JP2012525370A - インフルエンザに対して防御するためのアジュバント添加ワクチン - Google Patents

Abstract

Ｈ１亜型インフルエンザＡウイルス血球凝集素を含むワクチンは、水中油型乳剤アジュバントでアジュバント添加される。ワクチンは、「ブタインフルエンザ」と呼ばれるウイルスに対して患者を免疫するのに適切である。ワクチンは一価であってもよい。ワクチンは、２つの異なるＨ１亜型インフルエンザＡウイルス血球凝集素であって、（ｉ）第１のＨ１亜型インフルエンザＡウイルス血球凝集素が配列番号３に対してより、配列番号１に対してより密接に関係し、および（ｉｉ）第２のＨ１亜型インフルエンザＡウイルス血球凝集素が配列番号１に対してより、配列番号３に対してより密接に関係している、血球凝集素を含んでもよい。一価ワクチンは、三価Ａ／Ｈ１Ｎ１−Ａ／Ｈ３Ｎ２−Ｂ季節性インフルエンザワクチンと併用して投与されてもよい。

Description

本発明は、インフルエンザウイルス感染から、特に、２００９年４月に出現したブタインフルエンザ株（複数可）などの株から防御するためのアジュバント添加ワクチン（ａｄｊｕｖａｎｔｅｄ ｖａｃｃｉｎｅ）の分野にある。

２００９年４月、ブタインフルエンザのヒトでの発生が、メキシコおよび米国を含む多くの国において確認され、その後、世界中にわたって急速に広まった。２００９年６月に、ＷＨＯによりパンデミックが宣言された。その疾患は、新しく同定されたブタインフルエンザウイルスＡ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０４／２００９ Ａ（Ｈ１Ｎ１）によって引き起こされた。このブタインフルエンザ株は、現行のヒト季節性ワクチンにおけるＡ（Ｈ１Ｎ１）抗原を含む現行のヒトインフルエンザワクチン株と免疫学的交差反応性をもたないようである。そのウイルスは、「ブタインフルエンザ」、「新型ブタ起源Ｈ１Ｎ１インフルエンザ」、「ヒト−ブタインフルエンザ」、「新型インフルエンザＡ（Ｈ１Ｎ１）」、および「インフルエンザＡ（Ｈ１Ｎ１）ｖ」と様々、呼ばれている。

このブタインフルエンザおよびそれの変種のさらなるヒトからヒトへの伝染を防ぐためのワクチンの必要性がある。

本発明の第１態様によれば、Ｈ１亜型インフルエンザＡウイルス血球凝集素を含むワクチンが水中油型乳剤アジュバントでアジュバント添加される。血球凝集素は、レシピエントにおいて免疫応答を誘発し、アジュバントはこの応答のヘテロ変種（ｈｅｔｅｒｏｖａｒｉａｎｔ）適用範囲を広げる。特にＨ１抗原は、それだけではブタインフルエンザに対して防御しない可能性があるが、アジュバントは、たとえワクチンの血球凝集素がブタインフルエンザ血球凝集素と低い免疫学的交差反応性しか示さないとしても免疫応答を増強することができ、それにより防御が達成される。さらに、ワクチンが、ブタインフルエンザ血球凝集素と免疫学的に交差反応性である血球凝集素を含む場合には、同種株に対して、および自然に生じ得るドリフト株などのその変種にも対して防御を提供することができる。

したがって、本発明は、（ｉ）Ｈ１亜型インフルエンザＡウイルス血球凝集素および（ｉｉ）水中油型乳剤アジュバントを含むワクチンを患者に投与する工程を含む、ブタインスルエンザに対して患者（典型的にはヒト）を免疫するための方法を提供する。いくつかの実施形態において、Ｈ１血球凝集素は、配列番号３に対してより、配列番号１に対してより密接に関係している；他の実施形態において、それは、配列番号１に対してより、配列番号３に対してより密接に関係している。

本発明は、（ｉ）配列番号３に対してより、配列番号１に対してより密接に関係しているＨ１亜型インフルエンザＡウイルス血球凝集素、および（ｉｉ）水中油型乳剤アジュバントを含む免疫原性組成物を提供する。この組成物は、一価ワクチン（すなわち、それは、単一のインフルエンザウイルス株由来の血球凝集素抗原を含む）であってもよいが、いくつかの実施形態において、それは、多価ワクチン、例えば、Ｈ３Ｎ２インフルエンザＡウイルス血球凝集素およびインフルエンザＢウイルス血球凝集素もまた含む三価ワクチンであってもよい。

本発明の第２の態様によれば、本発明は、２つの異なるＨ１亜型インフルエンザＡウイルス血球凝集素を含む免疫原性組成物であって、（ｉ）第１のＨ１亜型インフルエンザＡウイルス血球凝集素が配列番号３に対してより、配列番号１に対してより密接に関係し、そして（ｉｉ）第２のＨ１亜型インフルエンザＡウイルス血球凝集素が配列番号１に対してより、配列番号３に対してより密接に関係し、ならびに組成物が免疫学的アジュバントとして水中油型乳剤アジュバントを含む、免疫原性組成物を提供する。このアジュバント添加Ｈ１血球凝集素の混合物は、現在利用可能なものよりＨ１インフルエンザＡウイルス株に対してより広域スペクトルの防御を与える。この組成物はまた、（ｉｉｉ）Ｈ３Ｎ２および／または（ｉｖ）インフルエンザＢウイルス抗原を含んでもよい。いくつかの実施形態において、組成物は、（ｉｉｉ）Ｈ３Ｎ２、（ｉｖ）Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２／８７様インフルエンザＢウイルス株、および（ｖ）Ｂ／Ｙａｍａｇａｔａ／１６／８８様インフルエンザＢウイルス株を含む。

本発明の第３の態様によれば、Ｈ１亜型インフルエンザＡウイルス血球凝集素を含む一価ワクチンが、三価Ａ／Ｈ１Ｎ１−Ａ／Ｈ３Ｎ２−Ｂ季節性インフルエンザワクチンと併用して投与され、ワクチン（複数可）の両方が水中油型乳剤でアジュバント添加されている。一価ワクチンは、配列番号３に対してより、配列番号１に対してより密接に関係しているＨ１亜型インフルエンザＡウイルス血球凝集素を含む；三価ワクチンは、配列番号１に対してより、配列番号３に対してより密接に関係しているＨ１亜型インフルエンザＡウイルス血球凝集素を含む。一価ワクチンは、三価ワクチンの前に、三価ワクチンの後に、または、三価ワクチンと同時に、投与されてもよい。２つのワクチンが別々に投与される場合、投与と投与の間に２〜２６週間、あってもよい。１つの有用な実施形態において、患者はまず、三価季節性ワクチン（アジュバント添加、ＦＬＵＡＤ（商標）製品など）を受け、後で一価ワクチン（アジュバント添加）を受ける。本明細書に示されているように、アジュバント添加三価季節性ワクチンの予備投与は、配列番号３に対してより、配列番号１に対してより密接に関係した血球凝集素を含む一価Ｈ１Ｎ１ワクチンの有効性を向上させることができる。

関連した実施形態において、Ｈ１亜型インフルエンザＡウイルス血球凝集素を含む一価ワクチンは、４価Ａ／Ｈ１Ｎ１−Ａ／Ｈ３Ｎ２−Ｂ−Ｂ季節性インフルエンザワクチンと併用して投与され、その２つのＢ株がＢ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２／８７様株およびＢ／Ｙａｍａｇａｔａ／１６／８８様株であり、ワクチンの両方が水中油型乳剤でアジュバント添加されている。一価ワクチンは、配列番号３に対してより、配列番号１に対してより密接に関係しているＨ１亜型インフルエンザＡウイルス血球凝集素を含む；４価ワクチンは、配列番号１に対してより、配列番号３に対してより密接に関係しているＨ１亜型インフルエンザＡウイルス血球凝集素を含む。一価ワクチンは、三価ワクチンの前に、三価ワクチンの後に、または、三価ワクチンと同時に、投与されてもよい。２つのワクチンが別々に投与される場合、投与と投与の間に２〜２６週間、あってもよい。１つの有用な実施形態において、患者はまず、一価ワクチンを受け、後で４価ワクチンを受ける。

本発明の第４の態様によれば、Ｈ１亜型インフルエンザＡウイルス血球凝集素を含む一価ワクチンは、２回用量投与計画（ｔｗｏ−ｄｏｓｅ ｒｅｇｉｍｅｎ）によって投与され、一価ワクチンのどちらの投与も、水中油型乳剤でアジュバント添加されている。一価ワクチンは、配列番号３に対してより、配列番号１に対してより密接に関係しているＨ１亜型インフルエンザＡウイルス血球凝集素を含む。２つの用量（ｔｗｏ ｄｏｓｅｓ）は、１〜６週間離して、例えば、１週間離して、２週間離して、３週間離して、４週間離して、５週間離して、６週間離して、投与される。いくつかの実施形態において、Ｈ１血球凝集素は、両方の一価ワクチンにおいて同一である；他の実施形態において、２つの一価ワクチンにおけるＨ１血球凝集素は、異なるアミノ酸配列を有し、例えば、それらはお互いに最高２０アミノ酸まで、異なり得る（例えば、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、または２０個のアミノ酸置換）。

抗原成分
本発明は、ワクチン抗原としてインフルエンザＡウイルス血球凝集素を用いる。その抗原は、典型的には、インフルエンザビリオンから調製されるが、代替法として、血球凝集素は組換え宿主において（例えば、バキュロウイルスベクターを用いる昆虫細胞系において）発現し、精製された形態で［１、２、３］、またはウイルス様粒子（ＶＬＰ；例えば、参考文献４および５参照）の形態で用いることができる。しかしながら、一般的に、抗原はビリオン由来である。

様々な形態のインフルエンザウイルスワクチンが現在、利用可能である（例えば、参考文献６の１７章および１８章参照）。公知のワクチンは、一般的に、生ウイルスかまたは不活性化ウイルスかのいずれかに基づいている。本発明のワクチンにおける抗原は、不活性化ウイルスの形態をとる。不活性化ワクチンは、ビリオン全体、「スプリット」ビリオンに基づいてもよいし、または精製された表面抗原に基づいてもよい。ウイルスを不活性化するための化学的手段には、有効量の以下の作用物質の１つ以上での処理が挙げられる：界面活性剤、ホルムアルデヒド、ホルマリン、β−プロピオラクトン、またはＵＶ光。不活性化のための追加の化学的手段には、メチレンブルー、ソラレン、カルボキシフラーレン（Ｃ６０）、またはそれらのいずれかの組み合わせでの処理が挙げられる。ウイルス不活性化の他の方法は、当技術分野において知られており、例えば、バイナリーエチルアミン（ｂｉｎａｒｙ ｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ）、アセチルエチレンイミン、またはγ照射などである。

ワクチンは、ビリオン全体、スプリットビリオン、または（血球凝集素を含み、通常、ノイラミニダーゼも含む）精製された表面抗原を含み得る。スプリットビリオンおよび精製された表面抗原（すなわち、不完全ビリオンワクチン）が特に本発明に有用である。

ビリオンは、様々な方法によってウイルス含有流体から回収することができる。例えば、精製プロセスは、ビリオンを破壊するための界面活性剤を含む線形ショ糖勾配溶液を用いるゾーン遠心分離を含んでもよい。その後、抗原を、必要に応じた希釈後、ダイアフィルトレーションによって精製してもよい。

スプリットビリオンは、「Ｔｗｅｅｎ−エーテル」スプリット化プロセスを含め、ビリオンを界面活性剤（例えば、エチルエーテル、ポリソルベート８０、デオキシコレート、トリ−Ｎ−ブチルホスフェート、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、Ｔｒｉｔｏｎ Ｎ１０１、臭化セチルトリメチルアンモニウム、Ｔｅｒｇｉｔｏｌ ＮＰ９など）で処理して、不完全ビリオン調製物を生成することによって得られる。インフルエンザウイルスをスプリット化する方法は、当技術分野においてよく知られており、例えば、参考文献７〜１２などを参照されたい。ウイルスのスプリット化は、典型的には、破壊濃度のスプリット化剤で、感染性であろうが非感染性であろうが、ウイルス全体を破壊し、または断片化することによって行われる。破壊は結果として、ウイルスタンパク質の完全な、または部分的な可溶化を生じ、ウイルスの完全性を変化させる。好ましいスプリット化剤は、非イオン性およびイオン性（例えば、陽イオン性）表面活性剤、例えば、アルキルグリコシド、アルキルチオグリコシド、アシル糖、スルホベタイン、ベタイン、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、Ｎ，Ｎ−ジアルキル−グルカミド、Ｈｅｃａｍｅｇ、アルキルフェノキシ−ポリエトキシエタノール、第四アンモニウム化合物、サルコシル、ＣＴＡＢ（臭化セチルトリメチルアンモニウム）、トリ−Ｎ−ブチルホスフェート、Ｃｅｔａｖｌｏｎ、ミリスチルトリメチルアンモニウム塩、リポフェクチン、リポフェクタミン、およびＤＯＴ−ＭＡ、オクチルフェノキシポリオキシエタノールまたはノニルフェノキシポリオキシエタノール（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００またはＴｒｉｔｏｎ Ｎ１０１などのＴｒｉｔｏｎ表面活性剤）、ポリオキシエチレンソルビタンエステル（Ｔｗｅｅｎ表面活性剤）、ポリオキシエチレンエーテル、ポリオキシエチレンエステルなどである。１つの有用なスプリット化手順は、デオキシコール酸ナトリウムおよびホルムアルデヒドの連続した効果を用い、スプリット化は、初期のビリオン精製の間（例えば、ショ糖密度勾配溶液において）に起こり得る。したがって、スプリット化プロセスは、（非ビリオン材料を除去するための）ビリオン含有材料の清澄、（例えば、ＣａＨＰＯ_４吸着などの吸着方法を用いる）回収されたビリオンの濃縮、非ビリオン材料からのビリオン全体の分離、（例えば、デオキシコール酸ナトリウムなどのスプリット化剤を含むショ糖勾配を用いる）密度勾配遠心分離工程におけるスプリット化剤を用いるビリオンのスプリット化、およびその後の、望ましくない材料を除去するための濾過（例えば、限外濾過）を含むことができる。スプリットビリオンは、有用には、リン酸ナトリウム緩衝等張塩化ナトリウム溶液に再懸濁することができる。ＢＥＧＲＩＶＡＣ（商標）、ＦＬＵＡＲＩＸ（商標）、ＦＬＵＺＯＮＥ（商標）、およびＦＬＵＳＨＩＥＬＤ（商標）製品はスプリットワクチンである。

精製された表面抗原ワクチンは、インフルエンザ表面抗原血球凝集素、および典型的には、ノイラミニダーゼも含む。精製された形態でこれらのタンパク質を調製するためのプロセスは当技術分野においてよく知られている。ＦＬＵＶＩＲＩＮ（商標）、ＡＧＲＩＰＰＡＬ（商標）、およびＩＮＦＬＵＶＡＣ（商標）製品はサブユニットワクチンである。

インフルエンザ抗原はまた、ＩＮＦＬＥＸＡＬ Ｖ（商標）およびＩＮＶＡＶＡＣ（商標）製品においてのように、ビロソーム［１３］（核酸を含まないウイルス様リポソーム粒子）の形態で提供することができるが、本発明に関してはビロソームを用いないことが好ましい。したがって、いくつかの実施形態において、インフルエンザ抗原はビロソームの形態をとらない。

ワクチンにおける血球凝集素抗原は、任意の適切な株由来であってよい。いくつかの実施形態において、血球凝集素は、アジュバント無添加の形態でヒト被験体に投与される場合、Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０４／２００９血球凝集素（配列番号１；ＧＩ：２２７８０９８３０）と交差反応しない抗血球凝集素抗体を誘発する血球凝集素である；これらの実施形態において、ワクチンのアジュバントは、ヒト被験体がＡ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０４／２００９血球凝集素と交差反応する抗体を産生するように免疫応答を増強させる。他の実施形態において、血球凝集素は、アジュバント無添加の形態でヒト被験体に投与される場合、Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０４／２００９血球凝集素（配列番号１）と交差反応する抗血球凝集素抗体を誘発することができる血球凝集素である；これらの実施形態において、ワクチンのアジュバントは、ヒト被験体が、Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０４／２００９のドリフト株に対して防御するのに役立つことができる、より広域スペクトルの抗体を産生するように、免疫応答を増強する。他の実施形態において、血球凝集素はＡ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０４／２００９（配列番号１）由来である。他の実施形態において、血球凝集素は、配列番号２に対して少なくともｉ％配列同一性を有するＨＡ１アミノ酸配列を含み、ｉは８５以上、例えば、８５、８８、９０、９２、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または９９超（例えば、１００）である。多くのそのような配列は、例えば、以下の公知の株のいずれかから入手できる：

さらに、適切なＨＡ抗原を有するＨ１Ｎ１株には、Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０４／２００９自体、Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／７／２００９、Ａ／Ｔｅｘａｓ／５／２００９、Ａ／Ｅｎｇｌａｎｄ／１９５／２００９、およびＡ／Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ／１８／２００９が挙げられる。

好ましい実施形態は、上記で論じられているように、配列番号２に対して少なくともｉ％配列同一性を有するアミノ酸配列を含む血球凝集素など、アジュバント無添加の形態でヒト被験体に投与される場合、Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０４／２００９血球凝集素（配列番号１）と交差反応する抗血球凝集素抗体を誘発することができる血球凝集素を含む。

