AT407255B - Rekombinanter zellklon mit erhöhter stabilität in serum- und proteinfreiem medium und verfahren zur gewinnung des stabilen zellklons - Google Patents

Rekombinanter zellklon mit erhöhter stabilität in serum- und proteinfreiem medium und verfahren zur gewinnung des stabilen zellklons Download PDF

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Description

AT 407 255 B
Die vorliegende Erfindung betrifft einen stabilen rekombinanten Zellklon, der im serum- und proteinfreien Medium für mindestens 40 Generationen stabil ist, eine Biomasse, erhalten durch Vermehrung des stabilen Zellklons unter serum- und proteinfreien Kultivierungsbedingungen und ein Verfahren zur Herstellung von rekombinanten Proteinen mittels der Biomasse. Desweiteren betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Gewinnung von stabilen rekombinanten Zellklonen.
Die Herstellung von rekombinanten Proteinen, insbesondere von biomedizinischen Produkten, wie Blutfaktoren, gewinnt immer mehr an Bedeutung. Um ein optimales Wachstum von rekombinanten Zellen zu ermöglichen, wird dem Medium zumeist Serum zugegeben. Aufgrund der hohen Kosten von Serum und um mögliche Verunreinigungen durch virale oder molekulare Pathogene durch das Serum im Kultivierungsmedium zu vermeiden, wurden eine Reihe von serumfreien Medien entwickelt, die insbesondere keine Zusätze bovinen oder humanen Usprungs enthalten sollten. Die Verwendung solcher Medien beim Herstellungsprozeß erlaubt neben der geringen Kontaminationsgefahr der hergestellten Produkte durch virale und molekulare Pathogene auch eine einfachere Reinigung der exprimierten Proteine.
Rekombinante Zellen werden zumeist in serumhaltigem Medium bis zu einer hohen Zelldichte, etwa für eine "Working cell bank" angezogen, und anschließend während der Produktionsphase auf serumfreies Medium umadaptiert.
Miyaji et al. (1990. Cytotechnology 3:133-140) selektionierten serum-unabhängige Zellklone in serumfreiem Medium, das Insulin und Transferrin enthielt. Es zeigte sich jedoch, daß nach 16 Tagen die Lebendzellzahl und die Expressionsrate ständig abnahm. Durch Koamplifikation mit einem Markergen versuchten Mayaji et al. (1990. Cytotechnology 4:173-180) die Expressionsrate und die Produktivität der rekombinanten Zellen zu verbessern.
Yamauchi et al. (1992. Biosci. Biotechnol. Biochem. 56:600-604) etablierten serum-unabhängige rekombinante CHO-Subklone durch Kultivierung serum-abhängiger Zellen auf Mikrotiterplatten als Monolayer für 3 bis 4 Wochen in serumfreiem Medium, das humanes Serumalbumin, Insulin und Transferrin enthielt. Etwa 0,1% der Zellen waren serum-unabhängig. Ein Teil der Sub-klone wuchs auch in Suspensionkultur in serumfreiem Medium, wobei die Zellen jedoch aggregierten und klumpten. Die Verdopplungszeit der Zellen betrug 1,5 Tage. Es werden jedoch weder Angaben über die Stabilität der erhaltenen serum-unabhängigen Klone noch über die Langzeitkultivierung dieser Klone unter serumfreien Bedingungen gemacht.
Medien, die die Aufrechterhaltung der metabolischen Aktivität und ein Wachstum von Zellen während der serumfreien Phase erlauben, enthalten oftmals zusätzlich Substanzen, z.B. Wachstumsfaktoren, wie Insulin oder Transferrin, oder Adhärenzfaktoren, die die Serumkomponenten ersetzen.
Um die Zugabe von Polypeptidfaktoren, wie Insulin oder Transferrin, zu vermeiden und proteinfreie Kultivierungsbedingungen zu erlauben, wurden verschiedene Techniken entwickelt. So wurden speziell definierte, komplette proteinfreie Medien entwickelt, die ein Zellwachstum auch unter proteinfreien Bedingungen erlauben. WO 97/05240 beschreibt die Herstellung von rekombinanten Proteinen unter proteinfreien Bedingungen, wobei die Zellen neben dem gewünschten Protein einen Wachstumsfaktor co-exprimieren. US 5,393,668 A beschreibt spezielle synthetische Oberflächen, die ein Wachstum von adhärenten Zellen unter proteinfreien Bedingungen erlauben.
Um die Zellproliferation zu stimulieren, wurden CHO-Zellen, die humanes Insulin überexpri-mieren, auf einem artifiziellen Substrat, an das kovalent Insulin gebunden ist, vermehrt (Ito et al. 1996. PNAS USA 93:3598-3601).
