KR20190137954A - 안정화된 액체 및 동결건조된 ａｄａｍｔｓ13 제제 - Google Patents

안정화된 액체 및 동결건조된 ａｄａｍｔｓ13 제제 Download PDF

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Abstract

본 발명은 증강된 또는 바람직한 특성을 갖는 ADAMTS13 제제에 관계한다. 따라서 본 발명에서는 제약학적 투여에 적합한 액체 및 동결건조된 ADAMTS13 제제를 제시한다. 다른 측면에서, 본 발명에서는 또한, 개체에서 VWF 및/또는 ADAMTS13 기능장애에 관련된 다양한 질환과 장애를 치료하는 방법을 제시한다. 또한, 다양한 질환과 장애의 치료에 유용한 ADAMTS13 제제를 포함하는 키트가 본 발명에서 제시된다.

Description

안정화된 액체 및 동결건조된 ＡＤＡＭＴＳ13 제제{STABILIZED LIQUID AND LYOPHILIZED ADAMTS13 FORMULATIONS}
관련된 출원에 대한 교차 참조
본 출원은 2009년 9월 21일 제출된 U.S. 특허가출원 No. 61/244,353에 우선권을 주장하고, 이것은 본 발명에 순전히 참조로서 편입된다.
연방 정부의 지원을 받은 연구 또는 개발 하에 만들어진 발명에 대한 권리에 관한 진술
해당사항 없음
콤팩트디스크에 담겨 제출된 "서열 목록", 표, 또는 컴퓨터 프로그램 목록 부록에 대한 언급
해당사항 없음
본 발명의 배경기술
ADAMTS (트롬보스폰딘 타입 I 모티프를 갖는 디스인테그린 및 금속단백질분해효소) 단백질은 아연-의존성 촉매 도메인, 시스테인-풍부한 도메인, 디스인테그린-유사 도메인, 그리고 적어도 하나의, 그리고 대부분의 경우에 복수의 트롬보스폰딘 타입 I 반복부를 비롯한 다수의 보존된 도메인을 내포하는 금속단백질분해효소의 패밀리이다 (검토를 위하여, Nicholson et al., BMC Evol Biol. 2005 Feb 4;5(1):11을 참조한다). 금속단백질분해효소의 ADAM과 MMP 패밀리에 진화적으로 관련되는 이들 단백질 (Jones GC, Curr Pharm Biotechnol. 2006 Feb;7(1):25-31)은 혈전성 혈소판감소성 자반증 (thrombotic thrombocytopenic purpura, TTP) (Moake JL, Semin Hematol. 2004 Jan;41(1):4-14), 결합 조직 장애 (connective tissue disorder), 암, 염증 (Nicholson et al.), 그리고 중증 열대열 말라리아 (plasmodium falciparum) (Larkin et al., PLoS Pathog. 2009 Mar;5(3):e1000349)를 비롯한 다수의 질환과 장애에 연관되는 분비된 효소이다. 이들 관련으로 인하여, ADAMTS 효소는 다수의 병리에 대한 잠재적 치료 표적으로서 인식되었다 (Jones GC, Curr Pharm Biotechnol. 2006 Feb;7(1):25-31).
한 가지 ADAMTS 패밀리 구성원, ADAMTS13은 잔기 Tyr 1605와 Met 1606 사이에서 폰 빌레브란트 인자 (von Willebrand factor, vWF)를 절단한다. ADAMTS13 활성의 상실은 다수의 질환, 예를 들면, TTP (Moake JL, Semin Hematol. 2004 Jan;41(1):4-14 ), 급성과 만성 염증 (Chauhan et al., J Exp Med. 2008 Sep 1;205(9):2065-74), 그리고 가장 최근에, 중증 열대열 말라리아 (Larkin et al., PLoS Pathog. 2009 Mar;5(3):e1000349)에 관련되었다.
혈전성 혈소판감소성 자반증 (TTP)은 다양한 정도의 조직 허혈과 경색을 유발할 수 있는 혈전성 미소혈관증 (thrombotic microangiopathy), 혈소판 감소증 (thrombocytopenia) 및 미세혈관 혈전증 (microvascular thrombosis)으로 특징되는 질환이다. 임상적으로, TTP 환자는 혈소판 감소증, 분열적혈구 (schistocyte) (적혈구의 단편) 및 상승된 수준의 유산탈수소효소 (lactate dehydrogenase)와 같은 증상으로 진단된다 (Moake J L. Thrombotic microangiopathies. N Engl J Med. 2002; 347:589-600; Moake J L. von Willebrand factor, ADAMTS-13, and thrombotic thrombocytopenic purpura. Semin Hematol. 2004; 41:4-14; Sadler J E, Moake J L, Miyata T, George J N. Recent advances in thrombotic thrombocytopenic purpura. Hematology (Am Soc Hematol Educ Program). 2004: 407-423; Sadler J E. New concepts in von Willebrand disease. Annu Rev Med. 2005; 56:173-191).
1982년에, Moake 등은 만성 재발성 TTP을 앓는 환자의 혈장에서 특이하게 큰 폰 빌레브란트 인자 (UL-vWF) 다합체를 발견하였다 (Moake J L, Rudy C K, Troll J H, Weinstein M J, Colannino N M, Azocar J, Seder R H, Hong S L, Deykin D. Unusually large plasma factor VIII:von Willebrand factor multimers in chronic relapsing thrombotic thrombocytopenic purpura. N Engl J Med. 1982; 307:1432-1435). UL-vWF와 TTP 사이에 관련은 TTP를 앓는 대부분의 환자가 vWF를 절단하는, 현재 ADAMTS13인 것으로 알려져 있는 혈장 금속단백질분해효소가 불충분하다는 Furlan 등 및 Tsai와 Lian에 의한 독립적인 조사 결과에 의해 뒷받침되었다 (Furlan M, Robles R, Solenthaler M, Wassmer M, Sandoz P, Laemmle B. Deficient activity of von Willebrand factor-cleaving protease in chronic relapsing thrombotic thrombocytopenic purpura. Blood. 1997; 89:3097-3103; Tsai H M, Sussman, I I, Ginsburg D, Lankhof H, Sixma J J, Nagel R L. Proteolytic cleavage of recombinant type 2A von Willebrand factor mutants R834W and R834Q: inhibition by doxycycline and by monoclonal antibody VP-1. Blood. 1997; 89:1954-1962; Tsai H M, Lian E C. Antibodies to von Willebrand factor-cleaving protease in acute thrombotic thrombocytopenic purpura. N Engl J Med. 1998; 339:1585-1594).
ADAMTS13 단백질분해효소는 주로 간에 의해 생산되는 190 kDa 당화된 단백질이다 (Levy G G, Nichols W C, Lian E C, Foroud T, McClintick J N, McGee B M, Yang A Y, Siemieniak D R, Stark K R, Gruppo R, Sarode R, Shurin S B, Chandrasekaran V, Stabler S P, Sabio H, Bouhassira E E, Upshaw J D, Jr., GinsburgD, Tsai H M. Mutations in a member of the ADAMTS gene family cause thrombotic thrombocytopenic purpura. Nature. 2001; 413:488-494; Fujikawa K, Suzuki H, McMullen B, Chung D. Purification of human von Willebrand factor-cleaving protease and its identification as a new member of the metalloproteinase family. Blood. 2001; 98:1662-1666; Zheng X, Chung D, Takayama T K, Majerus E M, Sadler J E, Fujikawa K. Structure of von Willebrand factor-cleaving protease (ADAMTS13), a metalloprotease involved in thrombotic thrombocytopenic purpura. J Biol Chem. 2001; 276:41059-41063; Soejima K, Mimura N, Hirashima M, Maeda H, Hamamoto T, Nakagaki T, Nozaki C. A novel human metalloprotease synthesized in the liver and secreted into the blood: possibly, the von Willebrand factor-cleaving protease; J Biochem (Tokyo). 2001; 130:475-480; Gerritsen H E, Robles R, Lammle B, Furlan M. Partial amino acid sequence of purified von Willebrand factor-cleaving protease. Blood. 2001; 98:1654-1661).
ADAMTS13 유전자에서 돌연변이는 TTP를 유발하는 것으로 밝혀졌다 (Levy G G, Nichols W C, Lian E C, Foroud T, McClintick J N, McGee B M, Yang A Y, Siemieniak D R, Stark K R, Gruppo R, Sarode R, Shurin S B, Chandrasekaran V, Stabler S P, Sabio H, Bouhassira E E, Upshaw J D, Jr., Ginsburg D, Tsai H M. Mutations in a member of the ADAMTS gene family cause thrombotic thrombocytopenic purpura. Nature. 2001; 413:488-494). 종종 ADAMTS-13 활성을 저해하는 자기항체 (autoantibody)에 의해 유발되는 특발성 TTP는 성인 및 청소년에서 발생하고 11-36%의 환자에서 규칙적인 간격으로 재발할 수 있는 더욱 일반적인 질환이다 (Tsai H M, Lian E C. Antibodies to von Willebrand factor-cleaving protease in acute thrombotic thrombocytopenic purpura. N Engl J Med. 1998; 339:1585-1594; Furlan M, Lammle B. Deficiency of von Willebrand factor-cleaving protease in familial and acquired thrombotic thrombocytopenic purpura. Baillieres Clin Haematol. 1998; 11:509-514).
비 중화 자기항체 역시 순환 (circulation)으로부터 제거 (clearance)를 유도함으로써 ADAMTS 활성을 저해한다 (Scheiflinger F, Knobl P, Trattner B, Plaimauer B, Mohr G, Dockal M, Dorner F, Rieger M. Nonneutralizing IgM and IgG antibodies to von Willebrand factor-cleaving protease (ADAMTS-13) in a patient with thrombotic thrombocytopenic purpura. Blood. 2003; 102:3241-3243). 건강한 성인에서 혈장 ADAMTS13 활성은 50% 내지 178% 범위에서 변한다 (Moake J L. Thrombotic thrombocytopenic purpura and the hemolytic uremic syndrome. Arch Pathol Lab Med. 2002; 126:1430-1433). 가족성 또는 후천성 TTP를 앓는 대부분의 환자에서, 혈장 ADAMTS13 활성은 없거나, 또는 정상의 5% 이하이다. 치료가 없으면, 사망률 (mortality rate)은 90%를 초과하지만, 혈장 요법은 사망률을 대략 20%까지 감소시켰다 (Moake J L. Thrombotic thrombocytopenic purpura and the hemolytic uremic syndrome. Arch Pathol Lab Med. 2002; 126:1430-1433).
거대핵세포 및 내피 세포에서 합성된 vWF는 각각, 초거대 vWF (UL-vWF)로서 혈소판 과립 (platelet-granule) 및 바이벨-펠라드 소체 (Weibel-Palade body) 내에 저장된다 (Moake J L, Rudy C K, Troll J H, Weinstein M J, Colannino N M, Azocar J, Seder R H, Hong S L, Deykin D. Unusually large plasma factor VIII:von Willebrand factor multimers in chronic relapsing thrombotic thrombocytopenic purpura. N Engl J Med. 1982; 307:1432-1435; Wagner D D, Olmsted J B, Marder V J. Immunolocalization of von Willebrand protein in Weibel-Palade bodies of human endothelial cells. J Cell Biol. 1982; 95:355-360; Wagner D D, Bonfanti R. von Willebrand factor and the endothelium. Mayo Clin Proc. 1991; 66:621-627; Sporn L A, Marder V J, Wagner D D. von Willebrand factor released from Weibel-Palade bodies binds more avidly to extracellular matrix than that secreted constitutively. Blood. 1987; 69:1531 -1534; Tsai H M, Nagel R L, Hatcher V B, Sussman, I I. Endothelial cell-derived high molecular weight von Willebrand factor is converted into the plasma multimer pattern by granulocyte proteases. Biochem Biophys Res Commun. 1989; 158:980-985; Tsai H M, Nagel R L, Hatcher V B, Sussman, I I. Multimeric composition of endothelial cell-derived von Willebrand factor. Blood. 1989; 73:2074-2076). 일단 내피 세포로부터 분비되면, 이들 UL-vWF 다합체는 순환 중인 ADAMTS13에 의해, vWF 분자 내에 특정 절단 부위에서 일련의 더욱 작은 다합체로 절단된다 (Tsai H M, Nagel R L, Hatcher V B, Sussman, I I. Endothelial cell-derived high molecular weight von Willebrand factor is converted into the plasma multimer pattern by granulocyte proteases. Biochem Biophys Res Commun. 1989; 158:980-985; Dent J A, Galbusera M, Ruggeri Z M. Heterogeneity of plasma von Willebrand factor multimers resulting from proteolysis of the constituent subunit. J Clin Invest. 1991; 88:774-782; Furlan M, Robles R, Affolter D, Meyer D, Baillod P, Lammle B. Triplet structure of von Willebrand factor reflects proteolytic degradation of high molecular weight multimers. Proc Natl Acad Sci USA. 1993; 90:7503-7507).
ADAMTS13은 성숙 vWF 아단위의 중심 A2 도메인 내에 Tyr842-Met843 결합을 절단하고, 그리고 활성을 위하여 아연 또는 칼슘을 필요로 한다 (Dent J A, Berkowitz S D, Ware J, Kasper C K, Ruggeri Z M. Identification of a cleavage site directing the immunochemical detection of molecular abnormalities in type IIA von Willebrand factor. Proc Natl Acad Sci USA. 1990; 87:6306-6310). vWF는 전자 현미경에 의해 관찰된 바와 같이 "털실 꾸러미 (ball-of-yarn)" 및 섬유상 형태로 존재한다 (Slayter H, Loscalzo J, Bockenstedt P, Handin R I. Native conformation of human von Willebrand protein. Analysis by electron microscopy and quasi-elastic light scattering. J Biol. Chem. 1985; 260:8559-8563). 게다가, 원자력 현미경 (atomic force microscopy)은 vWF가 정적인 조건 하에 공모양 배치 형태, 그리고 전단 응력 (shear stress)에 노출후 접힘되지 않은 섬유상 상태로 존재한다는 것을 확증한다 (Siedlecki C A, Lestini B J, Kottke-Marchant K K, Eppell S J, Wilson D L, Marchant R E. Shear-dependent changes in the three-dimensional structure of human von Willebrand factor. Blood. 1996; 88:2939-2950). 이것은 또한, vWF 섬유의 한쪽 단부가 표면에 고정될 때 생체내에서도 일어날 수 있다.
TTP 환자의 혈전은 섬유소 (fibrin)가 거의 없고 주로 vWF와 혈소판으로 구성되는데, 이것은 vWF-매개된 혈소판 집합을 혈전증의 원인으로서 암시한다 (Asada Y, Sumiyoshi A, Hayashi T, Suzumiya J, Kaketani K. Immunohistochemistry of vascular lesion in thrombotic thrombocytopenic purpura, with special reference to factor VIII related antigen. Thromb Res. 1985; 38:469-479). 재발성 TTP를 앓는 환자는 혈장 내에 초거대 다합체를 갖는다. 이들 UL-vWF 다합체는 시간의 흐름에서 축적되는데, 그 이유는 저해물질 (항-ADAMTS13 Ab)의 지속이 ADAMTS13 활성을 감소시키기 때문이다. 이들 UL-vWF 다합체는 과잉 활동성이고, 그리고 전단 응력의 결과로써 접힘되어 혈소판 집합이 유발되고 혈관내 혈전증이 발생한다 (Tsai H M. Von Willebrand factor, ADAMTS13, and thrombotic thrombocytopenic purpura. J Mol Med. 2002; 80:639-647; Tsai H M. Deficiency of ADAMTS-13 in thrombotic and thrombocytopenic purpura. J Thromb Haemost. 2003; 1:2038-2040; discussion 2040-2035).
ADAMTS13 결핍에 기인한 혈장 내에 과잉 활동성 UL-vWF 다합체의 존재는 관동맥성 심장 질환 (coronary heart disease)에 관련된 동맥 혈전증 (arterial thrombosis)의 증가된 위험과 연관될 수 있는 것으로 생각된다.
따라서 ADAMTS13과 VWF 기능장애와 연관된 다양한 질환과 장애의 치료에 적합한 ADAMTS13 단백질의 제약학적 제제가 당분야에서 요구된다. 본 발명에서는 특히, 제약학적 투여에 적합한 ADAMTS13 제제, 그리고 ADAMTS13과 VWF 기능장애와 연관된 질환 또는 장애를 앓는 개체를 치료하는 방법을 제시한다.
본 발명의 간단한 요약
한 측면에서, 본 발명에서는 제약학적 투여에 적합한 ADAMTS13 제제 (A13)를 제시한다. 유리하게는, 일부 구체예에서, 본 발명에서는 활성을 상실하거나, 또는 과도하게 집합되지 않으면서 연장된 기간 동안 저장될 수 있는 A13 제제를 제시한다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 제제는 적어도 대략 37℃까지의 온도에서 적어도 6개월 동안 저장될 수 있다.
한 측면에서, 본 발명에서는 (a) 0.05 ㎎/㎖ 내지 10.0 ㎎/㎖ ADAMTS13; (b) 0 mM 내지 200 mM의 제약학적으로 허용되는 염; (c) 0.5 mM 내지 20 mM 칼슘; (d) 당 및/또는 당알코올; (e) 비이온성 계면활성제; 그리고 (f) 6.0 내지 8.0의 pH를 유지하기 위한 완충제를 포함하는 ADAMTS13 (A13)의 안정화된 제제를 제시한다.
관련된 측면에서, 본 발명에서는 ADAMTS13 (A13)의 안정화된 동결건조된 제제를 제시하고, 여기서 상기 제제는 (a) 0.05 ㎎/㎖ 내지 10.0 ㎎/㎖ ADAMTS13; (b) 0 mM 내지 200 mM의 제약학적으로 허용되는 염; (c) 0.5 mM 내지 20 mM 칼슘; (d) 당 및/또는 당알코올; (e) 비이온성 계면활성제; 그리고 (f) 6.0 내지 8.0의 pH를 유지하기 위한 완충제를 포함하는 액체 제제로부터 동결건조된다.
본 발명의 한 측면에서, 제약학적 투여에 적합한 재조합 ADAMTS13 (rA13) 제제가 제시된다. 일부 구체예에서, 본 발명에서 제시된 제제는 높은 비활성 (specific activity)을 갖고 연장된 기간 동안 저장 시에 안정하다.
본 발명의 다른 측면에서, A13과 rA13의 감소된 이합체화 (dimerization) 또는 집합 (aggregation)을 갖는 제제가 제시된다. 일정한 구체예에서, 본 발명에서 제시된 제제는 연장된 기간 동안 저장될 때, A13과 rA13 이합체의 형성 및 집합을 지체시킨다. 일부 구체예에서, 이들 제제는 제약학적 투여에 적합하다.
한 측면에서, 본 발명은 하나 또는 그 이상의 혈전의 형성 및/또는 존재와 연관된 질환을 치료하거나 예방하는 방법, 그리고 병든 환자에서 하나 또는 그 이상의 혈전을 붕괴시키는 방법에 관계한다. 하나 또는 그 이상의 혈전의 형성 및/또는 존재와 연관된 질환의 실례는 유전성 혈전성 혈소판감소성 자반증 (TTP), 후천성 TTP, 동맥 혈전증, 급성 심근 경색 (AMI), 뇌졸중, 패혈증, 그리고 산재성 혈관내 응고증 (DIC)이다. 한 구체예에서, 치료하거나 예방하는 방법은 본 발명에서 제시된 A13 또는 rA13 제제의 투여를 포함한다.
다른 측면에서, 본 발명에서는 병든 환자에서 경색을 치료하거나 예방하는 방법을 제시한다. 일정한 구체예에서, 제한 없이 심근 경색 (심장 마비), 폐색전, 뇌혈관 사건, 예를 들면, 뇌졸중, 말초 동맥 폐쇄성 질환 (peripheral artery occlusive disease) (가령, 괴저), 휴즈 증후군 (antiphospholipid syndrome), 패혈증, 거대 세포 동맥염 (giant-cell arteritis, GCA), 탈장 (hernia), 그리고 장염전 (volvulus)을 비롯하여, 경색과 연관된 질환 또는 장애를 치료하거나 예방하는 방법이 제시된다. 한 구체예에서, 치료하거나 예방하는 방법은 본 발명에서 제시된 A13 또는 rA13 제제의 투여를 포함한다.
한 측면에서, 본 발명에서는 높은 안정성 및/또는 높은 비활성을 갖는 A13 또는 rA13을 조제하는 방법을 제시한다. 일정한 구체예에서, 이들 방법은 제약학적 투여에 바람직한 높은 비활성을 상실하지 않으면서 적어도 대략 37℃까지의 온도에서 연장된 기간 동안 저장될 수 있는 용액과 동결건조물을 조제하는데 유용하다.
다른 측면에서, A13 또는 rA13의 제약학적 투여를 위한 키트가 본 발명에서 제시된다. 본 발명의 키트는 일정한 구체예에서, 연장된 기간 동안 저장될 수 있는 액체 또는 동결건조된 제제를 포함할 수 있다.
본 발명의 상세한 설명
I. 도입
ADAMTS13은 폰 빌레브란트 인자 (VWF) 다합체를 절단하고 혈소판 집합에서 그들의 활성을 하향 조절하는 혈장 금속단백질분해효소이다. 혈전성 혈소판감소성 자반증 (TTP)은 특이하게 크고, 지혈적으로 과잉 활동성인 폰 빌레브란트 인자 (VWF), 그리고 ADAMTS-13의 심각한 결핍과 연관된 중증 질환이다. 재조합 ADAMTS13 산물 후보는 ADAMTS13 결핍 유발된 TTP의 치료를 위한 재조합 단백질 치환 요법으로서 개발되었다 (Plaimauer and Scheiflinger, Semin Hematol. 2004 Jan;41(1):24-33; Plaimauer B et al., F. Blood. 2002 Nov 15;100(10):3626-32. Epub 2002 Jul 12; 그리고 Bruno K et al., J Thromb Haemost. 2005 May;3(5):1064-73, 이들의 내용은 본 발명에 순전히 참조로서 편입된다).
본 발명은 International Conference on Harmonisation of Technical Requirements of Pharmaceuticals for Human Use에 의해 규정된 요건을 충족하는 증가된 안정성을 갖는 정제된 ADAMTS 단백질의 액체 및 동결건조된 제제의 발견에 부분적으로 기초된다 (ICH Guideline, PHARMACEUTICAL DEVELOPMENT Q8(R2), 2005).
VWF의 지혈 활성은 다합체의 크기에 크게 의존한다. 혈장 금속단백질분해효소 ADAMTS13은 VWF의 다합체성 크기를 생리학적으로 조절하는 확인된 주요 단백질분해효소이다. ADAMTS13은 VWF의 A2 도메인 내에 Tyr 1605와 Met 1606 사이를 절단하여 순환계에서 관찰되는 176 kDa와 140 kDa의 전형적인 절단 단편 및 더욱 작은 VWF 다합체를 산출한다. 인간 ADAMTS13 유전자는 29개 엑손을 내포하고, 그리고 염색체 9q34 상에서 대략 37 kb에 걸친다. 4.7 kb 전사체는 간 성상 세포 (hepatic stellate cell)에서뿐만 아니라, 혈관 내피 세포와 혈소판 내에서 주로 합성되고, 그리고 1427개 아미노산 잔기의 일차 번역 산물을 인코딩한다. 전구체 ADAMTS13 폴리펩티드는 신호 펩티드, 그리고 C-말단에서 절단을 위한 잠재적 푸린 (furin) 부위로 종결하고, 그 이후에 성숙 VWF-절단 단백질분해효소의 서열이 뒤따르는 프로펩티드로 구성된다. 성숙 ADAMTS13 폴리펩티드 (1353개 아미노산 잔기)는 모든 ADAMTS 패밀리 구성원에 특징적인 구조적 특성을 포함한다: 레프롤리신 (reprolysin)-유사 금속단백질분해효소 도메인, 디스인테그린-유사 도메인, 중심 트롬보스폰딘 타입 1 (TSP1) 반복부, 아마도 인테그린 상호작용에 중요한 RGD 모티프를 품는 시스테인-풍부한 도메인, 그리고 스페이서 도메인, 그 이후에 7개 연속 TSP1 반복부의 독특한 조합 (TSP1/#2-8) 및 2개의 CUB 도메인 (도 26).
성숙 ADAMTS13은 대략 145 kDa의 계산된 분자 질량을 갖고, 반면 정제된 혈장-유래된 ADAMTS13은 아마도, 10개의 잠재적 N-당화 부위에 대한 현재의 공통 서열, 그리고 TSP1 반복부 내에서 여러 O-당화 부위 및 하나의 C-만노실화 (mannosylation) 부위와 일치하는 번역후 변형에 기인한 대략 180 kDa의 겉보기 분자 질량을 갖는다. ADAMTS13의 VWF-단백질분해 활성은 이가 양이온 (divalent cation)에 크게 의존한다. 금속단백질분해효소 도메인 내에서 활성 부위 모티프는 촉매 Zn2+ 이온을 조화시키는 3개의 히스티딘 잔기 및 Glu 83, Asp 173, Cys 281과 Asp 284에 의해 조화되는 것으로 제안된 예측된 칼슘 결합 부위와 함께, 고도로 보존된 HEXXHXXGXXHD 모티프를 내포한다. 이들 ADAMTS13 도메인의 기능적 역할은 주로, 시험관내 분석평가 시스템을 이용하여 조사되었는데, 금속단백질분해효소에서부터 스페이서 도메인까지 N-말단 영역이 VWF-절단에 결정적인 것으로 밝혀졌다. C-말단 TSP1 반복부 및 CUB 도메인은 VWF 기질 인식, 그리고 내피 세포 상에서 CD36과 같은 잠재적 표면 수용체에 대한 결합에 중요한 것으로 생각된다.
단백질 제제 개발의 한 가지 주요 산물은 개별 단백질의 비활성화 경로 및 집합 또는 분해 경로의 확인이다. 1주 이내에 재조합 인간 ADAMTS13 단백질의 완전한 시간-의존성 비활성화는 40℃에서 액체 제제에서 FRETS 활성 분석평가에 의해 관찰되었다. 본 발명에서 개시된 바와 같이, 이러한 비활성화는 2 mM Ca2+의 존재에서 감소될 수 있는 것으로 밝혀졌다. 25℃에서, FRETS 활성은 Ca2+의 존재에서 더 이상 감소하지 않았다. 4℃에서, 액체 ADAMTS13 제제 활성은 Ca2+의 부재에서 24주 동안 안정하였다.
게다가, 동일한 동결건조된 제제에서, 상기 제제가 Ca2+의 부재에서 40℃에서 저장될 때, 비활성화가 약간 일어나거나, 또는 전혀 일어나지 않는 것으로 밝혀졌다. 2 mM 또는 4 mM Ca2+의 첨가는 40℃에서 안정성에 영향을 주지 않았다.
따라서 본 발명자들은 액체 제제 내에서 ADAMTS13 단백질의 시간-의존성 집합 (가령, 40℃에서 저장됨)이 분해 및/또는 효소 활성의 상실에 주요 유인이라는 것을 발견하였다. 중요하게는, 본 발명에서 제시된 바와 같이, 이러한 집합은 동결건조에 의해 및/또는 액체 제제에 Ca2+의 첨가에 의해 실질적으로 감소될 수 있다. 부가적으로, 비-이온성 계면활성제 (가령, 0.05% Tween 80)의 첨가는 동결건조된 제제 내에서 ADAMTS13 집합체의 형성을 감소시키는 것으로 밝혀졌다. 더 나아가, 하나 또는 그 이상의 당 및/또는 당알코올의 존재는 동결건조 동안 ADAMTS13을 유의미하게 안정화시키고 향상된 동결덩어리의 형성을 조력하는 것으로 밝혀졌다.
II. 정의
본 명세서에서, "ADAMTS13" 또는 "A13"은 잔기 Tyr 1605와 Met 1606 사이에서 폰 빌레브란트 인자 (vWF)를 절단하는 ADAMTS (트롬보스폰딘 타입 I 모티프를 갖는 디스인테그린 및 금속단백질분해효소) 패밀리의 금속단백질분해효소를 지칭한다. 본 발명의 맥락에서, ADAMTS13 단백질은 임의의 ADAMTS13 단백질, 예를 들면, 영장류, 인간 (NP_620594), 원숭이, 토끼, 돼지, 소 (XP_610784), 설치류, 생쥐 (NP_001001322), 쥐 (XP_342396), 햄스터, 게르빌, 개, 고양이, 개구리 (NP_001083331), 닭 (XP_415435)과 같은 포유동물로부터 ADAMTS13, 그리고 이의 생물학적 활성 유도체를 포함한다. ADAMTS13 단백질의 기능적 단편과 융합 단백질뿐만 아니라, 활성을 갖는 돌연변이체와 변이체 ADAMTS13 단백질 역시 포함된다. 게다가, 본 발명의 ADAMTS13 단백질은 정제, 검출, 또는 둘 모두를 용이하게 하는 태그 (tag)를 더욱 포함할 수 있다. 본 명세서에서 기술된 ADAMTS13 단백질은 치료 모이어티 (therapeutic moiety) 또는 시험관내 또는 생체내 이미징 (imaging)에 적합한 모이어티로 더욱 변형될 수 있다.
인간 ADAMTS13 단백질에는 제한 없이, GenBank 수탁 번호 NP_620594의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 또는 이의 가공된 폴리펩티드, 예를 들면, 신호 펩티드 (아미노산 1 내지 29) 및/또는 프로펩티드 (아미노산 30-74)가 제거된 폴리펩티드가 포함된다. 인간 ADAMTS13의 많은 자연 변이체는 당분야에 공지되어 있고, 그리고 본 발명의 제제에 포함되는데, 이들 중에서 일부는 R7W, V88M, H96D, R102C, R193W, T196I, H234Q, A250V, R268P, W390C, R398H, Q448E, Q456H, P457L, P475S, C508Y, R528G, P618A, R625H, I673F, R692C, A732V, E740K, A900V, S903L, C908Y, C951G, G982R, C1024G, A1033T, R1095W, R1095W, R1123C, C1213Y, T1226I, G1239V, 그리고 R1336W에서 선택되는 돌연변이를 포함한다. 부가적으로, ADAMTS13 단백질에는 예로써, 비-필수 아미노산에서 하나 또는 그 이상의 보존성 돌연변이에 의해 돌연변이된 자연과 재조합 단백질이 포함된다. 바람직하게는, ADAMTS13의 효소 활성에 필수적인 아미노산은 돌연변이되지 않을 것이다. 이들에는 예로써, 금속 결합 (metal binding)에 필수적인 것으로 알려져 있거나 추정되는 잔기, 예를 들면, 잔기 83, 173, 224, 228, 234, 281, 그리고 284, 그리고 상기 효소의 활성 부위에서 관찰되는 잔기, 예를 들면, 잔기 225가 포함된다. 유사하게, 본 발명의 맥락에서, ADAMTS13 단백질에는 대안적 동종형 (alternate isoform), 예를 들면, 전장 인간 단백질의 아미노산 275 내지 305 및/또는 1135 내지 1190이 없는 동종형이 포함된다.
본 명세서에서, 용어 "생물학적 활성 유도체"는 ADAMTS13과 실질적으로 동일한 생물학적 기능을 갖는 임의의 폴리펩티드를 지칭한다. 생물학적 활성 유도체의 폴리펩티드 서열은 부재, 존재 및/또는 치환이 각각, 폴리펩티드의 생물학적 활성에 실질적인 부정적인 영향을 주지 않는 하나 또는 그 이상의 아미노산의 결실, 부가 및/또는 치환을 포함할 수 있다. 이들 폴리펩티드의 생물학적 활성은 예로써, 내피 세포층에 혈소판 부착의 감소 또는 지연, 혈소판 집합의 감소 또는 지연, 혈소판 선 (platelet string)의 형성의 감소 또는 지연, 혈전 형성의 감소 또는 지연, 혈전 성장의 감소 또는 지연, 혈관 폐색증의 감소 또는 지연, vWF의 단백질분해 절단, 혈전의 붕괴, 또는 펩티드 기질, 예를 들면, FRETS-VWF73 펩티드 (Kokame et al., Br J Haematol. 2005 Apr;129(1):93-100) 또는 이의 변이체의 절단에 의해 측정될 수 있다.
유사하게, ADAMTS13 단백질은 예로써, 번역후 변형 (가령, 인간 잔기 142, 146, 552, 579, 614, 667, 707, 828, 1235, 1354, 또는 임의의 다른 자연 또는 가공된 변형 부위에서 선택되는 하나 또는 그 이상의 아미노산에서 당화)에 의해, 또는 제한 없이, 당화, 물 용해성 중합체에 의한 변형 (가령, PEG화, 시알릴화, HESylation 등), 태그 표식 (tagging) 등을 비롯한 탈체 화학적 또는 효소 변형에 의해 더욱 변형될 수 있다.
본 명세서에서, "1 단위의 ADAMTS13 활성"은 이용되는 검사법에 상관없이, 1 ㎖의 모아진 정상적인 인간 혈장에서 활성의 양으로서 정의된다. 가령, 1 단위의 ADAMTS13 FRETS-VWF73 활성은 1 ㎖의 모아진 정상적인 인간 혈장에 의해 절단될 때와 동일한 양의 FRETS-VWF73 기질을 절단하는데 요구되는 활성의 양이다 (Kokame et al., Br J Haematol. 2005 Apr;129(1):93-100).
본 명세서에서, 용어 "ADAMTS13" 및 "생물학적 활성 유도체"는 각각, 재조합 DNA 기술을 통해 획득된 폴리펩티드 역시 포함한다. 재조합 ADAMTS13 ("rADAMTS13"), 예를 들면, 재조합 인간 ADAMTS13 ("r-hu-ADAMTS13")은 당분야에 공지된 임의의 방법에 의해 생산될 수 있다. 한 가지 특정한 실례는 재조합 ADAMTS13을 생산하는 방법에 대하여 본 발명에 참조로서 편입되는 WO 02/42441에서 개시된다. 여기에는 (i) 예로써, RNA의 역전사 및/또는 DNA의 증폭을 통한 유전자 조작에 의해 재조합 DNA를 생산하고, (ii) 예로써, 전기천공 또는 미세주사를 통한 형질감염에 의해 재조합 DNA를 원핵 또는 진핵 세포 내로 도입하고, (iii) 예로써, 연속식 또는 회분식 방식으로 상기 형질전환된 세포를 배양하고, (iv) 예로써, 구성적으로 또는 도입 시에 ADAMTS13을 발현하고, 그리고 (v) 예로써, 배양 배지로부터 또는 형질전환된 세포를 수확함에 의해 상기 ADAMTS13을 단리하여, (vi) 예로써, 음이온 교환 크로마토그래피 또는 친화성 크로마토그래피를 통해 실질적으로 정제된 재조합 ADAMTS13를 획득하기 위한 당분야에 공지된 임의의 방법이 포함될 수 있다. 용어 "생물학적 활성 유도체"에는 또한, 생물학적/약리학적 특성, 예를 들면, 포유동물, 특히 인간의 순환계 (circulation system) 내에서 ADAMTS13의 반감기 (half life)를 향상시키기 위하여, 키메라 분자, 예를 들면, Ig과 공동으로 ADAMTS13 (또는 이의 생물학적 활성 유도체) 역시 포함된다. Ig는 선택적으로 돌연변이된 Fc 수용체에 대한 결합 부위 역시 보유할 수 있다.
본 명세서에서, 용어 "혈전"은 혈액 덩어리, 특히 혈소판-포함 혈액 덩어리, 미세혈전, 및/또는 색전을 지칭한다. 상기 혈전은 동맥 또는 정맥 혈관에 부착되거나 부착되지 않고, 그리고 동맥 또는 정맥 혈관 내에서 혈류를 부분적으로 또는 완전하게 차단할 수 있다.
본 명세서에서, 용어 "비타민 B3", "니코틴아미드", "니아신아미드", "니아신", 그리고 "니코틴산"은 비타민의 B3 패밀리의 임의의 구성원을 지칭하는데 교체가능하게 이용될 수 있다.