いくつかの実施形態において、血球凝集素は、配列番号３（Ａ／Ｃｈｉｌｅ／１／１９８３）に対してより、配列番号１（Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０４／２００９）に対してより密接に関係している；他の実施形態において、血球凝集素は、配列番号１に対してより、配列番号３に対してより密接に関係している。配列番号３に対してより、配列番号１に対してより密接に関係している（すなわち、同じアルゴリズムおよびパラメータを用いて比較した場合、配列番号３よりは配列番号１と、より高い程度の配列同一性を有する）血球凝集素を、以下、「Ｈ１^＊」血球凝集素と呼ぶ。配列番号１と配列番号３は８０．４％同一である。

本発明に用いるための有用な完全長Ｈ１血球凝集素配列として、配列番号１および配列番号６、加えて、上記で論じられているような配列番号２に対して少なくともｉ％配列同一性を有し、または配列番号７に対して少なくともｉ％配列同一性を有するアミノ酸配列を含むものが挙げられる。理想的には、血球凝集素は、ＨＡ１／ＨＡ２切断部位の周辺に高塩基性領域を含まない。好ましい血球凝集素は、Ｓｉａ（α２，３）Ｇａｌ末端二糖を有するオリゴ糖と比較して、Ｓｉａ（α２，６）Ｇａｌ末端二糖を有するオリゴ糖への結合を優先する（下記参照）。

（配列番号７を含む）配列番号６は、有用なＨ１^＊血球凝集素である。それは配列番号１と残基２１４、２２６、および２４０において異なる（すなわち、９９．４７％同一性）。

Ｈ１血球凝集素（Ｈ１^＊血球凝集素など）および水中油型乳剤アジュバントを含むことに加えて、本発明の組成物は、インフルエンザＡウイルスおよび／またはインフルエンザＢウイルスを含む１つ以上（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、またはそれを超える）の追加のインフルエンザウイルス株由来の抗原（複数可）を含んでもよい。したがって、組成物は、通常の季節性ワクチンに特有な１つ以上の株由来の抗原、および水中油型乳剤アジュバント、加えて少なくとも１つのＨ１^＊血球凝集素、例えば、２つのＨ１株（１つがＨ１^＊血球凝集素、１つがＨ１^＊血球凝集素ではない）、Ｈ３Ｎ２株、および１つのインフルエンザＢ株を含む４価ワクチン、または２つのＨ１株（１つがＨ１^＊血球凝集素、１つがＨ１^＊血球凝集素ではない）、Ｈ３Ｎ２株、および２つのインフルエンザＢウイルス株（Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２／８７様株およびＢ／Ｙａｍａｇａｔａ／１６／８８様株）を含む５価ワクチンを含んでもよい。本発明はまた、Ｈ１^＊血球凝集素およびＨ５血球凝集素および水中油型乳剤アジュバントを含む２価ワクチンを提供する。ワクチンが１つより多いインフルエンザ株を含む場合、異なる株は、典型的には、別々に増殖し、ウイルスが回収され、抗原が調製された後で混合される。したがって、本発明のプロセスは、１つより多いインフルエンザ株由来の抗原を混合する工程を含んでもよい。

本発明のワクチンが２つのインフルエンザＢ株を含む場合、１つのＢ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２／８７様株および１つのＢ／Ｙａｍａｇａｔａ／１６／８８様株が含まれる。これらの株は、通常、抗原性で識別されるが、アミノ酸配列の違いもまた、２つの系列を識別するために記載されており、例えば、Ｂ／Ｙａｍａｇａｔａ／１６／８８様株は、（常にではないが）しばしば、「Ｌｅｅ４０」ＨＡ配列に対して番号付けされたアミノ酸残基１６４において欠失をもつＨＡタンパク質を有する［１４］。２つ以上のインフルエンザＢウイルス株由来の抗原が存在する場合の本発明のいくつかの実施形態において、インフルエンザＢウイルス株のうちの少なくとも２つは、別個の血球凝集素を有し得るが、関連したノイラミニダーゼを有し得る。例えば、それらは両方とも、Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２／８７様ノイラミニダーゼを有してもよいし［１５］、または両方ともＢ／Ｙａｍａｇａｔａ／１６／８８様ノイラミニダーゼを有してもよい。例えば、２つのＢ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２／８７様ノイラミニダーゼは両方とも、以下の配列特性のうちの１つ以上を有してもよい：（１）残基２７はセリンではなく、好ましくはロイシン；（２）残基４４はグルタメートではなく、好ましくはリシン；（３）残基４６はスレオニンではなく、好ましくはイソロイシン；（４）残基５１はプロリンではなく、好ましくはセリン；（５）残基６５はアルギニンではなく、好ましくはヒスチジン；（６）残基７０はグリシンではなく、好ましくはグルタメート；（７）残基７３はロイシンではなく、好ましくはフェニルアラニン；および／または（８）残基８８はプロリンではなく、好ましくはグルタミン。同様に、いくつかの実施形態において、ノイラミニダーゼは、残基４３において欠失をもってもよく、またはスレオニンを有してもよい；ＮＡ遺伝子におけるトリヌクレオチド欠失から生じる残基４３における欠失は、Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２／８７様株の特性として報告されているが、最近の株はＴｈｒ−４３を回復している［１５］。逆に、もちろん、反対の特性が、２つのＢ／Ｙａｍａｇａｔａ／１６／８８様ノイラミニダーゼ、例えば、Ｓ２７、Ｅ４４、Ｔ４６、Ｐ５１、Ｒ６５、Ｇ７０、Ｌ７３、および／またはＰ８８によって共有されてもよい。これらのアミノ酸は、「Ｌｅｅ４０」ノイラミニダーゼ配列［１６］に対して番号付けられている。

血球凝集素タンパク質が精製されるインフルエンザウイルスは、抗ウイルス治療に抵抗性（例えば、オセルタミビル［１７］および／またはザナミビルに抵抗性）であってもよい。

いくつかの実施形態において、本発明に用いられる株は、したがって、Ｓｉａ（α２，３）Ｇａｌ末端二糖を有するオリゴ糖と比較してＳｉａ（α２，６）Ｇａｌ末端二糖を有するオリゴ糖への結合が優先する血球凝集素を有する。ヒトインフルエンザウイルスは、Ｓｉａ（α２，６）Ｇａｌ末端二糖（シアル酸がガラクトースにα−２，６結合している）を有する受容体オリゴ糖に結合するが、卵およびベロ細胞は、Ｓｉａ（α２，３）Ｇａｌ末端二糖を有する受容体オリゴ糖を有する。ＭＤＣＫなどの細胞におけるヒトインフルエンザウイルスの増殖は、卵での継代とは違って、本来のＳｉａ（α２，６）Ｇａｌ結合を維持するように血球凝集素へ淘汰圧を与える。ウイルスが、Ｓｉａ（α２，３）Ｇａｌ末端二糖を有するオリゴ糖と比較してＳｉａ（α２，６）Ｇａｌ末端二糖を有するオリゴ糖への結合を優先するかどうかを決定するために、様々なアッセイを用いることができる。例えば、参考文献１８は、親和定数の高感度かつ定量的測定を与えるインフルエンザウイルス受容体結合活性についての固相酵素結合型アッセイを記載する。参考文献１９は、２つの異なるシアリル糖タンパク質（Ｓｉａ（α２，３）Ｇａｌ決定基を有するオボムコイド、およびＳｉａ（α２，６）Ｇａｌ決定基を有するブタα_２−マクログロブリン）へのウイルスの結合が評価される固相アッセイを用いており、ウイルスの結合が２つの受容体類似体：遊離シアル酸（Ｎｅｕ５Ａｃ）および３’−シアリルラクトース（Ｎｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ）に対して評価されたアッセイも記載している。参考文献２０は、α２，３結合またはα２，６結合についての受容体優先性を明らかに区別することができたグリカンアレイを用いるアッセイを報告している。参考文献２１は、Ｓｉａ（α２，６）ＧａｌかまたはＳｉａ（α２，３）Ｇａｌのいずれかを含むように酵素的に改変されたヒト赤血球の凝集に基づいたアッセイを報告している。アッセイの型に応じて、それはウイルス自体に関して直接、行ってもよいし、またはウイルスから精製された血球凝集素に関して間接的に行うことができる。

いくつかの実施形態において、Ｈ１血球凝集素は、卵由来のウイルスに見られるパターンとは異なるグリコシル化パターンを有する。したがって、ＨＡ（および他の糖タンパク質）は、ニワトリの卵には見られないグリコフォームを含んでもよい。有用なＨＡにはイヌのグリコフォームが挙げられる。

血球凝集素抗原を含むことに加えて、本発明のワクチンは、典型的には、ノイラミニダーゼタンパク質も含み、例えば、ワクチンはウイルスのノイラミニダーゼを含む。本発明は、インフルエンザＡウイルスＮＡ亜型Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、Ｎ５、Ｎ６、Ｎ７、Ｎ８、またはＮ９の１つ以上に対して防御し得るが、通常にはＮ１（例えば、Ｈ１Ｎ１ウイルス）またはＮ２（例えば、Ｈ１Ｎ２ウイルス）に対してである。ビリオン全体、スプリットビリオン、およびサブユニットワクチンの全ては、血球凝集素およびノイラミニダーゼの両方を含む。ワクチンがノイラミニダーゼ抗原を含む場合、ノイラミニダーゼは、配列番号４に対して少なくともｊ％配列同一性を有し得、ｊは７５以上、例えば、７５、８０、８５、８８、９０、９２、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または９９超（例えば、１００）である。多くのそのような配列は利用可能である。いくつかの実施形態において、ノイラミニダーゼは、配列番号５に対してより、配列番号４に対してより密接に関係している。配列番号４と配列番号５は８２％同一である。

ワクチンはまた、Ｍ１および／もしくはＭ２（またはその断片）ならびに／または核タンパク質などのマトリックスタンパク質を含んでもよい。ブタのモデルは、不活性化Ｈ１Ｎ１ブタインフルエンザウイルスワクチン（水中油型乳剤でアジュバント添加されている）へのＭ２の添加がワクチンの有効性を増強し得ることを示している［２２］。

インフルエンザウイルスは、再集合体株であってもよく、逆遺伝学技術によって獲得されていてもよい。逆遺伝学技術［例えば、２３〜２７］により、所望のゲノムセグメントを有するインフルエンザウイルスを、インビトロでプラスミドを用いて、またはプラスミドを含まない系によって調製することが可能になる。典型的には、その技術は、（ａ）例えば、ｐｏｌＩプロモーターから、所望のウイルスＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ分子を、および（ｂ）例えば、ｐｏｌＩＩプロモーターから、ウイルスタンパク質をコードするＤＮＡ分子を、両方の型のＤＮＡの細胞における発現が完全な無傷の感染性ビリオンの構築をもたらすように、発現させることを含む。ＤＮＡは、好ましくは、ウイルスＲＮＡおよびタンパク質の全部を供給するが、ＲＮＡおよびタンパク質の一部を供給するためにヘルパーウイルスを用いることも可能である。各ウイルスＲＮＡを産生するために別々のプラスミドを用いるプラスミドに基づいた方法が好ましく［２８〜３０］、これらの方法はまた、ウイルスタンパク質の全部または一部（例えば、ＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、およびＮＰタンパク質だけ）を発現するためにプラスミドの使用を含み、いくつかの方法においては最高１２個までのプラスミドが用いられる。イヌの細胞を用いる場合には、イヌのｐｏｌＩプロモーターを用いてもよい［３１］。

必要とされるプラスミドの数を低減するために、１つのアプローチ［３２］は、同じプラスミド上の（ウイルスＲＮＡ合成のための）複数のＲＮＡポリメラーゼＩ転写カセット（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、または全ての８つのインフルエンザＡ ｖＲＮＡセグメントをコードする配列）、および別のプラスミド上のＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターと共の複数のタンパク質コード領域（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、または全ての８つのインフルエンザＡ ｍＲＮＡ転写産物をコードする配列）を組み合わせている。方法は、（ａ）単一のプラスミド上のＰＢ１、ＰＢ２、およびＰＡのｍＲＮＡコード領域、ならびに（ｂ）単一のプラスミド上の全ての８つのｖＲＮＡコードセグメントを含んでもよい。１つのプラスミド上のＮＡおよびＨＡセグメント、ならびに別のプラスミド上の６つの他のセグメントを含むこともまた、事態（ｍａｔｔｅｒ）を促進させることができる。

ウイルスＲＮＡセグメントをコードするためにｐｏｌＩプロモーターを用いることの代わりとして、バクテリオファージポリメラーゼプロモーターを用いることは可能である［３３］。例えば、ＳＰ６、Ｔ３、またはＴ７ポリメラーゼについてのプロモーターは便利に用いることができる。ｐｏｌＩプロモーターの種特異性のために、バクテリオファージポリメラーゼプロモーターは、多くの細胞型（例えば、ＭＤＣＫ）についてより好都合であり得るが、細胞はまた、外因性ポリメラーゼ酵素をコードするプラスミドでトランスフェクションされなければならない。

他の技術において、単一の鋳型からウイルスＲＮＡおよび発現可能なｍＲＮＡを同時にコードするために二重のｐｏｌＩプロモーターおよびｐｏｌＩＩプロモーターを用いることが可能である［３４、３５］。

本発明に用いられるインフルエンザＡウイルスは、特にウイルスが卵中で増殖する場合、Ａ／ＰＲ／８／３４ウイルス由来の１つ以上のＲＮＡセグメント（典型的には、Ａ／ＰＲ／８／３４由来の６つのセグメントで、ＨＡおよびＮセグメントはワクチン株由来である、すなわち、６：２再集合体）を含んでもよい。それはまた、Ａ／ＷＳＮ／３３ウイルス由来、またはワクチン調製のために再集合体ウイルスを作製するのに有用な任意の他のウイルス株由来の１つ以上のＲＮＡセグメントを含んでもよい。典型的には、本発明は、ヒトからヒトへの伝染の能力がある株から防御し、それゆえに、株のゲノムは、通常、哺乳類（例えば、ヒト）のインフルエンザウイルスを起源とする少なくとも１つのＲＮＡセグメントを含む。

抗原の供給源として用いられるウイルスは、卵または細胞培養物のどちらでも増殖することができる。インフルエンザウイルス増殖のための現在の標準方法は、特定病原体未感染（ＳＰＦ）胚形成の雌鳥卵を用い、ウイルスはその卵内容物（尿膜腔液）から精製される。しかしながら、最近になって、ウイルスを動物細胞培養物中で増殖させており、速さと患者アレルギーの理由により、この増殖方法が好ましい。卵に基づいたウイルス増殖を用いる場合には、１つ以上のアミノ酸をウイルスと共に卵の尿膜腔液へ導入してもよい［１２］。

細胞培養物が用いられる場合、ウイルス増殖培養基（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）は、典型的には、哺乳類起源の細胞系である。適切な哺乳類細胞の起源として、ハムスター、ウシ、（ヒトおよびサルを含む）霊長類、およびイヌの細胞が挙げられるが、それらに限定されない。例えば、腎臓細胞、線維芽細胞、網膜細胞、肺細胞などの様々な細胞型を用いることができる。適切なハムスター細胞の例は、ＢＨＫ２１またはＨＫＣＣという名前をもつ細胞系である。適切なサル細胞は、例えば、ベロ細胞系においてのような腎臓細胞などのアフリカミドリザル細胞である。適切なイヌ細胞は、例えば、ＭＤＣＫ細胞系においてのような腎臓細胞である。このように、適切な細胞系には、ＭＤＣＫ、ＣＨＯ、２９３Ｔ、ＢＨＫ、ベロ、ＭＲＣ−５、ＰＥＲ．Ｃ６、ＷＩ−３８などが挙げられるが、それらに限定されない。インフルエンザウイルスを増殖させるための好ましい哺乳類細胞系には、メイディン・ダービー・イヌ腎臓由来のＭＤＣＫ細胞［３６〜３９］、アフリカミドリザル（Ｃｅｒｃｏｐｉｔｈｅｃｕｓ ａｅｔｈｉｏｐｓ）腎臓由来のベロ細胞［４０〜４２］、またはヒト胚性網膜芽細胞由来のＰＥＲ．Ｃ６細胞［４３］が挙げられる。これらの細胞系は、例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（ＡＴＣＣ）コレクションから、Ｃｏｒｉｅｌｌ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｉｅｓから、またはＥｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ）から広く入手可能である。例えば、ＡＴＣＣは、カタログ番号ＣＣＬ−８１、ＣＣＬ−８１．２、ＣＲＬ−１５８６、およびＣＲＬ−１５８７の様々な異なるベロ細胞を供給し、カタログ番号ＣＣＬ−３４のＭＤＣＫ細胞を供給する。ＰＥＲ．Ｃ６は、寄託番号９６０２２９４０によりＥＣＡＣＣから入手可能である。哺乳類細胞系の代わりとしてあまり好ましくないが、ウイルスは、トリ細胞系において増殖させることができ［参考文献４４〜４６］、それにはアヒル（例えば、アヒル網膜）または雌鳥由来の細胞系が挙げられる。トリ細胞系の例として、トリ胚性幹細胞［４４、４７］およびアヒル網膜細胞［４５］が挙げられる。適切なトリ胚性幹細胞には、ニワトリ胚性幹細胞、ＥＢ４５、ＥＢ１４、およびＥＢ１４−０７４由来のＥＢｘ細胞系が挙げられる［４８］。ニワトリ胚性線維芽細胞（ＣＥＦ）もまた用いてもよい。

