CN109477074B - 用于疫苗开发的改进的乙型流感病毒复制 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种可用于制备高滴度乙型流感病毒（例如在缺乏辅助病毒的情况下）的组合物，所述组合物包含来自乙型流感病毒疫苗株或分离株的内部基因，所述乙型流感病毒疫苗株或分离株例如在人类中安全的乙型流感病毒疫苗株或分离株，例如不导致显著疾病的、在培养的细胞（例如MDCK细胞）中或在蛋中赋予生长提高的乙型流感病毒疫苗株或分离株。

Description

用于疫苗开发的改进的乙型流感病毒复制

相关申请的交叉引用

本申请要求2016年2月19日提交的序列号62/297,400的美国申请的申请日的权益，其内容通过引用并入本文。

政府权利声明

本发明是在国家卫生研究院授予的HHSN272201400008C的政府资助下进行的。政府享有本发明的某些权利。

背景技术

乙型流感病毒是人类呼吸系统疾病的主要病因。流感病毒基因组的分段特性使得两种或多种流感病毒感染的细胞中病毒复制过程中片段重配。片段重配联合遗传突变和漂移可随时间产生无数流感病毒相异毒株。新毒株在其血凝素（HA）和/或神经氨酸酶（NA）蛋白中表现抗原变异，特别是HA蛋白的编码基因具有高变异率。当前用于预防流感的主要实践是接种。由于流感HA蛋白是宿主对于病毒的保护性免疫应答的主要靶抗原，且高度变异，流感病毒的分离和与当前爆发相关的病毒中HA抗原的鉴定和表征对于疫苗产生是重要的。基于流行和预测，设计针对占优势和预期的流感病毒毒株刺激保护性免疫应答的疫苗（Park等，2004）。

流感病毒有三种常见的类型，甲型、乙型以及丙型，这是通过其内部蛋白之间缺乏血清学交叉反应而定义。基于糖蛋白HA的抗原和遗传差异，乙型流感病毒进一步分为两种谱系。

人类感染甲型和乙型流感病毒的负担是显著的，在某些季节乙型流感病毒感染的影响可超过甲型流感病毒感染的影响。在过去几十年，两种乙型流感病毒谱系的病毒（Victoria和Yamagata）在人类中传播，如世界卫生组织所推荐，现在两种谱系均在流感疫苗中呈现。用于人类的乙型流感病毒疫苗已经可获得持续有半个多世纪，然而，未进行系统努力以开发高产量候选株。基于流感病毒的抗原特性，将其分为三种类型（甲型、乙型以及丙型流感）；然而，仅甲型和乙型流感病毒导致人类健康问题。甲型流感病毒进一步分为18个血凝素（HA，主要的病毒抗原）和11个神经氨酸酶（NA，另一种病毒抗原）亚型，分别被称为H1–H18和N1–N11。甲型流感病毒造成年度流行（由具有HA抗原表位点突变的抗原逃逸变异体导致）和偶然的大流行。大流行是由编码人对其缺乏保护性免疫应答的HA蛋白的禽流感病毒或禽/人/猪重配流感病毒导致。乙型流感病毒的流行病学不同于甲型流感病毒。乙型流感病毒主要在人类传播，不导致大流行。尽管如此，乙型流感病毒感染对于流感相关的发病率和死亡率的影响是显著的，在某些季节已超过甲型流感病毒（Paul-Glezen等，2013；Tafalla等，2016；van de Sandt等，2015）。直至1983年，仅一种乙型流感病毒谱系在人类中传播。之后，可对于两种谱系（Victoria，根据B/Victoria/2/1987命名；和Yamagata，根据B/Yamagata/16/1988命名）基于其HA进行遗传和抗原性区分（Paul-Glezen等，2013；van deSandt等，2015；Rota等，1990）。直至2000年，这两种谱系之一趋于在各季节占优势；然而，自2001年以来，两种乙型流感病毒谱系每年在人群中共传播（Belshe, 2010；Belshe等，2010）。

直至最近，大多数流感疫苗是三价的：即，它们由H1N1和H3N2亚型的甲型流感毒株和乙型流感病毒毒株组成。有两个研究显示，所推荐的乙型流感疫苗毒株匹配仅在特定流感季节一半时间占优势的毒株（Belshe, 2010；Ambrose等，2010）。基于这些发现和Yamagata和Victoria谱系病毒的持续共传播，世界卫生组织（WHO）于2012年推荐在人流感疫苗中包含两种谱系的乙型流感病毒。由此，目前大多数季节性流感疫苗是四价的。

许多流感疫苗通过将WHO推荐的疫苗毒株的HA和NA病毒RNA（vRNA）片段与“骨架”毒株的其余六个vRNA片段组合而产生。对于甲型和乙型流感减毒活疫苗病毒，在20世纪60年代开发了病毒骨架（Maassab, 1969）。许多甲型流感灭活病毒疫苗基于A/Puerto Rico/8/34（H1N1；PR8）病毒骨架，所述病毒骨架是由于其在含胚鸡蛋中高效复制而被选择。对于乙型流感灭活疫苗，B/Lee/40、B/Panama/45/90或野生型毒株已用作骨架（www.who.int/influenza/vaccines/virus/recommendations/summary_b_vic_cvv_nh1516.pdf）。

发明内容

本发明涉及乙型流感病毒“内部”（internal）基因中的数种突变和乙型流感病毒的病毒糖蛋白HA和NA中的数种突变，所述突变提高培养细胞中的病毒滴度和/或HA产量，还可提高含胚鸡蛋中的病毒滴度和/或HA产量。例示的重配或重组亲本乙型流感病毒代表两种主要的乙型流感病毒谱系（即，“B/Victoria”和“B/Yamagata”谱系）。对于各谱系生成病毒文库，然后在所选择的细胞中对文库进行传代，鉴定提高病毒生长的突变。在疫苗病毒主毒株中使用这些突变中的一种或多种（其中，病毒内部基因—“骨架”与所选择的HA和NA一起使用，例如，传播毒株或预测为传播毒株的那些）导致体外细胞中和/或含胚鸡蛋中培养的病毒的较高病毒滴度，使得乙型流感病毒生长更高效，疫苗生成更快速和成本有效。

可应用数种策略（包括随机诱变和促生长突变的综合试验）以开发具有提高的特性的乙型流感病毒，例如，基于重配或重组B/Yamagata病毒和B/Victoria病毒，例如在培养细胞和/或含胚鸡蛋中复制至高滴度(例如10⁸ PFU/mL或更高，例如5×10⁸、10⁹、5×10⁹或10¹⁰ PFU/mL)的病毒。如本文所讨论的，鉴定增加乙型流感病毒产量的多种促生长突变（氨基酸和非编码核苷酸取代）。乙型流感病毒多肽中或乙型流感病毒片段的非编码核苷酸序列中的各个促生长氨基酸残基，可分别与相同流感病毒多肽中或相同病毒片段的非编码核苷酸中的一个或多个其他促生长残基组合，或与其他流感病毒多肽或病毒片段中的一个或多个其他促生长残基和/或核苷酸取代组合，例如启动子序列中或启动子序列和开放阅读框之间的核苷酸中的促生长核苷酸。具体地，对于乙型流感病毒六种“内部” RNA片段（不编码主要病毒抗原血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA）的那些）中具有随机突变的病毒文库筛选赋予高效复制的突变体。使用Victoria和Yamagata谱系的八种不同病毒的HA和NA基因检测支持细胞培养物中高产量的候选病毒。对于增加用于人流感疫苗病毒增殖的哺乳动物细胞中候选疫苗病毒滴度的突变的组合进行鉴定，将其用于含胚鸡蛋，其为用于流感病毒的最常用的增殖系统。这些乙型流感病毒疫苗骨架可用于改进的疫苗病毒制备。

例如，当制备乙型流感病毒（例如用于疫苗的乙型流感病毒）时，可组合NP蛋白中一种或多种促生长残基（例如NP中1、2、3或4种或更多种促生长残基），M蛋白中1、2、3或4种或更多种促生长残基（例如，BM2中的1、2、3或4种促生长残基，或M1中的1、2、3或4种促生长残基），PA中1、2、3或4种或更多种促生长残基，或NS1中1、2、3或4种或更多种促生长残基，或NP、PA、NS的病毒非编码序列或其他病毒片段中的促生长核苷酸，以提高病毒滴度。在一种实施方式中，可将非编码序列中的促生长核苷酸引入病毒片段，或当其存在于病毒片段中时可选择包含在乙型流感病毒中。在一种实施方式中，可将HA和/或NA中的一种或多种（例如1、2、3、4或5种或更多种）促生长残基引入流感病毒的HA病毒片段或NA病毒片段中，或当其存在于HA或NA时选择包含在流感病毒的HA病毒片段或NA病毒片段中。在一种实施方式中，所述一种或多种促生长残基可促进病毒生长至少1.2、2、2.8、4、3、5、6、8、10、100或200倍或更多倍。

在一种实施方式中，本发明提供了分离的重组、例如重配乙型流感病毒，所述乙型流感病毒在PA、PB1、PB2、NP、M（M1和BM2编码蛋白）和/或NS（NS1和NS2编码蛋白）一个或多个特定位置（包含本文描述的那些）具有选择的氨基酸残基，例如，在例如M1和BM2；M1、BM2以及NS1；NP；M1和NS1；NP、M1以及BM2；NP和M1；NP、M1以及NS1；BM2和NS1；BM2、NS1以及PA；M1、BM2以及PA；M1、BM2、NP和PA的位置的所选择的氨基酸残基，任选地，所述乙型流感病毒还包含促生长非编码核苷酸取代。在一种实施方式中，所述乙型流感病毒包含HA和NA目的基因/蛋白，例如，来自年度流行和大流行毒株的HA和NA目的基因/蛋白，或本文所述具有选择的氨基酸残基的HA和NA病毒片段，所述病毒通过细胞培养物（在MDCK或Vero细胞中）或在含胚鸡蛋中较高效和成本有效地产生。

在一种实施方式中，所述重配或重组乙型流感病毒在NP的28、40、51、52、57、204和/或343位具有氨基酸残基，和/或在NP vRNA的500位除c以外的核苷酸具有残基，或其任何组合，所述残基导致相对于相应病毒在包括MDCK细胞、Vero细胞和/或蛋的细胞中生长提高，所述相应病毒例如，在NP的28、40、51、52、57、204以及343位分别具有丙氨酸、脯氨酸、谷氨酸、丝氨酸、甲硫氨酸或脯氨酸的病毒，即，在重组乙型流感病毒的NP片段的分别28、40、51、52、57、204以及343位的残基不是丙氨酸、脯氨酸、脯氨酸、谷氨酸、丝氨酸、甲硫氨酸或脯氨酸，但是是与MDCK细胞、Vero细胞或蛋中复制提高有关的残基。所述重组病毒还可任选地在M1、BM2、PA、PB2或NS1中的一者或多者中的一个或多个特定位置包含其他选择的氨基酸残基，例如，本文所述的那些位置，任选PB1。在一种实施方式中，所述重组乙型流感病毒在NP的28、40、51、52、57、204和/或343位具有氨基酸残基，所述氨基酸残基导致相对于相应病毒在MDCK细胞、Vero细胞或蛋中与一种或多种宿主蛋白的相互作用提高，所述相应病毒在NP的28、40、51、52、57、204以及343位分别具有例如丙氨酸、脯氨酸、脯氨酸、谷氨酸、丝氨酸、甲硫氨酸或脯氨酸。在一种实施方式中，所述重组乙型流感病毒具有NP中的促生长残基，包括但不限于28位非丙氨酸残基，40位非脯氨酸残基，51位非脯氨酸残基，52位非谷氨酸残基，57位非丝氨酸残基，204位非甲硫氨酸残基，和/或343位非脯氨酸残基，和/或1795位非g核苷酸（斜体字表示核苷酸，位置相对于有义cRNA），或其任何组合。在一种实施方式中，所述重组乙型流感病毒具有NP中28位的苏氨酸、40位丝氨酸、51位谷氨酸、52位赖氨酸、57位甘氨酸、214位苏氨酸和/或343位苏氨酸，NP vRNA中1795核苷酸位的核苷酸a，和/或500核苷酸位的核苷酸t，或其任何组合，以及任选M、PA、PB1、PB2和/或NS病毒片段中一个或多个特定位置的选择的氨基酸残基。

在一种实施方式中，所述重配或重组乙型流感病毒具有M1中34、54、77、86和/或97位的氨基酸残基，所述氨基酸残基导致相对于相应病毒在包括MDCK细胞、Vero细胞或蛋的细胞中生长提高，所述相应病毒例如具有M1中分别34、54、77、86或97位的甘氨酸、天门冬氨酸、精氨酸、甲硫氨酸或异亮氨酸的病毒，即，所述重组流感病毒M片段M1中分别34、54、77、86或97位的残基不是甘氨酸、天门冬氨酸、精氨酸、甲硫氨酸或异亮氨酸，但是是与MDCK细胞、Vero细胞或蛋中复制提高相关的残基。所述重组病毒还可任选包含PA、BM2、PB2、NP和/或NS1中一个或多个特定位置的选择的氨基酸残基，例如本文所述的那些，任选PB1。在一种实施方式中，所述重组乙型流感病毒具有M1中34、54、77、86和/或97位的氨基酸残基，所述氨基酸残基导致相对于相应病毒在MDCK细胞、Vero细胞或蛋中与一种或多种宿主蛋白相互作用提高，所述相应病毒例如具有M1中分别34、54、77、86或97位的甘氨酸、天门冬氨酸、精氨酸、甲硫氨酸或异亮氨酸的病毒。在一种实施方式中，所述重组乙型流感病毒具有M1中分别34、54、77、86或97位的缬氨酸或天门冬酰胺、赖氨酸、苏氨酸或天门冬酰胺，以及任选NP、PA、PB1、PB2和/或NS中一个或多个特定位置的选择的氨基酸残基。

在一种实施方式中，所述重配或重组乙型流感病毒具有BM2中26位、27位、58位或80位的氨基酸残基，所述氨基酸残基导致相对于相应病毒在包括MDCK细胞、Vero细胞或蛋的细胞中生长提高，所述相应病毒例如具有BM2中分别26、27、58或80位的甘氨酸、组氨酸、组氨酸或精氨酸的病毒。所述重组病毒还可任选包含本文所述NS1、PA、NP、PB2和/或M1中一个或多个特定位置的选择的氨基酸残基。在一种实施方式中，BM2中26位的残基是精氨酸，27位的残基是精氨酸，58位的残基是精氨酸，或80位的残基是甘氨酸。

在一种实施方式中，所述重配或重组乙型流感病毒具有NS1中42位非酪氨酸氨基酸残基，117位非甲硫氨酸氨基酸残基，176位非赖氨酸氨基酸残基，和/或252位非丝氨酸氨基酸残基，39位非a核苷酸，38位之后核苷酸插入，或其任何组合，其导致相对于相应病毒在包括MDCK细胞、Vero细胞或蛋的细胞中生长提高，所述相应病毒具有例如42位酪氨酸、117位甲硫氨酸、176位赖氨酸、252位丝氨酸、或39位a。所述重组病毒还可任选包含PA、BM2、PB2、NP和/或M1中一个或多个特定位置的选择的氨基酸残基，例如本文所述的那些，任选PB1。在一种实施方式中，所述重组流感病毒具有NS1中42位天门冬酰胺，117位酪氨酸，176位谷氨酸，252位苏氨酸，39核苷酸位的g，38核苷酸位之后另外的g，或其任何组合，任选具有本文所述PA、PB2、BM2、NP和/或M1中一个或多个特定位置的选择的氨基酸残基。

在一种实施方式中，所述重配或重组乙型流感病毒具有PA中387位非酪氨酸氨基酸残基，434位非缬氨酸氨基酸残基，494位非天门冬氨酸氨基酸残基，524位非苏氨酸氨基酸残基，和/或PA vRNA中2272位非a核苷酸，2213位非g核苷酸，1406位非a核苷酸，和/或1445位非c核苷酸，或其任何组合，其导致相对于相应病毒在包括MDCK细胞、Vero细胞或蛋的细胞中生长提高，所述相应病毒具有例如387位酪氨酸、434位缬氨酸、494位天门冬氨酸、524位苏氨酸，和/或2272位核苷酸a、2213位核苷酸g、1406位核苷酸a，或1445位核苷酸c，或其任何组合。所述重组病毒还可任选包含NS1、BM2、NP、PB2和/或M1中一个或多个特定位置的选择的氨基酸残基，例如本文所述的那些，任选PB1。在一种实施方式中，所述重组流感病毒具有PA中387位组氨酸、434位缬氨酸、或494位天门冬酰胺、534位丙氨酸，和/或PA vRNA中2272位的t、2213位的a、1406位的g、和/或1445位的t，或其任何组合。

在一种实施方式中，所述重配或重组乙型流感病毒具有PB2中16位非天门冬酰胺的氨基酸残基，所述氨基酸残基导致相对于相应病毒在包括MDCK细胞、Vero细胞或蛋的细胞中生长提高，所述相应病毒具有例如16位的天门冬酰胺。所述重组病毒还可任选包含PA、NS1、BM2、NP和/或M1中一个或多个特定位置的选择的氨基酸残基，例如本文所述的那些，任选PB1。在一种实施方式中，所述重组流感病毒具有PB2中16位的丝氨酸。

