TW202400221A - 凝血因子x活化劑及其用於治療出血性疾病的製劑 - Google Patents

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Abstract

本發明涉及凝血因子X活化劑（FX活化劑，例如，RVV-X）組合物（例如藥物組合物），所述組合物包含蔗糖、組胺酸、聚山梨醇酯20和甘露醇，以及FX活化劑（例如，RVV-X）或其組合物（例如，藥物組合物）用於治療個體（例如，人類）出血性疾病（例如，血友病）的用途。

Description

凝血因子X活化劑及其用於治療出血性疾病的製劑
本發明要求於2022年6月20日提交的申請號為PCT/CN2022/099820的國際專利申請的優先權，其全部內容藉由引用併入本文中。
本發明提交的序列表的內容以其整體藉由引用併入本文中。
本發明關於凝血因子X活化劑（FX活化劑）的組合物（例如，藥物組合物），以及FX活化劑或其組合物（例如，藥物組合物）用於治療個體（例如，人類）的出血性疾病（例如，血友病）的用途。
止血是使出血停止的複雜生理過程。在正常情況下，組織損傷後，血小板、血漿蛋白、血管和內皮細胞立即協同參與到止血過程中，迅速形成血凝塊。在凝血級聯反應中，某些血漿蛋白（或凝血因子）被另一種已被事先激活的凝血因子依次“級聯”激活，導致凝血酶的快速生成。
凝血因子X（coagulation factor X；FX）是一種維生素K依賴的絲胺酸蛋白酶原，其活性形式（FXa）為體內凝血酶原（prothrombin）唯一的生理性激活物，在常見的凝血途徑中起關鍵作用。凝血因子X活化劑（coagulation factor X activator；FX activator）可特異性激活FX，使活性部位充分暴露，生成FXa。FXa在損傷部位與激活的血小板、FVa以及鈣離子形成凝血酶原複合物，從而增加凝血酶生成。凝血酶激活損傷部位的血小板及因子V和Ⅷ，並藉由將纖維蛋白原轉化為纖維蛋白以形成止血栓，從而達到為出血患者止血的目的。FX活化劑在外科創面出血、內科出血性疾病、凝血系統疾病，如血友病等方面都有潛在的巨大應用價值。
最早發現也是迄今為止活性最高的FX活化劑是從圓斑蝰蛇（Vipera russelli， Daboia russelii siamensis）的毒液中提取發現的，簡稱RVV-X。RVV-X為一種金屬蛋白酶，相對分子量（MW）為92880D，由分子量為57600D的重鏈和分子量分別為16400D和19400D的兩條輕鏈藉由二硫鍵組成。
自從McFarlane在圓斑蝰蛇蛇毒中首次發現了FX活化劑RVV-X之後（R.G. MacFarlane, “The coagulant action of Russell’s viper venom; the use of antivenom in defining its reaction with a serum factor,” Br J Haematol. 1961;7:496-511），在許多其他蛇毒中也發現了FX活化劑。FX活化劑普遍存在於蝰蛇與響尾蛇蛇毒中。在少數眼鏡蛇毒液中也發現了可激活FX的物質。此外，FX活化劑也可以藉由生物工程技術獲得，藉由在細胞中表達重組人FX活化劑以及從細胞培養液中分離並純化重組人FX活化劑。
FX活化劑的生物活性依賴於其二級和三級結構，因此，在製備、純化、儲存和給藥過程中，保持其生物活性尤為重要。
通常將凝血酶和FX活化劑共同製備成組合物，用作止血藥物，參見CN1520880A、CN1727002A、CN108785665A和CN1810258A。作為大分子蛋白，如果以FX活化劑為單一活性成分來製備FX活化劑藥物組合物，其容易發生變性，不利於長期儲存。人血白蛋白（HSA）是一種常用的保護劑，廣泛應用於生物製品中，作為蛋白質的穩定劑。但由於HSA易引起過敏反應以及潛在的病毒污染風險，已逐漸被淘汰。
出血性疾病包括先天性出血性疾病和獲得性出血性疾病，例如由於缺乏凝血因子（例如，FX）或由於存在凝血因子的獲得性抑制物（例如，自身抗體）等導致的出血性疾病。
血友病通常是一種遺傳性疾病，它會損害身體製造血凝塊以用於止血的能力。血友病A（HA）和血友病B（HB）是血友病的兩種主要類型。血友病A是由於凝血因子VIII（FVIII）含量較低導致，血友病B則是由於凝血因子IX（FIX）含量較低導致。血友病C（HC）是由於低水平的因子XI（FXI）而導致的另一種血友病。副血友病則是由於因子V（FV）水平較低導致。獲得性血友病可能與癌症、自身免疫性疾病或妊娠有關。
通常採用因子替代療法治療HA和HB患者的出血事件（bleeding episodes，BEs）；然而，20%-30%的HA患者和5%的HB患者會產生外源性FVIII或FIX抑制物。伴抑制物（例如，自身抗體）HA和HB難以控制。在這些患者中，替代缺陷因子可能無法實現止血（取決於抑制物的效價），因此可能需要施用旁路藥劑。儘管旁路治療藥劑，如活化的凝血酶複合物濃縮物（aPCC，例如，Feiba ®）、艾美賽珠單抗-kxwh（例如，HEMLIBRA®）和活化的重組人凝血因子VII（rFVIIa，例如，NovoSeven® RT）已被廣泛用作止血治療劑，但它們仍有缺點和局限性。例如，aPCC在中國不可用，aPCC中的微量FVIII可能誘導對FVIII的回憶應答；並且由於價格高，rFVIIa和艾美賽珠單抗未被廣泛應用。
本文提及的所有出版物、專利、專利申請和已公開的專利申請中披露的內容，以其整體藉由引用併入本文。
一方面，本發明提供一種藥物組合物，其包含：i) 凝血因子X活化劑（FX活化劑，例如，RVV-X），其含量為0.1 U/mL至200 U/mL；ii) 穩定劑，其含量為2 mg/ml至100 mg/ml；iii) 緩衝劑，其含量為0.1 mg/ml至50 mg/ml；iv) 表面活性劑，其含量為0.001% (w/v)至0.1% (w/v)和v) 賦形劑，其含量為1 mg/ml至100 mg/ml；其中，所述藥物組合物的pH為6.0至8.0。
在一些實施例中，如上所述任一種藥物組合物，所述FX活化劑為RVV-X。在一些實施例中，所述RVV-X包含：a) i) 重鏈，其包含序列SEQ ID NO: 1，或與SEQ ID NO: 1具有至少80%序列同一性的序列；ii) 輕鏈1，其包含序列SEQ ID NO: 2，或與SEQ ID NO: 2具有至少80%序列同一性的序列；以及iii) 輕鏈2，其包含序列SEQ ID NO: 3，或與SEQ ID NO: 3具有至少80%序列同一性的序列；b) i) 重鏈，其包含序列SEQ ID NO: 1，或與SEQ ID NO: 1具有至少80%序列同一性的序列；ii) 輕鏈1，其包含序列SEQ ID NO: 5，或與SEQ ID NO: 5具有至少80%序列同一性的序列；以及iii) 輕鏈2，其包含序列SEQ ID NO: 3，或與SEQ ID NO: 3具有至少80%序列同一性的序列；或c) a) 和b) 的混合物。在一些實施例中，所述RVV-X是從圓斑蝰蛇（Daboia russellii siamensis）的蛇毒中分離得到的。在一些實施例中，所述藥物組合物中RVV-X的純度至少為95%（例如，至少96%、97%、98%、99%或100%）。
在一些實施例中，如上所述任一種藥物組合物，所述FX活化劑（例如，RVV-X）的含量為1 U/mL至100 U/mL，如5 U/mL至100 U/mL、5 U/mL至50 U/mL，或10 U/mL。
在一些實施例中，如上所述任一種藥物組合物，所述穩定劑包含蔗糖和海藻糖中的一種或兩種。在一些實施例中，所述穩定劑是蔗糖。在一些實施例中，所述穩定劑（例如，蔗糖）的含量為2 mg/ml至60 mg/ml，如15 mg/ml至60 mg/ml、30 mg/ml至50 mg/ml，或30 mg/ml。
在一些實施例中，如上所述任一種藥物組合物，所述緩衝劑包含組胺酸和精胺酸中的一種或兩種。在一些實施例中，所述緩衝劑是組胺酸。在一些實施例中，所述緩衝劑（例如，組胺酸）的含量為2 mg/ml至20 mg/ml，如2 mg/ml至15 mg/ml、3 mg/ml至5 mg/ml，或3 mg/ml。
在一些實施例中，如上所述任一種藥物組合物，所述表面活性劑包含聚山梨醇酯和泊洛沙姆中的一種或兩種。在一些實施例中，所述表面活性劑為選自聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80和泊洛沙姆188中的一種或多種。在一些實施例中，所述表面活性劑是聚山梨醇酯20。在一些實施例中，所述表面活性劑（例如，聚山梨醇酯20）的含量為0.005% (w/v)至0.05% (w/v)，如0.01% (w/v)至0.05% (w/v)、0.01% (w/v)至0.03% (w/v)，或0.02% (w/v)。
在一些實施例中，如上所述任一種藥物組合物，所述賦形劑是甘露醇。在一些實施例中，所述賦形劑的含量為10 mg/ml至60 mg/ml，如30 mg/ml至60 mg/ml，或40 mg/ml。
在一些實施例中，如上所述任一種藥物組合物，所述藥物組合物的pH為6.3至7.3，如6.8至7.0，或6.85。
在一些實施例中，如上所述任一種藥物組合物，所述藥物組合物進一步包含抗氧化劑，如甲硫胺酸。在一些實施例中，所述抗氧化劑的含量為0.01 mg/ml至1 mg/ml，如0.05 mg/ml至1 mg/ml。
在一些實施例中，如上所述任一種藥物組合物，所述藥物組合物進一步包含鈣鹽，如氯化鈣。在一些實施例中，所述鈣鹽的含量為0.1 mg/ml至10 mg/ml。
在一些實施例中，如上所述任一種藥物組合物，所述藥物組合物包含：i) RVV-X，其含量為10 U/mL；ii) 蔗糖，其含量為30 mg/ml；iii) 組胺酸，其含量為3 mg/ml；iv) 聚山梨醇酯20，其含量為0.02% (w/v)；和v) 甘露醇，其含量為40 mg/ml；其中所述藥物組合物的pH值為6.85。
在一些實施例中，如上所述任一種藥物組合物，所述藥物組合物是凍乾的。在一些實施例中，所述藥物組合物是無菌的。在一些實施例中，所述藥物組合物在如下條件下是穩定的：i) 複溶後，置於25℃下至少4小時；ii) 置於2-8℃下至少3小時；和/或iii) 置於25℃加速穩定條件下至少3小時。在一些實施例中，在25°C加速穩定條件下儲存約6個月後再進行複溶，其藥物組合物包含小於約5%的直徑大於10 μm的不溶性顆粒。
另一方面，本發明提供治療個體（例如，人類）中出血性疾病（例如，血友病，如血友病A或血友病B）的方法，包括向個體施用有效量的如上所述任一種藥物組合物。
另一方面，本發明提供治療個體（例如，人類）中出血性疾病（例如，血友病，如血友病A或血友病B）的方法，包括向個體施用有效量的FX活化劑（例如，RVV-X），其中所述FX活化劑的給藥劑量為0.01 U/kg至0.48 U/kg。在一些實施例中，所述FX活化劑的給藥劑量為0.08 U/kg至0.48 U/kg，如0.01 U/kg至0.16 U/kg、0.08 U/kg至0.16 U/kg、0.1 U/kg至0.48 U/kg或0.1 U/kg至0.16 U/kg。在一些較佳實施例中，所述FX活化劑的給藥劑量為0.08 U/kg、0.1 U/kg、0.12 U/kg、0.14 U/kg或0.16 U/kg。在一些實施例中，所述FX活化劑的給藥次數為1次。在一些實施例中，所述FX活化劑最多給藥6次。在一些實施例中，所述FX活化劑給藥4次。在一些實施例中，所述FX活化劑每4小時（q4h）至每8小時（q8h）給藥1次，如q4h。在一些實施例中，所述FX活化劑給藥1次，劑量為0.01 U/kg至0.48 U/kg。在一些實施例中，所述FX活化劑的給藥劑量為0.16 U/kg q4h，最多給藥6次。在一些實施例中，所述FX活化劑的給藥劑量為0.16 U/kg q4h，給藥4次。在一些較佳實施例中，所述FX活化劑的給藥劑量為0.1 U/kg q4h，最多給藥6次。在一些較佳實施例中，所述FX活化劑的給藥劑量為0.1 U/kg q4h，給藥4次。
在一些實施例中，如上所述任一種方法，所述FX活化劑為RVV-X。在一些實施例中，所述RVV-X包含：a) i) 重鏈，其包含序列SEQ ID NO: 1，或與SEQ ID NO: 1具有至少80%序列同一性的序列；ii) 輕鏈1，其包含序列SEQ ID NO: 2，或與SEQ ID NO: 2具有至少80%序列同一性的序列；以及iii) 輕鏈2，其包含序列SEQ ID NO: 3，或與SEQ ID NO: 3具有至少80%序列同一性的序列；b) i) 重鏈，其包含序列SEQ ID NO: 1，或與SEQ ID NO: 1具有至少80%序列同一性的序列；ii) 輕鏈1，其包含序列SEQ ID NO: 5，或與SEQ ID NO: 5具有至少80%序列同一性的序列；以及iii) 輕鏈2，其包含序列SEQ ID NO: 3，或與SEQ ID NO: 3具有至少80%序列同一性的序列；或c) a) 和b) 的混合物。在一些實施例中，所述RVV-X是從圓斑蝰蛇的蛇毒中分離得到的。在一些實施例中，所述藥物組合物中RVV-X的純度至少為95%（例如，至少96%、97%、98%、99%或100%）。
在一些實施例中，如上所述任一種方法，其中所述FX活化劑包含在藥物組合物中。在一些實施例中，所述FX活化劑在藥物組合物中的濃度為1 U/mL至200 U/mL，如1 U/mL至100 U/mL、5 U/mL至100 U/mL、5 U/mL至50 U/mL或10 U/mL。在一些實施例中，所述藥物組合物進一步包含一種或多種穩定劑、緩衝劑、表面活性劑和賦形劑。在一些實施例中，所述穩定劑包含蔗糖和海藻糖中的一種或兩種。在一些實施例中，所述穩定劑是蔗糖。在一些實施例中，所述穩定劑（例如，蔗糖）的含量為2 mg/ml至100 mg/ml，如2 mg/ml至60 mg/ml、15 mg/ml至60 mg/ml、30 mg/ml至50 mg/ml或30 mg/ml。在一些實施例中，所述緩衝劑包含組胺酸和精胺酸中的一種或兩種。在一些實施例中，所述緩衝劑是組胺酸。在一些實施例中，所述緩衝劑（例如，組胺酸）的含量為0.1 mg/ml至50 mg/ml，如2 mg/ml至20 mg/ml、2 mg/ml至15 mg/ml、3 mg/ml至5 mg/ml或3 mg/ml。在一些實施例中，所述表面活性劑包含聚山梨醇酯和泊洛沙姆中的一種或兩種。在一些實施例中，所述表面活性劑為選自聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80和泊洛沙姆188中的一種或多種。在一些實施例中，所述表面活性劑是聚山梨醇酯20。在一些實施例中，所述表面活性劑（例如聚山梨醇酯20）的含量為0.001% (w/v)至0.1% (w/v)，如0.005% (w/v)至0.05% (w/v)、0.01% (w/v)至0.05% (w/v)、0.01% (w/v)至0.03% (w/v)或0.02% (w/v)。在一些實施例中，所述賦形劑是甘露醇。在一些實施例中，所述賦形劑的含量為1 mg/ml至100 mg/ml，如10 mg/ml至60 mg/ml、30 mg/ml至60 mg/ml或40 mg/ml。在一些實施例中，所述藥物組合物的pH值為6.0至8.0，如6.3至7.3、6.8至7.0或6.85。在一些實施例中，所述藥物組合物進一步包含抗氧化劑，所述抗氧化劑為甲硫胺酸。在一些實施例中，所述抗氧化劑的含量為0.01 mg/ml至1 mg/ml，如0.05 mg/ml至1 mg/ml。在一些實施例中，所述藥物組合物進一步包含鈣鹽。在一些實施例中，所述鈣鹽為氯化鈣。在一些實施例中，所述鈣鹽的含量為0.1 mg/ml至10 mg/ml。在一些實施例中，所述藥物組合物包含：i) RVV-X，其含量為10 U/mL；ii) 蔗糖，其含量為30 mg/ml；iii) 組胺酸，其含量為3 mg/ml；iv) 聚山梨醇酯20，其含量為0.02% (w/v)；和v) 甘露醇，其含量為40 mg/ml；其中所述藥物組合的pH值為6.85。在一些實施例中，所述藥物組合物是凍乾的。在一些實施例中，所述藥物組合物是無菌的。在一些實施例中，所述藥物組合物在如下條件下是穩定的：i) 複溶後，置於25℃下至少4小時；ii) 置於2-8℃下至少3小時；和/或iii) 置於25℃加速穩定條件下至少3小時。在一些實施例中，在25°C加速穩定條件下儲存約6個月後再進行複溶，其藥物組合物包含小於約5%的直徑大於10 μm的不溶性顆粒。
在一些實施例中，如上所述任一種方法，所述FX活化劑（例如，RVV-X）通過靜脈注射給藥。
在一些實施例中，如上所述任一種方法，所述出血性疾病為先天性出血性疾病或獲得性出血性疾病。在一些實施例中，所述出血性疾病選自由因缺乏凝血因子引起的疾病、因存在獲得性凝血因子抑制物引起的疾病、血液疾病、出血性疾病、血管性血友病（Von Willebrands’ disease）、由施用維生素K拮抗劑進行抗凝治療引起的疾病、遺傳性血小板疾病、維生素K環氧化物還原酶C1缺乏症、γ羧化酶缺乏症、與創傷或損傷或外科相關的出血、血栓、血小板減少症、腦中風、凝血功能障礙、彌散性血管內凝血（DIC）、Bernard-Soulier症候群、格蘭茲曼血栓形成症和儲存池缺乏症組成的組。在一些實施例中，所述出血性疾病是由於凝血因子缺乏所致。在一些實施例中，所述出血性疾病是血友病，如血友病A或血友病B。在一些實施例中，所述血友病是伴抑制物的血友病。
在一些實施例中，如上所述任一種方法，所述個體是人類。
同時還提供組合物（例如，藥物組合物）、試劑盒以及包含如上所述任一種藥物組合物的生產製品。同時還提供使用如本文所述任一種方法或其藥物組合物治療個體（人類）出血性疾病（例如，出血性疾病，如血友病A或血友病B）的方法。
通常將凝血酶和FX活化劑共同製備成組合物，用作止血藥物。作為大分子蛋白，如果以FX活化劑為單一活性成分來製備FX活化劑藥物組合物，FX活化劑容易發生變性，不利於長期儲存。此外，FX活化劑的生物活性依賴於其二級和三級結構，因此，在製備、純化、儲存和給藥過程中，保持其生物活性尤為重要。
伴抑制物（例如，自身抗體）的血友病A（HA）和血友病B（HB）患者中的出血事件難以控制。目前的旁路治療劑存在缺點和局限性。例如，活化的凝血酶複合物濃縮物（aPCC，例如，Feiba ®）未被廣泛應用。此外，aPCC中的微量FVIII可能誘導對FVIII的回憶應答。PCC可能誘導對FIX的記憶性免疫應答。另外，PCC和aPCC來自血液產品，因此存在病毒感染和過敏的潛在風險。艾美賽珠單抗（Emicizumab）-kxwh（Hemlibra ®）是一個雙特異性人源化的單克隆抗體，其藉由橋連激活的FIX和FX來恢復失活FVIII的功能，從而促進有效止血。FDA已批准其用於治療分別伴FVIII或FIX抑制物的HA和HB患者。然而，由於價格昂貴，其未被廣泛應用。活化的重組因子VII（rFVIIa，例如，NovoSeven®RT）也存在同樣的價格問題。rFVIIa藉由與組織因子形成複合物發揮作用，該複合物藉由外源途徑激活FX成為FXa，然後將凝血酶原轉化為凝血酶以實現止血。
一方面，本發明提供FX活化劑（例如，RVV-X）的組合物（例如，藥物組合物），如RVV-X先導製劑，其在長期儲存、加速或應力條件下，和/或在複溶後保持穩定且具有生物活性。另一方面，本發明提供FX活化劑或其組合物，如本文所述的任一FX活化劑藥物組合物，用於治療個體（例如，人類）的出血性疾病（例如，血友病，如伴抑制物HA或HB），所述FX活化劑或其組合物在體內表現出優異的治療效果（例如，高特異性、高活性、低劑量、起效快）、PK/PD曲線和安全性。此特性與FDA批准的rFVIIa（NovoSeven® RT）相當或更優。
如本文所述的FX活化劑（例如，RVV-X，如從圓斑蝰蛇的蛇毒中分離和純化的）及其藥物組合物（例如，RVV-X先導製劑），以及其在治療如本文所述的出血性疾病中的用途（例如，伴或不伴抑制物HA或HB），具有一個或多個優異療效： 1)其在促進伴抑制物（分別為FVIII抑制物或FIX抑制物）血友病A和血友病B患者的止血方面表現出良好的生物活性，這些患者是已知的難以治療的人群； 2)其在各種出血事件，如在外科手術期間（見實施例1-4）中，能有效促進止血； 3)其與FDA批准的價格昂貴或應用受限的止血劑相比，具有相當的或更優的治療效果，例如，RVV-X在人II期臨床試驗中的治療效果（100%有效止血）顯著優於凝血酶複合物濃縮物（PCC；有效止血率50%），並與可注射重組人凝血因子VIIa（例如，NovoSeven ®RT；有效止血率約90%）相當，在KOFVIII血友病小鼠中，低劑量單次注射RVV-X即能有效促進止血及降低死亡率，並顯示出與NovoSeven ®RT等類似甚至更優的治療效果； 4)其具有卓越的安全性，在本文所證實的劑量範圍內具有良好的耐受性，不會引起任何血栓栓塞事件、彌散性血管內凝血（DIC）、嚴重不良事件（SAE）、導致臨床試驗期間停藥的不良事件（AE）或疑似意外嚴重不良反應（SUSAR）（見實施例1和4）； 5)其在體內不會誘導抑制物（結合抗體）或抗RVV-X中和抗體（不期望的免疫反應）； 6)從哺乳動物（例如，小鼠）到人類個體，其均具有廣泛的止血應用； 7)其表現出卓越的藥代動力學（PK）曲線和藥效學（PD）曲線，如起效快及體內半衰期長等，例如低劑量RVV-X的單次和多次給藥後T 1/2達7-9小時，在給藥後5-10分鐘開始出現C max和治療指標（例如，凝血酶生成（TG）增加、內源性凝血酶生成潛力（ETP）增加、活化部分促凝血酶原激酶時間（APTT）縮短），並持續至少24小時，而FDA批准的NovoSeven ®RT的T 1/2僅為1.7-3.11小時（美國FDA NovoSeven包裝說明書）； 8)如本文所述的FX活化劑及其藥物組合物（例如，RVV-X先導製劑）半衰期長、生物活性高，因此可以以低頻率、低劑量進行給藥（例如，每4小時1次，共4次，每次劑量0.16 U/kg；或每4小時1次，共6次，每次劑量0.1 U/kg；或單次給藥，劑量為0.16U/kg-0.48U/kg）即能達到有效止血，並且可以通過靜脈注射給藥，為患者提供了方便，降低了成本；以及9) 如本文所述的FX活化劑其藥物組合物（例如，RVV-X先導製劑）及製劑方案（例如，粉狀凍乾注射劑）提供優異的穩定性和安全性（例如，與含有人血清白蛋白作為蛋白質穩定劑的處方相比），如在長期儲存條件（2-8℃）、加速條件（例如，25℃、RH 65±5%）、應力條件（例如，高溫（40±2℃）、高濕或光照）或複溶後，具有穩定的外觀、水分、pH值和生物活性穩定性，聚集體和/或不溶性顆粒顯著減少，從而有效地保持藥性，同時也避免了HSA作為蛋白質穩定劑時常見的過敏反應和/或病毒污染的風險。
同時還提供製備（例如，製劑方案）如本文所述任一種FX活化劑藥物組合物的方法，以及包含FX活化劑（例如，RVV-X）或其藥物組合物的生產製品。 [I. 定義]
除非上下文另有明確說明，實施本發明將採用本領域技術範圍內的病毒學、免疫學、微生物學、分子生物學和重組DNA技術的常規方法，許多所述方法將在下文詳述以供說明。所述技術在文獻中有充分解釋。參見Current Protocols in Molecular Biology or Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, New York, N.Y. (2009); Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology, 3rd ed., John Wiley & Sons, 1995; Sambrook and Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd Edition, 2001); Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1982); DNA Cloning: A Practical Approach, vol. I&II (D. Glover, ed.); Oligonucleotide Synthesis (N. Gait, ed., 1984); Nucleic Acid Hybridization (B. Hames & S. Higgins, eds., 1985); Transcription and Translation (B. Hames & S. Higgins, eds., 1984); Animal Cell Culture (R. Freshney, ed., 1986); Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (1984)和其他相似參考資料。
如本文所述，“治療（treatment）”或“治療（treating）”是一種獲得有益的或期望的結果的方法，包括臨床結果。鑒於本發明的目的，所述有益的或期望的臨床結果，包括但不限於以下一種或多種：緩解由疾病引起的一種或多種症狀，減輕疾病程度，穩定疾病（例如，預防或延遲疾病惡化），預防或延遲疾病的擴散（例如，轉移），預防或延遲疾病復發，延遲或減緩疾病進展，改善疾病狀態，緩解疾病（部分或全部），減少治療疾病所需的一種或多種其他藥物的劑量，延遲疾病進展，改善或提高生活品質，增加體重，和/或延長生存期。同時，“治療”還包括減少疾病病理結果。本發明的方法考慮了這些治療的任何一個或多個方面。例如，如果一個或多個與該疾病相關的症狀得到緩解或消除，包括但不限於減少該疾病引起的症狀，提高該疾病患者的生活品質，減少治療疾病所需的其它藥物的劑量，和/或延長個體的生存期，則認為該患者被成功“治療”。
術語“預防（prevent）”和類似的詞語，如“預防（prevented）”、“預防（preventing）”等表示預防、抑制或降低疾病或病症復發可能性的方法。它還指延緩疾病或病症的復發或延緩疾病或病症的復發。如本文所用，“預防”和類似詞語還包括在疾病或病症復發之前降低疾病或病症的強度、影響、症狀和/或負擔。
如本文所用，“延緩”疾病的發展表示推遲、阻礙、減緩、減慢、穩定和/或推遲疾病的發展。根據疾病史和/或接受治療的個體不同，延緩的時間可能不同。“延緩”疾病發展的方法是指與不使用該方法相比，在一個給定時間範圍內降低疾病發展的可能性和/或降低疾病程度的方法。這種比較通常基於臨床研究，使用統計學顯著的個體數量。
如本文所用，術語“有效量”是指足以治療特定紊亂、病症或疾病的藥物劑量或藥物組合物劑量，如改善、減輕、減弱和/或延緩一個或多個症狀。在一些實施例中，有效量是足以延緩疾病發展的量。在一些實施例中，有效量是足以預防或延緩疾病復發的量。在一些實施例中，有效量是足以在一定程度上緩解與疾病相關的一種或多種症狀的量。有效量可在一次或多次給藥中施用。在一些實施例中，藥物或組合物的有效量可以：(i) 減少出血量和/或時間；(ii) 增加凝血劑活性；(iii) 激活FX；(iv) 增加凝血酶生成（TG）和/或內源性凝血酶生成潛力（ETP）；(v) 縮短活化部分促凝血酶原激酶時間（APTT）、凝血酶原時間（PT）和/或凝血酶時間（TT）；(vi) 促進止血，如減少出血時間和/或出血量；(vii) 減少死亡率和/或(viii) 促進傷口癒合等。
如本文所用，“凝血途徑”或“凝血級聯反應”是指導致不溶性纖維蛋白凝塊形成的一系列激活事件。在凝血級聯或途徑中，藉由對絲胺酸蛋白酶（又稱酶原）的非活性蛋白中的一個或多個肽鍵進行切割，將其轉化為活性蛋白酶，然後作為級聯反應中下一個酶原分子的激活蛋白酶。在級聯反應的最後一個蛋白水解步驟中，凝血酶將纖維蛋白原水解為纖維蛋白，然後纖維蛋白在損傷部位交聯形成凝塊。
如本文所用，“止血”是指停止出血或使血液在一個器官或身體部位停止流動。術語“止血”可以包含防止血管損傷後失血的整個血液凝固過程，直至組織修復後的血凝塊溶解。
如本文所用，“凝血（clotting）”或“凝血（coagulation）”是指不溶性纖維蛋白凝塊的形成，或血液中的凝血因子在凝血級聯中相互作用，最終導致不溶性纖維蛋白凝塊形成的過程。
如本文所用，“促凝劑”是指任何促進血液凝固的物質。
如本文所用，“抗凝劑”是指任何抑制血液凝固的物質。
如本文所用，術語“滲透壓”是指溶質濃度的量度，定義為每千克溶液中溶質（非離子形式和離子形式）的毫莫耳數。藉由填加一種或多種穩定劑，如糖或糖醇，包括但不限於甘露醇、葡萄糖、海藻糖和/或蔗糖，可以達到所需的滲透壓水平。參考文獻詳述了適於提供滲透壓的其他穩定劑，如《藥物賦形劑手冊》（第四版，英國皇家藥學會，科學與實踐出版社）或《雷明頓：藥學的科學與實踐》（第十九版，麥克出版公司）。
如本文所用，術語“等滲的（isosmotic）”和“等滲的（isotonic）”與術語“實質上等滲的”互換使用，“實質上等滲的”是指製劑具有如下特性，即其滲透壓與另一溶液滲透壓相同或至少實質等同，該製劑中溶質的總濃度（包括滲透性溶質和非滲透性溶質）與另一溶液中溶質總數相同或至少實質等同。因此，儘管本領域技術人員所理解的用於體內給藥的“等滲（isosmotic）的”和“等滲（isotonic）的”製劑通常的滲透壓範圍約270 mmol/kg至310 mmol/kg，但在本文所述實施例中高濃度、低黏性製劑的背景下，術語“等滲（isosmotic）的”、“等滲（isotonic）的”、“實質上等滲的（substantially isosmotic）”和“實質上等滲的（substantially isotonic）”互換使用，是指滲透壓範圍約240 mOsm/kg至400 mOsm/kg或270 mOsm/kg至370 mOsm/kg或300 mOsm/kg至330 mOsm/kg的製劑。
如本文所用，“個體”或“主體”是指動如（例如哺乳動物），包括但不限於人類、牛、馬、貓、狗、齧齒動物、禽類或靈長類動物。在一些實施例中，所述個體是指人類。在一些實施例中，所述個體是小鼠、大鼠或猴子。
如本文所用，術語“特異性地結合”、“特異性地識別”或“對..來說是特異性的”是指可測量的和可再現的相互作用，例如配體與受體的結合，可以確定在異質分子群，包括生物分子中存在該配體。例如，配體能夠特異性地識別某受體是指，與其它受體結合相比，該配體與該受體的結合具有更高的親和力、親合力、更容易和/或更持久。在一些實施例中，所述配體與不相關受體的結合親和力小於其與所測量的靶受體的結合親和力的10%，例如藉由放射免疫檢定法（RIA）。在一些實施例中，特異性結合靶受體的配體的平衡解離常數（K d）≤10 -5M、≤10 -6M、≤10 -7M、≤10 -8M、≤10 -9M、≤10 -10M、≤10 -11M或≤10 -12M。在一些實施例中，配體能特異性結合在不同物種間保守的受體。在一些實施例中，特異性地結合包括但不要求專一結合。配體的結合特異性可以藉由本領域已知的方法進行實驗測定。這些方法包括，但不限於Western blots、ELISA-、RIA-、ECL-、IRMA-、EIA-、BIAcore測試和肽掃描。
如本文所用，“共價鍵”是指兩個原子之間藉由共用一個或多個電子形成的穩定鍵。共價鍵的示例包括但不限於肽鍵和二硫鍵。如本文所用，“肽鍵”是指胺基酸的羧基與相鄰胺基酸的胺基之間形成的共價鍵。如本文所用，“二硫鍵”是指兩個硫原子之間形成的共價鍵，如兩個Fc片段藉由一個或多個二硫鍵結合。兩個片段之間的一個或多個二硫鍵可能藉由連接兩個片段中的硫醇基形成。在一些實施例中，兩個Fc片段的一個或多個半胱胺酸之間可能形成一個或多個二硫鍵。氧化兩個硫醇基可形成二硫鍵。在一些實施例中，共價連接是藉由共價鍵直接連接而成的。在一些實施例中，共價連接藉由肽鍵或二硫鍵直接連接。
肽或多肽序列的“胺基酸序列同一性百分比（%）”或“同源性”被定義為候選序列中與特定多肽或多肽序列中相同胺基酸殘基所占的百分比，在序列比對並引入間隙（如果必要）後以實現序列同一性百分比的最大化，並且不考慮任何保守替換作為序列同一性的一部分。可以藉由本領域技術範圍內的多種比對方式來確定胺基酸序列同一性百分比，例如，使用如BLAST、BLAST-2、ALIGN、Megalign (DNASTAR)、或MUSCLE軟體等可公開獲得的電腦軟體。本領域技術人員可以確定用於測量比對的合適參數，包括在所比較的序列的全長上實現最大比對所需的任何演算法。
如本文所用，多肽的“C端”是指該多肽的最後一個胺基酸殘基，該殘基的胺基與其相鄰胺基酸殘基的羧基形成肽鍵。如本文所用，多肽的“N末端”是指該多肽的第一個胺基酸，該殘基的羧基與其相鄰胺基酸殘基的胺基形成肽鍵。
“分離的”多肽是指已從其生產環境（例如，天然或重組）的組分中鑒定、分離和/或回收的多肽。較佳地，所分離的多肽與其生產環境中的所有其它成分沒有關聯。生產環境的污染成分，如重組轉染細胞產生的污染成分，通常會干擾多肽的研究、診斷或治療，並且可能包括酶、激素和其它蛋白溶質或非蛋白溶質。在一些實施例中，多肽將被純化至：(1) 按重量計算，多肽含量大於95%，如藉由Lowry法確定，在一些實施例中，按重量計算，多肽含量大於99%；(2) 藉由使用旋杯測序儀達到足以獲得至少15個N端殘基或內部胺基酸的序列的程度；或(3) 藉由SDS-PAGE在非還原性或還原性條件下使用考馬斯藍或較佳為銀染色達到同質性。分離的多肽包括重組細胞內的原位多肽，因為多肽天然環境中的至少一個要素不存在。然而，通常情況下，至少要經過一個純化步驟來製備分離的多肽。
編碼構建體的“分離的”核酸分子是從至少含一種雜質的核酸分子中鑒定和分離出來的核酸分子，在產生該“分離的”核酸分子的天然環境中，其和雜質核酸分子通常是聯繫在一起的。較佳地，所分離的核酸與其生產環境中的所有成分沒有關聯。如本文所述的編碼多肽的分離的核酸分子所存在的形式，與它在自然界中天然存在的形式不同。因此，分離的核酸分子不同於細胞中天然存在的編碼本文所述多肽的核酸。分離的核酸包括含有該核酸分子的細胞中通常所含的核酸分子，但該核酸分子存在於染色體外，或者其在染色體中所處的位置與天然情況下不同。
術語“控制序列”是指在特定宿主生物體中表達可操作連接的編碼序列所必需的DNA序列。例如，適合原核生物的控制序列包括啟動子、任選的操控子序列和核糖體結合位點。已知真核細胞利用啟動子、多聚腺苷酸化訊號和增強子。
當核酸與另一個核酸序列建立功能性關係時，所述核酸即為“可操作地連接”。例如，如果多肽的DNA以前體蛋白形式（該前體蛋白參與多肽分泌過程中）進行表達，則前序列或分泌性先導序列的DNA可操作連接到多肽的DNA；如果啟動子或增強子影響序列的轉錄，則所述啟動子或增強子可操作連接到編碼序列；或如果核糖體結合位點處在便於轉譯的位置，則所述核糖體結合位點可操作連接到編碼序列。一般來說，“可操作連接”意味著連接的DNA序列是連續的，並且，對於分泌性先導序列而言，其不僅是連續的並且處於讀碼框內（reading phase）。然而，增強子不必是連續的。連接是藉由在適宜的限制性位點進行連接來完成的。如果不存在此類位點，則按照常規手段使用合成的寡核苷酸適配體或接頭。
如本文所用，術語“載體”是指一種核酸分子，其能夠擴增與其連接的另一核酸分子。該術語包括作為自我複製核酸結構的載體，以及可被整合進所導入的宿主細胞的基因組的載體。某些載體能夠指導與之連接的核酸表達。在本文中稱此類載體為“表達載體”。
如本文所用，術語“轉染”或“轉化”或“轉導”是指外源核酸轉移或導入宿主細胞的過程。“轉染的”或“轉化的”或“轉導的”細胞是用外源核酸轉染、轉化或轉導的細胞。所述細胞包括原代受試細胞及其子代細胞。
術語“宿主細胞”、“宿主細胞系”和“宿主細胞培養物”可互換使用，指已引入外源核酸的細胞，包括此類細胞的子代。宿主細胞包括“轉化體”和“轉化細胞”，其中包括原代轉化細胞和由此產生的子代，而不考慮傳代次數。子代細胞在核酸上可能與親代細胞不完全相同，可能含有突變。本文包括在原始轉化細胞中篩選或選擇與其具有相同功能或生物活性的突變子代。
術語“藥物製劑”或“藥物組合物”是指一種製劑，所述製劑以使活性成分的生物活性有效的形式存在，並且不包含對施用所述製劑的受試者具有不可接受毒性的額外成分。這種製劑是無菌的。“無菌”製劑是無菌的或不含任何活的微生物及其孢子。
本文中所述的本發明的實施例應理解為包括“由……組成”和/或“基本上由……組成”的實施例。
本文中提及“約”為一個數值或參數，包含（和描述）針對該數值或參數本身的變體。例如，涉及“約X”的描述包括對於“X”本身描述。
如本文所用，提及“不是”一個數值或參數，通常表示並描述“除了（other than）”某一數值或參數之外。例如，該方法不能用於治療X型疾病，意味著該方法通常用於治療除X型疾病之外的其它類型。
如本文所用，術語“約X-Y”與“約X到約Y”意思相同。
除非上下文另有明確說明，本文和所述權利要求中所採用的單數形式“一”，“一個”和“該”包括複數物件。 [II. 凝血因子X活化劑的藥物組合物]
本發明的發明人發現，使用雙糖（例如，蔗糖和/或海藻糖）作為穩定劑與胺基酸緩衝液（例如，精胺酸和/或組胺酸）共同配置以FX活化劑（例如，RVV-X）作為單一有效成分的組合物，不僅極大地提高了產品的穩定性，減少了蛋白質聚集和不溶性顆粒含量，而且避免了使用人血清白蛋白作為常用穩定劑而引起的過敏反應和潛在的病毒污染風險。在FX活化劑（例如，RVV-X）凍乾期間，使用蔗糖和/或海藻糖作為穩定劑可使FX活化劑高級結構更加穩定，防止其因凍乾而變形，在低溫冷凍脫水條件下保持FX活化劑的完整結構和功能，顯著提高FX活化劑的穩定性。
在FX活化劑（例如，RVV-X）溶液凍乾期間，FX活化劑的濃度逐漸增加，在蛋白質濃度較高時，溶液的pH值可能發生變化，嚴重時可能導致FX活化劑變性，致使FX活化劑失活。為了確保活性成分FX活化劑具有最大的生物活性，必須控制適當的pH範圍。本發明的發明人發現，用組胺酸和/或精胺酸作為緩衝劑，不僅具有良好的緩衝能力，而且還可以在一定範圍內保持產品pH的相對穩定性。此外，與常用的穩定劑HSA相比，當胺基酸緩衝劑（例如，精胺酸和/或組胺酸）與作為穩定劑的雙糖（例如，蔗糖和/或海藻糖）組合使用時，本發明的製劑方案不僅可以確保FX活化劑的生物活性，還可以進一步提高組合物的穩定性。