インフルエンザウイルスを増殖させるための最も好ましい細胞系は、ＭＤＣＫ細胞系である。もともとのＭＤＣＫ細胞系は、ＡＴＣＣからＣＣＬ−３４として入手可能であるが、この細胞系の誘導体もまた用いてもよい。例えば、参考文献３６は、懸濁培養物での増殖に適応したＭＤＣＫ細胞系（「ＭＤＣＫ ３３０１６」、ＤＳＭ ＡＣＣ ２２１９として寄託されている）を開示している。同様に、参考文献４９は、無血清培養において懸濁液で増殖するＭＤＣＫ由来細胞系（「Ｂ−７０２」、ＦＥＲＭ ＢＰ−７４４９として寄託されている）を開示している。参考文献５０は、「ＭＤＣＫ−Ｓ」（ＡＴＣＣ ＰＴＡ−６５００）、「ＭＤＣＫ−ＳＦ１０１」（ＡＴＣＣ ＰＴＡ−６５０１）、「ＭＤＣＫ−ＳＦ１０２」（ＡＴＣＣ ＰＴＡ−６５０２）、および「ＭＤＣＫ−ＳＦ１０３」（ＰＴＡ−６５０３）を含む非腫瘍原性ＭＤＣＫ細胞を開示している。参考文献５１は、「ＭＤＣＫ．５Ｆ１」細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１２０４２）を含む、感染に対して高感受性のＭＤＣＫ細胞系を開示している。これらのＭＤＣＫ細胞系のいずれでも用いることができる。

ウイルスを哺乳類細胞系で増殖させた場合、組成物は、有利には、卵タンパク質（例えば、オボアルブミンおよびオボムコイド）およびニワトリＤＮＡを含まず、それによりアレルゲン性を低下させる。

ウイルスを細胞系で増殖させた場合、増殖のための培養物および培養を開始するために用いられるウイルス接種物は、好ましくは、単純ヘルペスウイルス、呼吸器系合胞体ウイルス、パラインフルエンザウイルス３、ＳＡＲＳコロナウイルス、アデノウイルス、ライノウイルス、レオウイルス、ポリオーマウイルス、ビルナウイルス、サーコウイルス、および／またはパルボウイルスを含まない（すなわち、それらについて試験されて、それらによる汚染について陰性結果が示されている）［５２］。単純ヘルペスウイルスの非存在は特に好ましい。

ＭＤＣＫ細胞などの細胞系における増殖について、ウイルスを、懸濁液中の細胞［３６、５３、５４］、または付着培養物の細胞で増殖させてもよい。懸濁培養のための１つの適切なＭＤＣＫ細胞系は、ＭＤＣＫ ３３０１６（ＤＳＭ ＡＣＣ２２１９として寄託されている）である。代わりとして、マイクロキャリア培養を用いることができる。

インフルエンザウイルス複製を支持する細胞系は、好ましくは、無血清培地および／またはタンパク質を含まない培地中で増殖する。本発明との関連において、ヒトまたは動物起源の血清由来の添加物が存在しない培地が無血清培地と呼ばれる。タンパク質を含まないとは、細胞の増殖が、タンパク質、増殖因子、他のタンパク質添加物、および非血清タンパク質を排除して起こる培養を意味すると理解されるが、ウイルス増殖に必要である可能性があるトリプシンまたは他のプロテアーゼなどのタンパク質を必要に応じて含むことができる。そのような培養で増殖する細胞は、当然、それら自体のタンパク質を含む。

インフルエンザウイルス複製を支持する細胞系は、好ましくは、ウイルス複製中、３７℃未満、例えば、３０〜３６℃、３１〜３５℃、または３３±１℃で増殖する［５５］。

培養細胞中でウイルスを繁殖させるための方法は、一般的に、培養すべき株を培養細胞に接種する工程、感染した細胞を、例えば、ウイルス力価または抗原発現によって決定される場合などのウイルス繁殖にとって望ましい期間（例えば、接種後２４時間から１６８時間の間）、培養する工程、および繁殖したウイルスを収集する工程を含む。培養細胞に、１：５００〜１：１、好ましくは１：１００〜１：５、より好ましくは１：５０〜１：１０の細胞比で（ＰＦＵまたはＴＣＩＤ_５０によって測定される）ウイルスを接種する。ウイルスは細胞の懸濁液に加えられ、または細胞の単層にアプライされ、ウイルスは、細胞に少なくとも６０分間、しかし通常には、３００分間未満、好ましくは９０分間から２４０分間の間、２５℃〜４０℃、好ましくは２８℃〜３７℃で吸収される（ａｂｓｏｒｂｅｄ）。感染した細胞培養物（例えば、単層）を、回収された培養上清のウイルス含有量を増加させるために、凍結融解によるか、または酵素作用によるかのいずれかで取り出すことができる。回収された流体は、その後、不活性化されるか、または凍結保存されるかのいずれかである。培養細胞を、約０．０００１〜１０、好ましくは０．００２〜５、より好ましくは０．００１〜２までの感染多重度（「ｍ．ｏ．ｉ．」）で感染させ得る。さらにより好ましくは、細胞を、約０．０１のｍ．ｏ．ｉで感染させる。感染細胞は、感染から３０〜６０時間後に回収することができる。好ましくは、細胞を、感染させてから３４〜４８時間後に回収する。さらにより好ましくは、細胞を感染させてから３８〜４０時間後に回収する。プロテアーゼ（典型的にはトリプシン）は一般的に、ウイルス放出を可能にするために細胞培養中に加えられ、プロテアーゼは培養中の任意の適切な段階で加えることができる。

血球凝集素（ＨＡ）は、不活化インフルエンザワクチンにおける主要な免疫原であり、ワクチン用量は、典型的には一元放射免疫拡散（ＳＲＩＤ）アッセイによって測定される場合の、ＨＡレベルを参照することによって、標準化される。現在のワクチンは、典型的には、１株あたり約１５μｇのＨＡを含むが、より低い用量もまた、例えば、子ども用に、または緊急事態において、用いられる。１／２（すなわち、ＦＯＣＥＴＲＩＡ（商標）においてのように、１株あたり７．５μｇのＨＡ）、１／４（すなわち、ＰＲＥＰＡＮＤＲＩＸ（商標）においてのように、１株あたり３．７５μｇ）、および１／８などの分割用量は、より高い用量（例えば、３×または９×用量［５８、５９］）を有する場合に用いられている［５６、５７］。したがって、ワクチンは、１インフルエンザ株あたり０．１〜１５０μｇのＨＡ、好ましくは０．１μｇから５０μｇの間、例えば、０．１〜２０μｇ、０．１〜１５μｇ、０．１〜１０μｇ、０．１〜７．５μｇ、０．５〜５μｇ、３．７５〜１５μｇなどを含み得る。具体的な用量には、例えば、１株あたり約４５μｇ、約３０μｇ、約１５μｇ、約１０μｇ、約７．５μｇ、約５μｇ、約３．８μｇ、約３．７５μｇ、約１．９μｇ、約１．５μｇなどが挙げられる。１株あたりの等しいＨＡ総量（ＨＡ ｍａｓｓ）が典型的である。より低い用量（すなわち、＜１５μｇ／用量）が、本発明でのようにワクチン中にアジュバントが存在する場合、最も有用である。高くも９０μｇほどの用量がいくつかの研究に用いられているが（例えば、参考文献６０）、本発明の組成物は、通常、１５μｇ／用量／株またはそれ未満を含む。

本発明で用いられるＨＡは、ウイルス内に見出されるような天然ＨＡであってもよいし、改変されていてもよい。

本発明の組成物は、特にスプリットワクチンまたは表面抗原ワクチンについて、界面活性剤、例えば、ポリオキシエチレンソルビタンエステル表面活性剤（「Ｔｗｅｅｎ」として知られている、例えば、ポリソルベート８０）、オクトキシノール（オクトキシノール−９（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）もしくはオクトキシノール−１０、またはｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール）、臭化セチルトリメチルアンモニウム（「ＣＴＡＢ」）、またはデオキシコール酸ナトリウムを含んでもよい。界面活性剤は、痕跡量でのみ、存在する場合がある。したがって、ワクチンは、１ｍｇ／ｍｌ未満のオクトキシノール−１０、コハク酸水素α−トコフェリル、およびポリソルベート８０のそれぞれを含んでもよい。痕跡量の他の残留成分は抗生物質（例えば、ネオマイシン、カナマイシン、ポリミキシンＢ）であり得る。

宿主細胞ＤＮＡ
ウイルスが細胞系で増殖していた場合、ＤＮＡのいかなる腫瘍形成活性も最小限にするために、最終ワクチンにおいて残留細胞系ＤＮＡの量を最小限にすることは標準的な慣例である。したがって、組成物は、好ましくは、１用量あたり１０ｎｇ未満（好ましくは、１ｎｇ未満、より好ましくは１００ｐｇ未満）の残留宿主細胞ＤＮＡを含むが、痕跡量の宿主細胞ＤＮＡが存在する場合がある。一般的に、本発明の組成物から排除されることが望ましい宿主細胞ＤＮＡは、１００ｂｐより長いＤＮＡである。

残留宿主細胞ＤＮＡの測定は、現在、生物製剤についての日常的規制要件であり、当業者の標準能力でできる範囲内である。ＤＮＡを測定するために用いられるアッセイは、典型的には、確証されたアッセイである［６１、６２］。確証されたアッセイの性能特性は、数学的かつ数量化可能な用語で記載することができ、それの起こり得る誤差の原因が同定されていることになる。アッセイは、一般的に、正確度、精度、特異性などの特性について試験されている。いったんアッセイが（例えば、既知の標準量の宿主細胞ＤＮＡに対して）較正され、試験されたならば、定量的ＤＮＡ測定は日常的に実施することができる。ＤＮＡ定量化についての以下の３つの原理技術を用いることができる：サザンブロットまたはスロットブロットなどのハイブリダイゼーション方法［６３］；Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ（商標）システムなどのイムノアッセイ方法［６４］；および定量的ＰＣＲ［６５］。これらの方法は全て、当業者によく知られているが、各方法の正確な特性、例えば、ハイブリダイゼーションのためのプローブの選択、増幅のためのプライマーおよび／またはプローブの選択などは、問題の宿主細胞に依存し得る。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ製のＴｈｒｅｓｈｏｌｄ（商標）システムは、ピコグラムレベルの全ＤＮＡについての定量的アッセイであり、生物医薬品中の汚染ＤＮＡのレベルをモニターするのに用いられている［６４］。典型的なアッセイは、ビオチン化ｓｓＤＮＡ結合タンパク質である、ウレアーゼ連結抗ｓｓＤＮＡ抗体とＤＮＡとの間の反応複合体の非配列特異的形成を含む。全てのアッセイ成分は、製造業者から入手できる完全な全ＤＮＡアッセイキット中に含まれている。様々な商業的製造業者が、残留宿主細胞ＤＮＡを検出するための定量的ＰＣＲアッセイを提供しており、例えば、ＡｐｐＴｅｃ（商標）Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＢｉｏＲｅｌｉａｎｃｅ（商標）、Ａｌｔｈｅａ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓなどがある。ヒトウイルスワクチンの宿主細胞ＤＮＡ汚染を測定するための化学発光ハイブリダイゼーションアッセイと全ＤＮＡＴｈｒｅｓｈｏｌｄ（商標）システムとの比較は参考文献６６に見出すことができる。

汚染ＤＮＡは、標準精製手順、例えば、クロマトグラフィーなどを用いてワクチン調製中に除去することができる。残留宿主細胞ＤＮＡの除去は、ヌクレアーゼ処理により、例えば、ＤＮアーゼを用いることによって、強化することができる。宿主細胞ＤＮＡ汚染を低減するための便利な方法は、参考文献６７および６８に開示されており、それには、最初に、ウイルス増殖中に用いることができるＤＮアーゼ（例えば、Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ）を用い、その後ビリオン破壊中に用いることができる陽イオン性界面活性剤（例えば、ＣＴＡＢ）を用いる、２工程処理が含まれる。β−プロピオラクトンなどのアルキル化剤での処理もまた、宿主細胞ＤＮＡを除去するのに用いることができ、有利には、ビリオンを不活性化するためにも用いることができ［６９］、同時に、ホルムアルデヒドの使用を回避することができる。

１５μｇの血球凝集素あたり＜１０ｎｇ（例えば、＜１ｎｇ、＜１００ｐｇ）の宿主細胞ＤＮＡを含むワクチンが好ましく、０．２５ｍｌ容量あたり＜１０ｎｇ（例えば、＜１ｎｇ、＜１００ｐｇ）の宿主細胞ＤＮＡを含むワクチンも同様である。５０μｇの血球凝集素あたり＜１０ｎｇ（例えば、＜１ｎｇ、＜１００ｐｇ）の宿主細胞ＤＮＡを含むワクチンはより好ましく、０．５ｍｌ容量あたり＜１０ｎｇ（例えば、＜１ｎｇ、＜１００ｐｇ）の宿主細胞ＤＮＡを含むワクチンも同様である。

水中油型乳剤アジュバント
本発明の組成物は、組成物を受ける患者において誘発される免疫応答（体液性および／または細胞性）を増強するように機能することができる水中油型乳剤アジュバントを含む。Ｎｏｖａｒｔｉｓ Ｖａｃｃｉｎｅｓ製のＦＬＵＡＤ（商標）製品は、水中油型乳剤を含む。

様々の適切な乳剤が知られており、それらは典型的には、少なくとも１つの油および少なくとも１つの表面活性剤を含み、その油（複数可）および表面活性剤（複数可）は生分解性（代謝可能）および生体適合性である。乳剤における油滴は、一般的に、直径が５μｍ未満であり、有利には、乳剤は、サブミクロンの直径をもつ油滴を含み、これらの小さいサイズは、マイクロ流体化装置で達成され、安定な乳剤を提供する。２２０ｎｍ未満のサイズをもつ液滴は、濾過滅菌に供することができるため、好ましい。

本発明は、動物源（魚など）または植物源由来の油などの油と共に用いることができる。植物油についての源として、堅果、種子、および穀物が挙げられる。最も一般的に入手可能な、ピーナッツ油、大豆油、ココナッツ油、およびオリーブ油が堅果油を例示している。ホホバ油を用いることができ、例えば、ホホバ豆から得ることができる。種子油には、サフラワー油、綿実油、ヒマワリ種子油、ゴマ種子油などが挙げられる。穀物群において、コーン油が最も容易に入手できるが、例えば、コムギ、オートムギ、ライムギ、コメ、テフ、ライコムギ（ｔｒｉｔｉｃａｌｅ）などの他の穀物の油もまた用いてもよい。グリセロールおよび１，２−プロパンジオールの６〜１０炭素脂肪酸エステルは、種子油中に天然では存在しないが、堅果油および種子油から出発する適当な材料の加水分解、分離、およびエステル化によって調製してもよい。哺乳類の乳由来の脂肪および油は代謝可能であり、したがって、本発明の実施に用いてもよい。動物源から純粋な油を得るのに必要な分離、精製、鹸化、および他の手段についての手順は当技術分野において周知である。たいていの魚は、容易に回収することができる代謝可能油を含む。例えば、タラ肝油、サメ肝油、鯨蝋などの鯨油は、本明細書で用いることができる魚油のいくつかを例示している。いくつかの分岐鎖油は、５炭素イソプレン単位で生化学的に合成され、一般的にテルペノイドと呼ばれている。サメ肝油は、スクワレンとして知られた分岐不飽和テルペノイドである、２，６，１０，１５，１９，２３−ヘキサメチル−２，６，１０，１４，１８，２２−テトラコサヘキサエンを含む。他の好ましい油は、トロコフェロールである（下記参照）。スクワレンを含む水中油型乳剤が特に好ましい。油の混合物を用いることができる。

表面活性剤は、それらの「ＨＬＢ」（親水性／親油性バランス）によって分類することができる。本発明の好ましい表面活性剤は、少なくとも１０、好ましくは少なくとも１５、より好ましくは少なくとも１６のＨＬＢを有する。本発明は、以下を含む表面活性剤と共に用いることができるが、それらに限定されない：ポリオキシエチレンソルビタンエステル表面活性剤（一般的には、Ｔｗｅｅｎと呼ばれる）、特にポリソルベート２０およびポリソルベート８０；ＤＯＷＦＡＸ（商標）という商品名で販売されている、エチレンオキシド（ＥＯ）、プロピレンオキシド（ＰＯ）、および／またはブチレンオキシド（ＢＯ）のコポリマー、例えば、線状ＥＯ／ＰＯブロックコポリマー；エトキシ（オキシ−１，２−エタンジイル）基を繰り返す数が変化し得るオクトキシノールで、オクトキシノール−９（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００またはｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール）が特に関心対象である；（オクチルフェノキシ）ポリエトキシエタノール（ＩＧＥＰＡＬ ＣＡ−６３０／ＮＰ−４０）；ホスファチジルコリン（レシチン）などのリン脂質；ラウリルアルコール、セチルアルコール、ステアリルアルコール、およびオレイルアルコール由来のポリオキシエチレン脂肪エーテル（Ｂｒｉｊ表面活性剤として知られている）、例えば、トリエチレングリコールモノラウリルエーテル（Ｂｒｉｊ ３０）：ならびにソルビタンエステル（一般的にはＳＰＡＮとして知られている）、例えば、トリオレイン酸ソルビタン（Ｓｐａｎ ８５）およびモノラウリン酸ソルビタン。乳剤に含ませるのに好ましい表面活性剤はＴｗｅｅｎ ８０（モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン）、Ｓｐａｎ ８５（トリオレイン酸ソルビタン）、レシチン、およびＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００である。上記で述べられているように、Ｔｗｅｅｎ ８０などの界面活性剤は、下記の例に見られる熱安定性に寄与し得る。

表面活性剤の混合物を用いることができ、例えば、Ｔｗｅｅｎ ８０／Ｓｐａｎ ８５混合物がある。モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン（Ｔｗｅｅｎ ８０）などのポリオキシエチレンソルビタンエステルとｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）などのオクトキシノールの組み合わせもまた適している。もう一つの有用な組み合わせは、ラウレス９とポリオキシエチレンソルビタンエステルおよび／またはオクトキシノールを含む。

