JP2013172741A - 細胞を培養するための動物性タンパク質非含有培地 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】ダイズ加水分解物および酵母加水分解物に由来する非動物由来ペプチドの組み合わせを含む、動物性タンパク質非含有細胞培養培地に関する。また、動物性タンパク質非含有培養プロセスを提供し、ここで細胞は、動物由来の成分なしで培養され、増殖され、継代される。このプロセスは、細胞(例えば、組換え細胞またはウイルス感染細胞)を培養するため、動物性タンパク質成分を欠く条件下で細胞培養プロセスによって生物学的生成物を生成するために有用である。
【選択図】なし
Description
本発明は、ダイズ加水分解物および酵母加水分解物の組み合わせを含む動物性タンパク質非含有細胞培養培地に関する。本発明はまた、動物性タンパク質非含有培養プロセスに関し、このプロセスにおいて、細胞は、動物性タンパク質なしに培養され、増殖され、そして継代され得る。これらのプロセスは、細胞(例えば、組換え細胞またはウイルス感染細胞)を培養するにあたって、および細胞培養プロセスによって生物学的製品を生成するために有用である。
細胞(特に、真核生物細胞、およびより具体的には哺乳動物細胞)を培養するために、細胞の効率的な増殖および所望されるタンパク質もしくはウイルスの生成に必要な栄養素物質および増殖栄養素物質を利用可能にする特別の培養培地を使用することが、一貫して必要である。細胞培養培地処方物は、ある範囲の添加物(ウシ胎仔血清(FCS)、いくつかの動物由来のタンパク質および/またはウシ起源のタンパク質加水分解物のような規定されていない成分を含む)が補充されている。
びにマイコプラズマ、ウイルスまたはBSEによる汚染の危険性)があり、特に、これらの細胞がヒト投与のための医療的薬剤またはワクチンを生成するために使用される場合は、問題である。
組換え細胞の培養のための精製ダイズ加水分解物を含む培地は、WO01/23527において開示される。
生物学的生成物(例えば、ウイルスまたは組換えタンパク質)の効率的な生成のために、最適な細胞密度が達成されて最大生成物収量を得ることは重要である。
従って、生物学的生成物(例えば、ヒトにおいて医薬またはワクチンとして使用されるもの)の生成のために、細胞の増殖、代謝活性および密度を増大させ、動物性タンパク質なしの最適な細胞培養培地を提供することが現在でも必要である。さらに、動物性タンパク質が培地中に存在しなければ、後に続く処置(例えば、培養培地からの所望の生成物の精製)は、より費用効果的であり、かつ時間効率的であり得る。さらに、所望でない免疫原性動物性タンパク質が、有害な免疫学的反応を誘導し得るが、本発明の実施では、この反応は避けられる。
解物は、限外濾過で精製された酵母加水分解物であり得、ここで酵母加水分解物の少なくとも40%は、500ダルトン以下の分子量を有する。同様に、ダイズ加水分解物は、限外濾過で精製されたダイズ加水分解物であり得、ここでダイズ加水分解物の少なくとも40%は、500ダルトン以下の分子量を有する。
(項目1)
ダイズ加水分解物および酵母加水分解物を含む、動物性タンパク質非含有細胞培養培地。(項目2)
項目1に記載の動物性タンパク質非含有細胞培養培地であって、前記ダイズ加水分解物は、少なくとも0.05%(w/v)の濃度で存在し、酵母加水分解物は、少なくとも0.05%(w/v)の濃度で存在する、動物性タンパク質非含有細胞培養培地。
(項目3)
項目1に記載の動物性タンパク質非含有細胞培養培地であって、前記ダイズ加水分解物は、1.0%(w/v)未満の濃度で存在し、前記酵母加水分解物は、0.3%(w/v)未満の濃度で存在する、動物性タンパク質非含有細胞培養培地。
(項目4)
項目1に記載の動物性タンパク質非含有細胞培養培地であって、前記ダイズ加水分解物は、約0.2%(w/v)〜約0.6%(w/v)の間の濃度で存在し、前記酵母加水分解物は、約0.05%(w/v)〜約0.2%(w/v)の間の濃度で存在する、動物性タンパク質非含有細胞培養培地。
(項目5)
項目1に記載の動物性タンパク質非含有細胞培養培地であって、前記ダイズ加水分解物は、約0.25%(w/v)〜約0.35%(w/v)の間の濃度で存在し、前記酵母加水分解物は、約0.05%(w/v)〜約0.15%(w/v)の間の濃度で存在する、動物性タンパク質非含有細胞培養培地。
(項目6)
項目1に記載の動物性タンパク質非含有細胞培養培地であって、前記ダイズ加水分解物は、約0.3%(w/v)の濃度で存在し、前記酵母加水分解物は、約0.1%(w/v)の濃度で存在する、動物性タンパク質非含有細胞培養培地。