Reiter et al. (1992. Cytotechnology 9:247-253) beschreiben die Immobilisierung von in serumhaltigem Medium angezüchteten r-CHO Zellen bei einer hohen Dichte auf Trägern und anschließender Perfusion der immobilisierten Zellen in proteinfreiem Medium während der Produktionsphase, wobei eine kontinuierliche Freisetzung von Protein in den Zellkulturüberstand festgestellt wurde. Die Zellen wurden dabei jedoch für weniger als 10 Generationen in proteinfreiem Medium perfundiert.
Bisherige Verfahren zur erfolgreichen Herstellung einer großtechnischen "large-scale" Zellkultur unter proteinfreien Bedingungen werden für kontinuierliche Zellinien, insbesondere VERO Zellen, beschrieben (WO 96/15231). Die Zellen werden dabei unter serum- und proteinfreien 2
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Bedingungen von der Original-Ampulle bis zum großtechnischen Maßstab von 1200 I angezogen. Es handelt sich dabei jedoch nicht um rekombinante Zellen, sondern Wirtszellen, die für die Produktion von Virusantigen in einem lytischen Prozeß eingesetzt werden.
Im Gegensatz zu adhärenten VERO Zellen sind beispielsweise CHO-Zellen nur bedingt haftungsabhängig. Mittels konventioneller Methoden unter serumhaltigen Bedingungen angezogene CHO-Zellen können sowohl an glatte als auch an poröse Mikroträger binden (US 4,978,616 A, Reiter et al. 1992. Cytotechnology 9:247-253). Werden CHO-Zellen unter serumfreien Bedingungen angezogen, so verlieren sie diese Eigenschaft und haften nicht an glatten Trägem, wie etwa Cytodex 3, oder lösen sich leicht von diesen ab, sofern nicht adhärenzfördernde Zusätze, wie beispielsweise Fibronektin, ins Medium gegeben werden. Aufgrund der geringen Adhärenz von CHO-Zellen an Träger unter serumfreien Bedingungen erfolgt die Produktion von rekombinanten Proteinen daher zumeist in Suspensionskultur. Der Produktionsprozess kann dabei in einem kontinuierlichen oder batchweisen Verfahren ablaufen. Die rekombinante Zellkultur wird dabei bis zu einer optimalen Zelldichte im Bioreaktor angezogen, gegebenenfalls die Proteinexpression induziert und zum Ernten das Medium enthaltend die exprimierten Proteine, jedoch auch rekombinante Zellen, in gewissen Abständen dem Reaktionstank und damit dem Produktionsprozeß entzogen. Durch den ständigen Verlust an Biomasse sinkt die Produktionseffizienz im Bioreaktor ab und erhöht sich erst nach Zugabe von frischem Medium langsam wieder, da die Zellen auf die gewünschte Zelldichte hochwachsen müssen. Es gibt daher trotz des kontinuierlichen Prozesses immer wieder eine Verzögerungsphase, in der die Produktionsrate bei diesem System absinkt. Zudem ist die Wachstums- und Produktionskapazität durch die maximal erreichbare Zelldichte in einem solchen System begrenzt.
Bei der Adaptierung von unter serumhaltigen Bedingungen angezüchteten Zellen auf protein-freies Medium wurde immer wieder festgestellt, daß die Ausbeute an exprimiertem Protein und die Produktivität von rekombinanten CHO-Zellen nach Adaption in proteinfreiem Medium im Vergleich zu serumhaltigen Bedingungen stark absinkt (Paterson et al. 1994. Appl. Microbiol. Biotechnol. 40:691-658). Dies ist auf eine Instabilität oder reduziertes Wachstum der rekombinanten Klone aufgrund der geänderten Kulturbedingungen zurückzuführen. Aufgrund der veränderten Fermentationsbedingungen wird - trotz Einsetzen eines stabilen Ursprungsklons - immer wieder ein Großteil der Zellen zu Zellen mit verringerter Expression oder auch Nicht-Produzenten, die während des Produktionsprozesses Produkt-Produzenten überwuchern, wodurch die Fermenterkultur letztlich zu einem Großteil aus Nicht-Produzenten bzw. solchen Zellen mit geringer Expression besteht.
Dies hat zur Folge, daß die maximale Produktionskapazität der Fermentationskultur kontinuierlich absinkt und eine maximale Produktproduktion auf eine bestimmte Anzahl von Generationen oder Zellpassagen beschränkt ist.
Es besteht daher ein Bedarf an einem System, bei dem eine kontinuierliche Produktion, insbesondere bei der großtechnischen Herstellung von rekombinanten Proteinen unter serum- und proteinfreien Bedingungen über einen möglichst langen Zeitraum möglich ist.
Es wäre weiterhin wünschenswert, einen rekombinanten Zell-Klon zu erhalten, der für viele Generationen in der Produktionsphase unter proteinfreien Bedingungen stabil ist und rekombinantes Protein exprimiert.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, einen stabilen rekombinanten Zellklon zur Verfügung zu stellen.