在一种实施方式中，所述重配或重组乙型流感病毒具有HA1中34位非苏氨酸氨基酸残基、98位非精氨酸氨基酸残基、129位非赖氨酸氨基酸残基、168位非天门冬酰胺氨基酸残基、194位非天门冬酰胺氨基酸残基、和/或196位非苏氨酸氨基酸残基，和/或HA2中39位非赖氨酸氨基酸残基、56位非丝氨酸氨基酸残基、61位非赖氨酸氨基酸残基、或112位非天门冬氨酸氨基酸残基，或其任何组合，其导致相对于相应病毒在包括MDCK细胞、Vero细胞或蛋的细胞中生长提高，所述相应病毒具有例如HA1中34位苏氨酸、98位天门冬酰胺、129位赖氨酸、168位天门冬酰胺、194位天门冬酰胺、和/或196位苏氨酸，和/或HA2中39位赖氨酸、56位丝氨酸、61位赖氨酸、112位天门冬氨酸。所述重组病毒还可包含PA、BM2、PB2、NS1、NP和/或M1中一个或多个特定位置的选择的氨基酸残基，例如本文所述的那些，和/或PB1。在一种实施方式中，所述重组流感病毒具有34位异亮氨酸、129位谷氨酸、168位谷氨酸或天门冬氨酸、196位脯氨酸、丙氨酸、异亮氨酸或天门冬酰胺、98位赖氨酸、194位天门冬氨酸、39位甘氨酸（HA2中），56位甘氨酸（HA2中），51位天门冬酰胺（HA2中），或112位谷氨酸（HA2中），或其任何组合。

在一种实施方式中，所述重配或重组乙型流感病毒具有NA中76位非苏氨酸氨（T）基酸残基、102位非精氨酸（R）氨基酸残基、105位非谷氨酸（E）氨基酸残基、139位非脯氨酸（P）氨基酸残基、169位非天门冬酰胺（N）氨基酸残基、434位非甘氨酸（G）氨基酸残基、436位非苏氨酸氨基酸残基、和/或457位非天门冬氨酸（D）氨基酸残基，或其任何组合，其导致相对于相应病毒在包括MDCK细胞、Vero细胞或蛋的细胞中生长提高，所述相应病毒具有例如NA中76位T、102位R、139位P、169位N、434位G、436位T、和/或457位D，所述重组病毒还可任选包含PA、PB2、BM2、NP、NS1和/或M1中一个或多个特定位置的选择的氨基酸残基，例如本文所述的那些，PB1。在一种实施方式中，所述重组乙型流感病毒具有76位甲硫氨酸（M）、102位赖氨酸（K）、105位赖氨酸（K）、139位丝氨酸（S）、169位苏氨酸（T）、434位谷氨酸（E）、436位甲硫氨酸（M）、和/或457位天门冬酰胺（N），或其任何组合。

在一种实施方式中，本发明提供一种分离的重组重配流感病毒，所述流感病毒具有：来自流感疫苗病毒的六个“内部”基因片段，所述片段在本文所述的特定位置具有两个或多个选择的氨基酸残基；选自第一流感病毒分离株的NA基因片段；以及来自相同分离株或不同分离株的HA基因片段。

在一种实施方式中，本发明的流感病毒是重组乙型流感病毒，所述重组乙型流感病毒在PA、PB1、PB2、NP、M1和/或NS1之一、之二、之三或更多中的特定位置具有特定的氨基酸残基，其具有的氨基酸序列与SEQ ID No. 1-6（B/Yamagata/1/73的内部基因）编码的相应多肽具有至少80%，例如90%、92%、95%、97%、98%或99%（包括80和99之间的任何整数）连续氨基酸序列同一性，所述相应多肽例如：具有NP中28位非A残基、40位非P残基、51位非P残基、52位非E残基、57位非S残基、204位非M残基、52位非E残基、57位非S残基、204位非M残基、和/或343位非P残基，和/或NP vRNA中1795位g或500位t，或其任何组合；具有M1中34位非G残基、54位非D残基、77位非R残基、86位非M残基、97位非I残基，或其任何组合；具有BM2中58位非H残基、80位非R残基、27位非H残基、26位非G残基，例如，BM2中58位R、80位G、27位R和/或26位R；具有SN1中42位非Y残基、117位非M残基、176位非K残基、和/或252位非S残基，和/或NS1 vRNA中a39g、38之后另外的g，或其任何组合；具有PB2中16位非N残基；和/或具有PA中387位非Y残基、434位非V残基、494位非D残基、524位非T残基，和/或PA vRNA中a2272t、g2213a、a1406g和/或c1445t，或其任何组合。非特定残基的残基可为保守性取代。保守性氨基酸取代是指具有相似侧链的残基的互换。例如，一组具有脂肪族侧链的氨基酸是甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸以及异亮氨酸；一组具有脂肪族-羟基侧链的氨基酸是丝氨酸和苏氨酸；一组具有含酰胺侧链的氨基酸是天门冬酰胺和谷氨酰胺；一组具有芳香族侧链的氨基酸是丙氨酸、酪氨酸以及色氨酸；一组具有碱基侧链的氨基酸是赖氨酸、精氨酸以及组氨酸；一组具有含硫侧链的氨基酸是半胱氨酸和甲硫氨酸。在一种实施方式中，保守性氨基酸取代基是：苏氨酸-缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸-丙氨酸；苯丙氨酸-酪氨酸；赖氨酸-精氨酸；丙氨酸-缬氨酸；谷氨酸-天门冬氨酸；以及天门冬酰胺-谷氨酰胺。还考虑了非保守性取代。

在一种实施方式中，本发明的乙型流感病毒是重组乙型流感病毒，所述重组乙型流感病毒在PA、NS1、M或NP的之一、之二、之三或更多中的特定位置具有特定的氨基酸残基，其多肽具有的氨基酸序列分别与SEQ ID No. 1-6之一编码的相应多肽具有至少80%，例如90%、92%、95%、97%、98%或99%（包括80和99之间的任何整数）连续氨基酸序列同一性。在一种实施方式中，本发明的乙型流感病毒是重组乙型流感病毒，所述重组乙型流感病毒在PA、PB1、PB2、NP、M1和/或NS1的其一或更多中的特定位置具有特定的氨基酸残基，其具有的氨基酸序列与SEQ ID No. 1-6之一编码的相应多肽具有至少80%，例如90%、92%、95%、97%、98%或99%（包括80和99之间的任何整数）连续氨基酸序列同一性，所述相应多肽例如具有保守性取代的残基的多肽。

本发明还包含在本文所述特定位置的选择的氨基酸残基的组合。

在特定位置具有残基的PA、NP、M和/或NS的病毒片段可与PB1的病毒片段、PB2的病毒片段、HA的病毒片段以及NA的病毒片段组合，以提供本发明的重配疫苗病毒。在一种实施方式中，重配病毒中的HA病毒片段与PA、PB1、PB2、NP、M和NS的病毒片段是异源的。在一种实施方式中，重配病毒中的NA病毒片段与PA、PB1、PB2、NP、M和NS的病毒片段是异源的。在一种实施方式中，重配病毒中的HA病毒片段具有来自流感病毒分离株或毒株（“亲本”）的PA、PB1、PB2、NP、M和NS的病毒片段，或其变异体，例如，所述变异体具有编码流感病毒蛋白的病毒片段与亲本流感病毒分离株或毒株中的序列具有至少95%、96%、97%、98%、99%或99.5%氨基酸序列同一性或相对于所述序列具有1、2、5、10或20个取代。在一种实施方式中，所述亲本毒株具有的病毒片段具有与SEQ ID No. 1-6其中至少之一相对应的序列，所述重组病毒具有带有本文所述PA、NS、NP或M中至少一种取代的病毒片段中的至少一种，和亲本病毒片段中的至少一种。在一种实施方式中，重配病毒中的HA基因片段是嵌合HA基因片段，例如，与HA信号肽序列连接的异源HA胞外结构域序列的嵌合体和/或来自亲本分离株或毒株的HA基因片段的HA跨膜结构域序列的嵌合体，或它们的变异体。在一种实施方式中，分离的重组病毒中的NA基因片段是嵌合NA基因片段，例如，与来自亲本分离株或毒株的NA基因片段的NA跨膜结构域序列（或其变异体）和/或来自亲本分离株或毒株的茎序列（或其变异体）连接的异源NA胞外结构域序列的嵌合体，例如，乙型流感病毒NA和甲型流感病毒NA的嵌合体。在一种实施方式中，分离的重组病毒中的NA基因片段是嵌合NA基因片段，例如，与来自亲本分离株或毒株的NA基因片段的NA跨膜结构域序列（或其变异体）和/或来自亲本分离株或毒株的茎序列（或其变异体）连接的异源NA胞外结构域序列的嵌合体。在一种实施方式中，分离的重组病毒具有异源HA基因片段，异源NA基因片段，嵌合HA基因片段，嵌合NA基因片段，或其任何组合。用于制备vRNA或cRNA的核酸序列可为通过重组方法在特定位置引入残基的核酸序列，或可因具有特定位置的残基而被选择。

如本文所述，携带NA和/或HA的异源基因片段的可用作疫苗病毒的流感病毒分离株（例如，具有B/Yamagata或B/Victoria谱系病毒的B/Yamagata/1/73重配株）在MDCK细胞中连续传代，以获得在这些细胞中复制提高的病毒，例如约10-12代次，但可应用较少的代次。在一种实施方式中，连续传代后获得的复制提高的病毒具有的滴度比未连续传代的病毒高至少0.5至1或2个对数级。在一种实施方式中，连续传代后获得的病毒相对于亲本病毒在两个或多个内部基因片段中具有取代。

由此，对于有待在培养细胞（例如MDCK、或Vero细胞或蛋）中生长或传代的疫苗病毒来说，选择具有所揭示的PA、BM2、NP、M1和/或NS1之一或更多中的特定位置的残基的序列、或取代所述残基，当与HA和NA目的序列一起应用时赋予培养细胞中病毒生长提高，这可导致较高的病毒滴度。因此，本发明提供一种选择具有细胞培养物中复制提高的流感病毒的方法。所述方法包括：提供适于流感疫苗制备的细胞，在所述细胞中连续培养一种或多种流感病毒分离株，以及分离连续培养的病毒，所述连续培养的病毒相对于连续培养前的一种或多种分离株生长提高。在一种实施方式中，所述细胞是犬或灵长类细胞、例如人或猴细胞。

本发明提供多种流感病毒载体，例如用于制备重配病毒的那些，包括6:1:1重配株、6:2重配株以及7:1重配株。本发明范围内的6:1:1重配株是具有来自疫苗病毒的6个内部基因片段、来自不同（第二种）病毒分离株的NA基因片段、以及来自第三种分离株的HA基因片段的流感病毒；本发明范围内的6:2重配株是具有来自疫苗病毒的6个内部基因片段、和来自不同（第二种）病毒分离株的NA基因片段和HA基因片段的流感病毒；本发明范围内的7:1重配株是具有来自疫苗病毒的6个内部基因片段和NA基因片段、和来自非疫苗病毒的不同病毒源的HA基因片段的流感病毒，或具有来自疫苗病毒的6个内部基因片段和HA基因片段、和来自非疫苗病毒的不同病毒源的NA基因片段的流感病毒。

在本发明的一种实施方式中，多种载体包括用于vRNA或cRNA产生的载体，所述载体选自：包含操作性连接流感病毒PA DNA（例如cDNA）的启动子的载体，所述PA DNA连接转录终止序列；包含操作性连接流感病毒PB1 DNA（例如cDNA）的启动子的载体，所述PB1 DNA连接转录终止序列；包含操作性连接流感病毒PB2 DNA（例如cDNA）的启动子的载体，所述PB2 DNA连接转录终止序列；包含操作性连接流感病毒HA DNA（例如cDNA）的启动子的载体，所述HA DNA连接转录终止序列；包含操作性连接流感病毒NP DNA（例如cDNA）的启动子的载体，所述NP DNA连接转录终止序列；包含操作性连接流感病毒NA DNA（例如cDNA）的启动子的载体，所述NA DNA连接转录终止序列；包含操作性连接流感病毒M DNA（例如cDNA）的启动子的载体，所述M DNA连接转录终止序列；以及包含操作性连接流感病毒NS DNA的启动子的载体，所述NS DNA连接转录终止序列。在一种实施方式中，用于PB1、PB2、PA、NP、M以及NS的vRNA或cRNA产生的DNA具有来自在哺乳动物培养细胞中复制至高滴度的流感病毒的序列，和/或来自疫苗病毒的序列，所述培养细胞例如MDCK细胞、Vero细胞或PER.C6®细胞，以及任选含胚鸡蛋，所述疫苗病毒例如在人类不引起显著疾病的疫苗病毒。用于NA的vRNA或cRNA产生的DNA（例如cDNA）可来自任何NA，用于HA的vRNA或cRNA产生的DNA可来自任何HA。在一种实施方式中，用于vRNA或cRNA产生的DNA可为甲型流感或丙型流感病毒。用于NA和HA的vRNA或cRNA产生的DNA可来自不同毒株或分离株（6:1:1重配株）或来自相同毒株或分离株（6:2重配株），或NA可来自用于内部基因的相同毒株或分离株（7:1重配株）。多种载体还包括用于mRNA产生的载体，所述载体选自：编码流感病毒PA的载体，编码流感病毒PB1的载体，编码流感病毒PB2的载体，编码流感病毒NP的载体，任选编码NP、NS、M，例如，M1和BM2、HA或NA的一种或多种载体。编码病毒蛋白的载体可进一步包含转录终止序列。

本发明范围内可提供用于重配株的内部基因的病毒包括如下病毒：在MDCK细胞中具有高滴度，例如至少约10⁵ PFU/mL的滴度，例如至少10⁶ PFU/mL、10⁷ PFU/mL或10⁸ PFU/mL；在含胚鸡蛋中具有高滴度，例如，至少约10⁷ EID₅₀/mL的滴度，例如，至少10⁸ EID₅₀/mL、10⁹ EID₅₀/mL或10¹⁰ EID₅₀/mL；在诸如MDCK细胞的细胞中具有高滴度，例如，至少约10⁷ PFU/mL的滴度，例如至少10⁸ PFU/mL；或在两种或多种这些宿主细胞中具有高滴度。

在一种实施方式中，在诸如MDCK细胞或Vero细胞的细胞中的本发明重配病毒的滴度可比在特定位置无特定残基的相应病毒的滴度大1个对数级、2个对数级、3个对数级或更多。

在一种实施方式中，用于PB1、PB2、PA、NP、M以及NS的内部基因的DNA编码的蛋白质与SEQ ID NO：1-6之一编码的相应多肽具有基本相同的活性。如本文所使用的，“基本相同的活性”包括相应全长多肽的分别约0.1%、1%、10%、30%、50%、90%，例如达100%或更多的活性，或约80%、90%或更多的可检测蛋白水平，或更多的活性或蛋白水平。在一种实施方式中，所述核酸序列编码的多肽与SEQ ID NO：1-6之一编码的多肽具有基本相同，例如具有至少80%，例如90%、92%、95%、97%、98%或99%（包括80和99之间的任何整数）的连续氨基酸序列同一性。在一种实施方式中，分离和/或纯化的核酸分子包含与SEQ ID NO：1-6之一基本相同，例如具有至少50%，例如60%、70%、80%或90%（包括50和100之间的任何整数）或更多连续核酸序列同一性的核苷酸序列，在一种实施方式中，所述核酸分子还编码与SEQ ID NO：1-6之一编码的多肽具有至少80%，例如90%、92%、95%、97%、98%或99%（包括80和99之间的任何整数）的连续氨基酸序列同一性的多肽。在一种实施方式中，所述流感病毒多肽具有一种或多种，例如2、5、10、15、20或更多种保守性氨基酸取代，例如，保守和非保守性氨基酸取代组合中2、5、10、15、20或更多种的达10%或20%的保守性取代，例如，相对于SEQ ID NO：1-6之一编码的多肽达10%或20%的残基的保守性取代，所述流感病毒多肽相对于SEQ ID NO：1-6之一编码的多肽在PA、PB2、BM2、NP、M1和/或NS1之一或更多中具有特征性残基。在一种实施方式中，所述流感病毒多肽相对于SEQ ID NO：1-6之一编码的多肽具有一种或多种，例如2、3、4、5、6、7或8种保守性和/或非保守性氨基酸取代。

由此，本发明包括分离和纯化的载体或质粒的用途，所述载体或质粒表达或编码流感病毒蛋白，或表达或编码流感vRNA或cRNA，包括天然或重组vRNA或cRNA。所述载体可包含流感cDNA，例如甲型、乙型或丙型流感DNA（见Fields Virology（Fields等（编辑）,Lippincott, Williams和Wickens（2006），具体通过引用并入本文）。任何合适的启动子或转录终止序列可用于表达蛋白质或多肽，例如病毒蛋白质或多肽，非病毒病原体蛋白质或多肽，或治疗性蛋白质或肽。

