CN115836126A - Adamts13变体、组合物及其用途 - Google Patents

Adamts13变体、组合物及其用途 Download PDF

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Abstract

本发明涉及ADAMTS13变体，以及施用ADAMTS13变体以治疗与ADAMTS13和VWF功能障碍相关的疾病或病况的方法。

Description

ADAMTS13变体、组合物及其用途
相关申请的交叉引用
本申请要求2020年4月2日提交的美国第63/004,389号临时申请的优先权，其公开内容通过引用整体并入本文。
背景技术
ADAMTS(A Disintegrin-like And Metalloprotease with Thrombospondintype Imotif)蛋白是一种金属蛋白酶家族，其包含多个保守结构域，包括一个锌依赖的催化结构域、一个富含半胱氨酸的结构域、一个去整合蛋白样结构域和至少一个(在大多数情况下为多个)血小板反应蛋白I型重复(关于综述，参见Nicholson等，BMC Evol Biol，2005年2月4日，5(1):11，其通过引用整体并入本文用于所有目的)。这些蛋白在进化上与金属蛋白酶的ADAM和MMP家族有关(Jones G C，Curr Pharm Biotechnol，2006年2月，7(1):25-31，其通过引用整体并入本文用于所有目的)，是与多种疾病和病况有关的分泌酶，包括血栓性血小板减少性紫癜(TTP)(Moake J L，Semin Hematol，2004年1月，41(1):4-14，其通过引用整体并入本文用于所有目的)、结缔组织疾病、癌症、炎症(Nicholson等)和严重恶性疟原虫疟疾(Larkin等，PloS Pathog，2009年3月，5(3):e1000349，其通过引用整体并入本文用于所有目的)。由于这些联系，ADAMTS酶被认为是多种病症的潜在治疗靶标(Jones G C，CurrPharm Biotechnol，2006年2月，7(1):25-31，其通过引用整体并入本文用于所有目的)。
ADAMTS13(一种ADAMTS家族成员)在成熟vWF亚基A2中心结构域的Tyr842-Met843键(即vWF UniProt Id P04275中的Tyr1605-Met1606，其通过引用整体并入本文用于所有目的)处切割冯·威勒布兰德因子(vWF)，并需要锌或钙来活化(Dent J A等，Proc Natl AcadSci USA，1990年，87:6306-6310，其通过引用整体并入本文用于所有目的)。巨核细胞和内皮细胞中合成的vWF作为超大型vWF(UL-vWF)分别储存在血小板颗粒和韦伯-帕拉德小体中(Moake J L等，N Engl J Med 1982，307:1432-1435；Wagner D D等，J Cell Biol 1982，95:355-360；Wagner D D等，Mayo Clin Proc 1991，66:621-627；Sporn LA等，Blood 1987，69:1531-1534；Tsai H M等，Biochem Biophys Res Commun 1989，158:980-985；Tsai H M等，Blood 1989，73:2074-2076，其各自通过引用整体并入本文用于所有目的)。一旦从内皮细胞分泌出来，这些UL-vWF多聚体在循环中被ADAMTS13在vWF分子内的特定切割位点处切割成一系列更小的多聚体(Tsai H M等，Biochem Biophys Res Commun 1989，158:980-985；Dent J A等，J Clin Invest 1991，88:774-782；Furlan M等，Proc Natl Acad SciUSA 1993，90:7503-7507，其各自通过引用整体并入本文用于所有目的)。
ADAMTS13活性丧失或vWF水平增加与多种病况有关，例如TTP(Moake JL，SeminHematol，2004年1月，41(1):4-14)、急性和慢性炎症(Chauhan等，J exp Med，2008年9月1日，205(9):2065-74)、严重恶性疟原虫疟疾(Larkin等，PloS Pathog，2009年3月，5(3):e1000349)、镰状细胞疾病(SCD)相关的急性血管闭塞性事件、急性肺损伤、心血管疾病(Sonneveld等，Arterioscler Thromb Vasc Biol 2016，DOI:10.1161/ATVBAHA.116.308225)和缺血性中风(Sonneveld等，2016)，本段中的出版物各自通过引用整体并入本文用于所有目的。
ADAMTS13蛋白酶是一种主要由肝脏产生的190kDa糖基化蛋白(Levy G G等，Nature 2001，413:488-494；Fujikawa K等，Blood 2001，98:1662-1666；Zheng X等，J BiolChem 2001，276:41059-41063；Soejima K等，J Biochem(东京)2001，130:475-480；Gerritsen H E等，Blood 2001，98:1654-1661，其各自通过引用整体并入本文用于所有目的)。ADAMTS13被表达为具有N末端前肽的前体。如图4所示，成熟ADAMTS13包含一个金属蛋白酶(M)结构域、一个去整合蛋白样(D)结构域、一个血小板反应蛋白1型(T)重复、一个富含半胱氨酸(C)结构域和一个间隔(S)结构域，然后是七个连续的TSP1重复(T2至T8)和两个CUB结构域。已经报道了ADAMTS家族蛋白的不同结构域的结构信息，包括人ADAMTS13 DTCS的结构(残基287至685)(Akiyama M.、Takeda S.、Kokame K.、Takagi J.和Miyata T.，Crystal structures of the noncatalytic domains of ADAMTS13 reveal multiplediscontinuous exosites for von Willebrand factor，Proceedings of the NationalAcademy of Sciences 2009，106:19274-19279，其通过引用整体并入本文用于所有目的)。结构分析表明，ADAMTS家族成员共享MDTCS结构域的序列保守性和结构相似性(Akiyama等，2009年，同上；Mosyak L.、Georgiadis K.、Shane T.、Svenson K.等，Crystal structuresof the two major aggrecan degrading enzymes ADAMTS4 and ADAMTS5，ProteinScience 2008，17:16-21，其各自通过引用整体并入本文用于所有目的)。ADAMTS13的VWF蛋白水解活性高度依赖于二价阳离子，这在该ADAMTS家族的其他金属蛋白酶结构域中也观察到(Zheng等，2001年，同上；Gardner M.D.、Chion C.K.、de Groot R.、Shah A.、CrawleyJ.T.等，A functional calcium-binding site in the metalloprotease domain ofADAMTS13，Blood 2009，113:1149-1157，其通过引用整体并入本文用于所有目的)。此外，ADAMTS13的活性通过与VWF结合以及N末端MDTCS和C末端CUB结构域之间的相互作用进行变构调节(Muia J.、Zhu J.、Gupta G.、Haberichter S.L.、Friedman K.D.等，Allostericactivation of ADAMTS13 by von Willebrand factor，Proceedings of the NationalAcademy of Sciences 2014，111:18584-18589；South K.、Luken B.M.、Crawley J.T.B.、Phillips R.、Thomas M.等，Conformational activation of ADAMTS13，Proceedings ofthe National Academy of Sciences 2014，111:18578-18583，其各自通过引用整体并入本文用于所有目的)。
本文描述了ADAMTS13的变体，包括ADAMTS13的变体在治疗与ADAMTS13和VWF功能障碍相关的疾病或病况的组合物和方法中的用途。
发明内容
本公开涉及ADAMTS13的变体。本公开还涉及药物组合物和/或ADAMTS13变体用于制备药物的用途。本公开还涉及用ADAMTS13变体治疗、改善和/或预防与ADAMTS13缺陷、高vWF水平和/或高vWF抗原水平有关的疾病或病症的方法。本公开中还提供了其他相关方面。
在某些实施方式中，本公开提供了ADAMTS13的变体。在某些实施方式中，ADAMTS13变体包含相比于(即相对于)ADAMTS13蛋白氨基酸(例如SEQ ID NO：1)的至少一个氨基酸替代。在某些实施方式中，单个氨基酸替代是在ADAMTS13的催化结构域内(例如SEQ ID NO：1的氨基酸80至286)。在某些实施方式中，单个氨基酸替代是SEQ ID NO：1中所示的I79M、V88M、H96D、Q97R、R102C、S119F、I178T、R193W、T196I、S203P、L232Q、H234Q、D235H、A250V、S263C和/或R268P中的至少一种，或ADAMTS13中的等价氨基酸位置的单个氨基酸替代。在某些实施方式中，单个氨基酸替代不是SEQ IDNO：1中所示的I79M、V88M、H96D、R102C、S119F、I178T、R193W、T196I、S203P、L232Q、H234Q、D235H、A250V、S263C和/或R268P，或ADAMTS13中的等价氨基酸位置的单个氨基酸替代。在某些实施方式中，ADAMTS13变体包含SEQ ID NO：1中所示的Q97处或ADAMTS13中的等价氨基酸处的单个氨基酸替代。在某些实施方式中，氨基酸从Q变为D、E、K、H、L、N、P或R。在某些实施方式中，氨基酸从Q变为R。在某些实施方式中，ADAMTS13变体为ADAMTS13 Q97R(SEQID NO：2)或与其具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。
在某些实施方式中，本公开提供了包含至少一种ADAMTS13变体的药物组合物。在某些实施方式中，本公开提供了包含至少一种ADAMTS13变体和药学上可接受的载体或赋形剂的药物组合物。在某些实施方式中，药物组合物包含至少一种ADAMTS13变体和至少一种ADAMTS13蛋白(例如野生型)的组合。在某些实施方式中，药物组合物包含至少一种ADAMTS13变体、至少一种ADAMTS13蛋白(例如野生型)和药学上可接受的载体或赋形剂的组合。在某些实施方式中，ADAMTS13变体与野生型ADAMTS13(例如SEQ ID NO：1)的比率为约4：1至约1：4。在某些实施方式中，ADAMTS13变体与ADAMTS13野生型的比率为约3：1。在某些实施方式中，ADAMTS13变体与ADAMTS13野生型的比率为约2：1。在某些实施方式中，ADAMTS13变体与ADAMTS13野生型的比率为约1：1。在某些实施方式中，ADAMTS13变体与ADAMTS13野生型的比率为约1：2。在某些实施方式中，ADAMTS13变体与ADAMTS13野生型的比率为约2：3。在某些实施方式中，ADAMTS13变体与ADAMTS13野生型的比率为约3：2。在某些实施方式中，ADAMTS13变体包含SEQ ID NO：1中所示的Q97处或ADAMTS13中的等价氨基酸位置的单个氨基酸替代。在某些实施方式中，ADAMTS13变体为ADAMTS13Q97R(SEQ ID NO：2)或与其具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。在某些实施方式中，野生型ADAMTS13为人ADAMTS13或其生物活性衍生物或片段，如US专利申请公开号2011/0229455(其通过引用并入本文用于所有目的)中所述。在一个实施方式中，hADAMTS13的氨基酸序列为GenBank登录号NP_620594的序列。在某些实施方式中，hADAMTS13为SEQ ID NO：1。
在某些实施方式中，药物组合物包含至少一种ADAMTS13变体和至少一种ADAMTS13蛋白(例如野生型)的组合。在某些实施方式中，药物组合物包含至少一种ADAMTS13变体、至少一种ADAMTS13蛋白(例如野生型)和药学上可接受的载体或赋形剂的组合。在某些实施方式中，ADAMTS13变体构成组合物中所有ADAMTS13蛋白和变体总量的约52％至约72％或约47％至约84％。在某些实施方式中，ADAMTS13变体包含SEQ ID NO：1中所示的Q97处或ADAMTS13中的等价氨基酸位置的单个氨基酸替代。在某些实施方式中，ADAMTS13变体为ADAMTS13 Q97R(SEQ ID NO：2)或与其具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。在某些实施方式中，野生型ADAMTS13为人ADAMTS13或其生物活性衍生物或片段，如US专利申请公开号2011/0229455(其通过引用并入本文用于所有目的)中所述。在一个实施方式中，hADAMTS13的氨基酸序列为GenBank登录号NP_620594的序列。在某些实施方式中，hADAMTS13为SEQ IDNO：1。
在某些实施方式中，相对丰度、百分比和/或比率通过肽图谱法(peptide mapping method)来确定。在某些实施方式中，相对丰度、百分比和/或比率通过实施例3中所述的肽图谱法来确定。在某些实施方式中，相对丰度、百分比和/或比率通过对液相色谱法分离的胰蛋白酶消化肽(tryptic peptide)进行HPLC分析、然后进行质谱分析来确定。在某些实施方式中，相对丰度、百分比和/或比率基于萃取离子色谱图中的强度。在某些实施方式中，相对丰度、百分比和/或比率基于ADAMTS13变体(例如Q97R ADAMTS13变体)的胰蛋白酶消化肽的峰面积相对于组合物中所有ADAMTS13蛋白和变体的峰面积之和(例如Q97R ADAMTS13变体和Q97 ADAMTS13蛋白的总和)来确定。在某些实施方式中，被测量的组合物中所有ADAMTS13蛋白和变体的胰蛋白酶消化肽对ADAMTS13变体与组合物中所有其他ADAMTS13蛋白和变体相比的至少一个氨基酸差异具有特异性。例如，可针对Q97R ADAMTS13变体测量的胰蛋白酶消化肽可为AAGGILHLELLVAVGPDVFQAHR或AAGGILHLELLVAVGPDVFQAHR和EDTER的组合，针对Q97 ADAMTS13蛋白测量的胰蛋白酶消化肽可为AAGGILHLELLVAVGPDVFQAHQEDTER。
在某些实施方式中，相对丰度、百分比和/或比率基于ADAMTS13变体的总重量相对于组合物中所有ADAMTS13蛋白和变体的总和重量来确定。
在某些实施方式中，ADAMTS13变体和/或野生型为重组的。在某些实施方式中，野生型ADAMTS13变体和/或野生型为血浆来源的。
在一个方面，本公开提供了治疗或预防受试者的凝血障碍的方法，该方法包括向有此需要的受试者施用治疗有效量的ADAMTS13变体或其组合物，包括包含ADAMTS13蛋白的组合物。
在本文提供的方法的某些实施方式中，凝血障碍选自遗传性TTP(也称为先天性TTP、遗传的TTP、家族性TTP和厄普肖-舒尔曼综合征)、获得性TTP(也称为免疫介导的TTP)、梗死、脑梗死、心肌梗死、缺血/再灌注损伤、深静脉血栓形成和败血症相关的弥散性血管内凝血。在本文提供的方法的一个实施方式中，凝血障碍为遗传性TTP。在本文提供的方法的一个实施方式中，凝血障碍为获得性TTP。
在一个方面，本公开提供了治疗受试者的出血发作(bleeding episode)的方法，该方法包括向有此需要的受试者施用治疗有效量的ADAMTS13变体或其组合物，包括包含ADAMTS13蛋白的组合物。
在某些实施方式中，出血发作与遗传性TTP、获得性TTP、梗死、心肌梗死、脑梗死和/或缺血再灌注损伤有关。
在一个方面，本公开提供了治疗或预防患有镰状细胞疾病的受试者的血管闭塞危象的方法，该方法包括向有此需要的受试者施用治疗有效量的ADAMTS13变体或其组合物，包括包含ADAMTS13蛋白的组合物。
在一个方面，本公开提供了治疗或预防患有急性肺损伤(ALI)和/或急性呼吸窘迫综合征(ARDS)的受试者的血管闭塞危象的方法，该方法包括向有此需要的受试者施用治疗有效量的ADAMTS13变体或其组合物，包括包含ADAMTS13蛋白的组合物。
在一个方面，本公开提供了对患有脑梗死的受试者的闭塞血管进行再通的方法，该方法包括向有此需要的受试者施用治疗有效量的ADAMTS13变体或其组合物，包括包含ADAMTS13蛋白的组合物。
在一个方面，本公开提供了改善经历过脑梗死的受试者的感觉运动功能恢复的方法，该方法包括向有此需要的受试者施用治疗有效量的ADAMTS13变体或其组合物，包括包含ADAMTS13蛋白的组合物。
在一个方面，本公开提供了治疗或预防受试者的与心血管疾病相关的凝血障碍的方法，该方法包括向有此需要的受试者施用治疗有效量的ADAMTS13变体或其组合物，包括包含ADAMTS13蛋白的组合物。
在一个方面，本公开提供了治疗或预防受试者的血液病的方法，该方法包括向有此需要的受试者施用治疗有效量的ADAMTS13变体或其组合物，包括包含ADAMTS13蛋白的组合物。
在本文提供的方法的某些实施方式中，ADAMTS13变体或组合物(包括包含ADAMTS13的组合物)以单次弹丸式注射(bolus injection)的方式施用，每月一次、每两周一次、每周一次、每周两次、每天一次、每12小时一次、每8小时一次、每6小时一次、每4小时一次、每2小时一次或每小时一次。
在某些实施方式中，ADAMTS13变体或组合物(包括包含ADAMTS13的组合物)被静脉施用或皮下施用。
在某些实施方式中，ADAMTS13变体和/或ADAMTS13蛋白(例如野生型)是重组的。在某些实施方式中，ADAMTS13变体和/或ADAMTS13蛋白由HEK 293细胞重组产生。在某些实施方式中，ADAMTS13变体和/或ADAMTS13蛋白由CHO细胞重组产生。在某些实施方式中，ADAMTS13变体和/或ADAMTS13蛋白为血浆来源的。
在某些实施方式中，受试者为哺乳动物。在某些实施方式中，受试者为人类。
在某些实施方式中，组合物为用于施用的即用型的稳定水溶液。在某些实施方式中，组合物为冻干的。在某些实施方式中，组合物在施用之前用适用于注射的药学上可接受的载体进行重构(reconstitute)。
在一个方面，本公开提供了编码本文公开的ADAMTS13变体的核酸分子(例如SEQID NO：4)。
在一个方面，本公开提供了载体，其包含编码本文公开的ADAMTS13变体的核酸分子(例如SEQ ID NO：4)。在某些实施方式中，载体为表达载体，其中，编码ADAMTS13变体的多核苷酸序列与能够介导ADAMTS13变体在宿主细胞中表达的启动子可操作地连接。
在一个方面，本公开提供了宿主细胞，其包含编码本文公开的ADAMTS13变体的核酸分子(例如SEQ ID NO：4)或本文公开的载体。
在一个方面，本公开提供了宿主细胞系，其包含被修饰以表达本文公开的ADAMTS13变体(例如SEQ ID NO：2)和至少一种ADAMTS13蛋白(例如SEQ ID NO：1)的细胞。在某些实施方式中，ADAMTS13变体和ADAMTS13蛋白在宿主细胞系的不同细胞中表达。ADAMTS13变体和ADAMTS13蛋白在宿主细胞系的同一细胞中表达。
在某些实施方式中，宿主细胞或宿主细胞系为CHO细胞、COS细胞、HEK 293细胞、BHK细胞、SK-Hep细胞或Hep G2细胞或细胞系。在某些实施方式中，CHO细胞为CHO DBX-11细胞系或CHOZN细胞系。在某些实施方式中，CHOZN细胞为CHO DBX-11细胞系。在某些实施方式中，CHOZN细胞为CHOZN谷氨酰胺合成酶(GS)-/-细胞系。
附图说明
优先权申请文件包含至少一幅彩色附图，其可通过US专利商标局的专利审查研究数据集(PAIR)进行访问。
图1A-1C显示了野生型ADAMTS13(SEQ ID NO：1)和ADAMTS13 Q97R变体(SEQ ID NO：2)之间的比对。
图2A-2C显示了野生型ADAMTS13(SEQ ID NO：1)和野生型大猩猩ADAMTS13(SEQ IDNO：3)之间的比对。
图3是血浆来源的ADAMTS13(pdADAMTS13)以及野生型和Q97R变体重组ADAMTS13(rADAMTS13)的组合的比活(U/mgAg)的箱形图。pdADAMTS数据研究了来自不同供体的至少80个样品，而rADAMTS13组合研究了35个不同批次的rADAMTS13，其中变体的丰度为52％至72％。
图4显示了ADAMTS13的三维模型，包括ADAMTS13 Q97的位置，它暴露在M蛋白酶结构域上且位于稳定的螺旋-转角-螺旋(helix-turn-helix)结构中的一个短的两个残基转角内。
图5是包含野生型ADAMTS13和Q97R变体的组合的组合物的UV色谱图。插图显示，代表两个变体的胰蛋白酶消化肽被很好地分离。
图6是组合物中来自天然变体和Q97R变体的胰蛋白酶消化肽的总离子色谱图和萃取离子色谱图。天然变体的胰蛋白酶消化肽在Q97R变体的正确切割的胰蛋白酶消化肽之前洗脱。Q97R变体的错误切割(miss-cleaved)的肽在其他两个肽之前洗脱。峰的面积分别表示肽和变体的相对丰度。
图7是包含不同比率的Q97R rADAMTS13变体与野生型rADAMTS13的rADAMTS13组合物的比活(U/mgAg)的散点图。共测试了35种不同的rADAMTS13组合物。
图8是包含不同比率的Q97R rADAMTS13变体与野生型rADAMTS13的rADAMTS13组合物的VWF切割的散点图。共测试了35种不同的rADAMTS13组合物。
图9是Q97R rADAMTS13和Q97R rADAMTS13变体的Flamingo荧光染色CDC凝胶。Flamingo荧光染色显示蛋白质总量。凝胶图像显示两个ADAMTS13样品的带型如下：一个主要条带在约190kDa处，表示全长分子；一个较弱条带在约150kDa处，表示截短形式；两个更弱条带在150和75kDa之间，表示蛋白质被部分降解。然而，两个样品的带型在存在和强度上是相似的，表明总蛋白质组成具有可比性。1：对照样品；2：Q97rADAMTS13；以及3：Q97RrADAMTS13变体。
图10是Q97R rADAMTS13和Q97R rADAMTS13变体的蛋白质印迹分析。对于蛋白质印迹分析，使用抗ADAMTS13抗体来使ADAMTS13蛋白形式可视化。膜图像显示两个样品的带型具有可比性：全长蛋白在约190kDa处作为主要信号出现；截短形式在约150kDa处作为较弱的条带出现，在约125kDa处可见非常弱的条带。1：对照样品；2：Q97RrADAMTS13；以及3：Q97RrADAMTS13变体。
图11是在CHOZN GS-/-细胞系中产生的野生型ADAMTS13和Q97RrADAMTS13变体的叠加色谱图。
图12是图11的放大版本，显示了在CHOZN GS-/-细胞系中产生的野生型ADAMTS13和Q97R rADAMTS13变体的叠加色谱图。
图13是在CHO DBX-11细胞系中产生的野生型ADAMTS13和Q97RrADAMTS13变体的叠加色谱图。
图14A-14B显示了ADAMTS13的氨基酸序列(SEQ ID NO：4)。
具体实施方式
I.介绍
缺血事件(例如心脏病发作和中风)是全世界死亡和残疾的一个主要原因。用组织凝血酶原活化剂(tPA)进行溶栓治疗导致纤维蛋白降解并促进血块溶解，可用于治疗缺血，但tPA的使用仅限于缺血事件发生后的最初几个小时。此外，TPA会增加出血和水肿形成的发生率和严重程度。因此，仍然明显需要发现新的治疗药物，用于使缺血的影响最小化。除对凝血的影响之外，此类药剂还可以靶向血小板粘附和缺血事件后的炎症过程。
冯·威勒布兰德因子(VWF)是一种存在于血浆中的大的多聚体糖蛋白，在血液凝固中起主要作用。VWF以超大形式(UL-VWF，>2千万Da)储存在血小板α颗粒和内皮细胞的韦伯-帕拉德小体(Weibel-Palade body)中，在损伤或炎症期间被释放出来。如果不立即消耗用于血小板粘附，UL-VWF会被ADAMTS13切割成在血浆中循环的较小的、粘性较低的多聚体。缺血(例如溶栓后发生的缺血)是韦伯-帕拉德小体分泌的有力诱因，从而使梗死区域具有高度血栓形成性。
基础VWF单体是一种具有2050个氨基酸的蛋白质，其包括一些具有特定功能的特定结构域：(1)D7D3结构域，其与因子VIII结合；(2)A1结构域，其与血小板GPlb-受体、肝素和可能的胶原蛋白结合；(3)A3结构域，其与胶原蛋白结合；(4)C1结构域，其中的R-G-D基序在活化时与血小板整合素αIIbβ3结合；以及(5)位于C末端的“半胱氨酸结(cysteineknot)”结构域，VWF与血小板源性生长因子(PDGF)、转化生长因子-β(TGFβ)和β-人绒毛膜促性腺激素(βHCG)共享该结构域。VWF的多聚体可以非常大，由80多个单体组成，分子量超过20,000kDa。这些大的VWF多聚体的生物学功能最强，能够介导血小板粘附至血管损伤部位，以及结合和稳定促凝血蛋白因子VIII。已知VWF缺乏或VWF改变会导致各种出血性疾病。
VWF的生物分解主要由称为ADAMTS13(具有血小板反应蛋白I型基序的去整合蛋白样和金属蛋白酶13)的蛋白质介导，ADAMTS13是一种主要由肝脏产生的190kDa糖基化蛋白。ADAMTS13是一种血浆金属蛋白酶，它在1605位的酪氨酸和1606位的蛋氨酸之间切割VWF，将VWF多聚体分解成更小的单元，再由其他肽酶进行进一步降解。VWF还被证明在梗死中起作用，梗死是一种组织因供血不足而发生坏死的过程。例如，当VWF水平被抑制时，梗死体积会减少；而VWF水平增加会导致梗死体积增大。
低水平的ADAMTS13与凝血障碍有关，例如遗传性血栓性血小板减少性紫癜(TTP)(也被称为先天性TTP、遗传的TTP、家族性TTP和厄普肖-舒尔曼综合征)、获得性TTP(也称为免疫介导的TTP)、脑梗死、心肌梗死、缺血/再灌注损伤、深静脉血栓形成和弥散性血管内凝血(DIC)(例如败血症相关DIC)。ADAMTS13缺乏还与出血发作(例如与遗传性TTP、获得性TTP、脑梗死、心肌梗死、缺血/再灌注损伤、深静脉血栓形成和/或败血症相关的弥散性血管内凝血有关的出血发作)以及患有镰状细胞疾病的受试者的血管闭塞危象和患有或可能患有急性肺损伤(ALI)和/或急性呼吸窘迫综合征(ARDS)的受试者的肺部损伤有关。ADAMTS13的补充还可能改善冠状动脉闭塞(心肌梗死)后的恢复以及经历过脑梗死的受试者通过血管再通的感觉运动功能的恢复。
本发明部分地基于如下发现：ADAMTS13变体，例如ADAMTS13 Q97R(SEQ ID NO：2)对于治疗与ADAMTS13(例如SEQ ID NO：1)相同的疾病和病症有用。在某些实施方式中，可在本文所述的方法中将ADAMTS13变体与其他ADAMTS13蛋白(例如野生型)组合使用。
SEQ ID NO：1
Figure BDA0003972678030000101
SEQ ID NO：1包括信号肽(加粗和下划线)和前肽(加粗)。R97蛋白变体在97位上有一个由“Q”到“R”的氨基酸改变(黑体和斜体)。
II.定义
如本文所用，“ADAMTS13”或“A13”指ADAMTS(具有血小板反应蛋白I型基序的去整合蛋白样和金属蛋白酶)家族的金属蛋白酶，其在Tyr 1605和Met 1606残基之间切割冯·威勒布兰德因子(vWF)。在本发明上下文中，“ADAMTS13”包括任何ADAMTS13蛋白及其片段，例如来自哺乳动物的ADAMTS13，例如灵长类动物、人类(NP620594)、猴、兔、猪、牛(XP610784)、啮齿动物、小鼠(NP001001322)、大鼠(XP342396)、仓鼠、沙鼠、犬科、猫科、青蛙(NP001083331)和鸡(XP415435)。如本文所用，“ADAMTS13蛋白”指重组生产的和血浆来源的ADAMTS13蛋白。在某些实施方式中，ADAMTS13蛋白为野生型人ADAMTS13(hADAMTS13)或其片段，如US专利申请公开号2012/0229455(其通过引用并入本文用于所有目的)中所述。在某些实施方式中，hADAMTS13的氨基酸序列为GenBank登录号NP_620594的序列。在某些实施方式中，hADAMTS13的氨基酸序列为SEQ ID NO：1。
术语“ADAMTS13变体”指与野生型分子(例如SEQ ID NO：1)结构基本相似并具有相同生物活性的多肽，尽管在某些情况下的程度不同。与用于衍生变体的野生型多肽相比，变体的氨基酸序列的组成不同，其基于涉及如下的一个或多个突变：(i)在多肽(包括如上所述的片段)的一个或多个末端和/或野生型多肽序列的一个或多个内部区域处的一个或多个氨基酸残基的缺失；(ii)在多肽的一个或多个末端(通常为“添加”型变体)和/或野生型多肽序列的一个或多个内部区域(通常为“插入”型变体)处的一个或多个氨基酸的插入或添加；或(iii)野生型多肽序列中其他氨基酸的一个或多个氨基酸的替代。根据被替代的氨基酸和替代它的氨基酸的物理化学或功能相关性，替代是保守的或非保守的。变体包括用类似或同源的氨基酸或不类似的氨基酸替代肽序列中的一个或多个氨基酸。有许多标准可以将氨基酸分为相似或同源的(Gunnar von Heijne，Sequence Analysis in MolecularBiology，第123-139页，Academic Press，纽约，1987年，其通过引用并入本文用于所有目的)。
人ADAMTS13蛋白包括但不限于：包含GenBank登录号NP 620594的氨基酸序列的多肽或其加工多肽，例如其中信号肽(氨基酸1至29)和/或前肽(氨基酸30至74)已被去除的多肽。本领域已知许多人ADAMTS13的天然变体，它们可被本发明的组合物所包含，其中一些包括选自如下的突变：R7W、V88M、H96D、R102C、R193W、T196I、H234Q、A250V、R268P、W390C、R398H、Q448E、Q456H、P457L、P475S、C508Y、R528G、P618A、R625H、I673F、R692C、A732V、E740K、A900V、S903L、C908Y、C951G、G982R、C1024G、A1033T、R1095W、R1095W、R1123C、C1213Y、T1226I、G1239V和R1336W。优选地，对ADAMTS13的酶活性至关重要的氨基酸将不会被突变。这些包括例如已知或推测对金属结合至关重要的残基(例如残基83、173、224、228、234、281和284)以及在酶的活性位点发现的残基(例如残基225)。同样，在本发明上下文中，ADAMTS13蛋白包括替代同种型(alternate isoform)，例如，缺乏全长人类蛋白的氨基酸275至305和/或氨基酸1135至1190的同种型。
“保守修饰的变体(Conservatively modified variant)”适用于氨基酸序列和核酸序列。针对特定核酸序列，保守修饰的核酸指那些编码相同或基本相同的氨基酸序列的核酸，或者在核酸不编码氨基酸序列的情况下指基本相同的序列。由于遗传密码的简并性，大量功能相同的核酸可以编码任何给定蛋白质。例如，密码子GCA、GCC、GCG和GCU都编码氨基酸丙氨酸。因此，在密码子指定丙氨酸的每个位置处，密码子可以在不改变所编码的多肽的情况下被改变为所述的任意相应密码子。此种核酸变体为“沉默变体”，是保守修饰的变体的一个种类。本文编码多肽的每个核酸序列也描述了核酸的每个可能的沉默变体。技术人员会认识到，核酸中每个密码子(除AUG和TGG之外，AUG通常是蛋氨酸的唯一密码子，TGG通常是色氨酸的唯一密码子)可以被修改以产生功能相同的分子。因此，编码多肽的核酸的每个沉默变体都暗含在每个描述的序列中。
如本文所用，本文中“等价位置”(例如“等价氨基酸位置”或“等价残基位置”)被定义为使用比对算法(例如Clustal Needleman-Wunsch算法，Vector NTI)与参考氨基酸序列(例如SEQ ID NO：1)的相应位置匹配的氨基酸序列的位置(例如氨基酸位置或残基位置)。氨基酸序列的等价氨基酸位置不需要与参考氨基酸序列的相应位置具有相同的数字位置编号。作为示例，图2显示了人类野生型ADAMTS13(SEQ ID NO：1)与大猩猩野生型ADAMTS13(SEQ ID NO：3)比对的序列。在此示例中，SEQ ID NO：1的氨基酸位置编号97被认为是SEQID NO：3的氨基酸位置编号101的等价氨基酸位置(即“与之等价”)，因为SEQ ID NO：1的氨基酸位置97与SEQ ID NO：3的氨基酸位置101匹配。换言之，SEQ ID NO：1的氨基酸位置97对应于SEQ ID NO：3的氨基酸位置101。
如本文所用，在描述两个以上多核苷酸或氨基酸序列的上下文中，术语“同一”或百分比“同一性”指：当在比较窗口或指定区域内使用以下序列比较算法或通过手动比对和目视检查进行测量来进行比较和比对以获得最大对应关系时，两个以上序列或子序列相同或具有指定百分比的相同氨基酸残基或核苷酸(例如与参考序列如SEQ ID NO：1具有至少80％同一性，优选85％、90％、91％、92％、93、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性)。此种序列被称为“基本相同”。针对多核苷酸序列，此定义也指测试序列的互补序列。优选地，同一性在至少约50个氨基酸或核苷酸长度的区域内存在，或更优选在75至100个氨基酸或核苷酸长度的区域内存在。
如本文所用，组合物中的短语“ADAMTS13总量”或“总ADAMTS13”包括组合物中所有ADAMTS13变体和/或ADAMTS13蛋白(例如野生型SEQ ID NO：1)的总和。例如，如果组合物包含Q97 ADAMTS13和Q97R ADAMTS13，则“ADAMTS13总量”或“总ADAMTS13”将是组合物中Q97ADAMTS13和Q97R ADAMTS13的总和。同样，如果组合物仅包含Q97R ADAMTS13，则ADAMTS13总量或总ADAMTS13将是组合物中Q97RADAMTS13的总和。
对于氨基酸序列，技术人员将认识到对核酸、肽、多肽或蛋白质序列进行的单个替代、插入、缺失、添加或截短(使编码序列中的单个氨基酸或小比率的氨基酸改变、添加或缺失)是“保守修饰的变体”，其中所述改变导致氨基酸被化学上相似的氨基酸替代。保守替代(其提供功能相似的氨基酸)表格在本领域是众所周知的。此种保守修饰的变体是对公开的多态变体、种间同源物和等位基因的补充，并且不排除这些变体。
以下8组各自包含了互为保守替代的氨基酸。
1)丙氨酸(A)，甘氨酸(G)；
2)天冬氨酸(D)，谷氨酸(E)；
3)天冬酰胺(N)，谷氨酰胺(Q)；
4)精氨酸(R)，赖氨酸(K)；
5)异亮氨酸(I)，亮氨酸(L)，蛋氨酸(M)，缬氨酸(V)；
6)苯丙氨酸(F)，酪氨酸(Y)，色氨酸(W)；
7)丝氨酸(S)，苏氨酸(T)；以及
8)半胱氨酸(C)，蛋氨酸(M)(参见例如Creighton，Proteins 1984)。
如本文所用，多肽的“片段”指小于全长多肽或蛋白质表达产物的任何多肽的部分。片段通常是全长多肽的缺失类似物，其中一个以上氨基酸残基已经从全长多肽的氨基末端和/或羧基末端被移除。因此，“片段”是下面描述的缺失类似物的一个子集。
当针对例如细胞而言时，术语“重组”或“重组表达体系”表示该细胞已通过引入异源核酸或蛋白质或改变天然核酸或蛋白质而被修饰，或者该细胞衍生自如此修饰的细胞。因此，例如，重组细胞表达天然(非重组)形式的细胞中不存在的基因，或者表达异常表达、表达不足或根本不表达的天然基因。该术语还表示稳定地整合了重组基因元件或具有基因表达调节作用的元件(例如启动子或增强子)的宿主细胞。本文定义的重组表达体系将在与要表达的内源性DNA片段或基因相连的调控元件的诱导下表达细胞内源性的多肽或蛋白质。细胞可以为原核生物或真核生物。
ADAMTS13蛋白和变体可被进一步修饰，例如通过翻译后修饰(例如选自人类残基142、146、552、579、614、667、707、828、1235、1354或任何其他天然或工程修饰位点的一个以上氨基酸处的糖基化)或者通过体外化学修饰或酶修饰，包括但不限于糖基化、通过水溶性聚合物修饰(例如PEG化、唾液酸化、HES化等)、加标签等。例如，ADAMTS13蛋白或变体可包括有利于纯化、检测或两者的标签。本文所述的ADAMTS13蛋白可进一步用治疗性部分或适合体外或体内成像的部分进行修饰。
如本文所用，术语“糖基化”或“ADAMTS13的糖基化形式”指通过添加碳水化合物或聚糖残基而翻译后修饰的ADAMTS13蛋白。具有超过一个糖基化位点的ADAMTS13蛋白可以在每个糖基化位点上连接相同的聚糖残基，或可以在不同糖基化位点上连接不同聚糖残基。通过此种方式，不同的聚糖连接模式可以产生ADAMTS13蛋白的不同糖型。在糖基化的ADAMTS13上发现的主要糖是葡萄糖(Glc)、半乳糖(Gal)、甘露糖(Man)、岩藻糖(Fuc)、N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)、N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)和唾液酸(例如N-乙酰神经氨酸(NeuAc或NANA))。己糖(Hex)和HexNAc分别是表示单糖类(例如Man、Glc和Gal残基)以及GlcNAc和GalNAc残基的通用术语。
术语“糖基化”包括ADAMTS13糖蛋白的形成，其中聚糖残基被连接至蛋白质的天冬酰胺(Asn)残基(即N-连接)或丝氨酸(Ser)或苏氨酸(Thr)残基(即O-连接)或色氨酸(Trp)残基(即C-连接和/或C-甘露糖基化)的侧链。
术语“N-聚糖基化位点”指包括具有氮原子的氨基酸残基的任何氨基酸序列，例如天冬酰胺残基的酰胺氮。连接在糖蛋白上的N-聚糖在分支(触角)数量方面有所不同，其包含被添加至一个共同核心戊糖上的外周糖(例如GlcNAc、Gal、Fuc和NeuAc)，其中核心戊糖为：Man3GlcNAc2，它包含“三甘露糖”(Man3)组分和“壳二糖”(GlcNAc2)组分。通常根据其分支成分对N-聚糖进行分类(例如高甘露糖、混合或复合)。“高甘露糖”型N-聚糖包含未被取代的末端甘露糖糖类。这些聚糖通常含有连接至壳二糖核心的5至9个甘露糖残基。“混合”型N-聚糖可以同时包含具有GlcNAc连接的未取代的末端甘露糖残基和取代甘露糖残基。“复合”型N-聚糖通常有至少一个连接至α1,3甘露糖臂的GlcNAc，以及至少一个连接至三甘露糖核心的α1,6甘露糖臂的GlcNAc。复合N-聚糖也可以具有可选地用NeuAc残基修饰的Gal或GalNAc糖残基。复合N-聚糖还可以有链内取代，包括“二分”GlcNAc和核心Fuc残基。复合N-聚糖也可以在三甘露糖核心上有多个触角，通常被称为“多触角糖”。
“O-连接糖基化”指将碳水化合物残基(例如GalNAc、Gal)添加至羟基氨基酸(例如丝氨酸或苏氨酸)的糖基化形式。O-连接聚糖通常包含带有二糖Fuc-Glc的O-岩藻糖化或含有HexNAc-Hex-NeuAc0-2的粘蛋白型结构。术语“O-糖基化位点”指包括具有羟基的氨基酸残基(例如丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸侧链)的任何氨基酸序列。
“C-连接糖基化”指碳水化合物残基(例如Man)被添加至色氨酸侧链上的碳的糖基化形式。术语“C-糖基化位点”或“C-甘露糖基化位点”指包括具有碳原子(例如色氨酸侧链上的碳原子)的氨基酸残基的任何氨基酸序列。
如本文所用，术语“糖相似性指数”或“糖指数”或“N-聚糖指数”指参考糖基化特征与给定目标特征相比的符合程度。
如本文所用，“凝血障碍”被定义为包括血小板招募功能障碍和中性粒细胞招募功能障碍的障碍。凝血障碍”的非限制性示例包括遗传性血栓性血小板减少性紫癜(TTP)、获得性TTP、脑梗死、心肌梗死、缺血/再灌注损伤、深静脉血栓形成和弥散性血管内凝血(DIC)(例如败血症相关DIC)。
如本文所用，“ADAMTS13活性”包括全长VWF、VWF片段或VWF底物(例如FRETS-VWF73底物(Kokame等，Br J Haematol.2005年4月，129(1):93-100))。“ADAMTS13活性”可以指ADAMTS13变体、ADAMTS13蛋白(例如野生型)或它们的组合的活性。在某些实施方式中，当组合物为ADAMTS13变体和/或ADAMTS13(例如野生型)的混合物时，“ADAMTS13活性”指组合物中总ADAMTS13的活性。
如本文所用，“一个单位的ADAMTS13活性”被定义为1mL正常人混合血浆中的活性量，不论所用测定法如何。例如，一个单位的ADAMTS13 FRETS-VWF73活性为与用1mL正常人混合血浆切割相同量的FRETS-VWF73底物所需的活性量(Kokame等，Br J Haematol.2005年4月，129(1):93-100，通过引用整体并入本文用于所有目的)。其他活性测定法也可用于确定一个单位的ADAMTS13的活性。例如，可以使用SDS琼脂糖凝胶电泳进行直接ADAMTS13活性测定以检测全长VWF分子或VWF片段的切割，可以用胶原蛋白结合测定来间接检测ADAMTS13的活性。术语“一个单位的ADAMTS13活性”可与“活性单位”、“U”、“国际单位”、“IU”或“UFV73”互换使用。在某些实施方式中，国际单位基于WHO标准的使用，该WHO标准使用VWF FRETS测定对血浆进行校准(即“UFV73”或“IU”)。
如本文所用，术语“血栓”指血凝块，尤其是包含血小板的血凝块、微血栓和/或栓子。所述血栓可以连接或不连接在动脉或静脉血管上，可以部分或完全阻塞或阻断动脉或静脉血管的血流。
如本文所用，术语“镰状细胞疾病(SCD)”描述了一组以多种形式存在的遗传性红细胞疾病。SCD的一些形式是血红蛋白SS、血红蛋白SC、血红蛋白Sβ0地中海贫血、血红蛋白Sβ+地中海贫血、血红蛋白SD和血红蛋白SE。尽管血红蛋白SC病和血红蛋白Sβ地中海贫血是SCD的两种常见形式，但本公开涉及并包括SCD的所有形式。
如本文所用，术语“血管闭塞危象(VOC)”是一种突然发生的剧烈疼痛，可能毫无征兆地发生。VOC也被称为疼痛危象或镰状细胞危象，是青少年和成人SCD的一种常见疼痛并发症。VOC由镰状细胞、内皮细胞和血浆成分之间的相互作用启动和维持。血管闭塞是造成SCD各种临床并发症的原因，包括疼痛综合征、中风、腿部溃疡、自然流产和/或肾功能不全。
