CN101784283A - 低添加流感疫苗 - Google Patents

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Abstract

缺少以下组分中至少三种的流感疫苗：汞防腐剂；抗生素；甲醛；和鸡蛋衍生的物质。在一些实施方式中，所述疫苗不含这四种组分。

Description

低添加流感疫苗
技术领域
本发明属于提供保护免遭流感病毒感染的疫苗，特别是含有低水平的药物添加剂的疫苗领域。
背景技术
目前有各种形式的流感病毒疫苗可用(参见，例如参考文献1的第17和18章)。疫苗通常基于活病毒或灭活的病毒。灭活的病毒可以基于完整的病毒颗粒、“裂解的”病毒颗粒或纯化的表面抗原。
除了它们的抗原性内含物外，目前的疫苗也包含各种形式的药物添加剂和其他污染物，例如抗菌防腐剂，如硫柳汞；洗涤剂，如CTAB、聚山梨醇酯80、辛苯聚醇10等；抗生素，如新霉素、卡那霉素；甲醛；和鸡蛋衍生的物质，包括鸡蛋蛋白质(如卵清蛋白)和鸡DNA。
例如，对于2006/07季，美国使用的四种灭活疫苗的生产商数据表揭示了以下信息：
  疫苗   防腐剂   抗生素   甲醛   鸡蛋物质
  FluarixTM   硫柳汞   庆大霉素   有   有
  FluvirinTM   硫柳汞   无   无   有
  FluzoneTM   任选的硫柳汞   无   有   有
  FluLavalTM   硫柳汞   无   有   有
与FluvirinTM 2006-07产品相似，参考文献2制备了不含甲醛，但含有硫柳汞和鸡蛋产物的疫苗。
本发明的目的是提供进一步改良的流感疫苗和它们的制备方法，所述疫苗中这些药物添加剂的含量和/或数量降低或消除，从而得到更纯的疫苗产品。
发明内容
本发明的流感疫苗缺乏以下成分中的至少三种组分：汞防腐剂；抗生素；甲醛；和鸡蛋衍生的物质。在一些实施方式中，疫苗不含这四种组分。
因此，在一个实施方式中，本发明提供包含流感病毒抗原的疫苗，其中所述疫苗不含汞防腐剂，不含抗生素以及不含鸡蛋-衍生的物质。
优选不含甲醛的疫苗。因此，本发明提供包含流感病毒抗原的疫苗，其中所述疫苗不含汞防腐剂、不含抗生素以及不含甲醛。本发明还提供包含流感病毒抗原的疫苗，其中所述疫苗不含抗生素、不含甲醛以及不含鸡蛋-衍生的物质。
本发明还提供包含流感病毒抗原的疫苗，其中所述疫苗不含汞防腐剂、不含抗生素、不含甲醛以及不含鸡蛋-衍生的物质。
优选疫苗还应具有极低水平的内毒素，例如低于0.1IU/ml，优选低于0.05IU/ml。内毒素测量的国际单位是熟知的，可通过例如与国际标准[3，4]，如从NIBSC获得的2nd International Standard(第二国际标准)(代码94/580-IS)比较来计算样品的内毒素国际单位。目前从鸡蛋培养病毒制备的疫苗的内毒素水平为0.5-5IU/ml。
本发明还提供制备流感病毒抗原的方法，包括以下步骤：(i)没有鸡蛋-衍生物质和抗生素存在下，在细胞培养体系中培养流感病毒；(ii)在没有甲醛存在下，灭活步骤(i)所培养的流感病毒；和(iii)在没有硫柳汞存在下，从该灭活的流感病毒制备疫苗抗原制剂。得到的抗原制剂可以是能用于制备单价或多价疫苗的散装疫苗抗原。
抗原组分
本发明利用从流感病毒颗粒制备的流感病毒抗原。
不利用甲醛灭活病毒颗粒。灭活病毒的化学方法包括用有效量的以下一种或多种试剂处理：洗涤剂、β-丙内酯、或紫外光。灭活的其它化学方法包括用亚甲蓝、补骨脂素、羧基富勒烯(C60)或它们的任何组合处理。本领域已知病毒灭活的其它方法，例如二乙胺、乙酰乙烯亚胺、或γ射线。
可通过各种方法从含病毒液体收获病毒颗粒。例如，纯化方法可包括用线性蔗糖梯度溶液(含有洗涤剂以破坏病毒颗粒)进行区带离心。任选稀释后，可通过渗滤纯化抗原。
用洗涤剂(如乙醚、聚山梨醇酯80、脱氧胆酸盐、三正丁基磷酸盐、曲通X-100、曲通N101、溴化十六烷基三甲铵、Tergitol NP9等)处理纯化的病毒颗粒可获得裂解病毒颗粒，从而产生亚病毒颗粒制剂，包括“吐温-醚”裂解方法。裂解流感病毒的方法是本领域熟知的，例如参见参考文献5-10等。一般使用破坏浓度的裂解剂使得完整病毒破坏或断裂来裂解病毒，无论该病毒有无感染性。这种破坏导致病毒蛋白的完全或部分溶解，改变病毒的完整性。优选的裂解剂是非离子型和离子型(例如阳离子型)表面活性剂，如烷基糖苷、烷基硫苷、酰基糖、磺基甜菜碱、甜菜碱、聚氧乙烯烷基醚、N，N-二烷基-葡糖酰胺、Hecameg、烷基苯氧基-聚乙氧基乙醇、NP9、季铵化合物、肌氨酰、CTAB(溴化十六烷基三甲铵)、三正丁基磷酸酯、塞塔隆(Cetavlon)、十四烷基三甲铵盐、脂质转染试剂、利非他明(lipofectamine)和DOT-MA、辛基-或壬基苯氧基聚氧乙醇(如曲通表面活性剂，如曲通X-100或曲通N101)、聚氧乙烯去水山梨糖醇酯(吐温表面活性剂)、聚氧乙烯醚、聚氧乙烯酯等。一种有用的裂解方法利用脱氧胆酸钠和甲醛的连续作用，并且裂解可在病毒颗粒初始纯化期间发生(例如在蔗糖密度梯度溶液中)。可将裂解的病毒颗粒重悬于磷酸钠缓冲的等渗氯化钠溶液中。
纯化的表面抗原疫苗包含流感表面抗原血凝素，一般还包含神经氨酸酶。制备纯化形式的这些蛋白质的方法是本领域熟知的。
流感抗原也可以病毒体(无核酸的病毒样脂质体颗粒)的形式存在[11]，例如INFLEXAL VTM和INVAVACTM产品，
可使流感病毒减毒。流感病毒可以是温度敏感型。流感病毒可以是冷适应性病毒。然而，这三种特征与活病毒疫苗更相关。
用于疫苗的人流感病毒毒株随季节而变。在目前的大流行间期，疫苗一般包括两种甲型流感毒株(H1N1和H3N2)和一种乙型流感毒株，一般是三价疫苗。本发明也可采用大流行毒株(即疫苗接受者和普通人群从未与其发生过免疫接触的毒株)，如H2、H5、H7或H9亚型毒株(特别是甲型流感病毒)的HA，大流行毒株的流感疫苗可以是单价疫苗，或者可以基于补充有大流行毒株的正常三价疫苗。然而，根据季节和疫苗中所含抗原的特性，本发明可保护免受HA亚型H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15或H16(甲型流感病毒)中一种或多种亚型的感染。本发明可保护免受甲型流感病毒NA亚型N1、N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8或N9中一种或多种亚型的感染。
本发明组合物不仅适用于免疫大流行间期的免疫，尤其适用于对大流行毒株的免疫。可能引起大流行爆发的流感毒株的特征是：(a)与目前流行的人毒株中的血凝素相比，它含有新的血凝素，即有数十年没在人群中发现的血凝素(如H2)，或者从未在人群中发现的血凝素(如通常只出现在鸟群体中的H5、H6或H9)，和/或与目前流行的人毒株中的神经氨酸酶相比，它含有新的神经氨酸酶，以至于人群未曾免疫接触过该毒株的血凝素和/或神经氨酸酶；(b)它能够在人群中水平传播；和(c)它能使人致病。含H5血凝素类型的病毒优选用于对大流行流感，如H5N1毒株的免疫。其它可能的毒株包括H5N3、H9N2、H2N2、H7N1和H7N7，以及任何其它可能出现的大流行毒株。在H5亚型中，病毒分为HA进化支1、HA进化支1’、HA进化支2或HA进化支3[12]，进化支1和3尤其相关。
其抗原可用于包含在组合物中的其它毒株是对抗病毒治疗有抗性(例如对奥塞米韦[13]和/或扎那米韦有抗性)的毒株，包括抗性大流行毒株[14]。
本发明组合物可包含一种或多种(如1、2、3、4或更多种)流感病毒毒株，包括甲型流感病毒和/或乙型流感病毒的抗原。可制备单价疫苗，也可制备2-价、3-价、4-价疫苗，等等。当疫苗包含一种以上流感毒株时，一般单独培养不同毒株，收获病毒后将它们混合在一起，然后制备抗原。因此，本发明方法可包括混合一种以上流感毒株的抗原的步骤，且该步骤可在非冷藏条件下进行。优选三价疫苗，其包含来自两种甲型流感病毒毒株和一种乙型流感病毒毒株的抗原。
在本发明的一些实施方式中，该组合物可包含来自一种甲型流感毒株的抗原。在一些实施方式中，该组合物可包含来自两种甲型流感毒株的抗原，前提是这两种毒株不是H1N1和H3N2。在一些实施方式中，该组合物可包含来自两种以上甲型流感毒株的抗原。