表面活性剤の好ましい量（重量％）は以下の通りである：ポリオキシエチレンソルビタンエステル（Ｔｗｅｅｎ ８０など）０．０１〜１％、特に約０．１％；オクチルフェノキシポリオキシエタノールまたはノニルフェノキシポリオキシエタノール（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、またはＴｒｉｔｏｎシリーズの他の界面活性剤など）０．００１〜０．１％、特に０．００５〜０．０２％；ポリオキシエチレンエーテル（ラウレス９など）０．１〜２０％、好ましくは０．１〜１０％、特に０．１〜１％または約０．５％。

本発明に関して有用な特定の水中油型乳剤アジュバントには以下が挙げられるが、それらに限定されない：
・スクワレン、Ｔｗｅｅｎ ８０、およびＳｐａｎ ８５のサブミクロン乳剤。乳剤の容量組成は、約５％のスクワレン、約０．５％のポリソルベート８０、および約０．５％のＳｐａｎ ８５であり得る。重量に置き換えると、これらの比は、４．３％のスクワレン、０．５％のポリソルベート８０、および０．４８％のＳｐａｎ ８５になる。このアジュバントは、参考文献７３の１０章および参考文献７４の１２章においてより詳細に記載されているように、「ＭＦ５９」として知られている［７０〜７２］。ＭＦ５９乳剤は、有利には、クエン酸イオン、例えば、１０ｍＭのクエン酸ナトリウム緩衝液を含む。
・スクワレン、α−トコフェロール、およびポリソルベート８０を含む乳剤。これらの乳剤は、２％から１０％までのスクワレン、２％から１０％までのトコフェロール、および０．３％から３％までのＴｗｅｅｎ ８０を有し得、スクワレン：トコフェロールの重量比は、好ましくは、≦１（例えば、０．９０）であり、これがより安定な乳剤を与えるからである。スクワレンおよびＴｗｅｅｎ ８０は、約５：２の容量比、または約１１：５の重量比で存在してもよい。１つのそのような乳剤は、ＰＢＳ中にＴｗｅｅｎ ８０を溶解して２％溶液を生じ、その後、９０ｍｌのこの溶液を（５ｇのＤＬ−α−トコフェロールおよび５ｍｌのスクワレン）の混合物と混合し、その後、その混合物をマイクロ流体化する（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｓｉｎｇ）ことによって作製することができる。生じた乳剤は、サブミクロンの油滴、例えば、１００ｎｍから２５０ｎｍの間、好ましくは約１８０ｎｍの平均直径をもつ、油滴を有し得る。
・スクワレン、トコフェロール、およびＴｒｉｔｏｎ界面活性剤（例えば、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）の乳剤。その乳剤は、３ｄ−ＭＰＬも含んでもよい（下記参照）。その乳剤はリン酸緩衝液を含んでもよい。
・ポリソルベート（例えば、ポリソルベート８０）、Ｔｒｉｔｏｎ界面活性剤（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）、およびトコフェロール（例えば、コハク酸α−トコフェロール）を含む乳剤。その乳剤は、これらの３つの成分を約７５：１１：１０の質量比（例えば、７５０μｇ／ｍｌのポリソルベート８０、１１０μｇ／ｍｌのＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、および１００μｇ／ｍｌのコハク酸α−トコフェロール）で含み得、これらの濃度は、抗原由来のこれらの成分のいかなる寄与分も含むべきである。その乳剤はまたスクワレンも含んでもよい。その乳剤は、３ｄ−ＭＰＬも含んでもよい（下記参照）。その水性相はリン酸緩衝液を含んでもよい。
・スクワレン、ポリソルベート８０、およびポロキサマー４０１（「Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（商標）Ｌ１２１」）の乳剤。その乳剤は、リン酸緩衝食塩水、ｐＨ７．４中に製剤化することができる。この乳剤は、ムラミルジペプチドについての有用な送達ビヒクルであり、「ＳＡＦ−１」アジュバント［７５］（０．０５〜１％のＴｈｒ−ＭＤＰ、５％のスクワレン、２．５％のＰｌｕｒｏｎｉｃ Ｌ１２１、および０．２％のポリソルベート８０）においてスレオニル−ＭＤＰと共に用いられている。それはまた、「ＡＦ」アジュバント［７６］（５％のスクワレン、１．２５％のＰｌｕｒｏｎｉｃ Ｌ１２１、および０．２％のポリソルベート８０）においてのように、Ｔｈｒ−ＭＤＰなしに用いることもできる。マイクロ流体化が好ましい。
・スクワレン、水性溶媒、ポリオキシエチレンアルキルエーテル親水性非イオン性表面活性剤（例えば、ポリオキシエチレン（１２）セトステアリルエーテル）、および疎水性非イオン性表面活性剤（例えば、モノオレイン酸（ｍｏｎｏｌｅａｔｅ）ソルビタンまたは「Ｓｐａｎ ８０」などのソルビタンエステルまたはマンニドエステル）を含む乳剤。その乳剤は、好ましくは、熱可逆性であり、および／または２００ｎｍ未満のサイズをもつ少なくとも９０容量％の油滴を有する［７７］。その乳剤はまた、アルジトール（例えば、マンニトール）、凍結保護剤（例えば、ドデシルマルトシドおよび／またはショ糖などの糖）、および／またはアルキルポリグリコシドのうちの１つ以上を含んでもよい。そのような乳剤は、凍結乾燥されてもよい。その乳剤は、３３０：６３：４９：６１の質量比でのスクワレン：ポリオキシエチレンセトステアリルエーテル：オレイン酸ソルビタン：マンニトールを含んでもよい。
・０．５〜５０％の油、０．１〜１０％のリン脂質、および０．０５〜５％の非イオン性表面活性剤を有する乳剤。参考文献７８に記載されているように、好ましいリン脂質成分は、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジン酸、スフィンゴミエリン、およびカルジオリピンである。サブミクロンの液滴サイズが有利である。
・非代謝型油（例えば、軽鉱油（ｌｉｇｈｔ ｍｉｎｅｒａｌ ｏｉｌ））および少なくとも１つの表面活性剤（例えば、レシチン、Ｔｗｅｅｎ ８０、またはＳｐａｎ ８０）のサブミクロン水中油型乳剤。ＱｕｉｌＡサポニン、コレステロール、（グルクロン酸のカルボキシル基を介する脂肪族アミンのデスアシルサポニンへの付加により生じる、参考文献７９に記載されたＧＰＩ−０１００などの）サポニン親油性コンジュゲート、臭化ジメチルジオクタデシルアンモニウム、および／またはＮ，Ｎ−ジオクタデシル−Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）プロパンジアミンなどの添加物が含まれてもよい。
・鉱油、非イオン性親油性エトキシ化脂肪アルコール、および非イオン性親水性表面活性剤（例えば、エトキシ化脂肪アルコールおよび／またはポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマー）を含む乳剤［８０］。
・鉱油、非イオン性親水性エトキシ化脂肪アルコール、および非イオン性親油性表面活性剤（例えば、エトキシ化脂肪アルコールおよび／またはポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマー）を含む乳剤［８０］。
・サポニン（例えば、ＱｕｉｌＡまたはＱＳ２１）およびステロール（例えば、コレステロール）がヘリカルミセルとして会合している乳剤［８１］。

組成物における抗原およびアジュバントは、典型的には、患者への送達の時点で混合物となっている。乳剤は、製造中、または送達時点に即席で、抗原と混合されてもよい。したがって、アジュバントおよび抗原は、使用時点で最終調合する準備が整った状態の、パッケージングされたワクチンまたは分割されたワクチン（ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｅｄ ｖａｃｃｉｎｅ）中で別々に保管されてもよい。抗原は、一般的に、水性の形態であり、そのため、ワクチンは、最終的に、２つの液体を混合することによって調製される。混合するための２つの液体の容量比は変わり得るが（例えば、５：１から１：５の間）、一般的に約１：１である。

抗原およびアジュバントが混合された後、血球凝集素抗原は、一般的には、水溶液中に留まるが、油／水の界面の周囲に分布し得る。一般的に、血球凝集素はほとんど乳剤の油相に入らない。

組成物がトコフェロールを含む場合、α、β、γ、δ、ε、またはζトコフェロールのいずれも用いることができるが、α−トコフェロールが好ましい。トコフェロールは、いくつかの形態、例えば、異なる塩および／または異性体の形態をとることができる。塩には、コハク酸塩、酢酸塩、ニコチン酸塩などの有機塩が挙げられる。Ｄ−α−トコフェロールおよびＤＬ−α−トコフェロールはどちらも用いることができる。トコフェロールは、有利には、高齢患者（例えば、６０歳以上）に使用するためのワクチンに含まれるが、ビタミンＥがこの患者群において免疫応答へプラス効果を有することが報告されているからである［８２］。それらはまた、乳剤を安定化させるのに役立ち得る抗酸化剤の性質も有する［８３］。好ましいα−トコフェロールは、ＤＬ−α−トコフェロールであり、このトコフェロールの好ましい塩は、コハク酸塩である。コハク酸塩は、インビボでＴＮＦ関連リガンドと協力することが見出されている。さらに、コハク酸α−トコフェロールは、インフルエンザワクチンと適合性があること、および水銀化合物の代替物として有用な保存剤であることが知られている。

上記で述べられているように、スクワレンを含む水中油型乳剤は特に好ましい。いくつかの実施形態において、ワクチン用量中のスクワレン濃度は、５〜１５ｍｇの範囲（すなわち、０．５ｍｌ投与容量と仮定すれば、１０〜３０ｍｇ／ｍｌの濃度）であり得る。しかし、スクワレンの濃度を低下させること、例えば、用量あたり＜５ｍｇ、またはさらに用量あたり＜１．１ｍｇを含むことは可能である［８４、８５］。例えば、ヒト用量は、用量あたり９．７５ｍｇのスクワレンを含んでもよく（ＦＬＵＡＤ（商標）製品においての場合、０．５ｍｌ投与容量中、９．７５ｍｇのスクワレン、１．１７５ｍｇのポリソルベート８０、１．１７５ｍｇのトリオレイン酸ソルビタン）、またはその分割量、例えば、３／４、２／３、１／２、１／３、１／４、１／５、１／６、１／７、１／８、１／９、または１／１０を含んでもよい。例えば、組成物は、用量あたり７．３１ｍｇのスクワレン（および、それと共に、各０．８８ｍｇのポリソルベート８０およびトリオレイン酸ソルビタン）、４．８７５ｍｇスクワレン／用量（および、それと共に、各０．５８８ｍｇのポリソルベート８０およびトリオレイン酸ソルビタン）、３．２５ｍｇスクワレン／用量、２．４３８ｍｇ／用量、１．９５ｍｇ／用量、０．９７５ｍｇ／用量などを含んでもよい。ＦＬＵＡＤ（商標）−強化ＭＦ５９のこれらの分割希釈物を本発明に用いることができる。

上記で述べられているように、抗原／乳剤の混合は、送達時点で即席に行ってもよい。したがって、本発明は、いつでも混合できる状態になっている抗原成分およびアジュバント成分を含むキットを提供する。キットは、アジュバントおよび抗原を使用時点まで別々に保管されるようになっている。成分は、キット内で物理的にお互いから離れており、この分離は様々な方法で達成することができる。例えば、２つの成分は、バイアルなどの２つの別々の容器内であってもよい。その後、２つのバイアルの内容物は、例えば、一方のバイアルの内容物を別々に取り出して、それらを他方のバイアルへ加えることによって、または両方のバイアルの内容物を取り出して、それらを第３の容器内で混合することによって、混合することができる。好ましい配置（ａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ）において、キット成分の一方は、シリンジ内にあり、他方がバイアルなどの容器内にある。シリンジは、混合のためにその内容物を第２の容器へ挿入するために用いることができ（例えば、針で）、その後、混合物は、シリンジへ吸引することができる。その後、シリンジの混合された内容物は、患者へ、典型的には、新しい滅菌針を通して、投与することができる。シリンジ内に１つの成分を詰めることは、患者投与用の別個のシリンジを用いる必要性をなくす。別の好ましい配置において、２つのキット成分は、一緒に保持されるが、同じシリンジ内で別々に、例えば、参考文献８６〜９３などに開示されたものなどの二重チャンバー型シリンジ中に、保持される。シリンジを作動させたとき（例えば、患者への投与中）、２つのチャンバーの内容物が混合される。この配置は、使用時点での別途の混合工程の必要性を回避する。

薬学的組成物
本発明の組成物は、薬学的に許容され得る。それらは、通常、抗原およびアジュバントに加えて成分を含み、例えば、それらは、典型的には、１つ以上の薬学的キャリア（複数可）および／または賦形剤（複数可）を含む。そのような成分の徹底的な議論は、参考文献９４において入手できる。

組成物は、一般的に、水性の形態である。

組成物は、チオメルサール（ｔｈｉｏｍｅｒｓａｌ）（例えば、１０μｇ／ｍｌでの）または２−フェノキシエタノールなどの保存剤を含んでもよい。しかしながら、好ましくは、ワクチンが水銀材料を実質的に含まないように（すなわち、５μｇ／ｍｌ未満）、例えばチオメルサールを含まないように、するべきである［９５］。水銀を含まないワクチンはより好ましい。保存剤を含まないワクチンは特に好ましい。

張度を調節するために、ナトリウム塩などの生理学的塩を含むことは好ましい。塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）が好ましく、１ｍｇ／ｍｌから２０ｍｇ／ｍｌの間で存在してもよい。存在してもよい他の塩には、塩化カリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸二ナトリウム（無水）、塩化マグネシウム、塩化カルシウムなどが挙げられる。

組成物は、一般的に、２００ｍＯｓｍ／ｋｇから４００ｍＯｓｍ／ｋｇの間、好ましくは２４０ｍＯｓｍ／ｋｇ〜３６０ｍＯｓｍ／ｋｇの間の重量オスモル濃度を有し、より好ましくは、２９０〜３１０ｍＯｓｍ／ｋｇの範囲内にある。重量オスモル濃度は、以前には、ワクチン接種によって引き起こされる痛みへ影響を及ぼさないことが報告されているが［９６］、重量オスモル濃度をこの範囲に保つことは、やはり好ましい。

組成物は１つ以上の緩衝液を含んでもよい。典型的な緩衝液には、リン酸緩衝液、Ｔｒｉｓ緩衝液、ホウ酸緩衝液、コハク酸緩衝液、ヒスチジン緩衝液、またはクエン酸緩衝液が挙げられる。緩衝液は、典型的には、５〜２０ｍＭの範囲に含まれる。緩衝液は乳剤の水相内に存在し得る。

組成物のｐＨは、一般的に、５．０から８．１の間、より典型的には６．０から８．０の間、例えば、６．５から７．５の間、または７．０から７．８の間である。したがって、本発明のプロセスは、バルクワクチンのｐＨをパッケージングの前に調整する工程を含んでもよい。

組成物は、好ましくは、無菌である。組成物は、好ましくはグルテンを含まない。

好ましいワクチンは、低含有量の内毒素、例えば、１ＩＵ／ｍｌ未満、好ましくは０．５ＩＵ／ｍｌ未満の内毒素を有する。内毒素測定値についての国際単位はよく知られており、例えば、ＮＩＢＳＣから入手できる２ｎｄ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｔａｎｄａｒｄ（Ｃｏｄｅ ９４／５８０−ＩＳ）などの国際標準品［９７、９８］との比較によって試料について計算することができる。卵中で増殖したウイルスから調製される現在のワクチンは、０．５〜５ＩＵ／ｍｌの領域の内毒素レベルを有する。

ワクチンは、好ましくは、抗生物質（例えば、ネオマイシン、カナマイシン、ポリミキシンＢ）を含まない。

組成物は、単回の免疫用の材料を含んでもよいし、または複数回の免疫（すなわち、「複数用量（ｍｕｌｔｉｄｏｓｅ）」組成物）用の材料を含んでもよい。複数用量の配置（ｍｕｌｔｉｄｏｓｅ ａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ）は、通常、ワクチン内に保存剤を含ませる。この必要性を回避するために、ワクチンは、材料の取り出しのための無菌性アダプターを有する容器内に含まれてもよい。

インフルエンザワクチンは、典型的には、約０．５ｍｌの投与容量で投与されるが、半分の用量（すなわち、約０．２５ｍｌ）を子どもに投与してもよく、単位用量は、適宜、選択され、例えば、単位用量は、患者への投与として０．５ｍｌの用量が与えられる。

組成物またはキット成分のパッケージング
本発明のプロセスは、ワクチンを容器に、特に医師が用いるための分割用の容器に入れる工程を含むことができる。

ワクチン用の適切な容器には、バイアル、鼻腔用スプレー、および使い捨てシリンジが挙げられ、それらは無菌であるべきである。

組成物／成分がバイアル内に置かれている場合、バイアルは好ましくは、ガラス材料またはプラスチック材料でできている。バイアルは、好ましくは、組成物がそれに加えられる前に滅菌される。ラテックス感受性患者に関する問題を避けるために、バイアルは、好ましくは、ラテックスを含まないストッパーで密封され、全てのパッケージング材料においてラテックスが存在しないことが好ましい。バイアルは単回用量（ｓｉｎｇｌｅ ｄｏｓｅ）のワクチンを含んでもよいし、または１用量より多い用量（「複数用量」バイアル）、例えば、１０用量を含んでもよい。好ましいバイアルは無色ガラスでできている。

バイアルは、前もって充填されたシリンジをキャップへ挿入することができ、シリンジの内容物をバイアル中へ放出することができ、およびバイアルの内容物を取り出してシリンジへ戻すことができるように適応したキャップ（例えば、Ｌｕｅｒロック）を有することができる。バイアルからシリンジを取り出した後、針を取り付けることができ、組成物を患者に投与することができる。キャップに届くことができる前に、シールまたはカバーを取り除かなければならないように、キャップは、好ましくは、シールまたはカバーの内側に置かれる。バイアルは、特に複数用量バイアルについて、その内容物の無菌的取り出しを可能にするキャップを有してもよい。

