la mucosa nasal. Por tanto, no se prefieren los nebulizadores.
Dispositivos de espray adecuados para uso intranasal son dispositivos para los que el rendimiento del dispositivo no depende de la presion aplicada por el usuario. Estos dispositivos se conocen como dispositivos de umbral de presion. El liquido es liberado de la boquilla solo cuando se aplica una presion umbral. Estos dispositivos hacen mas facil de lograr un espray con un tamano de gotita regular. Los dispositivos de umbral de presion adecuados para su uso con la presente invencion se conocen en la tecnica y se describen, por ejemplo, en los documentos WO91N13281 y EP311863B y EP516636. Tales dispositivos estan comercialmente disponibles de Pfeiffer GmbH y tambien se describen en Bommer, R. Pharmaceutical Technology Europe, Sept 1999.
Los dispositivos intranasales adecuados producen gotitas (medidas usando agua como liquido) en el intervalo de 1 a 200 Im, adecuadamente de 10 a 120 Im. Por debajo de 10 Im hay un riesgo de inhalacion, por tanto se desea tener no mas de aproximadamente el 5% de gotitas inferior a 10 Im. Las gotitas por encima de 120 Im no se extienden tan bien como las gotitas mas pequenas, por lo que se desea tener no mas de aproximadamente el 5% de gotitas que supere 120 Im.
La administracion de bidosis es otra caracteristica adecuada de un sistema de administracion intranasal para su uso
con las vacunas segun la invencion. Los dispositivos de bidosis contienen dos subdosis de una unica dosis de vacuna, una subdosis para administracion a cada orificio nasal. Generalmente, las dos subdosis estan presentes en una unica camara y la construccion del dispositivo permite la administracion eficiente de una unica subdosis de una vez. Alternativamente puede usarse un dispositivo de monodosis para administrar las vacunas segun la invencion.
Alternativamente, la via de vacunacion epidermica o transdermica tambien se contempla en la presente invencion.
En un aspecto, la composicion inmunogenica adyuvantada para la primera administracion puede administrarse intramuscularmente, y la composicion de refuerzo, tanto adyuvantada como no, puede administrarse por una via diferente, por ejemplo, intradermica, subcutanea o intranasal. En una realizacion especifica, la composicion para la primera administracion contiene una cantidad de HA de menos de 15 Ig para la cepa de la gripe pandemica, y la composicion de refuerzo puede contener una cantidad estandar de 15 Ig o, adecuadamente una baja cantidad de HA, es decir, inferior a 15 Ig, que, dependiendo de la via de administracion, puede administrarse en un menor volumen.
Aunque la vacuna de la invencion puede administrarse como una dosis unica, los componentes de la misma tambien pueden coadministrarse juntos al mismo tiempo o en momentos diferentes (por ejemplo, los antigenos de la gripe podrian administrarse por separado, adecuadamente en el mismo momento que la administracion del adyuvante). Ademas de una unica via de administracion, pueden usarse 2 vias de administracion diferentes cuando se administran dos inyecciones. Por ejemplo, la primera administracion (por ejemplo, dosis de sensibilizacion) de antigenos de la gripe adyuvantados puede administrarse IM (o ID) y la segunda administracion (por ejemplo, dosis de refuerzo) puede administrarse IN (o ID). Ademas, las vacunas de la invencion pueden administrarse IM para la dosis de sensibilizacion e IN para las dosis de refuerzo.
El contenido de antigenos de la gripe en la vacuna estara en el intervalo 0,1-15 Ig de HA por cepa de la gripe, adecuadamente 1-10 Ig, lo mas normalmente en el intervalo 1-8 Ig. Un contenido adecuado de antigenos de la gripe sera inferior a o exactamente 5 Ig de HA por cepa de la gripe incluida en la vacuna. Tras una vacunacion inicial, los sujetos pueden recibir una o varias inmunizaciones de refuerzo adecuadamente separadas.
Poblaciones a vacunar
La poblacion diana a vacunar es toda la poblacion, por ejemplo, adultos jovenes sanos (por ejemplo, 18-50 o 18-60 anos de edad), ancianos (normalmente de mas de 60 anos) o lactantesNninos. La poblacion diana puede estar en particular inmunodeprimida. Los seres humanos inmunodeprimidos generalmente son menos capaces de responder a un antigeno, en particular a un antigeno de la gripe, en comparacion con adultos sanos.
Por ejemplo, la poblacion diana es una poblacion que no esta sensibilizada contra la gripe, tanto que no han recibido tratamiento previo (tal como con respecto a una cepa pandemica) como que han fracasado en responder previamente a la infeccion o vacunacion contra la gripe. Adecuadamente, la poblacion diana son personas ancianas adecuadamente de al menos 60 edad, o al menos 65 anos y mas, adultos de alto riesgo mas jovenes (es decir, entre 18 y 60 anos de edad) tal como personas que trabajan en instituciones sanitarias, o aquellos adultos jovenes con un factor de riesgo tal como enfermedad cardiovascular y pulmonar, o diabetes. Otra poblacion diana es todos los ninos desde el nacimiento, o de 2 meses edad y mas, o de 6 meses de edad y mas, especialmente ninos de 6-23 meses de edad que experimentan una tasa de hospitalizacion relacionada con la gripe relativamente alta. Otra poblacion diana es ninos mas jovenes desde el nacimiento hasta los 6 meses de edad.
Para evitar dudas, las realizaciones en este documento referentes a "composiciones de vacuna" de la invencion tambien son aplicables a realizaciones referentes a "composiciones inmunogenicas" de la invencion, y viceversa. El termino "aproximadamente" ( o alrededor de) en todos los valores numericos permite una variacion del 5%, es decir, un valor de aproximadamente el 1,25% significaria entre 1,19%-1,31%.
La invencion se describira adicionalmente por referencia a los siguientes ejemplos no limitantes:
El Ejemplo I describe procedimientos de lectura inmunologica usados en estudios en ratones, hurones, cerdos y seres humanos. El Ejemplo II describe la preparacion de las formulaciones de emulsion de aceite en agua y de adyuvante usadas en los estudios ejemplificados. El Ejemplo III muestra un ensayo clinico en una poblacion adulta de 18-59 anos de edad con una vacuna que contiene una preparacion de antigeno de la gripe fraccionado y dos dosis de adyuvante AS03. El Ejemplo IV muestra una evaluacion preclinica de vacunas contra la gripe fraccionadas adyuvantadas y no adyuvantadas (que comprenden diversas dosis de adyuvante AS03) en ratones BALBNc sensibilizados. El Ejemplo V muestra una evaluacion preclinica de vacunas contra la gripe fraccionadas adyuvantadas y no adyuvantadas (que comprenden diversas dosis de adyuvante AS03) en ratones C57BIN6 sensibilizados. El Ejemplo VI muestra una evaluacion preclinica de vacunas contra la gripe fraccionadas adyuvantadas y no adyuvantadas (que comprenden diversas dosis de adyuvante AS03 y antigeno de dosis baja) en ratones C57BIN6 sensibilizados. El Ejemplo VII muestra una evaluacion preclinica de vacunas contra H5N1 fraccionadas adyuvantadas y no adyuvantadas (que comprenden diversas dosis de adyuvante AS03 y antigeno) en ratones C57BIN6 sin
tratamiento previo. El Ejemplo VIII muestra una evaluacion preclinica de vacunas contra la gripe adyuvantadas y no adyuvantadas en cerdos Large White sensibilizados El Ejemplo IX muestra una evaluacion preclinica de vacunas estacionales TIV y QIV fraccionadas adyuvantadas y no adyuvantadas (que comprenden diversas dosis de adyuvante AS03 y antigeno) en ratones C57BIN6 sin tratamiento previo y sensibilizados, El Ejemplo X muestra un ensayo clinico en una poblacion adulta de 18-64 anos de edad con una vacuna que contiene una preparacion de antigeno de la gripe fraccionado y diversas dosis de adyuvante AS03. El Ejemplo XI muestra un ensayo clinico en una poblacion anciana de + 65 anos de edad con una vacuna que contiene una preparacion de antigeno de la gripe fraccionado y diversos adyuvantes.
Ejemplo I - Procedimientos de lectura inmunológica
I.1. Procedimientos en ratones
I.1.1. Prueba de inhibicion de la hemaglutinacion
Principio de la prueba (procedimiento clásico).
Los titulos de anticuerpos anti-hemaglutinina para las tres cepas del virus de la gripe (estacionales) se determinan usando la prueba de inhibicion de la hemaglutinacion (HI). El principio de la prueba de HI se basa en la capacidad de anticuerpos contra la gripe especificos para inhibir la hemaglutinacion de globulos rojos (RBC) por la hemaglutinina del virus de la gripe (HA). Los sueros inactivados con calor se tratan por caolin y RBC para eliminar inhibidores no especificos. Despues del pretratamiento, las diluciones dobles de sueros se incuban con 4 unidades de hemaglutinacion de cada cepa de la gripe. Luego se anaden globulos rojos y la inhibicion de la aglutinacion se puntua. Los titulos se expresan como el reciproco de la mayor dilucion de suero que inhibio completamente la hemaglutinacion. Como la primera dilucion de sueros es 1:20, un nivel indetectable se puntua como un titulo igual a
10.
Adaptación para H5N1 (descripción específica de HI usando eritrocitos de caballo):
Como se documento que el ensayo de HI clasico para determinar anticuerpos anti-HA no funcionaba bien para la cepa H5N1, se uso un protocolo adaptado usando RBC de caballo. Se usan eritrocitos de caballos para las cepas H5N1 pandemicas. 0,5% (concentracion final) de suspension de globulos rojos de caballo en fosfato tampon que contenia 0,5% de BSA (albumina de suero bovino, concentracion final). Esta suspension se prepara cada dia lavando globulo rojo con el mismo tampon fosfato y una etapa de centrifugacion posterior (10 min, 2000 rpm). Esta etapa de lavado tiene que repetirse una vez. Despues de la adicion de los globulos rojos de caballo a la mezcla de reaccion de sueros y suspension de virus; las placas tienen que incubarse a temperatura ambiente (TA, 20°C +N-2°C) durante dos horas debido a la baja velocidad de sedimentacion de los globulos rojos de caballo.
Análisis estadístico
Los analisis estadisticos se realizaron en titulos de HI despues de la vacunacion usando UNISTAT. El protocolo aplicado al analisis de la varianza puede describirse brevemente del siguiente modo:
•
Transformacion logaritmica de datos.
•
Prueba de Shapiro-Wilk en cada poblacion (grupo) con el fin de verificar la normalidad de la distribucion de grupos.
•
Prueba de Cochran con el fin de verificar la homogenicidad de la varianza entre las diferentes poblaciones (grupos).
•
Analisis de la varianza en datos seleccionados.
•
Prueba de interaccion de ANOVA bilateral.
•
Prueba de Tukey-HSD de multiples comparaciones.
I.1.2. Tincion intracelular de citocinas
Esta tecnica permite una cuantificacion de linfocitos T especificos de antigeno basandose en la produccion de citocinas: linfocitos T efectores yNo linfocitos T de memoria efectores producen IFN-γ yNo los linfocitos T de memoria central producen IL-2. Las PBMC se recogen en el dia 7 despues de la inmunizacion.
Las celulas linfoides son reestimuladas in vitro en presencia de inhibidor de la secrecion (brefeldina).
Entonces, estas celulas se procesan por procedimiento inmunofluorescente convencional usando anticuerpos fluorescentes (CD4, CD8, IFN-γ y IL-2). Los resultados se expresan como una frecuencia de celula positiva para citocinas dentro de los linfocitos T CD4NCD8. La tincion intracelular de citocinas de linfocitos T se realizo en PBMC 7 dias despues de la segunda inmunizacion. Se recogio sangre de ratones y se reunieron en medio heparinizado RPMI+ Add. Para la sangre, RPMI + suspensiones de PBL diluidas con Add se estratificaron sobre un gradiente de Lympholyte-Mammal segun el protocolo recomendado (centrifugar 20 min a 2500 rpm y TA). Las celulas
mononucleares en la interfase se eliminaron, se lavaron 2x en RPMI + Add y las suspensiones de PBMC se ajustaron a 2 x 106 celulasNml en RPMI-5% de suero bovino fetal.
La estimulacion de antigenos in vitro de PBMC se llevo a cabo a una concentracion final de 1 x 107 celulasNml (tubo FACS) con FI completo (1 Ig de HANcepa) y luego se incubo 2 h a 37°C con la adicion de anti-CD28 y anti-CD49d (1 IgNml para ambos).
Tras la etapa de reestimulacion de antigeno, las PBMC se incuban durante la noche a 37°C en presencia de brefeldina (1 IgNml) a 37°C para inhibir la secrecion de citocinas.
La tincion de IFN-γNIL-2NCD4NCD8 se realizo del siguiente modo: las suspensiones de celulas se lavaron, se resuspendieron en 50 Il de PBS con 1% de SBF que contenia 2% de reactivo de bloqueo de Fc (1N50; 2.4G2). Despues de 10 min de incubacion a 4°C se anadieron 50 Il de una mezcla de anti-CD4-PE (2N50) y anti-CD8 perCp (3N50) y se incubo 30 min a 4°C. Despues de un lavado en PBS con 1% de SBF, las celulas se permeabilizaron resuspendiendo en 200 Il de Citofix-Citoperm (kit BD) y se incubaron 20 min a 4°C. Entonces, las celulas se lavaron con Perm Wash (kit BD) y se resuspendieron con 50 Il de una mezcla de anti IFN-γ APC (1N50) + anti-IL-2 FITC (1N50) diluido en Perm Wash. Despues de una incubacion de min. 2 h max durante la noche a 4°C, las celulas se lavaron con Perm Wash y se resuspendieron en PBS con 1% de SBF + 1% de paraformaldehido. El analisis de las muestras se realizo por FACS. Las celulas vivas se separaron (FSCNSSC) y la adquisicion se realizo en -20.000 acontecimientos (linfocitos) o 35.000 acontecimientos en linfocitos T CD4+. El porcentajes de IFN-γ+ o IL2+ se calculo en poblaciones separadas de CD4+ y CD8+.
I.1.3. ELISA anti-H5N1
La cuantificacion de titulos de anticuerpos Ig, IgG1 y IgG2b contra H5N1 se realizo por ELISA usando H5N1 fraccionado como recubrimiento. Las disoluciones de virus y de anticuerpo se usaron a 100 Il por pocillo. El virus fraccionado H5N1 se diluyo a una concentracion final de 1 IgNml en PBS y se adsorbio durante la noche a 4°C a los pocillos de placas de microtitulacion de 96 pocillos (Maxisorb Immunoplate Nunc 439454). Entonces, las placas se incubaron durante 1 hora a 37°C con 200 Il por pocillo de PBS que contenia 1% de BSA y 0,1% de Tween 20 (tampon de saturacion). Se anadieron veinte diluciones dobles de sueros en tampon de saturacion a las placas recubiertas con H5N1 y se incubaron durante 1 h 30 a 37°C. Las placas se lavaron cuatro veces con PBS con 0,1% de Tween 20. El anticuerpo dirigido contra Ig de raton conjugada biotinilada (Prozan-E0413) diluido 1N500 o el anticuerpo dirigido contra IgG1 de raton conjugada biotinilada (Imtech 1070-08), o un anticuerpo dirigido contra IgG2b de raton biotinilada (Imtech 1090-08) diluido 1N4000 en PBS con 1% de BSA, 0,1% de Tween 20 se anadio a cada pocillo y se incubo durante 1,30 horas a 37°C; despues de una etapa de lavado, las placas se incubaron 30 min con un conjugado de estreptavidina-biotina-peroxidasa (Prozan P0397) diluido 1N10000 en PBS con 1% de BSA-Tween 20.
Para la revelacion colorimetrica, las placas se incubaron 20 min a 22°C con una disolucion de o-fenildiamina (Sigma P4664) al 0,04%, H2O2, al 0,03% en tampon citrato 0,1 M a pH 4,2. La reaccion se detuvo con H2SO4 2 N y las microplacas se leyeron a 490-630 nm.
I.2. Procedimientos en hurones
I.2.1. Prueba de inhibicion de la hemaglutinacion (HI)
Procedimiento de prueba.
Los titulos de anticuerpos anti-hemaglutinina para las tres cepas del virus de la gripe se determinaron usando la prueba de inhibicion de la hemaglutinacion (HI). El principio de la prueba de HI se basa en la capacidad de anticuerpos contra la gripe especificos para inhibir la hemaglutinacion de globulos rojos de pollo (RBC) por la hemaglutinina del virus de la gripe (HA). Los sueros se trataron primero con una disolucion de neuraminidasa al 25% (RDE) y se inactivaron por calor para eliminar inhibidores no especificos. Despues del pretratamiento, las diluciones dobles de sueros se incubaron con 4 unidades de hemaglutinacion de cada cepa de la gripe. Luego se anadieron los globulos rojos de pollo y se puntuo la inhibicion de la aglutinacion. Los titulos se expresaron como el reciproco de la mayor dilucion de suero que inhibio completamente la hemaglutinacion. Como la primera dilucion de sueros fue 1:10, un nivel indetectable se puntua como un titulo igual a 5.
Análisis estadístico.
Los analisis estadisticos se realizaron en titulos de HI (Dia 41, antes de la exposicion) usando UNISTAT. El protocolo aplicado al analisis de la varianza puede describirse brevemente del siguiente modo:
•
Transformacion logaritmica de datos.
•
Prueba de Shapiro-Wilk en cada poblacion (grupo) con el fin de verificar la normalidad de grupos distribucion.
•
Prueba de Cochran con el fin de verificar la homogenicidad de la varianza entre las diferentes poblaciones (grupos).
•
Prueba de interaccion de ANOVA unilateral.
•
Prueba de Tukey-HSD de multiples comparaciones.
I.2.2. Monitorizacion de la temperatura corporal
Las temperaturas individuales se monitorizaron durante el periodo de exposicion a los transmisores y por el registro de telemetria. Todos los implantes se comprobaron y se restauraron y se realizo una nueva calibracion por DSI (Data Sciences International, Centaurusweg 123, 5015 TC Tilburg, Los Paises Bajos) antes de la colocacion en la cavidad intraperitoneal. Todos los animales se alojaron individualmente en jaulas individuales durante estas mediciones.
Las temperaturas se registraron cada 15 minutos 4 dias antes de la exposicion hasta 7 dias despues de la exposicion.
1.2.3. Lavados nasales
Los lavados nasales se realizaron por administracion de 5 ml de PBS en ambos orificios nasales en animales despiertos. El inoculo se recogio en una placa de Petri y se coloco en recipientes de muestra sobre nieve carbonica.
Valoración vírica en lavados nasales
Todas las muestras nasales se esterilizaron primero por filtracion a traves de filtros Spin X (Costar) para eliminar cualquier contaminacion bacteriana. 50 Il de diluciones seriadas diez veces de lavados nasales se transfirieron a placas de microtitulacion que contenian 50 Il de medio (10 pocillosNdilucion). Luego se anadieron 100 Il de celulas MDCK (2,4 x 105 celulasNml) a cada pocillo y se incubaron a 35°C durante 5-7dias.
Despues de 5-7 dias de incubacion, el medio de cultivo se extrajo suavemente y se anadieron 100 Il de un medio que contenia 1N20 de WST-1 y se incubo durante otras 18 h.
La intensidad del colorante de formazan amarillo producido tras la reduccion de WST-1 por celulas viables es proporcional al numero de celulas viables presentes en el pocillo al final del ensayo de valoracion virica y se cuantifica midiendo la absorbancia de cada pocillo a la longitud de onda apropiada (450 nanometros). El corte se define como la DO promedio de celulas de control sin infectar -0,3 DO (0,3 DO se corresponde con +N- 3 DE de la DO de celulas de control sin infectar). Una puntuacion positiva se define cuando DO es < corte y a diferencia una puntuacion negativa se define cuando DO es � corte. Los titulos de propagacion virica se determinaron por "Reed y Muench" y se expresaron como log TCID50Nml.
I.3. Procedimientos en cerdos
I.3.1. Prueba de inhibicion de la hemaglutinacion (HI)
Procedimiento de prueba.
Los titulos de anticuerpos anti-hemaglutinina para las tres cepas del virus de la gripe se determinaron usando la prueba de inhibicion de la hemaglutinacion (HI). El principio de la prueba de HI se basa en la capacidad de anticuerpos contra la gripe especificos para inhibir la hemaglutinacion de globulos rojos de pollo (RBC) por la hemaglutinina del virus de la gripe (HA). Los sueros se trataron primero con una disolucion de neuraminidasa al 25% (RDE) y se inactivaron por calor para eliminar inhibidores no especificos. Despues del pretratamiento, las diluciones dobles de sueros se incubaron con 4 unidades de hemaglutinacion de cada cepa de la gripe. Luego se anadieron los globulos rojos de pollo y se puntuo la inhibicion de la aglutinacion. Los titulos se expresaron como el reciproco de la mayor dilucion de suero que inhibio completamente la hemaglutinacion. Como la primera dilucion de sueros fue 1:10, un nivel indetectable se puntua como un titulo igual a 5.
Análisis estadístico.
Los analisis estadisticos se realizaron en titulos de HI (Dia 41, antes de la exposicion) usando UNISTAT. El protocolo aplicado al analisis de la varianza puede describirse brevemente del siguiente modo:
•
Transformacion logaritmica de datos.
•
Prueba de Shapiro-Wilk en cada poblacion (grupo) con el fin de verificar la normalidad de la distribucion de grupos.
•
Prueba de Cochran con el fin de verificar la homogenicidad de la varianza entre las diferentes poblaciones (grupos).
•
Prueba de interaccion de ANOVA unilateral.
•
Prueba de Tukey-HSD de multiples comparaciones.
I.4. Ensayos para evaluar la respuesta inmunitaria en seres humanos
I.4.1. Ensayo de inhibicion de la hemaglutinacion
La respuesta inmunitaria se determino midiendo anticuerpos de HI usando el procedimiento descrito por el Centro de colaboracion con la OMS para la gripe, Centros para el control de enfermedad, Atlanta, EE.UU. (1991).
Las mediciones de titulos de anticuerpos se realizaron en muestras de suero congeladas con un microprocedimiento normalizado y exhaustivamente validado usando 4 unidades inhibidoras de la hemaglutinacion (4 UIH) de los antigenos apropiados y una suspension de 0,5% de eritrocitos de ave. Los inhibidores de suero no especificos se eliminaron por tratamiento termico y enzima destructora de receptores.
Los sueros obtenidos se evaluaron para niveles de anticuerpos de HI. Empezando con una dilucion inicial de 1:10 se preparo una serie de dilucion (por un factor de 2) hasta una dilucion final de 1:20480. El punto final de la valoracion se tomo como la mayor etapa de dilucion que mostro inhibicion completa (100%) de la hemaglutinacion. Todos los ensayos se realizaron por duplicado.
I.4.2. Ensayo de inhibicion de la neuraminidasa
El ensayo se realizo en placas de microtitulacion recubiertas con fetuina. Se preparo una serie de dilucion doble del antisuero y se mezclo con una cantidad normalizada del virus de la gripe A H3N2, H1N1 o de la gripe B. La prueba se baso en la actividad biologica de la neuraminidasa que libera enzimaticamente acido neuraminico de fetuina. Despues de la escision del acido neuraminico terminal, la �-D-galactosa-N-acetil-galactosamina se descubrio. A los pocillos se anadio aglutinina de cacahuete marcada con peroxidasa de rabano picante (HRP) de Arachis hypogaea, que se une especificamente a las estructuras de galactosa. La cantidad de aglutinina unida puede detectarse y cuantificarse en una reaccion en sustrato con tetrametilbencidina (TMB). La mayor dilucion de anticuerpos que todavia inhibe la actividad de la neuraminidasa virica al menos el 50% se indico como el titulo de NI.
I.4.3. Ensayo de anticuerpos neutralizantes
Las mediciones de anticuerpos neutralizantes se realizaron en muestras de suero congeladas descongeladas. La neutralizacion de virus por anticuerpos contenidos en el suero se determino en un ensayo de microneutralizacion. Los sueros se usaron sin tratamiento adicional en el ensayo. Cada suero se probo por triplicado. Una cantidad de virus normalizada se mezclo con diluciones seriadas de suero y se incubo para permitir la union de los anticuerpos al virus. Luego se anadio una suspension de celulas que contenia una cantidad definida de celulas MDCK a la mezcla de virus y antisuero y se incubo a 33°C. Despues del periodo de incubacion, la replicacion del virus se visualizo por hemaglutinacion de globulos rojos de pollo. El titulo de neutralizacion al 50% de un suero se calculo mediante el procedimiento de Reed y Muench.
I.4.4. La inmunidad mediada por celula se evaluo por citometria de flujo de citocinas (CFC)
Los linfocitos T CD4 y CD8 especificos de antigeno de sangre periferica pueden reestimularse in vitro para producir IL-2, CD40L, TNF-alfa y IFN si se incuban con su correspondiente antigeno. Por consiguiente, los linfocitos T CD4 y CD8 especificos de antigeno pueden enumerarse por citometria de flujo tras el marcado por inmunofluorescencia convencional de fenotipo celular, ademas de la produccion intracelular de citocinas. En el presente estudio se usaron el antigeno de la vacuna contra la gripe, ademas de peptidos derivados de proteina de la gripe especifica, como antigeno para reestimular los linfocitos T especificos de la gripe. Los resultados se expresaron como una frecuencia de linfocito T CD4 o CD8 positivo para citocina(s) dentro de la subpoblacion de linfocitos T CD4 o CD8.
I.4.5. Procedimientos estadisticos
I.4.5.1. Criterios de valoración primarios
•
Porcentaje, intensidad y relacion con la vacunacion de signos y sintomas locales y generales esperados durante un periodo de seguimiento de 7 dias (es decir, dia de la vacunacion y 6 dias posteriores) despues de la vacunacion y global.
•
Porcentaje, intensidad y relacion con la vacunacion de signos y sintomas locales y generales inesperados durante un periodo de seguimiento de 21 dias (es decir, dia de la vacunacion y 20 dias posteriores) despues de la vacunacion y global.
•
Aparicion de acontecimientos adversos graves durante el estudio completo.
1.4.5.2. Criterios de valoración secundarios
Para la respuesta inmunitaria humoral:
Variables observadas:
•
En los dias 0 y 21: inhibicion de la hemaglutinacion del suero (HI) y titulos de anticuerpos de NI, probados por separado contra cada una de las tres cepas del virus de la gripe representadas en la vacuna (anticuerpos anti-H1N1, anti-H3N2 y anti-B).
•
En los dias 0 y 21: titulos de anticuerpos neutralizantes, probados por separado contra cada una de las tres cepas del virus de la gripe representadas en la vacuna
Variables derivadas (con intervalos de confianza del 95%):
• Titulos medios geometricos (GMT) de anticuerpos de HI en suero con intervalos de confianza del 95% (IC del 95%) antes y despues de la vacunacion
• Tasas de seroconversion� con IC del 95% en el dia 21 5 • Factores de conversion� con IC del 95% en el dia 21
•
Tasas de seroproteccion��� con IC del 95% en el dia 21
•
GMT de anticuerpos de NI en suero (con intervalos de confianza del 95%) en todos los momentos de tiempo.
Tasa de seroconversion definida como el porcentaje de vacunados que tienen al menos un aumento de cuatro veces en los titulos de HI en suero en el dia 21 en comparacion con el dia 0, para cada cepa de vacuna. 10 Factor de conversion definido como el aumento en veces en GMT de HI en suero en el dia 21 en comparacion con el dia 0, para cada cepa de vacuna. ���Tasa de proteccion definida como el porcentaje de vacunados con un titulo de HI en suero =40 despues de la vacunacion (para cada cepa de vacuna) que normalmente es aceptado como que indica proteccion.
Debe entenderse que, para algunos de los ensayos clinicos, la reactogenicidadNseguridad pueden ser criterios de 15 valoracion secundarios, y la inmunogenicidad puede ser el criterio de valoracion primario.
Para la respuesta inmune mediada por célula (CMI)
Variable observada
En los dias 0 y 21: frecuencia de celulas CD4NCD8 positivas para citocinas por 106 en pruebas diferentes. Cada prueba cuantifica la respuesta de linfocito T CD4NCD8 a:
20 • Antigeno de peptido de la gripe (pf) (la naturaleza y el origen precisos de estos antigenos necesita facilitarseNexplicarse)
•
Antigeno de la gripe fraccionado (sf)
•
Antigeno de la gripe completo (wf).
Variables derivadas:
25 • celulas que producen al menos dos citocinas diferentes (CD40L, IL-2, IFNγ, TNFα)
•
celulas que producen al menos CD40L y otra citocina (IL-2, TNFα, IFNγ)
•
celulas que producen al menos IL-2 y otra citocina (CD40L, TNFα, IFNγ)
•
celulas que producen al menos IFNγ y otra citocina (IL-2, TNFα, CD40L)
•
celulas que producen al menos TNFα y otra citocina (IL-2, CD40L, IFNγ)
30 I.3.5.3. Análisis de inmunogenicidad
El analisis de inmunogenicidad se baso en la cohorte vacunada total. Para cada uno grupo de tratamiento se calcularon los siguientes parametros (con intervalos de confianza del 95%):
• Titulos medios geometricos (GMT) de HI y titulos de anticuerpos de NI en los dias 0 y 21
• Titulos medios geometricos (GMT) de titulos de anticuerpos neutralizantes en los dias 0 y 21. 35 • Factores de conversion en el dia 21.
•
Tasas de seroconversion (SC) en el dia 21 definidas como el porcentaje de vacunados que tienen al menos un aumento de cuatro veces en los titulos de HI en suero en el dia 21 en comparacion con el dia 0.
•
Tasas de proteccion en el dia 21 definidas como el porcentaje de vacunados con un titulo de HI en suero =1:40.
40 • Se resumio la frecuencia de linfocitos T CD4NCD8 que secretan en respuesta (estadistica descriptiva) para cada grupo de vacunacion, en cada momento de tiempo (Dia 0, Dia 21) y para cada antigeno (de la gripe de peptido (pf), de la gripe fraccionado (sf) y de la gripe completo (wf)).
• Estadistica descriptiva en diferencia individual entre respuestas de momento de tiempo (despues de-antes
de) para cada uno grupo de vacunacion y cada antigeno (pf, sf, y wf) en cada una de las 5 pruebas 45 diferentes.
• Se uso una prueba no parametrica (prueba de Kruskall-Wallis) para comparar las diferencias de localizacion entre los 3 grupos y se calculo el valor de p estadistico para cada antigeno en cada una de las 5 pruebas diferentes. Todas las pruebas de significancia fueron bilaterales. Los valores de p inferiores a o iguales a 0,05 se consideraron estadisticamente significativos.
50 Ejemplo II - Preparación de las formulaciones de emulsión de aceite en agua y de adyuvante
A menos que se establezca de otro modo, la emulsion de aceiteNagua usada en los ejemplos posteriores esta
compuesta por una fase organica constituida por 2 aceites (alfa-tocoferol y escualeno) y una fase acuosa de PBS que contiene Tween 80 ™ o Polisorbato 80™ como agente emulsionante. A menos que se establezca de otro modo, las formulaciones de adyuvante de emulsion de aceite en agua usadas en los ejemplos posteriores se prepararon comprendiendo cada una el siguiente componente de emulsion de aceite en agua (concentraciones finales dadas): 2,5% de escualeno (volumenNvolumen), 2,5% de alfa-tocoferol (volumenNvolumen), 0,9% de monooleato de polioxietilensorbitano (volumenNvolumen) (Tween 80), vease el documento WO 95N17210. Esta emulsion, llamada AS03 en los ejemplos posteriores, se preparo de la siguiente forma como un concentrado doble.
II.1. Preparación de la emulsión SB62
Este procedimiento se uso en los estudios informados en las secciones de ejemplos clinicos y preclinicos. La preparacion de la emulsion SB62 se hace mezclando con fuerte agitacion una fase de aceite compuesta por componentes hidrofobos (DL-α-tocoferol y escualeno) y una fase acuosa que contiene los componentes solubles en agua (el detergente anionico Tween 80 y PBS mod (modificado), pH 6,8). Mientras se agita, la fase aceitosa (1N10 del volumen total) se transfiere a la fase acuosa (9N10 del volumen total), y la mezcla se agita durante 15 minutos a temperatura ambiente. Entonces, la mezcla resultante se somete a fuerzas de cizallamiento, impacto y cavitacion en la camara de interaccion de un microfluidizador (15000 PSI -8 ciclos, o 3 ciclos en el adyuvante usado en el ensayo clinico informado en el Ejemplo III) para producir gotitas submicrometricas (distribucion entre 100 y 200 nm). El pH resultante esta entre 6,8 ± 0,1. Entonces, la emulsion SB62 se esteriliza por filtracion a traves de un membrana de 0,22 Im y la emulsion a granel esteril se almacena refrigerada en recipientes Cupac a 2 a 8°C. Se lava con gas inerte esteril (nitrogeno o argon) en el volumen muerto del recipiente a granel final de la emulsion SB62 durante al menos 15 segundos.
La composicion final de la emulsion SB62 es del siguiente modo:
Tween 80: 1,8% (volumenNvolumen) 19,4 mgNml; escualeno: 5% (volumenNvolumen) 42,8 mgNml; α-tocoferol: 5% (volumenNvolumen) 47,5 mgNml; PBS-mod: NaCl 121 mM, KCI 2,38 mM, Na2HPO4 7,14 mM, KH2PO4 1,3 mM; pH 6,8 ± 0,1.
Ejemplo III - Ensayo clínico en una población adulta de 18-59 años de edad con una vacuna que contiene una preparación de antígeno de la gripe fraccionado y dos dosis de adyuvante AS03 (Flu-LD-004)
III.1. Introducción
Se realizo un estudio de simple ciego aleatorizado controlado de fase II en una poblacion adulta de 18-59 anos de edad en 2006 con el fin de evaluar la inmunogenicidad, seguridad y reactogenicidad de la vacuna candidata contra la gripe de dosis baja de GlaxoSmithKline Biologicals (es decir, que contiene 5 Ig de HA por cepa) con dos dosis de adyuvante AS03.
La respuesta inmunitaria humoral (es decir, anti-hemaglutinina) se midio 21 dias despues de la administracion intramuscular de una dosis de una vacuna adyuvantada con AS03. Fluarix™ se uso como referencia.
III.2. Diseño del estudio
Tres grupos de sujetos recibieron en paralelo la siguiente vacuna intramuscularmente:
•
un grupo de 100 sujetos que recibe una inyeccion de la vacuna contra la gripe de virus fraccionado de dosis baja que contiene 5 Ig de HA adyuvantada con AS03 (FluLD1N1)
•
un grupo de 100 sujetos que recibe una inyeccion de la vacuna contra la gripe de virus fraccionado de dosis baja que contiene 5 Ig de HA adyuvantada con media dosis de AS03 (AS03 1N2) (FluLD1N2)
•
un grupo de 100 sujetos que recibe una dosis de Fluarix™ (Fluarix)
Programa: una inyeccion IM de vacuna contra la gripe en el dia 0, visitas al sitio de estudio en el dia 0 y dia 21 con una recogida de muestra de sangre (determinacion de anticuerpos de HI) y un contacto telefonico adicional en el dia 30 (conclusion del estudio).
La vacuna contra la gripe fraccionada trivalente convencional Fluarix™ usada en este estudio es una vacuna comercial del hemisferio norte del ano 2006N2007 desarrollada y fabricada por GlaxoSmithKline Biologicals.
III.3. Objetivos del estudio
III.3.1. Objetivo primario
-
Evaluar la respuesta inmunitaria humoral inducida por las vacunas del estudio en terminos de titulos de anticuerpos anti-hemaglutinina:
Variables observadas en los días 0 y 21: titulos de anticuerpos de la inhibicion de la hemaglutinacion en suero.
Variables derivadas (con intervalos de confianza del 95%):
-
Titulos medios geometricos (GMT) de anticuerpos en suero en los dias 0 y 21
-
Tasas de seroconversion� en el dia 21
-
Factores de seroconversion� en el dia 21
-
Tasas de seroproteccion��� en los dias 0 y 21
5 La tasa de seroconversion para la respuesta de anticuerpos de hemaglutinina se define como el porcentaje de vacunados que tienen tanto un titulo antes de la vacunacion < 1:10 como un titulo despues de la vacunacion � 1:40
o un titulo antes de la vacunacion � 1:10 y al menos un aumento de cuatro veces en el titulo despues de la vacunacion Factor de seroconversion definido como el aumento en veces en GMT de HI en suero despues de la vacunacion 10 en comparacion con el dia 0
Tasa de seroproteccion definida como el porcentaje de vacunados con un titulo de HI en suero �1:40 despues de la vacunacion que normalmente es aceptado como que indica proteccion.
III.3.2. Objetivo secundario
-
Evaluar la seguridad y reactogenicidad de las vacunas del estudio en terminos de acontecimientos adversos 15 locales y generales esperados, acontecimientos adversos inesperados y acontecimientos adversos graves:
1.
Aparicion, intensidad y relacion con la vacunacion de signos locales y generales esperados y sintomas durante un periodo de seguimiento de 7 dias (es decir, dia de la vacunacion y 6 dias posteriores) despues de cada vacunacion en cada grupo.
2.
Aparicion, intensidad y relacion con la vacunacion de signos locales y generales inesperados y
20 sintomas durante un periodo de seguimiento de 30 dias (es decir, dia de la vacunacion y 29 dias posteriores) despues de la vacunacion en cada grupo.
3. Aparicion y relacion de acontecimientos adversos graves durante el periodo de estudio completo en cada grupo.
III.4. Composición y administración de vacunas
25 III.4.1. Preparacion de vacunas
La vacuna contra la gripe no adyuvantada es una vacuna contra la gripe inactivada de virion fraccionado trivalente que consiste en tres vacunas de antigeno virico monovalente (preparadas respectivamente a partir de las cepas de la gripe ANH1N1, ANH3N2 y B). Los antigenos presentes en esta vacuna son los mismos que en la vacuna Fluarix™ autorizada que esta disponible en el mercado como Fluarix™ (α-Rix®) desde 1992 y contiene 15 Ig de HANcepa por
30 dosis. Las cepas de la gripe incluidas en los lotes clinicos de FluLD son las cepas que se eligieron para el hemisferio norte en 2006N2007:
•
Cepa similar a ANNueva CaledoniaN20N99 (H1N1): ANNueva CaledoniaN20N99 (H1N1) IVR-116
•
Cepa similar a ANWisconsinN67N2005 (H3N2): ANWisconsinN67N2005 (H3N2) NYMCX-161
•
BNMalasiaN2506N2004.
35 Los antigenos se derivan de virus cultivados en huevos. El fraccionamiento se lleva a cabo con desoxicolato de sodio antes de la etapa de inactivacion, que se realiza mediante la posterior accion de desoxicolato de sodio y formaldehido.
La vacuna contra la gripe de dosis baja adyuvantada con AS03 (FluLD) (lotes clinicos) se basa en la vacuna Fluarix™ (comercialmente disponible preparada respectivamente a partir de las cepas de la gripe ANH1N1, ANH3N2 y 40 B), pero con un menor contenido de antigeno y adyuvantada con el sistema de adyuvante de GSK AS03. AS03 consiste en una emulsion de aceite en agua (SB62) que contiene dos aceites biodegradables, escualeno y αtocoferol (vitamina E), y un tensioactivo, polisorbato 80 (Tween 80). Los antigenos de la gripe se incorporan en la fase acuosa del sistema de adyuvante por simple mezcla con la emulsion. Se han probado dos formulaciones, que se diferencian por la cantidad de adyuvante introducida con los antigenos de la gripe en el lote de vacuna. Las 45 vacunas adyuvantadas contienen 5 Ig de hemaglutinina (HA) de cada cepa del virus de la gripe por dosis, combinada con una dosis completa (AS03) o media dosis (AS03 1N2) del sistema de adyuvante AS03. Los excipientes son los siguientes: polisorbato 80 (Tween 80), octoxinol 10 (Triton X-100), hidrogenosuccinato de alfatocoferilo, cloruro sodico, hidrogenofosfato de disodio, hidrogenofosfato de potasio, cloruro de potasio, agua para inyeccion. Las vacunas contra la gripe de dosis baja adyuvantadas con AS03 (FluLD, dosis completa o media dosis
50 de AS03) son vacunas libres de conservante. Sin embargo, contienen cantidades traza de tiomersal (< 1,25 Ig de Hg por dosis) de las fases tempranas del procedimiento de fabricacion. Ambas se presentan como vacunas de monodosis en jeringuillas precargadas de vidrio (tipo I) a un volumen de 0,5 mlNdosis.
III.4.1.1. Composición de vacuna contra la gripe adyuvantada con AS03
Una dosis de FluLD (dosis completa o media dosis de AS03) se corresponde con 0,5 ml. La composicion se 55 proporciona en la Tabla 3. El contenido de HA por dosis es 5 Ig para ambas formulaciones, siendo la unica
diferencia la cantidad de AS03 presente en los recipientes finales.
Tabla 3 Composición de vacuna contra la gripe de dosis baja adyuvantada con AS03 (dosis completa y media dosis de AS03)
Componente
Cantidad por dosis (0,5 ml)
Viriones fraccionados inactivados - ANNueva CaledoniaN20N99 (H1N1) IVR-116 - ANWisconsinN67N2005 (H3N2) NYMCX-161 - BNMalasiaN2506N2004
5 Ig de HA 5 Ig de HA 5 Ig de HA
Adyuvante (dosis completa N media dosis) - Emulsion SB62 (volumen total) • Escualeno • DL-α-tocoferol • Polisorbato 80 (Tween 80)
0,250 ml 10,70 mg N 5,35 mg 11,88 mg N 5,94 mg 4,85 mg N 2,425 mg
Polisorbato 80 (Tween 80)
0,122 mg
Octoxinol 10 (Triton X-100)
0,0283 mg
Hidrogenosuccinato de α-tocoferilo
0,01665 mg
Cloruro sodico
4 mg
Fosfato de disodio
0,575 mg
Hidrogenofosfato de potasio
0,100 mg
Cloruro de potasio
0,101 mg
Agua para inyeccion
hasta 0,50 ml
Abreviaturas: HA = Hemaglutinina. El contenido total en Polisorbato 80 se corresponde con 4,972 mg por dosis cuando se usa la dosis completa de AS03, y 2,547 mg por dosis cuando se usa media dosis de AS03.
5 III.4.1.2. Producción de preparación de antígeno de la gripe inactivado fraccionado
Los antigenos de la gripe son identicos a los incluidos en Fluarix™ (vacuna contra el virus de la gripe). Las vacunas monovalentes consisten en virus fraccionados inactivados purificados que se preparan a partir de semillas de trabajo de las tres cepas del virus de la gripe, tipo A (H1N1 y H3N2) y tipo B, que se cultivan individualmente en huevos de gallina embrionados. Estas semillas de trabajo se derivan de cepas que se recibieron de un centro colaborador con
10 la OMS siguiendo las recomendaciones de la OMS anuales. Para el procedimiento para preparar los antigenos se hace referencia a modo de ilustracion al documento WO 02N097072. Los volumenes de las tres vacunas monovalentes se basan en el contenido de HA medido en cada vacuna monovalente antes de la formulacion y en el volumen de fabricacion diana.
Una solucion salina tamponada con fosfato concentrada 10 veces (pH 7,4 cuando se concentra 1 vez) y una pre
15 mezcla de Tween 80 e hidrogenosuccinato de α-tocoferilo se diluyen en agua para inyeccion, seguido de agitacion durante 5-30 minutos a temperatura ambiente.
Entonces, las tres vacunas monovalentes concentradas se diluyen sucesivamente en la disolucion resultante de solucion salina tamponada con fosfato N Tween 80 - hidrogenosuccinato de α-tocoferilo a una concentracion de
20 Ig de HA de cada vacuna monovalente de A (H1N1, H3N2) 23,32 Ig de HA de la vacuna monovalente de B
5 por ml de vacuna trivalente intermedia (5 Ig de HA de cada vacuna monovalente de A y 5,83 Ig de HA de B N 500 Il de vacuna final trivalente).
Entre las adiciones de cada vacuna monovalente, la mezcla se agita durante 10 -30 minutos a temperatura ambiente y durante 15 - 30 minutos despues de la adicion de la ultima vacuna monovalente. Esta vacuna trivalente intermedia tambien denominada en lo sucesivo "pre-mezcla" puede mantenerse a +2 -+8°C o adicionalmente
10 procesarse a la etapa de formulacion final en el mismo dia. El volumen final del pre-mezcla es 250 Il por dosis.
III.4.1.3. Preparación de las composiciones de vacuna con adyuvante AS03
Vacuna adyuvantada: LD AS03 1N1 (Tabla 4)
PBS mod concentrado 10 veces (pH 7,4 cuando se concentra una vez; NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, Na2HPO4 8,1 mM, KH2PO4 1,47 mM, pH 7,4), ademas de una mezcla que contiene Tween 80, Triton X-100 y VES (cantidades 15 teniendo en cuenta el detergente presente en las cepas), se anaden a agua para inyeccion. Despues de 5 a 30 minutos de agitacion, 20 Ig de HA por ml de cada cepa H1N1 y H3N2 y 23,32 Ig de HA por ml de cepa B se anaden con 10 a 30 minutos de agitacion entre cada adicion. Despues de 15 a 30 minutos de agitacion, un pequeno volumen de la llamada "vacuna intermedia" se desecha para analisis y se guarda entre +2 y +8°C. La vacuna intermedia esta en PBS mod concentrado 1 vez. La concentracion de detergente diana son 488 Ig de Tween 80 por
20 ml, 73,6 Ig de Triton X-100 por ml y 66,6 Ig de VES por ml.
Entonces se prepara la formulacion final: un volumen igual de SB62 (vease la preparacion en el Ejemplo II) se anade a cada 250 Il de vacuna intermedia de pre-mezcla y se mezcla durante 30 a 60 minutos a temperatura ambiente. El pH se comprueba para que oscile entre 6,8 y 7,5. La formulacion se lava con nitrogeno y luego se guarda entre +2 y 8°C antes de envasarse.
25 Tabla 4 Vacuna de dosis baja adyuvantada con AS03
Componente
Concentración Volumen (ml)
Etapa 1: Pre-mezcla
Vacuna monovalente de ANNueva Caledonia
104 IgNml 302,88
Vacuna monovalente de ANWisconsin
85 IgNml 370,59
Vacuna monovalente de BNMalasia
110 IgNml 333,90
PBS mod(1)
Vease la nota a pie de pagina 56,76
Tween 80
48000 IgNml 5,24
Triton X-100
Residuo de la cepa H3N2
Hidrogenosuccinato de α-tocoferilo
26480 IgNml 1,2
Agua filtrada
504,43
Volumenes totales = 1575 (ml) Se recuperan 75 ml de muestras de pre-mezcla para las pruebas Volumen de pre-mezcla restante = 1500 (ml)
Etapa 2: Añadido a pre-mezcla
Emulsion
1500
Volúmenes totales de vacuna final = 3000 (ml)
(1): La composicion a granel final del tampon es: NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, Na2HPO4 8,1 mM, KH2PO4 1,47 mM, pH 7,4
Vacuna adyuvantada: LD AS03 1N2 (Tabla 5)
PBS mod concentrado 10 veces (pH 7,4 cuando se concentra una vez - vease la composicion anterior), ademas de una mezcla que contiene Tween 80, Triton X-100 y VES (cantidades teniendo en cuenta el detergente presente en las cepas), se anaden a agua para inyeccion. Despues de 5 a 30 minutos de agitacion, 20 Ig de HA por ml de cada
5 cepa H1N1 y H3N2 y 23,32 Ig de HA por ml de cepa B se anaden con 10 a 30 minutos de agitacion entre cada adicion. Despues de 15 a 30 minutos de agitacion, un pequeno volumen de la llamada "vacuna intermedia" se desecha para analisis y se guarda entre +2 y +8°C. PBS mod se concentra 1 vez en la vacuna intermedia. La concentracion de detergente diana son 488 Ig de Tween 80 por ml, 73,6 Ig de Triton X-100 por ml y 66,6 Ig de VES por ml.
10 Entonces se prepara la formulacion final: SB62 se diluye primero con el tampon PBS mod y se agita durante 15 - 30 minutos a TA. Luego se anade un volumen igual de esta SB62 diluido a cada 250 Il de pre-mezcla de vacuna intermedia. Despues de 30 a 60 minutos de agitacion a TA, el pH se comprueba para que oscile entre 6,8 y 7,5. La formulacion se lava con nitrogeno y luego se guarda entre +2 y 8°C antes de envasarse.
El volumen final de ambas formulaciones es 500 Il por dosis y la concentracion de HA final es 10 Ig de cada vacuna
15 monovalente de A y 11,66 Ig de la vacuna monovalente de B por ml de vacuna final trivalente. Las concentraciones diana finales de Tween 80, Triton X-100 (residuo de la fabricacion de la vacuna monovalente H3N2) e hidrogenosuccinato de α-tocoferilo (el hidrogenosuccinato de α-tocoferilo es una forma de ester de RRR(isomero D)α-tocoferol) son 244 IgNml, 58,6 IgNml y 33,3 IgNml, respectivamente.
Tabla 5 Vacuna de dosis baja adyuvantada con AS03 (media dosis de adyuvante)
Componente
Concentración Volumen (ml)
Etapa 1: Pre-mezcla
Etapa 1: Pre-mezcla Vacuna monovalente de ANNueva Caledonia
104 IgNml 300,96
Vacuna monovalente de ANWisconsin
85 IgNml 368,24
Vacuna monovalente de BNMalasia
110 IgNml 331,78
PBS mod(1)
Vease la leyenda 56,4
Tween 80
48000 IgNml 5,2
Triton X-100
Residuo de la cepa H3N2
Hidrogenosuccinato de α-tocoferilo
26480 IgNml 1,2
Agua filtrada
501,22
Volumenes totales = 1565 (ml) Se recuperan 65 ml de pre-mezcla para las pruebas Volumen de pre-mezcla restante = 1500 (ml)
Etapa 2: Añadido a pre-mezcla
Emulsion SB62
750
PBS mod(1)
Vease la leyenda 75
Agua filtrada
675
Volúmenes totales de vacuna final = 3000 (ml)
(1): La composicion a granel final del tampon es: NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, Na2HPO4 8,1 mM, KH2PO4 1,47 mM, pH 7,4
20 III.4.2. Administracion de vacunas La vacuna se envasa en jeringuillas de vidrio de tipo I esteriles de 1,25 ml (Ph. Eur.). Cada jeringuilla esta cargada a un objetivo de 0,57 ml (intervalo: 0,54-0,60 ml). Las vacunas se administraron intramuscularmente en la region 41
deltoide del brazo no dominante. Todas las vacunas estuvieron presentes como jeringuillas precargadas (0,5 ml). Con el fin de garantizar la apropiada inyeccion IM de la vacuna se uso una aguja de al menos 25G y al menos 2,5 cm de longitud.
III.5 Resultados de las poblaciones en estudio
5 Un total de 300 sujetos se enrolaron en este estudio: 100 sujetos en cada uno de los 3 grupos. La edad media de la cohorte vacunada total en el momento de la vacunacion fue 36,7 anos con una desviacion estandar de 13,67 anos. La edad media y la distribucion por sexo de los sujetos a traves de los 3 grupos de vacuna fueron similares.
III.6 Resultados de inmunogenicidad
El analisis de inmunogenicidad se realizo en la cohorte de ATP para inmunogenicidad (297 sujetos).
10 Respuesta inmunitaria humoral
Con el fin de evaluar la respuesta inmunitaria humoral inducida por la vacuna candidata contra la gripe de dosis baja adyuvantada con AS03 se calcularon los siguientes parametros (con intervalos de confianza del 95%) para cada grupo de tratamiento:
• Titulos medios geometricos (GMT) de titulos de anticuerpos de HI en los dias 0 y 21; 15 • Tasas de seroconversion (SC) en los dias 21;
•
Factores de conversion en el dia 21;
•
Tasas de proteccion en el dia 0 y 21.
III.6.1 HI Títulos medios geométricos (GMT)
Los GMT para anticuerpos de HI con IC del 95% se muestran en la Tabla 6 y la Figura 1. Las relaciones de GMT 20 ajustadas entre grupos se muestran en la Tabla 7.
Los GMT antes de la vacunacion de anticuerpos de HI para las 3 cepas de vacuna estuvieron dentro del mismo intervalo en los 3 grupos de tratamiento. Los GMT observados en el dia 21 para grupos adyuvantados tienden a ser mayores que en el grupo de Fluarix para las 3 cepas con una diferencia estadistica (sin solapamiento del IC del 95% y la relacion de GMT ajustada no contuvo el valor 1) entre FluLD1N1 y Fluarix para la cepa de la vacuna ANWisconsin.
25 Una diferencia estadistica (la relacion de GMT ajustada no contuvo el valor 1) tambien se observo entre FluLD1N2 y Fluarix para la cepa de la vacuna BNMalasia.
Tabla 6 - Tasas de seropositividad y títulos medios geométricos (GMT) para anticuerpo anti-HA en el día 0 y 21 (cohorte de ATP para inmunogenicidad)
Anticuerpo
Grupo Momento N � 10 1/DIL n % IC del 95% LI LS 1/DL GMT IC del 95% LI LS Mín Máx
A/Nueva Caledonia
FluLD1N1 PRE 99 80 80,8 71,7 88,0 31,9 23,5 43,4 <10,0 2560,0
PI (D21)
99 99 100 96,3 100 475,4 352,2 641,6 20,0 7240,0
FluLD1N2
PRE 99 80 80,8 71,7 88,0 36,1 26,9 48,5 <10,0 3620,0
PI (D21)
99 98 99,0 94,5 100 399,0 294,7 540,2 <10,0 7240,0
Fluarix
PRE 98 85 86,7 78,4 92,7 26,1 20,5 33,2 <10,0 1280,0
PI (D21)
98 98 100 96,3 100 380,6 274,2 528,4 10,0 7240,0
A/Wisconsin
FluLD1N1 PRE 99 61 61,6 51,3 71,2 16,8 13,1 21,5 <10,0 453,0
PI (D21)
99 99 100 96,3 100 276,2 223,5 341,3 28,0 5120,0
FluLD1N2
PRE 99 66 66,7 56,5 75,8 19,9 15,2 25,9 <10,0 640,0
PI (D21)
99 99 100 96,3 100 241,9 192,9 303,4 20,0 5120,0
Fluarix
PRE 98 58 59,2 48,8 69,0 14,7 11,6 18,6 <10,0 320,0
PI (D21)
98 97 99,0 94,4 100 172,3 136,4 217,6 <10,0 5120,0
(continuacion)
B/Malasia
FluLD1N1 PRE PI (D21) 99 99 72 99 72,7 100 62,9 96,3 81,2 100 20,4 268,6 15,9 221,3 26,1 326,0 <10,0 28,0 453,0 2560,0
FluLD1N2 PRE
PI (D21) 99 99 76 99 76,8 100 67,2 96,3 84,7 100 22,2 301,5 17,6 246,1 27,9 369,4 <10,0 28,0 320,0 3620,0
Fluarix
PRE PI (D21) 98 98 76 97 77,6 99,0 68,0 94,4 85,4 100 26,5 219,2 20,9 171,4 33,6 280,2 <10,0 <10,0 320,0 5120,0
FluLD1N1 = Vacuna contra la gripe de dosis baja (5 ug de HANcepa) con dosis completa de adyuvante AS03 FluLD1N2 = Vacuna contra la gripe de dosis baja (5 ug de HANcepa) con media dosis de adyuvante AS03 Fluarix = Vacuna Fluarix GMT = Titulo de anticuerpos medio geometrico N = Numero de sujetos con resultados disponibles nN% = NumeroNporcentaje de sujetos seropositivos (titulo de HI �= 1:10) IC del 95% = Intervalo de confianza del 95%, LI = Limite inferior, LS = Limite superior MinNMax = MinimoNMaximo PRE = Antes de la vacunacion en el dia 0 PI (D21) = Despues de la vacunacion en el dia 21
TABLA 7 - Relaciones de GMT ajustadas entre grupos para cada cepa de vacuna en el día 21 (cohorte de ATP para inmunogenicidad)
Anticuerpo
Descripción del grupo N GMT ajustado Descripción delgrupo N GMT ajustado Relación de GMT ajustadaOrden de relación Valor IC del 95%LI LS
A/Nueva Caledonia(1/DIL)
FluLD1N1 FluLD1N1 FluLD1N2 999999 472,4472,3385,0 FluLD1N2 FluarixFluarix 999898 385,0396,9397,0 FluLD1N1 NFluLD1N2 FluLD1N1 N Fluarix FluLD1N2 N Fluarix 1,231,190,97 0,800,780,63 1,881,821,49
A/Wisconsin(1/DIL)
FluLD1N1 FluLD1N1 FluLD1N2 999999 277,3277,5230,0 FluLD1N2 FluarixFluarix 999898 230,0180,8180,6 FluLD1N1 NFluLD1N2 FluLD1N1 N Fluarix FluLD1N2 N Fluarix 1,211,541,27 0,901,140,95 1,622,061,71
B/Malasia(1/DIL)
FluLD1N1 FluLD1N1 FluLD1N2 999999 275,1275,2303,4 FluLD1N2 FluarixFluarix 999898 303,4212,7212,6 FluLD1N1 NFluLD1N2 FluLD1N1 N Fluarix FluLD1N2 N Fluarix 0,911,291,43 0,680,961,06 1,221,741,92
FluLD1N1 = Vacuna contra la gripe de dosis baja (5 ug de HANcepa) con dosis completa de adyuvante AS03FluLD1N2 = Vacuna contra la gripe de dosis baja (5 ug de HANcepa) con media dosis de adyuvante AS03Fluarix = Vacuna FluarixGMT ajustado = titulo de anticuerpos medio geometrico ajustado para titulo inicialN = Numero de sujetos con resultados disponibles tanto antes como despues de la vacunacionIC del 95% = Intervalo de confianza del 95% para la relacion de GMT ajustada (modelo de Ancova: ajuste para titulo inicial -varianza del conjunto con mas de 2grupos); LI = Limite inferior, LS = Limite superior
III.6.2 Factores de seroconversión de títulos de anticuerpos anti-HI, tasas de seroprotección y tasas de seroconversión (establece una correlación con la protección como se establece para la vacuna contra la gripe en seres humanos)
Los resultados se presentan en la Tabla 8 - Figura 2 para tasas de seroproteccion, Tabla 9 - Figura 3 para tasas de seroconversion y Tabla 10 -Figura 4 para factores de conversion.
El umbral requerido por las autoridades europeas para las tasas de seroproteccion (70%) se alcanzo en todos los grupos (al menos el 94,9%). Para cada cepa de vacuna, las tasas de seroproteccion en el dia 21 para los 3 grupos estuvieron dentro del mismo intervalo.
El umbral requerido por las autoridades europeas para las tasas de seroconversion (40%) se alcanzo en todos los grupos (al menos el 65%).
Para la cepa de la vacuna ANNueva Caledonia, las SCR en el dia 21 para los 3 grupos estuvieron dentro del mismo intervalo.
Para la cepa de la vacuna ANWisconsin, la SCR en el dia 21 para el grupo de FIuLD1N1 tendio a ser mayor en comparacion con el grupo de Fluarix. La SCR en el dia 21 para el grupo de FluLD1N2 estuvo dentro del mismo intervalo en comparacion con el grupo de Fluarix.
Para la cepa de vacuna BNMalasia, la SCR en el dia 21 para el grupo de FluLD1N2 tendio a ser mayor en comparacion con el grupo de Fluarix. La SCR en el dia 21 para el grupo de FluLD1N1 estuvo dentro del mismo intervalo en comparacion con el grupo de Fluarix.
El umbral requerido por las autoridades europeas para los factores de seroconversion (2,5) se alcanzo en todos los grupos (al menos 6,2).
Para the cepa de la vacuna ANNueva Caledonia, el SCF en el dia 21 para los 3 grupos parecio estar dentro del mismo intervalo. El valor observado para el grupo de FluLD1N2 fue inferior al valor observado para el grupo de Fluarix, pero pudo explicarse por la mayor tasa de seroproteccion antes de la vacunacion en el grupo de FluLD1N2.
Para la cepa de la vacuna ANWisconsin, el SCF en el dia 21 para el grupo de FluLD1N1 tendio a ser mayor en comparacion con el grupo de Fluarix. El SCF en el dia 21 para el grupo de FluLD1N2 estuvo dentro del mismo intervalo en comparacion con el grupo de Fluarix.
Para la cepa de vacuna BNMalasia, el SCF en el dia 21 para los dos grupos adyuvantados tendio a ser mayor en comparacion con el grupo de Fluarix.
TABLA 8 - Tasas de seroprotección (SPR) para título de anticuerpos de HI en el día 0 y día 21 (cohorte de ATP para inmunogenicidad)
Cepa de la vacuna
Grupo Momento N n % SPR IC del 95% LI LS
A/Nueva Caledonia
FluLD1N1 PRE 99 41 41,4 31,6 51,8
PI (D21)
99 95 96,0 90,0 98,9
FluLD1N2
PRE 99 55 55,6 45,2 65,5
PI (D21)
99 97 98,0 92,9 99,8
Fluarix
PRE 98 35 35,7 26,3 46,0
PI (D21)
98 93 94,9 88,5 98,3
(continuacion)
Cepa de la vacuna
Grupo Momento N SPR n % IC del 95% LI LS
A/Wisconsin
FluLD1N1 PRE PI (D21) 99 99 32 97 32,3 98,0 23,3 92,9 42,5 99,8
FluLD1N2
PRE PI (D21) 99 99 37 97 37,4 98,0 27,9 92,9 47,7 99,8
Fluarix
PRE PI (D21) 98 98 25 93 25,5 94,9 17,2 88,5 35,3 98,3
B/Malasia
FluLD1N1 PRE PI (D21) 99 99 31 97 31,3 98,0 22,4 92,9 41,4 99,8
FluLD1N2
PRE PI (D21) 99 99 39 98 39,4 99,0 29,7 94,5 49,7 100
Fluarix
PRE PI (D21) 98 98 44 94 44,9 95,9 34,8 89,9 55,3 98,9
FluLD1N1 = Vacuna contra la gripe de dosis baja (5 ug de HANcepa) con dosis completa de adyuvante AS03 FluLD1N2 = Vacuna contra la gripe de dosis baja (5 ug de HANcepa) con media dosis de adyuvante AS03 Fluarix = Vacuna Fluarix N = Numero de sujetos con resultados disponibles nN% = NumeroNporcentaje de sujetos seroprotegidos (titulo de HI �= 40 1NDIL) IC del 95% = Intervalo de confianza del 95%, LI = Limite inferior, LS = Limite superior PRE = Antes de la vacunacion en el dia 0 PI (D1) = Despues de la vacunacion en el dia 21 Fuente de datos = Tabla IIIA del apendice
TABLA 9 - Tasa de seroconversión (SCR) para título de anticuerpos de HI en el día 21 (cohorte de ATP para inmunogenicidad)
Cepa de la vacuna
Grupo N SCR
n
% IC del 95%
LI
LS
A/Nueva Caledonia
FluLD1N1 FluLD1N2 99 99 69 64 69,7 64,6 59,6 54,4 78,5 74,0
Fluarix
98 66 67,3 57,1 76,5
A/Wisconsin
FluLD1N1 99 88 88,9 81,0 94,3
FluLD1N2
99 79 79,8 70,5 87,2
Fluarix
98 73 74,5 64,7 82,8
(continuacion)
B/Malasia
FluLD1N1 FluLD1N2 Fluarix 99 99 98 76 82 65 76,8 82,8 66,3 67,2 73,9 56,1 84,7 89,7 75,6
FluLD1N1 = Vacuna contra la gripe de dosis baja (5 ug de HANcepa) con dosis completa de adyuvante AS03 FluLD1N2 = Vacuna contra la gripe de dosis baja (5 ug de HANcepa) con media dosis de adyuvante AS03 Fluarix = Vacuna Fluarix Seroconversion definida como: Para sujetos inicialmente seronegativos, titulo de anticuerpos �= 40 1NDIL despues de la vacunacion Para sujetos inicialmente seropositivos, titulo de anticuerpos despues de la vacunacion �= 4 veces el titulo de anticuerpos antes de la vacunacion N = Numero de sujetos con resultados disponibles antes y despues de la vacunacion nN% = NumeroNporcentaje de sujetos seroconvertidos IC del 95% = Intervalo de confianza del 95%, LI = Limite inferior, LS = Limite superior

