KR20150132449A - 재조합 인자 viii 제제 - Google Patents

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KR20150132449A
KR20150132449A KR1020157029441A KR20157029441A KR20150132449A KR 20150132449 A KR20150132449 A KR 20150132449A KR 1020157029441 A KR1020157029441 A KR 1020157029441A KR 20157029441 A KR20157029441 A KR 20157029441A KR 20150132449 A KR20150132449 A KR 20150132449A
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더 치엔 왕
싱항 마
넬리 츠베트코바
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바이엘 헬스케어 엘엘씨
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Abstract

페길화된 인자 VIII와 같은 중합체-콘쥬게이션된 FVIII에 대한 제제를 포함하는, 액체 및 동결건조된 재조합 인자 VIII 제제가 제공된다.

Description

재조합 인자 VIII 제제{RECOMBINANT FACTOR VIII FORMULATIONS}
본 출원은 2013년 3월 15일 출원된 U.S. 가출원 제61/779,495호 및 2013년 8월 23일 출원된 U.S. 가출원 제61/869,191호의 우선권을 주장하고, 둘 다 본원에 참조문헌으로서 포함된다.
혈우병 A는 응고 인자 VIII("FVIII")의 결핍이 원인이고, 남성 5000 명 당 1의 추정 발생율로 가장 흔한 유전 응고 질환이다. 혈우병 A에 대한 현재 치료는 재조합 또는 혈장-유래 인간 FVIII의 정맥내 주사를 포함한다. FVIII의 주사는 출혈 사건에 대응하여 또는 매주 2 내지 4번 투여되는 예방 요법으로서 요구에 따라 주어진다. 비록 많은 연구가 예방 요법이 혈우병 A의 합병증을 감소시킨다는 것을 보여주었지만, 잦은 정맥내 주사의 필요는 환자의 순응성에 대한 장애물을 만들고 환자의 삶의 질에 영향을 미친다. 잦은 주사의 필요는 주로 환자 내에서 12 내지 14 시간의 짧은 순환 FVIII 반감기로 인한 것이다.
긴-사슬 중합체, 예컨대 폴리에틸렌글리콜("PEG")의 공유 첨가는 단백질 치료제의 반감기를 증가시키는 것으로 보여져 왔고, 페길화(PEGylation)는 단백질에 PEG 분자의 공유 부착이다.
U.S. 특허 제5,763,401호(네이어(Nayar))는 안정한, 알부민-없는, 동결건조된 전체-길이 재조합 FVIII 제제("FL-rFVIII")를 개시한다. U.S. 특허 제7,632,921호(팬(Pan) 외) 및 문헌[메이(Mei) 외, Rational design of a fully active, long-acting PEGylated factor VII for hemophilia A treatment, 116 BLOOD 270-279 (2010)]은 PEG와 같은 하나 이상의 생체적합성 중합체에 공유적으로 결합하는 시스테인 증진된 FVIII 돌연변이를 개시한다. U.S. 특허 제7,087,723호(베스맨(Besman) 외)는 알부민-없는 FVIII 제제와 관계가 있다. 문헌[오스터버그(Osterberg) 외, Development of a freeze-drieel albumin-free formulation of recombinant factor VIII SQ, Pharmaceutical Research, vol. 14, No. 7 (1997), pp. 892-898] 및 [오스터버그 외, B-domain recombinant recombinant factor VIII formulation and stability, Seminars in Hematology, vol. 38, No. 2, suppl. 4 (April 2001), pp. 40-43]에서는 염화 나트륨, 수크로스, 히스티딘, 염화 칼슘 탈수물 및 폴리소르베이트 80를 포함하는, 동결건조를 위한 B-도메인 결실된 FVIII의 제제를 논의한다. 문헌[파토우로스(Fatouros) 외, Recombinant factor VIII SQ - influence of oxygen, metal ions, pH and ionic strength on its stability in aqueous solution, Int. J. of Pharmaceutics 155 (1997) 121 -131]은 알부민이 없는 용액 내에서의 저장시 rFVIII SQ의 성질을 개시한다. WO2011/027152(예젝(Jezek) 외)는 FVIII의 제제를 개시한다.
한 실시양태에서, 본 발명은: (a) 약 1 mM 내지 약 5 mM 범위의 2가 양이온; (b) 약 150 mM 내지 약 250 mM 범위의 염화 나트륨 또는 염화 칼륨; (c) 약 50 ppm 내지 약 200 ppm 범위의 비-이온 계면활성제; 및 (d) 약 100 IU/ml 내지 약 5000 IU/ml 범위의 rFVIII(여기서 rFVIII는 시스테인 잔기로 대체된 서열 3의 아미노산 내 하나 이상의 비-시스테인 잔기를 갖는 아미노산 서열을 포함함)을 포함하고, 약 pH 6.0 내지 약 pH 7.5 범위의 pH를 갖는 rFVIII 제제에 관한 것이다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명은: (a) 10 mM 내지 100 mM 범위의 MOPS; (b) 0.5 중량% 내지 10 중량% 범위의 당 또는 당 알콜; (c) 0.5 mM 내지 20 mM 범위의 2가 양이온; (d) 10 mM 내지 100 mM 범위의 염화 나트륨 또는 염화 칼륨; (e) 50 내지 150 ppm 범위의 비-이온 계면활성제; 및 (f) 약 100 IU/ml 내지 약 1500 IU/ml 범위의 rFVIII를 포함하고, 5.0 중량% 미만의 일차 또는 이차 아민 기를 갖는 rFVIII 외의 성분을 함유하는 rFVIII 제제에 관한 것이다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은: (a) 10 mM 내지 100 mM 범위의 MOPS; (b) 150 mM 내지 300 mM 범위의 NaCl; (c) 1 mM 내지 20 mM 범위의 2가 양이온; 및 (d) 약 100 IU/ml 내지 약 5000 IU/ml 범위의 비콘쥬게이션된 rFVIII를 포함하는 rFVIII 제제에 관한 것이다. 추가적인 실시양태에서, 본 발명은: (a) 10 mM 내지 100 mM 범위의 MOPS 또는 히스티딘; (b) 25 mM 내지 200 mM 범위의 NaCl; (c) 1 mM 내지 20 mM 범위의 2가 양이온; 및 (d) 약 100 IU/ml 내지 약 5000 IU/ml 범위의 콘쥬게이션된 rFVIII를 포함하는 rFVIII 제제에 관한 것이다. 추가적인 실시양태에서, 본 발명은: (a) 약 0 mM, 또는 약 1 mM 내지 약 20 mM 범위의 히스티딘; (b) 0.5 % 내지 20 % 범위의 수크로스 또는 트레할로스; (c) 약 1 mM 내지 약 5 mM 범위의 2가 양이온; (d) 약 0 mM, 또는 약 10 mM 내지 약 50 mM 범위의 염화 나트륨; (e) 약 0 mM, 또는 약 20 ppm 내지 약 80 ppm 범위의 비-이온 계면활성제; (f) 약 0%, 또는 약 1.0 % 내지 약 5.0 % 범위의 글리신 및 (g) 약 100 IU/ml 내지 약 5000 IU/ml 범위의 콘쥬게이션된 rFVIII를 포함하고, 약 pH 6.0 내지 약 pH 7.5 범위의 pH를 갖는 rFVIII 제제에 관한 것이다.
통상의 기술자는 하기 기재된 도면은 오직 예시 목적을 위한 것임을 이해할 것이다. 도면은 어떤 방식으로든 본원에 제공된 개시의 범위 또는 청구항의 범위를 제한하려는 의도가 아니다.
도 1은 전체-길이 인간 인자 VIII 및 BDD-rFVIII의 도메인을 개략적으로 나타낸다.
도 2는 이황화 결합에 의해 연결된 도메인을 갖는 BDD-rFVIII 돌연변이의 상대적인 혼탁도를 나타내는 그래프이다. 혼탁도는 염화 나트륨의 농도를 증가시키는 것을 포함하는 완충액에서 측정된다. 혼탁도는 Α340nm에 의해 측정되었다. 염화 나트륨에 더하여, 완충액은 20 mM 히스티딘, 2.5 mM 염화 칼슘, 29 mM 수크로스, 293 mM 글리신 및 80 ppm 폴리소르베이트 80를 포함한다.
도 3은 이황화 결합에 의해 연결된 도메인을 갖는 BDD-rFVIII 돌연변이의 상대적인 혼탁도를 나타내는 그래프이다. 혼탁도는 폴리소르베이트 80의 농도를 증가시키는 것을 포함하는 완충액에서 측정된다. 혼탁도는 Α340nm에 의해 측정되었다. 폴리소르베이트 80에 더하여, 완충액은 20 mM 히스티딘, 30 mM 염화 나트륨, 2.5 mM 염화 칼슘, 29 mM 수크로스 및 293 mM 글리신을 포함한다.
도 4는 이황화 결합에 의해 연결된 도메인을 갖는 BDD-rFVIII 돌연변이의 상대적인 혼탁도를 나타내는 그래프이다. 혼탁도는 인간 혈청 알부민("USA")의 농도를 증가시키는 것을 포함하는 완충액에서 측정된다. 혼탁도는 Α340nm에 의해 측정되었다. 완충액은 20 mM 히스티딘, 30 mM 염화 나트륨, 2.5 mM 염화 칼슘, 29 mM 수크로스, 293 mM 글리신 및 80 ppm 폴리소르베이트 80를 포함한다.
도 5는 이황화 결합에 의해 연결된 도메인을 갖는 BDD-rFVIII 돌연변이의 상대적인 혼탁도를 나타내는 그래프이다. 혼탁도는 폴리소르베이트 80 및 HSA와 함께 염화 나트륨의 농도를 증가시키는 것을 포함하는 완충액에서 측정되었다. 혼탁도는 Α340nm에 의해 측정되었다. 염화 나트륨, HSA 및 폴리소르베이트 80에 더하여, 완충액은 20 mM 히스티딘, 2.5 mM 염화 칼슘, 29 mM 수크로스 및 293 mM 글리신을 포함한다.
도 6은 부형제의 첨가 전과 후 용액에서 이황화 결합 연결 도메인이 있는 BDD-rFVIII 돌연변이에 대한 명확한 변화를 나타낸다. 왼쪽부터 오른쪽으로: (1) 부형제(HSA, 염화 나트륨 및 폴리소르베이트 80)의 조합물, (2) HSA, (3) 염화 나트륨, (4) 폴리소르베이트 80, 및 (5) HSA, 폴리소르베이트 80 및 염화 나트륨의 첨가 전이다.
도 7은 40 ℃에서 7 일 저장 동안 히스티딘, MOPS 및 TEA 완충액에서 전체-길이 FVIII의 액체 안정성을 나타내는 그래프이다.
도 8은 25 ℃에서 MOPS 및 히스티딘 완충액에서 rFVIII 안정성을 나타내는 그래프이다.
도 9는 페길화된 BDD-rFVIII의 구조를 나타내는 도표이다. A3 영역으로부터 튀어나온 사슬은 PEG 분자를 나타낸다.
도 10은 23 ℃에서 6일 저장 동안 페길화된 BDD-rFVIII의 잠재능 회복에 미치는 염화 나트륨의 영향을 나타내는 그래프이다.
도 11은 23 ℃에서 6일 저장 동안 페길화되지-않은 BDD-rFVIII의 잠재능 회복에 미치는 염화 나트륨의 영향을 나타내는 그래프이다.
도 12는 26주 후 동결건조된 제제 A 내 페길화된 BDD-rFVIII에 대한 정규화된 잠재능 경향을 나타내는 그래프이다. 제제 A는 2.5 mM 염화 칼슘, 30 mM 염화 나트륨, 20 mM 히스티딘, 293 mM 글리신, 29 mM 수크로스 및 80 ppm 폴리소르베이트 80를 함유한다.
도 13은 26주 후 동결건조된 제제 B 내 페길화된 BDD-rFVIII에 대한 정규화된 잠재능 경향을 나타내는 그래프이다. 제제 B는 2.5 mM 염화 칼슘, 30 mM 염화 나트륨, 20 mM 히스티딘, 346 mM 글리신, 38 mM 수크로스 및 80 ppm 폴리소르베이트 80를 함유한다.
도 14는 26주 후 동결건조된 제제 C 내 페길화된 BDD-rFVIII에 대한 정규화된 잠재능 경향을 나타내는 그래프이다. 제제 C는 2.5 mM 염화 칼슘, 20 mM 히스티딘, 234 mM 수크로스 및 80 ppm 폴리소르베이트 80를 함유한다.
도 15는 26주 후 동결건조된 제제 D 내 페길화된 BDD-rFVIII에 대한 정규화된 잠재능 경향을 나타내는 그래프이다. 제제 D는 2.5 mM 염화 칼슘, 20 mM 히스티딘, 211 mM 트레할로스 및 80 ppm 폴리소르베이트 80를 함유한다.
도 16은 30개월까지 동결건조된 제제 A 내 페길화된 BDD-rFVIII에 대한 정규화된 잠재능 경향을 나타내는 그래프이다. 제제 A는 2.5 mM 염화 칼슘, 30 mM 염화 나트륨, 20 mM 히스티딘, 293 mM 글리신, 29 mM 수크로스 및 80 ppm 폴리소르베이트 80를 함유한다.
도 17은 13주까지 동결건조된 제제 B 내 페길화된 BDD-rFVIII에 대한 정규화된 잠재능 경향을 나타내는 그래프이다. 제제 B는 2.5 mM 염화 칼슘, 30 mM 염화 나트륨, 20 mM 히스티딘, 346 mM 글리신, 38 mM 수크로스 및 80 ppm 폴리소르베이트 80를 함유한다.
도 18은 12개월까지 동결건조된 제제 A 내 페길화된 BDD-rFVIII(200 IU/mL)에 대한 정규화된 잠재능 경향을 나타내는 그래프이다. 제제 A는 2.5 mM 염화 칼슘, 30 mM 염화 나트륨, 20 mM 히스티딘, 293 mM 글리신, 29 mM 수크로스 및 80 ppm 폴리소르베이트 80를 함유한다.
도 19는 9개월까지 동결건조된 제제 A 내 페길화된 BDD-rFVIII(1200 IU/mL)에 대한 정규화된 잠재능 경향을 나타내는 그래프이다. 제제 A는 2.5 mM 염화 칼슘, 30 mM 염화 나트륨, 20 mM 히스티딘, 293 mM 글리신, 29 mM 수크로스 및 80 ppm 폴리소르베이트 80를 함유한다.
도 20은 BDD-rFVIII SQ(서열 3)의 아미노산 서열이다.
도 21은 FL-rFVIII(서열 1)의 아미노산 서열이다.
본 명세서를 해석하는 목적으로, 다르게 명시되지 않는 한, 하기 정의가 적용될 것이다. 본원에 언급된 모든 참조문헌은 그들 전체가 본원에 참조문헌으로서 포함된다.
인자 VIII: 인자 VIII("FVIII")는 대략 200 kDa의 중사슬 및 80 kDa의 경사슬로 이루어진 이질이합체로서 순환하는 응고 인자이다. 중사슬은 구조적으로 관련된 A1 및 A2 도메인, 뿐만 아니라 독특한 B 도메인을 함유하고, 경사슬은 A3, C1 및 C2 도메인을 포함한다. 문헌[메이 외, 116 BLOOD 270-279 (2010)]을 참조할 수 있다. 또한, FVIII의 도메인을 나타내는 도 1을 참조할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "인자 VIII" 또는 "FVIII"는, 혈장으로부터 유래되었든 또는 야생형 인간 FVIII의 일부 전구응고 활성 특성을 갖는 재조합 DNA 기술의 사용을 통해 생성되었든 모든 인자 VIII 분자를 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같이, FVIII는 야생형 인자 VIII 또는 활성화된 야생형 인자 VIII의 활성을 초과하는 전구응고 활성을 갖는 변종 또는 유실된 형태를 포함하는, 야생형 인자 VIII 또는 활성화된 야생형 인자 VIII의 일부 또는 모든 전구응고 활성을 보유하는 야생형 또는 재조합 인자 VIII의 변형된 또는 유실된 형태를 포함한다. FVIII는 또한 활성 인자 VIII를 함유하는 융합 생성물, 예컨대 면역글로불린 단편 또는 도메인과의 융합을 포함한다. 상업적으로 입수가능한 FVIII를 함유하는 치료상 제제의 예는 상표명 KOGENATE FS(미국 캘리포니아주 버클리 소재, 바이엘 헬스케어 LLC(Bayer Healthcare LLC)로부터 입수가능함) 하에 시판되는 것들을 포함한다.
