CN102548577A

CN102548577A - 用于抵抗流感的佐剂疫苗

Info

Publication number: CN102548577A
Application number: CN2010800275269A
Authority: CN
Inventors: K·施特尔; P·道米策; G·德尔古迪斯; M·布洛克
Original assignee: Novartis Vaccines and Diagnostics AG
Current assignee: Novartis Vaccines and Diagnostics AG
Priority date: 2009-04-27
Filing date: 2010-04-27
Publication date: 2012-07-04
Also published as: USH2283H1; KR20120027276A; FR2949344A1; CA2763816A1; DE102010018462A1; BE1019643A3; EP2424565A1; USH2284H1; WO2010125461A1; JP2012525370A

Abstract

用水包油乳液佐剂辅助含A型流感病毒H1亚型血凝素的疫苗。所述疫苗适合接种病人抵抗称作“猪流感”的病毒。疫苗可以是单价的。疫苗可包括A型流感病毒的两种不同H1亚型血凝素，其中(i)第一A型流感病毒H1亚型血凝素与SEQ ID NO：1较SEQ ID NO：3更密切相关，和(ii)第二A型流感病毒H1亚型血凝素与SEQ ID NO：3较SEQ ID NO：1更密切相关。单价疫苗可与三价A/H1N1-A/H3N2-B季节性流感疫苗联合施用。

Description

用于抵抗流感的佐剂疫苗

技术领域

本发明涉及用于抵抗流感病毒感染的佐剂疫苗领域，特别是针对例如2009年4月出现的猪流感等毒株。

背景技术

在2009年4月，包括墨西哥和美国在内的许多国家确诊了猪流感的爆发，并迅速扩散到全球。WHO于2009年6月宣告了大流行。该疾病是由一种新鉴定出的猪流感病毒A/加利福尼亚/04/2009A(H1N1)引发的。该猪流感毒株似乎与现有的人流感疫苗株，包括现有人季节性疫苗中的A(H1N1)抗原没有交叉反应性。该病毒有不同名称：“猪流感”、“新型猪来源H1N1流感”、“人-猪流感”、“新型流感A(H1N1)”和“流感A(H1N1)v”。

需要一种疫苗防止这种猪流感及其变体的进一步人人传播。

发明内容

根据本发明的第一个方面，用水包油乳液佐剂辅助含A型流感病毒H1亚型血凝素的疫苗。血凝素引起受体的免疫应答，而佐剂增强该应答的异体覆盖。虽然特定H1抗原可能本身不能抵抗猪流感，佐剂能增强免疫应答，从而即使疫苗血凝素与猪流感血凝素的免疫交叉反应性低也能实现保护。另外，如果疫苗包括与猪流感血凝素具有免疫学交叉反应性的血凝素，则可对同源菌株及其变体，例如天然产生的变异株提供保护。

因此，本发明提供了一种免疫病人(通常是人类)抵抗猪流感的方法，包括步骤：对病人施用疫苗，所述疫苗含有(i)A型流感病毒H1亚型的血凝素，和(ii)水包油乳液佐剂。在一些实施方式中，H1血凝素与SEQ ID NO：1较SEQ ID NO：3更密切相关；在其它实施方式中，它与SEQ ID NO：3较SEQ ID NO：1更密切相关。

本发明提供了一种免疫原性组合物，包含(i)与SEQ ID NO：1较SEQ ID NO：3更密切相关的A型流感病毒H1亚型血凝素，和(ii)水包油乳液佐剂。该组合物可以是单价疫苗(即它包含来自单一流感病毒株的血凝素抗原)，但在一些实施方式中它可以是多价疫苗，例如还包括A型流感病毒H3N2血凝素和B型流感病毒血凝素的三价疫苗。

根据本发明的第二个方面，本发明提供了一种免疫原性组合物，包含A型流感病毒的两种不同H1亚型血凝素，其中(i)第一A型流感病毒H1亚型血凝素与SEQID NO：1较SEQ ID NO：3更密切相关，和(ii)第二A型流感病毒H1亚型血凝素与SEQ ID NO：3较SEQ ID NO：1更密切相关，和其中该组合物包含作为免疫佐剂的水包油乳液佐剂。该佐剂化H1血凝素混合物提供了与现有相比针对A型流感病毒H1毒株的更广谱保护。该组合物还可包含(iii)H3N2和/或(iv)B型流感病毒抗原。在一些实施方式中，该组合物包含(iii)H3N2，(iv)B/维多利亚/2/87样B型流感病毒株；和(v)B/山方/16/88样B型流感病毒株。

根据本发明的第三个方面，含A型流感病毒H1亚型血凝素的单价疫苗与三价A/H1N1-A/H3N2-B季节性流感疫苗联合施用，其中两种疫苗都包含水包油乳液作为佐剂。单价疫苗包含相较SEQ ID NO：3与SEQ ID NO：1更密切相关的A型流感病毒H1亚型血凝素；三价疫苗包含相较SEQ ID NO：1与SEQ ID NO：3更密切相关的A型流感病毒H1亚型血凝素，可在三价疫苗之前，之后或同时施用单价疫苗。当两种疫苗分开施用时，在施用之间可相隔2-26周。在一个有用的实施方式中，病人首先接受三价季节性疫苗(有佐剂，例如FLUAD^TM产品)，然后接受单价疫苗(有佐剂)。如本文所示，先施用有佐剂的三价季节性疫苗可提高具有与SEQ IDNO：1较SEQ ID NO：3更密切相关的血凝素的单价H1N1疫苗的效力。

在相关实施方式中，含有A型流感病毒H1亚型血凝素的单价疫苗与4价A/H1N1-A/H3N2-B-B季节性流感疫苗联合施用，4价疫苗中两种B毒株是B/维多利亚/2/87样毒株和B/山方/16/88样毒株，其中两种疫苗中都加入水包油乳液佐剂。单价疫苗包含相较SEQ ID NO：3与SEQ ID NO：1更密切相关的A型流感病毒H1亚型血凝素；4价疫苗包含相较SEQ ID NO：1与SEQ ID NO：3更密切相关的A型流感病毒H1亚型血凝素。可在三价疫苗之前，之后或同时施用单价疫苗。当两种疫苗分开施用时，在施用之间可相隔2-26周。在一个有用的实施方式中，病人首先接受单价疫苗，然后接受4价疫苗。

根据本发明的第四个方面，用两剂方案施用含有A型流感病毒H1亚型血凝素的单价疫苗，其中两剂单价疫苗都含有水包油乳液佐剂。单价疫苗包含相较SEQID NO：3与SEQ ID NO：1更密切相关的A型流感病毒H1亚型血凝素；两剂相隔1-6周，例如隔1周，隔2周，隔3周，隔4周，隔5周，隔6周施用。在一些实施方式中，H1血凝素在两种单价疫苗中都是相同的；在其它实施方式中，两种单价疫苗中的H1血凝素具有不同的氨基酸序列，例如彼此有达20个氨基酸的差异(例如1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19或20个氨基酸取代)。

抗原组分

本发明用A型流感病毒血凝素作为疫苗抗原。通常用流感病毒颗粒制备抗原，但也可以在重组宿主中(例如用杆状病毒载体的昆虫细胞系中)表达血凝素，以纯化形式[1，2，3]或病毒样颗粒形式(VLP；例如见文献4和5)使用。然而，抗原通常来自病毒颗粒。

目前可以获得各种形式的流感病毒疫苗(例如参见参考文献6的第17和18章)。已知疫苗通常基于活病毒或灭活病毒。本发明疫苗中的抗原采取灭活病毒形式。灭活疫苗可基于全病毒颗粒、裂解病毒颗粒或基于纯化的表面抗原。灭活病毒的化学方法包括用有效量的以下一种或多种介质处理：去污剂、甲醛、福尔马林、β丙内酯或紫外线。其它化学灭活法包括用亚甲蓝、补骨脂素、羧基富勒烯(C60)或任何其组合处理。本领域已知病毒灭活的其它方法，例如二乙胺、乙酰基乙烯亚胺或γ射线。

疫苗可包含完整的病毒颗粒、裂解病毒颗粒或纯化的表面抗原(包括血凝素，通常也包括神经氨酸酶)。本发明中特别有用的是裂解病毒颗粒和纯化表面抗原(即亚病毒粒子疫苗)。

可通过各种方法由含病毒液体收获病毒颗粒。例如，纯化方法可包括用线性蔗糖梯度溶液(含有去污剂以破坏病毒颗粒)进行区带离心。任选稀释后，可通过渗滤纯化抗原。

获得裂解病毒颗粒可通过用去污剂(如乙醚、聚山梨醇酯80、脱氧胆酸盐、三正丁基磷酸盐、曲通X100、曲通N101、溴化十六烷基三甲铵、特吉托NP9等)处理病毒颗粒以产生亚病毒颗粒制剂，包括′吐温-醚′裂解方法。裂解流感病毒的方法是本领域熟知的，例如参见参考文献7-12等。一般使用破坏浓度的裂解剂破坏或片段化完整病毒来裂解病毒，无论该病毒有无感染性。这种破坏导致病毒蛋白的完全或部分溶解，改变病毒的完整性。优选的裂解剂是非离子型和离子型(例如阳离子型)表面活性剂，如烷基糖苷、烷基硫苷、酰基糖、磺基甜菜碱、甜菜碱、聚氧乙烯烷基醚、N，N-二烷基-葡糖酰胺、Hecameg(6-O(N庚甲酰)甲基葡萄糖苷)、烷基苯氧基-聚乙氧基乙醇、季铵化合物、肌氨酰、CTAB(溴化十六烷基三甲铵)、三正丁基磷酸酯、塞他弗伦)、十四烷基三甲铵盐、脂质体转染试剂、阳离子脂质体(lipofectamine)和DOT-MA、辛基-或壬基苯氧基聚氧乙醇(如曲通表面活性剂，如曲通X100或曲通N101)、聚氧乙烯去水山梨糖醇酯(吐温表面活性剂)、聚氧乙烯醚、聚氧乙烯酯等。一种有用的裂解方法利用脱氧胆酸钠和甲醛的连续作用，并且裂解可在病毒颗粒初始纯化期间(例如在蔗糖密度梯度溶液中)进行。因此，裂解过程可包括：澄清含病毒颗粒的物质(以去除非病毒颗粒物质)，浓缩收获的病毒颗粒(例如使用吸附方法，如CaHPO₄吸附)，从非病毒颗粒材料分离全病毒颗粒，用裂解剂在密度梯度离心步骤中裂解病毒颗粒(例如，用含有裂解剂如脱氧胆酸钠的蔗糖梯度)，然后过滤(例如超滤)以去除不需要的物质。可将裂解的病毒颗粒重悬于磷酸钠缓冲的等渗氯化钠溶液中。BEGRIVAC^TM、FLUARIX^TM、FLUZONE^TM和FLUSHIELD^TM产品是裂解疫苗。

纯化的表面抗原疫苗包含流感表面抗原血凝素，一般还包含神经氨酸酶。制备纯化形式的这些蛋白质的方法是本领域熟知的。FLUVIRIN^TM、AGRIPPAL^TM和INFLUVAC^TM产品是亚基疫苗。

流感抗原还可以病毒体的形式存在[13](无核酸病毒样脂质体颗粒)，例如INFLEXAL V^TM和INVAVAC^TM产品，但优选本发明不使用病毒体。因此，在一些实施方式中，流感抗原不是病毒体的形式。

疫苗中的血凝素抗原可以来自任何合适病毒株。在一些实施方式中，当以无佐剂形式施给人类对象时，血凝素能引起抗-血凝素抗体，其不与A/加利福尼亚/04/2009血凝素(SEQ ID NO：1；GI：227809830)交叉反应；在这些实施方式中，疫苗佐剂增强免疫应答，使得人类对象产生与A/加利福尼亚/04/2009血凝素交叉反应的抗体。在其它实施方式中，当以无佐剂形式施给人类对象时，血凝素能引起抗-血凝素抗体，其与A/加利福尼亚/04/2009血凝素(SEQ ID NO：1)交叉反应；在这些实施方式中，疫苗佐剂增强免疫应答，使得人类对象产生更广谱的抗体，能够帮助抵抗A/加利福尼亚/04/2009的变异株。在其它实施方式中，血凝素来自A/加利福尼亚/04/2009(SEQ ID NO：1)。在其它实施方式中，血凝素包含HA1氨基酸序列，其与SEQ ID NO：2具有至少i％的序列相同性，其中i是85或以上，例如85、88、90、92、94、95、96、97、98、99或更高(例如100)。许多这样的序列可来自例如任何下列已知毒株：

A/猪/广西/17/2005，A/猪/俄亥俄/891/01，A/猪/印第安纳/9K035/99，A/猪/印第安纳/P12439/00，A/猪/明尼苏达/1192/2001，A/SW/MN/23124-T/01，A/猪/广西/13/2006，A/猪/明尼苏达/00194/2，A/SW/MN/16419/01，A/猪/伊利诺斯/100085A/01，A/猪/OH/511445/2007，A/猪/伊利诺斯/100084/01，A/猪/北卡罗来纳/93523/01，A/火鸡/MO/24093/99，A/猪/韩国/PZ4/2006，A/猪/韩国/PZ7/2006，A/猪/堪萨斯/00246/2004，A/猪/爱荷华/24297/1991，A/猪/韩国/CY08/2007，A/猪/韩国/JL02/2005，A/猪/马里兰/23239/1991，A/猪/韩国/S11/2005，A/火鸡/IA/21089-3/1992，A/猪/威斯康星/1915/1988，A/猪/爱荷华/930/01，A/猪/韩国/Hongsong2/2004，A/俄亥俄/3559/1988，A/猪/爱荷华/17672/1988，A/火鸡/NC/19762/1988，A/猪/圣亚森特/106/1991，A/猪/韩国/JL04/2005，A/猪/韩国/JL01/2005，A/WI/4755/1994，A/猪/加利福尼亚/T9001707/1991，A/猪/韩国/牙山04/2006，A/MD/12/1991，A/猪/威斯康星/235/97，A/猪/堪萨斯/3228/1987，A/猪/印第安纳/1726/1988，A/猪/安大略/11112/04，A/猪/威斯康星/163/97，A/SW/MO/1877/01，A/猪/上海/3/2005，A/火鸡/NC/17026/1988，A/猪/爱荷华/31483/1988，A/猪/广东/2/01，A/猪/爱荷华/1/1987，A/猪/爱荷华/3/1985，A/猪/田纳西/31/1977，等。