术语“急性肺损伤”(ALI)和“急性呼吸窘迫综合征”(ARDS)描述了具有大量发病率和死亡率的急性呼吸衰竭的临床综合征(J.Johnson等，J.Aerosol Med.Pulmon.DrugDeliv.2010，23：243-52)。ALI和更严重的ARDS都表示一种肺部疾病谱系，其特点是继发于无数局部或全身性损伤的炎症性肺水肿的突然发病，包括双侧的炎症性肺浸润和氧合受损或低氧血症(Walkey等，Clinical Epidemiology 2012，4：159-6)。尽管ALI和ARDS是两种肺损伤或疾病的临床综合征，但本公开涉及并包括ADAMTS13变体和/或ADAMTS13蛋白在治疗、预防或改善不仅ALI和ARDS、而且所有形式的肺损伤和肺疾病(特别是与氧合受损相关的肺疾病)中的应用。
术语“再通”指在闭塞后通过恢复管腔或通过形成一个以上新通道来恢复血管的管腔。术语“再通”表示在闭塞后通过恢复管腔或通过形成一个以上新通道来恢复血管的管腔。在本文描述的某些实施方式中，再通与梗死(例如脑梗死)相关的闭塞血管有关。再通可以使用本领域已知的任何合适的方法来确定。在一些实施方式中，对于闭塞的脑血管的再通，再通由局部脑血流(rCBF)的恢复来确定。
“局部脑血流”和“rCBF”指在给定时间内流向大脑特定区域的血流量。局部脑血流可以使用本领域已知的任何合适的技术来测量，包括例如使用本文所述的激光多普勒血流监测技术。
术语“出血发作”指与ADAMTS13缺乏相关的内部出血。凝血活动的增加(例如发生在小血管和其他位置的凝血活动)会过度消耗可用的血小板和凝血因子，从而通过耗尽可用的血小板和凝血因子的来源来增加严重的内部和外部出血的机会。此种出血可见于在毛细血管和其他微血管中，可能导致器官损伤和/或缺血。
当提及症状时，术语“降低严重性”表示症状被延迟发病、降低严重性、降低频率或对受试者造成更少损害。一般而言，症状的严重性是与对照(例如不接受活性预防或治疗组合物的受试者)相比或与施用治疗前的症状严重性相比。例如，如果与症状的对照水平相比，症状被减少约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％或约100％(即基本消除)，则可以认为组合物降低了本文所列任何适应症的严重程度。在某些方面，如果与症状的对照水平相比，症状被减少约10％至约100％、约20％至约90％、约30％至约80％、约40％至约70％或约50％至约60％，则可以认为组合物降低了症状的严重程度。在某些方面，如果与症状的对照水平相比，症状被减少约10％至约30％、约20％至约40％、约30％至约50％、约40％至约60％、约50％至约70％、约60％至约80％、约70％至约90％或约80％至约100％，则可以认为组合物减少了症状的严重程度。
针对本发明目的，“患者”或“受试者”包括人类和其他动物，特别是哺乳动物。因此，本发明的组合物/制剂和方法适用于人类治疗和兽医应用。在某些实施方式中，患者为哺乳动物；在一个实施方式中，患者为人类。与ADAMTS13或VWF功能障碍相关的病况的其他已知治疗和疗法可与本发明提供的组合物和方法组合使用。
如本文所用，术语“维生素B3”、“烟酰胺”、“尼克酰胺”和“烟酸”可互换使用，表示维生素B3家族的任何成员。
如本文所用，“治疗有效量或剂量”或“足够量或剂量”指能产生其被施用的效果的剂量。确切剂量取决于治疗目的，本领域的技术人员可以使用已知技术来确定(参见例如Lieberman，Pharmaceutical Dosage Forms 1992，第1-3卷；Lloyd，The Art,Science andTechnology of Pharmaceutical Compounding 1999；Pickar，Dosage Calculations1999；以及Remington:The Science and Practice of Pharmacy 2003，第20版，Gennaro编辑，Lippincott，Williams&Wilkins)。
如本文所用，“生理浓度”的盐指盐浓度为约100mM至约200mM的药学上可接受的盐。药学上可接受的盐的非限制性示例包括但不限于氯化钠和氯化钾、乙酸钠和乙酸钾、柠檬酸钠和柠檬酸钾以及磷酸钠和磷酸钾。
如本文所用，“亚生理浓度”的盐指盐浓度低于约100mM的药学上可接受的盐的。在某些实施方式中，亚生理浓度的盐指低于约80mM的药用盐。在某些实施方式中，亚生理浓度的盐为低于约60mM的药用盐。
如本文所用，术语“化学成分确定的培养基”指合成的生长培养基，其中所有成分的特性和浓度已知。化学成分确定的培养基不包含细菌、酵母、动物或植物提取物，尽管它们可能包含或不包含个别植物或动物来源的成分(例如蛋白质、多肽等)。市售的化学成分确定培养基的非限制性示例包括各种
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培养基(SAFC Biosciences,Inc.)、各种Dulbecco改良的Eagle(DME)培养基(Sigma-Aldrich Co.；SAFC Biosciences,Inc.)、Ham's营养混合物(Sigma-Aldrich Co.；SAFC Biosciences,Inc.)等。制备化学成分确定的培养基的方法为本领域已知，例如US专利号6,171,825和6,936,441、WO2007/077217以及US专利申请公开号2008/0009040和2007/0212770，其公开内容通过引用整体并入本文。
如本文所用，术语“无寡肽培养基”指不含寡肽(例如来源于蛋白质水解物的寡肽)的无蛋白培养基。在一个实施方式中，培养基不包含具有20个以上氨基酸的寡肽。在本发明的一个实施方式中，培养基不包含具有15个以上氨基酸的寡肽。在本发明的其他实施方式中，培养基不包含具有10个以上氨基酸的寡肽。在一个实施方式中，培养基不包含具有7个以上氨基酸的寡肽。在其他实施方式中，培养基不包含具有5个以上氨基酸的寡肽。在其他实施方式中，培养基不包含具有3个以上氨基酸的寡肽。根据本发明的其他实施方式，培养基不包含具有2个以上氨基酸的寡肽。制备不含寡肽的培养基的方法为本领域已知，例如US专利号6,171,825和6,936,441、WO2007/077217和US专利申请公开号2008/0009040和2007/0212770，其公开内容通过引用整体并入本文用于所有目的。
如本文所用，术语“无血清培养基”指不补充动物血清的培养基。虽然通常情况下无血清培养基为化学成分确定的培养基，但无血清培养基可以补充离散的动物或植物蛋白或蛋白组分。制备无血清培养基的方法为本领域已知，例如US专利号6,171,825和6,936,441、WO2007/077217以及US专利申请公布号2008/0009040和2007/0212770，其公开内容通过引用整体并入本文用于所有目的。如本文所用，术语“无动物蛋白培养基”指不补充动物血清、蛋白或蛋白组分的培养基。尽管通常情况下，无动物蛋白培养基为化学成分确定的培养基，但无动物蛋白培养基可能含有植物或酵母的水解物。制备无动物蛋白培养基的方法为本领域已知，例如US专利号6,171,825和6,936,441、WO2007/077217以及US专利申请公布号2008/0009040和2007/0212770，其公开内容通过引用整体并入本文用于所有目的。在某些实施方式中，使用化学成分确定的培养基，不含任何动物或植物来源的蛋白或蛋白组分。
“表达载体”是重组或合成的核酸构建体，具有允许在宿主细胞中转录特定核酸一系列特定核酸元件。表达载体可以为质粒、病毒或核酸片段的一部分。通常，表达载体包含与启动子可操作地连接的要转录的核酸。
当用来指代核酸的部分时，术语“异源”表示该核酸包含两个以上在自然界中彼此没有相同亲缘的子序列。例如，核酸通常重组产生，具有两个以上来自不相关基因的序列以排列成一个新的功能性核酸，例如一种来源的启动子和另一种来源的编码区。类似地，异源蛋白表示该蛋白包含两个以上在自然界中彼此没有相同亲缘的子序列(例如融合蛋白)。
“启动子”被定义为指导核酸转录的核酸控制序列的阵列。如本文所用，启动子包括转录起始位点附近的必要核酸序列，例如在聚合酶II型启动子的情况下为TATA元件。启动子还可以可选地包括远端增强子或抑制子元件，它们可以位于离转录起始点多达几千个碱基对的位置。“组成型”启动子是一种在大多数环境和发育条件下都有活性的启动子。“诱导型”启动子是一种在环境或发育调节下有活性的启动子。术语“可操作地连接”指核酸表达控制序列(例如启动子，或转录因子结合位点阵列)和第二核酸序列之间的功能性连接，其中表达控制序列指导对应于第二序列的核酸的转录。
如本文所用，术语“约”表示指定值正负10％的近似范围。例如，语言“约20％”涵盖18％至22％的范围。如本文所用，“约”也包括精确数量。因此，“约20％”表示“约20％”以及“20％”。
如果本公开的方面被描述为“包含”(或其变型，例如“包括”)某个特征，则实施方式也被设想为“由该特征组成”或“基本上由该特征组成”。
还特别应理解，本文所列举的任何数值包括低值至高值的所有数值，即在所列举的最低值和最高值的所有可能的数值组合将被视为在本申请中被明确说明。例如，如果浓度范围被陈述为约1％至50％，则诸如2％至40％、10％至30％或1％至3％等数值都应视为在本说明书中明确列举。上文列出的数值仅仅是具体意图的示例而已。
III.ADAMTS13变体组合物
在一个方面，本发明提供了ADAMTS13变体。ADAMTS13变体可以包括与天然/野生型ADAMTS13氨基酸序列(例如SEQ ID NO：1)相比的一个以上氨基酸替代、缺失、插入和/或移码。例如，ADAMTS13变体可以包括与野生型ADAMTS13相比(即，相对于)的至少一个单个氨基酸替代。氨基酸替代可以在催化结构域、去整合蛋白结构域和/或第一血小板反应蛋白1型结构域(C1和C2)内。
例如，氨基酸替代可以为SEQ ID NO：1中所示的I79M、V88M、H96D、Q97R、R102C、S119F、I178T、R193W、T196I、S203P、L232Q、H234Q、D235H、A250V、S263C和/或R268P中的至少一种，或ADAMTS13中的等价氨基酸位置(换言之，SEQ ID NO：1被用作参考序列，以提供关于所识别的待改变的氨基酸残基位于ADAMTS13蛋白中的位置(例如M79、M88、D96、R97、C102、F119、T178、W193、I196、P203、Q232、Q234、H235、V250、C263和/或P268)的上下文)。在某些实施方式中，单个氨基酸替代不是SEQ ID NO：1中所示的I79M、V88M、H96D、R102C、S119F、I178T、R193W、T196I、S203P、L232Q、H234Q、D235H、A250V、S263C和/或R268P，或ADAMTS13中的等价氨基酸位置。
在某些实施方式中，ADAMTS13变体包含SEQ ID NO：1中所示的Q97处的单个氨基酸替代，或ADAMTS13中的等价氨基酸位置。在某些实施方式中，氨基酸从Q变为D、E、K、H、L、N、P或R。在某些实施方式中，氨基酸从Q变为R。在某些实施方式中，ADAMTS13变体为ADAMTS13Q97R(SEQ ID NO：2或与其具有至少80％序列同一性同时仍保留R97的氨基酸序列)。在一些实施方式中，ADAMTS13变体包含SEQ ID NO：2中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO：2具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性同时仍保留R97的变体。在某些实施方式中，编码ADAMTS13变体的核苷酸序列包含编码SEQ ID NO：2中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO：2具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性同时仍保留R97的变体的核苷酸序列。在某些实施方式中，ADAMTS13变体包含SEQ ID NO：2中所示的氨基酸序列。在某些实施方式中，ADAMTS13变体由SEQ ID NO：2中所示的氨基酸序列组成。在某些实施方式中，ADAMTS13变体基本上由SEQ ID NO：2中所示的氨基酸序列组成。
在某些实施方式中，ADAMTS13变体为R7W、Q44X、T167M、Y304C、C311Y、T339R、P341L、C347S、R349C、P353L、W390X、W390C、R398H、Q448E、Q449X、Q456H、P457L、P475S、R507Q、C508Y、G525D、R528G、A596V、A606P、P618A、R625H、P671L、I673F、R692C、Q723K、A732V、E740K、C758R、V832M、A900V、S903L、C908S、C908Y、R910X、Q929X、C951G、G982R、A1033T、W1016X、C1024G、A1033T、R1034X、S1036X、R1060W、R1123C、R1149W、R1206X、C1213Y、I1217T、R1219W、T1226I、G1239V、W1245X、Q1302X、S1314L和/或R1336W。在某些实施方式中，ADAMTS13变体不是SEQ ID NO：1中所示的R7W、Q44X、T167M、Y304C、C311Y、T339R、P341L、C347S、R349C、P353L、W390X、W390C、R398H、Q448E、Q449X、Q456H、P457L、P475S、R507Q、C508Y、G525D、R528G、A596V、A606P、P618A、R625H、P671L、I673F、R692C、Q723K、A732V、E740K、C758R、V832M、A900V、S903L、C908S、C908Y、R910X、Q929X、C951G、G982R、A1033T、W1016X、C1024G、A1033T、R1034X、S1036X、R1060W、R1123C、R1149W、R1206X、C1213Y、I1217T、R1219W、T1226I、G1239V、W1245X、Q1302X、S1314L和/或R1336W，或ADAMTS13中的等价氨基酸位置。
在某些实施方式中，本文提供的ADAMTS13变体保留显著的ADAMTS13活性。在某些实施方式中，ADAMTS13变体提供与野生型ADAMTS13相同的ADAMTS13活性。在某些实施方式中，ADAMTS13变体提供比野生型ADAMTS13本身更大的ADAMTS13活性。
在某些实施方式中，本发明提供了ADAMTS13变体的组合物，例如具有US专利申请公开号2011/0229455和/或US专利申请公开号2014/0271611(其各自通过引用整体并入本文用于所有目的)中描述的成分的组合物。在其他方面，本发明提供了ADAMTS13变体与血浆来源的ADAMTS13和/或野生型重组ADAMTS13(rADAMTS13)蛋白组合的组合物。在一个实施方式中，hADAMTS13的氨基酸序列为GenBank登录号NP_620594的氨基酸序列。在其他实施方式中，hADAMTS13的氨基酸序列包含NP_620594的氨基酸75至1427、其天然或保守变体或其生物活性片段。在某些实施方式中，ADAMTS13变体为ADAMTS13 Q97R(SEQ ID NO：2)或与其具有至少80％序列同一性同时仍保留R97的氨基酸序列。
在某些实施方式中，组合物为液体组合物或冻干组合物。在其他实施方式中，冻干组合物由液体组合物冻干得到，如US专利申请公开号2011/0229455和/或US专利申请公开号2014/0271611(其各自通过引用整体并入本文用于所有目的)中所述。
在某些实施方式中，药物组合物包含至少一种ADAMTS13变体和ADAMTS13蛋白(例如野生型)的组合。在某些实施方式中，组合物中ADAMTS13总量(即包括所有ADAMTS13变体和野生型)中存在的ADAMTS13变体的相对丰度(例如百分比)为约5％至约95％、约10％至约90％、约15％至约85％、约20％至约80％、约25％至约75％、约30％至约70％、约35％至约65％、约40％至约60％或约45％至约55％。在某些实施方式中，组合物中ADAMTS13总量中存在的ADAMTS13变体的百分比为约40％至约90％、约40％至约80％、约45％至约75％、约50％至约80％、约50％至约70％或约55％至约65％。在某些实施方式中，组合物中ADAMTS13总量中存在的ADAMTS13变体的百分比为约50％至约75％、约52％至约72％、约55％至约70％或约59％至约72％。在某些实施方式中，组合物中ADAMTS13总量中存在的ADAMTS13变体的百分比为约45％至约85％或约47％至约84％。在某些实施方式中，组合物中ADAMTS13总量中存在的ADAMTS13变体的百分比为约47％至约84％。在某些实施方式中，组合物中ADAMTS13总量中存在的ADAMTS13变体的百分比为约40％、约41％、约42％、约43％、约44％、约45％、约46％、约47％、约48％、约49％、约50％、约51％、约52％、约53％、约54％、约55％、约56％、约57％、约58％、约59％、约60％、约61％、约62％、约63％、约64％、约65％、约66％、约67％、约68％、约69％、约70％、约71％、约72％、约73％、约74％、约75％、约76％、约77％、约78％、约79％、约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％。在某些实施方式中，组合物中ADAMTS13总量中存在的ADAMTS13变体的百分比为约52％、约60％、约61％、约62％、约63％、约64％、约65％、约66％或约72％。
在某些实施方式中，药物组合物包含至少一种ADAMTS13变体和ADAMTS13蛋白的组合。在某些实施方式中，ADAMTS13变体与ADAMTS13蛋白的比率为约4：1至约1：4、约3：1至约1：3或约2：1至约1：2。在某些实施方式中，ADAMTS13变体与ADAMTS13蛋白的比率为约3：1至约1：3、约2：1至约1：2、约2：1至约1：3、约1：1至约1：3、约1：1.1至约1：2.9、约1：1.2至约1：2.8、约1：1.3至约1：2.7、约1：1.4至约1：2.6、约1：1.5至约1：2.5、约1：1.6至约1：2.4、约1：1.7至约1：2.3、约1：1.8至约1：2.2或约1：1.9至约1：2.1。在某些实施方式中，ADAMTS13变体与ADAMTS13蛋白的比率为约1.1：1至约2.9：1、约1.2：1至约2.8：1、约1.3：1至约2.7：1、约1.4：1至约2.6：1、约1.5：1至约2.5：1、约1.6：1至约2.4：1、约1.7：1至约2.3：1、约1.8：1至约2.2：1或约1.9：1至约2.1：1。在某些实施方式中，ADAMTS13变体与ADAMTS13野生型的比率为约1：1至约1：3。在某些实施方式中，ADAMTS13变体与ADAMTS13野生型的比率为约3：1至约1：1。在某些实施方式中，ADAMTS13变体与ADAMTS13野生型的比率为约1：1.1至约1：2.5。在某些实施方式中，ADAMTS13变体与ADAMTS13野生型的比率为约4：1、约4：1.5、约4：2、约4：2.5、约4：3、约4：3.5、约3：1、约3：1.5、约3：2、约3：2.5、约2：1或约2：1.5。在某些实施方式中，ADAMTS13变体与ADAMTS13野生型的比率为约1：1.5、约1：2、约1：2.5、约1：3、约1：3.5、约1：4、约2：2.5、约2：3、约2：3.5、约2：4、约3：3.5或约3：4。在某些实施方式中，ADAMTS13变体与ADAMTS13野生型的比率为约1：3。在某些实施方式中，ADAMTS13变体与ADAMTS13野生型的比率为约3：1。在某些实施方式中，ADAMTS13变体与ADAMTS13野生型的比率为约2：1。在某些实施方式中，ADAMTS13变体与ADAMTS13野生型的比率为约1：2。在某些实施方式中，ADAMTS13变体与ADAMTS13野生型的比率为约1：1。在某些实施方式中，ADAMTS13变体与ADAMTS13野生型的比率为约3：2。
在某些实施方式中，相对丰度、百分比和/或比率通过肽图谱法来确定。在某些实施方式中，相对丰度、百分比和/或比率通过实施例3中所述的肽图谱法来确定。在某些实施方式中，相对丰度、百分比和/或比率通过对液相色谱法分离的胰蛋白酶消化肽进行HPLC分析、然后进行质谱分析来确定。在某些实施方式中，相对丰度、百分比和/或比率基于萃取离子色谱图中的强度。在某些实施方式中，相对丰度、百分比和/或比率基于ADA MTS13变体(例如Q97R ADAMTS13变体)的胰蛋白酶消化肽的峰面积相对于组合物中所有ADAMTS13蛋白和变体的峰面积之和(例如Q97R ADAMTS13变体和Q97 ADAMT S13蛋白的总和)来确定。在某些实施方式中，被测量的组合物中所有ADAMTS13蛋白和变体的胰蛋白酶消化肽对ADAMTS13变体与组合物中所有其他ADAMTS13蛋白和变体相比的至少一个氨基酸差异具有特异性。例如，可针对Q97R ADAMTS13变体测量的胰蛋白酶消化肽可以为AAGGILHLELLVAVGPDVFQAHR或AAGGILHLELLVAVGPDVFQAHR和EDTER的组合，针对Q97 ADAMTS13蛋白测量的胰蛋白酶消化肽可以为AAGGILHLELLVAVGPDVFQAHQEDTER。
在某些实施方式中，相对丰度、百分比和/或比率基于ADAMTS13变体的总重量相对于组合物中所有ADAMTS13蛋白和变体的总和重量来确定。
在各种方面，本公开的组合物通过口服施用、局部施用、经皮施用、肠胃外施用、通过吸入喷雾施用、阴道施用、直肠施用通过或颅内注射施用。如本文所用，术语肠胃外包括皮下注射、静脉注射、肌肉注射、脑池内注射或输注技术。在一些实施方式中，施用为皮下施用。也考虑通过静脉内、皮内、肌肉内、乳腺内、腹膜内、鞘内、球后、肺内注射和或手术植入特定部位来施用。在某些实施方式况下，施用为静脉施用。一般而言，组合物基本上不含热原，以及其他可能对接受者有害的杂质。
在某些实施方式中，皮下组合物通过皮下注射施用。在具体实施方式中，皮下组合物被皮下注射至患者的同一部位(例如施用至上臂、大腿前侧表面、腹部下部或上背部)以重复或连续注射。在其他实施方式中，皮下组合物被皮下注射至患者的不同部位或轮换部位。
在某些实施方式中，皮下组合物通过皮下植入装置来施用。在某些实施方式中，植入的装置提供组合物的延时释放。在某些实施方式中，植入的装置提供组合物的连续释放。
组合物或药物组合物的制剂将根据选择的施用途径而变化(例如溶液或乳剂)。含待施用组合物的合适组合物在生理学上可接受的赋形剂或载体中制备。对于溶液或乳剂，合适的载体包括例如水溶液或酒精/水溶液、乳剂或悬浮液，包括生理盐水和缓冲介质。在某些实施方式中，肠胃外载体包括氯化钠溶液、林格氏葡萄糖、葡萄糖和氯化钠、乳酸林格氏或固定油。在某些方面，静脉内载体包括各种添加剂、防腐剂或液体、营养物质或电解质补充剂。
在各种方面，可用于本公开的化合物和方法的组合物或药物组合物包含至少一种ADAMTS13变体作为活性成分，以及药学上可接受的载体或添加剂(取决于施用途径)。此种载体或添加剂的示例包括水、药学上可接受的有机溶剂、胶原蛋白、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、羧基乙烯基聚合物、羧甲基纤维素钠、聚丙烯酸钠、海藻酸钠、水溶性葡聚糖、羧甲基淀粉钠、果胶、甲基纤维素、乙基纤维素、黄原胶、阿拉伯胶、酪蛋白、明胶、琼脂、二甘油、甘油、丙二醇、聚乙二醇、凡士林、石蜡、硬脂醇、硬脂酸、人血清白蛋白(HSA)、甘露醇、山梨醇、乳糖、药学上可接受的表面活性剂等。根据剂型，所用添加剂视情况选自但不限于上述或它们的组合。
在各种方面，各种水性载体(例如水、缓冲水、0.4％生理盐水、0.3％甘氨酸或水悬浮液)包含活性化合物与适合制造水悬浮液的赋形剂的混合。此种赋形剂为悬浮剂，例如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、海藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、黄蓍胶和阿拉伯树胶；分散剂或润湿剂，在某些情况下为天然存在的磷脂(例如卵磷脂)或环氧乙烷与脂肪酸的缩合产物(例如聚氧乙烯硬脂酸酯)或环氧乙烷与长链脂肪醇的缩合产物(例如十七亚乙氧基十六醇(heptadecaethyleneoxycetanol))或环氧乙烷与衍生自脂肪酸的部分酯和己醇的缩合产物(例如聚氧乙烯山梨醇单油酸酯)或环氧乙烷与衍生自脂肪酸的部分酯和己醇酐的缩合产物(例如聚乙烯脱水山梨醇单油酸酯)。在某些实施方式中，水悬浮液含有一种以上防腐剂，例如对羟基苯甲酸乙酯或对羟基苯甲酸正丙酯。
在某些实施方式中，ADAMTS13变体或ADAMTS13变体组合物，包括具有其他ADAMTS13蛋白的组合物，被冻干以储存并在使用前在合适载体中重构。可以采用本领域已知的任何合适的冻干和重构技术。本领域的技术人员可以理解，冻干和重构会导致不同程度的蛋白质活性损失，通常调整使用水平以进行补偿。
适合通过添加水制备水悬浮液的可分散粉末和颗粒提供了与分散剂或润湿剂、悬浮液和一种以上防腐剂混合的活性化合物。合适的分散剂或润湿剂和悬浮液以上文已经提及的那些为例。
在某些实施方式中，本文提供的ADAMTS13变体组合物(包括含ADAMTS13的组合物)还可以包含一种以上药学上可接受的赋形剂、载体和/或稀释剂，如US专利申请号20110229455和/或US专利申请公开号2014/0271611(其各自通过引用整体并入本文用于所有目的)中所述。
在某些实施方式中，本文提供的ADAMTS13变体组合物，包括具有其他ADAMTS13蛋白的组合物，将具有如US专利申请公开号2011/0229455和/或US专利申请公开号2014/0271611(其各自通过引用整体并入本文用于所有目的)中所述的范围内的渗透压(tonocity)。
在一个实施方式中，本发明提供了ADAMTS13变体的组合物，包括具有其他ADAMTS13蛋白的组合物，包含治疗有效量或剂量的至少一种ADAMTS13变体或总ADAMTS13的治疗有效量、亚生理浓度至生理浓度的药学上可接受的盐、稳定浓度的一种以上糖和/或糖醇、非离子表面活性剂、缓冲剂(为组合物提供中性pH)以及可选的钙盐和/或锌盐。一般而言，本文提供的稳定的组合物适合用于药物施用。
在某些实施方式中，组合物为液体组合物。在其他实施方式中，组合物为冻干组合物，该组合物由液体组合物冻干，如US专利申请公开号2011/0229455中所述。
在某些实施方式中，ADAMTS13变体以约0.01mg/mL至约10mg/mL的治疗有效剂量提供。在某些实施方式中，ADAMTS13变体以约0.05mg/mL至约10mg/mL的治疗有效剂量提供。在其他实施方式中，ADAMTS13变体以约0.1mg/mL至约10mg/mL的浓度存在。在其他实施方式中，ADAMTS13变体以约0.1mg/mL至约5mg/mL的浓度存在。在其他实施方式中，ADAMTS13变体以约0.03mg/mL至约0.4mg/mL的浓度存在。在其他实施方式中，ADAMTS13变体以约0.1mg/mL至约2mg/mL的浓度存在。在其他实施方式中，ADAMTS13变体可以以约0.01mg/mL、约0.02mg/mL、0.03mg/mL、0.04mg/mL、0.05mg/mL、0.06mg/mL、0.07mg/mL、0.08mg/mL、0.09mg/mL、0.1mg/mL、0.2mg/mL、0.3mg/mL、0.4mg/mL、0.5mg/mL、0.6mg/mL、0.7mg/mL、0.8mg/mL、0.9mg/mL、1.0mg/mL、1.1mg/mL、1.2mg/mL、1.3mg/mL、1.4mg/mL、1.5mg/mL、1.6mg/mL、1.7mg/mL、1.8mg/mL、1.9mg/mL、2.0mg/mL、2.5mg/mL、3.0mg/mL、3.5mg/mL、4.0mg/mL、4.5mg/mL、5.0mg/mL、5.5mg/mL、6.0mg/mL、6.5mg/mL、7.0mg/mL、7.5mg/mL、8.0mg/mL、8.5mg/mL、9.0mg/mL、9.5mg/mL或10.0mg/mL以上的浓度存在。在一个实施方式中，相对纯的ADAMTS13变体的浓度可以通过光谱法(即在A280处测量总蛋白)或其他本体测定法(例如Bradford测定法、SDS-PAGE结合诸如Coomassie染色或银染色的各种染色方法、冻干粉称重等)来确定。在其他实施方式中，ADAMTS13变体的浓度可以通过ADAMTS13 ELISA测定(例如mg/mL抗原)来确定。
在某些实施方式中，ADAMTS13变体与ADAMTS13蛋白(例如野生型ADAMTS13)一起以约0.01mg/mL至约10mg/mL的总ADAMTS13(即，两者一起的总量)的治疗有效剂量提供。在某些实施方式中，ADAMTS13变体与ADAMTS13蛋白一起以约0.05mg/mL至约10mg/mL的总ADAMTS13(即，两者一起的总量)的治疗有效剂量提供。在其他实施方式中，ADAMTS13变体与ADAMTS13蛋白一起以约0.1mg/mL至约10mg/mL的浓度存在。在其他实施方式中，ADAMTS13变体与ADAMTS13蛋白一起以约0.1mg/mL至约5mg/mL的浓度存在。在其他实施方式中，ADAMTS13变体与ADAMTS13蛋白一起以约0.03mg/mL至约0.4mg/mL的浓度存在。在其他实施方式中，ADAMTS13变体与ADAMTS13蛋白一起以约0.1mg/mL至约2mg/mL的浓度存在。在其他实施方式中，ADAMTS13变体与ADAMTS13蛋白一起可以以约0.01mg/mL、0.02mg/mL、0.03mg/mL、0.04mg/mL、0.05mg/mL、0.06mg/mL、0.07mg/mL、0.08mg/mL、0.09mg/mL、0.1mg/mL、0.2mg/mL、0.3mg/mL、0.4mg/mL、0.5mg/mL、0.6mg/mL、0.7mg/mL、0.8mg/mL、0.9mg/mL、1。0mg/mL、1.1mg/mL、1.2mg/mL、1.3mg/mL、1.4mg/mL、1.5mg/mL、1.6mg/mL、1.7mg/mL、1.8mg/mL、1.9mg/mL、2.0mg/mL、2.5mg/mL、3.0mg/mL、3.5mg/mL、4.0mg/mL、4.5mg/mL、5.0mg/mL、5.5mg/mL、6.0mg/mL、6.5mg/mL、7.0mg/mL、7.5mg/mL、8.0mg/mL、8.5mg/mL、9.0mg/mL、9.5mg/mL或10.0mg/mL以上的浓度存在。在一个实施方式中，相对纯的ADAMTS13变体和ADAMTS13蛋白的浓度可以通过光谱法(即在A280处测量总蛋白)或其他本体测定法(例如Bradford测定法、银染色法、冻干粉称重等)来确定。在其他实施方式中，ADAMTS13变体和ADAMTS13蛋白的浓度可通过ADAMTS13 ELISA测定(例如mg/mL抗原)来确定。在某些实施方式中，ADAMTS13变体和ADAMTS13蛋白被单独检测(即，能彼此区分)。在某些实施方式中，ADAMTS13变体和ADAMTS13蛋白被一起检测(即，不能彼此区分)。
在其他实施方式中，本发明提供的组合物中的ADAMTS13变体和/或ADAMTS13蛋白的浓度可被表示为酶活性的水平。例如，在一个实施方式中，制剂可包含约0.01个单位的FRETS-VWF73活性至约10,000个单位的FRETS-VWF73活性或其他合适的ADAMTS13酶单位(IU)。在其他实施方式中，制剂可包含约0.1个单位的FRETS-VWF73活性至约10,000个单位的FRETS-VWF73活性或其他合适的ADAMTS13酶单位(IU)。在其他实施方式中，制剂可包含约1个单位的FRETS-VWF73活性至约10,000个单位的FRETS-VWF73活性或其他合适的ADAMTS13酶单位(IU)。在其他实施方式中，制剂可包含约10个单位的FRETS-VWF73活性至约10,000个单位的FRETS-VWF73活性或其他合适的ADAMTS13酶单位(IU)。在其他实施方式中，制剂可包含约1个单位的FRETS-VWF73(UFV73)活性至约8,000个单位的FRETS-VWF73活性，或约30UFV73至约6,000UFV73，或约40UFV73至约4,000UFV73，或约50UFV73至约3,000UFV73，或约75UFV73至约2,500UFV73，或约100UFV73至约2,000UFV73，或约200UFV73至约1,500UFV73，或其中的其他范围。在某些实施方式中，本文提供的制剂包含约20至约10,000UFV73。在某些实施方式中，制剂包含约0.01个单位的FRETS-VWF73活性，或约0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900、1,000、1,100、1,200、1,300、1,400、1,500、1,600、1,700、1,800、1,900、2,000、2,100、2,200、2,300、2,400、2,500、2,600、2,700、2,800、2,900、3,000、3,100、3,200、3,300、3,400、3,500、3,600、3,700、3,800、3,900、4,000、4,100、4,200、4,300、4,400、4,500、4,600、4,700、4,800、4,900、5,000、5,100、5,200、5,300、5,400、5,500、5,600、5,700、5,800、5,900、6,000、6,100、6,200、6,300、6,400、6,500、6,600、6,700、6,800、6,900、7,000、7,100、7,200、7,300、7,400、7,500、7,600、7,700、7,800、7,900、8,000、8,100、8,200、8,300、8,400、8,500、8,600、8,700、8,800、8,900、9,000、9,100、9,200、9,300、9,400、9,500、9,600、9,700、9800、10,000以上单位的FRETS-VWF73活性。
类似地，在某些实施方式中，ADAMTS13变体和/或ADAMTS13蛋白的浓度可以被表示为每单位体积的酶活性，例如每毫升的ADAMTS13酶单位(IU/mL)。例如，在一个实施方式中，制剂可包含约0.01IU/mL至约10,000IU/mL。在其他实施方式中，制剂可包含约0.1IU/mL至约10,000IU/mL。在其他实施方式中，制剂可包含约1IU/mL至约10,000IU/mL。在其他实施方式中，制剂可包含约10IU/mL至约10,000IU/mL。在其他实施方式中，制剂可包含约1IU/mL至约10,000IU/mL，或约20IU/mL至约8,000IU/mL，或约30IU/mL至约6,000IU/mL，或约40IU/mL至约4,000IU/mL，或约50IU/mL至约3,000IU/mL，或约75IU/mL至约2,500IU/mL，或约100IU/mL至约2,000IU/mL，或约200IU/mL至约1,500IU/mL，或其中的其他范围。在某些实施方式中，本文提供的制剂包含约150IU/mL至约600IU/mL。在某些实施方式中，本文提供的制剂包含约100IU/mL至约1,000IU/mL。在某些实施方式中，制剂包含约0.01IU/mL，或约0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900、1,000、1,100、1,200、1,300、1,400、1,500、1,600、1,700、1,800、1,900、2,000、2,100、2,200、2,300、2,400、2,500、2,600、2,700、2,800、2,900、3,000、3,100、3,200、3,300、3,400、3,500、3,600、3,700、3,800、3,900、4,000、4,100、4,200、4,300、4,400、4,500、4,600、4,700、4,800、4,900、5,000、5,100、5,200、5,300、5,400、5,500、5,600、5,700、5,800、5,900、6,000、6,100、6,200、6,300、6,400、6,500、6,600、6,700、6,800、6,900、7,000、7,100、7,200、7,300、7,400、7,500、7,600、7,700、7,800、7,900、8,000、8,100、8,200、8,300、8,400、8,500、8,600、8,700、8,800、8,900、9,000、9,100、9,200、9,300、9,400、9,500、9,600、9,700、9,800、9900或10,000以上IU/mL。
在某些实施方式中，本公开提供了ADAMTS13变体的组合物(包括含ADAMTS13的组合物)，包含US专利申请公开号2011/0229455第III部分(“ADAMTS13组合物和制剂”)中描述的示例性组合物。如US专利申请公开号2011/0229455和/或US专利申请公开号2014/0271611(其各自通过引用整体并入本文用于所有目的)中描述的ADAMTS13的生产方法及其组合物。此外，制备可肠胃外施用的组合物的实际方法和组合物为已知的或对于本领域技术人员而言是显而易见的，更详细地描述于例如Remington’s Pharmaceutical Science，第15版，Mack Publishing Company，宾夕法尼亚州伊斯顿(1980)。
在某些实施方式中，ADAMTS13变体的组合物(包括含ADAMTS13的组合物)被生产且包含添加剂。ADAMTS13变体和/或ADAMTS13蛋白的生产方法及其组合物如US专利申请公开号2011/0229455(其通过引用整体并入本文用于所有目的)第IV节和第V节所述。
在各种方面，药物组合物为无菌注射用水、油性悬浮液、分散体或无菌粉末(用于无菌注射溶液或分散体的临时制备)的形式。在某些实施方式中，悬浮液根据已知技术使用上文提及的那些合适的分散剂或润湿剂和悬浮剂进行配制。在某些方面，无菌注射制剂为在无毒的肠胃外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌注射溶液或悬浮液，例如在1,3-丁二醇中的溶液。在一些实施方式中，载体为含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)、它们的合适的混合物、植物油、林格氏溶液和等渗氯化钠溶液的溶剂或分散介质。此外，无菌固定油通常被用来作为溶剂或悬浮介质。为此，可以采用任何温和的(bland)固定油，在各种方面，包括合成的单甘油酯或双甘油酯。此外，脂肪酸(例如油酸)也可用于制备注射剂。
在所有情况下，形式必须是无菌的，并且必须是达到易于注射程度的流体。例如，通过使用包衣(例如卵磷脂)，通过保持所需的颗粒大小(在分散体的情况下)，并通过使用表面活性剂，来保持合适的流动性。它必须在生产和储存条件下保持稳定，并且必须防止微生物(例如细菌和真菌)的污染作用。防止微生物的作用通过各种抗细菌剂和抗真菌剂来实现，例如尼泊金(paraben)、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等。在许多情况下，最好包含等渗剂，例如糖类或氯化钠。在某些方面，通过在组合物中使用延迟吸收剂(例如单硬脂酸铝和明胶)来延长可注射组合物的吸收时间。
在某些方面，用于施用的组合物与摄取或吸收促进剂一起配制以增加其功效。例如，此类促进剂包括水杨酸盐、甘氨胆酸盐/亚油酸盐、羟乙酸盐、抑肽酶、杆菌肽、SDS、癸酸盐等。参见例如Fix(J.Pharm.Sci.1996，85:1282-1285)和Oliyai等(Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.1993，32:521-544)，其各自通过引用整体并入本文用于所有目的。
此外，本公开的组合物和方法中使用的组合物的亲水性和疏水性的特性被很好地平衡，从而提高它们在体外尤其是体内使用的效用，而缺乏此种平衡的其他组合物的效用明显更低。具体而言，本公开的组合物在水介质中具有合适程度的可溶性(允许在体内吸收和生物利用)，同时在脂质中也具有一定程度的可溶性(允许化合物穿过细胞膜到达假定的作用部位)。
在某些实施方式中，ADAMTS13变体和/或ADAMTS13蛋白被提供在用作药物载体、赋形剂或介质的药学上可接受(即无菌无毒)的液体、半固体或固体稀释剂中。可使用本领域内已知的任何稀释剂。示例性稀释剂包括但不限于：聚氧乙烯脱水山梨糖醇单月桂酸酯、硬脂酸镁、羟基苯甲酸甲酯和羟基苯甲酸丙酯、滑石、藻酸盐、淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、山梨醇、甘露醇、阿拉伯胶、磷酸钙、矿物油、可可脂和可可油。
组合物以便于递送的形式进行包装。组合物被封装在胶囊、胶囊片、小袋、小包、明胶、纸或其他容器内。当与递送到受体生物体中的组合物相容时，特别是当组合物以单位剂量形式递送时，这些递送形式是优选。剂量单位被包装在例如小瓶、片剂、胶囊、栓剂或小袋中。
在某些实施方式中，ADAMTS13变体和/或ADAMTS13蛋白制剂可包含亚生理盐浓度至生理盐浓度，例如0mM至约200mM的药学上可接受的盐。在一个实施方式中，ADAMTS13变体和/或ADAMTS13蛋白制剂将包含生理浓度的盐，例如约100mM至约200mM的药学上可接受的盐。在一个实施方式中，ADAMTS13变体和/或ADAMTS13蛋白制剂将包含生理浓度的盐，例如约0mM至约60mM的药学上可接受的盐。在其他实施方式中，ADAMTS13变体和/或ADAMTS13蛋白制剂将包含约0mM，或约5mM、10mM、15mM、20mM、25mM、30mM、35mM、40mM、45mM、50mM、55mM、60mM、65mM、70mM、75mM、80mM、85mM、90mM、95mM、100mM、110mM、120mM、130mM、140mM、150mM、160mM、170mM、180mM、190mM、200mM以上的药学上可接受的盐。在某些实施方式中，氯化盐为氯化钠或氯化钾。
有利地，已经发现包含亚生理浓度的药学上可接受的盐的ADAMTS13变体和/或ADAMTS13蛋白制剂形成具有光滑表面的紧凑的冻干饼(lyocake)。此外，已经发现与用生理浓度的盐制备的制剂相比，ADAMTS13变体和/或ADAMTS13蛋白蛋白质的低盐冻干制剂减少了蛋白质聚集。因此，在某些实施方式中，本发明提供了ADAMTS13变体和/或ADAMTS13蛋白的低盐制剂，其包含亚生理浓度的药学上可接受的盐(例如低于约100mM的药学上可接受的盐)。在一个实施方式中，本文提供的低盐ADAMTS13变体和/或ADAMTS13蛋白制剂包含低于约100mM的药用盐。在某些实施方式中，本文提供的低盐ADAMTS13变体和/或ADAMTS13蛋白制剂包含低于约80mM的药用盐。在某些实施方式中，本文提供的低盐ADAMTS13变体和/或野生型ADAMTS13制剂包含低于约60mM的药用盐(即约0mM至约60mM盐)。在某些实施方式中，低盐ADAMTS13制剂将包含约30mM至约60mM的药学上可接受的盐。在其他实施方式中，低盐ADAMTS13变体和/或野生型ADAMTS13制剂将包含约0mM，或约5mM、10mM、15mM、20mM、25mM、30mM、35mM、40mM、45mM、50mM、55mM、60mM、65mM、70mM、75mM、80mM、85mM、90mM、95mM或100mM的药学上可接受的盐。在某些实施方式中，低盐ADAMTS13变体和/或ADAMTS13蛋白制剂为冻干制剂。在某些实施方式中，盐为氯化钠或氯化钾。