본 명세서에서, "치료 효과적인 양 또는 용량" 또는 "충분한 양 또는 용량"은 투여의 목적 효과를 산출하는 용량을 지칭한다. 정확한 용량은 치료의 목적에 좌우되고, 그리고 공지된 기술을 이용하여 당업자에 의해 확인될 수 있을 것이다 (참조: Lieberman, Pharmaceutical Dosage Forms (vols. 1-3, 1992); Lloyd, The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding (1999); Pickar, Dosage Calculations (1999); 그리고 Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th Edition, 2003, Gennaro, Ed., Lippincott, Williams & Wilkins).
본 명세서에서, 염의 "생리학적 농도"는 대략 100 mM 내지 대략 200 mM의 제약학적으로 허용되는 염의 염 농도를 지칭한다. 제약학적으로 허용되는 염의 무제한적 실례에는 제한 없이, 염화나트륨과 염화칼륨, 아세트산나트륨과 칼륨, 구연산나트륨과 칼륨, 인산나트륨과 칼륨이 포함된다.
본 명세서에서, 염의 "하위-생리학적 농도"는 제약학적으로 허용되는 염의 대략 100 mM 이하의 염 농도를 지칭한다. 바람직한 구체예에서, 염의 하위-생리학적 농도는 제약학적 염의 대략 80 mM 이하이다. 다른 바람직한 구체예에서, 염의 하위-생리학적 농도는 제약학적 염의 대략 60 mM 이하이다.
본 명세서에서, 용어 "대략"은 명시된 값으로부터 플러스 또는 마이너스 10%의 근사 범위 (approximate range)를 나타낸다. 가령, 용어 "대략 20%"는 18-22%의 범위를 포함한다. 본 명세서에서, 대략은 또한, 정확한 양을 포함한다. 따라서 "대략 20%"은 "대략 20%" 및 "20%"를 의미한다.
본 명세서에서, "저장"은 제제가 일단 제조되면 개체에 즉시 투여되지 않고, 사용에 앞서 특정 조건 (가령, 특정 온도 등) 하에 일정한 기간 동안 유지된다는 것을 의미한다. 가령, 액체 또는 동결건조된 제제는 변화된 온도, 예를 들면, 냉동 온도 (0℃ 내지 10℃) 또는 실온 (가령, 32℃까지의 온도) 하에 개체에 투여에 앞서, 수일, 수주, 수개월 또는 수년 동안 유지될 수 있다.
본 명세서에서, 용어 "화학적으로 정의된 배지"는 모든 성분의 실체와 농도가 알려져 있는 합성 성장 배지를 지칭한다. 화학적으로 정의된 배지는 비록 그들이 개별 식물 또는 동물-유래된 성분 (가령, 단백질, 폴리펩티드 등)을 포함하거나 포함하지 않을 수 있지만, 세균, 효모, 동물, 또는 식물 추출물을 내포하지 않는다. 상업적으로 구입가능한 화학적으로 정의된 배지의 무제한적 실례에는 다양한 EX-CELL® 배지 (SAFC Biosciences, Inc), 다양한 Dulbecco의 변형된 Eagle (DME) 배지 (Sigma-Aldrich Co; SAFC Biosciences, Inc), Ham의 영양 혼합물 (Sigma-Aldrich Co; SAFC Biosciences, Inc) 등이 포함된다. 화학적으로 정의된 배양 배지를 제조하는 방법은 당분야에서, 예를 들면, U.S. Patent Number 6,171,825와 6,936,441, WO 2007/077217, 그리고 U.S. Patent Application Publication Number 2008/0009040과 2007/0212770에서 공지되어 있고, 이들의 내용은 본 발명에 참조로서 편입된다.
본 명세서에서, 용어 "올리고펩티드-없는 배양 배지"는 올리고펩티드, 예를 들면, 단백질 가수분해물로부터 유래된 올리고펩티드를 포함하지 않는 단백질-없는 배지를 지칭한다. 한 구체예에서, 배지는 20개 또는 그 이상의 아미노산을 갖는 올리고펩티드를 포함하지 않는다. 본 발명의 한 구체예에서, 배지는 15개 또는 그 이상의 아미노산을 갖는 올리고펩티드를 포함하지 않는다. 본 발명의 다른 구체예에서, 배지는 10개 또는 그 이상의 아미노산을 갖는 올리고펩티드를 포함하지 않는다. 한 구체예에서, 배지는 7개 또는 그 이상의 아미노산을 갖는 올리고펩티드를 포함하지 않는다. 다른 구체예에서, 배지는 5개 또는 그 이상의 아미노산을 갖는 올리고펩티드를 포함하지 않는다. 또 다른 구체예에서, 배지는 3개 또는 그 이상의 아미노산을 갖는 올리고펩티드를 포함하지 않는다. 본 발명의 다른 구체예에 따라, 배지는 2개 또는 그 이상의 아미노산을 갖는 올리고펩티드를 포함하지 않는다. 올리고펩티드-없는 배양 배지를 제조하는 방법은 당분야에서, 예를 들면, U.S. Patent Number 6,171,825와 6,936,441, WO 2007/077217, 그리고 U.S. Patent Application Publication Number 2008/0009040과 2007/0212770에서 공지되어 있고, 이들의 내용은 본 발명에 순전히 참조로서 편입된다.
본 명세서에서, 용어 "혈청-없는 배양 배지"는 동물 혈청으로 보충되지 않은 배양 배지를 지칭한다. 비록 종종 혈청-없는 배지가 화학적으로 정의된 배지이긴 하지만, 혈청-없는 배지는 별개의 동물 또는 식물 단백질 또는 단백질 분획물로 보충될 수도 있다. 혈청-없는 배양 배지를 제조하는 방법은 당분야에서, 예를 들면, U.S. Patent Number 6,171,825와 6,936,441, WO 2007/077217, 그리고 U.S. Patent Application Publication Number 2008/0009040과 2007/0212770에서 공지되어 있고, 이들의 내용은 본 발명에 순전히 참조로서 편입된다.
본 명세서에서, 용어 "동물 단백질-없는 배양 배지"는 동물 혈청, 단백질, 또는 단백질 분획물로 보충되지 않은 배양 배지를 지칭한다. 비록 종종 동물 단백질-없는 배양 배지가 화학적으로 정의된 배지이긴 하지만, 동물 단백질-없는 배양 배지는 식물 또는 효모 가수분해물을 내포할 수도 있다. 동물 단백질-없는 배양 배지를 제조하는 방법은 당분야에서, 예를 들면, U.S. Patent Number 6,171,825와 6,936,441, WO 2007/077217, 그리고 U.S. Patent Application Publication Number 2008/0009040과 2007/0212770에서 공지되어 있고, 이들의 내용은 본 발명에 순전히 참조로서 편입된다.
"발현 벡터"는 숙주 세포 내에서 특정 핵산의 전사를 가능하게 하는 일련의 명시된 핵산 요소로 재조합적으로 또는 합성적으로 산출된 핵산 구조체이다. 발현 벡터는 플라스미드, 바이러스, 또는 핵산 단편의 일부일 수 있다. 전형적으로, 발현 벡터는 프로모터에 작동가능하게 연결된, 전사되는 핵산을 포함한다.
핵산의 일부분과 관련하여 이용될 때 용어 "이종기원성"은 상기 핵산이 현실적으로 서로에 동일한 상관관계로 발견되지 않는 2개 또는 그 이상의 하위서열을 포함한다는 것을 지시한다. 가령, 핵산은 전형적으로 재조합적으로 생산되고, 새로운 기능적 핵산을 만들기 위하여 정렬된 관계없는 유전자로부터 2개 또는 그 이상의 서열, 예를 들면, 한 출처로부터 프로모터 및 다른 출처로부터 코딩 영역을 갖는다. 유사하게, 이종기원성 단백질은 상기 단백질이 현실적으로 서로에 동일한 상관관계로 발견되지 않는 2개 또는 그 이상의 하위서열을 포함한다는 것을 지시한다 (가령, 융합 단백질).
"프로모터"는 핵산의 전사를 주도하는 핵산 제어 서열의 어레이로서 정의된다. 본 명세서에서, 프로모터는 전사의 시작 부위 근처에 필요한 핵산 서열, 예를 들면, 중합효소 II 타입 프로모터의 경우에, TATA 요소를 포함한다. 프로모터는 또한, 선택적으로 전사의 시작 부위로부터 수천 개의 염기쌍만큼 떨어져 위치할 수 있는 원위 인핸서 또는 리프레서 요소를 포함한다. "구조성" 프로모터는 대부분의 환경과 발달 조건 하에 활동성인 프로모터이다. "유도성" 프로모터는 환경 또는 발달 조절 하에 활동성인 프로모터이다. 용어 "작동가능하게 연결된"은 핵산 발현 제어 서열 (가령, 프로모터, 또는 전사 인자 결합 부위의 어레이) 및 두 번째 핵산 서열 사이에 기능적 연쇄를 지칭하는데, 여기서 발현 제어 서열은 두 번째 서열에 상응하는 핵산의 전사를 주도한다.
III. ADAMTS13 조성물과 제제
한 측면에서, 본 발명에서는 ADAMTS13 (A13)과 rADAMTS13 (rA13) 단백질의 안정화된 제제를 제시한다. 한 구체예에서, 본 발명의 제제는 적어도 대략 40℃까지의 온도에서 적어도 대략 6개월 동안 저장될 때 안정하다. 다른 구체예에서, 본 발명에서 제시된 제제는 연장된 기간 동안 저장될 때 유의미한 ADAMTS13 활성을 유지한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 제제는 ADAMTS13 단백질의 이합체화, 소중합화, 및/또는 집합을 감소시키거나 지체시킨다.
한 구체예에서, 본 발명에서는 치료 효과적인 양 또는 용량의 ADAMTS13 단백질, 하위-생리학적 내지 생리학적 농도의 제약학적으로 허용되는 염, 안정화 농도의 하나 또는 그 이상의 당 및/또는 당알코올, 비-이온성 계면활성제, 제제에 중성 pH를 제공하는 완충제, 그리고 선택적으로 칼슘 및/또는 아연 염을 포함하는 ADAMTS13 제제를 제시한다. 일반적으로, 본 발명에서 제시된 안정화된 A13 제제는 제약학적 투여에 적합하다. 바람직한 구체예에서, A13 단백질은 인간 ADAMTS13 또는 생물학적 활성 유도체 또는 이의 단편이다.
일정한 구체예에서, ADAMTS13 제제는 액체 제제이다. 다른 구체예에서, ADAMTS13 제제는 본 발명에서 제시된 바와 같이 액체 제제로부터 동결건조되는 동결건조된 제제이다.
본 발명에서 제시된 제제의 일정한 구체예에서, ADAMTS13 단백질은 인간 ADAMTS13 (hA13) 또는 재조합 인간 ADAMTS13 (rhA13), 또는 이의 생물학적 활성 유도체 또는 단편이다. 한 구체예에서, hA13의 아미노산 서열은 GenBank 수탁 번호 NP_620594의 아미노산 서열이다. 다른 구체예에서, hA13의 아미노산 서열은 NP_620594의 아미노산 75 내지 1427, 이의 자연 또는 보존성 변이체, 또는 이의 생물학적 활성 단편을 포함한다.
일정한 구체예에서, ADAMTS13은 대략 0.05 ㎎/㎖ 내지 대략 10 ㎎/㎖의 치료 효과적인 용량으로 제공된다. 다른 구체예에서, ADAMTS13은 대략 0.1 ㎎/㎖ 내지 대략 10 ㎎/㎖의 농도로 존재한다. 또 다른 구체예에서, ADAMTS13은 대략 0.1 ㎎/㎖ 내지 대략 5 ㎎/㎖의 농도로 존재한다. 다른 구체예에서, ADAMTS13은 대략 0.1 ㎎/㎖ 내지 대략 2 ㎎/㎖의 농도로 존재한다. 또 다른 구체예에서, ADAMTS13은 대략 0.01 ㎎/㎖, 또는 대략 0.02 ㎎/㎖, 0.03 ㎎/㎖, 0.04 ㎎/㎖, 0.05 ㎎/㎖, 0.06 ㎎/㎖, 0.07 ㎎/㎖, 0.08 ㎎/㎖, 0.09 ㎎/㎖, 0.1 ㎎/㎖, 0.2 ㎎/㎖, 0.3 ㎎/㎖, 0.4 ㎎/㎖, 0.5 ㎎/㎖, 0.6 ㎎/㎖, 0.7 ㎎/㎖, 0.8 ㎎/㎖, 0.9 ㎎/㎖, 1.0 ㎎/㎖, 1.1 ㎎/㎖, 1.2 ㎎/㎖, 1.3 ㎎/㎖, 1.4 ㎎/㎖, 1.5 ㎎/㎖, 1.6 ㎎/㎖, 1.7 ㎎/㎖, 1.8 ㎎/㎖, 1.9 ㎎/㎖, 2.0 ㎎/㎖, 2.5 ㎎/㎖, 3.0 ㎎/㎖, 3.5 ㎎/㎖, 4.0 ㎎/㎖, 4.5 ㎎/㎖, 5.0 ㎎/㎖, 5.5 ㎎/㎖, 6.0 ㎎/㎖, 6.5 ㎎/㎖, 7.0 ㎎/㎖, 7.5 ㎎/㎖, 8.0 ㎎/㎖, 8.5 ㎎/㎖, 9.0 ㎎/㎖, 9.5 ㎎/㎖, 10.0 ㎎/㎖, 또는 더욱 높은 농도로 존재할 수 있다. 한 구체예에서, 상대적으로 순수한 ADAMTS13 제제의 농도는 분광학 (즉, A280에서 측정된 총 단백질) 또는 기타 벌크 결정 (bulk determination) (가령, Bradford 검사법, 은 염색 (silver stain), 동결건조된 분말의 무게 등)에 의해 결정될 수 있다. 다른 구체예에서, ADAMTS13의 농도는 ADAMTS13 ELISA 검사법 (가령, ㎎/㎖ 항원)에 의해 결정될 수 있다.
또 다른 구체예에서, 본 발명에서 제시된 제제 내에서 ADAMTS13의 농도는 효소 활성의 수준으로서 표시될 수 있다. 가령, 한 구체예에서 ADAMTS13 제제는 대략 10 단위의 FRETS-VWF73 활성 및 대략 10,000 단위의 FRETS-VWF73 활성 또는 기타 적절한 A13 효소 단위 (IU)를 내포할 수 있다. 다른 구체예에서, 제제는 대략 20 단위의 FRETS-VWF73 (UFV73) 활성 내지 대략 8,000 단위의 FRETS-VWF73 활성, 또는 대략 30 UFV73 내지 대략 6,000 UFV73, 또는 대략 40 UFV73 내지 대략 4,000 UFV73, 또는 대략 50 UFV73 내지 대략 3,000 UFV73, 또는 대략 75 UFV73 내지 대략 2,500 UFV73, 또는 대략 100 UFV73 내지 대략 2,000 UFV73, 또는 대략 200 UFV73 내지 대략 1,500 UFV73, 또는 그 안에 대략 다른 범위를 내포할 수 있다. 바람직한 구체예에서, 본 발명에서 제시된 ADAMTS13 제제는 대략 150 내지 대략 600 UFV73을 내포한다. 일정한 구체예에서, 제제는 대략 10 단위의 FRETS-VWF73 활성, 또는 대략 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, 900, 1,000, 1,100, 1,200, 1,300, 1,400, 1,500, 1,600, 1,700, 1,800, 1,900, 2,000, 2,100, 2,200, 2,300, 2,400, 2,500, 2,600, 2,700, 2,800, 2,900, 3,000, 3,100, 3,200, 3,300, 3,400, 3,500, 3,600, 3,700, 3,800, 3,900, 4,000, 4,100, 4,200, 4,300, 4,400, 4,500, 4,600, 4,700, 4,800, 4,900, 5,000, 5,100, 5,200, 5,300, 5,400, 5,500, 5,600, 5,700, 5,800, 5,900, 6,000, 6,100, 6,200, 6,300, 6,400, 6,500, 6,600, 6,700, 6,800, 6,900, 7,000, 7,100, 7,200, 7,300, 7,400, 7,500, 7,600, 7,700, 7,800, 7,900, 8,000, 8,100, 8,200, 8,300, 8,400, 8,500, 8,600, 8,700, 8,800, 8,900, 9,000, 9,100, 9,200, 9,300, 9,400, 9,500, 9,600, 9,700, 9,800, 9,900, 10,000 또는 그 이상 단위의 FRETS-VWF73 활성을 내포한다.
유사하게, 일정한 구체예에서, ADAMTS13의 농도는 단위 부피당 효소 활성, 예를 들면, ㎖당 A13 효소 단위 (IU/㎖)로서 표시될 수 있다. 가령, 한 구체예에서 ADAMTS13 제제는 대략 10 IU/㎖ 내지 대략 10,000 IU/㎖을 내포할 수 있다. 다른 구체예에서, 제제는 대략 20 IU/㎖ 내지 대략 8,000 IU/㎖, 또는 대략 30 IU/㎖ 내지 대략 6,000 IU/㎖, 또는 대략 40 IU/㎖ 내지 대략 4,000 IU/㎖, 또는 대략 50 IU/㎖ 내지 대략 3,000 IU/㎖, 또는 대략 75 IU/㎖ 내지 대략 2,500 IU/㎖, 또는 대략 100 IU/㎖ 내지 대략 2,000 IU/㎖, 또는 대략 200 IU/㎖ 내지 대략 1,500 IU/㎖, 또는 그 안에 대략 다른 범위를 내포할 수 있다. 바람직한 구체예에서, 본 발명에서 제시된 ADAMTS13 제제는 대략 150 IU/㎖ 내지 대략 600 IU/㎖를 내포한다. 다른 바람직한 구체예에서, 본 발명에서 제시된 ADAMTS13 제제는 대략 100 IU/㎖ 내지 대략 1,000 IU/㎖를 내포한다. 일정한 구체예에서, 제제는 대략 10 IU/㎖, 또는 대략 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, 900, 1,000, 1,100, 1,200, 1,300, 1,400, 1,500, 1,600, 1,700, 1,800, 1,900, 2,000, 2,100, 2,200, 2,300, 2,400, 2,500, 2,600, 2,700, 2,800, 2,900, 3,000, 3,100, 3,200, 3,300, 3,400, 3,500, 3,600, 3,700, 3,800, 3,900, 4,000, 4,100, 4,200, 4,300, 4,400, 4,500, 4,600, 4,700, 4,800, 4,900, 5,000, 5,100, 5,200, 5,300, 5,400, 5,500, 5,600, 5,700, 5,800, 5,900, 6,000, 6,100, 6,200, 6,300, 6,400, 6,500, 6,600, 6,700, 6,800, 6,900, 7,000, 7,100, 7,200, 7,300, 7,400, 7,500, 7,600, 7,700, 7,800, 7,900, 8,000, 8,100, 8,200, 8,300, 8,400, 8,500, 8,600, 8,700, 8,800, 8,900, 9,000, 9,100, 9,200, 9,300, 9,400, 9,500, 9,600, 9,700, 9,800, 9,900, 10,000 또는 그 이상의 IU/㎖를 내포한다.
일정한 구체예에서, 본 발명에서 제시된 안정화된 ADAMTS13 제제는 하위-생리학적 내지 생리학적 염 농도, 예를 들면, 0 mM 내지 대략 200 mM의 제약학적으로 허용되는 염을 내포할 것이다. 한 구체예에서, ADAMTS13 제제는 생리학적 농도의 염, 예를 들면, 대략 100 mM 내지 대략 200 mM의 제약학적으로 허용되는 염을 내포할 것이다. 다른 구체예에서, ADAMTS13 제제는 대략 0 mM, 또는 대략 5 mM, 10 mM, 15 mM, 20 mM, 25 mM, 30 mM, 35 mM, 40 mM, 45 mM, 50 mM, 55 mM, 60 mM, 65 mM, 70 mM, 75 mM, 80 mM, 85 mM, 90 mM, 95 mM, 100 mM, 110 mM, 120 mM, 130 mM, 140 mM, 150 mM, 160 mM, 170 mM, 180 mM, 190 mM, 200 mM, 또는 그 이상의 제약학적으로 허용되는 염을 내포할 것이다. 바람직한 구체예에서, 염은 염화나트륨 또는 염화칼륨이다.
유리하게는, 하위-생리학적 농도의 제약학적으로 허용되는 염을 내포하는 ADAMTS13 제제는 부드러운 표면을 갖는 조밀한 동결덩어리를 형성하는 것으로 밝혀졌다. 게다가, ADAMTS13 단백질의 저염 동결건조된 제제는 생리학적 농도의 염으로 제조된 제제와 비교하여 단백질 집합을 감소시키는 것으로 밝혀졌다. 따라서 바람직한 구체예에서, 본 발명에서는 하위-생리학적 농도의 제약학적으로 허용되는 염, 예를 들면, 대략 100 mM 이하의 제약학적으로 허용되는 염을 내포하는 저염 ADAMTS13 제제를 제시한다. 한 구체예에서, 본 발명에서 제시된 저염 ADAMTS13 제제는 대략 100 mM 이하의 제약학적 염을 내포한다. 바람직한 구체예에서, 본 발명에서 제시된 저염 ADAMTS13 제제는 대략 80 mM 이하의 제약학적 염을 내포한다. 다른 바람직한 구체예에서, 본 발명에서 제시된 저염 ADAMTS13 제제는 대략 60 mM 이하의 제약학적 염 (즉, 대략 0 mM 내지 대략 60 mM 염)을 내포한다. 다른 바람직한 구체예에서, 저염 ADAMTS13 제제는 대략 30 mM 내지 대략 60 mM의 제약학적으로 허용되는 염을 내포할 것이다. 또 다른 구체예에서, 저염 ADAMTS13 제제는 대략 0 mM, 또는 대략 5 mM, 10 mM, 15 mM, 20 mM, 25 mM, 30 mM, 35 mM, 40 mM, 45 mM, 50 mM, 55 mM, 60 mM, 65 mM, 70 mM, 75 mM, 80 mM, 85 mM, 90 mM, 95 mM, 또는 100 mM의 제약학적으로 허용되는 염을 내포할 것이다. 바람직한 구체예에서, 저염 ADAMTS13 제제는 동결건조된 제제이다. 바람직한 구체예에서, 염은 염화나트륨 또는 염화칼륨이다.
또한, 중간 정도 수준 (즉, 대략 2% 내지 대략 6%)의 하나 또는 그 이상의 당 및/또는 당알코올의 포함은 부드러운 표면을 갖는 조밀한 동결덩어리의 제조를 조력하고, 그리고 동결건조 시에 ADAMTS13을 안정화시키는데 도움을 주는 것으로 밝혀졌다. 따라서 한 구체예에서, 본 발명에서는 대략 2% 내지 대략 6%의 하나 또는 그 이상의 당 및/또는 당알코올을 내포하는 ADAMTS13 제제를 제시한다. 예로써, 프럭토오스, 글루코오스, 만노오스, 소르보오스, 자일로오스, 말토오스, 락토오스, 수크로오스, 덱스트란, 트레할로스, 풀루란, 덱스트린, 시클로덱스트린, 용해성 전분, 히드록시에틸 전분, 그리고 카르복시메틸셀룰로오스를 비롯한 임의의 당, 예를 들면, 단당류, 이당류, 또는 다당류, 또는 물-용해성 글루칸이 이용될 수 있다. 특정 구체예에서, 수크로오스 또는 트레할로스가 당 첨가제로서 이용된다. 당알코올은 대략 4개 내지 대략 8개 탄소 원자 및 히드록실 기를 갖는 탄화수소로서 정의된다. 본 발명에서 제시된 ADAMTS13 제제에 이용될 수 있는 당알코올의 무제한적 실례에는 만니톨, 소르비톨, 이노시톨, 갈락티톨, 둘시톨, 자일리톨, 그리고 아라비톨이 포함된다. 한 구체예에서, 만니톨이 당알코올 첨가제로서 이용된다. 바람직한 구체예에서, ADAMTS13 제제는 당과 당알코올 첨가제를 모두 포함한다.
당과 당알코올은 개별적으로 또는 조합으로 이용될 수 있다. 일부 구체예에서, 당, 당알코올, 또는 이들의 조합은 제제 내에서 대략 0.5% 내지 대략 7%의 농도로 존재할 것이다. 한 구체예에서, 제제의 당 및/또는 당알코올 함량은 대략 0.5% 내지 대략 5%일 것이다. 일정한 구체예에서, 당, 당알코올, 또는 이들의 조합은 대략 1% 내지 대략 5%의 농도로 존재할 것이다. 바람직한 구체예에서, 당, 당알코올, 또는 이들의 조합은 대략 2% 내지 대략 6%의 농도로 존재할 것이다. 다른 바람직한 구체예에서, 당, 당알코올, 또는 이들의 조합은 대략 3% 내지 대략 5%의 농도로 존재할 것이다. 일정한 구체예에서, 최종 농도는 대략 0.5%, 1%, 1.5%, 2%, 2.5%, 3%, 3.5%, 4%, 4.5%, 5%, 5.5%, 6.0%, 6.5%, 또는 7.0% 당, 당알코올, 또는 이들의 조합일 수 있다. 특정 구체예에서, 본 발명에서 제시된 제제는 대략 0.5% 내지 대략 5.0%의 농도에서 당 및 대략 0.5% 내지 대략 5.0%의 농도에서 당알코올을 포함할 수 있다. 당과 당알코올 농도의 임의의 조합이 이용될 수도 있다, 가령, 당은 대략 0.5%, 1%, 1.5%, 2%, 2.5%, 3%, 3.5%, 4%, 4.5%, 5%, 5.5%, 6.0%, 6.5%, 또는 7.0%의 농도로 존재하고, 그리고 당알코올은 대략 0.5%, 1%, 1.5%, 2%, 2.5%, 3%, 3.5%, 4%, 4.5%, 5%, 5.5%, 6.0%, 6.5%, 또는 7.0%의 농도로 존재한다.
유리하게는, 비-이온성 계면활성제의 포함은 ADAMTS13 제제의 집합을 실질적으로 감소시키는 것으로 밝혀졌다. 따라서 한 구체예에서, 안정화 농도의 비-이온성 세정제를 내포하는 ADAMTS13 제제가 제시된다. 본 발명의 제제에 이용될 수 있는 제약학적으로 허용되는 비이온성 계면활성제는 제약 과학의 분야에서 공지되어 있는데, 여기에는 제한 없이, 폴리소르베이트 80 (Tween 80), 폴리소르베이트 20 (Tween 20), 그리고 플루로닉 F-68, 그리고 BRIJ 35, 또는 이들의 혼합물을 비롯한 다양한 폴록사머 (poloxamer) 또는 플루로닉 (pluronic)이 포함된다. 바람직한 구체예에서, 본 발명의 제약학적 제제에 이용되는 비이온성 계면활성제는 폴리소르베이트 80이다. 일정한 구체예에서, 계면활성제는 본 발명에서 제시된 제제에서, 대략 0.001% 내지 대략 0.2%의 농도로 이용될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 계면활성제는 대략 0.01% 내지 대략 0.1%의 농도로 이용된다. 다른 바람직한 구체예에서, 계면활성제는 대략 0.05%의 농도로 이용된다. 가령, 일정한 구체예에서, 상기 제제는 대략 0.001%, 0.005%, 0.01%, 0.02%, 0.03%, 0.04%, 0.05%, 0.06%, 0.07%, 0.08%, 0.09%, 0.1%, 0.125%, 0.15%, 0.175%, 0.2% 등의 농도에서 비이온성 계면활성제를 포함할 수 있다.
게다가, ADAMTS13 제제는 대략 6.5 내지 대략 7.5의 중성 pH에서 조제될 때 안정화되는 것으로 밝혀졌다. 따라서 일정한 구체예에서, 제제를 중성 pH에 유지시키는데 적합한 완충제를 내포하는 ADAMTS13 제제가 제시된다. 제약학적으로 허용되는 완충제는 당분야에 널리 공지되어 있는데, 여기에는 제한 없이, 인산염 완충액, 히스티딘, 구연산나트륨, HEPES, Tris, Bicine, 글리신, N-글리실글리신, 아세트산나트륨, 탄산나트륨, 글리실글리신, 리신, 아르기닌, 인산나트륨, 그리고 이들의 혼합물이 포함된다. 바람직한 구체예에서, 완충액은 히스티딘, 인산염 완충액, HEPES, 그리고 구연산나트륨에서 선택된다. 한 가지 바람직한 구체예에서, 완충액은 히스티딘 또는 HEPES이다. 특정 구체예에서, 완충액은 히스티딘이다. 다른 특정 구체예에서, 완충액은 HEPES이다. 한 구체예에서, 본 발명에서 제시된 제제의 pH는 대략 6.5 내지 대략 9.0이다. 일정한 구체예에서, 상기 제제의 pH는 대략 6.5 또는 대략 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7.0, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9, 8.0, 8.1, 8.2, 8.3, 8.4, 8.5, 8.6, 8.7, 8.8, 8.9, 또는 9.0이다. 바람직한 구체예에서, A13 제제의 pH는 대략 6.0 내지 대략 8.0이다. 더욱 바람직한 구체예에서, A13 제제의 pH는 대략 6.5 내지 대략 7.5이다. 특정 구체예에서, A13 제제의 pH는 대략 7.0이다. 다른 특정 구체예에서, A13 제제의 pH는 7.0±0.2이다.
또한, 본 발명에서 칼슘의 포함은 ADAMTS13 제제를 더욱 안정화시키는 것으로 증명된다. 따라서 일정한 구체예에서, 대략 0.5 mM 내지 대략 20 mM 칼슘 (가령, 염화칼슘)을 내포하는 안정화된 ADAMTS13 제제가 제시된다. 임의의 제약학적으로 허용되는 칼슘 염이 본 발명에서 제시된 제제에 이용될 수 있다. 이용될 수 있는 칼슘 염의 무제한적 실례에는 예로써, CaCl2, CaCO3, Ca(C6H11O7)2, Ca3(PO4)2, Ca(C18H35O2)2 등이 포함된다. 한 구체예에서, 칼슘은 본 발명의 ADAMTS13 제제 내에서 대략 0.5 mM 내지 대략 10 mM의 농도로 존재한다. 다른 구체예에서, 칼슘은 ADAMTS13 제제 내에서 대략 2 mM 내지 대략 5 mM의 농도로 존재한다. 바람직한 구체예에서, 칼슘은 ADAMTS13 제제 내에서 대략 2 mM 내지 대략 4 mM의 농도로 존재한다. 일정한 구체예에서, 칼슘의 농도는 대략 0.5 mM, 또는 대략 1 mM, 2 mM, 3 mM, 4 mM, 5 mM, 6 mM, 7 mM, 8 mM, 9 mM, 10 mM, 11 mM, 12 mM, 13 mM, 14 mM, 15 mM, 16 mM, 17 mM, 18 mM, 19 mM, 또는 20 mM이다. 특정 구체예에서, 칼슘의 농도는 대략 2 mM이다. 다른 바람직한 구체예에서, 칼슘의 농도는 대략 3 mM이다. 또 다른 바람직한 구체예에서, 칼슘의 농도는 대략 4 mM이다.
유사하게, 일정한 조건 하에, 아연의 포함은 본 발명에서 제시된 바와 같이 ADAMTS13 제제를 더욱 안정화시키는 것으로 밝혀졌다. 가령, 도 34에서는 대략 2 μM 내지 대략 10 μM 아연의 포함이 칼슘 내포 ADAMTS13 제제를 더욱 안정화시킨다는 것을 보여준다. 임의의 제약학적으로 허용되는 아연 염이 본 발명에서 제시된 제제에서 이용될 수 있다. 이용될 수 있는 아연 염의 무제한적 실례에는 예로써, ZnSO4ㆍ7H2O, ZnSO3ㆍ2H2O, Zn3(PO4)2, 그리고 (C6H5O7)2Zn3ㆍ2H2O 등이 포함된다. 한 구체예에서, ZnSO4가 본 발명에서 제시된 ADAMTS13 제제에 이용된다. 일부 구체예에서, 아연은 본 발명의 ADAMTS13 제제 내에서 대략 0.5 μM 내지 대략 20.0 μM의 농도로 존재한다. 바람직한 구체예에서, 아연은 대략 0.5 μM 내지 대략 10.0 μM의 농도로 ADAMTS13 제제에 포함된다. 일정한 구체예에서, 아연의 농도는 대략 0.5 μM, 또는 대략 1 μM, 2 μM, 3 μM, 4 μM, 5 μM, 6 μM, 7 μM, 8 μM, 9 μM, 또는 10 μM이다.
일부 구체예에서, 본 발명에서 제시된 ADAMTS13 제제는 하나 또는 그 이상의 제약학적으로 허용되는 부형제, 담체, 및/또는 희석제를 더욱 포함할 수 있다. 이에 더하여, 본 발명에서 제시된 제제는 다른 의약 작용제, 담체, 어쥬번트, 희석제, 조직 침투 강화제, 용해화제 등을 더욱 포함할 수 있다. 제약학적 투여를 위한 조성물과 제제를 제조하는 방법은 당업자에게 공지되어 있다 (Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA (1990))).
한 구체예에서, 본 발명에서 제시된 ADAMTS13 제제는 대략 200 mOsmol/ℓ 내지 대략 400 mOsmol/ℓ의 범위, 또는 대략 250 내지 대략 350 mOsmol/ℓ의 범위에서 긴장성 (tonicity)을 가질 것이다. 일정한 구체예에서, 본 발명에서 제시된 ADAMTS13 제제는 예로써, 대략 200 mOsmol/ℓ, 또는 대략 210 mOsmol/ℓ, 220 mOsmol/ℓ, 230 mOsmol/ℓ, 240 mOsmol/ℓ, 250 mOsmol/ℓ, 260 mOsmol/ℓ, 270 mOsmol/ℓ, 280 mOsmol/ℓ, 290 mOsmol/ℓ, 300 mOsmol/ℓ, 310 mOsmol/ℓ, 320 mOsmol/ℓ, 330 mOsmol/ℓ, 340 mOsmol/ℓ, 350 mOsmol/ℓ, 360 mOsmol/ℓ, 370 mOsmol/ℓ, 380 mOsmol/ℓ, 390 mOsmol/ℓ, 또는 400 mOsmol/ℓ의 긴장성을 가질 것이다.
본 발명에서 제시된 제제에 이용될 수 있는 긴장성 작용제의 실례에는 제한 없이, 염화나트륨, 덱스트로스, 수크로오스, 자일리톨, 프럭토오스, 글리세롤, 소르비톨, 만니톨, 트레할로스, 염화칼륨, 만노오스, 염화칼슘, 염화마그네슘, 기타 무기 염, 기타 당, 기타 당알코올, 그리고 이들의 조합이 포함된다. 일정한 구체예에서, ADAMTS13 제제는 적어도 하나의 긴장성 작용제, 또는 적어도 2개, 3개, 4개, 5개, 또는 그 이상의 긴장성 작용제를 포함할 수 있다.
본 발명에서 제시된 ADAMTS13 제제는 공지된 방법을 통한 투여, 예를 들면, 예로써, 근육내, 복강내, 뇌척수내, 피하, 관절내, 활액내, 수막강내, 경구, 국소, 또는 흡입 경로에 의해 일시 주사 (bolus)로서 또는 일정한 기간 동안 연속 주입에 의한 정맥내 투여용으로 조제될 수 있다. 일정한 구체예에서, 본 발명에서 제시된 ADAMTS13 제제는 전신 또는 국소 투여될 수 있다. 전신 투여에는 제한 없이, 경구, 피부밑, 복강내, 피하, 경비, 혀밑, 또는 직장 투여 경로가 포함된다. 국소 투여에는 제한 없이, 국부, 피하, 근육내, 그리고 복강내 투여 경로가 포함된다.
본 발명의 한 측면에서, 단위체성 ADAMTS13 단백질의 조성물이 제시된다. 일정한 구체예에서, 단위체성 ADAMTS13 단백질의 조성물은 집합된 ADAMTS13, 이합체성 ADAMTS13, 또는 양쪽 집합된 이합체성 ADAMTS13이 실질적으로 없다. 일부 구체예에서, 단위체성 조성물은 집합된 및/또는 이합체성 ADAMTS13 단백질을 내포하는 유사한 조성물보다 높은 비활성을 갖는다. 특정 구체예에서, 단위체성 ADAMTS13 조성물은 겔 여과 또는 크기 배제 크로마토그래피를 포함하는 방법에 의해 생산된다. 특정 구체예에서, ADAMTS13 단백질은 인간 ADAMTS13 (hA13) 또는 재조합 인간 ADAMTS13 (rhA13), 또는 이의 생물학적 활성 유도체 또는 단편이다.