TABLA 10 - Factor de seroconversión (SCF) para título de anticuerpos de HI en el día 21 (cohorte de ATP para inmunogenicidad)
Cepa de la vacuna
Grupo N SCF Valor IC del 95% LI LS
A/Nueva Caledonia
FluLD1N1 FluLD1N2 Fluarix 99 99 98 14,9 11,0 14,6 10,4 7,7 9,9 21,3 15,9 21,6
A/Wisconsin
FluLD1N1 FluLD1N2 Fluarix 99 99 98 16,5 12,2 11,7 13,0 9,2 8,8 20,9 16,1 15,6
B/Malasia
FluLD1N1 FluLD1N2 Fluarix 99 99 98 13,2 13,6 8,3 10,0 10,2 6,2 17,4 18,0 11,0
FluLD1N1 = Vacuna contra la gripe de dosis baja (5 ug de HANcepa) con dosis completa de adyuvante AS03 FluLD1N2 = Vacuna contra la gripe de dosis baja (5 ug de HANcepa) con media dosis de adyuvante AS03 Fluarix = Vacuna Fluarix N = Numero de sujetos con resultados disponibles antes y despues de la vacunacion SCF = Factor de seroconversion o relacion media geometrica (media[log10(PI (D21)NPRE)]) IC del 95% = Intervalo de confianza del 95%, LI = Limite inferior, LS = Limite superior
III.7 Conclusiones de seguridad
Una mayor reactogenicidad en terminos de sintomas esperados (localesNgenerales) e inesperados en los grupos de vacuna adyuvantada en comparacion con el grupo de Fluarix fue la tendencia global observada en este estudio. Una reduccion del contenido de AS03 en la vacuna adyuvantada tiene un impacto significativo sobre todos los sintomas de grado 3 generales y locales.
La aparicion de sintomas inesperados tendio a ser mayor en los grupos de vacuna adyuvantada (55% y 47% de sujetos) en comparacion con el grupo de Fluarix (35%).
De estos resultados puede concluirse que la perfil de reactogenicidad y de seguridad de las vacunas candidatas es satisfactorio y clinicamente aceptable.
III.8. Conclusiones globales
III.8.1. Resultados de inmunogenicidad
El objetivo primario de este estudio fue evaluar la respuesta inmunitaria humoral (titulos de anticuerpos anti-HI) provocada por la vacuna contra la gripe de dosis baja con dos concentraciones de adyuvante AS03 diferentes, y por Fluarix.
En el dia 21, las tres vacunas sobrepasaron los requisitos de las autoridades europeas para el registro anual de vacunas contra la gripe de virion fraccionado ("Nota orientativa para la armonizacion de requisitos para vacunas contra la gripe" para la evaluacion inmunologica de los cambios de cepas anuales -CPMPNBWPN214N96). Los GMT tendieron a ser mayores en los grupos adyuvantados en comparacion con el grupo de Fluarix, con una diferencia estadisticamente significativa observada para las cepas de la vacuna ANWisconsin (FluLD1N1 frente a Fluarix) y BNMalasia (FluLD1N2 frente a Fluarix). Se observaron tasas de seroproteccion similares en los tres grupos de vacuna que oscilan del 94,9% al 99%. Se observo que las tasas de seroconversion y los factores de seroconversion eran mayores en los grupos adyuvantados que en el grupo de Fluarix. Los datos de este ensayo tambien revelaron que la inmunogenicidad inducida por la vacuna con media dosificacion de adyuvante AS03 era comparable a la inducida con la dosis completa de adyuvante.
IIII.8.2. Resultados de reactogenicidad y de seguridad
La administracion del vacuna candidata contra la gripe de dosis baja adyuvantada con AS03 fue segura y clinicamente bien tolerada en la poblacion en estudio, es decir, personas adultas de edades entre 18 y 59 anos. La vacuna adyuvantada de media dosis mostro una marcada disminucion en la incidencia de sintomas locales y generales esperados en comparacion con la vacuna adyuvantada de dosis completa.
Ejemplo IV - Evaluación preclínica de vacunas contra la gripe fraccionadas adyuvantadas y no adyuvantadas (que comprenden diversas dosis de adyuvante AS03) en ratones BALB/c sensibilizados
IV.1. Diseño experimental y objetivo
Los experimentos en ratones sensibilizados a la gripe se realizaron con el fin de evaluar el aumento en las respuestas humorales por AS03 inducidas por vacunas contra la gripe formuladas con este adyuvante de aceite en agua. Para estar proximo a la situacion humana (las personas son seropositivas debido a una infeccion repetida con cepas desviadas aproximadamente cada dos anos), este experimento se realizo usando animales que fueron sensibilizados con cepas heterosubtipicas. La sensibilizacion heterosubtipica tambien es un modelo mas riguroso en comparacion con la sensibilizacion con cepas homotipicas y es un mejor modelo para discriminar entre diferentes adyuvantes.
IV.1.1. TratamientoNgrupo (Tabla 11)
Grupos de 27 ratones BALBNc hembra adultos se sensibilizaron intranasalmente (20 Il de volumen) en el dia 0 con virus de la gripe inactivado con formalina completo trivalente (5 Ig de HA para cada cepa). Las cepas de sensibilizacion consistieron en variantes de desviacion anteriores (5 Ig de HA para H1N1 ANJohannesburgoN82N96, H3N2 ANSidneyN5N97, BNHarbinN7N94 inactivadas completas) a las incluidas en la vacuna. Veintiocho dias despues, los ratones se vacunaron con una dosis unica del candidato a vacuna intramuscularmente en un volumen total de 50 Il. Los ratones se inmunizaron con formulaciones que contenian antigenos fraccionados solos (simples fraccionados trivalentes) o formulaciones que contenian antigenos fraccionados adyuvantados con dos dosis de AS03 (completa
o 1N5). Las cepas usadas para las inmunizaciones incluyeron antigenos viricos de H1N1 ANNueva CaledoniaN20N99, H3N2 ANPanamaN2007N99, BNShandongN7N97 (1,5 IgNcepa, 1N10 de la dosis humana).
Tabla 11
Gr
Antigeno N formulacion Otro tratamiento
1
Fraccionado trivalente N simple (no adyuvantada) Sensibilizacion heterologa D0
2
Fraccionado trivalente N AS03 Sensibilizacion heterologa D0
3
Fraccionado trivalente N AS03 1N5 Sensibilizacion heterologa D0
IV.1.2. Preparacion de las formulaciones de vacuna
Una premezcla de Tween 80, Triton X100 y succinato de vitamina E (VES) se prepara con el fin de alcanzar una concentracion final en la vacuna de 750 IgNml de Tween 80, 110 IgNml de Triton X100 y 100 IgNml de VES. Las cantidades usadas en la premezcla en se calculan teniendo en cuenta las cantidades de detergente y VES ya presentes en las cepas.
Preparacion de un litro de tampon de solucion salina concentrado 10 veces (PBS a pH 7,4): a 0,800 I de agua para inyeccion, anadir NaCl 80 g, KCI 2 g, Na2HPO4 11,44 g, KH2PO4 2 g. Despues de la solubilizacion, ajustar a 1,0 l con agua para inyeccion. El pH sera 7,4 cuando se diluya 10 veces.
Fraccionada trivalente / simple
La formulacion de una dosis de 50 Il se prepara extemporaneamente segun la secuencia: agua para inyeccion + tampon de solucion salina (PBS concentrado 10 veces a pH 7,4) + premezcla, 5 min de agitacion magnetica a temperatura ambiente, + 1,5 Ig de HA para la cepa H1N1, 10 min de agitacion magnetica a temperatura ambiente, + 1,5 Ig de HA para la cepa H3N2, 10 min de agitacion magnetica a temperatura ambiente, + 1,5 Ig de HA de la cepa B, 15 min de agitacion magnetica a temperatura ambiente. Las formulaciones se inyectan dentro de la hora siguiente al fin de su preparacion.
Fraccionada trivalente /AS03
Una premezcla de Tween 80, Triton X100 y succinato de vitamina E (VES) se prepara con el fin de alcanzar una concentracion final en la vacuna de 750 IgNml de Tween 80, 110 IgNm de Triton X100 y 100 IgNml de VES. Las cantidades usadas en la premezcla se calculan teniendo en cuenta las cantidades de detergente y VES ya presentes en las cepas.
La formulacion de una dosis de 50 Il se prepara extemporaneamente segun la secuencia: agua para inyeccion + tampon de solucion salina (PBS concentrado 10 veces a pH 7,4) + premezcla, 5 min de agitacion magnetica a temperatura ambiente, + 1,5 Ig de HA para la cepa H1N1, 10 min de agitacion magnetica a temperatura ambiente, + 1,5 Ig de HA para la cepa H3N2, 10 min de agitacion magnetica a temperatura ambiente, + 1,5 Ig de HA de la cepa B, 15 min de agitacion magnetica a temperatura ambiente, + 25 Il de emulsion SB62 para la dosis completa de AS03 o 5 Il de emulsion SB62 para 1N5 de dosis de AS03, 15 min de agitacion magnetica a temperatura ambiente. Las formulaciones se inyectan dentro de la hora siguiente al fin de su preparacion.
IV.1.3. Lecturas (Tabla 12)
La respuesta inmunitaria humoral a la vacunacion se midio antes de la inmunizacion (dia 28) y 14 dias despues de la inmunizacion (27 ratonesNgrupo). Las muestras de suero se probaron por la prueba de inhibicion de la hemaglutinacion (HI).
Tabla 12
Lectura
Momento de tiempo Tipo de muestra Procedimiento de analisis
Respuesta humoral
D28, D42 Sueros IHA
IV.2. Resultados
IV.2.1. Inmunidad humoral
Los resultados se presentan en la Figura 5. En este modelo de raton de sensibilizacion heterosubtipica seguida de una unica vacunacion se mostro que AS03 y diluciones del mismo inducian mayores titulos de HI en comparacion con la vacuna simple. Para todas las cepas de la gripe A se observo un aumento estadisticamente significativo de titulos de HI (p < 0,05). Para la cepa H1N1 tambien se observo una diferencia significativa en titulos de HI entre AS03 y AS03 1N5 (p < 0,05). Una dosis reducida de AS03 fracaso en aumentar los titulos de HI para la cepa B en
comparacion con la vacuna simple. Se observaron respuestas muy bajas contra la cepa B (BNShandong); esto es probablemente debido a la significativa desviacion antigenica entre la cepa B usada para la sensibilizacion y la vacuna.
IV.3. Resumen de resultados y conclusiones
En conclusion, se observo un aumento en titulos de HI en animales sensibilizados con cepas heterosubtipicas cuando se usaron vacunas adyuvantadas con AS03 en comparacion con la vacuna simple. Una dosis completa de AS03 fue optima para obtener titulos de HI robustos contra las tres cepas de la vacuna contra la gripe.
Ejemplo V - Evaluación preclínica de vacunas contra la gripe fraccionadas adyuvantadas y no adyuvantadas (que comprenden diversas dosis de adyuvante AS03) en ratones C57BI/6 sensibilizados
V.1. Diseño experimental y objetivo
Los experimentos en ratones sensibilizados a la gripe se realizaron con el fin de evaluar el aumento en respuestas humorales y celulares por AS03 inducidas por vacunas contra la gripe formuladas con este adyuvante de aceite en agua.
Para simular la situacion humana se realizo un experimento usando ratones sensibilizados con cepas heterosubtipicas.
V.1.1. TratamientoNgrupo (Tabla 13)
Grupos de 25 ratones C57BIN6 hembra adultos se sensibilizaron intranasalmente (20 Il de volumen) en el dia 0 con virus de la gripe inactivado con formalina completo trivalente (5 Ig de HA para cada cepa). Las cepas de sensibilizacion consistieron en variantes de desviacion anteriores (5 Ig de HA para H1N1 ANPekinN262N95, H3N2 ANPanamaN2007N99, BNShandongN7N97 inactivadas completas) a las incluidas en la vacuna. Veintiocho dias despues, los ratones se vacunaron con una dosis unica del candidato a vacuna intramuscularmente en un volumen total de 100 Il. Los ratones se inmunizaron con formulaciones que contenian antigenos fraccionados solos (simples fraccionados trivalentes) o formulaciones que contenian antigenos fraccionados adyuvantados con tres dosis de AS03 (completa, 1N2 o 1N5). Las cepas usadas para las inmunizaciones incluyeron antigenos viricos de H1N1 ANNueva CaledoniaN20N99, H3N2 ANNueva YorkN55N2004, BNJiangsuN10N2003 (1,5 IgNcepa, 1N10 de la dosis humana).
Tabla 13
Gr
Antigeno N formulacion Otro tratamiento
1
Fraccionado trivalente N simple (no adyuvantada) Sensibilizacion heterologa D0
2
Fraccionado trivalente N AS03 Sensibilizacion heterologa D0
3
Fraccionado trivalente N AS03 1N2 Sensibilizacion heterologa D0
4
Fraccionado trivalente N AS03 1N5 Sensibilizacion heterologa D0
5
PBS Sensibilizacion heterologa D0
V.1.2. Preparacion de las formulaciones de vacuna
Fraccionada trivalente / simple
Las formulaciones para una dosis de 100 Il se preparan extemporaneamente segun la secuencia: agua para inyeccion + tampon de solucion salina (PBS concentrado 10 veces a pH 7,4 preparado como se ensena en el Ejemplo IV) + lote de Fluarix DFLUA014 (1,5 Ig por cepa en la dosis final).
Fraccionada trivalente /AS03
Las formulaciones para una dosis de 100 Il se preparan extemporaneamente segun la secuencia: agua para inyeccion + tampon de solucion salina (PBS concentrado 10 veces a pH 7,4 preparado como se ensena en el Ejemplo IV) + lote de Fluarix DFLUA014 (1,5 Ig por cepa en la dosis final) + 25 Il de emulsion SB62 para la dosis completa o 12,5 Il de emulsion SB62 para la mitad de la dosis o 5 Il de emulsion SB62 para 1N5 de la dosis. Las formulaciones se inyectan dentro de la hora siguiente al fin de la preparacion.
V.1.3. Lecturas (Tabla 14)
La respuesta inmunitaria humoral a la vacunacion se midio 21 dias despues de la inmunizacion (10 ratonesNgrupo) y las muestras de suero se probaron por la prueba de inhibicion de la hemaglutinacion (HI). La respuesta inmunitaria
celular (15 ratones por grupo) se probo 7 dias despues de la inmunizacion por tincion intracelular de citocinas (ICS).
Tabla 14
Momento de tiempo de la lectura
Tipo de muestra Procedimiento de analisis
Respuesta humoral D49
Sueros IHA
Respuesta celular D35
PBMC ICS
V.2. Resultados
V.2.1. Inmunidad humoral (10 ratonesNgrupo).
Los resultados se presentan en la Figura 6. En este modelo de raton de sensibilizacion heterosubtipica seguido de una unica vacunacion se mostro que AS03 y diluciones (1N2 y 1N5) del mismo inducian mayores titulos de HI en comparacion con la vacuna simple. Para las tres cepas no se observo diferencia de titulos de HI entre ratones que recibieron la vacuna adyuvantada con una dosis completa de AS03 o dosis reducida de AS03.
V.2.2. Inmunidad celular (15 ratonesNgrupo).
Los resultados se presentan en la Figura 7. Independientemente de la dilucion de AS03, se observaron mayores respuestas de linfocitos T CD4+ en ratones inmunizados con vacuna fraccionada trivalente adyuvantada con AS03 en comparacion con ratones inmunizados con simple fraccionada trivalente. En comparacion con la respuesta inducida en ratones inmunizados con fraccionada trivalente adyuvantada con una dosis completa de AS03 se observo una tendencia a reducir las respuestas celulares cuando los ratones se inmunizaron con fraccionada trivalente adyuvantada con menores dosis de AS03.
V.3. Resumen de resultados y conclusiones
En conclusion, se observo un aumento en las respuestas humorales y celulares en animales sensibilizados con cepas heterosubtipicas cuando se usaron vacunas adyuvantadas con AS03 en comparacion con la vacuna simple. Se observo una magnitud similar de la respuesta humoral entre ratones inmunizados con dosis completa o dosis fraccionaria de adyuvante AS03. Sin embargo, una reduccion en la dosis de adyuvante se asocio a una tendencia a magnitud reducida de respuesta de linfocitos T CD4+.
Ejemplo VI - Evaluación preclínica de la respuesta inmunitaria celular inducida por vacunas contra la gripe fraccionadas adyuvantadas y no adyuvantadas (que comprenden diversas dosis de adyuvante AS03 y antígeno de dosis baja) en ratones C57BI/6 sensibilizados
VI.1. Diseño experimental y objetivo
Los experimentos en ratones sensibilizados a la gripe se realizaron con el fin de evaluar el aumento en las respuestas inmunitarias celulares por AS03 inducido por vacunas contra la gripe que contienen antigeno de dosis baja (0,5 IgNcepa, 1N30 de la dosis humana) y formuladas con este adyuvante de aceite en agua. Para simular la situacion humana se realizo un experimento usando ratones sensibilizados con cepas heterosubtipicas.
VI.1.1. TratamientoNgrupo (Tabla 15)
Grupos de 15 ratones C57BIN6 hembra adultos se sensibilizaron intranasalmente (20 Il de volumen) en el dia 0 con el virus de la gripe inactivado con formalina completo trivalente (5 Ig de HA para cada cepa). Las cepas de sensibilizacion consistieron en variantes de desviacion anteriores (5 Ig de HA para H1N1 ANPekinN262N95, H3N2 ANPanamaN2007N99, BNShandongN7N97 inactivadas completas) a las incluidas en la vacuna. Veintiocho dias despues, los ratones se vacunaron con una dosis unica del candidato a vacuna intramuscularmente en un volumen total de 50 Il. Los ratones se inmunizaron con formulaciones que contenian antigenos fraccionados solos (simples fraccionados trivalentes) o formulaciones que contenian antigenos fraccionados adyuvantados con tres dosis de AS03 (completa, 1N2 o 1N5). Las cepas usadas para las inmunizaciones incluyeron antigenos viricos de H1N1 ANNueva CaledoniaN20N99, H3N2 ANNueva YorkN55N2004, BNJiangsuN10N2003 (0,5 IgNcepa, 1N30 de la dosis humana).
Tabla 15
Gr
Antigeno N formulacion Otro tratamiento
1
Fraccionado trivalente N simple (no adyuvantada) Sensibilizacion heterologa D0
2
Fraccionado trivalente N AS03 Sensibilizacion heterologa D0
3
Fraccionado trivalente N AS03 1N2 Sensibilizacion heterologa D0
4
Fraccionado trivalente N AS03 1N5 Sensibilizacion heterologa D0
5
PBS Sensibilizacion heterologa D0
VI.1.2. Preparacion de las formulaciones de vacuna
Fraccionada trivalente / simple
Las formulaciones para una dosis de 50 Il se preparan extemporaneamente segun la secuencia: agua para inyeccion + tampon de solucion salina (PBS concentrado 10 veces a pH 7,4 preparado como se ensena en el Ejemplo IV) + lote de Fluarix DFLUA014 (0,5 Ig por cepa en la dosis final).
Fraccionada trivalente /AS03
Las formulaciones para una dosis de 50 Il se preparan extemporaneamente segun la secuencia: agua para inyeccion + tampon de solucion salina (PBS concentrado 10 veces a pH 7,4 preparado como se ensena en el Ejemplo IV) + lote de Fluarix DFLUA014 (0,5 Ig por cepa en la dosis final) + 25 Il de emulsion SB62 para la dosis completa o 12,5 Il de emulsion SB62 para 1N2 de la dosis o 5 Il de emulsion SB62 para 1N5 de la dosis. Las formulaciones se inyectan dentro de la hora siguiente al fin de la preparacion.
VI.1.3. Lecturas (Tabla 16) La respuesta inmunitaria celular se probo 7 dias despues de la inmunizacion por tincion intracelular de citocinas.
Tabla 16
Lectura
Momento de tiempo Tipo de muestra Procedimiento de analisis
Respuesta celular
D35 PBMC ICS
VI.2. Resultados
VI.2.1. Inmunidad celular
Los resultados se presentan en la Figura 8. Se observaron respuestas de linfocitos T CD4+ marginalmente mayores en ratones inmunizados con vacuna fraccionada trivalente adyuvantada con AS03 (dosis completa o 1N2 de la dosis) en comparacion con ratones inmunizados con simple fraccionada trivalente. En comparacion con la respuesta inducida en ratones inmunizados con fraccionada trivalente simple o adyuvantada con una dosis completa o media dosis de AS03 se observaron mayores respuestas celulares cuando los ratones se inmunizaron con fraccionada trivalente adyuvantada con 1N5 de la dosis de AS03.
VI.3. Resumen de resultados y conclusiones
En conclusion, se observo un aumento minimo en las respuestas de linfocitos T CD4+ en animales sensibilizados heterosubtipicos cuando se usaron vacunas adyuvantadas con AS03 en comparacion con la vacuna simple. No se observo respuesta a dosis de adyuvante en este experimento y de hecho un 1N5 de la dosis de AS03 indujo mayores frecuencias de linfocitos T CD4+ especificos de antigeno que las observadas con mayor dosis de adyuvante. En general, estos datos generados usando 0,5 Ig de HA por cepa no son similares a los datos de otros experimentos preclinicos generados usando 1,5 Ig de HA por cepa.
Ejemplo VII - Evaluación preclínica de vacunas contra H5N1 fraccionadas adyuvantadas y no adyuvantadas (que comprenden diversas dosis de adyuvante AS03 y antígeno) en ratones C57BI/6 sin tratamiento previo
VII.1. Diseño experimental y objetivo
Los experimentos en ratones sin tratamiento previo con H5N1 se realizaron con el fin de evaluar el aumento en las
respuestas inmunitarias humorales y celulares por AS03 inducidas por vacunas contra H5N1 fraccionadas formuladas con este adyuvante de aceite en agua. En el caso de una pandemia se espera que toda la poblacion mundial este sin tratamiento inmunologico previo a la cepa de la gripe pandemica recientemente en circulacion. Debido a este estado inmunitario sin tratamiento previo, una vacuna pandemica requerira probablemente dos dosis de vacuna para proteger a los individuos de la infeccion y la grave enfermedad producida por una nueva cepa de la gripe. Para representar esta falta de exposicion previa se desarrollo un modelo de raton sin tratamiento previo para evaluar la inmunogenicidad de las vacunas.
VII.1.1. TratamientoNgrupo (Tabla 17)
Grupos de 15 ratones C57BIN6 hembra adultos sin tratamiento previo se inmunizaron en los dias 0 y 21 con un candidato a vacuna contra H5N1 pandemica intramuscularmente en un volumen total de 50 Il. Los ratones se inmunizaron con formulaciones que contenian antigenos fraccionados H5N1 solos (H5N1 simples fraccionados) o formulaciones que contenian antigenos fraccionados adyuvantados con diferentes dosis de AS03 (doble, completa, 1N2 o 1N5). Las cepas usadas para las inmunizaciones incluyeron antigeno virico H5N1 ANVietnamN1194N04 (1,5 o 0,38 IgNcepa se corresponde con 1N10 de la dosis humana).
No se hizo formulacion con una dosis de AS03 doble, sino mas bien una inyeccion concomitante de una dosis completa de 50 Il de fraccionada contra H5N1 N dosis completa de AS03 + una dosis de 50 Il de AS03.
Tabla 17
Gr
Antigeno N formulacion Dosis de antigeno
1
Fraccionada contra H5N1 N simple (no adyuvantada) 1,5 Ig
2
Fraccionada contra H5N1 N dosis doble de AS03 1,5 Ig
3
Fraccionada contra H5N1 N AS03 1,5 Ig
4
Fraccionada contra H5N1 N AS03 1N2 1,5 Ig
5
Fraccionada contra H5N1 N AS03 1N5 1,5 Ig
6
Fraccionada contra H5N1 N simple (no adyuvantada) 0,38 Ig
7
Fraccionada contra H5N1 N dosis doble AS03 0,38 Ig
8
Fraccionada contra H5N1 N AS03 0,38 Ig
9
Fraccionada contra H5N1 N AS03 1N2 0,38 Ig
10
Fraccionada contra H5N1 N AS03 1N5 0,38 Ig
11
PBS
VII.1.2. Preparacion de las formulaciones de vacuna
Preparacion de un litro de tampon de cargar final (PBS a pH 7,2 ± 0,2): a 0,800 I de agua para inyeccion, anadir NaCl 7,699 g, KCI 0,200 g, MgCl2 x 6H2O 0,100 g, Na2HPO4 x 12H2O 2,600 g, KH2PO4 0,373 g. Despues de la solubilizacion, ajustar a 1,0 l con agua para inyeccion
Fraccionada contra H5N1 / simple
Preparacion de una dosis de 50 Il:
Se anaden tiomersal (cantidades teniendo en cuenta su concentracion en la cepa) y Triton X100 al tampon de cargar final. No se anade Tween 80 ya que el contenido diana en la formulacion se alcanza por la concentracion de Tween de la cepa. Las concentraciones finales son de 10 IgNml para tiomersal, 368 IgNml para Tween 80 y 35 IgNml para Triton X100 en la dosis de formulacion de 1,5 Ig. Son de 10 IgNml para tiomersal, 93 IgNml para Tween80 y 8,9 IgNml para Triton X100 en la dosis de formulacion de 0,38 Ig. Despues de 5-30 min de agitacion magnetica se anaden 1,5 o 0,38 Ig de HA (cepa H5N1). Las formulaciones se agitan durante 30-60 minutos. El pH se comprueba. Las inyecciones se producen dentro de la hora siguiente al fin de la formulacion.
Fraccionada contra H5N1 / AS03
Preparacion de una dosis de 50 Il:
Se anaden tiomersal (cantidades teniendo en cuenta su concentracion en la cepa) y Triton X100 al tampon de cargar final. No se anade Tween 80 ya que el contenido diana en la formulacion se alcanza por la concentracion de Tween de la cepa. Las concentraciones finales son de 10 IgNml para tiomersal, 368 IgNml para Tween 80 y 35 IgNml para Triton X100 en la dosis de formulacion de 1,5 Ig. Son de 10 IgNml para tiomersal, 93 IgNml para Tween 80 y 8,9
5 IgNml para Triton X100 en la dosis de formulacion de 0,38 Ig. Despues de 5-30 min de agitacion magnetica se anaden 1,5 o 0,38 Ig de HA (cepa H5N1). Despues de 30-60 minutos de agitacion magnetica se anaden 25 o 12,5 o 5 Il de emulsion SB62. Las formulaciones se agitan durante 30-60 minutos. El pH se comprueba. Las inyecciones se producen dentro de la hora siguiente al fin de la formulacion.
VII.1.3. Lecturas (Tabla 18A)
10 La respuesta inmunitaria humoral se midio 14 dias despues de la inmunizacion (10 ratonesNgrupo) por titulos de anticuerpos anti-Ig, IgG1 y IgG2b (Figura 9, A-F). La respuesta inmunitaria humoral tambien se midio 21 dias despues de la inmunizacion (10 ratonesNgrupo) por ensayo de inhibicion de la hemaglutinacion de anti-H5N1 (Figura10, A-B).
La respuesta inmunitaria celular se probo 6 dias despues de la inmunizacion (5 conjuntos de 3 ratones por grupo)
15 por tincion intracelular de citocinas (ICS) de linfocitos T CD4+ especificos de antigeno numerados por citometria de flujo (Figura 11, A-B).
Tabla 18A
Lectura
Momento de tiempo Tipo de muestra Procedimiento de analisis
Respuesta humoral
D42 Sueros ELISA, isotipos y titulos de HI
Respuesta celular
D47 PBMC ICS
VII.2. Resultados
20 VII.2.1. Respuesta inmunitaria humoral: ELISA e isotipos. Los resultados se presentan en la Figura 9 y en la Tabla 18B.
Tabla 18B
Fraccionada contra H5N1 SIMPLE
Fraccionada contra H5N1 2 X AS03 Fraccionada contra H5N1 AS03 Fraccionada contra H5N1 AS03N2 Fraccionada contra H5N1 AS03N5 PBS
Respuesta de Ig (títulos del punto medio por ELISA)
1,5 IgNratones
177 81680 59734 67772 57697 50
0,38 IgNratones
120 91319 76144 49162 54566
Respuesta de IgG1 (títulos del punto medio por ELISA)
1,5 IgNratones
124 54683 44965 40558 39854 50
0,38 IgNratones
144 62445 44381 31855 39269
Respuesta de IgG2b (títulos del punto medio por ELISA)
1,5 IgNratones
190 10928 10625 11215 7903 79
0,38 IgNratones
60 20993 12617 9352 9565
Relación de IgG1/IgG2b
1,5 IgNratones
0,7 5 4,2 3,6 5 79
0,38 IgNratones
2,4 3 3,5 3,4 4,1
A cada dosis de vacuna fraccionada contra H5N1, todos los grupos adyuvantados indujeron mayores titulos de anticuerpos Ig, IgG1 y IgG2b anti-H5N1 en comparacion con la vacuna fraccionada contra H5N1 no adyuvantada 25 (Figuras 9 -A a F). A cada dosis de vacuna fraccionada contra H5N1; la respuesta de anticuerpos IgG1 dirigidos contra H5N1 fue 4-5 veces superior a la respuesta de anticuerpos IgG2b dirigidos contra H5N1 (Figuras 9 -C a F).
Con una dosis de 1,5 Ig de HA de vacuna fraccionada contra H5N1 y combinada con cada dosis de adyuvante no se observo diferencia de respuestas de anticuerpos Ig, IgG1 y IgG2b dirigidos contra H5N1 (Figuras 9 - A, C y E).
Con una dosis de 0,38 Ig de HA de vacuna fraccionada contra H5N1 se obtuvo una tendencia a mayores titulos de Ig dirigida contra H5N1 despues de la inmunizacion con vacuna fraccionada contra H5N1 adyuvantada con 2x dosis completa en comparacion con la respuesta inducida por la vacuna fraccionada contra H5N1 adyuvantada con AS03N2 (p=0,7315) y AS03 1N5 (p=0,9744) (Figura 9-B). Esta tendencia tambien se observo para la respuesta de anticuerpos IgG1 dirigidos contra H5N1 (Figura 9 - D). Sin embargo, la potencia no fue suficiente para observar una diferencia estadisticamente significativa (25% de potencia para una diferencia de 1,7 veces, o 47% para una diferencia de 2 veces).
VII.2.2. Respuesta inmunitaria humoral: titulos de HI
Con una dosis de 1,5 µg de HA/ratones:
A cada dosis de adyuvante, todos los ratones inmunizados con la vacuna fraccionada contra H5N1 adyuvantada con AS03 indujeron mayores titulos de HI en comparacion con la respuesta obtenida en ratones inmunizados con la vacuna fraccionada contra H5N1 no adyuvantada (Figura 10-A). No se observo diferencia estadisticamente significativa de titulos de HI cuando la vacuna fraccionada contra H5N1 se adyuvanto con un intervalo de dosis de AS03 (Figura 10-A).
Con una dosis de 0,38 µg de HA/dosis
A cada dosis de adyuvante, todos los ratones inmunizados con vacuna fraccionada contra H5N1 adyuvantada con AS03 indujeron mayores titulos de HI en comparacion con la respuesta obtenida en ratones inmunizados con la vacuna fraccionada contra H5N1 no adyuvantada (Figura 10B).
Se observaron titulos de HI significativamente mayores con la vacuna fraccionada contra H5N1 adyuvantada con 2x dosis completa de AS03 en comparacion con la respuesta obtenida con la vacuna fraccionada contra H5N1 adyuvantada con AS03N2 (p=0,032 para una diferencia de 4 veces) (Figura 10B).
No se observo diferencia estadisticamente significativa de titulos de HI en ratones inmunizados con la vacuna fraccionada contra H5N1 adyuvantada con 2x dosis completa de AS03 o una dosis completa de AS03 o entre ratones inmunizados con vacuna fraccionada contra H5N1 adyuvantada con AS03N2 o AS03N5 (Figura 10B).
Comparación entre dosis de antígeno (1,5 µg o 0,38 µg):
No se observo diferencia estadisticamente significativa de titulos de HI entre ratones inmunizados con cada dosis de HA de la vacuna fraccionada contra H5N1 adyuvantada con AS03, AS03N2 o AS03N5, excepto entre ratones inmunizados con 1,5 Ig de HA de fraccionada contra H5N1 adyuvantada con AS03N5 que mostro titulo de HI significativamente menor (p=0,01) que con ratones inmunizados con 0,38 Ig de HA de fraccionada contra H5N1 adyuvantada con 2x dosis completa de AS03 (Figura 10).
VII.2.3. Respuesta inmunitaria celular
Para la evaluacion de respuestas inmunitarias celulares inducidas por una vacuna contra la gripe estacional trivalente, 1 Ig de HA de antigeno fraccionado por cepa se uso para la reestimulacion de linfocitos T CD4. Con el fin de mantener las mismas condiciones de reestimulacion para la vacuna contra la gripe de H5N1 monovalente, 3 Ig de HA del antigeno fraccionado monovalente se usaron en este experimento. Tambien se mostro que esta concentracion era optima para la discriminacion entre diferentes adyuvantes. Los resultados se presentan en la Figura 11.
A cada dosis de vacuna fraccionada contra H5N1 (1,5 o 0,38 Ig) se observaron mayores respuestas de linfocitos T CD4+ en ratones inmunizados con la vacuna fraccionada contra H5N1 adyuvantada con diversas dosis de AS03 en comparacion con ratones inmunizados con la vacuna fraccionada contra H5N1 no adyuvantada.
A una dosis de 1,5 Ig de vacuna fraccionada contra H5N1, una reduccion de la dosis de AS03 se correspondio con una disminucion en las frecuencias de linfocitos T CD4+ (Figura 11A). Sin embargo, a una dosis de 0,38 Ig de vacuna fraccionada contra H5N1 no se observo diferencia en respuestas de linfocitos T CD4+ entre diferentes dosis de adyuvante en ratones inmunizados con vacunas fraccionadas contra H5N1 adyuvantadas con AS03 (Figura 11B).
VII.3. Resumen de resultados y conclusiones
Los estudios de inmunogenicidad en ratones mostraron que la vacuna fraccionada contra H5N1 adyuvantada indujo respuestas humorales (titulos de ELISA y de HI anti-H5N1) y celulares (linfocitos T CD4 +) significativamente mayores que las inducidas por la vacuna fraccionada contra H5N1 no adyuvantada.
No se observo efecto de respuesta a dosis de antigeno para la respuesta inmunitaria humoral entre ratones inmunizados con 1,5 Ig y 0,38 Ig de vacuna fraccionada contra H5N1 adyuvantada, excepto para los dos grupos
mencionados en la Seccion VII.2.2, sugiriendo que en presencia de adyuvante pueden requerirse incluso dosis de HA menores para observar un efecto de respuesta a dosis en este modelo.
Se observo un fuerte aumento en las respuestas de linfocitos T CD4+ en ratones sin tratamiento previo cuando se usaron vacuna pandemicas contra H5N1 adyuvantadas con AS03 en comparacion con la vacuna contra H5N1 simple. No se observo impacto de la dilucion de AS03 cuando se uso una dosis de 0,38 Ig de vacuna fraccionada contra H5N1 como candidato a vacuna, mientras que se observo una disminucion de respuestas de linfocitos T CD4 cuando 1,5 Ig de vacuna fraccionada contra H5N1 se adyuvanto con la dosis reducida de AS03.
Como se ha observado previamente, no se observo diferencia en respuestas inmunitarias humorales y celulares entre ratones inmunizados con la vacuna fraccionada contra H5N1 (a cualquier dosis de antigeno) adyuvantada con una dosis completa de AS03 o con AS03N2. Se detecto algun potenciamiento en la respuesta inmunitaria cuando se uso 2x dosis completa de AS03 en la formulacion de vacunas y, por consiguiente, se detecto una disminucion en la respuesta inmunitaria cuando se uso AS03N5 en la formulacion de vacunas.
En conjunto, los datos informados aqui soportan la potencia de este sistema de adyuvante novedoso en esta formulacion de vacunas.
Ejemplo VIII - Evaluación preclínica de vacunas contra la gripe adyuvantadas y no adyuvantadas en cerdos Large White sensibilizados
VIII.1. Diseño experimental y objetivo
El experimento en cerdos sensibilizados a la gripe se realizo con el fin de evaluar el aumento en las respuestas humorales por AS03 inducidas por vacunas contra la gripe formuladas con este adyuvante de aceite en agua.
Se usaron cerdos con el fin de evaluar un intervalo de dosis de AS03 en un modelo animal proximo a seres humanos. Los cerdos muestran una larga lista de analogias biologicas que establecen este animal como fisiologicamente el mas proximo al hombre con muy pocas excepciones (Douglas R., 1972). Ademas, la manifestacion de infeccion de la gripe en cerdos es comunmente observada.
VIII.1.1. TratamientoNgrupo (Tabla 19)
Grupos de 10 cerdos hembra Large White adultos se sensibilizaron en el dia 0 con virus de la gripe inactivado con formalina completo trivalente (25 Ig de HA para cada cepa) intranasalmente en un volumen total de 200 Il. Las cepas de sensibilizacion consistieron en cepas homologas a la cepas de la vacuna (25 Ig de HA para H1N1 ANNueva CaledoniaN20N99, H3N2 ANPanamaN2007N99 y BNShandongN7N97 completo inactivado). Veintiocho dias despues, los cerdos se vacunaron con una dosis unica del candidato a vacuna intramuscularmente en un volumen total de 500 Il. Los cerdos se inmunizaron con formulaciones que contenian antigenos fraccionados solos (simples fraccionados trivalentes) o formulaciones que contenian antigenos fraccionados adyuvantados con un intervalo de dosis de AS03 (completa, 1N2 o 1N5). Las cepas usadas para las inmunizaciones incluyeron antigenos viricos de H1N1 ANNueva CaledoniaN20N99, H3N2 ANPanamaN2007N99 y BNShandongN7N97 (15 Ig de HA para cepas H1N1 ANNueva CaledoniaN20N99, H3N2 ANPanamaN2007N99 y 17,5 Ig de cepa BNShandongN7N97 como en una dosis humana).
Tabla 19
Gr
Antigeno N formulacion Otro tratamiento
1
Fraccionado trivalente N simple (no adyuvantada) Sensibilizacion homologa D0
2
Fraccionado trivalente N AS03 Sensibilizacion homologa D0
3
Fraccionado trivalente N AS03 1N2 Sensibilizacion homologa D0
4
Fraccionado trivalente N AS03 1N5 Sensibilizacion homologa D0
VIII.1.2. Preparacion de las formulaciones de vacuna
Simple fraccionada trivalente
Una premezcla de Tween 80, Triton X100 y succinato de vitamina E (VES) se prepara con el fin de alcanzar una concentracion final en la vacuna de 750 IgNml de Tween 80, 110 IgNml de Triton X100 y 100 IgNml de VES. Las cantidades usadas en la premezcla tienen en cuenta su contenido en las cepas.
La formulacion de una dosis de 500 Il se prepara extemporaneamente segun la secuencia: agua para inyeccion + tampon de solucion salina (PBS concentrado 10 veces a pH 7,4 preparado como se ensena en el Ejemplo IV) +
premezcla, 5 min de agitacion magnetica a temperatura ambiente, + 15 Ig de HA para la cepa H1N1, 10 min de agitacion magnetica a temperatura ambiente, + 15 Ig de HA para la cepa H3N2, 10 min de agitacion magnetica a temperatura ambiente, + 17,5 Ig de HA para la cepa B, 15 min de agitacion magnetica a temperatura ambiente. Las formulaciones se inyectan dentro de la hora siguiente al fin de su preparacion.
Fraccionada trivalente /AS03
Una premezcla de Tween 80, Triton X100 y succinato de vitamina E (VES) se prepara con el fin de alcanzar una concentracion final en la vacuna de 750 IgNml de Tween 80, 110 IgNml de Triton X100 y 100 IgNml de VES. Las cantidades usadas en la premezcla tienen en cuenta su contenido en las cepas.
La formulacion de una dosis de 500 Il se prepara extemporaneamente segun la secuencia: agua para inyeccion + tampon de solucion salina (PBS concentrado 10 veces a pH 7,4 preparado como se ensena en el Ejemplo IV) + premezcla, 5 min de agitacion magnetica a temperatura ambiente, + 15 Ig de HA para la cepa H1N1, 10 min de agitacion magnetica a temperatura ambiente, + 15 Ig de HA para la cepa H3N2, 10 min de agitacion magnetica a temperatura ambiente, + 17,5 Ig de HA para la cepa B, 15 min de agitacion magnetica a temperatura ambiente, + 250 Il de emulsion SB62 para la dosis completa de AS03 o 125 Il de emulsion SB62 para 1N2 dosis de AS03 o 50 Il de emulsion SB62 para 1N5 de dosis de AS03, 15 min de agitacion magnetica a temperatura ambiente. Las formulaciones se inyectan dentro de la hora siguiente al fin de su preparacion.
VIII.1.3. Lecturas (Tabla 20)
La respuesta inmunitaria humoral a la vacunacion se midio antes de la sensibilizacion intranasal (dia 0), antes de la inmunizacion (dia 28) y 14 dias despues de la inmunizacion (10 cerdosNgrupo). Las muestras de suero se probaron por la prueba de inhibicion de la hemaglutinacion (HI).
Tabla 20
Lectura
Momento de tiempo Tipo de muestra Procedimiento de analisis
Respuesta humoral
D0, D28, D42 Sueros IHA
VIII.2. Los resultados y conclusiones
VIII.2.1. Inmunidad humoral
Los resultados se presentan en la Figura 12. Independientemente de la dilucion del adyuvante, las formulaciones fraccionadas trivalentes adyuvantadas con AS03 indujeron una mayor respuesta de HI a todas las cepas que la formulacion trivalente simple en este modelo de sensibilizacion homologa, aunque la significancia estadistica no siempre se alcanzo para las tres cepas. Se observo un efecto de la dosis de adyuvante con ligeras diferencias de cepa a cepa. Para cepas menos inmunogenicas tales como BNShandong, solo la vacuna fraccionada trivalente adyuvantada con una dosis completa de AS03 fue significativamente diferente de la vacuna simple. A diferencia de la vacuna fraccionada trivalente adyuvantada con una dosis completa de AS03, una dosis reducida de AS03 fracaso en aumentar los titulos de HI para las tres cepas anteriores por encima de aquellos observados con la vacuna simple.
Ejemplo IX - Evaluación preclínica de vacunas trivalentes o cuadrivalentes fraccionadas adyuvantadas y no adyuvantadas (que contienen una segunda cepa B) en ratones C57BI/6 sin tratamiento previo y sensibilizados
IX.1. Diseño experimental y objetivo
Los experimentos en ratones sin tratamiento previo y sensibilizados se realizaron con el fin de evaluar el aumento en la respuesta inmunitaria humoral inducida por las vacunas trivalentes o cuadrivalente fraccionadas contra la gripe (que contienen una segunda cepa B) formuladas con este adyuvante de emulsion de aceite en agua (AS03 o media dosis de AS03). El analisis filogenico de la genes de HA del virus de la gripe B recientemente aislados demostro que ya a mediados de 1980 este gen habia evolucionado en dos linajes antigenicamente distintos representados por virus similares a BNVictoriaN2N87 y similares a BNYamagataN16N88. Estos experimentos evaluaron el impacto de la presencia de una segunda cepa B en la vacuna contra la gripe cuadrivalente (QIV) sobre la respuesta inmunitaria humoral en comparacion con la respuesta inducida por la vacuna contra la gripe trivalente (TIV).
IX.1.1. TratamientoNgrupo (Tabla 21)
Estos experimentos se realizaron usando grupos de 10 ratones sin tratamiento previo C57BIN6 hembra adultos o ratones sensibilizados con cepas heterologas en comparacion con cepas de la vacuna.
Los ratones sin tratamiento previo se inmunizaron en los dias 0 y 28 con candidato a vacuna contra la gripe
trivalente o cuadrivalente intramuscularmente en un volumen total de 1000 Il.
Los ratones sensibilizados recibieron primero una administracion intranasal (20 Il de volumen) en el dia 0 con virus de la gripe inactivado con formalina completo trivalente (5 Ig de HA para cada cepa). Las cepas de sensibilizacion consistieron en variantes de desviacion (5 Ig de HA para H1N1 ANPekinN262N95, H3N2 ANWellingtonN1N04 y BNBrisbaneN32N02 inactivadas completas) a las incluidas en la vacuna. Veintiocho dias despues, los ratones se vacunaron con una dosis unica del candidato a vacuna intramuscularmente en un volumen total de 100 Il.
Los ratones se inmunizaron con formulaciones que contenian TIV o QIV solas (vacuna simple) o formulaciones que contenian TIV o QIV adyuvantadas con diferentes dosis de AS03 (completa o media (1N2)). Las cepas usadas para las inmunizaciones incluyeron H1N1 ANNueva CaledoniaN20N99, H3N2 ANWisconsinN52N05 y BNShandongN7N97 (el linaje de BNVictoria se incluyo tanto en TIV como en QIV) y para la vacuna QIV tambien BNJiangsuN10N03 (el linaje de BNYamagata solo se incluyo en QIV) (1,5 IgNcepa se corresponde con 1N10 de la dosis humana).
Tabla 21
Grupo
Antigeno N formulacion Dosis de antigeno
1
TIV simple (no adyuvantada) 1,5 Ig
2
TIV AS03 1,5 Ig
3
TIV AS03N2 1,5 Ig
4
QIV simple (no adyuvantada) 1,5 Ig
5
QIV AS03 1,5 Ig
6
QIV AS03N2 1,5 Ig
7
PBS
IX.1.2. Preparacion de las formulaciones de vacuna
TIV simple (no adyuvantada)
Preparacion de una dosis de 100 Il:
PBS concentrado 10 veces y una premezcla de Tween 80, Triton X-100 y VES (cantidades teniendo en cuenta los detergentes presentes en las cepas) se anaden a agua para inyeccion. Las concentraciones finales son 354 IgNml para Tween 80, 52 IgNml para Triton X-100, 47,37 IgNml para VES en la formulacion. Despues de 5 min de agitacion magnetica se anaden 1,5 Ig de cada cepa (cepas H1N1, H3N2, B) con 10 min de agitacion magnetica entre cada adicion. Entonces, la formulacion se agita durante 15 min. El pH se comprueba. Las inyecciones se producen dentro de la hora siguiente al fin de la formulacion.
TIV AS03 o AS03 1/2
Preparacion de una dosis de 100 Il:
PBS concentrado 10 veces y una premezcla de Tween 80, Triton X-100 y VES (cantidades teniendo en cuenta los detergentes presentes en las cepas) se anaden a agua para inyeccion. Las concentraciones finales son 354 IgNml para Tween 80, 52 IgNml para Triton X-100, 47,37 IgNml para VES en la formulacion. Despues de 5 min de agitacion magnetica se anaden 1,5 Ig de cada cepa (cepas H1N1, H3N2, B) con 10 min de agitacion magnetica entre cada adicion. Despues de 15 min de agitacion magnetica se anaden 25 Il o 12,5 Il de emulsion SB62.
Entonces, la formulacion se agita durante 15 min. El pH se comprueba. Las inyecciones se producen dentro de la hora siguiente al fin de la formulacion.
QIV simple (no adyuvantada)
Preparacion de una dosis de 100 Il:
PBS concentrado 10 veces y una premezcla de Tween 80, Triton X-100 y VES (cantidades teniendo en cuenta los detergentes presentes en las cepas) se anaden a agua para inyeccion. Las concentraciones finales son 472 IgNml para Tween 80, 69,44 IgNml para Triton X-100, 63,16 IgNml para VES en la formulacion. Despues de 5 min de agitacion magnetica se anaden 1,5 Ig de cada cepa (H1N1, H3N2, 2 cepas B) con 10 min de agitacion magnetica
entre cada adicion. Entonces, la formulacion se agita durante 15 min. El pH se comprueba. Las inyecciones se producen dentro de la hora siguiente al fin de la formulacion.
QIV AS03 o AS03 1/2
Preparacion de una dosis de 100 Il:
PBS concentrado 10 veces y una premezcla de Tween 80, Triton X-100 y VES (cantidades teniendo en cuenta los detergentes presentes en las cepas) se anaden a agua para inyeccion. Las concentraciones finales son 472 IgNml para Tween 80, 69,44 IgNml para Triton X-100, 63,16 IgNml para VES en la formulacion. Despues de 5 min de agitacion magnetica se anaden 1,5 Ig de cada cepa (H1N1, H3N2, 2 cepas B) con 10 min de agitacion magnetica entre cada adicion. Despues de 15 min de agitacion magnetica se anaden 25 Il o 12,5 Il de emulsion SB62.
Entonces, la formulacion se agita durante 15 min. El pH se comprueba. Las inyecciones se producen dentro de la hora siguiente al fin de la formulacion.
IX.1.3. Lecturas (Tabla 22)
En ratones sin tratamiento previo, la respuesta inmunitaria humoral se midio 28 dias despues de la primera inmunizacion (D28 despues de I) y 21 dias despues de la segunda inmunizacion (D21 despues de II) en 10 ratones por grupo por el ensayo de inhibicion de la hemaglutinacion (Figura 13).
En ratones sensibilizados, la respuesta inmunitaria humoral se midio 28 dias despues de la sensibilizacion (Dia 28 despues de sensib) y 21 dias despues de the single inmunizacion (D21 despues de inmuniz) en 10 ratones por grupo por el ensayo de inhibicion de la hemaglutinacion (Figura 14).
Con el fin de simplificar y de basarse en el objetivo de este experimento solo se describieron las respuestas inmunitarias humorales inducidas contra las cepas B.
Tabla 22
Momento de tiempo de la lectura
Tipo de muestra Procedimiento de analisis
Respuesta humoral Dias 28 y 49
Sueros Titulos de HI
IX.2. Resultados
IX.2.1. Respuesta inmunitaria humoral en ratones sin tratamiento previo: titulos de HI
Ratones sin tratamiento previo inmunizados con vacunas fraccionadas contra la gripe adyuvantadas indujeron mayores titulos de HI en comparacion con la respuesta obtenida en ratones inmunizados con las vacunas fraccionadas contra la gripe no adyuvantadas (Figura 13, A y B).
Independientemente del adyuvante (AS03 o AS03N2), los ratones sin tratamiento previo inmunizados con la TIV adyuvantada o la QIV adyuvantada indujeron titulos de HI similares contra BNShandongN7N97 (el virus similar a BNVictoria se incluyo tanto en TIV como en QIV) (Figura 13; A).
Independientemente del adyuvante (AS03 o AS03N2), los ratones inmunizados sin tratamiento previo con la QIV adyuvantada indujeron mayores titulos de HI contra BNJiangsuN10N03 (el virus similar a BNYamagata solo se incluyo en QIV) en comparacion con la ausencia de titulos de HI observada en ratones sin tratamiento previo inmunizados con la TIV adyuvantada (Figura 13; B).
IX.2.2. Respuesta inmunitaria humoral en ratones sensibilizados: titulos de HI
Ratones sensibilizados con un virus similar a BNVictoria e inmunizados con vacunas fraccionadas contra la gripe adyuvantadas indujeron mayores titulos de HI en comparacion con la respuesta obtenida en ratones inmunizados con las vacunas fraccionadas contra la gripe no adyuvantadas (Figura 14, A y B).
Independientemente del adyuvante (AS03 o AS03N2), los ratones sensibilizados con un virus similar a Victoria e inmunizados con la TIV adyuvantada o la QIV adyuvantada indujeron titulos de HI similares contra el virus BNShandongN7N97 (el virus similar a BNVictoria se incluyo tanto en TIV como en QIV) (Figura 14; B).
Independientemente del adyuvante (AS03 o AS03N2), los ratones sensibilizados con un virus similar a Victoria e inmunizados con la QIV adyuvantada indujeron mayores titulos de HI contra BNJiangsuN10N03 (el virus similar a BNYamagata solo se incluyo en QIV) en comparacion con la ausencia de titulos de HI observada en ratones sin tratamiento previo inmunizados con la TIV adyuvantada (Figura 14; B).
IX.3. Resumen de resultados y conclusiones
Ratones sin tratamiento previo, o ratones sensibilizados con un virus similar a BNVictoria, inmunizados con la vacuna TIV o QIV adyuvantada (AS03 o AS03N2) mostraron reactividad cruzada contra el virus homotipico similar a BNVictoria incluido en la vacuna o un virus heterosubtipico que pertenece al mismo linaje de BNVictoria. Ratones sin tratamiento previo, o ratones sensibilizados con un virus similar a BNVictoria, inmunizados con la vacuna TIV adyuvantada (AS03 o AS03N2) no mostraron reactividad cruzada contra un virus heterosubtipico que pertenecia a otro linaje (virus similar a BNYamagata en este ejemplo) en comparacion con el virus B incluido en la vacuna.
Estos experimentos demostraron que se necesita una segunda cepa B y el adyuvante (AS03 o AS03N2) con el fin de inducir una reaccion cruzada contra un virus B que pertenece a tanto los linajes de BNVictoria como de BNYamagata.
Ejemplo X - Ensayo clínico en una población de 18-64 años de edad con una vacuna que contiene una preparación de antígeno de la gripe fraccionado y diversas dosis de adyuvante AS03 (Flu-LD-012)
X.1. Introducción
Se realizo un estudio de simple ciego aleatorizado controlado de fase II en una poblacion adulta de 18-64 anos de edad en 2007 con el fin de evaluar la inmunogenicidad, seguridad y reactogenicidad de la vacuna candidata contra la gripe de dosis baja de GlaxoSmithKline Biologicals (es decir, que contiene 5 Ig de HA por cepa) con diversas dosis de adyuvante AS03, administrada intramuscularmente, en comparacion con Fluarix™ (GlaxoSmithKline Biologicals) usada como referencia.
X.2. Diseño del estudio
Cinco grupos de sujetos (200 por grupo) recibieron en paralelo las siguientes vacunas IM:
-
FIuLD1N1: 5 Ig de HANcepa de vacuna contra la gripe adyuvantada con 1N1 de dosis de AS03
-
FluLD1N2: 5 Ig de HANcepa de vacuna contra la gripe adyuvantada con 1N2 de dosis de AS03
-
FluLD1N4: 5 Ig de HANcepa de vacuna contra la gripe adyuvantada con 1N4 de dosis de AS03
-
FluLD1N8: 5 Ig de HANcepa de vacuna contra la gripe adyuvantada con 1N8 de dosis de AS03
-
Un grupo de 200 sujetos que recibio una dosis completa del programa de 15 Ig de HANcepa de Fluarix™: una inyeccion IM de vacuna contra la gripe en el dia 0, recogida de muestra de sangre en el dia 0, dia 21 y dia 180 despues de la vacunacion.
La vacuna contra la gripe fraccionada trivalente convencional Fluarix™ usada en este estudio es una vacuna comercial del hemisferio norte del ano 2007N2008 desarrollada y fabricada por GlaxoSmithKline Biologicals.
X.2. Objetivos del estudio
X.2.1. Objetivo primario: inmunogenicidad
Demostrar la no inferioridad inmunologica (GMT) de la vacuna contra la gripe de dosis baja adyuvantada con AS03 (1N1, 1N2, 1N4, 1N8 de dosis de AS03) frente a Fluarix 21 dias tras vacunacion en todos los sujetos.
Variable observada:
• En los dias 0 y 21: titulo de anticuerpos de la inhibicion de la hemaglutinacion en suero (HI), contra cada una de las tres cepas de la vacuna, en todos los sujetos.
Variable derivada:
• Titulos medios geometricos (GMT) de titulos de anticuerpos de HI en los dias 0 y 21.
X.2.2. Objetivos secundarios
•
Evaluar la respuesta inmunitaria humoral en terminos de titulos de anticuerpos de anti-hemaglutinina (HI) provocados por la vacuna contra la gripe de dosis baja adyuvantada con AS03 (1N1, 1N2, 1N4, 1N8 de dosis de AS03) y por Fluarix 21 dias tras la vacunacion en todos los sujetos.
•
Evaluar la persistencia de anticuerpos de HI de la vacuna contra la gripe de dosis baja adyuvantada con AS03 (1N1, 1N2, 1N4, 1N8 de dosis de AS03) y por Fluarix 180 dias tras la vacunacion en todos los sujetos.
•
Evaluar la respuesta inmunitaria mediada por celula inducida por la vacuna contra la gripe de dosis baja adyuvantada con AS03 (1N1, 1N2, 1N4, 1N8 de dosis de AS03) y Fluarix en terminos de frecuencia de linfocitos T CD4NCD8 especificos de la gripe en el dia 0, 21 y 180 en un subconjunto de sujetos.
•
Evaluar la respuesta inmunitaria humoral en terminos de titulos de anticuerpos neutralizantes inducida por la vacuna contra la gripe de dosis baja adyuvantada con AS03 (1N1, 1N2, 1N4, 1N8 de dosis de AS03) y Fluarix en el dia 0, 21 y 180 en un subconjunto de sujetos.
•
Evaluar la seguridad y la reactogenicidad de la vacuna contra la gripe de dosis baja adyuvantada con AS03
5 (1N1, 1N2, 1N4, 1N8 de dosis de AS03) y Fluarix durante el periodo del estudio completo en todos los sujetos (seguimiento de sintomas esperados durante 7 dias, seguimiento de sintomas inesperados durante 21 dias, seguimiento de acontecimientos adversos graves y condiciones medicamente significativas durante 6 meses).
Variables observadas para la respuesta humoral:
• En el dia 0, 21 y 180: titulo de anticuerpos de la inhibicion de la hemaglutinacion en suero (HI), contra cada 10 una de las tres cepas de la vacuna, en todos los sujetos.
• En los dias 0, 21 y 180: titulos de anticuerpos neutralizantes, probados por separado contra cada una de las tres cepas del virus de la gripe representadas en la vacuna, en un subconjunto de sujetos.
Variables derivadas:
• Titulos medios geometricos (GMT) de titulos de anticuerpos de HI en los dias 0, 21 y 180
15 • Tasas de seroconversion� en el dia 21
•
Factores de seroconversion� en el dia 21
•
Tasas de seroproteccion��� en los dias 0 y 21
La tasa de seroconversion se define como el porcentaje de vacunados que tienen tanto un titulo antes de la vacunacion < 1:10 como un titulo despues de la vacunacion � 1:40 o un titulo antes de la vacunacion � 1:10 y al 20 menos un aumento de cuatro veces en el titulo despues de la vacunacion.
El factor de seroconversion se define como el aumento en veces en GMT de HI en suero despues de la vacunacion en comparacion con el dia 0.
La tasa de seroproteccion se define como el porcentaje de vacunados con un titulo de HI en suero � 1:40 que normalmente es aceptado como que indica proteccion.
25 Variables observadas para la respuesta CMI (en un subconjunto de sujetos):
• En los dias 0, 21 y 180:
-
Frecuencia de celulas CD4NCD8 positivas para citocinas por 106 en pruebas que producen al menos dos moleculas senal diferentes (IL-2, IFN-γ, TFN-α y CD40L).
-
Frecuencia de celulas CD4NCD8 positivas para citocinas por 106 en pruebas que producen al menos 30 CD40L y otra molecula senal (IL-2, IFN-γ, TFN-α).
-
Frecuencia de celulas CD4NCD8 positivas para citocinas por 106 en pruebas que producen al menos IL-2 y otra molecula senal (CD40L, IFN-γ, TFN-α).
-
Frecuencia de celulas CD4NCD8 positivas para citocinas por 106 en pruebas que producen al menos TFN-α y otra molecula senal (IL-2, IFN-γ, CD40L).
35 - Frecuencia de celulas CD4NCD8 positivas para citocinas por 106 en pruebas que producen al menos IFN-γ y otra molecula senal (CD40L, IL-2, TFN-α).
Variables derivadas
• Para cada prueba, media geometrica (GM) de linfocitos T CD4NCD8 de la gripe especificos en el dia 0, 21,
180.
40 X.2.3. Otros objetivos:
•
Evaluar la respuesta inmunitaria humoral en terminos de titulos de HI heterologos de vacuna (titulo de anticuerpos de inhibicion de la hemaglutinacion en suero (HI), contra cepas desviadas), en el dia 0, 21 y 180 en un subconjunto de sujetos.
•
Evaluar la respuesta inmunitaria humoral en terminos de titulos de anticuerpos neutralizantes heterologos de
vacuna (cepas del virus especificas de la gripe de reactividad cruzada (cepas desviadas)), en el dia 0, 21 y 180 en un subconjunto de sujetos.
• Evaluar la respuesta CMI en terminos de frecuencia de linfocitos T CD4NCD8 especificos de la gripe de reactividad cruzada (cepas heterologas) (cepas desviadas o epitopes de la gripe conservados), en el dia 0, 21 y 180 en un subconjunto de sujetos.
Las variables derivadas y los criterios (tasas de seroproteccion, seroconversion y factores de seroconversion) son como se han descrito anteriormente.
X.3. Composición y administración de vacunas
X.3.1. Preparacion de vacunas
La vacuna contra la gripe de dosis baja adyuvantada con AS03 usada en el estudio es una mezcla liquida de iguales cantidades (es decir, 3x 5 Ig de HA) de tres antigenos de la gripe inactivados fraccionados diferentes adyuvantados con AS03. Se presenta como vacuna de monodosis en jeringuillas precargadas de vidrio (tipo I) a un volumen de 0,5 mlNdosis. Las formulaciones candidatas a vacunas contra la gripe de dosis baja adyuvantadas con AS03 contuvieron las siguientes cepas:
•
Cepa similar a ANIslas SalomonN3N2006 (H1N1): ANIslas SalomonN03N2006 (IVR-145),
•
Cepa similar a ANWisconsinN67N2005 (H3N2): ANWisconsinN67N2005 (NYMCX)-161 B,
•
Cepa similar a BNMalasiaN2506N2004: BNMalasiaN2506N2004.
Las vacunas contuvieron 5 Ig de hemaglutinina (HA) de cada cepa del virus de la gripe por dosis, combinadas con una dosis completa, media dosis, 1N4 de dosis o 1N8 de dosis del sistema de adyuvante AS03. Los antigenos de la gripe se incorporan en la fase acuosa del sistema de adyuvante por simple mezcla con la emulsion.
La vacuna contiene los siguientes residuos que se derivan del procedimiento de fabricacion del principio activo: timerosal, albumina de huevo, sacarosa, formaldehido y desoxicolato de sodio, y niveles residuales de timerosal (< 1 Ig por dosis) de las fases tempranas del procedimiento de fabricacion. La produccion de las tres vacunas monovalentes de antigenos de virion fraccionados inactivados se realiza siguiendo el procedimiento de fabricacion de la vacuna comercial Fluarix™. Se hace como se ha explicado en la Seccion III.4.1.2. El fraccionamiento se lleva a cabo con desoxicolato de sodio antes de la etapa de inactivacion, que se realiza con formaldehido.
X.3.2. Composicion de vacuna
Una dosis de FluLD (completa, media dosis, 1N4 de dosis o 1N8 de dosis de AS03) se corresponde con 0,5 ml. La composicion se proporciona en la Tabla 23. El contenido de HA por dosis es aproximadamente 5 Ig para todas las formulaciones, siendo la unica diferencia la cantidad de AS03 presente en los recipientes finales.