재조합 인자 VIII: 본원에 사용된 바와 같은 재조합 인자 VIII("rFVIII")는 재조합 기술을 사용하여 생성된 FVIII 또는 그의 생물학적 활성 유도체를 지칭하고, 포유류 혈장으로부터 수득된 FVIII를 포함하지 않는다.
전체-길이, 천연 인간 인자 VIII("FL-FVIII")는 2,351 아미노산, 단일 사슬 글리코단백질이다. 그러나, 발현된 2,351 아미노산 서열은 서열 1로 제공된다. 발현된 폴리펩티드가 소포체의 내강으로 이동할 때, 19-아미노산 신호 서열이 나뉘어지고, 제2 서열이 된다. 본원에서 서열 2로 제공되는 이 제2 서열은 리딩 19 아미노산이 부족하고 종래에 연구자들에 의해 주어진 VIII의 아미노산 잔기에 숫자 위치(예컨대, Arg372)를 부과하도록 사용된 서열이다. 따라서, 구체적으로 명시되지 않는 한, 모든 아미노산 잔기의 숫자 위치의 부과는 서열 2를 바탕으로 한다. 예를 들어, 종래에 및 본원에 사용된 바와 같이, BDD rFVIII 내 돌연변이된 아미노산을 지칭할 때, 돌연변이된 아미노산은 전체-길이 FVIII의 서열 내에서 그의 위치에 의해 지정된다. 예를 들어, BDD rFVIII 돌연변이는 K1808C 아미노산 치환을 포함할 수 있고, 여기서 전체-길이 서열(여기서, 서열 2) 내 1808과 유사한 위치의 리신(K)이 시스테인(C)으로 치환된다.
B-도메인 결실("BDD") 인자 VIII: 본원에 사용된 바와 같이, BDD 또는 BDD-rFVIII는 B-도메인의 전체 또는 부분의 결실이 있는 아미노산 서열을 갖는 것으로 특징화된다. 한 실시양태에서, BDD는 인자 VIII의 B-도메인의 14 아미노산을 제외한 모두의 결실을 함유하는 BDD-SQ로 알려진 분자이다. BDD-SQ에서, B-도메인의 첫번째 4 아미노산(서열4)이 B-도메인의 10 마지막 잔기(서열 5)에 연결된다. 예컨대, 문헌[린드(Lind) 외, Novel forms of B-domain-deleted recombinant factor VIII molecules, 232 EUROPEAN JOURNAL OF BIOCHEMISTRY 19-27 (1995)]을 참조할 수 있다. 또한 도메인 조직에 의한 BDD를 나타내는 도 1도 참조할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 BDD-SQ는 서열 3의 아미노산 서열을 포함한다. 90 kD A1-A2 중사슬 더하기 80 kD 경사슬 인자를 갖는 BDD 분자가 혈우병 A에 대한 대체 요법으로 효과적인 것으로 보여져 왔기 때문에, 인자 VIII의 B-도메인은 불필요한 것으로 보여진다. B-도메인의 다른 부분이 결실된 또는 모든 B-도메인 결실된 FVIII 분자는 또한 본 발명의 제제 및 방법에 포함된다.
BDD 돌연변이 또는 BDD-rFVIII 돌연변이: BDD 돌연변이 또는 BDD-rFVIII 돌연변이는 적어도 일부의 FVIII 전구응고 활성을 유지하고 적어도 하나의 아미노산 잔기에 의해 BDD-SQ와 상이한 BDD-SQ의 변종이다. BDD 돌연변이 또는 BDD-rFVIII 돌연변이는, 예를 들어, 제한 없이, 하나 이상의 아미노산 잔기의 부위-지향적 돌연변이에 의해 BDD-SQ로부터의 아미노산 서열과 상이한 변종을 포함한다. 제한 없이, BDD 돌연변이 또는 BDD-rFVIII 돌연변이는 U.S. 특허 제7,928,199호(그리핀(Griffin) 외)에 개시된 도입된 시스테인 잔기가 있는 FVIII 폴리펩티드를 포함한다.
페길화: 페길화는 예컨대, FVIII에 존재하는 위치에 결합하는 활성 관능성을 갖는 PEG을 부착함에 의한, 단백질에의 긴-사슬 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 분자의 공유 부착이다. 페길화에 사용된 한 방법은 천연 단백질 내 존재하는 리신 잔기 또는 N-말단 아민에의 관능화된 PEG 부분의 부착이다. FVIII가 많은 아민 잔기를 함유하기 때문에, 아민-관능화된 중합체는 FVIII 상 다른 위치에 무질서하게 콘쥬게이션된다.
부위-지향적 페길화는 특이적 위치에 PEG 분자의 표적화를 허용한다. 이들 특이적 위치는 도입된 표면-노출된 시스테인을 포함하여 PEG 분자가 콘쥬게이션되도록 할 수 있다. U.S. 특허 제7,632,921호(팬 외)를 참조할 수 있다. PEG는 또한 FVIII 상의 당류에 공유 결합에 의해 FVIII에 부착될 수 있다. 예컨대, U.S. 특허 출원 공보 20110112028(투레켁(Turecek) 외)를 참조할 수 있다. PEG는 또한 FVIII 상의 글리칸, 예컨대 O-글리칸에 PEG의 효소 결합에 의해 FVIII에 부착될 수 있다. 스테닉(Stennicke) 외는 완충액 내 시알리다아제 및 과량의 CMP-SA-글리세롤-PEG 시약으로 전체-길이 FVIII를 인큐베이팅함으로써 FVIII B-도메인에서 유일한 O-글리칸에 PEG의 선택적 결합을 개시한다. 문헌[스테닉 외, "A novel B-domain O-glycoPEGylated FVIII (N8-GP) demonstrates full efficacy and prolonged effect in hemophilic mice models," 121 (11) BLOOD 2108-16 (2013)]. U.S. 특허 출원 공보 제20130137638호(볼트(Bolt))는 유실된 B-도메인을 갖는 FVIII 변종에의 PEG 부착을 개시한다. FVIII 분자는 유실된 B 도메인 내 O-연결된 올리고당을 통해 친수성 중합체로 공유적으로 콘쥬게이션된다. U.S. 특허 출원 공보 제20120322738호(베흐렌스(Behrens))는 B-도메인 내 O-연결된 당류를 통해 FVIII에 PEG를 공유적으로 콘쥬게이션하는 것을 포함하는, FVIII에 중합체를 콘쥬게이션하는 방법을 개시한다. 본원에 사용된 바와 같이, 페길화된 FVIII는 상기 논의된 기술분야에 알려진 다양한 방법을 포함하는 임의의 방법에 의한 페길화를 포함한다.
국제 단위, IU: 국제 단위 또는 IU는 표준 분석에 의해 측정된 바와 같은 FVIII의 혈액 응고 활성(잠재능)의 측정의 단위이다. 표준 분석은 기술분야에 기재된 바와 같이 1 단계 분석을 포함한다. 예컨대, 문헌[이(Lee) 외, An effect of predilution on potency assays of Factor VIII concentrates, 30 THROMBOSIS RESEARCH 511 -519 (1983)]을 참조할 수 있다. 1-단계 분석은 활성화된 부분 트롬보플라스틴 시간(aPTT)을 바탕으로 한다. FVIII는 인자 X의 Xa로의 효소 전환에서 인자 IXa, 칼슘 및 인지질의 존재 하에 보조인자로서 역할을 한다. 이 분석에서, 희석된 시험 샘플은 FVIII 결핍 혈장 기재 및 aPTT 시약의 혼합물로 37 ℃에서 인큐베이팅된다. 염화 칼슘이 인큐베이팅된 혼합물에 첨가되고 응고가 개시된다. 응고가 형성되는데 걸리는 시간(초)과 FVIII:C의 농도의 로그 사이에 역전 관계가 존재한다. 미지의 샘플에 대한 활성 수준이 알려진 활성의 표준 물질의 일련의 희석으로 구성된 곡선의 시험 물질의 다양한 희석의 응고 시간을 비교함으로써 내삽되고 mL 당 국제 단위(lU/mL)로 보고된다. 또한 상표명 COATEST SP FVIII(스웨덴 묄른달 소재 크로모제닉스 AB로부터 입수가능함) 하 분석을 포함하여 상업적으로 구입될 수 있는 색소생산성 분석이 유용하다. 색소생산성 분석 방법은 색의 강도가 FVIII 활성에 비례하는 두 연속적인 단계로 이루어졌다. 첫 번째 단계에서, 인자 X는 적정 양의 칼슘 이온 및 인지질의 존재 하에 FIXa와 이의 보조인자 FVIIIa에 의해 FXa로 활성화된다. 인자 X의 활성 속도가 오직 FVIII의 양에 의존하도록 과량의 인자 X가 존재한다. 두 번째 단계에서, 인자 Xa는 발색단을 생성하도록 색소생산성 기질을 가수분해하고 색 강도는 405 nm에서 광도계로 판독된다. 미지의 것의 잠재능이 계산되고 분석의 유효성이 기울기-비율 통계 방법으로 확인된다. 활성은 mL 당 국제 단위(IU/mL)로 보고된다.
동결-건조, 동결, 동결건조하는: 문맥에 의해 다르게 명시되지 않는 한, "동결-건조"는 동결건조 공정의 일부분을 나타내도록 사용되는 것으로 조제에서 물을 빼내기 위해 제약 조제의 온도가 일차 및 이차 건조 단계에서 승온되는 것으로 나타난다. 동결건조 공정의 "동결" 단계는 일차 및 이차 건조 단계 전 일어나는 이들 단계이다. 다르게 명시되지 않는 한, "동결건조하는"은 동결 단계 및 동결-건조 단계 모두를 포함하는 동결건조의 전체 공정을 지칭하는 것이다.
본 개시의 특정 측면 내에서, rFVIII 및 BDD-rFVIII를 포함하는 제제, 페길화된 FVIII 및 BDD-rFVIII를 포함하는 제제를 포함하는 것은 기술분야에 알려진 방법론에 따라 동결건조될 수 있다. 예를 들어, U.S. 특허 제5,399,670호 및 제5,763,401호는, 본원에 기재된 제제를 동결건조하도록 사용될 수 있는, 증진된 용해도의 동결건조된 FVIII 제제를 생성하는 방법론을 기재한다. 동결건조 공정은 동결 단계, 일차 건조 단계 및 이차 건조 단계를 갖는다. 동결 단계에서, 어닐링 단계가 있다. 동결 단계는 -40 ℃보다 높지 않은 온도에서 수행되고, 어닐링 단계는 -15 ℃보다 높지 않은 온도에서 발생하고, 일차 건조는 0 ℃보다 높지 않은 온도에서 수행되고, 이차 건조는 30 ℃보다 높지 않은 온도에서 행해진다. 일단 설정 온도가 동결 온도에 도달되면, 어닐링 온도, 최종 동결 온도, 일차 건조 온도 및 이차 건조 온도 같은 온도는, 특정 단백질 샘플이 관여됨을 고려하여 통상의 기술자에 의해 손쉽게 이해되듯이 상당 시간 기간 동안, 예컨대 1 시간, 2 시간, 3 시간 또는 3 시간 초과 동안 유지될 것이다.
어닐링: 용어 "어닐링"은 제제의 동결-건조 전, 동결건조를 거치는 제약학적 제제의 동결건조 공정 내 단계를 나타내도록 사용될 수 있고, 제제의 온도는 낮은 온도부터 높은 온도까지 승온되고 그 다음 일정 기간 후 다시 냉각된다.
증량제: 이 출원의 목적을 위해, 증량제는, 이것이 동결건조된 후 및 이를 붕괴로부터 보호하는 구조에 제약학적 제제의 "케이크(cake)" 또는 잔여 고체 질량을 제공하는 이들 화학적 물질이다. 결정가능 증량제는 동결건조 동안 결정화될 수 있는 본원에 기재된 바와 같은 증량제를 의미할 수 있다.
계면활성제: 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "계면활성제"는 폴리소르베이트 20 및 폴리소르베이트 80을 포함하는 폴리소르베이트, 폴록사머 184 또는 188을 포함하는 폴록사머, 플루로닉 폴리올(BASF 와이언도트 코포레이션(Wyandotte Corporation)에 의해 제조된 상표명 PLURONIC 하에 시판됨), 및 다른 에틸렌/폴리프로필렌 블록 중합체와 같은 "비-이온 계면활성제"를 포함한다. 비-이온 계면활성제는 계면 상호작용을 감소시킴에 의해 공정 및 저장 동안 rFVIII를 안정화하고 단백질이 흡착되지 않게 한다. 비-이온 계면활성제의 사용은 rFVIII의 변성을 초래함 없이 제제가 전단 및 표면 응력에 노출되도록 한다. 본원에 개시된 제제는, 폴리소르베이트, 예컨대 폴리소르베이트 20(상표명 TWEEN 20 하에 시판됨) 또는 폴리소르베이트 80(상표명 TWEEN 80 하에 시판됨)을 갖는 제제가 본원에서 예시되는, 하나 이상의 비-이온 계면활성제(들)를 갖는 제제를 포함한다.
삽투압: 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "삼투압"은 용매의 kg 당 용질의 오스몰 수로 정의되는 용질 농도의 측정을 지칭한다. 바람직한 수준의 삼투압은 만니톨, 덱스트로스, 글루코스, 트레할로스, 및/또는 수크로스를 포함하는 당 또는 당 알콜과 같은 하나 이상의 안정제의 첨가에 의해 달성될 수 있다. 삼투압을 제공하기 적절한 추가적인 안정제는 문헌[Pharmaceutical Excipients(Fourth Edition, Royal Pharmaceutical Society of Great Britain, Science & Practice Publishers)] 또는 [Remingtons: The Science and Practice of Pharmacy (Nineteenth Edition, Mack Publishing Company)]과 같은 참조문헌에 기재된다. 본원에 기재된 제제는 약 240 mOsm/kg 내지 약 450 mOsm/kg, 또는 약 750 mOsm/kg, 또는 약 1000 mOsm/kg, 또는 약 270 mOsm/kg 내지 약 425 mOsm/kg, 또는 약 300 mOsm/kg 내지 약 410 mOsm/kg의 범위의 삼투압을 갖는다.
언제든 적절할 때, 단수로 사용된 용어는 또한 복수를 포함할 수 있고, 그 반대도 가능하다. 본원의 "하나"의 사용은 다르게 명시되거나 "하나 이상"이 명확히 부적절하지 않는 한, "하나 이상"을 의미한다. "또는"의 사용은 다르게 명시되지 않는 한 "및/또는"을 의미한다. "포함한다," "포함하고," "포함하는," "비롯하여," "비롯하고," 및 "비롯하는"은 교체가능하고 제한을 의도하지 않는다. 용어 "예컨대"는 또한 제한을 의도하지 않는다. 예를 들어, 용어 "비롯하는"은 "포함하지만, 이로 제한되지는 않는"을 의미할 것이다. 더욱이, 하나 이상의 실시양태의 기재가 용어 "포함하는"을 사용할 때, 통상의 기술자는, 일부 특정 경우에, 그 실시양태 또는 실시양태들이 언어 "..로 본질적으로 이루어진" 및/또는 "..로 이루어진"를 사용하여 대체적으로 기재될 수 있음을 이해할 것이다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "약"은 제공된 단위 수치의 +/- 10 %를 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "실질적으로"는 관심의 특성 또는 성질의 총 또는 근사 도를 나타내는 질적 상태를 지칭한다. 생물학 분야의 통상의 기술자는 생물학 및 화학 현상은 생물학적 및 화학적 조성물 및 물질의 시험, 생산 및 저장에 영향을 미치는 많은 변수로 인해, 및 생물학적 및 화학적 조성물 및 물질의 시험, 생산 및 저장에 사용되는 기구 및 장치의 고유 오차로 인해, 절대적 결과에 좀처럼 도달하거나 피하지 못함을 이해할 것이다. 따라서 용어 실질적으로는 많은 생물학적 및 화학적 현상에 고유한 완전성의 잠재적 부족을 담아내도록 본원에 사용된다.
