BR112012006283B1 - Formulação de adamts13 estabilizada, método para fabricar uma formulação de adamts13 estabilizada, kit, e, usos de adamts13 - Google Patents

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Abstract

FORMULAÇÃO DE ADAMTS13 ESTABILIZADA, MÉTODO PARA FABRICAR UMA FORMULAÇÃO DE ADAMTS13 ESTABILIZADA, KIT, E, USO DE ADAMTS13. A presente invenção se refere a formulações de ADAMTS13 com propriedades intensificadas ou desejáveis. Como tal, a invenção fornece formulações líquidas e liofilizadas de ADAMTS13 que são adequadas para administração farmacêutica. Entre outros aspectos, a presente invenção também fornece métodos para tratar várias doenças e condições relacionadas com a disfunção de VWF e/ou ADAMTS13 em um sujeito. Também são fornecidos neste documento kits compreendendo formulações de ADAMTS13 úteis para o tratamento de várias doenças e condições.

Description

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS
[001] O presente pedido reivindica o benefício do Pedido Provisório US 61/244.353, depositado em 21 de setembro de 2009, que é aqui expressamente incorporado por referência na sua totalidade para todos os propósitos. DECLARAÇÃO SOBRE DIREITOS A INVENÇÕES FEITAS SOB PESQUISA OU DESENVOLVIMENTO PATROCINADO PELO GOVERNO FEDERAL
[002] Não Aplicável. REFERÊNCIA A UMA "LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS" UMA TABELA, OU UM APÊNDICE DE LISTAGEM DE PROGRAMA DE COMPUTADOR SUBMETIDO EM UM DISCO COMPACTO
[003] Não Aplicável.
FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO
[004] As proteínas ADAMTS (uma disintegrina e metaloproteinase com motivos de trombospondina tipo I) são uma família de metaloproteinases contendo um número de domínios conservados, incluindo um domínio catalítico dependente de zinco, um domínio rico em cisteína, um domínio tipo disintegrina, e em pelo menos um, e na maioria dos casos, múltiplas repetições de trombospondina I tipo (para revisão, ver Nicholson et al., BMC Evol Biol. 2005 Feb 4;5(1):11). Estas proteínas, que são evolutivamente relacionadas com as famílias de ADAM e MMP de metaloproteinases (Jones GC, Curr Pharm Biotechnol. 2006 Feb;7(1):25-31), são enzimas segregadas que foram ligadas a uma série de doenças e condições incluindo púrpura trombocitopênica trombótica (TTP) (Moake JL, Semin Hematol. 2004 Jan;41(1):4-14), distúrbios do tecido conjuntivo, cânceres, inflamação (Nicholson et al.) e malária grave por Plasmodium falciparum (Larkin et al., PLoS Pathog. 2009 Mar;5(3):e1000349). Devido a estas associações, as enzimas ADAMTS têm sido reconhecidas como potenciais alvos terapêuticos para uma série de patologias (Jones GC, Curr Pharm Biotechnol. 2006 Feb;7(1):25-31).
[005] Um membro da família de ADAMTS, a ADAMTS13, cliva o fator de von Willebrand (vWF) entre os resíduos de Tyr 1605 e Met 1606. A perda de atividade de ADAMTS13 tem sido associada a um determinado número de condições, tais como TTP (Moake JL, Semin Hematol. 2004 Jan;41(1):4-14), inflamação aguda e crônica (Chauhan et al., J Exp Med. 2008 Sep 1;205(9):2065-74) e, mais recentemente, malária grave por Plasmodium falciparum (Larkin et al., PLoS Pathog. 2009 Mar;5(3):e1000349).
[006] A púrpura trombocitopênica trombótica (TTP) é um distúrbio caracterizado por microangiopatia trombótica, trombocitopenia e trombose microvascular que pode causar vários graus de isquemia tecidual e infarto. Clinicamente, os pacientes com TTP são diagnosticados por sintomas tais como trombocitopenia, esquizócitos (fragmentos de eritrócitos) e níveis elevados de lactato desidrogenase (Moake J L. Thrombotic microangiopathies. N Engl J Med. 2002; 347:589-600; Moake J L. von Willebrand factor, ADAMTS-13, and thrombotic thrombocytopenic purpura. Semin Hematol. 2004; 41:4-14; Sadler J E, Moake J L, Miyata T, George J N. Recent advances in thrombotic thrombocytopenic purpura. Hematology (Am Soc Hematol Educ Program). 2004: 407-423; Sadler J E. New concepts in von Willebrand disease. Annu Rev Med. 2005; 56:173-191).
[007] Em 1982, Moake et al. encontraram multímeros de fator de von Willebrand (UL-vWF) surpreendentemente grandes no plasma de pacientes com TTP recorrente crônica (Moake J L, Rudy C K, Troll J H, Weinstein M J, Colannino N M, Azocar J, Seder R H, Hong S L, Deykin D. Unusually large plasma factor VIII:von Willebrand factor multimers in chronic relapsing thrombotic thrombocytopenic purpura. N Engl J Med. 1982; 307:1432-1435). A ligação entre a UL-FvW e TTP ganhou suporte com as verificações independentes por Furlan et al. e Tsai e Lian que a maioria dos pacientes que sofrem de TTP são deficientes em uma metaloprotease de plasma, agora conhecida por ser ADAMTS13, que cliva o vWF (Furlan M, Robles R, Solenthaler M, Wassmer M, Sandoz P, Laemmle B. Deficient activity of von Willebrand factor-cleaving protease in chronic relapsing thrombotic thrombocytopenic purpura. Blood. 1997; 89:3097-3103; Tsai H M, Sussman, II, Ginsburg D, Lankhof H, Sixma JJ, Nagel R L. Proteolytic cleavage of recombinant type 2A von Willebrand factor mutants R834W and R834Q: inhibition by doxycycline and by monoclonal antibody VP-1. Blood. 1997; 89:1954-1962; Tsai H M, Lian E C. Antibodies to von Willebrand factorcleaving protease in acute thrombotic thrombocytopenic purpura. N Engl J Med. 1998; 339:1585-1594).
[008] A protease ADAMTS13 é uma proteína glicosilada de 190 kDa produzida predominantemente pelo fígado (Levy G G, Nichols W C, Lian E C, Foroud T, McClintick J N, McGee B M, Yang A Y, Siemieniak D R, Stark K R, Gruppo R, Sarode R, Shurin S B, Chandrasekaran V, Stabler S P, Sabio H, Bouhassira E E, Upshaw J D, Jr., Ginsburg D, Tsai H M. Mutations in a member of the ADAMTS gene family cause thrombotic thrombocytopenic purpura. Nature. 2001; 413:488-494; Fujikawa K, Suzuki H, McMullen B, Chung D. Purification of human von Willebrand factor-cleaving protease and its identification as a new member of the metalloproteinase family. Blood. 2001; 98:1662-1666; Zheng X, Chung D, Takayama T K, Majerus E M, Sadler J E, Fujikawa K. Structure of von Willebrand factor-cleaving protease (ADAMTS13), a metalloprotease involved in thrombotic thrombocytopenic purpura. J Biol Chem. 2001; 276:41059-41063; Soejima K, Mimura N, Hirashima M, Maeda H, Hamamoto T, Nakagaki T, Nozaki C. A novel human metalloprotease synthesized in the liver and secreted into the blood: possibly, the von Willebrand factor- cleaving protease; J Biochem (Tokyo). 2001; 130:475-480; Gerritsen H E, Robles R, Lammle B, Furlan M. Partial amino acid sequence of purified von Willebrand factor-cleaving protease. Blood. 2001; 98:1654-1661).
[009] Mutações no gene de ADAMTS13 mostraram causar TTP (Levy G G, Nichols W C, Lian E C, Foroud T, McClintick J N, McGee B M, Yang A Y, Siemieniak D R, Stark K R, Gruppo R, Sarode R, Shurin S B, Chandrasekaran V, Stabler S P, Sabio H, Bouhassira E E, Upshaw J D, Jr., Ginsburg D, Tsai H M Mutations in a member of the ADAMTS gene family cause thrombotic thrombocytopenic purpura. Nature. 2001; 413:488-494). A TTP Idiopática, muitas vezes causada por autoanticorpos que inibem a atividade de ADAMTS-13, é um distúrbio mais comum que ocorre em adultos e crianças mais velhas e podem recorrer em intervalos regulares em 11-36% dos pacientes (Tsai H M, Lian E C. Antibodies to von Willebrand factor-cleaving protease in acute thrombotic thrombocytopenic purpura. N Engl J Med. 1998; 339:1585-1594; Furlan M, Lammle B. Deficiency of von Willebrand factor-cleaving protease in familial and acquired thrombotic thrombocytopenic purpura. Baillieres Clin Haematol. 1998; 11:509-514).
[0010] Os autoanticorpos não neutralizantes podem também inibir a atividade de ADAMTS pela indução de depuração de circulação (Scheiflinger F, Knobl P, Trattner B, Plaimauer B, Mohr G, Dockal M, Dorner F, Rieger M. Nonneutralizing IgM and IgG antibodies to von Willebrand factor-cleaving protease (ADAMTS-13) in a patient with thrombotic thrombocytopenic purpura. Blood. 2003; 102:3241-3243). A atividade de ADAMTS13 em adultos saudáveis varia de 50% a 178% (Moake J L. Thrombotic thrombocytopenic purpura and the hemolytic uremic syndrome. Arch Pathol Lab Med. 2002; 126:1430-1433). Na maioria dos pacientes com TTP familiar ou adquirida, a atividade de ADAMTS13 de plasma está ausente ou é menos do que 5% do normal. Sem tratamento, a taxa de mortalidade excede 90%, mas a terapia de plasma reduziu a mortalidade para cerca de 20% (Moake J L. Thrombotic thrombocytopenic purpura and the hemolytic uremic syndrome. Arch Pathol Lab Med. 2002; 126:1430-1433).
[0011] O vWF sintetizado em megacariócitos e células endoteliais é armazenado em grânulos de plaquetas e corpos de Weibel-Palade, respectivamente, como vWF ultra grande (UL-vWF) (Moake J L, Rudy C K, Troll J H, Weinstein M J, Colannino N M, Azocar J, Seder R H, Hong S L, Deykin D. Unusually large plasma factor VIII:von Willebrand factor multimers in chronic relapsing thrombotic thrombocytopenic purpura. N Engl J Med. 1982; 307:1432-1435; Wagner D D, Olmsted J B, Marder V J. Immunolocalization of von Willebrand protein in Weibel-Palade bodies of human endothelial cells. J Cell Biol. 1982; 95:355-360; Wagner D D, Bonfanti R. von Willebrand factor and the endothelium. Mayo Clin Proc. 1991; 66:621-627; Sporn L A, Marder V J, Wagner D D. von Willebrand factor released from Weibel-Palade bodies binds more avidly to extracellular matrix than that secreted constitutively. Blood. 1987; 69:1531 -1534; Tsai H M, Nagel R L, Hatcher V B, Sussman, I I. Endothelial cell- derived high molecular weight von Willebrand factor is converted into the plasma multimer pattern by granulocyte proteases. Biochem Biophys Res Commun. 1989; 158:980-985; Tsai H M, Nagel R L, Hatcher V B, Sussman, I I. Multimeric composition of endothelial cell-derived von Willebrand factor. Blood. 1989; 73:2074-2076). Uma vez secretados de células endoteliais, tais multimeros de UL- vWF são clivados por ADAMTS13 em circulação em uma série de multímeros menores em sítios de clivagem específicos dentro da molécula de vWF (Tsai H M, Nagel R L, Hatcher V B, Sussman, I I. Endothelial cell-derived high molecular weight von Willebrand factor is converted into the plasma multimer pattern by granulocyte proteases. Biochem Biophys Res Commun. 1989; 158:980-985; Dent J A, Galbusera M, Ruggeri Z M. Heterogeneity of plasma von Willebrand factor multimers resulting from proteolysis of the constituent subunit. J Clin Invest. 1991; 88:774-782; Furlan M, Robles R, Affolter D, Meyer D, Baillod P, Lammle B. Triplet structure of von Willebrand factor reflects proteolytic degradation of high molecular weight multimers. Proc Natl Acad Sci USA. 1993; 90:7503-7507).
[0012] ADAMTS13 cliva na ligação de Tyr842-Met843 no domínio A2 central da subunidade vWF madura e requer zinco ou cálcio para a atividade (Dent J A, Berkowitz S D, Ware J, Kasper C K, Ruggeri Z M. Identification of a cleavage site directing the immunochemical detection of molecular abnormalities in type IIA von Willebrand factor. Proc Natl Acad Sci USA. 1990; 87:6306-6310). O vWF existe na forma de "ball-of-yarn" e filamentosa visto por microscopia eletrônica (Slayter H, Loscalzo J, Bockenstedt P, Handin R I. Native conformation of human von Willebrand protein. Analysis by electron microscopy and quasi-elastic light scattering. J Biol. Chem. 1985; 260:8559-8563). Além disso, a microscopia de força atômica confirma que vFW sai em uma conformação globular em condições estáticas e um estado filamentoso desdobrado após a exposição ao estresse de cisalhamento (Siedlecki C A, Lestini B J, Kottke-Marchant K K, Eppell S J, Wilson D L, Marchant R E. Shear-dependent changes in the three-dimensional structure of human von Willebrand factor. Blood. 1996; 88:29392950). Isso pode ocorrer também in vivo, quando uma extremidade do filamento vWF é ancorada a uma superfície.
[0013] Trombos de pacientes com TTP consistem em pouca fibrina e principalmente em vWF e plaquetas, sugerindo a agregação de plaquetas mediada por vWF como uma causa de trombose (Asada Y, Sumiyoshi A, Hayashi T, Suzumiya J, Kaketani K. Immunohistochemistry of vascular lesion in thrombotic thrombocytopenic purpura, with special reference to factor VIII related antigen. Thromb Res. 1985; 38:469-479). Os pacientes com TTP recorrente têm multímeros ultra grandes no plasma. Os multimeros UL-vWF se acumulam ao longo do tempo devido à persistência do inibidor (Anti-ADAMTS13 Ab) diminuir a atividade de ADAMTS13. Os multímeros UL-FvW são hiperativos e desdobrados como resultado da tensão de cisalhamento que causa a agregação plaquetária, resultando em trombose intravascular (Tsai H M. Von Willebrand factor, ADAMTS13, and thrombotic thrombocytopenic purpura. J Mol Med. 2002; 80:639-647; Tsai H M. Deficiency of ADAMTS-13 in thrombotic and thrombocytopenic purpura. J Thromb Haemost. 2003; 1:2038-2040; discussão 2040-2035).
[0014] Acredita-se que a presença de multímeros de UL-vWF hiper- reativos no plasma devido a deficiência de ADAMTS13 pode estar associada com um risco aumentado de trombose arterial associada à doença cardíaca coronária.
[0015] Por conseguinte, existe uma necessidade na técnica para formulações farmacêuticas de proteínas ADAMTS13 adequadas para o tratamento de várias doenças e condições associadas com ADAMTS13 e disfunção de VWF. A presente invenção fornece, entre outros aspectos, formulações de ADAMTS13 adequadas para administração farmacêutica, bem como métodos de tratamento de indivíduos com doenças ou condições associadas com ADAMTS13 e disfunção de VWF.
BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[0016] Em um aspecto, a presente invenção fornece formulações de ADAMTS13 (A13) adequadas para administração farmacêutica. Vantajosamente, em algumas modalidades, a invenção fornece formulações A13 que podem ser armazenadas por longos períodos de tempo sem perder a atividade ou se tornar excessivamente agregada. Em certas modalidades, as formulações da invenção podem ser armazenadas durante pelo menos 6 meses a temperaturas de até pelo menos cerca de 37°C.
[0017] Em um aspecto, a presente invenção fornece uma formulação de ADAMTS13 estabilizada (A13) compreendendo (a) 0,05 mg/ml a 10,0 mg/ml de ADAMTS13, (b) 0 mm a 200 mM de um sal farmaceuticamente aceitável; (c) 0,5 mM a 20 mM de cálcio; (d) um açúcar e/ou álcool de açúcar, (e) um tensoativo não iônico, e (f) um agente tamponador para manutenção de um pH entre 6,0 e 8,0.
[0018] Em um aspecto relacionado, a presente invenção fornece uma formulação liofilizada estabilizada de ADAMTS13 (A13), em que a formulação é liofilizada a partir de uma formulação líquida compreendendo (a) 0,05 mg/ml a 10,0 mg/mL de ADAMTS13, (b) 0 mM a 200 mM de um sal farmaceuticamente aceitável, (c) 0,5 mM a 20 mM de cálcio, (d) um açúcar e/ou álcool de açúcar, (e) um tensoativo não iônico, e (f) um agente tamponador para manter um pH entre 6,0 e 8,0.
[0019] Em um aspecto da invenção, formulações de ADAMTS13 recombinante (rA13) adequadas para administração farmacêutica são fornecidas. Em algumas modalidades, as formulações fornecidas neste documento têm elevadas atividades específicas e são estáveis durante a armazenagem por períodos de tempo prolongados.
[0020] Em outro aspecto da invenção, são fornecidas formulações que têm a agregação ou dimerização de A13 e rA13 reduzidas. Em certas modalidades, as formulações fornecidas neste documento retardam a formação de dímeros e agregação A13 e rA13 quando armazenadas por longos períodos de tempo. Em algumas modalidades, estas formulações são adequadas para administração farmacêutica.
[0021] Em um aspecto, a presente invenção refere-se a um método para tratar ou prevenir um distúrbio associado com a formação e/ou presença de um ou mais trombos e a um método de desintegração de um ou mais trombos em um paciente com necessidade do mesmo. Exemplos de distúrbios associados com a formação e/ou presença de um ou mais trombos são púrpura trombocitopénica trombótica hereditária (TTP), TTP adquirida, trombose arterial, infarto agudo do miocárdio (AMI), acidente vascular cerebral, sepse, e coagulação intravascular disseminada (DIC). Em uma modalidade, os métodos para tratamento ou prevenção incluem a administração de uma formulação de A13 ou rA13 fornecida neste documento.
[0022] Em outro aspecto, a presente invenção fornece métodos para tratamento ou prevenção de um infarto em um paciente com necessidade do mesmo. Em certas modalidades, são fornecidos métodos para tratar ou prevenir uma doença ou condição associada com um infarto, incluindo, sem limitação, infarto do miocárdio (ataque cardíaco), embolia pulmonar, eventos cerebrovasculares, tais como acidente vascular cerebral, doença arterial periférica oclusiva (tais como gangrena), síndrome de antifosfolipídeo, sepse, artrite de células gigantes (GCA), hérnia, e volvulus. Em uma modalidade, os métodos para tratamento ou prevenção incluem a administração de uma formulação de A13 ou rA13 fornecida neste documento.
[0023] Em um aspecto, a presente invenção fornece métodos para formulação de A13 ou rA13 com elevada estabilidade e/ou altas atividades específicas. Em certas modalidades, os métodos são úteis para a formulação de soluções e liofilizados que podem ser armazenados por longos períodos de tempo a temperaturas até pelo menos cerca de 37°C sem perder as elevadas atividades específicas desejáveis para administração farmacêutica.
[0024] Em outro aspecto, os kits para a administração farmacêutica de A13 ou rA13 são fornecidos neste documento. Os kits da presente invenção, em certas modalidades, podem compreender formulações líquidas ou liofilizadas que podem ser armazenadas por longos períodos de tempo.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
[0025] Figura 1. ADAMTS13 recombinante foi formulada em tampão contendo NaCl 150 mM, 2% de sacarose, 0,05% de polissorbato 80, a um pH de 7,0 com 20 mM de um agente tamponador selecionado de (1) histidina, (2) tampão de fosfato, ou (3) citrato de sódio. As soluções foram armazenadas a 4°C ou 37°C por até 6 meses. (A) atividade de FRET-VWF73 e (B) concentração de proteína ADAMTS 13 como medidas por ELISA, foram determinadas nos pontos de tempo indicados.
[0026] Figura 2. ADAMTS13 recombinante foi formulada em tampão contendo NaCl 150 mM, 2% de sacarose, 0,05% de polissorbato 80, a um pH de 7,0 com 20 mM de um agente tamponador selecionado de (1) histidina, (2) tampão de fosfato, ou (3) citrato de sódio e liofilizada. As formulações liofilizadas foram armazenadas a 4°C ou 37°C por até 6 meses. As formulações de ADAMTS13 foram resconstituídas com água estéril e (A) atividade de FRET-VWF73 e (B) concentração de proteína ADAMTS 13 como medidas por ELISA, foram determinadas nos pontos de tempo indicados.
[0027] Figura 3. ADAMTS13 recombinante foi formulada em tampão contendo NaCl 150 mM, 2% de sacarose, 0,05% de polissorbato 80, a um pH de 7,0 com 20 mM de um agente tamponador selecionado de (1) histidina, (2) tampão de fosfato, ou (3) citrato de sódio e as amostras foram carregadas diretamente em uma coluna de filtração de gel Superose 6 ou liofilizadas e reconstituídas com água estéril antes do carregamento. As formulações de ADAMTS13 foram então analisadas por filtração em gel.
[0028] Figure 4. ADAMTS13 recombinante foi formulada em tampão contendo NaCl 150 mM, 2% de sacarose, 0,05% de polissorbato 80, e histidina 20 mM a pH 7,0. As soluções foram armazenadas a (A) 4°C ou (B) 37°C por até 6 meses. As formulações de ADAMTS13 foram então analisadas por filtração em gel nos pontos de tempo indicados.
[0029] Figura 5. ADAMTS13 recombinante foi formulada em tampão contendo NaCl 150 mM, 2% de sacarose, 0,05% de polissorbato 80, e histidina 20 mM em pH 7,0 e então liofilizadas. As formulações liofilizadas foram então armazenadas a (A) 4°C ou (B) 37°C por até 6 meses. As formulações de ADAMTS13 foram resconstituídas em água estéril nos pontos de tempo indicados e analisadas por filtração em gel.
[0030] Figura 6. ADAMTS13 recombinante foi formulada em tampão contendo NaCl 150 mM, 2% de sacarose, 0,05% de polissorbato 80, e histidina 20 mM em pH 7,0 e então armazenadas (A) em solução ou (B) liofilizadas a 4°C ou 37°C por até 6 meses. As formulações liofilizadas foram reconstituídas em água estéril e as amostras armazenadas em solução e as formulações liofilizadas foram caracterizadas por análise de espalhamento de luz dinâmico.
[0031] Figura 7. ADAMTS13 recombinante foi formulada em tampão contendo NaCl 150 mM, 2% de sacarose, 0,05% de polissorbato 80, e tampão de fosfato de sódio 20 mM a pH 7,0 e então armazenadas (A) em solução ou (B) liofilizadas a 4°C ou 37°C por até 6 meses. As formulações liofilizadas foram reconstituídas em água estéril e as amostras armazenadas em solução e as formulações liofilizadas foram caracterizadas por análise de espalhamento de luz dinâmico.
[0032] Figura 8. ADAMTS13 recombinante foi formulada em tampão contendo NaCl 150 mM, 2% de sacarose, 0,05% de polissorbato 80, e citrato trissódico 20mM a pH 7,0 e então armazenada (A) em solução ou (B) liofilizada a 4°C ou 37°C por até 6 meses. As formulações liofilizadas foram reconstituídas em água estéril e as amostras armazenadas em solução e as formulações liofilizadas foram caracterizadas por análise de espalhamento de luz dinâmico.
[0033] Figura 9. ADAMTS13 recombinante foi formulada em tampão contendo NaCl 150 mM, 2% de sacarose, 0,05% de polissorbato 80, e histidina 20 mM em pH 7,0 e então liofilizada. As amostras liofilizadas foram armazenadas a 4°C ou 37°C por 3 meses, e então reconstituídas em água estéril. As amostras de ADAMTS13 foram então caracterizadas por espectroscopia de infravermelho por transformada de Fourrier e os resultados foram comparados com amostra recentemente formulada e liofilizada.
[0034] Figura 10. ADAMTS13 recombinante foi formulada em tampão contendo NaCl 150 mM, 2% de sacarose, 0,05% de polissorbato 80, a um pH de 7,0 com 20 mM de um agente tamponador selecionado de (1) histidina, (2) tampão de fosfato, ou (3) citrato de sódio. As soluções foram armazenadas a 4°C ou 37°C por 6 meses. As formulações liofilizadas foram reconstituídas com água estéril e a pureza de todas as amostras foi determinada por análise de HPLC em fase reversa.
[0035] Figura 11. ADAMTS13 recombinante foi formulada em tampão contendo NaCl 150 mM, 2% de sacarose, 0,05% de polissorbato 80, a um pH de 7,0 com 20 mM de um agente tamponador selecionado de (1) histidina, (2) tampão de fosfato, ou (3) citrato de sódio. As amostras e as formulações da solução foram liofilizadas e reconstituídas com água estéril. A solução e as formulações liofilizadas reconstituídas foram caracterizadas por análise de calorimetria por varredura diferencial.
[0036] Figura 12. ADAMTS13 recombinante foi formulada em tampão contendo NaCl 150 mM, 2% de sacarose, 0,05% de polissorbato 80, a um pH de 7,0 com 20 mM de um agente tamponador selecionado de (1) histidina, (2) tampão de fosfato, ou (3) citrato de sódio. O diâmetro médio z de ADAMTS13 nas formulações foi caracterizado por análise de espalhamento de luz dinâmico.
[0037] Figura 13. ADAMTS13 recombinante foi formulada em tampão contendo NaCl 150 mM, 0%-2% de sacarose, manitol 0%-3%, cálcio 0 mM-2 mM, 0,05% de polissorbato 80, e histidina 20 mM em pH 7,0 e analisadas por filtração em gel. A cromatografia completa é mostrada no painel (A), uma seção ampliada do pico-dímero é mostrada no painel (B).
[0038] Figura 14. ADAMTS13 recombinante foi formulada em tampão contendo NaCl 150 mM and 20 mM histidina a pH 5,5, 6,5, 7,5, 8,5, e 9,5. As formulações foram armazenadas a 4°C ou 40°C por 24 horas. Atividade de FRETS-VWF73 e a concentração de proteína ADAMTS13 como medido por ELISA, foram então determinadas para as formulações de pH indicados.
[0039] Figura 15. ADAMTS13 recombinante foi formulada em tampão contendo NaCl 150 mM, 2% de sacarose, 0,05% de polissorbato 80, e histidina 20 mM em pH 7,0 com (12B e D) e sem (12A w C) CaCl2 2 mM. As formulações líquidas foram armazenadas ou a 25°C (12A e B) ou 37°C (12C e D) por três semanas. A estabilidade da enzima foi medida por Ensaio de FRETS-VWF73 nos pontos de tempo indicados.
[0040] Figura 16. (A) ADAMTS13 recombinante foi carregada em uma coluna de filtração em gel de Superose 6 GL equilibrada com tampão contendo 20 mM Na2HPO4 (pH 7,5) e NaCl 500 mM, e as espécies moleculares foram separadas por tamanho é forma. Três pools de eluição foram criados correspondendo ao agregado A13 (poço 1), dimérico A13 (poço 2), e monomérico A13 (poço 3). A atividade de FRETS-VWF73 de cada poço foi então determinada. (B) O estado monomérico e polidispersidade das frações de poço foram ainda avaliados por análise de espalhamento de luz dinâmico.
[0041] Figura 17. ADAMTS13 recombinante foi formulada em tampão contendo 2% de sacarose, 0,05% de polissorbato 80, histidina 20 mM a pH 7,0, e NaCl a (A) 0 mM, (B) 30 mM, (C) 60 mM, (D) 90 mM, (E) 120 mM, ou (F) 150 mM. As composições de ADAMTS13 formuladas foram então liofilizadas e visualmente inspecionadas para a aparência do bolo de liofilizado (lyocake) resultante.
[0042] Figura 18. Os bolos de liofilizado de ADAMTS13 recombinante produzidos das formulações contendo de 0 a NaCl 150 mM foram reconstituídos em água. Os estados de agregação das proteínas ADAMTS13 reconstituídas foram determinados por análise de filtração em gel.
[0043] Figura 19. ADAMTS13 recombinante foi formulada em tampão contendo 0,05% de polissorbato 80, histidina 20 mM a pH 7,0, sacarose a uma concentração de 5 mM a 20 mM, e NaCl a uma concentração de 0 a 150 mM. A atividade da proteína ADAMTS13 em cada formulação foi determinada por Ensaio de FRETS-VWF73.
[0044] Figura 20. Tampões com elevada quantidade de sal e baixa quantidade de sal foram liofilizados. O tampão com elevada quantidade de sal (A) continha histidina 20 mM (pH 7,0), NaCl 150 mM, 2% de sacarose mM, 0,05% de polissorbato 80, e 2 mM de CaCl2, enquanto que o tampão com baixo quantidade de sal (B) continha histidina 20 mM (pH 7,0), NaCl 30 mM, sacarose a 1%, 3% de manitol, 0,05% de polissorbato 80 e CaCl2 2 mM. As duas formulações foram então liofilizadas em condições padrões e os bolos de liofilizado resultantes foram então inspecionados visualmente.
[0045] Figura 21. O estado de ADAMTS13 recombinante multimérica isolada por cromatografia de troca catiônica (A) antes e (B) após filtração em gel foi analisado por cromatografia de exclusão por tamanho usando uma coluna de Superose 6 GL.
[0046] Figura 22. O estado de ADAMTS13 recombinante multimérica isolada por cromatografia de troca catiônica (A) antes e (B) após filtração em gel foi analisado por espalhamento de luz dinâmico.
[0047] Figura 23. (A) padrão e (B) protocolos estendidos para a liofilização de formulações de rADAMTS13.
[0048] Figura 24. Comparação de bolos de liofilizado de rADAMTS13 produzidos por liofilização de (A) formulações 1 a 4 de rA13 usando um protocolo padrão de liofilização, (B) formulações 1 a 4 de rA13 usando um protocolo de liofilização estendido, (C) formulações de 5 a 8 de rA13 usando um protocolo padrão de liofilização, e (D) formulações de 5 a 8 de rA13 usando um protocolo de liofilização estendido. As formulações e os protocolos de liofilização usados para a geração destes dados podem ser encontrados no exemplo 12.
[0049] Figura 24. Bolos de liofilizado de ADAMTS13 recombinante produzidos a partir de formulações contendo (A) NaCl 30 mM ou (B) NaCl 60 mM, sob protocolos de liofilização tanto padrões (A LYO) quanto estendidos (B LYO) foram reconstituídos em água. Os estados de agregação das proteínas ADAMTS13 reconstituídas foram determinados por análise de espalhamento de luz dinâmico.
[0050] Figura 25. O estado oligomérico e polidispersidade de composições de ADAMTS13 formuladas com (A) NaCl 30 mM ou (B) NaCl 60 mM foi avaliado por análise de espalhamento de luz dinâmico após liofilização com um protocolo padrão ou estendido.
[0051] Figura 26. Estrutura de domínio de protease ADAMTS13 de clivagem de fator de von Willebrand humano (VWF). O polipeptídeo de ADAMTS13 precursor consiste em um peptídeo sinal (S), um pró-peptídeo (P), seguido pelas características estruturais do polipeptídeo maduro que compreende um domínio de metaloprotease catalítico, um domínio tipo disintegrina, um motivo de trombospondina tipo 1 (TSP1), um domínio rico em cisteína e espaçador, 7 repetições de TSP1 adicionais e 2 domínios CUB. Dez sítios de N-glicosilação potenciais são marcados por círculos fechados.
[0052] Figura 27. Diâmetros hidrodinâmicos de composições de ADAMTS13 formuladas com agentes tamponadores diferentes conforme determinado por análise de espalhamento de luz dinâmico (DLS).
[0053] Figura 28. Influência da tensão de cisalhamento em ADAMTS13 recombinante humana como determinado por análise de espalhamento de luz dinâmico (DLS).
[0054] Figura 29. Estabilidade de congelamento-descongelamento de ADAMTS13 recombinante humana conforme determinado pela atividade de FRETS.
[0055] Figura 30. Estabilidade de congelamento-descongelamento de ADAMTS13 recombinante humana como determinado por análise de espalhamento de luz dinâmico (DLS).
[0056] Figura 31. Fotoestabilidade de ADAMTS13 recombinantes humana liofilizada conforme determinado por SE-HPLC.
[0057] Figura 32. Fotoestabilidade de ADAMTS13 recombinante humana líquida e liofilizada, conforme determinado por análise de espalhamento de luz dinâmico (DLS).
[0058] Figura 33. Fotoestabilidade de ADAMTS13 recombinante humana líquida e liofilizada, conforme determinado pela atividade de FRETS.
[0059] Figura 34. Influência de cálcio e de zinco na atividade de FRETS de ADAMTS13 recombinante humana.
[0060] Figura 35. Influência do sal e teor de açúcar no estado oligomérico da formulação de ADAMTS13 recombinante humana liofilizada como determinado por SE-HPLC. O teor de açúcar de cada formulação deve ser apresentado em g/L, ao invés de concentrações molares (por exemplo, 20 mM = 20 g/L).
[0061] Figura 36. Bolos de liofilizado produzidos por liofilização de ADAMTS13 recombinante humana formulada de acordo com a Tabela 15.
[0062] Figura 37. Análise de espalhamento de luz dinâmico (DLS) do estado oligomérico de ADAMTS13 recombinante humana liofilizada com um programa de liofilização padrão de 3 dias, armazenada por 6 meses em (painel superior) 4°C; (painel do meio) 30°C, e (painel inferior) 40°C.
[0063] Figura 38. Análise de espalhamento de luz dinâmico (DLS) do estado oligomérico de ADAMTS13 recombinante humana liofilizada com um programa de liofilização estendido de 10 dias, armazenada por 6 meses em (painel superior) 4°C; (painel do meio) 30°C, e (painel inferior) 40°C.
[0064] Figura 39. Análise de espalhamento de luz dinâmico (DLS) do estado monomérico de ADAMTS13 recombinante humana formulada em diferentes concentrações de proteína após armazenagem a 4°C, 30°C, e 40°C. DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO Introdução
[0065] ADAMTS13 é uma metaloprotease de plasma que cliva multímeros de fator de von Willebrand (VWF) e subrregula a sua atividade na agregação plaquetária. A púrpura trombocitopênica trombótica (TTP) é uma doença grave associada com fator de von Willebrand (VWF) hemostaticamente hiperativo, invulgarmente grande e deficiência grave em ADAMTS-13. Um candidato de produto de ADAMTS13 recombinante tem sido desenvolvido como uma terapia de substituição da proteína recombinante para o tratamento de deficiência de ADAMTS13 causada por TTP (Plaimauer and Scheiflinger, Semin Hematol. 2004 Jan;41(1):24-33; Plaimauer B et al., F. Blood. 2002 Nov 15;100(10):3626-32. Epub 2002 Jul 12; and Bruno K et al., J Thromb Haemost. 2005 May;3(5):1064-73, cujas descrições são todas expressamente incorporadas neste documento por referência na sua totalidade para todos os propósitos.).
[0066] A presente invenção baseia-se em parte na identificação de formulações líquidas e liofilizado de proteínas ADAMTS purificadas com estabilidade aumentada que atendam os requisitos estabelecidos pela Conferência Internacional sobre Harmonização dos Requisitos Técnicos de Produtos Farmacêuticos para uso Humano (ICH Guideline, PHARMACEUTICAL DEVELOPMENT Q8(R2), 2005).