(項目7)
項目1に記載の動物性タンパク質非含有細胞培養培地であって、前記ダイズ加水分解物の3重量部が、前記酵母加水分解物の1重量部に対して存在する、動物性タンパク質非含有細胞培養培地。
(項目8)
項目1に記載の動物性タンパク質非含有細胞培養培地であって、前記酵母加水分解物は、限外濾過精製された酵母加水分解物であり、該酵母加水分解物の少なくとも40%が、500ダルトン以下の分子量を有する、動物性タンパク質非含有細胞培養培地。
(項目9)
項目1に記載の動物性タンパク質非含有細胞培養培地であって、前記ダイズ加水分解物は、限外濾過精製されたダイズ加水分解物であり、該ダイズ加水分解物の少なくとも40%が、500ダルトン以下の分子量を有する、動物性タンパク質非含有細胞培養培地。
(項目10)
動物性タンパク質非含有細胞培養培地を生成する方法であって、いかなる動物性タンパク質も含まない基本培地は、酵母加水分解物およびダイズ加水分解物が補充される、方法。(項目11)
項目10に記載の方法であって、前記ダイズ加水分解物の濃度は、少なくとも0.05%(w/v)であり、前記酵母加水分解物の濃度は、少なくとも0.05%(w/v)である、方法。
(項目12)
項目10に記載の方法であって、前記ダイズ加水分解物の濃度は、1.0%(w/v)未満であり、前記酵母加水分解物の濃度は、0.3%(w/v)未満である、方法。
(項目13)
細胞の細胞培養物を培養する方法であって、該方法は、以下の工程:
約0.05%(w/v)〜約1%(w/v)の濃度のダイズ加水分解物および約0.05%(w/v)〜約0.3%(w/v)の濃度の酵母加水分解物を含む培地を提供する工程;ならびに
該細胞を該培地中で増殖させて、該細胞培養物を形成する工程、
を包含する、方法。
(項目14)
項目13に記載の方法であって、前記細胞は、昆虫細胞、鳥類細胞および哺乳動物細胞からなる群より選択される動物細胞である、方法。
(項目15)
項目13に記載の方法であって、前記細胞は組換え細胞である、方法。
(項目16)
項目13に記載の方法であって、前記細胞は、BSC−1細胞、LLC−MK細胞、CV−1細胞、COS−細胞、VERO細胞、MDBK細胞、MDCK細胞、CRFK細胞、RAF細胞、RK−細胞、TCMK−1細胞、LLC−PK細胞、PK15細胞、LLC−RK細胞、MDOK細胞、BHK−21細胞、CHO細胞、NS−1細胞、MRC−5細胞、WI−38細胞、BHK細胞、およびRK−細胞からなる群より選択される、方法。
(項目17)
動物性タンパク質非含有コンフルエント細胞培養プロセスであって、該プロセスは、以下の工程:
ダイズ加水分解物および酵母加水分解物を含む動物性タンパク質非含有培地を提供する工程;
該培地中で該細胞を増殖させる工程;ならびに
非動物由来プロテアーゼと接触させながら該培地中で増殖させた細胞を継代および継代培養して、コンフルエントな細胞培養物を得る工程、
を包含する、プロセス。
(項目18)
動物性タンパク質非含有培地中で培養された細胞の培養物であって、該培地は、約0.05%(w/v)〜約1%(w/v)の濃度のダイズ加水分解物および約0.05%(w/v)〜約0.3%(w/v)の濃度の酵母加水分解物を含む、培養物。
(項目19)
項目18に記載の細胞の培養物であって、前記細胞は、昆虫細胞、鳥類細胞、および哺乳動物細胞からなる群より選択される動物細胞である、細胞の培養物。
(項目20)
項目18に記載の細胞の培養物であって、前記細胞は組換え細胞である、細胞の培養物。(項目21)
項目18に記載の細胞の培養物であって、前記細胞は、ウイルスが感染している、細胞の培養物。
(項目22)
項目18に記載の細胞の培養物であって、前記細胞は、BSC−1細胞、LLC−MK細胞、CV−1細胞、COS−細胞、VERO細胞、MDBK細胞、MDCK細胞、CRFK細胞、RAF細胞、RK−細胞、TCMK−1細胞、LLC−PK細胞、PK15細胞、LLC−RK細胞、MDOK細胞、BHK−21細胞、CHO細胞、NS−1細胞、MRC−5細胞、WI−38細胞、BHK細胞、およびRK−細胞からなる群より選択される、細胞の培養物。
(項目23)
ウイルスを生成する方法であって、該方法は、以下の工程:
約0.05%(w/v)〜約1%(w/v)の濃度のダイズ加水分解物および約0.05%(w/v)〜約0.3%(w/v)の濃度の酵母加水分解物を含む動物性タンパク質非含有培地中で増殖させた細胞の培養物を提供する工程;
該細胞にウイルスを感染させる工程;ならびに
該感染させた細胞をインキュベートして、該ウイルスを増殖させる工程、