具有合适HA抗原的其它H1N1毒株包括A/加利福尼亚/04/2009本身、A/加利福尼亚/7/2009、A/得克萨斯/5/2009、A/英格兰/195/2009、和A/纽约/18/2009。

优选的实施方式所包括的血凝素以无佐剂形式施给人类个体时，能引起抗-血凝素抗体，其与A/加利福尼亚/04/2009血凝素(SEQ ID NO：1)交叉反应，例如包含与SEQ ID NO：2具有至少i％的序列相同性的氨基酸序列的血凝素，如上所述。

在一些实施方式中，血凝素与SEQ ID NO：1(A/加利福尼亚/04/2009)较SEQ IDNO：3(A/智利/1/1983)更密切相关；在其它实施方式中，血凝素与SEQ ID NO：3较SEQ ID NO：1更密切相关。本文中将相较SEQ ID NO：3与SEQ ID NO：1更密切相关(即当使用相同算法和参数与SEQ ID NO：1比较时具有比SEQ ID NO：3更高的序列相同度)的血凝素称作“H1*”血凝素。SEQ ID NO：1和3具有80.4％的相同性。

用于本发明的有用全长H1血凝素序列包括SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：6，以及如上所述氨基酸序列与SEQ ID NO：2具有至少i％的序列相同性的的血凝素，或与SEQ ID NO：7具有至少i％序列相同性。理想地，血凝素在HA1/HA2切割位点周围没有超碱性区域。优选血凝素对具有Sia(α2，6)Gal末端二糖的寡糖的结合优先于具有Sia(α2，3)Gal末端二糖的寡糖(见下文)。

SEQ ID NO：6(包含SEQ ID NO：7)是有用的H1*血凝素。其与SEQ ID NO：1在残基214、226和240处不同(即99.47％相同性)。

本发明的组合物除了包括H1血凝素(例如H1*血凝素)和水包油乳液佐剂以外，还可以包括一种或多种(例如1，2，3，4或更多)其它流感病毒株(包括A型流感病毒和/或B型流感病毒)的抗原。因此，组合物可包含来自一种或多种具有正常季节性疫苗特征的毒株抗原和水包油乳液佐剂，加上至少一种H1*血凝素，例如4价疫苗，其含有两种H1毒株(一种是H1*血凝素，另一种不是H1*血凝素)、H3N2毒株和一种B型流感毒株，或5价疫苗，其含有两种H1毒株(一种是H1*血凝素，另一种不是H1*血凝素)、H3N2毒株、和两种B型流感病毒株(B/维多利亚/2/87样毒株和B/山方/16/88样毒株)。本发明还提供了2价疫苗，其包含一种H1*血凝素和一种H5血凝素，以及水包油乳液佐剂。疫苗包含一种以上流感毒株时，一般单独培养不同毒株，收获病毒后将它们混合在一起，然后制备抗原。因此，本发明方法可包括混合一种以上流感毒株的抗原的步骤。

当本发明的疫苗包含两种B型流感毒株时，可包含一种B/维多利亚/2/87样毒株和一种B/山方/16/88样毒株。通常可从抗原性区分这些毒株，但氨基酸序列的不同也可以区分这两种谱系，例如B/山方/16/88-样毒株常常(但并非总是)具有氨基酸残基164缺失(相对′Lee40′HA序列进行编号)的HA蛋白[14]。在本发明的一些实施方式中，当其中存在的抗原来自两种或多种B型流感病毒株时，至少两种B型流感病毒株可以具有不同的血凝素但相关的神经氨酸酶。例如，它们都可以具有B/维多利亚/2/87样神经氨酸酶[15]或可以都具有B/山方/16/88样神经氨酸酶。例如，两种B/维多利亚/2/87样神经氨酸酶都可具有以下序列特征中的一种或多种：(1)残基27处不是丝氨酸，但优选是亮氨酸；(2)残基44处不是谷氨酸，但优选是赖氨酸；(3)残基46处不是苏氨酸，但优选是异亮氨酸；(4)残基51处不是脯氨酸，但优选是丝氨酸；(5)残基65处不是精氨酸，但优选是组氨酸；(6)残基70处不是甘氨酸，但优选是谷氨酸；(7)残基73处不是亮氨酸，但优选是苯丙氨酸；和/或(8)残基88处不是脯氨酸，但优选是谷氨酰胺。类似地，在一些实施方式中，神经氨酸酶可在残基43处有缺失，或可以是苏氨酸；由NA基因中三核苷缺失引起的残基43处的缺失，被报导为B/维多利亚/2/87样毒株特征，虽然近来的毒株重新获得了Thr-43[15]。当然，反之，两种B/山方/16/88样神经氨酸酶也可具有相反性质，例如S27、E44、T46、P51、R65、G70、L73、和/或P88。这些氨基酸编号是根据‘Lee40’神经氨酸酶序列[16]。

纯化出血凝素蛋白的流感病毒可对抗病毒治疗有抗性(例如对奥塞米韦[17]和/或扎那米韦有抗性)。

因此，在一些实施方式中，本发明所用毒株具有的血凝素对含Sia(α2，6)Gal末端二糖的寡糖的结合优先于含Sia(α2，3)Gal末端二糖的寡糖。人流感病毒结合具有Sia(α2，6)Gal末端二糖(经α-2，6连接半乳糖的唾液酸)的受体寡糖，而蛋和Vero细胞具有含Sia(α2，3)Gal末端二糖的受体寡糖。人流感病毒在细胞如MDCK中的生长提供了血凝素选择压，从而维持了天然的Sia(α2，6)Gal结合，这点与鸡蛋传代不同。为了确定病毒是否对含Sia(α2，6)Gal末端二糖的寡糖的结合优先于含Sia(α2，3)Gal末端二糖的寡糖，可利用各种分析试验。例如，参考文献18描述了测定流感病毒受体-结合活性的固相酶联试验，以便对亲合常数进行灵敏的定量测定。参考文献19采用固相试验，该试验评估病毒与两种不同的唾液酸糖蛋白的结合(卵类粘蛋白，具有Sia(α2，3)Gal决定簇；和猪α2巨球蛋白，具有Sia(α2，6)Gal决定簇)，也描述了针对两种受体类似物：无唾液酸(Neu5Ac)和3′-唾液酸乳糖(Neu5Ac α2-3Gal β1-4Glc)评价病毒结合的试验。参考文献20报道了采用能够清楚区分α2，3或α2，6连接受体偏好的聚糖试验。参考文献21报道了一种基于经酶促修饰包含Sia(α2，6)Gal或Sia(α2，3)Gal的人红细胞的凝集的试验。根据试验类型，可利用病毒本身直接进行试验，或者可利用从病毒纯化的血凝素间接进行试验。

在一些实施方式中，H1血凝素与鸡蛋衍生的病毒具有不同的糖基化模式。因此，所述HA(和其它糖蛋白)包含鸡蛋中未见的糖形。有用的HA包括犬糖形。

除了包括血凝素抗原，本发明的疫苗通常还包括神经氨酸酶蛋白，例如疫苗可包括病毒神经氨酸酶。本发明还提供保护抵御一种或多种A型流感病毒NA亚型N1、N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8或N9，但通常抵抗N1(例如H1N1病毒)或N2(例如H1N2病毒)。全病毒颗粒、裂解病毒颗粒和亚基疫苗都可包括血凝素和神经氨酸酶。当疫苗包括神经氨酸酶抗原时，神经氨酸酶可以与SEQ ID NO：4具有至少j％的序列相同性，其中j是75或以上，例如75、80、85、88、90、92、94、95、96、97、98、99或以上(例如100)。许多这些序列是可得的。在一些实施方式中，神经氨酸酶与SEQ ID NO：4较SEQ ID NO：5更密切相关。SEQ ID NO：4和5具有82％相同性。

疫苗还可包括基质蛋白，例如M1和/或M2(或其片段)，和/或核蛋白。猪模型已显示在灭活的H1N1猪流感病毒疫苗(加有水包油乳液佐剂)中加入M2能增强疫苗效力[22]。

流感病毒可以是再分类毒株，并可通过反向遗传学技术获得。反向遗传技术[例如23-27]能实现体外用质粒或无质粒系统制备具有所需基因组片段的流感病毒。该技术一般包括表达(a)例如，来自polI启动子的编码所需病毒RNA分子的DNA分子，和(b)例如，来自polII启动子的编码病毒蛋白的DNA分子，以便在细胞中表达两种类型的DNA，从而组装成完整的感染性病毒颗粒。DNA优选提供所有病毒RNA和蛋白质，但也可能用辅助病毒提供一些RNA和蛋白质。优选采用不同质粒产生各病毒RNA的质粒方法[28-30]，这些方法也包括使用质粒表达所有或一些(例如仅PB1、PB2、PA和NP蛋白)病毒蛋白，一些方法中至多使用12种质粒。如果使用犬细胞，可使用犬polII启动子[31]。

为了降低所需的质粒数量，有一种方法[32]将多个RNA聚合酶I转录盒(用于合成病毒RNA)合并到同一质粒(如编码1、2、3、4、5、6、7或所有8种流感A vRNA区段的序列)上，并且将多个蛋白编码区与RNA聚合酶II启动子合并到另一个质粒(如编码1、2、3、4、5、6、7或所有8种流感A mRNA转录物的序列)上。该方法可涉及：(a)在单一质粒上的PB1、PB2和PA mRNA编码区域；和(b)在单一质粒上的所有8种vRNA编码区段。一个质粒上包含NA和HA区段而另外六个区段位于另一质粒上也可能是有利的。

作为使用polI启动子编码病毒RNA区段的替换方式，可能使用噬菌体聚合酶启动子[33]。例如，可方便地使用SP6、T3或T7聚合酶的启动子。因为polI启动子的物种特异性，对于许多细胞类型(例如MDCK)更宜使用噬菌体聚合酶启动子，但必须用编码外源性聚合酶的质粒转染细胞。

在其它技术中，可能使用polI和polII双启动子由一个模板同时编码病毒RNA和可表达的mRNA[34，35]。

用于本发明的A型流感病毒可包含来自A/PR/8/34病毒(一般是来自A/PR/8/34的6个区段，HA和N区段来自疫苗毒株，即6:2重组株)的一个或多个RNA区段，特别是当病毒在蛋内生长时。也可包含来自A/WSN/33病毒，或用于产生疫苗制剂的重组病毒的任何其它毒株的一个或多个RNA区段。本发明一般提供保护抵御能够在人之间传播的毒株，因此该毒株的基因组通常包含在哺乳动物(如人)流感病毒中起源的至少一个RNA区段。

可以在鸡蛋或细胞培养物上培养用作抗原来源的病毒。目前培养流感病毒的标准方法采用特异性无病原(SPF)含胚的鸡蛋，由鸡蛋内容物(尿囊液)纯化病毒。然而，更近一段时间以来，已经在动物细胞培养物上培养病毒，出于速度和患者变态反应的原因，优选这种培养方法。如果使用基于鸡蛋的病毒培养，则可将一种或多种氨基酸与病毒一起引入鸡蛋的尿囊液中[12]。

当使用细胞培养时，病毒生长物质通常是哺乳动物来源的细胞系。合适的哺乳动物细胞来源包括但不限于仓鼠、牛、灵长类(包括人类和猴)，以及犬细胞。可使用各种细胞类型，例如肾细胞、成纤维细胞、视网膜细胞、肺细胞等。合适的仓鼠细胞的例子是称为BHK21或HKCC的细胞系。合适的猴细胞是例如，非洲绿猴细胞，如Vero细胞系中的肾细胞。合适的犬细胞是例如肾细胞，如MDCK细胞系。因此，合适的细胞系包括但不限于：MDCK、CHO、293T、BHK、Vero、MRC5、PER.C6、WI-38等。用于培养流感病毒的哺乳动物细胞系优选包括：MDCK细胞[36-39]，衍生自小猎犬(Madin Darby)肾；Vero细胞[40-42]，衍生自非洲绿猴(Cercopithecus aethiops)肾；或PER.C6细胞[43]，衍生自人胚视网膜母细胞。这些细胞系可由各种来源获得，例如美国典型细胞培养物保藏中心(ATCC)、Coriell细胞库或欧洲细胞培养物保藏中心(ECACC)。例如，ATCC提供各种不同Vero细胞，目录号为CCL81、CCL81.2、CRL1586和CRL-1587；并提供MDCK细胞，目录号为CCL34。PER.C6可获自ECACC，保藏号为96022940。作为哺乳动物细胞系的次优选替代物，病毒也可在禽细胞系上生长[例如参考文献44-46]，包括衍生自鸭(例如鸭视网膜)或母鸡的细胞系。禽细胞系的例子包括禽胚胎干细胞[44，47]和鸭视网膜细胞[45]。合适的禽胚胎干细胞包括衍生自鸡胚胎干细胞的EBx细胞系、EB45、EB14和EB14-074[48]。也可利用鸡胚成纤维细胞(CEF)。