流感病毒可能是重配毒株，可通过反向遗传学技术获得该病毒。反向遗传学技术[如15-19]能够用质粒在体外制备含有所需基因组区段的流感病毒。该技术一般包括例如(a)由polI启动子表达编码所需病毒RNA分子的DNA分子，和(b)由polII启动子表达编码病毒蛋白的DNA分子，这两种类型的DNA在细胞中的表达导致组装成完整的感染性病毒颗粒。该DNA优选提供病毒的所有RNA和蛋白质，但也可能使用辅助病毒来提供一些RNA和蛋白质。优选采用不同质粒产生各病毒RNA的基于质粒的方法[20-22]，这些方法也包括使用质粒来表达所有或一些病毒蛋白(例如，仅PB1、PB2、PA和NP蛋白)，在一些方法中使用最多12种质粒。为了减少所需的质粒数量，近期方法[23]将多个RNA聚合酶I转录盒(用于合成病毒RNA)合并到同一质粒上(如编码1、2、3、4、5、6、7或所有8种甲型流感vRNA区段的序列)，并且将多个蛋白编码区与RNA聚合酶II启动子合并到另一个质粒上(如编码1、2、3、4、5、6、7或所有8种甲型流感mRNA转录物的序列)。参考文献23方法的优选方面包括：(a)PB1、PB2和PA mRNA编码区在一个质粒上；和(b)所有8个vRNA编码区段在一个质粒上。一个质粒上包含NA和HA区段而另外六个区段位于另一质粒上也可能是有利的。
作为使用polI启动子来编码病毒RNA区段的替换方式，可使用噬菌体聚合酶启动子[24]。例如，可方便地使用SP6、T3或T7聚合酶的启动子。由于polI启动子的物种特异性，噬菌体聚合酶启动子可能较适合许多细胞类型(如MDCK)，但也必须用编码外源性聚合酶的质粒转染细胞。
在其它技术中，可使用polI和polII双启动子由一个模板同时编码病毒RNA和可表达的mRNA[25，26]。
因此，病毒，特别是甲型流感病毒可包含来自A/PR/8/34病毒的一个或多个RNA区段(一般6个区段来自A/PR/8/34，HA和N区段来自疫苗毒株，即6∶2重配毒株)。也可包含来自A/WSN/33病毒，或用于产生疫苗制剂的重配病毒的任何其它毒株的一个或多个RNA区段。本发明一般保护免受能够在人之间传播的毒株的感染，因此该毒株的基因组通常包含起源于哺乳动物(如人)流感病毒的至少一个RNA区段。它可包含起源于禽流感病毒的NS区段。
如上所述，通常在细胞培养物上培养用作抗原来源的病毒，从而能避免含胚鸡蛋组分的污染。因此，本发明疫苗可不含鸡DNA以及不含鸡蛋蛋白质(例如，卵白蛋白或卵类粘蛋白)。
细胞底物一般是哺乳动物来源的细胞系。合适的哺乳动物细胞来源包括但不限于：仓鼠、牛、灵长动物(包括人和猴)和犬细胞。可采用各种细胞类型，例如肾细胞、成纤维细胞、视网膜细胞、肺细胞等。合适的仓鼠细胞的例子是称为BHK21或HKCC的细胞系。合适的猴细胞是(例如)非洲绿猴细胞，例如肾细胞，如Vero细胞系。合适的犬细胞是(例如)肾细胞，例如MDCK细胞系。因此，合适的细胞系包括但不限于：MDCK、CHO、293T、BHK、Vero、MRC-5、PER.C6、WI-38等。
用于培养流感病毒的哺优选乳动物细胞系包括：马-达二氏(MadinDarby)犬肾来源的MDCK细胞[27-30]；非洲绿猴(Cercopithecus aethiops)肾来源的Vero细胞[31-33]；或人胚视网膜母细胞来源的PER.C6细胞[34]。这些细胞系可由各种来源获得，例如美国典型培养物保藏中心(ATCC)[35]、Coriell细胞库[36]或欧洲细胞培养物保藏中心(ECACC)。例如，ATCC供应各种不同Vero细胞，目录号为CCL-81、CCL-81.2、CRL-1586和CRL-1587，还供应MDCK细胞，目录号为CCL-34。PER.C6可获自ECACC，保藏号96022940。作为哺乳动物细胞系的代替，可在禽细胞系[如参考文献37-39]，包括禽胚胎干细胞[37，40]和鸭(如鸭视网膜)或母鸡来源的细胞系上培养病毒。合适的禽胚胎干细胞包括衍生自鸡胚胎干细胞的Ebx细胞系、EB45、EB14和EB14-074[41]。也可使用鸡胚成纤维细胞(CEF)，等等。
用于培养流感病毒的最优选细胞系是MDCK细胞系。原始MDCK细胞系可购自ATCC(CCL-34)，但也可利用该细胞系的衍生细胞系。例如，参考文献27公开了适合悬浮培养的MDCK细胞系(’MDCK 33016’，保藏号DSM ACC2219)。类似地，参考文献42公开了在无血清培养基中悬浮培养的MDCK衍生细胞系(’B-702’，保藏号FERM BP-7449)。参考文献43公开了非致瘤性MDCK细胞，包括’MDCK-S’(ATCC PTA-6500)、’MDCK-SF101’(ATCC PTA-6501)、’MDCK-SF102’(ATCC PTA-6502)和’MDCK-SF103’(PTA-6503)。参考文献44公开了非常易于感染的MDCK细胞系，包括’MDCK.5F1’细胞(ATCCCRL-12042)。可使用任何这些MDCK细胞系。
细胞生长培养物，以及用于启动培养的病毒接种物优选不含(即经测试且得到阴性污染结果)单纯疱疹病毒、呼吸道合胞体病毒、副流感病毒3、SARS冠状病毒、腺病毒、鼻病毒、呼肠孤病毒、多瘤病毒、双RNA病毒、环病毒和/或细小病毒[45]。特别优选不存在单纯疱疹病毒。
可以在悬浮[27，46，47]或贴壁培养的细胞中培养病毒。在一个实施方式中，细胞可能适合悬浮培养。一种适合悬浮培养的MDCK细胞系是MDCK33016(保藏号DSM ACC 2219)。或者，可采用微载体培养。
优选在无血清培养基和/或无蛋白培养基中培养支持流感病毒复制的细胞系。在本发明中，如果培养基中没有人或动物来源的血清添加剂，则称为无血清培养基。无蛋白应理解为在不含蛋白质、生长因子、其它蛋白添加剂和非血清蛋白质的情况下发生细胞增殖的培养物，但可任选包含诸如胰蛋白酶和其它蛋白酶等病毒生长可能必需的蛋白质。在这类培养物中培养的细胞在天然情况下本身含有蛋白质。
在病毒复制过程中，支持流感病毒复制的细胞系优选在37℃以下[48](如30-36℃)培养。
在培养细胞中增殖病毒的方法通常包括以下步骤：用待培养的毒株接种培养的细胞，将感染细胞培养所需时间以使病毒增殖，例如通过病毒滴度或抗原表达来确定所需时间(如接种后24-168小时)，然后收获增殖的病毒。用1∶500-1∶1，优选1∶100-1∶5，更优选1∶50-1∶10的病毒(由PFU或TCID50测定)：细胞比接种培养的细胞。将病毒加入细胞悬液中，或施加于细胞单层，在25-40℃，优选28-37℃下，使病毒吸附于细胞至少60分钟，但通常小于300分钟，优选90-240分钟。可通过冻融或酶作用去除感染的细胞培养物(如单层)，以提高收获的细胞上清液的病毒含量。然后，可灭活或冷冻储存收获的液体。可以约0.0001-10、优选0.002-5、更优选0.001-2的感染复数(″m.o.i.″)感染培养的细胞。更优选地，以约0.01的m.o.i.感染细胞。可以在感染后30-60小时收获感染的细胞。优选在感染后34-48小时收获细胞。更优选在感染后38-40小时收获细胞。通常在细胞培养期间加入蛋白酶(一般是胰蛋白酶)，以使病毒释放，可以在培养的任何合适阶段加入蛋白酶。按照本发明，培养期间可避免抗生素。
目前参照一般由SRID测定的HA水平来标准化流感疫苗。现有疫苗一般含有约15μg HA/毒株，但较低剂量也可使用(例如，当用佐剂时)。采用了分数剂量如1/2(即7.5μg HA/毒株)、1/4和1/8[62，63]，以及较高剂量(如3x或9x剂量[49，50])。因此，疫苗可包含0.1-150μg HA/流感毒株，优选0.1-50μg，例如0.1-20μg、0.1-15μg、0.1-10μg、0.1-7.5μg、0.5-5μg等。具体剂量包括例如，约90、约45、约30、约15、约10、约7.5、约5、约3.8、约1.9、约1.5/毒株等。可选择本发明所述疫苗、试剂盒和方法的组分(例如，它们的体积和浓度)以在最终产品中提供这些抗原剂量。
本发明所用HA可以是天然HA，如病毒中发现的，或者可以是经修饰的。例如，已知修饰HA以去除决定簇(如HA1和HA2之间切割位点周围的超碱性区域(hyper-basic region))。
除了包含血凝素，本发明的组合物还可包含其它流感病毒蛋白。例如，它们通常包含神经氨酸酶糖蛋白。它们还可包含基质蛋白，如M1和/或M2(或其片段)，和/或核蛋白。
宿主细胞DNA
用细胞系培养病毒时，标准实践是最大程度减少最终疫苗中残留的细胞系DNA的含量，以尽可能降低这些DNA的致癌活性。因此，本发明组合物优选含有小于10ng(优选小于1ng，更优选小于100pg)残留的宿主细胞DNA/剂量，但可能存在痕量宿主细胞DNA。通常，需要从本发明组合物中排除的宿主细胞DNA是长度大于100bp的DNA。
