ES2394085T3 - Medio exento de proteínas animales para el cultivo de células - Google Patents
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Abstract
Un procedimiento para cultivar un cultivo celular confluyente de células dependientes de superficie quecomprende:proporcionar un medio exento de proteínas animales que comprende hidrolizado de soja a una concentración del0,05% (p/v) al 1% (p/v) e hidrolizado de levadura a una concentración del 0,05% (p/v) al 0,3%(p/v); ypropagar las células en el medio para formar el cultivo celular confluyente, y pasar y subcultivar las células mientrasestán en contacto con una proteasa no derivada de animales.
Description
Medio exento de proteínas animales para el cultivo de células
La presente desvelación se refiere a un medio de cultivo celular exento de proteínas animales quecomprende una combinación de un hidrolizado de soja y un hidrolizado de levadura. La invención se refiere a procesos de cultivo exentos de proteínas animales, en los que las células pueden ser cultivadas, propagadas y pasadas sin proteínas animales. Estos procesos son útiles para cultivar células, tales como células recombinantes océlulas infectadas con un virus, y para producir productos biológicos mediante procesos de cultivo celular.
Para el cultivo de células, particularmente de células eucariotas, y más específicamente células de mamífero, existe una necesidad constante de usar medios de cultivo especiales que hacen disponibles lassustancias nutrientes y las sustancias nutrientes de crecimiento que son necesarias para un crecimiento eficaz delas células y para la producción de las proteínas o de los virus que se desean. Las formulaciones de medios decultivos celulares se han complementado con diversos aditivos, que incluyen componentes indefinidos tales como suero bovino fetal (fetal calf serum, FCS), diversas proteínas derivadas de animales y/o hidrolizados de proteínas de origen bovino.
En general, el suero o las sustancias derivadas del suero, tales como la albúmina, la transferrina o lainsulina, pueden contener agentes no deseados que pueden contaminar los cultivos y los productos biológicosobtenidos a partir de los mismos. Adicionalmente, los aditivos derivados de suero humano deben ser ensayadospara comprobar todos los virus conocidos, incluyendo hepatitis y VIH, que pueden ser transmitidos por el suero. Además, el suero bovino y los productos derivados del mismo, por ejemplo, la tripsina, son portadores de un riesgode contaminación por BSE. Además, todos los productos derivados de suero pueden estar contaminados poragentes desconocidos. En el caso del suero o de aditivos proteicos que derivan de seres humanos o de otrasfuentes animales en cultivos celulares, existen numerosos problemas (por ejemplo, la calidad y la composiciónvariables de los diferentes lotes y el riesgo de contaminación por agentes de micoplasma, virus o BSE),particularmente si las células se usan para la producción de agentes medicinales o de vacunas para su administración a seres humanos.
Por lo tanto, se han realizado muchos intentos para proporcionar sistemas hospedadores y condiciones decultivo eficaces que no requieran suero ni otros compuestos proteicos animales. El medio simple exento de sueroincluye típicamente medio basal, vitaminas, aminoácidos o sales orgánicas e inorgánicas, y quizás componentes adicionales para hacer el medio nutricionalmente complejo. Sin embargo, tales medios son a menudo insuficientesnutricionalmente y deben complementarse con complementos proteicos derivados de animales o versiones recombinantes de proteínas usadas en los cultivos celulares, tales como insulina, factor de crecimiento insulinoide uotros factores de crecimiento.
Para evitar el uso de complementos proteicos derivados de animales en medios de cultivo celulares exentos de suero, se han realizado muchos intentos para proporcionar medios de cultivo celulares que estén completamenteexentos de proteínas.
Cinatl y col., Cell Biology International 17: 885-895 (1993) desvelan el desarrollo de un medio (PFK-1) específico para la propagación continua de células VERO en una superficie de cultivo de polivinilo formal (PVF).
El documento WO96/15231 desvela un medio exento de suero formado por un medio sintético mínimo esencial y extracto de levadura para la propagación de células de vertebrados y procesos de producción de virus.
En el documento WO98/15614 se desvela una formulación de medio compuesta por medio de un cultivocelular basal que comprende un péptido de arroz y un extracto de levadura o un digerido enzimático de los mismos, y/o un lípido vegetal para el crecimiento de células animales.
En el documento WO01/23527 se desvela un medio que comprende un hidrolizado de soja purificado para el cultivo de células recombinantes.
En el documento WO00/03000 se desvela un medio que comprende un hidrolizado de soja y un extracto de levadura, pero también requiere la presencia de formas recombinantes de proteínas animales, tales como factoresde crecimiento.
Para una producción eficaz de los productos biológicos, tales como virus o proteínas recombinantes, es importante que se alcance una densidad celular óptima para obtener el máximo rendimiento del producto.
Por lo tanto, existe una necesidad actual de aumentar el crecimiento, la actividad metabólica y la densidad de las células, y de proporcionar un medio de cultivo celular óptimo desprovisto de proteínas animales para laproducción de productos biológicos, tales como aquellos usados como medicinas o vacunas en seres humanos.Además, el procesamiento anterógrado, por ejemplo, la purificación del producto deseado a partir del medio de cultivo puede ser más eficaz en coste y tiempo si no hay proteínas animales presentes en el suero. Adicionalmente,las proteínas animales inmunógenas indeseadas pueden inducir reacciones inmunológicas perjudiciales, que seevitan con la práctica de la presente invención.
5 10 15 20
25 30
35 40
50 55
La presente invención se establece en las reivindicaciones.
Es un objeto de la presente descripción proporcionar un medio de cultivo celular exento de proteínasanimales. Para conseguir este y otros objetos, se proporciona un medio de cultivo celular exento de proteínasanimales que comprende hidrolizado de soja e hidrolizado de levadura. El hidrolizado de soja puede estar presente en una concentración de al menos el 0,05% (p/v) y el hidrolizado de levadura está presente en una concentración deal menos 0,05% (p/v). Opcionalmente, el hidrolizado de soja puede estar presente en una concentración de menosdel 1,0% (p/v) y el hidrolizado de soja puede estar presente en una concentración de menos del 0,3% (p/v). Opcionalmente, el hidrolizado de soja puede estar presente en una concentración de entre aproximadamente el0,2% (p/v) hasta aproximadamente el 0,6% (p/v) y el hidrolizado de levadura puede estar presente en una concentración de entre aproximadamente el 0,05% (p/v) hasta aproximadamente el 0,2% (p/v). Opcionalmente, el hidrolizado de soja puede estar presente en una concentración de entre aproximadamente el 0,25% (p/v) hastaaproximadamente el 0,35% (p/v) y el hidrolizado de levadura puede estar presente en una concentración de entreaproximadamente el 0,05% hasta aproximadamente el 0,15% (p/v). Opcionalmente, el hidrolizado de soja puedeestar presente en una concentración de aproximadamente el 0,3% (p/v) y el hidrolizado de levadura puede estar presente en una concentración de aproximadamente el 0,1% (p/v). Opcionalmente, el medio comprende 3 partes enpeso de hidrolizado de soja por 1 parte en peso de hidrolizado de levadura. El hidrolizado de levadura puede ser unhidrolizado de levadura ultrafiltrado purificado, en el que al menos el 40% de dicho hidrolizado de levadura tiene unpeso molecular menor o igual a 500 Dalton. De forma similar, el hidrolizado de soja puede ser un hidrolizado de sojaultrafiltrado purificado, en el que al menos el 40% de dicho hidrolizado de soja tiene un peso molecular menor o igual a 500 Dalton.