[0067] A atividade hemostática de VWF é altamente dependente do tamanho dos multímeros. A metaloprotease de plasma ADAMTS13 é a protease principal identificada que regula fisiologicamente o tamanho mulitmérico de VWF. ADAMTS13 cliva entre Tyr 1605 e Met 1606 no domínio A2 do VWF produzindo os fragmentos de clivagem típicos de 176 kDa e 140 kDa e multimetros de VWF menores encontrados na circulação. O gene ADAMTS13 humana contém 29 exons e vazios de aproximadamente 37 kb no cromossoma 9q34. O transcrito de 4,7 kb é predominantemente sintetizado em células estreladas hepáticas, mas também nas células endoteliais vasculares e plaquetas e codifica um produto de tradução primária de 1427 resíduos de aminoácidos. O polipeptídeo de ADAMTS13 precursor consiste em um peptídeo sinal e um pró-peptídeo que C-terminalmente termina em um sítio de furina potencial para a clivagem, seguido pela sequência da protease de clivagem de VWF madura. O polipeptídeo de ADAMTS13 maduro (1353 resíduos de aminoácidos) compreende aspectos estruturais característicos de todos os membros da família de ADAMTS: um domínio de metaloprotease tipo reprolisina, um domínio tipo disintegrina, uma repetição de trombospondina central tipo 1 (TSP1), um domínio rico em cisteína abrigando um motivo de RGD possivelmente importante para as interações de integrina, e um domínio espaçador, depois seguido por uma combinação única de 7 repetições consecutivos de TSP1 (TSP1/# 2-8) e dois domínios CUB (Figura 26).
[0068] A ADAMTS13 madura tem uma massa molecular calculada de cerca de 145 kDa, enquanto que a ADAMTS13 derivada de plasma purificada tem uma massa molecular aparente de cerca de 180 kDa, provavelmente devido a modificações pós-traducionais que consistem com as sequências de consenso presentes para 10 sítios de N-glicosilação potenciais, e vários sítios de O-glicosilação e um sítio de C-manosilação nas repetições TSP1. A atividade proteolítica de VWF de ADAMTS13 é altamente dependente cátions divalentes. O motivo de sítio ativo no domínio de metaloprotease contém o motivo altamente conservado HEXXHXXGXXHD com três resíduos de histidina que coordenam um íon de Zn2+ catalítico e um sítio de ligação de cálcio predito proposto como sendo coordenado por Glu 83, Asp 173, Cys 281 e Asp 284. Os papéis funcionais dos domínios de ADAMTS13 têm sido estudados usando principalmente sistemas de ensaio in vitro, mostrando que as regiões N-terminais a partir da metaloprotease para o domínio espaçador são cruciais para a clivagem por VWF. As repetições de TSP1 C-terminais e os domínios CUB parecem ser importantes para o reconhecimento do substrato VWF e ligação aos receptores de superfície potenciais tipo CD36 nas células endoteliais.
[0069] Uma produção principal do desenvolvimento da formulação de proteína é a identificação de vias de inativação e vias de agregação ou de degradação da proteína correspondente. A inativação completa dependente do tempo da proteína ADAMTS13 recombinante humana dentro de 1 semana foi observada a 40°C na formulação líquida, por ensaio de atividade de FRETS. Como aqui divulgado, verificou-se que esta inativação pode ser reduzida na presença de Ca2+ 2 mM. A 25 °C, a atividade de FRETS não diminui mais na presença de Ca2+. A 4°C, as formulações líquidas de atividade de ADAMTS13 foram estáveis durante 24 semanas na ausência de Ca2 +.
[0070] Além disso, verificou-se que em formulações liofilizadas idênticas, apenas leve ou nenhuma inativação ocorreu quando a formulação foi armazenada a 40°C na ausência de Ca2+. A adição de Ca2+ 2 mM ou 4 mM não influenciou a estabilidade a 40°C.
[0071] Em consequência, os inventores identificaram que a agregação dependente do tempo de proteínas ADAMTS13 em formulação líquida (por exemplo, armazenadas a 40°C) é um contribuinte importante para a degradação e/ou perda de atividade enzimática. Importantemente, tal como previsto pela presente invenção, esta agregação pode ser substancialmente reduzida por liofilização e/ou pela adição de Ca2+ para formulações líquidas. Além disso, verificou-se que a adição de um tensoativo não iônico (por exemplo, 0,05% de Tween 80) reduz a formação de agregados em formulações de ADAMTS13 liofilizadas. Além disso, verificou-se que a presença de um ou mais açúcares e/ou alcoóis de açúcar estabilizaram significativamente ADAMTS13 durante a liofilização e auxiliam na formação de um bolo de liofilizado melhorado. Definições
[0072] Tal como usado neste documento, "ADAMTS13" ou "A13" referem-se a uma metaloprotease da família de ADAMTS (uma disintegrina e metaloproteinase com motivos de trombospondina tipo I) que cliva o fator de von Willebrand (vWF) entre os resíduos de Tyr 1605 e Met 1606. No contexto da presente invenção, uma proteína ADAMTS13 engloba qualquer proteína ADAMTS13, por exemplo, ADAMTS13 a partir de um mamífero tal como um primata, humano, (NP_620594), macaco, coelho, porco, bovino (XP_610784), roedor, camundongo (NP_001001322), rato (XP_342396), hamster, gerbil, canino, felino, sapo (NP_001083331), frango (XP_415435), e derivados biologicamente ativos. As proteínas ADAMTS13 mutantes e variantes possuindo atividade são também englobadas, tal como são os fragmentos funcionais e as proteínas de fusão das proteínas ADAMTS13. Além disso, as proteínas ADAMTS13 da invenção podem ainda compreender rótulos que facilitam a purificação, a detecção, ou ambos. As proteínas ADAMTS13 descritas neste documento podem ainda ser modificadas com uma fração terapêutica ou uma imagem adequada da fração in vitro ou in vivo.
[0073] Proteínas ADAMTS13 humanas incluem, sem limitação, os polipeptídeos compreendendo a sequência de aminoácidos de Número de acesso do banco de genes NP_620594 ou um polipeptídeo processado dos mesmos, por exemplo, um polipeptídeo no qual o peptídeo sinal (aminoácidos 1 a 29) e/ou pró-peptídeo (amino ácidos 30-74) foram removidos. Muitas variantes naturais de ADAMTS13 humanas são conhecidas na técnica, e são englobadas pelas formulações da presente invenção, algumas das quais incluem mutações selecionadas de R7W, V88M, H96D, R102C, R193W, T196I, H234Q, A250V, R268P, W390C, R398H, Q448E, Q456H, P457L, P475S, C508Y, R528G, P618A, R625H, I673F, R692C, A732V, E740K, A900V, S903L, C908Y, C951G, G982R, C1024G, A1033T, R1095W, R1095W, R1123C, C1213Y, T1226I, G1239V, e R1336W. Adicionalmente, as proteínas ADAMTS13 incluem proteínas naturais e recombinantes que foram mutadas, por exemplo, por uma ou mais mutações conservativas em um aminoácido não essencial. Preferencialmente, os aminoácidos essenciais para a atividade enzimática de ADAMTS13 não serão mutados. Estes incluem, por exemplo, resíduos conhecidos ou presumidos serem essenciais para a ligação de metal tais como os resíduos 83, 173, 224, 228, 234, 281, e 284, e os resíduos encontrados no sítio ativo da enzima, por exemplo, resíduo 225. Do mesmo modo, no contexto da presente invenção, as proteínas ADAMTS13 incluem isoformas alternadas, por exemplo, isoformas que não apresentam os aminoácidos 275 a 305 e/ou 1135 a 1190 da proteína de comprimento completo humana.
[0074] Tal como usado neste documento, o termo "derivado biologicamente ativo" refere-se a qualquer polipeptídeo com substancialmente a mesma função biológica que a de ADAMTS13. As sequências polipeptídicas dos derivados biologicamente ativos podem compreender deleções, adições e/ou substituição de um ou mais aminoácidos cuja ausência, presença e/ou de substituição, respectivamente, não têm qualquer impacto negativo sobre a atividade biológica do polipeptídeo. A atividade biológica dos ditos polipeptídeos pode ser medida, por exemplo, pela redução ou atraso da adesão das plaquetas ao endotélio, redução ou atraso da agregação plaquetária, a redução ou atraso da formação de fileiras de plaquetas, a redução ou o atraso de formação de trombo, a redução ou o atraso de crescimento de trombo, redução ou atraso de oclusão do vaso, clivagem proteolítica de vWF, desintegração de trombos, ou por clivagem de um substrato de peptídeo, por exemplo, um peptídeo de FRETS-VWF73 (Kokame et al., Br J Haematol 2005 Apr; 129(1):93-100) ou um variante do mesmo.
[0075] Da mesma forma, as proteínas ADAMTS13 podem ser ainda modificadas, por exemplo, por modificações pós-traducionais (por exemplo, glicosilação em um ou mais aminoácidos selecionados a partir de resíduos humanos 142, 146, 552, 579, 614, 667, 707, 828, 1235, 1354, ou qualquer outro sítio de modificação natural ou projetada) ou por modificação enzimática ou química ex vivo, incluindo, sem limitação, glicosilação modificação por polímero solúvel em água (por exemplo, PEGuilação, sialilação, HESilação, etc.) marcação e semelhantes.
[0076] Tal como usado neste documento, "uma unidade de atividade de ADAMTS13" é definida como a quantidade de atividade em 1 ml de poço de plasma humano normal, independentemente do ensaio a ser usado. Por exemplo, uma unidade de atividade de ADAMTS13 de FRETS-VWF73 é a quantidade de atividade necessária para clivar a mesma quantidade de substrato de FRETS- VWF73 (Kokame et al., Br J Haematol 2005 Apr;129(1):93-100) como é clivada por uma ml de poço de plasma humano normal.
[0077] Como usado neste documento, os termos "ADAMTS13" e "derivado biologicamente ativo", respectivamente, também incluem polipeptídeos obtidos através da tecnologia de DNA recombinante. A ADAMTS13 recombinante ("rADAMTS13"), por exemplo, ADAMTS13 recombinante humana ("r-hu-ADAMTS13"), pode ser produzida por qualquer método conhecido na técnica. Um exemplo específico é divulgado no WO 02/42441 que é incorporado neste documento por referência com respeito ao método de produção de ADAMTS13 recombinante. Isto pode incluir qualquer método conhecido na técnica para (i) a produção de DNA recombinante por engenharia genética, por exemplo, através de transcrição reversa do RNA e/ou amplificação de DNA, (ii) introdução de DNA recombinante em células procarióticas ou eucarióticas por transfecção, ou seja, através de eletroporação ou microinjeção, (iii) cultivo das ditas células transformadas, por exemplo, de uma maneira contínua ou descontínua, (iv) expressão de ADAMTS13, por exemplo, constitutivamente ou após indução, e (v) isolamento de dita ADAMTS13, por exemplo, a partir do meio de cultura ou por colheita das células transformadas, para (vi) obter ADAMTS13 recombinante substancialmente purificada, por exemplo, através de cromatografia de troca aniônica ou cromatografia de afinidade. O termo "derivado biologicamente ativo" inclui também moléculas quiméricas, como, por exemplo, ADAMTS13 (ou um derivado biologicamente ativo) em combinação com Ig, a fim de melhorar as propriedades biológicas/farmacológicas, tais como, por exemplo, meia vida de ADAMTS13 no sistema de circulação de um mamífero, particularmente de humanos. A Ig pode ter também o sítio de ligação para um receptor de Fc opcionalmente mutado.
[0078] Tal como usado neste documento, o termo "trombo" refere-se a um coágulo de sangue, especialmente um coágulo de sangue compreendendo plaquetas, um microtrombos, e/ou um êmbolo. Dito trombo pode ser fixo a um vaso sanguíneo arterial ou venoso ou não, e pode bloquear parcialmente ou completamente o fluxo de sangue em um vaso sanguíneo arterial ou venoso.
[0079] Como usado neste documento, os termos "vitamina B3", "nicotinamida", "niacinamida", "niacina", e "ácido nicotínico" pode ser usado para se referir a qualquer membro da família de vitaminas B3.
[0080] Tal como usado neste documento, uma "quantidade terapeuticamente eficaz ou dose" ou "quantidade suficiente ou dose" refere-se a uma dose que produz efeitos para os quais ela é administrada. A dose exata dependerá do propósito do tratamento, e será determinável por um versado na técnica usando técnicas conhecidas (ver, por exemplo, Lieberman, Pharmaceutical Dosage Forms (vols. 1-3, 1992); Lloyd, The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding (1999); Pickar, Dosage Calculations (1999); and Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th Edition, 2003, Gennaro, Ed., Lippincott, Williams & Wilkins).
[0081] Tal como usado neste documento, uma "concentração fisiológica" de sal refere-se a uma concentração de sal entre cerca de 100 mM e cerca de 200 mM de um sal farmaceuticamente aceitável. Exemplos não limitativos de sais farmaceuticamente aceitáveis incluem, sem limitação, sódio e cloreto de potássio, sódio e acetato de potássio, sódio e citrato de potássio, sódio e fosfato de potássio.
[0082] Tal como usado neste documento, uma "concentração subfisiológica" de sal refere-se a uma concentração de sal de menor que cerca de 100 mM de um sal farmaceuticamente aceitável. Em modalidades preferidas, uma concentração subfisiológica de sal é menor que cerca de 80 mM de um sal farmacêutico. Em outra modalidade preferida, uma concentração subfisiológica de sal é menor que cerca de 60 mM de um sal farmacêutico.
[0083] Tal como usado neste documento, o termo "cerca de" denota uma faixa aproximada de mais ou menos 10% a partir de um valor especificado. Por exemplo, a linguagem "cerca de 20%" engloba uma faixa de 18-22%. Como usado neste documento, cerca de também inclui a quantidade exata. Por isso, "cerca de 20%" significa "cerca de 20%" e também "20%".
[0084] Tal como usado neste documento, "armazenagem" significa que uma formulação não é imediatamente administrada a um sujeito, uma vez preparada, mas é mantida por um período de tempo em condições particulares (por exemplo, temperatura particular, etc.) antes de usar. Por exemplo, uma formulação líquida ou liofilizada pode ser mantida por dias, semanas, meses ou anos, antes da administração a um sujeito em temperaturas variadas, tais como temperatura refrigerada (0° a 10°C) ou ambiente (por exemplo, a temperatura até 32°C).
[0085] Tal como usado neste documento, o termo "meio quimicamente definido" refere-se a um meio de crescimento sintético em que a identidade e a concentração de todos os componentes são conhecidas. Meios quimicamente definidos não contêm extratos de bactérias, levedura, animal, ou de plantas, embora eles possam ou não incluir componentes derivados de plantas ou animais (por exemplo, proteínas, polipeptídeos, etc.) Exemplos não limitativos de meios definidos quimicamente comercialmente disponíveis incluem, vários meios de EX-CELL® (SAFC Biosciences, Inc.), vários meios de Eagle Modificado por Dulbecco (DME) Os suportes (Sigma-Aldrich Co; SAFC Biosciences, Inc), mistura nutriente de Ham (Sigma -Aldrich Co; SAFC Biosciences, Inc), e semelhantes. Métodos para preparação de meios de cultura quimicamente definidos são conhecidos na técnica, por exemplo, nas patentes US 6.171.825 e 6.936.441, WO 2007/077217, e nas Publicações de Pedidos de Patente US 2008/0009040 e 2007/0212770, cujas descrições são incorporadas neste documento por referência na sua totalidade para todos os efeitos.
[0086] Tal como usado neste documento, o termo "meio de cultura isento de oligopeptídeo" refere-se a um meio isento de proteínas que não compreende oligopeptídeos, tais como, por exemplo, oligopeptídeos derivados de um hidrolisado de proteína. Em uma modalidade, o meio não compreende oligopeptídeos com vinte ou mais aminoácidos. Em uma modalidade da presente invenção, o meio não compreende oligopeptídeos com quinze ou mais aminoácidos. Em outra modalidade da invenção, o meio não compreende oligopeptídeos com dez ou mais aminoácidos. Em uma modalidade o meio não compreende oligopeptídeos possuindo sete ou mais aminoácidos. Em outra modalidade o meio não compreende oligopeptídeos com cinco ou mais aminoácidos. Em ainda outra modalidade o meio não compreende oligopeptídeos com três ou mais aminoácidos. De acordo com outra modalidade da presente invenção, o meio não compreende oligopeptídeos com dois ou mais aminoácidos. Métodos para preparação de meios de cultura isentos de oligopeptídeo são conhecidos na técnica, por exemplo, na patente US 6.171.825 e 6.936.441, WO 2007/077217, e na Publicação de Pedido de Patente US 2008/0009040 e 2007/0212770, cujas descrições são incorporadas neste documento por referência na sua totalidade para todos os propósitos.
[0087] Tal como usado neste documento, o termo "meio de cultura isento de soro" refere-se a um meio de cultura que não é suplementado com um soro de animal. Embora muitas vezes os meios isentos de soro sejam meios quimicamente definidos, os meios isentos de soro podem ser suplementados com proteínas de animais ou plantas discretas ou frações de proteína. Métodos para preparação de meios de cultura isentos de soro são conhecidos na técnica, por exemplo, nas Patentes US 6.171.825 e 6.936.441, WO 2007/077217, e na Publicação de Pedido de Patente US 2008/0009040 e 2007/0212770, cujas descrições são incorporadas neste documento por referência na sua totalidade para todos os propósitos.
[0088] Tal como usado neste documento, o termo "meio de cultura isento de proteína animal" refere-se a um meio de cultura que não é suplementado com um soro de animal, proteína, ou fração de proteína. Embora muitas vezes os meios de cultura isentos de proteínas animais sejam meios quimicamente definidos, os meios de cultura isentos de proteína animal podem conter hidrolisados de plantas ou levedura. Os métodos de preparação de meios de cultura isentos de proteínas animais são conhecidos na técnica, por exemplo, nas patentes US 6.171.825 e 6.936.441, WO 2007/077217, e na Publicação de Pedido de Patente US 2008/0009040 e 2007/0212770, cujas descrições são incorporadas neste documento por referência na sua totalidade para todos os propósitos.
[0089] Um "vetor de expressão" é um construto de ácido nucleico, gerado de forma recombinante ou sintética, com uma série de elementos de ácidos nucleicos determinados que permitem a transcrição de um ácido nucleico particular em uma célula hospedeira. O vetor de expressão pode ser parte de um vírus, plasmídeo, ou fragmento de ácido nucleico. Tipicamente, o vetor de expressão inclui um ácido nucleico a ser transcrito ligado operativamente a um promotor.
[0090] O termo "heterólogo" quando usado com referência a porções de um ácido nucleico indica que o ácido nucleico compreende duas ou mais subsequências que não são encontradas na mesma relação entre si na natureza. Por exemplo, o ácido nucleico é tipicamente produzido de forma recombinante, tendo duas ou mais sequências de genes independentes dispostas para fazer um novo ácido nucleico funcional, por exemplo, um promotor de uma fonte e uma região de codificação de outra fonte. Do mesmo modo, uma proteína heteróloga indica que a proteína compreende duas ou mais subsequências que não são encontradas na mesma relação entre si na natureza (por exemplo, uma proteína de fusão).
[0091] Um "promotor" é definido como uma matriz de sequências de controle de ácidos nucleicos que dirigem a transcrição de um ácido nucleico. Tal como usado neste documento, um promotor inclui sequências necessárias de ácidos nucleicos próximas do sítio de partida da transcrição, tais como, no caso de um promotor de tipo polimerase II, um elemento TATA. Um promotor também inclui opcionalmente elementos potenciadores ou repressores distais, que podem ser localizados tanto como vários milhares de pares de bases a partir do sítio de partida da transcrição. Um promotor "constitutivo" é um promotor que está ativo na maioria das condições ambientais e de desenvolvimento. Um promotor "induzido" é um promotor que está ativo mediante regulamentação ambiental ou de desenvolvimento. O termo "operativamente ligado" refere-se a uma ligação funcional entre uma sequência de controle de expressão de ácido nucleico (tal como um promotor, ou uma matriz de sítios de ligação do fator de transcrição) e uma segunda sequência de ácido nucleico, em que a sequência de controle de expressão dirige a transcrição do ácido nucleico correspondente à segunda sequência. Composições e Formulações de ADAMTS13
[0092] Em um aspecto, a presente invenção fornece formulações estabilizadas de proteínas ADAMTS13 (A13) e rADAMTS13 (rA13). Em uma modalidade, as formulações da invenção são estáveis quando armazenadas a temperaturas de até pelo menos cerca de 40°C durante pelo menos cerca de 6 meses. Em outras modalidades, as formulações fornecidas neste documento mantêm a atividade de ADAMTS13 significativa quando armazenadas durante longos períodos de tempo. Em ainda outras modalidades, as formulações da invenção reduzem ou retardam a dimerização, oligomerização, e/ou agregação de uma proteína ADAMTS13.
[0093] Em uma modalidade, a presente invenção fornece formulações de ADAMTS13 compreendendo uma quantidade ou dose terapeuticamente eficaz de uma proteína ADAMTS13, uma concentração subfisiológica a fisiológica de um sal farmaceuticamente aceitável, uma concentração de estabilização de um ou mais açúcares e/ou alcoóis de açúcar, um tensoativo não iônico, um agente tamponador fornecendo um pH neutro para a formulação, e opcionalmente um sal de cálcio e/ou zinco. Geralmente, as formulações estabilizadas de A13 fornecidas neste documento são adequadas para administração farmacêutica. Em uma modalidade preferida, a proteína A13 é ADAMTS13 humana ou um derivado biologicamente ativo ou um fragmento do mesmo.
[0094] Em certas modalidades, as formulações de ADAMTS13 são formulações líquidas. Em outras modalidades, as formulações de ADAMTS13 são formulações liofilizadas que são liofilizadas a partir de uma formulação líquida tal como fornecida neste documento.
[0095] Em certas modalidades das formulações fornecidas neste documento, a proteína ADAMTS13 é uma ADAMTS13 humana (hA13) ou ADAMTS13 recombinante humana (rhA13), ou um derivado biologicamente ativo ou um fragmento do mesmo. Em uma modalidade, a sequência de aminoácidos de hA13 é a de número de acesso do banco de genes NP_620594. Em outra modalidade, a sequência de aminoácidos de hA13 compreende os aminoácidos 75 a 1427 de NP_620594, uma variante natural ou conservativa do mesmo, ou um fragmento biologicamente ativo do mesmo.
[0096] Em certas modalidades, ADAMTS13 é fornecida em uma dose terapeuticamente eficaz entre cerca de 0,05 mg/mL e cerca de 10 mg/mL. Em outras modalidades, ADAMTS13 está presente a uma concentração de entre cerca de 0,1 mg/mL e cerca de 10 mg/mL. Em ainda outras modalidades, ADAMTS13 está presente a uma concentração de entre cerca de 0,1 mg/mL e cerca de 5 mg/mL. Em outra modalidade, ADAMTS13 está presente a uma concentração de entre cerca de 0,1 mg/mL e cerca de 2 mg/mL. Em ainda outras modalidades, ADAMTS13 pode estar presente em cerca de 0,01 mg/mL, ou menos cerca de 0,02 mg/mL, 0,03 mg/mL, 0,04 mg/mL, 0,05 mg/mL, 0,06 mg/mL, 0,07 mg/mL, 0,08 mg/mL, 0,09 mg/mL, 0,1 mg/mL, 0,2 mg/mL, 0,3 mg/mL, 0,4 mg/mL, 0,5 mg/mL, 0,6 mg/mL, 0,7 mg/mL, 0,8 mg/mL, 0,9 mg/mL, 1,0 mg/mL, 1,1 mg/mL, 1,2 mg/mL, 1,3 mg/mL, 1,4 mg/mL, 1,5 mg/mL, 1,6 mg/mL, 1,7 mg/mL, 1,8 mg/mL, 1,9 mg/mL, 2,0 mg/mL, 2,5 mg/mL, 3,0 mg/mL, 3,5 mg/mL, 4,0 mg/mL, 4,5 mg/mL, 5,0 mg/mL, 5,5 mg/mL, 6,0 mg/mL, 6,5 mg/mL, 7,0 mg/mL, 7,5 mg/mL, 8,0 mg/mL, 8,5 mg/mL, 9,0 mg/mL, 9,5 mg/mL, 10,0 mg/mL, ou uma concentração mais elevada. Em uma modalidade, a concentração de uma formulação de ADAMTS13 relativamente pura pode ser determinada por espectroscopia (isto é, proteína total medida em A280) ou outras determinações em grande escala (por exemplo, ensaio de Bradford, coloração de prata, peso de um pó liofilizado, etc.) Em outras modalidades, a concentração de ADAMTS13 pode ser determinada por um ensaio de ELISA em ADAMTS13 (por exemplo, mg/mL de antígeno).
[0097] Em ainda outras modalidades, a concentração de ADAMTS13 em uma formulação fornecida pela presente invenção pode ser expressa como um nível de atividade enzimática. Por exemplo, em uma modalidade uma formulação de ADAMTS13 pode conter entre cerca de 10 unidades de Atividade de FRETS-VWF73 e cerca de 10.000 unidades de Atividade de FRETS-VWF73 ou outra unidade enzimática (UI) A13 adequado. Em outras modalidades, a formulação pode conter entre cerca de 20 unidades de atividade de FRETS-VWF73 (UFV73) e cerca de 8.000 unidades de atividade de FRETS-VWF73, ou entre cerca de 30 UFV73 e cerca de 6.000 UFV73, ou entre cerca de 40 UFV73 e cerca de 4.000 UFV73, ou entre cerca de 50 UFV73 e cerca de 3.000 UFV73, ou entre cerca de 75 UFV73 e cerca de 2.500 UFV73, ou entre cerca de 100 UFV73 e cerca de 2.000 UFV73, ou entre cerca de 200 UFV73 e cerca de 1.500 UFV73, ou entre cerca de outras faixas das mesmas. Em uma modalidade preferida, uma formulação de ADAMTS13 fornecida neste documento contém entre cerca de 150 e cerca de 600 UFV73. Em certas modalidades, uma formulação contém cerca de 10 unidades de atividade de FRETS-VWF73, ou cerca de 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, 900, 1.000, 1.100, 1.200, 1.300, 1.400, 1.500, 1.600, 1.700, 1.800, 1.900, 2.000, 2.100, 2.200, 2.300, 2.400, 2.500, 2.600, 2.700, 2.800, 2.900, 3.000, 3.100, 3.200, 3.300, 3.400, 3.500, 3.600, 3.700, 3.800, 3.900, 4.000, 4.100, 4.200, 4.300, 4.400, 4.500, 4.600, 4.700, 4.800, 4.900, 5.000, 5.100, 5.200, 5.300, 5.400, 5.500, 5.600, 5.700, 5.800, 5.900, 6.000, 6.100, 6.200, 6.300, 6.400, 6.500, 6.600, 6.700, 6.800, 6.900, 7.000, 7.100, 7.200, 7.300, 7.400, 7.500, 7.600, 7.700, 7.800, 7.900, 8.000, 8.100, 8.200, 8.300, 8.400, 8.500, 8.600, 8.700, 8.800, 8.900, 9.000, 9.100, 9.200, 9.300, 9.400, 9.500, 9.600, 9.700, 9.800, 9.900, 10.000 ou mais unidades de atividade de FRETS- VWF73.
[0098] Do mesmo modo, em certas modalidades, a concentração de ADAMTS13 pode ser expressa como uma atividade enzimática por unidade de volume, por exemplo, unidades enzimáticas de A13 por mL (IU/mL). Por exemplo, em uma modalidade uma formulação de ADAMTS13 pode conter entre cerca de 10 IU/mL e cerca de 10.000 IU /mL. Em outras modalidades, a formulação pode conter entre cerca de 20 IU/mL e cerca de 8000 IU /mL, ou entre cerca de 30 IU/mL e cerca de 6000 IU /mL, ou entre cerca de 40 IU/mL e cerca de 4000 IU /mL, ou entre cerca de 50 IU/mL e cerca de 3000 IU /mL, ou entre cerca de 75 IU /mL e cerca de 2500 IU /mL, ou entre cerca de 100 IU /mL e cerca de 2000 IU /mL, ou entre cerca de 200 IU /mL e cerca 1500 IU /mL, ou entre cerca de outras faixas das mesmas. Em uma modalidade preferida, uma formulação de ADAMTS13 fornecida neste documento contém entre cerca de 150 v/mL e cerca de 600 IU /mL. Em outra modalidade preferida, uma formulação de ADAMTS13 fornecida neste documento contém entre cerca de 100 IU /mL e cerca de 1000 IU /mL. Em certas modalidades, uma formulação contém cerca de 10 IU /mL, ou cerca de 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, 900, 1.000, 1.100, 1.200, 1.300, 1.400, 1.500, 1.600, 1.700, 1.800, 1.900, 2.000, 2.100, 2.200, 2.300, 2.400, 2.500, 2.600, 2.700, 2.800, 2.900, 3.000, 3.100, 3.200, 3.300, 3.400, 3.500, 3.600, 3.700, 3.800, 3.900, 4.000, 4.100, 4.200, 4.300, 4.400, 4.500, 4.600, 4.700, 4.800, 4.900, 5.000, 5.100, 5.200, 5.300, 5.400, 5.500, 5.600, 5.700, 5.800, 5.900, 6.000, 6.100, 6.200, 6.300, 6.400, 6.500, 6.600, 6.700, 6.800, 6.900, 7.000, 7.100, 7.200, 7.300, 7.400, 7.500, 7.600, 7.700, 7.800, 7.900, 8.000, 8.100, 8.200, 8.300, 8.400, 8.500, 8.600, 8.700, 8.800, 8.900, 9.000, 9.100, 9.200, 9.300, 9.400, 9.500, 9.600, 9.700, 9.800, 9.900, 10.000 ou mais IU/mL.
[0099] Em certas modalidades, as formulações de ADAMTS13 estabilizadas fornecidas pela presente invenção irão conter uma concentração de sal subfisiológica a fisiológica, por exemplo, entre 0 mM e cerca de 200 mM de um sal farmaceuticamente aceitável. Em uma modalidade, uma formulação de ADAMTS13 irá conter uma concentração fisiológica de sal, por exemplo, entre cerca de 100 mM e cerca de 200 mM de um sal farmaceuticamente aceitável. Em outras modalidades, uma formulação de ADAMTS13 irá conter cerca de 0 mM, ou cerca de 5 mM, 10 mM, 15 mM, 20 mM, 25 mM, 30 mM, 35 mM, 40 mM, 45 mM, 50 mM, 55 mM, 60 mM, 65 mM, 70 mM, 75 mM, 80 mM, 85 mM, 90 mM, 95 mM, 100 mM, 110 mM, 120 mM, 130 mM, 140 mM, 150 mM, 160 mM, 170 mM, 180 mM, 190 mM, 200 mM, ou mais de um sal farmaceuticamente aceitável. Em uma modalidade preferida, o sal é sódio ou cloreto de potássio.
[00100] Vantajosamente, verificou-se que as formulações de ADAMTS13 contendo uma concentração sub-fisiológica de um sal farmaceuticamente aceitável formam bolos de liofilizado compactos com superfícies lisas. Além disso, verificou-se que as formulações liofilizadas com baixa quantidade de sal de proteínas ADAMTS13 reduzem a agregação de proteínas, em comparação com formulações preparadas com concentrações fisiológicas de sal. Por conseguinte, em uma modalidade preferida, a presente invenção fornece formulações de ADAMTS13 com baixa quantidade de sal contendo uma concentração subfisiológica de um sal farmaceuticamente aceitável, por exemplo, menos do que cerca de 100 mM de um sal farmaceuticamente aceitável. Em uma modalidade, uma formulação de ADAMTS13 com baixa quantidade de sal fornecida neste documento contém menos do que cerca de 100 mM de um sal farmacêutico. Em uma modalidade preferida, uma formulação de ADAMTS13 com baixa quantidade de sal fornecida neste documento contém menos do que cerca de 80 mM de um sal farmacêutico. Em outra modalidade preferida, uma formulação de ADAMTS13 com baixa quantidade de sal fornecida neste documento contém menos do que cerca de 60 mM de um sal farmacêutico (ou seja, entre cerca de 0 mM e cerca de 60 mM de sal). Em outra modalidade preferida, uma formulação de ADAMTS13 com baixa quantidade de sal conterá entre cerca de 30 mM e cerca de 60 mM de um sal farmaceuticamente aceitável. Em ainda outras modalidades, uma formulação de ADAMTS13 com baixa quantidade de sal conterá cerca de 0 mM, ou cerca de 5 mM, 10 mM, 15 mM, 20 mM, 25 mM, 30 mM, 35 mM, 40 mM, 45 mM, 50 mM, 55 mM, 60 mM, 65 mM, 70 mM, 75 mM, 80 mM, 85 mM, 90 mM, 95 mM ou 100 mM de um sal farmaceuticamente aceitável. Em uma modalidade preferida, uma formulação de ADAMTS13 com baixa quantidade de sal é uma formulação liofilizada. Em uma modalidade preferida, o sal é sódio ou cloreto de potássio.
[00101] Também foi verificado que a inclusão de níveis moderados (isto é, entre cerca de 2% e cerca de 6%) de um ou mais açúcares e/ou alcoóis de açúcar auxilia na preparação de bolos de liofilizado compactos com superfícies lisas e ajuda a estabilizar ADAMTS13 mediante liofilização. Por conseguinte, em uma modalidade, a presente invenção fornece formulações de ADAMTS13 contendo entre cerca de 2% e cerca de 6% de um ou mais açúcares e/ou alcoóis de açúcar. Qualquer açúcar, tal como mono-, di-, ou polissacarídeos, ou glucanas solúveis em água, incluindo, por exemplo, frutose, glicose, manose, sorbose, xilose, maltose, lactose, sacarose, dextrano, trealose, pululano, dextrina, ciclodextrina, amido solúvel, amido de hidroxietilo, e carboximetilcelulose podem ser usados. Em uma modalidade particular, a sacarose ou trealose é usada como um aditivo de açúcar. Os alcoóis de açúcar são definidos como um hidrocarboneto tendo entre cerca de 4 e cerca de 8 átomos de carbono e um grupo hidroxila. Exemplos não limitativos de alcoóis de açúcar que podem ser usados nas formulações de ADAMTS13 fornecidas neste documento incluem manitol, sorbitol, inositol, galactitol, dulcitol, xilitol, e arabitol. Em uma modalidade, o manitol é usado como um aditivo de álcool de açúcar. Em uma modalidade preferida, uma formulação de ADAMTS13 contém tanto um açúcar quanto um aditivo de álcool de açúcar.
[00102] Os açúcares e alcoóis de açúcar podem ser usados individualmente ou em combinação. Em algumas modalidades, o açúcar, álcool de açúcar, ou uma combinação dos mesmos estará presente na formulação em uma concentração de entre cerca de 0,5% e cerca de 7%. Em uma modalidade, o teor de álcool de açúcar e/ou açúcar da formulação será entre cerca de 0,5% e cerca de 5%. Em certas modalidades, o açúcar, álcool de açúcar, ou uma combinação dos mesmos estará presente em uma concentração de entre cerca de 1% e cerca de 5%. Em uma modalidade preferida, o açúcar, álcool de açúcar, ou uma combinação dos mesmos estará presente em uma concentração de entre cerca de 2% e cerca de 6%. Em outra modalidade preferida, o açúcar, álcool de açúcar, ou uma combinação dos mesmos estará presente em uma concentração de entre cerca de 3% e cerca de 5%. Em certas modalidades, a concentração final pode ser de cerca de 0,5%, 1%, 1,5%, 2%, 2,5%, 3%, 3,5%, 4%, 4,5%, 5%, 5,5%, 6,0%, 6,5%, ou 7,0% de açúcar, álcool de açúcar, ou combinação dos mesmos. Em modalidades particulares, uma formulação fornecida neste documento pode compreender um açúcar em uma concentração de cerca de 0,5% a cerca de 5,0% e um álcool de açúcar em uma concentração de cerca de 0,5% a cerca de 5,0%. Qualquer combinação de concentrações de álcool de açúcar ou de açúcar pode ser usada, por exemplo, um açúcar presente em uma concentração de cerca de 0,5%, 1%, 1,5%, 2%, 2,5%, 3%, 3,5%, 4%, 4,5%, 5%, 5,5%, 6,0%, 6,5%, ou 7,0% e um álcool de açúcar presente em uma concentração de cerca de 0,5%, 1%, 1,5%, 2%, 2,5%, 3%, 3,5%, 4%, 4,5%, 5%, 5,5%, 6,0%, 6,5%, ou 7,0%.