を包含する、方法。
(項目24)
項目21に記載の方法であって、前記細胞は、昆虫細胞、鳥類細胞および哺乳動物細胞からなる群より選択される動物細胞である、方法。
(項目25)
ワクシニアウイルスを生成する方法であって、該方法は、以下の工程:
約0.05%(w/v)〜約1%(w/v)の濃度のダイズ加水分解物および約0.0
5%(w/v)〜約0.3%(w/v)の濃度の酵母加水分解物を含む動物性タンパク質非含有培地中で増殖させた細胞の培養物を提供する工程;
該細胞にワクシニアウイルスを感染させる工程;ならびに
該感染させた細胞をインキュベートして、ワクシニアウイルスを増殖させる工程、
を包含する、方法。
(項目26)
コロナウイルスを生成するための方法であって、該方法は、以下の工程:
約0.05%(w/v)〜約1%(w/v)の濃度のダイズ加水分解物および約0.05%(w/v)〜約0.3%(w/v)の濃度の酵母加水分解物を含む動物性タンパク質非含有培地中で増殖させた細胞の培養物を提供する工程;
該細胞にコロナウイルスを感染させる工程;ならびに
該感染させた細胞をインキュベートして、コロナウイルスを増殖させる工程;
を包含する、方法。
(項目27)
オルソミクソウイルスを生成するための方法であって、該方法は、以下の工程:
約0.05%(w/v)〜約1%(w/v)の濃度のダイズ加水分解物および約0.05%(w/v)〜約0.3%(w/v)の濃度の酵母加水分解物を含む動物性タンパク質非含有培地中で増殖させた細胞の培養物を提供する工程;
該細胞に、オルソミクソウイルスを感染させる工程;ならびに
該感染させた細胞をインキュベートして、オルソミクソウイルスを増殖させる工程、
を包含する、方法。
(項目28)
項目27に記載の方法であって、前記オルソミクソウイルスは、インフルエンザA型ウイルス、インフルエンザB型ウイルスまたはインフルエンザC型ウイルスである、方法。
(項目29)
ロス川ウイルスを生成するための方法であって、該方法は、以下の工程:
約0.05%(w/v)〜約1%(w/v)の濃度のダイズ加水分解物および約0.05%(w/v)〜約0.3%(w/v)の濃度の酵母加水分解物を含む動物性タンパク質非含有培地中で増殖させた細胞の培養物を提供する工程;
該細胞にロス川ウイルスを感染させる工程;ならびに
該感染させた細胞をインキュベートして、ロス川ウイルスを増殖させる工程、
を包含する、方法。
(項目30)
フラビウイルスを生成するための方法であって、該方法は、以下の工程:
約0.05%(w/v)〜約1%(w/v)の濃度のダイズ加水分解物および約0.05%(w/v)〜約0.3%(w/v)の濃度の酵母加水分解物を含む動物性タンパク質非含有培地中で増殖させた細胞の培養物を提供する工程;
該細胞にフラビウイルスを感染させる工程;ならびに
該感染させた細胞をインキュベートして、フラビウイルスを増殖させる工程、
を包含する、方法。
(項目31)
項目30に記載の方法であって、前記フラビウイルスは、黄熱病ウイルス、日本脳炎ウイルス、ダニ媒介脳炎ウイルス、西ナイルウイルスおよびC型肝炎ウイルスからなる群より選択される、方法。
(項目32)
ピコルナウイルスを生成するための方法であって、該方法は、以下の工程:
約0.05%(w/v)〜約1%(w/v)の濃度のダイズ加水分解物および約0.05%(w/v)〜約0.3%(w/v)の濃度の酵母加水分解物を含む動物性タンパク質非含有培地中で増殖させた細胞の培養物を提供する工程;
該細胞にピコルナウイルスを感染させる工程;ならびに
該感染させた細胞をインキュベートして、ピコルナウイルスを増殖させる工程、
を包含する、方法。
(項目33)
項目32に記載の方法であって、前記ピコルナウイルスは、ポリオウイルスおよびA型肝炎ウイルスである、方法。
(項目34)
ウイルスまたはウイルス抗原を含む免疫原性組成物を生成する方法であって、該方法は、以下の工程:
約0.05%(w/v)〜約1%(w/v)の濃度のダイズ加水分解物および約0.05%(w/v)〜約0.3%(w/v)の濃度の酵母加水分解物を含む動物性タンパク質非含有培地中で増殖させた細胞の培養物を提供する工程;
該細胞にウイルスを感染させる工程;
該感染させた細胞をインキュベートして、ウイルスを増殖させる工程;
生成された該ウイルスまたはウイルス抗原を回収する工程;
該回収されたウイルスまたはウイルス抗原から免疫原性組成物を調製する工程、
を包含する、方法。
(項目35)
項目34に記載の方法であって、前記回収されたウイルスまたはウイルス抗原は、精製に供される、方法。
(項目36)