組成物／成分がシリンジにパッケージングされる場合、シリンジには、針が取り付けられていてもよい。針が取り付けられていない場合には、組み合わせ（ａｓｓｅｍｂｌｙ）および使用のために針をシリンジとは離してシリンジと共に供給してもよい。そのような針は外筒に収められていてもよい。安全針が好ましい。１インチ２３ゲージ、１インチ２５ゲージ、および５／８インチ２５ゲージの針が典型的である。シリンジは、記録管理を容易にするために、ロット番号、インフルエンザ季節、および内容物の有効期限が印刷され得る剥離式ラベルを付けて提供されてもよい。シリンジ中のプランジャーは、好ましくは、プランジャーが吸引中に偶然に外れるのを防ぐためにストッパーを有する。シリンジは、ラテックスゴムキャップおよび／またはプランジャーを有してもよい。使い捨てシリンジは、単回用量のワクチンを含む。シリンジは、一般的に、針の装着前に先端を密閉するための先端キャップを有し、先端キャップは好ましくは、ブチルゴムでできている。シリンジおよび針が別々にパッケージングされる場合には、針は、好ましくは、ブチルゴムの保護物を取り付けられている。好ましいシリンジは、「Ｔｉｐ−Ｌｏｋ」（商標）という商品名で販売されたものである。

容器は、例えば、子どもへの送達を容易にするために、半分用量の容量を示すように印を付けられていてもよい。例えば、０．５ｍｌの用量を含むシリンジは、０．２５ｍｌの容量を示す印があってもよい。

ガラス容器（例えば、シリンジまたはバイアル）が用いられる場合、ソーダ石灰ガラス製よりもむしろホウケイ酸ガラス製の容器を用いることが好ましい。

組成物は、ワクチンの詳細を含む小冊子、例えば、投与、ワクチン内の抗原の詳細などについての説明書と組み合わせてもよい（例えば、同じ箱の中に）。説明書はまた、例えば、ワクチン接種後のアナフィラキシー反応の場合に容易に利用できるアドレナリンの溶液を置いておくことなどの注意を含んでもよい。

ワクチンによる処置方法および投与方法
本発明の組成物は、ヒト患者への投与に適しており、本発明は、本発明の組成物を患者に投与する工程を含む、患者において免疫応答を起こす方法を提供する。

本発明はまた、薬物として用いる本発明のキットまたは組成物も提供する。

本発明の方法および使用によって起こる免疫応答は、一般的に、抗体応答、好ましくは防御抗体応答を含む。インフルエンザウイルスワクチン接種後の抗体応答、中和能、および防御を評価するための方法は、当技術分野においてよく知られている。ヒト研究により、ヒトインフルエンザウイルスの血球凝集素に対する抗体価が防御と相関していることが示されている（約３０〜４０の血清試料血球凝集阻害力価が、同種ウイルスによる感染からの約５０％防御を与える）［９９］。抗体応答は、典型的には、血球凝集阻害法により、マイクロ中和法により、一元放射免疫拡散法（ＳＲＩＤ）により、および／または一元放射溶血法（ＳＲＨ）により測定される。これらのアッセイ技術は当技術分野においてよく知られている。

本発明の組成物は、様々な方法で投与することができる。最も好ましい免疫経路は、（例えば、腕または脚への）筋肉内注射によるが、他の利用可能な経路には、皮下注射、鼻腔内［１００〜１０２］、皮内［１０３、１０４］、経口［１０５］、経皮（ｔｒａｎｓｃｕｔａｎｅｏｕｓ）、経皮（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ）［１０６］などが挙げられる。皮内経路および鼻腔内経路は魅力的である。皮内投与は、例えば、約１．５ｍｍの長さの針を有する、マイクロインジェクションデバイスを含む場合がある。

本発明に従って調製されるワクチンは、子どもおよび成人のどちらを処置するのにも用いることができる。インフルエンザワクチンは、現在、小児および成人の免疫における使用として、生後６ヶ月から推奨されている。したがって、患者は、１歳未満（例えば、生後６ヶ月未満）、１〜５歳、５〜１５歳、１５〜５５歳、または少なくとも５５歳であってもよい。ワクチンを受けるのに好ましい患者は高齢者（例えば、≧５０歳、≧６０歳、および好ましくは≧６５歳）、若者（例えば、≦５歳、または生後６ヶ月から２４歳の間、もしくは生後６ヶ月から４歳の間、もしくは５〜１８歳の間の者）、中高年（２５〜６４歳）、入院患者、保健健康管理従事者、武装業務の人員および軍人、妊婦、慢性病の患者、免疫不全の患者、ワクチンを受ける前の７日間、抗ウイルス化合物（例えば、オセルタミビルまたはザナミビル化合物；下記参照）を服用している患者、卵アレルギーをもつ人、および海外旅行する人である。ワクチンはこれらの群だけに適しているわけではなく、集団においてより一般的に用いられてもよい。

いくらかの高齢者（６０歳より上の者の約３分の１）は、パンデミックＡ／ＣＡ／０４／０９株に対する既存の血清抗体を有するが、若年成人のほとんど、および本質的にどの子どもも、該抗体を有しない。若者の季節性株に対する免疫はこの株に対する抗体を誘発しない［１０７］。水中油型アジュバントを含む本発明の免疫原性組成物を受けるべき有用な被験体群は、パンデミックＡ／ＣＡ／０４／０９株に対する現存する血清抗体を有しない被験体、例えば、１９６０年以降、１９７０年以降、１９８０年以降、１９９０年以降、または２０００年以降に生まれた患者である。

本発明の好ましい組成物は、有効性についてＣＰＭＰ判定基準の１、２、または３を満たす。成人（１８〜６０歳）において、これらの判定基準は、（１）≧７０％の血清防御（ｓｅｒｏｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ）；（２）≧４０％のセロコンバージョン；および／または（３）≧２．５倍のＧＭＴ増加である。高齢者（＞６０歳）において、これらの判定基準は、（１）≧６０％の血清防御；（２）≧３０％のセロコンバージョン；および／または（３）≧２倍のＧＭＴ増加である。これらの判定基準は、少なくとも５０人の患者に関する非盲検試験に基づいている。判定基準は、ワクチンにおける株ごとに適用される。

処置は、単回用量スケジュールまたは複数回用量（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｄｏｓｅ）スケジュールによることができる。複数回用量は、一次免疫スケジュールおよび／または追加免疫スケジュールに用いることができる。複数回用量スケジュールにおいて、様々な用量を、同じ経路または異なる経路によって、例えば、非経口での初回抗原刺激（ｐｒｉｍｅ）および粘膜での追加免疫（ｂｏｏｓｔ）、粘膜での初回抗原刺激および非経口での追加免疫などによって与えてもよい。１用量より多い用量（典型的には２つの用量）の投与は、免疫学的にナイーブの患者において、例えば、以前にインフルエンザワクチンを受けたことがない人について、または新しいＨＡ亜型に対してワクチン接種することにおいて、特に有用である。複数回用量は、典型的には、少なくとも１週間（例えば、約２週間、約３週間、約４週間、約６週間、約８週間、約１２週間、約１６週間など）離して投与される。

本発明によって作製されるワクチンは、他のワクチンと実質的に同時に（例えば、同じ医師への相談、または医療専門家もしくは予防接種センターへの訪問中に）、例えば、麻疹ワクチン、ムンプスワクチン、風疹ワクチン、ＭＭＲワクチン、水痘ワクチン、ＭＭＲＶワクチン、ジフテリアワクチン、破傷風ワクチン、百日咳ワクチン、ＤＴＰワクチン、結合型Ｈ．インフルエンザ菌（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）ｂ型ワクチン、不活性化ポリオウイルスワクチン、Ｂ型肝炎ウイルスワクチン、髄膜炎菌結合型ワクチン（４価Ａ−Ｃ−Ｗ１３５−Ｙワクチンなど）、呼吸器系合胞体ウイルスワクチン、肺炎球菌結合型ワクチンなどと実質的に同時に、患者に投与されてもよい。肺炎球菌ワクチンおよび／または髄膜炎菌ワクチンと実質的に同時の投与は特に、高齢患者において特に有用である。

同様に、本発明のワクチンは、抗ウイルス化合物、特にインフルエンザウイルスに対して活性のある抗ウイルス化合物（例えば、オセルタミビルおよび／またはザナミビル）と実質的に同時に（例えば、同じ医師への相談、または医療専門家への訪問中に）患者へ投与してもよい。これらの抗ウイルス剤には、そのエステル（例えば、そのエチルエステル）およびその塩（例えば、そのリン酸塩）を含む、（３Ｒ，４Ｒ，５Ｓ）−４−アセチルアミノ−５−アミノ−３（１−エチルプロポキシ）−１−シクロヘキセン−１−カルボン酸、または５−（アセチルアミノ）−４−［（アミノイミノメチル）−アミノ］−２，６−アンヒドロ−３，４，５−トリデオキシ−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクトノン−２−エノン酸などのノイラミニダーゼ阻害剤が挙げられる。好ましい抗ウイルス剤は、オセルタミビルリン酸塩（ＴＡＭＩＦＬＵ（商標））としても知られた、（３Ｒ，４Ｒ，５Ｓ）−４−アセチルアミノ−５−アミノ−３（１−エチルプロポキシ）−１−シクロヘキセン−１−カルボン酸のエチルエステル、リン酸塩（１：１）である。投与することができるもう一つの抗ウイルス剤は、チモシンα１（例えば、チマルファシン、２８アミノ酸の合成ペプチド、ＺＡＤＡＸＩＮ（商標）として入手可能）である［１０８］。１つの特定の実施形態において、患者は、オセルタミビルリン酸塩などのノイラミニダーゼ阻害剤を、不活化ビリオン全体のワクチン（例えば、一価、Ｈ１^＊）を受けるのと実質的に同時に受ける。

ワクチン製品およびキット
上記で述べられているように、本発明は、（ｉ）配列番号３に対してより、配列番号１に対してより密接に関係しているＨ１亜型インフルエンザＡウイルス血球凝集素、および（ｉｉ）水中油型乳剤アジュバントを含むワクチンを提供する。有用な実施形態において、この組成物は、一価の不活性化表面抗原ワクチンである。不活性化ウイルスは、卵で増殖していてもよいし、または細胞培養物中（例えば、ＭＤＣＫ細胞中［３６、１１８］）で増殖していてもよい。ワクチンは、０．５ｍｌの単位用量を含むシリンジ（例えば、ホウケイ酸ガラス）中で提供されてもよく、各単位用量は約７．５μｇのＨ１血球凝集素（例えば、再集合体株Ｘ−１７９ＡまたはＸ−１８１由来などのＡ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／７／２００９様株）を含む。シリンジは、ブロモブチルゴムのプランジャー−ストッパーを有してもよい。アジュバントは、スクワレン、ポリソルベート８０、およびトリオレイン酸ソルビタン、例えば、７．５μｇのＨＡあたり約９．７５ｍｇのスクワレン、約１．１８ｍｇのポリソルベート８０、および約１．１８ｍｇのトリオレイン酸ソルビタンを含む。組成物は、クエン酸緩衝液を含んでもよい。組成物は理想的には水銀を含まないが、低用量のチメロサールを含む場合がある。いくつかの実施形態において、アジュバント添加ワクチンは、特に０．２５ｍｌの投与容量が用いられる場合、３．７５μｇのＨＡを有する。アジュバント添加ワクチンは、筋肉内に、例えば、三角筋または大腿前外側に投与してもよい。被験体は、アジュバント添加ワクチンの単回用量を受けてもよいし、２つの用量（例えば、２週間〜６ヶ月間離れた、例えば３週間離れた）を受けてもよい。シリンジは、カートンに、例えば、それぞれがブリスターパックに入った、カートンあたり１０個で、パッケージングすることができる。

本発明はまた、（ｉ）配列番号３に対してより、配列番号１に対してより密接に関係しているＨ１亜型インフルエンザＡウイルス血球凝集素、および（ｉｉ）水中油型乳剤アジュバントを含むワクチンを提供する。有用な実施形態において、この組成物は、一価の不活性化表面抗原ワクチンである。不活性化ウイルスは卵で増殖していてもよい。ワクチンは、複数回の０．５ｍｌ単位用量を含むバイアル、例えば、各単位用量が、約７．５μｇまたは１５μｇまたは３０μｇのＨ１血球凝集素（例えば、再集合体株Ｘ−１７９Ａ由来などのＡ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／７／２００９様株）を含む、チメロサール含有の１０回投与バイアルで提供されてもよい。アジュバントは、スクワレン、ポリソルベート８０、およびトリオレイン酸ソルビタン、例えば、７．５μｇのＨＡあたり約９．７５ｍｇのスクワレン、約１．１８ｍｇのポリソルベート８０、および約１．１８ｍｇのトリオレイン酸ソルビタンを含む。組成物は、クエン酸緩衝液を含んでもよい。アジュバント添加ワクチンは、筋肉内に、例えば、三角筋または大腿前外側に投与してもよい。被験体は、アジュバント添加ワクチンの単回用量を受けてもよいし、２つの用量（例えば、２週間〜６ヶ月間離れた、例えば３週間離れた）を受けてもよい。

本発明はまた、（ｉ）配列番号３に対してより、配列番号１に対してより密接に関係しているアジュバント無添加のＨ１亜型インフルエンザＡウイルス血球凝集素を含む第１のキット成分、および（ｉｉ）水中油型乳剤アジュバントを含む第２のキット成分を含むキットを提供する。２つのキット成分は、使用時点で混合して、本発明の一価ワクチンを生じさせることができる。有用な実施形態において、第１のキット成分は、一価のスプリットビリオン不活性化ワクチンである。不活性化ウイルスは卵で増殖していてもよい。キットは、各バイアルが、１：１容量比で混合するための、例えば、２．５ｍｌの抗原を２．５ｍｌのアジュバントと混合するための等容量の液体を含む、２つのバイアル構成（例えば、ホウケイ酸ガラス、必要に応じてブチルゴムのストッパーを有する）として提供されてもよい。０．５ｍｌの単位用量の一価アジュバント添加ワクチンは、約７．５μｇ、３．７５μｇ、または１．９μｇのＨ１血球凝集素（例えば、再集合体株Ｘ−１７９Ａ由来などのＡ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／７／２００９様株）を含むことができる。アジュバントは、スクワレン、ＤＬ−α−トコフェロール、およびポリソルベート８０、例えば、０．５ｍｌの単位用量中、約１０．７ｍｇのスクワレン、約１１．９ｍｇのトコフェロール、および約４．９ｍｇのポリソルベート８０（またはそれらの分割量、例えば、スクワレン、トコフェロール、およびポリソルベート８０のこれらの量の３／４、２／３、１／２、１／３、１／４、１／５、１／６、１／７、１／８、１／９、または１／１０）を含む。したがって、アジュバント成分は、２．２０：２．４４：１の質量比（スクワレン：トコフェロール：ポリソルベート８０）で存在してもよい。アジュバント成分は、１μｇのＨ１血球凝集素あたり２．８５μｇのスクワレン、３．１６μｇのトコフェロール、および１．３０μｇのポリソルベート８０で存在してもよい。ワクチンは、チオメルサール保存剤を、例えば、約１０μｇ／ｍｌで、すなわち、０．５ｍｌ用量中、約５μｇを含んでもよい。被験体は、アジュバント添加ワクチンの単回用量を受けてもよいし、２つの用量（例えば、１週間、２週間、もしくは３週間、または３週間より長く、例えば、３〜２６週間、離れた）を受けてもよい。１８歳〜６０歳の成人は、有用には、単回用量を受け得るが、６０歳より上の高齢者は、２つの用量を受けてもよい。３〜９歳の子どもは、半分用量、例えば、１．８７５μｇのＨＡを含む０．２５ｍｌの容量を受けてもよい。抗原成分およびアジュバント成分は、どちらもリン酸緩衝液を含んでもよい。抗原成分はポリソルベート８０、オクトキシノール１０、塩化カリウム、および／または塩化マグネシウムを含んでもよい。本発明のキットは、５０個のバイアルの抗原（それぞれにおいて２．５ｍｌの懸濁液）および５０個のバイアルのアジュバント（それぞれにおいて２．５ｍｌの乳剤）を含んでもよい。抗原バイアルは、単一のパックに入っていてもよい；アジュバントバイアルは２つのパックに入っていてもよい。アジュバント添加ワクチンは、筋肉内に、例えば、三角筋または大腿前外側に投与してもよい。

本発明はまた、（ｉ）配列番号３に対してより、配列番号１に対してより密接に関係しているＨ１亜型インフルエンザＡウイルス血球凝集素、および（ｉｉ）水中油型乳剤アジュバントを含むワクチンを提供する。有用な実施形態において、この組成物は、一価の不活性化表面抗原ワクチンである。不活性化ウイルスはＭＤＣＫ細胞中で増殖した［３６、１１８］。ワクチンは、３．７５μｇのＨ１血球凝集素（例えば、再集合体株Ｘ−１７９Ａ由来などのＡ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／７／２００９様株）を含む単位用量で提供される。アジュバントは、スクワレン、ポリソルベート８０、およびトリオレイン酸ソルビタン、例えば、約４．８７５ｍｇのスクワレン、約０．５９ｍｇのポリソルベート８０、および約０．５９ｍｇのトリオレイン酸ソルビタンを含む。組成物は、クエン酸緩衝液を含んでもよい。アジュバント添加ワクチンは、筋肉内に、例えば、三角筋または大腿前外側に投与してもよい。被験体は、アジュバント添加ワクチンの単回用量を受けてもよいし、２つの用量（例えば、２週間〜６ヶ月間、離れた、例えば３週間離れた）を受けてもよい。単位用量は、０．２５ｍｌの容量を有する場合があり、患者は、単一の免疫において１単位用量（例えば、３〜１７歳または１８〜４０歳の患者に対して）、または２単位用量（４０歳より上の患者に対して）を受けることができる。ワクチンは１０×０．２５ｍｌ用量のパックとして分割されてもよい。