Ein weiteres Ziel ist es, ein effizientes Verfahren für die Herstellung von rekombinanten Proteinen unter serum- und proteinfreien Kultivierungs- und Produktionsbedingungen zur Verfügung zu stellen.
Die Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch Zurverfügungstellen eines rekombinanten Zellklons. Der erfindungsgemäße rekombinante Zellklon zeichnet sich dadurch aus, daß er in serumfreiem und proteinfreiem Medium für mindestens 40, vorzugsweise mindestens 50, insbesondere mehr als 60 Generationen stabil ist und rekombinantes Produkt exprimiert.
Gemäß einem besonderen Aspekt der Erfindung liegt der stabile rekombinante Zellklon in isolierter Form vor. Ausgehend vom stabilen Zellklon wird unter serum- und proteinfreien Bedingungen eine Zellkultur durch Vermehrung der stabilen Zellen gewonnen.
Der erfindungsgemäße stabile rekombinante Zellklon ist vorzugsweise von einer rekombinanten Säugerzelle abgeleitet. Rekombinante Säugerzellen können dabei alle Zellen sein, die für ein 3
AT 407 255 B rekombinantes Polypeptid oder Protein kodierende Sequenzen enthalten. Umfaßt sind dabei alle kontinuierlich wachsende Zellen, die sowohl adhärent als auch nicht-adhärent wachsen. Besonders bevorzugt sind rekombinante CHO-Zellen oder BHK-Zellen. Rekombinante Polypeptide oder Proteine können Blutfaktoren, Wachstumsfaktoren oder andere biomedizinisch relevante Produkte sein.
Gemäß der vorliegenden Erfindung sind stabile rekombinante Zellklone bevorzugt, welche die kodierende Sequenz für einen rekombinanten Blutfaktor wie Faktor II, Faktor V, Faktor VII, Faktor VIII, Faktor IX, Faktor X, Faktor XI, Protein S, Protein C, eine aktivierte Form eines dieser Faktoren, oder vWF enthalten, und in der Lage sind, diesen Faktor stabil über mehrere Generationen zu exprimieren. Besonders bevorzugt sind dabei rekombinante CHO-Zellen, die vWF, Faktor VIII, vWF und Faktor VIII, Faktor IX oder Faktor II exprimieren.
Der unter serum- und proteinfreien Bedingungen selektionierte erfindungsgemäße Zellklon zeichnet sich insbesondere dadurch aus, daß er für mindestens 40, vorzugsweise für mindestens 50 Generationen, besonders bevorzugt für mehr als 60 Generation in serum- und proteinfreiem Medium stabil ist.
Um eine Masterzellbank anzulegen, werden 30 Generationen benötigt. Um eine durchschnittliche Batchkultur mit 1000 Liter Maßstab durchzuführen, sind mindestens etwa 40 Generationen erforderlich. Damit ist es erstmals möglich, ausgehend von einem Einzelklon eine “Master cell bank" (MCB), eine "Working cell Bank" (WCB) mit etwa 8 bis 10 Generationen und damit eine Zellkultur im Produktionsmaßstab (Produktionsbiomasse) mit bis zu 20 bis 25 Generationen unter diesen Bedingungen herzustellen, da bisherige Zellklone einige Generationen nach Wachstum auf serum- oder proteinfreiem Medium instabil wurden oder reduzierte Viabilität aufwiesen, wodurch a) keine einheitlich Zellkultur mit Produkt-Produzenten und b) keine stabile Produktproduktivität über eine längeren Zeitraum möglich war.
Der erfindungsgemäße Zellklon ist damit unter Produktionsbedingungen in serum- und protein-freiem Medium für mindestens 40 Generationen stabil und produktiv. Bisher beschriebene Verfahren zeigten lediglich eine Generationszahl von weniger als 10 Generationen Produktproduktivität unter proteinfreien Bedingungen (Reiter et al. 1992, supra).
Als Stabilitätskriterium gilt eine Mindestanzahl von mindestens 40 Generationen, vorzugsweise mehr als 50, besonders bevorzugt mehr als 60 Generationen im Produktionsprozeß, während der eine stabile Expression der Proteine stattfindet und die Zellen keine tumorogenen Eigenschaften aufweisen.
Es wurde überraschenderweise gefunden, daß der erfindungsgemäße Zellklon unter serum-und proteinfreien Bedingungen eine erhöhte Produkt-Produktivität selbst im Vergleich zum Ursprungszellklon, der in serumhaltigem Medium kultiviert wurde, aufweist.
Ein derartiger rekombinanter Zellklon ist erhältlich aus einer Zellkultur, die nach Kultivierung eines rekombinanten Ursprungszellklons auf serumhaltigem Medium und Umadaptierung der Zellen auf serum- und proteinfreies Medium erhalten wird. Die Zellen werden dabei für mindestens 40 Generationen in serum- und proteinfreiem Medium unter produktionsäquivalenten Bedingungen weiterkultiviert.