La invención también proporciona procedimientos para cultivar cultivos confluyentes de células dependientes de la superficie que comprende proporcionar un medio que comprende hidrolizado de soja a una concentración del 0,05% (p/v) hasta el 1% (p/v) e hidrolizado de levadura a una concentración del 0,05% (p/v) hastael 0,3% (p/v); y propagar las células en el medio para formar el cultivo confluyente y pasar y subcultivar las células mientras están en contacto con una proteasa no derivada de animales. También pueden emplearse según lainvención otras concentraciones de hidrolizados, como se ejemplificó anteriormente,. Las células pueden ser célulasanimales, tales como células de insecto, células de ave, células de mamífero, células madre, y preferiblemente aquellas células que se usan para la producción de virus in vitro. Las células también pueden ser células recombinantes. Algunos ejemplos de células incluyen aquellas elegidas del grupo de células formado por células BSC-1, células LLC-MK, células CV-1, células COS, células VERO, células MDBK, células MDCK, células CRFK, células RAF, células RK, células TCMK-1, células LLC-PK, células PK15, células LLC-RK, células MDOK, células BHK-21, células CHO, células NS-1, células MRC-5, células WI-38, células BHK, células 293 y células RK.
La invención también proporciona un proceso de cultivo de células confluyentes exento de proteínasanimales que comprende: proporcionar un medio exento de proteínas animales que comprende hidrolizado de soja e hidrolizado de levadura; hacer crecer células dependientes de la superficie en el medio, y pasar y subcultivar lascélulas que han crecido en el medio mientras están en contacto con una proteasa no derivada de animales conobjeto de obtener un cultivo de células confluyentes. Las células pueden ser células animales, células recombinantes y/o células infectadas por un virus. Las características de los medios y los tipos celulares expuestosen este documento se pueden aplicar aquí también.
Además, la desvelación proporciona un cultivo de células cultivadas en un medio exento de proteínasanimales, en el que el medio comprende un hidrolizado de soja a una concentración de aproximadamente el 0,05%(p/v) hasta aproximadamente el 1% (p/v) y un hidrolizado de levadura a una concentración de aproximadamente el 0,05% (p/v) hasta el 0,03% (p/v). También pueden emplearse otras concentraciones de hidrolizados, como se haejemplificado anteriormente. Las células pueden ser células animales, células recombinantes y/o células infectadas por un virus. Las características de los medios y los tipos celulares expuestos en este documento se pueden aplicaraquí también.
Adicionalmente, en este documento se describen procedimientos para producir virus que comprenden:proporcionar un cultivo de células crecidas en un medio exento de proteínas animales que comprende hidrolizado de soja y un hidrolizado de levadura; infectar las células con un virus; e incubar las células infectadas para propagar el virus. Las células pueden ser células animales y/o células recombinantes, y en particular, células de mamífero. Lascaracterísticas de los medios y de los tipos celulares establecidos en este documento se pueden aplicar aquítambién. Los virus que se van a producir en las células cultivadas se pueden elegir de una serie de virus conocidospor infectar el tipo celular cultivado. Por ejemplo, cuando se utiliza un cultivo de células de mamífero, los virus sepueden elegir de entre los géneros ortomixovirus, paramixovirus, reovirus, picornavirus, flavivirus, arenavirus, herpesvirus, poxvirus, coronavirus y adenovirus. El virus usado puede ser un virus natural, un virus atenuado, unvirus reagrupado o un virus recombinante. Además, en lugar de los actuales viriones usados para infectar las células con un virus, se puede utilizar un clon de un ácido nucleico infeccioso según los procedimientos de transfección de clones conocidos por los expertos en el campo de la virología.
En el presente documento se describen procedimientos para producir poxvirus (incluido virus vaccinia), que comprenden: proporcionar un cultivo de células crecido en un medio exento de proteínas animales que comprende hidrolizado de soja e hidrolizado de levadura; infectar las células con poxvirus; e incubar las células infectadas parapropagar el poxvirus. Las células pueden ser células de mamífero y/o células recombinantes. Las características delos medios y de los tipos celulares expuestos en este documento se pueden aplicar aquí también.
Además, en el presente documento se describen procedimientos para producir coronavirus (incluido el coronavirus asociado al síndrome respiratorio agudo severo), que comprenden: proporcionar un cultivo de célulascrecido en un medio exento de proteínas animales que comprende hidrolizado de soja e hidrolizado de levadura;infectar las células con coronavirus; e incubar las células infectadas para propagar el coronavirus. Las células
pueden ser células de mamífero y/o células recombinantes. Las características de los medios y los tipos celularesexpuestos en este documento se pueden aplicar aquí también.
Además, en el presente documento se describen procedimientos para producir ortomixovirus, quecomprenden: proporcionar un cultivo de células crecido en un medio exento de proteínas animales que comprendehidrolizado de soja e hidrolizado de levadura; infectar las células con ortomixovirus; e incubar las células infectadaspara propagar el ortomixovirus. El ortomixovirus puede ser virus de la gripe A, B o C. Las células pueden ser células de mamífero y/o células recombinantes. Las características de los medios y los tipos celulares expuestos en estedocumento se pueden aplicar aquí también.
En el presente documento se describen procedimientos para producir virus de Ross-River, quecomprenden: proporcionar un cultivo de células crecido en un medio exento de proteínas animales que comprendehidrolizado de soja e hidrolizado de levadura; infectar las células con virus de Ross-River; e incubar las célulasinfectadas para propagar el virus de Ross-River. Las células pueden ser células de mamífero y/o célulasrecombinantes. Las características de los medios y los tipos celulares expuestos en este documento se puedenaplicar aquí también.
En el presente documento se describen procedimientos para producir flavivirus, que comprenden:proporcionar un cultivo de células crecido en un medio exento de proteínas animales que comprende hidrolizado desoja e hidrolizado de levadura; infectar las células con el flavivirus; e incubar las células infectadas para propagar elflavivirus. El flavivirus se puede elegir del grupo formado por: virus de la fiebre amarilla, y virus quiméricos derivadosdel mismo, virus de la encefalitis japonesa, virus de la encefalitis transmitida por garrapatas, virus del Nilo occidentaly virus de la hepatitis C. Las células pueden ser células animales y/o células recombinantes. Las características delos medios y los tipos celulares expuestos en este documento se pueden aplicar aquí también.
En el presente documento se describen procedimientos para producir composiciones inmunógenas quecomprenden un virus o antígenos de un virus, en los que el procedimiento comprende proporcionar un cultivo decélulas crecido en un medio exento de proteínas animales que comprende hidrolizado de soja e hidrolizado delevadura; infectar las células con el virus; incubar las células infectadas para propagar el virus; recoger el virus o elantígeno del virus producido; preparar una composición inmunógena a partir del antígeno del virus o del antígeno delvirus recogido. Las células pueden ser células animales y/o células recombinantes. Las características de los mediosy los tipos celulares expuestos en este documento se pueden aplicar aquí también.
En el presente documento se describen procedimientos para producir composiciones inmunógenas quecomprenden un virus o un antígeno de un virus, en los que el procedimiento comprende proporcionar un cultivo decélulas de mamífero, en el que las células se eligen del grupo formado por células renales de mono, células renalesde bovino, células renales de perro, células renales de cerdo, células renales de ratón, células renales de rata, células renales de oveja, células renales de hámster y células humanas crecidas en un medio de cultivo exento deproteínas animales que comprende un hidrolizado de soja y un hidrolizado de levadura; infectar las células con unvirus elegido del grupo formado por ortomixovirus, paramixovirus, reovirus, picornavirus, flavivirus, arenavirus, herpesvirus, poxvirus, coronavirus y adenovirus; incubar el cultivo de células para propagar el virus; recoger el virus
o el antígeno del virus así producido; y preparar una composición inmunógena a partir del virus o el antígeno delvirus recogido.