用于培养流感病毒的最优选的细胞系是MDCK细胞系。原始MDCK细胞系可购自ATCC(CCL34)，但也可利用该细胞系的衍生物。例如，参考文献36公开了适合悬浮培养的MDCK细胞系(′MDCK 33016′，保藏号DSM ACC 2219)。类似地，参考文献49公开了在无血清培养物中悬浮生长的MDCK衍生细胞系(′B-702′，保藏号FERM BP-7449)。参考文献50公开了非致瘤性MDCK细胞，包括′MDCK-S′(ATCC PTA-6500)、′MDCK-SF101′(ATCC PTA-6501)、′MDCK-SF102′(ATCC PTA-6502)和′MDCK-SF103′(PTA-6503)。参考文献51公开了非常容易感染的MDCK细胞系，包括‘MDCK.5F1’细胞(ATCC CRL 12042)。可使用任何这些MDCK细胞系。

在哺乳动物细胞系上培养病毒时，该组合物宜不含鸡蛋蛋白质(如卵清蛋白和卵类粘蛋白)和鸡DNA，从而降低变应原性。

在细胞系上培养病毒时，生长培养物以及用于起始培养的病毒接种物优选不含(即经污染检测且得到阴性污染结果)单纯疱疹病毒、呼吸道合胞病毒、副流感病毒3、SARS冠状病毒、腺病毒、鼻病毒、呼肠孤病毒、多瘤病毒、双RNA病毒、环病毒和/或细小病毒[52]。特别优选不存在单纯疱疹病毒。

为了在细胞系如MDCK细胞上生长，可以在悬浮[36，53，54]或贴壁培养的细胞上培养病毒。一种适合悬浮培养的MDCK细胞系是MDCK 33016(保藏号为DSMACC 2219)。或者，可采用微载体培养。

优选在无血清培养基和/或无蛋白培养基中培养支持流感病毒复制的细胞系。在本发明中，如果培养基中没有人或动物血清来源的添加剂，则称为无血清培养基。无蛋白应理解为在不含蛋白质、生长因子、其它蛋白添加剂和非血清蛋白质的情况下发生细胞增殖的培养物，但可任选包含诸如胰蛋白酶和其它蛋白酶等可能是病毒生长所必需的蛋白质。在这类培养物中生长的细胞在天然情况下本身含有蛋白质。

支持流感病毒复制的细胞系优选在病毒复制期间在37℃以下[55]，例如30-36℃、31-35℃、或33+1℃下生长。

在培养细胞中增殖病毒的方法通常包括以下步骤：用要培养的毒株接种培养的细胞；将感染细胞培养所需时间以增殖病毒，例如根据病毒效价或抗原表达进行测定(例如，在接种后培养24至168小时)；收集增殖的病毒。用1∶500-1∶1，优选1∶100-1∶5，更优选1∶50-1∶10的病毒(由PFU或TCID₅₀测定)：细胞比接种培养的细胞。在细胞悬液中加入病毒，或将病毒加到单层细胞上，病毒在25-40℃，优选28-37℃吸附到细胞上至少60分钟，通常短于300分钟，优选在90-240分钟之间。可通过冻融或酶作用除去感染的细胞培养物(例如单层)，以提高所收获培养上清中的病毒含量。然后，可灭活或冷冻储存收获的液体。可以约0.0001-10、优选0.002-5、更优选0.001-2的感染复数(″m.o.i″)感染培养的细胞。更优选以约0.01的m.o.i感染细胞。可以在感染后30-60小时收获感染的细胞。优选在感染后34-48小时收获细胞。更优选在感染后38-40小时收获细胞。通常在细胞培养期间加入蛋白酶(通常为胰蛋白酶)，以释放病毒，可在培养期间任何合适的阶段加入蛋白酶。

血细胞凝集素(HA)是灭活流感疫苗中的主要免疫原，参考一般通过单向免疫扩散(SRID)试验测定的HA水平使疫苗剂量标准化。疫苗一般含有约15μgHA/毒株，但(例如)儿童使用时，或者在大流行情况下，也可采用较低剂量。已使用过分数剂量，例如1/2(即7.5μg HA/毒株，如FOCETRIA^TM中)、1/4(即3.75μg/毒株，如PREPANDRIX^TM中)和1/8[56，57]，以及更高的剂量(例如3x或9x剂量[58，59])。因此，疫苗可包括0.1-150μg的HA/流感毒株，优选0.1-50μg，例如0.1-20μg、0.1-15μg、0.1-10μg、0.1-7.5μg、0.5-5μg、3.75-15μg等。具体剂量包括例如，约45、约30、约15、约10、约7.5、约5、约3.8、约1.9、约1.5μg等/毒株。一般每毒株HA质量相等。在本发明疫苗中存在佐剂时低剂量(例如＜15μg/剂)最有用。虽然在一些研究中使用过高达90μg的剂量(例如文献60)，本发明的组合物通常含有15μg/剂/毒株或以下。

本发明所用HA可以是如病毒中发现的天然HA，或者可以是经修饰的HA。

本发明组合物可包含去污剂，如聚氧乙烯去水山梨糖醇酯表面活性剂(称为′吐温′，例如聚山梨醇酯80)、辛苯聚糖(如辛苯聚糖-9(曲通X100)或10、或叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇)、溴化十六烷基三甲铵(′CTAB′)或脱氧胆酸钠，特别用于裂解疫苗或表面抗原疫苗。去污剂可仅以痕量存在。因此，疫苗可包含少于1mg/ml的各辛苯聚醇10、α-生育酚、氢化琥珀酸盐和聚山梨酯80。其它痕量残留组分可以是抗生素(如新霉素、卡那霉素、多粘菌素B)。

宿主细胞DNA

用细胞系培养病毒时，标准实践是最大程度减少最终疫苗中残留的细胞系DNA的含量，以使该DNA的致癌活性最小。因此，所述组合物优选含有小于10ng(优选小于1ng，更优选小于100pg)残留的宿主细胞DNA/剂量，但可能存在痕量宿主细胞DNA。通常，需要从本发明组合物中排除长于100bp的宿主细胞DNA。

现在，残留宿主细胞DNA的测定是生物制品的常规管理要求，它在技术人员的普通能力范围内。用于测定DNA的实验一般是已验证的实验[61，62]。可通过数学和可以量化的条件来描述验证实验的性能特征，并鉴定可能的误差来源。通常测试该实验的某些特征，如精确性、准确性、特异性。一旦校正(例如用已知标准量的宿主细胞DNA校正)并检测了某个实验，则可按常规进行定量DNA测定。可采用三种DNA定量的基本技术：杂交方法，如Southern印迹或狭线印迹[63]；免疫测定方法，如Threshold^TM系统[64]；和定量PCR[65]。本领域技术人员熟悉这些方法，但各方法的准确特征，例如杂交探针的选择、引物的选择和/或用于扩增的探针等可能取决于所研究的宿主细胞。来自分子设备公司(Molecular Devices)的Threshold^TM系统是皮克水平总DNA的定量实验，已用于监测生物药品中污染DNA的水平[64]。典型实验包括生物素化ssDNA结合蛋白、脲酶偶联的抗ssDNA抗体和DNA之间以非序列特异性方式形成反应复合物。购自生产商的总DNA测定试剂盒(Total DNA Assay Kit)中包含所有实验组分。多个商业生产商均提供用以检测残留宿主细胞DNA的定量PCR试验，例如AppTec^TM实验室服务公司(AppTec^TMLaboratory Services)、BioReliance^TM公司、奥西科技公司(Althea Technologies)等。对测定人病毒疫苗的宿主细胞DNA污染的化学发光杂交实验和总DNAThreshold^TM系统的比较参见参考文献66。

在疫苗制备过程中可采用标准纯化方法，如层析法等去除污染的DNA。可通过核酸酶处理，例如用DNA酶来改进对残留宿主细胞DNA的清除效果。参考文献67和68公开了一种减少宿主细胞DNA污染的简便方法，该方法包括两步处理，先使用可以在病毒生长过程中采用的DNA酶(如Benzonase)处理，然后使用可以在病毒颗粒破坏过程中采用的阳离子去污剂(如CTAB)处理。也可利用烷化剂如β-丙内酯处理来去除宿主细胞DNA，该方法也宜用于灭活病毒颗粒[69]而同时避免使用甲醛。

优选每15μg血凝素中宿主细胞DNA含量＜10ng(如＜1ng、＜100pg)的疫苗，以及每0.25ml体积中宿主细胞DNA含量＜10ng(如＜1ng、＜100pg)的疫苗。更优选每50μg血凝素中宿主细胞DNA含量＜10ng(如＜1ng、＜100pg)的疫苗，以及每0.5ml体积中宿主细胞DNA含量＜10ng(如＜1ng、＜100pg)的疫苗。

水包油乳液佐剂

本发明组合物包含水包油乳液佐剂，佐剂的作用是增强在接受该组合物的患者中引起的免疫应答(体液免疫和/或细胞免疫)。诺华疫苗公司(Novartis Vaccines)的FLUAD^TM产品包含水包油乳液。

已知各种合适的乳液，其通常包含至少一种油和至少一种表面活性剂，所述油和表面活性剂是生物可降解(可代谢)和生物相容的。乳剂中的油滴直径通常小于5μm，乳液优选包含具有亚微米直径的油滴，通过微流化床实现这种小尺寸以提供稳定乳剂。优选尺寸小于220nm的液滴，因为其可进行过滤灭菌。

本发明可使用的油诸如动物(如鱼)或植物来源的油。植物油的来源包括坚果、种籽和谷物。最常见的花生油、大豆油、椰子油和橄榄油是坚果油的代表例子。也可使用获自(例如)霍霍巴豆的霍霍巴油。种籽油包括红花油、棉花籽油、葵花籽油、芝麻籽油等。在谷物油中，最常见的是玉米油，但也可以使用其它谷类的油，如小麦、燕麦、黑麦、稻、画眉草、黑小麦等。可从坚果和种籽油开始，通过水解、分离和酯化合适物质制备甘油和1，2-丙二醇的6-10碳脂肪酸酯(不是种籽油中天然产生的)。来自哺乳动物乳汁的脂肪和油类是可代谢的，因此可以用于实施本发明。由动物来源获得纯油必需的分离、纯化、皂化和其它方法的过程在本领域熟知。大多数鱼类含有容易回收的可代谢油。例如，鳕鱼肝油、鲨鱼肝油和如鲸蜡的鲸油是可以用于本发明的几种鱼油的代表例子。通过生化途径用5-碳异戊二烯单位合成许多支链油，它们总称为萜类。鲨鱼肝油含有称为鲨烯的支链不饱和萜类化合物，即2，6，10，15，19，23-六甲基-2，6，10，14，18，22-二十四碳六烯。其它优选油是生育酚(见下)。包含鲨烯的水包油乳液是特别优选的。可以使用油的混合物。

表面活性剂可以通过其HLB(亲水/亲脂平衡)分类。本发明优选的表面活性剂的HLB为至少10，优选至少15，更优选至少16。可以与本发明一起使用的表面活性剂包括但不限于：聚氧乙烯去水山梨糖醇酯表面活性剂(通常称为吐温)，特别是聚山梨酯20和聚山梨酯80；以商品名DOWFAX^TM出售的环氧乙烷(EO)、环氧丙烷(PO)和/或环氧丁烷(BO)的共聚物，如直链EP/PO嵌段共聚物；重复的乙氧基(氧-1，2-乙二基)数量不同的辛苯聚醇，特别感兴趣的是辛苯聚醇9(曲通(Triton)X-100，或叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇)；(辛基苯氧基)聚乙氧基乙醇(IGEPAL CA-630/NP-40)；磷脂如磷脂酰胆碱(卵磷脂)；衍生自十二烷醇、十六烷醇、十八烷醇和油醇的聚氧乙烯脂肪醚(称为苄泽表面活性剂)，如三乙二醇单月桂基醚(苄泽30)；以及去水山梨糖醇酯(通常称为司盘)，如去水山梨糖醇三油酸酯(司盘85)和去水山梨糖醇单月桂酸酯。乳液中包含的优选表面活性剂是吐温80(聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯)、司盘85(脱水山梨糖醇三油酸酯)、卵磷脂和曲通X-100。如上所述，吐温80等去污剂可有助于下文实施例所述的热稳定性。

可使用表面活性剂的混合物，如吐温80/司盘85混合物。聚氧乙烯去水山梨糖醇酯如聚氧乙烯去水山梨糖醇单油酸酯(吐温80)和辛苯聚醇如叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(曲通X-100)的组合也适合。另一种有用的组合包含月桂醇聚醚-9和聚氧乙烯去水山梨糖醇酯和/或辛苯聚醇。

优选的表面活性剂的用量(重量％)为：聚氧乙烯去水山梨糖醇酯(如吐温80)0.01-1％，特定是约0.1％；辛基-或壬基-苯氧基聚氧乙醇(如曲通X100或曲通系列的其它去污剂)0.001-0.1％，特定是0.005-0.02％；聚氧乙烯醚(如月桂醇聚醚9)0.1-20％，优选0.1-10％，特定是0.1-1％或约0.5％。

本发明所用的具体水包油乳液佐剂包括但不限于：

鲨烯、吐温80和司盘85的亚微米乳液。所述乳液的体积组成可以是约5％鲨烯、约0.5％聚山梨酯80和约0.5％司盘85。以重量计，这些比例为4.3％角鲨烯、0.5％聚山梨酯80和0.48％司盘85。这种佐剂称为‘MF59’[70-72]，参考文献73的第10章和参考文献74的第12章更详细地描述了该佐剂。MF59乳液宜包含柠檬酸根离子，如10mM柠檬酸钠缓冲液。

包含鲨烯、α-生育酚和聚山梨酯80的乳液。这些乳液可含有2-10％鲨烯、2-10％生育酚和0.3-3％吐温80，鲨烯∶生育酚的重量比优选≤1(例如0.90)，因为这能使乳液更稳定。鲨烯和吐温80的体积比可以约为5∶2，或者重量比约为11∶5。可通过将吐温80溶解于PBS产生2％溶液，然后将90ml该溶液与5g DL-α-生育酚和5ml鲨烯的混合物混合，随后使该混合物微流体化来制备这一类乳液。得到的乳液可含有(如)平均直径为100-250nm，优选约180nm的亚微米油滴。