还发现，含有适量(即约2％至约6％)的一种以上糖和/或糖醇有助于制备具有光滑表面的紧凑的冻干饼，并有助于在冻干时稳定ADAMTS13变体和/或野生型ADAMTS13。因此，在一个实施方式中，本发明提供的ADAMTS13变体和/或ADAMTS13蛋白制剂包含约2％至约6％的一种以上糖类和/或糖醇。可以使用任何糖，例如单糖、双糖或多糖，或水溶性葡聚糖，包括例如果糖、葡萄糖、甘露糖、山梨糖、木糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖、葡聚糖、海藻糖、普鲁兰多糖、糊精、环糊精、可溶性淀粉、羟乙基淀粉和羧甲基纤维素。在一个具体实施方式中，蔗糖或海藻糖被用作糖添加剂。糖醇被定义为具有约4至约8个碳原子和羟基的碳氢化合物。可用于本文提供的ADAMTS13变体和/或ADAMTS13蛋白制剂的糖醇的非限制性示例包括甘露醇、山梨醇、肌醇、半乳糖醇、卫矛醇、木糖醇和阿拉伯糖醇。在一个实施方式中，甘露醇被用作糖醇添加剂。在某些实施方式中，ADAMTS13变体和/或ADAMTS13蛋白制剂同时含有糖和糖醇添加剂。
糖和糖醇可以单独或组合使用。在一些实施方式中，糖、糖醇或它们的组合将以约0.5％至约7％的浓度存在于制剂中。在一个实施方式中，制剂中的糖和/或糖醇含量将为约0.5％至约5％。在某些实施方式中，糖、糖醇或它们的组合将以约1％至约5％的浓度存在。在某些实施方式中，糖、糖醇或它们的组合将以约2％至约6％的浓度存在。在某些实施方式中，糖、糖醇或它们的组合将以约3％至约5％的浓度存在。在某些实施方式中，最终浓度可以为约0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％、5％、5.5％、6.0％、6.5％或7.0％的糖、糖醇或它们的组合。在某些实施方式中，本文提供的制剂可包含浓度为约0.5％至约5.0％的糖和浓度为约0.5％至约5.0％的糖醇。可以使用糖浓度和糖醇浓度的任何组合，例如以约0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％、5％、5.5％、6.0％、6.5％或7.0％的浓度存在的糖以及以约0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％、5％、5.5％、6.0％、6.5％或7.0％的浓度存在的糖醇。
有利地，还发现含有非离子表面活性剂会明显减少ADAMTS13变体和/或ADAMTS13蛋白制剂的聚集。因此，在一个实施方式中，提供了含有稳定浓度的非离子去污剂的ADAMTS13变体和/或ADAMTS13蛋白制剂。可用于本发明制剂的药学上可接受的非离子表面活性剂为制药科学领域已知的，包括但不限于聚山梨酯80(吐温80)、聚山梨酯20(吐温20)和各种泊洛沙姆类或普郎尼克类，包括普朗尼克F-68和BRIJ 35或它们的混合物。在某些实施方式中，本发明药物制剂中使用的非离子表面活性剂为聚山梨酯80。在某些实施方式中，可用于本发明提供的制剂中的表面活性剂的浓度为约0.001％至约0.2％。在某些实施方式中，表面活性剂的使用浓度为约0.01％至约0.1％。在某些实施方式中，表面活性剂的使用浓度为约0.05％。例如，在某些实施方式中，制剂可包含浓度为约0.001％、0.005％、0.01％、0.02％、0.03％、0.04％、0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.09％、0.1％、0.125％、0.15％、0.175％、0.2％等的非离子表面活性剂。
此外，发现ADAMTS13变体和/或ADAMTS13蛋白制剂在约6.5至约7.5的中性pH下配制时是稳定的。因此，在某些实施方式中，提供的ADAMTS13变体和/或ADAMTS13蛋白制剂包含适合将制剂保持在中性pH的缓冲剂。药学上可接受的缓冲剂为本领域众所周知，包括但不限于磷酸盐缓冲剂、组氨酸、柠檬酸钠、HEPES、Tris、Bicine、甘氨酸、N-甘氨酰甘氨酸、乙酸钠、碳酸钠、甘氨酰甘氨酸、赖氨酸、精氨酸、磷酸钠及它们的混合物。在某些实施方式中，缓冲液选自组氨酸、磷酸盐缓冲液、HEPES和柠檬酸钠。在某些实施方式中，缓冲液为组氨酸或HEPES。在一个具体实施方式中，缓冲液为组氨酸。在另一个具体实施方式中，缓冲液为HEPES。在一个实施方式中，本文提供的制剂的pH为约6.5至约9.0。在某些实施方式中，制剂的pH为约6.5，或约6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9或9.0。在某些实施方式中，ADAMTS13变体和/或ADAMTS13蛋白制剂的pH为约6.0至约8.0。在某些实施方式中，ADAMTS13变体和/或ADAMTS13蛋白制剂的pH为约6.5至约7.5。在一个具体实施方式中，ADAMTS13变体和/或ADAMTS13蛋白制剂的pH为约7.0。在另一个具体实施方式中，ADAMTS13变体和/或ADAMTS13蛋白制剂的pH为7.0±0.2。
本文还证明，含有钙进一步稳定了ADAMTS13变体和/或ADAMTS13的制剂。因此，在某些实施方式中，提供了稳定的ADAMTS13变体和/或ADAMTS13蛋白制剂，其含有约0.5mM至约20mM的钙(例如氯化钙)。任何药学上可接受的钙盐可用于本文提供的制剂中。例如，可使用的钙盐的非限制性示例包括CaCl2、CaCO3、Ca(C6H11O7)2、Ca3(PO4)2、Ca(C18H35O2)2等。在一个实施方式中，钙以约0.5mM至约10mM的浓度存在于本发明的ADAMTS13变体和/或ADAMTS13蛋白制剂中。在其他实施方式中，钙以约2mM至约5mM的浓度存在于本发明的ADAMTS13变体和/或ADAMTS13蛋白制剂中。在某些实施方式中，钙以约2mM至约4mM的浓度存在于ADAMTS13变体和/或ADAMTS13蛋白制剂中。在某些实施方式中，钙的浓度为约0.5mM，或约1mM、2mM、3mM、4mM、5mM、6mM、7mM、8mM、9mM、10mM、11mM、12mM、13mM、14mM、15mM、16mM、17mM、18mM、19mM或20mM。在一个具体实施方式中，钙的浓度为约2mM。在其他实施方式中，钙的浓度为约3mM。在其他实施方式中，钙的浓度为约4mM。
类似地，已经发现在某些条件下含有锌进一步稳定了本文提供的ADAMTS13变体和/或ADAMTS13蛋白制剂。例如，图34显示含有约2μM至约10μM的锌可进一步稳定了含有钙的ADAMTS13变体和/或ADAMTS13蛋白制剂。任何药学上可接受的锌盐可用于本文提供的制剂中。例如，可使用的锌盐的非限制性示例包括ZnSO4·7H2O、ZnSO3·2H2O、Zn3(PO4)2和(C6H5O7)2Zn3·2H2O等。在一个实施方式中，ZnSO4用于本文提供的ADAMTS13变体和/或ADAMTS13蛋白制剂中。在一些实施方式中，锌以约0.5μM至约20.0μM的浓度存在于本发明的ADAMTS13变体和/或ADAMTS13蛋白制剂中。在某些实施方式中，锌以约0.5μM至约10.0μM的浓度包含在ADAMTS13变体和/或ADAMTS13蛋白制剂中。在某些实施方式中，锌的浓度为约0.5μM，或约1μM、2μM、3μM、4μM、5MμM、6μM、7μM、8μM、9μM或10μM。
在一个实施方式中，本文提供的ADAMTS13变体和/或ADAMTS13蛋白制剂的渗透压将为约200mOsmol/L至约400mOsmol/L，或约250至约350mOsmol/L。在某些实施方式中，本文提供的ADAMTS13变体和/或ADAMTS13蛋白制剂的渗透压将为例如约200mOsmol/L，或约210mOsmol/L、220mOsmol/L、230mOsmol/L、240mOsmol/L、250mOsmol/L、260mOsmol/L、270mOsmol/L、280mOsmol/L、290mOsmol/L、300mOsmol/L、310mOsmol/L、320mOsmol/L、330mOsmol/L、340mOsmol/L、350mOsmol/L、360mOsmol/L、370mOsmol/L、380mOsmol/L、390mOsmol/L或400mOsmol/L。
可用于本文提供的制剂中的张度剂的示例包括但不限于氯化钠、葡萄糖、蔗糖、木糖醇、果糖、甘油、山梨醇、甘露醇、海藻糖、氯化钾、甘露糖、氯化钙、氯化镁、其他无机盐、其他糖类、其他糖醇及它们的组合。在某些实施方式中，ADAMTS13变体和/或ADAMTS13蛋白制剂可包含至少一种张度剂，或至少两种、三种、四种、五种或更多种张度剂。
本文提供的ADAMTS13变体和/或ADAMTS13蛋白制剂可被配制为通过已知的方法施用，例如静脉内施用，例如作为丸剂，或通过一段时间的持续输注，通过肌肉内、腹膜内、脑脊液内、皮下、关节内、鞘内、口服、局部或吸入途径。在某些实施方式中，本文提供的ADAMTS13变体和/或ADAMTS13蛋白制剂可以全身施用或局部施用。全身施用包括但不限于：口服、真皮下、腹腔内、皮下、经鼻、舌下或直肠施用途径。局部施用包括但不限于：局部、皮下、肌肉注射和腹膜内施用途径。
在本发明的一个方面，提供了单体ADAMTS13变体和/或ADAMTS13蛋白的组合物。在某些实施方式中，单体ADAMTS13变体和/或ADAMTS13蛋白的组合物基本上不含聚集的ADAMTS13变体和/或ADAMTS13、二聚的ADAMTS13变体和/或ADAMTS13，或聚集的且二聚的ADAMTS13变体和/或ADAMTS13。在一些实施方式中，单体组合物比含有聚集的和/或二聚的ADAMTS13变体和/或ADAMTS13蛋白的类似组合物具有更高的比活。在一个具体实施方式中，单体ADAMTS13变体和/或ADAMTS13蛋白组合物通过包括凝胶过滤或尺寸排阻色谱的方法产生。在一个具体实施方式中，ADAMTS13变体和/或ADAMTS13蛋白为人ADAMTS13变体和/或ADAMTS13蛋白或重组的人ADAMTS13变体和/或ADAMTS13，或其生物活性衍生物或片段。
在某些实施方式中，本发明提供了ADAMTS13变体和/或ADAMTS13蛋白的制剂，其包含约0.01mg/mL至约10.0mg/mL的总ADAMTS13蛋白、约0mM至约200mM的药学上可接受的盐、糖和/或糖醇、非离子型表面活性剂和缓冲剂。在某些实施方式中，制剂还可以包含钙和/或锌。在其他实施方式中，制剂可被缓冲在约6.5至9.0的pH下。在某些实施方式中，ADAMTS13变体和/或ADAMTS13蛋白制剂适用于药物施用。
在某些实施方式中，本发明提供了ADAMTS13变体和/或ADAMTS13的稳定制剂，其包含：0.01mg/mL至10.0mg/mL的总ADAMTS13；0mM至200mM的药学上可接受的盐；0.5mM至20mM的钙；糖和/或糖醇；非离子表面活性剂；以及用于将pH维持在约6.5至约7.5的缓冲剂。在某些实施方式中，药学上可接受的盐为氯化钠或氯化钾。
在一个实施方式中，提供的ADAMTS13变体和/或ADAMTS13蛋白制剂包含0.01mg/mL至10.0mg/mL的总ADAMTS13；0mM至200mM的药学上可接受的盐；0.5mM至20mM的钙；糖和/或糖醇；非离子表面活性剂；以及用于将pH维持在约6.5至约7.5的缓冲剂，该制剂包含约50个单位/mL至约1000个单位/mL的ADAMTS13活性。在某些实施方式中，药学上可接受的盐为氯化钠或氯化钾。
在其他实施方式中，本发明提供了稳定的ADAMTS13变体和/或ADAMTS13蛋白制剂，其包含：0.01mg/mL至10.0mg/mL的总ADAMTS13；0mM至200mM的药学上可接受的盐；1mM至10mM的钙；糖和/或糖醇；非离子表面活性剂；以及用于将pH维持在约6.5至约7.5的缓冲剂。在某些实施方式中，制剂包含约2mM至约4mM的钙。在某些实施方式中，药学上可接受的盐为氯化钠或氯化钾。
在其他实施方式中，本发明提供了稳定的ADAMTS13变体和/或ADAMTS13蛋白制剂，其包含：0.01mg/mL至10.0mg/mL的总ADAMTS13；0mM至200mM的药学上可接受的盐；0.5mM至20mM的钙；约2％至约6％的糖和/或糖醇；非离子表面活性剂；以及用于将pH维持在约6.5至约7.5的缓冲剂。在某些实施方式中，糖和/或糖醇选自蔗糖、海藻糖、甘露醇及它们的组合。在某些实施方式中，糖和/或糖醇为蔗糖和甘露醇的混合物。在一个具体实施方式中，蔗糖和甘露醇的混合物包含约1％的蔗糖和约3％的甘露醇。在某些实施方式中，制剂包含约1mM至约10mM的钙或约2mM至约4mM的钙。在某些实施方式中，药学上可接受的盐为氯化钠或氯化钾。
在其他实施方式中，本发明提供了稳定的ADAMTS13变体和/或ADAMTS13蛋白制剂，其包含：0.01mg/mL至10.0mg/mL的总ADAMTS13；0mM至200mM的药学上可接受的盐；0.5mM至20mM的钙；糖和/或糖醇；约0.01％至0.1％的非离子表面活性剂；以及用于将pH维持在约6.5至约7.5的缓冲剂。在某些实施方式中，表面活性剂选自聚山梨酯20、聚山梨酯80、普朗尼克F-68、BRIJ35及它们的组合。在某些实施方式中，糖和/或糖醇为蔗糖和甘露醇的混合物。在一个具体实施方式中，表面活性剂为聚山梨酯80。在某些实施方式中，制剂包含约1mM至约10mM的钙或约2mM至约4mM的钙。在某些实施方式中，药学上可接受的盐为氯化钠或氯化钾。
在其他实施方式中，本发明提供了稳定的ADAMTS13变体和/或ADAMTS13蛋白制剂，其包含：0.01mg/mL至10.0mg/mL的总ADAMTS13；0mM至200mM的药学上可接受的盐；0.5mM至20mM的钙；糖和/或糖醇；非离子表面活性剂；以及用于将pH维持在约6.5至约7.5的缓冲剂，其中，缓冲剂为组氨酸或HEPES。在某些实施方式中，缓冲剂的浓度为约5mM至约100mM，或约10mM至约50mM。在其他实施方式中，制剂的pH为7.0±0.2。在某些实施方式中，制剂包含约1mM至约10mM的钙或约2mM至约4mM的钙。在某些实施方式中，药学上可接受的盐为氯化钠或氯化钾。
在其他实施方式中，本发明提供了稳定的ADAMTS13变体和/或ADAMTS13蛋白制剂，其包含：0.01mg/mL至10.0mg/mL的总ADAMTS13；0mM至200mM的药学上可接受的盐；0.5mM至20mM的钙；糖和/或糖醇；非离子表面活性剂；以及用于将pH维持在约6.5至约7.5的缓冲剂。在某些实施方式中，制剂还包含约0.5μM至约20μM的锌。在某些实施方式中，制剂包含约1mM至约10mM的钙或约2mM至约4mM的钙。在某些实施方式中，药学上可接受的盐为氯化钠或氯化钾。
在某些实施方式中，本发明提供了稳定的ADAMTS13变体和/或ADAMTS13蛋白制剂，其包含：0.01mg/mL至10.0mg/mL的总ADAMTS13；0至60mM的氯化钠；2mM至4mM的钙；2％至4％的甘露醇；0.5％至2％的蔗糖；0.025％至0.1％的聚山梨酯80；以及10mM至50mM的组氨酸(pH7.0±0.2)。在一个实施方式中，制剂还包含约0.5μM至约20μM的锌。
在其他实施方式中，提供了稳定的低盐ADAMTS13变体和/或ADAMTS13蛋白制剂，其包含：0.01mg/mL至10.0mg/mL的总ADAMTS13；低于约100mM的药学上可接受的盐；0.5mM至20mM的钙；糖和/或糖醇；非离子表面活性剂；以及用于将pH维持在约6.5至约7.5的缓冲剂。在某些实施方式中，药学上可接受的盐为氯化钠或氯化钾。在某些实施方式中，低盐ADAMTS13变体和/或ADAMTS13蛋白制剂为冻干制剂。
在一个实施方式中，提供了稳定的低盐ADAMTS13变体和/或ADAMTS13蛋白制剂，其包含：0.01mg/mL至10.0mg/mL的总ADAMTS13；低于约100mM的药学上可接受的盐；0.5mM至20mM的钙；糖和/或糖醇；非离子表面活性剂；以及用于将pH维持在约6.5至约7.5的缓冲剂，该制剂包含约50个单位/mL至约1000个单位/mL的ADAMTS13活性。在某些实施方式中，药学上可接受的盐为氯化钠或氯化钾。在某些实施方式中，低盐ADAMTS13变体和/或ADAMTS13蛋白制剂为冻干制剂。
在其他实施方式中，本发明提供了稳定的低盐ADAMTS13变体和/或ADAMTS13蛋白制剂，其包含：0.01mg/mL至10.0mg/mL的总ADAMTS13；低于约100mM的药学上可接受的盐；1mM至10mM的钙；糖和/或糖醇；非离子表面活性剂；以及用于将pH维持在约6.5至约7.5的缓冲剂。在某些实施方式中，制剂包含约2mM至约4mM的钙。在某些实施方式中，药学上可接受的盐为氯化钠或氯化钾。在某些实施方式中，低盐ADAMTS13变体和/或ADAMTS13蛋白制剂为冻干制剂。
在其他实施方式中，本发明提供了稳定的低盐ADAMTS13变体和/或ADAMTS13蛋白制剂，其包含：0.01mg/mL至10.0mg/mL的总ADAMTS13；低于约100mM的药学上可接受的盐；0.5mM至20mM的钙；约2％至约6％的糖和/或糖醇；非离子表面活性剂；以及用于将pH维持在约6.5至约7.5的缓冲剂。在某些实施方式中，糖和/或糖醇选自蔗糖、海藻糖、甘露醇及它们的组合。在某些实施方式中，糖和/或糖醇为蔗糖和甘露醇的混合物。在一个具体实施方式中，蔗糖和甘露醇的混合物包含约1％的蔗糖和约3％的甘露醇。在某些实施方式中，制剂包含约1mM至约10mM的钙或约2mM至约4mM的钙。在某些实施方式中，药学上可接受的盐为氯化钠或氯化钾。在某些实施方式中，低盐ADAMTS13变体和/或ADAMTS13蛋白制剂为冻干制剂。
在其他实施方式中，本发明提供了稳定的低盐ADAMTS13变体和/或ADAMTS13蛋白制剂，其包含：0.01mg/mL至10.0mg/mL的总ADAMTS13；低于约100mM的药学上可接受的盐；0.5mM至20mM的钙；糖和/或糖醇；约0.01％至0.1％的非离子表面活性剂；以及用于将pH维持在约6.5至约7.5的缓冲剂。在某些实施方式中，表面活性剂选自聚山梨酯20、聚山梨酯80、普朗尼克F-68、BRIJ35及它们的组合。在某些实施方式中，糖和/或糖醇为蔗糖和甘露醇的混合物。在一个具体实施方式中，表面活性剂为聚山梨酯80。在某些实施方式中，制剂包含约1mM至约10mM的钙或约2mM至约4mM的钙。在某些实施方式中，药学上可接受的盐为氯化钠或氯化钾。在某些实施方式中，低盐ADAMTS13变体和/或ADAMTS13蛋白制剂为冻干制剂。
在其他实施方式中，本发明提供了稳定的低盐ADAMTS13变体和/或ADAMTS13蛋白制剂，其包含：0.01mg/mL至10.0mg/mL的总ADAMTS13；低于约100mM的药学上可接受的盐；0.5mM至20mM的钙；糖和/或糖醇；非离子表面活性剂；以及用于将pH维持在约6.5至约7.5的缓冲剂，其中，缓冲剂为组氨酸或HEPES。在某些实施方式中，缓冲剂的浓度为约5mM至约100mM或约10mM至约50mM。在其他实施方式中，制剂的pH为7.0±0.2。在某些实施方式中，制剂包含约1mM至约10mM的钙或约2mM至约4mM的钙。在某些实施方式中，药学上可接受的盐为氯化钠或氯化钾。在某些实施方式中，低盐ADAMTS13变体和/或ADAMTS13蛋白制剂为冻干制剂。
在其他实施方式中，本发明提供了稳定的低盐ADAMTS13变体和/或ADAMTS13蛋白制剂，其包含：0.01mg/mL至10.0mg/mL的总ADAMTS13；低于约100mM的药学上可接受的盐；0.5mM至20mM的钙；糖和/或糖醇；非离子表面活性剂；以及用于将pH维持在约6.5至约7.5的缓冲剂。在某些实施方式中，制剂还包含约0.5μM至约20μM的锌。在某些实施方式中，制剂包含约1mM至约10mM的钙或约2mM至约4mM的钙。在某些实施方式中，药学上可接受的盐为氯化钠或氯化钾。在某些实施方式中，低盐ADAMTS13变体和/或ADAMTS13蛋白制剂为冻干制剂。
在某些实施方式中，本发明提供了稳定的低盐ADAMTS13变体和/或ADAMTS13蛋白制剂，其包含：0.01mg/mL至10.0mg/mL的总ADAMTS13；低于约100mM的氯化钠；2mM至4mM的钙；2％至4％的甘露醇；0.5％至2％的蔗糖；0.025％至0.1％的聚山梨酯80；以及10mM至50mM的组氨酸(pH7.0±0.2)。在一个实施方式中，制剂还包含约0.5μM至约20μM的锌。在某些实施方式中，低盐ADAMTS13变体和/或ADAMTS13蛋白制剂为冻干制剂。
在一个实施方式中，本发明提供了制剂，其包含：(a)至少0.01个单位的ADAMTS13活性(即FRETS-vWF73活性)/mg ADAMTS13变体或ADAMTS13变体和ADAMTS13的组合(即总ADAMTS13)；(b)0mM至200mM的药学上可接受的盐；(c)0.5mM至20mM的钙；(d)糖和/或糖醇；(e)非离子表面活性剂；以及(f)用于将pH维持在约6.0至约8.0的缓冲剂。在一个实施方式中，ADAMTS13变体和/或ADAMTS13蛋白的稳定制剂包含至少10个单位的ADAMTS13活性/mg总ADAMTS13。在一个实施方式中，ADAMTS13变体和/或ADAMTS13蛋白的稳定制剂包含至少100个单位的ADAMTS13活性/mg总ADAMTS13。在一个实施方式中，制剂包含至少200个单位的ADAMTS13活性/mg ADAMTS13变体或ADAMTS13变体和ADAMTS13的组合(即总ADAMTS13)。在其他实施方式中，ADAMTS13变体和/或ADAMTS13蛋白的稳定制剂包含至少400个单位的ADAMTS13活性/mg总ADAMTS13。在某些实施方式中，ADAMTS13变体和/或ADAMTS13蛋白的稳定制剂包含至少600个单位的ADAMTS13活性/mg总ADAMTS13。在更多的实施方式中，ADAMTS13变体和/或ADAMTS13蛋白的稳定制剂包含至少800个单位的ADAMTS13活性/mg总ADAMTS13。在其他实施方式中，ADAMTS13变体和/或ADAMTS13蛋白的稳定制剂包含至少1000个单位的ADAMTS13活性/mg总ADAMTS13。在一个实施方式中，ADAMTS13变体和/或ADAMTS13蛋白的稳定制剂包含约100个单位至约2000个单位的ADAMTS13活性/mg总ADAMTS13。在某些实施方式中，制剂为冻干制剂，由本文所述的液体制剂冻干得到。
在稳定的ADAMTS13变体和/或ADAMTS13蛋白制剂的一个实施方式中，制剂包含约1.0mM至约10.0mM的钙。在某些实施方式中，制剂包含约2.0至约4.0mM的钙。
在稳定的ADAMTS13变体和/或ADAMTS13蛋白制剂的其他实施方式中，制剂包含约2％至约6％的糖和/或糖醇。在某些实施方式中，制剂包含约3％至约5％的糖和/或糖醇。在一个具体实施方式中，制剂包含约4％的糖和/或糖醇。在一个实施方式中，糖和/或糖醇选自蔗糖、海藻糖、甘露醇及它们的组合。在某些实施方式中，糖和/或糖醇为蔗糖和甘露醇的混合物。
在稳定的ADAMTS13变体和/或ADAMTS13蛋白制剂的一个实施方式中，制剂包含约0.01％至约0.1％的非离子表面活性剂。在某些实施方式中，制剂包含约0.05％的非离子表面活性剂。在一个实施方式中，表面活性剂选自聚山梨酯20、聚山梨酯80、普朗尼克F-68和BRIJ35。在某些实施方式中，表面活性剂为聚山梨酯80。
在稳定的ADAMTS13变体和/或ADAMTS13蛋白制剂的一个实施方式中，制剂包含约5mM至约100mM的缓冲剂。在某些实施方式中，制剂包含约10mM至约50mM的缓冲剂。在其他实施方式中，缓冲剂为组氨酸或HEPES。在某些实施方式中，缓冲剂为组氨酸。在一个实施方式中，制剂的pH为约6.5和7.5。在某些实施方式中，制剂的pH为7.0±0.2。
在稳定的ADAMTS13变体和/或ADAMTS13蛋白制剂的一个实施方式中，制剂还包含约0.5μM至20μM的锌。
在一个具体实施方式中，本发明提供了ADAMTS13变体和/或ADAMTS13蛋白的稳定制剂，其包含：(a)至少0.01个单位的ADAMTS13活性/mg总ADAMTS13；(b)0至200mM的氯化钠；(c)2mM至4mM的钙；(d)2％至4％的甘露醇；(e)0.5％至2％的蔗糖；(f)0.025％至0.1％的聚山梨酯80；以及(g)10mM至50mM的组氨酸(pH7.0±0.2)。
在一个实施方式中，本发明提供了制剂，其包含：(a)至少0.01个单位的ADAMTS13活性(即FRETS-vWF73活性)/mg ADAMTS13变体或ADAMTS13变体和ADAMTS13的组合(即总ADAMTS13)；(b)0mM至100mM的药学上可接受的盐；(c)0.5mM至20mM的钙；(d)糖和/或糖醇；(e)非离子表面活性剂；以及(f)用于将pH维持在约6.0至约8.0的缓冲剂。在一个实施方式中，ADAMTS13变体和/或ADAMTS13蛋白的稳定制剂包含至少10个单位的ADAMTS13活性/mg总ADAMTS13。在一个实施方式中，ADAMTS13变体和/或ADAMTS13蛋白的稳定制剂包含至少100个单位的ADAMTS13活性/mg总ADAMTS13。在一个实施方式中，制剂包含至少200个单位的ADAMTS13活性/mg总ADAMTS13。在其他实施方式中，制剂包含至少400个单位的ADAMTS13活性/mg总ADAMTS13。在其他实施方式中，制剂包含至少600个单位的ADAMTS13活性/mg总ADAMTS13。在其他实施方式中，制剂包含至少800个单位的ADAMTS13活性/mg总ADAMTS13。在其他实施方式中，制剂包含至少1000个单位的ADAMTS13活性/mg总ADAMTS13。在一个实施方式中，制剂包含约100个单位至约2000个单位的ADAMTS13活性/mg总ADAMTS13。在某些实施方式中，制剂为冻干制剂，由本文所述的液体制剂冻干得到。
在一个实施方式中，制剂包含约1.0mM至约10.0mM的钙。在其他实施方式中，制剂包含约2.0至约4.0mM的钙。
在其他实施方式中，制剂包含约2％至约6％的糖和/或糖醇。在其他实施方式中，制剂包含约3％至约5％的糖和/或糖醇。在某些实施方式中，制剂包含约4％的糖和/或糖醇。在某些实施方式中，糖和/或糖醇选自蔗糖、海藻糖、甘露醇及它们的组合。在其他实施方式中，糖和/或糖醇为蔗糖和甘露醇的混合物。
在其他实施方式中，制剂包含约0.01％至约0.1％的非离子表面活性剂。在其他实施方式中，制剂包含约0.05％的非离子表面活性剂。在某些实施方式中，表面活性剂选自聚山梨酯20、聚山梨酯80、普朗尼克F-68和BRIJ35。在其他实施方式中，表面活性剂为聚山梨酯80。
在其他实施方式中，制剂包含约5mM至约100mM的缓冲剂。在其他实施方式中，制剂包含约10mM至约50mM的缓冲剂。在某些实施方式中，缓冲剂为组氨酸或HEPES。在其他实施方式中，缓冲剂为组氨酸。在其他实施方式中，制剂的pH为约6.5和7.5。在其他实施方式中，制剂的pH为7.0±0.2。
在其他实施方式中，制剂还包含约0.5μM至20μM的锌。
在某些实施方式中，本发明提供了ADAMTS13变体和/或野生型ADAMTS13的制剂，其包含：(a)至少0.01个单位的ADAMTS13活性/mg ADAMTS13变体或ADAMTS13变体和ADAMTS13的组合(即总ADAMTS13)；(b)0至200mM的氯化钠；(c)2mM至4mM的钙；(d)2％至4％的甘露醇；(e)0.5％至2％的蔗糖；(f)0.025％至0.1％的聚山梨酯80；以及(g)10mM至50mM的组氨酸(pH7.0±0.2)。在一个实施方式中，ADAMTS13变体和/或ADAMTS13蛋白的稳定制剂包含至少10个单位的ADAMTS13活性/mg总ADAMTS13。在一个实施方式中，ADAMTS13变体和/或ADAMTS13蛋白的稳定制剂包含至少100个单位的ADAMTS13活性/mg总ADAMTS13。
在某些实施方式中，本发明提供了ADAMTS13变体和/或ADAMTS13蛋白的制剂，其包含：(a)至少0.01个单位的ADAMTS13活性/mg ADAMTS13变体或总ADAMTS13；(b)0至100mM的NaCl；(c)2mM至4mM的钙；(d)2％至4％的甘露醇；(e)0.5％至2％的蔗糖；(f)0.025％至0.1％的聚山梨酯80；以及(g)10mM至50mM的组氨酸(pH7.0±0.2)。在一个实施方式中，ADAMTS13变体和/或ADAMTS13蛋白的稳定制剂包含至少10个单位的ADAMTS13活性/mg总ADAMTS13。在一个实施方式中，ADAMTS13变体和/或ADAMTS13蛋白的稳定制剂包含至少100个单位的ADAMTS13活性/mg总ADAMTS13。
在其他实施方式中，本发明提供了ADAMTS13变体和/或ADAMTS13蛋白的制剂，其包含：(a)至少0.01个单位的ADAMTS13活性/mg ADAMTS13变体或总ADAMTS13；(b)0至60mM的NaCl；(c)2mM至4mM的钙；(d)2％至4％的甘露醇；(e)0.5％至2％的蔗糖；(f)0.025％至0.1％的聚山梨酯80；以及(g)10mM至50mM的组氨酸(pH7.0±0.2)。在一个实施方式中，ADAMTS13变体和/或ADAMTS13蛋白的稳定制剂包含至少10个单位的ADAMTS13活性/mg总ADAMTS13。在一个实施方式中，ADAMTS13变体和/或ADAMTS13蛋白的稳定制剂包含至少100个单位的ADAMTS13活性/mg总ADAMTS13。
在其他实施方式中，本发明提供了ADAMTS13变体和/或ADAMTS13蛋白的冻干制剂，其中，该制剂由液体制剂冻干得到，该液体制剂包含：(a)至少0.01个单位的ADAMTS13活性/mg ADAMTS13变体或总ADAMTS13；(b)0至200mM的氯化钠；(c)2mM至4mM的钙；(d)2％至4％的甘露醇；(e)0.5％至2％的蔗糖；(f)0.025％至0.1％的聚山梨酯80；以及(g)10mM至50mM的组氨酸(pH7.0±0.2)。在一个实施方式中，ADAMTS13变体和/或ADAMTS13蛋白的稳定制剂包含至少10个单位的ADAMTS13活性/mg总ADAMTS13。在一个实施方式中，ADAMTS13变体和/或ADAMTS13蛋白的稳定制剂包含至少100个单位的ADAMTS13活性/mg总ADAMTS13。
在其他实施方式中，本发明提供了ADAMTS13变体和/或ADAMTS13蛋白的冻干制剂，其中，该制剂由液体制剂冻干得到，该液体制剂包含：(a)至少0.01个单位的ADAMTS13活性/mg ADAMTS13变体或总ADAMTS13；(b)0至100mM的氯化钠；(c)2mM至4mM的钙；(d)2％至4％的甘露醇；(e)0.5％至2％的蔗糖；(f)0.025％至0.1％的聚山梨酯80；以及(g)10mM至50mM的组氨酸(pH7.0±0.2)。在一个实施方式中，ADAMTS13变体和/或ADAMTS13蛋白的稳定制剂包含至少10个单位的ADAMTS13活性/mg总ADAMTS13。在一个实施方式中，ADAMTS13变体和/或ADAMTS13蛋白的稳定制剂包含至少100个单位的ADAMTS13活性/mg总ADAMTS13。
在其他实施方式中，本发明提供了ADAMTS13变体和/或ADAMTS13蛋白的低盐冻干制剂，其中，该制剂由液体制剂冻干得到，该液体制剂包含：(a)至少0.01个单位的ADAMTS13活性/mg ADAMTS13变体或总ADAMTS13；(b)0至60mM的氯化钠；(c)2mM至4mM的钙；(d)2％至4％的甘露醇；(e)0.5％至2％的蔗糖；(f)0.025％至0.1％的聚山梨酯80；以及(g)10mM至50mM的组氨酸(pH7.0±0.2)。在一个实施方式中，ADAMTS13变体和/或ADAMTS13蛋白的稳定制剂包含至少10个单位的ADAMTS13活性/mg总ADAMTS13。在一个实施方式中，ADAMTS13变体和/或ADAMTS13蛋白的稳定制剂包含至少100个单位的ADAMTS13活性/mg总ADAMTS13。
IV.治疗方法
本文所述的组合物可用于治疗性或预防性治疗。一般而言，对于治疗性应用，将组合物以“治疗有效剂量”施用于患有与ADAMTS13或VWF功能障碍相关的疾病或病况的受试者，或其他有此需要的受试者。在某些实施方式中，本文所述的组合物被用于治疗和预防血栓性疾病和病况。在某些实施方式中，本文所述的组合物用于治疗和预防梗死。对这些用途有效的组合物和量将取决于疾病或病况的严重程度和患者的一般健康状态。可以根据患者需要和耐受的剂量和频率，单次或多次施用该组合物。
在一个实施方式中，ADAMTS13变体单独或与ADAMTS13蛋白一起(即总ADAMTS13)以0.01UFV73/kg体重(即IU/kg体重)至10000UFV73/kg体重(即IU/kg体重)的总ADAMTS13的剂量施用。在一个实施方式中，ADAMTS13变体单独或与ADAMTS13蛋白一起以0.1UFV73/kg体重至10000UFV73/kg体重的剂量施用。在一个实施方式中，ADAMTS13变体单独或与ADAMTS13蛋白一起以0.1UFV73/kg体重至6000UFV73/kg体重、0.1UFV73/kg体重至5000UFV73/kg体重、0.1UFV73/kg体重至4000UFV73/kg体重、0.1UFV73/kg体重至3000UFV73/kg体重、0.1UFV73/kg体重至2000UFV73/kg体重、0.1UFV73/kg体重至1000UFV73/kg体重、0.1UFV73/kg体重至500UFV73/kg体重、0.1UFV73/kg体重至200UFV73/kg体重、0.1UFV73/kg体重至160UFV73/kg体重、0.1UFV73/kg体重至100UFV73/kg体重、0.1UFV73/kg体重至80UFV73/kg体重、0.1UFV73/kg体重至40UFV73/kg体重、0.1UFV73/kg体重至20UFV73/kg体重或0.1UFV73/kg体重至10UFV73/kg体重的剂量施用。在一个实施方式中，ADAMTS13变体单独或与ADAMTS13蛋白一起以1UFV73/kg体重至10000UFV73/kg体重、1UFV73/kg体重至6000UFV73/kg体重、1UFV73/kg体重至5000UFV73/kg体重、1UFV73/kg体重至4000UFV73/kg体重、1UFV73/kg体重至3000UFV73/kg体重、1UFV73/kg体重至2000UFV73/kg体重、1UFV73/kg体重至1000UFV73/kg体重、1UFV73/kg体重至500UFV73/kg体重、1UFV73/kg体重至200UFV73/kg体重、1UFV73/kg体重至160UFV73/kg体重、1UFV73/kg体重至100UFV73/kg体重、1UFV73/kg体重至80UFV73/kg体重、1UFV73/kg体重至40UFV73/kg体重、1UFV73/kg体重至20UFV73/kg体重或1UFV73/kg体重至10UFV73/kg体重的剂量施用。在一个实施方式中，ADAMTS13变体单独或与ADAMTS13蛋白一起以5UFV73/kg体重至10000UFV73/kg体重、5UFV73/kg体重至6000UFV73/kg体重、5UFV73/kg体重至5000UFV73/kg体重、5UFV73/kg体重至4000UFV73/kg体重、5UFV73/kg体重至3000UFV73/kg体重、5UFV73/kg体重至2000UFV73/kg体重、5UFV73/kg体重至1000UFV73/kg体重、5UFV73/kg体重至500UFV73/kg体重、5UFV73/kg体重至200UFV73/kg体重、5UFV73/kg体重至160UFV73/kg体重、或5UFV73/kg体重至100UFV73/kg体重、5UFV73/kg体重至80UFV73/kg体重、5UFV73/kg体重至40UFV73/kg体重、5UFV73/kg体重至20UFV73/kg体重或5UFV73/kg体重至10UFV73/kg体重。在一个实施方式中，ADAMTS13变体单独或与ADAMTS13蛋白一起以10UFV73/kg体重至10000UFV73/kg体重、10UFV73/kg体重至6000UFV73/kg体重、10UFV73/kg体重至5000UFV73/kg体重、10UFV73/kg体重至4000UFV73/kg体重、10UFV73/kg体重至3000UFV73/kg体重、10UFV73/kg体重至2000UFV73/kg体重、10UFV73/kg体重至1000UFV73/kg体重、10UFV73/kg体重至500UFV73/kg体重、10UFV73/kg体重至200UFV73/kg体重、10UFV73/kg体重至160UFV73/kg体重、10UFV73/kg体重至100UFV73/kg体重、10UFV73/kg体重至80UFV73/kg体重、10UFV73/kg体重至40UFV73/kg体重或10UFV73/kg体重至20UFV73/kg体重的剂量施用。在一个实施方式中，ADAMTS13变体单独或与ADAMTS13蛋白一起以20UFV73/kg体重至10000UFV73/kg体重、20UFV73/kg体重至6000UFV73/kg体重、20UFV73/kg体重至5000UFV73/kg体重、20UFV73/kg体重至4000UFV73/kg体重、20UFV73/kg体重至3000UFV73/kg体重、20UFV73/kg体重至2000UFV73/kg体重、20UFV73/kg体重至1000UFV73/kg体重、20UFV73/kg体重至500UFV73/kg体重、20UFV73/kg体重至200UFV73/kg体重、20UFV73/kg体重至160UFV73/kg体重、20UFV73/kg体重至100UFV73/kg体重、20UFV73/kg体重至80UFV73/kg体重或20UFV73/kg体重至40UFV73/kg体重的剂量施用。在一个实施方式中，ADAMTS13变体单独或与ADAMTS13蛋白一起以25UFV73/kg体重至10000UFV73/kg体重、25UFV73/kg体重至6000UFV73/kg体重、25UFV73/kg体重至5000UFV73/kg体重、25UFV73/kg体重至4000UFV73/kg体重、25UFV73/kg体重至3000UFV73/kg体重、25UFV73/kg体重至2000UFV73/kg体重、25UFV73/kg体重至1000UFV73/kg体重、25UFV73/kg体重至500UFV73/kg体重、25UFV73/kg体重至400UFV73/kg体重、25UFV73/kg体重至200UFV73/kg体重、25UFV73/kg体重至160UFV73/kg体重、25UFV73/kg体重至100UFV73/kg体重、25UFV73/kg体重至80UFV73/kg体重或25UFV73/kg体重至40UFV73/kg体重的剂量施用。在一个实施方式中，ADAMTS13变体单独或与ADAMTS13蛋白一起以40UFV73/kg体重至10000UFV73/kg体重、40UFV73/kg体重至6000UFV73/kg体重、40UFV73/kg体重至5000UFV73/kg体重、40UFV73/kg体重至4000UFV73/kg体重、40UFV73/kg体重至3000UFV73/kg体重、40UFV73/kg体重至2000UFV73/kg体重、40UFV73/kg体重至1000UFV73/kg体重、40UFV73/kg体重至500UFV73/kg体重、40UFV73/kg体重至200UFV73/kg体重、40UFV73/kg体重至160UFV73/kg体重、40UFV73/kg体重至100UFV73/kg体重或40UFV73/kg体重至80UFV73/kg体重的剂量施用。在一个实施方式中，ADAMTS13变体单独或与ADAMTS13蛋白一起以50UFV73/kg体重至10000UFV73/kg体重、50UFV73/kg体重至6000UFV73/kg体重、50UFV73/kg体重至5000UFV73/kg体重、50UFV73/kg体重至4000UFV73/kg体重、50UFV73/kg体重至3000UFV73/kg体重、50UFV73/kg体重至2000UFV73/kg体重、50UFV73/kg体重至1000UFV73/kg体重、50UFV73/kg体重至500UFV73/kg体重、50UFV73/kg体重至200UFV73/kg体重、50UFV73/kg体重至160UFV73/kg体重或50UFV73/kg体重至100UFV73/kg体重的剂量施用。在一个实施方式中，ADAMTS13变体单独或与ADAMTS13蛋白一起以100UFV73/kg体重至10000UFV73/kg体重、100UFV73/kg体重至6000UFV73/kg体重、100UFV73/kg体重至5000UFV73/kg体重、100UFV73/kg体重至4000UFV73/kg体重、100UFV73/kg体重至3000UFV73/kg体重、100UFV73/kg体重至2000UFV73/kg体重、100UFV73/kg体重至1000UFV73/kg体重、100UFV73/kg体重至500UFV73/kg体重、100UFV73/kg体重至200UFV73/kg体重或100UFV73/kg体重至160UFV73/kg体重的剂量施用。
类似地，在某些实施方式中，ADAMTS13变体和/或ADAMTS13蛋白以约0.01UFV73/kg体重(即IU/kg体重)至约10,000UFV73/kg体重的总ADAMTS13的剂量施用。在其他实施方式中，剂量可以为约1UFV73/kg体重至约10,000UFV73/kg体重，或约20UFV73/kg体重至约8,000UFV73/kg体重，或约30UFV73/kg体重至约6,000UFV73/kg体重，或约40UFV73/kg体重至约4,000UFV73/kg体重，或约50UFV73/kg体重至约3000UFV73/kg体重，或约75UFV73/kg体重至约2500UFV73/kg体重，或约100UFV73/kg体重至约2000UFV73/kg体重，或约200UFV73/kg体重至约1500UFV73/kg体重的总ADAMTS13，或其中的其他范围。在某些实施方式中，剂量可以为约150UFV73/kg体重至约600UFV73/kg体重。在某些实施方式中，剂量可以为约100UFV73/kg体重至约1,000UFV73/kg体重的总ADAMTS13。在某些实施方式中，剂量可以为约0.01UFV73/kg体重，或约0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、160、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900、1,000、1,100、1,200、1,300、1,400、1,500、1,600、1,700、1,800、1,900、2,000、2,100、2,200、2,300、2,400、2,500、2,600、2,700、2,800、2,900、3,000、3,100、3,200、3,300、3,400、3,500、3,600、3,700、3,800、3,900、4,000、4,100、4,200、4,300、4,400、4,500、4,600、4,700、4,800、4,900、5,000、5,100、5,200、5,300、5,400、5,500、5,600、5,700、5,800、5,900、6,000、6,100、6,200、6,300、6,400、6,500、6,600、6,700、6,800、6,900、7,000、7,100、7,200、7,300、7,400、7,500、7,600、7,700、7,800、7,900、8,000、8,100、8,200、8,300、8,400、8,500、8,600、8,700、8,800、8,900、9,000、9,100、9,200、9,300、9,400、9,500、9,600、9,700、9800或10,000以上UFV73/kg体重。
