CN102573792B - 稳定化的液体和冻干的adamts13制剂 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及具有改善的或期望的性质的ADAMTS13制剂。因此，本发明提供了适合于药物施用的液体和冻干的ADAMTS13制剂。除了其它方面，本发明还提供了治疗受治疗者中与VWF和/或ADAMTS13机能障碍相关的各种疾病和病况的方法。本文还提供的是包含可用于治疗各种疾病和病况的ADAMTS13制剂的药剂盒。

Description

稳定化的液体和冻干的ADAMTS13制剂
交叉参考相关申请
本申请要求2009年9月21日提交的第61/244,353号美国临时申请的利益，为了所有目的将该申请通过引用整体并入本文。
关于对在联邦政府资助的研究或开发下进行的发明的权利的声明
不适用
参考于光盘上提交的“序列表”、表或计算机程序列表附录
不适用
发明背景
ADAMTS(具有血小板反应蛋白I型(thrombospondin type I)模体的去整合素(disintegrin)和金属蛋白酶)蛋白是包含许多保守结构域(包括锌依赖性催化结构域、富含半胱氨酸的结构域、去整合素样结构域(disintegrin-like domain)和至少一个(在大多数情况下多个)血小板反应蛋白I型重复的金属蛋白酶家族(关于综述，参见Nicholson等人，BMC Evol Biol.2005Feb 4；5(1)：11)。在进化上与金属蛋白酶的ADAM和MMP家族相关的此类蛋白(Jones GC，CurrPharm Biotechnol.2006Feb；7(1)：25-31)是与许多疾病和病况，包括血栓性血小板减少性紫癜(TTP)(Moake JL，Semin Hematol.2004Jan；41(1)：4-14)、结缔组织障碍、癌症、炎症(Nicholson等人)和严重恶性疟原虫型疟疾(plasmodiumfalciparum malaria)(Larkin等人，PLoS Pathog.2009Mar；5(3)：e1000349)关联的分泌性酶。由于这些关联性，因此ADAMTS酶已被公认为许多疾病的潜在治疗性靶(Jones GC，Curr Pharm Biotechnol.2006Feb；7(1)：25-31)。
一个ADAMTS家族成员，ADAMTS13，在残基Tyr1605与Met 1606之间切割von Willebrand因子(vWF)。ADAMTS13活性的丧失与许多病况例如TTP(Moake JL，Semin Hematol.2004Jan；41(1)：4-14)、急性和慢性炎症(Chauhan等人，J Exp Med.2008Sep 1；205(9)：2065-74)以及最近若干种恶性疟原虫致疟疾(Larkin等人，PLoS Pathog.2009Mar；5(3)：e1000349)关联。
血栓性血小板减少性紫癜(TTP)是特征在于血栓性微血管病、血小板减少症和可引起不同程度的组织缺血和梗塞的微血管血栓形成。在临床上，TTP患者通过症状例如血小板减少症、裂红细胞(红细胞的碎片)和升高的乳酸脱氢酶水平(Moake J L.Thrombotic microangiopathies.N Engl J Med.2002；347：589-600；Moake J L.von Willebrand factor，ADAMTS-13，and thromboticthrombocytopenic purpura.Semin Hematol.2004；41：4-14；Sadler J E，Moake JL，Miyata T，George J N.Recent advances in thrombotic thrombocytopenicpurpura.Hematology(Am Soc Hematol Educ Program).2004：407-423；Sadler J E.New concepts in von Willebrand disease.Annu Rev Med.2005；56：173-191)来诊断。
在1982年，Moake等人在慢性复发性TTP患者的血浆中发现非常大的von Willebrand因子(UL-vWF)多聚体(Moake J L，Rudy C K，Troll J H，WeinsteinM J，Colannino N M，Azocar J，Seder R H，Hong S L，Deykin D.Unusuallylarge plasma factor VIII：von Willebrand factor multimers in chronic relapsingthrombotic thrombocytopenic purpura.N Engl J Med.1982；307：1432-1435)。UL-vWF与TTP之间的关联性获得Furlan等人以及Tsai和Lian的独立发现支持，所述发现是：大多数罹患TTP的患者缺乏血浆金属蛋白酶(现称为ADAMTS13)，所述酶切割vWF(Furlan M，Robles R，Solenthaler M，WassmerM，Sandoz P，Laemmle B.Deficient activity of von Willebrand factor-cleavingprotease in chronic relapsing thrombotic thrombocytopenic purpura.Blood.1997；89：3097-3103；Tsai H M，Sussman，II，Ginsburg D，Lankhof H，Sixma JJ，Nagel R L.Proteolytic cleavage of recombinant type 2A von Willebrand factormutants R834W and R834Q：inhibition by doxycycline and by monoclonalantibody VP-1.Blood.1997；89：1954-1962；Tsai H M，Lian E C.Antibodies to vonWillebrand factor-cleaving protease in acute thrombotic thrombocytopenic purpura.N Engl J Med.1998；339：1585-1594)。
ADAMTS13蛋白酶是主要由肝产生的190kDa糖基化蛋白(Levy G G，Nichols W C，Lian E C，Foroud T，McClintick J N，McGee B M，Yang AY，Siemieniak D R，Stark K R，Gruppo R，Sarode R，Shurin S B，ChandrasekaranV，Stabler S P，Sabio H，Bouhassira E E，Upshaw J D，Jr.，Ginsburg D，TsaiH M.Mutations in a member of the ADAMTS gene family cause thromboticthrombocytopenic purpura.Nature.2001；413：488-494；Fujikawa K，Suzuki H，McMullen B，Chung D.Purification of human von Willebrand factor-cleavingprotease and its identification as a new member of the metalloproteinase family.Blood.2001；98：1662-1666；Zheng X，Chung D，Takayama T K，Majerus E M，Sadler J E，Fujikawa K.Structure of von Willebrand factor-cleavingprotease(ADAMTS13)，a metalloprotease involved in thromboticthrombocytopenic purpura.J Biol Chem.2001；276：41059-41063；Soejima K，Mimura N，Hirashima M，Maeda H，Hamamoto T，Nakagaki T，Nozaki C.A novelhuman metalloprotease  synthesized in the  liver and  secreted into the blood：possibly，the von Willebrand factor-cleaving protease；J Biochem(Tokyo).2001；130：475-480；Gerritsen H E，Robles R，Lammle B，Furlan M.Partial amino acidsequence of purified von Willebrand factor-cleaving protease.Blood.2001；98：1654-1661)。
已显示ADAMTS13基因中的突变引起TTP(Levy G G，Nichols W C，LianE C，Foroud T，McClintick J N，McGee B M，Yang AY，Siemieniak D R，StarkK R，Gruppo R，Sarode R，Shurin S B，Chandrasekaran V，Stabler S P，SabioH，Bouhassira E E，Upshaw J D，Jr.，Ginsburg D，Tsai H M.Mutations in amember of the ADAMTS gene family cause thrombotic thrombocytopenic purpura.Nature.2001；413：488-494)。通常由抑制ADAMTS-13活性的自身抗体引起的特发性TTP是在成人和年长孩子中发生的更常见的障碍，并且可在11-36％的患者(Tsai H M，Lian E C.Antibodies to von Willebrand factor-cleaving proteasein acute thrombotic thrombocytopenic purpura.N Engl J Med.1998；339：1585-1594；Furlan M，Lammle B.Deficiency of von Willebrandfactor-cleaving protease in familial and acquired thrombotic thrombocytopenicpurpura.Baillieres Clin Haematol.1998；11：509-514)中定期间隔发生。
非中和抗体也可通过诱导从循环的清除来抑制ADAMTS活性(Scheiflinger F，Knobl P，Trattner B，Plaimauer B，Mohr G，Dockal M，DornerF，Rieger M.Nonneutralizing IgM and IgG antibodies to von Willebrandfactor-cleaving protease(ADAMTS-13)in a patient with thromboticthrombocytopenic purpura.Blood.2003；102：3241-3243)。健康成人的血浆ADAMTS13活性在50％至178％的范围内变化(Moake J L.Thromboticthrombocytopenic purpura and the hemolytic uremic syndrome.Arch Pathol LabMed.2002；126：1430-1433)。在大多数家族性TTP或获得性TTP患者中，血浆ADAMTS13活性不存在或低于5％的正常活性。在不治疗的情况下，死亡率超过90％，但血浆疗法使死亡率降低至约20％(Moake J L.Thromboticthrombocytopenic purpura and the hemolytic uremic syndrome.Arch Pathol LabMed.2002；126：1430-1433)。
巨核细胞和内皮细胞中合成的vWF分别贮存在血小板-颗粒和Weibel-Palade小体如超大vWF(UL-vWF)中(Moake J L，Rudy C K，Troll J H，Weinstein M J，Colannino N M，Azocar J，Seder R H，Hong S L，Deykin D.Unusually large plasma factor VIII：von Willebrand factor multimers in chronicrelapsing  thrombotic thrombocytopenic  purpura.N  Engl J Med.1982；307：1432-1435；Wagner D D，Olmsted J B，Marder V J.Immunolocalization ofvon Willebrand protein in Weibel-Palade bodies of human endothelial cells.J CellBiol.1982；95：355-360；Wagner D D，Bonfanti R.von Willebrand factor and theendothelium.Mayo Clin Proc.1991；66：621-627；Sporn L A，Marder V J，WagnerD D.von Willebrand factor released from Weibel-Palade bodies binds more avidlyto extracellular matrix than that secreted constitutively.Blood.1987；69：1531-1534；Tsai H M，Nagel R L，Hatcher V B，Sussman，II.Endothelialcell-derived high molecular weight von Willebrand factor is converted into theplasma multimer pattern by granulocyte proteases.Biochem Biophys Res Commun.1989；158：980-985；Tsai H M，Nagel R L，Hatcher V B，Sussman，II.Multimericcomposition of endothelial cell-derived von Willebrand factor.Blood.1989；73：2074-2076)。一旦从内皮细胞分泌，此类UL-vWF多聚体被循环中的ADAMTS13在vWF分子中的特定切割位点上切割成一系列更小的多聚体(Tsai H M，Nagel R L，Hatcher V B，Sussman，II.Endothelial cell-derived highmolecular weight von Willebrand factor is converted into the plasma multimerpattern by granulocyte proteases.Biochem Biophys Res Commun.1989；158：980-985；Dent JA，Galbusera M，Ruggeri Z M.Heterogeneity of plasma vonWillebrand factor multimers resulting from proteolysis of the constituent subunit.JClin Invest.1991；88：774-782；Furlan M，Robles R，Affolter D，Meyer D，BaillodP，Lammle B.Triplet structure of von Willebrand factor reflects proteolyticdegradation of high molecular weight multimers.Proc Natl Acad Sci USA.1993；90：7503-7507)。
ADAMTS13在成熟vWF亚基的中心A2结构域中的Tyr842-Met843键上切割并且需要锌或钙来获得活性(Dent J A，Berkowitz S D，Ware J，Kasper C K，Ruggeri Z M.Identification of a cleavage site directing the immunochemicaldetection of molecular abnormalities in type IIA von Willebrand factor.Proc NatlAcad Sci USA.1990；87：6306-6310)。vWF存在于″纱线球(ball-of-yarn)″和丝状体(filamentous form)(如通过电子显微镜术看到的)中(Slayter H，Loscalzo J，Bockenstedt P，Handin R I.Native conformation of human von Willebrand protein.Analysis by electron microscopy and quasi-elastic light scattering.J Biol.Chem.1985；260：8559-8563)。此外，原子力显微镜确认了vWF在静止条件下以球形构造存在并且在暴露于剪切应力后以展开的丝状态存在(Siedlecki C A，Lestini B J，Kottke-Marchant K K，Eppell S J，Wilson D L，Marchant R E.Shear-dependent changes in the three-dimensional structure of human vonWillebrand factor.Blood.1996；88：2939-2950)。当vWF纤丝的一个末端被锚定于表面时，这也可在体内发生。
TTP患者的血栓由少量纤维蛋白和主要地vWF和血小板组成，这表明vWF-介导的血小板聚集为血栓形成的原因(Asada Y，Sumiyoshi A，Hayashi T，Suzumiya J，Kaketani K.Immunohistochemistry of vascular lesion in thromboticthrombocytopenic purpura，with special reference to factor VIII related antigen.Thromb Res.1985；38：469-479)。具有复发性TTP的患者在血浆中具有超大多聚体。UL-vWF多聚体随时间过去积累，因为抑制剂(抗-ADAMTS13Ab)的持续存在降低了ADAMTS13的活性。UL-vWF多聚体极度活跃并且因剪切应力而展开，从而引起血小板聚集，这导致血管内血栓形成(Tsai H M.VonWillebrand factor，ADAMTS 13，and thrombotic thrombocytopenic purpura.J MolMed.2002；80：639-647；Tsai H M.Deficiency ofADAMTS-13in thrombotic andthrombocytopenic purpura.J Thromb Haemost.2003；1：2038-2040；discussion2040-2035)。
据认为因ADAMTS13缺乏而导致的反应过度UL-vWF多聚体在血浆中的存在可以与增加的患与冠状动脉心脏病相关的动脉血栓形成的风险相关。
因此，本领域存在对适合用于治疗与ADAMTS13和VWF机能障碍相关的各种疾病和病况的ADAMTS13蛋白的药物制剂的需要。除了其它方面，本发明提供了适合用于药物施用的ADAMTS13制剂以及治疗患有与ADAMTS13和VWF机能障碍相关的疾病或病况的受治疗者的方法。
发明概述
在一个方面，本发明提供了适合用于药物施用的ADAMTS13(A13)制剂。有利地，在某些实施方案中，本发明提供了可被储存延长的时期而不损失活性或变得过度聚集的A13制剂。在某些实施方案中，本发明的制剂可在高达至少约37℃的温度下被储存至少6个月。
在一个方面，本发明提供了稳定化的ADAMTS13(A13)制剂，其包含(a)0.05mg/ml至10.0mg/ml的ADAMTS13；(b)0mM至200mM的药学上可接受的盐；(c)0.5mM至20mM的钙；(d)糖和/或糖醇；(e)非离子型表面活性剂；和(f)用于维持pH在6.0和8.0之间的缓冲剂。
在相关的方面，本发明提供了稳定化的冻干的ADAMTS13(A13)制剂，其中所述制剂由包含以下的液体制剂冻干：(a)0.05mg/ml至10.0mg/ml的ADAMTS13；(b)0mM至200mM的药学上可接受的盐；(c)0.5mM至20mM的钙；(d)糖和/或糖醇；(e)非离子型表面活性剂；和(f)用于维持pH在6.0和8.0之间的缓冲剂。
在本发明的一个方面，提供了适合用于药物施用的重组ADAMTS13(A13)制剂。在某些实施方案中，本文提供的制剂具有高比活性并在储存延长的时期后是稳定的。
在本发明的另一方面，提供了具有A13和rA13的降低的二聚作用或聚集。在某些实施方案中，本文提供的制剂在储存延长的时期时延迟了A13和rA13二聚体的形成和聚集作用。在某些实施方案中，这些制剂适合用于药物施用。
在一个方面，本发明涉及治疗或预防与一种或多种血栓的形成/存在相关的病症的方法以及瓦解在需要其的患者中的一种或多种血栓的方法。与一种或多种血栓的形成/存在相关的病症的实例是遗传性血栓性血小板减少性紫癜(TTP)、获得性TTP、动脉栓塞、急性心肌梗塞(AMI)、中风、败血症和弥漫性血管内凝血(DIC)。在一个实施方案中，所述的治疗或预防的方法包括施用本文提供的A13或rA13制剂。
在另一方面，本发明提供了治疗或预防在需要其的患者中的梗塞的方法。在某些实施方案中，提供了用于治疗或预防与梗塞相关的疾病或病况的方法，所述疾病或病况包括但不限于心肌梗塞(心脏病发作)、肺栓塞、脑血管事件如中风、外周动脉闭塞性疾病(例如坏疽)、抗磷脂综合征、败血症、巨细胞性动脉炎(GCA)、疝气和肠扭转。在一个实施方案中，所述的治疗或预防的方法包括施用本文提供的A13或rA13制剂。
在一个方面，本发明提供了配制具有高稳定性和/或高比活性的A13或rA13的方法。在某些实施方案中，所述方法可用于配制可在高达至少约37℃的温度下储存延长的时期而不损失对于药物施用所期望的高比活性的溶液和冻干片。
在另一方面，本文提供了用于A13或rA13的药物施用的药剂盒。在某些实施方案中，本发明的药剂盒可包括可被储存延长的时期的液体或冻干的制剂。
附图简述
图1.在包含150mM NaCl、2％蔗糖、0.05％聚山梨醇酯80的缓冲液中，在pH 7.0下，采用20mM的选自(1)组氨酸、(2)磷酸盐缓冲液或(3)柠檬酸钠的缓冲剂配制重组ADAMTS13。溶液在4℃或37℃下储存高达6个月。在所示的时间点测定(A)FRETS-VWF73活性和(B)由ELISA测量的ADAMTS13蛋白浓度。
图2.在包含150mM NaCl、2％蔗糖、0.05％聚山梨醇酯80的缓冲液中，在pH 7.0下，采用20mM的选自(1)组氨酸、(2)磷酸盐缓冲液或(3)柠檬酸钠的缓冲剂配制重组ADAMTS13然后冻干。冻干的制剂在4℃或37℃下储存高达6个月。ADAMTS13制剂用无菌水复原并在所示的时间点测定(A)FRETS-VWF73活性和(B)由ELISA测量的ADAMTS13蛋白浓度。
图3.在包含150mM NaCl、2％蔗糖、0.05％聚山梨醇酯80的缓冲液中，在pH 7.0下，采用20mM的选自(1)组氨酸、(2)磷酸盐缓冲液或(3)柠檬酸钠的缓冲剂配制重组ADAMTS13，然后将样品直接加载到Superose 6凝胶过滤柱上或在加载前冻干并用无菌水复原。然后通过凝胶过滤分析ADAMTS13制剂。
图4.在包含150mM NaCl、2％蔗糖、0.05％聚山梨醇酯80和20mM组氨酸的缓冲液中，在pH 7.0下配制重组ADAMTS13。溶液在(A)4℃或(B)37℃下储存高达6个月。然后在所示的时间点通过凝胶过滤分析ADAMTS13制剂。
图5.在包含150mM NaCl、2％蔗糖、0.05％聚山梨醇酯80和20mM组氨酸的缓冲液中，在pH 7.0下配制重组ADAMTS13然后冻干。然后冻干的制剂在(A)4℃或(B)37℃下储存高达6个月。ADAMTS13制剂在所示的时间点在无菌水中复原并通过凝胶过滤分析。
图6.在包含150mM NaCl、2％蔗糖、0.05％聚山梨醇酯80和20mM组氨酸的缓冲液中，在pH 7.0下配制重组ADAMTS13并然后(A)在溶液中储存或(B)在4℃或37℃下冻干储存高达6个月。冻干的制剂在无菌水中复原，并通过动态光散射分析来表征在溶液中和冻干的制剂中储存的样品。
图7.在包含150mM NaCl、2％蔗糖、0.05％聚山梨醇酯80和20mM磷酸钠缓冲液的缓冲液中，在pH 7.0下配制重组ADAMTS13并然后(A)在溶液中储存或(B)在4℃或37℃下冻干储存高达6个月。冻干的制剂在无菌水中复原，并通过动态光散射分析来表征在溶液中和冻干的制剂中储存的样品。
图8.在包含150mM NaCl、2％蔗糖、0.05％聚山梨醇酯80和20mM柠檬酸三钠的缓冲液中，在pH 7.0下配制重组ADAMTS13并然后(A)在溶液中储存或(B)在4℃或37℃下冻干储存高达6个月。冻干的制剂在无菌水中复原，并通过动态光散射分析来表征在溶液中和冻干的制剂中储存的样品。
图9.在包含150mM NaCl、2％蔗糖、0.05％聚山梨醇酯80和20mM组氨酸的缓冲液中，在pH 7.0下配制重组ADAMTS13并然后冻干。冻干的样品在4℃或37℃下储存3个月然后在无菌水中复原。然后通过傅里叶变换红外光谱法表征ADAMTS13样品，并将结果与新配制和冻干的样品进行比较。
图10.在包含150mM NaCl、2％蔗糖、0.05％聚山梨醇酯80的缓冲液中，在pH 7.0下，采用20mM的选自(1)组氨酸、(2)磷酸盐缓冲液或(3)柠檬酸钠的缓冲剂配制重组ADAMTS13。溶液在4℃或37℃下储存高达6个月。冻干的制剂用无菌水复原并通过反相HPLC分析测定所有样品的纯度。
图11.在包含150mM NaCl、2％蔗糖、0.05％聚山梨醇酯80的缓冲液中，在pH 7.0下，采用20mM的选自(1)组氨酸、(2)磷酸盐缓冲液或(3)柠檬酸钠的缓冲剂配制重组ADAMTS13。溶液制剂的样品也被冻干并用无菌水复原。溶液和复原的冻干的制剂通过差示扫描量热分析表征。
图12.在包含150mM NaCl、2％蔗糖、0.05％聚山梨醇酯80的缓冲液中，在pH 7.0下，采用20mM的选自(1)组氨酸、(2)磷酸盐缓冲液或(3)柠檬酸钠的缓冲剂配制重组ADAMTS13。在制剂中的ADAMTS13的z-平均直径通过动态光散射分析来表征。
图13.在包含150mM NaCl、0％-2％蔗糖、0％-3％甘露醇、0mM-2mM钙、0.05％聚山梨醇酯80和20mM组氨酸的缓冲液中，在pH 7.0下配制重组ADAMTS13，并通过凝胶过滤分析。完整的谱在图(A)中示出，二聚体峰的放大的部分在图(B)中示出。
图14.在包含150mMNaCl和20mM组氨酸的缓冲液中，在pH 5.5、6.5、7.5、8.5、和9.5下配制重组ADAMTS13。制剂在4℃或40℃下储存24小时。然后对所示的pH制剂测定FRETS-VWF73活性和由ELISA测量的ADAMTS13蛋白浓度。