본원에 기재된 본 발명의 제제는 중량, 예컨대 중량 퍼센트 또는 몰농도로 성분 농도의 면에서 기재될 수 있다. 본 발명은 또한, 투여 또는 저장을 위해 적절한 희석제, 예컨대 식염수 또는 물에서 재구성될 때, 보고된 농도를 갖는 이들 제제의 동결건조된 제제를 포함한다는 것이 이해되어야 한다. 본원의 범위는 범위의 종점을 포함한다.
다르게 명시되지 않는 한, 퍼센트 용어는 중량/부피 퍼센트를 나타내고 온도는 섭씨 눈금이다.
<조성물 성분>
본 발명의 FVIII 조성물은 안정제, 완충제, 염화 나트륨, 칼슘 염 및 유리하게 다른 부형제를 포함할 수 있다. 이들 부형제는 동결건조된 조제에서 및/또는 액체 조제에서 FVIII의 안정성을 극대화하도록 선택되었다.
본 조성물 내 사용된 증량제는 바람직하게는 만니톨, 글리신 및 알라닌으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 만니톨, 글리신 및 알라닌은 1-5 %, 2-3 %, 및 2.2-2.6 %의 양으로 존재할 수 있다. 글리신은 선택된 증량제일 수 있다. 증량제를 함유하지 않는 조성물이 가능하다.
본 조성물에 사용된 안정제는, 수크로스, 만니톨, 덱스트로스, 글루코스 및 트레할로스를 포함하지만 이로 제한되지는 않는 당 또는 당 알콜로 이루어진 군으로부터 선택된다. 이들 작용제는 0.5-10 %, 1-8 %, 2-7 %, 3-6 %, 4-5 %, 1-5 %, 1-4 %, 1-3 % 또는 1-2 %의 양으로 조성물에 존재한다. 증량제를 함유하는 조성물에서, 수크로스는 1-3 %의 양으로 바람직한 안정제이다. 증량제가 부족한 조성물에서, 수크로스 또는 트레할로스는 약 8 %의 양으로 안정제로서 선택될 수 있다. 이들 당 또는 당 알콜은 또한 동결-방지제로서 기능한다.
더욱이, 완충액은 본 발명의 특정 조성물에 존재한다. 완충액은, 예컨대 FVIII가 동결건조 동안 pH 이동에 의해 불리하게 영향을 받을 것으로 보이기 때문에, 동결건조를 거치는 FVIII 제제에서 유용할 수 있다. 완충액은 히스티딘 및 MOPS(3-(N-모폴리노)프로판술폰산)를 포함하는 완충액으로서 역할을 할 수 있는 능력을 가진 임의의 생리적으로 허용가능한 화학 물질 또는 화학 물질의 조합일 수 있다. 히스티딘은 약 20 mM의 양으로 선택된 완충액일 수 있다.
FVIII의 활성을 보존하기 위해, 본 발명의 조성물은 또한 FVIII와 상호작용하고, 짐작건대 FVIII의 중사슬 및 경사슬의 회합을 유지시킴으로써 그의 활성을 유지시킬 수 있는 칼슘 또는 또 다른 2가 양이온을 포함할 수 있다. 1 mM 내지 5 mM의 칼슘 염이 사용될 수 있다. 칼슘 염은 염화 칼슘일 수 있지만, 또한 칼슘 글루코네이트, 칼슘 글루비오네이트 또는 칼슘 글루셉테이트와 같은 다른 칼슘 염일 수 있다. 본 발명의 FVIII 조성물은 또한 계면활성제, 특히 폴리소르베이트 20 및 폴리소르베이트 80으로 이루어진 군으로부터 선택된 비이온 계면활성제, 폴록사머 184 또는 188을 포함하는 폴리옥사머, 플루로닉 폴리올(BASF 와이언도트 코포레이션에 의해 제조된, 상표명 PLURONIC 하에 시판됨) 및 다른 에틸렌/폴리프로필렌 블록 중합체를 포함할 수 있다. 계면활성제는 약 80 ppm의 양의 폴리소르베이트 80일 수 있다.
본 조성물에서 사용된 FVIII는 생체적합성 중합체, 예컨대 PEG에 공유적으로 부착될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "폴리에틸렌 글리콜" 또는 "PEG"는 상호교환가능하고, 임의의 수-가용성 폴리(산화 에틸렌)을 포함한다. PEG는 (n)이 2 내지 4000인 하기 구조 "--(OCH2CH2)n--"를 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, PEG는 또한 말단 산소가 치환되었는지에 따라 "--CH2CH2--0(CH2CH20)n--CH2CH2--" 및 "--(OCH2CH2)nO--"을 포함한다. 용어 "PEG"는 다양한 말단 또는 "말단 캡핑(end capping)" 기, 예컨대 히드록실 또는 메톡시와 같은 C1-20 알콕시 기를 가진 구조를 포함한다. 용어 "PEG"는 또한 대부분의, 즉, 50 % 초과의 --OCH2CH2-- 반복 하위단위를 포함하는 중합체를 뜻한다. 구체적인 형태에 대하여, PEG는 임의의 수의 다양한 분자량 뿐만 아니라 구조 또는 기하학 예컨대, 분지형, 선형, 갈라진 형태(forked) 및 다기능적 형태를 가질 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "페길화"는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)이 단백질과 같은 분자에 공유적으로 부착하는 과정을 지칭한다. 생체적합성 중합체와 같은 작용기가 활성화된 것으로 기재될 때, 작용기는 또 다른 분자 상의 친전자체 또는 친핵체와 쉽게 반응한다.
본원에 개시된 콘쥬게이트 내 사용된 생체적합성 중합체는 본원에 논의된 또는 기술분야에 공지된 임의의 중합체일 수 있다. 생체적합성 중합체는 약동학에서 바람직한 개선을 제공하도록 선택된다. 예를 들어, 중합체의 유사성, 크기 및 구조가 선택되어 FVIII의 순환 반감기를 개선시키거나 또는 활성의 허용가능하지 않은 감소 없이 FVIII의 항원성을 감소시키도록 한다. 중합체는 PEG를 포함할 수 있다. 예를 들어, 중합체는 히드록실, 알콕시, 치환된 알콕시, 알켄옥시, 치환된 알켄옥시, 알킨옥시, 치환된 알킨옥시, 아릴옥시 및 치환된 아릴옥시와 같은 말단-캡핑 부분으로 말단 캡핑된 폴리에틸렌 글리콜일 수 있다. 일부 실시양태에서, 중합체는 3 kD 내지 200 kD의 크기 범위를 가지는 메톡시폴리에틸렌 글리콜과 같은 메톡시폴리에틸렌 글리콜을 포함할 수 있다.
중합체는 반응성 부분을 포함할 수 있다. 예를 들어, 중합체는 기능적 FVIII 폴리펩티드 상의 자유 시스테인과 반응할 수 있는 술프하이드릴 반응성 부분을 가져 공유 연결을 형성할 수 있다. 이러한 술프하이드릴 반응성 부분은 티올, 트리플레이트, 트레실레이트, 아지리딘, 옥시란, S-피리딜 또는 말레이미드 부분을 포함한다. 중합체는 선형일 수 있고, 다른 말단의 술프히드릴(예컨대 메톡시) 및 술프히드릴 반응성 부분에 강한 반응성이 있지는 않은 한 말단에 "캡"을 포함할 수 있다. 콘쥬게이트는 5 kD 내지 64 kD의 범위의 크기를 갖는 PEG-말레이미드를 포함할 수 있다. 대안적으로, 중합체는 아민 반응성 부분, 예컨대 숙신이미딜 프로피오네이트, 숙신이미딜 부타노에이트, 벤조트리아졸 카보네이트, 히드로숙신이미드, 프로피온알데히드, 부트리알데히드, 아세탈, 피페리돈, 메틸케톤 등과 같은 알데히드를 가질 수 있다(U.S. 특허 제7,199,223호(보사르(Bossard)) 참조).
FVIII 분자는 중합체의 FVIII의 탄수화물 부분에의 콘쥬게이션을 통한 생체적합성 중합체에 콘쥬게이션될 수 있다. US 특허 출원 공보 제20110112028호(투레켁 외)를 참조할 수 있다. FVIII 분자는 수 가용성 중합체의 FVIII의 산화된 탄수화물 부분에의 수-가용성 중합체의 콘쥬게이션에 의해 수-가용성 중합체로 콘쥬게이션될 수 있다. 일부 실시양태에서 수 가용성 중합체는 PEG, 폴리시알산("PSA") 및 덱스트란으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 또 다른 측면에서, 활성화된 수 가용성 중합체는 PEG-히드라지드, PSA-히드라진 및 알데히드-활성화된 덱스트란으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 본 발명의 또 다른 측면에서, 탄수화물 부분은 NaI04를 포함하는 완충액에서 인큐베이팅에 의해 산화된다.
본 발명 내 사용된 적합한 FVIII 단백질은 특이적 공지된 아미노산 서열과 상동성을 갖는다. 예를 들어, 본 발명에 사용하기에 적합한 FVIII 변종은 공지된 FVIII 아미노산 서열, 예컨대 전체-길이 FVIII의 아미노산 서열(서열 1) 또는 BDD-FVIII의 그것(서열 3)에 적어도 약 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99 퍼센트 상동성을 갖는 변종이다. 또한 본 발명에 유용한 것은 공지된 FVIII 서열, 예컨대 전체-길이 FVIII의 아미노산 서열(서열 1) 또는 BDD-SQ(서열 3)와 같은, 천연, 공지된 또는 대조군 서열과 비교할 때, 아미노산 서열 내 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1- 10, 1-5, 2-6 또는 3-8 차이를 갖는 아미노산 서열을 포함하는 FVIII 분자와 같은 공지된 FVIII 서열로부터의 정의된 서열 차이를 갖는 유전적 변종이다. 대립유전자 변종은 또한 본 발명에서 유용하다. FVIII의 대립유전자 변종의 예시는 U.S. 특허 출원 공보 제2010/0256062호(하워드(Howard) 외)에서 개시된 것들이다; 문헌[하워드 외, "African-Americans Express Multiple Haplotypic Forms of the Wildtype Factor VIII (FVUl) Protein: A Possible Role for Pharmacogenetics in FVIII Inhibitor Development?" Blood, Vol. 104, 2004, Abstract 384]; 및 문헌[비엘(Viel), K.R. 외, "Inhibitors of Factor VIII in Black Patients with Hemophilia, " The New England Journal of Medicine, Vol. 360, 2009, pp. 1618-27]. 대립유전자 변종은 위치 484의 아르기닌에 대한 히스티딘(R484H), 위치 776의 아르기닌에 대한 글리신(R776G), 위치 1241의 아스파르트산에 대한 글루탐산(D1241E) 및 위치 2238의 메티오닌에 대한 발린(M2238V)과 같은 아미노산 치환이 있는 것들을 포함한다. 아미노산 치환을 명시하는데 사용된 넘버링 시스템은 본원의 서열 2를 기준으로 한다.
비교를 위한 뉴클레오티드 및 아미노산 서열의 정렬 방법은 기술분야에 주지되어 있다. 본 발명의 정렬은 비교를 위한 서열의 최적 정렬을 행할 수 있는 문헌[스미스(Smith) 및 워터맨(Waterman), Adv. Appl. Math 2:482 (1981)]의 국부 상동성 알고리즘(BESTFIT)을 사용함에 의해; 문헌[니들맨(Needleman) 및 분슈(Wunsch), J. Mol. Biol. 48:443-53 (1970)]의 상동성 정렬 알고리즘(GAP)을 사용함에 의해; 또는 문헌[피어슨(Pearson) 및 리프맨(Lipman), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988)]의 유사도 방법(Tfasta 및 Fasta)에 대한 검색을 사용함에 의한 것을 포함하는 적합한 방법을 사용하여 측정될 수 있다. 정렬은, 캘리포니아 마운틴뷰 소재 인텔리제네틱스(Intelligenetics)에 의한 PC/유전자 프로그램의 CLUSTAL, 위스콘신 제네틱스 소프트웨어 패키지(Wisconsin Genetics Software Package), 버전 8(제네틱스 컴퓨터 그룹((GCG® 프로그램(캘리포니아주 샌디에고 소재 엑설리스, 인크.(Accelrys, Inc.)))으로부터 입수가능함)의 GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA 및 TFASTA를 포함하지만 이들로 제한되지는 않는 이들 알고리즘의 컴퓨터 구현성을 사용함에 의해 수행될 수 있다. CLUSTAL 프로그램은 문헌[Higgins and Sharp, Gene 73:237-44 (1988)]; 문헌[Higgins and Sharp, CABIOS 5: 151-3 (1989)]; 문헌[코르펫(Corpet) 외, Nucleic Acids Res. 16: 10881-90 (1988)]; 문헌[후앙(Huang) 외, Computer Applications in the Biosciences 8: 155-65 (1992)]; 및 문헌[피어슨 외, Meth, Mol. Biol. 24:307-31 (1994)]에 의해 잘 설명된다. 다중 서열의 최적 전반 정렬용의 한 프로그램은 문헌[히긴스(Higgins) 및 샤프(Sharp), CABIOS 5: 151-53 (1989)]에 의해 기재된 방법과 유사한 파일업(PileUp)(문헌[펭(Feng) 및 둘리틀(Doolittle), J. Mol. Evol., 25:351-60 (1987)])이다. BLAST 계열 프로그램은 다른 적합한 FVIII 분자를 식별하기 위한 것과 같은 데이터베이스 유사성 조사를 위해 사용될 수 있다. 문헌[CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Chapter 19, 오수벨(Ausubel) 외, eds., Greene Publishing and Wiley- Interscience, New York (1995)]을 참조할 수 있다.
FVIII의 B-도메인은, 상기 논의된 바와 같이, 활성에 불필요한 것으로 여겨진다. 특정 실시양태에서, 본 발명에 사용된 FVIII는 모든 또는 일부의 B-도메인 결실을 가질 수 있다. 따라서, 본 발명은 FVIII 변종 또는, 전체-길이 FVIII(서열 1)의 아미노산 1-740에 적어도 약 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99 퍼센트 상동성 및 전체-길이 FVIII(서열 1)의 아미노산 1689-2351에 적어도 약 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99 상동성을 갖는 아미노산 서열을 코딩하거나 또는 아미노산 서열을 포함하는 이러한 변종을 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 적용된다. 대안적으로, 본 발명은 FVIII 변종 또는, 아미노산 서열 1의 전체-길이에 적어도 약 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99 퍼센트 상동성을 갖는 아미노산 서열을 코딩하거나 또는 아미노산 서열을 포함하는 이러한 변종을 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 적용된다.
본 발명의 특정 실시양태에서, FVIII는 PEG와 같은 생체적합성 중합체에 공유적으로 부착하도록 FVIII 상에 결합 위치를 만드는 부위-지향적 돌연변이의 결과일 수 있다. FVIII 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 부위-지향적 돌연변이는 기술분야에 주지된 임의의 방법에 의해 일어날 수 있다.
방법은 중합체의 공유 부착을 위해 선택된 위치에서 시스테인 코돈을 도입하는 돌연변이유발(mutagenesis)을 포함한다. 이는 STRATAGENE CQUICKCHANGE II 부위-지향적 돌연변이유발 키트, CLONETECH TRANSFORMER 부위-지향적 돌연변이유발 키트 제K1600-1, INVITROGEN GENTAYLOR 부위-지향적 돌연변이유발 시스템 제12397014, PROMEGA ALTERED SITES II 시험관내 돌연변이유발 시스템 키트 제Q6210 또는 TAKARA MIRUS BIO LA PGR 돌연변이유발 키트 제TAK RR016과 같은 상업적으로 입수가능한 부위-지향적 돌연변이유발 키트를 사용하여 달성될 수 있다. 본원에 기재된 콘쥬게이트는 코돈을 시스테인을 위한 코돈이 있는 기능적 FVIII 폴리펩티드의 표면 상의 하나 이상의 아미노산으로 먼저 대체하고, 재조합 발현 시스템에 시스테인 돌연변이를 생성하고, 돌연변이를 시스테인-특이적 중합체 작용제와 반응시키고, 돌연변이단백질(mutein)을 정제함으로써 제조될 수 있다. 이 시스템에서, 시스테인 위치의 중합체의 첨가는 중합체 상의 말레이미드 활성 관능성을 통해 성취될 수 있다. U.S. 특허 제7,632,921호(팬 외)를 참조할 수 있다.