在其他实施方式中，ADAMTS13变体单独或与ADAMTS13蛋白一起(即总ADAMTS13)以约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900、1,000、1,100、1,200、1,300、1,400、1,500、1,600、1,700、1,800、1,900、2,000、2,100、2,200、2,300、2,400、2,500、2,600、2,700、2,800、2,900、3,000、3,100、3,200、3,300、3,400、3,500、3,600、3,700、3,800、3,900、4,000、4,100、4,200、4,300、4,400、4,500、4,600、4,700、4,800、4,900、5,100、5,200、5,300、5,400、5,500、5,600、5,700、5,800、5,900或6,000UFV73/kg体重或其中间浓度或中间浓度范围施用。在某些实施方式中，ADAMTS13变体单独或与ADAMTS13蛋白一起(即总ADAMTS13)以约10、20、40、80或160UFV73/kg体重施用。
在某些实施方式中，本公开提供了治疗或预防疾病或病况的方法，该方法包括向有此需要的受试者施用本文提供组合物中任一种的组合物。
在一些实施方式中，ADAMTS13变体包含SEQ ID NO：2中所示的氨基酸序列或与SEQID NO：2具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性同时仍保留R97的变体。在某些实施方式中，编码ADAMTS13变体的核苷酸序列包含编码SEQ ID NO：2中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO：2具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性同时仍保留R97的变体的核苷酸序列。在某些实施方式中，ADAMTS13变体包含SEQ ID NO：2中所示的氨基酸序列。在某些实施方式中，ADAMTS13变体由SEQ ID NO：2中所示的氨基酸序列组成。在某些实施方式中，ADAMTS13变体基本上由SEQ ID NO：2中所示的氨基酸序列组成。
在一些实施方式中，ADAMTS13蛋白包含SEQ ID NO：1中所示的氨基酸序列或与SEQID NO：1具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的序列。在某些实施方式中，编码ADAMTS13蛋白的核苷酸序列包含编码SEQ ID NO：1的氨基酸序列或与SEQ ID NO：2具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的序列的核苷酸序列。在某些实施方式中，ADAMTS13蛋白包含SEQ ID NO：1中所示的氨基酸序列。在某些实施方式中，ADAMTS13蛋白由SEQ ID NO：1中所示的氨基酸序列组成。在某些实施方式中，ADAMTS13蛋白基本上由SEQ ID NO：1中所示的氨基酸序列组成。
在某些实施方式中，ADAMTS13变体或其组合物(包括含ADAMTS13的组合物)被施用给受试者以治疗或预防疾病或病况。例如，ADAMTS13变体(与或不与ADAMTS13蛋白一起)以单次弹丸式注射或多剂量施用，以维持对治疗或预防疾病或病况有效的总ADAMTS13的循环水平。在这些方面，包含ADAMTS13变体或其组合物的组合物(包括含ADAMTS13的组合物)被每月一次、每两周一次、每周一次、每周两次、每两天一次、每天一次、每12小时一次、每8小时一次、每6小时一次、每4小时一次、每2小时一次或每小时一次地施用。在特定方面，注射剂被皮下施用。在其他方面，注射剂被静脉内施用。
在某些实施方式中，ADAMTS13变体或其组合物(包括含ADAMTS13的组合物)在发现疾病或病况时立即施用，例如在5分钟内、10分钟内、15分钟内、20分钟内、25分钟内、30分钟内、35分钟内、40分钟内、45分钟内、50分钟内、55分钟内、60分钟内、90分钟内、110分钟内、120分钟内、3小时内、4小时内、5小时内、6小时内、7小时内、8小时内、9小时内、10小时内、11小时内、12小时内、13小时内、14小时内、15小时内、16小时内、17小时内、18小时内、19小时内、20小时内、21小时内、22小时内、23小时内、24小时内、25小时内或更长时间内或它们的任何组合。
在某些实施方式中，与归一化为相同剂量的静脉施用相比，ADAMTS13变体和/或ADAMTS13蛋白皮下施用后的生物利用度为至少约40％、或至少约45％、或至少约50％、或至少约51％、或至少约52％、或至少约53％、或至少约54％、或至少约55％、或至少约56％、或至少约57％、或至少约58％、或至少约59％、或至少约60％、或至少约61％、或至少约62％、或至少约63％、或至少约64％、或至少约65％、或至少约66％、或至少约67％、或至少约68％、或至少约69％、或至少约70％、或至少约71％、或至少约72％、或至少约73％、或至少约74％、或至少约75％、或至少约76％、或至少约77％、或至少约78％、或至少约79％、或至少约80％、或至少约81％、或至少约82％、或至少约83％、或至少约84％、或至少约85％。
在某些实施方式中，与归一化为相同剂量的静脉施用相比，ADAMTS13变体和/或ADAMTS13蛋白皮下施用后的生物利用度为约30％至约90％，或约80％或约50％。在某些实施方式中，与归一化为相同剂量的静脉施用相比，ADAMTS13变体和/或ADAMTS13蛋白皮下施用后的生物利用度为约60％至约80％。在某些实施方式中，与归一化为相同剂量的静脉施用相比，ADAMTS13变体和/或ADAMTS13蛋白皮下施用后的生物利用度为约50％至约70％。在某些实施方式中，与归一化为相同剂量的静脉施用相比，ADAMTS13变体和/或ADAMTS13蛋白皮下施用后的生物利用度为约55％至约70％。在某些实施方式中，与归一化为相同剂量的静脉施用相比，ADAMTS13变体和/或ADAMTS13蛋白皮下施用后的生物利用度为约55％至约65％。在某些实施方式中，与归一化为相同剂量的静脉施用相比，ADAMTS13变体和/或ADAMTS13蛋白皮下施用后的生物利用度为约65％。
在某些实施方式中，与归一化为相同剂量的静脉施用相比，ADAMTS13变体和/或ADAMTS13蛋白皮下施用后的生物利用度为约65％。因此，在某些实施方式中，如果总ADAMTS13的治疗有效量通过静脉施用包含至少20至160个国际单位/千克体重(IU/kg)且生物利用度为65％，如果采用±15％的变化范围，则在皮下施用时将有40％至80％的生物利用度，结果是25至400个国际单位。
在某些实施方式中，本公开提供了一种治疗或预防具有血栓形成和/或存在血栓的疾病或病况的方法，该方法包括向有此需要的受试者施用本文提供的组合物中任一种的组合物。
在某些实施方式中，本公开提供了治疗或预防例如但不限于凝血障碍(例如遗传性TTP、获得性TTP、梗死、脑梗死、心肌梗死、缺血/再灌注损伤、深静脉血栓形成(DVT)、败血症相关的弥散性血管内凝血(DIC))、出血发作(例如与遗传性TTP、获得性TTP、心肌梗死、脑梗死、缺血再灌注损伤相关的出血发作)、心肌梗死、脑梗死、深静脉血栓形成、缺血/再灌注损伤、DIC、镰状细胞疾病、血管闭塞危象、急性肺损伤、急性呼吸窘迫综合征、肝病(例如肝衰竭、门静脉血栓形成和Budd-Chiari综合征)、肾脏疾病(例如溶血性尿毒症综合征和肾静脉血栓形成)、受试者体内器官移植排斥的方法，该方法包括向有此需要的受试者施用治疗有效量的ADAMTS13变体或其组合物(包括含ADAMTS13的组合物)。
在某些实施方式中，本公开提供了治疗或预防受试者的凝血障碍的方法，该方法包括向其有此需要的受试者施用治疗有效量的ADAMTS13变体或其组合物(包括含ADAMTS13的组合物)。在本文提供的方法的某些实施方式中，凝血障碍包括但不限于遗传性TTP、获得性TTP、梗死、脑梗死、心肌梗死、缺血/再灌注损伤、深静脉血栓形成(DVT)和败血症相关的弥散性血管内凝血(DIC)。在本文提供的方法的一个实施方式中，凝血障碍为遗传性TTP。在本文提供的方法的一个实施方式中，凝血障碍为获得性TTP。
在某些实施方式中，ADAMTS13变体或其组合物(包括含ADAMTS13的组合物)被施用给受试者以治疗或预防凝血障碍。例如，ADAMTS13变体(与或不与ADAMTS13蛋白一起)以单次弹丸式注射或多剂量施用，以维持对治疗或预防凝血障碍有效的总ADAMTS13的循环水平。在这些方面，包含ADAMTS13变体或其组合物的组合物(包括含ADAMTS13的组合物)被每月一次、每两周一次、每周一次、每周两次、每两天一次、每天一次、每12小时一次、每8小时一次、每6小时一次、每4小时一次、每2小时一次或每小时一次地施用。在特定方面，注射剂被皮下施用。在其他方面，注射剂被静脉内施用。
在某些实施方式中，ADAMTS13变体或其组合物(包括含ADAMTS13的组合物)在发现凝血障碍时立即施用，例如在5分钟内、10分钟内、15分钟内、20分钟内、25分钟内、30分钟内、35分钟内、40分钟内、45分钟内、50分钟内、55分钟内、60分钟内、90分钟内、110分钟内、120分钟内、3小时内、4小时内、5小时内、6小时内、7小时内、8小时内、9小时内、10小时内、11小时内、12小时内、13小时内、14小时内、15小时内、16小时内、17小时内、18小时内、19小时内、20小时内、21小时内、22小时内、23小时内、24小时内、25小时或更长时间内或它们的任何组合。
在一个方面，本公开提供了治疗受试者的出血发作的方法，该方法包括向有此需要的受试者施用治疗有效量的ADAMTS13变体或其组合物(包括含ADAMTS13的组合物)。在某些实施方式中，出血发作与遗传性TTP、获得性TTP、梗死、心肌梗死、脑梗死和/或缺血再灌注损伤有关。
在某些实施方式中，将ADAMTS13变体或其组合物(包括含ADAMTS13的组合物)施用给受试者以治疗或预防出血发作。例如，ADAMTS13变体(与或不与ADAMTS13蛋白一起)以单次弹丸式注射或多剂量施用，以维持对治疗或预防出血发作有效的总ADAMTS13的循环水平。在这些方面，包含ADAMTS13变体或其组合物的组合物(包括含ADAMTS13的组合物)被每月一次、每两周一次、每周一次、每周两次、每两天一次、每天一次、每12小时一次、每8小时一次、每6小时一次、每4小时一次、每2小时一次或每小时一次地施用。在特定方面，注射剂被皮下施用。在其他方面，注射剂被静脉内施用。
在某些实施方式中，ADAMTS13变体或其组合物(包括含ADAMTS13的组合物)在发现出血发作时立即施用，例如在5分钟内、10分钟内、15分钟内、20分钟内、25分钟内、30分钟内、35分钟内、40分钟内、45分钟内、50分钟内、55分钟内、60分钟内、90分钟内、110分钟内、120分钟内、3小时内、4小时内、5小时内、6小时内、7小时内、8小时内、9小时内、10小时内、11小时内、12小时内、13小时内、14小时内、15小时内、16小时内、17小时内、18小时内、19小时内、20小时内、21小时内、22小时内、23小时内、24小时内、25小时或更长时间内或它们的任何组合。
在某些实施方式中，本公开提供了治疗或预防遗传性TTP的方法。遗传性TTP由于ADAMTS13基因的遗传突变所致。遗传性TTP可导致神经系统临床表现(例如精神状态、中风、癫痫发作、偏瘫、麻痹、视觉障碍和失语)、疲劳和严重出血。如果不进行治疗，获得性TTP可能致命或可能造成持久性生理损害。此外，由于遗传性TTP由基因突变引起，因此需要终身治疗，并要求患者依从。
在一个实施方式中，本公开提供了一种治疗有此需要的哺乳动物的遗传性TTP的方法，该方法包括向哺乳动物施用治疗有效量的包含ADAMTS13变体的组合物(含或不含ADAMTS13蛋白)，其中，总ADAMTS13的治疗有效量为约1至约4000个单位FRETS-VWF73活性每千克哺乳动物体重(IU/kg)。在一个具体实施方式中，哺乳动物为人类。在一个实施方式中，约1IU/kg至约4000IU/kg的总ADAMTS13约每月施用一次。在一个实施方式中，约1IU/kg至约4000IU/kg的总ADAMTS13约每月施用两次。在一个实施方式中，约1IU/kg至约4000IU/kg的总ADAMTS13约每周施用一次。在一个实施方式中，约1IU/kg至约4000IU/kg的总ADAMTS13约每周施用两次。在一个实施方式中，约1IU/kg至约4000IU/kg的总ADAMTS13约每周施用三次。在一个实施方式中，约1IU/kg至约4000IU/kg的总ADAMTS13约每48小时施用一次。在一个实施方式中，约1IU/kg至约4000IU/kg的总ADAMTS13约每24小时施用一次。在一个实施方式中，约1IU/kg至约4000IU/kg的总ADAMTS13约每12小时施用一次。在某些方面，注射剂被静脉内施用。在其他方面，注射剂被皮下施用。
在一个实施方式中，本公开提供了一种治疗有此需要的哺乳动物的遗传性TTP的方法，该方法包括向哺乳动物施用治疗有效量的包含ADAMTS13变体的组合物(含或不含ADAMTS13蛋白)，其中，总ADAMTS13的治疗有效量为约5至约4000个单位FRETS-VWF73活性每千克哺乳动物体重(IU/kg)。在一个具体实施方式中，哺乳动物为人类。在一个实施方式中，约5IU/kg至约4000IU/kg的总ADAMTS13约每月施用一次。在一个实施方式中，约5IU/kg至约4000IU/kg的总ADAMTS13约每月施用两次。在一个实施方式中，约5IU/kg至约4000IU/kg的总ADAMTS13约每周施用一次。在一个实施方式中，约5IU/kg至约4000IU/kg的总ADAMTS13约每周施用两次。在一个实施方式中，约5IU/kg至约4000IU/kg的总ADAMTS13约每周施用三次。在一个实施方式中，约5IU/kg至约4000IU/kg的总ADAMTS13约每48小时施用一次。在一个实施方式中，约5IU/kg至约4000IU/kg的总ADAMTS13约每24小时施用一次。在一个实施方式中，约5IU/kg至约4000IU/kg的总ADAMTS13约每12小时施用一次。在某些方面，注射剂被静脉内施用。在其他方面，注射剂被皮下施用。
在一个实施方式中，本公开提供了一种治疗有此需要的哺乳动物的遗传性TTP的方法，该方法包括向哺乳动物施用治疗有效量的包含ADAMTS13变体的组合物(含或不含ADAMTS13蛋白)，其中，总ADAMTS13的治疗有效量为约20至约4000个单位FRETS-VWF73活性每千克哺乳动物体重(IU/kg)。在一个具体实施方式中，哺乳动物为人类。在一个实施方式中，约20IU/kg至约4000IU/kg的总ADAMTS13约每月施用一次。在一个实施方式中，约20IU/kg至约4000IU/kg的总ADAMTS13约每月施用两次。在一个实施方式中，约20IU/kg至约4000IU/kg的总ADAMTS13约每周施用一次。在一个实施方式中，约20IU/kg至约4000IU/kg的总ADAMTS13约每周施用两次。在一个实施方式中，约20IU/kg至约4000IU/kg的总ADAMTS13约每周施用三次。在一个实施方式中，约20IU/kg至约4000IU/kg的总ADAMTS13约每48小时施用一次。在一个实施方式中，约20IU/kg至约4000IU/kg的总ADAMTS13约每24小时施用一次。在一个实施方式中，约20IU/kg至约4000IU/kg的总ADAMTS13约每12小时施用一次。在某些方面，注射剂被静脉内施用。在其他方面，注射剂被皮下施用。
在一个实施方式中，本公开提供了一种治疗有此需要的哺乳动物的遗传性TTP的方法，该方法包括向哺乳动物施用治疗有效量的包含ADAMTS13变体的组合物(含或不含ADAMTS13蛋白)，其中，总ADAMTS13的治疗有效量为约20至约2000个单位FRETS-VWF73活性每千克哺乳动物体重(IU/kg)。在一个具体实施方式中，哺乳动物为人类。在一个实施方式中，约20IU/kg至约2000IU/kg的总ADAMTS13约每月施用一次。在一个实施方式中，约20IU/kg至约2000IU/kg的总ADAMTS13约每月施用两次。在一个实施方式中，约20IU/kg至约2000IU/kg的总ADAMTS13约每周施用一次。在一个实施方式中，约20IU/kg至约2000IU/kg的总ADAMTS13约每周施用两次。在一个实施方式中，约20IU/kg至约2000IU/kg的总ADAMTS13约每周施用三次。在一个实施方式中，约20IU/kg至约2000IU/kg的总ADAMTS13约每48小时施用一次。在一个实施方式中，约20IU/kg至约2000IU/kg的总ADAMTS13约每24小时施用一次。在一个实施方式中，约20IU/kg至约2000IU/kg的总ADAMTS13约每12小时施用一次。在某些方面，注射剂被静脉内施用。在其他方面，注射剂被皮下施用。
在一个实施方式中，本公开提供了一种治疗有此需要的哺乳动物的遗传性TTP的方法，该方法包括向哺乳动物施用治疗有效量的包含ADAMTS13变体的组合物(含或不含ADAMTS13蛋白)，其中，总ADAMTS13的治疗有效量为约20至约1000个单位FRETS-VWF73活性每千克哺乳动物体重(IU/kg)。在一个具体实施方式中，哺乳动物为人类。在一个实施方式中，约20IU/kg至约1000IU/kg的总ADAMTS13约每月施用一次。在一个实施方式中，约20IU/kg至约1000IU/kg的总ADAMTS13约每月施用两次。在一个实施方式中，约20IU/kg至约1000IU/kg的总ADAMTS13约每周施用一次。在一个实施方式中，约20IU/kg至约1000IU/kg的总ADAMTS13约每周施用两次。在一个实施方式中，约20IU/kg至约1000IU/kg的总ADAMTS13约每周施用三次。在一个实施方式中，约20IU/kg至约1000IU/kg的总ADAMTS13约每48小时施用一次。在一个实施方式中，约20IU/kg至约1000IU/kg的总ADAMTS13约每24小时施用一次。在一个实施方式中，约20IU/kg至约1000IU/kg的总ADAMTS13约每12小时施用一次。在某些方面，注射剂被静脉内施用。在其他方面，注射剂被皮下施用。
在一个实施方式中，本公开提供了一种治疗有此需要的哺乳动物的遗传性TTP的方法，该方法包括向哺乳动物施用治疗有效量的包含ADAMTS13变体的组合物(含或不含ADAMTS13蛋白)，其中，总ADAMTS13的治疗有效量为约5至约500个单位FRETS-VWF73活性每千克哺乳动物体重(IU/kg)。在一个具体实施方式中，哺乳动物为人类。在一个实施方式中，约5IU/kg至约500IU/kg的总ADAMTS13约每月施用一次。在一个实施方式中，约5IU/kg至约500IU/kg的总ADAMTS13约每月施用两次。在一个实施方式中，约5IU/kg至约500IU/kg的总ADAMTS13约每周施用一次。在一个实施方式中，约5IU/kg至约500IU/kg的总ADAMTS13约每周施用两次。在一个实施方式中，约5IU/kg至约500IU/kg的总ADAMTS13约每周施用三次。在一个实施方式中，约5IU/kg至约500IU/kg的总ADAMTS13约每48小时施用一次。在一个实施方式中，约5IU/kg至约500IU/kg的总ADAMTS13约每24小时施用一次。在一个实施方式中，约5IU/kg至约500IU/kg的总ADAMTS13每12小时施用一次。在某些方面，注射剂被静脉内施用。在其他方面，注射剂被皮下施用。
在一个实施方式中，本公开提供了一种治疗有此需要的哺乳动物的遗传性TTP的方法，该方法包括向哺乳动物施用治疗有效量的包含ADAMTS13变体的组合物(含或不含ADAMTS13蛋白)，其中，总ADAMTS13的治疗有效量为约10至约1500个单位FRETS-VWF73活性每千克哺乳动物体重(IU/kg)。在一个具体实施方式中，哺乳动物为人类。在一个实施方式中，约10IU/kg至约1,500IU/kg的总ADAMTS13约每月施用一次。在一个实施方式中，约10IU/kg至约1,500IU/kg的总ADAMTS13约每月施用两次。在一个实施方式中，约10IU/kg至约1,500IU/kg的总ADAMTS13约每周施用一次。在一个实施方式中，约10IU/kg至约1,500IU/kg的总ADAMTS13约每周施用两次。在一个实施方式中，约10IU/kg至约1,500IU/kg的总ADAMTS13约每48小时施用一次。在一个实施方式中，约10IU/kg至约1,500IU/kg的总ADAMTS13约每24小时施用一次。在一个实施方式中，约10IU/kg至约1,500IU/kg的总ADAMTS13约每12小时施用一次。在某些方面，注射剂被静脉内施用。在其他方面，注射剂被皮下施用。
在一个实施方式中，本公开提供了一种治疗有此需要的哺乳动物的遗传性TTP的方法，该方法包括向哺乳动物施用治疗有效量的包含ADAMTS13变体的组合物(含或不含ADAMTS13蛋白)，其中，总ADAMTS13的治疗有效量为约20至约500个单位FRETS-VWF73活性每千克哺乳动物体重(IU/kg)。在一个具体实施方式中，哺乳动物为人类。在一个实施方式中，约20IU/kg至约500IU/kg的总ADAMTS13约每月施用一次。在一个实施方式中，约5IU/kg至约500IU/kg的总ADAMTS13约每月施用两次。在一个实施方式中，约20IU/kg至约500IU/kg的总ADAMTS13约每周施用一次。在一个实施方式中，约20IU/kg至约500IU/kg的总ADAMTS13约每周施用两次。在一个实施方式中，约20IU/kg至约500IU/kg的总ADAMTS13约每周施用三次。在一个实施方式中，约20IU/kg至约500IU/kg的总ADAMTS13约每48小时施用一次。在一个实施方式中，约20IU/kg至约500IU/kg的总ADAMTS13约每24小时施用一次。在一个实施方式中，约20IU/kg至约500IU/kg的总ADAMTS13约每12小时施用一次。在某些方面，注射剂被静脉内施用。在其他方面，注射剂被皮下施用。
在一个实施方式中，本公开提供了一种治疗有此需要的哺乳动物的遗传性TTP的方法，该方法包括向哺乳动物施用治疗有效量的包含ADAMTS13变体的组合物(含或不含ADAMTS13蛋白)，其中，总ADAMTS13的治疗有效量为约20至约200个单位FRETS-VWF73活性每千克哺乳动物体重(IU/kg)。在一个具体实施方式中，哺乳动物为人类。在一个实施方式中，约20IU/kg至约200IU/kg的总ADAMTS13约每月施用一次。在一个实施方式中，约5IU/kg至约200IU/kg的总ADAMTS13约每月施用两次。在一个实施方式中，约20IU/kg至约200IU/kg的总ADAMTS13约每周施用一次。在一个实施方式中，约20IU/kg至约200IU/kg的总ADAMTS13约每周施用两次。在一个实施方式中，约20IU/kg至约200IU/kg的总ADAMTS13约每周施用三次。在一个实施方式中，约20IU/kg至约200IU/kg的总ADAMTS13约每48小时施用一次。在一个实施方式中，约20IU/kg至约200IU/kg的总ADAMTS13约每24小时施用一次。在一个实施方式中，约20IU/kg至约200IU/kg的总ADAMTS13约每12小时施用一次。在某些方面，注射剂被静脉内施用。在其他方面，注射剂被皮下施用。
在一个实施方式中，本公开提供了一种治疗有此需要的哺乳动物的遗传性TTP的方法，该方法包括向哺乳动物施用治疗有效量的包含ADAMTS13变体的组合物(含或不含ADAMTS13蛋白)，其中，总ADAMTS13的治疗有效量为约20至约100个单位FRETS-VWF73活性每千克哺乳动物体重(IU/kg)。在一个具体实施方式中，哺乳动物为人类。在一个实施方式中，约20IU/kg至约100IU/kg的总ADAMTS13约每月施用一次。在一个实施方式中，约5IU/kg至约100IU/kg的总ADAMTS13约每月施用两次。在一个实施方式中，约20IU/kg至约100IU/kg的总ADAMTS13约每周施用一次。在一个实施方式中，约20IU/kg至约100IU/kg的总ADAMTS13约每周施用两次。在一个实施方式中，约20IU/kg至约100IU/kg的总ADAMTS13约每周施用三次。在一个实施方式中，约20IU/kg至约100IU/kg的总ADAMTS13约每48小时施用一次。在一个实施方式中，约20IU/kg至约100IU/kg的总ADAMTS13约每24小时施用一次。在一个实施方式中，约20IU/kg至约100IU/kg的总ADAMTS13约每12小时施用一次。在某些方面，注射剂被静脉内施用。在其他方面，注射剂被皮下施用。
在一个实施方式中，本公开提供了一种治疗有此需要的哺乳动物的遗传性TTP的方法，该方法包括向哺乳动物施用治疗有效量的包含ADAMTS13变体的组合物(含或不含ADAMTS13蛋白)，其中，总ADAMTS13的治疗有效量为约40至约200个单位FRETS-VWF73活性每千克哺乳动物体重(IU/kg)。在一个具体实施方式中，哺乳动物为人类。在一个实施方式中，约40IU/kg至约200IU/kg的总ADAMTS13约每月施用一次。在一个实施方式中，约5IU/kg至约200IU/kg的总ADAMTS13约每月施用两次。在一个实施方式中，约40IU/kg至约200IU/kg的总ADAMTS13约每周施用一次。在一个实施方式中，约40IU/kg至约200IU/kg的总ADAMTS13约每周施用两次。在一个实施方式中，约40IU/kg至约200IU/kg的总ADAMTS13约每周施用三次。在一个实施方式中，约40IU/kg至约200IU/kg的总ADAMTS13约每48小时施用一次。在一个实施方式中，约40IU/kg至约200IU/kg的总ADAMTS13约每24小时施用一次。在一个实施方式中，约40IU/kg至约200IU/kg的总ADAMTS13约每12小时施用一次。在某些方面，注射剂被静脉内施用。在其他方面，注射剂被皮下施用。
在一个实施方式中，本公开提供了一种治疗有此需要的哺乳动物的遗传性TTP的方法，该方法包括向哺乳动物施用治疗有效量的包含ADAMTS13变体的组合物(含或不含ADAMTS13蛋白)，其中，总ADAMTS13的治疗有效量为约10至约160个FRETS-VWF73活性单位每千克哺乳动物体重(IU/kg)。在一个具体实施方式中，哺乳动物为人类。在一个实施方式中，约10IU/kg至约160IU/kg的总ADAMTS13约每月施用一次。在一个实施方式中，约10IU/kg至约160IU/kg的总ADAMTS13约每月施用两次。在一个实施方式中，约10IU/kg至约160IU/kg的总ADAMTS13约每周施用一次。在一个实施方式中，约10IU/kg至约160IU/kg的总ADAMTS13约每周施用两次。在一个实施方式中，约10IU/kg至约160IU/kg的总ADAMTS13约每48小时施用一次。在一个实施方式中，约10IU/kg至约160IU/kg的总ADAMTS13约每24小时施用一次。在一个实施方式中，约10IU/kg至约160IU/kg的总ADAMTS13约每12小时施用一次。在某些方面，注射剂被静脉内施用。在其他方面，注射剂被皮下施用。
在一个实施方式中，本公开提供了一种治疗有此需要的哺乳动物的遗传性TTP的方法，该方法包括向哺乳动物施用治疗有效量的包含ADAMTS13变体的组合物(含或不含ADAMTS13蛋白)，其中，总ADAMTS13的治疗有效量为约20至约160个单位FRETS-VWF73活性每千克哺乳动物体重(IU/kg)。在一个具体实施方式中，哺乳动物为人类。在一个实施方式中，约20IU/kg至约160IU/kg的总ADAMTS13约每月施用一次。在一个实施方式中，约20至约160IU/kg的总ADAMTS13约每月施用两次。在一个实施方式中，约20至约160IU/kg的总ADAMTS13约每周施用一次。在一个实施方式中，约20至约160IU/kg的总ADAMTS13约每周施用两次。在一个实施方式中，约20至约160IU/kg的总ADAMTS13约每48小时施用一次。在一个实施方式中，约20至约160IU/kg的总ADAMTS13约每24小时施用一次。在一个实施方式中，约20至约160IU/kg的总ADAMTS13约每12小时施用一次。在某些实施方式中，总ADAMTS13为约20IU/kg、约40IU/kg、约50IU/kg、约60IU/kg、约70IU/kg、约75IU/kg、约80IU/kg、约90IU/kg、约100IU/kg、约100IU/kg、约120IU/kg、约125IU/kg、约130IU/kg、约140IU/kg、约150IU/kg或约160IU/kg。在某些方面，注射剂被静脉内施用。在其他方面，注射剂被皮下施用。
在一个实施方式中，本公开提供了一种治疗有此需要的哺乳动物的遗传性TTP的方法，该方法包括向哺乳动物施用治疗有效量的包含ADAMTS13变体的组合物(含或不含ADAMTS13蛋白)，其中，总ADAMTS13的治疗有效量为约20至约40个单位FRETS-VWF73活性每千克哺乳动物体重(IU/kg)。在一个具体实施方式中，哺乳动物为人类。在一个实施方式中，约20IU/kg至约40IU/kg的总ADAMTS13约每月施用一次。在一个实施方式中，约20至约40IU/kg的总ADAMTS13约每月施用两次。在一个实施方式中，约20至约40IU/kg的总ADAMTS13约每周施用一次。在一个实施方式中，约20至约40IU/kg的总ADAMTS13约每周施用两次。在一个实施方式中，约20至约40IU/kg的总ADAMTS13约每48小时施用一次。在一个实施方式中，约20至约40IU/kg的总ADAMTS13约每24小时施用一次。在一个实施方式中，约20至约40IU/kg的总ADAMTS13约每12小时施用一次。在某些实施方式中，总ADAMTS13为约20IU/kg、约21IU/kg、约22IU/kg、约23IU/kg、约24IU/kg、约25IU/kg、约26IU/kg、约27IU/kg、约28IU/kg、约29IU/kg、约30IU/kg、约31IU/kg、约32IU/kg、约33IU/kg、约34IU/kg、约35IU/kg、约36IU/kg、约37IU/kg、约38IU/kg、约39IU/kg或约40IU/kg。在某些实施方式中，总ADAMTS13为约20IU/kg或约40IU/kg。在某些方面，注射剂被静脉内施用。在其他方面，注射剂被皮下施用。
在某些实施方式中，本公开提供了一种治疗有此需要的哺乳动物的遗传性TTP的方法，该方法包括向哺乳动物施用治疗有效量的包含ADAMTS13变体的组合物(含或不含ADAMTS13蛋白)，其中，总ADAMTS13的治疗有效量为约40个单位FRETS-VWF73活性每千克哺乳动物体重(IU/kg)。在某些实施方式中，约40IU/kg的总ADAMTS13约每周施用一次。在某些实施方式中，治疗方案用于遗传性TTP的治疗或预防性治疗。在某些方面，注射剂被静脉内施用。在其他方面，注射剂被皮下施用。
在某些实施方式中，本公开提供了治疗有此需要的哺乳动物的遗传性TTP的方法，该方法包括向哺乳动物施用治疗有效量的包含ADAMTS13变体的组合物(含或不含ADAMTS13蛋白)，其中，总ADAMTS13的治疗有效量为约20至约40个单位FRETS-VWF73活性每千克哺乳动物体重(IU/kg)。在某些实施方式中，治疗方案用于治疗急性遗传性TTP。在某些实施方式中，治疗在第一天以约20IU/kg、约21IU/kg、约22IU/kg、约23IU/kg、约24IU/kg、约25IU/kg、约26IU/kg、约27IU/kg、约28IU/kg、约29IU/kg、约30IU/kg、约31IU/kg、约32IU/kg、约33IU/kg、约34IU/kg、约35IU/kg、约36IU/kg、约37IU/kg、约38IU/kg、约39IU/kg或约40IU/kg的负荷剂量(loading dose)开始。在某些实施方式中，在负荷剂量之后，每天施用约20IU/kg、约21IU/kg、约22IU/kg、约23IU/kg、约24IU/kg、约25IU/kg、约26IU/kg、约27IU/kg、约28IU/kg、约29IU/kg、约30IU/kg、约31IU/kg、约32IU/kg、约33IU/kg、约34IU/kg、约35IU/kg、约36IU/kg、约37IU/kg、约38IU/kg、约39IU/kg或约40IU/kg的剂量，直至事件解决或事件解决后1天或2天。在某些实施方式中，在负荷剂量之后，每天施用约20IU/kg至约40IU/kg，直至事件解决或事件解决后1天或2天。在某些实施方式中，在第一天的负荷剂量为约20IU/kg或约40IU/kg，之后每天的剂量为约20IU/kg、约21IU/kg、约22IU/kg、约23IU/kg、约24IU/kg、约25IU/kg、约26IU/kg、约27IU/kg、约28IU/kg、约29IU/kg、约30IU/kg、约31IU/kg、约32IU/kg、约33IU/kg、约34IU/kg、约35IU/kg、约36IU/kg、约37IU/kg、约38IU/kg、约39IU/kg或约40IU/kg，直至事件解决或事件解决后1天或2天。在某些实施方式中，对急性遗传性TTP的治疗在第一天以约40IU/kg的负荷剂量开始，之后每天的剂量为约20IU/kg、约21IU/kg、约22IU/kg、约23IU/kg、约24IU/kg、约25IU/kg、约26IU/kg、约27IU/kg、约28IU/kg、约29IU/kg、约30IU/kg、约31IU/kg、约32IU/kg、约33IU/kg、约34IU/kg、约35IU/kg、约36IU/kg、约37IU/kg、约38IU/kg、约39IU/kg或约40IU/kg，直至事件解决或事件解决后1天或2天。在某些实施方式中，对急性遗传性TTP的治疗在第一天以约40IU/kg的负荷剂量开始，之后每天的剂量为约20IU/kg至约40IU/kg，直至事件解决。在某些实施方式中，对急性遗传性TTP的治疗在第一天以约40IU/kg的负荷剂量开始，之后每天的剂量为约20IU/kg至约40IU/kg，直至事件解决后1天。在某些实施方式中，对急性遗传性TTP的治疗在第一天以约40IU/kg的负荷剂量开始，之后每天的剂量为约20IU/kg至约40IU/kg，直至事件解决后2天。在某些方面，注射剂被静脉内施用。在其他方面，注射剂被皮下施用。在某些实施方式中，本发明提供了治疗或预防获得性TTP的方法。在获得性TTP中，由于针对ADAMTS13的自身免疫抗体的发展，患者的ADAMTS13活性低。免疫复合的ADAMTS13被灭活、中和和/或从血流和患者血浆中清除。ADAMTS13活性降低导致大量未切割VWF多聚体积聚，它们会自发粘附在血小板上并导致微循环中富含血小板-VWF的血栓。与遗传性TTP一样，获得性TTP也会导致神经系统临床表现(例如精神状态、中风、癫痫、偏瘫、感觉异常、视觉障碍和失语症)、疲劳和严重出血。如果不进行治疗，获得性TTP可能致命或可能造成持久性生理损害。
在一个实施方式中，本公开提供了治疗有此需要的哺乳动物的获得性TTP的方法，该方法包括向哺乳动物施用治疗有效量的包含ADAMTS13变体的组合物(含或不含ADAMTS13蛋白)，其中，总ADAMTS13的治疗有效量为约1至约4000个单位FTS-VWF73活性每千克哺乳动物体重(IU/kg)。在一个具体实施方式中，哺乳动物为人类。在一个实施方式中，约1IU/kg至约4000IU/kg的总ADAMTS13约每月施用一次。在一个实施方式中，约1IU/kg至约4000IU/kg的总ADAMTS13约每月施用两次。在一个实施方式中，约1IU/kg至约4000IU/kg的总ADAMTS13约每周施用一次。在一个实施方式中，约1IU/kg至约4000IU/kg的总ADAMTS13约每周施用两次。在一个实施方式中，约1IU/kg至约4000IU/kg的总ADAMTS13约每周施用三次。在一个实施方式中，约1IU/kg至约4000IU/kg的总ADAMTS13约每48小时施用一次。在一个实施方式中，约1IU/kg至约4000IU/kg的总ADAMTS13约每24小时施用一次。在一个实施方式中，约1IU/kg至约4000IU/kg的总ADAMTS13约每12小时施用一次。在某些方面，注射剂被静脉内施用。在其他方面，注射剂被皮下施用。
在一个实施方式中，本公开提供了治疗有此需要的哺乳动物的获得性TTP的方法，该方法包括向哺乳动物施用治疗有效量的包含ADAMTS13变体的组合物(含或不含ADAMTS13蛋白)，其中，总ADAMTS13的治疗有效量为约5至约4000个单位FTS-VWF73活性每千克哺乳动物体重(IU/kg)。在一个具体实施方式中，哺乳动物为人类。在一个实施方式中，约5IU/kg至约4000IU/kg的总ADAMTS13约每月施用一次。在一个实施方式中，约5IU/kg至约4000IU/kg的总ADAMTS13约每月施用两次。在一个实施方式中，约5IU/kg至约4000IU/kg的总ADAMTS13约每周施用一次。在一个实施方式中，约5IU/kg至约4000IU/kg的总ADAMTS13约每周施用两次。在一个实施方式中，约5IU/kg至约4000IU/kg的总ADAMTS13约每周施用三次。在一个实施方式中，约5IU/kg至约4000IU/kg的总ADAMTS13约每48小时施用一次。在一个实施方式中，约5IU/kg至约4000IU/kg的总ADAMTS13约每24小时施用一次。在一个实施方式中，约每12小时施用一次5IU/kg至约4000IU/kg的总ADAMTS13。在某些方面，注射剂被静脉内施用。在其他方面，注射剂被皮下施用。
在一个实施方式中，本公开提供了治疗有此需要的哺乳动物的获得性TTP的方法，该方法包括向哺乳动物施用治疗有效量的包含ADAMTS13变体的组合物(含或不含ADAMTS13蛋白)，其中，总ADAMTS13的治疗有效量为约10至约1500个单位FTS-VWF73活性每千克哺乳动物体重(IU/kg)。在一个具体实施方式中，哺乳动物为人类。在一个实施方式中，约10IU/kg至约1500IU/kg的总ADAMTS13约每月施用一次。在一个实施方式中，约10IU/kg至约1500IU/kg的总ADAMTS13约每月施用两次。在一个实施方式中，约10IU/kg至约1500IU/kg的总ADAMTS13约每周施用一次。在一个实施方式中，约10IU/kg至约1500IU/kg的总ADAMTS13约每周施用两次。在一个实施方式中，约10IU/kg至约1500IU/kg的总ADAMTS13约每48小时施用一次。在一个实施方式中，约10IU/kg至约1500IU/kg的总ADAMTS13约每24小时施用一次。在一个实施方式中，约10IU/kg至约1500IU/kg的总ADAMTS13约每12小时施用一次。在某些方面，注射剂被静脉内施用。在其他方面，注射剂被皮下施用。
在一个实施方式中，本公开提供了治疗有此需要的哺乳动物的获得性TTP的方法，该方法包括向哺乳动物施用治疗有效量的包含ADAMTS13变体的组合物(含或不含ADAMTS13蛋白)，其中，总ADAMTS13的治疗有效量为约20至约160个单位FTS-VWF73活性每千克哺乳动物体重(IU/kg)。在一个具体实施方式中，哺乳动物为人类。在一个实施方式中，约20IU/kg至约160IU/kg的总ADAMTS13约每月施用一次。在一个实施方式中，约20至约160IU/kg的总ADAMTS13约每月施用两次。在一个实施方式中，约20至约160IU/kg的总ADAMTS13约每周施用一次。在一个实施方式中，约20至约160IU/kg的总ADAMTS13约每周施用两次。在一个实施方式中，约20至约160IU/kg的总ADAMTS13约每48小时施用一次。在一个实施方式中，约20至约160IU/kg的总ADAMTS13约每24小时施用一次。在一个实施方式中，约20至约160IU/kg的总ADAMTS13约每12小时施用一次。在某些实施方式中，总ADAMTS13为约20IU/kg、约40IU/kg、约50IU/kg、约60IU/kg、约70IU/kg、约75IU/kg、约80IU/kg、约90IU/kg、约100IU/kg、约100IU/kg、约120IU/kg、约125IU/kg、约130IU/kg、约140IU/kg、约150IU/kg或约160IU/kg。在某些方面，注射剂被静脉内施用。在其他方面，注射剂被皮下施用。
在一个实施方式中，本公开提供了治疗有此需要的哺乳动物的获得性TTP的方法，该方法包括向哺乳动物施用治疗有效量的包含ADAMTS13变体的组合物(含或不含ADAMTS13蛋白)，其中，总ADAMTS13的治疗有效量为约20至约80个单位FTS-VWF73活性每千克哺乳动物体重(IU/kg)。在一个具体实施方式中，哺乳动物为人类。在一个实施方式中，约20IU/kg至约80IU/kg的总ADAMTS13约每月施用一次。在一个实施方式中，约20至约80IU/kg的总ADAMTS13约每月施用两次。在一个实施方式中，约20至约80IU/kg的总ADAMTS13约每周施用一次。在一个实施方式中，约20至约80IU/kg的总ADAMTS13约每周施用两次。在一个实施方式中，约20至约80IU/kg的总ADAMTS13约每48小时施用一次。在一个实施方式中，约20至约80IU/kg的总ADAMTS13约每24小时施用一次。在一个实施方式中，约20至约80IU/kg的总ADAMTS13约每12小时施用一次。在某些实施方式中，总ADAMTS13为约20IU/kg、约40IU/kg、约50IU/kg、约60IU/kg、约70IU/kg、约75IU/kg或约80IU/kg。在某些实施方式中，剂量为在同一天内施用两次的分次剂量。例如，如果剂量为80IU/kg，则将以40IU/kg的剂量在同一天内施用两次。在某些方面，注射剂被静脉内施用。在其他方面，注射剂被皮下施用。