鲨烯、生育酚和曲通去污剂(如曲通X-100)的乳液。该乳液也可包含3d-MPL(见下)。所述乳液可包含磷酸盐缓冲液。

含有聚山梨酯(如聚山梨酯80)、曲通去污剂(如曲通X-100)和生育酚(如琥珀酸α-生育酚)。该乳液可包含这三种组分，其质量比约为75∶11∶10(如750μg/ml聚山梨酯80、110μg/ml曲通X-100和100μg/mlα-生育酚琥珀酸盐)，这些浓度应包括抗原中这些组分的贡献。所述乳液还可包含角鲨烯。该乳液也可包含3d-MPL(见下)。所述水相可包含磷酸盐缓冲液。

鲨烷、聚山梨酯80和泊洛沙姆401(″普流罗尼克^TM L121″)的乳液。可以用pH7.4的磷酸盐缓冲盐水配制所述乳液。该乳液是一种有用的胞壁酰二肽递送载体，已与含苏氨酰基-MDP的″SAF-I″佐剂(0.05-1％Thr-MDP、5％鲨烯、2.5％普流罗尼克L121和0.2％聚山梨酸酯80)[75]一起使用。也可不与Thr-MDP一起使用，例如用″AF″佐剂(5％鲨烯、1.25％普流罗尼克L121和0.2％聚山梨酸酯80)[76]。优选微流体化。

含有鲨烯、水性溶剂、聚氧乙烯烷基醚亲水性非离子型表面活性剂(如聚氧乙烯(12)十六十八醚)和疏水性非离子型表面活性剂(如去水山梨糖醇酯或二缩甘露醇酯，如去水山梨糖醇单油酸酯或‘司盘80’)的乳液。该乳液优选为热可逆的和/或其中至少90％油滴(以体积计)的尺寸小于200nm[77]。该乳液也可含有以下一种或多种物质：糖醇(例如甘露醇)；低温保护剂(例如，糖，如十二烷基麦芽苷和/或蔗糖)；和/或烷基多糖苷。这类乳液可冻干。乳液还可包括鲨烯∶聚氧乙烯十六十八醚∶去水山梨糖醇油酸酯∶甘露醇，其质量比为330∶63∶49∶61。

含有0.5-50％油、0.1-10％磷脂和0.05-5％非离子型表面活性剂的乳液。如参考文献78所述，优选的磷脂组分是磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油、磷脂酸、鞘磷脂和心磷脂。优选亚微米液滴尺寸。

不可代谢油(如轻质矿物油)和至少一种表面活性剂(如卵磷脂、吐温80或司盘80)的亚微米水包油乳液。可包含添加剂，例如QuilA皂苷、胆固醇、皂苷-亲脂体偶联物(如通过葡糖醛酸的羧基将脂族胺加到脱酰基皂苷上而产生的GPI-0100，如参考文献79所述)、二甲基双十八烷基溴化铵和/或N，N-双十八烷基-N，N-双(2-羟乙基)丙二胺。

包含矿物油、非离子亲脂性乙氧基化脂肪醇和非离子亲水性表面活性剂(例如，乙氧基化脂肪醇和/或聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物)的乳液[80]。

包含矿物油、非离子亲水性乙氧基化脂肪醇和非离子亲脂性表面活性剂(例如，乙氧基化脂肪醇和/或聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物)的乳液[80]。

皂苷(如QuilA或QS21)和固醇(如胆固醇)结合成螺旋胶束的乳液[81]。

通常在传递给病人时混合组合物中的抗原和佐剂。可以在生产期间或在递送时临时将该乳液与抗原混合。因此，在包装或出售的疫苗中该佐剂和抗原可分开保存，使用时配制成最终制剂。所述抗原通常是水性形式，以便最终通过混合两种液体制备疫苗。所述两种液体的混合体积比可变(例如5∶1-1∶5)，但通常约为1∶1。

抗原和佐剂混合后，血凝素抗原通常保留在水溶液中，但其本身可分布于油/水界面附近。通常，很少(如果有)血凝素会进入该乳液的油相。

当组合物包含生育酚时，可采用α、β、γ、δ、ε或ξ生育酚中的任何一种，但优选α-生育酚。生育酚可取多种形式，例如不同的盐和/或异构体。盐包括有机盐，例如琥珀酸盐、乙酸盐、烟酸盐等。可同时采用D-α-生育酚和DL-α-生育酚。用于老年患者(如年龄大于60岁或更大的患者)的疫苗中宜包含生育酚，因为据报道维生素E在此患者群体中对免疫应答有正面作用[82]。它们也具有抗氧化特性，这种特性有助于稳定该乳液[83]。优选的α-生育酚是DL-α-生育酚，此种生育酚的优选盐是琥珀酸盐。发现琥珀酸盐在体内与TNF相关配体协作。另外，已知α-生育酚琥珀酸盐与流感疫苗相容，并且是替代含汞化合物的有用防腐剂。

如上所述，包含鲨烯的水包油乳液是特别优选的。在一些实施方式中，疫苗剂量中的鲨烯浓度可以是5-15mg(即10-30mg/ml的浓度，假设是0.5ml剂量体积)。然而，可以减少鲨烯浓度[84，85]，例如包括＜5mg/剂，或甚至＜1.1mg/剂。例如，人剂量可包括9.75mg鲨烯/剂(例如在FLUAD^TM产品中：9.75mg鲨烯、1.175mg聚山梨酯80、1.175mg去水山梨糖醇三油酸酯，剂量体积为0.5ml)，或可以包括其部分量，例如3/4、2/3、1/2、1/3、1/4、1/5、1/6、1/7、1/8、1/9、或1/10。例如，组合物可包括7.31mg鲨烯/剂(因此是各0.88mg聚山梨酯80和去水山梨糖醇三油酸酯)，4.875mg鲨烯/剂(因此是各0.588mg聚山梨酯80和去水山梨糖醇三油酸酯)，3.25mg鲨烯/剂，2.438mg/剂，1.95mg/剂，0.975mg/剂等。本发明可使用任何的这些FLUAD^TM-强MF59的部分稀释物。

如上所述，可临时在传递时进行抗原/乳液混合。因此，本发明提供了包含易混的抗原和佐剂组分的药盒。该药盒可将佐剂和抗原单独保存，直到使用。在药盒中，这些组分在物理上相互分离，这种分离可通过多种方式实现。例如，这两种组分可以装在两个不同的容器，如药瓶中。可通过(例如)取出一个药瓶的内含物并将其加入另一个药瓶，或者分别取出两个药瓶的内含物并在第三个容器中将它们混合在一起，来混合两个药瓶的内含物。在优选的配置中，药盒的一种组分在注射器中，另一种组分在容器如药瓶中。可使用该注射器(例如装有针头的注射器)将其内含物注入第二个容器中混合，然后将该混合物抽回注射器中。然后，一般通过新的无菌针头将该注射器中的混合成分给予患者。将一种组分包装到注射器中无需用单独注射器对患者给药。在另一优选配置中，这两种药盒组分在同一注射器，例如双室注射器(如参考文献86-93等所述)中分开保存。当注射器致动时(例如给予患者时)，将这两室中的内含物混合。这种配置在使用时无需单独的混合步骤。

药物组合物

本发明组合物是药学上可接受的组合物。除抗原和佐剂外，它们通常还包含其它组分，例如它们一般包含一种或多种药物载体和/或赋形剂。对这类组分的充分讨论参见参考文献94。

该组合物通常是水性形式。

该组合物可含有防腐剂，如硫柳汞(例如10μg/ml)或2-苯氧乙醇。然而，疫苗优选应基本不含(即小于5μg/ml)含汞物质，如不含硫柳汞[95]。更优选无汞的疫苗。特别优选不含防腐剂的疫苗。

为了控制张度，优选包含生理性盐如钠盐。优选氯化钠(NaCl)，它的浓度可以是1-20mg/ml。可以存在的其它盐包括氯化钾、磷酸二氢钾、无水磷酸氢二钠、氯化镁、氯化钙等。

组合物的渗透压通常为200mOsm/kg-400mOsm/kg，优选为240-360mOsm/kg，更优选为290-310mOsm/kg。虽然以前报道过渗透压对疫苗接种引起的疼痛无影响[96]，但优选将渗透压保持在此范围内。

组合物可含有一种或多种缓冲剂。缓冲剂一般包括：磷酸盐缓冲剂；Tris缓冲剂；硼酸盐缓冲剂；琥珀酸盐缓冲剂；组氨酸缓冲剂；或柠檬酸盐缓冲剂。包含的缓冲剂的浓度一般是5-20mM。缓冲剂可以在乳液水相内。

组合物的pH通常为5.0-8.1，更常为6.0-8.0，例如6.5-7.5，或者7.0-7.8。因此，本发明方法可包括在包装前调整散装疫苗pH的步骤。

所述组合物优选无菌。该组合物优选不含谷蛋白。

优选的疫苗具有低内毒素含量，例如低于1IU/ml，优选低于0.5IU/ml。内毒素测量的国际单位是公知的，可通过例如与国际标准，如来自NIBBC的第2次国际标准(Code 94/580-IS)比较来计算样品的内毒素[97，98]。从在鸡蛋中生长的病毒制备的现有疫苗的内毒素水平为0.5-5IU/ml。

疫苗优选不含抗生素(例如新霉素、卡那霉素、多粘菌素B)。

该组合物可含有一次免疫的物质，或者可含有多次免疫的物质(即‘多剂量’组合物)。多剂量配置通常在疫苗中包含防腐剂。为了避免这种需要，疫苗可装在具有用于除去物质的无菌适配器的容器中。

流感病毒通常以约0.5ml的剂量体积施用，虽然可对儿童施用半剂量(即约0.25ml)，因此可选择单位剂量，例如对病人施用0.5ml剂量的单位剂量。

组合物或药盒组分的包装

本发明的方法可包括步骤将疫苗置于容器中，特别是置于为医师使用配制的容器中。

疫苗的合适容器包括小瓶、鼻喷雾剂和一次性针筒，其应是无菌的。

组合物/组分装在药瓶中时，药瓶优选由玻璃或塑料材料制成。在将组合物加入药瓶之前，优选对其进行灭菌。为了避免对胶乳过敏患者产生问题，药瓶优选用无胶乳塞子密封，且优选所有包装材料均不含胶乳。药瓶可包含单一剂量的疫苗，或者可以包含一个以上剂量(′多剂量′药瓶)，如10个剂量。优选的药瓶由无色玻璃制成。

药瓶可具有适合的帽(如鲁尔锁)，以便将预填装注射器插入该帽，可以将注射器的内含物推入药瓶，可以将药瓶的内容物吸回注射器中。从药瓶中拔出注射器后，可连上针头，将该组合物给予患者。该帽优选位于封口或盖子内侧，以便在封口或盖子打开后才能接触到该帽。药瓶，特别是多剂量药瓶装有瓶帽，以便无菌地取出其内含物。

某组合物/组分包装到注射器中时，该注射器可连有针头。如果未连接针头，可随注射器提供单独的针头以便组装和使用。这种针头可装在护罩中。优选安全性针头。一般是1英寸23号、1英寸25号和5/8英寸25号针头。可提供有剥离标签的注射器，该标签上可打印上内含物的批号、流感季节和过期日期，以帮助记录保存。注射器的活塞优选带有防脱装置，以防止活塞在吸出时偶然脱出。注射器可以有胶乳橡胶帽和/或活塞。一次性注射器含有单一剂量的疫苗。注射器通常带有顶帽，以在连接针头前密封顶端，顶帽优选由丁基橡胶制成。如果注射器和针头分开包装，则针头优选装有丁基橡胶护罩。优选的注射器是以商品名″Tip-Lok″^TM销售的注射器。

容器可标注有半剂量体积，以例如利于递送给儿童。例如，含有0.5ml剂量的注射器可标有0.25ml体积的标记。

采用玻璃容器(如注射器或药瓶)时，优选采用由硼硅酸盐玻璃，而非钠钙玻璃制成的容器。

可将组合物与单页宣传品合并在一起(如在同一个盒子中)，所述单页宣传品包括疫苗的详细情况如给药说明书、疫苗内所含抗原的详情等。说明书也可包含警告，(例如)使肾上腺素溶液随时可用以应对疫苗接种后发生过敏反应的情况等。

治疗方法和疫苗给予

本发明组合物适合给予人类患者，本发明提供了在患者中产生免疫应答的方法，包括将本发明组合物给予患者的步骤。

本发明也提供用作药物的本发明药盒或组合物。

本发明的方法和应用引起的免疫应答通常包括抗体应答，优选保护性抗体应答。评价接种流感病毒疫苗后抗体应答、中和能力和保护水平的方法是本领域熟知的。人类研究表明，对人流感病毒血凝素的抗体效价与保护作用相关联(约30-40的血清样品血凝-抑制效价对同源病毒感染产生约50％保护作用)[99]。一般通过血凝反应抑制、微量中和、单向免疫扩散(SRID)和/或单向溶血(SRH)来测定抗体应答。本领域熟知这些测定技术。

可以各种方式给予本发明组合物。最优选的免疫途径是肌肉内注射(如注射到上肢或下肢)，但其它可用的途径包括皮下注射、鼻内[100-102]、皮内[103，104]、口服[105]、经皮、透皮[106]等。皮下和鼻内途径很吸引人。皮内给药可能涉及微注射装置，例如具有约1.5mm长的针。

可利用按照本发明制备的疫苗治疗儿童和成年人。目前，推荐将流感疫苗用于年龄大于6个月的儿童和成年人免疫。因此，患者可以小于1岁(例如小于6个月)、1-5岁、5-15岁、15-55岁或至少55岁。接受该疫苗的优选患者是老年人(例如≥50岁、≥60岁，优选≥65岁)、年轻人(如≤5岁，或6个月-24岁，或6个月-4岁，或5-18岁)、中年(25-64岁)、住院患者、健康护理工作人员、军队服务人员和军人、妊娠妇女、慢性疾病患者、免疫缺陷患者、在接受该疫苗前7天接受过抗病毒化合物(如奥塞米韦或扎那米韦化合物；见下)的患者、对鸡蛋过敏的人和出国旅行者。然而所述疫苗不仅适用于这些人群，还可用于更广泛的人群。