本發明的FX活化劑藥物組合物（例如，注射粉劑）至少具有如下有益效果：1) 本發明所述的FX活化劑藥物組合物或製劑方案，採用FX活化劑作為單一活性成分，使用蔗糖和/或海藻糖代替白蛋白（例如，HSA）作為穩定劑，並與精胺酸和/或組胺酸的緩衝劑和表面活性劑組合，不僅顯著提高了FX活化劑組合物產品的穩定性，而且避免由病毒或白蛋白攜帶的其它未知成分引起的潛在風險；2) 本發明所述的FX活化劑藥物組合物或製劑方案，採用FX活化劑作為單一活性成分，因此有效成分及其含量明確，此外，蔗糖和/或海藻糖純度高且來源廣、便於長期批量生產、也便於控制成本及提高產品品質；3) 本發明所述的FX活化劑藥物組合物或製劑方案可確保FX活化劑在製備、運輸和儲存過程中保持良好的穩定性，不溶性顆粒含量低，並且具有更好的臨床用藥安全性和品質可控性；以及4) 本發明所述的FX活化劑藥物組合物或製劑方案不包含白蛋白且穩定性更高，用0.9%氯化鈉注射液複溶後，室溫下至少能保持穩定約8小時。
一方面，本發明提供凝血因子X活化劑（FX活化劑）藥物組合物，以下也稱為“FX活化劑藥物組合物”或“FX活化劑製劑”。在一些實施例中，所述FX活化劑藥物組合物（例如，凍乾的），其包含（或基本上由如下成分組成、或由如下成分組成）：i) FX活化劑（例如，RVV-X），其含量為0.1 U/mL至200 U/mL（例如，10 U/mL）；ii) 穩定劑（例如，蔗糖），其含量為2 mg/ml至100 mg/ml（例如，30 mg/ml）；iii) 緩衝劑（例如，組胺酸），其含量為0.1 mg/ml至50 mg/ml（例如，3 mg/ml）；iv) 表面活性劑（例如，聚山梨醇酯20），其含量為0.001% (w/v)至0.1% (w/v)（例如，0.02% (w/v)）；以及v) 賦形劑（甘露醇），其含量為1 mg/ml至100 mg/ml（例如，40 mg/ml）；其中，所述藥物組合物的pH值為6.0至8.0（例如，6.85）。在一些實施例中，所述FX活化劑是RVV-X。在一些實施例中，所述RVV-X是從圓斑蝰蛇的蛇毒中分離得到的。在一些實施例中，所述RVV-X包含：a) i) 重鏈，其包含序列SEQ ID NO: 1，或與SEQ ID NO: 1具有至少80%（例如，至少85%、88%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更多）序列同一性的序列；ii) 輕鏈1，其包含序列SEQ ID NO: 2，或與SEQ ID NO: 2具有至少80%（例如，至少85%、88%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更多）序列同一性的序列；以及iii) 輕鏈2，其包含序列SEQ ID NO: 3，或與SEQ ID NO: 3具有至少80%（例如，至少85%、88%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更多）序列同一性的序列；b) i) 重鏈，其包含序列SEQ ID NO: 1，或與SEQ ID NO: 1具有至少80%（例如，至少85%、88%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更多）序列同一性的序列；ii) 輕鏈1，其包含序列SEQ ID NO: 5，或與SEQ ID NO: 5具有至少80%（例如，至少85%、88%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更多）序列同一性的序列；以及iii) 輕鏈2，其包含序列SEQ ID NO: 3，或與SEQ ID NO: 3具有至少80%（例如，至少85%、88%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更多）序列同一性的序列；或c) a) 和b) 的混合物。
在一些實施例中，提供FX活化劑藥物組合物（例如，凍乾的），其包含（或基本上由如下成分組成、或由如下成分組成）：i) FX活化劑（例如，RVV-X），其含量為0.1 U/mL至100 U/mL；ii) 穩定劑（例如，蔗糖），其含量為15 mg/ml至60 mg/ml；iii) 緩衝劑（例如，組胺酸），其含量為2 mg/ml至50 mg/ml；iv) 表面活性劑（例如聚山梨醇酯20），其含量為0.005% (w/v)至0.05% (w/v)；以及v) 賦形劑（甘露醇），其含量為10 mg/ml至60 mg/ml；其中，所述藥物組合物的pH值為6.0至8.0。在一些實施例中，所述FX活化劑是RVV-X。在一些實施例中，所述RVV-X是從圓斑蝰蛇的蛇毒中分離得到的。
在一些實施例中，提供FX活化劑藥物組合物（例如，凍乾的），其包含（或基本上由如下成分組成、或由如下成分組成）：i) FX活化劑（例如，RVV-X），其含量為5 U/mL至100 U/mL；ii) 穩定劑（例如，蔗糖），其含量為30 mg/ml至50 mg/ml；iii) 緩衝劑（例如，組胺酸），其含量為2 mg/ml至15 mg/ml；iv) 表面活性劑（例如聚山梨醇酯20），其含量為0.01% (w/v)至0.05% (w/v)；以及v) 賦形劑（甘露醇），其含量為30 mg/ml至60 mg/ml；其中，所述藥物組合物的pH值為6.3至7.3。在一些實施例中，所述FX活化劑是RVV-X。在一些實施例中，所述RVV-X是從圓斑蝰蛇的蛇毒中分離得到的。
在一些實施例中，提供FX活化劑藥物組合物（例如，凍乾的），其包含（或基本上由如下成分組成、或由如下成分組成）：i) FX活化劑（例如，RVV-X），其含量為5 U/mL至50 U/mL；ii) 穩定劑（例如，蔗糖），其含量為30 mg/ml至50 mg/ml；iii) 緩衝劑（例如，組胺酸），其含量為3 mg/ml至5 mg/ml；iv) 表面活性劑（例如聚山梨醇酯20），其含量為0.01% (w/v)至0.03% (w/v)；以及v) 賦形劑（甘露醇），其含量為30 mg/ml至60 mg/ml；其中，所述藥物組合物的pH值為6.8至7.0。在一些實施例中，所述FX活化劑是RVV-X。在一些實施例中，所述RVV-X是從圓斑蝰蛇的蛇毒中分離得到的。
在一些實施例中，提供FX活化劑藥物組合物（例如，凍乾的），其包含（或基本上由如下成分組成、或由如下成分組成）：i) FX活化劑（例如，RVV-X），其含量為5 U/mL、10 U/mL、20 U/mL、30 U/mL、40 U/mL或50 U/mL；ii) 穩定劑（例如，蔗糖），其含量為30 mg/ml至50 mg/ml；iii) 緩衝劑（例如，組胺酸），其含量為3 mg/ml至5 mg/ml；iv) 表面活性劑（例如聚山梨醇酯20），其含量為0.01% (w/v)至0.03% (w/v)；以及v) 賦形劑（甘露醇），其含量為30 mg/ml至60 mg/ml；其中，所述藥物組合物的pH值為6.8至7.0（例如，6.85）。在一些實施例中，所述FX活化劑是RVV-X。在一些實施例中，所述RVV-X是從圓斑蝰蛇的蛇毒中分離得到的。
在一些實施例中，提供FX活化劑藥物組合物（例如，凍乾的），其包含（或基本上由如下成分組成、或由如下成分組成）：i) FX活化劑（例如，RVV-X），其含量為5 U/mL至50 U/mL；ii) 穩定劑（例如，蔗糖），其含量為30 mg/ml、40 mg/ml或50 mg/ml；iii) 緩衝劑（例如，組胺酸），其含量為3 mg/ml至5 mg/ml；iv) 表面活性劑（例如聚山梨醇酯20），其含量為0.01% (w/v)至0.03% (w/v)；以及v) 賦形劑（甘露醇），其含量為30 mg/ml至60 mg/ml；其中，所述藥物組合物的pH值為6.8至7.0（例如，6.85）。在一些實施例中，所述FX活化劑是RVV-X。在一些實施例中，所述RVV-X是從圓斑蝰蛇的蛇毒中分離得到的。
在一些實施例中，提供FX活化劑藥物組合物（例如，凍乾的），其包含（或基本上由如下成分組成、或由如下成分組成）：i) FX活化劑（例如，RVV-X），其含量為5 U/mL至50 U/mL；ii) 穩定劑（例如，蔗糖），其含量為30 mg/ml至50 mg/ml；iii) 緩衝劑（例如，組胺酸），其含量為3 mg/ml、4 mg/ml或5 mg/ml；iv) 表面活性劑（例如聚山梨醇酯20），其含量為0.01% (w/v)至0.03% (w/v)；以及v) 賦形劑（甘露醇），其含量為30 mg/ml至60 mg/ml；其中，所述藥物組合物的pH值為6.8至7.0（例如，6.85）。在一些實施例中，所述FX活化劑是RVV-X。在一些實施例中，所述RVV-X是從圓斑蝰蛇的蛇毒中分離得到的。
在一些實施例中，提供FX活化劑藥物組合物（例如，凍乾的），其包含（或基本上由如下成分組成、或由如下成分組成）：i) FX活化劑（例如，RVV-X），其含量為5 U/mL至50 U/mL；ii) 穩定劑（例如，蔗糖），其含量為30 mg/ml至50 mg/ml；iii) 緩衝劑（例如，組胺酸），其含量為3 mg/ml至5 mg/ml；iv) 表面活性劑（例如聚山梨醇酯20），其含量為0.01% (w/v)、0.02% (w/v)或0.03% (w/v)；以及v) 賦形劑（甘露醇），其含量為30 mg/ml至60 mg/ml；其中，所述藥物組合物的pH值為6.8至7.0（例如，6.85）。在一些實施例中，所述FX活化劑是RVV-X。在一些實施例中，所述RVV-X是從圓斑蝰蛇的蛇毒中分離得到的。
在一些實施例中，提供FX活化劑藥物組合物（例如，凍乾的），其包含（或基本上由如下成分組成、或由如下成分組成）：i) FX活化劑（例如，RVV-X），其含量為5 U/mL至50 U/mL；ii) 穩定劑（例如，蔗糖），其含量為30 mg/ml至50 mg/ml；iii) 緩衝劑（例如，組胺酸），其含量為3 mg/ml至5 mg/ml；iv) 表面活性劑（例如聚山梨醇酯20），其含量為0.01% (w/v)至0.03% (w/v)；以及v) 賦形劑（甘露醇），其含量為30 mg/ml、40 mg/ml、50 mg/ml或60 mg/ml；其中，所述藥物組合物的pH值為6.8至7.0（例如，6.85）。在一些實施例中，所述FX活化劑是RVV-X。在一些實施例中，所述RVV-X是從圓斑蝰蛇的蛇毒中分離得到的。
在一些實施例中，提供FX活化劑藥物組合物（例如，凍乾的），其包含（或基本上由如下成分組成、或由如下成分組成）：i) RVV-X，其含量為10 U/mL；ii)蔗糖，其含量為30 mg/ml；iii) 組胺酸，其含量為3 mg/ml；iv) 聚山梨醇酯20，其含量為0.02% (w/v)；以及v)甘露醇，其含量為40 mg/ml；其中，所述藥物組合物的pH值為6.85（以下也稱“先導製劑”或“RVV-X先導製劑”）。在一些實施例中，所述RVV-X是從圓斑蝰蛇的蛇毒中分離得到的。在一些實施例中，所述RVV-X包含：a) i) 重鏈，其包含序列SEQ ID NO: 1；ii) 輕鏈1，其包含序列SEQ ID NO: 2；以及iii) 輕鏈2，其包含序列SEQ ID NO: 3；b) i) 重鏈，其包含序列SEQ ID NO: 1；ii) 輕鏈1，其包含序列SEQ ID NO: 5；以及iii) 輕鏈2，其包含序列SEQ ID NO: 3；或c) a) 和b) 的混合物。
在一些實施例中，所述藥物組合物為凍乾製劑（例如，注射粉劑）。在一些實施例中，所述藥物組合物為水溶液。
可藉由將凍乾FX活化劑藥物組合物溶解在稀釋液中使蛋白質分散在整個溶液中以製備複溶製劑。適用於本發明的示例性藥學上可接受的（對人施用安全且無毒）稀釋液包括，但不限於，無菌水、注射用抑菌水（BWFI）、pH緩衝溶液（例如，磷酸鹽緩衝鹽水）、無菌鹽水溶液（例如，0.9% NaCl注射液）、葡萄糖注射液（例如，5%葡萄糖注射液）、林格氏溶液或葡萄糖溶液，或鹽和/或緩衝液的水溶液。
在一些實施例中，所述藥物組合物是無菌的。為了使藥物組合物用於體內給藥，它們必須是無菌的。所述藥物組合物可以通過無菌濾膜過濾使其無菌。通常將本文所述的藥物組合物放置在帶有無菌進入口的容器中，例如，具有可被皮下注射針刺穿的塞子的靜脈注射溶液袋或小瓶。
本文所述的藥物組合物還可能包含治療特定適應症所需的一種以上活性化合物，較佳地，具有互補活性且互不產生不利影響的化合物。此類分子在組合中的含量為對預期目的有效的量。
在一些實施例中，所述藥物組合物裝在一次性小瓶中，如一次性密封小瓶。在一些實施例中，所述藥物組合物裝在可多次使用的小瓶中。在一些實施例中，所述藥物組合物散裝在容器中。在一些實施例中，所述藥物組合物是冷凍保存的。
在一些實施例中，所述藥物組合物裝在一次性小瓶中。在一些實施例中，所述小瓶包含FX活化劑（例如，RVV-X），含量為1U至30U，如1U至5U、1U至10U、2U至18U、3U至15U或5U至10U中的任一。在一些實施例中，所述小瓶包含FX活化劑（例如，RVV-X），含量為5U。在一些實施例中，所述藥物組合物（例如，凍乾的）用2 mL 0.9%氯化鈉注射液複溶，用於給藥。
在一些實施例中，所述藥物組合物包含本文所述的FX活化劑（例如，RVV-X）的同質群體。同質群體表示FX活化劑彼此完全相同。在一些實施例中，藥物組合物中至少約70%（如至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%）的FX活化劑是同質的。
在一些實施例中，所述藥物組合物主要包含（或由如下成分組成）：如本文所述的FX活化劑（例如，RVV-X），以及可選的藥物可接受的載體。在一些實施例中，所述藥物組合物不包含任何宿主細胞（例如CHO）或非FX活化劑的動物（例如，蛇）蛋白。 凝血因子X活化劑（FX活化劑）
任何能從FX重鏈N端去除激活肽從而獲得激活的FXa形態的試劑都可以用作FX活化劑。在一些實施例中，本文所述的FX活化劑是一種蛋白活化劑，如作用於FX的具有蛋白水解特性的酶。在一些實施例中，所述FX活化劑可以是非蛋白質活化劑。
在一些實施例中，所述FX活化劑是從蛇的蛇毒中分離得到的，如屬於蝰蛇科和響尾科的蛇種，以及一些眼鏡蛇種。同時，可用於本發明的任何毒液來源的FX活化劑見於G. Tans和J. Rosing, “Snake venom activators of factor X: an overview” Haemostasis. 2001;31(3-6):225-33（其內容藉由整體引用併入本文）。在一些實施例中，所述FX活化劑是金屬蛋白酶。在一些實施例中，所述FX活化劑是絲胺酸蛋白酶。在一些實施例中，所述FX活化劑是RVV-X，如從圓斑蝰蛇（Daboia russellii siamensis）蛇毒中分離的RVV-X。在一些實施例中，所述FX活化劑可以藉由重組製備得到。
在一些實施例中，所述FX活化劑是野生的蛇毒來源的FX活化劑。在一些實施例中，所述FX活化劑是蛇毒來源的FX活化劑的天然變體。在一些實施例中，所述FX活化劑是蛇毒來源的FX活化劑的衍生物。在一些實施例中，所述FX活化劑是蛇毒來源的FX活化劑的功能片段。在一些實施例中，所述FX活化劑是蛇毒來源的FX活化劑的突變體。在一些實施例中，蛇毒來源的FX活化劑的功能片段或突變體形式保留了野生蛇毒來源的FX活化劑活性的至少約30%（如至少約40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或更多）。
在一些實施例中，所述藥物組合物（例如，凍乾的）包含FX活化劑（例如，RVV-X），含量為0.1 U/mL至200 U/mL，如0.1 U/mL至1 U/mL、1 U/mL至100 U/mL、5 U/mL至100 U/mL、5 U/mL至80 U/mL、10 U/mL至50 U/mL、1 U/mL至50 U/mL、5 U/mL至50 U/mL、5 U/mL至20 U/mL、5U/mL至10 U/mL、1 U/mL至30 U/mL或5 U/mL至15 U/mL。在一些實施例中，所述藥物組合物（例如，凍乾的）包含FX活化劑（例如，RVV-X），含量為0.1 U/mL、0.5 U/mL、1 U/mL、5 U/mL、10 U/mL、20 U/mL、30 U/mL、40 U/mL、50 U/mL、60 U/mL、70 U/mL、80 U/mL、90 U/mL或100 U/mL，如10 U/mL。同時，關於活性單位（U）的測定見於下文“生物活性”小結。 [凝血因子X（FX）及激活的FX（FXa）]
FX或FX多肽是一種絲胺酸蛋白酶多肽，在激活狀態下對凝血酶原表現出催化活性（即促凝血活性）。FX是一種絲胺酸蛋白酶，是凝血途徑的一部分，特別是共同凝血途徑中的第一個絲胺酸蛋白酶。在細胞中，FX由前體多肽（precursor）加工產生含有前肽（propeptide）的多肽，該前肽最終被切割以產生缺少訊號序列和前肽的成熟FX多肽。分泌的FX多肽是一種雙鏈多肽。活化的FXa缺少激活肽。FXa是FX的一種形式，表現出催化活性，活化的FX（FXa）與其輔因子Va結合後，催化活性大大提高。還可藉由加入Ca2+和磷脂而增強FXa的活性。可以引入突變使FXa形式發生酶原樣形式（zymogen-like）的構象變化，當FVa輔因子存在時，FXa處於完全激活狀態，對凝血酶原表現出催化活性。本文所提及的FX或FX多肽包括其所有形式，包括前體（precursor）、單鏈和雙鏈形式，包括成熟形式、酶原形態。
FX可以來自任何有機體，如哺乳動物，包括但不限於家畜（例如，牛、綿羊、山羊、貓、狗、驢和馬）、靈長類動物（例如，人類和非人類靈長類動物，如猴子或黑猩猩）、兔子和齧齒動物（例如，小鼠、大鼠、沙鼠和倉鼠）。FX也可藉由重組或合成的方法製備。在一些實施例中，FX是重組FX（rFX），如重組小鼠FX（rmFX）或重組人FX（rhFX）。
在一些實施例中，FX是人FX多肽（如野生型人FX），包括前體多肽（488aa）及其單鏈和雙鏈形式，包括成熟形式（448aa）和酶原形式。其人酶原形式是一種雙鏈形式，包含139個胺基酸的輕鏈和306個胺基酸的重鏈。人FXa形式是一種雙鏈形式，包含139個胺基酸的輕鏈和254個胺基酸的重鏈。
所述的FX還包括其變體，如等位基因變體和物種變體，由剪接變體編碼的變體以及其他變體，包含與前體多肽（例如，人前體FX）或成熟形式或酶原形式具有至少約40%、45%、50%、55%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更多的序列同一性的多肽。這種變體表現出一種或多種FX活性，包括但不限於FVa結合、催化活性、凝血酶原結合、凝血酶活性和/或凝血活性。與天然或野生型FX的活性相比，其活性可能減少或增加。例如，FX多肽變體表現出天然或野生型FX多肽活性的至少約20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、110%、120%、130%、140%、150%、160%、170%、180%、190%、200%或更多。
前體FX多肽是指一種非分泌型的FX多肽，其包含一個用於分泌該蛋白的N端訊號肽（signal peptide）和一個前肽（propeptide）。訊號肽在內質網中被切掉。
“前區（proregion）”、“前肽（propeptide）”或“前序列（pro-sequence）”是指可被切割從而產生成熟蛋白的區域或片段。前區是位於成熟生物活性多肽的胺基酸末端的胺基酸序列，可以只有幾個胺基酸，也可以是多域結構。對於FX多肽，前肽區域通常約為9個胺基酸，但可能根據物種的不同而不同（例如，更長或更短）。對於FX，前肽序列在蛋白質的轉譯後修飾中起作用，並在細胞分泌蛋白之前被切割。例如，前肽是內質網上維生素K依賴性羧化酶的γ-羧基化識別元件。該反應藉由將FX的Gla結構域中的谷胺酸殘基轉化為γ-羧基谷胺酸（Gla）而發生。這種修飾是血液中最理想的Ca 2+介導的酶原激活所必需的。例如，Gla殘基允許因子X/Xa以鈣依賴性方式結合磷脂（即細胞表面），這是凝血酶原複合物組裝的一個必要條件。
FX的前肽形式是一種缺少訊號肽但保留前肽的蛋白質。
“成熟的FX多肽”是指缺少訊號肽序列和前肽序列的FX多肽。在多肽分泌前，前肽在反式高爾基體中被蛋白水解切割去除。成熟的FX多肽通常是指在鏈內蛋白水解產生雙鏈多肽之前的單鏈形式的FX。
激活肽是存在於FX重鏈N端的片段，其功能是藉由掩蔽催化機制抑制蛋白水解活性，從而防止催化中間體的形成（即藉由構象封閉底物結合位點）。FX激活肽的示例是成熟人FX多肽重鏈N端的52個胺基酸殘基激活肽。
所述的“野生型”或“天然”FX是指由天然或自然產生的FX基因編碼的FX多肽，包括存在於自然界有機體的等位基因變體，包括人類和其他動物。當提及野生型或天然FXa多肽時，應理解為FXa多肽的活化的或有催化活性的部分。提及野生型因子X而不提及物種是為了涵蓋任何物種的野生型因子X。野生型FX多肽包括編碼的前體多肽、其片段及其經加工的形式，如缺少訊號肽和前肽的成熟形式，及其任何轉譯前或轉譯後加工或修飾過的形式。天然FX多肽也包括轉譯後修飾的多肽，包括但不限於糖基化、羧基化和羥基化修飾。天然FX多肽還包括雙鏈分泌型，包括酶原型和激活型，以及任何經加工的形式或其異構體。例如，人類表達天然FX。
物種變體是指存在於不同物種間的多肽變體，包括不同的哺乳動物物種，如小鼠和人類。等位基因變體是指存在於同一物種成員之間的蛋白質變體。剪接變體是指藉由對基因組DNA初級轉錄本的差異化加工產生的一種變體，該差異化加工可產生一種以上的mRNA。
因子X以非活躍狀態的前體在血液中循環，稱為酶原，需要蛋白水解來激活。與激活後產生的絲胺酸蛋白酶相比，酶原具有約10,000倍或更少的蛋白水解活性。
活化的FX（FXa）或激活的FX是指雙鏈形式的FX多肽，其重鏈不包含N端激活肽。FXa藉由裂解重鏈以去除激活肽而被激活。因此，FXa是一種異質二聚體，它由藉由二硫鍵連接的兩條鏈組成。對於人FX，其輕鏈的分子量為16000道爾頓（139 aa），重鏈的分子量為38000道爾頓（254 aa），構成絲胺酸蛋白酶結構域。人FX的激活是藉由Arg194-Ile195鍵斷裂，釋放激活肽而發生。激活是藉由外源性因子Xase複合物（因子VIIa/TF複合物）或內源性因子Xase複合物（FIXa/FVIIIa複合物）實現。激活通常需要磷脂和鈣離子存在。也可以藉由圓斑蝰蛇毒液（RVV-X）激活。FXa具有催化活性、FVa結合、肝素結合、凝血酶原結合、凝血酶原活性和/或凝血活性。為了本文的目的，提及的FXa是指任何缺少激活肽且能夠顯示FXa活性（如催化活性、FVa結合、肝素結合、凝血酶原結合、凝固酶活性和/或凝血活性）的FX雙鏈形式。提及的FXa包括酶原樣FXa多肽，在FVa飽和濃度條件下，表現出FXa活性。
FXa多肽的“催化活性部分”是指包含重鏈胺基酸的連續部分的FXa多肽，其包括催化三聯體殘基，但不包括重鏈的全序列。催化活性部分還可能包含FXa輕鏈的全部或部分。與全長FXa相比，FXa多肽的催化活性部分表現出至少約1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或更多的活性，如至少約120%、130%、140%、150%、200%、300%、400%、500%或更多的活性。本文所提及的修飾的FXa或其催化活性部分是指所述催化活性部分包含修飾（例如，胺基酸取代）。
FXa可繞過級聯中其它有缺陷的凝血因子，具有作為治療性促凝劑的潛力，但由於過度激活全身凝血，已證明直接使用全功能FX作為治療手段是不切實際的。直接使用FXa作為治療手段的另一個限制在於循環FXa的半衰期短，這是由於其被血漿蛋白酶抑制劑（如抗凝血酶（AT）III和蛋白C）快速滅活。 [圓斑蝰蛇蛇毒（RVV-X）]
圓斑蝰蛇蛇毒（RVV-X）是圓斑蝰蛇（Russell’s viper）或圓斑蝰蛇（ Daboia russelli）或圓斑蝰蛇（ Vipera russelli）（例如 Daboia russellii siamensis, Daboia russellii russellii）的蛇毒金屬蛋白酶，可特異性激活因子X（Takeya et al. (1992) J. Biol. Chem.,267:14109-14117）。RVV-X的分子量為79,000道爾頓，包含二硫鍵連接的重鏈和輕鏈。RVV-X激活因子X不需要磷脂，但需要外源的Ca 2+和胺基末端Gla結構域存在來增強激活。EDTA存在時，RVV-X的活性被抑制。純化的RVV-X製劑是已知且可用的（參見Catalog No. RVVX-2010, Haematologic Technologies, Inc.; Catalog No. ab62233, Abcam, Cambridge, Mass.），且其序列是已知的（參見Takeya et al. (1992) J. Biol. Chem.,267:14109-14117 and Uniprot No. Q7LZ61, Q4PRD1 and Q4PRD2）。RVV-X與FX的Gla結構域結合並切除FX的重鏈。來自其他蛇毒的金屬蛋白酶FX活化劑可能具有相似的催化機制，因為它們的結構類似於RVV-X。
RVV-X包含3條多肽鏈：一條包含催化結構域的重鏈，兩條與C型凝集素同源的輕鏈，認為所述輕鏈在Ca 2+依賴性的FX激活中發揮調節作用。在一些實施例中，RVV-X包含：a) i) 重鏈（RVV-XH或α鏈），其包含序列SEQ ID NO: 1，或與SEQ ID NO: 1具有至少80%（例如，至少85%、88%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更多）序列同一性的序列；ii) 輕鏈1（RVV-XL1或γ鏈），其包含序列SEQ ID NO: 2，或與SEQ ID NO: 2具有至少80%（例如，至少85%、88%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更多）序列同一性的序列；以及iii) 輕鏈2（RVV-XL2或β鏈），其包含序列SEQ ID NO: 3，或與SEQ ID NO: 3具有至少80%（例如，至少85%、88%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更多）序列同一性的序列；b) i) 重鏈，其包含序列SEQ ID NO: 1，或與SEQ ID NO: 1具有至少80%（例如，至少85%、88%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更多）序列同一性的序列；ii) 輕鏈1，其包含序列SEQ ID NO: 5，或與SEQ ID NO: 5具有至少80%（例如，至少85%、88%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更多）序列同一性的序列；以及iii) 輕鏈2，其包含序列SEQ ID NO: 3，或與SEQ ID NO: 3具有至少80%（例如，至少85%、88%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更多）序列同一性的序列；或c) a) 和b) 的混合物。在一些實施例中，RVV-X包含：a) i) 重鏈，其包含序列SEQ ID NO: 1；ii) 輕鏈1，其包含序列SEQ ID NO: 2；以及iii) 輕鏈2，其包含序列SEQ ID NO: 3；b) i) 重鏈，其包含序列SEQ ID NO: 1；ii) 輕鏈1，其包含序列SEQ ID NO: 5；以及iii) 輕鏈2，其包含序列SEQ ID NO: 3；或c) a) 和b) 的混合物。當RVV-X包含SEQ ID NO: 2或5（或與SEQ ID NO: 2或5具有至少80%序列同一性的序列）的混合物作為γ鏈時，SEQ ID NO: 2（或與SEQ ID NO: 2具有至少80%序列同一性的序列）的γ鏈和SEQ ID NO: 5（或與SEQ ID NO: 5具有至少80%序列同一性的序列）的γ鏈可以是任何比例，如99.9:0.1、99:1、98:2、97:3、96:4、95:5、90:10、85:15、80:20、75:25、70:30、65:35、60:40、55:45、50:50、45:55、40:60、25:75、30:70、25:75、20:80、15:85、10:90、5:95、1:99、0.1:99.9，或兩者之間的任何比例。在一些實施例中，RVV-X包含（基本上由如下序列組成、或由如下序列組成）：i) 重鏈，其包含序列SEQ ID NO: 1；ii) 輕鏈1，其包含序列SEQ ID NO: 2；以及iii) 輕鏈2，其包含序列SEQ ID NO: 3。
在一些實施例中，所述RVV-X是野生型RVV-X。在一些實施例中，所述RVV-X是RVV-X的天然變體。在一些實施例中，所述RVV-X是RVV-X的類似物，如包含不超過約5個胺基酸（如4、3、2或1 aa）突變位點的RVV-X。在一些實施例中，所述RVV-X是RVV-X衍生物。在一些實施例中，所述RVV-X是糖基化的。在一些實施例中，所述RVV-X沒有糖基化。
如本文所用，術語“RVV-X的衍生物”是指具有RVV-X或RVV-X類似物的胺基酸序列的分子，但在一個或多個胺基酸基團、α碳原子、胺基末端或羧基末端上還具有額外的化學修飾。化學修飾包括但不限於，添加化學基團、生成新化學鍵和移除化學基團。胺基酸側基團的修飾包括但不限於賴胺酸的ε胺基醯基化，精胺酸、組胺酸或賴胺酸的N-烷基化，谷胺酸或天冬胺酸的羧基烷基化，穀胺醯胺或天冬醯胺的脫胺。胺基末端的修飾包括但不限於脫胺、N-低烷基，N-二低烷基和N-醯基修飾。羧基末端的修飾包括但不限於醯胺、低烷基醯基、二烷基醯胺和低烷基酯修飾。在一些實施例中，低烷基基團為C1-C4烷基基團。此外，一個或多個側基或末端基團可以由化學領域的技術人員利用已知的保護基團來保護。胺基酸的α碳可以是單甲基化或二甲基化。
在一些實施例中，所述RVV-X是修飾的RVV-X，如聚乙二醇化的RVV-X，或共價修飾的RVV-X。
提及的RVV-X還包括野生型RVV-X的功能片段。在一些實施例中，所述RVV-X是突變的RVV-X，如在野生型RVV-X的一條或多條多肽鏈上包含一個或多個突變（例如，胺基酸插入、缺失、取代和截段）。當用作本文中FX活化劑時，野生型RVV-X的功能性片段或其突變形式保留野生型RVV-X活化劑FX至少30%（如至少40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或更多）的活性。
本文所述的FX活化劑（例如，RVV-X）的胺基酸序列變體可以藉由將適當的修飾引入編碼該蛋白質的核酸序列或藉由多肽合成來製備。所述修飾包括，例如，在FX活化劑（例如，RVV-X）的胺基酸序列中進行殘基的缺失和/或插入和/或取代。可以藉由缺失、插入和取代的任何組合來獲得最終的構建體，只要最終構建體具有預期的特性，例如保持/提高（例如，增加至少1.2倍）FX激活，保持/延長半衰期，減少（例如，減少至少1.2倍）FX激活（如減少全身凝血過度活化）等。
在一些實施例中，所述FX活化劑（例如，RVV-X）具有一個或多個保守的胺基酸取代。“保守取代”是指被另一胺基酸所取代，所述另一胺基酸與被取代胺基酸帶有相同的淨電荷和大致相同的大小和形狀。當側鏈上的碳原子和雜原子總數相差不超過4個時，帶有脂肪族或取代脂肪族胺基酸側鏈的胺基酸大小大致相同。當其側鏈上的分支數相差不超過1個時，胺基酸的形狀大致相同。在側鏈上具有苯基或取代苯基的胺基酸，可以認為其大小和形狀大致相同。除非另有說明，保守取代較佳應用天然胺基酸。
表 A所示為保守型取代。在表A“取代示例”標題下提供了更多實質性取代，如下文關於胺基酸側鏈類別部分進一步詳述。胺基酸可以根據常見的側鏈性質分類：(1) 疏水性：正亮胺酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；(2) 中性親水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；(3) 酸性：Asp、Glu；(4) 鹼性：His、Lys、Arg；(5) 影響鏈方向的殘基：Gly、Pro；(6) 芳香族：Trp、Tyr、Phe。非保守型取代需要將這些類別中的一個成員替換為另一類別的成員。可以將胺基酸取代引入到蛋白質構建體中，並篩選符合上文所述所需活性的產品。 [表A 胺基酸取代]
原始殘基 取代示例 較佳取代 原始殘基 取代示例 較佳取代
Ala (A) Val; Leu; Ile Val Leu (L) Norleucine; Ile; Val; Met; Ala; Phe Ile
Arg (R) Lys; Gln; Asn Lys Lys (K) Arg; Gln; Asn Arg
Asn (N) Gln; His; Asp, Lys; Arg Gln Met (M) Leu; Phe; Ile Leu
Asp (D) Glu; Asn Glu Phe (F) Trp; Leu; Val; Ile; Ala; Tyr Tyr
Cys (C) Ser; Ala Ser Pro (P) Ala Ala
Gln (Q) Asn; Glu Asn Ser (S) Thr Thr
Glu (E) Asp; Gln Asp Thr (T) Val; Ser Ser
Gly (G) Ala Ala Trp (W) Tyr; Phe Tyr
His (H) Asn; Gln; Lys; Arg Arg Tyr (Y) Trp; Phe; Thr; Ser Phe
Ile (I) Leu; Val; Met; Ala; Phe; Norleucine Leu Val (V) Ile; Leu; Met; Phe; Ala; Norleucine Leu
如本文所用，廣義的“胺基酸”既包括天然存在的胺基酸，也包括非天然存在的胺基酸，包括胺基酸類似物和衍生物。後者包括含有胺基酸部分的分子。根據這一寬泛的定義，本領域的技術人員會發現，本文所述胺基酸包括，例如，形成蛋白質的天然L-胺基酸；D-胺基酸；化學修飾的胺基酸，如胺基酸類似物和衍生物；不形成蛋白質的天然胺基酸，如正亮胺酸、β-丙胺酸、鳥胺酸、GABA等；以及本領域已知的具有胺基酸特徵的化學合成的化合物。如本文所用，術語“蛋白質形成”是指可以藉由代謝途徑合成細胞的肽、多肽或蛋白質的胺基酸。
將包括合成的非天然胺基酸、取代胺基酸或一種或多種D-胺基酸在內的非天然胺基酸插入到本發明的FX活化劑（例如，RVV-X）中可具有多種益處。與含有L-胺基酸的多肽相比，含有D-胺基酸的多肽等在體外和體內表現出更高的穩定性。因此，當需要更好的細胞內穩定性時，如藉由加入D-胺基酸進行多肽的構建是特別有用的。特別是D-肽和其類似物對內源性肽酶和蛋白酶活性有抗性，從而在需要時提高分子的生物有效性並延長其在體內的壽命。此外，D-肽和其類似物不能被有效加工，這是由於II型主要組織相容性複合體（MHC）呈遞給輔助T細胞的過程受限，因此不易在受試者中誘導體液免疫反應。
在一些實施例中，所述FX活化劑（例如，RVV-X）是重組表達的，如在原核細胞（例如，大腸桿菌）或真核細胞（例如，CHO細胞）中。
在一些實施例中，所述FX活化劑（例如，RVV-X）是從圓斑蝰蛇的蛇毒中分離的和/或純化的。在一些實施例中，所述RVV-X是如CN109943554B所述分離的和/或純化的（其內容藉由整體引用併入本文）。在一些實施例中，所述RVV-X是無菌的和/或經病毒滅活的。在一些實施例中，所述RVV-X的純化包括一個或多個病毒滅活、陰離子交換層析、超濾、羥基磷灰石（HA）層析（HAC）和尺寸排阻層析(SEC)的步驟。在一些實施例中，分離和/或純化後的RVV-X的純度至少95%（如至少96%、96.5%、97%、97.5%、98%、98.5%、99%、99.5%或100%）。例如，在一些實施例中，使用高效液相層析（HPLC）測量的分離和/或純化後的RVV-X的純度至少約98%。在一些實施例中，使用SDS-PAGE測量的分離和/或純化後的RVV-X的純度至少98%（例如100%）。在一些實施例中，分離和/或純化後的RVV-X的生物活性至少為2×10 4U/mg（如至少為2.5×10 4U/mg、2.7×10 4U/mg、2.9×10 4U/mg、3×10 4U/mg、4×10 4U/mg、5×10 4U/mg、1×10 5U/mg、1×10 6U/mg或更多）。 [穩定劑]
在一些實施例中，所述藥物組合物（例如，凍乾的）包含穩定劑（例如，蔗糖），含量為0.1 mg/ml至100 mg/ml，如0.1 mg/ml至1 mg/ml、1 mg/ml至100 mg/ml、2 mg/ml至100 mg/ml、2 mg/ml至60 mg/ml、10 mg/ml至100 mg/ml、1 mg/ml至80 mg/ml、10 mg/ml至80 mg/ml、10 mg/ml至70 mg/ml、10 mg/ml至60 mg/ml、1 mg/ml至60 mg/ml、1 mg/ml至50 mg/ml、10 mg/ml至50 mg/ml、10 mg/ml至40 mg/ml、10 mg/ml至30 mg/ml、15 mg/ml至50 mg/ml、20 mg/ml至60 mg/ml、15 mg/ml至60 mg/ml、30 mg/ml至50 mg/ml、25 mg/ml至50 mg/ml或20 mg/ml至40 mg/ml。在一些實施例中，所述藥物組合物（例如，凍乾的）包含穩定劑（例如，蔗糖），含量為0.1 mg/ml、0.5 mg/ml、1 mg/ml、5 mg/ml、10 mg/ml、20 mg/ml、25 mg/ml、30 mg/ml、40 mg/ml、50 mg/ml、60 mg/ml、70 mg/ml、80 mg/ml、90 mg/ml或100 mg/ml。在一些實施例中，所述藥物組合物（例如，凍乾的）包含穩定劑（例如，蔗糖），含量為25 mg/ml、30 mg/ml、40 mg/ml或50 mg/ml，如30 mg/ml。