[00103] Vantajosamente, constatou-se igualmente que a inclusão de um tensoativo não iônico reduz substancialmente a agregação de formulações de ADAMTS13. Por conseguinte, em uma modalidade, as formulações de ADAMTS13 contendo uma concentração de estabilização de um detergente não iônico são fornecidas. Agentes tensoativos não iônicos farmaceuticamente aceitáveis que podem ser usados nas formulações da presente invenção são conhecidos na técnica da ciência farmacêutica, e incluem, sem limitação Polissorbato 80 (Tween 80), Polissorbato 20 (Tween 20), e vários poloxâmeros ou plurônicos, incluindo Pluronic F-68, e BRIJ 35, ou misturas dos mesmos. Em uma modalidade preferida, o tensoativo não iônico usado nas presentes formulações farmacêuticas é o Polisorbato 80. Em certas modalidades, um tensoativo pode ser usado em uma formulação fornecida neste documento a uma concentração entre cerca de 0,001% e cerca de 0,2%. Em uma modalidade preferida, o tensoativo é usado em uma concentração de entre cerca de 0,01% e cerca de 0,1%. Em outra modalidade preferida, o tensoativo é usado em uma concentração de cerca de 0,05%. Por exemplo, em certas modalidades, a formulação pode incluir um tensoativo não iônico a uma concentração de cerca de 0,001%, 0,005%, 0,01%, 0,02%, 0,03%, 0,04%, 0,05%, 0,06%, 0,07%, 0,08%, 0,09 %, 0,1%, 0,125%, 0,15%, 0,175%, 0,2%, e semelhantes.
[00104] Além disso, verificou-se que as formulações de ADAMTS13 foram estabilizadas quando formuladas a um pH neutro, entre cerca de 6,5 e cerca de 7,5. Assim, em certas modalidades, as formulações de ADAMTS13 são fornecidas as quais contêm um agente tamponador apropriado para manter a formulação a um pH neutro. Agentes tamponadores farmaceuticamente aceitáveis são bem conhecidos na técnica, e incluem, sem limitação, tampões de fosfatos, histidina, citrato de sódio, HEPES, Tris, bicina, glicina, N- glicilglicina, acetato de sódio, carbonato de sódio, glicilglicina, lisina, arginina, fosfato de sódio, e misturas dos mesmos. Em modalidades preferidas, o tampão é selecionado a partir histidina, tampão de fosfato, HEPES, e de citrato Sódio. Em uma modalidade preferida, o tampão é histidina ou HEPES. Em uma modalidade específica, o tampão é de histidina. Em outra modalidade específica, o tampão é HEPES. Em uma modalidade, o pH das formulações fornecidas neste documento é entre cerca de 6,5 e cerca de 9,0. Em certas modalidades, o pH da formulação é de cerca de 6,5 ou cerca de 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 7,9, 8,0, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, ou 9,0. Em uma modalidade preferida, o pH da formulação de A13 está entre cerca de 6,0 e cerca de 8,0. Em uma modalidade mais preferida, o pH da formulação de A13 está entre cerca de 6,5 e cerca de 7,5. Em uma modalidade particular, o pH da formulação de A13 é de cerca de 7,0. Em outra modalidade particular, o pH da formulação de A13 é de 7,0 ± 0,2.
[00105] Também é demonstrado neste documento que a inclusão de cálcio estabiliza ainda mais formulações de ADAMTS13. Assim, em certas modalidades, formulações de ADAMTS13 estabilizadas são fornecidas, as quais contêm entre cerca de 0,5 mM e cerca de 20 mM de cálcio (por exemplo, cloreto de cálcio). Qualquer sal de cálcio farmaceuticamente aceitável pode ser usado nas formulações fornecidas neste documento. Exemplos não limitativos de sais de cálcio que podem ser usados incluem, por exemplo, CaCl2, CaCO3, Ca(C6H11O7)2, Ca3(PO4)2, Ca(C18H35O2)2, e semelhantes. Em uma modalidade, o cálcio está presente em uma formulação de ADAMTS13 da invenção a uma concentração de cerca de 0,5 mM a cerca de 10 mM. Em uma outra modalidade, o cálcio está presente em uma formulação de ADAMTS13 a uma concentração entre cerca de 2 mM e cerca de 5 mM. Em uma modalidade preferida, o cálcio está presente em uma formulação de ADAMTS13 a uma concentração de cerca de 2 mM a cerca de 4 mN. Em certas modalidades, a concentração de cálcio é de cerca de 0,5 mM, ou cerca de 1 mM, 2 mM, 3 mM, 4 mM, 5 mM, 6 mM, 7 mM, 8 mM, 9 mM, 10 mM, 11 mM, 12 mM, 13 mM, 14 mM, 15 mM, 16 mM, 17 mM, 18 mM, 19 mM, ou 20 mM. Em uma modalidade particular, a concentração de cálcio é de cerca de 2 mM. Em outra modalidade preferida, a concentração de cálcio é de cerca de 3 mM. Em ainda outra modalidade preferida, a concentração de cálcio é de cerca de 4 mM.
[00106] Do mesmo modo, verificou-se que em certas condições, a inclusão de zinco estabiliza ainda mais uma formulação de ADAMTS13 tal como fornecida neste documento. Por exemplo, A Figura 34 mostra que a inclusão de entre cerca de 2 μM e cerca de 10 μM de zinco estabilizou ainda mais as formulações de ADAMTS13 contendo cálcio. Qualquer sal de zinco farmaceuticamente aceitável pode ser usado nas formulações fornecidas neste documento. Exemplos não limitativos de sal de zinco que podem ser usados incluem, por exemplo, ZnSC)r7H2C), ZnSOy2H2O, Zn3(PO4)2, e (CZ^CZbZn^^O, e semelhantes. Em uma modalidade, ZnSO4 é usado nas formulações de ADAMTS13 fornecidas neste documento. Em algumas modalidades, o zinco está presente em uma formulação de ADAMTS13 da invenção a uma concentração de cerca de 0,5 μM a cerca de 20,0 μM. Em uma modalidade preferida, o zinco é incluído em uma formulação de ADAMTS13 a uma concentração de entre cerca de 0,5 μM a cerca de 10,0 μM. Em certas modalidades, a concentração de zinco é de cerca de 0,5 μM, ou cerca de 1 μM, 2 μM, 3 μM, 4 μM, 5 μM, 6 μM, 7 μM, 8 μM, 9 μM, ou 10 μM.
[00107] Em algumas modalidades, as formulações de ADAMTS13 fornecidas neste documento podem ainda compreender um ou mais excipientes farmaceuticamente aceitáveis, carreadores e/ou diluentes. Além disso, as formulações fornecidas neste documento podem ainda compreender outros agentes medicinais, carreadores, adjuvantes, diluentes, potenciadores de permeação de tecidos, solubilizantes, e outros semelhantes. Métodos para a preparação de composições e formulações para administração farmacêutica são conhecidos dos versados na técnica (ver, por exemplo, REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 18a ed., Mack Publishing Co., Easton, PA (1990)).
[00108] Em uma modalidade, as formulações de ADAMTS13 fornecidas neste documento terão uma tonicidade em uma faixa entre cerca de 200 mOsmol/L e cerca de 400 mOsmol/L, ou em uma faixa entre cerca de 250 e cerca de 350 mOsmol/L. Em certas modalidades, uma formulação de ADAMTS13 fornecida neste documento terá uma tonicidade, por exemplo, de cerca de 200 mOsmol/L, ou de cerca de 210 mOsmol/L, 220 mOsmol/L, 230 mOsmol/L, 240 mOsmol/L, 250 mOsmol/L, 260 mOsmol/L, 270 mOsmol/L, 280 mOsmol/L, 290 mOsmol/L, 300 mOsmol/L, 310 mOsmol/L, 320 mOsmol/L, 330 mOsmol/L, 340 mOsmol/L, 350 mOsmol/L, 360 mOsmol/L, 370 mOsmol/L, 380 mOsmol/L, 390 mOsmol/L, ou 400 mOsmol/L.
[00109] Exemplos de agentes de tonicidade que podem ser usados nas formulações fornecidas neste documento incluem, sem limitação, cloreto de sódio, dextrose, sacarose, xilitol, frutose, glicerol, sorbitol, manitol, trealose, cloreto de potássio, manose, cloreto de cálcio, cloreto de magnésio, outros sais inorgânicos, outros açúcares, outros alcoóis de açúcar, e combinações dos mesmos. Em certas modalidades, uma formulação de ADAMTS13 pode compreender pelo menos um agente de tonicidade, ou agentes de tonicidade, pelo menos, dois, três, quatro, cinco, ou mais.
[00110] As formulações de ADAMTS13 fornecidas neste documento podem ser formuladas para administração por meio de métodos conhecidos, tais como administração intravenosa, por exemplo, como um bolus ou por infusão contínua ao longo de um período de tempo, por rotas intramuscular, intraperitoneal, intracerobrospinal, subcutânea, intra-articular, intra-sinovial, intratecal, oral, tópica, ou inalação. Em certas modalidades, as formulações de ADAMTS13 fornecidas neste documento podem ser administradas sistemicamente ou localmente. A administração sistêmica inclui, sem limitação: rotas de administração oral, subcutânea, intraperitioneal, subcutânea, transnasal, sublingual, ou retal. A administração local inclui, sem limitação: rotas de administração tópica, subcutânea, intramuscular e intraperitoneal.
[00111] Em um aspecto da invenção, uma composição de proteína ADAMTS13 monomérica é fornecida. Em certas modalidades, a composição de proteína ADAMTS13 monomérica é substancialmente isenta de ADAMTS13 agregada, ADAMTS13 dimérica, ou ambas as ADAMTS13 agregadas e diméricas. Em algumas modalidades, a composição monomérica tem uma atividade específica mais alta do que uma composição semelhante contendo proteína ADAMTS13 agregada e/ou dimérica. Em uma modalidade particular, a composição ADAMTS13 monomérica é produzida por um método compreendendo a filtração em gel ou cromatografia de exclusão por tamanho. Em uma modalidade particular, a proteína ADAMTS13 é uma ADAMTS13 humana (hA13) ou ADAMTS13 recombinante humana (rhA13), ou um derivado biologicamente ativo ou um fragmento da mesmo.
[00112] Em outro aspecto, as formulações de composições de ADAMTS13 monoméricas são fornecidas. Em uma modalidade, a formulação é uma formulação farmaceuticamente aceitável da proteína ADAMTS13 monomérica. Em certas modalidades, a formulação é substancialmente isenta de ADAMTS13 agregada, ADAMTS13 dimérica, ou ambas as ADAMTS13 agregadas e diméricas. Em algumas modalidades, as formulações de ADAMTS13 monoméricas têm uma maior atividade específica do que as formulações semelhantes contendo proteína ADAMTS13 agregada e/ou dimérica. Em uma modalidade particular, a formulação de ADAMTS13 monomérica é produzida por um método compreendendo a filtração em gel ou cromatografia de exclusão por tamanho. Em uma modalidade particular, a proteína ADAMTS13 na formulação é uma ADAMTS13 humana (hA13) ou ADAMTS13 recombinante humana (rhA13), ou um derivado biologicamente ativa ou fragmento da mesma. Em certas modalidades, a proteína ADAMTS13 monomérica é formulada de acordo com uma formulação fornecida neste documento.
[00113] Em modalidade, a presente invenção fornece formulações de ADAMTS13 compreendendo de cerca de 0,05 mg/mL a cerca de 10,0 mg/mL de proteína ADAMTS13, desde cerca de 0 mM a cerca de 200 mM de um sal farmaceuticamente aceitável, um açúcar e/ou álcool de açúcar, um tensoativo não iônico, e um agente tamponador. Em certas modalidades, as formulações podem ainda compreender cálcio e/ou de zinco. Em outras modalidades, a formulação pode ser tamponada a um pH de entre cerca de 6,5 e 9,0. Em certas modalidades, as formulações de A13 são adequadas para administração farmacêutica.
[00114] Em uma modalidade específica, a presente invenção fornece uma formulação de ADAMTS13 estabilizada, compreendendo: 0,05 mg/mL a 10,0 mg/mL de ADAMTS13; 0 mM a 200 mM de um sal farmaceuticamente aceitável; 0,5 mM a 20 mM de cálcio; um açúcar e/ou álcool de açúcar; um tensoativo não iônico, e um agente tamponador para manter um pH de entre cerca de 6,5 e cerca de 7,5. Em uma modalidade preferida, o sal farmaceuticamente aceitável é cloreto de sódio ou cloreto de potássio.
[00115] Em uma modalidade, uma formulação de ADAMTS13 estabilizada é fornecida compreendendo 0,05 mg/mL a 10,0 mg/mL de ADAMTS13; 0 mM a 200 mM de um sal farmaceuticamente aceitável; 0,5 mM a 20 mM de cálcio; um açúcar e/ou álcool de açúcar; um tensoativo não iônico, e um agente tamponador para manter um pH de entre cerca de 6,5 e cerca de 7,5 contém entre cerca de 50 unidades por mL e cerca de 1000 unidades por ml de atividade de ADAMTS13. Em uma modalidade preferida, o sal farmaceuticamente aceitável é cloreto de sódio ou cloreto de potássio.
[00116] Em outra modalidade, a presente invenção fornece formulações de ADAMTS13 estabilizadas compreendendo 0,05 mg/mL a 10,0 mg/mL de ADAMTS13; 0 mM a 200 mM de um sal farmaceuticamente aceitável; 1 mM a 10 mM de cálcio; um açúcar e/ou álcool de açúcar; um tensoativo não iônico, e um agente tamponador para manter um pH de entre cerca de 6,5 e cerca de 7,5. Em uma modalidade preferida, a formulação contém entre cerca de 2 mM e cerca de 4 mM de cálcio. Em uma modalidade preferida, o sal farmaceuticamente aceitável é cloreto de sódio ou cloreto de potássio.
[00117] Em outra modalidade, a presente invenção fornece formulações de ADAMTS13 estabilizadas compreendendo 0,05 mg/mL a 10,0 mg/mL de ADAMTS13; 0 mM a 200 mM de um sal farmaceuticamente aceitável; 0,5 mM a 20 mM de cálcio; entre cerca de 2% e cerca 6% de um açúcar e/ou álcool de açúcar; um tensoativo não iônico, e um agente tamponador para manter um pH de entre cerca de 6,5 e cerca de 7,5. Em certas modalidades, o açúcar e/ou álcool de açúcar é selecionado a partir do grupo consistindo em sacarose, trealose, manitol, e uma combinação dos mesmos. Em uma modalidade preferida, o açúcar e/ou álcool de açúcar é uma mistura de sacarose e manitol. Em uma modalidade particular, a mistura de sacarose e manitol consiste em cerca de 1% de sacarose e cerca de 3% de manitol. Em certas modalidades, a formulação compreende entre cerca de 1 mM e cerca de 10 mM de cálcio, preferencialmente entre cerca de 2 mM e cerca de 4 mM de cálcio. Em uma modalidade preferida, o sal farmaceuticamente aceitável é cloreto de sódio ou cloreto de potássio.
[00118] Em outra modalidade, a presente invenção fornece formulações de ADAMTS13 estabilizadas compreendendo 0,05 mg/mL a 10,0 mg/mL de ADAMTS13; 0 mM a 200 mM de um sal farmaceuticamente aceitável; 0,5 mM a 20 mM de cálcio; um açúcar e/ou álcool de açúcar; entre cerca de 0,01% e 0,1% de um tensoativo não iônico, e um agente tamponador para manter um pH de entre cerca de 6,5 e cerca de 7,5. Em certas modalidades, o tensoativo é selecionado a partir do grupo consistindo em Polissorbato 20, Polissorbato 80, Plurônico F-68, BRIJ 35, e uma combinação dos mesmos. Em uma modalidade preferida, o açúcar e/ou álcool de açúcar é uma mistura de sacarose e manitol. Em uma modalidade particular, o tensoativo é polissorbato 80. Em certas modalidades, a formulação compreende entre cerca de 1 mM e cerca de 10 mM de cálcio, preferencialmente, entre cerca de 2 mM e cerca de 4 mM de cálcio. Em uma modalidade preferida, o sal farmaceuticamente aceitável é cloreto de sódio ou cloreto de potássio.
[00119] Em outra modalidade, a presente invenção fornece formulações de ADAMTS13 estabilizadas compreendendo 0,05 mg/mL a 10,0 mg/mL de ADAMTS13; 0 mM a 200 mM de um sal farmaceuticamente aceitável; 0,5 mM a 20 mM de cálcio; um açúcar e/ou álcool de açúcar; um tensoativo não iônico, e um agente tamponador para manter um pH de entre cerca de 6,5 e cerca de 7,5, em que o agente tamponador é histidina ou HEPES. Em certas modalidades, o agente tamponador está presente em uma concentração entre cerca de 5 mM e cerca de 100 mM, preferencialmente, entre cerca de 10 mM e cerca de 50 mM. Em outra modalidade preferida, o pH da formulação é de 7,0 ± 0,2. Em certas modalidades, a formulação compreende entre cerca de 1 mM e cerca de 10 mM de cálcio, preferencialmente, entre cerca de 2 mM e cerca de 4 mM de cálcio. Em uma modalidade preferida, o sal farmaceuticamente aceitável é cloreto de sódio ou cloreto de potássio.
[00120] Em outra modalidade, a presente invenção fornece formulações de ADAMTS13 estabilizadas compreendendo 0,05 mg/mL a 10,0 mg/mL de ADAMTS13; 0 mM a 200 mM de um sal farmaceuticamente aceitável; 0,5 mM a 20 mM de cálcio; um açúcar e/ou álcool de açúcar; um tensoativo não iônico, e um agente tamponador para manter um pH de entre cerca de 6,5 e cerca de 7,5. Em certas modalidades, a formulação compreende ainda entre cerca de 0,5 μM e cerca de 20 μM de zinco. Em certas modalidades, a formulação compreende entre cerca de 1 mM e cerca de 10 mM de cálcio, preferencialmente, entre cerca de 2 mM e cerca de 4 mM de cálcio. Em uma modalidade preferida, o sal farmaceuticamente aceitável é cloreto de sódio ou cloreto de potássio.
[00121] Em uma modalidade preferida, a presente invenção fornece uma formulação de ADAMTS13 estabilizada compreendendo 0,05 mg/mL a 10,0 mg/mL de ADAMTS13; 0 a 60 mM de NaCl; 2 mM de 4 mM de cálcio; 2% a 4% de manitol, 0,5% a 2% de sacarose; 0,025-0,1% de Polissorbato 80, e histidina de 10 mM a 50 mM (pH 7,0 ± 0,2). Em uma modalidade, a formulação compreende ainda entre cerca de 0,5 μM e cerca de 20 μM de zinco.
[00122] Em outra modalidade, as formulações de ADAMTS13 estabilizadas com baixa quantidade de sal são fornecidas compreendendo 0,05 mg/mL a 10,0 mg/mL de ADAMTS13; menor que cerca de 100 mM de um sal farmaceuticamente aceitável; 0,5 mM a 20 mM de cálcio; um açúcar e/ou álcool de açúcar; um tensoativo não iônico, e um agente tamponador para manter um pH de aproximadamente entre 6,5 e 7,5. Em uma modalidade preferida, o sal farmaceuticamente aceitável é cloreto de sódio ou cloreto de potássio. Em uma modalidade preferida, a formulação de ADAMTS13 com baixa quantidade de sal é uma formulação liofilizada.
[00123] Em uma modalidade, um baixo estabilizado sal ADAMTS13 formulação é fornecido compreendendo 0,05 mg/mL a 10,0 mg/mL de ADAMTS13; menor que cerca de 100 mM de um sal farmaceuticamente aceitável; 0,5 mM a 20 mM de cálcio; um açúcar e/ou álcool de açúcar; um tensoativo não iônico, e um agente tamponador para manter um pH de entre cerca de 6,5 e cerca de 7,5 contém entre cerca de 50 unidades por mL e cerca de 1000 unidades por ml de atividade de ADAMTS13. Em uma modalidade preferida, o sal farmaceuticamente aceitável é cloreto de sódio ou cloreto de potássio. Em uma modalidade preferida, a formulação de ADAMTS13 com baixa quantidade de sal é uma formulação liofilizada.
[00124] Em outra modalidade, a presente invenção fornece formulações de ADAMTS13 estabilizadas com baixa quantidade de sal compreendendo 0,05 mg/mL a 10,0 mg/mL de ADAMTS13; menor que cerca de 100 mM de um sal farmaceuticamente aceitável; 1 mM a 10 mM de cálcio; um açúcar e/ou álcool de açúcar; um tensoativo não iônico, e um agente tamponador para manter um pH de entre cerca de 6,5 e cerca de 7,5. Em uma modalidade preferida, a formulação contém entre cerca de 2 mM e cerca de 4 mM de cálcio. Em uma modalidade preferida, o sal farmaceuticamente aceitável é cloreto de sódio ou cloreto de potássio. Em uma modalidade preferida, a formulação de ADAMTS13 com baixa quantidade de sal é uma formulação liofilizada.
[00125] Em outra modalidade, a presente invenção fornece formulações de ADAMTS13 estabilizadas com baixa quantidade de sal compreendendo 0,05 mg/mL a 10,0 mg/mL de ADAMTS13; menor que cerca de 100 mM de um sal farmaceuticamente aceitável; 0,5 mM a 20 mM de cálcio, entre cerca de 2% e cerca de 6% de um açúcar e/ou álcool de açúcar; um tensoativo não iônico, e um agente tamponador para manter um pH de entre cerca de 6,5 e cerca de 7,5. Em certas modalidades, o açúcar e/ou álcool de açúcar é selecionado a partir do grupo consistindo em sacarose, trealose, manitol, e uma combinação dos mesmos. Em uma modalidade preferida, o açúcar e/ou álcool de açúcar é uma mistura de sacarose e manitol. Em uma modalidade particular, a mistura de sacarose e manitol consiste em cerca de 1% de sacarose e cerca de 3% de manitol. Em certas modalidades, a formulação compreende entre cerca de 1 mM e cerca de 10 mM de cálcio, preferencialmente, entre cerca de 2 mM e cerca de 4 mM de cálcio. Em uma modalidade preferida, o sal farmaceuticamente aceitável é cloreto de sódio ou cloreto de potássio. Em uma modalidade preferida, a formulação de ADAMTS13 com baixa quantidade de sal é uma formulação liofilizada.
[00126] Em outra modalidade, a presente invenção fornece formulações de ADAMTS13 estabilizadas com baixa quantidade de sal compreendendo 0,05 mg/mL a 10,0 mg/mL de ADAMTS13; menor que cerca de 100 mM de um sal farmaceuticamente aceitável; 0,5 mM a 20 mM de cálcio; um açúcar e/ou álcool de açúcar; entre cerca de 0,01% e 0,1% de um tensoativo não iônico, e um agente tamponador para manter um pH de entre cerca de 6,5 e cerca de 7,5. Em certas modalidades, o tensoativo é selecionado a partir do grupo consistindo em Polissorbato 20, Polissorbato 80, Plurônico F-68, BRIJ 35, e uma combinação dos mesmos. Em uma modalidade preferida, o açúcar e/ou álcool de açúcar é uma mistura de sacarose e manitol. Em uma modalidade particular, o tensoativo é polissorbato 80. Em certas modalidades, a formulação compreende entre cerca de 1 mM e cerca de 10 mM de cálcio, preferencialmente, entre cerca de 2 mM e cerca de 4 mM de cálcio. Em uma modalidade preferida, o sal farmaceuticamente aceitável é cloreto de sódio ou cloreto de potássio. Em uma modalidade preferida, a formulação de ADAMTS13 com baixa quantidade de sal é uma formulação liofilizada.
[00127] Em outra modalidade, a presente invenção fornece formulações de ADAMTS13 estabilizadas com baixa quantidade de sal compreendendo 0,05 mg/mL a 10,0 mg/mL de ADAMTS13; menor que cerca de 100 mM de um sal farmaceuticamente aceitável; 0,5 mM a 20 mM de cálcio; um açúcar e/ou álcool de açúcar; um tensoativo não iônico, e um agente tamponador para manter um pH de entre cerca de 6,5 e cerca de 7,5, em que o agente tamponador é histidina ou HEPES. Em certas modalidades, o agente tamponador está presente em uma concentração entre cerca de 5 mM e cerca de 100 mM, preferencialmente entre cerca de 10 mM e cerca de 50 mM. Em outra modalidade preferida, o pH da formulação é de 7,0 ± 0,2. Em certas modalidades, a formulação compreende entre cerca de 1 mM e cerca de 10 mM de cálcio, preferencialmente, entre cerca de 2 mM e cerca de 4 mM de cálcio. Em uma modalidade preferida, o sal farmaceuticamente aceitável é cloreto de sódio ou cloreto de potássio. Em uma modalidade preferida, a formulação de ADAMTS13 com baixa quantidade de sal é uma formulação liofilizada.
[00128] Em outra modalidade, a presente invenção fornece formulações de ADAMTS13 estabilizadas com baixa quantidade de sal compreendendo 0,05 mg/mL a 10,0 mg/mL de ADAMTS13; menor que cerca de 100 mM de um sal farmaceuticamente aceitável; 0,5 mM a 20 mM de cálcio; um açúcar e/ou álcool de açúcar; um tensoativo não iônico, e um agente tamponador para manter um pH de entre cerca de 6,5 e cerca de 7,5. Em certas modalidades, a formulação compreende ainda entre cerca de 0,5 μM e cerca de 20 μM de zinco. Em certas modalidades, a formulação compreende entre cerca de 1 mm e cerca de 10 mM de cálcio, preferencialmente entre cerca de 2 mm e cerca de 4 mM de cálcio. Em uma modalidade preferida, o sal farmaceuticamente aceitável é cloreto de sódio ou cloreto de potássio. Em uma modalidade preferida, a formulação de ADAMTS13 com baixa quantidade de sal é uma formulação liofilizada.
[00129] Em uma modalidade preferida, a presente invenção fornece um baixo estabilizado sal ADAMTS13 formulação compreendendo 0,05 mg/mL a 10,0 mg/mL de ADAMTS13; menos que cerca de 100 mM de NaCl; 2 mm a 4 mM de cálcio; 2% a 4% de manitol; 0,5% a 2% de sacarose; 0,025-0,1% de Polissorbato 80, e histidina de 10 mM a 50 mM (pH 7,0 ± 0,2). Em uma modalidade, a formulação compreende ainda entre cerca de 0,5 μM e cerca de 20 μM de zinco. Em uma modalidade preferida, a formulação de ADAMTS13 com baixa quantidade de sal é uma formulação liofilizada.
[00130] Em uma modalidade, a presente invenção fornece uma formulação de ADAMTS13 estabilizada (A13) que compreende (a) pelo menos 100 unidades de atividade de ADAMTS13 (isto é, atividade de FRETS-VWF73) por mg de ADAMTS13, (b) 0 mM a 200 mM de um seu sal farmaceuticamente aceitável; (c) 0,5 mM a 20 mM de cálcio, (d) um açúcar e/ou álcool de açúcar, (e) um tensoativo não iônico, e (f) um agente tamponador para manter um pH entre 6,0 e 8,0. Em uma modalidade, a formulação de ADAMTS13 estabilizada compreende pelo menos 200 unidades de atividade de A13 por mg de ADAMTS13. Em outra modalidade, a formulação de ADAMTS13 estabilizada compreende pelo menos 400 unidades de atividade de A13 por mg de ADAMTS13. Em uma modalidade preferida, a formulação de ADAMTS13 estabilizada compreende pelo menos 600 unidades de atividade de A13 por mg de ADAMTS13. Em uma modalidade mais preferida, a formulação de ADAMTS13 estabilizada compreende pelo menos 800 unidades de atividade de A13 por mg de ADAMTS13. Em ainda outra modalidade preferida, a formulação de ADAMTS13 estabilizada compreende pelo menos 1000 unidades de atividade de A13 por mg de ADAMTS13. Em uma modalidade, a formulação de ADAMTS13 estabilizada compreende entre cerca de 100 unidades e cerca de 2000 unidades de atividade de ADAMTS13 por mg de ADAMTS 13.
[00131] Em uma modalidade da formulação de A13 estabilizada, a formulação compreende entre cerca de 1,0 mM e cerca de 10,0 mM de cálcio. Em uma modalidade preferida, a formulação contém entre cerca de 2,0 e cerca de 4,0 mM de cálcio.
[00132] Em outra modalidade da formulação de A13 estabilizada, a formulação compreende entre cerca de 2% e cerca de 6% de um açúcar e/ou álcool de açúcar. Em uma modalidade preferida, a formulação compreende entre cerca de 3% e cerca de 5% de um açúcar e/ou álcool de açúcar. Em uma modalidade específica, a formulação compreende cerca de 4% de um açúcar e/ou álcool de açúcar. Em uma modalidade, o açúcar e/ou álcool de açúcar é selecionado a partir do grupo consistindo em sacarose, trealose, manitol, e uma combinação dos mesmos. Em uma modalidade preferida, o açúcar e/ou álcool de açúcar é uma mistura de sacarose e manitol.
[00133] Em uma modalidade da formulação de A13 estabilizada, a formulação compreende entre cerca de 0,01% e cerca de 0,1% de um tensoativo não iônico. Em uma modalidade preferida, a formulação compreende cerca de 0,05% de um tensoativo não iônico. Em uma modalidade, o tensoativo é selecionado a partir do grupo consistindo em Polissorbato 20, Polissorbato 80, Plurônico F-68, e BRIJ 35. Em uma modalidade preferida, o tensoativo é polissorbato 80.
[00134] Em uma modalidade da formulação de A13 estabilizada, a formulação compreende entre cerca de 5 mM e cerca de 100 mM de um agente tamponador. Em uma modalidade preferida, a formulação compreende entre cerca de 10 mM e cerca de 50 mM de um agente tamponador. Em outra modalidade, o agente tamponador é histidina ou HEPES. Em uma modalidade preferida, o agente tamponador é histidina. Em uma modalidade, o pH da formulação está entre cerca de 6,5 e 7,5. Em uma modalidade preferida, o pH da formulação é de 7,0 ± 0,2.
[00135] Em uma modalidade da formulação de A13 estabilizada, a formulação compreende ainda entre cerca de 0,5 μM e 20 μM de zinco.
[00136] Em uma modalidade específica, a presente invenção fornece uma formulação de ADAMTS13 estabilizada (A13) compreendendo (a) pelo menos 100 unidades de atividade de ADAMTS13 por mg de ADAMTS13, (b) NaCl de 0 a 200 mM; (c) 2 mM a 4 mM de cálcio; (d) 2% a 4% de manitol, (e) 0,5% a 2% de sacarose; (f) 0,025% a 0,1% de polissobarto 80, e (g) histidina de 10 mM a 50 mM (pH 7,0 ± 0,2).
[00137] Em uma modalidade, a presente invenção fornece uma formulação de ADAMTS13 (A13) estabilizada com baixa quantidade de sal compreendendo (a) pelo menos 100 unidades de atividade de ADAMTS13 (ou seja, atividade de FRETS-VWF73) por mg de ADAMTS13, (b) 0 mM a 100 mM de um sal farmaceuticamente aceitável, (c) 0,5 mM a 20 mM de cálcio, (d) um açúcar e/ou álcool de açúcar, (e) um tensoativo não iônico, e (f) um agente tamponador para manter um pH entre 6,0 e 8,0. Em uma modalidade, a formulação de ADAMTS13 estabilizada compreende pelo menos 200 unidades de atividade de A13 por mg de ADAMTS13. Em outra modalidade, a formulação de ADAMTS13 estabilizada compreende pelo menos 400 unidades de atividade de A13 por mg de ADAMTS13. Em uma modalidade preferida, a formulação de ADAMTS13 estabilizada compreende pelo menos 600 unidades de atividade de A13 por mg de ADAMTS13. Em uma modalidade mais preferida, a formulação de ADAMTS13 estabilizada compreende pelo menos 800 unidades de atividade de A13 por mg de ADAMTS13. Em ainda outra modalidade preferida, a formulação de ADAMTS13 estabilizada compreende pelo menos 1000 unidades de atividade de A13 por mg de ADAMTS13. Em uma modalidade, a formulação de ADAMTS13 estabilizada compreende entre cerca de 100 unidades e cerca de 2000 unidades de atividade de ADAMTS13 por mg de ADAMTS 13.
[00138] Em uma modalidade da formulação de A13 estabilizada com baixa quantidade de sal, a formulação compreende entre cerca de 1,0 mM e cerca de 10,0 mM de cálcio. Em uma modalidade preferida, a formulação contém entre cerca de 2,0 e cerca de 4,0 mM de cálcio.
[00139] Em outra modalidade da formulação de A13 estabilizada com baixa quantidade de sal, a formulação compreende entre cerca de 2% e cerca de 6% de um açúcar e/ou álcool de açúcar. Em uma modalidade preferida, a formulação compreende entre cerca de 3% e cerca de 5% de um açúcar e/ou álcool de açúcar. Em uma modalidade específica, a formulação compreende cerca de 4% de um açúcar e/ou álcool de açúcar. Em uma modalidade, o açúcar e/ou álcool de açúcar é selecionado a partir do grupo consistindo em sacarose, trealose, manitol, e uma combinação dos mesmos. Em uma modalidade preferida, o açúcar e/ou álcool de açúcar é uma mistura de sacarose e manitol.
[00140] Em uma modalidade da formulação de A13 estabilizada com baixa quantidade de sal, a formulação compreende entre cerca de 0,01% e cerca de 0,1% de um tensoativo não iônico. Em uma modalidade preferida, a formulação compreende cerca de 0,05% de um tensoativo não iônico. Em uma modalidade, o tensoativo é selecionado do grupo consistindo em Polissorbato 20, Polissorbato 80, Plurônico F-68, e BRIJ 35. Em uma modalidade preferida, o tensoativo é polissorbato 80.
[00141] Em uma modalidade da formulação de A13 estabilizada com baixa quantidade de sal, a formulação compreende entre cerca de 5 mM e cerca de 100 mM de um agente tamponador. Em uma modalidade preferida, a formulação compreende entre cerca de 10 mM e cerca de 50 mM de um agente tamponador. Em outra modalidade, o agente tamponador é histidina ou HEPES. Em uma modalidade preferida, o agente tamponador é histidina. Em uma modalidade, o pH da formulação está entre cerca de 6,5 e 7,5. Em uma modalidade preferida, o pH da formulação é de 7,0 ± 0,2.
[00142] Em uma modalidade da formulação de A13 estabilizada com baixa quantidade de sal, a formulação compreende ainda entre cerca de 0,5 μM e 20 μM de zinco.
[00143] Em uma modalidade específica, a presente invenção fornece uma formulação de ADAMTS13 (A13) estabilizada com baixa quantidade de sal compreendendo (a) pelo menos 100 unidades de atividade de ADAMTS13 por mg de ADAMTS13, (b) 0 a 60 mM de NaCl, (c) 2 mM a 4 mM de cálcio; (d) 2% a 4% de manitol, (e) 0,5% a 2% de sacarose; (f) 0,025% a 0,1% de polissobarto 80, e (g) histidina de 10 mM a 50 mM (pH 7,0 ± 0,2).
[00144] Em uma modalidade relacionada, a presente invenção fornece uma formulação estabilizada liofilizada de ADAMTS13 (A13), em que a formulação é liofilizada a partir de uma formulação líquida compreendendo (a) pelo menos 100 unidades de atividade de ADAMTS13 (ou seja, atividade de FRETS-VWF73) por mg de ADAMTS13, (b) 0 mM a 200 mM de um sal farmaceuticamente aceitável, (c) 0,5 mM a 20 mM de cálcio, (d) um açúcar e/ou álcool de açúcar, (e) um tensoativo não iônico, e (f) um agente tamponador para manter um pH entre 6,0 e 8,0. Em uma modalidade, a formulação de ADAMTS13 estabilizada compreende pelo menos 200 unidades de atividade de A13 por mg de ADAMTS13. Em uma outra modalidade, a formulação de ADAMTS13 estabilizada compreende pelo menos 400 unidades de atividade de A13 por mg de ADAMTS13. Em uma modalidade preferida, a formulação de ADAMTS13 estabilizada compreende pelo menos 600 unidades de atividade de A13 por mg de ADAMTS13. Em uma modalidade mais preferida, a formulação de ADAMTS13 estabilizada compreende pelo menos 800 unidades de atividade de A13 por mg de ADAMTS13. Em ainda outra modalidade preferida, a formulação de ADAMTS13 estabilizada compreende pelo menos 1000 unidades de atividade de A13 por mg de ADAMTS13. Em uma modalidade, a formulação de ADAMTS13 estabilizada compreende entre cerca de 100 unidades e cerca de 2000 unidades de atividade de ADAMTS13 por mg de ADAMTS 13.