사용된 술프히드릴 반응성 중합체의 양은 유도체합성(derivatize)되기 위해서 적어도 시스테인의 몰량과 등몰이어야 하고 과량으로 존재할 수 있다. 5-배 또는 10-배 몰 과량의 술프히드릴 반응성 중합체가 사용될 수 있다. 공유 부착에 유용한 다른 조건은 기술분야의 기술 내이다.
중합체, 예컨대 PEG의 공유 결합을 위한 사전정의된 위치는, FVIII 활성에 관여하지 않거나 또는 FVIII를 체내에서 안정화시키는 다른 메커니즘, 예컨대 vWF에 결합하는 것에 관여하는 rFVIII 또는 BDD rFVIII 폴리펩티드의 표면 상에 노출된 위치로부터 선택될 수 있다. 이러한 부위는 또한 FVIII가 비활성화되거나 또는 순환으로부터 없어지는 메커니즘에 관여하는 것으로 알려진 이들 위치로부터 최선으로 선택된 것이다. 아미노산을 시스테인으로 치환하기 위한 위치는 (a) 저밀도 리포단백질 수용체 관련 단백질, (b) 헤파린 술페이트 프로테오글리칸, (c) 저밀도 리포단백질 수용체 및/또는 (d) FVIII 억제 항체에 대한 결합 위치 내 또는 주변의 아미노산 잔기를 포함한다. "결합 위치 내 또는 주변"은 결합 위치에 충분히 가까워 생체적합성 중합체의 위치에의 공유적 부착이 결합 위치의 입체 장애를 초래할 수 있는 잔기를 의미한다. 이러한 위치는 예를 들어 결합 위치의 20 A 내인 것으로 예상된다.
생체적합성 중합체는 하나 이상의 FVIII 아미노산 위치 81, 129, 377, 378, 468, 487, 491, 504, 556, 570, 711, 1648, 1795, 1796, 1803, 1804, 1808, 1810, 1864, 1903, 1911, 2091, 2118 및 2284에서 rFVIII 또는 BDD rFVIII 폴리펩티드 또는 그의 돌연변이 변종에 공유적으로 부착될 수 있다. 기능적 FVIII 폴리펩티드 상의 하나 이상의 위치, 예컨대 하나 또는 두개는 중합체 부착에 대해 사전정의된 위치일 수 있다. 특정 실시양태에서, 폴리펩티드는, 각각 1 PEG 또는 2 PEG 분자가 각 FVIII에 부착되는 것을 의미하는, 단일-페길화된 또는 2페길화된 것이다.
FVIII 돌연변이의 위치 지향 페길화는 또한 (a) 돌연변이가 FVIII 돌연변이의 노출된 표면 상의 아미노산 잔기의 시스테인 대체를 갖고 그 시스테인이 캡핑된 부위-지향적 FVIII 돌연변이를 발현하고; (b) 시스테인 돌연변이를 조건 하에 환원제와 접촉시켜 시스테인 돌연변이를 약하게 환원시키고 캡핑을 풀어주고; (c) 캡 및 환원제를 시스테인 돌연변이로부터 제거하고; (d) 환원제의 제거 후, 시스테인 돌연변이를 조건 하에 술프히드릴 커플링 부분을 포함하는 PEG로 처리하여 페길화된 FVIII 돌연변이단백질을 생성함으로써, 달성될 수 있다. PEG의 술프히드릴 커플링 부분은 티올, 트리플레이트, 트레실레이트, 아지리딘, 옥시란, S-피리딜 및 말레이미드 부분으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 말레이미드일 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 예컨대 PEG와 같은 생체적합성 중합체는 아민-특이적 작용기로 관능화된 중합체의 사용을 통해 공유적으로 부착된다. 중합체는, 예컨대, mPEG 트레실레이트 또는 mPEG 숙신이미딜 숙시네이트로 관능화되어 FVIII 상의 리신과 반응성이 있을 수 있다. 커플링은 FVIII의 용액에 고체 상태의 활성화된 mPEG를 첨가하고 상온에서 교반함으로써 FVIII 상의 무작위 리신에서 일어날 수 있다. 변형의 정도는 사용된 과하게 활성화된 mPEG의 수준에 의해 느슨하게 조절될 수 있다. 문헌[로스틴(Rostin) 외, "B-Domain Deleted Recombinant Coagulation Factor VIII Modified with Monomethoxy Polyethylene Glycol" 11 Bioconjug. Chem., 2000, pp. 387-396]. 페길화 조건 및 시약의 추가적인 예는 U.S. 특허 제7,199,223호(보사르) 및 U.S. 특허 제4,970,300호(풀톤(Fulton))에 제공된다. 본 발명은 또한 본 발명의 액체 제제 중 하나가 반응이 발생하는 용액인, 생체적합성 분자를 FVIII에 공유적으로 부착하는 방법에 관한 것이다.
본 개시는 또한 필요한 환자에게 본원에 기재된 치료 유효량의 하나 이상의 제제를 투여하는 것을 포함하는, 환자 내 혈우병 A의 치료를 위한 방법을 제공한다. 이들 제제는 정맥내 주사, 피하 주사 또는 지속 주입을 통해 환자에게 투여될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, rFVIII 제제 또는 페길화된 rFVIII 제제의 용어 "치료 유효량"은 필요로 하는 환자에게 투여 요법으로 치료 효과를 제공하는 제제의 양을 지칭한다. 예를 들어, 혈우병 A에 대한 대체 요법에 대해, 정맥내 주사를 위해 10-30 IU/kg 체중의 재조합 전체-길이 FVIII의 양이 권고된다. 혈우병 A에 대한 소아 예방을 위해, 정맥내 주사를 위해 25 IU/kg 체중의 재조합 전체-길이 FVIII가 권고된다. 수술 전, 정맥내 주사를 위한 15-30 IU/kg(소 수술) 또는 50 IU/kg(대 수술)의 재조합 전체-길이 FVIII가 혈우병 A의 소아를 위해 권고된다. 본 발명의 제제 내 사용된 다양한 FVIII 분자에 대한 상응하는 투여량이 통상의 기술자에 의해 결정될 수 있다. 바람직하게는 본 발명의 치료상의 FVIII 제제는 100, 250, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1200, 1400, 1600, 1800, 2000, 2200, 2400, 2600, 2800, 3000, 3200, 3400, 3600, 3800, 4000 또는 5000 IU의 단일 사용 투여량, 또는 이들 투여량 중 임의의 두 개 사이 범위로, 즉, 100 내지 250 IU, 100 내지 500 IU, 1000 내지 2000 IU 등(종점 포함)으로 제공된다. 이들의 낮은 점성으로 인해, 현재 개시된 rFVIII 및 PEG-rFVIII 제제는 예컨대 한외여과 및 무균 여과를 통해 편리하게 처리될 수 있고, 정맥내 주사, 피하 주사 및 지속 주입을 통해 환자에게 투여될 수 있다.
본 출원에 기재된 FVIII 조성물은 동결건조되고 나타난 농도로 재구성될 수 있다. 이들 FVIII 조성물은 또한 더 희석된 형태로 재구성될 수 있다. 예를 들어, 동결건조된 및/또는 통상 2 ml의 용액으로 재구성된 본 발명에 따른 제제는 또한 예컨대 5 ml와 같이 더 큰 부피의 희석제로 재구성될 수 있다. 이 경우 FVIII의 더 희석된 용액에서 더 빠르게 발생될 수 있어서, FVIII가 활성을 잃을 가능성이 더 적기 때문에, 이는 FVIII 제제가 즉시 환자에게 주입될 때 특히 적절하다.
실시양태 1
재조합 FVIII는 혈장-유래된 FVIII를 안정화하는 혈장 단백질, 예컨대 폰 빌레브란트 인자(von Willebrand Factor)(vWF)의 부재 하에 생성된다. 이러한 안정화 단백질의 부재는 rFVIII를 극히 불안정하게 만든다. 추가로, rFVIII는 치료학적 용액 내 매우 낮은 농도로 존재하고(1000 IU BDD-SQ의 치료학적 투여량에 대해 ml 당 0.02 mg 단백질), 이는 표면 흡착을 활성의 손실의 원인으로 만든다.
본 발명의 한 실시양태는 rFVIII, 특히 BDD-rFVIII, 및 심지어 특별히 Al 및 A2 또는 A3 도메인과 같은 도메인 사이의 가교-결합이 있는 BDD-rFVIII 돌연변이의 제제이다. 한 실시양태에서, 제제는, A2 및 A1 또는 A3 도메인, 바람직하게는 A2 및 A3 도메인을, 예컨대 그리핀 외의 U.S. 특허 제7,928,199호(2011년 4월 19일 등록됨)에 기재된 이황화 결합을 통해 가교-결합하는, 하나 이상의 시스테인이 하나 이상의 위치에 도입되고; 적어도 한 쌍의 시스테인이 야생형 FVIII에서 발견되지 않는 이황화 결합을 생성하는, BDD SQ의 돌연변이(서열 3)를 포함하는 FVIII의 돌연변이를 제한 없이 포함하는, 이중 시스테인 돌연변이를 가진 FVIII를 갖는다. 한 실시양태에서, 돌연변이 FVIII는 적어도 한 쌍의 재조합적으로 도입된 시스테인을 포함하고, 여기서 시스테인의 쌍은 Met 662 및 Asp 1828, Ser 268 및 Phe 673, He 312 및 Pro 672, Ser 313 및 Ala 644, Met 662 및 Lys 1827, Tyr 664 및 Thr 1826, Pro 264 및 Gin 645, Arg 282 및 Thr 522, Ser 285 및 Phe 673, His 311 및 Phe 673, Ser 314 및 Ala 644, Ser 314 및 Gin 645, Val 663 및 Glu 1829, Asn 694 및 Pro 1980, 및 Ser 695 및 Glu 1844로 이루어진 군으로부터 선택된 한 쌍의 잔기를 대체한다. 본 실시양태의 제제에 적합한 FVIII 분자는 용액 내 응집의 단점을 겪고/거나 높은 침전의 경향을 보인다. 이 불리점은 적합한 치료학적 투여량을 제조하는 데 어려움을 발생시킨다. 또한, FVIII 분자가 예컨대 PEG와 같은 생체적합성 분자의 공유 부착에 의해 더 처리된다면, FVIII 분자는 용액 내에서 바람직하게, FVIII가 현탁액 또는 용액에 있고 응집되지 않는 것을 필요로 하는, 페길화에 대한 좋은 수율과 같은, 좋은 처리를 제공하도록 한다. 한 실시양태에서, 본 출원의 FVIII 제제는 침전 및/또는 응집을 감소시키거나 없애고 안정성을 제공하는데 충분한 양의 염화 나트륨 또는 염화 칼륨을 함유한다.
실시양태 1의 제제는 하기와 같을 수 있다. rFVIII 제제는
(a) 약 0 mM 내지 약 20 mM, 약 1 mM 내지 약 20 mM, 약 1 mM 내지 약 50 mM, 약 10 mM 내지 약 50 mM, 약 10 mM 내지 약 20 mM, 약 10 mM 내지 약 30mM, 또는 약 20 mM 내지 약 50 mM 범위의 히스티딘;
(b) 약 0 mM 내지 약 29 mM, 약 1 mM 내지 약 29 mM, 약 1 mM 내지 약 300 mM, 약 10 mM 내지 약 30 mM, 약 10 mM 내지 약 100 mM, 약 10 mM 내지 약 200 mM, 약 10 mM 내지 약 50 mM, 약 29 mM 내지 약 58 mM, 약 34 mM 내지 약 58 mM, 약 58 mM 내지 약 100 mM, 또는 약 100 mM 내지 약 300 mM의 범위, 또는 약 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 또는 약 300 mM의 양의 당 또는 당 알콜;
(c) 약 1 mM 내지 약 2 mM, 약 1 mM 내지 약 2.5 mM, 약 1.5 mM 내지 약 3.5 mM, 또는 약 1 mM 내지 약 5 mM 범위의 2가 양이온, 예컨대 염화 칼슘을 포함하는 2가 칼슘 염;
(d) 약 150 mM 내지 약 250 mM, 약 150 mM 내지 약 220 mM, 약 150 mM 내지 약 200 mM, 약 150 mM 내지 약 190 mM, 약 170 niM 내지 약 250 mM; 약 200 mM 내지 약 220 mM, 약 170 mM 내지 약 200 mM, 약 200 mM 내지 약 250 mM, 약 1 70 mM 내지 약 220 mM, 약 190 mM 내지 약 220 mM, 약 210 mM 내지 약 220 mM, 약 150 mM 내지 약 180 mM, 약 1 50 mM 내지 약 160 mM, 또는 약 220 mM 내지 약 250 mM 범위의 염화 나트륨 또는 염화 칼륨;
(e) 약 20 ppm 내지 약 200 ppm, 약 20 ppm 내지 약 50 ppm, 약 20 ppm 내지 약 80 ppm, 약 50 ppm 내지 약 80 ppm, 약 80 ppm 내지 약 100 ppm, 약 80 ppm 내지 약 200 ppm, 약 50 ppm 내지 약 100 ppm, 또는 약 50 ppm 내지 약 200 ppm 범위의 비-이온 계면활성제, 또는 약 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 1 10, 1 15, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 160, 1 70, 1 80, 190, 200, or 210 ppm의 비-이온 계면활성제;
(f) 약 0 mM 내지 약 50 mM, 약 1 mM 내지 약 50 mM, 약 50 mM 내지 약 100 mM, 약 100 mM 내지 약 150 mM, 약 150 mM 내지 약 293 mM, 약 150 mM 내지 약 400 mM, 약 200 mM 내지 약 300 mM; 약 250 mM 내지 약 300 mM, 또는 약 200 mM 내지 약 400 mM 범위의 글리신, 또는 약 100, 200, 210, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 293, 295, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 또는 약 400 mM 글리신; 및
(g) 약 100 IU/ml 내지 약 5000 IlJ/ml, 약 100 TU/ml 내지 약 2000 IU/ml, 약 100 IU/ml 내지 약 3000 IU/ml, 약 100 IU/ml 내지 약 4000 IU/ml, 약 100 IU/ml 내지 약 1200 IU/ml, 약 250 IU/ml 내지 약 5000 IU/ml, 약 250 IU/ml 내지 약 1000 IU/ml, 약 250 IU/ml 내지 약 2000 IU/ml, 약 250 IU/ml 내지 약 3000 IU/ml, 약 500 IU/ml 내지 약 1000 IU/ml, 약 500 IU/ml 내지 약 3000 IU/ml, 약 1000 IU/ml 내지 약 2000 IU/ml, 약 1000 IU/ml 내지 약 3000 IU/ml, 약 1000 IU/ml 내지 약 4000 IU/ml, 또는 약 1000 IU/ml 내지 약 5000 IU/ml의 범위, 또는 약 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1200, 1400, 1600, 1800, 2000, 2200, 2400, 2600, 2800, 3000, 3200, 3500, 3800, 4000, 4200, 4500, 4800, 5000, 5500 또는 6000 IU/ml의, rFVIII, BDD-rFVIII, BDD-rFVIII 돌연변이, 및 FVIII 도메인 사이에 가교-결합이 있는 BDD-rFVIII 돌연변이로부터 선택된 rFVIII
를 포함하고,
여기서, rFVIII 제제는 약 pH 6.0 내지 약 pH 6.5, 약 pH 6.0 내지 약 pH 7.0, 약 pH 6.0 내지 약 pH 7.5, 약 pH 6.5 내지 약 pH 7.5, 또는 약 pH 7.0 내지 약 pH 7.5 범위의 pH, 또는 약 pH 6.0, 6.5, 7.0, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4 또는 약 pH 7.5의 pH를 갖는다.