在一些實施例中，所述藥物組合物（例如，凍乾的）包含穩定劑（例如，蔗糖），含量為0.1 mM至300 mM，如0.1 mM至1 mM、1 mM至300 mM、1 mM至200 mM、1 mM至100 mM、10 mM至300 mM、10 mM至200 mM、10 mM至100 mM、50 mM至300 mM、50 mM至200 mM、50 mM至100 mM、50 mM至90 mM或70 mM至90 mM。在一些實施例中，所述藥物組合物（例如，凍乾的）包含穩定劑（例如，蔗糖），含量為87.64 mM。
在一些實施例中，所述穩定劑包含或是二糖。在一些實施例中，所述穩定劑是蔗糖和海藻糖的混合物。在一些實施例中，所述穩定劑是海藻糖。在一些實施例中，所述穩定劑是蔗糖。在一些實施例中，所述穩定劑是無水形式。在一些實施例中，所述穩定劑是水合形式，如二水合形式。
在一些實施例中，穩定劑可以保護蛋白質免於因凍乾而變性。在一些實施例中，穩定劑在凍乾過程中使用，由此產生的凍乾劑和組合物包含穩定劑。在一些實施例中，穩定劑使藥物組合物在暴露於應力（如升溫和/或輻射）條件下能夠免於降解。在一些實施例中，當藥物組合施用於損傷或出血部位時，穩定劑可增強藥物組合物的溶解能力。在一些實施例中，穩定劑提高了藥物組合物的可用的保質期。在一些實施例中，穩定劑給藥物組合物提供至少3個月的保質期（例如，至少6個月、1年、2年、3年或更長時間)。如本文所用，術語可用保質期是指藥物組合物在未放大或放大（如放大鏡或顯微鏡）觀察時未表現出可觀測的降解。
如本文所述，任何可提高藥物組合物的穩定性和/或延長保質期的試劑均可用作穩定劑。穩定劑的示例包括但不限於，甘胺酸、丙胺酸、谷胺酸、蛋胺酸、精胺酸、苯甲酸、檸檬酸、乙醇酸、乳酸、蘋果酸、馬來酸、多元醇（如山梨醇、甘露醇和海藻糖）、人血清白蛋白（HSA）、糖（如葡萄糖、果糖、半乳糖、麥芽糖、乳糖和蔗糖）、乙二胺四乙酸（EDTA）、二乙烯三胺五乙酸（DTPA）、羥乙基二胺三乙酸（HEDTA）、乙二醇雙-(2-胺基乙基)-N, N, N', N'-四乙酸（EGTA）、氮三乙酸（NTA）、金屬離子穩定劑和檸檬酸鹽。 [緩衝劑]
在一些實施例中，所述藥物組合物（例如，凍乾的）包含緩衝劑（例如，組胺酸），含量為0.1 mg/ml至50 mg/ml，如0.1 mg/ml至1 mg/ml、0.1 mg/ml至5 mg/ml、1 mg/ml至50 mg/ml、1 mg/ml至40 mg/ml、1 mg/ml至30 mg/ml、2 mg/ml至20 mg/ml、1 mg/ml至10 mg/ml、2 mg/ml至15 mg/ml、1 mg/ml至8 mg/ml、3 mg/ml至5 mg/ml、2.5 mg/ml至5 mg/ml或1 mg/ml至5 mg/ml。在一些實施例中，所述藥物組合物（例如，凍乾的）包含緩衝劑（例如，組胺酸），含量為0.1 mg/ml、0.5 mg/ml、1 mg/ml、2 mg/ml、2.5 mg/ml、3 mg/ml、4 mg/ml、5 mg/ml、10 mg/ml、20 mg/ml、30 mg/ml、40 mg/ml或50 mg/ml。在一些實施例中，所述藥物組合物（例如，凍乾的）包含緩衝劑（例如，組胺酸），含量為2.5 mg/ml、3 mg/ml、4 mg/ml或5 mg/ml，如3 mg/ml。
在一些實施例中，所述藥物組合物（例如，凍乾的）包含緩衝劑（例如，組胺酸），含量為0.5 mM至350 mM，如0.5 mM至1 mM、1 mM至300 mM、1 mM至200 mM、1 mM至100 mM、1 mM至50 mM、10 mM至50 mM、50 mM至300 mM、100 mM至300 mM、5 mM至40 mM、5 mM至30 mM、10 mM至30 mM或10 mM至20 mM。在一些實施例中，所述藥物組合物（例如，凍乾的）包含緩衝劑（例如，組胺酸），含量為19.33 mM。
與本發明相關的緩衝劑或緩衝液在所期望的終端應用時與蛋白質（如RVV-X）相容，在符合可接受的滲透壓的濃度下提供足夠的緩衝能力。與本發明相關的緩衝劑或緩衝液是惰性的、穩定的且其在或接近所需的pH值時具有最大緩衝能力。
根據本發明的各個方面和實施例，可以在凍乾溶液中使用多種緩衝劑。相同的緩衝液可用於複溶凍乾粉。緩衝劑包括但不限於，檸檬酸鹽、檸檬酸-磷酸鹽、磷酸鹽、乙酸鹽、琥珀酸鹽、酒石酸鹽、馬來酸鹽、HEPES、Tris、Bicine、甘胺酸、N-甘胺酸、碳酸鹽、雙甘胺酸、賴胺酸、精胺酸、組胺酸和/或它們的混合物。在一些實施例中，緩衝劑為乙酸鈉。在一些實施例中，緩衝劑包括組胺酸和精胺酸的一種或兩種。在一些實施例中，所述緩衝劑是組胺酸。
符合本發明的緩衝液可有效維持適宜的pH值。確切的最佳pH值將因蛋白質而異。因此，對於不同的蛋白質，不同的緩衝系統或多或少會優於其他另一個緩衝系統。然而，一般來說，首選的緩衝液在pH值為5至8或6至8範圍內是有效的，特別是在5.5至7.5範圍內。 [表面活性劑]
在一些實施例中，所述藥物組合物（例如，凍乾的）包含表面活性劑（例如，聚山梨醇酯20），含量為0.001% (w/v)至0.1% (w/v)，如0.001% (w/v)至0.01% (w/v)、0.005% (w/v)至0.05% (w/v)、0.005% (w/v)至0.01% (w/v)、0.01% (w/v)至0.1% (w/v)、0.01% (w/v)至0.05% (w/v)或0.01% (w/v)至0.03% (w/v)。在一些實施例中，所述藥物組合物（例如，凍乾的）包含表面活性劑（例如，聚山梨醇酯20），含量(w/v)為0.001%、0.005%、0.01%、0.02%、0.03%、0.04%、0.05%、0.06%、0.07%、0.08%、0.09%或0.1%。在一些實施例中，所述藥物組合物（例如，凍乾的）包含表面活性劑（例如，聚山梨醇酯20），含量為0.01% (w/v)、0.02% (w/v)或0.03% (w/v)，如0.02% (w/v)。
表面活性劑可藉由減少介面相互作用和防止蛋白質吸附，在製備和儲存期間使製劑穩定。表面活性劑可以幫助溶解蛋白質，並保護蛋白質免受振盪誘導的聚集，這使得製劑在暴露於剪切表面應力時，不會引起活性蛋白質變性。本文可以使用任何已知的表面活性劑。在一些實施例中，所述表面活性劑包括聚山梨醇酯和泊洛沙姆中的一種或兩者。在一些實施例中，所述表面活性劑選自聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80和泊洛沙姆188中的一種或多種。在一些實施例中，所述表面活性劑是聚山梨醇酯20（PS20）。
在一些實施例中，所述表面活性劑為非離子表面活性劑。非離子表面活性劑包括，但不限於聚山梨醇酯，聚山梨醇酯（Tween®）20、聚山梨醇酯（Tween®）80、聚山梨醇酯（Tween®）40、聚山梨醇酯（Tween®）60；多氧雜聚物，如泊洛沙姆184和188；PLURONIC ®多元醇；司盤類（例如，山梨聚糖）；乙氧基化物；脂肪醇乙氧基化物；烷基酚聚氧乙烯醚（例如，Triton X-100）；PLURONIC®多元醇；脂肪酸乙氧基化物；聚桂醇400；聚氧基40硬脂酸酯；聚氧乙烯氫化蓖麻油10、50和60；單硬脂酸甘油酯；蔗糖脂肪酸酯；甲基纖維素；羧甲基纖維素；以及其它乙烯/聚丙烯塊聚合物。非離子表面活性劑的存在範圍為約0.05 mg/ml至1.0 mg/ml，較佳0.07 mg/ml至0.2 mg/ml。
在一些實施例中，所述表面活性劑為離子表面活性劑，如陰離子表面活性劑（例如，十二烷基硫酸鈉（SDS），二丁酸二辛酯磺酸鈉，二辛基磺酸鈉）或陽離子表面活性劑（例如，苯紮氯銨，苄索氯銨）。
在FX活化劑組合物凍乾過程中，表面活性劑不僅可以減少在冷凍和脫水過程中由於冰水介面張力引起的冷凍和脫水變形，還可以在複水過程中，對活性成分起到潤濕劑和重折痕劑（heavy crease agent）的作用。本發明的發明者發現使用聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80和泊洛沙姆188中的至少一種作為表面活性劑，不僅具有較低的毒性，而且可以有效抑制FX活化劑在各種條件下的表面吸附和聚集，從而提高組合物的穩定性。 [賦形劑]
在一些實施例中，所述藥物組合物（例如，凍乾的）包含賦形劑（例如，甘露醇），含量為1 mg/ml至100 mg/ml，如1 mg/ml至50 mg/ml、10 mg/ml至80 mg/ml、10 mg/ml至60 mg/ml、5 mg/ml至50 mg/ml、20 mg/ml至50 mg/ml、30 mg/ml至60 mg/ml或30 mg/ml至50 mg/ml。在一些實施例中，所述藥物組合物（例如，凍乾的）包含賦形劑（例如，甘露醇），含量為1 mg/ml、5 mg/ml、10 mg/ml、20 mg/ml、30 mg/ml、40 mg/ml、50 mg/ml、60 mg/ml、70 mg/ml、80 mg/ml、90 mg/ml或100 mg/ml。在一些實施例中，所述藥物組合物（例如，凍乾的）包含賦形劑（例如，甘露醇），含量為30 mg/ml、40 mg/ml、50 mg/ml或60 mg/ml，如40 mg/ml。在一些實施例中，所述賦形劑是甘露醇。
在一些實施例中，所述藥物組合物（例如，凍乾的）包含賦形劑（例如，甘露醇），含量為5 mM至550 mM，如5 mM至50 mM、10 mM至500 mM、50 mM至400 mM、50 mM至300 mM、100 mM至500 mM、100 mM至400 mM、100 mM至300 mM、150 mM至400 mM、150 mM至300 mM、180 mM至250 mM或200 mM至220 mM。在一些實施例中，所述藥物組合物（例如，凍乾的）包含賦形劑（例如，甘露醇），含量為219.58 mM。
如本文所述的藥物組合物包含一種或多種賦形劑。賦形劑藉由防止施用部位的滲透性休克，從而減少藥物製劑/組合物引起的局部刺激。可以存在賦形劑以調節或維持組合物中液體的張力。當與帶電的生物大分子（如蛋白質）一起使用時，賦形劑可以與胺基酸側鏈的帶電基團相互作用，以減少分子間和分子內相互作用的可能性。考慮到其他成分的相對含量，賦形劑可以以0.1% - 25%的重量比存在，較佳1% - 5%。賦形劑的示例包括但不限於，糖醇或多元醇（如甘露醇或山梨糖醇）、非離子表面活性劑（如聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯40、聚山梨醇酯60、聚山梨醇酯80），以及糖（如蔗糖）。較佳的賦形劑包括多羥基糖醇，較佳為三羥基或更高的糖醇，如甘油、赤蘚糖醇、阿拉伯糖醇、木糖醇、山梨糖醇和甘露醇。 [pH]
在一些實施例中，所述藥物組合物的pH值為6.0至8.0，如6.3至7.3、6.8至7.0、6.0至7.0、7.0至8.0、6.5至7.5或6.5至7.0。在一些實施例中，所述藥物組合物的pH值為6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.85、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9或8.0。在一些實施例中，所述藥物組合物的pH值為6.8 ± 0.5。在一些實施例中，所述藥物組合物的pH值為6.8或6.85。 其他組分
藥物組合物中可採用在所用劑量和濃度下對接受者無毒的可接受的載體或賦形劑，包括抗氧化劑，包括抗壞血酸、蛋胺酸、維生素E、焦亞硫酸鈉；防腐劑（例如十八烷基二甲基苄基氯化銨；六甲基氯化銨；苯紮氯銨；苄索氯銨；苯酚；丁醇或苄醇；對羥基苯甲酸烷基酯，如對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯；鄰苯二酚；間苯二酚；環己醇；3-戊醇和間甲酚）；等滲劑（例如，氯化鈉）；金屬複合物（例如，鋅蛋白複合物）；低分子量（少於10個殘基）多肽；蛋白質，例如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；胺基酸，例如甘胺酸、穀胺醯胺、天冬醯胺、組胺酸、精胺酸或賴胺酸；單糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；有機糖或糖醇，如蔗糖、乳糖、乳糖醇、海藻糖、水蘇糖、甘露糖、山梨糖、木糖、核糖、核糖醇、肌醇、肌醇、半乳糖、半乳糖醇、甘油、環醇（例如，纖維醇)、聚乙二醇;含硫還原劑，如尿素、谷胱甘肽、硫辛酸、巰基乙酸鈉、硫甘油、α-單硫甘油和硫代硫酸鈉;成鹽反離子，如鈉；和/或螯合劑，如EDTA。
添加防腐劑可以延緩微生物的生長，其通常以0.2 %-1.0 % (w/v)的範圍存在。添加防腐劑可促進多次使用（多劑量）製劑的生產。適用於本發明的防腐劑包括十八烷基二甲基苄基氯化銨；六甲基氯化銨；苯紮氯銨（例如，氯化物、溴化物、碘化物）、苄索氯銨；硫柳汞、苯酚、丁醇或苄醇；對羥基苯甲酸烷基酯，如對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯；鄰苯二酚；間苯二酚；環己醇；3-戊醇和間甲酚。 [抗氧化劑]
在一些實施例中，所述藥物組合物進一步包含抗氧化劑，如蛋胺酸、硫代硫酸鈉、過氧化氫酶、鉑、維生素E、焦亞硫酸鈉等。在一些實施例中，所述抗氧化劑為蛋胺酸。在一些實施例中，所述抗氧化劑的含量為0.01 mg/ml至1 mg/ml，如0.01 mg/ml至0.05 mg/ml、0.01 mg/ml至0.1 mg/ml、0.1 mg/ml至1 mg/ml或0.05 mg/ml至1 mg/ml。在一些實施例中，所述抗氧化劑的含量為0.01 mg/ml、0.05 mg/ml、0.1 mg/ml、0.2 mg/ml、0.3 mg/ml、0.4 mg/ml、0.5 mg/ml、0.6 mg/ml、0.7 mg/ml、0.8 mg/ml、0.9 mg/ml或1 mg/ml。
抗氧化劑可以賦予蛋白製劑穩定性和/或抵抗自由基誘導的氧化或降解。由於一種或多種不利條件，可發生自由基氧化或降解，如暴露於光，包括紫外線、可見光和/或螢光燈，暴露於其他來源產生的自由基，和/或暴露於金屬離子。任何已知的抗氧化劑都可用於本文所述的藥物組合物中。
抗氧化劑也可選自由香草酸、沒食子酸、丁香酸、原兒茶酸、肉桂酸、香豆酸、咖啡酸、阿魏酸、芥子酸、綠原酸、苯甲酸、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸乙酯、對羥基苯甲酸丙酯、對羥基苯甲酸丁酯、間甲酚、苯氧乙醇、苯酚、胞嘧啶、硫胺素、吡啶醇、富馬酸、莽草酸、乙醇酸、對羥基苯甲酸、對胺基苯甲酸、兒茶素、表兒茶素、呋喃醇、磺胺苯酮、藥物上可接受的鹽或酯及其混合物組成的組中。 [鈣鹽]
在一些實施例中，所述藥物組合物進一步包含鈣鹽。在一些實施例中，所述鈣鹽為氯化鈣。在一些實施例中，所述鈣鹽的含量為0.1 mg/ml至10 mg/ml，如0.1 mg/ml至1 mg/ml、0.5 mg/ml至3 mg/ml、1 mg/ml至10 mg/ml、1 mg/ml至5 mg/ml、5 mg/ml至10 mg/ml。在一些實施例中，所述鈣鹽的含量為0.1 mg/ml、0.5 mg/ml、1 mg/ml、2 mg/ml、3 mg/ml、4 mg/ml、5 mg/ml、6 mg/ml、7 mg/ml、8 mg/ml、9 mg/ml或10 mg/ml在一些實施例中，所述鈣鹽的含量為1 mg/ml、3 mg/ml或10 mg/ml。
任何合適的鈣鹽均可用於本文，包括但不限於氯化鈣、磷酸鈣、醋酸鈣、檸檬酸鈣、碳酸鈣等。 [生物活性（bioactivity）]
如本文所用，“生物活性”（biological activity）是指化合物的體內活性，或由於在體內給予一種化合物、組合物或其他混合物而產生的生理反應。因此，生物活性包括這些化合物、組合物和混合物的治療效果和藥物活性。藉由設計用於測試或應用這些活性的體外系統，可以在上述體外系統中觀察到所述生物活性。因此，對於本文中的目的，FX多肽的生物活性包括凝血活性。
生物測定側重於測試蛋白的生物活性（例如，FX活化劑），並將其用作讀數。在生物測定中，樣品的活性在敏感樣品（例如，人血漿）或被測蛋白相關疾病（例如，出血性疾病）的動物模型/人上進行測試，並將該活性（例如，止血）的結果與對照（例如，其他止血劑）進行比較。FX活化劑其他方面的生物活性包括：(i) 激活FX和/或促進FXa產生；(ii) 增加凝血酶生成（TG）和/或內源性凝血酶生成潛力（ETP）；(iii) 縮短活化部分促凝血酶原激酶時間（APTT）、凝血酶原時間（PT）和/或凝血酶時間（TT）；(iv) 促進止血，如減少出血時間和/或出血量；(v) 降低死亡率；(vi) 促進傷口癒合等。
用於測定如本文所述的FX活化劑（例如，蛇毒來源的FX活化劑（例如，RVV-X））生物活性的各種體外或體內方法在是本領域已知的。FX活化劑活性的測量技術主要有兩種。一種是血漿凝固時間法，藉由測定血漿凝固時間，並與活性對照品的凝固時間進行比較，從而確定FX活化劑的活性。另一種是顯色底物連續速率法，藉由比較被測樣品與活性對照品的反應速率來確定FX活化劑的活性。參見J. Li et al.（“The activity determination of factor X activator from Vipera russelliby an enzyme rate method using chromogenic substrates,” Chinese Journal of New Drugs. 2007;16(18);1491-1495）和CN108089006B，其內容藉由整體引用併入本文。其普遍機制是：FX活化劑將無活性的FX轉化為具有水解活性的FXa，生成的FXa反過來水解合成的顯色底物Suc-Ile-Gly(γPip)Gly-Arg-pNA（SEQ ID NO: 4），水解底物可以釋放405nm處具有特徵吸收峰的對硝基苯胺。反應速率可以用單位時間內生成的產物（對硝基苯胺）的量來計算，酶活性與反應速率成正比。測試樣品（FX活化劑）的活性單位（U）可以參考活性對照品的反應速率來計算。除非另有說明，本文所述的FX活化劑（例如，RVV-X）的活性單位（U）採用如CN108089006B所述的顯色底物連續速率法來測量。
可對施用FX活化劑後得到的產物和/或中間體進行分析測試，如FX ELISA、TGA（凝血酶生成試驗）和FXa特異性活性試驗。儘管測定FXa的顯色底物對蛋白酶的特異性很強，但不是100%，因此，其他潛在靶點也會發生少量的裂解，尤其是在蛋白酶濃度較高的情況下。在存在交叉反應蛋白時，FXa特異性活性試驗仍可用於測定FXa。為了測定FXa特異性活性，可以使用FXa的高特異性抑制劑（即利伐沙班）測定抑制量，代表蛋白酶的特異性活性。可計算活化效率，並用加入到反應中的總FX產生的FXa的百分比表示。可根據製造商的操作說明書進行TGA，如使用Technothrombin® TGA試劑盒（Technoclone）。讀出參數為血凝酶峰值濃度（PTC），nM。
FX活化劑（例如，RVV-X）的生物活性也可用凝血儀測量，例如測定凝血時間。凝血測驗也可以用於評估受試者的凝血功能，反映FX活化劑的生物活性，如凝血酶原時間（PT；測量血液凝固的程度和時間），活化部分促凝血酶原激酶時間（aPTT；測量血液凝固的時間）和凝血酶時間（TT；測量纖維蛋白原的工作情況）。見於實施例1-3、6和10。 [穩定性]
所述藥物組合物較佳是穩定的，其中所含的蛋白質（FX活化劑，例如，RVV-X）在存儲時基本上保持其物理和化學穩定性和完整性。各種測量蛋白質穩定性的分析技術在本領域可用，並在 Peptide and Protein Drug Delivery,247-301, Vincent Lee Ed., Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., Pubs. (1991)和Jones, A. Adv. Drug Delivery Rev.10: 29-90 (1993)中進行了綜述。可以在選定的溫度、濕度、光照或其他條件下，在選定的時間段測量穩定性。為快速篩選，製劑可在40°C放置2周至1個月，此時測量穩定性。如果製劑要在2-8°C儲存，一般來說，該製劑應在30°C或40°C保持穩定至少1個月和/或在2-8°C保持穩定至少2年。如果製劑要在30°C儲存，一般來說，該製劑應在30°C保持穩定至少2年和/或在40°C保持穩定至少6個月。例如，儲存期間的聚集程度可作為蛋白質穩定性的指標。
在一些實施例中，本文所述的FX活化劑（例如，RVV-X）藥物組合物（例如，RVV-X先導製劑）具有卓越的穩定性，如物理穩定性、化學穩定性和/或生物穩定性。在一些實施例中，本文所述的FX活化劑藥物組合物具有卓越的熱穩定性。在一些實施例中，本文所述的FX活化劑藥物組合物在加速穩定性條件下（例如，25℃、RH 65%±5%；或25°C±2°C、RH 60%±5%）、長期儲存條件下（例如，2-8℃至少3個月）和/或應力條件下（例如，高溫（如40±2℃）、高濕（如2-8℃、RH 92.5%±5%）、光照（如2-8℃、4500±500LX）），具有優異的穩定性，如與使用HSA作為穩定劑的FX活化劑藥物組合物相比，較少或沒有碎片化、聚集體形成、不溶性顆粒（尤其是大於10μm的不溶性顆粒）和/或聚集增量。
蛋白質的穩定性，特別是對聚集的敏感性，主要取決於蛋白質分子的構象和膠體穩定性。一般認為，非天然蛋白質聚集的第一步，即最普遍的聚集形式，是分子結構的輕微擾動，例如，蛋白質的部分去折疊，即構象變化。這是由蛋白質的構象穩定性決定的。在第二步中，部分未折疊的分子在擴散和隨機布朗運動的驅動下靠近，形成聚集體。第二步主要由分子的膠體穩定性決定（見於Chi et al., Roles of conformational stability and colloidal stability in the aggregation of recombinant human granulocyte colony stimulating factor. Protein Science, 2003 May; 12(5): 903-913）。如本文所用，術語“穩定性”通常是指維持生物活性物質（如蛋白質）的完整性或儘量減少其降解、變性、聚集或去折疊。如本文所用，“改良的穩定性”通常意味著，在已知會導致降解、變性、聚集或去折疊的條件下，與對照組蛋白質（或對照藥物組合物中的相同蛋白）相比，目標蛋白質（或目標藥物組合物中的蛋白）保持更佳的穩定性。
差示掃描量熱法（DSC）和差示掃描螢光法（DSF）是本領域公知的技術，用於預測蛋白質製劑的穩定性。具體而言，這些技術可用於確定給定製劑中蛋白質的去折疊溫度（Tm）。將給定製劑中蛋白質的高Tm測量值與可用於長期、穩定儲存的更可靠和穩定的蛋白質製劑相關聯是本領域的標準做法。
一種“穩定的”蛋白質（或製劑），例如，本文所述的FX活化劑（例如，RVV-X）藥物組合物，基本上在製造過程中和/或儲存時保持其物理穩定性和/或化學穩定性和/或生物活性。本領域有多種用於測量蛋白質穩定性的分析技術，並在Peptide and Protein Drug Delivery, 247-301, Vincent Lee Ed., Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., Pubs. (1991)和Jones, A. (1993) Adv. Drug Delivery Rev. 10: 29-90中進行了綜述。例如，在一個實施例中，根據溶液中單體蛋白質的百分比確定蛋白質（或製劑）的穩定性，其中降解（例如，片段化）和/或聚集蛋白質的百分比較低。較佳地，蛋白質（或製劑）在室溫或40°C下穩定至少1個月和/或在2-8°C下穩定至少6個月，或至少1年或至少2年。此外，該蛋白質（或製劑）較佳在冷凍（例如，-70℃至-80℃）和融解後是穩定的，以下稱為“凍/融循環”。
一種蛋白質（或製劑），例如，本文所述的FX活化劑（例如，RVV-X）藥物組合物，如果在目視檢查（例如，顏色、飽滿度、平滑度、清晰度、貼壁性）或藉由紫外光散射或多角度光散射尺寸排除色譜法（SEC-MALS）、SEC、SEC-HPLC、反相色譜（RP-HPLC）或成像毛細管等電聚焦（iCIEF）測量時間，基本上沒有不穩定跡象，例如聚集、沉澱和/或變性，則這種蛋白質在製劑中“保持其物理穩定性”。聚集是單個蛋白質分子或複合物共價或非共價結合形成聚集體的過程。聚集可以進行到形成可見沉澱的程度。
一種蛋白質（或製劑），例如，本文所述的FX活化劑（例如，RVV-X）藥物組合物，如果在給定時間內的化學穩定性是該蛋白質仍然保持其生物活性（例如，如上文“生物活性”小節所述），則該蛋白質在製劑中“保持其化學穩定性”。化學穩定性可以藉由例如檢測和量化蛋白質的化學變化形式來評估。化學變化可能涉及尺寸改變（例如，剪切），可使用尺寸排阻色譜法（SEC）、SDS-PAGE（例如，還原或非還原）、毛細管電泳十二烷基硫酸鈉（CE-SDS，還原或非還原）和/或基質輔助雷射解吸電離/飛行時間質譜（MALDI/TOF MS）進行評估。其他類型的化學變化包括電荷變化（例如，由於脫醯胺或氧化而發生的變化），例如，可藉由離子交換色譜法進行評估。
一種蛋白質（或製劑），例如，本文所述的FX活化劑（例如，RVV-X）藥物組合物，如果藥物製劑中的蛋白質對於其預期目的具有生物活性，則該蛋白質在製劑中“保留其生物活性”。例如，如果製劑中蛋白質的生物活性的改變不超過在製備製劑時所顯示生物活性的30%、20%或10%（在分析誤差範圍內）內，則該蛋白保留了其生物活性。
本領域技術人員將理解蛋白質（例如，FX活化劑，如RVV-X）的穩定性除製劑的組成外還取決於其他特性。例如，穩定性可能受到溫度、應力、濕度、pH值、光照和外部輻射的影響。蛋白質製劑中蛋白質的穩定性可藉由多種方法確定。在一些實施例中，藉由SEC確定蛋白質穩定性。SEC根據分析物（例如，蛋白質等大分子）的流體力學尺寸、擴散係數和表面性質來分離分析物。因此，例如，SEC可將本文所述的天然三維構象的FX活化劑（例如，RVV-X）與處於各種變性狀態的蛋白質和/或已降解的蛋白質分離。在SEC中，固定相通常由填充在玻璃或鋼柱內緻密的三維琪質中的惰性顆粒組成。流動相可以是純水、水性緩衝液、有機溶劑、它們的混合物或其它溶劑。固定相顆粒具有小孔和/或通道，僅允許小於一定尺寸的物質進入。因此，大顆粒被排除在這些孔隙和通道之外，但較小顆粒從流動相中移除。顆粒被固定在固定孔隙中的時間在一定程度上取決於它們能滲透到孔隙中的深度。它們從流動相液流中移除會導致其從色譜柱中洗脫所需的時間更長，因此顆粒之間基於其大小差異而進行分離。
在一些實施例中，SEC與鑒定技術相結合，以鑒定或表徵蛋白質（例如，FX活化劑，如RVV-X）或其片段。蛋白質鑒定和表徵可藉由多種技術完成，包括但不限於色譜技術，例如高效液相色譜（HPLC）、十二烷基硫酸鈉毛細管電泳（CE-SDS）、免疫分析、電泳、紫外/可見/紅外光譜、拉曼光譜、表面增強拉曼光譜、質譜、氣相色譜、靜態光散射（SLS）、傅立葉變換紅外光譜（FTIR）、圓二色譜（CD）、尿素誘導蛋白質去折疊技術、固有色胺酸螢光、差示掃描量熱法和/或ANS蛋白結合。
在一些實施例中，在處理階段之前可選地對樣品製劑（例如，本文所述的FX活化劑藥物組合物，例如，蔗糖用作穩定劑）和對照製劑（例如，包含HSA作為穩定劑的FX活化劑藥物組合物或標準品）進行測定，以確定單體的含量，聚集體和/或片段化蛋白（和/或片段增加百分比，聚集體增加百分比等），如下文實施例6所述。隨後，每種蛋白質製劑都要經歷一個處理階段。例如，每種蛋白質製劑可在特定溫度（例如，40℃、25℃或5℃）下儲存較長時間（例如，3個月、6個月、12個月或更長）。在一些實施例中，對蛋白質製劑進行物理應力測試，如攪拌應力試驗。在一些實施例中，對所述蛋白質製劑進行複溶試驗或溶劑相容性試驗。在一些實施例中，對蛋白質製劑進行加速穩定性試驗，例如在加速應力下進行處理，包括高溫（例如，40℃或以上）、高濕、光照和/或低pH值等。在一些實施例中，對蛋白質製劑進行冷凍和融解循環。在一些實施例中，相同蛋白質製劑的樣品接受不同處理，例如，在不同溫度/濕度/光照下儲存一段時間。在處理階段之後，對蛋白質製劑進行測定，以確定蛋白質單體、聚集體和/或片段的含量（和/或片段增加百分比，聚集體增加百分比等）。也可以測定蛋白質製劑的物體外觀或pH值變化。
穩定性，例如組合物或製劑的物理穩定性，可藉由本領域公知的方法評估，包括測量樣品的表觀光衰減（吸光度或光密度）。這種光衰減的測量與製劑的渾濁度有關。製劑的渾濁度是溶解在溶液中的蛋白質的固有特性，通常藉由比濁法測定，並以比濁法濁度單位（NTU）測量。
濁度，例如，作為溶液中一種或多種成分濃度的函數，例如，蛋白質和/或鹽濃度，也指製劑的“乳白色”或“乳白色外觀”。濁度可以藉由使用已知濁度的懸浮液生成的標準曲線來計算。確定藥物組合物渾濁度的參考標準可基於歐洲藥典標準（歐洲藥典，第四版，歐洲委員會藥品品質理事會（EDQM），斯特拉斯堡，法國）。根據歐洲藥典標準，澄清溶液定義為濁度小於或等於對照懸浮液的溶液，所述對照懸浮液根據歐洲藥典標準的濁度約為3。在沒有關聯或非理想效應的情況下，濁度測量可以檢測瑞利散射，其通常隨濃度線性變化。用於評估藥物蛋白質的物理穩定性的其它方法在本領域是公知的，例如，尺寸排阻色譜法或分析性超速離心法。
在一些實施例中，穩定性是指包含本文所述的FX活化劑（例如，RVV-X）的製劑具有低至檢測不到的微粒形成水平，或低至檢測不到的直徑大於10 μm的微粒的形成水平。本文所用的短語“低至檢測不到的微粒形成水平”是指藉由HIAC分析、目視分析或根據《中國藥典》2015年版第四通則確定，含有小於2500個微粒/ml、2000個微粒/ml、1800個微粒/ml、1500個微粒/ml、1400個微粒/ml、1200粒/ml、1000個微粒/ml、950個微粒/ml、900個微粒/ml、700個微粒/ml、500個微粒/ml、400個微粒/ml、300個微粒/ml、200個微粒/ml、150個微粒/ml、120個微粒/ml、110個微粒/ml、100個微粒/ml、50個微粒/ml、30個微粒/ml、20個微粒/ml、15個微粒/ml、10個微粒/ml、5個微粒/ml或更少的樣品。在一些實施例中，本文所述的FX活化劑藥物組合物（例如，複溶後）具有不多於約350個不溶性微粒/mL，如不多於約200個或不多於約150個不溶性微粒/mL。在一些實施例中，本文所述的FX活化劑藥物組合物（例如，複溶後）在加速儲存條件下放置6個月後，具有不多於約2500個不溶性微粒/mL，如不多於約1500個或不多於約1000個不溶性微粒/mL。
“大量的蛋白質聚集”是指蛋白質製劑中的蛋白質聚集水平顯著高於對照蛋白質製劑中的蛋白質聚集水平。對照蛋白質製劑可以是儲存期之前或處理之前（例如，在經受不穩定條件之前，如升高的溫度、濕度、pH和/或長期儲存）的相同蛋白質製劑。對照蛋白質製劑可以是在相同條件下測試的不同蛋白質製劑（例如，使用HSA作為穩定劑的其他FX活化劑製劑）。
“基本無蛋白質聚集”是指本發明的蛋白質（或製劑），其蛋白質聚集的水平或百分比不顯著高於對照製劑。例如，該術語指蛋白質（或製劑）中的蛋白聚集水平低於15%、14%、13%、12%、11%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%、0.2%或0.1%。蛋白質聚集水平可使用本領域已知的標準技術來確定。在一些實施例中，本文所述的FX活化劑（例如，RVV-X）藥物組合物基本上無蛋白質聚集（例如，在加速穩定性試驗或長期儲存條件下）。在一些實施例中，FX活化劑（例如，RVV-X）藥物組合物（例如，複溶後）最多具有15%的蛋白質聚集，例如最多14%、13%、12%、11%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%或0.5%的蛋白質聚集（例如，加速穩定性試驗，反復凍/融（例如，直到5次）或長期儲存條件下）。在一些實施例中，本文所述的FX活化劑（例如，RVV-X）藥物組合物（例如，複溶後）沒有蛋白質聚集（例如，加速穩定性試驗，反復凍/融（例如，直到5次）或長期儲存條件下）。在一些實施例中， FX活化劑（例如，RVV-X）藥物組合物具有不超過15%的聚集體增加，例如不超過14%、13%、12%、11%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%或0.5%的聚集體增加（例如，加速穩定性試驗，反復凍/融（例如，直到5次）或長期儲存條件下）。在一些實施例中，藉由SEC或SEC-HPLS測量穩定性。在一些實施例中，藉由CE-SDS測量穩定性。
在一些實施例中，穩定性是指蛋白質片段化減少。本文所用的術語“低至檢測不到的片段水平”是指含有等於或大於80%、85%、90%、95%、98%或99%的總蛋白質的樣品，例如，在HPSEC測定的單峰中，或在還原毛細管凝膠電泳（rCGE）測定的多峰中（例如，與亞基數量相同的峰），代表未降解蛋白質或其未降解片段，且不含占總蛋白質的超過5%、超過4%、超過3%、超過2%、超過1%或超過0.5%的其它單峰。本文所用的術語“還原的毛細管凝膠電泳”是指在足以還原測試蛋白中二硫鍵的還原條件下進行的毛細管凝膠電泳。在一些實施例中，FX活化劑（例如，RVV-X）藥物組合物（例如，複溶後）具有0%至15%的片段，例如0%至12%的片段（例如，在加速穩定性試驗或長時間儲存條件下）。在一些實施例中，FX活化劑（例如，RVV-X）藥物組合物（例如，複溶後）具有不超過30%的片段，例如不超過29%、28%、27%、26%、25%、24%、23%、22%、21%、20%、19%、18%、17%、16%、15%、14%、13%、12%、11%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%或1%的片段（例如，在加速穩定性試驗或長時間儲存條件下）。在一些實施例中，FX活化劑（例如，RVV-X）藥物組合物（例如，複溶後）沒有片段（例如，在加速穩定性試驗或長時間儲存條件下）。在一些實施例中，FX活化劑（例如，RVV-X）藥物組合物（例如，複溶後）的片段增加不超過30%，如片段增加不超過29%、28%、27%、26%、25%、24%、23%、22%、21%、20%、19%、18%、17%、16%、15%、14%、13%、12%、11%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%或1%（例如，在加速穩定性試驗或長時間儲存條件下）。在一些實施例中，FX活化劑（例如，RVV-X）藥物組合物（例如，複溶後）具有至少75%的主峰，例如至少76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的主峰（例如，在加速穩定性試驗或長時間儲存條件下）。在一些實施例中，藉由SEC測量穩定性。在一些實施例中，藉由CE-SDS測量穩定性。
在一些實施例中，藥物組合物的“穩定性”或“穩定”特性包括外觀、水分含量、複溶時間、pH值和生物活性中的一種或多種。
在一些實施例中，凍乾後的FX活化劑（例如，RVV-X）藥物組合物的水分含量最多5%，如最多4.5%、4.0%、3.5%、3.0%、2.9%、2.8%、2.7%、2.6%、2.5%、2.4%、2.3%、2.2%、2.1%、2.0%、1.9%、1.8%、1.7%、1.6%、1.5%、1.4%、1.3%、1.2%、1.1%、1.0%、0.8%、0.5%或更少。在一些實施例中，凍乾後的FX活化劑（例如，RVV-X）藥物組合物的複溶時間最多30秒，如最多28、26、24、22、20、18、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3秒或更少。在一些實施例中，凍乾後的FX活化劑（例如，RVV-X）藥物組合物的收縮率最多10%（例如，與細膩/飽滿的粉末相比），如最多9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%或更少。在一些實施例中，凍乾的FX活化劑（例如，RVV-X）藥物組合物複溶後為無色澄明液體。在一些實施例中，凍乾的FX活化劑（例如，RVV-X）藥物組合物（例如，複溶後）pH改變（例如，如與凍乾前或有影響的儲存條件開始前相比，增加或較少）最多1，如最多0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2、0.1或更少（如0）。在一些實施例中，凍乾的FX活化劑（例如，RVV-X）藥物組合物（例如，複溶後）生物活性改變（例如，如與凍乾前或有影響的儲存條件開始前相比，增加或較少）最多30%，如最多25%、20%、19%、18%、17%、16%、15%、14%、13%、12%、11%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.9%、0.8%、0.7%、0.6%、0.5%、0.4%、0.3%、0.2%、0.1%或更少（如0）。在一些實施例中，上述特性適用於標準儲存條件（例如，複溶後2-8℃至少放置2小時）、高溫條件（例如至少35℃、36℃、38℃、40℃、42℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃或更高）、高濕度條件（例如，2-8℃，相對濕度（RH）至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、87.5%、90%、92.5%、97.5%或更高）、光照條件（例如，2-8℃，至少4000 lx、4200 lx、4400 lx、4500 lx、4600 lx、4800 lx、5000 lx、5500 lx或更高）、長期儲存條件（例如，2-8℃或低於-70℃放置至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、18、24、30、36個月或更長）、凍融條件（例如，-70℃/2-8℃凍融1、2、3、4、5或更多次）或加速儲存條件（例如，25℃ ± 2℃，RH至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、87.5%、90%、92.5%、97.5%或更高），如在相應儲存條件下放置至少2小時、4小時、6小時、8小時、10小時、12小時、16小時、18小時、24小時、2天、3天、4天、5天、6天、7天、10天、12天、14天、16天、20天、25天、30天、1個月、2個月、3個月、6個月、30個月或更長。在一些實施例中，FX活化劑（例如，RVV-X）藥物組合物（例如，複溶後）與有影響的儲存條件開始前相比（例如，高溫、高濕度、光照、長期儲存或加速），其生物活性增加最多20%（例如，最多15%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.9%、0.8%、0.7%、0.6%、0.5%、0.4%、0.3%、0.2%、0.1%或更少（如0%）），如在有影響的儲存條件下放置最多30個月內（例如，最多18個月、12個月、10個月、9個月、8個月、7個月、6個月、5個月、4個月、3個月、2個月、1個月、28天、20天、14天、10天、7天、5天、3天或1天）。
