KR101188382B1 - 수중유 에멀젼 인플루엔자 백신 - Google Patents

수중유 에멀젼 인플루엔자 백신 Download PDF

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Abstract

본 발명은 인플루엔자 바이러스 항원 또는 이의 항원성 제조물, 및 수중유 에멀젼을 포함하는 애주번트 조성물을 포함하는, 인간 용도에 적합한 용량 부피의 면역원성 인플루엔자 조성물을 제공하며, 여기서 상기 수중유 에멀젼은 11 mg 미만 수준의 대사가능한 오일 및 5 mg 미만 수준의 유화제, 및 임의로 12 mg 미만 수준의 토콜 또는 스테롤을 포함한다. 적합하게는, 용량당 균주당 인플루엔자 항원의 양은 15 ㎍의 HA이거나 15 ㎍ 미만의 HA와 같은 적은 양이다.

Description

수중유 에멀젼 인플루엔자 백신{OIL-IN-WATER EMULSION INFLUENZA VACCINE}
본 발명은 인플루엔자 질병에 대해 인간을 면역화시키기 위한 인플루엔자 면역원성 조성물 및 백신접종 요법, 의약에서의 이의 용도, 특히 다양한 항원에 대한 면역 반응의 증강에서의 이의 용도, 및 이의 제조 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 수중유 에멀젼 애주번트와 조합된 인플루엔자 바이러스 항원 또는 항원성 제조물을 포함하는 인플루엔자 백신에 관한 것으로, 상기 수중유 에멀젼 애주번트는 대사가능한 오일 및 유화제, 및 임의로 토콜 및/또는 스테롤을 포함한다.
인플루엔자 바이러스는 인간 및 가축 둘 모두를 감염시키는 전세계에 존재하는 가장 편재성인 바이러스 중 하나이다. 인플루엔자는 현저한 경제적 부담, 이환율 및 심지어 사망률을 발생시킨다.
인플루엔자 바이러스는 약 125 nm 직경의 입자 크기를 갖는 RNA 외피 바이러스이다. 이는 기본적으로 지질 이중층 구조 및 외부 당단백질과 함께 바이러스 외피에 의해 둘러싸인 핵산단백질(nucleoprotein)과 결합된 리보핵산(RNA)의 코어 또는 내부 누클레오캡시드(nucleocapsid)로 구성된다. 바이러스 외피의 내부층은 주로 매트릭스 단백질로 이루어지고, 외부층은 대부분 숙주 유래의 지질 물질로 이루어진다. 인플루엔자 바이러스는 입자의 표면에서 10 내지 12 nm 길이의 스파이 크(spike)로 보이는 2개의 표면 항원, 당단백질 뉴라미니다아제(neuraminidase, NA) 및 헤마글루티닌(haemagglutinin, HA)을 포함한다. 이것이 상기 표면 단백질, 특히 인플루엔자 서브타입의 항원 특이성을 결정하는 헤마글루티닌이다. 바이러스 균주는 기원 숙주종, 지리적 위치 및 분리 년도, 일련 번호에 따라 분류되고, 인플루엔자 A에 대해서는 HA 및 NA의 서브타입의 혈청학적 특성에 의해 분류된다. 16개의 HA 서브타입(H1-H16) 및 9개의 NA 서브타입(N1-N9)가 인플루엔자 A 바이러스에 대해 확인되었다[Webster RG et al. Evolution and ecology of influenza A viruses. Microbiol . Rev . 1992;56:152-179; Fouchier RA et al.. Characterization of a Novel Influenza A Virus Hemagglutinin Subtype (H16) Obtained from Black-Headed Gulls. J. Virol. 2005;79:2814-2822]. 모든 HA 및 NA 서브타입의 바이러스가 물새로부터 회수되었으나, 1918년 이래로 단지 3개의 HA 서브타입(H1, H2 및 H3) 및 2개의 NA 서브타입(N1 및 N2)이 인간 집단에서 안정적인 계통을 확립하였다. 단지 1개의 HA 서브타입 및 1개의 NA 서브타입이 인플루엔자 B 바이러스에 대해 인지된다.
인플루엔자 A 바이러스는 지속적으로 진화하고, 항원 변이성을 겪는다[Wiley D, Skehel J. The structure and the function of the hemagglutinin membrane glycoprotein of influenza virus. Ann. Rev. Biochem. 1987;56:365-394]. 바이러스 RNA 중합효소에 의한 효과적인 프루프리딩(proofreading)의 결핍은 표면 당단백질에서 아미노산 치환을 발생시킬 수 있는 높은 비율의 전사 오류를 야기시킨다. 이는 "항원성 드리프트(antigenic drift)"로 언급된다. 분할된 바이러스 유전체는 제 2 유형의 항원성 변이를 가능케 한다. 2개의 인플루엔자 바이러스가 숙주 세포를 동시에 감염시키는 경우, "항원성 시프트(antigenic shift)"라 언급되는 유전자 재편성(genetic reassortment)이 신규한 표면 또는 내부 단백질을 갖는 신규한 바이러스를 생성시킬 수 있다. '드리프트(drift)' 및 '시프트(shift)' 둘 모두의 상기 항원성 변화는 예측할 수 없고, 이들은 결국은 신규한 인플루엔자 균주의 출현시키고, 바이러스가 면역계로부터 회피하여 널리 공지된 대부분 일년에 걸친 유행병을 야기하는 것을 가능하게 함에 따라 면역학적 관점으로부터 극적인 영향을 미칠 수 있다. 이러한 유전적 변형 둘 모두는 인간에서 범유행병의 원인이 되는 신규한 바이러스 변이체를 야기시킨다.
인플루엔자 B 바이러스 항원성 드리프트는 A 균주에서의 항원성 드리프트 보다 덜 빈번하고, 항원성 시프트는 공지되어 있지 않다. 인플루엔자 B의 항원적으로 별개의 계통(보통, 2개, 예를 들어, B/야마가타(B/Yamagata) 및 B/빅토리아(B/Victoria))은 매년 및 나라마다 다양한 비로 때때로 공동 순환(co-circulate)하나, 인플루엔자 백신은 단지 1개의 인플루엔자 B 균주를 함유하는 것이 보통이다.
HA는 다양한 인플루엔자 균주의 혈청학적 특이성의 규정에서 가장 중요한 항원이다. 이러한 75-80 kD의 단백질은 다수의 항원성 결정기를 함유하고, 이중 여러개는 다양한 균주에서 서열 변화를 겪는 영역(균주 특이적 결정기)에 존재하고, 다른 것들은 다수의 HA 분자에 공통적인 영역(결정기에 대해 공통임)에 존재한다.
인플루엔자 바이러스는 6주의 기간에 걸쳐 40% 만큼 높은 타입 A 또는 B 바 이러스에 대한 감염 속도로 거의 매년 겨울에 유행병을 야기시킨다. 인플루엔자 감염은 가벼운 상기도 감염을 통한 무증상 감염으로부터 여러 바이러스성 폐렴까지 다양한 질병 상태를 야기시킨다. 통상적인 인플루엔자 유행병은 입원 또는 사망률의 증가된 비율에 의해 입증되는 바와 같이 폐렴 및 하기도 질병의 발병률을 증가시킨다. 상기 질병의 중증도는 주로 숙주의 연령, 이의 면역 상태 및 감염 부위에 의해 결정된다.
65세 또는 이 이상의 노인이 특히 취약하고, 개발도상국에서 모든 인플루엔자 관련 사망의 80-90%의 원인이다. 만성 질병을 갖거나 면역 반응 부전을 갖는 개체가 또한 가장 상기 합병증을 경험할 수 있다. 어린 유아가 또한 중증 질병에 걸릴 수 있다. 따라서, 특히 이러한 군은 보호될 필요가 있다. 이러한 '위험'군 이외에 건강 기구는 또한 의료 관계자가 백신접종하는 것을 권장하고 있다.
백신접종은 연간 인플루엔자 유행병 제어에서 중요한 역할을 한다. 현재 이용가능한 인플루엔자 백신은 불활성화되거나 생(生) 약독화된 인플루엔자 백신이다. 불활성화된 인플루엔자 백신은 불활성화된 전체(whole) 바이러스, 정제된 바이러스 입자가 지질 외피를 용해시키기 위한 세제 또는 다른 시약으로 분쇄된 서브-비리온(sub-virion)(소위 "스플리트(split)" 백신) 또는 정제된 HA 및 NA(서브유닛 백신)의 3개의 가능한 형태의 항원 제조물로 구성된다. 이러한 불활성화된 백신은 근내(i.m.), 피하(s.c), 또는 비내(i.n.) 제공된다.
범유행기 사이(interpandemic) 사용을 위한 모든 종류의 인플루엔자 백신은 보통 3가 백신이다. 이는 일반적으로 2개의 인플루엔자 A 바이러스 균주 및 1개의 인플루엔자 B 균주로부터 유래된 항원을 함유한다. 대부분의 경우에서 표준 0.5 ㎖의 주사가능한 용량은 단일원면역확산법(single radial immunodiffusion, SRD)에 의해 측정시 각각의 균주로부터 (적어도) 15 ㎍의 헤마글루티닌 항원 성분을 함유한다(J. M. Wood et al.: An improved single radial immunodiffusion technique for the assay of influenza haemagglutinin antigen: adaptation for potency determination of inactivated whole virus and subunit vaccines. J. Biol. Stand. 5 (1977) 237-247; J. M. Wood et al., International collaborative study of single radial diffusion and immunoelectrophoresis techniques for the assay of haemagglutinin antigen of influenza virus. J. Biol. Stand. 9 (1981) 317-330). 4가 백신이 또한 보고되었으며, 이는 3개의 고전적인 균주 외에 추가의 B 균주(Commun Dis lntell 2006, 30, 350-357) 또는 추가의 H3N2 균주(Vaccine 1992, 10, 506-511)를 함유한다.
각 계절에서 인플루엔자 백신에 통합되는 범유행기 사이 인플루엔자 바이러스 균주는 국가보건기구 및 백신 제조업체와 협력하여 세계보건기구에 의해 결정된다. 현재 이용가능한 범유행기 사이 인플루엔자 백신은 모든 연령군에서 안전한 것으로 간주된다(De Donato et al. 1999, Vaccine, 17, 3094-3101).
그러나, 백신 효능은 수용체의 연령 및 면역 상태 및 백신과 순환 인플루엔자 균주 사이의 매치(match)에 의해 영향을 받는다. 현재의 인플루엔자 백신은 2세 이하의 연령의 소아에서 효능이 있는 것으로 거의 입증되지 않는다. 또한, 통상적인 확인된 인플루엔자 질병의 예방을 위한 백신 효능의 보고된 비율은 노인에 대해 23-72%이며, 이는 보다 젊은 성인에 대해 보고된 60-90%의 효능 비율보다 현저하게 낮다(Govaert, 1994, J. Am. Med. Assoc, 21, 166-1665; Gross, 1995, Ann Intern. Med. 123, 523-527). 인플루엔자 백신의 효과는 바이러스 균주에 대한 적혈구응집 억제(HI) 항체의 혈청 역가와 서로 관련된 것으로 밝혀졌고, 여러 연구에서 나이 많은 성인이 보다 젊은 성인에 비해 인플루엔자 면역화 후 낮은 HI 역가를 나타내는 것이 밝혀졌다(Murasko, 2002, Experimental gerontology, 37, 427-439).
배경기술로서, 범유행기 사이의 기간 동안, 이전의 범유행병으로부터의 것들과 관련된 인플루엔자 바이러스가 순환된다. 바이러스는 생애 초기 감염으로부터 다양한 수준의 면역원성을 갖는 인간 사이에 퍼진다. 일반적으로 2-3년의 기간에 걸친 이러한 순환은 일반 집단에서 범유행성을 다시 야기시킬 정도로 충분히 변화된 신규한 균주의 선택을 촉진한다: 이 과정을 '항원성 드리프트'라고 한다. '드리프트 변이체'는, 비록 이들의 전체적인 영향력이 종종 수 년에 걸쳐 유사하긴 하나, 상이한 공동체, 지역, 국가 또는 대륙에서 임의로 1년간 상이한 영향을 미칠 수 있다. 통상적인 인플루엔자 범유행병은 폐렴 및 하기도 질병의 발병률을 증가시키고, 이것은 입원률 또는 사망률의 증가에 의해 입증된다. 노인 또는 만성 질병이 있는 인간이 가장 많이 이러한 합병증을 경험하나, 어린 유아도 중증 질병에 걸릴 수 있다.
예측할 수 없는 간격으로, 신규한 인플루엔자 바이러스가 이전 계절에 순환된 균주와 전혀 다른 서브타입의 중요한 표면 항원인 헤마글루티닌을 지니며 출현한다. 여기서, 생성된 항원은 인간에서 이전에 순환된 균주의 상응하는 단백질로 부터 20% 내지 50% 변화될 수 있다. "항원성 시프트(antigenic shift)"로 언급되는 이러한 현상은 바이러스가 '집단 면역'을 회피하여 범유행병을 확립시킬 수 있게 한다. 즉, 면역성을 갖지 않는 인간 집단에 대해 새로운 인플루엔자 바이러스가 출현하는 경우 인플루엔자 범유행병이 발생한다. 상이한 종으로부터의 인플루엔자 바이러스, 예를 들어, 조류 또는 돼지 인플루엔자 바이러스가 종 장벽을 넘는 경우, 적어도 과거의 범유행병이 발생했다고 생각된다. 이러한 바이러스가 인간에서 인간으로 퍼질 잠재성을 갖는 경우, 이는 수개월 내지 수년내에 전세계로 퍼져 범유행병을 초래할 수 있다. 예를 들어, 1957년에(아시아 인플루엔자 범유행병), H2N2 서브타입의 바이러스는 바이러스가 최초 분리된 적어도 1918년 이래로 인간 집단에 순환하는 H1N1 바이러스를 대신하였다. H2 HA 및 N2 NA는 HA가 H3N2 인플루엔자 서브타입의 출현에 의해 1968년(홍콩 인플루엔자 범유행병)에 대체될 까지 1957년에서 1968년 사이에 항원성 드리프트를 겪었으며, 이후 N2 NA는 H3 HA와 함께 계속 드리프트되었다[Nakajima et al., 1991, Epidemiol. Infect. 106, 383-395].
프라이밍되지 않은 집단에서 비-순환 H2N2 또는 H9N2 균주와 같은 범유행성 균주를 함유하는 일가 후보 백신을 이용하여 안전성 및 면역원성을 평가하기 위해 여러 임상 연구가 수행되었다. 상기 연구들에서 명반(alum) 애주번트를 이용하거나 이용하지 않고, 다양한 HA 농도 (용량당 1.9, 3.8, 7.5 또는 15 ㎍ HA)의 스플리트 또는 전체 바이러스 제형을 조사하였다. H2N2 서브타입의 인플루엔자 바이러스는 1957년부터 이들이 '홍콩 범유행기' 동안 H3N2 균주로 대체된 1968년까지 순 환되었다. 오늘날, 1968년 이후 태어난 개체들은 H2N2 균주에 대해 면역학적으로 나이브(naive)이다. 이러한 백신 후보는 면역원성이며 충분히 관용성인 것으로 나타났다. 결과가 문헌[Hehme, N et al. 2002, Med. Microbiol. Immunol. 191, 203-208; in Hehme N et al. 2004, Virus Research 103, 163-171]에 보고되어 있고 H5N1을 이용한 두 연구가 보고되었다[Bresson JL et al. The Lancet. 2006: 367 (9523): 1657-1664; Treanor JJ et al. N Engl J Med. 2006; 354:1343-1351]. 다른 연구들은 MF59 애주번트 첨가된 인플루엔자 백신을 이용한 결과를 보고하였다. 한 연구는 MF59로 애주번트 첨가된 두 용량의 H5N3 인플루엔자 백신이 프라이밍된 집단에서 인플루엔자 H5N1에 대해 면역성을 부스팅(boosting)한다고 보고하였고 (Stephenson et al., Vaccine 2003, 21, 1687-1693), 또 다른 연구는 MF59-애주번트 첨가된 인플루엔자 H5N3 백신의 3회 투여 후에 수득된 H5N1 바이러스에 대한 교차-반응성 항체 반응을 보고하였다 (Stephenson et al., J. Infect. Diseases 2005, 191, 1210-1215).
인플루엔자 범유행기에 위험한 인간은 계절 인플루엔자로 인한 합병증에 대해 규정된 위험-그룹과 상이할 수 있다. WHO에 따르면, 조류 인플루엔자 균주 H5N1에 의해 야기된 인간에서의 경우 중 50%가 20세 미만의 연령의 인간에게서 발생하고, 90%가 40세 미만의 연령의 인간에게서 발생하였다 (WHO, weekly epidemiological record, 30 June 2006).
범유행기 동안, 항바이러스 약물은 요구를 충족하기에 충분하거나 효과적이지 않을 수 있고, 인플루엔자에 위험한 개체의 수가 범유행기 사이 기간에서 보다 많을 것이므로, 다량으로 생성될 수 있고 효과적인 분포 및 투여 잠재성을 지니는 적합한 백신의 개발이 필수적이다. 범유행성 인플루엔자 백신의 생성을 위한 일부 생성 능력을 신속하게 구하는 것이 한 방법이 될 것이다. 그러나, 대량의 백신접종은 범유행병의 발현 후에만 시작하며, 이는 균주를 확인하고, 첫번째 로트(lot)를 생성하는데 필요한 시간에 의해 야기되는 중요한 지연을 발생시킬 것이다. 또한, 이는 고정될 것이고, 이에 따라 백신 제조업체에 의한 매주의 생산이 제한될 것이다. 이는 현재의 접근법이 거의 확실히 범유행병이 발생하는 경우 전세계적으로 보호되지 않는 거대한 집단의 일부를 남길 것임을 의미한다. 백신은 거대한 집단의 일부에 대해 이용되기에는 너무 늦게될 것이고, 사망률이 전세계적으로 1억 8천 내지 3억 6천명의 추정 사망자로 높게 예측된다.
상기 현재의 딜레마를 다루기 위한 한 방법은 범유행병에 앞서 범유행성 백신을 생성하고, 주로 면역학적으로 나이브 수용체에서 보호 항체 수준을 달성하기 위해 2개 용량의 백신이 필요함에 따라 백신 부피를 감소시키기 위한 시도에서 3가 백신 대신 "최적 후보 범유행성 균주"를 이용하여 1가 백신을 계획하는 것이다(Wood JM et al. Med Mircobiol Immunol. 2002;191:197-201. Wood JM et al. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 2001;356:1953-1960). 이후, 이러한 백신은 범유행기 사이 동안 집단의 비축(stockpiling) 또는 프라이밍을 위해 사용될 수 있다.
불운하게도, 현재 생산 시설은 전적으로 북반구 및 남반구에서 연간 백신접종을 위한 계절성 3가 백신의 생산으로 연중 계속되어 소비되므로, 상기 "최적 후 보 범유행성 균주"를 생산하기 위한 추가 생산 능력이 없으므로 상기 언급된 둘 모두의 접근법은 이용가능하지 않다. 또한, 연간 인플루엔자 계절 동안 정기적으로 조우되는 범유행기 사이 인플루엔자 백신의 부족을 대처하기 위한 해법을 찾을 시급한 필요성이 존재함이 인지되어야 한다. 한 해법은 추가 생산 능력을 확립하는 것이 될 수 있으나, 이는 수년의 건설기간이 필요하며, 이는 어쨌든 범유행병 발생 다음해 이내에는 부적절한 접근법이다.
현재, 추가 능력을 신속하게 얻기 위한 유일한 방법은 연간 3가 백신에 대한 생산 시간을 단축하는 것이 될 것이다. 인플루엔자 백신의 반복되는 부족은 중증 인플루엔자 질병 및 합병증이 발달할 위험이 높은 것으로 간주되는 집단의 최적 적용 범위를 배제하는 대부분의 국가에서 매 계절에 발생한다. 항원 생산은 백신 생산에서 속도 제한 요인이며, 대안적인 항원 보존(sparing) 방법이 개발되어야 한다.
몇몇 접근법은 애주번트화(adjuvantation)이며, 이의 목적은 항원 함량(항원 보존)을 감소시킴으로써 이용가능한 백신 용량의 수를 증가시킬 수 있게 하기 위해 백신의 면역원성을 증가시키는 것이다. 애주번트의 사용은 또한 나이브 집단에서 항원의 잠재적으로 약한 면역원성을 극복할 수 있다. 여러 접근법이 공개되었다. 예는 알루미늄염으로 애주번트 첨가된 전체 불활성화 H2N2 또는 H9N2 바이러스(N. Hehme et al. Virus Research 2004, 103, 163-171) 또는 플레인(plain) 서브비리온(subvirion) H5N1 백신 또는 수산화알루미늄으로 애주번트 첨가된 스플리트 바이러스 H5N1 백신(Bresson JL et al. The Lancet. 2006:367 (9523): 1657-1664; Treanor JJ et al. N Engl J Med. 2006;354:1343-1351)을 이용하여 제시되었다. 상기 마지막 시도의 결과는 플레인 및 애주번트 첨가된 H5N1 바이러스 백신 둘 모두가 90 ㎍의 항원 용량까지 안전한 것을 나타낸다(플레인 서브비리온 백신으로만 시험됨). 그러나, 이러한 높은 용량의 항원의 이용은 범유행병의 경우에 필수적이 되는 항원 보존 방법과는 양립되지 않는다. 수중유 에멀젼 형태의 애주번트 MF59로 애주번트 첨가된 서브유닛 인플루엔자 백신은 노인 및 위험 집단에 대해 시판되며, 애주번트 첨가되지 않은 서브유닛 백신으로 수득된 항체 역가보다 높은 항체 역가를 유도하는 능력이 입증되었다(De Donato et al. 1999, Vaccine, 17, 3094-3101). 그러나, 이후의 간행물에서, 동일한 백신이 애주번트 첨가되지 않은 스플리트 백신에 비해 개선된 프로파일이 입증되지 않았다(Puig-Barbera et al., 2004, Vaccine 23, 283-289).
따라서, 항원 보존 고려사항을 다루면서 효과적인 새로운 백신이 여전히 필요하다. 이러한 새로운 백신은 면역원성이 개선되지 않은 경우, 특히 약하거나 비면역원성인 범유행성 균주, 또는 노인 집단과 같이 면역약화된 개체에 대해 허용될 것이다. 이러한 새로운 백신은 또한 이상적으로 교차 보호 잠재성을 가져, 이들은 범유행병의 선언 전 또는 선언 시에 범유행성 균주에 대해 면역학적 나이브 집단을 프라이밍하기 위한 범유행병전(prepandemic) 또는 비축 백신으로 사용될 수 있을 것이다.
발명의 진술
본 발명은 인플루엔자 백신의 공급을 개선시키기 위해, 적은 양의 인플루엔자 항원이 사용될 수 있게 하는 애주번트를 함유하는 신규한 효과적인 면역원성 인플루엔자 제형이 개발될 수 있는 것을 발견하였다. 세포 매개 면역 반응 및/또는 체액 반응과 관련하여 모든 연령 그룹의 충분한 보호를 제공하는 항원 보존 제형을 허용하는 신규한 애주번트 첨가된 조성물이 본원에 제공된다.
본 발명자들은 특히 면역원성 조성물 내의 애주번트의 각각의 개별적 성분 또는 모든 개별적 성분이 이전에 유용한 것으로 생각된 수준보다 낮게 존재하는 것을 특징으로 하는 면역원성 인플루엔자 조성물에 의존하는 것을 발견하였다. 이는 숙주 수용체 내의 반응원성이 감소되면서 항원에 대한 면역원성의 수준을 유지시키는 이점을 지닌다.
따라서, 본 발명의 첫번째 양태에서, 수중유 에멀젼 애주번트와 조합된 인플루엔자 바이러스 항원 또는 항원성 제조물을 포함하는 인간 용도에 적합한 용량 부피의 면역원성 인플루엔자 조성물, 특히 백신이 제공되며, 상기 수중유 에멀젼 애주번트는 대가가능성 오일 및 유화제, 및 임의로 토콜 및/또는 스테롤을 포함하고, 상기 대사가능한 오일은 11 mg 미만의 수주으로 상기 인간 용량에 존재하고, 상기 유화제는 5 mg 미만의 수준으로 상기 인간 용량에 존재한다. 상기 토콜 및/또는 스테롤은 존재시 12 mg 미만의 수준으로 상기 인간 용량에 존재한다. 적합하게는, 용량당 균주당 인플루엔자 항원의 양은 15 ㎍의 HA 또는 15 ㎍ 미만의 HA와 같이 적은 양이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 인플루엔자 바이러스 항원 성분 또는 인플루엔자 바이러스 항원성 제조물 성분, 임의로 적은 양의 항원 성분을 포함하고, 본원에 정의된 동반 또는 연속 투여를 위한 애주번트를 추가로 포함하는 백신 키트를 제공한다.
세번째 양태에서, 본 발명은 범유행병 상황, 범유행병전 상황 또는 범유행기 사이(계절) 상황 동안의 인플루엔자 면역원성 조성물의 생성 방법을 제공하며, 이러한 방법은 인플루엔자 바이러스 항원 또는 이의 항원성 제조물과 본원에 정의된 수중유 에멀젼 애주번트를 혼합하는 단계를 포함한다. 특히, 본 발명은 애주번트 첨가된 면역원성 조성물과 약학적으로 허용되는 부형제를 혼합하는 단계, 및 용량당 15 ㎍ 이하의 인플루엔자 헤마글루티닌 항원을 함유하는 백신 단위를 제공하는 단계를 포함하는, 인플루엔자 백신을 생성하기 위한 방법을 제공한다. 인플루엔자 바이러스는 난(egg) 유래, 식물 유래, 세포 유래된 것일 수 있거나, 재조합적으로 생성될 수 있다. 적합하게는, 인플루엔자 바이러스 항원은 란 유래되거나 세포 배양 유래된다.
네번째 양태에서, 인플루엔자 감염에 의해 야기되는 질병의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 본원에 정의된 면역원성 조성물 또는 백신이 제공된다. 관련 양태에서, 본 발명은 인플루엔자 바이러스에 의해 야기되는 감염 또는 질병에 대한 보호를 위한 면역원성 조성물, 예를 들어, 백신의 제조에서의 인플루엔자 바이러스 항원 또는 이의 항원성 제조물 및 본원에 정의된 수중유 에멀젼의 용도를 제공한다.
또 다른 양태에서, 애주번트 첨가되지 않은 조성물로 수득된 반응에 비해, 인간에서 상기 바이러스 항원 또는 항원성 조성물에 대한 ⅰ) 개선된 CD4 T-세포 면역 반응, ⅱ) 개선된 B 세포 기억 반응, ⅲ) 개선된 체액 반응 중 하나 이상을 유도하기 위한 면역원성 조성물, 또는 키트의 제조에 있어서, (a) 인플루엔자 균주로부터의 본원에 정의된 바와 같은 적은 양의 인플루엔자 바이러스 항원 또는 이의 항원성 제조물, 및 (b) 본원에 정의된 수중유 에멀젼 애주번트의 용도가 제공된다.
한 추가 양태에서, 면역원성 조성물 내의 항원이 유래되는 바이러스의 변이체인 인플루엔자 바이러스에 의해 야기되는 감염 또는 질병에 대한 보호를 위한, 본원에 정의된 방법 또는 용도가 제공된다. 또 다른 구체예에서, 면역원성 조성물 내의 항원의 변이체인 항원을 포함하는 병원체에 의해 야기되는 인플루엔자 감염 또는 질병에 대한 보호를 위한 본원에 정의된 방법 또는 용도가 제공된다.
본 발명은 또한 본원에 정의된 항원 및 수중유 에멀젼 애주번트의 전달을 포함하는 백신접종 방법에 관한 것이다.
본 발명의 다른 양태 및 이점은 하기 바람직한 구체예의 상세한 설명에서 추가로 기재된다.
도면의 간단한 설명
도 1: 임상 시험: 상이한 시점에서 항-HA 항체에 대한 기하 평균 역가(GMT)(면역원성에 대한 ATP 코호트(cohort)).
도 2: 임상 시험: 0일 및 21일에서 95% 신뢰 구간을 갖는 HI 항체 역가에 대한 혈청보호율(SPR)(면역원성에 대한 ATP 코호트).
도 3: 임상 시험: 21일에서 95% 신뢰 구간을 갖는 HI 항체 역가에 대한 혈청전환률(SCR)(면역원성에 대한 ATP 코호트).
도 4: 임상 시험: 21일에서 95% 신뢰 구간을 갖는 HI 항체 역가에 대한 혈청전환 인자(SCF)(면역원성에 대한 ATP 코호트).
도 5: 마우스 연구: 이종아형(heterosubtypic) 균주(용량 범위 AS03)로 프라이밍된 BALB/c 마우스에서의 헤마글루티닌 억제 시험(GMT +/- IC95). 도 5A: 항-A/뉴 칼레도니아/20/99 HI 역가; 도 5B: 항-A/파나마/2007/99 HI 역가. 도 5C: 항-B/산동/7/97 HI 역가.
도 6: 마우스 연구: 이종아형 균주(용량 범위 AS03)로 프라이밍된 C57BI/6 마우스에서의 헤마글루티닌 억제 시험(GMT +/- IC95).
도 7: 마우스 연구: 이종아형 균주(용량 범위 AS03)로 프라이밍된 C57BI/6 마우스로부터의 PBMC에서의 세포 면역 반응(CD4+ T 세포).
도 8: 마우스 연구: 이종아형 균주로 프라이밍되고 용량 범위 AS03으로 애주번트 첨가된 저 용량 항원(0.5 ㎍)으로 면역화된 C57BI/6 마우스로부터의 PBMC에서의 세포 면역 반응(CD4+ T 세포).
도 9: 마우스 연구: 두 상이한 항원 용량, 1.5 ㎍ (A, C 및 E) 또는 0.38 ㎍ (B, D 및 F)에 대한 면역화 14일 후의 H5N1-특이적 혈청 Ig ELISA 역가(A 및 B) 및 항-H5N1 IgG1(C 및 D) 및 IgG2b(E 및 F) 동형(isotypic) 반응(GMT +/- IC95).
도 10: 마우스 연구: 두 상이한 항원 용량, 1.5 ㎍(A) 또는 0.38 ㎍(B)에 대한 면역화(GMT +/- IC95) 21일 후의 적혈구응집 억제 시험(GMT +/- IC95).
도 11: 마우스 연구: 용량 범위 AS03으로 애주번트 첨가된 상이한 용량의 H5N1 백신(1.5 ㎍ 또는 0.38 ㎍)으로 면역화된 나이브 C57BI/6 마우스에서 세포 면역 반응(CD4+ T 세포): (A) 1.5 ㎍ HA Ag(항원) 또는 (B) 0.38 ㎍ HA Ag(항원).
도 12: 돼지 연구: 동종 균주(용량 범위 AS03)로 프라이밍된 돼지에서의 헤마글루티닌 억제 시험(GMT +/- IC95).
도 13: TIV 또는 QIV 플레인으로 면역화되거나 AS03 또는 AS03/2로 애주번트 첨가된 C57BI/6 나이브 마우스에서의 헤마글루티닌 억제 시험(GMT +/- IC95).
도 14: B/빅토리아-유사 바이러스로 프라이밍되고, TIV 또는 QIV 플레인으로 면역화되거나 AS03 또는 AS03/2로 애주번트 첨가된 C57BI/6 마우스에서의 헤마글루티닌 억제 시험(GMT +/- IC95).
도 15: 인간 임상 시험(애주번트 용량 범위): 0 및 21일에서의 HI 항체 역가에 대한 GMT.
도 16: 인간 임상 시험(성인에서의 애주번트 용량 범위): 0 및 21일에서의 HI 항체 역가에 대한 혈청보호율(SPR).
도 17: 인간 임상 시험(성인에서의 애주번트 용량 범위): 도 17A: PI(21일)에서의 HI 항체 역가에 대한 혈청전환률(SCR); 도 17B: 연령 범주에 의한 PI(21일)에서의 HI 항체 역가에 대한 SCR.
도 18: 인간 임상 시험(성인에서의 애주번트 용량 범위): 도 18A: PI(21일)에서의 HI 항체 역가에 대한 혈청전환 인자(SCF); 도 18B: 연령 범주에 의한 PI(21일)에서의 HI 항체 역가에 대한 SCF.
도 19: 인간 임상 시험(노인에서의 애주번트 용량 범위): 0 및 21일에서의 HI 항체 역가에 대한 GMT.
도 20: 인간 임상 시험(노인에서의 애주번트 용량 범위): 0 및 21일에 95% 신뢰 구간을 갖는 HI 항체 역가에 대한 혈청보호율(SPR).
도 21: 인간 임상 시험(노인에서의 애주번트 용량 범위): PI(21일)에서의 HI 항체 역가에 대한 혈청전환률(SCR).
도 22: 인간 임상 시험(노인에서의 애주번트 용량 범위): 21일에서 95% CI를 갖는 HI 항체 역가에 대한 SCF(면역원성 HI에 대한 ATP 코호트).
도 23: 인간 임상 시험(노인에서의 애주번트 용량 범위): 0 및 21일에서의 풀링된 균주에 대한 사이토카인-양성 CD4 T-세포(CMI에 대한 ATP 코호트).
도 24: 인간 임상 시험(노인에서의 애주번트 용량 범위): 백신접종 후 7일(0-6일)의 기간 동안 관련 요망 또는 비요망 증상(모든 등급 / 등급 3)을 나타내는 피검체의 백분율(전체 백신접종된 코호트).
상세한 설명
본 발명의 발명자들은 대사가능한 오일 및 유화제, 및 임의로 토콜 및/또는 스테롤을 포함하고, 여기서 각각의 성분이 이전에 사용되는 것보다 적은 인간 백신 용량당 수준으로 존재하는 애주번트 조성물이 인플루엔자 제조물에 대한 면역 반응을 개선하면서, 동시에 애주번트 성분이 인간 용량당 높은 수준(적합하게는, 2배 이상)으로 존재하는 종래 분야의 제형의 일부 보다 낮은 반응원성을 갖는 것을 발견하였다.
본 발명의 발명자들은 인플루엔자 바이러스 또는 이의 항원성 제조물과 함께 본원에 정의된 애주번트를 포함하고, 임의로 면역자극제, 예를 들어, 지질 A 유도체, 예를 들어, 3D-MPL을 추가로 포함하는 인플루엔자 제형이 ⅰ) 애주번트 첨가되지 않은 바이러스 또는 이의 항원성 제조물로 수득된 것에 비해 상기 항원 또는 항원성 조성물에 대해 CD4 T-세포 면역 반응 및/또는 체액 면역 반응을 개선시키고/시키거나, ⅱ) 각각의 성분이 보다 높은(적합하게는, 2배 이상) 수준으로 존재하는 애주번트 첨가된 조성물로 수득된 것과 동등한 상기 항원 또는 항원성 조성물에 대한 CD4 T-세포 면역 반응 및/또는 체액 면역 반응을 발생시킬 수 있다는 것을 추가로 발견하였다. 애주번트 첨가된 제형은 MHC 클래스 Ⅱ 분자에 의해 제시된 인플루엔자 에피토프를 검출할 수 있는 항-인플루엔자 CD4-T 세포 반응을 유도하는데 유리하게 사용된다. 본 발명의 출원인은 동종 및 드리프트 인플루엔자 균주에 대한 반응성을 증가(백신접종 및 감염 후)시키기 위해 세포 매개 면역계를 표적으로 하는 것이 효과적인 것을 발견하였다.
본 발명에 사용하기 위한 조성물은 임의의, 여러 또는 모든 인플루엔자 관련 보호(즉, 혈청전환률, 전환 이자, 보호율)를 충족시키는 인간 피검체의 수로 측정시, 인간에 (ⅰ) 애주번트 첨가되지 않은 조성물에 비해 재백신접종 후에 인플루엔자에 대한 보다 나은 혈청보호, 및 (ⅱ) 각각의 성분이 보다 높은 수준으로 존재하는 애주번트 첨가된 조성물에 비해 재백신접종 후에 인플루엔자에 대한 동등한 혈청보호 중 하나 또는 둘 모두를 제공할 수 있는 것이 본 발명의 특정 구체예이다. 더욱이, 본 발명에 사용하기 위한 조성물은 또한 (ⅰ) 애주번트 첨가되지 않은 조성물에 비해 인간 피검체의 일차 백신접종 후의 보다 높은 B 세포 기억 반응, 및 재백신접종 후의 보다 높은 체액 반응, 및 (ⅱ) 각각의 성분이 보다 높은(적합하게는, 2배 이상) 수준으로 존재하는 애주번트 첨가된 조성물에 비해 인간 피검체의 일차 백신접종 후의 동등한 B 세포 기억 반응, 및 재백신접종 후의 동등한 체액 반응 중 하나 또는 둘 모두를 유도할 수 있는 것이 또 다른 특정 구체예이다.
본 발명에 따른 애주번트 첨가된 인플루엔자 조성물은 여러 장점을 갖는다. 이러한 장점은 동등한 애주번트 첨가되지 않은 조성물과의 비교, 또는 각각의 애주번트 성분이 보다 높은 수준으로 존재하는 애주번트 첨가된 조성물과의 비교에 의해 평가될 수 있다:
1) ⅰ) 덜 면역원성인 인플루엔자 균주에 대한 약한 면역 반응을 애주번트 첨가되지 않은 제형으로 수득된 것보다 높은 수준으로 개선시키고; ⅱ) 노인(50세를 초과하는 연령, 통상적으로 65세를 초과하는 연령)과 같은 특정 집단에서 약한 면역 반응을 청년에서 관찰되는 수준(항체 및/또는 T 세포 반응)으로 회복시키는 것 중 어느 하나 또는 둘 모두를 가능케 함으로써, 애주번트 첨가되지 않은 조성물에 비해 개선된 면역원성;
2) 애주번트의 사용은 나이브 집단 또는 어린 유아(6개월 내지 4세, 특히 1세 미만의 연령의 아동)에서 항원의 잠재적인 약한 면역원성을 극복하고 프라이밍 및 보호를 유도할 수 있다;
3) 고전적인 백신(예를 들어, 시판되는 스플리트 백신)에 비해 백신 균주에 대해 적어도 동등한 보호를 제공하는 것 외에, 이들은 개선된 교차 보호 프로파일인, 교차 프라이밍 방법의 설정을 가능케 하는 변이체(드리프트된) 인플루엔자 균주에 대한 증가된 교차 반응성 및 교차 보호를 야기시킴으로써 드리프트 균주에 대한 추가 보호층을 제공할 수 있고; 이는 (순환하는) 범유행병 균주에 대한 보호를 향상시키는데 요구되는 범유행병 백신의 1회 용량을 추가로 가능케 하는 범유행병전 백신으로 사용될 수 있어 특히 흥미롭고; 이는 또한 다른 범유행기 사이 A 균주 H1N1에서보다 더욱 신속한 것으로 보이는 경향이 있는 H3N2 드르프트의 문제를 다룰 수 있어 흥미롭다;
4) 만족스러운 면역원성 잠재성을 유지하면서, 각각의 성분이 보다 높은(적합하게는, 2배 이상) 수준으로 존재하는 조성물로 수득된 프로파일에 비해 애주번트 첨가된 조성물의 감소된 반응원성 프로파일.
감소된 항원 투여량(통상적으로, 15 ㎍/균주/용량 미만) 및 감소된 애주번트 투여량을 이용하여 상기 장점 중 어느 하나 또는 모두에 추가로 도달함으로써, 이들은 비상 상태의 경우 또는 범유행병 상황에 대한 준비(범유행병 상황에서의 항원 보존)에 대해 증가된 용량을 보장하고, 범유행병 사이 백신접종 계절 동안 집단이 이용가능한 보다 많은 수의 백신 용량의 가능성을 제공할 것이다.
감소된 항원 투여량 및/또는 감소된 애주번트 투여량의 조합에 기초함으로써, 이들은 표준 3가 백신에 첨가되는 제 2의 인플루엔자 B 균주 또는 범유행성 인플루엔자 균주일 수 있는 제 4의 균주를 포함하는 4가 백신과 같은 보다 복잡한 인플루엔자 조성물의 개발을 가능케 할 것이다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 본원에 정의된 바와 같은 애주번트 첨가된 면역원성 조성물은 애주번트 첨가되지 않은 백신 또는 애주번트 성분이 보다 높은 수준으로 존재하는 애주번트 첨가된 백신으로 각각 생성된 것보다 크거나 이와 동등한 인플루엔자 특이적(임의로, 교차 반응성) CD4의 백신접종 후 빈도 및 항체 생성 둘 모두에 대한 면역원성 결과를 입증한다. 이러한 효과는 소아 집단 또는 노인 집단에서 특히 가치가 있으며, 이는 애주번트 성분이 보다 높은(적합하게는, 2배 이상) 양으로 존재하는 애주번트 첨가된 백신을 투여받은 그룹에 비해 보다 적거나 소수의 반응원성 증상을 나타내면서, 현재 시판되는 백신보다 높은 효능을 가능케 한다.
수중유 에멀젼 애주번트
본 발명에 따른 애주번트는 에멀젼, 특히 수중유 에멀젼이고, 이는 임의로 다른 면역자극제를 포함할 수 있다. 특히, 에멀젼 시스템의 오일상은 대사가능한 오일을 포함한다. 용어 대사가능한 오일의 의미는 당 분야에 널리 공지되어 있다. 대사가능함은 "대사에 의해 변형될 수 있는"으로 정의될 수 있다(Dorland's Illustrated Medical Dictionary, W. B. Sanders Company, 25th edition (1974)). 오일은 임의의 식물성 오일, 어류 오일, 동물 또는 합성오일일 수 있고, 이는 수용체에 대해 비독성이고, 대사에 의해 변형될 수 있다. 땅콩, 씨 및 곡물이 식물성 오일의 통상적인 공급원이다. 합성 오일이 또한 본 발명의 일부이며, 이는 시판되는 오일, 예를 들어, NEOBEE? 및 다른 오일을 포함할 수 있다. 특히 적합한 대사가능한 오일은 스쿠알렌이다. 스쿠알렌(2,6,10,15,19,23-헥사메틸-2,6,10,14,18,22-테트라코사헥사엔)은 상어-간 오일에서 대량으로 발견되고, 올리브유, 맥아유, 쌀겨유 및 효모에서 소량 발견되는 불포화 오일이며, 이는 본 발명에 사용하기 위한 오일이다. 스쿠알렌은 콜레스테롤의 생합성에서 중간체라는 사실에 의해 대사가능한 오일이다(Merck index, 10th Edition, entry no.8619).
수중유 에멀젼은 그 자체로 당 분야에 널리 공지되어 있으며, 애주번트 조성물로 유용한 것으로 제안되었고(EP399843B호); 또한 수중유 에멀젼과 다른 활성제의 조합물이 백신을 위한 애주번트로 기재되어 있다: WO 95/17210호; WO 98/56414호; WO 99/12565호; WO 99/11241호; WO 2006/100109호; WO 2006/100110호; WO 2006/1001 11호, 이들은 임의로 면역자극제 QS21 및/또는 3D-MPL과 함께 제형화된 스쿠알렌, α-토코페롤 및 트윈 80(TWEEN 80)을 기초로 한 에멀젼 애주번트를 기재한다. WO 90/14837호; WO 00/50006호; WO 2007/080308호; WO 2007/006939호에 기재된 것과 같은 다른 수중유 에멀젼 기재 애주번트가 기재되어 있으며, 이들 모두는 오일 에멀젼 시스템(특히, 스쿠알렌을 기초로 하는 경우)을 형성하고, 이는 본 발명의 대안적 애주번트 및 조성물을 형성한다.
한 특정 구체예에서, 수중유 에멀젼은 대사가능한 비독성 오일, 예를 들어, 스쿠알란 또는 스쿠알렌, 임의로 토콜, 예를 들어, 토코페롤, 특히 알파 토코페롤(및 임의로 스쿠알렌 및 알파 토코페롤 둘 모두) 및 유화제(또는 계면활성제), 예를 들어, 비이온성 계면활성제 트윈 80™ 또는 폴리소르베이트 80을 포함한다. 한 특정 구체예에서, 오일 에멀젼은 스테롤, 예를 들어, 콜레스테롤을 추가로 포함한다.
토콜(예를 들어, 비타민 E)이 또한 오일 에멀젼 애주번트에서 종종 사용된다(EP0382271B1호; US5667784호; WO 95/17210호). 본 발명의 오일 에멀젼(임의로, 수중유 에멀젼)에 사용되는 토콜은 EP0382271B1호에 기재된 바와 같이 제형화될 수 있고, 여기서 토콜은 임의로 1 마이크론 미만 직경의 유화제를 임의로 포함하는 토콜 점적의 분산제일 수 있다. 대안적으로, 토콜은 또 다른 오일과 조합되어 오일 에멀젼의 오일상을 형성시키기 위해 사용될 수 있다. 토콜과 조합되어 사용될 수 있는 오일 에멀젼의 예는, 상기 기재된 대사가능한 오일과 같이 본원에 기재되어 있다.
수중유 에멀젼을 생성하는 방법은 당업자에게 널리 공지되어 있다. 통상적으로, 상기 방법은 오일상과 계면활성제, 예를 들어, PBS/트윈 80™ 용액을 혼합한 후, 균질화기를 이용한 균질화를 포함하며, 주사기 바늘을 통해 2회로 혼합물을 통과시키는 것을 포함하는 방법이 소량의 액체의 균질화에 적합한 것이 당업자에게 명백할 것이다. 동시에, 마이크로플루이다이저(microfluidiser)(M110S 미세유체역학 기계, 6바(bar)의 최대 압력 투입(약 850 바의 출력 압력)에서 2분의 기간 동안 최대 50회의 통과)에서의 유화 과정이 작거나 많은 부피의 에멀젼을 생성하기 위해 당업자에 의해 적합화될 수 있다. 적합화는 제조물이 요망되는 직경의 오일 점적으로 달성될때까지의 생성된 에멀젼의 측정을 포함하는 통상적인 실험에 의해 달성될 수 있다.
수중유 에멀젼에서, 오일 및 유화제는 수성 담체 내에 존재하여야 한다. 수성 담체는, 예를 들어, 인산염 완충 염수일 수 있다.
안정적인 수중유 에멀젼 내에서 발견되는 오일 점적의 크기는 광자 상관 분광법(photon correlation spectroscopy)에 의해 측정시 임의로 1 마이크론 미만이고, 실질적으로 30-600nm, 임의로 실질적으로 약 30-500nm 직경, 임의로 실질적으로 150-500nm 직경, 특히 약 150 nm 직경의 범위일 수 있다. 이와 관련하여, 오일 점적 수의 80%가 상기 범위 내에 속해야 하고, 임의로 90% 이상 및 임의로 95% 이상의 오일 점적 수가 상기 규정된 크기 범위에 속해야 한다.