실시양태 1의 또 다른 버전에서, 본 발명은
(a) 약 0 mM 내지 약 20 mM, 약 10 mM 내지 약 50 mM, 또는 약 10 mM 내지 약 30mM 범위의 히스티딘;
(b) 약 1 mM 내지 약 29 mM, 약 10 mM 내지 약 30 mM, 약 10 mM 내지 약 100 mM, 약 10 mM 내지 약 200 mM, 약 10 mM 내지 약 50 mM, 약 29 mM 내지 약 58 mM, 또는 약 34 mM 내지 약 58 mM의 범위, 또는 약 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 또는 40 mM의 양의 당 또는 당 알콜;
(c) 약 1 mM 내지 약 2 mM, 약 1 mM 내지 약 2.5 mM, 약 1.5 mM 내지 약 3.5 mM, 또는 약 1 mM 내지 약 5 mM 범위의, 염화 칼슘을 포함하는 2가 칼슘 염과 같은 2가 양이온;
(d) 약 150 mM 내지 약 200 mM, 약 150 mM 내지 약 220 mM, 약 170 mM 내지 약 250 mM 범위의 염화 나트륨 또는 염화 칼륨;
(e) 약 20 ppm 내지 약 80 ppm, 약 80 ppm 내지 약 100 ppm, 약 50 ppm 내지 약 100 ppm, 또는 약 50 ppm 내지 약 200 ppm 범위의 비-이온 계면활성제, 또는 약 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 또는 120 ppm의 비-이온 계면활성제;
(f) 약 1 mM 내지 약 50 mM, 약 150 mM 내지 약 300 mM, 약 150 mM 내지 약 400 mM, 약 200 mM 내지 약 300 mM; 또는 약 250 mM 내지 약 300 mM의 범위, 또는 약 250, 260, 270, 280, 290, 293, 295, 300, 310, 또는 약 320 mM 글리신; 및
(g) 약 100 IU/ml 내지 약 5000 IU/ml, 약 100 IU/ml 내지 약 2000 IU/ml, 약 100 IU/ml 내지 약 3000 IU/ml, 약 100 IU/ml 내지 약 4000 IU/ml, 약 100 IU/ml 내지 약 1200 IU/ml, 약 250 IU/ml 내지 약 5000 IU/ml, 약 250 IU/ml 내지 약 1000 IU/ml, 약 250 IU/ml 내지 약 2000 IU/ml, 약 250 IU/ml 내지 약 3000 IU/ml, 약 500 IU/ml 내지 약 1000 IU/ml, 약 500 IU/ml 내지 약 3000 IU/ml, 약 1000 IU/ml 내지 약 2000 IU/ml, 약 1000 IU/ml 내지 약 3000 IU/ml, 약 1000 IU/ml 내지 약 4000 IU/ml, 또는 약 1000 IU/ml 내지 약 5000 IU/ml의 범위, 또는 약 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1200, 1400, 1600, 1800, 2000, 2200, 2400, 2600, 2800, 3000, 3200, 3500, 3800, 4000, 4200, 4500, 4600, 4800, 5000, 5500 또는 6000 IU/ml의, rFVIII, BDD-rFVIII, BDD-rFVIII 돌연변이, 및 FVIII 도메인 사이에 가교-결합이 있는 BDD-rFVIII 돌연변이로부터 선택된 rFVIII
를 포함하고,
여기서, rFVIII 제제가 약 pH 6.0 내지 약 pH 7.5, 약 pH 6.5 내지 약 pH 7.5, 또는 약 pH 7.0 내지 약 pH 7.5 범위의 pH, 또는 약 pH 6.0, 6.5, 7.0, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4 또는 약 pH 7.5의 pH를 갖는 rFVIII 제제에 관한 것이다.
특정 실시양태에서, 당 또는 당 알콜은 수크로스이고, 염화 나트륨이 존재한다.
실시양태 1의 또 다른 버전에서, 본 발명은
(a) 10 mM 내지 약 30 mM 범위의 히스티딘;
(b) 약 10 mM 내자 약 30 mM, 약 10 mM 내지 약 100 mM, 약 10 mM 내지 약 200 mM, 약 10 mM 내지 약 50 mM, 약 29 mM 내지 약 58 mM, 또는 약 34 mM 내지 약 58 mM 범위의 당 또는 당 알콜;
(c) 약 1 mM 내지 약 2 mM, 약 1 mM 내지 약 2.5 mM, 약 1.5 mM 내지 약 3.5 mM, 또는 약 1 mM 내지 약 5 mM 범위의 염화 칼슘을 포함하는 2가 칼슘 염;
(d) 약 150 mM 내지 약 220 mM, 약 170 mM 내지 약 250 mM 범위의 염화 나트륨 또는 염화 칼륨;
(e) 약 50 ppm 내지 약 200 ppm 범위의 비-이온 계면활성제;
(f) 약 1 mM 내지 약 50 mM, 약 150 mM 내지 약 300 mM, 약 150 mM 내지 약 400 mM, 약 200 mM 내지 약 300 mM; 또는 약 250 mM 내지 약 300 mM 범위의 글리신; 및
(g) 약 100 IU/ml 내지 약 5000 IU/ml, 약 100 IU/ml 내지 약 2000 IU/ml, 약 100 IU/ml 내지 약 3000 IU/ml, 약 100 IU/ml 내지 약 4000 IU/ml, 약 100 IU/ml 내지 약 1 200 IU/ml, 약 250 TU/ml 내지 약 5000 IU/ml, 약 250 IU/ml 내지 약 1000 IU/ml, 약 250 IU/ml 내지 약 2000 IU/ml, 약 250 IU/ml 내지 약 3000 IU/ml, 약 500 IU/ml 내지 약 1000 IU/ml, 약 500 IU/ml 내지 약 3000 IU/ml, 약 1000 IU/ml 내지 약 2000 IU/ml, 약 1000 IU/ml 내지 약 3000 IU/ml, 약 1000 IU/ml 내지 약 4000 IU/ml, 또는 약 1000 IU/ml 내지 약 5000 TU/ml의 범위, 또는 약 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1200, 1400, 1600, 1800, 2000, 2200, 2400, 2600, 2800, 3000, 3200, 3500, 3800, 4000, 4200, 4500, 4600, 4800, 5000, 5500 또는 6000 IU/ml의, rFVIII, BDD-rFVIII, BDD-rFVIII 돌연변이, 및 FVIII 도메인 사이에 가교-결합이 있는 BDD-rFVIII 돌연변이로부터 선택된 rFVIII, 여기서 rFVIII 제제는 pH 6.0 내지 약 pH 7.5, 약 pH 6.5 내지 약 pH 7.5, 또는 약 pH 7.0 내지 약 pH 7.5 범위의 pH, 또는 약 pH 6.0, 6.5, 7.0, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4 또는 약 pH 7.5의 pH를 갖는다.
실시양태 1의 또 다른 버전에서, 본 발명은 다음을 포함하는 rFVIII 제제에 관한 것이다:
(a) 약 1 0 mM 내지 약 30 mM 범위의 히스티딘;
(b) 약 10 mM 내지 약 50 mM 범위의 수크로스;
(c) 약 1.5 mM 내지 약 3.5 mM 범위의 염화 칼슘;
(d) 약 150 mM 내지 약 220 mM 또는 약 170 mM 내지 약 220 mM 범위의 염화 나트륨;
(e) 약 70 ppm 내지 약 90 ppm 범위의 비-이온 계면활성제;
(f) 약 200 mM 내지 약 300 mM 또는 약 250 mM 내지 약 300 mM 범위의 글리신; 및
(g) 약 100 IU/ml 내지 약 2000 IU/ml, 약 100 lU/ml 내지 약 3000 IU/ml, 약 250 I U/ml 내지 약 1 000 I U/ml, 약 250 IU/ml 내지 약 2000 IU/ml, 약 250 IU/ml 내지 약 3000 IU/ml, 약 500 IU/ml 내지 약 1000 IU/ml, 약 500 IU/ml 내지 약 3000 IU/ml, 약 1000 IU/ml 내지 약 2000 IU/ml, 또는 약 1000 IU/ml 내지 약 3000 IU/ml 범위의 BDD-rFVIII, BDD-rFVIII 돌연변이, 및 FVIII 도메인 사이에 가교-결합이 있는 BDD-rFVIII 돌연변이로부터 선택된 rFVIII를 포함하고, 여기서 rFVIII 제제가 약 pH 6.0 내지 약 pH 7.5, 약 pH 6.5 내지 약 pH 7.5, 또는 약 pH 7.0 내지 약 pH 7.5 범위의 pH, 또는 약 pH 6.0, 6.5, 7.0, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4 또는 약 pH 7.5의 pH를 갖는 rFVIII에 관한 것이다.
실시양태 1의 rFVIII 제제는 HSA와 같은 알부민을 임의로 함유할 수 있다. 특정 실시양태에서, HSA는 약 10 내지 약 50 mg/mL, 약 15 내지 약 30 mg/mL, 약 20 내지 약 30 mg/mL 또는 약 25 내지 약 30 mg/mL 범위로 존재한다.
실시양태 2
생체적합성 중합체의 FVIII에의 공유 첨가 동안, 완충 성분이 공유 첨가를 방해할 수 있음이 발견되었다. 예를 들어, FVIII가, 리신 잔기에 첨가될 아민-반응성 기를 갖도록 관능화된 PEG를 사용하여 PEG에 공유적으로 결합할 때, 반응 완충액 내 아민-함유 성분이 반응을 방해하는 것으로 발견되었다. 따라서, 본 발명은 개선된 액체 FVIII 제제 또는 FVIII에의 중합체 첨가 반응이 일어날 수 있는 완충액을 포함한다. 실시양태 2의 한 버전에서, 액체 FVIII 제제는 FVIII 외에, 일차 또는 이차 아민기의 성분을 포함하지 않거나, 또는 10 중량% 미만, 또는 5 중량% 미만, 또는 1 중량% 미만, 또는 0.5 중량% 미만 또는 오직 흔적량으로 포함한다. 본 실시양태의 본 발명의 FVIII 제제는 히스티딘 및 글리신의 사용을 피하는 제제를 포함한다. 히스티딘 및 글리신은 페길화 처리를 방해할 수 있는 아민을 함유한다.
본 발명의 실시양태 2의 한 버전은, 염화 칼슘(중요한 rFVIII 안정제)과 불용성 착화물 또는 킬레이트를 형성하지 않고 일차 또는 이차 아민기의 성분을 함유하지 않거나, 또는 10 중량% 이하, 5 중량% 이하, 1 중량% 이하 또는 흔적량의 이러한 성분을 함유하는, pH 6-7의 완충 용량을 갖는 rFVIII의 제제이다. 이 제제는 10 mM 내지 100 mM 범위, 10 mM 내지 70 mM 범위, 10 mM 내지 50 mM 범위, 10 mM 내지 40 mM 범위, 10 mM 내지 30 mM 범위, 12 mM 내지 30 mM 범위, 14 mM 내지 30 mM 범위, 16 mM 내지 30 mM 범위, 18 mM 내지 30 mM 범위, 20 mM 내지 28 mM 범위, 12 mM 내지 28 mM 범위, 12 mM 내지 26 mM 범위, 12 mM 내지 24 mM 범위, 12 mM 내지 22 mM 범위, 14 mM 내지 22 mM 범위, 또는 18 mM 내지 22 mM 범위의 MOPS를 포함할 수 있거나, 또는 약 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30 mM MOPS를 함유할 수 있다. 이 제제는 약 100 IU/ml 내지 약 1000 IU/ml, 약 100 lU/ml 내지 약 500 IU/ml, 약 100 IU/ml 내지 약 2000 IU/ml, 약 100 IU/ml 내지 약 3000 IU/ml, 약 500 IU/ml 내지 약 3000 IU/ml, 약 500 IU/ml 내지 약 2000 IU/ml, 약 500 IU/ml 내지 약 2500 IU/ml, 약 500 IU/ml 내지 약 1200 IU/ml, 약 500 IU/ml 내지 약 1000 IU/ml, 약 500 IU/ml 내지 약 1500 IU/ml, 약 1000 IU/ml 내지 약 2000 IU/ml, 약 1 00 IU/ml 내지 약 3000 IU/ml, 약 1000 IU/ml 내지 약 2500 IU/ml, 약 1000 IU/ml 내지 약 1500 IU/ml, 약 1000 IU/ml 내지 약 6000 IU/ml, 또는 약 1000 IU/ml 내지 약 5000 IU/ml 범위의 rFVIII 또는 약 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1200, 1400, 1600, 1800, 2000, 2200, 2400, 2600, 2800, 3000, 3200, 3500, 3800, 4000, 4200, 4500, 4800, 5000, 5500 또는 6000 IU/ml의 rFVIII를 포함한다. 또한 본 발명은 6000 IU/ml보다 높은 활성을 갖는 rFVIII 제제와 함께 사용되는 것이 가능하다.
실시양태 2의 한 버전에서, rFVIII 제제는 재조합적으로 생성된 FVIII 또는 BDD를 포함한다. 실시양태 2의 또 다른 버전에서, 제제는 서열 1의 아미노산 서열 또는 그의 대립유전자 변종을 포함하는 FVIII와 같은 재조합적으로 생성된 전체-길이 FVIII를 포함한다. 실시양태 2의 또 다른 버전에서, 제제는 BDD의 돌연변이 또는 FL-FVIII의 돌연변이를 포함한다.
본 제제는 또한 0.5 중량% 내지 10 중량% 범위, 0.6 중량% 내지 10 중량% 범위, 0.7 중량% 내지 10 중량% 범위, 0.8 중량% 내지 10 중량% 범위, 0.9 중량% 내지 10 중량% 범위, 1.0 중량% 내지 10 중량% 범위, 0.6 중량% 내지 5 중량% 범위, 0.6 중량% 내지 2.5 중량% 범위, 0.6 중량% 내지 2.0 중량% 범위, 0.6 중량% 내지 1.5 중량% 범위, 0.6 중량% 내지 1.2 중량% 범위, 0.8 중량% 내지 1.2 중량% 범위, 0.9 중량% 내지 1.2 중량% 범위, 또는 0.9 중량% 내지 1.1 중량% 범위, 또는 약 0.8, 0.9, 1.0, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9 또는 2.0 중량%의 수크로스와 같은 당 또는 당 알콜을 포함할 수 있다. 이 제제는 또한 0.5 mM 내지 20 mM 범위, 1 mM 내지 10 mM 범위, 1 mM 내지 5 mM 범위, 1.5 mM 내지 5 mM 범위, 2 mM 내지 5 mM 범위, 2.5 mM 내지 5 mM 범위, 3 mM 내지 5 mM 범위, 3.5 mM 내지 5 mM 범위, 4 mM 내지 5 mM 범위, 1.5 mM 내지 4.5 mM 범위, 1.5 mM 내지 4 mM 범위, 1.5 mM 내지 3.5 mM 범위, 1.5 mM 내지 3 mM 범위, 1.5 mM 내지 2.5 mM 범위, 2 mM 내지 3 mM 범위, 2.2 mM 내지 2.8 mM 범위, 또는 2.4 mM 내지 2.6 mM 범위의, 염화 칼슘과 같은 칼슘 염과 같은 2가 양이온을 포함할 수 있다. 이 제제는 또한 10 mM 내지 100 mM 범위, 10 mM 내지 70 mM 범위, 10 mM 내지 50 mM 범위, 15 mM 내지 50 mM 범위, 20 mM 내지 50 mM 범위, 25 mM 내지 50 mM 범위, 30 mM 내지 50 mM 범위, 15 mM 내지 45 mM 범위, 15 mM 내지 40 mM 범위, 15 mM 내지 35 mM 범위, 20 mM 내지 45 mM 범위, 20 mM 내지 40 mM 범위, 25 mM 내지 40 mM 범위, 25 mM 내지 35 mM 범위, 25 mM 내지 30 mM 범위, 또는 30 mM 내지 35 mM 범위의 염화 나트륨 또는 염화 칼륨을 포함할 수 있다. 이 제제는 또한 50 내지 150 ppm 범위, 60 ppm 내지 150 ppm 범위, 70 ppm 내지 150 ppm 범위, 80 ppm 내지 150 ppm 범위, 60 ppm 내지 140 ppm 범위, 60 ppm 내지 130 ppm 범위, 60 ppm 내지 120 ppm 범위, 60 ppm 내지 110 ppm 범위, 60 ppm 내지 100 ppm 범위, 60 ppm 내지 90 ppm 범위, 70 ppm 내지 90 ppm 범위, 70 ppm 내지 80 ppm 범위, 및 80 ppm 내지 90 ppm 범위의 폴리소르베이트 20 또는 폴리소르베이트 80과 같은 비-이온 계면활성제를 포함할 수 있다. 이 조성물은 용액 내 rFVIII에 허용가능한 안정성을 제공하고, 아민 잔기에서 활성을 갖도록 관능화된 중합체를 사용하여 중합체의 FVIII에의 콘쥬게이션 동안 반응 완충액으로서 사용될 수 있다.