本発明はまた、（ｉ）配列番号３に対してより、配列番号１に対してより密接に関係しているアジュバント無添加のＨ１亜型インフルエンザＡウイルス血球凝集素を含む第１のキット成分、および（ｉｉ）水中油型乳剤アジュバントを含む第２のキット成分を含むキットを提供する。２つのキット成分は、使用時点で混合して、本発明の一価ワクチンを生じさせることができる。有用な実施形態において、第１のキット成分は、一価の不活性化スプリットビリオンである。不活性化ウイルスは卵で増殖していてもよい。キットは、例えば、混合して単位容量の４倍の最終ワクチンを生じさせるために、第１のバイアルが単位容量の抗原を含み、第２のバイアルがその単位容量の３倍の乳剤を含む、２つのバイアル構成（例えば、ホウケイ酸ガラス、必要に応じてクロロブチルのストッパーを有する）として提供されてもよい。したがって、１．５ｍｌの抗原は、４．５ｍｌの乳剤と組み合わせて６ｍｌのワクチンを生じさせることができる。０．５ｍｌ単位用量の一価アジュバント添加ワクチンは、約３．８μｇのＨ１血球凝集素（例えば、再集合体株Ｘ−１７９Ａ由来などのＡ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／７／２００９様株）を含むことができる。アジュバントは、スクワレン、オレイン酸ソルビタン、ポリオキシエチレンセトステアリルエーテル、およびマンニトール、例えば、０．５ｍｌの単位用量中、約１２．４ｍｇのスクワレン、約１．９ｍｇのオレイン酸ソルビタン、約２．４ｍｇのポリオキシエチレンセトステアリルエーテル、および約２．３ｍｇのマンニトール（またはそれらの分割量、例えば、スクワレン、オレイン酸ソルビタン、ポリオキシエチレンセトステアリルエーテル、およびマンニトールのこれらの量の３／４、２／３、１／２、１／３、１／４、１／５、１／６、１／７、１／８、１／９、または１／１０）を含む。したがって、アジュバント成分は、１２４：１９：２４：２３の質量比（スクワレン：オレイン酸ソルビタン：ポリオキシエチレンセトステアリルエーテル：マンニトール）で存在してもよい。ワクチンは、チオメルサール保存剤を、例えば、０．５ｍｌあたり約１１．３μｇ、または１μｇの血球凝集素あたり約３μｇのチオメルサールで含んでもよい。抗原成分およびアジュバント成分は、どちらもリン酸緩衝液を含んでもよい。被験体は、アジュバント添加ワクチンの単回用量を受けてもよく、または、より典型的には、２つの用量（例えば、３週間より長く、例えば、３〜２６週間、離れた）を受けてもよい。３歳〜６０歳の被験体は、有用には、単回用量を受け得るが、６０歳より上の高齢者は、２つの用量を受けてもよい。生後６ヶ月〜３歳未満の子どもは、半分用量、例えば、１．９μｇのＨＡを含む０．２５ｍｌの容量を受けてもよい。アジュバント添加ワクチンは、筋肉内に、例えば、三角筋または大腿前外側に投与してもよい。

本発明はまた、前の段落で定義されているような第１のキット成分を、前の段落で定義されているような第２のキット成分と混合する工程を含む、インフルエンザワクチンを調製するための方法を提供する。

このセクションで述べられたワクチンは、有用には、配列番号７を含む血球凝集素を含むことができる。

混合源ワクチン
上記で述べられた本発明のいくつかの実施形態は、多価である、すなわち、それらは１つより多いインフルエンザウイルス株由来のＨＡ抗原を含む。多価ワクチンを調製するために用いられるウイルスを、全て、同じ培養基を用いて増殖させてもよいし（例えば、全てを卵中で増殖させる、または全てをＭＤＣＫ培養物中で増殖させるなど）、またはそれらを異なる培養基中で増殖させてもよい（例えば、１つの株を卵中で増殖させ、別の株を細胞培養物中で増殖させる；または１つの株をＭＤＣＫ培養物中で増殖させ、別の株をベロ培養物中で増殖させる）。

例えば、増殖培養基は、特定の株の増殖嗜好性に従って選択することができ、例えば、Ｈ１Ｎ１株は卵中よりも細胞培養物中でより良く増殖するが、インフルエンザＢウイルスがその反対の嗜好を示す場合には、それらを別々の培養基上で増殖させ、その後、混合してもよい。

一実施形態において、Ｈ１^＊株（例えば、Ｈ１Ｎ１）を、細胞培養物中（例えば、懸濁培養物などのＭＤＣＫ培養物中［３６、１１８］）で増殖させ、別の株（例えば、Ｈ３Ｎ２株、インフルエンザＢ株など）を卵中で増殖させる。株から調製された抗原は、その後、混合されて、多価インフルエンザワクチンを提供する。このプロセスは、２つのＨ１株（１つがＨ１^＊血球凝集素、１つがＨ１^＊血球凝集素でない）、Ｈ３Ｎ２株、および１つのインフルエンザＢ株を有する４価ワクチンを調製するのに特に適している。

したがって、本発明は、少なくとも２つの異なるインフルエンザウイルス株から得られる血球凝集素を含むワクチンであって、第１の血球凝集素が卵中で増殖したインフルエンザウイルスから調製され、第２の血球凝集素が細胞培養物中で増殖したインフルエンザウイルスから調製される、ワクチンを提供する。このように、２つの異なるインフルエンザウイルス株について、１つを細胞培養物中で、１つを卵中で増殖させる。ウイルスを、両方の源から精製し、その後、混合してワクチンを生じさせる。

第１および第２の血球凝集素は、どちらもインフルエンザＡウイルス由来、どちらもインフルエンザＢウイルス由来であってもよいし、または一方がインフルエンザＡウイルス由来で、他方がインフルエンザＢウイルス由来であってもよい。好ましくは、第１および第２の血球凝集素の少なくとも１つがインフルエンザＡウイルス由来である。第１の血球凝集素および第２の血球凝集素の両方がインフルエンザＡウイルス由来である場合、これは、典型的には、例えば、Ｈ１Ｎ１株由来およびＨ３Ｎ２株由来の、Ｈ１血球凝集素およびＨ３血球凝集素である。

第１および第２の血球凝集素がインフルエンザＡウイルス血球凝集素を含む場合、これらの１つはＨ１^＊血球凝集素であり得る。Ｈ１^＊血球凝集素であるのが２つのインフルエンザＡ血球凝集素の両方ではないことが好ましく、Ｈ１血球凝集素であるのが２つのインフルエンザＡ血球凝集素の両方ではないことがより好ましい。ワクチンがＨ１^＊血球凝集素を含む場合、これは、好ましくは、第２血球凝集素であり、すなわち、Ｈ１^＊株を細胞培養物中で増殖させ、その後、Ｈ１^＊ワクチン抗原を、卵から調製された非Ｈ１^＊ワクチン抗原と組み合わせる。他の実施形態において、Ｈ１^＊血球凝集素は第１血球凝集素であり、すなわち、Ｈ１^＊株を卵中で増殖させ、その後、Ｈ１^＊ワクチン抗原を、細胞培養物から調製された非Ｈ１^＊ワクチン抗原と組み合わせる。

適切な細胞培養宿主は上で記載されており、それにはＭＤＣＫ細胞、例えば、ＭＤＣＫ ３３０１６が挙げられ、それは、懸濁液中で増殖することができ、Ｈ１^＊血球凝集素を有するウイルスを調製するのに有用である。

この混合源（ｍｉｘｅｄ−ｓｏｕｒｃｅ）の手法は、Ｈ１^＊株、非Ｈ１^＊のＨ１株、Ｈ３株、およびインフルエンザＢ株を含むワクチンを作製するのに特に有用である。Ｈ１^＊株は、細胞培養物中で増殖することができ、その他の３つの株（すなわち、最近の季節性ワクチンについての通常の三価混合物）は、通常の様式で卵中で増殖することができる。

全般
用語「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、「含むこと（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、および「からなること（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」を包含し、例えば、Ｘを「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」組成物は、独占的にＸからなる場合もあるし、追加の何かを含む、例えば、Ｘ＋Ｙを含む場合もある。

単語「実質的に」は、「完全に」を排除せず、例えば、Ｙを「実質的に含まない」組成物は、完全にＹを含まない場合もある。必要な場合、単語「実質的に」を、本発明の定義から削除してもよい。

数値ｘに関しての用語「約」は任意選択であり、例えば、ｘ±１０％を意味する。

「ＧＩ」番号付けが上記で用いられている。ＧＩ番号、または「ＧｅｎＩｎｆｏ識別名」は、配列がＮＣＢＩのデータベースに加えられたとき、ＮＣＢＩによって処理される各配列記録へ連続的に割り当てられる一連の数字である。ＧＩ番号は、配列記録のアクセッション番号との類似性はない。配列が（例えば、訂正のために、またはより多くの注釈もしくは情報を加えるために）アップデートされたとき、それは新しいＧＩ番号を受け取る。したがって、与えられたＧＩ番号に関連づけられる配列は決して変化しない。

具体的に言及されない限り、２つ以上の成分を混合する工程を含むプロセスは、いかなる特定の混合順序を必要としない。したがって、成分は任意の順序で混合することができる。３つの成分がある場合、２つの成分をお互いに組み合わせて、その後、その組み合わせ物を３つ目の成分と組み合わせてもよいなど。

動物（および特にウシ）材料が細胞の培養に用いられる場合、それらは、伝達性海綿状脳症（ＴＳＥ）を含まず、特に、ウシ海綿状脳症（ＢＳＥ）を含まない供給源から得られるべきである。全体的に見れば、動物由来材料の完全な非存在下で細胞を培養することが好ましい。

化合物が組成物の一部として身体に投与される場合、その化合物を、代替として、適切なプロドラッグに置き換えてもよい。

細胞培養基が再集合（ｒｅａｓｓｏｒｔｍｅｎｔ）手順または逆遺伝学手順のために用いられる場合、それは、好ましくは、例えば、Ｐｈ Ｅｕｒ総則５．２．３章にあるような、ヒトワクチン製造での使用が認可されているものである。

ポリペプチド配列間の同一性は、好ましくは、ＭＰＳＲＣＨプログラム（ＯｘｆｏｒｄＭｏｌｅｃｕｌａｒ）において実行されているようなＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎホモロジー検索アルゴリズムによって、ギャップ開始ペナルティ＝１２およびギャップ伸長ペナルティ＝１のパラメータでのアフィンギャップ検索を用いて、決定される。

図１は、アジュバントを添加していない（０．５μｇまたは１μｇのＨＡ用量）かまたはＭＦ５９のアジュバントを添加した（０．５μｇ）かのいずれかのＨ１Ｎ１ｓｗ抗原での免疫後に得られたＨＩ力価を示す。ＰＢＳ対照も用いられた。黒色バーは１回の免疫後の力価を示す；灰色バーは２回の免疫後の力価を示す。 図２は、様々な初回抗原刺激／追加免疫投与計画で免疫したフェレットにおける肺のウイルス負荷を示す。動物群Ａ〜Ｈは下部に記載されている。ｙ軸はＬｏｇ_１０ＴＣＩＤ_５０／群を示す。 図３は、同じフェレットにおける鼻のウイルス負荷を示し、ｙ軸はｌｏｇ_１０ＣＤＵを示す。 図４は、同じフェレットにおけるＨＩ力価を示す。 図５は、季節性Ｈ１Ｎ１（Ｂｒｉｓｂａｎｅ）での初回抗原刺激を受けたマウスにおける２回のＨ１Ｎ１ｓｗ追加免疫投与後のＩｇＧ血清抗体価（ＥＬＩＳＡ）を示す。初回抗原刺激した株および追加免疫した株ならびに添加したアジュバントが示されている。

フェレット研究
参考文献１０９は、インフルエンザワクチンを調べるためのフェレットモデルを報告している。フェレットをアジュバント添加（スクワレン含有水中油型乳剤、ＭＦ５９（商標））もしくはアジュバント無添加の季節性ワクチンで、またはＰＢＳで初回抗原刺激した。３週間後（２１日目）、これらのフェレットは、追加免疫量のアジュバント添加もしくはアジュバント無添加の三価季節性ワクチンもしくは一価パンデミックワクチン（「Ｈ１Ｎ１ｓｗ」）またはＰＢＳを受けた。合計８つの動物群Ａ〜Ｈが用いられた。

その後、４９日目に、フェレットをＨ１Ｎ１ｓｗ株（１０^６ＴＣＩＤ_５０）でチャレンジし、肺の病変を各群において評価した。鼻および気管のみに感染する季節性Ｈ１Ｎ１と違って、Ｈ１Ｎ１ｓｗウイルスは肺にも感染する。Ｈ１Ｎ１ｓｗウイルスはフェレットにとって致死性ではない。

冒された肺実質の平均％は以下であった：

このように、ＰＢＳ群と比較して、アジュバント添加またはアジュバント無添加の季節性ワクチンで予め初回抗原刺激を受けさせ、その後、同種の季節性ワクチンかまたはＨ１Ｎ１ｓｗかのいずれかで追加免疫した全てのフェレットは、肺病変の重要な低下を有した。最良の効果は、追加免疫投与がＨ１Ｎ１ｓｗであり、かつ初回抗原刺激ワクチンおよび追加免疫ワクチンの両方ともアジュバント添加されていた場合に観察された（Ｃ群）。アジュバント添加Ｈ１Ｎ１ｓｗの単回用量により、初回抗原刺激の非存在下でさえも同様の防御を与えられた。

肺のウイルス負荷もまた評価し、結果は図２に示されている。ＰＢＳと比較して、アジュバント添加Ｈ１Ｎ１ｓｗワクチンの１用量は、肺のウイルス負荷を２ｌｏｇ〜３ｌｏｇ、低下させた（Ｇ群とＨ群を比較する）。Ｈ１Ｎ１ｓｗワクチン接種がアジュバント無添加季節性インフルエンザワクチンの投与に先行された場合には、肺におけるウイルス負荷はほとんど検出不可能なレベルまで低下し（Ｆ群）、先行の季節性ワクチンがアジュバント添加された場合には、ウイルス負荷は検出不可能なレベルであった（Ｃ群）。

ウイルス負荷をまた鼻スワブから評価した（図３）。ＰＢＳと比較して、アジュバント添加Ｈ１Ｎ１ｓｗワクチンの１用量は、鼻スワブにおけるウイルス負荷を１ｌｏｇ、低下させたが、アジュバント無添加ワクチンについては低下させなかった。Ｈ１Ｎ１ｓｗワクチン接種がアジュバント無添加の季節性ワクチンでのワクチン接種に先行された場合には、鼻のウイルス負荷はさらに低下した（Ｆ群）。Ｈ１Ｎ１ｓｗワクチン接種がアジュバント添加の季節性ワクチンでのワクチン接種に先行された場合には、鼻のウイルス負荷は検出不可能であった（Ｃ群）。同様の結果は喉スワブにおいて見出された。

ＨＩ抗体応答もまた４９日目に測定した（図４）。アジュバント添加Ｈ１Ｎ１ｓｗワクチンの１用量は、アジュバント無添加Ｈ１Ｎ１ｓｗワクチンより免疫原性が高かった。Ｈ１Ｎ１ｓｗウイルスに対するＨＩ力価は、アジュバント添加の季節性ワクチンで予め免疫したフェレットにおいて少なくとも１ｌｏｇ、増加した。

季節性Ｈ１Ｎ１およびＨ３Ｎ２季節性株に対するＨＩ抗体応答も評価した。季節性Ｈ１Ｎ１とＨ１Ｎ１ｓｗとの間で交差反応する抗体は、ＨＩによって検出されなかった。

したがって、アジュバント添加Ｈ１Ｎ１ｓｗワクチンの１用量は、肺、鼻、および喉におけるウイルス負荷によって測定した場合、アジュバント無添加ワクチンより免疫原性が高く、かつより有効であった。免疫原性および有効性の両方が、季節性インフルエンザワクチンでの予めの免疫によって増強され、この効果は、季節性ワクチンがアジュバントを添加された場合にはより高かった。この免疫原性および有効性の増強は、季節性Ｈ１Ｎ１とＨ１Ｎ１ｓｗとの間で交差反応する（ＨＩによる）抗体のせいではないようである。

これらの結果より、なぜ高齢の人々が、抗体の交差反応性がほとんどないにも関わらず、Ｈ１Ｎ１ｓｗウイルスに対してより良く防御され得るのかが説明することができる。その結果によりまた、抗体に交差反応性がほとんどまたは全くないにも関わらず、健康な成人における１回の単回用量後の良い応答を示す臨床試験の予備的結果を、この効果が季節性ウイルスでの以前の免疫学的経験（自然感染またはワクチン接種による）のせいであり得るからということで説明することができる。その結果はまた、アジュバントの存在下で、および患者がアジュバント添加の季節性ワクチンで以前に免疫されている場合には、より良いＨ１Ｎ１ｓｗ防御が達成されることも含意する。免疫学的にナイーブの個体（例えば、子ども）および免疫学的に虚弱な個体は、単回用量でも臨床的に有用であり得るとしても、最適かつ持続性の防御のためにアジュバント添加Ｈ１Ｎ１ｓｗワクチンの１用量より多い用量を必要とし得る。