Vorzusgweise erfolgt die Kultivierung der Zellen dabei ohne Selektion auf das Selektionsmarker- und/oder Amplifikationsgen, beispielsweise in Abwesenheit MTX bei CHO-dhfr"-Zellen.
Unter Ursprungszellklon wird im Rahmen dieser Erfindung ein rekombinanter Zellklon-Trans-fektant verstanden, der nach Transfektion von Wirtszellen mit einer rekombinanten Nukleotidsequenz unter Laborbedingungen stabil rekombinantes Produkt exprimiert. Der Ursprungsklon wird zur Optimierung des Wachstums in serumhaltigem Medium angezüchtet. Zur Erhöhung der Produktivität wird der Urprungsklon gegebenenfalls in Gegenwart eines Selektionsmittels durch Selektion auf den Selektionsmarker und/oder Amplifikationsmarker angezogen. Für die großtechnische Produktion wird der Ursprungszellklon unter serumhaltigen Kultivierungsbedingungen bis zu einer hohen Zelldichte angezogen und kurz vor der Produktionsphase auf serum- und/oder proteinfreies Medium umadaptiert. Die Kultivierung erfolgt dabei vorzugsweise ohne Selektionsdruck.
Es wurde gefunden, daß unter diesen Bedingungen ein Großteil von mehr als 95% der Zellen in einer solchen auf serum- und proteinfreiem Medium umadaptierten Zellkultur zu Nicht-Produkt-Produzenten werden. Mittels Immunfluoreszenz mit produkt-spezifischen Antikörpern konnte gezeigt werden, daß abhängig von der Generationszeit der Zellen in serum- und proteinfreiem 4
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Medium die Anzahl der Nicht-Produzenten in einer Kultur ansteigt und die Produkt-Produzenten überwachst, wodurch die Produktionskapazität der Kultur absinkt.
Die nach Umadaptierung auf serum- und proteinfreies Medium erhaltene Zellkultur wird auf diejenigen Zellklone der Zellpopulation getestet, die unter serum- und proteinfreien Bedingungen, gegebenenfalls in Abwesenheit eines Selektionsdruckes, stabil Produkt produzieren. Dies kann beispielsweise durch Immunfluoreszenz mit markierten, spezifischen gegen das rekombinante Polypeptid oder Protein gerichteten Antikörpern erfolgen. Die als Produkt-Produzenten identifizierten Zellen werden aus der Zellkultur isoliert und unter serum- und proteinfreien, vorzugsweise unter produktionsäquivalenten Bedingungen, erneut vermehrt. Die Isolierung der Zellen kann dabei durch Vereinzelung der Zellen und Testen auf Produkt-Produzenten erfolgen. Gegebenenfalls wird die Zellkultur enthaltend die stabilen Zellen erneut auf stabile rekombinante Klone getestet und diese aus der Zellkultur isoliert und auskloniert. Anschließend werden die unter serum- und protein-freien Bedingungen erhaltenen stabilen rekombinanten Zell-Klone unter serum- und proteinfreien Bedingungen weitervermehrt.
Gemäß einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung eine Zellkultur zur Verfügung, die mindestens 90%, vorzugsweise mehr als 95%, besonders bevorzugt mehr als 98% stabile rekombinante Zellen enthält, die unter serum- und proteinfreien Bedingungen für mindestens 40 Generationen, insbesondere für mindestens 50 Generationen, stabil sind und rekombinantes Produkt exprimieren..
Unter Zellkultur wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung eine Master Cell Bank (MCB), eine Working Cell Bank (WCB-Arbeitszellbank) oder eine Produktionsbiomasse in einem großtechnischen Produktionsbioreaktor verstanden.
Erfindungsgemäß wird die Zellkultur insbesondere durch Kultivieren eines stabilen rekombinanten Zellklons der oben beschriebenen Art unter serum- und proteinfreien Bedingungen erhalten.
Die erfindungsgemäße Zellkultur ist dabei erhältlich durch Vermehren des isolierten stabilen Zellklons vom Einzelklon, der Saatzellen bis zur der MCB, der WCB oder einer Biomasse im Produktionsmaßstab im Bioreaktor unter serum- und proteinfreien Bedingungen, vorzugsweise ohne Selektionsdruck auf das Selektions- und/oder Markergen. Es hat sich insbesondere gezeigt, daß die rekombinanten Zellen in einer Zellkultur, die ausgehend vom erfindungsgemäßen stabilen rekombinanten Klon erhalten werden, für mindestens 40 Generationen unter serum- und proteinfreien Bedingungen stabil sind.