실시양태 2의 한 버전에서, 본 발명은
(a) 12 mM 내지 28 mM 범위, 12 mM 내지 22 mM 범위, 또는 18 m 내지 22 mM 범위의 MOPS;
(b) 100 IU/ml 내지 3000 IU/ml 범위, 또는 1000- 1500 IU/ml 범위의 FVIII;
(c) 0.5 % 내지 5 % 범위, 0.6 % 내지 2.5 % 범위, 또는 0.9 % 내지 1.1 % 범위의 수크로스;
(d) 10 mM 내지 50 mM 범위, 15 mM 내지 35 mM 범위, 또는 25 mM 내지 35 mM 범위의 염화 나트륨 또는 염화 칼륨;
(e) 1 mM 내지 5 mM 범위, 1.5 mM 내지 3.5 mM 범위, 또는 2.4 mM 내지 2.6 mM 범위의, 염화 칼슘과 같은 2가 칼슘 염; 및
(f) 60 ppm 내지 100 ppm 범위, 또는 70 ppm 내지 90 ppm 범위의 폴리소르베이트 20 또는 폴리소르베이트 80와 같은 비-이온 계면활성제를 포함하는 rFVIII 제제에 관한 것이고
여기서, rFVIII 제제는 10 % 미만, 5 % 미만, 1 % 미만, 0.5 % 미만, 또는 흔적량 수준 미만, 또는 실질적으로 없는, 일차 또는 이차 아민기를 갖는 성분을 함유한다.
본 발명은 또한 실시양태 2의 rFVIII 제제에 FVIII를 현탁시키거나 용해시키고, 아민 반응성 중합체를 첨가하고, 그 결과의 혼합물을 콘쥬게이션이 발생할 수 있는 시간 및 온도의 조건 하에서 인큐베이팅하는 것을 포함하는, FVIII에 아민-반응성 PEG와 같은 아민-반응성 생체적합성 중합체를 콘쥬게이션하는 방법에 관한 것이다. 이러한 조건은 바람직하게는 약 주변 온도이다. 중합체는 FVIII를 초과하는 과량의 몰량(1-100-배 초과)으로 첨가될 수 있다. 중합체 및 FVIII는 회전 또는 교반으로 몇 시간 동안 함께 인큐베이션에 의해 콘쥬게이션될 수 있다.
비록 실시양태 2의 상기 제제가 아민-반응성 작용기를 포함하는 중합체 첨가 동안 반응 완충액으로서 유용하다고 보여졌지만, 제제는 또한 이러한 반응 외의 다른 상황에서도 유용함이 지견되었고, 따라서 제제는 안정한 FVIII 제제가 필요할 때 사용될 수 있다.
실시양태 3
실시양태 3에서, rFVIII 제제는 NaCl, MOPS, 2가 칼슘 이온 또는 또 다른 2가 양이온, 및 임의로 비이온 계면활성제 및/또는 임의로 당 또는 당 알콜을 포함한다. 실시양태 3의 제제는 특히 PEG에 공유적으로 부착되지 않고 야생-형 FVIII에 존재하는 글리칸 외 다른 임의의 중합체에 공유적으로 부착되지 않은 FVIII과 같은 생체적합성 중합체에 콘쥬게이션되지 않은 FVIII 분자의 응집 없이 저장을 제공하는 것으로 나타난다. 실시양태 3의 제제는 특히 비-페길화된 BDD에 적합하다. 본원에 사용된 바와 같이, "비콘쥬게이션된 FVIII"는 FVIII가 생성된 숙주 세포로부터 나온 천연 포유류 글리코실화 패턴과 관련된 글리칸 외의 중합체에 콘쥬게이션되지 않은 FVIII를 지칭한다. 예를 들어, "비콘쥬게이션된 FVIII"는 시판된 제품 KOGENATE® 및 RECOMBINATE® FVIII과 같은 BHK 세포 또는 CHO 세포와 같은 포유류 숙주 세포 내 재조합적으로 생성된 야생형 인간 FVIII를 포함한다.
본원에 기재된 조성물의 실시양태 3의 한 버전은, FVIII에 대한 안정성을 제공하고, 150 mM 내지 300 mM, 150 mM 내지 275 mM, 150 mM 내지 250 mM, 150 mM 내지 225 mM, 150 mM 내지 200 mM, 150 mM 내지 175 mM, 175 mM 내지 300 mM, 175 mM 내지 275 mM, 175 mM 내지 250 mM, 175 mM 내지 225 mM, 175 mM 내지 200 mM, 175 mM 내지 190 mM; 200 mM 내지 300 mM, 200 mM 내지 275 mM, 200 mM 내지 250 mM, 200 mM 내지 225 mM, 200 mM 내지 210 mM, 250 mM 내지 300 mM의 범위; 또는 약 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290 또는 300 mM의 염화 나트륨을 함유하는 조성물이다. 이 조성물은 또한 10 mM 내지 100 mM 범위, 10 mM 내지 60 mM 범위, 10 mM 내지 50 mM 범위, 10 mM 내지 40 mM 범위, 10 mM 내지 30 mM 범위, 12 mM 내지 30 mM 범위, 14 mM 내지 30 mM 범위, 16 mM 내지 30 mM 범위, 18 mM 내지 30 mM 범위, 12 mM 내지 28 mM 범위, 12 mM 내지 26 mM 범위, 12 mM 내지 24 mM 범위, 16 mM 내지 24 mM 범위, 18 mM 내지 24 mM 범위, 20 mM 내지 24 mM 범위, 또는 18 mM 내지 22 mM 범위의 MOPS 완충액을 포함한다. 조성물은 또한 1 mM 내지 20 mM 범위, 5 mM 내지 10 mM 범위, 1 mM 내지 30 mM 범위, 6 mM 내지 30 mM 범위, 7 mM 내지 30 mM 범위, 8 mM 내지 30 mM 범위, 5 mM 내지 20 mM 범위, 5 mM 내지 25 mM 범위, 또는 9 mM 내지 12 mM 범위의, 염화 칼슘과 같은 2가 양이온을 포함한다. 실시양태 3의 제제 내 존재하는 rFVIII의 양은 실시양태 1에 제공된 양과 동일할 수 있다.
조성물은 또한 0.5 % 내지 10 % 범위, 0.6 % 내지 10 % 범위, 0.7 % 내지 10 % 범위, 0.8 % 내지 10 % 범위, 0.9 % 내지 10 % 범위, 1.0 % 내지 10 % 범위, 0.5 % 내지 5 % 범위, 0.6 % 내지 5 % 범위, 0.7 % 내지 5 % 범위, 0.8 % 내지 5 % 범위, 0.9 % 내지 5 % 범위, 1.0 % 내지 5 % 범위, 0.5 % 내지 2.5 % 범위, 0.6 % 내지 2.5 % 범위, 0.5 % 내지 2.0 % 범위, 0.5 % 내지 1.5 % 범위, 0.6 % 내지 1.2 % 범위, 0.8 % 내지 1.2 % 범위, 0.9 % 내지 1.2 % 범위, 또는 0.9 % 내지 1.1 % 범위의, 수크로스와 같은 당 또는 당 알콜을 포함할 수 있다. 조성물은 또한 20 ppm 내지 250 ppm 범위, 50 ppm 내지 250 ppm 범위, 50 ppm 내지 150 ppm 범위, 60 ppm 내지 150 ppm 범위, 70 ppm 내지 150 ppm 범위, 80 ppm 내지 150 ppm 범위, 60 ppm 내지 140 ppm 범위, 60 ppm 내지 130 ppm 범위, 60 ppm 내지 120 ppm 범위, 60 ppm 내지 110 ppm 범위, 60 ppm 내지 100 ppm 범위, 70 ppm 내지 1 10 ppm 범위, 70 ppm 내지 105 ppm 범위, 70 ppm 내지 100 ppm 범위, 80 ppm 내지 100 ppm 범위, 또는 90 ppm 내지 110 ppm 범위의, 폴리소르베이트 80과 같은 비-이온 계면활성제를 포함할 수 있다.
실시양태 3의 특정 버전에서, FVIII 제제는 히스티딘 및/또는 (4-(2-히드록시에틸)-l-피페라진에탄술폰산)("HEPES") 및/또는 알부민이 없거나, 또는 0.1 중량% 미만, 0.5 중량% 미만, 0.8 중량% 미만, 1.0 중량% 미만, 또는 5.0 중량% 미만의 히스티딘 및/또는 HEPES 및/또는 알부민을 함유한다. 실시양태 3의 한 버전은 히스티딘, HEPES 및 알부민이 필수적으로 없는 FVIII 제제이다.
실시양태 4
페길화된 FVIII와 같은 중합체-콘쥬게이션된 FVIII는, 상응하는 콘쥬게이션되지 않은 FVIII보다 더 친수성일 수 있다. 따라서, 페길화된 FVIII와 같은 콘쥬게이션된 FVIII에 대한 제제는 콘쥬게이션되지 않은 FVIII로 확인된 것과 다른 성분을 필요로 할 수 있다. 우리는 상승된 수준의 NaCl(200 mM)을 함유하는 완충액 내 페길화된 FVIII를 제조하였다. 이러한 상승된 수준의 염화 나트륨은 동결건조 동안 문제점을 가지는 것으로 관찰되었다. 우리는 주변 온도에서 6일에 걸쳐 저장될 때 바람직하지 않게 높은 수준의 NaCl을 막고, 응집체의 형성을 막고 FVIII의 잠재능을 실질적으로 보유하는, 중합체-콘쥬게이션된 FVIII에 대한 본 발명의 조성물을 발견하였다. 본 출원은 염화 나트륨 농도가 200 mM로부터 50 mM으로 감소될 수 있고 주변 온도에서 저장 후 여전히 rFVIII의 잠재능을 얻을 수 있는 예상치 못한 결과를 제공한다. 실시양태 4에서, rFVIII 제제는 히스티딘 또는 MOPS, NaCl, 2가 칼슘 이온 또는 또 다른 2가 양이온, 및 임의로 비이온 계면활성제 및/또는 임의로 당 또는 당 알콜과 같은 완충액을 포함한다. 특히 실시양태 4의 제제는 생체적합성 중합체, 특히 PEG와 같은 친수성 생체적합성 중합체에 콘쥬게이션된 FVIII 분자의 응집 없는 저장을 제공하는 것으로 나타난다. 본원에 사용된 바와 같이, "콘쥬게이션된 FVIII"는 FVIII가 생성되는 숙주 세포로부터 나온 천연 포유류 글리코실화 패턴에 관련된 글리칸 외의 중합체에 콘쥬게이션되는 FVIII를 지칭한다.
본원에 기재된 실시양태 4의 한 버전은 25 mM 내지 200 mM 범위, 25 mM 내지 175 mM 범위, 25 mM 내지 150 mM 범위, 25 mM 내지 125 mM 범위, 25 mM 내지 100 mM 범위, 25 mM 내지 75 mM 범위, 25 mM 내지 50 mM 범위, 40 mM 내지 55 mM 범위, 25 mM 내지 35 mM 범위, 25 mM 내지 30 mM 범위, 30 mM 내지 60 mM 범위, 50 mM 내지 200 mM 범위, 50 mM 내지 175 mM 범위, 50 mM 내지 150 mM 범위, 50 mM 내지 125 mM 범위, 50 mM 내지 100 mM 범위, 또는 50 mM 내지 75 mM 범위의 염화 나트륨을 함유하는 rFVIII 조성물이다. 제제가 동결건조되면, 상기 제공된 낮은 수준의 NaCl이 바람직하다. 실시양태 4의 제제 내 존재하는 rFVIII의 양은 실시양태 1 내 제공되는 양과 동일할 수 있다.
조성물은 또한 10 mM 내지 100 mM 범위, 10 mM 내지 60 mM 범위, 10 mM 내지 50 mM 범위, 10 mM 내지 40 mM 범위, 10 mM 내지 30 mM 범위, 12 mM 내지 30 mM 범위, 14 mM 내지 30 mM 범위, 16 mM 내지 30 mM 범위, 18 mM 내지 30 mM 범위, 12 mM 내지 28 mM 범위, 12 mM 내지 26 mM 범위, 12 mM 내지 24 mM 범위, 16 mM 내지 24 mM 범위, 18 mM 내지 24 mM 범위, 20 mM 내지 24 mM 범위, 또는 18 mM 내지 22 mM 범위의 히스티딘 또는 MOPS 완충액과 같은 완충제를 포함한다. 조성물은 또한 1 mM 내지 20 mM 범위, 5 mM 내지 10 mM 범위, 1 mM 내지 30 mM 범위, 6 mM 내지 30 mM 범위, 7 mM 내지 30 mM 범위, 8 mM 내지 30 mM 범위, 5 mM 내지 20 mM 범위, 5 mM 내지 25 mM 범위, 또는 9 mM 내지 12 mM 범위의, 염화 칼슘과 같은 2가 양이온을 포함한다.
조성물은 또한 0.5 % 내지 10 % 범위, 0.6 % 내지 10 % 범위, 0.7 % 내지 10 % 범위, 0.8 % 내지 10 % 범위, 0.9 % 내지 10 % 범위, 1.0 % 내지 10 % 범위, 0.5 % 내지 5 % 범위, 0.6 % 내지 5 % 범위, 0.7 % 내지 5 % 범위, 0.8 % 내지 5 % 범위, 0.9 % 내지 5 % 범위, 1.0 % 내지 5 % 범위, 0.5 % 내지 2.5 % 범위, 0.6 % 내지 2.5 % 범위, 0.5 % 내지 2.0 %, 0.5 % 내지 1.5 % 범위, 0.6 % 내지 1.2 % 범위, 0.8 % 내지 1.2 % 범위, 0.9 % 내지 1.2 % 범위, 또는 0.9 % 내지 1.1 % 범위의 수크로스 또는 트레할로스와 같은 당 또는 당 알콜을 포함할 수 있다. 조성물은 또한 20 ppm 내지 250 ppm 범위, 50 ppm 내지 250 ppm 범위, 50 ppm 내지 150 ppm 범위, 60 ppm 내지 150 ppm 범위, 70 ppm 내지 150 ppm 범위, 80 ppm 내지 150 ppm 범위, 60 ppm 내지 140 ppm 범위, 60 ppm 내지 130 ppm 범위, 60 ppm 내지 120 ppm 범위, 60 ppm 내지 110 ppm 범위, 60 ppm 내지 100 ppm, 70 ppm 내지 110 ppm 범위, 70 ppm 내지 105 ppm 범위, 70 ppm 내지 100 ppm 범위, 80 ppm 내지 100 ppm 범위, 또는 90 ppm 내지 110 ppm 범위의, 폴리소르베이트 80과 같은 비-이온 계면활성제를 포함할 수 있다.
실시양태 4의 특정 버전에서, FVIII 제제는 히스티딘 및/또는 HEPES 및/또는 알부민이 없거나, 또는 0.1 중량% 미만, 0.5 중량% 미만, 0.8 중량% 미만, 1.0 중량% 미만, 또는 5.0 중량% 미만의 히스티딘, 및/또는 HEPES, 및/또는 알부민을 함유한다. 실시양태 3의 한 버전은 히스티딘, HEPES 및 알부민이 필수적으로 없는 FVIII 제제이다.
실시양태 5
본 발명은 또한 동결건조에 적합한 rFVIII 제제를 포함한다. 본 실시양태의 특정 버전에서, FVIII 제제는 특히 콘쥬게이션된 FVIII, 페길화된 FVIII, 페길화된 BDD 또는 페길화된 BDD 돌연변이의 동결건조에 적합하다. 본 실시양태의 rFVIII 제제는: (1) 염화 나트륨 및/또는 수크로스 및/또는 트레할로스, (2) 글리신 및/또는 수크로스 및/또는 트레할로스; 및 (3) 염화 칼슘과 같은 2가 양이온을 포함하고, 및 임의로 (1) 비이온 계면활성제, 및/또는 (2) 히스티딘, 및 NaCl이 존재한다면, 임의로 또한, 수크로스 및/또는 트레할로스를 제한 없이 포함하는 당 또는 당 알콜을 함유한다.