一些更年长者(其中约1/3超过60岁)和少数年轻人且基本没有儿童具有抵抗流行性A/C/A/04/09毒株的现存血清抗体。年轻人的季节性免疫不引起针对该毒株的抗体[107]。一组接受本发明含水包油佐剂的免疫原性组合物的有用对象是没有现存的针对流行性A/CA/04/09毒株的血清抗体的对象，例如出生于1960年后、1970年后、1980年后、1990年后、或2000年后的患者。

本发明优选组合物的功效满足CPMP标准的1、2或3。在成年人(18-60岁)中，这些标准是：(1)≥70％血清保护；(2)≥40％血清转化；和/或(3)GMT增加≥2.5倍。在老年人(＞60岁)中，这些标准是：(1)≥60％血清保护；(2)≥30％血清转化；和/或(3)GMT增加≥2倍。这些标准基于至少50位患者的开放标记研究。所述标准用于疫苗中的每一毒株。

可通过单剂量方案或多剂量方案进行治疗。多剂量可以用于初次免疫方案和/或加强免疫方案。在多剂量方案中，可通过相同或不同途径给予各种剂量，例如采用胃肠道外初次免疫和粘膜加强免疫、粘膜初次免疫和胃肠道外加强免疫等。给予一个以上剂量(一般是两个剂量)特别可用于未曾免疫接触的患者，例如从未接受过流感疫苗的人，或者用于接种免疫抵抗新HA亚型。一般以至少1周(例如约2周、约3周、约4周、约6周、约8周、约12周、约16周等)的间隔给予多个剂量。

可将本发明产生的疫苗与其它疫苗基本上同时(例如在健康护理专业人员或疫苗接种中心的同一用药咨询或就诊期间)给予患者，例如与麻疹疫苗、腮腺炎疫苗、风疹疫苗、MMR疫苗、水痘疫苗、MMRV疫苗、白喉疫苗、破伤风疫苗、百日咳疫苗、DTP疫苗、偶联的B型流感嗜血杆菌疫苗、脊髓灰质炎病毒灭活疫苗、乙型肝炎病毒疫苗、脑膜炎球菌偶联疫苗(如四价A-C-W135-Y疫苗)、呼吸道合胞病毒疫苗、肺炎球菌偶联疫苗等同时给药。在老年患者中特别有用的是与肺炎球菌疫苗和/或脑膜炎球菌疫苗基本上同时给药。

相似地，可将本发明疫苗与抗病毒化合物，具体是对流感病毒有活性的抗病毒化合物(如奥塞米韦和/或扎那米韦)基本上同时给予患者(在向健康护理专业人员进行的同一用药咨询或就诊期间)。这些抗病毒药包括神经氨酸酶抑制剂，如(3R，4R，5S)-4-乙酰基氨基-5-氨基-3(1-乙基丙氧基)-1-环己烯-1-羧酸或5-(乙酰基氨基)-4-[(氨基亚氨基甲基)-氨基]-2，6-脱水-3，4，5-三脱氧-D-甘油-D-半乳糖壬-2-烯酮酸，包括它们的酯(如乙酯)和盐(如磷酸盐)。优选的抗病毒药是(3R，4R，5S)-4-乙酰基氨基-5-氨基-3(1-乙基丙氧基)-1-环己烯-1-羧酸的乙酯和磷酸盐(1∶1)，也称为磷酸奥塞米韦(TAMIFLU^TM)。可施用的另一种抗病毒药是胸腺素α1(例如胸腺法新，一种28氨基酸的合成肽，以ZADAXIN^TM出售)[108]。在一个具体实施方式中，病人在几乎与接受灭活的全病毒颗粒疫苗(例如单价，H1*)同时接受神经氨酸酶抑制剂，例如磷酸奥塞米韦。

疫苗产品和药盒

如上所述，本发明提供了一种疫苗，包含(i)相较SEQ ID NO：3与SEQ ID NO：1更密切相关的A型流感病毒H1亚型的血凝素，和(ii)水包油乳液佐剂。在一个有用的实施方式中，该组合物是单价灭活表面抗原疫苗。灭活病毒可生长于在鸡蛋上或细胞培养物中(例如在MDCK细胞[36，118])。疫苗可装在含0.5ml单位剂量的注射器(例如硼硅酸盐玻璃)中，每单位剂量包含约7.5μg H1血凝素(例如A/加利福尼亚/7/2009样毒株，如来自重组毒株X-179A或X-181)。注射器可具有溴-丁基橡胶活塞-防脱装置。佐剂包含鲨烯、聚山梨酯80和去水山梨糖醇三油酸酯，例如每7.5μg HA约9.75mg鲨烯，约1.18mg聚山梨酯80和约1.18mg去水山梨糖醇三油酸酯。组合物可含有柠檬酸缓冲液。组合物理想上不含汞，虽然有时可包含低剂量的硫柳汞。在一些实施方式中，佐剂化疫苗具有3.75μgHA，特别是当使用0.25ml剂量体积时。可肌肉内，例如对三角肌或大腿前外侧施用佐剂化疫苗。个体可接受单剂佐剂化疫苗或可接受两剂(例如间隔2周到6个月，例如相隔3周)。注射器可包装在纸盒中，例如每盒10支，每支套有泡罩包装。

本发明还提供了一种疫苗，包含(i)相较SEQ ID NO：3与SEQ ID NO：1更密切相关的A型流感病毒H1亚型的血凝素，和(ii)水包油乳液佐剂。在一个有用的实施方式中，该组合物是单价灭活表面抗原疫苗。灭活病毒可在鸡蛋上生长。疫苗可装在含多个0.5ml单位剂量的小瓶中，例如包含硫柳汞的10剂小瓶，每单位剂量包含约7.5μg或15μg或30μg H1血凝素(例如A/加利福尼亚/7/2009样毒株，例如来自重组毒株X-179A)。佐剂包含鲨烯、聚山梨酯80和去水山梨糖醇三油酸酯，例如每7.5μg HA约9.75mg鲨烯、约1.18mg聚山梨酯80和约1.18mg去水山梨糖醇三油酸酯。组合物可含有柠檬酸缓冲液。可肌肉内，例如对三角肌或大腿前外侧施用佐剂化疫苗。个体可接受单剂佐剂化疫苗或可接受两剂(例如间隔2周到6个月，例如相隔3周)。

本发明还提供了一种药盒，包含(i)含有未佐剂化A型流感病毒H1亚型血凝素的第一药盒组分，该血凝素与SEQ ID NO：1较SEQ ID NO：3更密切相关，和(ii)包含水包油乳液佐剂的第二药盒组分。可在使用时混合两种药盒组分，得到本发明的单价疫苗。在一个有用的实施方式中，第一药盒组分是单价裂解病毒颗粒灭活疫苗。灭活病毒可在鸡蛋上生长。药盒可以是双小瓶组合物(例如硼硅酸盐玻璃，可任选具有丁基橡胶塞)，每小瓶包含等体积液体，用于1∶1体积混合，例如，混合2.5ml抗原和2.5ml佐剂。0.5ml单位剂量的单价佐剂疫苗可包含约7.5μg、3.75μg或1.9μg H1血凝素(例如A/加利福尼亚/7/2009样毒株，例如重组毒株X-179A)。佐剂含有鲨烯、DL α-生育酚和聚山梨酯80，例如在0.5ml单位剂量中：约10.7mg鲨烯、约11.9mg生育酚和约4.9mg聚山梨酯80(或其部分量，例如3/4、2/3、1/2、1/3、1/4、1/5、1/6、1/7、1/8、1/9、或1/10的鲨烯、生育酚和聚山梨酯量)。因此，佐剂组分可以质量比(鲨烯∶生育酚∶聚山梨酯80)2.20∶2.44∶1存在。佐剂组分可以是每微克H1血凝素含2.85μg鲨烯、3.16μg生育酚和1.30μg聚山梨酯80。疫苗可包含硫柳汞防腐剂，例如约10μg/ml，即在0.5ml剂量中含5μg。个体可接受单剂佐剂化疫苗或可接受两剂(例如间隔1、2或3周或3周以上，例如3-26周)。18-60岁的成年人可有用地接受单剂，而＞60岁的长者可接受两剂。3-9岁的儿童可接受半剂量，例如含有1.875μgHA的0.25ml体积。抗原和佐剂组分都可含有磷酸缓冲液。抗原组分可包含聚山梨酯80、辛苯聚醇10、氯化钾、和/或氯化镁。本发明的药盒可包含50小瓶抗原(各含2.5ml悬液)和50个小瓶的佐剂(各含2.5ml乳液)。抗原小瓶可单独包装；佐剂小瓶可以双组份包装。可肌肉内，例如对三角肌或大腿前外侧施用佐剂化疫苗。

本发明还提供了一种疫苗，包含(i)相较SEQ ID NO：3与SEQ ID NO：1更密切相关的A型流感病毒H1亚型的血凝素，和(ii)水包油乳液佐剂。在一个有用的实施方式中，该组合物是单价灭活表面抗原疫苗。灭活病毒在MDCK细胞中生长[36，118]。疫苗以单剂存在，含有3.75μgH1血凝素(例如A/加利福尼亚/7/2009样毒株，例如来自重组毒株X-179A)。佐剂包含鲨烯、聚山梨酯80和去水山梨糖醇三油酸酯，例如约4.875mg鲨烯、约0.59mg聚山梨酯80和约0.59mg去水山梨糖醇三油酸酯。组合物可含有柠檬酸缓冲液。可肌肉内，例如对三角肌或大腿前外侧施用佐剂化疫苗。个体可接受单剂佐剂化疫苗或可接受两剂(例如间隔2周到6个月，例如相隔3周)。单位剂量体积可以是0.25ml，病人可在一次免疫接种中接受一个单位剂量(例如对于3-17或18-40岁的病人)或两个单位剂量(例如对于40岁以上的病人)。疫苗可装在一个包含10x0.25ml剂量的包装内。

本发明还提供了一种药盒，包含(i)含有未佐剂化A型流感病毒H1亚型血凝素的第一药盒组分，该血凝素与SEQ ID NO：1较SEQ ID NO：3更密切相关，和(ii)包含水包油乳液佐剂的第二药盒组分。可在使用时混合两种药盒组分，得到本发明的单价疫苗。在一个有用的实施方式中，第一药盒组分是单价灭活裂解病毒颗粒。灭活病毒可在鸡蛋上生长。药盒可以2小瓶组合物(例如硼硅酸盐玻璃，可任选具有氯化丁基塞)存在，其中第一小瓶含有单位体积的抗原，第二小瓶含有3x单位体积的乳液，例如混合获得4x单位体积的最终疫苗。因此，1.5ml抗原可与4.5ml乳液混合，获得6ml疫苗。0.5ml单位剂量的单价佐剂疫苗可包含约3.8μg H1血凝素(例如A/加利福尼亚/7/2009样毒株，例如来自重组毒株X-179A)。佐剂包含鲨烯、去水山梨糖醇油酸酯、聚氧乙烯十六十八醚和甘露醇，例如在0.5ml单位剂量中含有：约12.4mg鲨烯、约1.9mg去水山梨糖醇油酸酯和约2.4mg聚氧乙烯十六十八醚和约2.3mg甘露醇(或其部分量，例如3/4、2/3、1/2、1/3、1/4、1/5、1/6、1/7、1/8、1/9、或1/10的鲨烯、去水山梨糖醇油酸酯、聚氧乙烯十六十八醚和甘露醇量)。因此，佐剂组分可以124∶19∶24∶23的(鲨烯∶去水山梨糖醇油酸酯∶聚氧乙烯十六十八醚∶甘露醇)质量比存在。疫苗可包含硫柳汞防腐剂，例如约11.3μg/0.5ml，或约3μg硫柳汞/每μg血凝素。抗原和佐剂组分都可含有磷酸缓冲液。个体可接受单剂佐剂化疫苗，或更通常可接受两剂(例如间隔3周以上，例如3-26周)。3-60岁的个体可有用地接受单剂，而＞60岁的长者可接受两剂。6个月到小于3岁的儿童可接受半剂量，例如含有1.9μgHA的0.25ml体积。可肌肉内，例如对三角肌或大腿前外侧施用佐剂化疫苗。

本发明还提供了制备流感病毒疫苗的方法，包括步骤：混合前面章节定义的第一药盒组分和前面章节定义的第二药盒组分。

本节中所提到的疫苗可有用地包括含有SEQ ID NO：7的血凝素。

混合来源的疫苗

上述本发明的一些实施方式是多价的，即它们包含一种以上流感病毒株的HA抗原。用于制备多价疫苗的病毒都可在相同基质(例如全部在鸡蛋中，或全部在MDCK培养物中生长等)上生长，或它们可在不同基质中生长(例如一毒株在鸡蛋中生长，另一毒株在细胞培养物中生长；或一毒株在MDCK培养物中生长，或另一毒株在Vero培养物中生长)。

例如，可根据具体毒株的生长偏好选择生长基质，例如如果H1N1毒株在细胞培养物中比在鸡蛋中长得更好，但是B型流感病毒显示相反的偏好，它们可在不同基质上生长，然后混合。

在一个实施方式中，一种H1*毒株(例如H1N1)在细胞培养物中(例如MDCK培养物，如悬浮培养物[36，118])生长，而另一毒株(例如H3N2毒株，B型流感病毒毒株等)在鸡蛋中生长。然后混合这些毒株制得的抗原，提供多价流感疫苗。该方法特别适合制备4价疫苗，其含有两种H1毒株(一种是H1*血凝素，一种不是H1*血凝素)、H3N2毒株和一种B型流感病毒株。