Die gemäß der vorliegenden Erfindung zur Verfügung gestellte Zellkultur, die von einem serum- und proteinunabhängigen stabilen Zellklon hergestellt ist, weist unter proteinfreien Kultivie-rungs- und Produktionsbedingungen mindestens 90%, vorzugsweise mindestens zu 95%, besonders bevorzugt mindestens 98% stabile rekombinante Zellen auf. Unter stabilen rekombinanten Zellen werden dabei insbesondere rekombinante Säugerzellen verstanden, die vom stabilen Zellklon abgeleitet sind. Bevorzugt sind dabei rekombinante CHO-Zellen, vorzugsweise CHO-dhfr'-Zellen, CHO-K1-Zellen, und BHK-Zellen, die einen Blutfaktor, vorzugsweise rekombinanten vWF, Faktor VIII, Faktor VIII und vWF, Faktor IX oder Faktor II exprimieren.
Die erfindungsgemäße Zellkultur kann die stabilen rekombinanten Zellen als Suspensionskultur enthalten. Die Zellen können auch an einen Träger, insbesondere einen Mikroträger, immobilisiert sein, wobei insbesondere poröse Mikroträger bevorzugt sind. Als besonders geeignet haben sich dabei poröse Träger, wie etwa hydrophobe Microcarrier auf Basis von Polyethylen (CytolinedD) oder quervemetzte Zellulose, die mit positiv geladenen N,N-Diethylaminoethyl-Gruppen substituiert ist (Cytopore®), gezeigt.
Gemäß einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur großtechnischen Herstellung eines rekombinanten Produktes unter serum- und proteinfreien Bedingungen, unter Einsatz des erfindungsgemäßen stabilen Zellklons zur Verfügung. Das Verfahren umfaßt dabei die Schritte des Bereitstellens eines isolierten, stabilen rekombinanten Zellklons der oben beschriebenen Art zur Herstellung einer Zellkultur. Dabei erfolgt die Vermehrung des isolierten stabilen Zellklons unter serum- und proteinfreien Bedingungen vom stabilen Einzel-Zellklon bis zur Zellkultur. Insbesondere erfolgt auch die Subkultivierung der stabilen Zellklone unter proteinfreien Bedingungen, insbesondere ohne Zugabe einer Protease, wie etwa Trypsin. Dadurch ist gewährleistet, daß zu keinem Zeitpunkt während der Herstellung einer in der Produktion eines rekombi- 5
AT 407 255 B nanten Produktes eingesetzten Zellkultur eine Kontamination, gegebenenfalls verursacht durch die Zugabe von serum- oder proteinhaltigen Zusätzen humanen oder tierischen Ursprungs zur Zellkultur, erfolgt. Damit wird erstmals ein Verfahren beschrieben, das vom Ausgangsklon über die Herstellung einer Working cell Bank bis zur Produktionsbiomasse und die anschließende Produktion von rekombinantem Protein arbeiten unter serum- und proteinfreien Bedingungen erlaubt.
Die Herstellung der rekombinanten Produkte mit der erfindungsgemäßen Zellkultur, die mehr als 90%, vorzugsweise mehr als 95%, besonders bevorzugt mehr als 98% stabile Produktprodu-zenten-Zellen enthält, kann als Suspensionskultur oder mit an Trägern immobilisierten Zellen erfolgen. Der Prozeß kann dabei im batchweisen, kontinuierlichen Verfahren oder durch Perfusionstechnik mit serum- und proteinfreiem Medium erfolgen.
Die exprimierten rekombinanten Proteine werden anschließend aus dem Zellkulturüberstand gewonnen, mit aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren gereinigt und weiterverarbeitet.
Als serum- und proteinfreies Medium kann jedes bekannte synthetische Medium eingesetzt werden. Bevorzugt ist jedoch ein synthetisches Minimalmedium, enthaltend Soja- oder Hefeextrakt und gegebenenfalls ein Cyclodextrin oder ein Derivat davon. Vorzugsweise enthält das serum- und proteinfreie Medium einen Proteaseinhibitor, wie etwa Serinproteaseinhibitoren, die Gewebekulturtauglich und synthetischen oder pflanzlichen Ursprungs sind.
Die Parameter für die Kultivierung der Zellen, wie 02-Konzentration, Perfusionsgeschwindigkeit oder Mediumswechsel, pH, Temperatur und Kultivierungstechnik sind dabei abhängig von den jeweils eingesetzten Zelltypen und können vom Fachmann in einfacher Weise ermittelt werden. Beispielsweise kann die Kultivierung von CHO-Zellen in einem Rührtank und Perfusion mit proteinfreiem Medium mit einer Perfusionsrate von 2 bis 10 Volumenwechsel/Tag, einem pH-Wert zwischen 7,0 und 7,8, vorzugsweise bei 7,4, einer 02-Konzentration zwischen 40% bis 60%, vorzugsweise bei 50% und einer Temperatur zwischen 34°C und 38°C, vorzugsweise von 37°C, erfolgen.