본 발명의 중요 양태는 면역원성 조성물의 애주번트에 존재하는 성분이 이전에 유용한 것으로 생각되었던 것보다 적은 양, 적합하게는 면역원성 조성물의 인간 용량당 11 mg 미만의 대사가능한 오일(예를 들어, 스쿠알렌), 예를 들어, 0.5-11 mg, 0.5-10 mg 또는 0.5-9 mg, 및 5 mg 미만, 예를 들어, 0.1-5 mg의 유화제(적합하게는, 예를 들어, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레에이트)로 존재한다는 사실이다. 적합하게는, 토콜(예를 들어, 알파-토코페롤)은 존재하는 경우 12 mg 미만, 예를 들어, 0.5-12 mg으로 존재한다. 본 발명의 애주번트 조성물은 수중유 에멀젼 애주번트를 포함하고, 적합하게는 상기 에멀젼은 0.5-10mg의 양의 대사가능한 오일, 및 0.4-4 mg의 양의 유화제, 및 임의로 0.5-11 mg의 양의 토콜을 포함한다. 적합하게는, 상기 에멀젼은 오일 점적의 70% 이상, 적합하게는 80% 이상의 농도가 1 μm 미만의 직경을 갖는 오일 점적을 갖는다.
따라서, 본 발명은 인간 용량의 애주번트 첨가된 면역원성 조성물을 제공하고, 상기 애주번트는 인간 용량당 11 mg 미만의 수준의 대사가능한 오일, 적합하게는 스쿠알렌, 적합하게는 인간 용량당 0.5-11, 0.5-10, 0.5-9, 1-10, 1-11 , 2-10, 4-8 또는 4.5-5.5 mg(예를 들어, 2-3, 5-6 또는 9-10 mg)의 대사가능한 오일을 포함하는 수중유 에멀젼 애주번트를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명은 인간 용량의 애주번트 첨가된 면역원성 조성물을 제공하고, 상기 애주번트는 인간 용량당 5 mg 미만 수준의 유화제, 적합하게는 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레에이트(예를 들어, 트윈 80 또는 폴리소르베이트 80™), 적합하게는 인간 용량당 0.1-5, 0.2-5, 0.3-5, 0.4-5, 0.5-4, 1-2 또는 2-3 mg(예를 들어, 0.4-1.2, 2-3 또는 4-5 mg)의 유화제를 포함하는 수중유 에멀젼 애주번트를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명은 인간 용량의 애주번트 첨가된 면역원성 조성물을 제공하고, 상기 애주번트는 인간 용량당 12 mg 미만 수준의 토콜, 적합하게는 알파-토코페롤, 적합하게는 인간 용량당 0.5-12, 10-11, 1-11, 2-10, 4-9, 5-7 mg(예를 들어, 10-11, 5-6, 2.5-3.5, 1-2 또는 1-3 mg)의 토콜을 추가로 포함한다.
적합하게는, 본 발명에 따른 인간 용량의 애주번트 면역원성 조성물은 수중유 에멀젼 애주번트가 4.5-5.5 또는 5-6 mg의 대사가능한 오일(적합하게는, 스쿠알렌), 5-7 mg의 토콜(적합하게는, 알파-토코페롤), 및 비이온성 계면활성제(적합하게는, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레에이트, 예를 들어, 트윈 80™ 또는 폴리소르베이트 80™)일 수 있는 2-3 mg의 유화제를 포함하는 것이다. 또 다른 적합한 구체예에 따르면, 본 발명에 따른 인간 용량의 애주번트 면역원성 조성물은 수중유 에멀젼 애주번트가 2-3 mg의 대사가능한 오일(적합하게는, 스쿠알렌), 2.5-3.5 mg의 토콜(적합하게는, 알파-토코페롤) 및 1-1.5 mg의 유화제(적합하게는, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레에이트, 예를 들어, 트윈 80™ 또는 폴리소르베이트 80™)를 포함하는 것이다. 또 다른 구체예에서, 본 발명에 따른 애주번트 면역원성 조성물의 인간 용량은 수중유 에멀젼 애주번트가 0.5-1.5 mg의 대사가능한 오일(적합하게는, 스쿠알렌), 0.5-1.5 mg의 토콜(적합하게는, 알파-토코페롤) 및 0.25-0.75 mg의 유화제(적합하게는, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레에이트, 예를 들어, 트윈 80™ 또는 폴리소르베이트 80™)를 포함하는 것이다. 몇몇 경우에, 본 발명의 백신이 안정화제를 추가로 포함하는 것이 유리할 수 있다.
용어 "인간 용량"은 인간 용도에 적합한 부피로 전달되는 인플루엔자 조성물 용량(애주번트와 항원 성분의 혼합 후)을 의미한다. 일반적으로, 이는 0.25 내지 1.5 ㎖이다. 한 구체예에서, 인간 용량은 약 0.5 ㎖이다. 한 추가 구체예에서, 인간 용량은 0.5 ㎖ 보다 높고, 예를 들어, 약 0.6, 0.7, 0.8, 0.9 또는 약 1 ㎖이다. 한 추가 구체예에서, 인간 용량은 1 ㎖ 내지 1.5 ㎖이다. 또 다른 구체예에서, 특히 면역원성 조성물이 소아 집단을 위한 것인 경우, 인간 용량은 0.5 ㎖ 미만, 예를 들어, 0.25 내지 0.5 ㎖ 또는 정확히 0.1 ㎖, 0.2 ㎖, 0.25 ㎖, 0.3 ㎖ 또는 0.4 ㎖일 수 있다. 본 발명은 면역원성 조성물 내의 애주번트의 개별적 성분 각각 또는 모두는 이전에 유용한 것으로 생각되었던 것보다 적은 수준이고, 전형적으로 상기 언급된 바와 같은 것을 특징으로 한다. 특히 적합한 조성물은 인간 용량의 최종 부피에서 하기 양(적합하게는, 약 0.5 ㎖ 또는 약 0.7 ㎖)의 하기 o/w 애주번트 성분을 포함한다(표 1):
표 1A - 본 발명에 따른 특정 o/w 에멀젼 기재 애주번트
Figure 112009071406810-pct00001
표 1B - 본 발명에 따른 특정 o/w 에멀젼 기재 애주번트
Figure 112009071406810-pct00002
표 1의 숫자 값을 포함하는 모든 제공된 숫자 값(예를 들어, % 또는 mg 중)은 5%의 변동을 허용하는 것으로 이해되어야 하며, 즉 4.88 mg의 스쿠알렌은 4.64-5.12 mg을 의미하는 것으로 이해되어야 한다.
필요한 HA 양 및 필요한 애주번트 성분 양을 전달하는 애주번트 첨가된 백신을 생성하기 위해 각각의 성분(o/w 에멀젼 및 항원)의 예비-희석이 수행될 수 있다.
본 발명의 한 양태에서, 본 발명의 애주번트 첨가된 백신의 o/w 에멀젼(예비 희석되거나 예비 희석되지 않음)이 전체 용량 부피의 절반을 초과하지 않거나, 적합하게는 이보다 적은 부피로 첨가될 수 있다. 예시를 위해, 적합한 부피(예를 들어, 125 ㎕ 내지 25 ㎕)가 표 1A에 예시된 제형 A-H의 에멀젼 함량에 대해 제공된다. 따라서, 본 발명의 한 양태에서, 제 1 부피의 수중유 에멀젼과 제 2 부피의 인플루엔자 바이러스 또는 이의 항원성 제조물을 포함하는 수성 현탁액을 혼합하는 단계를 포함하는 애주번트 첨가된 인플루엔자 백신을 제조하는 방법이 제공되고, 여기서 상기 제 2 부피는 상기 제 2 부피보다 크다. 적합하게는, 제 1 부피의 o/w 에멀젼이 농축된 에멀젼의 희석 후에 수득된다.
대안적으로, 실질적으로 동등한 부피(예비 희석 후이거나 그렇지 않음)의 o/w 에멀젼 및 항원 현탁액이 혼합되어, 본 발명의 애주번트 첨가된 백신 조성물이 생성된다. 각각의 성분의 각각의 부피는 이후 통상적으로 다른 성분의 10% 부피의 최대 과량(즉, 1:1.1 내지 1.1:1의 애주번트 에멀젼:항원 현탁액 비), 적합하게는 5%의 최대 과량(즉, 1:1.05 내지 1.05:1의 o/w 에멀젼:항원 현탁액 비), 적합하게는 2.5%의 최대 과량(즉, 1:1.025 내지 1.025:1의 애주번트 에멀젼:항원 현탁액 비)으로 존재할 것이다. 따라서, 본 발명의 또 다른 양태에서, 실질적으로 동등한 부피의 수중유 에멀젼, 및 인플루엔자 바이러스 또는 이의 항원성 제조물을 포함하는 수성 현탁액을 혼합하는 단계를 포함하는, 애주번트 첨가된 인플루엔자 백신을 제조하는 방법이 제공된다. 적합하게는, 제 1 부피의 o/w 에멀젼이 농축된 에멀젼의 희석 후에 수득된다.
또 다른 구체예에서, 본 발명의 애주번트 첨가된 백신의 o/w 에멀젼 애주번트가 전체 용량 부피의 절반을 초과하는 부피로 첨가된다. 따라서, 본 발명의 또 다른 양태에서, 제 1 부피의 수중유 에멀젼과 제 2부피의 인플루엔자 바이러스 또는 이의 항원성 제조물을 포함하는 수성 현탁액을 혼합하는 단계를 포함하는, 애주번트 첨가된 인플루엔자 백신을 제조하는 방법이 제공되고, 여기서 상기 제 1 부피는 상기 제 2 부피보다 크다. 적합하게는, 제 1 부피의 o/w 에멀젼은 농축된 에멀젼의 희석 후에 수득된다.
모든 3개의 방법에서, 최종 인간 용량 부피 내의 에멀젼 성분 및 임의로 HA의 양은 이전에 유용한 것으로 생각되었던 것보다 적고, 이는 본원에 청구된 바와 같다. 적합하게는, 이들은 본원에 청구된 바와 같은 특정 양으로 존재한다.
백신 내의 각각의 개별적 성분의 양은 전체 백신 조성물의 백분율, 즉 % (v/v) 또는 % (w/v)로 표현될 수 있다. 하기 전환값(conversion figure)은 당업자에게 공지되어 있을 것이고, 적용될 수 있다: 스쿠알렌 0.855 g/㎖, 알파-토코페롤 0.949 g/㎖, 폴리소르베이트 80 1.080 g/㎖, 및 스팬 85 0.94 g/㎖.
따라서, 대사가능한 오일(적합하게는, 스쿠알렌)이 전체 백신 부피의 0.5% 내지 2%, 적합하게는 0.25-2, 또는 0.25-1.75, 또는 0.5-1.65, 또는 0.6-1.5, 또는 0.8-1.4 또는 1-1.25% (w/v)의 오일의 양으로 백신 조성물에 존재한다. 또 다른 특정 구체예에서, 대사가능한 오일(적합하게는, 스쿠알렌)은 백신 조성물의 전체 부피의 약 1.25%, 또는 약 0.6% (w/v)의 최종 양으로 존재한다. 또 다른 특정 구체예에서, 대사가능한 오일은 전체 백신 부피의 0.25% (w/v)의 최종 양으로 존재한다.
토콜의 양은 또한 전체 백신 조성물 부피의 백분율로 표현될 수 있다. 적합하게는, 토콜은 면역원성 조성물의 전체 부피의 0.25% 내지 2% (w/v)의 양으로 백신 조성물에 존재하고, 예를 들어, 0.25-2는 전체 백신 부피의 0.25-2, 또는 0.25-1.75, 또는 0.5-1.65, 또는 0.6-1.5, 또는 0.8-1.4, 또는 1-1.25 % (w/v)의 토콜을 포함한다. 본 발명의 한 구체예에서, 토콜은 백신 조성물의 전체 부피의 0.2% 내지 2% (v/v)의 양, 또는 0.5 ㎖ 백신 용량 부피 중에 1.25% (v/v)의 양으로 존재한다. 한 특정 구체예에서, 토콜은 면역원성 조성물의 전체 부피의 약 1.25%의 최종 양으로 존재한다. 또 다른 특정 구체예에서, 토콜은 전체 백신 부피의 0.25% (v/v), 또는 0.5 ㎖ 백신 용량 부피 중의 1.25% (v/v), 또는 0.7 ㎖ 백신 용량 부피 중의 0.9% (v/v), 또는 0.5㎖ 백신 용량 중의 0.5% (v/v), 또는 0.7㎖ 백신 용량 중의 0.35-0.37% 또는 0.36%의 최종 양으로 존재한다.
본 발명의 한 구체예에서, 유화제는 인간 용량당 0.1-5, 0.2-5, 0.3-5, 0.4-5, 0.4-1.2, 0.5-4, 1-2, 2-3 또는 4-5 mg의 양으로 존재한다. 하나 이상의 유화제가 존재하는 경우, 예를 들어, 트윈 80 및 스팬 85 둘 모두가 존재하는 경우, 청구된 양은 유화제의 전체 양인 것으로 이해된다. 유화제의 양은 전체 백신 조성물 부피의 백분율로 표현될 수 있다. 적합하게는, 유화제는 면역원성 조성물의 전체 부피의 0.125-0.8% (w/v)의 양, 예를 들어, 전체 백신 부피의 0.08-0.05, 또는 0.1-0.7, 또는 0.2-0.6, 또는 0.25-0.55, 또는 0.3-0.52 또는 0.4-0.5% (w/v)의 양으로 백신 조성물에 존재한다. 한 특정 구체예에서, 유화제는 전체 백신 조성물 부피의 1%, 0.5% 또는 0.2% (w/v)의 양으로 존재한다.
한 특정 구체예에서, 0.5 ㎖의 백신 용량 부피는 0.5% (w/w)의 트윈 80을 함유하고, 0.7 ㎖의 백신 용량 부피는 0.35% (w/w)의 트윈 80을 함유한다. 또 다른 특정 구체예에서, 0.5 ㎖의 백신 용량은 0.2% (w/w)의 유화제를 함유하고, 0.7 ㎖의 백신 용량은 0.14% (w/w)의 유화제를 함유한다. 스팬 85(소르비탄 트리올레에이트)는 또한 본 발명에 사용되는 유화제 중의 0.1 내지 1%, 적합하게는 약 0.5% 또는 이 미만의 수준으로 존재할 수 있다. 한 특정 구체예에서, 스팬 85는 존재하는 경우, 폴리소르베이트 80의 백분율과 동일한 백분율로 조성물에 첨가된다.
몇몇 경우에, 본 발명의 면역원성 조성물 및 백신이 안정화제, 예를 들어, 카프릴산(merck index 10th Edition, entry no. 1739), 예를 들어, 트리카프릴린을 포함하는 다른 유화제/계면활성제를 추가로 함유하는 것이 유리할 수 있다.
본 발명은 상기 본원에 정의된 개개 성분들을 상기 정의된 양으로 포함하는 애주번트 조성물을 추가로 제공하나, 예를 들어, 표 1에 예시된 대로 한정되는 것은 아니다. 통상적으로, 상기 애주번트 조성물은 인간 용량에 적합한 부피일 것이다. 애주번트가 항원성 조성물의 액체 형태와 조합된 액체 형태일 경우, 애주번트 조성물은 인간 용량의 의도된 최종 부피의 분획인 인간 용량에 적합한 부피일 것이고, 예를 들어, 인간 용량의 의도된 최종 부피의 대략 절반, 예를 들어, 0.7 ㎖의 의도된 인간 용량의 경우 360 ㎕의 부피, 또는 0.5 ㎖의 의도된 인간 용량의 경우 250 ㎕의 부피이다. 인간 백신 용량이 증가되는 경우, 상기 용량 부피의 증가에 의해 애주번트 성분의 양(mg)이 변경되지 않고 유지되어, 간단히 더욱 희석되도록 의도된다. 애주번트 조성물이 최종 인간 용량 백신을 제공하기 위해 항원 조성물과 조합되는 경우 필요에 따라 희석된다. 이러한 용량의 최종 부피는 물론 애주번트 조성물의 최초 부피 및 애주번트 조성물에 첨가되는 항원 조성물의 부피에 따라 다양할 것이다.
한 대안적 구체예에서, 동결건조된 항원 조성물을 재구성하기 위해 액체 애주번트가 사용된다. 이러한 구체예에서, 애주번트 조성물의 인간 용량 적합 부피는 인간 용량의 최종 부피와 대략 동등하다. 액체 애주번트 조성물이 동결건조된 항원 조성물을 함유하는 바이얼에 첨가된다. 최종 인간 용량은 0.5 내지 1.5 ㎖로 다양할 수 있다. 한 특정 구체예에서, 인간 용량은 약 0.5 ㎖ 또는 약 0.7 ㎖이고, 이러한 구체예에서, 본 발명의 백신 조성물은 0.5 ㎖ 인간 용량당 11 mg 미만 또는 상기 정의된 양, 예를 들어, 적합하게는 0.5-11, 1-11, 2-10, 4-8, 또는 5-6 mg(예를 들어, 2-3, 5-6, 또는 9-10 mg)의 대사가능한 오일의 수준을 포함할 것이고, 또한 이러한 구체예에서, 본 발명의 애주번트 조성물은 애주번트 조성물이 각각 액체 또는 동결건조된 항원 조성물과 조합되기 위한 것인지의 여부에 따라 250 ㎕의 애주번트 조성물당, 또는 500㎕의 애주번트 조성물당 11 mg 미만의 대사가능한 오일 또는 상기 정의된 양, 예를 들어, 적합하게는 0.5-11, 1-11, 2-10, 4-8, 또는 5-6 mg(예를 들어, 2-3, 5-6, 또는 9-10 mg)의 대사가능한 오일의 수준을 포함할 것이다. 마찬가지로, 인간 용량이 0.5 ㎖인 특정 구체예에서, 이러한 구체예에서, 본 발명의 백신 조성물은 인간 용량당 5 mg 미만의 수준의 유화제, 적합하게는 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레에이트(예를 들어, 트윈 80™ 또는 폴리소르베이트 80™), 적합하게는 0.5㎖의 인간 용량당 0.1-5, 0.2-5, 0.3-5, 0.4-5, 0.5-4, 또는 2-3 mg(예를 들어, 0.4-1.2, 2-3 또는 4-5 mg)의 유화제의 수준을 포함할 것이고, 또한, 이러한 구체예에서, 본 발명의 애주번트 조성물은 인간 용량당 5 mg 미만 수준의 유화제, 적합하게는 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레에이트(예를 들어, 트윈 80™ 또는 폴리소르베이트 80™), 적합하게는 애주번트 조성물이 각각 액체 또는 동결건조된 항원 조성물과 조합되기 위한 것인지의 여부에 따라 250 ㎕의 애주번트 조성물, 또는 500㎕의 애주번트 조성물당 0.1-5, 0.2-5, 0.3-5, 0.4-5, 0.5-4, 또는 2-3 mg(예를 들어, 0.4-1.2, 2-3 또는 4-5 mg)의 유화제의 수준을 포함할 것이다. 유사하게, 인간 용량이 0.5 ㎖인 특정 구체예에서, 상기 구체예에서, 본 발명의 백신 조성물은 인간 용량당 12 mg 미만 수준의 토콜, 적합하게는 알파-토코페롤, 적합하게는 0.5㎖의 인간 용량당 0.5-12, 1-11, 2-10, 4-9, 5-7 mg(예를 들어, 10-11, 5-6, 2.5-3.5, 또는 1-3 mg)의 토콜의 수준을 포함할 것이고, 또한 상기 구체예에서, 본 발명의 애주번트 조성물은 인간 용량당 12 mg 미만 수준의 토콜, 적합하게는 알파-토코페롤, 적합하게는 애주번트 조성물이 각각 액체와 조합되기 위한 것이나 동결건조된 항원 조성물인지의 여부에 따라 250 ㎕의 애주번트 조성물, 또는 500㎕의 애주번트 조성물당 0.5-12, 1-11, 2-10, 4-9, 5-7 mg(예를 들어, 10-11, 5-6, 2.5-3.5, 또는 1-3 mg)의 토콜의 수준을 포함할 것이다.
임의로, 오일(예를 들어, 스쿠알렌):토콜(예를 들어, α-토코페롤)의 비는 동등하거나 1 미만이고, 이러한 비가 보다 안정한 에멀젼을 제공한다.
몇몇 경우에, 본 발명의 백신이 안정화제를 추가로 함유하는 것이 이로울 수 있다.
면역원성 조성물 내에서 애주번트가 작동되는 성분의 용량은 적합하게는 인간에서 항원에 대한 면역 반응을 향상시킬 수 있다. 특히, 적합한 양의 대사가능한 오일, 토콜 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레에이트는 반응원성 프로파일로부터 허용되면서 표적 인간 집단에서 애주번트 첨가되지 않은 조성물에 비해 조성물의 면역학적 잠재성을 개선시시키는 것이거나, 다른(보다 높은) 양의 상기 성분을 포함하는 애주번트가 첨가된 조성물로 수득된 것과 유사한 면역학적 잠재성을 발생시키는 것이다.
임의의 면역자극제
본 발명에 따른 한 특정 구체예에서, 애주번트는 상기 정의된 양의 대사가능한 오일, 예를 들어, 스쿠알렌, 토콜, 예를 들어, 알파-토코페롤, 및 계면활성제, 예를 들어, 폴리소르베이트 80을 포함하는 수중유 에멀젼 애주번트이고, 이는 임의의 추가 면역자극제(들)을 함유하지 않고, 특히 비독성 지질 A 유도체(예를 들어, 3D-MPL) 또는 사포닌(예를 들어, QS21)을 함유하지 않는다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 항원 또는 항원 조성물, 및 수중유 에멀젼 및 임의로 하나 이상의 추가 면역자극제를 포함하는 애주번트 조성물을 포함하는 백신 조성물이 제공되며, 상기 수중유 에멀젼은 0.5-10 mg의 대사가능한 오일(적합하게는, 스쿠알렌), 0.5-11 mg의 토콜(적합하게는, 알파-토코페롤) 및 0.4-4 mg의 유화제를 포함한다.
한 특정 구체예에서, 수중유 에멀젼 애주번트는 임의로 하나 이상의 추가 애주번트 또는 QS21 및/또는 MPL이 아닌 면역자극제를 포함한다.
또 다른 특정 구체예에서, 수중유 에멀젼 애주번트 및 면역원성 조성물은 지질다당류, 적합하게는 지질 A의 비독성 유도체, 특히 모노포스포릴 지질 A 또는 더욱 특히 3-데아실화된 모노포스포릴 지질 A(3D-MPL)인 추가의 면역자극제를 추가로 포함한다. 3D-MPL은 글락소스미스클라인 바이오로지칼즈 엔.에이.(GlaxoSmithKline Biologicals N.A.)사에 의해 상표명 MPL로 판매되며, 이는 MPL 또는 3D-MPL로 문헌을 통해 언급된다. 예를 들어, 미국 특허 번호 제4,436,727호; 제 4,877,611호; 제 4,866,034호 및 제 4,912,094호를 참조하라. 3D-MPL은 주로 IFN-g(Th 1) 표현형을 갖는 CD4+ T 세포 반응을 촉진한다. 3D-MPL은 GB2220211 A호에 기재된 방법에 따라 생성될 수 있다. 화학적으로, 3D-MPL은 3-데아실화된 모노포스포릴 지질 A와 3, 4, 5 또는 6개의 아실화된 사슬의 혼합물이다. 본 발명의 조성물에서, 작은 미립자 3D-MPL이 사용될 수 있다. 작은 미립자 3D-MPL은 0.22μm의 필터를 통해 멸균 여과되도록 하는 입자 크기를 갖는다. 이러한 제법은 WO 94/21292호에 기재되어 있다.
상기 지질다당류, 예를 들어, 3D-MPL은 면역원성 조성물의 인간 용량당 1 내지 50㎍의 양으로 사용될 수 있다. 이러한 3D-MPL은 약 25 ㎍, 예를 들어, 20-30 ㎍, 적합하게는 21-29 ㎍ 또는 22 내지 28 ㎍ 또는 23 내지 27 ㎍ 또는 24 내지 26 ㎍, 또는 25 ㎍의 수준으로 사용될 수 있다. 또 다른 구체예에서, 면역원성 조성물의 인간 용량은 약 10 ㎍, 예를 들어, 5 내지 15 ㎍, 적합하게는 6 내지 14 ㎍, 예를 들어, 7 내지 13 ㎍ 또는 8 내지 12 ㎍ 또는 9 내지 11 ㎍, 또는 10㎍의 수준의 3D-MPL을 포함한다. 한 추가 구체예에서, 면역원성 조성물의 인간 용량은 약 5 ㎍, 예를 들어, 1 내지 9 ㎍, 또는 2 내지 8 ㎍, 또는 적합하게는 3 내지 7 ㎍ 또는 4 내지 6 ㎍, 또는 5 ㎍의 수준의 3D-MPL을 포함한다.
또 다른 구체예에서, 지질 A의 합성 유도체가 임의의 추가 면역자극제로 사용되고, 이중 일부는 TLR-4 효능제로 기재되며, 이는 하기를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다:
OM174 (2-데옥시-6-o-[2-데옥시-2-[(R)-3-도데카노일옥시테트라-데카노일아미노]-4-o-포스포노-β-D-글루코피라노실]-2-[(R)-3-히드록시테트라데카노일아미노]-α-D-글루코피라노실디히드로겐포스페이트), (WO 95/14026호)
OM 294 DP (3S, 9R)-3-[(R)-도데카노일옥시테트라데카노일아미노]-4-옥소-5-아자-9(R)-[(R)-3-히드록시테트라데카노일아미노]데칸-1,10-디올,1,10-비스(디히드로게노포스페이트)(WO99/64301호 및 WO 00/0462호)
OM 197 MP-Ac DP (3S-, 9R)-3-[(R)-도데카노일옥시테트라데카노일아미노]-4-옥소-5-아자-9-[(R)-3-히드록시테트라데카노일아미노]데칸-1,10-디올,1-디히드로게노포스페이트 10-(6-아미노헥사노에이트)(WO 01/46127호)
이용될 수 있는 다른 TLR4 리간드는 WO 9850399호 또는 US6303347호(AGP를 제조하는 방법도 기술되어 있음)에 개시된 것들, 적합하게는 RC527 또는 RC529와 같은 알킬 글루코사미니드 포스페이트(AGP), 또는 US6764840호에 개시된 AGP의 약제학적으로 허용되는 염이다. 일부 AGP는 TLR4 효능제이고, 일부는 TLR4 길항제이다. 둘 모두는 애주번트로서 유용한 것으로 고려된다.
TLR-4를 통한 신호전달 반응을 야기할 수 있는 다른 적합한 TLR-4 리간드 (Sabroe et al, JI 2003 p1630-5)는, 예를 들어, 그램-음성 박테리아의 지질다당류 및 이의 유도체 또는 단편, 특히 LPS의 비독성 유도체(예를 들어, 3D-MPL)이다. 다른 적합한 TLR 효능제로는 열 쇼크 단백질 (HSP) 10, 60, 65, 70, 75 또는 90; 계면활성제 단백질 A, 히알루로난 올리고당류, 헤파란 설페이트 단편, 피브로넥틴 단편, 피브리노겐 펩티드 및 b-데펜신-2, 무라밀 디펩티드 (MDP) 또는 호흡기세포 융합 바이러스의 F 단백질이 있다. 한 구체예에서, TLR 효능제는 HSP 60, 70 또는 90이다. 다른 적합한 TLR-4 리간드는 WO 2003/011223호 및 WO 2003/099195호에 기재된 것, 예를 들어, WO 2003/011223호의 4-5 페이지 또는 WO 2003/099195호의 3-4페이지에 기재된 화합물 Ⅰ, 화합물 Ⅱ 및 화합물 Ⅲ, 및 특히 ER803022, ER803058, ER803732, ER804053, ER804057, ER804058, ER804059, ER804442, ER804680 및 ER804764로서 WO 2003/011223호에 기재된 화합물이다. 적합하게는, 상기 TLR-4 리간드는 ER804057이다.
Toll-유사 수용체 (TLR)는 곤충과 인간 사이에 진화적으로 보존된 타입 I 막횡단(transmembrane) 수용체이다. 지금까지 10개의 TLR이 확립되었다 (TLR 1-10) (Sabroe et al, JI 2003 p1630-5). TLR 과의 일원는 유사한 세포외 및 세포내 도메인을 지닌다; 이들의 세포외 도메인은 류신-부화 반복 서열을 지니고, 이들의 세포내 도메인은 인터루킨-1 수용체 (IL-1R)의 세포내 영역과 유사한 것으로 나타났다. TLR 세포는 면역 세포 및 다른 세포 (혈관 상피 세포, 지방세포, 심장 근육세포 및 창자 상피세포 포함) 간에 다르게 발현된다. TLR의 세포내 도메인은 세포질 영역에 IL-1R 도메인을 또한 소유하는 어댑터(adaptor) 단백질 Myd88과 상호작용할 수 있어서 사이토카인의 NF-KB 활성화를 초래하고; 이러한 Myd88 경로는 사이토카인 방출이 TLR 활성화에 의해 영향을 받는 한 경로이다. TLR의 주요 발현은 항원 제시 세포(예를 들어, 수지상 세포, 매크로파지 등)와 같은 세포 유형에 있다.
TLR을 통한 자극에 의한 수지상 세포의 활성화는 수지상 세포를 성숙시키고, IL-12와 같은 염증 사이토카인을 생성한다. 지금까지 수행된 연구로부터, 일부 효능제가 여러 TLR에 공통이긴 하나 TLR이 상이한 유형의 효능제를 인식함이 밝혀졌다. TLR 효능제는 주로 박테리아 또는 바이러스로부터 유래되고, 플라겔린(flagellin) 또는 박테리아 지질다당류(LPS)와 같은 분자를 포함한다. "TLR 효능제"는 직접적인 리간드로서 또는 내인성 또는 외인성 리간드의 생성을 통해 간접적으로, TLR 신호전달 경로를 통해 신호전달 반응을 야기할 수 있는 성분을 의미한다 (Sabroe et al, JI 2003 p1630-5).
또 다른 구체예에서, TLR 분자의 다른 천연 또는 합성 효능제가 임의의 추가의 면역자극제로서 이용된다. 이들은 TLR2, TLR3, TLR7, TLR8 및 TLR9에 대한 효능제를 포함할 수 있으나, 이로 제한되지 않는다.
따라서, 한 구체예에서, 애주번트 및 면역원성 조성물은 TLR-1 효능제, TLR-2 효능제, TLR-3 효능제, TLR-4 효능제, TLR-5 효능제, TLR-6 효능제, TLR-7 효능제, TLR-8 효능제, TLR-9 효능제 또는 이들의 조합물로 구성된 그룹으로부터 선택된 추가 면역자극제를 추가로 포함한다.
본 발명의 한 구체예에서, TLR-1을 통해 신호전달 반응을 야기할 수 있는 TLR 효능제가 이용된다(Sabroe et al, JI 2003 p1630-5). 적합하게는, TLR-1을 통해 신호전달 반응을 야기할 수 있는 TLR 효능제가 하기로부터 선택된다: 트리-아실화 리포펩티드 (LP); 페놀-가용성 모둘린; 미코박테리움 투베르쿨로시 스(Mycobacterium tuberculosis) LP; S-(2,3-비스(팔미토일옥시)-(2-RS)-프로필)-N-팔미토일-(R)-Cys-(S)-Ser-(S)-Lys(4)-OH, 박테리아 지질단백질의 아세틸화 아미노 말단을 모방하는 트리히드로클로라이드 (Pam3Cys) LP 및 보렐리아 부르그도르페 리(Borrelia burgdorferi)로부터의 OspA LP.
한 대안적인 구체예에서, TLR-2를 통해 신호전달 반응을 야기할 수 있는 TLR 효능제가 이용된다(Sabroe et al, JI 2003 p1630-5). 적합하게는, TLR-2를 통해 신호전달 반응을 야기할 수 있는 TLR 효능제는 지질단백질, 펩티도글리칸, M 투베르쿨로시스(M tuberculosis), B 부르그도르페리(B burgdorferi), T 팔리둠(T pallidum)으로부터의 박테리아 리포펩티드; 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)를 포함하는 종으로부터의 펩티도글리칸; 리포테이코산, 만누론산, 네이세리아 포린(Neisseria porin), 박테리아 핌브리애(fimbriae), 예르시나(Yersina) 독성 인자, CMV 비리온, 홍역 헤마글루티닌, 및 효모로부터의 지모산(zymosan) 중 하나 이상이다.
한 대안적인 구체예에서, TLR-3을 통해 신호전달 반응을 야기할 수 있는 TLR 효능제가 이용된다(Sabroe et al, JI 2003 p1630-5). 적합하게는, TLR-3을 통해 신호전달 반응을 야기할 수 있는 TLR 효능제는 이중 가닥 RNA (dsRNA), 또는 바이러스 감염과 관련된 분자 핵산 패턴인 폴리이노시닉-폴리시티딜(polyinosinic-polycytidylic acid, Poly IC)이다.
한 대안적인 구체예에서, TLR-5를 통해 신호전달 반응을 야기할 수 있는 TLR 효능제가 이용된다(Sabroe et al, JI 2003 p1630-5). 적합하게는, TLR-5를 통해 신호전달 반응을 야기할 수 있는 TLR 효능제는 박테리아 플라겔린이다.
한 대안적인 구체예에서, TLR-6을 통해 신호전달 반응을 야기할 수 있는 TLR 효능제가 이용된다(Sabroe et al, JI 2003 p1630-5). 적합하게는, TLR-6을 통해 신호전달 반응을 야기할 수 있는 TLR 효능제는 미코박테리아 지질단백질, 디-아실화된 LP 및 페놀-가용성 모둘린이다. 추가로, TLR-6 효능제는 WO 2003043572호에 개시되어 있다.
대안적인 구체예에서, TLR-7을 통해 신호전달 반응을 야기할 수 있는 TLR 효능제가 이용된다(Sabroe et al, JI 2003 p1630-5). 적합하게는, TLR-7을 통해 신호전달 반응을 야기할 수 있는 TLR 효능제는 단일 가닥 RNA (ssRNA), 아이옥소리빈(Ioxoribine), 위치 N7 및 C8에서의 구아노신 유사체, 또는 이미다조퀴놀린 화합물 또는 이의 유도체이다. 한 구체예에서, TLR 효능제는 이미퀴모드(imiquimod)이다. 추가로, TLR-7 효능제는 WO 02085905호에 개시되어 있다.
한 대안적인 구체예에서, TLR-8을 통해 신호전달 반응을 야기할 수 있는 TLR 효능제가 이용된다(Sabroe et al, JI 2003 p1630-5). 적합하게는, TLR-8을 통해 신호전달 반응을 야기할 수 있는 TLR 효능제는 단일 가닥 RNA (ssRNA), 항-바이러스 활성을 갖는 이미다조퀴놀린 분자, 예를 들어, 레시퀴모드(resiquimod)(R848)이다; 레시퀴모드는 TLR-7에 의해서도 인식될 수 있다. 이용될 수 있는 다른 TLR-8 효능제는 WO 2004071459호에 개시되어 있다.
한 대안적 구체예에서, TLR-9를 통해 신호전달 반응을 야기할 수 있는 TLR 효능제가 사용된다(Sabroe et al, JI 2003 p1630-5). 한 구체예에서, TLR-9를 통해 신호전달 반응을 야기할 수 있는 TLR 효능제는 HSP90이다.
대안적으로, TLR-9를 통해 신호전달 반응을 야기할 수 있는 TLR 효능제는 박테리아 또는 바이러스 DNA, 비메틸화된 CpG 누클레오티드, 특히 CpG 모티프로 공지된 서열 환경을 함유하는 DNA이다. CpG-함유 올리고누클레오티드는 주로 Th1 반응을 유도한다. 이러한 올리고누클레오티드는 널리 공지되어 있고, 예를 들어, WO 96/02555호, WO 99/33488호 및 미국 특허 제 6,008,200호 및 제 5,856,462호에 기재되어 있다. 적합하게는, CpG 누클레오티드가 CpG 올리고누클레오티드이다. 본 발명의 면역원성 조성물에 사용하기에 적합한 올리고누클레오티드는, 3개 이상, 적합하게는 6개 이상의 누클레오티드에 의해 분리된 2개 이상의 디누클레오티드 CpG 모티프를 임의로 함유하는 CpG 함유 올리고누클레오티드이다. CpG 모티프는 시토신 누클레오티드 후에 구아닌 누클레오티드가 존재한다. 본 발명의 CpG 올리고누클레오티드는 통상적으로 데옥시누클레오티드이다. 한 특정 구체예에서, 올리고누클레오티드 내의 누클레오티드간(internucleotide)이 포스포로디티오에이트, 또는 적합하게는 포스포로티오에이트 결합이나, 포스포디에스테르 및 기타 누클레오티드간 결합이 본 발명의 범위에 해당한다. 혼합된 누클레오티드간 결합을 갖는 올리고누클레오티드도 본 발명의 범위내에 포함된다. 포스포로티오에이트 올리고누클레오티드 또는 포스포로디티오에이트를 생성하는 방법이 US 5,666,153호, US 5,278,302호 및 WO 95/26204호에 개시되어 있다. 바람직한 올리고누클레오티드의 예는 하기 서열을 지닌다. 서열은 포스포로티오에이트 변형된 누클레오티드간 결합을 함유할 수 있다:
OLIGO 1 (서열 목록 번호:1): TCC ATG ACG TTC CTG ACG TT (CpG 1826)
OLIGO 2 (서열 목록 번호:2): TCT CCC AGC GTG CGC CAT (CpG 1758)
OLIGO 3 (서열 목록 번호:3): ACC GAT GAC GTC GCC GGT GAC GGC ACC ACG
OLIGO 4 (서열 목록 번호:4): TCG TCG TTT TGT CGT TTT GTC GTT (CpG 2006 또는 7909)
OLIGO 5 (서열 목록 번호:5): TCC ATG ACG TTC CTG ATG CT (CpG 1668)
OLIGO 6 (서열 목록 번호:6): TCG ACG TTT TCG GCG CGC GCC G (CpG 5456)
적합하게는, 포스포로티오에이트 백본 CpG7909 (서열 목록 번호:4)가 사용된다. 대안적인 CpG 올리고누클레오티드는 상기 특정된 서열을 포함할 수 있고, 여기에 중요하지 않은 결실 또는 첨가를 갖는다. 본 발명에서 이용되는 CpG 올리고누클레오티드는 당 분야에 공지된 임의의 방법에 의해 합성될 수 있다 (예를 들어, EP468520호 참조). 편리하게는, 이러한 올리고누클레오티드가 자동 합성기를 이용하여 합성될 수 있다.
또 다른 구체예에서, 애주번트 및 면역원성 조성물은 추가로 사포닌 애주번트를 포함한다. 본 발명에 사용하기에 특히 적합한 사포닌은 Quil A 및 이의 유도체이다. Quil A는 남아메리카 나무 퀼라자 사포나리아 몰리나(Quillaja Saponaria Molina)로부터 분리된 사포닌 제조물이고, 이는 애주번트 활성을 갖는 것이 1974년에 달스가르드 등(Dalsgaard et al.)에 의해 처음 기재되었다("Saponin adjuvants", Archiv. fur die gesamte Virusforschung, Vol. 44, Springer Verlag, Berlin, p243- 254). Quil A(EP 0 362 278호), 예를 들어, QS7 및 QS21(QA7 및 QA21로도 공지되어 있음)와 관련된 독성이 없는 애주번트 활성을 보유하는 Quil A의 정제된 단편이 HPLC에 의해 분리되었다. QS-21은 퀼라자 사포나리아 몰리나의 나무껍질로부터 유래된 천연 사포닌이고, 이는 CD8+ 세포독성 T 세포(CTL), Th1 세포 및 현저한 IgG2a 항체 반응을 유도하고, 이는 본 발명의 상황에서 바람직한 사포닌이다. 본 발명의 적합한 형태에서, 면역원성 조성물 내의 사포닌 애주번트는 사포나리아 몰리나 quil A의 유도체, 예를 들어, Quil A의 면역학적 활성 분획, 예를 들어, QS-17 또는 QS-21, 적합하게는 QS-21이다. 한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 실질적으로 순수한 형태의 면역학적으로 활성인 사포닌 분획을 함유한다. 한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 실질적으로 순수한 형태의 QS21을 함유하고, 다시 말하면, QS21은 90% 이상 순수하고, 예를 들어, 95% 이상 순수하거나, 98% 이상 순수하다.
다른 유용한 사포닌은 식물 아에스쿨루스 히포카스타눔(Aesculus hippocastanum) 또는 지오필라 스트루튬(Gyophilla struthium)으로부터 유래된다. 상기 문헌에 기재된 기타 사포닌은 마로니에(horse chestnut) 나무(Lat: 아에스쿨루스 히포카스타눔)의 종자에서 발생하는 사포닌의 혼합물로서 머크(Merck) 색인(12th ed: entry 3737)에 기재된 에스신(Escin)을 포함한다. 이의 분리는 크로마토그래피 및 정제(Fiedler, Arzneimittel - Forsch. 4, 213 (1953)), 및 이온-교환 수지(Erbring et al ., US 3,238,190호)에 의해 기재되어 있다. 에스신의 분획은 정제되었고, 생물학적으로 활성인 것으로 밝혀졌다(Yoshikawa M, et al. (Chem Pharm Bull (Tokyo) 1996 Aug;44(8): 1454-1464)). 집소필라 스트루튬(Gypsophilla struthium)으로부터의 사포알빈(Sapoalbin)(R. Vochten et al., 1968, J. Pharm. Belg., 42, 213-226)이 또한 옵션이다.
상기 면역학적으로 활성인 사포닌, 예를 들어, QS21은 면역원성 조성물의 인간 용량당 1 내지 50 ㎍의 양으로 사용될 수 있다. 유리하게는, QS21은 약 25 ㎍, 예를 들어, 20-30 ㎍, 적합하게는 21-29 ㎍ 또는 22-28 ㎍ 또는 23-27 ㎍ 또는 24-26 ㎍, 또는 25 ㎍의 수준으로 사용된다. 또 다른 구체예에서, 면역원성 조성물의 인간 용량은 약 10 ㎍, 예를 들어, 5 내지 15 ㎍, 적합하게는 6-14 ㎍, 예를 들어, 7-13 ㎍ 또는 8-12 ㎍ 또는 9-11 ㎍, 또는 10 ㎍의 수준의 QS21을 포함한다. 한 추가 구체예에서, 면역원성 조성물의 인간 용량은 약 5 ㎍, 예를 들어, 1-9 ㎍, 또는 2-8 ㎍ 또는 적합하게는 3-7 ㎍ 또는 4-6 ㎍, 또는 5 ㎍의 수준의 QS21을 포함한다.
3D-MPL 및/또는 QS21의 용량은 적합하게는 인간에서 항원에 대한 면역 반응을 향상시킬 수 있다. 특히, 적합한 3D-MPL 및/또는 QS21의 양은 반응원성 프로파일로부터 허용되면서, 애주번트 첨가되지 않은 조성물에 비하거나, 또 다른 3D-MPL 또는 QS21의 양으로 애주번트 첨가된 조성물에 비해 조성물의 면역학적 잠재성을 개선시키는 양이다. 통상적으로, 인간 투여를 위해, 사포닌(예를 들어, QS21) 및/또는 LPS 유도체(예를 들어, 3D-MPL)는 용량당 1㎍-200㎍, 예를 들어, 10-50㎍, 또는 1 ㎍-25㎍의 범위의 면역원성 조성물의 인간 용량으로 존재할 것이다.
한 특정 구체예에서, 본 발명에 따른 애주번트 및 면역원성 조성물은 스테롤(예를 들어, 콜레스테롤)과 함께, 상기 기재된 오일 에멀젼 중의 사포닌(예를 들어, QS21) 및/또는 LPS 유도체(예를 들어, 3D-MPL)를 포함한다. 이러한 스테롤은 당 분야에 널리 공지되어 있고, 예를 들어, 콜레스테롤은 동물 지방에서 발견되는 천연 발생 스테롤로서 머크 색인 11판 341페이지에 기재되어 있다. 추가로, 오일 에멀젼(특히, 수중유 에멀젼)은 스팬85(Span85) 및/또는 레시틴 및/또는 트리카프릴린을 함유할 수 있다. 수중율 에멀젼, 스테롤 및 사포닌을 포함하는 애주번트는 WO 99/12565호에 기재되어 있다. 추가의 면역자극제의 예는 본원 및 문헌["Vaccine Design - The Subunit and Adjuvant Approach" 1995, Pharmaceutical Biotechnology, Volume 6, Eds. Powell, M.F., and Newman, M.J., Plenum Press, New York and London, ISBN 0-306-44867-X]에 기재되어 있다.
스쿠알렌 및 사포닌(임의로, QS21)이 포함되는 경우, 에멀젼 중의 전체 오일 수준의 감소를 가능케 함에 따라 제형에 스테롤(임의로, 콜레스테롤)을 포함하는 것이 또한 이롭다. 이는 제작 비용 감소, 백신접종의 전체적인 편안함의 개선, 및 결과로서 발생한 면역 반응의 정성적 및 정량적 개선, 예를 들어, 개선된 IFN-γ 생성을 발생시킨다. 따라서, 본 발명의 애주번트 시스템은 통상적으로 200:1 내지 300:1의 범위의 대사가능한 오일:사포닌의 비(w/w)를 포함하고, 또한 본 발명은 1:1 내지 200:1, 임의로 20:1 내지 100:1, 또는 실질적으로 48:1의 임의의 범위를 형성하는 "저급 오일(low oil)"에서 사용될 수 있고, 이러한 백신은 크게 감소된 반응원성 프로파일과 함께 성분 모두의 이로운 애주번트 특성을 보유한다. 따라서, 몇몇 구체예는 1:1 내지 250:1, 또는 20:1 내지 200:1, 또는 20:1 내지 100:1, 또는 실질적으로 48:1의 범위의 스쿠알렌:QS21의 비(w/w)를 갖는다. 임의로, 포함되는 스테롤(예를 들어, 콜레스테롤)은 또한 본원에 기재된 사포닌:스테롤의 비로 존재한다.
추가의 면역자극제가 임의로 포함되는 애주번트는 유아 및/또는 노인 백신 제형에 특히 적합하다.
따라서, 본 발명에 따른 수중유 에멀젼 애주번트는 임의로 5-60, 10-50, 또는 20-30 ㎍(예를 들어, 5-15, 40-50, 10, 20, 30, 40 또는 50 ㎍)의 지질 A 유도체(예를 들어, 3D-MPL)을 추가로 포함할 수 있다. 수중유 애주번트는 임의로 0.025-2.5, 0.05-1.5, 0.075-0.75, 0.1-0.3, 또는 0.125-0.25 mg(예를 들어, 0.2-0.3, 0.1-0.15, 0.25 또는 0.125 mg)의 스테롤(예를 들어, 콜레스테롤), 1-60, 10-50, 또는 20-30 ㎍(예를 들어, 1-10, 5-15, 40-50, 10, 20, 30, 40 또는 50 ㎍)의 지질 A 유도체(예를 들어, 3D-MPL 또는 지질 A의 임의의 합성 유도체), 및 1-60, 10-50, 또는 20-30 ㎍(예를 들어, 1-10, 5-15, 40-50, 10, 20, 30, 40 또는 50 ㎍)의 사포닌(예를 들어, QS21)을 함유할 수 있다.