因此，本发明提供了一种疫苗，其含有从至少两种不同流感病毒株获得的血凝素，其中第一血凝素是从鸡蛋中生长的流感病毒制备的，第二血凝素是从细胞培养物中生长的流感病毒制备的。因此，培养了两种不同的流感病毒株，一种在细胞培养物中，一种在鸡蛋中。从两种来源纯化病毒，然后混合得到疫苗。

第一和第二血凝素可都来自A型流感病毒，来自B型流感病毒，或一种可来自A型流感病毒且另一种来自B型流感病毒。优选第一和第二血凝素中的至少一种来自A型流感病毒。当第一和第二血凝素都来自A型流感病毒时，通常这是H1血凝素和H3血凝素，例如来自H1N1毒株和H3N2毒株。

当第一和第二血凝素包含A型流感病毒血凝素时，其中之一可以是H1*血凝素。优选两种A型流感病毒血凝素不同时为H1*血凝素，更优选两种A型流感病毒血凝素不同时为H1血凝素。当疫苗包含H1*血凝素时，优选第二血凝素，即H1*毒株在细胞培养物中生长，然后H1*疫苗抗原与从鸡蛋制备的非H1*疫苗抗原混合。在其它实施方式中，H1*血凝素是第一血凝素，即H1*毒株在鸡蛋中生长，然后H1*疫苗抗原与从细胞培养物制备的非H1*疫苗抗原混合。

合适的细胞培养物宿主如上所述，包括MDCK细胞，例如MDCK 33016，它可悬浮生长，并可用于制备具有H1*血凝素的病毒。

该混合来源法对于制备含有H1*毒株、非H1*毒株、H3毒株和B型流感病毒株的疫苗特别有用。H1*毒株可在细胞培养物中生长，其它三种毒株(即近期季节性疫苗的常见三价混合物)可以通常方式在鸡蛋中生长。

概述

术语“包含”涵盖“包括”以及“由……组成”，例如，“包含”X的组合物可以仅由X组成或可以包括其它物质，例如X+Y。

术语“基本上”不排除“完全”，如“基本上不含”Y的组合物可能完全不含Y。必要时，术语“基本上”可从本发明定义中省略。

与数值x相关的术语“约”是可任选的并表示例如x±10％。

上文使用“GI”编号。GI编号，或者“基因信息识别号”(GenInfo Identifier)是NCBI将序列加入其数据库时，连续对每一序列记录指定的一串数字。GI编号与序列记录登录号没有相似之处。序列更新(如纠正或加入更多注释或信息)后，将接受新GI编号。因此与给定GI编号相关的序列是不变的。

除非另有说明，包括混合两种或多种组分的步骤的过程不要求任何特定的混合顺序。因此，可以任何顺序对组分进行混合。在有三种组分时，可将两种组分相互合并，然后可将合并的组分再与第三种组分混合等。

将动物(特别是牛)材料用于培养细胞时，其应获自未患传染性海绵状脑病(TSE)，特别是未患牛海绵状脑病(BSE)的来源。总之，优选在完全不含动物来源材料的情况下培养细胞。

在将化合物作为组合物的一部分给予机体时，该化合物可被合适的前药所替代。

当细胞底物用于重组或反向遗传学方法时，优选批准用于人类疫苗生产的细胞底物，例如Ph Eur(《欧洲药典》)总纲5.2.3所述的细胞底物。

优选通过MPSRCH程序(牛津分子科技公司(Oxford Molecular))执行的Smith-Waterman同源性搜索算法，利用仿射缺口搜索测定多肽序列之间的相同性，其中参数为缺口开放罚分＝12、缺口延伸罚分＝1。

附图简要说明

图1显示了用未加佐剂(0.5或1μg HA剂量)或添加MF59佐剂(0.5μg)的H1N1sw抗原免疫接种后获得的HI效价。还使用了PBS对照。黑色柱显示一次免疫后的效价；灰色柱显示两次免疫后的效价。

图2显示了用各种初次/增强方案免疫的雪貂中的肺病毒负荷。下文描述了动物组A-H。y轴显示Log₁₀TCID₅₀/gr。图3显示了同一雪貂中鼻病毒负荷，y轴显示log₁₀CDU。图4显示了相同雪貂中的HI效价。

图5显示了用季节性H1N1(布里斯班(Brisbane))在初免小鼠内经两次H1N1sw增强剂量后的IgG血清抗体效价(ELISA)。标出了初免和增强毒株和加入佐剂。

实施本发明的具体实施方式

雪貂研究

参考文献109报导了用于研究流感病毒的雪貂模型。用添加佐剂(含鲨烯的水包油乳液，MF59^TM)或未加佐剂的季节性疫苗，或用PBS初免雪貂。三周后(第21日)，这些雪貂接受增强剂量的添加佐剂或未加佐剂的季节性或单价流行性(‘H1N1sw’)疫苗或PBS。总共使用了8组动物A-H：

组

A

B

C

D

E

F

G

H

初免

S，A

S

PBS

增强

S，A

sw

sw，A

S

sw

sw，A

PBS

S＝季节性，sw＝猪，A＝佐剂化

在第49日，接着用H1N1sw株(10⁶TCID₅₀)攻击雪貂，评估各组中的肺发病。与仅感染鼻和气管的季节性H1N1不同，H1N1sw病毒还感染肺。H1N1sw病毒对于雪貂不致命。

影响的肺间充质的平均％为：

组	A	B	C	D	E	F	G	H
									％	13.3	6.7	3.3	15.8	7.5	6.7	3.3	48.3

因此，与PBS组相比，先前用添加或不添加佐剂的季节性疫苗初免且然后用同源季节性或H1N1sw增强的全部雪貂的肺病变都显著减弱。当增强剂量为H1N1sw，而且初免和增强疫苗都添加佐剂(组C)时，观察到最佳效果。单剂的佐剂化H1N1sw，甚至不初免时都获得相似保护力。

还评估了肺病毒负荷，结果如图2所示。与PBS相比，一剂佐剂化H1N1sw疫苗使肺病毒负荷减少2-3个对数级(比较组G和H)。如果在H1N1sw免疫之前先施用未添加佐剂的季节性流感疫苗，肺中的病毒负荷减少到几乎不可检测的水平(组F)，如果先前的季节性疫苗中添加佐剂，所述病毒负荷为不可检测水平(组C)。

还用鼻拭子评估了病毒负荷(图3)。与PBS相比，一剂佐剂化H1N1sw疫苗而不是未加佐剂的疫苗，使鼻拭子中的病毒负荷减少1个对数级。如果H1N1sw接种前先用未加佐剂的季节性疫苗接种，可进一步减少鼻病毒负荷(组F)。如果H1N1sw接种前先用佐剂化季节性疫苗接种，鼻病毒负荷不可检测(组C)。喉拭子中发现了相似结果。

还在第49日测定了HI抗体反应(图4)。一剂佐剂化H1N1sw疫苗比未加佐剂的H1N1sw疫苗更有免疫原性。在先用佐剂化季节性疫苗免疫的雪貂中，针对H1N1sw病毒的HI效价增加了至少一个对数级。

还评估了针对季节性H1N1和H3N2季节性毒株的HI抗体反应。HI没有检测到在季节性H1N1和H1N1sw之间交叉反应的抗体。

因此，根据肺、鼻和喉中的病毒负荷测定，一剂佐剂化H1N1sw疫苗比未加佐剂的疫苗具有更强的免疫原性和更高的功效。先前用季节性流感疫苗免疫能同时增强免疫原性和效力，如果季节性疫苗中加入佐剂，这种效果更好。这种免疫原性和效力的增强似乎并不是由于季节性H1N1和H1N1sw之间的抗体交叉反应(通过HI)。

这些结果可解释为什么可对年长者提供更好保护抵御H1N1sw病毒，尽管抗体的交叉反应性少。它们也解释了临床实验的初步结果，显示了在健康成人中一剂后的良好反应，而该效果可能是由于用季节性病毒的先前免疫实验(通过天然感染或接种)，虽然抗体的交叉反应性少或没有。该结果也提示，在佐剂存在下且如果病人先前用佐剂化季节性疫苗免疫过，能够实现更好的H1N1sw保护。数据提示，无免疫力的个体(例如儿童)和免疫脆弱的个体可能需要一剂以上的佐剂化H1N1sw疫苗，以获得最佳和持续的保护力，即使一剂也仍然是临床有用的。

该雪貂研究的更多细节如参考文献110所述。

小鼠研究I

在小鼠中进行的免疫原性研究清楚显示了H1N1sw疫苗中使用水包油乳液佐剂的益处。在未初免小鼠中，在没有任何先前接触流感抗原的情况下，单剂添加乳液佐剂的H1N1sw疫苗产生了和人中的保护相关的HI效价。.然而不加佐剂需要两剂来达到该效价。因此，用单剂佐剂疫苗也可实现人(甚至儿童)的保护。相反，1976年的猪流感疫苗对于儿童和年轻人都需要两剂。另外，因为佐剂甚至能在未初免个体中实现单剂免疫，已经接触流感的个体(例如一般的成人群体)也应该只需要单剂佐剂疫苗就可实现强烈反应。

从在鸡蛋中生长的H1N1sw A/加利福尼亚/07/2009H1N1样病毒制备疫苗。疫苗中不添加佐剂，或添加包含鲨烯(MF59^TM)的水包油乳液佐剂。用SRID对疫苗定标，其中HA剂量为0.5μg或1μg。在第0日，用磷酸盐缓冲盐水与单独的0.5或1.0μg(HA含量)抗原，或用0.5μg抗原与50μl佐剂，肌肉内免疫6-7周龄的Balb/c小鼠。剂量体积为100μl。第13日获得血清。在第14日用与第一剂匹配的第二剂增强免疫小鼠。在第21日再次收集血清。用针对抗原的灭活全病毒和火鸡红血球通过血凝抑制(HI)测定血清。

用0.5μg佐剂抗原一次免疫在免疫后2周所得血清中引起平均功能性抗体(HI)效价为1∶63(图1)。1∶40或更高的HI效价与保护人抵御季节性流感相关[111]。两周后用佐剂疫苗第二次免疫，使得增强免疫后一周所得血清中的平均HI效价提高到1∶1280。用无佐剂的抗原一次免疫不能引起显著HI效价，但两周后第二次免疫引起了1∶160的HI效价。用0.5μg或1.0μg未加佐剂的抗原免疫引起的效价没有显著差异。

这些数据与针对其它可能的流行性流感毒株的疫苗免疫人获得的结果一致。不加佐剂时，针对H5禽流感毒株的疫苗引起的抗体效价低；MF59大大提高了引发抗体的迅速程度、效价、和广度[112，113]。在1976年猪源流感一次小得多的人类爆发中，佐剂疫苗尚不可得。单剂的1976年疫苗在年轻人中引发的抗体效价小，但是在年长个体中引发显著较高的效价，可能是由于年长的对象已经经历了多次初次流感感染或免疫[114]。

小鼠免疫的数据支持包含佐剂如在H1N1sw流行性免疫接种活动中的MF59，特别是用于先前很少或没有接触过流感感染或免疫接种的儿童和年轻人。这些个体在目前的流行中特别脆弱，容易发病和死亡[115]。使用添加MF59佐剂的大流行抗原，对未经免疫的小鼠给予单剂引起了与保护人抵御季节性流感相关的抗体反应；不用佐剂就需要两剂。在该研究中，0.5-1μg未加佐剂的抗原没有观察到剂量反应。小鼠中的该发现增加了这样的可能性，即增加可用剂量数目的节约剂量方案可能在人临床实验中证明是有效的。

小鼠研究II

用季节性H1N1(A/布里斯班/59/2007；0.2μg HA剂量)单价疫苗(含或不含MF59佐剂)初免的小鼠可用从大流行H1N1sw毒株(A/加利福尼亚/04/2009血凝素)制备的相同疫苗或等效单价疫苗(也是含或不含MF59佐剂)增强免疫两次(第36日和第66日)。

免疫应答的ELISA分析(图5)提示先前的季节性佐剂疫苗接种有效引发了小鼠对H1N1sw疫苗的更高效价反应，如果H1N1sw疫苗不含佐剂，这种引发尤其重要。在未初免的小鼠或用未加佐剂的季节性H1N1初免的小鼠中，只有在H1N1sw疫苗添加了佐剂时才观察到高效价应答。

因此，对于强烈免疫应答，H1N1sw疫苗中添加佐剂似乎是重要的。另外，佐剂化对于用季节性疫苗引发对大流行疫苗的强抗体反应也是重要的。

总体上，用两剂未加佐剂的大流行疫苗免疫在未初免小鼠或在用未加佐剂的季节性疫苗初免的小鼠中引起的功能性抗体少。然而在用季节性佐剂疫苗初免的小鼠中，两剂未加佐剂的大流行疫苗提供了良好反应。小鼠对两剂大流行佐剂疫苗反应强烈，无论它们是否经过初免。虽然季节性佐剂疫苗不能有效引发针对大流行毒株的抗体，它们可引发对大流行疫苗的较高效价反应。这些数据支持将水包油佐剂用于大流行免疫接种和季节性活动以使人群为大流行免疫接种做准备。

小鼠研究III

三组40只的6周龄雌性BALB/c小鼠接受肌肉内注射单剂三价季节性疫苗，所述疫苗来自2005/06季或2009/10季(都在北半球)。未经流感攻击的对照小鼠接受PBS。在第0日施用1/10人剂量(1.5μgHA/毒株)的疫苗。在第40日将小鼠分成四小组，每组10只，重新用单价灭活的H1N1sw疫苗接种。4组接受含或不含亚微米水包油乳液佐剂的高或低剂量(3μg HA或0.3μg HA)，佐剂含有鲨烯与去水山梨糖醇油酸酯、聚氧乙烯十六十八醚和甘露醇的组合。然后，全部动物在第61日接受第二剂H1N1sw。在第40、61、75和102日评估针对季节性和大流行H1N1毒株的HI抗体的存在。该小鼠研究的全部细节如参考文献116所示。