在一个实施方式中，本公开提供了治疗有此需要的哺乳动物的获得性TTP的方法，该方法包括向哺乳动物施用治疗有效量的包含ADAMTS13变体的组合物(含或不含ADAMTS13蛋白)，其中，总ADAMTS13的治疗有效量为约20至约40个单位FTS-VWF73活性每千克哺乳动物体重(IU/kg)。在一个具体实施方式中，哺乳动物为人类。在一个实施方式中，约20IU/kg至约40IU/kg的总ADAMTS13约每月施用一次。在一个实施方式中，约20至约40IU/kg的总ADAMTS13约每月施用两次。在一个实施方式中，约20至约40IU/kg的总ADAMTS13约每周施用一次。在一个实施方式中，约20至约40IU/kg的总ADAMTS13约每周施用两次。在一个实施方式中，约20至约40IU/kg的总ADAMTS13约每48小时施用一次。在一个实施方式中，约20至约40IU/kg的总ADAMTS13约每24小时施用一次。在一个实施方式中，约20至约40IU/kg的总ADAMTS13约每12小时施用一次。在某些实施方式中，总ADAMTS13为约20IU/kg、约21IU/kg、约22IU/kg、约23IU/kg、约24IU/kg、约25IU/kg、约26IU/kg、约27IU/kg、约28IU/kg、约29IU/kg、约30IU/kg、约31IU/kg、约32IU/kg、约33IU/kg、约36IU/kg、约37IU/kg、约38IU/kg、约39IU/kg或约40IU/kg。在某些实施方式中，总ADAMTS13为约20IU/kg或约40IU/kg。在某些实施方式中，总ADAMTS13为约20IU/kg。在某些实施方式中，总ADAMTS13为约40IU/kg。在某些方面，注射剂被静脉内施用。在其他方面，注射剂被皮下施用。
在某些实施方式中，本公开提供了治疗有此需要的哺乳动物的获得性TTP的方法，该方法包括向哺乳动物施用治疗有效量的包含ADAMTS13变体的组合物(含或不含ADAMTS13蛋白)，其中，总ADAMTS13的治疗有效量为约20至约40个单位FRETS-VWF73活性每千克哺乳动物体重(IU/kg)。在某些实施方式中，治疗方案用于获得性TTP的治疗。在某些实施方式中，治疗以约20IU/kg、约21IU/kg、约22IU/kg、约23IU/kg、约24IU/kg、约25IU/kg、约26IU/kg、约27IU/kg、约28IU/kg、约29IU/kg、约30IU/kg、约31IU/kg、约32IU/kg、约33IU/kg、约36IU/kg、约37IU/kg、约38IU/kg、约39IU/kg或约40IU/kg的负荷剂量开始。在某些实施方式中，在负荷剂量之后，每天施用约20IU/kg至约40IU/kg，或每天或BID施用约20IU/kg至约80IU/kg，直至事件解决或事件解决后1天或2天。在某些实施方式，在第一天的负荷剂量为约20IU/kg、约40IU/kg或约80IU/kg，之后每天或BID的剂量为约20IU/kg、约21IU/kg、约22IU/kg、约23IU/kg、约24IU/kg、约25IU/kg、约26IU/kg、约27IU/kg、约28IU/kg、约29IU/kg、约30IU/kg、约31IU/kg、约32IU/kg、约33IU/kg、约34IU/kg、约35IU/kg、约36IU/kg、约37IU/kg、约38IU/kg、约39IU/kg或约40IU/kg，直至事件解决或事件解决后1天或2天。在具体实施方式中，对获得性TTP的治疗在第一天以约40IU/kg的负荷剂量开始，之后每天或BID的剂量为约20IU/kg、约21IU/kg、约22IU/kg、约23IU/kg、约24IU/kg、约25IU/kg、约26IU/kg、约27IU/kg、约28IU/kg、约29IU/kg、约30IU/kg、约31IU/kg、约32IU/kg、约33IU/kg、约34IU/kg、约35IU/kg、约36IU/kg、约37IU/kg、约38IU/kg、约39IU/kg或约40IU/kg，直至事件解决或事件解决后1天或2天。在某些实施方式中，对获得性TTP的治疗在第一天以约40IU/kg的负荷剂量开始，之后每天或BID的剂量为约20IU/kg至约40IU/kg，直至事件解决。在某些实施方式中，对获得性TTP的治疗在第一天以约40IU/kg的负荷剂量开始，之后每天或BID的剂量为约20IU/kg至约40IU/kg，直至事件解决后1天。在某些实施方式中，对获得性TTP的治疗在第一天以约40IU/kg的负荷剂量开始，之后每天或BID的剂量为约20IU/kg至约40IU/kg，直至事件解决后2天。在某些实施方式中，对获得性TTP的治疗在第一天以约40IU/kg的负荷剂量开始，之后每天或BID的剂量为约40IU/kg，直至事件解决。在某些实施方式中，对获得性TTP的治疗在第一天以约40IU/kg的负荷剂量开始，之后每天或BID的剂量为约40IU/kg，直至事件解决后1天。在某些实施方式中，对获得性TTP的治疗在第一天以约40IU/kg的负荷剂量开始，之后每天或BID的剂量为约40IU/kg，直至事件解决后2天。在某些方面，注射剂被静脉内施用。在其他方面，注射剂被皮下施用。
在一个实施方式中，本公开提供了治疗有此需要的哺乳动物的获得性TTP的方法，该方法包括在缓解期向哺乳动物施用一次治疗有效量的包含ADAMTS13变体的组合物(含或不含ADAMTS13蛋白)，其中，总ADAMTS13的治疗有效量为约20至约40个单位FTS-VWF73活性每千克哺乳动物体重(IU/kg)。在一个具体实施方式中，哺乳动物为人类。在一个实施方式中，约20IU/kg至约40IU/kg的总ADAMTS13约每月施用一次。在一个实施方式中，约20至约40IU/kg的总ADAMTS13约每月施用两次。在一个实施方式中，约20至约40IU/kg的总ADAMTS13约每周施用一次。在一个实施方式中，约20至约40IU/kg的总ADAMTS13约每周施用两次。在一个实施方式中，约20至约40IU/kg的总ADAMTS13约每周施用三次。在一个实施方式中，约20至约40IU/kg的总ADAMTS13约每48小时施用一次。在一个实施方式中，约20至约40IU/kg的总ADAMTS13约每24小时施用一次。在一个实施方式中，约20至约40IU/kg的总ADAMTS13约每12小时施用一次。在某些实施方式中，总ADAMTS13为约20IU/kg、约21IU/kg、约22IU/kg、约23IU/kg、约24IU/kg、约25IU/kg、约26IU/kg、约27IU/kg、约28IU/kg、约29IU/kg、约30IU/kg、约31IU/kg、约32IU/kg、约33IU/kg、约36IU/kg、约37IU/kg、约38IU/kg、约39IU/kg或约40IU/kg。在某些实施方式中，总ADAMTS13为约20IU/kg或约40IU/kg。在某些实施方式中，总ADAMTS13为约20IU/kg。在某些实施方式中，总ADAMTS13为约40IU/kg。在某些方面，注射剂被静脉内施用。在其他方面，注射剂被皮下施用。
在某些实施方式中，本公开提供了治疗或预防心肌梗死的方法。在某些实施方式中，本文描述的ADAMTS13变体或其组合物(包括含ADAMTS13的组合物)用于缺血/再灌注损伤的治疗和预防。再灌注是对缺血组织(由于血液供应减少)的血液供应进行恢复。再灌注是一种治疗梗死(例如心肌梗死和脑梗死)或其他缺血的方法，其通过使存活的缺血组织恢复，从而限制进一步坏死。但是，再灌注本身可能进一步损伤缺血组织，造成再灌注损伤。例如，急性心肌梗死(AMI)由冠状动脉血栓闭塞引起。除了在血流中断期间发生的直接损伤之外，缺血/再灌注损伤还包括在血流由再灌注恢复后发生的组织损伤。
此外，已报道ADAMTS13具有抗炎作用，可防止或减少缺血再灌注过程中的继发性损伤。De Meyer等(“Protective anti-inflammatory effect of ADAMTS13 onmyocardial ischemia/reperfusion injury in mice”，Blood 2012，120(26)：5217-5223，通过引用整体并入本文用于所有目的)。如De Meyer等所述，VWF和ADAMTS13参与血小板粘附和血栓形成，因为ADAMTS13将最具血栓形成作用的VWF多聚体切割成更小、止血活性更低的VWF片段。De Meyer等还描述了ADAMTS在下调炎症反应中的作用。还有研究表明，ADAMTS13可以减少血栓形成和炎症(例如动脉粥样硬化)。Chauhan等(“ADAMTS13:a newlink between thrombosis and inflammatio”，J Exp Med.2008，205:2065-2074)；Chauhan等(“Systemic antithrombotic effects of ADAMTS13”，J Exp Med.2006，203:767-776；Gandhi等(“ADAMTS13 reduces vascular inflammation and the developmentof early atherosclerosis in mice”，Blood 2012，119(10):2385-2391)，其各自通过引用整体并入本文用于所有目的。
De Meyer等表明，ADAMTS13通过切割VWF来防止缺血心肌中VWF介导的血小板和白细胞的过度募集。基于这一假设，De Meyer等显示，当动物接受ADAMTS13治疗时，诱发心肌梗死的动物心肌中的中性粒细胞浸润降低了9倍。因此，De Meyer等显示，ADAMTS13可以减少缺血心肌的炎症反应。此种炎症减少也通过防止白细胞浸润和损伤来减少再灌注损伤。因此，本文公开的ADAMTS13变体及其组合物(包括含ADAMTS13的组合物)可用于减少炎症反应，避免炎症导致梗死(例如心肌梗死和脑梗死)和再灌注过程中的组织损伤。
在某些实施方式中，本公开提供了治疗或预防脑梗死的方法。当血液流向大脑的部分被阻止时会发生脑梗死(通常被称为中风)。例如，当向大脑供血的血管被血凝块阻断时，会发生脑梗死。脑梗死也可能是钝器外伤和机械损伤的结果。这可能是由大脑动脉中的血块(血栓性中风)或来自身体其他部位的血块到达大脑(栓塞性中风)造成。因此，在一些实施方式中，本发明提供了改善脑梗死后患者的感觉和/或运动功能恢复(或减少脑梗死后患者的感觉和/或运动功能损伤)的方法，该方法包括向个体施用药物组合物的步骤，该药物组合物包含治疗有效量的ADAMTS13变体或其组合物(包括含ADAMTS13的组合物)，从而改善脑梗死后个体的感觉和/或运动功能的恢复(或减少脑梗死后个体的感觉和/或运动功能的损伤)。
在某些实施方式中，本公开提供了治疗或预防深静脉血栓形成(DVT)的方法。DVT是一种在身体深处的静脉中形成的血凝块，使用ADAMTS13变体或其组合物(包括含ADAMTS13的组合物)。虽然大多数深静脉血栓发生在小腿或大腿，但也可能发生在全身。DVT是一种特别危险的疾病，因为血凝块会脱落并通过血流(栓子)到达心脏、肺或大脑等。此种栓塞可能对器官造成损伤，并可能导致死亡。因此，如上所述，ADAMTS13变体及其组合物(包括含ADAMTS13的组合物)可用于治疗DVT和由此产生的栓塞。
在某些实施方式中，本公开提供了治疗或预防弥散性血管内凝血(DIC)的方法，特别是与败血症相关的DIC。DIC是一种在全身小血管中形成血凝块的病况。这些血凝块会减少或阻断全身的血液流动，并可能导致组织和器官的损伤。小血管中的血凝块是由凝血活性增加引起的。这种活性的增加超过了可用血小板和凝血因子的使用，从而也通过消耗可用的血小板和凝血因子来源增加了严重内部和外部出血的机会。因此，DIC患者通常会出现血栓和严重的出血性疾病。
某些疾病，例如败血症、手术/创伤、癌症、分娩/怀孕并发症、毒蛇咬伤(响尾蛇和蝰蛇)、冻伤和烧伤，会导致凝血因子过度活跃，从而导致DIC。DIC也可以为急性的(在数小时或数天内迅速发展)或慢性的(在数周或数月内发展)。虽然这两种类型的DIC都需要医疗治疗，但急性DIC必须立即治疗以防止小血管内过度凝血(其迅速导致严重出血)。
在一个实施方式中，本公开提供了在有此需要的哺乳动物中治疗凝血障碍(例如但不限于心肌梗死、脑梗死、缺血再灌注损伤、DVT或DIC)和/或减少炎症事件/反应的方法，该方法包括向哺乳动物施用治疗有效量的包含ADAMTS13变体的组合物(含或不含ADAMTS13蛋白)，其中，总ADAMTS13的治疗有效量为约1至约4000个单位FRETS-VWF73活性每千克哺乳动物体重(IU/kg)。在一个具体实施方式中，哺乳动物为人类。在一个实施方式中，约1IU/kg至约4000IU/kg的总ADAMTS13约每月施用一次。在一个实施方式中，约1IU/kg至约4000IU/kg的总ADAMTS13约每月施用两次。在一个实施方式中，约1IU/kg至约4000IU/kg的总ADAMTS13约每周施用一次。在一个实施方式中，约1IU/kg至约4000IU/kg的总ADAMTS13约每周施用两次。在一个实施方式中，约1IU/kg至约4000IU/kg的总ADAMTS13约每周施用三次。在一个实施方式中，约1IU/kg至约4000IU/kg的总ADAMTS13约每48小时施用一次。在一个实施方式中，约1IU/kg至约4000IU/kg的总ADAMTS13约每24小时施用一次。在一个实施方式中，约1IU/kg至约4000IU/kg的总ADAMTS13约每12小时施用一次。在某些实施方式中，剂量被施用以进行治疗和/或预防。在某些方面，注射剂被静脉内施用。在其他方面，注射剂被皮下施用。
在一个实施方式中，本公开提供了在有此需要的哺乳动物中治疗凝血障碍(例如但不限于心肌梗死、脑梗死、缺血再灌注损伤、DVT或DIC)和/或减少炎症事件/反应的方法，该方法包括向哺乳动物施用治疗有效量的包含ADAMTS13变体的组合物(含或不含ADAMTS13蛋白)，其中，总ADAMTS13的治疗有效量为约5至约4000个单位FRETS-VWF73活性每千克哺乳动物体重(IU/kg)。在一个具体实施方式中，哺乳动物为人类。在一个实施方式中，约5IU/kg至约4000IU/kg的总ADAMTS13约每月施用一次。在一个实施方式中，约5IU/kg至约4000IU/kg的总ADAMTS13约每月施用两次。在一个实施方式中，约5IU/kg至约4000IU/kg的总ADAMTS13约每周施用一次。在一个实施方式中，约5IU/kg至约4000IU/kg的总ADAMTS13约每周施用两次。在一个实施方式中，约5IU/kg至约4000IU/kg的总ADAMTS13约每周施用三次。在一个实施方式中，约5IU/kg至约4000IU/kg的总ADAMTS13约每48小时施用一次。在一个实施方式中，约5IU/kg至约4000IU/kg的总ADAMTS13约每24小时施用一次。在一个实施方式中，约5IU/kg至约4000IU/kg的总ADAMTS13约每12小时施用一次。在某些实施方式中，剂量被施用以进行治疗和/或预防。在某些方面，注射剂被静脉内施用。在其他方面，注射剂被皮下施用。
在一个实施方式中，本公开提供了在有此需要的哺乳动物中治疗凝血障碍(例如但不限于心肌梗死、脑梗死、缺血再灌注损伤、DVT或DIC)和/或减少炎症事件/反应的方法，该方法包括向哺乳动物施用治疗有效量的包含ADAMTS13变体的组合物(含或不含ADAMTS13蛋白)，其中，总ADAMTS13的治疗有效量为约10至约2000个单位FRETS-VWF73活性每千克哺乳动物体重(IU/kg)。在一个具体实施方式中，哺乳动物为人类。在一个实施方式中，约10IU/kg至约2000IU/kg的总ADAMTS13约每月施用一次。在一个实施方式中，约10IU/kg至约2000IU/kg的总ADAMTS13约每月施用两次。在一个实施方式中，约10IU/kg至约2000IU/kg的总ADAMTS13约每周施用一次。在一个实施方式中，约10IU/kg至约2000IU/kg的总ADAMTS13约每周施用两次。在一个实施方式中，约10IU/kg至约2000IU/kg的总ADAMTS13约每48小时施用一次。在一个实施方式中，约10IU/kg至约2000IU/kg的总ADAMTS13约每24小时施用一次。在一个实施方式中，约10IU/kg至约2000IU/kg的总ADAMTS13约每12小时施用一次。在某些实施方式中，剂量被施用以进行治疗和/或预防。在某些方面，注射剂被静脉内施用。在其他方面，注射剂被皮下施用。
在一个实施方式中，本公开提供了在有此需要的哺乳动物中治疗凝血障碍(例如但不限于心肌梗死、脑梗死、缺血再灌注损伤、DVT或DIC)和/或减少炎症事件/反应的方法，该方法包括向哺乳动物施用治疗有效量的包含ADAMTS13变体的组合物(含或不含ADAMTS13蛋白)，其中，总ADAMTS13的治疗有效量为约20至约1500个单位FRETS-VWF73活性每千克哺乳动物体重(IU/kg)。在一个具体实施方式中，哺乳动物为人类。在一个实施方式中，约20IU/kg至约1500IU/kg的总ADAMTS13约每月施用一次。在一个实施方式中，约20IU/kg至约1500IU/kg的总ADAMTS13约每月施用两次。在一个实施方式中，约20IU/kg至约1500IU/kg的总ADAMTS13约每周施用一次。在一个实施方式中，约20IU/kg至约1500IU/kg的总ADAMTS13约每周施用两次。在一个实施方式中，约20IU/kg至约1500IU/kg的总ADAMTS13约每48小时施用一次。在一个实施方式中，约20IU/kg至约1500IU/kg的总ADAMTS13约每24小时施用一次。在一个实施方式中，约20IU/kg至约1500IU/kg的总ADAMTS13约每12小时施用一次。在具体实施方式中，总ADAMTS13为约20IU/kg、约21IU/kg、约22IU/kg、约23IU/kg、约24IU/kg、约25IU/kg、约26IU/kg、约27IU/kg、约28IU/kg、约29IU/kg、约30IU/kg、约31IU/kg、约32IU/kg、约33IU/kg、约34IU/kg、约35IU/kg、约36IU/kg、约37IU/kg、约38IU/kg、约39IU/kg、约40IU/kg、约45IU/kg、约50IU/kg、约60IU/kg、约70IU/kg、约75IU/kg、约80IU/kg、关于90IU/kg、约100IU/kg、约110IU/kg、约120IU/kg、约125IU/kg、约130IU/kg、约140IU/kg、约150IU/kg、约160IU/kg、约170IU/kg、约175IU/kg、约180IU/kg、约190IU/kg、约200IU/kg、约225IU/kg、约250IU/kg、约275IU/kg、约300IU/kg、约350IU/kg、约400IU/kg、约450IU/kg、约500IU/kg、约550IU/kg、约600IU/kg、约650IU/kg、约700IU/kg、约750IU/kg、约800IU/kg、约850IU/kg、约900IU/kg、约950IU/kg、约1000IU/kg、约1150IU/kg、约1200IU/kg、约1250IU/kg、约1300IU/kg、约1350IU/kg、约1400IU/kg、约1450IU/kg或约1500IU/kg。在某些实施方式中，剂量被施用以进行治疗和/或预防。在某些方面，注射剂被静脉内施用。在其他方面，注射剂被皮下施用。
在某些实施方式中，本公开提供了治疗或预防镰状细胞疾病(SCD)中的血管闭塞危象(VOC)的方法，如国际申请WO2018027169(其被整体并入本文用于所有目的)中所述。SCD是一种世界范围内的遗传性红细胞疾病，由β-珠蛋白基因的点突变引起病理性HbS的合成和缺氧条件下HbS的异常聚合导致。SCD的两种主要临床表现为慢性溶血性贫血和急性VOC，它们是SCD患者住院的主要原因。最近的研究强调了镰状血管病在镰状细胞相关急性事件和慢性器官并发症的产生中的核心作用(Sparkenbaugh等，Br.J.Haematol.2013:162:3-14；DeFranceschi等，Semin.Thromb.Hemost.2011，226-236；以及Hebbel等，Cardiovasc.Hematol.Disord.Drug Targets 2009，9:271-292，其各自通过引用整体并入本文用于所有目的)。这些并发症的病理生理学基于毛细血管和小血管中的血管内镰状细胞化，导致VOC、血流受损、血管炎症和/或血栓形成伴有缺血性细胞损伤。
SCD的最常见的临床表现为VOC。当微循环被镰状红细胞阻塞时会发生VOC，造成供血器官的缺血性损伤并产生疼痛。疼痛危象是SCD最显著的临床特征，并且是受影响的SCD受试者或患者急诊和/或住院的主要原因。
约一半SCD受试者或纯合子型HbS疾病患者经历VOC。危象发生的频率极其不同。一些SCD受试者或患者每年发作多达6次或6次以上，而另一些可能只是隔很长时间发作一次或根本不发作。每个受试者或患者通常具有一致的危象频率模式。
本公开包括减少VOC的至少一种症状的方法，症状包括但不限于缺血和疼痛(例如指炎、阴茎异常勃起、腹部、胸部和关节)、黄疸、骨梗死、呼吸异常(例如呼吸急促和呼吸短促)、缺氧、酸中毒、低血压和/或与VOC相关的心动过速。在某些方面，VOC可以被定义为包含一个以上这些症状的病况。疼痛危象突然开始。危象可能会持续几个小时至几天，如同它突然开始一样突然结束。疼痛可能影响身体的任何部位，通常涉及腹部、附器、胸部、背部、骨骼、关节和软组织，它可能表现为指炎(儿童双侧疼痛和肿胀的手和/或脚)、急性关节坏死或缺血性坏死、或急腹症。随着在脾脏中反复发作，梗死和自体脾切除往往容易导致危及生命的感染。随着时间推移，肝脏也可能发生梗死并进展至衰竭。乳头状坏死是VOC的常见肾脏临床表现，导致等渗尿(即无法浓缩尿)。
严重的深度疼痛出现在四肢(包括长骨)。腹痛可能很严重，如同急腹症；它可能是由其他部位或腹腔内实体器官或软组织梗塞引起的牵涉性疼痛引起的。反应性肠梗阻导致肠胀和疼痛。面部也可能会受到影响。疼痛可能伴有发热、不适、呼吸困难、勃起疼痛、黄疸和白细胞增多。骨痛通常由骨髓梗死引起。某些模式是可以预测的，因为疼痛往往涉及骨髓活动最多的骨头，而且骨髓活动随着年龄而变化。在生命的前18个月，可能累及跖骨和掌骨，表现为指炎或手足综合征。虽然上述模式描述了常见表现，但受试者身体中任何有血液供应和感觉神经的区域都可能受到VOC的影响。
通常，无法确定VOC的诱因。然而，由于脱氧HbS变成半固态，VOC最可能的生理触发因素是低氧血症。这可能是由于急性胸部综合征或伴随的呼吸系统并发症。脱水也会引发疼痛，因为酸中毒会导致氧解离曲线的偏移(波尔效应)，导致血红蛋白更容易去饱和。血液浓缩也是一种常见机制。VOC的另一个常见诱因是体温的变化，无论由于发烧而升高还由于环境温度变化而降低。由于周围血管收缩，体温降低可能导致危象。
在某些实施方式中，VOC可被定义为与对照相比外周中性粒细胞增加。在某些实施方式中，VOC可被定义为与对照相比肺血管渗漏的增加，例如支气管肺泡灌洗液(BAL)中白细胞数量的增加和/或蛋白质含量(BAL蛋白质(mg/mL))的增加。
在某些实施方式中，与对照相比，器官中血管活化水平增加(例如通过VCAM-1和/或ICAM-1的表达、水平和/或活性的增加来测量)是VOC的标志。在某些实施方式中，与对照相比，器官炎症性血管病变水平的增加是VOC的标志。在某些实施方式中，与对照相比，组织中血管活化和炎症性血管病变水平的增加是VOC的标志。在某些实施方式中，器官为肺和/或肾。在某些实施方式中，器官为肾脏。
在某些实施方式中，VOC可被定义为与对照相比NF-kB(NF-kB的活化由P-NF-kB或P-NF-kB/NF-kB比率来测量)、VCAM-1和ICAM-1中至少一种的表达、水平和/或活化的增加。在某些实施方式中，VOC可被定义为与对照相比内皮素-1(ET-1)、血栓素合成酶(TXAS)和血红素-氧合酶-1(HO-1)中至少一种的表达或的水平增加。在某些实施方式中，可以在肺组织中看到这些增加。在某些实施方式中，可以在肾脏组织中看到这些增加。在某些实施方式中，肾组织中TXAS、ET-1和VCAM-1的表达和/或水平的增加以及NF-kB的活化是VOC的标志。
在某些实施方式中，VOC可以由血液学参数来定义。在某些实施方式中，VOC可被定义为与对照相比Hct、Hb、MCV和MCH中至少一种的水平降低。在某些实施方式中，VOC可被定义为与对照相比Hct、Hb、MCV和MCH中至少两种的水平降低。在某些实施方式中，VOC可被定义为与对照相比Hct、Hb、MCV和MCH中至少三种的水平降低。在某些实施方式中，VOC可被定义为与对照相比CHCM、HDW、中性粒细胞数和LDH中至少一种的水平增加。在某些实施方式中，VOC可被定义为与对照相比CHCM、HDW、中性粒细胞数和LDH中至少两种的水平增加。在某些实施方式中，VOC可被定义为与对照相比CHCM、HDW、中性粒细胞数和LDH中至少三种的水平增加。在某些实施方式中，VOC可被定义为与对照相比Hct的水平降低。在某些实施方式中，VOC可被定义为与对照相比Hb的水平降低。在某些实施方式中，VOC可被定义为与对照相比MCV的减少。在某些实施方式中，VOC可被定义为与对照相比MCH的减少。在某些实施方式中，VOC可被定义为与对照相比CHCM的增加。在某些实施方式中，VOC可被定义为与对照相比HDW的增加。在某些实施方式中，VOC可被定义为与对照相比中性粒细胞数量的增加。在某些实施方式中，VOC可被定义为与对照相比LDH的增加。在某些实施方式中，VOC可被定义为与对照相比Hct、Hb、MCV和MCH中至少一种的水平降低和/或与对照相比CHCM、HDW、中性粒细胞数和LDH中至少一种的水平增加。在某些实施方式中，VOC可被定义为与对照相比Hct、Hb、MCV和MCH的水平降低和/或与对照相比CHCM、HDW、中性粒细胞数量和LDH的水平增加。
在具体实施方式中，包含ADAMTS13变体的组合物(包括含ADAMTS13的组合物)在VOC发病后1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、60、72、84、96、108或120小时内被施用给受试者。在某些实施方式中，包含ADAMTS13变体的组合物(包括含ADAMTS13的组合物)在VOC发病后约1至2小时、约1至5小时、约1至10小时、约1至12小时、约1至24小时、约1至36小时、约1至48小时、约1至60小时、约1至72小时、约1至84小时、约1至96小时、约1至108小时或约1至120小时内被施用给受试者。在某些实施方式中，包含ADAMTS13变体的组合物(含或不含ADAMTS13蛋白)在VOC发病后约2至5小时、约5至10小时、约10至20小时、约20至40小时、约30至60小时、约40至80小时、约50至100小时或约60至120小时内被施用给受试者。在一些实施方式中，组合物在VOC的1周内被施用。在一些实施方式中，组合物在VOC后被每天施用。在一些实施方式中，组合物在VOC后被每周施用。在一些实施方式中，组合物被每天施用一次。在某些实施方式中，组合物被每两天施用一次。在一些实施方式中，组合物被每三天施用一次。在一些实施方式中，组合物被每周施用两次。在一些实施方式中，组合物被施用直至临床表现消退。在某些实施方式中，组合物被施用至临床表现消退后一天。在一些实施方式中，在临床表现消退后，组合物被施用至少两天。在一些实施方式中，在临床表现消退后，组合物被施用至少三天。在一些实施方式中，在临床表现消退后，组合物被施用至少一周。
在某些实施方式中，包含ADAMTS13变体的组合物(包括含ADAMTS13的组合物)被施用给受试者以预防VOC发病。在此种预防性治疗中，ADAMTS13变体(与或不与ADAMTS13蛋白一起)以单次弹丸式注射或多剂量注射，以维持对预防VOC发病有效的总ADAMTS13的循环水平。在这些方面，包含ADAMTS13变体的组合物(包括含ADAMTS13的组合物)被每月一次、每两周一次、每周一次、每周两次、每两天一次、每天一次、每12小时一次、每8小时一次、每6小时一次、每4小时一次、每2小时一次或每小时一次地施用。在某些方面，注射剂被皮下施用。在其他方面，注射剂被静脉内施用。
在一个实施方式中，本公开提供了治疗有此需要的哺乳动物的SCD中的VOC的方法，该方法包括向哺乳动物施用治疗有效量的包含ADAMTS13变体的组合物(含或不含ADAMTS13蛋白)，其中，总ADAMTS13的治疗有效量为约1至约4000个单位FTS-VWF73活性每千克哺乳动物体重(IU/kg)。在一个具体实施方式中，哺乳动物为人类。在一个实施方式中，约1IU/kg至约4000IU/kg的总ADAMTS13约每月施用一次。在一个实施方式中，约1IU/kg至约4000IU/kg的总ADAMTS13约每月施用两次。在一个实施方式中，约1IU/kg至约4000IU/kg的总ADAMTS13约每周施用一次。在一个实施方式中，约1IU/kg至约4000IU/kg的总ADAMTS13约每周施用两次。在一个实施方式中，约1IU/kg至约4000IU/kg的总ADAMTS13约每周施用三次。在一个实施方式中，约1IU/kg至约4000IU/kg的总ADAMTS13约每48小时施用一次。在一个实施方式中，约1IU/kg至约4000IU/kg的总ADAMTS13约每24小时施用一次。在一个实施方式中，约1IU/kg至约4000IU/kg的总ADAMTS13约每12小时施用一次。在某些实施方式中，剂量被施用以进行治疗和/或预防。在某些方面，注射剂被静脉内施用。在其他方面，注射剂被皮下施用。
在一个实施方式中，本公开提供了治疗有此需要的哺乳动物的SCD中的VOC的方法，该方法包括向哺乳动物施用治疗有效量的包含ADAMTS13变体的组合物(含或不含ADAMTS13蛋白)，其中，总ADAMTS13的治疗有效量为约5至约4000个单位FTS-VWF73活性每千克哺乳动物体重(IU/kg)。在一个具体实施方式中，哺乳动物为人类。在一个实施方式中，约5IU/kg至约4000IU/kg的总ADAMTS13约每月施用一次。在一个实施方式中，约5IU/kg至约4000IU/kg的总ADAMTS13约每月施用两次。在一个实施方式中，约5IU/kg至约4000IU/kg的总ADAMTS13约每周施用一次。在一个实施方式中，约5IU/kg至约4000IU/kg的总ADAMTS13约每周施用两次。在一个实施方式中，约5IU/kg至约4000IU/kg的总ADAMTS13约每周施用三次。在一个实施方式中，约5IU/kg至约4000IU/kg的总ADAMTS13约每48小时施用一次。在一个实施方式中，约5IU/kg至约4000IU/kg的总ADAMTS13约每24小时施用一次。在一个实施方式中，约5IU/kg至约4000IU/kg的总ADAMTS13约每12小时施用一次。在某些实施方式中，剂量被施用以进行治疗和/或预防。在某些方面，注射剂被静脉内施用。在其他方面，注射剂被皮下施用。
在一个实施方式中，本公开提供了治疗有此需要的哺乳动物的SCD中的VOC的方法，该方法包括向哺乳动物施用治疗有效量的包含ADAMTS13变体的组合物(含或不含ADAMTS13蛋白)，其中，总ADAMTS13的治疗有效量为约20至约2000个单位FTS-VWF73活性每千克哺乳动物体重(IU/kg)。在一个具体实施方式中，哺乳动物为人类。在一个实施方式中，约20IU/kg至约2000IU/kg的总ADAMTS13约每月施用一次。在一个实施方式中，约20IU/kg至约2000IU/kg的总ADAMTS13约每月施用两次。在一个实施方式中，约20IU/kg至约2000IU/kg的总ADAMTS13约每周施用一次。在一个实施方式中，约20IU/kg至约2000IU/kg的总ADAMTS13约每周施用两次。在一个实施方式中，约20IU/kg至约2000IU/kg的总ADAMTS13约每周施用三次。在一个实施方式中，约20IU/kg至约2000IU/kg的总ADAMTS13约每48小时施用一次。在一个实施方式中，约20IU/kg至约2000IU/kg的总ADAMTS13约每24小时施用一次。在一个实施方式中，约20IU/kg至约2000IU/kg的总ADAMTS13约每12小时施用一次。在某些实施方式中，剂量被施用以进行治疗和/或预防。在某些方面，注射剂被静脉内施用。在其他方面，注射剂被皮下施用。
在一个实施方式中，本公开提供了治疗有此需要的哺乳动物的SCD中的VOC的方法，该方法包括向哺乳动物施用治疗有效量的包含ADAMTS13变体的组合物(含或不含ADAMTS13蛋白)，其中，总ADAMTS13的治疗有效量为约20至约500个单位FTS-VWF73活性每千克哺乳动物体重(IU/kg)。在一个具体实施方式中，哺乳动物为人类。在一个实施方式中，约20IU/kg至约500IU/kg的总ADAMTS13约每月施用一次。在一个实施方式中，约20IU/kg至约500IU/kg的总ADAMTS13约每月施用两次。在一个实施方式中，约20IU/kg至约500IU/kg的总ADAMTS13约每周施用一次。在一个实施方式中，约20IU/kg至约500IU/kg的总ADAMTS13约每周施用两次。在一个实施方式中，约20IU/kg至约500IU/kg的总ADAMTS13约每周施用三次。在一个实施方式中，约20IU/kg至约500IU/kg的总ADAMTS13约每48小时施用一次。在一个实施方式中，约20IU/kg至约500IU/kg的总ADAMTS13约每24小时施用一次。在一个实施方式中，约20IU/kg至约500IU/kg的总ADAMTS13约每12小时施用一次。在某些实施方式中，剂量被施用以进行治疗和/或预防。在某些方面，注射剂被静脉内施用。在其他方面，注射剂被皮下施用。
在一个实施方式中，本公开提供了治疗有此需要的哺乳动物的SCD中的VOC的方法，该方法包括向哺乳动物施用治疗有效量的包含ADAMTS13变体的组合物(含或不含ADAMTS13蛋白)，其中，总ADAMTS13的治疗有效量为约20至约160个单位FTS-VWF73活性每千克哺乳动物体重(IU/kg)。在一个具体实施方式中，哺乳动物为人类。在一个实施方式中，约20IU/kg至约160IU/kg的总ADAMTS13约每月施用一次。在一个实施方式中，约20IU/kg至约160IU/kg的总ADAMTS13约每月施用两次。在一个实施方式中，约20IU/kg至约160IU/kg的总ADAMTS13约每周施用一次。在一个实施方式中，约20IU/kg至约160IU/kg的总ADAMTS13约每周施用两次。在一个实施方式中，约20IU/kg至约160IU/kg的总ADAMTS13约每周施用三次。在一个实施方式中，约20IU/kg至约160IU/kg的总ADAMTS13约每48小时施用一次。在一个实施方式中，约20IU/kg至约160IU/kg的总ADAMTS13约每24小时施用一次。在一个实施方式中，约20IU/kg至约160IU/kg的总ADAMTS13约每12小时施用一次。在某些实施方式中，剂量被施用以进行治疗和/或预防。在某些方面，注射剂被静脉内施用。在其他方面，注射剂被皮下施用。
在一个实施方式中，本公开提供了治疗有此需要的哺乳动物的SCD中的VOC的方法，该方法包括向哺乳动物施用治疗有效量的包含ADAMTS13变体的组合物(含或不含ADAMTS13蛋白)，其中，总ADAMTS13的治疗有效量为约40至约160个单位FTS-VWF73活性每千克哺乳动物体重(IU/kg)。在一个具体实施方式中，哺乳动物为人类。在一个实施方式中，约40IU/kg至约160IU/kg的总ADAMTS13约每月施用一次。在一个实施方式中，约40IU/kg至约160IU/kg的总ADAMTS13约每月施用两次。在一个实施方式中，约40IU/kg至约160IU/kg的总ADAMTS13约每周施用一次。在一个实施方式中，约40IU/kg至约160IU/kg的总ADAMTS13约每周施用两次。在一个实施方式中，约40IU/kg至约160IU/kg的总ADAMTS13约每周施用三次。在一个实施方式中，约40IU/kg至约160IU/kg的总ADAMTS13约每48小时施用一次。在一个实施方式中，约40IU/kg至约160IU/kg的总ADAMTS13约每24小时施用一次。在一个实施方式中，约40IU/kg至约160IU/kg的总ADAMTS13约每12小时施用一次。在某些实施方式中，总ADAMTS13的剂量为约20IU/kg、约40IU/kg、约50IU/kg、约60IU/kg、约70IU/kg、约75IU/kg、约80IU/kg、约90IU/kg、约100IU/kg、约100IU/kg、约120IU/kg、约125IU/kg、约130IU/kg、约140IU/kg、约150IU/kg或约160IU/kg。在某些实施方式中，总ADAMTS13的剂量为约40IU/kg、约80IU/kg或约160IU/kg。在某些实施方式中，剂量被施用以进行治疗和/或预防。在某些方面，注射剂被静脉内施用。在其他方面，注射剂被皮下施用。
在某些实施方式中，本公开提供了治疗和/或预防急性肺损伤(ALI)和急性呼吸窘迫综合征(ARDS)的方法，包括由此产生的呼吸机相关的肺损伤。ALI/ARDS的发病机制可通过血管内皮和肺泡上皮的损伤来解释。NHLBI ARDS网络的III期临床试验已经通过肺保护性通气策略和液体保守方案提高了生存率并缩短了机械通气的持续时间。然而，由于目前尚无针对ALI/ARDS的特异性药物疗法，对额外治疗的医疗需求尚未得到满足。因此，使用ADAMTS13治疗ALI/ARDS代表了ALI/ARDS治疗的突破。
在某些实施方式中，ALI是一种急性炎症病症，其可引起肺内皮和上皮屏障的破坏。ALI的细胞特征包括：肺泡-毛细血管膜完整性的丧失、中性粒细胞过度跨上皮迁移和促炎、细胞毒性介质的释放。一些研究证实了内皮损伤后VWF的释放会增加和细胞内粘附分子-1(ICAM-1)的上调(Johnson，同上)。中性粒细胞跨上皮迁移是ALI的一个重要特征，因为中性粒细胞是炎症的主要原因。中性粒细胞的长时间活化有助于基底膜的破坏和肺泡-毛细血管屏障的通透性增加(Johnson，同上)。
在某些实施方式中，ARDS包括急性发作的呼吸急促、低氧血症、弥漫性肺浸润和肺依从性丧失，其特征是成年人的短期高死亡率(Walkey，同上)。ARDS的治疗策略侧重于治疗潜在的病因和提供支持性护理，以减少肺损伤的进展。大多数ARDS患者会发展成严重到需要机械通气支持的呼吸衰竭。机械通气可引起进一步的肺损伤，称为呼吸机相关肺损伤(VALI)，由过度扩张和循环复张的联合机械力造成。VALI通过全身释放炎症细胞因子产生“生物创伤”。目前，ARDS管理的主要目标是降低VALI(Walkey，同上)。
ADAMTS13变体或其组合物(包括含ADAMTS13的组合物)可用于治疗或改善由急性肺损伤引起的肺损伤，急性肺损伤的特征是肺水肿(包括炎症性肺水肿)的突然发病，继发于无数局部或全身性损伤，包括双侧、炎症性肺浸润和氧合受损或低氧血症。
在某些实施方式中，ALI和/或ARDS可以定义为但不限于与ALI/ARDS相关的缺血、呼吸异常(例如呼吸急促和呼吸短促)、非心源性肺水肿、肺浸润、氧合减少以及通气减少中的一种以上。本公开包括减少ALI/ARDS症状的方法，包括但不限于与ALI/ARDS相关的缺血、呼吸异常(例如呼吸急促和呼吸短促)、非心源性肺水肿、肺浸润、氧合减少、通气减少及它们的组合中的至少一种。
在某些实施方式中，ALI和/或ARDS可被定义为与对照相比外周血中性粒细胞的增加。在某些实施方式中，ALI和/或ARDS可被定义为与对照相比肺血管渗漏的增加，例如支气管肺泡灌洗液(BAL)中白细胞数量的增加和/或蛋白质含量(BAL蛋白质(mg/mL))的增加。
在某些实施方式中，与对照相比器官中血管活化水平的增加是ALI和/或ARDS的标志。在某些实施方式中，与对照相比器官中炎症性血管病变水平的增加是ALI和/或ARDS的标志。在某些实施方式中，与对照相比组织中血管活化和炎症性血管病变水平的增加是ALI和/或ARDS的标志。在某些实施方式中，器官为肺和/或肾。
在某些实施方式中，ALI和/或ARDS可被定义为与对照相比NF-kB(NF-kB的活化由P-NF-kB或P-NF-kB/NF-kB比率进行测量)、VCAM-1和/或ICAM-1的表达、水平和/或活化的增加。在某些实施方式中，ALI和/或ARDS可被定义为与对照相比内皮素-1(ET-1)、血栓素合成酶(TXAS)和血红素-氧合酶-1(HO-1)中至少一种的表达或水平的增加。在某些实施方式中，可以在肺组织中看到这些增加。在某些实施方式中，可以在肾脏组织中看到这些增加。在某些实施方式中，肾组织中TXAS和ET-1的表达和/或水平增加以及NF-kB的活化是ALI和/或ARDS的标志。
在某些实施方式中，ALI和/或ARDS可以由血液学参数来定义。在某些实施方式中，ALI和/或ARDS可被定义为与对照相比中性粒细胞数量的增加。在某些实施方式中，ALI和/或ARDS可被定义为与对照相比中性粒细胞的增加。
在具体实施方式中，包含ADAMTS13变体的组合物(包括含ADAMTS13的组合物)在ALI或ARDS发病后1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、60、72、84、96、108或120小时内被施用给受试者。在某些实施方式中，包含ADAMTS13变体的组合物(包括含ADAMTS13的组合物)在ALI或ARDS发病后约1至2小时、约1至5小时、约1至10小时、约1至12小时、约1至24小时、约1至36小时、约1至48小时、约1至60小时、约1至72小时、约1至84小时、约1至96小时、约1至108小时或约1至120小时内被施用给受试者。在某些实施方式中，包含ADAMTS13变体的组合物(包括含ADAMTS13蛋白的组合物)在ALI或ARDS发病后约2至5小时、约5至10小时、约10至20小时、约20至40小时、约30至60小时、约40至80小时、约50至100小时或约60至120小时内被施用给受试者。在一些实施方式中，组合物在ALI或ARDS发病或诊断后4小时内、8小时内、12小时内、1天内、2天内、3天内、4天内、5天内、6天内被施用。在某些实施方式中，组合物在ALI或ARDS发病或诊断后1周内被施用。在一些实施方式中，组合物在ALI或ARDS发病或诊断后被每天施用。在某些实施方式中，组合物在ALI或ARDS发病或诊断后被每周施用。在一些实施方式中，组合物被每天施用一次。在某些实施方式中，组合物被每两天施用一次。在一些实施方式中，组合物被每三天施用一次。在一些实施方式中，组合物被每周施用两次。在一些实施方式中，组合物被施用直至临床表现消退。在某些实施方式中，组合物被施用至临床表现消退后一天。在一些实施方式中，在临床表现消退后，组合物被施用至少两天。在一些实施方式中，在临床表现消退后，组合物被施用至少三天。在一些实施方式中，在临床表现消退后，组合物被施用至少一周。
在某些实施方式中，包含ADAMTS13变体的组合物(包括含ADAMTS13的组合物)被施用给受试者以预防ALI或ARDS发病。在此种预防性治疗中，ADAMTS13变体(包括含ADAMTS13的组合物)以单次弹丸式注射或多剂量施用，以维持对预防ALI或ARDS发病有效的ADAMTS13变体的循环水平。在这些方面，包含ADAMTS13变体的组合物(含或不含ADAMTS13蛋白)被每月一次、每两周一次、每周一次、每周两次、每两天一次、每天一次、每12小时一次、每8小时一次、每6小时一次、每4小时一次、每2小时一次或每小时一次地施用。在某些实施方式中，注射剂被皮下施用。在其他方面，注射剂被静脉内施用。
在一些实施方式中，包含ADAMTS13变体的组合物(包括含ADAMTS13的组合物)在ALI或ARDS发病前被施用给受试者以预防ALI或ARDS。在本公开的这些方面，组合物以足以维持受试者或受试者血液中ADAMTS13活性的有效水平的治疗有效量或剂量施用。