本发明的组合物或多种载体还可包含目的异源基因或开放阅读框，例如可用作疫苗编码免疫原性肽或蛋白质的外源基因，或在基因取代中所述外源基因可编码例如可用于癌症治疗或疫苗的表位，或可用于基因治疗的肽或多肽。当制备病毒时，包含目的基因或cDNA的载体或质粒可取代用于流感病毒基因的载体或质粒，或可为除用于所有流感病毒基因的载体或质粒之外的载体或质粒。由此，本发明的另一种实施方式包括如上所述的组合物或多种载体，其中，所述载体中的一种被5'流感病毒序列取代或进一步包含5'流感病毒序列，所述5'流感病毒序列任选包含5'流感病毒编码序列或其一部分，所述5'流感病毒序列连接所需的核酸序列（例如所需的cDNA），连接3'流感病毒序列，所述3'流感病毒序列任选包含3'流感病毒编码序列或其一部分。在一种实施方式中，诸如cDNA的所需核酸序列为反义（反基因组）方向。引入这样的载体连同上述其他载体至流感病毒复制允许的宿主细胞中产生包含与载体异源序列对应的vRNA或cRNA的重组病毒。

用于产生vRNA或cRNA的载体中的启动子可为RNA聚合酶I启动子，RNA聚合酶II启动子，RNA聚合酶III启动子，T7启动子，或T3启动子，任选地所述载体包含转录终止序列，例如RNA聚合酶I转录终止序列，RNA聚合酶II转录终止序列，RNA聚合酶III转录终止序列，或核酶。本发明范围内的核酶包括但不限于四膜虫属核酶、RNA酶P、锤头核酶、发夹核酶、肝炎核酶以及合成的核酶。在一种实施方式中，RNA聚合酶I启动子是人RNA聚合酶I启动子。

vRNA、cRNA或病毒蛋白表达载体中的启动子或转录终止序列相对于所述启动子或任何其他载体可以是相同或不同的。在一种实施方式中，表达流感vRNA或cRNA的载体或质粒包含适于在至少一种特定宿主细胞或在多于一种宿主中表达的启动子，所述宿主细胞例如禽或哺乳动物宿主细胞，例如犬、猫、马、牛、或灵长类动物细胞，包括人细胞。

在一种实施方式中，用于vRNA或cRNA的至少一种载体包含连接核酶序列的RNA聚合酶II启动子，所述核酶序列连接病毒编码序列，所述病毒编码序列连接另一核酶序列，任选地另一核酶序列连接RNA聚合酶II转录终止序列。在一种实施方式中，用于vRNA或cRNA产生的至少2种、例如3、4、5、6、7或8种载体包含RNA聚合酶II启动子，第一核酶序列，所述第一核酶序列与对应于包含病毒编码序列的病毒序列的序列5'连接，所述与对应于包含病毒编码序列的病毒序列的序列与第二核酶序列5'连接，所述第二核酶序列于转录终止序列5'连接。各vRNA或cRNA载体中的各RNA聚合酶II启动子可与任何其他vRNA或cRNA载体中的RNA聚合酶II启动子相同或不同。相似地，各vRNA或cRNA载体中的各核酶序列可与任何其他vRNA或cRNA载体中的核酶序列相同或不同。在一种实施方式中，单个载体中的核酶序列不相同。

在一种实施方式中，本发明提供多种用于重配株的流感病毒载体，所述载体包括：用于产生vRNA或cRNA的载体，其包含操作性连接流感病毒PA DNA（例如cDNA）的启动子，所述PA DNA连接转录终止序列；用于产生vRNA或cRNA的载体，其包含操作性连接流感病毒PB1DNA（例如cDNA）的启动子，所述PB1 DNA连接转录终止序列；用于产生vRNA或cRNA的载体，其包含操作性连接流感病毒PB2 DNA（例如cDNA）的启动子，所述PB2 DNA连接转录终止序列；用于产生vRNA或cRNA的载体，其包含操作性连接流感病毒HA DNA（例如cDNA）的启动子，所述HA DNA连接转录终止序列；用于产生vRNA或cRNA的载体，其包含操作性连接流感病毒NPDNA（例如cDNA）的启动子，所述NP DNA连接转录终止序列；用于产生vRNA或cRNA的载体，其包含操作性连接流感病毒NA DNA（例如cDNA）的启动子，所述NA DNA连接转录终止序列；用于产生vRNA或cRNA的载体，其包含操作性连接流感病毒M DNA（例如cDNA）的启动子，所述MDNA连接转录终止序列；以及用于产生vRNA或cRNA的载体，其包含操作性连接流感病毒NSDNA（例如cDNA）的启动子，所述NS DNA连接转录终止序列，其中用于PB1、PB2、PA、NP、NS以及M的DNA来自一种或多种流感疫苗种子病毒，在特定位置包含两种或多种特征性残基；用于mRNA产生的载体，其包含操作性连接编码流感病毒PA的DNA片段的启动子；用于mRNA产生的载体，其包含操作性连接编码流感病毒PB1的DNA片段的启动子；用于mRNA产生的载体，其包含操作性连接编码流感病毒PB2的DNA片段的启动子；用于mRNA产生的载体，其包含操作性连接编码流感病毒NP的DNA片段的启动子；任选地，用于mRNA产生的载体，其包含操作性连接编码流感病毒HA的DNA片段的启动子；用于mRNA产生的载体，其包含操作性连接编码流感病毒NA的DNA片段的启动子；用于mRNA产生的载体，其包含操作性连接编码流感病毒M1的DNA片段的启动子；用于mRNA产生的载体，其包含操作性连接编码流感病毒BM2的DNA片段的启动子；或用于mRNA产生的载体，其包含操作性连接编码流感病毒NS2的DNA片段的启动子。在一种实施方式中，至少一种载体包含与编码PB1、PB2、PA、NP、M或NS或其一部分的那些序列对应的序列，所述序列与SEQ ID NO：1-6之一编码的相应多肽具有基本相同的活性，例如，编码与SEQ ID NO：1-6之一编码的多肽具有至少80%、例如85%、90%、92%、95%、98%、99%或100%（包括80和100之间的任何整数）氨基酸同一性的多肽的序列。任选地，可应用两种载体代替包含操作性连接流感病毒M cDNA（连接转录终止序列）的启动子的载体，例如，包含操作性连接流感病毒M1 cDNA（连接转录终止序列）的启动子的载体，和包含操作性连接流感病毒BM2 cDNA（连接转录终止序列）的启动子的载体。

本发明的多种载体可物理连接，或各载体可存在于单个质粒或其他，例如线性核酸递送媒介物。在一种实施方式中，各vRNA或cRNA产生载体位于分开的质粒。在一种实施方式中，各mRNA产生载体位于分开的质粒。

本发明还提供一种制备流感病毒的方法。所述方法包括以有效产生感染性流感病毒的量使细胞与本发明的多种载体接触，例如，顺序或同时。本发明还包括从与多种载体接触的细胞分离病毒。由此，本发明进一步提供分离的病毒，以及与本发明多种载体或表达接触的宿主细胞。在另一种实施方式中，本发明包括使所述细胞与一种或多种载体，vRNA或cRNA或蛋白质产生载体接触，之后与另外的载体，vRNA或蛋白质产生载体接触。在一种实施方式中，用于所述方法的vRNA或cRNA载体的启动子是RNA聚合酶I启动子，RNA聚合酶II启动子，RNA聚合酶III启动子，T3或T7启动子。在一种实施方式中，所述RNA聚合酶I启动子是人RNA聚合酶I启动子。在一种实施方式中，用于所述方法的各vRNA或cRNA载体位于分开的质粒。在一种实施方式中，用于所述方法的vRNA或cRNA载体位于一种质粒或位于两种或三种不同的质粒。在一种实施方式中，用于所述方法的各mRNA载体位于分开的质粒。在一种实施方式中，用于所述方法的PA、PB1、PB2和NP的mRNA载体位于一种质粒或位于两种或三种不同的质粒。

在一种实施方式中，本发明提供一种选择细胞培养物中复制提高的流感病毒的方法。所述方法包括：提供适于流感疫苗产生的细胞，连续培养所述细胞中的一种或多种流感病毒分离株，分离相对于连续培养前的一种或多种分离株生长提高的连续培养病毒。在一种实施方式中，所述细胞是啮齿类或灵长类动物细胞。

本文所述制备病毒的方法，不需要辅助病毒感染，可用于病毒诱变研究，及制备疫苗（例如，用于AIDS，流感，乙型肝炎，丙型肝炎，鼻病毒，纤丝病毒，疟疾，疱疹，以及口蹄疫）和基因治疗载体（例如，用于癌症，AIDS，腺苷脱氨酶，肌营养不良，鸟氨酸氨甲酰转移酶缺乏症以及中枢神经系统肿瘤）。由此，提供用于医学治疗（例如，用于疫苗或基因治疗）的病毒。

本发明还提供分离的病毒多肽，及制备和使用本发明的重组病毒的方法。所述方法包括施用于宿主生物，例如哺乳动物，有效量本发明的流感病毒，例如灭活病毒制剂，任选联合例如佐剂和/或赋形剂，以有效预防或缓解动物、例如哺乳动物的病毒或抗原密切相关病毒的感染。在一种实施方式中，肌内施用所述病毒，而在另一种实施方式中，鼻内施用所述病毒。在一些给药方案中，可肌内或鼻内施用所有剂量，而在其他给药方案中，联合应用肌内和鼻内施用。所述疫苗可进一步包含例如其他流感病毒分离株，包括重组流感病毒，其他病原体，另外的生物制剂或微生物组分，以形成多价疫苗。在一种实施方式中，鼻内接种例如包含灭活流感病毒和粘膜佐剂，可诱导鼻咽中的病毒特异性IgA和中和抗体，以及血清IgG。

本发明的流感病毒可连同其他抗病毒剂使用，例如金刚烷胺、金刚乙胺和/或神经氨酸酶抑制剂，例如，病毒可与这些抗病毒剂分开施用，例如，在这些抗病毒剂之前和/或之后施用，或与这些抗病毒剂一起施用。

附图说明

图1，B/Yamagata/1/1973（SEQ ID NO：1-6、9以及10）的核苷酸序列，及HA（SEQ IDNO：7）和NA（SEQ ID NO：8）的氨基酸序列。

图2A-B，MDCK细胞中的文库传代概述，及高产量（HY）候选株(HY(Yam）和HY(Vic））的鉴定。指定的vRNA中具有随机突变的Yamagata和Victoria谱系病毒文库在MDCK细胞中传代12次，或传代两次，混合，再传代10多次。对于各病毒谱系挑选700多个病毒噬斑。基于血凝反应和病毒滴度，在分步选择过程中鉴定各谱系的前8个候选株。对于组合突变的检测导致筛选RG(Yam）#8和RG(Vic）#2。引入另外的突变（在Vero细胞中在病毒文库筛选中鉴定）导致高产量疫苗骨架HY(Yam）和HY(Vic）。HA滴度，血凝滴度。

图3A-B，筛选B/Yamagata-（A）和B/Victoria-（B）谱系高产量候选株的病毒滴度（生长动力学）和血凝（HA）滴度。具有Yamagata（A）和Victoria谱系(B）的高产量疫苗骨架的病毒。候选病毒中检测到的突变分别示于表1和2。从三个独立的试验获得数据，显示平均滴度±标准差。通过使用线性混合模型来确定统计学显著性(*p<0.05；**p<0.01），如果高产量疫苗候选株的滴度低于野生型病毒，则不显示P值。星号颜色表示各病毒与野生型（WT）病毒的比较。

图4A-B，B/Yamagata谱系(A）和B/Victoria谱系（B）再生高产量候选株的病毒滴度和HA滴度。引入Yamagata谱系(A）和Victoria谱系(B）病毒的突变分别示于表3和4。从三个独立的试验获得数据，显示平均滴度±标准差。通过使用线性混合模型计算p值(*p<0.05；**p<0.01），如果高产量疫苗候选株的滴度低于野生型病毒，则不显示P值。星号颜色表示各病毒与野生型（WT）病毒的比较。

图5，嵌合HA和NA构建体。乙型流感病毒HA（绿色）和NA（蓝色）蛋白质胞外结构域插入甲型流感病毒PR8 HA（粉色）和NA（暗橙色）vRNA的其余序列之间。宽条表示编码区，小条表示非编码区（NCR）。SP，信号肽；TM，跨膜结构域；CT，胞质尾。

图6A-B，高产量Yamagata和Victoria谱系病毒的生长动力学和HA滴度。(A）指定的Yamagata谱系野生型病毒与Yamagata谱系高产量候选株RG(Yam）#8（表3）和具有PA-a2272t突变的RG(Yam）#8进行比较，后一种病毒被选择作为首要的候选株HY(Yam）。(B）指定的Victoria谱系野生型病毒与Victoria谱系高产量候选株RG(Vic）#2（表4）和具有PA-a2272t突变的RG(Vic）#2进行比较，后一种病毒被选择作为首要的候选株HY(Vic）。在两组试验中，使用指定病毒以0.001 MOI一式三份感染MDCK细胞和35°C温育。在指定的时间点，分别通过进行噬斑或血凝分析检测病毒滴度和血凝滴度。所呈现的数值为三个独立试验的平均值±标准差（SD）。通过使用线性混合模型计算p值(*p<0.05；**p<0.01）。红色和蓝色星号表示各病毒与WT病毒的比较，米色星号表示红色和蓝色描述的病毒之间的比较。

图7A-F，野生型病毒和具有不同HA和NA vRNA的高产量病毒的比较。具有指定病毒的HA和NA vRNA连同各天然野生型分离株（WT）或HY(Yam）（A–C）或HY(Vic）（D–F）（黑曲线表示的病毒具有人乙型流感病毒分离株的8个野生型vRNA片段）的内部vRNA片段的病毒。所呈现的数值为三个独立试验的平均值±标准差（SD）。通过使用线性混合模型计算p值(*p<0.05；**p<0.01）。红色星号表示各病毒与WT病毒的比较。

图8A-D，HY(Yam）和HY(Vic）骨架的交换。(A和B）两种野生型Yamagata谱系病毒与具有相同HA和NA vRNA连同HY(Yam）或HY(Vic）的内部基因的病毒的病毒滴度和血凝滴度的比较。(C和D）两种野生型Victoria谱系病毒与具有相同HA和NA vRNA连同HY(Yam）或HY(Vic）的内部基因的病毒的病毒滴度和血凝滴度的比较。所呈现的数值为三个独立试验的平均值±标准差（SD）。通过使用线性混合模型计算p值(*p<0.05；**p<0.01）。红色和蓝色星号表示各病毒与WT病毒的比较，米色星号表示红色和蓝色描述的病毒之间的比较。

图9A-F，高产量甲型流感和乙型流感疫苗病毒骨架的比较。(A和B），如下的病毒产量和血凝滴度：(i）指定的野生型病毒；(ii）具有指定的HA和NA vRNA连同HY(Yam）的内部基因的病毒；以及(iii）具有指定的甲型/乙型嵌合HA和NA vRNA连同高产量甲型流感病毒内部基因的病毒。(C和D），比较。对于Victoria谱系病毒进行相似的试验。(E和F）在含胚鸡蛋中对指定的野生型和杂交病毒进行比较。所呈现的数值为三个独立试验的平均值±标准差（SD）。通过使用线性混合模型(A–D）或双因素方差分析接着Tukey事后检验来确定统计学显著性(E和F）（*P < 0.05；**P < 0.01），如果高产量疫苗候选株的滴度低于野生型病毒，则不显示P值。红色和蓝色星号表示各病毒与WT病毒的比较，米色星号表示红色和蓝色描述的病毒之间的比较。

图10A-B，HY(Yam）和HY(Vic）病毒的病毒总蛋白产量及HA含量的评估。A）具有指定的Yamagata谱系病毒的HA和NA vRNA连同相同天然野生型病毒（WT）或HY(Yam）的内部vRNA的病毒的比较。B）具有指定的Victoria谱系病毒的HA和NA vRNA连同相同天然野生型病毒（WT）或HY(Vic）的内部vRNA的病毒的比较。显示MDCK细胞培养的蔗糖梯度纯化病毒样品的病毒总蛋白产量（左和中）。PNGaseF处理对HA1和HA2去糖基化，进行该处理是因为糖基化HA2以与M1相似的分子量迁移。基于病毒蛋白总量和HA相对量计算HA含量（右）。所呈现的数值为三个独立试验的平均值±标准差（SD）。通过使用单因素方差分析接着Dunnett检验来评价统计学显著性，对野生型病毒的病毒蛋白总产量和HA含量与重组的高产量疫苗病毒的病毒总产量和HA含量进行比较(*P < 0.05；**P < 0.01）。

图11A-F，小鼠中HY(Yam）和HY(Vic）病毒的毒性。A–C）比较野生型Yamagata谱系病毒(B/Massachusetts/2/2012）、具有B/Massachusetts/2/2012 HA和NA vRNA连同其余的B/Yamagata/1/73的vRNA（用于病毒文库生成）的病毒、以及具有B/Massachusetts/2/2012 HA和NA vRNA连同其余的HY(Yam）的vRNA的病毒。D–F）比较野生型Victoria谱系病毒(B/Brisbane/60/2008）、具有B/Brisbane/60/2008 HA和NA vRNA连同其余的B/Yamagata/1/73的vRNA（用于病毒文库生成）的病毒、以及具有B/Brisbane/60/2008 HA和NA vRNA连同其余的HY(Vic）的vRNA的病毒。使用10⁶ pfu的指定病毒鼻内接种BALB/c小鼠（每组5只），每天监测体重变化（A和D）和存活率（B和E）。为了评价小鼠中的病毒复制，将10⁶ pfu的指定病毒用于感染10只另外的小鼠。在感染后的3天和6天，处死各组中的5只小鼠，通过在MDCK细胞中使用噬斑分析检测肺病毒滴度（C和F）。通过使用单因素方差分析接着Dunnett检验来评价统计学显著性，(*P < 0.05；**P < 0.01）。