ウイルスまたはウイルス抗原を含む免疫原性組成物を生成する方法であって、該方法は、以下の工程:
哺乳動物細胞の培養物を提供する工程であって、該細胞は、ダイズ加水分解物および酵母加水分解物を含む動物性タンパク質非含有培養培地中で増殖させた、サル腎臓細胞、ウシ腎臓細胞、イヌ腎臓細胞、ブタ腎臓細胞、マウス腎臓細胞、ラット腎臓細胞、ヒツジ腎臓細胞、ハムスター腎臓細胞およびヒト細胞の群から選択される、工程;
該細胞に、オルソミクソウイルス、パラミクソウイルス、レオウイルス、ピコルナウイルス、フラビウイルス、アレナウイルス、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、コロナウイルスおよびアデノウイルスの群から選択されるウイルスを感染させる工程;
該細胞の培養物をインキュベートして、該ウイルスを増殖させる工程;
このように生成された該ウイルスまたはウイルス抗原を回収する工程;ならびに
該回収されたウイルスまたはウイルス抗原から免疫原性組成物を調製する工程、
を包含する、方法。
(項目37)
オルソミクソウイルスを感染させた細胞の培養物であって、該細胞は、動物性タンパク質非含有培地中で培養され、該培地は、ダイズ加水分解物および酵母加水分解物を含む、細胞の培養物。
(項目38)
項目37に記載の培養物であって、前記ダイズ加水分解物は、約0.05%(w/v)〜約1%(w/v)の濃度であり、前記酵母加水分解物は、約0.05%(w/v)〜約0.3%(w/v)の濃度である、培養物。
(項目39)
ポックスウイルスを感染させた細胞の培養物であって、該細胞は、動物性タンパク質非含有培地中で培養され、該培地は、ダイズ加水分解物および酵母加水分解物を含む、培養物。
(項目40)
項目39に記載の培養物であって、前記ダイズ加水分解物は、約0.05%(w/v)〜約1%(w/v)の濃度であり、前記酵母加水分解物は、約0.05%(w/v)〜約0.3%(w/v)の濃度である、培養物。
(項目41)
ヘルペスウイルスを感染させた細胞の培養物であって、該細胞は、動物性タンパク質非含有培地中で培養され、該培地は、ダイズ加水分解物および酵母加水分解物を含む、培養物。
(項目42)
項目41に記載の培養物であって、前記ダイズ加水分解物は、約0.05%(w/v)〜約1%(w/v)の濃度であり、前記酵母加水分解物は、約0.05%(w/v)〜約0.3%(w/v)の濃度である、培養物。
(項目43)
動物性タンパク質を含まないオルソミクソウイルス調製物であって、該調製物は、動物性タンパク質非含有培地中でインフルエンザウイルスに感染させた細胞を培養することによって得られ、該培地は、ダイズ加水分解物および酵母加水分解物を含む、調製物。
(項目44)
動物性タンパク質を含まないヘルペスウイルス調製物であって、該調製物は、動物性タンパク質非含有培地中でインフルエンザウイルスに感染させた細胞を培養することによって得られ、該培地は、ダイズ加水分解物および酵母加水分解物を含む、調製物。
(項目45)
動物性タンパク質を含まないポックスウイルス調製物であって、該調製物は、動物性タンパク質非含有培地中でインフルエンザウイルスに感染させた細胞を培養することによって得られ、該培地は、ダイズ加水分解物および酵母加水分解物を含む、調製物。
分解物および酵母加水分解物を含む動物性タンパク質非含有培地中で増殖させた細胞の培養物を提供する工程;細胞にウイルスを感染させる工程;ならびに感染させた細胞をインキュベートして、ウイルスを増殖させる工程を包含する。この細胞は、動物細胞および/または組換え細胞、特に哺乳動物細胞であり得る。本明細書中に記載される培地の特徴および細胞型は、ここでも適用可能である。培養細胞で生成されるべきウイルスは、培養細胞型に感染することが公知のある範囲のウイルスから選択され得る。例えば、哺乳動物細胞培養物を利用する場合、ウイルスは、オルソミクソウイルス、パラミクソウイルス、レオウイルス、ピコルナウイルス、フラビウイルス、アレナウイルス、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、コロナウイルスおよびアデノウイルスの属から選択され得る。使用されるウイルスは、野生型ウイルス、弱毒化ウイルス、再集合体ウイルス、または組換えウイルスであり得る。さらに、ウイルスを細胞に感染させるために使用される実際のビリオンの代わりに、感染性核酸クローンが、ウイルス学の分野の当業者に公知の感染性クローントランスフェクション方法に従って利用され得る。
およびC型肝炎ウイルスからなる群より選択され得る。この細胞は、哺乳動物細胞および/または組換え細胞であり得る。本明細書中に記載される培地の特徴および細胞型は、ここでも適用可能である。