现在，残留宿主细胞DNA的测定是生物制品的常规管理要求，并且在技术人员的普通能力范围内。用于测定DNA的实验一般是验证实验[51，52]。可通过数学和可以量化的术语来描述验证实验的性能特征，并鉴定可能的误差来源。通常测试该实验的某些特征，如精确性、准确性、特异性。一旦校正(例如用已知标准量的宿主细胞DNA校正)并检验了某个实验，则可按常规进行定量DNA测定。可采用三种DNA定量的基本技术：杂交方法，如Southern印迹或狭线印迹[53]；免疫测定法，如ThresholdTM系统[54]；和定量PCR[55]。本领域技术人员熟悉这些方法，但各方法的准确特征，例如杂交探针的选择、用于扩增的引物的和/或探针的选择等可能取决于所研究的宿主细胞。来自分子设备公司(Molecular Devices)的ThresholdTM系统是皮克水平的总DNA的定量实验，已用于监测生物药品中污染DNA的水平[54]。典型实验包括生物素化ssDNA结合蛋白、脲酶偶联的抗ssDNA抗体和DNA之间以非序列特异性方式形成反应复合物。购自生产商的总DNA测定试剂盒(Total DNA Assay Kit)中包含所有实验组分。多个商业生产商均提供了用于检测残留宿主细胞DNA的定量PCR实验，例如AppTecTM实验室服务公司(AppTecTM Laboratory Services)、BioRelianceTM公司奥西科技公司(Althea Technologies)等。用于测定人病毒疫苗的宿主细胞DNA污染的化学发光杂交实验和总DNA ThresholTM系统的比较参见参考文献56。
在疫苗制备过程中可采用标准纯化方法，如层析法等去除污染性DNA。可通过核酸酶处理，例如DNA酶处理来改进对残留宿主细胞DNA的清除效果。参考文献57和58公开了一种减少宿主细胞DNA污染的方便方法，该方法包括两步处理，第一步是在病毒生长期间使用DNA酶(如Benzonase)处理，然后是在病毒颗粒破裂期间使用阳离子洗涤剂(如CTAB)进行处理。也可利用烷化剂如β-丙内酯处理来去除宿主细胞DNA，该方法也宜用于灭活病毒颗粒[59]。
优选每15μg血凝素中宿主细胞DNA含量＜10ng(如＜1ng、＜100pg)的疫苗，以及每0.25ml体积中宿主细胞DNA含量＜10ng(如＜1ng、＜100pg)的疫苗。更优选每50μg血凝素中宿主细胞DNA含量＜10ng(如＜1ng、＜100pg)的疫苗，以及每0.5ml体积中宿主细胞DNA含量＜10ng(如＜1ng、＜100pg)的疫苗。
佐剂
本发明组合物宜包含佐剂，佐剂可用于在接受该组合物的患者中提高所引发的免疫应答反应(体液或细胞免疫应答)。曾经描述过将佐剂与流感疫苗一起使用。参考文献60和62中使用了氢氧化铝，参考文献62中使用了氢氧化铝和磷酸铝的混合物。参考文献63也描述了铝盐佐剂的应用。希龙疫苗公司(Chiron Vaccines)的FLUADTM产品包含水包油乳液。
可用于本发明的佐剂包括但不限于：
·包含钙盐和铝盐(或其混合物)的含矿物质组合物。钙盐包括磷酸钙(如参考文献64公开的“CAP”颗粒)。铝盐包括氢氧化铝、磷酸铝、硫酸铝等，所述盐取任何合适的形式(如凝胶、晶体、无定形态等)。优选吸附于这些盐。也可将含有矿物质的组合物制成金属盐的颗粒[65]。下面更详细地描述了铝盐佐剂。
·细胞因子诱导剂(详述见下)。
·皂苷[参考文献101第22章]，皂苷是在许多种类的植物的皮、叶、茎干、根甚至花中发现的甾醇糖苷和三萜糖苷的异质群体。已广泛研究了作为佐剂的来自皂树(Quillaia saponaria)Molina树皮的皂苷。皂苷也可购自丽花菝葜(Smilax ornata)(墨西哥菝葜)、满天星(Gypsophilla paniculata)(婚纱花)和肥皂草(Saponaria officianalis)(皂根)。皂苷佐剂制剂包括纯化制剂如QS21以及脂质制剂如ISCOM。QS21以商标StimulonTM出售。已采用HPLC和RP-HPLC来纯化皂苷组合物。已鉴定了用这些技术纯化的特定组分，包括QS7、QS17、QS18、QS21、QH-A、QH-B和QH-C。皂苷优选QS21。制备QS21的方法参见参考文献66。也可将Quil A的组分A与至少一种其他佐剂一起使用[67]。皂苷制剂也可包含甾醇，如胆固醇[68]。皂苷和胆固醇的组合可用于形成称为免疫刺激复合物(ISCOM)的独特颗粒[参考文献101的第23章]。ISCOM通常也含有磷脂如磷脂酰乙醇胺或磷脂酰胆碱。ISCOM中可采用任何已知的皂苷。ISCOM优选包含QuilA、QHA和QHC中的一种或多种。参考文献68-70中进一步描述了ISCOM。任选地，ISCOM可不含其它去污剂[71]。也可使用至少两种ISCOM复合物的混合物，各种复合物基本上包含一种皂苷组分，此时的复合物是ISCOM复合物或ISCOM基质复合物[72]。开发基于皂苷的佐剂的综述可参见参考文献73和74。
·脂肪佐剂(详述见下)。
·细菌ADP-核糖基化毒素(如大肠杆菌(E.coli)不耐热肠毒素″LT″、霍乱毒素″CT″或百日咳毒素″PT″)及其脱毒衍生物，如称为LT-K63和LT-R72的突变毒素[75]。参考文献76中描述了将脱毒的ADP-核糖基化毒素用作粘膜佐剂，参考文献77中描述了将其用作胃肠道外佐剂。
·生物粘附剂和粘膜粘附剂，如酯化透明质酸微球[78]或壳聚糖及其衍生物[79]。
·由可生物降解和无毒材料(例如聚(α-羟酸)、聚羟基丁酸、聚原酸酯、聚酐、聚己酸内酯等)，优选丙交酯-乙交酯共聚物形成的微粒(即直径约100nm-150μm，更优选约200nm-30μm，或约500nm-10μm的颗粒)，任选处理以具有带负电表面(如用SDS处理)或带正电表面(例如用阳离子去污剂如CTAB处理)。
·脂质体(参考文献101第13和14章)。适合用作佐剂的脂质体制剂的例子见参考文献80-82所述。
·水包油乳液(详述见下)
·聚氧乙烯醚和聚氧乙烯酯制剂[83]。这种制剂还包括聚氧乙烯失水山梨糖醇酯表面活性剂和辛苯聚醇[84]以及聚氧乙烯烷基醚或酯表面活性剂和至少一种其它非离子表面活性剂如辛苯聚醇[85]的混合物。优选的聚氧乙烯醚选自：聚氧乙烯-9-月桂醚(laureth 9)、聚氧乙烯-9-固醇醚(steoryl ether)、聚氧乙烯-8-固醇醚、聚氧乙烯-4-月桂醚、聚氧乙烯-35-月桂醚和聚氧乙烯-23-月桂醚。
·胞壁酰肽，例如N-乙酰胞壁酰-L-苏氨酰-D-异谷氨酰胺(thr-MDP)、N-乙酰-去甲胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺(去甲MDP)、N-乙酰葡萄糖胺酰-N-乙酰胞壁酰-L-Al-D-异谷氨酰-L-Ala-二棕榈酰丙酰胺(″DTP-DPP″或″TheramideTM″)、N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺酰-L-丙氨酸-2-(1′-2′-二棕榈酰-sn-甘油-3-羟基磷酰氧基)-乙胺(MTP-PE)。
·由第一种革兰氏阴性菌制备的外膜蛋白蛋白酶体制剂与第二种革兰氏阴性菌产生的脂多糖制剂的组合，其中所述外膜蛋白蛋白酶体和脂多糖制剂形成稳定的非共价佐剂复合物。这类复合物包括″IVX-908″，它是由脑膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)外膜蛋白和脂多糖组成的复合物。已将它们用作流感疫苗佐剂[86]。
·甲基肌苷5’-单磷酸酯(″MIMP″)[87]。
·多聚羟化吡咯双烷类化合物[88]，如下式化合物或其药学上可接受的盐或衍生物：
Figure GPA00001029410300111
式中R选自：氢，直链或支链、未取代或取代、饱和或不饱和的酰基、烷基(如环烷基)、烯基、炔基和芳基。例子包括但不限于：木麻黄(casuarine)、木麻黄-6-α-D-吡喃葡萄糖、3-表-木麻黄、7-表-木麻黄、3，7-二表-木麻黄等。
·γ菊糖[89]或其衍生物，如藻类菊粉(algammulin)。
·CD1d配体，如α-糖基神经酰胺，例如α-半乳糖基神经酰胺。
参考文献101和102中更详细地讨论了这些和其它佐剂活性物质。
组合物可包含两种或多种所述佐剂。例如，它们宜同时包含水包油乳液和细胞因子诱导剂，因为这种组合提高了流感疫苗引发的细胞因子应答，如干扰素-γ应答，与该乳液或药剂单用时相比，它们联用时引发的应答高得多。
组合物中的抗原和佐剂通常是混合在一起的。
当疫苗包含佐剂时，它可在递送时当场制备。因此，本发明提供了包含各种易混的抗原和佐剂组分的试剂盒。该试剂盒可将佐剂和抗原单独保存，直到使用。试剂盒中诸组分在物理上互相分离，可通过各种方式实现这种分离。例如，这两种组分可以装在两个不同的容器，如药瓶中。可通过(例如)取出一个药瓶的内容物并将其加入另一个药瓶，或者分别取出两个药瓶的内容物并在第三个容器中将它们混合在一起，来混合两个药瓶的内容物。在优选的安排中，试剂盒的一种组分在注射器中，另一种组分在容器如药瓶中。可使用该注射器(例如装有针头的)将其内容物注入第二个容器中混合，然后将该混合物抽回注射器中。然后，一般通过新的无菌针头将该注射器中的混合成分给予患者。将一种组分包装到注射器中使得不需要另外准备注射器进行给药。在另一优选的安排中，这两种试剂盒组分在同一注射器，例如双室注射器(如参考文献90-97等所述)中分开保存。当注射器致动时(例如给予患者时)，则这两室中的内容物混合。这种安排避免了使用时的单独混合步骤。