在一些實施例中，本文所述的FX活化劑（例如，RVV-X）藥物組合物可能包含少於10%（較佳少於5%）的在藥物組合物（例如，凍乾粉末複溶後）中以聚集體或不溶性顆粒形式存在的FX活化劑。在一些實施例中，所述藥物組合物為凍乾的。在一些實施例中，所述藥物組合物（例如，凍乾的）在25℃放置至少4個小時（如至少6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、36、48、60、72個小時或更長）是穩定的。在一些實施例中，所述藥物組合物（例如，凍乾的）在2-8℃（例如，2、3、4、5、6、7或8℃）放置至少3個月（如至少4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、36、48、60個月或更長）是穩定的。在一些實施例中，所述藥物組合物（例如，凍乾的）在25℃加速穩定性條件下至少3個月（如至少4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、36、48、60個月或更長）是穩定的。在一些實施例中，所述藥物組合物在25℃加速穩定性條件下儲存至少6個月（例如，至少8、10、12、14、16、18、20、22、24、36、48或更長）後，包含少於100個（例如，少於90、80、70、60、50、40、30、20或10）直徑大於10μm（例如，至少10、15、20、25、30 μm或更大）的不溶性微粒。在一些實施例中，凍乾的藥物組合物在2-8℃（例如，2、3、4、5、6、7或8℃）放置至少6個月（如至少9、10、12、14、16、18、20、22、24、36、48、60個月或更長），如至少30個月，是穩定的。在一些實施例中，凍乾的藥物組合物在25°C ± 2°C（例如，23、24、25、26或27℃）放置至少1個月（如至少2、3、4、5、6、10、12個月或更長），如至少6個月，是穩定的。例如，FX活化劑（例如，RVV-X）的生物活性改變（例如，如與長期或加速儲存條件開始前相比，增加或較少）最多10%（如最多9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2% 1%、0.9%、0.8%、0.7%、0.6%、0.5%、0.4%、0.3%、0.2%、0.1%或更少（如0%））；pH值改變（例如，如與長期或加速儲存條件開始前相比，增加或較少）最多0.5（如最多0.45、0.4、0.35、0.3、0.25、0.2、0.15、0.1、0.09、0.08、0.05、0.02、0.01或更少（如0））；或水分含量改變（例如，如與長期或加速儲存條件開始前相比，增加或較少）最多5%（如最多4%、3%、2% 1%、0.9%、0.8%、0.7%、0.6%、0.5%、0.4%、0.3%、0.2%、0.1%或更少（如0%））。
在一些實施例中，所述FX活化劑藥物組合物為非凍乾的。在一些實施例中，所述藥物組合物（例如，非凍乾的）在-70℃以下放置至少6個月（如至少8、10、12、14、16、18、20、22、24、36、48、60個月或更長），如至少24個月，是穩定的。在一些實施例中，所述藥物組合物（例如，非凍乾的）在2-8℃放置至少1個月（如至少2、3、4、5、6、8、10、12個月或更長），如至少6個月，是穩定的。在一些實施例中，所述藥物組合物（例如，非凍乾的）在凍/融至少1次後（如至少2、3、4、5、6、10次或更多），如高達5次後，是穩定的。例如，其蛋白含量改變（例如，如與長期、加速或凍/融儲存條件開始前相比，增加或較少）最多10%（如最多9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.9%、0.8%、0.7%、0.6%、0.5%、0.4%、0.3%、0.2%、0.1%或更少（如0%））；FX活化劑（例如，RVV-X）的生物活性改變（例如，如與長期、加速或凍/融儲存條件開始前相比，增加或較少）最多10%（如最多9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.9%、0.8%、0.7%、0.6%、0.5%、0.4%、0.3%、0.2%、0.1%或更少（如0%））；pH值改變（例如，如與長期、加速或凍/融儲存條件開始前相比，增加或較少）最多0.5（如最多0.45、0.4、0.35、0.3、0.25、0.2、0.15、0.1、0.09、0.08、0.05、0.02、0.01或更少（如0））；純度（例如，藉由SEC-HPLC測量）改變（例如，如與長期、加速或凍/融儲存條件開始前相比，增加或較少）最多10%（如最多9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.9%、0.8%、0.7%、0.6%、0.5%、0.4%、0.3%、0.2%、0.1%或更少（如0%））。
本文所述的FX活化劑（例如，RVV-X）藥物組合物可以用任何合適的溶劑複溶，如用於靜脈給藥的溶劑。在一些實施例中，所述溶劑為注射用無菌水、0.9%氯化鈉注射液或5%葡萄糖注射液。在一些實施例中，所述溶劑為0.9%氯化鈉注射液。在一些實施例中，所述FX活化劑（例如，RVV-X）藥物組合物複溶後在室溫儲存至少2小時（例如，至少3、4、5、6、7、8或更長）後，如8小時後，與複溶後0小時相比，其生物活性改變（例如，增加或減少）最多30%，如最多25%、20%、15%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2% 1%、0.9%、0.8%、0.7%、0.6%、0.5%、0.4%、0.3%、0.2%、0.1%或更少（如0%）。在一些實施例中，所述FX活化劑（例如，RVV-X）藥物組合物複溶後在室溫儲存至少2小時（例如，至少3、4、5、6、7、8或更長）後，如8小時後，與複溶後0小時相比，其pH值改變（例如，增加或減少）最多0.5，如最多0.45、0.4、0.35、0.3、0.25、0.2、0.15、0.1、0.09、0.08、0.05、0.02、0.01或更少（如0）。在一些實施例中，所述FX活化劑（例如，RVV-X）藥物組合物複溶後在室溫儲存至少2小時（例如，至少3、4、5、6、7、8或更長）後，如8小時後，與複溶後0小時相比，其滲透壓改變（例如，增加或減少）最多5%，如最多4%、3%、2% 1%、0.9%、0.8%、0.7%、0.6%、0.5%、0.4%、0.3%、0.2%、0.1%或更少（如0%）。在一些實施例中，所述FX活化劑（例如，RVV-X）藥物組合物（例如，複溶後）的滲透壓為80 mOsm/kg至450 mOsm/kg，如100 mOsm/kg至400 mOsm/kg、100 mOsm/kg至150 mOsm/kg、150 mOsm/kg至400 mOsm/kg、350 mOsm/kg至400 mOsm/kg、100 mOsm/kg至150 mOsm/kg、200 mOsm/kg至400 mOsm/kg、240 mOsm/kg至400 mOsm/kg、270 mOsm/kg至370 mOsm/kg、300 mOsm/kg至400 mOsm/kg、250 mOsm/kg至350 mOsm/kg、350 mOsm/kg至400 mOsm/kg、300 mOsm/kg至330 mOsm/kg或280 mOsm/kg至320 mOsm/kg。人血漿正常滲透壓約為280 mOsm/kg至320 mOsm/kg。在一些實施例中，所述FX活化劑（例如，RVV-X）藥物組合物（例如，複溶後）是等滲或基本等滲的，或在280 mOsm/kg至320 mOsm/kg範圍內變化50%（例如，40%、30%、20%、10%、5%或更低）以內。在一些實施例中，所述FX活化劑（例如，RVV-X）藥物組合物複溶後在室溫儲存至少2小時（例如，至少3、4、5、6、7、8或更長）後，如8小時後，保持無色透明液體。
在一些實施例中，所述FX活化劑（例如，RVV-X）藥物組合物（例如，凍乾的）的保質期至少15天，如至少20天、1個月、2個月、3個月、6個月、1年、2年、3年或更長，例如，在2-25°C，如2-8°C。如本文所用，“保質期”是指當藥物製劑在特定儲存條件下儲存時，例如2-8°C，藥物製劑中的活性成分如治療性蛋白質（例如，本文所述的FX活化劑）發生最小降解（例如，不超過5%降解，如不超過4%、3%，或2%降解）的儲存期。用於評估蛋白質或製劑穩定性的示例性技術包括尺寸排阻色譜SEC-HPLC以檢測，例如，聚集、反相液相色譜（RP）-HPLC以檢測，例如，蛋白質片段、離子交換HPLC以檢測，例如，蛋白質電荷變化、質譜、螢光光譜、圓二色（CD）光譜、傅立葉變換紅外光譜（FT-IR）和拉曼光譜以檢測蛋白質構象變化。所有這些技術均可單獨或組合使用，以評估藥物製劑中蛋白質的降解情況，並確定該製劑的保質期。在一些實施例中，當本發明的藥物製劑儲存在2-8°C時，至少15天（例如，至少20天、1個月、2個月、3個月、6個月、1年、2年、3年或更長的時間）表現出不超過5%（例如，不超過4%、3%、2%或1%）的降解（例如，片段化、聚集或去折疊）。 [III. 製備凝血因子X活化劑藥物組合物的方法]
本發明還提供製備本文所述的任何FX活化劑（例如，RVV-X）藥物組合物（例如，RVV-X先導製劑）的方法。在一些實施例中，提供製備FX活化劑（例如，RVV-X）藥物組合物的方法，包含使用本文所述的任何藥物組合物組分配製FX活化劑（例如，RVV-X）。在一些實施例中，所述方法進一步包含對所述藥物組合物進行凍乾。在一些實施例中，所述方法進一步包含複溶所述的凍乾的藥物組合物。在一些實施例中，製備所述藥物組合物的原液，然後根據需要進行稀釋。同時，見於實施例5、7和8。
在一些實施例中，提供製備FX活化劑（例如，RVV-X）藥物組合物（例如，RVV-X先導製劑）的方法，包含配製FX活化劑（例如，RVV-X），其含量為0.1 U/mL至200 U/mL（例如，約10 U/mL），帶有i) 穩定劑（例如，蔗糖），其含量為2 mg/ml至10 mg/ml（例如，約30 mg/ml）；ii) 表面活性劑（例如，組胺酸），其含量為0.1 mg/ml至50 mg/ml（例如，約3 mg/ml）；iii) 緩衝劑（例如，聚山梨醇酯20），其含量為0.001% (w/v)至0.1% (w/v)（例如，約0.02% (w/v)）；iv) 賦形劑（例如，甘露醇），其含量為1 mg/ml至100 mg/ml（例如，約40 mg/ml）；其中，所述藥物組合物的pH值為6.0至8.0（例如，約6.85）。在一些實施例中，所述FX活化劑是RVV-X。在一些實施例中，所述RVV-X是從圓斑蝰蛇的蛇毒中分離得到的。在一些實施例中，所述方法進一步包含對所述藥物組合物進行凍乾。
在一些實施例中，提供製備FX活化劑藥物組合物（例如，RVV-X先導製劑）的方法，包含配製FX活化劑RVV-X，其含量為10 U/mL，帶有i)蔗糖，其含量為30 mg/ml；ii)組胺酸，其含量為3 mg/ml；iii)聚山梨醇酯20，其含量為0.02% (w/v)；iv)甘露醇，其含量為40 mg/ml；其中，所述藥物組合物的pH值為6.85。在一些實施例中，所述RVV-X是從圓斑蝰蛇的蛇毒中分離得到的。在一些實施例中，所述方法進一步包含對所述藥物組合物進行凍乾。
本發明還提供編碼本文所述的任何FX活化劑（例如，RVV-X）的分離的核酸及包含所述核酸的載體。同時，提供包含編碼本文所述的任何FX活化劑（例如，RVV-X）的核酸和載體的分離的宿主細胞（例如， E. coli、CHO細胞、HEK 293細胞、Hela細胞或COS細胞）。在一些實施例中，所述分離的核酸進一步編碼在FX活化劑N末端的訊號肽序列（例如，每條RVV-X多肽鏈的N末端）。
在一些實施例中，包含編碼本文所述的任何FX活化劑（例如，RVV-X）的核酸的載體適於在真核細胞中複製和整合，如哺乳動物細胞（例如，CHO細胞、HEK 293細胞、Hela細胞、COS細胞）。在一些實施例中，所述載體是病毒載體。在一些實施例中，載體是非病毒載體。
已經開發出許多基於病毒的系統用於將基因轉移到哺乳動物細胞中。病毒載體的示例包括但不限於腺病毒載體、腺相關病毒載體、慢病毒載體、逆轉錄病毒載體、單純皰疹病毒載體及其衍生物。病毒載體技術是本領域公知的，例如，在Sambrook等（2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York）中，及其他病毒學和分子生物學手冊中均對其進行了詳述。逆轉錄病毒為基因傳遞系統提供了一個方便的平台。可使用本領域已知的技術將異源核酸插入載體並包裝在逆轉錄病毒微粒中。然後，可分離重組病毒並在體外或離體條件下將其輸送至工程哺乳動物細胞。許多逆轉錄病毒系統是本領域已知的。在一些實施例中，使用腺病毒載體。許多腺病毒載體是本領域已知的。在一些實施例中，使用慢病毒載體。在一些實施例中，使用自失活慢病毒載體。例如，攜帶構建體蛋白編碼序列的自失活慢病毒載體可以用本領域已知的實驗方法進行包裝。所得的慢病毒載體可用於使用本領域已知的方法轉導哺乳動物細胞。來自逆轉錄病毒（如慢病毒）的載體是實現長期基因轉導的合適工具，因為它們允許轉基因長期、穩定地整合並在子代細胞中的繁殖。慢病毒載體也具有低免疫原性，並且可以轉導非增殖細胞。
在一些實施例中，載體是非病毒載體。在一些實施例中，載體是轉座子，例如睡美人（SB）轉座子系統或PiggyBac轉座子系統。在一些實施例中，載體是基於聚合物的非病毒載體，包括，例如，聚（乳酸-羥基乙酸共聚物）（PLGA）和聚乳酸（PLA）、聚（乙烯亞胺）（PEI）和樹枝狀大分子。在一些實施例中，載體是基於陽離子脂質的非病毒載體，如陽離子脂質體、脂質奈米乳和固體脂質奈米粒（SLN）。在一些實施例中，載體是基於肽的非病毒基因載體，例如聚-L-賴胺酸。適用於基因組編輯的任何已知非病毒載體都可用於將編碼的核酸引入宿主細胞。參見Yin H. et al., Nature Rev. Genetics(2014) 15:521-555; Aronovich EL et al., “The Sleeping Beauty transposon system: a non-viral vector for gene therapy.” Hum. Mol. Genet. (2011) R1: R14-20和Zhao S. et al., “PiggyBac transposon vectors: the tools of the human gene editing.” Transl. Lung Cancer Res.(2016) 5(1): 120-125，藉由引用併入本文。在一些實施例中，藉由物理方法將編碼本文所述FX活化劑（例如，RVV-X）的任何一個或多個核酸或載體引入宿主細胞（例如，CHO、HEK 293、Hela或COS），包括但不限於電穿孔、聲穿孔、光穿孔、磁轉染、水穿孔。
在一些實施例中，所述載體包含可選擇的標記基因或報告基因，用於從載體（例如，慢病毒載體、pTT5載體）轉染的宿主細胞群中選擇出表達本文所述的FX活化劑（例如，RVV-X）的細胞。可選擇的標記和報告基因的側翼可具有適當的調控序列，以使其能夠在宿主細胞中表達。例如，載體可包含轉錄和轉譯終止子、起始序列和用於調節核酸序列表達的啟動子。
可使用本領域已知的任何分子克隆方法，包括，例如，使用限制性內切酶位點和一個或多個可選擇的標記將核酸克隆到載體中。在一些實施例中，核酸可操作地連接到啟動子上。已經開發出多種用於在原核細胞或真核細胞（例如，哺乳動物細胞）中進行基因表達的啟動子，並且本領域已知的任何啟動子都可用於本發明。啟動子大致可分為組成型啟動子或調控型啟動子，如誘導型啟動子。
在一些實施例中，編碼本文所述的FX活化劑（例如，RVV-X）的核酸可操作地連接到組成型啟動子上。組成型啟動子允許異源基因（也稱為轉基因）在宿主細胞中組成型表達。本文所考慮的啟動子示例包括但不限於CMV啟動子（CMV）、人類延伸因子-1α（hEF1α）、泛素C啟動子（UbiC）、磷酸甘油激酶啟動子（PGK）、猿猴病毒40早期啟動子（SV40）、雞β-肌動蛋白啟動子與CMV早期增強子（CAGG）偶聯，羅氏肉瘤病毒（RSV）啟動子、多瘤病毒增強子/單純皰疹胸苷激酶（MC1）啟動子、β肌動蛋白（β-ACT）啟動子、“骨髓增生性肉瘤病毒增強子、陰性對照區缺失、d1587rev引物結合位點取代（MND）”啟動子。大量研究中已廣泛比較了這些組成型啟動子在驅動轉基因表達方面的效率。
在一些實施例中，編碼本文所述的FX活化劑（例如，RVV-X）的核酸可操作地連接到誘導型啟動子。誘導型啟動子屬於調控型啟動子的範疇。誘導型啟動子可被一個或多個條件誘導，如物理條件、宿主細胞的微環境或宿主細胞的生理狀態、誘導劑（即誘導劑）或其組合物。在一些實施例中，誘導條件不誘導宿主細胞中內源性基因的表達。在一些實施例中，誘導條件選自：誘導劑、輻射（如電離輻射、光）、溫度（如熱）、氧化還原狀態和宿主細胞的激活狀態。在一些實施例中，誘導型啟動子可以是NFAT啟動子、TETON ®啟動子或NFκB啟動子。
適於表達本發明的蛋白質的原核宿主細胞包括古細菌和真細菌，如革蘭氏陰性菌或革蘭氏陽性菌。可用的細菌的示例包括大腸桿菌（例如，大腸桿菌）、桿菌（例如，枯草芽孢桿菌）、腸桿菌、假單胞菌（例如，銅綠假單胞菌）、鼠傷寒沙門氏菌、黏質沙雷氏菌、克雷伯菌、變形桿菌、志賀菌、根瘤菌、透明顫菌或副球菌。在一些實施例中，使用革蘭氏陰性細胞。在一些實施例中，大腸桿菌細胞作為本發明的宿主。大腸桿菌菌株的示例包括菌株W3110（Bachmann, Cellular and Molecular Biology, vol. 2 (Washington, D.C.: American Society for Microbiology, 1987), pp. 1190-1219; ATCC Deposit No. 27,325）及其衍生物，包括具有基因型W3110 AfhuA（AtonA）ptr3 lac Iq lacL8 AompT A（nmpc fepE）degP41 kan R的菌株33D3（U.S. Pat. No. 5,639,635)。其它菌株及其衍生物，如 E. coli294（ATCC 31446）、 E. coliB、 E. coli1776（ATCC 31537）和 E. coliRV308（ATCC 31608）也同樣適用。這些例子是說明性而非限制性。構建任何上述提及的已知基因型的細菌衍生物的方法在本領域已知，並在例如Bass et al., Proteins,8:309-314 (1990)中進行了詳述。考慮到複製子在細菌細胞中的可複製性，通常需要選擇合適的細菌。例如，當使用公知的質粒如pBR322、pBR325、pACYC177或pKN410來提供複製子時，大腸桿菌、沙雷氏菌或沙門氏菌適於用作宿主。
用於克隆或表達本文所述載體中的DNA的合適的真核宿主細胞包括脊椎動物宿主細胞。脊椎動物細胞的培養繁殖（組織培養）已成為常規程式。有用的哺乳動物宿主細胞系示例為SV40轉化的猴腎CV1系（COS-7，ATCC CRL 1651）；來源於猴腎組織的COS成纖維細胞樣細胞系；人類胚胎腎系（293或293細胞亞克隆，用於懸浮培養生長，Graham et al., J. Gen Virol.36:59 (1977)）；乳倉鼠腎細胞（BHK，ATCC CCL 10）；中國倉鼠卵巢細胞/−DHFR（CHO，Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA77:4216 (1980)）；小鼠塞爾托力氏細胞（TM4，Mather, Biol. Reprod.23:243-251 (1980)）；猴腎細胞（CV1 ATCC CCL 70）；非洲綠猴腎細胞（VERO-76，ATCC CRL-1587）；人宮頸癌細胞（HELA，ATCC-ccl2）；犬腎細胞（MDCK，ATCC-ccl34）；水牛-大鼠肝細胞（BRL 3A，ATCC CRL 1442）；人類肺細胞（W138，ATCC CCL 75）；人類肝細胞（Hep G2，HB 8065）；小鼠乳腺腫瘤（MMT 060562，ATCC CCL51）；TR1細胞（Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci.383:44-68 (1982)）；MRC5細胞；FS4細胞和人類肝癌細胞系（Hep G2）。
用上述表達載體或克隆載體轉化宿主細胞以產生蛋白質構建體，並在經改良以適合於誘導啟動子、選擇轉化子或擴增編碼所需序列的基因的常規營養培養基中進行培養。
同時，提供製備本文所述的任何FX活化劑（例如，RVV-X）的方法。因此，在一些實施例中，提供一種製備FX活化劑（例如，RVV-X）的方法，包括：(a) 在可有效表達編碼的FX活化劑的條件下，培養包含任何編碼本文所述的FX活化劑的核酸或載體的宿主細胞（例如，CHO細胞）；以及(b) 從所述宿主細胞獲得表達的FX活化劑。在一些實施例中，步驟(a) 的方法進一步包含產生宿主細胞，所述宿主細胞包含編碼本文所述的FX活化劑（例如，RVV-X）的核酸或載體。本文所述的FX活化劑（例如，RVV-X）可使用本領域已知的任何重組製備方法進行製備，或分離和/或純化（如從蛇毒中）。
在一些實施例中，所述FX活化劑（例如，RVV-X）是從蛇（如屬於蝰蛇科和響尾科的蛇種，以及一些眼鏡蛇種）的蛇毒中分離的和/或純化的。在一些實施例中，所述FX活化劑RVV-X是從圓斑蝰蛇蛇毒中分離的和/或純化的。在一些實施例中，所述FX活化劑（例如，RVV-X）是根據CN109943554B中所述的方法分離的和/或純化的。任何合適的蛋白質純化方法都可用於FX活化劑的純化，如離子交換柱分餾、乙醇沉澱、反相液相色譜HPLC、矽膠層析、肝素SEPHAROSE™色譜、陰離子或陽離子交換樹脂（如聚天冬胺酸柱）、色譜聚焦、SDS-PAGE和硫酸銨沉澱，取決於要回收的蛋白質構建體。在一些實施例中，所述FX活化劑是無菌的和/或經病毒滅活的。在一些實施例中，FX激化劑的純化包括一個或多個病毒滅活、陰離子交換層析、超濾、羥基磷灰石（HA）層析（HAC）和SEC的步驟。 [IV. 治療出血性疾病的方法]
本文所述的FX活化劑（例如，RVV-X）或其組合物（例如，RVV-X先導製劑）可用於多種用途，例如診斷、分子檢測和治療（例如，按需治療或預防性治療）。在一些實施例中，待治療或診斷的個體是家畜（例如，豬、綿羊、山羊、奶牛、公牛、馬、驢、騾子、鴨、鵝）。在一些實施例中，待治療或診斷的個體是伴侶動物（例如，寵物）或輔助動物，如狗、毛、兔子、倉鼠，豚鼠，栗鼠，雪貂，鳥等。在一些實施例中，待治療或診斷的個體是人類。在一些實施例中，待治療或診斷的個體是靈長類動物（例如，猴）。
在一些實施例中，提供治療個體（例如，人類）中出血性疾病（例如，血友病，如血友病A或B，伴或不伴抑制物）的方法，包括向個體施用有效量的本文所述的任何FX活化劑（例如，RVV-X）或其藥物組合物（例如，RVV-X先導製劑）。在一些實施例中，提供治療個體（例如，人類）中出血性疾病（例如，血友病，如血友病A或B，伴或不伴抑制物）的方法，包括向個體施用有效量的本文所述的任何FX活化劑（例如，RVV-X）或其藥物組合物（例如，RVV-X先導製劑），其中所述FX活化劑或其藥物組合物的給藥劑量為0.01 U/kg至0.48 U/kg（例如，約0.08 U/kg至0.48 U/kg，如0.1 U/kg至0.48 U/kg、0.01 U/kg至0.16 U/kg、0.08 U/kg至0.16 U/kg、0.1 U/kg至0.16 U/kg或0.1 U/kg、0.12 U/kg、0.14 U/kg或0.16 U/kg）。在一些實施例中，所述FX活化劑或其藥物組合物通過靜脈給藥，如靜脈注射。當提及“FX活化劑藥物組合物以劑量X給藥”時，意味著所述藥物組合物以有效量給藥，其中包含的FX活化劑的劑量為X。在一些實施例中，所述FX活化劑或其藥物組合物給藥1次。在一些實施例中，所述FX活化劑或其藥物組合物最多給藥6次，如6、5、4、3、2或1次。在一些實施例中，所述FX活化劑或其藥物組合物給藥4次。在一些實施例中，所述FX活化劑或其藥物組合物每4小時（q4h）至每8小時（q8h）給藥1次，如4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5或8小時。在一些實施例中，所述FX活化劑或其藥物組合物以q4h給藥。在一些實施例中，所述FX活化劑或其藥物組合物給藥1次的劑量為0.01 U/kg至0.48 U/kg（例如，0.01 U/kg、0.04 U/kg、0.08 U/kg、0.1 U/kg、0.12 U/kg、0.14 U/kg、0.16 U/kg、0.32 U/kg或0.48 U/kg）。在一些實施例中，所述FX活化劑或其藥物組合物的給藥劑量為0.16 U/kg，q8h，最多給藥6次（例如，6、5、4、3、2或1次）。在一些實施例中，所述FX活化劑或其藥物組合物的給藥劑量為0.16 U/kg，q8h，給藥4次。在一些實施例中，所述FX活化劑或其藥物組合物的給藥劑量為0.1 U/kg，q8h，最多給藥6次（例如，6、5、4、3、2或1次）。在一些實施例中，所述FX活化劑或其藥物組合物的給藥劑量為0.1 U/kg，q8h，給藥4次。在一些實施例中，所述FX活化劑或其藥物組合物的給藥劑量為0.16 U/kg，q4h，最多給藥6次（例如，6、5、4、3、2或1次）。在一些實施例中，所述FX活化劑或其藥物組合物的給藥劑量為0.16 U/kg，q4h，給藥4次。在一些實施例中，所述FX活化劑或其藥物組合物的給藥劑量為0.1 U/kg，q4h，最多給藥6次（例如，6、5、4、3、2或1次）。在一些實施例中，所述FX活化劑或其藥物組合物的給藥劑量為0.1 U/kg，q4h，給藥4次。在一些實施例中，所述FX活化劑是RVV-X。在一些實施例中，所述RVV-X是從圓斑蝰蛇的蛇毒中分離得到的。在一些實施例中，所述RVV-X的純度至少約為95%。在一些實施例中，所述RVV-X包含a) i) 重鏈，其包含序列SEQ ID NO: 1；ii) 輕鏈1，其包含序列SEQ ID NO: 2；以及iii) 輕鏈2，其包含序列SEQ ID NO: 3；b) i) 重鏈，其包含序列SEQ ID NO: 1；ii) 輕鏈1，其包含序列SEQ ID NO: 5；以及iii) 輕鏈2，其包含序列SEQ ID NO: 3；或c) a) 和b) 的混合物。在一些實施例中，所述出血性疾病是血友病A，如伴或不伴FVIII抑制物的血友病A。在一些實施例中，所述出血性疾病是血友病B，如伴或不伴IX抑制物的血友病B。在一些實施例中，所述出血性疾病是外科傷口出血。在一些實施例中，對所述個人進一步給予鞏固治療，如額外給藥1次相同劑量的FX活化劑或其藥物組合物，例如在治療方法最後1次給藥的24小時內。在一些實施例中，在出血開始的24小時內（如20小時、18小時、16小時、12小時、10小時、8小時、6小時、4小時、2小時、1小時、30分鐘、20分鐘、10分鐘或更短時間內）向個體施用所述FX活化劑（例如，RVV-X）或其藥物組合物（例如，RVV-X先導製劑）。在一些實施例中，在出血開始前（例如，外科手術之前）至少5分鐘（如至少10分鐘、15分鐘、20分鐘、30分鐘、40分鐘、50分鐘、1小時、2小時或更長）向個體施用所述FX活化劑（例如，RVV-X）或其藥物組合物（例如，RVV-X先導製劑）。在一些實施例中，在出血開始前10分鐘至15分鐘向個體施用所述FX活化劑或其藥物組合物。在一些實施例中，所述個體是人類。在一些實施例中，所述個體是動物，如小鼠、兔、貓、狗、豚鼠、倉鼠、馬、奶牛、綿羊、鳥（例如，雞、鴨）等。
本發明的藥物組合物的劑量和所需藥物濃度可根據特定用途而變化。確定合適的給藥劑量或給藥途徑完全屬於普通技術人員的技術範圍。動物實驗為確定人類治療的有效劑量提供了可靠的指導。可以依據Mordenti, J.和Chappell, W. “The Use of Interspecies Scaling in Toxicokinetics,” In Toxicokinetics and New Drug Development, Yacobi et al., Eds, Pergamon Press, New York 1989, pp. 42-46中的原則進行有效劑量的種間類推。
在本發明的範圍內，不同的製劑將對不同的治療方法和不同的疾病有效，並且旨在治療特定器官或組織的給藥方式可能與針對另一器官或組織的方式不同。此外，劑量可藉由一次或多次單獨給藥或持續輸注給藥。對於幾天或更長時間內的重複給藥，根據病情，治療持續到疾病症狀達到預期的抑制程度為止（例如，止血）。然而，其他劑量方案可能是有用的。這種治療的進展很容易藉由常規技術和分析進行監測。
在一些實施例中，本文所述的FX活化劑（例如，RVV-X）或其藥物組合物（例如，RVV-X先導製劑）是一次性給藥的（例如，團注法）。在一些實施例中，所述FX活化劑或其藥物組合物是多次（如2、3、4、5、6或更多次）給藥。如果多次給藥，則可藉由相同或不同的途徑進行，並可在相同部位或不同的部位進行。所述FX活化劑或其藥物組合物可以每小時、每天、每月或按需給藥。兩次給藥之間的間隔可以是1小時到1天中的任意時間。間隔也可能是不規則的（例如，伴隨出血事件）。在一些實施例中，給藥計畫中無中斷。特定患者的最佳劑量和治療方案可以由醫學領域的技術人員藉由監測患者的疾病體徵並相應地進行調整以確定。在一些實施例中，所述FX活化劑或其藥物組合物給藥頻次為q1h、q2h、q4h、q6h、q8h、q12h、q16h、q18h、每天給藥一次（每日給藥）、每2天一次、每3天一次、每週一次、每2週一次、每3週一次、每月一次。在一些實施例中，所述FX活化劑或其藥物組合物給藥頻次為q4h到q8h。
在一些實施例中，本文所述的FX活化劑（例如，RVV-X）或其藥物組合物（例如，RVV-X先導製劑）是分劑量給藥的，例如2、3、4、5或6次。在一些實施例中，分劑量給藥超過1天、2天、3天、1周、1個月或更長時間。在一些實施例中，劑量被等分。在一些實施例中，分劑量為總劑量的17%、20%、25%、30%或50%。在一些實施例中，連續的分劑量給藥之間的間隔為2小時、4小時、6小時、8小時、10小時、12小時、18小時、1天、2天、3天、1周、1個月或更長。對於幾小時、幾天或更長時間的重複給藥，根據病情，治療持續到疾病症狀出現預期的抑制程度為止。然而，其他劑量方案可能是有用的。這種治療的進展很容易藉由常規技術和分析進行監測。
在一些實施例中，所述FX活化劑（例如，RVV-X）或其藥物組合物（例如，RVV-X先導製劑）的給藥劑量為0.01 U/kg至0.48 U/kg，如0.01 U/kg至0.1 U/kg、0.02 U/kg至0.08 U/kg、0.01 U/kg至0.05 U/kg、0.01 U/kg至0.08 U/kg、0.05 U/kg至0.1 U/kg、0.1 U/kg至0.48 U/kg、0.1 U/kg至0.4 U/kg、0.1 U/kg至0.3 U/kg、0.1 U/kg至0.2 U/kg、0.2 U/kg至0.48 U/kg、0.2 U/kg至0.4 U/kg、0.2 U/kg至0.3 U/kg、0.3 U/kg至0.48 U/kg、0.08 U/kg至0.48 U/kg、0.16 U/kg至0.48 U/kg、0.16 U/kg至0.2 U/kg、0.01 U/kg至0.16 U/kg、0.02 U/kg至0.14 U/kg、0.04 U/kg至0.12 U/kg、0.06 U/kg至0.12 U/kg、0.08 U/kg至0.1 U/kg、0.02 U/kg至0.16 U/kg、0.04 U/kg至0.16 U/kg、0.06 U/kg至0.16 U/kg、0.1 U/kg至0.16 U/kg、0.12 U/kg至0.16 U/kg、0.14 U/kg至0.16 U/kg、0.08 U/kg至0.16 U/kg或0.1 U/kg至0.16 U/kg。在一些實施例中，治療個體為人類。在一些實施例中，所述FX活化劑（例如，RVV-X）或其藥物組合物的給藥劑量為0.01 U/kg、0.02 U/kg、0.03 U/kg、0.04 U/kg、0.05 U/kg、0.06 U/kg、0.07 U/kg、0.08 U/kg、0.09 U/kg、0.1 U/kg、0.11 U/kg、0.12 U/kg、0.13 U/kg、0.14 U/kg、0.15 U/kg、0.16 U/kg、0.18 U/kg、0.2 U/kg、0.22 U/kg、0.24 U/kg、0.26 U/kg、0.28 U/kg、0.3 U/kg、0.32 U/kg、0.36 U/kg、0.4 U/kg、0.44 U/kg和0.48 U/kg，如0.16 U/kg。
在一些實施例中，提供治療個體（例如，人類）中血友病（例如，血友病A或B，伴或不伴抑制物）的方法，包括向個體施用有效量的RVV-X或其藥物組合物（例如，RVV-X先導製劑），其中所述RVV-X或其藥物組合物給藥1次，劑量為0.01 U/kg至0.48 U/kg、0.16 U/kg至0.48 U/kg、0.08 U/kg至0.48 U/kg、0.1 U/kg至0.48 U/kg、0.01 U/kg至0.16 U/kg、0.08 U/kg至0.16 U/kg、0.1 U/kg至0.16 U/kg或0.1 U/kg至0.12 U/kg、0.14 U/kg或0.16 U/kg。在一些實施例中，提供治療個體（例如，人類）中血友病（例如，如血友病A或B，伴或不伴抑制物）的方法，包括向個體施用有效量的RVV-X或其藥物組合物（例如，RVV-X先導製劑），其中所述RVV-X或其藥物組合物給藥1次，劑量為0.01 U/kg至0.48 U/kg、0.1 U/kg至0.48 U/kg或0.16 U/kg至0.48 U/kg。在一些實施例中，提供治療個體（例如，人類）中血友病（例如，如血友病A或B，伴或不伴抑制物）的方法，包括向個體施用有效量的RVV-X或其藥物組合物（例如，RVV-X先導製劑），其中所述RVV-X或其藥物組合物給藥1次，劑量為0.01 U/kg、0.04 U/kg、0.08 U/kg、0.1 U/kg、0.12 U/kg、0.14 U/kg、0.16 U/kg、0.32 U/kg和0.48 U/kg。在一些實施例中，提供治療個體（例如，人類）中血友病（例如，如血友病A或B，伴或不伴抑制物）的方法，包括向個體施用有效量的RVV-X或其藥物組合物（例如，RVV-X先導製劑），其中所述RVV-X或其藥物組合物給藥1次，劑量為0.1 U/kg、0.12 U/kg、0.14 U/kg、0.16 U/kg、0.32 U/kg或0.48 U/kg。在一些實施例中，所述RVV-X或其藥物組合物（例如，RVV-X先導製劑）通過靜脈給藥，如靜脈注射。在一些實施例中，所述RVV-X是從圓斑蝰蛇的蛇毒中分離得到的。在一些實施例中，所述RVV-X的純度至少約為95%。在一些實施例中，所述RVV-X包含a) i) 重鏈，其包含序列SEQ ID NO: 1；ii) 輕鏈1，其包含序列SEQ ID NO: 2；以及iii) 輕鏈2，其包含序列SEQ ID NO: 3；b) i) 重鏈，其包含序列SEQ ID NO: 1；ii) 輕鏈1，其包含序列SEQ ID NO: 5；以及iii) 輕鏈2，其包含序列SEQ ID NO: 3；或c) a) 和b) 的混合物。