图12A-B，单个重配株病毒的生长动力学和血凝滴度。A）用于Yamagata谱系病毒文库生成的亲本病毒（具有B/Yokohama/UT-K31/2012的HA和NA vRNA的B/Yamagata/1/73）与还具有HY(Yam）的单个vRNA的病毒进行比较。B）用于Victoria谱系病毒文库生成的亲本病毒（即具有B/Yokohama/UT-K1A/2011的HA和NA vRNA的B/Yamagata/1/73）与还具有HY(Vic）的单个vRNA的病毒进行比较。从三个独立的试验获得数据，显示为平均滴度±SD。所呈现的数值为三个独立试验的平均值±标准差（SD）。通过使用线性混合模型确定统计学显著性(*p<0.05；**p<0.01）。星号颜色表示各病毒与对照病毒（黑色描述）的比较。

图13A-D，35ºC下微复制子分析中萤光素酶的活性。NP蛋白或PA和NS vRNA中的突变对病毒聚合酶活性的影响。使用用于聚合酶蛋白和野生型或突变体NP的蛋白表达质粒、和使用转录编码萤光素酶的病毒样RNA的质粒转染293T（A）或MDCK（B）细胞。48小时后检测萤光素酶活性。并行地，使用上述蛋白表达质粒和使用编码萤光素酶和具有PA vRNA（C）或NS vRNA（D）非编码区中指定突变的野生型或突变体病毒样RNA转染MDCK细胞。48小时后检测萤光素酶活性。从三个独立的试验获得数据，显示为平均滴度±SD。通过使用单因素方差分析接着Dunnett检验确定统计学显著性(*p<0.05；**p<0.01）。

图14A-B，HY骨架中M1突变对HA、NP和M1 VLP掺入和组合的作用。使用HA、NA、NP、BM2、NS2及野生型或突变体M1的蛋白表达质粒转染293T细胞。转染后48小时，使用抗HA、抗NP、以及抗M1单克隆抗体对细胞培养上清中的细胞裂解物和VLP进行蛋白质印迹(A）。通过使用ImageJ软件（NIH）对HA、NP以及M1的条带强度进行定量，VLP中HA、NP以及M1的相对百分数显示于(B）。从三个独立的试验获得数据，显示为平均滴度±SD。通过使用单因素方差分析接着Tukey事后检验确定统计学显著性(*p<0.05；**p<0.01）。

图15A-B，NS1突变对IFN活性的影响。A）为比较野生型和突变体NS1干扰IFN-β合成的能力，使用野生型或NS1蛋白表达质粒和使用报告质粒pGL-IFN-β（在IFN-β启动子调控下编码萤火虫萤光素酶蛋白）转染293T细胞。温育细胞24小时，使用仙台（Sendai）病毒在5MOI下感染细胞，之后再温育细胞24小时，然后裂解以检测萤火虫萤光素酶。B）为检测野生型和突变体NS1干扰IFN-β刺激的基因的能力，使用野生型或突变体NS1蛋白表达质粒和使用报告质粒pISRE-Luc（在干扰素调节启动子的调控下编码萤火虫萤光素酶）转染293T细胞。24小时后，使用人IFN-β刺激细胞。转染后48小时，检测萤光素酶活性。从三个独立的试验获得数据，显示为平均滴度±SD。通过使用单因素方差分析接着Tukey事后检验确定统计学显著性(*p<0.05；**p<0.01）。

图16，HY选择克隆中病毒片段的核苷酸序列（来自Yamagata/1/73的PB2和PB1（SEQID No. 11和12），来自具有a1406g/c1445t/a2272t的Yamagata/1/73的PA(SEQ ID NO：13），来自具有P40S、c500t(SEQ ID NO：14）或P40S/M204T、c500t（SEQ ID NO：15）的Yamagata/1/73的NP，来自具有R77K（SEQ ID NO：16）或M86T（SEQ ID NO：17）的Yamagata/1/73的M，以及来自具有a39g K176Q（SEQ ID NO：18）或38(+1）g（SEQ ID NO：19）的Yamagata/1/73的NS。

具体实施方式

如本文所使用，术语“分离”是指体外制备和/后分离核酸分子，例如，本发明的载体或质粒，肽或多肽（蛋白质）或病毒，使得其与体内物质无关，或基本由体外物质纯化而来。分离的病毒制备物通常通过体外培养和传代，和/或在蛋中传代而获得，基本无其他感染因子。

如本文所使用，“基本纯”是指目的物是优势物，例如，在组合物中摩尔基础上比任何其他单个物质更丰富，优选组合物中存在至少约80%的目的物，任选存在90%或更多，例如95%、98%、99%或更多目的物。

如本文所使用，“基本无”是指使用特定感染因子的标准检测方法在所述因子的检测水平以下。

“重组”病毒是体外操作，例如使用重组DNA技术，以引入变化至病毒基因组中的病毒。重配病毒可通过重组或非重组技术制备。

如本文所使用，术语“重组核酸”或“重组DNA序列或片段”是指自来源衍生或分离的核酸，例如DNA，可接下来对其体外化学改变，使得其序列是非天然存在的，或对应于不像在天然基因组中定位的天然存在的序列。自来源“衍生”的DNA的实例可为被鉴定为有用片段的DNA序列，其然后以基本纯形式化学合成。这种自来源“分离”的DNA的实例可为通过化学方法从所述来源离断或移取的有用DNA序列，例如通过使用限制性内切酶，使得可通过遗传工程对其进一步操作，例如扩增，以用于本发明。

如本文所使用，“异源”流感病毒基因或基因片段来自与重组、例如重配流感病毒中大多数其他流感病毒基因或基因片段不同的流感病毒源。

术语“分离的多肽”、“分离的肽”或“分离的蛋白质”包括cDNA或重组RNA编码的多肽、肽或蛋白质，包括合成来源的，或它们的一些组合。

本文使用的术语“重组蛋白”或“重组多肽”是指重组DNA分子表达的蛋白分子。相比较而言，本文使用的术语“天然蛋白”是指自天然存在的（即非重组）来源分离的蛋白质。分子生物技术可用于制备与蛋白天然形式相比较具有相同特性的蛋白的重组形式。

用于比较的序列比对方法为本领域公知。由此，可使用数学算法实现确定任何两个序列之间的同一性百分数。

可利用这些数学算法的计算机操作用于比较序列以确定序列同一性。使用这些程序的比对可使用缺省参数进行。进行BLAST分析的软件可通过国家生物技术信息中心公开获得(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）。所述算法可涉及首先通过鉴定问询序列中长度W的短字母的高分序列配对（HSP），当其与数据库序列相同长度的字母比对时匹配或满足某些阳性阈值分数T。T是指邻近字母分数阈值。这些起始邻近字母采样数作为起始检索的种子以发现包含它们的更长的HSP。然后沿各序列两个方向延伸字母采样数，远至可增加累积比对分数。使用参数M（用于匹配残基对的赏分，总是> 0）和N（用于错配残基的罚分，总是<0）计算核苷酸序列的累积分数。对于氨基酸序列，得分矩阵用于计算累积分数。当累积比对分数自其最大获取值降落X量时，各方向的字母采样数延伸停止，由于一个或多个阴性得分残基比对累积，累积分数达零，或更低，或达到任一序列的末端。

除了计算序列同一性百分数，BLAST算法还可进行两个序列之间相似性的统计学分析。BLAST算法提供的对相似性的一种检测可为最小总和概率(P(N）），其提供概率指示，通过该指示会偶然发生两个核苷酸或氨基酸之间的匹配。例如，如果在对测试核酸序列与参考核酸序列进行的比较中最小总和概率小于约0.1，更优选小于约0.01，最有效小于约0.001，则认为测试核酸序列与参考序列相似，

可如下使用BLASTN程序（用于核苷酸序列）：字母长度（W）缺省值11，期待值（E）10，截断值100，M= 5，N=－4，两条带比较。对于氨基酸序列，可如下使用BLASTP程序，字母长度（W）缺省值3，期待值（E）10，及BLOSUM62得分矩阵。见http://www.ncbi.n1m.nih.gov。还可通过检查手工进行比对。

对于序列比较，通常一个序列用作参考序列，测试序列与之比较。当使用序列比较算法时，将测试序列和参考序列输入计算机，如有必要指定次序列定位，并指定序列算法程序参数。然后，基于指定的程序参数，序列比较算法计算测试序列相对于参考序列的序列同一性。

乙型流感病毒的结构和增殖

乙型流感病毒基因组具有8个单链反义病毒RNA（vRNA），所述RNA编码至少10种蛋白质。流感病毒生命周期起始于血凝素（HA）与宿主细胞表面含唾液酸的受体结合，之后是受体介导的胞吞。晚期内含体中低pH触发HA中的构象移位，由此暴露HA2亚单位（所谓的融合肽）的N末端。融合肽起始病毒和内含体膜的融合，基质蛋白（MA）和RNP复合体被释放至细胞质。RNP由核蛋白（NP）和病毒聚合酶复合体构成，核蛋白（NP）使vRNA壳体化，病毒聚合酶复合体由PA、PB1以及PB2蛋白形成。RNP被运输至细胞核中，其中发生转录和复制。RNA聚合酶复合体催化三种不同反应：合成具有5'帽和3'聚腺苷酸结构的mRNA，合成全长互补RNA（cRNA），以及使用cRNA作为模板合成基因组vRNA。然后新合成的vRNA、NP以及聚合酶蛋白被组装成RNP，从细胞核输出，运输至胞质膜，其中发生子代病毒颗粒的萌芽。神经氨酸酶（NA）蛋白在感染晚期通过从唾液酸寡糖移除唾液酸而在感染晚期起到关键作用，由此从细胞表面释放新组装的病毒体并防止病毒颗粒自聚集。尽管病毒组装涉及蛋白质-蛋白质及蛋白质-vRNA相互作用，这些相互作用的性质很大程度上是未知的。

本发明的乙型流感病毒

增加细胞培养物和/或含胚鸡蛋中病毒复制能力的突变可用于扩增流感病毒和建立强健的流感疫苗平台。当前，大多数乙型流感疫苗在含胚鸡蛋中生成。在在美国和欧洲，MDCK细胞中生成的流感疫苗现在被批准用于人类，在欧洲衍生自Vero细胞的流感疫苗被批准用于人类。如本文所使用，疫苗病毒分离株的病毒“内部”基因（除编码病毒表面糖蛋白HA和NA的基因之外的病毒基因）中具有随机突变的病毒文库在细胞（例如MDCK细胞或Vero细胞）中生成和传代，例如B/Yamagata/1/73的内部基因与来自B/Yokohama/UT-K31/2012的NA和HA基因（表示Yamagata谱系）或来自B/Yokohama/UT-K1A/2011的NA和HA基因（表示Victoria谱系）。所鉴定的突变导致细胞中较高的病毒滴度（还可增加异源细胞和/或含胚鸡蛋中的病毒滴度），允许更高效的乙型流感病毒生长和更成本有效的疫苗制备。除了病毒内部片段和病毒糖蛋白的编码区中的突变外，还观察到非编码区中增加病毒滴度的突变，例如NP片段中的g1795a，NS片段中的a39g，NS片段中38位之后另外的g，或PA片段中的g2213a或a2272t。所产生的编码序列赋予提高的生长还可被密码子利用率优化，例如，被优化用于在哺乳动物细胞中表达，例如犬细胞或灵长类动物细胞，或禽细胞，例如鸡胚。突变可以以不同组合使用，具有受使用的细胞系（或蛋）影响的结果，和所需的病毒复制改进水平。可将一种或多种选择的突变引入疫苗病毒分离株的一种或多种内部病毒基因中，或具有一种或多种突变的一种或多种内部病毒基因可被选择包含在可用作疫苗病毒的重配株中。然后可将所述病毒与其他病毒组合，例如一种或多种甲型流感病毒和/或一种或多种其他乙型流感病毒，以形成多价疫苗。

可用于本发明的细胞系

任何支持流感病毒高效复制的细胞，例如任何禽细胞或哺乳动物细胞，例如人细胞（例如293T或PER.C6®细胞），或犬（例如MDCK）、牛、马、猫、猪、羊、啮齿动物细胞，例如貂细胞（例如MvLu1细胞），或仓鼠细胞（例如CHO细胞），或非人灵长类动物（例如Vero细胞），包括突变体细胞，均可用于分离和/或增殖流感病毒。分离的病毒可用于制备重配株病毒。在一种实施方式中，用于疫苗制备的宿主细胞为连续的哺乳动物或禽细胞系或细胞株。可对待使用的细胞进行完整表征，使得可包括用于最终产品纯度的合适试验。可用于表征细胞的数据包括：(a）有关其起源、衍生及传代史的信息；(b）有关其生长和形态学特征的信息；(c）偶发因素的试验结果；(d）使得将所述细胞与其他细胞系明显识别的区别特征，例如生物化学、免疫学以及细胞遗传学模式；以及(e）致肿瘤性试验的结果。在一种实施方式中，所使用的宿主细胞的传代水平或群体倍增数尽可能低。

在一种实施方式中，所述细胞为WHO所保证的或可保证的连续细胞系。保证这些细胞系的要求包括：有关谱系、生长特性、免疫学标志、病毒易感性致肿瘤性以及储存条件之一的表征，以及通过在动物、蛋以及细胞培养物中检测。这样的表征用于证实所述细胞无可检测的外源因子。在某些国家，还可需要细胞核学。另外，在用于疫苗生成的那些细胞相同传代水平的细胞中检测致肿瘤性。可在疫苗制备之前通过显示给出一致结果的方法纯化病毒（见，例如，世界卫生组织，1982）。

可在疫苗或基因治疗制剂前对宿主细胞产生的病毒进行高度纯化。通常，纯化操作导致充分去除细胞DNA和其他细胞组分以及外源因子。还可使用充分降解DNA或使DNA变性的操作。

流感疫苗

本发明的疫苗包含本发明分离的重组流感病毒，任选一种或多种包含其他分离流感病毒的其他分离病毒，一种或多种分离流感病毒或一种或多种其他病原体的一种或多种免疫原性蛋白或糖蛋白，例如，来自一种或多种细菌、非流感病毒、酵母菌或真菌的免疫原性蛋白，或编码一种或多种病毒蛋白的分离核酸（例如DNA疫苗），所述病毒蛋白包含本发明分离流感病毒的一种或多种免疫原性蛋白。在一种实施方式中，本发明的流感病毒可为用于流感病毒或其他病原体的疫苗载体。

完整的病毒体疫苗可通过超滤浓缩，然后通过区带离心或通过层析进行纯化。除本发明病毒以外的病毒，例如包含在多价疫苗中的那些，可在纯化之前或之后使用例如福尔马林或β-丙内酯来灭活。

亚单位疫苗包含纯化的糖蛋白。这样的疫苗可如下制备：使用通过去污剂处理裂解的病毒悬浮液，通过例如超速离心纯化表面抗原。由此，亚单位疫苗主要包含HA蛋白，还包含00NA。所使用的去污剂可为例如阳离子去污剂，例如十六烷基三甲基溴化铵（Bachmeyer，1975）阴离子去污剂，例如脱氧胆酸铵（Laver & Webster, 1976），或非离子去污剂，例如TRITON X100名下商业化的去污剂。还可在使用蛋白酶（例如凤梨酶）处理病毒体之后分离血凝素，然后对其纯化。在多价疫苗中，可将亚单位疫苗与本发明的减毒病毒组合。

裂解疫苗包含经受使用溶解脂质的试剂处理的病毒体。裂解疫苗可如下制备：在搅拌下通过脂质溶剂例如乙醚或氯仿联合去污剂处理如上所述获得的灭活或未灭活的纯化病毒的水悬浮液。病毒包膜脂质溶解导致病毒颗粒碎裂。复原水相，其含有裂解疫苗及其核心或降解产物，所述裂解疫苗主要由原始脂质环境去除的血凝素和神经氨酸酶组成。如果尚未灭活残留的感染颗粒则然后对其进行灭活。在多价疫苗中，可将裂解疫苗与本发明的减毒病毒组合。

灭活疫苗

使用已知方法，例如但不限于福尔马林或β-丙内酯处理，灭活复制的病毒而提供灭活的流感病毒。可用于本发明的灭活疫苗类型可包括全病毒（WV）疫苗或亚病毒体（SV）（裂解）疫苗。WV疫苗包含完整的灭活病毒，而SV疫苗包含纯化病毒，所述纯化病毒使用溶解含脂质的病毒包膜的去污剂破坏，之后通过化学灭活残留病毒。

另外，可使用的疫苗包括包含分离的HA和NA表面蛋白的那些（被称为表面抗原或亚单位疫苗）。

减毒活病毒疫苗

减毒活流感病毒疫苗，例如包含本发明重组病毒的那些，可用于预防或治疗流感病毒感染。可根据已知方法通过将来自减毒供体病毒的减毒基因递送至复制的分离株病毒或重配病毒以单一步骤实现减毒。由于对于甲型流感病毒的抗性主要由发生对于HA和/或NA糖蛋白的免疫反应而介导，编码这些表面抗原的基因来自重病毒或临床分离株。减毒基因衍生自减毒亲本株。以此方法，通常赋予减毒的基因不编码HA和NA糖蛋白。