水包油乳液佐剂
发现水包油乳液特别适用于含佐剂的流感病毒疫苗。多种这类乳液是已知的，它们一般包含至少一种油和至少一种表面活性剂，油与表面活性剂是可生物降解(可代谢)和生物相容性的。乳液中油滴的直径通常小于5μm，甚至可以是亚微米级，用微流化床实现这种小尺寸以提供稳定的乳液。优选小于220nm的液滴，因为它们可进行过滤除菌。
本发明可使用的油诸如动物油(如鱼油)或植物油。植物油的来源包括坚果、种籽和谷粒。坚果油中最常见的是花生油、大豆油、可可油和橄榄油。也可使用获自(例如)霍霍巴豆的霍霍巴油。种籽油包括红花油、棉花籽油、葵花籽油、芝麻油等。在谷粒油中，最常见的是玉米油，但也可采用其它谷类如小麦、燕麦、裸麦、稻、画眉草、黑小麦等的油。可从坚果和种籽油开始，通过水解、分离和酯化合适的物质来制备6-10碳脂肪酸甘油酯和1，2-丙二醇，虽然这些物质不是种籽油中天然产生的。来自哺乳动物乳汁的脂肪和油是可代谢的，因此可用于实施本发明。由动物来源获得纯油的过程中必需的分离、纯化、皂化和其它步骤是本领域熟知的。大多数鱼类含有容易回收的可代谢油。例如，鳕鱼肝油、鲨鱼肝油和鲸油如鲸蜡代表了可用于本发明的几种鱼油的例子。通过生化途径用5-碳异戊二烯单元合成许多支链油，它们总称为萜类。鲨鱼肝油含有支链不饱和类萜，称为鲨烯2，6，10，15，19，23-六甲基-2，6，10，14，18，22-二十四碳六烯，本文特别优选此类萜。鲨烯的饱和类似物鲨烷也是优选的油。鱼油，包括鲨烯和鲨烷，易于从商业来源购得，或可通过本领域已知方法获得。其它优选油是生育酚(见下)。可采用油的混合物。
可根据表面活性剂的“HLB”(亲水/亲油平衡)将其分类。优选的本发明表面活性剂的HLB至少为10，优选至少15，更优选至少16。本发明可用的表面活性剂包括但不限于：聚氧乙烯失水山梨糖醇酯表面活性剂(通常称为吐温)，特别是聚山梨醇酯20和聚山梨醇酯80；环氧乙烷(EO)、环氧丙烷(PO)和/或环氧丁烷(BO)的共聚物，以DOWFAXTM为商品名出售，例如线形EO/PO嵌段共聚物；重复的乙氧基(氧-1，2-乙二基)基团数目可能不同的辛苯聚醇，其中特别感兴趣的是辛苯聚醇-9(曲通X-100或叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇)；(辛基苯氧基)聚乙氧基乙醇(IGEPAL CA-630/NP-40)；磷脂，例如磷脂酰聚胆碱(卵磷脂)；衍生自月桂醇、鲸蜡醇、硬脂醇和油醇的聚氧乙烯脂肪醚(称为Brij表面活性剂)，例如三乙烯乙二醇单月桂基醚(triethyleneglycol monolauryl ether)(苄泽30)；和失水山梨糖醇酯(通常称为司盘(SPAN))，例如失水山梨糖醇三油酸酯(司盘85)和失水山梨糖醇单月桂酸酯。乳液中所含的优选表面活性剂是吐温80(聚氧乙烯失水山梨糖醇单油酸酯)、司盘85(失水山梨糖醇三油酸酯)、卵磷脂和曲通X-100。如上所述，洗涤剂如吐温80也可提高热稳定性，从下面的实施例可见。
可使用表面活性剂的混合物，如吐温80/司盘85混合物。也适合采用聚氧乙烯失水山梨糖醇酯如聚氧乙烯失水山梨糖醇单油酸酯(吐温80)和辛苯聚醇如叔-辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(曲通X-100)的混合物。另一种有用的混合物包含聚乙二醇单月桂醚9和聚氧乙烯失水山梨糖醇酯和/或辛苯聚醇。
表面活性剂的含量(重量％)优选为：聚氧乙烯失水山梨糖醇酯(如吐温80)0.01-1％，特别是约0.1％；辛基-或壬基苯氧基聚氧乙醇(如曲通X-100，或曲通系列的其它洗涤剂)0.001-0.1％，特别是0.005-0.02％；聚氧乙烯醚(如聚乙二醇单月桂醚9)0.1-20％，优选0.1-10％，特别是0.1-1％或约0.5％。
本发明所用的具体水包油乳液佐剂包括但不限于：
·鲨烯、吐温80和司盘85的亚微米乳液。该乳液的体积组成可以是约5％鲨烯、约0.5％聚山梨酯80和约0.5％司盘85。以重量计，这些比例变为4.3％鲨烯、0.5％聚山梨酯80和0.48％司盘85。此佐剂称为’MF59’[98-100]，如参考文献101的第10章和参考文献102的第12章所详述。MF59乳液宜包含柠檬酸根离子，如10mM柠檬酸钠缓冲液。
·鲨烯、生育酚和吐温80的乳液。该乳液可包含磷酸盐缓冲盐水。它也可含有司盘85(如1％)和/或卵磷脂。这些乳液可含有2-10％鲨烯、2-10％生育酚和0.3-3％吐温80，鲨烯∶生育酚的重量比优选≤1，因为这能使乳液更稳定。鲨烯和吐温80的体积比可以约为5∶2。可通过下述方法制备一种这样的乳液：将吐温80溶解于PBS得到2％溶液，然后将90ml该溶液与5g DL-α-生育酚和5ml鲨烯的混合物混合，然后使该混合物微流体化。得到的乳液可含有，例如，平均直径为100-250nm，优选约180nm的亚微米油滴。
·鲨烯、生育酚和曲通洗涤剂(如曲通X-100)的乳液。该乳液也可包含3d-MPL(见下)。该乳液可含有磷酸盐缓冲液。
·含有聚山梨酯(如聚山梨酯80)、曲通洗涤剂(如曲通X-100)和生育酚(如琥珀酸α-生育酚)的乳液。该乳液可包含这三种组分，其质量比约为75∶11∶10(如750μg/ml聚山梨酯80，110μg/ml曲通X-100和100μg/ml琥珀酸α-生育酚)，这些浓度应包括抗原中这些组分的贡献。该乳液还可包含鲨烯。该乳液也可包含3d-MPL(见下)。水相可含有磷酸盐缓冲液。
·鲨烯、聚山梨酯80和泊洛沙姆401(″PluronicTML121″)的乳液。可以用磷酸盐缓冲盐水，pH 7.4配制该乳液。该乳液是一种有用的胞壁酰二肽递送载体，已知与用″SAF-I″佐剂(0.05-1％Thr-MDP、5％鲨烯、2.5％Pluronic L121和0.2％聚山梨酸酯80)配的苏氨酰基-MDP一起使用[103]。也可不与Thr-MDP一起使用，例如用″AF″佐剂(5％鲨烯、1.25％Pluronic L121和0.2％聚山梨酸酯80)[104]。优选微流体化。
·包含角鲨烯、水性溶剂、聚氧乙烯烷基醚亲水性非离子型表面活性剂(例如聚氧乙烯(12)鲸蜡基硬脂基(cetostearyl)醚)和疏水性非离子型表面活性剂(例如失水山梨糖醇酯或二缩甘露醇酯，如失水山梨糖醇单油酸酯或‘司盘80’)的乳液。乳液优选是热致可逆的和/或至少90％油滴(按体积计)的大小小于200nm[105]。乳液中还可包含以下一种或多种：醛醇；冷冻保护剂(例如糖，如十二烷基麦芽苷和/或蔗糖)；和/或烷基聚糖苷。这种乳液可被冻干。
·含有0.5-50％油、0.1-10％磷脂和0.05-5％非离子型表面活性剂的乳液。如参考文献106所述，优选的磷脂组分是磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油、磷脂酸、鞘磷脂和心磷脂。优选亚微米液滴大小。
·不可代谢油(如轻质矿物油)和至少一种表面活性剂(如卵磷脂、吐温80或司盘80)的亚微米水包油乳液。可包含添加剂，例如QuilA皂苷、胆固醇、皂苷-亲脂体偶联物(如通过葡糖醛酸的羧基将脂族胺加到脱酰基皂苷上而产生的GPI-0100，参见参考文献107)、二甲基二-十八烷基溴化铵和/或N，N-二-十八烷基-N，N-双(2-羟乙基)丙二胺。
·含有矿物油、非离子型亲脂乙氧基化脂肪醇和非离子型亲水表面活性剂(如乙氧基化脂肪醇和/或聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物)的乳液[108]。
·含有矿物油、非离子型亲水乙氧基化脂肪醇和非离子型亲脂表面活性剂(如乙氧基化脂肪醇和/或聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物)的乳液[108]。
·皂苷(如QuilA或QS21)和固醇(如胆固醇)结合成螺旋胶束的乳液[109]。
可以在递送时将该乳液与抗原临时混合。因此，在包装或出售的疫苗中该佐剂和抗原可分开保存，使用时配制成最终制剂。抗原通常是水性形式，以便最终通过混合两种液体制备疫苗。混合的两种液体的体积比可变(例如5∶1-1∶5)，但通常约为1∶1。
将抗原与佐剂混合之后，血凝素抗原通常保留在水溶液中，但其本身可分布于油/水界面附近。通常，血凝素很少(如果有)会进入该乳液的油相。