다른 측면에서, 단위체성 ADAMTS13 조성물의 제제가 제시된다. 한 구체예에서, 상기 제제는 단위체성 ADAMTS13 단백질의 제약학적으로 허용되는 제제이다. 일정한 구체예에서, 상기 제제는 집합된 ADAMTS13, 이합체성 ADAMTS13, 또는 양쪽 집합된 이합체성 ADAMTS13이 실질적으로 없다. 일부 구체예에서, 단위체성 ADAMTS13 제제는 집합된 및/또는 이합체성 ADAMTS13 단백질을 내포하는 유사한 제제보다 높은 비활성을 갖는다. 특정 구체예에서, 단위체성 ADAMTS13 제제는 겔 여과 또는 크기 배제 크로마토그래피를 포함하는 방법에 의해 생산된다. 특정 구체예에서, 제제 내에서 ADAMTS13 단백질은 인간 ADAMTS13 (hA13) 또는 재조합 인간 ADAMTS13 (rhA13), 또는 이의 생물학적 활성 유도체 또는 단편이다. 일정한 구체예에서, 단위체성 ADAMTS13 단백질은 본 발명에서 제시된 제제에 따라 조제된다.
구체예에서, 본 발명에서는 대략 0.0.5 ㎎/㎖ 내지 대략 10.0 ㎎/㎖ ADAMTS13 단백질, 대략 0 mM 내지 대략 200 mM의 제약학적으로 허용되는 염, 당 및/또는 당알코올, 비-이온성 계면활성제, 그리고 완충제를 포함하는 ADAMTS13 제제를 제시한다. 일정한 구체예에서, 상기 제제는 칼슘 및/또는 아연을 더욱 포함할 수 있다. 다른 구체예에서, 제제는 대략 6.5 내지 9.0의 pH에서 완충될 수 있다. 일정한 구체예에서, A13 제제는 제약학적 투여에 적합하다.
특정 구체예에서, 본 발명에서는 0.05 ㎎/㎖ 내지 10.0 ㎎/㎖ ADAMTS13; 0 mM 내지 200 mM의 제약학적으로 허용되는 염; 0.5 mM 내지 20 mM 칼슘; 당 및/또는 당알코올; 비이온성 계면활성제; 그리고 대략 6.5 내지 대략 7.5의 pH를 유지하기 위한 완충제를 포함하는 ADAMTS13의 안정화된 제제를 제시한다. 바람직한 구체예에서, 제약학적으로 허용되는 염은 염화나트륨 또는 염화칼륨이다.
한 구체예에서, 0.05 ㎎/㎖ 내지 10.0 ㎎/㎖ ADAMTS13; 0 mM 내지 200 mM의 제약학적으로 허용되는 염; 0.5 mM 내지 20 mM 칼슘; 당 및/또는 당알코올; 비이온성 계면활성제; 그리고 대략 6.5 내지 대략 7.5의 pH를 유지하기 위한 완충제를 포함하고 ㎖당 대략 50 단위 내지 ㎖당 대략 1000 단위의 ADAMTS13 활성을 내포하는 안정화된 ADAMTS13 제제가 제시된다. 바람직한 구체예에서, 제약학적으로 허용되는 염은 염화나트륨 또는 염화칼륨이다.
다른 구체예에서, 본 발명에서는 0.05 ㎎/㎖ 내지 10.0 ㎎/㎖ ADAMTS13; 0 mM 내지 200 mM의 제약학적으로 허용되는 염; 1 mM 내지 10 mM 칼슘; 당 및/또는 당알코올; 비이온성 계면활성제; 그리고 대략 6.5 내지 대략 7.5의 pH를 유지하기 위한 완충제를 포함하는 안정화된 ADAMTS13 제제를 제시한다. 바람직한 구체예에서, 상기 제제는 대략 2 mM 내지 대략 4 mM 칼슘을 내포한다. 바람직한 구체예에서, 제약학적으로 허용되는 염은 염화나트륨 또는 염화칼륨이다.
다른 구체예에서, 본 발명에서는 0.05 ㎎/㎖ 내지 10.0 ㎎/㎖ ADAMTS13; 0 mM 내지 200 mM의 제약학적으로 허용되는 염; 0.5 mM 내지 20 mM 칼슘; 대략 2% 내지 대략 6%의 당 및/또는 당알코올; 비이온성 계면활성제; 그리고 대략 6.5 내지 대략 7.5의 pH를 유지하기 위한 완충제를 포함하는 안정화된 ADAMTS13 제제를 제시한다. 일정한 구체예에서, 당 및/또는 당알코올은 수크로오스, 트레할로스, 만니톨, 그리고 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택된다. 바람직한 구체예에서, 당 및/또는 당알코올은 수크로오스와 만니톨의 혼합물이다. 특정 구체예에서, 수크로오스와 만니톨의 혼합물은 대략 1% 수크로오스 및 대략 3% 만니톨로 구성된다. 일정한 구체예에서, 상기 제제는 대략 1 mM 내지 대략 10 mM 칼슘, 바람직하게는 대략 2 mM 내지 대략 4 mM 칼슘을 포함한다. 바람직한 구체예에서, 제약학적으로 허용되는 염은 염화나트륨 또는 염화칼륨이다.
다른 구체예에서, 본 발명에서는 0.05 ㎎/㎖ 내지 10.0 ㎎/㎖ ADAMTS13; 0 mM 내지 200 mM의 제약학적으로 허용되는 염; 0.5 mM 내지 20 mM 칼슘; 당 및/또는 당알코올; 대략 0.01% 내지 0.1%의 비이온성 계면활성제; 그리고 대략 6.5 내지 대략 7.5의 pH를 유지하기 위한 완충제를 포함하는 안정화된 ADAMTS13 제제를 제시한다. 일정한 구체예에서, 계면활성제는 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 80, 플루로닉 F-68, BRIJ 35, 그리고 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택된다. 바람직한 구체예에서, 당 및/또는 당알코올은 수크로오스와 만니톨의 혼합물이다. 특정 구체예에서, 계면활성제는 폴리소르베이트 80이다. 일정한 구체예에서, 상기 제제는 대략 1 mM 내지 대략 10 mM 칼슘, 바람직하게는 대략 2 mM 내지 대략 4 mM 칼슘을 포함한다. 바람직한 구체예에서, 제약학적으로 허용되는 염은 염화나트륨 또는 염화칼륨이다.
다른 구체예에서, 본 발명에서는 0.05 ㎎/㎖ 내지 10.0 ㎎/㎖ ADAMTS13; 0 mM 내지 200 mM의 제약학적으로 허용되는 염; 0.5 mM 내지 20 mM 칼슘; 당 및/또는 당알코올; 비이온성 계면활성제; 그리고 대략 6.5 내지 대략 7.5의 pH를 유지하기 위한 완충제를 포함하는 안정화된 ADAMTS13 제제를 제시하고, 여기서 완충제는 히스티딘 또는 HEPES이다. 일정한 구체예에서, 완충제는 대략 5 mM 내지 대략 100 mM, 바람직하게는 대략 10 mM 내지 대략 50 mM의 농도로 존재한다. 다른 바람직한 구체예에서, 상기 제제의 pH는 7.0±0.2이다. 일정한 구체예에서, 상기 제제는 대략 1 mM 내지 대략 10 mM 칼슘, 바람직하게는 대략 2 mM 내지 대략 4 mM 칼슘을 포함한다. 바람직한 구체예에서, 제약학적으로 허용되는 염은 염화나트륨 또는 염화칼륨이다.
다른 구체예에서, 본 발명에서는 0.05 ㎎/㎖ 내지 10.0 ㎎/㎖ ADAMTS13; 0 mM 내지 200 mM의 제약학적으로 허용되는 염; 0.5 mM 내지 20 mM 칼슘; 당 및/또는 당알코올; 비이온성 계면활성제; 그리고 대략 6.5 내지 대략 7.5의 pH를 유지하기 위한 완충제를 포함하는 안정화된 ADAMTS13 제제를 제시한다. 일정한 구체예에서, 상기 제제는 대략 0.5 μM 내지 대략 20 μM 아연을 더욱 포함한다. 일정한 구체예에서, 상기 제제는 대략 1 mM 내지 대략 10 mM 칼슘, 바람직하게는 대략 2 mM 내지 대략 4 mM 칼슘을 포함한다. 바람직한 구체예에서, 제약학적으로 허용되는 염은 염화나트륨 또는 염화칼륨이다.
바람직한 구체예에서, 본 발명에서는 0.05 ㎎/㎖ 내지 10.0 ㎎/㎖ ADAMTS13; 0 내지 60 mM NaCl; 2 mM 내지 4 mM 칼슘; 2% 내지 4% 만니톨; 0.5% 내지 2% 수크로오스; 0.025 내지 0.1% 폴리소르베이트 80; 그리고 10 mM 내지 50 mM 히스티딘 (pH 7.0±0.2)을 포함하는 안정화된 ADAMTS13 제제를 제시한다. 한 구체예에서, 상기 제제는 대략 0.5 μM 내지 대략 20 μM 아연을 더욱 포함한다.
다른 구체예에서, 0.05 ㎎/㎖ 내지 10.0 ㎎/㎖ ADAMTS13; 대략 100 mM 이하의 제약학적으로 허용되는 염; 0.5 mM 내지 20 mM 칼슘; 당 및/또는 당알코올; 비이온성 계면활성제; 그리고 대략 6.5 내지 7.5의 pH를 유지하기 위한 완충제를 포함하는 안정화된 저염 ADAMTS13 제제가 제시된다. 바람직한 구체예에서, 제약학적으로 허용되는 염은 염화나트륨 또는 염화칼륨이다. 바람직한 구체예에서, 저염 ADAMTS13 제제는 동결건조된 제제이다.
한 구체예에서, 0.05 ㎎/㎖ 내지 10.0 ㎎/㎖ ADAMTS13; 대략 100 mM 이하의 제약학적으로 허용되는 염; 0.5 mM 내지 20 mM 칼슘; 당 및/또는 당알코올; 비이온성 계면활성제; 그리고 대략 6.5 내지 대략 7.5의 pH를 유지하기 위한 완충제를 포함하고 ㎖당 대략 50 단위 내지 ㎖당의 대략 1000 단위의 ADAMTS13 활성을 내포하는 안정화된 저염 ADAMTS13 제제가 제시된다. 바람직한 구체예에서, 제약학적으로 허용되는 염은 염화나트륨 또는 염화칼륨이다. 바람직한 구체예에서, 저염 ADAMTS13 제제는 동결건조된 제제이다.
다른 구체예에서, 본 발명에서는 0.05 ㎎/㎖ 내지 10.0 ㎎/㎖ ADAMTS13; 대략 100 mM 이하의 제약학적으로 허용되는 염; 1 mM 내지 10 mM 칼슘; 당 및/또는 당알코올; 비이온성 계면활성제; 그리고 대략 6.5 내지 대략 7.5의 pH를 유지하기 위한 완충제를 포함하는 안정화된 저염 ADAMTS13 제제를 제시한다. 바람직한 구체예에서, 상기 제제는 대략 2 mM 내지 대략 4 mM 칼슘을 내포한다. 바람직한 구체예에서, 제약학적으로 허용되는 염은 염화나트륨 또는 염화칼륨이다. 바람직한 구체예에서, 저염 ADAMTS13 제제는 동결건조된 제제이다.
다른 구체예에서, 본 발명에서는 0.05 ㎎/㎖ 내지 10.0 ㎎/㎖ ADAMTS13; 대략 100 mM 이하의 제약학적으로 허용되는 염; 0.5 mM 내지 20 mM 칼슘; 대략 2% 내지 대략 6%의 당 및/또는 당알코올; 비이온성 계면활성제; 그리고 대략 6.5 내지 대략 7.5의 pH를 유지하기 위한 완충제를 포함하는 안정화된 저염 ADAMTS13 제제를 제시한다. 일정한 구체예에서, 당 및/또는 당알코올은 수크로오스, 트레할로스, 만니톨, 그리고 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택된다. 바람직한 구체예에서, 당 및/또는 당알코올은 수크로오스와 만니톨의 혼합물이다. 특정 구체예에서, 수크로오스와 만니톨의 혼합물은 대략 1% 수크로오스 및 대략 3% 만니톨로 구성된다. 일정한 구체예에서, 상기 제제는 대략 1 mM 내지 대략 10 mM 칼슘, 바람직하게는 대략 2 mM 내지 대략 4 mM 칼슘을 포함한다. 바람직한 구체예에서, 제약학적으로 허용되는 염은 염화나트륨 또는 염화칼륨이다. 바람직한 구체예에서, 저염 ADAMTS13 제제는 동결건조된 제제이다.
다른 구체예에서, 본 발명에서는 0.05 ㎎/㎖ 내지 10.0 ㎎/㎖ ADAMTS13; 대략 100 mM 이하의 제약학적으로 허용되는 염; 0.5 mM 내지 20 mM 칼슘; 당 및/또는 당알코올; 대략 0.01% 내지 0.1%의 비이온성 계면활성제; 그리고 대략 6.5 내지 대략 7.5의 pH를 유지하기 위한 완충제를 포함하는 안정화된 저염 ADAMTS13 제제를 제시한다. 일정한 구체예에서, 계면활성제는 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 80, 플루로닉 F-68, BRIJ 35, 그리고 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택된다. 바람직한 구체예에서, 당 및/또는 당알코올은 수크로오스와 만니톨의 혼합물이다. 특정 구체예에서, 계면활성제는 폴리소르베이트 80이다. 일정한 구체예에서, 상기 제제는 대략 1 mM 내지 대략 10 mM 칼슘, 바람직하게는 대략 2 mM 내지 대략 4 mM 칼슘을 포함한다. 바람직한 구체예에서, 제약학적으로 허용되는 염은 염화나트륨 또는 염화칼륨이다. 바람직한 구체예에서, 저염 ADAMTS13 제제는 동결건조된 제제이다.
다른 구체예에서, 본 발명에서는 0.05 ㎎/㎖ 내지 10.0 ㎎/㎖ ADAMTS13; 대략 100 mM 이하의 제약학적으로 허용되는 염; 0.5 mM 내지 20 mM 칼슘; 당 및/또는 당알코올; 비이온성 계면활성제; 그리고 대략 6.5 내지 대략 7.5의 pH를 유지하기 위한 완충제를 포함하는 안정화된 저염 ADAMTS13 제제를 제시하고, 여기서 완충제는 히스티딘 또는 HEPES이다. 일정한 구체예에서, 완충제는 대략 5 mM 내지 대략 100 mM, 바람직하게는 대략 10 mM 내지 대략 50 mM의 농도로 존재한다. 다른 바람직한 구체예에서, 상기 제제의 pH는 7.0±0.2이다. 일정한 구체예에서, 상기 제제는 대략 1 mM 내지 대략 10 mM 칼슘, 바람직하게는 대략 2 mM 내지 대략 4 mM 칼슘을 포함한다. 바람직한 구체예에서, 제약학적으로 허용되는 염은 염화나트륨 또는 염화칼륨이다. 바람직한 구체예에서, 저염 ADAMTS13 제제는 동결건조된 제제이다.
다른 구체예에서, 본 발명에서는 0.05 ㎎/㎖ 내지 10.0 ㎎/㎖ ADAMTS13; 대략 100 mM 이하의 제약학적으로 허용되는 염; 0.5 mM 내지 20 mM 칼슘; 당 및/또는 당알코올; 비이온성 계면활성제; 그리고 대략 6.5 내지 대략 7.5의 pH를 유지하기 위한 완충제를 포함하는 안정화된 저염 ADAMTS13 제제를 제시한다. 일정한 구체예에서, 상기 제제는 대략 0.5 μM 내지 대략 20 μM 아연을 더욱 포함한다. 일정한 구체예에서, 상기 제제는 대략 1 mM 내지 대략 10 mM 칼슘, 바람직하게는 대략 2 mM 내지 대략 4 mM 칼슘을 포함한다. 바람직한 구체예에서, 제약학적으로 허용되는 염은 염화나트륨 또는 염화칼륨이다. 바람직한 구체예에서, 저염 ADAMTS13 제제는 동결건조된 제제이다.
바람직한 구체예에서, 본 발명에서는 0.05 ㎎/㎖ 내지 10.0 ㎎/㎖ ADAMTS13; 대략 100 mM 이하의 NaCl; 2 mM 내지 4 mM 칼슘; 2% 내지 4% 만니톨; 0.5% 내지 2% 수크로오스; 0.025 내지 0.1% 폴리소르베이트 80; 그리고 10 mM 내지 50 mM 히스티딘 (pH 7.0±0.2)을 포함하는 안정화된 저염 ADAMTS13 제제를 제시한다. 한 구체예에서, 상기 제제는 대략 0.5 μM 내지 대략 20 μM 아연을 더욱 포함한다. 바람직한 구체예에서, 저염 ADAMTS13 제제는 동결건조된 제제이다.
한 구체예에서, 본 발명에서는 (a) ADAMTS13 mg당 적어도 100 단위 ADAMTS13 활성 (즉, FRETS-vWF73 활성); (b) 0 mM 내지 200 mM의 제약학적으로 허용되는 염; (c) 0.5 mM 내지 20 mM 칼슘; (d) 당 및/또는 당알코올; (e) 비이온성 계면활성제; 그리고 (f) 6.0 내지 8.0의 pH를 유지하기 위한 완충제를 포함하는 ADAMTS13 (A13)의 안정화된 제제를 제시한다. 한 구체예에서, ADAMTS13의 안정화된 제제는 ADAMTS13 mg당 적어도 200 단위 A13 활성을 포함한다. 다른 구체예에서, ADAMTS13의 안정화된 제제는 ADAMTS13 mg당 적어도 400 단위 A13 활성을 포함한다. 바람직한 구체예에서, ADAMTS13의 안정화된 제제는 ADAMTS13 mg당 적어도 600 단위 A13 활성을 포함한다. 더욱 바람직한 구체예에서, ADAMTS13의 안정화된 제제는 ADAMTS13 mg당 적어도 800 단위 A13 활성을 포함한다. 또 다른 바람직한 구체예에서, ADAMTS13의 안정화된 제제는 ADAMTS13 mg당 적어도 1000 단위 A13 활성을 포함한다. 한 구체예에서, ADAMTS13의 안정화된 제제는 ADAMTS13 mg당 대략 100 단위 내지 대략 2000 단위의 ADAMTS13 활성을 포함한다.
안정화된 A13 제제의 한 구체예에서, 상기 제제는 대략 1.0 mM 내지 대략 10.0 mM 칼슘을 포함한다. 바람직한 구체예에서, 상기 제제는 대략 2.0 내지 대략 4.0 mM 칼슘을 내포한다.
안정화된 A13 제제의 다른 구체예에서, 상기 제제는 대략 2% 내지 대략 6%의 당 및/또는 당알코올을 포함한다. 바람직한 구체예에서, 상기 제제는 대략 3% 내지 대략 5%의 당 및/또는 당알코올을 포함한다. 특정 구체예에서, 상기 제제는 대략 4%의 당 및/또는 당알코올을 포함한다. 한 구체예에서, 당 및/또는 당알코올은 수크로오스, 트레할로스, 만니톨, 그리고 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택된다. 바람직한 구체예에서, 당 및/또는 당알코올은 수크로오스와 만니톨의 혼합물이다.
안정화된 A13 제제의 한 구체예에서, 상기 제제는 대략 0.01% 내지 대략 0.1%의 비-이온성 계면활성제를 포함한다. 바람직한 구체예에서, 상기 제제는 대략 0.05%의 비-이온성 계면활성제를 포함한다. 한 구체예에서, 계면활성제는 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 80, 플루로닉 F-68, 그리고 BRIJ 35로 구성된 군에서 선택된다. 바람직한 구체예에서, 계면활성제는 폴리소르베이트 80이다.
안정화된 A13 제제의 한 구체예에서, 상기 제제는 대략 5 mM 내지 대략 100 mM의 완충제를 포함한다. 바람직한 구체예에서, 상기 제제는 대략 10 mM 내지 대략 50 mM의 완충제를 포함한다. 다른 구체예에서, 완충제는 히스티딘 또는 HEPES이다. 바람직한 구체예에서, 완충제는 히스티딘이다. 한 구체예에서, 상기 제제의 pH는 대략 6.5 내지 7.5이다. 바람직한 구체예에서, 상기 제제의 pH는 7.0±0.2이다.
안정화된 A13 제제의 한 구체예에서, 상기 제제는 대략 0.5 μM 내지 20 μM 아연을 더욱 포함한다.
특정 구체예에서, 본 발명에서는 (a) ADAMTS13 mg당 적어도 100 단위 ADAMTS13 활성; (b) 0 내지 200 mM NaCl; (c) 2 mM 내지 4 mM 칼슘; (d) 2% 내지 4% 만니톨; (e) 0.5% 내지 2% 수크로오스; (f) 0.025 내지 0.1% 폴리소르베이트 80; 그리고 (g) 10 mM 내지 50 mM 히스티딘 (pH 7.0±0.2)을 포함하는 ADAMTS13 (A13)의 안정화된 제제를 제시한다.
한 구체예에서, 본 발명에서는 (a) ADAMTS13 mg당 적어도 100 단위 ADAMTS13 활성 (즉, FRETS-vWF73 활성); (b) 0 mM 내지 100 mM의 제약학적으로 허용되는 염; (c) 0.5 mM 내지 20 mM 칼슘; (d) 당 및/또는 당알코올; (e) 비이온성 계면활성제; 그리고 (f) 6.0 내지 8.0의 pH를 유지하기 위한 완충제를 포함하는 ADAMTS13 (A13)의 안정화된 저염 제제를 제시한다. 한 구체예에서, ADAMTS13의 안정화된 제제는 ADAMTS13 mg당 적어도 200 단위 A13 활성을 포함한다. 다른 구체예에서, ADAMTS13의 안정화된 제제는 ADAMTS13 mg당 적어도 400 단위 A13 활성을 포함한다. 바람직한 구체예에서, ADAMTS13의 안정화된 제제는 ADAMTS13 mg당 적어도 600 단위 A13 활성을 포함한다. 더욱 바람직한 구체예에서, ADAMTS13의 안정화된 제제는 ADAMTS13 mg당 적어도 800 단위 A13 활성을 포함한다. 또 다른 바람직한 구체예에서, ADAMTS13의 안정화된 제제는 ADAMTS13 mg당 적어도 1000 단위 A13 활성을 포함한다. 한 구체예에서, ADAMTS13의 안정화된 제제는 ADAMTS13 mg당 대략 100 단위 내지 대략 2000 단위의 ADAMTS13 활성을 포함한다.
안정화된 저염 A13 제제의 한 구체예에서, 상기 제제는 대략 1.0 mM 내지 대략 10.0 mM 칼슘을 포함한다. 바람직한 구체예에서, 상기 제제는 대략 2.0 내지 대략 4.0 mM 칼슘을 내포한다.
안정화된 저염 A13 제제의 다른 구체예에서, 상기 제제는 대략 2% 내지 대략 6%의 당 및/또는 당알코올을 포함한다. 바람직한 구체예에서, 상기 제제는 대략 3% 내지 대략 5%의 당 및/또는 당알코올을 포함한다. 특정 구체예에서, 상기 제제는 대략 4%의 당 및/또는 당알코올을 포함한다. 한 구체예에서, 당 및/또는 당알코올은 수크로오스, 트레할로스, 만니톨, 그리고 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택된다. 바람직한 구체예에서, 당 및/또는 당알코올은 수크로오스와 만니톨의 혼합물이다.
안정화된 저염 A13 제제의 한 구체예에서, 상기 제제는 대략 0.01% 내지 대략 0.1%의 비-이온성 계면활성제를 포함한다. 바람직한 구체예에서, 상기 제제는 대략 0.05%의 비-이온성 계면활성제를 포함한다. 한 구체예에서, 계면활성제는 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 80, 플루로닉 F-68, 그리고 BRIJ 35로 구성된 군에서 선택된다. 바람직한 구체예에서, 계면활성제는 폴리소르베이트 80이다.
안정화된 저염 A13 제제의 한 구체예에서, 상기 제제는 대략 5 mM 내지 대략 100 mM의 완충제를 포함한다. 바람직한 구체예에서, 상기 제제는 대략 10 mM 내지 대략 50 mM의 완충제를 포함한다. 다른 구체예에서, 완충제는 히스티딘 또는 HEPES이다. 바람직한 구체예에서, 완충제는 히스티딘이다. 한 구체예에서, 상기 제제의 pH는 대략 6.5 내지 7.5이다. 바람직한 구체예에서, 상기 제제의 pH는 7.0±0.2이다.
안정화된 저염 A13 제제의 한 구체예에서, 상기 제제는 대략 0.5 μM 내지 20 μM 아연을 더욱 포함한다.
특정 구체예에서, 본 발명에서는 (a) ADAMTS13 mg당 적어도 100 단위 ADAMTS13 활성; (b) 0 내지 60 mM NaCl; (c) 2 mM 내지 4 mM 칼슘; (d) 2% 내지 4% 만니톨; (e) 0.5% 내지 2% 수크로오스; (f) 0.025 내지 0.1% 폴리소르베이트 80; 그리고 (g) 10 mM 내지 50 mM 히스티딘 (pH 7.0±0.2)을 포함하는 ADAMTS13 (A13)의 안정화된 저염 제제를 제시한다.
관련된 구체예에서, 본 발명에서는 ADAMTS13 (A13)의 안정화된 동결건조된 제제를 제시하고, 여기서 상기 제제는 (a) ADAMTS13 mg당 적어도 100 단위 ADAMTS13 활성 (즉, FRETS-vWF73 활성); (b) 0 mM 내지 200 mM의 제약학적으로 허용되는 염; (c) 0.5 mM 내지 20 mM 칼슘; (d) 당 및/또는 당알코올; (e) 비이온성 계면활성제; 그리고 (f) 6.0 내지 8.0의 pH를 유지하기 위한 완충제를 포함하는 액체 제제로부터 동결건조된다. 한 구체예에서, ADAMTS13의 안정화된 제제는 ADAMTS13 mg당 적어도 200 단위 A13 활성을 포함한다. 다른 구체예에서, ADAMTS13의 안정화된 제제는 ADAMTS13 mg당 적어도 400 단위 A13 활성을 포함한다. 바람직한 구체예에서, ADAMTS13의 안정화된 제제는 ADAMTS13 mg당 적어도 600 단위 A13 활성을 포함한다. 더욱 바람직한 구체예에서, ADAMTS13의 안정화된 제제는 ADAMTS13 mg당 적어도 800 단위 A13 활성을 포함한다. 또 다른 바람직한 구체예에서, ADAMTS13의 안정화된 제제는 ADAMTS13 mg당 적어도 1000 단위 A13 활성을 포함한다. 한 구체예에서, ADAMTS13의 안정화된 제제는 ADAMTS13 mg당 대략 100 단위 내지 대략 2000 단위의 ADAMTS13 활성을 포함한다.
안정화된 동결건조된 A13 제제의 한 구체예에서, 상기 제제는 대략 1.0 mM 내지 대략 10.0 mM 칼슘을 포함한다. 바람직한 구체예에서, 상기 제제는 대략 2.0 내지 대략 4.0 mM 칼슘을 내포한다.
안정화된 동결건조된 A13 제제의 다른 구체예에서, 상기 제제는 대략 2% 내지 대략 6%의 당 및/또는 당알코올을 포함한다. 바람직한 구체예에서, 상기 제제는 대략 3% 내지 대략 5%의 당 및/또는 당알코올을 포함한다. 특정 구체예에서, 상기 제제는 대략 4%의 당 및/또는 당알코올을 포함한다. 한 구체예에서, 당 및/또는 당알코올은 수크로오스, 트레할로스, 만니톨, 그리고 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택된다. 바람직한 구체예에서, 당 및/또는 당알코올은 수크로오스와 만니톨의 혼합물이다.
안정화된 동결건조된 A13 제제의 한 구체예에서, 상기 제제는 대략 0.01% 내지 대략 0.1%의 비-이온성 계면활성제를 포함한다. 바람직한 구체예에서, 상기 제제는 대략 0.05%의 비-이온성 계면활성제를 포함한다. 한 구체예에서, 계면활성제는 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 80, 플루로닉 F-68, 그리고 BRIJ 35로 구성된 군에서 선택된다. 바람직한 구체예에서, 계면활성제는 폴리소르베이트 80이다.
안정화된 동결건조된 A13 제제의 한 구체예에서, 상기 제제는 대략 5 mM 내지 대략 100 mM의 완충제를 포함한다. 바람직한 구체예에서, 상기 제제는 대략 10 mM 내지 대략 50 mM의 완충제를 포함한다. 다른 구체예에서, 완충제는 히스티딘 또는 HEPES이다. 바람직한 구체예에서, 완충제는 히스티딘이다. 한 구체예에서, 상기 제제의 pH는 대략 6.5 내지 7.5이다. 바람직한 구체예에서, 상기 제제의 pH는 7.0±0.2이다.
안정화된 동결건조된 A13 제제의 한 구체예에서, 상기 제제는 대략 0.5 μM 내지 20 μM 아연을 더욱 포함한다.
특정 구체예에서, 본 발명에서는 ADAMTS13 (A13)의 안정화된 동결건조된 제제를 제시하고, 여기서 상기 제제는 (a) ADAMTS13 mg당 적어도 100 단위 ADAMTS13 활성; (b) 0 내지 200 mM NaCl; (c) 2 mM 내지 4 mM 칼슘; (d) 2% 내지 4% 만니톨; (e) 0.5% 내지 2% 수크로오스; (f) 0.025 내지 0.1% 폴리소르베이트 80; 그리고 (g) 10 mM 내지 50 mM 히스티딘 (pH 7.0±0.2)을 포함하는 액체 제제로부터 동결건조된다.
관련된 구체예에서, 본 발명에서는 ADAMTS13 (A13)의 안정화된 저염 동결건조된 제제를 제시하고, 여기서 상기 제제는 (a) ADAMTS13 mg당 적어도 100 단위 ADAMTS13 활성 (즉, FRETS-vWF73 활성); (b) 0 mM 내지 100 mM의 제약학적으로 허용되는 염; (c) 0.5 mM 내지 20 mM 칼슘; (d) 당 및/또는 당알코올; (e) 비이온성 계면활성제; 그리고 (f) 6.0 내지 8.0의 pH를 유지하기 위한 완충제를 포함하는 액체 제제로부터 동결건조된다. 한 구체예에서, ADAMTS13의 안정화된 제제는 ADAMTS13 mg당 적어도 200 단위 A13 활성을 포함한다. 다른 구체예에서, ADAMTS13의 안정화된 제제는 ADAMTS13 mg당 적어도 400 단위 A13 활성을 포함한다. 바람직한 구체예에서, ADAMTS13의 안정화된 제제는 ADAMTS13 mg당 적어도 600 단위 A13 활성을 포함한다. 더욱 바람직한 구체예에서, ADAMTS13의 안정화된 제제는 ADAMTS13 mg당 적어도 800 단위 A13 활성을 포함한다. 또 다른 바람직한 구체예에서, ADAMTS13의 안정화된 제제는 ADAMTS13 mg당 적어도 1000 단위 A13 활성을 포함한다. 한 구체예에서, ADAMTS13의 안정화된 제제는 ADAMTS13 mg당 대략 100 단위 내지 대략 2000 단위의 ADAMTS13 활성을 포함한다.
안정화된 저염 동결건조된 A13 제제의 한 구체예에서, 상기 제제는 대략 1.0 mM 내지 대략 10.0 mM 칼슘을 포함한다. 바람직한 구체예에서, 상기 제제는 대략 2.0 내지 대략 4.0 mM 칼슘을 내포한다.
안정화된 저염 동결건조된 A13 제제의 다른 구체예에서, 상기 제제는 대략 2% 내지 대략 6%의 당 및/또는 당알코올을 포함한다. 바람직한 구체예에서, 상기 제제는 대략 3% 내지 대략 5%의 당 및/또는 당알코올을 포함한다. 특정 구체예에서, 상기 제제는 대략 4%의 당 및/또는 당알코올을 포함한다. 한 구체예에서, 당 및/또는 당알코올은 수크로오스, 트레할로스, 만니톨, 그리고 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택된다. 바람직한 구체예에서, 당 및/또는 당알코올은 수크로오스와 만니톨의 혼합물이다.
안정화된 저염 동결건조된 A13 제제의 한 구체예에서, 상기 제제는 대략 0.01% 내지 대략 0.1%의 비-이온성 계면활성제를 포함한다. 바람직한 구체예에서, 상기 제제는 대략 0.05%의 비-이온성 계면활성제를 포함한다. 한 구체예에서, 계면활성제는 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 80, 플루로닉 F-68, 그리고 BRIJ 35로 구성된 군에서 선택된다. 바람직한 구체예에서, 계면활성제는 폴리소르베이트 80이다.
안정화된 저염 동결건조된 A13 제제의 한 구체예에서, 상기 제제는 대략 5 mM 내지 대략 100 mM의 완충제를 포함한다. 바람직한 구체예에서, 상기 제제는 대략 10 mM 내지 대략 50 mM의 완충제를 포함한다. 다른 구체예에서, 완충제는 히스티딘 또는 HEPES이다. 바람직한 구체예에서, 완충제는 히스티딘이다. 한 구체예에서, 상기 제제의 pH는 대략 6.5 내지 7.5이다. 바람직한 구체예에서, 상기 제제의 pH는 7.0±0.2이다.
안정화된 저염 동결건조된 A13 제제의 한 구체예에서, 상기 제제는 대략 0.5 μM 내지 20 μM 아연을 더욱 포함한다.
특정 구체예에서, 본 발명에서는 ADAMTS13 (A13)의 안정화된 저염 동결건조된 제제를 제시하고, 여기서 상기 제제는 (a) ADAMTS13 mg당 적어도 100 단위 ADAMTS13 활성; (b) 0 내지 60 mM NaCl; (c) 2 mM 내지 4 mM 칼슘; (d) 2% 내지 4% 만니톨; (e) 0.5% 내지 2% 수크로오스; (f) 0.025 내지 0.1% 폴리소르베이트 80; 그리고 (g) 10 mM 내지 50 mM 히스티딘 (pH 7.0±0.2)을 포함하는 액체 제제로부터 동결건조된다.
IV. ADAMTS13 제제의 안정성
일정한 구체예에서, 본 발명에서 제시된 ADAMTS13 제제는 일정한 온도, 예를 들면, 대략 -80℃, -20℃, 4℃, 18℃, 실온, 25℃, 30℃, 35℃, 37℃, 40℃, 또는 더욱 높은 온도에서 저장될 때 연장된 기간 동안 안정될 수 있다. 일부 구체예에서, 연장된 기간은 적어도 대략 1주이다. 다른 구체예에서, 연장된 기간은 적어도 대략 2주, 또는 적어도 대략 3주, 또는 적어도 대략 1개월, 또는 적어도 대략 2개월, 또는 적어도 대략 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ,10, 11, 12, 14, 16, 또는 18개월을 포함할 수 있다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 제제는 적어도 대략 2, 3, 4, 5년 또는 그 이상 동안 안정할 수 있다.
본 발명의 일정한 구체예에서, 안정성 (stability)은 제제 내에서 A13 또는 rA13 단백질의 하나 또는 그 이상의 생물물리학적 특성 및/또는 효소 특성에 의해 측정될 수 있다. 안정성을 평가하는데 이용될 수 있는 특성의 무제한적 실례에는 효소 활성, 비활성, 단백질의 단일분산성 (mono-dispersity) 또는 다분산성 (poly-dispersity)의 정도, 단백질의 이합체화, 소중합화, 또는 집합의 정도, 단백질의 풀림 (unfolding)의 정도가 포함된다.