Adicionalmente, se describen en este documento cultivos de células infectadas por ortomixovirus, poxvirus,paramixovirus, reovirus, picornavirus, flavivirus, arenavirus, herpesvirus, poxvirus o adenovirus, en los que lascélulas se cultivan en un medio exento de proteínas animales, en el que el medio comprende hidrolizado de soja ehidrolizado de levadura. El hidrolizado de soja puede estar en una concentración de aproximadamente el 0,05 (p/v)hasta aproximadamente el 1% (p/v) y el hidrolizado de levadura puede estar a una concentración de aproximadamente el 0,05% (p/v) hasta aproximadamente el 0,3% (p/v). También pueden emplearse otrasconcentraciones de hidrolizados, como se ejemplificó anteriormente.
En este documento se describen preparaciones de ortomixovirus, poxvirus, paramixovirus, reovirus, picornavirus, flavivirus, arenavirus, herpesvirus, poxvirus o adenovirus que están exentas de proteínas animales,incluyendo versiones producidas recombinantemente de los mismos, a partir del medio, en el que la preparación seobtiene mediante el cultivo de células infectadas con virus de la gripe en un medio exento de proteínas animales, enel que el medio comprende hidrolizado de soja e hidrolizado de levadura. El hidrolizado de soja puede estar en unaconcentración de aproximadamente el 0,05% (p/v) hasta aproximadamente el 1% (p/v) y el hidrolizado de levadurapuede estar en una concentración de aproximadamente el 0,05% (p/v) hasta aproximadamente el 0,3% (p/v).También pueden emplearse otras concentraciones de hidrolizados, como se ejemplificó anteriormente . Estas preparaciones víricas son adecuadas para su uso en la elaboración de antígenos víricos tras un procesamientoadicional.
Estos y otros aspectos de la invención serán evidentes para la persona experta vista la explicación y losdatos expuestos a continuación.
La invención se establece en las reivindicaciones.
El término "medio exento de proteínas animales", en sus diversas formas gramaticales, se refiere a unmedio que no está complementado con proteínas ni componentes proteicos procedentes de eucariotas superiorespluricelulares no vegetales (esto es, vertebrados), que poseen las características de estructura secundaria, terciariay cuaternaria de las proteínas según aparecen en la naturaleza. Las proteínas típicas que se evitan son aquellas quese encuentran en el suero y en las sustancias derivadas del suelo, tales como albúmina, transferrina, insulina y otrosfactores de crecimiento. Las versiones producidas recombinantemente de proteínas animales, que pueden contener
componentes bacterianos inmunógenos, también son evitadas según la invención, y no están presentes en el medioexento de proteínas animales descrito en este documento. Las proteínas animales y los componentes proteicosdeben distinguirse de las proteínas no animales, pequeños polipéptidos y oligopéptidos obtenidos a partir devegetales (habitualmente de aproximadamente 10-30 aminoácidos de longitud), tales como la semilla de soja, y deeucariotas inferiores, tales como la levadura. Por supuesto, una vez que el medio expuesto en contacto o inoculado con las células que se van a propagar, el medio contendrá proteínas animales desprendidas o secretadas por esascélulas, incluyendo cualquier proteína recombinante expresada por las células modificadas genéticamente si secultivan dichas células. Por lo tanto, el término medio exento de proteínas animales, y los materiales y preparaciones biológicas producidos con ellos, no debe interpretarse como que requieren la ausencia de proteínas desprendidas osecretadas por las células propagadas en el medio, sino que más bien se refiere a la ausencia de una complementación directa del medio con proteínas y componentes proteicos animales obtenidos a partir de fuentes animales o similares producidos recombinantemente.
El término "medio basal", en sus diversas formas gramaticales, es un medio sintético, tal como DMEM, HAMBs F12, Medio 199 o RPMI, o combinaciones de los mismos, y otros que son conocidos a partir de labibliografía o están disponibles comercialmente. Según la invención, cualquier medio sintético que no contenga proteínas animales puede usarse en combinación con la combinación de hidrolizado de soja e hidrolizado delevadura.
El medio basal puede comprender varios ingredientes, incluyendo aminoácidos, vitaminas, sales orgánicase inorgánicas fuentes de carbohidratos, estando presente cada ingrediente en una cantidad que sustente el cultivo de una célulain vitro. Por ejemplo, puede usarse el medio DMEM/HAM's F12 (1:1) como medio basal. . El mediopuede contener sustancias auxiliares, tales como sustancias tamponantes como bicarbonato sódico, estabilizantesde la oxidación, estabilizantes para contrarrestar el estrés mecánico, o inhibidores de la proteasa. Si se requierepuede añadirse al medio como agente antiespumante un tensioactivo no iónico, tal como polipropilenglicol (PLURONIC F-61, PLURONIC F-68, SYNPERONIC F-68, PLURONIC F-71 or PLURONIC F-108). Estos agentes seusan generalmente para proteger las células de los efectos negativos de la aireación, dado que, sin la adición de un tensioactivo, las burbujas de aire que ascienden y explotan pueden producir daños en aquellas células que estánubicadas en la superficie de estas burbujas de aire ("burbujeo (sparging)"). La cantidad de tensioactivo no iónico estápreferiblemente entre aproximadamente 0,05 y aproximadamente 10 g/L, típicamente entre aproximadamente 0,1 y aproximadamente 5 g/L. además, el medio también puede contener ciclodextrina o derivados de la misma, típicamente entre aproximadamente 0,001 g/L y aproximadamente 1 g/L.
El medio descrito en este documento comprende hidrolizado de soja e hidrolizado de levadura, que puedenañadirse a un medio basal. El término "hidrolizado" incluye un digerido enzimático de peptona de soja o de extractode levadura. El hidrolizado puede obtenerse a partir de una pluralidad de preparaciones de peptona de soja o deextracto de levadura, respectivamente, que pueden ser digeridos adicionalmente enzimáticamente (por ejemplo, conpapaína) y/o formados mediante autolisis, termolisis y/o plasmolisis. Los hidrolizados también pueden obtenerse comercialmente, tales como Hy-Soy, Hy-Yeast 412 y Hi-Yeast 444, de fuentes tales como Quest International,Norwich, Nueva York, OrganoTechnie, S.A. Francia; Deutsche Hefewerke GmbH, Alemania. Algunas fuentes deextractos de levadura también se desvelan en el documento WO98/15614. Algunas fuentes de extractos de levaduray de hidrolizados de soja también se desvelan en el documento WO00/03000.
Los hidrolizados usados en el medio descrito en este documento se purifican preferiblemente a partir de lafracción en bruto, ya que las impurezas que podrían interferir con un cultivo eficaz se eliminan preferiblementedurante esta purificación, mejorando así la consistencia del hidrolizado. La purificación puede realizarse medianteultrafiltración o con cromatografía de Sephadex, por ejemplo, con Sephadex 25 o Sephadex G10 o materialesequivalentes, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de afinidad, cromatografía de exclusión por tamaños o cromatografía en fase inversa. Estos procesos son conocidos en la materia. Usando estos procedimientos, pueden elegirse fracciones que contienen hidrolizado de soja o de levadura con un peso moleculardefinido preferiblemente :1000 Dalton, más preferiblemente :500 Dalton, aún más preferiblemente :350 Dalton. Al menos el 90 del hidrolizado tiene preferiblemente un peso molecular de :1000 Dalton. El peso molecular medio delos hidrolizados de soja y de levadura está preferiblemente entre aproximadamente 220 y 375 Daltons. El valor del pH del hidrolizado del hidrolizado de soja y de levadura debería estar en el intervalo de aproximadamente 6,5 y 7,5. El contenido total en nitrógeno debería estar entre aproximadamente el 8 y el 11%, preferiblemente de entre el 9,0 y el 10,0%, y el contenido en cenizas :18%. Un hidrolizado ventajoso se caracteriza por la característica de que tieneun contenido en aminoácidos de entre aproximadamente el 5 y el 30%. El contenido en endotoxinas, si las hubiera,debería ser <500 U/g.