当组合物包含生育酚时，可使用α、β、γ、δ、ε或ξ生育酚中任何一种，但优选α-生育酚。生育酚可采取不同形式，例如不同的盐和/或异构体。盐包括有机盐，例如琥珀酸盐、乙酸盐、烟酸盐等。D-α-生育酚和DL-α-生育酚均可使用。用于老年患者(如年龄大于60岁或更大的患者)的疫苗中宜包含生育酚，因为据报道维生素E在此患者群体中对免疫应答有正面作用[110]。它们也具有抗氧化特性，这种特性有助于稳定该乳液[111]。优选的α-生育酚是DL-α-生育酚，这种生育酚的优选盐是琥珀酸盐。发现琥珀酸盐在体内能与TNF相关配体协作。而且，已知琥珀酸α-生育酚与流感疫苗相容，并且是有用的替代含汞化合物的防腐剂[8]。
细胞因子-诱导剂
给予患者时包含在本发明组合物中的细胞因子诱导剂能够引发免疫系统释放细胞因子，包括干扰素和白细胞介素。已知细胞因子应答参与针对流感病毒感染的宿主防御的早期和决定阶段[112]。优选药剂可引发以下一种或多种物质的释放：干扰素γ；白细胞介素-1；白细胞介素-2；白细胞介素-12；TNF-α；TNF-β；和GM-CSF。优选的药剂引发与Th1型免疫应答有关的细胞因子释放，如干扰素γ、TNF-α、白介素-2。优选刺激干扰素-γ和白细胞介素-2。
因此，接受本发明组合物的结果是，用流感抗原刺激时，患者的T细胞以抗原特异性方式释放所需细胞因子。例如，由它们的血液纯化的T细胞在体外接触流感病毒血凝素时释放γ干扰素。本领域已知测定外周血单核的细胞(PBMC)的这类应答的方法，包括ELISA、ELISPOT、流式细胞术和实时PCR。例如，参考文献113报道了监测针对破伤风类毒素的抗原特异性T细胞介导的免疫应答，特别是γ干扰素应答的一项研究，发现ELISPOT是区分抗原特异性TT诱导的应答与自发性应答的最灵敏的方法，但通过流式细胞术检测胞浆内细胞因子则是检测再刺激作用的最有效方法。
合适的细胞因子诱导剂包括但不限于：
·免疫刺激性寡核苷酸，例如含有CpG基序的寡核苷酸(含有通过磷酸键连接于鸟嘌呤的未甲基化胞嘧啶的二核苷酸序列)、或双链RNA、或含有回文序列的寡核苷酸、或含有聚(dG)序列的寡核苷酸。
·3-O-脱酰化单磷酰脂质A(’3dMPL’，也称为’MPLTM’)[114-117]。
·咪唑喹啉化合物，如咪喹莫特(″R-837″)[118，119]、瑞喹莫德(″R-848″)[120]、和它们的类似物；以及它们的盐(如盐酸盐)。有关免疫刺激性咪唑喹啉的其它细节可参见参考文献121-125。
·缩氨基硫脲化合物，如参考文献126所述的化合物。参考文献126中也描述了配制、制备和筛选活性化合物的方法。缩氨基硫脲在刺激人外周血单核细胞产生细胞因子如TNF-α方面特别有效。
·色胺酮化合物，如参考文献127所述的化合物。参考文献127中也描述了配制、制备和筛选活性化合物的方法。缩氨基硫脲在刺激人外周血单核细胞产生细胞因子如TNF-α方面特别有效。
·核苷类似物，如(a)艾沙托立宾(Isatorabine)(ANA-245；7-硫杂-8-氧代鸟苷)及其前药：
Figure GPA00001029410300181
(b)ANA975；(c)ANA-025-1；(d)ANA380；(e)参考文献128-130所述的化合物；(f)具有下式的化合物：
Figure GPA00001029410300182
式中：
R1和R2各自独立地是氢、卤素、-NRaRb、-OH、C1-6烷氧基、取代的C1-6烷氧基、杂环基、取代的杂环基、C6-10芳基、取代的C6-10芳基、C1-6烷基、或取代的C1-6烷基；
R3不存在，或者是H、C1-6烷基、取代的C1-6烷基、C6-10芳基、取代的C6-10芳基、杂环基、或取代的杂环基；
R4和R5各自独立地是氢、卤素、杂环基、取代的杂环基、-C(O)-Rd、C1-6烷基、取代的C1-6烷基、或结合在一起形成5元环，如R4-5：
Figure GPA00001029410300183
R4-5
在
Figure GPA00001029410300184
所示的化学键处实现结合，
X1和X2各自独立地是N、C、O或S；
R8是氢、卤素、-OH、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、-OH、-NRaRb、-(CH2)n-O-Rc、-O-(C1-6烷基)、-S(O)pRe、或-C(O)-Rd；
R9是氢、C1-6烷基、取代的C1-6烷基、杂环基、取代的杂环基或R9a，其中R9a是：
Figure GPA00001029410300185
R9a
在
Figure GPA00001029410300186
所示的化学键处实现结合，
R10和R11各自独立地是氢、卤素、C1-6烷氧基、取代的C1-6烷氧基、-NRaRb、或-OH；
Ra和Rb各自独立地是氢、C1-6烷基、取代的C1-6烷基、-C(O)-Rd、C6-10芳基；
Rc各自独立地是氢、磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯、C1-6烷基、或取代的C1-6烷基；
Rd各自独立地是氢、卤素、C1-6烷基、取代的C1-6烷基、C1-6烷氧基、取代的C1-6烷氧基、-NH2、-NH(C1-6烷基)、-NH(取代的C1-6烷基)、-N(C1-6烷基)2、-N(取代的C1-6烷基)2、C6-10芳基、或杂环基；
Re各自独立地是氢、C1-6烷基、取代的C1-6烷基、C6-10芳基、取代的C6-10芳基、杂环基、或取代的杂环基；
Rf各自独立地是氢、C1-6烷基、取代的C1-6烷基、-C(O)-Rd、磷酸酯、二磷酸酯、或三磷酸酯基；
n各自独立地是0、1、2或3；
p各自独立地是0、1或2；或
或者(g)(a)-(f)中任一项的药学上可接受的盐，(a)-(f)中任一项的互变异构体，或互变异构体的药学上可接受的盐。
·洛索立宾(7-烯丙基-8-氧代鸟苷)[131]。
·参考文献132所述化合物，包括：酰基哌嗪化合物、吲哚二酮化合物、四氢异喹啉(THIQ)化合物、苯并环二酮化合物、氨基氮杂乙烯基化合物、氨基苯并咪唑喹啉酮(ABIQ)化合物[133，134]、水合酞酰胺(hydrapthalamide)化合物、苯并苯基酮化合物、异噁唑化合物、固醇化合物、喹唑啉酮(quinazilinone)化合物、吡咯化合物[135]、蒽醌化合物、喹喔啉化合物、三嗪化合物、吡唑并嘧啶化合物、和吲哚化合物[136]。
·聚氧鎓(polyoxidonium)聚合物[137，138]或其它N-氧化的聚乙烯-哌嗪衍生物。
·参考文献139所述化合物。
·氨烷基氨基葡糖苷磷酸衍生物，如RC-529[140，141]。
·CD1d配体，如α-糖基神经酰胺[142-149](例如α-半乳糖基神经酰胺)、含植物鞘氨醇的α-糖基神经酰胺、OCH、KRN7000[(2S，3S，4R)-1-O-(α-D-吡喃乳糖基)-2-(N-二十六烷基氨基)-1，3，4-十八烷三醇]、CRONY-101、3”-O-硫代-半乳糖基神经酰胺，等等。
·磷腈，如参考文献150和151中所述的聚[二(羧酸苯氧基)磷腈](poly[di(carboxylatophenoxy)phosphazene]，“PCPP”)。
·小分子免疫增强剂(SMIP)，例如：
N2-甲基-1-(2-甲基丙基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-2，4-二胺
N2，N2-二甲基-1-(2-甲基丙基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-2，4-二胺
N2-乙基-N2-甲基-1-(2-甲基丙基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-2，4-二胺
N2-甲基-1-(2-甲基丙基)-N2-丙基-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-2，4-二胺
1-(2-甲基丙基)-N2-丙基-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-2，4-二胺
N2-丁基-1-(2-甲基丙基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-2，4-二胺
N2-丁基-N2-甲基-1-(2-甲基丙基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-2，4-二胺
N2-甲基-1-(2-甲基丙基)-N2-戊基-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-2，4-二胺
N2-甲基-1-(2-甲基丙基)-N2-丙-2-烯基-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-2，4-二胺