图15.在包含150mM NaCl、2％蔗糖、0.05％聚山梨醇酯80和20mM组氨酸的缓冲液中，在pH 7.0下，采用(12B和12D)和不采用(12A和12C)2mMCaCl2配制重组ADAMTS13。将液体制剂在25℃(12A和12B)或37℃(12C和12D)下储存3周。在所示的时间点通过FRETS-VWF73测定酶稳定性。
图16.(A)将重组ADAMTS13加载到用包含20mM Na2HPO4(pH 7.5)和500mM NaCl的缓冲液平衡的Superose 6GL凝胶过滤柱上，并且分子种类通过尺寸和形状分离。产生对应于聚集的A13(池1)、二聚的A13(池2)和单体的A13(池3)的三个洗脱池(elution pool)。然后测定每个池的FRETS-VWF73活性。(B)通过动态光散射分析进一步评价混合的部分的低聚状态和多分散性。
图17.在包含2％蔗糖、0.05％聚山梨醇酯80、20mM组氨酸的缓冲液中，在pH 7.0下且NaCl为(A)0mM、(B)30mM、(C)60mM、(D)90mM、(E)120mM、或(F)150mM的条件下配制重组ADAMTS13。接着将配制的ADAMTS13组合物冻干并目视检查所得冻干饼(lyocake)的外观。
图18.将从包含0至150mM NaCl的制剂制成的重组ADAMTS13冻干饼在水中复原。通过凝胶过滤分析测定复原的ADAMTS13蛋白的聚集状态。
图19.在包含0.05％聚山梨醇酯80、20mM组氨酸的缓冲液中，在pH 7.0下，蔗糖浓度为从5mM至20mM且NaCl浓度为从0至150mM的条件下配制重组ADAMTS13。通过FRETS-VWF73检验测定每个制剂中ADAMTS13蛋白的活性。
图20.将高盐和低盐缓冲液冻干。高盐缓冲液(A)包含20mM组氨酸(pH7.0)、150mM NaCl、2％蔗糖、0.05％聚山梨醇酯80和2mM CaCl2，而低盐缓冲液(B)包含20mM组氨酸(pH 7.0)、30mM NaCl、1％蔗糖、3％甘露醇、0.05％聚山梨醇酯80和2mM CaCl2。然后在标准条件下冻干这两种制剂并接着目视检查所得的冻干饼。
图21.通过使用Superose 6GL柱的尺寸排阻色谱法分析在凝胶过滤(A)之前和(B)之后通过阳离子交换色谱法分离的重组ADAMTS13的多聚体状态。
图22.通过动态光散射分析在凝胶过滤(A)之前和(B)之后通过阳离子交换色谱法分离的重组ADAMTS13的多聚体状态。
图23.对于rADAMTS13制剂的冻干的(A)标准的方案和(B)延长的方案。
图24.通过(A)使用标准的冻干方案冻干rA13制剂1至4，(B)使用延长的冻干方案冻干rA13制剂1至4，(C)使用标准的冻干方案冻干rA13制剂5至8和(D)使用延长的冻干方案冻干rA13制剂5至8而产生的rADAMTS13冻干饼的比较。用于生成此数据的制剂和冻干方案可在实施例12中找到。
图24.将在标准的(A LYO)或延长的(B LYO)冻干方案下由包含(A)30mM NaCl或(B)60mM NaCl的制剂产生的重组ADAMTS13冻干饼在水中复原。通过动态光散射分析测定复原的ADAMTS13蛋白的聚集状态。
图25.在采用标准的或延长的方案冻干之后通过动态光散射分析评价由(A)30mM NaCl或(B)60mM NaCl配制的ADAMTS13组合物的低聚状态和多分散性。
图26.人von Willebrand因子(vWF)-切割蛋白酶ADAMTS13的结构域结构(domain structure)。前体ADAMTS13多肽由信号肽(S)、前肽(P)、然后是包含催化金属蛋白酶结构域、去整合素样结构域、血小板反应蛋白1型(TSP1)模体、富含半胱氨酸的和间隔区结构域、7个另外的TSP1重复单元和2个CUB结构域的成熟多肽的结构特征组成。由闭合的圈标记十个可能的N-糖基化位点。
图27.采用不同缓冲剂配制的ADAMTS13组合物的流体力学直径，如通过动态光散射分析(DLS)测定的。
图28.剪切力对重组人ADAMTS13的影响，如通过动态光散射分析(DLS)测定的。
图29.重组人ADAMTS13的冻融稳定性，如通过FRETS活性测定的。
图30.重组人ADAMTS13的冻融稳定性，如通过动态光散射分析(DLS)测定的。
图31.冻干的重组人ADAMTS13的光稳定性，如通过SE-HPLC测定的。
图32.液体和冻干的重组人ADAMTS13的光稳定性，如通过动态光散射分析(DLS)测定的。
图33.液体和冻干的重组人ADAMTS13的光稳定性，如通过FRETS活性测定的。
图34.钙和锌对重组人ADAMTS13的FRETS活性的影响。
图35.盐和糖含量对冻干的重组人ADAMTS13制剂的低聚状态的影响，如通过SE-HPLC测定的。每种制剂的糖含量应当以g/L报告，而不是摩尔浓度(例如，20mM＝20g/L)。
图36.通过对根据表15配制的重组人ADAMTS13的冻干产生的冻干饼。
图37.重组人ADAMTS13的低聚状态的动态光散射(DLS)分析，所述重组人ADAMTS13采用标准的3天冻干程序冻干、在(上图)4℃下；(中图)30℃下；和(下图)40℃下储存6个月。
图38.重组人ADAMTS13的低聚状态的动态光散射(DLS)分析，所述重组人ADAMTS13采用延长的10天冻干程序冻干、在(上图)4℃下；(中图)30℃下；和(下图)40℃下储存6个月。
图39.重组人ADAMTS13的低聚状态的动态光散射(DLS)分析，所述重组人ADAMTS13是在4℃、30℃和40℃下储存之后以不同蛋白浓度配制的。
发明详述
I.引言
ADAMTS13是一种血浆金属蛋白酶，其切割von Willebrand因子(VWF)多聚体并向下调节它们在血小板聚集中的活性。血栓性血小板减少性紫癜(TTP)是与异乎寻常的大的、止血过度的von Willebrand因子(VWF)相关的严重疾病以及ADAMTS-13的严重缺乏。已开发了一种重组ADAMTS13产品候选者作为治疗ADAMTS13缺乏导致的TTP的重组蛋白替代疗法(Plaimauer和Scheiflinger，Semin Hematol.2004Jan；41(1)：24-33；Plaimauer B等人，F.Blood.2002Nov 15；100(10)：3626-32.Epub 2002Jul 12；和Bruno K等人，J ThrombHaemost.2005May；3(5)：1064-73，为了所有目的将该公开内容全部通过引用以其整体特别并入本文。)
本发明部分基于对纯化的ADAMTS蛋白的液体和冻干的制剂具有满足由人用药物注册技术要求国际协调会(International Conference onHarmonisation of Technical Requirements of Pharmaceuticals for HumanUse)(ICH Guideline，PHARMACEUTICAL DEVELOPMENT Q8(R2)，2005)提出的要求的增加的稳定性的发现。
VWF的止血活性高度依赖于多聚体的尺寸。血浆金属蛋白酶ADAMTS13是被鉴定为生理学调节VWF的多聚体尺寸的主要蛋白酶。ADAMTS13在VWF的A2结构域中在Tyr1605与Met 1606之间切割，得到176kDa和140kDa的典型的切割片段以及在循环中发现的较小的VWF多聚体。人ADAMTS13基因包含29个外显子并并在染色体9q34上跨越约37kb。4.7kb转录主要在肝的星状细胞中合成，但也在血管内皮细胞和血小板中合成并编码1427个氨基酸残基的初级翻译产物。前体ADAMTS13多肽由信号肽和前肽组成，所述前肽的C末端为用于切割的可能的弗林蛋白酶位点、然后是成熟的VWF-切割蛋白酶的序列。成熟的ADAMTS13多肽(1353个氨基酸残基)包括特征为所有ADAMTS家组成员的结构特征：reprolysin样金属蛋白酶结构域、去整合素样结构域、中心血小板反应蛋白1型(TSP1)重复单元、具有对整合素相互作用可能重要的RGD模体的富含半胱氨酸的结构域、间隔区结构域、其后是7个连续的TSP1重复单元(TSP1/#2-8)与2个CUB结构域的独特的组合(图26)。
成熟的ADAMTS13具有约145kDa的计算的分子质量，而纯化的血浆衍生的ADAMTS13可能是由于翻译后修饰而具有约180kDa的表观分子质量，这与目前对在TSP1重复单元中的10个可能的N-糖基化位点和若干O-糖基化位点及一个C-甘露糖基化位点的共有序列一致。ADAMTS13的VWF-蛋白水解活性高度依赖于二价阳离子。在金属蛋白酶结构域中的活性位点模体包含具有3个组氨酸残基的高度保守的HEXXHXXGXXHD模体，该组氨酸残基配位催化的Zn2+离子和预测的钙结合位点，该钙结合位点被提出由Glu 83、Asp 173、Cys 281和Asp 284配位。ADAMTS13结构域的功能作用主要使用体外测定系统来研究，表明了从金属蛋白酶至间隔区结构域的N端区域对VWF切割是关键性的。C端TSP1重复单元和CUB结构域看起来对于VWF底物识别和结合至可能的表面受体如内皮细胞上的CD36是重要的。
蛋白制剂发展的一个主要结果是鉴别了各个蛋白的灭活通道和聚集或降解通道。在40℃下在液体制剂中，通过FRETS活性测定观察到重组人ADAMTS13蛋白在1周内的完全时间依赖的灭活。如本文公开的，发现这种灭活可以在2mM Ca2+存在下被减轻。在25℃下，FRETS活性在Ca2+存在下不再降低。在4℃下，ADAMTS13的液体制剂活性在Ca2+不存在下稳定24周。
此外，发现在相同冻干的制剂中，当制剂在Ca2+不存在下在40℃下储存时仅出现轻微的灭活或未出现灭活。在40℃下添加2mM或4mM Ca2+不影响稳定性。
因此，本发明人已发现在液体制剂(例如，在40℃下储存)中的ADAMTS13蛋白的时间依赖的聚集对于酶活性的降解和/或损失是主要的原因。重要地，如由本发明所提供的，这种聚集可通过冻干和/或通过将Ca2+添加至液体制剂中而显著减少。此外，已发现在冻干的制剂中添加非离子型表面活性剂(例如，0.05％Tween 80)减少ADAMTS13聚集体的形成。而且，发现一种或多种糖和/或糖醇的存在在冻干期间显著稳定化ADAMTS13并有助于形成改善的冻干饼。
II.定义
如本文中所使用的，“ADAMTS13”或“A13”是指在残基Tyr 1605与Met1606之间切割von Willebrand因子(vWF)的ADAMTS的金属蛋白酶(具有血小板反应蛋白I型模体的去整合素和金属蛋白酶)家族。在本发明的上下文中，ADAMTS13蛋白包括任何ADAMTS13蛋白，例如来自诸如灵长类的动物、人(NP_620594)、猴、兔、猪、牛(XP_610784)、啮齿动物、小鼠(NP_001001322)、大鼠(XP_342396)、仓鼠、沙鼠、犬科动物、猫科动物、青蛙(NP_001083331)、鸡(XP_415435)的哺乳动物的ADAMTS13及其生物活性衍生物。还包括具有活性的突变型和变异型ADAMTS13蛋白，如ADAMTS13蛋白的功能片段和融合蛋白。此外，本发明的ADAMTS13蛋白还可包括促进纯化、检测或两者的标签。本文描述的ADAMTS13蛋白还可用治疗性部分或适合体外或体内成像的部分进行修饰。
人ADAMTS13蛋白包括但不限于包含GenBank登记号NP_620594的氨基酸序列的多肽或其处理的多肽，例如其中信号肽(氨基酸1至29)和/或前肽(氨基酸30-74)已被除去的多肽。人ADAMTS13的许多天然变异体在本领域中是已知的，并且被本发明的制剂所涵盖，其中的一些包括选自以下的突变体：R7W、V88M、H96D、R102C、R193W、T196I、H234Q、A250V、R268P、W390C、R398H、Q448E、Q456H、P457L、P475S、C508Y、R528G、P618A、R625H、I673F、R692C、A732V、E740K、A900V、S903L、C908Y、C951G、G982R、C1024G、A1033T、R1095W、R1095W、R1123C、C1213Y、T1226I、G1239V、和R1336W。此外，ADAMTS13蛋白包括已突变的、例如在非必需氨基酸处具有一种或多种保守突变的天然蛋白和重组蛋白。优选地，对于ADAMTS13的酶活性所必需的氨基酸将不发生突变。这些包括，例如，已知或推测对金属结合是必需的残基，例如残基83、173、224、228、234、281和284，以及在酶的活性位点中发现的残基，如残基225。类似地，在本发明的上下文中，ADAMTS13蛋白包括交替同种型，例如缺少全长人蛋白的氨基酸275至305和/或1135至1190的同种型。
如本文中所使用的，术语“生物活性的衍生物”是指具有基本上与ADAMTS13相同的生物功能的任何多肽。生物活性衍生物的多肽序列可包括一种或多种氨基酸的缺失、添加和/或替换，所述一种或多种氨基酸的不存在、存在和/或替换分别对多肽的生物活性没有任何明显的负面影响。所述多肽的生物活性可通过例如以下来测量：至内皮的血小板粘附的减少或延迟，血小板聚集的减少或延迟，血小板系状物(platelet string)的形成的减少或延迟，血栓形成的减少或延迟，血栓生长的减少或延迟，血管闭塞的减少或延迟，vWF的溶蛋白性裂解，血栓症的瓦解或肽底物的裂解，例如FRETS-VWF73肽(Kokame等人，Br J Haematol.2005Apr；129(1)：93-100)或其变体。
同样地，ADAMTS13蛋白可被进一步修饰，例如通过翻译后修饰(例如，在选自人残基142、146、552、579、614、667、707、828、1235、1354或任何其它天然或设计修饰的位点的一种或多种氨基酸处的糖基化)或通过离体化学修饰或酶促修饰，包括但不限于糖基化、通过水溶性聚合物的修饰(例如，PEG化、唾液酸化作用、HES化等)、标记及类似修饰。
如本文中所使用的，“一个ADAMTS13活性单位”被定义为1ml混合的正常人血浆的活性的量，无论所使用的测定是什么。例如，一个ADAMTS13FRETS-VWF73活性单位是切割与被1ml的混合正常人血浆切割的FRETS-VWF73底物的量相同的量的FRETS-VWF73底物所需的活性的量(Kokame等人，Br J Haematol.2005Apr；129(1)：93-100)。
如本文中所使用的，“ADAMTS13”和“生物活性衍生物”分别还包括经重组DNA技术获得的多肽。重组ADAMTS13(“rADAMTS13”)，例如重组人ADAMTS13(“r-hu-ADAMTS13”)，可通过本领域已知的任何方法产生。一个具体的实例在WO 02/42441中公开，其关于产生重组ADAMTS13的方法在此通过引用并入。这可包括用于以下的本领域已知的任何方法：(i)通过基因工程产生重组DNA，如通过RNA的逆转录和/或DNA的扩增，(ii)通过转染将重组DNA引入原核或真核细胞，即通过电穿孔或显微注射，(iii)培养所述转化细胞，例如以连续方式或分批方式，(iv)表达ADAMTS13，例如在必要时或在诱导时，以及(v)分离所述ADAMTS13，例如从培养基中或通过收获转化细胞，目的是(vi)获得基本上纯化的重组ADAMTS13，例如通过阴离子交换色谱法或亲合色谱法。术语“生物活性衍生物”还包括嵌合分子，例如与Ig结合的ADAMTS13(或其生物活性衍生物)，目的是改善生物学/药学性质，例如在哺乳动物、特别是人的循环系统中的ADAMTS13的半衰期。Ig能够还具有结合至任选地突变的Fc受体的位点。
如本文中所使用的，术语“血栓”血凝块，特别是含血小板的血凝块、微血栓和/或栓子。所述血栓可附着于动脉或静脉血管或不附着，并可部分地或完全地阻塞动脉或静脉血管的血流。
如本文中所使用的，术语“维生素B3”、“烟碱”、“烟酰胺”、“尼亚新”和“烟酸”可互换地用于指维生素的B3家族的任何成员。
如本文中所使用的，“治疗有效的量或剂量”或“足够的量或剂量”是指对于所施用于的对象产生效果的剂量。精确的剂量将取决于治疗的目的，并且通过本领域技术人员使用已知技术将是可确定的(参见，例如，Lieberman，Pharmaceutical Dosage Forms(第1-3卷，1992)；Lloyd，The Art，Science andTechnology of Pharmaceutical Compounding(1999)；Pickar，DosageCalculations(1999)；和Remington：The Science andPractice of Pharmacy，第20版，2003，Gennaro编辑，Lippincott，Williams & Wilkins)。
如本文中所使用的，盐的“生理浓度”是指在约100mM和约200mM之间的药学上可接受的盐的盐浓度。药学上可接受的盐的非限制性实例包括但不限于氯化钠和氯化钾、乙酸钠和乙酸钾、柠檬酸钠和柠檬酸钾、磷酸钠和磷酸钾。
如本文中所使用的，盐的“亚生理浓度”是指小于约100mM的药学上可接受的盐的盐浓度。在优选实施方案中，盐的亚生理浓度为小于约80mM的药用盐。在另一个优选实施方案中，盐的亚生理浓度为小于约60mM的药用盐。
如本文中所使用的，术语“约”是指与指定值相差正或负10％的大致范围。例如，措辞“约20％”涵盖18-22％的范围。如本文中所使用的，约还包括精确量。因此，“约20％”是指“约20％”且也指“20％”。
如本文中所使用的，“储存”是指制剂在制成后不立即施用于受治疗者，而是在使用前在特定条件(例如特定温度等等)下保持一段时间。例如，在施用于受治疗者之前，液体或冻干的制剂可在各种温度下如冷冻的温度(0℃-10℃)或室温(例如高达32℃的温度)下保持数天、数周、数月或数年。
如本文中所使用的，术语“化学成分确定的培养基”是指其中所有成分的身份和浓度都是已知的合成生长培养基。化学成分确定的培养基不包含细菌、酵母、动物或植物提取物，虽然它们可以包括或不包括个别植物或动物源性成分(例如，蛋白质、多肽等)。商购可得的化学成分确定的培养基的非限定性实例包括各种培养基(SAFC Biosciences，Inc)、各种达尔伯克改良伊格尔(DME)培养基(Sigma-Aldrich Co；SAFC Biosciences，Inc)、Ham’s营养培养基(Sigma-Aldrich Co；SAFC Biosciences，Inc)等。制备化学成分确定的培养基的方法在本领域中，例如在第6,171,825和6,936,441号美国专利、WO2007/077217以及第2008/0009040和2007/0212770号专利申请公布(为了所有目的将所述专利的公开内容通过引用整体并入本文)中是已知的。
如本文中所使用的，术语“不含寡肽的培养基”是指不包含寡肽例如衍生自蛋白质水解物的寡肽的不含蛋白质的培养基。在一个实施方案中，培养基不包含具有20或更多个氨基酸的寡肽。在本发明的一个实施方案中，培养基不包含具有15或更多个氨基酸的寡肽。在本发明的另一个实施方案中，培养基不包含具有10个或更多个氨基酸的寡肽。在一个实施方案中，培养基不包含具有7个或更多个氨基酸的寡肽。在另一个实施方案中，培养基不包含具有5个或更多个氨基酸的寡肽。在另一个实施方案中，培养基不包含具有3个或更多个氨基酸的寡肽。根据本发明的其它实施方案，培养基不包含具有2个或更多个氨基酸的寡肽。制备不含寡肽的培养基的方法在本领域中，例如在第6,171,825和6,936,441号美国专利、WO 2007/077217以及第2008/0009040号和第2007/0212770号美国专利申请公布(为了所有目的将所述专利的公开内容通过引用整体并入本文)中是已知的。
如本文中所使用的，术语“无血清培养基”是指未补充有动物血清的培养基。虽然许多时候无血清培养基是化学成分确定的培养基，但无血清培养基可补充有分离的动物或植物蛋白质或蛋白质级分。制备无血清培养基的方法在本领域中，例如在第6,171,825和6,936,441号美国专利、WO 2007/077217以及第2008/0009040号和第2007/0212770号美国专利申请公布(为了所有目的将所述专利的公开内容通过引用整体并入本文)中是已知的。
如本文中所使用的，术语“无动物蛋白质培养基”是指未补充有动物血清、蛋白质或蛋白质级分的培养基。虽然许多时候无动物蛋白质培养基是化学成分确定的培养基，但无动物蛋白质培养基可包含植物或酵母水解物。制备无动物蛋白质培养基的方法在本领域中，例如在第6,171,825和6,936,441号美国专利、WO 2007/077217以及第2008/0009040号和第2007/0212770号美国专利申请公布(为了所有目的将所述专利的公开内容通过引用整体并入本文)中是已知的。
“表达载体”是重组或合成产生的核酸构建体，其具有一系列允许特定核酸在宿主细胞中转录的特定核酸元件。表达载体可以是质粒、病毒或核酸片段的部分。通常，表达载体包括有效地连接于启动子的待转录的核酸。
术语“异源”，当用于指核酸的部分时，表示所述核酸包含在自然界中未以相同的彼此关系被发现的两个或更多个子序列。例如，所述核酸通常是重组产生的，具有两个或更多个来自无关基因的序列(它们经排列产生新型功能核酸)，例如来自一个来源的启动子和来自另一个来源的编码区。类似地，异源蛋白质表示所述蛋白质包含在自然界中未以相同的彼此关系被发现的两个或更多个子序列(例如，融合蛋白)。
“启动子”被定义为一系列指导核酸转录的核酸控制序列。如本文中所使用的，启动子包括转录起始位点附近的必需核酸序列，例如，在聚合酶II型启动子的情况下，TATA元件。启动子还任选地包括远端增强子或阻遏子元件，其可位于远离转录起始位点多达数千碱基对。“组成型”启动子是在大多数环境和发育条件下具有活性的启动子。“诱导型”启动子是在环境或发育调控下具有活性的启动子。术语“有效连接的”是指核酸表达控制序列(例如启动子或一系列转录因子结合位点)与第二核酸序列之间的功能连接，其中所述表达控制序列指导对应于所述第二序列的核酸的转录。
III.ADAMTS13组合物和制剂
在一个方面，本发明提供了ADAMTS13(A13)和rADAMTS13(rA13)蛋白的稳定化的制剂。在一个实施方案中，本发明的制剂当在高达至少约40℃的温度下储存至少约6个月时是稳定的。在其它实施方案中，本文提供的制剂当储存在延长的时期时保留显著的ADAMTS13活性。在其它实施方案中，本发明的制剂减少或延迟ADAMTS13蛋白的二聚作用、低聚反应和/或聚集。
在一个实施方案中，本发明提供了包含以下的ADAMTS13的制剂：治疗有效的量或剂量的ADAMTS13蛋白、亚生理浓度至生理浓度的药学上可接受的盐、稳定化浓度的一种或多种糖和/或糖醇、非离子型表面活性剂、为制剂提供中性pH的缓冲剂、和任选的钙和/或锌盐。一般地，本文提供的稳定化的A13制剂适合于药物施用。在优选实施方案中，A13蛋白是人ADAMTS13或其生物活性衍生物或片段。
在某些实施方案中，ADAMTS13(A13)制剂是液体制剂。在其它实施方案中，ADAMTS13制剂是由本文提供的液体制剂冻干的冻干的制剂。
在本文提供的制剂的某些实施方案中，ADAMTS13蛋白是人ADAMTS13(hA13)或重组人ADAMTS13(rhA13)、或其生物活性衍生物或片段。在一个实施方案中，hA13的氨基酸序列是GenBank登记号NP_620594的氨基酸序列。在另一个实施方案中，hA13的氨基酸序列包含NP_620594的氨基酸75至1427，其天然或保守的变异体，或其生物活性片段。
在某些实施方案中，以在约0.05mg/mL和约10mg/mL之间的治疗有效剂量提供ADAMTS13。在其它实施方案中，ADAMTS13以在约0.1mg/mL和约10mg/mL之间的浓度存在。在其它实施方案中，ADAMTS13以在约0.1mg/mL和约5mg/mL之间的浓度存在。在另一个实施方案中，ADAMTS13以在约0.1mg/mL和约2mg/mL之间的浓度存在。在其它实施方案中，ADAMTS13可以约0.01mg/mL、或以约0.02mg/mL、0.03mg/mL、0.04mg/mL、0.05mg/mL、0.06mg/mL、0.07mg/mL、0.08mg/mL、0.09mg/mL、0.1mg/mL、0.2mg/mL、0.3mg/mL、0.4mg/mL、0.5mg/mL、0.6mg/mL、0.7mg/mL、0.8mg/mL、0.9mg/mL、1.0mg/mL、1.1mg/mL、1.2mg/mL、1.3mg/mL、1.4mg/mL、1.5mg/mL、1.6mg/mL、1.7mg/mL、1.8mg/mL、1.9mg/mL、2.0mg/mL、2.5mg/mL、3.0mg/mL、3.5mg/mL、4.0mg/mL、4.5mg/mL、5.0mg/mL、5.5mg/mL、6.0mg/mL、6.5mg/mL、7.0mg/mL、7.5mg/mL、8.0mg/mL、8.5mg/mL、9.0mg/mL、9.5mg/mL、10.0mg/mL或更高浓度存在。在一个实施方案中，相对纯的ADAMTS13制剂的浓度可通过光谱法(即以A280测量的总蛋白质)或其它容积测定(bulk determination)来测定。在其它实施方案中，ADAMTS13浓度可通过ADAMTS13ELISA测定(例如，mg/mL抗原)来测定。
在其它实施方案中，由本发明提供的制剂中的ADAMTS13浓度可以酶活性水平来表示。例如，在一个实施方案中，ADAMTS13制剂可包含约10个单位的FRETS-VWF73活性至约10,000个单位的FRETS-VWF73活性或其它合适的A13酶单位(IU)。在其它实施方案中，所述制剂可包含约20个单位的FRETS-VWF73(UFV73)活性至约8,000个单位的FRETS-VWF73活性，或约30UFV73至约6,000UFV73、或约40UFV73至约4,000UFV73、或约50UFV73至约3,000UFV73、或约75UFV73至约2,500UFV73、或约100UFV73至约2,000UFV73、或约200UFV73至约1,500UFV73或约其它在其中的范围。在优选实施方案中，本文提供的ADAMTS13制剂包含约150至约600UFV73。在某些实施方案中，所述制剂包含约10个单位的FRETS-VWF73活性，或约20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900、1,000、1,100、1,200、1,300、1,400、1,500、1,600、1,700、1,800、1,900、2,000、2,100、2,200、2,300、2,400、2,500、2,600、2,700、2,800、2,900、3,000、3,100、3,200、3,300、3,400、3,500、3,600、3,700、3,800、3,900、4,000、4,100、4,200、4,300、4,400、4,500、4,600、4,700、4,800、4,900、5,000、5,100、5,200、5,300、5,400、5,500、5,600、5,700、5,800、5,900、6,000、6,100、6,200、6,300、6,400、6,500、6,600、6,700、6,800、6,900、7,000、7,100、7,200、7,300、7,400、7,500、7,600、7,700、7,800、7,900、8,000、8,100、8,200、8,300、8,400、8,500、8,600、8,700、8,800、8,900、9,000、9,100、9,200、9,300、9,400、9,500、9,600、9,700、9,800、9,900、10,000或更多单位的FRETS-VWF73活性。