[00145] Em uma modalidade da formulação de A13 estabilizada liofilizada, a formulação compreende entre cerca de 1,0 mM e cerca de 10,0 mM de cálcio. Em uma modalidade preferida, a formulação contém entre cerca de 2,0 e cerca de 4,0 mM de cálcio.
[00146] Em outra modalidade da formulação de A13 estabilizada liofilizada, a formulação compreende entre cerca de 2% e cerca de 6% de um açúcar e/ou álcool de açúcar. Em uma modalidade preferida, a formulação compreende entre cerca de 3% e cerca de 5% de um açúcar e/ou álcool de açúcar. Em uma modalidade específica, a formulação compreende cerca de 4% de um açúcar e/ou álcool de açúcar. Em uma modalidade, o açúcar e/ou álcool de açúcar é selecionado a partir do grupo consistindo em sacarose, trealose, manitol, e uma combinação dos mesmos. Em uma modalidade preferida, o açúcar e/ou álcool de açúcar é uma mistura de sacarose e manitol.
[00147] Em uma modalidade da formulação de A13 estabilizada liofilizada, a formulação compreende entre cerca de 0,01% e cerca de 0,1% de um tensoativo não iônico. Em uma modalidade preferida, a formulação compreende cerca de 0,05% de um tensoativo não iônico. Em uma modalidade, o tensoativo é selecionado a partir do grupo consistindo em Polissorbato 20, Polissorbato 80, Plurônico F-68, e BRIJ 35. Em uma modalidade preferida, o tensoativo é polissorbato 80.
[00148] Em uma modalidade da formulação de A13 estabilizada liofilizada, a formulação compreende entre cerca de 5 mM e cerca de 100 mM de um agente tamponador. Em uma modalidade preferida, a formulação compreende entre cerca de 10 mM e cerca de 50 mM de um agente tamponador. Em outra modalidade, o agente tamponador é histidina ou HEPES. Em uma modalidade preferida, o agente tamponador é histidina. Em uma modalidade, o pH da formulação está entre cerca de 6,5 e 7,5. Em uma modalidade preferida, o pH da formulação é de 7,0 ± 0,2.
[00149] Em uma modalidade da formulação de A13 estabilizada liofilizada, a formulação compreende ainda entre cerca de 0,5 μM e 20 μM de zinco.
[00150] Em uma modalidade específica, a presente invenção fornece uma formulação estabilizada liofilizada de ADAMTS13 (A13), em que a formulação é liofilizada a partir de uma formulação líquida compreendendo (a) pelo menos 100 unidades de atividade de ADAMTS13 por mg de ADAMTS13, (b) NaCl de 0 a 200 mM, (c) 2 mM a 4 mM de cálcio; (d) 2% a 4% de manitol; (e) 0,5% a 2% de sacarose; (f) 0,025% a 0,1% de polissobarto 80, e (g) histidina de 10 mM a 50 mM (pH 7,0 ± 0,2).
[00151] Em uma modalidade relacionada, a presente invenção fornece uma formulação de ADAMTS 13 (A13) estabilizada liofilizada com baixa quantidade de sal, em que a formulação é liofilizada a partir de uma formulação líquida compreendendo (a) pelo menos 100 unidades de atividade de ADAMTS13 (ou seja, atividade de FRETS-VWF73) por mg de ADAMTS13, (b) 0 mM a 100 mM de um sal farmaceuticamente aceitável, (c) 0,5 mM a 20 mM de cálcio, (d) um açúcar e/ou álcool de açúcar; (e) um tensoativo não iônico, e (f) um agente tamponador para manter um pH entre 6,0 e 8,0. Em uma modalidade, a formulação de ADAMTS13 estabilizada compreende pelo menos 200 unidades de atividade de A13 por mg de ADAMTS13. Em uma outra modalidade, a formulação de ADAMTS13 estabilizada compreende pelo menos 400 unidades de atividade de A13 por mg de ADAMTS13. Em uma modalidade preferida, a formulação de ADAMTS13 estabilizada compreende pelo menos 600 unidades de atividade de A13 por mg de ADAMTS13. Em uma modalidade mais preferida, a formulação de ADAMTS13 estabilizada compreende pelo menos 800 unidades de atividade de A13 por mg de ADAMTS13. Em ainda outra modalidade preferida, a formulação de ADAMTS13 estabilizada compreende pelo menos 1000 unidades de atividade de A13 por mg de ADAMTS13. Em uma modalidade, a formulação de ADAMTS13 estabilizada compreende entre cerca de 100 unidades e cerca de 2000 unidades de atividade de ADAMTS13 por mg de ADAMTS 13.
[00152] Em uma modalidade da formulação de A13 estabilizada liofilizada com baixa quantidade de sal, a formulação compreende entre cerca de 1,0 mM e cerca de 10,0 mM de cálcio. Em uma modalidade preferida, a formulação contém entre cerca de 2,0 e cerca de 4,0 mM de cálcio.
[00153] Em outra modalidade da formulação de A13 estabilizada liofilizada com baixa quantidade de sal, a formulação compreende entre cerca de 2% e cerca de 6% de um açúcar e/ou álcool de açúcar. Em uma modalidade preferida, a formulação compreende entre cerca de 3% e cerca de 5% de um açúcar e/ou álcool de açúcar. Em uma modalidade específica, a formulação compreende cerca de 4% de um açúcar e/ou álcool de açúcar. Em uma modalidade, o açúcar e/ou álcool de açúcar é selecionado a partir do grupo consistindo em sacarose, trealose, manitol, e uma combinação dos mesmos. Em uma modalidade preferida, o açúcar e/ou álcool de açúcar é uma mistura de sacarose e manitol.
[00154] Em uma modalidade da formulação de A13 estabilizada liofilizada com baixa quantidade de sal, a formulação compreende entre cerca de 0,01% e cerca de 0,1% de um tensoativo não iônico. Em uma modalidade preferida, a formulação compreende cerca de 0,05% de um tensoativo não iônico. Em uma modalidade, o tensoativo é selecionado a partir do grupo consistindo em Polissorbato 20, Polissorbato 80, Plurônico F-68, e BRIJ 35. Em uma modalidade preferida, o tensoativo é polissorbato 80.
[00155] Em uma modalidade da formulação de A13 estabilizada liofilizada com baixa quantidade de sal, a formulação compreende entre cerca de 5 mM e cerca de 100 mM de um agente tamponador. Em uma modalidade preferida, a formulação compreende entre cerca de 10 mM e cerca de 50 mM de um agente tamponador. Em outra modalidade, o agente tamponador é histidina ou HEPES. Em uma modalidade preferida, o agente tamponador é histidina. Em uma modalidade, o pH da formulação está entre cerca de 6,5 e 7,5. Em uma modalidade preferida, o pH da formulação é de 7,0 ± 0,2.
[00156] Em uma modalidade da formulação de A13 estabilizada liofilizada com baixa quantidade de sal, a formulação compreende ainda entre cerca de 0,5 μM e 20 μM de zinco.
[00157] Em uma modalidade específica, a presente invenção fornece uma formulação de ADAMTS 13 (A13) estabilizada liofilizada com baixa quantidade de sal, em que a formulação é liofilizada a partir de uma formulação líquida compreendendo (a) pelo menos 100 unidades de atividade de ADAMTS13 por mg de ADAMTS13, (b) 0 a 60 mM NaCl; (c) 2 mM a 4 mM de cálcio; (d) 2% a 4% de manitol; (e) 0,5% a 2% de sacarose; (f) 0,025% a 0,1% de polissobarto 80, e (g ) histidina de 10 mM a 50 mM (pH 7,0 ± 0,2). Estabilidade das Formulações de ADAMTS13
[00158] Em certas modalidades, as formulações de ADAMTS13 fornecidas neste documento podem ser estáveis durante um período prolongado de tempo, quando armazenadas a uma determinada temperatura, por exemplo, a cerca de -80°C, -20°C, 4°C, 18°C, temperatura ambiente, 25°C, 30°C, 35°C, 37°C, 40°C, ou superior. Em algumas modalidades, um período de tempo prolongado é pelo menos cerca de uma semana. Em outras modalidades, um período de tempo prolongado pode compreender pelo menos cerca de 2 semanas, ou pelo menos cerca de 3 semanas, ou pelo menos cerca de 1 mês, ou pelo menos cerca de 2 meses, ou pelo menos cerca de 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 14, 16 ou 18 meses. Em ainda outras modalidades, as formulações da invenção podem ser estáveis durante pelo menos cerca de 2, 3, 4, 5 ou mais anos.
[00159] Em certas modalidades da invenção, a estabilidade pode ser medida por uma ou mais propriedades biofísicas e/ou enzimática da proteína A13 ou rA13 na formulação. Exemplos não limitativos de propriedades que podem ser usadas para avaliar a estabilidade incluem, atividade enzimática, atividade específica, grau de mono- ou poli-dispersibilidade da proteína, a extensão da dimerização, oligomerização, ou agregação da proteína, grau de desdobramento da proteína.
[00160] Alguém versado na técnica saberá prontamente de outras medidas de estabilidade que podem ser empregadas para avaliar a estabilidade de uma formulação de ADAMTS13, incluindo, sem limitação, filtração em gel, espalhamento de luz dinâmico ou estático, ultracentrifugação analítica, rp-HPLC, cromatografia de troca iônica, espectroscopia de Infravermelho por transformada de Fourrier, calorimetria, calorimetria de varredura diferencial, espectroscopia de RMN, espectrometria de massa, espalhamento de raios-x de ângulo pequeno (SAX), eletroforese em gel de poliacrilamida, e semelhantes.
[00161] Em uma modalidade, a presente invenção fornece formulações de A13 ou rA13 que retêm pelo menos cerca de 50% da atividade total de ADAMTS13 após armazenagem durante um período de tempo prolongado. Em outras modalidades, a formulação é fornecida a qual retém pelo menos cerca de 60%, ou pelo menos cerca de 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% da atividade total de ADAMTS13 após armazenagem durante um período de tempo prolongado.
[00162] Em uma outra modalidade, são fornecidas formulações que mantém pelo menos cerca de 50% da atividade específica de ADAMTS13 após armazenagem durante um período de tempo prolongado. Em outras modalidades, uma formulação é fornecida a qual retém pelo menos cerca de 60%, ou pelo menos cerca de 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% da atividade específica de ADAMTS13 após armazenagem durante um período de tempo prolongado.
[00163] Em outras modalidades, as formulações da invenção irão possuir uma atividade específica de pelo menos cerca de 600U de Atividade de FRETS-VWF73 por mg de proteína ADAMTS13 após armazenagem durante um período de tempo prolongado. Em outras modalidades, uma formulação fornecida neste documento terá pelo menos cerca de 700 U/mg de A13, ou pelo menos cerca de 800 U/mg, 900 U/mg, 1,000 U/mg, 1,100 U/mg, 1,200 U/mg, 1,300 U/mg, 1,400 U/mg, 1,500 U/mg, ou maior atividade específica após armazenagem durante um período de tempo prolongado.
[00164] Em uma modalidade, uma formulação de A13 fornecida neste documento terá uma polidispersidade, como determinado por análise de espalhamento de luz dinâmico, menor que cerca de 50% após armazenagem durante um período de tempo prolongado. Em outras modalidades, uma formulação de A13 terá uma polidispersão de menos de cerca de 45%, ou menor que cerca de 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5% de polidispersibilidade, Como medido por análise de espalhamento de Luz dinâmico após armazenagem durante um período de tempo prolongado.
[00165] Em outra modalidade da invenção, uma formulação de A13 fornecida neste documento terá uma população de proteínas A13 consistindo em pelo menos cerca de 50% de monômeros de A13 após armazenagem durante um período de tempo prolongado. Em outras modalidades, uma formulação pode ter pelo menos cerca de 60% de monômeros de A13, ou pelo menos cerca de 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou uma percentagem mais elevada de monômeros de A13. Expressão e Purificação de ADAMTS13
[00166] Em certas modalidades, uma proteína ADAMTS13 usada nas formulações fornecidas neste documento pode ser expressa, produzida, ou purificada de acordo com um método descrito anteriormente, por exemplo, em US 6.926.894, US 2005/0266528, US 2007/0015703, Pedido de Patente US 12/437.384, Pedido de Patente 12/847.999, e WO 2002/42441, todos os quais são incorporados neste documento por referência na sua totalidade para todos os propósitos. Células Hospedeiras e Vetores
[00167] As proteínas ADAMTS recombinantes podem ser produzidas por expressão em qualquer sistema hospedeiro procariótico ou eucariótico adequado. Exemplos de células eucarióticas incluem, sem limitação, as células de mamíferos, tais como células CHO, COS, HEK 293, BHK, SK- Hep, e HepG2; células de insetos, por exemplo, células SF9, células SF21, células S2, e células High Five; e células de levedura, por exemplo, células de Saccharomyces ou Schizosaccharomyces. Em uma modalidade, as proteínas ADAMTS podem ser expressas em células bacterianas, células de levedura, células de insetos, células de aves, células de mamíferos, e semelhantes. Por exemplo, em uma linhagem de células humana, uma linhagem de células de hamster, ou uma linhagem de células de murinos. Em uma modalidade particular, a linhagem de células é uma linhagem de células de CHO, BHK, ou HEK. Em uma modalidade preferida, a linhagem de células é uma linhagem de células de CHO.
[00168] Em uma modalidade, as células podem ser qualquer célula de mamífero que podem ser cultivadas, preferencialmente, em um processo de fabricação (isto é, pelo menos 1 litro), para produzir uma proteína ADAMTS desejada, tal como ADAMTS13. Exemplos incluem a linhagem de rim de macaco CV1 transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); linhagem de rim embrionário humano (células 293 ou 293 subclonadas para crescimento em cultura em suspensão, Graham et al., J. Gen Virol, 36:59 (1977)); células de rim de hamster bebê (BHK, ATCC CCL 10); células de ovário de hamster chinês /-DHFR, tais como o subclone DUKX-B11 (CHO, Uriaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980)); células de rato Sertoli (TM4, Mather, Biol Reprod, 23:243-251 (1980.)), células de rim de macaco (CV1 ATCC CCL 70); células de rim de macaco verde africano (VERO-76, ATCC CRL-1587); células de carcinoma cervical humanas (HELA, ATCC CCL 2); células de rim canino (MDCK, ATCC CCL 34); células de fígado de rato búfalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); células pulmonares humanas (W138, ATCC CCL 75 ); células hepáticas humanas (Hep G2, HB 8065); tumor mamário de camundongo (MMT 060562, ATCC CCL51); células TRI (Mather et al., Annals NY Acad Sci, 383:44-68 (1982)); células MRC 5; células FS4; e linhagem de hepatoma humano (Hep G2). Preferencialmente, a linhagem de células é uma linhagem de células de roedores, especialmente, uma linhagem de células de hamster, tais como CHO ou BHK.
[00169] Uma ampla variedade de vetores pode ser usada para a expressão de uma proteína ADAMTS (por exemplo, ADAMTS13) e pode ser selecionada a partir de vetores de expressão eucarióticos e procarióticos. Em certas modalidades, um vetor plasmídico é contemplado para uso na expressão de uma proteína ADAMTS (por exemplo, ADAMTS13). Em geral, vetores plasmídicos contendo sequências de replicon e de controle que são derivadas de espécies compatíveis com a célula hospedeira são usados em conexão com estes hospedeiros. O vetor pode carregar um sítio de replicação, bem como sequências de marcação que são capazes de fornecer seleção fenotípica em células transformadas. O plasmídeo compreenderá uma sequência de nucleotídeos que codifica uma proteína ADAMTS (por exemplo, ADAMTS13) operável ligada a uma ou mais sequências de controle, por exemplo, um promotor.
[00170] Um método preferido de preparação de clones de células de CHO estáveis que expressam uma proteína recombinante ADAMTS é como segue. Uma linhagem de células de CHO deficiente em DHFR, a DUKX-B11, é transfectada com um vetor de expressão de DHFR para permitir a expressão da proteína recombinante relevante, essencialmente como descrito na Patente US 5.250.421 (Kaufman et al., Genetics Institute, Inc.). A seleção é realizada por crescimento em meio isento de hipoxantina/timidina (HT) e amplificação da região relevante que codifica a expressão da proteína recombinante ADAMTS e o gene DHFR é conseguido através da propagação das células em concentrações crescentes de metotrexato. Quando apropriado, as linhagem de células de CHO podem ser adaptadas para o crescimento no soro e/ou um meio isento de proteínas, essencialmente como descrito no US 6.100.061 (Reiter et al., lmmuno Aktiengesellschaft).
[00171] Em outra modalidade preferida, as células HEK293 estáveis são preparadas por transfecção com um construto contendo um marcador selecionável de higromicina e seleção de transformantes por resistência aos antibióticos.
[00172] A capacidade de certos vírus para infectar as células ou a entrar nas células através de endocitose mediada por receptor e, para integrar no genoma da célula hospedeira e expressar genes virais de forma estável e eficiente os tornaram candidatos atrativos para a transferência de ácidos nucleicos estranhos em células (por exemplo, células de mamíferos). Assim, em certas modalidades, um vetor viral é usado para introduzir uma sequência de nucleotídeos que codifica uma proteína ADAMTS (por exemplo, ADAMTS13) em uma célula hospedeira para a expressão. O vetor viral irá compreender uma sequência de nucleotídeos que codifica uma proteína ADAMTS (por exemplo, ADAMTS13) operável ligada a uma ou mais sequências de controle, por exemplo, um promotor. Alternativamente, o vetor viral pode não conter uma sequência de controle e em vez disso, depender de uma sequência de controle dentro da célula hospedeira para dirigir a expressão da proteína ADAMTS. Exemplos não limitativos de vetores de vírus que podem ser usados para distribuir um ácido nucleico incluem vetores adenovirais, vetores de AAV, e vetores retrovirais.
[00173] Em uma modalidade, um vetor de expressão de Adenovírus inclui aqueles construtos que contêm sequências de adenovírus suficientes para suportar a embalagem do construto e para finalmente expressar um construto de ADAMTS que tenha sido clonado no mesmo. Vetores adenovirais permitem a introdução de sequências de estranhos de até 7 kb (Grunhaus et al., Seminar in Virology, 200 (2):535-546, 1992)).
[00174] Em outra modalidade, um vírus adeno-associado (AAV) pode ser usado para introduzir uma sequência de nucleotídeos que codifica uma proteína ADAMTS (por exemplo, ADAMTS13) em uma célula hospedeira para a expressão. Sistemas de AAV foram descritos anteriormente e são geralmente bem conhecidos na técnica (Kelleher and Vos, Biotechniques, 17(6):1110-7, 1994; Cotten et al., Proc Natl Acad Sci USA, 89(13):6094- 6098, 1992; Curiel, Nat Immun, 13(2-3):141-64, 1994; Muzyczka, Curr Top Microbiol Immunol, 158:97-129, 1992). Os detalhes sobre a geração e uso de vetores rAAV são descritos, por exemplo, nas Patentes US 5.139.941 e 4.797.368, cada uma incorporada neste documento por referência na sua totalidade para todos os propósitos.
[00175] Em uma modalidade, um vetor de expressão retroviral pode ser usado para introduzir uma sequência de nucleotídeos que codifica uma proteína ADAMTS (por exemplo, ADAMTS13) em uma célula hospedeira para a expressão. Estes sistemas foram descritos anteriormente e são geralmente bem conhecidos na técnica (Mann et al., Cell, 33:153-159, 1983; Nicolas and Rubinstein, In: Vectors: A survey of molecular cloning vectors and their uses, Rodriguez and Denhardt, eds., Stoneham: Butterworth, pp. 494-513, 1988; Temin, In: Gene Transfer, Kucherlapati (ed.), New York: Plenum Press, pp. 149-188, 1986). Em uma modalidade específica, o vetor retroviral é um vetor lentiviral (ver, por exemplo, Naldini et al., Science, 272(5259):263-267, 1996; Zufferey et al., Nat Biotechnol, 15(9):871-875, 1997; Blomer et al., J Virol., 71(9):6641-6649, 1997; Patentes US 6.013.516 e 5.994.136).
[00176] Exemplos não limitativos de vetores para a expressão procariótica incluem plasmídeos tais como pRSET, pET, pBAD, etc., em que os promotores usados em vetores de expressão procarióticos incluem lac, trc, trp, recA, araBAD, etc.. Exemplos de vetores para a expressão eucariótica incluem: (i) para a expressão em levedura, vetores tais como pAO, pPIC, pYES, pMET, usando promotores, tais como AOX1, GAP, GAL1, AUG1, etc., (ii) para a expressão em células de inseto, vetores tais como pMT, pAc5, pIB, pMIB, pBac, etc., usando promotores, tais como PH, p10, MT, Ac5, OpIE2, gp64, polh, etc, e (iii) para expressão em células de mamíferos, tais como vetores de pSVL, pCMV, pRc/RSV, pcDNA3, pBPV, etc., e vetores derivados de sistemas de forma viral, tais como o vírus vaccinia, vírus adeno- associados, vírus de herpes, retrovírus, etc., usando promotores, tais como CMV, SV40, EF-1, UbC, RSV, ADV, BPV, e β-actina.
[00177] Em certas modalidades, a expressão da cultura de células de ADAMTS13 pode compreender o uso de um microtransportador. A presente invenção fornece, entre outro aspecto, os métodos de expressão da proteína ADAMTS em grande escala a. Em algumas modalidades, as culturas de células de das modalidades podem ser realizadas em biorreatores grandes em condições adequadas para fornecer elevadas áreas de superfície de cultura específica-volumes para atingir elevadas densidades celulares e expressão da proteína. Um meio para proporcionar as condições de crescimento é o uso de tais microtransportadores para cultura de células em biorreatores de tanque agitado. Em outra modalidade, estes requisitos de crescimento são atendidos através do uso de uma cultura de células em suspensão. B. Métodos de Cultivo
[00178] Em certas modalidades, a expressão de ADAMTS13 pode compreender o uso de um sistema de cultura celular operado sob um modo de operação em batelada ou contínuo. Por exemplo, quando as culturas de células de batelada são usadas, podem ser operadas sob um modo de operação de batelada única, batelada alimentada, ou batelada repetida. Da mesma forma, as culturas de células contínuas podem ser operadas em modo de, por exemplo, perfusão, turbidostato ou quimiostato. O cultivo celular contínuo ou em batelada pode ser realizado sob qualquer suspensão ou condições de aderência. Quando operadas em condições de suspensão, as células serão livremente suspensas e misturadas dentro do meio de cultura. Alternativamente, em condições de aderência, as células serão ligadas a uma fase sólida, por exemplo, um microtransportador, um microtransportador poroso, transportador de disco, cartucho de cerâmica, fibra oca, folha plana, matriz de gel, e semelhantes.
[00179] Uma cultura em batelada é tipicamente uma cultura de células em larga escala em que um inóculo de célula é cultivado até uma densidade máxima em um tanque ou fermentador, e colhido e processado como uma batelada única. Uma cultura de batelada alimentada é tipicamente uma cultura em batelada que é fornecida tanto com nutrientes frescos (por exemplo, substratos limitadores de crescimento) ou aditivos (por exemplo, precursores de produtos). A solução de alimentação é normalmente altamente concentrada para evitar a diluição do biorreator. Em uma cultura em batelada repetida, as células são colocadas em um meio de cultura e crescidas até uma densidade celular desejada. Para evitar o aparecimento de uma fase de declínio e morte celular, a cultura é então diluída com meio de crescimento completo antes que as células atinjam a sua concentração máxima. A quantidade e a frequência de diluição variam amplamente e dependem das características de crescimento da linhagem de células e da conveniência do processo de cultura. O processo pode ser repetido quantas vezes necessárias e, a menos que as células e meios sejam descartados na subcultura, o volume de cultura irá aumentar gradualmente na medida em que medida que cada diluição é feita. O aumento de volume pode ser manuseado por ter um reator de tamanho suficiente para permitir diluições no interior do vaso ou pela divisão da cultura diluída em vários vasos. A razão deste tipo de cultura é manter as células em um estado de crescimento de forma exponencial. A subcultura serial é caracterizada pelo fato de que o volume de cultura é sempre gradualmente crescente, pode haver múltiplas colheitas, as células continuam a crescer e o processo pode continuar por tanto tempo quanto desejado. Em certas modalidades, uma proteína ADAMTS (por exemplo, ADAMTS13) pode ser recuperada após a colheita do sobrenadante de uma cultura em batelada.
[00180] Uma cultura contínua pode ser uma cultura em suspensão que é continuamente abastecida com nutrientes pelo influxo de meio fresco, em que o volume de cultura é geralmente mantido constante pela remoção concomitante do meio gasto. Nos métodos de quimiostato e turbidostato, o meio extraído contém células. Assim, as células restantes no vaso de cultura de células devem aumentar para manter um estado estacionário. No método de quimiostato, a taxa de crescimento é tipicamente controlada pelo controle da taxa de diluição, ou seja, a taxa à qual um meio fresco é adicionado. A taxa de crescimento das células na cultura pode ser controlada, por exemplo, a uma taxa de crescimento submáxima, por alteração da taxa de diluição. Em contraste, no método de turbidostato, a taxa de diluição é ajustada para permitir a taxa de crescimento máxima que as células podem atingir nas condições de funcionamento determinadas, como o pH e a temperatura.
[00181] Em uma cultura de perfusão, o meio extraído é empobrecido de células, que são retidas no vaso de cultura, por exemplo, por filtração ou por métodos centrífugos que levam à reintrodução das células na cultura. No entanto, as membranas normalmente usadas para a filtração não retêm 100% das células, e assim uma proporção é removida quando o meio é extraído. Não pode ser crucial operar as culturas de perfusão em taxas de crescimento muito elevadas, uma vez que a maioria das células é retida no vaso de cultura.
[00182] Os sistemas de reator de tanque agitado podem ser usados para cultivo de células em batelada e contínuo operados em modos de suspensão ou aderentes. Geralmente, o sistema de reator de tanque agitado pode ser operado como qualquer reator de tanque agitado convencional com qualquer tipo de agitador, tal como um Rushton, hidrofólio, de lâmina em ângulo ou marinho. C. Meios de Cultura
[00183] As ADAMTS13 podem ser expressas em meios de cultura que estão isentos de proteína adicionada exogenamente. "Meio de cultura isento de proteína" e termos relacionados refere-se a um meio de cultura isento de proteína que é a partir de uma fonte exógena ou diferente de células na cultura, o que naturalmente derramam proteínas durante o crescimento. Em uma modalidade, uma proteína ADAMTS13 pode ser expressa em um meio que é isento de proteína adicionada exogenamente (isto é, isento de proteínas) e é suplementado com zinco, cálcio, e/ou nicotinamida (vitamina B3). Em certas modalidades, o meio de cultura isento de proteína contém uma poliamina. Por exemplo, em uma concentração de pelo menos 2 mg/L, ou de ou cerca de entre 2 mg/L e 30 mg/L, ou de ou cerca de entre 2 mg/L e 8 mg/L. Em uma modalidade específica, a poliamina é a putrescina. Meios de cultura isentos de proteínas exemplares são ensinados nas Patentes US 6.171.825 e 6.936.441, WO 2007/077217, Publicação de Pedido de Patente US 2008/0009040 e 2007/ 0212770, e do Pedido de Patente US 12/847.999, cujas descrições são incorporadas neste documento por referência na sua totalidade para todos os propósitos.
[00184] Os métodos de preparação de meios de cultura quimicamente definidos e isentos de proteína animal são conhecidos na técnica, por exemplo, nas Patentes US 6.171.825 e 6.936.441, WO 2007/077217, e nas publicações de Pedido de Patente US 2008/0009040 e 2007/0212770, cujas descrições são incorporadas neste documento por referência na sua totalidade para todos os propósitos. Em uma modalidade, o meio de cultura usado para expressar uma proteína ADAMTS13 é o meio isento de proteína animal ou isento de oligopeptídeo. Em certas modalidades, o meio de cultura pode ser quimicamente definido. Em certas modalidades, o meio de cultura pode conter pelo menos uma poliamina com uma concentração de cerca de 0,5 mg/L até cerca de 10 mg/L.
[00185] A proteína ADAMTS13 também pode ser expressa em meios de cultura que estão isentos de oligopeptídeos adicionados exogenamente. Em uma modalidade, a ADAMTS13 é expressa em um meio de cultura que é isento de oligopeptídeos adicionados exogenamente (isto é, isento de polipeptídeo) e é suplementado com zinco, cálcio, e/ou nicotinamida (vitamina B3). Em certas modalidades, o meio de cultura isento de oligopeptídeo contém uma poliamina. Por exemplo, a uma concentração de pelo menos 2 mg/L, ou de ou cerca de entre 2 mg/L e 30 mg/L, ou de ou cerca de entre 2 mg/L e 8 mg/L. Em uma modalidade específica, a poliamina é a putrescina. Exemplos de meios de cultura isentos de oligopeptídeos são ensinados nas patentes US 6.171.825 e 6.936.441, WO 2007/077217, Publicações de Pedido de Patente US 2008/0009040 e 2007/0212770, e do Pedido de Patente US 12/847.999 cujas descrições são incorporadas neste documento por referência na sua totalidade para todos os propósitos.
[00186] A proteína ADAMTS13 também pode ser expressa em meios de cultura que estão isentos de soro. Em uma modalidade, ADAMTS13 é expressa em um meio de cultura que é isento de soro adicionado exogenamente (isto é, isento de soro) e é suplementado com zinco, cálcio, e/ou nicotinamida (vitamina B3). Em certas modalidades, o meio de cultura isento de soro contém uma poliamina. Por exemplo, a uma concentração de, pelo menos, 2 mg/L, ou de, ou cerca de entre 2 mg/L e 30 mg/L, ou de, ou cerca de entre 2 mg/L e 8 mg/L. Em uma modalidade específica, a poliamina é a putrescina. Exemplos de meios isentos de soro de cultura são ensinados nas patentes US 6.171.825 e 6.936.441, WO 2007/077217, Publicações de Pedido de Patente US 2008/0009040 e 2007/0212770, e Pedido de Patente US 12/847.999, as descrições dos quais sendo incorporadas neste documento por referência na sua totalidade para todos os propósitos.
[00187] A proteína ADAMTS13 também pode ser expressa em meios de cultura que estão isentos de proteínas animais. Em uma modalidade, a ADAMTS13 é expressa em um meio de cultura que é isento de proteínas ou polipeptídeos animais adicionados exogenamente (isto é, isento de proteína animal) e é suplementada com zinco, cálcio, e/ou nicotinamida (vitamina B3). Em certas modalidades, o meio de cultura isento de proteína animal contém uma poliamina. Por exemplo, a uma concentração de pelo menos 2 mg/L, ou de, ou cerca de entre 2 mg/L e 30 mg/L, ou de, ou cerca de entre 2 mg/L e 8 mg/L. Em uma modalidade específica, a poliamina é a putrescina. Exemplos de meios de cultura isentos de proteína animal são ensinados nas patentes US 6.171.825 e 6.936.441, WO 2007/077217, publicações de Pedido de Patente US 2008/0009040 e 2007/0212770, e Pedido de Patente US 12/847.999, as descrições dos quais sendo incorporadas neste documento por referência na sua totalidade para todos os propósitos.
[00188] As proteínas ADAMTS13 podem também ser expressas em meios de cultura suplementados com cálcio, zinco, e/ou vitamina B3 adicional, tal como descrito no Pedido de Patente US 12/847.999, cuja descrição é incorporada neste documento por referência na sua totalidade para todos os propósitos. Em certas modalidades, o meio pode ser um meio isento de proteína animal, isento de oligopeptídeo, ou quimicamente definido. Em certas modalidades, o meio isento de proteína animal ou isento de oligopeptídeo é preparado tal como ensinado nas patentes US 6.171.825 e 6.936.441, WO 2007/077217, e Publicações de Pedido de Patente US2008/0009040 e 2007/0212770, cujas descrições são incorporadas neste documento por referência na sua totalidade para todos os propósitos, ambas as quais sendo incorporadas neste documento por referência na sua totalidade para todos os efeitos, e suplementadas com cálcio, zinco, e/ou vitamina B3 adicional. Em uma modalidade específica, o meio de cultura quimicamente definido pode ser semelhante ao Meio de Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM), que foi suplementado com cálcio, zinco, e/ou vitamina B3 adicional, a fim de aumentar a atividade específica de uma proteína ADAMTS expressa em uma célula cultivada no meio. Em ainda outras modalidades, o meio de cultura é isento de componente animal. Em outra modalidade, o meio de cultura contém proteína, proteína, por exemplo, proteína animal a partir do soro, tal como soro fetal de vitelo. Em outra modalidade, a cultura tem proteínas recombinantes adicionadas exogenamente. Em uma outra modalidade, as proteínas são a partir de um animal isento de patógeno certificado. D. Purificação de ADAMTS13
[00189] Métodos para purificação de ADAMTS13 nativa a partir de um poço de plasma são bem conhecidos na técnica. Da mesma forma, os métodos para a expressão e purificação de ADAMTS13 recombinante são também conhecidos na técnica. Por exemplo, a purificação e expressão recombinante são ensinadas por Plaimauer and Scheiflinger, Semin Hematol. 2004 Jan;41(1):24-33; Plaimauer B et al., F. Blood. 2002 Nov 15;100(10):3626-32. Epub 2002 Jul 12; Bruno K et al., J Thromb Haemost. 2005 May;3(5):1064-73, e Pedido de Patente US No. de série 12/847.999, cujas descrições são todas expressamente incorporadas neste documento por referência na sua totalidade para todos os propósitos.
[00190] Além disso, a presente descrição fornece métodos adicionais para a purificação de ADAMTS13 recombinante. Em uma modalidade, ADAMTS13 recombinante é expressa em células de CHO recombinantes e purificada de meios condicionados resultantes por cromatografia de troca catiônica POROS SH. Para eliminar ADAMTS13 dimérica, monomérica e/ou agregada indesejável, a composição é então submetida a filtração em gel de exclusão por tamanho. As composições de ADAMTS13 serão também geralmente submetidas a pelo menos uma, preferencialmente, duas, etapas de remoção ou inativação viral.
[00191] Em certas modalidades, os métodos fornecidos neste documento para a preparação de uma formulação de ADAMTS13 irão ainda incluir pelo menos uma etapa de inativação ou remoção viral. Em certas modalidades, os métodos fornecidos neste documento incluirão, pelo menos, duas ou pelo menos três, etapas de inativação ou remoção viral. Exemplos não limitativos etapas de inativação ou remoção viral que podem ser empregadas com os métodos fornecidos neste documento incluem, tratamento com detergente solvente (Horowitz et al., Blood Coagul Fibrinolysis 1994 (5 Suppl 3):S21-S28 and Kreil et al., Transfusion 2003 (43):1023-1028, cujas descrições são expressamente incorporadas neste documento por referência na sua totalidade para todos os efeitos), nanofiltração (Hamamoto et al., Vox Sang 1989 (56)230-236 and Yuasa et al., J Gen Virol. 1991 (72 (pt 8)):2021- 2024, cujas descrições são expressamente incorporadas neste documento por referência na sua totalidade para todos os propósitos). Em uma modalidade preferida, a presente invenção fornece métodos para a preparação de uma formulação de ADAMTS13 compreendendo nanofiltração e tratamento com detergente solvente.