Gemäß einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Gewinnung eines stabilen rekombinanten Zellklons zur Verfügung, umfassend die Schritte der
Vermehrung eines rekombinanten Ursprungsklons bis zur Zellkultur in serumhaltigem Medium, vorzugsweise ohne Selektionsdruck
Kultivierung der Zellen unter serum- und proteinfreien, vorzugsweise unter produktionsäquivalenten Bedingungen
Testen der Zellkultur unter serum- und proteinfreien Bedingungen auf Produktproduzenten Klonieren der stabilen rekombinanten Zellklone unter serum- und proteinfreien Bedingungen, wobei die Klonierung durch allgemein bekannte Techniken, wie Vereinzelung der Zellen durch Ausverdünnen und Anzüchten der Einzelklone erfolgen kann Vermehrung der isolierten Zellklone unter serum- und proteinfreien Bedingungen und gegebenenfalls Austesten der Zellkultur auf Produktproduzenten.
Dabei werden nur solche rekombinanten Zellklone als stabil angesehen, die für mindestens 10, vorzugsweise mindestens 20, und insbesondere mindestens 50 Generationen in proteinfreiem Medium stabil rekombinantes Protein exprimieren. Gemäß einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zur Gewinnung eines stabilen rekombinanten Zellklons zur Verfügung, umfassend die Schritte
Vermehren einer nicht-rekombinanten Ausgangszeile oder Zellinie unter serum- und proteinfreien Bedingungen und Klonieren eines stabilen nicht-rekombinanten Zellklons unter serum- und proteinfreien Bedingungen
Transfizieren des stabilen Zellklons mit einer rekombinanten Nukleinsäure und Isolieren von stabilen rekombinanten Zellklonen
Kultivieren der Transfektanten in serum- und proteinfreien Medium unter gegebenenfalls produktionsäquivalenten Bedingungen
Testen der stabilen rekombinanten Zellen auf Produktions- und Produktstabilität.
Die Erfindung wird anhand der nachfolgenden Beispiele beschrieben, wobei sie jedoch nicht auf die Beispiele beschränkt ist.
Kurze Beschreibung der Figuren
Figur 1: zeigt die mikroskopische Aufnahme einer Arbeitszellbank eines Ursprungsklons zum 6
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Zeitpunkt der Umadaptierung von serumhaltigem auf serum- und proteinfreies Medium (A), nach 10 Generationen in serum- und proteinfreiem Medium (B) und nach 60 Generationen in serum- und proteinfreiem Medium (C).
Figur 2: zeigt die mikroskopische Aufnahme einer Zellkultur, ausgehend von einem stabilen rekombinanten Zellklon unter serum- und proteinfreien Bedingungen auf der Stufe der Arbeitszellbank (A), nach 10 Generationen (B) und nach 60 Generationen (C).
Beispiele:
Beispiel 1: Stabilität von rvWF-CHO-Zellen nach Umstellen von serumhaltigem auf serum- und proteinfreies Medium CHO-dhfr"-Zellen wurden mit Plasmid phAct-rvWF und pSV-dhfr, co-transfiziert und vWF exprimierende Klone, wie in Fischer et al. (1994. FEBS Leiters 351:345-348) beschrieben, sub-kloniert. Von den Subklonen, die stabil rvWF exprimierten, wurde unter serumhaltigen Bedingungen, jedoch in Abwesenheit von MTX, eine Arbeitszellbank (Working cell bank, WCB) angelegt, und die Zellen wurden unter serumhaltigen Bedingungen auf einem porösen Mikroträger (Cytopore®) immobilisiert. Nachdem eine Zelldichte von 2x107 Zellen/ml Trägermatrix erreicht wurde, erfolgte die Umstellung der Zellen auf serum- und proteinfreies Medium. Die Zellen wurden für mehrere Generationen unter serum- und proteinfreien Bedingungen weiterkultiviert. Mittels Immunfluoreszenz mit markierten anti-vWF Antikörpern wurden die Zellen zu verschiedenen Zeitpunkten in serum- und proteinfreiem Medium getestet. Die Bewertung der Stabilität der Zellen erfolgte bei der Arbeitszellbank vor der Mediumsumstellung, nach 10 und 60 Generationen im serum- und proteinfreiem Medium. Während die Arbeitszellbank noch 100% rvWF-Produzenten aufwies (Figur 1 A), sank der Anteil der rvWF-Produzenten nach 10 Generationen in serum- und proteinfreiem Medium auf etwa 50% ab (Figur 1 B). Nach 60 Generationen wurden mehr als 95% der Zellen als Nicht-Produzenten identifiziert (Figur 1 C).