この細胞に、オルソミクソウイルス、パラミクソウイルス、レオウイルス、ピコルナウイルス、フラビウイルス、アレナウイルス、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、コロナウイルスおよびアデノウイルスの群から選択されるウイルスを感染させる工程;この細胞の培養物をインキュベートして、ウイルスを増殖させる工程;このように生成されたウイルスまたはウイルス抗原を回収する工程;ならびに回収されたウイルスまたはウイルス抗原から免疫原性組成物を調製する工程を包含する。
本発明はさらに、培地からの、動物性タンパク質を含まない、オルソミクソウイルス、パラミクソウイルス、レオウイルス、ピコルナウイルス、フラビウイルス、アレナウイルス、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、コロナウイルスまたはアデノウイルス(これらの組み換え的に生成されたバージョンを含む)の調製物を提供し、この調製物は、動物性タンパク質非含有培地中で、インフルエンザウイルスを感染させた細胞を培養することによって得ることができ、ここで、この培地はダイズ加水分解物および酵母加水分解物を含む。ダイズ加水分解物は、0.05%(w/v)〜1.0%(w/v)の濃度であり得、そして酵母加水分解物は、0.05%(w/v)〜0.3%(w/v)の濃度であり得る。上記で例示される加水分解物の他の濃度もまた、本発明に従って使用され得る。これらのウイルス調製物は、ウイルス抗原およびさらに処理した後にワクチンを作製するための使用に適切である。
それらの種々の文法的形態にある用語「動物性タンパク質非含有培地」とは、高等の多細胞性非植物真核生物(すなわち、脊椎動物)に由来するタンパク質およびタンパク質成分を補充していない培地をいい、これらの培地は、天然に存在するとおりのそのタンパク質に特徴的な二次構造、三次構造および四次構造を有する。避けられる代表的なタンパク質は、血清および血清由来物質(例えば、アルブミン、トランスフェリン、インスリンおよび他の増殖因子)中に見出されるものである。組換え生成版の動物性タンパク質は、免疫原性の細菌成分を含み得、本発明によればやはり避けられ、本発明の動物性タンパク質非含有培地中に存在しない。動物性タンパク質およびタンパク質成分は、非動物性タンパク質、低分子ポリペプチドならびに植物(例えば、ダイズ)および下等真核生物(例えば、酵母)から得られ得るオリゴペプチド(通常、約10〜30アミノ酸長)から区別されなければならない。当然のことながら、一旦培地が細胞と接触し、増殖されるべき細胞に接種されると、その培地は、これらの細胞により流されるかもしくは分泌されるタンパク質(このような細胞が培養される場合に、遺伝的に改変された細胞により発現される任意の組換えタンパク質を含む)を含む。従って、用語、動物性タンパク質非含有培地、ならびに生物学的物質およびそれによって生成される調製物は、培地中で増殖させた細胞により流されるかまたは分泌されるタンパク質がないことを要すると解釈されるべきでないが、むしろ、動物性タンパク質および動物源から得られるタンパク質成分または組換え生成されるタンパク質もしくはタンパク質成分を培地に直接補充することはないということに言及する。
よび文献から公知の他の培地または市販の培地をいう。本発明に従って、あらゆる合成培地は、動物性タンパク質を含まず、ダイズ加水分解物および酵母加水分解物の組み合わせとともに使用され得る。基本培地は、多くの成分(アミノ酸、ビタミン、有機塩および無機塩、炭水化物源を含み、各成文は、インビトロで細胞の培養を指示する量で存在する)を含み得る。例えば、基本培地として、DMEM/HAM’s F12(1:1)培地が使用され得る。この培地は、機械的ストレスに対処するための補助物質(例えば、炭酸水素ナトリウムのような緩衝物質、酸化安定化剤、安定化剤)またはプロテアーゼインヒビターを含み得る。必要であれば、非イオン性界面活性剤(例えば、ポリプロピレングリコール(PLURONIC F−61、PLURONIC F−68、SYNPERONIC F−68、PLURONIC F−71またはPLURONIC F−108)が、消泡剤として培地に添加され得る。これらの薬剤は、一般に、細胞を通気の負の影響から保護するために使用される。なぜなら、界面活性剤を添加しない場合、上昇し、破裂する気泡は、これらの気泡の表面に位置する細胞に損傷を与え得るからである(「スパージング」)。非イオン性界面活性剤の量は、好ましくは、約0.05g/Lと約10g/Lとの間、代表的には、約0.1g/Lと約5g/Lとの間である。さらに、この培地はまた代表的には、約0.001g/Lと約1g/Lとの間のシクロデキストリンまたはその誘導体を含み得る。