[00192] Em uma modalidade, é fornecido um método para fornecer uma formulação de proteína ADAMTS13 viralmente segura, o método compreendendo as etapas de (a) cultivar de uma célula portadora de um ácido nucleico que codifica uma proteína ADAMTS13 em um meio de cultura, (b) recuperar uma porção do meio de cultura sobrenadante contendo a proteína ADAMTS13, (c) enriquecer a proteína ADAMTS13 com uma etapa cromatográfica, (d) realizar pelo menos uma etapa de inativação ou remoção do vírus, e (e) formular a composição de ADAMTS13 enriquecida de acordo com uma formulação fornecida neste documento, fornecendo assim uma formulação de ADAMTS13 viralmente segura. Em uma modalidade, o meio de cultura contém cálcio, zinco e, opcionalmente, nicotinamida (vitamina B3). Em uma modalidade preferida, a etapa de cultivar a célula compreende um cultivo contínuo (por exemplo, cultivo por perfusão ou quimiostático). Em outra modalidade preferida, a cultura é mantida a uma temperatura entre 34°C e 37°C. Em ainda outra modalidade preferida, a cultura é mantida a um pH entre 6,9 e 7,2. Em uma modalidade, a etapa de remoção de vírus é de a nanofiltração.
[00193] Em um aspecto da modalidade, a presente invenção fornece um método para a fabricação de uma formulação de ADAMTS13 estabilizada, o método compreendendo as etapas de: (a) expressar uma proteína ADAMTS13, ou um derivado biologicamente ativo da mesma, em uma célula cultivada em um meio compreendendo zinco a uma concentração de cerca de 2 μM a cerca de 12 μM e cálcio a uma concentração de cerca de 0,5 mM a cerca de 1,5 mM; (b) purificar a proteína ADAMTS13, e (c) preparar uma formulação de acordo com qualquer uma das formulações fornecidas neste documento.
[00194] Em uma modalidade, a presente invenção fornece um método para a fabricação de uma formulação de ADAMTS13 estabilizada, o método compreendendo as etapas de: (i) expressar uma proteína ADAMTS13, ou um derivado biologicamente ativo da mesma, em uma célula cultivada em um meio compreendendo zinco a uma concentração de cerca de 2 μM a cerca de 12 μM e cálcio a uma concentração de cerca de 0,5 mM a cerca de 1,5 mM, (ii) purificar a proteína ADAMTS13, e (iii) preparar uma formulação compreendendo (a) pelo menos 100 unidades de atividade de ADAMTS13 (ou seja, atividade de FRETS-VWF73) por mg de ADAMTS13, (b) 0 mM a 200 mM de um sal farmaceuticamente aceitável, (c) 0,5 mM a 20 mM de cálcio, (d) um açúcar e/ou álcool de açúcar; (e) um tensoativo não iônico, e (f) um agente tamponador para manter um pH entre 6,0 e 8,0. Em uma modalidade, a formulação de ADAMTS13 estabilizada compreende pelo menos 200 unidades de atividade de A13 por mg de ADAMTS13. Em outra modalidade, a formulação de ADAMTS13 estabilizada compreende pelo menos 400 unidades de atividade de A13 por mg de ADAMTS13. Em uma modalidade preferida, a formulação de ADAMTS13 estabilizada compreende pelo menos 600 unidades de atividade de A13 por mg de ADAMTS13. Em uma modalidade mais preferida, a formulação de ADAMTS13 estabilizada compreende pelo menos 800 unidades de atividade de A13 por mg de ADAMTS13. Em ainda outra modalidade preferida, a formulação de ADAMTS13 estabilizada compreende pelo menos 1000 unidades de atividade de A13 por mg de ADAMTS13. Em uma modalidade, a formulação de ADAMTS13 estabilizada compreende entre cerca de 100 unidades e cerca de 2000 unidades de atividade de ADAMTS13 por mg de ADAMTS 13.
[00195] Em uma modalidade da formulação de A13 estabilizada, a formulação compreende entre cerca de 1,0 mM e cerca de 10,0 mM de cálcio. Em uma modalidade preferida, a formulação contém entre cerca de 2,0 e cerca de 4,0 mM de cálcio.
[00196] Em outra modalidade da formulação de A13 estabilizada, a formulação compreende entre cerca de 2% e cerca de 6% de um açúcar e/ou álcool de açúcar. Em uma modalidade preferida, a formulação compreende entre cerca de 3% e cerca de 5% de um açúcar e/ou álcool de açúcar. Em uma modalidade específica, a formulação compreende cerca de 4% de um açúcar e/ou álcool de açúcar. Em uma modalidade, o açúcar e/ou álcool de açúcar é selecionado a partir do grupo consistindo em sacarose, trealose, manitol, e uma combinação dos mesmos. Em uma modalidade preferida, o açúcar e/ou álcool de açúcar é uma mistura de sacarose e manitol.
[00197] Em uma modalidade da formulação de A13 estabilizada, a formulação compreende entre cerca de 0,01% e cerca de 0,1% de um tensoativo não iônico. Em uma modalidade preferida, a formulação compreende cerca de 0,05% de um tensoativo não iônico. Em uma modalidade, o tensoativo é selecionado a partir do grupo consistindo em Polissorbato 20, Polissorbato 80, Plurônico F-68, e BRIJ 35. Em uma modalidade preferida, o tensoativo é Polissorbato 80.
[00198] Em uma modalidade da formulação de A13 estabilizada, a formulação compreende entre cerca de 5 mM e cerca de 100 mM de um agente tamponador. Em uma modalidade preferida, a formulação compreende entre cerca de 10 mM e cerca de 50 mM de um agente tamponador. Em outra modalidade, o agente tamponador é histidina ou HEPES. Em uma modalidade preferida, o agente tamponador é histidina. Em uma modalidade, o pH da formulação está entre cerca de 6,5 e 7,5. Em uma modalidade preferida, o pH da formulação é de 7,0 ± 0,2.
[00199] Em uma modalidade da formulação de A13 estabilizada, a formulação compreende ainda entre cerca de 0,5 μM e 20 μM de zinco.
[00200] Em uma modalidade específica, a presente invenção fornece uma formulação estabilizada de ADAMTS13 (A13) compreendendo (a) pelo menos 100 unidades de atividade de ADAMTS13 por mg de ADAMTS13, (b) NaCl de 0 a 200 mM; (c) 2 mM a 4 mM de cálcio; (d) 2% a 4% de manitol, (e) 0,5% a 2% de sacarose; (f) 0,025% a 0,1% de polissobarto 80, e (g) histidina de 10 mM a 50 mM (pH 7,0 ± 0,2).
[00201] Em uma modalidade, a presente invenção fornece um método para a fabricação de uma formulação de ADAMTS13 estabilizada, o método compreendendo as etapas de: (i) expressar uma proteína de ADAMTS13, ou um derivado biologicamente ativo da mesma, em uma célula cultivada em um meio compreendendo zinco a uma concentração de cerca de 2 μM a cerca de 12 μM e cálcio a uma concentração de cerca de 0,5 mM a cerca de 1,5 mM, (ii) purificar a proteína ADAMTS13, e (iii) preparar uma formulação compreendendo (a) pelo menos 100 unidades de atividade de ADAMTS13 (ou seja, atividade de FRETS-VWF73) por mg de ADAMTS13, (b) 0 mM a 100 mM de um sal farmaceuticamente aceitável, (c) 0,5 mM a 20 mM de cálcio, (d) um açúcar e/ou álcool de açúcar; (e) um tensoativo não iônico, e (f) um agente tamponador para manter um pH entre 6,0 e 8,0. Em uma modalidade, a formulação de ADAMTS13 estabilizada compreende pelo menos 200 unidades de atividade de A13 por mg de ADAMTS13. Em outra modalidade, a formulação de ADAMTS13 estabilizada compreende pelo menos 400 unidades de atividade de A13 por mg de ADAMTS13. Em uma modalidade preferida, a formulação de ADAMTS13 estabilizada compreende pelo menos 600 unidades de atividade de A13 por mg de ADAMTS13. Em uma modalidade mais preferida, a formulação de ADAMTS13 estabilizada compreende pelo menos 800 unidades de atividade de A13 por mg de ADAMTS13. Em ainda outra modalidade preferida, a formulação de ADAMTS13 estabilizada compreende pelo menos 1000 unidades de atividade de A13 por mg de ADAMTS13. Em uma modalidade, a formulação de ADAMTS13 estabilizada compreende entre cerca de 100 unidades e cerca de 2000 unidades de atividade de ADAMTS13 por mg de ADAMTS 13.
[00202] Em uma modalidade da formulação de A13 estabilizada com baixa quantidade de sal, a formulação compreende entre cerca de 1,0 mM e cerca de 10,0 mM de cálcio. Em uma modalidade preferida, a formulação contém entre cerca de 2,0 e cerca de 4,0 mM de cálcio.
[00203] Em outra modalidade da formulação de A13 estabilizada com baixa quantidade de sal, a formulação compreende entre cerca de 2% e cerca de 6% de um açúcar e/ou álcool de açúcar. Em uma modalidade preferida, a formulação compreende entre cerca de 3% e cerca de 5% de um açúcar e/ou álcool de açúcar. Em uma modalidade específica, a formulação compreende cerca de 4% de um açúcar e/ou álcool de açúcar. Em uma modalidade, o açúcar e/ou álcool de açúcar é selecionado a partir do grupo consistindo em sacarose, trealose, manitol, e uma combinação dos mesmos. Em uma modalidade preferida, o açúcar e/ou álcool de açúcar é uma mistura de sacarose e manitol.
[00204] Em uma modalidade da formulação de A13 estabilizada com baixa quantidade de sal, a formulação compreende entre cerca de 0,01% e cerca de 0,1% de um tensoativo não iônico. Em uma modalidade preferida, a formulação compreende cerca de 0,05% de um tensoativo não iônico. Em uma modalidade, o tensoativo é selecionado a partir do grupo consistindo em Polissorbato 20, Polissorbato 80, Plurônico F-68, e BRIJ 35. Em uma modalidade preferida, o tensoativo é Polissorbato 80.
[00205] Em uma modalidade da formulação de A13 estabilizada com baixa quantidade de sal, a formulação compreende entre cerca de 5 mM e cerca de 100 mM de um agente tamponador. Em uma modalidade preferida, a formulação compreende entre cerca de 10 mM e cerca de 50 mM de um agente tamponador. Em outra modalidade, o agente tamponador é histidina ou HEPES. Em uma modalidade preferida, o agente tamponador é histidina. Em uma modalidade, o pH da formulação está entre cerca de 6,5 e 7,5. Em uma modalidade preferida, o pH da formulação é de 7,0 ± 0,2.
[00206] Em uma modalidade da formulação de A13 estabilizada com baixa quantidade de sal, a formulação compreende ainda entre cerca de 0,5 μM e 20 μM de zinco.
[00207] Em uma modalidade específica, a presente invenção fornece uma formulação de ADAMTS13 (A13) estabilizada com baixa quantidade de sal compreendendo (a) pelo menos 100 unidades de atividade de ADAMTS13 por mg de ADAMTS13, (b) 0-60 mM de NaCl, (c) 2 mM a 4 mM de cálcio; (d) 2% a 4% de manitol, (e) 0,5% a 2% de sacarose; (f) 0,025% a 0,1% de polissobarto 80, e (g) histidina de 10 mM a 50 mM (pH 7,0 ± 0,2).
[00208] Em uma modalidade, a presente invenção fornece um método para a fabricação de uma formulação de ADAMTS13 estabilizada, o método compreendendo as etapas de: (i) expressar uma proteína de ADAMTS13, ou um derivado biologicamente ativo da mesma, em uma célula cultivada em um meio compreendendo zinco a uma concentração de cerca de 2 μM a cerca de 12 μM e cálcio a uma concentração de cerca de 0,5 mM a cerca de 1,5 mM, (ii) purificar a proteína ADAMTS13, e (iii) preparar uma formulação compreendendo (a) pelo menos 100 unidades de atividade de ADAMTS13 (ou seja, atividade de FRETS-VWF73) por mg de ADAMTS13, (b) 0 mM a 200 mM de um sal farmaceuticamente aceitável, (c) 0,5 mM a 20 mM de cálcio, (d) um açúcar e/ou álcool de açúcar; (e) um tensoativo não iônico, e (f) um agente tamponador para manter um pH entre 6,0 e 8,0. Em uma modalidade, a formulação de ADAMTS13 estabilizada compreende pelo menos 200 unidades de atividade de A13 por mg de ADAMTS13. Em uma outra modalidade, a formulação de ADAMTS13 estabilizada compreende pelo menos 400 unidades de atividade de A13 por mg de ADAMTS13. Em uma modalidade preferida, a formulação de ADAMTS13 estabilizada compreende pelo menos 600 unidades de atividade de A13 por mg de ADAMTS13. Em uma modalidade mais preferida, a formulação de ADAMTS13 estabilizada compreende pelo menos 800 unidades de atividade de A13 por mg de ADAMTS13. Em ainda outra modalidade preferida, a formulação de ADAMTS13 estabilizada compreende pelo menos 1000 unidades de atividade de A13 por mg de ADAMTS13. Em uma modalidade, a formulação de ADAMTS13 estabilizada compreende entre cerca de 100 unidades e cerca de 2000 unidades de atividade de ADAMTS13 por mg de ADAMTS 13.
[00209] Em uma modalidade da formulação de A13 estabilizada liofilizada, a formulação compreende entre cerca de 1,0 mM e cerca de 10,0 mM de cálcio. Em uma modalidade preferida, a formulação contém entre cerca de 2,0 e cerca de 4,0 mM de cálcio.
[00210] Em outra modalidade da formulação de A13 estabilizada liofilizada, a formulação compreende entre cerca de 2% e cerca de 6% de um açúcar e/ou álcool de açúcar. Em uma modalidade preferida, a formulação compreende entre cerca de 3% e cerca de 5% de um açúcar e/ou álcool de açúcar. Em uma modalidade específica, a formulação compreende cerca de 4% de um açúcar e/ou álcool de açúcar. Em uma modalidade, o açúcar e/ou álcool de açúcar é selecionado a partir do grupo consistindo em sacarose, trealose, manitol, e uma combinação dos mesmos. Em uma modalidade preferida, o açúcar e/ou álcool de açúcar é uma mistura de sacarose e manitol.
[00211] Em uma modalidade da formulação de A13 estabilizada liofilizada, a formulação compreende entre cerca de 0,01% e cerca de 0,1% de um tensoativo não iônico. Em uma modalidade preferida, a formulação compreende cerca de 0,05% de um tensoativo não iônico. Em uma modalidade, o tensoativo é selecionado a partir do grupo consistindo em Polissorbato 20, Polissorbato 80, Plurônico F-68, e BRIJ 35. Em uma modalidade preferida, o tensoativo é polissorbato 80.
[00212] Em uma modalidade da formulação de A13 estabilizada liofilizada, a formulação compreende entre cerca de 5 mM e cerca de 100 mM de um agente tamponador. Em uma modalidade preferida, a formulação compreende entre cerca de 10 mM e cerca de 50 mM de um agente tamponador. Em outra modalidade, o agente tamponador é histidina ou HEPES. Em uma modalidade preferida, o agente tamponador é histidina. Em uma modalidade, o pH da formulação está entre cerca de 6,5 e 7,5. Em uma modalidade preferida, o pH da formulação é de 7,0 ± 0,2.
[00213] Em uma modalidade da formulação de A13 estabilizada liofilizada, a formulação compreende ainda entre cerca de 0,5 μM e 20 μM de zinco.
[00214] Em uma modalidade específica, a presente invenção fornece uma formulação estabilizada liofilizada de ADAMTS13 (A13), em que a formulação é liofilizada a partir de uma formulação líquida compreendendo (a) pelo menos 100 unidades de atividade de ADAMTS13 por mg de ADAMTS 13, (b) NaCl de 0 a 200 mM; (c) 2 mM a 4 mM de cálcio; (d) 2% a 4% de manitol; (e) 0,5% a 2% de sacarose; (f) 0,025% a 0,1% de polissobarto 80, e (g) histidina de 10 mM a 50 mM (pH 7,0 ± 0,2).
[00215] Em uma modalidade, a presente invenção fornece um método para a fabricação de uma formulação de ADAMTS13 estabilizada, o método compreendendo as etapas de: (i) expressar uma proteína de ADAMTS13, ou um derivado biologicamente ativo da mesma, em uma célula cultivada em um meio compreendendo zinco a uma concentração de cerca de 2 μM a cerca de 12 μM e cálcio a uma concentração de cerca de 0,5 mM a cerca de 1,5 mM, (ii) purificar a proteína ADAMTS13, e (iii) preparar uma formulação compreendendo (a) pelo menos 100 unidades de atividade de ADAMTS13 (ou seja, atividade de FRETS-VWF73) por mg de ADAMTS13, (b) 0 mM a 100 mM de um sal farmaceuticamente aceitável, (c) 0,5 mM a 20 mM de cálcio, (d) um açúcar e/ou álcool de açúcar; ( e) um tensoativo não iônico, e (f) um agente tamponador para manter um pH entre 6,0 e 8,0. Em uma modalidade, a formulação de ADAMTS13 estabilizada compreende pelo menos 200 unidades de atividade de A13 por mg de ADAMTS13. Em outra modalidade, a formulação de ADAMTS13 estabilizada compreende pelo menos 400 unidades de atividade de A13 por mg de ADAMTS13. Em uma modalidade preferida, a formulação de ADAMTS13 estabilizada compreende pelo menos 600 unidades de atividade de A13 por mg de ADAMTS13. Em uma modalidade mais preferida, a formulação de ADAMTS13 estabilizada compreende pelo menos 800 unidades de atividade de A13 por mg de ADAMTS13. Em ainda outra modalidade preferida, a formulação de ADAMTS13 estabilizada compreende pelo menos 1000 unidades de atividade de A13 por mg de ADAMTS13. Em uma modalidade, a formulação de ADAMTS13 estabilizada compreende entre cerca de 100 unidades e cerca de 2000 unidades de atividade de ADAMTS13 por mg de ADAMTS 13.
[00216] Em uma modalidade da formulação de A13 estabilizada liofilizada com baixa quantidade de sal, a formulação compreende entre cerca de 1,0 mM e cerca de 10,0 mM de cálcio. Em uma modalidade preferida, a formulação contém entre cerca de 2,0 e cerca de 4,0 mM de cálcio.
[00217] Em outra modalidade da formulação de A13 estabilizada liofilizada com baixa quantidade de sal, a formulação compreende entre cerca de 2% e cerca de 6% de um açúcar e/ou álcool de açúcar. Em uma modalidade preferida, a formulação compreende entre cerca de 3% e cerca de 5% de um açúcar e/ou álcool de açúcar. Em uma modalidade específica, a formulação compreende cerca de 4% de um açúcar e/ou álcool de açúcar. Em uma modalidade, o açúcar e/ou álcool de açúcar é selecionado a partir do grupo consistindo em sacarose, trealose, manitol, e uma combinação dos mesmos. Em uma modalidade preferida, o açúcar e/ou álcool de açúcar é uma mistura de sacarose e manitol.
[00218] Em uma modalidade da formulação de A13 estabilizada liofilizada com baixa quantidade de sal, a formulação compreende entre cerca de 0,01% e cerca de 0,1% de um tensoativo não iônico. Em uma modalidade preferida, a formulação compreende cerca de 0,05% de um tensoativo não iônico. Em uma modalidade, o tensoativo é selecionado a partir do grupo consistindo em Polissorbato 20, Polissorbato 80, Plurônico F-68, e BRIJ 35. Em uma modalidade preferida, o tensoativo é Polissorbato 80.
[00219] Em uma modalidade da formulação de A13 estabilizada liofilizada com baixa quantidade de sal, a formulação compreende entre cerca de 5 mM e cerca de 100 mM de um agente tamponador. Em uma modalidade preferida, a formulação compreende entre cerca de 10 mM e cerca de 50 mM de um agente tamponador. Em outra modalidade, o agente tamponador é histidina ou HEPES. Em uma modalidade preferida, o agente tamponador é histidina. Em uma modalidade, o pH da formulação está entre cerca de 6,5 e 7,5. Em uma modalidade preferida, o pH da formulação é de 7,0 ± 0,2.
[00220] Em uma modalidade da formulação de A13 estabilizada liofilizada com baixa quantidade de sal, a formulação compreende ainda entre cerca de 0,5 μM e 20 μM de zinco.
[00221] Em uma modalidade específica, a presente invenção fornece uma formulação de ADAMTS 13 (A13) estabilizada liofilizada com baixa quantidade de sal, em que a formulação é liofilizada a partir de uma formulação líquida compreendendo (a) pelo menos 100 unidades de atividade de ADAMTS13 por mg de ADAMTS13, (b) 0 a 60 mM NaCl; (c) 2 mM a 4 mM de cálcio; (d) 2% a 4% de manitol; (e) 0,5% a 2% de sacarose; (f) 0,025% a 0,1% de polissobarto 80, e (g) histidina de 10 mM a 50 mM (pH 7,0 ± 0,2). Tratamento com Solvente e Detergente (S /D)
[00222] A fim de inativar vários contaminantes virais que podem estar presentes em uma formulação de ADAMTS13, um ou mais soluções intermediárias de ADAMTS13 podem ser submetidas a um tratamento com detergente e solvente (S/D). Métodos para o tratamento de soluções com detergente são bem conhecidos na técnica (para revisão ver, Pelletier J.P. et al., Best Pract Res Clin Haematol 2006;19(1):205-42, a descrição da qual é expressamente incorporada neste documento por referência na sua totalidade para todos os propósitos). Geralmente, qualquer tratamento de S/D padrão pode ser usado em conjunto com os métodos fornecidos neste documento. Por exemplo, um protocolo exemplar para um tratamento de S/D é fornecido abaixo.
[00223] Em uma modalidade, Triton X-100, Tween-20, e tri (n-butil) fosfato (TNBP) são adicionados a uma solução intermediária de ADAMTS13 em concentrações finais de, ou cerca de, 1,0%, 0,3% e 0,3%, respectivamente. A mistura é então agitada a uma temperatura de, ou cerca de entre, 18°C e 25°C durante pelo menos cerca de uma hora. 2. Nanofiltração e Ultra/diafiltração
[00224] A fim de reduzir a carga viral de uma formulação de proteína ADAMTS13 fornecida neste documento, a formulação, ou uma composição intermediária, pode ser nanofiltrada usando um dispositivo de nanofiltração adequado. Em certas modalidades, o dispositivo de nanofiltração terá um tamanho de poro médio de, ou cerca de entre 15 nm e 200 nm. Exemplos de nanofiltros adequados para este uso incluem, sem limitação, DVD, DV 50, DV 20 (Pall), Viresolve NFP®, Viresolve NFR® (Millipore), Planova® 15N, 20N, 35N, 75N e (Planova). Em uma modalidade específica, o nanofiltro pode ter um tamanho de poro médio de, ou cerca de entre 15 e 72 nm, ou de, ou cerca de entre 19 e 35 nm, ou de, ou cerca de 15 nm, 19 nm, 20 nm, 35 nm, ou 72 nm. Em uma modalidade preferida, o nanofiltro terá um tamanho médio de poro de, ou cerca de, 19 nm, 20 nm, ou 35 nm, tais como um filtro PLANOVA Asahi® 20N ou PLANOVA® 35N ou um equivalente do mesmo.
[00225] Subsequente à nanofiltração, o filtrado pode opcionalmente ser concentrado por ultrafiltração e/ou a composição do tampão ajustada por diafiltração. Em certas modalidades, a ultrafiltração é realizada em um cassete com uma tela de canal aberto e a membrana de ultrafiltração tem um corte de peso molecular nominal (NMWCO) de menos de ou cerca de 175 kDa ou menos do que de ou cerca de 170, 160, 150, 140, 130, 120, 110, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, ou menor kDa. Em uma modalidade preferida, a membrana de ultrafiltração tem um NMWCO de não mais que 30 kDa. Em outra modalidade preferida, a membrana de ultrafiltração tem um NMWCO de não mais que 30 kDa. 3. Liofilização e Tratamento Térmico
[00226] Em ainda outras modalidades, a atividade viral de uma formulação de ADAMTS13 liofilizada, que pode ter sido previamente submetida a outras etapas de inativação ou remoção viral, tais como nanofiltração, pode ser ainda mais reduzida por tratamento térmico da composição liofilizada. Tratamentos térmicos para a inativação de cargas virais nos fatores de sanguíneos são bem conhecidos na técnica (por exemplo, ver, Piszkiewicz et al., Thromb Res. 1987 Jul 15;47(2):235-41; Piszkiewicz et al., Curr Stud Hematol Blood Transfus. 1989;(56):44-54; Epstein e Fricke, Arch Pathol Lab Med. 1990 Mar;114(3):335-40). Administração e Métodos de Tratamento
[00227] As formulações podem ser administradas para tratamentos terapêuticos ou profilácticos. Geralmente, para aplicações terapêuticas, as formulações são administradas a um sujeito com uma doença ou condição associada com disfunção de ADAMTS13 ou VWF ou de outra forma em necessidade deste, em uma "dose terapeuticamente eficaz". Formulações e quantidades eficazes para estes usos dependerão da gravidade ou condição da doença e do estado geral de saúde do paciente. Administrações únicas ou múltiplas das formulações podem ser administradas dependendo da dosagem e frequência, conforme necessário e tolerado pelo paciente.
[00228] Um "paciente" ou "sujeito" para os propósitos da presente invenção inclui tanto os humanos quanto outros animais, especialmente mamíferos. Assim, as composições, formulações e métodos são aplicáveis tanto na terapia humana quanto em aplicações veterinárias. Em uma modalidade particular, o paciente é um mamífero, e em uma modalidade, é um humano. Outros tratamentos conhecidos e terapias para condições associadas com disfunção de ADAMTS13 ou VWF podem ser usados em combinação com as formulações e métodos fornecidos pela invenção.
[00229] Em um aspecto da invenção, os métodos para preparar uma formulação de rA13 estabilizada tendo elevadas atividades específicas são fornecidos. Em uma modalidade, o método compreende as etapas de expressar uma proteína ADAMTS13, ou um derivado biologicamente ativo da mesma, em uma célula cultivada em um meio compreendendo zinco a uma concentração de cerca de 2 μM a cerca de 12 μM e de cálcio a uma concentração de cerca de 0,5 mM a cerca de 1,5 mM, purificar a proteína A13, e preparar uma formulação tal como descrito acima. Em certas modalidades, o meio de cultura é ainda suplementado com vitamina B3 a uma concentração de cerca de 1 mg/L até cerca de 20 mg/L.
[00230] Em um outro aspecto, a presente invenção fornece métodos de tratamento ou prevenção de uma doença ou condição associada com uma disfunção de ADAMTS13 ou VWF. Em uma outra modalidade, a invenção fornece métodos de tratamento ou prevenção de uma doença ou condição associada com a formação e/ou presença de um ou mais trombos. Em uma outra modalidade, a invenção fornece métodos de desintegração de um ou mais trombos em um sujeito com necessidade dos mesmos. Em ainda outras modalidades, a invenção fornece métodos de tratamento ou prevenção de um infarto em sujeito com necessidade dos mesmos. Geralmente, os métodos fornecidos pela invenção compreendem a administração de uma formulação de ADAMTS13 tal como fornecida neste documento a um sujeito em necessidade da mesma.
[00231] Exemplos não limitativos de distúrbios associados com a formação e/ou presença de um ou mais trombos são púrpura trombocitopénica trombótica (TTP) hereditária, TTP adquirida, trombose arterial, infarto agudo do miocárdio (AMI), acidente vascular cerebral, sépsis e coagulação intravascular disseminada (DIC).
[00232] Exemplos não limitativos de distúrbios associados com um infarto incluem, sem limitação, infarto do miocárdio (ataque cardíaco), embolia pulmonar, eventos cerebrovasculares, tais como acidente vascular cerebral, doença oclusiva arterial periférica, (tais como gangrena), síndrome de antifosfolipídeo, sépsis, arterite de células gigantes (GCA), hérnia, e volvulus. Tratamento e Profilaxia para Disfunção de ADAMTS13 e vWF
[00233] Em um aspecto da modalidade, a presente invenção fornece um método para tratar ou prevenir uma doença ou condição associada com uma disfunção de ADAMTS13 ou VWF, o método compreendendo a administração a um sujeito com necessidade do mesmo, de uma formulação de ADAMTS13 de acordo com qualquer uma das formulações fornecidas neste documento.
[00234] Em uma modalidade, a presente invenção fornece um método para tratar ou prevenir uma doença ou condição associada com uma disfunção de ADAMTS13 ou VWF, o método compreendendo a administração a um sujeito com necessidade do mesmo de uma formulação de ADAMTS13 compreendendo (a) pelo menos 100 unidades de atividade de ADAMTS13 (ou seja, atividade de FRETS-VWF73) por mg de ADAMTS13, (b) 0 mM a 200 mM de um sal farmaceuticamente aceitável, (c) 0,5 mM a 20 mM de cálcio, (d) um açúcar e/ou álcool de açúcar; (e) um tensoativo não iônico, e (f) um agente tamponador para manter um pH entre 6,0 e 8,0. Em uma modalidade, a formulação de ADAMTS13 estabilizada compreende pelo menos 200 unidades de atividade de A13 por mg de ADAMTS13. Em uma outra modalidade, a formulação de ADAMTS13 estabilizada compreende pelo menos 400 unidades de atividade de A13 por mg de ADAMTS13. Em uma modalidade preferida, a formulação de ADAMTS13 estabilizada compreende pelo menos 600 unidades de atividade de A13 por mg de ADAMTS13. Em uma modalidade mais preferida, a formulação de ADAMTS13 estabilizada compreende pelo menos 800 unidades de atividade de A13 por mg de ADAMTS13. Em ainda outra modalidade preferida, a formulação de ADAMTS13 estabilizada compreende pelo menos 1000 unidades de atividade de A13 por mg de ADAMTS13. Em uma modalidade, a formulação de ADAMTS13 estabilizada compreende entre cerca de 100 unidades e cerca de 2000 unidades de atividade de ADAMTS13 por mg de ADAMTS 13.
[00235] Em uma modalidade da formulação de A13 estabilizada, a formulação compreende entre cerca de 1,0 mM e cerca de 10,0 mM de cálcio. Em uma modalidade preferida, a formulação contém entre cerca de 2,0 e cerca de 4,0 mM de cálcio.
[00236] Em outra modalidade da formulação de A13 estabilizada, a formulação compreende entre cerca de 2% e cerca de 6% de um açúcar e/ou álcool de açúcar. Em uma modalidade preferida, a formulação compreende entre cerca de 3% e cerca de 5% de um açúcar e/ou álcool de açúcar. Em uma modalidade específica, a formulação compreende cerca de 4% de um açúcar e/ou álcool de açúcar. Em uma modalidade, o açúcar e/ou álcool de açúcar é selecionado a partir do grupo consistindo em sacarose, trealose, manitol, e uma combinação dos mesmos. Em uma modalidade preferida, o açúcar e/ou álcool de açúcar é uma mistura de sacarose e manitol.
[00237] Em uma modalidade da formulação de A13 estabilizada, a formulação compreende entre cerca de 0,01% e cerca de 0,1% de um tensoativo não iônico. Em uma modalidade preferida, a formulação compreende cerca de 0,05% de um tensoativo não iônico. Em uma modalidade, o tensoativo é selecionado a partir do grupo consistindo em Polissorbato 20, Polissorbato 80, Plurônico F-68, e BRIJ 35. Em uma modalidade preferida, o tensoativo é Polissorbato 80.
[00238] Em uma modalidade da formulação de A13 estabilizada, a formulação compreende entre cerca de 5 mM e cerca de 100 mM de um agente tamponador. Em uma modalidade preferida, a formulação compreende entre cerca de 10 mM e cerca de 50 mM de um agente tamponador. Em outra modalidade, o agente tamponador é histidina ou HEPES. Em uma modalidade preferida, o agente tamponador é histidina. Em uma modalidade, o pH da formulação está entre cerca de 6,5 e 7,5. Em uma modalidade preferida, o pH da formulação é de 7,0 ± 0,2.
[00239] Em uma modalidade da formulação de A13 estabilizada, a formulação compreende ainda entre cerca de 0,5 μM e 20 μM de zinco.
[00240] Em uma modalidade específica, a presente invenção fornece uma formulação de ADAMTS13 estabilizada (A13) compreendendo (a) pelo menos 100 unidades de atividade de ADAMTS13 por mg de ADAMTS13, (b) NaCl de 0 a 200 mM; (c) 2 mM a 4 mM de cálcio; (d) 2% a 4% de manitol, (e) 0,5% a 2% de sacarose; (f) 0,025% a 0,1% de polissobarto 80, e (g) histidina de 10 mM a 50 mM (pH 7,0 ± 0,2).
[00241] Em uma modalidade, a presente invenção fornece um método para tratar ou prevenir uma doença ou condição associada com uma disfunção de ADAMTS13 ou VWF, o método compreendendo a administração a um sujeito com necessidade do mesmo de uma formulação de ADAMTS13 compreendendo (a) pelo menos 100 unidades de atividade de ADAMTS13 (ou seja, atividade de FRETS-VWF73) por mg de ADAMTS13, (b) 0 mM a 100 mM de um sal farmaceuticamente aceitável, (c) 0,5 mM a 20 mM de cálcio; (d) um açúcar e/ou álcool de açúcar; (e) um tensoativo não iônico, e (f) um agente tamponador para manter um pH entre 6,0 e 8,0. Em uma modalidade, a formulação de ADAMTS13 estabilizada compreende pelo menos 200 unidades de atividade de A13 por mg de ADAMTS13. Em outra modalidade, a formulação de ADAMTS13 estabilizada compreende pelo menos 400 unidades de atividade de A13 por mg de ADAMTS13. Em uma modalidade preferida, a formulação de ADAMTS13 estabilizada compreende pelo menos 600 unidades de atividade de A13 por mg de ADAMTS13. Em uma modalidade mais preferida, a formulação de ADAMTS13 estabilizada compreende pelo menos 800 unidades de atividade de A13 por mg de ADAMTS13. Em ainda outra modalidade preferida, a formulação de ADAMTS13 estabilizada compreende pelo menos 1000 unidades de atividade de A13 por mg de ADAMTS13. Em uma modalidade, a formulação de ADAMTS13 estabilizada compreende entre cerca de 100 unidades e cerca de 2000 unidades de atividade de ADAMTS13 por mg de ADAMTS 13.
[00242] Em uma modalidade da formulação de A13 estabilizada com baixa quantidade de sal, a formulação compreende entre cerca de 1,0 mM e cerca de 10,0 mM de cálcio. Em uma modalidade preferida, a formulação contém entre cerca de 2,0 e cerca de 4,0 mM de cálcio
[00243] Em outra modalidade da formulação de A13 estabilizada com baixa quantidade de sal, a formulação compreende entre cerca de 2% e cerca de 6% de um açúcar e/ou álcool de açúcar. Em uma modalidade preferida, a formulação compreende entre cerca de 3% e cerca de 5% de um açúcar e/ou álcool de açúcar. Em uma modalidade específica, a formulação compreende cerca de 4% de um açúcar e/ou álcool de açúcar. Em uma modalidade, o açúcar e/ou álcool de açúcar é selecionado a partir do grupo consistindo em sacarose, trealose, manitol, e uma combinação dos mesmos. Em uma modalidade preferida, o açúcar e/ou álcool de açúcar é uma mistura de sacarose e manitol.
[00244] Em uma modalidade da formulação de A13 estabilizada com baixa quantidade de sal, a formulação compreende entre cerca de 0,01% e cerca de 0,1% de um tensoativo não iônico. Em uma modalidade preferida, a formulação compreende cerca de 0,05% de um tensoativo não iônico. Em uma modalidade, o tensoativo é selecionado a partir do grupo consistindo em Polissorbato 20, Polissorbato 80, Plurônico F-68, e BRIJ 35. Em uma modalidade preferida, o tensoativo é Polissorbato 80.
[00245] Em uma modalidade da formulação de A13 estabilizada com baixa quantidade de sal, a formulação compreende entre cerca de 5 mM e cerca de 100 mM de um agente tamponador. Em uma modalidade preferida, a formulação compreende entre cerca de 10 mM e cerca de 50 mM de um agente tamponador. Em outra modalidade, o agente tamponador é histidina ou HEPES. Em uma modalidade preferida, o agente tamponador é histidina. Em uma modalidade, o pH da formulação está entre cerca de 6,5 e 7,5. Em uma modalidade preferida, o pH da formulação é de 7,0 ± 0,2.