Un medio descrito en este documento tiene la siguiente circunscripción: medio minimo sintético (medio DMEM/HAM's F12 (1:1) (1-25 g/L), hidrolizado de soja (0,5-10 g/L) e hidrolizado de levadura (0,5-3 g/L), L-glutamina (0,05-1 g/L), NaHCO3 (0,1-10 g/L). El pH del medio está entre pH 6,8 y 7,6, preferiblemente entre pH 7,0 y 7,3.
Como es evidente para la persona experta, el término "aproximadamente" en el contexto de valores numéricos o intervalos se refiere a valores con intervalos que se aproximan o son cercanos a los valores o intervalosmencionados, de forma que la invención puede realizarse como se pretende, tal como promoviendo un gradodeseado de crecimiento celular, como resulta evidente a partir de las enseñanzas contenidas en este documento, y se aplica a todos los valores. Por lo tanto, este término engloba valores más allá de los resultantes de un errorsistemático.
Sorprendentemente se ha averiguado que un medio basal exento de proteínas animales complementadocon hidrolizado de levadura e hidrolizado de soja en el intervalo según la presente desvelación es más favorable para la tasa de crecimiento celular, la actividad metabólica celular y la densidad celular final en comparación con losmedios descritos en la técnica anterior. Esto fue incluso más sorprendente en vista de las enseñanzas deldocumento WO98/15614 que mostraba que concentraciones mayores de péptidos vegetales son menos óptimas.Con un medio exento de proteínas animales que comprende hidrolizado de levadura e hidrolizado de soja según se
describe en este documento, las células mostraron una mayor tasa de crecimiento, una mayor densidad celular finalde la biomasa y un incremento en la actividad metabólica (expresado en consumo de oxígeno en % por min) encomparación con un medio que comprende sólo hidrolizado de soja o hidrolizado de levadura, incluso si la concentración final del hidrolizado de levadura o del hidrolizado de soja añadido individualmente al medio esequivalente a la suma de la concentración de los hidrolizados combinados. Por ejemplo, a una concentración final de aproximadamente el 0,4% (p/v) de hidrolizado de levadura solo en el medio tuvo un efecto inhibidor sobre elcrecimiento celular y la densidad celular. Un medio que comprende un 0,4% (p/v) o concentraciones mayores dehidrolizado de soja no alcanzó una densidad celular mayor que un medio que comprende un 0,3% (p/v). Sinembargo, un medio que comprende una combinación de hidrolizado de soja e hidrolizado de levadura en unaconcentración final total de hidrolizado del 0,4% (p/v) mostró un incremento significativo en la actividad metabólicacelular, el crecimiento celular y la densidad celular final.
Según la invención, la suma de la cantidad del hidrolizado de soja y de levadura en el medio debería estarentre aproximadamente el 0,2% (p/v) y aproximadamente el 0,6% (p/v), con una proporción mayor de hidrolizado desoja en el medio en comparación con el hidrolizado de levadura. Una proporción óptima entre el hidrolizado de soja y de levadura debería ser de aproximadamente 3 : 1 (soja / levadura), respectivamente.
El medio según se describe en este documento es útil, en particular, para cultivar células. En el ámbito de lainvención, el término "células" significa un término genérico y engloba el cultivo de células individuales, tejidos,órganos, células de insecto, células de ave, células de mamífero, células primarias, líneas celulares continuas,células madre y/o células modificadas genéticamente, tales como células recombinantes que expresan unpolipéptido o una proteína heteróloga. Algunas células recombinantes incluyen, por ejemplo, células CHO o célulasBHK que expresan polipéptidos o proteínas heterólogas, tales como un factor de crecimiento o un factor sanguíneo.Las células usadas a menudo para la propagación de virus incluyen células VERO y células CV-1.
Las células de mamífero adecuadas para su cultivo en el medio de cultivo celular según se describe en este documento incluyen aquellas de origen humano, que pueden ser células primarias derivadas de una muestra tisular, cepas celulares diploides, células transformadas o líneas celulares establecidas. Las células de mamífero pueden incluir células humanas y células semejantes no humanas. Las células de mamífero de origen no humano puedenser células renales de mono, células renales de bovino, células renales de perro, células renales de cerdo, célulasrenales de conejo, células renales de ratón, células renales de rata, células renales de oveja, células renales dehámster, células ováricas de hámster chino o una célula animal derivada de cualquier tejido. En particular, lascélulas de mamífero que pueden cultivarse en el medio de cultivo pueden ser células BSC-1, células LLC-MK,células CV-1, células COS, células COS-1, células COS-3, células COS-7, células VERO, células MDBK, células MDGK, células CRFK, células RAF, células RK, células TCMK-1, células LLC-PK, células PK15, células LLC-RK, células MDOK, células BHK-21, células CHO, células 293, células NS-1, células MRC-5, células WI-38, células BHK, células 293 y células RK. Algunos ejemplos de células recombinantes incluyen células CHO que expresan el FactorFVIII, FII, FIX, FX, vWF, por ejemplo, todas las cuales son conocidas por la persona experta en la materia.
Los términos "células continuas" o "línea celular continua" (continuous cell line, CCL), en sus diversasformas gramaticales, significan células cultivadas que se replican indefinidamente y son capaces de crecer en un cultivo en suspensión o en un cultivo a gran escala en un biorreactor. El crecimiento sin restricciones de las CCLpermite un cultivo a largo plazo a partir de un sustrato celular estandarizado y disminuye los costes. Las líneascelulares de mamífero pueden elegirse del grupo de células CHO, células COS, células VERO, células LLK-MK2,células NS-1, células MDBK, células MDCK, células MRC-5, células WI-38, células BHK, células CV-1, células renales de conejo (rabbit kidney, RK) y otras líneas celulares según desvelan Butler y col., BIOS Scientific Publisherpágs. 1-24 (1992). Las CCL se ensayan preferiblemente para comprobar la ausencia de agentes adventicios, talescomo bacterias, hongos, micoplasma, protozoos y virus.
El término "cultivo celular", en sus diversas formas gramaticales, se refiere a células crecidas en suspensión, en frascos rotatorios, matraces y similares. También están incluidas las metodologías a gran escala,tales como los biorreactores, incluyendo las células adherentes que crecen fijadas a microportadores en fermentadores agitados. Además, es posible no sólo cultivar células dependientes de la superficie, sino también usarlas técnicas de cultivo en suspensión con el medio inventivo. Si las células son crecidas sobre microportadores, el microportador puede elegirse del grupo de microportadores basados en dextrano, colágeno, plástico, gelatina y celulosa y otros según se describe en Butler, Spier & Griffiths, Animal cell Biotechnology 3: 283-303 (1988). Sonadecuados los portadores porosos, tales como, por ejemplo Cytoline® o Cytopore®, así como portadores basadosen dextrano, tales como DEAE-dextrano (Cytodex 1®), dextrano recubierto con aminas cuaternarias (Cytodex 2®) oportadores basados en gelatina, tales como dextrano recubierto con gelatina (Cytodex 3®). Estos portadores pueden obtenerse en Pharmacia.