可获得能够可重复地对流感病毒减毒的病毒（供体流感病毒），例如，冷适应（ca）供体病毒可用于减毒疫苗制备。减毒活重配病毒疫苗可通过将ca供体病毒与毒性复制病毒偶配而生成。然后在25°C（对毒性病毒复制具有限制性）于合适的抗血清存在下选择重配子代，所述抗血清抑制携带减毒ca供体病毒表面抗原的病毒的复制。有用的重配株：(a）具有感染性，(b）被减毒用于血清阴性非成人哺乳动物和免疫预处理的成人哺乳动物，(c）具有免疫原性，以及(d）具有遗传稳定性。Ca重配株的免疫原性与其复制水平平行。由此，通过新野生型病毒获取ca供体病毒的六种可转移基因已可重复地对这些病毒进行减毒，以用于对易感的成人和非成人哺乳动物进行接种。

可通过定向诱变将其他减毒突变引入流感病毒以拯救携带这些突变基因的感染病毒。不仅可将减毒突变引入基因组的非编码区，而且可将其引入编码区。还可将这样的减毒突变引入非HA或NA基因，例如PB2聚合酶基因。由此，还可生成携带定向诱变引入的减毒突变的新供体病毒，以上述用于ca供体病毒相似的方式可将这样的新供体病毒用于产生减毒或重配疫苗候选株。相似地，可将其他已知和合适的减毒供体毒株与流感病毒重配以获得适用于哺乳动物接种的减毒疫苗。

在一种实施方式中，这样的减毒病毒保持来自编码基本与原始临床分离株相似的抗原决定簇的病毒的基因。这是出于下述目的，即，减毒疫苗提供与病毒原始临床分离株基本相同抗原性而同时缺乏病原性，所述缺乏病原性达到疫苗导致最小机会诱导接种的哺乳动物中严重疾病的程度。

由此，可根据已知方法将多价疫苗中的病毒进行减毒或灭活、制剂以及作为诱导动物（例如哺乳动物）免疫反应的疫苗施用。确定这样的减毒或灭活疫苗是否保存与临床分离株或从其衍生的高生长株相似抗原性的方法为本领域公知。这样的已知方法包括：使用抗血清或抗体已消除表达供体病毒抗原决定簇的病毒；化学选择（例如，金刚烷胺或金刚乙胺）；HA和NA活性和抑制；以及核酸筛选（例如探针杂交或PCR），以验证编码抗原决定簇的供体基因（例如HA或NA基因）不存在于减毒病毒中。

药用组合物

适于接种（例如鼻、胃肠外或口服施用）的本发明药用组合物包含一种或多种流感病毒分离株，例如一种或多种减毒或灭活流感病毒，其亚单位，其分离蛋白，和/或编码一种或多种其蛋白的分离核酸，任选进一步包括无菌水溶液或非水溶液、悬浮液以及乳浊液。所述组合物可进一步包含本领域已知的佐剂或赋形剂。本发明的组合物通常以单剂（单位剂量）提供。

常规疫苗通常包含约0.1至200 μg，例如30至100 μg的来自各毒株参与其组成的HA。形成本发明疫苗组合物主要组分的疫苗可包含单流感病毒，或流感病毒组合，例如，至少两种或三种流感病毒，包括一种或多种重配株。

用于胃肠外施用的制剂包括无菌水溶液或非水溶液，悬浮液，和/或乳浊液，其可包含本领域已知的佐剂或赋形剂。非水溶剂的实例为丙二醇，聚乙二醇，植物油（例如橄榄油），可住宿的有机酯（例如油酸乙酯）。载体或封闭敷料可用于增加皮肤渗透性和增强抗原吸收。用于口服施用的液体剂型通常可包含含有液体剂型的脂质体溶液。合适的悬浮脂质体形式包括乳浊液，悬浮液，溶液，糖浆剂，以及包含通常用于本领域的惰性稀释剂（例如净化水）的酏剂。除了惰性稀释剂，所述组合物还可包含佐剂，增湿剂，乳化剂以及悬浮剂，或增甜剂，调味剂或芳香剂。

当本发明的组合物用于施用于个体时，其可进一步包含盐、缓冲剂、佐剂或合乎需要的用于改进所述组合物功效的其他物质。对于疫苗，可使用佐剂—可增强特定免疫反应的物质。常规地，在呈递给免疫系统之前混合佐剂和组合物，或分开呈递，但呈递至受免疫的生物体的相同位点。

可通过混合对于至少两种流感病毒毒株(例如2-20种毒株，或其中的任何范围或数值)的复制流感病毒而提供疫苗的异质性。可使用本领域已知技术提供给疫苗单株流感病毒的差异性。

根据本发明的药用组合物可进一步或另外包含至少一种化学治疗化合物，例如，用于基因治疗、免疫抑制剂、抗炎剂或免疫增强剂；和对于疫苗，化学治疗剂包括但不限于γ-球蛋白、金刚烷胺、胍、羟基苯并咪唑、干扰素-α、干扰素-β、干扰素-γ、肿瘤坏死因子-α、氨基硫脲、甲红硫脲、利福平、三氮唑核苷、嘧啶类似物、嘌呤类似物、膦甲酸、磷羟酰乙酸、阿昔洛维（acyclovir）、双脱氧核苷、蛋白酶抑制剂或更昔洛韦（ganciclovir）。

所述组合物还可包含可变量但小量的无内毒素甲醛，和防腐剂，其被发现安全且不导致被施用所述组合物的生物体中的不良反应。

药用目的

所述组合物（或其引发的抗血清）的使用可用于“预防”或“治疗”目的。当预防性提供时，在病原感染的任何症状或临床体征变得明显之前提供作为疫苗的本发明组合物。所述组合物的预防性应用用于预防或缓解任何后续的感染。当预防性提供时，在疾病的任何症状或临床体征变得明显之前提供本发明的基因治疗组合物。所述组合物的预防性施用用于预防或缓解与疾病相关的一种或多种症状或临床体征。

当治疗性提供时，在检测到急性感染的症状或临床体征时提供病毒疫苗。化合物的治疗性施用用于缓解任何急性感染。当治疗性提供时，在检测到疾病的症状或临床体征时提供基因治疗组合物。化合物的治疗性施用用于缓解所述疾病的症状或临床体征。

由此，本发明的疫苗组合物可在感染发病之前提供（以预防或缓解预期感染）或在急性感染开始之后提供。相似地，对于基因治疗，可在病症或疾病的任何症状或临床体征明显之前或在检测到一种或多种症状之后提供所述组合物。

如果组合物的施用可被受体哺乳动物耐受，则其被认为是“药理学可接受的”。如果施用量具有生理学意义，则这样的制剂被认为以“治疗有效量”施用。如果本发明的组合物的存在导致受体患者的生理学可检测改变，则其具有生理学意义，例如，提高针对感染性流感病毒的至少一种毒株的至少一种初级或次级体液或细胞免疫反应。

如果相对于哺乳动物对照群或组具有统计学显著改进，所提供的“保护”不需要是绝对的，即，流感感染不需要被完全预防或消除。保护可限于缓解流感病毒感染的症状或临床体征发病的严重性或迅速性。

药学施用

本发明的组合物可通过被动免疫或主动免疫赋予对一种或多种病原体（例如一种或多种流感病毒毒株）的抵抗力。在主动免疫中，预防性将减毒活疫苗组合物施用于宿主（例如哺乳动物），宿主对施用的免疫反应针对感染和/或疾病进行保护。对于被动免疫，可收集引发的抗血清，并将其施用于易于患有至少一种流感病毒毒株导致的感染的受体。本发明的基因治疗组合物可通过主动免疫产生预防或治疗水平的所需基因产物。

在一种实施方式中，在足以导致产生保护雌性和胎儿或新生儿的免疫反应（经通过胎盘或在母体乳汁中被动掺入抗体）的时间和量的条件下将疫苗提供给雌性哺乳动物（在怀孕或分娩时或之前）。

由此，本发明包括用于预防或缓解病症或疾病（例如至少一种病原体毒株引起的感染）的方法。如本文所使用，如果疫苗的施用导致疾病临床体征或状况总体或部分缓解（即抑制），或个体对疾病总体或部分免疫，则所述疫苗被认为预防或缓解所述疾病。如本文所使用，如果基因治疗组合物的施用导致疾病临床体征或状况总体或部分缓解（即抑制），或个体对疾病总体或部分免疫，则所述基因治疗组合物被认为预防或缓解所述疾病。

具有本发明至少一种流感病毒的组合物可通过任何实现预期目的的方式施用，所述组合物包含被减毒的流感病毒，和一种或多种其他分离的病毒，其一种或多种分离的病毒蛋白，编码其一种或多种病毒蛋白的一种或多种分离的核酸分子，或它们的组合。

例如，这样的组合物的施用可通过多种胃肠外途径，例如皮下、静脉内、皮内、肌内、腹膜内、鼻内、口服或经皮途径。胃肠外施用可通过推注或通过随时间逐渐输注来实现。

用于预防、抑制或治疗流感病毒相关病理的典型方案包括：经达和包括1周和约24个月之间的时期，或其中的任何范围或数值，施用有效量的本文所述疫苗组合物，所述疫苗组合物作为单次治疗施用、或作为提高或加强剂量重复。

根据本发明，“有效量”的组合物是足以实现所需作用的量。应理解有效剂量可取决于受体的物种、年龄、性别、健康状况和体重、同步治疗（如果有的话）的种类、治疗的频率、以及期望的作用的性质。下列提供的有效剂量范围并非旨在限制本发明，其代表剂量范围。

用于动物（例如哺乳动物成年生物）的减毒活病毒疫苗或杀死病毒疫苗的剂量可为约10²-10¹⁵（例如10³-10¹²）噬斑形成单位（PFU），或其中的任何范围或数值。灭活疫苗的剂量可为约0.1至1000（例如30至100）μg HA蛋白。然而，所述剂量应为使用现有疫苗作为起始点通过常规方法确定的安全有效量。

可将每一剂复制病毒疫苗中的免疫反应性HA的剂量标准化为包含合适的量，例如30至100 μg，或其中任何范围或数值，或政府机构或认可的专业组织所推荐的量。还可将NA的量进行标准化，然而，在纯化和储存过程中此糖蛋白可能不稳定。

可将每一剂复制病毒疫苗中的免疫反应性HA的剂量标准化为包含合适的量，例如1-50 μg，或其中任何范围或数值，或美国公共健康服务中心（PHS）所推荐的量，对于大龄儿童（大于或等于3岁年龄）每一组分通常是15 μg，对于小于3岁年龄的儿童每一组分为7.5 μg。还可将NA的量进行标准化，然而，在加工纯化和储存过程中此糖蛋白可能不稳定（Kendal等，1980；Kerr等，1975）。各0.5 ml剂量的疫苗可包含大约10-500亿的病毒颗粒，优选100亿颗粒。

例示实施方式

在一种实施方式中，重组或重配乙型流感病毒具有导致MDCK细胞中复制提高的氨基酸，例如，HA中的残基，包括但不限于34位非T残基，129位非K残基，168位非N残基，196位非T残基，或其任何组合；NA中的残基，包括但不限于169位非N残基，和/或434位非G残基；NP中的残基，包括但不限于28位非丙氨酸（A）残基，40位非P残基，51位非P残基，52位非E残基，57位非S残基，204位非M残基，1795核苷酸位非g残基，或其任何组合；M1中的残基，包括但不限于34位非G残基，54位非天门冬氨酸（D）残基，77位非R残基，86位非M残基；BM2中的残基，包括但不限于58位非H残基，和/或80位非R残基；NS1中的残基，包括但不限于117位非M残基，176位非K残基，和/或252位非S残基，39位非a核苷酸，或其任何组合。在一种实施方式中，所述重组乙型流感病毒具有导致MDCK细胞中复制提高的氨基酸，例如，HA1中，34位残基I，129位残基E，168位E、D，196位P、异亮氨酸（I）、A或N，或其任何组合；NA中，169位残基T和/或434位残基E；NP中，28位残基T，40位残基S，51位残基Q，52位残基K，57位残基G，214位残基T，1795核苷酸位g，或其任何组合；M1中，34位残基缬氨酸（V）或N，54位残基G，77位残基K，86位残基T，97位残基N，或其任何组合；BM2中，包括58位残基R和/或80位残基G；NS1中，包括117位残基酪氨酸（Y），176位残基谷氨酰胺（Q），252位残基T，39核苷酸位g，38核苷酸位后另外的g，或其任何组合。

在一种实施方式中，重组或重配乙型流感病毒具有导致Vero细胞中复制提高的氨基酸，例如，HA1中的残基，包括但不限于98位的非R残基，194位的非N残基，和/或196位的非T残基；和/或HA2中的残基，包括但不限于39位非K残基，56位非S残基，61位非K残基，或112位非D残基，或其任何组合；NA中的残基，包括但不限于76位非T残基，102位非R残基，105位非E残基，139位非P残基，436位非T残基，457位非D残基，或其任何组合；NP中的残基，包括但不限于343位非P残基；M1中的残基，34位非G残基，97位非I残基，或其任何组合；BM2中的残基，58位非H残基，80位非R残基，27位非H残基，26位非G残基，或其任何组合；NS1中的残基，包括但不限于42位非Y残基；PA中的残基，387位非Y残基，434位非V残基，494位非D残基、524位非T残基、2272核苷酸位非a核苷酸、2213核苷酸位非g核苷酸；PB2中的残基，16位非N残基；或其任何组合。在一种实施方式中，重组乙型流感病毒具有导致Vero细胞中复制提高的氨基酸，例如，HA中，196位P、I、A或N(HA1中），98位残基K(HA1中），194位残基D（HA1中），39位残基G（HA2中），56位残基G（HA2中），51位残基N(HA2中）或112位残基E（HA2中），或其任何组合；NA中，76位残基M，102位残基K，105位残基K，139位残基S，436位残基M和/或457位残基N，或其任何组合；NP中，343位残基T；M1中，包括34位残基V或N和/或97位残基N；BM2中，58位残基R，80位残基G，27位残基R，26位残基R，或其任何组合；NS1中，位残基N；PA中，387位残基H，434位残基A，494位残基N，534位残基A，2272核苷酸位g，2213核苷酸位t；PB2中16位残基S；或其任何组合。

在一种实施方式中，对于B/Yamagata谱系相关病毒，重组或重配乙型流感病毒具有：HA1中，129位非K氨基酸，168位非N氨基酸，194位非N氨基酸，196位非T氨基酸，112位非D氨基酸，或其任何组合；NA中，76位非T氨基酸，102位非R氨基酸，105位非E氨基酸，139位非P氨基酸，434位非G氨基酸，436位非T氨基酸，457位非D氨基酸，或其任何组合；NP中，52位非E氨基酸，57位非S氨基酸，343位非P氨基酸，或其任何组合；M1中，34位非G氨基酸，77位非R氨基酸，97位非I氨基酸，或NP vRNA中，500位非c核苷酸，或其任何组合；BM2中，58位非H氨基酸，80位非R氨基酸，27位非H氨基酸，26位非G氨基酸，或其任何组合；NS1中，117位非M氨基酸，252位非S氨基酸以及/或PA中，494位非D氨基酸；和/或PA vRNA中，2272位非a核苷酸，2213位非g核苷酸，1406位非a核苷酸和/或1445位非c核苷酸，或其任何组合；PB2中16位非N残基；或其任何组合。在一种实施方式中，重组乙型流感病毒具有：HA1中，129位E，168位D，196位P，194位D；HA2中，112位，或其任何组合；NA中，76位M，102位K，105位K，139位S，434位E，436位M和/或457位N，或其任何组合；NP中，52位K，57位G，343位T，或其任何组合；M1中，34位V或N，77位K，97位N，或其任何组合；BM2中，58位R，80位G，27位R，26位R，或其任何组合；NS1中，117位Y，252位T，或其任何组合；PA中，494位N，2272位t，2213位a；PB2中，16位S；或其任何组合。

在一种实施方式中，对于B/Victoria谱系相关的乙型流感病毒，重组或重配乙型流感病毒具有：HA1中，34位非T氨基酸，98位非R氨基酸，196位非T氨基酸和/或HA2中，非K39位残基，56位非S残基，61位非K残基，或其任何组合；NA中，169位非N残基和/或457位非D残基；NP中，28位非A残基，40位非P残基，51位非P残基，204位非M残基，NP vRNA中1795位非g核苷酸或500位非c核苷酸，或其任何组合；M1中，54位非D残基和/或86位非M残基；BM2中，80位非R残基；NS1中，42位非Y残基，176位非K残基，39位非a核苷酸；PA中，387位非Y残基，434位非V残基，524位非T残基，或PA vRNA中2272核苷酸位非a核苷酸，2213核苷酸位非g核苷酸，1406位非a核苷酸，1445位非c核苷酸，或其任何组合。在一种实施方式中，重组乙型流感病毒具有：HA中，34位I氨基酸，196位P、I、A或N氨基酸，98位K氨基酸；HA2中，39位残基G，56位残基G，61位残基N，或其任何组合；NA中，T169位T残基和/或457位N残基；NP中，28位T残基，40位S残基，51位Q残基，204位T残基，1795位a，或其任何组合；M1中，54位G和/或86位T；BM2中，80位G；NS1中，42位N，176位Q，39位g，38位之后另外的g；PA中，387位H，434位A，534位A，2272位t，2213位a，或其任何组合。