Beispiel 2: Klonierung von stabilen rekombinanten CHO-Klonen
Von der Zellkultur, enthaltend rvWF-CHO-Zellen gemäß Beispiel 1, die für 60 Generationen in serum- und proteinfreiem Medium kultiviert worden war (Figur 1 C), wurde eine Verdünnung angelegt und jeweils 0,1 Zellen/well einer Mikrotiterplatte ausgesät. Die Zellen wurden in DMEM/HAM's F12 ohne Serum- oder Proteinzusätze und ohne Selektionsdruck für etwa 3 Wochen kultiviert und die Zellen mit Immunfluoreszenz mit markierten anti-vWF-Antikörper getestet. Ein als positiv identifizierter Zellklon wurde als Ausgangsklon für die Herstellung einer Saat-Zellbank eingesetzt. Von der Saat-Zellbank wurde eine Master-Zellbank (MCB) in serum- und proteinfreiem Medium angelegt, und Einzelampullen wurden für die weitere Herstellung einer Arbeitszellbank weggefroren. Ausgehend von einer Einzelampulle wurde eine Arbeitszellbank in serum- und proteinfreiem Medium hergestellt. Die Zellen wurden auf poröse Mikroträger immobilisiert und für mehrere Generationen unter serum- und proteinfreien Bedingungen weiterkultiviert. Mittels Immunfluoreszenz mit markierten anti-vWF-Antikörpern wurden die Zellen zu verschiedenen Zeitpunkten in serum- und proteinfreiem Medium auf Produktivität getestet. Die Bewertung der Stabilität der Zellen erfolgte auf der Stufe der Arbeitszellbank und nach 10 und 60 Generationen im serum- und proteinfreiem Medium. Sowohl auf Stufe der Arbeitszellbank (Figur 2 A), als auch nach 10 (Figur 2 B) und 60 Generationen (Figur 2 C) wurden annähernd 100% der Zellen als positive stabile rekombinante Klone identifiziert, die rvWF exprimieren.
Beispiel 3: Zellspezifische Produktivität der rekombinanten Zellklone
Von einer definierten Stufe während der Kultivierung von rekombinanten Zellen wurde eine definierte Zeitzahl entnommen und mit frischen Medium für 24 h inkubiert. Die rvWF:Risto-CoF-Aktivität wurde in den Zellkulturüberständen bestimmt. Tabelle 1 zeigt, daß die zellspezifische Produktivität bei den erfindungsgemäßen stabilen rekombinanten Zellklonen auch nach 60 Generationen in serum- und proteinfreiem Medium stabil war, und sogar im Vergleich zum Urspungsklon, der in serumhaltigem Medium kultiviert war, erhöht war. 7

Claims (25)

  1. AT 407 255 B Tabelle 1 Zellklon zellspezifische Produktivität der Arbeitszeiten mU rvWF/106Zellen/Taq zellspezifische Produktivität nach 10 Generationen mU rvWF/106Zellen/Tag zellspezifische Produktivität nach 60 Generationen mU rvWF/106Zelien/Taq rvWF-CHO #808.68 Ursprungszellklon 55 30 < 10 r-vWF-CHO F7 stabiler Klone 62 65 60 PATENTANSPRÜCHE: 1. Verfahren zur Herstellung eines stabilen rekombinanten Zellklons, gekennzeichnet durch die folgenden Schritte: Bereitstellen eines rekombinanten Ursprungszellklons, Kultivierung des rekombinanten Ursprungszellklons auf serumhaltigem Medium, Umadaptieren der Zellen auf serum- und proteinfreies Medium, Testen der Zellkultur auf stabile Produkt-Produzenten und Klonieren eines stabilen Produkt-Produzenten-Zellklons unter serum- und proteinfreien Bedingungen.
  2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß nach dem Klonieren der erhaltene stabile Zellklon in isolierter Form vorliegt.
  3. 3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß eine rekombinante Säugerzelle als Ursprungsklon bereitgestellt wird.
  4. 4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Säugerzelle eine rekombinante CHO-Zelle oder BHK-Zelle ist.
  5. 5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß der rekombinante Zellklon die für ein rekombinantes Polypeptid oder Protein kodierenden Sequenzen enthält.
  6. 6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß das rekombinante Protein ein Blutfaktor, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Faktor II, Faktor V, Faktor VII, Faktor VIII, Faktor IX, Faktor X, Faktor XI, Protein S, Protein C oder einer aktivierten Form eines der Faktoren, oder vWF ist.
  7. 7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß als Ursprungsklon eine rekombinante CHO-Zelle, die von Willebrand-Faktor exprimiert, bereitgestellt wird.
  8. 8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß als Ursprungsklon eine rekombinante CHO-Zelle, die Faktor VIII exprimiert, bereitgestellt wird.