인플루엔자 바이러스 균주 및 인플루엔자 항원, 백신접종 요법, 투여( dosing ) 및 효능 기준
상기 인플루엔자 바이러스 또는 이의 항원성 제조물은 란 유래되거나 세포 배양 유래될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 따른 인플루엔자 바이러스 항원 또는 이의 항원성 제조물은 인플루엔자 바이러스를 란에서 성장시키고 수거된 요막액을 정제시킴으로써 통상적인 부화란 방법으로부터 유래될 수 있다. 란은 신속히 다수의 수로 축적될 수 있다. 대안적으로, 이들은 바이러스를 성장시키거나 재조합 인플루엔자 바이러스 표면 항원을 발현시키기 위해 세포 또는 세포 배양액을 이용하는 임의의 새로운 생성 방법으로부터 유래될 수 있다. 바이러스를 성장시키기 위해 적합한 세포 기질은, 예를 들어, 개 신장 세포, 예를 들어, MDCK 또는 MDCK의 클론으로부터의 세포, MDCK-유사 세포, 원숭이 신장 세포, 예를 들어, Vero 세포를 포함하는 AGMK 세포, 적합한 돼지 세포주, 또는 백신 목적을 위한 인플루엔자 바이러스의 생성에 적합한 임의의 기타 포유동물 세포 유형을 포함한다. 적합한 세포 기질은 또한 인간 세포, 예를 들어, MRC-5 세포 또는 Per.C6 세포주를 포함한다. 적합한 세포 기질은 세포주에 제한되지 않고; 예를 들어, 일차 세포, 예를 들어, 닭 배아 섬유모세포 및 조류 세포주, 예를 들어, 닭 또는 오리 세포주(예를 들어, EBx 세포주, 예를 들어, 닭 또는 오리 배아 줄기 세포로부터 각각 유래된 EB14 또는 EB24)가 또한 포함된다. 적합한 곤충 세포는 Sf9 또는 Hi5이다.
한 구체예에서, 본 발명에 따라 사용하기 위한 인플루엔자 바이러스 또는 이의 항원성 제조물은 스플리트 인플루엔자 바이러스 또는 이의 스플리트 바이러스 항원성 제조물일 수 있다. 한 대안적 구체예에서, 인플루엔자 제조물은 또 다른 유형의 불활성화된 인플루엔자 항원, 예를 들어, 불활성화된 전체 바이러스 또는 정제된 HA 및 NA(서브유닛 백신), 또는 인플루엔자 바이로솜(virosome)을 함유할 수 있다. 한 추가 구체예에서, 인플루엔자 바이러스 생 약독화된 인플루엔자 제조물일 수 있다.
본 발명에 따른 스플리트 인플루엔자 바이러스 또는 이의 스플리트 바이러스 항원성 제조물은 적합하게는 바이러스 입자가 지질 외피를 용해시키는 세제 또는 다른 시약으로 붕괴된 불활성화된 바이러스 제조물이다. 스플리트 바이러스 또는 이의 스플리트 바이러스 항원성 제조물은 적합하게는 감염성이거나 불활성화된 전체 인플루엔자 바이러스를 용해화 농도의 유기 용매 또는 세제로 단편화시키고, 이어서 상기 용해제 전부 또는 대부분 및 바이러스 지질 물질의 일부 또는 대부분을 제거함으로써 제조된다. 이의 스플리트 바이러스 항원성 제조물은 스플리트 바이러스와 비교하여 어느 정도 정제가 진행된 것이나 스플리트 바이러스 성분의 항원성 특성을 대부분 보유할 수 있는 스플리트 바이러스 제조물을 의미한다. 예를 들어, 란에서 생성되는 경우, 스플리트 바이러스는 란-오염 단백질로부터 고갈되거나, 세포 배양물에서 생성되는 경우, 스플리트 바이러스는 숙주 세포 오염물질로부터 소모될 수 있다. 스플리트 바이러스 항원성 제조물은 하나 이상의 바이러스 균주의 스플리트 바이러스 항원성 성분을 포함할 수 있다. 스플리트 바이러스를 함유하는 백신(소위 '인플루엔자 스플리트 백신') 또는 스플리트 바이러스 항원성 제조물은 일반적으로 잔류하는 기질 단백질 및 핵단백질, 및 때때로 지질, 뿐만 아니라 막외피 단백질을 함유한다. 이러한 스플리트 바이러스 백신은 반드시 전체 바이러스에서 발생하는 것과 동일한 비율은 아니지만 일반적으로 바이러스 구조 단백질을 대부분 또는 전부 함유할 것이다. 시판되는 스플리트 백신의 예는, 예를 들어, 플루아릭스(FLUARIX™), 피우실드(FIUSHIELD™), 또는 플루존(FLUZONE™)이다.
대안적으로, 인플루엔자 바이러스는 전체 바이러스 백신의 형태로 존재할 수 있다. 이는 스플리트 바이러스 백신이 새로운 인플루엔자 바이러스 균주에 대해 성공적으로 제조될 수 있는 지에 대한 불확실성을 피함으로써 범유행성 상황에 대해 스플리트 바이러스 백신에 비해 유리한 것으로 입증할 수 있다. 몇몇 균주에 대해, 스플리트 바이러스를 생성하는 데 사용되는 통상적인 세제는 바이러스를 손상시켜, 사용할 수 없게 할 수 있다. 스플리트 백신을 제조하기 위해 다른 세제를 사용하고/하거나 다른 방법을 개발할 가능성이 항상 존재하지만, 이는 시간을 필요로 하여 범유행성 상태에서 이용하지 못할 수 있다. 전체 바이러스 접근법을 이용한 보다 큰 확실성 이외에, 또한 적합한 스플리트 백신을 제조하기 위해 필요한 추가의 정제 단계 동안에 상당량의 항원이 손실되기 때문에, 스플리트 바이러스 보다 큰 백신 생성 용량이 있어야 한다.
또 다른 구체예에서, 인플루엔자 바이러스 제조물은 정제된 서브유닛 인플루엔자 백신의 형태로 존재한다. 서브유닛 인플루엔자 백신은 일반적으로 두 개의 주요 외피 단백질인 HA 및 NA를 함유하며, 특히 어린 백신접종자에게서 일반적으로 반응원성이 덜하기 때문에 전체 비리온 백신에 비해 추가의 이점을 가질 수 있다. 서브유닛 백신은 붕괴된 바이러스 입자로부터 정제되거나 재조합에 의해 생성될 수 있다. 시판되는 서브유닛 백신의 예는, 예를 들어, 아그리팔(AGRIPPAL™) 또는 플루비린(FLUVIRIN™)이다. 한 특정 구체예에서, 서브유닛 백신은 하나 이상의 주요 외피 성분, 예를 들어, 헤마글루티닌(HA), 뉴라미다아제(NA), 또는 M2, 적합하게는 HA로부터 제조된다. 적합하게는, 이들은 2개 이상의 항원의 조합물, 예를 들어, 2개 이상의 인플루엔자 구조 단백질 HA, NA, Matrix 1(M1) 및 M2의 조합물, 적합하게는 임의로 M1을 포함하는 HA 및 NA 둘 모두의 조합물을 포함한다. 적합하게는, 인플루엔자 성분은 재조합 DNA 기술에 의해 생성되고, 즉, 이는 간 재조합 벡터(우두) 또는 재조합 서브유닛 단백질(배큘로바이러스/곤충 세포, 포유동물 세포, 조류 세포, 효모, 식물 또는 박테리아)를 포함하는 재조합 DNA 조작으로부터 발생된 핵산으로부터 발생되거나 이로부터 발현된다. 적합한 곤충 세포는 스포돕테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda)(Sf9) 곤충 세포 또는 트리코플루시아 니(Trichoplusia ni)(Invitrogen)로부터 발생된 하이 파이브(High Five)(Hi5) 곤충 세포이고, 적합하게는 배큘로바이러스는 오토그라파 칼리포르니카(Autographa californica) 핵 폴리헤드론형성 바이러스(AcNPV)(Baculogold, Becton Dickinson, PharMingen) 또는 소위 배크미드(Bacmid) 시스템이다.
한 구체예에서, 인플루엔자 바이러스 제조물은 바이로솜의 형태로 존재한다. 바이로솜은 바이로솜의 인지질 이중층 막에 개재된(intercalate), 확실한 형태의 기능성 바이러스 외피 당단백질 HA 및 NA를 보유하는 구상의 단층 소포이다. 시판되는 바이로솜 백신의 예는, 예를 들어, 인플렉살 V(INFLEXAL V™) 또는 인바백(INVAVAC™)이다.
또 다른 구체예에서, 서브유닛 인플루엔자 성분은 바이러스-유사-입자(VLP) 또는 캡소머, 적합하게는 식물 제조 또는 곤충세포 제조 VLP의 형태로 발현된다. VLP는 이들의 천연 형태의 항원이다. VLP 서브유닛 기술은 인플루엔자 단백질에 전적으로 기초하거나, 뮤린 백혈병 바이러스(MLV)와 같은 다른 바이러스에 좌우될 수 있고, 따라서 이는 MLV gag 단백질과 같은 비-인플루엔자 항원을 포함할 수 있다. 적합한 VLP는 임의로 다른 인플루엔자 또는 비-인플루엔자 단백질, 예를 들어, M1 및 HA, HA 및 NA, HA, NA 및 M1 또는 HA, NA 및 MLV gag과 함께 1개 이상, 적합하게는 2개 이상의 인플루엔자 단백질을 포함한다. 이는 식물 세포 또는 곤충 세포에서 생성될 수 있다. VLP는 또한 1개 이상의 인플루엔자 균주로부터의 항원, 예를 들어, 2개의 계절성 균주(예를 들어, H1N1 및 H3N2), 또는 1개의 계절성 및 1개의 범유행성 균주(예를 들어, H3N2 및 H5N1)으로부터 제조된 VLP를 지닐 수 있다.
따라서, 한 구체예에서, 본 발명의 면역원성 조성물은 란 또는 세포 배양액에서 성장한 인플루엔자 바이러스로부터의 인플루엔자 바이러스 항원 또는 이의 항원성 제조물을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 상기 인플루엔자 바이러스 항원 또는 이의 항원성 제조물은 전체 바이러스, 스플리트 바이러스, 바이로솜, 또는 HA, NA, M1 및 M2로부터 선택된 1개 이상의 정제된 항원을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 상기 정제된 항원(들)은 포유동물, 조류 또는 곤충 세포에서 성장한 인플루엔자 바이러스로부터 제조된다. 특히, 상기 정제된 항원(들)은 재조합적으로 생성된다. 이들은 바이러스-유사-입자의 형태일 수 있다.
인플루엔자 바이러스 항원 또는 이의 항원성 제조물은, 예를 들어, 본원에 참조로서 포함되는 특허 제 DD 300 833호 및 제 DD 211 444호에 기술된 스플리트 인플루엔자 방법과 같은 임의의 다수의 상업적으로 이용가능한 방법에 의해 생성될 수 있다. 전통적으로 스플리트 인플루엔자는 용매/세제 처리, 예를 들어, 트리-n-부틸 포스페이트, 또는 트윈(Tween)™과 조합된 디에틸에테르("트윈-에테르" 스플리팅으로서 공지되어 있음)를 사용하여 생성되었으며, 이 방법은 일부 생산 설비에서 여전히 사용되고 있다. 현재 사용되는 다른 스플리팅제로는 세제 또는 단백질분해 효소 또는 담즙 염, 예를 들어, 본원에 참조로서 포함되는 특허 번호 DD 155 875에 기술된 바와 같은 소듐 데옥시콜레이트가 포함된다. 스플리팅제로서 사용될 수 있는 세제는 양이온성 세제, 예를 들어, 세틸 트리메틸 암모늄 브로마이드(CTAB), 그 밖의 이온성 세제, 예를 들어, 라우릴설페이트, 타우로데옥시콜레이트, 또는 비이온성 세제, 예를 들어, 트리톤(Triton) X-100(예를 들어, Lina et al, 2000, Biologicals 28, 95-103) 및 트리톤 N-101, 또는 임의의 두개 이상의 세제의 조합을 포함하는 상기 기술된 것들이 포함된다.
스플리트 백신을 제조하는 방법은 다수의 상이한 여과 및/또는 다른 분리 단계, 예를 들어, 다양한 조합의 초원심분리, 초여과, 띠 원심분리 및 크로마토그래피(예를 들어, 이온 교환) 단계, 및 임의로 스플리팅 전 또는 후에 수행될 수 있는, 예를 들어, 열, 포름알데히드 또는 β-프로피오락톤 또는 U.V.에 의한 불활성화 단계를 포함할 수 있다. 스플리팅 방법은 배치(batch)식, 연속식 또는 반연속식 공정으로서 수행될 수 있다. 스플리트 면역원성 조성물을 위한 바람직한 스플리팅 및 정제 방법이 WO 02/097072호에 기술되어 있다.
본 발명에 따른 바람직한 스플리트 인플루엔자 백신 항원 제조물은 제조 공정으로부터 잔류하는 잔류량의 트윈 80 및/또는 트리톤 X-100를 포함하나, 이들은 스플리트 항원의 제조 후에 첨가되거나 농도가 조절될 수 있다. 한 구체예에서, 트윈 80 및 트리톤 X-100 둘 모두가 존재한다. 항원성 제조물로부터 발생하는, 백신 용량 중의 상기 비이온성 계면활성제의 최종 농도의 바람직한 범위는 하기와 같다:
트윈 80: 0.01 내지 1 %, 또는 약 0.1 % (v/v)
트리톤 X-100: 0.001 내지 0.1 (% w/v), 또는 0.005 내지 0.02% (w/v).
한 특정 구체예에서, 항원성 제조물로부터 발생하는 트윈 80에 대한 최종 농도는 0.025% 내지 0.09% w/v이다. 또 다른 특정 구체예에서, 항원은 2배 농축된 혼합물로 제공되는데, 이 혼합물은 트윈 80 농도가 0.025%-0.2%(w/v) 범위이고, 애주번트 첨가되는(또는 대조군 제형에서 완충액) 최종 제형시 두배 희석되어야 한다.
또 다른 특정 구체예에서, 트리톤 X-100에 대한 최종 농도는 0.004%-0.017% w/v이다. 또 다른 특정 구체예에서, 항원은 2배 농축된 혼합물로 제공되는데, 이 혼합물은 트리톤 X-100 농도가 0.005%-0.034%(w/v) 범위이고, 애주번트 첨가된(또는 대조군 제형에서 완충액) 최종 제형시 두배 희석되어야 한다.
한 구체예에서, 인플루엔자 제조물은 낮은 수준의 티오메르살(thiomersal)의 존재 하에서, 또는 티오메르살의 부재 하에서 제조된다. 또 다른 구체예에서, 생성되는 인플루엔자 제조물은 유기수은 보존제의 부재 하에서 안정하며, 특히 잔류하는 티오메르살을 전혀 함유하지 않는다. 특히, 인플루엔자 바이러스 제조물은 티오메르살의 부재 하에서, 또는 저수준의 티오메르살(일반적으로 5㎍/㎖ 이하)에서 안정화된 헤마글루티닌 항원을 포함한다. 특이적으로, B 인플루엔자 균주의 안정화는 알파 토코페롤의 유도체, 예를 들어, 알파 토코페롤 숙시네이트(또한, 비타민 E 숙시네이트, 즉, VES로서 공지되어 있음)에 의해 수행된다. 이러한 제조물 및 이의 제조 방법이 WO 02/097072호에 개시되어 있다.
바람직한 조성물은 WHO 권고된 적절한 인플루엔자 계절의 균주로부터 제조된 3개의 불활성화 스플리트 비리온 항원을 함유한다.
한 구체예에서, 본 발명에 따른 인플루엔자 바이러스 또는 이의 항원성 제조물 및 애주번트가 동일 용기에 함유된다. 이를 '원 바이얼법(one vial approach)'이라 한다. 또 다른 구체예에서, 바이얼은 미리충전된(pre-filled) 주사기이다. 한 대안적 구체예에서, 본 발명에 따른 인플루엔자 바이러스 또는 이의 항원성 제조물 및 애주번트는 개별 용기 또는 바이얼에 함유되어 피검체에 투여되기 직전 또는 투여시에 혼합된다. 이를 "투 바이얼법(two vial approach)"이라 한다. 적합하게는, 2개 성분의 백신은 타입 Ⅰ 유리 바이얼(항원 용기)에 제공된 0.5 ㎖의 농축된 불활성화 스플리트 비리온 항원 및 0.5 ㎖의 애주번트를 함유하는 미리 충전된 타입 Ⅰ 유리 주사기(애주번트 용기)로 구성된다. 대안적으로, 백신은 이후의 실온에서 24시간 이내에 첫번째 환자로의 투여 전에 혼합 및 이후의 투여를 위한 짧은 기간(예를 들어, 1주 이내) 동안의 4℃에서의 이후의 보관을 위한 2개의 바이얼(10회 투여 각각에서, 하나는 항원을 위한 것이고, 하나는 애주번트를 위한 것임)로 제공된 2개 성분의 백신이다. 주사 시, 다중-용량 바이얼 또는 애주번트를 함유하는 주사기의 내용물이 농축된 스플리트 비리온 항원을 함유하는 바이얼에 주사된다. 혼합 후, 내용물이 주사기로 회수되고, 바늘이 근내 바늘로 대체된다. 재구성된 애주번트 첨가된 인플루엔자 후보 백신의 1회 용량은 0.5 ㎖에 해당한다.
한 구체예에서, 면역원성 조성물의 각각의 인간 용량은 SRID에 의해 결정시 용량당 인플루엔자 균주당 15 ㎍의 HA를 함유한다. 이는 특히 노인 집단에 유용하다.
본 발명의 중요한 양태는 면역원성 조성물의 인간 용량당 인플루엔자 항원(들)이 이전에 유용한 것으로 생각된 것보다 적은 양, 적합하게는 바이러스의 균주당 15㎍ HA 미만, 예를 들어, 균주당 1 내지 10㎍ HA의 수준으로 사용될 수 있다는 사실이다.
따라서, 한 구체예에서, 면역원성 조성물의 각각의 인간 용량은 단일원면역확산법(SRD)에 의해 측정시 용량당 15 ㎍ 미만의 HA, 적합하게는 10 ㎍ 미만의 양으로 정의되는 적은 용량의 헤마글루티닌(HA)을 함유한다(J. M. Wood et al.: J. Biol. Stand. 5 (1977) 237-247; J. M. Wood et al., J. Biol. Stand. 9 (1981) 317-330). 한 특정 구체예에서, 면역원성 조성물의 인간 용량은 약 10 ㎍, 예를 들어, 5 내지 15 ㎍, 적합하게는 6 내지 14 ㎍, 예를 들어, 7 내지 13 ㎍ 또는 8 내지 12 ㎍ 또는 9 내지 11 ㎍, 또는 10 ㎍의 수준으로 균주당 헤마글루티닌(HA)의 용량을 포함한다. 한 추가 구체예에서, 면역원성 조성물의 인간 용량은 약 5 ㎍, 예를 들어, 1 내지 9 ㎍, 또는 2 내지 8 ㎍ 또는 적합하게는 3 내지 7 ㎍ 또는 4 내지 6 ㎍, 또는 5 ㎍의 수준으로 균주당 헤마글루티닌(HA)의 용량을 포함한다. 적합한 양은 1.9 ㎍, 2.5 ㎍, 3.8 ㎍, 5.0 ㎍, 7.5 ㎍ 또는 10 ㎍ HA, 또는 백신 조성물이 본원에 정의된 효능 기준을 충족하도록 결정되는 15 ㎍ 미만의 HA의 임의의 적합한 양이다. 유리하게는, 표 2에 정의된 조절 기준을 충족시키는 1 ㎍의 HA 또는 심지어 0.5 ㎍ 미만의 HA의 HA 용량이 사용될 수 있다. 적합한 양의 HA는, 예를 들어, 면역원성 조성물의 인간 용량당 인플루엔자 균주당 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ㎍(w/v) 중 어느 하나이다. 상기 적은 양의 HA는 하기 상술(표 2 및 나열된 특정 파라미터 참조)되는 바와 같이 국제적 기준, 예를 들어, 효능에 대한 EU 또는 FDA 기준을 충족시키는 백신을 제형화시키도록, 실제로 실행가능할 만큼 낮을 수 있다.
적합하게는, 0.5 ㎖의 백신 용량이 사용된다. 1 ㎖(0.5 ㎖의 애주번트 + 0.5 ㎖의 항원 제조물)의 백신 용량이 또한 적합하다. 유리하게는, 본 발명에 따른 백신 용량, 특히 적은 HA 양의 백신이 일반적으로 용량당 약 0.5, 0.7 또는 1 ㎖인 통상적인 주사되는 스플리트 인플루엔자 백신보다 적은 부피로 제공될 수 있다. 본 발명에 따른 적은 부피 용량은 적합하게는 용량당 500 ㎕ 미만, 통상적으로 300 ㎕ 미만, 및 적합하게는 약 200 ㎕ 이하이다. 용량 부피의 약간의 적합화는 통상적으로 본래의 벌크 샘플 중의 HA 농도, 또는 비내 또는 피내 경로에 의해 제공되는 용량 보다 작은 용량을 이용하는 전달 경로, 또는 표적 집단(예를 들어, 유아는 성인 인간 용량의 절반이 투여될 수 있음)에 따라 이루어질 것이다.
적합하게는, 면역원성 또는 백신 조성물에 포함되는 인플루엔자 바이러스 균주 또는 균주들은 범유행기 사이(계절성) 균주(들), 또는 범유행병 발생과 관련되거나 범유행병 발생과 관련될 잠재성을 갖는 균주(들), 또는 적합하게는 상기 균주의 혼합물인 다가 조성물이다.
범유행기 사이 균주는, 예를 들어, H1N1, H1N2, H3N2 또는 B와 같으나 이에 제한되지는 않는, 범유행기 사이 기간 동안에 세계적으로 순환하는 균주이다. 시판되는 인플루엔자 백신은 1개의 인플루엔자 B 균주 및 2개의 인플루엔자 A 균주(H1N1, H3N2)를 포함하는 3가 조합물이다.
인플루엔자 바이러스 균주에 범유행병 또는 범유행성 인플루엔자 균주와 관련된 인플루엔자 질병의 발생을 야기시킬 잠재성을 제공하는 인플루엔자 바이러스 균주의 특징은, 이것이 현재 순환되는 균주에서의 헤마글루티닌과 비교하여 신규한 헤마글루티닌을 함유하므로 거의 모든 인간이 면역학적으로 나이브이고; 인간 집단에서 수평적으로 전염될 수 있으며; 이것이 인간에 대해 병원성이라는 것이다. 신규한 헤마글루티닌은 연장된 기간 동안, 아마도 수십년 동안, H2와 같이 인간 집단에서 뚜렷하지 않았던 것일 수 있다. 또는, 이는 이전에는 인간 집단에서 순환되지 않았던 헤마글루티닌일 수 있고, 예를 들어, 이는 조류 종(새)에서 발견되는 H5, H9, H7 또는 H6이 있다. 대부분의 경우에, 또는 적어도 다수의 집단 비율 또는 심지어 전체 집단이 이전에 그 항원을 만난 적이 없고 이에 대해 면역학적으로 나이브이다. 현재, WHO에 의해 인간에서 잠재적으로 범유행병을 야기시킬 수 있는 것으로 확인된 인플루엔자 A 바이러스는 고도로 병원성인 H5N1 조류 인플루엔자 바이러스이다. 따라서, 본 발명에 따른 범유행병 백신은 H5N1 바이러스를 포함하는 것이 적합할 것이다. 청구된 조성물에 포함시키기 위한 2개의 다른 적합한 균주는 H9N2 또는 H7N1이다.
특정 무리가 일반적으로 범유행병 상황에서 인플루엔자에 감염될 위험성이 높다. 만성적으로 아픈 노인 및 소아가 특히 걸리기 쉬우나 많은 청년 및 명백히 건강한 인간도 위험이 있다. H2 인플루엔자의 경우, 1968년 이후에 태어난 집단의 일부가 증가된 위험성을 지닌다. 이들 그룹을 가능한 한 효과적으로 간단한 방법으로 보호하는 것이 중요하다.
위험성이 증가된 또 다른 그룹의 인간은 여행자들이다. 인간은 오늘날 이전보다 더 많이 여행하며, 대부분의 새로운 바이러스가 출현하는 지역인 중국 및 동남아시아는 최근 인기있는 여행지가 되었다. 여행 패턴의 이러한 변화는 신규한 바이러스가 수 개월 또는 수 년이 아닌 수 주 내에 세계적으로 도달되도록 한다.
따라서, 이러한 그룹의 인간에 대하여, 범유행병 상황 또는 잠재적인 범유행병 상황에서 인플루엔자에 대해 보호하는 백신접종이 특히 필요하다. 적합한 균주는 H5N1, H5N8, H5N9, H7N4, H9N2, H7N7, H7N3, H2N2 및 H7N1을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 다른 인간에서의 범유행병 균주는 H7N3 (캐나다에서 보고된 2 경우), H10N7 (이집트에서 보고된 2 경우) 및 H5N2 (일본에서 보고된 한 경우) 및 H7N2이다. 범유행병 균주 또는 범유행병과 관련하여 민감한 균주인 인플루엔자 균주는 요컨대 "범유행병 균주"로서 본 문헌에 언급될 것이다.
본 발명의 인플루엔자 약제는 적합하게는 백신에 대한 특정 내부 기준을 충족한다. 표준은 인플루엔자 백신의 효능을 측정하기 위해 국제적으로 적용된다. 혈청학적 변화는 인플루엔자 백신의 연간 라이센싱(licensing) 절차와 관련된 임상 시험을 위한 인간 용도를 위한 의약 제품의 평가를 위한 유럽 기관(European Agency for the Evaluation of Medicinal Products)의 기준에 따라 측정된다(표 2)(CHMP/BWP/214/96, Committee for Proprietary Medicinal Products (CPMP). Note for harmonization of requirements for influenza vaccines, 1997. CHMP/BWP/214/96 circular N°96-0666:1-22).
필요조건은 성인 집단(18-60세) 및 노인 집단(>60세)에 대해 상이하다(표 2). 범유행기 사이 인플루엔자 백신에 대해, 하나 이상의 평가(혈청전환 인자, 혈청전환률, 혈청보호율)은 백신에 포함된 인플루엔자의 모든 균주에 대해 유럽 필요조건을 충족하여야 한다. 1:40과 동등하거나 이보다 큰 역가의 비율이 가장 적절한 것으로 간주되는데, 이는 이러한 역가가 보호와 가장 상관관계가 있는 것으로 예상되기 때문이다[Beyer W et al. 1998. Clin Drug Invest.;15:1-12].
"범유행성 인플루엔자 백신 판매 허가 신청을 위한 서류 구성 및 내용에 대한 지침"에 특정된 바와 같이(CHMP/VEG/4717/03, 2004년 4월 5일, 또는 보다 최근에는 www.emea.eu.int에서 이용가능한 '범유행병을 야기하는 잠재성을 갖는 바이러스로부터 제조된 인플루엔자 백신에 대한 지침'의 표제의 2007년 1월 24일의 EMEA/CHMP/VWP/263499/2006), 비순환 균주로부터 유래된 인플루엔자 백신에 대한 특정 기준의 부재하에서, 범유행성 후보 백신은 (적어도) 백신의 2회 용량 후 프라이밍되지 않은 성인 또는 노인 피검체에서 현존하는 백신에 대해 설정된 현재의 3개 모두의 표준을 적합하게 충족시키기에 충분한 면역학적 반응을 유발할 수 있어야 하는 것이 예견된다. EMEA 지침은 범유행병의 경우 상기 집단이 면역학적으로 나이브일 상황을 기재하고 있고, 따라서 계절성 백신에 대한 모든 3개의 CHMP 기준이 범유행성 후보 백신에 의해 달성될 것으로 추정된다. 백신접종 전의 혈청반응 음성 피검체에서 상기를 증명하기 위해 엄격한 필요조건이 요구되지는 않는다.
본 발명의 조성물은 적합하게는 표 2A에 기술된 바와 같이 보호를 위한 조성물에 포함된 범유행병 균주에 대한 1개 이상의 상기 기준(승인을 얻기에 1개의 기준이 충분함), 적합하게는 2개 이상, 또는 통상적으로 적어도 3개 모두의 기준을 충족한다.
표 2A (CHMP 기준)
18-60세 >60세
혈청전환률* >40% >30%
전환 인자** >2.5 >2.0
보호율*** >70% >60%
*혈청전환률은 ≥ 1:40의 보호적 백신접종후 역가를 갖는 각각의 그룹의 피검체의 비율로 정의된다. 간단히 말해서, 혈청전환률은 < 1:10의 백신접종 전 HI 역가 및 ≥1:40의 백신접종 후 HI 역가를 갖는 피검체의 %이다. 그러나, 최초 역가가 ≥1:10인 경우, 백신접종 후에 항체의 양이 4배 이상 증가하는 것이 필요하다.
**전환 인자는 각각의 백신 균주에 대해 백신접종 후에 혈청 HI 기하 평균 역가(GMT)에서의 증가 배수로 정의된다.
***보호율은 백신접종 전에 혈청음성이고 ≥ 1:40의 백신접종 후 HI 역가를 갖거나, 백신접종 전에 혈청양성이고 백신접종 후에 현저한 4배의 역가 증가를 갖는 피검체의 비율로 정의되고; 이는 보호를 나타내는 것으로 일반적으로 수용된다.
유럽 건강 규제 기구(CHMP - 인간 용도를 위한 의약 제품에 대한 위원회)에 의해 정의되는 70% 혈청보호율은 연간 계절 인플루엔자 백신에 대해 충족되는 것이 일반적으로 요구되는 3개의 기준중 하나이고, CHMP는 또한 충족되어야 하는 범유행성 후보 백신을 예측한다. 그러나, 수학적 모델링은 집단 수준에서 특정 드리프트된 균주에 대해 단지 30% 효과적인 백신이 또한 범유행병의 규모를 감소시키는 것을 돕는 것에 유리할 수 있고, 범유행병 균주에 대해 30%의 효능(30%의 교차 보호)을 갖는 (범유행병전) 백신을 이용하는 범유행병 백신접종 캠페인이 임상 발병률을 75%까지 효과적으로 감소시켜, 결과적으로 집단 내의 이환율/사망률을 효과적으로 감소시킬 수 있는 것을 나타낸다(Ferguson et al, Nature 2006).
FDA는 범유행병 인플루엔자 백신의 개업허가(Licensure)를 뒷받침하기 위해 필요한 임상 데이터에 대한 공개된 드래프트(draft) 지침(CBER 드래프트 기준)(통신, 교육 및 제조업 지원청(Office of Communication, Training and Manufacturers Assistance)(HFM-40)(1401 Rockville Pike, Suite 200N, Rockville, MD 20852-1448), 또는 전화 1-800-835-4709 또는 301-827-1800, 또는 인터넷 http://www.fda.gov/cber/guidelines.htm에서 이용가능함)을 갖고, 제안된 기준은 또한 CHMP 기준을 기초로 한다. FDA는 약간 상이한 연령 컷-오프 포인트를 이용한다. 적절한 종점은 유사하게 1) ≥ 1:40의 HI 항체 역가를 달성하는 피검체의 백분율, 및 2) 백신접종 후 HI 항체 역가에서 4배의 상승으로 정의되는 혈청전환률을 포함한다. 기하 평균 역가(GMT)가 결과에 포함되어야 하나, 데이터는 추정치 뿐만 아니라 혈청전환의 발병률의 95% 신뢰 구간의 하한을 포함하여야 하며, ≥ 1:40의 HI 역가의 42일 발병률은 목표값을 초과하여야 한다. 따라서, 이러한 데이터 및 상기 평가의 추정치의 95% 신뢰 구간(CI)이 제공되어야 한다. FDA 드래프트 지침은 둘 모두의 목표가 충족되는 것을 요구한다. 이는 표 2B에 요약되어 있다.
표 2B(CBER 드래프트 기준)
18-64세 >64세
혈청전환률* >40% >30%
≥ 1:40의 HI 역가 비율 >70% >60%
*혈청전환률은 a) ≥ 1:10의 기준 역가를 갖는 피검체에 대해, 4배 이상의 상승; 또는 b) < 1:10의 기준 역가를 갖는 피검체에 대해, ≥ 1:40으로의 상승으로 정의된다.
이러한 기준은 참값(true value)에 대해 95% CI의 하한에서 충족되어야 한다.
따라서, 본 발명의 한 양태에서, 계획된 인플루엔자 조성물의 투여에 의해 유도된 상기 면역 반응 또는 보호가 인플루엔자 백신 효능에 대한 모든 3개의 EU 규제 기준을 충족시키는 본원에 청구된 조성물, 방법 또는 용도가 제공된다. 적합하게는, 하기 기준 중 1개 이상, 적합하게는 2개 또는 3개가 조성물의 균주 또는 각각의 균주에 대해 충족된다:
성인 집단(18-60세 연령) 및/또는 적합하게는 또한 노인 집단(>60세 연령)에서 >50%, >60%, >70%, 적합하게는 >80% 또는 >90%의 혈청전환률;
성인 집단(18-60세 연령) 및/또는 적합하게는 또한 노인 집단(>60세 연령)에서 >75%, >80%, >85%, 적합하게는 >90%의 보호율;
성인 집단(18-60세 연령) 및/또는 적합하게는 또한 노인 집단(>60세 연령)에서 >4.0, >5.0, >6.0, >7.0, >8.0, >9.0 또는 10 또는 10 이상의 전환 인자.
한 특정 구체예에서, 본 발명의 따른 조성물은 성인 집단에서 >60% 또는 >70%, 또는 적합하게는 >80%의 혈청전환률, 및 >75%, 적합하게는 >80%의 보호율 둘 모두를 충족할 것이다. 또 다른 특정 구체예에서, 본 발명에 따른 조성물은 성인 집단에서 >5.0 또는 >7.0, 또는 적합하게는 >10.0의 전환 인자, 및 >60% 또는 >70%, 또는 적합하게는 >80%의 혈청전환률 둘 모두를 충족할 것이다. 또 다른 특정 구체예에서, 본 발명에 따른 조성물은 성인 집단에서 >5.0 또는 >7.0, 또는 적합하게는 >10.0의 전환 인자, 및 >75%, 적합하게는 >80%의 보호율 둘 모두를 충족할 것이다. 또 다른 특정 구체예에서, 본 발명에 따른 조성물은 10.0 이상의 전환 인자, 80% 이상의 혈청전환률, 및 80% 이상의 보호율을 충족할 것이다.
또 다른 구체예에서, 청구된 백신, 적합하게는 범유행병 균주 또는 범유행병과 관련하여 민감한 균주를 함유하는 범유행전 백신은 순환하는 범유행병 균주에 대해 30%의 효능(30%의 교차 보호)을 가질 것이다. 특히, 청구된 백신은 드리프트된 균주에 대해 30% 이상, 적합하게는 드리프트된 균주에 대해 40% 이상, 또는 >50% 또는 >60%의 혈청보호율을 충족할 것이다. 적합하게는, 혈청보호율은 드리프트 균주에 대해 >70%, 또는 적합하게는 >80%일 것이다. 교차 보호를 부여할 수 있는 상기 범유행전 백신은 전체 감염 발병률을 50% 이상, 또는 적합하게는 75% 이상 실질적으로 감소시켜, 결과적으로 집단 내의 이환율/사망률을 감소시킬 수 있을 것이다.
또 다른 구체예에서, 청구된 애주번트 첨가된 백신은 드리프트된 균주 또는 다양한 클레이드(clade)로부터의 균주에 대해 50% 이상의 피검체, 60% 이상, 적합하게는 70% 이상, 또는 적합하게는 75% 이상의 피검체에서 중화 항체를 유도할 수 있다. 적합하게는, 이러한 효과는 7.5 ㎍의 HA와 같은 적은 용량의 항원, 또는 심지어 3.8 ㎍ 또는 1.9 ㎍의 HA와 같은 보다 낮은 항원 용량으로 달성된다.
적합하게는, 상기 기준 중 어느 하나 또는 모두는 또한 다른 집단, 예를 들어, 아동 및 임의의 면역약화 집단에 대해 충족된다.
본 발명의 한 양태에서, 면역원성 조성물의 인간 용량은 단일 인플루엔자 균주로부터의 헤마글루티닌(HA)를 함유하고, 이는 "1가" 인플루엔자 조성물로 언급된다. 본 발명의 또 다른 양태에서, 면역원성 조성물의 인간 용량은 하나 이상의 인플루엔자 균주로부터의 헤마글루티닌(HA)를 포함하고, 이는 "다가" 인플루엔자 조성물로 언급된다. 본 발명에 따른 적합한 다가 조성물은 2가 조성물(2개의 인플루엔자 바이러스 균주, 예를 들어, 비제한적으로 범유행병과 관련되거나 범유행병과 관련하여 민감한 2개의 균주로부터의 헤마글루티닌(HA)을 포함함, 예를 들어, H5=H2), 3가 조성물(3개의 인플루엔자 바이러스 균주, 임의로 2개의 A 균주 및 1개의 B 균주, 예를 들어, 비제한적인 예로 B/야마가타 또는 B/빅토리아로부터의 헤마글루티닌(HA)을 포함함), 4가 조성물(4개의 인플루엔자 바이러스 균주로부터의 헤마글루티닌(HA)을 포함함) 또는 5가 조성물(5개의 인플루엔자 바이러스 균주로부터의 헤마글루티닌(HA)을 포함함)이다. 적합한 4가 조성물은 다양한 계통으로부터의 2개의 A 균주 및 2개의 B 균주(예를 들어, B/야마가타 또는 B/빅토리아)로부터의 헤마글루티닌을 포함한다. 대안적으로, 4가 조성물은 3개의 A 균주(임의로, H1N1, H3N2, 및 범유행병과 관련되거나 범유행병과 관련하여 민감한 1개의 A 균주) 및 1개의 B 균주(예를 들어, B/야마가타 또는 B/빅토리아)로부터의 헤마글루티닌을 포함한다. 또 다른 대안적 4가 조성물은 범유행병과 관련되거나 범유행병과 관련하여 민감한 균주로부터의 4개의 A 균주, 예를 들어, H5 + H2 + H7 + H9와 같은 조류 균주로부터의 헤마글루티닌을 포함한다. 특히, 다가의 애주번트 첨가된 범유행병 조성물, 예를 들어, 범유행성 2가(예를 들어, H5+H2) 또는 3가 또는 4가(예를 들어, H5 + H2 + H7 + H9) 조성물은 범유행성 인플루엔자 A 위협 서브타입에 대한 예방 면역화 및 위협 서브타입에 대한 지속성 프라이밍의 장점을 제공한다. 통상적으로, 2회 용량이 편리한 스케줄(예를 들어, 6-12개월 간격), 및 임의로 예견된 주기적 부스터(예를 들어, 10년)를 이용하여 6주의 연령으로부터 제공된다. 임의로, 이러한 범유행병 백신은 계절성 백신과 조합될 수 있다.
다가 조성물은 또한 5개 이상의 인플루엔자 균주, 예를 들어, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 인플루엔자 균주를 포함할 수 있다.
다가의 계절성 조성물에서 2개의 B 균주가 사용되는 경우, 이들은 2개의 상이한 계통(임의로, B/빅토리아 및 B/야마가타)로부터 유래될 수 있다. 상기 B 균주중 하나 이상, 적합하게는 둘 모두의 B 균주는 순환 계통으로부터 유래될 것이다. 이러한 조성물은 아동에 특히 적합하다. 적합하게는, 아동에 사용하기 위한 다가 조성물이 2개의 B 균주를 포함하는 경우, B 균주에 대해 일반적으로 할당된 항원의 양은 2개의 B 균주 사이에 분배된다. 특히, 애주번트 첨가된 4가(H1 + H3 + 둘 모두의 B 계통)의 인플루엔자 백신은 애주번트 첨가되지 않은 백신에 비한 우수한 효능(둘 모두의 상동성 및 드리프트 보호, 및 2개의 순환 B 계통에 대한 이의 효능과 관련됨) 및 연령에 기초한 가능한 연중 계속되는 면역화와 같은 나이브 아동에 대한 향상된 예방의 장점을 제공한다. 1회 투여 또는 2회 투여는 적합하게는 6주, 또는 6 내지 35개월의 연령과 같이 초기에 투여된다.
한 특정 구체예에서, 면역원성 조성물의 인간 용량은 2개의 A 균주(임의로, H1N1, H3N2) 및 1개의 B 균주로부터의 헤마글루티닌(HA)을 포함하는 3가 면역원성 또는 백신 조성물이다. 적합하게는, 균주당 HA는 적은 양의 HA(임의로, 균주당 10 ㎍ HA 또는 이 미만)이고, 이는 상기 정의된 바와 같다. 적합하게는, 균주당 HA는 약 5 ㎍ 또는 5 ㎍ 미만, 약 2.5 ㎍ 또는 2.5 ㎍ 미만이다. 애주번트는 본원에 정의된 바와 같고, 특히 표 1에 정의된 바와 같다. 적합하게는, 애주번트 조성물은 각각 용량당 5-6 mg, 5-6 mg 및 2-3 mg의 양의 스쿠알렌, 알파-토코페롤 및 폴리소르베이트 80을 포함하는 수중유 에멀젼이다. 대안적으로, 애주번트 조성물은 각각 용량당 2.5-3.5 mg, 2-3 mg 및 1-2 mg의 양의 스쿠알렌, 알파-토코페롤 및 폴리소르베이트 80을 포함하는 수중유 에멀젼이다. 이러한 애주번트 첨가된 면역원성 조성물 또는 백신은 성인(18-60세) 또는 나이가 있는 아동(3-17세) 집단에 특히 적합하고, H3N2 드리프트 변이체 및 다양한 계통으로부터의 B 균주에 대해 교차 보호를 제공할 수 있다.
또 다른 특정 구체예에서, 면역원성 조성물의 인간 용량은 2개의 A 균주(임의로, H1N1, H3N2) 및 2개의 B 균주(임의로, B/빅토리아 및 B/야마가타와 같은 상이한 계통으로부터 유래됨)로부터의 헤마글루티닌(HA)을 포함하는 4가 면역원성 또는 백신 조성물이다. 적합하게는, 용량당 균주당 HA는 약 15 ㎍이다. 적합하게는, 균주당 HA는 적은 양의 HA(임의로, 용량당 40-45 ㎍의 HA의 최대량을 달성하기 위해 용량당 균주당 약 10 ㎍의 HA 또는 이 미만)이고, 이는 상기 정의된 바와 같다. 적합하게는, 균주당 HA는 약 5 ㎍ 또는 5 ㎍ 미만, 약 2.5 ㎍ 또는 2.5 ㎍ 미만이다. 애주번트는 본원에 정의된 바와 같고, 특히 표 1에 정의된 바와 같다. 적합하게는, 애주번트 조성물은 각각 용량당 5-6 mg, 5-6 mg 및 2-3 mg의 양의 스쿠알렌, 알파-토코페롤 및 폴리소르베이트 80을 포함하는 수중유 에멀젼이다. 대안적으로, 애주번트 조성물은 각각 용량당 2.5-3.5 mg, 2-3 mg 및 1-2 mg의 양의 스쿠알렌, 알파-토코페롤 및 폴리소르베이트 80을 포함하는 수중유 에멀젼이다. 제 2의 B 균주를 포함하는 이러한 조성물은 사전 노출 또는 프라이밍이 특히 중요한 매우 어린 아동에 특히 적합하다. 애주번트는 상기 집단에 증가된 보호를 전달하는 이점을 제공할 것이다. 아동 집단을 위한 면역원성 조성물의 인간 용량은 성인 인간 용량의 절반이 적합하고, 이는 적합하게는 균주당 2.5 ㎍ HA, 및 용량당 2.5-3.5 mg, 2-3 mg 및 1-2 mg의 양의 스쿠알렌, 알파-토코페롤 및 폴리소르베이트 80을 포함하는 수중유 에멀젼을 포함할 것이다.
대안적으로, 적합하게는 4가 조성물과 관련하여 상기 특성을 갖고 상기 정의된 양의 상기 추가 B 균주가 상기 기재된 바와 같이 3가 조성물에 1가 조성물의 형태로 첨가될 수 있다. 10 ㎍ 또는 10 ㎍ 미만, 또는 5 ㎍ 또는 5 ㎍ 미만, 또는 임의로 어린 아동에 대해 2.5 ㎍ 또는 2.5 ㎍ 미만과 같은 적은 양의 HA를 이용하여, 세계적 백신 공급에 있어서 추가적인 인플루엔자 균주의 영향을 제한하는 이점을 가질 수 있다. 적합하게는, 2개의 B 균주가 백신 조성물에 포함되는 경우, B 균주에 대해 일반적으로 할당되는 항원의 양은 2개의 B 균주 사이에 분배된다.
또 다른 특정 구체예에서, 면역원성 조성물의 인간 용량은 2개의 범유행기 사이 A 균주(임의로, H1N1, H3N2), 1개의 B 균주 및 범유행병과 관련되거나 범유행병과 관련하여 민감한 1개의 A 균주(임의로, H5N1, H9N2, H7N7, H5N8, H5N9, H7N4, H7N3, H2N2, H10N7, H5N2, H7N2 및 H7N1)으로부터의 헤마글루티닌(HA)을 포함하는 4가 면역원성 또는 백신 조성물이다. 적합하게는, 균주당 HA는 적은 양의 HA(임의로, 균주당 10 ㎍ HA 또는 이 미만)이고, 이는 상기 정의된 바와 같다. 적합하게는, 균주당 HA는 약 5 ㎍ 또는 5 ㎍ 미만, 약 2.5 ㎍ 또는 2.5 ㎍ 미만이다. 애주번트는 상기 정의된 바와 같고, 특히 표 1에 정의된 바와 같다.
적합하게는, 애주번트 조성물은 각각 용량당 5-6 mg, 5-6 mg 및 2-3 mg의 양의 스쿠알렌, 알파-토코페롤 및 폴리소르베이트 80을 포함하는 수중유 에멀젼이다. 대안적으로, 애주번트 조성물은 각각 용량당 2.5-3.5 mg, 2-3 mg 및 1-2 mg의 양의 스쿠알렌, 알파-토코페롤 및 폴리소르베이트 80을 포함하는 수중유 에멀젼이다.
또 다른 특정 구체예에서, 면역원성 조성물의 인간 용량은 3개의 범유행기 사이 A 균주(임의로, H1N1, 및 2개의 H3N2 균주) 및 1개의 B 균주로부터의 헤마글루티닌(HA)을 포함하는 4가 면역원성 또는 백신 조성물이다. 적합하게는, 균주당 HA는 적은 양의 HA(임의로, 균주당 10 ㎍ HA 또는 이 미만)이고, 이는 상기 정의된 바와 같다. 적합하게는, 균주당 HA는 약 5 ㎍ 또는 5 ㎍ 미만, 약 2.5 ㎍ 또는 2.5 ㎍ 미만이다. 애주번트는 본원에 정의된 바와 같고, 특히 표 1에 정의된 바와 같다. 적합하게는, 애주번트 조성물은 각각 용량당 5-6 mg, 5-6 mg 및 2-3 mg의 양의 스쿠알렌, 알파-토코페롤 및 폴리소르베이트 80을 포함하는 수중유 에멀젼이다. 대안적으로, 애주번트 조성물은 각각 용량당 2.5-3.5 mg, 2-3 mg 및 1-2 mg의 양의 스쿠알렌, 알파-토코페롤 및 폴리소르베이트 80을 포함하는 수중유 에멀젼이다. 제 3 계절성 A 균주를 포함하는 이러한 조성물은 매우 어린 아동에 특히 적합하다. 적합하게는, 3개의 범유행기 사이 균주 중 2개는 제 1의 H3N2 균주에 비해 가깝거나 먼 클레이드인 제 2의 H3N2 균주인 H3N2이다. 애주번트는 상기 집단에 증가된 보호를 전달하는 장점을 제공할 것이다. 아동 집단을 위한 면역원성 조성물의 인간 용량은 적합하게는 성인 인간 용량의 절반이고, 이는 적합하게는 균주당 2.5 ㎍ HA, 및 용량당 2.5-3.5 mg, 2-3 mg 및 1-2 mg의 양의 스쿠알렌, 알파-토코페롤 및 폴리소르베이트 80을 포함하는 수중유 에멀젼을 포함할 것이다.