Las células son crecidas preferiblemente desde la ampolla a la biomasa en el medio exento de proteínasanimales, y las condiciones del medio de cultivo se mantienen durante el crecimiento del cultivo celular y el procesode producción del producto. Preferiblemente se usan células que ya han sido adaptadas al medio. Se encontró queno sólo se conseguía un aumento en el rendimiento con dichas células preadaptadas, sino que su estabilidad para elcultivo también está claramente mejorada mediante el uso del medio según la invención.
El término "cultivo", en sus diversas formas gramaticales, se refiere al mantenimiento de las células in vitro en unas condiciones permisivas para el crecimiento y la viabilidad continuos. Las células de mamífero se cultivantípicamente en un incubador celular aproximadamente a 37°C, teniendo el medio de cultivo un pH óptimo en elintervalo de aproximadamente 6,8 a 7,6, preferiblemente entre 7,0 y 7,3. Las células en cultivo discontinuo podrían tener un cambio completo del medio cada 2 o 3 días, o más o menos frecuentemente, si fuera necesario. Las células de un cultivo por perfusión (por ejemplo, en un biorreactor o un fermentador) podrían tener un cambio de medio nuevo sobre una base de recirculación continua. Las metodologías de cultivo pueden incluir, dependiendo del
contexto y de las necesidades, el subcultivo, los pases y la propagación de las células.
La invención proporciona por tanto procedimientos para cultivar un cultivo celular confluyente quecomprenden las etapas de hacer crecer células dependientes de superficie en un medio basal que comprendehidrolizado de levadura e hidrolizado de soja. Las células son crecidas en un medio que comprende hidrolizado desoja en una concentración del 0,05% (p/v) al 1,0% (p/v) e hidrolizado de levadura en una concentración del 0,05% (p/v) al 0,3% (p/v). Según este aspecto de la invención, las células son crecidas desde pequeña escala hasta unabiomasa a gran escala en el medio exento de proteínas animales de la invención. Los pases y el subcultivo de lascélulas para obtener una biomasa de cultivo celular se realizan con una proteasa no derivada de animales, talescomo pronasa o una fracción purificada de la misma. Una proteasa es la fracción purificada de tipo tripsina deStreptomyces griseus (SGT) según se describe en la solicitud de EE.UU. con número de serie 10/006.223. Paraevitar el material derivado de animales durante el cultivo de un cultivo celular, en particular durante el cultivo decélulas adherentes que crecen fijadas a un portador, el portador es preferiblemente un portador sintético o unmicroportador recubierto con un material no derivado de animales. Por ejemplo, un microportador de DEAE-dextrano
o de dextrano recubierto con un amina cuaternaria.
La invención también proporciona un proceso para el cultivo celular exento de proteínas animales, en el que las células dependientes de superficie se cultivan, se subcultivan y se pasan en unas condiciones desprovistas deproteínas animales. El proceso comprende las etapas de proporcionar un medio exento de proteínas animales quecomprende hidrolizado de levadura e hidrolizado de soja, hacer crecer las células en dicho medio, pasar ysubcultivar dichas células crecidas en ese medio usando una proteasa no derivada de animales, hacer creceradicionalmente las células sucultivadas hasta alcanzar una densidad celular confluyente y repetir las etapas desubcultivo y crecimiento de las células hasta que se alcance la biomasa de cultivo celular final. El proceso incluye elcrecimiento de las células en un medio exento de proteínas animales, el subcultivo y el paso de las células usandouna proteasa no derivada de animales, preferiblemente una fracción purificada de tipo tripsina de Streptomyces griseus (SGT). Durante el cultivo de las células adherentes que crecen fijadas a un portador, el portador espreferiblemente un portador sintético o un microportador recubierto con un material no derivado de animales. Mediante la combinación de estas etapas puede evitarse el uso de proteínas animales.
Las células adecuadas para el crecimiento en el medio exento de proteínas animales de la presenteinvención incluyen, pero no se limitan a, células BSC-1, células LLC-MK, células CV-1, células VERO, célulasMDBK, células MDCK, células CRFK, células RAF, células TCMK-1, células LLC-PK, células PK15, células LLC-RK, células MDOK, células RK, células BHK-21, células WI-38, células 293 y/o células MRC-5. Estas células pueden serinfectadas por virus, tales como un ortomixovirus, paramixovirus, reovirus, picornavirus, flavivirus, arenavirus,herpesvirus, poxvirus, coronavirus, adenovirus y otros virus conocidos por la persona experta. Más específicamente,el virus usado para infectar el cultivo celular puede ser virus de la gripe, virus de vaccinia y de la viruela, virus de laviruela aviar, virus de la viruela vacuna, virus de la encefalitis transmitida por garrapatas (tick-bome encephalitis, TBE), poliovirus, virus de la hepatitis A, virus de Ross River, virus de la fiebre amarilla y un virus quimérico derivado del mismo, virus del Nilo occidental, virus de la encefalitis japonesa, virus de la rubéola, virus de la hepatitis C (HCV), virus de la parotiditis, virus del sarampión, virus respiratorio sincitial (respiratory syncytial virus, RSV), virus del herpes simple (herpes simplex virus, HSV), citomegalovirus (CMV), virus de Epstein-Barr (EBV), rotavirus, virus de la glosopeda (foot and mouth disease virus, FMDV). En el conocimiento del experto en la materia está la selección delvirus y de las células en las que se va propagar el virus. Las células pueden cultivarse en el medio de la invención y crecerse hasta alcanzar una densidad celular óptima antes de la infección con el respectivo virus. Sorprendentemente, un cultivo celular crecido y propagado en un medio exento de proteínas animales de la invención muestra un incremento significativo en el rendimiento de la productividad del virus. Algunos ejemplos dediferentes virus propagados en células cultivadas y crecidas en el medio de la invención muestran un incremento de2 a 5 veces en el rendimiento del virus en comparación con un medio que comprende únicamente extracto de levadura. Esto hace que el sistema sea más favorable para los procesos de crecimiento celular y de producción devirus que los descritos en la técnica anterior.
Según una forma de realización de la invención, las células son células VERO y el virus se elige del grupode virus de la gripe, virus de la hepatitis A, virus de Ross River, virus de la fiebre amarilla y un virus quiméricoderivado del mismo, virus del Nilo occidental, virus de la encefalitis japonesa, virus de la rubéola, HCV, virus de laparotiditis, virus del sarampión, virus respiratorio sincitial, HSV, CMV, EBV, rotavirus. También pueden usarse otrosvirus conocidos por crecer en células VERO.
En este documento se describe la producción del virus de vaccinia proporcionando un cultivo de células crecido y cultivado en un medio exento de proteínas animales que comprende hidrolizado de levadura e hidrolizadode soja, infectar dichas células con un virus de vaccinia e incubar el cultivo de células para propagar el virus de vaccinia. Preferiblemente, las células se hacen crecer en un medio que comprende hidrolizado de soja en una concentración de aproximadamente el 0,05% (p/v) hasta aproximadamente el 0,3% (p/v). Según este aspecto de lainvención, las células pueden ser células VERO, células CV-1, células RK, células BHK-21, células MRC-5 ocualquier célula en la que pueda crecer el virus de vaccinia. El virus de vaccinia puede ser un virus de vaccinianatural, una cepa del virus de vacuna antivariólica, cepas virulentas de vaccinia, cepas atenuadas de vaccinia y unvirus de vaccinia recombinante.