类似地，在某些实施方案中，ADAMTS13的浓度可表示为酶活性每单位体积，例如，A13酶单位每mL(IU/mL)。例如，在一个实施方案中，ADAMTS13制剂可包含约10IU/mL至约10,000IU/mL。在其它实施方案中，所述制剂可包含约20IU/mL至约8,000IU/mL、或约30IU/mL至约6,000IU/mL、或约40IU/mL至约4,000IU/mL、或约50IU/mL至约3,000IU/mL、或约75IU/mL至约2,500IU/mL、或约100IU/mL至约2,000IU/mL、或约200IU/mL至约1,500IU/mL、或约其它在其中的范围。在优选实施方案中，本文提供的ADAMTS13制剂包含约150IU/mL至约600IU/mL。在另一个优选实施方案中，本文提供的ADAMTS13制剂包含约100IU/mL至约1,000IU/mL。在某些实施方案中，所述制剂包含约10IU/mL、或约20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900、1,000、1,100、1,200、1,300、1,400、1,500、1,600、1,700、1,800、1,900、2,000、2,100、2,200、2,300、2,400、2,500、2,600、2,700、2,800、2,900、3,000、3,100、3,200、3,300、3,400、3,500、3,600、3,700、3,800、3,900、4,000、4,100、4,200、4,300、4,400、4,500、4,600、4,700、4,800、4,900、5,000、5,100、5,200、5,300、5,400、5,500、5,600、5,700、5,800、5,900、6,000、6,100、6,200、6,300、6,400、6,500、6,600、6,700、6,800、6,900、7,000、7,100、7,200、7,300、7,400、7,500、7,600、7,700、7,800、7,900、8,000、8,100、8,200、8,300、8,400、8,500、8,600、8,700、8,800、8,900、9,000、9,100、9,200、9,300、9,400、9,500、9,600、9,700、9,800、9,900、10,000或更多的IU/mL。
在某些实施方案中，由本发明提供的稳定化的ADAMTS13制剂将包含亚生理至生理盐浓度，例如，0mM至约200mM的药学上可接受的盐。在一个实施方案中，ADAMTS13制剂将包含生理浓度的盐，例如在约100mM和约200mM之间的药学上可接受的盐。在其它实施方案中，ADAMTS13制剂将包含约0mM、或约5mM、10mM、15mM、20mM、25mM、30mM、35mM、40mM、45mM、50mM、55mM、60mM、65mM、70mM、75mM、80mM、85mM、90mM、95mM、100mM、110mM、120mM、130mM、140mM、150mM、160mM、170mM、180mM、190mM、200mM或更多的药学上可接受的盐。在优选实施方案中，所述盐是氯化钠或氯化钾。
有利地，已发现包含亚生理浓度的药学上可接受的盐的ADAMTS13制剂形成具有光滑表面的紧密的冻干饼。此外，发现与采用生理浓度的盐制备的制剂相比，ADAMTS13蛋白的低盐冻干的制剂降低蛋白聚集。因此，在优选实施方案中，本发明提供了包含亚生理浓度的药学上可接受的盐的ADAMTS13的低盐制剂，例如，小于约100mM的药学上可接受的盐。在一个实施方案中，本文提供的低盐ADAMTS13制剂包含小于约100mM的药用盐。在优选实施方案中，本文提供的低盐ADAMTS13制剂包含小于约80mM的药用盐。在另一个优选实施方案中，本文提供的低盐ADAMTS13制剂包含小于约60mM的药用盐(即约0mM和约60mM之间的盐)。在另一个优选实施方案中，低盐ADAMTS13制剂将包含在约30mM和约60mM之间的药学上可接受的盐。在其它实施方案中，低盐ADAMTS13制剂将包含约0mM、或约5mM、10mM、15mM、20mM、25mM、30mM、35mM、40mM、45mM、50mM、55mM、60mM、65mM、70mM、75mM、80mM、85mM、90mM、95mM、或100mM的药学上可接受的盐。在优选实施方案中，低盐ADAMTS13制剂是冻干的制剂。在优选实施方案中，所述盐是氯化钠或氯化钾。
已发现，包含中等水平(即，在约2％和约6％之间)的一种或多种糖和/或糖醇有助于制成具有光滑表面的紧密的冻干饼并且经冻干后促进稳定化ADAMTS13。因此，在一个实施方案中，本发明提供了包含约2％和约6％之间的一种或多种糖和/或糖醇的ADAMTS13制剂。可使用任何糖例如单糖、二糖或多糖、或水溶性的葡聚糖(包括例如果糖、葡萄糖、甘露糖、山梨糖、木糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖、葡聚糖、海藻糖、普鲁兰多糖、糊精、环糊精、可溶性淀粉、羟乙基淀粉和羧甲基纤维素。在具体的实施方案中，蔗糖或海藻糖被用作糖添加剂。糖醇被定义为具有约4个至约8个碳原子和羟基的烃。可用于本文提供的ADAMTS13制剂的糖醇的非限制性实例包括甘露醇、山梨醇、肌醇、半乳糖醇、卫茅醇、木糖醇和阿拉伯糖醇。在一个实施方案中，甘露醇被用作糖醇添加剂。在优选实施方案中，ADAMTS13制剂包含糖和糖醇添加剂两者。
糖和糖醇可单独使用或组合使用。在某些实施方案中，糖、糖醇或其组合将以约0.5％至约7％的浓度存在于制剂中。在一个实施方案中，所述制剂中的糖和/或糖醇含量将为约0.5％至约5％。在某些实施方案中，糖、糖醇或其组合将以约1％至约5％的浓度存在。在优选实施方案中，糖、糖醇或其组合将以约2％至约6％的浓度存在。在另一个优选实施方案中，糖、糖醇或其组合将以约3％至约5％的浓度存在。在某些实施方案中，最终浓度可以是约0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％、5％、5.5％、6.0％、6.5％、或7.0％的糖、糖醇或其组合。在具体的实施方案中，本文提供的制剂可包含约0.5％至约5.0％浓度的糖和约0.5％至约5.0％浓度的糖醇。可使用糖和糖醇浓度的任意组合，例如以约0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％、5％、5.5％、6.0％、6.5％、或7.0％的浓度存在的糖和以约0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％、5％、5.5％、6.0％、6.5％、或7.0％的浓度存在的糖醇。
有利地，还发现包含非离子型表面活性剂显著减少ADAMTS13制剂的聚集。因此，在一个实施方案中，提供了包含稳定化浓度的非离子型洗涤剂的ADAMTS13制剂。可用于本发明的制剂中的药学上可接受的非离子型表面活性剂在药学科学领域中是公知的，并且包括但不限于聚山梨醇酯80(Tween80)、聚山梨醇酯20(Tween 20)和各种泊洛沙姆或普朗尼克，包括Pluronic F-68和BRIJ 35或其混合物。在优选实施方案中，本发明的药物制剂中使用的非离子型表面活性剂是聚山梨醇酯80。在某些实施方案中，表面活性剂可以约0.001％和约0.2％之间的浓度用于本文提供的制剂中。在优选实施方案中，表面活性剂以约0.01％和约0.1％之间的浓度使用。在另一个优选实施方案中，表面活性剂以约0.05％的浓度使用。例如，在某些实施方案中，所述制剂可包含以约0.001％、0.005％、0.01％、0.02％、0.03％、0.04％、0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.09％、0.1％、0.125％、0.15％、0.175％、0.2％的浓度或类似浓度的非离子型表面活性剂。
此外，发现ADAMTS13制剂在以约6.5至约7.5的中性pH下配制时被稳定化。因此，在某些实施方案中，提供了ADAMTS13制剂，其包含适合于将制剂维持在中性pH的缓冲剂。药学上可接受的缓冲剂是本领域众所周知的，并且包括但不限于磷酸盐缓冲液、组氨酸、柠檬酸钠、HEPES、Tris、N，N-二(羟乙基)甘氨酸(Bicine)、甘氨酸、N-甘氨酰甘氨酸、乙酸钠、碳酸钠、双甘氨肽、赖氨酸、精氨酸、磷酸钠及其混合物。在优选实施方案中，缓冲液选自组氨酸、磷酸盐缓冲液、HEPES和柠檬酸钠。在一个优选实施方案中，缓冲液是组氨酸或HEPES。在具体实施方案中，缓冲液是组氨酸。在另一具体实施方案中，缓冲液是HEPES。在一个实施方案中，本文提供的制剂的pH在约6.5和约9.0之间。在某些实施方案中，所述制剂的pH为约6.5或约6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、或9.0。在优选实施方案中，A13制剂的pH在约6.0和约8.0之间。在更优选的实施方案中，A13制剂的pH在约6.5和约7.5之间。在具体的实施方案中，A13制剂的pH在约6.5和约7.5之间。在具体的实施方案中，A13制剂的pH为约7.0。在另一具体实施方案中，A13制剂的pH为7.0±0.2。
本文还证实了包含钙进一步稳定化ADAMTS13的制剂。因此，在某些实施方案中，提供了稳定化的ADAMTS13制剂，其包含0.5mM至约20mM的钙(例如，氯化钙)。任何药学上可接受的钙盐都可用于本文提供的制剂。可使用的钙盐的非限制性实例包括，例如，CaCl2、CaCO3、Ca(C6H11O7)2、Ca3(PO4)2、Ca(C18H35O2)2及类似物。在一个实施方案中，钙以约0.5mM至约10mM的浓度存在于本发明的ADAMTS13制剂中。在另一个实施方案中，钙以约2mM和约5mM之间的浓度存在于ADAMTS13制剂中。在优选实施方案中，钙以约2mM至约4mM的浓度存在于ADAMTS13制剂中。在某些实施方案中，钙的浓度为约0.5mM或约1mM、2mM、3mM、4mM、5mM、6mM、7mM、8mM、9mM、10mM、11mM、12mM、13mM、14mM、15mM、16mM、17mM、18mM、19mM、或20mM。在具体的实施方案中，钙的浓度为约2mM。在另一个优选实施方案中，钙的浓度为约3mM。在另一个优选实施方案中，钙的浓度为约4mM。
类似地，已发现在某些条件下，包含锌进一步稳定化如本文提供的ADAMTS13制剂。例如，图34显示了包含约2μM至约10μM锌进一步稳定化含钙的ADAMTS13制剂。任何药学上可接受的锌盐都可用于本文提供的制剂中。可使用的锌盐的非限制性实例包括，例如，ZnSO4·7H2O、ZnSO3·2H2O、Zn3(PO4)2和(C6H5O7)2Zn3·2H2O及类似物。在一个实施方案中，ZnSO4被用于本文提供的ADAMTS13制剂中。在某些实施方案中，锌以约0.5μM至约20.0μM的浓度存在于本发明的ADAMTS13制剂中。在优选实施方案中，锌以约0.5μM至约10.0μM之间的浓度包含在ADAMTS13制剂中。在某些实施方案中，锌的浓度为约0.5μM或约1μM、2μM、3μM、4μM、5μM、6μM、7μM、8μM、9μM、或10μM。
在某些实施方案中，本文提供的ADAMTS13制剂还可包含一种或多种药学上可接受的赋形剂、载体和/或稀释剂。此外，本文提供的制剂还可包含其它药用剂(medicinal agent)、载体、佐剂、稀释剂、组织促渗剂、增溶剂及类似物。用于制备用于药物施用的组合物和制剂的方法是本领域技术人员公知的(参见，例如，REMINGTON′S PHARMACEUTICAL SCIENCES，第18版，MackPublishing Co.，Easton，PA(1990))。
在一个实施方案中，本文提供的ADAMTS13制剂将具有在约200mOsmol/L和约400mOsmol/L之间的范围的张力(tonocity)、或在约250mOsmol/L和约350mOsmol/L之间的范围的张力。在某些实施方案中，本文提供的ADAMTS13制剂将具有，例如，约200mOsmol/L、或约210mOsmol/L、220mOsmol/L、230mOsmol/L、240mOsmol/L、250mOsmol/L、260mOsmol/L、270mOsmol/L、280mOsmol/L、290mOsmol/L、300mOsmol/L、310mOsmol/L、320mOsmol/L、330mOsmol/L、340mOsmol/L、350mOsmol/L、360mOsmol/L、370mOsmol/L、380mOsmol/L、390mOsmol/L、或400mOsmol/L的张力。
可用于本文提供的制剂中的张度剂(tonocity agent)的实例包括但不限于氯化钠、右旋糖、蔗糖、木糖醇、果糖、甘油、山梨醇、甘露醇、海藻糖、氯化钾、甘露糖、氯化钙、氯化镁、其它无机盐、其它糖、其它糖醇及其组合。在某些实施方案中，ADAMTS13制剂可包含至少一种张度剂或至少2、3、4、5或更多种张度剂。
本文提供的ADAMTS13制剂可配制用于经已知方法施用，例如静脉内施用，例如作为快速推注或通过经一段时期的连续输注，通过肌肉内、腹膜内、脑脊髓内、皮下、关节内、滑膜内、鞘内、口腔、局部或吸入途径。在某些实施方案中，本文提供的ADAMTS13制剂可被系统施用或局部施用。系统施用包括但不限于：口腔、真皮下、腹膜内、皮下、经鼻、舌下或直肠途径的施用。局部施用包括但不限于：局部、皮下、肌肉内和腹膜内途径的施用。
在本发明的一方面，提供了单体的ADAMTS13蛋白的组合物。在某些实施方案中，单体的ADAMTS13蛋白的组合物基本上不含聚集的ADAMTS13、二聚的ADAMTS13或聚集的和二聚的ADAMTS13两者。在某些实施方案中，单体的组合物比包含聚集的和/或二聚的ADAMTS13蛋白的类似的组合物具有较高的比活性。在具体的实施方案中，单体的ADAMTS13组合物通过包括凝胶过滤或尺寸排阻色谱法的方法产生。在一个具体的实施方案中，ADAMTS13蛋白是人ADAMTS13(hA13)或重组人ADAMTS13(rhA13)或其生物活性衍生物或片段。
在另一方面，提供了单体的ADAMTS13组合物的制剂。在一个实施方案中，该制剂是单体的ADAMTS13蛋白的药学上可接受的制剂。在某些实施方案中，该制剂基本上不含聚集的ADAMTS13、二聚的ADAMTS13或聚集的和二聚的ADAMTS13两者。在某些实施方案中，单体的组合物比包含聚集的和/或二聚的ADAMTS13蛋白的类似的组合物具有较高的比活性。在具体的实施方案中，单体的ADAMTS13制剂通过包括凝胶过滤或尺寸排阻色谱法的方法产生。在一个具体的实施方案中，在制剂中的ADAMTS13蛋白是人ADAMTS13(hA13)或重组人ADAMTS13(rhA13)或其生物活性衍生物或片段。在某些实施方案中，单体的ADAMTS13蛋白根据本文提供的制剂配制。
在实施方案中，本发明提供了包含以下的ADAMTS13的制剂：约0.05mg/ml至约10.0mg/ml的ADAMTS13蛋白、约0mM至约200mM的药学上可接受的盐、糖和/或糖醇、非离子型表面活性剂和缓冲剂。在某些实施方案中，所述制剂还可包含钙和/或锌。在其它实施方案中，所述制剂可被缓冲在pH约6.5和9.0之间。在某些实施方案中，A13制剂适合于药物施用。
在具体实施方案中，本发明提供了稳定化的ADAMTS13制剂，包含：0.05mg/ml至10.0mg/ml的ADAMTS13；0mM至200mM的药学上可接受的盐；0.5mM至20mM的钙；糖和/或糖醇；非离子型表面活性剂；和用于维持pH在约6.5和约7.5之间的缓冲剂。在优选实施方案中，药学上可接受的盐是氯化钠或氯化钾。
在一个实施方案中，稳定化的ADAMTS13制剂被提供为包含0.05mg/ml至10.0mg/ml的ADAMTS13；0mM至200mM的药学上可接受的盐；0.5mM至20mM的钙；糖和/或糖醇；非离子型表面活性剂；和用于维持pH在约6.5和约7.5之间的缓冲剂，包含约50个单位每mL和约1000个单位每mL之间的ADAMTS13活性。在优选实施方案中，药学上可接受的盐是氯化钠或氯化钾。
在另一个实施方案中，本发明提供了稳定化的ADAMTS13制剂，其包含0.05mg/ml至10.0mg/ml的ADAMTS13；0mM至200mM的药学上可接受的盐；1mM至10mM的钙；糖和/或糖醇；非离子型表面活性剂；和用于维持pH在约6.5和约7.5之间的缓冲剂。在优选实施方案中，所述制剂包含约2mM和约4mM之间的钙。在优选实施方案中，药学上可接受的盐是氯化钠或氯化钾。
在另一个实施方案中，本发明提供了稳定化的ADAMTS13制剂，其包含0.05mg/ml至10.0mg/ml的ADAMTS13；0mM至200mM的药学上可接受的盐；0.5mM至20mM的钙；约2％和约6％之间的糖和/或糖醇；非离子型表面活性剂；和用于维持pH在约6.5和约7.5之间的缓冲剂。在某些实施方案中，糖和/或糖醇选自由蔗糖、海藻糖、甘露糖及其组合组成的组。在优选实施方案中，糖和/或糖醇是蔗糖和甘露醇的混合物。在具体的实施方案中，蔗糖和甘露醇的混合物由约1％蔗糖和约3％甘露糖组成。在某些实施方案中，所述制剂包含约1mM和约10mM之间的钙，优选地约2mM和约4mM之间的钙。在优选实施方案中，药学上可接受的盐是氯化钠或氯化钾。
在另一个实施方案中，本发明提供了稳定化的ADAMTS13制剂，其包含0.05mg/ml至10.0mg/ml的ADAMTS13；0mM至200mM的药学上可接受的盐；0.5mM至20mM的钙；糖和/或糖醇；约0.01％和0.1％之间的非离子型表面活性剂；和用于维持pH在约6.5和约7.5之间的缓冲剂。在某些实施方案中，表面活性剂选自由聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80、Pluronic F-68、BRIJ 35及其组合组成的组。在优选实施方案中，糖和/或糖醇是蔗糖和甘露醇的混合物。在具体的实施方案中，表面活性剂是聚山梨醇酯80。在某些实施方案中，所述制剂包含约1mM和约10mM之间的钙，优选地约2mM和约4mM之间的钙。在优选实施方案中，药学上可接受的盐是氯化钠或氯化钾。
在另一个实施方案中，本发明提供了稳定化的ADAMTS13制剂，其包含0.05mg/ml至10.0mg/ml的ADAMTS13；0mM至200mM的药学上可接受的盐；0.5mM至20mM的钙；糖和/或糖醇；非离子型表面活性剂；和用于维持pH在约6.5和约7.5之间的缓冲剂，其中缓冲剂是组氨酸或HEPES。在某些实施方案中，缓冲剂以约5mM和约100mM之间的浓度存在，优选地以约10mM和约50mM之间的浓度存在。在另一个优选实施方案中，所述制剂的pH为7.0±0.2。在某些实施方案中，所述制剂包含约1mM和约10mM之间的钙，优选地约2mM和约4mM之间的钙。在优选实施方案中，药学上可接受的盐是氯化钠或氯化钾。
在另一个实施方案中，本发明提供了稳定化的ADAMTS13制剂，其包含0.05mg/ml至10.0mg/ml的ADAMTS13；0mM至200mM的药学上可接受的盐；0.5mM至20mM的钙；糖和/或糖醇；非离子型表面活性剂；和用于维持pH在约6.5和约7.5之间的缓冲剂。在某些实施方案中，所述制剂还包含约0.5μM和约20μM之间的锌。在某些实施方案中，所述制剂包含约1mM和约10mM之间的钙，优选地约2mM和约4mM之间的钙。在优选实施方案中，药学上可接受的盐是氯化钠或氯化钾。
在优选实施方案中，本发明提供了稳定化的ADAMTS13制剂，其包含0.05mg/ml至10.0mg/ml的ADAMTS13；0至60mM NaCl；2mM至4mM的钙；2％至4％甘露醇；0.5％至2％的蔗糖；0.025至0.1％的聚山梨醇酯80；和10mM至50mM组氨酸(pH 7.0±0.2)。在一个实施方案中，所述制剂还包含约0.5μM和约20μM之间的锌。
在另一个实施方案中，稳定化的低盐ADAMTS13制剂被提供为包含0.05mg/ml至10.0mg/ml的ADAMTS13；小于约100mM的药学上可接受的盐；0.5mM至20mM的钙；糖和/或糖醇；非离子型表面活性剂；和用于维持pH在约6.5和7.5之间的缓冲剂。在优选实施方案中，药学上可接受的盐是氯化钠或氯化钾。在优选实施方案中，低盐ADAMTS13制剂是冻干的制剂。
在一个实施方案中，稳定化的低盐ADAMTS13制剂被提供为包含0.05mg/ml至10.0mg/ml的ADAMTS13；小于约100mM的药学上可接受的盐；0.5mM至20mM的钙；糖和/或糖醇；非离子型表面活性剂；和用于维持pH在约6.5和约7.5之间的缓冲剂，包含约50个单位每mL和约1000个单位每mL之间的ADAMTS13活性。在优选实施方案中，药学上可接受的盐是氯化钠或氯化钾。在优选实施方案中，低盐ADAMTS13制剂是冻干的制剂。
在另一个实施方案中，本发明提供了稳定化的低盐ADAMTS13制剂，其包含0.05mg/ml至10.0mg/ml的ADAMTS13；小于约100mM的药学上可接受的盐；1mM至10mM的钙；糖和/或糖醇；非离子型表面活性剂；和用于维持pH在约6.5和约7.5之间的缓冲剂。在优选实施方案中，所述制剂包含约2mM和约4mM之间的钙。在优选实施方案中，药学上可接受的盐是氯化钠或氯化钾。在优选实施方案中，低盐ADAMTS13制剂是冻干的制剂。
在另一个实施方案中，本发明提供了稳定化的低盐ADAMTS13制剂，其包含0.05mg/ml至10.0mg/ml的ADAMTS13；小于约100mM的药学上可接受的盐；0.5mM至20mM的钙；约2％和约6％之间的糖和/或糖醇；非离子型表面活性剂；和用于维持pH在约6.5和约7.5之间的缓冲剂。在某些实施方案中，糖和/或糖醇选自由蔗糖、海藻糖、甘露糖及其组合组成的组。在优选实施方案中，糖和/或糖醇是蔗糖和甘露醇的混合物。在具体的实施方案中，蔗糖和甘露醇的混合物由约1％蔗糖和约3％甘露醇组成。在某些实施方案中，所述制剂包含约1mM和约10mM之间的钙，优选地约2mM和约4mM之间的钙。在优选实施方案中，药学上可接受的盐是氯化钠或氯化钾。在优选实施方案中，低盐ADAMTS13制剂是冻干的制剂。
在另一个实施方案中，本发明提供了稳定化的低盐ADAMTS13制剂，其包含0.05mg/ml至10.0mg/ml的ADAMTS13；小于约100mM的药学上可接受的盐；0.5mM至20mM的钙；糖和/或糖醇；约0.01％和0.1％之间的非离子型表面活性剂；和用于维持pH在约6.5和约7.5之间的缓冲剂。在某些实施方案中，表面活性剂选自由聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80、Pluronic F-68、BRIJ 35及其组合组成的组。在优选实施方案中，糖和/或糖醇是蔗糖和甘露醇的混合物。在具体的实施方案中，表面活性剂是聚山梨醇酯80。在某些实施方案中，所述制剂包含约1mM和约10mM之间的钙，优选地约2mM和约4mM之间的钙。在优选实施方案中，药学上可接受的盐是氯化钠或氯化钾。在优选实施方案中，低盐ADAMTS13制剂是冻干的制剂。
在另一个实施方案中，本发明提供了稳定化的低盐ADAMTS13制剂，其包含0.05mg/ml至10.0mg/ml的ADAMTS13；小于约100mM的药学上可接受的盐；0.5mM至20mM的钙；糖和/或糖醇；非离子型表面活性剂；和用于维持pH在约6.5和约7.5之间的缓冲剂，其中缓冲剂是组氨酸或HEPES。在某些实施方案中，缓冲剂以约5mM和约100mM之间的浓度存在，优选地以约10mM和约50mM之间的浓度存在。在另一个优选实施方案中，所述制剂的pH为7.0±0.2。在某些实施方案中，所述制剂包含约1mM和约10mM之间的钙，优选地约2mM和约4mM之间的钙。在优选实施方案中，药学上可接受的盐是氯化钠或氯化钾。在优选实施方案中，低盐ADAMTS13制剂是冻干的制剂。
在另一个实施方案中，本发明提供了稳定化的低盐ADAMTS13制剂，其包含0.05mg/ml至10.0mg/ml的ADAMTS13；小于约100mM的药学上可接受的盐；0.5mM至20mM的钙；糖和/或糖醇；非离子型表面活性剂；和用于维持pH在约6.5和约7.5之间的缓冲剂。在某些实施方案中，所述制剂还包含约0.5μM和约20μM之间的锌。在某些实施方案中，所述制剂包含约1mM和约10mM之间的钙，优选地约2mM和约4mM之间的钙。在优选实施方案中，药学上可接受的盐是氯化钠或氯化钾。在优选实施方案中，低盐ADAMTS13制剂是冻干的制剂。
在优选实施方案中，本发明提供了稳定化的低盐ADAMTS13制剂，其包含0.05mg/ml至10.0mg/ml的ADAMTS13；小于约100mM的NaCl；2mM至4mM的钙；2％至4％的甘露醇；0.5％至2％的蔗糖；0.025至0.1％的聚山梨醇酯80；和10mM至50mM的组氨酸(pH 7.0±0.2)。在一个实施方案中，所述制剂还包含约0.5μM和约20μM之间的锌。在优选实施方案中，低盐ADAMTS13制剂是冻干的制剂。
在一个实施方案中，本发明提供了稳定化的ADAMTS13(A13)制剂，其包含(a)至少100个单位的ADAMTS13活性(即，FRETS-vWF73活性)每mgADAMTS13；(b)0mM至200mM的药学上可接受的盐；(c)0.5mM至20mM的钙；(d)糖和/或糖醇；(e)非离子型表面活性剂；和(f)用于维持pH在6.0和8.0之间的缓冲剂。在一个实施方案中，稳定化的ADAMTS13制剂包含至少200个单位的A13活性每mg ADAMTS13。在另一个实施方案中，稳定化的ADAMTS13制剂包含至少400个单位的A13活性每mg ADAMTS13。在优选实施方案中，稳定化的ADAMTS13制剂包含至少600个单位的A13活性每mg ADAMTS13。在更优选的实施方案中，稳定化的ADAMTS13制剂包含至少800个单位的A13活性每mg ADAMTS13。在另一个优选实施方案中，稳定化的ADAMTS13制剂包含至少1000个单位的A13活性每mg ADAMTS13。在一个实施方案中，稳定化的ADAMTS13制剂包含约100个单位和约2000个单位之间的ADAMTS13活性每mg ADAMTS13。
在稳定化的A13制剂的一个实施方案中，所述制剂包含约1.0mM和约10.0mM之间的钙。在优选实施方案中，所述制剂包含约2.0和约4.0mM之间的钙。
在稳定化的A13制剂的另一个实施方案中，所述制剂包含约2％和约6％之间的糖和/或糖醇。在优选实施方案中，所述制剂包含约3％和约5％之间的糖和/或糖醇。在具体实施方案中，所述制剂包含约4％的糖和/或糖醇。在一个实施方案中，糖和/或糖醇选自由蔗糖、海藻糖、甘露糖及其组合组成的组。在优选实施方案中，糖和/或糖醇是蔗糖和甘露醇的混合物。
在稳定化的A13制剂的一个实施方案中，所述制剂包含约0.01％和约0.1％之间的非离子型表面活性剂。在优选实施方案中，所述制剂包含约0.05％的非离子型表面活性剂。在一个实施方案中，表面活性剂选自由聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80、Pluronic F-68和BRIJ 35组成的组。在优选实施方案中，表面活性剂是聚山梨醇酯80。
在稳定化的A13制剂的一个实施方案中，所述制剂包含约5mM和约100mM之间的缓冲剂。在优选实施方案中，所述制剂包含约10mM和约50mM之间的缓冲剂。在另一个实施方案中，缓冲剂是组氨酸或HEPES。在优选实施方案中，缓冲剂是组氨酸。在一个实施方案中，所述制剂的pH在约6.5和7.5之间。在优选实施方案中，所述制剂的pH为7.0±0.2。