在一种实施方式中，重组或重配乙型流感病毒具有下列的一种或多种，例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多种：PA或PA vRNA中，387位非Y残基，434位非V残基，494位非D残基，524位非T残基，2272位非a核苷酸，2213位非g核苷酸，1406位非a核苷酸，1445位非c核苷酸，或其任何组合，例如，2272t，2213a，1406g，1445t，387H，434A，494N，524A，或其任何组合（例如，387位残基H，434位残基A，494位残基N，524位残基A，或其任何组合）；HA1中，34位非T残基，98位非R残基，129位非K残基，168位非N残基，194位非N残基；和/或HA2中，196位非T残基，39位非K残基，56位非S残基，61位非K残基或112位非D残基，例如，HA1中34I，K129E，168D，196P/I/A/N，98K或194D，HA2中包括39G、56G、61N或112E，或其任何组合；NA中，76位非T残基，非R102位残基，105位非E残基，139位非P残基，169位非N残基，434位非G残基，436位非T残基和/或NA中457位残基D，例如169T、434E、76M、102K、105K、139S、436M、457N，或其任何组合；BM2中，58位非H残基，80位非R残基，27位非H残基，26位非G残基，例如58位残基R，80位残基G，27位残基R和/或26位残基R；NP中，28位非A残基；40位非P残基，51位非P残基，52位非E残基，57位非S残基，204位非M残基和/或343位非P残基和/或1795位g，或其任何组合，例如，28位残基T，40位残基S，51位残基Q，52位残基K，57位残基G，位214残基T，343位残基T，或其任何组合；M1中，34位非G残基，54位非D残基，77位非R残基，86位非M残基，97位非I残基，或其任何组合，例如，34位残基V或N，54位残基G，77位残基K，86位残基T和/或97位残基N；PB中，16位非N残基。在一种实施方式中，重组病毒具有M1 34V/I97N，BM2 58R/80G，NP 40S，NS1 86T。

在一种实施方式中，本发明的流感病毒是在PA、NP、M（M1和BM2）和/或NS的一个或多个片段的特定位置具有两种或多种选择的氨基酸残基的重组或重配流感病毒，所述PA、NP、M（M1和BM2）和/或NS可与HA和NA目的基因一起使用。在一种实施方式中，重组或重配流感病毒具有下列中的两种或多种：NP中，A28T、P40S、P51Q、E52K、S57G、M204T和/或P343T和/或g1795a；M1中，G34V/N、D54G、R77K、M86T、I97N；BM2中，H58R、R80G、H27R、G26R；NS1中，M117Y，K176Q，S252T，a39g，38之后另外的g，Y42N；PA中，a2272t，g2213g，Y387H，V434A，D494N，T524A；PB2中，N16S。

在一种实施方式中，本发明的流感病毒是在PA、BM2、NP、M1和/或NS1其中之一或更多的特定位置具有两种或多种选择的氨基酸残基的重组或重配流感病毒，所述PA、BM2、NP、M1和/或NS1可与HA和NA目的基因一起使用。例如，在一种实施方式中，重组乙型流感病毒具有M1 34V/I97N、BM2 58R/80G、NP 40S、M1 M86T，或具有NP P40S或具有NP E52K，或具有表3中克隆1-8中NP、M1、以及任选NS1和BM2中的取代，和表4中克隆1-8中NP、M1、以及任选NS1中的取代。

在一种实施方式中，本发明的流感病毒是具有下述一种或多种的重组或重配流感病毒：PA vRNA中a1406g、c1445t、a2272t；NP中P40S或P40S/M204T；NP vRNA中c500t；NSvRNA中M77K或M86T，及a39g或38(+1)g；或NS中K176 Q，例如具有PA a1406g/c1445t/ a2272t，NP P40S，c500t，M R77K及NS a39g K176Q，或具有PA a1406g/c1445t/a2272，NPP40S/M204T，c500t，M M86T及NS 38(+1)g的流感病毒。

本发明将通过下列非限制性实施例来阐述。

实施例1

从经济的观点来看，疫苗病毒的产量是重要的。甚至更重要的，在紧密时间线下产生大量疫苗剂量的能力可在病毒爆发过程中挽救许多生命。增加细胞培养物和/或含胚鸡蛋中病毒复制能力的突变可用于扩增流感病毒，并建立强健的流感疫苗平台。当前，大多数流感疫苗在含胚鸡蛋中产生。在美国和欧洲，MDCK细胞中产生的流感疫苗现在被批准用于人类，在欧洲衍生自Vero细胞的流感疫苗被批准用于人类。

为开发用于在这些特定宿主细胞中疫苗病毒生长的高产量乙型流感病毒骨架，对B/Yamagata/1/73内部基因进行随机诱变，突变体病毒文库的HA和NA基因衍生自B/Yokohama/UT-K31/2012（Yamagata谱系）或B/Yokohama/UT-K1A/2011（Victoria谱系），它们代表两种主要的乙型流感病毒谱系。所产生的病毒文库具有病毒“内部”基因中及编码病毒表面糖蛋白血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA）的那些基因中的随机突变，还具有非编码突变。对于赋予改进的生长的那些疫苗病毒（为疫苗病毒候选株）进行进一步评价。具体地，这些疫苗病毒候选株赋予用于流感疫苗病毒制备的常用增殖系统(即，含胚鸡蛋，Madin–Darby犬肾细胞，以及非洲绿猴(Vero）细胞）中的较高产量。这些疫苗候选株可用于改进乙型流感病毒疫苗产生过程。

材料和方法

细胞：在含5%（体积/体积）新生牛血清的MEM中培养MDCK细胞。在含10%（体积/体积）FBS的MEM中维持Vero细胞。在补充有10%（体积/体积）FBS的DMEM中培养293T人胚肾细胞。

质粒的构建

B/Yamagata/1/73病毒的8种病毒RNA的序列用于设计gBlock基因片段(Integrated DNA Technologies），所述片段通过PCR扩增和连接，将所产生的病毒cDNA插入RNA聚合酶I载体pHH21(Neumann等，1999）。通过使用RNeasy试剂盒(Qiagen）从病毒原液提取B/Yokohama/UT-K31/2012，B/Yokohama/UT-K1A/2011，B/Yokohama/P-2922/2005，B/Tokyo/UTE2/2008，B/Tochigi/UT-T1/2011，B/Massachusetts/2/2012，以及B/Brisbane/60/2008病毒的vRNA。通过使用一步RT-PCR试剂盒(Invitrogen）使用基因特异性寡核苷酸扩增病毒HA和NA基因，将PCR产物克隆至pHH21载体。通过接合的gBlock基因片段的PCR扩增合成B/Yamagata/16/1988的HA和NA基因，之后将其克隆至pHH21。通过重叠PCR生成B/Yokohama/UT-K31/2012，B/Yokohama/UT-K1A/2011，B/Massachusetts/2/2012及B/Brisbane/60/2008病毒的A/B型嵌合HA和NA基因。

质粒文库的构建

使用GeneMorph II随机诱变试剂盒通过易错PCR将1至4种随机突变引入B/Yamagata/1/73病毒的6个内部基因。将随机突变PCR产物插入pHH21载体，通过对各病毒基因的至少24种大肠杆菌（Escherichia coli）克隆进行序列分析证实所产生的质粒文库的差异性。

病毒挽救和病毒文库生成

借助于反向遗传技术生成野生型病毒和具有内部基因随机突变的病毒文库(Neumann等，1999）。通过使用突变质粒文库替代野生型构建体转染293T细胞生成病毒文库。48小时后，收集质粒转染的293T细胞的上清液，在MDCK细胞中扩增，以产生病毒原液。通过在MDCK细胞中使用噬斑分析测定病毒原液的滴度。

病毒生长动力学评价

以0.001的感染复数(MOI）将野生型或重组病毒一式三份接种至MDCK细胞中。感染后，使用含0.6 μg/mL TPCK胰蛋白酶的MEM/BSA培养基培养温育细胞。在指定的时间点收集上清液，通过在MDCK细胞中的噬斑分析评价病毒滴度。

为分析含胚鸡蛋中的病毒复制，使用1×10⁴ pfu病毒接种10天龄的含胚鸡蛋（每种病毒4只），在35°C接种。在指定的时间点收集尿囊液，通过使用在MDCK细胞中的噬斑分析评价病毒滴度。

通过使用血凝分析测定MDCK细胞或含胚鸡蛋中扩增的病毒的血凝滴度。简言之，在包含50 μL PBS/孔的96孔U底微滴定板(Thermo Scientific）中连续两倍稀释50 μL病毒样品。接下来，将50 μL 0.5%的火鸡红细胞添加至各孔，在室温下温育45分钟，将血凝滴度作为发生凝聚的最高稀释度的倒数值来计算。

病毒浓缩和纯化

在4层Easy-Fill Cell Factories（Thermo Scientific）中培养MDCK细胞，当细胞达到95%融合时，使用野生型或高产量乙型流感病毒以0.001 MOI对其进行感染。48小时后收获细胞培养上清液，通过离心澄清（在Beckman SX4750转子中3,500 rpm，15分钟，4°C）。通过超速离心(Beckman Type19转子，18,500 rpm，4°C，90分钟）沉淀病毒，重悬浮于5 mLPBS，上样至20–50%（重量/体积）连续蔗糖梯度，在Beckman SW32转子中25,000 rpm和4°C离心90分钟。收集含病毒的条带，在PBS中稀释，再通过离心沉淀（Beckman SW32转子，25,000rpm，90分钟，4°C）。将病毒沉淀重悬浮于400 μL PBS，蒸馏，于−80°C储存。

总蛋白测定

通过使用Pierce BCA蛋白测定试剂盒(Thermo Scientific）根据制造商的说明书测定病毒浓缩物的总蛋白产量。

使用PNGase F对病毒蛋白去糖基化

为了去除糖部分，对10 μL病毒浓缩物进行变性。然后在37°C将样品与制造商提供的缓冲液中2 μL 1/10稀释的PNGase F酶(New England Biolabs）和终浓度1%的NonidetP-40一起温育。

SDS/PAGE

将2 μL病毒浓缩物与PBS混合至10 μL总体积，添加2.5 μL含有2%（体积/体积）β-巯基乙醇（作为还原剂）的上样染料，加热混合物至95°C，持续5分钟。然后将样品上样至NuPage 4–12%（重量/体积）Bris-Tris precast 凝胶(Life technology），使用1×Mes缓冲液(Bio-Rad）在150 V运行120分钟，然后使用SYPRO-Ruby（Sigma）染色。通过使用ImageJ软件(NIH）进行蛋白质定量。通过HA量(通过HA1和HA2的量的总和计算）除以HA1、HA2、NP以及M1的总量并乘以总病毒蛋白量来计算HA浓度。

小鼠中的毒力研究

使用异氟烷麻醉6周龄BALB/c小鼠(Jackson Laboratory），使用50 μL体积10⁶pfu乙型流感病毒鼻内接种。每组感染5只小鼠，此样品规模足以检测组间大的作用。将小鼠随机化，观察者非盲选。监测体重变化和存活率持续14天。为了评价小鼠中的病毒复制，每种病毒使用10⁶ pfu感染10只小鼠，在感染后第3和6天，处死各组中的5只小鼠，通过在MDCK细胞中使用噬斑分析测定肺中的病毒滴度。

遗传稳定性试验

为了评价高产量疫苗骨架的遗传稳定性，在MDCK细胞中以0.01 MOI对于分别与B/Yokohama/UT-K31/2012和B/Yokohama/UT-K1A/2011的HA和NA vRNA组合的具有HY(Yam）和HY(Vic）骨架的病毒进行传代。通过Sanger测序对各传代之后收集的病毒进行测序。

微复制子测定

对于微复制子测定，使用表达B/Yamagata/1/73 PB2、PB1、PA和NP蛋白并分别连同0.05 μg pPolI-B/Yamagata/1/73-NS-Luc(在人RNA聚合酶I启动子调控下编码萤火虫萤光素酶基因）或pPolIC250-B/Yamagata/1/73-NS-Luc(在犬RNA聚合酶I启动子调控下编码萤火虫萤光素酶基因）的0.25 μg各质粒转染293T细胞和MDCK细胞。使用0.025 μg pGL4.74(hRluc/TK）(监测转染效率的内对照，Promega）共转染细胞。在35°C温育转染的细胞48小时，裂解，并通过使用双萤光素酶系统检测试剂盒根据制造商的方案(Promega）分析萤光素酶活性。将萤火虫萤光素酶表达水平标准化至海肾萤光素酶活性。所表示的数据是三个独立试验的平均值±SD。

为了研究B/Yamagata/1/73 PA和NS1 vRNA非编码区中突变的显著性，如上所述转染细胞，然而，使用报告子构建体替代pPolIC250-NP(0）Fluc(0），所述报告子构建体中萤火虫萤光素酶基因分别侧邻PA或NS vRNA野生型或突变体编码区。在转染后48小时，如上所述检测萤光素酶活性。

VLP出芽分析

对于VLP出芽分析，使用2 μg各野生型或突变B/Yamagata/1/73 M1、HA、NA、NP、BM2，以及NS2的蛋白表达质粒转染293T细胞。在转染后48小时，收获培养上清液，澄清，上样于20%（重量/体积）蔗糖垫，在Beckman SW 60 Ti转子中于60,000 rpm超速离心2小时，然后将沉淀的VLP重悬于PBS中，4°C过夜。并行地，使用RIPA缓冲液转染细胞。

将纯化的VLP和细胞裂解物分开与5×上样染料缓冲液混合，并在NuPage 4–12%（重量/体积）Bris-Tris预制胶(Life Technology）上分级。通过使用iBlot干印迹系统(Invitrogen）将蛋白质转移至硝酸纤维素膜。然后在室温下使用具有0.05% Tween 20（PBS-T）包含5%（重量/体积）脱脂奶的PBS封闭膜。然后，在4°C过夜将膜与B/Brisbane/60/2008 HA的单克隆抗体(1:1,000；my BioSource，MBS430175）或乙型流感病毒NP蛋白的单克隆抗体(1:1,000；Abcam，ab47876）或M1蛋白的单克隆抗体(1:2,000；Abcam，ab82608）一起温育。在使用PBS-T每次10分钟洗涤4次之后，在室温下将膜与偶联辣根过氧化物酶的山羊抗小鼠二级抗体(1:2,000；Life Technology）一起温育1小时。在使用PBS-T每次10分钟洗涤4次之后，通过使用lumi-light蛋白质印迹底物(Roche Applied Science）对印迹显影，在自动放射术之后观察。通过使用ImageJ软件(NIH）进行蛋白质定量。为了计算掺入VLP中的HA、NP及M1蛋白百分数，使用下列公式：(突变体VLP的蛋白量与突变蛋白总量(VLP+细胞裂解物）的比值/野生型VLP的蛋白量与野生型蛋白总量(VLP+细胞裂解物）的比值）×100。

IFN拮抗剂分析

为了评价野生型和突变NS1蛋白的IFN拮抗剂活性，使用NS1蛋白表达质粒和报告子质粒pGL–IFN-β（在IFN-β启动子调控下编码萤火虫萤光素酶）转染293T细胞（Bale等，2012）。在转染后24小时，使用仙台病毒以5个MOI感染细胞1小时。温育细胞24小时，使用Glo裂解缓冲液(Promega）裂解细胞，然后，添加Steady-Glo分析缓冲液(Promega），检测萤光素酶表达。在另一组试验中，使用野生型或突变NS1蛋白表达质粒和报告子质粒pISRE-Luc（（在IFN调节启动子调控下编码萤火虫萤光素酶）Promega）转染293T细胞。24小时之后，使用104 U/mL的人IFN-β再处理细胞24小时，之后裂解，检测萤光素酶表达水平。

统计学分析

使用v3.1.R软件(www.r-project.org）实现数据统计学分析。为了在几个时间点比较具有单独收集的检测值的多个组，使用双因素方差分析，之后Tukey事后检验。为了在单个时间点比较来自多个组的检测值，使用单因素方差分析，之后是Tukey或Dunnett事后检验。为了比较具有单独检测值的多个组（例如，细胞培养物中的病毒生长曲线，对此在不同时间点从相同培养物收集试样），对于使用R软件包NLME的线性混合效应模型，考虑时间、病毒株及这两因素之间相互作用。R软件包PHIA用于构建比较相同时间点配对方式的比较矩阵(例如，在感染后24小时group_1与group_2，在感染后24小时group_1与group_3，在感染后24小时group_2与group_3）。单个进行比较，因此，通过使用Holm方法调整最终的P值以解释多重比较。

将来自生长曲线的原始数据转化为对数模式，然后进行分析，对结果考虑P（或调整的P值）< 0.05的统计学显著性。通过使用Levene检验评价组间差异（与所比较的组相似，P > 0.05）。

伦理学和生物安全性

小鼠中的试验遵照威斯康星大学麦迪逊分校动物照顾和使用方案。所有试验均得到威斯康星大学麦迪逊分校大学动物照顾和使用委员会批准(方案号V00806），其承认和接受用于动物的法律和伦理责任，如在动物福利法案中正确管理动物实验和相关行为的基本方针和相关的动物福利规章和公众卫生服务政策中所指定的。