Tabla 23 Composición de vacuna contra la gripe de dosis baja adyuvantada con AS03
Componente
Cantidad por dosis (0,5 ml)
Viriones fraccionados inactivados - ANIslas SalomonN03N2006 (IVR-145) - ANWisconsin16712005 (H3N2) NYMCX-1 61 B - BNMalasiaN2506N2004
5,0 Ig de HA 5,0 Ig de HA 5,0 Ig de HA
Adyuvante
Dosis completa Media dosis 1/4 de dosis 1/8 de dosis
- Emulsion SB62 (volumen total)
0,250 ml 0,125 ml 0,0625 ml 0,0,31 ml
• Escualeno
10,70 mg 5,35 mg 2,675 mg 1,337 mg
• DL-α-tocoferol
11,88 mg 5,94 mg 2,97 mg 1,5 mg
• Polisorbato 80 (Tween 80)
4,85 mg 2,425 mg 1,21 mg 0,6 mg
PBS mod
hasta 0,250 ml
Excipientes (valor diana)
Componente
Cantidad por dosis (0,5 ml)
Polisorbato 80 (Tween-80)
0,40 mg
Octoxinol 10 (Triton® X-100)
0,05 mg
Hidrogenosuccinato de alfa-tocoferilo
0,05 mg
Cloruro sodico
4 mg
Cloruro de magnesio
0,03 mg
Fosfato de disodio
1,30 mg
Hidrogenofosfato de potasio
0,19 mg
Cloruro de potasio
0,10 mg
Agua para inyeccion
hasta 0,50 ml
Abreviaturas: HA = Hemaglutinina; el contenido total en Polisorbato 80 se corresponde con 4,972 mg por dosis cuando se usa la dosis completa de AS03, y 2,547 mg por dosis cuando se usa media dosis de AS03.
X.3.3. Preparacion de las composiciones de vacuna con adyuvante AS03
Preparacion de antigeno ("vacuna intermedia"): Tween 80, Triton X-100 y VES se anaden a PBS mod NaNK (NaCl 132,7 mM, KCl 2,7 mM, MgCl2 1,1 mM, Na2HPO4 7,26 mM, KH2PO4 2,72 mM, pH 7,2) en cantidades tales que las
5 concentraciones finales en la vacuna intermedia fueran, respectivamente, de 952,5 IgNml, 130,9 IgNml y 119,1 IgNml. Despues de 15 a 45 minutos de agitacion se anaden 35,71 Ig de HA por ml de cada cepa H1N1, 36,90 IgNml de cepa H3N2 y 39,29 Ig de HA por ml de cepa B.
Vacuna adyuvantada: PBS mod NaNK (NaCl 132,7 mM, KCl 2,7 mM, MgCl2 1,1 mM, Na2HPO4 7,26 mM, KH2PO4 2,72 mM, pH 7,2) se anade a agua para inyeccion para lograr un volumen final de 0,5 ml por dosis humana. 10 Despues de 15 a 45 min de agitacion, un volumen de la llamada "vacuna intermedia" se anade y se mezcla durante 15-45 min. Luego se anade PBS mod 20 x concentrado (NaCl 2,74 M, KCI 54 mM, Na2HPO4 142,8 mM, KH2PO4 26 mM, pH 6,8) y se mezcla durante 15 a 45 min. Este PBS mod 20 x concentrado tiene la misma composicion que la emulsion AS03 y la cantidad anadida es funcion de la dosis de AS03 y se calcula para mantener la composicion ionica de la vacuna constante mientras que se reduce el contenido de emulsion. Finalmente se anade la cantidad
15 requerida de emulsion (31,25 o 62,5 o 125 o 250 Il N dosis) y se mezcla durante 15 a 45 min para alcanzar los valores diana finales ilustrados en la Tabla 23.
X.4. Resultados de inmunogenicidad - Respuesta inmunitaria humoral
X.4.1 Titulos medios geometricos (GMT) de HI
Los GMT para anticuerpos de HI con IC del 95% se muestran en la Tabla 24 y la Figura 15. Los GMT para 20 anticuerpos de HI con 95% por grupo de edad (18-49 anos y 50-64 anos) se muestran en la Tabla 25.