당업자는 제한 없이, 겔 여과, 동적 또는 정적 광 산란, 분석적 초원심분리, rp-HPLC, 이온-교환 크로마토그래피, 푸리에 변환 적외선 분광학, 열량측정법, 시차 주사 열량계, NMR 분광학, 질량분석법, 소각 X-선 산란 (small angle x-ray scattering, SAX), 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 등을 비롯하여, ADAMTS13 제제의 안정성을 평가하는데 이용될 수 있는 안정성의 다른 척도를 쉽게 인지할 것이다.
한 구체예에서, 본 발명에서는 연장된 기간 동안 저장후 전체 ADAMTS13 활성 중에서 적어도 대략 50%를 유지하는 A13 또는 rA13의 제제를 제시한다. 다른 구체예에서, 연장된 기간 동안 저장후 전체 ADAMTS13 활성 중에서 적어도 대략 60%, 또는 적어도 대략 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%를 유지하는 제제가 제시된다.
다른 구체예에서, 연장된 기간 동안 저장후 ADAMTS13 비활성 중에서 적어도 대략 50%를 유지하는 제제가 제시된다. 다른 구체예에서, 연장된 기간 동안 저장후 ADAMTS13 비활성 중에서 적어도 대략 60%, 또는 적어도 대략 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%를 유지하는 제제가 제시된다.
다른 구체예에서, 본 발명의 제제는 연장된 기간 동안 저장후 ADAMTS13 단백질 mg당 적어도 대략 600U의 FRETS-VWF73 활성의 비활성을 가질 것이다. 다른 구체예에서, 본 발명에서 제시된 제제는 연장된 기간 동안 저장후 적어도 대략 700 U/mg A13, 또는 적어도 대략 800 U/mg, 900 U/mg, 1000 U/mg, 1100 U/mg, 1200 U/mg, 1300 U/mg, 1400 U/mg, 1500 U/mg, 또는 그 이상의 비활성을 가질 것이다.
한 구체예에서, 본 발명에서 제시된 A13 제제는 동적 광 산란 분석에 의해 측정될 때, 연장된 기간 동안 저장후 대략 50% 이하의 다분산성을 가질 것이다. 다른 구체예에서, A13 제제는 동적 광 산란 분석에 의해 측정될 때, 연장된 기간 동안 저장후 대략 45% 이하의 다분산성, 또는 대략 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5% 이하의 다분산성을 가질 것이다.
본 발명의 다른 구체예에서, 본 발명에서 제시된 A13 제제는 연장된 기간 동안 저장후 적어도 대략 50% A13 단위체로 구성되는 A13 단백질 집단을 가질 것이다. 다른 구체예에서, 제제는 적어도 대략 60% A13 단위체, 또는 적어도 대략 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 더욱 높은 비율의 A13 단위체를 가질 수 있다.
V. ADAMTS13 발현과 정제
일정한 구체예에서, 본 발명에서 제시된 제제에 이용되는 ADAMTS13 단백질은 예로써, US 6,926,894, US 2005/0266528, US 2007/0015703, US Patent Application Serial No. 12/437,384, U.S. Patent Application Serial No. 12/847,999, 그리고 WO 2002/42441에서 이전에 개시된 방법에 따라 발현되거나, 생산되거나, 또는 정제될 수 있고, 이들 모두 본 발명에 순전히 참조로서 편입된다.
A. 숙주 세포와 벡터
재조합 ADAMTS 단백질은 임의의 적절한 원핵 또는 진핵 숙주 시스템에서 발현에 의해 생산될 수 있다. 진핵 세포의 실례에는 제한 없이, 포유동물 세포, 예를 들면, CHO, COS, HEK 293, BHK, SK-Hep, 그리고 HepG2; 곤충 세포, 예를 들면, SF9 세포, SF21 세포, S2 세포, 그리고 High Five 세포; 그리고 효모 세포, 예를 들면, 사카로미세스 (Saccharomyces) 또는 쉬조사카로미세스 (Schizosaccharomyces) 세포가 포함된다. 한 구체예에서, ADAMTS 단백질은 세균 세포, 효모 세포, 곤충 세포, 조류 세포, 포유동물 세포 등에서 발현될 수 있다. 가령, 인간 세포주, 햄스터 세포주, 또는 뮤린 세포주에서. 특정 구체예에서, 세포주는 CHO, BHK, 또는 HEK 세포주이다. 바람직한 구체예에서, 세포주는 CHO 세포주이다.
한 구체예에서, 세포는 원하는 ADAMTS 단백질, 예를 들면, ADAMTS13을 생산하기 위하여, 바람직하게는 제조 공정 (즉, 적어도 1 ℓ)에서 배양될 수 있는 임의의 포유동물 세포일 수 있다. 실례에는 SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 계열 (COS-7, ATCC CRL 1651); 인간 배아 신장 계열 (현탁 배양에서 성장을 위하여 서브클로닝된 293 또는 293 세포, Graham et al., J. Gen Virol., 36:59 (1977)); 아기 햄스터 신장 세포 (BHK, ATCC CCL 10); 중국 햄스터 난소 세포/-DHFR, 예를 들면, DUKX-B11 서브클론 (CHO, Uriaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980)); 생쥐 버팀세포 (TM4, Mather, Biol. Reprod, 23:243-251 (1980)); 원숭이 신장 세포 (CV1 ATCC CCL 70); 아프리가 녹색 원숭이 신장 세포 (VERO-76, ATCC CRL-1587); 인간 자궁경부 암종 세포 (HeLa, ATCC CCL 2); 개 신장 세포 (MDCK, ATCC CCL 34); 버팔로 쥐 간 세포 (BRL 3A, ATCC CRL 1442); 인간 폐 세포 (W138, ATCC CCL 75); 인간 간 세포 (Hep G2, HB 8065); 생쥐 유방암 (MMT 060562, ATCC CCL51 ); TRI 세포 (Mather et al., Annals N. Y. Acad. Sci., 383:44-68 (1982)); MRC 5 세포; FS4 세포; 그리고 인간 간암 계열 (Hep G2)이 포함된다. 바람직하게는, 세포주는 설치류 세포주, 특히 햄스터 세포주, 예를 들면, CHO 또는 BHK이다.
ADAMTS 단백질 (가령, ADAMTS13)의 발현을 위하여 매우 다양한 벡터가 이용될 수 있고, 그리고 진핵과 원핵 발현 벡터에서 선택될 수 있다. 일정한 구체예에서, 플라스미드 벡터는 ADAMTS 단백질 (가령, ADAMTS13)을 발현하는데 이용이 예기된다. 일반적으로, 숙주 세포와 융화성인 종으로부터 유래되는 레플리콘 및 제어 서열을 내포하는 플라스미드 벡터가 이들 숙주와 관련하여 이용된다. 벡터는 복제 부위, 그리고 형질전환된 세포에서 표형현적 선별 (phenotypic selection)을 제공할 수 있는 마킹 서열 (marking sequence)을 보유할 수 있다. 플라스미드는 하나 또는 그 이상의 제어 서열, 예를 들면, 프로모터에 작동가능하게 연결된 ADAMTS 단백질 (가령, ADAMTS13)을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 것이다.
재조합 ADAMTS 단백질을 발현하는 안정된 CHO 세포 클론을 제조하는 바람직한 방법은 아래와 같다. DHFR 결함성 CHO 세포주 DUKX-B11은 본질적으로 U.S. Patent Number 5,250,421 (Kaufman et al., Genetics Institute, Inc.)에서 기술된 바와 같이, 관련된 재조합 단백질의 발현을 가능하게 하는 DHFR 발현 벡터로 형질감염된다. 선별은 히포크산틴/티미딘 (HT) 없음 배지에서 성장에 의해 수행되고, 그리고 재조합 ADAMTS 단백질과 DHFR 유전자의 발현을 코딩하는 관련된 영역의 증폭은 증가하는 농도의 메토트렉사트에서 이들 세포의 증식에 의해 달성된다. 적절한 경우에, CHO 세포주는 본질적으로 US 6,100,061 (Reiter et al, lmmuno Aktiengesellschaft)에서 기술된 바와 같이, 혈청 및/또는 단백질 없음 배지에서 성장을 위하여 순응될 수 있다.
다른 바람직한 구체예에서, 안정된 HEK293 세포는 히그로마이신 선별가능 마커를 내포하는 구조체로 형질감염시키고, 그리고 항생제 내성 (antibiotic resistance)으로 형질전환체 (transformant)를 선별함으로써 준비된다. 세포를 감염시키거나, 또는 수용체-매개된 엔도시토시스 (endocytosis)를 통해 세포로 들어가고, 그리고 숙주 세포 게놈 내로 통합하여 바이러스 유전자를 안정적으로 및 효율적으로 발현하는 능력으로 인하여, 일정한 바이러스는 외래 핵산의 세포 (가령, 포유동물 세포) 내로의 이전을 위한 매력적인 후보이다. 따라서 일정한 구체예에서, 바이러스 벡터는 발현을 위하여 ADAMTS 단백질 (가령, ADAMTS13)을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 숙주 세포 내로 도입하는데 이용된다. 바이러스 벡터는 하나 또는 그 이상의 제어 서열, 예를 들면, 프로모터에 작동가능하게 연결된 ADAMTS 단백질 (가령, ADAMTS13)을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 것이다. 대안으로, 바이러스 벡터는 제어 서열을 내포하지 않고, 그 대신에 ADAMTS 단백질의 발현을 유도하기 위하여 숙주 세포 내에 제어 서열에 의존할 것이다. 핵산을 전달하는데 이용될 수 있는 바이러스 벡터의 무제한적 실례에는 아데노바이러스 벡터, AAV 벡터, 그리고 레트로바이러스 벡터가 포함된다.
한 구체예에서, 아데노바이러스 발현 벡터는 구조체의 포장 (packaging)을 뒷받침하고, 그리고 그 속에 클로닝된 ADAMTS 구조체를 궁극적으로 발현하기 위한 충분한 아데노바이러스 서열을 내포하는 구조체를 포함한다. 아데노바이러스 벡터는 7 kb까지 외래 서열의 도입을 가능하게 한다 (Grunhaus et al., Seminar in Virology, 200(2):535-546, 1992)).
다른 구체예에서, 아데노-연관된 바이러스 (AAV)가 발현을 위하여 ADAMTS 단백질 (가령, ADAMTS13)을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 숙주 세포 내로 도입하는데 이용될 수 있다. AAV 시스템은 이전에 보고되었고 당분야에서 널리 공지되어 있다 (Kelleher and Vos, Biotechniques, 17(6):1110-7, 1994; Cotten et al., Proc Natl Acad Sci USA, 89(13):6094-6098, 1992; Curiel, Nat Immun, 13(2-3):141-64, 1994; Muzyczka, Curr Top Microbiol Immunol, 158:97-129, 1992). rAAV 벡터의 산출과 용도에 관한 상세는 예로써, U.S. Patent No. 5,139,941과 4,797,368에서 기술되고, 이들 각각은 본 발명에 순전히 참조로서 편입된다.
한 구체예에서, 레트로바이러스 발현 벡터가 발현을 위하여 ADAMTS 단백질 (가령, ADAMTS13)을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 숙주 세포 내로 도입하는데 이용될 수 있다. 이들 시스템은 이전에 보고되었고 당분야에 널리 공지되어 있다 (Mann et al., Cell, 33:153-159, 1983; Nicolas and Rubinstein, In: Vectors: A survey of molecular cloning vectors and their uses, Rodriguez and Denhardt, eds., Stoneham: Butterworth, pp. 494-513, 1988; Temin, In: Gene Transfer, Kucherlapati (ed.), New York: Plenum Press, pp. 149-188, 1986). 특정 구체예에서, 레트로바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터이다 (참조: Naldini et al., Science, 272(5259):263-267, 1996; Zufferey et al., Nat Biotechnol, 15(9):871-875, 1997; Blomer et al., J Virol., 71(9):6641-6649, 1997; U.S. Pat. Nos. 6,013,516 and 5,994,136).
원핵 발현을 위한 벡터의 무제한적 실례에는 pRSET, pET, pBAD 등과 같은 플라스미드가 포함되는데, 여기서 원핵 발현 벡터에 이용되는 프로모터에는 lac, trc, trp, recA, araBAD 등이 포함된다. 진핵 발현을 위한 벡터의 실례에는 (i) 효모에서 발현의 경우에, AOX1, GAP, GAL1, AUG1 등과 같은 프로모터를 이용하는 pAO, pPIC, pYES, pMET와 같은 벡터; (ii) 곤충 세포에서 발현의 경우에, PH, p10, MT, Ac5, OpIE2, gp64, polh 등과 같은 프로모터를 이용하는 pMT, pAc5, pIB, pMIB, pBAC 등과 같은 벡터, 그리고 (iii) 포유동물 세포에서 발현의 경우에, CMV, SV40, EF-1, UbC, RSV, ADV, BPV, 그리고 β-악틴과 같은 프로모터를 이용하는 pSVL, pCMV, pRc/RSV, pcDNA3, pBPV 등, 그리고 우두 바이러스, 아데노-연관된 바이러스, 포진 바이러스, 레트로바이러스 등과 같은 바이러스 체계로부터 유래된 벡터와 같은 벡터가 포함된다.
일정한 구체예에서, ADAMTS13의 세포-배양 발현은 미세담체의 이용을 포함할 수 있다. 본 발명에서는 다른 측면에서, 대규모 ADAMTS 단백질 발현의 방법을 제시한다. 일부 구체예에서, 이들 구체예의 세포-배양은 높은 세포 밀도와 단백질 발현을 달성하기 위한 높은 부피-특이적 배양 표면적을 제공하는데 적합한 조건 하에 대형 생물반응기에서 수행될 수 있다. 이런 성장 조건을 제공하는 한 가지 수단은 교반된 탱크 생물반응기에서 세포-배양을 위한 미세담체를 이용하는 것이다. 다른 구체예에서, 이들 성장 요건은 현탁 세포 배양의 이용에 의해 충족된다.
B. 배양 방법
일정한 구체예에서, ADAMTS13 발현은 회분식 또는 연속식 작업 하에 가동된 세포 배양 시스템의 이용을 포함할 수 있다. 가령, 회분식 세포 배양이 이용될 때, 이들은 단일 회분식, 유가식, 또는 반복 회분식 하에 가동될 수 있다. 유사하게, 연속식 세포 배양은 예로써, 관류, 터비도스탯 또는 키모스탯 양식 하에 가동될 수 있다. 회분식과 연속식 세포 배양은 현탁 또는 부착 조건 하에 수행될 수 있다. 현탁 조건 하에 가동될 때, 세포는 배양 배지 내에서 자유롭게 현탁되고 혼합될 것이다. 대안으로, 부착 조건 하에, 세포는 고형 상 (solid phase), 예를 들면, 미세담체, 다공성 미세담체, 디스크 담체, 세라믹 카트리지, 중공 섬유, 플랫 시트 (flat sheet), 겔 매트릭스 등에 결합될 것이다.
회분식 배양 (batch culture)은 전형적으로 대규모 세포 배양인데, 여기서 세포 접종물은 탱크 또는 발효기 내에서 최대 밀도로 배양되고, 그리고 단일 회분으로서 수확되고 가공된다. 유가식 배양 (fed-batch culture)은 전형적으로, 새로운 영양소 (가령, 성장-제한 기질) 또는 첨가제 (가령, 산물의 전구체)가 공급되는 회분식 배양이다. 공급 용액 (feed solution)은 생물반응기의 희석을 피하기 위하여 일반적으로 고도로 농축된다. 반복 회분식 배양 (repeated-batch culture)에서, 세포는 배양 배지 내에 배치되고 원하는 세포 밀도로 성장된다. 쇠퇴기 (decline phase)와 세포 사멸 (cell death)의 시작을 피하기 위하여, 배양 조직은 이후, 세포가 그들의 최대 농도에 도달하기 이전에 완전 성장 배지로 희석된다. 희석의 양과 빈도는 폭넓게 변하고 세포주의 성장 특징 및 배양 공정의 편의성에 좌우된다. 이러한 공정은 필요에 따라 여러 회 반복될 수 있고, 그리고 세포와 배지가 계대배양 (subculture)에서 폐기되지 않으면, 배양 부피는 각 희석이 이루어지는 시점마다 단계적으로 증가할 것이다. 증가하는 부피는 용기 내에서 희석이 가능할 만큼 충분한 크기의 반응기를 가지거나, 또는 희석된 배양 조직을 몇몇 용기로 분배함으로써 처리될 수 있다. 이러한 유형의 배양의 이론적 근거는 세포를 기하급수적 성장 상태 (exponentially growing state)에 유지하는 것이다. 일련의 계대배양은 배양 부피가 단계적으로 항상 증가하고, 다수의 수확이 있을 수 있고, 세포가 지속적으로 성장하고, 그리고 이러한 공정이 원하는 만큼 오랫동안 지속될 수 있다는 것으로 특징된다. 일정한 구체예에서, ADAMTS 단백질 (가령, ADAMTS13)은 회분식 배양의 상층액을 수확한 이후에 회수될 수 있다.
연속식 배양은 새로운 배지의 유입에 의해 영양소가 연속적으로 공급되는 현탁 배양일 수 있는데, 여기서 배양 부피는 일반적으로, 소모된 배지의 동시 제거 (concomitant removal)에 의해 일정하게 유지된다. 키모스탯과 터비도스탯 방법에서, 추출된 배지는 세포를 내포한다. 따라서 세포 배양 용기 내에 남아있는 세포는 정상 상태 (steady state)를 유지하기 위하여 성장해야 한다. 키모스탯 방법에서, 성장률은 전형적으로, 희석률, 다시 말하면, 새로운 배지가 첨가되는 비율을 제어함으로써 조절된다. 배양 동안 세포의 성장률은 예로써, 최대하 성장률에서, 희석률의 변경에 의해 제어될 수 있다. 대조적으로, 터비도스탯 방법에서, 희석률은 소정의 가동 조건, 예를 들면, pH와 온도에서 세포가 최대 성장률을 달성할 수 있도록 설정된다.
관류 배양에서, 추출된 배지는 세포가 고갈되고, 이들 세포는 예로써, 여과에 의해 또는 세포의 배양 조직으로의 재도입을 유발하는 원심분리 방법에 의해 배양 용기 내에 잔류된다. 하지만, 전형적으로, 여과에 이용되는 막은 100%의 세포를 유지하지 못하고, 따라서 배지가 추출될 때 일정한 비율이 제거된다. 이것은 매우 높은 성장률에서 관류 배양을 가동시키는데 중요하지 않을 수도 있는데, 그 이유는 대부분의 세포가 배양 용기 내에 유지되기 때문이다.
교반된-탱크 반응기 시스템은 현탁 또는 부착 양식 하에 가동된 회분식과 연속식 세포 배양에 이용될 수 있다. 일반적으로, 교반된-탱크 반응기 시스템은 임의의 유형의 교반기 (agitator), 예를 들면, Rushton, 수중익선 (hydrofoil), 피치 블레이드 (pitched blade), 또는 마린 (marine) 교반기가 장비된 임의의 전통적인 교반된-탱크 반응기로서 가동될 수 있다.
C. 배양 배지
ADAMTS13은 외인성으로 첨가된 단백질이 없는 배양 배지에서 발현될 수 있다. "단백질 없음 배양 배지" 및 관련된 용어는 성장 동안 단백질을 자연적으로 발산하는, 배양 조직 내에 세포에 외인성 출처 또는 이들 세포 이외의 출처로부터 유래되는 단백질이 없는 배양 배지를 지칭한다. 한 구체예에서, ADAMTS13 단백질은 외인성으로 첨가된 단백질이 없고 (즉, 단백질-없고) 아연, 칼슘, 및/또는 니코틴아미드 (비타민 B3)로 보충되는 배지에서 발현될 수 있다. 일정한 구체예에서, 단백질 없음 배양 배지는 폴리아민을 내포한다. 가령, 적어도 2 ㎎/ℓ, 또는 대략 2 ㎎/ℓ 내지 30 ㎎/ℓ, 또는 대략 2 ㎎/ℓ 내지 8 ㎎/ℓ의 농도에서. 특정 구체예에서, 폴리아민은 푸트레신 (putrescine)이다. 전형적인 단백질 없음 배양 배지는 U.S. Patent Number 6,171,825와 6,936,441, WO 2007/077217, U.S. Patent Application Publication Number 2008/0009040과 2007/0212770, 그리고 U.S. Patent Application Serial No. 12/847,999에서 교시되고, 이들의 내용은 본 발명에 순전히 참조로서 편입된다.
동물 단백질-없고 화학적으로 정의된 배양 배지를 제조하는 방법은 당분야에서, 예를 들면, U.S. Patent Number 6,171,825와 6,936,441, WO 2007/077217, 그리고 U.S. Patent Application Publication Number 2008/0009040과 2007/0212770에서 공지되어 있고, 이들의 내용은 본 발명에 순전히 참조로서 편입된다. 한 구체예에서, ADAMTS13 단백질을 발현하는데 이용되는 배양 배지는 동물 단백질-없는 또는 올리고펩티드-없는 배지이다. 일정한 구체예에서, 배양 배지는 화학적으로 정의될 수 있다. 일정한 구체예에서, 배양 배지는 대략 0.5 ㎎/ℓ 내지 대략 10 ㎎/ℓ의 농도에서 적어도 하나의 폴리아민을 내포할 수 있다.
ADAMTS13 단백질은 또한, 외인성으로 첨가된 올리고펩티드가 없는 배양 배지에서 발현될 수 있다. 한 구체예에서, ADAMTS13은 외인성으로 첨가된 올리고펩티드가 없고 (즉, 폴리펩티드-없고) 아연, 칼슘, 및/또는 니코틴아미드 (비타민 B3)로 보충되는 배양 배지에서 발현될 수 있다. 일정한 구체예에서, 올리고펩티드 없음 배양 배지는 폴리아민을 내포한다. 가령, 적어도 2 ㎎/ℓ, 또는 대략 2 ㎎/ℓ 내지 30 ㎎/ℓ, 또는 대략 2 ㎎/ℓ 내지 8 ㎎/ℓ의 농도에서. 특정 구체예에서, 폴리아민은 푸트레신이다. 전형적인 올리고펩티드 없음 배양 배지는 U.S. Patent Number 6,171,825와 6,936,441, WO 2007/077217, U.S. Patent Application Publication Number 2008/0009040과 2007/0212770, 그리고 U.S. Patent Application Serial No. 12/847,999에서 교시되고, 이들의 내용은 본 발명에 순전히 참조로서 편입된다.
ADAMTS13 단백질은 또한, 혈청이 없는 배양 배지에서 발현될 수 있다. 한 구체예에서, ADAMTS13은 외인성으로 첨가된 혈청이 없고 (즉, 혈청-없고) 아연, 칼슘, 및/또는 니코틴아미드 (비타민 B3)로 보충되는 배양 배지에서 발현된다. 일정한 구체예에서, 혈청-없는 배양 배지는 폴리아민을 내포한다. 가령, 적어도 2 ㎎/ℓ, 또는 대략 2 ㎎/ℓ 내지 30 ㎎/ℓ, 또는 대략 2 ㎎/ℓ 내지 8 ㎎/ℓ의 농도에서. 특정 구체예에서, 폴리아민은 푸트레신이다. 전형적인 혈청-없는 배양 배지는 U.S. Patent Number 6,171,825와 6,936,441, WO 2007/077217, U.S. Patent Application Publication Number 2008/0009040과 2007/0212770, 그리고 U.S. Patent Application Serial No. 12/847,999에서 교시되고, 이들의 내용은 본 발명에 순전히 참조로서 편입된다.
ADAMTS13 단백질은 또한, 동물 단백질이 없는 배양 배지에서 발현될 수 있다. 한 구체예에서, ADAMTS13은 외인성으로 첨가된 동물 단백질 또는 폴리펩티드가 없고 (즉, 동물 단백질-없고) 아연, 칼슘, 및/또는 니코틴아미드 (비타민 B3)로 보충되는 배양 배지에서 발현된다. 일정한 구체예에서, 동물 단백질 없음 배양 배지는 폴리아민을 내포한다. 가령, 적어도 2 ㎎/ℓ, 또는 대략 2 ㎎/ℓ 내지 30 ㎎/ℓ, 또는 대략 2 ㎎/ℓ 내지 8 ㎎/ℓ의 농도에서. 특정 구체예에서, 폴리아민은 푸트레신이다. 전형적인 동물 단백질 없음 배양 배지는 U.S. Patent Number 6,171,825와 6,936,441, WO 2007/077217, U.S. Patent Application Publication Number 2008/0009040과 2007/0212770, 그리고 U.S. Patent Application Serial No. 12/847,999에서 교시되고, 이들의 내용은 본 발명에 순전히 참조로서 편입된다.
ADAMTS13 단백질은 또한, 본 발명에 순전히 참조로서 편입되는 U.S. Patent Application Serial No. 12/847,999에서 기술된 바와 같이, 추가의 칼슘, 아연, 및/또는 비타민 B3로 보충된 배양 배지에서 발현될 수 있다. 일정한 구체예에서, 배지는 동물 단백질-없는, 올리고펩티드-없는, 또는 화학적으로 정의된 배지일 수 있다. 일정한 구체예에서, 동물 단백질-없는 또는 올리고펩티드-없는 배지는 U.S. Patent Number 6,171,825와 6,936,441, WO 2007/077217, 그리고 U.S. Patent Application Publication Number 2008/0009040과 2007/0212770에서 교시된 바와 같이 제조되고, 이들의 내용은 본 발명에 순전히 참조로서 편입되고, 그리고 추가의 칼슘, 아연, 및/또는 비타민 B3으로 보충된다. 특정 구체예에서, 화학적으로 정의된 배양 배지는 배지 내에서 배양된 세포에서 발현된 ADAMTS 단백질의 비활성을 증가시키기 위하여 추가의 칼슘, 아연, 및/또는 비타민 B3으로 보충된 Dulbecco의 변형된 Eagle 배지 (DMEM)와 유사할 수도 있다. 또 다른 구체예에서, 배양 배지는 동물 성분이 없다. 다른 구체예에서, 배양 배지는 단백질, 예를 들면, 우태 혈청과 같은 혈청으로부터 동물 단백질을 내포한다. 다른 구체예에서, 배양 조직은 재조합 단백질이 외인성으로 첨가된다. 다른 구체예에서, 단백질은 보증된 병원균 없음 동물로부터 유래된다.
D. ADAMTS13 정제
모아진 혈장으로부터 고유 ADAMTS13 정제를 위한 방법은 당분야에 널리 공지되어 있다. 유사하게, 재조합 ADAMTS13의 발현과 정제를 위한 방법 역시 당분야에 공지되어 있다. 가령, 재조합 발현과 정제는 Plaimauer and Scheiflinger, Semin Hematol. 2004 Jan;41(1):24-33; Plaimauer B et al., F. Blood. 2002 Nov 15;100(10):3626-32. Epub 2002 Jul 12; Bruno K et al., J Thromb Haemost. 2005 May;3(5):1064-73, 그리고 U.S. Patent Application Serial No. 12/847,999에서 교시되고, 이들의 내용은 본 발명에 순전히 참조로서 편입된다.
부가적으로, 본 발명에서는 재조합 ADAMTS13의 정제를 위한 추가의 방법을 제시한다. 한 구체예에서, 재조합 ADAMTS13은 재조합 CHO 세포에서 발현되고, 그리고 POROS HS 양이온 교환 크로마토그래피에 의해 결과의 조건화 배지 (conditioned media)로부터 정제된다. 바람직하지 않은 이합체성, 단위체성, 및/또는 집합된 ADAMTS13을 제거하기 위하여, 조성물은 이후, 크기 배제 겔 여과를 받는다. ADAMTS13 조성물은 또한, 일반적으로 적어도 한 가지, 바람직하게는 2가지 바이러스 제거 또는 비활성화 단계를 받게 될 것이다.
일정한 구체예에서, ADAMTS13 제제의 제조를 위한 본 발명에서 제시된 방법은 적어도 한 가지 바이러스 비활성화 또는 제거 단계를 더욱 포함할 것이다. 일정한 구체예에서, 본 발명에서 제시된 방법은 적어도 2가지 또는 적어도 3가지 바이러스 비활성화 또는 제거 단계를 포함할 것이다. 본 발명에서 제시된 방법에서 이용될 수 있는 바이러스 비활성화 또는 제거 단계의 무제한적 실례에는 용매 세정제 처리 (Horowitz et al., Blood Coagul Fibrinolysis 1994 (5 Suppl 3):S21-S28 및 Kreil et al., Transfusion 2003 (43):1023-1028, 이들의 내용은 본 발명에 순전히 참조로서 편입된다), 나노여과 (Hamamoto et al., Vox Sang 1989 (56)230-236 및 Yuasa et al., J Gen Virol. 1991 (72 (pt 8)):2021-2024, 이들의 내용은 본 발명에 순전히 참조로서 편입된다)가 포함된다. 바람직한 구체예에서, 본 발명에서는 용매 세정제 처리 및 나노여과를 포함하는, ADAMTS13 제제의 제조 방법을 제시한다.
한 구체예에서, 바이러스적으로 안전한 ADAMTS13 단백질 제제를 제공하는 방법이 제시되는데, 상기 방법은 (a) ADAMTS13 단백질을 인코딩하는 핵산을 보유하는 세포를 배양 배지에서 배양하는 단계; (b) ADAMTS13 단백질을 내포하는 배양 배지 상층액의 일부분을 회수하는 단계; (c) ADAMTS13 단백질을 크로마토그래피 단계로 농축하는 단계; (d) 적어도 한 가지의 바이러스 비활성화 또는 제거 단계를 수행하는 단계; 그리고 (e) 본 발명에서 제시된 제법에 따라 농축된 ADAMTS13 조성물을 조제하고, 따라서 바이러스적으로 안전한 ADAMTS13 제제를 제공하는 단계를 포함한다. 한 구체예에서, 배양 배지는 아연, 칼슘, 그리고 선택적으로 니코틴아미드 (비타민 B3)를 내포한다. 바람직한 구체예에서, 세포를 배양하는 단계는 연속식 배양 (가령, 관류 또는 키모스탯 배양)을 포함한다. 다른 바람직한 구체예에서, 배양은 34℃ 내지 37℃의 온도에서 유지된다. 또 다른 바람직한 구체예에서, 배양은 6.9 내지 7.2의 pH에서 유지된다. 한 구체예에서, 바이러스 제거 단계는 나노여과이다.
한 측면 구체예에서, 본 발명에서는 안정화된 ADAMTS13 제제를 제조하는 방법을 제시하고, 상기 방법은 (a) 대략 2 μM 내지 대략 12 μM의 농도에서 아연 및 대략 0.5 mM 내지 대략 1.5 mM의 농도에서 칼슘을 포함하는 배지에서 배양된 세포에서 ADAMTS13 단백질, 또는 이의 생물학적 활성 유도체를 발현하는 단계; (b) ADAMTS13 단백질을 정제하는 단계; 그리고 (c) 본 발명에서 제시된 제제 중에서 임의의 한 가지에 따른 제제를 제조하는 단계를 포함한다.
한 구체예에서, 본 발명에서는 안정화된 ADAMTS13 제제를 제조하는 방법을 제시하고, 상기 방법은 (i) 대략 2 μM 내지 대략 12 μM의 농도에서 아연 및 대략 0.5 mM 내지 대략 1.5 mM의 농도에서 칼슘을 포함하는 배지에서 배양된 세포에서 ADAMTS13 단백질, 또는 이의 생물학적 활성 유도체를 발현하는 단계; (ii) ADAMTS13 단백질을 정제하는 단계; 그리고 (iii) (a) ADAMTS13 mg당 적어도 100 단위 ADAMTS13 활성 (즉, FRETS-vWF73 활성); (b) 0 mM 내지 200 mM의 제약학적으로 허용되는 염; (c) 0.5 mM 내지 20 mM 칼슘; (d) 당 및/또는 당알코올; (e) 비이온성 계면활성제; 그리고 (f) 6.0 내지 8.0의 pH를 유지하기 위한 완충제를 포함하는 제제를 제조하는 단계를 포함한다. 한 구체예에서, ADAMTS13의 안정화된 제제는 ADAMTS13 mg당 적어도 200 단위 A13 활성을 포함한다. 다른 구체예에서, ADAMTS13의 안정화된 제제는 ADAMTS13 mg당 적어도 400 단위 A13 활성을 포함한다. 바람직한 구체예에서, ADAMTS13의 안정화된 제제는 ADAMTS13 mg당 적어도 600 단위 A13 활성을 포함한다. 더욱 바람직한 구체예에서, ADAMTS13의 안정화된 제제는 ADAMTS13 mg당 적어도 800 단위 A13 활성을 포함한다. 또 다른 바람직한 구체예에서, ADAMTS13의 안정화된 제제는 ADAMTS13 mg당 적어도 1000 단위 A13 활성을 포함한다. 한 구체예에서, ADAMTS13의 안정화된 제제는 ADAMTS13 mg당 대략 100 단위 내지 대략 2000 단위의 ADAMTS13 활성을 포함한다.
안정화된 A13 제제의 한 구체예에서, 상기 제제는 대략 1.0 mM 내지 대략 10.0 mM 칼슘을 포함한다. 바람직한 구체예에서, 상기 제제는 대략 2.0 내지 대략 4.0 mM 칼슘을 내포한다.
안정화된 A13 제제의 다른 구체예에서, 상기 제제는 대략 2% 내지 대략 6%의 당 및/또는 당알코올을 포함한다. 바람직한 구체예에서, 상기 제제는 대략 3% 내지 대략 5%의 당 및/또는 당알코올을 포함한다. 특정 구체예에서, 상기 제제는 대략 4%의 당 및/또는 당알코올을 포함한다. 한 구체예에서, 당 및/또는 당알코올은 수크로오스, 트레할로스, 만니톨, 그리고 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택된다. 바람직한 구체예에서, 당 및/또는 당알코올은 수크로오스와 만니톨의 혼합물이다.
안정화된 A13 제제의 한 구체예에서, 상기 제제는 대략 0.01% 내지 대략 0.1%의 비-이온성 계면활성제를 포함한다. 바람직한 구체예에서, 상기 제제는 대략 0.05%의 비-이온성 계면활성제를 포함한다. 한 구체예에서, 계면활성제는 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 80, 플루로닉 F-68, 그리고 BRIJ 35로 구성된 군에서 선택된다. 바람직한 구체예에서, 계면활성제는 폴리소르베이트 80이다.
안정화된 A13 제제의 한 구체예에서, 상기 제제는 대략 5 mM 내지 대략 100 mM의 완충제를 포함한다. 바람직한 구체예에서, 상기 제제는 대략 10 mM 내지 대략 50 mM의 완충제를 포함한다. 다른 구체예에서, 완충제는 히스티딘 또는 HEPES이다. 바람직한 구체예에서, 완충제는 히스티딘이다. 한 구체예에서, 상기 제제의 pH는 대략 6.5 내지 7.5이다. 바람직한 구체예에서, 상기 제제의 pH는 7.0±0.2이다.
안정화된 A13 제제의 한 구체예에서, 상기 제제는 대략 0.5 μM 내지 20 μM 아연을 더욱 포함한다.
특정 구체예에서, 본 발명에서는 (a) ADAMTS13 mg당 적어도 100 단위 ADAMTS13 활성; (b) 0 내지 200 mM NaCl; (c) 2 mM 내지 4 mM 칼슘; (d) 2% 내지 4% 만니톨; (e) 0.5% 내지 2% 수크로오스; (f) 0.025 내지 0.1% 폴리소르베이트 80; 그리고 (g) 10 mM 내지 50 mM 히스티딘 (pH 7.0±0.2)을 포함하는 ADAMTS13 (A13)의 안정화된 제제를 제시한다.