结果

用于MDCK细胞中高产量变异株的病毒文库筛选

与开发高产量甲型流感病毒PR8疫苗骨架的策略可比较，诱变和筛选方法用于鉴定与乙型流感病毒高产量相关的突变。六个内部vRNA片段来自B/Yamagata/1/73病毒，该病毒在MDCK细胞中高效生长，在Victoria和Yamagata谱系分开之前进行分离。然后，基于易错PCR的诱变方法用于生成在病毒蛋白质中具有1至4个随机氨基酸变化的cDNA文库（图2）。然后，这些cDNA文库用于生成病毒文库。生成了6个分别代表各内部vRNA的文库(即PB2、PB1、PA、NP、M、及NS）(图2）：三个文库用于聚合酶vRNA的组合(即PB2+PB1、PB2+PA、PB2+PB1+PA）；一个文库用于聚合酶和核酸蛋白(NP）vRNA(即PB2+PB1+PA+NP），这是因为PB2、PB1、PA、及NP蛋白形成病毒复制复合物；一个文库用于PB2和NS vRNA（PB2+NS），这是因为甲型流感病毒的PB2和NS1蛋白(NS vRNA编码）是宿主毒力的重要决定簇(Wright等，2013）；一个文库用于M和NS vRNA，这是因为甲型流感病毒的M1蛋白(M vRNA编码）与高生长特性相（Ramanunninair等，2013）。分别使用Victoria（B/Yokohama/UT-K1A/2011）或Yamagata（B/Yokohama/UTK31/2012）谱系的HA和NA vRNA生成这12种病毒文库的各种文库，导致总共24种病毒文库。使用Victoria谱系或Yamagata谱系病毒的HA和NA vRNA生成的文库分别称为“Victoria谱系”或“Yamagata谱系”文库。

为了筛选具有生长提高特性的变异株，在MDCK细胞中对各文库传代12次。并行地，在MDCK细胞中传两代之后合并病毒文库，然后在MDCK细胞中进行另外10次传代(图2）。分别从Victoria和Yamagata谱系文库各随机筛选700多个病毒噬斑，产生总共1,472个单个噬斑纯化的病毒（图2）。然后在MDCK细胞中扩增噬斑纯化的病毒，在血凝分析中评价其产量（作为高HA产量的替代），并与亲本Victoria和Yamagata谱系病毒的产量进行比较（具有Victoria或Yamagata谱系HA和NA vRNA连同B/Yamagata/1/73病毒的其余六种vRNA）。以血凝滴度鉴定29种Yamagata谱系病毒和28种Victoria谱系病毒，所述血凝滴度是各对照病毒的至少两倍。在MDCK细胞中再扩增这些候选病毒，通过评价MDCK细胞中的血凝滴度和复制动力学证实其高产量特性（用作高HA产量的另一个替代）（图3）。

接下来，对各谱系前8种候选株的完整病毒基因组进行测序，对于Yamagata和Victoria谱系的高产量候选株发现不同组的突变（评价非编码区中的氨基酸变化和变化）（表1和2）。从Yamagata谱系文库分离的8种高产量候选株中的7种具有M1基质蛋白中的G34V和I97N突变，和BM2离子通道蛋白（也由M基因编码）中的H58R和R80G突变（表1），表明这些氨基酸取代可赋予MDCK细胞中的高效复制。

所有从Victoria谱系文库获得的8种高产量候选株编码NP中的P40S突变和M1中的M86T突变（表2）。另外，这8种高产量候选株中的6种编码NS vRNA的非编码区中的核苷酸变化，在5种病毒中检测到另外的38位之后的核苷酸（NS-38(+1）g，非编码区中所有核苷酸均以斜体小写字母显示），在1种病毒中检测到a39g核苷酸置换（表2）。在3种高产量候选株中NP片段的非编码区中鉴定到g1795a突变。

尽管HA和NA vRNA未被PCR介导的随机诱变靶向，但在HA和NA蛋白中检测到几种突变（表1和2）。具体地，在衍生自Victoria谱系文库的8种高产量候选株的7株中，HA的196位苏氨酸被多种其他氨基酸（例如丙氨酸、异亮氨酸、脯氨酸或天门冬酰胺）取代（表2），表明在此位置的强选择压力。

突变的潜在组合效应

接下来，使用逆向遗传学方法产生具有不同组合的存在于前8种高产量Yamagata或Victoria谱系候选株的突变的病毒（表3和4）。例如，存在于高产量候选株#21（在MDCK细胞中复制至最高滴度）的NP-E52K和M1-R77K突变（图3）与存在于高产量候选株#23和#26中的NS1-M117Y/S252T突变（图3）组合。因为Yamagata和Victoria谱系文库的内部vRNA衍生自相同病毒，还组合存在于高产量Yamagata和Victoria谱系候选株的突变（表3和4）。对所产生的病毒检测其在MDCK细胞中的血凝滴度和病毒滴度（图4）。与野生型病毒相比，在一个或多个时间点，所有高产量Yamagata和Victoria谱系候选株均在MDCK细胞中较高效复制，且具有较高血凝滴度，大多数这些差异具有统计学显著性(图4）。

Yamagata谱系RG(Yam）#8(编码NP-P40S、M1-R77K、NS1-K176Q、以及NS-a39g突变）和Victoria谱系RG(Vic）#2（编码NP-P40S/M204T、M1-M86T、以及NS-38（+1）g突变）被选作首要的候选疫苗骨架，这是因为在它们的各组中它们具有最高滴度。

用于Vero细胞中高产量变异株的病毒文库筛选

理想的疫苗病毒骨架应在当前用于人流感疫苗商业制造的所有三种增殖系统（即，MDCK细胞、Vero细胞以及含胚鸡蛋）中均赋予高产量。与MDCK细胞中高产量乙型流感疫苗骨架的开发相并行，在Vero细胞中对所有24种病毒文库进行传代（图2）。因为乙型流感病毒文库在Vero细胞中的滴度低，首先在共培养的MDCK和Vero细胞中对文库进行传代，之后在Vero细胞中传5代。并行地，在共培养的MDCK和Vero细胞中两代之后组合病毒文库，在共培养的细胞中再传代3次，然后在Vero细胞中传代5次。从多种病毒文库随机选取总共382个独立的病毒噬斑，在Vero细胞中进行扩增。基于血凝分析的结果，从Yamagata和Victoria谱系（Vero细胞传代的文库）选取前6种候选株，检测其全基因组序列（表5和6）。

高产量候选株具有数种突变，所述突变在MDCK细胞传代之后鉴定，可在共培养的细胞中传代过程中在MDCK细胞中筛选。这些突变包括在M1-34/97、BM2-58或BM2-80、及HA1-196位的氨基酸变化（将表1和2与表5和6进行比较）。仅在Yamagata谱系文库检测到M1-34/97和BM2-58位的突变，而在Yamagata和Victoria谱系病毒均存在BM2-80位的突变。HA1-196位突变在Victoria谱系的病毒中占优势，还在一种Yamagata谱系的病毒中存在。另外，观察到先前在MDCK细胞中传代后未发现的突变，最显著的是在PA的非编码区中的a2272t核苷酸取代，其在两种病毒谱系的高产量候选株中均存在（表5和6）。

高产量Yamagata和Victoria谱系疫苗病毒候选株的筛选

接下来，检测Vero细胞传代后发现的PA-a2272t突变是否提高RG(Yam）#8和/或RG(Vic）#2的生长特性。与RG(Yam）#8和RG(Vic）#2及亲本Yamagata和Victoria谱系病毒相比，所产生的病毒（分别HY(Yam）和HY(Vic））表现出在MDCK细胞中较高的血凝和病毒滴度，这些差异中的有些差异小（但具有统计学显著性）。因此，HY(Yam）（编码NP-P40S、M1-R77K、NS1-K176Q、NS-a39g、PA-a2272t）和HY(Vic）（编码NP-P40S/M204T、M1-M86T、NS-(38+1）g、PA-a2272t）被选作首要的高产量候选株。

对具有不同乙型流感病毒HA和NA基因的高产量疫苗病毒骨架的评价

分别开发具有B/Yamagata/UT-K31/2012和B/Yokohama/UT-K1A/2011的HA和NA基因的HY(Yam）和HY(Vic）。因为高产量疫苗病毒骨架应具有通常的促生长作用，检测具有经数个级联分离的6种乙型流感病毒（包括WHO推荐的疫苗病毒）的HA和NA基因的HY(Yam）和HY(Vic）疫苗病毒骨架（图7）。在一个或多个检测的时间点，与亲本病毒相比，HY(Yam）和HY(Vic）疫苗病毒骨架赋予较高的病毒滴度或血凝滴度，尽管并非所有差异均具有统计学显著性。对于所检测的病毒，HY(Vic）比HY(Yam）具有较高的促生长作用。

HY(Yam）和HY(Vic）骨架的交换

接下来，检测HY(Yam）和HY(Vic）骨架是否支持具有衍生自其他乙型流感病毒谱系的HA和NA基因的病毒的高效复制（图8）。对于编码Victoria谱系HA和NA基因的HY(Yam）病毒，和对于编码Yamagata谱系HA和NA基因的HY(Vic）病毒，检测到高病毒滴度和血凝滴度。总体上，在数个时间点，HY(Yam）疫苗骨架比HY(Vic）疫苗骨架导致稍高的病毒滴度或血凝滴度，但大多数这些差异不具有统计学显著性。这些数据表明HY(Yam）和HY(Vic）疫苗骨架赋予两种谱系的病毒高效复制。

甲型流感和乙型流感病毒疫苗骨架的比较

先前已有生成具有乙型流感病毒的HA和NA基因的嵌合甲型流感病毒（Horimoto等，2004和Flandorfer等，2003）。使用甲型流感和乙型流感病毒的通用骨架会简化疫苗制备过程。可能由于位于流感vRNA片段的5′和3′端区域的类型特异性病毒包装信号，甲型流感和乙型流感病毒的重配株并非天然存在（Fujii等，2003；Baker等，2014）。因此，产生下述vRNA片段，即，其中，甲型流感PR8病毒HA和NA蛋白的胞外结构域被乙型流感病毒相应部分代替（图5）。然后，比较下列三种病毒的血凝滴度和病毒滴度：野生型Yamagata谱系乙型流感病毒，具有Yamagata谱系病毒的HA和NA基因的HY(Yam），具有Yamagata谱系病毒的甲型/乙型嵌合HA和NA基因的高产量PR8病毒（图9A-B）。对于Victoria谱系的病毒进行相似的试验（图9C-D）。在所检测的大多数时间点，与野生型病毒相比，高产量甲型流感或乙型流感疫苗病毒骨架赋予显著增加的血凝滴度和病毒滴度。甲型流感和乙型流感疫苗骨架的比较揭示使用乙型流感疫苗骨架具有较高的病毒滴度，但是有趣的是，使用甲型流感疫苗骨架则具有较高的血凝滴度。另外，对于代表两种谱系的两种乙型流感病毒，在有关含胚鸡蛋中的血凝滴度和病毒滴度方面，甲型流感疫苗骨架要优于乙型流感疫苗骨架(图4E-F）。不管什么骨架（野生型或高产量），其他包含来自B/Yokohama/UT-K1A/2011、B/Yokohama/P-2922/2005、B/Tokyo/UTE2/2008或B/Tochigi/UT-T1/2014的HA和NA的乙型流感病毒在含胚鸡蛋中生长不良，表明这些人类病毒的HA和NA基因可限制含胚鸡蛋中的高效生长。

总病毒蛋白产量和HA含量的评价

大多数灭活流感疫苗制备物含15 μg的各H1 HA、H3 HA以及B型HA蛋白。对于疫苗优化，总的病毒蛋白产量和HA含量由此是重要的参数，促进发明人对MDCK细胞中不同HY(Yam）和HY(Vic）病毒的总的病毒蛋白产量和HA含量与其各自野生型病毒进行比较。从感染的细胞收集细胞培养上清，浓缩病毒，通过蔗糖梯度离心进行纯化。然后，通过使用PierceBCA分析试剂盒（Thermo Scientific）检测病毒蛋白总产量。并行地，使用PNGASE F处理纯化的病毒样品，导致HA去糖基化，使得更容易检测HA2（其糖基化形式的大小与M1相似）。通过使用SDS/PAGE（图10A-B）分离样品，基于光密度分析检测HA1、HA2、NP以及M1的量。通过HA1、HA2、NP以及M1的总量除HA量（通过合计HA1和HA2的量计算）且通过凝胶电泳分析的样品中的总病毒蛋白量乘以此数值来计算HA含量(图10A-B）。对于所有检测的病毒，与HA和NAvRNA从中衍生的野生型病毒相比，具有HY(Yam）和HY(Vic）疫苗骨架的总病毒蛋白产量和HA含量显著较高。

基于PR8-HY的疫苗病毒在小鼠中的毒力

设计一种试验方法以筛选复制能力增强的突变体，所述突变体还可增强其在哺乳动物中的毒力。为了解决这个问题，使用10⁶ pfu的野生型Yamagata谱系病毒、具有Yamagata谱系病毒的HA和NA vRNA连同野生型B/Yamagata/1/73病毒（用于生成病毒文库）的其余6种基因的病毒、以及具有Yamagata谱系病毒的HA和NA vRNA连同HY(Yam）疫苗病毒骨架的病毒对每组5只小鼠进行感染(图11A-B）。并行地，使用10⁶ pfu的上述病毒感染10只小鼠的各组，在感染后第3和第6天处死各组5只动物以平静肺病毒滴度(图11C）。相似地，使用Victoria谱系病毒和HY(Vic）疫苗骨架进行试验(图11D–F）。野生型B/Yamagata/1/73病毒骨架分别比B/Massachusetts/2/2012和B/Brisbane/60/2008骨架赋予较高的病原性。然而，HY(Yam）和HY(Vic）的提高产量的突变不进一步增加小鼠的毒力，事实上，它们与B/Yamagata/1/73骨架相比具有稍衰减的作用。

HY(Yam）和HY(Vic）疫苗骨架的遗传稳定性

疫苗病毒应具有遗传稳定性，使得其所需特性得以维持。为了检测高产量候选株的遗传稳定性，在MDCK细胞中使用B/Yokohama/UTK31/2012和具有B/Yokohama/UT-K1A/2011的HA和NA vRNA的HY(Vic）病毒的HA和NA vRNA进行HY(Yam）病毒的连续10次传代。在各代之后，通过Sanger测序检测病毒的基因组序列。对于Yamagata谱系病毒，未检测到突变。对于Victoria谱系病毒，未检测到限定HY(Vic）的高产量特性的内部基因中的突变。然而，在第5代之后检测到编码HA1-196T和HA1-196I的混合群，在第10代之后，仅检测到HA1-196I突变体。

相似地，在含胚鸡蛋中对两种谱系的数种野生型和高产量乙型流感病毒进行传代（表7）。在连续5–10代之后，未检测到内部基因中的适应鸡蛋的突变。然而，对于在HA的氨基酸194–196具有糖基化位点的病毒，出现导致糖基化位点丧失的突变。此发现与早先在Victoria谱系病毒中对此糖基化位点的突变的发现一致（表2）。总体上，数据表明HY(Yam）和HY(Vic）中提高产量的突变对于MDCK细胞和含胚鸡蛋中的至少5-10次连续传代具有遗传稳定性。

各vRNA对于HY(Yam）和HY(Vic）的高产量特性的贡献

HY(Yam）和HY(Vic）疫苗骨架在数种vRNA中具有突变。为了更好地理解这些突变对HY(Yam）和HY(Vic）表型的作用，反向遗传学用于生成具有HY(Yam）或HY(Vic）的各突变vRNA片段的病毒，例如，生成下述病毒，即其中Yamagata谱系病毒的HA和NA vRNA与野生型B/Yamagata/1/73（用于生成病毒文库）、野生型B/Yamagata/1/73（也编码存在于HY(Yam）中的NP-P40S突变）或HY(Yam）的其余6种vRNA组合（图12）。检测所产生的病毒在MDCK细胞中的复制能力和血凝滴度（图12）。当单个检测时，与参照病毒相比，NP-P40S、M1-R77K以及NS-a39g+NS1-K176Q突变显著增加Yamagata谱系病毒在一个或多个时间点的病毒滴度和血凝滴度。对于Victoria谱系病毒，所检测的各突变在一个或多个时间点具有统计学显著的促生长作用。大多数具有存在于HY(Yam）或HY(Vic）的各突变的病毒不如高产量疫苗候选株高效复制，表明数种突变的组合对于HY(Yam）和HY(Vic）的高产量特性重要。

HY(Yam）和HY(Vic）的各突变对病毒复制复合物活性的作用

单独选择NP-P40S突变，分别与来自Yamagata和Victoria谱系文库的NP-M204T组合。另外，当在无其他促生长突变的情况下检测时，这些突变增加病毒滴度和血凝滴度（图12）。为了评价这些突变是否影响病毒复制复合物的活性，使用表达B/Yamagata/1/73病毒、野生型或突变B/Yamagata/1/73 NP的三种聚合酶亚单位的质粒和表达萤光素酶报告蛋白的乙型流感病毒样RNA转染293T和MDCK细胞（NP-M204T突变体不分开检测，因为其选自仅与NP-P40S组合的病毒文库）。有趣地，NP-P40S和NP-P40S/M204T突变显著降低病毒复制复合物的复制活性（图13A-B）。