Tabla 24 - Tasas de seropositividad y GMT para título de anticuerpos de HI en el día 0 y día 21 (cohorte de ATP para inmunogenicidad)
>= 10 1/DIL
GMT
IC del 95%
IC del 95%
Anticuerpo
Grupo Momento N n % LI LS Valor LI LS Mín Máx
ANSalomon
FluLD11 PRE 187 94 50,3 42,9 57,6 13,0 10,9 15,5 <10,0 905,0
PI (D21)
187 187 100 98,0 100 203,2 171,7 240,3 10,0 5120,0
FluLD12
PRE 189 83 43,9 36,7 51,3 12,3 10,2 14,8 <10,0 1280,0
PI (D21)
189 185 97,9 94,7 99,4 155,8 128,2 189,4 <10,0 2560,0
FluLD14
PRE 190 84 44,2 37,0 51,6 12,9 10,6 15,8 <10,0 1280,0
PI (D21)
190 186 97,9 94,7 99,4 164,9 137,6 197,8 <10,0 2560,0
FluLD18
PRE 192 100 52,1 44,8 59,3 14,9 12,3 18,2 <10,0 640,0
PI (D21)
192 187 97,4 94,0 99,1 151,1 124,7 183,1 <10,0 3620,0
Fluarix
PRE 185 106 57,3 49,8 64,5 15,1 12,5 18,2 <10,0 640,0
PI (D21)
185 183 98,9 96,1 99,9 191,0 158,5 230,2 <10,0 3620,0
ANWisconsin
FluLD11 PRE 187 142 75,9 69,2 81,9 29,4 23,8 36,4 <10,0 1280,0
PI (D21)
187 187 100 98,0 100 380,1 321,3 449,8 14,0 5120,0
FluLD12
PRE 189 141 74,6 67,8 80,6 30,0 24,3 37,2 <10,0 1280,0
PI (D21)
189 188 99,5 97,1 100 326,4 275,6 386,7 <10,0 5120,0
FluLD14
PRE 190 141 74,2 67,4 80,3 29,9 24,5 36,5 <10,0 640,0
PI (D21)
190 188 98,9 96,2 99,9 319,9 270,0 379,1 <10,0 20480,0
FluLD18
PRE 192 149 77,6 71,0 83,3 27,2 22,6 32,8 <10,0 905,0
PI (D21)
192 191 99,5 97,1 100 273,9 232,0 323,3 <10,0 5120,0
Fluarix
PRE 185 155 83,8 77,7 88,8 37,4 30,2 46,4 <10,0 1280,0
PI (D21)
185 185 100 98,0 100 335,3 286,2 392,7 20,0 5120,0
(continuacion)
>= 10 1/DIL
GMT
IC del 95%
IC del 95%
Anticuerpo
Grupo Momento N n % LI LS Valor LI LS Mín Máx
BNMalasia
FIuLD11 PRE 187 142 75,9 69,2 81,9 25,8 21,3 31,3 <10,0 2560,0
PI (D21)
187 187 100 98,0 100 225,8 195,3 261,1 20,0 2560,0
FluLD12
PRE 189 145 76,7 70,0 82,5 27,3 22,6 32,9 <10,0 3620,0
PI (D21)
189 188 99,5 97,1 100 246,1 210,9 287,2 <10,0 3620,0
FluLD14
PRE 190 138 72,6 65,7 78,8 22,6 18,8 27,1 <10,0 1280,0
PI (D21)
190 188 98,9 96,2 99,9 195,5 165,1 231,4 <10,0 2560,0
FluLD18
PRE 192 142 74,0 67,1 80,0 23,2 19,5 27,8 <10,0 1280,0
PI (D21)
192 188 97,9 94,8 99,4 171,2 144,2 203,2 <10,0 5120,0
Fluarix
PRE 185 139 75,1 68,3 81,2 27,0 22,2 32,7 <10,0 1280,0
PI (D21)
185 183 98,9 96,1 99,9 217,8 184,3 257,4 <10,0 3620,0
FIuLD11 = 5 Ig de HANcepa con 1N1 de dosis de AS03; FIuLD12 = 5 Ig de HANcepa con 1N2 de dosis de AS03; FluLD14 = 5 Ig de HANcepa con 1N4 de dosis de AS03; FluLD18 = 5 Ig de HANcepa con 1N8 de dosis AS03; Fluarix = Fluarix (15 Ig deHANcepa)N = Numero de sujetos con resultados disponiblesnN% = NumeroNporcentaje de sujetos seropositivos (titulo de HI�=1:10)IC del 95% = Intervalo de confianza del 95%, LI = Limite inferior, LS = Limite superiorGMT = Titulo de anticuerpos medio geometrico; PRE = Antes de la vacunacion en el dia 0; MinNMax= MinimoNmaximoPI (D21) = Despues de la vacunacion en el dia 21