在一个实施方式中，本公开提供了治疗有此需要的哺乳动物的ALI和/或ARDS的方法，该方法包括向哺乳动物施用治疗有效量的包含ADAMTS13变体的组合物(含或不含ADAMTS13蛋白)，其中，总ADAMTS13的治疗有效量为约1至约4000个单位FRETS-VWF73活性每千克哺乳动物体重(IU/kg)。在一个具体实施方式中，哺乳动物为人类。在一个实施方式中，约1IU/kg至约4000IU/kg的总ADAMTS13约每月施用一次。在一个实施方式中，约1IU/kg至约4000IU/kg的总ADAMTS13约每月施用两次。在一个实施方式中，约1IU/kg至约4000IU/kg的总ADAMTS13约每周施用一次。在一个实施方式中，约1IU/kg至约4000IU/kg的总ADAMTS13约每周施用两次。在一个实施方式中，约1IU/kg至约4000IU/kg的总ADAMTS13约每周施用三次。在一个实施方式中，约1IU/kg至约4000IU/kg的总ADAMTS13约每48小时施用一次。在一个实施方式中，约1IU/kg至约4000IU/kg的总ADAMTS13约每24小时施用一次。在一个实施方式中，约1IU/kg至约4000IU/kg的总ADAMTS13约每12小时施用一次。在某些实施方式中，剂量被施用以进行治疗和/或预防。在某些方面，注射剂被静脉内施用。在其他方面，注射剂被皮下施用。
在一个实施方式中，本公开提供了治疗有此需要的哺乳动物的ALI和/或ARDS的方法，该方法包括向哺乳动物施用治疗有效量的包含ADAMTS13变体的组合物(含或不含ADAMTS13蛋白)，其中，总ADAMTS13的治疗有效量为约5至约4000个单位FRETS-VWF73活性每千克哺乳动物体重(IU/kg)。在一个具体实施方式中，哺乳动物为人类。在一个实施方式中，约5IU/kg至约4000IU/kg的总ADAMTS13约每月施用一次。在一个实施方式中，约5IU/kg至约4000IU/kg的总ADAMTS13约每月施用两次。在一个实施方式中，约5IU/kg至约4000IU/kg的总ADAMTS13约每周施用一次。在一个实施方式中，约5IU/kg至约4000IU/kg的总ADAMTS13约每周施用两次。在一个实施方式中，约5IU/kg至约4000IU/kg的总ADAMTS13约每周施用三次。在一个实施方式中，约5IU/kg至约4000IU/kg的总ADAMTS13约每48小时施用一次。在一个实施方式中，约5IU/kg至约4000IU/kg的总ADAMTS13约每24小时施用一次。在一个实施方式中，约5IU/kg至约4000IU/kg的总ADAMTS13约每12小时施用一次。在某些实施方式中，剂量被施用以进行治疗和/或预防。在某些方面，注射剂被静脉内施用。在其他方面，注射剂被皮下施用。
在一个实施方式中，本公开提供了治疗有此需要的哺乳动物的ALI和/或ARDS的方法，该方法包括向哺乳动物施用治疗有效量的包含ADAMTS13变体的组合物(含或不含ADAMTS13蛋白)，其中，总ADAMTS13的治疗有效量为约20至约2000个单位FRETS-VWF73活性每千克哺乳动物体重(IU/kg)。在一个具体实施方式中，哺乳动物为人类。在一个实施方式中，约20IU/kg至约2000IU/kg的总ADAMTS13约每月施用一次。在一个实施方式中，约20IU/kg至约2000IU/kg的总ADAMTS13约每月施用两次。在一个实施方式中，约20IU/kg至约2000IU/kg的总ADAMTS13约每周施用一次。在一个实施方式中，约20IU/kg至约2000IU/kg的总ADAMTS13约每周施用两次。在一个实施方式中，约20IU/kg至约2000IU/kg的总ADAMTS13约每周施用三次。在一个实施方式中，约20IU/kg至约2000IU/kg的总ADAMTS13约每48小时施用一次。在一个实施方式中，约20IU/kg至约2000IU/kg的总ADAMTS13约每24小时施用一次。在一个实施方式中，约20IU/kg至约2000IU/kg的总ADAMTS13约每12小时施用一次。在某些实施方式中，剂量被施用以进行治疗和/或预防。在某些方面，注射剂被静脉内施用。在其他方面，注射剂被皮下施用。
在一个实施方式中，本公开提供了治疗有此需要的哺乳动物的ALI和/或ARDS的方法，该方法包括向哺乳动物施用治疗有效量的包含ADAMTS13变体的组合物(含或不含ADAMTS13蛋白)，其中，总ADAMTS13的治疗有效量为约20至约500个单位FRETS-VWF73活性每千克哺乳动物体重(IU/kg)。在一个具体实施方式中，哺乳动物为人类。在一个实施方式中，约20IU/kg至约500IU/kg的总ADAMTS13约每月施用一次。在一个实施方式中，约20IU/kg至约500IU/kg的总ADAMTS13约每月施用两次。在一个实施方式中，约20IU/kg至约500IU/kg的总ADAMTS13约每周施用一次。在一个实施方式中，约20IU/kg至约500IU/kg的总ADAMTS13约每周施用两次。在一个实施方式中，约20IU/kg至约500IU/kg的总ADAMTS13约每周施用三次。在一个实施方式中，约20IU/kg至约500IU/kg的总ADAMTS13约每48小时施用一次。在一个实施方式中，约20IU/kg至约500IU/kg的总ADAMTS13约每24小时施用一次。在一个实施方式中，约20IU/kg至约500IU/kg的总ADAMTS13约每12小时施用一次。在某些实施方式中，剂量被施用以进行治疗和/或预防。在某些方面，注射剂被静脉内施用。在其他方面，注射剂被皮下施用。
在一个实施方式中，本公开提供了治疗有此需要的哺乳动物的ALI和/或ARDS的方法，该方法包括向哺乳动物施用治疗有效量的包含ADAMTS13变体的组合物(含或不含ADAMTS13蛋白)，其中，总ADAMTS13的治疗有效量为约20至约160个单位FRETS-VWF73活性每千克哺乳动物体重(IU/kg)。在一个具体实施方式中，哺乳动物为人类。在一个实施方式中，约20IU/kg至约160IU/kg的总ADAMTS13约每月施用一次。在一个实施方式中，约20IU/kg至约160IU/kg的总ADAMTS13约每月施用两次。在一个实施方式中，约20IU/kg至约160IU/kg的总ADAMTS13约每周施用一次。在一个实施方式中，约20IU/kg至约160IU/kg的总ADAMTS13约每周施用两次。在一个实施方式中，约20IU/kg至约160IU/kg的总ADAMTS13约每周施用三次。在一个实施方式中，约20IU/kg至约160IU/kg的总ADAMTS13约每48小时施用一次。在一个实施方式中，约20IU/kg至约160IU/kg的总ADAMTS13约每24小时施用一次。在一个实施方式中，约20IU/kg至约160IU/kg的总ADAMTS13约每12小时施用一次。在某些实施方式中，剂量被施用以进行治疗和/或预防。在某些方面，注射剂被静脉内施用。在其他方面，注射剂被皮下施用。
在一个实施方式中，本公开提供了治疗有此需要的哺乳动物的ALI和/或ARDS的方法，该方法包括向哺乳动物施用治疗有效量的包含ADAMTS13变体的组合物(含或不含ADAMTS13蛋白)，其中，总ADAMTS13的治疗有效量为约40至约160个单位FRETS-VWF73活性每千克哺乳动物体重(IU/kg)。在一个具体实施方式中，哺乳动物为人类。在一个实施方式中，约40IU/kg至约160IU/kg的总ADAMTS13约每月施用一次。在一个实施方式中，约40IU/kg至约160IU/kg的总ADAMTS13约每月施用两次。在一个实施方式中，约40IU/kg至约160IU/kg的总ADAMTS13约每周施用一次。在一个实施方式中，约40IU/kg至约160IU/kg的总ADAMTS13约每周施用两次。在一个实施方式中，约40IU/kg至约160IU/kg的总ADAMTS13约每周施用三次。在一个实施方式中，约40IU/kg至约160IU/kg的总ADAMTS13约每48小时施用一次。在一个实施方式中，约40IU/kg至约160IU/kg的总ADAMTS13约每24小时施用一次。在一个实施方式中，约40IU/kg至约160IU/kg的总ADAMTS13约每12小时施用一次。在某些实施方式中，总ADAMTS13的剂量为约20IU/kg、约40IU/kg、约50IU/kg、约60IU/kg、约70IU/kg、约75IU/kg、约80IU/kg、约90IU/kg、约100IU/kg、约100IU/kg、约120IU/kg、约125IU/kg、约130IU/kg、约140IU/kg、约150IU/kg或约160IU/kg。在某些实施方式中，总ADAMTS13的剂量为约40IU/kg、约80IU/kg或约160IU/kg。在某些实施方式中，剂量被施用以进行治疗和/或预防。在某些方面，注射剂被静脉内施用。在其他方面，注射剂被皮下施用。
在某些实施方式中，本公开提供了治疗或预防受试者的与心血管疾病相关的凝血障碍的方法，该方法包括向有此需要的受试者施用治疗有效量的ADAMTS13变体或其组合物(包括含ADAMTS13的组合物)。在本文提供的方法的某些实施方式中，凝血障碍包括但不限于心肌梗死、心肌缺血、深静脉血栓形成、周围血管疾病、中风、短暂性缺血发作和医疗器械相关的血栓形成。
在某些实施方式中，本发明提供了治疗或预防受试者的血液病的方法，该方法包括向有此需要的受试者施用治疗有效量的ADAMTS13变体或其组合物(包括含ADAMTS13的组合物)。在本文提供的方法的某些实施方式中，血液病包括但不限于TTP(遗传性和获得性)、血栓性微血管病和镰状细胞疾病。
在某些实施方式中，本公开提供了对患有梗死(例如脑梗死)的受试者的闭塞血管进行再通的方法，如WO2016/191565(其被整体并入本文用于所有目的)中所描述的。ADAMTS13变体及其组合物(包括含ADAMTS13的组合物)有利地以剂量依赖的方式发挥其作用，并且即使在血管闭塞后的长时间内也观察到这些作用。
本主题方法包括在检测到梗死后以特定剂量和时间范围向受试者施用治疗有效量的ADAMTS13变体(与或不与ADAMTS13蛋白一起)的步骤。
本主题方法适用于血管闭塞引起的任何梗死的治疗。此种梗死包括但不限于心肌梗死、脑梗死、肺梗死、脾梗死、肢体梗死、骨梗死、睾丸梗死和眼梗死。
在示例性实施方式中，本主题方法用于患有脑梗死的受试者的闭塞血管的再通。“脑梗死”指一种因大脑供血血管阻断而导致脑组织死亡的缺血性中风。脑梗死的症状取决于受影响的大脑部位。例如，初级运动皮质的梗死可导致对侧偏瘫。脑干梗死可引起Wallenberg综合征、Weber综合征、Millard-Bubler综合征和Benedikt综合征等脑干综合征。
可以使用任何合适的技术测量闭塞血管的再通。例如，再通可以通过与对照基线值(例如没有闭塞血管或梗死的对照个体的血流)相比的血流量百分比来衡量。例如，血流可以使用视频毛细管显微镜帧对帧分析或激光多普勒测速技术来测量。参见例如Stucker等，Microvascular Research 1996，52(2):188-192，其通过引用并入本文。在某些实施方式中，与对照基线值(例如没有闭塞血管或梗死的对照受试者的血流)相比，本主题方法使血流增加至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％。
在不受任何特定操作理论约束的情况下，认为通过本公开的组合物使闭塞血管再通可减少梗死体积。在某些实施方式中，施用本文公开的组合物可减少受试者的梗死体积，减少程度为对照受试者(其未被施用单独的ADAMTS13变体或ADAMTS13变体与ADAMTS13蛋白的组合)的梗死体积的至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％。
在一个实施方式中，ADAMTS13变体组合物(包括含ADAMTS13的组合物)被施用以减少凝血障碍(例如梗死)引起的炎症，从而防止或减少组织损伤(例如对脑损伤的损伤)和/或通过防止白细胞浸润和损伤来减少再灌注损伤。在一个实施方式中，ADAMTS13组合物(包括含ADAMTS13的组合物)被施用以防止再灌注引起的对梗死组织(例如脑组织和心肌组织)的继发性损伤。在某些方面，注射剂被皮下施用。在其他方面，注射剂被静脉内施用。
V.ADAMTS13变体的表达
在某些实施方式中，本文提供的组合物中使用的ADAMTS13变体和/或ADAMTS13蛋白可以根据先前公开的方法(例如US6,926,894、US8,313,926、US2005/0266528、US2007/0015703、US2009/0317375和WO2002/42441，所有这些通过引用整体并入本文用于所有目的)进行表达、生产或纯化。
A.宿主细胞和载体
重组ADAMTS13变体和/或ADAMTS13蛋白可以在任何合适的原核或真核宿主系统中表达产生。真核细胞的示例包括但不限于：哺乳动物细胞，例如CHO(例如CHO DBX-11，CHOZN(Sigma))、COS、HEK 293、BHK、SK-Hep和Hep G2；昆虫细胞，例如SF9细胞、SF21细胞、S2细胞和High Five细胞；以及酵母细胞，例如酵母属细胞或裂殖酵母属细胞。在一个实施方式中，ADAMTS13蛋白可在细菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞、鸟类细胞、哺乳动物细胞等中表达，例如在人类细胞系、仓鼠细胞系或小鼠细胞系中。在一个具体实施方式中，细胞系为CHO、BHK或HEK细胞系。在某些实施方式中，细胞系为CHO细胞系。
在某些实施方式中，可以在上游(例如在培养和收获期间)和下游(例如纯化期间)生产中添加丝氨酸蛋白酶抑制剂(例如抑肽酶、抗蛋白酶、胰凝乳蛋白酶抑制剂、弹性蛋白酶抑制剂、苯甲基磺酰氟(PMSF)、APMSF、TLCK、TPCK、亮抑蛋白酶肽和大豆胰蛋白酶抑制剂)，以防止ADAMTS13变体和/或ADAMTS13蛋白被截短。在某些实施方式中，丝氨酸蛋白酶抑制剂为抑肽酶。
在一个实施方式中，细胞可以为可在生产过程中(即至少1升)培养的任何哺乳动物细胞以生产所需的ADAMTS13蛋白，例如ADAMTS13变体和/或ADAMTS13蛋白。示例包括：由SV40转化的猴肾CV1系(COS-7，ATCC CRL 1651)；人胚胎肾系(293细胞或亚克隆用于悬浮培养生长的293细胞，Graham等，J.Genvirrol.1977，36:59)；幼仓鼠肾细胞(BHK，ATCC CCL10)；中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR，例如DUKX-B11亚克隆(CHO，Uriaub和Chasin，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1980，77:4216)；小鼠Sertoli细胞(TM4，Mather,Biol.Reprod1980，23:243-251)；猴肾细胞(CV1 ATCC CCL 70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)；人宫颈癌细胞(HeLa，ATCC CCL 2)；犬肾细胞(MDCK，ATCC CCL 34)；水牛大鼠肝细胞(BRL3A，ATCC CRL 1442)；人肺细胞(W138，ATCC CCL 75)；人肝细胞(Hep G2，HB 8065)；小鼠乳腺肿瘤(MMT 060562，ATCC CCL 51)；TRI细胞(Mather等，Annals N.Y.Acad.Sci.1982，383:44-68)；MRC-5细胞；FS4细胞；以及人肝癌系(Hep G2)。在某些实施方式中，细胞系为啮齿动物细胞系，特别是仓鼠细胞系(例如CHO或BHK)。
多种载体可用于表达ADAMTS13变体(例如SEQ ID NO：2)和/或ADAMTS13蛋白(例如SEQ ID NO：1)，可以从真核表达载体和原核表达载体中选择。在某些实施方式中，考虑使用质粒载体来表达ADAMTS13变体和/或ADAMTS13蛋白。一般而言，含有复制子和控制序列(其来源于与宿主细胞兼容的物种)的质粒载体与这些宿主结合使用。载体可以携带复制位点，以及能够在转化细胞中提供表型选择的标记序列。质粒将包含编码ADAMTS13变体和/或ADAMTS13蛋白的核苷酸序列，其被可操作地连接至一个以上控制序列(例如启动子)。
需要制备表达重组ADAMTS13变体和/或ADAMTS13蛋白的稳定CHO细胞克隆的方法的一个实施方式如下所示。用DHFR表达载体转染DHFR缺陷型CHO细胞系DUKX-B11以允许相关重组蛋白的表达，基本如US专利号5,250，421(Kaufman等，Genetics Institute,Inc.)中所述。通过在不含次黄嘌呤/胸腺嘧啶(HT)的培养基中生长进行选择，通过在增加浓度的甲氨蝶呤中增殖细胞来实现编码重组ADAMTS13变体和/或ADAMTS13蛋白和DHFR基因表达的相关区域的扩增。在合适情况下，CHO细胞系可适应在无血清和/或无蛋白培养基中生长，基本如US 6,100,061(Reiter等，Immuno Aktiengesellschaft)中所述。
在某些实施方式中，重组ADAMTS13变体和/或ADAMTS13蛋白蛋白可通过在CHO细胞系中表达来产生，CHO细胞系已被工程改造为不表达谷氨酰胺合成酶(GS)，并被培养为在化学成分确定和/或无动物成分的培养基(可选地不含谷氨酰胺和/或次黄嘌呤/胸苷激酶)中生长。在某些实施方式中，CHO细胞系为经工程改造的CHOK1细胞系，其被工程改造为不表达谷氨酰胺合成酶(GS)，并被培养为在化学成分确定和/或无动物成分的培养基(可选地不含谷氨酰胺和/或次黄嘌呤/胸苷激酶)中生长。在某些实施方式中，维持细胞系的谷氨酰胺的来源来自与重组ADAMTS13变体和/或ADAMTS13蛋白表达相关的外源性谷氨酰胺的表达。在某些实施方式中，细胞系可以为US专利号6,534,261、6,607,882、6,746,838、6,794,136、6,824,978、6,866,997、6,9333,113、6,979,539、7,013,219、7,030,215、7,220,719、7,241,573、7,245,574、7,585,849、7,595,376、6,903,185、6,479,626、US20030232410和/或US20090203140(其各自通过引用整体并入本文用于所有目的)中所描述的细胞系。在某些实施方式中，化学成分确定的培养基可以为但不限于EX-Cell培养基(例如EX-Cell CD CHO融合培养基、EX-Cell Advanced CHO Fed-batch培养基或Cellvento4Feed)。在某些实施方式中，细胞系可以为但不限于CHOZN GS-/-细胞系(Sigma)。在某些实施方式中，细胞系为CHOZN GS-/-细胞系。在某些实施方式中，细胞系在EX-Cell Advanced CHO Fed-batch培养基中培养。
在某些实施方式中，重组ADAMTS13变体和/或ADAMTS13蛋白蛋白可以通过在Advanced CHO Fed-batch培养基中生产的CHOZN GS-/-细胞系中表达产生。在某些实施方式中，可以在上游(例如在培养和收获期间)和下游(例如纯化期间)生产中添加丝氨酸蛋白酶抑制剂(例如抑肽酶、抗蛋白酶、胰凝乳蛋白酶抑制剂、弹性蛋白酶抑制剂、苯甲基磺酰氟(PMSF)、APMSF、TLCK、TPCK、亮抑蛋白酶肽和大豆胰蛋白酶抑制剂)，以防止ADAMTS13变体和/或ADAMTS13蛋白被截短。在某些实施方式中，丝氨酸蛋白酶抑制剂为抑肽酶。
在某些实施方式中，稳定的HEK 293细胞如下制备：用含有潮霉素可筛选标志的构建体进行转染，通过抗生素耐受性来筛选转化株。
在某些实施方式中，ADAMTS13蛋白在一个以上糖基化位点处被糖基化。例如，糖基化可以发生在ADAMTS13蛋白的O-聚糖基化位点，包括SEQ ID NO：1中所示的氨基酸序列的丝氨酸残基S399、S698、S757、S907、S965、S1027或S1087。在某些实施方式中，可以用双糖(例如Fuc-Glc双糖)或粘蛋白型O-聚糖(例如具有HexNAc-Hex-NeuAc0-2结构)对ADAMTS13蛋白进行O-聚糖基化。
在某些实施方式中，ADAMTS13蛋白在N-糖基化位点处被糖基化。例如，糖基化可以发生在ADAMTS13蛋白的一个以上N-糖基化位点，包括SEQ ID NO：1中所示氨基酸序列的天冬酰胺残基N142、N146、N552、N579、N614、N667、N707、N828、N1235或N1354。在某些实施方式中，用高甘露糖型N-聚糖对ADAMTS13蛋白进行糖基化。在其他实施方式中，用混合型N-聚糖对ADAMTS13进行糖基化。在某些实施方式中，用复合型N-聚糖(其可包含例如一个核心岩藻糖残基和/或一个以上唾液酸残基)对ADAMTS13蛋白进行糖基化。在某些实施方式中，可以用单唾液酸化、二唾液酸化、三唾液酸化或四唾液酸化的N-聚糖对ADAMTS13蛋白进行修饰。在某些实施方式中，唾液酸化是通过α2,6-连接或α2,3-连接。
在某些实施方式中，ADAMTS13蛋白在一个以上C-甘露糖基化位点的色氨酸残基(例如SEQ ID NO：1中所示ADAMTS13氨基酸序列的W387或W390)处被糖基化。
在某些实施方式中，ADAMTS13或ADAMTS13变体包含N-聚糖特征(signature)，其具有合计至少约75％、约76％、约77％、约78％、约79％、约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％或约86％的中性、单唾液酸化和二唾液酸化的N-聚糖。在某些实施方式中，ADAMTS13或ADAMTS13变体包含N-聚糖特征，其具有合计至少约5％、约6％、约7％、约8％、约9％、约10％、约11％、约12％、约13％、约14％或约15％的三唾液酸化和四唾液酸化的聚糖。在一些实施方式，ADAMTS13或ADAMTS13变体包含N-聚糖特征，其具有约10％至约35％、约11％至约34％、约12％至约33％、约13％至约32％、约14％至约31％、约15％至约30％、约16％至约29％、约17％至约28％、约18％至约27％、约19％至约26％、约20％至约25％、约21％至约24％、约22％至约24％，或23％至约24％的中性N-聚糖。在一些实施方式，ADAMTS13或ADAMTS13变体包含N-聚糖特征，其具有约20％至约50％、约21％至约49％、约22％至约48％、约23％至约47％、约24％至约46％、约25％至约45％、约26％至约44％、约27％至约43％、约28％至约42％、约29％至约41％、约30％至约40％、约31％至约39％、约32％至约38％、约33％至约37％、约34％至约36％或约35％的单唾液酸化N-聚糖。在一些实施方式，ADAMTS13或ADAMTS13变体包含N-聚糖特征，其具有约10％至约40％、约11％至约39％、约12％至约38％、约13％至约37％、约14％至约36％、约15％至约35％、约16％至约34％、约17％至约33％、约18％至约32％、约19％至约31％、约20％至约30％、约22％至约30％、约24％至约30％、约25％至约29％、约26％至约29％、约27％或约28％的二唾液酸化N-聚糖。在一些实施方式中，ADAMTS13或ADAMTS13变体包含N-聚糖特征，其具有约1％至25％、约2％至24％、约3％至23％、约4％至22％、约5％至20％、约6％至19％、约7％至18％、约8％至17％、约9％至16％、约10％至15％、约11％至14％或约11％至12％的三唾液酸化N-聚糖。在一些实施方式中，ADAMTS13或ADAMTS13变体包含N-聚糖特征，其具有约0.1％至10％、约0.5％至8％、约1％至7％、约1％至5％、约1％至4％、约2％至6％、约2％至4％或约3％的四唾液酸化N-聚糖。在一些实施方式，ADAMTS13或ADAMTS13变体包含N-聚糖特征，其N-聚糖指数为约110至约160、约111至约159、约112至约158、约113至约157、约114至约156、约115至约155、约116至约154、约117至约153、约118至约152、约119至约151、约120至约150、约121至约149、约122至约148、约123至约147、约124至约146、约125至约145、约126至约144、约127至约143、约128至约142、约129至约141、约130至约140、约133至约139、约134、约135、约136、约137或约138。在一些实施方式中，ADAMTS13或ADAMTS13变体在CHO细胞系、COS细胞系、HEK 293细胞系、BHK细胞系、SK-Hep细胞系或Hep G2细胞系中产生。在一些实施方式中，ADAMTS13或ADAMTS13变体在CHO DBX-11细胞系或CHOZN细胞系中产生。在一些实施方式中，ADAMTS13或ADAMTS13变体在CHOZN谷氨酰胺合成酶(GS)-/-细胞系中产生。
在一些实施方式，ADAMTS13或ADAMTS13变体包含唾液酸特征，其中NGNA相对于NANA的比率为约1％至约15％、约2％至约12％、约2％至约10％、约3％至约9％、约3％至约8％、约3％至约6％、约4％至约5％或约1％、约2％、约3％、约4％、约5％、约6％、约7％、约8％、约9％、约10％、约11％、约12％、约13％、约14％或约15％。在一些实施方式中，ADAMTS13或ADAMTS13变体在CHO细胞系、COS细胞系、HEK 293细胞系、BHK细胞系、SK-Hep细胞系或Hep G2细胞系中产生。在一些实施方式中，ADAMTS13或ADAMTS13变体在CHO DBX-11细胞系或CHOZN细胞系中产生。在一些实施方式中，ADAMTS13或ADAMTS13变体在CHOZN谷氨酰胺合成酶(GS)-/-细胞系中产生。
在一些实施方式中，ADAMTS13或ADAMTS13变体包含N-聚糖特征，其具有合计至少约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％或约86％的中性、单唾液酸化和二唾液酸化的N-聚糖。在一些实施方式中，ADAMTS13或ADAMTS13变体包含N-聚糖特征，其具有合计至少约16％、约17％、约18％或约19％的三唾液酸化和四唾液酸化的聚糖。在一些实施方式中，ADAMTS13或ADAMTS13变体包含N-聚糖特征，其具有合计至少约16％、约17％、约18％或约19％的三唾液酸化和四唾液酸化的聚糖。在一些实施方式中，ADAMTS13或ADAMTS13变体包含N-聚糖特征，其具有约5％至30％、约6％至28％、约7％至26％、约8％至25％、约9％至22％、约10％至20％、约11％至18％、约12％至17％或约13％至16％的中性N-聚糖。在一些实施方式中，ADAMTS13或ADAMTS13变体包含N-聚糖特征，其具有约10％至约45％、约11％至约44％、约12％至约43％、约13％至约42％、约14％至约41％、约15％至约40％、约16％至约39％、约17％至约38％、约18％至约37％、约19％至约36％、约20％至约35％、约22％至约34％、约24％至约34％、约26％至约33％、约27％、约28％、约29％、约30％、约31％或约32％的单唾液酸化N-聚糖。在一些实施方式中，ADAMTS13或ADAMTS13变体包含N-聚糖特征，其具有约20％至约55％、约21％至约54％、约22％至约53％、约23％至约52％、约24％至约51％、约25％至约50％、约26％至约49％、约27％至约48％、约28％至约47％、约29％至约46％、约30％至约45％、约35％至约44％、约36％至约44％、约37％至约43％、约38％、约39％、约40％、约41％或约42％的二唾液酸化N-聚糖。在一些实施方式中，ADAMTS13或ADAMTS13变体包含N-聚糖特征，其具有约1％至约30％、约2％至约29％、约3％至约28％、约4％至约27％、约5％至约25％、约6％至约24％、约7％至约23％、约8％至约22％、约9％至约21％、约10％至约20％、约11％至约18％、约12％至约15％、约13％或约14％的三唾液酸化N-聚糖。在一些实施方式中，ADAMTS13或ADAMTS13变体包含N-聚糖特征，其具有约0.1％至15％、0.5％至12％、约1％至10％、1％至9％、约2％至8％、2％至7％、约3％至6％、约4％或约5％的四唾液酸化N-聚糖。在一些实施方式，ADAMTS13或ADAMTS13变体包含N-聚糖特征，其N-聚糖指数为约130至190、132至189、134至188、136至186、140至185、141至183、142至181、143至179、144至177、145至175、147至174、149至173、151至172、152至171、153至170、约154人、约155约156、约157、约158、约159、约160、约161、约163、约163、约163、约165、约166、约167、约168或约169。在一些实施方式中，ADAMTS13或ADAMTS13变体在CHO细胞系、COS细胞系、HEK 293细胞系、BHK细胞系、SK-Hep细胞系或Hep G2细胞系中产生。在一些实施方式中，ADAMTS13或ADAMTS13变体在CHO DBX-11细胞系或CHOZN细胞系中产生。在一些实施方式中，ADAMTS13或ADAMTS13变体在CHO DBX-11细胞系中产生。
在一些实施方式，ADAMTS13或ADAMTS13变体包含单糖特征，其具有约10％至约40％、约11％至约39％、约12％至约38％、约13％至约37％、约14％至约36％、约15％至约35％、约16％至约34％、约17％至约33％、约18％至约32％、约19％至约31％、约20％至约30％、约21％至约30％、约23％至约30％、约25％至约29％、约26％至约29％，约27％至约29％或28％的GlcNAc。在一些实施方式中，ADAMTS13或ADAMTS13变体包含单糖特征，其具有约0.1％至约10％、约1％至约8％、约5％至约6％或约6％的GalNAc。在一些实施方式，ADAMTS13或ADAMTS13变体包含单糖特征，其具有约10％至约35％、约11％至约34％、约12％至约33％、约13％至约32％、约14％至约31％、约15％至约30％、约16％至约29％、约17％至约28％、约18％至约27％、约19％至约26％、约20％至约25％、约21％至约25％、约22％至约24％或约23％至约24％的Gal。在一些实施方式中，ADAMTS13或ADAMTS13变体包含约10％至约35％、约11％至约34％、约12％至约33％、约13％至约32％、约14％至约31％、约15％至约30％、约16％至约29％、约18％至约28％、约20％至约28％、约21％至约27％、约22％至约26％、约23％至约25％、约23％、约24％或约25％的Man。在一些实施方式中，ADAMTS13或ADAMTS13变体包含约0.1％至约20％、约0.5％至约18％、约1％至约15％、约2％至约14％、约3％至约13％、约4％至约12％、约5％至约10％、约5％至约8％、约6％至约7％、约6％或约7％的Glc。在一些实施方式中，ADAMTS13或ADAMTS13变体包含约5％至约20％、约6％至约19％、约7％至约18％、约8％至约17％、约9％至约16％、约10％至约15％、约10％至约14％、约11％至约13％、约11％至约12％、约10％、约11％或约12％的Fuc。在一些实施方式中，ADAMTS13或ADAMTS13变体在CHO细胞系、COS细胞系、HEK 293细胞系、BHK细胞系、SK-Hep细胞系或Hep G2细胞系中产生。在一些实施方式中，ADAMTS13或ADAMTS13变体在CHO DBX-11细胞系或CHOZN细胞系中产生。在一些实施方式中，ADAMTS13或ADAMTS13变体在CHO DBX-11细胞系中产生。
在一些实施方式，ADAMTS13或ADAMTS13变体包含单糖特征，其具有约100nmol约200nmol、约105nmol至约190nmol、约110nmol至约180nmol、约118nmol至约175nmol、约120nmol约172、约125nmol至约170nmol、约130nmol至约169nmol、约135nmol、约140nmol、约145nmol、约150nmol、约155nmol、约160nmol或约165nmol NANA/mg。在一些实施方式，ADAMTS13或ADAMTS13变体包含单糖特征，其具有约0.01nmol至约1nmol、约0.02nmol至约0.75nmol、约0.04nmol至约0.60nmol、约0.05nmol至约0.50nmol、约0.06nmol至约0.40nmol、约0.07nmol至约0.35nmol、约0.08nmol至约0.30nmol、约0.1nmol至约0.3nmol、约0.1nmol、约0.2nmol、约0.3nmol NGNA/mg。在一些实施方式中，ADAMTS13或ADAMTS13变体包含单糖特征，其中NGNA相对于NANA的比率为约0.01％至约1％、约0.02％至约0.75％、约0.04％至约0.6％、约0.05％至约0.5％、约0.06％至约0.4％、约0.06％至约0.2％、约0.08％至约0.2％、约0.1％至约0.2％或约0.15％、约0.2％、或约0.15％。在一些实施方式中，ADAMTS13或ADAMTS13变体在CHO细胞系、COS细胞系、HEK 293细胞系、BHK细胞系、SK-Hep细胞系或Hep G2细胞系中产生。在一些实施方式中，ADAMTS13或ADAMTS13变体在CHO DBX-11细胞系或CHOZN细胞系中产生。在一些实施方式中，ADAMTS13或ADAMTS13变体在CHO DBX-11细胞系中产生。
某些病毒具有感染细胞或通过受体介导的内吞作用进入细胞、整合到宿主细胞基因组中并稳定有效地表达病毒基因的能力，这使它们成为将外源核酸转移到细胞(例如哺乳动物细胞)中的有吸引力的候选者。因此，在某些实施方式中，病毒载体用于将编码ADAMTS13变体和/或ADAMTS13蛋白的核苷酸序列引入宿主细胞进行表达。病毒载体将包含编码ADAMTS变体和/或ADAMTS13的核苷酸序列，其被可操作地连接一个以上控制序列(例如启动子)。或者，病毒载体可以不包含控制序列，而是依赖宿主细胞内的控制序列来驱动ADAMTS13变体和/或ADAMTS13蛋白的表达。可用于递送核酸的病毒载体的非限制性示例包括腺病毒载体、AAV载体和逆转录病毒载体。
在一个实施方式中，腺病毒表达载体包括包含腺病毒序列的构建体，其足以支持该构建体的包装，并最终表达其中克隆的ADAMTS构建体。腺病毒载体允许引入至多7kb的外来序列(Grunhaus等，Seminar in Virology 1992，200(2):535-546)。
在其他实施方式中，腺相关病毒(AAV)可用于将编码ADAMTS13蛋白(例如ADAMTS13)的核苷酸序列引入宿主细胞进行表达。AAV体系先前已经被描述过，在本领域通常是众所周知的(Kelleher和Vos，Biotechniques 1994，17(6):1110-1117；Cotten等，ProcNatl Acad Sci USA 1992，89(13):6094-6098；Curiel,Nat Immun 1994，13(2-3):141-164；Muzyczka，Curr Top Microbiol Immunol 1992，158:97-129)。例如，关于rAAV载体的产生和使用的细节被描述于US专利号5139941和4,797,368，其各自通过引用整体并入本文用于所有目的。
在一个实施方式中，逆转录病毒表达载体可用于将编码ADAMTS13变体和/或ADAMTS13蛋白的核苷酸序列引入宿主细胞进行表达。这些体系先前已经被描述过，在本领域通常是众所周知的(Mann等，Cell 1983，33:3-159；Nicola和Rubinstein，Vectors:Asurvey of molecular cloning vectors and their uses 1988，Rodriguez和Denhardt编辑，Butterworth-Heinemann出版社，第494-513页；Temin，Gene Transfer 1986，Kucherlapati编辑，New York:Plenum出版社，第149-188页)。在一个具体实施方式中，逆转录病毒载体是慢病毒载体(参见例如Naldini等，Science 1996，272(5259):263-267；Zufferey等，Nat Biotechnol 1997，15(9):871-875；Blomer等，J Virol.1997，71(9):6641-6649；US专利号6,013,516和5,994,136)。
原核表达载体的非限制性示例包括质粒(例如pRSET、pET、pBAD等)，其中，原核表达载体中使用的启动子包括lac、trc、trp、recA、araBAD等。真核表达载体的示例包括：(i)用于在酵母中表达的载体(例如pAO、pPIC、pYES、pMET)，使用启动子(例如AOX1、GAP、GAL1、AUG1等)；(ii)用于在昆虫细胞中表达的载体(例如pMT、pAc5、pIB、pMIB、pBAC等)，使用启动子(例如PH、p10、MT、Ac5、OpIE2、gp64、polh等)；(iii)用于在哺乳动物细胞中表达的载体(例如pSVL、pCMV、pRc/RSV、pcDNA3、pBPV等)，以及来自病毒体系的载体(例如痘苗病毒、腺相关病毒、疱疹病毒、逆转录病毒等)，使用启动子(例如CMV、SV40、EF-1、UbC、RSV、ADV、BPV和β-actin)。
在某些实施方式中，ADAMTS13变体和/或ADAMTS13蛋白的细胞培养表达可以包括使用微载体。在其他方面中，本发明提供了大规模ADAMTS13变体和/或ADAMTS13蛋白表达的方法。在一些实施方式中，实施方式的细胞培养可以在适合提供高体积特异性培养表面积以实现高细胞密度和蛋白表达的条件下在大型生物反应器中进行。提供此种生长条件的一种方法是在搅拌槽生物反应器中使用微载体进行细胞培养。在其他实施方式中，通过使用悬浮细胞培养来满足这些生长要求。
B.培养方法
在某些实施方式中，ADAMTS13变体和/或ADAMTS13蛋白表达可以包括在分批或连续操作模式下操作的细胞培养体系的使用。例如，当使用分批细胞培养时，它们可以在单批次、分批补料(fed-batch)或重复分批(repeated-batch)模式下操作。同样，连续细胞培养也可以在灌注、恒浊(turbidostat)或恒化(chemostat)模式下进行。分批和连续细胞培养可以在悬浮或贴壁条件下进行。当在悬浮条件下操作时，细胞将在培养基中自由悬浮并混合。或者，在贴壁条件下，细胞将结合到固相(例如，微载体、多孔微载体、圆盘载体、陶瓷盒、中空纤维、平板、凝胶基质等)。
分批培养通常是一种大规模的细胞培养，其中，细胞接种物在罐中或发酵罐中被培养至最大密度，并作为单个批次进行收获和加工。分批补料培养通常是一种提供新鲜营养物质(例如限制生长的基质)或添加剂(例如产品的前体)的分批培养。补料溶液通常是高度浓缩的，以避免生物反应物被稀释。在重复分批培养中，细胞被置于培养基中并生长至所需的细胞密度。为了避免衰退期开始和细胞死亡，然后在细胞达到其最大浓度之前用完全生长培养基稀释培养物。稀释的数量和频率差异很大，取决于细胞系的生长特性和培养过程的方便性。这个过程可以根据需要重复很多次，除非细胞和培养基在传代培养时被丢弃，否则随着每次稀释的进行，培养体积将逐步增加。增加的体积可以如下处理：提供足够大的反应器以允许在容器内稀释，或将稀释的培养物分成几个容器。此种培养的基本原理是保持细胞在指数增长的状态。连续传代的特点是培养体积总是逐步增加，可以多次收获，细胞持续生长，这个过程可以根据需要持续进行。在某些实施方式中，ADAMTS13变体和/或ADAMTS13蛋白可以在收获分批培养物的上清液后回收。
连续培养可以是一种悬浮培养，通过流入新鲜培养基来连续提供养分，其中培养体积通常通过去除废培养基而保持恒定。在恒化法和恒浊法中，提取的培养基中含有细胞。因此，留在细胞培养容器中的细胞必须生长以保持稳定状态。在恒化法中，生长速率通常通过控制稀释速率(即添加新鲜培养基的速率)来控制。细胞在培养物中的生长速率可以通过改变稀释速率来控制，例如在次最大生长速率下。相比之下，在恒浊法中，稀释率被设置为允许在给定操作条件下(例如pH和温度)细胞可实现的最大生长速率。
在灌注培养中，提取的培养基中细胞被耗尽，细胞被保留在培养容器中，例如，通过过滤或离心方法使细胞重新引入培养。然而，通常用于过滤的膜不能保留100％的细胞，因此在提取培养基时要去除一部分。在非常高的生长速率下操作灌注培养可能并不重要，因为大多数细胞保留在培养容器中。
搅拌槽反应器体系可用于悬浮或贴壁模式下的分批和连续细胞培养。一般而言，搅拌槽反应器体系可以如任何常规搅拌槽反应器一样操作，具有任何类型的搅拌器(例如Rushton搅拌器、水翼搅拌器、斜桨搅拌器或船用搅拌器)。
C.培养基
ADAMTS13变体和/或ADAMTS13蛋白可以在不添加外源蛋白的培养基中表达。“无蛋白质培养基”及相关术语指缺乏蛋白质的培养基，其来源是外源性的、而不是培养物中在生长过程中自然脱落蛋白质的细胞。在一个实施方式中，ADAMTS13变体和/或ADAMTS13蛋白可以在不含外源添加蛋白质(即无蛋白)且补充有锌、钙和/或烟酰胺(维生素B3)的培养基中表达。在某些实施方式中，无蛋白质培养基包含多胺。例如，浓度至少为2mg/L、或约2mg/L至30mg/L、或约2mg/L至8mg/L。在具体实施方式中，多胺为腐胺。示例性无蛋白培养基被教导于US专利号6,171,825、6,936,441和8,313,926；WO 2007/077217；以及US专利申请公开号2008/0009040和2007/0212770，其公开内容通过引用整体并入本文用于所有目的。
制备无动物蛋白和化学成分确定培养基的方法为本领域已知，例如US专利号6,171,825和6,936,441、WO2007/077217以及US专利申请公开号2008/0009040和2007/0212770，其公开内容通过引用整体并入本文用于所有目的。在一个实施方式中，用于表达ADAMTS13蛋白的培养基为无动物蛋白或无寡肽培养基。在某些实施方式中，培养基可以为化学成分确定的。在某些实施方式中，培养基可包含至少一种浓度为约0.5mg/L至约10mg/L的多胺。
ADAMTS13变体和/或ADAMTS13蛋白也可以在不添加外源寡肽的培养基中表达。在一个实施方式中，ADAMTS13变体和/或ADAMTS13蛋白在不含外源添加的寡肽(即无多肽)且补充有锌、钙和/或烟酰胺(维生素B3)的培养基中表达。在某些实施方式中，无寡肽培养基包含多胺。例如，浓度至少为2mg/L、或约2mg/L至30mg/L、或约2mg/L至8mg/L。在具体实施方式中，多胺为腐胺。示例性无寡肽培养基被教导于US专利号6,171,825、6,936,441和8,313,926；WO 2007/077217；以及US专利申请公开号2008/0009040和2007/0212770，其公开内容通过引用整体并入本文用于所有目的。