结果证实一次注射H1N1sw疫苗足够诱导达到保护性水平的HI抗体反应，不论加入佐剂与否。针对H1N1sw毒株的HI抗体效价(GMT)在所有组中＞40，除了用无佐剂疫苗(0.3μgHA)免疫的未经免疫小鼠组。

用先前的季节性流感免疫接种引发的抗体不和H1N1sw毒株交叉反应，但是用季节性流感疫苗初免确实能引发对无佐剂H1N1sw疫苗更高的抗体反应。相反，先前的季节性免疫接种似乎在小鼠中不影响佐剂化H1N1sw疫苗的免疫原性，这可能是由于佐剂疫苗在这些组中引起强烈初次应答。

总的说，小鼠研究III支持在人类中使用调配有水包鲨烯乳液的裂解病毒颗粒灭活H1N1sw疫苗。

Focetria^TM和Celtura^TM产品

用重组A型流感病毒H1N1毒株感染SPF鸡蛋(用于Focetria^TM)或MDCK细胞的悬浮培养物(用于Celtura^TM)，其中该毒株具有相较SEQ ID NO：3与SEQ IDNO：1更密切相关的血凝素。用已知技术培养病毒，然后收集和灭活，从纯化的病毒制备单价表面抗原疫苗。稀释纯化的抗原，然后与水包油乳液混合，该乳液含有亚微米鲨烯液滴(MF59^TM)，以提供用于Focetria^TM产品(每0.5ml单位剂量含有7.5μg血凝素)和Celtura^TM产品(每0.25ml单位剂量具有3.75μg血凝素)的散装疫苗。将产品装入注射器。因此，产品分布于预填充的注射器以用于注射。这两种单价佐剂化产品已被各国许可人用。

人类研究I(莱斯特，英国)

如参考文献117中所报导，从A/加利福尼亚/7/2009H1N1sw毒株制备单价表面抗原疫苗。疫苗毒株含有来自A/加利福尼亚/7/2001H1N1sw的HA、NA和PB1片段，以及来自A/PR8/8/34的其它5种片段。病毒在MDCK细胞中生长。用制备三价OPTAFLU^TM产品的方法制备病毒和抗原[118]。制备了两种疫苗：一种佐剂疫苗，其含有7.5μgHA和含亚微米鲨烯液滴的MF59水包油乳液；一种未加佐剂的疫苗，其含有溶于缓冲液的15μgHA。全部疫苗的体积为0.5ml。对于一些对象使用半剂量的佐剂疫苗(即0.25ml体积)。通过反相HPLC测定最终疫苗中的HA含量，因为不能获得SRID试剂。

175个对象分成7组。对象接受一剂(第0日)或相同的两剂(第0日，第7、14或21日)。这7组A-G如下(剂量；adj＝佐剂化的)：

在第0、14和21日评估免疫原性。在第21日施用剂量前立即通过中期评估测定免疫原性。因此，组A-C完成了它们的方案，而组D只接受一次7.5μg的佐剂化剂量。在该中间阶段未评估组E-G。通过血凝(HI)实验、几何平均效价(GMT)、几何平均比、血清转化(％)和血清保护(％)评估了抗体反应。还用微量中和(MN)以GMT、具有≥40(％)效价的个体比例或血清转化评估抗体反应。中期评估中通过HI测定的抗体反应如下：

中期评估中通过MN测定的抗体反应如下：

分别在14％和39％个体中通过HI实验(效价＞1∶8)和MN实验(效价＞1∶10)检测到了预免疫抗体，该频率与年龄和先前接受季节性疫苗无关。在第14日，用HI和MN实验测定的几何平均效价(GMT)在接受两次7.5μg佐剂化剂量的个体中比仅接受一剂的个体要高(比较组A-C和组D)，但各组间的效价没有显著差异。第21日时接受一剂或两剂的个体在效价上无显著差异。所有个体在21日时都具有超过1∶40的MN抗体效价。

因此，免疫应答在中间阶段一致，在给予一剂佐剂疫苗后的两周内产生对2009H1N1sw病毒的血清保护。根据不同计划给予一或两剂含有7.5μg HA的佐剂疫苗引发了强抗体效价。虽然双倍剂量(15μgHA)比一剂得到的抗体水平更高，但是在每组的至少80％个体中都得到了血清保护效价。

人类研究II

用在鸡蛋中生长的A/加利福尼亚/7/2009H1N1sw病毒制备单价灭活表面抗原疫苗。抗原稀释到HA浓度为30μg/ml，与MF59水包油乳液(含有柠檬酸盐缓冲液中的亚微米鲨烯液滴)混合得到HA浓度为15μg/ml的佐剂散料。将佐剂疫苗装填到注射器内，各0.5ml剂量，得到每0.5ml剂量含有7.5μgHA的疫苗。肌肉内施用佐剂疫苗(例如FOCETRIA^TM产品)，例如对三角肌或大腿前外侧施用。

人类研究III

对成年人志愿者(18-60岁)给予来自H1N1sw毒株的单价灭活裂解疫苗。病人接受佐剂化或未佐剂化疫苗。佐剂化疫苗含有5.25μgHA和含鲨烯(AS03)的亚微米水包油乳液；未佐剂化疫苗含有21μg HA。第0和21日给予疫苗。评估这些天中针对A/加利福尼亚/7/2009的HI效价，以及血清转化和血清保护。该人类研究的全部细节如文献119所示。

疫苗被良好耐受，免疫原性结果如下：

	佐剂化	未佐剂化
			第0日	GMT	10.6	11.7
血清保护	12.5％	13.1％
			第21日	GMT(提高倍数)	541.7(51.3)	530.5(45.3)
血清保护	98.2％	98.4％
				血清转化	98.2％	95.1％

如此佐剂化和未佐剂化疫苗在成人中都具有免疫原性，一剂5.25μgHA(佐剂化)或21μgHA(未佐剂化)都足以满足颁发许可的条件。仅有1/4抗原的佐剂化疫苗诱导了与未佐剂化疫苗相当的免疫应答。

人类研究IV

对人对象(成人或老人)在与施用三价(3x15μg HA)2009/10季节性疫苗(佐剂化或未佐剂化)同时或三个月后施用佐剂化单价H1N1sw疫苗(7.5μg HA；FOCETRIA^TM)。全部疫苗都是灭活表面抗原疫苗，佐剂是含鲨烯的水包油乳液(MF59^TM)。在第1和22日通过血凝抑制评估全部疫苗的免疫原性，用病人日志监测安全性和反应原性。该人类研究的全部细节如参考文献120所示。

对于季节性接种3个月后的成人和老人对象，或同时接种季节性疫苗的成人来说，一剂佐剂化H1N1sw符合颁发许可的条件，而不影响这些疫苗的耐受性或免疫原性。

人类研究V：组合治疗

对患有末期肾病和正在长期透析的病人施用含有H1N1*血凝素的FOCETRIA^TM疫苗，其形式为每剂7.5μg的单价灭活表面抗原。疫苗包括含鲨烯的MF59^TM亚微米水包油乳液佐剂。一些病人还接受胸腺法新(胸腺素α1；以ZADAXIN^TM产品出售)，这是一种已知用于治疗肝炎病毒的肽。测试了两种不同剂量胸腺法新，进行随机化的三手开放标签研究。给予胸腺法新两次，第一次注射在接种前7日，第二次在接种日。所有在第21天未达到至少1∶40的抗体效价的个体在该日接受第2次接种。

与单独接受FOCETRIA^TM的个体比较，两个剂量都添加胸腺法新在接种后第21日和42日引起血清转化的个体百分数在统计学上显著增加。93％接受低剂量胸腺法新(3.2mg)的病人和94％接受高剂量(6.4mg)的病人在42日后实现了对H1N1*病毒的血清转化，而单独接受疫苗的病人只有77％。

人类研究VI

两个多中心随机化剂量范围的研究评估了6个月到17岁的健康儿童中的佐剂化(MF59)和未佐剂化鸡蛋衍生和细胞培养物衍生的单价H1N1sw疫苗。目标是鉴定健康儿童和青少年中优选的疫苗配方(含或不含佐剂)、剂量和方案(一或两次施用)。

在招募时，个体(i)分成4个年龄组，即9-17岁、3-8岁、12-35个月、和6-11个月；和(ii)随机分成三个疫苗组，即3.75μg HA+1/2剂MF59、7.5μg HA+全剂MF59或15μg不加佐剂的HA。9-17岁的儿童和6-11个月的婴儿仅接受佐剂化疫苗。个体隔21天接受2次接种。在鸡蛋或在MDCK细胞培养物(悬浮培养)中制备疫苗。

每次接种后通过血凝抑制(HI)测定免疫原性。计算接种前后HI效价的几何平均HI效价(GMT)和几何平均比(GMR)。还评估了血清转化率，即接种后HI≥1∶40和基线阴性(HI＜1∶10)的个体％，或基线阳性(HI≥1∶10)的个体中HI效价最少增加4倍。还评估了血清保护率(SP)，即HI滴度≥1∶40的个体^。

从3-8岁和9-17岁的个体(388名个体接受细胞衍生的疫苗，403名个体接受鸡蛋衍生的疫苗)获得了中间期表征。

接受细胞衍生疫苗的个体中的GMT和GMR值如下：

接受鸡蛋衍生疫苗的个体中的GMT和GMR值如下：

两个研究中佐剂化疫苗在9-17和3-8岁年龄组中第一次和第二次接种后3周具有≥70％的SP率。两个研究中的未佐剂化疫苗在3-8岁年龄组中第二次接种后3周具有≥70％的SP率。两个年龄组中的全部疫苗(3-17岁)在两个研究中的第一次和第二次接种后三周都具有≥40％的SC率。每剂三周后GMT显著提高，两组中全部疫苗的GMR都≥2.5。

佐剂化鸡蛋衍生的(FOCETRIA^TM)和细胞培养物衍生的(CELTURA^TM)疫苗在低于未佐剂化疫苗的HA剂量下诱导迅速且强烈的免疫应答。单剂的所有佐剂化疫苗的免疫原性都符合欧洲常规大流行流感疫苗条件(＞70％的个体具有≥1∶40的HI效价；血清转化＞40％，GMR＞2.5)。

人类研究VII(哥斯达黎加)

该研究的目的是确定佐剂化(MF59)或未佐剂化H1N1sw疫苗在儿科群体中施用后的安全性和抗体反应。用来自鸡蛋生长的病毒制备疫苗。个体分成两个年龄组(3-8岁儿童和9-17岁的青少年)，随机分成(a)一次7.5μg剂量的佐剂化疫苗，(b)一次15μg的未佐剂化剂量，或(c)30μg未佐剂化的剂量(2x15μg剂量)。三周后，个体接受MF-59佐剂化疫苗，其中含有7.5μg H5N1血凝素(表面抗原疫苗，鸡蛋衍生)。在第1日(免疫日)、第22日、第29日和第43日收集血样用于血清学测试。用血凝抑制(HI)评估针对H1N1疫苗抗原的抗体效价。计算抗血凝抑制抗体的几何平均效价(GMT)、血清转化(SC)率和HI效价≥1∶40的个体百分数。将SC率和≥1∶40的HI效价与现有的生物制品评价和研究中心(CBER)的监管标准作比较。SC率的95％CI下限应当为≥40％。HI效价≥1∶40的百分数的95％CI下限应当是≥70％。

招募了194名儿童和196名青少年。在第一剂(第22日)后，接受7.5μg佐剂化疫苗的儿童中93％达到了≥1∶40的HI效价，相比之下接受未佐剂化疫苗的为72-74％。3-8岁的儿童中接受佐剂化疫苗的SC率(第22日，91％)高于未佐剂化疫苗(71-72％)。第29日，全部接受7.5μg佐剂化疫苗的个体获得≥1∶40的HI效价；全部疫苗符合CBER标准。第2剂疫苗后的SC率在全部研究组中为83-95％。每次接种后GMT都升高，但是在给予7.5μg佐剂化疫苗的个体中更强烈，特别是在儿童中。

全部三种H1N1疫苗在2剂疫苗内都在儿科群体中产生高HI抗体反应，但是在1剂后仅佐剂化疫苗实现符合CBER免疫原性标准的HI抗体反应。与未佐剂化疫苗相比，即使在佐剂化疫苗中用较低的总抗原剂量(7.5μg)都符合这些标准。

人研究VIII(美国)

进行剂量范围研究，评估儿科群体中含或不含水包油佐剂(MF59)的单价H1N1sw疫苗的最佳剂量。招募了总共1357名3岁-小于9岁的健康儿童。将儿童随机等分成8组，第1日和第22日肌肉内注射疫苗。疫苗配制成3.75、7.5、15或30μgHA，含有或不含全或半剂量MF59。

在第22日和第43日评估了根据CBER标准的免疫原性(HI实验)[HI效价≥1∶40(95％CI下限≥70％)和血清转化率(95％CI下限≥40％)]。血清转化定义为接种前HI效价＜1∶10，接种后效价≥1∶40，或接种前HI效价≥1∶10而接种后效价增加≥4倍。HI抗体反应表示成几何平均效价(GMT)和接种后相对接种前效价的几何平均比(GMR)。在各组之间两两比较GMT比，对非劣效界值0.5和随后的0.67评估95％CI。如果GMT比左右双侧95％CI不含1，认为各疫苗组之间差异在统计学上显著，显示统计学显著的优势或劣势。

GMT和GMR结果如下所示：

各组中的基线血清阳性率(HI效价≥10)相当(18％-27％)。全部佐剂化组在一剂后满足HI效价≥1∶40标准，而未佐剂化组仅在两剂后满足血清保护标准。全部疫苗组中的个体(除了未佐剂化的7.5μg组)在1剂后满足血清转化标准，全部组在两剂后都满足该标准。用双侧95％CI群体两两比较第22日时的GMT，显示所有佐剂化疫苗优于未佐剂化疫苗。佐剂化组在一剂后符合许可标准，而用7.5μg抗原和半剂量MF59佐剂的疫苗剂量显示明显优越的反应。

应理解，仅以举例的方式描述了本发明，可对之进行修改而仍在本发明的范围和构思内。

参考文献

[1]WO96/37624.