このフェレット研究のさらなる詳細は参考文献１１０にある。

マウス研究Ｉ
Ｈ１Ｎ１ｓｗワクチンで水中油型乳剤アジュバントを用いることの利点は、マウスにおいて実施した免疫原性研究から明らかである。初回抗原刺激を受けていないマウスにおいて、インフルエンザ抗原へのいかなる先行曝露もなしで、乳剤アジュバント添加Ｈ１Ｎ１ｓｗワクチンの単回用量は、ヒトにおける防御と関連づけられるＨＩ力価を与える。しかしながら、アジュバントなしでは、この力価に達するには２つの用量が必要とされた。したがって、ヒト防御は、子どもにおいてさえも、アジュバント添加された単回用量で達成し得る。対照的に、１９７６年ブタインフルエンザワクチンは、子どもおよび若年成人に対して２つの用量を必要とした。さらに、アジュバントは、初回抗原刺激を受けていない被験体においてさえも、単回用量での免疫を促進することができるため、すでにインフルエンザに曝されたことがある被験体（例えば、一般的な成人集団）もまた、頑強な応答に達するために単回用量のアジュバント添加されたワクチンだけを必要とするはずである。

ワクチンを、卵中で増殖したＨ１Ｎ１ｓｗ Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９ Ｈ１Ｎ１様ウイルスから調製した。ワクチンに、アジュバントを添加しないか、またはスクワレンを含む水中油型乳剤（ＭＦ５９（商標））でアジュバントを添加するかのいずれかを行なった。ワクチンを、０．５μｇか１μｇかのいずれかのＨＡ用量を用いるＳＲＩＤによって標準化した。６〜７週齢のＢａｌｂ／ｃマウスを０日目に、リン酸緩衝食塩水、０．５μｇもしくは１．０μｇ（ＨＡ含有量）の抗原単独、または５０μｌのアジュバントと共の０．５μｇの抗原で筋肉内に免疫した。投与容量は１００μｌであった。１３日目に血清を採取した。マウスを、１４日目に、１回目に匹敵する２回目の用量で追加免疫した。２１日目に再び、血清を収集した。抗原としての不活化ウイルス全体およびシチメンチョウの赤血球を用いる血球凝集阻害（ＨＩ）によって血清を評価した。

０．５μｇのアジュバント添加抗原での単回免疫は、免疫から２週間後に採取された血清において１：６３の平均機能性抗体（ＨＩ）力価を誘発した（図１）。１：４０以上のＨＩ力価が、季節性インフルエンザからのヒトの防御と関連づけられている［１１１］。２週間後のアジュバント添加ワクチンでの２回目の免疫は、追加免疫から１週間後に採取された血清における平均ＨＩ力価を１：１２８０まで増加させた。アジュバントなしでの抗原による単回免疫は、有意なＨＩ力価を誘発しなかったが、２週間後の２回目の免疫は、１：１６０のＨＩ力価を誘発した。０．５μｇまたは１．０μｇのアジュバント無添加の抗原での免疫により誘発された力価において有意差はなかった。

これらのデータは、他の潜在的なパンデミックインフルエンザ株に対するワクチンでのヒト免疫の結果と一致している。アジュバントなしで、Ｈ５トリインフルエンザ株に対するワクチンは、低い抗体価を誘発する；ＭＦ５９は、誘発された抗体の迅速性（ｒａｐｉｄｉｔｙ）、力価、および幅を大いに増加させる［１１２、１１３］。１９７６年のブタ起源インフルエンザのはるかに小さいヒトでの発生の間には、アジュバント添加ワクチンは入手できなかった。１９７６年ワクチンの単回用量は、若者において低い抗体価を誘発したが、高齢の個体においては有意により高い力価を誘発し、それは、おそらく、高齢の被験体が初回抗原刺激を受けるインフルエンザ感染または免疫をより多く経験していたからである［１１４］。

マウス免疫データにより、特に、インフルエンザ感染または免疫への過去の曝露をほとんどまたは全くもたない子どもおよび若年成人に対する、Ｈ１Ｎ１ｓｗパンデミックインフルエンザワクチンによる免疫キャンペーンにおいてＭＦ５９などのアジュバントを含めることが支持される。これらの個体は、特に、現在のパンデミックにおいて罹患および死亡に陥りやすい［１１５］。ＭＦ５９アジュバント添加のパンデミック抗原に関して、免疫学的にナイーブのマウスへ与えられる単回用量は、ヒトにおける季節性インフルエンザからの防御と関連づけられている抗体応答を生じさせる；アジュバントなしでは、２つの用量が必要とされる。この研究において、０．５μｇと１μｇのアジュバント無添加の抗原の間で、用量反応性は観察されなかった。マウスにおけるこの所見は、有効な投与回数を増加させることができる用量節約型投与計画がヒト臨床試験において有効であることを証明し得る可能性を増加させるものである。

マウス研究ＩＩ
季節性Ｈ１Ｎ１（Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７；０．２μｇのＨＡ用量）一価ワクチン（ＭＦ５９アジュバントを含む、または含まない）で初回抗原刺激を受けさせたマウスを、同じワクチンで、またはパンデミックＨ１Ｎ１ｓｗ株（Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０４／２００９血球凝集素）から調製された等価の一価ワクチン（この場合もやはり、ＭＦ５９アジュバントを含む、または含まない）で、２回（３６日目および６６日目）、追加免疫した。

免疫応答のＥＬＩＳＡ分析（図５）は、先行の季節性アジュバント添加ワクチン接種が、Ｈ１Ｎ１ｓｗワクチンへのより高い力価応答としてマウスを効果的に初回抗原刺激を受けさせ、この初回抗原刺激は、Ｈ１Ｎ１ｓｗワクチンがアジュバントを添加されていない場合には特に重要であった。初回抗原刺激を受けさせていないマウスまたはアジュバント無添加の季節性Ｈ１Ｎ１で初回抗原刺激を受けさせたマウスにおいて、Ｈ１Ｎ１ｓｗワクチンがアジュバントを添加された場合のみ、高い力価応答が見られた。

したがって、Ｈ１Ｎ１ｓｗワクチンのアジュバント添加は、頑強な免疫応答にとって重要であるようである。さらに、アジュバント添加は、季節性ワクチンが抗原刺激してパンデミックワクチンへの頑強な抗体応答を可能にすることにとって重要であるようである。

要約すれば、アジュバント無添加のパンデミックワクチンの２つの用量での免疫は、初回抗原刺激を受けていないマウスにおいて、またはアジュバント無添加の季節性ワクチンで初回抗原刺激を受けたマウスにおいて、機能性抗体をほとんど誘発しなかった。しかしながら、アジュバント添加の季節性ワクチンで初回抗原刺激を受けたマウスにおいて、アジュバント無添加のパンデミックワクチンの２つの用量は、良好な応答を与えた。マウスは、自身が初回抗原刺激を受けていたかどうかに関わらず、アジュバント添加のパンデミックワクチンの２つの用量に頑強に応答した。アジュバント添加の季節性ワクチンはパンデミック株に対する抗体を効率的に誘発しない可能性があるが、その代わりに、それらは、パンデミックワクチンへのより高い力価応答をプライムし得る。これらのデータは、パンデミックインフルエンザワクチンによる免疫のために、およびパンデミックインフルエンザワクチンによる免疫に対して集団を用意するための季節性キャンペーンにおいても、水中油型アジュバントの使用を支持するものである。

マウス研究ＩＩＩ
４０匹の６週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウスの３つの群は、２００５／０６季節かまたは２００９／１０季節（どちらも北半球）のいずれか由来の三価季節性ワクチンの単回筋肉内注射を受けた。インフルエンザについてナイーブの対照マウスはＰＢＳを受けた。０日目にヒト用量の１／１０（１株あたり１．５μｇＨＡ）でワクチンを投与した。４０日目、マウスをそれぞれ１０匹の動物の４つの部分群に分け、一価の不活性化Ｈ１Ｎ１ｓｗワクチンを再接種した。４つの群は、オレイン酸ソルビタン、ポリオキシエチレンセトステアリルエーテル、およびマンニトールと組み合わせたスクワレンを含むサブミクロンの水中油型乳剤アジュバント有りまたは無しで、高用量または低用量（３μｇのＨＡまたは０．３μｇのＨＡ）を受けた。その後、全ての動物は、６１日目に２回目のＨ１Ｎ１ｓｗ投与を受けた。季節性Ｈ１Ｎ１株およびパンデミックＨ１Ｎ１株に対するＨＩ抗体の存在を、４０日目、６１日目、７５日目、および１０２日目に評価した。このマウス研究の完全な詳細は参考文献１１６に示されている。

結果から、Ｈ１Ｎ１ｓｗワクチンの単回注射が、アジュバントの有無に関わらず、防御レベルまでＨＩ抗体応答を誘導するのに十分であることを確認した。Ｈ１Ｎ１ｓｗ株に対するＨＩ抗体価（ＧＭＴ）は、０．３μｇ ＨＡのアジュバント無添加ワクチンで免疫されたナイーブマウスの群を除く全ての群において＞４０であった。

以前の季節性インフルエンザワクチン接種により誘発された抗体は、Ｈ１Ｎ１ｓｗ株と交差反応しなかったが、季節性インフルエンザワクチンでの初回抗原刺激は、結果として、アジュバント無添加Ｈ１Ｎ１ｓｗワクチンへのより高い抗体応答を生じた。対照的に、以前の季節性インフルエンザワクチンによる免疫は、マウスにおいてアジュバント添加Ｈ１Ｎ１ｓｗワクチンの免疫原性に影響を及ぼしていないようであり、それは、おそらく、これらの群におけるアジュバント添加ワクチンによって誘導された強い一次応答によるものである。

結論として、マウス研究ＩＩＩは、水中スクワレン乳剤と共に製剤化されたスプリットビリオン不活性化Ｈ１Ｎ１ｓｗワクチンのヒトにおける使用を支持する。

Ｆｏｃｅｔｒｉａ（商標）製品およびＣｅｌｔｕｒａ（商標）製品
ＳＰＦ卵（Ｆｏｃｅｔｒｉａ（商標）について）またはＭＤＣＫ細胞の懸濁培養物（Ｃｅｌｔｕｒａ（商標）について）のいずれも、配列番号３に対してより、配列番号１に対してより密接に関係している血球凝集素を有する再集合体Ｈ１Ｎ１インフルエンザＡウイルス株を感染させている。ウイルスを、公知の技術を用いて増殖させ、その後、収集し、不活性化しており、一価の表面抗原ワクチンは精製されたウイルスから調製している。精製した抗原を希釈し、その後、サブミクロンのスクワレン液滴を含む水中油型乳剤（ＭＦ５９（商標））と組み合わせて、Ｆｏｃｅｔｒｉａ（商標）製品（０．５ｍｌの単位用量あたり７．５μｇの血球凝集素を有する）およびＣｅｌｔｕｒａ（商標）製品（０．２５ｍｌの単位用量あたり３．７５μｇの血球凝集素を有する）のためのバルクワクチンを提供する。製品はシリンジに充填される。このように、製品は、注射用の予め充填されたシリンジで配送される。これらの２つの一価アジュバント添加製品は、様々な地方（ｔｅｒｉｔｏｒｙ）においてヒト使用について認可されている。

ヒト研究Ｉ（レスター（Ｌｅｉｃｅｓｔｅｒ）、ＵＫ）
参考文献１１７に報告されているように、一価表面抗原ワクチンを、Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／７／２００９ Ｈ１Ｎ１ｓｗ株から調製した。ワクチン株は、Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／７／２００１ Ｈ１Ｎ１ｓｗ由来のＨＡ、ＮＡ、およびＰＢ１遺伝子セグメントを有し、他の５つのセグメントはＡ／ＰＲ８／８／３４由来であった。ウイルスをＭＤＣＫ細胞中で増殖させた。ウイルスおよび抗原は、三価ＯＰＴＡＦＬＵ（商標）製品を製造するために用いられたプロセスを用いて調製した［１１８］。以下の２つのワクチンを調製した：７．５μｇのＨＡおよびサブミクロンのスクワレン液滴を含むＭＦ５９水中油型乳剤を含むアジュバント添加ワクチン；ならびに緩衝液中の１５μｇのＨＡを含むアジュバント無添加ワクチン。全てのワクチンは０．５ｍｌの容量を有した。アジュバント添加ワクチンの半分用量をいくつかの被験体に用いた（すなわち、０．２５ｍｌの容量で）。最終ワクチンにおけるＨＡ含有量については、ＳＲＩＤ試薬が利用できないため、逆相ＨＰＬＣを用いて決定した。

１７５人の被験体を７つの群に分けた。被験体は、１用量（０日目）かまたは２つのの同一の用量（０日目；７日目、１４日目、または２１日目）のいずれかを受けた。７つのＡ〜Ｇ群は以下の通りであった（用量；ａｄｊ＝アジュバント添加）：

免疫原性を、０日目、１４日目、および２１日目に評価した。中間評価は、２１日目の用量の投与直前に免疫原性を測定した。したがって、Ａ〜Ｃ群は、それらの投与計画を完了していたが、Ｄ群は、１回の７．５μｇのアジュバント添加された用量のみを受けていた。Ｅ〜Ｇ群については、この中間段階では評価しなかった。抗体応答を、幾何平均力価（ＧＭＴ）、幾何平均比、セロコンバージョン（％）、および血清防御（％）として血球凝集（ＨＩ）アッセイによって評価した。抗体応答をまた、ＧＭＴ、力価≧４０を有する被験体の割合（％）、またはセロコンバージョンとしてマイクロ中和法（ＭＮ）によって評価した。中間評価におけるＨＩによる抗体応答は以下の通りであった：

中間評価におけるＭＮによる抗体応答は以下の通りであった：

免疫前の抗体を、ＨＩアッセイ（力価＞１：８）およびＭＮアッセイ（力価＞１：１０）によってそれぞれ、１４％の被験体および３９％の被験体において検出し、この頻度は、年齢または季節性ワクチンの過去の接種と関係がなかった。１４日目、ＨＩおよびＭＮアッセイを用いて測定した場合の幾何平均力価（ＧＭＴ）は、１用量のみを受けていた被験体と比較して２つのの７．５μｇのアジュバント添加された用量を受けた被験体においてより高かった（Ｄ群に対してＡ〜Ｃ群を比較する）が、群内で力価において有意差はなかった。２１日目において、１つの用量または２つの用量を受けていた被験体の間で力価における有意差はなかった。全ての被験体は、２１日目までに１：４０を超える力価のＭＮ抗体を有した。

このように、中間段階での免疫応答は、アジュバント添加ワクチンの単回用量の投与から２週間内の２００９ Ｈ１Ｎ１ｓｗウイルスに対する血清防御と一致した。様々なスケジュールで投与された７．５μｇのＨＡを含むアジュバント添加ワクチンの１回または２つの用量は、頑強な抗体価を誘発した。２倍用量（１５μｇのＨＡ）は、１用量より高い抗体レベルを与えたが、血清防御の力価は、あらゆる群において少なくとも８０％の被験体で達成された。

ヒト研究ＩＩ
一価の不活性化表面抗原ワクチンを、卵中で増殖したＡ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／７／２００９ Ｈ１Ｎ１ｓｗウイルスから調製した。抗原を３０μｇ／ｍｌのＨＡ濃度まで希釈し、ＭＦ５９水中油型乳剤（クエン酸緩衝液中にサブミクロンのスクワレン液滴を含む）と混合し、１５μｇ／ｍｌのＨＡ濃度をもつアジュバント添加バルクを生じさせた。アジュバント添加ワクチンを、０．５ｍｌ用量あたり７．５μｇＨＡを有するワクチンを提供するように、それぞれ０．５ｍｌ用量としてシリンジへパッケージングした。アジュバント添加ワクチン（例えば、ＦＯＣＥＴＲＩＡ（商標）製品）は、筋肉内に、例えば、三角筋または大腿前外側に投与される。

ヒト研究ＩＩＩ
Ｈ１Ｎ１ｓｗ株由来の一価の不活性化スプリットワクチンを、ヒト成人ボランティア（１８〜６０歳）に与えた。患者は、アジュバント添加ワクチンかまたはアジュバント無添加ワクチンのいずれかを受けた。アジュバント添加ワクチンは、スクワレンを含むサブミクロンの水中油型乳剤（ＡＳ０３）と共に５．２５μｇのＨＡを有した；アジュバント無添加ワクチンは２１μｇのＨＡを有した。ワクチンを０日目および２１日目に投与した。Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／７／２００９に対するＨＩ力価、加えてセロコンバージョンおよび血清防御を、これらの日に評価した。このヒト研究の完全な詳細は参考文献１１９に示されている。

ワクチンは耐容性が良好で、免疫原性結果は以下の通りであった：

このように、アジュバント添加ワクチンおよびアジュバント無添加ワクチンは、どちらも成人において免疫原性であり、５．２５μｇのＨＡ（アジュバント添加）かまたは２１μｇのＨＡ（アジュバント無添加）のいずれかの単回用量が認可下付判定基準を満たすのに十分であった。４分の１の抗原を有するアジュバント添加ワクチンが、アジュバント無添加ワクチンに匹敵する免疫応答を誘導した。

ヒト研究ＩＶ
アジュバント添加の一価Ｈ１Ｎ１ｓｗワクチン（７．５μｇのＨＡ；ＦＯＣＥＴＲＩＡ（商標））をヒト被験体（成人および高齢者）に、三価（３×１５μｇのＨＡ）２００９／１０季節性ワクチン（アジュバント添加またはアジュバント無添加）と同時かまたは該季節性ワクチンを与えてから３ヶ月後かのいずれかに与えた。全てのワクチンは、不活性化表面抗原ワクチンであり、アジュバントは、スクワレン含有水中油型乳剤（ＭＦ５９（商標））であった。全てのワクチンの免疫原性を、１日目および２２日目に血球凝集阻害によって評価し、安全性および反応原性を、患者の日誌を用いてモニターした。このヒト研究の完全な詳細は参考文献１２０に示されている。