[00246] Em uma modalidade da formulação de A13 estabilizada com baixa quantidade de sal, a formulação compreende ainda entre cerca de 0,5 μM e 20 μM de zinco.
[00247] Em uma modalidade específica, a presente invenção fornece uma formulação de ADAMTS13 (A13) estabilizada com baixa quantidade de sal compreendendo (a) pelo menos 100 unidades de atividade de ADAMTS13 por mg de ADAMTS13, (b) 0 a 60 mM de NaCl, (c) 2 mM a 4 mM de cálcio; (d) 2% a 4% de manitol, (e) 0,5% a 2% de sacarose; (f) 0,025% a 0,1% de polissobarto 80, e (g) histidina de 10 mM a 50 mM (pH 7,0 ± 0,2).
[00248] Em uma modalidade, a presente invenção fornece um método para tratar ou prevenir uma doença ou condição associada com uma disfunção de ADAMTS13 ou VWF, o método compreendendo a administração a um sujeito com necessidade do mesmo de uma formulação de ADAMTS13 compreendendo (a) pelo menos 100 unidades de atividade de ADAMTS13 (ou seja, atividade de FRETS-VWF73) por mg de ADAMTS13, (b) 0 mM a 200 mM de um sal farmaceuticamente aceitável, (c) 0,5 mM a 20 mM de cálcio, (d) um açúcar e/ou álcool de açúcar; (e) um tensoativo não iônico, e (f) um agente tamponador para manter um pH entre 6,0 e 8,0. Em uma modalidade, a formulação de ADAMTS13 estabilizada compreende pelo menos 200 unidades de atividade de A13 por mg de ADAMTS13. Em uma outra modalidade, a formulação de ADAMTS13 estabilizada compreende pelo menos 400 unidades de atividade de A13 por mg de ADAMTS13. Em uma modalidade preferida, a formulação de ADAMTS13 estabilizada compreende pelo menos 600 unidades de atividade de A13 por mg de ADAMTS13. Em uma modalidade mais preferida, a formulação de ADAMTS13 estabilizada compreende pelo menos 800 unidades de atividade de A13 por mg de ADAMTS13. Em ainda outra modalidade preferida, a formulação de ADAMTS13 estabilizada compreende pelo menos 1000 unidades de atividade de A13 por mg de ADAMTS13. Em uma modalidade, a formulação de ADAMTS13 estabilizada compreende entre cerca de 100 unidades e cerca de 2000 unidades de atividade de ADAMTS13 por mg de ADAMTS 13.
[00249] Em uma modalidade da formulação de A13 estabilizada liofilizada, a formulação compreende entre cerca de 1,0 mM e cerca de 10,0 mM de cálcio. Em uma modalidade preferida, a formulação contém entre cerca de 2,0 e cerca de 4,0 mM de cálcio.
[00250] Em outra modalidade da formulação de A13 estabilizada liofilizada, a formulação compreende entre cerca de 2% e cerca de 6% de um açúcar e/ou álcool de açúcar. Em uma modalidade preferida, a formulação compreende entre cerca de 3% e cerca de 5% de um açúcar e/ou álcool de açúcar. Em uma modalidade específica, a formulação compreende cerca de 4% de um açúcar e/ou álcool de açúcar. Em uma modalidade, o açúcar e/ou álcool de açúcar é selecionado a partir do grupo consistindo em sacarose, trealose, manitol, e uma combinação dos mesmos. Em uma modalidade preferida, o açúcar e/ou álcool de açúcar é uma mistura de sacarose e manitol.
[00251] Em uma modalidade da formulação de A13 estabilizada liofilizada, a formulação compreende entre cerca de 0,01% e cerca de 0,1% de um tensoativo não iônico. Em uma modalidade preferida, a formulação compreende cerca de 0,05% de um tensoativo não iônico. Em uma modalidade, o tensoativo é selecionado a partir do grupo consistindo em Polissorbato 20, Polissorbato 80, Plurônico F-68, e BRIJ 35. Em uma modalidade preferida, o tensoativo é Polissorbato 80.
[00252] Em uma modalidade da formulação de A13 estabilizada liofilizada, a formulação compreende entre cerca de 5 mM e cerca de 100 mM de um agente tamponador. Em uma modalidade preferida, a formulação compreende entre cerca de 10 mM e cerca de 50 mM de um agente tamponador. Em outra modalidade, o agente tamponador é histidina ou HEPES. Em uma modalidade preferida, o agente tamponador é histidina. Em uma modalidade, o pH da formulação está entre cerca de 6,5 e 7,5. Em uma modalidade preferida, o pH da formulação é de 7,0 ± 0,2.
[00253] Em uma modalidade da formulação de A13 estabilizada liofilizada, a formulação compreende ainda entre cerca de 0,5 μM e 20 μM de zinco.
[00254] Em uma modalidade específica, a presente invenção fornece uma formulação estabilizada liofilizada de ADAMTS13 (A13), em que a formulação é liofilizada a partir de uma formulação líquida compreendendo (a) pelo menos 100 unidades de atividade de ADAMTS13 por mg de ADAMTS13, (b) NaCl de 0 a 200 mM, (c) 2 mM a 4 mM de cálcio; (d) 2% a 4% de manitol; (e) 0,5% a 2% de sacarose; (f) 0,025% a 0,1% de polissobarto 80, e (g) histidina de 10 mM a 50 mM (pH 7,0 ± 0,2).
[00255] Em uma modalidade, a presente invenção fornece um método para tratar ou prevenir uma doença ou condição associada com uma disfunção de ADAMTS13 ou VWF, o método compreendendo a administração a um sujeito com necessidade do mesmo de uma formulação de ADAMTS13 compreendendo (a) pelo menos 100 unidades de atividade de ADAMTS13 (ou seja, atividade de FRETS-VWF73) por mg de ADAMTS13, (b) 0 mM a 100 mM de um sal farmaceuticamente aceitável, (c) 0,5 mM a 20 mM de cálcio; (d) um açúcar e/ou álcool de açúcar; (e) um tensoativo não iônico, e (f) um agente tamponador para manter um pH entre 6,0 e 8,0. Em uma modalidade, a formulação de ADAMTS13 estabilizada compreende pelo menos 200 unidades de atividade de A13 por mg de ADAMTS13. Em outra modalidade, a formulação de ADAMTS13 estabilizada compreende pelo menos 400 unidades de atividade de A13 por mg de ADAMTS13. Em uma modalidade preferida, a formulação de ADAMTS13 estabilizada compreende pelo menos 600 unidades de atividade de A13 por mg de ADAMTS13. Em uma modalidade mais preferida, a formulação de ADAMTS13 estabilizada compreende pelo menos 800 unidades de atividade de A13 por mg de ADAMTS13. Em ainda outra modalidade preferida, a formulação de ADAMTS13 estabilizada compreende pelo menos 1000 unidades de atividade de A13 por mg de ADAMTS13. Em uma modalidade, a formulação de ADAMTS13 estabilizada compreende entre cerca de 100 unidades e cerca de 2000 unidades de atividade de ADAMTS13 por mg de ADAMTS 13.
[00256] Em uma modalidade da formulação de A13 estabilizada liofilizada com baixa quantidade de sal, a formulação compreende entre cerca de 1,0 mM e cerca de 10,0 mM de cálcio. Em uma modalidade preferida, a formulação contém entre cerca de 2,0 e cerca de 4,0 mM de cálcio.
[00257] Em outra modalidade da formulação de A13 estabilizada liofilizada com baixa quantidade de sal, a formulação compreende entre cerca de 2% e cerca de 6% de um açúcar e/ou álcool de açúcar. Em uma modalidade preferida, a formulação compreende entre cerca de 3% e cerca de 5% de um açúcar e/ou álcool de açúcar. Em uma modalidade específica, a formulação compreende cerca de 4% de um açúcar e/ou álcool de açúcar. Em uma modalidade, o açúcar e/ou álcool de açúcar é selecionado a partir do grupo consistindo em sacarose, trealose, manitol, e uma combinação dos mesmos. Em uma modalidade preferida, o açúcar e/ou álcool de açúcar é uma mistura de sacarose e manitol.
[00258] Em uma modalidade da formulação de A13 estabilizada liofilizada com baixa quantidade de sal, a formulação compreende entre cerca de 0,01% e cerca de 0,1% de um tensoativo não iônico. Em uma modalidade preferida, a formulação compreende cerca de 0,05% de um tensoativo não iônico. Em uma modalidade, o tensoativo é selecionado a partir do grupo consistindo em Polissorbato 20, Polissorbato 80, Plurônico F-68, e BRIJ 35. Em uma modalidade preferida, o tensoativo é Polissorbato 80.
[00259] Em uma modalidade da formulação de A13 estabilizada liofilizada com baixa quantidade de sal, a formulação compreende entre cerca de 5 mM e cerca de 100 mM de um agente tamponador. Em uma modalidade preferida, a formulação compreende entre cerca de 10 mM e cerca de 50 mM de um agente tamponador. Em outra modalidade, o agente tamponador é histidina ou HEPES. Em uma modalidade preferida, o agente tamponador é histidina. Em uma modalidade, o pH da formulação está entre cerca de 6,5 e 7,5. Em uma modalidade preferida, o pH da formulação é de 7,0 ± 0,2.
[00260] Em uma modalidade da formulação de A13 estabilizada liofilizada com baixa quantidade de sal, a formulação compreende ainda entre cerca de 0,5 μM e 20 μM de zinco.
[00261] Em uma modalidade específica, a presente invenção fornece uma formulação de ADAMTS 13 (A13) estabilizada liofilizada com baixa quantidade de sal, em que a formulação é liofilizada a partir de uma formulação líquida compreendendo (a) pelo menos 100 unidades de atividade de ADAMTS13 por mg de ADAMTS13, (b) 0 a 60 mM NaCl; (c) 2 mM a 4 mM de cálcio; (d) 2% a 4% de manitol; (e) 0,5% a 2% de sacarose; (f) 0,025% a 0,1% de polissobarto 80, e (g) histidina de 10 mM a 50 mM (pH 7,0 ± 0,2). B. Tratamento e Profilaxia de Doenças e Condições Trombóticas
[00262] Em um aspecto da modalidade, a presente invenção fornece um método para tratar ou prevenir uma doença ou condição, com a formação e/ou presença de um trombo, o método compreendendo a administração a um sujeito com necessidade do mesmo de uma formulação de ADAMTS13 de acordo com qualquer uma das formulações fornecidas neste documento.
[00263] Em uma modalidade, a presente invenção fornece um método para tratar ou prevenir uma doença ou condição associada com a formação e/ou presença de um trombo, o método compreendendo a administração a um sujeito com necessidade do mesmo de uma formulação de ADAMTS13 compreendendo (a) pelo menos 100 unidades de atividade de ADAMTS13 (isto é, atividade de FRETS-VWF73) por mg de ADAMTS13, (b) 0 mM a 200 mM de um sal farmaceuticamente aceitável, (c) 0,5 mM a 20 mM de cálcio, (d) um açúcar e/ou álcool de açúcar, (e) um tensoativo não iônico, e (f) um agente tamponador para manter um pH entre 6,0 e 8,0. Em uma modalidade, a formulação de ADAMTS13 estabilizada compreende pelo menos 200 unidades de atividade de A13 por mg de ADAMTS13. Em uma outra modalidade, a formulação de ADAMTS13 estabilizada compreende pelo menos 400 unidades de atividade de A13 por mg de ADAMTS13. Em uma modalidade preferida, a formulação de ADAMTS13 estabilizada compreende pelo menos 600 unidades de atividade de A13 por mg de ADAMTS13. Em uma modalidade mais preferida, a formulação de ADAMTS13 estabilizada compreende pelo menos 800 unidades de atividade de A13 por mg de ADAMTS13. Em ainda outra modalidade preferida, a formulação de ADAMTS13 estabilizada compreende pelo menos 1000 unidades de atividade de A13 por mg de ADAMTS13. Em uma modalidade, a formulação de ADAMTS13 estabilizada compreende entre cerca de 100 unidades e cerca de 2000 unidades de atividade de ADAMTS13 por mg de ADAMTS 13.
[00264] Em uma modalidade da formulação de A13 estabilizada, a formulação compreende entre cerca de 1,0 mM e cerca de 10,0 mM de cálcio. Em uma modalidade preferida, a formulação contém entre cerca de 2,0 e cerca de 4,0 mM de cálcio.
[00265] Em outra modalidade da formulação de A13 estabilizada, a formulação compreende entre cerca de 2% e cerca de 6% de um açúcar e/ou álcool de açúcar. Em uma modalidade preferida, a formulação compreende entre cerca de 3% e cerca de 5% de um açúcar e/ou álcool de açúcar. Em uma modalidade específica, a formulação compreende cerca de 4% de um açúcar e/ou álcool de açúcar. Em uma modalidade, o açúcar e/ou álcool de açúcar é selecionado a partir do grupo consistindo em sacarose, trealose, manitol, e uma combinação dos mesmos. Em uma modalidade preferida, o açúcar e/ou álcool de açúcar é uma mistura de sacarose e manitol.
[00266] Em uma modalidade da formulação de A13 estabilizada, a formulação compreende entre cerca de 0,01% e cerca de 0,1% de um tensoativo não iônico. Em uma modalidade preferida, a formulação compreende cerca de 0,05% de um tensoativo não iônico. Em uma modalidade, o tensoativo é selecionado a partir do grupo consistindo em Polissorbato 20, Polissorbato 80, Plurônico F-68, e BRIJ 35. Em uma modalidade preferida, o tensoativo é Polissorbato 80.
[00267] Em uma modalidade da formulação de A13 estabilizada, a formulação compreende entre cerca de 5 mM e cerca de 100 mM de um agente tamponador. Em uma modalidade preferida, a formulação compreende entre cerca de 10 mM e cerca de 50 mM de um agente tamponador. Em outra modalidade, o agente tamponador é histidina ou HEPES. Em uma modalidade preferida, o agente tamponador é histidina. Em uma modalidade, o pH da formulação está entre cerca de 6,5 e 7,5. Em uma modalidade preferida, o pH da formulação é de 7,0 ± 0,2
[00268] Em uma modalidade da formulação de A13 estabilizada, a formulação compreende ainda entre cerca de 0,5 μM e 20 μM de zinco.
[00269] Em uma modalidade específica, a presente invenção fornece uma formulação de ADAMTS13 estabilizada (A13) compreendendo (a) pelo menos 100 unidades de atividade de ADAMTS13 por mg de ADAMTS13, (b) 0 a 200 mM de NaCl; (c) 2 mM a 4 mM de cálcio; (d) 2% a 4% de manitol, (e) 0,5% a 2% de sacarose; (f) 0,025% a 0,1% de polissobarto 80, e (g) histidina de 10 mM a 50 mM (pH 7,0 ± 0,2).
[00270] Em uma modalidade, a presente invenção fornece um método para tratar ou prevenir uma doença ou condição associada com a formação e/ou presença de um trombo, o método compreendendo a administração a um sujeito com necessidade do mesmo de uma formulação de ADAMTS13 compreendendo (a) pelo menos 100 unidades de atividade de ADAMTS13 (isto é, atividade de FRETS-VWF73) por mg de ADAMTS13, (b) 0 mM a 100 mM de um sal farmaceuticamente aceitável, (c) 0,5 mM a 20 mM de cálcio, (d) um açúcar e/ou álcool de açúcar, (e) um tensoativo não iônico, e (f) um agente tamponador para manter um pH entre 6,0 e 8,0. Em uma modalidade, a formulação de ADAMTS13 estabilizada compreende pelo menos 200 unidades de atividade de A13 por mg de ADAMTS13. Em uma outra modalidade, a formulação de ADAMTS13 estabilizada compreende pelo menos 400 unidades de atividade de A13 por mg de ADAMTS13. Em uma modalidade preferida, a formulação de ADAMTS13 estabilizada compreende pelo menos 600 unidades de atividade de A13 por mg de ADAMTS13. Em uma modalidade mais preferida, a formulação de ADAMTS13 estabilizada compreende pelo menos 800 unidades de atividade de A13 por mg de ADAMTS13. Em ainda outra modalidade preferida, a formulação de ADAMTS13 estabilizada compreende pelo menos 1000 unidades de atividade de A13 por mg de ADAMTS13. Em uma modalidade, a formulação de ADAMTS13 estabilizada compreende entre cerca de 100 unidades e cerca de 2000 unidades de atividade de ADAMTS13 por mg de ADAMTS 13.
[00271] Em uma modalidade da formulação de A13 estabilizada com baixa quantidade de sal, a formulação compreende entre cerca de 1,0 mM e cerca de 10,0 mM de cálcio. Em uma modalidade preferida, a formulação contém entre cerca de 2,0 e cerca de 4,0 mM de cálcio.
[00272] Em outra modalidade da formulação de A13 estabilizada com baixa quantidade de sal, a formulação compreende entre cerca de 2% e cerca de 6% de um açúcar e/ou álcool de açúcar. Em uma modalidade preferida, a formulação compreende entre cerca de 3% e cerca de 5% de um açúcar e/ou álcool de açúcar. Em uma modalidade específica, a formulação compreende cerca de 4% de um açúcar e/ou álcool de açúcar. Em uma modalidade, o açúcar e/ou álcool de açúcar é selecionado a partir do grupo consistindo em sacarose, trealose, manitol, e uma combinação dos mesmos. Em uma modalidade preferida, o açúcar e/ou álcool de açúcar é uma mistura de sacarose e manitol.
[00273] Em uma modalidade da formulação de A13 estabilizada com baixa quantidade de sal, a formulação compreende entre cerca de 0,01% e cerca de 0,1% de um tensoativo não iônico. Em uma modalidade preferida, a formulação compreende cerca de 0,05% de um tensoativo não iônico. Em uma modalidade, o tensoativo é selecionado a partir do grupo consistindo em Polissorbato 20, Polissorbato 80, Plurônico F-68, e BRIJ 35. Em uma modalidade preferida, o tensoativo é Polissorbato 80.
[00274] Em uma modalidade da formulação de A13 estabilizada com baixa quantidade de sal, a formulação compreende entre cerca de 5 mM e cerca de 100 mM de um agente tamponador. Em uma modalidade preferida, a formulação compreende entre cerca de 10 mM e cerca de 50 mM de um agente tamponador. Em outra modalidade, o agente tamponador é histidina ou HEPES. Em uma modalidade preferida, o agente tamponador é histidina. Em uma modalidade, o pH da formulação está entre cerca de 6,5 e 7,5. Em uma modalidade preferida, o pH da formulação é de 7,0 ± 0,2.
[00275] Em uma modalidade da formulação de A13 estabilizada com baixa quantidade de sal, a formulação compreende ainda entre cerca de 0,5 μM e 20 μM de zinco.
[00276] Em uma modalidade específica, a presente invenção fornece uma formulação de ADAMTS13 (A13) estabilizada com baixa quantidade de sal compreendendo (a) pelo menos 100 unidades de atividade de ADAMTS13 por mg de ADAMTS13, (b) 0 a 60 mM de NaCl, (c) 2 mM a 4 mM de cálcio; (d) 2% a 4% de manitol, (e) 0,5% a 2% de sacarose; (f) 0,025% a 0,1% de polissobarto 80, e (g) histidina de 10 mM a 50 mM (pH 7,0 ± 0,2).
[00277] Em uma modalidade, a presente invenção fornece um método para tratar ou prevenir uma doença ou condição associada com a formação e/ou presença de um trombo, o método compreendendo a administração a um sujeito com necessidade do mesmo de uma formulação de ADAMTS13 compreendendo (a) pelo menos 100 unidades de atividade de ADAMTS13 (isto é, atividade de FRETS-VWF73) por mg de ADAMTS13, (b) 0 mM a 200 mM de um sal farmaceuticamente aceitável, (c) 0,5 mM a 20 mM de cálcio, (d) um açúcar e/ou álcool de açúcar, (e) um tensoativo não iônico, e (f) um agente tamponador para manter um pH entre 6,0 e 8,0. Em uma modalidade, a formulação de ADAMTS13 estabilizada compreende pelo menos 200 unidades de atividade de A13 por mg de ADAMTS13. Em outra modalidade, a formulação de ADAMTS13 estabilizada compreende pelo menos 400 unidades de atividade de A13 por mg de ADAMTS13. Em uma modalidade preferida, a formulação de ADAMTS13 estabilizada compreende pelo menos 600 unidades de atividade de A13 por mg de ADAMTS13. Em uma modalidade mais preferida, a formulação de ADAMTS13 estabilizada compreende pelo menos 800 unidades de atividade de A13 por mg de ADAMTS13. Em ainda outra modalidade preferida, a formulação de ADAMTS13 estabilizada compreende pelo menos 1000 unidades de atividade de A13 por mg de ADAMTS13. Em uma modalidade, a formulação de ADAMTS13 estabilizada compreende entre cerca de 100 unidades e cerca de 2000 unidades de atividade de ADAMTS13 por mg de ADAMTS 13.
[00278] Em uma modalidade da formulação de A13 estabilizada liofilizada, a formulação compreende entre cerca de 1,0 mM e cerca de 10,0 mM de cálcio. Em uma modalidade preferida, a formulação contém entre cerca de 2,0 e cerca de 4,0 mM de cálcio.
[00279] Em outra modalidade da formulação de A13 estabilizada liofilizada, a formulação compreende entre cerca de 2% e cerca de 6% de um açúcar e/ou álcool de açúcar. Em uma modalidade preferida, a formulação compreende entre cerca de 3% e cerca de 5% de um açúcar e/ou álcool de açúcar. Em uma modalidade específica, a formulação compreende cerca de 4% de um açúcar e/ou álcool de açúcar. Em uma modalidade, o açúcar e/ou álcool de açúcar é selecionado a partir do grupo consistindo em sacarose, trealose, manitol, e uma combinação dos mesmos. Em uma modalidade preferida, o açúcar e/ou álcool de açúcar é uma mistura de sacarose e manitol.
[00280] Em uma modalidade da formulação de A13 estabilizada liofilizada, a formulação compreende entre cerca de 0,01% e cerca de 0,1% de um tensoativo não iônico. Em uma modalidade preferida, a formulação compreende cerca de 0,05% de um tensoativo não iônico. Em uma modalidade, o tensoativo é selecionado a partir do grupo consistindo em Polissorbato 20, Polissorbato 80, Plurônico F-68, e BRIJ 35. Em uma modalidade preferida, o tensoativo é Polissorbato 80.
[00281] Em uma modalidade da formulação de A13 estabilizada liofilizada, a formulação compreende entre cerca de 5 mM e cerca de 100 mM de um agente tamponador. Em uma modalidade preferida, a formulação compreende entre cerca de 10 mM e cerca de 50 mM de um agente tamponador. Em outra modalidade, o agente tamponador é histidina ou HEPES. Em uma modalidade preferida, o agente tamponador é histidina. Em uma modalidade, o pH da formulação está entre cerca de 6,5 e 7,5. Em uma modalidade preferida, o pH da formulação é de 7,0 ± 0,2.
[00282] Em uma modalidade da formulação de A13 estabilizada liofilizada, a formulação compreende ainda entre cerca de 0,5 μM e 20 μM de zinco.
[00283] Em uma modalidade específica, a presente invenção fornece uma formulação estabilizada liofilizada de ADAMTS13 (A13), em que a formulação é liofilizada a partir de uma formulação líquida compreendendo (a) pelo menos 100 unidades de atividade de ADAMTS13 por mg de ADAMTS13, (b) NaCl de 0 a 200 mM, (c) 2 mM a 4 mM de cálcio; (d) 2% a 4% de manitol; (e) 0,5% a 2% de sacarose; (f) 0,025% a 0,1% de polissobarto 80, e (g) histidina de 10 mM a 50 mM (pH 7,0 ± 0,2).
[00284] Em uma modalidade, a presente invenção fornece um método para tratar ou prevenir uma doença ou condição associada com a formação e/ou presença de um trombo, o método compreendendo a administração a um sujeito com necessidade do mesmo de uma formulação de ADAMTS13 compreendendo (a) pelo menos 100 unidades de atividade de ADAMTS13 (isto é, atividade de FRETS-VWF73) por mg de ADAMTS13, (b) 0 mMa 100 mM de um sal farmaceuticamente aceitável, (c) 0,5 mM a 20 mM de cálcio, (d) um açúcar e/ou álcool de açúcar, (e) um tensoativo não iônico, e (f) um agente tamponador para manter um pH entre 6,0 e 8,0. Em uma modalidade, a formulação de ADAMTS13 estabilizada compreende pelo menos 200 unidades de atividade de A13 por mg de ADAMTS13. Em uma outra modalidade, a formulação de ADAMTS13 estabilizada compreende pelo menos 400 unidades de atividade de A13 por mg de ADAMTS13. Em uma modalidade preferida, a formulação de ADAMTS13 estabilizada compreende pelo menos 600 unidades de atividade de A13 por mg de ADAMTS13. Em uma modalidade mais preferida, a formulação de ADAMTS13 estabilizada compreende pelo menos 800 unidades de atividade de A13 por mg de ADAMTS13. Em ainda outra modalidade preferida, a formulação de ADAMTS13 estabilizada compreende pelo menos 1000 unidades de atividade de A13 por mg de ADAMTS13. Em uma modalidade, a formulação de ADAMTS13 estabilizada compreende entre cerca de 100 unidades e cerca de 2000 unidades de atividade de ADAMTS13 por mg de ADAMTS 13.
[00285] Em uma modalidade da formulação de A13 estabilizada liofilizada com baixa quantidade de sal, a formulação compreende entre cerca de 1,0 mM e cerca de 10,0 mM de cálcio. Em uma modalidade preferida, a formulação contém entre cerca de 2,0 e cerca de 4,0 mM de cálcio.
[00286] Em outra modalidade da formulação de A13 estabilizada liofilizada com baixa quantidade de sal, a formulação compreende entre cerca de 2% e cerca de 6% de um açúcar e/ou álcool de açúcar. Em uma modalidade preferida, a formulação compreende entre cerca de 3% e cerca de 5% de um açúcar e/ou álcool de açúcar. Em uma modalidade específica, a formulação compreende cerca de 4% de um açúcar e/ou álcool de açúcar. Em uma modalidade, o açúcar e/ou álcool de açúcar é selecionado a partir do grupo consistindo em sacarose, trealose, manitol, e uma combinação dos mesmos. Em uma modalidade preferida, o açúcar e/ou álcool de açúcar é uma mistura de sacarose e manitol.
[00287] Em uma modalidade da formulação de A13 estabilizada liofilizada com baixa quantidade de sal, a formulação compreende entre cerca de 0,01% e cerca de 0,1% de um tensoativo não iônico. Em uma modalidade preferida, a formulação compreende cerca de 0,05% de um tensoativo não iônico. Em uma modalidade, o tensoativo é selecionado a partir do grupo consistindo em Polissorbato 20, Polissorbato 80, Plurônico F-68, e BRIJ 35. Em uma modalidade preferida, o tensoativo é Polissorbato 80.
[00288] Em uma modalidade da formulação de A13 estabilizada liofilizada com baixa quantidade de sal, a formulação compreende entre cerca de 5 mM e cerca de 100 mM de um agente tamponador. Em uma modalidade preferida, a formulação compreende entre cerca de 10 mM e cerca de 50 mM de um agente tamponador. Em outra modalidade, o agente tamponador é histidina ou HEPES. Em uma modalidade preferida, o agente tamponador é histidina. Em uma modalidade, o pH da formulação está entre cerca de 6,5 e 7,5. Em uma modalidade preferida, o pH da formulação é de 7,0 ± 0,2.
[00289] Em uma modalidade da formulação de A13 estabilizada liofilizada com baixa quantidade de sal, a formulação compreende ainda entre cerca de 0,5 μM e 20 μM de zinco.
[00290] Em uma modalidade específica, a presente invenção fornece uma formulação de ADAMTS 13 (A13) estabilizada liofilizada com baixa quantidade de sal, em que a formulação é liofilizada a partir de uma formulação líquida compreendendo (a) pelo menos 100 unidades de atividade de ADAMTS13 por mg de ADAMTS13, (b) 0 a 60 mM NaCl; (c) 2 mM a 4 mM de cálcio; (d) 2% a 4% de manitol; (e) 0,5% a 2% de sacarose; (f) 0,025% a 0,1% de polissobarto 80, e (g ) histidina de 10 mM a 50 mM (pH 7,0 ± 0,2). C. Tratamento e Profilaxia para um Infarto
[00291] Em um aspecto da modalidade, a presente invenção fornece um método para tratar ou prevenir um infarto, o método compreendendo a administração a um sujeito com necessidade do mesmo de uma formulação de ADAMTS13 de acordo com qualquer uma das formulações fornecidas neste documento.
[00292] Em uma modalidade, a presente invenção fornece um método para tratar ou prevenir um infarto, o método compreendendo a administração a um sujeito com necessidade do mesmo de uma formulação de ADAMTS13 compreendendo (a) pelo menos 100 unidades de atividade de ADAMTS13 (ou seja, atividade de FRETS-VWF73) por mg de ADAMTS13, (b) 0 mM a 200 mM de um sal farmaceuticamente aceitável, (c) 0,5 mM a 20 mM de cálcio, (d) um açúcar e/ou álcool de açúcar, (e) um tensoativo não iônico, e (f) um agente tamponador para manter um pH entre 6,0 e 8,0. Em uma modalidade, a formulação de ADAMTS13 estabilizada compreende pelo menos 200 unidades de atividade de A13 por mg de ADAMTS13. Em uma outra modalidade, a formulação de ADAMTS13 estabilizada compreende pelo menos 400 unidades de atividade de A13 por mg de ADAMTS13. Em uma modalidade preferida, a formulação de ADAMTS13 estabilizada compreende pelo menos 600 unidades de atividade de A13 por mg de ADAMTS13. Em uma modalidade mais preferida, a formulação de ADAMTS13 estabilizada compreende pelo menos 800 unidades de atividade de A13 por mg de ADAMTS13. Em ainda outra modalidade preferida, a formulação de ADAMTS13 estabilizada compreende pelo menos 1000 unidades de atividade de A13 por mg de ADAMTS13. Em uma modalidade, a formulação de ADAMTS13 estabilizada compreende entre cerca de 100 unidades e cerca de 2000 unidades de atividade de ADAMTS13 por mg de ADAMTS 13.
[00293] Em uma modalidade da formulação de A13 estabilizada, a formulação compreende entre cerca de 1,0 mM e cerca de 10,0 mM de cálcio. Em uma modalidade preferida, a formulação contém entre cerca de 2,0 e cerca de 4,0 mM de cálcio.
[00294] Em outra modalidade da formulação de A13 estabilizada, a formulação compreende entre cerca de 2% e cerca de 6% de um açúcar e/ou álcool de açúcar. Em uma modalidade preferida, a formulação compreende entre cerca de 3% e cerca de 5% de um açúcar e/ou álcool de açúcar. Em uma modalidade específica, a formulação compreende cerca de 4% de um açúcar e/ou álcool de açúcar. Em uma modalidade, o açúcar e/ou álcool de açúcar é selecionado a partir do grupo consistindo em sacarose, trealose, manitol, e uma combinação dos mesmos. Em uma modalidade preferida, o açúcar e/ou álcool de açúcar é uma mistura de sacarose e manitol.
[00295] Em uma modalidade da formulação de A13 estabilizada, a formulação compreende entre cerca de 0,01% e cerca de 0,1% de um tensoativo não iônico. Em uma modalidade preferida, a formulação compreende cerca de 0,05% de um tensoativo não iônico. Em uma modalidade, o tensoativo é selecionado do grupo consistindo em Polissorbato 20, Polissorbato 80, Plurônico F-68, e BRIJ 35. Em uma modalidade preferida, o tensoativo é Polissorbato 80.
[00296] Em uma modalidade da formulação de A13 estabilizada, a formulação compreende entre cerca de 5 mM e cerca de 100 mM de um agente tamponador. Em uma modalidade preferida, a formulação compreende entre cerca de 10 mM e cerca de 50 mM de um agente tamponador. Em outra modalidade, o agente tamponador é histidina ou HEPES. Em uma modalidade preferida, o agente tamponador é histidina. Em uma modalidade, o pH da formulação está entre cerca de 6,5 e 7,5. Em uma modalidade preferida, o pH da formulação é de 7,0 ± 0,2.
[00297] Em uma modalidade da formulação de A13 estabilizada, a formulação compreende ainda entre cerca de 0,5 μM e 20 μM de zinco.
[00298] Em uma modalidade específica, a presente invenção fornece uma formulação de ADAMTS13 estabilizada (A13) compreendendo (a) pelo menos 100 unidades de atividade de ADAMTS13 por mg de ADAMTS13, (b) NaCl de 0 a 200 mM; (c) 2 mM a 4 mM de cálcio; (d) 2% a 4% de manitol, (e) 0,5% a 2% de sacarose; (f) 0,025% a 0,1% de polissobarto 80, e (g) histidina de 10 mM a 50 mM (pH 7,0 ± 0,2).
[00299] Em uma modalidade, a presente invenção fornece um método para tratar ou prevenir um infarto, o método compreendendo a administração a um sujeito com necessidade do mesmo de uma formulação de ADAMTS13 compreendendo (a) pelo menos 100 unidades de atividade de ADAMTS13 (ou seja, atividade de FRETS- VWF73) por mg de ADAMTS13, (b) 0 mM a 100 mM de um sal farmaceuticamente aceitável, (c) 0,5 mM a 20 mM de cálcio, (d) um açúcar e/ou álcool de açúcar; (e) um tensoativo não iônico, e (f) um agente tamponador para manter um pH entre 6,0 e 8,0. Em uma modalidade, a formulação de ADAMTS13 estabilizada compreende pelo menos 200 unidades de atividade de A13 por mg de ADAMTS13. Em outra modalidade, a formulação de ADAMTS13 estabilizada compreende pelo menos 400 unidades de atividade de A13 por mg de ADAMTS13. Em uma modalidade preferida, a formulação de ADAMTS13 estabilizada compreende pelo menos 600 unidades de atividade de A13 por mg de ADAMTS13. Em uma modalidade mais preferida, a formulação de ADAMTS13 estabilizada compreende pelo menos 800 unidades de atividade de A13 por mg de ADAMTS13. Em ainda outra modalidade preferida, a formulação de ADAMTS13 estabilizada compreende pelo menos 1000 unidades de atividade de A13 por mg de ADAMTS13. Em uma modalidade, a formulação de ADAMTS13 estabilizada compreende entre cerca de 100 unidades e cerca de 2000 unidades de atividade de ADAMTS13 por mg de ADAMTS 13.
[00300] Em uma modalidade da formulação de A13 estabilizada com baixa quantidade de sal, a formulação compreende entre cerca de 1,0 mM e cerca de 10,0 mM de cálcio. Em uma modalidade preferida, a formulação contém entre cerca de 2,0 e cerca de 4,0 mM de cálcio.
[00301] Em outra modalidade da formulação de A13 estabilizada com baixa quantidade de sal, a formulação compreende entre cerca de 2% e cerca de 6% de um açúcar e/ou álcool de açúcar. Em uma modalidade preferida, a formulação compreende entre cerca de 3% e cerca de 5% de um açúcar e/ou álcool de açúcar. Em uma modalidade específica, a formulação compreende cerca de 4% de um açúcar e/ou álcool de açúcar. Em uma modalidade, o açúcar e/ou álcool de açúcar é selecionado a partir do grupo consistindo em sacarose, trealose, manitol, e uma combinação dos mesmos. Em uma modalidade preferida, o açúcar e/ou álcool de açúcar é uma mistura de sacarose e manitol.
[00302] Em uma modalidade da formulação de A13 estabilizada com baixa quantidade de sal, a formulação compreende entre cerca de 0,01% e cerca de 0,1% de um tensoativo não iônico. Em uma modalidade preferida, a formulação compreende cerca de 0,05% de um tensoativo não iônico. Em uma modalidade, o tensoativo é selecionado a partir do grupo consistindo em Polissorbato 20, Polissorbato 80, Plurônico F-68, e BRIJ 35. Em uma modalidade preferida, o tensoativo é polissorbato 80.