在稳定化的A13制剂的一个实施方案中，所述制剂还包含约0.5μM和约20μM之间的锌。
在具体实施方案中，本发明提供了稳定化的ADAMTS13(A13)制剂，其包含(a)至少100个单位的ADAMTS13活性每mg ADAMTS13；(b)0至200mM的NaCl；(c)2mM至4mM的钙；(d)2％至4％的甘露醇；(e)0.5％至2％的蔗糖；(f)0.025至0.1％的聚山梨醇酯80；和(g)10mM至50mM的组氨酸(pH 7.0±0.2)。
在一个实施方案中，本发明提供了稳定化的低盐ADAMTS13(A13)制剂，其包含(a)至少100个单位的ADAMTS13活性(即，FRETS-vWF73活性)每mgADAMTS13；(b)0mM至100mM的药学上可接受的盐；(c)0.5mM至20mM的钙；(d)糖和/或糖醇；(e)非离子型表面活性剂；和(f)用于维持pH在6.0和8.0之间的缓冲剂。在一个实施方案中，稳定化的ADAMTS13制剂包含至少200个单位的A13活性每mg ADAMTS13。在另一个实施方案中，稳定化的ADAMTS13制剂包含至少400个单位的A13活性每mg ADAMTS13。在优选实施方案中，稳定化的ADAMTS13制剂包含至少600个单位的A13活性每mg ADAMTS13。在更优选的实施方案中，稳定化的ADAMTS13制剂包含至少800个单位的A13活性每mg ADAMTS13。在另一个优选实施方案中，稳定化的ADAMTS13制剂包含至少1000个单位的A13活性每mg ADAMTS13。在一个实施方案中，稳定化的ADAMTS13制剂包含约100个单位和约2000个单位之间的ADAMTS13活性每mg ADAMTS13。
在稳定化的低盐A13制剂的一个实施方案中，所述制剂包含约1.0mM和约10.0mM之间的钙。在优选实施方案中，所述制剂包含约2.0和约4.0mM之间的钙。
在稳定化的低盐A13制剂的另一个实施方案中，所述制剂包含约2％和约6％之间的糖和/或糖醇。在优选实施方案中，所述制剂包含约3％和约5％之间的糖和/或糖醇。在具体实施方案中，所述制剂包含约4％的糖和/或糖醇。在一个实施方案中，糖和/或糖醇选自由蔗糖、海藻糖、甘露糖及其组合组成的组。在优选实施方案中，糖和/或糖醇是蔗糖和甘露醇的混合物。
在稳定化的低盐A13制剂的一个实施方案中，所述制剂包含约0.01％和约0.1％之间的非离子型表面活性剂。在优选实施方案中，所述制剂包含约0.05％的非离子型表面活性剂。在一个实施方案中，表面活性剂选自由聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80、Pluronic F-68和BRIJ 35组成的组。在优选实施方案中，表面活性剂是聚山梨醇酯80。
在稳定化的低盐A13制剂的一个实施方案中，所述制剂包含约5mM和约100mM之间的缓冲剂。在优选实施方案中，所述制剂包含约10mM和约50mM之间的缓冲剂。在另一个实施方案中，缓冲剂是组氨酸或HEPES。在优选实施方案中，缓冲剂是组氨酸。在一个实施方案中，所述制剂的pH在约6.5和7.5之间。在优选实施方案中，所述制剂的pH为7.0±0.2。
在稳定化的低盐A13制剂的一个实施方案中，所述制剂还包含约0.5μM和约20μM之间的锌。
在具体实施方案中，本发明提供了稳定化的低盐ADAMTS13(A13)制剂，其包含(a)至少100个单位的ADAMTS13活性每mg ADAMTS13；(b)0至60mM的NaCl；(c)2mM至4mM的钙；(d)2％至4％的甘露醇；(e)0.5％至2％的蔗糖；(f)0.025至0.1％的聚山梨醇酯80；和(g)10mM至50mM的组氨酸(pH 7.0±0.2)。
在相关的实施方案中，本发明提供了稳定化的冻干的ADAMTS13(A13)制剂，其中所述制剂由包含以下的液体制剂冻干：(a)至少100个单位的ADAMTS13活性(即，FRETS-vWF73活性)每mg ADAMTS13；(b)0mM至200mM的药学上可接受的盐；(c)0.5mM至20mM的钙；(d)糖和/或糖醇；(e)非离子型表面活性剂；和(f)用于维持pH在6.0和8.0之间的缓冲剂。在一个实施方案中，稳定化的ADAMTS13制剂包含至少200个单位的A13活性每mg ADAMTS13。在另一个实施方案中，稳定化的ADAMTS13制剂包含至少400个单位的A13活性每mg ADAMTS13。在优选实施方案中，稳定化的ADAMTS13制剂包含至少600个单位的A13活性每mg ADAMTS13。在更优选的实施方案中，稳定化的ADAMTS13制剂包含至少800个单位的A13活性每mg ADAMTS13。在另一个优选实施方案中，稳定化的ADAMTS13制剂包含至少1000个单位的A13活性每mg ADAMTS13。在一个实施方案中，稳定化的ADAMTS13制剂包含约100个单位和约2000个单位之间的ADAMTS13活性每mg ADAMTS13。
在稳定化的冻干的A13制剂的一个实施方案中，所述制剂包含约1.0mM和约10.0mM之间的钙。在优选实施方案中，所述制剂包含约2.0和约4.0mM之间的钙。
在稳定化的冻干的A13制剂的另一个实施方案中，所述制剂包含约2％和约6％之间的糖和/或糖醇。在优选实施方案中，所述制剂包含约3％和约5％之间的糖和/或糖醇。在具体实施方案中，所述制剂包含约4％的糖和/或糖醇。在一个实施方案中，糖和/或糖醇选自由蔗糖、海藻糖、甘露糖及其组合组成的组。在优选实施方案中，糖和/或糖醇是蔗糖和甘露醇的混合物。
在稳定化的冻干的A13制剂的一个实施方案中，所述制剂包含约0.01％和约0.1％之间的非离子型表面活性剂。在优选实施方案中，所述制剂包含约0.05％的非离子型表面活性剂。在一个实施方案中，表面活性剂选自由聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80、Pluronic F-68和BRIJ 35组成的组。在优选实施方案中，表面活性剂是聚山梨醇酯80。
在稳定化的冻干的A13制剂的一个实施方案中，所述制剂包含约5mM和约100mM之间的缓冲剂。在优选实施方案中，所述制剂包含约10mM和约50mM之间的缓冲剂。在另一个实施方案中，缓冲剂是组氨酸或HEPES。在优选实施方案中，缓冲剂是组氨酸。在一个实施方案中，所述制剂的pH在约6.5和7.5之间。在优选实施方案中，所述制剂的pH为7.0±0.2。
在稳定化的冻干的A13制剂的一个实施方案中，所述制剂还包含约0.5μM和约20μM之间的锌。
在具体实施方案中，本发明提供了稳定化的冻干的ADAMTS13(A13)制剂，其中所述制剂由包含以下的液体制剂冻干：(a)至少100个单位的ADAMTS13活性每mgADAMTS13；(b)0至200mM的NaCl；(c)2mM至4mM的钙；(d)2％至4％的甘露醇；(e)0.5％至2％的蔗糖；(f)0.025至0.1％的聚山梨醇酯80；和(g)10mM至50mM的组氨酸(pH 7.0±0.2)。
在相关的实施方案中，本发明提供了稳定化的低盐冻干的ADAMTS13(A13)制剂，其中所述制剂由包含以下的液体制剂冻干：(a)至少100个单位的ADAMTS13活性(即，FRETS-vWF73活性)每mg ADAMTS13；(b)0mM至100mM的药学上可接受的盐；(c)0.5mM至20mM的钙；(d)糖和/或糖醇；(e)非离子型表面活性剂；和(f)用于维持pH在6.0和8.0之间的缓冲剂。在一个实施方案中，稳定化的ADAMTS13制剂包含至少200个单位的A13活性每mg ADAMTS13。在另一个实施方案中，稳定化的ADAMTS13制剂包含至少400个单位的A13活性每mg ADAMTS13。在优选实施方案中，稳定化的ADAMTS13制剂包含至少600个单位的A13活性每mgADAMTS13。在更优选的实施方案中，稳定化的ADAMTS13制剂包含至少800个单位的A13活性每mg ADAMTS13。在另一个优选实施方案中，稳定化的ADAMTS13制剂包含至少1000个单位的A13活性每mg ADAMTS13。在一个实施方案中，稳定化的ADAMTS13制剂包含约100个单位和约2000个单位之间的ADAMTS13活性每mg ADAMTS13。
在稳定化的低盐冻干的A13制剂的一个实施方案中，所述制剂包含约1.0mM和约10.0mM之间的钙。在优选实施方案中，所述制剂包含约2.0和约4.0mM之间的钙。
在稳定化的低盐冻干的A13制剂的另一个实施方案中，所述制剂包含约2％和约6％之间的糖和/或糖醇。在优选实施方案中，所述制剂包含约3％和约5％之间的糖和/或糖醇。在具体实施方案中，所述制剂包含约4％的糖和/或糖醇。在一个实施方案中，糖和/或糖醇选自由蔗糖、海藻糖、甘露糖及其组合组成的组。在优选实施方案中，糖和/或糖醇是蔗糖和甘露醇的混合物。
在稳定化的低盐冻干的A13制剂的一个实施方案中，所述制剂包含约0.01％和约0.1％之间的非离子型表面活性剂。在优选实施方案中，所述制剂包含约0.05％的非离子型表面活性剂。在一个实施方案中，表面活性剂选自由聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80、Pluronic F-68和BRIJ 35组成的组。在优选实施方案中，表面活性剂是聚山梨醇酯80。
在稳定化的低盐冻干的A13制剂的一个实施方案中，所述制剂包含约5mM和约100mM之间的缓冲剂。在优选实施方案中，所述制剂包含约10mM和约50mM之间的缓冲剂。在另一个实施方案中，缓冲剂是组氨酸或HEPES。在优选实施方案中，缓冲剂是组氨酸。在一个实施方案中，所述制剂的pH在约6.5和7.5之间。在优选实施方案中，所述制剂的pH为7.0±0.2。
在稳定化的低盐冻干的A13制剂的一个实施方案中，所述制剂还包含约0.5μM和约20μM之间的锌。
在具体实施方案中，本发明提供了稳定化的低盐冻干的ADAMTS13(A13)制剂，其中所述制剂由包含以下的液体制剂冻干：(a)至少100个单位的ADAMTS13活性每mg ADAMTS13；(b)0至60mM的NaCl；(c)2mM至4mM的钙；(d)2％至4％的甘露醇；(e)0.5％至2％的蔗糖；(f)0.025至0.1％的聚山梨醇酯80；和(g)10mM至50mM的组氨酸(pH 7.0±0.2)。
IV.ADAMTS13制剂的稳定性
在某些实施方案中，本文提供的ADAMTS13制剂在储存在某些温度时，例如约-80℃、-20℃、4℃、18℃、室温、25℃、30℃、35℃、37℃、40℃或更高时，可稳定延长的时期。在某些实施方案中，延长的时期为至少约一周。在其它实施方案中，延长的时期可包括至少约2周，或至少约3周，或至少约1个月，或至少约2个月，或至少约3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、14、16或18个月。在其它实施方案中，本发明的制剂可稳定至少约2、3、4、5或更多年。
在本发明的某些实施方案中，稳定性可通过制剂中A13或rA13蛋白的一种或多种生物物理和/或酶性质来测定。可用于评价稳定性的性质的非限制性实例包括酶活性、比活性、蛋白的单分散性或多分散性的程度、蛋白的二聚、寡聚或聚集的程度、蛋白的解折叠程度。
本领域技术人员将容易了解可用于评价ADAMTS13制剂的稳定性的其它稳定性测量方法，包括但不限于，凝胶过滤、动态或静态光散射、分析超速离心、rp-HPLC、离子交换色谱法、傅里叶变换红外光谱法、量热法、差示扫描量热法、NMR光谱法、质谱法、小角度x-射线衍射(SAX)、聚丙烯酰胺凝胶电泳及类似方法。
在一个实施方案中，本发明提供了在储存延长的时期后保留至少约50％的总ADAMTS13活性的A13或rA13的制剂。在其它实施方案中，提供在储存延长的时期后保留至少约60％，或至少约70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％的总ADAMTS13活性的制剂。
在另一个实施方案中，提供在储存延长的时期后维持至少约50％的ADAMTS13比活性的制剂。在其它实施方案中，提供在储存延长的时期后保留至少约60％，或至少约70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的ADAMTS13比活性的制剂。
在其它实施方案中，本发明的制剂在储存延长的时期后将具有至少约600U的FRETS-VWF73活性每mg ADAMTS13蛋白的比活性。在其它实施方案中，本文提供的制剂在储存延长的时期后将具有至少约700U/mg A13，或至少约800U/mg、900U/mg、1000U/mg、1100U/mg、1200U/mg、1300U/mg、1400U/mg、1500U/mg或更高的比活性。
在一个实施方案中，本文提供的A13制剂在储存延长的时期后将具有小于约50％的多分散性，如通过动态光散射分析测定的。在其它实施方案中，A13制剂在储存延长的时期后将具有小于约45％，或小于约40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、5％的多分散性，如通过动态光散射分析测定的。
在本发明的另一个实施方案中，本文提供的A13制剂在储存延长的时期后将具有由至少约50％的A13单体组成的A13蛋白种群(protein population)。在其它实施方案中，所述制剂可具有至少约60％的A13单体，或至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高百分比的A13单体。
V.ADAMTS13表达和纯化
在某些实施方案中，用于本文提供的制剂中的ADAMTS13蛋白可根据先前公开的方法来表达、制备或纯化，例如US 6,926,894、US 2005/0266528、US 2007/0015703、US专利申请序列号12/437,384、U.S.专利申请序列号12/847,999、和WO 2002/42441，其全部为了所有目的通过引用整体并入本文。
A.宿主细胞和载体
可通过在任何适当的原核或真核宿主系统中表达来产生重组ADAMTS蛋白。真核细胞的实例包括但不限于哺乳动物细胞例如CHO、COS、HEK 293、BHK、SK-Hep和HepG2；昆虫细胞，例如SF9细胞、SF21细胞、S2细胞和High Five细胞；以及酵母细胞，例如酵母属(Saccharomyces)或裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)细胞。在一个实施方案中，所述ADAMTS蛋白可在细菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞、鸟类细胞、哺乳动物细胞等中表达。例如，在人细胞系、仓鼠细胞系或鼠细胞系中表达。在一个具体实施方案中，所述细胞系是CHO、BHK或HEK细胞系。在优选实施方案中，所述细胞系是CHO细胞系。
在一个实施方案中，所述细胞可以是可以优选在制造工艺(即，至少1升)中培养(以产生期望的ADAMTS蛋白例如ADAMTS13)的任何哺乳动物细胞。实例包括被SV40转化的猴肾CV1细胞系(COS-7，ATCC CRL 1651)；人胚胎肾细胞系(经亚克隆以在悬浮培养液中生长的293或293细胞，Graham等人，J.Gen Virol.，36：59(1977))；幼仓鼠肾细胞(BHK，ATCC CCL 10)；中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR，例如DUKX-B11亚克隆(CHO，Uriaub和Chasin，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，77：4216(1980))；小鼠塞尔托利细胞(TM4，Mather，Biol.Reprod，23：243-251(1980))；猴肾细胞(CV1ATCC CCL 70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)；人宫颈癌细胞(HeLa，ATCC CCL 2)；犬肾细胞(MDCK，ATCC CCL 34)；水牛大鼠肝细胞(BRL 3A，ATCC CRL 1442)；人肺细胞(W138，ATCC CCL 75)；人肝细胞(Hep G2，HB 8065)；小鼠乳腺癌(MMT 060562，ATCCCCL51)；TRI细胞(Mather等人，Annals N.Y.Acad.Sci.，383：44-68(1982))；MRC 5细胞；FS4细胞和人肝细胞瘤细胞系(Hep G2)。优选，所述细胞系是啮齿类动物细胞系，优选仓鼠细胞系例如CHO或BHK。
许多种载体可用于表达ADAMTS蛋白(例如，ADAMTS13)并且可选自真核和原核表达载体。在某些实施方案中，包括用于表达ADAMTS蛋白(例如，ADAMTS13)的质粒载体。通常，将包含复制子和来源于与宿主细胞相容的物种的控制序列的质粒载体与此类宿主结合使用。载体可具有复制位点以及能够提供转化的细胞中的表型选择的标记序列。质粒可包含编码与一个或多个控制序列例如启动子有效连接的ADAMTS蛋白(例如，ADAMTS13)的核苷酸序列。
制备表达重组ADAMTS蛋白的稳定CHO细胞克隆的方法优选如下。用DHFR表达载体转染DHFR缺陷CHO细胞系DUKX-B11，以允许相关重组蛋白质表达，基本上如第5,250,421号美国专利(Kaufman等人，Genetics Institute，Inc.)中所描述的。通过在不含次黄嘌呤/胸苷(HT)的培养基中生长进行选择，通过在递增浓度的氨甲蝶呤中增殖细胞来实现编码重组ADAMTS蛋白和DHFR基因的表达的相关区域的扩增。适当时，可使CHO细胞系适应在无血清和/或蛋白质的培养基中生长，基本上如US 6,100,061(Reiter等人，lmmunoAktiengesellschaft)中所描述的。
在另一个优选实施方案中，稳定的HEK293细胞可通过用包含潮霉素选择标记的构建体转染，然后利用抗生素抗性选择转化体来制备。
某些病毒通过受体介导的内吞作用感染细胞或进入细胞以及整合入宿主细胞基因组并且稳定且高效地表达病毒基因的能力，已使它们成为用于将外源核酸转移进入细胞(例如，哺乳动物细胞)的吸引人的候选者。因此，在某些实施方案中，将病毒载体用于将编码ADAMTS蛋白(例如，ADAMTS13)的核苷酸序列引入宿主细胞以进行表达。病毒载体可包含编码与一个或多个控制序列例如启动子有效连接的ADAMTS蛋白(例如，ADAMTS13)的核苷酸序列。可选择地，病毒载体可以不包含控制序列，取而代之依赖于宿主细胞中的控制序列来驱动ADAMTS蛋白的表达。可用于递送核酸的病毒载体的非限定性实例包括腺病毒载体、AAV载体和逆转录病毒载体。
在一个实施方案中，腺病毒载体包括包含足以支持构建体的包装和最终表达已被克隆入其中的ADAMTS构建体的腺病毒序列的那些构建体。腺病毒载体允许引入高达7kb的外源序列(Grunhaus等人，Seminar in Virology，200(2)：535-546，1992))。
在另一个实施方案中，腺伴随病毒(AAV)可被用于将编码ADAMTS蛋白(例如，ADAMTS13)的核苷酸序列引入宿主细胞以进行表达。AAV系统先前已被描述并且在本领域通常是公知的(Kelleher和Vos，Biotechniques，17(6)：1110-7，1994；Cotten等人，Proc Natl Acad Sci USA，89(13)：6094-6098，1992；Curiel，Nat Immun，13(2-3)：141-64，1994；Muzyczka，Curr Top MicrobiolImmunol，158：97-129，1992)。关于rAAV载体的产生和用途的详细内容描述于例如第5,139,941和4,797,368号美国专利(为了所有目的将每一个专利通过引用整体并入本文)中。
在一个实施方案中，逆转录病毒表达载体可用于将编码ADAMTS蛋白(例如，ADAMTS13)的核苷酸序列引入宿主细胞以进行表达。这些系统先前已被描述并且在本领域通常是公知的(Mann等人，Cell，33：153-159，1983；Nicolas和Rubinstein，In：Vectors：A survey of molecular cloning vectors and their uses，Rodriguez和Denhardt编，Stoneham：Butterworth，pp.494-513，1988；Temin，In：Gene Transfer，Kucherlapati(ed.)，New York：Plenum Press，pp.149-188，1986)。在具体实施方案中，所述逆转录病毒载体是慢病毒载体(参见，例如，Naldini等人，Science，272(5259)：263-267，1996；Zufferey等人，Nat Biotechnol，15(9)：871-875，1997；Blomer等人，J Virol.，71(9)：6641-6649，1997；美国专利No.6,013,516和5,994,136)。
用于原核表达的载体的非限定性实例包括质粒例如pRSET、pET、pBAD等，其中用于原核表达载体的启动子包括lac、trc、trp、recA、araBAD等。用于真核表达的载体的实例包括：(i)对于酵母中的表达，载体例如pAO、pPIC、pYES、pMET，使用启动子例如AOX1、GAP、GAL1、AUG1等；(ii)对于昆虫细胞中的表达，载体例如pMT、pAc5、pIB、pMIB、pBAC等，使用启动子例如PH、p10、MT、Ac5、OpIE2、gp64、polh等，和(iii)对于哺乳动物细胞中的表达，载体例如pSVL、pCMV、pRc/RSV、pcDNA3、pBPV等，和来源于病毒系统例如痘苗病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒、逆转录病毒等的载体，使用启动子例如CMV、SV40、EF-1、UbC、RSV、ADV、BPV和β-？肌动蛋白。
在某些实施方案中，ADAMTS13的细胞培养表达可包括使用微载体。本发明提供了，除其它方面以外，大规模ADAMTS蛋白表达的方法。在某些实施方案中，可在适合于提供高容积-比培养表面积以获得高细胞密度和蛋白质表达的条件下在大生物反应器中进行所述实施方案的细胞培养。提供此类生长条件的一个方法是在搅拌的罐生物反应器中使用微载体来进行细胞培养。在另一个实施方案中，这些生长要求通过使用悬浮细胞培养来满足。
B.培养方法
在某些实施方案中，ADAMTS13表达可包括使用在分批或连续操作模式下操作的细胞培养系统。例如，当使用分批细胞培养时，可在单批、分批补料或重复分批模式下操作它们。同样地，可在例如灌注、恒浊或恒化模式下操作连续细胞培养。可在悬浮或附着条件下进行分批和连续细胞培养。当在悬浮条件下操作时，可游离地悬浮细胞，将其混合在培养基中。可选择地，在附着条件下，可将细胞与固相例如微载体、多孔微载体、盘载体(disk carrier)、陶瓷筒(ceramic cartridge)、中空纤维、扁平薄片(flat sheet)、凝胶基质等结合。
分批培养通常是其中将细胞接种物在罐或发酵罐中培养至最大密度，然后作为单批进行收获和处理的大规模细胞培养。分批补料培养，其通常为用新鲜营养物(例如，生长限定基质(growth-limiting substrate))或添加剂(例如，产物前体)补充的分批培养。进料溶液通常被高度浓缩以避免生物反应器的稀释。在重复分批培养中，将细胞置于培养基中并且生长至所需的细胞密度。为了避免衰退期和细胞死亡的发生，随后在细胞达到它们的最大浓度之前用完全生长培养基稀释培养物。稀释的量和频率变化很大并且取决于细胞系的生长特征和培养方法的方便性。可按要求重复所述方法多次，并且在传代培养时，除非弃去细胞和培养基，否则随着每一次稀释进行，培养物的容积将逐步增加。可通过使反应器具有足够大的大小来允许在容器内进行稀释或通过将稀释的培养物分入几个容器来处理递增的体积。该类型的培养的原理是将细胞维持在指数生长状态。连续传代培养的特征在于培养物的容积总是逐步增加，可存在多次收获，细胞持续生长并且只要需要该过程可持续进行。在某些实施方案中，可在收获分批培养物的上清液后回收ADAMTS蛋白(例如，ADAMTS13)。
连续培养可以是通过流入新鲜培养基连续提供营养物的悬浮培养，其中培养容积通常通过废培养基的伴随性去除来保持恒定。在恒化和恒浊法中，提取的培养基包含细胞。因此，保留在细胞培养容器中的细胞必须生长至维持稳定状态。在恒化法中，生长速率通常通过控制稀释速率即加入新鲜培养的速率来进行控制。可通过改变稀释速率将培养中细胞的生长速率控制在例如次最大生长速率。相反地，在恒浊法中，设置稀释速率以允许细胞可在给定的操作条件例如pH和温度下实现的最大生长速率。
在灌注培养中，通过例如过滤或通过离心方法(该方法导致细胞至培养基的重新引入)使提取的培养基耗尽保留在培养容器中的细胞。然而，通常地用于过滤的膜不保留100％的细胞，因此当提取培养基时，一部分细胞被除去。以极高的生长速率操作灌注培养可以不是至关重要的，因为大部分细胞保留在培养容器中。
搅拌罐反应器系统可用于在悬浮或附着模式下操作的分批和连续细胞培养。通常，可操作搅拌罐反应器系统，如具有任何类型的搅拌器例如Rushton、水翼(hydrofoil)、斜叶(pitched blade)或marine的任何常规搅拌罐反应器。
C.培养基
ADAMTS13可在无外源添加的蛋白的培养基中表达。“无蛋白质培养基”和相关术语是指不存在来自对于培养物中的细胞是外源的来源或除所述细胞外的来源的蛋白质的培养基，所述细胞在生长过程中天然流出蛋白质。在一个实施方案中，ADAMTS13蛋白可在培养基中表达，所述培养基不含外源添加的蛋白质(即，无蛋白质)并且补充有锌、钙和/或烟酰胺(维生素B3)。在某些实施方案中，无蛋白质的培养基包含多胺。例如，以至少2mg/L，或为或约为2mg/L至30mg/L，或为或约为2mg/L至8mg/L的浓度。在具体实施方案中，所述多胺是腐胺。在第6,171,825号和6,936,441号美国专利、WO2007/077217、第2008/0009040号和第2007/0212770号美国专利申请公布、以及美国专利申请序列号12/847,999(其公开内容为了所有目的通过引用整体并入本文)中教导了示例性无蛋白质培养基。
制备无动物蛋白质且化学成分确定的培养基的方法在本领域中，例如在第6,171,825和6,936,441号美国专利、WO 2007/077217和第2008/0009040号和第2007/0212770号美国专利申请公布(其公开内容为了所有目的通过引用整体并入本文)中是已知的。在一个实施方案中，用于表达ADAMTS13蛋白的培养基是无动物蛋白质或无寡肽培养基。在某些实施方案中，培养基可以是化学成分确定的。在某些实施方案中，培养基可以以约0.5mg/L至约10mg/L的浓度包含至少一种多胺。
ADAMTS13蛋白还可以在不含外源添加的寡肽的培养基中表达。在一个实施方案中，ADAMTS13在培养基中表达，所述培养基不含外源添加的寡肽(即，无多肽)并且补充有锌、钙和/或烟酰胺(维生素B3)。在某些实施方案中，所述无寡肽培养基包含多胺。例如，以至少2mg/L，或为或约为2mg/L至30mg/L，或为或约为2mg/L至8mg/L的浓度。在具体实施方案中，所述多胺是腐胺。在第6,171,825号和6,936,441号美国专利、WO 2007/077217、第2008/0009040号和第2007/0212770号美国专利申请公布、以及美国专利申请序列号12/847,999(其公开内容为了所有目的通过引用整体并入本文)中教导了示例性无寡肽培养基。