한 구체예에서, 본 발명에서는 안정화된 ADAMTS13 제제를 제조하는 방법을 제시하고, 상기 방법은 (i) 대략 2 μM 내지 대략 12 μM의 농도에서 아연 및 대략 0.5 mM 내지 대략 1.5 mM의 농도에서 칼슘을 포함하는 배지에서 배양된 세포에서 ADAMTS13 단백질, 또는 이의 생물학적 활성 유도체를 발현하는 단계; (ii) ADAMTS13 단백질을 정제하는 단계; 그리고 (iii) (a) ADAMTS13 mg당 적어도 100 단위 ADAMTS13 활성 (즉, FRETS-vWF73 활성); (b) 0 mM 내지 100 mM의 제약학적으로 허용되는 염; (c) 0.5 mM 내지 20 mM 칼슘; (d) 당 및/또는 당알코올; (e) 비이온성 계면활성제; 그리고 (f) 6.0 내지 8.0의 pH를 유지하기 위한 완충제를 포함하는 제제를 제조하는 단계를 포함한다. 한 구체예에서, ADAMTS13의 안정화된 제제는 ADAMTS13 mg당 적어도 200 단위 A13 활성을 포함한다. 다른 구체예에서, ADAMTS13의 안정화된 제제는 ADAMTS13 mg당 적어도 400 단위 A13 활성을 포함한다. 바람직한 구체예에서, ADAMTS13의 안정화된 제제는 ADAMTS13 mg당 적어도 600 단위 A13 활성을 포함한다. 더욱 바람직한 구체예에서, ADAMTS13의 안정화된 제제는 ADAMTS13 mg당 적어도 800 단위 A13 활성을 포함한다. 또 다른 바람직한 구체예에서, ADAMTS13의 안정화된 제제는 ADAMTS13 mg당 적어도 1000 단위 A13 활성을 포함한다. 한 구체예에서, ADAMTS13의 안정화된 제제는 ADAMTS13 mg당 대략 100 단위 내지 대략 2000 단위의 ADAMTS13 활성을 포함한다.
안정화된 저염 A13 제제의 한 구체예에서, 상기 제제는 대략 1.0 mM 내지 대략 10.0 mM 칼슘을 포함한다. 바람직한 구체예에서, 상기 제제는 대략 2.0 내지 대략 4.0 mM 칼슘을 내포한다.
안정화된 저염 A13 제제의 다른 구체예에서, 상기 제제는 대략 2% 내지 대략 6%의 당 및/또는 당알코올을 포함한다. 바람직한 구체예에서, 상기 제제는 대략 3% 내지 대략 5%의 당 및/또는 당알코올을 포함한다. 특정 구체예에서, 상기 제제는 대략 4%의 당 및/또는 당알코올을 포함한다. 한 구체예에서, 당 및/또는 당알코올은 수크로오스, 트레할로스, 만니톨, 그리고 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택된다. 바람직한 구체예에서, 당 및/또는 당알코올은 수크로오스와 만니톨의 혼합물이다.
안정화된 저염 A13 제제의 한 구체예에서, 상기 제제는 대략 0.01% 내지 대략 0.1%의 비-이온성 계면활성제를 포함한다. 바람직한 구체예에서, 상기 제제는 대략 0.05%의 비-이온성 계면활성제를 포함한다. 한 구체예에서, 계면활성제는 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 80, 플루로닉 F-68, 그리고 BRIJ 35로 구성된 군에서 선택된다. 바람직한 구체예에서, 계면활성제는 폴리소르베이트 80이다.
안정화된 저염 A13 제제의 한 구체예에서, 상기 제제는 대략 5 mM 내지 대략 100 mM의 완충제를 포함한다. 바람직한 구체예에서, 상기 제제는 대략 10 mM 내지 대략 50 mM의 완충제를 포함한다. 다른 구체예에서, 완충제는 히스티딘 또는 HEPES이다. 바람직한 구체예에서, 완충제는 히스티딘이다. 한 구체예에서, 상기 제제의 pH는 대략 6.5 내지 7.5이다. 바람직한 구체예에서, 상기 제제의 pH는 7.0±0.2이다.
안정화된 저염 A13 제제의 한 구체예에서, 상기 제제는 대략 0.5 μM 내지 20 μM 아연을 더욱 포함한다.
특정 구체예에서, 본 발명에서는 (a) ADAMTS13 mg당 적어도 100 단위 ADAMTS13 활성; (b) 0 내지 60 mM NaCl; (c) 2 mM 내지 4 mM 칼슘; (d) 2% 내지 4% 만니톨; (e) 0.5% 내지 2% 수크로오스; (f) 0.025 내지 0.1% 폴리소르베이트 80; 그리고 (g) 10 mM 내지 50 mM 히스티딘 (pH 7.0±0.2)을 포함하는 ADAMTS13 (A13)의 안정화된 저염 제제를 제시한다.
한 구체예에서, 본 발명에서는 안정화된 ADAMTS13 제제를 제조하는 방법을 제시하고, 상기 방법은 (i) 대략 2 μM 내지 대략 12 μM의 농도에서 아연 및 대략 0.5 mM 내지 대략 1.5 mM의 농도에서 칼슘을 포함하는 배지에서 배양된 세포에서 ADAMTS13 단백질, 또는 이의 생물학적 활성 유도체를 발현하는 단계; (ii) ADAMTS13 단백질을 정제하는 단계; 그리고 (iii) (a) ADAMTS13 mg당 적어도 100 단위 ADAMTS13 활성 (즉, FRETS-vWF73 활성); (b) 0 mM 내지 200 mM의 제약학적으로 허용되는 염; (c) 0.5 mM 내지 20 mM 칼슘; (d) 당 및/또는 당알코올; (e) 비이온성 계면활성제; 그리고 (f) 6.0 내지 8.0의 pH를 유지하기 위한 완충제를 포함하는 제제를 제조하는 단계를 포함한다. 한 구체예에서, ADAMTS13의 안정화된 제제는 ADAMTS13 mg당 적어도 200 단위 A13 활성을 포함한다. 다른 구체예에서, ADAMTS13의 안정화된 제제는 ADAMTS13 mg당 적어도 400 단위 A13 활성을 포함한다. 바람직한 구체예에서, ADAMTS13의 안정화된 제제는 ADAMTS13 mg당 적어도 600 단위 A13 활성을 포함한다. 더욱 바람직한 구체예에서, ADAMTS13의 안정화된 제제는 ADAMTS13 mg당 적어도 800 단위 A13 활성을 포함한다. 또 다른 바람직한 구체예에서, ADAMTS13의 안정화된 제제는 ADAMTS13 mg당 적어도 1000 단위 A13 활성을 포함한다. 한 구체예에서, ADAMTS13의 안정화된 제제는 ADAMTS13 mg당 대략 100 단위 내지 대략 2000 단위의 ADAMTS13 활성을 포함한다.
안정화된 동결건조된 A13 제제의 한 구체예에서, 상기 제제는 대략 1.0 mM 내지 대략 10.0 mM 칼슘을 포함한다. 바람직한 구체예에서, 상기 제제는 대략 2.0 내지 대략 4.0 mM 칼슘을 내포한다.
안정화된 동결건조된 A13 제제의 다른 구체예에서, 상기 제제는 대략 2% 내지 대략 6%의 당 및/또는 당알코올을 포함한다. 바람직한 구체예에서, 상기 제제는 대략 3% 내지 대략 5%의 당 및/또는 당알코올을 포함한다. 특정 구체예에서, 상기 제제는 대략 4%의 당 및/또는 당알코올을 포함한다. 한 구체예에서, 당 및/또는 당알코올은 수크로오스, 트레할로스, 만니톨, 그리고 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택된다. 바람직한 구체예에서, 당 및/또는 당알코올은 수크로오스와 만니톨의 혼합물이다.
안정화된 동결건조된 A13 제제의 한 구체예에서, 상기 제제는 대략 0.01% 내지 대략 0.1%의 비-이온성 계면활성제를 포함한다. 바람직한 구체예에서, 상기 제제는 대략 0.05%의 비-이온성 계면활성제를 포함한다. 한 구체예에서, 계면활성제는 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 80, 플루로닉 F-68, 그리고 BRIJ 35로 구성된 군에서 선택된다. 바람직한 구체예에서, 계면활성제는 폴리소르베이트 80이다.
안정화된 동결건조된 A13 제제의 한 구체예에서, 상기 제제는 대략 5 mM 내지 대략 100 mM의 완충제를 포함한다. 바람직한 구체예에서, 상기 제제는 대략 10 mM 내지 대략 50 mM의 완충제를 포함한다. 다른 구체예에서, 완충제는 히스티딘 또는 HEPES이다. 바람직한 구체예에서, 완충제는 히스티딘이다. 한 구체예에서, 상기 제제의 pH는 대략 6.5 내지 7.5이다. 바람직한 구체예에서, 상기 제제의 pH는 7.0±0.2이다.
안정화된 동결건조된 A13 제제의 한 구체예에서, 상기 제제는 대략 0.5 μM 내지 20 μM 아연을 더욱 포함한다.
특정 구체예에서, 본 발명에서는 ADAMTS13 (A13)의 안정화된 동결건조된 제제를 제시하고, 여기서 상기 제제는 (a) ADAMTS13 mg당 적어도 100 단위 ADAMTS13 활성; (b) 0 내지 200 mM NaCl; (c) 2 mM 내지 4 mM 칼슘; (d) 2% 내지 4% 만니톨; (e) 0.5% 내지 2% 수크로오스; (f) 0.025 내지 0.1% 폴리소르베이트 80; 그리고 (g) 10 mM 내지 50 mM 히스티딘 (pH 7.0±0.2)을 포함하는 액체 제제로부터 동결건조된다.
한 구체예에서, 본 발명에서는 안정화된 ADAMTS13 제제를 제조하는 방법을 제시하고, 상기 방법은 (i) 대략 2 μM 내지 대략 12 μM의 농도에서 아연 및 대략 0.5 mM 내지 대략 1.5 mM의 농도에서 칼슘을 포함하는 배지에서 배양된 세포에서 ADAMTS13 단백질, 또는 이의 생물학적 활성 유도체를 발현하는 단계; (ii) ADAMTS13 단백질을 정제하는 단계; 그리고 (iii) (a) ADAMTS13 mg당 적어도 100 단위 ADAMTS13 활성 (즉, FRETS-vWF73 활성); (b) 0 mM 내지 100 mM의 제약학적으로 허용되는 염; (c) 0.5 mM 내지 20 mM 칼슘; (d) 당 및/또는 당알코올; (e) 비이온성 계면활성제; 그리고 (f) 6.0 내지 8.0의 pH를 유지하기 위한 완충제를 포함하는 제제를 제조하는 단계를 포함한다. 한 구체예에서, ADAMTS13의 안정화된 제제는 ADAMTS13 mg당 적어도 200 단위 A13 활성을 포함한다. 다른 구체예에서, ADAMTS13의 안정화된 제제는 ADAMTS13 mg당 적어도 400 단위 A13 활성을 포함한다. 바람직한 구체예에서, ADAMTS13의 안정화된 제제는 ADAMTS13 mg당 적어도 600 단위 A13 활성을 포함한다. 더욱 바람직한 구체예에서, ADAMTS13의 안정화된 제제는 ADAMTS13 mg당 적어도 800 단위 A13 활성을 포함한다. 또 다른 바람직한 구체예에서, ADAMTS13의 안정화된 제제는 ADAMTS13 mg당 적어도 1000 단위 A13 활성을 포함한다. 한 구체예에서, ADAMTS13의 안정화된 제제는 ADAMTS13 mg당 대략 100 단위 내지 대략 2000 단위의 ADAMTS13 활성을 포함한다.
안정화된 저염 동결건조된 A13 제제의 한 구체예에서, 상기 제제는 대략 1.0 mM 내지 대략 10.0 mM 칼슘을 포함한다. 바람직한 구체예에서, 상기 제제는 대략 2.0 내지 대략 4.0 mM 칼슘을 내포한다.
안정화된 저염 동결건조된 A13 제제의 다른 구체예에서, 상기 제제는 대략 2% 내지 대략 6%의 당 및/또는 당알코올을 포함한다. 바람직한 구체예에서, 상기 제제는 대략 3% 내지 대략 5%의 당 및/또는 당알코올을 포함한다. 특정 구체예에서, 상기 제제는 대략 4%의 당 및/또는 당알코올을 포함한다. 한 구체예에서, 당 및/또는 당알코올은 수크로오스, 트레할로스, 만니톨, 그리고 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택된다. 바람직한 구체예에서, 당 및/또는 당알코올은 수크로오스와 만니톨의 혼합물이다.
안정화된 저염 동결건조된 A13 제제의 한 구체예에서, 상기 제제는 대략 0.01% 내지 대략 0.1%의 비-이온성 계면활성제를 포함한다. 바람직한 구체예에서, 상기 제제는 대략 0.05%의 비-이온성 계면활성제를 포함한다. 한 구체예에서, 계면활성제는 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 80, 플루로닉 F-68, 그리고 BRIJ 35로 구성된 군에서 선택된다. 바람직한 구체예에서, 계면활성제는 폴리소르베이트 80이다.
안정화된 저염 동결건조된 A13 제제의 한 구체예에서, 상기 제제는 대략 5 mM 내지 대략 100 mM의 완충제를 포함한다. 바람직한 구체예에서, 상기 제제는 대략 10 mM 내지 대략 50 mM의 완충제를 포함한다. 다른 구체예에서, 완충제는 히스티딘 또는 HEPES이다. 바람직한 구체예에서, 완충제는 히스티딘이다. 한 구체예에서, 상기 제제의 pH는 대략 6.5 내지 7.5이다. 바람직한 구체예에서, 상기 제제의 pH는 7.0±0.2이다.
안정화된 저염 동결건조된 A13 제제의 한 구체예에서, 상기 제제는 대략 0.5 μM 내지 20 μM 아연을 더욱 포함한다.
특정 구체예에서, 본 발명에서는 ADAMTS13 (A13)의 안정화된 저염 동결건조된 제제를 제시하고, 여기서 상기 제제는 (a) ADAMTS13 mg당 적어도 100 단위 ADAMTS13 활성; (b) 0 내지 60 mM NaCl; (c) 2 mM 내지 4 mM 칼슘; (d) 2% 내지 4% 만니톨; (e) 0.5% 내지 2% 수크로오스; (f) 0.025 내지 0.1% 폴리소르베이트 80; 그리고 (g) 10 mM 내지 50 mM 히스티딘 (pH 7.0±0.2)을 포함하는 액체 제제로부터 동결건조된다.
1. 용매와 세정제 (S/D) 처리
ADAMTS13 제제 내에 존재할 수 있는 다양한 바이러스 오염물질을 비활성화시키기 위하여, 하나 또는 그 이상의 ADAMTS13 중간 용액은 용매 세정제 (S/D) 처리를 받을 수 있다. 용액의 세정제 처리를 위한 방법은 당분야에 널리 공지되어 있다 (참조: Pelletier JP et al., Best Pract Res Clin Haematol. 2006;19(1):205-42, 이의 내용은 본 발명에 순전히 참조로서 편입된다). 일반적으로, 임의의 표준 S/D 처리는 본 발명에서 제시된 방법과 함께 이용될 수 있다. 가령, S/D 처리를 위한 전형적인 프로토콜은 하기에 제시된다.
한 구체예에서, Triton X-100, Tween-20, 그리고 트리(n-부틸)인산염 (TNBP)은 각각, 대략 1.0%, 0.3%, 그리고 0.3%의 최종 농도에서 ADAMTS13 중간 용액에 첨가된다. 혼합물은 이후, 대략 18℃ 내지 25℃의 온도에서 적어도 대략 1시간 동안 교반된다.
2. 나노여과 및 한외/정용여과
본 발명에서 제시된 ADAMTS13 단백질 제제의 바이러스 부하 (virus load)를 감소시키기 위하여, 상기 제제, 또는 중간 조성물은 적절한 나노여과 장치를 이용하여 나노여과될 수 있다. 일정한 구체예에서, 나노여과 장치는 대략 15 nm 내지 200 nm의 평균 구멍 크기를 가질 것이다. 이러한 용도에 적합한 나노필터의 실례에는 제한 없이, DVD, DV 50, DV 20 (Pall), Viresolve NFP®, Viresolve NFR® (Millipore), Planova® 15N, 20N, 35N, 그리고 75N (Planova)이 포함된다. 특정 구체예에서, 나노필터는 대략 15 내지 72 nm, 또는 대략 19 내지 35 nm, 또는 대략 15 nm, 19 nm, 20 nm, 35 nm, 또는 72 nm의 평균 구멍 크기를 가질 수 있다. 바람직한 구체예에서, 나노필터는 대략 19 nm, 20 nm, 또는 35 nm의 평균 구멍 크기, 예를 들면, Asahi PLANOVA® 20N 또는 PLANOVA® 35N 필터 또는 이의 등가물을 가질 것이다.
나노여과 이후에, 여과액은 선택적으로, 한외여과에 의해 농축될 수 있고 및/또는 완충액 조성물은 정용여과에 의해 조정될 수 있다. 일정한 구체예에서, 한외여과는 카세트 (cassette) 내에서 열린 채널 스크린 (open channel screen)으로 수행되고, 그리고 한외여과 막은 대략 175 kDa 이하, 또는 대략 170, 160, 150, 140, 130, 120, 110, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 또는 더욱 적은 kDa 이하의 명목 분자량 컷오프 (nominal molecular weight cut off, NMWCO)를 갖는다. 바람직한 구체예에서, 한외여과 막은 30 kDa 이내의 NMWCO를 갖는다. 다른 바람직한 구체예에서, 한외여과 막은 30 kDa 이내의 NMWCO를 갖는다.
3. 동결건조와 열 처리
또 다른 구체예에서, 다른 바이러스 비활성화 또는 제거 단계, 예를 들면, 나노여과를 미리 받았을 지도 모르는 동결건조된 ADAMTS13 제제의 바이러스 활성은 동결건조된 조성물의 열 처리에 의해 더욱 감소될 수 있다. 혈액 인자 (blood factor) 내에서 바이러스 부하의 비활성화를 위한 열 처리는 당분야에 널리 공지되어 있다 (참조: Piszkiewicz et al., Thromb Res. 1987 Jul 15;47(2):235-41; Piszkiewicz et al., Curr Stud Hematol Blood Transfus. 1989;(56):44-54; Epstein and Fricke, Arch Pathol Lab Med. 1990 Mar;114(3):335-40).
VI. 투여 및 치료 방법
이들 제제는 치료적 또는 예방적 처치를 위하여 투여될 수 있다. 일반적으로, 치료적 적용을 위하여, 제제는 ADAMTS13 또는 VWF 기능장애와 연관된 질환 또는 장애를 앓거나, 또는 달리 이를 필요로 하는 개체에, "치료 효과적인 용량"으로 투여된다. 이들 용도에 효과적인 제제와 양은 질환 또는 장애의 심각도 및 환자 건강의 전반적인 상태에 좌우될 것이다. 이들 제제의 단일 또는 복수 투여는 환자에 의해 요구되고 용인되는 용량과 빈도에 따라 제공될 수 있다.
본 발명에서 "환자" 또는 "개체"는 인간 및 기타 동물, 특히 포유동물 둘 모두를 포함한다. 따라서 이들 조성물, 제제, 그리고 방법은 인간 요법 및 수의 용도 둘 모두에 적용될 수 있다. 특정 구체예에서, 환자는 포유동물이고, 그리고 한 구체예에서, 인간이다. ADAMTS13 또는 VWF 기능장애와 연관된 장애에 대한 다른 공지된 치료제와 요법이 본 발명에서 제시된 제제와 방법과 병용될 수 있다.
본 발명의 한 측면에서, 높은 비활성을 갖는 안정화된 rA13 제제를 만드는 방법이 제시된다. 한 구체예에서, 상기 방법은 대략 2μM 내지 대략 12 μM의 농도에서 아연 및 대략 0.5 mM 내지 대략 1.5 mM의 농도에서 칼슘을 포함하는 배지에서 배양된 세포에서 ADAMTS13 단백질, 또는 이의 생물학적 활성 유도체를 발현하는 단계, A13 단백질을 정제하는 단계, 그리고 앞서 기술된 바와 같은 제제를 제조하는 단계를 포함한다. 일정한 구체예에서, 배양 배지는 대략 1㎎/ℓ 내지 대략 20㎎/ℓ의 농도에서 비타민 B3로 더욱 보충된다.
다른 측면에서, 본 발명에서는 ADAMTS13 또는 VWF 기능장애와 연관된 질환 또는 장애를 치료하거나 예방하는 방법을 제시한다. 다른 구체예에서, 본 발명에서는 하나 또는 그 이상의 혈전의 형성 및/또는 존재와 연관된 질환 또는 장애를 치료하거나 예방하는 방법을 제시한다. 다른 구체예에서, 본 발명에서는 병든 개체에서 하나 또는 그 이상의 혈전을 붕괴시키는 방법을 제시한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명에서는 병든 개체에서 경색을 치료하거나 예방하는 방법을 제시한다. 일반적으로, 본 발명에서 제시된 방법은 본 발명에서 제시된 바와 같은 ADAMTS13 제제를 병든 개체에 투여하는 단계를 포함한다.
하나 또는 그 이상의 혈전의 형성 및/또는 존재와 연관된 질환의 무제한적 실례는 유전성 혈전성 혈소판감소성 자반증 (TTP), 후천성 TTP, 동맥 혈전증, 급성 심근 경색 (AMI), 뇌졸중, 패혈증, 그리고 산재성 혈관내 응고증 (DIC)이다.
경색과 연관된 질환의 무제한적 실례에는 제한 없이, 심근 경색 (심장 마비), 폐색전, 뇌혈관 사건, 예를 들면, 뇌졸중, 말초 동맥 폐쇄성 질환 (가령, 괴저), 휴즈 증후군, 패혈증, 거대 세포 동맥염 (GCA), 탈장, 그리고 장염전이 포함된다.
A. ADAMTS13과 vWF 기능장애의 치료와 예방
한 측면 구체예에서, 본 발명에서는 ADAMTS13 또는 VWF 기능장애와 연관된 질환 또는 장애를 치료하거나 예방하는 방법을 제시하고, 상기 방법은 본 발명에서 제시된 제제 중에서 임의의 한 가지에 따른 ADAMTS13 제제를 병든 개체에 투여하는 단계를 포함한다.
한 구체예에서, 본 발명에서는 ADAMTS13 또는 VWF 기능장애와 연관된 질환 또는 장애를 치료하거나 예방하는 방법을 제시하고, 상기 방법은 (a) ADAMTS13 mg당 적어도 100 단위 ADAMTS13 활성 (즉, FRETS-vWF73 활성); (b) 0 mM 내지 200 mM의 제약학적으로 허용되는 염; (c) 0.5 mM 내지 20 mM 칼슘; (d) 당 및/또는 당알코올; (e) 비이온성 계면활성제; 그리고 (f) 6.0 내지 8.0의 pH를 유지하기 위한 완충제를 포함하는 ADAMTS13 제제를 병든 개체에 투여하는 단계를 포함한다. 한 구체예에서, ADAMTS13의 안정화된 제제는 ADAMTS13 mg당 적어도 200 단위 A13 활성을 포함한다. 다른 구체예에서, ADAMTS13의 안정화된 제제는 ADAMTS13 mg당 적어도 400 단위 A13 활성을 포함한다. 바람직한 구체예에서, ADAMTS13의 안정화된 제제는 ADAMTS13 mg당 적어도 600 단위 A13 활성을 포함한다. 더욱 바람직한 구체예에서, ADAMTS13의 안정화된 제제는 ADAMTS13 mg당 적어도 800 단위 A13 활성을 포함한다. 또 다른 바람직한 구체예에서, ADAMTS13의 안정화된 제제는 ADAMTS13 mg당 적어도 1000 단위 A13 활성을 포함한다. 한 구체예에서, ADAMTS13의 안정화된 제제는 ADAMTS13 mg당 대략 100 단위 내지 대략 2000 단위의 ADAMTS13 활성을 포함한다.
안정화된 A13 제제의 한 구체예에서, 상기 제제는 대략 1.0 mM 내지 대략 10.0 mM 칼슘을 포함한다. 바람직한 구체예에서, 상기 제제는 대략 2.0 내지 대략 4.0 mM 칼슘을 내포한다.
안정화된 A13 제제의 다른 구체예에서, 상기 제제는 대략 2% 내지 대략 6%의 당 및/또는 당알코올을 포함한다. 바람직한 구체예에서, 상기 제제는 대략 3% 내지 대략 5%의 당 및/또는 당알코올을 포함한다. 특정 구체예에서, 상기 제제는 대략 4%의 당 및/또는 당알코올을 포함한다. 한 구체예에서, 당 및/또는 당알코올은 수크로오스, 트레할로스, 만니톨, 그리고 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택된다. 바람직한 구체예에서, 당 및/또는 당알코올은 수크로오스와 만니톨의 혼합물이다.
안정화된 A13 제제의 한 구체예에서, 상기 제제는 대략 0.01% 내지 대략 0.1%의 비-이온성 계면활성제를 포함한다. 바람직한 구체예에서, 상기 제제는 대략 0.05%의 비-이온성 계면활성제를 포함한다. 한 구체예에서, 계면활성제는 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 80, 플루로닉 F-68, 그리고 BRIJ 35로 구성된 군에서 선택된다. 바람직한 구체예에서, 계면활성제는 폴리소르베이트 80이다.
안정화된 A13 제제의 한 구체예에서, 상기 제제는 대략 5 mM 내지 대략 100 mM의 완충제를 포함한다. 바람직한 구체예에서, 상기 제제는 대략 10 mM 내지 대략 50 mM의 완충제를 포함한다. 다른 구체예에서, 완충제는 히스티딘 또는 HEPES이다. 바람직한 구체예에서, 완충제는 히스티딘이다. 한 구체예에서, 상기 제제의 pH는 대략 6.5 내지 7.5이다. 바람직한 구체예에서, 상기 제제의 pH는 7.0±0.2이다.
안정화된 A13 제제의 한 구체예에서, 상기 제제는 대략 0.5 μM 내지 20 μM 아연을 더욱 포함한다.
특정 구체예에서, 본 발명에서는 (a) ADAMTS13 mg당 적어도 100 단위 ADAMTS13 활성; (b) 0 내지 200 mM NaCl; (c) 2 mM 내지 4 mM 칼슘; (d) 2% 내지 4% 만니톨; (e) 0.5% 내지 2% 수크로오스; (f) 0.025 내지 0.1% 폴리소르베이트 80; 그리고 (g) 10 mM 내지 50 mM 히스티딘 (pH 7.0±0.2)을 포함하는 ADAMTS13 (A13)의 안정화된 제제를 제시한다.
한 구체예에서, 본 발명에서는 ADAMTS13 또는 VWF 기능장애와 연관된 질환 또는 장애를 치료하거나 예방하는 방법을 제시하고, 상기 방법은 (a) ADAMTS13 mg당 적어도 100 단위 ADAMTS13 활성 (즉, FRETS-vWF73 활성); (b) 0 mM 내지 100 mM의 제약학적으로 허용되는 염; (c) 0.5 mM 내지 20 mM 칼슘; (d) 당 및/또는 당알코올; (e) 비이온성 계면활성제; 그리고 (f) 6.0 내지 8.0의 pH를 유지하기 위한 완충제를 포함하는 ADAMTS13 제제를 병든 개체에 투여하는 단계를 포함한다. 한 구체예에서, ADAMTS13의 안정화된 제제는 ADAMTS13 mg당 적어도 200 단위 A13 활성을 포함한다. 다른 구체예에서, ADAMTS13의 안정화된 제제는 ADAMTS13 mg당 적어도 400 단위 A13 활성을 포함한다. 바람직한 구체예에서, ADAMTS13의 안정화된 제제는 ADAMTS13 mg당 적어도 600 단위 A13 활성을 포함한다. 더욱 바람직한 구체예에서, ADAMTS13의 안정화된 제제는 ADAMTS13 mg당 적어도 800 단위 A13 활성을 포함한다. 또 다른 바람직한 구체예에서, ADAMTS13의 안정화된 제제는 ADAMTS13 mg당 적어도 1000 단위 A13 활성을 포함한다. 한 구체예에서, ADAMTS13의 안정화된 제제는 ADAMTS13 mg당 대략 100 단위 내지 대략 2000 단위의 ADAMTS13 활성을 포함한다.
안정화된 저염 A13 제제의 한 구체예에서, 상기 제제는 대략 1.0 mM 내지 대략 10.0 mM 칼슘을 포함한다. 바람직한 구체예에서, 상기 제제는 대략 2.0 내지 대략 4.0 mM 칼슘을 내포한다.
안정화된 저염 A13 제제의 다른 구체예에서, 상기 제제는 대략 2% 내지 대략 6%의 당 및/또는 당알코올을 포함한다. 바람직한 구체예에서, 상기 제제는 대략 3% 내지 대략 5%의 당 및/또는 당알코올을 포함한다. 특정 구체예에서, 상기 제제는 대략 4%의 당 및/또는 당알코올을 포함한다. 한 구체예에서, 당 및/또는 당알코올은 수크로오스, 트레할로스, 만니톨, 그리고 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택된다. 바람직한 구체예에서, 당 및/또는 당알코올은 수크로오스와 만니톨의 혼합물이다.
안정화된 저염 A13 제제의 한 구체예에서, 상기 제제는 대략 0.01% 내지 대략 0.1%의 비-이온성 계면활성제를 포함한다. 바람직한 구체예에서, 상기 제제는 대략 0.05%의 비-이온성 계면활성제를 포함한다. 한 구체예에서, 계면활성제는 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 80, 플루로닉 F-68, 그리고 BRIJ 35로 구성된 군에서 선택된다. 바람직한 구체예에서, 계면활성제는 폴리소르베이트 80이다.
안정화된 저염 A13 제제의 한 구체예에서, 상기 제제는 대략 5 mM 내지 대략 100 mM의 완충제를 포함한다. 바람직한 구체예에서, 상기 제제는 대략 10 mM 내지 대략 50 mM의 완충제를 포함한다. 다른 구체예에서, 완충제는 히스티딘 또는 HEPES이다. 바람직한 구체예에서, 완충제는 히스티딘이다. 한 구체예에서, 상기 제제의 pH는 대략 6.5 내지 7.5이다. 바람직한 구체예에서, 상기 제제의 pH는 7.0±0.2이다.
안정화된 저염 A13 제제의 한 구체예에서, 상기 제제는 대략 0.5 μM 내지 20 μM 아연을 더욱 포함한다.
특정 구체예에서, 본 발명에서는 (a) ADAMTS13 mg당 적어도 100 단위 ADAMTS13 활성; (b) 0 내지 60 mM NaCl; (c) 2 mM 내지 4 mM 칼슘; (d) 2% 내지 4% 만니톨; (e) 0.5% 내지 2% 수크로오스; (f) 0.025 내지 0.1% 폴리소르베이트 80; 그리고 (g) 10 mM 내지 50 mM 히스티딘 (pH 7.0±0.2)을 포함하는 ADAMTS13 (A13)의 안정화된 저염 제제를 제시한다.
한 구체예에서, 본 발명에서는 ADAMTS13 또는 VWF 기능장애와 연관된 질환 또는 장애를 치료하거나 예방하는 방법을 제시하고, 상기 방법은 (a) ADAMTS13 mg당 적어도 100 단위 ADAMTS13 활성 (즉, FRETS-vWF73 활성); (b) 0 mM 내지 200 mM의 제약학적으로 허용되는 염; (c) 0.5 mM 내지 20 mM 칼슘; (d) 당 및/또는 당알코올; (e) 비이온성 계면활성제; 그리고 (f) 6.0 내지 8.0의 pH를 유지하기 위한 완충제를 포함하는 ADAMTS13 제제를 병든 개체에 투여하는 단계를 포함한다. 한 구체예에서, ADAMTS13의 안정화된 제제는 ADAMTS13 mg당 적어도 200 단위 A13 활성을 포함한다. 다른 구체예에서, ADAMTS13의 안정화된 제제는 ADAMTS13 mg당 적어도 400 단위 A13 활성을 포함한다. 바람직한 구체예에서, ADAMTS13의 안정화된 제제는 ADAMTS13 mg당 적어도 600 단위 A13 활성을 포함한다. 더욱 바람직한 구체예에서, ADAMTS13의 안정화된 제제는 ADAMTS13 mg당 적어도 800 단위 A13 활성을 포함한다. 또 다른 바람직한 구체예에서, ADAMTS13의 안정화된 제제는 ADAMTS13 mg당 적어도 1000 단위 A13 활성을 포함한다. 한 구체예에서, ADAMTS13의 안정화된 제제는 ADAMTS13 mg당 대략 100 단위 내지 대략 2000 단위의 ADAMTS13 활성을 포함한다.
안정화된 동결건조된 A13 제제의 한 구체예에서, 상기 제제는 대략 1.0 mM 내지 대략 10.0 mM 칼슘을 포함한다. 바람직한 구체예에서, 상기 제제는 대략 2.0 내지 대략 4.0 mM 칼슘을 내포한다.
안정화된 동결건조된 A13 제제의 다른 구체예에서, 상기 제제는 대략 2% 내지 대략 6%의 당 및/또는 당알코올을 포함한다. 바람직한 구체예에서, 상기 제제는 대략 3% 내지 대략 5%의 당 및/또는 당알코올을 포함한다. 특정 구체예에서, 상기 제제는 대략 4%의 당 및/또는 당알코올을 포함한다. 한 구체예에서, 당 및/또는 당알코올은 수크로오스, 트레할로스, 만니톨, 그리고 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택된다. 바람직한 구체예에서, 당 및/또는 당알코올은 수크로오스와 만니톨의 혼합물이다.
안정화된 동결건조된 A13 제제의 한 구체예에서, 상기 제제는 대략 0.01% 내지 대략 0.1%의 비-이온성 계면활성제를 포함한다. 바람직한 구체예에서, 상기 제제는 대략 0.05%의 비-이온성 계면활성제를 포함한다. 한 구체예에서, 계면활성제는 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 80, 플루로닉 F-68, 그리고 BRIJ 35로 구성된 군에서 선택된다. 바람직한 구체예에서, 계면활성제는 폴리소르베이트 80이다.
안정화된 동결건조된 A13 제제의 한 구체예에서, 상기 제제는 대략 5 mM 내지 대략 100 mM의 완충제를 포함한다. 바람직한 구체예에서, 상기 제제는 대략 10 mM 내지 대략 50 mM의 완충제를 포함한다. 다른 구체예에서, 완충제는 히스티딘 또는 HEPES이다. 바람직한 구체예에서, 완충제는 히스티딘이다. 한 구체예에서, 상기 제제의 pH는 대략 6.5 내지 7.5이다. 바람직한 구체예에서, 상기 제제의 pH는 7.0±0.2이다.
안정화된 동결건조된 A13 제제의 한 구체예에서, 상기 제제는 대략 0.5 μM 내지 20 μM 아연을 더욱 포함한다.
특정 구체예에서, 본 발명에서는 ADAMTS13 (A13)의 안정화된 동결건조된 제제를 제시하고, 여기서 상기 제제는 (a) ADAMTS13 mg당 적어도 100 단위 ADAMTS13 활성; (b) 0 내지 200 mM NaCl; (c) 2 mM 내지 4 mM 칼슘; (d) 2% 내지 4% 만니톨; (e) 0.5% 내지 2% 수크로오스; (f) 0.025 내지 0.1% 폴리소르베이트 80; 그리고 (g) 10 mM 내지 50 mM 히스티딘 (pH 7.0±0.2)을 포함하는 액체 제제로부터 동결건조된다.
한 구체예에서, 본 발명에서는 ADAMTS13 또는 VWF 기능장애와 연관된 질환 또는 장애를 치료하거나 예방하는 방법을 제시하고, 상기 방법은 (a) ADAMTS13 mg당 적어도 100 단위 ADAMTS13 활성 (즉, FRETS-vWF73 활성); (b) 0 mM 내지 100 mM의 제약학적으로 허용되는 염; (c) 0.5 mM 내지 20 mM 칼슘; (d) 당 및/또는 당알코올; (e) 비이온성 계면활성제; 그리고 (f) 6.0 내지 8.0의 pH를 유지하기 위한 완충제를 포함하는 ADAMTS13 제제를 병든 개체에 투여하는 단계를 포함한다. 한 구체예에서, ADAMTS13의 안정화된 제제는 ADAMTS13 mg당 적어도 200 단위 A13 활성을 포함한다. 다른 구체예에서, ADAMTS13의 안정화된 제제는 ADAMTS13 mg당 적어도 400 단위 A13 활성을 포함한다. 바람직한 구체예에서, ADAMTS13의 안정화된 제제는 ADAMTS13 mg당 적어도 600 단위 A13 활성을 포함한다. 더욱 바람직한 구체예에서, ADAMTS13의 안정화된 제제는 ADAMTS13 mg당 적어도 800 단위 A13 활성을 포함한다. 또 다른 바람직한 구체예에서, ADAMTS13의 안정화된 제제는 ADAMTS13 mg당 적어도 1000 단위 A13 활성을 포함한다. 한 구체예에서, ADAMTS13의 안정화된 제제는 ADAMTS13 mg당 대략 100 단위 내지 대략 2000 단위의 ADAMTS13 활성을 포함한다.