PA-a2272t突变在Vero细胞中的病毒文库传代过程中出现（表5和6），显著增加Victoria谱系疫苗候选株的病毒滴度和血凝滴度（图6）。发现此突变显著增加微复制子分析中的病毒样RNA（图105C）。HY(Yam）和HY(Vic）分别具有NS-a39g和NS-38(+1）g突变。将这些突变引入表达萤光素酶的病毒样RNA。两种突变均赋予来自病毒样RNA的报告蛋白的显著增加的表达（图13D），此作用在NS-38(+1）g突变显著大于NS-a39g突变。

HY(Yam）和HY(Vic）中的各突变对病毒样颗粒的组成的作用

当单独检测时，HY(Yam）和HY(Vic）中的M1-R77K和M1-M86T突变影响病毒滴度和血凝滴度（图12）。M1是病毒体的主要结构组分，此蛋白中的突变可影响病毒体的组成。使用用于表达B/Yamagata/1/73 HA、NA、NP、BM2、NS2以及野生型或突变M1蛋白的质粒转染293T细胞，这组病毒蛋白的表达导致高效的病毒样颗粒（VLP）形成和释放（Gomez-Puertas等，1999）。收集细胞培养上清，评价病毒蛋白的VLP掺入效率（图14）。M1中的两种突变均显著增加培养上清中病毒HA、NP、以及M1蛋白的量，推断这导致M1-R77K和M1-86T突变赋予的病毒滴度和血凝滴度增加。

HY(Yam）NS1蛋白中的突变对IFN拮抗剂活性的作用

NS1蛋白是主要的流感病毒IFN拮抗剂（Yuan等，2001；Dauber等，2004）。为了评价HY(Yam）NS1-K176Q突变对NS1干扰IFN-β合成的能力的作用，使用野生型或突变体NS1蛋白表达质粒和使用报告基因质粒pGL–IFN-β转染293T细胞，所述报告基因质粒pGL–IFN-β在IFN-β启动子的调控下编码萤火虫萤光素酶蛋白（Bale等，2012）。然后使用仙台病毒感染细胞以刺激IFN-β合成，导致报告基因表达增加。野生型和突变体NS1在其下调IFN-β合成方面具有可比性（图12A）。为了测定野生型和突变体NS1干扰IFN-β刺激的基因的表达的能力，使用野生型或突变体NS1蛋白表达质粒和报告基因质粒pISRE-Luc（Promega）转染293T细胞，所述报告基因质粒pISRE-Luc在IFN调节启动子的调控下编码萤火虫萤光素酶蛋白。24小时后，使用IFN-β刺激细胞，再温育24小时，然后分析萤光素酶表达。在抑制从IFN调节启动子进行基因合成方面，NS1-K176Q蛋白的效力稍低于野生型NS1（图12B），表明其他机制导致其促生长作用。

讨论

迄今，尚未进行系统努力以开发高产量乙型流感疫苗骨架。Vodeiko等(Vodeiko等，2003）对两种乙型流感病毒进行了比较，它们在含胚鸡蛋中的复制能力不同。再分配试验揭示导致表型差异的数种vRNA（Vodeiko等，2003），然而，未鉴定出决定生长特性的特定氨基酸。Kim等(Kim等，2015）发现乙型流感病毒冷适应提高其生长特性。HA、NA以及NP中的数种氨基酸变化（非本文报道的突变）导致病毒滴度增加（Kim等，2015）。Le等(2015）检测了2002–2007分离的B/Lee/40与Yamagata和Victoria谱系乙型流感病毒之间的重配株，所有14种高产量候选株均具有B/Lee/40病毒的NP vRNA，表明此vRNA赋予高效复制能力。Ping等(2015）公开了开发高产量甲型流感疫苗骨架的综合策略，在本发明中应用于乙型流感病毒：从具有内部基因中随机突变的病毒文库，筛选改进MDCK和Vero细胞中乙型流感病毒复制的候选株。突变的组合导致在MDCK和Vero细胞中及在含胚鸡蛋中具有高产量的Yamagata和Victoria谱系疫苗候选株（编码Yamagata谱系疫苗的NP-P40S、M1-R77K、NS1-K176Q、NS-a39g以及PA-a2272t突变，和Victoria谱系疫苗的NP-P40S/M204T、M1-M86T、NS-(38+1）g以及PA-a2272t突变）。另外的(半)工业设置中的研究对于确定谱系特异性疫苗骨架是否提供优于用于两种谱系的病毒的单个骨架的优点是必要的。

从HY(Yam）和HY(Vic）获得的总病毒蛋白产量和HA含量显著高于来自野生型病毒的总病毒蛋白产量和HA含量（图10）。高病毒和HA产量对于成本有效的疫苗制备是重要的。更重要地，疫苗病毒产量增加可在具有大量疫苗需求的数年间和具有缩减的病毒产量疫苗制备次数的数年间是急需的。然而，有些所观察到的病毒滴度或HA产量的差异小（但具有统计学显著性），当前并不知道HY(Yam）和HY(Vic）增加工业疫苗制备中疫苗病毒产量的程度。

乙型流感病毒序列的评价揭示HY(Yam）和HY(Vic）中的氨基酸变化在天然乙型流感病毒中是罕见的（已在一种分离株中发现NP-P40S、NP-M204T以及M1-M86T突变，在14种分离株中已报道了M1-R77K突变，尚未检测到NS1-K176Q突变）。乙型流感病毒NP蛋白的三维结构已被解析（Ng等，2012），但40位（在此从Yamagata和Victoria谱系文库选择P至S突变）是N末端71个氨基酸的一部分（对此未获得结构数据），表明此区域具有高度柔性。乙型流感病毒NP蛋白的序列分析揭示40位脯氨酸高度保守：3,234个序列中仅一个序列不编码NP-40P（唯一的例外，B/Tennessee/01/2015，编码NP-40S，如本研究中所发现的）。有趣地，在微复制子分析中NP P40S突变减弱病毒复制复合物的活性，表明此突变提高产量的作用由非复制和转录功能介导。例如，在病毒核糖核蛋白复合物从细胞核运输至细胞质的过程中或在病毒体组装过程中，NP中的此区域可与病毒或细胞蛋白相互作用。

在增加病毒产量的vRNA片段的非编码区中也鉴定了数种突变，这些突变中的某些突变赋予了复制和转录水平的增加，如在微复制子分析中所检测的。这些突变可例如增加vRNA的稳定性，或影响其与病毒聚合酶复合物的相互作用。需要进一步的研究以破解这些突变的确切机制功能。

总体上，开发了可增加当前用于人流感疫苗病毒制备的增殖系统中季节性乙型流感疫苗的滴度的乙型流感疫苗病毒骨架。

表1：所选择的Yamagata谱系高产量克隆的氨基酸变化

表2：所选择的Victoria谱系高产量克隆的氨基酸变化

此表格及后面表格以小写斜体字母表示的突变代表非编码区中的核苷酸变化。

表3：通过使用反向遗传学生成的Yamagata谱系HY疫苗病毒候选株的氨基酸变化

表4：通过使用反向遗传学生成的Victoria谱系HY疫苗病毒候选株的氨基酸变化

在MDCK细胞中对病毒文库传代总共12次，例如在2代之后混合文库，然后进行另外的10次传代（图2）。在MDCK细胞中传代之后，进行噬斑分析，挑取超过1400个单个噬斑。高产量候选株示于表1-4。

表5和6显示使用相似方案导致Vero细胞中生长提高的变化。

表5：Vero细胞适应的HY Yamagata谱系病毒的氨基酸变化

表6：Vero细胞适应的HY Victoria谱系病毒的氨基酸变化

表7：在含胚鸡蛋中连续病毒传代之后检测的氨基酸变化

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所有出版物、专利及专利公开均通过引用并入本文。尽管在前述说明书中就其某些优选实施方式描述了本发明，且出于例示的目的阐述了许多细节，但是对于本领域技术人员来说明显的是，本发明接受另外的实施方式，在不背离本发明基本原则的情况下本文描述的某些细节可显著改变。

Claims (15)

1.一种分离的重组乙型流感病毒，其具有PA、PB1、PB2、NP、NS和M病毒片段，异源或嵌合流感病毒NA病毒片段，以及异源或嵌合HA病毒片段，

其中所述NP病毒片段编码具有第40位的S或第40位的S和第204位的T的NP多肽；并且

i) 任选地，所述NS病毒片段编码具有第42位的N、第117位的Y、第176位的Q或第252位的T中至少之一的NS1多肽，或者所述NS病毒片段具有第38核苷酸位之后的g核苷酸插入或第39核苷酸位的g中至少之一，或其任何组合；

ii) 任选地，所述M病毒片段编码具有第34位的V或N、第54位的G、第77位的K、第86位的T或第97位的N中至少之一的M1多肽，或者所述M病毒片段编码具有第58位的R、第80位的G、第27位的R或第26位的R中至少之一的BM2多肽；

iii) 任选地，所述NP病毒片段具有第1795核苷酸位的a或第500核苷酸位的t中至少之一，或者所述NP多肽具有第28位的T、第51位的Q、第52位的K、第57位的G或第343位的T中至少之一，或其任何组合；

iv) 任选地，所述PA病毒片段编码具有第387位的H、第434位的A、第494位的N或第524位的A中至少之一的PA多肽，或者所述PA病毒片段具有第1406核苷酸位的g、第2272核苷酸位的t、第1445核苷酸位的t或第2213核苷酸位的a中至少之一，或其任何组合；

v) 任选地，所述PB2病毒片段编码具有第16位的S的PB2多肽；或者

vi) i)-v)中的任何组合，

其中在PA、PB2、NP、NS和M病毒片段或多肽中的位置分别相对于SEQ ID NO: 3、1、4、6和5的核苷酸序列，或由所述核苷酸序列编码的多肽。

2.根据权利要求1所述的分离的病毒，其中所述NP多肽具有第40位的S和所述NP病毒片段具有第500核苷酸位的t，所述M1多肽具有第77位的K，所述NS1多肽具有第176位的Q和所述NS病毒片段具有第39核苷酸位的g，和所述PA病毒片段具有第1406核苷酸位的g、第1445核苷酸位的t和第2272核苷酸位的t。

3.根据权利要求1所述的分离的病毒，其中所述NP多肽具有第40位的S和第204位的T，和所述NP病毒片段具有第500核苷酸位的t，所述M1多肽具有第86位的T，所述NS病毒片段具有第38核苷酸位之后的g插入，所述PA病毒片段具有第1406核苷酸位的g、第1445核苷酸位的t和第2272核苷酸位的t。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的分离的病毒，其中所述NA病毒片段和HA病毒片段来自相同的流感病毒分离株。

5.根据权利要求1至3中任一项所述的分离的病毒，其中所述PA、PB1、PB2、NP、NS以及M病毒片段包含编码下述至少之一的序列：具有SEQ ID NO：2编码的氨基酸序列的PB1，或与SEQ ID NO：2编码的PB1具有至少80%氨基酸序列同一性的PB1；具有SEQ ID NO：1编码的氨基酸序列的PB2，或与SEQ ID NO：1编码的PB2具有至少80%氨基酸序列同一性的PB2；具有SEQ ID NO：3编码的氨基酸序列的PA，或与SEQ ID NO：3编码的PA具有至少80%氨基酸序列同一性的PA；具有SEQ ID NO：4编码的氨基酸序列的NP，或与SEQ ID NO：4编码的NP具有至少80%氨基酸序列同一性的NP；具有SEQ ID NO：5编码的氨基酸序列的M，或与SEQ ID NO：5编码的M具有至少80%氨基酸序列同一性的M；或具有SEQ ID NO：6编码的氨基酸序列的NS，或与SEQ ID NO：6编码的NS具有至少95%氨基酸序列同一性的NS。

6.根据权利要求1至3中任一项所述的分离的病毒，所述分离的病毒具有异源HA病毒片段或异源NA病毒片段。

7.根据权利要求1至3中任一项所述的分离的病毒，其中所述M1多肽具有第34位的V、第97位的N或第86位的T，或其任何组合；或所述BM2多肽具有第58位的R和/或第80位的G；或所述NP多肽具有第52位的K。

8.一种疫苗，所述疫苗具有权利要求1至7中任一项所述的分离的重组病毒。

9.一种制备流感病毒的方法，所述方法包括使细胞与有效产生感染性流感病毒的量的下列载体接触：

i) 用于产生vRNA或cRNA的载体，其包含操作性连接流感病毒PA DNA的启动子，所述PADNA连接转录终止序列；

ii) 用于产生vRNA或cRNA的载体，其包含操作性连接流感病毒PB1 DNA的启动子，所述PB1 DNA连接转录终止序列；

iii) 用于产生vRNA或cRNA的载体，其包含操作性连接流感病毒PB2 DNA的启动子，所述PB2 DNA连接转录终止序列；

iv) 用于产生vRNA或cRNA的载体，其包含操作性连接流感病毒HA DNA的启动子，所述HA DNA连接转录终止序列；

v) 用于产生vRNA或cRNA的载体，其包含操作性连接流感病毒NP DNA的启动子，所述NPDNA连接转录终止序列；

vi) 用于产生vRNA或cRNA的载体，其包含操作性连接流感病毒NA DNA的启动子，所述NA DNA连接转录终止序列；

vii) 用于产生vRNA或cRNA的载体，其包含操作性连接流感病毒M DNA的启动子，所述MDNA连接转录终止序列；以及

viii) 用于产生vRNA或cRNA的载体，其包含操作性连接流感病毒NS DNA的启动子，所述NS DNA连接转录终止序列，

其中用于产生vRNA或cRNA的载体中的PB1 DNA、PB2 DNA、PA DNA、NP DNA、NS DNA以及MDNA来自一种或多种流感疫苗病毒分离株，其中用于产生NA的vRNA或cRNA的载体中的NADNA具有异源或嵌合NA的序列，和其中用于产生HA的vRNA或cRNA的载体中的HA DNA具有异源或嵌合HA的序列，

其中所述NP vRNA或cRNA编码具有第40位的S或第40位的S和第204位的T的NP多肽，其中任选地所述NS vRNA或cRNA编码具有第42位的N、第117位的Y、第176位的Q或第252位的T中至少之一的NS1多肽，和/或具有第38核苷酸位之后的g核苷酸插入或第39核苷酸位的g中至少之一，或其任何组合；或者任选地所述M vRNA或cRNA编码具有第34位的V或N、第54位的G、第77位的K、第86位的T或第97位的N中至少之一的M1多肽；或者任选地所述M vRNA或cRNA编码具有第58位的R、第80位的G、第27位的R或第26位的R中至少之一的BM2多肽；或者任选地所述NP vRNA或cRNA具有第1795核苷酸位的a或第500核苷酸位的t中至少之一；或者任选地所述NP多肽具有第28位的T、第51位的Q、第52位的K、第57位的G或第343位的T中至少之一；或者任选地所述PA vRNA或cRNA编码具有第387位的H、第434位的A、第494位的N或第524位的A中至少之一的PA多肽，和/或所述PA vRNA或cRNA具有第1406核苷酸位的g、第2272核苷酸位的t、第1445核苷酸位的t或第2213核苷酸位的a中至少之一，或其任何组合；或者任选地所述PB2 vRNA或cRNA编码具有第16位的S的PB2多肽；或其任何组合，

其中在PA、PB2、NP、NS和M病毒片段或多肽中的位置分别相对于SEQ ID NO: 3、1、4、6和5的核苷酸序列，或由所述核苷酸序列编码的多肽；和

用于产生mRNA的载体，所述载体包含操作性连接编码流感病毒PA的DNA片段的启动子；用于产生mRNA的载体，所述载体包含操作性连接编码流感病毒PB1的DNA片段的启动子；用于产生mRNA的载体，所述载体包含操作性连接编码流感病毒PB2的DNA片段的启动子；以及用于产生mRNA的载体，所述载体包含操作性连接编码流感病毒NP的DNA片段的启动子。

10.根据权利要求9所述的方法，其中所述细胞是禽细胞或哺乳动物细胞。

11.根据权利要求10所述的方法，其中所述细胞是Vero细胞、人细胞或MDCK细胞。

12.根据权利要求9至11中任一项所述的方法，其中所述NP多肽具有第40位的S和所述NP vRNA具有第500核苷酸位的t，所述M1多肽具有第77位的K，所述NS1多肽具有第176位的Q和所述NS vRNA具有第39核苷酸位的g，和所述PA vRNA具有第1406核苷酸位的g、第1445核苷酸位的t和第2272核苷酸位的t。

13.根据权利要求9至11中任一项所述的方法，其中所述NP多肽具有第40位的S和第204位的T，和所述NP vRNA具有第500核苷酸位的t，所述M1多肽具有第86位的T，所述NS vRNA具有第38核苷酸位之后的g插入，和所述PA vRNA具有第1406核苷酸位的g、第1445核苷酸位的t和第2272核苷酸位的t。

14.根据权利要求9至11中任一项所述的方法，所述方法进一步包括分离感染性流感病毒。

15.一种载体，所述载体用于乙型流感病毒NP vRNA、cRNA或mRNA表达，其中所述乙型流感病毒NP与SEQ ID NO：4、14或15编码的多肽具有至少85%氨基酸序列同一性，并且具有第40位的S或第40位的S和第204位的T，并任选地具有第28位的T、第51位的Q、第52位的K、第57位的G或第343位的T中至少之一，以及所述vRNA、cRNA或mRNA任选地具有第1795核苷酸位的a或第500核苷酸位的t中至少之一，其中在所述载体中，流感病毒NP DNA与异源启动子操作性连接。

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