[2]WO98/46262.

[3]WO95/18861.

[4]Bright等(2008)PLoS ONE 3：e 1501.

[5]Crevar & Ross(2008)病毒杂志(Virology Journal)5：131.

[6]疫苗(Plotkin & Orenstein编，第四版，2004，ISBN：0-7216-9688-0.

[7]WO02/28422.

[8]WO02/067983.

[9]WO02/074336.

[10]WO01/21151.

[11]WO02/091998.

[12]WO2005/113756.

[13]Huckriede等(2003)酶学方法(Methods Enzymol)373：74-91.

[14]GenBank序列GI：325176.

[15]McCullers等(1999)病毒学杂志(J Virol)73：7343-8.

[16]GenBank序列GI：325237.

[17]Herlocher等(2004)感染性疾病杂志(J Infect Dis)190(9)：1627-30.

[18]Gambaryan和Matrosovich(1992)病毒学方法杂志(J Virol Methods)39(1-2)：111-23.

[19]Mastrosovich等(1999)病毒学杂志(J virol)73：1146-55.

[20]Stevens等，(2006)分子生物学杂志(J Mol Biol)355：1143-55

[21]Couceiro & Baum(1994)Mem Inst Oswaldo Cruz 89(4)：587-91

[22]Kitikoon等，(2009)疫苗(Vaccine)doi：10.1016/疫苗杂志(j.vaccine).2009.09.130.

[23]Hoffmann等，(2002)疫苗20：3165-3170.

[24]Subbarao等，(2003)病毒学(Virology)305：192-200.

[25]Liu等，(2003)病毒学(Virology)314：580-590.

[26]Ozaki等，(2004)病毒学杂志(J Virol)78：1851-1857.

[27]Webby等，(2004)柳叶刀(Lancet)363：1099-1103.

[28]WO00/60050.

[29]WO01/04333.

[30]US 6649372

[31]WO2007/002008.

[32]Neumann等，(2005)美国科学院院刊(Proc Natl Acad Sci)USA102：16825-9

[33]WO2006/067211.

[34]WO01/83794.

[35]Hoffmann等，(2000)病毒学(Virology)267(2)：310-7.

[36]WO97/37000.

[37]Brands等，(1999)标准发育生物学(Dev Biol Stand)98：93-100.

[38]Halperin等，(2002)疫苗(Vaccine)20：1240-7.

[39]Tree等，(2001)疫苗(Vaccine)19：3444-50.

[40]Kistner等，(1998)疫苗(Vaccine)16：960-8.

[41]Kistner等，(1999)标准发育生物学(Dev Biol Stand)98：101-110.

[42]Bruhl等，(2000)疫苗(Vaccine)19：1149-58.

[43]Pau等，(2001)疫苗(Vaccine)19：2716-21.

[44]WO03/076601

[45]WO2005/042728.

[46]WO03/043415.

[47]WO01/85938.

[48]WO2006/108846.

[49]EP-A-1260581(WO01/64846).

[50]WO2006/071563.

[51]WO2005/113758.

[52]WO2006/027698.

[53]WO03/023021

[54]WO03/023025

[55]WO97/37001.

[56]WO01/22992.

[57]Hehme等，(2004)病毒研究(Virus Res.)103(1-2)：163-71.

[58]Treanor等，(1996)感染性疾病杂志(J Infect Dis)173(1467).

[59]Keitel等，(1996)临床诊断实验免疫学(Clin Diagn Lab Immunol)3：507-10

[60]Zangwill等，(2008)临床感染病杂志(J Infect Dis.)197(4)：580-3.

[61]Lundblad(2001)生物技术和应用生物化学(Biotechnology and AppliedBiochemistry)34：195-197.

[62]Guidance for Industry：Bioanalytical Method Validation.(《工业指南：生物统计学方法认证》)美国卫生和公共服务部，食品和药品管理局药物评估和研究(CDER)的兽药中心(CVM)，2001年5月。

[63]Ji等，(2002)生物技术(Biotechniques).32：1162-7.

[64]Briggs(1991)胃肠外科学技术杂志(J Parenter Sci Technol)45：7-12.

[65]Lahijani等，(1998)人类基因治疗(Hum Gene Ther.)9：1173-80.

[66]Loksteff等，(2001)生物(Biologicals.)29：123-32.

[67]EP B 0870508.

[68]US 5948410

[69]WO2007/052163

[70]WO96/14837.

[71]Podda & Del Giudice(2003)疫苗专家回顾(Expert Rev Vaccines)2：197-203

[72]Podda(2001)疫苗(Vaccine)19：2673-2680.

[73]Vaccine Design：The Subunit and Adjuvant Approach(《疫苗设计：亚基和佐剂法》，Powell和Newman编)普莱南出版公司(Plenum Press)1995(ISBN0-306-44867-X).

[74]Vaccine Adjuvants：Preparation Methods and Research Protocols(《疫苗佐剂：制备方法和研究方案》)(Methods in Molecular Medicine series(《分子药物方法丛书》第42卷)ISBN：1-59259-083-7.O’Hagan编

[75]Allison & Byars(1992)免疫学研究(Res Immunol)143：519-25.

[76]Hariharan等，(1995)癌症研究(Cancer Res)55：3486-9.

[77]US 2007/014805.

[78]WO95/11700.

[79]美国专利6,080,725.

[80]WO2006/113373.

[81]WO2005/097181.

[82]Han等，(2005)Impact of Vitamin E on Immune Function and InfectiousDiseases in the Aged(《维生素E对老年人免疫功能和感染性疾病的影响》)，Immunefunctions and Health EuroConference(欧洲营养、免疫功能和健康会议)，巴黎，2005年6月9-10日。

[83]US 6630161

[84]WO2007/052155

[85]WO2005/128939.

[86]WO2005/089837.

[87]美国专利6,692,468.

[88]WO00/07647.

[89]WO99/17820.

[90]美国专利5,971,953.

[91]美国专利4,060,082.

[92]EP-A-0520618

[93]WO98/01174

[94]Gennaro(2000)Remington：The Science and Practice of Pharmacy(《雷明顿：药物科学和实践》)，第20版，ISBN：0683306472.

[95]Banzhoff(2000)免疫学通信(Immunology Letters)71：91-96.

[96]Nony等，(2001)疫苗(Vaccine)27：3645-51.

[97]Poole & Mussett(1989)生物学标准杂志(J Biol Stand)17：161-71.

[98]Poole等，(1997)内毒素研究杂志(J.Endotoxin Res)4：221-31

[99]Potter和Oxford(1979)英国医学公报(Br Med Bull)35：69-75.

[100]Greenbaum等，(2004)疫苗(Vaccine)22：2566-77.

[101]Zurbriggen等，(2003)疫苗专家回顾(Expert Rev Vaccines)2：295-304.

[102]Piascik(2003)美国药物学协会杂志(J Am Pharm Assoc)(华盛顿特区).43：728-30.

[103]Halperin等，(1979)美国公共健康杂志(Am J Public Health)69：1247-50.

[104]Herbert等，(1979)感染性疾病杂志(J Infect Dis)140：234-8.

[105]Mann等，(2004)疫苗(Vaccine)22：2425-9.

[106]Chen等，(2003)疫苗(Vaccine)21：2830-6.

[107]疾病控制和预防中心，(2009)MMWR 58：521.

[108]Ershler等，(2007)纽约科学院记事(Ann N Y Acad Sci.)1112：375-84.

[109]Munster等，(2009)科学杂志325：481-3.

[110]Giudice等，(2009)科学转化医学(Sci Transl Med.)1：12re1

[111]de Jong等，(2003)发展生物学(Dev Biol)(Basel)115：63

[112]Galli等，(2009)PNAS USA 106：7962.

[113]Stephenson等，(2003)疫苗(Vaccine)17：2951-2958.

[114]Dolin等，(1977)感染性疾病杂志(J.Infect.Dis.)136增刊S435.

[115]世界卫生组织(2009)每周流行病记录(Weekly Epidemiol.Rec.)84：249.

[116]Caillet等，(2010)疫苗(Vaccine)28：3076-9.

[117]Clark等，(2009)NEJM 361(10.1056/NEJMoa0907650).

[118]Doroshenko和Halperin(2009)疫苗专家回顾(Expert Rev Vaccines)8：679-88.

[119]Roman等，(2010)疫苗(Vaccine)28：1740-45.

[120]Gasparini等，(2009)国际临床实践杂志(Int J Clin Pract.)12月(17)

[121]US-6630161.

Claims

1.一种免疫人类的方法，包括步骤：对病人施用疫苗，所述疫苗含有(i)与SEQID NO：1较SEQ ID NO：3更密切相关的A型流感病毒H1亚型的血凝素，和(ii)水包油乳液佐剂。

2.一种免疫原性组合物，包含(i)与SEQ ID NO：1较SEQ ID NO：3更密切相关的A型流感病毒H1亚型的血凝素，和(ii)水包油乳液佐剂。

3.如权利要求2所述的组合物，其特征在于，所述组合物是单价疫苗。

4.如权利要求2或权利要求3所述的组合物，其特征在于，所述血凝素包含与SEQ ID NO：2具有至少90％序列相同性的氨基酸序列。

5.如权利要求2-4中任一所述的组合物，其特征在于，所述水包油乳液佐剂包含鲨烯，液滴直径小于250nm。

6.如权利要求2-5中任一所述的组合物，其特征在于，所述组合物具有约7.5或约15μg/ml的血凝素浓度。

7.如权利要求2所述的组合物，其特征在于，所述组合物是三价疫苗，所述疫苗还包含A型流感病毒H3N2血凝素和B型流感病毒血凝素。

8.一种免疫原性组合物，所述组合物包含A型流感病毒的两种不同H1亚型血凝素和水包油乳液佐剂，其中(i)第一A型流感病毒H1亚型血凝素与SEQ IDNO：1较SEQ ID NO：3更密切相关，和(ii)第二A型流感病毒AH1亚型血凝素与SEQ ID NO：3较SEQ ID NO：1更密切相关。

9.如权利要求8所述的组合物，其特征在于，所述组合物还包含(iii)A型流感病毒H3N2血凝素和(iv)B型流感病毒血凝素。

10.如权利要求8所述的组合物，其特征在于，所述组合物还包含(iii)A型流感病毒H3N2血凝素，(iv)B/维多利亚/2/87样B型流感病毒血凝素；和(v)B/山方/16/88样B型流感病毒血凝素。

11.一种免疫人类抵抗流感病毒的方法，包括步骤：(i)对病人施用单价疫苗，所述单价疫苗含有A型流感病毒H1亚型血凝素和(ii)对病人施用三价A/H1N1-A/H3N2-B季节性流感病毒；其中(a)所述单价疫苗包含与SEQ ID NO：1较SEQ ID NO：3更密切相关的A型流感病毒H1亚型血凝素，和(b)所述三价疫苗包含相较SEQ ID NO：3与SEQ ID NO：1更密切相关的A型流感病毒H1亚型血凝素，(c)所述单价疫苗包含水包油佐剂，和(d)所述三价疫苗包含水包油乳液佐剂。

12.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述单价疫苗在三价疫苗之前至少4周施用。

13.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述单价疫苗在三价疫苗之后至少4周施用。

14.A型流感病毒H1亚型血凝素在制备免疫人类的单价疫苗中的应用，其中所述疫苗包含水包油乳液佐剂，其中所述单价疫苗包含与SEQ ID NO：1较SEQID NO：3更密切相关的A型流感病毒H1亚型血凝素。

15.如权利要求14所述的应用，其特征在于，所述人类先接受三价A/H1N1-A/H3N2-B季节性流感疫苗，和其中所述三价疫苗包含相较SEQ ID NO：3与SEQ ID NO：1更密切相关的A型流感病毒H1亚型血凝素。

16.如前述任一权利要求所述的方法、组合物或应用，其特征在于，所述乳液包含具有亚微米直径的液滴，其中所述乳液包含鲨烯。

17.一种疫苗，所述疫苗包含从至少两种不同流感病毒株获得的血凝素，其中第一血凝素是从在鸡蛋中培养的流感病毒制备的，所述第二血凝素是从在细胞培养物中生长的流感病毒制备的，其中所述第二血凝素相较SEQ ID NO：3与SEQ IDNO：1更密切相关。

18.如权利要求17所述的疫苗，其特征在于，所述细胞培养物是MDCK细胞培养物。

19.一种免疫原性组合物，所述组合物包含(i)重组宿主中表达的纯化的A型流感病毒H1亚型血凝素，其中所述H1血凝素相较SEQ ID NO：3与SEQ ID NO：1更密切相关，和(ii)水包油乳液佐剂。

20.如权利要求19所述的组合物，其特征在于，所述血凝素用杆状病毒载体在昆虫细胞中表达。

21.如权利要求19或权利要求20所述的组合物，其特征在于，所述组合物包含重组流感病毒神经氨酸酶。

22.一种免疫接种个体的方法，所述方法包括对个体施用两个独立剂量的流感疫苗，其中(a)所述两个剂量分隔1-6周施用，(b)每种疫苗含有一种A型流感病毒H1亚型血凝素，所述血凝素相较SEQ ID NO：3与SEQ ID NO：1更密切相关，和(c)所述个体在接受两个疫苗剂量之间至少接受神经氨酸酶抑制剂如磷酸奥塞米韦3次。

23.如权利要求22所述的方法，其特征在于，所述施用的疫苗之一或两者包含水包油乳液佐剂。