  9. 9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß als Ursprungsklon eine rekombinante CHO-Zelle, die Faktor VIII und vWF co-exprimiert, bereitgestellt wird.
  10. 10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß als Ursprungsklon eine rekombinante CHO-Zelle, die Faktor IX exprimiert, bereitgestellt wird.
  11. 11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß als Ursprungsklon eine rekombinante CHO-Zelle, die Faktor II exprimiert, bereitgestellt wird.
  12. 12. Rekombinanter Zellklon, dadurch gekennzeichnet, daß er durch ein Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11 erhältlich ist.
  13. 13. Zellkultur, dadurch gekennzeichnet, daß sie durch die folgenden Schritte erhältlich ist: Vermehren eines rekombinanten Ursprungsklons in serumhaltigem Medium, Kultivieren der Zellen unter serum- und proteinfreien Bedingungen bis zur Zellkultur, Testen der Zellkultur unter serum- und proteinfreien Bedingungen auf Produktproduzenten, 8 AT 407 255 B Klonieren von stabilen Zellklonen unter serum- und proteinfreien Bedingungen, Vermehren stabiler Zellklone unter serum- und proteinfreien Bedingungen.
  14. 14. Zellkultur, dadurch gekennzeichnet daß sie durch Kultivieren eines stabilen rekombi-nanten Zellklons nach Anspruch 12 erhältlich ist.
  15. 15. Zellkultur nach Anspruch 13 oder 14, dadurch gekennzeichnet, daß sie unter serum- und proteinfreien Bedingungen zur Expression von rekombinantem Produkt veranlaßt wurde.
  16. 16. Zellkultur nach einem der Ansprüche 13 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß die stabilen rekombinanten Zellklone Säugerzellen sind.
  17. 17. Zellkultur nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß die Säugerzellen rekombinante CHO-Zellen, vorzugsweise CHO-DHFR -Zellen, CHO-K1-Zellen oder BHK-Zellen, sind.
  18. 18. Zellkultur nach einem der Ansprüche 13 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß die stabilen rekombinanten Zellen eine für ein rekombinantes Polypeptid oder Protein kodierende Sequenz enthalten.
  19. 19. Zellkultur nach einem der Ansprüche 13 bis 18, dadurch gekennzeichnet, daß die stabilen rekombinanten Zellen an einem Mikroträger immobilisiert sind.
  20. 20. Verfahren zur großtechnischen Herstellung eines rekombinanten Produktes unter serum-und proteinfreien Bedingungen, dadurch gekennzeichnet, daß es die folgenden Schritte umfaßt: Bereitstellen eines isolierten, stabilen rekombinanten Zellklons nach Anspruch 12, Vermehren des stabilen Zellklons in serum- und proteinfreiem Medium vom Ausgangs-klon bis zur Zellkultur, Herstellen der Zellkultur enthaltend stabile Zellen im Bioreaktor, und Ernten der Proteine aus dem Kulturüberstand.
  21. 21. Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß das serum- und proteinfreie Medium ein synthetisches Minimalmedium enthaltend einen Hefe- oder Sojaextrakt ist.
  22. 22. Verfahren nach Anspruch 20 oder 21, dadurch gekennzeichnet, daß das Medium Cyclo-dextrin oder ein Derivat davon enthält.
  23. 23. Verfahren nach einem der Ansprüche 20 bis 22, dadurch gekennzeichnet, daß das serum-und proteinfreie Medium einen Proteaseinhibitor enthält.
  24. 24. Verfahren zur Gewinnung eines stabilen rekombinanten Zellklons, dadurch gekennzeichnet, daß es die folgenden Schritte umfaßt: Vermehren eines rekombinanten Ursprungsklons bis zur Zellkultur in serumhaltigem Medium, Kultivieren der Zellen unter serum- und proteinfreien produktionsäquivalenten Bedingungen, Testen der Zellkultur unter serum- und proteinfreien Bedingungen auf Produktproduzenten, Klonieren der unter serum- und proteinfreien Bedingungen stabilen rekombinanten Zellklone und Vermehren der stabilen Zellklone unter serum- und proteinfreien Bedingungen.
  25. 25. Verfahren zur Gewinnung eines stabilen rekombinanten Zellklons, dadurch gekennzeichnet, daß es die folgenden Schritte umfaßt: Vermehren einer nicht-rekombinanten Ausgangszeile unter serum- und proteinfreien Bedingungen, Klonieren eines stabilen nicht-rekombinanten Zellklons unter serum- und proteinfreien Bedingungen, Transfizieren des stabilen Zellklons mit einer rekombinanten Nukleinsäure und Isolieren von stabilen Transfektanten, Kultivieren der Transfektanten in serum- und proteinfreiem Medium unter produktionsäquivalenten Bedingungen und Testen der Zellen auf Produktionsstabilität. HIEZU 2 BLATT ZEICHNUNGEN 9
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