안정화된 저염 동결건조된 A13 제제의 한 구체예에서, 상기 제제는 대략 1.0 mM 내지 대략 10.0 mM 칼슘을 포함한다. 바람직한 구체예에서, 상기 제제는 대략 2.0 내지 대략 4.0 mM 칼슘을 내포한다.
안정화된 저염 동결건조된 A13 제제의 다른 구체예에서, 상기 제제는 대략 2% 내지 대략 6%의 당 및/또는 당알코올을 포함한다. 바람직한 구체예에서, 상기 제제는 대략 3% 내지 대략 5%의 당 및/또는 당알코올을 포함한다. 특정 구체예에서, 상기 제제는 대략 4%의 당 및/또는 당알코올을 포함한다. 한 구체예에서, 당 및/또는 당알코올은 수크로오스, 트레할로스, 만니톨, 그리고 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택된다. 바람직한 구체예에서, 당 및/또는 당알코올은 수크로오스와 만니톨의 혼합물이다.
안정화된 저염 동결건조된 A13 제제의 한 구체예에서, 상기 제제는 대략 0.01% 내지 대략 0.1%의 비-이온성 계면활성제를 포함한다. 바람직한 구체예에서, 상기 제제는 대략 0.05%의 비-이온성 계면활성제를 포함한다. 한 구체예에서, 계면활성제는 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 80, 플루로닉 F-68, 그리고 BRIJ 35로 구성된 군에서 선택된다. 바람직한 구체예에서, 계면활성제는 폴리소르베이트 80이다.
안정화된 저염 동결건조된 A13 제제의 한 구체예에서, 상기 제제는 대략 5 mM 내지 대략 100 mM의 완충제를 포함한다. 바람직한 구체예에서, 상기 제제는 대략 10 mM 내지 대략 50 mM의 완충제를 포함한다. 다른 구체예에서, 완충제는 히스티딘 또는 HEPES이다. 바람직한 구체예에서, 완충제는 히스티딘이다. 한 구체예에서, 상기 제제의 pH는 대략 6.5 내지 7.5이다. 바람직한 구체예에서, 상기 제제의 pH는 7.0±0.2이다.
안정화된 저염 동결건조된 A13 제제의 한 구체예에서, 상기 제제는 대략 0.5 μM 내지 20 μM 아연을 더욱 포함한다.
특정 구체예에서, 본 발명에서는 ADAMTS13 (A13)의 안정화된 저염 동결건조된 제제를 제시하고, 여기서 상기 제제는 (a) ADAMTS13 mg당 적어도 100 단위 ADAMTS13 활성; (b) 0 내지 60 mM NaCl; (c) 2 mM 내지 4 mM 칼슘; (d) 2% 내지 4% 만니톨; (e) 0.5% 내지 2% 수크로오스; (f) 0.025 내지 0.1% 폴리소르베이트 80; 그리고 (g) 10 mM 내지 50 mM 히스티딘 (pH 7.0±0.2)을 포함하는 액체 제제로부터 동결건조된다.
B. 혈전성 질환과 장애의 치료와 예방
한 측면 구체예에서, 본 발명에서는 혈전의 형성 및/또는 존재와 연관된 질환 또는 장애를 치료하거나 예방하는 방법을 제시하고, 상기 방법은 본 발명에서 제시된 제제 중에서 임의의 한 가지에 따른 ADAMTS13 제제를 병든 개체에 투여하는 단계를 포함한다.
한 구체예에서, 본 발명에서는 혈전의 형성 및/또는 존재와 연관된 질환 또는 장애를 치료하거나 예방하는 방법을 제시하고, 상기 방법은 (a) ADAMTS13 mg당 적어도 100 단위 ADAMTS13 활성 (즉, FRETS-vWF73 활성); (b) 0 mM 내지 200 mM의 제약학적으로 허용되는 염; (c) 0.5 mM 내지 20 mM 칼슘; (d) 당 및/또는 당알코올; (e) 비이온성 계면활성제; 그리고 (f) 6.0 내지 8.0의 pH를 유지하기 위한 완충제를 포함하는 ADAMTS13 제제를 병든 개체에 투여하는 단계를 포함한다. 한 구체예에서, ADAMTS13의 안정화된 제제는 ADAMTS13 mg당 적어도 200 단위 A13 활성을 포함한다. 다른 구체예에서, ADAMTS13의 안정화된 제제는 ADAMTS13 mg당 적어도 400 단위 A13 활성을 포함한다. 바람직한 구체예에서, ADAMTS13의 안정화된 제제는 ADAMTS13 mg당 적어도 600 단위 A13 활성을 포함한다. 더욱 바람직한 구체예에서, ADAMTS13의 안정화된 제제는 ADAMTS13 mg당 적어도 800 단위 A13 활성을 포함한다. 또 다른 바람직한 구체예에서, ADAMTS13의 안정화된 제제는 ADAMTS13 mg당 적어도 1000 단위 A13 활성을 포함한다. 한 구체예에서, ADAMTS13의 안정화된 제제는 ADAMTS13 mg당 대략 100 단위 내지 대략 2000 단위의 ADAMTS13 활성을 포함한다.
안정화된 A13 제제의 한 구체예에서, 상기 제제는 대략 1.0 mM 내지 대략 10.0 mM 칼슘을 포함한다. 바람직한 구체예에서, 상기 제제는 대략 2.0 내지 대략 4.0 mM 칼슘을 내포한다.
안정화된 A13 제제의 다른 구체예에서, 상기 제제는 대략 2% 내지 대략 6%의 당 및/또는 당알코올을 포함한다. 바람직한 구체예에서, 상기 제제는 대략 3% 내지 대략 5%의 당 및/또는 당알코올을 포함한다. 특정 구체예에서, 상기 제제는 대략 4%의 당 및/또는 당알코올을 포함한다. 한 구체예에서, 당 및/또는 당알코올은 수크로오스, 트레할로스, 만니톨, 그리고 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택된다. 바람직한 구체예에서, 당 및/또는 당알코올은 수크로오스와 만니톨의 혼합물이다.
안정화된 A13 제제의 한 구체예에서, 상기 제제는 대략 0.01% 내지 대략 0.1%의 비-이온성 계면활성제를 포함한다. 바람직한 구체예에서, 상기 제제는 대략 0.05%의 비-이온성 계면활성제를 포함한다. 한 구체예에서, 계면활성제는 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 80, 플루로닉 F-68, 그리고 BRIJ 35로 구성된 군에서 선택된다. 바람직한 구체예에서, 계면활성제는 폴리소르베이트 80이다.
안정화된 A13 제제의 한 구체예에서, 상기 제제는 대략 5 mM 내지 대략 100 mM의 완충제를 포함한다. 바람직한 구체예에서, 상기 제제는 대략 10 mM 내지 대략 50 mM의 완충제를 포함한다. 다른 구체예에서, 완충제는 히스티딘 또는 HEPES이다. 바람직한 구체예에서, 완충제는 히스티딘이다. 한 구체예에서, 상기 제제의 pH는 대략 6.5 내지 7.5이다. 바람직한 구체예에서, 상기 제제의 pH는 7.0±0.2이다.
안정화된 A13 제제의 한 구체예에서, 상기 제제는 대략 0.5 μM 내지 20 μM 아연을 더욱 포함한다.
특정 구체예에서, 본 발명에서는 (a) ADAMTS13 mg당 적어도 100 단위 ADAMTS13 활성; (b) 0 내지 200 mM NaCl; (c) 2 mM 내지 4 mM 칼슘; (d) 2% 내지 4% 만니톨; (e) 0.5% 내지 2% 수크로오스; (f) 0.025 내지 0.1% 폴리소르베이트 80; 그리고 (g) 10 mM 내지 50 mM 히스티딘 (pH 7.0±0.2)을 포함하는 ADAMTS13 (A13)의 안정화된 제제를 제시한다.
한 구체예에서, 본 발명에서는 혈전의 형성 및/또는 존재와 연관된 질환 또는 장애를 치료하거나 예방하는 방법을 제시하고, 상기 방법은 (a) ADAMTS13 mg당 적어도 100 단위 ADAMTS13 활성 (즉, FRETS-vWF73 활성); (b) 0 mM 내지 100 mM의 제약학적으로 허용되는 염; (c) 0.5 mM 내지 20 mM 칼슘; (d) 당 및/또는 당알코올; (e) 비이온성 계면활성제; 그리고 (f) 6.0 내지 8.0의 pH를 유지하기 위한 완충제를 포함하는 ADAMTS13 제제를 병든 개체에 투여하는 단계를 포함한다. 한 구체예에서, ADAMTS13의 안정화된 제제는 ADAMTS13 mg당 적어도 200 단위 A13 활성을 포함한다. 다른 구체예에서, ADAMTS13의 안정화된 제제는 ADAMTS13 mg당 적어도 400 단위 A13 활성을 포함한다. 바람직한 구체예에서, ADAMTS13의 안정화된 제제는 ADAMTS13 mg당 적어도 600 단위 A13 활성을 포함한다. 더욱 바람직한 구체예에서, ADAMTS13의 안정화된 제제는 ADAMTS13 mg당 적어도 800 단위 A13 활성을 포함한다. 또 다른 바람직한 구체예에서, ADAMTS13의 안정화된 제제는 ADAMTS13 mg당 적어도 1000 단위 A13 활성을 포함한다. 한 구체예에서, ADAMTS13의 안정화된 제제는 ADAMTS13 mg당 대략 100 단위 내지 대략 2000 단위의 ADAMTS13 활성을 포함한다.
안정화된 저염 A13 제제의 한 구체예에서, 상기 제제는 대략 1.0 mM 내지 대략 10.0 mM 칼슘을 포함한다. 바람직한 구체예에서, 상기 제제는 대략 2.0 내지 대략 4.0 mM 칼슘을 내포한다.
안정화된 저염 A13 제제의 다른 구체예에서, 상기 제제는 대략 2% 내지 대략 6%의 당 및/또는 당알코올을 포함한다. 바람직한 구체예에서, 상기 제제는 대략 3% 내지 대략 5%의 당 및/또는 당알코올을 포함한다. 특정 구체예에서, 상기 제제는 대략 4%의 당 및/또는 당알코올을 포함한다. 한 구체예에서, 당 및/또는 당알코올은 수크로오스, 트레할로스, 만니톨, 그리고 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택된다. 바람직한 구체예에서, 당 및/또는 당알코올은 수크로오스와 만니톨의 혼합물이다.
안정화된 저염 A13 제제의 한 구체예에서, 상기 제제는 대략 0.01% 내지 대략 0.1%의 비-이온성 계면활성제를 포함한다. 바람직한 구체예에서, 상기 제제는 대략 0.05%의 비-이온성 계면활성제를 포함한다. 한 구체예에서, 계면활성제는 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 80, 플루로닉 F-68, 그리고 BRIJ 35로 구성된 군에서 선택된다. 바람직한 구체예에서, 계면활성제는 폴리소르베이트 80이다.
안정화된 저염 A13 제제의 한 구체예에서, 상기 제제는 대략 5 mM 내지 대략 100 mM의 완충제를 포함한다. 바람직한 구체예에서, 상기 제제는 대략 10 mM 내지 대략 50 mM의 완충제를 포함한다. 다른 구체예에서, 완충제는 히스티딘 또는 HEPES이다. 바람직한 구체예에서, 완충제는 히스티딘이다. 한 구체예에서, 상기 제제의 pH는 대략 6.5 내지 7.5이다. 바람직한 구체예에서, 상기 제제의 pH는 7.0±0.2이다.
안정화된 저염 A13 제제의 한 구체예에서, 상기 제제는 대략 0.5 μM 내지 20 μM 아연을 더욱 포함한다.
특정 구체예에서, 본 발명에서는 (a) ADAMTS13 mg당 적어도 100 단위 ADAMTS13 활성; (b) 0 내지 60 mM NaCl; (c) 2 mM 내지 4 mM 칼슘; (d) 2% 내지 4% 만니톨; (e) 0.5% 내지 2% 수크로오스; (f) 0.025 내지 0.1% 폴리소르베이트 80; 그리고 (g) 10 mM 내지 50 mM 히스티딘 (pH 7.0±0.2)을 포함하는 ADAMTS13 (A13)의 안정화된 저염 제제를 제시한다.
한 구체예에서, 본 발명에서는 혈전의 형성 및/또는 존재와 연관된 질환 또는 장애를 치료하거나 예방하는 방법을 제시하고, 상기 방법은 (a) ADAMTS13 mg당 적어도 100 단위 ADAMTS13 활성 (즉, FRETS-vWF73 활성); (b) 0 mM 내지 200 mM의 제약학적으로 허용되는 염; (c) 0.5 mM 내지 20 mM 칼슘; (d) 당 및/또는 당알코올; (e) 비이온성 계면활성제; 그리고 (f) 6.0 내지 8.0의 pH를 유지하기 위한 완충제를 포함하는 ADAMTS13 제제를 병든 개체에 투여하는 단계를 포함한다. 한 구체예에서, ADAMTS13의 안정화된 제제는 ADAMTS13 mg당 적어도 200 단위 A13 활성을 포함한다. 다른 구체예에서, ADAMTS13의 안정화된 제제는 ADAMTS13 mg당 적어도 400 단위 A13 활성을 포함한다. 바람직한 구체예에서, ADAMTS13의 안정화된 제제는 ADAMTS13 mg당 적어도 600 단위 A13 활성을 포함한다. 더욱 바람직한 구체예에서, ADAMTS13의 안정화된 제제는 ADAMTS13 mg당 적어도 800 단위 A13 활성을 포함한다. 또 다른 바람직한 구체예에서, ADAMTS13의 안정화된 제제는 ADAMTS13 mg당 적어도 1000 단위 A13 활성을 포함한다. 한 구체예에서, ADAMTS13의 안정화된 제제는 ADAMTS13 mg당 대략 100 단위 내지 대략 2000 단위의 ADAMTS13 활성을 포함한다.
안정화된 동결건조된 A13 제제의 한 구체예에서, 상기 제제는 대략 1.0 mM 내지 대략 10.0 mM 칼슘을 포함한다. 바람직한 구체예에서, 상기 제제는 대략 2.0 내지 대략 4.0 mM 칼슘을 내포한다.
안정화된 동결건조된 A13 제제의 다른 구체예에서, 상기 제제는 대략 2% 내지 대략 6%의 당 및/또는 당알코올을 포함한다. 바람직한 구체예에서, 상기 제제는 대략 3% 내지 대략 5%의 당 및/또는 당알코올을 포함한다. 특정 구체예에서, 상기 제제는 대략 4%의 당 및/또는 당알코올을 포함한다. 한 구체예에서, 당 및/또는 당알코올은 수크로오스, 트레할로스, 만니톨, 그리고 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택된다. 바람직한 구체예에서, 당 및/또는 당알코올은 수크로오스와 만니톨의 혼합물이다.
안정화된 동결건조된 A13 제제의 한 구체예에서, 상기 제제는 대략 0.01% 내지 대략 0.1%의 비-이온성 계면활성제를 포함한다. 바람직한 구체예에서, 상기 제제는 대략 0.05%의 비-이온성 계면활성제를 포함한다. 한 구체예에서, 계면활성제는 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 80, 플루로닉 F-68, 그리고 BRIJ 35로 구성된 군에서 선택된다. 바람직한 구체예에서, 계면활성제는 폴리소르베이트 80이다.
안정화된 동결건조된 A13 제제의 한 구체예에서, 상기 제제는 대략 5 mM 내지 대략 100 mM의 완충제를 포함한다. 바람직한 구체예에서, 상기 제제는 대략 10 mM 내지 대략 50 mM의 완충제를 포함한다. 다른 구체예에서, 완충제는 히스티딘 또는 HEPES이다. 바람직한 구체예에서, 완충제는 히스티딘이다. 한 구체예에서, 상기 제제의 pH는 대략 6.5 내지 7.5이다. 바람직한 구체예에서, 상기 제제의 pH는 7.0±0.2이다.
안정화된 동결건조된 A13 제제의 한 구체예에서, 상기 제제는 대략 0.5 μM 내지 20 μM 아연을 더욱 포함한다.
특정 구체예에서, 본 발명에서는 ADAMTS13 (A13)의 안정화된 동결건조된 제제를 제시하고, 여기서 상기 제제는 (a) ADAMTS13 mg당 적어도 100 단위 ADAMTS13 활성; (b) 0 내지 200 mM NaCl; (c) 2 mM 내지 4 mM 칼슘; (d) 2% 내지 4% 만니톨; (e) 0.5% 내지 2% 수크로오스; (f) 0.025 내지 0.1% 폴리소르베이트 80; 그리고 (g) 10 mM 내지 50 mM 히스티딘 (pH 7.0±0.2)을 포함하는 액체 제제로부터 동결건조된다.
한 구체예에서, 본 발명에서는 혈전의 형성 및/또는 존재와 연관된 질환 또는 장애를 치료하거나 예방하는 방법을 제시하고, 상기 방법은 (a) ADAMTS13 mg당 적어도 100 단위 ADAMTS13 활성 (즉, FRETS-vWF73 활성); (b) 0 mM 내지 100 mM의 제약학적으로 허용되는 염; (c) 0.5 mM 내지 20 mM 칼슘; (d) 당 및/또는 당알코올; (e) 비이온성 계면활성제; 그리고 (f) 6.0 내지 8.0의 pH를 유지하기 위한 완충제를 포함하는 ADAMTS13 제제를 병든 개체에 투여하는 단계를 포함한다. 한 구체예에서, ADAMTS13의 안정화된 제제는 ADAMTS13 mg당 적어도 200 단위 A13 활성을 포함한다. 다른 구체예에서, ADAMTS13의 안정화된 제제는 ADAMTS13 mg당 적어도 400 단위 A13 활성을 포함한다. 바람직한 구체예에서, ADAMTS13의 안정화된 제제는 ADAMTS13 mg당 적어도 600 단위 A13 활성을 포함한다. 더욱 바람직한 구체예에서, ADAMTS13의 안정화된 제제는 ADAMTS13 mg당 적어도 800 단위 A13 활성을 포함한다. 또 다른 바람직한 구체예에서, ADAMTS13의 안정화된 제제는 ADAMTS13 mg당 적어도 1000 단위 A13 활성을 포함한다. 한 구체예에서, ADAMTS13의 안정화된 제제는 ADAMTS13 mg당 대략 100 단위 내지 대략 2000 단위의 ADAMTS13 활성을 포함한다.
안정화된 저염 동결건조된 A13 제제의 한 구체예에서, 상기 제제는 대략 1.0 mM 내지 대략 10.0 mM 칼슘을 포함한다. 바람직한 구체예에서, 상기 제제는 대략 2.0 내지 대략 4.0 mM 칼슘을 내포한다.
안정화된 저염 동결건조된 A13 제제의 다른 구체예에서, 상기 제제는 대략 2% 내지 대략 6%의 당 및/또는 당알코올을 포함한다. 바람직한 구체예에서, 상기 제제는 대략 3% 내지 대략 5%의 당 및/또는 당알코올을 포함한다. 특정 구체예에서, 상기 제제는 대략 4%의 당 및/또는 당알코올을 포함한다. 한 구체예에서, 당 및/또는 당알코올은 수크로오스, 트레할로스, 만니톨, 그리고 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택된다. 바람직한 구체예에서, 당 및/또는 당알코올은 수크로오스와 만니톨의 혼합물이다.
안정화된 저염 동결건조된 A13 제제의 한 구체예에서, 상기 제제는 대략 0.01% 내지 대략 0.1%의 비-이온성 계면활성제를 포함한다. 바람직한 구체예에서, 상기 제제는 대략 0.05%의 비-이온성 계면활성제를 포함한다. 한 구체예에서, 계면활성제는 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 80, 플루로닉 F-68, 그리고 BRIJ 35로 구성된 군에서 선택된다. 바람직한 구체예에서, 계면활성제는 폴리소르베이트 80이다.
안정화된 저염 동결건조된 A13 제제의 한 구체예에서, 상기 제제는 대략 5 mM 내지 대략 100 mM의 완충제를 포함한다. 바람직한 구체예에서, 상기 제제는 대략 10 mM 내지 대략 50 mM의 완충제를 포함한다. 다른 구체예에서, 완충제는 히스티딘 또는 HEPES이다. 바람직한 구체예에서, 완충제는 히스티딘이다. 한 구체예에서, 상기 제제의 pH는 대략 6.5 내지 7.5이다. 바람직한 구체예에서, 상기 제제의 pH는 7.0±0.2이다.
안정화된 저염 동결건조된 A13 제제의 한 구체예에서, 상기 제제는 대략 0.5 μM 내지 20 μM 아연을 더욱 포함한다.
특정 구체예에서, 본 발명에서는 ADAMTS13 (A13)의 안정화된 저염 동결건조된 제제를 제시하고, 여기서 상기 제제는 (a) ADAMTS13 mg당 적어도 100 단위 ADAMTS13 활성; (b) 0 내지 60 mM NaCl; (c) 2 mM 내지 4 mM 칼슘; (d) 2% 내지 4% 만니톨; (e) 0.5% 내지 2% 수크로오스; (f) 0.025 내지 0.1% 폴리소르베이트 80; 그리고 (g) 10 mM 내지 50 mM 히스티딘 (pH 7.0±0.2)을 포함하는 액체 제제로부터 동결건조된다.
C. 경색의 치료와 예방
한 측면 구체예에서, 본 발명에서는 경색을 치료하거나 예방하는 방법을 제시하고, 상기 방법은 본 발명에서 제시된 제제 중에서 임의의 한 가지에 따른 ADAMTS13 제제를 병든 개체에 투여하는 단계를 포함한다.
한 구체예에서, 본 발명에서는 경색을 치료하거나 예방하는 방법을 제시하고, 상기 방법은 (a) ADAMTS13 mg당 적어도 100 단위 ADAMTS13 활성 (즉, FRETS-vWF73 활성); (b) 0 mM 내지 200 mM의 제약학적으로 허용되는 염; (c) 0.5 mM 내지 20 mM 칼슘; (d) 당 및/또는 당알코올; (e) 비이온성 계면활성제; 그리고 (f) 6.0 내지 8.0의 pH를 유지하기 위한 완충제를 포함하는 ADAMTS13 제제를 병든 개체에 투여하는 단계를 포함한다. 한 구체예에서, ADAMTS13의 안정화된 제제는 ADAMTS13 mg당 적어도 200 단위 A13 활성을 포함한다. 다른 구체예에서, ADAMTS13의 안정화된 제제는 ADAMTS13 mg당 적어도 400 단위 A13 활성을 포함한다. 바람직한 구체예에서, ADAMTS13의 안정화된 제제는 ADAMTS13 mg당 적어도 600 단위 A13 활성을 포함한다. 더욱 바람직한 구체예에서, ADAMTS13의 안정화된 제제는 ADAMTS13 mg당 적어도 800 단위 A13 활성을 포함한다. 또 다른 바람직한 구체예에서, ADAMTS13의 안정화된 제제는 ADAMTS13 mg당 적어도 1000 단위 A13 활성을 포함한다. 한 구체예에서, ADAMTS13의 안정화된 제제는 ADAMTS13 mg당 대략 100 단위 내지 대략 2000 단위의 ADAMTS13 활성을 포함한다.
안정화된 A13 제제의 한 구체예에서, 상기 제제는 대략 1.0 mM 내지 대략 10.0 mM 칼슘을 포함한다. 바람직한 구체예에서, 상기 제제는 대략 2.0 내지 대략 4.0 mM 칼슘을 내포한다.
안정화된 A13 제제의 다른 구체예에서, 상기 제제는 대략 2% 내지 대략 6%의 당 및/또는 당알코올을 포함한다. 바람직한 구체예에서, 상기 제제는 대략 3% 내지 대략 5%의 당 및/또는 당알코올을 포함한다. 특정 구체예에서, 상기 제제는 대략 4%의 당 및/또는 당알코올을 포함한다. 한 구체예에서, 당 및/또는 당알코올은 수크로오스, 트레할로스, 만니톨, 그리고 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택된다. 바람직한 구체예에서, 당 및/또는 당알코올은 수크로오스와 만니톨의 혼합물이다.
안정화된 A13 제제의 한 구체예에서, 상기 제제는 대략 0.01% 내지 대략 0.1%의 비-이온성 계면활성제를 포함한다. 바람직한 구체예에서, 상기 제제는 대략 0.05%의 비-이온성 계면활성제를 포함한다. 한 구체예에서, 계면활성제는 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 80, 플루로닉 F-68, 그리고 BRIJ 35로 구성된 군에서 선택된다. 바람직한 구체예에서, 계면활성제는 폴리소르베이트 80이다.
안정화된 A13 제제의 한 구체예에서, 상기 제제는 대략 5 mM 내지 대략 100 mM의 완충제를 포함한다. 바람직한 구체예에서, 상기 제제는 대략 10 mM 내지 대략 50 mM의 완충제를 포함한다. 다른 구체예에서, 완충제는 히스티딘 또는 HEPES이다. 바람직한 구체예에서, 완충제는 히스티딘이다. 한 구체예에서, 상기 제제의 pH는 대략 6.5 내지 7.5이다. 바람직한 구체예에서, 상기 제제의 pH는 7.0±0.2이다.
안정화된 A13 제제의 한 구체예에서, 상기 제제는 대략 0.5 μM 내지 20 μM 아연을 더욱 포함한다.
특정 구체예에서, 본 발명에서는 (a) ADAMTS13 mg당 적어도 100 단위 ADAMTS13 활성; (b) 0 내지 200 mM NaCl; (c) 2 mM 내지 4 mM 칼슘; (d) 2% 내지 4% 만니톨; (e) 0.5% 내지 2% 수크로오스; (f) 0.025 내지 0.1% 폴리소르베이트 80; 그리고 (g) 10 mM 내지 50 mM 히스티딘 (pH 7.0±0.2)을 포함하는 ADAMTS13 (A13)의 안정화된 제제를 제시한다.
한 구체예에서, 본 발명에서는 경색을 치료하거나 예방하는 방법을 제시하고, 상기 방법은 (a) ADAMTS13 mg당 적어도 100 단위 ADAMTS13 활성 (즉, FRETS-vWF73 활성); (b) 0 mM 내지 100 mM의 제약학적으로 허용되는 염; (c) 0.5 mM 내지 20 mM 칼슘; (d) 당 및/또는 당알코올; (e) 비이온성 계면활성제; 그리고 (f) 6.0 내지 8.0의 pH를 유지하기 위한 완충제를 포함하는 ADAMTS13 제제를 병든 개체에 투여하는 단계를 포함한다. 한 구체예에서, ADAMTS13의 안정화된 제제는 ADAMTS13 mg당 적어도 200 단위 A13 활성을 포함한다. 다른 구체예에서, ADAMTS13의 안정화된 제제는 ADAMTS13 mg당 적어도 400 단위 A13 활성을 포함한다. 바람직한 구체예에서, ADAMTS13의 안정화된 제제는 ADAMTS13 mg당 적어도 600 단위 A13 활성을 포함한다. 더욱 바람직한 구체예에서, ADAMTS13의 안정화된 제제는 ADAMTS13 mg당 적어도 800 단위 A13 활성을 포함한다. 또 다른 바람직한 구체예에서, ADAMTS13의 안정화된 제제는 ADAMTS13 mg당 적어도 1000 단위 A13 활성을 포함한다. 한 구체예에서, ADAMTS13의 안정화된 제제는 ADAMTS13 mg당 대략 100 단위 내지 대략 2000 단위의 ADAMTS13 활성을 포함한다.
안정화된 저염 A13 제제의 한 구체예에서, 상기 제제는 대략 1.0 mM 내지 대략 10.0 mM 칼슘을 포함한다. 바람직한 구체예에서, 상기 제제는 대략 2.0 내지 대략 4.0 mM 칼슘을 내포한다.
안정화된 저염 A13 제제의 다른 구체예에서, 상기 제제는 대략 2% 내지 대략 6%의 당 및/또는 당알코올을 포함한다. 바람직한 구체예에서, 상기 제제는 대략 3% 내지 대략 5%의 당 및/또는 당알코올을 포함한다. 특정 구체예에서, 상기 제제는 대략 4%의 당 및/또는 당알코올을 포함한다. 한 구체예에서, 당 및/또는 당알코올은 수크로오스, 트레할로스, 만니톨, 그리고 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택된다. 바람직한 구체예에서, 당 및/또는 당알코올은 수크로오스와 만니톨의 혼합물이다.
안정화된 저염 A13 제제의 한 구체예에서, 상기 제제는 대략 0.01% 내지 대략 0.1%의 비-이온성 계면활성제를 포함한다. 바람직한 구체예에서, 상기 제제는 대략 0.05%의 비-이온성 계면활성제를 포함한다. 한 구체예에서, 계면활성제는 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 80, 플루로닉 F-68, 그리고 BRIJ 35로 구성된 군에서 선택된다. 바람직한 구체예에서, 계면활성제는 폴리소르베이트 80이다.
안정화된 저염 A13 제제의 한 구체예에서, 상기 제제는 대략 5 mM 내지 대략 100 mM의 완충제를 포함한다. 바람직한 구체예에서, 상기 제제는 대략 10 mM 내지 대략 50 mM의 완충제를 포함한다. 다른 구체예에서, 완충제는 히스티딘 또는 HEPES이다. 바람직한 구체예에서, 완충제는 히스티딘이다. 한 구체예에서, 상기 제제의 pH는 대략 6.5 내지 7.5이다. 바람직한 구체예에서, 상기 제제의 pH는 7.0±0.2이다.
안정화된 저염 A13 제제의 한 구체예에서, 상기 제제는 대략 0.5 μM 내지 20 μM 아연을 더욱 포함한다.
특정 구체예에서, 본 발명에서는 (a) ADAMTS13 mg당 적어도 100 단위 ADAMTS13 활성; (b) 0 내지 60 mM NaCl; (c) 2 mM 내지 4 mM 칼슘; (d) 2% 내지 4% 만니톨; (e) 0.5% 내지 2% 수크로오스; (f) 0.025 내지 0.1% 폴리소르베이트 80; 그리고 (g) 10 mM 내지 50 mM 히스티딘 (pH 7.0±0.2)을 포함하는 ADAMTS13 (A13)의 안정화된 저염 제제를 제시한다.
한 구체예에서, 본 발명에서는 경색을 치료하거나 예방하는 방법을 제시하고, 상기 방법은 (a) ADAMTS13 mg당 적어도 100 단위 ADAMTS13 활성 (즉, FRETS-vWF73 활성); (b) 0 mM 내지 200 mM의 제약학적으로 허용되는 염; (c) 0.5 mM 내지 20 mM 칼슘; (d) 당 및/또는 당알코올; (e) 비이온성 계면활성제; 그리고 (f) 6.0 내지 8.0의 pH를 유지하기 위한 완충제를 포함하는 ADAMTS13 제제를 병든 개체에 투여하는 단계를 포함한다. 한 구체예에서, ADAMTS13의 안정화된 제제는 ADAMTS13 mg당 적어도 200 단위 A13 활성을 포함한다. 다른 구체예에서, ADAMTS13의 안정화된 제제는 ADAMTS13 mg당 적어도 400 단위 A13 활성을 포함한다. 바람직한 구체예에서, ADAMTS13의 안정화된 제제는 ADAMTS13 mg당 적어도 600 단위 A13 활성을 포함한다. 더욱 바람직한 구체예에서, ADAMTS13의 안정화된 제제는 ADAMTS13 mg당 적어도 800 단위 A13 활성을 포함한다. 또 다른 바람직한 구체예에서, ADAMTS13의 안정화된 제제는 ADAMTS13 mg당 적어도 1000 단위 A13 활성을 포함한다. 한 구체예에서, ADAMTS13의 안정화된 제제는 ADAMTS13 mg당 대략 100 단위 내지 대략 2000 단위의 ADAMTS13 활성을 포함한다.
안정화된 동결건조된 A13 제제의 한 구체예에서, 상기 제제는 대략 1.0 mM 내지 대략 10.0 mM 칼슘을 포함한다. 바람직한 구체예에서, 상기 제제는 대략 2.0 내지 대략 4.0 mM 칼슘을 내포한다.
안정화된 동결건조된 A13 제제의 다른 구체예에서, 상기 제제는 대략 2% 내지 대략 6%의 당 및/또는 당알코올을 포함한다. 바람직한 구체예에서, 상기 제제는 대략 3% 내지 대략 5%의 당 및/또는 당알코올을 포함한다. 특정 구체예에서, 상기 제제는 대략 4%의 당 및/또는 당알코올을 포함한다. 한 구체예에서, 당 및/또는 당알코올은 수크로오스, 트레할로스, 만니톨, 그리고 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택된다. 바람직한 구체예에서, 당 및/또는 당알코올은 수크로오스와 만니톨의 혼합물이다.
안정화된 동결건조된 A13 제제의 한 구체예에서, 상기 제제는 대략 0.01% 내지 대략 0.1%의 비-이온성 계면활성제를 포함한다. 바람직한 구체예에서, 상기 제제는 대략 0.05%의 비-이온성 계면활성제를 포함한다. 한 구체예에서, 계면활성제는 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 80, 플루로닉 F-68, 그리고 BRIJ 35로 구성된 군에서 선택된다. 바람직한 구체예에서, 계면활성제는 폴리소르베이트 80이다.
안정화된 동결건조된 A13 제제의 한 구체예에서, 상기 제제는 대략 5 mM 내지 대략 100 mM의 완충제를 포함한다. 바람직한 구체예에서, 상기 제제는 대략 10 mM 내지 대략 50 mM의 완충제를 포함한다. 다른 구체예에서, 완충제는 히스티딘 또는 HEPES이다. 바람직한 구체예에서, 완충제는 히스티딘이다. 한 구체예에서, 상기 제제의 pH는 대략 6.5 내지 7.5이다. 바람직한 구체예에서, 상기 제제의 pH는 7.0±0.2이다.
안정화된 동결건조된 A13 제제의 한 구체예에서, 상기 제제는 대략 0.5 μM 내지 20 μM 아연을 더욱 포함한다.
특정 구체예에서, 본 발명에서는 ADAMTS13 (A13)의 안정화된 동결건조된 제제를 제시하고, 여기서 상기 제제는 (a) ADAMTS13 mg당 적어도 100 단위 ADAMTS13 활성; (b) 0 내지 200 mM NaCl; (c) 2 mM 내지 4 mM 칼슘; (d) 2% 내지 4% 만니톨; (e) 0.5% 내지 2% 수크로오스; (f) 0.025 내지 0.1% 폴리소르베이트 80; 그리고 (g) 10 mM 내지 50 mM 히스티딘 (pH 7.0±0.2)을 포함하는 액체 제제로부터 동결건조된다.
한 구체예에서, 본 발명에서는 경색을 치료하거나 예방하는 방법을 제시하고, 상기 방법은 (a) ADAMTS13 mg당 적어도 100 단위 ADAMTS13 활성 (즉, FRETS-vWF73 활성); (b) 0 mM 내지 100 mM의 제약학적으로 허용되는 염; (c) 0.5 mM 내지 20 mM 칼슘; (d) 당 및/또는 당알코올; (e) 비이온성 계면활성제; 그리고 (f) 6.0 내지 8.0의 pH를 유지하기 위한 완충제를 포함하는 ADAMTS13 제제를 병든 개체에 투여하는 단계를 포함한다. 한 구체예에서, ADAMTS13의 안정화된 제제는 ADAMTS13 mg당 적어도 200 단위 A13 활성을 포함한다. 다른 구체예에서, ADAMTS13의 안정화된 제제는 ADAMTS13 mg당 적어도 400 단위 A13 활성을 포함한다. 바람직한 구체예에서, ADAMTS13의 안정화된 제제는 ADAMTS13 mg당 적어도 600 단위 A13 활성을 포함한다. 더욱 바람직한 구체예에서, ADAMTS13의 안정화된 제제는 ADAMTS13 mg당 적어도 800 단위 A13 활성을 포함한다. 또 다른 바람직한 구체예에서, ADAMTS13의 안정화된 제제는 ADAMTS13 mg당 적어도 1000 단위 A13 활성을 포함한다. 한 구체예에서, ADAMTS13의 안정화된 제제는 ADAMTS13 mg당 대략 100 단위 내지 대략 2000 단위의 ADAMTS13 활성을 포함한다.