1-(2-甲基丙基)-2-[(苯基甲基)硫代]-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-4-胺
1-(2-甲基丙基)-2-(丙硫基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-4-胺
2-[[4-氨基-1-(2-甲基丙基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-2-基](甲基)氨基]乙醇
2-[[4-氨基-1-(2-甲基丙基)-1H-咪唑并[4-c]喹啉-2-基](甲基)氨基]乙酸乙酯
4-氨基-1-(2-甲基丙基)-1，3-二氢-2H-咪唑并[4，5-c]喹啉-2-酮
N2-丁基-1-(2-甲基丙基)-N4，N4-双(苯基甲基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-2，4-二胺
N2-丁基-N2-甲基-1-(2-甲基丙基)-N4，N4-双(苯基甲基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-2，4-二胺
N2-甲基-1-(2-甲基丙基)-N4，N4-双(苯基甲基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-2，4-二胺
N2，N2-二甲基-1-(2-甲基丙基)-N4，N4-双(苯基甲基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-2，4-二胺
1-{4-氨基-2-[甲基(丙基)氨基]-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-1-基}-2-甲基丙-2-醇
1-[4-氨基-2-(丙基氨基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-1-基]-2-甲基丙-2-醇
N4，N4-二苄基-1-(2-甲氧基-2-甲基丙基)-N2-丙基-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-2，4-二胺。
用于本发明的细胞因子诱导剂可以是Toll样受体(TLR)的调节剂和/或激动剂。例如，它们可以是人TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR7、TLR8和/或TLR9蛋白中一种或多种的激动剂。优选试剂是TLR7激动剂(如咪唑并喹啉)和/或TLR9激动剂(如CpG寡核苷酸)。这些试剂可用于激活先天性免疫途径。
可以在本发明组合物生产过程的各个阶段加入细胞因子诱导剂。例如，可将其加入抗原组合物中，然后将此混合物加入水包油乳液中。或者，可将其加入水包油乳液中，在这种情况下可以在乳液组分乳化之前加入该试剂，或者可以在乳液乳化后加入该试剂。相似地，该试剂可以凝聚在乳液液滴中。细胞因子诱导剂在最终组合物中的位置和分布将取决于其亲水/亲脂特性，例如该药剂可位于水相中、油相中和/或油水界面上。
该细胞因子诱导剂可偶联于另一种试剂，如抗原(如CRM197)。参考文献152中提供了有关小分子偶联技术的综述。或者，佐剂可与其它试剂非共价(例如通过疏水作用或离子相互作用)结合。
两种优选的细胞因子诱导剂是(a)免疫刺激性寡核苷酸和(b)3dMPL。
免疫刺激性寡核苷酸可包含核苷酸修饰/类似物，如硫代磷酸酯修饰，可以是双链或(除RNA外)单链。参考文献153、154和155公开了可能的类似取代，例如用2’-脱氧-7-脱氮鸟苷代替鸟苷。参考文献156-161中进一步讨论了CpG寡核苷酸的佐剂作用。CpG序列可能导向TLR9，例如基序GTCGTT或TTCGTT[162]。CpG序列可特异性诱导Th1免疫应答，例如CpG-AODN(寡脱氧核糖核苷酸)，或更特异地诱导B细胞应答，例如CpG-B ODN。参考文献163-165中讨论了CpG-A和CpG-B ODN。CpG优选CpG-A ODN。优选构建CpG寡核苷酸时使其5’端可为受体所识别。任选将两个CpG寡核苷酸序列的3’端相连接形成“免疫聚体”。参见例如，参考文献162和166-168。有用的CpG佐剂是CpG7909，也称为ProMuneTM  (科雷制药集团公司(Coley Pharmaceut ical Group，Inc.))。
或者，或此外，除使用CpG序列外，也可使用TpG序列[169]。这些寡核苷酸可以不含未甲基化的CpG基序。
免疫刺激性寡核苷酸可能富含嘧啶。例如，它可能含有一个以上连续的胸腺嘧啶核苷酸(例如，参考文献169所公开的TTTT)，和/或它的核苷酸组成中可能含有＞25％胸腺嘧啶(例如＞35％、＞40％、＞50％、＞60％、＞80％等)。例如，它可能含有一个以上连续的胞嘧啶核苷酸(例如，参考文献169所公开的CCCC)，和/或它的核苷酸组成中可能含有＞25％胞嘧啶(例如＞35％、＞40％、＞50％、＞60％、＞80％等)。这些寡核苷酸可以不含未甲基化的CpG基序。
免疫刺激性寡核苷酸一般含有至少20个核苷酸。它们可含有少于100个核苷酸。
3dMPL(也称为3脱-O-酰化单磷酰脂质A或3-O-脱酰基-4’-单磷酰脂质A)是单磷酰脂质A的还原性末端葡糖胺的3位脱酰化的佐剂。3dMPL可由明尼苏达沙门菌(Salmonella minnesota)的无庚糖突变体制备，在化学上类似于脂质A，但缺少酸-不稳定性磷酰基和碱-不稳定性酰基。它能激活单核细胞/巨噬细胞谱系的细胞，并刺激几种细胞因子的释放，包括IL-I、IL-12、TNF-α和GM-CSF(也参见参考文献170)。参考文献171最先描述了3dMPL的制备。
3dMPL可以采取酰基化不同的相关分子(如具有3、4、5或6个酰基链，它们的长度可以不同)的混合物的形式。两个葡糖胺(也称为2-脱氧-2-氨基-葡萄糖)单糖在其2-位(即2和2’位)碳上N-酰基化，3’位上也有O-酰基化。连接于碳2的基团具有下式：-NH-CO-CH2-CR1R1’。连接于碳2’的基团具有下式：-NH-CO-CH2-CR2R2’。连接于碳3’的基团具有下式：-O-CO-CH2-CR3R3’。代表性结构为：
Figure GPA00001029410300231
基团R1、R2和R3各自独立地是-(CH2)n-CH3。n值优选为8-16，更优选为9-12，最优选为10。
基团R1’、R2’和R3’各自独立地是：(a)-H；(b)-OH；或(c)-O-CO-R4，其中R4是-H或-(CH2)m-CH3，其中m值优选为8-16，更优选为10、12或14。在2位上，m优选为14。在2’位上，m优选为10。在3’位上，m优选为12。因此，基团R1’、R2’和R3’优选为来自十二烷酸、十四烷酸或十六烷酸的-O-酰基。
R1’、R2’和R3’均为-H时，3dMPL仅含有3条酰基链(2、2’和3’位置上各有一条)。R1’、R2’和R3’中仅有两个是-H时，3dMPL可含有4条酰基链。R1’、R2’和R3’中仅有一个是-H时，3dMPL可含有5条酰基链。R1’、R2’和R3’中没有一个是-H时，3d-MPL可含有6条酰基链。本发明所用的3dMPL佐剂可以是含有3-6条酰基链的这些形式的混合物，但混合物中优选包含具有6条酰基链的3dMPL，具体说，保证6条酰基链的形式占3dMPL总重的至少10％，例如≥20％、≥30％、≥40％、≥50％或更多。发现具有6条酰基链的3dMPL是佐剂活性最高的形式。
因此，本发明组合物包含的3dMPL的最优选形式具有下式(IV)：
Figure GPA00001029410300241
以混合物的形式使用3dMPL时，提到3dMPL在本发明组合物中的含量或浓度，指混合物中的混合3dMPL物质。
在水性条件下，3dMPL可形成不同大小，如直径＜150nm或＞500nm的胶束聚集体或颗粒。其中一种或两者都可用于本发明，可通过常规实验选择更好的颗粒。本发明优选使用小颗粒(如小到足以产生澄清的3dMPL水悬液)，因为它们活性高[172]。优选颗粒的平均直径小于220nm，更优选小于200nm，小于150nm，或小于120nm，它们的直径甚至可以小于100nm。然而在大多数情况下，平均直径不小于50nm。这些颗粒足够小，以便适合过滤除菌。可用揭示平均粒径的常规技术动态光散射评价粒径。据称颗粒的直径为xnm时，粒径通常分布在此平均值附近，但至少50数量％(例如≥60％、≥70％、≥80％、≥90％或更多)颗粒的直径在x±25％的范围内。
3dMPL宜与水包油乳液联合使用。基本上所有3dMPL均位于该乳液的水相中。