成人における季節性ワクチン接種から３ヶ月後、または季節性ワクチンと同時でのアジュバント添加Ｈ１Ｎ１ｓｗワクチンの１用量は、いずれのワクチンの耐容性または免疫原性に影響することなく、成人および高齢者の被験体についての認可下付判定基準を満たした。

ヒト研究Ｖ：併用治療
末期腎疾患を有する患者、および慢性透析中である患者に、１用量あたり７．５μｇの一価不活性化表面抗原ワクチンの形態をとるＨ１Ｎ１^＊血球凝集素を含むＦＯＣＥＴＲＩＡ（商標）ワクチンを与えた。ワクチンは、スクワレンを含むＭＦ５９（商標）サブミクロンの水中油型乳剤アジュバントを含んだ。一部の患者は、肝炎ウイルスの処置用として知られているペプチドであるチマルファシン（チモシンα１；ＺＡＤＡＸＩＮ（商標）製品として市販されている）も受けた。２つの異なる用量のチマルファシンを試験して、無作為化３群非盲検研究を行なった。チマルファシンを２回与えたが、１回目の注射はワクチン接種の７日前であり、２回目注射はワクチン接種の日であった。２１日目に少なくとも１：４０の抗体価に達成しなかった全被験体はその日に２回目のワクチン接種を受けた。

ＦＯＣＥＴＲＩＡ（商標）ワクチンのみを受けた被験体と比較して、両方の用量でのチマルファシンの追加も、ワクチン接種後の２１日目および４２日目の両方の時点で、セロコンバージョンした被験体のパーセンテージにおいて統計的に有意な増加をもたらした。低用量（３．２ｍｇ）のチマルファシンを受けた患者の９３％、および高用量（６．４ｍｇ）を受けた患者の９４％が、ワクチンのみを受けた患者の７７％と比較して、４２日後のＨ１Ｎ１^＊ウイルスに対するセロコンバージョンを達成した。

ヒト研究ＶＩ
２つの多施設無作為化用量範囲探索試験（ｄｏｓｅ−ｒａｎｇｉｎｇ ｓｔｕｄｙ）は、生後６ヶ月〜１７歳の健康な子どもにおいて（ＭＦ５９での）アジュバント添加およびアジュバント無添加の卵由来および細胞培養物由来の一価Ｈ１Ｎ１ｓｗワクチンを評価した。目的は、健康な子どもおよび青年における好ましいワクチン製剤（アジュバント有りまたは無し）、投薬量、およびスケジュール（１回または２回投与）を特定することであった。

登録時に、被験体を（ｉ）４つの年齢コホート、すなわち、９〜１７歳、３〜８歳、生後１２〜３５ヶ月、および生後６〜１１ヶ月へ層別化し、（ｉｉ）３．７５μｇＨＡ＋１／２用量ＭＦ５９、７．５μｇＨＡ＋完全用量ＭＦ５９、またはアジュバント無添加の１５μｇＨＡを与えられる３つのワクチン群へ無作為化した。９〜１７歳の子どもおよび生後６〜１１ヶ月の乳児は、アジュバント添加ワクチンのみを受けた。被験体は、２１日間離して、２回のワクチン接種を受けた。ワクチンは卵中かまたはＭＤＣＫ細胞培養物（懸濁培養）中かのいずれかで調製した。

免疫原性を、血球凝集阻害（ＨＩ）によって各ワクチン接種から２１日後に決定した。ワクチン接種後のＨＩ力価／ワクチン接種前のＨＩ力価についての幾何平均ＨＩ力価（ＧＭＴ）および幾何平均比（ＧＭＲ）を計算した。セロコンバージョン率、すなわち、≧１：４０のワクチン接種後ＨＩおよびベースラインにおいて陰性（ＨＩ＜１：１０）、またはベースラインにおいて陽性（ＨＩ≧１：１０）の被験体についてＨＩ力価における少なくとも４倍の増加をもつ被験体の％を評価した。血清防御率（ＳＰ）、すなわち、ＨＩ力価≧１：４０をもつ被験体の％も評価した。

中間評価を、３〜８歳および９〜１７歳の被験体から得た（細胞由来ワクチンを受けた３８８人の被験体、および卵由来のワクチンを受けた４０３人の被験体）。

細胞由来ワクチンを受けた被験体におけるＧＭＴ値およびＧＭＲ値は以下の通りであった：

卵由来のワクチンを受けた被験体におけるＧＭＴ値およびＧＭＲ値は以下の通りであった：

２つの研究におけるアジュバント添加ワクチンは、９〜１７歳および３〜８歳のコホートにおいて１回目および２回目のワクチン接種から３週間後、ＳＰ率≧７０％を有した。２つの研究におけるアジュバント無添加ワクチンは、２回目のワクチン投与から３週間後に、３〜８歳のコホートにおいてＳＰ率≧７０％に達した。両方の年齢のコホート（３〜１７歳）における全てのワクチンは、両方の研究において１回目および２回目のワクチン接種から３週間後、ＳＣ率≧４０％を有した。ＧＭＴは各投与から３週間後、大きく増加し、両方のコホートにおける全てのワクチンはＧＭＲ≧２．５を有した。

アジュバント添加の卵由来（ＦＯＣＥＴＲＩＡ（商標））ワクチンおよび細胞培養物由来（ＣＥＬＴＵＲＡ（商標））ワクチンは、アジュバント無添加ワクチンより低いＨＡ用量で迅速で強い免疫応答を誘導した。全てのアジュバント添加ワクチンの免疫原性は、単回用量に関して欧州規制パンデミックインフルエンザワクチン判定基準（被験体の＞７０％がＨＩ力価≧１：４０；セロコンバージョン＞４０％かつＧＭＲ＞２．５を有する）を満たした。

ヒト研究ＶＩＩ（コスタリカ）
この研究は、小児集団において（ＭＦ５９での）アジュバント添加またはアジュバント無添加のＨ１Ｎ１ｓｗワクチンの投与後の安全性および抗体応答を決定することを目的とした。ワクチンを、卵で増殖させたウイルスから調製した。被験体を２つの年齢群（３〜８歳の子どもおよび９〜１７歳の青年）に分け、（ａ）７．５μｇのアジュバント添加ワクチンの１回投与、（ｂ）１５μｇのアジュバント無添加ワクチンの１回投与、または（ｃ）３０μｇのアジュバント無添加ワクチンの投与（２×１５μｇ投与）へ無作為化した。３週間後、被験体は、７．５μｇのＨ５Ｎ１血球凝集素（表面抗原ワクチン、卵由来）を含むＭＦ５９アジュバント添加ワクチンを受けた。血清学的試験のための血液試料を１日目（免疫）、２２日目、２９日目、４３日目に収集した。Ｈ１Ｎ１ワクチン抗原に対する抗体価を血球凝集阻害（ＨＩ）によって評価した。抗血球凝集阻害抗体の幾何平均力価（ＧＭＴ）、セロコンバージョン（ＳＣ）率、およびＨＩ力価≧１：４０をもつ被験体のパーセンテージを計算した。ＳＣ率およびＨＩ力価≧１：４０を、有効な生物製剤評価および研究センター（ＣＢＥＲ）規制判定基準と比較した。ＳＣ率についての９５％ＣＩの下界（ｌｏｗｅｒ ｂｏｕｎｄ）は、≧４０％であるべきである。ＨＩ力価≧１：４０をもつパーセンテージについての９５％ＣＩの下界は≧７０％であるべきである。

１９４人の子どもおよび１９６人の青年を登録した。１回目の投与後（２２日目）、アジュバント無添加ワクチンを与えられた子どもの７２〜７４％と比較して、７．５μｇのアジュバント添加ワクチンを与えられた子どもの９３％が、ＨＩ力価≧１：４０に達した。３〜８歳の子どもにおけるアジュバント添加ワクチンについてのＳＣ率（２２日目）（９１％）は、アジュバント無添加ワクチンについてのＳＣ率（７１〜７２％）より高かった。２９日目までに、７．５μｇのアジュバント添加ワクチンを与えられた全ての被験体は、ＨＩ力価≧１：４０に達した；全てのワクチンはＣＢＥＲ判定基準を満たした。２回目のワクチン投与後のＳＣ率は、全研究群にわたって８３〜９５％の範囲であった。ＧＭＴは、各ワクチン接種後、上昇したが、７．５μｇのアジュバント添加ワクチンを与えられた被験体において、特に子どもにおいて、より強く上昇した。

全ての３つのＨ１Ｎ１ワクチンは、ワクチンの２つの用量以内で小児集団において高いＨＩ抗体応答を生じたが、単回用量後では、アジュバント添加ワクチンだけが、ＣＢＥＲ免疫原性判定基準を満たすＨＩ抗体応答を達成した。アジュバント無添加ワクチンと比較して、アジュバント添加ワクチンにおいてより低い総用量の抗原（７．５μｇ）でさえもこれらの判定基準が満たされた。

ヒト研究ＶＩＩＩ（ＵＳＡ）
小児集団において水中油型アジュバント（ＭＦ５９）を含むまたは含まない一価Ｈ１Ｎ１ｓｗワクチンの最適な用量を評価するために用量決定研究を実施した。３歳から９歳未満までの合計１３５７人の健康な子どもを登録した。子どもを、等しく８つの群に無作為化し、１日目および２２日目に筋肉内ワクチン注射を与えた。ワクチンについては、完全用量または半分用量のＭＦ５９の有りまたは無しの３．７５μｇ、７．５μｇ、１５μｇ、または３０μｇのＨＡとして製剤化した。

ＣＢＥＲ判定基準［ＨＩ力価≧１：４０（９５％ＣＩ下界≧７０％）およびセロコンバージョン率（９５％ＣＩ下界≧４０％）］に従う免疫原性（ＨＩアッセイ）を、２２日目および４３日目に評価した。セロコンバージョンを、ワクチン接種前ＨＩ力価＜１：１０およびワクチン接種後力価≧１：４０、またはワクチン接種前ＨＩ力価≧１：１０およびワクチン接種後力価における４倍以上の上昇と定義した。ＨＩ抗体応答を、ワクチン接種前力価に対するワクチン接種後力価の幾何平均力価（ＧＭＴ）および幾何平均比として表した。各群間のＧＭＴ比の対での比較を行い、９５％ＣＩを、０．５、および次に、０．６７の非劣性マージンに対して評価した。ワクチン群間の差を、ＧＭＴ比前後の両側９５％ＣＩが１（統計的に有意な優越性または劣性のいずれかを示す）を含まなかった場合には、統計的に有意であると仮定した。

ＧＭＴおよびＧＭＲの結果は以下の通りであった：

各群におけるベースライン血清陽性率（ＨＩ力価≧１０）は同程度であった（１８％〜２７％）。全てのアジュバント添加の群は、１用量後にＨＩ力価≧１：４０判定基準を満たしたが、アジュバント無添加の群は、２つの用量後のみ、血清防御判定基準を満たした。全てのワクチン群（アジュバント無添加の７．５μｇ群を除く）における被験体は、１用量投与後にセロコンバージョン判定基準を満たし、２つの用量後に全ての群がこの判定基準を満たした。両側９５％ＣＩを用いる２２日目のＧＭＴの対での群比較は、全てのアジュバント添加ワクチンがアジュバント無添加ワクチンよりも優れていたことを示している。アジュバント添加の群は、１回の投与後に認可下付判定基準を満たし、７．５μｇ抗原および半分用量のＭＦ５９アジュバントを含むワクチン投与が明らかに優れた応答を示した。

本発明は、例としてのみ記載されており、本発明の範囲および精神内に留まりながら、改変をなし得ることは理解されている。

Claims (23)

1. （ｉ）配列番号３に対してより、配列番号１に対してより密接に関係しているＨ１亜型インフルエンザＡウイルス血球凝集素、および（ｉｉ）水中油型乳剤アジュバントを含むワクチンを患者に投与する工程を含む、ヒトを免疫するための方法。
2. ｉ）配列番号３に対してより、配列番号１に対してより密接に関係しているＨ１亜型インフルエンザＡウイルス血球凝集素、および（ｉｉ）水中油型乳剤アジュバントを含む免疫原性組成物。
3. 一価ワクチンである、請求項２に記載の組成物。
4. 血球凝集素が、配列番号２と少なくとも９０％配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項２または３に記載の組成物。
5. 前記水中油型乳剤アジュバントがスクワレンを含み、２５０ｎｍ未満の直径をもつ液滴を有する、請求項２〜４のいずれか一項に記載の組成物。
6. 約７．５μｇ／ｍｌまたは約１５μｇ／ｍｌの血球凝集素濃度を有する、請求項２〜５のいずれか一項に記載の組成物。
7. Ｈ３Ｎ２インフルエンザＡウイルス血球凝集素およびインフルエンザＢウイルス血球凝集素もまた含む三価ワクチンである、請求項２に記載の組成物。
8. ２つの異なるＨ１亜型インフルエンザＡウイルス血球凝集素および水中油型乳剤アジュバントを含む免疫原性組成物であって、（ｉ）第１のＨ１亜型インフルエンザＡウイルス血球凝集素が配列番号３に対してより、配列番号１に対してより密接に関係し、および（ｉｉ）第２のＨ１亜型インフルエンザＡウイルス血球凝集素が配列番号１に対してより、配列番号３に対してより密接に関係している、免疫原性組成物。
9. （ｉｉｉ）Ｈ３Ｎ２インフルエンザＡウイルス血球凝集素および（ｉｖ）インフルエンザＢウイルス血球凝集素もまた含む、請求項８に記載の組成物。
10. （ｉｉｉ）Ｈ３Ｎ２インフルエンザＡウイルス血球凝集素、（ｉｖ）Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２／８７様インフルエンザＢウイルス血球凝集素、および（ｖ）Ｂ／Ｙａｍａｇａｔａ／１６／８８様インフルエンザＢウイルス血球凝集素もまた含む、請求項８に記載の組成物。
11. （ｉ）Ｈ１亜型インフルエンザＡウイルス血球凝集素を含む一価ワクチンを患者に投与する工程、および（ｉｉ）三価Ａ／Ｈ１Ｎ１−Ａ／Ｈ３Ｎ２−Ｂ季節性インフルエンザワクチンを該患者に投与する工程を含む、インフルエンザウイルスに対してヒトを免疫するための方法であって、（ａ）該一価ワクチンが、配列番号３に対してより、配列番号１に対してより密接に関係しているＨ１亜型インフルエンザＡウイルス血球凝集素を含み、（ｂ）該三価ワクチンが、配列番号１に対してより、配列番号３に対してより密接に関係しているＨ１亜型インフルエンザＡウイルス血球凝集素を含み、（ｃ）該一価ワクチンが水中油型乳剤アジュバントを含み、および（ｄ）該三価ワクチンが水中油型乳剤アジュバントを含む、方法。
12. 前記一価ワクチンが前記三価ワクチンの少なくとも４週間前に投与される、請求項１１に記載の方法。
13. 前記一価ワクチンが前記三価ワクチンから少なくとも４週間後に投与される、請求項１１に記載の方法。
14. ヒトを免疫するための一価ワクチンの製造におけるＨ１亜型インフルエンザＡウイルス血球凝集素の使用であって、該ワクチンが水中油型乳剤アジュバントを含み、該一価ワクチンが、配列番号３に対してより、配列番号１に対してより密接に関係しているＨ１亜型インフルエンザＡウイルス血球凝集素を含む、使用。
15. 前記ヒトが以前に、三価Ａ／Ｈ１Ｎ１−Ａ／Ｈ３Ｎ２−Ｂ季節性インフルエンザワクチンを受けたことがあり、該三価ワクチンが、配列番号１に対してより、配列番号３に対してより密接に関係しているＨ１亜型インフルエンザＡウイルス血球凝集素を含む、請求項１４に記載の使用。
16. 前記乳剤が、サブミクロン直径を有する油滴を含み、該乳剤がスクワレンを含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法、組成物、または使用。
17. 少なくとも２つの異なるインフルエンザウイルス株から得られる血球凝集素を含むワクチンであって、第１の血球凝集素が卵中で増殖したインフルエンザウイルスから調製され、第２の血球凝集素が細胞培養物中で増殖したインフルエンザウイルスから調製され、該第２の血球凝集素が配列番号３に対してより、配列番号１に対してより密接に関係している、ワクチン。
18. 前記細胞培養物がＭＤＣＫ細胞培養物である、請求項１７に記載のワクチン。
19. （ｉ）組換え宿主において発現した精製されたＨ１亜型インフルエンザＡウイルス血球凝集素であって、配列番号３に対してより、配列番号１に対してより密接に関係している、Ｈ１血球凝集素、および（ｉｉ）水中油型乳剤アジュバントを含む、免疫原性組成物。
20. 前記血球凝集素が、バキュロウイルスベクターを用いて昆虫細胞系において発現する、請求項１９に記載の組成物。
21. 組換えインフルエンザウイルスノイラミニダーゼを含む、請求項１９または２０に記載の組成物。
22. インフルエンザワクチンの２つの別々の用量を被験体に投与する工程を含む、該被験体を免役するための方法であって、（ａ）該２つの用量が１〜６週間離して投与され、（ｂ）各ワクチンが、配列番号３に対してより、配列番号１に対してより密接に関係しているＨ１亜型インフルエンザＡウイルス血球凝集素を含み、および（ｃ）該被験体が、オセルタミビルリン酸塩などのノイラミニダーゼ阻害剤を、該２つのワクチン用量を受ける間に少なくとも３回、摂取する、方法。
23. 投与されるワクチンの１つまたは両方が水中油型乳剤アジュバントを含む、請求項２２に記載の方法。

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