、無限に複製し、かつ懸濁培養またはバイオリアクタでの大規模培養において増殖し得る培養細胞を意味する。CCLの非制限的増殖は、標準化細胞基質からの長期間培養および低コストを可能にする。哺乳動物細胞株は、CHO細胞、COS細胞、VERO細胞、LLK−MK2細胞、NS−1細胞、MDBK細胞、MDCK細胞、MRC−5細胞、WI−38細胞、BHK細胞、CV−1細胞、ウサギ腎臓(RK)細胞およびButlerら.BIOS Scientific Publisher p.1−24(1992)(これは、本明細書中に参考として援用される)に開示される他の細胞株の群から選択され得る。CCLは、好ましくは、外来因子(例えば、細菌、真菌、マイコプラズマ、原生動物およびウイルス)の非存在について試験される。
ースのキャリア(例えば、DEAE−デキストラン(Cytodex1(登録商標))、四級アミンコーティングデキストラン(Cytodex 2(登録商標))またはゼラチンベースのキャリア(例えば、(Cytodex3(登録商標))が適切である。これらのキャリアは、Pharmaciaから入手可能である。
細胞、CRFK細胞、RAF細胞、TCMK−1細胞、LLC−PK細胞、PK15細胞、LLC−RK細胞、MDOK細胞、RK−細胞、BHK−21細胞、WI−38細胞、293細胞および/またはMRC−5細胞を含む。これらの細胞は、オルソミクソウイルス、パラミクソウイルス、レオウイルス、ピコルナウイルス、フラビウイルス、アレナウイルス、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、コロナウイルスおよび当業者に公知のその他のウイルスで感染され得る。より詳細には、細胞培養物を感染するために用いられるウイルスは、インフルエンザウイルス、ワクシニアウイルスおよび痘瘡、鶏痘ウイルス、牛痘ウイルス、ダニ媒介脳炎ウイルス(TBE)、ポリオウイルス、A型肝炎ウイルス、ロス川ウイルス、黄熱病ウイルスおよびそれら由来のキメラウイルス、西ナイルウイルス、日本脳炎ウイルス、風疹ウイルス、C型肝炎ウイルス(HCV)、流行性耳下腺炎ウイルス、麻疹ウイルス、RSウイルス(RSV)、単純ヘルペスウイルス(HSV)、サイトメガロウイルス(CMV)、エプスタイン‐バーウイルス(EBV)、ロタウイルス、口蹄疫ウイルス(FMDV)であり得る。ウイルスおよびこのウイルスが増殖され得る細胞を選択することは当業者の知識内である。これら細胞は、本発明の培地中で培養され得、そして個々のウイルスでの感染前に最適細胞密度に到達するように増殖する。驚くべきことに、本発明の動物性タンパク質非含有培地中で増殖および増殖した細胞培養は、ウイルス収量生産性の有意な増加を示す。本発明の培地で培養かつ増殖された細胞で増殖した異なるウイルスの例は、単に酵母抽出物を含む培地と比較して2〜5倍のウイルス収量の増加を示した。これは、このシステムを、先行技術に記載のシステムより、細胞増殖およびウイルス産生プロセスのために好適にする。
インフルエンザウイルスであり得る。
(培養培地の処方)
動物性タンパク質非含有培地は、無機塩類、アミノ酸類、ビタミン類およびその他の成
分が補充される基本DMEM/HAM F12(1:1)培地を用いて調製される。また添加されるのは、重炭酸ナトリウム(1〜3g/L)、L−グルタミン(0.1〜1g/L)および変化する濃度のダイズ加水分解物(Quest Technologies、New York)または酵母加水分解物(Deutsche Hefewerke、Germany)またはその組み合わせである。
(動物性タンパク質非含有培地における細胞の増殖)
(動物性タンパク質非含有培地におけるVERO細胞)
VERO細胞(アフリカミドリザル、Cercopthecus aethiops、腎臓)を細胞株として用いた。この細胞は、American Type Cell Culture Collection、Rockville、Marylandから、命名ATCC CCL 81の下、継代数124で得た。細胞を、本明細書に記載のように種々の培地で増殖した。