본 발명은 하기와 같이 실시양태 5의 제제를 포함한다. rFVIII 제제는
(a) 약 0 mM, 또는 약 1 mM 내지 약 20 mM, 약 1 mM 내지 약 50 mM, 약 10 mM 내지 약 50 mM, 약 10 mM 내지 약 20 mM, 약 10 mM 내지 약 30 mM, 또는 약 20 mM 내지 약 50 mM 범위의 히스티딘;
(b) 0.5 % 내지 20 % 범위, 1.0 % 내지 20 % 범위, 0.6 % 내지 10 % 범위, 0.7 % 내지 10 % 범위, 0.8 % 내지 10 % 범위, 0.9 % 내지 10 % 범위, 1.0 % 내지 10 % 범위, 0.5 % 내지 5 % 범위, 0.6 % 내지 5 % 범위, 0.7 % 내지 5 % 범위, 0.8 % 내지 5 % 범위, 0.9 % 내지 5 % 범위, 1.0 % 내지 5 % 범위, 0.5 % 내지 2.5 % 범위, 0.6 % 내지 2.5 % 범위, 0.5 % 내지 2.0 % 범위, 0.5 % 내지 1.5 % 범위, 0.6 % 내지 1.4 % 범위, 0.8 % 내지 1.4 % 범위, 0.9 % 내지 1.2 % 범위, 3.0 % 내지 9.0 % 범위, 5.0 % 내지 9.0 % 범위, 6.0 % 내지 8.0 % 범위, 7.0 % 내지 9.0 % 범위, 또는 0.9 % 내지 1.1 % 범위, 또는 약 1.0 %, 1.1 %, 1.2 %, 1.3 %, 1.4 %, 1.5 %, 1.6 %, 1.7 %, 1.8 %, 1.9 %, 2.0 %, 3.0 %, 4.0 %, 5.0 %, 6.0 %, 7.0 %, 7.5 %, 8.0 %, 8.5 %, 9.0 %, 9.5 %, 10.0 %, 12.0 % 또는 5.0 %의 수크로스 또는 트레할로스;
(c) 약 1 mM 내지 약 5 mM, 약 1 mM 내지 약 3 mM, 약 1.5 mM 내지 약 3.5 mM, 또는 약 1 mM 내지 약 2.5 mM 범위의, 염화 칼슘을 포함하는 2가 칼슘 염과 같은 2가 양이온;
(d) 약 0 mM, 또는 약 10 mM 내지 약 50 mM, 약 10 mM 내지 약 40 mM, 약 10 mM 내지 약 35 mM, 약 10 mM 내지 약 30 mM; 약 10 mM 내지 약 20 mM, 약 20 mM 내지 약 50 mM, 약 20 mM 내지 약 40 mM, 또는 약 20 mM 내지 약 80 mM 범위의 염화 나트륨;
(e) 약 0 mM, 또는 약 20 ppm 내지 약 50 ppm, 약 20 ppm 내지 약 80 ppm, 약 50 ppm 내지 약 80 ppm, 약 80 ppm 내지 약 100 ppm, 약 80 ppm 내지 약 200 ppm, 또는 약 50 ppm 내지 약 100 ppm 범위의 비-이온 계면활성제, 또는 약 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 1 10, 1 15, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 160, 170, 180, 190 또는 200 ppm의 비-이온 계면활성제;
(f) 약 0 %, 또는 약 1.0 % 내지 약 5.0 % 범위, 약 1.0 % 내지 약 4.0 % 범위, 약 1.0 % 내지 약 3.0 % 범위, 약 1.0 % 내지 약 2.0 % 범위, 약 1.0 % 내지 약 1.5 % 범위, 약 1.0 % 내지 약 1.4 % 범위, 약 0.5 % 내지 약 5.0 % 범위, 약 0.5 % 내지 약 4.0 % 범위, 약 0.5 % 내지 약 3.0 % 범위, 약 0.5 % 내지 약 2.0 % 범위, 약 0.5 % 내지 약 1.5 % 범위의 글리신, 또는 약 1.5 %, 1.8 %, 2.0 %, 2.1 %, 2.2 %, 2.3 %, 2.4 %, 2.5 %, 2.6 %, 2.7 %, 2.8 %, 2.9 %, 3.0 %, 3.3 %, 3.5 % 또는 4.0 % 글리신 및
(g) 약 100 IU/ml 내지 약 5000 IU/ml, 약 100 IU/ml 내지 약 2000 IU/ml, 약 100 IU/ml 내지 약 3000 IU/ml, 약 100 IU/ml 내지 약 4000 IU/ml, 약 100 IU/ml 내지 약 1200 IU/ml, 약 250 IU/ml 내지 약 5000 IU/ml, 약 250 IU/ml 내지 약 1000 IU/ml, 약 250 IU/ml 내지 약 2000 IU/ml, 약 250 IU/ml 내지 약 3000 TU/ml, 약 500 IU/ml 내지 약 1000 IU/ml, 약 500 IU/ml 내지 약 3000 IU/ml, 약 1000 IU/ml 내지 약 2000 TU/ml, 약 1000 IU/ml 내지 약 3000 IU/ml, 약 1000 IU/ml 내지 약 4000 IU/ml, 또는 약 1000 IU/ml 내지 약 5000 IU/ml의 범위, 또는 약 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1200, 1400, 1600, 1800, 2000, 2200, 2400, 2600, 2800, 3000, 3200, 3500, 3800, 4000, 4200, 4500, 4600, 4800, 5000, 5500 또는 6000 IU/ml의 rFVIII
를 포함하고,
여기서, rFVIII 제제는 약 pH 6.0 내지 약 pH 6.5, 약 pH 6.0 내지 약 pH 7.0, 약 pH 6.0 내지 약 pH 7.5, 약 pH 6.5 내지 약 pH 7.5, 또는 약 pH 7.0 내지 약 pH 7.5 범위의 pH, 또는 약 pH 6.0, 6.5, 7.0, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4 또는 약 pH 7.5의 pH를 갖는다.
실시양태 5의 한 버전에서, rFVIII 제제는 염화 나트륨을 포함하고 2.0 % 미만의 수크로스 또는 0.5 % 내지 2.0 % 범위의 수크로스를 함유하고, 1.0 % 미만, 0.5 % 미만, 0.1 % 미만의 트레할로스를 함유하거나 또는 이를 함유하지 않는다. 이 버전에서, NaCl은 약 10 mM 내지 약 50 mM, 약 10 mM 내지 약 40 mM, 약 10 mM 내지 약 35 mM, 약 10 mM 내지 약 30 mM; 약 10 mM 내지 약 20 mM, 약 20 mM 내지 약 50 mM, 약 20 mM 내지 약 40 mM, 또는 약 20 mM 내지 약 80 mM 범위의 염화 나트륨으로 존재할 수 있다. 실시양태 5의 이 버전에서, 글리신은 약 1.0 % 내지 약 5.0 % 범위, 약 1.0 % 내지 약 4.0 % 범위, 약 1.0 % 내지 약 3.0 % 범위, 약 1.0 % 내지 약 2.0 % 범위, 약 1.0 % 내지 약 1.5 % 범위, 약 1.0 % 내지 약 1.4 % 범위, 약 0.5 % 내지 약 5.0 % 범위, 약 0.5 % 내지 약 4.0 % 범위, 약 0.5 % 내지 약 3.0 % 범위, 약 0.5 % 내지 약 2.0 % 범위, 약 0.5 % 내지 약 1.5 % 범위, 또는 약 1.5 %, 1.8 %, 2.0 %, 2.1 %, 2.2 %, 2.3 %, 2.4 %, 2.5 %, 2.6 %, 2.7 %, 2.8 %, 2.9 %, 3.0 %, 3.3 %, 3.5 % 또는 4.0 %로 존재하고 수크로스는 0.5 % 내지 5 % 범위, 0.6 % 내지 5 % 범위, 0.7 % 내지 5 % 범위, 0.8 % 내지 5 % 범위, 0.9 % 내지 5 % 범위, 1.0 % 내지 5 % 범위, 0.5 % 내지 2.5 % 범위, 0.6 % 내지 2.5 % 범위, 0.5 % 내지 2.0 % 범위, 0.5 % 내지 1.5 % 범위, 0.6 % 내지 1.4 % 범위, 0.8 % 내지 1.4 % 범위, 0.9 % 내지 1.2 % 범위, 또는 0.9 % 내지 1.1 % 범위, 또는 약 1.0 %, 1.1 %, 1.2 %, 1.3 %, 1.4 %, 1.5 %, 1.6 %, 1.7 %, 1.8 %, 1.9 %, 2.0 %, 3.0 %, 4.0 % 수크로스로 존재한다. 실시양태 5의 이 버전에서, 히스티딘은 약 1 mM 내지 약 20mM, 약 1 mM 내지 약 50 mM, 약 10 mM 내지 약 50 mM, 약 10 mM 내지 약 20mM, 약 10 mM 내지 약 30mM, 또는 약 20 mM 내지 약 50 mM 범위로 존재하고, 폴리소르베이트 20 또는 폴리소르베이트 80과 같은 비-이온 계면활성제는 약 20 ppm 내지 약 50 ppm, 약 20 ppm 내지 약 80 ppm, 약 50 ppm 내지 약 80 ppm, 약 80 ppm 내지 약 100 ppm, 약 80 ppm 내지 약 200 ppm, 또는 약 50 ppm 내지 약 100 ppm 범위의 비-이온 계면활성제, 또는 약 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 1 10, 1 15, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 160, 170, 180, 190 또는 200 ppm로 존재한다. 실시양태 5의 이 버전에서, 트레할로스는 1.0 중량% 미만, 0.5 중량% 미만, 0.1 중량% 미만으로 존재하거나 또는 존재하지 않았다.
실시양태 5의 또 다른 버전에서, 염화 나트륨은 1.0 중량% 미만, 0.5 중량% 미만, 0.1 중량% 미만으로 존재하거나 존재하지 않았다. 이 버전에서, 수크로스 또는 트레할로스는 0.5 % 내지 20 % 범위, 1.0 % 내지 20 % 범위, 0.6 % 내지 10 % 범위, 0.7 % 내지 10 % 범위, 0.8 % 내지 10 % 범위, 0.9 % 내지 10 % 범위, 1.0 % 내지 10 % 범위, 3.0 % 내지 9.0 % 범위, %, 5.0 % 내지 9.0 % 범위, 6.0 % 내지 8.0 % 범위, %, 또는 7.0 % 내지 9.0 % 범위, 또는 약 5.0 %, 6.0 %, 7.0 %, 7.5 %, 8.0 %, 8.5 %, 9.0 %, 9.5 %, 10.0 % 또는 12.0 %로 존재한다. 실시양태 5의 이 버전에서, 글리신은 1.0 중량% 미만, 0.5 중량% 미만, 0.1 중량% 미만으로 존재하거나 존재하지 않았다.
본 개시의 측면은 하기 실시예에 비추어 추가로 이해될 수 있고, 이는 어떤 방식으로든 본 교시의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
실시예
실시예 1: BDD - rFVIII 단백질 용해성 및 안정성에의 염화 나트륨 , 폴리소르베이트 80 및 인간 혈청 알부민의 영향
염화 나트륨의 영향
연구가 FVIII의 다른 도메인 사이의 적어도 한 이황화 결합의 형성에 의해 FVIII의 안정화를 허용하는 도입된 시스테인 잔기를 갖는 BDD 돌연변이 상에서 수행되었다. 특히, BDD-SQ(서열 3)는 Tyr664Cys:Thrl826Cys에서 돌연변이되어 이 실시예에서 사용된 C664-BDD 돌연변이를 만들었다. 제조의 방법을 위해, 특허 제7,928,199호(그리핀 외)를 참조할 수 있다. C664-BDD 돌연변이가 히스티딘을 함유하는 완충액에서 제제화될 때, 허용할 수 없는 수준의 침전이 관찰되었다.
연구가 C664-BDD 돌연변이가 히스티딘 완충액에 놓여질 때 관찰된 침전이 역전될 수 있는지를 측정하기 위해 수행되었다. 침전이 관찰된 완충 용액은 20 mM 히스티딘, 30 mM 염화 나트륨, 2.5 mM 염화 칼슘, 29 mM 수크로스, 293 mM 글리신 및 80 ppm 폴리소르베이트 80을 함유하였다. C664 BDD 돌연변이는 145 lU/ml로 존재하였다. 연구의 목적은 BDD-rFVIII 돌연변이를 안정화하는 제제를 개발하는 것이었다. 용해화제 및 안정화제, 예컨대 염화 나트륨, 폴리소르베이트 80 및 인간 혈청 알부민(HSA)을 돌연변이의 용해도를 증가시키거나 단백질 응집을 감소시킴으로써 안정성을 개선시키는지에 대해 시험하였다. 결과는 도 2-6에서 나타난다. 도 2 및 5에서 나타난 실험은 둘다 NaCl 농도의 변화를 포함하고, 각 경우의 그 결과는 약 120 mM NaCl을 함유하는 용액에 비해서 30 mM NaCl을 함유하는 용액으로부터 주목할만한 혼탁도 감소를 나타냈다. 연구는 염화 나트륨 농도가 증가하면, 돌연변이를 포함하는 용액의 혼탁도가 감소하고, 이는 염화 나트륨이 침전 과정을 역전한다는 것을 밝혔다. 염화 나트륨 농도가 176 mM 이상일 때, 탁한 용액이 맑은 용액으로 되고 혼탁도는 0.169에서 0.029로 떨어지고, 이는 A340 nm 측정을 바탕으로 80 %를 초과하는 것이다(도 2). 이 결과는 염화 나트륨이 BDD-rFVIII 돌연변이에 대해 효과적인 용해화제이고 이의 침전을 역전시킬 수 있다는 것을 나타낸다. 정리하면, 더 높은 염화 나트륨 농도는 BDD-rFVIII 돌연변이의 용해성을 개선시킨다. 표 2는 바람직한 제제를 보여준다. 표 2의 "BDD-rFVIII 돌연변이"는 Tyr664Cys:Thrl 826Cys에서 돌연변이된 BDD-SQ의 제제를 나타낸다. 표 2의 "전체-길이 rFVIII"는 서열 2(전체-길이 FVIII)의 아미노산 서열을 갖는 FVIII의 제제를 지칭한다.
<표 2>
전체-길이 rFVIII 및 BDD - rFVIII 돌연변이에 대한 제제 조성물
Figure pct00001
실시예 2: 무작위 리신 커플링을 통한 rFVIII 페길화에 대한 제제 개발
PEG 중합체는 무작위 리신 커플링을 사용하여 서열 1의 전체-길이 rFVIII에 콘쥬게이션되었다. 이 형태의 커플링에서, 반응성 기는 주로 단백질 내 리신의 N-말단 아민 또는 ε-아미노기이다. 제제 내 다른 일차 또는 이차 아민기는 반응을 방해할 수 있다. 많은 전체-길이 및 BDD-rFVIII 제제가 아미노산, 예컨대 글리신 및 히스티딘을 포함하기 때문에, 신규 제제가 이들 분자의 페길화에 대해 개발되었다. 글리신이 전체-길이 rFVIII 제제 내 증량제로서 사용되고 페길화 동안 제거될 수 있는 동안, 히스티딘은 완충액 성분으로 역할을 하고 또 다른 완충액으로 대체될 필요가 있다.
적합한 완충 시스템은 하기 기준을 충족시킨다: (1) 이는 pH 6-7에서 완충 용량을 제공한다; (2) 이는 중요한 rFVIII 안정제인 염화칼슘과의 불용성 착화물 또는 킬레이트를 형성하지 않는다; (3) 이는 일차 또는 이차 아민기를 포함하지 않는다.
몇가지 흔히 사용되는 완충액은 rFVIII의 무작위 페길화에 대해 고려되었다. 표 3에서 보여지는 바와 같이, 오직 두 완충 시스템, 트리-에탄올아민("TEA") 및 MOPS가 추가 조사를 위해 선택되었다.
<표 3>
rFVIII의 무작위 페길화에 대해 고려된 완충액
Figure pct00002
이 연구에 대해, 전체-길이 rFVIII는 표 4에 열거된 제제에 대해 투석되었다. 3가지 제제 내 투석된 rFVIII는 40 ℃(도 7) 또는 25 ℃(도 8)에 놓여져 가속된 조건에서 안정성을 확립하고 그 결과는 도 7 및 8에 나타난다.