Tabla 25 - Tasas de seropositividad y GMT para título de anticuerpos de HI en D0 y d21 por categoría de edad
>= 10 1/DIL
GMT
IC del 95%
IC del 95%
Anticuerpo
Subgrupo Grupo Momento N n % LI LS Valor LI LS Mín Máx
ANSalomon
18-49 anos FluLD11 PRE 129 68 52,7 43,7 61,6 14,7 11,7 18,5 <10,0 905,0
PI (D21)
129 129 100 97,2 100 271,6 224,5 328,5 10,0 5120,0
FluLD12
PRE 128 58 45,3 36,5 54,3 14,1 11,0 18,0 <10,0 1280,0
PI (D21)
128 125 97,7 93,3 99,5 195,4 153,3 249,0 <10,0 2560,0
FluLD14
PRE 130 62 47,7 38,9 56,6 15,3 11,7 20,0 <10,0 1280,0
PI (D21)
130 128 98,5 94,6 99,8 205,5 167,0 252,8 <10,0 2560,0
FluLD18
PRE 132 73 55,3 46,4 64,0 17,2 13,4 22,0 <10,0 640,0
PI (D21)
132 130 98,5 94,6 99,8 195,7 156,2 245,1 <10,0 3620,0
Fluarix
PRE 130 70 53,8 44,9 62,6 15,1 12,0 19,2 <10,0 640,0
PI (D21)
130 128 98,5 94,6 99,8 247,6 197,7 310,0 <10,0 3620,0
50-64 anos
FluLD11 PRE 58 26 44,8 31,7 58,5 9,9 7,8 12,5 <10,0 113,0
PI (D21)
58 58 100 93,8 100 106,5 80,5 141,0 10,0 905,0
FluLD12
PRE 61 25 41,0 28,6 54,3 9,3 7,4 11,8 <10,0 80,0
PI (D21)
61 60 98,4 91,2 100 96,9 71,9 130,8 <10,0 1810,0
FluLD14
PRE 60 22 36,7 24,6 50,1 9,0 7,1 11,4 <10,0 160,0
PI (D21)
60 58 96,7 88,5 99,6 102,5 73,2 143,4 <10,0 1280,0
FluLD18
PRE 60 27 45,0 32,1 58,4 11,0 8,1 14,8 <10,0 453,0
PI (D21)
60 57 95,0 86,1 99,0 85,6 61,7 118,8 <10,0 1280,0
Fluarix
PRE 55 36 65,5 51,4 77,8 14,9 11,2 19,9 <10,0 226,0
PI (D21)
55 55 100 93,5 100 103,5 77,9 137,3 20,0 2560,0
(continuacion)(continuacion)
>= 10 1/DIL
GMT
IC del 95%
IC del 95%
Anticuerpo
Subgrupo Grupo Momento N n % LI LS Valor LI LS Mín Máx
ANWisconsin
18-49 anos FluLD11 PRE 129 98 76,0 67,7 83,1 28,7 22,2 37,1 <10,0 1280,0
PI (D21)
129 129 100 97,2 100 360,1 294,7 440,1 14,0 5120,0
FluLD12
PRE 128 95 74,2 65,7 81,5 31,2 23,9 40,6 <10,0 1280,0
PI (D21)
128 127 99,2 95,7 100 335,0 271,4 413,4 <10,0 5120,0
FluLD14
PRE 130 99 76,2 67,9 83,2 32,1 25,2 41,0 <10,0 640,0
PI (D21)
130 130 100 97,2 100 334,8 276,0 406,1 10,0 20480,0
FluLD18
PRE 132 105 79,5 71,7 86,1 27,7 22,2 34,5 <10,0 905,0
PI (D21)
132 131 99,2 95,9 100 273,2 223,8 333,6 <10,0 3620,0
Fluarix
PRE 130 106 81,5 73,8 87,8 34,0 26,6 43,4 <10,0 1280,0
PI (D21)
130 130 100 97,2 100 360,7 299,2 434,8 20,0 5120,0
50-64 anos
FluLD11 PRE 58 44 75,9 62,8 86,1 31,1 20,9 46,4 <10,0 1280,0
PI (D21 )
58 58 100 93,8 100 428,8 312,7 587,9 20,0 2560,0
FluLD12
PRE 61 46 75,4 62,7 85,5 27,8 19,2 40,2 <10,0 640,0
PI (DiA 21)
61 61 100 94,1 100 309,2 231,0 413,9 20,0 5120,0
FluLD14
PRE 60 42 70,0 56,8 81,2 25,6 17,9 36,6 <10,0 640,0
PI (D21)
60 58 96,7 88,5 99,6 290,0 205,5 409,1 <10,0 2560,0
FluLD18
PRE 60 44 73,3 60,3 83,9 26,2 18,3 37,6 <10,0 640,0
PI (D21)
60 60 100 94,0 100 275,3 202,4 374,4 10,0 5120,0
Fluarix
PRE 55 49 89,1 77,8 95,9 47,1 30,4 72,9 <10,0 1280,0
PI (D21)
55 55 100 93,5 100 282,0 208,9 380,6 40,0 2560,0
>= 10 1/DIL
GMT
IC del 95%
IC del 95%
Anticuerpo
Subgrupo Grupo Momento N n % LI LS Valor LI LS Mín Máx
BNMalasia
18-49 anos FluLD11 PRE 129 101 78,3 70,2 85,1 26,3 20,8 33,4 <10,0 2560,0
PI (D21)
129 129 100 97,2 100 281,2 237,9 332,4 40,0 2560,0
FluLD12
PRE 128 98 76,6 68,3 83,6 27,2 21,5 34,4 <10,0 3620,0
PI (D21)
128 128 100 97,2 100 335,9 283,3 398,3 28,0 3620,0
FluLD14
PRE 130 94 72,3 63,8 79,8 22,7 18,2 28,2 <10,0 640,0
PI (D21)
130 128 98,5 94,6 99,8 219,1 179,8 266,9 <10,0 2560,0
FluLD18
PRE 132 95 72,0 63,5 79,4 23,9 19,1 30,0 <10,0 1280,0
PI (D21)
132 130 98,5 94,6 99,8 203,5 166,7 248,5 <10,0 5120,0
Fluarix
PRE 130 98 75,4 67,1 82,5 27,4 21,7 34,4 <10,0 453,0
PI (D21)
130 129 99,2 95,8 100 250,9 206,9 304,3 <10,0 2560,0
50-64 anos
FluLD11 PRE 58 41 70,7 57,3 81,9 24,8 17,7 34,7 <10,0 320,0
PI (D21 )
58 58 100 93,8 100 138,6 108,1 177,6 20,0 1280,0
FluLD12
PRE 61 47 77,0 64,5 86,8 27,5 19,9 37,8 <10,0 640,0
PI (D21)
61 60 98,4 91,2 100 128,1 99,3 165,1 <10,0 1280,0
FIuLD14
PRE 60 44 73,3 60,3 83,9 22,4 15,9 31,6 <10,0 1280,0
PI (D21)
60 60 100 94,0 100 152,7 110,9 210,3 10,0 2560,0
FluLD18
PRE 60 47 78,3 65,8 87,9 21,8 16,2 29,2 <10,0 453,0
PI (D21)
60 58 96,7 88,5 99,6 117,0 85,4 160,3 <10,0 1810,0
Fluarix
PRE 55 41 74,5 61,0 85,3 26,0 18,0 37,6 <10,0 1280,0
PI (D21)
55 54 98,2 90,3 100 155,9 113,0 215,0 <10,0 3620,0
Conclusión intermedia
Para ANIslas Salomon (H1N1), los GMT estuvieron en el mismo intervalo para todos los grupos del estudio. Todos los grupos adyuvantados son no inferiores al grupo de Fluarix para todas las cepas y todas las categorias de edad. Para ANWisconsin (H3N2) se mostro una tendencia a una respuesta inmunitaria disminuida con concentracion de
5 AS03 decreciente sin diferencia estadisticamente significativa. Para BNMalasia tambien se mostro una tendencia a una respuesta inmunitaria disminuida con concentracion de AS03 decreciente, pero la unica diferencia estadisticamente significativa se mostro entre GMT inducidos con FluLD1N2 y FluLD1N8 para esta cepa (vease la Figura 15).
Se observaron resultados similares cuando los datos se analizaron por grupo de edad. Sin embargo, para BNMalasia,
10 el GMT inducido con FluLD1N2 fue estadisticamente significativamente superior a con FluLD1N4 en el grupo de edad mas joven (18-49 anos).
X.4.2 Factores de seroconversion de titulos de anticuerpos anti-HI, tasas de seroproteccion y tasas de seroconversion (establece una correlacion de la proteccion como se establece para la vacuna contra la gripe en seres humanos)
15 Los resultados se presentan en las Tablas 26 y 26 -Figura 16 para tasas de seroproteccion, Tablas 28 y 29 -Figura 17A y 17B para tasas de seroconversion y Tablas 30 y 31 - Figura 17 para factores de conversion.

Tabla 26 - Tasas de seroprotección (SPR) para título de anticuerpos de HI en D0 y D21
SPR
IC del 95%
Cepa de la vacuna
Grupo Momento N n % LI LS
ANSalomon
FluLD11 PRE 187 45 24,1 18,1 30,8
PI (DiA21)
187 177 94,7 90,4 97,4
FluLD12
PRE 189 46 24,3 18,4 31,1
PI (DiA21)
189 170 89,9 84,7 93,8
FluLD14
PRE 190 43 22,6 16,9 29,2
PI (DiA21)
190 169 88,9 83,6 93,0
FluLD18
PRE 192 52 27,1 20,9 34,0
PI (DiA21)
192 166 86,5 80,8 91,0
Fluarix
PRE 185 50 27,0 20,8 34,0
PI (DiA21)
185 172 93,0 88,3 96,2
ANWisconsin
FluLD11 PRE 187 90 48,1 40,8 55,5
PI (DiA21)
187 183 97,9 94,6 99,4
Fluid12
PRE 189 90 47,6 40,3 55,0
PI (DiA21)
189 186 98,4 95,4 99,7
FluL14
PRE 190 96 50,5 43,2 57,8
PI (DiA21)
190 185 97,4 94,0 99,1
FluLD18
PRE 192 91 47,4 40,2 54,7
PI (DiA21)
192 184 95,8 92,0 98,2
Fluarix
PRE 185 95 51,4 43,9 58,8
PI (DiA21)
185 183 98,9 96,1 99,9
(continuacion)
SPR
IC del 95%
Cepa de la vacuna
Grupo Momento N n % LI LS
BNMalasia
FluLD11 PRE 187 80 42,8 35,6 50,2
PI (DiA21)
187 183 97,9 94,6 99,4
FluLD12
PRE 189 88 46,6 39,3 53,9
PI (DiA21)
189 186 98,4 95,4 99,7
FluLD14
PRE 190 81 42,6 35,5 50,0
PI (DiA21)
190 180 94,7 90,5 97,4
FluLD18
PRE 192 86 44,8 37,6 52,1
PI (DiA21)
192 180 93,8 89,3 96,7
Fluarix
PRE 185 88 47,6 40,2 55,0
PI (DiA21)
185 178 96,2 92,4 98,5
FluLD11 = 5 Ig de HANcepa con 1N1 de dosis de AS03 FluLD21 = 5 Ig de HANcepa con 1N2 de dosis de AS03 FluLD14 = 5 Ig de HANcepa con 1N4 de dosis de AS03 FluLD18 = 5 Ig de HANcepa con 1N8 de dosis de AS03 Fluarix = Fluarix (15 Ig de HANcepa) Tasa de seroproteccion definida como el porcentaje de vacunados con un titulo de HI en suero � 1:40 N = Numero de sujetos con resultados disponibles antes y despues de la vacunacion nN% = NumeroNporcentaje de sujetos seroprotegidos IC del 95% = Intervalo de confianza del 95%, LI = Limite inferior, LS = Limite superior PRE = Antes de la vacunacion en el dia 0; PI (DiA21) = Despues de la vacunacion en el dia 21

Tabla 27 - Tasas de seroprotección (SPR) para título de anticuerpos de HI en D0 y D21 por categoría de edad
SPR
IC del 95%
Cepa de la vacuna
Subgrupo Grupo Momento N n % LI LS
ANSalomon
18-49 anos FluLD11 PRE 129 36 27,9 20,4 36,5
PI (DiA21)
129 127 98,4 94,5 99,8
Fluid12
PRE 128 35 27,3 19,8 35,9
PI (DiA21)
128 117 91,4 85,1 95,6
FluLD14
PRE 130 35 26,9 19,5 35,4
PI (DiA21)
130 119 91,5 85,4 95,7
FluLD18
PRE 132 43 32,6 24,7 41,3
PI (DiA21)
132 119 90,2 83,7 94,7
Fluarix
PRE 130 34 26,2 18,8 34,6
PI (DiA21)
130 124 95,4 90,2 98,3
50-64 anos
FluLD11 PRE 58 9 15,5 7,3 27,4
PI (DiA21)
58 50 86,2 74,6 93,9
FluLD12
PRE 61 11 18,0 9,4 30,0
PI (DiA21)
61 53 86,9 75,8 94,2
FluLD14
PRE 60 8 13,3 5,9 24,6
PI (DiA21)
60 50 83,3 71,5 91,7
FluLD18
PRE 60 9 15,0 7,1 26,6
PI (DiA21)
60 47 78,3 65,8 87,9
Fluarix
PRE 55 16 29,1 17,6 42,9
PI (DiA21)
55 48 87,3 75,5 94,7
(continuacion) (continuacion)
SPR
IC del 95%
Cepa de la vacuna
Subgrupo Grupo Momento N n % LI LS
ANWisconsin
18-49 anos Fluid11 PRE 129 62 48,1 39,2 57,0
PI (DiA21)
129 127 98,4 94,5 99,8
FluLD12
PRE 128 62 48,4 39,5 57,4
PI (DiA21)
128 126 98,4 94,5 99,8
FluLD14
PRE 130 68 52,3 43,4 61,1
PI (DiA21)
130 128 98,5 94,6 99,8
FluLD18
PRE 132 62 47,0 38,2 55,8
PI (DiA21)
132 127 96,2 91,4 98,8
Fluarix
PRE 130 66 50,8 41,9 59,6
PI (DiA21)
130 128 98,5 94,6 99,8
50-64 anos
FluLD11 PRE 58 ,28 48,3 35,0. 61,8
PI (DiA21)
58 56 96,6 88,1 99,6
FluLD12
PRE 61 28 45,9 33,1 59,2
PI (DiA21)
61 60 98,4 91,2 100
FluLD14
PRE 60 28 46,7 33,7 60,0
PI (DiA21)
60 57 95,0 86,1 99,0
FluLD18
PRE 60 29 48,3 35,2 61,6
PI (DiA21)
60 57 95,0 86,1 99,0
Fluarix
PRE 55 29 52,7 38,8 66,3
PI (DiA21)
55 55 100 93,5 100
BNMalasia
18-49 anos FluLD11 PRE 129 53 41,1 32,5 50,1
PI (DiA21)
129 129 100 97,2 100
FluLD12
PRE 128 59 46,1 37,2 55,1
PI (DiA21)
128 127 99,2 95,7 100
FluLD14
PRE 130 57 43,8 35,2 52,8
PI (DiA21)
130 125 96,2 91,3 98,7
FluLD18
PRE 132 61 46,2 37,5 55,1
PI (DiA21)
132 128 97,0 92,4 99,2
Fluarix
PRE 130 61 46,9 38,1 55,9
PI (DiA21)
130 126 96,9 92,3 99,2
50-64 anos
FluLD11 PRE 58 27 46,6 33,3 60,1
SPR
IC del 95%
Cepa de la vacuna
Subgrupo Grupo Momento N n % LI LS
PI (DiA21)
58 54 93,1 83,3 98,1
FluLD12
PRE 61 29 47,5 34,6 60,7
PI (DiA21 )
61 59 96,7 88,7 99,6
FluLD14
PRE 60 24 40,0 27,6 53,5
PI (DiA21)
60 55 91,7 81,6 97,2
FluLD18
PRE 60 25 41,7 29,1 55,1
PI (DiA21)
60 52 86,7 75,4 94,1
Fluarix
PRE 55 27 49,1 35,4 62,9
PI (DiA21)
55 52 94,5 84,9 98,9
Misma leyenda que en la Tabla 24

Tabla 28 - Tasa de seroconversión (SCR) para título de anticuerpos de HI en PI (D�?A21)
Conclusión intermedia
La SPR cumple los criterios del CHMP (media � 70) y de la FDA (LI del IC del 95% � 70) para todos los grupos y las tres cepas. Se mostro que la SPR estaba dentro del mismo intervalo para todos los grupos.
SCR
IC del 95%
Cepa de la vacuna
Grupo Momento N n % LI LS
ANSalomon
FluLD11 PI (DiA21) 187 154 82,4 76,1 87,5
FluLD12
PI (DiA21) 189 141 74,6 67,8 80,6
FluLD14
PI (DiA21) 190 133 70,0 62,9 76,4
FluLD18
PI (DiA21) 192 119 62,0 54,7 68,9
Fluarix
PI (DiA21) 185 131 70,8 63,7 77,2
ANWisconsin
FluLD11 PI (DiA21) 187 150 80,2 73,8 85,7
FluLD12
PI (DiA21) 189 147 77,8 71,2 83,5
FluLD14
PI (DiA21) 190 142 74,7 67,9 80,7
FluLD18
PI (DiA21) 192 142 74,0 67,1 80,0
Fluarix
PI (DiA21) 185 118 63,8 56,4 70,7
BNMalasia
FluLD11 PI (DiA21) 187 136 72,7 65,7 79,0
FluLD12
PI (DiA21) 189 127 67,2 60,0 73,8
FluLD14
PI (DiA21) 190 128 67,4 60,2 74,0
(continuacion) (continuacion)
SCR
IC del 95%
Cepa de la vacuna
Grupo Momento N n % LI LS
FluLD18
PI (DiA21) 192 127 66,1 59,0 72,8
Fluarix
PI (DiA21) 185 125 67,6 60,3 74,3
FluLD11 = 5 Ig de HANcepa con 1N1 de dosis de AS03; FluLD12 = 5 Ig de HANcepa con 1N2 de dosis de AS03; FluLD14 =5 Ig de HANcepa con 1N4 de dosis de AS03; FluLD18 = 5 Ig de HANcepa con 1N8 de dosis de AS03; Fluarix = Fluarix (15 Ig de HANcepa) Seroconversion definida como: Para sujetos inicialmente seronegativos, titulo de anticuerpos �= 40 1NDIL despues de la vacunacion Para sujetos inicialmente seropositivos, titulo de anticuerpos despues de la vacunacion �= 4 veces el titulo de anticuerpos antes de la vacunacion N = Numero de sujetos con resultados disponibles antes y despues de la vacunacion nN% = NumeroNporcentaje de sujetos seroconvertidos IC del 95% = Intervalo de confianza del 95%, LI = Limite inferior, LS = Limite superior PI (DiA21)= Despues de la vacunacion en el dia 21

Tabla 29 - Tasa de seroconversión (SCR) para título de anticuerpos de HI en PI (D�?A21) por categoría de edad
SCR
IC del 95%
Cepa de la vacuna
Subgrupo Grupo Momento N n % LI LS
ANSalomon
18-49 anos FluLD11 PI (DiA21) 129 113 87,6 80,6 92,7
FluLD12
PI (DiA21) 128 96 75,0 66,6 82,2
FluLD12
PI (DiA21) 130 91 70,0 61,3 77,7
FluLD18
PI (DiA21) 132 84 63,6 54,8 71,8
Fluarix
PI (DiA21) 130 101 77,7 69,6 84,5
50-64 anos
FluLD11 PI (DiA21) 58 41 70,7 57,3 81,9
FluLD12
PI (DiA21) 61 45 73,8 60,9 84,2
FluLD14
PI (DiA21) 60 42 70,0 56,8 81,2
FluLD18
PI (DiA21) 60 35 58,3 44,9 70,9
Fluarix
PI (DiA21) 55 30 54,5 40,6 68,0
ANWisconsin
18-49 anos FluLD11 PI (DiA21) 129 104 80,6 72,7 87,0
FluLD12
PI (DiA21) 128 101 78,9 70,8 85,6
FluLD14
PI (DiA21) 130 97 74,6 66,2 81,8
FluLD18
PI (DiA21) 132 96 72,7 64,3 80,1
SCR
IC del 95%
Cepa de la vacuna
Subgrupo Grupo Momento N n % LI LS
Fluarix
PI (DiA21) 130 89 68,5 59,7 76,3
50-64 anos
FIuLD11 PI (DiA21) 58 46 79,3 66,6 88,8
FluLD12
PI (DiA21) 61 46 75,4 62,7 85,5
FluLD14
PI (DiA21) 60 45 75,0 62,1 85,3
FluLD18
PI (DiA21) 60 46 76,7 64,0 86,6
Fluarix
PI (DiA21) 55 29 52,7 38,8 66,3
BNMalasia
18-49 anos FluLD11 PI (DiA21) 129 102 79,1 71,0 85,7
FluLD12
PI (DiA21) 128 96 75,0 66,6 82,2
FluLD14
PI (DiA21) 130 93 71,5 63,0 79,1
FluLD18
PI (DiA21) 132 96 72,7 64,3 80,1
Fluarix
PI (DiA21) 130 94 72,3 63,8 79,8
50-64 anos
FluLD11 PI (DiA21) 58 34 58,6 44,9 71,4
FluLD12
PI (DiA21) 61 31 50,8 37,7 63,9
FluLD14
PI (DiA21) 60 35 58,3 44,9 70,9
FluLD18
PI (DiA21) 60 31 51,7 38,4 64,8
Fluarix
PI (DiA21) 55 31 56,4 42,3 69,7
Misma leyenda que para la Tabla 26
Conclusión intermedia
La SPR cumple los criterios del CHMP (media � 40) y de la FDA (LI del IC del 95% � 40) para todas las vacunas del estudio y para las 3 cepas. Se mostro una tendencia a una SCR disminuida con contenido de AS03 disminuido, excepto para BNMalasia (en la que se mostro que todos los resultados estaban dentro del mismo intervalo). Para ANIslas Salomon, FluLD1N1 indujo una SCR estadisticamente significativamente mayor en comparacion con FluLDlN8. Para todos los grupos, las SCR inducidas por FluLDlN2 y FluLD1N4 estuvieron dentro del mismo intervalo.