ADAMTS13蛋白还可以在不含血清的培养基中表达。在一个实施方案中，ADAMTS13在培养基中表达，所述培养基不含外源添加的血清(即，无血清)并且补充有锌、钙和/或烟酰胺(维生素B3)。在某些实施方案中，所述无血清培养基包含多胺。例如，以至少2mg/L，或为或约为2mg/L至30mg/L，或为或约为2mg/L至8mg/L的浓度。在具体实施方案中，所述多胺是腐胺。在第6,171,825号和6,936,441号美国专利、WO 2007/077217、第2008/0009040号和第2007/0212770号美国专利申请公布、以及美国专利申请序列号12/847,999(其公开内容为了所有目的通过引用整体并入本文)中教导了示例性无血清培养基。
ADAMTS13蛋白还可以在不含动物蛋白质的培养基中表达。在一个实施方案中，ADAMTS13在培养基中表达，所述培养基不含外源添加的动物蛋白质或多肽(即，无动物蛋白质)并且补充有锌、钙和/或烟酰胺(维生素B3)。在某些实施方案中，所述无动物蛋白质培养基包含多胺。例如，以至少2mg/L，或为或约为2mg/L至30mg/L，或为或约为2mg/L至8mg/L的浓度。在具体实施方案中，所述多胺是腐胺。在第6,171,825号和6,936,441号美国专利、WO 2007/077217、第2008/0009040号和第2007/0212770号美国专利申请公布、以及美国专利申请序列号12/847,999(其公开内容为了所有目的通过引用整体并入本文)中教导了示例性无动物蛋白质培养基。
ADAMTS13蛋白还可以在补充有额外的钙、锌和/或维生素B3的培养基中表达，如美国专利申请序列号12/847,999中所述，为了所有目的将该专利申请的公开内容通过引用整体并入本文。在某些实施方案中，培养基可以是无动物蛋白质的、无寡肽的或化学成分确定的培养基。在某些实施方案中，按照第6,171,825和6,936,441号美国专利、WO 2007/077217和第2008/0009040和第2007/0212770号美国专利申请公布(其公开内容为了所有目的通过引用整体并入本文)中所教导的制备无动物蛋白质或无寡肽培养基，并且所述培养基补充有额外的钙、锌和/或维生素B3。在具体实施方案中，化学成分确定的培养基可与达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM)相似，所述化学成分确定的培养基已补充了额外的钙、锌和/或维生素B3，以增加在于所述培养基中培养的细胞中表达的ADAMTS蛋白的比活性。在其它实施方案中，培养基不含动物成分。在另一个实施方案中，培养基包含蛋白质，例如来自血清例如胎牛血清的动物蛋白质。在另一个实施方案中，培养基具有外源添加的重组蛋白质。在另一个实施方案中，所述蛋白质来自经检验无病原体的动物。
D.ADAMTS13纯化
用于对来自混合的血清的天然ADAMTS13纯化的方法是本领域中众所周知的。同样，用于重组ADAMTS13的表达和纯化的方法也是本领域公知的。例如，由Plaimauer和Scheiflinger，Semin Hematol.2004Jan；41(1)：24-33；Plaimauer B等人，F.Blood.2002Nov 15；100(10)：3626-32.Epub 2002Jul 12；Bruno K等人，J Thromb Haemost.2005May；3(5)：1064-73和美国专利申请序列号12/847,999(其公开内容为了所有目的通过引用以其整体明确地全部并入)教导了重组表达和纯化。
此外，本公开内容提供了用于纯化重组ADAMTS13的另外的方法。在一个实施方案中，重组ADAMTS13在重组CHO细胞中表达并通过POROS HS阳离子交换色谱法从所得的条件培养基中纯化。为了消除不期望的二聚的、单体的和/或聚集的ADAMTS13，组合物接着经历尺寸排阻凝胶过滤。ADAMTS13组合物通常还将经历至少一个，优选两个病毒去除或灭活步骤。
在某些实施方案中，本文中提供的用于制备ADAMTS13制剂的方法还包括至少一个病毒灭活或去除步骤。在某些实施方案中，本文中提供的方法可包括至少两个或至少三个病毒灭活或去除步骤。可与本文中提供的方法一起使用的病毒灭活或去除步骤的非限定性实例包括溶剂去垢剂处理(Horowitz等人，Blood Coagul Fibrinolysis 1994(5Suppl 3)：S21-S28和Kreil等人，Transfusion2003(43)：1023-1028，为了所有目的将所述文献的公开内容通过引用明确地整体并入本文)、纳米过滤(Hamamoto等人，Vox Sang 1989(56)230-236和Yuasa等人，J Gen Virol.1991(72(pt 8))：2021-2024，为了所有目的将所述文献的公开内容通过引用明确地整体并入本文)。在优选实施方案中，本发明提供了用于制备ADAMTS13制剂的方法，所述方法包括溶剂去垢剂处理和纳米过滤。
在一个实施方案中，提供了一种用于提供病毒上安全的ADAMTS13蛋白制剂，所述方法包括以下步骤：(a)在培养基中培养具有编码ADAMTS13蛋白的核酸的细胞；(b)回收一部分包含ADAMTS13蛋白的培养基上清液；(c)利用层析步骤富集ADAMTS13蛋白；(d)进行至少一个病毒灭活或去除步骤；和(e)根据本文提供的制剂配制富集的ADAMTS13组合物，由此提供病毒上安全的ADAMTS13制剂。在一个实施方案中，培养基包含锌、钙和任选地烟酰胺(维生素B3)。在优选实施方案中，培养细胞的步骤包括连续培养(例如，灌注或恒化培养)。在另一个优选实施方案中，将培养物维持在34℃至37℃的温度下。在另一个优选实施方案中，将培养物维持在6.9至7.2的pH下。在一个实施方案中，病毒去除步骤是纳米过滤。
在一方面的实施方案中，本发明提供了用于制造稳定化的ADAMTS13制剂的方法，所述方法包括以下步骤：(a)在含有约2μM至约12μM浓度的锌和约0.5mM至约1.5mM的浓度的钙的培养基中培养的细胞中表达ADAMTS13蛋白或其生物活性衍生物；(b)纯化该ADAMTS13蛋白；和(c)制备根据本文提供的制剂中的任一种的制剂。
在一个实施方案中，本发明提供了用于制造稳定化的ADAMTS13制剂的方法，所述方法包括以下步骤：(i)在含有约2μM至约12μM浓度的锌和约0.5mM至约1.5mM的浓度的钙的培养基中培养的细胞中表达ADAMTS13蛋白或其生物活性衍生物；(ii)纯化该ADAMTS13蛋白；和(iii)制备包含以下的制剂：(a)至少100个单位的ADAMTS13活性(即，FRETS-vWF73活性)每mgADAMTS13；(b)0mM至200mM的药学上可接受的盐；(c)0.5mM至20mM的钙；(d)糖和/或糖醇；(e)非离子型表面活性剂；和(f)用于维持pH在6.0和8.0之间的缓冲剂。在一个实施方案中，稳定化的ADAMTS13制剂包含至少200个单位的A13活性每mg ADAMTS13。在另一个实施方案中，稳定化的ADAMTS13制剂包含至少400个单位的A13活性每mgADAMTS13。在优选实施方案中，稳定化的ADAMTS13制剂包含至少600个单位的A13活性每mg ADAMTS13。在更优选的实施方案中，稳定化的ADAMTS13制剂包含至少800个单位的A13活性每mg ADAMTS13。在另一个优选实施方案中，稳定化的ADAMTS13制剂包含至少1000个单位的A13活性每mg ADAMTS13。在一个实施方案中，稳定化的ADAMTS13制剂包含约100个单位和约2000个单位之间的ADAMTS13活性每mg ADAMTS13。
在稳定化的A13制剂的一个实施方案中，所述制剂包含约1.0mM和约10.0mM之间的钙。在优选实施方案中，所述制剂包含约2.0和约4.0mM之间的钙。
在稳定化的A13制剂的另一个实施方案中，所述制剂包含约2％和约6％之间的糖和/或糖醇。在优选实施方案中，所述制剂包含约3％和约5％之间的糖和/或糖醇。在具体实施方案中，所述制剂包含约4％的糖和/或糖醇。在一个实施方案中，糖和/或糖醇选自由蔗糖、海藻糖、甘露糖及其组合组成的组。在优选实施方案中，糖和/或糖醇是蔗糖和甘露醇的混合物。
在稳定化的A13制剂的一个实施方案中，所述制剂包含约0.01％和约0.1％之间的非离子型表面活性剂。在优选实施方案中，所述制剂包含约0.05％的非离子型表面活性剂。在一个实施方案中，表面活性剂选自由聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80、Pluronic F-68和BRIJ 35组成的组。在优选实施方案中，表面活性剂是聚山梨醇酯80。
在稳定化的A13制剂的一个实施方案中，所述制剂包含约5mM和约100mM之间的缓冲剂。在优选实施方案中，所述制剂包含约10mM和约50mM之间的缓冲剂。在另一个实施方案中，缓冲剂是组氨酸或HEPES。在优选实施方案中，缓冲剂是组氨酸。在一个实施方案中，所述制剂的pH在约6.5和7.5之间。在优选实施方案中，所述制剂的pH为7.0±0.2。
在稳定化的A13制剂的一个实施方案中，所述制剂还包含约0.5μM和约20μM之间的锌。
在具体实施方案中，本发明提供了稳定化的ADAMTS13(A13)制剂，其包含(a)至少100个单位的ADAMTS13活性每mg ADAMTS13；(b)0至200mM的NaCl；(c)2mM至4mM的钙；(d)2％至4％的甘露醇；(e)0.5％至2％的蔗糖；(f)0.025至0.1％的聚山梨醇酯80；和(g)10mM至50mM的组氨酸(pH 7.0±0.2)。
在一个实施方案中，本发明提供了用于制造稳定化的ADAMTS13制剂的方法，所述方法包括以下步骤：(i)在含有约2μM至约12μM浓度的锌和约0.5mM至约1.5mM的浓度的钙的培养基中培养的细胞中表达ADAMTS13蛋白或其生物活性衍生物；(ii)纯化该ADAMTS13蛋白；和(iii)制备包含以下的制剂：(a)至少100个单位的ADAMTS13活性(即，FRETS-vWF73活性)每mgADAMTS13；(b)0mM至100mM的药学上可接受的盐；(c)0.5mM至20mM的钙；(d)糖和/或糖醇；(e)非离子型表面活性剂；和(f)用于维持pH在6.0和8.0之间的缓冲剂。在一个实施方案中，稳定化的ADAMTS13制剂包含至少200个单位的A13活性每mg ADAMTS13。在另一个实施方案中，稳定化的ADAMTS13制剂包含至少400个单位的A13活性每mg ADAMTS13。在优选实施方案中，稳定化的ADAMTS13制剂包含至少600个单位的A13活性每mg ADAMTS13。在更优选的实施方案中，稳定化的ADAMTS13制剂包含至少800个单位的A13活性每mg ADAMTS13。在另一个优选实施方案中，稳定化的ADAMTS13制剂包含至少1000个单位的A13活性每mgADAMTS13。在一个实施方案中，稳定化的ADAMTS13制剂包含约100个单位和约2000个单位之间的ADAMTS13活性每mg ADAMTS13。
在稳定化的低盐A13制剂的一个实施方案中，所述制剂包含约1.0mM和约10.0mM之间的钙。在优选实施方案中，所述制剂包含约2.0和约4.0mM之间的钙。
在稳定化的低盐A13制剂的另一个实施方案中，所述制剂包含约2％和约6％之间的糖和/或糖醇。在优选实施方案中，所述制剂包含约3％和约5％之间的糖和/或糖醇。在具体实施方案中，所述制剂包含约4％的糖和/或糖醇。在一个实施方案中，糖和/或糖醇选自由蔗糖、海藻糖、甘露糖及其组合组成的组。在优选实施方案中，糖和/或糖醇是蔗糖和甘露醇的混合物。
在稳定化的低盐A13制剂的一个实施方案中，所述制剂包含约0.01％和约0.1％之间的非离子型表面活性剂。在优选实施方案中，所述制剂包含约0.05％的非离子型表面活性剂。在一个实施方案中，表面活性剂选自由聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80、Pluronic F-68和BRIJ 35组成的组。在优选实施方案中，表面活性剂是聚山梨醇酯80。
在稳定化的低盐A13制剂的一个实施方案中，所述制剂包含约5mM和约100mM之间的缓冲剂。在优选实施方案中，所述制剂包含约10mM和约50mM之间的缓冲剂。在另一个实施方案中，缓冲剂是组氨酸或HEPES。在优选实施方案中，缓冲剂是组氨酸。在一个实施方案中，所述制剂的pH在约6.5和7.5之间。在优选实施方案中，所述制剂的pH为7.0±0.2。
在稳定化的低盐A13制剂的一个实施方案中，所述制剂还包含约0.5μM和约20μM之间的锌。
在具体实施方案中，本发明提供了稳定化的低盐ADAMTS13(A13)制剂，其包含(a)至少100个单位的ADAMTS13活性每mg ADAMTS13；(b)0至60mM的NaCl；(c)2mM至4mM的钙；(d)2％至4％的甘露醇；(e)0.5％至2％的蔗糖；(f)0.025至0.1％的聚山梨醇酯80；和(g)10mM至50mM的组氨酸(pH 7.0±0.2)。
在一个实施方案中，本发明提供了用于制造稳定化的ADAMTS13制剂的方法，所述方法包括以下步骤：(i)在含有约2μM至约12μM浓度的锌和约0.5mM至约1.5mM的浓度的钙的培养基中培养的细胞中表达ADAMTS13蛋白或其生物活性衍生物；(ii)纯化该ADAMTS13蛋白；和(iii)制备包含以下的制剂：(a)至少100个单位的ADAMTS13活性(即，FRETS-vWF73活性)每mgADAMTS13；(b)0mM至200mM的药学上可接受的盐；(c)0.5mM至20mM的钙；(d)糖和/或糖醇；(e)非离子型表面活性剂；和(f)用于维持pH在6.0和8.0之间的缓冲剂。在一个实施方案中，稳定化的ADAMTS13制剂包含至少200个单位的A13活性每mg ADAMTS13。在另一个实施方案中，稳定化的ADAMTS13制剂包含至少400个单位的A13活性每mg ADAMTS13。在优选实施方案中，稳定化的ADAMTS13制剂包含至少600个单位的A13活性每mg ADAMTS13。在更优选的实施方案中，稳定化的ADAMTS13制剂包含至少800个单位的A13活性每mg ADAMTS13。在另一个优选实施方案中，稳定化的ADAMTS13制剂包含至少1000个单位的A13活性每mgADAMTS13。在一个实施方案中，稳定化的ADAMTS13制剂包含约100个单位和约2000个单位之间的ADAMTS13活性每mg ADAMTS13。
在稳定化的冻干的A13制剂的一个实施方案中，所述制剂包含约1.0mM和约10.0mM之间的钙。在优选实施方案中，所述制剂包含约2.0和约4.0mM之间的钙。
在稳定化的冻干的A13制剂的另一个实施方案中，所述制剂包含约2％和约6％之间的糖和/或糖醇。在优选实施方案中，所述制剂包含约3％和约5％之间的糖和/或糖醇。在具体实施方案中，所述制剂包含约4％的糖和/或糖醇。在一个实施方案中，糖和/或糖醇选自由蔗糖、海藻糖、甘露糖及其组合组成的组。在优选实施方案中，糖和/或糖醇是蔗糖和甘露醇的混合物。
在稳定化的冻干的A13制剂的一个实施方案中，所述制剂包含约0.01％和约0.1％之间的非离子型表面活性剂。在优选实施方案中，所述制剂包含约0.05％的非离子型表面活性剂。在一个实施方案中，表面活性剂选自由聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80、Pluronic F-68和BRIJ 35组成的组。在优选实施方案中，表面活性剂是聚山梨醇酯80。
在稳定化的冻干的A13制剂的一个实施方案中，所述制剂包含约5mM和约100mM之间的缓冲剂。在优选实施方案中，所述制剂包含约10mM和约50mM之间的缓冲剂。在另一个实施方案中，缓冲剂是组氨酸或HEPES。在优选实施方案中，缓冲剂是组氨酸。在一个实施方案中，所述制剂的pH在约6.5和7.5之间。在优选实施方案中，所述制剂的pH为7.0±0.2。
在稳定化的冻干的A13制剂的一个实施方案中，所述制剂还包含约0.5μM和约20μM之间的锌。
在具体实施方案中，本发明提供了稳定化的冻干的ADAMTS13(A13)制剂，其中所述制剂由包含以下的液体制剂冻干：(a)至少100个单位的ADAMTS13活性每mgADAMTS13；(b)0至200mM的NaCl；(c)2mM至4mM的钙；(d)2％至4％的甘露醇；(e)0.5％至2％的蔗糖；(f)0.025至0.1％的聚山梨醇酯80；和(g)10mM至50mM的组氨酸(pH 7.0±0.2)。
在一个实施方案中，本发明提供了用于制造稳定化的ADAMTS13制剂的方法，所述方法包括以下步骤：(i)在含有约2μM至约12μM浓度的锌和约0.5mM至约1.5mM的浓度的钙的培养基中培养的细胞中表达ADAMTS13蛋白或其生物活性衍生物；(ii)纯化该ADAMTS13蛋白；和(iii)制备包含以下的制剂：(a)至少100个单位的ADAMTS13活性(即，FRETS-vWF73活性)每mgADAMTS13；(b)0mM至100mM的药学上可接受的盐；(c)0.5mM至20mM的钙；(d)糖和/或糖醇；(e)非离子型表面活性剂；和(f)用于维持pH在6.0和8.0之间的缓冲剂。在一个实施方案中，稳定化的ADAMTS13制剂包含至少200个单位的A13活性每mg ADAMTS13。在另一个实施方案中，稳定化的ADAMTS13制剂包含至少400个单位的A13活性每mg ADAMTS13。在优选实施方案中，稳定化的ADAMTS13制剂包含至少600个单位的A13活性每mg ADAMTS13。在更优选的实施方案中，稳定化的ADAMTS13制剂包含至少800个单位的A13活性每mg ADAMTS13。在另一个优选实施方案中，稳定化的ADAMTS13制剂包含至少1000个单位的A13活性每mgADAMTS13。在一个实施方案中，稳定化的ADAMTS13制剂包含约100个单位和约2000个单位之间的ADAMTS13活性每mg ADAMTS13。
在稳定化的低盐冻干的A13制剂的一个实施方案中，所述制剂包含约1.0mM和约10.0mM之间的钙。在优选实施方案中，所述制剂包含约2.0和约4.0mM之间的钙。
在稳定化的低盐冻干的A13制剂的另一个实施方案中，所述制剂包含约2％和约6％之间的糖和/或糖醇。在优选实施方案中，所述制剂包含约3％和约5％之间的糖和/或糖醇。在具体实施方案中，所述制剂包含约4％的糖和/或糖醇。在一个实施方案中，糖和/或糖醇选自由蔗糖、海藻糖、甘露糖及其组合组成的组。在优选实施方案中，糖和/或糖醇是蔗糖和甘露醇的混合物。
在稳定化的低盐冻干的A13制剂的一个实施方案中，所述制剂包含约0.01％和约0.1％之间的非离子型表面活性剂。在优选实施方案中，所述制剂包含约0.05％的非离子型表面活性剂。在一个实施方案中，表面活性剂选自由聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80、Pluronic F-68和BRIJ 35组成的组。在优选实施方案中，表面活性剂是聚山梨醇酯80。
在稳定化的低盐冻干的A13制剂的一个实施方案中，所述制剂包含约5mM和约100mM之间的缓冲剂。在优选实施方案中，所述制剂包含约10mM和约50mM之间的缓冲剂。在另一个实施方案中，缓冲剂是组氨酸或HEPES。在优选实施方案中，缓冲剂是组氨酸。在一个实施方案中，所述制剂的pH在约6.5和7.5之间。在优选实施方案中，所述制剂的pH为7.0±0.2。
在稳定化的低盐冻干的A13制剂的一个实施方案中，所述制剂还包含约0.5μM和约20μM之间的锌。
在具体实施方案中，本发明提供了稳定化的低盐冻干的ADAMTS13(A13)制剂，其中所述制剂由包含以下的液体制剂冻干：(a)至少100个单位的ADAMTS13活性每mg ADAMTS13；(b)0至60mM的NaCl；(c)2mM至4mM的钙；(d)2％至4％的甘露醇；(e)0.5％至2％的蔗糖；(f)0.025至0.1％的聚山梨醇酯80；和(g)10mM至50mM的组氨酸(pH 7.0±0.2)。
1.溶剂和去垢剂(S/D)处理
为了灭活可存在于ADAMTS13制剂中的各种病毒污染物，一种或多种ADAMTS13中间溶液可经历溶剂去垢剂(S/D)处理。用于溶液的去垢剂处理的方法在本领域是公知的(关于综述参见，Pelletier JP等人，Best Pract Res ClinHaematol.2006；19(1)：205-42，为了所有目的将所述文献的公开内容通过引用明确地整体并入本文)。通常，可将任何标准S/D处理与本文中提供的方法结合使用。例如，下面提供用于S/D处理的示例性方法。
在一个实施方案中，将Triton X-100、Tween-20和磷酸三(正-丁基)酯(TNBP)以分别为或约为1.0％、0.3％和0.3％的终浓度加入ADAMTS13中间溶液。随后在或约在18℃至25℃的温度下搅拌混合物，进行至少约1小时。
2.纳米过滤和超滤/渗滤
为了减少本文中提供的ADAMTS13蛋白制剂的病毒载量，可使用适当的纳米过滤设备对制剂或中间体组合物进行纳米过滤。在某些实施方案中，纳米过滤设备可具有为或约为15nm至200nm的平均孔径。适合用于该用途的纳米过滤的实例包括但不限于DVD、DV 50、DV 20(Pall)、Viresolve Viresolve(Millipore)、15N、20N、35N和75N(Planova)。在具体实施方案中，纳米过滤可具有为或约为15至72nm，或为或约为19至35nm，或为或约为15nm、19nm、20nm、35nm或72nm的平均孔径。在优选实施方案中，纳米过滤可具有为或约为19nm、20nm或35nm的平均孔径，例如Asahi20N或35N滤器或其等同物。
在纳米过滤后，可任选地利用超滤和/或通过渗滤调整的缓冲液组合物浓缩滤液。在某些实施方案中，利用开放通道筛选(open channel screen)在盒(cassette)中进行超滤，并且超滤膜具有小于为或约为175kDa或小于为或约为170、160、150、140、130、120、110、100、90、80、70、60、50、40、30或更小的kDa的标称截留分子量(NMWCO)。在优选实施方案中，超滤膜具有不超过30kDa的NMWCO。在另一个优选实施方案中，超滤膜具有不超过30kDa的NMWCO。
3.冻干法和热处理
在其它实施方案中，可通过热处理冻干的组合物来进一步减小先前可能已经历其它病毒灭活或去除步骤例如纳米过滤的冻干的ADAMTS13蛋白(例如，ADAMTS13)的病毒活性。用于灭活血液因子中的病毒载量的热处理在本领域是公知的(例如，参见，Piszkiewicz等人，Thromb Res.1987Jul 15；47(2)：235-41；Piszkiewicz等人，Curr Stud Hematol Blood Transfus.1989；(56)：44-54；Epstein和Fricke，Arch Pathol Lab Med.1990Mar；114(3)：335-40)。
VI.施用和处理方法
所述制剂可被施用用于治疗性或预防性治疗。通常，对于治疗性应用，所述制剂以“治疗有效剂量”被施用于患有与ADAMTS13或VWF机能障碍相关的疾病或病况或在其它方面需要其的受治疗者。对这些用途有效的制剂和量将取决于疾病或病况的严重性和患者健康的一般状态。取决于患者所需要和所耐受的剂量和频率来施用制剂的单次施用或多次施用。
为本发明的目的的“患者”或“受治疗者”包括人和其它动物，特别是哺乳动物。因此，所述的组合物、制剂和方法可应用于人治疗和兽医应用。在特定的实施方案中，患者是哺乳动物，而在一个实施方案中是人。用于与ADAMTS13或VWF机能障碍相关的病况的其它已知的治疗和疗法可与本发明提供的制剂和方法结合使用。
在本发明的一个方面，提供了制备具有高比活性的稳定化的rA13制剂的方法。在一个实施方案中，所述方法包括以下步骤：在含有约2μM至约12μM浓度的锌和约0.5mM至约1.5mM的浓度的钙的培养基中培养的细胞中表达ADAMTS13蛋白或其生物活性衍生物，纯化该ADAMTS13蛋白，和制备如上所述的制剂。在某些实施方案中，培养基还补充有约1mg/L至约20mg/mL的浓度的维生素B3。
在另一方面，本发明提供了治疗或预防与ADAMTS13或VWF机能障碍相关的疾病或病况的方法。在另一个实施方案中，本发明提供了治疗或预防与一种或多种血栓的形成/存在相关的疾病或病况。在另一个实施方案中，本发明提供了瓦解在需要其的受治疗者中的一种或多种血栓的方法。在其它实施方案中，本发明提供了治疗或预防在需要其的受治疗者中的梗塞的方法。通常，本发明提供的方法包括将本文提供的ADAMTS13制剂施用于需要其的受治疗者。
与一种或多种血栓的形成/存在相关的病症的非限制性实例是血栓性血小板减少性紫癜(TTP)、获得性TTP、动脉栓塞、急性心肌梗塞(AMI)、中风、败血症和弥漫性血管内凝血(DIC)。
与梗塞相关的病症的非限制性实例包括但不限于心肌梗塞(心脏病发作)、肺栓塞、脑血管事件如中风、外周动脉闭塞性疾病(例如坏疽)、抗磷脂综合征、败血症、巨细胞性动脉炎(GCA)、疝气和肠扭转。
A.用于ADAMTS13和VWF机能障碍的治疗和预防
在一方面的实施方案中，本发明提供了用于治疗或预防与ADAMTS13或VWF机能障碍相关的疾病或病况的方法，所述方法包括将根据本文提供的制剂中的任一种的ADAMTS13制剂施用于需要其的受治疗者。
在一个实施方案中，本发明提供了用于治疗或预防与ADAMTS13或VWF机能障碍相关的疾病或病况的方法，所述方法包括将ADAMTS13制剂施用于需要其的受治疗者，所述ADAMTS13制剂包含(a)至少100个单位的ADAMTS13活性(即，FRETS-vWF73活性)每mg ADAMTS13；(b)0mM至200mM的药学上可接受的盐；(c)0.5mM至20mM的钙；(d)糖和/或糖醇；(e)非离子型表面活性剂；和(f)用于维持pH在6.0和8.0之间的缓冲剂。在一个实施方案中，稳定化的ADAMTS13制剂包含至少200个单位的A13活性每mg ADAMTS13。在另一个实施方案中，稳定化的ADAMTS13制剂包含至少400个单位的A13活性每mg ADAMTS13。在优选实施方案中，稳定化的ADAMTS13制剂包含至少600个单位的A13活性每mg ADAMTS13。在更优选的实施方案中，稳定化的ADAMTS13制剂包含至少800个单位的A13活性每mg ADAMTS13。在另一个优选实施方案中，稳定化的ADAMTS13制剂包含至少1000个单位的A13活性每mg ADAMTS13。在一个实施方案中，稳定化的ADAMTS13制剂包含约100个单位和约2000个单位之间的ADAMTS13活性每mg ADAMTS13。
在稳定化的A13制剂的一个实施方案中，所述制剂包含约1.0mM和约10.0mM之间的钙。在优选实施方案中，所述制剂包含约2.0和约4.0mM之间的钙。
在稳定化的A13制剂的另一个实施方案中，所述制剂包含约2％和约6％之间的糖和/或糖醇。在优选实施方案中，所述制剂包含约3％和约5％之间的糖和/或糖醇。在具体实施方案中，所述制剂包含约4％的糖和/或糖醇。在一个实施方案中，糖和/或糖醇选自由蔗糖、海藻糖、甘露糖及其组合组成的组。在优选实施方案中，糖和/或糖醇是蔗糖和甘露醇的混合物。
在稳定化的A13制剂的一个实施方案中，所述制剂包含约0.01％和约0.1％之间的非离子型表面活性剂。在优选实施方案中，所述制剂包含约0.05％的非离子型表面活性剂。在一个实施方案中，表面活性剂选自由聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80、Pluronic F-68和BRIJ 35组成的组。在优选实施方案中，表面活性剂是聚山梨醇酯80。