3dMPL可以独自使用，或者与一种或多种其它化合物联用。例如，已知将3dMP与以下物质联用：QS21皂苷[173](包含在水包油乳液中[174])、免疫刺激性寡核苷酸、QS21和免疫刺激性寡核苷酸、磷酸铝[175]、氢氧化铝[176]或磷酸铝和氢氧化铝。
脂肪佐剂
可用于本发明的脂肪佐剂包括上述水包油乳液，还包括例如：
式I、II或III的化合物或其盐：
Figure GPA00001029410300251
如参考文献177所述，如’ER 803058’、’ER 803732’、’ER 804053’、’ER 804058’、’ER 804059’、’ER 804442’、’ER 804680’、’ER 804764’、’ER 803022’或’ER 804057’，如：
Figure GPA00001029410300252
Figure GPA00001029410300261
·大肠杆菌(Escherichia coli)的脂质A的衍生物如OM-174(如参考文献178和179所述)。
·阳离子脂质与(通常为中性)共脂质(co-lipid)的制剂，如氨基丙基-二甲基-肉豆蔻烯酰氧基-溴化丙铵-二植酰基磷脂酰-乙醇胺(″VaxfectinTM″)或氨基丙基-二甲基-双十二烷基氧基-溴化丙铵-二油酰基磷脂酰-乙醇胺(″GAP-DLRIE：DOPE″)的制剂。优选含有(±)-N-(3-氨基丙基)-N，N-二甲基-2，3-双(顺-9-四癸烯氧基)-1-丙铵盐的制剂[180]。
·3-O-脱酰化单磷酰脂质A(见上)。
·含有连接于含磷酸无环主链的脂质的化合物，如TLR4拮抗剂E5564[181，182]：
Figure GPA00001029410300262
铝盐佐剂
可使用称为氢氧化铝和磷酸铝的佐剂。这些名称是常规名称，但仅为方便使用，因为它们都不是所代表的实际化合物的准确描述[例如参见参考文献101的第9章]。本发明可采用通常用作佐剂的任何″氢氧化物″或″磷酸盐″佐剂。
称为″氢氧化铝″的佐剂一般是羟基氧化铝盐(通常至少部分为晶体)。可采用红外(IR)光谱将式AlO(OH)代表的羟基氧化铝与其它铝化合物，如氢氧化铝Al(OH)3区别开，特别是1070cm-1处存在吸收条带和3090-3100cm-1处存在强肩峰[参考文献101的第9章]。半高的衍射条带宽度(WHH)反映出氢氧化铝佐剂的结晶度，结晶差的颗粒由于结晶较小而谱线增宽较大。随着WHH增加，表面积增大，观察到WHH值较高的佐剂具有较大的抗原吸附能力。纤维形态(如透射电镜照片中所见)是氢氧化铝佐剂的典型形态。氢氧化铝佐剂的pI一般约为11，即该佐剂本身在生理pH下表面带正电荷。据报道，pH 7.4时氢氧化铝佐剂的吸附容量为1.8-2.6毫克蛋白质/毫克Al+++。
称为″磷酸铝″的佐剂一般是羟基磷酸铝，也常常含有少量硫酸盐(即羟基磷酸硫酸铝)。它们可通过沉淀获得，沉淀期间的反应条件和浓度都会影响该盐中磷酸取代羟基的程度。羟基磷酸盐的PO4/Al摩尔比通常为0.3-1.2。可以通过是否存在羟基将羟基磷酸盐与严格的AlPO4区别开。例如，3164cm-1处的IR谱带(例如加热到200℃)表明存在结构羟基[参考文献101的第9章]。
磷酸铝佐剂的PO4/Al3+摩尔比通常为0.3-1.2，优选为0.8-1.2，更优选为0.95±0.1。磷酸铝通常是无定形的，尤其是羟基磷酸盐。典型的佐剂是PO4/Al摩尔比为0.84-0.92的无定形的羟基磷酸铝，每毫升包含0.6mgAl3+。磷酸铝通常是颗粒(如在透射电子显微镜照片上观察到的板状形态)。抗原吸附后颗粒直径一般是0.5-20μm(如约5-10μm)。据报道，pH 7.4时磷酸铝佐剂的吸附容量为0.7-1.5毫克蛋白质/毫克Al+++。
磷酸铝的零电荷点(PZC)与磷酸对羟基的取代程度逆相关，这种取代程度可能取决于用于通过沉淀制备盐的反应条件和反应物浓度。也可通过改变溶液中游离磷酸根离子的浓度(更多磷酸根＝偏酸性PZC)或加入缓冲液如组氨酸缓冲液(使PZC偏碱性)来改变PZC。本发明所用的磷酸铝的PZC通常为4.0-7.0，更优选为5.0-6.5，例如约为5.7。
用于制备本发明组合物的铝盐悬浮液可以，但不一定含有缓冲液(如磷酸盐或组氨酸或Tris缓冲液)。该悬浮液优选无菌且无热原。该悬浮液可含有游离的水性磷酸根离子，如浓度为1.0-20mM，优选5-15mM，更优选约10mM的磷酸根离子。该悬浮液也可含有氯化钠。
本发明可使用氢氧化铝和磷酸铝的混合物[62]。在这种情况下，磷酸铝比氢氧化铝多，例如重量比为至少2∶1，例如≥5∶1、≥6∶1、≥7∶1、≥8∶1、≥9∶1等。
给予患者的组合物中Al+++的浓度优选小于10mg/ml，例如≤5mg/ml、≤4mg/ml、≤3mg/ml、≤2mg/ml、≤1mg/ml等。优选范围是0.3-1mg/ml。最大值优选为0.85毫克/剂量。
除包含一种或多种铝盐佐剂外，佐剂组分还可包含一种或多种其它佐剂或免疫刺激剂。其它这类组分包括但不限于：3-O-脱酰化单磷酰脂质A佐剂(’3d-MPL’)；和/或水包油乳液。3dMPL也称为3脱-O-酰化单磷酰脂质A或3-O-脱酰基-4’-单磷酰脂质A。该命名表明单磷酰脂质A的还原性末端葡糖胺的3位脱酰化。它是由明尼苏达沙门菌(S.minnesota)的无庚糖突变体(heptoseless mutant)制备，在化学上类似于脂质A，但缺少酸-不稳定性磷酰基和碱-不稳定性酰基。它能激活单核细胞/巨噬细胞谱系的细胞，并刺激释放几种细胞因子，包括IL-I、IL-12、TNF-α和GM-CSF。参考文献171中首先描述了3d-MPL的制备，该产品由考科萨公司(CorixaCorporation)生产并以商品名MPLTM出售。其它详情可参见参考文献114-117。
药物组合物
本发明组合物是药学上可接受的。除抗原外，它们通常还包含其它组分，例如它们一般包含一种或多种药物载体和/或赋形剂。对这类组分的充分讨论参见参考文献183。
该组合物通常是水性形式。
该组合物不含汞物质。其可包含2-苯氧乙醇，但更优选不含防腐剂的疫苗。
为了控制张力，优选包含生理性盐如钠盐。优选氯化钠(NaCl)，它的浓度可以是1-20mg/ml。可以存在的其它盐包括氯化钾、磷酸二氢钾、二水合磷酸氢二钠、氯化镁、氯化钙等。
组合物的渗透压通常为200-400mOsm/kg，优选为240-360mOsm/kg，更优选为290-310mOsm/kg。虽然以前报道过渗透压对疫苗接种引起的疼痛无影响[184]，但优选将渗透压保持在此范围内。
组合物可含有一种或多种缓冲剂。典型的缓冲剂包括：磷酸盐缓冲剂；Tris缓冲剂；硼酸盐缓冲剂；琥珀酸盐缓冲剂；组氨酸缓冲剂；或柠檬酸盐缓冲剂。包含的缓冲剂的浓度一般是5-20mM。缓冲剂可存在于乳剂水相中。
组合物的pH通常为5.0-8.1，更一般为6.0-8.0，例如6.5-7.5，或者7.0-7.8。因此，本发明方法可包括在包装前调整散装疫苗pH的步骤。
该组合物优选无菌。该组合物优选不含谷蛋白。
疫苗不含抗生素(例如新霉素、卡那霉素、多粘菌素B)。
该组合物可含有一次免疫的物质，或者可含有多次免疫的物质(即‘多剂量’组合物)。多剂量配置优选含有防腐剂。为避免需要防腐剂，了将疫苗装在具有用于取出物质的无菌接头的容器中。
流感疫苗的典型给药体积约为0.5ml，但也可将一半剂量(即约0.25ml)给予儿童，并相应地选择单位剂量，如将0.5ml的单位剂量给予患者。
组合物或药盒组分的包装
本发明的方法可包括将疫苗置入容器内、尤其是置入销售容器以供医师使用的步骤。装入这种容器之后，该容器无需冷藏。
适用于该疫苗的容器包括药瓶、鼻喷雾和一次性注射器等，这些容器应无菌。
组合物/组分位于药瓶中时，该药瓶优选由玻璃或塑料材料制成。优选先灭菌药瓶，再加入组合物。为了避免胶乳敏感型患者的问题，优选用无胶乳的塞子密封药瓶，优选所有包装材料中不含胶乳。药瓶可包括单一剂量的疫苗，或者可以包括一个以上剂量(’多剂量’药瓶)，如10个剂量。优选的药瓶由无色玻璃制成。
药瓶可以有适合的帽(如吕埃锁(Luer lock))，以便将预填装注射器插入该帽，将注射器的内容物推入药瓶，并将药瓶的内容物吸回注射器中。从药瓶中拔出注射器后，可连上针头，并将该组合物给予患者。该帽优选位于封口或盖子内侧，以便在封口或盖子打开后才能接触到该帽。药瓶，特别是多剂量药瓶装有瓶帽，以便无菌地取出其内含物。
某组合物/组分包装在注射器中时，该注射器可连有针头。如果未连接针头，可随注射器提供单独的针头以便组装和使用。这种针头可装在护罩中。优选安全性针头。一般是1-英寸23-号、1-英寸25-号和5/8-英寸25-号针头。可提供有剥离标签的注射器，该标签上可打印上内含物的批号、流感季节和到期日期，以帮助记录保存。注射器的活塞优选带有抑止装置，以防止活塞在吸出时意外脱出。注射器可以有胶乳橡胶帽和/或活塞。一次性注射器含有单一剂量的疫苗。注射器通常带有顶帽，以在连接针头前密封顶端，顶帽优选由丁基橡胶制成。如果注射器和针头分开包装，那么针头优选装有丁基橡胶护罩。优选的注射器是以商品名″Tip-Lok″TM销售的注射器。