또 다른 특정 구체예에서, 면역원성 조성물의 인간 용량은 2개의 범유행기 사이 A 균주(임의로, H1N1, H3N2), 2개의 B 균주(임의로, 상이한 계통, 예를 들어, B/빅토리아 및 B/야마가타로부터 유래됨), 및 범유행병과 관련되거나 범유행병과 관련하여 민감한 1개의 A 균주(임의로, H5N1, H9N2, H5N8, H5N9, H7N4, H7N7, H7N3, H2N2, H10N7, H5N2 및 H7N1)로부터의 헤마글루티닌(HA)을 포함하는 5가 면역원성 또는 백신 조성물이다. 적합하게는, 용량당 균주당 HA는 약 15 ㎍이다. 적합하게는, 균주당 HA는 적은 양의 HA(임의로, 용량당 40-45 ㎍ HA의 최대량을 달성하기 위해, 용량당 균주당 약 10 ㎍ HA 또는 이 미만)이고, 이는 상기에 정의된 바와 같다. 적합하게는, 균주당 HA는 약 5 ㎍ 또는 5 ㎍ 미만, 약 2.5 ㎍ 또는 2.5 ㎍ 미만이다. 애주번트는 본원에 정의된 바와 같고, 특히 표 1에 정의된 바와 같다. 적합하게는, 애주번트 조성물은 각각 용량당 5-6 mg, 5-6 mg 및 2-3 mg의 양의 스쿠알렌, 알파-토코페롤 및 폴리소르베이트 80을 포함하는 수중유 에멀젼이다. 대안적으로, 애주번트 조성물은 각각 용량당 2.5-3.5 mg, 2-3 mg 및 1-2 mg의 양의 스쿠알렌, 알파-토코페롤 및 폴리소르베이트 80을 포함하는 수중유 에멀젼이다.
또 다른 특정 구체예에서, 면역원성 조성물의 인간 용량은 3개의 범유행기 사이 A 균주(임의로, H1N1, 2개의 H3N2 균주) 및 2개의 B 균주(임의로, 상이한 계통, 예를 들어, B/빅토리아 및 B/야마가타로부터 유래)로부터의 헤마글루티닌(HA)을 포함하는 5가 면역원성 또는 백신 조성물이다. 적합하게는, 균주당 HA는 적은 양의 HA(임의로, 균주당 10 ㎍ HA 또는 이 미만)이고, 이는 상기 정의된 바와 같다. 적합하게는, 균주당 HA는 약 5 ㎍ 또는 5 ㎍ 미만, 약 2.5 ㎍ 또는 2.5 ㎍ 미만이다. 애주번트는 본원에 정의된 바와 같고, 특히 표 1에 정의된 바와 같다. 적합하게는, 애주번트 조성물은 각각 용량당 5-6 mg, 5-6 mg 및 2-3 mg의 양의 스쿠알렌, 알파-토코페롤 및 폴리소르베이트 80을 포함하는 수중유 에멀젼이다. 대안적으로, 애주번트 조성물은 각각 용량당 2.5-3.5 mg, 2-3 mg 및 1-2 mg의 양의 스쿠알렌, 알파-토코페롤 및 폴리소르베이트 80을 포함하는 수중유 에멀젼이다.
따라서, 한 특정 구체예에서, 본 발명은 스쿠알렌 및 HA를 포함하는 인플루엔자 면역원성 조성물을 제공하며, 여기서 스쿠알렌: 전체량의 HA(모든 인플루엔자 균주가 포함됨)의 중량비는 약 50-150 또는 약 150-400(예를 들어, 약 200-300)의 범위이다. 이러한 조성물이 노인 집단에 사용하고, 반응원성과 면역원성을 최적으로 균형을 맞추는데 적합하나, 이에 제한되지는 않는다. 또 다른 구체예에서, 본 발명은 스쿠알렌 및 HA를 포함하는 인플루엔자 면역원성 조성물을 제공하며, 여기서 스쿠알렌:전체량의 HA(모든 인플루엔자 균주가 포함됨)의 중량비는 약 50-400, 예를 들어, 약 50-100, 75-150, 75-200, 75-400, 100-200, 100-250 또는 200-400이다. 상기 비는 적합하게는 보호를 위한 2개 이상, 적합하게는 모든 3개의 기준(표 2)이 특정 집단에 대해 충족하도록 될 것이다. TLR 효능제, 적합하게는 TLR-4(예를 들어, 3D-MPL, MPL; AGP 분자, 예를 들어, RC527 또는 RC529, 또는 ER804057로부터 선택됨) 또는 TLR-9(적합하게는, CpG 올리고누클레오티드, 예를 들어, CpG7909) 효능제가 포함될 수 있다. 적합하게는, 스쿠알렌:TLR-4의 중량비는 약 100-450, 예를 들어, 50-250, 50-150, 100-250, 200-250, 350-450이다. 적합하게는, 스쿠알렌:TLR-9의 중량비는 약 50-1000, 예를 들어, 50-500, 100-1000, 100-400, 400-600이다. HA는 계절성 인플루엔자 균주로부터 유래될 수 있다. 이러한 조성물은 성인 또는 소아 집단에서 사용될 수 있거나, 반응원성과 면역원성을 최적으로 균형을 맞추는데 적합하나, 이에 제한되지는 않는다. 적합하게는, HA는 3개 이상, 4개 이상의 인플루엔자 균주로부터 유래된다. 적합하게는, 3개의 계절성(예를 들어, H1N1, H3N2, B) 균주가 존재한다. 적합하게는, 4개의 균주가 존재하는 경우, 이들은 4개의 계절성 균주(예를 들어, H1N1, H3N2, 2개의 B 균주; 또는 H1N1, B, 2개의 H3N2 균주)의 그룹, 또는 1개의 범유행병(예를 들어, 조류) 균주 + 3개의 계절성 균주(예를 들어, H1N1, H3N2, B)의 그룹으로부터 유래된다.
모든 청구된 애주번트 첨가된 면역원성 조성물 또는 백신은 유리하게는 백신접종 후 6개월 초과, 적합하게는 12개월의 기간에 걸쳐 지속적인 면역 반응을 제공하는 애주번트에 의지할 수 있다.
적합하게는, 상기 반응(들)은 동일한 진행성 일차 면역 반응 동안 1회 투여, 또는 통상적으로 2회 투여 후에 수득된다. 면역 반응이 애주번트 첨가된 조성물 또는 백신의 단지 1회 투여 후에 수득되는 본 발명에 청구된 조성물의 특별한 장점이 존재한다. 또한, 적합하게는 나이브 또는 면역 약화된 집단 또는 개체에 대해 동일한 진행성 일차 면역 반응 동안 2회의 용량이 투여되는 것이 적합하다. 적합하게는, 이전에 백신접종되지 않은 아동, 특히 6세 또는 9-10세 미만의 연령의 아동에 2회의 용량이 필요할 수 있다.
따라서, 본 발명의 한 양태에서 인플루엔자에 대해 1회 용량 또는 2회 용량의 백신접종을 위한 백신 조성물의 제조에 있어서, 살아있지 않은 범유행성 인플루엔자 바이러스 항원 제조물, 특히 스플리트 인플루엔자 바이러스 또는 이의 항원성 제조물의 용도가 제공되고, 여기서 1회 용량 또는 2회 용량의 백신접종은 1개 이상, 적합하게는 2개 또는 3개의 인플루엔자 백신에 대한 국제 규제 필요조건을 충족시키는 면역 반응을 발생시킨다. 또 다른 특정 구체예에서, 상기 1회 용량의 백신접종은 또한 또는 추가로 애주번트 첨가되지 않은 백신으로 수득된 것보다 높은 CD4 T 세포 면역 반응 및/또는 B 세포 기억 반응을 발생시킨다. 한 특정 구체예에서, 상기 면역 반응은 교차 반응성 항체 반응 또는 교차 반응성 CD4 T 세포 반응 또는 둘 모두이다. 한 특정 구체예에서, 인간 환자는 백신접종 균주에 대해 면역학적으로 나이브(즉, 면역원성이 선재하지 않음)이다. 특히, 백신 조성물은 낮은 HA 항원 양, 및 이전에 유용한 것으로 생각된 것보다 낮은 수준의 성분을 갖는 수중유 에멀젼을 함유하고, 상기 양은 본원에 정의된 바와 같다. 특히, 백신 조성물은 본원에 정의된 바와 같다. 특히, 백신 조성물의 면역원성 특성은 본원에 정의된 바와 같다. 적합하게는, 백신은 근내 투여된다.
본 발명의 백신접종(임의로, 일차 백신접종)에 사용되는 면역원성 조성물의 면역원성 특성
본 발명에서, 애주번트 첨가된 면역원성 조성물은 적합하게는 애주번트 첨가되지 않은, 즉 임의의 외인성 애주번트를 함유하지 않는(본원에서는, "플레인 조성물"로도 언급됨) 조성물로 수득된 CD4+ T-세포 면역 반응에 비해, 성분 항원 또는 항원성 조성물 또는 하나 이상의 성분 항원들 또는 항원성 조성물에 대해 개선된 CD4+ T-세포 면역 반응을 유도할 수 있다. 한 특정 구체예에서, 면역원성 인플루엔자 조성물이 여러 인플루엔자 균주로부터 유래되는 경우, 이중 하나는 제 2의 B 균주, 또는 제 3의 범유행기 사이 A 균주, 또는 범유행성 균주이고, 상기 개선된 CD4+ T-세포 면역 반응은 상기 균주 중 하나 이상에 대한 것이다. 또 다른 구체예에서, 애주번트 성분(들)이 이전에 유용한 것으로 생각된 것보다 적은 수준이고/이거나 통상적으로 상기 정의된 바와 같은 경우 애주번트 첨가된 면역원성 조성물은 적합하게는 종래 분야의 애주번트의 일부로 애주번트 첨가된 조성물로 수득된 것과 적어도 동등한, 성분 항원 또는 항원성 조성물 또는 하나 이상의 성분 항원들 또는 항원성 조성물에 대한 CD4+ T-세포 면역 반응을 유도할 수 있다. 이러한 특징은 하기에서 "동등한 CD4+ T-세포 면역 반응"으로 언급될 것이다.
"개선된 CD4+ T-세포 면역 반응"은 보다 높은 CD4+ 반응이 인간 환자에게서 애주번트 부재의 동일한 조성물의 투여 후 얻어진 것보다 본원에 정의된 애주번트 첨가된 면역원성 조성물의 투여 후에 얻어진다는 것을 의미한다. 예를 들어, 보다 높은 CD4+ T-세포 반응은 인간 환자에게서 애주번트 첨가되지 않는 인플루엔자 바이러스 또는 이의 항원성 제조물을 포함하는 면역원성 조성물을 투여한 후 유도된 반응과 비교하여, 인플루엔자 바이러스 또는 이의 항원성 제조물과 함께, 대사가능한 오일(임의로, 스쿠알렌), 토콜(임의로, 알파 토코페롤) 및 유화제(임의로, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레에이트, 예를 들어, 트윈 80™ 또는 폴리소르베이트 80™)를 포함하는 수중유 에멀젼 애주번트를 포함하는 면역원성 조성물의 투여시에 얻어진다. 이러한 애주번트 첨가된 제형은 유리하게는 MHC 클래스 II 분자에 의해 제공되는 인플루엔자 에피토프를 검출할 수 있는 항-인플루엔자 CD4+ T-세포 반응을 유도하는 데 사용될 것이다.
적합하게는, 본 발명에 사용하기 위한 애주번트 첨가된 스플리트 인플루엔자 조성물에 의해 유도된 상기 면역학적 반응은 임의의 다른 통상적인 애주번트 첨가되지 않은 인플루엔자 백신, 예를 들어, 서브유닛 인플루엔자 백신 또는 전체 인플루엔자 바이러스 백신에 의해 유도된 면역학적 반응보다 높다.
특히, 상기 "개선된 CD4+ T-세포 면역 반응" 또는 "동등한 CD4+ T-세포 면역 반응"은 면역학적으로 프라이밍되지 않은 환자, 즉, 상기 인플루엔자 바이러스 또는 항원에 대해 혈청음성인 환자에게서 달성되나, 이에 한정되지는 않는다. 이러한 혈청음성은 이러한 바이러스 또는 항원에 전혀 접한 적이 없거나(소위 '나이브' 환자), 또는 다르게는 직면된 경우 상기 항원에 대한 반응이 실패된 환자의 결과일 수 있다. 적합하게는, 상기 개선된 CD4+ T-세포 면역 반응은 노인, 일반적으로 50세 이상의 연령, 통상적으로 65세 이상의 연령, 또는 고위험 의학적 질환을 갖는 65세 미만의 연령의 성인('고위험' 성인), 또는 2세 미만의 연령의 소아와 같은 면역약화된 피검체에서 얻어진다.
(개선된) CD4+ T-세포 면역 반응은 임의의 하기 사이토카인을 생성하는 세포의 수를 측정함으로써 평가될 수 있다:
ㆍ 적어도 2개의 상이한 사이토카인(CD40L, IL-2, IFNγ, TNFα)을 생성하는 세포
ㆍ 적어도 CD40L 및 또 다른 사이토카인(IL-2, TNFα, IFNγ)을 생성하는 세포
ㆍ 적어도 IL-2 및 또 다른 사이토카인(CD40L, TNFα, IFNγ)을 생성하는 세포
ㆍ 적어도 IFNγ 및 또 다른 사이토카인(IL-2, TNFα, CD40L)을 생성하는 세포
ㆍ 적어도 TNFα 및 또 다른 사이토카인(IL-2, CD40L, IFNγ)을 생성하는 세포
임의의 상기 사이토카인을 생성하는 세포가 애주번트 첨가되지 않는 조성물의 투여와 비교하여 애주번트 첨가된 조성물의 투여 후에 보다 많은 양으로 존재할 경우에 "개선된" CD4+ T-세포 면역 반응이 존재할 것이다. 통상적으로, 상기 본원에 언급된 하나 이상, 바람직하게는 5개 조건 중 두 개가 충족될 것이다. 특정 구체예에서, 4개 모두의 사이토카인을 생성하는 세포가 애주번트 첨가되지 않은 그룹과 비교하여 애주번트 첨가된 그룹에서 보다 많은 양으로 존재할 것이다. 종래 분야의 애주번트의 일부로 애주번트 첨가된 조성물(즉, 높은 수준의 동일한 성분(들)을 가짐)로 수득된 것에 비해 애주번트 성분(들)이 이전에 유용한 것으로 생각한 것보다 낮은 수준으로 존재하고/하거나 통상적으로 본원에 정의된 바와 같은, 애주번트 첨가된 면역원성 조성물로 수득된 반응에서 현저하지 않은, 임의로 통계적으로 현저하지 않은 감소가 존재하게 되는 경우, "동등한" CD4+ T-세포 면역 반응이 존재할 것이다.
한 특정 구체예에서, 개선된 CD4 T-세포 면역 반응은 본 발명의 애주번트 첨가된 인플루엔자 조성물에 의해 부여될 수 있고, 이는 이상적으로는 1회 단일 투여 후에 얻어질 수 있다. 단일 용량 방법은, 예를 들어, 빠르게 전개되는 발생 상황에서 매우 적합할 것이다. 특정 상황에서, 특히 노인 집단에 대해, 또는 인플루엔자에 대해 최초로 백신접종된 어린 아동(9세 미만의 연령)의 경우에, 또는 범유행성의 경우에, 상기 계절에 대해 동일한 조성물을 2회 용량으로 투여하는 것이 유리할 수 있다. 상기 동일 조성물의 제 2 용량(여전히 '일차 백신접종을 위한 조성물'로서 간주됨)은 진행중인 일차 면역 반응 동안에 투여될 수 있으며, 적절한 간격으로 투여된다. 통상적으로 조성물의 제 2 용량은 제 1 용량 이후 수주일, 또는 대략 1개월 후, 예를 들어, 2주, 3주, 4주, 5주, 6주 후에 제공되어 비반응성 또는 반응성이 낮은 개체에서의 면역 시스템을 프라이밍하는 것을 돕는다. 한 특정 양태에서, 프리모(primo)-백신접종 이후에 이종성 인플루엔자 균주를 함유하는 애주번트 첨가된 백신 제품의 후속적인 백신접종이 진행된다.
한 특정 구체예에서, 상기 면역원성 조성물의 투여는 대안적으로 또는 추가로 애주번트 첨가되지 않은 조성물로 면역화된 개체에서 유도된 B-기억 세포 반응과 비교하여 애주번트 첨가된 면역원성 조성물이 투여된 환자에게서 개선된 B-기억 세포 반응을 유도한다. 개선된 B-기억 세포 반응은 시험관내 분화의 촉진에 의해 측정하여, 항원 직면시 항체 분비 혈장 세포로 분화될 수 있는 말초혈액 B 림프구의 증가된 빈도를 의미한다[참조: 실시예 부분, 예를 들어, 엘리스폿(Elispot) B 세포 기억 방법]. 또 다른 구체예에서, 애주번트 성분(들)이 이전에 유용한 것으로 생각한 것보다 낮은 수준으로 존재하고/하거나 통상적으로 상기 정의된 바와 같이 존재하는 경우 애주번트 첨가된 면역원성 조성물은 적합하게는 종래 분야의 애주번트의 일부로 애주번트 첨가된 조성물로 수득된 것과 동등한(즉, 현저하지 않거나, 임의로 통계적으로 현저하게 열등하지 않음), 성분 항원 또는 항원성 조성물 또는 하나 이상의 성분 항원들 또는 항원성 조성물에 대한 B-기억 세포 반응을 유도할 수 있다. 이러한 특성은 본원에서 "동등한 B-기억 세포 반응"으로 언급될 것이다.
추가의 특정 구체예에서, 애주번트 첨가된 일차 백신접종을 위한 조성물을 이용한 백신접종은 CD8 반응에 측정가능할 정도의 영향은 주지 않는다.
적합하게는, 본원에 정의된 바와 같은 적은 양의 수중유 에멀젼 애주번트, 특히 대사가능한 오일(임의로, 스쿠알렌), 토콜(임의로, 알파-토코페롤), 및 유화제(임의로, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레에이트, 예를 들어, 트윈 80™ 또는 폴리소르베이트 80™)를 포함하는 수중유 에멀젼 애주번트로 제형화된 인플루엔자 바이러스 또는 이의 항원성 제조물을 포함하는 본원에 청구된 조성물이 면역-약화되거나 면역학적으로 나이브인 인간 집단에서 T 세포 반응을 촉진시키는 데 효과적일 것이다. 적합하게는, 본 발명에 기재된 바와 같은 일차 백신접종을 위한 애주번트 첨가된 면역원성 조성물의 단일 용량의 투여는 애주번트 첨가되지 않은 인플루엔자 백신으로 백신접종하는 것보다, 인플루엔자에 대한 재백신접종 이후에 인플루엔자 백신에 대한 보호와 상관관계에 의해 평가시, 보다 우수한 혈청-보호를 제공할 수 있을 것이다. 또한, 본원에 청구된 애주번트 첨가된 제형은 유리하게는 애주번트 첨가되지 않은 제형으로 얻어지는 것과 비교하여 인플루엔자 바이러스에 대해 개선된 CD4 T-세포 면역 반응을 유도할 것이다. 이러한 특성은 인플루엔자 항원성 노출에 대한 백신접종 또는 감염시 증가된 반응성과 관련될 수 있다. 추가로, 이는 또한 교차-반응성, 즉, 변이체 인플루엔자 균주에 대한 보다 높은 반응력과 관련될 수 있다. 이러한 정성적으로 및/또는 정량적으로 개선된 반응은 범유행병의 경우에 모든 집단에서 유리할 수 있고, 특히 노인 집단(65세 이상의 연량), 및 특히 고위험 노인 집단과 같은 면역-약화된 인간 집단에서 유리할 수 있다. 이는 또한 대부분의 나이브 유아 집단(5세 미만, 적합하게는 2세 미만의 연령)에 유리할 수 있다. 조성물이 1개 이상의 범유행병 균주를 포함하는 경우, 이러한 개선된 반응은 범유행성 발생 이전 또는 개시 시점에 드리프트 변이체를 함유하는, 예를 들어, 비축된 백신으로부터 프라이밍을 위해 사용하는데 유리할 것이다. 이는 전체적인 이환율 및 사망율을 감소시키고 폐렴 및 다른 인플루엔자-유사 질병으로 병원에 긴급 방문하게 되는 것을 막을 것이다. 추가로, 애주번트 첨가되지 않은 제형으로 유도된 반응과 비교하여 일차 백신접종 후 소정 기간 지속되는, 예를 들어, 1년간 존재하는 CD4 T-세포 반응을 유도할 수 있다. 보다 많은 성분(들)의 양(들)을 갖는 애주번트에 비해 전체적인 반응원성을 감소시키면서 본원에 청구된 애주번트 조성물로 상기 모든 장점이 수득될 수 있다.
적합직하게는, 프라이밍되지 않은 피검체에서 수득된 CD4 T-세포 반응, 예를 들어, "개선된" 또는 "동등한" CD4 T-세포 면역 반응은 교차 반응성 CD4 T 헬퍼(helper) 반응의 유도를 포함한다. 특히, 교차-반응성 CD4 T세포의 양이 증가된다. '교차-반응성' CD4 반응은 임의로 상이한 클레이드 또는 계통으로부터의 인플루엔자 균주 간에 공유된 에피토프를 표적화하는 CD4 T-세포를 의미한다.
보통, 이용가능한 인플루엔자 백신은 유사한 항원성 특징의 헤마글루티닌을 갖는 인플루엔자 바이러스 균주를 감염시키는 것에 대해서만 효과적이다. 감염(순환) 인플루엔자 바이러스가 특정 헤마글루티닌에서 표면 당단백질에 약간의 변화(예를 들어, 점 돌연변이 또는 아미노산 변화를 초래하는 점 돌연변이의 축적)를 겪은 경우(항원성 드리프트 변이체 바이러스 균주), 백신은 새롭게 생긴 변이체가 이전의 인플루엔자 감염 또는 백신접종에 의해 유도된 면역성을 벗어날 수 있음에 따라 단지 제한된 보호를 제공할 수 있기는 하지만, 백신은 여전히 약간의 보호를 제공할 수 있다. 항원성 드리프트는 범유행기 사이 동안에 일어나는 연간 유행병의 원인이 된다[참조: Wiley & Skehel, 1987, Ann. Rev. Biochem. 56, 365-394]. 교차-반응성 CD4 T 세포의 유도는 또한 교차 보호, 즉, 이종 감염, 즉, 면역원성 조성물에 함유된 인플루엔자 균주의 변이체(예를 들어, 드리프트)인 순환하는 인플루엔자 균주에 의해 야기된 감염에 대한 보호를 제공할 수 있다는 점에서 본 발명의 조성물에 추가의 이점을 제공한다. 이는 드리프트된 균주를 대안 작업에서 사용하게 하는, 순환 균주가 란에서 전파되거나 세포 배양물에서 생성되기가 어려운 경우에 유리할 수 있다. 이는 또한 피검체가 수개월 또는 일년 간격으로 일차 및 이차 백신접종을 하고, 제 2 면역화에 사용된 면역원성 조성물내 인플루엔자 균주가 일차 백신접종에 사용된 조성물에 사용된 균주의 드리프트 변이체 균주인 경우에 유리할 수 있다.
본원에 정의된 애주번트 첨가된 인플루엔자 면역원성 조성물은 따라서 백신접종된 노인 또는 어린 아동 피검체에서 혈청-보호 및 교차-반응성 CD4 T 세포를 유도하는 높은 능력을 지닌다. 이러한 특성은 면역원성 조성물에 존재하는 균주의 변이체 균주에 반응하는 더 높은 능력과 관련될 수 있다. 이는 범유행병 상황에서 중요한 이점인 것으로 입증될 수 있다. 예를 들어, 1개 이상의 범유행병 균주, 임의로 H5, H2, H9, H7 또는 H6 균주(들) 중 임의의 것을 포함하는 면역원성 인플루엔자 조성물은 상기 드리프트 균주에 의한 후속적인 백신접종시 또는 감염시에 범유행성 변이체, 즉 상기 범유행성 균주(들)의 드리프트 균주에 대해 반응하는 더 높은 능력을 제공할 수 있다. 예를 들어, 애주번트 첨가된 백신 조성물은 A/인도네시안 균주를 포함하고, 이는 1개, 적합하게는 1개 이상의 드리프트 균주, 예를 들어, A/홍콩, A/터키, A/베트남 및/또는 A/안후이 균주(들)에 대해 교차 보호 및/또는 교차 반응성 면역 반응을 생성시킬 수 있다.
인플루엔자 백신에 의한 백신접종 후 교차-반응성 CD4 T-세포의 검출
고전적인 3가 인플루엔자 백신 투여 후(3주), 백신에 존재하는 것과 상동성인 항원성 균주 제조물(전체 바이러스 또는 스플리트 항원)(H3N2: A/파나마/2007/99, H1N1: A/뉴 칼레도니아/20/99, B: B/산동/7/97)에 반응하는 말초혈액 CD4 T-세포의 빈도가 상당히 증가한다(실시예 Ⅲ 참조). 빈도에서 필적할 만한 증가가 말초혈액 CD4 T-세포가 드리프트된 균주로서 분류된 인플루엔자 균주(H3N2: A/시드니/5/97, H1N1: A/베이징/262/95, B: B/야마나시/166/98)로 재자극되는 경우에 관찰될 수 있다. 대조적으로, 말초혈액 CD4 T-세포가 당해 숙련자에 의해 시프트 균주로서 분류된 인플루엔자 균주(H2N2: A/싱가폴/1/57, H9N2: A/홍콩/1073/99)로 재자극되는 경우, 백신접종 후 관찰될 수 있을 정도의 증가가 없다.
상동성인 인플루엔자 균주 및 드리프트된 인플루엔자 균주 둘 모두를 인지할 수 있는 CD4 T-세포는 본 명세서에서 "교차-반응성"으로 명명된다. 본원에 기술된 애주번트 첨가된 인플루엔자 조성물은, 드리프트된 인플루엔자 균주에 대해 교차-반응성이 관찰가능한 정도이기 때문에 이종아형 교차 반응성을 나타낼 수 있었다. 상기와 같이, 드리프트 범유행성 균주(들)에 대해 유효한 1개 이상의 범유행병 균주를 포함하는 백신 제형의 능력은 범유행병의 경우에 중요한 특징으로 입증될 수 있다.
상기 관찰과 일치하게, 상이한 인플루엔자 균주에 의해 공유되는 CD4 T-세포 에피토프가 인간에게서 확인되었다[참조: Gelder C et al. 1998, Int Immunol. 10(2):211-22; Gelder CM et al. 1996 J Virol. 70(7):4787-90; Gelder CM et al. 1995 J Virol. 1995 69(12):7497-506].
본원에 청구된 조성물은 이의 면역원성으로 인해, 범유행성의 개시에 더 잘 대비하기 위해 범유행병전 백신을 비축하는 것을 포함하여, 인간 인플루엔자 범유행성의 위협에 대한 사전행동의 백신접종 전략을 확립할 수 있다. 이는 또한 백신 조성물에 존재하는 균주(들)과 정확하게 매치되지 않을 수 있는 순환 균주에 대한 사전 행동의 백신접종 방법을 확립할 수 있다. 한 특정 구체예에서, 애주번트 첨가된 조성물은 현재 이용가능한 백신이 효능이 없는 헤마글루티닌(항원성 시프트)에서 주요 변화(예를 들어, 2개의 상이한 종 사이의 유전자 재조합)를 겪는 순환 균주에 대해 보다 나은 보호를 제공하는 추가 이점을 제공할 수 있다.
구체적으로, 범유행병전 백신은 새 집단에서 현재 순환되는 것과 유사한 1개 이상의 범유행병 균주(임의로, H5N1(조류 인플루엔자))를 포함하는 것이며, 이는, 예를 들어, 역 유전학의 사용을 통해 생성되었다. 범유행병전 백신에 반응하여 발생된 면역성이, 면역계가 대비적으로 '프라이밍'되거나 '훈련(educated)'되도록 할 것이므로, 실제 범유행성 바이러스 균주와 만난 후 보호성 면역 반응의 보다 신속한 전개를 가능하게 하며, 이것은 인플루엔자의 관련 범유행성 균주에 대한 감수성을 감소시킨다. 일단, 범유행병이 WHO에 의해 선언되고 최종 범유행성 균주가 동정되면 (이는 드리프트 균주이거나 드리프트 균주가 아닐 수 있음), 범유행병전 백신도 후자가 이용가능할 때 범유행성 백신에 대한 더욱 신속한 면역 반응을 허용할 것이다.
재백신접종 및 재백신접종에 사용되는 조성물(부스팅 조성물)
본 발명의 한 양태에서, 제 1 인플루엔자 균주의 변이체인 인플루엔자 균주에 의해 야기된 인플루엔자 감염에 대한 보호를 위한 본원에 정의된 바와 같은 면역원성 조성물의 제조에 있어서, (a) 상기 제 1 인플루엔자 균주로부터의 인플루엔자 바이러스 또는 이의 항원성 제조물, 및 (b) 본원에 정의된 수중유 에멀젼 애주번트의 용도가 제공된다.
또한, 제 1 인플루엔자 균주의 변이체인 인플루엔자 균주에 의해 야기된 인플루엔자 감염에 대한 인간 또는 인간 집단의 보호에서 사용하기 위한, 상기 제 1 인플루엔자 균주로부터의 인플루엔자 바이러스 또는 이의 항원성 제조물, 및 본원에 정의된 수중유 에멀젼 애주번트를 포함하는 면역원성 조성물이 제공된다.
본 발명의 양태는 본원에 정의된 바와 같은 애주번트 첨가된 인플루엔자 조성물로 이전에 백신접종(1회 또는 2회 용량)된 인간의 재백신접종을 위한 인플루엔자 면역원성 조성물의 제조에 있어서 인플루엔자 항원의 용도를 제공한다. 또한, 본원에 정의된 바와 같은 애주번트 첨가된 인플루엔자 조성물로 이전에 백신접종(1회 또는 2회 용량)된 인간의 재백신접종에 사용하기 위한, 인플루엔자 바이러스 또는 이의 항원성 제조물과 함께 임의로 본원에 정의된 바와 같은 수중유 에멀젼 애주번트를 포함하는 면역원성 조성물이 제공된다.
한 구체예에서, 재백신접종을 위한 면역원성 조성물은 일차 백신접종에 사용되는 인플루엔자 바이러스 또는 이의 항원성 제조물과 공통의 CD4 T-세포 에피토프를 공유하는 인플루엔자 바이러스 또는 이의 항원성 제조물을 함유한다. 공통의 CD4 T 세포 에피토프는 동일한 CD4 세포에 의해 인지될 수 있는 상이한 항원으로부터의 펩티드/서열/에피토프를 의미한다(예를 들어, 문헌[Gelder C et al. 1998, lnt Immunol. 10(2):211-22; Gelder CM et al. 1996 J Virol. 70(7):4787-90; Gelder CM et al. 1995 J Virol. 1995 69(12):7497-506]에 기재된 에피토프 참조).
본 발명의 한 양태에서, 제 1 인플루엔자(임의로, 범유행성) 균주의 변이체인 인플루엔자 균주에 의해 야기된 인플루엔자 감염에 대한 보호를 위한 본원에 정의된 바와 같은 애주번트 첨가된 면역원성 조성물의 제조에 있어서, 제 1 인플루엔자(임의로, 범유행성) 균주로부터의 인플루엔자 바이러스 또는 이의 항원성 제조물의 용도가 제공된다. 또한, 제 1 인플루엔자(임의로, 범유행성) 균주의 변이체인 인플루엔자 균주에 의해 야기된 인플루엔자 감염에 대한 보호에 사용하기 위한, 제 1 인플루엔자(임의로, 범유행성) 균주로부터의 인플루엔자 바이러스 또는 이의 항원성 제조물, 및 본원에 정의된 바와 같은 애주번트를 포함하는 애주번트 첨가된 면역원성 조성물이 제공된다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 본원에 청구된 애주번트 첨가된 인플루엔자 조성물 또는 변이체 인플루엔자 균주를 포함하는 애주번트 첨가된 인플루엔자 조성물로 이전에 백신접종된 인간의 재백신접종을 위한 인플루엔자 면역원성 조성물의 제조에 있어서 인플루엔자 바이러스 또는 이의 항원성 제조물의 용도를 제공하며, 상기 애주번트는 본원에 정의된 바와 같다. 또한, 본원에 청구된 애주번트 첨가된 인플루엔자 조성물 또는 변이체 인플루엔자 균주를 포함하는 애주번트 첨가된 인플루엔자 조성물로 이전에 백신접종된 인간의 재백신접종에 사용하기 위한, 인플루엔자 바이러스 또는 이의 항원성 제조물과 함께 임의로 본원에 정의된 바와 같은 수중유 에멀젼 애주번트를 포함하는 인플루엔자 면역원성 조성물이 제공되며, 상기 애주번트는 본원에 정의된 바와 같다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 (ⅰ) 제 1 인플루엔자 바이러스 균주로부터의 인플루엔자 바이러스 또는 이의 항원성 제조물 및 본원에 정의된 바와 같은 애주번트를 포함하는 제 1 조성물, 및 (ⅱ) 상기 제 1 인플루엔자 바이러스 균주의 인플루엔자 바이러스 균주 변이체를 포함하는 제 2 면역원성 조성물을 인간에 투여하는 것을 포함하는, 1개의 인플루엔자 바이러스 균주에 대해 인간 집단 또는 개체를 백신접종한 후 변이체 인플루엔자 바이러스 균주에 대해 상기 인간 또는 집단을 재백신접종하는 방법을 제공한다. 한 특정 구체예에서, 상기 제 1 균주는 범유행병과 관련되거나, 범유행병 발생과 관련될 잠재성을 갖는다. 또 다른 특정 구체예에서, 상기 변이체 균주는 범유행병과 관련되거나, 범유행병 발생과 관련될 잠재성을 갖는다. 특히, 재백신접종은 순환하는 범유행성 균주인 1개 이상의 균주를 포함하는 인플루엔자 조성물로 이루어진다. 또 다른 구체예에서, 상기 변이체 균주는 임의로 제 1 균주로서 사용되는 H3N2에 가깝거나 적합하게는 먼 클레이드로부터의 드리프트 변이체이다. 또 다른 구체예에서, 상기 변이체 균주는 제 1 B 균주(예를 들어, 상이한 계통에 속하는, B/야마가타 또는 B/빅토리아)의 계통과 상이한 계통의 B 균주이다. 프라이밍 조성물 및 부스팅 조성물 둘 모두는 1가 또는 적합하게는 다가일 수 있고, 즉 이는 2개 이상의 인플루엔자 바이러스 균주, 예를 들어, 2가, 3가, 4가 또는 5가 백신을 함유할 수 있다. 조성물(들)이 다가인 경우, 1개 이상의 균주는 적합하게는 범유행성 균주, B 균주(예를 들어, B/야마가타 또는 B/빅토리아), H3N2 균주로 구성된 그룹으로부터 선택되고, 이는 임의로 일차 백신접종에 사용된 백신에 존재하는 균주의 드리프트 변이체이다.
일차 백신접종은 적합하게는 상기 정의된 바와 같이 동일한 진행성 면역 반응 동안 수주 이내에 투여되는 2회 용량을 포함할 수 있다. 통상적으로, 재백신접종은 일차 백신접종 수개월 후, 적합하게는 일차 백신접종의 3개월 이상 후, 또는 4개월 후, 적합하게는 8 내지 14개월 후, 적합하게는 약 10 내지 12개월 후, 또는 이 이상 후에 이루어진다. 적합하게는, 재백신접종은 일차 백신접종(들) 6개월 이상 후에 이루어진다. 적합하게는, 재백신접종은 다음 인플루엔자 계절에 가깝게 또는 다음 인플루엔자 계절에 이루어지고, 예를 들어, 첫번째 면역원성 조성물의 약 1년 후에 이루어진다. 부스팅 조성물은 또한 매 후년(세번째, 네번째, 다섯번째 백신접종 등)에 제공될 수 있다.
따라서, 한 구체예에서, 본 발명은 (ⅰ) 연중 어느 시간(즉, 인플루엔자 계절 외)에 1 또는 2회 용량으로 제공(적합하게는, 간격을 두어, 예를 들어, 3 내지 6주 또는 3 내지 4주의 간격을 두어)되는 본 발명에 따른 애주번트 첨가된 조성물로 이루어지는 일차 백신접종 후의 (ⅱ) 일차 백신접종 6주 이상 내지 1년 후에 투여되는 부스트 백신접종을 포함하는, 백신접종 계획(또는 이러한 계획에서 사용되는 조성물)을 제공한다. 2회 용량이 일차 백신접종에서 투여되는 경우, 일차는 애주번트 첨가된 3가 또는 4가 계절 백신 후, 범유행성(예를 들어, 1가)의 애주번트 첨가된 백신의 두번째 용량에 의해 이루어질 수 있다. 적합하게는, 부스트는 일차 백신접종 6주 이상 후 및 통상적인 면역화 예정표(예를 들어, 아동용) 내의 임의의 시간, 또는 다음 인플루엔자 계절에 투여된다. 부스트 조성물은 임의의 시판되는 승인된 인플루엔자 백신(예를 들어, 고전적인 3가의 애주번트 첨가되거나 첨가되지 않은 백신, 예를 들어, FluAd™), 또는 본 발명에 따른 애주번트 첨가된 조성물(예를 들어, 애주번트 첨가된 3가 또는 4가 조성물)을 이용할 수 있다. 적합하게는, 부스트 조성물은 일차 백신에 존재하는 균주로부터의 드리프트 변이체일 수 있는, 계절용의 순환하는 계절성 균주를 포함한다. 이러한 백신접종 계획은 이용가능한 백신으로 생애 초기(예를 들어, 6개월 미만 또는 2개월 미만의 연령)에 프라이밍된 후, 일차 조성물에 존재하는 균주로부터의 드리프트 변이체일 수 있는 순환 균주를 포함하는 조성물로 부스팅될 수 있는 소아 집단에 적합하다.
재백신접종을 위한 면역원성 조성물(부스팅 조성물)은 불활성화되거나 생(生) 약독화된 임의의 유형의 항원 제조물을 함유할 수 있다. 이는 일차 백신접종에 사용된 면역원성 조성물과 동일한 유형의 항원 제조물, 예를 들어, 스플리트 인플루엔자 바이러스 또는 이의 항원성 제조물, 전체 비리온, 또는 정제된 HA 및 NA(서브유닛) 백신을 함유할 수 있다. 부스팅 조성물은 일차 백신접종에 사용된 것과 동일한 서브타입의 인플루엔자 항원(들)을 함유할 수 있다. 예를 들어, 일차 백신접종이 범유행병의 선언시에 이루어지고 재백신접종이 이후에 이루어지는 경우, 재백신접종은 일차 백신접종에 사용된 것(예를 들어, H5N1 베트남)과 동일한 서브타입인 인플루엔자 균주(예를 들어, H5N1 베트남)를 포함하는 백신으로 이루어진다. 대안적으로, 부스팅 조성물은 일차 백신접종에 사용된 것, 예를 들어, H5N1 인도네시아와 동일한 서브타입의 인플루엔자 항원(들)의 드리프트 균주를 함유할 수 있다. 또 다른 구체예에서, 재백신접종에 사용된 상기 인플루엔자 균주는 시프트 균주이고, 즉 이는 일차 백신접종에 사용된 것과 상이하며, 예를 들어, 이는 상이한 HA 또는 NA 서브타입, 예를 들어, H5N2(HA 서브타입은 H5N1과 동일하나, NA 서브타입은 상이함) 또는 H7N1(HA 서브타입은 H5N1과 상이하나, NA 서브타입은 동일함)을 갖는다. 예를 들어, 일차 면역화를 위한 백신 조성물은 A/인도네시아 균주를 포함하고, 부스팅 조성물은 A/홍콩, A/터키, A/베트남 및/또는 A/안후이 균주(들)을 포함한다.
한 구체예에서, 스플리트 바이러스가 사용된다. 부스팅 조성물은 애주번트 첨가되거나 애주번트 참가되지 않을 수 있다. 애주번트 첨가되지 않은 부스팅 조성물은 적절한 인플루엔자 계절의 WHO 권고된 균주로부터 제조된 3개의 불활성화 스플리트 비리온 항원을 함유하는, 근내 투여되는 플루아릭스(Fluarix™)/α-릭스(α-Rix?)/인플루스플리트(Influsplit?)일 수 있다. 특히, 인플루엔자 바이러스 균주 또는 이의 항원성 제조물은 이들이 재백신접종 해에 순환되는 인플루엔자 균주에 적합되도록, 세계보건기구에 의해 배포된 참고자료에 따라 선택된다. 애주번트 첨가된 부스팅 조성물은 적합하게는 본원에 정의된 바와 같은 수중유 에멀젼 애주번트와 함께 임의로 추가의 면역자극제, 예를 들어, TLR-4 리간드, 예를 들어, 3D-MPL 또는 사포닌을 포함할 수 있다.
적합하게는, 본원에 정의된 애주번트를 포함하는 조성물로 이루어진 재백신접종은 애주번트 첨가되지 않은 인플루엔자 바이러스 또는 이의 항원성 제조물을 이용한 일차 백신접종으로 유도된 동등한 반응에 비해, (ⅰ) 인플루엔자 바이러스 또는 이의 항원성 제조물에 대한 개선된 CD4+ T-세포 면역 반응, 또는 (ⅱ) 개선된 B 세포 기억 반응, 또는 (ⅲ) 개선된 체액 반응 중 어느 하나, 적합하게는 2개 또는 전부를 유도한다. 적합하게는, 본원에 정의된 바와 같은 애주번트를 포함하는 조성물로 이루어지는 재백신접종은 성분이 높은 수준으로 존재하는 애주번트로 애주번트 첨가된 인플루엔자 바이러스 또는 이의 항원성 제조물을 이용한 일차 백신접종 후에 유도된 동등한 반응에 비해, (ⅰ) 인플루엔자 바이러스 또는 이의 항원성 제조물에 대해 동등한 CD4+ T-세포 면역 반응, 또는 (ⅱ) 동등한 B 세포 기억 반응, 또는 (ⅲ) 동등한 체액 반응 중 어느 하나, 적합하게는 2개 또는 전부를 유도한다.
본 발명에 따른 한 양태에서, 상기 정의된 양의 대사가능한 오일(임의로, 스쿠알렌), 토콜(임의로, 알파-토코페롤), 및 유화제(임의로, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레에이트)를 포함하는 수중유 에멀젼 애주번트 및 인플루엔자 바이러스를 포함하는 부스팅 조성물을 이용한 피검체의 재백신접종은 애주번트가 첨가되지 않은 조성물로 일차 백신접종되고, 애주번트가 첨가되지 않은 조성물로 부스팅된 인간 그룹에서의 상응하는 값보다 높은 항체 역가를 보여줄 것이다. 재백신접종에 대한 항체 반응을 향상시킴에 있어서 애주번트의 효과는 인플루엔자 바이러스에 의한 감염 또는 백신접종에 대해 낮은 반응을 갖는 것으로 알려진 노인 집단 또는 어린 소아 집단에서 특히 중요하다. 특히, 애주번트 첨가된 조성물과 관련된 이점은 재백신접종 후 CD4 T-세포 반응을 개선시킨다는 점에서 두드러진다.
재백신접종을 위한 본 발명의 애주번트 첨가된 조성물은 대조군 백신에 의해 부여된 보호와 비교하여 드리프트된 균주(다음 인플루엔자 계절로부터의 인플루엔자 균주)에 대해 보다 우수한 교차-반응성을 유도할 수 있다. 상기 교차-반응성은 애주번트가 첨가되지 않은 제형으로 얻어지는 것과 비교하여 보다 높은 지속성을 나타내었다. 드리프트된 균주에 대한 교차-반응성을 향상시키는데 있어서 애주번트의 효과는 범유행병 상황에서 중요하다.
한 추가 구체예에서, 본 발명은 일차 백신접종을 잠재적으로 범유행병을 야기할 수 있었던 인플루엔자 균주를 함유하는 인플루엔자 조성물, 적합하게는 스플리트 인플루엔자 조성물로 수행하고, 재백신접종을 범유행성 균주 또는 고전적인 균주인 하나 이상의 순환 균주를 포함하는 일가 또는 다가 조성물로 수행하는 백신접종 요법에 관한 것이다.
한 특정 구체예에서, 재백신접종을 위한 면역원성 조성물의 인간 용량은 수중유 에멀젼 애주번트로 애주번트 첨가된다. 적합하게는, 이러한 애주번트는 토콜을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 적합하게는, 용량당 균주당 HA는 약 15 ㎍이다. 한 특정 구체예에서, 균주당 HA는 적은 양의 HA(임의로, 용량당 40-45 ㎍ HA의 최대값을 달성하기 위해, 용량당 균주당 약 10 ㎍ HA 또는 이 미만)이고, 이는 상기 정의된 바와 같다. 적합하게는, 균주당 HA는 약 5 ㎍ 또는 5 ㎍ 미만, 약 2.5 ㎍ 또는 2.5 ㎍ 미만이다. 적합하게는, 애주번트 조성물은 각각 용량당 5-6 mg, 5-6 mg 및 2-3 mg의 양의 스쿠알렌, 알파-토코페롤 및 폴리소르베이트 80을 포함하는 수중유 에멀젼이다. 대안적으로, 애주번트 조성물은 각각 용량당 2.5-3.5 mg, 2-3 mg 및 1-2 mg의 양의 스쿠알렌, 알파-토코페롤 및 폴리소르베이트 80을 포함하는 수중유 에멀젼이다. 재백신접종을 위한 면역원성 조성물의 인간 용량은 적합하게는 일차 백신접종에 사용된 조성물에 존재하는 성분의 절반을 포함하는 수중유 에멀젼 애주번트를 포함하고, 이는 적합하게는 용량당 2.5-3.5 mg, 2-3 mg 및 1-2 mg의 양의 스쿠알렌, 알파-토코페롤 및 폴리소르베이트 80을 포함하는 수중유 에멀젼을 포함할 것이다. 한 특정 구체예에서, 상기 재백신접종 용량은 일차 백신접종 약 1년 후 또는 약 2년 후에 제공된다.
HA에서의 CD4 에피토프
본 항원성 드리프트는 바이러스 표면 단백질인 헤마글루티닌(HA) 및 뉴라미니다아제(NA)의 에피토프 영역에 주로 존재한다. 숙주 면역 시스템의 적응성 반응을 회피하는 바이러스에 의해 사용되는, 상이한 인플루엔자 균주 간의 CD4 및 B 세포 에피토프에서의 임의의 차이점이 인플루엔자 백신접종에 중요한 역할을 할 것으로 공지되어 있다.
상이한 인플루엔자 균주에 의해 공유되는 CD4 T-세포 에피토프가 인간에게서 확인되었다[참조예: Gelder C et al. 1998, Int Immunol. 10(2):211-22; Gelder CM et al. 1996 J Virol. 70(7):4787-90; and Gelder CM et al. 1995 J Virol. 1995 69(12):7497-506].