ADAMTS13变体和/或ADAMTS13蛋白也可以在不含血清的培养基中表达。在一个实施方式中，ADAMTS13变体和/或ADAMTS13蛋白在不含外源添加的血清(即无血清)且补充有锌、钙和/或烟酰胺(维生素B3)的培养基中表达。在某些实施方式中，无血清培养基包含多胺。例如，浓度至少为2mg/L、或约2mg/L至30mg/L、或约2mg/L至8mg/L。在具体实施方式中，多胺为腐胺。示例性无血清培养基被教导于US专利号6,171,825、6,936,441和8,313,926；WO 2007/077217；以及US专利申请公开号2008/0009040和2007/0212770，其公开内容通过引用整体并入本文用于所有目的。
ADAMTS13变体和/或ADAMTS13蛋白也可以在不含动物蛋白的培养基中表达。在一个实施方式中，ADAMTS13变体和/或ADAMTS13蛋白在不含外源添加的动物蛋白或多肽(即，无动物蛋白)且补充有锌、钙和/或烟酰胺(维生素B3)的培养基中表达。在某些实施方式中，无动物蛋白培养基包含多胺。例如，浓度为至少2mg/L、或约2mg/L至30mg/L、或约2mg/L至8mg/L。在具体实施方式中，多胺为腐胺。示例性无动物蛋白培养基被教导于US专利号6,171,825、6,936,441和8,313,926；WO 2007/077217；以及US专利申请公开号2008/0009040和2007/0212770，其公开内容通过引用整体并入本文用于所有目的。
ADAMTS13变体和/或ADAMTS13蛋白也可以在补充额外的钙、锌和/或维生素B3的培养基中表达，如US专利号8,313,926(其公开内容通过引用整体并入本文用于所有目的)中所述。在某些实施方式中，培养基可以为无动物蛋白、无寡肽或化学成分确定的培养基。在某些实施方式中，无动物蛋白或无寡肽培养按照US专利号6,171,825和6,936,441、WO2007/077217和US专利申请公开号2008/0009040和2007/0212770(其公开内容各自通过引用整体并入本文用于所有目的，它们均通过引用整体并入本文用于所有目的)中教导地进行制备，并补充有额外的钙、锌和/或维生素B3。在一个具体实施方式中，化学成分确定的培养基可以类似于Dulbecco改良型Eagle培养基(DMEM)，该培养基添加有额外的钙、锌和/或维生素B3以增加在该培养基中培养的细胞中表达的ADAMTS变体和/或ADAMTS13的比活。在其他实施方式中，培养基不含动物成分。在其他实施方式中，培养基包含蛋白质，例如来自血清的动物蛋白，例如胎牛血清。在其他实施方式中，培养物具有外源添加的重组蛋白。在其他实施方式中，蛋白质来自经认证的无病原体动物。
VI.ADAMTS13变体试剂盒
在另一个方面，提供试剂盒用于治疗与ADAMTS13或VWF功能障碍相关的疾病或病况。在一个实施方式中，试剂盒包含ADAMTS13变体和/或ADAMTS13蛋白的组合物。在某些实施方式中，本文提供的试剂盒可包含一剂以上本文提供的液体组合物或冻干组合物。当试剂盒中含有冻干ADAMTS13变体和/或ADAMTS13蛋白组合物时，通常该试剂盒中还应包含用于将液体组合物重构的合适液体，例如无菌水或药物学上可接受的缓冲液。在一些实施方式中，试剂盒包含ADAMTS13变体组合物，包括预先包装在注射器中的ADAMTS13组合物，用于由保健专业人员皮下施用或用于家庭使用。
在一些实施方式，ADAMTS13变体包含SEQ ID NO：2中所示的氨基酸序列或与SEQID NO：2具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性同时仍保留R97的变体。在某些实施方式中，编码ADAMTS13变体的核苷酸序列包含编码SEQ ID NO：2中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO：2具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性同时仍保留R97的变体的核苷酸序列。在某些实施方式中，ADAMTS13变体包含SEQ ID NO：2中所示的氨基酸序列。在某些实施方式中，ADAMTS13变体由SEQ ID NO：2中所示的氨基酸序列组成。在某些实施方式中，ADAMTS13变体基本上由SEQ ID NO：2中所示的氨基酸序列组成。
在一些实施方式，ADAMTS13蛋白包含SEQ ID NO：1中所示的氨基酸序列或与SEQID NO：1具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的序列。在某些实施方式中，编码ADAMTS13蛋白的核苷酸序列包含编码SEQ ID NO：1的氨基酸序列或与SEQ ID NO：2具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的序列的核苷酸序列。在某些实施方式中，ADAMTS13蛋白包含SEQ ID NO：1中所示的氨基酸序列。在某些实施方式中，ADAMTS13蛋白由SEQ ID NO：1中所示的氨基酸序列组成。在某些实施方式中，ADAMTS13蛋白基本上由SEQ ID NO：1中所示的氨基酸序列组成。
在一个实施方式中，提供了包含约1个单位的FTS-VWF73活性至约10,000个单位的FTS-VWF73活性的试剂盒。在其他实施方式，试剂盒可以提供例如约20个单位FRETS-VWF73(UFV73)活性至8000个单位FRETS-VWF73活性，或约30UFV73至约6000UFV73、约40UFV73至约4000UFV73、约50UFV73至约3000UFV73、约75UFV73至约2500UFV73、约100UFV73至约2000UFV73、约200UFV73至约1500UFV73或其中的其他范围。在具体实施方式中，试剂盒可以提供约10个单位的FRETS-VWF73活性，或约1、5、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2100、2200、2300、2400、2500、2600、2700、2800、2900、3000、3100、3200、3300、3400、3500、3600、3700、3800、3900、4000、4100、4200、4300、4400、4500、4600、4700、4800、4900、5000、5100、5200、5300、5400、5500、5600、5800、5900、6000、6,100、6,200、6,300、6,400、6,900、7,000、7,100、7,200、7,300、7,400、7,900、8,000、8,100、8,200、7,300、7,900、8,900、8,100、8,200、8,300、8,900、9,000、9,100、9,200、9,300、9,400、9,900、10,000、11,000、12,000、13,000、14,000、15,000、16,000、17,000、18,000、19,000或20,000个以上单位的FRETS-VWF73活性。
在某些实施方式中，试剂盒用于ADAMTS13变体和/或ADAMTS13蛋白的单次施用或剂量。在其他实施方式中，试剂盒可以包含多剂量的ADAMTS13变体和/或ADAMTS13蛋白用于施用。在一个实施方式中，试剂盒可以包含预先包装在注射器中的ADAMTS13变体和/或ADAMTS13蛋白组合物，用于由保健专业人员皮下施用或用于家庭使用。
VII.实施方式
本申请供了如下非限制性实施方式。
1.一种重组ADAMTS13变体，其中，与ADAMTS13蛋白相比，所述ADAMTS13变体包含具有至少一个氨基酸替代的氨基酸序列。
2.根据实施方式1所述的重组ADAMTS13变体，其中，所述ADAMTS13蛋白为人ADAMTS13。
3.根据实施方式1所述的重组ADAMTS13变体，其中，所述ADAMTS13蛋白包含SEQ IDNO：1的氨基酸序列。
4.根据实施方式1至3中任一项所述的重组ADAMTS13变体，其中，与ADAMTS13蛋白相比，至少一个单个氨基酸替代位于ADAMTS13催化结构域内。
5.根据实施方式1至3中任一项所述的重组ADAMTS13变体，其中，单个氨基酸替代不是SEQ ID NO：1中所示的I79M、V88M、H96D、R102C、S119F、I178T、R193W、T196I、S203P、L232Q、H234Q、D235H、A250V、S263C和/或R268P，或ADAMTS13中的等价氨基酸位置。
6.根据实施方式1至3中任一项所述的重组ADAMTS13变体，其中，单个氨基酸替代位于SEQ ID NO：1中所示的氨基酸Q97处或ADAMTS13中的等价氨基酸位置。
7.根据实施方式6所述的重组ADAMTS13变体，其中，单个氨基酸从Q变为D、E、K、H、L、N、P或R。
8.根据实施方式6所述的重组ADAMTS13变体，其中，单个氨基酸从Q变为R。
9.根据实施方式8所述的重组ADAMTS13变体，其中，所述ADAMTS13变体包含SEQ IDNO：2的氨基酸序列或与SEQ ID NO：2具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。
10.根据实施方式8所述的重组ADAMTS13变体，其中，ADAMTS13基本上由SEQ IDNO：2的氨基酸序列组成。
11.根据实施方式8所述的重组ADAMTS13变体，其中，ADAMTS13由SEQ ID NO：2的氨基酸序列组成。
12.一种药物组合物，其包含实施方式1至11中任一项所述的至少一种ADAMTS13变体和药学上可接受的载体或赋形剂。
13.根据实施方式12所述的药物组合物，其中，所述药物组合物还包含ADAMTS13蛋白。
14.根据实施方式13所述的药物组合物，其中，所述ADAMTS13蛋白包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列或与SEQ ID NO：1具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。
15.根据实施方式13所述的药物组合物，其中，所述ADAMTS13蛋白由SEQ ID NO：1的氨基酸序列组成。
16.根据实施方式13至15中任一项所述的药物组合物，其中，所述ADAMTS13蛋白是重组产生的。
17.根据实施方式13至15中任一项所述的药物组合物，其中，所述ADAMTS13蛋白为血浆来源的。
18.根据实施方式13至15中任一项所述的药物组合物，其中，所述ADAMTS13变体与ADAMTS13蛋白的比率为约1：1至约3：1、约1：1或约3：2。
19.根据实施方式13至18中任一项所述的药物组合物，其中，所述ADAMTS13变体构成所述组合物中所有ADAMTS13蛋白和变体的总量的约52％至约72％，或约47％至约84％。
20.根据实施方式18或19所述的药物组合物，其中，所述比率或百分比由肽图谱法确定。
21.根据实施方式18或19所述的药物组合物，其中，所述比率或百分比通过对液相色谱法分离的胰蛋白酶消化肽进行HPLC分析、然后进行质谱分析来确定。
22.根据实施方式18至21中任一项所述的药物组合物，其中，所述比率或百分比基于萃取离子色谱图中的强度来确定。
23.根据实施方式18至22中任一项所述的药物组合物，其中，所述比率或百分比基于ADAMTS13变体的胰蛋白酶消化肽的峰面积相对于组合物中所有ADAMTS13蛋白和变体的峰面积之和来确定。
24.根据实施方式23所述的药物组合物，其中，被测量的组合物中所有ADAMTS13蛋白和变体的胰蛋白酶消化肽对ADAMTS13变体与组合物中所有其他ADAMTS13蛋白和变体相比的至少一个氨基酸差异具有特异性。
25.根据实施方式24所述的药物组合物，其中，针对ADAMTS13变体测量的胰蛋白酶消化肽为AAGGILHLELLVAVGPDVFQAHR，或AAGGILHLELLVAVGPDVFQAHR与EDTER的组合。
26.根据实施方式24或25所述的药物组合物，其中，针对ADAMTS13蛋白测量的胰蛋白酶消化肽为AAGGILHLELLVAVGPDVFQAHQEDTER。
27.根据实施方式18或19所述的药物组合物，其中，所述比率或百分比基于ADAMTS13变体的总重量相对于组合物中所有ADAMTS13蛋白和变体的总和重量来确定。
28.一种治疗或预防患有或可能患有凝血障碍的受试者的凝血障碍的方法，其包括向有此需要的受试者施用治疗有效量的实施方式1至11中任一项所述的ADAMTS13变体或实施方式12至27中任一项所述的药物组合物。
29.根据实施方式28所述的方法，其中，总ADAMTS13的治疗有效量为约1至约4000IU/kg体重。
30.根据实施方式28所述的方法，其中，总ADAMTS13的治疗有效量为约5至约4000IU/kg体重。
31.根据实施方式28所述的方法，其中，总ADAMTS13的治疗有效量为约10至约2000IU/kg体重。
32.根据实施方式28所述的方法，其中，总ADAMTS13的治疗有效量为约20至200IU/kg体重。
33.根据实施方式28所述的方法，其中，总ADAMTS13的治疗有效量为约10至约200IU/kg体重。
34.根据实施方式28所述的方法，其中，通过持续输注，总ADAMTS13的治疗有效量为约0.1至约4000IU/kg/天。
35.根据实施方式28所述的方法，其中，通过持续输注，总ADAMTS13的治疗有效量为约1至约200IU/kg/天。
36.根据实施方式28至35中任一项所述的方法，其中，所述凝血障碍为遗传性TTP、获得性TTP、梗死、脑梗死、心肌梗死、缺血/再灌注损伤、深静脉血栓形成或败血症相关的弥散性血管内凝血。
37.根据实施方式28至36中任一项所述的方法，其中，所述凝血障碍为遗传性TTP。
38.根据实施方式37所述的方法，其中，总ADAMTS13的治疗有效量包含至少约1至约4000IU/kg体重。
39.根据实施方式37所述的方法，其中，总ADAMTS13的治疗有效量包含至少约5至约4000IU/kg体重。
40.根据实施方式37所述的方法，其中，总ADAMTS13的治疗有效量包含至少约5至约500IU/kg体重。
41.根据实施方式37所述的方法，其中，总ADAMTS13的治疗有效量包含至少约10至约1,500IU/kg体重。
42.根据实施方式37所述的方法，其中，总ADAMTS13的治疗有效量包含至少约10至约160IU/kg体重。
43.根据实施方式37所述的方法，其中，总ADAMTS13的治疗有效量包含至少约10至约40IU/kg体重。
44.根据实施方式37所述的方法，其中，总ADAMTS13的治疗有效量包含至少约20至约40IU/kg体重。
45.根据实施方式37所述的方法，其中，总ADAMTS13的治疗有效量包含至少约20至约160IU/kg体重。
46.根据实施方式37所述的方法，其中，总ADAMTS13的治疗有效量为约20至160IU/kg体重。
47.根据实施方式37所述的方法，其中，总ADAMTS13的治疗有效量为约20IU/kg体重。
48.根据实施方式37所述的方法，其中，总ADAMTS13的治疗有效量为约40IU/kg体重。
49.根据实施方式28至36中任一项所述的方法，其中，所述凝血障碍为获得性TTP。
50.根据实施方式49所述的方法，其中，总ADAMTS13的治疗有效量为约1至约4000IU/kg体重。
51.根据实施方式49所述的方法，其中，总ADAMTS13的治疗有效量为约5至约4000IU/kg体重。
52.根据实施方式49所述的方法，其中，总ADAMTS13的治疗有效量为约10至1500IU/kg体重。
53.根据实施方式49所述的方法，其中，总ADAMTS13的治疗有效量为约10至80IU/kg体重。
54.根据实施方式49所述的方法，其中，总ADAMTS13的治疗有效量为约20至80IU/kg体重。
55.根据实施方式49所述的方法，其中，总ADAMTS13的治疗有效量为约20至40IU/kg体重。
56.根据实施方式49所述的方法，其中，总ADAMTS13的治疗有效量为约40至约2000IU/kg体重。
57.根据实施方式28至36中任一项所述的方法，其中，所述凝血障碍为脑梗死和/或缺血再灌注损伤。
58.根据实施方式57所述的方法，其中，总ADAMTS13的治疗有效量为约1至约4000IU/kg体重。
59.根据实施方式57所述的方法，其中，总ADAMTS13的治疗有效量为约5至约4000IU/kg体重。
60.根据实施方式57所述的方法，其中，总ADAMTS13的治疗有效量为约10至约2000IU/kg体重。
61.根据实施方式57所述的方法，其中，总ADAMTS13的治疗有效量为约10至1500IU/kg体重。
62.根据实施方式57所述的方法，其中，总ADAMTS13的治疗有效量为约40至约4000IU/kg体重。
63.根据实施方式28至36中的任意一个，其中，所述凝血障碍为心肌梗死和/或缺血再灌注损伤。
64.根据实施方式63所述的方法，其中，总ADAMTS13的治疗有效量为约1至约4000IU/kg体重。
65.根据实施方式63所述的方法，其中，总ADAMTS13的治疗有效量为约5至约4000IU/kg体重。
66.根据实施方式63所述的方法，其中，总ADAMTS13的治疗有效量为约10至约2000IU/kg体重。
67.根据实施方式63所述的方法，其中，总ADAMTS13的治疗有效量为约10至1500IU/kg体重。
68.根据实施方式63所述的方法，其中，总ADAMTS13的治疗有效量为约40至约2000IU/kg体重。
69.一种治疗或预防患有或可能患有出血障碍的受试者的出血发作的方法，其包括向有此需要的受试者施用治疗有效量的实施方式1至11中任一项所述的ADAMTS13变体或实施方式12至27中任一项所述的药物组合物。
70.根据实施方式69所述的方法，其中，所述出血发作与遗传性TTP、获得性TTP、梗死、脑梗死、心肌梗死、缺血/再灌注损伤、深静脉血栓形成或败血症相关的弥散性血管内凝血相关。
71.一种治疗或预防患有镰状细胞疾病的受试者的血管闭塞危象的方法，其包括向有此需要的受试者施用治疗有效量的实施方式1至11中任一项所述的ADAMTS13变体或实施方式12至27中任一项所述的药物组合物。
72.根据实施方式71所述的方法，其中，在出现血管闭塞危象的症状之后，向受试者施用ADAMTS13变体或组合物。
73.根据实施方式71所述的方法，其中，在出现血管闭塞危象的症状之前，向受试者施用ADAMTS13变体或组合物。
74.根据实施方式71至73中任一项所述的方法，其中，与对照或不进行治疗相比，施用ADAMTS13变体或组合物减少炎症、血管收缩、血小板聚集或它们的任意组合中的至少一种。
75.根据实施方式71至74中任一项所述的方法，其中，与对照或不进行治疗相比，施用ADAMTS13变体或组合物导致生存率改善、肺功能改善、器官损伤减少、肺血管渗漏减少或它们的任意组合中的至少一种。
76.根据实施方式71至75中任一项所述的方法，其中，与对照或不进行治疗相比，施用ADAMTS13变体或组合物减少和/或预防血流受损、凝血、血管炎症、血栓形成、缺血性细胞损伤或器官损伤或它们的任意组合中的至少一种。
77.根据实施方式71至76中任一项所述的方法，其中，与对照或不进行治疗相比，施用ADAMTS13变体或组合物减少和/或防止疼痛或疼痛的严重程度。
78.根据实施方式71至77中任一项所述的方法，其中，与不进行治疗相比，施用ADAMTS13变体或组合物减少VOC发生的频率和/或VOC发作的持续时间。
79.根据实施方式71至78中任一项所述的方法，其中，总ADAMTS13的治疗有效量为约1至约4000IU/kg体重。
80.根据实施方式71至78中任一项所述的方法，其中，总ADAMTS13的治疗有效量为约5至约4000IU/kg体重。
81.根据实施方式71至78中任一项所述的方法，其中，总ADAMTS13的治疗有效量为约20至约2000IU/kg体重。
82.根据实施方式71至78中任一项所述的方法，其中，总ADAMTS13的治疗有效量为约20至约500IU/kg体重。
83.根据实施方式71至78中任一项所述的方法，其中，总ADAMTS13的治疗有效量为约20至约80IU/kg体重。
84.根据实施方式71至78中任一项所述的方法，其中，总ADAMTS13的治疗有效量为约40至约160IU/kg体重。
85.根据实施方式71至78中任一项所述的方法，其中，总ADAMTS13的治疗有效量为约40至约80IU/kg体重。
86.根据实施方式71至78中任一项所述的方法，其中，总ADAMTS13的治疗有效量为约40IU/kg体重、约80IU/kg体重或约160IU/kg体重。
87.根据实施方式71至78中任一项所述的方法，其中，总ADAMTS13的治疗有效量为约10至约6,000IU/kg体重。
88.根据实施方式71至78中任一项所述的方法，其中，总ADAMTS13的治疗有效量为约20至约4000IU/kg体重。
89.根据实施方式71至78中任一项所述的方法，其中，总ADAMTS13的治疗有效量为约50至约500IU/kg体重。
90.根据实施方式71至78中任一项所述的方法，其中，总ADAMTS13的治疗有效量为约100至约3000IU/kg体重。
91.根据实施方式71、72或74至90中任一项所述的方法，其中，在血管闭塞危象发病后48小时内向给受试者施用所述ADAMTS13变体或药物组合物。
92.根据实施方式71至91中任一项所述的方法，其中，用于防止血管闭塞危象的ADAMTS13变体或组合物足以维持受试者中ADAMTS13活性的有效水平。
93.一种治疗或预防患有或可能患有急性肺损伤(ALI)和/或急性呼吸窘迫综合征(ARDS)的受试者的肺损伤的方法，其包括向有此需要的受试者施用治疗有效量的实施方式1至11中任一项所述的ADAMTS13变体或实施方式12至27中任一项所述的药物组合物。
94.根据实施方式93所述的方法，其中，所述受试者患有选自炎症性肺水肿、炎症性肺浸润、氧合受损和低氧血症的病况或病况组合。
95.根据实施方式93或94所述的方法，其中，与对照或不进行治疗相比，施用ADAMTS13变体或组合物导致生存率改善、肺功能改善、器官损伤减少、肺血管渗漏减少或它们的任意组合中的至少一种。
96.根据实施方式93至95中任一项所述的方法，其中，与对照或不进行治疗相比，施用ADAMTS13变体或组合物减少炎症、血管收缩、血小板聚集或它们的任意组合中的至少一种。
97.根据实施方式93至96中任一项所述的方法，其中，与对照或不进行治疗相比，施用ADAMTS13变体或组合物减少和/或防止血流受损、凝血、血管炎症、血栓形成、缺血性细胞损伤、器官损伤或它们的任意组合中的至少一种。
98.根据实施方式93至97中任一项所述的方法，其中，与对照或不进行治疗相比，施用ADAMTS13变体或组合物减少和/或防止疼痛或疼痛的严重程度。
99.根据实施方式93至98中任一项所述的方法，其中，与不进行治疗相比，施用ADAMTS13变体或组合物减少ALI和/或ARDS的发生频率和/或ALI和/或ARDS发作的持续时间。
100.根据实施方式93至99中任一项所述的方法，其中，总ADAMTS13的治疗有效量为约1至约4000IU/kg体重。
101.根据实施方式93至99中任一项所述的方法，其中，总ADAMTS13的治疗有效量为约5至约4000IU/kg体重。
102.根据实施方式93至99中任一项所述的方法，其中，总ADAMTS13的治疗有效量为约20至约2000IU/kg体重。
103.根据实施方式93至99中任一项所述的方法，其中，总ADAMTS13的治疗有效量为约40至约160IU/kg体重。
104.根据实施方式93至99中任一项所述的方法，其中，总ADAMTS13的治疗有效量为约40IU/kg体重、约80IU/kg体重或约160IU/kg体重。
105.根据实施方式93至99中任一项所述的方法，其中，总ADAMTS13的治疗有效量为约10至约6,000IU/kg体重。
106.根据实施方式93至99中任一项所述的方法，其中，总ADAMTS13的治疗有效量为约20至约4000IU/kg体重。
107.根据实施方式93至99中任一项所述的方法，其中，总ADAMTS13的治疗有效量为约50至约500IU/kg体重。
108.根据实施方式93至99中任一项所述的方法，其中，总ADAMTS13的治疗有效量为约100至约3000IU/kg体重。
109.根据实施方式93至108中任一项所述的方法，其中，在检测到炎症性肺水肿、炎症性肺浸润、氧合受损或低氧血症后48小时内，向受试者施用所述ADAMTS13变体或组合物。
110.根据实施方式93至109中任一项所述的方法，其中，所述ADAMTS13变体或药物组合物足以维持受试者中ADAMTS13活性的有效水平。
111.一种对患有脑梗死的受试者的闭塞血管进行再通的方法，其包括向有此需要的受试者施用治疗有效量的实施方式1至11中任一项所述的ADAMTS13变体或实施方式12至27中任一项所述的药物组合物，从而使闭塞血管再通。
112.根据实施方式111所述的方法，其中，将所述ADAMTS13变体或药物组合物以约40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1250、1500、1750或2000IU/kg的剂量和/或在检测到梗死的15、30、60、90、120、180、210、240、270或300分钟内施用给受试者。
113.一种通过对受试者的闭塞血管进行再通来治疗受试者的脑梗死的方法，其包括向有此需要的受试者施用治疗有效量的实施方式1至11中任一项所述的ADAMTS13变体或实施方式12至27中任一项所述的药物组合物，从而使闭塞血管再通。
114.根据实施方式113所述的方法，其中，将所述ADAMTS13变体或药物组合物以约40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、800、850、900、950、1000、1250、1500、1750或2000IU/kg的剂量和/或在检测到梗死的15、30、60、90、120、180、210、240、270或300分钟内施用给受试者。
115.根据实施方式111至114中任一项所述的方法，其中，将所述ADAMTS13变体或药物组合物以约40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1250、1500、1750或2000IU/kg的剂量以及在检测到梗死的15、30、60、90、120、180、210、240、270或300分钟内施用给受试者。
116.一种对患有脑梗死的受试者的闭塞血管进行再通的方法，其包括向受试者施用药物组合物的步骤，包括向有此需要的受试者施用治疗有效量的实施方式1至11中任一项所述的ADAMTS13变体或实施方式12至27中任一项所述的药物组合物，从而使闭塞血管再通，其中，所述药物组合物以一定量施用给受试者，所述量使受试者体内的总ADAMTS13蛋白水平比施用前受试者体内的总ADAMTS13蛋白水平增加1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15或20倍。
117.根据实施方式116所述的方法，其中，将所述ADAMTS13变体或药物组合物在检测到梗死的15、30、60、90、120、180、210、240、270或300分钟内施用给受试者。
118.根据实施方式111至117中任一项所述的方法，其中，与没有脑梗死的对照受试者相比，所述受试者的局部脑血流被改善至少25％。
119.根据实施方式111至118中任一项所述的方法，其中，与对照受试者的局部脑血流相比，局部脑血流被改善至少50％。
120.根据实施方式111至118中任一项所述的方法，其中，与对照受试者的局部脑血流相比，局部脑血流被改善至少75％。
121.根据实施方式111至120中任一项所述的方法，其中，所述ADAMTS13变体或药物组合物被多次施用或通过持续输注来施用。
122.根据实施方式111至121中任一项所述的方法，其中，与未接受ADAMTS13变体或组合物的受试者的出血水平相比，所述施用不会增加出血水平。
123.根据实施方式111至122中任一项所述的方法，其中，所述施用减少梗死体积。
124.根据实施方式123所述的方法，其中，与没有脑梗死的对照受试者的梗死体积相比，所述梗死体积被减少至少50％。
125.一种改善经历过脑梗死的受试者的感觉运动功能恢复的方法，其包括向有此需要的受试者施用治疗有效量的实施方式1至11中任一项所述的ADAMTS13变体或实施方式12至27中任一项所述的药物组合物，从而改善感觉运动功能的恢复，其中，与没有脑梗死的对照受试者的局部脑血流相比，所述受试者的局部脑血流被改善至少25％。
126.根据实施方式25至125中任一项所述的方法，其中，所述ADAMTS13变体或药物组合物以单次弹丸式注射的方式施用，每月一次、每两周一次、每周一次、每周两次、每天一次、每12小时一次、每8小时一次、每6小时一次、每4小时一次、每2小时一次或每小时一次。
127.一种治疗或预防受试者的与心血管疾病相关的凝血障碍的方法，其包括向有此需要的受试者施用治疗有效量的实施方式1至11中任一项所述的ADAMTS13变体或实施方式12至27中任一项所述的药物组合物。
128.根据实施方式127所述的方法，其中，与心血管疾病相关的凝血障碍与心肌梗死、心肌缺血、深静脉血栓形成、周围血管疾病、中风、短暂性缺血发作或医疗器械相关血栓形成相关。
129.一种治疗或预防受试者的血液病的方法，其包括向有此需要的受试者施用治疗有效量的实施方式1至11中任一项所述的ADAMTS13变体或实施方式12至27中任一项所述的药物组合物。
130.根据实施方式129所述的方法，其中，所述血液病为遗传性TTP、获得性TTP、血栓性微血管病或镰状细胞疾病。
131.根据实施方式28至130中任一项所述的方法，其中，所述ADAMTS13变体或组合物被静脉施用或皮下施用。
132.根据实施方式131所述的方法，其中，所述ADAMTS13变体或其组合物被静脉施用。
133.根据实施方式132所述的方法，其中，所述ADAMTS13变体或药物组合物被皮下施用。
134.根据实施方式133所述的方法，其中，所述ADAMTS13变体或其组合物被皮下施用，所述治疗有效量为针对静脉使用的治疗量，如果皮下施用则必须对用量进行调整。
135.根据实施方式134所述的方法，其中，与归一化为相同剂量的静脉施用相比，ADAMTS13变体或组合物皮下施用后的生物利用度为50％至80％。
136.根据实施方式134所述的方法，其中，所述ADAMTS13变体或药物组合物的治疗有效量包含针对特定适应症的静脉内剂量的至少120％至300％，以活性单位/千克计量。
137.根据实施方式28至136中任一项所述的方法，其中，所述ADAMTS13变体和/或ADAMTS13蛋白是重组产生的。
138.根据实施方式28至137中任一项所述的方法，其中，所述ADAMTS13变体和/或ADAMTS13蛋白由HEK 293细胞重组产生。
139.根据实施方式28至137中任一项所述的方法，其中，所述ADAMTS13变体和/或ADAMTS13蛋白由CHO细胞重组产生。
140.根据实施方式28至139中任一项所述的方法，其中，所述ADAMTS13变体和/或ADAMTS13蛋白是糖基化的。
141.根据实施方式28至140中任一项所述的方法，其中，所述ADAMTS13变体的等离子半衰期超过1小时。
142.根据实施方式28至141中任一项所述的方法，其中，所述受试者为哺乳动物。
143.根据实施方式28至142中任一项所述的方法，其中，所述受试者为人类。
144.根据实施方式28至143中任一项所述的方法，其中，所述组合物为冻干的。
145.根据实施方式144所述的方法，其中，所述组合物在施用之前用适用于注射的药学上可接受的载体进行重构。
146.根据实施方式28至143中任一项所述的方法，其中，所述组合物为用于施用的即用型的稳定水溶液。
147.包含实施方式1至11中任一项所述的ADAMTS13变体或实施方式12至27中任一项所述的药物组合物的组合物在治疗或预防受试者的凝血障碍中的应用。
148.包含实施方式1至11中任一项所述的ADAMTS13变体或实施方式12至27中任一项所述的药物组合物的组合物，其用作治疗或预防受试者的凝血障碍的药物。
149.根据实施方式147所述的应用或根据实施方式148所述的组合物，其中，所述凝血障碍为遗传性TTP、获得性TTP、脑梗死、心肌梗死、缺血/再灌注损伤、深静脉血栓形成或败血症相关的弥散性血管内凝血。
150.包含实施方式1至11中任一项所述的ADAMTS13变体或实施方式12至27中任一项所述的药物组合物的组合物在治疗或防止受试者的出血发作中的应用。
151.包含实施方式1至11中任一项所述的ADAMTS13变体或实施方式12至27中任一项所述的药物组合物的组合物，其用作治疗或预防受试者的出血发作的药物。
152.根据实施方式150所述的应用或根据实施方式151所述的组合物，其中，所述出血发作与遗传性TTP、获得性TTP、脑梗死、心肌梗死、缺血/再灌注损伤、深静脉血栓形成或败血症相关的弥散性血管内凝血相关。
153.包含实施方式1至11中任一项所述的ADAMTS13变体或实施方式12至27中任一项所述的药物组合物的组合物在治疗或预防患有镰状细胞疾病的受试者的血管闭塞危象中的应用。
154.包含实施方式1至11中任一项所述的ADAMTS13变体或实施方式12至27中任一项所述的药物组合物的组合物，其用作治疗或预防患有镰状细胞疾病的受试者的血管闭塞危象的药物。
155.包含实施方式1至11中任一项所述的ADAMTS13变体或实施方式12至27中任一项所述的药物组合物的组合物在治疗、改善或预防患有或可能患有急性肺损伤(ALI)和/或急性呼吸窘迫综合征(ARDS)的受试者的肺损伤中的应用。
156.包含实施方式1至11中任一项所述的ADAMTS13变体或实施方式12至27中任一项所述的药物组合物的组合物，其用作治疗、改善或预防患有或可能患有急性肺损伤(ALI)和/或急性呼吸窘迫综合征(ARDS)的受试者的肺损伤的药物。
157.包含实施方式1至11中任一项所述的ADAMTS13变体或实施方式12至27中任一项所述的药物组合物的组合物在改善经历过脑梗死的受试者的感觉运动功能恢复中的应用，其中，与没有脑梗死的对照受试者的局部脑血流相比，所述受试者的局部脑血流被改善至少25％。
158.包含实施方式1至11中任一项所述的ADAMTS13变体或实施方式12至27中任一项所述的药物组合物的组合物，其用作改善经历过脑梗死的受试者的感觉运动功能恢复的药物，其中，与没有脑梗死的对照受试者的局部脑血流相比，所述受试者的局部脑血流被改善至少25％。
159.一种编码实施方式1至11中任一项所述的ADAMTS13变体的核酸分子。
160.一种包含实施方式159所述的核酸分子的载体。
161.根据实施方式160所述的载体，其中，所述载体为表达载体，编码ADAMTS13变体的多核苷酸序列与能够介导ADAMTS13变体在宿主细胞中表达的启动子可操作地连接。
162.一种包含实施方式159所述的核酸分子的宿主细胞。
163.一种包含实施方式160或161所述的载体的宿主细胞。
164.一种宿主细胞系，其被修饰为表达实施方式1至11中任一项所述的ADAMTS13变体和至少一种ADAMTS13蛋白。
165.根据实施方式164所述的宿主细胞系，其中，所述ADAMTS13变体包含SEQ IDNO：2的氨基酸序列或与SEQ ID NO：2具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。
166.根据实施方式164或165所述的宿主细胞系，其中，所述ADAMTS13蛋白的氨基酸序列包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列或与SEQ ID NO：1具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。
167.根据实施方式164至166中任一项所述的宿主细胞系，其中，所述ADAMTS13蛋白的氨基酸序列由SEQ ID NO：1的氨基酸序列组成。
168.根据实施方式164至168中任一项所述的宿主细胞系，其中，所述ADAMTS13变体和ADAMTS13蛋白在宿主细胞系的不同细胞中表达。
169.根据实施方式162至169中任一项所述的宿主细胞系，其中，所述ADAMTS13变体和ADAMTS13蛋白在同一细胞中表达。
170.根据实施方式162至169中任一项所述的宿主细胞或宿主细胞系，其中，所述细胞为CHO细胞、COS细胞、HEK 293细胞、BHK细胞、SK-Hep细胞或Hep G2细胞。
171.根据实施方式170所述的宿主细胞或宿主细胞系，其中，所述CHO细胞为CHODBX-11细胞系或CHOZN细胞系。
172.根据实施方式171所述的宿主细胞或宿主细胞系，其中，所述CHOZN细胞为CHODBX-11细胞系。
173.根据实施方式171所述的宿主细胞或宿主细胞系，其中，所述CHOZN细胞为CHOZN谷氨酰胺合成酶(GS)-/-细胞系。
174.一种ADAMTS13蛋白或其变体，其包含一个以上糖基化位点。
175.根据实施方式174的ADAMTS13或其变体，其中，所述ADAMTS13变体包含实施方式1至11中任一项所述的ADAMTS13变体。
176.根据实施方式174的ADAMTS13或其变体，其中，所述ADAMTS13蛋白包含SEQ IDNO：1的氨基酸序列或与SEQ ID NO：1具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。
177.根据实施方式174至176中任一项所述的ADAMTS13或其变体，其在O-糖基化位点处被糖基化。
178.根据实施方式177所述的ADAMTS13或其变体，其在一个以上O-聚糖基化位点S399、S698、S757、S907、S965、S1027或S1087的丝氨酸残基处被糖基化。
179.根据实施方式177所述的ADAMTS13或其变体，其被双糖Fuc-Glc糖基化。
180.根据实施方式177所述的ADAMTS13或其变体，其被粘蛋白型O-聚糖糖基化。
181.根据实施方式180所述的ADAMTS13或其变体，其中，所述粘蛋白型O-聚糖具有结构HexNAc-Hex-NeuAc0-2。
182.根据实施方式174至181中任一项所述的ADAMTS13或其变体，其在N-糖基化位点处被糖基化。
183.根据实施方式182所述的ADAMTS13或其变体，其在一个以上N-糖基化位点N142、N146、N552、N579、N614、N667、N707、N828、N1235或N1354的天冬酰胺残基处被糖基化。
184.根据实施方式182所述的ADAMTS13或其变体，其被高甘露糖型N-聚糖糖基化。
185.根据实施方式182所述的ADAMTS13或其变体，其被混合型N-聚糖糖基化。
186.根据实施方式182所述的ADAMTS13或其变体，其被复合型N-聚糖糖基化。
187.根据实施方式186所述的ADAMTS13或其变体，其中，所述复合型N-连接聚糖包含核心-岩藻糖残基。
188.根据实施方式186所述的ADAMTS13或其变体，其中，所述复合型N-连接聚糖包含一个以上唾液酸残基。
189.根据实施方式186所述的ADAMTS13或其变体，其中，所述复合型N-连接聚糖包含一个唾液酸残基。
190.根据实施方式186所述的ADAMTS13或其变体，其中，所述复合型N-连接聚糖包含两个唾液酸残基。
191.根据实施方式186所述的ADAMTS13或其变体，其中，所述复合型N-连接聚糖包含三个唾液酸残基。
192.根据实施方式186所述的ADAMTS13或其变体，其中，所述复合型N-连接聚糖包含四个唾液酸残基。
193.根据实施方式188所述的ADAMTS13或其变体，其中，所述唾液酸残基通过α2,6-连接来连接。
194.根据实施方式188所述的ADAMTS13或其变体，其中，所述唾液酸残基通过α2,3-连接来连接。
195.根据实施方式174至181中任一项所述的ADAMTS13或其变体，其在一个以上C-甘露糖基化位点的色氨酸残基处被糖基化。
196.根据实施方式187所述的ADAMTS13或其变体，其在一个以上C-甘露糖基化位点W387或W390的色氨酸残基处被糖基化。
197.根据实施方式187所述的ADAMTS13或其变体，其被甘露醇残基糖基化。
198.根据实施方式174至181中任一项所述的ADAMTS13或其变体，其中，所述ADAMTS13变体的N-聚糖指数基本上类似于ADAMTS13的N-聚糖指数。
199.根据实施方式174至181中任一项所述的ADAMTS13或其变体，其中，N-聚糖指数为约120至约190。
200.根据实施方式174至181中任一项所述的ADAMTS13或其变体，其中，N-聚糖指数低于140。
201.根据实施方式174至181中任一项所述的ADAMTS13或其变体，其中，唾液酸残基的量为约130至约169nmol唾液酸/mg ADAMTS13蛋白。
202.根据实施方式174至176中任一项所述的ADAMTS13或其变体，其包含匹配如下参数中的一个以上的N-聚糖特征(即总和100％)：
a.中性、单唾液酸化和二唾液酸化的N-聚糖合计为至少约75％；
b.三唾液酸化和四唾液酸化的聚糖合计为至少约5％；
c.中性N-聚糖为约10％至约35％；
d.单唾液酸化N-聚糖为约20％至约50％；
e.二唾液酸化N-聚糖为约10％至约40％；
f.三唾液酸化N-聚糖为约1％至约25％；
g.四唾液酸化N-聚糖为约0.1％至约10％；和/或
h.N-聚糖指数为约110至约160。
203.根据实施方式202所述的ADAMTS13或其变体，其包含匹配如下参数中的一个以上的N-聚糖特征：
a.中性、单唾液酸化和二唾液酸化的N-聚糖合计为至少约80％；
b.三唾液酸化和四唾液酸化的聚糖合计为至少约10％；
c.中性N-聚糖为约15％至约30％；
d.单唾液酸化N-聚糖为约25％至约45％；
e.二唾液酸化N-聚糖为约15％至约35％；
f.三唾液酸化N-聚糖为约5％至约20％；
g.四唾液酸化N-聚糖为约1％至约5％；和/或
h.N-聚糖指数为约120至约150。
204.根据实施方式202所述的ADAMTS13或其变体，其包含匹配如下参数中的一个以上的N-聚糖特征：
a.中性、单唾液酸化和二唾液酸化的N-聚糖合计为至少约85％；
b.三唾液酸化和四唾液酸化的聚糖合计为至少约14％；
c.中性N-聚糖为约20％至约25％；
d.单唾液酸化N-聚糖为约30％至约40％；
e.二唾液酸化N-聚糖为约20％至约30％；
f.三唾液酸化N-聚糖为约10％至约15％；
g.四唾液酸化N-聚糖为约2％至约4％；和/或
h.N-聚糖指数为约130至约140。
205.根据实施方式202所述的ADAMTS13或其变体，其包含匹配如下参数中的一个以上的N-聚糖特征：
a.中性、单唾液酸化和二唾液酸化的N-聚糖合计为至少约86％；
b.三唾液酸化和四唾液酸化的聚糖合计为至少约15％；
c.中性N-聚糖为约23％至约24％；
d.单唾液酸化N-聚糖为约34％至约36％；
e.二唾液酸化N-聚糖为约26％至约29％；
f.三唾液酸化N-聚糖为约11％至约12％；