Tabla 30 - Factor de seroconversión (SCF) para título de anticuerpos de HI en D21
SCF
IC del 95%
Cepa de la vacuna
Grupo Momento N Valor LI LS
ANSalomon (1NDIL)
FluLD11 PI (DiA21) 187 15,6 12,7 19,2
FluLD12
PI (DiA21) 189 12,7 10,2 15,8
FluLD14
PI (DiA21) 190 12,8 10,1 16,1
FluLD18
PI (DiA21) 192 10,1 8,0 12,8
Fluarix
PI (DiA21) 185 12,7 9,9 16,2
ANWisconsin (1NDIL)
FluLD11 PI (DiA21) 187 12,9 10,5 16,0
FluLD12
PI (DiA21) 189 10,9 8,9 13,3
FluLD14
PI (DiA21) 190 10,7 8,6 13,2
FluLD18
PI (DiA21) 192 10,1 8,2 12,3
Fluarix
PI (DiA21) 185 9,0 7,2 11,2
BNMalasia (1NDIL)
FluLD11 PI (DiA21) 187 8,7 7,2 10,6
FluLD12
PI (DiA21) 189 9,0 7,3 11,2
FluLD14
PI (DiA21) 190 8,7 7,0 10,8
FluLD18
PI (DiA21) 192 7,4 6,1 8,9
Fluarix
PI (DiA21) 185 8,1 6,6 9,9
FluLD11 = 5 Ig de HANcepa con 1N1 de dosis de AS03; FluLD12 = 5 Ig de HANcepa con 1N2 de dosis de AS03; FluLD14 = 5 Ig de HANcepa con 1N4 de dosis de AS03; FluLD18 = 5 Ig de HANcepa con 1N8 de dosis de AS03; Fluarix = Fluarix (15 Ig de HANcepa) N = Numero de sujetos con resultados disponibles antes y despues de la vacunacion SCF = Factor de seroconversion o relacion media geometrica (media[log10(DESPUESNANTES)]) IC del 95% = Intervalo de confianza del 95%, LI = Limite inferior, LS = Limite superior PI (DiA21)= Despues de la vacunacion en el dia 21

Tabla 31 - Factor de seroconversión (SCF) para título de anticuerpos de HI en D21 por categoría de edad
SCF
IC del 95%
Cepa de la vacuna
Subgrupo Grupo Momento N Valor LI LS
ANSalomon (1NDIL)
18-49 anos FluLD11 PI (DiA21) 129 18,5 14,3 23,8
FluLD12
PI (DiA21) 128 13,9 10,5 18,4
FluLD14
PI (DiA21) 130 13,4 10,1 17,8
FluLD18
PI (DiA21) 132 11,4 8,4 15,4
Fluarix
PI (DiA21) 130 16,3 12,1 22,1
50-64 anos
FluLD11 PI (DiA21) 58 10,8 7,7 15,1
FluLD12
PI (DiA21) 61 10,4 7,4 14,6
FluLD14
PI (DiA21) 60 11,4 7,7 17,1
FluLD18
PI (DiA21) 60 7,8 5,5 11,2
Fluarix
PI (DiA21) 55 6,9 4,6 10,4
ANWisconsin (1NDIL)
18-49 anos FluLD11 PI (DiA21) 129 12,5 9,8 16,0
FluLD12
PI (DiA21) 128 10,7 8,5 13,7
FluLD14
PI (DiA21) 130 10,4 8,0 13,5
FluLD18
PI (DiA21) 132 9,9 7,8 12,5
Fluarix
PI (DiA21) 130 10,6 8,2 13,8
50-64 anos
FluLD11 PI (DiA21) 58 13,8 9,0 21,2
FluLD12
PI (DiA21) 61 11,1 7,5 16,4
FluLD14
PI (DiA21) 60 11,3 7,7 16,7
FluLD18
PI (DiA21) 60 10,5 7,0 15,7
Fluarix
PI (DiA21) 55 6,0 4,0 8,9
BNMalasia (1NDIL)
18-49 anos FluLD11 PI (DiA21) 129 10,7 8,4 13,5
FluLD12
PI (DiA21) 128 12,4 9,5 16,1
FluLD14
PI (DiA21) 130 9,7 7,4 12,6
FluLD18
PI (DiA21) 132 8,5 6,8 10,7
Fluarix
PI (DiA21) 130 9,2 7,2 11,7
50-64 anos
FluLD11 PI (DiA21) 58 5,6 4,0 7,7
FluLD12
PI (DiA21) 61 4,7 3,4 6,5
FluLD14
PI (DiA21) 60 6,8 4,6 10,0
FluLD18
PI (DiA21) 60 5,4 3,8 7,5
Fluarix
PI (DiA21) 55 6,0 4,1 8,8
Misma leyenda que en la Tabla 28
Conclusión intermedia
Para todas las vacunas en estudio, los SCF estuvieron muy por encima de los criterios del CHMP (�2) para las 3 cepas. Los SCF estuvieron dentro del mismo intervalo para todas las vacunas en estudio.
X.4.3 No inferioridad de las vacunas de dosis baja adyuvantadas con respecto a Fluarix (GMT)
La no inferioridad de las vacunas de dosis baja adyuvantadas con respecto a Fluarix en terminos de relaciones de GMT en el dia 21 para las 3 cepas viricas se muestra en la Tabla 32.
Conclusión intermedia
Se mostro que FluLD 1N1, 1N2, 1N4 eran no inferiores a Fluarix en terminos de relaciones de GMT para las tres cepas. Se mostro que FluLD 1N8 era no inferior a Fluarix para la cepa H1N1 y H3N2, pero no para B.
X.5. Conclusiones globales
X.5. 1 Conclusiones de seguridad
Se mostro una mayor reactogenicidad con las vacunas adyuvantadas en comparacion con la mostrada con la vacuna comercialmente disponible Fluarix. Para las vacunas adyuvantadas se mostro una tendencia a disminuir la reactogenicidad con una cantidad decreciente de AS03. En conjunto, se obtuvo un perfil de reactogenicidad similar a FluDL1N4 y FluDL1N8.
Los sintomas inesperados fueron los mismos para todos los grupos de vacunas.
X.5.2 Conclusiones de inmunogenicidad
El objetivo primario de este estudio fue evaluar la no inferioridad (GMT) de las formulaciones de vacuna de LD frente a Fluarix en D21.
En el dia 21 despues de la vacunacion con una dosis de la vacuna adyuvantada FluDL1N1, FluDL1N2 y FluDL1N4 se mostro que las relaciones de GMT para las tres cepas era no inferior a las obtenidas con Fluarix. En ese estudio se mostro que la relacion de GMT obtenida con la vacuna FluDL1N8 era no inferior a Fluarix para la cepa H1N1 y H3N2, pero no para la cepa B.
A pesar de una tendencia a respuesta inmunitaria decreciente mostrada con cantidades de adyuvante decrecientes, se mostro que todas las vacunas cumplian los 3 criterios del CHMP para la autorizacion reguladora, para toda las cepas.
Ejemplo XI - Ensayo clínico en una población de +65 años de edad con una vacuna que contiene una preparación de antígeno de la gripe fraccionado y diversos adyuvantes
XI.1. Introducción
La eficacia de una vacuna fraccionada contra la gripe clasica tal como Fluarix™ en ancianos adultos es significativamente inferior a la de en una poblacion adulta o joven. Se sugiere que el envejecimiento del sistema inmunitario (es decir, inmunosenescencia) es la causa subyacente de la falta relativa de eficacia observada en ancianos adultos, por tanto, dejando margen para la mejora de las vacunas estimulando respuestas inmunitarias mas fuertes. Por tanto, se realizo un estudio de simple ciego aleatorizado controlado de fase II en una poblacion anciana de +65 anos de edad en 2007 con el fin de evaluar la inmunogenicidad, seguridad y reactogenicidad de una vacuna candidata contra la gripe con ocho formulaciones de adyuvante diferentes, administrada intramuscularmente, en comparacion con Fluarix™ (GlaxoSmithKline Biologicals) usada como referencia.
Ya se ha probado una vacuna contra la gripe adyuvantada que comprende una emulsion de aceite en agua y 25 Ig de 3D-MPL por dosis y demostro ser eficaz (documento WO 2006N100111). En ese estudio, las cantidades de cada componente se fijaron en 250 Il de emulsion de aceite en agua y 25 Ig de MPL. El presente estudio tiene como objetivo determinar una formulacion de vacuna optima que equilibre la aceptabilidad del perfil de reactogenicidadNseguridad observado con el del perfil de inmunogenicidad.
XI.2. Diseño del estudio y objetivos
Diez grupos de sujetos (200 por grupo de �65 anos de edad, excepto para el grupo Fluarix YNG de 18-40 anos de edad) recibieron en paralelo las siguientes vacunas contra la gripe i.m.:
•
FluAS03 1N1: vacuna adyuvantada con dosis completa de emulsion oNw (AS03 1N1)
•
FluAS03 1N2: vacuna adyuvantada con 1N2 de dosis de emulsion oNw (AS03 1N2)
•
FluAS03 1N4: vacuna adyuvantada con 1N4 de dosis de emulsion oNw (AS03 1N4)
•
FluAS25 1N1: vacuna adyuvantada con 25 Ig MPL + dosis completa de emulsion oNw (AS25A)
•
FluAS25 1N2: vacuna adyuvantada con 25 Ig MPL + 1N2 de dosis de emulsion oNw (AS25B)
•
FluAS25 1N4: vacuna adyuvantada con 25 Ig MPL + 1N4 de dosis de emulsion oNw (AS25C)
•
FluAS50 1N2: vacuna adyuvantada con 50 Ig MPL + 1N2 de dosis de emulsion oNw (AS25E)
•
FluAS50 1N4: vacuna adyuvantada con 50 Ig MPL + 1N4 de dosis de emulsion oNw (AS25F)
•
Fluarix ELD (�65 anos de edad): Fluarix™
•
Fluarix YNG (18-40 anos de edad): Fluarix™
Programa: una inyeccion IM de la vacuna contra la gripe en el dia 0, recogida de muestra de sangre en el dia 0, dia 21 y dia 180 despues de la vacunacion. La vacuna contra la gripe fraccionada trivalente convencional Fluarix™ usada en este estudio es la misma que se uso en el Ejemplo X.
Las formulaciones de vacuna se describen en las Tablas 31-32.
XI.2.1. Objetivo primario: inmunogenicidad
Identificar una formulacion optima (combinacion de una dosificacion de emulsion oNw y una dosificacion de MPL) de la vacuna contra la gripe adyuvantada en comparacion con Fluarix, administrada intramuscularmente en sujetos de
�65 anos de edad, basandose en la inmunogenicidad (GMT) para las tres cepas de la vacuna 21 dias despues de la vacunacion. Las variables son como en el Ejemplo X.2.1 y para los sujetos de +65 anos de edad (titulo de anticuerpos de HI y GMT de titulos de HI de anticuerpos en el dia 21).
X.2.2. Objetivos secundarios que van a evaluarse:
•
la seguridad y la reactogenicidad en todos los sujetos vacunados con las vacunas contra la gripe
•
la inmunogenicidad (GMT, SCF, SCR y SPR) de las vacunas contra la gripe en todos los sujetos, 21 dias despues de la vacunacion.
•
la persistencia de anticuerpos de HI 180 dias despues de la primera vacunacion, en todos los sujetos.
•
la respuesta inmunitaria mediada por celula (CMI) inducida por las vacunas contra la gripe en terminos de frecuencia de linfocitos T CD4NCD8 especificos de la gripe que producen al menos dos citocinas diferentes (IFN-γ, IL-2, CD40L o TNF-α), en los dias 0, 21 y 180 (solo para un subconjunto de sujetos).
Las variables observadas y derivadas (y definiciones) son como se describen en el Ejemplo X.
XI.3. Composición y administración de vacunas
La vacuna contra la gripe adyuvantada se basa en la vacuna comercialmente disponible Fluarix, ya comercializada desde 1992 por GSK Bio. Las formulaciones candidatas consisten en los antigenos de la gripe inactivados de virion fraccionados trivalentes compuestos por 3 vacunas de antigeno virico monovalente (preparadas respectivamente a partir de las cepas de la gripe ANH1N1, ANH3N2 y B recomendadas para el hemisferio norte en 2007N2008, vease el Ejemplo X), combinadas con los sistemas de adyuvante basados en MPL yNo una emulsion de aceite en agua (oNw).
En ese ensayo se probaran dos familias del sistema de adyuvante patentado de GSK Bio:
•
La familia de AS03 clasificada (1N1 -Y -...) por la cantidad de emulsion por dosis humana de vacuna adyuvantada;
•
La familia de AS25 de emulsion de aceite en agua complementada con MPL y clasificada (A, B, ...) por las cantidades de cada componente por dosis humana de vacuna adyuvantada.
XI.3.1. Composicion de vacuna
La produccion de las tres vacunas monovalentes de antigenos de virion inactivados fraccionados preparados a partir de semillas de trabajo de tres cepas del virus de la gripe, tipo A (H1N1 y H3N2) y tipo B, cultivadas individualmente en huevos de gallina embrionados es como ya se ha descrito (vease el Ejemplo X). Los lotes clinicos contienen 15 Ig de hemaglutinina (HA) de cada cepa del virus de la gripe por dosis. Los antigenos de la gripe estan adyuvantados con 3-O-desacil-4'-monofosforil lipido A (MPL) yNo una emulsion de aceite en agua (oNw) AS03. Van a combinarse ocho formulaciones diferentes del AS con los antigenos de la gripe de virion fraccionados. El procedimiento de preparacion de los adyuvantes se adapta a partir del descrito en el Ejemplo II del documento WO 2006N100111, en el que la cantidad de los componentes individuales se adaptan segun la informacion facilitada en la Tablas 31 y 32. Los excipientes son los siguientes: Polisorbato 80 (Tween-80), octoxinol 10 (Triton® X-100), hidrogenosuccinato de αtocoferilo, cloruro sodico, cloruro de magnesio, hidrogenofosfato de disodio, hidrogenofosfato de potasio, cloruro de potasio y agua para inyeccion. Las diferentes formulaciones de la vacuna contra la gripe adyuvantada son formulaciones libres de conservante. Sin embargo, contienen cantidades traza de tiomersal (< 1,25 Ig de Hg por dosis) de las fases tempranas del procedimiento de fabricacion del principio activo en las que se anade para reducir la biocarga.
La vacuna contra la gripe adyuvantada es una emulsion blanquecida esteril del virus de la gripe purificado fraccionado adyuvantado para inyeccion. Se presenta como una vacuna de 2 componentes que consiste en un vial de vidrio de tipo I que contiene el antigeno (suspension) y una jeringuilla precargada de vidrio de tipo I (PFS) que contiene el adyuvante (emulsion). La vacuna se almacena a 2 a 8°C. En el momento de la inyeccion, el contenido de la jeringuilla precargada de antigeno se inyecta en el vial que contiene los antigenos de virion concentrados fraccionados inactivados trivalentes. Despues de mezclar el contenido se saca en la jeringuilla y la aguja se sustituye por una aguja intramuscular. Una dosis de la vacuna candidata contra la gripe adyuvantada reconstituida se corresponde con 0,7 ml (Tablas 33 y 34).

Tabla 33 Formulaciones de vacuna
Sistema de adyuvante
Volumen de emulsión o/w Cantidad de MPL Antígenos de la gripe NH 2007/2008
AS25A (AS25 1 1)
250 Il 25 Ig ANIslas SalomonN3N2006 (H1N1)IVR-145 ANWisconsinN67N2005
AS25B (AS25 1 2)
125 Il 25 Ig
AS25C (AS25 1 4)
62,5 Il 25 Ig
AS031N1 (AS03 1 1)
250 Il 0 Ig
AS031N2 (AS03 1 2)
125 Il 0 Ig (H3N2) NYMCX-161 B BNMalasiaN2506N2004
AS031N4 (AS03 1 4)
62,5 Il 0 Ig
AS25E - AS50 1N2 (AS50 1 2)
125 Il 50 Ig
AS25F - AS50114 (AS50 1 4)
62,5 Il 50 Ig
Tabla 34 Composición de las vacunas contra la gripe adyuvantadas
Componente
Cantidad por dosis (0,7 ml)
PRINCIPIOS ACTIVOS
Viriones fraccionados inactivados - H1N1 - H3N2 - B
15 Ig de HA 15 Ig de HA 15 Ig de HA
ADYUVANTE
AS25A AS25B AS25C AS03111 AS03112 AS03114 AS25E AS25F
- Emulsion (Il)
250 125 62,5 250 125 62,5 125 62,5
• Escualeno (mg)
10,69 5,34 2,67 10,69 5,34 2,67 5,34 2,67
• DL-α-tocoferol (mg)
11,86 5,93 2,97 11,86 5,93 2,97 5,93 2,97
• Polisorbato 80 (Tween-80) (mg)
4,86 2,43 1,22 4,86 2,43 1,22 2,43 1,22
- MPL
25 Ig 25 Ig 25 Ig N N N 50 Ig 50 Ig
(Continuacion)
EXCIPIENTES (VALORES DIANA)
Polisorbato 80 (Tween-80)
0,40 mg
Octoxinol 10 (Triton® X-100)
0,05 mg
Hidrogenosuccinato de α-tocoferilo
0,05 mg
Cloruro sodico
3,92 mg
Cloruro de magnesio
0,03 mg
Fosfato de disodio
0,54 mg
Hidrogenofosfato de potasio
0,16 mg
Cloruro de potasio
0,10 mg
Agua para inyeccion
Hasta 0,70 ml
XI.3.2. Preparacion de vacunas
Las formulaciones de AS03 se preparan diluyendo el tampon fosfato (NaNK PO43-191,4 mM, NaCl 2,74 mM, KCl 54 mM, pH 6,8, y PO43 9,57 mM) con agua para inyeccion (agitacion durante 15-45 min a TA hasta homogeneidad). 5 Entonces se anade la cantidad apropiada de vacuna de emulsion de aceite en agua. La mezcla se agita durante 1545 minutos a temperatura ambiente, y el pH se mide. Entonces, la mezcla se esteriliza por filtracion a traves de una membrana de 0,2 Im. Se realiza lavado con gas inerte esteril (nitrogeno) para producir espacio de cabeza inerte en los recipientes cargados durante minimo 1 minuto. El adyuvante AS03 esteril se almacena a +2 -8°C hasta envasarse asepticamente en 1,25 ml de jeringuillas de vidrio tipo I (Ph. Eur.) esteriles. Cada jeringuilla contiene un
10 volumen promedio de 60 Il (280 Il + 60 Il de sobrellenado).
Las formulaciones de AS25 se preparan diluyendo el tampon fosfato con agua para inyeccion (agitacion durante 1545 min a TA hasta homogeneidad). Entonces se anaden las cantidades apropiadas de vacuna de SB62 y vacuna de liquido de MPL. El resto del procedimiento es como se ha descrito anteriormente.
Una dosis de la vacuna contra la gripe adyuvantada reconstituida se corresponde con 0,7 ml. La concentracion de
15 HA final es 21,4 Ig de cada vacuna monovalente por ml de vacuna final trivalente. La vacuna de antigenos (Ag) final se envasa en viales de vidrio de 3 ml, una dosis de antigenos de la gripe trivalentes se corresponde con un volumen de 0,42 ml. La vacuna final adyuvantada se envasa en vidrio PFS de 1,25 ml, una dosis se corresponde con un volumen de 0,28 ml. La dosis de vacuna final despues de reconstitucion sera de 0,7 ml.
Para permitir la inyeccion del volumen nominal (0,7 ml) despues de la reconstitucion, cada vial de Ag se carga con 20 un volumen diana de 0,51 ml y cada jeringuilla de AS se carga con un volumen diana de 0,34 ml.
XI.4. Resultados de inmunogenicidad - Respuesta inmunitaria humoral
XI.4.1 Titulos medios geometricos de HI (GMT)
Los GMT para anticuerpos de HI con IC del 95% se muestran en la Tabla 35 y la Figura 19.

Tabla 35 - Tasas de seropositividad y GMT para título de anticuerpos de HI en los días 0 y 21 (cohorte de ATP para HI por inmunogenicidad)
>=10 1/DIL
GMT
IC del 95%
IC del 95%
Anticuerpo
Grupo Momento N n % LI LS valor LI LS Mín Máx
ANIslas Salomon
AS03 1 4 PRE 191 97 50,8 43,5 58,1 10,6 9,3 12,2 <10,0 453,0
PI (D21)
191 184 96,3 92,6 98,5 82,3 69,7 97,1 <10,0 2560,0
AS03 1 2
PRE 191 91 47,6 40,4 55,0 10,8 9,4 12,4 <10,0 226,0
PI (D21)
192 188 97,9 94,8 99,4 102,2 87,0 119,9 <10,0 1280,0
AS03 1 1
PRE 189 86 45,5 38,3 52,9 10,1 8,8 11,5 <10,0 320,0
PI (D21)
189 185 97,9 94,7 99,4 98,2 84,3 114,3 <10,0 3620,0
AS25 1 4
PRE 194 97 50,0 42,8 57,2 10,6 9,3 12,1 <10,0 226,0
PI (D21)
194 189 97,4 94,1 99,2 91,7 76,9 109,3 <10,0 1810,0
AS25 1 2
PRE 192 97 50,5 43,2 57,8 12,0 10,3 14,0 <10,0 320,0
PI (D21)
192 190 99,0 96,3 99,9 113,2 96,0 133,6 <10,0 2560,0
AS25 1 1
PRE 193 88 45,6 38,4 52,9 9,9 8,6 11,3 <10,0 320,0
PI (D21)
193 188 97,4 94,1 99,2 114,4 97,1 134,8 <10,0 1810,0
AS50 1 4
PRE 192 87 45,3 38,1 52,6 10,2 8,9 11,7 <10,0 160,0
PI (D21)
192 183 95,3 91,3 97,8 78,5 65,9 93,5 <10,0 1280,0
AS50 1 2
PRE 189 91 48,1 40,8 55,5 10,3 9,0 11,9 <10,0 640,0
PI (D21)
189 183 96,8 93,2 98,8 111,8 93,3 134,0 <10,0 1280,0
Flu ELD
PRE 187 88 47,1 39,7 54,5 10,7 9,2 12,4 <10,0 2560,0
PI (D21)
188 177 94,1 89,8 97,0 59,6 49,6 71,7 <10,0 3620,0
(continuacion)(continuacion)(continuacion)
>=10 1/DIL
GMT
IC del 95%
IC del 95%
Anticuerpo
Grupo Momento N n % LI LS valor LI LS Mín Máx
Flu YNG
PRE 197 122 61,9 54,8 68,7 21,3 17,1 26,5 <10,0 1810,0
PI (D21)
197 195 99,0 96,4 99,9 271,6 224,6 328,4 <10,0 5120,0
ANWisconsin
AS03 1 4 PRE 191 176 92,1 87,4 95,5 59,9 49,5 72,4 <10,0 1280,0
PI (D21)
191 190 99,5 97,1 100 276,2 238,8 319,6 <10,0 5120,0
AS03 1 2
PRE 191 168 88,0 82,5 92,2 51,2 41,9 62,4 <10,0 905,0
PI (D21)
192 192 100 98,1 100 350,2 298,0 411,4 14,0 14480,0
AS03 1 1
PRE 189 168 88,9 83,5 93,0 44,4 36,5 54,0 <10,0 2560,0
PI (D21)
189 189 100 98,1 100 351,3 304,8 404,8 28,0 5120,0
AS25 1 4
PRE 194 175 90,2 85,1 94,0 65,7 53,7 80,4 <10,0 2560,0
PI (D21)
194 194 100 98,1 100 309,2 264,9 361,0 10,0 5120,0
AS25 1 2
PRE 192 174 90,6 85,6 94,3 61,1 50,6 73,8 <10,0 1280,0
PI (D21)
192 192 100 98,1 100 331,1 289,6 378,6 40,0 5120,0
AS25 1 1
PRE 193 173 89,6 84,4 93,6 55,8 46,2 67,4 <10,0 1280,0
PI (D21)
193 192 99,5 97,1 100 438,1 379,7 505,4 <10,0 3620,0
AS50 1 4
PRE 192 168 87,5 82,0 91,8 54,6 44,5 67,0 <10,0 2560,0
PI (D21)
192 191 99,5 97,1 100 263,3 225,3 307,7 <10,0 5120,0
AS50 1 2
PRE 189 166 87,8 82,3 92,1 57,8 47,1 70,9 <10,0 2560,0
>=10 1/DIL
GMT
IC del 95%
IC del 95%
Anticuerpo
Grupo Momento N n % LI LS valor LI LS Mín Máx
PI (D21)
189 188 99,5 97,1 100 347,5 296,4 407,3 <10,0 2560,0
Flu ELD
PRE 187 169 90,4 85,2 94,2 61,0 49,8 74,7 <10,0 1810,0
PI (D21)
188 188 100 98,1 100 186,7 158,0 220,7 10,0 2560,0
Flu YNG
PRE 197 166 84,3 78,4 89,1 47,8 39,2 58,4 <10,0 1280,0
PI (D21)
197 197 100 98,1 100 380,2 331,6 435,9 40,0 5120,0
BNMalasia
AS03 1 4 PRE 191 178 93,2 88,6 96,3 58,6 49,8 68,9 <10,0 2560,0
PI (D21)
191 190 99,5 97,1 100 147,1 129,1 167,6 <10,0 2560,0
AS03 1 2
PRE 191 180 94,2 89,9 97,1 53,7 45,7 63,2 <10,0 640,0
PI (D21)
192 192 100 98,1 100 163,1 142,5 186,6 14,0 2560,0
AS03 1 1
PRE 189 177 93,7 89,2 96,7 57,0 48,2 67,5 <10,0 2560,0
PI (D21)
189 189 100 98,1 100 172,1 149,9 197,6 14,0 2560,0
AS25 1 4
PRE 194 183 94,3 90,1 97,1 62,6 53,3 73,4 <10,0 1810,0
PI (D21)
194 194 100 98,1 100 152,4 134,4 172,7 20,0 2560,0
AS25 1 2
PRE 192 184 95,8 92,0 98,2 77,8 66,0 91,7 <10,0 1280,0
PI (D21)
192 192 100 98,1 100 181,4 158,9 207,1 10,0 2560,0
AS25 1 1
PRE 193 186 96,4 92,7 98,5 62,9 53,9 73,4 <10,0 2560,0
PI (D21)
193 193 100 98,1 100 202,0 179,7 227,1 20,0 3620,0
AS50 1 4
PRE 192 179 93,2 88,7 96,3 58,2 49,0 69,1 <10,0 1280,0
>=10 1/DIL
GMT
IC del 95%
IC del 95%
Anticuerpo
Grupo Momento N n % LI LS valor LI LS Mín Máx
PI (D21)
192 192 100 98,1 100 155,7 134,8 179,8 20,0 5120,0
AS50 1 2
PRE 189 176 93,1 88,5 96,3 62,6 53,0 74,0 <10,0 1280,0
PI (D21)
189 189 100 98,1 100 174,6 152,0 200,7 10,0 2560,0
Flu ELD
PRE 187 179 95,7 91,7 98,1 66,5 56,5 78,3 <10,0 905,0
PI (D21)
188 188 100 98,1 100 153,0 135,2 173,1 20,0 1280,0
Flu YNG
PRE 197 135 68,5 61,5 74,9 23,4 19,1 28,7 <10,0 1280,0
PI (D21)
197 197 100 98,1 100 1281,9 241,7 328,7 20,0 5120,0
Flu ELD = Fluarix para ancianos (edad �= 65 anos); Flu YNG = Fluarix para jovenes (edad 18-40 anos)GMT = Titulo de anticuerpos medio geometrico calculado en todos los sujetosN = Numero de sujetos con resultados disponiblesnN% = NumeroNporcentaje de sujetos con titulo dentro del intervalo especificadoIC del 95% = Intervalo de confianza del 95%; LI = Limite inferior, LS = Limite superior; MinNMax = MinimoNmaximoPRE = Dosis 1 antes de la vacunacion (Dia 0); PI (D21) = Dosis 1 despues de la vacunacion (Dia 21)
Conclusión intermedia
La vacuna contra la gripe adyuvantada con una dosis completa de AS03 y 25 Ig de MPL (AS25 1 1) provoca una respuesta de HI estadisticamente significativamente mejor para la cepa BNMalasia en comparacion con Fluarix en sujetos de �65 anos de edad. Para las otras dos cepas, todas las vacunas adyuvantadas, excepto aquellas con un
5 cuarto de una dosis de AS03, funcionaron bien en comparacion con Fluarix en sujetos de �65 anos de edad en este estudio.
XI.4.2 Factores de seroconversion de titulos de anticuerpos anti-HI, tasas de seroproteccion y tasas de seroconversion (establece una correlacion de la proteccion como se establece para la vacuna contra la gripe en seres humanos)
10 Los resultados se presentan en la Tablas 36 -Figura 20 (una por cepa) para tasas de seroproteccion, Tabla 37 -Figura 21 para tasas de seroconversion y Tabla 38 - Figura 22 para factores de seroconversion.