한 특정 구체예에서, 재백신접종은 일차 백신접종에 사용된 인플루엔자 바이러스 항원 또는 이의 항원성 제조물과 공통되는 CD4 T-세포 에피토프를 공유하는 인플루엔자 바이러스 또는 이의 항원성 제조물을 함유하는 부스팅 조성물을 사용함으로써 이루어진다. 따라서, 본 발명은 추가로 부스팅 투여량으로서 일차 백신접종에 제공된 투여량의 범유행성 인플루엔자 바이러스 항원 또는 이의 바이러스 항원성 제조물과 공통되는 CD4 T-세포 에피토프를 공유하는 인플루엔자 바이러스 또는 이의 항원성 제조물을 포함하는 다중용량 백신의 일차 백신접종-성분의 제조에 있어서, 범유행성 인플루엔자 바이러스 또는 이의 항원성 제조물 및 상기 정의된 수중유 에멀젼 애주번트를 포함하는 면역원성 조성물의 용도에 관한 것이다.
백신접종 수단
본 발명의 조성물은 피내, 점막, 예를 들어, 비내, 경구, 근내 또는 피하와 같은 임의의 적합한 전달 경로에 의해 투여될 수 있다. 그 밖의 전달 경로가 당 분야에 널리 공지되어 있다.
근내 전달 경로가 애주번트 첨가된 인플루엔자 조성물에 특히 바람직하다. 본 발명에 따른 조성물은 범유행성 백신에 특히 적합한 단일용량 용기 또는 대안적으로 다중용량 용기로 제공될 수 있다. 이 경우, 티오메르살(thiomersal)과 같은 항균 보존제가 사용 동안의 오염을 방지하기 위해 통상적으로 존재한다. 티오메르살 농도는 25 ㎍/0.5 ㎖ 용량 (즉, 50 ㎍/㎖)일 수 있다. 5 ㎍/0.5 ㎖ 용량 (즉, 10 ㎍/㎖) 또는 10 ㎍/0.5 ㎖ 용량 (즉, 20 ㎍/㎖)의 티오메르살 농도가 적합하다. 바늘이 없는 액체 제트(jet) 주사 장치와 같은 적합한 IM 전달 장치, 예를 들어, 바이오젝터 2000(Bioject, Portland, OR)이 이용될 수 있다. 대안적으로는, 에피네프린의 앳-홈(at-home) 전달에 이용되는 것과 같은 펜-인젝터(pen-injector) 장치를 백신의 자가 투여를 위해 이용할 수 있었다. 이러한 전달 장치의 이용은 범유행병 동안 요구될 대규모 면역화 캠페인에 특히 적합할 수 있다.
피내 전달이 또 다른 적합한 경로이다. 임의의 적합한 기구, 예를 들어, 숏 니들(short needle) 기구가 피내 전달에 사용될 수 있다. 피내 백신은 또한 본원에 참고로서 포함되는 WO 99/34850호 및 EP 1092444호에 기술된 것들과 같이, 피부에 침투되는 효과적인 니들 길이를 제한하는 기구 및 이의 기능적 등가물에 의해 투여될 수도 있다. 또한, 액체 젯트 인젝터를 통해 또는 각질층을 뚫어 진피에 이르는 젯트를 생성하는 니들을 통해 진피에 액체 백신을 전달하는 젯트 주사 기구가 적합하다. 또한, 분말 형태의 백신을 피부의 외층을 통해 진피로 가속화시키기 위해 압축 기체를 사용하는 탄도 분말/입자 전달 기구가 적합하다. 또한, 통상적인 주사기가 피내 투여의 고전적인 망토우(mantoux) 방법에서 사용될 수 있다.
또 다른 적합한 투여 경로는 피하 경로이다. 임의의 적합한 기구, 예를 들어, 고전적인 니들이 피하 전달에 사용될 수 있다. 적합하게는, 니들 부재 젯트 인젝터 서비스가 사용된다. 적합하게는, 이러한 기구는 액체 백신 제형으로 미리 충전된다.
대안적으로, 백신은 비내 투여된다. 통상적으로, 백신은 적합하게는 폐에 흡입되지 않으면서 비인두 영역에 국부적으로 투여된다. 폐에 도입되지 않거나, 실질적으로 도입되지 않으면서 비인두 영역에 백신 제형을 전달하는 비내 전달 기구를 사용하는 것이 바람직할 수 있다.
본 발명에 따른 백신의 비내 투여에 적합한 기구는 분무 기구이다. 적합하게는, 시판되는 비강 분무 기구는 아쿠스프레이(Accuspray™)(Becton Dickinson)를 포함한다. 네뷸라이저(nebuliser)는 폐에 쉽게 흡입될 수 있어 비강 점막에는 효과적으로 도달하지 않는 매우 미세한 분무를 생성한다. 그러므로, 네뷸라이저는 바람직하지 않다.
비내 사용에 적합한 분무 기구는 기구의 성능이 사용자에 의해 가해지는 압력에 의존하지 않는 기구이다. 이러한 기구는 압력 역치 기구(pressure threshold device)로서 공지되어 있다. 액체는 역치 압력이 가해지는 경우에만 노즐로부터 방출된다. 이러한 기구는 규칙적인 점적 크기를 갖는 분무를 용이하게 달성하도록 한다. 본 발명에 사용하기에 적합한 압력 역치 기구는 당해 공지되어 있으며, 예를 들어, 본원에 참고로서 포함되는 WO 91/13281호 및 EP 311 863B호에 기술되어 있다. 이러한 기구는 파이퍼 게엠바하(Pfeiffer GmbH)로부터 시판되며, 또한 문헌(Bommer, R. Pharmaceutical Technology Europe, Sept 1999)에 개시되어 있다.
적합한 비내 기구는 1 내지 200㎛, 적합하게는 10 내지 120㎛ 범위의 점적(액체로서 물을 사용하여 측정함)을 생성한다. 10㎛ 미만의 경우, 흡입 위험이 있으므로, 10㎛ 미만의 점적은 약 5% 이하인 것이 바람직할 수 있다. 120㎛ 초과의 점적 뿐만 아니라 보다 작은 점적은 확산되지 않으므로, 120㎛를 초과하는 점적은 약 5% 이하인 것이 바람직할 수 있다.
이중-용량 전달(Bi-dose delivery)이 본 발명에 따른 백신과 사용하기 위한 비내 전달 시스템의 추가의 적합한 특징이다. 이중-용량 기구는 단일 백신 용량의 두개의 서브-용량, 즉, 각 콧구멍에 투여하기 위한 하나의 서브-용량을 함유한다. 일반적으로, 두개의 서브-용량은 단일 챔버에 존재하며, 기구의 구성이 한번에 단일 서브-용량의 전달을 효과적이게 한다. 대안적으로, 본 발명에 따른 백신을 투여하기 위해 단일용량 기구가 사용될 수 있다.
대안적으로, 상피 또는 경피 백신 접종 경로 또한 본 발명에서 고려된다.
본 발명의 한 양태에서, 일차 투여를 위한 애주번트 첨가된 면역원성 조성물은 근내 제공될 수 있으며, 애주번트 첨가되거나 첨가되지 않은 부스팅 조성물은 상이한 경로, 예를 들어, 피내, 피하 또는 비내를 통해 투여될 수 있다. 한 특정 구체예에서, 일차 투여를 위한 조성물은 범유행성 인플루엔자 균주에 대해 15㎍ 미만의 HA 양을 함유하고, 부스팅 조성물은 표준 양인 15㎍을 함유하거나, 적합하게는 적은 양의 HA, 즉 15㎍ 미만의 HA를 함유할 수 있으며, 투여 경로에 따라 보다 적은 용량으로 투여될 수 있다.
본 발명의 백신은 단일 용량으로 투여될 수 있으나, 이의 성분은 또한 동시에 또는 다양한 시점(예를 들어, 인플루엔자 항원은 별개로, 적합하게는 애주번트의 투여와 동시에 투여될 수 있음)에서 함께 공동 투여될 수 있다. 단일 경로의 투여 외에, 2회의 주사가 투여되는 경우 2개의 상이한 경로의 투여가 이용될 수 있다. 예를 들어, 애주번트 첨가된 인플루엔자 항원의 일차 투여(예를 들어, 프라이밍 용량)는 IM(또는 ID) 투여될 수 있고, 이차 투여(예를 들어, 부스터 용량)는 IN(또는 ID) 투여될 수 있다. 또한, 본 발명의 백신은 프라이밍 용량에 대해 IM 투여될 수 있고, 부스터 용량에 대해 IN 투여될 수 있다.
백신 내의 인플루엔자 항원의 함량은 통상적으로 인플루엔자 균주당 0.1-15 ㎍ HA, 적합하게는 1-1O㎍, 가장 통상적으로는 1-8㎍의 범위일 것이다. 인플루엔자 항원의 적절한 함량은 백신 내에 포함되는 인플루엔자 균주당 5 ㎍ HA 미만 또는 정확히 5 ㎍ HA일 것이다. 최초의 백신접종 후, 피검체는 적당한 간격으로 1회 또는 수회의 부스터 면역화를 투여받을 수 있다.
백신접종을 위한 집단
백신접종을 위한 표적 집단은 건강한 성인 (예를 들어, 18-50세 또는 18-60세의 연령), 노인 (통상적으로 60세가 넘음) 또는 유아/소아와 같은 전체 집단이다. 표적 집단은 특히 면역 약화된 집단일 수 있다. 면역-약화된 인간은 일반적으로 건강한 성인과 비교하여 항원, 특히 인플루엔자 항원에 대해 덜 반응할 수 있다.
본 발명에 따른 한 양태에서, 표적 집단은 나이브(예를 들어, 범유행성 균주를 경험한 적 없음)이거나, 인플루엔자 감염 또는 백신접종에 대해 이전에 반응한 적이 없는, 인플루엔자에 대해 프라이밍되지 않은 집단이다. 적합하게는, 표적 집단은 적어도 60세, 또는 65세 이상의 노인, 보건 연구소에서 일하는 인간들과 같은 보다 젊은 고위험 성인(즉, 18세 내지 60세의 연령), 또는 심혈관 및 폐 질환, 또는 당뇨병과 같은 위험 인자를 지닌 젊은 성인이다. 또 다른 표적 집단은 비교적 높은 인플루엔자 관련 입원률을 겪는 탄생, 또는 2개월 이상의 연령, 또는 6개월 이상의 연령, 특히 6-23개월의 모든 아동이다. 또 다른 표적 집단은 탄생으로부터 6개월 연령의 어린 아동이다.
특허 출원 및 특허결정된 특허를 포함하는 본 출원 내의 모든 참고문헌의 교시내용은 참조로서 본원에 완전히 포함된다. 우선권을 주장하는 임의의 특허 출원은 공개 및 참조를 위해 본원에 기재된 방식으로 전체내용이 본원에 참조로서 포함된다.
불확실성을 회피하기 위해, 본원의 용어 '포함하는', '포함하다' 및 '-들을 포함하다'는 본 발명자들에 의해 모든 경우에서 용어 '-으로 구성되는', '-으로 구성되다' 및 '-들로 구성되다'들과 임의로 치환될 수 있다. 본 발명의 "백신 조성물"과 관련된 본원의 구체예는 또한 본 발명의 "면역원성 조성물"과 관련된 구체예에 적용될 수 있고, 반대도 마찬가지이다. 모든 숫자 값에서의 용어 "약"(또는 "대략")은 5%의 변화를 허용하고, 즉 약 1.25%의 값은 1.19%-1.31%를 의미한다.
본 발명은 하기 비제한적 실시예를 참조로 하여 추가로 기술될 것이다:
실시예 I은 마우스, 페렛, 돼지 및 인간 연구에 사용된 면역학적 판독 방법 을 기술한 것이다.
실시예 Ⅱ는 예시된 연구에 사용된 수중유 에멀젼 및 애주번트 제형의 제조 를 기술한 것이다.
실시예 Ⅲ은 스플리트 인플루엔자 항원 제조물 및 2개의 용량의 AS03 애주번트를 함유하는 백신을 이용한 18-59세 연령의 성인 집단에서의 임상 시험을 설명한다.
실시예 Ⅳ는 프라이밍된 BALB/c 마우스에서 애주번트 첨가 및 애주번트 첨가되지 않은 스플리트 인플루엔자 백신(다양한 용량의 AS03 애주번트 포함)의 임상전 평가를 설명한다.
실시예 Ⅴ는 프라이밍된 C57BI/6 마우스에서 애주번트 첨가 및 애주번트 첨가되지 않은 스플리트 인플루엔자 백신(다양한 용량의 AS03 애주번트 포함)의 임상전 평가를 설명한다.
실시예 Ⅵ은 프라이밍된 C57BI/6 마우스에서 애주번트 첨가 및 애주번트 첨가되지 않은 스플리트 인플루엔자 백신(다양한 용량의 AS03 애주번트 및 저 용량 항원 포함)의 임상전 평가를 설명한다.
실시예 Ⅶ은 나이브 C57BI/6 마우스에서 애주번트 첨가 및 애주번트 첨가되지 않은 스플리트 H5N1 백신(다양한 용량의 AS03 애주번트 및 항원 포함)의 임상전 평가를 설명한다.
실시예 Ⅷ은 프라이밍된 대백돈(Large White pig)에서 애주번트 첨가 및 애주번트 첨가되지 않은 인플루엔자 백신의 임상전 평가를 설명한다.
실시예 Ⅸ은 나이브 및 프라이밍된 C57BI/6 마우스에서 애주번트 첨가 및 애주번트 첨가되지 않은 스플리트 TIV 및 QIV 계절 백신(다양한 용량의 AS03 애주번트 및 항원 포함)의 전임상 평가를 설명한다.
실시예 Ⅹ는 스플리트 인플루엔자 항원 제조물 및 다양한 용량의 AS03 애주번트를 함유하는 백신을 이용한 18-64세 연령의 성인 집단에서의 임상 시험을 나타낸다.
실시예 ⅩⅠ은 스플리트 인플루엔자 항원 제조물 및 다양한 애주번트를 함유하는 백신을 이용한 65세 이상의 연령의 노인 집단에서의 임상 시험을 나타낸다.
실시예 Ⅰ - 면역학적 판독 방법
Ⅰ.1. 마우스 방법
Ⅰ.1.1. 적혈구응집 억제 시험
시험 원리 (고전적 절차)
3개(계절성)의 인플루엔자 바이러스 균주에 대한 항-헤마글루티닌 항체 역가를 적혈구응집 억제 시험(HI)을 이용하여 결정하였다. HI 시험의 원리는 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌(HA)에 의한 적혈구 세포(RBC)의 적혈구응집을 억제하는 특정 항-인플루엔자 항체의 능력에 기초한다. 열에 의해 불활성화된 혈청을 카올린 및 RBC로 처리하여 비특이적 억제제를 제거하였다. 전처리 후, 혈청의 2배 희석액을 4 적혈구응집 단위의 각각의 인플루엔자 균주와 함께 인큐베이션시켰다. 이후, 적혈구 세포를 첨가하고, 응집의 억제를 기록하였다. 적혈구응집을 완전하게 억제한 혈청의 가장 높은 희석액의 역수로 역가를 나타내었다. 혈청의 첫 번째 희석액은 1:20이었으므로, 검출불가능한 수준은 10과 동일한 역가로 기록하였다.
H5N1 에 대한 적합화 (말 적혈구를 이용한 HI 의 구체적 기재):
항-HA 항체를 결정하기 위한 고전적인 HI 검정은 H5N1 균주에 잘 적용되도록 문서화되어 있지 않으므로, 말 RBC를 이용하여 적합된 프로토콜을 이용하였다.
말의 적혈구를 H5N1 범유행성 균주에 대하여 이용한다. 0.5% BSA(소 혈청 알부민, 최종 농도)를 함유하는 인산염 완충액 중 0.5% (최종 농도)의 말 적혈구 세포 현탁액. 적혈구를 동일한 인산염 완충액으로 세척하고 후속적인 원심분리 단계(10분, 2000 rpm)에 의해 상기 현탁액을 매일 제조한다. 이러한 세척 단계는 1회 반복되어야 한다. 말 적혈구 세포의 낮은 침강율로 인해 말 적혈구를 혈청 및 바이러스 현탁액의 반응 믹스에 첨가시킨 후, 플레이트를 실온(RT, 20℃+/-2℃)에서 2시간 동안 인큐베이션해야 한다.
통계적 분석
백신접종 후의 HI 역가에 대해 UNISTAT을 이용하여 통계적 분석을 수행하였다. 분산 분석에 적용된 프로토콜은 하기와 같이 간단히 기술될 수 있다:
■ 데이터의 Log 변환.
■ 그룹 분포의 정상 상태를 입증하기 위한 각각의 집단(그룹)에 대한 샤피로-윌크(Shapiro-Wilk) 시험.
■ 다양한 집단(그룹) 사이의 분산의 균질성을 확인하기 위한 코크란(Cochran) 시험.
■ 선택된 데이터에 대한 분산 분석
■ 이원 ANOVA의 상호작용에 대한 시험
■ 다중 비교를 위한 터키(Tukey)-HSD 시험.
Ⅰ.1.2. 세포내 사이토카인 염색
본 기술은 사이토카인 생성을 기초로 하여 항원 특이적 T 림프구의 정량을 가능케 한다: 효과기 T 세포 및/또는 효과기-기억 T 세포는 IFN-γ를 생성하고/하거나 중추 기억 T 세포는 IL-2를 생성한다. PBMC를 면역화 7일 후에 수거하였다.
림프구 세포를 분비 억제제(브레펠딘(Brefeldine))의 존재하에서 시험관내에서 재자극시켰다. 이후, 이러한 세포를 형광 항체(CD4, CD8, IFN-γ 및 IL-2)를 이용하는 통상적인 면역형광 방법에 의해 처리하였다. 결과를 CD4/CD8 T 세포 내의 사이토카인 양성 세포의 빈도로 나타내었다. T 세포의 사이토카인의 세포내 염색을 두 번째 면역화 7일 후에 PBMC에서 수행하였다. 마우스로부터 혈액을 수거하고, 헤파린 처리된 배지 RPMI+ Add에서 풀링시켰다. 혈액에 대해서는, RPMI+ Add 희석된 PBL 현탁액을 권장 프로토콜(2500 rpm 및 R.T에서 20분 동안 원심분리)에 따라 림포라이트-포유동물(Lympholyte-mammal) 구배 상에 층을 이루게 하였다. 계면의 단핵 세포를 분리시키고, RPMI+ Add로 2회 세척하고, PBMC 현탁액을 RPMI 5% 우태아 혈청 중에 2 x 106 세포/㎖로 조정하였다.
PBMC의 시험관내 항원 자극을 전체 FI(1 ㎍ HA/균주)와 함께 1 x 107 세포/㎖(튜브 FACS)의 최종 농도에서 수행한 다음, 항-CD28 및 항-CD49d(둘 모두 1 ㎍/㎖)를 첨가시켜 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션하였다.
항원 재자극 단계 후, PBMC를 브레펠딘(1 ㎍/㎖)의 존재하에서 37℃에서 밤새 인큐베이션시켜, 사이토카인 분비를 억제시켰다.
IFN-γ/IL-2/CD4/CD8 염색을 다음과 같이 수행하였다: 세포 현탁액을 세척하고, 2% Fc 차단 시약(1/50; 2.4G2)을 함유하는 50 ㎕의 PBS 1% FCS에 재현탁시켰다. 4℃에서의 10분의 인큐베이션 후, 50 ㎕의 항-CD4-PE(2/50) 및 항-CD8 perCp(3/50)의 혼합물을 첨가하고, 4℃에서 30분 동안 인큐베이션시켰다. PBS 1% FCS에서 세척한 후, 세포를 200 ㎕의 사이토픽스-사이토펌(Cytofix-Cytoperm)(Kit BD)에 재현탁시킴으로써 투과화시키고, 4℃에서 20분 동안 인큐베이션시켰다. 이후, 세포를 펌 워시(Perm Wash)(Kit BD)로 세척하고, 펌 워시에 희석된 50 ㎕의 항-IFN-γ APC(1/50) + 항-IL-2 FITC(1/50)의 혼합물에 재현탁시켰다. 4℃에서 최소 2시간, 최대 밤새 인큐베이션시킨 후, 세포를 펌 워시로 세척하고, PBS 1% FCS + 1% 파라포름알데히드에 재현탁시켰다. FACS에 의해 샘플 분석을 수행하였다. 살아 있는 세포를 게이팅(gating)(FSC/SSC)시키고, CD4+T 세포 상의 ~ 20,000개의 이벤트(림프구) 또는 35,000개의 이벤트에서 포착(acquisition)을 수행하였다. IFN-γ+ 또는 IL2+의 백분율을 CD4+ 및 CD8+ 게이팅된 집단에서 계산하였다.
I.1.3. 항- H5N1 ELISA .
항-H5N1 Ig, IgG1 및 IgG2b 항체 역가의 정량을 코팅으로서 스플리트 H5N1을 이용한 ELISA에 의해 수행하였다. 바이러스 및 항체 용액을 웰 당 100 ㎕로 이용하였다. 스플리트 바이러스 H5N1을 PBS에서 1 ㎍/㎖의 최종 농도로 희석시키고 96 웰 미세역가 플레이트(Maxisorb Immunoplate Nunc 439454)의 웰에 4℃에서 밤새 흡 착시켰다. 이후, 플레이트를 1% BSA 및 0.1% 트윈 20을 함유하는 웰 당 200 ㎕의 PBS (포화 완충액)와 함께 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 포화 완충액 중 혈청의 22배 희석액을 H5N1-코팅된 플레이트에 첨가하고 37℃에서 1시간 30분 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 PBS 0.1% 트윈 20으로 4회 세척하였다. PBS 1% BSA 0.1% 트윈 20에 1/500 희석된 비오티닐화-컨주게이션된 항-마우스 Ig(Prozan-E0413) 또는 1/4000 희석된 비오티닐화-컨주게이션된 항-마우스 IgG1(Imtech 1070-08) 또는 비오티닐화된 항-마우스 IgG2b(Imtech 1090-08)를 각 웰에 첨가하고 37℃에서 1시간 30분 동안 인큐베이션하였다; 세척 단계 후, 플레이트를 PBS 1% BSA 트윈 20에 1/10000 희석된 스트렙타비딘-비오틴-프리옥시다아제 컨주게이션(Prozan P0397)과 함께 30분 동안 인큐베이션하였다.
비색 계시를 위해, 플레이트를 0.1M 시트레이트 완충액(pH 4.2) 중 o-페닐디아민(Sigma P4664) 0.04% H2O2 0.03%의 용액과 함께 22℃에서 20분 동안 인큐베이션하였다. H2SO4 2N으로 반응을 중단시키고, 490-630 nm에서 미세플레이트를 판독하였다.
I.2. 페렛 방법
I.2.1. 적혈구응집 억제 시험(HI)
시험 절차
세 개의 인플루엔자 바이러스 균주에 대한 항-헤마글루티닌 항체 역가를 적혈구응집 억제 시험(HI)을 이용하여 결정하였다. HI 시험의 원리는 인플루엔자 바 이러스 헤마글루티닌(HA)에 의한 닭 적혈구 세포(RBC)의 적혈구응집을 억제하는 특정 항-인플루엔자 항체의 능력에 기초한다. 혈청을 먼저 25% 뉴라미니다아제 용액(RDE)으로 처리하고, 열-불활성화시켜 비특이적 억제제를 제거하였다. 전처리 후, 혈청의 두 배의 희석액을 4 적혈구응집 단위의 각각의 인플루엔자 균주와 함께 인큐베이션시켰다. 이후, 닭 적혈구 세포를 첨가하고, 응집의 억제를 기록하였다. 적혈구응집을 완전하게 억제한 혈청의 가장 높은 희석액의 역수로 역가를 나타내었다. 혈청의 첫번째 희석액은 1:10이었으므로, 검출불가능한 수준은 5와 동일한 역가로 기록하였다.
통계적 분석
UNISTAT을 이용하여 HI 역가 (공격(challenge) 41일 전)에 대해 통계적 분석을 수행하였다. 분산 분석에 적용된 프로토콜은 하기와 같이 간단히 기술될 수 있다:
■ 데이터의 Log 변환.
■ 그룹 분포의 정상 상태를 입증하기 위한 각각의 집단(그룹)에 대한 샤피로-윌크 시험.
■ 다양한 집단(그룹) 사이의 분산의 균질성을 확인하기 위한 코크란 시험.
■ 일원 ANOVA의 상호작용에 대한 시험.
■ 다중 비교를 위한 터키-HSD 시험.
I.2.2. 체온 모니터링
개별적 온도를 공격 기간 동안 트랜스미터를 이용하여 원격측정 기록에 의해 모니터링하였다. 모든 이식물을 조사하고, 쇄신시키고, 복강내에 배치시키기 전에 DSI(Data Sciences International, Centaurusweg 123, 5015 TC Tilburg, The Netherlands)에 의해 새로운 교정을 수행하였다. 모든 동물을 상기 측정 동안 하나의 우리에서 개별적으로 사육하였다. 온도를 공격 4일 전부터 공격 7일 후까지 매 15분마다 기록하였다.
I.2.3. 비내 세척
의식이 있는 동물의 양 콧구멍에 5 ㎖의 PBS를 투여함으로써 비내 세척을 수행하였다. 접종물을 페트리 접시에 수거하고, 드라이아이스 상의 샘플 용기에 두었다.
비내 세척액에서의 바이러스 적정
모든 비내 샘플을 먼저 스핀(Spin) X 필터(Costar)를 통해 여과 멸균시켜, 임의의 박테리아 오염물을 제거하였다. 50 ㎕의 비내 세척물의 연속 10배 희석액을 50 ㎕의 배지를 함유하는 미세역가 플레이트(10 웰/희석액)로 옮겼다. 이후, 100 ㎕의 MDCK 세포(2.4 x 105 세포/㎖)를 각각의 웰에 첨가하고, 5-7일 동안 35℃에서 인큐베이션시켰다.
5-7일의 인큐베이션 후, 배양 배지를 천천히 제거하고, 100 ㎕의 1/20 WST-1 함유 배지를 첨가하고, 추가로 18시간 동안 인큐베이션시켰다.
살아 있는 세포에 의한 WST-1의 환원으로 생성된 황색 포르마잔 염료의 강도는 바이러스 적정 분석의 종료시에 웰에 존재하는 살아 있는 세포의 수에 비례하 며, 적절한 파장(450 나노미터)에서 각각의 웰의 흡광도를 측정함으로써 정량된다. 컷-오프(cut-off)는 감염되지 않은 대조 세포의 OD 평균인 0.3 OD(0.3 OD는 감염되지 않은 대조 세포의 OD의 +/- 3 StDev에 해당함)로 정의된다. OD가 컷-오프 미만인 경우 양성 스코어로 규정되고, 대조적으로 OD가 컷-오프를 초과하는 경우 음성 스코어로 규정된다. 바이러스 쉐딩(shedding) 역가를 "리드 및 뮌크(Reed and Muench)" 방법에 의해 결정하였고, Log TCID50/㎖로 나타내었다.
I.3. 돼지 방법
I.3.1. 적혈구응집 억제 시험(HI)
시험 절차
세 개의 인플루엔자 바이러스 균주에 대한 항-헤마글루티닌 항체 역가를 적혈구응집 억제 시험(HI)을 이용하여 결정하였다. HI 시험의 원리는 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌(HA)에 의한 닭 적혈구 세포(RBC)의 적혈구응집을 억제하는 특정 항-인플루엔자 항체의 능력에 기초한다. 혈청을 먼저 25% 뉴라미니다아제 용액(RDE)으로 처리하고, 열-불활성화시켜 비특이적 억제제를 제거하였다. 전처리 후, 혈청의 두 배의 희석액을 4 적혈구응집 단위의 각각의 인플루엔자 균주와 함께 인큐베이션시켰다. 이후, 닭 적혈구 세포를 첨가하고, 응집의 억제를 기록하였다. 적혈구응집을 완전하게 억제한 혈청의 가장 높은 희석액의 역수로 역가를 나타내었다. 혈청의 첫번째 희석액은 1:10이었으므로, 검출불가능한 수준은 5와 동일한 역가로 기록하였다.
통계적 분석
UNISTAT을 이용하여 HI 역가(공격 41일 전)에 대해 통계적 분석을 수행하였다. 분산 분석에 적용된 프로토콜은 하기와 같이 간단히 기술될 수 있다:
■ 데이터의 Log 변환.
■ 그룹 분포의 정상 상태를 입증하기 위한 각각의 집단(그룹)에 대한 샤피로-윌크 시험.
■ 다양한 집단(그룹) 사이의 분산의 균질성을 확인하기 위한 코크란 시험.
■ 일원 ANOVA의 상호작용에 대한 시험.
■ 다중 비교를 위한 터키-HSD 시험.
I.4. 인간에서의 면역 반응을 평가하기 위한 분석
I.4.1. 적혈구응집 억제 분석
인플루엔자에 대한 세계보건기구 협력센터, 미국 질병통제센터(Atlanta, USA (1991))에 의해 기술되는 방법을 이용하여 HI 항체를 측정함으로써 면역 반응을 결정하였다.
항체 역가 측정을 4 적혈구응집-억제 단위 (4 HIU)의 적절한 항원 및 0.5% 닭 적혈구 현탁액을 이용하는 표준화되고 광범위하게 인정된 미세법을 이용하여 해동된 동결 혈청 샘플에서 수행하였다. 열 처리 및 수용체-파괴 효소에 의해 비특이적 혈청 억제제를 제거하였다.
수득된 혈청을 HI 항체 수준에 대해 평가하였다. 1:10의 최초 희석으로부터 출발하여, 희석액 시리즈(2배)를 1:20480의 최종 희석까지 제조하였다. 적정 종점을 적혈구응집의 완전 억제(100%)를 나타낸 가장 높은 희석 단계로 택하였다. 모 든 분석을 이중으로 수행하였다.
I.4.2. 뉴라미니다아제 억제 분석
피투인(fetuin)-코팅된 미세역가 플레이트에서 분석을 수행하였다. 항혈청의 2배 희석 시리즈를 제조하고, 표준화된 양의 인플루엔자 A H3N2, H1N1 또는 인플루엔자 B 바이러스와 혼합시켰다. 시험은 피투인으로부터 뉴라민산을 효소적으로 방출시키는 뉴라미니다아제의 생물학적 활성을 기초로 하였다. 말단 뉴라민산의 절단 후, β-D-갈락토오스-N-아세틸-갈락토사민이 언마스킹(unmasking)되었다. 호스라디쉬 퍼옥시다아제(HRP)-표지된, 갈락토오스 구조에 특이적으로 결합하는 아 라키스 히포가에아(Arachis hypogaea)로부터의 땅콩 응집소를 웰에 첨가하였다. 결합된 응집소의 양을 검출할 수 있었고, 테트라메틸벤지딘(TMB)과의 기질 반응으로 정량하였다. 바이러스 뉴라미니다아제 활성을 여전히 50% 이상 억제하는 것으로 나타낸 가장 높은 항체 희석액이 NI 역가이다.
I.4.3. 중화 항체 분석
해동된 동결 혈청 샘플에서 중화 항체 측정을 수행하였다. 혈청 내에 함유된 항체에 의한 바이러스 중화를 미세중화 분석으로 결정하였다. 이러한 분석에서 혈청을 추가 처리 없이 사용하였다. 각각의 혈청을 삼중으로 시험하였다. 표준화된 양의 바이러스를 혈청의 연속 희석액과 함께 혼합하고, 인큐베이션시켜, 바이러스에 항체가 결합하도록 하였다. 이후, 소정량의 MDCK 세포를 함유하는 세포 현탁액을 바이러스 및 항혈청의 혼합물에 첨가하고, 33℃에서 인큐베이션시켰다. 인큐베이션 기간 후, 바이러스 복제를 닭 적혈구 세포의 적혈구응집에 의해 가시화시켰 다. 혈청의 50%의 중화 역가를 리드 및 뮌크(Reed and Muench) 방법에 의해 계산하였다.
I.4.4. 세포 매개된 면역성을 사이토카인 유세포분석(CFC)에 의해 평가하였다
말초 혈액 항원-특이적 CD4 및 CD8 T 세포를 이들의 상응하는 항원과 함께 인큐베이션시켜 IL-2, CD40L, TNF-알파 및 IFN를 생성시키기 위해 시험관내에서 재자극시킬 수 있었다. 이후, 세포 표현형 뿐만 아니라 세포내 사이토카인 생성의 통상적인 면역형광 표지 후에 유세포분석에 의해 항원-특이적 CD4 및 CD8 T 세포를 계수할 수 있었다. 본 연구에서, 인플루엔자 백신 항원 뿐만 아니라 특정 인플루엔자 단백질로부터 유래된 펩티드를 항원으로 사용하여 인플루엔자-특이적 T 세포를 재자극시켰다. 결과를 CD4 또는 CD8 T 세포 아집단 내의 사이토카인(들)-양성 CD4 또는 CD8 T 세포의 빈도로 나타내었다.
I.4.5. 통계적 방법
I.4.5.1. 일차 종점
· 백신접종 후의 7일의 후속 기간(즉, 백신접종일 및 이후의 6일) 및 전체 기간 동안 요망되는 국소적 및 전신적 증후 및 증상의 백분율, 강도 및 백신접종과의 관련성.
· 백신접종 후의 21일의 후속 기간(즉, 백신접종일 및 이후의 20일) 및 전체 기간 동안 요망지 않는 국소적 및 전신적 증후 및 증상의 백분율, 강도 및 백신접종과의 관련성.
· 전체 연구 동안의 심각한 부작용의 발생.
I.4.5.2. 이차 종점
체액 면역 반응의 경우:
관찰된 변화:
· 0일 및 21일: 백신 내에 존재하는 3개의 인플루엔자 바이러스 균주의 각각에 대해 별개로 시험된 혈청 적혈구응집-억제(HI) 및 NI 항체 역가(항-H1N1, 항-H3N2 & 항-B-항체).
· 0일 및 21일: 백신 내에 존재하는 3개의 인플루엔자 바이러스 균주의 각각에 대해 별개로 시험된 중화 항체 역가.
유도된 변화(95% 신뢰구간):
· 백신접종 전 및 후의 95% 신뢰구간(95% CI)을 지니는 혈청 HI 항체의 기하 평균 역가 (GMT).
· 21일에서 95% CI를 지니는 혈청전환률*
· 21일에서 95% CI를 지니는 전환 인자**
· 21일에서 95% CI를 지니는 혈청보호율***
· 모든 시점에서의 혈청 NI 항체 GMT(95% 신뢰구간을 지님).
* 혈청전환률은 각각의 백신 균주에 대해, 0일에 비해 21일에서의 혈청 HI 역가가 4배 이상 증가한 백신접종자의 백분율로 정의된다.
** 전환 인자는 각각의 백신 균주에 대해, 0일에 비해 21일에서의 혈청 HI GMT의 증가 배수로 정의된다.
*** 보호율은 백신접종 (각각의 백신 균주에 대해) 후에, 일반적으로 보호를 나타내는 것으로 인정되는 혈청 HI 역가가 40인 백신접종자의 백분율로 정의된다.
일부 임상 시험의 경우, 반응원성/안전성이 이차 종점일 수 있고, 면역원성이 일차 종점일 수 있음을 이해하여야 한다.
세포 매개 면역( CMI ) 반응의 경우
관찰된 변화
0일 및 21일: 다양한 시험에서의 106개의 세포당 사이토카인-양성 CD4/CD8 세포의 빈도. 각각의 시험은 하기 항원에 대한 CD4/CD8 T 세포의 반응을 정량한다:
· 펩티드 인플루엔자(pf) 항원(이러한 항원의 정확한 특성 및 기원은 제공되거나/설명되어야 함).
· 스플리트 인플루엔자(sf) 항원.
· 전체 인플루엔자(wf) 항원.
유도된 변화:
· 두개 이상의 상이한 사이토카인(CD40L, IL-2, IFNγ, TNFα)을 생성하는 세포.
· 적어도 CD40L 및 또 다른 사이토카인(IL-2, TNFα, IFNγ)을 생성하는 세포.
· 적어도 IL-2 및 또 다른 사이토카인(CD40L, TNFα, IFNγ)을 생성하는 세포.
· 적어도 IFNγ 및 또 다른 사이토카인(IL-2, TNFα, CD40L)을 생성하는 세포.
· 적어도 TNFα 및 또 다른 사이토카인(IL-2, CD40L, IFNγ)을 생성하는 세포.
I.3.5.3. 면역원성의 분석
면역원성 분석은 전체 백신접종된 코호트를 기초로 하였다. 각각의 처리 그룹에 대해, 하기 파라미터(95% 신뢰구간을 지니는 것)를 계산하였다:
· 0일 및 21일에서의 HI 및 NI 항체 역가의 기하 평균 역가(GMT).
· 0일 및 21일에서의 중화 항체 역가의 기하 평균 역가(GMT).
· 21일에서의 전환 인자.
· 0일과 비교하여 21일에서의 혈청 HI 역가가 4배 이상 증가된 백신접종자의 백분율로 정의된 21일에서의 혈청전환률(SC).
· 혈청 HI 역가가 1:40인 백신접종자의 백분율로 정의된 21일에서의 보호율.
· 반응에서의 CD4/CD8 T-림프구 분비의 빈도를 각각의 백신접종 그룹, 각각의 시점 (0일, 21일) 및 각각의 항원(펩티드 인플루엔자(pf), 스플리트 인플루엔자(sf) 및 전체 인플루엔자(wf))에 대해 요약하였다(기술통계).
· 각각의 5개의 상이한 시험에서의 각각의 백신접종 그룹 및 각각의 항 원(pf, sf 및 wf)에 대한 시점(후-전) 반응 사이의 개별적 차이의 기술통계.
· 3개의 그룹 사이의 위치 차이를 비교하기 위해 비파라미터적(non-parametric) 시험 (Kruskall-Wallis test)을 이용하였고, 각각의 5개의 상이한 시험에서의 각각의 항원에 대해 통계적 p-값을 계산하였다. 모든 유의성 시험은 양측-꼬리(two-tailed) 시험이었다. 0.05 이하의 P-값을 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다.
실시예 Ⅱ - 수중유 에멀젼 및 애주번트 제형의 제조
달리 언급되지 않는 한, 후속되는 실시예에서 사용된 오일/물 에멀젼은 2 가지의 오일(알파-토코페롤 및 스쿠알렌)으로 제조된 유기상과, 유화제로서 트윈 80™ 또는 폴리소르베이트 80™를 함유하는 PBS의 수성상으로 구성된다. 달리 언급되지 않는 한, 후속되는 실시예에서 사용된 수중유 에멀젼 애주번트 제형은 다음 수중유 에멀젼 성분(최종 농도가 제공됨)을 포함함으로써 제조되었다: 2.5% 스쿠알렌(v/v), 2.5% 알파-토코페롤(v/v), 0.9% 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레에이트(v/v)(트윈 80), 참조 WO 95/17210호. 후속되는 실시예에서 ASO3으로 지칭되는 본 에멀젼을 다음과 같이 2배 농축물로서 제조하였다.
II .1. 에멀젼 SB62 의 제조
임상 및 임상전 실시예 섹션에 보고된 연구에 이 방법을 이용하였다. SB62 에멀젼의 제조는 소수성 성분(DL-α-토코페롤 및 스쿠알렌)으로 구성된 오일상과 수용성 성분(음이온 세제 트윈 80 및 PBS mod(개질됨), pH 6.8)을 함유하는 수성상을 강한 진탕하에 혼합함으로써 수행된다. 교반하면서, 오일상(전체 부피의 1/10) 을 수성상(전체 부피의 9/10)에 옮기고, 혼합물을 15분 동안 실온에서 교반한다. 생성되는 혼합물을 이어서 마이크로플루이다이저(15000 PSI - 8 사이클 또는 실시예 Ⅲ에 보고된 임상 시험에 사용된 애주번트에서 3 사이클)의 상호작용 챔버에서 전단, 충격 및 공동화 작용력을 가하여 마이크론 이하 점적(100 내지 200nm 사이에 분포)을 생성시킨다. 생성된 pH는 6.8 ± 0.1이다. SB62 에멀젼을 이어서 0.22㎛ 막을 통해서 여과하여 멸균화시키고, 멸균 벌크 에멀젼을 2 내지 8℃에서 큐팩(Cupac) 용기에 냉장 저장한다. 멸균의 불활성 가스(질소 또는 아르곤)을 SB62 에멀젼 최종 벌크 용기의 빈 공간에 15초 이상 동안 플러싱(flushing)한다.
SB62 에멀젼의 최종 조성은 다음과 같다:
트윈 80: 1.8% (v/v) 19.4 mg/㎖; 스쿠알렌: 5% (v/v) 42.8 mg/㎖; α-토코페롤: 5% (v/v) 47.5 mg/㎖; PBS-mod: NaCl 121 mM, KCl 2.38 mM, Na2HPO4 7.14 mM, KH2PO4 1.3 mM; pH 6.8 ± 0.1.
실시예 Ⅲ - 스플리트 인플루엔자 항원 제조물 및 2개 용량의 AS03 애주번트 를 함유하는 백신( Flu - LD -004)을 이용한 18-59세 연령의 성인 집단에서의 임상 시험
Ⅲ.1. 서언
두 용량의 애주번트 AS03을 지니는 글락소스미스클라인 바이올로지칼즈 저 용량 인플루엔자 후보 백신(즉, 균주당 5 ㎍의 HA 함유)의 면역원성, 안전성 및 반응원성을 평가하기 위해 Ⅱ기의 제어된 무작위 단일 맹검(phase Ⅱ, controlled, randomized, single blind) 연구를 2006년에 18세 내지 59세 연령의 성인 집단에서 수행하였다.
체액 면역 반응(즉, 항-헤마글루티닌)을 AS03 애주번트 첨가된 백신의 일 용량을 근내 투여 21일 후에 측정하였다. 플루아릭스(Fluarix™)를 기준으로서 이용하였다.
Ⅲ.2. 연구 설계
3 그룹의 피검체가 하기 백신을 근내로 동시에 투여받았다:
·5 ㎍ HA를 함유하고 AS03으로 애주번트 첨가된 저 용량 스플리트 바이러스 인플루엔자 백신을 1회 주사한 100명 피검체의 일 그룹(FluLD1/1).
·5 ㎍ HA를 함유하고 절반 용량의 AS03으로 애주번트 첨가된(AD03 ½) 저 용량 스플리트 바이러스 인플루엔자 백신을 1회 주사한 100명 피검체의 일 그룹(FluLD1/2).
·일 용량의 플루아릭스™를 투여받은 100명 피검체의 일 그룹(Fluarix).
스케줄: 0일에 인플루엔자 백신의 1회 IM 주사, 0일 및 21일에 연구소 방문하여 혈액 샘플 수집(HI 항체 결정) 및 30일에 추가로 전화 연결(연구 결론).
본 연구에 이용된 표준 3가 스플리트 인플루엔자 백신 - 플루아릭스™는 글락소스미스클라인 바이올로지칼즈에 의해 2006/2007년에 북반구(Northern Hemisphere)에서 개발되고 제조된 상업용 백신이다.
Ⅲ.3. 연구 목표
Ⅲ.3.1. 일차 목표
- 항-헤마글루티닌 항체 역가와 관련하여 연구 백신에 의해 유도된 체액 면역 반응을 평가하기 위한 것이다.
0일 및 21일에 관찰된 변화: 혈청 적혈구응집-억제 항체 역가.
유도된 변화(95% 신뢰 구간):
- 0일 및 21일에서의 혈청 항체의 기하 평균 역가(GMT)
- 21일에서의 혈청전환률*
- 21일에서의 혈청전환 인자**
- 0일 및 21일에서의 혈청보호율***
*헤마글루티닌 항체 반응에 대한 혈청전환률은 백신접종 전 역가가 <1:10이고 백신접종 후 역가가 ≥1:40이거나, 백신접종 전 역가가 ≥1:10이고 백신접종 후 역가가 적어도 4배의 증가를 나타내는 백신접종자의 백분율로서 정의된다.
**혈청전환 인자는 0일째에 비해 백신접종 후 혈청 HI GMT에 있어서의 증가 배수로서 정의된다.
***혈청보호율은 지정된 보호로서 일반적으로 인정된 백신접종 후 혈청 HI 역가가 ≥1:40인 백신접종자의 백분율로서 정의된다.
Ⅲ.3.2. 이차 목표
- 요망되는 국소적 및 전신적인 부작용, 요망되지 않는 부작용 및 심각한 부 작용과 관련하여 본 연구 백신의 안전성 및 반응원성을 평가하기 위한 것이다.
1. 각 그룹에서 각 백신접종 후 7일의 후속 기간(즉, 백신접종일 및 추후 6일) 동안, 요망되는 국소적 및 전신적 징후 및 증상의 발생, 강도 및 백신접종과의 관련성.
2. 각 그룹에서 백신접종 후 30일의 후속 기간(즉, 백신접종일 및 추후 29일), 요망되지 않는 국소적 및 전신적 징후 및 증상의 발생, 강도 및 백신접종과의 관련성.
3. 각 그룹에서 전체 연구 동안 심각한 부작용의 발생 및 관련성.
Ⅲ.4. 백신 조성물 및 투여
Ⅲ.4.1. 백신 제조
애주번트 첨가되지 않은 인플루엔자 백신은 세 개의 일가 바이러스 항원 벌크(각각 인플루엔자 균주 A/H1N1, A/H3N2 및 B로부터 제조됨)로 구성된 불활성화된 인플루엔자 백신인 3가 스플리트 비리온이다. 이 백신에 존재하는 항원은 1992년 이래로 판매 중인 플루아릭스™(α-릭스(Rix)?)로서 이용가능한 라이센싱된 플루아릭스™ 백신과 동일하며 용량 당 15 ㎍ HA/균주를 함유한다. FluLD 임상 로트에 포함된 인플루엔자 균주는 2006/2007년 동안 북반구에서 선택되었던 균주들이다.
·A/뉴 칼레도니아/20/99(H1N1)-유사 균주: A/뉴 칼레도니아/20/99(H1N1) IVR-116
·A/위스콘신/67/2005(H3N2)-유사 균주: A/위스콘신/67/2005(H3N2) NYMCX- 161
·B/말레이시아/2506/2004.
항원은 란(egg)-성장된 바이러스로부터 유래된다. 스플리팅은 불활성화 단계 이전에 소듐 데옥시콜레이트로 수행되며, 이것은 소듐 데옥시콜레이트 및 포름알데히드의 후속 작용을 통해 수행된다.