在稳定化的A13制剂的一个实施方案中，所述制剂包含约5mM和约100mM之间的缓冲剂。在优选实施方案中，所述制剂包含约10mM和约50mM之间的缓冲剂。在另一个实施方案中，缓冲剂是组氨酸或HEPES。在优选实施方案中，缓冲剂是组氨酸。在一个实施方案中，所述制剂的pH在约6.5和7.5之间。在优选实施方案中，所述制剂的pH为7.0±0.2。
在稳定化的A13制剂的一个实施方案中，所述制剂还包含约0.5μM和约20μM之间的锌。
在具体实施方案中，本发明提供了稳定化的ADAMTS13(A13)制剂，其包含(a)至少100个单位的ADAMTS13活性每mg ADAMTS13；(b)0至200mM的NaCl；(c)2mM至4mM的钙；(d)2％至4％的甘露醇；(e)0.5％至2％的蔗糖；(f)0.025至0.1％的聚山梨醇酯80；和(g)10mM至50mM的组氨酸(pH 7.0±0.2)。
在一个实施方案中，本发明提供了用于治疗或预防与ADAMTS13或VWF机能障碍相关的疾病或病况的方法，所述方法包括将ADAMTS13制剂施用于需要其的受治疗者，所述ADAMTS13制剂包含(a)至少100个单位的ADAMTS13活性(即，FRETS-vWF73活性)每mg ADAMTS13；(b)0mM至100mM的药学上可接受的盐；(c)0.5mM至20mM的钙；(d)糖和/或糖醇；(e)非离子型表面活性剂；和(f)用于维持pH在6.0和8.0之间的缓冲剂。在一个实施方案中，稳定化的ADAMTS13制剂包含至少200个单位的A13活性每mg ADAMTS13。在另一个实施方案中，稳定化的ADAMTS13制剂包含至少400个单位的A13活性每mg ADAMTS13。在优选实施方案中，稳定化的ADAMTS13制剂包含至少600个单位的A13活性每mg ADAMTS13。在更优选的实施方案中，稳定化的ADAMTS13制剂包含至少800个单位的A13活性每mg ADAMTS13。在另一个优选实施方案中，稳定化的ADAMTS13制剂包含至少1000个单位的A13活性每mg ADAMTS13。在一个实施方案中，稳定化的ADAMTS13制剂包含约100个单位和约2000个单位之间的ADAMTS13活性每mg ADAMTS13。
在稳定化的低盐A13制剂的一个实施方案中，所述制剂包含约1.0mM和约10.0mM之间的钙。在优选实施方案中，所述制剂包含约2.0和约4.0mM之间的钙。
在稳定化的低盐A13制剂的另一个实施方案中，所述制剂包含约2％和约6％之间的糖和/或糖醇。在优选实施方案中，所述制剂包含约3％和约5％之间的糖和/或糖醇。在具体实施方案中，所述制剂包含约4％的糖和/或糖醇。在一个实施方案中，糖和/或糖醇选自由蔗糖、海藻糖、甘露糖及其组合组成的组。在优选实施方案中，糖和/或糖醇是蔗糖和甘露醇的混合物。
在稳定化的低盐A13制剂的一个实施方案中，所述制剂包含约0.01％和约0.1％之间的非离子型表面活性剂。在优选实施方案中，所述制剂包含约0.05％的非离子型表面活性剂。在一个实施方案中，表面活性剂选自由聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80、Pluronic F-68和BRIJ 35组成的组。在优选实施方案中，表面活性剂是聚山梨醇酯80。
在稳定化的低盐A13制剂的一个实施方案中，所述制剂包含约5mM和约100mM之间的缓冲剂。在优选实施方案中，所述制剂包含约10mM和约50mM之间的缓冲剂。在另一个实施方案中，缓冲剂是组氨酸或HEPES。在优选实施方案中，缓冲剂是组氨酸。在一个实施方案中，所述制剂的pH在约6.5和7.5之间。在优选实施方案中，所述制剂的pH为7.0±0.2。
在稳定化的低盐A13制剂的一个实施方案中，所述制剂还包含约0.5μM和约20μM之间的锌。
在具体实施方案中，本发明提供了稳定化的低盐ADAMTS13(A13)制剂，其包含(a)至少100个单位的ADAMTS13活性每mgADAMTS13；(b)0至60mM的NaCl；(c)2mM至4mM的钙；(d)2％至4％的甘露醇；(e)0.5％至2％的蔗糖；(f)0.025至0.1％的聚山梨醇酯80；和(g)10mM至50mM的组氨酸(pH 7.0±0.2)。
在一个实施方案中，本发明提供了用于治疗或预防与ADAMTS13或VWF机能障碍相关的疾病或病况的方法，所述方法包括将ADAMTS13制剂施用于需要其的受治疗者，所述ADAMTS13制剂包含(a)至少100个单位的ADAMTS13活性(即，FRETS-vWF73活性)每mg ADAMTS13；(b)0mM至200mM的药学上可接受的盐；(c)0.5mM至20mM的钙；(d)糖和/或糖醇；(e)非离子型表面活性剂；和(f)用于维持pH在6.0和8.0之间的缓冲剂。在一个实施方案中，稳定化的ADAMTS13制剂包含至少200个单位的A13活性每mg ADAMTS13。在另一个实施方案中，稳定化的ADAMTS13制剂包含至少400个单位的A13活性每mg ADAMTS13。在优选实施方案中，稳定化的ADAMTS13制剂包含至少600个单位的A13活性每mgADAMTS13。在更优选的实施方案中，稳定化的ADAMTS13制剂包含至少800个单位的A13活性每mg ADAMTS13。在另一个优选实施方案中，稳定化的ADAMTS13制剂包含至少1000个单位的A13活性每mg ADAMTS13。在一个实施方案中，稳定化的ADAMTS13制剂包含约100个单位和约2000个单位之间的ADAMTS13活性每mg ADAMTS13。
在稳定化的冻干的A13制剂的一个实施方案中，所述制剂包含约1.0mM和约10.0mM之间的钙。在优选实施方案中，所述制剂包含约2.0和约4.0mM之间的钙。
在稳定化的冻干的A13制剂的另一个实施方案中，所述制剂包含约2％和约6％之间的糖和/或糖醇。在优选实施方案中，所述制剂包含约3％和约5％之间的糖和/或糖醇。在具体实施方案中，所述制剂包含约4％的糖和/或糖醇。在一个实施方案中，糖和/或糖醇选自由蔗糖、海藻糖、甘露糖及其组合组成的组。在优选实施方案中，糖和/或糖醇是蔗糖和甘露醇的混合物。
在稳定化的冻干的A13制剂的一个实施方案中，所述制剂包含约0.01％和约0.1％之间的非离子型表面活性剂。在优选实施方案中，所述制剂包含约0.05％的非离子型表面活性剂。在一个实施方案中，表面活性剂选自由聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80、Pluronic F-68和BRIJ 35组成的组。在优选实施方案中，表面活性剂是聚山梨醇酯80。
在稳定化的冻干的A13制剂的一个实施方案中，所述制剂包含约5mM和约100mM之间的缓冲剂。在优选实施方案中，所述制剂包含约10mM和约50mM之间的缓冲剂。在另一个实施方案中，缓冲剂是组氨酸或HEPES。在优选实施方案中，缓冲剂是组氨酸。在一个实施方案中，所述制剂的pH在约6.5和7.5之间。在优选实施方案中，所述制剂的pH为7.0±0.2。
在稳定化的冻干的A13制剂的一个实施方案中，所述制剂还包含约0.5μM和约20μM之间的锌。
在具体实施方案中，本发明提供了稳定化的冻干的ADAMTS13(A13)制剂，其中所述制剂由包含以下的液体制剂冻干：(a)至少100个单位的ADAMTS13活性每mg ADAMTS13；(b)0至200mM的NaCl；(c)2mM至4mM的钙；(d)2％至4％的甘露醇；(e)0.5％至2％的蔗糖；(f)0.025至0.1％的聚山梨醇酯80；和(g)10mM至50mM的组氨酸(pH 7.0±0.2)。
在一个实施方案中，本发明提供了用于治疗或预防与ADAMTS13或VWF机能障碍相关的疾病或病况的方法，所述方法包括将ADAMTS13制剂施用于需要其的受治疗者，所述ADAMTS13制剂包含(a)至少100个单位的ADAMTS13活性(即，FRETS-vWF73活性)每mg ADAMTS13；(b)0mM至100mM的药学上可接受的盐；(c)0.5mM至20mM的钙；(d)糖和/或糖醇；(e)非离子型表面活性剂；和(f)用于维持pH在6.0和8.0之间的缓冲剂。在一个实施方案中，稳定化的ADAMTS13制剂包含至少200个单位的A13活性每mg ADAMTS13。在另一个实施方案中，稳定化的ADAMTS13制剂包含至少400个单位的A13活性每mg ADAMTS13。在优选实施方案中，稳定化的ADAMTS13制剂包含至少600个单位的A13活性每mgADAMTS13。在更优选的实施方案中，稳定化的ADAMTS13制剂包含至少800个单位的A13活性每mg ADAMTS13。在另一个优选实施方案中，稳定化的ADAMTS13制剂包含至少1000个单位的A13活性每mg ADAMTS13。在一个实施方案中，稳定化的ADAMTS13制剂包含约100个单位和约2000个单位之间的ADAMTS13活性每mg ADAMTS13。
在稳定化的低盐冻干的A13制剂的一个实施方案中，所述制剂包含约1.0mM和约10.0mM之间的钙。在优选实施方案中，所述制剂包含约2.0和约4.0mM之间的钙。
在稳定化的低盐冻干的A13制剂的另一个实施方案中，所述制剂包含约2％和约6％之间的糖和/或糖醇。在优选实施方案中，所述制剂包含约3％和约5％之间的糖和/或糖醇。在具体实施方案中，所述制剂包含约4％的糖和/或糖醇。在一个实施方案中，糖和/或糖醇选自由蔗糖、海藻糖、甘露糖及其组合组成的组。在优选实施方案中，糖和/或糖醇是蔗糖和甘露醇的混合物。
在稳定化的低盐冻干的A13制剂的一个实施方案中，所述制剂包含约0.01％和约0.1％之间的非离子型表面活性剂。在优选实施方案中，所述制剂包含约0.05％的非离子型表面活性剂。在一个实施方案中，表面活性剂选自由聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80、Pluronic F-68和BRIJ 35组成的组。在优选实施方案中，表面活性剂是聚山梨醇酯80。
在稳定化的低盐冻干的A13制剂的一个实施方案中，所述制剂包含约5mM和约100mM之间的缓冲剂。在优选实施方案中，所述制剂包含约10mM和约50mM之间的缓冲剂。在另一个实施方案中，缓冲剂是组氨酸或HEPES。在优选实施方案中，缓冲剂是组氨酸。在一个实施方案中，所述制剂的pH在约6.5和7.5之间。在优选实施方案中，所述制剂的pH为7.0±0.2。
在稳定化的低盐冻干的A13制剂的一个实施方案中，所述制剂还包含约0.5μM和约20μM之间的锌。
在具体实施方案中，本发明提供了稳定化的低盐冻干的ADAMTS13(A13)制剂，其中所述制剂由包含以下的液体制剂冻干：(a)至少100个单位的ADAMTS13活性每mg ADAMTS13；(b)0至60mM的NaCl；(c)2mM至4mM的钙；(d)2％至4％的甘露醇；(e)0.5％至2％的蔗糖；(f)0.025至0.1％的聚山梨醇酯80；和(g)10mM至50mM的组氨酸(pH 7.0±0.2)。
B.用于血栓形成的疾病或病况的治疗和预防
在一方面的实施方案中，本发明提供了用于治疗或预防与血栓的形成和/或存在相关的疾病或病况的方法，所述方法包括将根据本文提供的制剂中的任一种的ADAMTS13制剂施用于需要其的受治疗者。
在一个实施方案中，本发明提供了用于治疗或预防与血栓的形成和/或存在相关的疾病或病况的方法，所述方法包括将ADAMTS13制剂施用于需要其的受治疗者，所述ADAMTS13制剂包含(a)至少100个单位的ADAMTS13活性(即，FRETS-vWF73活性)每mg ADAMTS13；(b)0mM至200mM的药学上可接受的盐；(c)0.5mM至20mM的钙；(d)糖和/或糖醇；(e)非离子型表面活性剂；和(f)用于维持pH在6.0和8.0之间的缓冲剂。在一个实施方案中，稳定化的ADAMTS13制剂包含至少200个单位的A13活性每mgADAMTS13。在另一个实施方案中，稳定化的ADAMTS13制剂包含至少400个单位的A13活性每mg ADAMTS13。在优选实施方案中，稳定化的ADAMTS13制剂包含至少600个单位的A13活性每mg ADAMTS13。在更优选的实施方案中，稳定化的ADAMTS13制剂包含至少800个单位的A13活性每mg ADAMTS13。在另一个优选实施方案中，稳定化的ADAMTS13制剂包含至少1000个单位的A13活性每mg ADAMTS13。在一个实施方案中，稳定化的ADAMTS13制剂包含约100个单位和约2000个单位之间的ADAMTS13活性每mg ADAMTS13。
在稳定化的A13制剂的一个实施方案中，所述制剂包含约1.0mM和约10.0mM之间的钙。在优选实施方案中，所述制剂包含约2.0和约4.0mM之间的钙。
在稳定化的A13制剂的另一个实施方案中，所述制剂包含约2％和约6％之间的糖和/或糖醇。在优选实施方案中，所述制剂包含约3％和约5％之间的糖和/或糖醇。在具体实施方案中，所述制剂包含约4％的糖和/或糖醇。在一个实施方案中，糖和/或糖醇选自由蔗糖、海藻糖、甘露糖及其组合组成的组。在优选实施方案中，糖和/或糖醇是蔗糖和甘露醇的混合物。
在稳定化的A13制剂的一个实施方案中，所述制剂包含约0.01％和约0.1％之间的非离子型表面活性剂。在优选实施方案中，所述制剂包含约0.05％的非离子型表面活性剂。在一个实施方案中，表面活性剂选自由聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80、Pluronic F-68和BRIJ 35组成的组。在优选实施方案中，表面活性剂是聚山梨醇酯80。
在稳定化的A13制剂的一个实施方案中，所述制剂包含约5mM和约100mM之间的缓冲剂。在优选实施方案中，所述制剂包含约10mM和约50mM之间的缓冲剂。在另一个实施方案中，缓冲剂是组氨酸或HEPES。在优选实施方案中，缓冲剂是组氨酸。在一个实施方案中，所述制剂的pH在约6.5和7.5之间。在优选实施方案中，所述制剂的pH为7.0±0.2。
在稳定化的A13制剂的一个实施方案中，所述制剂还包含约0.5μM和约20μM之间的锌。
在具体实施方案中，本发明提供了稳定化的ADAMTS13(A13)制剂，其包含(a)至少100个单位的ADAMTS13活性每mgADAMTS13；(b)0至200mM的NaCl；(c)2mM至4mM的钙；(d)2％至4％的甘露醇；(e)0.5％至2％的蔗糖；(f)0.025至0.1％的聚山梨醇酯80；和(g)10mM至50mM的组氨酸(pH 7.0±0.2)。
在一个实施方案中，本发明提供了用于治疗或预防与血栓的形成和/或存在相关的疾病或病况的方法，所述方法包括将ADAMTS13制剂施用于需要其的受治疗者，所述ADAMTS13制剂包含(a)至少100个单位的ADAMTS13活性(即，FRETS-vWF73活性)每mg ADAMTS13；(b)0mM至100mM的药学上可接受的盐；(c)0.5mM至20mM的钙；(d)糖和/或糖醇；(e)非离子型表面活性剂；和(f)用于维持pH在6.0和8.0之间的缓冲剂。在一个实施方案中，稳定化的ADAMTS13制剂包含至少200个单位的A13活性每mg ADAMTS13。在另一个实施方案中，稳定化的ADAMTS13制剂包含至少400个单位的A13活性每mg ADAMTS13。在优选实施方案中，稳定化的ADAMTS13制剂包含至少600个单位的A13活性每mg ADAMTS13。在更优选的实施方案中，稳定化的ADAMTS13制剂包含至少800个单位的A13活性每mg ADAMTS13。在另一个优选实施方案中，稳定化的ADAMTS13制剂包含至少1000个单位的A13活性每mg ADAMTS13。在一个实施方案中，稳定化的ADAMTS13制剂包含约100个单位和约2000个单位之间的ADAMTS13活性每mg ADAMTS13。
在稳定化的低盐A13制剂的一个实施方案中，所述制剂包含约1.0mM和约10.0mM之间的钙。在优选实施方案中，所述制剂包含约2.0和约4.0mM之间的钙。
在稳定化的低盐A13制剂的另一个实施方案中，所述制剂包含约2％和约6％之间的糖和/或糖醇。在优选实施方案中，所述制剂包含约3％和约5％之间的糖和/或糖醇。在具体实施方案中，所述制剂包含约4％的糖和/或糖醇。在一个实施方案中，糖和/或糖醇选自由蔗糖、海藻糖、甘露糖及其组合组成的组。在优选实施方案中，糖和/或糖醇是蔗糖和甘露醇的混合物。
在稳定化的低盐A13制剂的一个实施方案中，所述制剂包含约0.01％和约0.1％之间的非离子型表面活性剂。在优选实施方案中，所述制剂包含约0.05％的非离子型表面活性剂。在一个实施方案中，表面活性剂选自由聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80、Pluronic F-68和BRIJ 35组成的组。在优选实施方案中，表面活性剂是聚山梨醇酯80。
在稳定化的低盐A13制剂的一个实施方案中，所述制剂包含约5mM和约100mM之间的缓冲剂。在优选实施方案中，所述制剂包含约10mM和约50mM之间的缓冲剂。在另一个实施方案中，缓冲剂是组氨酸或HEPES。在优选实施方案中，缓冲剂是组氨酸。在一个实施方案中，所述制剂的pH在约6.5和7.5之间。在优选实施方案中，所述制剂的pH为7.0±0.2。
在稳定化的低盐A13制剂的一个实施方案中，所述制剂还包含约0.5μM和约20μM之间的锌。
在具体实施方案中，本发明提供了稳定化的低盐ADAMTS13(A13)制剂，其包含(a)至少100个单位的ADAMTS13活性每mgADAMTS13；(b)0至60mM的NaCl；(c)2mM至4mM的钙；(d)2％至4％的甘露醇；(e)0.5％至2％的蔗糖；(f)0.025至0.1％的聚山梨醇酯80；和(g)10mM至50mM的组氨酸(pH 7.0±0.2)。
在一个实施方案中，本发明提供了用于治疗或预防与血栓的形成和/或存在相关的疾病或病况的方法，所述方法包括将ADAMTS13制剂施用于需要其的受治疗者，所述ADAMTS13制剂包含(a)至少100个单位的ADAMTS13活性(即，FRETS-vWF73活性)每mg ADAMTS13；(b)0mM至200mM的药学上可接受的盐；(c)0.5mM至20mM的钙；(d)糖和/或糖醇；(e)非离子型表面活性剂；和(f)用于维持pH在6.0和8.0之间的缓冲剂。在一个实施方案中，稳定化的ADAMTS13制剂包含至少200个单位的A13活性每mg ADAMTS13。在另一个实施方案中，稳定化的ADAMTS13制剂包含至少400个单位的A13活性每mg ADAMTS13。在优选实施方案中，稳定化的ADAMTS13制剂包含至少600个单位的A13活性每mg ADAMTS13。在更优选的实施方案中，稳定化的ADAMTS13制剂包含至少800个单位的A13活性每mg ADAMTS13。在另一个优选实施方案中，稳定化的ADAMTS13制剂包含至少1000个单位的A13活性每mg ADAMTS13。在一个实施方案中，稳定化的ADAMTS13制剂包含约100个单位和约2000个单位之间的ADAMTS13活性每mg ADAMTS13。
在稳定化的冻干的A13制剂的一个实施方案中，所述制剂包含约1.0mM和约10.0mM之间的钙。在优选实施方案中，所述制剂包含约2.0和约4.0mM之间的钙。
在稳定化的冻干的A13制剂的另一个实施方案中，所述制剂包含约2％和约6％之间的糖和/或糖醇。在优选实施方案中，所述制剂包含约3％和约5％之间的糖和/或糖醇。在具体实施方案中，所述制剂包含约4％的糖和/或糖醇。在一个实施方案中，糖和/或糖醇选自由蔗糖、海藻糖、甘露糖及其组合组成的组。在优选实施方案中，糖和/或糖醇是蔗糖和甘露醇的混合物。
在稳定化的冻干的A13制剂的一个实施方案中，所述制剂包含约0.01％和约0.1％之间的非离子型表面活性剂。在优选实施方案中，所述制剂包含约0.05％的非离子型表面活性剂。在一个实施方案中，表面活性剂选自由聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80、Pluronic F-68和BRIJ 35组成的组。在优选实施方案中，表面活性剂是聚山梨醇酯80。
在稳定化的冻干的A13制剂的一个实施方案中，所述制剂包含约5mM和约100mM之间的缓冲剂。在优选实施方案中，所述制剂包含约10mM和约50mM之间的缓冲剂。在另一个实施方案中，缓冲剂是组氨酸或HEPES。在优选实施方案中，缓冲剂是组氨酸。在一个实施方案中，所述制剂的pH在约6.5和7.5之间。在优选实施方案中，所述制剂的pH为7.0±0.2。
在稳定化的冻干的A13制剂的一个实施方案中，所述制剂还包含约0.5μM和约20μM之间的锌。
在具体实施方案中，本发明提供了稳定化的冻干的ADAMTS13(A13)制剂，其中所述制剂由包含以下的液体制剂冻干：(a)至少100个单位的ADAMTS13活性每mg ADAMTS13；(b)0至200mM的NaCl；(c)2mM至4mM的钙；(d)2％至4％的甘露醇；(e)0.5％至2％的蔗糖；(f)0.025至0.1％的聚山梨醇酯80；和(g)10mM至50mM的组氨酸(pH 7.0±0.2)。
在一个实施方案中，本发明提供了用于治疗或预防与血栓的形成和/或存在相关的疾病或病况的方法，所述方法包括将ADAMTS13制剂施用于需要其的受治疗者，所述ADAMTS13制剂包含(a)至少100个单位的ADAMTS13活性(即，FRETS-vWF73活性)每mg ADAMTS13；(b)0mM至100mM的药学上可接受的盐；(c)0.5mM至20mM的钙；(d)糖和/或糖醇；(e)非离子型表面活性剂；和(f)用于维持pH在6.0和8.0之间的缓冲剂。在一个实施方案中，稳定化的ADAMTS13制剂包含至少200个单位的A13活性每mg ADAMTS13。在另一个实施方案中，稳定化的ADAMTS13制剂包含至少400个单位的A13活性每mg ADAMTS13。在优选实施方案中，稳定化的ADAMTS13制剂包含至少600个单位的A13活性每mg ADAMTS13。在更优选的实施方案中，稳定化的ADAMTS13制剂包含至少800个单位的A13活性每mg ADAMTS13。在另一个优选实施方案中，稳定化的ADAMTS13制剂包含至少1000个单位的A13活性每mg ADAMTS13。在一个实施方案中，稳定化的ADAMTS13制剂包含约100个单位和约2000个单位之间的ADAMTS13活性每mg ADAMTS13。
在稳定化的低盐冻干的A13制剂的一个实施方案中，所述制剂包含约1.0mM和约10.0mM之间的钙。在优选实施方案中，所述制剂包含约2.0和约4.0mM之间的钙。
在稳定化的低盐冻干的A13制剂的另一个实施方案中，所述制剂包含约2％和约6％之间的糖和/或糖醇。在优选实施方案中，所述制剂包含约3％和约5％之间的糖和/或糖醇。在具体实施方案中，所述制剂包含约4％的糖和/或糖醇。在一个实施方案中，糖和/或糖醇选自由蔗糖、海藻糖、甘露糖及其组合组成的组。在优选实施方案中，糖和/或糖醇是蔗糖和甘露醇的混合物。
在稳定化的低盐冻干的A13制剂的一个实施方案中，所述制剂包含约0.01％和约0.1％之间的非离子型表面活性剂。在优选实施方案中，所述制剂包含约0.05％的非离子型表面活性剂。在一个实施方案中，表面活性剂选自由聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80、Pluronic F-68和BRIJ 35组成的组。在优选实施方案中，表面活性剂是聚山梨醇酯80。
在稳定化的低盐冻干的A13制剂的一个实施方案中，所述制剂包含约5mM和约100mM之间的缓冲剂。在优选实施方案中，所述制剂包含约10mM和约50mM之间的缓冲剂。在另一个实施方案中，缓冲剂是组氨酸或HEPES。在优选实施方案中，缓冲剂是组氨酸。在一个实施方案中，所述制剂的pH在约6.5和7.5之间。在优选实施方案中，所述制剂的pH为7.0±0.2。
在稳定化的低盐冻干的A13制剂的一个实施方案中，所述制剂还包含约0.5μM和约20μM之间的锌。
在具体实施方案中，本发明提供了稳定化的低盐冻干的ADAMTS13(A13)制剂，其中所述制剂由包含以下的液体制剂冻干：(a)至少100个单位的ADAMTS13活性每mg ADAMTS13；(b)0至60mM的NaCl；(c)2mM至4mM的钙；(d)2％至4％的甘露醇；(e)0.5％至2％的蔗糖；(f)0.025至0.1％的聚山梨醇酯80；和(g)10mM至50mM的组氨酸(pH 7.0±0.2)。
C.用于梗塞的治疗和预防
在一方面的实施方案中，本发明提供了用于治疗或预防梗塞的方法，所述方法包括将根据本文提供的制剂中的任一种的ADAMTS13制剂施用于需要其的受治疗者。
在一个实施方案中，本发明提供了用于治疗或预防梗塞的方法，所述方法包括将ADAMTS13制剂施用于需要其的受治疗者，所述ADAMTS13制剂包含(a)至少100个单位的ADAMTS13活性(即，FRETS-vWF73活性)每mgADAMTS13；(b)0mM至200mM的药学上可接受的盐；(c)0.5mM至20mM的钙；(d)糖和/或糖醇；(e)非离子型表面活性剂；和(f)用于维持pH在6.0和8.0之间的缓冲剂。在一个实施方案中，稳定化的ADAMTS13制剂包含至少200个单位的A13活性每mg ADAMTS13。在另一个实施方案中，稳定化的ADAMTS13制剂包含至少400个单位的A13活性每mg ADAMTS13。在优选实施方案中，稳定化的ADAMTS13制剂包含至少600个单位的A13活性每mg ADAMTS13。在更优选的实施方案中，稳定化的ADAMTS13制剂包含至少800个单位的A13活性每mg ADAMTS13。在另一个优选实施方案中，稳定化的ADAMTS13制剂包含至少1000个单位的A13活性每mg ADAMTS13。在一个实施方案中，稳定化的ADAMTS13制剂包含约100个单位和约2000个单位之间的ADAMTS13活性每mg ADAMTS13。
在稳定化的A13制剂的一个实施方案中，所述制剂包含约1.0mM和约10.0mM之间的钙。在优选实施方案中，所述制剂包含约2.0和约4.0mM之间的钙。
在稳定化的A13制剂的另一个实施方案中，所述制剂包含约2％和约6％之间的糖和/或糖醇。在优选实施方案中，所述制剂包含约3％和约5％之间的糖和/或糖醇。在具体实施方案中，所述制剂包含约4％的糖和/或糖醇。在一个实施方案中，糖和/或糖醇选自由蔗糖、海藻糖、甘露糖及其组合组成的组。在优选实施方案中，糖和/或糖醇是蔗糖和甘露醇的混合物。
在稳定化的A13制剂的一个实施方案中，所述制剂包含约0.01％和约0.1％之间的非离子型表面活性剂。在优选实施方案中，所述制剂包含约0.05％的非离子型表面活性剂。在一个实施方案中，表面活性剂选自由聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80、Pluronic F-68和BRIJ 35组成的组。在优选实施方案中，表面活性剂是聚山梨醇酯80。
在稳定化的A13制剂的一个实施方案中，所述制剂包含约5mM和约100mM之间的缓冲剂。在优选实施方案中，所述制剂包含约10mM和约50mM之间的缓冲剂。在另一个实施方案中，缓冲剂是组氨酸或HEPES。在优选实施方案中，缓冲剂是组氨酸。在一个实施方案中，所述制剂的pH在约6.5和7.5之间。在优选实施方案中，所述制剂的pH为7.0±0.2。
在稳定化的A13制剂的一个实施方案中，所述制剂还包含约0.5ìM和约20ìM之间的锌。