[00303] Em uma modalidade da formulação de A13 estabilizada com baixa quantidade de sal, a formulação compreende entre cerca de 5 mM e cerca de 100 mM de um agente tamponador. Em uma modalidade preferida, a formulação compreende entre cerca de 10 mM e cerca de 50 mM de um agente tamponador. Em outra modalidade, o agente tamponador é histidina ou HEPES. Em uma modalidade preferida, o agente tamponador é histidina. Em uma modalidade, o pH da formulação está entre cerca de 6,5 e 7,5. Em uma modalidade preferida, o pH da formulação é de 7,0 ± 0,2.
[00304] Em uma modalidade da formulação de A13 estabilizada com baixa quantidade de sal, a formulação compreende ainda entre cerca de 0,5 μM e 20 μM de zinco.
[00305] Em uma modalidade específica, a presente invenção fornece uma formulação de ADAMTS13 (A13) estabilizada com baixa quantidade de sal compreendendo (a) pelo menos 100 unidades de atividade de ADAMTS13 por mg de ADAMTS13, (b) 0 a60 mM de NaCl, (c) 2 mM a 4 mM de cálcio; (d) 2% a 4% de manitol, (e) 0,5% a 2% de sacarose; (f) 0,025% a 0,1% de polissobarto 80, e (g) histidina de 10 mM a 50 mM (pH 7,0 ± 0,2).
[00306] Em uma modalidade, a presente invenção fornece um método para tratar ou prevenir um infarto, o método compreendendo a administração a um sujeito com necessidade do mesmo de uma formulação de ADAMTS13 compreendendo (a) pelo menos 100 unidades de atividade de ADAMTS13 (ou seja, Atividade de FRETS- VWF73) por mg de ADAMTS13, (b) 0 mM a 200 mM de um sal farmaceuticamente aceitável, (c) 0,5 mM a 20 mM de cálcio, (d) um açúcar e/ou álcool de açúcar, (e) um tensoativo não iônico, e (f) um agente tamponador para manter um pH entre 6,0 e 8,0. Em uma modalidade, a formulação de ADAMTS13 estabilizada compreende pelo menos 200 unidades de atividade de A13 por mg de ADAMTS13. Em uma outra modalidade, a formulação de ADAMTS13 estabilizada compreende pelo menos 400 unidades de atividade de A13 por mg de ADAMTS13. Em uma modalidade preferida, a formulação de ADAMTS13 estabilizada compreende pelo menos 600 unidades de atividade de A13 por mg de ADAMTS13. Em uma modalidade mais preferida, a formulação de ADAMTS13 estabilizada compreende pelo menos 800 unidades de atividade de A13 por mg de ADAMTS13. Em ainda outra modalidade preferida, a formulação de ADAMTS13 estabilizada compreende pelo menos 1000 unidades de atividade de A13 por mg de ADAMTS13. Em uma modalidade, a formulação de ADAMTS13 estabilizada compreende entre cerca de 100 unidades e cerca de 2000 unidades de atividade de ADAMTS13 por mg de ADAMTS 13.
[00307] Em uma modalidade da formulação de A13 estabilizada liofilizada, a formulação compreende entre cerca de 1,0 mM e cerca de 10,0 mM de cálcio. Em uma modalidade preferida, a formulação contém entre cerca de 2,0 e cerca de 4,0 mM de cálcio.
[00308] Em outra modalidade da formulação de A13 estabilizada liofilizada, a formulação compreende entre cerca de 2% e cerca de 6% de um açúcar e/ou álcool de açúcar. Em uma modalidade preferida, a formulação compreende entre cerca de 3% e cerca de 5% de um açúcar e/ou álcool de açúcar. Em uma modalidade específica, a formulação compreende cerca de 4% de um açúcar e/ou álcool de açúcar. Em uma modalidade, o açúcar e/ou álcool de açúcar é selecionado a partir do grupo consistindo em sacarose, trealose, manitol, e uma combinação dos mesmos. Em uma modalidade preferida, o açúcar e/ou álcool de açúcar é uma mistura de sacarose e manitol.
[00309] Em uma modalidade da formulação de A13 estabilizada liofilizada, a formulação compreende entre cerca de 0,01% e cerca de 0,1% de um tensoativo não iônico. Em uma modalidade preferida, a formulação compreende cerca de 0,05% de um tensoativo não iônico. Em uma modalidade, o tensoativo é selecionado a partir do grupo consistindo em Polissorbato 20, Polissorbato 80, Plurônico F-68, e BRIJ 35. Em uma modalidade preferida, o tensoativo é Polissorbato 80.
[00310] Em uma modalidade da formulação de A13 estabilizada liofilizada, a formulação compreende entre cerca de 5 mM e cerca de 100 mM de um agente tamponador. Em uma modalidade preferida, a formulação compreende entre cerca de 10 mM e cerca de 50 mM de um agente tamponador. Em outra modalidade, o agente tamponador é histidina ou HEPES. Em uma modalidade preferida, o agente tamponador é histidina. Em uma modalidade, o pH da formulação está entre cerca de 6,5 e 7,5. Em uma modalidade preferida, o pH da formulação é de 7,0 ± 0,2.
[00311] Em uma modalidade da formulação de A13 estabilizada liofilizada, a formulação compreende ainda entre cerca de 0,5 μM e 20 μM de zinco.
[00312] Em uma modalidade específica, a presente invenção fornece uma formulação estabilizada liofilizada de ADAMTS13 (A13), em que a formulação é liofilizada a partir de uma formulação líquida compreendendo (a) pelo menos 100 unidades de atividade de ADAMTS13 por mg de ADAMTS13, (b) NaCl de 0 a 200 mM, (c) 2 mM a 4 mM de cálcio; (d) 2% a 4% de manitol; (e) 0,5% a 2% de sacarose; (f) 0,025% a 0,1% de polissobarto 80, e (g) histidina de 10 mM a 50 mM (pH 7,0 ± 0,2).
[00313] Em uma modalidade, a presente invenção fornece um método para tratar ou prevenir um infarto, o método compreendendo a administração a um sujeito com necessidade do mesmo de uma formulação de ADAMTS13 compreendendo (a) pelo menos 100 unidades de atividade de ADAMTS13 (ou seja, atividade de FRETS-VWF73) por mg de ADAMTS13, (b) 0 mM a 100 mM de um sal farmaceuticamente aceitável, (c) 0,5 mM a 20 mM de cálcio, (d) um açúcar e/ou álcool de açúcar; (e) um tensoativo não iônico, e (f) um agente tamponador para manter um pH entre 6,0 e 8,0. Em uma modalidade, a formulação de ADAMTS13 estabilizada compreende pelo menos 200 unidades de atividade de A13 por mg de ADAMTS13. Em uma outra modalidade, a formulação de ADAMTS13 estabilizada compreende pelo menos 400 unidades de atividade de A13 por mg de ADAMTS13. Em uma modalidade preferida, a formulação de ADAMTS13 estabilizada compreende pelo menos 600 unidades de atividade de A13 por mg de ADAMTS13. Em uma modalidade mais preferida, a formulação de ADAMTS13 estabilizada compreende pelo menos 800 unidades de atividade de A13 por mg de ADAMTS13. Em ainda outra modalidade preferida, a formulação de ADAMTS13 estabilizada compreende pelo menos 1000 unidades de atividade de A13 por mg de ADAMTS13. Em uma modalidade, a formulação de ADAMTS13 estabilizada compreende entre cerca de 100 unidades e cerca de 2000 unidades de atividade de ADAMTS13 por mg de ADAMTS 13.
[00314] Em uma modalidade da formulação de A13 estabilizada liofilizada com baixa quantidade de sal, a formulação compreende entre cerca de 1,0 mM e cerca de 10,0 mM de cálcio. Em uma modalidade preferida, a formulação contém entre cerca de 2,0 e cerca de 4,0 mM de cálcio.
[00315] Em outra modalidade da formulação de A13 estabilizada liofilizada com baixa quantidade de sal, a formulação compreende entre cerca de 2% e cerca de 6% de um açúcar e/ou álcool de açúcar. Em uma modalidade preferida, a formulação compreende entre cerca de 3% e cerca de 5% de um açúcar e/ou álcool de açúcar. Em uma modalidade específica, a formulação compreende cerca de 4% de um açúcar e/ou álcool de açúcar. Em uma modalidade, o açúcar e/ou álcool de açúcar é selecionado a partir do grupo consistindo em sacarose, trealose, manitol, e uma combinação dos mesmos. Em uma modalidade preferida, o açúcar e/ou álcool de açúcar é uma mistura de sacarose e manitol.
[00316] Em uma modalidade da formulação de A13 estabilizada liofilizada com baixa quantidade de sal, a formulação compreende entre cerca de 0,01% e cerca de 0,1% de um tensoativo não iônico. Em uma modalidade preferida, a formulação compreende cerca de 0,05% de um tensoativo não iônico. Em uma modalidade, o tensoativo é selecionado a partir do grupo consistindo em Polissorbato 20, Polissorbato 80, Plurônico F-68, e BRIJ 35. Em uma modalidade preferida, o tensoativo é polissorbato 80.
[00317] Em uma modalidade da formulação de A13 estabilizada liofilizada com baixa quantidade de sal, a formulação compreende entre cerca de 5 mm e cerca de 100 mM de um agente tamponador. Em uma modalidade preferida, a formulação compreende entre cerca de 10 mM e cerca de 50 mM de um agente tamponador. Em outra modalidade, o agente tamponador é histidina ou HEPES. Em uma modalidade preferida, o agente tamponador é histidina. Em uma modalidade, o pH da formulação está entre cerca de 6,5 e 7,5. Em uma modalidade preferida, o pH da formulação é de 7,0 ± 0,2.
[00318] Em uma modalidade da formulação de A13 estabilizada liofilizada com baixa quantidade de sal, a formulação compreende ainda entre cerca de 0,5 μM e 20 μM de zinco.
[00319] Em uma modalidade específica, a presente invenção fornece uma formulação de ADAMTS 13 (A13) estabilizada liofilizada com baixa quantidade de sal, em que a formulação é liofilizada a partir de uma formulação líquida compreendendo (a) pelo menos 100 unidades de atividade de ADAMTS13 por mg de ADAMTS13, (b) 0 a 60 mM NaCl; (c) 2 mm a 4 mM de cálcio; (d) 2% a 4% de manitol; (e) 0,5% a 2% de sacarose; (f) 0,025% a 0,1% de polissobarto 80, e (g ) histidina de 10 mM a 50 mM (pH 7,0 ± 0,2). Kits de ADAMTS13
[00320] Em outro aspecto da invenção, são fornecidos kits para o tratamento de uma doença ou condição associada com disfunção de ADAMTS13 ou VWF. Em uma modalidade, o kit compreende uma formulação de A13 ou rA13, como determinado acima. Em algumas modalidades, os kits fornecidos neste documento podem conter uma ou mais doses de uma formulação líquida ou liofilizada, como fornecidas neste documento. Quando os kits compreendem uma formulação liofilizada de A13 ou rA13, geralmente, os kits também irão conter um líquido adequado para a reconstituição da formulação líquida, por exemplo, água estéril ou uma solução tampão farmaceuticamente aceitável. Em algumas modalidades, os kits podem compreender uma formulação de ADAMTS13 pré-embalada em uma seringa para administração por um profissional de saúde ou para uso doméstico.
[00321] Em uma modalidade, um kit é fornecido compreendendo entre cerca de 10 unidades de Atividade de FRETS-VWF73 e cerca de 10.000 unidades de Atividade de FRETS-VWF73. Em outras modalidades, o kit pode fornecer, por exemplo, entre cerca de 20 unidades de atividade de FRETS- VWF73 (UFV73) e cerca de 8.000 unidades de Atividade de FRETS-VWF73, ou entre cerca de 30 UFV73 e cerca de 6.000 UFV73, ou entre cerca de 40 UFV73 e cerca de 4.000 UFV73, ou entre cerca de 50 UFV73 e cerca de 3.000 UFV73, ou entre cerca de 75 UFV73 e cerca de 2.500 UFV73, ou entre cerca de 100 UFV73 e cerca de 2.000 UFV73, ou entre cerca de 200 UFV73 e cerca de 1.500 UFV73, ou entre cerca de outras faixas nas mesmas. Em certas modalidades, um kit pode fornecer cerca de 10 unidades de atividade de FRETS-VWF73, ou cerca de 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, 900, 1.000, 1.100, 1.200, 1.300, 1.400, 1.500, 1.600, 1.700, 1.800, 1.900, 2.000, 2.100, 2.200, 2.300, 2.400, 2.500, 2.600, 2.700, 2.800, 2.900, 3.000, 3.100, 3.200, 3.300, 3.400, 3.500, 3.600, 3.700, 3.800, 3.900, 4.000, 4.100, 4.200, 4.300, 4.400, 4.500, 4.600, 4.700, 4.800, 4.900, 5.000, 5.100, 5.200, 5.300, 5.400, 5.500, 5.600, 5.700, 5.800, 5.900, 6.000, 6.100, 6.200, 6.300, 6.400, 6.500, 6.600, 6.700, 6.800, 6.900, 7.000, 7.100, 7.200, 7.300, 7.400, 7.500, 7.600, 7.700, 7.800, 7.900, 8.000, 8.100, 8.200, 8.300, 8.400, 8.500, 8.600, 8.700, 8.800, 8.900, 9.000, 9.100, 9.200, 9.300, 9.400, 9.500, 9.600, 9.700, 9.800, 9.900, 10.000 ou mais unidades de Atividade FRETS de -VWF73.
[00322] Em certas modalidades, o kit será para uma administração única ou dose de ADAMTS13. Em outras modalidades, o kit pode conter doses múltiplas de ADAMTS13 para administração. Em uma modalidade, o kit pode compreender uma formulação de ADAMTS13 pré-embalada em uma seringa para administração por um profissional de saúde ou para uso doméstico. Exemplos Exemplo 1: Expressão de ADAMTS13 recombinante (rA13)
[00323] Uma cultura de células de quimiostato da linhagem de células de CHO recombinante #640-2 expressando ADAMTS13 humana foi crescida em meio BACD-A13 definido quimicamente suplementado com zinco e vitamina B3 adicional. A cultura de 10L foi mantida durante 53 dias e a produção de atividade e proteína rA13 foi monitorada ao longo do tempo.
[00324] As células de CHO recombinantes que expressam ADAMTS13 humana foram adaptadas a um meio de propriedade quimicamente definido (médio BCS). Um DWCB foi descongelado e o inóculo de células foi preparado em meio de BCS. Células propagadas do clone de expressão de rA13 # 640-2 foram transferidas para um biorreator de 10L com impulsores de tipo Rushton e cultivadas em culturas de batelada repetida com meio BACD-A13 de propriedade sob um pH controlado em linha 7,15-7,20 a 37°C com uma concentração de oxigênio dissolvido de 20% de saturação do ar. Após 2 culturas de bateladas terem sido crescidas ao volume de trabalho final de 10L, o biorreator foi mudado para meio contínuo de alimentação no dia 5 e operado durante um período adicional de 48 dias em um modo de quimiostato.
[00325] As amostras do sobrenadante dos biorreatores foram tomadas semanalmente e analisadas para a produção de proteína rA13 por ELISA e atividade de rA13 por Ensaio de FRETS-VWF73. As contagens de células foram determinadas por tecnologia Nucleocounter. As taxas de diluição foram medidas e usadas para o cálculo das taxas de crescimento e produtividades volumétricas.
[00326] Sob condições de cultura contínua usando meio BACD-A13 quimicamente definido suplementado com zinco e nicotinamida a uma concentração final de 1,432 mg/L de ZnSO4 7H2O e 7,02 mg/L de nicotinamida, os níveis elevados de produção de proteína rA13, entre 0,9 e 1,3 mg/L/D, e atividades específicas, entre cerca de 800 e 1100 mU/μg de rA13, foram alcançados (Tabela 1). Notavelmente, as produtividades específicas das células e volumétricas aumentaram ao longo do tempo na cultura de longo prazo, provavelmente devido ao aumento do crescimento e das taxas de diluição ao longo do tempo. A atividade específica elevada de rA13 expressa pode ser pelo menos mantida a um nível constantemente elevado durante pelo menos semanas 7 inteiros que a cultura foi crescida sob condições quimiostáticas. Na verdade, a atividade específica de rA13 produzida na cultura aumentou realmente de cerca de 800 mU/μg de A13 na semana 2 a cerca de 1100 mU/μg de A13 na semana 7. Tabela 1. Dados de fermentação para experimento em batelada CP_07/18_M07: hA13 CHO Klon #985/1 985 DWCB#01.
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B. Exemplo 2: Formulação de ADAMTS13 recombinante (rA13) Purificada
[00327] ADAMTS13 recombinante foi expressa em células de CHO recombinantes e purificada por cromatografia de troca aniônica. A rA13 purificada teve uma concentração final de aproximadamente 750 μg/ml com uma atividade específica de aproximadamente 850 mU/μg. A rA13 foi formulada em tampão contendo NaCl 150 mM, 2% de sacarose, 0,05% de polissorbato 80, um pH de 7,0 com 20 mM de um agente tamponador selecionado de (1) histidina, (2) tampão de fosfato, ou (3) citrato de Sódio. As amostras foram então divididas uniformemente e a metade das amostras foi liofilizada.
[00328] As amostras liofilizadas foram reconstituídas com água estéril até um volume final igual ao da formulação pré-liofilizada. Uma alíquota única de cada formulação líquida e liofilizada foi então caracterizada por filtração em gel pelo carregamento da amostra em uma coluna de Superose 6 GL (GE Healthcare). Como pode ser visto na Figura 3, todas as formulações resultaram em amostras ADAMTS13 que foram executadas como um único pico correspondendo à proteína rA13 monomérica por filtração em gel. C. Exemplo 3: Caracterização da retenção de atividade de Formulações de rA13 armazenadas a 4°C e 37°C
[00329] As rA13 amostras formuladas e aliquotadas como no exemplo 2 foram armazenadas a 4 °C ou 37 °C por até 6 meses. As formulações da solução foram analisadas para a concentração de proteína rA13, como determinado por ELISA, e atividade de rA13 por Ensaio de FRETS-VWF73 a 0, 1, 2, 3, 12, e 24 semanas (Figura 1). As amostras liofilizadas foram reconstituídas com água estéril até um volume final igual ao da formulação pré-liofilizada e analisadas de forma semelhante às 0, 2, 4, 8, 12 e 24 semanas (Figura 2).
[00330] As formulações líquidas de rA13 armazenadas a 4°C não apresentaram perda de teor de antígeno, isto é, a concentração de proteína, ou atividade de FRETS-VWF73 em pontos de tempo fora de 6 meses. Como visto na Figura 1, este foi o caso para as três formulações, tamponadas com histidina, fosfato e citrato de sódio, respectivamente. Por outro lado, as formulações líquidas, tamponadas com histidina ou de citrato sódio, apresentaram perda quase completa da atividade após uma semana a 37°C (Figura 1A; ◊ = histidina, □ = citrato de Sódio). Esta perda de atividade foi acompanhada com um pico no teor em antígeno em uma semana para estas amostras, sugerindo que as proteínas rA13 foram se desnaturando. A formulação líquida de histidina de rA13 exibiu teor de antígeno drasticamente reduzido a 3 e 6 meses, sugerindo que a proteína foi sendo degradada. Notavelmente, rA13 líquida formulada com tampão de fosfato mostrou atividade significativa em três semanas, quando armazenada a 37 °C (Figura 1A; o = tampão de fosfato). Consistentemente, o teor de antígeno da presente formulação aumentou a uma taxa mais lenta, sugerindo que a desnaturação de rA13 é retardada quando formulada com tampão de fosfato.
[00331] As formulações liofilizadas de rA13 aparentam ser estáveis durante pelo menos 6 meses, quando armazenadas a 4°C ou 37°C (Figura 2). A rA13 liofilizada formulada com tampão de fosfato exibiu uma perda gradual de atividade (30% em 6 meses), quando armazenada a 37°C, mas não a 4°C, no entanto, esta perda de atividade não foi acompanhada por um aumento na disponibilidade de antígeno por ELISA (Figura 2; o = tampão de fosfato). Nenhuma outra formulação liofilizada mostrou uma perda de atividade ou aumento na disponibilidade de antígeno, quando armazenada a 4°C ou 37°C. D. Exemplo 4: Estabilidade Conformacional de rA13 nas Formulações Armazenadas a 4°C e 37°C
[00332] As amostras de rA13 formuladas e aliquotadas como no exemplo 2 foram armazenadas a 4 °C ou 37 °C por até 6 meses. As conformações globais de rA13 formuladas e armazenadas em solução e os estados de liofilizado foram caracterizados por filtração em gel com os pontos de tempo descritos no exemplo 3. Os resultados dos experimentos de filtração em gel realizados com a rA13 formulada em histidina em 0, 1, 2, 3, e 24 semanas para as formulações líquidas (Figura 4) e 0, 2, 4, 8, 12 e 24 semanas para as formulações liofilizadas (Figura 5) são mostrados.
[00333] As formulações líquidas com histidina, armazenadas a 4°C por até 6 meses, foram executadas principalmente como um monômero ao longo da filtração em gel (Figura 4A), sugerindo que a proteína é muito estável em solução a 4°C. Este resultado é consistente com os descritos no exemplo 3, que mostrou que rA13 formulada com histidina e armazenada em solução a 4°C por até 6 meses não perde a atividade de FRETS-VWF73. Por outro lado, rA13 formulada com histidina e armazenada a 37°C, foi executada como espécies desnaturadas de ordem superior/parcialmente ou totalmente, como indicado pelos volumes de eluição/tempos de retenção reduzidos (Figura 4B). Consistente com os resultados observados no exemplo 3, a A13 formulada com histidina armazenada a 37°C por 6 meses pareceu estar na sua maioria degradada.
[00334] As experiências de filtração em gel foram repetidas para cada formulação, armazenada a 4°C e 37°C, e as áreas relativas sob os picos eluídos foram integradas, a fim de determinar as populações relativas de monômero rA13 (3), dímero rA13 (2), e rA13 agregada/desnaturada (1) nas formulações. Os resultados dos experimentos de filtração em gel realizados sobre as três formulações liofilizadas armazenadas a 4°C e 37°C durante seis meses são dados na Tabela 2. As amostras liofilizadas foram reconstituídas com água estéril até um volume final igual ao da formulação pré-liofilizada antes da análise por meio de filtração em gel. Tabela 2. Área Relativa Sobre a Curva (AUC) para Filtrações em Gel de Formulações de ADAMTS13 Liofilizadas.
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[00335] Consistente com os resultados observados no exemplo 3, as formulações de rA13 liofilizadas não exibiram nenhum aumento na quantidade de espécies de dímero ou agregado/desnaturadas após armazenagem a 4°C durante pelo menos 6 meses. Do mesmo modo, as rA13 formuladas e liofilizadas com histidina ou citrato sódio mostraram níveis apenas pequenos de dimerização, quando armazenadas a 37°C durante pelo menos 6 meses. Além disso, não houve qualquer indicação de que qualquer uma destas formulações resultou em níveis aumentados de agregação e/ou desnaturação. Por outro lado, a rA13 formulada e liofilizada com tampão de fosfato exibiu níveis significativos de dimerização e agregação e/ou desnaturação, quando armazenada a 37°C durante pelo menos 6 meses. E. Exemplo 5: Caracterização Biofísica de formulações de rA13 Armazenadas a 4°C e 37°C
[00336] As amostras de rA13 formuladas e aliquotadas como no exemplo 2 foram armazenadas a 4°C ou 37°C por até 6 meses. Como uma medida da estabilidade conformacional da proteína rA13 formulada como descrito acima, os raios de Stokes foram determinados por espalhamento de luz dinâmico para a solução (A) e liofilizada (B) formulações de rA13 com histidina (Figura 6), tampão de fosfato (Figura 7), e citrato de sódio (Figura 8), em cada um dos pontos de tempo indicados.
[00337] Além disso, as taxas de contagem derivadas para cada formulação líquida, antes da armazenagem foram determinadas por espalhamento de luz dinâmico. Como pode ser visto na Figura 12, existe uma descontinuidade na mudança dos raios de Stokes e, assim, a estabilidade de rA13 acima de cerca de 35°C para as formulações de histidina e citrato de sódio, e acima de cerca de 40°C para a formulação de fosfato. Além disso, embora a formulação de fosfato tenha um raio de Stokes maior do que as formulações de histidina ou citrato de sódio a temperaturas inferiores a cerca de 37°C, a formulação de fosfato parece ser ligeiramente mais estável a temperaturas entre cerca de 40°C e 50°C.
[00338] As amostras liofilizadas formuladas com histidina foram armazenadas a 4°C ou 37°C por 3 meses, e então reconstituídas em água estéril. A fim de caracterizar se as mudanças conformacionais globais ou locais ocorreram ou não na rA13 reconstituída, a espectroscopia de Infravermelho por Transformada de Fourrier foi realizada para as amostras armazenadas a 4°C e 37°C por 3 meses e comparadas com as de A13 recém formuladas e liofilizadas. Como pode ser visto na Figura 9, os espectros de absorvância para todas as três amostras se sobrepõem quase perfeitamente, sugerindo que nenhuma transição conformacional está ocorrendo na rA13 armazenada como uma formulação liofilizada em histidina, a 4°C ou 37°C durante 3 meses.
[00339] As formulações de rA13 armazenadas a 4°C ou 37°C por 6 meses também foram caracterizadas por cromatografia líquida de fase reversa de alto rendimento (rp-HPLC). A rp-HPLC permite a separação de moléculas de proteína estreitamente relacionadas e, assim, em muitos casos, pode diferenciar entre as versões modificadas do mesmo polipeptídeo, por exemplo, com modificado por carga, parcialmente degradado ou parcialmente desdobrado. Como pode ser visto na Figura 10, todas as formulações de rA13 parecem ser estáveis durante pelo menos 6 meses a 4°C, consistente com os vários resultados vistos acima.
[00340] As amostras de rA13 formuladas como no exemplo 2 foram, em seguida, analisadas por calorimetria de varredura diferencial para caracterizar ainda a estabilidade da proteína rA13 nas várias formulações. A natureza bimodal da curva de capacidade de calor gerada na Figura 11 sugere que dois domínios da proteína podem se desdobrar separados um do outro, com a primeira transição de desdobramento ocorrendo a uma temperatura entre cerca de 54°C e 55°C. As temperaturas de desdobramento para rA13 são semelhantes para as várias formulações. No entanto, a entalpia de transição aumentada, como indicado pela área maior abaixo da endoterma, para a formulação de fosfato, e, em menor medida, para a formulação de citrato, sugere formulações de A13 ligeiramente estabilizadas. F. Exemplo 6: Caracterização de Formação de Dímero em Formulações de rA13
[00341] A fim de determinar o efeito de agentes estabilizantes sobre o estado oligomérico de rA13 em solução, a rA13 foi formulada em histidina 20 mM (pH 7,0), NaCl 150 mM, e 0,05% de polissorbato 80 com diferentes combinações de sacarose (0% a 2%), manitol (0% a 3%), e de cálcio (0 mM ou 2 mM). As várias formulações foram analisadas então por filtração em gel sobre uma coluna de Sepharose GL 6 (GE Healthcare). Como visto na Figura 13, várias combinações dos agentes estabilizadores foram capazes de reduzir a quantidade de formação de dímero de A13 de cerca de 50%. As percentagens de agregados, dímeros/oligos, e monômeros para cada formulação é apresentado na Tabela 14. Tabela 14. Formulações Usadas para Determinar o Efeito de Vários Agentes Tamponadores da Formulação de ADAMTS13.
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G. Exemplo 7: Efeito do pH na Estabilidadae das Formulações de ADAMTS13
[00342] A fim de determinar o efeito do pH sobre a estabilidade de rA13 em solução, rA13 foi dialisada em tampão contendo histidina 20 mM e NaCl 150 mM, ajustado a uma faixa de pH de entre 5,5 e 9,5, e armazenada a 4°C ou 40°C durante 24 horas. Estabilidade foi medida por concentração de antígeno de rA13, tal como determinada por ELISA, e a atividade de rA13 por Ensaio de FRETS-VWF73, em 24 horas. Como visto na Tabela 3 e Figura 14, a rADAMTS13 é relativamente estável durante 24 horas a 4°C, quando formulada em uma solução possuindo um pH entre 5,5 e 9,5. Tabela 3. Estabilidade de ADAMTS13 em Formulação Líquida Quando Armazenada a 4°C por 24 horas.
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Tabela 4. Estabilidade de ADAMTS13 em Formulação Líquida Quando Armazenada a 40°C por 24 horas.
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H. Exemplo 8: Efeito de Baixos Níveis de CaCl2 na estabilidade de Formulações de ADAMTS13
[00343] A fim de determinar o efeito de níveis baixos de CaCl2 sobre a estabilidade de rA13 em solução, rA13 foi formulada em tampão contendo NaCl 150 mM, 2% de sacarose, 0,05% de polissorbato 80, e histidina 20 mM em pH 7, 0 com (12B e D) e sem (12A e C) 2 mM de CaCl2. As formulações líquidas foram armazenadas ou a 25 °C ou a 37°C por três Semanas. A estabilidade da formulação foi então avaliada pela determinação da atividade relativa de FRETS-VWF73 em 0, 1, 2 e 3 semanas. Como pode ser visto na Figura 15, a adição de 2 mM de CaCl2 estabilizou as formulações líquidas de rADAMTS13 armazenadas a 25°C e 37 °C, em graus variáveis. Notavelmente, a adição de baixos níveis de CaCl2 às formulações líquidas de rADAMTS13 armazenadas a 25°C conferiram cerca de 95% de estabilidade a atividade de enzima por três semanas, como comparado com uma perda de 80% da atividade observada em formulações sem CaCl2. Exemplo 9: Atividade de FRETS-VWF73 de Espécies Oligoméricas de ADAMTS13 Recombinante
[00344] A fim de determinar a atividade enzimática das diferentes espécies oligoméricas de proteína ADAMTS13 isolada durante a purificação, rA13 foi carregada em uma Coluna de filtração em gel de Superose 6 GL equilibrada com tampão contendo 20 mM de Na2HPO4 (pH 7,5) e 500 mM de NaCl. As espécies moleculares de ADAMTS13 foram então separadas por tamanho e forma. As frações que eluíram a partir da coluna foram reunidas de acordo com o seu estado oligomérico aparente, por exemplo, A13 agregadas (poço 1), A13 diméricas (poço 2), e A13 monoméricas (poço 3) (Figura 16A). Uma confirmação adicional do estado monomérico de ADAMTS13 foi obtida por determinação do raio médio de Stokes da proteína em cada poço por espalhamento de luz dinâmico (Figura 16B).
[00345] A atividade enzimática de cada grupo foi então determinada por Ensaio de FRETS VWF73. Como pode ser visto na Figura 16, a atividade volumétrica das espécies A13 agregadas foi de cerca de 218 mU/ml, a atividade de dimérica A13 foi de cerca de 1,435 U/ml, e da atividade do A13 monomérica foi de cerca de 97.905 U/ml. Após a normalização das atividades para o volume de poço, mais que 99% da atividade total é encontrada no poço de eluição correspondente à proteína monomérica. Quando as atividades são, em seguida, normalizadas para a quantidade total de proteína, pode ser visto que o poço de proteína monomérica tem uma atividade específica mais alta do que o poço de proteína dimérica e o poço de proteína agregada. J. Exemplo 10: Efeito da Concentração de NaCl na Liofilização de Formulações de ADAMTS13
[00346] A fim de determinar o efeito da concentração de NaCl na produção de bolos de liofilizado, ADAMTS13 recombinante foi formulada em tampão contendo 2% de sacarose, 0,05% de polissorbato 80, e histidina 20 mM (pH 7,0) com diferentes quantidades de NaCl (0 a 150 mM). As formulações de ADAMTS13 foram então liofilizadas sob condições padrões e inspecionadas visualmente para a qualidade dos bolos de liofilizado resultantes (Figura 17). Os bolos de liofilizado produzidos de formulações de ADAMTS13 contendo concentrações mais baixas de sal (0 a 60 mM; Figuras 17A-C) tinham estruturas compactas com superfícies lisas, enquanto os bolos de liofilizado produzidos a partir de formulações coam alta quantidade de sal (120 mM e NaCl 150 mM; Figuras 17 E e F) foram porosos e não compactos, com uma aparência tipo corda ou rachada. As formulações de ADAMTS13 contendo níveis intermediários de NaCl (90 mM; Figura 17D) foram parcialmente compactos com uma superfície semiporosa ou tipo cratera.
[00347] Um bolo de liofilizado não compacto, poroso, indica a fusão durante o processo de liofilização. Geralmente, concentrações elevadas de sal são usadas para diminuir a temperatura de colapso (ou temperatura vítrea) que pode resultar na fusão parcial do material congelado durante o processo de secagem primária. Isso pode ter um impacto negativo nos níveis de agregação de proteína e/ou a recuperação da atividade enzimática. Portanto, uma boa aparência do bolo liofilizado geralmente correlaciona-se com uma melhor recuperação de atividade e menor agregação da proteína respectiva formulada. Vantajosamente, a presente invenção fornece formulações de ADAMTS13 que permitam a produção de bolos de liofilizado de alta qualidade. Em certas modalidades, as formulações inventivas fornecidas neste documento permitem formulações de ADAMTS13 com baixa quantidade de sal, que são particularmente estáveis durante a liofilização, resultando na formação de bolos de liofilizado de alta qualidade.
[00348] Uma preocupação com o uso de formulações de proteína com baixa quantidade de sal é que o aumento da agregação de proteína pode ocorrer. Para determinar se este foi o caso para as formulações de ADAMTS13 com baixas quantidades de sal, os bolos de liofilizado produzidos acima foram reconstituídos em água deionizada e os estados de agregação das proteínas ADAMTS13 reconstituídas foram analisados por cromatografia de exclusão por tamanho. Como pode ser visto na Figura 18, a concentração de sal das formulações liofilizadas não teve efeito sobre o estado de agregação da proteína ADAMTS13 reconstituída (comparar 0 mM de NaCl com NaCl 150 mM).