g.四唾液酸化N-聚糖为约3％；和/或
h.N-聚糖指数为约133至约139。
206.根据实施方式174至约176中任一项所述的ADAMTS13或其变体，其包含NGNA相对于NANA的比率为约1％至约15％的唾液酸特征。
207.根据实施方式206所述的ADAMTS13或其变体，其包含NGNA相对于NANA的比率为约2％至约10％的唾液酸特征。
208.根据实施方式206所述的ADAMTS13或其变体，其包含NGNA相对于NANA的比率为约3％至约8％的唾液酸特征。
209.根据实施方式206所述的ADAMTS13或其变体，其包含NGNA相对于NANA的比率为约4％至约5％的唾液酸特征。
210.根据实施方式174至约176中任一项所述的ADAMTS13或其变体，其包含匹配如下参数中的一个以上的N-聚糖特征(即总和100％)：
a.中性、单唾液酸化和二唾液酸化的N-聚糖合计为至少约80％；
b.三唾液酸化和四唾液酸化的聚糖合计为至少约16％；
c.中性N-聚糖为约5％至约30％；
d.单唾液酸化N-聚糖为约10％至约45％；
e.二唾液酸化N-聚糖为约20％至约55％；
f.三唾液酸化N-聚糖为约1％至约30％；
g.四唾液酸化N-聚糖为约0.1％至约15％；和/或
h.N-聚糖指数为约130至约190。
211.根据实施方式210所述的ADAMTS13或其变体，其包含匹配如下参数中的一个以上的N-聚糖特征：
a.中性、单唾液酸化和二唾液酸化的N-聚糖合计为至少约83％；
b.三唾液酸化和四唾液酸化的聚糖合计为至少约17％；
c.中性N-聚糖为约8％至约25％；
d.单唾液酸化N-聚糖为约15％至约40％；
e.二唾液酸化N-聚糖为约25％至约50％；
f.三唾液酸化N-聚糖为约5％至约25％；
g.四唾液酸化N-聚糖为约1％至约10％；和/或
h.N-聚糖指数为约140至约185。
212.根据实施方式210所述的ADAMTS13或其变体，其包含匹配如下参数中的一个以上的N-聚糖特征：
a.中性、单唾液酸化和二唾液酸化的N-聚糖合计为至少约85％；
b.三唾液酸化和四唾液酸化的聚糖合计为至少约18％；
c.中性N-聚糖为约10％至约20％；
d.单唾液酸化N-聚糖为约20％至约35％；
e.二唾液酸化N-聚糖为约30％至约45％；
f.三唾液酸化N-聚糖为约10％至约20％；
g.四唾液酸化N-聚糖为约2％至约8％；和/或
h.N-聚糖指数为约145至约175。
213.根据实施方式210所述的ADAMTS13或其变体，其包含匹配如下参数中的一个以上的N-聚糖特征：
a.中性、单唾液酸化和二唾液酸化的N-聚糖合计为至少约86％；
b.三唾液酸化和四唾液酸化的聚糖合计为至少约19％；
c.中性N-聚糖为约13％至约16％；
d.单唾液酸化N-聚糖为约26％至约33％；
e.二唾液酸化N-聚糖为约37％至约43％；
f.三唾液酸化N-聚糖为约12％至约15％；
g.四唾液酸化N-聚糖为约3％至约6％；和/或
h.N-聚糖指数为约153至约170。
214.根据实施方式174至约176中任一项所述的ADAMTS13或其变体，其包含匹配如下参数中的一个以上的单糖特征(即总和100％)：
a.GlcNAc为约10％至约40％；
b.GalNAc为约0.1％至约10％；
c.Gal为约10％至约35％；
d.Man为约10％至约35％；
e.Glc为约0.1％至约20％；和/或
f.Fuc为约5％至约20％。
215.根据实施方式214所述的ADAMTS13或其变体，其包含匹配如下参数中的一个以上的单糖特征：
a.GlcNAc为约15％至约35％；
b.GalNAc为约1％至约8％；
c.Gal为约15％至约30％；
d.Man为约15％至约30％；
e.Glc为约1％至约15％；和/或
f.Fuc为约10％至约15％。
216.根据实施方式214所述的ADAMTS13或其变体，其包含匹配如下参数中的一个以上的单糖特征：
a.GlcNAc为约20％至约30％；
b.GalNAc为约5％至约6％；
c.Gal为约20％至约25％；
d.Man为约20％至约28％；
e.Glc为约5％至约10％；和/或
f.Fuc为约11％至约12％。
217.根据实施方式214所述的ADAMTS13或其变体，其包含匹配如下参数中的一个以上的单糖特征：
a.GlcNAc为约27％至约29％；
b.GalNAc为约6％；
c.Gal为约23％至约24％；
d.Man为约23％至约25％；
e.Glc为约6％至约7％；和/或
f.Fuc为约12％。
218.根据实施方式174至约176中任一项所述的ADAMTS13或其变体，其包含匹配如下参数中的一个以上的唾液酸特征：
a.含有约100nmol NANA/mg至约200nmol NANA/mg；
b.含有约0.01nmol NGNA/mg至约1nmol NGNA/mg；和/或
c.NGNA相对于NANA的比率为约0.01％至约1％。
219.根据实施方式218所述的ADAMTS13或其变体，其包含匹配如下参数中的一个以上的唾液酸特征：
a.含有约110nmol NANA/mg至约180nmol NANA/mg；
b.含有约0.05nmol NGNA/mg至约0.50nmol NGNA/mg；和/或
c.NGNA相对于NANA的比率为约0.05％至约0.5％。
220.根据实施方式218所述的ADAMTS13或其变体，其包含匹配如下参数中的一个以上的唾液酸特征：
a.含有约125nmol NANA/mg至约170nmol NANA/mg；
b.含有约0.08nmol NGNA/mg至约0.30nmol NGNA/mg；和/或
c.NGNA相对于NANA的比率为约0.06％至约0.2％。
221.根据实施方式218所述的ADAMTS13或其变体，其包含匹配如下参数中的一个以上的唾液酸特征：
a.含有约130nmol NANA/mg至约169nmol NANA/mg；
b.含有约0.1nmol NGNA/mg至约0.3nmol NGNA/mg；和/或
c.NGNA相对于NANA的比率为约0.1％至约0.2％。
222.根据实施方式174至221中任一项所述的ADAMTS13或其变体，其中，所述ADAMTS13或其变体在CHO细胞系、COS细胞系、HEK 293细胞系、BHK细胞系、SK-Hep细胞系或Hep G2细胞系中产生。
223.根据实施方式222所述的ADAMTS13或其变体，其中，所述CHO细胞为CHO DBX-11细胞系或CHOZN细胞系。
224.根据实施方式223所述的ADAMTS13或其变体，其中，所述CHOZN细胞为CHOZN谷氨酰胺合成酶(GS)-/-细胞系。
225.根据实施方式174至201或210至221中任一项所述的ADAMTS13或其变体，其中，所述ADAMTS13或其变体在CHO细胞系中产生。
226.根据实施方式225所述的ADAMTS13或其变体，其中，所述CHOZN细胞为CHOZN谷氨酰胺合成酶(GS)-/-细胞系。
227.根据实施方式174至209中任一项所述的ADAMTS13或其变体，其中，所述ADAMTS13或其变体在CHO细胞系中产生。
228.根据实施方式227所述的ADAMTS13或其变体，其中，所述CHOZN细胞为CHODBX-11。
VIII.实施例
实施例1：血浆来源的ADAMTS13(pdADAMTS13)与rADAMTS13组合物(包含野生型rADAMTS13和Q97R rADAMTS13变体的组合)的VWF切割的评价
比活提供了蛋白质的质量和效价的信息，活性更低表明蛋白质质量和效价降低。因此，将由野生型rADAMTS13和Q97R变体的混合物组成的50批rADAMTS13的比活数据(FRETSU/抗原U)与80例健康供体的血浆来源(pdADAMTS13)的比活数据(FRETS U/抗原U)进行比较。在rADAMTS13 cDNA(mRNA)的编码序列的第290位处进行从腺嘌呤到鸟嘌呤的单个编码核苷酸变换，由此产生Q97R ADAMTS13变体。
通过UV吸收分光光度法测定ADAMTS13活性(FRETS-VWF73)/mg总蛋白来测定比活。样品中含有的VWF(＝瑞斯西丁素辅因子)在瑞斯西丁素的存在下导致稳定的血小板的凝集，二者均被包含在“冯威勒布兰德试剂”(Behring Coagulation System，BCS，西门子，德国)中。凝集降低了试剂制剂的浑浊度，用凝血系统分析仪(Behring Coagulation System，BCS，西门子，德国)测量光密度的变化。VWF：RCo活性根据由参照血浆的不同稀释度构建的参照曲线来进行计算(参照WHO标准进行校准)。
与所分析的重组混合野生型和Q97R变体批次相比，来自个体健康供体的血浆样品显示出更高的ADAMTS13比活差异(图3)。然而，混合rADAMTS13批次的平均比活与pdADAMTS13的比活具有可比性，这表明混合rADAMTS13批次的效价也与pdADAMTS13的效价具有可比性。
全长VWF被人ADAMTS13在A2结构域内的Tyr1605和Met1606之间的单个肽键处切割，由此产生140kDa的N末端片段和176kDa的C末端片段。因此，VWF的切割是ADAMTS13效价的另一个指标。降解动力学实验数据表明，混合rADAMTS13批次和pdADAMTS13具有相似的切割率，这说明混合rADAMTS13批次和pdADAMTS13的活性具有可比性(见表1)。
表1：rADAMTS13和pdADAMTS13对VWF的体外切割用0.1、0.5和1.0U/mL的ADAMTS13进行切割
Figure BDA0003972678030001061
因此，pdADAMTS13和混合rADAMTS13批次在比活和VWF切割方面没有区别。
实施例2：Q97R rADAMTS13变体的结构功能关系
为了预测Q97R rADAMTS13变体是否对rADAMTS13的结构/功能有影响，对Q97RrADAMTS13变体进行了建模(图4)。本研究对ADAMTS13N末端MDTCS结构域的三维结构进行了建模，并对已发表的有关M结构域中的C末端结构域调节的ADAMTS13活性的数据进行了研究。结果发现，M结构域中的Q97被暴露在溶剂中，并位于远离VWF切割位点和金属离子结合位点的位置，排除了这些结合结构域的调控作用。但本研究不排除Q97可能参与C末端CUB1-2相互作用的可能性。
本研究旨在使用计算机工具产生ADAMTS13的计算模型，并在该模型上对Q97进行定位。目的是根据计算模型和来自公开文献的知识，揭示Q97R是否可能导致蛋白质折叠、稳定性或蛋白酶活化的变化。通过将人ADAMTS13 DTCS结构域的晶体结构与MD结构域的模型拼接在一起，建立了人ADAMTS13 MDTCS结构域的模型。
使用人ADAMTS13(Uniprot Q76LX8)的残基80至383(覆盖MD结构域)来生成计算模型。在Dell Linux工作站(系统桌面管理信息：44454C4C-4300-1038-804B-B6C04F584732)上用MOE程序(版本2016.0802)中的同源建模工具进行建模。输入AD AMTS4的MD结构域(PDB代码2JRP[2])的晶体结构作为建模模板。
通过在Coot程序(版本0.8.6)中用SSM比对将D结构域进行对齐，将ADAMTS13 MD结构域的输出模型叠加至人ADAMTS13 DCTS结构域(PDB代码3JHN[1])。然后将建模的M结构域拼接至DCTS结构域(通过将M结构域的Asp298手动连接至D结构域的A1a299)，得到MDTCS结构域的完整模型。
然后将MDTCS模型加载至PyMOL程序(1.8.2.2版本)中进行可视化、Q97定位和图形准备。
Q97暴露在M蛋白酶结构域上，并位于稳定的螺旋-转角-螺旋结构中的短的两个残基转角上。通过在M结构域内折叠或介导MD结构域界面相互作用来使Q97侧螺旋稳定。M结构域内的Q97和E98不介导折叠或金属离子结合，Q97远离提出的VWF结合位点。目前的知识不能排除Q97参与CUB结构域调控的可能性。最近的两篇论文通过小角度X射线散射和电子显微镜表明，CUB1-2结构域折回到N末端MDTCS结构域，并调节ADAMTS13活性(Muia等，同上；South等，同上，其各自通过引用整体并入本文用于所有目的)。原位建模提供了Q97R突变不影响ADAMTS13功能的证据。
确定了Q97位于M结构域表面且不介导蛋白质折叠。此残基也远离提出的功能位点(包括VWF结合和切割位点、锌和钙结合位点)以及M和DTCS之间的结构域界面。MDTCS结构域的计算模型表明，Q97不介导ADAMTS13的N末端结构域的结构和功能。但是，已发表的数据显示了ADAMTS13的变构活化，其中C-末端CUB1-2结构域与MDTCS结构域相互作用以使蛋白酶在VWF结合前保持在低活性状态。目前尚不清楚Q97是否可能参与CUB1-2和MDTCS的结构域的相互作用。
实施例3：包含不同比率的Q97R rADAMTS13变体与野生型rADAMTS13的rADAMTS13组合物的评价
本实施例总共研究了35个批次。为进行评估，对样品进行基于胰蛋白酶消化的肽图谱构建。特别地，纯化的rADAMTS13 BDS样品被二硫代苏糖醇(DTT)还原，游离巯基被碘乙酰胺封闭。样品脱盐后与测序级胰蛋白酶孵育18小时。用反相色谱法分离得到的肽混合物，用在线UV检测和在线电喷雾电离质谱法在214nm处检测洗脱后的肽。为确定Q97R变体的丰度，对携带突变氨基酸的肽进行了分析。
天然蛋白质的N末端胰蛋白酶消化肽含有28个氨基酸：
75至102位：
Figure BDA0003972678030001071
在Q97R变体序列中，氨基酸从“Q”变为“R”引入了一个额外的胰蛋白酶切割位点。因此，对应的肽得到两个胰蛋白酶消化肽：
75至97位：
Figure BDA0003972678030001072
98至102位：EDTER
还必须考虑Q97R变体的错误切割形式：
75至102位：
Figure BDA0003972678030001073
对于Q97R变体，还在75至102位的错误切割形式中发现了感兴趣的肽段。错误切割形式的丰度低于正确切割的肽段，但程度因方法变化而异。差异还包括胰蛋白酶酶活性的变化，这是分析人员无法控制的。因此，为正确测定Q97R的量，将正确切割的胰蛋白酶消化肽(75至97)和错误切割形式(98至102)的峰面积加起来。
HPLC数据表明，变体的胰蛋白酶消化肽可通过液相色谱法来分离。下文质谱分析证实，天然变体的胰蛋白酶消化肽在Q97R变体的胰蛋白酶消化肽之前洗脱(图5)。Q97R变体的错误切割的胰蛋白酶消化肽甚至在天然变体的肽之前洗脱。这些肽在单个组合物中的丰度具有可比性，并根据萃取离子色谱图中的强度来确定(图6)，结果表明在整个生产活动中两种变体的丰度具有可比性。天然变体和Q97R变体的萃取离子色谱图被生成、积分，并计算相对峰面积(表2)。
Q97R变体的相对丰度根据相对于Q97肽和Q97R变体的峰面积之和计算的胰蛋白酶消化肽的峰面积来确定。Q97肽和Q97R变体(正确切割的Q97R变体和错误切割的Q97R变体)的萃取离子色谱图被生成、积分，并计算相对峰面积。
表2：Q97R变体组合物批次的丰度结果
Figure BDA0003972678030001091
1Q97R变体的相对峰面积相对于两个变体的峰面积之和来计算。
2样品8未测定多聚体rVWF。
为评价Q97R变体的功能，使用回归分析将比活(FRETS U/mgUV蛋白)与Q97R的相对丰度关联起来(图7)。如图7所示，变体比率(即Q97R rADAMTS13变体与野生型ADAMTS13的比率)与比活之间没有相关性，这表明Q97R rADAMTS13变体与野生型ADAMTS13具有相似的活性。
全长VWF被人ADAMTS13在A2结构域内的Tyr1605和Met1606之间的单个肽键处切割，由此产生140kDa的N末端片段和176kDa的C末端片段。用琼脂糖凝胶电泳检测多聚VWF丰度的降低。因此，VWF的切割是ADAMTS13效价的另一个指标。
对功能的影响也使用全长VWF切割测定进行评价。因此，将VWF切割数据相对于Q97R变体丰度进行作图(图8)。分析得到的p值为0.832，说明Q97R变体的丰度与VWF切割活性之间没有相关性。
实施例4：Q97R变体的相对量的测定
总共分析了12个批次的Q97R蛋白变体的相对比例。这12个批次包括相对低和相对高的Q97R部分，如通过重新评价在使用胰蛋白酶消化法进行生化表征过程中获得的数据所揭示的，并考虑了由于生产过程的性质而产生的潜在差异。
针对Q97R变体的相对含量的测定，使用基于凝血酶蛋白消化的方法对样品进行检测，随后使用反相高效液相色谱结合荧光检测(RP-HPLC-FLD)对其进行分析。样品制备包括：丙酮沉淀、用二硫苏糖醇进行还原(DTT)、用碘乙酰胺进行烷基化(IAA)，以及用PNGaseF孵育过夜以切割N-连接寡糖。最后，用凝血酶消化蛋白质60分钟，然后由含有氨基酸交换位点的两种蛋白质变体产生同样地切割的片段。采用RP-HPLC，在Agilent Zorbax 300SB-C8柱(1.8μm；2.1×100mm)上在70℃柱温下以0.4mL/min运行对20μL样品进行分析。在5.8min内从12％到44％ B进行梯度洗脱，然后用280nm激发波长和340nm发射波长进行荧光检测。针对数据分析，对Q97和Q97R变体的相应峰进行积分，表3中报告了相对峰面积(％)。
表3：Q97R变体组合物批次的丰度的结果
样品 Q<sup>97</sup>R面积％ Q<sup>97</sup>面积％
1 66.3 33.7
2 65.7 34.3
3 66.4 33.6
4 66.7 33.3
5 60.4 39.6
6 60.8 39.2
7 64.8 35.2
8 60.4 39.6
9 70.9 29.1
10 66.6 33.4
11 63.0 37.0
12 72.9 27.1
置信区间为95％，总体概率(population probability)为99.73％，Q97R变体的相对部分为46.5％至84.3％，其等于均值±4.8x标准差。Q97R的平均含量为65.4％。
实施例5：Q97 ADAMTS13和Q97R ADAMTS13变体的表达与表征
总体策略是分别表达Q97 ADAMTS13和Q97R ADAMTS13变体，以进行结构和功能表征。对两种单独的蛋白质(Q97和R97)进行了分析表征。表征关注功能、初级结构和更高级结构。表征结果概述在表5和表8中。
这两株细胞系在基于SAFC CHOZN GS-/-宿主细胞体系的克隆池中产生，并被维持在EX-Cell Advanced CHO Fed-batch培养基中。抑肽酶用于上游过程和下游过程，以防止两种ADAMTS13蛋白被截短。
这两种单独的ADAMTS13蛋白在两种不同的细胞体系中产生，这导致蛋白质浓度不同。蛋白质浓度的差异预计会导致活性和抗原水平的差异。样品的蛋白质浓度如表4所示，其被用于关联活性。相关参数为比活性值(与蛋白质浓度无关)，这两种单独变体的这些结果具有高度可比性。
表4：两种单独ADAMTS13蛋白的样品
样品 蛋白浓度[mg/mL]
Q<sup>97</sup> ADAMTS13 1.262
Q<sup>97</sup>R ADAMTS13 0.786
表5：Q97 ADAMTS13和Q97R ADAMTS13的表征结果
Figure BDA0003972678030001121
1比活的计算采用UV测得的活性和总蛋白值(Q97：1.262mg/mL，Q97R：0.786mg/mL)
2两种变体的差异用两种变体生产工艺提供的总蛋白(蛋白质浓度)的差异来追踪
3～130是CHOZN细胞系的典型的N-聚糖指数
使用尺寸排阻高效液相色谱法(SE-HPLC)来测定ADAMTS13形式的寡聚结构。这两种样品大多数都以单体形式存在。单体峰显示出一个小的肩部，表示蛋白质的截短形式。但是，两种蛋白质变体样品中都存在肩部。蛋白质也以少量的二聚形式和聚集形式存在(表6)。两种ADAMTS13蛋白的寡聚结构具有可比性。
表6：两种ADAMTS13蛋白形式的尺寸排阻色谱的详细结果
Figure BDA0003972678030001122
对两种ADAMTS13蛋白进行了进一步特性分析。进行了表征测试面板，如下所述，基于列出的标准评估了可比性。在进一步表征程序中对两种蛋白质使用并行测试，以减少测试变化的影响。
对于初级结构分析，rADAMTS13的初级结构使用肽图谱法进行研究。纯化的rADAMTS13样品用二硫苏糖醇进行还原，游离巯基用碘乙酰胺进行封闭。使用Zeba自旋柱去除试剂，加入质谱级胰酶，在+37℃下反应18h。用RP-HPLC分离所得肽混合物，通过在线UV在214nm处对洗脱的肽进行检测，使用质谱检测进行鉴定。肽图谱数据显示，两种ADAMTS13蛋白以纯的形式存在，没有检测到另一种形式的污染。
对于蛋白质组成分析，通过SDS-PAGE在还原条件下使用3％至8％的Tris-醋酸纤维凝胶对rADAMTS13 BDS批次进行分析。用Flamingo荧光凝胶染色对凝胶进行染色，以评价所分析批次的蛋白质组成(图9)。对于蛋白质印迹，用抗ADAMTS13抗体染色后将蛋白质转移至硝化纤维素膜上。通过对染色凝胶/膜的目视比较来评估可比性(图10)。对于rADAMTS13平均分子质量测定，样品中加入芥子酸作为基质分子。将样品/基质混合物点样到目标上，使用配备有HM-1高质量检测器(CovalX)的型号4800MALDI TOF/TOF仪器(AppliedBiosystems)，使用矩阵辅助激光解吸电离质谱法(MALDI MS)在线性正离子模式下测定分子质量。
针对翻译后修饰分析，通过用PNGase F释放N-连接的糖，并用2-AB(2-氨基苯甲酰胺)标记所释放的寡糖的还原端，来确定rADAMTS13的结合蛋白的寡糖。通过正相HPLC和荧光检测对标记的寡糖进行分离和相对定量。因此，将样品变性，用PNGase F进行酶促去糖基化。释放的N-聚糖被洗涤并冻干，然后用2-氨基苯甲酰胺通过还原胺化进行标记。在LunaAmino 3μ柱上使用水/乙腈/250mM醋酸铵pH 4.5梯度对寡糖进行分离，进行荧光检测。N-聚糖根据其与唾液酸数量相关的电荷被分为5组电荷簇(中性、单唾液酸化、二唾液酸化、三唾液酸化和四唾液酸化的N-聚糖)。除了比较色谱图谱之外，还计算了每组电荷态簇的相对丰度和N-聚糖指数。根据不同电荷态簇的相对面积(％)由下式来计算N-聚糖指数：N-聚糖指数＝中性*0+单唾液酸化*1+二唾液酸化*2+三唾液酸化*3+四唾液酸化*4。通过温和酸水解从rADAMTS13中释放出结合蛋白的唾液酸，用DMB(1,2-二氨基-4,5-亚甲氧基苯)进行标记，然后通过具有FLD的反相HPLC进行定量。简言之，rADAMTS13 BDS样品通过丙酮沉淀进行脱盐。脱盐后的样品在MilliQ水中重构，并被调整至醋酸最终浓度为2M，在+80℃下孵育2.5h。用DMB对释放的唾液酸进行标记，通过RP-HPLC在Jupiter 5μC18柱上使用乙腈/甲醇/水梯度进行分离。用N-乙酰神经氨酸(NANA)和N-羟乙酰神经氨酸(NGNA)标准制剂进行校准。
通过用PNGase F释放N-连接糖，然后对释放的寡糖进行标记，来确定rADAMTS13的结合蛋白的寡糖。色谱图的叠加如图11和图12所示。此外，根据其亚组进对N-聚糖图谱数据行了分析，结果概述在表7中。数据显示对于各亚组和N-聚糖指数，两个样品之间具有良好的可比性。具体而言，两个样品的N-聚糖指数基本相似，且低于N-聚糖接受范围(140至185)。
表7：两种ADAMTS13蛋白形式的N-聚糖亚组的相对峰面积
Figure BDA0003972678030001141
对于更高级结构分析，蛋白质分子的三级结构可以通过近UV波长区(250至350nm)的CD分析进行评估。在这些波长下，芳香族氨基酸和二硫键具有光学活性，它们的复合信号产生对给定蛋白质的三维构象具有特异性的光谱特征。蛋白质的二级结构可以在远UV波长区(190至250nm)用CD光谱测定。在此区域，肽键(酰胺键)产生的CD信号具有有序二级结构(例如螺旋和片状)的特征。SV AUC直接由溶液中的样品确定蛋白质的大小和构象。蛋白质尺寸变体(例如单体和二聚体)根据其沉积系数的差异进行分离。蛋白质的沉积系数是物种的分子量和形态的函数。蛋白沉淀通过在高角速度(通常40000至60000rpm)下离心完成。用吸光度光学器件测量每种蛋白质尺寸变体的浓度作为时间和径向位置的函数。随后对浓度曲线进行分析，提供蛋白质尺寸分布的信息，绘制成c(s)分布。c(s)分布中的每个峰都可以积分，其面积(作为占总面积的百分比)表示该物种的相对浓度。DSC通过定量监测蛋白质的展开与温度的关系，提供有关蛋白质的热稳定性和构象稳定性的信息。样品细胞和参考细胞(基质相同，但缺乏蛋白质)同时从20℃加热至100℃，扫描速度为60℃/h。随着温度升高，对加热两种细胞所需的功率进行连续测量，使用细胞之间的功率差来确定样品热容。蛋白质的热容被绘制成温度的函数。对该图(称为热图)的分析提供了关于样品的热力学信息，包括每个展开事件的展开焓和转变(即熔化)温度(Tm)。
对于功能分析，在静态条件下使用全长VWF底物进行功能表征测定。此种设置需要添加变性剂(尿素)来展开VWF底物，使它易于进行ADAMTS13切割。所有rADAMTS13样品根据指定的FRETS-VWF73活性被稀释至30mIU/mL。稀释后的样品在5mM Tris和1.5M尿素存在下用BaCl2活化，pH 8.0，在37℃下持续30分钟。将活化后的ADAMTS13与1VWF：Ag IU/mL的重组VWF混合，在37℃下进一步孵育2小时。通过加入终浓度为8.25mM的Na2SO4来停止反应。作为对照，实验设置包括用缓冲液而不是rADAMTS13对rVWF进行处理，遵循与rADAMTS13相同的程序。样品在2500×g下离心5分钟，取上清液进行进一步分析。采用水平SDS琼脂糖凝胶电泳技术，在低分辨率条件下分析rVWF在与rADAMTS13孵育后的多聚体结构的变化，以分析VWF的尺寸分布。VWF多聚体通过使用多克隆兔抗人VWF抗体进行免疫染色在分离凝胶中显现。rADAMTS13的氨基酸序列中含有23个蛋氨酸残基，其代表了将蛋氨酸修饰为蛋氨酸亚砜的潜在氧化位点。通过胰蛋白酶消化肽来测定rADAMTS13的氧化变体。对于非氧化肽和氧化肽，分别生成重构离子色谱图，对其进行积分，计算相应的面积。根据历史强迫降解数据，选取6种蛋氨酸进行定量数据评价。
表8：两种ADAMTS13蛋白形式的尺寸排阻色谱的详细结果
Figure BDA0003972678030001151
单个变体的结果具有高度可比性，这表明两种蛋白质变体在一级结构、二级结构和更高级结构以及功能上具有相似性。根据本实施例中概述的结果，可以得出结论，Q97ADAMTS13和Q97R ADAMTS13具有相同的物理化学、生物物理和生物学特性，无论在同一细胞中产生或在同一背景的不同细胞中产生，均继续保持这些特性。
实施例6：Q97 ADAMTS13和Q97R ADAMTS13的糖基化分析
本实施例使用几种分析方法来确定ADAMTS13糖基化模式的糖基化程度和基本性质。
Q97 ADAMTS13和Q97R ADAMTS13一起在CHO DBX-11宿主细胞系中表达(即，一个细胞系同时产生两种ADAMTS13蛋白)。
对于胰蛋白酶消化肽图谱，纯化的ADAMTS13样品用二硫代苏糖醇(DTT)进行还原，游离巯基用碘乙酰胺进行封闭。通过透析来除去试剂，收集rADAMTS13，冻干。加入测序级胰蛋白酶或LysC，反应2小时，然后第二次加入酶，孵育18小时。此外，用PNGase F去除N-聚糖，以获得更完整的序列覆盖度。用反相色谱法对所得肽混合物进行分离。通过在线UV在214nm处对洗脱的肽进行检测，此外仅对胰蛋白酶消化肽混合物进行在线质谱检测。ADAMTS13的氨基酸序列涉及的肽列在表9中。
表9：按序列分类的ADAMTS13肽图谱中识别到的信号
Figure BDA0003972678030001161
Figure BDA0003972678030001171
Figure BDA0003972678030001181
Figure BDA0003972678030001191
Figure BDA0003972678030001201
Figure BDA0003972678030001211
Figure BDA0003972678030001221
1无信号肽和前肽的编号；
2未对此肽进行修饰；n.d.未检测到
几个样品的胰蛋白酶消化肽图谱的重叠显示了样品的高度可比性，因为峰型没有观察到重大差异。因此，相似的翻译后修饰发生在所有样品中。
重组ADAMTS13显示具有C-甘露糖基化，这是包含序列WXXW的1型血小板反应蛋白(TSP-1)基序的典型特征。可以检测到此种修饰，发现约30％被修饰，70％未被修饰。
通过肽图谱发现的主要N-聚糖变体为双触角、单唾液酸化、岩藻糖基化的聚糖和双触角、二唾液酸化、岩藻糖基化的聚糖。
发现TSP-1基序上的7个O-岩藻糖基化全部被双糖Fuc-Glc完全占据。此外，还识别到几种具有HexNAc-Hex-NeuAc0-2结构的粘蛋白型O-聚糖。表10概述了这些O-糖基化及它们的近似占比。发现肽T071被HexNAc-Hex-NeuAc2完全修饰。对于肽T100，大部分(88％)也被此种结构修饰，仅少量未被修饰。对于肽T072，60％以未修饰形式检测到，约40％被O-聚糖HexNac-Hex-NeuAc2修饰。检测到胰蛋白酶消化肽T098-099具有多达4种(30％)唾液酸水平不同的相同类型的O-聚糖，发现约70％带有3种O-聚糖，未检测到未被修饰的肽。
表10：ADAMTS13中识别到的O-连接糖基化
Figure BDA0003972678030001231
*n.d.＝未检测到
还通过释放的水解rADAMTS13聚糖的单糖分析对ADAMTS13糖基化进行评价。程序包括：酸水解、用2-AA进行标记以及通过反相HPLC进行分离/检测/定量，结合荧光检测。rADAMTS13样品通过丙酮沉淀来脱盐。脱盐后的样品被重悬于6.75M三氟乙酸中，在100℃下孵育1.5小时。释放的单糖用2-AA(邻氨基苯甲酸)通过还原胺化进行标记，并通过反相HPLC在Jupiter 5μC18色谱柱上进行分离(使用乙腈梯度，磷酸和丁胺作为改性剂)。用标准单糖的合适混合物进行校准。表11概述了所有分析样品的数据。
表11：ADAMTS13的单糖分析
Figure BDA0003972678030001241
还通过2-AB聚糖分析对ADAMTS13糖基化进行评估，包括用PNGase F释放N-连接寡糖的聚糖和用2-AB(2-氨基苯甲酰胺)标记还原端。用正相HPLC和荧光检测对标记的寡糖进行分离和相对定量。简言之，样品用尿素进行变性，并结合到AssayMap小柱上。使用PNGaseF进行酶促去糖基化，释放的N-聚糖被从柱上洗涤下来、冻干，然后用2-氨基苯甲酰胺通过还原胺化进行标记。在Luna Amino 3μ柱上使用水/乙腈/250mM醋酸铵pH 4.5梯度对寡糖进行分离，使用荧光进行检测。基于与唾液酸数量相关的电荷，将N-连接聚糖分为5组电荷簇(中性、单唾液酸化、二唾液酸化、三唾液酸化和四唾液酸化的N-聚糖)。除了比较色谱特征之外，还计算了每组电荷态簇的相对丰度和N-聚糖指数。通过下式由不同电荷态簇的相对面积(％)来计算N-聚糖指数：N-聚糖指数＝中性*0+单唾液酸化*1+二唾液酸化*2+三唾液酸化*3+四唾液酸化*4。
通过肽图谱发现的主要N-聚糖变体为双触角、单唾液酸化、岩藻糖基化的聚糖和双触角、二唾液酸化、岩藻糖基化的聚糖，这与N-聚糖图谱数据一致(图13)。表12概述了所有样品的N-聚糖图谱数据。ADAMTS13上发现的主要N-聚糖结构为双触角、核心岩藻糖基化的复合型寡糖，其具有一个或两个唾液酸。
表12：N-聚糖图谱数据
Figure BDA0003972678030001251
通过温和酸水解从rADAMTS13中释放出结合蛋白的唾液酸，使用DMB进行标记，然后用反相HPLC和荧光检测进行定量。将ADAMTS13样品通过丙酮沉淀进行脱盐，在MilliQ水中重构至醋酸最终浓度为2M，在80℃下孵育2.5小时。用1,2-二氨基-4,5-亚甲基二氧苯(DMB)对释放的唾液酸进行标记，并通过反相HPLC在Jupiter 5μC18柱上用乙腈/甲醇/水梯度进行分离。用N-乙酰神经氨酸(NANA)和N-羟乙酰神经氨酸(NGNA)标准制剂进行校准。表13概述了所有分析样品的数据。
表13：唾液酸定量分析的NANA和NGNA的数据
Figure BDA0003972678030001261
样品中检测到的NANA的量具有高度可比性，范围为约130至169nmol NANA/mgrADAMTS13蛋白。
***
本发明的范围不受本文所述的具体实施方式的限制。事实上，通过上述描述，除本文描述的那些之外的本发明的各种变型对本领域技术人员而言将是显而易见的。此类变型旨在落入所附权利要求的范围内。
本文中引用的所有专利、申请、出版物、测试方法、文献和其他材料均通过引用整体并入本说明书中。

Claims (58)

1.一种重组ADAMTS13变体，其中，与ADAMTS13蛋白相比，所述ADAMTS13变体包含具有至少一个氨基酸替代的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的重组ADAMTS13变体，其中，单个氨基酸替代位于SEQ IDNO：1中所示的氨基酸Q97处或ADAMTS13中的等价氨基酸位置。
3.根据权利要求2所述的重组ADAMTS13变体，其中，单个氨基酸改变是从Q变为D、E、K、H、L、N、P或R。
4.根据权利要求2所述的重组ADAMTS13变体，其中，单个氨基酸改变是从Q变为R。
5.根据权利要求4所述的重组ADAMTS13变体，其中，所述ADAMTS13变体包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列或与SEQ ID NO：2具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。
6.根据权利要求5所述的重组ADAMTS13变体，其中，ADAMTS13基本上由SEQ ID NO：2的氨基酸序列组成。
7.根据权利要求5所述的重组ADAMTS13变体，其中，ADAMTS13由SEQ ID NO：2的氨基酸序列组成。
8.根据权利要求1所述的重组ADAMTS13变体，其中，所述ADAMTS13蛋白为人ADAMTS13。
9.根据权利要求1所述的重组ADAMTS13变体，其中，所述ADAMTS13蛋白包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列。
10.根据前述权利要求中任一项所述的重组ADAMTS13变体，其中，与ADAMTS13蛋白相比，至少一个单个氨基酸替代位于ADAMTS13催化结构域内。
11.根据前述权利要求中任一项所述的重组ADAMTS13变体，其中，单个氨基酸替代不是SEQ ID NO：1中所示的I79M、V88M、H96D、R102C、S119F、I178T、R193W、T196I、S203P、L232Q、H234Q、D235H、A250V、S263C和/或R268P，或ADAMTS13中的等价氨基酸位置。
12.一种药物组合物，其包含权利要求1至11中任一项所述的至少一种ADAMTS13变体和药学上可接受的载体或赋形剂。
13.根据权利要求12所述的药物组合物，其中，所述药物组合物还包含ADAMTS13蛋白。
14.根据权利要求13所述的药物组合物，其中，所述ADAMTS13蛋白包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列或与SEQ ID NO：1具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。
15.根据权利要求13所述的药物组合物，其中，所述ADAMTS13蛋白由SEQ ID NO：1的氨基酸序列组成。
16.根据权利要求13至15中任一项所述的药物组合物，其中，所述ADAMTS13蛋白是重组产生的。
17.根据权利要求13至15中任一项所述的药物组合物，其中，所述ADAMTS13蛋白为血浆来源的。
18.根据权利要求13至15中任一项所述的药物组合物，其中，所述ADAMTS13变体与ADAMTS13蛋白的比率为约1：1至约3：1、约1：1或约3：2。
19.根据权利要求13至18中任一项所述的药物组合物，其中，所述ADAMTS13变体构成所述组合物中所有ADAMTS13蛋白和变体的总量的约52％至约72％，或约47％至约84％。
20.根据权利要求18或19所述的药物组合物，其中，所述比率或百分比由肽图谱法确定。
21.根据权利要求18或19所述的药物组合物，其中，所述比率或百分比通过对液相色谱法分离的胰蛋白酶肽进行HPLC分析、然后进行质谱分析来确定。
22.根据权利要求18至21中任一项所述的药物组合物，其中，所述比率或百分比基于萃取离子色谱图中的强度来确定。
23.根据权利要求18至22中任一项所述的药物组合物，其中，所述比率或百分比基于ADAMTS13变体的胰蛋白酶肽的峰面积相对于组合物中所有ADAMTS13蛋白和变体的峰面积之和来确定。
24.根据权利要求23所述的药物组合物，其中，被测量的组合物中所有ADAMTS13蛋白和变体的胰蛋白酶肽对ADAMTS13变体与组合物中所有其他ADAMTS13蛋白和变体相比的至少一个氨基酸差异具有特异性。
25.根据权利要求24所述的药物组合物，其中，针对ADAMTS13变体测量的胰蛋白酶肽为AAGGILHLELLVAVGPDVFQAHR，或AAGGILHLELLVAVGPDVFQAHR与EDTER的组合。
26.根据权利要求24或25所述的药物组合物，其中，针对ADAMTS13蛋白测量的胰蛋白酶肽为AAGGILHLELLVAVGPDVFQAHQEDTER。
27.根据权利要求18或19所述的药物组合物，其中，所述比率或百分比基于ADAMTS13变体的总重量相对于组合物中所有ADAMTS13蛋白和变体的总和重量来确定。
28.一种治疗或预防患有或可能患有凝血障碍的受试者的凝血障碍的方法，其包括向有此需要的受试者施用治疗有效量的权利要求1至7中任一项所述的ADAMTS13变体或权利要求12至27中任一项所述的药物组合物。
29.根据权利要求28所述的方法，其中，所述凝血障碍为遗传性TTP、获得性TTP、梗塞、脑梗塞、心肌梗塞、缺血/再灌注损伤、深静脉血栓形成或败血症相关的弥散性血管内凝血。
30.一种治疗或预防患有或可能患有出血障碍的受试者的出血发作的方法，其包括向有此需要的受试者施用治疗有效量的权利要求1至7中任一项所述的ADAMTS13变体或权利要求12至27中任一项所述的药物组合物。
31.根据权利要求30所述的方法，其中，所述出血发作与遗传性TTP、获得性TTP、梗塞、脑梗塞、心肌梗塞、缺血/再灌注损伤、深静脉血栓形成或败血症相关的弥散性血管内凝血相关。
32.一种治疗或预防患有镰状细胞疾病的受试者的血管闭塞危象的方法，其包括向有此需要的受试者施用治疗有效量的权利要求1至7中任一项所述的ADAMTS13变体或权利要求12至27中任一项所述的药物组合物。
33.一种治疗或预防患有或可能患有急性肺损伤(ALI)和/或急性呼吸窘迫综合征(ARDS)的受试者的肺损伤的方法，包括向有此需要的受试者施用治疗有效量的权利要求1至7中任一项所述的ADAMTS13变体或权利要求12至27中任一项所述的药物组合物。
34.一种通过对受试者的闭塞血管进行再通来治疗受试者的脑梗塞的方法，包括向有此需要的受试者施用治疗有效量的权利要求1至7中任一项所述的ADAMTS13变体或权利要求12至27中任一项所述的药物组合物，从而使闭塞血管再通。
35.一种治疗或预防受试者的与心血管疾病相关的凝血障碍的方法，包括向有此需要的受试者施用治疗有效量的权利要求1至7中任一项所述的ADAMTS13变体或权利要求12至27中任一项所述的药物组合物。
36.根据权利要求35所述的方法，其中，与心血管疾病相关的凝血障碍与心肌梗塞、心肌缺血、深静脉血栓形成、外周血管疾病、中风、短暂性缺血发作或医疗器械相关的血栓形成相关。
37.一种治疗或预防受试者的血液病的方法，包括向有此需要的受试者施用治疗有效量的权利要求1至7中任一项所述的ADAMTS13变体或权利要求12至27中任一项所述的药物组合物。
38.根据权利要求28至37中任一项所述的方法，其中，所述ADAMTS13变体和/或ADAMTS13蛋白是重组产生的。
39.根据权利要求28至38中任一项所述的方法，其中，所述受试者为哺乳动物。
40.根据权利要求28至38中任一项所述的方法，其中，所述受试者为人类。
41.根据权利要求28至40中任一项所述的方法，其中，所述组合物为冻干的。
42.根据权利要求41所述的方法，其中，所述组合物在施用之前用适用于注射的药学上可接受的载体进行重构。
43.根据权利要求28至40中任一项所述的方法，其中，所述组合物为用于施用的即用型的稳定水溶液。
44.一种编码权利要求1至7中任一项所述的ADAMTS13变体的核酸分子。
45.一种包含权利要求44所述的核酸分子的载体。
46.根据权利要求45所述的载体，其中，所述载体为表达载体，编码ADAMTS13变体的多核苷酸序列与能够介导ADAMTS13变体在宿主细胞中表达的启动子可操作地连接。
47.一种包含权利要求44所述的核酸分子的宿主细胞。
48.一种包含权利要求45或46所述的载体的宿主细胞。
49.一种宿主细胞系，其包含经修饰为表达权利要求1至12中任一项所述的ADAMTS13变体和至少一种ADAMTS13蛋白的细胞。
50.根据权利要求49所述的宿主细胞系，其中，所述ADAMTS13变体包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列或与SEQ ID NO：2具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。
51.根据权利要求49或50所述的宿主细胞系，其中，所述ADAMTS13蛋白的氨基酸序列包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列或与SEQ ID NO：1具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。
52.根据权利要求49至51中任一项所述的宿主细胞系，其中，所述ADAMTS13蛋白的氨基酸序列由SEQ ID NO：1的氨基酸序列组成。
53.根据权利要求49至53中任一项所述的宿主细胞系，其中，所述ADAMTS13变体和ADAMTS13蛋白在宿主细胞系的不同细胞中表达。
54.根据权利要求49至53中任一项所述的宿主细胞系，其中，所述ADAMTS13变体和ADAMTS13蛋白在同一细胞中表达。
55.根据权利要求47至54中任一项所述的宿主细胞或宿主细胞系，其中，所述细胞为CHO细胞、COS细胞、HEK 293细胞、BHK细胞、SK-Hep细胞或Hep G2细胞。
56.根据权利要求55所述的宿主细胞或宿主细胞系，其中，所述CHO细胞为CHO DBX-11细胞系或CHOZN细胞系。
57.根据权利要求56所述的宿主细胞或宿主细胞系，其中，所述CHOZN细胞为CHO DBX-11细胞系。
58.根据权利要求56所述的宿主细胞或宿主细胞系，其中，所述CHOZN细胞为CHOZN谷氨酰胺合成酶(GS)-/-细胞系。
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