在一些實施例中，提供治療個體（例如，人類）中血友病（例如，血友病A或B，伴或不伴抑制物）的方法，包括向個體施用有效量的藥物組合物，其中所述藥物組合物包含i) FX活化劑（例如，RVV-X），其含量為0.1 U/mL至200 U/mL（例如，1 U/mL至100 U/mL、5 U/mL至100 U/mL、5 U/mL至50 U/mL或10 U/mL）；ii) 穩定劑（例如，蔗糖），其含量為2 mg/ml至100 mg/ml（例如，2 mg/ml至60 mg/ml、15 mg/ml至60 mg/ml、30 mg/ml至50 mg/ml或30 mg/ml）；iii) 緩衝劑（例如，組胺酸），其含量為0.1 mg/ml至50 mg/ml（例如，2 mg/ml至20 mg/ml、2 mg/ml至15 mg/ml、3 mg/ml至5 mg/ml或3 mg/ml）；iv) 表面活性劑（例如，聚山梨醇酯20），其含量為0.001% (w/v)至0.1% (w/v)（例如，0.005% (w/v)至0.05% (w/v)、0.01% (w/v)至0.05% (w/v)、0.01% (w/v)至0.03% (w/v)或0.02% (w/v)）；以及v) 賦形劑（例如，甘露醇），其含量為1 mg/ml至100 mg/ml（例如，10 mg/ml至60 mg/ml、30 mg/ml至60 mg/ml或40 mg/ml）；其中所述藥物組合物的pH值約6.0至8.0（例如，6.3至7.3、6.8至7.0或6.85）；並且其中所述藥物組合物給藥1次的劑量為0.01 U/kg至0.48 U/kg、0.16 U/kg至0.48 U/kg、0.08 U/kg至0.48 U/kg、0.1 U/kg至0.48 U/kg、0.01 U/kg至0.16 U/kg、0.08 U/kg至0.16 U/kg、0.1 U/kg至0.16 U/kg或0.1 U/kg、0.12 U/kg、0.14 U/kg或0.16 U/kg。在一些實施例中，提供治療個體（例如，人類）中血友病（例如，血友病A或B，伴或不伴抑制物）的方法，包括向個體施用有效量的藥物組合物，其中所述藥物組合物包含i) FX活化劑（例如，RVV-X），其含量為0.1 U/mL至200 U/mL（例如，1 U/mL至100 U/mL、5 U/mL至100 U/mL、5 U/mL至50 U/mL或10 U/mL）；ii) 穩定劑（例如，蔗糖），其含量為2 mg/ml至100 mg/ml（例如，2 mg/ml至60 mg/ml、15 mg/ml至60 mg/ml、30 mg/ml至50 mg/m或30 mg/ml）；iii) 緩衝劑（例如，組胺酸），其含量為0.1 mg/ml至50 mg/ml（例如，2 mg/ml至20 mg/ml、2 mg/ml至15 mg/ml、3 mg/ml至5 mg/ml或3 mg/ml）；iv) 表面活性劑（例如，聚山梨醇酯20），其含量為0.001% (w/v)至0.1% (w/v)（例如，0.005% (w/v)至0.05% (w/v)、0.01% (w/v)至0.05% (w/v)、0.01% (w/v)至0.03% (w/v)或0.02% (w/v)）；以及v) 賦形劑（例如，甘露醇），其含量為1 mg/ml至100 mg/ml（例如，10 mg/ml至60 mg/ml、30 mg/ml至60 mg/ml或40 mg/ml）；其中所述藥物組合物的pH值為6.0至8.0（例如，6.3至7.3、6.8至7.0或6.85）；並且其中所述藥物組合物給藥1次的劑量為0.01 U/kg至0.48 U/kg、0.1 U/kg至0.48 U/kg或0.16 U/kg至0.48 U/kg。在一些實施例中，提供治療個體（例如，人類）中血友病（例如，血友病A或B，伴或不伴抑制物）的方法，包括向個體施用有效量的藥物組合物，其中所述藥物組合物包含i) FX活化劑（例如，RVV-X），其含量為0.1 U/mL至200 U/mL（例如，1 U/mL至100 U/mL、5 U/mL至100 U/mL、5 U/mL至50 U/mL或10 U/mL）；ii) 穩定劑（例如，蔗糖），其含量為2 mg/ml至100 mg/ml（例如，2 mg/ml至60 mg/ml、15 mg/ml至60 mg/ml、30 mg/ml至50 mg/m或30 mg/ml）；iii) 緩衝劑（例如，組胺酸），其含量為0.1 mg/ml至50 mg/ml（例如，2 mg/ml至20 mg/ml、2 mg/ml至15 mg/ml、3 mg/ml至5 mg/ml或3 mg/ml）；iv) 表面活性劑（例如，聚山梨醇酯20），其含量為0.001% (w/v)至0.1% (w/v)（例如，0.005% (w/v)至0.05% (w/v)、0.01% (w/v)至0.05% (w/v)、0.01% (w/v)至0.03% (w/v)或0.02% (w/v)）；以及v) 賦形劑（例如，甘露醇），其含量為1 mg/ml至100 mg/ml（例如，10 mg/ml至60 mg/ml、30 mg/ml至60 mg/ml或40 mg/ml）；其中所述藥物組合物的pH值為6.0至8.0（例如，6.3至7.3、6.8至7.0或6.85）；並且其中所述藥物組合物給藥1次的劑量為0.01 U/kg、0.04 U/kg、0.08 U/kg、0.1 U/kg、0.12 U/kg、0.14 U/kg、0.16 U/kg、0.32 U/kg和0.48 U/kg。在一些實施例中，提供治療個體（例如，人類）中血友病（例如，血友病A或B，伴或不伴抑制物）的方法，包括向個體施用有效量的藥物組合物，其中所述藥物組合物包含i) FX活化劑（例如，RVV-X），其含量為0.1 U/mL至200 U/mL（例如，1 U/mL至100 U/mL、5 U/mL至100 U/mL、5 U/mL至50 U/mL或10 U/mL）；ii) 穩定劑（例如，蔗糖），其含量為2 mg/ml至100 mg/ml（例如，2 mg/ml至60 mg/ml、15 mg/ml至60 mg/ml、30 mg/ml至50 mg/m或30 mg/ml）；iii) 緩衝劑（例如，組胺酸），其含量為0.1 mg/ml至50 mg/ml（例如，2 mg/ml至20 mg/ml、2 mg/ml至15 mg/ml、3 mg/ml至5 mg/ml或3 mg/ml）；iv) 表面活性劑（例如，聚山梨醇酯20），其含量為0.001% (w/v)至0.1% (w/v)（例如，0.005% (w/v)至0.05% (w/v)、0.01% (w/v)至0.05% (w/v)、0.01% (w/v)至0.03% (w/v)或0.02% (w/v)）；以及v) 賦形劑（例如，甘露醇），其含量為1 mg/ml至100 mg/ml（例如，10 mg/ml至60 mg/ml、30 mg/ml至60 mg/ml或40 mg/ml）；其中所述藥物組合物的pH值為6.0至8.0（例如，6.3至7.3、6.8至7.0或6.85）；並且其中所述藥物組合物給藥1次的劑量為0.1 U/kg、0.12 U/kg、0.14 U/kg、0.16 U/kg、0.32 U/kg和0.48 U/kg。在一些實施例中，所述藥物組合物是凍乾的。在一些實施例中，所述藥物組合物是無菌的。在一些實施例中，所述方法進一步包含在給藥前複溶所述藥物組合物（例如，用0.9%氯化鈉注射液）。在一些實施例中，所述藥物組合物通過靜脈給藥，如靜脈注射。在一些實施例中，所述FX活化劑是RVV-X。在一些實施例中，所述RVV-X是從圓斑蝰蛇的蛇毒中分離得到的。在一些實施例中，所述RVV-X的純度至少約為95%。在一些實施例中，所述RVV-X包含a) i) 重鏈，其包含序列SEQ ID NO: 1，或與SEQ ID NO: 1具有至少80%序列同一性的序列；ii) 輕鏈1，其包含序列SEQ ID NO: 2，或與SEQ ID NO: 2具有至少80%序列同一性的序列；以及iii) 輕鏈2，其包含序列SEQ ID NO: 3，或與SEQ ID NO: 3具有至少80%序列同一性的序列；b) i) 重鏈，其包含序列SEQ ID NO: 1，或與SEQ ID NO: 1具有至少80%序列同一性的序列；ii) 輕鏈1，其包含序列SEQ ID NO: 5，或與SEQ ID NO: 5具有至少80%序列同一性的序列；以及iii) 輕鏈2，其包含序列SEQ ID NO: 3，或與SEQ ID NO: 3具有至少80%序列同一性的序列；或c) a) 和b) 的混合物。
在一些實施例中，提供治療個體（例如，人類）中血友病（例如，血友病A或B，伴或不伴抑制物）的方法，包括向個體施用有效量的藥物組合物，其中所述藥物組合物包含i) RVV-X，其含量為10 U/mL；ii) 蔗糖，其含量為30 mg/ml；iii) 組胺酸，其含量為3 mg/ml；iv) 聚山梨醇酯20，其含量為0.02% (w/v)；以及v) 甘露醇，其含量為40 mg/ml；其中所述藥物組合物的pH值為6.85；並且其中所述藥物組合物給藥1次的劑量為0.01 U/kg至0.48 U/kg、0.16 U/kg至0.48 U/kg、0.08 U/kg至0.48 U/kg、0.1 U/kg至0.48 U/kg、0.01 U/kg至0.16 U/kg、0.08 U/kg至0.16 U/kg、0.1 U/kg至0.16 U/kg或0.1 U/kg至0.12 U/kg、0.14 U/kg或0.16 U/kg。在一些實施例中，提供治療個體（例如，人類）中血友病（例如，血友病A或B，伴或不伴抑制物）的方法，包括向個體施用有效量的藥物組合物，其中所述藥物組合物包含i) RVV-X，其含量為10 U/mL；ii) 蔗糖，其含量為30 mg/ml；iii) 組胺酸，其含量為3 mg/ml；iv) 聚山梨醇酯20，其含量為0.02% (w/v)；以及v) 甘露醇，其含量為40 mg/ml；其中所述藥物組合物的pH值為6.85；並且其中所述藥物組合物給藥1次的劑量為0.01 U/kg至0.48 U/kg、0.1 U/kg至0.48 U/kg或0.16 U/kg至0.48 U/kg。在一些實施例中，提供治療個體（例如，人類）中血友病（例如，血友病A或B，伴或不伴抑制物）的方法，包括向個體施用有效量的藥物組合物，其中所述藥物組合物包含i) RVV-X，其含量為10 U/mL；ii) 蔗糖，其含量為30 mg/ml；iii) 組胺酸，其含量為3 mg/ml；iv) 聚山梨醇酯20，其含量為0.02% (w/v)；以及v) 甘露醇，其含量為40 mg/ml；其中所述藥物組合物的pH值為6.85；並且其中所述藥物組合物給藥1次的劑量為0.01 U/kg、0.04 U/kg、0.08 U/kg、0.1 U/kg、0.12 U/kg、0.14 U/kg、0.16 U/kg、0.32 U/kg和0.48 U/kg。在一些實施例中，提供治療個體（例如，人類）中血友病（例如，血友病A或B，伴或不伴抑制物）的方法，包括向個體施用有效量的藥物組合物，其中所述藥物組合物包含i) RVV-X，其含量為10 U/mL；ii) 蔗糖，其含量為30 mg/ml；iii) 組胺酸，其含量為3 mg/ml；iv) 聚山梨醇酯20，其含量為0.02% (w/v)；以及v) 甘露醇，其含量為40 mg/ml；其中所述藥物組合物的pH值為6.85；並且其中所述藥物組合物給藥1次的劑量為0.1 U/kg、0.12 U/kg、0.14 U/kg、0.16 U/kg、0.32 U/kg或0.48 U/kg。在一些實施例中，所述藥物組合物是凍乾的。在一些實施例中，所述藥物組合物是無菌的。在一些實施例中，所述方法進一步包含在給藥前複溶所述藥物組合物（例如，用0.9%氯化鈉注射液）。在一些實施例中，所述藥物組合物通過靜脈給藥，如靜脈注射。在一些實施例中，所述RVV-X是從圓斑蝰蛇的蛇毒中分離得到的。在一些實施例中，所述RVV-X的純度至少約為95%。在一些實施例中，所述RVV-X包含a) i) 重鏈，其包含序列SEQ ID NO: 1；ii) 輕鏈1，其包含序列SEQ ID NO: 2；以及iii) 輕鏈2，其包含序列SEQ ID NO: 3；b) i) 重鏈，其包含序列SEQ ID NO: 1；ii) 輕鏈1，其包含序列SEQ ID NO: 5；以及iii) 輕鏈2，其包含序列SEQ ID NO: 3；或c) a) 和b) 的混合物。
在一些實施例中，提供治療個體（例如，人類）中血友病（例如，血友病A或B，伴或不伴抑制物）的方法，包括向個體施用有效量的RVV-X或其藥物組合物（例如，RVV-X先導製劑），其中所述RVV-X或其藥物組合物的給藥劑量為0.01 U/kg至0.48 U/kg（如0.16 U/kg至0.48 U/kg、0.08 U/kg至0.48 U/kg、0.1 U/kg至0.48 U/kg、0.01 U/kg至0.16 U/kg、0.08 U/kg至0.16 U/kg、0.1 U/kg至0.16 U/kg或0.1 U/kg或0.16 U/kg），q4h至q8h（如q4h、q5h、q6h、q7h或q8h），最多給藥6次（如1、2、3、4、5或6次）。在一些實施例中，提供治療個體（例如，人類）中血友病（例如，血友病A或B，伴或不伴抑制物）的方法，包括向個體施用有效量的RVV-X或其藥物組合物（例如，RVV-X先導製劑），其中所述RVV-X或其藥物組合物的給藥劑量為0.1 U/kg或0.16 U/kg，q4h至q8h（如q4h、q5h、q6h、q7h或q8h），最多給藥6次（如1、2、3、4、5或6次）。在一些實施例中，提供治療個體（例如，人類）中血友病（例如，血友病A或B，伴或不伴抑制物）的方法，包括向個體施用有效量的RVV-X或其藥物組合物（例如，RVV-X先導製劑），其中所述RVV-X或其藥物組合物的給藥劑量為0.1 U/kg或0.16 U/kg，q4h，最多給藥6次（如1、2、3、4、5或6次）。在一些實施例中，提供治療個體（例如，人類）中血友病（例如，血友病A或B，伴或不伴抑制物）的方法，包括向個體施用有效量的RVV-X或其藥物組合物（例如，RVV-X先導製劑），其中所述RVV-X或其藥物組合物的給藥劑量為0.1 U/kg或0.16 U/kg q4h，給藥4次。在一些實施例中，所述RVV-X或其藥物組合物（例如，RVV-X先導製劑）通過靜脈給藥，如靜脈注射。在一些實施例中，所述RVV-X是從圓斑蝰蛇的蛇毒中分離得到的。在一些實施例中，所述RVV-X的純度至少約為95%。在一些實施例中，所述RVV-X包含a) i) 重鏈，其包含序列SEQ ID NO: 1；ii) 輕鏈1，其包含序列SEQ ID NO: 2；以及iii) 輕鏈2，其包含序列SEQ ID NO: 3；b) i) 重鏈，其包含序列SEQ ID NO: 1；ii) 輕鏈1，其包含序列SEQ ID NO: 5；以及iii) 輕鏈2，其包含序列SEQ ID NO: 3；或c) a) 和b) 的混合物。
在一些實施例中，提供治療個體（例如，人類）中血友病（例如，血友病A或B，伴或不伴抑制物）的方法，包括向個體施用有效量的藥物組合物，其中所述藥物組合物包含i) FX活化劑（例如，RVV-X），其含量為0.1 U/mL至200 U/mL（例如，1 U/mL至100 U/mL、5 U/mL至100 U/mL、5 U/mL至50 U/mL或10 U/mL）；ii) 穩定劑（例如，蔗糖），其含量為2 mg/ml至100 mg/ml（例如，2 mg/ml至60 mg/ml、15 mg/ml至60 mg/ml、30 mg/ml至50 mg/ml或30 mg/ml）；iii) 緩衝劑（例如，組胺酸），其含量為0.1 mg/ml至50 mg/ml（例如，2 mg/ml至20 mg/ml、2 mg/ml至15 mg/ml、3 mg/ml至5 mg/ml或3 mg/ml）；iv) 表面活性劑（例如，聚山梨醇酯20），其含量為0.001% (w/v)至0.1% (w/v)（例如，0.005% (w/v)至0.05% (w/v)、0.01% (w/v)至0.05% (w/v)、0.01% (w/v)至0.03% (w/v)或0.02% (w/v)）；以及v) 賦形劑（例如，甘露醇），其含量為1 mg/ml至100 mg/ml（例如，10 mg/ml至60 mg/ml、30 mg/ml至60 mg/ml或40 mg/ml）；其中所述藥物組合物的pH值約6.0至8.0（例如，6.3至7.3、6.8至7.0或6.85）；並且其中所述藥物組合物的給藥劑量為0.01 U/kg至0.48 U/kg（如0.16 U/kg至0.48 U/kg、0.08 U/kg至0.48 U/kg、0.1 U/kg至0.48 U/kg、0.01 U/kg至0.16 U/kg、0.08 U/kg至0.16 U/kg、0.1 U/kg至0.16 U/kg或0.1 U/kg或0.16 U/kg），q4h至q8h（如q4h、q5h、q6h、q7h或q8h），最多給藥6次（如1、2、3、4、5或6次）。在一些實施例中，提供治療個體（例如，人類）中血友病（例如，血友病A或B，伴或不伴抑制物）的方法，包括向個體施用有效量的藥物組合物，其中所述藥物組合物包含i) FX活化劑（例如，RVV-X），其含量為0.1 U/mL至200 U/mL（例如，1 U/mL至100 U/mL、5 U/mL至100 U/mL、5 U/mL至50 U/mL或10 U/mL）；ii) 穩定劑（例如，蔗糖），其含量為2 mg/ml至100 mg/ml（例如，2 mg/ml至60 mg/ml、15 mg/ml至60 mg/ml、30 mg/ml至50 mg/m或30 mg/ml）；iii) 緩衝劑（例如，組胺酸），其含量為0.1 mg/ml至50 mg/ml（例如，2 mg/ml至20 mg/ml、2 mg/ml至15 mg/ml、3 mg/ml至5 mg/ml或3 mg/ml）；iv) 表面活性劑（例如，聚山梨醇酯20），其含量為0.001% (w/v)至0.1% (w/v)（例如，0.005% (w/v)至0.05% (w/v)、0.01% (w/v)至0.05% (w/v)、0.01% (w/v)至0.03% (w/v)或0.02% (w/v)）；以及v) 賦形劑（例如，甘露醇），其含量為1 mg/ml至100 mg/ml（例如，10 mg/ml至60 mg/ml、30 mg/ml至60 mg/ml或40 mg/ml）；其中所述藥物組合物的pH值為6.0至8.0（例如，6.3至7.3、6.8至7.0或6.85）；並且其中所述藥物組合物的給藥劑量為0.1 U/kg或0.16 U/kg，q4h至q8h（如q4h、q5h、q6h、q7h或q8h），最多給藥6次（如1、2、3、4、5或6次）。在一些實施例中，提供治療個體（例如，人類）中血友病（例如，血友病A或B，伴或不伴抑制物）的方法，包括向個體施用有效量的藥物組合物，其中所述藥物組合物包含i) FX活化劑（例如，RVV-X），其含量為0.1 U/mL至200 U/mL（例如，1 U/mL至100 U/mL、5 U/mL至100 U/mL、5 U/mL至50 U/mL或10 U/mL）；ii) 穩定劑（例如，蔗糖），其含量為2 mg/ml至100 mg/ml（例如，2 mg/ml至60 mg/ml、15 mg/ml至60 mg/ml、30 mg/ml至50 mg/m或30 mg/ml）；iii) 緩衝劑（例如，組胺酸），其含量為0.1 mg/ml至50 mg/ml（例如，2 mg/ml至20 mg/ml、2 mg/ml至15 mg/ml、3 mg/ml至5 mg/ml或3 mg/ml）；iv) 表面活性劑（例如，聚山梨醇酯20），其含量為0.001% (w/v)至0.1% (w/v)（例如，0.005% (w/v)至0.05% (w/v)、0.01% (w/v)至0.05% (w/v)、0.01% (w/v)至0.03% (w/v)或0.02% (w/v)）；以及v) 賦形劑（例如，甘露醇），其含量為1 mg/ml至100 mg/ml（例如，10 mg/ml至60 mg/ml、30 mg/ml至60 mg/ml或40 mg/ml）；其中所述藥物組合物的pH值為6.0至8.0（例如，6.3至7.3、6.8至7.0或6.85）；並且其中所述藥物組合物的給藥劑量為0.1 U/kg或0.16 U/kg，q4h，最多給藥6次（如1、2、3、4、5或6次）。在一些實施例中，提供治療個體（例如，人類）中血友病（例如，血友病A或B，伴或不伴抑制物）的方法，包括向個體施用有效量的藥物組合物，其中所述藥物組合物包含i) FX活化劑（例如，RVV-X），其含量為0.1 U/mL至200 U/mL（例如，1 U/mL至100 U/mL、5 U/mL至100 U/mL、5 U/mL至50 U/mL或10 U/mL）；ii) 穩定劑（例如，蔗糖），其含量為2 mg/ml至100 mg/ml（例如，2 mg/ml至60 mg/ml、15 mg/ml至60 mg/ml、30 mg/ml至50 mg/m或30 mg/ml）；iii) 緩衝劑（例如，組胺酸），其含量為0.1 mg/ml至50 mg/ml（例如，2 mg/ml至20 mg/ml、2 mg/ml至15 mg/ml、3 mg/ml至5 mg/ml或3 mg/ml）；iv) 表面活性劑（例如，聚山梨醇酯20），其含量為0.001% (w/v)至0.1% (w/v)（例如，0.005% (w/v)至0.05% (w/v)、0.01% (w/v)至0.05% (w/v)、0.01% (w/v)至0.03% (w/v)或0.02% (w/v)）；以及v) 賦形劑（例如，甘露醇），其含量為1 mg/ml至100 mg/ml（例如，10 mg/ml至60 mg/ml、30 mg/ml至60 mg/ml或40 mg/ml）；其中所述藥物組合物的pH值為6.0至8.0（例如，6.3至7.3、6.8至7.0或6.85）；並且其中所述藥物組合物1次的給藥劑量為0.1 U/kg或0.16 U/kg，q4h，給藥4次。在一些實施例中，所述藥物組合物是凍乾的。在一些實施例中，所述藥物組合物是無菌的。在一些實施例中，所述方法進一步包含在給藥前複溶所述藥物組合物（例如，用0.9%氯化鈉注射液）。在一些實施例中，所述藥物組合物通過靜脈給藥，如靜脈注射。在一些實施例中，所述FX活化劑是RVV-X。在一些實施例中，所述RVV-X是從圓斑蝰蛇的蛇毒中分離得到的。在一些實施例中，所述RVV-X的純度至少約為95%。在一些實施例中，所述RVV-X包含a) i) 重鏈，其包含序列SEQ ID NO: 1，或與SEQ ID NO: 1具有至少80%序列同一性的序列；ii) 輕鏈1，其包含序列SEQ ID NO: 2，或與SEQ ID NO: 2具有至少80%序列同一性的序列；以及iii) 輕鏈2，其包含序列SEQ ID NO: 3，或與SEQ ID NO: 3具有至少80%序列同一性的序列；b) i) 重鏈，其包含序列SEQ ID NO: 1，或與SEQ ID NO: 1具有至少80%序列同一性的序列；ii) 輕鏈1，其包含序列SEQ ID NO: 5，或與SEQ ID NO: 5具有至少80%序列同一性的序列；以及iii) 輕鏈2，其包含序列SEQ ID NO: 3，或與SEQ ID NO: 3具有至少80%序列同一性的序列；或c) a) 和b) 的混合物。
在一些實施例中，提供治療個體（例如，人類）中血友病（例如，血友病A或B，伴或不伴抑制物）的方法，包括向個體施用有效量的藥物組合物，其中所述藥物組合物包含i) RVV-X，其含量為10 U/mL；ii) 蔗糖，其含量為30 mg/ml；iii) 組胺酸，其含量為3 mg/ml；iv) 聚山梨醇酯20，其含量為0.02% (w/v)；以及v) 甘露醇，其含量為40 mg/ml；其中所述藥物組合物的pH值為6.85；並且其中所述藥物組合物的給藥劑量為0.01 U/kg至0.48 U/kg（如0.16 U/kg至0.48 U/kg、0.08 U/kg至0.48 U/kg、0.1 U/kg至0.48 U/kg、0.01 U/kg至0.16 U/kg、0.08 U/kg至0.16 U/kg、0.1 U/kg至0.16 U/kg、0.1 U/kg或0.16 U/kg），q4h至q8h（如q4h、q5h、q6h、q7h或q8h），最多給藥6次（如1、2、3、4、5或6次）。在一些實施例中，提供治療個體（例如，人類）中血友病（例如，血友病A或B，伴或不伴抑制物）的方法，包括向個體施用有效量的藥物組合物，其中所述藥物組合物包含i) RVV-X，其含量為10 U/mL；ii) 蔗糖，其含量為30 mg/ml；iii) 組胺酸，其含量為3 mg/ml；iv) 聚山梨醇酯20，其含量為0.02% (w/v)；以及v) 甘露醇，其含量為40 mg/ml；其中所述藥物組合物的pH值為6.85；並且其中所述藥物組合物的給藥劑量為0.1 U/kg或0.16 U/kg，q4h至q8h（如q4h、q5h、q6h、q7h或q8h），最多給藥6次（如1、2、3、4、5或6次）。在一些實施例中，提供治療個體（例如，人類）中血友病（例如，血友病A或B，伴或不伴抑制物）的方法，包括向個體施用有效量的藥物組合物，其中所述藥物組合物包含i) RVV-X，其含量為10 U/mL；ii) 蔗糖，其含量為30 mg/ml；iii) 組胺酸，其含量為3 mg/ml；iv) 聚山梨醇酯20，其含量為0.02% (w/v)；以及v) 甘露醇，其含量為40 mg/ml；其中所述藥物組合物的pH值為6.85；並且其中所述藥物組合物的給藥劑量為0.1 U/kg或0.16 U/kg，q4h，最多給藥6次（如1、2、3、4、5或6次）。在一些實施例中，提供治療個體（例如，人類）中血友病（例如，血友病A或B，伴或不伴抑制物）的方法，包括向個體施用有效量的藥物組合物，其中所述藥物組合物包含i) RVV-X，其含量為10 U/mL；ii) 蔗糖，其含量為30 mg/ml；iii) 組胺酸，其含量為3 mg/ml；iv) 聚山梨醇酯20，其含量為0.02% (w/v)；以及v) 甘露醇，其含量為40 mg/ml；其中所述藥物組合物的pH值為6.85；並且其中所述藥物組合物給藥1次的劑量為0.1 U/kg或0.16 U/kg，q4h，給藥4次。在一些實施例中，所述藥物組合物是凍乾的。在一些實施例中，所述藥物組合物是無菌的。在一些實施例中，所述方法進一步包含在給藥前複溶所述藥物組合物（例如，用0.9%氯化鈉注射液）。在一些實施例中，所述藥物組合物通過靜脈給藥，如靜脈注射。在一些實施例中，所述RVV-X是從圓斑蝰蛇的蛇毒中分離得到的。在一些實施例中，所述RVV-X的純度至少約為95%。在一些實施例中，所述RVV-X包含a) i) 重鏈，其包含序列SEQ ID NO: 1；ii) 輕鏈1，其包含序列SEQ ID NO: 2；以及iii) 輕鏈2，其包含序列SEQ ID NO: 3；b) i) 重鏈，其包含序列SEQ ID NO: 1；ii) 輕鏈1，其包含序列SEQ ID NO: 5；以及iii) 輕鏈2，其包含序列SEQ ID NO: 3；或c) a) 和b) 的混合物。
在一些實施例中，所述治療出血性疾病（例如，血友病，如血友病A或B，伴或不伴抑制物；或外科傷口出血）的方法與患出血性疾病但未接受所述治療或接受對照藥劑（例如，安慰劑或其他止血劑）的個體相比，具有一個或多個以下生物活性：(i) 激活FX和/或促進FXa產生；(ii) 增加凝血酶生成（TG）和/或內源性凝血酶生成潛力（ETP）；(iii) 縮短活化部分促凝血酶原激酶時間（APTT）、凝血酶原時間（PT）和/或凝血酶時間（TT）；(iv) 促進止血，改善出血症狀，如減少出血時間和/或出血量；(v) 減少死亡率；(vi) 促進傷口癒合；(vii) 延長患者生存期；和/或(viii) 減輕或緩解疼痛等。在一些實施例中，激活FX和/或促進FXa產生的方法可增加FXa至少約50%、60%、70%、80%、90%、100%、1.5倍、2倍、5倍、10倍、30倍或更多。在一些實施例中，增加TG和/或ETP的方法可增加TG和/或ETP至少約50%、60%、70%、80%、90%、100%、1.5倍、2倍、5倍、10倍、30倍或更多。在一些實施例中，縮短APTT、PT和/或TT的方法可縮短APTT、PT和/或TT至少約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或更多。在一些實施例中，促進止血的方法可減少出血時間和/或出血量至少約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或更多。在一些實施例中，減少死亡率的方法可減少死亡率至少約30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或更多。在一些實施例中，促進傷口癒合的方法可促進至少約1.1倍（包括例如，至少1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40或50倍或更多）的傷口癒合。在一些實施例中，延長個體（例如，人類）生存期的方法可延長個體生存期至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、18、24個月或2、3、4、5、6、7、8、9、10年或更長時間。在一些實施例中，減輕或緩解疼痛的方法減輕疼痛至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或100%。
本文所述的FX活化劑（例如，RVV-X）或其藥物組合物（例如，RVV-X先導製劑）的給藥方式可以以任何方便的方式進行，包括通過注射或輸液。給藥途徑依照已知和公認的方法，如藉由單次或多次推注或以適當方式長時間輸液。FX活化劑或其藥物組合物藉由注射向患者給藥（例如，皮下注射，靜脈注射或腹腔注射）。在一些實施例中，全身施用FX活化劑或其藥物組合物。在一些實施例中，藉由輸注（如靜脈輸注）向個體施用FX活化劑或其藥物組合物。免疫治療所用的輸注技術在本領域已知（參見 Rosenberg et al., New Eng. J. of Med. 319: 1676 (1988)）。在一些實施例中，藉由皮內或皮下（即在皮膚下）注射向個體施用FX活化劑或其藥物組合物。對於皮下注射，可使用注射器注射FX活化劑或其藥物組合物。然而，還有其他用於FX活化劑或其藥物組合物給藥的裝置，如注射裝置；注射筆；自動注射器裝置、無針裝置；和皮下貼片給藥系統。在一些實施例中，通過靜脈注射施用FX活化劑或其藥物組合物。在一些實施例中，將FX活化劑或其藥物組合物局部適用於損傷或傷口處，如直接在傷口組織或出血部位。在一些實施例中，將FX活化劑或其藥物組合物局部施用於損傷或傷害部位，如直接施用於傷口組織。在一些實施例中，藉由緩釋或延長釋放技術施用FX活化劑或其藥物組合物。
在本文所述的任何用於治療出血性疾病的方法的實施例中，所述方法還包括施用一個或多個額外的凝血因子。例如，一個或多個額外的凝血因子可以是血漿純化或重組凝血因子、促凝劑，如維生素K、維生素K衍生物和蛋白C抑制劑、血漿、血小板、紅細胞或皮質類固醇。 [出血性疾病]
如本文所用，“疾病（disease）”或“紊亂（disorder）”是指生物體中由病因或病症引起的病理狀況，包括但不限於感染、獲得性病症、遺傳性病症，並以可識別的症狀為特徵。本文關注的疾病和紊亂涉及凝血，包括由凝血蛋白介導的疾病和其中凝血蛋白在病因學或病理學中起作用的疾病和紊亂。疾病和紊亂還包括由缺乏蛋白質引起的疾病和紊亂，例如血友病，並且本文特別關注的是由於凝血蛋白缺陷而不發生凝血的那些疾病。示例性疾病和紊亂，例如但不限於血液凝固疾病、血液學疾病、出血性疾病、血友病、凝血因子缺乏和獲得性血液疾病，包括與創傷和手術相關的出血。
如本文所用，“出血性疾病”是指由於血液凝固不足，患者控制出血能力降低的病症。出血性疾病可以是遺傳性或獲得性的，並且可以由例如凝血途徑的缺陷或不足、血小板活性的缺陷或缺乏或血管缺陷引起。在一些實施例中，出血性疾病是先天性出血性疾病或獲得性出血性疾病。
如本文所用，“獲得性出血性疾病”是指由肝病、維生素K缺乏或香豆素（華法林）或其他抗凝劑治療引起的凝血缺陷所導致的出血性疾病。
出血性疾病可以是因缺乏凝血因子引起的疾病、因存在獲得性凝血因子抑制物引起的疾病、血液疾病、出血性疾病、血管性血友病、因施用維生素K拮抗劑進行抗凝治療引起的疾病、遺傳性血小板疾病、維生素K環氧化物還原酶C1缺乏症、γ羧化酶缺乏症、與創傷或損傷相關的出血、血栓形成、血小板減少症、腦中風、凝血功能障礙、彌散性血管內凝血（DIC）、Bernard-Soulier症候群、Glanzman血栓形成症或儲存池缺乏症。在實施例中，對於由於缺乏凝血因子或由於存在獲得性凝血因子抑制物所致的出血性疾病，凝血因子可以是因子VII、因子IX、因子X、因子XI、因子V、因子XII、因子II或血管性血友病因子。在實施例中，對於由於缺乏凝血因子所致的出血性疾病，凝血因子可以是因子VII、因子VIII、因子IX、因子XI。在一些實施例中，出血性疾病是由於缺乏凝血因子所致。在一些實施例中，出血性疾病是血友病。例如，出血性疾病可以是血友病A、血友病B或血友病C。在一些實施例中，血友病是伴抑制物（例如，抗體）血友病。在一些實施例中，出血性疾病是不伴抑制物的血友病A。在一些實施例中，出血性疾病是伴FVIII抑制物（抗FVIII抗體，例如，外源性FVIII）的血友病A。在一些實施例中，出血性疾病是不伴抑制物的血友病B。在一些實施例中，出血性疾病是伴FIX抑制物（抗FIX抗體，例如，外源性FIX）的血友病B。
在本文所述的方法的示例中，出血性疾病是由於凝血因子缺乏所致，該疾病是家族性多凝血因子缺乏症（FMFD）。在本文所述的示例中，出血性疾病是由於存在凝血因子的獲得性抑制物，凝血因子是因子VII、因子VIII、因子IX、因子X、因子XI和因子XII。在這類示例中，獲得性抑制物是自身抗體。例如，出血性疾病是獲得性血友病。在本文所述的方法的示例中，出血性疾病是遺傳性血小板疾病，其可以是Chediak-Higashi症候群、Hermansky-Pudlak症候群、血栓素A2功能障礙、Glanzmann血栓形成症和Bernard-Soulier症候群。在本文所述的其他實施例中，當疾病由維生素K拮抗劑的抗凝治療引起時，維生素K拮抗藥可以是肝素、五糖、華法林、小分子抗血栓藥物和FXa抑制物。
在本文所述的方法的其他示例中，所述疾病是血栓形成、血小板減少、中風和凝血障礙。在本文所述的方法的進一步示例中，出血性病症由創傷、手術或傷口引起。例如，在這類示例中，出血表現為急性血腫、慢性血友病性關節病、血腫、血尿、中樞神經系統出血、胃腸道出血或腦出血。在本文所述的其他示例中，出血是由於拔牙。在本文所述的其他示例中，所述出血性疾病是由於手術引起的，手術是心臟手術、血管成形術、肺手術、腹部手術、脊柱手術、腦手術、血管手術、牙科手術或器官移植手術。例如，手術是移植手術，藉由骨髓、心臟、肺、胰腺或肝臟的移植。 [先天性出血性疾病]
本文所述的FX活化劑（例如，RVV-X）或其藥物組合物（例如，RVV-X先導製劑）可用於繞過內源性或外源性凝血途徑中的任何凝血因子，並治療因其缺陷引起的凝血病。先天性凝血因子缺乏引起的出血性疾病，包括血友病A（因子VIII缺陷症）；血友病B（因子IX缺陷症）；血友病C（XI因子缺陷症）；因子VII缺陷症；因子X缺陷症；因子XII缺陷症；以及I型、II型、IV型、V型和VI型家族性多凝血因子缺乏症（FMFD）（見於Roberts, H R and M D Bingham, “Other Coagulation Factor Deficiencies,” Thrombosis and Hemorrhage, 2nd ed. Baltimore, Md.: Williams & Wilkins, 1998: 773-802）。FX活化劑或其藥物組合物也可用於治療其他先天性出血性疾病和病症，例如但不限於血管性血友病、遺傳性血小板疾病（例如，儲存池疾病，如Chediak-Higashi和Hermansky-Pudlak症候群、血栓素A2功能障礙、Glanzmann’s血栓形成症和Bernard-Soulier症候群），遺傳性出血性毛細血管擴張症，也稱為Rendu-Osler-Weber症候群。
其他先天性出血性疾病可以用本文所述的FX活化劑（例如，RVV-X）或其藥物組合物（例如，RVV-X先導製劑）治療，以促進凝血。可使用FX活化劑或其藥物組合物治療與血管性血友病（vWD）相關的自發性和手術相關的出血事件。血管性血友病是一種出血性疾病，由凝血蛋白血管性血友病因子（vWF）缺陷或缺乏所引起，估計在1%至2%的人群中發生。vWD患者容易擦傷，反復流鼻血，拔牙、扁桃體切除術或其他手術後出血，女性患者月經出血增多。FX活化劑或其藥物組合物可用於改善vWD患者的自發出血和手術相關出血。
其他血小板相關出血疾病也與內源性凝血活性降低有關，例如Glanzmann’s血栓形成症和Hermansky-Pudlak症候群。血小板相關出血疾病患者的過度自發或手術相關出血也可以藉由治療劑量的本文所述的FX活化劑（例如，RVV-X）或其藥物組合物（例如，RVV-X先導製劑）來控制。例如，在手術前、手術中和/或手術後，可使用FX活化劑或其藥物組合物治療患有格蘭茲曼血栓形成症的患者，以防止大出血。 [獲得性出血性疾病]
出血性疾病也可以是獲得性的，而不是先天性的。本文所述的FX活化劑（例如，RVV-X）或其藥物組合物（例如，RV-X先導製劑）也可用於治療獲得性出血性疾病。獲得性出血性疾病包括外科手術引起的凝血障礙或藥物誘導的凝血障礙，例如化療方案引起的血小板減少症。在一些示例中，FX活化劑或其藥物組合物可用作過量抗凝劑治療劑的解毒劑。FX活化劑或其藥物組合物也可用於治療獲得性凝血因子缺乏症，如由於肝病導致的獲得性因子X缺乏症、維生素K缺乏症。可受益於FX活化劑或其藥物組合物治療的其他獲得性出血性疾病包括溶血性尿毒癥症候群、過敏性紫癜（過敏性紫斑，Henoch Schonlein purpura）和彌散性血管內凝血（DIC）。
在一些實施例中，本文所述的FX活化劑（例如，RVV-X）或其藥物組合物（例如，RVV-X先導製劑）可用於治療受試者因創傷或手術或血小板計數或活性降低而引起的出血事件。例如，可使用FX活化劑或其藥物組合物治療例如由於輸血引起的血液稀釋性凝血障礙或創傷後的急性創傷性凝血障礙。用於手術患者的示例性方法包括在治療和手術之前、期間或之後防止出血或治療，例如但不限於心臟手術、血管成形術、肺手術、腹部手術、脊柱手術、腦手術、血管手術、牙科手術或器官移植手術，包括骨髓、心臟、肺、胰腺或肝臟移植。在一些實施例中，獲得性出血性疾病是化療獲得性血小板減少症、其他凝血障礙、移植獲得性出血（例如，骨髓移植（BMT）或乾細胞移植（SCT）後的嚴重出血），抗凝治療引起的出血（接受抗凝治療以治療血栓栓塞等疾病的患者在急性服用抗凝劑，如華法林、肝素、磺達肝素和利伐沙班後，可能出現出血事件，或由於長期使用此類治療而出現出血性疾病），或獲得性血友病。 [創傷與外科出血]