Tabla 36 - SPR para título de anticuerpos de HI en D0 y D21 (cohorte de ATP para HI)
SPR
IC del 95%
Cepa de la vacuna
Grupo Momento N n % LI LS
ANIslas Salomon
AS03 1 4 PRE 191 27 14,1 9,5 19,9
PI (D21)
191 160 83,8 77,8 88,7
AS03 1 2
PRE 191 31 16,2 11,3 22,2
PI (D21)
192 168 87,5 82,0 91,8
AS03 1 1
PRE 189 25 13,2 8,7 18,9
PI (D21)
189 171 90,5 85,4 94,3
AS25 1 4
PRE 194 33 17,0 12,0 23,1
PI (D21)
194 158 81,4 75,2 86,7
AS25 1 2
PRE 192 44 22,9 17,2 29,5
PI (D21)
192 169 88,0 82,6 92,3
AS25 1 1
PRE 193 23 11,9 7,7 17,3
PI (D21)
193 172 89,1 83,8 93,1
AS50 1 4
PRE 192 22 11,5 7,3 16,8
PI (D21)
192 153 79,7 73,3 85,1
AS50 1 2
PRE 189 26 13,8 9,2 19,5
PI (D21)
189 163 86,2 80,5 90,8
Flu ELD
PRE 187 31 16,6 11,6 22,7
PI (D21)
188 132 70,2 63,1 76,6
Flu YNG
PRE 197 69 35,0 28,4 42,1
PI (D21)
197 182 92,4 87,8 95,7
(continuacion) (continuacion)
SPR
IC del 95%
Cepa de la vacuna
Grupo Momento N n % LI LS
ANWisconsin
AS03 1 4 PRE 191 133 69,6 62,6 76,1
PI (D21)
191 188 98,4 95,5 99,7
AS03 1 2
PRE 191 124 64,9 57,7 71,7
PI (D21)
192 189 98,4 95,5 99,7
AS03 1 1
PRE 189 113 59,8 52,4 66,8
PI (D21)
189 188 99,5 97,1 100
AS25 1 4
PRE 194 139 71,6 64,8 77,9
PI (D21)
194 190 97,9 94,8 99,4
AS25 1 2
PRE 192 131 68,2 61,1 74,7
PI (D21)
192 192 100 98,1 100
AS25 1 1
PRE 193 139 72,0 65,1 78,2
PI (D21)
193 191 99,0 96,3 99,9
AS50 1 4
PRE 192 130 67,7 60,6 74,3
PI (D21)
192 187 97,4 94,0 99,1
AS50 1 2
PRE 189 134 70,9 63,9 77,3
PI (D21)
189 185 97,9 94,7 99,4
Flu ELD
PRE 187 132 70,6 63,5 77,0
PI (D21)
188 179 95,2 91,1 97,8
Flu YNG
PRE 197 122 61,9 54,8 68,7
PI (D21)
197 197 100 98,1 100
SPR
IC del 95%
Cepa de la vacuna
Grupo Momento N n % LI LS
BNMalasia
AS03 1 4 PRE 191 138 72,3 65,3 78,5
PI (D21)
191 183 95,8 91,9 98,2
AS03 1 2
PRE 191 140 73,3 66,4 79,4
PI (D21)
192 183 95,3 91,3 97,8
AS03 1 1
PRE 189 138 73,0 66,1 79,2
PI (D21)
189 184 97,4 93,9 99,1
AS25 1 4
PRE 194 148 76,3 69,7 82,1
PI (D21)
194 187 96,4 92,7 98,5
AS25 1 2
PRE 192 156 81,3 75,0 86,5
PI (D21)
192 186 96,9 93,3 98,8
AS25 1 1
PRE 193 149 77,2 70,6 82,9
PI (D21)
193 192 99,5 97,1 100
AS50 1 4
PRE 192 139 72,4 65,5 78,6
PI (D21)
192 182 94,8 90,6 97,5
AS50 1 2
PRE 189 145 76,7 70,0 82,5
PI (D21)
189 184 97,4 93,9 99,1
Flu ELD
PRE 187 144 77,0 70,3 82,8
PI (D21)
188 183 97,3 93,9 99,1
Flu YNG
PRE 197 77 39,1 32,2 46,3
PI (D21)
197 195 99,0 96,4 99,9

Tabla 37 - SCR para título de anticuerpos de HI en el día 21 (cohorte de ATP para HI por inmunogenicidad)
SCR
IC del 95%
Cepa de la vacuna
Grupo N n % LI LS
ANIslas Salomon
AS03 1 4 191 133 69,6 62,6 76,1
AS03 1 2
191 138 72,3 65,3 78,5
AS03 1 1
189 154 81,5 75,2 86,7
AS25 1 4
194 130 67,0 59,9 73,6
AS25 1 2
192 142 74,0 67,1 80,0
AS25 1 1
193 151 78,2 71,7 83,8
AS50 1 4
192 129 67,2 60,1 73,8
AS50 1 2
189 146 77,2 70,6 83,0
Flu ELD
187 99 52,9 45,5 60,3
Flu YNG
197 135 68,5 61,5 74,9
ANWisconsin
AS03 1 4 191 108 56,5 49,2 63,7
AS03 1 2
191 124 64,9 57,7 71,7
AS03 1 1
189 141 74,6 67,8 80,6
AS25 1 4
194 104 53,6 46,3 60,8
AS25 1 2
192 124 64,6 57,4 71,3
AS25 1 1
193 142 73,6 66,8 79,6
AS50 1 4
192 110 57,3 50,0 64,4
AS50 1 2
189 131 69,3 62,2 75,8
Flu ELD
187 69 36,9 30,0 44,2
Flu YNG
197 130 66,0 58,9 72,6
BNMalasia
AS03 1 4 191 47 24,6 18,7 31,3
AS03 1 2
191 73 38,2 31,3 45,5
AS03 1 1
189 65 34,4 27,6 41,6
AS25 1 4
194 44 22,7 17,0 29,2
AS25 1 2
192 45 23,4 17,6 30,1
AS25 1 1
193 79 40,9 33,9 48,2
AS50 1 4
192 50 26,0 20,0 32,9
AS50 1 2
189 55 29,1 22,7 36,1
Flu ELD
187 47 25,1 19,1 32,0
Flu YNG
197 147 74,6 67,9 80,5
(continuacion)
Seroconversion definida como: Para sujetos inicialmente seronegativos, titulo de anticuerpos �= 40 1NDIL despues de la vacunacion Para sujetos inicialmente seropositivos, titulo de anticuerpos despues de la vacunacion �= 4 veces el titulo de
anticuerpos antes de la vacunacion N = Numero de sujetos con resultados disponibles antes y despues de la vacunacion nN% = NumeroNporcentaje de sujetos seroconvertidos IC del 95% = Intervalo de confianza del 95%, LI = Limite inferior, LS = Limite superior

Tabla 38 - SCF para título de anticuerpos de HI en el día 21 (cohorte de ATP para HI por inmunogenicidad)
SCF
IC del 95%
Cepa de la vacuna
Grupo N Valor LI LS
ANIslas Salomon
AS03 1 4 191 7,7 6,5 9,2
AS03 1 2
191 9,4 7,8 11,3
AS03 1 1
189 9,8 8,3 11,5
AS25 1 4
194 8,6 7,2 10,4
AS25 1 2
192 9,4 8,0 11,1
AS25 1 1
193 11,6 9,7 13,9
AS50 1 4
192 7,7 6,5 9,2
AS50 1 2
189 10,8 9,0 13,0
Flu ELD
187 5,6 4,7 6,8
Flu YNG
197 12,8 10,0 16,3
ANWisconsin
AS03 1 4 191 4,6 3,9 5,4
AS03 1 2
191 6,8 5,6 8,1
AS03 1 1
189 7,9 6,6 9,5
AS25 1 4
194 4,7 4,0 5,5
AS25 1 2
192 5,4 4,6 6,3
AS25 1 1
193 7,8 6,5 9,5
AS50 1 4
192 4,8 4,1 5,7
AS50 1 2
189 6,0 5,1 7,1
Flu ELD
187 3,1 2,6 3,6
Flu YNG
197 7,9 6,4 9,8
(continuacion)
SCF
IC del 95%
Cepa de la vacuna
Grupo N Valor LI LS
BNMalasia
AS03 1 4 191 2,5 2,2 2,8
AS03 1 2
191 3,0 2,6 3,5
AS03 1 1
189 3,0 2,6 3,5
AS25 1 4
194 2,4 2,2 2,8
AS25 1 2
192 2,3 2,1 2,6
AS25 1 1
193 3,2 2,8 3,7
AS50 1 4
192 2,7 2,3 3,1
AS50 1 2
189 2,8 2,4 3,2
Flu ELD
187 2,3 2,0 2,6
Flu YNG
197 12,0 9,7 15,0
N = Numero de sujetos con resultados disponibles antes y despues de la vacunacion SCF = Factor de seroconversion o relacion de media geometrica (media[log10(DESPUESNANTES)]) IC del 95% = Intervalo de confianza del 95%, LI = Limite inferior, LS = Limite superior Fuente de datos = Tabla IIIA del apendice
Conclusión intermedia para la respuesta inmunitaria humoral
Es visible un claro efecto de la dosis de AS03 (emulsion de aceite en agua) en los datos de HI.
5 Los GMT fueron significativamente estadisticamente mayores en los grupos de vacuna contra la gripe adyuvantada en comparacion con el grupo Flu ELD para la cepa ANIslas Salomon (excepto para AS03 1 4 y A50 1 4) y la cepa ANWisconsin. Para la cepa BNMalasia, los GMT fueron significativamente estadisticamente mayores en el grupo AS25 1 1 en comparacion con el grupo Flu ELD. Para la cepa H3N2 (ANWisconsin), la respuesta humoral aumenta hasta el nivel observado en adultos jovenes para todos los grupos de vacuna contra la gripe adyuvantada, excepto
10 en los grupos en los que se uso un 1N4 de dosis de la emulsion.
Las SCR fueron significativamente estadisticamente mayores en los grupos de vacuna contra la gripe adyuvantada en comparacion con el grupo Flu ELD para la cepa ANIslas Salomon (excepto para AS25 1 4 y A50 1 4) y la cepa ANWisconsin. Para la cepa BNMalasia, las SCR fueron significativamente estadisticamente mayores en el grupo AS25 1 1 en comparacion con el grupo Flu ELD.
15 XI.5. Análisis de respuesta inmunitaria mediada por célula
Las frecuencias de linfocitos T CD4 especificos de la gripe que producen al menos dos citocinas (todas dobles) en el dia 0 y el dia 21 se presentan en la Tabla 39 y la Figura 23 para celulas reestimuladas con cepas de la vacuna reunidas.

Tabla 39 – Frecuencia de linfocitos T CD4 positivos para citocinas (por millón de linfocitos T CD4) para cepas reunidas en los días 0 y 21 (cohorte de ATP para CMI por inmunogenicidad)
Descripción de la prueba
Grupo Momento N Naus GM DE Mín Q1 Mediana Q3 Máx
CD4-TODOS DOBLES
AS03 1 4 PRE 42 1 1013,57 679,94 1,00 819,00 1202,00 1790,00 2841,00
PI (D21)
43 0 2038,17 1508,79 422,00 1479,00 2156,00 3215,00 6834,00
AS03 1 2
PRE 38 1 1085,68 912,10 1,00 939,00 1382,50 1921,00 3502,00
PI (D21)
39 0 2780,75 1529,68 426,00 2023,00 2851,00 4126,00 8108,00
AS03 1 1
PRE 48 1 870,96 1342,41 1,00 685,00 1035,50 1534,50 6956,00
PI (D21)
49 0 2563,84 1840,16 280,00 1907,00 2826,00 3636,00 8830,00
AS25 1 4
PRE 47 0 1089,72 853,67 139,00 664,00 1177,00 1933,00 3321,00
PI (D21)
47 0 2186,84 1776,15 506,00 1447,00 2155,00 3234,00 9385,00
AS25 1 2
PRE 41 2 1124,53 1071,90 384,00 674,00 1194,00 1717,00 4917,00
PI (D21)
43 0 2153,42 1871,41 348,00 1383,00 1978,00 3751,00 8426,00
AS25 1 1
PRE 44 0 1106,74 3071,01 140,00 669,00 1140,50 1731,00 20615,00
PI (D21)
44 0 2771,86 2784,80 526,00 1742,00 2773,50 4855,00 15247,00
AS50 1 4
PRE 41 2 867,17 666,69 77,00 559,00 835,00 1364,00 2671,00
PI (D21)
43 0 2067,82 1008,33 303,00 1560,00 2142,00 2949,00 5044,00
AS50 1 2
PRE 41 6 1067,79 1038,58 169,00 794,00 1192,00 1512,00 6122,00
PI (D21)
47 0 2421,78 6581,38 202,00 1447,00 2389,00 4010,00 46387,00
Flu ELD
PRE 42 3 960,35 998,67 189,00 561,00 863,50 1706,00 4356,00
PI (D21)
45 0 1509,05 2074,14 211,00 897,00 1452,00 2818,00 11117,00
Flu YNG
PRE 40 6 1681,05 1196,39 225,00 1144,00 1907,50 2611,00 5110,00
PI (D21)
46 0 2687,64 2151,90 830,00 1900,00 2459,50 4241,00 11758,00
(contiuacion) (contiuacion) (contiuacion) (contiuacion)
Descripción de la prueba
Grupo Momento N Naus GM DE Mín Q1 Mediana Q3 Máx
CD4-CD40L
AS03 1 4 PRE 42 1 967,13 664,97 1,00 842,00 1186,50 1742,00 2748,00
PI (D21)
43 0 1916,56 1502,81 168,00 1353,00 2102,00 3122,00 6538,00
AS03 1 2
PRE 38 1 1060,88 878,50 1,00 891,00 1384,00 1921,00 3398,00
PI (D21)
39 0 2714,74 1519,80 486,00 1957,00 2829,00 4076,00 8038,00
AS03 1 1
PRE 48 1 762,13 1329,02 1,00 645,00 1022,50 1541,00 6797,00
PI (D21)
49 0 2428,54 1856,48 210,00 1862,00 2733,00 3589,00 8809,00
AS25 1 4
PRE 47 0 994,17 865,71 35,00 579,00 1076,00 1912,00 3340,00
PI (D21)
47 0 1982,33 1801,26 73,00 1293,00 2055,00 3159,00 9312,00
AS25 1 2
PRE 41 2 1039,63 1062,10 116,00 596,00 1152,00 1715,00 4899,00
PI (D21)
43 0 1998,69 1842,77 309,00 1396,00 1946,00 3459,00 8149,00
AS25 1 1
PRE 44 0 1048,77 1485,48 145,00 674,00 1108,50 1632,50 8844,00
PI (D21)
44 0 2529,59 2189,87 102,00 1599,50 2763,00 4419,50 9999,00
AS50 1 4
PRE 41 2 847,56 663,49 95,00 549,00 842,00 1350,00 2588,00
PI (D21)
43 0 1673,39 1043,51 1,00 1413,00 2062,00 2880,00 4884,00
AS50 1 2
PRE 41 6 1037,41 982,61 171,00 799,00 1168,00 1492,00 5650,00
PI (D21)
47 0 2268,52 6584,73 117,00 1447,00 2245,00 3739,00 46410,00
Flu ELD
PRE 42 3 923,98 976,85 110,00 607,00 816,50 1597,00 4296,00
PI (D21)
45 0 1299,05 2034,85 1,00 896,00 1545,00 2818,00 10836,00
Flu YNG
PRE 40 6 1636,72 1186,79 233,00 1068,00 1878,50 2418,00 5088,00
PI (D21)
46 0 2575,50 2169,43 456,00 1862,00 2331,50 4178,00 11718,00
Descripción de la prueba
Grupo Momento N Naus GM DE Mín Q1 Mediana Q3 Máx
CD4-IFNγ
AS03 1 4 PRE 42 1 721,19 483,64 114,00 475,00 772,00 1142,00 2052,00
PI (D21)
43 0 1394,52 1096,51 347,00 898,00 1305,00 2261,00 5075,00
AS03 1 2
PRE 38 1 712,34 598,18 1,00 566,00 936,50 1412,00 2422,00
PI (D21)
39 0 1894,63 1156,37 581,00 1297,00 2083,00 3016,00 6342,00
AS03 1 1
PRE 48 1 527,46 1053,96 1,00 395,00 544,00 985,50 6583,00
PI (D21)
49 0 1623,21 1383,09 104,00 1208,00 1652,00 2380,00 6983,00
AS25 1 4
PRE 47 0 741,88 643,41 36,00 430,00 770,00 1401,00 2602,00
PI (D21)
47 0 1433,90 1206,49 246,00 861,00 1374,00 2301,00 5754,00
AS25 1 2
PRE 41 2 670,69 656,68 218,00 380,00 596,00 1151,00 3664,00
PI (D21)
43 0 1279,87 1279,29 173,00 617,00 1330,00 2402,00 5385,00
AS25 1 1
PRE 44 0 597,78 2794,11 1,00 372,50 652,50 1226,00 18946,00
PI (D21)
44 0 1802,95 2189,25 258,00 1133,50 1970,00 3238,00 13164,00
AS50 1 4
PRE 41 2 571,79 448,58 134,00 335,00 597,00 945,00 1901,00
PI (D21)
43 0 1325,52 769,76 188,00 936,00 1428,00 1959,00 3841,00
AS50-1-2
PRE 41 6 601,27 513,44 32,00 485,00 743,00 1025,00 2283,00
PI (D21)
47 0 1550,79 6051,21 41,00 1016,00 1624,00 2710,00 42697,00
Flu ELD
PRE 42 3 584,91 588,62 77,00 396,00 598,00 955,00 2680,00
PI (D21)
45 0 980,97 1396,79 137,00 614,00 876,00 1662,00 6633,00
Flu YNG
PRE 40 6 1156,67 945,24 126,00 731,50 1248,00 2152,50 3774,00
PI (D21)
46 0 1811,65 1618,60 411,00 1162,00 1813,00 2524,00 8432,00
Descripción de la prueba
Grupo Momento N Naus GM DE Mín Q1 Mediana Q3 Máx
CD4-IL2
AS03-1-4 PRE 42 1 805,41 572,67 1,00 683,00 971,50 1429,00 2562,00
PI (D21)
43 0 1563,40 1203,93 296,00 1116,00 1509,00 2516,00 5786,00
AS03 1 2
PRE 38 1 881,32 713,88 1,00 727,00 1191,50 1605,00 2791,00
PI (D21)
39 0 2057,58 1251,53 205,00 1522,00 2184,00 3140,00 7019,00
AS03 1 1
PRE 48 1 640,10 1098,72 1,00 513,50 813,50 1240,50 6391,00
PI (D21)
49 0 1955,75 1528,09 232,00 1407,00 2088,00 2874,00 7173,00
AS25 1 4
PRE 47 0 864,60 696,78 117,00 557,00 896,00 1612,00 2771,00
PI (D21)
47 0 1629,80 1344,02 330,00 1080,00 1595,00 2504,00 6819,00
AS25 1 2
PRE 41 2 887,73 863,40 275,00 554,00 924,00 1431,00 4256,00
PI (D21)
43 0 1656,36 1486,45 316,00 1128,00 1617,00 2760,00 6311,00
AS25 1 1
PRE 44 0 834,27 755,62 131,00 537,00 877,00 1457,50 4105,00
PI (D21)
44 0 2028,18 1595,73 325,00 1334,00 2044,50 3624,00 7175,00
AS50 1 4
PRE 41 2 690,38 574,37 35,00 466,00 730,00 1132,00 2423,00
PI (D21)
43 0 1533,43 780,68 194,00 1145,00 1477,00 2269,00 3752,00
AS50 1 2
PRE 41 6 831,91 720,68 102,00 620,00 879,00 1221,00 3918,00
PI (D21)
47 0 1862,37 5848,13 158,00 1154,00 1852,00 3278,00 41253,00
Flu ELD
PRE 42 3 729,05 856,17 177,00 369,00 716,00 1299,00 3514,00
PI (D21)
45 0 1191,28 1688,15 145,00 620,00 1301,00 2414,00 9166,00
Flu YNG
PRE 40 6 1210,88 920,74 138,00 747,00 1308,50 1909,50 3925,00
PI (D21)
46 0 2033,00 1700,20 684,00 1429,00 1940,50 3296,00 9375,00
Descripción de la prueba
Grupo Momento N Naus GM DE Mín Q1 Mediana Q3 Máx
CD4-TNFα
AS03 1 4 PRE 42 1 652,51 499,99 1,00 538,00 778,00 1141,00 2037,00
PI (D21)
43 0 1147,97 942,25 126,00 677,00 1251,00 2054,00 4142,00
AS03 1 2
PRE 38 1 755,02 646,69 1,00 607,00 985,00 1429,00 2844,00
PI (D21)
39 0 1596,30 975,22 295,00 1113,00 1695,00 2577,00 4927,00
AS03 1 1
PRE 48 1 550,23 1016,73 1,00 343,50 605,50 1001,00 5709,00
PI (D21)
49 0 1445,35 1172,61 132,00 989,00 1578,00 2128,00 5107,00
AS25 1 4
PRE 47 0 673,18 622,76 91,00 352,00 673,00 1460,00 2299,00
PI (D21)
47 0 1172,10 1122,07 193,00 722,00 1122,00 1987,00 6086,00
AS25 1 2
PRE 41 2 708,33 761,85 191,00 447,00 730,00 1004,00 3592,00
PI (D21)
43 0 1228,68 1330,12 171,00 671,00 1224,00 2452,00 6334,00
AS25 1 1
PRE 44 0 693,62 2910,36 116,00 358,00 615,00 1077,00 19515,00
PI (D21)
44 0 1435,67 2242,66 13,00 908,50 1490,00 3017,00 13332,00
AS50 1 4
PRE 41 2 538,80 433,49 37,00 331,00 655,00 935,00 1648,00
PI (D21)
43 0 1204,59 698,67 364,00 814,00 1295,00 1934,00 3219,00
AS50 1 2
PRE 41 6 658,48 764,82 75,00 440,00 810,00 1078,00 4501,00
PI (D21)
47 0 1349,54 4822,50 39,00 895,00 1297,00 2514,00 33798,00
Flu ELD
PRE 42 3 558,80 704,36 40,00 326,00 627,00 1189,00 2767,00
PI (D21)
45 0 819,29 1407,45 1,00 543,00 969,00 1694,00 7960,00
Flu YNG
PRE 40 6 1056,84 852,19 221,00 633,00 1129,50 1724,50 3947,00
PI (D21)
46 0 1426,37 1615,23 385,00 852,00 1505,00 2355,00 9378,00
N = Numero de sujetos con resultados disponiblesNaus = Numero de sujetos con resultados ausentesGM= Media geometricaDE = Desviacion estandarQ1, Q3 = Primer y tercer cuartilesMinNMax = MinimoNMaximo
Conclusión intermedia para la respuesta inmunitaria mediada por célula
Cinco vacunas adyuvantadas (AS03 1 1, AS03 1 2, AS25 1 1, AS50 1 2 y AS50 1 4) indujeron una respuesta CMI significativamente mayor a cepas reunidas en comparacion con Fluarix en sujetos de �65 anos de edad para todas las combinaciones de citocinas en terminos de diferencias individuales (D21 -D0). Tres de estas vacunas adyuvantadas (AS03 1 1, AS03 1 2 y AS25 1 1) tambien indujeron una respuesta CMI significativamente mayor a cepas reunidas en comparacion con Fluarix en adultos mas jovenes para todas las combinaciones de citocinas en terminos de diferencias individuales (Dia 21 - Dia 0).
XI.6. Reactogenicidad
Síntomas locales
El porcentaje de sujetos que informan sintomas locales esperados (cualquier grado N grado 3) durante el periodo de 7 dias despues de la vacunacion se ha evaluado usando la clasificacion de EMEA y FDA para sintomas cuantificables.
Clasificacion de EMEA: equimosis (cualquier grado [�0 mm] y grado 3 [�50 mm]); dolor (cualquier grado); dolor de grado 3; rojez (cualquier grado [�0 mm] y grado 3 [�50 mm]) e hinchazon (cualquier grado [�0 mm]); hinchazon de grado 3 (�50 mm). Clasificacion de FDA: equimosis (cualquier grado [�25 mm] y grado 3 [�100 mm]), rojez de grado 3 (�100 mm); hinchazon de grado 3 (�100 mm), rojez (cualquier grado [�25 mm]); hinchazon (cualquier grado [�25 mm]).
Síntomas generales
Clasificacion EMEA: fiebre (�37,58°C), fiebre de grado 3 (�39,0°C). Clasificacion de FDA: fiebre (�38°C) y fiebre de grado 3 (�40°C).
La incidencia global y la naturaleza de cualquier sintoma esperado e inesperado y de grado 3 informado durante el periodo de 7 dias (Dias 0-6) despues de la vacunacion se presenta en la Figura 24.
Conclusión
El porcentaje de sujetos que informan al menos un sintoma general fue significativamente estadisticamente mayor en los grupos de vacuna contra la gripe adyuvantada en comparacion con el grupo Flu ELD, pero en el mismo intervalo que para el grupo Flu YNG (excepto para A03 1 4).
El porcentaje de sujetos que informan al menos un sintoma general de grado 3 estan en el mismo intervalo para todos los grupos.
El porcentaje de sujetos que informan al menos un sintoma local fue significativamente estadisticamente mayor en los grupos de vacuna contra la gripe adyuvantada en comparacion con el grupo Flu ELD y en el grupo AS25 1 1 en comparacion con el grupo Flu YNG.
El porcentaje de sujetos que informan al menos un sintoma local de grado 3 fue significativamente estadisticamente mayor en los grupos AS03 1 1, AS25 1 2, AS25 1 1 y AS50 1 2 en comparacion con los grupos Flu ELD y Flu YNG grupos.
Xl.7. Conclusión general
Estos datos son importantes para equilibrar apropiadamente la respuesta inmunitariaNefecto adverso en una poblacion humana.
En terminos de inmunogenicidad de HI se demostro un claro efecto del adyuvante, con en particular un aumento significativo para H1N1 y H3N2 con todas las dosificaciones de adyuvante. Se obtuvo un aumento significativo para la cepa B principalmente con AS25 1 N1, pero tambien con AS03 1N1, AS03 1N2 y AS50 1N2. Se mostro un efecto a la dosis con el componente de emulsion de aceite en agua del adyuvante, y tambien para el componente de MPL del adyuvante, aunque este ultimo estuvo menos claramente marcado.
En terminos de respuesta inmunitaria mediada por celula, tambien se demostro un efecto del adyuvante con una diferencia significativa en comparacion con Fluarix en los ancianos para cepas reunidas (frecuencia, todas las medidas) para AS03 1N1, AS03 Y, AS25 1N1 y AS50 Y. Las mayores respuestas se obtuvieron con AS25 1N1, AS03 1N1 y AS03 1N2.
En terminos de reactogenicidad, las vacunas adyuvantadas son mas reactogenicas que Fluarix, asociado al componente de emulsion de aceite en agua de la vacuna; tambien esta presente un efecto de la dosis de MPL aunque menos pronunciado. AS03 1N2 es menos reactogenica que AS03 1N1, aunque presente un perfil de inmunogenicidad satisfactorio en esta poblacion anciana.
LISTADO DE SECUENCIAS
<110� GlaxoSmithKline Biologicals sa <120� Vaccine <130� VB62342 <160� 6 <170� FastSEQ para Windows version 4.0 <210� 1 <211� 20 <212� ADN <213� Secuencia artificial <220� <223� Secuencia sintetica, secuencia que contiene CG sin metilar <400� 1 tccatgacgt tcctgacgtt 20 <210� 2 <211� 18 <212� ADN <213� Secuencia artificial <220� <223� Secuencia sintetica, secuencia que contiene CG sin metilar <400� 2 tctcccagcg tgcgccat 18 <210� 3 <211� 30 <212� ADN <213� Secuencia artificial <220� <223� Secuencia sintetica, secuencia que contiene CG sin metilar <400� 3 accgatgacg tcgccggtga cggcaccacg 30 <210� 4 <211� 24 <212� ADN <213� Secuencia artificial <220� <223� Secuencia sintetica, secuencia que contiene CG sin metilar <400� 4
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24 <210� 5 <211� 20 <212� ADN
5 <213� Secuencia artificial <220� <223� Secuencia sintetica, secuencia que contiene CG sin metilar <400� 5 tccatgacgt tcctgatgct 20
10 <210� 6 <211� 22 <212� ADN <213� Secuencia artificial <220�
15 <223� Secuencia sintetica, secuencia que contiene CG sin metilar <400� 6 tcgacgtttt cggcgcgcgc cg 22

Claims (23)