안정화된 저염 동결건조된 A13 제제의 한 구체예에서, 상기 제제는 대략 1.0 mM 내지 대략 10.0 mM 칼슘을 포함한다. 바람직한 구체예에서, 상기 제제는 대략 2.0 내지 대략 4.0 mM 칼슘을 내포한다.
안정화된 저염 동결건조된 A13 제제의 다른 구체예에서, 상기 제제는 대략 2% 내지 대략 6%의 당 및/또는 당알코올을 포함한다. 바람직한 구체예에서, 상기 제제는 대략 3% 내지 대략 5%의 당 및/또는 당알코올을 포함한다. 특정 구체예에서, 상기 제제는 대략 4%의 당 및/또는 당알코올을 포함한다. 한 구체예에서, 당 및/또는 당알코올은 수크로오스, 트레할로스, 만니톨, 그리고 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택된다. 바람직한 구체예에서, 당 및/또는 당알코올은 수크로오스와 만니톨의 혼합물이다.
안정화된 저염 동결건조된 A13 제제의 한 구체예에서, 상기 제제는 대략 0.01% 내지 대략 0.1%의 비-이온성 계면활성제를 포함한다. 바람직한 구체예에서, 상기 제제는 대략 0.05%의 비-이온성 계면활성제를 포함한다. 한 구체예에서, 계면활성제는 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 80, 플루로닉 F-68, 그리고 BRIJ 35로 구성된 군에서 선택된다. 바람직한 구체예에서, 계면활성제는 폴리소르베이트 80이다.
안정화된 저염 동결건조된 A13 제제의 한 구체예에서, 상기 제제는 대략 5 mM 내지 대략 100 mM의 완충제를 포함한다. 바람직한 구체예에서, 상기 제제는 대략 10 mM 내지 대략 50 mM의 완충제를 포함한다. 다른 구체예에서, 완충제는 히스티딘 또는 HEPES이다. 바람직한 구체예에서, 완충제는 히스티딘이다. 한 구체예에서, 상기 제제의 pH는 대략 6.5 내지 7.5이다. 바람직한 구체예에서, 상기 제제의 pH는 7.0±0.2이다.
안정화된 저염 동결건조된 A13 제제의 한 구체예에서, 상기 제제는 대략 0.5 μM 내지 20 μM 아연을 더욱 포함한다.
특정 구체예에서, 본 발명에서는 ADAMTS13 (A13)의 안정화된 저염 동결건조된 제제를 제시하고, 여기서 상기 제제는 (a) ADAMTS13 mg당 적어도 100 단위 ADAMTS13 활성; (b) 0 내지 60 mM NaCl; (c) 2 mM 내지 4 mM 칼슘; (d) 2% 내지 4% 만니톨; (e) 0.5% 내지 2% 수크로오스; (f) 0.025 내지 0.1% 폴리소르베이트 80; 그리고 (g) 10 mM 내지 50 mM 히스티딘 (pH 7.0±0.2)을 포함하는 액체 제제로부터 동결건조된다.
VII. ADAMTS13 키트
본 발명의 다른 측면에서, ADAMTS13 또는 VWF 기능장애와 연관된 질환 또는 장애의 치료를 위한 키트가 제시된다. 한 구체예에서, 키트는 앞서 제시된 바와 같이, A13 또는 rA13의 제제를 포함한다. 일부 구체예에서, 본 발명에서 제시된 키트는 본 발명에서 제시된 바와 같은 액체 또는 동결건조된 제제의 하나 또는 그 이상의 용량을 내포할 수 있다. 키트가 동결건조된 A13 또는 rA13 제제를 포함할 때, 일반적으로 키트는 또한, 액체 제제의 재구성 (reconstitution)에 적합한 액체, 예를 들면, 무균수 또는 제약학적으로 허용되는 완충액을 내포할 것이다. 일부 구체예에서, 키트는 건강 관리 전문가에 의한 투여를 위한 또는 가정용으로, 주사기에 미리 포장된 ADAMTS13 제제를 포함할 수 있다.
한 구체예에서, 대략 10 단위의 FRETS-VWF73 활성 및 대략 10,000 단위의 FRETS-VWF73 활성을 포함하는 키트가 제시된다. 다른 구체예에서, 키트는 예로써, 대략 20 단위의 FRETS-VWF73 (UFV73) 활성 내지 대략 8,000 단위의 FRETS-VWF73 활성, 또는 대략 30 UFV73 내지 대략 6,000 UFV73, 또는 대략 40 UFV73 내지 대략 4,000 UFV73, 또는 대략 50 UFV73 내지 대략 3,000 UFV73, 또는 대략 75 UFV73 내지 대략 2,500 UFV73, 또는 대략 100 UFV73 내지 대략 2,000 UFV73, 또는 대략 200 UFV73 내지 대략 1,500 UFV73, 또는 그 안에 대략 다른 범위를 제공할 수 있다. 일정한 구체예에서, 키트는 대략 10 단위의 FRETS-VWF73 활성, 또는 대략 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, 900, 1,000, 1,100, 1,200, 1,300, 1,400, 1,500, 1,600, 1,700, 1,800, 1,900, 2,000, 2,100, 2,200, 2,300, 2,400, 2,500, 2,600, 2,700, 2,800, 2,900, 3,000, 3,100, 3,200, 3,300, 3,400, 3,500, 3,600, 3,700, 3,800, 3,900, 4,000, 4,100, 4,200, 4,300, 4,400, 4,500, 4,600, 4,700, 4,800, 4,900, 5,000, 5,100, 5,200, 5,300, 5,400, 5,500, 5,600, 5,700, 5,800, 5,900, 6,000, 6,100, 6,200, 6,300, 6,400, 6,500, 6,600, 6,700, 6,800, 6,900, 7,000, 7,100, 7,200, 7,300, 7,400, 7,500, 7,600, 7,700, 7,800, 7,900, 8,000, 8,100, 8,200, 8,300, 8,400, 8,500, 8,600, 8,700, 8,800, 8,900, 9,000, 9,100, 9,200, 9,300, 9,400, 9,500, 9,600, 9,700, 9,800, 9,900, 10,000 또는 그 이상 단위의 FRETS-VWF73 활성을 제공할 수 있다.
일정한 구체예에서, 키트는 ADAMTS13의 단일 투여 또는 복용을 위한 것이다. 다른 구체예에서, 키트는 투여를 위한 ADAMTS13의 복수 용량을 내포할 수도 있다. 한 구체예에서, 키트는 건강 관리 전문가에 의한 투여를 위한 또는 가정용으로, 주사기에 미리 포장된 ADAMTS13 제제를 포함할 수 있다.
도면의 간단한 설명
도 1. 재조합 ADAMTS13은 (1) 히스티딘, (2) 인산염 완충액, 또는 (3) 구연산나트륨에서 선택되는 20 mM의 완충제로 pH 7.0에서 150 mM NaCl, 2% 수크로오스, 0.05% 폴리소르베이트 80을 내포하는 완충액에서 조제되었다. 용액은 4℃ 또는 37℃에서 최대 6개월 동안 저장되었다. (A) FRETS-VWF73 활성 및 (B) ADAMTS13 단백질 농도는 ELISA에 의해 측정될 때, 지정된 시점에서 결정되었다.
도 2. 재조합 ADAMTS13은 (1) 히스티딘, (2) 인산염 완충액, 또는 (3) 구연산나트륨에서 선택되는 20 mM의 완충제로 pH 7.0에서 150 mM NaCl, 2% 수크로오스, 0.05% 폴리소르베이트 80을 내포하는 완충액에서 조제되고 동결건조되었다. 동결건조된 제제는 4℃ 또는 37℃에서 최대 6개월 동안 저장되었다. ADAMTS13 제제는 무균수로 재구성되고, 그리고 (A) FRETS-VWF73 활성 및 (B) ADAMTS13 단백질 농도는 ELISA에 의해 측정될 때, 지정된 시점에서 결정되었다.
도 3. 재조합 ADAMTS13은 (1) 히스티딘, (2) 인산염 완충액, 또는 (3) 구연산나트륨에서 선택되는 20 mM의 완충제로 pH 7.0에서 150 mM NaCl, 2% 수크로오스, 0.05% 폴리소르베이트 80을 내포하는 완충액에서 조제되고, 그리고 샘플은 Superose 6 겔 여과 칼럼 상에 직접적으로 적하 (loading)되거나, 또는 동결건조되고, 그리고 적하에 앞서 무균수로 재구성되었다. 이들 ADAMTS13 제제는 이후, 겔 여과에 의해 분석되었다.
도 4. 재조합 ADAMTS13은 150 mM NaCl, 2% 수크로오스, 0.05% 폴리소르베이트 80, 그리고 pH 7.0에서 20 mM 히스티딘을 내포하는 완충액에서 조제되었다. 용액은 (A) 4℃ 또는 (B) 37℃에서 최대 6개월 동안 저장되었다. ADAMTS13 제제는 이후, 지정된 시점에서 겔 여과에 의해 분석되었다.
도 5. 재조합 ADAMTS13은 150 mM NaCl, 2% 수크로오스, 0.05% 폴리소르베이트 80, 그리고 pH 7.0에서 20 mM 히스티딘을 내포하는 완충액에서 조제되고, 이후 동결건조되었다. 동결건조된 제제는 이후, (A) 4℃ 또는 (B) 37℃에서 최대 6개월 동안 저장되었다. ADAMTS13 제제는 지정된 시점에서 무균수에서 재구성되고 겔 여과에 의해 분석되었다.
도 6. 재조합 ADAMTS13은 150 mM NaCl, 2% 수크로오스, 0.05% 폴리소르베이트 80, 그리고 pH 7.0에서 20 mM 히스티딘을 내포하는 완충액에서 조제되고, 이후 4℃ 또는 37℃에서 최대 6개월 동안 (A) 용해 상태 또는 (B) 동결건조된 상태로 저장되었다. 동결건조된 제제는 무균수에서 재구성되고, 샘플은 용해 상태에서 저장되고, 그리고 동결건조된 제제는 동적 광 산란 분석에 의해 특징지어졌다.
도 7. 재조합 ADAMTS13은 150 mM NaCl, 2% 수크로오스, 0.05% 폴리소르베이트 80, 그리고 pH 7.0에서 20 mM 인산나트륨 완충액을 내포하는 완충액에서 조제되고, 이후 4℃ 또는 37℃에서 최대 6개월 동안 (A) 용해 상태에서 또는 (B) 동결건조된 상태에서 저장되었다. 동결건조된 제제는 무균수에서 재구성되고, 샘플은 용해 상태에서 저장되고, 그리고 동결건조된 제제는 동적 광 산란 분석에 의해 특징지어졌다.
도 8. 재조합 ADAMTS13은 150 mM NaCl, 2% 수크로오스, 0.05% 폴리소르베이트 80, 그리고 pH 7.0에서 20 mM 트리-구연산나트륨을 내포하는 완충액에서 조제되고, 이후 4℃ 또는 37℃에서 최대 6개월 동안 (A) 용해 상태에서 또는 (B) 동결건조된 상태에서 저장되었다. 동결건조된 제제는 무균수에서 재구성되고, 샘플은 용해 상태에서 저장되고, 그리고 동결건조된 제제는 동적 광 산란 분석에 의해 특징지어졌다.
도 9. 재조합 ADAMTS13은 150 mM NaCl, 2% 수크로오스, 0.05% 폴리소르베이트 80, 그리고 pH 7.0에서 20 mM 히스티딘을 내포하는 완충액에서 조제되고, 이후 동결건조되었다. 동결건조된 샘플은 4℃ 또는 37℃에서 3개월 동안 저장되고, 이후 무균수에서 재구성되었다. ADAMTS13 샘플은 이후, 푸리에 변환 적외선 분광학 (Fourier Transform Infrared 분광학)으로 특징지어지고, 그리고 획득된 결과는 새로 조제되고 동결건조된 샘플과 비교되었다.
도 10. 재조합 ADAMTS13은 (1) 히스티딘, (2) 인산염 완충액, 또는 (3) 구연산나트륨에서 선택되는 20 mM의 완충제로 pH 7.0에서 150 mM NaCl, 2% 수크로오스, 0.05% 폴리소르베이트 80을 내포하는 완충액에서 조제되었다. 용액은 4℃ 또는 37℃에서 6개월 동안 저장되었다. 동결건조된 제제는 무균수로 재구성되고, 그리고 모든 샘플의 순도는 역상-HPLC 분석에 의해 결정되었다.
도 11. 재조합 ADAMTS13은 (1) 히스티딘, (2) 인산염 완충액, 또는 (3) 구연산나트륨에서 선택되는 20 mM의 완충제로 pH 7.0에서 150 mM NaCl, 2% 수크로오스, 0.05% 폴리소르베이트 80을 내포하는 완충액에서 조제되었다. 용액 제제의 샘플 역시 동결건조되고 무균수로 재구성되었다. 용액 및 재구성된 동결건조된 제제는 시차 주사 열량계 (differential scanning calorimetry) 분석로 특징지어졌다.
도 12. 재조합 ADAMTS13은 (1) 히스티딘, (2) 인산염 완충액, 또는 (3) 구연산나트륨에서 선택되는 20 mM의 완충제로 pH 7.0에서 150 mM NaCl, 2% 수크로오스, 0.05% 폴리소르베이트 80을 내포하는 완충액에서 조제되었다. 제제 내에서 ADAMTS13의 z-평균 직경 (average diameter)은 동적 광 산란 분석에 의해 특징지어졌다.
도 13. 재조합 ADAMTS13은 150 mM NaCl, 0%-2% 수크로오스, 0%-3% 만니톨, 0 mM-2 mM 칼슘, 0.05% 폴리소르베이트 80, 그리고 pH 7.0에서 20 mM 히스티딘을 내포하는 완충액에서 조제되고, 그리고 겔 여과에 의해 분석되었다. 전체 크로마토그래프는 패널 (A)에 도시되고, 이합체-피크의 줌 (zoom)된 구획은 패널 (B)에 도시된다.
도 14. 재조합 ADAMTS13은 pH 5.5, 6.5, 7.5, 8.5, 그리고 9.5에서 150 mM NaCl과 20 mM 히스티딘을 내포하는 완충액에서 조제되었다. 제제는 4℃ 또는 40℃에서 24시간 동안 저장되었다. 이후, FRETS-VWF73 활성 및 ADAMTS13 단백질 농도는 ELISA에 의해 측정될 때, 지정된 pH 제제에 대하여 결정되었다.
도 15. 재조합 ADAMTS13은 2 mM CaCl2와 함께 (12B와 D) 및 2 mM CaCl2 없이 (12A와 C), 150 mM NaCl, 2% 수크로오스, 0.05% 폴리소르베이트 80, 그리고 pH 7.0에서 20 mM 히스티딘을 내포하는 완충액에서 조제되었다. 이들 액체 제제는 3주 동안 25℃ (12A와 B) 또는 37℃ (12C와 D)에서 저장되었다. 효소 안정성은 FRETS-VWF73 분석평가에 의해 지정된 시점에서 측정되었다.
도 16. (A) 재조합 ADAMTS13은 20 mM Na2HPO4 (pH 7.5)와 500 mM NaCl을 내포하는 완충액으로 평형화된 Superose 6 GL 겔 여과 칼럼 상에 적하되고, 그리고 분자 종류는 크기와 형상에 의해 분리되었다. 3가지 용리 풀 (elution pool)은 집합된 A13 (풀 1), 이합체성 A13 (풀 2), 그리고 단위체성 A13 (풀 3)에 상응하게 산출되었다. 이후, 각 풀의 FRETS-VWF73 활성이 결정되었다. (B) 모아진 분획물 (fraction)의 소중합체성 상태 및 다분산성 (polydispersity)은 동적 광 산란 분석에 의해 더욱 평가되었다.
도 17. 재조합 ADAMTS13은 2% 수크로오스, 0.05% 폴리소르베이트 80, pH 7.0에서 20 mM 히스티딘, 그리고 (A) 0 mM, (B) 30 mM, (C) 60 mM, (D) 90 mM, (E) 120 mM, 또는 (F) 150 mM에서 NaCl을 내포하는 완충액에서 조제되었다. 조제된 ADAMTS13 조성물은 이후, 동결건조되고 결과의 동결덩어리 (lyocake)의 출현에 대하여 시각적으로 조사되었다.
도 18. 0 내지 150 mM NaCl을 내포하는 제제로부터 생산된 재조합 ADAMTS13 동결덩어리는 물에서 재구성되었다. 재구성된 ADAMTS13 단백질의 집합 상태는 겔 여과 분석에 의해 결정되었다.
도 19. 재조합 ADAMTS13은 0.05% 폴리소르베이트 80, pH 7.0에서 20 mM 히스티딘, 5 mM 내지 20 mM의 농도에서 수크로오스, 그리고 0 내지 150 mM의 농도에서 NaCl을 내포하는 완충액에서 조제되었다. 각 제제에서 ADAMTS13 단백질의 활성은 FRETS-VWF73 분석평가에 의해 결정되었다.
도 20. 고염과 저염 완충액은 동결건조되었다. 고염 완충액 (A)은 20 mM 히스티딘 (pH 7.0), 150 mM NaCl, 2% 수크로오스, 0.05% 폴리소르베이트 80, 그리고 2 mM CaCl2를 내포하는 반면, 저염 완충액 (B)은 20 mM 히스티딘 (pH 7.0), 30 mM NaCl, 1% 수크로오스, 3% 만니톨, 0.05% 폴리소르베이트 80, 그리고 2 mM CaCl2를 내포하였다. 이들 두 제제는 이후, 표준 조건 하에 동결건조되고, 그리고 결과의 동결덩어리는 이후, 시각적으로 조사되었다.
도 21. (A) 겔 여과전 및 (B) 겔 여과후, 양이온 교환 크로마토그래피에 의해 단리된 재조합 ADAMTS13의 다합체성 상태는 Superose 6 GL 칼럼을 이용한 크기 배제 크로마토그래피에 의해 분석되었다.
도 22. (A) 겔 여과전 및 (B) 겔 여과후, 양이온 교환 크로마토그래피에 의해 단리된 재조합 ADAMTS13의 다합체성 상태는 동적 광 산란에 의해 분석되었다.
도 23. rADAMTS13 제제의 동결건조를 위한 (A) 표준 프로토콜 및 (B) 연장된 프로토콜.
도 24. (A) 표준 동결건조 프로토콜을 이용한 rA13 제제 1 내지 4, (B) 연장된 동결건조 프로토콜을 이용한 rA13 제제 1 내지 4, (C) 표준 동결건조 프로토콜을 이용한 rA13 제제 5 내지 8, 그리고 (D) 연장된 동결건조 프로토콜을 이용한 rA13 제제 5 내지 8의 동결건조에 의해 생산된 rADAMTS13 동결덩어리의 비교. 이러한 데이터의 산출에 이용되는 제제 및 동결건조 프로토콜은 실시예 12에서 확인될 수 있다.
도 24. 표준 (A LYO) 또는 연장된 (B LYO) 동결건조 프로토콜 하에, (A) 30 mM NaCl 또는 (B) 60 mM NaCl을 내포하는 제제로부터 생산된 재조합 ADAMTS13 동결덩어리는 물에서 재구성되었다. 재구성된 ADAMTS13 단백질의 집합 상태는 동적 광 산란 분석에 의해 결정되었다.
도 25. (A) 30 mM NaCl 또는 (B) 60 mM NaCl로 조제된 ADAMTS13 조성물의 소중합체성 상태와 다분산성은 표준 또는 연장된 프로토콜로 동결건조후 동적 광 산란 분석에 의해 평가되었다.
도 26. 인간 폰 빌레브란트 인자 (VWF)-절단 단백질분해효소 ADAMTS13의 도메인 구조. 전구체 ADAMTS13 폴리펩티드는 신호 펩티드 (S), 프로펩티드 (P), 그 이후에 촉매 금속단백질분해효소 도메인, 디스인테그린-유사 도메인, 트롬보스폰딘 타입 1 (TSP1) 모티프, 시스테인-풍부한 스페이서 도메인, 7개의 추가 TSP1 반복부 및 2개의 CUB 도메인을 포함하는 성숙 폴리펩티드의 구조적 특성으로 구성된다. 10개의 잠재적 N-당화 부위는 닫힌 원으로 표시된다.
도 27. 동적 광 산란 분석 (DLS)에 의해 결정될 때, 상이한 완충제로 조제된 ADAMTS13 조성물의 유체역학적 직경.
도 28. 동적 광 산란 분석 (DLS)에 의해 결정될 때, 재조합 인간 ADAMTS13에 대한 전단 응력의 영향.
도 29. FRETS 활성에 의해 결정될 때, 재조합 인간 ADAMTS13의 동결-해동 안정성.
도 30. 동적 광 산란 분석 (DLS)에 의해 결정될 때, 재조합 인간 ADAMTS13의 동결-해동 안정성.
도 31. SE-HPLC에 의해 측정될 때, 동결건조된 재조합 인간 ADAMTS13의 광안정성.
도 32. 동적 광 산란 분석 (DLS)에 의해 결정될 때, 액체 및 동결건조된 재조합 인간 ADAMTS13의 광안정성.
도 33. FRETS 활성에 의해 결정될 때, 액체 및 동결건조된 재조합 인간 ADAMTS13의 광안정성.
도 34. 재조합 인간 ADAMTS13의 FRETS 활성에 대한 칼슘과 아연의 영향.
도 35. SE-HPLC에 의해 측정될 때, 동결건조된 재조합 인간 ADAMTS13 제제의 소중합체성 상태에 대한 염과 당 함량의 영향. 각 제제의 당 함량은 몰 농도보다는 g/ℓ로 보고된다 (가령, 20 mM = 20 g/ℓ).
도 36. 표 15에 따라 조제된 재조합 인간 ADAMTS13의 동결건조에 의해 생산된 동결덩어리.
도 37. 표준 3일 동결건조 프로그램으로 동결건조되고, (위쪽 패널) 4℃; (중간 패널) 30℃; 그리고 (아래쪽 패널) 40℃에서 6개월 동안 저장된 재조합 인간 ADAMTS13의 소중합체성 상태의 동적 광 산란 (DLS) 분석.
도 38. 연장된 10일 동결건조 프로그램으로 동결건조되고, (위쪽 패널) 4℃; (중간 패널) 30℃; 그리고 (아래쪽 패널) 40℃에서 6개월 동안 저장된 재조합 인간 ADAMTS13의 소중합체성 상태의 동적 광 산란 (DLS) 분석.
도 39. 4℃, 30℃, 그리고 40℃에서 저장후 상이한 단백질 농도에서 조제된 재조합 인간 ADAMTS13의 소중합체성 상태의 동적 광 산란 (DLS) 분석.
VIII. 실시예
A. 실시예 1: 재조합 ADAMTS13 (rA13)의 발현
인간 ADAMTS13을 발현하는 재조합 CHO 세포주 #640-2의 키모스탯 세포-배양은 추가의 아연과 비타민 B3으로 보충된 화학적으로 정의된 BACD-A13 배지에서 성장되었다. 10ℓ 배양은 53일 동안 유지되고, 그리고 rA13 단백질과 활성 생산은 시간의 흐름에서 모니터링되었다.
인간 ADAMTS13을 발현하는 재조합 CHO 세포는 화학적으로 정의된 독점 배지 (BCS 배지)에 순응되었다. DWCB는 해동되고, 그리고 세포 접종물은 BCS 배지에서 준비되었다. rA13 발현 클론 #640-2로부터 증식된 세포는 Rushton 타입 임펠러가 장비된 10ℓ 생물반응기로 이전되고, 그리고 7.15-7.20의 인라인 제어된 pH 하에 37℃에서 20% 공기 포화 (air saturation)의 용존 산소 농도를 갖는 독점 BACD-A13 배지를 이용한 반복 회분식 배양에서 배양되었다.
2가지 회분식 배양이 10ℓ의 최종 작업 부피 (final working volume)로 성장된 이후에, 생물반응기는 5일자에 연속식 배지 공급 (medium feed)으로 전환되고 키모스탯 양식에서 추가로 48일 동안 가동되었다.
생물반응기로부터 상층액의 샘플은 주1회 채취되고, 그리고 ELISA에 의해 rA13 단백질 생산에 대하여 및 FRETS-VWF73 분석평가에 의해 rA13 활성에 대하여 분석되었다. 세포 수는 Nucleocounter 기술에 의해 결정되었다. 희석률은 측정되고 성장률 및 부피 생산성 (volumetric productivity)의 계산에 이용되었다. 1.432 ㎎/ℓ ZnSO47H2O 및 7.02 ㎎/ℓ 니코틴아미드의 최종 농도에서 아연과 니코틴아미드로 보충된 화학적으로 정의된 BACD-A13 배지를 이용한 연속식 배양 조건 하에, 0.9 내지 1.3 ㎎/ℓ/D rA13 단백질 생산, 그리고 대략 800 내지 1100 mU/㎍ rA13 비활성의 높은 수준이 달성되었다 (표 1). 특히, 부피와 세포 비생산성은 아마도, 시간의 흐름에서 증가하는 성장과 희석률로 인하여, 장기 배양 동안 시간의 흐름에서 증가하였다. 발현된 rA13의 높은 비활성은 배양이 키모스탯 조건 하에 성장되는 적어도 전체 7주 동안 일정하게 높은 수준에서 적어도 유지될 수 있었다. 실제로, 배양 동안 생산된 rA13의 비활성은 2주 시점에 대략 800 mU/㎍ A13에서 7주 시점에 대략 1100 mU/㎍ A13으로 실질적으로 증가하였다.
Figure pat00001
B. 실시예 2: 정제된 재조합 ADAMTS13 (rA13)의 제제
재조합 ADAMTS13은 재조합 CHO 세포에서 발현되고 음이온 교환 크로마토그래피에 의해 정제되었다. 정제된 rA13은 대략 850 mU/㎍의 비활성과 함께, 대략 750 ㎍/㎖의 최종 농도를 가졌다. rA13은 (1) 히스티딘, (2) 인산염 완충액, 또는 (3) 구연산나트륨에서 선택되는 20 mM의 완충제로 pH 7.0에서, 150 mM NaCl, 2% 수크로오스, 0.05% 폴리소르베이트 80을 내포하는 완충액에서 조제되었다. 샘플은 이후, 균등하게 분배되고, 그리고 샘플의 절반은 동결건조되었다.
동결건조된 샘플은 미리 동결건조된 제제에서와 동등한 최종 부피로 무균수로 재구성되었다. 각 액체 및 동결건조된 제제의 단일 분취량 (aliquot)은 이후, 샘플을 Superose 6 GL 칼럼 (GE Healthcare) 상에 적하함으로써 겔 여과에 의해 특징지어졌다. 도 3에서 확인할 수 있는 바와 같이, 모든 제제는 겔 여과에 의해 단위체성 rA13 단백질에 상응하는 단일 피크로서 움직이는 ADAMTS13 샘플을 유발하였다.
C. 실시예 3: 4℃와 37℃에서 저장된 rA13 제제의 활성 유지의 특성화
실시예 2에서와 같이 조제되고 분취된 rA13 샘플은 최대 6개월 기간 동안 4℃ 또는 37℃에서 저장되었다. 용액 제제는 0, 1, 2, 3, 12, 그리고 24주 시점에 ELISA에 의해 rA13 단백질 농도에 대하여, 그리고 FRETS-VWF73 분석평가에 의해 rA13 활성에 대하여 분석되었다 (도 1). 동결건조된 샘플은 미리 동결건조된 제제에서와 동등한 최종 부피로 무균수로 재구성되고, 그리고 0, 2, 4, 8, 12, 그리고 24주 시점에 유사하게 분석되었다 (도 2).
4℃에서 저장된 rA13 액체 제제는 6개월까지의 시점에서 항원 함량, 다시 말하면, 단백질 농도, 또는 FRETS-VWF73 활성에서 상실을 보이지 않았다. 도 1에서 확인되는 바와 같이, 이것은 각각, 히스티딘, 인산염, 그리고 구연산나트륨으로 완충된 3가지 제제 모두에서 그러하였다. 반대로, 히스티딘 또는 구연산나트륨으로 완충된 액체 제제는 37℃에서 1주후 활성의 거의 완전한 상실을 보였다 (도 1A; ◇ = 히스티딘, □ = 구연산나트륨). 이러한 활성 상실은 1주 시점에 이들 샘플에 대한 항원 함량에서 스파이크 (spike)를 동반하였는데, 이것은 rA13 단백질이 변성된다는 것을 암시하였다. rA13의 히스티딘 액체 제제는 3개월과 6개월 시점에서 극적으로 감소된 항원 함량을 보였는데, 이것은 상기 단백질이 분해된다는 것을 암시하였다. 특히, 인산염 완충액으로 조제된 액체 rA13은 37℃에서 저장될 때 3주 시점에 유의미한 활성을 보였다 (도 1A; ○ = 인산염 완충액). 일관되게, 이러한 제제의 항원 함량은 더욱 느린 비율로 증가하였는데, 이것은 rA13 변성이 인산염 완충액으로 조제될 때 지체된다는 것을 암시하였다.
rA13 동결건조된 제제는 4℃ 또는 37℃에서 저장될 때 적어도 6개월 동안 안정한 것으로 나타났다 (도 2). 인산염 완충액으로 조제된 동결건조된 rA13은 37℃에서 저장될 때 활성의 점진적인 상실 (6개월 시점에 30%)을 보이지만 4℃에서는 그렇지 않았다. 하지만, 이러한 활성 상실은 ELISA에 의한 항원 이용도 (antigen availability)에서 증가를 동반하지 않았다 (도 2; ○ = 인산염 완충액). 다른 동결건조된 제제는 4℃ 또는 37℃에서 저장될 때 활성 상실 또는 항원 이용도에서 증가를 보이지 않았다.
D. 실시예 4: 4℃와 37℃에서 저장된 제제에서 rA13의 배치 형태적 안정성
실시예 2에서와 같이 조제되고 분취된 rA13 샘플은 최대 6개월 기간 동안 4℃ 또는 37℃에서 저장되었다. 용해 상태 및 동결건조된 상태에서 조제되고 저장된 rA13의 전체적인 배치 형태는 실시예 3에서 기술된 시점에서 겔 여과에 의해 특징지어졌다. 액체 제제 (도 4)의 경우에 0, 1, 2, 3, 그리고 24주 시점에, 그리고 동결건조된 제제 (도 5)의 경우에 0, 2, 4, 8, 12, 그리고 24주 시점에 히스티딘 조제된 rA13으로 수행된 겔 여과 실험의 결과가 도시된다.
4℃에서 최대 6개월 동안 저장된, 히스티딘 포함 액체 제제는 겔 여과 시에 주로 단위체로서 움직였는데 (도 4A), 이것은 상기 단백질이 4℃에서 용해 상태에서 매우 안정하다는 것을 암시하였다. 이러한 결과는 히스티딘으로 조제되고 4℃에서 최대 6개월 동안 용해 상태에서 저장된 rA13이 FRETS-VWF73 활성을 전혀 상실하지 않는다는 것을 증명하는 실시예 3에서 기술된 결과와 일치한다. 반대로, 히스티딘으로 조제되고 37℃에서 저장된 rA13은 감소된 용리 부피/유지 시간에 의해 지시되는 바와 같이, 더욱 높은 무리 (order)/부분적으로 또는 완전하게 변성된 종류로서 움직였다 (도 4B). 실시예 3에서 관찰된 결과와 일관되게, 히스티딘으로 조제되고 37℃에서 6개월 동안 저장된 A13은 대부분 분해되는 것으로 나타났다.
겔 여과 실험은 각 제제에 대하여 반복되고, 4℃와 37℃에서 저장되고, 그리고 상대적인 용리된 피크 아래 면적은 제제 내에서 단위체 rA13 (3), 이합체 rA13 (2), 그리고 집합된/변성된 rA13 (1)의 상대적인 집단을 결정하기 위하여 적분되었다. 4℃와 37℃에서 6개월 동안 저장된 3가지 동결건조된 제제 상에서 수행된 겔 여과 실험의 결과는 표 2에 제공된다. 동결건조된 샘플은 겔 여과를 통한 분석에 앞서, 미리 동결건조된 제제에서와 동등한 최종 부피로 무균수로 재구성되었다.
Figure pat00002
실시예 3에서 관찰된 결과와 일관되게, 동결건조된 rA13 제제는 4℃에서 적어도 6개월 동안 저장후 이합체 또는 집합체/변성된 종류의 양에서 증가를 보이지 않았다. 유사하게, 히스티딘 또는 구연산나트륨으로 조제되고 동결건조된 rA13은 37℃에서 적어도 6개월 동안 저장될 때 단지 경미한 수준의 이합체화를 보였다. 게다가, 이들 제제 중에서 어느 한쪽도 증가된 수준의 집합 및/또는 변성이 유발되는 징후가 없었다. 반대로, 인산염 완충액으로 조제되고 동결건조된 rA13은 37℃에서 적어도 6개월 동안 저장될 때, 유의미한 수준의 이합체화 및 집합 및/또는 변성을 보였다.
E. 실시예 5: 4℃와 37℃에서 저장된 rA13 제제의 생물물리학 특성화
실시예 2에서와 같이 조제되고 분취된 rA13 샘플은 4℃ 또는 37℃에서 최대 6개월 기간 동안 저장되었다. 앞서 기술된 바와 같이 조제된 rA13 단백질의 배치 형태적 안정성의 척도로서, 스토크스 반경 (stokes radus)은 각각의 지정된 시점에서, 히스티딘 (도 6), 인산염 완충액 (도 7), 그리고 구연산나트륨 (도 8)으로 조제된 용액 (A)과 동결건조된 (B) rA13 제제에 대하여 동적 광 산란에 의해 결정되었다.
게다가, 저장 이전에 각 액체 제제에 대하여 도출된 카운트 레이트 (count rate)는 동적 광 산란에 의해 결정되었다. 도 12에서 확인할 수 있는 바와 같이, 히스티딘과 구연산나트륨 제제의 경우에 대략 35℃ 이상에서, 그리고 인산염 제제의 경우에 대략 40℃ 이상에서 스토크스 반경의 변화, 따라서 rA13 안정성에서 불연속 (discontinuity)이 나타난다. 게다가, 비록 인산염 제제가 대략 37℃ 이하의 온도에서 히스티딘 또는 구연산나트륨 제제보다 큰 스토크스 반경을 갖긴 하지만, 인산염 제제는 대략 40℃ 내지 50℃의 온도에서 약간 더 안정한 것으로 생각된다.
히스티딘으로 조제된 동결건조된 샘플은 4℃ 또는 37℃에서 3개월 동안 저장되고, 이후 무균수에서 재구성되었다. 재구성된 rA13에서 지역적인 또는 전체적인 배치 형태적 변화가 일어나는 지의 여부를 특징짓기 위하여, 푸리에 변환 적외선 분광학이 4℃와 37℃에서 3개월 동안 저장된 샘플에서 수행되고, 그리고 새로 조제되고 동결건조된 A13과 비교되었다. 도 9에서 확인할 수 있는 바와 같이, 3가지 샘플 모두에 대한 흡광 스펙트럼 (absorbance spectrum)은 거의 완벽하게 겹쳐지는데, 이것은 배치 형태적 전이가 히스티딘에서 동결건조된 제제로서 4℃ 또는 37℃에서 3개월 동안 저장된 rA13에서 일어나지 않는다는 것을 암시하였다.