En este documento se describe la producción de ortomixovirus proporcionando un cultivo de células cultivado y crecido en un medio exento de proteínas animales elaborado a partir de medio basal que comprendehidrolizado de levadura e hidrolizado de soja, infectar las células con un ortomixovirus e incubar el cultivo de célulaspara propagar el ortomixovirus. Preferiblemente, las células se hacen crecer en un medio que comprende hidrolizado de soja en una concentración de aproximadamente el 0,05% (p/v) hasta aproximadamente el 1,0% (p/v) ehidrolizado de levadura en una concentración de aproximadamente el 0,05% (p/v) hasta aproximadamente el 0,3%(p/v). Las células pueden ser células BSC-1, células CV-1, células VERO, células MDBK, células MOCK, células MDOK, células BHK-21, células Wl-38, células MRC-5 o cualquier célula en la que pueda propagarse el ortomixovirus. El ortomixovirus puede ser un virus de la gripe, tal como de la gripe A, B o C.
En este documento se describe la producción de virus de Ross River proporcionando un cultivo de células crecido y cultivado en un medio exento de proteínas animales elaborado a partir de medio basal que comprendehidrolizado de levadura e hidrolizado de soja, infectar dichas células con un virus de Ross River e incubar el cultivode células para propagar el virus de Ross River. Preferiblemente, las células se hacen crecer en un medio quecomprende hidrolizado de soja en una concentración de aproximadamente el 0,05% (p/v) hasta aproximadamente el1,0% (p/v) e hidrolizado de levadura en una concentración de aproximadamente el 0,05% (p/v) hasta aproximadamente el 0,3% (p/v). Las células pueden ser células BSC-1, células CV-1, células VERO, células MDBK,células MOCK, células CRFK, células BHK-21, células Wl-38, células MRC-5 o cualquier célula en la que pueda propagarse el virus de Ross River.
Adicionalmente, en este documento se describe la producción de flavivirus proporcionando un cultivo decélulas crecido y cultivado en un medio exento de proteínas animales elaborado a partir de medio basal quecomprende hidrolizado de levadura e hidrolizado de soja, infectar las células con un flavivirus e incubar el cultivo decélulas para propagar el flavivirus. Preferiblemente, las células se hacen crecer en un medio que comprendehidrolizado de soja en una concentración de aproximadamente el 0,05% (p/v) hasta aproximadamente el 1,0% (p/v)e hidrolizado de levadura en una concentración de aproximadamente el 0,05% (p/v) hasta aproximadamente el 0,3%(p/v). El flavivirus puede ser virus de la fiebre amarilla o un derivado quimérico recombinante del mismo, virus de la encefalitis japonesa, virus de la encefalitis transmitida por garrapatas, virus del Nilo occidental y virus de la hepatitis
C. Los tipos celulares identificados en este documento pueden usarse para la propagación del flavivirus.
En este documento se describe la producción de picornavirus proporcionando un cultivo de células crecido y cultivado en un medio exento de proteínas animales elaborado a partir de medio basal que comprende hidrolizadode levadura e hidrolizado de soja, infectar las células con un picornavirus e incubar el cultivo de células parapropagar el picornavirus. Preferiblemente, las células se hacen crecer en un medio que comprende hidrolizado desoja en una concentración de aproximadamente el 0,05% (p/v) hasta aproximadamente el 1,0% (p/v) e hidrolizado de levadura en una concentración de aproximadamente el 0,05% (p/v) hasta aproximadamente el 0,3% (p/v). Elpicornavirus puede ser un poliovirus o un virus de la hepatitis A. Los tipos celulares identificados en este documentopueden usarse para la propagación del picornavirus.
En este documento se describen procedimientos para producir composiciones inmunógenas quecomprenden un virus o un antígeno de un virus, que comprenden las etapas de proporcionar un cultivo de célulasanimales, en el que las células se eligen del grupo formado por células renales de mono, células renales de bovino,células renales de perro, células renales de cerdo, células renales de ratón, células renales de rata, células renalesde oveja, células renales de conejo, células renales de hámster y células humanas crecidas en un medio de la invención; infectar las células con un virus elegido del grupo de ortomixovirus, paramixovirus, reovirus, picornvirus,flavivirus, arenavirus, herpesvirus, poxvirus, coronavirus y adenovirus, incubar el cultivo de células para propagar elvirus, recoger el virus producido y preparar una composición inmunógena a partir del virus recogido. El virusproducido y recogido puede purificarse con un procedimiento conocido en la materia, tales como intercambio iónico
o filtración en gel.
Habiendo descrito ahora de forma general esta invención, la misma se comprenderá adicionalmentemediante referencia a los siguientes ejemplos, que se proporcionan en este documento con propósitos ilustrativos y no son en modo alguno limitantes.
Ejemplo 1
Se prepara un medio exento de proteínas animales con un medio basal DMEM / HAM's F12 (1:1)complementado con sales inorgánicas, aminoácidos, vitaminas y otros componentes (. También se añaden bicarbonato sódico (1-3 g/L),L-glutamina (de 0,1 a 1 g/L) y concentraciones variables de hidrolizado de soja (QuestTechnologies, Nueva York) o de hidrolizado de levadura (Deutsche Hefewerke, Alemania) o combinaciones de losmismos.
Ejemplo 2
Propagación de células en medio exento de proteínas animales
Células VERO en medio exento de proteínas animales
Se usaron células VERO (mono verde africano, Cercopthecus aethiops, riñón) como línea celular. Las células se habían obtenido de la American Type Cell Culture Collection, Rockville, Maryland, con un número depases de 124 bajo la designación ATCC CCL 81. Las células se hicieron crecer en diversos medios según sedescribe en este documento.
Las células del banco de trabajo celular se expandieron en matraces en T y frascos rotatorios y sistemasmicroportadores con una tasa de escisión de 1:6 -1:8. Las células se hicieron crecer a 37°C durante 6-8 días. Lascondiciones de cultivo de saturación de oxígeno del 20% +/-10% y pH 7,1 +/-0,35 se mantuvieron constantes. Alfinal de la producción de la biomasa, cuando las células habían alcanzado el crecimiento confluyente, se determinóla densidad celular y la tasa de consumo de oxígeno.
El número de células de la biomasa de cultivo celular al final de la producción de la biomasa se determinóbien mediante tripsinización de las células y un recuento con un citómetro CASY® (método A) según se describe enSchärfe y col. Biotechnologie in LaborPraxis 10: 1096-1103 1988), o bien mediante un tratamiento con ácido cítrico y
violeta de cristal seguido de un recuento con un hemocitómetro (método B) según se describe en Sanford y col., J, Nat'I Cancer Inst. 11: 773-795 (1951).
Las células VERO se cultivaron y crecieron en un medio exento de proteínas animales que comprende hidrolizado de levadura en una concentración del 0,05%, 0,1%, 0,2%, 0,3% o del 0,4%, 0,5% (p/v), o hidrolizado desoja en una concentración del 0,05%, 0,1%, 0,2%, 0,3% o del 0,4%, 0,5% (p/v), o hidrolizado de soja e hidrolizado de levadura en una concentración entre levadura y soja (levadura / soja) del 0,05% / 0,05% (p/v), 0,1% / 0,2% (p/v),0,1% / 0,3% (p/v), 0,2% / 0,2% (p/v), 0,3% / 0,2% (p/v) o 0,2% / 1,0% (p/v). La densidad celular del cultivo celular alfinal de la producción de la biomasa en el medio exento de proteínas animales que comprende concentraciones variables de hidrolizado de soja, hidrolizado de levadura o combinaciones de los mismos se calculó mediante losmétodos A y B.