[00349] Para validar adicionalmente o uso de formulações de ADAMTS13 com baixas quantidades de sal, a atividade de FRETS-VWF73 de várias formulações que variam de 0 a NaCl 150 mM foi determinada. Como pode ser visto na Figura 19, a concentração de sal, bem como a concentração de sacarose, das formulações de ADAMTS13 não influenciou a atividade da proteína ADAMTS13 recombinante. Estes resultados sugerem que as formulações de proteínas ADAMTS13 recombinantes líquidas e liofilizadas com baixa quantidade de sal (isto é, 0 a 100 mM de NaCl) são bem adequadas para uso farmacêutico. K. Exemplo 11: Formulação Liofilizada de ADAMTS13 em Tampões com Alta Quantidade de Sal e Baixa Quantidade de Sal
[00350] Para comparar as formulações liofilizadas de ADAMTS13 recombinante, as formulações com alta quantidade de sal (NaCl 150 mM) e baixa quantidade de sal (30 mM de NaCl) foram preparadas. Tanto as formulações com alta quantidade sal quanto com baixa quantidade de sal continham histidina 20 mM (pH 7,0), NaCl 150 mM, 0,05% de polissorbato 80, e 2 mM de CaCl2. A formulação com alta quantidade de sal ainda continha 2% de sacarose e NaCl 150 mM, enquanto que a formulação com baixa quantidade de sal ainda continha 1% de sacarose, 3% de manitol, e 30 mM de NaCl. As duas formulações foram então liofilizadas em condições padrões. O bolo de liofilizado resultante produzido a partir da formulação de ADAMTS13 com alta quantidade de sal foi não compacto, não uniforme, aglomerado, e poroso (Figura 20A), enquanto que o bolo de liofilizado produzido a partir da formulação de ADAMTS13 com baixa quantidade de sal foi compacto, bastante uniforme, e tinha uma superfície lisa (Figura 20B). Estes resultados sugerem que as formulações de ADAMTS13 liofilizada com baixa quantidade de sal são bem adequadas para uso farmacêutico. K. Exemplo 12: Purificação de rADAMTS13 para Formulações Liofilizadas
[00351] ADAMTS13 recombinante foi expressa em células de CHO recombinantes e purificada a partir dos meios condicionados resultantes por cromatografia de troca catiônica POROS HS. As frações recolhidas de rADAMTS13 eluídas da coluna HS foram então analisadas, por cromatografia de exclusão por tamanho usando um Superose 6 GL: coluna TC10/30, para a dimerização e agregação antes e após a filtração em gel, por meio de cromatografia de exclusão por tamanho (Figuras 21A e B, respectivamente) e espalhamento de luz dinâmico (Figuras 22A e B, respectivamente). Como pode ser visto na Figura 21A, quase 20% do total de rADAMTS13 nas frações eluídas de HS antes da filtração em gel, estavam em estados diméricos, monoméricos, ou agregados indesejáveis. Em contraste, quase todas as rADAMTS13 de poço da etapa de filtração em gel são monoméricas (Figura 21B). Do mesmo modo, o raio médio hidrodinâmico da rADAMS13 eluído em HS (cerca de 20,5 nm; Figura 22A) foi quase o dobro das rADAMTS recuperadas após cromatografia de exclusão por tamanho (cerca de 12-13 nm; Figura 22B). M. Exemplo 13: Comparação de Protocolos Padrões e Estendidos para a Liofilização de Formulações de rADAMTS13
[00352] A fim de comparar a liofilização de formulações de rADAMTS13 contendo baixas concentrações de sal variável (30 mM e 60 mM de NaCl), cálcio (2 mM e 4 mM de CaCl2), e açúcar (1% de sacarose e 1% de trealose), rADAMTS13 foi purificada por meio de cromatografia de troca catiônica e cromatografia de exclusão por tamanho, como acima, e formulada em histidina 20 mM, 3% de manitol, 0,05% de polissorbato 80, com todas as oito combinações de sal, cálcio e açúcar dadas acima. Todos os frascos tinham a mesma concentração de ADAMTS13 (190 μg/mL de antígeno). As formulações de rA13 de 1 a 8 (Tabelas 5 e 6) foram então liofilizadas usando um padrão (3 dias; Figura 23A) ou protocolo de liofilização estendido (11 dias, Figura 23B). Após a liofilização, os bolos de liofilizado foram inspecionados visualmente para qualidades desejáveis (Figura 24). Tabela 5. Formulações de rADAMTS13 Liofilizadas Usadas no Protocolo de Liofilização Padrão.
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Tabela 6. Formulações de rADAMTS13 Liofilizadas Usadas em Protocolo de Liofilização Padrão
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[00353] Para determinar o estado de multimérico ADAMTS13 em cada uma das formulações, a proteína liofilizada foi reconstituída em água deionizada e analisada por espalhamento de luz dinâmico. Como pode ser visto na Figura 25, as formulações liofilizadas preparadas por meio de protocolos padrão e de liofilização estendida, produziram moléculas de ADAMTS13 essencialmente monoméricas (pico em cerca de 12-13 nm) após a reconstituição. Embora o pico de ADAMTS13 correspondente à proteína agregada (entre 100 e 110 nm) pareça ser de cerca da metade da altura do pico do monômero, um versado na técnica reconhecerá que o eixo y está medindo a intensidade, ao invés da massa total e, como tal, o gráfico exagera muito o percentual de espécies de ADAMTS13 que estão agregadas. Veja-se também que as formulações preparadas com protocolos de liofilização estendidos (linhas tracejadas) contêm menos ADAMTS13 agregadas do que as formulações preparadas com protocolos padrões de liofilização (linhas contínuas), após reconstituição em água deionizada.
[00354] A fim avaliar a estabilidade de rADAMTS13 liofilizado em cada uma das formulações apresentadas acima, a bolos de liofilizado produzidos pelos protocolos padrões e estendidos foram usados para preparar uma série de frascos para a armazenagem sob várias temperaturas por até 36 meses. Tal como referido na Tabela 7, os frascos contendo 5 mg ou 10 mg de rADAMTS13 liofilizada foram preparados para armazenagem a + 2- +8°C (isto é, sob condições de refrigeração padrão), 30°C (temperatura ambiente), e 40°C. Todos os frascos foram testados por FTIR, SE-HPLC e DLS. A atividade de FRETS e o antígeno ADAMTS13 também foram testados para todas as amostras. As formulações de ADAMTS13 liofilizadas podem então ser testadas para a atividade de FRETS VWF73 e a estabilidade de antígeno, como descrito acima, nos pontos de tempo indicados para determinar a estabilidade da proteína em várias formulações liofilizadas. As Tabelas 8 e 9 fornecem os resultados dos ensaios de atividade de FRETS -VWF73s para as formulações de ADAMTS13 reconstituídas geradas pelos protocolos de liofilização padrão e estendido, respectivamente. Do mesmo modo, a recuperação de antígeno é dada em Tabelas 10 e 11, para as amostras geradas com os protocolos padrão e de liofilização estendida, respectivamente. Tabela 7. Configuração Experimental para Testar a Estabilidade de Formulações de ADAMTS13As Configurações correspondem tanto a Liofilizações tipo A quanto B.
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Tabela 8. Atividade de FRETS-VWF73 em Formulações de ADAMTS13 Liofilizadas Preparadas por Protocolos de Liofilização padrão.
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Tabela 9. Atividade de FRETS-VWF73 em Formulações de ADAMTS13 Preparadas por Protocolos de Liofilização Estendida.
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Tabela 10. Recuperação de antígeno A13 em Formulações de ADAMTS13 Liofilizadas Preparadas por Protocolos de Liofilização Padrão.
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Tabela 11. Recuperação de antígeno A13 em Formulações de ADAMTS13 Liofilizadas Preparadas por Protocolos de Liofilização Estendida.
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[00355] As Tabelas 17 e 18 resumem os resultados de FTIR de diferentes programas de Liofilização (Lyo) para formulações de rADAMTS022-1. Nem o tempo nem a temperatura tiveram uma grande influência em estruturas secundárias. Além disso, o programa lyo não alterou os elementos estruturais, além da diminuição aparente de hélice alfa, a 40°C para o programa padrão A, que não foi observada para o programa lyo B mais longo. Tabela 17. Estrutura Secundária de Formulação de rADAMTS13 Liofilizada 22 -1A Avaliada por FTIR.
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Tabela 18. Estrutura Secundária de Formulação de rADAMTS13 Liofilizada 22 -1B Avaliada por FTIR.
Figure img0016
[00356] O estado oligomérico de ADAMTS13 nas formulações liofilizadas 1A e 1B foi analisado por espalhamento de luz dinâmico ao longo de 6 meses de armazenagem a 4°C, 30°C, e 40°C. Como visto nas Figuras 37 e 38, os níveis mais elevados de agregados foram observados nas amostras preparadas com o programa de liofilização estendida. No entanto, os níveis de agregação não aumentam substancialmente ao longo do tempo de armazenagem.
[00357] Do mesmo modo, a HPLC de exclusão por tamanho não mostra nenhuma alteração importante entre os diferentes programas lyo para formulações de rADAMTS022 após 6 meses (dados não mostrados). A análise demonstra que nenhum agregado foi induzido após armazenagem a 4°C, 30°C, e 40°C ao longo de 3 meses. H. Exemplo 14: Expressão e Purificação de ADAMTS13 Recombinante Humano
[00358] ADAMTS-13 recombinante é gerada por um clone de célula de Ovário de Hamster Chinês (CHO) recombinante em um processo de fermentação em cultura em suspensão. O meio de crescimento, desenvolvido por Baxter é isento de substâncias derivadas de animal ou humano e proteínas recombinantes. Exemplos destes tipos de meios de crescimento úteis para a expressão de ADAMTS13 podem ser encontrados, por exemplo, no Pedido de Patente US N ° de Série 12/847.999. O processo de fabricação usa um método de cultura de células contínuo (quimiostato). O processo de purificação começa com uma etapa de remoção de células inicial por filtração. O produto isento de células de até 4 dias subsequentes é combinado para produzir uma batelada a jusante. As colheitas filtradas de poço são concentradas por uma ultra/diafiltração e, em seguida, submetidas a uma etapa de inativação de vírus detergente solvente. A purificação adicional inclui uma etapa de captura cromatográfica (troca aniônica), uma etapa de nanofiltração (etapa de redução do segundo vírus), uma etapa de cromatografia negativa (hidroxiapatita) seguida por uma cromatografia de modo misto (Capto MMC) e uma etapa de concentração cromatográfica final e de pré-formulação (troca catiônica). A substância droga pré-formulada em larga escala (BDS) é congelada a -60°C em um congelador controlado por temperatura. O. Exemplo 15: Ensaio de FRETS-VWF73 para Atividade de ADAMTS13
[00359] A atividade proteolítica de 13 ADAMTS foi medida contra um substrato de extinção de fluorescência (FRETS-VWF73, Peptides Institute, Inc; Osaka, Japão) de acordo com a descrição de ensaio do fabricante. Resumidamente, as amostras de rADAMTS13 foram diluídas (em 100 μL de volume de total) em tampão contendo 5 mM de Bis-Tris, 25 mM de CaCl2, e 0,005% de Tween20 e transferido em uma placa de microtitulação preta. As amostras foram medidas contra uma curva de referência de amostras de plasma humano diluídas (de 80 para 5 mU/ml de plasma). A reação foi iniciada pela adição do substrato (100 μL, FRETS-VWF73; 2 μM de concentração final) e a fluorescência foi medida a cada dois minutos por 45 minutos em um espectrofotômetro de fluorescência com lex = 360 nm, e lem = 460 a 30°C (FLx800, Bio Tek). Os resultados de atividade foram lidos fora uma curva de referência do plasma humano. Os dados estão expressos como unidades/ml. O plasma humano normal foi considerado como 1 unidade/ml. P. Exemplo 16: Antígeno ADAMTS13 por ELISA
[00360] As amostras contendo ADAMTS13 são analisadas em um ensaio de ELISA usando IgG de coelho policlonal dirigida contra ADAMTS13 humana, tanto como na captura e na sua forma marcada como anticorpo de detecção. O antígeno de ADAMTS13 presente na amostra é capturado pelo anticorpo específico para ADAMTS13 revestido em uma placa de microtitulação de 96 poços. As amostras foram diluídas em tampão (250 mM de Tris, 350 mM de NaCl, 0,5% de BSA, 0,1% de Tween 20) e transferida para os poços de microtitulação revestidos. O antígeno de ADAMTS13 ligado é detectado com IgG anti- ADAMTS13 de coelho conjugada a HRP usando TMB como substrato (Thermo Art: # 34021). A absorbância foi medida em um espectrofotômetro (TECAN SpectraFluorPlus, Tecan Sales Austria, Groding, Áustria) em l = 450 nm. As concentrações de antígeno de ADAMTS13 (expressas em μg/mL) foram calculadas a partir de um padrão de referência usando diluições que variam de 250 a 7,81 ng/mL de ADAMTS13 recombinante que foi purificada a partir de colheitas de cultura de células HEK293 transfectadas estavelmente. Q. Exemplo 17: Análise de ADAMTS13 por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência com Exclusão por Tamanho (SE-HPLC)
[00361] SE-HPLC foi realizada usando um purificador AKTA "série 900" (GE Healthcare). O sistema foi equipado com uma coluna de Superose GL 12 (GE Healthcare, TC10/30) que foi executado com uma taxa de fluxo constante de 0,3 mL por minuto à temperatura ambiente. Como tampão de corrida 20 mM de Tris, 100 mM de acetato de sódio, 500mM de cloreto de sódio, pH 7,4 foram usados. A amostra foi centrifugada (Centrífuga 5415C, Eppendorf, Viena, Áustria) durante 5 min a 10.000 rpm e 100 μL foram aplicados automaticamente por um amostrador automático. A absorvância do efluente da coluna foi medida continuamente a 280 nm. R. Exemplo 18: Análise de ADAMTS13 por Espalhamento de Luz Dinâmico (DLS)
[00362] O espalhamento de luz dinâmico (DLS) foi realizado usando um Malvern Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments Ltd Enigma Business Park, Grovewood Road, Malvern, Worcestershire, Reino Unido. WR14 1XZ) e um Haake RheoStress 1 (Thermo Fisher Scientific, Karlsruhe, Alemanha) equipado com um cone com 60 milímetros de diameter/0,5° de ângulo para medições de viscosidade de tampão.
[00363] Todas as amostras foram centrifugadas (Centrífuga 5415C, Eppendorf, Viena, Áustria) durante 5 min a 10.000 rpm para determinar o diâmetro hidrodinâmico de uma proteína. 60μL de amostra foram introduzidos em uma microcubeta ZEN0040 descartável e a viscosidade da solução tampão foi determinada por RheoStress 1. Este parâmetro é usado para a análise de tamanho efetivo de proteínas por DLS. A temperatura de operação foi de 25°C com um tempo de equilíbrio de 2 minutos. O ângulo de proteínas foi ajustado para 173° de retroespalhamento para medir o tamanho e 3 execuções por amostra foram realizadas para a média dos resultados.
[00364] As amostras foram medidas pelo aumento do modo de temperatura para monitorar a influência da temperatura em uma proteína. O procedimento de medição foi semelhante a uma medida de tamanho normal, exceto para diferentes temperaturas, com um valor crescente de 1 °C/min a partir de 15°C a 80°C e um tempo de equilíbrio de 2 min. Uma cubeta de vidro de baixo volume DTS2145 foi usada para estas rampas de temperatura. S. Exemplo 19: Análise de ADAMTS13 por Espectroscopia de Infravermelho por Transformada de Fourier (FTIR)
[00365] A espectroscopia de infravermelho por transformada de Fourier foi realizada usando o espectroscópio FTIR TENSOR 27 (Bruker Optik GmbH, 76275 Ettlingen, Alemanha) equipado com uma célula BioATR II trabalhando em modo de reflexão total atenuada. Esta configuração do instrumento pode ser usada para analisar a conformação de formulações de proteínas.
[00366] Durante uma temperatura operacional de 20°C, 20 μL de água foram introduzidos para dentro da célula e foram medidos para a varredura de fundo. Depois, 20 μL de tampão foram introduzidos para dentro da célula e medidos contra a varredura de fundo, para subtrair a água do tampão. Este procedimento foi repetido com tampão como varredura de fundo para a medição da amostra (faixa de medição da frequência: 4000-650 cm-1). Um interferograma foi gerado e traduzido em um espectro de transmissão. Diferentes espectros foram corrigidos para o mesmo desvio e foram normalizados para a mesma concentração de proteína. Além disso, a estrutura secundária (% de a-hélice,% de β folhas) da proteína foi calculada pelo software de avaliação (OPUS 6.0/Bruker) que continha uma base de dados de ~ 40 proteínas de estrutura secundária conhecida. T. Exemplo 20: Análise de Fosfoirradiação de Estabilidade de ADAMTS13
[00367] O teste de fotoestabilidade foi realizado usando a Câmara de Fotoestabilidade Atlas Suntest CPS+ (Chicago, Illinois, EUA) de acordo com SOP VN-09-45058TB. Os monitores e controles de irradiância de CPS +, temperatura padrão preto e temperatura de ar da câmara. A Fotoestabilidade foi testada na mesma formulação que foi usada para experimentos de cisalhamento e congelamento-descongelamento (Tabela 12). As amostras e controles foram testados por DLS e SE-HPLC. Os resultados são mostrados na Figura 31 e Figura 32. Ambas as formulações (líquida e liofilizada) mostraram os mesmos resultados por SE-HPLC. O pico de ADAMTS13 monômero diminuiu e o pico de dímero aumentou com o tempo de irradiação. O diâmetro hidrodinâmico de formulação líquida e liofilizada também aumentou ligeiramente com o tempo (Figura 32). A formulação liofilizada irradiada por 10h (como recomendado por ICH Q1B) não mostrou qualquer diferença para o controle protegido de luz. A atividade de FRETS monitorada durante fotoirradiação diminuiu rapidamente no líquido, mas menos nas formulações liofilizadas, como mostrado na Figura 33. Mesmo depois da dose fotoirradiação de quatro vezes a, tal como recomendado pela orientação ICH Q1B que corresponde a 4,8 Mlux horas, mais que 50% da atividade de FRETS permaneceu.
[00368] Os frascos de "controle" foram embrulhados em papel de alumínio para eliminar a exposição à luz e colocados na câmara de fotoestabilidade juntamente com as amostras de ensaio. Todas as amostras foram colocadas horizontalmente. Um tempo de irradiação de 10h correspondeu a 1.2 a 1.8 milhões de lux h, e 765W/m2 de luz UV. As amostras foram retiradas da câmara de fotoestabilidade após 10h e o espectro (190-800nm) e valor de pH foram medidos. U. Exemplo 21: Análise de Estabilidade de ADAMTS13 por Tensão Mecânica
[00369] A tensão de cisalhamento foi aplicada com um Haake Rheostress 1 (Thermo Eletron Karlsruhe GmbH, Karlsruhe, Alemanha) usando um cone com o diâmetro de 60 mm e um ângulo de 0,5°. A temperatura foi ajustada para 25,0 °C.
[00370] Resumidamente, ADAMTS13 recombinante humana, preparada como descrito acima, foi formulada como na Tabela 12. 500μL de amostra de ADAMTS13 por corrida foram aplicados e estressados a 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 500 e 600 rpm por 15 min. Em seguida, a amostra foi transferida para um frasco de Eppendorf. As medições de DLS foram aplicadas para controlar a tensão de cisalhamento potencial induziu desdobramento ou agregação parcial. Como mostrado na Figura 28, os agregados foram formados com uma tensão de cisalhamento de 200 rpm. Tabela 12. Formulação Usada por Análise de Tensão Mecânica de Estabilidade de ADAMTS13.
Figure img0017
V. Exemplo 22: Efeitos de Vários Agentes Tamponadores sobre Formulações ADAMT13
[00371] Para determinar o efeito que vários tampões tiveram sobre a estabilidade e conformação de formulações de ADAMTS13, a ADAMTS13 recombinante humana, expressa e purificada como descrito acima, foi dialisada contra diferentes tampões (Tabela 13) e analisada por espalhamento de luz dinâmico (DLS) para identificar preferências de tampão básicas de ADAMTS13. Como pode ser visto na Figura 27, os diâmetros hidrodinâmicos menores de ADAMTS13 foram encontrados quando a proteína foi formulada em tampão quer de histidina ou de HEPES. Tabela 13. Formulações Usadas Para Determinar o Efeito de Vários Agentes Tamponadores da Formulação de ADAMTS13.
Figure img0018
*Todas as formulações continham 2% de sacarose e 0,05% de polissorbato 80. W. Exemplo 23: Análise de Estabilidade de ADAMTS13 de Congelamento e Descongelamento
[00372] A mesma formulação (Tabela 12) como usada para os experimentos de tensão de cisalhamento foi novamente usada para investigar o comportamento da proteína durante o estresse de congelamento - descongelamento. Duas condições de congelamento-descongelamento -20 °C/Temperatura Ambiente (RT) e -80 °C/37°C foram escolhidas. A Figura 29 resume os resultados de medições de atividade de FRETS. Todas as amostras são estáveis dentro da faixa de variação do ensaio (25% de desvio padrão relativo). Nenhuma perda de atividade de FRETS foi vista mesmo após um ciclo de congelamento-descongelamento de 5 vezes. A estabilidade de BAX930 nesta formulação líquida é confirmada pelos resultados de medições de DLS e SE-HPLC. Nenhum aumento na intensidade dos picos de agregação (entre 100 e 1000 nm) por DLS foi observado independente das condições de congelamento-descongelamento (Figura 30). Da mesma forma, SE-HPLC não mostrou um aumento do nível de agregação após ciclos de congelamento e descongelamento repetidos a -80°C /+37°C, mas mostrou algum aumento a - 20°C/ RT (dados não mostrados). X. Exemplo 24: Efeito de Cálcio e Zinco sobre a Atividade de FRETS de ADAMTS13
[00373] ADAMTS13 recombinante humana, preparado como descrito acima, foi tratada com 10 mM de EDTA e, em seguida, dialisada contra tampão contendo histidina 20 mM e 190 mM de NaCl (pH 7,5). Após a diálise, CaCl2 e ZnCl2 foram adicionados de volta para as formulações em diferentes concentrações. A atividade das formulações de ADAMTS13 contendo diferentes concentrações de cálcio e de zinco foi então testada para a atividade FRET como descrito acima. Como pode ser visto na Figura 34, os níveis crescentes de cálcio aumentaram a recuperação da atividade de FRETS. A atividade quase máxima foi conseguida com a inclusão de 4 mM de CaCl2, tanto na presença quanto na ausência de zinco. Em concentrações intermediários de cálcio (2 mM e 4 mM), a adição de zinco forneceu um aumento modesto na atividade de FRETS. Y. Exemplo 25: Influência da Concentração de Sal e Açúcar na Agregação em Formulações de ADAMTS13 Liofilizadas
[00374] Para investigar o efeito que as concentrações de sal e açúcar têm em formulações de ADAMTS13 liofilizadas, o estado oligomérico de várias formulações liofilizadas foi determinado após a reconstituição com água deionizada. Resumidamente, ADAMTS13 recombinante humana foi produzida como descrito acima. As amostras de proteína foram formuladas com histidina 20 mM (pH 7,0), 2 mM de cloreto de cálcio, e 0,05% de polissorbato 80 com o cloreto de sódio e os níveis de sacarose dados na Tabela 15. As formulações foram depois liofilizadas como descrito acima, e reconstituídas com água deionizada. As características oligoméricas foram então determinadas por análise de SE-HPLC, os resultados dos quais são mostrados na Tabela 15 e na Figura 35. Como pode ser observado em formulações contendo baixas concentrações de açúcar, os níveis elevados de sal (150 mM) aumentam a agregação de ADAMTS13 e reduzem o teor monomérico da formulação. Tabela 15. Influência da Concentração de sal e Açúcar na Agregação em Formulações de ADAMTS13 Liofilizadas Medidas Por Área de Pico de SE-HPLC.
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[00375] A mesma formulação apresentada na Tabela 15 foi então usada para avaliar a qualidade de bolo de liofilizado produzido após liofilização de formulações de ADAMTS13. Tal como resumido na Tabela 16, e mostrado na Figura 36, a presença de altas concentrações de cloreto de sódio (150 mM) não resultou em nenhum bolo de liofilizado. Inversamente, o os melhores bolos de liofilizado foram obtidos com formulações contendo entre 0 mM e 60 mM de cloreto de sódio na presença de 2% de sacarose. Tabela 16. Qualidade do Bolo de Liofilizado Produzido para Várias Formulações de ADAMTS13 Recombinante Humana.
Figure img0020
Z. Exemplo 26: Teste de Tensão de Temperature de Longo Prazo
[00376] Para caracterizar adicionalmente a estabilidade de formulações liofilizadas de ADAMTS13, um segundo teste de tensão de longo prazo foi iniciado. Para este teste, ADAMTS13 recombinante humana foi formulada em três concentrações de proteína final de acordo com a Tabela 19. Um segundo açúcar (manitol) foi incluído na formulação na medida em que foi verificado estabilizar a proteína durante a liofilização, e forneceu um bolo de liofilizado compacto com uma superfície lisa. Todas as amostras de teste de tensão foram caracterizadas por DLS (Figura 39), SE-HPLC (Tabela 20), e FTIR. A atividade FRETS (Tabela 21) e antígeno A13 por ELISA (Tabela 22) foram também medidas ao longo do tempo para todas as formulações. Tabela 19. Formulações de rADAMTS13 com tampão His Para o Teste de Tensão (rADAMTS025)
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Tabela 20. Influência de Concentração Elevada de ADAMTS13 sobre o Nível de Agregado como Determinado por SE-HPLC (rADAMTS025).
Figure img0022
Tabela 21. Atividade de FRETS-VWF73 em Formulações de ADAMTS13 Liofilizadas.
Figure img0023
Tabela 22. Recuperação de Antígeno de A13 em Formulações de ADAMTS13 Liofilizadas.
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[00377] Entende-se que os exemplos e as modalidades descritas neste documento são apenas para fins ilustrativos e que várias modificações ou alterações à luz dos mesmos serão sugeridas por pessoas versadas na técnica e devem ser incluídas dentro do espírito e alcance do presente pedido e escopo das reivindicações anexas. Todas as publicações, patentes, e pedidos de patente citados neste documento são incorporados aqui por referência na sua totalidade para todos os propósitos.

Claims (23)

1. Formulação de ADAMTS13 estabilizada, caracterizada pelo fato de que compreende: (a) 0,05 mg/ml a 10,0 mg/ml de ADAMTS13; (b) menos de 100 mM de um sal farmaceuticamente aceitável; (c) cálcio de 0,5 mM a 20 mM; (d) um açúcar e/ou álcool de açúcar; (e) um tensoativo não iônico; (f) um agente tamponador; e (g) um pH entre 6,0 e 8,0.
2. Formulação estabilizada de ADAMTS13, caracterizada pelo fato de que compreende: (a) pelo menos 100 unidades de atividade de ADAMTS13 por mg de ADAMTS13; (b) menos de 100 mM de um sal farmaceuticamente aceitável; (c) cálcio 0,5 mM a 20 mM; (d) um açúcar e/ou álcool de açúcar; (e) um tensoativo não iônico; e um agente tamponador para manter um pH entre 6,0 e 8,0.
3. Formulação de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que a formulação compreende entre 50 unidades e 1000 unidades de atividade de ADAMTS13 por ml.
4. Formulação de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que o sal é cloreto de sódio ou cloreto de potássio.
5. Formulação de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo fato de que compreende (a) entre 1,0 mM e 10,0 mM de cálcio; ou (b) entre 2,0 mM e 4,0 mM de cálcio.
6. Formulação de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada pelo fato de que compreende entre 2% e 6% de um açúcar e/ou álcool de açúcar.
7. Formulação de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada pelo fato de que o açúcar e/ou álcool de açúcar é selecionado do grupo consistindo em sacarose, trealose, manitol e uma combinação dos mesmos.
8. Formulação de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que o açúcar e/ou álcool de açúcar compreende sacarose e manitol.
9. Formulação de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizada pelo fato de que o agente tamponador é histidina ou HEPES.
10. Formulação de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizada pelo fato de que o pH da formulação é de 7,0 ± 0,2.
11. Formulação de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizada pelo fato de que compreende: (a) 0,05 mg/ml a 10,0 mg/ml de ADAMTS13; (b) NaCl de 0 mM a 60 mM; (c) cálcio de 2 mM a 4 mM; (d) 2% a 4% de manitol; (e) 0,5% a 2% de sacarose; (f) 0,025% a 0,1% de Polissorbato 80; e (g) histidina de 10 mM a 50 mM (pH 7,0 ± 0,2).
12. Formulação de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizada pelo fato de que compreende: (a) pelo menos 100 unidades de atividade de ADAMTS13 por mg de ADAMTS13, (b) NaCl de 0 mM a 60 mM; (c) cálcio de 2 mM a 4 mM; (d) 2% a 4% de manitol; (e) 0,5% a 2% de sacarose; (f) 0,025% a 0,1% de Polissorbato 80; e (g) histidina de 10 mM a 50 mM (pH 7,0 ± 0,2).
13. Formulação de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizada pelo fato de que compreende zinco entre 0,5 μM e 20 μM.
14. Formulação de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizada pelo fato de que a ADAMTS13 é estável a 4°C por pelo menos 6 meses, em que: (a) a formulação mantém pelo menos 90% da atividade de ADAMTS13 após armazenagem a 4°C por pelo menos 6 meses; (b) a formulação mantém pelo menos 95% da atividade de ADAMTS13 após armazenagem a 4°C por pelo menos 6 meses; ou (c) a formulação mantém pelo menos 98% da atividade de ADAMTS13 após armazenagem a 4°C por pelo menos 6 meses.
15. Formulação liofilizada de ADAMTS13, caracterizada pelo fato de que a formulação é liofilizada de uma formulação líquida como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 14.
16. Formulação de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, caracterizada pelo fato de que (a) a atividade específica da proteína de ADAMTS13 é pelo menos 600 U de atividade FRETS-VWF73 por mg de proteína de ADAMTS13; (b) a atividade específica da proteína de ADAMTS13 é pelo menos 800 U de atividade FRETS-VWF73 por mg de proteína de ADAMTS13; ou (c) a atividade específica da proteína de ADAMTS13 é pelo menos 1000U de atividade FRETS-VWF73 por mg de proteína de ADAMTS13.
17. Formulação de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16, caracterizada pelo fato de que a proteína de ADAMTS13 é ADAMTS13 humana.
18. Formulação de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 17, caracterizada pelo fato de que a proteína ADAMTS13 humana é ADAMTS13 recombinante.
19. Método para fabricar uma formulação de ADAMTS13 estabilizada, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: (a) expressar uma proteína de ADAMTS13 ou um derivado biologicamente ativo da mesma em uma célula cultivada num meio compreendendo zinco em uma concentração de 2 μM a 12 μM e cálcio em uma concentração de 0,5 mM a 1,5 mM; (b) purificar a proteína de ADAMTS13; e (c) preparar uma formulação como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 18.
20. Kit, caracterizado pelo fato de que compreende uma formulação de ADAMTS13 estabilizada como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 18.
21. Uso de ADAMTS13, caracterizado pelo fato de ser para manufatura de um medicamento como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 18 para tratar ou prevenir uma doença ou condição associada com uma disfunção de ADAMTS13 ou VWF.
22. Uso de ADAMTS13, caracterizado pelo fato de ser para manufatura de um medicamento como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 18 para tratar ou prevenir uma doença ou condição associada com a formação e/ou presença de um trombo.
23. Uso de ADAMTS13, caracterizado pelo fato de ser para manufatura de um medicamento como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 18 para tratar ou prevenir um enfarte.
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Families Citing this family (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2745805C (en) 2008-12-05 2021-01-19 Baxter International Inc. Methods of measuring adamts13-mediated in vivo cleavage of von willebrand factor and uses thereof
KR20190137954A (ko) * 2009-09-21 2019-12-11 박스알타 인코퍼레이티드 안정화된 액체 및 동결건조된 ａｄａｍｔｓ13 제제
ES2652136T3 (es) * 2012-02-16 2018-01-31 Atyr Pharma, Inc. Histidil-tRNA sintetasas para tratar enfermedades autoinmunitarias e inflamatorias
CN103566362B (zh) * 2012-07-21 2015-07-29 复旦大学 重组adamts13在制备脑出血药物中的用途
WO2014075033A2 (en) 2012-11-09 2014-05-15 Puget Sound Blood Center Protein stabilizing factors
EP2970921B1 (en) 2013-03-15 2018-09-19 aTyr Pharma, Inc. Histidyl-trna synthetase-fc conjugates
AU2013203062C1 (en) 2013-03-15 2018-06-28 Takeda Pharmaceutical Company Limited Subcutaneous administration of adamts13
US20170209582A1 (en) * 2014-06-26 2017-07-27 Amgen Inc. Protein formulations
GB201510870D0 (en) * 2015-05-26 2015-08-05 Baxalta Inc And Katholieke Universiteit Leuven And Baxalta Gmbh Treatment of infarction
EP3988938B1 (en) 2016-01-08 2024-06-12 Kyoto University Medicine comprising adamts13 as main ingredient
EP3493830A1 (en) 2016-08-04 2019-06-12 Baxalta Incorporated Use of adamts13 for treating, ameliorating and/or preventing vaso-occlusive crisis in sickle cell disease, acute lung injury and/or acute respiratory distress syndrome
US11583563B2 (en) 2016-11-04 2023-02-21 Takeda Pharmaceutical Company Limited Adeno-associated virus formulations
WO2018195338A1 (en) 2017-04-20 2018-10-25 Atyr Pharma, Inc. Compositions and methods for treating lung inflammation
CA3070016A1 (en) * 2017-07-25 2019-01-31 Jiangsu Hengrui Medicine Co., Ltd. Il-15 protein complex pharmaceutical composition and uses thereof
BR112021000327A2 (pt) * 2018-07-11 2021-04-06 Baxalta Incorporated Composições de aav
CN115836126A (zh) 2020-04-02 2023-03-21 武田药品工业株式会社 Adamts13变体、组合物及其用途
CN115835904A (zh) 2020-05-22 2023-03-21 武田药品工业有限公司 用于治疗和诊断冠状病毒疾病并发症的adamts13组合物和方法
WO2023170680A1 (en) 2022-03-08 2023-09-14 Equashield Medical Ltd Fluid transfer station in a robotic pharmaceutical preparation system
WO2024151093A1 (ko) * 2023-01-11 2024-07-18 주식회사 녹십자 혈전성 질환의 예방 또는 치료를 위한 신규한 액상 제형물

Family Cites Families (24)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4797368A (en) 1985-03-15 1989-01-10 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Adeno-associated virus as eukaryotic expression vector
US5139941A (en) 1985-10-31 1992-08-18 University Of Florida Research Foundation, Inc. AAV transduction vectors
US5250421A (en) 1986-01-03 1993-10-05 Genetics Institute, Inc. Method for producing factor VIII:C-type proteins
US6013516A (en) 1995-10-06 2000-01-11 The Salk Institute For Biological Studies Vector and method of use for nucleic acid delivery to non-dividing cells
US5804420A (en) 1997-04-18 1998-09-08 Bayer Corporation Preparation of recombinant Factor VIII in a protein free medium
AT407255B (de) 1997-06-20 2001-02-26 Immuno Ag Rekombinanter zellklon mit erhöhter stabilität in serum- und proteinfreiem medium und verfahren zur gewinnung des stabilen zellklons
US6475725B1 (en) 1997-06-20 2002-11-05 Baxter Aktiengesellschaft Recombinant cell clones having increased stability and methods of making and using the same
US5994136A (en) 1997-12-12 1999-11-30 Cell Genesys, Inc. Method and means for producing high titer, safe, recombinant lentivirus vectors
EP1154796B1 (en) 1999-02-22 2007-06-20 University of Connecticut Novel albumin-free factor viii formulations
JP2001227510A (ja) 2000-02-15 2001-08-24 Tomoe Tech Res Co 複作動型の空気式アクチュエータ
JP3783507B2 (ja) 2000-02-16 2006-06-07 日本精工株式会社 トロイダル型無段変速機用ディスクの加工方法
US6926894B2 (en) 2000-11-22 2005-08-09 Baxter Aktiengesellschaft Composition exhibiting a von willebrand factor (vWF) protease activity comprising a polypeptide chain with the amino acid sequence AAGGILHLELLV
JP2003284570A (ja) 2001-04-25 2003-10-07 Chemo Sero Therapeut Res Inst フォンビルブラント因子（ｖＷＦ）切断酵素
WO2003016492A2 (en) * 2001-08-16 2003-02-27 The Regents Of The University Of Michigan Adamts13 genes and proteins and variants, and uses thereof
ITPR20010055A1 (it) 2001-08-31 2003-03-03 Vetroarredo Spa Procedimento e impianto per la realizzazione di mattoni in vetro.
KR100472006B1 (ko) 2002-10-09 2005-03-10 동부아남반도체 주식회사 모스 트랜지스터 제조 방법
WO2005008241A1 (en) * 2003-07-07 2005-01-27 University Of North Carolina At Chapel Hill Method and system for detection of von willebrand factor (vwf) multimers
GB0404693D0 (en) * 2004-03-02 2004-04-07 Univ London Pharmaceutical preparations for the treatment of ocular surface and other disorders
US20060094104A1 (en) 2004-10-29 2006-05-04 Leopold Grillberger Animal protein-free media for cultivation of cells
ATE544866T1 (de) * 2005-06-17 2012-02-15 Baxter Int Adamts13-haltige zusammensetzungen mit thrombolytischer wirkung
JP4880997B2 (ja) * 2005-12-28 2012-02-22 アルフレッサファーマ株式会社 Ａｄａｍｔｓ１３の安定化方法
ES2474573T3 (es) 2006-01-04 2014-07-09 Baxter International Inc Medio de cultivo celular sin oligop�ptidos
KR20190137954A (ko) * 2009-09-21 2019-12-11 박스알타 인코퍼레이티드 안정화된 액체 및 동결건조된 ａｄａｍｔｓ13 제제
US8823352B2 (en) 2011-07-11 2014-09-02 Linear Technology Corporation Switching power supply having separate AC and DC current sensing paths

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