v)〜1.0%(w/v)であると決定した。基本培地にダイズ加水分解物と酵母加水分解物との組み合わせを補充することによって、最終的な細胞密度が、ダイズ加水分解物単独または酵母加水分解物単独を含む培地と比較して、顕著に増加した。0.05%(w/v)のダイズ加水分解物および0.05%(w/v)の酵母加水分解物の濃度において達成された細胞密度は、約12.1×105細胞/mlであり、0.1%(w/v)のダイズ加水分解物単独(10×105細胞/ml)または0.1%(w/v)の酵母加水分解物単独(11.8×105細胞/ml)のいずれかを単独で含む培地中で増殖する細胞と比較して、より高い細胞培養細胞密度を有した。0.2%(w/v)の酵母加水分解物および1.0%(w/v)のダイズ加水分解を含む培地中での細胞培養増殖の細胞密度は、0.05%(w/v)のダイズ加水分解物および0.05%(w/v)の酵母加水分解物を含む培地において得られた密度と同様であった。
(組換え細胞の増殖)
組換え哺乳動物細胞の細胞培養物(例えば、rFVIII−CHO細胞)を、10Lの攪拌タンク中で、潅流しながら、培養した。実施例1の培地を、培養増殖培地として使用する。細胞を、多孔性マイクロキャリア(Cytopore(登録商標),Pharmacia)に固定化して、少なくとも6週間培養した。灌流速度は、1日あたり4容量交換であり;pHは6.9〜7.2であり;O2濃度は、約20〜50%であり、温度は37℃である。細胞密度を決定する。
(酵母加水分解物およびダイズ加水分解物を補充した培地中でのベロ細胞増殖におけるウイルス抗原の産生の比較)
(a.細胞培養バイオマスの産生)
規定された継代数を有するベロ細胞を、液体窒素から融解し、そしてルーおよびローラーボトル中で継代し、1.5リットルのバイオリアクターに接種するのに十分な細胞を産生した。実施例1および2に記載のように、細胞を、酵母加水分解物を補充した基本培地、または酵母加水分解物とダイズ加水分解物との組み合わせを補充した基本培地のいずれかにおいて、増殖させた。最終濃度1.5×106細胞/mlのコンフルエントに達した後、細胞を、米国特許出願第10/006,223号に記載されるように、プロナーゼ(
S.griseusトリプシン(SGT))の精製画分を用いて、マイクロキャリアから放出し、そして、10リットルのバイオリアクターに移した。これを次に、3.0g/lのマイクロキャリア濃度を有する100リットルのバイオリアクターのための接種材料として用いた。107細胞を含む作業(working)細胞バンクのアンプルから開始して、最後の発酵容器中での最終的なコンフルエントのベロ細胞バイオマスに達するために、約30世代が必要であった。細胞を37℃で増殖した。酸素飽和20%+/−10%、およびpH7.1+/−0.35の培養条件を、ウイルス増殖プロセスの間、一定に維持した。
ベロ細胞を、2つの異なるインフルエンザ株(New Caledonia A/H1N1およびPanama A/H3N2)に感染させ、そしてそれぞれの培地中で増殖させた。ウイルス増殖プロセスの終期において、ウイルスを含む明澄化した上清を、超遠心にて精製した。酵母加水分解物を単独で含むか、または酵母加水分解物とダイズ加水分解物を含む、採取したベロ細胞培養物を、容量での抗原産生性(総SRD、単純放射免疫拡散法)、および培養の終期での上清の抗原含量(密度勾配精製抗原)を基礎に比較した。両方の培地組成での収量を比較して、表1にまとめた。
ベロ細胞を、0.1〜0.3の感染効率(m.o.i.)での何回かの継代による動物性タンパク質非含有ベロ細胞中での増殖に適合した、天然痘ワクチン産生株(Dryvax,Wyeth Vaccines,Acambis,Inc.より入手。永久細胞株における増殖に適合したウシリンパワクチン株)で感染させた。2〜4日、37℃での細胞のインキュベーションの後、細胞を、採取して、ウイルスを細胞から回収した。
本明細書に記載されるように得たベロ細胞培養物を、ロス川ウイルスに0.1〜0.3の感染効率(m.o.i.)で感染させた。2〜4日、37℃での細胞のインキュベーションの後、細胞を、採取して、ウイルスを細胞から回収した。表3は、酵母加水分解物単独を補充したか、または酵母加水分解物およびダイズ加水分解物を補充した基本培地におおて増殖した細胞において得られたウイルスの収量の結果を示す。
Claims (14)
- 以下の工程を包含する、ウイルスを生成する方法:
0.05%(w/v)〜1%(w/v)の濃度のダイズ加水分解物および0.05%(w/v)〜0.3%(w/v)の濃度の酵母加水分解物を含む動物性タンパク質非含有培地中で細胞の培養物を増殖させる工程;
該細胞にウイルスを感染させる工程;ならびに
該感染させた細胞をインキュベートして、該ウイルスを増殖させる工程。 - 該細胞が、昆虫細胞、鳥類細胞および哺乳動物細胞からなる群より選択される動物細胞である、請求項1に記載の方法。