容器可标注有半剂量体积，以便递送给儿童。例如，含有0.5ml剂量的注射器可标有0.25ml体积的标记。
采用玻璃容器(如注射器或药瓶)时，优选采用由硼硅酸盐玻璃，而非钠钙玻璃制成的容器。
可将组合物与单页宣传品包装在一起(在同一个箱子中)，所述单页宣传品包括疫苗的详细情况如给药说明书、疫苗内所含抗原的详情等。说明书也可包含警示内容，(例如)准备好肾上腺素溶液以应对疫苗接种后发生过敏反应的情况等。
治疗方法和疫苗的给药
本发明组合物适合给予人类患者，本发明提供了在患者中产生免疫应答的方法，该方法包括将本发明组合物给予患者的步骤。
本发明也提供用作药物的本发明试剂盒或组合物。
这些方法和应用引发的免疫应答通常包括抗体应答，优选保护性抗体应答。评价接种流感病毒疫苗后抗体应答、中和能力和保护作用的方法是本领域众所周知的。人体研究表明，对人流感病毒血凝素的抗体滴度与保护作用相关联(约30-40的血清样品血凝反应-抑制滴度对同源病毒感染产生约50％保护作用)[185]。一般通过血凝反应抑制、微量中和、单径向免疫扩散(SRID)和/或单径向溶血(SRH)来测定抗体应答。本领域熟知这些测定技术。
可以各种方式给予本发明组合物。最优选的免疫途径是肌内注射(如注射到上肢或下肢)，但其它可用的途径包括皮下注射、鼻内[186-188]、口服[189]、皮内[190，191]、经皮、透皮[192]等。
可利用按照本发明制备的疫苗来治疗儿童和成年人。目前，推荐将流感疫苗用于年龄＞6个月的儿童和成年人免疫。因此，患者可以小于1岁、1-5岁、5-15岁、15-55岁或至少55岁。接受该疫苗的优选患者是老年人(例如≥50岁、≥60岁，优选≥65岁)、年轻人(如≤5岁)、住院患者、医护工作人员、军队服务人员和军人、妊娠妇女、慢性疾病患者、免疫缺陷患者、在接受该疫苗前7天接受过抗病毒化合物(如奥塞米韦或扎那米韦化合物；见下)的患者、对鸡蛋过敏的人和出国旅行者。然而，该疫苗不只适用于这些人群，还可以在更广泛的人群中使用。就大流行毒株而言，优选给予所有年龄的人。
本发明优选组合物满足CPMP的功效标准1、2或3。在成年人(18-60岁)中，这些标准是：(1)≥70％血清保护；(2)≥40％血清转化；和/或(3)GMT增加≥2.5倍。在老年人(＞60岁)中，这些标准是：(1)≥60％血清保护；(2)≥30％血清转化；和/或(3)GMT增加≥2倍。这些标准基于至少50位患者的标签公开研究。
可以通过单剂量方案或多剂量方案进行治疗。多剂量可用于初免方案和/或加强免疫方案。在多剂量方案中，可通过相同或不同途径给予各种剂量，例如胃肠外初免和粘膜加强，粘膜初免和胃肠外加强，等等。给予一个以上剂量(一般是两个剂量)特别可用于免疫原初患者，例如从未接受过流感疫苗的人，或者用于免疫对抗新的HA亚型(如大流行爆发中的亚型)。多剂量的给予一般至少间隔1周(例如约2周、约3周、约4周、约6周、约8周、约12周、约16周等)。
可将本发明产生的疫苗与其它疫苗基本上同时给予患者(例如，可在医护专家或疫苗接种中心的同一次用药咨询或就诊期间)，例如与麻疹疫苗、腮腺炎疫苗、风疹疫苗、MMR疫苗、水痘疫苗、MMRV疫苗、白喉疫苗、破伤风疫苗、百日咳疫苗、DTP疫苗、偶联的乙型流感嗜血杆菌疫苗、脊髓灰质炎病毒灭活疫苗、乙型肝炎病毒疫苗、脑膜炎球菌偶联疫苗(如四价A-C-W135-Y疫苗)、呼吸道合胞体病毒疫苗、肺炎球菌偶联疫苗等基本上同时给药。与肺炎球菌疫苗和/或脑膜炎球菌疫苗基本上同时给予在老年患者中特别有用。
相似地，可将本发明疫苗与抗病毒化合物，特别是对流感病毒有活性的抗病毒化合物(如奥塞米韦和/或扎那米韦)基本上同时给予患者(例如，在医护专家的同一次用药咨询或就诊期间)。这些抗病毒化合物包括神经氨酸酶抑制剂，如(3R，4R，5S)-4-乙酰基氨基-5-氨基-3(1-乙基丙氧基)-1-环己烯-1-羧酸或5-(乙酰基氨基)-4-[(氨基亚氨基甲基)-氨基]-2，6-脱水-3，4，5-三脱氧-D-甘油-D-半乳糖壬-2-烯酮酸，包括它们的酯(如乙酯)和盐(如磷酸盐)。优选的抗病毒化合物是(3R，4R，5S)-4-乙酰基氨基-5-氨基-3(1-乙基丙氧基)-1-环己烯-1-羧酸的乙酯和磷酸盐(1∶1)，也称为磷酸奥塞米韦(TAMIFLUTM)。
概述
术语“含有”包括“包含”以及“由…组成”，例如“含有”X的组合物可仅由X组成或可包含其它物质，例如X+Y。
词语“基本上”不排除“完全”，例如“基本上无”Y的组合物可完全无Y。该词语“基本上”可视需要从本发明定义中省去。
与数值x有关的术语“约”表示，例如x±10％。
除非另有说明，包括混合两种或多种组分的步骤的方法不需要任何特定的混合顺序。因此，可以任何顺序混合这些组分。有三种组分时，两种组分可以相互混合，然后将混合的组分再与第三种组分混合等。
将动物(具体是牛)材料用于培养细胞时，它们应获自未患传染性海绵状脑病(TSE)，特别是未患牛海绵状脑病(BSE)的来源。总体上，优选在完全不含动物来源的材料中培养细胞。
当某化合物作为组合物的一部分给予人体时，该化合物可被合适的前药所替换。
当使用细胞底物进行重配或反向遗传学方法时，优选批准用于人类疫苗生产的细胞底物，例如欧洲药典总纲5.2.3所述的细胞底物。
优选通过MPSRCH程序(牛津分子公司(Oxford Molecular))执行的Smith-Waterman同源性检索算法，利用仿射空位检索测定多肽序列之间的相同性，其中参数为空位开放罚分＝12、空位延伸罚分＝1。
本发明的实施方式
按照参考文献27和47的指导，将甲型和乙型流感病毒培养在MDCK细胞悬浮培养液中，而不用鸡蛋。该培养液不含任何抗生素。
澄清化最终的培养液以提供病毒颗粒，然后进行层析和超滤/渗滤。
按照参考文献59的指导，利用β-丙内酯(终浓度0.05％v/v；2-8℃温育16-20小时，然后在37℃温育2-2.5小时水解)灭活所得物质中的病毒颗粒，而不利用甲醛灭活。然后利用CTAB裂解病毒颗粒，经各种进一步的加工步骤获得含有纯化的表面蛋白质的最终单价散装疫苗。
最终的散装物质不含汞防腐剂、不含抗生素、不含甲醛、不含鸡蛋-衍生的物质。
从散装疫苗制备各剂量的疫苗，各含有A/H1N1、A/H3N2和B毒株的15μgHA。该疫苗已在临床试验中给予了患者，其中对照患者接受鸡蛋-衍生的AgrippalTM  (其可能包含甲醛和痕量的抗生素)。MDCK-衍生的疫苗耐受良好，免疫原性高(免疫学上不差于Agrippal)，符合评估流感疫苗的CHMP和CBER标准。三个不同批次的MDCK-衍生的疫苗诱导了类似的免疫原性和安全性概况，证实该细胞培养物制备技术能产生一致的临床结果。
应该理解，只是借助实施例描述了本发明，可作出改进而仍属于本发明的范围和构思内。
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Claims (12)

1.一种包含流感病毒抗原的疫苗，其中所述疫苗不含抗生素、不含甲醛以及不含鸡蛋-衍生的物质。
2.一种包含流感病毒抗原的疫苗，其中所述疫苗不含汞防腐剂、不含抗生素以及不含甲醛。
3.一种包含流感病毒抗原的疫苗，其中所述疫苗不含汞防腐剂、不含甲醛以及不含鸡蛋-衍生的物质。
4.一种包含流感病毒抗原的疫苗，其中所述疫苗不含汞防腐剂、不含抗生素、不含甲醛以及不含鸡蛋-衍生的物质。
5.如以上权利要求中任一项所述的疫苗，其特征在于，所述疫苗具有低于0.1IU/ml的内毒素。
6.如以上权利要求中任一项所述的疫苗，其特征在于，每15μg血凝素中宿主细胞DNA含量小于10ng。
7.如以上权利要求中任一项所述的疫苗，其特征在于，所述抗原是完整的病毒抗原。
8.如以上权利要求中任一项所述的疫苗，其特征在于，所述抗原是裂解病毒抗原。
9.如以上权利要求中任一项所述的疫苗，其特征在于，所述抗原是纯化的表面糖蛋白抗原。
10.如以上权利要求中任一项所述的疫苗，其特征在于，所述抗原是病毒体。
11.如以上权利要求中任一项所述的疫苗，其特征在于，所述疫苗包含来自多于一种流感病毒毒株的抗原。
12.一种制备流感病毒抗原的方法，包括以下步骤：(i)在没有鸡蛋-衍生的物质和抗生素存在下，在细胞培养体系中培养流感病毒；(ii)在没有甲醛存在下，灭活步骤(i)所培养的流感病毒；和(iii)在没有硫柳汞存在下，由该灭活的流感病毒制备疫苗抗原制剂。
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