Los resultados demuestran que el hidrolizado de levadura y de soja sustentaron individualmente el crecimiento celular. A una concentración del 0,1% de hidrolizado de levadura se alcanzó una densidad celular de aproximadamente 11,8 x 105 células/ml, sin embargo, la concentración creciente de hidrolizado de levadura hastamás del 0,3% (p/v) tuvo un efecto negativo sobre el crecimiento celular, y consecuentemente, sobre la densidadcelular. Las concentraciones de hidrolizado de soja solo entre el 0,1% (p/v) y el 0,2% (p/v) mostraron un menor crecimiento celular y densidad celular que con concentraciones de soja del 0,3% (p/v) y del 0,4% (p/v). No obstante,la densidad celular y el consumo de oxígeno de las células cultivadas en medio que comprende un 0,3% (p/v) o un0,4% (p/v) de hidrolizado de soja no difieren significativamente, y concentraciones mayores de aproximadamente el1% p/v de hidrolizado de soja no tuvieron efectos positivos sobre el crecimiento celular. Se determinó que laconcentración óptima del hidrolizado de soja solo estaba entre el 0,2% p/v y el 1,0% p/v. Complementando el mediobasal con una combinación de hidrolizado de soja e hidrolizado de levadura, la densidad final alcanzada aumentósignificativamente en comparación con un medio que comprendía únicamente hidrolizado de soja o de levadura. Ladensidad celular que se alcanzó a una concentración del 0,05% (p/v) de soja y del 0,05% (p/v) de levadura fue deaproximadamente 12,1 x 105 células/ml, y tenía una densidad de cultivo celular mayor en comparación con lascélulas crecidas en medio que comprende únicamente bien un 0,1% (p/v) de hidrolizado de soja (10 x 105 células/ml)
o bien un 0,1% (p/v) de hidrolizado de levadura (11,8 x 105 células/ml). La densidad celular de un cultivo celularcrecido en un medio que comprende levadura con una concentración del 0,2% (p/v) y de soja del 1,0% (p/v) erasimilar a la densidad obtenida en un medio que comprende un 0,05% (p/v) de soja y un 0,05% de levadura (p/v).
El efecto más significativo sobre el crecimiento celular fue en el medio en el que la concentración dehidrolizado de soja en comparación con el hidrolizado de levadura era aproximadamente 2-3 veces mayor. Las células crecidas en medio que comprende hidrolizado de soja a una concentración de aproximadamente el 0,3%(p/v) e hidrolizado de levadura de aproximadamente el 0,1% (p/v) alcanzaron una densidad celular de aproximadamente 21,0 x 105 células/ml y mostraron por tanto una densidad celular aproximadamente 2 veces mayoren comparación con las células crecidas únicamente en hidrolizado de soja de aproximadamente un 0,4% (p/v), y ladensidad celular aproximadamente 2,5 veces mayor en comparación con las células cultivadas en un medio que comprende únicamente el hidrolizado de levadura de aproximadamente un 0,4% (p/v). La actividad metabólica delas células cultivadas en un medio que comprende hidrolizado de levadura y de soja también fue mayor en comparación con células crecidas en un medio que comprende únicamente el hidrolizado de levadura o de soja. Latasa de consumo de oxígeno fue de 1,5 (% por min,) en un medio que comprende un 0,1% (p/v) de hidrolizado delevadura, y de menos de 1,0 (% por min,) en un medio que comprende un 0,4% (p/v) de hidrolizado de levadura o dehidrolizado de soja solos. En un medio que comprende un 0,1% (p/v) de hidrolizado de levadura y un 0,3% (p/v) dehidrolizado de soja, el consumo de oxígeno fue de aproximadamente 2,9 (% por min.), lo que era aproximadamente2 veces mayor que el de las células cultivadas en un medio que comprende únicamente hidrolizado de soja o delevadura.
Adicionalmente, el ciclo celular, que es de 7 días en el medio exento de proteínas animales complementado con hidrolizado de levadura o de soja solos, se reduce a 6 días en el medio con la combinación de hidrolizados (sojay levadura).
Ejemplo 3
Propagación de células recombinantes
Se cultiva un cultivo celular de células recombinantes de mamífero, tales como células rFVIII-CHO en un tanque agitado de 10L con perfusión. Como medio de cultivo y crecimiento se usa un medio según el Ejemplo 1. Lascélulas se inmovilizaron sobre un microportador poroso (Cytopore®, Pharmacia) y se cultivaron durante al menos 6semanas. La tasa de perfusión es de 4 cambios de volumen por día; el pH es de 6,9 a 7,2; la concentración de O2 es de aproximadamente el 20-50% y la temperatura es de 37°C. Se determina la densidad celular.
Ejemplo 4
Comparación de la producción de antígenos víricos en células VERO crecidas en medio complementado con hidrolizado de levadura e hidrolizado de soja
Se descongelaron de nitrógeno líquido células VERO con un número definido de pasos y se pasaron en frascos de roux y giratorios para producir células suficientes para inocular un biorreactor de 1,5 litros. Las células sehacen crecer en un medio basal complementado bien con hidrolizado de levadura o bien con una combinación dehidrolizado de levadura e hidrolizado de soja según se describe en los Ejemplos 1 y 2. Después de alcanzar laconfluencia con una densidad celular final de 1,5 x 106 células / ml, las células se liberaron del microportador con una fracción purificada de pronasa, la tripsina de S. griseus (SGT) según se describe en la solicitud EE.UU. connúmero de serie 10/006.223, y se transfirieron a un biorreactor de 10 litros. Esto a su vez se usó como inóculo para
un biorreactor de 100 litros con una concentración de microportador de 3,0 g/l. Partiendo de una ampolla del bancocelular del trabajo que contenía 107 células, se necesitaron aproximadamente 30 generaciones para alcanzar labiomasa confluyente final de células VERO en el último recipiente de fermentación. Las células se hicieron crecer a 37°C. Las condiciones de cultivo de saturación de oxígeno del 20% +/-10% y pH de 7,1 +/-0,35 se mantuvieronconstantes durante el proceso de propagación del virus.
Las células del banco de trabajo celular de células VERO se expandieron en matraces en T y en frascosrotatorios con una tasa de escisión de 1:6. Se realizó una propagación adicional de las células en un fermentadoragitado de 1,5, 10 y 50 I como biorreactor usando un microportador Cytodex1® como sustrato de fijación. Lascélulas se hicieron crecer a 37°C. Las condiciones de cultivo de saturación de oxígeno del 20% +/-10% y pH de 7,1+/-0,35 se mantuvieron constantes durante el proceso de propagación del virus.
Se infectaron células VERO con dos cepas diferentes de gripe, New Caledonia A/H1N1 y Panama A/H3N2,y se propagaron en los medios respectivos. Al final del proceso de propagación del virus, el sobrenadante clarificadoque contenía el virus se purificó mediante ultracentrifugación. La recolección de los cultivos de células VERO bienúnicamente con hidrolizado de levadura o bien con hidrolizado de levadura y de soja se comparó sobre la base de la productividad volumétrica de antígeno (SRD total, single radial immunodiffusion, inmunodifusión radial individual) y el contenido en antígeno del sobrenadante al final de la serie (antígeno purificado en gradiente de densidad). Se compararon los rendimientos de ambas formulaciones de medio, y se resumen en la Tabla 1.