AS03 애주번트 첨가된 저 용량 인플루엔자(FluLD) 백신(임상 로트)은 시판되는 플루아릭스™ 백신(각각 인플루엔자 균주 A/H1N1, A/H3N2 및 B로부터 제조됨)에 기초하나, 더 낮은 항원 함량을 갖고 GSK 애주번트 시스템 AS03으로 애주번트 첨가된다. AS03은 두 개의 생분해가능한 오일, 스쿠알렌 및 α-토코페롤(비타민 E), 및 계면활성제, 폴리소르베이트 80(트윈 80)을 함유하는 수중유 에멀젼 (SB62)로 구성된다. 인플루엔자 항원은 에멀젼과의 단순한 혼합에 의해 애주번트 시스템의 수성상으로 혼입된다. 백신 로트에 인플루엔자 항원과 함께 도입되는 애주번트의 양을 달리 하여 두 제형을 시험하였다. 애주번트 첨가된 백신은 애주번트 시스템 AS03의 전체 용량(AS03) 또는 절반의 용량(AS03 ½)과 조합된, 용량 당 각 인플루엔자 바이러스 균주의 5 ㎍의 헤마글루티닌(HA)을 함유한다. 부형제는 하기와 같다: 폴리소르베이트 80(트윈 80), 옥토시놀 10(트리톤 X-100), 알파-토코페릴 수소 숙시네이트, 염화나트륨, 인산수소이나트륨, 인산이수소칼륨, 염화칼륨, 주사용수. AS03 애주번트 첨가된 저 용량 인플루엔자 백신(FluLD, 전체 또는 절반 용량의 AS03)은 보존제가 없는 백신이다. 그러나, 이들은 제조 공정의 초기 단계로부터 미량의 티오메르살(용량 당 <1.25 ㎍의 Hg)을 함유한다. 이들 둘 모두는 미리-충 전된 유리(타입 I) 주사기 중 단일용량(monodose) 백신으로서 0.5 ㎖/용량의 부피로 제공된다.
Ⅲ.4.1.1. AS03 애주번트 첨가된 인플루엔자 백신의 조성
일 용량의 FluLD(전체 또는 절반 용량의 AS03)는 0.5 ㎖이다. 조성이 표 3에 제공된다. 용량 당 HA 함량은 두 제형 모두에 대해 5 ㎍이고, 유일한 차이는 최종 용기에 존재하는 AS03의 양이다.
표 3 - AS03 애주번트 첨가된 저 용량 인플루엔자 백신의 조성(전체 또는 절반 용량의 AS03 )
Figure 112009071406810-pct00003
Ⅲ.4.1.2. 스플리트 불활성화된 인플루엔자 항원 제조물의 생성
인플루엔자 항원은 플루아릭스™(인플루엔자 바이러스 백신)에 포함된 것들 과 동일하다. 1가 벌크는 발육란(embryonated hen's eggs)에서 개별적으로 성장한 타입 A(H1N1 및 H3N2) 및 타입 B의 3개 균주의 인플루엔자 바이러스의 제조용 바이러스(working seed)로부터 제조된 정제되고 불활성화된 스플리트 바이러스로 구성된다. 이러한 제조용 바이러스는 연간 WHO 권장에 따라 WHO 협력 센터로부터 받은 균주에서 유래된다. 항원을 제조하는 공정에 대해서는 예시로서 WO 02/097072호를 참조한다. 세 개의 1가 벌크의 부피는 제형화 이전에 각각의 1가 벌크에서 측정된 HA 함량 및 목표 제조 부피에 기초한다.
10배 농축된 인산염 완충된 염수(1배 농축시 pH 7.4), 및 트윈 80 및 α-토코페릴 수소 숙시네이트의 예비-혼합물을 주사용수에 희석시키고, 5-30분 동안 실온에서 교반한다.
이후, 3개의 농축된 1가 벌크를, 생성된 인산염 완충된 염수/트윈 80-α-토코페릴 수소 숙시네이트 용액에서 중간체 3가 벌크 1 ㎖당,
20 ㎍ HA의 각각의 A 1가 벌크(H1N1, H3N2)
23.32 ㎍ HA의 B 1가 벌크의 농도로 연속하여 희석시킨다 (500 ㎕의 3가 최종 벌크에 대하여 5 ㎍ HA의 각각의 A 1가 벌크 및 5.83 ㎍ HA의 B).
각각의 1가 벌크의 첨가 사이에, 혼합물을 실온에서 10-30분 동안 교반하고, 마지막 1가 벌크의 첨가 후에 15-30분 동안 교반한다. "예비-풀(pre-pool)"이라고도 불리는 이러한 중간체 3가 벌크를 +2 - +8℃에 유지하거나 동일한 날에 최종 제형 단계로 추가로 처리할 수 있다. 예비-풀의 최종 부피는 용량 당 250 ㎕이다.
Ⅲ.4.1.3. AS03 애주번트 첨가된 백신 조성물의 제조
애주번트 첨가된 백신: LD AS03 1/1(표 4)
10배 농축된 PBS mod(1배 농축시 pH 7.4; 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 8.1 mM Na2HPO4, 1.47 mM KH2PO4, pH 7.4), 및 트윈 80, 트리톤 X-100 및 VES(균주에 존재하는 세제를 고려한 양)를 함유하는 혼합물을 주사용수에 첨가하였다. 5 내지 30분 교반시킨 후, 각각의 균주 H1N1 및 H3N2의 ㎖당 20 ㎍의 HA, 및 B 균주의 ㎖당 23.32 ㎍의 HA를 각 첨가 사이에 10 내지 30분 동안 교반하면서 첨가하였다. 15 내지 30분 동안 교반시킨 후, 적은 부피의 소위 "중간체 벌크"를 분석을 위해 버리고, +2 내지 +8℃에서 저장하였다. 중간체 벌크를 PBS mod에서 1배 농축하였다. 목표 세제 농도는 ㎖ 당 488 ㎍의 트윈 80, ㎖ 당 73.6 ㎍의 트리톤 X-100 및 ㎖ 당 66.6 ㎍의 VES이다.
이후 최종 제형을 제조하였다: 동일한 부피의 SB62(실시예 Ⅱ의 제조 참조)를 각각의 250 ㎕의 예비-풀 중간체 벌크에 첨가하고 30 내지 60분 동안 실온에서 혼합하였다. pH가 6.8 내지 7.5의 범위인 것을 확인하였다. 제형을 질소로 플러싱한 다음 충전 전에 +2 내지 8℃로 저장하였다.
표 4 - AS03 애주번트 첨가된 저 용량 백신
Figure 112009071406810-pct00004
애주번트 첨가된 백신: LD AS03 1/2 (표 5)
10배 농축된 PBS mod(1배 농축시 pH 7.4; 상기 조성 참조), 및 트윈 80, 트리톤 X-100 및 VES(균주에 존재하는 세제를 고려한 양)를 함유하는 혼합물을 주사용수에 첨가하였다. 5 내지 30분 교반시킨 후, 각 균주 H1N1 및 H3N2 ㎖당 20 ㎍의 HA, 및 B 균주 ㎖당 23.32 ㎍의 HA를 각 첨가 사이에 10 내지 30분 동안 교반하면서 첨가하였다. 15 내지 30분 동안 교반시킨 후, 적은 부피의 소위 "중간체 벌크"를 분석을 위해 버리고, +2 내지 +8℃에서 저장하였다. 중간체 벌크를 PBS mod에서 1배 농축하였다. 표적 세제 농도는 ㎖ 당 488 ㎍의 트윈 80, ㎖ 당 73.6 ㎍의 트리톤 X-100 및 ㎖ 당 66.6 ㎍의 VES이다. 이후, 최종 제형을 제조하였다: SB62를 먼저 PBS mod 완충액으로 희석시키고, 실온에서 15-30분 동안 교반하였다. 이후, 이렇게 희석된 동일한 부피의 SB62를 각각의 250 ㎕의 예비-풀 중간체 벌크에 첨가하였다. 30 내지 60분 동안 실온에서 교반시킨 후, pH가 6.8 내지 7.5의 범위인 것을 확인하였다. 제형을 질소로 플러싱한 다음, 충전 전에 +2 내지 8℃로 저장하였다.
두 제형의 최종 부피는 용량 당 500 ㎕이고 최종 HA 농도는 3가 최종 벌크 1 ㎖당 10 ㎍의 각각의 A 1가 벌크 및 11.66 ㎍의 B 1가 벌크이다. 최종 트윈 80, 트리톤 X-100(H3N2 1가 벌크 제조로부터의 잔류물) 및 α-토코페릴 수소 숙시네이트(α-토코페릴 수소 숙시네이트는 RRR (D-이성질체)-α-토코페롤의 에스테르 형태임) 목표 농도는 각각 244 ㎍/㎖, 58.6 ㎍/㎖ 및 33.3 ㎍/㎖이다.
표 5 - AS03 애주번트 첨가된 저 용량 백신(절반 용량의 애주번트 )
Figure 112009071406810-pct00005
Ⅲ.4.2. 백신 투여
백신을 1.25-㎖ 멸균 타입 I (Ph. Eur.) 유리 주사기에 충전시킨다. 각 주사기에 0.57 ㎖(범위: 0.54-0.60 ㎖)의 목표로 채운다. 백신을 비-우성 팔의 어깨세모근 부위에 근내 주사하였다. 모든 백신은 미리-충전된 주사기(0.5 ㎖)로 제공 되었다. 백신의 적합한 IM 주사를 보장하기 위해, 적어도 25G 및 적어도 2.5 cm 길이의 바늘을 이용하였다.
Ⅲ.5. 연구 집단 결과
총 300명의 피검체가 본 연구에 등록되었다: 3 그룹 각각에 100명의 피검체. 백신접종시 백신접종된 총 코호트의 평균 연령은 36.7세이며 표준 편차가 13.67세였다. 피검체의 평균 연령 및 성별 분포는 3개의 백신 그룹 모두에서 유사하였다.
Ⅲ.6. 면역원성 결과
면역원성을 위한 ATP 코호트(297명 피검체)에 대하여 면역원성 분석을 수행하였다.
체액 면역 반응
AS03으로 애주번트 첨가된 저 용량 인플루엔자 후보 백신에 의해 유도된 체액 면역 반응을 평가하기 위해, 하기 파라미터(95% 신뢰 구간을 지님)를 각 처리 그룹에 대해 계산하였다:
·0일 및 21일에서의 HI 항체 역가의 기하 평균 역가(GMT);
·21일에서의 혈청전환률(SC);
·21일에서의 전환 인자;
·0일 및 21일에서의 보호율.
Ⅲ.6.1. HI 기하 평균 역가( GMT )
95% CI를 갖는 HI 항체에 대한 GMT를 표 6 및 도 1에 제시한다. 그룹간 조정된 GMT 비를 표 7에 제시한다.
3개 모두의 백신 균주에 대한 HI 항체의 백신접종전 GMT는 3개의 처리 그룹에서 동일한 범위 내에 있었다. 조정된 그룹에 대해 21일에 관찰된 GMT는 3개 모두의 균주에 대하여 플루아릭스 그룹 보다 높은 경향이 있으며, A/위스콘신 백신 균주에 대하여 FluLD1/1 및 플루아릭스 간에 통계적 차이가 있다(95% CI의 중복 없이, 조정된 GMT 비는 값 1을 함유하지 않음). 통계적 차이(조정된 GMT 비는 값 1을 함유하지 않음)가 B/말레이시아 백신 균주에 대하여 FluLD1/2 및 플루아릭스 간에도 관찰되었다.
표 6 - 0일 및 21일에서의 항- HA 항체에 대한 혈청양성률 및 기하 평균 역가( GMT )(면역원성에 대한 ATP 코호트 )
Figure 112009071406810-pct00006
표 7 - 21일에서의 각각의 백신 균주에 대한 그룹간 조정된 GMT 비(면역원성에 대한 ATP 코호트 )
Figure 112009071406810-pct00007
Ⅲ.6.2. 항- HI 항체 역가의 혈청전환 인자, 혈청보호율 및 혈청전환률(인간에서 인플루엔자 백신에 대해 확립된 보호와 관련됨)
결과는 혈청보호율에 대하여 표 8-도 2, 혈청전환률에 대하여 표 9-도 3 및 전환 인자에 대하여 표 10-도 4에 제시되어 있다.
혈청보호율에 대하여 유럽 당국에 의해 요구되는 역치(70%)가 모든 그룹에서 도달되었다(94.9% 이상). 각 백신 균주에 대하여, 3 그룹의 21일에서의 혈청보호율은 동일한 범위 내에 있었다.
혈청전환률에 대하여 유럽 당국에 의해 요구되는 역치(40%)가 모든 그룹에서 도달되었다(65% 이상).
A/뉴 칼레도니아 백신 균주의 경우, 3 그룹의 21일에서의 SCR은 동일한 범위 내에 있었다.
A/위스콘신 백신 균주의 경우, FluLD1/1 그룹에 대한 21일에서의 SCR은 플루아릭스 그룹에 비해 높게 나타나는 경향이 있었다. FluLD1/2 그룹에 대한 21일에서의 SCR은 플루아릭스 그룹과 동일한 범위내에 있었다.
B/말레이시아 백신 균주의 경우, FluLD1/2 그룹에 대한 21일에서의 SCR은 플루아릭스 그룹에 비해 높게 나타나는 경향이 있었다. FluLD1/1 그룹에 대한 21일에서의 SCR은 플루아릭스 그룹과 동일한 범위내에 있었다.
혈청전환 인자에 대하여 유럽 당국에 의해 요구되는 역치(2.5)가 모든 그룹에서 도달되었다(6.2 이상).
A/뉴 칼레도니아 백신 균주의 경우, 3 그룹에 대한 21일에서의 SCF는 동일한 범위내에 있는 것으로 나타났다. FluLD1/2 그룹에 대해 관찰된 값은 플루아릭스 그룹에 대해 관찰된 값 보다 낮았으나, 이는 FluLD1/2 그룹에서의 보다 높은 백신접종전 혈청보호율로 설명될 수 있었다.
A/위스콘신 백신 균주의 경우, FluLD1/1 그룹에 대한 21일에서의 SCF는 플루아릭스 그룹에 비해 높게 나타나는 경향이 있었다. FluLD1/2 그룹에 대한 21일에서의 SCF는 플루아릭스 그룹과 동일한 범위내에 있었다.
B/말레이시아 백신 균주의 경우, 두 애주번트 첨가된 그룹의 21일서의 SCF는 플루아릭스 그룹에 비해 높게 나타나는 경향이 있었다.
표 8 - 0일 및 21일에서의 HI 항체 역가에 대한 혈청보호율( SPR )(면역원성에 대한 ATP 코호트 )
Figure 112009071406810-pct00008
표 9 - 21일에서의 HI 항체 역가에 대한 혈청전환률( SCR )(면역원성에 대한 ATP 코호트 )
Figure 112009071406810-pct00009
표 10 - 21일에서의 HI 항체 역가에 대한 혈청전환 인자( SCF )(면역원성에 대한 ATP 코호트 )
Figure 112009071406810-pct00010
Ⅲ.7. 안전성 결론
플루아릭스 그룹에 비해 애주번트 첨가된 백신 그룹에서 요망(국소/전신) 및 비요망 증상과 관련된 높은 반응원성이 본 연구에서 관찰된 전체적인 경향이었다. 애주번트 첨가된 백신 중 AS03 함량의 감소는 전신적이고 국소적인 3 등급 증상에 현저한 영향을 미쳤다.
요망되지 않는 증상의 발생은 플루아릭스 그룹(35%)에 비해 애주번트 첨가된 백신 그룹(피검체의 55% 및 47%)에서 높게 나타나는 경향이 있었다.
이러한 결과로부터, 후보 백신의 반응원성 및 안전성 프로파일이 만족스럽고 임상적으로 허용될 수 있는 것으로 결론내릴 수 있었다.
Ⅲ.8. 전체 결론
Ⅲ.8.1. 면역원성 결과
본 연구의 1차 목적은 두 상이한 농도의 AS03 애주번트를 지니는 저 용량 인플루엔자 백신 및 플루아릭스에 의해 유도된 체액 면역 반응(항-HI 항체 역가)을 측정하는 것이었다.
21일에, 3개 백신은 스플리트 비리온 인플루엔자 백신의 연간 등록을 위한 유럽 당국의 필요조건을 초과하였다(연간 균주 변화의 면역 분석 평가를 위한 "인플루엔자 백신에 대한 평준화 및 필요조건에 대한 지침을 위한 주"-CPMP/BWP214/96). GMT는 플루아릭스 그룹에 비해 애주번트 첨가된 그룹에서 높은 경향이 있으며, A/위스콘신(FluLD1/1 대 플루아릭스) 및 B/말레이시아 백신 균주(FluLD1/2 대 플루아릭스)에 대하여 통계적으로 유의한 차이가 관찰되었다. 유사한 혈청보호율이 3개 모두의 백신 그룹에서 관찰되었고, 그 범위는 94.9% 내지 99%였다. 혈청전환률 및 혈청전환 인자는 플루아릭스 그룹 보다 애주번트 첨가된 그룹에서 높게 관찰되었다. 이 시험으로부터의 데이터는 절반 투여량의 AS03 애주번트가 첨가된 백신에 의해 유도된 면역원성이 전체 용량의 애주번트로 유도된 면역원성에 필적하였음을 또한 나타내었다.
Ⅲ.8.2. 반응원성 및 안전성 결과
AS03으로 애주번트 첨가된 저 용량 인플루엔자 후보 백신의 투여는 본 연구 집단, 즉 18세 내지 59세 연령의 성인에서 안전하고 임상적으로 잘 용인된다. 절반 용량의 애주번트 첨가된 백신은 전체 용량의 애주번트 첨가된 백신에 비해 요망되는 국소적 및 전신적 증상의 빈도에 있어서 상당한 감소를 나타내었다.
실시예 Ⅳ - 프라이밍된 BALB /c 마우스에서 애주번트 첨가 및 애주번트 첨가되지 않은 스플리트 인플루엔자 백신(다양한 용량의 AS03 애주번트 포함)의 임상전 평가
Ⅳ.1. 실험 설계 및 목적
인플루엔자-프라이밍된 마우스에서의 실험을 수행하여 본 수중유 애주번트로 제형화된 인플루엔자 백신에 의해 유도된 AS03에 의한 체액 반응에서의 증가를 평가하였다. 인간 상황에 보다 근접시키기 위해(인간은 약 2년 마다 드리프트된 균주로 반복된 감염에 의해 혈청양성임), 상기 실험을 이종아형 균주로 프라이밍된 동물을 이용하여 수행하였다. 이종아형 프라이밍은 또한 동종형(homotypic) 균주를 이용한 프라이밍에 비해 더 엄격한 모델이며, 이는 다양한 애주번트 사이를 구별하는데 더 나은 모델이다.
Ⅳ.1.1. 처리/그룹(표 11)
27마리의 성체 암컷 BALB/c 마우스의 그룹을 0일째에 3가 전체(whole), 포르말린-불활성화된 인플루엔자 바이러스(각 균주에 대해 5 ㎍의 HA)로 비내 프라이밍시켰다(20 ㎕의 부피). 프라이밍 균주는 백신에 포함된 것들에 대한 조기 드리프트(earlier drift) 변이체 (5 ㎍의 HA 전체 불활성화된 H1N1 A/요하네스버그/82/96, H3N2 A/시드니/5/97, B/하얼빈/7/94)로 구성되었다. 28일 후, 마우스를 총 50 ㎕ 부피의 단일 용량의 백신 후보로 근내 백신접종하였다. 마우스를 스플리트 항원만을 함유하는 제형(3가 스플리트 플레인) 또는 두 용량의 AS03(전체 또는 1/5)으로 애주번트 첨가된 스플리트 항원을 함유하는 제형으로 면역화시켰다. 면역화에 이용된 균주는 H1N1 A/뉴 칼레도니아/20/99, H3N2 A/파나마/2007/99, B/산동/7/97 바이러스 항원(1.5 ㎍/균주, 인간 용량의 1/10)을 포함하였다.
표 11
Figure 112009071406810-pct00011
Ⅳ.1.2. 백신 제형의 제조
트윈 80, 트리톤 X100 및 비타민 E 숙시네이트(VES)의 프리믹스(premix)를 제조하여 최종 농도가 750 ㎍/㎖의 트윈 80, 110 ㎍/㎖의 트리톤 X100 및 100 ㎍/㎖의 VES의 백신에 도달하도록 하였다. 프리믹스에 이용된 양들은 균주에 이미 존재하는 세제 및 VES의 양을 고려하여 계산되었다.
1 리터의 10배 농축된 염수 완충액(PBS pH 7.4)의 제조: 0.800 ℓ의 주사용 수에, NaCl 80 g, KCl 2 g, Na2HPO4 11.44 g, KH2PO4 2 g을 첨가한다. 용해시킨 후 주사용수로 1.0L가 되게 한다. 10배 희석시, pH는 7.4일 것이다.
3가 스플리트 / 플레인
다음 순서에 따라서 50 ㎕의 일 용량 제형을 즉석에서 제조한다: 주사용수 + 염수 완충액(10배 농축된 PBS pH 7.4) + 프리믹스, 실온에서 5분 자기 교반, + 1.5 ㎍ HA H1N1 균주, 실온에서 10분 자기 교반, + 1.5 ㎍ HA H3N2 균주, 실온에서 10분 자기 교반, + 1.5 ㎍ HA B 균주, 실온에서 15분 자기 교반. 제조를 완료한 후 1시간 이내에 제형을 주사한다.
3가 스플리트 / AS03
트윈 80, 트리톤 X100 및 비타민 E 숙시네이트 (VES)의 프리믹스를 제조하여 최종 농도가 750 ㎍/㎖의 트윈 80, 110 ㎍/㎖의 트리톤 X100 및 100 ㎍/㎖의 VES의 백신에 도달하게 하였다. 프리믹스에 이용된 양들은 균주에 이미 존재하는 세제 및 VES의 양을 고려하여 계산되었다.
다음 순서에 따라서 50 ㎕의 일 용량 제형을 즉석에서 제조한다: 주사용수 + 염수 완충액(10배 농축된 PBS pH 7.4) + 프리믹스, 실온에서 5분 자기 교반, + 1.5 ㎍ HA H1N1 균주, 실온에서 10분 자기 교반, + 1.5 ㎍ HA H3N2 균주, 실온에서 10분 자기 교반, + 1.5 ㎍ HA B 균주, 실온에서 15분 자기 교반, + 전체 용량 AS03의 경우 25 ㎕의 SB62 에멀젼 또는 1/5 용량 AS03의 경우 5 ㎕의 SB62 에멀젼, 실온에서 15분 자기 교반. 제조를 완료한 후 1시간 이내에 제형을 주사한다.
Ⅳ.1.3. 판독(표 12)
백신접종에 대한 체액 면역 반응을 면역화 전(28일) 및 면역화 14일 후(27마리 마우스/그룹)에 측정하였다. 혈청 샘플을 적혈구응집 억제(HI) 시험에 의해 시험하였다.
표 12
판독 시점 샘플 유형 분석 방법
체액 반응 D28, D42 혈청 IHA
Ⅳ.2. 결과
Ⅳ.2.1. 체액 면역성
결과를 도 5에 제공한다. 이종아형 프라이밍 후 단일 백신접종된 마우스 모델에서, AS03 및 이의 희석액은 플레인 백신에 비해 높은 HI 역가를 유도하는 것으로 나타났다. 모든 인플루엔자 A 균주에 대하여, 통계적으로 유의한 HI 역가의 증가가 관찰되었다(p<0.05). H1N1 균주의 경우, HI 역가에서의 현저한 차이도 AS03 및 AS03 1/5간에 관찰되었다(p<0.05). 감소된 용량의 AS03은 B 균주에 대해 플레인 백신에 비해 HI 역가를 증가시키지 못했다. B 균주에 대해서는 매우 낮은 반응이 관찰되었다(B/산동); 이것은 아마도 프라이밍에 사용된 B 균주 및 백신 간의 현저한 항원성 드리프트 때문일 것이다.
Ⅳ.3. 결과 및 결론의 요약
결론적으로, HI 역가의 증가가 플레인 백신과 비교하여 AS03 애주번트 첨가된 백신 이용시 이종아형 균주로 프라이밍된 동물에서 관찰되었다. 전체 용량의 AS03이 3개 모두의 인플루엔자 백신 균주에 대해 강한 HI 역가를 수득하는데 최적 이었다.
실시예 V - 프라이밍된 C57BI /6 마우스에서 애주번트 첨가 및 애주번트 첨가되지 않은 스플리트 인플루엔자 백신(다양한 용량의 AS03 애주번트 포함)의 임상전 평가
V.1. 실험 계획 및 목적
인플루엔자-프라이밍된 마우스에서 실험을 수행하여 본 수중유 애주번트와 함께 제형화된 인플루엔자 백신에 의해 유도된 AS03에 의한 체액 및 세포 반응에서의 증가를 평가하였다.
인간 상황을 흉내내기 위해, 이종아형 균주로 프라이밍된 마우스를 이용하여 실험을 수행하였다.
V.1.1. 처리/그룹(표 13)
25마리의 성체 암컷 C57BI/6 마우스의 그룹을 0일째에 3가 전체, 포르말린-불활성화된 인플루엔자 바이러스(각 균주에 대해 5 ㎍의 HA)로 비내 프라이밍시켰다(20 ㎕의 부피). 프라이밍 균주는 백신에 포함된 것들에 대한 조기 드리프트 변이체(5 ㎍의 HA 전체 불활성화된 H1N1 A/베이징/262/95, H3N2 A/파나마/2007/99, B/산동/7/97)로 구성되었다. 28일 후, 마우스를 총 100 ㎕ 부피의 단일 용량의 백신 후보로 근내 백신접종하였다. 마우스를 스플리트 항원만을 함유하는 제형(3가 스플리트 플레인) 또는 세 용량의 AS03(전체, 1/2 또는 1/5)으로 애주번트 첨가된 스플리트 항원을 함유하는 제형으로 면역화시켰다. 면역화에 이용된 균주는 H1N1 A/뉴 칼레도니아/20/99, H3N2 A/뉴욕/55/2004, B/강소/10/2003 바이러스 항원(1.5 ㎍/균주, 인간 용량의 1/10)을 포함하였다.
표 13
Figure 112009071406810-pct00012
V.1.2. 백신 제형의 제조
3가 스플리트 / 플레인
다음 순서에 따라서 100 ㎕의 용량 제형을 즉석에서 제조한다: 주사용수 + 염수 완충액(실시예 Ⅳ에 교시된 대로 제조된 10배 농축된 PBS pH 7.4) + 플루아릭스 로트 DFLUA014(최종 용량 중 균주 당 1.5 ㎍).
3가 스플리트 / AS03
다음 순서에 따라서 100 ㎕의 용량 제형을 즉석에서 제조한다: 주사용수 + 염수 완충액(실시예 IV에 교시된 대로 제조된 10배 농축된 PBS pH 7.4) + 플루아릭스 로트 DFLUA014(최종 용량 중 균주 당 1.5 ㎍) + 전체 용량의 경우 25 ㎕의 SB62 에멀젼 또는 1/2 용량의 경우 12.5 ㎕의 SB62 에멀젼 또는 1/5 용량의 경우 5 ㎕의 SB62 에멀젼. 제조를 완료한 후 1시간 이내에 제형을 주사한다.
V.1.3. 판독(표 14)
백신접종에 대한 체액 면역 반응을 면역화 21일 후(10마리 마우스/그룹)에 측정하였고, 혈청 샘플을 적혈구응집 억제(HI) 시험에 의해 시험하였다. 세포 면 역 반응(그룹당 15마리의 마우스)을 세포내 사이토카인 염색(ICS)에 의해 면역화 7일 후에 시험하였다.
표 14
판독 시점 샘플 유형 분석 방법
체액 반응 D49 혈청 IHA
세포 반응 D35 PBMC ICS
V.2. 결과
V.2.1. 체액 면역성(10마리 마우스/그룹)
결과를 도 6에 제공한다. 이종아형 프라이밍 후 단일 백신접종된 마우스 모델에서, AS03 및 이의 희석액(1/2 및 1/5)은 플레인 백신에 비해 높은 HI 역가를 유도하는 것으로 나타났다. 3개 모두의 균주에 대하여, 전체 용량의 AS03 또는 감소된 용량의 AS03으로 애주번트 첨가된 백신을 투여받은 마우스 간에 HI 역가의 차이는 관찰되지 않았다.
V.2.2. 세포 면역성(15마리 마우스/그룹)
결과를 도 7에 제공한다. AS03의 희석과 무관하게, 3가 스플리트 플레인으로 면역화된 마우스에 비해 AS03-애주번트 첨가된 3가 스플리트 백신으로 면역화된 마우스에서 보다 높은 CD4+ T 세포 반응이 관찰되었다. 전체 용량의 AS03으로 애주번트 첨가된 3가 스플리트로 면역화된 마우스에서 유도된 반응에 비해, 마우스를 저 용량의 AS03으로 애주번트 첨가된 3가 스플리트로 면역화시킬 때, 더 낮은 세포 반응의 경향이 관찰되었다.
V.3. 결과 및 결론의 요약
결론적으로, 체액 및 세포 반응의 증가가 플레인 백신에 비해 AS03 애주번트 첨가된 백신 이용시 이종아형 균주로 프라이밍된 동물에서 관찰되었다. 유사한 크기의 체액 반응이 전체 용량 또는 분획 용량의 AS03 애주번트로 면역화된 마우스 간에 관찰되었다. 그러나, 애주번트 용량의 감소는 CD4+ T 세포 반응의 크기를 감소시키는 경향과 관련되었다.
실시예 Ⅵ - 프라이밍된 C57BI /6 마우스에서 애주번트 첨가 및 애주번트 첨가되지 않은 스플리트 인플루엔자 백신(다양한 용량의 AS03 애주번트 및 저 용량 항원 포함)에 의해 유도된 세포 면역 반응의 임상전 평가
Ⅵ.1. 실험 계획 및 목적
인플루엔자-프라이밍된 마우스에서 실험을 수행하여 저 용량 항원을 함유(0.5 ㎍/균주, 인간 용량의 1/30)하고, 본 수중유 애주번트와 함께 제형화된 인플루엔자 백신에 의해 유도된 AS03에 의한 세포 면역 반응에서의 증가를 평가하였다.
인간 상황을 흉내내기 위해, 이종아형 균주로 프라이밍된 마우스를 이용하여 실험을 수행하였다.
Ⅵ.1.1. 처리/그룹(표 15)
15마리의 성체 암컷 C57BI/6 마우스의 그룹을 0일째에 3가 전체, 포르말린-불활성화된 인플루엔자 바이러스(각 균주에 대해 5 ㎍의 HA)로 비내 프라이밍시켰다(20 ㎕의 부피). 프라이밍 균주는 백신에 포함된 것들에 대한 조기 드리프트 변이체(5 ㎍의 HA 전체 불활성화된 H1N1 A/베이징/262/95, H3N2 A/파나마/2007/99, B/산동/7/97)로 구성되었다. 28일 후, 마우스를 총 50 ㎕ 부피의 단일 용량의 백신 후보로 근내 백신접종하였다. 마우스를 스플리트 항원만을 함유하는 제형(3가 스플리트 플레인) 또는 세 용량의 AS03(전체, 1/2 또는 1/5)으로 애주번트 첨가된 스플리트 항원을 함유하는 제형으로 면역화시켰다. 면역화에 이용된 균주는 H1N1 A/뉴 칼레도니아/20/99, H3N2 A/뉴욕/55/2004, B/강소/10/2003 바이러스 항원(0.5 ㎍/균주, 인간 용량의 1/30)을 포함하였다.
표 15
Figure 112009071406810-pct00013
Ⅵ.1.2. 백신 제형의 제조
3가 스플리트 / 플레인
다음 순서에 따라서 50 ㎕의 용량 제형을 즉석에서 제조한다: 주사용수 + 염수 완충액(실시예 Ⅳ에 교시된 대로 제조된 10배 농축된 PBS pH 7.4) + 플루아릭스 로트 DFLUA014(최종 용량 중 균주 당 0.5 ㎍).
3가 스플리트 / AS03
다음 순서에 따라서 50 ㎕의 용량 제형을 즉석에서 제조한다: 주사용수 + 염수 완충액(실시예 IV에 교시된 대로 제조된 10배 농축된 PBS pH 7.4) + 플루아릭스 로트 DFLUA014(최종 용량 중 균주 당 0.5 ㎍) + 전체 용량의 경우 25 ㎕의 SB62 에 멀젼 또는 1/2 용량의 경우 12.5 ㎕의 SB62 에멀젼 또는 1/5 용량의 경우 5 ㎕의 SB62 에멀젼. 제조를 완료한 후 1시간 이내에 제형을 주사한다.
Ⅵ.1.3. 판독(표 16)
세포 면역 반응을 세포내 사이토카인 염색에 의해 면역화 7일 후에 시험하였다.
표 16
판독 시점 샘플 유형 분석 방법
세포 반응 D35 PBMC ICS
Ⅵ.2. 결과
Ⅵ.2.1. 세포 면역성
결과를 도 8에 제공한다. 약간 더 높은 CD4+ T 세포 반응이 3가 스플리트 플레인으로 면역화된 마우스에 비해 AS03(전체 또는 1/2 용량)으로 애주번트 첨가된 3가 스플리트 백신으로 면역화된 마우스에서 관찰되었다. 3가 스플리트 플레인으로 면역화되거나 전체 용량 또는 절반 용량의 AS03으로 애주번트 첨가된 마우스에서 유도된 반응에 비해, 마우스를 1/5의 AS03 용량으로 애주번트 첨가된 3가 스플리트로 면역화시킬 때 더 높은 세포 반응이 관찰되었다.
Ⅵ.3. 결과 및 결론의 요약
결론적으로, CD4+ T 세포 반응에서의 최소 증가가 플레인 백신과 비교하여 AS03 애주번트 첨가된 백신 이용시 이종아형 균주로 프라이밍된 동물에서 관찰되었다. 이 실험에서 어떠한 애주번트 용량 반응도 관찰되지 않았고, 실제로 1/5의 AS03 용량이 더 높은 애주번트 용량에서 나타난 것 보다 높은 항원 특이적인 CD4+ T 세포의 빈도를 유도하였다. 균주당 0.5 ㎍ HA를 이용하여 생성된 전반적인 이러한 데이터는 균주당 1.5 ㎍ HA를 이용하여 생성된 다른 전임상 실험으로부터의 데이터와 유사하지 않다.
실시예 Ⅶ - 나이브 C57BI /6 마우스에서 애주번트 첨가 및 애주번트 첨가되지 않은 스플리트 H5N1 백신(다양한 용량의 AS03 애주번트 및 항원 포함)의 임상전 평가
Ⅶ.1. 실험 계획 및 목적
H5N1-나이브 마우스에서 실험을 수행하여 본 수중유 애주번트와 함께 제형화된 H5N1 스플리트 백신에 의해 유도된 AS03에 의한 체액 및 세포 면역 반응에서의 증가를 평가하였다. 범유행병(pandemic)의 경우에, 전세계의 집단이 새롭게 순환되는 범유행성 인플루엔자 균주에 면역학적으로 나이브일 것으로 예상된다. 이러한 나이브 면역 상태로 인해, 범유행성 백신은 개체를 새로운 인플루엔자 균주에 의해 야기된 감염 및 심각한 질병으로부터 보호하기 위해 두 백신 용량을 필요로 할 것이다. 이러한 사전 노출의 결여를 나타내기 위해, 백신 면역원성을 평가하기 위한 나이브 마우스 모델을 개발하였다.
Ⅶ.1.1. 처리/그룹(표 17)
15마리의 성체 나이브 암컷 C57BI/6 마우스의 그룹을 0일 및 21일에 총 부피가 50 ㎕인 범유행성 H5N1 백신 후보로 근내 면역화시켰다. 마우스를 스플리트 H5N1 항원만을 함유하는 제형(H5N1 스플리트 플레인) 또는 상이한 용량의 AS03(이중, 전체, 1/2 또는 1/5)으로 애주번트 첨가된 스플리트 항원을 함유하는 제형으로 면역화시켰다. 면역화에 사용된 균주는 H5N1 A/베트남/1194/04 바이러스 항원(인간 용량의 1/10에 해당하는 1.5 또는 0.38 ㎍/균주)을 포함하였다.
어떠한 제형도 이중 AS03 용량으로 수행되지 않았고, 오히려 하나의 50 ㎕ H5N1 스플리트/AS03 전체 용량 + 하나의 50 ㎕ 용량 AS03을 동반주사하였다.
표 17
Figure 112009071406810-pct00014
Ⅶ.1.2. 백신 제형의 제조
1 리터의 최종 벌크 완충액(PBS pH 7.2±0.2)의 제조: 0.800 ℓ의 주사용수에, NaCl 7.699 g, KCl 0.200 g, MgCl2 x 6H2O 0.100 g, Na2HPO4 x 12H2O 2.600 g, KH2PO4 0.373 g을 첨가한다. 용해시킨 후, 주사용수로 1.0L가 되게 한다.
H5N1 스플리트 / 플레인
50 ㎕ 용량의 제조:
티오메르살(균주에서의 이의 농도를 고려한 양) 및 트리톤 X100을 최종 벌크 완충액에 첨가하였다. 제형 중의 함량 목표가 균주의 트윈 농도에 의해 도달되었 으므로 트윈 80을 첨가하지 않았다. 최종 농도는 1.5 ㎍의 제형 용량 중 티오메르살 10 ㎍/㎖, 트윈 80 368 ㎍/㎖ 및 트리톤 X100 35 ㎍/㎖이다. 0.38 ㎍의 제형 용량에서 최종 농도는 티오메르살 10 ㎍/㎖, 트윈 80 93 ㎍/㎖ 및 트리톤 X100 8.9 ㎍/㎖이다. 5-30분간 자기 교반시킨 후, 1.5 또는 0.38 ㎍의 HA(H5N1 균주)를 첨가하였다. 제형을 30-60분 동안 교반하였다. pH를 확인하였다. 제형화를 완료한 지 1시간 내에 주사한다.
H5N1 스플리트 / AS03
50 ㎕ 용량의 제조:
티오메르살(균주에서의 이의 농도를 고려한 양) 및 트리톤 X100을 최종 벌크 완충액에 첨가하였다. 제형 중의 함량 목표가 균주의 트윈 농도에 의해 도달되었으므로 트윈 80을 첨가하지 않았다. 최종 농도는 1.5 ㎍의 제형 용량 중 티오메르살 10 ㎍/㎖, 트윈 80 368 ㎍/㎖ 및 트리톤 X100 35 ㎍/㎖이다. 0.38 ㎍의 제형 용량에서 최종 농도는 티오메르살 10 ㎍/㎖, 트윈 80 93 ㎍/㎖ 및 트리톤 X100 8.9 ㎍/㎖이다. 5-30분간 자기 교반시킨 후, 1.5 또는 0.38 ㎍의 HA(H5N1 균주)를 첨가하였다. 제형을 30-60분 동안 자기 교반시킨 후, 25 또는 12.5 또는 5 ㎕의 SB62 에멀젼을 첨가하였다. 제형을 30-60분간 교반하였다. pH를 확인하였다. 제형화를 완료한 지 1시간 내에 주사한다.
Ⅶ.1.3. 판독(표 18A)
체액 면역 반응을 면역화(10마리의 마우스/그룹) 14일 후에 항-Ig, IgG1 및 IgG2b 항체 역가에 의해 측정하였다(도 9, A-F). 체액 면역 반응을 또한 면역 화(10마리의 마우스/그룹) 21일 후에 항-H5N1 적혈구응집 억제 검정에 의해 측정하였다(도 10, A-B).
세포 면역 반응을 면역화 6일 후(그룹 당 3마리 마우스의 5개 풀), 유세포 분석에 의해 계산된 항원-특이적인 CD4+ T 세포의 세포내 사이토카인 염색(ICS)에 의해 시험하였다(도 11, A-B).
표 18A
판독 시점 샘플 유형 분석 방법
체액 반응 D42 혈청 ELISA, 동형 및 HI 역가
세포 반응 D47 PBMC ICS
Ⅶ.2. 결과
Ⅶ.2.1. 체액 면역 반응: ELISA 및 동형
결과를 도 9 및 표 18B에 제공한다.
표 18B
Figure 112009071406810-pct00015
각 용량의 H5N1 스플리트 백신에서, 모든 애주번트 첨가된 그룹이 애주번트 첨가되지 않은 H5N1 스플리트 백신에 비해 높은 항-H5N1 Ig, IgG1 및 IgG2b 항체 역가를 유도하였다 (도 9 - A 내지 F). 각 용량의 H5N1 스플리트 백신; 항-H5N1 IgG1 항체 반응은 항-H5N1 IgG2b 항체 반응 보다 4-5배 더 높았다(도 9 - C 내지 F). 1.5 ㎍ HA의 H5N1 스플리트 백신의 용량 및 각 용량의 애주번트 조합시에, 항-H5N1 Ig, IgG1 및 IgG2b 항체 반응의 어떠한 차이도 관찰되지 않았다(도 9-A, C 및 E). 0.38 ㎍ HA의 H5N1 스플리트 백신의 용량에서, AS03/2(p=0.7315) 및 AS03 1/5 (p=0.9744)로 애주번트 첨가된 H5N1 스플리트 백신에 의해 유도된 반응에 비해 2x-전체 용량으로 애주번트 첨가된 H5N1 스플리트 백신으로 면역화시킨 후에 더 높 은 항-H5N1 Ig 역가의 경향이 관찰되었다(도 9-B). 이러한 경향은 항-H5N1 IgG1 항체 반응에서도 관찰되었다 (도 9-D). 그러나, 통계적으로 유의한 차이가 관찰될 정도로 세기가 충분하지 않았다(1.7배 차이에 대해 25% 세기, 또는 2배 차이에 대해 47%).
Ⅶ.2.2. 체액 면역 반응: HI 역가
1.5 ㎍ HA /마우스의 용량에 관해서:
각 애주번트 용량에서, AS03-애주번트 첨가된 H5N1 스플리트 백신으로 면역화된 모든 마우스가 애주번트 첨가되지 않은 H5N1 스플리트 백신으로 면역화된 마우스에서 수득된 반응에 비해 높은 HI 역가를 유도하였다(도 10-A). H5N1 스플리트 백신에 용량 범위의 AS03을 애주번트 첨가했을 때 HI 역가의 통계적으로 현저한 차이가 관찰되지 않았다 (도 10-A).
용량당 0.38 ㎍ HA 의 용량에 관해서:
각 애주번트 용량에서, AS03-애주번트 첨가된 H5N1 스플리트 백신으로 면역화된 모든 마우스가 애주번트 첨가되지 않은 H5N1 스플리트 백신으로 면역화된 마우스에서 수득된 반응에 비해 높은 HI 역가를 유도하였다(도 10B).
현저하게 더 높은 HI 역가가 AS03/2로 애주번트 첨가된 H5N1 스플리트 백신에서 수득된 반응에 비해 2x 전체 용량의 AS03이 애주번트 첨가된 H5N1 스플리트 백신에서 관찰되었다(4배 차이의 경우 p=0.032)(도 10B).
2x 전체 용량의 AS03 또는 전체 용량의 AS03으로 애주번트 첨가된 H5N1 스플리트 백신으로 면역화된 마우스, 또는 AS03/2 또는 AS03/5로 애주번트 첨가된 H5N1 스플리트 백신으로 면역화된 마우스 간에 HI 역가의 통계적으로 현저한 차이가 관찰되지 않았다(도 10B).
항원 용량간 비교(1.5 ㎍ 또는 0.38 ㎍):
2x 전체 용량의 AS03으로 애주번트 첨가된 0.38 ㎍ HA의 스플리트 H5N1로 면역화된 마우스보다 현저하게 낮은 HI 역가(p=0.01)를 나타낸 AS03/5로 애주번트 첨가된 1.5 ㎍ HA의 스플리트 H5N1으로 면역화된 마우스 간을 제외하고는, AS03, AS03/2 또는 AS03/5로 애주번트 첨가된 각 HA 용량의 H5N1 스플리트 백신으로 면역화된 마우스 간에 HI 역가의 통계적으로 현저한 차이가 관찰되지 않았다(도 10).
Ⅶ.2.3. 세포 면역 반응
3가 계절성 인플루엔자 백신에 의해 유도된 세포 면역 반응의 평가를 위해, CD4 T 세포의 재자극을 위해 균주당 1 ㎍ HA의 스플리트 항원을 사용하였다. 1가 H5N1 인플루엔자 백신에 대해 동일한 재자극 조건을 유지시키기 위해, 3 ㎍ HA의 1가 스플리트 항원을 본 실험에 사용하였다. 이러한 농도는 또한 다양한 애주번트 사이의 구별에 최적인 것으로 나타났다. 결과를 도 11에 제시하였다.
각 용량의 H5N1 스플리트 백신(1.5 또는 0.38 ㎍)에서, 애주번트 첨가되지 않은 H5N1 스플리트 백신으로 면역화된 마우스에 비해 다양한 용량의 AS03으로 애주번트 첨가된 H5N1 스플리트 백신으로 면역화된 마우스에서 더 높은 CD4+ T 세포 반응이 관찰되었다.
1.5 ㎍ H5N1 스플리트 백신의 용량에서, AS03 용량의 감소는 CD4+ T 세포 빈도의 감소에 상응하였다(도 11A). 그러나, 0.38 ㎍ H5N1 스플리트 백신의 용량에 서, AS03-애주번트 첨가된 H5N1 스플리트 백신으로 면역화된 마우스에서 상이한 애주번트 용량 간에 CD4+ T 세포 반응의 어떠한 차이도 관찰되지 않았다(도 11B).
Ⅶ.3. 결과 및 결론의 요약
마우스에서의 면역원성 연구는, 애주번트 첨가된 H5N1 스플리트 백신이 애주번트 첨가되지 않은 H5N1 스플리트 백신에 의해 유도된 반응들에 비해 현저하게 더 높은 체액(항-H5N1 ELISA 및 HI 역가) 및 세포(CD4+ T 세포) 반응을 유도하였음을 나타내었다.
섹션 Ⅶ.2.2에 언급된 2개의 그룹을 제외하고는, 1.5 ㎍ 및 0.38 ㎍ 애주번트 첨가된 H5N1 스플리트 백신으로 면역화된 마우스 간에 체액 면역 반응에 있어서의 어떠한 항원 용량 반응 효과가 관찰되지 않았는데, 이는 상기 모델에서 용량 반응 효과를 관찰하기 위해서는 애주번트의 존재하에 심지어 더 낮은 용량의 HA가 요구될 수 있음을 시사한다.
CD4+ T 세포 반응에서의 강한 증가가 플레인 H5N1 백신에 비해 AS03 애주번트 첨가된 H5N1 범유행성 백신 이용시 나이브 마우스에서 관찰되었다. 0.38 ㎍의 H5N1 스플리트 백신의 용량을 백신 후보로 이용할 때 AS03 희석의 영향은 관찰되지 않았으나, 1.5 ㎍의 H5N1 스플리트 백신을 감소된 용량의 AS03으로 애주번트 첨가했을 때 CD4 T 세포 반응의 감소가 관찰되었다.
이전에 관찰된 대로, 체액 및 세포 면역 반응에서의 어떠한 차이도 전체 용량의 AS03 또는 AS03/2로 애주번트 첨가된 H5N1 스플리트 백신(어떠한 항원 용량에서)으로 면역화된 마우스간에 관찰되지 않았다. 면역 반응에서의 일부 향상이 2x 전체 용량 AS03을 백신 제형에 이용한 경우에 검출되었고, 따라서 면역 반응에서의 감소가 AS03/5를 백신 제형에 이용했을 때 검출되었다.
전체적으로, 여기에 보고된 데이터는 상기 백신 제형에서의 본 신규한 애주번트 시스템의 효능을 지지한다.
실시예 Ⅷ - 프라이밍된 대백돈(Large White pig)에서 애주번트 첨가 및 애 주번트 첨가되지 않은 인플루엔자 백신의 임상전 평가
Ⅷ.1. 실험 계획 및 목적
인플루엔자-프라이밍된 돼지에서의 실험을 수행하여 본 수중유 애주번트와 함께 제형화된 인플루엔자 백신에 의해 유도된 AS03에 의한 체액 반응에서의 증가를 평가하였다.