本文所述的FX活化劑（例如，RVV-X）或其藥物組合物（例如，RVV-X先導製劑）可用於治療具有正常凝血系統的受試者中與圍手術期失血和創傷性失血相關的出血。例如，FX活化劑或其藥物組合物可施用於患者以促進凝血並減少與手術相關的失血，進一步減少輸血需求。
在一些實例中，本文所述的FX活化劑（例如，RVV-X）或其藥物組合物（例如，RVV-X先導製劑）可施用於經歷各種類型手術的凝血功能正常的患者，以實現快速止血並防止失血。用FX活化劑或其藥物組合物治療可促進手術部位的止血並減少或防止失血，從而減少或消除輸血的需要。在一些實施方案中，FX活化劑或其藥物組合物可表現出增強的性質，例如半衰期延長、對循環蛋白酶抑制劑的抗性和/或催化活性提高，因此，可以以例如，較低劑量、較少頻率給藥，且具有更少的不良反應。
本文所述的FX活化劑（例如，RVV-X）或其藥物組合物（例如，RV-X先導製劑）也可用於促進創傷受試者的凝血和防止失血。創傷被定義為外來因素對生物組織的損傷，是美國第四大死亡原因。創傷分為鈍性創傷（導致內部壓迫、器官損傷和內部出血）或穿透性創傷（藥劑穿透身體並破壞組織、血管和器官，導致外部出血）。創傷可由多種事件引起，包括但不限於車禍（造成鈍性和/或穿透性創傷）、槍傷（造成穿透性創傷），刺傷（造成貫穿性創傷）、機械事故（造成穿透和/或鈍性創傷），以及從高空墜落（造成穿透傷和/或鈍器創傷）。創傷導致的不受控制的出血是大多數相關死亡的原因。
彌漫性凝血障礙是與創傷患者相關的一種相對常見的併發症，在25-36%的患者中發生。凝血障礙可在損傷後早期發展，由多種因素引起，如凝血因子和血小板的稀釋和消耗、纖維蛋白溶解、酸中毒和低溫。常規治療包括藉由輸注新鮮冷凍血漿（FFP）血小板、紅細胞和/或冷凍沉澱物的替代性療法、糾正酸中毒和治療低溫過低。這些步驟通常不足以止血和防止死亡。 [血友病]
如本文所用，“血友病”是指由凝血因子缺乏引起的出血性疾病。血友病可以是由於凝血因子缺乏、表達減少或功能降低導致的。最常見的血友病類型是血友病A，它是由缺乏因子VIII引起的。第二種最常見的血友病是血友病B，它是由缺乏因子IX引起的。血友病C，也稱為FXI缺乏症，是一種較溫和且較不常見的血友病。
如本文所用，“先天性血友病”是指遺傳的血友病類型。先天性血友病是由於凝血因子基因的突變、缺失、插入或其他修飾導致的，在該疾病中，凝血因子的產生缺失、減少或無功能。例如，凝血因子基因的遺傳突變，如因子VIII和因子IX，導致先天性血友病，分別為血友病A和血友病B。
如本文所用，“獲得性血友病”指的是一種在成年期因自身抗體的產生而發生的血友病，該抗體使凝血因子如FVIII失活。因子VIII抑制物可在其他健康個體中自發產生，導致“獲得性血友病”。獲得性血友病是一種罕見的疾病，每年發病率為百萬分之0.2-1.0。自身抗體主要是IgG4抗體，當與FVIII結合時，其藉由干擾凝血酶切割、血管性血友病因子相互作用和/或磷脂結合來抑制FVIII活性。這導致約87%的受影響患者出現危及生命的出血。常見的出血部位是皮膚、黏膜、肌肉和腹膜後，而遺傳性血友病患者主要在關節和肌肉出血。獲得性血友病可用活化凝血酶原複合物濃縮物或重組活化因子VII（NovoSeven®，Novo Nordisk）治療，以控制出血事件。本文所述的FX活化劑（例如，RVV-X）或其藥物組合物（例如，RVV-X先導製劑）可表現出增強的凝血活性，無需FVII替代治療。
血友病是一種出血性疾病，由一種或多種凝血因子缺乏引起。其特徵是在組織損傷部位形成血凝塊的能力降低。先天性X連鎖血友病包括血友病A和血友病B，它們分別由導致FVIII和FIX缺陷的突變引起。血友病A的發病率為每100000名男性中有1名，而血友病B的發病率則為每50000名男性中的1名。血友病A和B進一步分為輕度、中度或重度。功能正常的因子VIII或IX在血漿中的水平為5%-25%時為輕度，1%-5%為中度，低於1%為重度。血友病C，通常被稱為FXI缺乏症，是一種相對溫和和罕見的常染色體隱性疾病，發病率約1/10萬人。
血友病患者反復出現關節和肌肉出血，這可能是自發的，也可能是對創傷的反應。出血可引起嚴重的急性疼痛，活動受限，並導致繼發性併發症，包括滑膜肥大。此外，關節反復出血可導致慢性滑膜炎，會引起關節損傷，破壞滑膜、軟骨和骨骼。出血通常藉由輸注新鮮冷凍血漿（FFP）、FXI替代療法，或局部治療，如對外部傷口或拔牙的治療，纖維蛋白膠。血友病A或B最常見的治療是替代性治療，向患者施用FVIII或FIX。該製劑為血漿衍生產品或重組產品，可市售獲得，現在，重組蛋白是先前未治療患者的治療選擇。雖然這些療法可能非常成功，但如果患者對新施用的因子VIII或因子IX產生抑制物，則會出現併發症。
抑制物是能與FVIII或FIX反應並干擾促凝血功能的IgG抗體，主要是IgG4亞類。抑制物影響大約五分之一的嚴重血友病A患者。儘管受試者後來會產生出抑制物，但大多數受試者在第一次注射因子VIII（通常在兒童早期）後很快產生這些抑制物。抑制物也影響約15分之一的輕度或中度血友病A患者。這些抑制物通常在成年期產生，不僅破壞施用的外源性FVIII，還破壞內源性FVIII。結果，輕度和中度血友病患者病情進一步惡化。臨床上，根據其再次暴露於FVIII時所經歷的記憶反應強度，伴有抑制物的血友病A患者分為高反應者和低反應者。抑制物約影響百分之一的血友病B患者。在大多數情況下，抑制物在第一次注射治療因子IX後產生，並可能伴隨過敏反應。
本文所述的FX活化劑（例如，RVV-X）或其藥物組合物（例如，RV-X先導製劑）以及本文提供的編碼FX激活物的核酸可普遍用於治療血友病患者，包括伴抑制物血友病患者，並可用於治療與血友病相關的出血性病症。本文所述的FX活化劑或其藥物組合物可用於例如控制或預防自發出血事件，或藉由增強凝血酶生成而控制或預防創傷或外科手術引起的出血，同時不再需要FVIIA和/或FIXa。
本文所述的FX活化劑（例如，RVV-X）或其藥物組合物（例如，RVV-X先導製劑）可藉由使用例如動物模型檢測其治療有效性。例如，FVIII或FIX缺陷小鼠（例如，M-KOVIII小鼠）、抗體誘導的血友病小鼠或血友病的任何其他已知疾病模型可以用FX活化劑或其藥物組合物治療。監測疾病症狀和表型的進展以評估FX活化劑或其藥物組合物的效果。FX活化劑或其藥物組合物也可施用於動物模型以及受試者，例如在臨床試驗中，與安慰劑對照和/或使用其他止血劑的對照相比以評估體內有效性。
本文所述的FX活化劑（例如，RVV-X）或其藥物組合物（例如，RVV-X先導製劑）也可用於治療因FVIII和FIX以外的凝血因子缺乏而導致的凝血障礙的患者。例如，FX活化劑或其藥物組合物可用於治療因子VII缺乏症、因子X缺乏症、因子XIII缺乏症和II、IV、V和VI型家族性多凝血因子缺乏症（FMFD）的患者（見於Roberts, H R and M D Bingham, “Other Coagulation Factor Deficiencies,” Thrombosis and Hemorrhage, 2nd ed. Baltimore, Md.: Williams & Wilkins, 1998: 773-802）。 [藥代動力學（PK）]
藥代動力學（PK）是指藥物（例如，FX活化劑，如RVV-X）在向受試者施用後的吸收、分佈、代謝和排泄。可用於確定臨床效用的藥代動力學參數包括但不限於血清/血漿濃度、隨時間變化的血清/血漿濃度、最大血清/血漿濃度（C max）、達到最大濃度的時間（T max）、半衰期（t 1/2）、給藥間隔內濃度-時間曲線下面積（AUC τ）等。
用於獲得藥物的PK曲線的技術是本領域已知的。參見Heller et al., Annu Rev Anal Chem, 11, 2018；和Ghandforoush Sattari et al., J Amino Acids, ArticleID 346237, Volume 2010。在一些實施例中，在個體的血液、血漿或血清樣本中測量FX活化劑（例如，RVV-X）的PK曲線。在一些實施例中，使用質譜技術（例如，LC-MS/MS或ELISA）測量個體中FX活化劑（例如，RVV-X）的PK曲線。可藉由本領域已知的任何方法在PK曲線上進行PK分析，如非室間分析，例如，使用PKSolver V2軟體（Zhang Y. et al., “PKSolver: An add-in program for pharmacokinetic and pharmacodynamic data analysis in Microsoft Excel,” Comput Methods Programs Biomed. 2010; 99(3):306-1)。也可參見實施例1。
“C”表示受試者血漿、血清或任何合適的體液或組織中的藥物濃度，通常表示為每單位體積中的品質，例如納克/毫升或皮克/毫升。為方便起見，血清或血漿中的藥物濃度在本文中稱為“血清濃度”或“血漿濃度”。給藥後任何時間（例如，FX活化劑，例如靜脈注射、腹腔注射或皮下注射）的血清/血漿濃度稱為C time或C t。給藥期間的最大血清/血漿藥物濃度被稱為C max；C min是指給藥間隔結束時的最小血清/血漿藥物濃度；C ave指給藥間隔期間的平均濃度。
術語“生物利用度”是指藥物（例如，FX活化劑，如RVV-X））藉由體循環，從而進入作用部位的程度或速率。
“AUC”是血清/血漿濃度-時間曲線下的面積，被認為是對生物利用度最可靠的測量方式，如給藥間隔內濃度-時間曲線下的面積（AUCτ），“總暴露”或“一段時間內的總藥物暴露”（AUC 0-last或AUC 0-inf），給藥後t時間內的濃度-時間曲線下的面積（AUC 0-t）等。
血清/血漿濃度峰值時間（T max）是給藥後達到血清/血漿濃度（C max）峰值的時間。
半衰期（t 1/2）是指在血漿或血清（或其它生物基質）中測得的藥物濃度（例如，FX活化劑（例如，RVV-X））降至其在特定時間點的濃度或量的一半所需的時間。例如，靜脈給藥後，由於藥物的分佈和消除，血漿或血清中的藥物濃度下降。在靜脈給藥後血漿或血清藥物濃度隨時間變化的曲線中，第一階段或快速下降階段被認為主要是由於分佈導致，而後期的下降通常較慢，主要是由於消除導致，儘管這兩個過程在這兩個階段都會發生。在足夠的時間後，假定藥物的分佈已完成。一般來講，消除半衰期由血漿/血清濃度-時間曲線的終末期或消除（主要）階段決定。參見Michael Schrag和Kelly Regal，“臨床前藥物開發毒理學綜合指南”的“第3章-藥代動力學和毒代動力學”，2013。
在一些實施例中，本文所述的FX活化劑（例如，RVV-X）或其藥物組合物（例如，RVV-X先導製劑）具有至少5小時的半衰期（例如，靜脈注射，如給人類注射），如至少為5.5、6、6.5、6.7、6.8、6.9、7、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.7、9、9.5、10、10.5、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、36、48小時或更長。在一些實施例中，所述FX活化劑或其藥物組合物具有5小時至12小時的半衰期（例如，靜脈注射，如給人類注射），如5小時至10小時、5小時至8.5小時、6.5小時至9小時、6.7小時至8.8小時或7小時至8.5小時。在一些實施例中，所述FX活化劑或其藥物組合物以單次給藥的方式給藥，如單次靜脈注射，如劑量為0.1U/kg至0.48U/kg或0.16U/kg至0.48U/kg。在一些實施例中，所述FX活化劑或其藥物組合物以多次給藥的方式給藥（例如，4-6次，如5次），如靜脈注射，每次劑量為0.1U/kg或0.16U/kg，q4h。
在一些實施例中，本文所述的FX活化劑（例如，RVV-X）或其藥物組合物（例如，RVV-X先導製劑）以單次或多次給藥的方式給藥可提高AUC 0-∞約600 h*pg/mL至4000 h*pg/mL，如650 h*pg/mL至3500 h*pg/mL、650 h*pg/mL至1500 h*pg/mL、900 h*pg/mL至2000 h*pg/mL、1500 h*pg/mL至3500 h*pg/mL,、3200 h*pg/mL至3500 h*pg/mL、1200 h*pg/mL至1500 h*pg/mL、800 h*pg/mL至1000 h*pg/mL、2200 h*pg/mL至2600 h*pg/mL、1000 h*pg/mL至4000 h*pg/mL、2000 h*pg/mL至4000 h*pg/mL、3000 h*pg/mL至4000 h*pg/mL或600 h*pg/mL至1000 h*pg/mL。在一些實施例中，所述FX活化劑或其藥物組合物的給藥劑量為每次0.1U/kg至0.48U/kg或0.16U/kg至0.48U/kg（或單次劑量），如每次0.1U/kg或0.16U/kg。
在一些實施例中，本文所述的FX活化劑（例如，RVV-X）或其藥物組合物（例如，RVV-X先導製劑）以單次給藥的方式給藥（例如，靜脈注射，如向人類注射），如劑量為0.1U/kg至0.48U/kg或0.16U/kg至0.48U/kg，提供的C max約為60 pg/mL至500 pg/mL，如70 pg/mL至450 pg/mL、70 pg/mL至150 pg/mL、100 pg/mL至500 pg/mL、200 pg/mL至500 pg/mL、300 pg/mL至500 pg/mL、400 pg/mL至500 pg/mL、100 pg/mL至300 pg/mL、90 pg/mL至120 pg/mL、100 pg/mL至250 pg/mL、140 pg/mL至180 pg/mL、150 pg/mL至450 pg/mL或270 pg/mL至320 pg/mL。在一些實施例中，在給藥最多10分鐘（例如，最多9、8、7、6、5、4、3、2、1分鐘）內達到C max，如給藥5分鐘。 [藥效學（PD）]
本文所述的FX活化劑（例如，RVV-X）或其藥物組合物（例如，RVV-X先導製劑）可以使用試驗或體內參數評估其生物活性，如體外凝血試驗或血友病模型或個體的藥效學（PD）效應。
PD參數或檢測凝血活性的試驗是本領域已知的，包括單不限於，活化部分促凝血酶原激酶時間（APTT）、因子X活性試驗（FX:C）、凝血酶生成（TG）（包括峰高）、校準的自動凝血酶生成分析（CAT）、內源性凝血酶生成潛力（ETP）、活化凝血時間（ACT）、全凝血時間（WBCT）等。APTT測試是藉由測量在血漿樣本中加入藥物後形成血栓所需的時間（以秒為單位）來測量和評估所有凝血級聯反應的內源性和共同途徑的凝血因子。APTT可使用APTT-ACTIN FSL試劑盒（Siemens，德國）、CS-5100 （Sysmex，日本）自動血液凝血分析儀或STA-CK Prest（斯塔戈，法國）和STA-R Max（Stago）自動凝血分析儀進行評估。FX:C可以藉由使用自動凝血分析儀（Sysmex）或FX顯色活性測定試劑盒進行驗證性凝固試驗。TG可以藉由使用TG（CAT）分析儀（Stago）校準的自動血栓譜分析來測量，如以組織因子（TF）和磷脂（Stago）為觸發器。也可參見實施例1。
在一些實施例中，本文所述的FX活化劑（例如，RVV-X）或其藥物組合物（例如，RVV-X先導製劑）以單次給藥的方式給藥（例如，靜脈注射，如給人類注射），如劑量為0.16U/kg至0.48U/kg，可以i) 增加TG的峰高和ETP，呈劑量依賴性；ii) 在5分鐘達到TG和/或ETP的峰值；iii) 保持TG和/或ETP在較高水平至給藥後4小時；和/或iv) 給藥約24小時後，TG和/或ETP恢復至劑量前水平。
在一些實施例中，本文所述的FX活化劑（例如，RVV-X）或其藥物組合物（例如，RVV-X先導製劑）以單次給藥的方式給藥（例如，靜脈注射，如給人類注射），如劑量為0.16U/kg至0.48U/kg，可以i) 縮短APTT，呈劑量依賴性；ii) 縮短APTT至少約5%（例如，至少約10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、60%、70%或更多）；iii) 給藥後約5分鐘APTT的縮短達到最大；和/或iv) 給藥約24小時後，APTT恢復至劑量前水平。
在一些實施例中，本文所述的FX活化劑（例如，RVV-X）或其藥物組合物（例如，RVV-X先導製劑）以多次給藥的方式給藥（例如，靜脈注射，如給人類注射），如劑量為0.1U/kg或0.16U/kg至0.48U/kg，q4h，2-6次（例如，2、3、4、5或6次），能夠i) 在首次給藥10分鐘內縮短APTT；ii) 縮短APTT至少約20%（例如，至少約25%、30%、35%、40%、45%、50%、60%、70%或更多）；iii) 縮短APTT至少約20秒（例如，至少約21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、40、50、60、70、80或更多）；iv) 第三次給藥4小時後APTT達到平台期；v) 縮短APTT至末次給藥後約8小時；和/或vi) 末次給藥約28小時至26小時後，APTT恢復至劑量前水平。 [安全性]
本文所述的FX活化劑（例如，RVV-X）或其藥物組合物（例如，RVV-X先導製劑）的安全性結果可以藉由生命體徵、身體檢查、實驗室檢查結果、心電圖（ECG）、超聲（雙下肢腹部和深靜脈）和不良事件概述來評估。不良事件的嚴重程度可參考NCI的不良事件通用術語標準（CTCAE v5.0）來確定。參見實施例1、表4-1、表4-2、表S1、表S2的安全性測量方法和參數。例如，可以檢測劑量限制性毒性（DLT）事件、嚴重不良事件（SAE）、導致停藥的不良事件（AE）、劑量依賴性的AE、藥物相關的AE、藥物相關的SAE或疑似意外嚴重不良反應（SUSAR）。其他不良參數包括但不限於臨床相關的凝血異常、下肢深靜脈血栓形成（DVT）、血栓事件、D-二聚體（血凝塊溶解時產生的蛋白片段）增加、纖維蛋白降解產物（FDP）增加等。不良參數還包括FX水平和/或纖維蛋白原（FIB）水平下降超過正常值範圍，和/或一段時間後（例如，3小時）不能恢復正常範圍。
在一些實施例中，本文所述的治療出血性疾病的方法（例如，單次或多次給藥），以及本文所述的FX活化劑（例如，RVV-X）或其藥物組合物（例如，RVV-X先導製劑）不誘導或誘導低水平不良反應，如藉由本文所述的一個或多個參數和/或試驗測定。沒有或較低水平的不良反應包括但不限於，1-2級內的AE（例如，藥物相關的AE）；3級AE少於總AE的5%（例如，少於5%、4%、3%、2%、1%或0%）；各劑量依賴性的AE、DLT事件、SAE、AE、導致停藥的AE、藥物相關的SAE、SUSAR、臨床相關的凝血異常、DVT、DIC、D-二聚體增加、FDP增加和/或靜脈血栓事件少於總AE的5%（例如，少於5%、4%、3%、2%、1%或0%）；FX水平和/或FIB水平在正常範圍內的降低等。 [免疫原性]
在給患者施用蛋白質藥物的上下文中，術語“免疫原性”被定義為該蛋白質藥物在給藥後或反復給藥後對病人產生免疫反應的傾向。
血漿中的抗FX活化劑（例如，抗RVV-X）結合抗體可以藉由有效的電化學發光分析法（Meso Scale Discovery）檢測。可進一步評估抗體效價和中和抗體（針對FX活化劑）。
在一些實施例中，本文所述的治療出血性疾病的方法（例如，單次或多次給藥），以及本文所述的FX活化劑（例如，RVV-X）或其藥物組合物（例如，RVV-X先導製劑）不誘導中和抗體或誘導低效價（例如，少於30、20、10、5或2）的中和抗體。
在一些實施例中，本文所述的治療出血性疾病的方法（例如，單次或多次給藥），以及本文所述的FX活化劑（例如，RVV-X）或其藥物組合物（例如，RVV-X先導製劑）i) 在血漿中不會誘導抗FX活化劑（例如，抗RVV-X）的結合抗體，或誘導低效價（例如，少於30）的結合抗體；和/或ii) 不會使得抑制物效價增加或抑制物效價的增加少於10%。 [V.製品及試劑盒]
進一步提供包含本文所述的任何FX活化劑（例如，RVV-X）或其藥物組合物（例如，RVV-X先導製劑）的試劑盒、單位劑量和製品。在一些實施例中，提供包含本文所述的任一種FX活化劑藥物組合物的試劑盒，並且較佳地提供其使用說明，如用於治療本文所述的出血性疾病（例如，血友病A或B，伴或不伴抑制物）。
在一些實施例中，所述FX活化劑（例如，RVV-X）藥物組合物（例如，凍乾的，如RVV-X先導製劑）包裝在小瓶中（例如，具有可被皮下注射針刺穿的塞子）。在一些實施例中，所述藥物組合物為粉末狀。在一些實施例中，每小瓶裝有5 U的FX活化劑（例如，RVV-X）。在一些實施例中，所述試劑盒進一步提供說明書，說明藥物組合物用2ml 0.9%氯化鈉注射液複溶。在一些實施例中，所述試劑盒進一步提供說明書，說明藥物組合物用於靜脈注射。在一些實施例中，所述試劑盒進一步包含注射針。在一些實施例中，所述試劑盒進一步包含裝在單獨容器中的0.9%氯化鈉注射液。
本發明的試劑盒包括一個或多個包含本文所述的FX活化劑（例如，RVV-X）或其藥物組合物（例如，RVV-X先導製劑）的容器，例如，用於治療出血性疾病。例如，包含描述施用FX活化劑（例如，RVV-X）或其藥物組合物以治療疾病出血性疾病（如血友病）的說明書。試劑盒可能進一步包含識別個體是否患有疾病和疾病階段以選擇適合治療的個體（例如，人類）的描述。與FX活化劑（例如，RVV-X）或其藥物組合物的使用相關的說明通常包括關於預期治療的劑量、給藥計畫和給藥途徑的資訊。容器可以是單位劑量、散裝包裝（例如，多劑量包裝）或亞單位劑量。本發明的試劑盒中提供的說明通常是寫在標籤或藥品說明書上的書面說明（例如，試劑盒中包括的紙張），但機器可讀說明（例如，存儲在磁片或光碟上的說明）也是可以接受的。本發明的試劑盒採用合適的包裝。合適的包裝包括但不限於小瓶、瓶子、罐子、軟包裝（例如，密封的聚酯薄膜或塑膠袋）等。還考慮與特定裝置結合使用的包裝，如輸液裝置如微型泵。試劑盒可具有無菌接入埠（例如，容器可為靜脈注射溶液袋或具有可被皮下注射針刺穿的塞子的小瓶）。該組合物中的至少一種活性劑是如本文所述的FX活化劑（例如，RVV-X）。容器可進一步包含第二種醫藥活性劑。試劑盒可選擇性地提供附加組分，如緩衝液和解釋資訊。一般來說，試劑盒包含一個容器和容器上或與容器相關的標籤或藥品說明書。
本發明還提供製品，包括小瓶（如密封小瓶）、瓶、罐、軟包裝等。該製品包含容器和容器上或與容器相關的標籤或藥品說明書。合適的容器包括，例如，瓶子、小瓶、注射器等。容器可以由多種材料製成，如玻璃或塑膠。一般來說，容器容納的組合物可有效治療本文所述疾病或紊亂，並且可具有無菌接入埠（例如，容器可為靜脈注射溶液袋或具有可被皮下注射針刺穿的塞子的小瓶）。標籤或藥品說明書表明該組合物用於治療個體的特定病症。標籤或藥品說明書進一步包含向個體施用組合物的說明。標籤可能會注明複溶和/或使用的說明。容納藥物組合物的容器可以是多次使用的小瓶，允許複溶製劑重複給藥（例如，2-6次給藥）。藥品說明書是指通常包含在治療產品商業包裝中的說明書，其中包含與此類治療產品使用有關的適應症、用法、劑量、給藥、禁忌症和/或警告資訊。此外，製品可能進一步包含第二容器，包含藥學可接受的緩衝液，如注射用抑菌水（BWFI）、磷酸鹽緩衝鹽水、林格溶液和葡萄糖溶液。從商業和用戶角度來看，可能進一步包括其它需要的材料，包括其它緩衝液、稀釋劑、篩檢程式、針頭和注射器。
所述試劑盒或製品包括多個單位劑量的藥物組合物和使用說明書，其包裝量足以在藥房中儲存和使用，例如，醫院藥房和複方藥房。 [具體實施方式]
以下實施例旨在僅僅作為本發明的示例，因此不應被視為以任何方式限制本發明。提供以下實施例和詳述僅用於說明而非限制。 實施例1：FX活化劑RVV-X在伴抑制物血友病A或B患者中的首個人體I期研究
血友病A（HA）和血友病B（HB）是分別由於缺乏因子VIII（FVIII）和因子IX（FIX）引起的遺傳性出血性疾病。這些患者的出血事件（BEs）通常採用因子替代治療；然而，20%-30%的血友病A患者和5%的血友病B患者會產生外源性FVIII或FIX抑制物 1。伴抑制物的患者出血事件難以控制。在這些患者中，藉由替代缺陷因子（取決於抑制物滴度）可能無法實現止血，因此可能需要使用旁路藥物。目前推薦的兩種用於伴抑制物患者的一線旁路藥物是活化的凝血酶複合物濃縮物（aPCC）和活化的重組因子VII（rFVIIa） 2-4。然而，aPCC在中國不可用，且aPCC中微量的因子VIII可能會誘導對FVIII的回憶應答。由於醫療費用較高，rFVIIa並沒有得到廣泛應用，特別是在發展中國家。
RVV-X是一種分子量為93kDa的異源三聚體，從圓斑蝰蛇（ Daboia russellii siamensis）毒液中純化而來。它由α鏈（重鏈）、β鏈（輕鏈1）和γ鏈（輕鏈2） 8-10組成。RVV-X可以特異性激活凝血因子X（FX）。該激活過程包括在FX重鏈N端特定的“Arg-Ile”肽鍵上切割FX，使活性位點充分暴露，產生凝血因子Xa（FXa）。然後FXa與血小板、凝血因子Va（FVa）和損傷部位激活的鈣離子形成凝血酶原複合物，從而增加凝血酶的產生，達到止血的目的 10。臨床前研究證實RVV-X可以將FX激活為FXa，並以劑量依賴的方式增加人血漿中凝血酶的含量和凝血酶產生的峰值。此外，RVV-X能縮短血友病小鼠的APTT，降低血友病小鼠斷尾24小時死亡率。臨床前毒理學研究表明，RVV-X具有較好的耐受性和安全性。
在本研究中，我們對RVV-X進行了I期臨床、首次在人體內、多中心、開放、劑量遞增的研究，評估了RVV-X在分別伴因子VIII/IX抑制物血友病A或B患者中的安全性、藥代動力學（PK）和藥效學（PD）。
伴抑制物HA或HB的中國人群患者在無出血狀態下單次靜脈注射RVV-X（0.01 U/kg、0.04 U/kg、0.08 U/kg、0.16U/kg、0.32 U/kg和0.48 U/kg）或多次靜脈注射RVV-X（0.16U/kg），每4小時（q4h），最多注射6次。本研究註冊於www.clinicaltrials.gov，試驗編號NCT-04747964和NCT-05027230。此外，還評估了多劑量施用0.1 U/kg，每4小时（q4h），注射6次。
單劑量組結果：RVV-X表現出線性的PK曲線。RVV-X給藥後，凝血酶生成（TG）峰值高度的變化和內源性凝血酶生成潛力（ETP）均呈劑量依賴性增加。活化部分促凝血酶原激酶時間（APTT）呈劑量依賴性縮短。
0.16 U/kg多劑量組結果：RVV-X前三次給藥後，TG峰高度的升高，APTT的縮短均達到平台期。0.1 U/kg多劑量組結果：RVV-X前三次給藥後，APTT的縮短達到平台期。在給藥期間，TG峰值持續升高。
綜上，單次注射和多次注射RVV-X都是安全的，且耐受性良好。從單次劑量0.16 U/kg開始，RVV-X顯著改善凝血相關的實驗指標。在多劑量組中，RVV-X以0.16 U/kg劑量給藥4次後，APTT和ETP的改善達到平台期。未報告嚴重不良事件（SAE）或劑量限制性毒性（DLT）事件。未觀察到血栓栓塞事件和彌散性血管內凝血（DIC）。RVV-X給藥後未檢出抗藥抗體。這些結果表明，無論是HA還是HB，RVV-X具有用作血友病患者出血事件按需治療的潛力。 [方法] [研究設計及參與者]
本研究為首次在人體內進行的多中心、開放、劑量遞增的I期臨床研究。本研究在中國醫學科學院血液病醫院（天津，中國）及河南省腫瘤醫院（鄭州，中國）開展，遵循《赫爾辛基宣言》和國際臨床研究管理規範（ICH-GCP）。本研究獲得了各參與中心倫理委員會的批准（XY2019039-EC-2和XY2021034-EC-2）並在www.clinicaltrials.gov上註冊（NCT-04747964和NCT-05027230）。所有受試者在登記前均簽署知情同意書。
患有中度或重度伴有抑制物（分別伴有因子VIII或IX抑制物）血友病A或B（因子活性水平＜5% IU/dL）的中國男性患者（年齡18-65周歲）符合入選標準。排除既往或目前對藥物或蛋白血液製品的任何成分有臨床顯著過敏史、除血友病A或B以外的凝血障礙、血栓栓塞性疾病的受試者。
單劑量組，符合條件的患者分為1組（0.01U/kg，n=2）、2組（0.04U/kg，n=2）、3組（0.08U/kg，n=3）、4組（0.16U/kg，n=3）、5組（0.32U/kg，n=3）和6組（0.48U/kg，n=3），分別接受單次靜脈（IV）注射RVV-X。
0.16 U/kg多劑量組，符合條件的患者（n=6）接受靜脈注射RVV-X，注射劑量為0.16U/kg，每4小時一次（q4h），最多注射6次。根據A期研究結果，0.16U/kg RVV-X可顯著縮短APTT，因此選擇0.16U/kg作為多次劑量遞增的初始劑量。在0.1 U/kg多劑量組中，符合條件的患者（n=6）也接受靜脈注射RVV-X，注射劑量為0.1 U/kg，每4小時一次（q4h），最多注射6次。
劑量遞增從最低劑量RVV-X開始，並遵循逐步遞增劑量的程式。在單劑量組中，RVV-X每次給藥時，首先只向1名受試者給藥。在48小時確認安全性後，再向其餘受試者施用RVV-X。在給藥後的168小時內監測生命體徵、實驗室檢查（見於實施例2“實驗室檢查”各項指標）、心電圖（ECG）、超聲（雙下肢腹部和深靜脈）、不良事件。在耐受性和安全性得到確認後，資料和安全監查委員會決定進行下一個劑量水平。在確認單劑量組的耐受性和安全性後進行多劑量組給藥。
FVIII缺乏的人血漿、FIX缺乏的人血漿和正常人血漿中RVV-X對APTT影響的研究結果表明，0.001U/ml~10U/ml RVV-X可縮短FVIII缺陷和FIX缺陷人血漿中的APTT，並呈劑量依賴性（圖4），據此確定最低預期生物效應劑量（MABEL）為0.001U/ml。根據平均健康人類體重60kg、循環血量4000ml估算，最大推薦起始劑量（MRSD）為0.067U/kg。 [研究藥物及給藥]
用於給藥的製劑包含從圓斑蝰蛇（ Daboia russellii siamensis）的蛇毒中分離和純化的RVV-X（包括SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO：3）及賦形劑。賦形劑包括蔗糖、組胺酸、聚山梨酯酯20和甘露醇。
本品為白色或白色稀疏塊狀或粉末，無菌，用於注射。每個小瓶含有5U的凍乾RVV-X。注射前，每個小瓶用2ml 0.9%氯化鈉注射液複溶。將複溶製劑緩慢靜脈注射給受試者，並根據各組劑量計算每個受試者的注射量。 [測量結果]
觀察以下各項指標：生命體徵、12導聯心電圖、胸片、超聲（腹部、下肢深靜脈）、凝血因子Ⅷ濃度（FVIII:C）、凝血因子Ⅸ濃度（FⅨ:C）、FⅧ或FⅨ抑制物、血常規、血液生化、尿常規、凝血酶原時間（PT）、APTT、纖維蛋白原（FIB）、凝血酶時間（TT）、凝血因子X濃度（FX:C），凝血酶生成（TG）、D-二聚體、纖維蛋白降解產物（FDP）、RVV-X的PK試驗和抗RVV-X抗體。 [藥代動力學（PK）]
血漿RVV-X濃度藉由經驗證的電化學發光分析法測定（Meso Scale Discovery，美國）。定量下限為5pg/mL。 [藥效學（PD）]
評估了APTT、因子X活性分析（FX:C）、凝血酶生成（TG），包括峰值高度、內源性凝血酶生成潛力（ETP）。使用APTT-ACTIN FSL試劑盒（Siemens，德國）、CS-5100（Sysmex，日本）自動血液凝固分析儀或STA-CK Prest（Stago，法國）和STA-R Max（Stago）自動血液凝結分析儀測定APTT。使用自動血液凝固分析儀（Sysmex）藉由驗證的凝血分析對FX:C進行測定。使用TG（CAT）分析儀（Stago）藉由校準的自動血栓圖測定法，以1μM組織因子（TF）和4μM磷脂（Stago）作為觸發因素，對TG進行測定。 [安全性]
藉由生命體徵、體格檢查、實驗室檢查、心電圖（ECG）、超聲（腹部和下肢深靜脈）以及不良事件概況評估安全性結果。不良事件的嚴重程度參照NCI不良事件通用術語標準（CTCAE v5.0）確定。 [免疫原性]
血漿中的抗RVV-X結合抗體藉由經驗證的電化學發光分析（Meso Scale Discovery）進行篩選和確認。對於陽性樣品，進一步測定抗體滴度和中和抗體。 [統計分析]
對人口統計學特徵、PK、PD和安全性結果進行總結統計。在單劑量組，計畫在每個組中至少招募兩名患者，以評估安全性、PK和PD。PK參數包括達到峰值的最大血漿濃度（C max）、從零時到最後一個可測定血藥濃度的採集時間t的血藥濃度-時間曲線下面積（AUC 0-t）、從零外推至無窮遠時間的曲線下面積（AUC 0-∞)、達到最大血漿濃度的時間（T max）、半衰期（t 1/2）、表觀分佈容積（V z）、血漿清除率（CL z）、消除速率常數（λ z），使用Phoenix WinNonlin軟體8.1版，從每個受試者的RVV-X血漿濃度-時間曲線計算從最後一次可量化濃度到無窮遠的時間外推得出的殘留面積百分比（AUC %Extrap）。藉由冪函數模型分析AUC與劑量、C max和劑量之間的關係。在多劑量組中，計算AUC 0-t、AUC 0-∞、t 1/2。 [結果] [研究群體]
單劑量組：本試驗共納入16名中國血友病患者。其中，15名患者為伴有抑制物的血友病A（HA），1名患者為伴有抑制物的血友病B（HB）（ 表 1）。
多劑量組：對於0.16 U/kg組，本試驗共納入7名中國血友病患者，其中，5名受試者接受5次，1名受試對象接受6次，1名患者接受2次。其中，5名患者為伴有抑制物的血友病A（HA），2名患者為伴有抑制物的血友病B（HB）。對於0.1 U/kg組，本試驗共納入6名中國血友病患者，其中，6名受試者均接受6次。其中，5名患者為伴有抑制物的血友病A（HA），1名患者為伴有抑制物的血友病B（HB）（ 表 1）。
所有患者均為漢族，並按照方案要求完成RVV-X給藥。 [表1 入組受試者人口學資料和臨床特徵]
   單劑量組 多劑量組
0.01U/kg (N=2) 0.04U/kg (N=2) 0.08U/kg (N=3) 0.16U/kg (N=3) 0.32U/kg (N=3) 0.48U/kg (N=3) 0.16U/kg (N=7) 0.1 U/kg (N=6)   
年齡（yr）      
    中位數 44.5 35.5 26.0 21.0 31.0 31.0 34 42
    最小～最大 42～47 25～46 20～27 20～29 30～47 27～31 22~48 25~49
體重（kg）      
    中位數 70.90 63.65 59.00 49.00 66.00 66.00 76.00 64.75
    最小～最大 68～73.8 55～72.3 56.1～61 40.4～89.4 51.7～97.7 39.1～85 59~100 59~81
BMI(kg/m 2)      
    中位數 25.45 22.14 19.19 18.22 25.46 23.11 25.991 22.81
    最小～最大 24.66～26.23 19.26～25.02 19.04～21.41 13.98～29.53 18.99～30.84 14.72～28.08 21.41~31.38 19.7~27.1
血友病類型                        
    A 2 2 3 3 3 2 5 5
    B 0 0 0 0 0 1 2 1
血友病嚴重程度                        
重度n(%) 2(100.0) 1(50.0) 2(66.7) 1(33.3) 1(33.3) 2(66.7) 7(100.0) 6(100.0)
中度n(%) 0(0) 1(50.0) 1(33.3) 2(66.7) 2(66.7) 1(33.3) 0(0) 0(0)
血友病嚴重程度的分類。嚴重：因子活性水平（IU/dL）＜1%，中度：因子活性級別（IU/dL）1-5，輕度：因子活性等級（IU/dL）＞5%。
[PK]
單劑量組：劑量為0.16 U/kg、0.32 U/kg和0.48 U/kg時，RVV-X的血漿濃度以劑量依賴性的方式增加，C max以線性PK特徵增加，（ 圖 1A-1C）。C max出現在5分鐘，並在給藥24小時後逐漸恢復到給藥前水平。PK參數分析結果（ 表 2）顯示，單劑量0.16 U/kg、0.32 U/kg和0.48 U/kg RVV-X的C max分別為110.04±32.03 pg/mL、163.51±50.79 pg/mL和296.48±122.65 pg/mL。AUC 0-∞分別為988.38±325.97小時*pg/mL、1419.10±497.46小時*pgs/mL和2478.88±944.98小時*pg/mL，AUC 0-∞也隨著劑量增加而增加。T 1/2分別為7.33±0.55h、8.33±1.41h和7.57±0.68h。 [表2-1 單次注射RVV-X後的PK參數]
參數 0.16U/kg (N=3) 0.32U/kg (N=3) 0.48U/kg (N=3)
C max(pg/mL) 110.04±32.03 163.51±50.79 296.48±122.65
AUC 0-∞(h*pg/mL) 988.38±325.97 1419.10±497.46 2478.88±944.98
T max(h) 0.19±0.10 0.19±0.10 0.22±0.24
t 1/2z(h) 7.33±0.55 8.33±0.41 7.57±0.68
V z(×10 -3U/(pg/mL)/kg) 1.84±0.62 2.90±0.85 2.41±1.17
CL z(×10 -4U/(h*pg/mL)/kg) 1.73±0.52 2.44±0.80 2.21±1.08
λ z(1/h) 0.09±0.01 0.08±0.00 0.09±0.01
AUC _%Extrap(%) 9.90±1.22 12.00±1.75 9.88±1.84
資料用平均數±標準差表示。