在具体实施方案中，本发明提供了稳定化的ADAMTS13(A13)制剂，其包含(a)至少100个单位的ADAMTS13活性每mgADAMTS13；(b)0至200mM的NaCl；(c)2mM至4mM的钙；(d)2％至4％的甘露醇；(e)0.5％至2％的蔗糖；(f)0.025至0.1％的聚山梨醇酯80；和(g)10mM至50mM的组氨酸(pH 7.0±0.2)。
在一个实施方案中，本发明提供了用于治疗或预防梗塞的方法，所述方法包括将ADAMTS13制剂施用于需要其的受治疗者，所述ADAMTS13制剂包含(a)至少100个单位的ADAMTS13活性(即，FRETS-vWF73活性)每mgADAMTS13；(b)0mM至100mM的药学上可接受的盐；(c)0.5mM至20mM的钙；(d)糖和/或糖醇；(e)非离子型表面活性剂；和(f)用于维持pH在6.0和8.0之间的缓冲剂。在一个实施方案中，稳定化的ADAMTS13制剂包含至少200个单位的A13活性每mg ADAMTS13。在另一个实施方案中，稳定化的ADAMTS13制剂包含至少400个单位的A13活性每mg ADAMTS13。在优选实施方案中，稳定化的ADAMTS13制剂包含至少600个单位的A13活性每mg ADAMTS13。在更优选的实施方案中，稳定化的ADAMTS13制剂包含至少800个单位的A13活性每mg ADAMTS13。在另一个优选实施方案中，稳定化的ADAMTS13制剂包含至少1000个单位的A13活性每mgADAMTS13。在一个实施方案中，稳定化的ADAMTS13制剂包含约100个单位和约2000个单位之间的ADAMTS13活性每mg ADAMTS13。
在稳定化的低盐A13制剂的一个实施方案中，所述制剂包含约1.0mM和约10.0mM之间的钙。在优选实施方案中，所述制剂包含约2.0和约4.0mM之间的钙。
在稳定化的低盐A13制剂的另一个实施方案中，所述制剂包含约2％和约6％之间的糖和/或糖醇。在优选实施方案中，所述制剂包含约3％和约5％之间的糖和/或糖醇。在具体实施方案中，所述制剂包含约4％的糖和/或糖醇。在一个实施方案中，糖和/或糖醇选自由蔗糖、海藻糖、甘露糖及其组合组成的组。在优选实施方案中，糖和/或糖醇是蔗糖和甘露醇的混合物。
在稳定化的低盐A13制剂的一个实施方案中，所述制剂包含约0.01％和约0.1％之间的非离子型表面活性剂。在优选实施方案中，所述制剂包含约0.05％的非离子型表面活性剂。在一个实施方案中，表面活性剂选自由聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80、Pluronic F-68和BRIJ 35组成的组。在优选实施方案中，表面活性剂是聚山梨醇酯80。
在稳定化的低盐A13制剂的一个实施方案中，所述制剂包含约5mM和约100mM之间的缓冲剂。在优选实施方案中，所述制剂包含约10mM和约50mM之间的缓冲剂。在另一个实施方案中，缓冲剂是组氨酸或HEPES。在优选实施方案中，缓冲剂是组氨酸。在一个实施方案中，所述制剂的pH在约6.5和7.5之间。在优选实施方案中，所述制剂的pH为7.0±0.2。
在稳定化的低盐A13制剂的一个实施方案中，所述制剂还包含约0.5μM和约20μM之间的锌。
在具体实施方案中，本发明提供了稳定化的低盐ADAMTS13(A13)制剂，其包含(a)至少100个单位的ADAMTS13活性每mgADAMTS13；(b)0至60mM的NaCl；(c)2mM至4mM的钙；(d)2％至4％的甘露醇；(e)0.5％至2％的蔗糖；(f)0.025至0.1％的聚山梨醇酯80；和(g)10mM至50mM的组氨酸(pH 7.0±0.2)。
在一个实施方案中，本发明提供了用于治疗或预防梗塞的方法，所述方法包括将ADAMTS13制剂施用于需要其的受治疗者，所述ADAMTS13制剂包含(a)至少100个单位的ADAMTS13活性(即，FRETS-vWF73活性)每mgADAMTS13；(b)0mM至200mM的药学上可接受的盐；(c)0.5mM至20mM的钙；(d)糖和/或糖醇；(e)非离子型表面活性剂；和(f)用于维持pH在6.0和8.0之间的缓冲剂。在一个实施方案中，稳定化的ADAMTS13制剂包含至少200个单位的A13活性每mg ADAMTS13。在另一个实施方案中，稳定化的ADAMTS13制剂包含至少400个单位的A13活性每mg ADAMTS13。在优选实施方案中，稳定化的ADAMTS13制剂包含至少600个单位的A13活性每mg ADAMTS13。在更优选的实施方案中，稳定化的ADAMTS13制剂包含至少800个单位的A13活性每mg ADAMTS13。在另一个优选实施方案中，稳定化的ADAMTS13制剂包含至少1000个单位的A13活性每mgADAMTS13。在一个实施方案中，稳定化的ADAMTS13制剂包含约100个单位和约2000个单位之间的ADAMTS13活性每mg ADAMTS13。
在稳定化的冻干的A13制剂的一个实施方案中，所述制剂包含约1.0mM和约10.0mM之间的钙。在优选实施方案中，所述制剂包含约2.0和约4.0mM之间的钙。
在稳定化的冻干的A13制剂的另一个实施方案中，所述制剂包含约2％和约6％之间的糖和/或糖醇。在优选实施方案中，所述制剂包含约3％和约5％之间的糖和/或糖醇。在具体实施方案中，所述制剂包含约4％的糖和/或糖醇。在一个实施方案中，糖和/或糖醇选自由蔗糖、海藻糖、甘露糖及其组合组成的组。在优选实施方案中，糖和/或糖醇是蔗糖和甘露醇的混合物。
在稳定化的冻干的A13制剂的一个实施方案中，所述制剂包含约0.01％和约0.1％之间的非离子型表面活性剂。在优选实施方案中，所述制剂包含约0.05％的非离子型表面活性剂。在一个实施方案中，表面活性剂选自由聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80、Pluronic F-68和BRIJ 35组成的组。在优选实施方案中，表面活性剂是聚山梨醇酯80。
在稳定化的冻干的A13制剂的一个实施方案中，所述制剂包含约5mM和约100mM之间的缓冲剂。在优选实施方案中，所述制剂包含约10mM和约50mM之间的缓冲剂。在另一个实施方案中，缓冲剂是组氨酸或HEPES。在优选实施方案中，缓冲剂是组氨酸。在一个实施方案中，所述制剂的pH在约6.5和7.5之间。在优选实施方案中，所述制剂的pH为7.0±0.2。
在稳定化的冻干的A13制剂的一个实施方案中，所述制剂还包含约0.5ìM和约20ìM之间的锌。
在具体实施方案中，本发明提供了稳定化的冻干的ADAMTS13(A13)制剂，其中所述制剂由包含以下的液体制剂冻干：(a)至少100个单位的ADAMTS13活性每mg ADAMTS13；(b)0至200mM的NaCl；(c)2mM至4mM的钙；(d)2％至4％的甘露醇；(e)0.5％至2％的蔗糖；(f)0.025至0.1％的聚山梨醇酯80；和(g)10mM至50mM的组氨酸(pH 7.0±0.2)。
在一个实施方案中，本发明提供了用于治疗或预防梗塞的方法，所述方法包括将ADAMTS13制剂施用于需要其的受治疗者，所述ADAMTS13制剂包含(a)至少100个单位的ADAMTS13活性(即，FRETS-vWF73活性)每mgADAMTS13；(b)0mM至100mM的药学上可接受的盐；(c)0.5mM至20mM的钙；(d)糖和/或糖醇；(e)非离子型表面活性剂；和(f)用于维持pH在6.0和8.0之间的缓冲剂。在一个实施方案中，稳定化的ADAMTS13制剂包含至少200个单位的A13活性每mg ADAMTS13。在另一个实施方案中，稳定化的ADAMTS13制剂包含至少400个单位的A13活性每mg ADAMTS13。在优选实施方案中，稳定化的ADAMTS13制剂包含至少600个单位的A13活性每mg ADAMTS13。在更优选的实施方案中，稳定化的ADAMTS13制剂包含至少800个单位的A13活性每mg ADAMTS13。在另一个优选实施方案中，稳定化的ADAMTS13制剂包含至少1000个单位的A13活性每mgADAMTS13。在一个实施方案中，稳定化的ADAMTS13制剂包含约100个单位和约2000个单位之间的ADAMTS13活性每mg ADAMTS13。
在稳定化的低盐冻干的A13制剂的一个实施方案中，所述制剂包含约1.0mM和约10.0mM之间的钙。在优选实施方案中，所述制剂包含约2.0和约4.0mM之间的钙。
在稳定化的低盐冻干的A13制剂的另一个实施方案中，所述制剂包含约2％和约6％之间的糖和/或糖醇。在优选实施方案中，所述制剂包含约3％和约5％之间的糖和/或糖醇。在具体实施方案中，所述制剂包含约4％的糖和/或糖醇。在一个实施方案中，糖和/或糖醇选自由蔗糖、海藻糖、甘露糖及其组合组成的组。在优选实施方案中，糖和/或糖醇是蔗糖和甘露醇的混合物。
在稳定化的低盐冻干的A13制剂的一个实施方案中，所述制剂包含约0.01％和约0.1％之间的非离子型表面活性剂。在优选实施方案中，所述制剂包含约0.05％的非离子型表面活性剂。在一个实施方案中，表面活性剂选自由聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80、Pluronic F-68和BRIJ 35组成的组。在优选实施方案中，表面活性剂是聚山梨醇酯80。
在稳定化的低盐冻干的A13制剂的一个实施方案中，所述制剂包含约5mM和约100mM之间的缓冲剂。在优选实施方案中，所述制剂包含约10mM和约50mM之间的缓冲剂。在另一个实施方案中，缓冲剂是组氨酸或HEPES。在优选实施方案中，缓冲剂是组氨酸。在一个实施方案中，所述制剂的pH在约6.5和7.5之间。在优选实施方案中，所述制剂的pH为7.0±0.2。
在稳定化的低盐冻干的A13制剂的一个实施方案中，所述制剂还包含约0.5μM和约20μM之间的锌。
在具体实施方案中，本发明提供了稳定化的低盐冻干的ADAMTS13(A13)制剂，其中所述制剂由包含以下的液体制剂冻干：(a)至少100个单位的ADAMTS13活性每mg ADAMTS13；(b)0至60mM的NaCl；(c)2mM至4mM的钙；(d)2％至4％的甘露醇；(e)0.5％至2％的蔗糖；(f)0.025至0.1％的聚山梨醇酯80；和(g)10mM至50mM的组氨酸(pH 7.0±0.2)。
VII.ADAMTS13药剂盒
在本发明的另一方面，提供了用于治疗与ADAMTS13或VWF机能障碍相关的疾病或病况的药剂盒。在一个实施方案中，所述药剂盒包含如上所述的A13或rA13的制剂。在某些实施方案中，本文提供的药剂盒可包含一剂或多剂本文提供的液体或冻干的制剂。当药剂盒包含冻干的A13或rA13制剂时，药剂盒通常还将包含用于液体制剂的重构的合适的液体，例如无菌水或药学上可接受的缓冲液。在某些实施方案中，药剂盒可包含预先包装在注射器中用于通过健康护理专业人员施用或用于家用的ADAMTS13制剂。
在一个实施方案中，提供包含约10个单位的FRETS-VWF73活性至约10,000个单位的FRETS-VWF73活性的药剂盒。在其它实施方案中，药剂盒可提供，例如，约20个单位的FRETS-VWF73(UFV73)活性至约8,000个单位的FRETS-VWF73活性，或约30UFV73至约6,000UFV73，或约40UFV73至约4,000UFV73，或约50UFV73至约3,000UFV73，或约75UFV73至约2,500UFV73，或约100UFV73至约2,000UFV73，或约200UFV73至约1,500UFV73，或约其它在其中的范围。在某些实施方案中，药剂盒可提供约10个单位的FRETS-VWF73活性，或约20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900、1,000、1,100、1,200、1,300、1,400、1,500、1,600、1,700、1,800、1,900、2,000、2,100、2,200、2,300、2,400、2,500、2,600、2,700、2,800、2,900、3,000、3,100、3,200、3,300、3,400、3,500、3,600、3,700、3,800、3,900、4,000、4,100、4,200、4,300、4,400、4,500、4,600、4,700、4,800、4,900、5,000、5,100、5,200、5,300、5,400、5,500、5,600、5,700、5,800、5,900、6,000、6,100、6,200、6,300、6,400、6,500、6,600、6,700、6,800、6,900、7,000、7,100、7,200、7,300、7,400、7,500、7,600、7,700、7,800、7,900、8,000、8,100、8,200、8,300、8,400、8,500、8,600、8,700、8,800、8,900、9,000、9,100、9,200、9,300、9,400、9,500、9,600、9,700、9,800、9,900、10,000或更多个单位的FRETS-VWF73活性。
在某些实施方案中，药剂盒将是用于ADAMTS13的单次施用或剂量。在其它实施方案中，药剂盒可包含多剂ADAMTS13以用于施用。在一个实施方案中，药剂盒可包含预先包装在注射器中用于通过健康护理专业人员施用或用于家用的ADAMTS13制剂。
VIII.实施例
A.实施例1：重组ADAMTS13(rA13)的表达
将表达人ADAMTS13的重组CHO细胞系#640-2的恒化细胞培养物生长在补充有额外锌和维生素B3的化学成分确定的BACD-A13培养基中。将10L培养物维持53天，并且随时间过去监控rA13蛋白和活性的产生。
使表达人ADAMTS13的重组CHO细胞适应化学成分确定的专利培养基(BCS培养基)。将DWCB解冻，在BCS培养基中制备细胞接种物。将从A13表达克隆#640-2繁殖的细胞转移至具有Rushton型叶轮的10L生物反应器中，利用具有专利权的BACD-A13培养基，于在线控制的7.15-7.20的pH、37℃和20％空气饱和度的溶解氧浓度下以重复分批培养方式培养所述细胞。将2个分批培养物生长至10L的终工作体积，在第5天将生物反应器转换成连续培养基进料，以恒化模式操作另外48天。
每周一次从生物反应器取出上清液的样品，利用ELISA分析其rA13蛋白的产量，利用FRETS-VWF73测定法测定rA13的活性。利用Nucleocounter技术测定细胞计数。测量稀释速率，将其用于计算生长速率和容积生产率。
在连续培养条件下，通过使用以1.432mg/L ZnSO4·7H2O和7.02mg/L烟酰胺的终浓度补充有锌和烟酰胺的化学成分确定的BACD-A13培养基，获得了0.9至1.3mg/L/D的高水平rA13蛋白产量和约800至1100mU/μg rA13的比活性(表1)。值得注意地，容积和细胞比生产率在长期培养中随时间过去增加，可能归因于随时间过去递增的生长和稀释速率。可将所表达的rA13的高比活性在至少整个7周中维持在恒定的高水平上，将培养物在恒化条件下生长。事实上，培养物中产生的rA13的比活性实际上从第2周的约800mU/μg A13增加至第7周的约1100mU/μgA13。
表1.分批实验CP_07/18_M07：hA13CHO Klon#985/1985DWCB#01的发酵数据
B.实施例2：纯化的重组ADAMTS13(rA13)的形成
重组ADAMTS13在重组CHO细胞中表达并通过阴离子交换色谱法纯化。纯化的rA13具有约750μg/ml的最终浓度以及约850mU/μg的比活性。在含有150mMNaCl、2％蔗糖、0.05％聚山梨醇酯80的缓冲液中，在pH 7.0下，用20mM选自(1)组氨酸、(2)磷酸盐缓冲液或(3)柠檬酸钠的缓冲剂配制rA13。然后，将样品平均地分开并将一半样品冻干。
冻干的样品用无菌水重构为等于预先冻干的制剂的最终体积的最终体积。然后，每种液体制剂和冻干的制剂的单个等分试样由通过将样品加载到Superose 6GL柱(GE Healthcare)上的凝胶过滤来表征。如图3中可看出的，所有的制剂通过凝胶过滤都得到作为相应于单体rA13蛋白的单峰运行的ADAMTS13样品。
C.实施例3：在4℃和37℃下储存的rA13制剂的活性保留的表征
如实施例2中配制并等分的rA13样品被储存在4℃或37℃下持续多达6个月的时间。在第0、1、2、3、12和24周通过ELISA测定来分析溶液制剂的rA13蛋白浓度以及通过FRETS-VWF73检验分析其rA13活性(图1)。冻干的样品用无菌水重构为等于预先冻干的制剂的最终体积的最终体积并在第0、2、4、8、12和24周进行类似的分析(图2)。
在4℃下储存的rA13液体制剂显示，在接近6个月的时间点处，在抗原含量(即蛋白浓度)或FRETS-VWF73活性上没有损失。如图1中可看出的，对于分别用组氨酸、磷酸盐和柠檬酸钠缓冲的所有3种制剂都是这种情况。相反地，用组氨酸或柠檬酸钠缓冲的液体制剂在37℃下在一周后显示几乎全部的活性损失(图1A；◇＝组氨酸，□＝柠檬酸钠)。对于这些样品，这种活性损失伴有抗原含量在一周时的峰值，表明rA13蛋白正被变性。rA13的组氨酸液体制剂在3个月和6个月时显示显著降低的抗原含量，表明蛋白在被降解。特别地，用磷酸盐缓冲液配制的液态rA13当在37℃下储存时，在3个月时显示显著的活性(图1A；○＝磷酸盐缓冲液)。相应地，该制剂的抗原含量以较低的速率增加，表明rA13变性在用磷酸盐缓冲液配制时被延迟。
rA13冻干的制剂当储存在4℃或37℃时看起来稳定至少6个月(图2)。用磷酸盐缓冲液配制的冻干的rA13当储存在37℃而不是4℃时，显示渐进的活性损失(在6个月时30％)，然而，这种活性损失不伴有通过ELISA的抗原可用性的增加(图2；○＝磷酸盐缓冲液)。当在4℃或37℃下储存时，没有其它冻干的制剂显示活性损失或抗原可用性的增加。
D.实施例4：在4℃和37℃下储存的制剂中的rA13的构象稳定性
如实施例2中配制并等分的rA13样品被储存在4℃或37℃下持续多达6个月的时间。以溶液和冻干状态配制和储存的rA13的球型构象在实施例3中描述的时间点，通过凝胶过滤来表征。显示了凝胶过滤实验的结果，该实验采用组氨酸配制的rA13，对于液体制剂在第0、1、2、3和24周(图4)而对于冻干的制剂在第0、2、4、8、12和24周(图5)进行。
储存在4℃持续多达6个月的具有组氨酸的液体制剂经凝胶过滤主要作为单体运行(图4A)，表明蛋白在4℃的溶液中是很稳定的。该结果与实施例3中描述的一致，实施例3中显示，采用组氨酸配制且在4℃的溶液中储存持续多达6个月的rA13并损失任何FRETS-VWF73活性。相反地，用组氨酸配制且在37℃下储存的rA13作为较高级别/部分或完全变性的物质运行，如通过降低的洗脱体积/保留时间所指示的(图4B)。与实施例3中所见的结果一致地，在37℃下储存持续6个月的、组氨酸配制的A13看起来大部分被降解。
对于每个储存在4℃和37℃的制剂重复凝胶过滤试验，且对洗脱峰下相对面积积分以确定制剂中rA13(3)、二聚体rA13(2)、和聚集的/变性的rA13(1)的相对数量。在表2中给出了在4℃和37℃下储存持续6个月的三种冻干的制剂上进行的凝胶过滤试验的结果。冻干的样品用无菌水重构为等于经凝胶过滤分析前的预先冻干的制剂的最终体积的最终体积。
表2.对于重构的ADAMTS13冻干的制剂的凝胶过滤的相对曲线下面积(AUC)。
与实施例3中所见的结果一致，冻干的rA13制剂显示，在4℃下储存持续至少6个月之后二聚体或聚集/变性的物质的量没有增加。类似地，用组氨酸或柠檬酸钠配制并冻干的rA13在37℃下储存持续至少6个月时仅显示较小水平的二聚作用。此外，不存在这些制剂中的任一种导致增加水平的聚集和/或变性的迹象。相反地，用磷酸盐缓冲液配制并冻干的rA13当在37℃下储存持续至少6个月时，显示显著水平的二聚作用和聚集和/或变性。
E.实施例5：在4℃和37℃下储存的rA13制剂的生物物理表征
如实施例2中配制并等分的rA13样品被储存在4℃或37℃下持续多达6个月的时间。作为如上所述配制的rA13蛋白的构象稳定性的度量，通过动态光散射在每个所示的时间点上测定具有组氨酸(图6)、磷酸盐缓冲液(图7)和柠檬酸钠(图8)的溶液(A)和冻干的(B)rA13制剂的stokes半径。
此外，通过动态光散射测定每种液体制剂(在储存前)的导出的计数速率(derived count rate)。如图12中可见的，存在stokes半径的变化的突变点(discontinuity)，并因此rA13稳定性的突变点，对于组氨酸和柠檬酸钠制剂约35℃以上，而对于磷酸盐制剂约40℃以上。此外，虽然磷酸盐制剂在低于约37℃的温度下比组氨酸或柠檬酸钠制剂具有较大的stokes半径，但磷酸盐制剂在约40℃和50℃之间的温度下看起来稍稍更稳定。
用组氨酸配制的冻干的样品在4℃或37℃下储存3个月，然后在无菌水中重构。为了表征在重构的rA13中是否发生局部的或球型的构象变化，对于在4℃和37℃下储存3个月的样品进行傅里叶变换红外光谱法，并与新配制并冻干的A13比较。如图9中可见的，对于所有三种样品的吸收光谱几乎完美地重叠，表明在组氨酸中作为冻干的制剂在4℃或37℃下储存3个月的rA13中没有发生构象转变。
在4℃或37℃下储存6个月的rA13制剂还通过反相高效液相色谱法(rp-HPLC)来表征。rp-HPLC允许紧密相关的蛋白分子的分离，并因此在许多情况下能够在相同多肽的改性形式之间作区分，例如电荷改性的、部分降解的或部分解折叠的。如图10中可看出的，所有rA13制剂看起来在4℃下稳定至少6个月，与以上所见的若干结果一致。
如实施例2中配制的rA13样品接着通过差示扫描量热法分析以进一步表征rA13蛋白在各种制剂中的稳定性。在图11中产生的热容曲线的双峰特性表明蛋白的两个区域可彼此分离地解折叠，第一解折叠转变发生在约54℃和55℃之间的温度。rA13的解折叠温度对于各种制剂是类似的。然而，对于磷酸盐制剂所增加的转变焓，如通过较大的吸热峰下的面积所表明的，并且较少程度的柠檬酸盐制剂，表明稍微稳定化的A13制剂。
F.实施例6：rA13制剂中二聚体形成的表征
为了确定稳定剂对rA13在溶液中的低聚状态的影响，在20mM组氨酸(pH 7.0)、150mM NaCl和具有蔗糖(0％至2％)、甘露醇(0％至3％)和钙(0mM或2mM)的不同组合的0.05％聚山梨醇酯80中配制rA13。然后通过在Superose6GL柱(GE Healthcare)上的凝胶过滤分析多种制剂。如在图13中所见，多种稳定剂的组合能够使A13二聚体形成的量减少约50％。对每种制剂的聚集体、二聚体/寡聚体(oligos)和单体的百分比在表14中提供。
表14.用于测定ADAMTS13制剂的各种缓冲剂的影响的制剂
G.实施例7：pH对ADAMTS13制剂稳定性的影响
为了确定pH对rA13在溶液中的稳定性的影响，rA13被渗析至含有20mM组氨酸和150mMNaCl的缓冲液中，调节至5.5至9.5之间的pH范围且储存在4℃或40℃下24小时。在24小时时，通过如由ELISA测定的rA13抗原浓度和由FRETS-VWF73测定的rA13活性来测定稳定性。如表3和图14中所见，rADAMTS13在配制在具有5.5和9.5之间的pH的溶液中时，在4℃下持续24小时是相对稳定的。
表3.在4℃下储存24小时时，ADAMTS13在液体制剂中的稳定性
表4.在40℃下储存24小时时，ADAMTS13在液体制剂中的稳定性
H.实施例8：低水平的CaCl2对ADAMTS13制剂稳定性的影响
为了确定低水平的CaCl2对rA13在溶液中的稳定性的影响，将rA13配制在具有(12B和12D)和不具有(12A和12C)2mM CaCl2的、含有150mM NaCl、2％蔗糖、0.05％聚山梨醇酯80、和20mM组氨酸(pH 7.0)的缓冲液中。将液体制剂储存在25℃或37℃下3周。然后通过在第0、1、2和3周测定相对FRETS-VWF73活性而评价制剂的稳定性。如图15中可见，2mM CaCl2的添加使在25℃和37℃两种温度下储存的液体rADAMTS13制剂稳定化至不同的程度。显著地，将低水平CaCl2添加至在25℃下储存的rADAMTS13液体制剂赋予约95％酶活性稳定性持续3周，作为对照，不具有CaCl2的制剂中观察到80％的活性损失。
I.实施例9：重组ADAMTS13的寡聚物的FRETS-VWF73活性
为了测定纯化期间分离的ADAMTS13蛋白的不同寡聚物的酶活性，将rA13加载到用包含20mM Na2HPO4(pH 7.5)和500mM NaCl的缓冲液平衡的Superose 6GL凝胶过滤柱上。然后，ADAMTS13分子种类通过尺寸和形状分离。从柱洗脱的级分根据它们表观低聚状态混合，例如聚集的A13(池1)、二聚的A13(池2)和单体的A13(池3)(图16A)。通过经动态光散射测定每个池中的蛋白的平均stokes半径而获得对低聚状态的ADAMTS13的进一步确认。
然后通过FRETS-VWF73测定来测定每个池的酶活性。如图16中可见，聚集的A13种类的体积活性为约218mU/ml，二聚的A13的活性为约1.435U/ml，而单体的A13为约97.905U/ml。将池体积的活性标准化之后，发现在洗脱池中大于99％的总活性对应于单体蛋白。当随后将蛋白总量的活性标准化时，可看出单体蛋白池具有比二聚的蛋白池和聚集的蛋白池都高的比活性。
J.实施例10：NaCl浓度对ADAMTS13制剂的冻干的影响
为了测定NaCl浓度对冻干饼的产生的影响，采用不同量的NaCl(0至150mM)，在含有2％蔗糖、0.05％聚山梨醇酯80和20mM组氨酸(pH 7.0)的缓冲液中配制重组ADAMTS13。然后在标准条件下将ADAMTS13制剂冻干并目测检查所得冻干饼的质量(图17)。由包含较低的盐浓度(0至60mM；图17A-C)的ADAMTS13制剂产生的冻干饼具有光滑表面的致密结构，而由高盐制剂(120mM和150mM的NaCl；图17E和F)产生的冻干饼是多孔的且不致密，具有线状(string-like)或破碎的外观。含有中间水平的NaCl(90mM；图17D)的ADAMTS13制剂是部分致密的，具有半多孔的或坑状表面。
多孔的、非致密的冻干饼预示在冻干过程中熔解。通常，高盐浓度用于降低塌陷温度(collapse temperature)(或玻璃温度)，塌陷温度可导致冷冻的材料在初步干燥过程中部分熔解。这可能对蛋白聚集水平和/或酶活性的恢复具有负面影响。因此，良好的冻干饼外观通常与较好的活性恢复和各个配制的蛋白较少的聚集相关联。有利地，本发明提供允许产生高质量冻干饼的ADAMTS13制剂。在某些实施方案中，本文提供的创造性的制剂允许在冻干期间特别稳定的低盐ADAMTS13制剂导致形成高质量冻干饼。
使用低盐蛋白制剂的一个担忧是可能出现增加的蛋白聚集。为确定对于低盐ADAMTS13制剂是否是这样，如上产生的冻干饼在去离子水中被重构并且重构的ADAMTS13蛋白的聚集状态通过尺寸排阻色谱法分析。如图18中可见，冻干的制剂的盐浓度对重构的ADAMTS13蛋白的聚集状态没有影响(比较0mM NaCl与150mM NaCl)。
为进一步证实低盐ADAMTS13制剂的用途，测定了从0至150mM NaCl变化的各种制剂的FRETS-VWF73活性。如图19中可见，ADAMTS13制剂的盐浓度以及蔗糖浓度不影响重组ADAMTS13蛋白的活性。这些结果表明液体和冻干的重组ADAMTS13蛋白的低盐(即0至100mM NaCl)制剂是良好适合于药物用途的。
K.实施例11：在高盐和低盐的缓冲液中的冻干的ADAMTS13制剂