- 該細胞が、BSC−1細胞、LLC−MK細胞、CV−1細胞、COS−細胞、VERO細胞、MDBK細胞、MDCK細胞、CRFK細胞、RAF細胞、RK−細胞、TCMK−1細胞、LLC−PK細胞、PK15細胞、LLC−RK細胞、MDOK細胞、RK細胞、BHK−21細胞、WI−38細胞、293細胞、およびMRC−5細胞からなる群より選択される、請求項2に記載の方法。
- 該細胞が、インフルエンザウイルス、ワクシニアウイルスおよび痘瘡、鶏痘ウイルス、牛痘ウイルス、ダニ媒介脳炎ウイルス(TBE)、ポリオウイルス、A型肝炎ウイルス、ロス川ウイルス、黄熱病ウイルスおよびそれら由来のキメラウイルス、西ナイルウイルス、日本脳炎ウイルス、風疹ウイルス、C型肝炎ウイルス(HCV)、流行性耳下腺炎ウイルス、麻疹ウイルス、RSウイルス(RSV)、単純ヘルペスウイルス(HSV)、サイトメガロウイルス(CMV)、エプスタイン‐バーウイルス(EBV)、ロタウイルス、および口蹄疫ウイルス(FMDV)からなる群より選択される、請求項1に記載の方法。
- 該細胞がVERO細胞であり、該ウイルスが、インフルエンザウイルス、TBEウイルス、ワクシニアウイルス、ポリオウイルス、A型肝炎ウイルス、ロス川ウイルス、黄熱病ウイルスおよびそれ由来のキメラウイルス、西ナイルウイルス、日本脳炎ウイルス、風疹ウイルス、HCV、流行性耳下腺炎ウイルス、麻疹ウイルス、RSウイルス、HSV、CMV、EBV、およびロタウイルスから選択される、請求項1に記載の方法。
- 該ダイズ加水分解物および該酵母加水分解物が精製されたものである、請求項1に記載の方法。
- 該ダイズ加水分解物および該酵母加水分解物が限外濾過されたものである、請求項6に記載の方法。
- 以下の工程を包含する、ウイルスまたはウイルス抗原を含む免疫原性組成物を生成する方法:
0.05%(w/v)〜1%(w/v)の濃度のダイズ加水分解物および0.05%(w/v)〜0.3%(w/v)の濃度の酵母加水分解物を含む動物性タンパク質非含有培地中で細胞の培養物を増殖させる工程;
該細胞にウイルスを感染させる工程;
該感染させた細胞をインキュベートして、ウイルスを増殖させる工程;
生成された該ウイルスまたはウイルス抗原を回収する工程;および
該回収したウイルスまたはウイルス抗原から免疫原性組成物を調製する工程。 - 該回収したウイルスまたはウイルス抗原を精製に供する、請求項8に記載の方法。
- 以下の工程を包含する、ウイルスまたはウイルス抗原を含む免疫原性組成物を生成する方法:
0.05%(w/v)〜1%(w/v)の濃度のダイズ加水分解物および0.05%(w/v)〜0.3%(w/v)の濃度の酵母加水分解物を含む動物性タンパク質非含有培養培地中で、サル腎臓細胞、ウシ腎臓細胞、イヌ腎臓細胞、ブタ腎臓細胞、マウス腎臓細胞、ラット腎臓細胞、ヒツジ腎臓細胞、ハムスター腎臓細胞およびヒト細胞の群から選択される哺乳動物細胞の培養物を増殖させる工程;
該細胞に、オルソミクソウイルス、パラミクソウイルス、レオウイルス、ピコルナウイルス、フラビウイルス、アレナウイルス、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、コロナウイルスおよびアデノウイルスの群から選択されるウイルスを感染させる工程;
該細胞の培養物をインキュベートして、該ウイルスを増殖させる工程;
このように生成された該ウイルスまたはウイルス抗原を回収する工程;および
該回収されたウイルスまたはウイルス抗原から免疫原性組成物を調製する工程。 - 該ダイズ加水分解物および該酵母加水分解物が精製されたものである、請求項8に記載の方法。
- 該ダイズ加水分解物および該酵母加水分解物が限外濾過されたものである、請求項11に記載の方法。
- 該細胞が、インフルエンザウイルス、ワクシニアウイルスおよび痘瘡、鶏痘ウイルス、牛痘ウイルス、ダニ媒介脳炎ウイルス(TBE)、ポリオウイルス、A型肝炎ウイルス、ロス川ウイルス、黄熱病ウイルスおよびそれら由来のキメラウイルス、西ナイルウイルス、日本脳炎ウイルス、風疹ウイルス、C型肝炎ウイルス(HCV)、流行性耳下腺炎ウイルス、麻疹ウイルス、RSウイルス(RSV)、単純ヘルペスウイルス(HSV)、サイトメガロウイルス(CMV)、エプスタイン‐バーウイルス(EBV)、ロタウイルス、および口蹄疫ウイルス(FMDV)からなる群より選択される、請求項8または9に記載の方法。
- 該細胞がVERO細胞であり、該ウイルスがインフルエンザウイルスである、請求項8、9、または13に記載の方法。
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