0.16 U/kg多劑量組：隨著5次連續給藥，RVV-X的血漿濃度逐漸增加，但增加趨勢逐漸平緩（ 圖 1D）。多次注射0.16 U/kg的PK參數分析結果表明，AUC 0-∞為3342.02 h*pg/mL，T 1/2為8.40小時。
0.1 U/kg多劑量組：隨著6次連續給藥，RVV-X的血漿濃度也逐漸增加（表2-2）。多次注射0.1 U/kg的PK參數分析結果表明，AUC0-∞為1580.93 h*pg/mL，T1/2為8.68小時。 [表2-2 多次注射RVV-X後的血藥濃度 (0.1 U/kg)]
RVV-X的平均血藥濃度 (pg/mL)
N=6 基線 首次給藥後10min 首次給藥後4h 首次給藥後4h10min 首次給藥後8h 首次給藥後8h10min 首次給藥後12h 首次給藥後12h10min
平均值 (SD) 0.0 52.92 (5.91) 28.59 (3.72) 81.41 (7.96) 44.88 (7.60) 87.10 (20.09) 62.02 (9.35) 103.56 (16.01)
RVV-X的平均濃度 (pg/mL)
N=6 首次給藥後16h 首次給藥後16h10min 首次給藥後20h 首次給藥後20h10min 末次給藥後8h 末次給藥後28h 末次給藥後36h   
平均值(SD) 66.50 (14.74) 119.88 (17.27) 69.41 (13.94) 119.94 (15.47) 50.57 (13.00) 9.73 (5.59) 25.29 (44.83)   
單劑量和多劑量方案的PK資料一致且具有可比性。 [PD]
單劑量組：在RVV-X給藥後，TG的峰高和ETP的變化均以劑量依賴性方式增加，在5分鐘達到峰值，在前4小時保持在高水平，並在24小時後逐漸恢復到給藥前水平（ 圖 2A 和 2B）。APTT以劑量依賴性方式縮短，在5分鐘時觀察到APTT的最大縮短，持續到12小時，並在24小時後逐漸恢復到給藥前水平（ 表 3-1）。
在單劑量組中，隨著研究藥物劑量的增加，APTT和ETP的改善越來越明顯，從0.16 U/kg劑量開始，RVV-X顯著改善了凝血相關實驗指標（見實施例2中“實驗室檢測”中的指標）。 [表3-1 單劑量組的APTT]
   APTT值（s）
   0.01U/kg （N=2） 0.04U/kg （N=2） 0.08U/kg （N=3） 0.16U/kg （N=3） 0.32U/kg （N=3） 0.48U/kg （N=3）
患者編碼 1001 1002 2001 2002 3001 3002 3003 4001 4002 4003 5001 5002 5003 6001 6002 6003
Baseline 81.7 89.1 95.6 87.90 85.1 83.00 103.9 95.7 111.50 121.90 86.5 105.60 112.00 90.2 86.3 146.6
5min 88 89.1 91.5 77.10 83.3 67.60 99.1 88.4 71.10 90.90 77.4 75.70 80.20 73.7 67.8 83.90
15min 86 87.7 90.4 75.00 81.8 67.90 100.1 87.8 65.90 87.60 75.7 74.30 80.30 74.1 66.7 85.30
30min 86.3 89 92.2 77.70 82 67.50 97.7 85.8 66.80 90.90 75.4 74.50 81.40 72.1 61.8 84.60
1h 83.8 89.4 92.2 77.80 82 70.40 97.4 88.7 71.90 90.40 71.4 75.40 79.80 70.6 64.3 83.80
2h 85.2 84.4 89.8 77.90 80.2 65.90 96.7 85.6 68.40 91.40 69.6 74.60 69.60 69.6 60 84.00
4h 85.4 85.1 89.5 79.60 85 72.00 99.9 84 71.90 93.50 68.4 78.80 89.70 69.5 56.9 83.90
8h 87 86.8 86.3 81.90 77.1 73.50 90.4 80 84.50 83.70 69.1 86.00 92.80 67.6 55.2 83.30
12h 86.1 84.1 87.7 83.50 77.8 79.30 95.2 80.7 74.30 101.40 71.6 89.60 101.10 70.1 54.7 83.00
24h 83.5 87.4 92.2 85.90 81.8 86.70 104.4 88.9 94.30 111.70 82.8 97.30 110.20 83.9 70.9 166.00
0.16 U/kg多劑量組：在RVV-X的前3次給藥後，TG的峰高持續增加，第4次給藥之後沒有顯著增加。RVV-X給藥後，APTT迅速縮短（首次給藥10min內，與基線水平相比平均縮短約22秒），第3次給藥後4小時降至平台期。這表明RVV-X在給藥4次時已達到最大功效。APTT的縮短持續至最後一次給藥後的8小時，並在最後一次給藥後28-36小時逐漸恢復至給藥前水平（ 表 3-2）。
0.1 U/kg多劑量組：在RVV-X的6次給藥後，TG的峰高持續增加。RVV-X給藥後，APTT迅速縮短（首次給藥10min內，與基線水平相比平均縮短約7秒，給藥3次後，與基線水平相比平均縮短約23秒）。APTT的縮短持續至最後一次給藥後的8小時，並在最後一次給藥後36小時逐漸恢復至給藥前水平（ 表 3-3）。
多劑量的0.16U/kg或0.1 U/kg也顯著改善凝血相關實驗指標。 [表3-2 多劑量組的APTT（0.16 U/kg）]
   APTT值（s）
患者編號 基線 首次給藥後10min 第二次給藥後10min 第三次給藥後10min 第四次給藥後10min 第五次給藥後10min 第六次給藥後10min 末次給藥後8h 末次給藥後28h 末次給藥後36h 首次給藥後168h
1001 83.1 76.8 65.3 58.6 53.8 54.4 51.7 56.2 72.7 78.9 81.8
1002 139.7 105 83.8 65.7 61.5 64 - 62.9 104.8 121.9 142.2
1003 98.5 86.5 72.6 - - - - 68 86.1 124.8 130.1
1004 82.2 77.1 70.3 67.2 63.2 60.4 - 63.1 79.1 78.1 81.3
1005 92.5 49.5 51.9 50.5 45.8 43.8 - 47.2 69.3 80.9 86.6
1006 78.2 60.9 49 44 43.5 48.5 - 55 76.8 78.8 116.8
1007 83.7 74 67.3 59.5 60.5 59.1 - 63.2 81.4 83.9 82.3
註： - 表示該時間點無數據。
[表3-3 多劑量組的APTT縮短量 (0.1 U/kg)]
   APTT縮短的值（s）
N=6 基線 首次給藥後10min 首次給藥後 4h 10min 首次給藥後 8h 10min 首次給藥後 12h 10min 首給藥後16h 10min 首次給藥後20h 10min 末次給藥後8h 末次給藥後28h 末次給藥後36h 首次給藥後168h
平均值 92.30 -6.35 -14.15 -22.62 -25.65 -26.85 -27.00 -23.23 -9.30 -13.15 0.88
[安全性結果]
單劑量組：研究期間，RVV-X在高達0.48 U/kg的劑量下耐受性良好。16名患者中的14名（88%）共報告了36起不良事件（ 表 4-1），其中32起（89%）事件嚴重程度為1級，4起（11%）事件為2級。試驗期間未報告劑量限制性毒性（DLT）事件、嚴重不良事件（SAE）或導致研究停止的不良事件（AE）。此外，不良事件的發生率並沒有隨劑量增加而增加。研究人員判斷的所有與藥物相關的不良事件均為1級，未報告與藥物相關的SAE或疑似意外嚴重不良反應（SUSAR）。
基於不良事件的報告，未發現臨床相關凝血異常的證據，未發現下肢深靜脈血栓形成（DVT），也未報告血栓栓塞事件（表 4-1）。在施用RVV-X的24小時內，每組FX顯示出一定程度的降低，但與基線相比其變化在10%以內（ 圖 3A），實際測量值在正常值的90%以上（ 圖 3B）。該結果表明，RVV-X激活FX是非常安全的，並且對FX的消耗是最小的。 [表4-1 單劑量組的所有AEs]
事件SOC PT 患者數量（%）
RVV-X組   
0.01U/kg (n=2) 0.04U/kg (n=2) 0.08U/kg (n=3) 0.16U/kg (n=3) 0.32U/kg (n=3) 0.48U/kg (n=3) Total (n=16)
血液和淋巴系統疾病
貧血 0(0) 0(0) 1(33.3) 0(0) 1(33.3) 0(0) 2(12.5)
心臟疾病 1(50.0) 0(0) 0(0) 1(33.3) 0(0) 1(33.3) 3(18.8)
竇性心動過緩 0(0) 0(0) 0(0) 1(33.3) 0(0) 1(33.3) 2(12.5)
腦室內缺陷傳導 1(50.0) 0(0) 0(0) 0(0) 0(0) 0(0) 1(6.3)
眼部疾病
眼外肌輕度癱瘓 1(50.0) 0(0) 0(0) 0(0) 0(0) 0(0) 1(6.3)
胃腸道疾病
腹瀉 0(0) 1(50.0) 0(0) 0(0) 0(0) 0(0) 1(6.3)
一般疾病和給藥部位各種反應
流感樣疾病 0(0) 0(0) 0(0) 1(33.3) 0(0) 0(0) 1(6.3)
胸痛 0(0) 1(50.0) 0(0) 0(0) 0(0) 0(0) 1(6.3)
肝膽系統疾病
肝功能異常 1(50.0) 0(0) 0(0) 0(0) 0(0) 1(33.3) 1(12.5)
肝腫大 0(0) 0(0) 0(0) 0(0) 0(0) 1(33.3) 1(6.3)
感染
尿路感染 0(0) 0(0) 1(33.3) 0(0) 0(0) 0(0) 1(6.3)
各類檢查
纖維蛋白D － 二聚體升高 0(0) 0(0) 1(33.3) 0(0) 1(33.3) 0(0) 2(12.5)
纖維蛋白降解物升高 0(0) 0(0) 1(33.3) 0(0) 1(33.3) 0(0) 2(12.5)
血膽紅素升高 0(0) 1(50.0) 0(0) 1(33.3) 0(0) 0(0) 2(12.5)
超聲波掃描異常 1(50.0) 0(0) 0(0) 0(0) 0(0) 0(0) 1(6.3)
抗凝血酶III下降 0(0) 0(0) 0(0) 0(0) 1(33.3) 0(0) 1(6.3)
紅細胞尿陽性 1(50.0) 0(0) 0(0) 0(0) 0(0) 0(0) 1(6.3)
尿隱血陽性 1(50.0) 0(0) 0(0) 0(0) 0(0) 0(0) 1(6.3)
心電圖QT延長 1(50.0) 0(0) 0(0) 0(0) 0(0) 0(0) 1(6.3)
血纖維蛋白原減少 0(0) 0(0) 0(0) 0(0) 1(33.3) 0(0) 1(6.3)
代謝和營養失調
低鉀血症 1(50.0) 0(0) 1(33.3) 0(0) 0(0) 0(0) 2(12.5)
低白蛋白血症 0(0) 0(0) 0(0) 0(0) 1(33.3) 0(0) 1(6.3)
肌肉骨骼和結締組織疾病
肌肉骨骼不適 1(50.0) 1(50.0) 0(0) 0(0) 0(0) 0(0) 2(12.5)
關節微出血 0(0) 1(50.0) 0(0) 0(0) 0(0) 0(0) 1(6.3)
腎臟和泌尿系統疾病
腎積水 0(0) 0(0) 1(33.3) 0(0) 0(0) 0(0) 1(6.3)
腎盂腎盞擴張 1(50.0) 0(0) 0(0) 0(0) 0(0) 0(0) 1(6.3)
皮膚和皮下組織疾病
瘙癢 0(0) 1(50.0) 0(0) 0(0) 0(0) 0(0) 1(6.3)
MedDRA V24.0用於編碼。註：SOC：系統器官分類，PT：首選術語。
0.16U/kg多劑量組：多次注射RVV-X是安全的且是可耐受的。7名患者中的7名（100%）共報告了26起不良事件（AE）（ 表 4-2），其中24起（92%）事件為1級，1起（4%）事件為2級，1例（4%）為3級。不良事件導致6名受試者停止連續給藥，其中1例退出試驗。具體原因為：4例中出現D-二聚體（血凝塊溶解時產生的蛋白片段）和纖維蛋白降解產物（FDP）增加，1例出現纖維蛋白原減少，1例出現右背足寒冷。RVV-X給藥3-4次後，D-二聚體顯著增加，但大多數患者中的最大值均未超過5mg/L，且停止給藥後自動下降。未報告血栓栓塞事件或彌散性血管內凝血（DIC）。在施用RVV-X的24小時內，FX顯示出一定程度的降低，但與基線相比變化在20%以內。
6名受試者共報告了18例與研究藥物RVV-X相關的不良事件，其中17例為1級，1例為3級。大多數不良事件在停止RVV-X後未經治療而恢復。唯一的3級AE是纖維蛋白原（FIB）水平下降。該不良事件的過程：5次RVV-X給藥後，FIB從1.91g/L降至0.92g/L；未經治療，3小時後FIB水平恢復到1.84g/L。在其他受試者中，與基線相比，FIB下降不超過1g/L，且均在正常值範圍內。未報告RVV-X相關的SAE和SUSAR。
在0.16 U/kg的多劑量組中，多達6個劑量的RVV-X沒有引起血栓事件，表明RVV-X在改善血友病患者凝血功能障礙時具有良好的安全性。然而，在施用3-4個劑量的RVV-X後，D-二聚體顯著增加，因此不超過4次連續劑量是更安全的。
0.1 U/kg多劑量組：多次注射RVV-X是安全的且是可耐受的。6名患者共報告了11起不良事件（AE）（ 表 4-2），其中8起（73%）事件為1級，3起（27%）事件為2級。6名受試者共報告了4例與研究藥物RVV-X相關的不良事件，其中3例為1級，1例為2級。大多數不良事件在停止施用RVV-X後未經治療而恢復。未報告RVV-X相關的SAE和SUSAR。結果表明，與0.16U/kg多劑量相比，0.1U/kg多劑量在改善血友病患者凝血功能障礙時具有更好的安全性。 [表4-2 多劑量組的所有AEs]
事件SOC PT 患者數量 (%) 0.16 U/kg (n=7) 患者數量 (%) 0.1 U/kg (n=6)     
血液和淋巴系統疾病        
四肢厥冷 1(14.3) 0(0)  
心臟疾病 肝膽的障礙        
竇性心動過緩 1(14.3) 0(0)  
胃腸道功能紊亂        
腹瀉 1(14.3) 0(0)  
肝膽系統疾病        
膽囊息肉 1(14.3) 0(0)  
肝脂肪變性 1(14.3) 0(0)  
醫學檢查        
纖維蛋白原降解產物增加 6(42.9) 1(16.67)  
纖維蛋白D二聚體增加 6(42.9) 2(33.33)  
血纖維蛋白原減少 3(14.3) 1(16.67)  
心電圖ST段異常 1(14.3) 0(0)  
代謝和營養疾病      
低鉀血 1(14.3) 1(16.67)  
高甘油三酯血症 3(42.9) 1(16.67)  
骨骼肌和結締組織疾病   
肢體疼痛 1(14.3) 1(16.67)  
腎臟和泌尿系統疾病        
腎結石 0(0) 1(16.67)  
腎臟囊腫 0(0) 1(16.67)  
感染性疾病        
上呼吸道感染 0(0) 1(16.67)  
生殖系統和乳腺疾病        
良性前列腺增生 0(0) 1(16.67)  
RVV-X的靶標是FX，因此RVV-X激活FX會導致一定數量的FX消耗。單劑量組和多劑量組（0.16 U/kg組和0.1 U/kg組）的上述結果表明，RVV-X對FX的激活不會導致FX的過度消耗。 [免疫原性] [結合抗體]
單劑量組：在RVV-X給藥前和給藥後第8天，16名受試者中有1名具有較低滴度的結合抗體（＜30）。然而，未觀察到該受試者的抑制物滴度增加。因此，結合抗體陽性的結果被認為與RVV-X無關，但可能與以前使用其他促凝藥物有關。該受試者的APTT和TG在給藥後均有改善。
0.16 U/kg多劑量組：在RVV-X給藥前和給藥後第7天，7名受試者中有1名具有較低滴度的結合抗體（＜30）。然而，未觀察到該受試者的抑制物滴度明顯增加。因此，結合抗體陽性的結果被認為與RVV-X無關，但可能與以前使用其他促凝藥物有關。該受試者的APTT和TG在給藥後均有改善。0.1 U/kg多劑量組：6名受試者均未檢測到結合抗體。 [中和抗體]
在單次注射組和多次注射組中，所有受試者的中和抗體均為陰性（0.16 U/kg組和0.1 U/kg組）。
這些發現得出一個初步結論，即RVV-X具有低免疫原性，並且施用RVV-X不會獲得超敏反應。
綜上，這項首次在人體內進行的RVV-X研究表明，靜脈注射RVV-X單次劑量高達0.48 U/kg和多次注射0.16 U/kg或0.1 U/kg是安全的且耐受性良好。從單劑量0.16 U/kg開始，RVV-X顯著改善凝血相關實驗指標。在多次注射0.16 U/kg RVV-X時，四次給藥後，APTT和ETP的改善達到平台階段。總之，這些結果表明，RVV-X具有作為血友病患者出血事件按需治療的潛力，無論是HA還是HB。這項研究發現將推動RVV-X進入後續臨床試驗，以探索其治療伴有抑制物血友病患者中的出血事件的有效性和安全性。 [參考文獻] 1. Astermark J. Overview of inhibitors. Semin Hematol. 2006;43:S3‐S7. 2. Chevreux G, Faid V, Scohyers JM, Bihoreau N. N-/O-glycosylation analysis of human FVIIa produced in the milk of transgenic rabbits. Glycobiology. 2013;23:1531‐1546. 3. Fenaille F, Groseil C, Ramon C, et al. Mass spectrometric characterization of N-and O-glycans of plasma-derived coagulation factor VII. Glycoconj J. 2008;25:827‐842. 4. Grandoni J, Perret G, Forier C. Kinetic analysis and binding studies of a new recombinant human factor VIIa for treatment of haemophilia. Haemophilia. 2017;23:300‐308. 5. Baxter HC. Anti-Inhibitor Coagulant Complex For Intravenous Use(FEIBA®) Label. 2013.11. 6. Parameswaran R, Shapiro AD, Gill JC, Kessler CM. Dose effect and efficacy of rFVIIa in the treatment of haemophilia patients with inhibitors: analysis from the Hemophilia and Thrombosis Research Society Registry. Haemophilia 2005; 11: 100–6. 7. Santagostino E, Mancuso ME, Rocino A, Mancuso G, Scaraggi F, Mannucci PM. A prospective randomized trial of high and standard dosages of recombinant factor VIIa for treatment of hemarthroses in hemophiliacs with inhibitors. J Thromb Haemost 2006; 4: 367–71. 8. Gowda DC, Jackson CM, Hensley P, Davidson EA. Factor X-activating glycoprotein of Russell's viper venom. Polypeptide composition and characterization of the carbohydrate moieties. J Biol Chem. 1994. 269(14): 10644-50. 9. Takeda S, Igarashi T, Mori H. Crystal structure of RVV-X: an example of evolutionary gain of specificity by ADAM proteinases. FEBS Lett. 2007. 581(30): 5859-64. 10. Tans G, Rosing J. Snake venom activators of factor X: an overview. Haemostasis. 2001. 31(3-6): 225-33. 11. Drug levels, anti-drug antibodies, and clinical efficacy of the anti-TNFα biologics in rheumatic diseases.[J]. Clinical Rheumatology, 2013, 32(10):1429-1435. 實施例2：FX活化劑RVV-X在伴有抑制物的血友病A或B患者中的II期療效研究
經研究者審查後，在I期研究中確定0.16 U/kg多劑量組是安全的，其中，在施用研究藥物RVV-X後，APTT顯著改善。因此，採用0.16 U/kg多劑量方案進行II期試驗（按需治療出血事件的療效觀察試驗）。
進一步擴大了II期試驗的規模：除此前所述入組的8名受試者外（報告了19例出血事件），更多受試者入組該試驗（總N=35），並且報告了更多的出血事件（171例）。
此外，由於0.1 U/kg多劑量組更安全，且APTT改善程度相當。因此，本試驗還進行了0.10 U/kg的多劑量給藥方案（總N=20）。 [研究說明]
II期臨床試驗入選的受試者是伴有抑制物的血友病患者。受試者在出血事件後接受研究藥物治療，並評估療效。
完成I期試驗的受試者，經過研究者評估並獲得受試者知情同意後，可以繼續參與II期試驗。
如果受試者在入組時沒有出血，則可以進行隨訪。在隨訪期間，出現出血事件（非致命性或致殘性出血事件，不包括中樞神經系統出血和胃腸道出血）的受試者立即前往研究中心接受RVV-X治療。入組時發生出血事件的受試者應在入組後立即接受RVV-X止血治療。
給藥方案：連續給藥，兩次給藥之間至少間隔4小時，直到止血，最多給藥6次。可在臨床判斷止血後進行研究藥物的鞏固治療（最後一次給藥後8小時，最多1次，並且對於已經給藥6次的患者，不額外進行鞏固治療）。如果連續6次給藥結束後的4小時，出血事件仍未得到有效控制，且需要進一步治療，則不再繼續給予研究藥物，而應使用當前臨床指南推薦的標準治療方法進行搶救治療（如重組人凝血因子VIIa或PCC），並記錄在案。如果RVV-X連續給藥超過2次但少於6次，但受試者的出血在給藥期間繼續惡化，若研究人員判斷繼續給藥RVV-X可能無法阻止出血且可能存在重大醫療風險，也可以進行搶救治療。
受試者入組後，隨訪至第12周，經研究者評估並獲得受試者知情同意後，可重新入組。對於隨訪期間發生的出血事件，根據首次止血的給藥原則，對所有患者進行按需RVV-X治療，並記錄劑量和給藥頻率，以評估止血效果。如果受試者在研究中心外接受出血事件治療，則應以日記卡的形式詳細記錄出血事件和醫療處理。 [參與者]
II期研究的參與者是分別伴有因子Ⅷ或Ⅸ抑制物的血友病A或血友病B患者。
入組標準：1) 年齡18-65歲，男性；2) 血友病A或B患者；3) 具有高抑制物滴度或高記憶應答的血友病患者：在之前的至少1次測試中，抑制物滴度＞5 BU/ml，並且在入組時抑制物測試呈陽性；4) 能夠建立適當的靜脈通路；5) 受試者在試驗期間和隨訪結束後3個月內沒有生育計畫，並同意採取適當的避孕措施，避免其伴侶懷孕；6) 自願參與並簽署知情同意書。
排除標準：1) 血友病A和B以外的其他凝血障礙；2) 計畫在試驗期間接受免疫耐受誘導治療或凝血因子預防，或停止免疫耐受誘導療法或凝血因子治療少於4周的血友病患者；3) 在研究藥物給藥前7天內接受抗凝或抗纖溶治療，或計畫在試驗期間使用這些藥物；4) 有動靜脈血栓、彌散性血管內凝血、心肌梗死、腦梗死、血栓性微血管病、自身免疫性疾病、惡性腫瘤、肝硬化等疾病史，經研究者判斷不適合入組者；5）血小板減少症（PLT＜100×10 9/L）、中重度貧血（血紅蛋白＜90g/L）；6) 符合以下指標之一的肝病患者：a) 總膽紅素≥正常值上限的2倍，以及b) 丙胺酸胺基轉移酶（ALT）和天冬胺酸胺基轉移酶≥正常值上限的2倍；腎病患者（血清肌酐≥正常上限的1.5倍）；7) 篩查前發生嚴重出血（致命或致殘性出血、中樞神經系統出血或胃腸道出血）；8) 在篩查前4周內接受了大手術並接受了血液或血液成分輸注；9) 抗人類免疫缺陷病毒（HIV）抗體檢測呈陽性，或已知HIV感染，且伴CD4計數＜200細胞/μL；10) 對組合物的任何成分或其他蛋白質血液製品嚴重過敏的；11) 一個月內參加過其他新藥臨床試驗的；12) 研究藥物給藥前7天內使用促凝血藥物（如凝血酶原複合物、重組人凝血因子VIIa）的；或13) 研究者認為不適合參加本試驗的。 [停止給藥參考標準]
在多次給藥過程中，如果受試者的測試結果符合以下任何一項標準，經研究者判斷後，可以停止給藥：i) 纖維蛋白原（FIB）下降超過正常值下限的50%，或與基線相比下降超過1 g/L；ii) APTT恢復到正常值上限以下；iii) D-二聚體顯著高於基線水平且大於5 mg/L；和iv) 發生血栓栓塞事件。
給藥過程中應注意實驗室測試結果的報告，獲得測試結果後應及時做出安全判斷。 [研究藥物及給藥]
用於給藥的製劑包括從圓斑蝰蛇（ Daboia russellii siamensis）蛇毒中分離和純化的RVV-X（包括SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO：3）和賦形劑。賦形劑包括蔗糖、組胺酸、聚山梨酯酯20和甘露醇。每個小瓶含有5U的凍乾RVV-X。注射前，每個小瓶用2ml 0.9%氯化鈉注射液複溶。將複溶製劑緩慢靜脈注射給受試者，並根據劑量方案計算每個受試者的注射量。 [研究設計]
篩選期：受試者簽署知情同意書後開始，並採集基線資料。
隨訪和治療期：受試者在發生出血事件（非致死性或致殘性出血事件）後立即進入研究中心接受RVV-X治療。
隨訪期為12周。受試者完成入組後第12周的隨訪內容後，定義為受試者完成試驗。 [監測指標] [日常安全性監測指標]
體格檢查：全面體檢。
生命體徵：血壓、脈搏、呼吸、體溫。 [實驗室測試]
血常規：測定白細胞（WBC）計數和分類（中性粒細胞絕對值（NEUT#）、淋巴細胞絕對值（LYMP#）、單核細胞絕對值（MONO#），嗜酸性粒細胞絕對值（EOS#）、絕對嗜鹼性粒細胞絕對值（BASO#））、血紅蛋白（HGB）、紅細胞（RBC）計數、紅細胞壓積（HCT）和血小板（PLT）計數。
血生化：測定穀丙轉胺酶（ALT）、穀草轉胺酶（AST）、總蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、總膽紅素（TBIL）、直接膽紅素（DBIL）、鹼性磷酸酶（ALP）、血糖（GLU）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白（LDL-C）、乳酸脫氫酶（LDH）、肌酸激酶（CK）、肌酸激酶同工酶（CK-MB）、肌酐（Cr）、尿素（Urea）、尿酸（UA）、鉀（K）、鈉（Na）、鈣（Ca）、磷（P）和氯（Cl）。
尿常規：晨尿測定尿比重（SG）、pH值、葡萄糖（GLU）、酮體（KET）、尿蛋白（PRO）、白細胞（LEU）、隱血（BLD）、亞硝酸鹽（NIT）、尿膽原（URO）、尿膽紅素（BIL）。
常規凝血功能：檢測凝血酶原時間（PT）、活化部分促凝血酶原激酶時間（APTT）、凝血酶時間（TT）和纖維蛋白原（FIB）。
凝血因子X（FX:C）和凝血酶生成（TG）測定。
纖溶指數檢測：檢測D-二聚體和纖維蛋白降解產物（FDP）。
FVIII和FIX活性以及抑制物測定。
12導聯心電圖。
胸部X光：在篩查期間檢查一次。
感染篩查：篩查期間檢查一次。
B超：包括腹部B超和下肢深靜脈彩超。
免疫原性篩選：檢測抗藥物抗體。
血藥濃度。 [療效終點] [主要療效終點]
有效止血率（所有出血事件）：根據療效評估表（ 表 5）進行判斷，療效等級為良好或以上的評為有效。 [次要療效終點]
首劑給藥後第4h/8h/24h的臨床緩解率（所有出血事件）：臨床緩解定義為每一次出血事件中，首次給藥後患者疼痛明顯緩解和/或出血體徵改善。 [統計分析]
計算有效止血率及其95% CI。計算每次出血事件首次給藥後4h、8h和24h的臨床緩解率及其95% CI。 [結果]
入組的是患有中度或重度血友病A或B且伴有因子Ⅷ或Ⅸ抑制物的中國男性患者（18-65歲）（因子活性水平＜5% IU/dL）。受試者發生出血事件後，使用研究藥物RVV-X進行治療，然後評估治療效果。RVV-X以0.16U/kg每4小時給藥一次，共4-6次。對於0.1 U/kg組，RVV-X以0.1 U/kg每4小時給藥一次，共6次。
先前描述共有8名受試者出現了19次出血事件，所有出血事件在RVV-X以0.16 U/kg給藥4次以內均實現止血，其中16次出血事件達到了臨床試驗方案中規定的“有效止血”標準（“有效止血”在療效等級為優秀或良好時實現，見於 表 5）。擴大試驗規模後，35名受試者共出現了總計171次出血事件，其中，共164次出血事件達到了臨床試驗方案中規定的“有效止血”標準，有效止血率達95.91%。此外，首次給藥有效止血率高達86.21%。在164次有效止血事件中，平均有效止血所需給藥次數為1.6±0.9。
共有20名受試者出現了70次出血事件，所有出血事件在RVV-X以0.1 U/kg給藥6次後達到止血，其中66次出血事件達到了臨床試驗方案中規定的“有效止血”標準，有效止血率達94.29%（“有效止血”在療效等級為優秀或良好時實現，見於 表 5）。此外，首次給藥後有效止血率高達95.00%，該結果在0.16 U/kg組（p=0.64）中不顯著。在66次有效止血事件中，平均有效止血所需給藥次數為2.2±1.2。 [表5 血友病療效評估表]
等級 療效
優秀 首次注射後8小時內，疼痛完全緩解和/或出血症狀改善；在方案結束後24小時內，不需要額外的治療以緩解同一出血部位的持續症狀
良好 首次注射後8小時內，疼痛明顯緩解和/或出血症狀改善；在方案結束後24小時內，需要進行至少一次額外治療才能完全緩解同一出血部位的出血事件
中等 疼痛和/或出血症狀在首次注射後8小時內開始改善；在方案結束後24小時內，需要進行至少一次額外治療才能部分緩解同一出血部位的出血事件
無效 首次注射後8小時內，疼痛和/或出血症狀沒有或僅有輕微改善，或狀況惡化
研究結果發現RVV-X（0.16 U/kg劑量和0.1 U/kg劑量）的治療效果明顯優於凝血酶複合物濃縮物（PCC；有效止血率為50%）[見於J.M. Lusher, “Controlled clinical trials with prothrombin complex concentrates,” Prog Clin Biol Res. 1984;150:277-290])。還發現RVV-X的治療效果與可注射重組人凝血因子VIIa的治療效果相當（有效止血率約為90% [見於C. Knight et al., “Systematic review of efficacy of rFVIIa and aPCC treatment for hemophilia patients with inhibitors,” Adv Ther. 2009;26(1):68-88]）。 實施例3：RVV-X對M-KOFVIII血友病小鼠的研究
FDA批准的活化重組因子VII（rFVIIa，例如，NovoSeven ®RT）藉由與組織因子形成複合物發揮作用，藉由外源途徑激活FX為FXa，然後將凝血酶原轉化為凝血酶以實現止血。NovoSeven ®RT常用於治療伴抑制物的HA和HB患者。然而，它的價格極其昂貴，因此應用有限。此外，非臨床研究表明，NovoSeven ®RT體內半衰期較短：在大鼠中t 1/2為0.5小時，在狗和猴子中t 1/2約為3小時。NovoSeven ®RT的急性給藥小鼠出現肺血管凝固；並且反復注射NovoSeven ®RT的大鼠和食蟹猴均出現肺血栓和注射部位的局部刺激反應。見於NovoSeven : EPAR – SCIENTIFIC DISCUSSION（https://www.ema.europa.eu/en/medicines/human/EPAR/novoseven）及NovoSeven ®RT處方資料（修正的7/2020；https://www.novomedlink.com/rare-bleeding-disorders/products/treatments/novosevenrt/about/why-novosevenrt.html）。
本實施例證明，與NovoSeven ®RT相比，RVV-X具有相當甚至更優的體內治療效果。 [注射用RVV-X對M-KOFVIII血友病小鼠的促凝血藥效預試驗]
試驗選用M-KOFVIII（FVIII基因敲除）血友病小鼠。RVV-X（包含SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 3和SEQ ID NO: 5）通過尾靜脈注射給藥，分別在D1和D5給藥兩次，給藥劑量為0.1 U/kg、1 U/kg、10 U/kg和100U/kg。首次給藥後30 min檢測出血量、出血時間，第二次給藥後30 min檢測凝血酶原時間（PT）、活化部分促凝血酶原激酶時間（APTT）。諾其（NovoSeven ®RT）用作陽性對照。RVV-X稀釋液作為安慰劑（PBO）。
如 表 6所示，M-KOFVIII小鼠的APTT明顯高於正常小鼠。諾其處理的M-KOFVIII小鼠出血時間和出血量均發生降低（資料未顯示），APTT恢復至正常動物的水平（表6）。與未經處理的動物相比，RVV-X在單次靜脈注射0.1 U/kg時即有縮短M-KOFVIII血友病小鼠的APTT的趨勢（41.7±14.9s vs 55.7±10.8s）。在0.1～100 U/kg劑量下單次靜脈注射RVV-X後劑量依賴性地縮短APTT（表6）。RVV-X也不同程度地降低了血友病小鼠的出血時間和出血量（資料未顯示）。0.1 U/kg即為RVV-X作為M-KOFVIII血友病小鼠的藥物活性劑量（PAD）。 [表6 RVV-X對M-KOFVIII血友病小鼠APTT和PT的影響]
組別 供試品/對照品 動物品系 劑量 PT動物數（n） PT（s） APTT動物數（n） APTT（s）
1 RVV-X稀釋液 正常 — 4 9.2±0.2 4 20.1±1.6
2 RVV-X稀釋液 血友病 — 4 9.3±0.4 5 55.7±10.8 *
3 諾其 血友病 3mg/kg 3 6.5±0.1 4 20.4±2.3 ▲
4 RVV-X 血友病 0.1 U/kg 2 9.2±0.4 3 41.7±14.9 *
5 RVV-X 血友病 1 U/kg 4 9.3±0.3 4 25.3±7.0 ▲
6 RVV-X 血友病 10 U/kg 2 8.9±0.5 4 19.0±11.0 ▲
7 RVV-X 血友病 100 U/kg 3 9.3±1.1 3 27.2±12.8 ▲
△在單次注射RVV-X 30分鐘後測定APTT，用平均數±標準差表示；與1組比較， *表示 P≤0.05；與2組比較， ▲表示 P≤0.05；APTT，活化部分凝血活酶時間；諾其，活化的重組因子VII（rFVIIa），已被FDA批准用於治療伴抑制物的血友病A或B。 [注射用RVV-X對M-KOFVIII血友病小鼠APTT的影響]
試驗選用C57BL/6小鼠和M-KOFⅧ血友病小鼠。測試藥物或對照通過尾靜脈單次給藥30 min後，腹主動脈採血，凝固法測定APTT。諾其用作陽性對照。RVV-X稀釋液作為安慰劑（PBO）。
如 表 7所示，M-KOFⅧ血友病小鼠對照組APTT顯著高於正常對照組。諾其處理後，M-KOFⅧ小鼠的APTT顯著降低，接近但仍高於正常動物水平。單次靜脈注射0.25 U/kg-4 U/kg的RVV-X可顯著縮短M-KOFVIII小鼠的APTT，且呈劑量依賴性。此外，單次靜脈注射4 U/kg的RVV-X縮短APTT，其效果甚至優於諾其，且將APTT降至正常水平。1 U/kg的單劑量RVV-X可顯著縮短M-KOFVIII血友病小鼠的APTT，與3mg/kg諾其的效果相當。 [表7 注射用RVV-X對M-KOFⅧ血友病小鼠APTT的影響]
組別 供試品/對照品 劑量 動物品系 動物數（n） APTT（s）
1 RVV-X稀釋液 — C57BL/6 小鼠 12 17.70±1.29
2 RVV-X稀釋液 — 血友病小鼠 12 53.37±12.04 *
3 諾其 3 mg/kg 10 23.95±11.70 ▲
4 RVV-X 4 U/kg 12 18.89±9.35 ▲
5 RVV-X 1 U/kg 10 28.05±4.62 * ▲
6 RVV-X 0.25 U/kg 12 35.38±7.11 * ▲□