돼지를 이용하여 인간에 근접한 동물 모델에서 용량 범위의 AS03을 평가하였다. 돼지는 긴 목록의 생물학적 유사성을 나타내며, 이것은 돼지가 예외가 극히 적은 생리학적으로 인간에 가장 근접한 동물임을 확인시켜 준다(Douglas R., 1972). 더욱이, 돼지에서 인플루엔자 감염의 표시가 상례로 관찰된다.
Ⅷ.1.1. 처리/그룹(표 19)
10마리의 성체 암컷 대백돈의 그룹을 0일째에 총 부피가 200 ㎕인 3가 전체, 포르말린-불활성화된 인플루엔자 바이러스(각 균주에 대해 25 ㎍의 HA)로 비내 프라이밍시켰다. 프라이밍 균주는 백신 균주와 상동인 균주로 구성되었다(25 ㎍의 HA 전체 불활성화된 H1N1 A/뉴 칼레도니아/20/99, H3N2 A/파나마/2007/99 및 B/산동/7/97)로 구성되었다. 28일 후, 돼지를 총 500 ㎕ 부피의 단일 용량의 백신 후 보로 근내 백신접종하였다. 돼지를 스플리트 항원만을 함유하는 제형(3가 스플리트 플레인) 또는 용량 범위의 AS03(전체, 1/2 또는 1/5)으로 애주번트 첨가된 스플리트 항원을 함유하는 제형으로 면역화시켰다. 면역화에 이용된 균주는 H1N1 A/뉴 칼레도니아/20/99, H3N2 A/파나마/2007/99 및 B/산동/7/97 바이러스 항원(일 인간 용량으로서 H1N1 A/뉴 칼레도니아/20/99, H3N2 A/파나마/2007/99 균주에 대해 15 ㎍ HA, 및 B/산동/7/97 균주 17.5 ㎍)을 포함하였다.
표 19
Figure 112009071406810-pct00016
Ⅷ.1.2. 백신 제형의 제조
3가 스플리트 / 플레인
트윈 80, 트리톤 X100 및 비타민 E 숙시네이트(VES)의 프리믹스를 제조하여 최종 농도가 750 ㎍/㎖의 트윈 80, 110 ㎍/㎖의 트리톤 X100 및 100 ㎍/㎖의 VES의 백신에 도달하도록 하였다. 프리믹스에 이용된 양들은 균주에 대한 이들의 함량을 고려한 것이다.
다음 순서에 따라서 500 ㎕의 일 용량 제형을 즉석에서 제조한다: 주사용수 + 염수 완충액(실시예 Ⅳ에 교시된 대로 제조된 10배 농축된 PBS pH 7.4) + 프리믹스, 실온에서 5분간 자기 교반, + 15 ㎍ HA H1N1 균주, 실온에서 10분간 자기 교반, + 15 ㎍ HA H3N2 균주, 실온에서 10분간 자기 교반, + 17.5 ㎍ HA B 균주, 실 온에서 15분간 자기 교반. 제조를 완료한 후 1시간 이내에 제형을 주사한다.
3가 스플리트 / AS03
트윈 80, 트리톤 X100 및 비타민 E 숙시네이트(VES)의 프리믹스를 제조하여 최종 농도가 750 ㎍/㎖의 트윈 80, 110 ㎍/㎖의 트리톤 X100 및 100 ㎍/㎖의 VES의 백신에 도달하도록 하였다. 프리믹스에 이용된 양들은 균주에 대한 이들의 함량을 고려한 것이다.
다음 순서에 따라서 500 ㎕의 일 용량 제형을 즉석에서 제조한다: 주사용수 + 염수 완충액(실시예 Ⅳ에 교시된 대로 제조된 10배 농축된 PBS pH 7.4) + 프리믹스, 실온에서 5분간 자기 교반, + 15 ㎍ HA H1N1 균주, 실온에서 10분간 자기 교반, + 15 ㎍ HA H3N2 균주, 실온에서 10분간 자기 교반, + 17.5 ㎍ HA B 균주, 실온에서 15분간 자기 교반, + 전체 용량의 AS03의 경우 250 ㎕ SB62 에멀젼, 또는 1/2 용량의 AS03의 경우 125 ㎕ SB62 에멀젼, 또는 1/5 용량의 AS03의 경우 50 ㎕ SB62 에멀젼, 실온에서 15분간 자기 교반. 제조를 완료한 후 1시간 이내에 제형을 주사한다.
Ⅷ.1.3. 판독(표 20)
백신접종에 대한 체액 면역 반응을 비내 프라이밍 전(0일), 면역화 전(28일) 및 면역화 14일 후에 측정하였다(10마리 돼지/그룹). 혈청 샘플을 적혈구응집 억제(HI) 시험에 의해 시험하였다.
표 20
판독 시점 샘플 유형 분석 방법
체액 반응 D0, D28, D42 혈청 IHA
Ⅷ.2. 결과 및 결론
Ⅷ.2.1. 체액 면역성
결과를 도 12에 제공한다. 애주번트의 희석과 무관하게, AS03 애주번트 첨가된 3가 스플리트 제형은, 비록 3개 모두의 균주에서 항상 통계적 유의성에 도달하지는 않았으나, 동종성 프라이밍의 모델에서 플레인 3가 제형에 비교하여 모든 균주에 대해 더 강한 HI 반응을 유도하였다. 애주번트 용량 효과가 균주마다 다소 상이하게 관찰되었다. B/산동과 같이 덜 면역원성인 균주의 경우, 전체 용량의 AS03으로 애주번트 첨가된 3가 스플리트 백신만이 플레인 백신과 현저하게 상이하였다. 전체 용량의 AS03으로 애주번트 첨가된 3가 스플리트 백신과 대조적으로, 감소된 용량의 AS03은 3개 모두의 균주에 대하여 플레인 백신에서 보여진 것들을 초과하여 HI 역가를 증가시키지 못했다.
실시예 Ⅸ - 나이브 및 프라이밍된 C57BI /6 마우스에서 애주번트 첨가 및 애 주번트 첨가되지 않은 스플리트 3가 또는 4가(제 2의 B 균주를 함유) 백신의 임상전 평가
Ⅸ.1. 실험 계획 및 목적
상기 수중유 에멀젼 애주번트(AS03 또는 AS03 절반 용량)로 제형화된 인플루엔자 스플리트 3가 또는 4가(제 2의 B 균주를 함유함) 백신에 의해 유도된 체액 면역 반응에서의 증가를 평가하기 위해 나이브 및 프라이밍된 마우스에서의 실험을 수행하였다. 최근의 분리체 인플루엔자 B 바이러스의 HA 유전자의 계통발생 분석은 1980년 중반 이후로 상기 유전자가 B/빅토리아/2/87-유사 및 B/야마가타/16/88- 유사 바이러스로 대표되는 2개의 항원적으로 별개의 계통으로 진화한 것을 입증하였다. 이러한 실험으로 3가 인플루엔자 백신(TIV)에 의해 유도된 반응에 비한 체액 면역 반응에 대한 4가 인플루엔자 백신(QIV)에서의 제 2의 B 균주의 존재의 영향을 평가하였다.
Ⅸ.1.1. 처리/그룹(표 21)
10마리의 성체 암컷 C57BI/6 나이브 마우스 또는 백신 균주에 비해 이종성 균주로 프라이밍된 마우스의 그룹을 이용하여 본 실험을 수행하였다. 나이브 마우스를 3가 또는 4가 인플루엔자 백신 후보자로 0 및 28일에 전체 1000 ㎕의 부피로 근내 면역화시켰다. 프라이밍된 마우스에 먼저 3가의 전체 포르말린 불활성화된 인플루엔자 바이러스(각각의 균주에 대해 5 ㎍ HA)를 이용하여 0일에 비내 투여(20 ㎕ 부피)하였다. 프라이밍 균주는 백신에 포함된 균주에 대해 드리프트 변이체(5 ㎍ HA 전체 불활성화된 H1N1 A/베이징/262/95, H3N2 A/웰링턴/1/04 및 B/브리즈번/32/02)로 구성되었다. 28일 후, 마우스를 100 ㎕의 전체 부피의 백신 후보자의 일 용량으로 근내 백신접종하였다. 마우스를 TIV 또는 QIV 단독을 함유하는 제형(플레인 백신) 또는 다양한 용량의 AS03(전체 또는 절반(1/2))로 애주번트 첨가된 TIV 또는 QIV를 함유하는 제형으로 면역화시켰다. 면역화에 사용된 균주는 H1N1 A/뉴 칼레도니아/20/99, H3N2 A/위스콘신/52/05 및 B/산동/7/97(TIV 및 QIV 둘 모두에 포함된 B/빅토리아 계통)을 포함하였고, QIV 백신에 대해서는 또한 B/강소/10/03(QIV에만 포함된 B/야마가타 계통)(인간 용량의 1/10에 해당하는 1.5 ㎍/균주)을 포함하였다.
표 21
Figure 112009071406810-pct00017
Ⅸ.1.2. 백신 제형의 제조
TIV 플레인 ( 애주번트 첨가되지 않음)
100㎕ 용량의 제조:
10배 농축된 PBS, 및 트윈 80, 트리톤 X-100 및 VES의 예비혼합물(균주에 존재하는 세제를 고려한 양)을 주사용수에 첨가하였다. 최종 농도는 제형 내에서 트윈 80에 대해 354 ㎍/㎖, 트리톤 X-100에 대해 52 ㎍/㎖, VES에 대해 47.37 ㎍/㎖였다. 5분의 자기 교반 후, 1.5 ㎍의 각각의 균주(H1N1, H3N2, B 균주)를 각각의 첨가 사이에 10분의 자기 교반과 함께 첨가하였다. 이후, 제형을 15분 동안 교반하였다. pH를 확인하였다. 제형 완성 후 1시간 이내에 주사하였다.
TIV AS03 또는 AS03 1/2
100㎕ 용량의 제조:
10배 농축된 PBS, 및 트윈 80, 트리톤 X-100 및 VES의 예비혼합물(균주에 존재하는 세제를 고려한 양)을 주사용수에 첨가하였다. 최종 농도는 제형 내에서 트윈 80에 대해 354 ㎍/㎖, 트리톤 X-100에 대해 52 ㎍/㎖, VES에 대해 47.37 ㎍/㎖ 였다. 5분의 자기 교반 후, 1.5 ㎍의 각각의 균주(H1N1, H3N2, B 균주)를 각각의 첨가 사이에 10분의 자기 교반과 함께 첨가하였다. 15분의 자기 교반 후, 25 ㎕ 또는 12.5 ㎕의 SB62 에멀젼을 첨가하였다. 이후, 제형을 15분 동안 교반하였다. pH를 확인하였다. 제형 완성 후 1시간 이내에 주사하였다.
QIV 플레인 ( 애주번트 첨가되지 않음)
100㎕ 용량의 제조:
10배 농축된 PBS, 및 트윈 80, 트리톤 X-100 및 VES의 예비혼합물(균주에 존재하는 세제를 고려한 양)을 주사용수에 첨가하였다. 최종 농도는 제형 내에서 트윈 80에 대해 472 ㎍/㎖, 트리톤 X-100에 대해 69.44 ㎍/㎖, VES에 대해 63.16 ㎍/㎖이다. 5분의 자기 교반 후, 1.5 ㎍의 각각의 균주(H1N1, H3N2, B 균주)를 각각의 첨가 사이에 10분의 자기 교반과 함께 첨가하였다. 이후, 제형을 15분 동안 교반하였다. pH를 확인하였다. 제형 완성 후 1시간 이내에 주사하였다.
QIV AS03 또는 AS03 1/2
100㎕ 용량의 제조:
10배 농축된 PBS, 및 트윈 80, 트리톤 X-100 및 VES의 예비혼합물(균주에 존재하는 세제를 고려한 양)을 주사용수에 첨가하였다. 최종 농도는 제형 내에서 트윈 80에 대해 472 ㎍/㎖, 트리톤 X-100에 대해 69.44 ㎍/㎖, VES에 대해 63.16 ㎍/㎖이다. 5분의 자기 교반 후, 1.5 ㎍의 각각의 균주(H1N1, H3N2, 2 B 균주)를 각각의 첨가 사이에 10분의 자기 교반과 함께 첨가하였다. 15분의 자기 교반 후, 25 ㎕ 또는 12.5 ㎕의 SB62 에멀젼을 첨가하였다. 이후, 제형을 15분 동안 교반하였 다. pH를 확인하였다. 제형 완성 후 1시간 이내에 주사하였다.
Ⅸ.1.3. 판독(표 22)
나이브 마우스에서, 일차 면역화 28일 후(D28 Post-Ⅰ) 및 이차 면역화 21일 후(D21 Post-Ⅱ)에 적혈구응집 억제 검정에 의해 그룹당 10마리의 마우스에서 체액 면역 반응을 측정하였다(도 13).
프라이밍된 마우스에서, 프라이밍 28일 후(Day 28 Post-Prim) 및 단일 면역화 21일 후(D21 Post-Imm)에 적혈구응집 억제 검정에 의해 그룹당 10마리의 마우스에서 체액 면역 반응을 측정하였다(도 14).
본 실험의 목적을 간소화시키고 이에 집중하기 위해, B 균주에 대해 유도된 체액 면역 반응만 기재하였다.
표 22
판독 시점 샘플 유형 분석 방법
체액 반응 28일 및 49일 혈청 HI 역가
Ⅸ.2. 결과
Ⅸ.2.1. 나이브 마우스에서의 체액 면역 반응: HI 역가 .
애주번트 첨가된 인플루엔자 스플리트 백신으로 면역화된 나이브 마우스는 애주번트 첨가되지 않은 인플루엔자 스플리트 백신으로 면역화된 마우스에서 수득된 반응에 비해 높은 HI 역가를 유도하였다(도 13, A 및 B).
애주번트(AS03 또는 AS03/2)에 상관없이, 애주번트 첨가된 TIV 또는 애주번트 첨가된 QIV로 면역화된 나이브 마우스는 B/산동/7/97(TIV 및 QIV 둘 모두에 포함된 B/빅토리아-유사 바이러스)에 대해 유사한 HI 역가를 유도하였다(도 13; A).
애주번트(AS03 또는 AS03/2)에 상관없이, 애주번트 첨가된 QIV로 면역화된 나이브 마우스는 애주번트 첨가된 TIV로 면역화된 나이브 마우스에서 관찰된 HI 역가의 부재에 비해 B/강소/10/03(QIV에 포함된 B/야마가타-유사 바이러스 단독)에 대해 높은 HI 역가를 유도하였다(도 13; B).
Ⅸ.2.2. 프라이밍된 마우스에서의 체액 면역 반응: HI 역가 .
B/빅토리아-유사 바이러스로 프라이밍되고, 애주번트 첨가된 인플루엔자 스플리트 백신으로 면역화된 마우스는 애주번트 첨가되지 않은 인플루엔자 스플리트 백신으로 면역화된 마우스에서 수득된 반응에 비해 높은 HI 역가를 유도하였다(도 14, A 및 B).
애주번트(AS03 또는 AS03/2)에 상관없이, 빅토리아-유사 바이러스로 프라이밍되고, 애주번트 첨가된 TIV 또는 애주번트 첨가된 QIV로 면역화된 마우스는 B/산동/7/97 바이러스(TIV 및 QIV 둘 모두에 포함된 B/빅토리아-유사 바이러스)에 대해 유사한 HI 역가를 유도하였다(도 14; B).
애주번트(AS03 또는 AS03/2)에 상관없이, 빅토리아-유사 바이러스로 프라이밍되고, 애주번트 첨가된 QIV로 면역화된 마우스는 애주번트 첨가된 TIV로 면역화된 나이브 마우스에서 관찰된 HI 역가의 부재에 비해 B/강소/10/03(QIV에 포함된 B/야마가타-유사 바이러스 단독)에 높은 HI 역가를 유도하였다(도 14; B).
Ⅸ.3. 결과 및 결론의 요약
나이브 마우스, 또는 B/빅토리아-유사 바이러스로 프라이밍되고, 애주번트(AS03 또는 AS03/2) 첨가된 TIV 또는 QIV 백신으로 면역화된 마우스는 백신에 포 함된 동종형 B/빅토리아-유사 바이러스 또는 동일한 B/빅토리아 계통에 속하는 이종아형 바이러스에 대해 교차 반응성을 나타내었다. 나이브 마우스, 또는 B/빅토리아-유사 바이러스로 프라이밍되고, 애주번트(AS03 또는 AS03/2) 첨가된 TIV 백신으로 면역화된 마우스는 백신에 포함된 B 바이러스에 비해 또 다른 계통에 속하는 이종아형 바이러스(본 실시예에서 B/야마가타-유사 바이러스)에 대해 임의의 교차 반응성을 나타내지 않았다.
이러한 실험은 B/빅토리아- 및 B/야마가타-계통 둘 모두에 속하는 B 바이러스에 대해 교차 반응성을 유도하기 위해 제 2의 B 균주 및 애주번트(AS03 또는 AS03/2)가 필요한 것을 입증하였다.
실시예 Ⅹ - 스플리트 인플루엔자 항원 제조물 및 다양한 용량의 AS03 애주 번트를 함유하는 백신( Flu - LD -012)을 이용한 18-64세 연령의 집단에서의 임상 시험
Ⅹ.1. 서언
참조로서 사용되는 플루아릭스(Fluarix™)(GlaxoSmithKline Biologicals)에 비해 근내 투여되는 다양한 용량의 애주번트 AS03을 지니는 글락소스미스클라인 바이올로지칼즈 저 용량 인플루엔자 후보 백신(즉, 균주당 5 ㎍의 HA 함유)의 면역원성, 안전성 및 반응원성을 평가하기 위해 Ⅱ기의 제어된 무작위 단일 맹검 연구를 2007년에 18세 내지 64세 연령의 성인 집단에서 수행하였다.
Ⅹ.2. 연구 계획
5 그룹의 피검체(그룹당 200명)가 하기 백신을 근내로 동시에 투여받았다:
- FluLD1/1: 1/1 용량의 AS03로 애주번트 첨가된 5 ㎍ HA/균주의 인플루엔자 백신
- FluLD1/2: 1/2 용량의 AS03로 애주번트 첨가된 5 ㎍ HA/균주의 인플루엔자 백신
- FluLD1/4: 1/4 용량의 AS03로 애주번트 첨가된 5 ㎍ HA/균주의 인플루엔자 백신
- FluLD1/8: 1/8 용량의 AS03로 애주번트 첨가된 5 ㎍ HA/균주의 인플루엔자 백신
- 일 전체 용량의 플루아릭스™ 15 ㎍ HA/균주를 투여한 200명의 피검체의 한 그룹
스케줄: 0일에 인플루엔자 백신의 1회 IM 주사, 0일 및 21일에 혈액 샘플 수집, 및 180일 후에 백신접종
연구에 이용된 표준 3가 스플리트 인플루엔자 백신 - 플루아릭스™는 글락소스미스클라인 바이올로지칼즈에 의해 2006/2007년에 북반구(Northern Hemisphere)에서 개발되고 제조된 상업용 백신이다.
Ⅹ.2. 연구 목적
Ⅹ.2.1. 1차 목적: 면역원성
모든 피검체에서 백신접종 21일 후에 AS03(AS03의 1/1, 1/2, 1/4, 1/8 용량)으로 애주번트 첨가된 저용량의 인플루엔자 백신 대 플루아릭스 21의 면역학적 비-열등성(GMT)을 입증하기 위한 것이다.
관찰된 변화:
· 0 및 21일: 모든 피검체에서의 3개의 백신 균주 각각에 대한 혈청 적혈구응집-억제(HI) 항체 역가.
유도된 변화:
· 0일 및 21일에서의 HI 항체 역가의 기하 평균 역가(GMT).
Ⅹ.2.2. 2차 목적
· 모든 피검체에서 백신접종 21일 후 AS03(AS03의 1/1, 1/2, 1/4, 1/8 용량)으로 애주번트 첨가된 저용량 인플루엔자 백신 및 플루아릭스에 의해 유도된 항적혈구응집(HI) 항체 역가와 관련된 체액 면역 반응을 평가하기 위한 것이다.
· 모든 피검체에서 백신접종 180일 후 AS03(AS03의 1/1, 1/2, 1/4, 1/8 용량)으로 애주번트 첨가된 저용량 인플루엔자 백신 및 플루아릭스의 HI 항체의 지속성을 평가하기 위한 것이다.
· 피검체 부분집합에서 0, 21 및 180일에서 인플루엔자 특이적 CD4/CD8 T 림프구의 빈도와 관련된, AS03(AS03의 1/1, 1/2, 1/4, 1/8 용량)으로 애주번트 첨가된 저용량 인플루엔자 백신 및 플루아릭스에 의해 유도된 세포 매개 면역 반응을 평가하기 위한 것이다.
· 피검체 부분집합에서 0, 21 및 180일에서 AS03(AS03의 1/1, 1/2, 1/4, 1/8 용량)으로 애주번트 첨가된 저용량 인플루엔자 백신 및 플루아릭스에 의해 유도된 중화 항체 역가와 관련된 체액 면역 반응을 평가하기 위한 것이다.
· 모든 피검체에서 전체 연구 기간(7일 동안의 요망되는 증상의 추적, 21일 동안의 요망되지 않는 증상의 추적, 6개월 동안의 심각한 부작용 및 의학적으로 유 의한 상태의 추적) 동안 AS03(AS03의 1/1, 1/2, 1/4, 1/8 용량)으로 애주번트 첨가된 저용량 인플루엔자 백신 및 플루아릭스의 안전성 및 반응원성을 평가하기 위한 것이다.
체액 반응에 대해 관찰된 변화:
· 0, 21 및 180일: 모든 피검체에서 3개의 백신 균주의 각각에 대한 혈청 적혈구응집-억제(HI) 항체 역가.
· 0, 21 및 180일: 피검체 부분집합에서 백신에 존재하는 3개의 인플루엔자 바이러스 균주 각각에 대해 별개로 시험된 중화 항체 역가.
유도된 변화:
· 0, 21 및 180일에서 HI 항체 역가의 기하 평균 역가(GMT)
· 21일에서의 혈청전환률*
· 21일에서의 혈청전환 인자**
· 0 및 21일에서의 혈청보호율***
*혈청전환률은 백신접종 전 역가가 <1:10이고 백신접종 후 역가가 ≥1:40이거나, 백신접종 전 역가가 ≥1:10이고 백신접종 후 역가가 적어도 4배의 증가를 나타내는 백신접종자의 백분율로 정의된다.
**혈청전환 인자는 0일째에 비해 백신접종 후 혈청 HI GMT에 있어서의 증가 배수로서 정의된다.
***혈청보호율은 지정된 보호로서 일반적으로 인정되는 혈청 HI 역가가 ≥1:40인 백신접종자의 백분율로 정의된다.
CMI 반응( 피검체의 부분 집합에서)에 대해 관찰된 변화:
· 0, 21 및 180일에서:
- 2개 이상의 상이한 신호 분자(IL-2, IFN-γ, TFN-α 및 CD40L)를 생성하는 시험에서 106개당 사이토카인-양성 CD4/CD8 세포의 빈도.
- 적어도 CD40L 및 또 다른 신호 분자(IL-2, IFN-γ, TFN-α)를 생성하는 시험에서 106개당 사이토카인-양성 CD4/CD8 세포의 빈도.
- 적어도 IL-2 및 또 다른 신호 분자(CD40L, IFN-γ, TFN-α)를 생성하는 시험에서 106개당 사이토카인-양성 CD4/CD8 세포의 빈도.
- 적어도 TFN-α 및 또 다른 신호 분자(IL-2, IFN-γ, CD40L)를 생성하는 시험에서 106개당 사이토카인-양성 CD4/CD8 세포의 빈도.
- 적어도 IFN-γ 및 또 다른 신호 분자(CD40L, IL-2, TFN-α)를 생성하는 시험에서 106개당 사이토카인-양성 CD4/CD8 세포의 빈도.
유도된 변화
· 각각의 시험에서, 0, 21 및 180일에서의 특정 인플루엔자 CD4/CD8 T 림프구의 기하 평균(GM).
Ⅹ.2.3. 추가 목적:
· 피검체의 부분집합에서 0, 21 및 180일에서 백신 이종성 HI 역가(드리프트된 균주에 대한 혈청 적혈구응집 억제(HI) 항체 역가)와 관련된 체액 면역 반응을 평가하기 위한 것이다.
· 피검체의 부분집합에서 0, 21 및 180일에서 백신 이종성 중화 항체 역가(교차 반응성 인플루엔자 특이적 바이러스 균주(드리프트된 균주))와 관련된 체액 면역 반응을 평가하기 위한 것이다.
· 피검체의 부분집합에서 0, 21 및 180일에서 교차 반응성 인플루엔자 특이적 CD4/CD8 T 림프구(이종성 균주)(드리프트된 균주 또는 보존된 인플루엔자 에피토프)의 빈도와 관련된 CMI 반응을 평가하기 위한 것이다.
유도된 변화 및 기준(혈청보호율, 혈청전환률, 및 혈청전환 인자)은 상기 기재된 바와 같다.
Ⅹ.3. 백신 조성물 및 투여
Ⅹ.3.1. 백신 제조물
본 연구에 사용된 AS03 애주번트 첨가된 저용량 인플루엔자 백신은 동등한 양(즉, 3x 5 ㎍ HA)의 AS03으로 애주번트 첨가된 3개의 상이한 스플리트 불활성화 인플루엔자 항원의 액체 혼합물이다. 이는 미리 충전된 유리(타입 Ⅰ) 주사기 중의 단일용량(monodose) 백신으로서 0.5 ㎖/용량의 부피로 제시된다. AS03 애주번트 첨가된 저용량 인플루엔자 후보 제형은 하기 균주를 함유하였다:
■ A/솔로몬 섬/3/2006 (H1N1)-유사 균주: A/솔로몬 섬/03/2006 (IVR-145),
■ A/위스콘신/67/2005 (H3N2)-유사 균주: A/위스콘신/67/2005 (NYMCX)-161B,
■ B/말레이시아/2506/2004-유사 균주: B/말레이시아/2506/2004.
백신은 전체 용량, 절반 용량, 1/4 용량 또는 1/8 용량의 애주번트 시스템 AS03과 조합된, 용량당 각각의 인플루엔자 바이러스 균주의 5 ㎍의 헤마글루티닌(HA)를 함유하였다. 인플루엔자 항원은 에멀젼을 이용한 간단한 혼합에 의해 애주번트 시스템의 수성상에 혼입된다.
백신은 약물 물질의 제조 과정으로부터 유래되는 잔여물인 티메로살, 난알부민(ovalbumin), 수크로오스, 포름알데히드 및 소듐 데옥시콜레이트, 및 잔여 수준의 제조 과정의 초기 단계로부터의 티메로살(용량당 < 1 ㎍)을 함유한다. 상기 불활성화된 스플리트 비리온 항원의 3개의 1가 벌크의 생성은 시판되는 플루아릭스™ 백신의 제조 과정에 따라 수행된다. 이는 섹션 Ⅲ.4.1.2에 설명된 바와 같이 수행된다. 스플리팅(Splitting)이 포름알데히드로 수행되는 불활성화 단계 전에 소듐 데옥시콜레이트로 수행된다.
Ⅹ.3.2. 백신 조성물
1회 용량의 FluLD(전체, 절반 용량, 1/4 용량 또는 1/8 용량의 AS03)는 0.5 ㎖에 해당한다. 조성물이 표 23에 제공된다. 용량당 HA 함량은 모든 제형에 대해 약 5 ㎍이고, 단지 하나가 최종 용기에 존재하는 AS03의 양으로 차이가 난다.
표 23 - AS03 애주번트 첨가된 저용량 인플루엔자 백신의 조성
Figure 112009071406810-pct00018
Ⅹ.3.3. AS03 애주번트를 갖는 백신 조성물의 제조
항원 제조물("중간체 벌크(intermediate bulk)"): 트윈 80, 트리톤 X-100 및 VES가 중간체 벌크 내의 최종 농도가 각각 952.5 ㎍/㎖, 130.9 ㎍/㎖ 및 119.1 ㎍/㎖이 되는 양으로 PBS mod Na/K (132.7 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 1.1 mM MgCl2, 7.26 mM Na2HPO4, 2.72 mM KH2PO4, pH 7.2)에 첨가된다. 15 내지 45분의 교반 후, 각각의 균주 H1N1의 ㎖당 35.71 ㎍의 HA, 균주 H3N2의 ㎖당 36.90 ㎍의 HA, 및 B 균주의 ㎖당 39.29 ㎍의 HA를 첨가하였다.
애주번트 첨가된 백신: PBS mod Na/K (132.7 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 1.1 mM MgCl2, 7.26 mM Na2HPO4, 2.72 mM KH2PO4, pH 7.2)를 주사용수에 첨가하여 인간 용량당 0.5 ㎖의 최종 부피를 달성하였다. 15 내지 45분의 교반 후, 소위 "중간체 벌크"의 부피를 첨가하고, 15-45분 동안 혼합하였다. 이후, 20배 농축된 PBS mod (2.74 M NaCl, 54 mM KCl, 142.8 mM Na2HPO4, 26 mM KH2PO4, pH 6.8)를 첨가하고, 15 내지 45분 동안 혼합하였다. AS03 에멀젼 및 첨가된 양과 동일한 조성에 따른 상기 20배 농축된 PBS mod는 AS03 용량의 함수이며, 이는 에멀젼 함량을 감소시키면서 백신의 이온 조성을 동일하게 유지시키기 위해 계산된다. 최종적으로, 필요한 에멀젼이 첨가(31.25 또는 62.5 또는 125 또는 250 ㎕/용량)되고, 15 내지 45분 동안 혼합되어, 표 23에 예시된 최종 목표 값에 도달된다.
Ⅹ.4. 면역원성 결과 - 체액 면역 반응
Ⅹ.4.1. HI 기하 평균 역가 ( GMT )
95% CI를 갖는 HI 항체에 대한 GMT가 표 24 및 도 15에 제공된다. 연령 그룹(18-49세 및 50-64세)당 95% CI를 갖는 HI 항체에 대한 GMT가 표 25에 제공된다.
표 24 - 0 및 21일에서의 HI 항체 역가에 대한 혈청양성률 및 GMT(면역원성에 대한 ATP 코호트 )
Figure 112009071406810-pct00019
표 25 - 연령 범주에 의한 0 및 21일에서의 HI 항체 역가에 대한 혈청양성률 및 GMT
Figure 112009071406810-pct00020
Figure 112009071406810-pct00021
중간 결론
A/솔로몬 섬(H1N1)에 대해, GMT는 모든 연구 그룹에서 동일 범위에 존재하였다. 모든 애주번트 첨가된 그룹은 모든 균주 및 모든 연령 범주에 대해 플루아릭스 그룹에 비해 열등하지 않다. A/위스콘신(H3N2)에 대해, 감소하는 AS03 농도를 이용한 감소된 면역 반응에 대한 경향이 통계적으로 유의한 차이 없이 나타났다. B/말레이시아에 대해, 감소하는 AS03 농도를 이용한 감소된 면역 반응에 대한 경향이 또한 나타났으나, 상기 균주에 대해 FluLD1/2 및 FluLD1/8로 유도된 GMT 사이에만 통계적으로 유의한 차이가 나타났다(도 15 참조). 연령 그룹에 의해 데이터가 분석되는 경우에 유사한 결과가 관찰되었다. 그러나, B/말레이시아에 대해, FluLD1/2로 유도된 GMT는 보다 어린 연령 그룹(18-49세)에서 FluLD1/4를 이용하는 것보다 통계적으로 현저하게 높았다.
Ⅹ.4.2. 항- HI 항체 역가의 혈청전환 인자, 혈청보호율 및 혈청전환률 (인간 에서 인플루엔자 백신에 대해 확립된 보호와 상관됨)
결과를 혈청보호율에 대해 표 26 및 27 - 도 16, 혈청전환률에 대해 표 28 및 29 - 도 17A 및 17B, 및 전환 인자에 대해 표 30 및 31 - 도 17에 제시하였다.
표 26 - 0 및 21일에서의 HI 항체 역가에 대한 혈청보호율(SPR)
Figure 112009071406810-pct00022
표 27 - 연령 범주에 의한 0 및 21일에서의 HI 항체 역가에 대한 혈청보호율(SPR)
Figure 112009071406810-pct00023
Figure 112009071406810-pct00024
중간 결론
SPR은 모든 그룹 및 모든 3개의 균주에 대해 CHMP (평균 > 70) 및 FDA 기준 (95% CI > 70의 LL)을 충족시켰다. SPR은 모든 그룹에 대해 동일 범위에 해당하는 것으로 밝혀졌다.
표 28 - PI (21일)에서의 HI 항체 역가에 대한 혈청전환률( SCR )
Figure 112009071406810-pct00025
표 29 - 연령 범주에 의한 PI(21일)에서의 HI 항체 역가에 대한 혈청전환률( SCR )
Figure 112009071406810-pct00026
중간 결론
SCR은 모든 연구 백신 및 모든 3개의 균주에 대해 CHMP 기준(평균 > 40) 및 FDA 기준(95% Cl > 40의 LL)을 충족시켰다. 감소된 AS03 함량을 이용한 감소된 SCR에 대한 경향이 B/말레이시아를 제외하고 나타났다(모든 결과는 동일 범위에 존재하는 것으로 나타났다). A/솔로몬 섬에 대해, FluLD1/1은 FluLD1/8에 비해 통계적으로 현저히 높은 SCR을 유도하였다. 모든 그룹에 대해, FluLD1/2 및 FluLD1/4에 의해 유도된 SCR은 동일 범위에 해당하였다.
표 30 - 21일에서 HI 항체 역가에 대한 혈청전환 인자( SCF )
Figure 112009071406810-pct00027
표 31 - 연령 범주에 의한 21일에서의 HI 항체 역가에 대한 혈청전환 인자(SCF)
Figure 112009071406810-pct00028
중간 결론
모든 연구 백신에 대해, SCF는 모든 3개의 균주에 대해 CHMP 기준(>2)을 훨씬 초과하였다. SCF는 모든 연구 백신에 대해 동일 범위에 해당하였다.
Ⅹ.4.3. 플루아릭스와 관련한 애주번트 첨가된 저용량 백신의 비-열등성( GMT )
21일에서의 GMT 비에 의한 플루아릭스와 관련한 애주번트 첨가된 저용량 백신의 비-열등성이 표 32에 제공된다.
표 32 - 3개의 바이러스 균주에 대한 21일에서의 GMT 비에 의한 플루아릭스 와 관련한 애주번트 첨가된 저용량 백신의 비- 열등성
Figure 112009071406810-pct00029
중간 결론
FluLD1/1, 1/2, 1/4는 모든 3개의 균주에 대해 GMT 비에 의해 플루아릭스에 대해 비-열등성인 것으로 밝혀졌다. FluLD 1/8은 H1N1 및 H3N2 균주에 대해 플루아릭스에 비해 비-열등성인 것으로 밝혀졌으나, B에 대해서는 그렇지 않았다.
Ⅹ.5. 종합 결론
Ⅹ.5.1 안전성 결론
시판되는 플루아릭스 백신으로 밝혀진 반응원성에 비해, 애주번트 첨가된 백신으로 보다 높은 반응원성이 나타났다. 애주번트 첨가된 백신에 대해, 감소하는 양의 AS03을 이용하여 감소하는 반응원성에 대한 경향이 나타났다. 종합적으로, FluDL1/4 및 FluDL1/8을 이용하여 유사한 반응원성 프로파일이 수득되었다. 요망되지 않는 증상은 모든 백신 그룹에 대해 동일하였다.
Ⅹ.5.2. 면역원성 결론
본 연구의 1차 목적은 21일에서의 LD 백신 제형 대 플루아릭스의 비-열등성(GMT)을 평가하기 위한 것이었다.
애주번트 첨가된 백신 FluDL1/1, FluDL1/2 및 FluDL1/4의 일 용량을 이용한 백신접종 21일 후에, 모든 3개의 균주에 대한 GMT 비는 플루아릭스로 수득된 것에 비해 비-열등성인 것으로 밝혀졌다. 이러한 연구에서, 백신 FluDL1/8로 수득된 GMT 비는 H1N1 및 H3N2에 대해 플루아릭스에 비해 비-열등성인 것으로 밝혀졌으나, B 균주에 대해서는 그렇지 않았다.
감소하는 양의 애주번트로 밝혀진 감소하는 면역 반응의 경향에도 불구하고, 모든 백신은 모든 균주에 대해 규제 승인에 대한 모든 3개의 CHMP 기준을 충족시키는 것으로 밝혀졌다.
실시예 ⅩⅠ - 스플리트 인플루엔자 항원 제조물 및 다양한 애주번트를 함유하는 백신을 이용한 65세 이상의 연령 집단에서의 임상 시험
ⅩⅠ.1. 서언
노인에서의 플루아릭스™과 같은 고전적 스플리트 인플루엔자 백신의 효능은 성인 또는 청년 집단에서의 효능 보다 현저히 낮다. 면역계의 노화(즉, 면역노화)가 노인에서 관찰되는 효능의 상대적 결핍의 근원적인 원인으로, 따라서 보다 강한 면역 반응의 자극에 의한 백신 개선을 위한 여지를 남김이 암시된다. 따라서, 참조로서 사용되는 플루아릭스™(GlaxoSmithKline Biologicals)에 비해 근내 투여되는 8개의 상이한 애주번트 제형을 갖는 인플루엔자 후보 백신의 면역원성, 안전성 및 반응원성을 평가하기 위해 Ⅱ기의 제어된 무작위 단일 맹검 연구를 2007년에 65세 이상의 연령의 노인 집단에서 수행하였다.
수중유 에멀젼 및 용량당 25 ㎍의 3D-MPL을 포함하는 애주번트 첨가된 인플루엔자 백신이 이미 시험되었고, 유효한 것으로 입증되었다(WO 2006/100111호). 이러한 연구에서, 각각의 성분의 양은 250 ㎕의 수중유 에멀젼 및 25 ㎍의 MPL로 고정되었다. 본 발명의 연구는 면연원성 프로파일의 용인성과 상기 관찰된 반응원성/안전성 프로파일의 용인성이 균형을 이루는 최적의 백신 제형을 결정하는데 목적을 둔다.
ⅩⅠ. 연구 계획 및 목적
10개 그룹의 피검체(18-40세 연령의 플루아릭스 YNG 그룹을 제외하고는 65세 이상의 연령의 그룹당 200명)에 동시에 하기 인플루엔자 백신을 근육내 투여하였다:
· FluAS03 1/1: 전체 용량의 o/w 에멀젼(AS03 1/1)으로 애주번트 첨가된 백 신
· FluAS03 1/2: 1/2 용량의 o/w 에멀젼(AS03 1/2)으로 애주번트 첨가된 백신
· FluAS03 1/4: 1/4 용량의 o/w 에멀젼(AS03 1/4)으로 애주번트 첨가된 백신
· FluAS25 1/1: 25㎍의 MPL + 전체 용량의 o/w 에멀젼(AS25A)으로 애주번트 첨가된 백신
· FluAS25 1/2: 25㎍의 MPL + 1/2 용량의 o/w 에멀젼(AS25B)으로 애주번트 첨가된 백신
· FluAS25 1/4: 25㎍의 MPL + 1/4 용량의 o/w 에멀젼(AS25C)으로 애주번트 첨가된 백신
· FluAS50 1/2: 50㎍의 MPL + 1/2 용량의 o/w 에멀젼(AS25E)으로 애주번트 첨가된 백신
· FluAS50 1/4: 50㎍의 MPL + 1/4 용량의 o/w 에멀젼(AS25F)으로 애주번트 첨가된 백신
· 플루아릭스 ELD (65세 이상의 연령): 플루아릭스™
· 플루아릭스 YNG (18-40세 연령): 플루아릭스™
스케줄: 0일에 인플루엔자 백신의 1회 IM 주사, 0일 및 21일에 혈액 샘플 수집, 및 180일 후에 백신접종. 본 연구에 이용된 표준 3가 스플리트 인플루엔자 백신 - 플루아릭스™는 실시예 Ⅹ에서 사용된 것과 동일한 것이다. 백신 제형은 표 31-32에 기재되어 있다.
ⅩⅠ.2.1. 1차 목적: 면역원성
백신접종 21일 후 3개의 백신 균주에 대한 면역원성(GMT)에 기초하여, 65세 이상의 연령의 피검체에서 근내 투여된 플루아릭스에 비한 애주번트 첨가된 인플루엔자 백신의 최적 제형(1개의 o/w 에멀젼 투여량 및 1개의 MPL 투여량의 조합)을 확인하기 위한 것이다. 변화는 실시예 Ⅹ.2.1에 기재된 것과 같고, 이는 65세 이상의 연령의 피검체에 대한 것이다(21일에서의 HI 항체 역가 및 HI 항체 역가의 GMT).
Ⅹ.2.2. 2차 목적은 하기를 평가하기 위한 것이다:
· 인플루엔자 백신으로 백신접종된 모든 피검체에서의 안전성 및 반응원성
· 백신접종 21일 후 모든 피검체에서의 인플루엔자 백신의 면역원성(GMT, SCF, SCR 및 SPR)
· 모든 피검체에서 일차 백신접종 180일 후의 HI 항체의 지속성
· 0, 21 및 180일(피검체 부분집합 단독에 대해)에서 2개 이상의 상이한 사이토카인(IFN-γ, IL-2, CD40L 또는 TNF-α)을 생성하는 인플루엔자 특이적 CD4/CD8 T 림프구의 빈도와 관련된 인플루엔자 백신에 의해 유도된 세포 매개 면역(CMI) 반응.
관찰된 변화 및 유도된 변화(및 정의)는 실시예 Ⅹ에 기재되어 있다.
ⅩⅠ.3. 백신 조성물 및 투여
애주번트 첨가된 인플루엔자 백신은 GSK Bio에서 1992년 이래로 판매하는 시 판되는 플루아릭스 백신을 기초로 한다. 후보 제형은 MPL 및/또는 수중유(o/w) 에멀젼에 기초한 애주번트 시스템과 조합된 3개의 1가 바이러스 항원 벌크(2007/2008년 북반구에 대해 권고된, 각각 인플루엔자 균주 A/H1N1, A/H3N2 및 B로부터 제조됨, 실시예 Ⅹ 참조)로 이루어진 불활성화 인플루엔자 항원인 3가 스플리트 비리온으로 구성된다.
GSK Bio 전매 특허의 애주번트 시스템의 하기 2개의 패밀리가 상기 시험에서 시험될 것이다:
- 애주번트 첨가된 백신의 인간 용량당 에멀젼의 양에 의해 범주화된(1/1 - 1/2 - ...) AS03 패밀리;
- MPL로 보충되고, 애주번트 첨가된 백신의 인간 용량당 각각의 성분의 양에 의해 범주화된(A, B, ...) 수중유 에멀젼의 AS25 패밀리.
ⅩⅠ.3.1. 백신 조성물
암탉의 부화란에서 개별적으로 성장한 3개의 인플루엔자 바이러스 균주 타입 A(H1N1 및 H3N2) 및 타입 B의 제조용 바이러스(working seed)로부터 제조된 스플리트 불활성화 비리온 항원의 3개의 모노벌크(monobulk)의 생성이 이미 기재된 바와 같다(실시예 Ⅹ 참조). 임상 로트는 용량당 각각의 인플루엔자 바이러스 균주의 15 ㎍의 헤마글루티닌(HA)을 함유한다. 인플루엔자 항원은 3-O-데스아실-4'-모노포스포릴 지질 A(MPL) 및/또는 수중유(o/w) 에멀젼 AS03으로 애주번트 첨가된다. AS의 8개의 상이한 제형이 스플리트 비리온 인플루엔자 항원과 조합된다. 애주번트의 제조 방법은 WO 2006/100111호의 실시예 Ⅱ에 기재된 것으로부터 적합화되고, 여기서 개별적 성분의 양은 표 31 및 32에 제공된 정보에 따라 적합화된다. 부형제는 다음과 같다: 폴리소르베이트 80 (트윈-80), 옥토시놀 10 (트리톤n? X-100), α-토코페릴 수소 숙시네이트, 염화나트륨, 염화마그네슘, 인산수소이나트륨, 인산이수소칼륨, 염화칼륨 및 주사용수. 애주번트 첨가된 인플루엔자 백신의 상이한 제형은 보존제를 함유하지 않는 제형이다. 그러나, 이들은 바이오버든(bioburden)을 감소시키기 위해 첨가되는, 약물 물질 제조 과정의 초기 단계로부터의 미량의 티오메르살(용량당 < 1.25 ㎍의 Hg)을 함유한다.
애주번트 첨가된 인플루엔자 백신은 주사를 위한 애주번트 첨가된 스플리트 정제 인플루엔자 바이러스의 멸균된 희끄무레한 에멀젼이다. 이는 항원을 함유하는 타입 Ⅰ 유리 바이얼(현탁액) 및 에멀젼을 함유하는 미리 충전된 타입 Ⅰ 유리 주사기(PES)(에멀젼)으로 구성된 2개 성분의 백신으로 제공된다. 백신은 2 내지 8℃에서 저장된다. 주사시, 항원이 미리 충전된 주사기의 내용물이 농축된 3가 불활성화 스플리트 비리온 항원을 함유하는 바이얼에 주사된다. 혼합 후, 내용물이 주사기로 회수되고, 바늘이 근내 바늘로 대체된다. 재구성된 애주번트 첨가된 인플루엔자 후보 백신의 일 용량은 0.7 ㎖에 해당한다(표 33 및 34).
표 33 - 백신 제형
Figure 112009071406810-pct00030
표 34 - 애주번트 첨가된 인플루엔자 백신의 조성
Figure 112009071406810-pct00031
ⅩⅠ.3.2. 백신 제조
인산염 완충용액(Na/K 191.4 mM PO4 3-, 2.74 mM NaCl, 54 mM KCL, pH 6.8, ad 9.57 mM PO4 3)을 주사용수로 희석하여 AS03 제형을 제조하였다(균질해질 때까지 RT에서 15-45분 동안 교반). 이후, 적절한 양의 수중유 에멀젼 벌크를 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 15-45분 동안 교반하고, pH를 측정하였다. 이후, 혼합물을 0.2 μm 막을 통해 여과시켜 멸균시켰다. 멸균 비활성 가스(질소) 플러싱(flushing)을 수행하여 최소 1분 동안 충전된 용기에서 비활성 공간 부분을 생성시켰다. 멸균 AS03 애주번트를 1.25-㎖ 멸균 타입 I(Ph. Eur.) 유리 주사기로의 멸균 충전때까지 +2 - 8℃에서 저장하였다. 각각의 주사기는 60 ㎕의 부피 과잉(volume overage)(280 ㎕ + 60 ㎕가 넘음)을 함유한다.
인산염 완충용액을 주사용수로 희석하여 AS25 제형을 제조하였다(균질해질 때까지 RT에서 15-45분 동안 교반함). 이후, SB62 벌크 및 MPL 액체 벌크의 적절한 양을 첨가하였다. 나머지 과정은 상기 기재된 바와 같다.