<표 4>
rFVIII의 무작위 페길화에 대해 평가된 완충액
Figure pct00003
실시예 3: BDD - rFVIII에 대한 페길화
BDD-rFVIII는 이것의 응집 경향으로 인해 제제 난제에 직면한다. 따라서, 페길화된 rFVIII에 대한 제제를 설계하는 목적 중 하나는 용액 내 그것의 안정성을 보장하기 위해서이다. 페길화된 BDD-rFVIII에 대한 실시 제제는 200 mM 염화 나트륨, 20 mM MOPS, 10 mM CaCl2, 100 ppm 폴리소르베이트 80 및 29 mM 수크로스를 포함한다. 200 mM 염화 나트륨은 동결-건조 동안 어려움을 가질 것이다. 따라서, 페길화된 BDD-rFVIII의 용해성 및 잠재능은 50 및 250 mM 범위의 염화 나트륨 농도의 함수로 평가된다.
이 연구에 사용된 완충 조성물은 표 5에서 나타나고 데이터는 도 10 및 11에서 정리된다. 이 실시예에서 사용된 페길화된 BDD는 한 아미노산 돌연변이가 있는 서열 3의 아미노산 서열을 포함하여 PEG가 첨가되는 자유 시스테인을 생성한다. 이는 도 9에서 그림으로 나타난다. 페길화된 BDD-rFVIII는 23 ℃에서 6일 저장 동안 50-150 mM 염화 나트륨을 포함하는 제제 내 87 % 초과의 잠재능을 보유한다. 페길화되지 않은 BDD-rFVIII는 23 ℃에서 6일 저장 동안 동일한 제제 내 70 % 잠재능을 보유한다. 두 분자는 침전 또는 유광의 육안 검출 없이 연구 동안 가용성을 유지하였다. 이들 및 이전의 데이터는 100 mM 염화 나트륨이 추가의 제제 개발을 위해 사용될 수 있음을 제시하였다.
<표 5>
염화 나트륨의 영향을 평가하기 위해 사용된 제제의 조성물
Figure pct00004
페길화된 및 페길화되지 않은 BDD-rFVIII의 용해성 및 응집에 대한 염화 나트륨의 영향이 조사되었다.
25 mM, 55 mM, 75 mM, 125 mM 및 200 mM 염화 나트륨을 포함하는 MOPS 완충액 내 페길화된 BDD-rFVIII의 UV 흡수는, 시험된 모든 염화 나트륨 농도에서 페길화된 BDD-rFVIII의 산란을 보이지 않았고, 이는 응집의 결여를 나타낸다. 반대로, 페길화되지 않은-rFVIII는 아마도 가용성 응집체의 형성으로 인해 25 mM, 55 mM 및 75 mM 염화 나트륨에서 상당한 산란을 보였다. 염화 나트륨 농도가 125 mM 내지 200 mM까지 증가될 때, 산란이 관찰되지 않았다. 따라서, 높은 염 농도가 응집체 형성을 방해한다는 결론이 내려졌다.
실시예 4: 페길화된 BDD - rFVIII에 대한 동결-건조 제제의 개발
4 개의 후보물질 제제를 페길화된 BDD-rFVIII의 동결건조를 위해 스크리닝하였다. 이 실시예에서 사용된 페길화된 BDD는 PEG가 첨가된 곳에 자유 시스테인을 만들기 위한 1 아미노산 돌연변이가 있는 서열 3의 아미노산 서열을 포함하였다. 목적은 이들 제제 내 동결건조된 의약품의 안정성을 평가하고, 선두의 안정성 연구를 위해 제제를 선택하는 것이다. 스크리닝된 제제는 (1) 페길화되지 않은 전체-길이 rFVIII에서 성공적인 제제 A, (2) 제제 A에 비해 증가도니 고체 함량을 포함하는 제제 B, (3) 제제 A 내 사용된 NaCl 대신 수크로스가 있는 제제 C, 및 (4) 제제 A 내 사용된 NaCl 대신 트레할로스가 있는 제제 D이다. 마지막 두 제제는 동결건조된 의약품에 대한 무정형 매트릭스를 제공한다.
안정성은 3 가지 저장 온도(5 ℃, 25 ℃ 및 40 ℃)에서 평가하였다. 표 6은 안정성 평가를 위해 사용된 페길화된 BDD-rFVIII를 위한 제제를 나타낸다.
수크로스 및 글리신의 농도는 제제 A 내 29 mM 내지 293 mM에서 제제 B 내 38 mM 내지 346 mM까지 증가되었다. 추가적인 고체는 동결-건조된 케이크의 기계적 강도를 증진시키고 최종 의약품의 모양을 개선하도록 첨가되었다.
<표 6>
안정성 평가에 사용된 페길화된 BDD - rFVIII에 대한 제제 조성물
Figure pct00005
제제 C 및 D가 다른 두 제제와 비교하여 대체 매트릭스를 제공하도록 설계되었다. 제제 A 및 B는 구조 안정성 및 증량제로서의 염화 나트륨 및 글리신의 존재로 인해 동결-건조 시 결정질 매트릭스를 형성하였다. 수크로스 및 트레할로스의 농도는 염화 나트륨 및 글리신을 포함하는 대신에, 각각 234 mM 및 211 mM으로 증가되었다. 이는 그 결과 동결-건조된 의약품에 대한 무정형 매트릭스가 되었다.
각 4 개 후보물질 제제에 대한 안정성 프로그램이 26 주 시간 기간 동안 설정되었다. 안정성은 잠재능, 수분 함량, 퍼센트 고분자량(HMW) 불순물 및 불순물 관련된 총 생성물에 대해 SEC-HPLC에 의해 평가되었다. 4 개 제제에 대한 잠재능 회복 데이터가 도 12-15에 정리되었다.
4 개 제제에 대한 잠재능 회복, 칼 피셔(Karl Fischer)에 의한 수분 함량 및 SEC-HPLC에 의한 응집체 퍼센트 및 불순물 관련 생성물의 데이터(26 주 시험됨)는 rFVIII가 4 제제에서 안정하다는 것을 나타낸다.
페길화된 BDD-rFVIII에 대한 안정성은 제제 A 및 B에 대해 추가로 평가되었다(제제 조성물에 대한 표 6 참조). 두 의약품은 실험실-규모로 제조되고 5 ℃ 및 25 ℃ 및 40 ℃에서 안정성에 놓여진다. 색소유전자(chromogenic) 분석에 의한 잠재능, SEC-HPLC에 의한 퍼센트 고분자량 불순물 및 총 불순물 관련 생성물, 및 칼 피셔에 의한 수분이 의약품 안정성 평가에 사용되었다. 제제 A에 사용된 성분의 표적 농도 및 범위는 표 7에 제시된다.
<표 7>
제제 A 내 사용된 성분의 표적 농도 및 범위
Figure pct00006
이들 데이터는 두 제제에서 비교할만한 의약품 안정성을 나타낸다. 제제 A에 대한 연구는 30 개월까지 계속되었고, 반면 제제 B에 대한 연구는 3 개월에 종료되었다(각각, 도 16 및 17). 도 18 및 19 내 rFVIII 농도는 400 IU/mL이었다.
제제 A는 추가적인 개발을 위해 선택되었고 200 IU IU/mL 및 1200 IU/mL의 농도에서 페길화된 rFVIII로 시험되었다. 200 IU/mL 및 1200 IU/mL의 잠재능 프로파일이 도 18 및 19에서 각각 나타난다. 데이터는 제제 A가 페길화된 rFVIII에 대한 지속적인 안정성을 제공함을 나타낸다.
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Leu Gly Met Ala Ser Gly His Ile Arg 1145 1150 1155 Asp Phe Gln Ile Thr Ala Ser Gly Gln Tyr Gly Gln Trp Ala Pro 1160 1165 1170 Lys Leu Ala Arg Leu His Tyr Ser Gly Ser Ile Asn Ala Trp Ser 1175 1180 1185 Thr Lys Glu Pro Phe Ser Trp Ile Lys Val Asp Leu Leu Ala Pro 1190 1195 1200 Met Ile Ile His Gly Ile Lys Thr Gln Gly Ala Arg Gln Lys Phe 1205 1210 1215 Ser Ser Leu Tyr Ile Ser Gln Phe Ile Ile Met Tyr Ser Leu Asp 1220 1225 1230 Gly Lys Lys Trp Gln Thr Tyr Arg Gly Asn Ser Thr Gly Thr Leu 1235 1240 1245 Met Val Phe Phe Gly Asn Val Asp Ser Ser Gly Ile Lys His Asn 1250 1255 1260 Ile Phe Asn Pro Pro Ile Ile Ala Arg Tyr Ile Arg Leu His Pro 1265 1270 1275 Thr His Tyr Ser Ile Arg Ser Thr Leu Arg Met Glu Leu Met Gly 1280 1285 1290 Cys Asp Leu Asn Ser Cys Ser Met Pro Leu Gly Met Glu Ser Lys 1295 1300 1305 Ala Ile Ser Asp Ala Gln Ile Thr Ala Ser Ser Tyr Phe Thr Asn 1310 1315 1320 Met Phe Ala Thr Trp Ser Pro Ser Lys Ala Arg Leu His Leu Gln 1325 1330 1335 Gly Arg Ser Asn Ala Trp Arg Pro Gln Val Asn Asn Pro Lys Glu 1340 1345 1350 Trp Leu Gln Val Asp Phe Gln Lys Thr Met Lys Val Thr Gly Val 1355 1360 1365 Thr Thr Gln Gly Val Lys Ser Leu Leu Thr Ser Met Tyr Val Lys 1370 1375 1380 Glu Phe Leu Ile Ser Ser Ser Gln Asp Gly His Gln Trp Thr Leu 1385 1390 1395 Phe Phe Gln Asn Gly Lys Val Lys Val Phe Gln Gly Asn Gln Asp 1400 1405 1410 Ser Phe Thr Pro Val Val Asn Ser Leu Asp Pro Pro Leu Leu Thr 1415 1420 1425 Arg Tyr Leu Arg Ile His Pro Gln Ser Trp Val His Gln Ile Ala 1430 1435 1440 Leu Arg Met Glu Val Leu Gly Cys Glu Ala Gln Asp Leu Tyr 1445 1450 1455 <210> 4 <211> 4 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Ser Phe Ser Gln 1 <210> 5 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Asn Pro Pro Val Leu Lys Arg His Gln Arg 1 5 10

Claims (14)

  1. (a) 약 1 mM 내지 약 5 mM 범위의 2가 양이온;
    (b) 약 150 mM 내지 약 250 mM 범위의 염화 나트륨 또는 염화 칼륨;
    (c) 약 50 ppm 내지 약 200 ppm 범위의 비-이온 계면활성제; 및
    (d) 약 100 IU/ml 내지 약 5000 IU/ml 범위의, 시스테인 잔기로 대체된 서열 3의 아미노산 서열 내 하나 이상의 비-시스테인 잔기를 갖는 아미노산 서열을 포함하는 rFVIII
    를 포함하고, 약 pH 6.0 내지 약 pH 7.5 범위의 pH를 갖는 rFVIII 제제.
  2. 제1항에 있어서,
    (a) 약 10 mM 내지 약 50 mM 범위의 히스티딘;
    (b) 약 10 mM 내지 약 100 mM 범위의 당 또는 당 알콜; 및
    (c) 약 150 mM 내지 약 400 mM 범위의 글리신
    을 더 포함하는 rFVIII 제제.
  3. (a) 10 mM 내지 100 mM 범위의 MOPS;
    (b) 0.5 중량% 내지 10 중량% 범위의 당 또는 당 알콜;
    (c) 0.5 mM 내지 20 mM 범위의 2가 양이온;
    (d) 10 mM 내지 100 mM 범위의 염화 나트륨 또는 염화 칼륨;
    (e) 50 내지 150 ppm 범위의 비-이온 계면활성제; 및
    (f) 약 1000 IU/ml 내지 약 1500 IU/ml 범위의 rFVIII
    를 포함하고, 일차 또는 이차 아민기를 갖는 rFVIII 외 성분 5.0 중량% 미만을 함유하는 rFVIII 제제.
  4. 제3항에 있어서, 히스티딘 및 글리신이 필수적으로 없는 rFVIII 제제.
  5. (a) 제3항 또는 제4항의 rFVIII 제제를 수득하는 단계;
    (b) 관능화된 중합체를 첨가하여 반응 혼합물을 생성하고, 여기서 중합체가 rFVIII 상의 아민기와 반응하는 화학적 부분으로 관능화되는 것인 단계; 및
    (c) rFVIII에의 중합체의 공유 부착이 일어나도록 하는 시간 및 온도의 조건 하에 반응 혼합물을 인큐베이팅하는 단계
    를 포함하는, 생체적합성 중합체에의 rFVIII의 공유 콘쥬게이션 방법.
  6. (a) 10 mM 내지 100 mM 범위의 MOPS;
    (b) 150 mM 내지 300 mM 범위의 NaCl;
    (c) 1 mM 내지 20 mM 범위의 2가 양이온; 및
    (d) 약 100 IU/ml 내지 약 5000 IU/ml 범위의 콘쥬게이션되지 않은 rFVIII
    를 포함하는 rFVIII 제제.
  7. 제6항에 있어서,
    (a) 0.5 % 내지 10 % 범위의 당 또는 당 알콜; 및
    (b) 20 ppm 내지 250 ppm 범위의 비-이온 계면활성제
    를 더 포함하는 rFVIII 제제.
  8. (a) 10 mM 내지 100 mM 범위의 MOPS 또는 히스티딘;
    (b) 25 mM 내지 200 mM 범위의 NaCl;
    (c) 1 mM 내지 20 mM 범위의 2가 양이온; 및
    (d) 약 100 IU/ml 내지 약 5000 IU/ml 범위의 콘쥬게이션된 rFVIII
    를 포함하는 rFVIII 제제.
  9. 제8항에 있어서,
    (a) 0.5 % 내지 10 % 범위의 당 또는 당 알콜; 및
    (b) 20 ppm 내지 250 ppm 범위의 비-이온 계면활성제
    를 더 포함하는 rFVIII 제제.
  10. (a) 약 0 mM, 또는 약 1 mM 내지 약 20 mM 범위의 히스티딘;
    (b) 0.5 % 내지 20 % 범위의 수크로스 또는 트레할로스;
    (c) 약 1 mM 내지 약 5 mM 범위의 2가 양이온;
    (d) 약 0 mM, 또는 약 10 mM 내지 약 50 mM 범위의 염화 나트륨;
    (e) 약 0 mM, 또는 약 20 ppm 내지 약 80 ppm 범위의 비-이온 계면활성제;
    (f) 약 0 %, 또는 약 1.0 % 내지 약 5.0 % 범위의 글리신; 및
    (g) 약 100 IU/ml 내지 약 5000 IU/ml 범위의 콘쥬게이션된 rFVIII
    를 포함하고, 약 pH 6.0 내지 약 pH 7.5의 pH를 갖는 rFVIII 제제.
  11. 제10항에 있어서,
    (a) 염화 나트륨이 약 10 mM 내지 약 50 mM의 범위로 존재하고;
    (b) 수크로스가 0.5 % 내지 2.0 %의 범위로 존재하고;
    (c) 글리신이 약 1.0 % 내지 약 5.0 %의 범위로 존재하고;
    (d) 히스티딘이 약 1 mM 내지 약 20 mM의 범위로 존재하고;
    (e) 비-이온 계면활성제가 약 20 ppm 내지 약 80 ppm의 범위로 존재하는,
    rFVIII 제제.
  12. 제10항에 있어서,
    (a) 염화 나트륨이 1.0 중량% 미만으로 존재하거나 또는 존재하지 않고;
    (b) 수크로스 또는 트레할로스가 0.5 % 내지 20 %의 범위로 존재하고;
    (c) 글리신이 1.0 중량% 미만으로 존재하거나 또는 존재하지 않는,
    rFVIII 제제.
  13. 제12항에 있어서, 수크로스 또는 트레할로스가 1.0 % 내지 10.0 % 범위로 존재하는, rFVIII 제제.
  14. 제1항, 제3항, 제6항, 제8항 또는 제10항 중 어느 한 항의 치료 유효량의 rFVIII 제제를 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 혈우병 A 치료 방법.


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