Comparación del rendimiento de producto en la producción de gripe VERO en diferentes composiciones de medio
- SRD (!g/ml)
- Proteína (!g/ml) SRD/ Proteína Dosis / Litro (porcepa)
- Cepa
- New Caledonia A/H1N1
- 1 g/L de hidrolizado de levadura+ 3 q/l de hidrolizado de soja
- 130 341 0,38 146
- 1 g/L de hidrolizado de levadura
- 51 147 0,35 57
- Cepa
- Panama A/H3N2
- 1 g/L de hidrolizado de levadura + 3 g/l de hidrolizado de soja
- 130 233 0,56 103
- 1 g/L de hidrolizado de levadura
- 44 117 0,38 35
La combinación de hidrolizado de levadura e hidrolizado de soja muestra una notable mejora con respectoal hidrolizado de levadura solo.
Se infectaron células VERO con una cepa de producción de vacuna de viruela (Dryvax, Wyeth Vaccines,obtenida en Acambis, Inc., una cepa de vacuna de linfa bovina adaptada para un crecimiento en una línea celularpermanente) adaptada para crecer en células VERO exentas de proteínas animales mediante pases seriados a una multiplicidad de infección (multiplicity of infection, m.o.i.) de 0,1 -0,3. Después de un tiempo de incubación de 2-4 días a 37ºC, las células se recogieron y se recuperó el virus de las células.
La Tabla 2 muestra los resultados del rendimiento de virus obtenido de las células crecidas en medio basal complementado con hidrolizado de levadura solo o con hidrolizado de levadura y de soja.
TABLA 2:
Determinación del título de virus de vaccinia al final del ciclo de producción en el sistema debiorreactor.
- Complemento del medio
- moi Título final (ufp) Ufp / célula
- 1 g/l de hidrolizado de levadura
- 0,1 -0,3 1,42 x 107 /ml 14
- 1 g/l de hidrolizado de levadura +3 g/l de hidrolizado de soja
- 0,1 -0,3 16,00 x 107 /ml 69
La combinación de hidrolizado de levadura e hidrolizado de soja muestra una notable mejora con respectoal hidrolizado de levadura solo.
El cultivo de células VERO obtenido según se describe en este documento se infectó con el virus de Ross
10 River Virus a una multiplicidad de infección (multiplicity of infection, m.o.i.) de 0,1 -0,3. Después de un tiempo de incubación de 2-4 días a 37ºC las células se recogieron y se recuperó el virus de las células. La Tabla 3 muestra los resultados del rendimiento de virus obtenido de las células crecidas en medio basal complementado con hidrolizadode levadura solo o con hidrolizado de levadura y de soja.
TABLA 3
15 Determinación del título de virus de Ross River al final del ciclo de producción en el sistema de biorreactor.
- Complemento del medio
- Título final (ufp)/ml) Rendimiento relativo (%)
- 1 g/l de hidrolizado de levadura
- 1,5, x 107 100
- 1 g/l de hidrolizado delevadura + 3 g/l de hidrolizadode soja
- 2,5 x 107 167
La combinación de hidrolizado de levadura e hidrolizado de soja muestra una notable mejora con respecto20 al hidrolizado de levadura solo.
Debe entenderse que la descripción, los ejemplos específicos y los datos, aunque indican formas de realización ejemplares, se proporcionan a modo de ilustración y no pretenden limitar la presente invención.
Claims (14)
- REIVINDICACIONES1. Un procedimiento para cultivar un cultivo celular confluyente de células dependientes de superficie quecomprende:proporcionar un medio exento de proteínas animales que comprende hidrolizado de soja a una concentración del0,05% (p/v) al 1% (p/v) e hidrolizado de levadura a una concentración del 0,05% (p/v) al 0,3%(p/v); ypropagar las células en el medio para formar el cultivo celular confluyente, y pasar y subcultivar las células mientrasestán en contacto con una proteasa no derivada de animales.
-
- 2.
- El procedimiento según la reivindicación 1, en el que las células son células animales elegidas del grupo formado por células de insecto, células de ave y células de mamífero.
-
- 3.
- El procedimiento según la reivindicación 1, en el que las células son células recombinantes.
-
- 4.
- El procedimiento según la reivindicación 1, en el que las células se eligen del grupo de células formado porcélulas BSC-1, células LLC-MK, células CV-1, células COS-, células VERO, células MDBK, células MDCK, células CRFK, células RAF, células TCMK-1, células LLC-PK, células PK15, células LLC-RK, células MDOK, células BHK21, células CHO, células NS-1, células MRC-5, células WI-38, células BHK y células RK.
-
- 5.
- El procedimiento de la reivindicación 4, en el que las células son infectadas con un virus.
-
- 6.
- El procedimiento de la reivindicación 5, en el que el virus se elige del grupo de ortomixovirus, paramixovirus,reovirus, picornavirus, flavivirus, arenavirus, herpesvirus, poxvirus, coronavirus y adenovirus.
-
- 7.
- El procedimiento de la reivindicación 5 o la reivindicación 6, en el que dicho virus se elige del grupo del virus de la gripe, virus de vaccinia y de la viruela, virus de la viruela aviar, virus de la viruela vacuna, virus de la encefalitistransmitida por garrapatas (tick-borne encephalitis, TBE), poliovirus, virus de la hepatitis A, virus de Ross River, virus de la fiebre amarilla y un virus quimérico derivado del mismo, virus del Nilo occidental, virus de la encefalitisjaponesa, virus de la rubéola, virus de la hepatitis C (HCV), virus de la parotiditis, virus del sarampión, virusrespiratorio sincitial (respiratory syncytial virus, RSV), virus del herpes simple (herpes simplex virus, HSV),citomegalovirus (CMV), virus de Epstein-Barr (EBV), rotavirus y virus de la glosopeda (foot and mouth disease virus, FMDV).
-
- 8.
- El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 5-7, en el que dichas células son célulasVERO y dicho virus se eligen del grupo del virus de la gripe, virus de la TBE, virus de vaccinia, poliovirus, virus de lahepatitis A, virus de Ross River, virus de la fiebre amarilla y un virus quimérico derivado del mismo, virus del Nilo occidental, virus de la encefalitis japonesa, virus de la rubéola,, HCV, virus de la parotiditis, virus del sarampión, virusrespiratorio sincitial, HSV, CMV, EBV y rotavirus.
-
- 9.
- Un proceso de cultivo de células confluyentes exento de proteínas animales, que comprende:
proporcionar un medio exento de proteínas animales que comprende hidrolizado de soja e hidrolizado de levadura;hacer crecer células dependientes de superficie en el medio, ypasar y subcultivar las células crecidas en el medio mientras están en contacto con una proteasa no derivada deanimales con objeto de obtener un cultivo celular confluyente. -
- 10.
- El uso de un medio exento de proteínas animales en el cultivo de un cultivo celular confluyente de células dependientes de superficie, comprendiendo el medio hidrolizado de soja a una concentración del 0,05% (p/v) al 1%(p/v) e hidrolizado de levadura a una concentración del 0,05% (p/v) al 0,3% (p/v).
-
- 11.
- El procedimiento, proceso o uso según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que lascélulas se hacen crecer sobre un portador.
-
- 12.
- El procedimiento, proceso o uso según la reivindicación 11, en los que el portador es un portador sintético oun microportador recubierto con un material no animal.
-
- 13.
- El procedimiento, proceso o uso según la reivindicación 12, en los que el portador se basa en dextrano,colágeno, plástico, gelatina o celulosa.
-
- 14.
- El procedimiento, proceso o uso según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en los que laproteasa es una fracción de tipo tripsina purificada de Streptomyces griseus (SGT).
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