为比较冻干的重组ADAMTS13制剂，配制了高盐(150mM NaCl)和低盐(30mM NaCl)制剂。高盐和低盐制剂都包含20mM组氨酸(pH 7.0)、150mMNaCl、0.05％聚山梨醇酯80和2mM CaCl2。高盐制剂还包含2％蔗糖和150mMNaCl，而低盐制剂还包含1％蔗糖、3％甘露醇和30mM NaCl。两种制剂接着在标准条件下被冻干。由高盐ADAMTS13制剂产生的冻干饼是不致密的、非均匀的、成块的和多孔的(图20A)，而由低盐ADAMTS13制剂产生的冻干饼是致密的、相当均匀的且具有光滑表面(图20B)。这些结果表明冻干的ADAMTS13的低盐制剂是良好适合于药物用途的。
L.实施例12：为冻干的制剂纯化rADAMTS13
重组ADAMTS13在重组CHO细胞中表达并通过POROS HS阳离子交换色谱法从所得的条件培养基中纯化。然后通过使用superose 6GL：TC10/30柱的尺寸排阻色谱法分析所收集的从HS柱洗脱出的rADAMTS13级分在凝胶过滤之前和之后的二聚作用和聚集，通过尺寸排阻色谱法(分别为图21A和21B)和动态光散射(分别为图22A和22B)。如图21A中可见，在HS洗脱的级分中，总rADAMTS 13的近20％在凝胶过滤之前处于不希望的二聚、单体或聚集的状态。相反，从凝胶过滤步骤混合的几乎所有的rADAMTS13是单体的(图21B)。类似地，HS洗脱的rADAMS13的平均水力半径(约20.5nm；图22A)差不多是尺寸排阻色谱法之后恢复的rADAMTS的平均水力半径(约12-13nm；图22B)的两倍。
M.实施例13：rADAMTS13制剂的标准的和延长的冻干方案的比较
为了比较含有可变的低盐(30mM和60mM NaCl)、钙(2mM和4mMCaCl2)和糖(1％蔗糖和1％海藻糖)浓度的rADAMTS13制剂的冻干，通过如上所述的阳离子交换色谱法和尺寸排阻色谱法纯化rADAMTS13，并采用以上给出的盐、钙和糖的全部8种组合将rADAMTS13配制在20mM组氨酸、3％甘露醇、0.05％聚山梨醇酯80中。所有小瓶具有相同的ADAMTS13浓度(190μg/mL抗原)。然后使用标准的(3天；图23A)或延长的(11天；图23B)冻干方案将rA13制剂1至8(表5和6)冻干。冻干后，目测检查冻干饼的期望的质量(图24)。
表5.用于标准的冻干方案的冻干的rADAMTS13制剂
表6.用于延长的冻干方案的冻干的rADAMTS13制剂
为了确定在每种制剂中的ADAMTS13的多聚状态，冻干的蛋白在去离子水中重构并通过动态光散射分析。如图25中可见，通过使用标准的和延长的冻干方案制备的冻干的制剂在重构后都得到主要单体的ADAMTS13分子(在约12-13nm的峰)。虽然与聚集的蛋白对应的ADAMTS13峰(100和110nm之间)呈现出与单体峰的约一半一样高，但普通技术人员将认识到，y轴度量强度而不是总质量，且就此而论，该图夸大了聚集的ADAMTS13种类的百分比。还看出，采用延长的冻干方案制备的制剂(虚线)比采用标准的冻干方案制备的制剂(实线)在去离子水中重构后含有较少聚集的ADAMTS13。
为了评价以上提出的每种制剂中冻干的rADAMTS13的稳定性，使用通过标准的和延长的方案制成的冻干饼来制备一系列小瓶以用于在各种温度下储存高达36个月。如表7中所概述的，含有5mg或10mg冻干的rADAMTS13的小瓶被制备用于在+2-+8℃(即在标准冷藏条件下)、30℃(室温)和40℃下储存。所有小瓶通过FTIR、SE-HPLC和DLS测试。此外，测试所有样品的FRETS活性和ADAMTS13抗原。然后，可在指示的时间点测试冻干的ADAMTS13制剂的FRETS-VWF73活性和抗原稳定性，如以上所概述的，以确定蛋白在各种冻干的制剂中的稳定性。表8和9提供了分别通过标准的和延长的冻干方案产生的重构的ADAMTS13制剂的FRETS-VWF73活性测定结果。类似地，在表10和表11中给出对于分别采用标准的和延长的冻干方案产生的样品的抗原恢复。
表7.用于测试冻干的ADAMTS13制剂的稳定性的实验设置。设置对应于A型和B型冻干。
表8.通过标准的冻干方案制备的冻干的ADAMTS13制剂中的FRETS-VWF73活性
表9.通过延长的冻干方案制备的冻干的ADAMTS13制剂中的FRETS-VWF73活性
表10.通过标准的冻干方案制备的冻干的ADAMTS13制剂中的A13抗原的恢复
表11.通过标准的冻干方案制备的冻干的ADAMTS13制剂中的A13抗原的恢复
表17和18概述了rADAMTS022-1制剂的不同冻干程序的FTIR结果。时间和温度都没有对二级结构具有显著影响。此外，冻干程序不改变结构元件，除了在40℃下对于标准程序A的α螺旋的明显减少以外，而这对于较长的冻干程序B未观察到。
表17.通过FTIR评价的冻干的rADAMTS13制剂22-1A的二级结构。
表18.通过FTIR评价的冻干的rADAMTS13制剂22-1B的二级结构。
经过在4℃、30℃和40℃下储存6个月的过程，通过动态光散射分析1A和1B冻干的制剂中的ADAMTS13的低聚状态。如图37和38中所见，在采用延长的冻干程序制备样品中观察到较高聚集水平。然而，聚集水平并不随储存时间显著增加。
类似地，尺寸排阻HPLC未示出在6个月后对于rADAMTS022制剂的不同冻干程序之间无主要变化(数据未示出)。分析示出了在4℃、30℃和40℃下储存经过3个月的过程后未引起聚集。
N.实施例14：重组人ADAMTS13的表达和纯化
通过在悬浮培养中以发酵工艺的重组中国仓鼠卵巢(CHO)细胞克隆产生重组ADAMTS-13。由Baxter开发的培养基并且两者都是不含人或动物衍生的物质和重组蛋白。可用于ADAMTS13的表达的这些类型的培养基的实例可以在例如美国专利申请序列号12/847,999中找到。制造过程利用了连续的(恒化器)细胞培养方法。纯化过程以通过过滤的原始细胞去除步骤开始。其后多达4天的无细胞产品被合并以产生一个下游的批次。混合的、过滤的收获通过超滤/渗滤浓缩并然后经受溶剂洗涤剂病毒灭活步骤。进一步的纯化包括色谱捕获步骤(阴离子交换)、纳滤步骤(第二病毒减少步骤)、负向色谱(negativechromatography)步骤(羟磷灰石)随后是混合模式色谱(Capto MMC)和最终的色谱浓缩以及预配制步骤(阳离子交换)。预配制的原料药物质(bulk drugsubstance)(BDS)在温度控制的冷冻室中在-60℃下冷冻。
O.实施例15：用于ADAMTS13活性的FRETS-VWF73测定
根据制造商的测定说明测量针对荧光猝灭底物(FRETS-VWF73，PeptidesInstitute，Inc；Osaka，日本)的ADAMTS13的蛋白水解活性。简要的说，rADAMTS13样品在含有5mM Bis-Tris、25mM CaCl2和0.005％Tween 20的缓冲液中被稀释(以100μL的总体积)并被转移至黑色微量滴定板。针对稀释的人血浆样品(从80至5mU/mL血浆)的参考曲线测量样品。通过添加底物(100μL，FRETS-VWF73；2μM最终浓度)起动反应，并且于30℃下在采用lex＝360nm且lem＝460的荧光光度计(FLx800，Bio Tek)中每隔2分钟测量荧光，持续45分钟。活性结果从人血浆的参考曲线读出。数据以单位/mL表示。正常的人血浆被视为1单位/mL。
P.实施例16：ADAMTS13抗原ELISA
含ADAMTS13的样品以ELISA测定来分析，ELISA测定使用针对人ADAMTS13导向的多克隆兔IgG，两者都作为捕获物且以其标记形式作为检测抗体。存在于样品中的ADAMTS13抗原被涂覆在96孔微量滴定板上的ADAMTS13特异性抗体所捕获。将样品在缓冲液(250mM Tris、350mM NaCl、0.5％BSA、0.1％Tween 20)中稀释并转移至涂覆微量滴定板。用HRP轭合的兔抗ADAMTS13IgG使用TMB作为底物(Thermo Art：#34021)检测结合的ADAMTS13抗原。在以1＝450nm的分光光度计(TECAN SpectraFluorPlus，Tecan Sales Austria，奥地利)中测量吸光度。使用由稳定转染的HEK293细胞培养收获纯化的重组ADAMTS13的从250至7.81ng/mL变化的稀释物，由参考标准计算ADAMTS13抗原浓度(以μg/mL表示)。
Q.实施例17：ADAMTS13的尺寸排阻高效液相色谱法(SE-HPLC)分析
使用提纯器“900-系列”(GE Healthcare)进行SE-HPLC。该系统配备有Superose 12GL柱(GE Healthcare，TC10/30)，其在室温下以0.3mL每分钟的恒定流速运行。运行时，使用缓冲液20mM Tris、100mM乙酸钠、500mM氯化钠，pH 7.4。将该样品在10,000rpm下离心(Centrifuge 5415C，Eppendorf，Vienna，奥地利)5min并通过自动取样器自动应用100μL。柱的流出液的吸光度在280nm下连续测量。
R.实施例18：ADAMTS13的动态光散射(DLS)分析
使用Malvern Nano Zetasizer ZS(Malvern Instruments Ltd Enigma BusinessPark，Grovewood Road，Malvern，Worcestershire，UK.WR141XZ)和HaakeRheostress 1(Thermo Fisher Scientific，Karlsruhe，德国)(配备具有60mm直径/0.5°角的锥体(cone))进行动态光散射(DLS)用于缓冲液粘度测量。
将所有样品在10.000rpm下离心(Centrifuge 5415C，Eppendorf，Vienna，奥地利)5min以确定蛋白的水力直径。将60μL的样品填充至ZEN0040一次性微量吸收池中并通过Rheostress 1测定缓冲液的粘度。这个参数被用来分析通过DLS的蛋白的有效尺寸。操作温度是25℃，且平衡时间为2分钟。蛋白角度被设置为173°背向散射以测量其尺寸并且每个样品进行3次试验以求出结果的平均值。
通过增加温度模式测量样品以检测温度对蛋白的影响。测量程序类似于正常的尺寸测量，除了从15℃至80℃的递增值为1℃/min的不同温度以及2min的平衡时间。对于这些温度坡度使用DTS2145低容积玻璃吸收池。
S.实施例19：ADAMTS13的傅里叶变换红外光谱法(FTIR)分析
使用配备有BioATR II池的、以衰减全反射模式工作的FTIR分光镜NSOR27(Bruker Optik GmbH，76275Ettlingen，德国)进行傅里叶变换红外光谱法。此仪器配置可用于分析蛋白制剂的构象。
在20℃的操作温度期间，20μL的水被填充至池中并测量背景扫描。之后，将20μL缓冲液填充至池中并针对背景扫描测量，以从缓冲液中减去水。采用缓冲液作为背景扫描重复此程序，用来测量样品(测量的频率范围：4000-650cm-1)。生成干涉图并翻译成透射谱。不同的光谱被校正相同的补偿并被归一化为相同的蛋白浓度。此外，蛋白的二级结构(％α-螺旋，％β-折叠)通过评价软件(OPUS 6.0/Bruker)来计算，其包括具有～40种已知二级结构的蛋白的数据库。
T.实施例20：ADAMTS13稳定性的光致辐照分析
使用根据SOP VN-09-45058TB的Atlas Suntest CPS+耐光箱(photostabilitychamber)(Chicago，Illinois，USA)进行光稳定性测试。CPS+监测并控制辐照度、黑色标准温度和箱的气温。
在与用于剪切和冻融实验的相同的制剂中测试光稳定性(表12)。通过DLS和SE-HPLC测试样品和对照。结果在图31和图32中示出。两种制剂(液体和冻干的)通过SE-HPLC均示出相同的结果。单体ADAMTS13峰随辐照时间减少而二聚体峰随辐照时间增加。液体和冻干的制剂的水力直径也随时间稍稍增加(图32)。辐照10h(如由ICH Q1B所推荐的)的冻干的制剂与避光的对照未显示任何差别。在液体制剂中FRETS活性在光辐照期间迅速降低但在冻干的制剂中降低较少，如图33所示。即使在4倍光辐照剂量(如由ICH指南Q1B所推荐的，对应于4.8M勒时)之后，仍保留大于50％的FRETS活性。
“对照”小瓶被包在铝箔中以排除光照并连同试样被置于耐光箱中。所有样品水平放置。辐照时间10h对应于1.2至1.8百万lux h和765W/m2UV光。10h后从耐光箱中移除样品并测量光谱(190-800nm)和pH值。
U.实施例21：ADAMTS13稳定性的机械应力分析
使用Haake Rheostress 1(Thermo Electron Karlsruhe GmbH，Karlsruhe，德国)、使用具有60mm直径和0.5°角的锥体施加剪切应力。温度设定为25.0℃。
简言之，如上所述制备的重组人ADAMTS13按表12中配制。应用500μL的ADAMTS13每次试验并且以50、100、150、200、250、300、350、500和600rpm施加应力15min。然后将样品转移到Eppendorf瓶。应用DLS测量以监测可能的剪切应力诱导的部分解折叠或聚集。如图28所示，在200rpm的剪切应力下形成聚集体。
表12.用于ADAMTS13稳定性的机械应力分析的制剂
  缓冲液物质   BAX930FL
  NaCl        [mM]   150
  组氨酸      [mM]   20
  蔗糖        [％]   2
  聚山梨醇酯80[％]   005
  pH   70
V.实施例22：各种缓冲剂对ADAMTS13制剂的影响
为了确定各种缓冲液对ADAMTS13制剂的稳定性和构象的影响，使如上所述表达和纯化的重组人ADAMTS13针对不同缓冲液渗析并通过动态光散射(DLS)分析以识别ADAMTS13的基本缓冲液偏好。如图27中可见，当蛋白在组氨酸或HEPES缓冲液中配制时发现ADAMTS13的最小水力直径。
表13.用于测定ADAMTS13制剂的各种缓冲剂的影响的制剂
  缓冲液物质   -1    -2   -3   -4     -5
  NaCl        [mM]   150   150   150   150   150
  组氨酸      [mM]   20   -   -   -   -
  Hepes       [mM]   -   20   -   -   -
  磷酸钠      [mM]   -   -   20   -   -
  柠檬酸盐    [mM]   -   -   -   20   -
  EDTA        [mM]   -   -   -   -   20
  pH   7.5   7.5   7.5   7.5   7.5
*所有制剂都包含2％蔗糖和0.05％聚山梨醇酯80。
W.实施例23：ADAMTS13稳定性的冻融分析
与用于剪切应力实验相同的制剂(表12)被再次用于研究蛋白在冻融应力期间的行为。选择两种冻融条件-20℃/RT和-80℃/+37℃。图29概述了FRETS活性测量的结果。所有样品在试验的变化的范围内是稳定的(25％相对标准偏差)。即使在5倍冻融周期之后也未观察到FRETS活性损失。通过DLS和SE-HPLC测量的结果证实了这种液体制剂中的BAX930的稳定性。没有观察到DLS的聚集峰(100和1000nm之间)强度的增加是独立于冻融条件的(图30)。类似地，在-80℃/+37℃重复的冻融周期之后，SE-HPLC不显示聚集水平的增加，但在-20℃/RT下显示某些增加(数据未显示)。
X.实施例24：钙和锌对ADAMTS13的FRETS活性的影响
如以上所述制备的重组人ADAMTS13用10mM EDTA处理并然后针对含有20mM组氨酸和190mM NaCl的缓冲液(pH 7.5)渗析。渗析后，以不同浓度将CaCl2和ZnCl2添加回至所述制剂。然后对于含有不同浓度的钙和锌的ADAMTS13制剂的活性测试其FRET活性，如上所述。如图34中可见，增加的水平的钙增加了FRETS活性的恢复。在存在和不存在锌的情况下，包含4mM CaCl2获得接近最大的活性。在中等浓度的钙(2mM和4mM)的情况下，添加锌提供了FRETS活性的适度增加。
Y.实施例25：盐和糖浓度对冻干的ADAMTS13制剂中的聚集的影响
为了进一步研究盐和糖浓度对冻干的ADAMTS13制剂的影响，若干冻干的制剂的低聚状态在用去离子水重构后被确定。简言之，如上所述地产生重组人ADAMTS13。然后用20mM组氨酸(pH 7.0)、2mM氯化钙、和0.05％聚山梨醇酯80采用表15中给出的氯化钠和蔗糖水平来配制蛋白样品。然后将制剂冻干，如上所述，并用去离子水重构。然后通过SE-HPLC分析确定低聚特性，该分析的结果在表15和图35中示出。如在含有低糖浓度的制剂中可见，高盐水平(150mM)增加了ADAMTS13聚集并减少制剂的单体含量。
表15.盐和糖浓度对由SE-HPLC峰面积测定的冻干的ADAMTS13制剂中的聚集的影响
然后使用表15中示出的相同的制剂来评价ADAMTS13制剂冻干后产生的冻干饼的质量。如表16中所概述，并在图36中示出，高浓度的氯化钠(150mM)的存在导致没有冻干饼。相反，采用在2％蔗糖存在下含有0mM至60mM氯化钠的制剂获得最好的冻干饼。
表16.重组人ADAMTS13的各种制剂的所产生的冻干饼的质量
批次 冻干饼定量
rADAMTS016-1 致密的冻干饼，光滑表面且与玻璃壁分离
rADAMTS016-2 致密的冻干饼，光滑表面且与玻璃壁分离
  rADAMTS016-3   致密的冻干饼，光滑表面且与玻璃壁分离
rADAMTS016-4 致密的、多孔的冻干饼，粗糙表面，与玻璃壁部分分离
rADAMTS016-5 多孔的冻干饼，粗糙表面，与玻璃壁部分分离
rADAMTS016-6 无冻干饼，仅轻盈的膜
  rADAMTS016-7 致密的、多孔的冻干饼，粗糙表面，与玻璃壁部分分离
rADAMTS016-8 无冻干饼，仅轻盈的膜
  rADAMTS016-9 轻盈的、光滑的膜
rADAMTS016-10 粉状的、光滑的表面
  rADAMTS016-11 无冻干饼，仅轻盈的膜
  rADAMTS016-12   粉状的、光滑的表面
Z.实施例26：长期温度应力测试
为了进一步表征冻干的ADAMTS13制剂的稳定性，开始第二长期应力测试。对于该测试，以根据表19的三种最终蛋白浓度配制重组人ADAMTS13。在该制剂中包括第二糖(甘露糖)，因为发现它在冻干期间稳定化蛋白并提供具有光滑表面的致密的冻干饼。所有应力试样通过DLS(图39)、SE-HPLC(表20)和FTIR来表征。还随时间变化测量所有制剂的FRETS活性(表21)和A13抗原ELISA(表22)。
表19.用于应力测试的His-缓冲液rADAMTS13制剂(rADAMTS025)
  rADAMTS025-1   rADAMTS025-2   rADAMTS025-3
  浓度[U FRETS/mL]   600   300   150
  NaCl        [mM]   30   30   30
  组氨酸      [mM]   20   20   20
  CaCl2       [mM]   2   2   2
  聚山梨醇酯80[％]   0.05   0.05   0.05
  蔗糖        [％]   1   1   1
  甘露醇      [％]   3   3   3
  pH   70   70   70
表20.如通过SE-HPLC测定的高ADAMTS13浓度对聚集水平的影响(rADAMTS025)
表21.冻干的ADAMTS13制剂的FRETS-VWF73活性。
表22.冻干的ADAMTS13制剂中A13抗原的回收。
应理解，本文中描述的实施例和实施方案仅用于举例说明目的并且根据其的不同变动或变化对于本领域技术人员来说是显然的，并且包括在本申请的精神和权限内以及所附权利要求的范围内。为了所有目的将本文中引用的所有出版物、专利和专利申请通过引用整体并入本文。

Claims (47)

1.一种用于冻干的稳定化的ADAMTS13液体制剂，包含：
(a)0.05mg/ml至10.0mg/ml的ADAMTS13；
(b)0mM至90mM的氯化钠或氯化钾；
(c)0.5mM至20mM的钙；
(d)2%至6%的蔗糖、海藻糖、甘露醇或其组合；
(e)0.001%至0.2%的聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80、Pluronic F-68或BRIJ35；
(f)5mM至100mM的组氨酸、柠檬酸钠或HEPES；以及
(g)pH在6.0和8.0之间。
2.根据权利要求1所述的制剂，包含50个单位和1000个单位之间的ADAMTS13活性每mL。
3.根据权利要求1或2所述的制剂，包含
1.0mM和10.0mM之间的钙。
4.根据权利要求3所述制剂，包含
2.0mM和4.0mM之间的钙。
5.根据权利要求1所述的制剂，其中所述制剂包括蔗糖和甘露醇。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的制剂，包含0.01%和0.1%之间的非离子型表面活性剂。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的制剂，其中缓冲剂是组氨酸或HEPES。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的制剂，其中所述制剂的pH为7.0±0.2。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的制剂，包含
(a)0.05mg/ml至10.0mg/ml的ADAMTS13；
(b)0mM至60mM的NaCl；
(c)2mM至4mM的钙；
(d)2%至4%的甘露醇；
(e)0.5%至2%蔗糖；
(f)0.025%至0.1%的聚山梨醇酯80；
(g)10mM至50mM的组氨酸；以及
（h）pH为7.0±0.2。
10.根据权利要求1至8中任一项所述的制剂，包含
(a)至少100个单位的ADAMTS13活性每mg ADAMTS13；
(b)0mM至60mM NaCl；
(c)2mM至4mM的钙；
(d)2%至4%的甘露醇；
(e)0.5%至2%的蔗糖；
(f)0.025%至0.1%的聚山梨醇酯80；
(g)10mM至50mM的组氨酸；以及
（h）pH为7.0±0.2。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的制剂，还包含0.5μM和20μM之间的锌。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的制剂，其中所述ADAMTS13在4℃下稳定至少6个月。
13.根据权利要求12所述的制剂，其中:
所述制剂在4℃下储存至少6个月后维持至少90%的ADAMTS13活性。
14.根据权利要求13所述的制剂，其中：
所述制剂在4℃下储存至少6个月后维持至少95%的ADAMTS13活性。
15.根据权利要求14所述的制剂，其中：
所述制剂在4℃下储存至少6个月后维持至少98%的ADAMTS13活性。
16.一种冻干的ADAMTS13制剂，其中所述制剂由根据权利要求1至15中任一项所述的液体制剂冻干。
17.根据权利要求16所述的冻干的制剂，其中所述制剂在37℃下稳定至少6个月。
18.根据权利要求17所述的制剂，其中：
所述制剂在37℃下储存至少6个月后维持至少80%的ADAMTS13活性。
19.根据权利要求18所述的制剂，其中：
所述制剂在37℃下储存至少6个月后维持至少90%的ADAMTS13活性。
20.根据权利要求19所述的制剂，其中：
所述制剂在37℃下储存至少6个月后维持至少95%的ADAMTS13活性。
21.根据权利要求1至20中任一项所述的制剂，其中：
所述ADAMTS13蛋白是至少80%纯的。
22.根据权利要求21所述的制剂，其中：
所述ADAMTS13蛋白是至少90%纯的。
23.根据权利要求22所述的制剂，其中：
所述ADAMTS13蛋白是至少95%纯的。
24.根据权利要求23所述的制剂，其中：
所述ADAMTS13蛋白是至少99%纯的。
25.根据权利要求1至24中任一项所述的制剂，其中所述制剂包含单体ADAMTS13蛋白。
26.根据权利要求25所述的制剂，其中：
ADAMTS13聚集体的含量为小于5%。
27.根据权利要求26所述的制剂，其中：
ADAMTS13聚集体的含量为小于2.5%。
28.根据权利要求26所述的制剂，其中:
所述ADAMTS13聚集体的含量在储存至少6个月后被维持在小于5%。
29.根据权利要求28所述的制剂，其中：
所述ADAMTS13聚集体的含量在储存至少6个月后被维持在小于2.5%。
30.根据权利要求25所述的制剂，其中：
ADAMTS13二聚体的含量为小于10%。
31.根据权利要求30所述的制剂，其中：
ADAMTS13二聚体的含量为小于5%。
32.根据权利要求30所述的制剂，其中：
所述ADAMTS13二聚体的含量在储存至少6个月后被维持在小于10%。
33.根据权利要求32所述的制剂，其中：
所述ADAMTS13二聚体的含量在储存至少6个月后被维持在小于5%。
34.根据权利要求1至33中任一项所述的制剂，其中：
所述ADAMTS13蛋白的比活性为至少600U的FRETS-VWF73活性每mg ADAMTS13蛋白。
35.根据权利要求34所述的制剂，其中：
所述ADAMTS13蛋白的比活性为至少800U的FRETS-VWF73活性每mg ADAMTS13蛋白。
36.根据权利要求35所述的制剂，其中：
所述ADAMTS13蛋白的比活性为至少1000U的FRETS-VWF73活性每mg ADAMTS13蛋白。
37.根据权利要求1至36中任一项所述的制剂，其中所述ADAMTS13蛋白是人ADAMTS13。
38.根据权利要求1至37中任一项所述的制剂，其中所述ADAMTS13蛋白是重组ADAMTS13。
39.一种用于制造稳定化的ADAMTS13制剂的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)在含有2μM至12μM浓度的锌和0.5mM至1.5mM的浓度的钙的培养基中培养的细胞中表达ADAMTS13蛋白；
(b)纯化所述ADAMTS13蛋白；和
(c)制备根据权利要求1至38中任一项所述的制剂。
40.根据权利要求39所述的方法，其中所述培养基还包含1mg/L至20mg/L的浓度的维生素B3。
41.根据权利要求39或40所述的方法，其中所述ADAMTS13蛋白在哺乳动物细胞系中表达。
42.根据权利要求41所述的方法，其中所述哺乳动物细胞系选自由CHO细胞系、BHK细胞系和HEK细胞系组成的组。
43.一种药剂盒，包含根据权利要求1至38中任一项所述的稳定化的ADAMTS13制剂。
44.根据权利要求43所述的药剂盒，其中所述药剂盒包含40U至4000U的FRETS-VWF73活性。
45.根据权利要求1至38中任一项所述的ADAMTS13制剂在制备治疗或预防与ADAMTS13或VWF机能障碍相关的疾病或病况的药物中的应用，其中将根据权利要求1至38中任一项所述的ADAMTS13制剂施用于需要其的受治疗者。
46.根据权利要求1至38中任一项所述的ADAMTS13制剂在制备治疗或预防与血栓的形成和/或存在相关的疾病或病况的药物中的应用，其中将根据权利要求1至38中任一项所述的ADAMTS13制剂施用于需要其的受治疗者。
47.根据权利要求1至38中任一项所述的ADAMTS13制剂在制备治疗或预防梗塞的药物中的应用，其中将根据权利要求1至38中任一项所述的ADAMTS13制剂施用于需要其的受治疗者。
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