4℃ 또는 37℃에서 6개월 동안 저장된 rA13 제제 역시, 역상-고성능 액체 크로마토그래피 (rp-HPLC)에 의해 특징지어졌다. rp-HPLC는 밀접하게 관련된 단백질 분자의 분리를 가능하게 하고, 따라서 많은 경우에, 동일한 폴리펩티드의 변형된 이형 (version), 예를 들면, 전하-변경된, 부분적으로 분해된, 또는 부분적으로 풀림된 이형을 구별할 수 있다. 도 10에서 확인할 수 있는 바와 같이, 모든 rA13 제제는 앞서 관찰된 여러 결과와 일관되게, 4℃에서 적어도 6개월 동안 안정한 것으로 생각된다.
그 다음, 실시예 2에서와 같이 조제된 rA13 샘플은 다양한 제제 내에서 rA13 단백질의 안정성을 더욱 특징짓기 위하여 시차 주사 열량계에 의해 분석되었다. 도 11에서 산출된 열용량 곡선 (heat capacity curve)의 이정점 성격 (bimodal nature)은 상기 단백질의 두 도메인이 서로 독립적으로 풀림되고, 첫 번째 풀림 전이 (unfolding transition)가 대략 54℃ 내지 55℃의 온도에서 일어난다는 것을 암시한다. rA13에 대한 풀림 온도는 다양한 제제에서 유사하다. 하지만, 인산염 제제, 그리고 다소 덜하긴 하지만 구연산염 제제의 경우에, 내온 (endotherm) 아래의 더욱 큰 영역에 의해 지시된 바와 같이, 전이의 증가된 엔탈피 (enthalpy)는 A13의 약간 안정화된 제제를 암시한다.
F. 실시예 6: rA13 제제에서 이합체 형성의 특성화
용해 상태에서 rA13의 소중합체성 상태에 대한 안정화제의 효과를 결정하기 위하여, rA13은 수크로오스 (0% 내지 2%), 만니톨 (0% 내지 3%), 그리고 칼슘 (0 mM 또는 2 mM)의 상이한 조합으로 20 mM 히스티딘 (pH 7.0), 150 mM NaCl, 그리고 0.05% 폴리소르베이트 80에서 조제되었다. 이후, 다양한 제제는 Sepharose 6 GL 칼럼 (GE Healthcare) 위에서 겔 여과에 의해 분석되었다. 도 13에서 확인되는 바와 같이, 이들 안정화제의 다양한 조합이 A13 이합체 형성의 양을 대략 50% 정도 감소시킬 수 있었다. 각 제제에 대한 집합체, 이합체/소중합체, 그리고 단위체의 비율은 표 14에 제공된다.
Figure pat00003
G. 실시예 7: ADAMTS13 제제 안정성에 대한 pH의 효과
용해 상태에서 rA13의 안정성에 대한 pH의 효과를 결정하기 위하여, rA13은 20 mM 히스티딘 및 150 mM NaCl을 내포하는 완충액 내로 투석되고, 5.5 내지 9.5의 pH 범위로 조정되고, 그리고 4℃ 또는 40℃에서 24시간 동안 저장되었다. 24시간 시점에, 안정성은 ELISA에 의해 결정될 때 rA13 항원 농도에 의해 측정되고, 그리고 rA13 활성은 FRETS-VWF73 분석평가에 의해 측정되었다. 표 3과 도 14에서 확인되는 바와 같이, rADAMTS13은 5.5 내지 9.5의 pH를 갖는 용액에서 조제될 때, 4℃에서 24시간 동안 상대적으로 안정하다.
Figure pat00004
Figure pat00005
H. 실시예 8: ADAMTS13 제제 안정성에 대한 낮은 수준의 CaCl 2 의 효과
용해 상태에서 rA13의 안정성에 대한 낮은 수준의 CaCl2의 효과를 결정하기 위하여, rA13은 2 mM CaCl2와 함께 (12B와 D) 및 2 mM CaCl2 없이 (12A와 C), 150 mM NaCl, 2% 수크로오스, 0.05% 폴리소르베이트 80, 그리고 pH 7.0에서 20 mM 히스티딘을 내포하는 완충액에서 조제되었다. 이들 액체 제제는 25℃ 또는 37℃에서 3주 동안 저장되었다. 제제의 안정성은 이후, 0, 1, 2, 그리고 3주 시점에 상대적인 FRETS-VWF73 활성을 결정함으로써 평가되었다. 도 15에서 확인할 수 있는 바와 같이, 2 mM CaCl2의 첨가는 25℃와 37℃ 둘 모두에서 저장된 액체 rADAMTS13 제제를 다양한 정도로 안정화시켰다. 특히, 25℃에서 저장된 rADAMTS13 액체 제제에 낮은 수준의 CaCl2의 첨가는 CaCl2가 없는 제제에서 관찰되는 활성의 80% 상실과 비교하여, 3주 동안 대략 95% 효소 활성 안정성을 공여하였다.
I. 실시예 9: 재조합 ADAMTS13의 소중합체성 종류의 FRETS-VWF73 활성
정제 동안 단리된 ADAMTS13 단백질의 상이한 소중합체성 종류의 효소 활성을 결정하기 위하여, rA13은 20 mM Na2HPO4 (pH 7.5) 및 500 mM NaCl을 내포하는 완충액으로 평형화된 Superose 6 GL 겔 여과 칼럼 위에 적하되었다. ADAMTS13 분자 종류는 이후, 크기와 형상에 의해 분리되었다. 칼럼으로부터 용리하는 분획물은 그들의 겉보기 소중합체성 상태, 예를 들면, 집합된 A13 (풀 1), 이합체성 A13 (풀 2), 그리고 단위체성 A13 (풀 3)에 따라 모아졌다 (도 16A). ADAMTS13의 소중합체성 상태의 추가 확증은 각 풀에서 단백질의 평균 스토크스 반경을 동적 광 산란에 의해 결정함으로써 획득되었다 (도 16B).
각 풀의 효소 활성은 이후, FRETS-VWF73 분석평가에 의해 결정되었다. 도 16에서 확인할 수 있는 바와 같이, 집합된 A13 종류의 부피 활성 (volumetric activity)은 대략 218 mU/㎖이고, 이합체성 A13의 활성은 대략 1.435 U/㎖이고, 그리고 단위체성 A13의 활성은 대략 97.905 U/㎖이었다. 이들 풀의 부피에 대한 활성을 표준화한 이후, 총 활성의 99% 이상이 단위체성 단백질에 상응하는 용리 풀에서 관찰된다. 이들 활성이 이후, 단백질의 총량에 대하여 표준화될 때, 단위체성 단백질 풀은 이합체성 단백질 풀 및 집합된 단백질 풀 둘 모두보다 높은 비활성을 갖는 것으로 확인될 수 있다.
J. 실시예 10: ADAMTS13 제제의 동결건조에 대한 NaCl 농도의 효과
동결덩어리의 생산에 대한 NaCl 농도의 효과를 결정하기 위하여, 재조합 ADAMTS13은 다양한 양의 NaCl (0 내지 150 mM)과 함께 2% 수크로오스, 0.05% 폴리소르베이트 80, 그리고 20 mM 히스티딘 (pH 7.0)을 내포하는 완충액에서 조제되었다. ADAMTS13 제제는 이후, 표준 조건 하에 동결건조되고 결과의 동결덩어리의 품질에 대하여 시각적으로 조사되었다 (도 17). 더욱 낮은 염 농도를 내포하는 ADAMTS13 제제 (0 내지 60 mM; 도 17A-C)로부터 생산된 동결덩어리는 부드러운 표면을 갖는 조밀한 구조를 보유하는 반면, 고염 제제 (120 mM과 150 mM NaCl; 도 17 E와 F)로부터 생산된 동결덩어리는 다공성이고 조밀하지 않으며 실-유사 또는 금이 간 외관을 보유하였다. 중간 수준의 NaCl를 내포하는 ADAMTS13 제제 (90 mM; 도 17D)는 부분적으로 조밀하고 반-다공성 또는 분화구-유사 표면을 보유하였다.
다공성, 비-조밀한 동결덩어리는 동결건조 과정 동안 융해 (melting)를 보인다. 일반적으로, 고염 농도는 일차 건조 과정 동안 동결된 물질의 부분적인 융해를 유발할 수 있는 붕괴 온도 (collapse temperature) (또는 유리 온도)를 감소시키는데 이용된다. 이것은 단백질 집합 수준 및/또는 효소 활성의 회복에 부정적인 영향을 줄 수 있다. 이런 이유로, 우수한 동결덩어리 외관은 일반적으로, 활성의 더욱 우수한 회복 및 개별 조제된 단백질의 더욱 적은 집합과 상관한다. 유리하게는, 본 발명에서는 높은 품질 동결덩어리의 생산을 가능하게 하는 ADAMTS13 제제를 제시한다. 일정한 구체예에서, 본 발명에서 제시된 제제는 동결건조 동안 특히 안정하고, 높은 품질 동결덩어리의 형성을 유발하는 저염 ADAMTS13 제제를 허용한다.
저염 단백질 제제의 이용 시에 한 가지 우려되는 점은 증가된 단백질 집합이 일어날 수 있다는 것이다. 이것이 저염 ADAMTS13 제제에 해당하는 지를 결정하기 위하여, 앞서 생산된 동결덩어리는 탈이온수에서 재구성되고, 그리고 재구성된 ADAMTS13 단백질의 집합 상태는 크기 배제 크로마토그래피에 의해 분석되었다. 도 18에서 확인할 수 있는 바와 같이, 동결건조된 제제의 염 농도는 재구성된 ADAMTS13 단백질의 집합 상태에 어떤 영향도 주지 않았다 (0 mM NaCl을 150 mM NaCl과 비교한다).
저염 ADAMTS13 제제의 효용을 더욱 입증하기 위하여, 0 내지 150 mM NaCl 범위의 다양한 제제의 FRETS-VWF73 활성이 결정되었다. 도 19에서 확인할 수 있는 바와 같이, ADAMTS13 제제의 염 농도, 그리고 수크로오스 농도는 재조합 ADAMTS13 단백질의 활성에 영향을 주지 않았다. 이들 결과는 액체 및 동결건조된 재조합 ADAMTS13 단백질의 저염 (즉, 0 내지 100 mM NaCl) 제제가 제약학적 용도에 충분히 적합하다는 것을 암시한다.
K. 실시예 11: 고염과 저염 완충액에서 동결건조된 ADAMTS13 제제
재조합 ADAMTS13의 동결건조된 제제를 비교하기 위하여, 고염 (150 mM NaCl)과 저염 (30 mM NaCl) 제제가 제조되었다. 고염과 저염 제제 둘 모두 20 mM 히스티딘 (pH 7.0), 150 mM NaCl, 0.05% 폴리소르베이트 80, 그리고 2 mM CaCl2를 내포하였다. 고염 제제는 2% 수크로오스와 150 mM NaCl을 더욱 내포하는 반면, 저염 제제는 1% 수크로오스, 3% 만니톨, 그리고 30 mM NaCl을 더욱 내포하였다. 이들 두 제제는 이후, 표준 조건 하에 동결건조되었다. 고염 ADAMTS13 제제로부터 생산된 결과의 동결덩어리는 조밀하지 않고, 균일하지 않고, 덩어리져 있고, 그리고 다공성인 반면 (도 20A), 저염 ADAMTS13 제제로부터 생산된 동결덩어리는 조밀하고, 상당히 균일하고, 그리고 부드러운 표면을 가졌다 (도 20B). 이들 결과는 동결건조된 ADAMTS13의 저염 제제가 제약학적 용도에 충분히 적합하다는 것을 암시한다.
L. 실시예 12: 동결건조된 제제를 위한 rADAMTS13의 정제
재조합 ADAMTS13은 재조합 CHO 세포에서 발현되고, 그리고 POROS HS 양이온 교환 크로마토그래피에 의해 결과의 조건화 배지로부터 정제되었다. rADAMTS13의 수집된 분획물은 HS 칼럼으로부터 용리되고, 이후 superose 6 GL: TC10/30 칼럼을 이용한 크기 배제 크로마토그래피에 의해, 겔 여과 전후에 이합체화와 집합에 대하여 분석되고, 크기 배제 크로마토그래피 (도 21A와 B, 각각) 및 동적 광 산란 (도 22A와 B, 각각)에 의해 분석되었다. 도 21A에서 확인할 수 있는 바와 같이, 겔 여과 이전에 HS-용리된 분획물 내에 전체 rADAMTS13 중에서 거의 20%가 바람직하지 않은 이합체성, 단위체성, 또는 집합된 상태에 있었다. 대조적으로, 겔 여과 단계로부터 모아진 거의 모든 rADAMTS13은 단위체성이었다 (도 21B). 유사하게, HS-용리된 rADAMS13의 평균 유체역학적 반경 (대략 20.5 nm; 도 22A)은 크기 배제 크로마토그래피 이후 회수된 rADAMTS의 평균 유체역학적 반경 (대략 12-13 nm; 도 22B)의 거의 2배이었다.
M. 실시예 13: rADAMTS13 제제의 동결건조를 위한 표준과 연장된 프로토콜의 비교
가변성 저염 (30 mM과 60 mM NaCl), 칼슘 (2 mM과 4 mM CaCl2), 그리고 당 (1% 수크로오스와 1% 트레할로스) 농도를 내포하는 rADAMTS13 제제의 동결건조를 비교하기 위하여, rADAMTS13은 앞서 기술된 바와 같이 양이온 교환 크로마토그래피와 크기 배제 크로마토그래피에 의해 정제되고, 그리고 앞서 제시된 염, 칼슘, 그리고 당의 전체 8가지 조합과 함께 20 mM 히스티딘, 3% 만니톨, 0.05% 폴리소르베이트 80에서 조제되었다. 모든 바이알은 동일한 농도의 ADAMTS13 (190 ㎍/㎖ 항원)을 보유하였다. rA13 제제 1 내지 8 (표 5와 6)은 이후, 표준 (3일; 도 23A) 또는 연장된 (11일; 도 23B) 동결건조 프로토콜을 이용하여 동결건조되었다. 동결건조후, 동결덩어리는 바람직한 특성에 대하여 시각적으로 조사되었다 (도 24).
Figure pat00006
Figure pat00007
각 제제에서 ADAMTS13의 다합체성 상태를 결정하기 위하여, 동결건조된 단백질은 탈이온수에서 재구성되고 동적 광 산란에 의해 분석되었다. 도 25에서 확인할 수 있는 바와 같이, 표준과 연장된 동결건조 프로토콜 둘 모두를 이용함으로써 제조된 동결건조된 제제는 재구성후, 주로 단위체성 ADAMTS13 분자 (대략 12-13 nm에서 피크)를 산출하였다. 비록 집합된 단백질에 상응하는 ADAMTS13 피크 (100 내지 110 nm)가 단위체 피크의 대략 절반 정도의 높이인 것으로 보이긴 하지만, 당업자는 y-축이 총 질량 (total mass)보다는 강도 (intensity)를 측정하기 때문에 상기 그래프에서 집합되는 ADAMTS13 종류의 비율이 극히 과장될 것이라는 것을 인지할 것이다. 또한, 연장된 동결건조 프로토콜로 제조된 제제 (쇄선)는 탈이온수에서 재구성후, 표준 동결건조 프로토콜로 제조된 제제 (실선)보다 더욱 적은 집합된 ADAMTS13을 내포하는 것으로 관찰된다.
앞서 제시된 각 제제에서 동결건조된 rADAMTS13의 안정성을 평가하기 위하여, 표준과 연장된 프로토콜에 의해 생산된 동결덩어리는 최대 36개월 동안 다양한 온도 하에 저장을 위한 일련의 바이알을 제조하는데 이용되었다. 표 7에 개설된 바와 같이, 5 mg 또는 10 mg 동결건조된 rADAMTS13을 내포하는 바이알은 +2 - +8℃ (즉, 표준 냉동 조건 하에), 30℃ (실온), 그리고 40℃에서 저장을 위하여 제조되었다. 모든 바이알은 FTIR, SE-HPLC 및 DLS에 의해 조사되었다. 또한, FRETS 활성 및 ADAMTS13 항원이 모든 샘플에서 조사되었다. 동결건조된 ADAMTS13 제제는 이후, 다양한 동결건조된 제제 내에서 상기 단백질의 안정성을 결정하기 위하여, 지정된 시점에서 앞서 개설된 바와 같이 FRETS-VWF73 활성 및 항원 안정성에 대하여 조사될 수 있다. 표 8과 9에서는 각각, 표준과 연장된 동결건조 프로토콜에 의해 산출된 재구성된 ADAMTS13 제제의 FRETS-VWF73 활성 분석평가의 결과를 제공한다. 유사하게, 항원 회수는 각각, 표준과 연장된 동결건조 프로토콜로 산출된 샘플에 대하여, 표 10과 11에서 제공된다.
Figure pat00008
Figure pat00009
Figure pat00010
Figure pat00011
Figure pat00012
표 17과 18에서는 rADAMTS022-1 제제에 대한 상이한 lyo 프로그램의 FTIR 결과를 요약한다. 시간과 온도 둘 모두 이차 구조에 별다른 영향을 주지 않았다. 또한, 이러한 lyo 프로그램은 더욱 긴 lyo 프로그램 B에서 관찰되지 않은 표준 프로그램 A에 대한 40℃에서 알파 나선 (alpha helix)의 겉보기 감소 (apparent decrease)를 제외하고, 구조 요소를 변화시키지 않았다.
Figure pat00013
Figure pat00014
1A와 1B 동결건조된 제제 내에서 ADAMTS13의 소중합체성 상태는 4℃, 30℃, 그리고 40℃에서 6개월간 저장의 경과에서 동적 광 산란에 의해 분석되었다. 도 37과 38에서 확인되는 바와 같이, 더욱 높은 집합체 수준은 연장된 동결건조 프로그램으로 조제된 샘플에서 관찰되었다. 하지만, 집합 수준은 저장 기간 동안 실질적으로 증가하지 않았다.
유사하게, 크기 배제 HPLC는 6개월후 rADAMTS022 제제에 대하여 상이한 lyo 프로그램 간에 별다른 변화를 보이지 않았다 (데이터 제시되지 않음). 이러한 분석 결과는 3개월의 경과 동안 4℃, 30℃, 그리고 40℃에서 저장후 집합체가 전혀 유도되지 않았다는 것을 증명한다.
N. 실시예 14: 재조합 인간 ADAMTS13의 발현과 정제
재조합 ADAMTS-13은 현탁 배양 동안 발효 과정에서 재조합 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포 클론에 의해 산출된다. Baxter에 의해 개발된 성장 배지는 인간 또는 동물 유래된 물질 및 재조합 단백질이 모두 없다. ADAMTS13의 발현에 유용한 이들 유형의 성장 배지의 실례는 예로써, U.S. Patent Application Serial No. 12/847,999에서 찾아볼 수 있다. 제조 공정은 연속식 (키모스탯) 세포 배양 방법을 이용한다. 정제 과정은 여과에 의한 최초 세포 제거 단계로 시작된다. 차후 4일까지의 세포 없는 산물은 하나의 하류 회분을 생산하기 위하여 합동된다. 모아지고, 여과된 수확물은 한외/정용여과에 의해 농축되고, 이후 용매 세정제 바이러스 비활성화 단계가 수행된다. 추가의 정제는 크로마토그래피 포획 단계 (음이온 교환), 나노여과 단계 (이차 바이러스 감소 단계), 음성 크로마토그래피 단계 (hydroxyapatite), 그 이후에 혼성 양식 크로마토그래피 (Capto MMC)와 최종 크로마토그래피 농축, 그리고 선-조제 단계 (양이온 교환)를 포함한다. 선-조제된 원료의약품 (bulk drug substance, BDS)은 온도-제어된 냉동장치에서 -60℃에 동결된다.
O. 실시예 15: ADAMTS13 활성에 대한 FRETS-VWF73 분석평가
ADAMTS 13의 단백질분해 활성은 제조업체의 검사 설명서에 따라 형광-소멸 (fluorescence-quenching) 기질 (FRETS-VWF73, Peptide Institute, Inc; Osaka, Japan)에 대하여 측정되었다. 간단히 말하면, rADAMTS13 샘플은 5 mM Bis-Tris, 25 mM CaCl2, 그리고 0.005% Tween20을 내포하는 완충액에서 희석되고 (100 ㎕ 총 부피) 검은 마이크로역가 평판으로 이전되었다. 샘플은 희석된 인간 혈장 샘플 (80 내지 5 mU/㎖ 혈장)의 참고 곡선 (reference curve)에 대하여 측정되었다. 반응은 기질 (100 ㎕, FRETS-VWF73; 2 μM 최종 농도)를 첨가함으로써 시작되고, 그리고 형광은 30℃에서 lex = 360 nm 및 lem = 460을 갖는 형광 분광광도계 (fluorescence spectrophotometer) (FLx800, Bio Tek)에서 45분 동안 2분마다 측정되었다. 이들 활성 결과는 인간 혈장의 참고 곡선으로부터 판독되었다. 데이터는 단위/㎖로서 표시된다. 정상적인 인간 혈장은 1 단위/㎖로서 간주되었다.
P. 실시예 16: ADAMTS13 항원 ELISA
ADAMTS13 내포 샘플은 포획 항체 (capture antibody)로서 및 표지된 형태에서 검출 항체 (detection antibody)로서, 인간 ADAMTS13에 지향된 다중클론 토끼 IgG를 이용한 ELISA 검사법으로 분석된다. 샘플 내에 존재하는 ADAMTS13 항원은 96-웰 마이크로역가 평판 상에 코팅된 ADAMTS13-특이적 항체에 의해 포획된다. 샘플은 완충액 (250 mM Tris, 350 mM NaCl, 0.5% BSA, 0.1% Tween 20)에서 희석되고, 그리고 코팅된 마이크로역가 웰로 이전되었다. 결합된 ADAMTS13 항원은 TMB를 기질로서 이용하는 HRP-접합된 토끼 항-ADAMTS13 IgG (Thermo Art: # 34021)로 검출된다. 흡광도 (absorbance)는 l = 450 nm에서 분광광도계 (TECAN SpectraFluorPlus, Tecan Sales Austria, Groding, Austria)에서 측정되었다. ADAMTS13 항원 농도 (㎍/㎖로 표시됨)는 안정적으로 형질감염된 HEK293 세포 배양 수확물로부터 정제되는 250 내지 7.81 ng/㎖의 재조합 ADAMTS13 범위에서 변하는 희석액을 이용하여 참고 표준으로부터 계산되었다.
Q. 실시예 17: ADAMTS13의 크기 배제 고성능 액체 크로마토그래피 (SE-HPLC) 분석
SE-HPLC는 AKTA 정화기 "900-시리즈" (GE Healthcare)를 이용하여 수행되었다. 상기 시스템은 실온에서 분당 0.3㎖의 일정한 유속으로 이동되는 Superose 12 GL 칼럼 (GE Healthcare, TC10/30)이 장비되었다. 이동 완충액 (running buffer)으로서, 20mM Tris, 100mM 아세트산나트륨, 500mM 염화나트륨, pH 7.4가 이용되었다. 샘플은 10,000rpm에서 5분 동안 원심분리되고 (Centrifuge 5415C, Eppendorf, Vienna, Austria), 그리고 100㎕가 자동샘플주입기에 의해 자동적으로 적용되었다. 칼럼 용출물의 흡광도는 280nm에서 연속적으로 측정되었다.
R. 실시예 18: ADAMTS13의 동적 광 산란 (DLS) 분석
동적 광 산란 (DLS)은 완충액 점성 측정을 위한 60 mm 직경/0.5° 각도를 갖는 원뿔체가 장비된 Malvern Nano Zetasizer ZS (Malvern Instruments Ltd Enigma Business Park, Grovewood Road, Malvern, Worcestershire, UK. WR14 1XZ) 및 Haake Rheostress 1 (Thermo Fisher Scientific, Karlsruhe, Germany)을 이용하여 수행되었다.
모든 샘플은 단백질의 유체역학적 직경을 결정하기 위하여 10.000 rpm에서 5분 동안 원심분리되었다 (Centrifuge 5415C, Eppendorf, Vienna, Austria). 60㎕의 샘플은 ZEN0040 일회용 마이크로 큐벳 내로 채워지고, 그리고 완충액의 점성은 Rheostress 1에 의해 결정되었다. 이러한 파라미터는 DLS에 의해 단백질의 유효한 크기를 분석하는데 이용된다. 작업 온도는 2분의 평형화 시간 (equilibration time)에서 25℃이었다. 단백질 각도는 샘플의 크기를 측정하기 위하여 173° 후방산란 (backscatter)으로 설정되고, 그리고 이들 결과를 평균하기 위하여 샘플당 3회 시험 (run)이 수행되었다.
샘플은 단백질에 대한 온도의 영향을 모니터링하기 위하여 온도 양식 (temperature mode)을 증가시킴에 의해 측정되었다. 측정 절차는 15℃에서부터 80℃까지 1℃/min의 증가하는 값과 2분의 평형화 시간에서 상이한 온도를 제외하고, 정상적인 크기 측정과 유사하였다. DTS2145 적은 부피 유리 큐벳이 이들 온도 램프 (temperature ramp)에 이용되었다.
S. 실시예 19: ADAMTS13의 푸리에-변환 적외선 분광학 (FTIR) 분석
푸리에-변환 적외선 분광학은 감쇠 전반사 (attenuated total reflection) 양식으로 작동하는 BioATR II 셀 (cell)이 장비된 FTIR 분광기 TENSOR 27 (Bruker Optik GmbH, 76275 Ettlingen, Germany)을 이용하여 수행되었다. 이러한 기구 배치 (instrument configuration)는 단백질 제제의 배치 형태를 분석하는데 이용될 수 있다.
20℃의 가동 온도 동안, 20㎕의 물이 셀 내로 채워지고 배경 스캔 (background scan)에 대하여 측정되었다. 이후, 20㎕ 완충액이 셀 내로 채워지고, 그리고 완충액으로부터 물을 뺄셈하기 위하여 배경 스캔에 대하여 측정되었다. 이러한 절차는 샘플을 측정하기 위한 배경 스캔으로서 완충액으로 반복되었다 (주파수의 측정 범위: 4000 - 650 cm-1). 인터페로그램 (interferogram)이 산출되고 투과 스펙트럼 (transmission spectrum)으로 번역되었다. 상이한 스펙트럼은 동일한 오프셋 (offset)에 대하여 보정되고 동일한 단백질 농도에 표준화되었다. 부가적으로, 상기 단백질의 이차 구조 (α-나선%, β-시트%)는 공지된 이차 구조의 ~40개 단백질의 데이터베이스를 포함하는 평가 소프트웨어 (OPUS 6.0 / Bruker)에 의해 계산되었다.
T. 실시예 20: ADAMTS13 안정성의 광조사 (photoirradiation) 분석
광안정성 검사는 SOP VN-09-45058TB에 따라, Atlas Suntest CPS+ 광안정성 챔버 (Chicago, Illinois, USA)를 이용하여 수행되었다. CPS+는 복사조도 (irradiance), 검정 표준 온도 (black standard temperature) 및 챔버 기온 (chamber air temperature)을 모니터링하고 제어한다.
광안정성은 전단 실험 및 동결-해동 실험에 이용된 제제와 동일한 제제에서 조사되었다 (표 12). 이들 샘플 및 대조는 DLS와 SE-HPLC에 의해 조사되었다. 획득된 결과는 도 31과 도 32에 도시된다. 양쪽 제제 (액체와 Lyo)는 SE-HPLC에 의해 동일한 결과를 보였다. 조사 (irradiation) 기간 동안, 단위체 ADAMTS13 피크는 감소하고 이합체 피크는 증가하였다. 액체 및 동결건조된 제제의 유체역학적 직경 역시 시간이 흐름에 따라 약간 증가하였다 (도 32). 10시간 (ICH Q1B에 의해 권장됨) 동안 조사 (irradiation)된 동결건조된 제제는 광-보호된 대조와 차이를 보이지 않았다. 광-조사 동안 모니터링된 FRETS 활성은 도 33에 도시된 바와 같이 액체에서 급속하게 감소하지만 동결건조된 제제에서는 적게 감소하였다. 4.8M lux 시간에 상응하는 ICH Guideline Q1B에 의해 권장된 4-배 광조사량 이후에도, FRETS 활성 중에서 50% 이상이 여전히 존속하였다.
"대조" 바이알은 광 노출을 배제하기 위하여 알루미늄 호일에 싸이고, 그리고 검사 샘플과 함께 광안정성 챔버 내에 배치되었다. 모든 샘플은 수평으로 배치되었다. 10시간의 조사 (irradiation) 시간은 1.2 내지 1.8 백만 lux h 및 765W/㎡ UV 광에 상응하였다. 샘플은 10시간후 광안정성 챔버로부터 제거되고, 그리고 스펙트럼 (190-800nm)과 pH 값이 측정되었다.
U. 실시예 21: ADAMTS13 안정성의 기계적 응력 분석
전단 응력은 60mm 직경 및 0.5° 각도를 갖는 원뿔체를 이용한 Haake Rheostress1 (Thermo Electron Karlsruhe GmbH, Karlsruhe, Gemany)로 가해졌다. 온도는 25.0℃로 설정되었다.
간단히 말하면, 앞서 기술된 바와 같이 제조된 재조합 인간 ADAMTS13은 표 12에서와 같이 조제되었다. 시험 (run)당 500㎕의 ADAMTS13 샘플이 가해지고 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 500과 600rpm에서 15분 동안 압박되었다. 이후, 샘플은 Eppendorf 바이알로 이전되었다. 잠재적 전단 응력 유도된 부분 풀림 또는 집합을 모니터링하기 위하여 DLS 측정이 적용되었다. 도 28에 도시된 바와 같이, 집합체는 200rpm의 전단 응력에서 형성되었다.
Figure pat00015
V. 실시예 22: ADAMT13 제제에 대한 다양한 완충제의 효과
다양한 완충액이 ADAMTS13 제제의 안정성과 배치 형태에 미치는 효과를 결정하기 위하여, 앞서 기술된 바와 같이 발현되고 정제된 재조합 인간 ADAMTS13은 상이한 완충액에 대하여 투석되고 (표 13), 그리고 ADAMTS13의 기본적인 완충액 선호도 (preference)를 확인하기 위하여 동적 광 산란 (DLS)에 의해 분석되었다. 도 27에서 확인할 수 있는 바와 같이, ADAMTS13의 가장 작은 유체역학적 직경은 상기 단백질이 히스티딘 또는 HEPES 완충액에서 조제될 때 관찰되었다.
Figure pat00016
W. 실시예 23: ADAMTS13 안정성의 동결-해동 분석
전단 응력 실험에 이용된 것과 동일한 제제 (표 12)가 동결-해동 응력 동안 상기 단백질의 거동을 조사하기 위하여 다시 한 번 이용되었다. 2가지 동결-해동 조건 -20℃/RT 및 -80℃/+37℃가 선택되었다. 도 29에서는 FRETS 활성 측정의 결과를 요약한다. 모든 샘플은 상기 분석의 변동 범위 (25% 상대적 표준 편차) 내에서 안정하다. 1회 5-배 동결-해동 사이클 이후에도 FRETS 활성 상실은 전혀 관찰되지 않았다. 이러한 액체 제제 내에서 BAX930의 안정성은 DLS와 SE-HPLC 측정의 결과에 의해 확증된다. DLS에 의한 집합 피크의 강도 (100 내지 1000nm)에서 증가는 동결-해동 조건과 독립적인 것으로 관찰되지 않았다 (도 30). 유사하게, SE-HPLC는 -80℃/+37℃에서 반복된 동결 해동 사이클 이후에도 집합 수준의 증가를 보이지 않았지만, 일부는 -20℃/RT에서 증가하였다 (데이터 제시되지 않음).
X. 실시예 24: ADAMTS13의 FRETS 활성에 대한 칼슘과 아연의 효과
앞서 기술된 바와 같이 제조된 재조합 인간 ADAMTS13은 10 mM EDTA로 처리되고, 이후 20 mM 히스티딘과 190 mM NaCl (pH 7.5)을 내포하는 완충액에 대하여 투석되었다. 투석후, CaCl2와 ZnCl2는 상이한 농도에서 이들 제제에 되돌려 첨가되었다. 이후, 상이한 농도의 칼슘과 아연을 내포하는 ADAMTS13 제제의 활성은 앞서 기술된 바와 같이 FRET 활성에 대하여 조사되었다. 도 34에서 확인할 수 있는 바와 같이, 증가하는 수준의 칼슘은 FRETS 활성의 회복을 증가시켰다. 아연의 존재와 부재 둘 모두에서, 4 mM CaCl2의 포함에 의해 거의 최대 활성이 달성되었다. 중간 농도의 칼슘 (2 mM와 4 mM)에서, 아연의 첨가는 FRETS 활성에서 완만한 증가를 제공하였다.
Y. 실시예 25: 동결건조된 ADAMTS13 제제 내에서 집합에 대한 염과 당 농도의 영향
염과 당 농도가 동결건조된 ADAMTS13 제제에 미치는 효과를 더욱 조사하기 위하여, 여러 동결건조된 제제의 소중합체성 상태가 탈이온수로 재구성 이후에 결정되었다. 간단히 말하면, 재조합 인간 ADAMTS13은 앞서 기술된 바와 같이 생산되었다. 단백질 샘플은 이후, 표 15에 제공된 염화나트륨과 수크로오스 수준과 함께 20 mM 히스티딘 (pH 7.0), 2 mM 염화칼슘, 그리고 0.05% 폴리소르베이트 80으로 조제되었다. 이들 제제는 이후, 앞서 기술된 바와 같이 동결건조되고, 그리고 탈이온수로 재구성되었다. 소중합체성 특징은 이후, SE-HPLC 분석에 의해 결정되었는데, 이들의 결과는 표 15와 도 35에 도시된다. 낮은 당 농도를 내포하는 제제에서 확인할 수 있는 바와 같이, 고염 수준 (150 mM)은 제제의 ADAMTS13 집합을 증가시키고 단위체성 함량을 감소시킨다.
Figure pat00017
표 15에서 도시된 동일한 제제는 이후, ADAMTS13 제제의 동결건조후 생산된 동결덩어리의 품질을 평가하는데 이용되었다. 표 16에서 요약되고, 그리고 도 36에서 도시된 바와 같이, 높은 농도의 염화나트륨 (150 mM)의 존재는 동결덩어리를 유발하지 않았다. 반대로, 최고 동결덩어리는 2% 수크로오스의 존재에서 0 mM 내지 60 mM 염화나트륨을 내포하는 제제에서 획득되었다.
Figure pat00018
Z. 실시예 26: 장기 온도 응력 검사
동결건조된 ADAMTS13 제제의 안정성을 더욱 특징짓기 위하여, 이차 장기 응력 검사가 시작되었다. 이러한 검사를 위하여, 재조합 인간 ADAMTS13은 표 19에 따라 3가지 최종 단백질 농도에서 조제되었다. 두 번째 당 (만니톨)이 제제 내에 포함되었는데, 그 이유는 이것이 동결건조 동안 상기 단백질을 안정화시키는 것으로 밝혀졌고 부드러운 표면을 갖는 조밀한 동결덩어리를 제공했기 때문이다. 모든 응력 검사 샘플은 DLS (도 39), SE-HPLC (표 20), 그리고 FTIR로 특징지어졌다. FRETS 활성 (표 21) 및 A13 항원 ELISA (표 22) 역시 모든 제제에 대하여 시간의 흐름에서 측정되었다.
Figure pat00019
Figure pat00020
Figure pat00021
Figure pat00022
본 명세서에서 기술된 실시예와 구체예는 단지 예시를 목적으로 하고, 그리고 이에 비추어 다양한 변형 또는 변화는 당업자에게 연상되고 본 출원의 기술적 사상과 범위, 그리고 첨부된 특허청구범위의 범위 내에 포함되는 것으로 이해된다. 본 명세서에서 인용된 모든 간행물, 특허, 그리고 특허 출원은 본 발명에 순전히 참조로서 편입된다.

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  1. 0.05 ㎎/㎖ 내지 10.0 ㎎/㎖ ADAMTS13를 포함하는, ADAMTS13의 안정화된 제제의 용도.
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