재구성된 애주번트 첨가된 인플루엔자 백신의 일 용량은 0.7 ㎖에 해당한다. 최종 HA 농도는 3가 최종 벌크 ㎖당 21.4 ㎍의 각각의 1가 벌크이다. 항원(Ags)의 최종 벌크를 3-㎖ 유리 바이얼에 충전시키고, 3가 인플루엔자 항원의 일 용량은 0.42 ㎖의 부피에 해당한다. 애주번트 첨가된 벌크를 1.25-㎖ 유리 PFS에 충전시키고, 일 용량은 0.28 ㎖의 부피에 해당한다. 재구성 후 최종 백신 용량은 0.7 ㎖가 될 것이다.
재구성 후 명목 부피(0.7 ㎖)의 주사를 위해, 각각의 Ags 바이얼을 0.51 ㎖의 목표 부피로 충전시키고, 각각의 AS 주사기를 0.34 ㎖의 목표 부피로 충전시켰다.
ⅩⅠ.4. 면역원성 결과 - 체액 면역 반응
ⅩⅠ.4.1. HI 기하 평균 역가( GMT )
95% CI를 갖는 HI 항체의 GMT는 표 35 및 도 19에 제시된다.
표 35 - 0 및 21일에서의 HI 항체 역가에 대한 혈청양성률 및 GMT(면역원성 HI에 대한 ATP 코호트 )
Figure 112009071406810-pct00032
Figure 112009071406810-pct00033
중간 결론
1개 전체 용량의 AS03 및 25 ㎍의 MPL(AS25_1_1)로 애주번트 첨가된 인플루엔자 백신은 65세 이상의 연령의 피검체에서 플루아릭스에 비해 B/말레이시아 균주에 대해 통계적으로 현저하게 나은 HI 반응을 유도하였다. 나머지 2개의 균주에 대해, 1/4 용량의 AS03을 갖는 것을 제외하고는 모든 애주번트 첨가된 백신은 본 연구에서 65세 이상의 연령의 피검체에서 플루아릭스에 비해 나은 결과를 유도하였다.
Ⅹ.4.2. 항- HI 항체 역가의 혈청 전환 인자, 혈청보호율 및 혈청전환률 (인간에서의 인플루엔자 백신에 대해 확립된 바와 같은 보호와 상관됨)
결과는 혈청보호율에 대해 표 36 - 도 20(균주당 1개), 혈청전환률에 대해 표 37 - 도 21, 및 혈청 전환 인자에 대해 표 38 - 도 22에 제공된다.
표 36 - 0 및 21일에서의 HI 항체 역가에 대한 SPR( HI 에 대한 ATP 코호트 )
Figure 112009071406810-pct00034
Figure 112009071406810-pct00035
표 37 - 21일에서의 HI 항체 역가에 대한 SCR(면역원성 HI 에 대한 ATP 코호트 )
Figure 112009071406810-pct00036
표 38 - 21일에서의 HI 항체 역가에 대한 SCF(면역원성 HI에 대한 ATP 코호트)
Figure 112009071406810-pct00037
체액 면역 반응에 대한 중간 결론
AS03(수중유 에멀젼)의 명백한 용량 효과가 HI 데이터에서 관찰된다.
GMT는 A/솔로몬 섬 균주(AS03_1_4 및 AS50_1_4 제외) 및 A/위스콘신 균주에 대해 Flu_ELD 그룹에 비해 애주번트 첨가된 인플루엔자 백신 그룹에서 통계적으로 현저하게 높았다. B/말레이시아 균주에 대해, GMT는 Flu_ELD 그룹에 비해 AS25_1_1 그룹에서 통계적으로 현저하게 높았다. H3N2 균주(A/위스콘신)에 대해, 체액 반응이 1/4 용량의 에멀젼이 사용된 그룹을 제외하고는 모든 애주번트 첨가된 인플루엔자 백신 그룹에 대해 청년에서 관찰되는 수준으로 증가하였다.
SCR은 A/솔로몬 섬 균주(AS25_1_4 및 AS50_1_4 제외) 및 A/위스콘신 균주에 대해 Flu_ELD 그룹에 비해 애주번트 첨가된 인플루엔자 백신 그룹에서 통계적으로 현저하게 높았다. B/말레이시아 균주에 대해, SCR은 Flu_ELD 그룹에 비해 AS25_1_1 그룹에서 통계적으로 현저하게 높았다.
ⅩⅠ.5. 세포 매개 면역 반응의 분석
0 및 21일에서 2개 이상의 사이토카인(all doubles)을 생성하는 인플루엔자 특이적 CD4 T-세포의 빈도는 풀링된 백신 균주로 재자극된 세포에 대해 표 39 및 도 23에 제공된다.
표 39 - 0 및 21일에서 풀링된 균주에 대한 사이토카인-양성 CD4 T-세포(백만개의 CD4 T-세포당)의 빈도(면역원성 CMI에 대한 ATP 코호트)
Figure 112009071406810-pct00038
Figure 112009071406810-pct00039
Figure 112009071406810-pct00040
세포 매개 면역 반응에 대한 중간 결론
5개의 애주번트 첨가된 백신(AS03_1_1, AS03_1_2, AS25_1_1, AS50_1_2 및 AS50_1_4)은 개체 차이(D21 - DO)와 관련하여 모든 사이토카인 조합물에 대해 65세 이상의 연령의 피검체에서 플루아릭스에 비해 풀링된 균주에 대해 현저하게 높은 CMI 반응을 유도하였다. 3개의 상기 애주번트 첨가된 백신(AS03_1_1, AS03_1_2 및 AS25_1_1)이 또한 개체 차이(Day 21 - Day O)와 관련하여 모든 사이토카인 조합물에 대해 청년에서 플루아릭스에 비해 풀링된 균주에 대해 현저하게 높은 CMI 반응을 유도하였다.
ⅩⅠ.6. 반응원성
국소 증상
백신접종 후 7일의 기간 동안 요망되는 국소 증상(임의의 등급/등급 3)을 나타내는 피검체의 백분율을 정량가능한 증상에 대한 EMEA 및 FDA 등급화를 이용하여 평가하였다.
EMEA 등급화: 반상출혈(임의의 등급 [>0mm] 및 등급 3 [>50mm]); 동통 (임의의 등급); 등급 3 동통; 발적(임의의 등급 [>0mm] 및 등급 3 [>50mm]) 및 종창(임의의 등급 [>0mm]); 등급 3 종창 (>50mm). FDA 등급화: 반상출혈(임의의 등급 [≥25mm] 및 등급 3 [>100mm]), 등급 3 발적(>100mm); 등급 3 종창(>100mm), 발적(임의의 등급 [≥25mm]); 종창(임의의 등급 [≥25mm]).
일반 증상
EMEA 등급화: 열(≥37.5°C), 등급 3 열(>39.0°C). FDA 등급화: 열(≥38°C) 및 등급 3 열(>40°C).
백신접종 후 7일의 기간(0-6일) 동안 보고된 임의 및 등급 3의 요망되는 증상 및 요망되지 않는 증상의 종합적 발병률 및 특성이 도 24에 제공된다.
결론
하나 이상의 일반 증상을 나타내는 피검체의 백분율은 Flu_ELD 그룹에 비해 애주번트 첨가된 인플루엔자 백신 그룹에서 통계적으로 현저하게 높았으나, Flu_YNG 그룹(AS03_1_4 제외)에 대해서는 동일 범위였다.
1개 이상의 등급 3 일반 증상을 나타내는 피검체의 백분율은 모든 그룹에 대해 동일 범위였다.
1개 이상의 국소 증상을 나타내는 피검체의 백분율은 Flu_ELD 그룹에 비해 애주번트 첨가된 인플루엔자 백신 그룹에서 및 Flu_YNG 그룹에 비해 AS25_1_1 그룹에서 통계적으로 현저하게 높았다.
1개 이상의 등급 3 국소 증상을 나타내는 피검체의 백분율은 Flu_ELD 및 Flu_YNG 그룹에 비해 AS03_1_1, AS25_1_2, AS25_1_1 및 AS50_1_2 그룹에서 통계적으로 현저하게 높았다.
ⅩⅠ.7. 일반 결론
상기 데이터는 인간 집단에서 면역 반응/부작용을 적절히 균형을 이루게 하는데 중요하다.
HI 면역원성에 관하여, 명백한 애주번트 효과가 입증되었고, 특히 모든 애주번트 투여량을 이용하여 H1N1 및 H3N2에 대해 현저한 증가가 입증되었다. 주로 AS25 1/1을 이용하나 AS03 1/1, AS03 1/2 및 AS50 1/2도 이용하여 B 균주에 대해 현저한 증가가 수득되었다. 용량-효과가 애주번트의 수중유 에멀젼 성분, 및 또한 애주번트의 MPL 성분에 대해 관찰되었으나, 애주번트의 MPL 성분은 덜 명백하였다.
세포 매개 면역 반응에 관하여, 애주번트 효과가 또한 AS03 1/1, AS03 1/2, AS25 1/1 및 AS50 1/2에 대해 풀링된 균주(빈도, 모두 측정함)에 대해 노인에서 플루아릭스에 비해 현저한 차이를 갖는 것이 입증되었다. AS25 1/1, AS03 1/1 및 AS03 1/2으로 가장 높은 반응이 수득되었다.
반응원성에 관하여, 애주번트 첨가된 백신은 백신의 수중유 에멀젼 성분과 결합된 플루아릭스 보다 더욱 반응원성이며, 덜 현저하지만 MPL의 용량 효과가 또한 존재한다. AS03 1/2은 상기 노인 집단에서 만족스러운 면역원성 프로파일을 나타내면서 AS03 1/1보다 덜 반응원성이다.
SEQUENCE LISTING <110> GlaxoSmithKline Biologicals sa <120> Vaccine <130> VB62342 <160> 6 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence, unmethylated CG containing sequence <400> 1 tccatgacgt tcctgacgtt 20 <210> 2 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence, unmethylated CG containing sequence <400> 2 tctcccagcg tgcgccat 18 <210> 3 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence, unmethylated CG containing sequence <400> 3 accgatgacg tcgccggtga cggcaccacg 30 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence, unmethylated CG containing sequence <400> 4 tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence, unmethylated CG containing sequence <400> 5 tccatgacgt tcctgatgct 20 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence, unmethylated CG containing sequence <400> 6 tcgacgtttt cggcgcgcgc cg 22

Claims (60)

  1. 수중유 에멀젼 애주번트와 조합된 인플루엔자 바이러스 항원 또는 항원성 제조물을 포함하는 인간 용도에 적합한 용량 부피의 면역원성 인플루엔자 조성물로서, 상기 애주번트가 (ⅰ) 인간 용량당 5-6 mg의 스쿠알렌, 2-3 mg의 유화제, 및 5-7 mg의 토콜로 구성되는 애주번트; (ⅱ) 인간 용량당 2-3 mg의 스쿠알렌, 1-1.5 mg의 유화제, 및 2.5-3.5 mg의 토콜로 구성되는 애주번트; 및 (ⅲ) 인간 용량당 0.5-1.5 mg의 스쿠알렌, 0.25-0.75 mg의 유화제, 및 0.5-1.5 mg의 토콜로 구성되는 애주번트로 구성된 군으로부터 선택된, 면역원성 인플루엔자 조성물.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 유화제가 비이온성 계면활성제인 면역원성 조성물.
  3. 제 2항에 있어서, 상기 유화제가 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레에이트 또는 소르비탄 트리올레에이트 또는 상기 둘 모두의 혼합물인 면역원성 조성물.
  4. 제 3항에 있어서, 상기 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레에이트가 폴리소르베이트 80 또는 트윈? 80(Tween? 80)을 포함하는 군으로부터 선택되고, 상기 소르비탄 트리올레에이트가 스팬85(Span85)인 면역원성 조성물.
  5. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 토콜이 알파-토코페롤인 면역원성 조성물.
  6. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 애주번트가 스테롤을 추가로 포함하는 면역원성 조성물.
  7. 청구항 7은(는) 설정등록료 납부시 포기되었습니다.
    제 6항에 있어서, 상기 스테롤이 콜레스테롤인 면역원성 조성물.
  8. 청구항 8은(는) 설정등록료 납부시 포기되었습니다.
    제 6항 또는 제 7항에 있어서, 상기 스테롤이 인간 용량당 0.025-2.5, 0.05-1.5, 0.075-0.75, 0.1-0.3 또는 0.125-0.25 mg(예를 들어, 0.2-0.3, 0.1-0.15, 0.25 또는 0.125 mg)의 양으로 존재하는 면역원성 조성물.
  9. 청구항 9은(는) 설정등록료 납부시 포기되었습니다.
    제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 애주번트가 TLR-1, TLR-2, TLR-3, TLR-4, TLR-7, TLR-8, TLR-9 또는 이의 조합물로부터 선택된 TLR 리간드를 추가로 포함하는 면역원성 조성물.
  10. 청구항 10은(는) 설정등록료 납부시 포기되었습니다.
    제 9항에 있어서, 상기 TLR-4 리간드가 지질 A 유도체, 아미노알킬 글루코사미니드 포스페이트 유도체(AGP), 및 ER803022, ER803058, ER803732, ER804053, ER804057, ER804058, ER804059, ER804442, ER804680 및 ER804764의 군으로부터 선택된 화합물로부터 선택된 면역원성 조성물.
  11. 청구항 11은(는) 설정등록료 납부시 포기되었습니다.
    제 10항에 있어서, 상기 지질 A 유도체가 3D-MPL이거나 지질 A의 임의의 합성 유도체인 면역원성 조성물.
  12. 청구항 12은(는) 설정등록료 납부시 포기되었습니다.
    제 10항 또는 제 11항에 있어서, 상기 TLR-4 리간드가 인간 용량당 5-60, 40-50, 10-50, 20-30, 5-15, 10, 20, 30, 40 또는 50 ㎍의 양으로 존재하는 면역원성 조성물.
  13. 제 1항 내지 제 12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 애주번트가 사포닌 또는 이의 유도체를 추가로 포함하는 면역원성 조성물.
  14. 청구항 14은(는) 설정등록료 납부시 포기되었습니다.
    제 13항에 있어서, 상기 사포닌 또는 이의 유도체가 QS21인 면역원성 조성물.
  15. 청구항 15은(는) 설정등록료 납부시 포기되었습니다.
    제 13항 또는 제 14항에 있어서, 상기 사포닌이 인간 용량당 5-60, 40-50, 10-50, 20-30, 5-15, 10, 20, 30, 40 또는 50 ㎍의 양으로 존재하는 면역원성 조성물.
  16. 제 1항 내지 제 15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 바이러스 항원 또는 항원성 제조물이 인플루엔자 균주당 인간 용량당 15 ㎍ 또는 15 ㎍ 미만의 헤마글루티닌(haemagglutinin, HA)인 면역원성 조성물.
  17. 제 16항에 있어서, 상기 바이러스 항원 또는 항원성 제조물이 인플루엔자 균주당 인간 용량당 10 ㎍ 미만, 또는 8 ㎍ 미만, 또는 4 ㎍ 미만, 또는 2 ㎍ 미만의 HA, 또는 1 ㎍ 미만의 HA, 또는 0.5 ㎍ 미만, 또는 0.1 ㎍ 미만의 HA인 면역원성 조성물.
  18. 제 16항 또는 제 17항에 있어서, 상기 바이러스 항원 또는 항원성 제조물이 인플루엔자 균주당 인간 용량당 2-7.5 ㎍, 또는 1-5 ㎍의 HA인 면역원성 조성물.
  19. 제 16항 내지 제 18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 바이러스 항원 또는 항원성 제조물이 인플루엔자 균주당 인간 용량당 5 ㎍ 미만 또는 정확히 5 ㎍의 HA, 또는 2.5 ㎍ 미만 또는 정확히 2.5 ㎍, 또는 1 ㎍ 미만 또는 정확히 1 ㎍인 면역원성 조성물.
  20. 제 1항 내지 제 19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 범유행병 발생과 관련되거나 범유행병 발생과 관련될 잠재성을 갖는 1개 이상의 인플루엔자 균주로부터의 바이러스 항원 또는 항원성 제조물을 포함하는 1가 조성물인 면역원성 조성물.
  21. 제 1항 내지 제 19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 또는 5개 이상의 인플루엔자 균주로부터의 바이러스 항원 또는 항원성 제조물을 포함하는 다가 조성물인 면역원성 조성물.
  22. 청구항 22은(는) 설정등록료 납부시 포기되었습니다.
    제 21항에 있어서, 상기 조성물이 3개 이상의 인플루엔자 계절성(범유행기 사이(interpandemic)) 균주로부터의 바이러스 항원 또는 항원성 제조물을 포함하고, 범유행병 발생과 관련되거나 범유행병 발생과 관련될 잠재성을 갖는 1개 이상의 인플루엔자 균주로부터의 바이러스 항원 또는 항원성 제조물을 임의로 포함하는 면역원성 조성물.
  23. 청구항 23은(는) 설정등록료 납부시 포기되었습니다.
    제 21항 또는 제 22항에 있어서, 상기 다가 조성물이 (ⅰ) H1N1 및 H3N2의 군으로부터 선택된 2개의 범유행기 사이 A 균주, 및 B/야마가타(B/yamagata) 및 B/빅토리아(B/Victoria)의 군으로부터 선택된 2개의 B 균주; (ⅱ) H1N1 및 H3N2의 군으로부터 선택된 3개의 범유행기 사이 A 균주, 및 B/야마가타 및 B/빅토리아의 군으로부터 선택된 1개의 B 균주; 및 (ⅲ) H1N1 및 H3N2의 군으로부터 선택된 2개의 범유행기 사이 A 균주, H5N1인 1개의 범유행병 A 균주, 및 B/야마가타 및 B/빅토리아의 군으로부터 선택된 1개의 B 균주로 구성된 군으로부터 선택된 바이러스 항원 또는 항원성 제조물을 포함하는 면역원성 조성물.
  24. 제 20항 또는 제 22항 또는 제 23항에 있어서, 상기 범유행병 인플루엔자 바이러스 균주가 H5N1, H9N2, H5N8, H5N9, H7N4, H7N7, H2N2, H10N7, H5N2, H7N2, H7N1 및 H7N3으로 구성된 군으로부터 선택된 면역원성 조성물.
  25. 제 1항 내지 제 24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인플루엔자 바이러스 항원 또는 이의 항원성 제조물이 란(egg) 또는 세포 배양물에서 성장한 인플루엔자 바이러스로부터 유래된 것인 면역원성 조성물.
  26. 제 1항 내지 제 25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인플루엔자 바이러스 항원 또는 이의 항원성 제조물이 전체 바이러스, 스플리트(split) 바이러스, 바이로솜, 또는 HA, NA, M1 및 M2로부터 선택된 1개 이상의 정제된 항원을 포함하는 면역원성 조성물.
  27. 청구항 27은(는) 설정등록료 납부시 포기되었습니다.
    제 26항에 있어서, 상기 정제된 항원(들)이 포유동물, 조류 또는 곤충 세포에서 성장한 인플루엔자 바이러스로부터 제조된 것인 면역원성 조성물.
  28. 청구항 28은(는) 설정등록료 납부시 포기되었습니다.
    제 26항 또는 제 27항에 있어서, 상기 정제된 항원(들)이 재조합적으로 생성된 것인 면역원성 조성물.
  29. 제 1항 내지 제 28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인간 용량이 0.5 ㎖ 이하, 0.5 내지 1.5 ㎖, 0.2 내지 1.2 ㎖, 0.2 내지 0.7 ㎖, 및 0.25 ㎖ 미만 또는 정확히 0.25 ㎖, 또는 0.5 ㎖, 또는 0.7 ㎖, 또는 1 ㎖로부터 선택된 면역원성 조성물.
  30. 제 1 부피의 수중유 에멀젼 및 제 2 부피의 인플루엔자 바이러스 또는 이의 항원성 제조물을 포함하는 수성 현탁액을 혼합하는 단계로서, 상기 제 1 부피가 상기 제 2 부피보다 큰 단계를 포함하는, 제 1항 내지 제 29항 중 어느 한 항에 청구된 애주번트 첨가된 인플루엔자 백신을 제조하는 방법.
  31. 실질적으로 동일한 부피의 수중유 에멀젼, 및 인플루엔자 바이러스 또는 이의 항원성 제조물을 포함하는 수성 현탁액을 혼합하는 단계를 포함하는, 제 1항 내지 제 29항 중 어느 한 항에 청구된 애주번트 첨가된 인플루엔자 백신을 제조하는 방법.
  32. 제 1 부피의 수중유 에멀젼 및 제 2 부피의 인플루엔자 바이러스 또는 이의 항원성 제조물을 포함하는 수성 현탁액을 혼합하는 단계로서, 상기 제 2 부피가 상기 제 2 부피보다 큰 단계를 포함하는, 제 1항 내지 제 29항 중 어느 한 항에 청구된 애주번트 첨가된 인플루엔자 백신을 제조하는 방법.
  33. 청구항 33은(는) 설정등록료 납부시 포기되었습니다.
    제 30항 내지 제 32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생성된 희석된 에멀젼과 상기 인플루엔자 수성 현탁액을 혼합시키기 전에 수중유 에멀젼을 희석시키는 단계를 포함하는 방법.
  34. 제 16항 내지 제 29항 중 어느 한 항에 정의된 인플루엔자 바이러스 항원 성분 또는 인플루엔자 바이러스 항원성 제조물 성분을 포함하고, 동반 또는 순차 투여를 위한 제 1항 내지 제 15항 중 어느 한 항에 정의된 애주번트를 추가로 포함하는 백신 키트.
  35. 제 1항 내지 제 29항 중 어느 한 항의 면역원성 조성물 및 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 백신.
  36. 청구항 36은(는) 설정등록료 납부시 포기되었습니다.
    제 1항 내지 제 29항 중 어느 한 항의 면역원성 조성물과 약학적으로 허용되는 부형제를 혼합하는 단계를 포함하는, 제 35항의 백신을 제조하는 방법.
  37. 삭제
  38. 삭제
  39. 삭제
  40. 의약에 사용하기 위한 제 1항 내지 제 29항 중 어느 한 항의 면역원성 조성물 또는 제 35항의 백신.
  41. 인플루엔자 감염에 의해 야기된 질병의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 제 1항 내지 제 29항 중 어느 한 항의 면역원성 조성물 또는 제 35항의 백신.
  42. 삭제
  43. 제 1항 내지 제 29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 인간에서 (ⅰ) 애주번트 첨가되지 않은 조성물로 수득된 것에 비해 상기 항원 또는 이의 항원성 제조물에 대해 개선된 CD4 T-세포 면역 반응, (ⅱ) 애주번트 첨가되지 않은 조성물로 수득된 것에 비해 상기 항원 또는 이의 항원성 제조물에 대해 개선된 체액 면역 반응, (ⅲ) 애주번트 첨가되지 않은 조성물로 수득된 것에 비해 상기 항원 또는 이의 항원성 제조물에 대해 개선된 B-기억 세포 반응 중 1개 이상, 또는 2개 이상, 또는 전부를 유도할 수 있는 면역원성 조성물.
  44. 제 1항 내지 제 29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 인간에서 (ⅰ) 애주번트 성분이 보다 많은 양으로 존재하는 애주번트 첨가된 조성물로 수득된 것과 비교하여 상기 항원 또는 이의 항원성 제조물에 대해 동등한 CD4 T-세포 면역 반응, (ⅱ) 애주번트 성분이 보다 많은 양으로 존재하는 애주번트 첨가된 조성물로 수득된 것과 비교하여 상기 항원 또는 이의 항원성 제조물에 대해 동등한 체액 면역 반응, (ⅲ) 애주번트 성분이 보다 많은 양으로 존재하는 애주번트 첨가된 조성물로 수득된 것과 비교하여 상기 항원 또는 이의 항원성 제조물에 대해 동등한 B-기억 세포 반응 중 1개 이상, 또는 2개 이상, 또는 전부를 유도할 수 있는 면역원성 조성물.
  45. 제 43항 또는 제 44항에 있어서, 상기 CD4 T-세포 면역 반응이 교차 반응성 CD4 T 헬퍼(helper) 반응의 유도를 포함하는 면역원성 조성물.
  46. 제 43항 또는 제 44항에 있어서, 상기 체액 면역 반응이 교차 반응성 체액 면역 반응의 유도를 포함하는 면역원성 조성물.
  47. 면역원성 조성물 내의 항원이 유래되는 병원체의 변이체인 인플루엔자 병원체에 의해 야기된 질병의 치료 또는 예방에 사용하기 위한, 제 1항 내지 제 29항 중 어느 한 항의 면역원성 조성물 또는 제 35항의 백신.
  48. 삭제
  49. 제 43항 또는 제 44항에 있어서, 면역원성 조성물 내의 항원의 변이체인 항원을 포함하는 병원체에 의해 야기된 감염 또는 질병에 대한 보호를 위한 면역원성 조성물.
  50. 제 1항 내지 제 29항 중 어느 한 항의 면역원성 조성물 또는 제 40항의 백신으로 이전에 백신접종된 개체의 재백신접종을 위한 면역원성 인플루엔자 조성물.
  51. 삭제
  52. 제 50항에 있어서, 이전의 백신접종에 사용된 조성물의 항원과 공통의 CD4 T-세포 에피토프를 공유하는 인플루엔자 항원을 포함하는 재백신접종을 위한 면역원성 조성물.
  53. 제 50항 또는 제 52항에 있어서, 재백신접종을 위한 항원 또는 항원성 조성물이 애주번트 첨가된 것인 면역원성 조성물.
  54. 제 53항에 있어서, 재백신접종 조성물을 위한 수중유 에멀젼이 제 1항 내지 제 15항 중 어느 한 항에 정의된 것인 면역원성 조성물.
  55. 제 41항, 제 43항 내지 제 47항, 제 49항, 제50항 또는 제 52항 내지 제 54항 중 어느 한 항에 있어서, 질병이 65세 이상의 연령의 노인, 18-50세 또는 18-65세 연령의 성인, 0-18세 연령의 아동으로 구성된 군으로부터 선택된 인간 숙주 또는 인간 집단의 계절성 또는 범유행병 또는 둘 모두의 인플루엔자 감염인 면역원성 조성물.
  56. 삭제
  57. 삭제
  58. 삭제
  59. 삭제
  60. 삭제
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6207646B1 (en) * 1994-07-15 2001-03-27 University Of Iowa Research Foundation Immunostimulatory nucleic acid molecules
CA2371994C (en) * 1999-02-26 2010-09-28 Guido Grandi Enhancement of bactericidal activity of neisseria antigens with oligonucleotides containing cg motifs
GB9923176D0 (en) * 1999-09-30 1999-12-01 Smithkline Beecham Biolog Novel composition
US20100221284A1 (en) * 2001-05-30 2010-09-02 Saech-Sisches Serumwerk Dresden Novel vaccine composition
DE10144906B4 (de) 2001-09-12 2013-11-28 Novartis Vaccines And Diagnostics Gmbh Verfahren zur großtechnischen Herstellung von Impfstoffen
EP1861122A1 (en) * 2005-03-23 2007-12-05 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Composition
US11707520B2 (en) 2005-11-03 2023-07-25 Seqirus UK Limited Adjuvanted vaccines with non-virion antigens prepared from influenza viruses grown in cell culture
EP2377552A3 (en) * 2005-11-04 2013-05-15 Novartis Vaccines and Diagnostics S.r.l. Influenza vaccines with reduced amount of emulsion adjuvant
ES2420829T3 (es) 2005-11-04 2013-08-27 Novartis Vaccines And Diagnostics S.R.L. Vacunas adyuvantadas con antígeno de no virión preparadas a partir de virus de la gripe cultivados en cultivo celular
KR101696727B1 (ko) 2006-07-17 2017-01-16 글락소스미스클라인 바이오로지칼즈 에스.에이. 인플루엔자 백신
CN101522218B (zh) 2006-10-12 2012-09-26 葛兰素史密丝克莱恩生物有限公司 包含水包油乳液佐剂的疫苗
AR066405A1 (es) 2007-04-20 2009-08-19 Glaxosmithkline Biolog Sa Vacuna
KR101580660B1 (ko) * 2007-08-02 2015-12-28 바이오앤드백스 파마슈티칼즈, 리미티드. 다중체 다중-에피토프 인플루엔자 백신
US8506966B2 (en) 2008-02-22 2013-08-13 Novartis Ag Adjuvanted influenza vaccines for pediatric use
WO2009155489A2 (en) 2008-06-19 2009-12-23 Variation Biotechnologies, Inc. Compositions and methods for treating influenza
EP2331127A2 (en) 2008-09-18 2011-06-15 Novartis AG Vaccine adjuvant combinations
EP2396030B1 (en) * 2009-02-10 2015-08-12 Novartis AG Influenza vaccine regimens for pandemic-associated strains
DK2396032T3 (en) * 2009-02-10 2016-12-19 Seqirus Uk Ltd Influenza vaccines with reduced amounts of squalene
AU2015203072B2 (en) * 2009-02-10 2017-05-25 Seqirus UK Limited Influenza vaccine regimens for pandemic-associated strains
JP2012525370A (ja) 2009-04-27 2012-10-22 ノバルティス アーゲー インフルエンザに対して防御するためのアジュバント添加ワクチン
US20110097418A1 (en) * 2009-05-29 2011-04-28 Variation Biotechnologies, Inc. Compositions and methods for treating influenza
US20120288850A1 (en) * 2009-10-21 2012-11-15 De Staat Der Nederlanden, Vert. Door De Minister Van Vws Methods for diagnosis of immune responses against viruses
GB0919117D0 (en) 2009-10-30 2009-12-16 Glaxosmithkline Biolog Sa Process
EP2547357A1 (en) 2010-03-18 2013-01-23 Novartis AG Adjuvanted vaccines for serogroup b meningococcus
WO2011130652A2 (en) * 2010-04-15 2011-10-20 George Baer Compositions and methods for vaccinating humans and animals against enveloped viruses
CA2801149A1 (en) * 2010-06-01 2011-12-08 Novartis Ag Concentration of vaccine antigens without lyophilization
GB201009273D0 (en) * 2010-06-03 2010-07-21 Glaxosmithkline Biolog Sa Novel vaccine
CA2803239A1 (en) 2010-06-25 2011-12-29 Novartis Ag Combinations of meningococcal factor h binding proteins
EP2667852B1 (en) * 2011-01-27 2016-11-09 GlaxoSmithKline Biologicals SA Adjuvant nanoemulsions with crystallisation inhibitors
CA2828068C (en) * 2011-02-22 2019-03-19 Biondvax Pharmaceuticals Ltd. Multimeric multiepitope polypeptides in improved seasonal and pandemic influenza vaccines
US10183069B2 (en) 2011-03-21 2019-01-22 Altimmune Inc. Rapid and prolonged immunologic-therapeutic
EP2768528A1 (en) * 2011-10-20 2014-08-27 Novartis AG Adjuvanted influenza b virus vaccines for pediatric priming
CN104159608A (zh) * 2012-03-06 2014-11-19 克鲁塞尔荷兰公司 针对流感的改善的疫苗接种
GB201218195D0 (en) 2012-10-10 2012-11-21 Istituto Zooprofilattico Sperimentale Delle Venezie Composition
GB201405921D0 (en) * 2014-04-02 2014-05-14 Glaxosmithkline Biolog Sa Novel methods for inducing an immune response
JP6719388B2 (ja) * 2014-12-25 2020-07-08 テルモ株式会社 皮内投与インフルエンザワクチン組成物
KR102632419B1 (ko) * 2016-12-23 2024-01-31 인터벳 인터내셔널 비.브이. 돼지용 조합 백신
WO2018144438A1 (en) 2017-01-31 2018-08-09 Merck Sharp & Dohme Corp. Methods for production of capsular polysaccharide protein conjugates from streptococcus pneumoniae serotype 19f
MX2019009580A (es) * 2017-02-13 2020-01-30 Boehringer Ingelheim Animal Health Usa Inc Aplicador de liquidos para suministrar vacunas.
EP3917567A1 (en) * 2019-01-30 2021-12-08 GlaxoSmithKline Biologicals SA Oil/surfactant mixtures for self-emulsification
CN114222817A (zh) * 2019-04-06 2022-03-22 艾尔特免疫公司 广泛且持久的流感疫苗
RU2740751C1 (ru) * 2019-08-28 2021-01-20 Общество с ограниченной ответственностью "Развитие БиоТехнологий" Способ получения тетравалентной субъединичной противогриппозной вакцины
CN113827715A (zh) * 2020-06-23 2021-12-24 普莱柯生物工程股份有限公司 一种抗h7亚型和h5亚型禽流感病毒的疫苗组合物、及其制备方法和应用
KR20230135562A (ko) 2020-10-29 2023-09-25 인더스트리얼 폴리머스 앤드 케미컬스, 인크. 병원체 모니터링 및 불활성화를 갖는 공기 필터
WO2023059857A1 (en) * 2021-10-08 2023-04-13 Sanofi Pasteur Inc. Multivalent influenza vaccines
KR20240033309A (ko) * 2022-09-05 2024-03-12 주식회사 차백신연구소 에멀전 제형의 면역증강제 조성물 및 이의 제조 방법

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006100110A1 (en) 2005-03-23 2006-09-28 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Novel composition

Family Cites Families (94)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3238190A (en) 1963-10-23 1966-03-01 Madaus & Co K G Fa Dr Aescin recovery
US4235877A (en) 1979-06-27 1980-11-25 Merck & Co., Inc. Liposome particle containing viral or bacterial antigenic subunit
DD155875A1 (de) 1980-12-31 1982-07-14 Willy Nordheim Verfahren zur herstellung eines ballaststoffarmen inaktivierten influenzaimpfstoffes
US4454119A (en) 1981-06-29 1984-06-12 Mitsubishi Chemical Industries Limited Therapeutic agents
US4436727A (en) 1982-05-26 1984-03-13 Ribi Immunochem Research, Inc. Refined detoxified endotoxin product
US4866034A (en) 1982-05-26 1989-09-12 Ribi Immunochem Research Inc. Refined detoxified endotoxin
FI69639C (fi) 1982-07-02 1986-03-10 Orion Yhtymae Oy Preparat foer anvaendning vid klamydia-diagnostik
DD211444A3 (de) 1982-08-19 1984-07-11 Saechsisches Serumwerk Verfahren zur herstellung von influenza-impfstoffen
GB8300467D0 (en) 1983-01-08 1983-02-09 Wellcome Found Equine influenza
FI861417A0 (fi) 1985-04-15 1986-04-01 Endotronics Inc Hepatitis b ytantigen framstaelld med rekombinant-dna-teknik, vaccin, diagnostiskt medel och cellinjer samt foerfaranden foer framstaellning daerav.
DD300833A7 (de) 1985-10-28 1992-08-13 Saechsische Landesgewerbefoerd Verfahren zur herstellung von inaktivierten influenza-vollvirusimpfstoffen
US4877611A (en) 1986-04-15 1989-10-31 Ribi Immunochem Research Inc. Vaccine containing tumor antigens and adjuvants
JP2851288B2 (ja) 1987-06-05 1999-01-27 アメリカ合衆国 癌診断および管理における自己分泌運動性因子
EP0304578B1 (en) 1987-06-22 2001-10-24 Medeva Holdings Bv Peptide comprising hepatitis B surface antigen
DE3734306A1 (de) 1987-10-10 1989-04-27 Pfeiffer Erich Gmbh & Co Kg Austragvorrichtung fuer fliessfaehige medien
US5376369A (en) 1987-11-03 1994-12-27 Syntex (U.S.A.) Inc. Vaccine adjuvant
US5278302A (en) 1988-05-26 1994-01-11 University Patents, Inc. Polynucleotide phosphorodithioates
US4912094B1 (en) 1988-06-29 1994-02-15 Ribi Immunochem Research Inc. Modified lipopolysaccharides and process of preparation
GB8819209D0 (en) 1988-08-12 1988-09-14 Research Corp Ltd Polypeptide & dna encoding same
GB8821049D0 (en) 1988-09-08 1988-10-05 Health Lab Service Board Method & composition for treatment & prevention of viral infections
US4999403A (en) 1988-10-28 1991-03-12 Exxon Chemical Patents Inc. Graft polymers of functionalized ethylene-alpha-olefin copolymer with polypropylene, methods of preparation, and use in polypropylene compositions
DK0382271T3 (da) 1989-02-04 1995-05-01 Akzo Nobel Nv Tocoler som adjuvanser i vacciner
HU212924B (en) * 1989-05-25 1996-12-30 Chiron Corp Adjuvant formulation comprising a submicron oil droplet emulsion
ES2109921T3 (es) 1989-07-25 1998-02-01 Smithkline Beecham Biolog Nuevos antigenos y procedimientos para su preparacion.
DE4005528C2 (de) 1990-02-22 1998-01-15 Pfeiffer Erich Gmbh & Co Kg Austragvorrichtung für Medien
US5969109A (en) 1990-02-28 1999-10-19 Bona; Constantin Chimeric antibodies comprising antigen binding sites and B and T cell epitopes
US5149531A (en) 1990-06-27 1992-09-22 University Of Pittsburgh Of The Commonwealth System Of Higher Education Method of using cold-adapted live influenza virus vaccine as an antiviral agent against influenza
US5030115A (en) 1990-07-23 1991-07-09 Molex Incorporated Tired socket assembly with integral ground shield
EP0468520A3 (en) 1990-07-27 1992-07-01 Mitsui Toatsu Chemicals, Inc. Immunostimulatory remedies containing palindromic dna sequences
GB9105992D0 (en) 1991-03-21 1991-05-08 Smithkline Beecham Biolog Vaccine
WO1993010152A1 (en) 1991-11-16 1993-05-27 Smithkline Beecham Biologicals S.A. HYBRID PROTEIN BETWEEN CS FROM PLASMODIUM AND HBsAG
MA22842A1 (fr) 1992-03-27 1993-10-01 Smithkline Beecham Biolog Procede de preparation de compositions de vaccin.
WO1994019013A1 (en) 1993-02-19 1994-09-01 Smithkline Beecham Corporation Influenza vaccine compositions containing 3-o-deacylated monophosphoryl lipid a
CN1087176C (zh) 1993-03-23 2002-07-10 史密斯克莱·比奇曼生物公司 含有3－o脱酰基单磷酰脂a的疫苗制剂
US5762939A (en) * 1993-09-13 1998-06-09 Mg-Pmc, Llc Method for producing influenza hemagglutinin multivalent vaccines using baculovirus
WO1995011700A1 (en) 1993-10-29 1995-05-04 Pharmos Corp. Submicron emulsions as vaccine adjuvants
HU219810B (hu) 1993-11-17 2001-08-28 Deutsche Om Arzneimittel Gmbh. Glükózamin-diszacharidok, eljárás előállításukra és a vegyületeket tartalmazó gyógyszerkészítmények, valamint alkalmazásuk
GB9326253D0 (en) 1993-12-23 1994-02-23 Smithkline Beecham Biolog Vaccines
WO1995022989A1 (en) 1994-02-24 1995-08-31 Micro-Pak, Inc. Vaccines containing paucilamellar lipid vesicles as immunological adjuvants
WO1995026204A1 (en) 1994-03-25 1995-10-05 Isis Pharmaceuticals, Inc. Immune stimulation by phosphorothioate oligonucleotide analogs
PT772619E (pt) 1994-07-15 2006-10-31 Univ Iowa Res Found Oligonucleotidos imunomoduladores
US5629052A (en) 1995-02-15 1997-05-13 The Procter & Gamble Company Method of applying a curable resin to a substrate for use in papermaking
EP0812358A1 (en) 1995-02-24 1997-12-17 Cantab Pharmaceuticals Research Limited Polypeptides useful as immunotherapeutic agents and methods of polypeptide preparation
UA56132C2 (uk) 1995-04-25 2003-05-15 Смітклайн Бічем Байолоджікалс С.А. Композиція вакцини (варіанти), спосіб стабілізації qs21 відносно гідролізу (варіанти), спосіб приготування композиції вакцини
US5666153A (en) 1995-10-03 1997-09-09 Virtual Shopping, Inc. Retractable teleconferencing apparatus
US20030133944A1 (en) 2001-04-05 2003-07-17 Smithkline Beecham Biologicals S.A. Vaccine composition against malaria
US5856462A (en) 1996-09-10 1999-01-05 Hybridon Incorporated Oligonucleotides having modified CpG dinucleosides
TW570803B (en) 1997-04-09 2004-01-11 Duphar Int Res Influenza vaccine
WO1998050567A1 (en) 1997-05-02 1998-11-12 Abbott Laboratories Reagents and methods useful for detecting diseases of the prostate
US6764840B2 (en) 1997-05-08 2004-07-20 Corixa Corporation Aminoalkyl glucosaminide phosphate compounds and their use as adjuvants and immunoeffectors
US6113918A (en) 1997-05-08 2000-09-05 Ribi Immunochem Research, Inc. Aminoalkyl glucosamine phosphate compounds and their use as adjuvants and immunoeffectors
US6303347B1 (en) 1997-05-08 2001-10-16 Corixa Corporation Aminoalkyl glucosaminide phosphate compounds and their use as adjuvants and immunoeffectors
GB9711990D0 (en) 1997-06-11 1997-08-06 Smithkline Beecham Biolog Vaccine
EP1279401B1 (en) 1997-09-05 2008-01-09 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Oil in water emulsions containing saponins
GB9718901D0 (en) 1997-09-05 1997-11-12 Smithkline Beecham Biolog Vaccine
US7459524B1 (en) 1997-10-02 2008-12-02 Emergent Product Development Gaithersburg Inc. Chlamydia protein, sequence and uses thereof
GB9727262D0 (en) 1997-12-24 1998-02-25 Smithkline Beecham Biolog Vaccine
IT1298087B1 (it) 1998-01-08 1999-12-20 Fiderm S R L Dispositivo per il controllo della profondita' di penetrazione di un ago, in particolare applicabile ad una siringa per iniezioni
ES2296390T3 (es) 1998-05-07 2008-04-16 Corixa Corporation Composicion coadyuvante y procedimiento para su uso.
WO1999064301A1 (fr) 1998-06-08 1999-12-16 Sca Emballage France Emballage a remise a plat rapide
AU761396B2 (en) 1998-06-30 2003-06-05 Om Pharma Novel acyl pseudodipeptides, preparation method and pharmaceutical compositions containing same
AT408615B (de) * 1998-09-15 2002-01-25 Immuno Ag Neue influenzavirus-impfstoffzusammensetzung
US20040006242A1 (en) 1999-02-01 2004-01-08 Hawkins Lynn D. Immunomodulatory compounds and method of use thereof
US6551600B2 (en) 1999-02-01 2003-04-22 Eisai Co., Ltd. Immunological adjuvant compounds compositions and methods of use thereof
AT407958B (de) 1999-02-11 2001-07-25 Immuno Ag Inaktivierte influenza-virus-vakzine zur nasalen oder oralen applikation
DE60020677T2 (de) 1999-02-26 2006-05-04 Chiron Corp., Emeryville Mikroemulsionen mit adsorbierten makromolekülen und mikropartikeln
GB9923176D0 (en) * 1999-09-30 1999-12-01 Smithkline Beecham Biolog Novel composition
US6494865B1 (en) 1999-10-14 2002-12-17 Becton Dickinson And Company Intradermal delivery device including a needle assembly
AU1581400A (en) 1999-12-22 2001-07-03 Om Pharma Acyl pseudopeptides bearing a functionalised auxiliary spacer
US20030158134A1 (en) 2000-01-31 2003-08-21 Gerald Voss Vaccine for the prophylactic or therapeutic immunization against hiv
GB0025577D0 (en) 2000-10-18 2000-12-06 Smithkline Beecham Biolog Vaccine
EP1201250A1 (en) 2000-10-25 2002-05-02 SMITHKLINE BEECHAM BIOLOGICALS s.a. Immunogenic compositions comprising liver stage malarial antigens
CA2438942A1 (en) 2001-02-23 2002-09-26 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Influenza vaccine formulations for intradermal delivery
ES2314042T3 (es) 2001-04-17 2009-03-16 Dainippon Sumitomo Pharma Co., Ltd. Derivados nuevos de adenina.
MY134424A (en) 2001-05-30 2007-12-31 Saechsisches Serumwerk Stable influenza virus preparations with low or no amount of thiomersal
PT1719511E (pt) 2001-11-16 2009-03-06 Coley Pharm Group Inc N-[4-(4-amino-2-etil-1h-imidazo[4,5-c]quinolina-1- -il)-butil]-metano-sulfonamida, uma composição farmacêutica que a contém e sua utilização
US6861410B1 (en) 2002-03-21 2005-03-01 Chiron Corporation Immunological adjuvant compositions
US20040074760A1 (en) * 2002-10-17 2004-04-22 Carnegie Mellon University Production of biofuels
WO2004075829A2 (en) 2003-01-30 2004-09-10 Chiron Corporation Adjuvanted influenza vaccine
US7375180B2 (en) 2003-02-13 2008-05-20 3M Innovative Properties Company Methods and compositions related to IRM compounds and Toll-like receptor 8
CN1522691A (zh) * 2003-09-05 2004-08-25 韦怀新 核酸、蛋白多肽及疫苗乳剂的制备方法
EP1722815A1 (en) 2004-03-09 2006-11-22 Chiron Corporation Influenza virus vaccines
US20090028903A1 (en) * 2005-03-23 2009-01-29 Glaxosmithkline Biologicals, S.A. Novel use
AR054822A1 (es) 2005-07-07 2007-07-18 Sanofi Pasteur Emulsion inmuno adyuvante
ES2420829T3 (es) 2005-11-04 2013-08-27 Novartis Vaccines And Diagnostics S.R.L. Vacunas adyuvantadas con antígeno de no virión preparadas a partir de virus de la gripe cultivados en cultivo celular
EP2377552A3 (en) 2005-11-04 2013-05-15 Novartis Vaccines and Diagnostics S.r.l. Influenza vaccines with reduced amount of emulsion adjuvant
FR2896162B1 (fr) 2006-01-13 2008-02-15 Sanofi Pasteur Sa Emulsion huile dans eau thermoreversible
EP2422810B1 (en) * 2006-07-17 2014-10-22 GlaxoSmithKline Biologicals s.a. Influenza vaccine
KR101696727B1 (ko) 2006-07-17 2017-01-16 글락소스미스클라인 바이오로지칼즈 에스.에이. 인플루엔자 백신
US20080014217A1 (en) * 2006-07-17 2008-01-17 Emmanuel Jules Hanon Influenza vaccine
CN101522218B (zh) 2006-10-12 2012-09-26 葛兰素史密丝克莱恩生物有限公司 包含水包油乳液佐剂的疫苗
AR066405A1 (es) 2007-04-20 2009-08-19 Glaxosmithkline Biolog Sa Vacuna
EP2227251A1 (en) 2007-12-06 2010-09-15 GlaxoSmithKline Biologicals SA Influenza composition
SG175771A1 (en) * 2009-04-21 2011-12-29 Dow Technology Investments Llc Improved method of achieving and maintaining a specified alkylene oxide production parameter with a high efficiency catalyst

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006100110A1 (en) 2005-03-23 2006-09-28 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Novel composition

Also Published As

Publication number Publication date
KR20100009576A (ko) 2010-01-27
US20100189741A1 (en) 2010-07-29
MA31381B1 (fr) 2010-05-03
DOP2009000239A (es) 2009-11-15
EA200901161A1 (ru) 2010-06-30
EP2136837B1 (en) 2011-12-21
CA2683075C (en) 2015-11-10
IL200859A (en) 2015-10-29
TW200908994A (en) 2009-03-01
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