  1. REIVINDICACIONES
    1.
    Una composicion inmunogenica contra la gripe en un volumen de dosis adecuado para uso humano que comprende un antigeno del virus de la gripe o preparacion antigenica en combinacion con un adyuvante de emulsion de aceite en agua, en la que el adyuvante se selecciona del grupo que consiste en: (i) un adyuvante que consiste en 5-6 mg de escualeno, 2-3 mg de agente emulsionante, 5-7 mg de tocol por dosis humana; (ii) un adyuvante que consiste en 2-3 mg de escualeno, 1-1,5 mg de agente emulsionante, y 2,5-3,5 mg de tocol por dosis humana; (iii) un adyuvante que consiste en 0,5-1,5 mg de escualeno, 0,25-0,75 mg de agente emulsionante y 0,5-1,5 mg de tocol por dosis humana.
  2. 2.
    La composicion inmunogenica de la reivindicacion 1, en la que dicho agente emulsionante es un tensioactivo no ionico.
  3. 3.
    La composicion inmunogenica de la reivindicacion 2, en la que dicho agente emulsionante es un monooleato de polioxietilensorbitano o un trioleato de sorbitano o una mezcla de ambos.
  4. 4.
    La composicion inmunogenica de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que dicho tocol es alfatocoferol.
  5. 5.
    La composicion inmunogenica de las reivindicaciones 1-4, en la que el adyuvante comprende ademas un ligando TLR seleccionado de: un agonista de TLR-1, TLR-2, TLR-3, TLR-4, TLR-7, TLR-8, TLR-9 o combinacion de los mismos.
  6. 6.
    La composicion inmunogenica de las reivindicaciones 1-5, en la que dicho antigeno del virus o preparacion antigenica es 15 Ig o inferior a 15 Ig de HA por dosis humana por cepa de la gripe.
  7. 7.
    La composicion inmunogenica de la reivindicacion 6, en la que dicho antigeno del virus o preparacion antigenica es inferior a 10 Ig, o inferior a 8 Ig, o inferior a 4 Ig, o inferior a 2 Ig de HA, o inferior a 1 Ig de HA, o inferior a 0,5,
    o inferior a 0,1 Ig de HA por dosis humana por cepa de la gripe.
  8. 8.
    La composicion inmunogenica de la reivindicacion 6 o 7, en la que dicho antigeno del virus o preparacion antigenica esta entre 2 - 7,5 Ig, o de 1 - 5 Ig de HA por dosis humana por cepa de la gripe.
  9. 9.
    La composicion inmunogenica de las reivindicaciones 6-8, en la que dicho antigeno del virus o preparacion antigenica esta entre inferior a o exactamente 5 Ig de HA, o inferior a o exactamente 2,5 Ig, o inferior a o exactamente 1 Ig por dosis humana por cepa de la gripe.
  10. 10.
    La composicion inmunogenica de las reivindicaciones 1-9, en la que dicha composicion es una composicion monovalente que comprende un antigeno del virus o preparacion antigenica de al menos una cepa de la gripe que esta asociada a un brote pandemico o que tiene el potencial a asociarse a un brote de pandemia.
  11. 11.
    La composicion inmunogenica de las reivindicaciones 1-9, en la que dicha composicion es una composicion multivalente que comprende un antigeno del virus o preparacion antigenica de al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, o al menos cinco cepas de la gripe.
  12. 12.
    La composicion inmunogenica de la reivindicacion 11, en la que dicha composicion comprende un antigeno del virus o preparacion antigenica de al menos tres de las cepas estacionales de la gripe (interpandemicas) y opcionalmente comprende un antigeno del virus o preparacion antigenica de al menos una cepa de la gripe que esta asociada a un brote pandemico o que tiene el potencial a asociarse a un brote de pandemia.
  13. 13.
    La composicion inmunogenica de la reivindicacion 11 o 12, en la que dicha composicion multivalente comprende un antigeno del virus o preparacion antigenica seleccionada del grupo que consiste en: (i) dos cepas A interpandemicas elegidas del grupo de: H1N1 y H3N2 y dos cepas B elegidas del grupo de: BNYamagata y BNVictoria; (ii) tres cepas A interpandemicas elegidas del grupo de: H1N1 y H3N2 y una cepa B elegida del grupo de: BNYamagata y BNVictoria; (iii) dos cepas A interpandemicas elegidas del grupo de: H1N1 y H3N2, una cepa A pandemica, en la que la cepa es H5N1, y una cepa B elegida del grupo de BNYamagata y BNVictoria.
  14. 14.
    La composicion inmunogenica de las reivindicaciones 10, 12-13, en la que dicha cepa del virus de la gripe pandemica se selecciona del grupo que consiste en: H5N1, H9N2, H5N8, H5N9, H7N4, H7N7, H2N2, H10N7, H5N2, H7N2, H7N1 y H7N3.
  15. 15.
    La composicion inmunogenica segun cualquier reivindicacion precedente en la que dicho antigeno del virus de la gripe o preparacion antigenica del mismo es del virus de la gripe cultivado en huevos o en cultivo celular.
  16. 16.
    La composicion inmunogenica segun cualquier reivindicacion precedente, en la que dicho antigeno del virus de la gripe o preparacion antigenica del mismo comprende un virus completo, un virus fraccionado, un virosoma o uno o mas antigenos purificados elegidos de: HA, NA, M1, M2.
  17. 17.
    La composicion inmunogenica segun la reivindicacion 16 en la que dicho(s) antigeno(s) purificado(s) se
    prepara(n) a partir del virus de la gripe cultivado en celulas de mamifero, aviares o de insecto.
  18. 18.
    La composicion inmunogenica segun cualquier reivindicacion precedente, en la que dicha dosis humana se selecciona de: 0,5 ml o menos, entre 0,5 y 1,5 ml, entre 0,2 y 1,2 ml, entre 0,2 y 0,7 ml y menos que o exactamente 0,25, o 0,5, o 0,7, o 1 ml.
    5 19. Un procedimiento para la preparacion de una vacuna contra la gripe adyuvantada segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18 que comprende una etapa de mezclar un primer volumen de una emulsion de aceite en agua y un segundo volumen de una suspension acuosa que comprende un virus de la gripe o preparacion antigenica del mismo.
  19. 20. Un procedimiento segun la reivindicacion 19, en el que el segundo volumen es mayor que el primer volumen.
    10 21. Un procedimiento segun la reivindicacion 19, en el que el primer y segundo volumenes son volumenes sustancialmente iguales.
  20. 22.
    El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 19 a 21 que comprende una etapa de diluir la emulsion de aceite en agua antes de mezclar la emulsion diluida resultante con dicha suspension acuosa de la gripe.
  21. 23.
    Un kit de vacuna que comprende un componente de antigeno del virus de la gripe o un componente de
    15 preparacion antigenica del virus de la gripe como se define en cualquiera de las reivindicaciones 6 a 17 y que comprende ademas para administracion concomitante o secuencial un adyuvante como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.
  22. 24. La composicion inmunogenica de las reivindicaciones 1-18 para su uso en medicina.
  23. 25. La composicion inmunogenica de las reivindicaciones 1-18 para su uso en la prevencion de enfermedad 20 producida por infeccion de la gripe.
ES08736288T 2007-04-20 2008-04-16 Vacuna contra la gripe de emulsión de aceite en agua Active ES2377761T3 (es)

Applications Claiming Priority (11)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GB0707697A GB0707697D0 (en) 2007-04-20 2007-04-20 Vaccine
GB0707697 2007-04-20
GB0711357A GB0711357D0 (en) 2007-06-12 2007-06-12 Vaccine
GB0711357 2007-06-12
GB0712062A GB0712062D0 (en) 2007-06-21 2007-06-21 Vaccine
GB0712062 2007-06-21
PCT/EP2007/060743 WO2008043774A1 (en) 2006-10-12 2007-10-10 Vaccine comprising an oil in water emulsion adjuvant
WOPCT/EP2007/060743 2007-10-10
GB0724651 2007-12-18
GB0724651A GB0724651D0 (en) 2007-12-18 2007-12-18 Vaccine
PCT/EP2008/054614 WO2008128939A1 (en) 2007-04-20 2008-04-16 Oil-in-water emulsion influenza vaccine

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2377761T3 true ES2377761T3 (es) 2012-03-30

Family

ID=39766893

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES08736288T Active ES2377761T3 (es) 2007-04-20 2008-04-16 Vacuna contra la gripe de emulsión de aceite en agua

Country Status (21)

Country Link
US (4) US9452209B2 (es)
EP (2) EP2455101A3 (es)
JP (1) JP2010524883A (es)
KR (1) KR101188382B1 (es)
CN (2) CN101678096A (es)
AR (1) AR066405A1 (es)
AT (1) ATE537841T1 (es)
AU (1) AU2008240761B2 (es)
BR (1) BRPI0810015B1 (es)
CA (1) CA2683075C (es)
CO (1) CO6251369A2 (es)
CR (1) CR11122A (es)
DO (1) DOP2009000239A (es)
EA (1) EA024250B1 (es)
ES (1) ES2377761T3 (es)
IL (1) IL200859A (es)
MA (1) MA31381B1 (es)
PE (1) PE20090146A1 (es)
TW (1) TW200908994A (es)
WO (1) WO2008128939A1 (es)
ZA (1) ZA200906753B (es)

Families Citing this family (47)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6207646B1 (en) * 1994-07-15 2001-03-27 University Of Iowa Research Foundation Immunostimulatory nucleic acid molecules
ES2228454T3 (es) * 1999-02-26 2005-04-16 Chiron S.R.L. Mejora de la actividad bacteriana de antigenos de neisseria con oligonucleotidos que contienen motivos cg.
GB9923176D0 (en) * 1999-09-30 1999-12-01 Smithkline Beecham Biolog Novel composition
US20100221284A1 (en) * 2001-05-30 2010-09-02 Saech-Sisches Serumwerk Dresden Novel vaccine composition
DE10144906B4 (de) 2001-09-12 2013-11-28 Novartis Vaccines And Diagnostics Gmbh Verfahren zur großtechnischen Herstellung von Impfstoffen
WO2006100111A1 (en) * 2005-03-23 2006-09-28 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Composition
US11707520B2 (en) 2005-11-03 2023-07-25 Seqirus UK Limited Adjuvanted vaccines with non-virion antigens prepared from influenza viruses grown in cell culture
US20090304742A1 (en) * 2005-11-04 2009-12-10 Novartis Vaccines And Diagnostics Srl Influenza vaccines with reduced amount of emulsion adjuvant
PT2368572T (pt) 2005-11-04 2020-06-16 Seqirus Uk Ltd Vacinas com adjuvante dotadas de antigénios não-virião preparados a partir de vírus da gripe cultivado em cultura celular
EP2043682B1 (en) 2006-07-17 2014-04-02 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Influenza vaccine
KR101151202B1 (ko) * 2006-10-12 2012-06-11 글락소스미스클라인 바이오로지칼즈 에스.에이. 수중유 에멀젼 애주번트를 포함하는 백신
US9452209B2 (en) 2007-04-20 2016-09-27 Glaxosmithkline Biologicals Sa Influenza vaccine
BRPI0815008B8 (pt) * 2007-08-02 2021-05-25 Biondvax Pharmaceuticals Ltd vacinas multiméricas com múltiplos epítopos contra influenza
US8506966B2 (en) 2008-02-22 2013-08-13 Novartis Ag Adjuvanted influenza vaccines for pediatric use
BRPI0914224A2 (pt) 2008-06-19 2019-09-24 Variation Biotechnologies Inc composições e métodos para tratar a gripe
US20110236489A1 (en) 2008-09-18 2011-09-29 Novartis Ag Vaccine adjuvant combinations
CA2752039A1 (en) * 2009-02-10 2010-08-19 Novartis Ag Influenza vaccine regimens for pandemic-associated strains
AU2015203072B2 (en) * 2009-02-10 2017-05-25 Seqirus UK Limited Influenza vaccine regimens for pandemic-associated strains
CN102307590A (zh) 2009-02-10 2012-01-04 诺华有限公司 具有减少量的角鲨烯的流感疫苗
DE102010018462A1 (de) 2009-04-27 2011-04-07 Novartis Ag Impfstoffe zum Schutz gegen Influenza
US20110097418A1 (en) * 2009-05-29 2011-04-28 Variation Biotechnologies, Inc. Compositions and methods for treating influenza
CN102656455B (zh) * 2009-10-21 2015-03-11 由卫生福利和体育大臣代表的荷兰王国 用于诊断针对病毒的免疫应答的方法
GB0919117D0 (en) 2009-10-30 2009-12-16 Glaxosmithkline Biolog Sa Process
JP2013522287A (ja) 2010-03-18 2013-06-13 ノバルティス アーゲー 血清群ｂ髄膜炎菌のためのアジュバント添加ワクチン
WO2011130652A2 (en) * 2010-04-15 2011-10-20 George Baer Compositions and methods for vaccinating humans and animals against enveloped viruses
HUE051711T2 (hu) * 2010-06-01 2021-03-29 Seqirus Uk Ltd Influenzavakcina antigénjeinek koncentrálása liofilizálás nélkül
GB201009273D0 (en) * 2010-06-03 2010-07-21 Glaxosmithkline Biolog Sa Novel vaccine
US10478483B2 (en) 2010-06-25 2019-11-19 Glaxosmithkline Biologicals Sa Combinations of meningococcal factor H binding proteins
EP2667852B1 (en) * 2011-01-27 2016-11-09 GlaxoSmithKline Biologicals SA Adjuvant nanoemulsions with crystallisation inhibitors
AU2011360572B2 (en) * 2011-02-22 2017-03-02 Biondvax Pharmaceuticals Ltd. Multimeric multiepitope polypeptides in improved seasonal and pandemic influenza vaccines
WO2012116714A1 (en) * 2011-03-02 2012-09-07 Curevac Gmbh Vaccination in elderly patients
US10183069B2 (en) 2011-03-21 2019-01-22 Altimmune Inc. Rapid and prolonged immunologic-therapeutic
US20140248320A1 (en) * 2011-10-20 2014-09-04 Novartis Ag Adjuvanted influenza b virus vaccines for pediatric priming
EP2822585B1 (en) * 2012-03-06 2017-05-17 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Improved vaccination against influenza
GB201218195D0 (en) 2012-10-10 2012-11-21 Istituto Zooprofilattico Sperimentale Delle Venezie Composition
GB201405921D0 (en) * 2014-04-02 2014-05-14 Glaxosmithkline Biolog Sa Novel methods for inducing an immune response
WO2016104584A1 (ja) * 2014-12-25 2016-06-30 第一三共株式会社 皮内投与インフルエンザワクチン組成物
EP3558351B1 (en) * 2016-12-23 2022-01-26 Intervet International B.V. Combination vaccine for swine
EP3576759A4 (en) 2017-01-31 2020-11-11 Merck Sharp & Dohme Corp. PROCESS FOR THE PREPARATION OF CAPSULE POLYSACCHARIDE PROTEIN CONJUGATES FROM STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE SEROTYPE 19F
MA47461A (fr) 2017-02-13 2019-12-18 Boehringer Ingelheim Animal Health Usa Inc Applicateur de liquide pour administrer des vaccins
CA3127639A1 (en) * 2019-01-30 2020-08-06 Glaxosmithkline Biologicals Sa Oil/surfactant mixtures for self-emulsification
JP2022526632A (ja) * 2019-04-06 2022-05-25 アルティミューン インコーポレーティッド 広範囲及び持続性のインフルエンザワクチン
RU2740751C1 (ru) * 2019-08-28 2021-01-20 Общество с ограниченной ответственностью "Развитие БиоТехнологий" Способ получения тетравалентной субъединичной противогриппозной вакцины
CN113827715B (zh) * 2020-06-23 2024-07-05 普莱柯生物工程股份有限公司 一种抗h7亚型和h5亚型禽流感病毒的疫苗组合物、及其制备方法和应用
WO2022093620A1 (en) 2020-10-29 2022-05-05 Industrial Polymers and Chemicals, Inc. Air filter with pathogen monitoring and inactivation
WO2023059857A1 (en) * 2021-10-08 2023-04-13 Sanofi Pasteur Inc. Multivalent influenza vaccines
KR20240033309A (ko) * 2022-09-05 2024-03-12 주식회사 차백신연구소 에멀전 제형의 면역증강제 조성물 및 이의 제조 방법

Family Cites Families (95)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3238190A (en) 1963-10-23 1966-03-01 Madaus & Co K G Fa Dr Aescin recovery
US4235877A (en) 1979-06-27 1980-11-25 Merck & Co., Inc. Liposome particle containing viral or bacterial antigenic subunit
DD155875A1 (de) 1980-12-31 1982-07-14 Willy Nordheim Verfahren zur herstellung eines ballaststoffarmen inaktivierten influenzaimpfstoffes
US4454119A (en) 1981-06-29 1984-06-12 Mitsubishi Chemical Industries Limited Therapeutic agents
US4436727A (en) 1982-05-26 1984-03-13 Ribi Immunochem Research, Inc. Refined detoxified endotoxin product
US4866034A (en) 1982-05-26 1989-09-12 Ribi Immunochem Research Inc. Refined detoxified endotoxin
FI69639C (fi) 1982-07-02 1986-03-10 Orion Yhtymae Oy Preparat foer anvaendning vid klamydia-diagnostik
DD211444A3 (de) 1982-08-19 1984-07-11 Saechsisches Serumwerk Verfahren zur herstellung von influenza-impfstoffen
GB8300467D0 (en) 1983-01-08 1983-02-09 Wellcome Found Equine influenza
FI861417A0 (fi) 1985-04-15 1986-04-01 Endotronics Inc Hepatitis b ytantigen framstaelld med rekombinant-dna-teknik, vaccin, diagnostiskt medel och cellinjer samt foerfaranden foer framstaellning daerav.
DD300833A7 (de) 1985-10-28 1992-08-13 Saechsische Landesgewerbefoerd Verfahren zur herstellung von inaktivierten influenza-vollvirusimpfstoffen
US4877611A (en) 1986-04-15 1989-10-31 Ribi Immunochem Research Inc. Vaccine containing tumor antigens and adjuvants
EP0362278A4 (en) 1987-06-05 1990-05-14 Us Health FACTORS OF AUTOCRINE MOTILITY IN THE DIAGNOSIS AND TREATMENT OF CANCER.
EP0304578B1 (en) 1987-06-22 2001-10-24 Medeva Holdings Bv Peptide comprising hepatitis B surface antigen
DE3734306A1 (de) 1987-10-10 1989-04-27 Pfeiffer Erich Gmbh & Co Kg Austragvorrichtung fuer fliessfaehige medien
US5376369A (en) 1987-11-03 1994-12-27 Syntex (U.S.A.) Inc. Vaccine adjuvant
US5278302A (en) 1988-05-26 1994-01-11 University Patents, Inc. Polynucleotide phosphorodithioates
US4912094B1 (en) 1988-06-29 1994-02-15 Ribi Immunochem Research Inc. Modified lipopolysaccharides and process of preparation
GB8819209D0 (en) 1988-08-12 1988-09-14 Research Corp Ltd Polypeptide & dna encoding same
GB8821049D0 (en) 1988-09-08 1988-10-05 Health Lab Service Board Method & composition for treatment & prevention of viral infections
US4999403A (en) 1988-10-28 1991-03-12 Exxon Chemical Patents Inc. Graft polymers of functionalized ethylene-alpha-olefin copolymer with polypropylene, methods of preparation, and use in polypropylene compositions
DK0382271T3 (da) 1989-02-04 1995-05-01 Akzo Nobel Nv Tocoler som adjuvanser i vacciner
JPH0832638B2 (ja) 1989-05-25 1996-03-29 カイロン コーポレイション サブミクロン油滴乳剤を含んで成るアジュバント製剤
SG48175A1 (en) 1989-07-25 1998-04-17 Smithkline Beecham Biolog Novel antigens and method for their preparation
DE4005528C2 (de) 1990-02-22 1998-01-15 Pfeiffer Erich Gmbh & Co Kg Austragvorrichtung für Medien
US5969109A (en) 1990-02-28 1999-10-19 Bona; Constantin Chimeric antibodies comprising antigen binding sites and B and T cell epitopes
US5149531A (en) 1990-06-27 1992-09-22 University Of Pittsburgh Of The Commonwealth System Of Higher Education Method of using cold-adapted live influenza virus vaccine as an antiviral agent against influenza
US5030115A (en) 1990-07-23 1991-07-09 Molex Incorporated Tired socket assembly with integral ground shield
EP0468520A3 (en) 1990-07-27 1992-07-01 Mitsui Toatsu Chemicals, Inc. Immunostimulatory remedies containing palindromic dna sequences
GB9105992D0 (en) 1991-03-21 1991-05-08 Smithkline Beecham Biolog Vaccine
SG48390A1 (en) 1991-11-16 1998-04-17 Smithkline Beecham Biolog Hybrid protein between cs from plasmodium and hbs ag
MA22842A1 (fr) 1992-03-27 1993-10-01 Smithkline Beecham Biolog Procede de preparation de compositions de vaccin.
CA2156525A1 (en) 1993-02-19 1994-09-01 Susan Dillon Influenza vaccine compositions containing 3-o-deacylated monophosphoryl lipid a
ATE157882T1 (de) 1993-03-23 1997-09-15 Smithkline Beecham Biolog 3-0-deazylierte monophosphoryl lipid a enthaltende impfstoff-zusammensetzungen
US5762939A (en) * 1993-09-13 1998-06-09 Mg-Pmc, Llc Method for producing influenza hemagglutinin multivalent vaccines using baculovirus
WO1995011700A1 (en) 1993-10-29 1995-05-04 Pharmos Corp. Submicron emulsions as vaccine adjuvants
EP0729473B1 (en) 1993-11-17 2000-08-23 OM Pharma Glucosamine disaccharides, method for their preparation, pharmaceutical composition comprising same, and their use
GB9326253D0 (en) 1993-12-23 1994-02-23 Smithkline Beecham Biolog Vaccines
CA2183435C (en) 1994-02-24 2008-05-13 Craig D. Wright Vaccines containing paucilamellar lipid vesicles as immunological adjuvants
WO1995026204A1 (en) 1994-03-25 1995-10-05 Isis Pharmaceuticals, Inc. Immune stimulation by phosphorothioate oligonucleotide analogs
WO1996002555A1 (en) 1994-07-15 1996-02-01 The University Of Iowa Research Foundation Immunomodulatory oligonucleotides
US5629052A (en) 1995-02-15 1997-05-13 The Procter & Gamble Company Method of applying a curable resin to a substrate for use in papermaking
AU4727296A (en) 1995-02-24 1996-09-11 Cantab Pharmaceuticals Research Limited Polypeptides useful as immunotherapeutic agents and methods of polypeptide preparation
UA56132C2 (uk) 1995-04-25 2003-05-15 Смітклайн Бічем Байолоджікалс С.А. Композиція вакцини (варіанти), спосіб стабілізації qs21 відносно гідролізу (варіанти), спосіб приготування композиції вакцини
US5666153A (en) 1995-10-03 1997-09-09 Virtual Shopping, Inc. Retractable teleconferencing apparatus
US20030133944A1 (en) 2001-04-05 2003-07-17 Smithkline Beecham Biologicals S.A. Vaccine composition against malaria
US5856462A (en) 1996-09-10 1999-01-05 Hybridon Incorporated Oligonucleotides having modified CpG dinucleosides
TW570803B (en) 1997-04-09 2004-01-11 Duphar Int Res Influenza vaccine
US6130043A (en) 1997-05-02 2000-10-10 Abbott Laboratories Reagents and methods useful for detecting diseases of the prostate
US6764840B2 (en) 1997-05-08 2004-07-20 Corixa Corporation Aminoalkyl glucosaminide phosphate compounds and their use as adjuvants and immunoeffectors
US6303347B1 (en) 1997-05-08 2001-10-16 Corixa Corporation Aminoalkyl glucosaminide phosphate compounds and their use as adjuvants and immunoeffectors
US6113918A (en) 1997-05-08 2000-09-05 Ribi Immunochem Research, Inc. Aminoalkyl glucosamine phosphate compounds and their use as adjuvants and immunoeffectors
GB9711990D0 (en) 1997-06-11 1997-08-06 Smithkline Beecham Biolog Vaccine
EP1279401B1 (en) 1997-09-05 2008-01-09 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Oil in water emulsions containing saponins
GB9718901D0 (en) * 1997-09-05 1997-11-12 Smithkline Beecham Biolog Vaccine
US7459524B1 (en) 1997-10-02 2008-12-02 Emergent Product Development Gaithersburg Inc. Chlamydia protein, sequence and uses thereof
GB9727262D0 (en) 1997-12-24 1998-02-25 Smithkline Beecham Biolog Vaccine
IT1298087B1 (it) 1998-01-08 1999-12-20 Fiderm S R L Dispositivo per il controllo della profondita' di penetrazione di un ago, in particolare applicabile ad una siringa per iniezioni
WO1999056776A2 (en) 1998-05-07 1999-11-11 Corixa Corporation Adjuvant composition and methods for its use
WO1999064301A1 (fr) 1998-06-08 1999-12-16 Sca Emballage France Emballage a remise a plat rapide
WO2000000462A1 (fr) 1998-06-30 2000-01-06 Om Pharma Nouveaux pseudodipeptides acyles, leur mode de preparation et les compositions pharmaceutiques en renfermant
AT408615B (de) * 1998-09-15 2002-01-25 Immuno Ag Neue influenzavirus-impfstoffzusammensetzung
US20040006242A1 (en) 1999-02-01 2004-01-08 Hawkins Lynn D. Immunomodulatory compounds and method of use thereof
US6551600B2 (en) 1999-02-01 2003-04-22 Eisai Co., Ltd. Immunological adjuvant compounds compositions and methods of use thereof
AT407958B (de) 1999-02-11 2001-07-25 Immuno Ag Inaktivierte influenza-virus-vakzine zur nasalen oder oralen applikation
CA2689696C (en) 1999-02-26 2013-08-06 Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. Microemulsions with adsorbed macromolecules and microparticles
GB9923176D0 (en) * 1999-09-30 1999-12-01 Smithkline Beecham Biolog Novel composition
US6494865B1 (en) 1999-10-14 2002-12-17 Becton Dickinson And Company Intradermal delivery device including a needle assembly
WO2001046127A1 (fr) 1999-12-22 2001-06-28 Om Pharma Pseudodipeptides acyles porteurs d'un bras auxiliaire fonctionnalise
JP2003529559A (ja) 2000-01-31 2003-10-07 グラクソスミスクライン バイオロジカルズ ソシエテ アノニム 新規用途
GB0025577D0 (en) 2000-10-18 2000-12-06 Smithkline Beecham Biolog Vaccine
EP1201250A1 (en) 2000-10-25 2002-05-02 SMITHKLINE BEECHAM BIOLOGICALS s.a. Immunogenic compositions comprising liver stage malarial antigens
WO2002074336A2 (en) 2001-02-23 2002-09-26 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Influenza vaccine formulations for intradermal delivery
DE60228229D1 (de) 2001-04-17 2008-09-25 Dainippon Sumitomo Pharma Co Neue adeninderivate
TWI228420B (en) 2001-05-30 2005-03-01 Smithkline Beecham Pharma Gmbh Novel vaccine composition
EP1455700A4 (en) 2001-11-16 2007-02-14 3M Innovative Properties Co METHODS AND COMPOSITIONS RELATED TO MRI COMPOUNDS AND TO TOLL-TYPE RECEPTOR (TLR) PATHWAYS
US6861410B1 (en) 2002-03-21 2005-03-01 Chiron Corporation Immunological adjuvant compositions
US20040074760A1 (en) * 2002-10-17 2004-04-22 Carnegie Mellon University Production of biofuels
US20050106178A1 (en) 2003-01-30 2005-05-19 Chiron Corporation Adjuvanted influenza vaccine
WO2004071459A2 (en) 2003-02-13 2004-08-26 3M Innovative Properties Company Methods and compositions related to irm compounds and toll-like receptor 8
CN1522691A (zh) * 2003-09-05 2004-08-25 韦怀新 核酸、蛋白多肽及疫苗乳剂的制备方法
DE202005022108U1 (de) 2004-03-09 2013-11-12 Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. Influenza-Virus-Impfstoffe
US20090028903A1 (en) * 2005-03-23 2009-01-29 Glaxosmithkline Biologicals, S.A. Novel use
WO2006100111A1 (en) * 2005-03-23 2006-09-28 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Composition
AR054822A1 (es) 2005-07-07 2007-07-18 Sanofi Pasteur Emulsion inmuno adyuvante
US20090304742A1 (en) 2005-11-04 2009-12-10 Novartis Vaccines And Diagnostics Srl Influenza vaccines with reduced amount of emulsion adjuvant
PT2368572T (pt) 2005-11-04 2020-06-16 Seqirus Uk Ltd Vacinas com adjuvante dotadas de antigénios não-virião preparados a partir de vírus da gripe cultivado em cultura celular
FR2896162B1 (fr) 2006-01-13 2008-02-15 Sanofi Pasteur Sa Emulsion huile dans eau thermoreversible
US20080014217A1 (en) * 2006-07-17 2008-01-17 Emmanuel Jules Hanon Influenza vaccine
CN105727276A (zh) * 2006-07-17 2016-07-06 葛兰素史密丝克莱恩生物有限公司 流感疫苗
EP2043682B1 (en) 2006-07-17 2014-04-02 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Influenza vaccine
KR101151202B1 (ko) * 2006-10-12 2012-06-11 글락소스미스클라인 바이오로지칼즈 에스.에이. 수중유 에멀젼 애주번트를 포함하는 백신
US9452209B2 (en) 2007-04-20 2016-09-27 Glaxosmithkline Biologicals Sa Influenza vaccine
EP2227251A1 (en) 2007-12-06 2010-09-15 GlaxoSmithKline Biologicals SA Influenza composition
WO2010123844A1 (en) * 2009-04-21 2010-10-28 Dow Technology Investments Llc Improved method of achieving and maintaining a specified alkylene oxide production parameter with a high efficiency catalyst

Also Published As

Publication number Publication date
US20180339037A1 (en) 2018-11-29
CA2683075A1 (en) 2008-10-30
AU2008240761B2 (en) 2014-05-29
CR11122A (es) 2010-03-22
ATE537841T1 (de) 2012-01-15
US9452209B2 (en) 2016-09-27
BRPI0810015B1 (pt) 2021-12-14
JP2010524883A (ja) 2010-07-22
EP2455101A3 (en) 2013-04-24
ZA200906753B (en) 2010-12-29
US20170246290A1 (en) 2017-08-31
PE20090146A1 (es) 2009-03-23
AR066405A1 (es) 2009-08-19
DOP2009000239A (es) 2009-11-15
EP2136837A1 (en) 2009-12-30
IL200859A (en) 2015-10-29
CO6251369A2 (es) 2011-02-21
CN101678096A (zh) 2010-03-24
US10016495B2 (en) 2018-07-10
EA024250B1 (ru) 2016-08-31
BRPI0810015A2 (pt) 2014-10-14
CA2683075C (en) 2015-11-10
IL200859A0 (en) 2010-05-17
TW200908994A (en) 2009-03-01
KR101188382B1 (ko) 2012-10-08
US20090136543A1 (en) 2009-05-28
CN105311629A (zh) 2016-02-10
US10548969B2 (en) 2020-02-04
KR20100009576A (ko) 2010-01-27
EP2136837B1 (en) 2011-12-21
EP2455101A2 (en) 2012-05-23
AU2008240761A1 (en) 2008-10-30
US9597389B2 (en) 2017-03-21
WO2008128939A1 (en) 2008-10-30
MA31381B1 (fr) 2010-05-03
EA200901161A1 (ru) 2010-06-30
US20100189741A1 (en) 2010-07-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US10548969B2 (en) Oil-in-water emulsion influenza vaccine
US11564984B2 (en) Influenza vaccine
US9730999B2 (en) Adjuvanted influenza virus compositions
ES2525572T3 (es) Vacuna antigripal
US20070141078A1 (en) Influenza vaccine
US20080014217A1 (en) Influenza vaccine
US8668904B2 (en) Influenza composition
US20230201329A1 (en) Influenza vaccine
AU2007202129B2 (en) Influenza vaccine