△在單次注射RVV-X 30分鐘後測定APTT；NA，不顯著；與1組比較， *表示P≤0.05；與2組比較， ▲表示P≤0.05；與3組比較， □表示P≤0.05。 [注射用RVV-X對M-KOFVIII血友病小鼠出血量、出血時間和斷尾24h死亡率的影響]
出血量和出血事件受多種因素影響，如血小板的數量和品質、毛細血管的結構和功能、血小板與毛細血管的相互作用和凝血因子。而斷尾後24h死亡率受這些因素影響較小，也更接近臨床評價指標，因此作為本實驗的主要評價指標。
試驗選用C57BL/6小鼠和M-KOFⅧ血友病小鼠。單次尾靜脈注射測試藥物或安慰劑，給藥30 min後斷尾測定出血量和出血時間。然後將動物放回原籠繼續飼養，第二天記錄測試動物死亡率。諾其用作陽性對照。RVV-X稀釋液作為安慰劑（PBO）。
如 表 8所示，正常小鼠斷尾24h後死亡率為0%，而M-KOFⅧ血友病小鼠死亡率為66.7%。諾其給藥後顯著降低M-KOFⅧ血友病小鼠斷尾24h死亡率，降至8.3%。單次靜脈注射0.25 U/kg的RVV-X已經證明有能力降低M-KOFVIII血友病小鼠的斷尾24h死亡率。單次靜脈注射0.25 U/kg-4 U/kg的RVV-X明顯抑制M-KOFⅧ血友病小鼠出血傾向（資料未顯示），且24h死亡率的降低呈劑量依賴關係。此外，單次靜脈注射4 U/kg的RVV-X的M-KOFVIII血友病小鼠的死亡率與正常小鼠相同，為0%，該效果明顯優於諾其。 [表8 注射用RVV-X對M-KOFⅧ血友病小鼠斷尾24h死亡率的影響]
組別 供試品/對照品 劑量 動物品系 動物數（n） 死亡率（%）
1 RVV-X稀釋液 — C57BL/6 小鼠 12 0.0%
2 RVV-X稀釋液 — 血友病小鼠 12 66.7%
3 諾其 3mg/kg 12 8.3%
4 RVV-X 4U/kg 11 0.0%
5 RVV-X 1U/kg 12 33.3%
6 RVV-X 0.25U/kg 12 50.0%
[注射用RVV-X不同時間點對M-KOFⅧ血友病小鼠APTT的影響]
本試驗考察了注射用RVV-X對M-KOFⅧ血友病小鼠凝血功能的時效關係。試驗選用C57BL/6小鼠（正常對照組）和M-KOFⅧ血友病小鼠。血友病小鼠單次尾靜脈注射1 U/kg的RVV-X，於給藥後5min、10min、30 min、1h、2h、4h、6h及8h採血，8隻/時間點，檢測APTT。
如 表 9所示，與正常小鼠相比，M-KOFⅧ血友病小鼠的APTT顯著增加。單次靜脈注射1 U/kg劑量的RVV-X，在藥後5 min即可明顯縮短M-KOFVIII血友病小鼠APTT，作用持續至給藥後2 h，給藥後4 h基本恢復至藥前水平，具有明顯的時效關係。 [表9 注射用RVV-X不同時間點對M-KOFⅧ血友病小鼠APTT的影響]
時間點 品系 動物數（n） APTT（s）
藥前 C57BL/6 8 21.2±8.3
藥前 血友病小鼠 8 46.1±7.3 *
藥後5min 8 32.2±16.7 *#
藥後10min 8 25.7±2.3 #
藥後30min 8 30.1±11.1 *#
藥後1h 8 31.5±5.6 *#
藥後2h 8 31.8±5.3 *#
藥後4h 8 40.6±4.2 *
藥後6h 8 38.3±3.5 *
藥後8h 8 46.0±12.7 *
註： *表示與C57BL/6藥前組相比p＜0.05； #表示與血友病小鼠藥前組相比p＜0.05。
基於以上體內藥效試驗，在M-KOFVIII血友病小鼠中單次靜脈注射RVV-X可顯著縮短APTT，在0.1 U/kg劑量下即有縮短APTT的趨勢，在0.25～4 U/kg的劑量範圍內以劑量依賴性的方式顯著縮短血友病小鼠的APTT，且可抑制出血傾向，降低斷尾後死亡率。時效研究表明，靜脈注射1 U/kg 的RVV-X，給藥後5 min-2 h可明顯縮短血友病小鼠APTT，給藥後4h基本恢復至給藥前水平。
對M-KOFⅧ血友病小鼠反復靜脈注射RVV-X，每天5 U/kg劑量，連續4周的毒理學研究顯示，除注射部位形成局部血栓外，無其他全身毒性反應。因此，小鼠的安全劑量確定為5 U/kg。 實施例4：手術患者多劑量注射用FX活化劑的I期臨床研究
在手術患者中進行FX活化劑RVV-X多次給藥的安全性和耐受性研究。選擇二、三類手術患者入組研究，並分為幾個劑量組。共給藥2次：一次在手術前10-15分鐘，一次在手術中（第一次給藥後1.5小時），通過靜脈注射給藥。術後觀察3天，然後完成研究。
試驗共入組18名受試者，包括6名男性和12名女性，其中2名患者接受普通外科手術，5名患者接受泌尿外科手術，11名患者接受婦科手術。
試驗期間共發生9例（13例次）不良事件，均為輕度，包括7例次白細胞增加、1例次紅細胞減少、1例次血紅蛋白降低、1例次凝血功能國際標準化比值（INR）增加、1例次凝血功能凝血酶原時間（PT）延長、1例次皮疹、1例次左上肺結節陰影。其中，PT延長和皮疹可能與研究藥物有關，其他均與研究藥物無關。除左上肺結節陰影外，所有其他不良事件在試驗結束時均恢復正常。試驗期間未發生嚴重不良事件（SAE）。未發生導致試驗終止的不良事件。
因此，手術患者對注射用FX活化劑的所有劑量均具有良好的耐受性。
還對多次注射FX活化劑RVV-X的手術患者進行了療效研究。數十名手術患者入組研究，並通過靜脈注射施用RVV-X。術後進行觀察。
RVV-X在手術患者中顯示出治療效果（資料未顯示）。 實施例5：製備凝血因子X活化劑注射粉劑
凝血因子X（FX）活化劑原液取自圓斑蝰蛇的毒液，經CN109943554A（其內容藉由整體引用併入本文）中實施例6的方法製備獲得，其餘輔料除非特別說明，均為注射級別。
按照 表 10A中的處方稱取處方量的穩定劑、緩衝劑、賦形劑、表面活性劑、抗氧劑、二價鈣鹽，加入適量注射用水攪拌至完全溶解（當表面活性劑為液體時，可先溶解其他組分，再加入液體表面活性劑攪拌均勻），加入處方量FX活化劑原液，用HCl或NaOH調pH，最後加注射用水定容至刻度，混合均勻後，經0.22μM濾膜過濾至無菌容器中，製備成半成品溶液。 [表10A FX活化劑製劑處方1-10]
處方成分 用途 製劑處方 #
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
凝血因子X活化劑 活性成分（U/ml） 50 50 10 1 5 10 100 5 50 1
人血白蛋白 穩定劑（mg/ml） 1                           
蔗糖    30    15    50 50 40      
海藻糖       60    30          30 40
組胺酸 緩衝劑（mg/ml）    5    10    4          4
精胺酸       3    4    2 3 15   
甘胺酸 20                           
聚山梨酯20 表面活性劑（mg/ml）    0.1          0.3    0.3      
聚山梨酯80       0.05    0.5             0.1
泊洛沙姆188          0.1       0.2    0.5   
甘露醇 賦形劑（mg/ml） 50 60 10 55 40 40 30 30 40 30
蛋胺酸 抗氧劑（mg/ml）       0.05    1       0.3      
氯化鈣 二價鈣鹽（mg/ml）          1 10             3
溶液pH值    6.85 6.85 6.80 6.00 6.30 6.80 7.30 7.00 6.50 8.00
根據 表 10A製備FX活化劑製劑1-10（製劑1作為對照組），按0.53±0.03ml/瓶分裝至中硼矽玻璃注射劑瓶中，半壓塞，經冷凍乾燥，即得FX活化劑注射粉劑（以下簡稱“FX活化劑製劑1-10注射粉劑”）。
冷凍乾燥的具體步驟參照表10B進行： [表10B 冷凍乾燥工藝參數]
過程 階段 設定溫度（℃） 設定時間（min） 持續時間（min） 控制真空（mbar）
冷凍控制 第1階段 -3 1 60 —
第2階段 -45 1 180 —
一次昇華 第2階段 -30 1 600 0.15
解析乾燥 第1階段 30 120 120 0.20
第2階段 30 1 120 0.20
“—”表示不設定該參數 實施例6：凝血因子X活化劑製劑性能測試 I) 外觀、水分、複溶時間、pH、生物學活性檢測
對FX活化劑製劑1-10注射粉劑的外觀、水分含量、複溶時間、pH值和生物學活性進行檢測，生物學活性採用凝血儀進行檢測，結果如 表 11所示。 [表11 FX活化劑製劑1-10的檢測結果]
實施例 外觀* 水分 （%） 複溶時間 （s） pH 生物學活性 （相對於標示量,%）
1 1級 1.3 5 6.83 101.0
2 1級 2.1 7 6.81 99.7
3 2級 2.8 13 6.82 99.8
4 1級 1.7 6 6.03 96.5
5 1級 2.1 8 6.21 99.6
6 1級 2.0 7 6.81 99.8
7 1級 2.3 8 7.26 99.8
8 1級 2.1 8 7.02 99.5
9 1級 2.7 8 6.51 99.7
10 1級 2.4 7 7.93 99.5
為更直觀描述外觀，將外觀分為以下4個等級。1級：細膩、飽滿、白色疏鬆體。2級：輕微萎縮，表面略顯粗糙，有顆粒物，輕微離壁。3級：中度萎縮，離壁，塊狀物稍微縮小。4級：嚴重萎縮，塊狀物明顯縮小，嚴重離壁。
如 表 11所示，檢測的製劑的外觀、水分含量、複溶時間、pH值、生物學活性均符合相應的產品標準。除製劑3外，其他注射粉劑製劑的外觀均為細膩、飽滿、白色疏鬆體，加2ml複溶劑後均迅速溶解為無色澄明液體。由於製劑3注射粉劑海藻糖用量較高，甘露醇用量較少，其外觀發生輕微萎縮，水分接近3.0%，複溶時間略微長於其他製劑，但均在30s內，溶解後均為無色澄明液體。所有制劑凍乾前後pH值及生物活性無明顯差異。 II) 高溫、高濕、光照條件下穩定性試驗
由於製劑在儲藏過程中會遇到偏離預設條件的情況，因此，我們利用影響因素試驗考察樣品在短期內暴露於高溫（40±2℃）、高濕（2-8℃，RH 92.5%±5%）及光照（2-8℃，4500±500LX）條件下，對樣品關鍵指標的影響。試驗結果如 表 12、 表 13所示。 [表12 影響因素條件下部分指標]
放置條件 放置 時間 檢測項 製劑處方
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
　 0天 外觀 1級 1級 2級 1級 1級 1級 1級 1級 1級 1級
水分 1.3 2.1 2.8 1.7 2.1 2.0 2.3 2.1 2.7 2.4
複溶時間(s) 5 7 13 6 8 7 8 8 8 7
pH 6.83 6.81 6.82 6.03 6.21 6.81 7.26 7.02 6.51 7.93
高溫 7天 外觀 1級 1級 3級 1級 2級 1級 2級 1級 2級 2級
水分 1.5 2.2 2.9 1.6 2.2 2.1 2.3 2.5 2.7 2.5
複溶時間(s) 5 7 16 8 10 7 8 7 9 9
pH 6.85 6.83 6.80 6.03 6.28 6.81 7.3 7.01 6.5 7.98
14天 外觀 2級 1級 3級 1級 2級 1級 2級 1級 2級 3級
水分 1.5 2.3 2.9 1.8 2.3 2.1 2.3 2.4 2.8 2.6
複溶時間(s) 7 6 17 6 10 8 10 8 9 10
pH 6.85 6.83 6.81 6.01 6.27 6.81 7.28 7.01 6.5 7.98
高濕 7天 外觀 1級 1級 2級 1級 1級 1級 1級 1級 1級 1級
水分 1.4 2.0 2.7 1.7 2.0 2.1 2.4 2.2 2.6 2.4
複溶時間(s) 6 6 14 7 9 6 8 8 7 8
pH 6.86 6.82 6.79 6.01 6.26 6.78 7.29 7.02 6.49 7.96
14天 外觀 1級 1級 2級 1級 1級 1級 1級 1級 1級 1級
水分 1.4 2.1 2.6 1.9 2.0 2.2 2.2 2.4 2.5 2.5
複溶時間(s) 6 8 12 8 7 8 9 9 9 6
pH 6.79 6.84 6.81 5.99 6.26 6.79 7.25 7.02 6.51 7.93
光照 7天 外觀 1級 1級 2級 1級 1級 1級 1級 1級 1級 1級
水分 1.2 2.0 2.8 1.6 2.1 2.1 2.5 2.2 2.6 2.7
複溶時間(s) 6 8 12 7 8 7 7 9 7 8
pH 6.85 6.83 6.77 5.99 6.31 6.82 7.29 7.01 6.49 7.98
14天 外觀 1級 1級 2級 1級 1級 1級 1級 1級 1級 1級
水分 1.3 2.0 2.7 1.6 2.2 2.1 2.2 2.2 2.8 2.5
複溶時間(s) 7 6 12 8 9 9 6 9 9 6
pH 6.84 6.87 6.76 5.99 6.21 6.83 7.26 6.99 6.52 7.96
如 表 12所示，在高溫條件下，隨著儲存時間延長，所有制劑均符合相應的產品標準。製劑3和10的外觀出現萎縮趨勢，複溶時間略微延長。在其他測試條件下，製劑2、4-9與0天相比，外觀、水分、pH無明顯變化。特別是製劑2、4、6和8在外觀上始終維持在1級狀態。 [表13 影響因素條件下的生物活性（%；與標示量相比）]
放置條件 放置時間 製劑處方
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
   0天 101.0 99.7 99.8 96.5 99.6 99.8 99.8 99.5 99.7 99.5
高溫 7天 93.6 98.7 97.9 93.2 100.2 98.9 98.2 99.3 98.6 96.1
14天 85.9 98.2 94.6 90.8 98.6    98.6 98.6 98.7 98.9 92.8
14天下降率 14.95 1.50 5.21 5.91 1.00    1.20 1.20 0.80 0.80 6.73
高濕 7天 99.8 99.6 100.2 96.7 99.7 99.8 99.9 99.6 99.4 99.7
14天 100.3 99.8 99.6 95.8 99.3 99.5 99.6 99.7 99.5 99.8
14天下降率 0.69 -0.10 0.20 0.73 0.30 0.30 0.20 -0.20 0.20 -0.30
光照 7天 96.5 98.5 99.1 95.3 99.4 98.9 99.3 98.8 98.0 94.5
14天 91.4 99.1 96.4 91.2 99.2 98.2 99.1 99.2 98.2 90.1
14天下降率 9.50 0.60 3.41 5.49 0.40 1.60 0.70 0.30 1.50 9.45
如 表 13所示，製劑3、4、10在高溫或光照14天后，活性略有降低，降低率在3.41%-9.45%之間，但仍優於對照組（製劑1）。製劑2、5-9在影響因素條件下活性基本保持穩定，在高溫或光照14天后活性降低率僅低於1.60%。對照組（製劑1）與本發明的技術方案（製劑2-10）相比，FX活化劑的生物活性明顯降低。該結果表明，在高溫和光照條件下，人血白蛋白（HSA）對活性成分（FX活化劑）的穩定和保護作用不足，而本發明的技術方案則能夠提供更加有效的穩定和保護作用。
上述結果表明，本發明的技術方案在高溫、高濕及光照的條件下，均能夠顯著且有效地穩定和保護凝血因子X活化劑的活性。 III) 加速及長期穩定性試驗
對所有制劑進行穩定性研究，以考察生物學活性及不溶性微粒變化情況。 1）生物活性檢測
將製劑1-10置於加速（25±2℃、RH 65±5%）及長期儲存（2-8℃）條件下進行穩定性考察，檢測生物學活性變化情況。結果如 表 14所示。 [表14 加速及長期儲存條件下的生物學活性（%；與標示量相比）]
放置條件 放置 時間 製劑處方
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
　 0月 101.0 99.7 99.8 96.5 99.6 99.8 99.8 99.5 99.7 99.5
加速 　 1月 96.7 99.1 99.0 95.3 101.3 99.1 99.0 100.7 98.5 98.9
2月 96.5 98.9 97.5 93.2 99.2 98.3 98.6 99.2 98.9 98.2
3月 93.2 98.2 96.1 93.3 99.8 98.4 98.7 98.8 99.0 98.5
6月 88.7 98.5 94.3 89.1 98.3 98.2 98.2 98.9 98.3 97.3
下降率 12.18 1.20 5.51 7.67 1.31 1.60 1.60 0.60 1.40 2.21
長期 　 3月 98.3 99.4 99.3 95.9 99.3 99.5 99.9 99.6 99.5 98.6
6月 96.2 99.2 97.5 94.2 98.8 98.9 99.3 99.4 99.1 98.0
下降率 4.75 0.50 2.30 2.38 0.8 0.09 0.50 0.10 0.60 1.51
生物學活性檢測結果表明，在加速或長期儲存6個月後，根據本發明的技術方案配製的凍乾的製劑（製劑2-10），其穩定性均明顯優於對照組（製劑1），特別是製劑2、5-9在加速或長期儲存6個月後活性降低率低於1.60%或0.80%。上述結果表明本發明的技術方案可以使FX活化劑在加速及長期儲存條件下更加穩定。 2）不溶性微粒檢測
由於人體毛細血管的直徑為7-12μm，靜脈給藥過程中，不溶性微粒可能會造成血管栓塞、誘發靜脈炎、肉芽腫、肺動脈高壓及熱原樣反應，對於靜脈給藥的藥物，應避免和減少不溶性微粒的含量。因此，在相關藥物製備過程中需要對不溶性微粒進行檢測。
不溶性微粒主要來源於藥物的生產過程、配伍過程及給藥過程。另外，蛋白質藥物在攪拌、凍乾及儲存過程中也可能產生不溶性微粒。
本發明採用FlowCAM®8000亞可見微粒成像分析系統，藉由電子成像系統拍攝動態流經流通池的微粒，再藉由軟體對不溶性微粒的大小、形態、折光性等參數進行分析，進而對所有圖像進行區分，如蛋白顆粒、矽油、氣泡、纖維等。微粒粒徑的可檢測範圍為2-100μm。
所有注射粉劑製劑於0月、加速6個月後用2ml生理鹽水溶解後，根據《中國藥典》2015版四部通則0903中不溶性微粒檢查方法檢測不溶性微粒情況，結果如 表 15和 表 16所示（表中數據已扣除背景微粒）。 [表15 0月不溶性微粒結果]
不溶性微粒分類　 製劑處方
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
2-10μm 1230 165 612 367 153 161 213 229 216 138
10μm+ 25 4 13 9 5 7 6 6 7 6
25μm+ 5 0 4 0 0 0 0 0 0 0
2-10μm（矽油） 53 33 11 16 18 9 11 22 18 31
10μm+（矽油） 26 12 13 7 7 6 3 0 9 14
25μm+（矽油） 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
纖維 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
合計 1339 214 653 399 183 183 233 257 250 189
2-10μm 占總百分比 96% 93% 95% 96% 93% 93% 96% 98% 94% 89%
如 表 15所示，各凍乾製劑樣品中不溶性微粒的數量均符合藥典要求，但對照樣品（製劑1）中各粒徑的不溶性微粒的數量均明顯高於其他凍乾的製劑。本發明的凍乾的製劑中的不溶性微粒數量均處於較低水平，尤其是製劑2、5-10，其不溶性微粒總數甚至低於260個。這些結果表明本發明的製劑方案能夠顯著減少不溶性微粒。也可參見 圖 5。 [表16 加速6個月不溶性微粒結果]
　不溶性微粒分類 製劑處方
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
2-10μm 11339 1815 5015 3052 1282 1346 1888 1795 1744 1213
10μm+ 193 34 53 68 34 44 33 24 38 26
25μm+ 35 0 11 0 0 0 0 0 0 0
2-10μm（矽油） 67 31 17 25 25 16 23 21 19 33
10μm+（矽油） 20 10 10 5 5 5 6 0 9 14
25μm+（矽油） 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
纖維 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
合計 11654 1890 5106 3150 1346 1411 1950 1840 1810 1286
2-10μm 占總百分比 98% 98% 99% 98% 97% 97% 98% 99% 97% 97%
如 表 16所示，加速儲存6個月後，對照樣品（製劑1）中不溶性微粒明顯增加，其中以粒徑2-10μm範圍的微粒數量最多，如 圖 6所示。可能是由於製劑中添加的人血白蛋白在自身儲存過程中發生了部分聚集，從而造成不溶性微粒含量升高。雖然對照樣品中不溶性微粒的數量仍在合格範圍內，但是遠高於本發明其他製劑樣品中的數量。而本發明的製劑樣品中的不溶性微粒總量均處於較低水平，尤其是製劑2、5-10，其不溶性微粒總量甚至低於2000個。上述結果再一次表明，相對於對照製劑，本發明的技術方案能夠有效改善不溶性微粒含量，從而進一步降低不溶性微粒帶來的風險，提高臨床使用安全性。
綜上所述，本發明採用二糖（即，蔗糖或/和海藻糖）作為穩定劑，並與胺基酸緩衝劑（即，精胺酸或/和組胺酸）組合使用，所得到的製劑不僅顯著提高FX活化劑組合物產品的穩定性，還能夠避免因使用白蛋白作為穩定劑引起的病毒或其他未知成分帶來的潛在風險。尤其當FX活化劑的活性濃度為5U/ml-50U/ml、穩定劑的品質體積濃度為30mg/ml-50mg/ml、緩衝劑的品質體積濃度為3mg/ml-5mg/ml、表面活性劑的品質體積濃度為0.1mg/ml-0.3mg/ml、賦形劑的品質體積濃度為30mg/ml-60mg/ml、製劑的pH為6.8-7.0時，組合物的外觀細膩飽滿，水分含量、複溶時間、pH值、生物學活性均符合產品標準，且在高溫、高濕、光照、加速及長期條件下，組合物的穩定性均保持良好。 實施例7：製劑優化試驗
為進一步優化FX活化劑製劑，按照 表 17，參照實施例5所述的方法配製製劑，以製備濃度為10U/ml，0.5ml/瓶（即，5U/瓶）的凝血因子X活化劑半成品溶液。隨後，將製備的製劑採用如前所述的凍乾工藝製備成注射用無菌粉劑。 [表17 優化FX活化劑的製劑處方]
成分 功能 製劑處方
6 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21
FX活化劑 活性成分（U/ml） 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 5 50
蔗糖 穩定劑（mg/ml） 50 30 30    25 50 30 30 30 30 30 30
海藻糖          30                        
組胺酸 緩衝劑（mg/ml） 4 3    3 3 3 2.5 5 3 3 3 3
精胺酸       3                           
聚山梨醇酯20 表面活性劑（mg/ml） 0.3 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.1 0.3
甘露醇 賦形劑（mg/ml） 40 40 40 40 40 40 40 40 30 60 40 40
pH    6.80 6.85 6.85 6.85 6.8 6.85 6.9 6.85 6.85 6.9 7 6.7
於0月、加速6個月後的樣品用2ml生理鹽水複溶後，根據《中國藥典》2015版四部通則0903中不溶性微粒檢查方法檢測不溶性微粒情況，結果如 表 18-19所示。 [表18 0月時各製劑處方中不溶性微粒的結果]
不溶性微粒分類 製劑處方 #
6 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21
2-10μm 160 100 179 186 173 167 166 175 162 158 154 165
10μm+ 7 3 11 10 8 9 8 6 9 10 8 7
25μm+ 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
2-10μm（矽油） 8 4 9 10 9 9 9 7 6 10 9 8
10μm+（矽油） 6 3 7 6 8 6 8 8 7 6 8 5
25μm+（矽油） 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
纖維 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
合計 181 110 206 212 198 191 191 196 184 184 179 185
[表19 加速6個月後各製劑處方中不溶性微粒的結果]
不溶性微粒分類 製劑處方
6 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21
2-10μm 1340 889 1400 1398 1359 1364 1356 1369 1338 1346 1348 1336
10μm+ 45 30 55 51 48 45 47 45 43 47 45 46
25μm+ 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
2-10μm（矽油） 16 8 20 21 15 18 17 16 13 14 16 17
10μm+（矽油） 5 2 6 7 5 6 7 6 5 6 7 7
25μm+（矽油） 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
纖維 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
合計 1406 929 1481 1477 1427 1433 1427 1436 1399 1413 1416 1406
如 表 18所示，各凍乾製劑樣品的不溶性微粒數量均符合藥典要求。其中，製劑11的不溶性微粒數量最少，穩定性最優。 表 19說明，經6個月的加速實驗，各凍乾製劑中的不溶性微粒總量均處於較低水平，尤其是製劑11，其不溶性微粒總量甚至低於1000個。 實施例8：FX活化劑半成品溶液的性能測試
按照製劑11的處方，製備三批（批號20160306、20160307、20160308）FX活化劑溶液半成品（0.5ml/瓶；未凍乾），隨後進行長期穩定性研究（-70℃以下，24個月）、加速穩定性研究（2~8℃，6個月）及凍融穩定性研究（凍融5次，-70℃/2~8℃），檢測指標包括蛋白質含量、生物學活性（相對於標示量）、pH值和純度（SEC-HPLC法）。 I. 長期穩定性研究
將三批FX活化劑溶液半成品在-70℃條件下儲存24個月，分別在第3、6、9、12、18及24個月進行取樣並檢測。 [表20 半成品溶液的長期穩定性結果]
检测项目 批号 0月 3月 6月 9月 12月 18月 24月 24月相对於0月变化
蛋白质含量（mg/ml） 20160306 0.47 0.52 0.48 0.51 0.52 0.50 0.48 0.01
20160307 0.49 0.51 0.50 0.53 0.53 0.53 0.51 0.02
20160308 0.50 0.52 0.52 0.54 0.54 0.54 0.53 0.03
生物学活性（相对於标示量，%） 20160306 99.9% 100.1% 99.7% 99.3% 99.8% 99.1% 99.2% -0.7%
20160307 100.2% 100.3% 99.9% 99.9% 100.0% 99.9% 99.8% -0.4%
20160308 100.5% 100.2% 100.0% 99.9% 99.5% 99.8% 99.9% -0.6%
pH值 20160306 6.82 6.73 6.75 6.81 6.90 6.85 6.90 0.08
20160307 6.82 6.82 6.73 6.82 6.91 6.84 6.91 0.09
20160308 6.71 6.71 6.72 6.77 6.83 6.88 6.90 0.19
纯度（SEC-HPLC法） 20160306 98.8% 99.4% 99.5% 98.7% 99.6% 99.3% 98.8% 0
20160307 99.0% 99.4% 99.5% 98.9% 99.2% 98.7% 98.4% -0.6%
20160308 99.0% 99.6% 99.3% 98.9% 99.3% 99.2% 99.2% 0.2
檢測結果如 表 20所示：三批半成品溶液在-70℃條件下儲存24個月後，相比於0月時，蛋白質含量變化為0.01mg/ml~0.03mg/ml，生物學活性變化為-0.4%~-0.7%，pH值變化為0.08~0.19，SEC-HPLC法檢測的純度變化為-0.6%~0.2%。這些結果表明，半成品溶液的各檢測指標變化小或基本無變化（製劑處方11），均在可接受標準範圍內。
綜上，凝血因子X活化劑溶液半成品在-70℃保存24個月各檢測指標無差異，且批間一致性較高，製劑穩定性良好 II. 加速穩定性試驗
將上述三批FX活化劑溶液半成品置於2~8℃條件下，分別在第1個月、2個月、3個月與6個月取樣並檢測。 [表21 半成品溶液的加速穩定性結果]
檢測項目 批號 0月 1月 2月 3月 6月 6月相對於0月變化
蛋白質含量（mg/ml） 20160306 0.47 0.47 0.47 0.52 0.47 0
20160307 0.49 0.49 0.49 0.58 0.49 0
20160308 0.50 0.50 0.50 0.59 0.50 0
生物學活性（相對於標示量，%） 20160306 99.9% 100.0% 99.9% 99.7% 99.8% -0.1%
20160307 100.2% 99.9% 100.0% 99.9% 99.7% -0.5%
20160308 100.8% 100.3% 100.4% 99.9% 100.2% -0.6%
pH值 20160306 6.82 6.9 6.8 6.8 6.72 -0.10
20160307 6.82 7.0 6.8 6.8 6.82 0
20160308 6.71 6.8 6.8 6.7 6.80 0.09
純度（SEC-HPLC法） 20160306 98.8% 99.4% 99.1% 99.8% 99.6% 0.8%
20160307 99.0% 99.2% 99.1% 99.6% 99.7% 0.7%
20160308 99.0% 99.2% 99.0% 99.6% 99.8% 0.8%
檢測結果見 表 21，三批半成品溶液在2~8℃儲存6個月後，相對於0月時，蛋白質含量幾乎無變化，生物學活性變化為-0.1%~-0.6%，pH變化為-0.1~0.09，SEC-HPLC法檢測的純度變化為0.7%~0.8%。這些結果表明，在半成品FX活化劑溶液（製劑處方11）中，各檢測指標變化較小甚至無變化，均在可接受標準範圍內。
綜上，凝血因子X活化劑溶液半成品在2~8℃條件下儲存6個月，各檢測指標變化較小甚至幾乎無變化，半成品製劑穩定性良好。 III. 凍融穩定性試驗
將上述三批凝血因子X活化劑溶液半成品反復凍融（在-70℃冷凍24h，在2~8℃條件下複融）1次、2次、3次、4次、5次，分別取樣並檢測。經5次凍融後，相對於未凍融時，三批溶液半成品的蛋白質含量幾乎無變化，生物學活性變化為-0.5%~-0.7%，pH變化為0.02-0.11，SEC-HPLC法檢測的純度變化為0.5%~0.8%。這些結果表明，在半成品FX活化劑溶液（製劑處方11）中，各檢測指標變化較小甚至無變化，均在可接受標準範圍內。
綜上所述，在反復凍融5次時（在-70℃冷凍24h，在2~8℃條件下複融），凝血因子X活化劑溶液半成品（製劑處方11：未凍乾）均能保持穩定。 實施例9：凝血因子X活化劑製劑成品的穩定性研究
按照製劑處方11製備三批(批號：201606008、201606009、201606010)注射用凝血因子X活化劑半成品（規格為0.5ml/瓶），冷凍乾燥後製得成品。對上述成品分別進行長期穩定性研究（2~8℃，48個月）、加速穩定性研究（25℃±2℃，6個月）。檢測產品外觀、不溶性微粒、pH值、滲透壓、水分含量和生物學活性（相對於標示量，%）等指標。 I. FX活化劑製劑成品的長期穩定性試驗
上述三批注射用凍乾的FX活化劑製劑成品在2~8℃條件下儲存30個月，分別在9、18、30個月取樣並檢測。 [表22 三批成品的長期穩定性試驗結果]
檢測項目 批號 0月 9月 18月 30月 30月相對於0月變化
pH值 201606008 6.80 6.92 6.82 7.00 0.20
201606009 6.80 6.91 6.80 6.90 0.10
201606010 6.71 6.91 6.85 6.90 0.19
水分含量 201606008 2.4% 1.6% 1.6% 1.6% -0.8%
201606009 2.3% 1.8% 1.6% 1.6% -0.7%
201606010 2.4% 1.8% 1.9% 2.0% -0.4%
生物學活性 （相對於標示量，%） 201606008 101.0% 100.9% 99.2% 99.2% -1.8%
201606009 99.9% 99.7% 98.9% 99.4% -0.5%
201606010 100.2 99.9% 100.1% 97.9% -2.3%
製劑成品在2~8℃條件下儲存30個月後，其產品外觀、不溶性微粒均符合標準。如表22中所示，放置30個月後，相對於0月時，pH值變化為0.10-0.20，水分含量變化為-0.4%~-0.8%，生物學活性變化為-0.5%~-2.3%。這些結果表明，FX活化劑製劑成品在2~8℃條件下儲存30個月後，各檢測指標變化較小，且均在可接受標準範圍內。
綜上，凝血因子X活化劑製劑成品（凍乾）在2~8℃條件下儲存30個月，穩定性良好。 II. FX活化劑製劑成品的加速穩定性研究
上述三批凝血因子X活化劑製劑成品在25℃±2℃條件下儲存6個月，分別在0、1、2、3、6個月取樣並檢測。 [表23 三批成品的加速穩定性試驗結果]
檢測項目 批號 0月 1月 2月 3月 6月 6月相對於0月變化
水分 201606008 2.4% 2.2% 1.9% 1.9% 1.8% -0.6%
201606009 2.3% 2.2% 1.8% 1.8% 1.9% -0.4%
201606010 2.4% 2.6% 2.2% 2.1% 2.1% -0.3%
pH值 201606008 6.80 6.81 6.68 6.81 6.80 0
201606009 6.80 6.80 6.78 6.80 6.81 0.01
201606010 6.71 6.72 6.71 6.80 6.81 0.10
生物學活性 （相對於標示量，%） 201606008 101.0% 99.1% 100.8% 99.9% 100.1% -0.9%
201606009 99.9% 99.8% 100.0% 99.8% 98.9% -1.0%
201606010 100.2 101.0% 99.8% 99.7% 99.9% -0.3%
三批製劑成品（凍乾）在25℃±2℃條件下加速6個月後，產品外觀及不溶性微粒均符合標準。如 表 23所示：製劑成品在加速條件下（25℃±2℃）儲存6個月後，相對於0月時，水分含量變化為-0.3%~-0.6%、pH值變化為0~0.1，生物學活性變化為-0.3%~-1.0%。這些結果表明，FX活化劑製劑成品在25℃±2℃條件下加速6個月後，各檢測指標變化較小甚至無變化，各指標均在可接受標準範圍內。
綜上，凝血因子X活化劑製劑成品（凍乾）在室溫25℃±2℃條件下保存6個月內，穩定性良好。 實施例10：FX活化劑凍乾製劑的配伍穩定性試驗
本發明的產品（FX活化劑製劑）凍乾後為注射用無菌粉末。該劑型的產品在使用前需使用適量的溶媒溶解後靜脈注射給藥。為研究溶劑的配伍穩定性及其對蛋白質穩定性的影響，根據臨床上常用的配伍用藥方法，選擇滅菌注射用水、0.9%氯化鈉注射液、5%葡萄糖注射液作為溶媒。在起始及終點時間點（保質期或報告時間）檢測製劑的穩定性，以研究配伍穩定性，從而為臨床用藥提供依據。
製劑處方6和製劑處方11的凍乾成品作為示例性製劑，分別用2ml滅菌注射用水、0.9%氯化鈉注射液、5%葡萄糖注射液複溶，輕輕搖勻，得均勻溶液。將複溶的製劑6和製劑11溶液於室溫條件下（25℃）放置0、2、4、6、8h，記錄溶液的外觀，記錄pH、滲透壓、活性、不溶性顆粒、內毒素、生物活性（相對於標示量）和無菌情況。 [表24 製劑處方6的配伍穩定性試驗結果]
溶劑 檢測項目 放置時間 (h)
0 2 4 6 8
2ml 滅菌注射用水 外觀 無色澄明液體 無色澄明液體 無色澄明液體 無色澄明液體 無色澄明液體
pH 6.78 6.81 6.80 6.79 6.82
滲透壓 102 100 101 102 103
活性（%） 97% 102% 96% 80% 76%
2ml 0.9%氯化鈉注射液 外觀 無色澄明液體 無色澄明液體 無色澄明液體 無色澄明液體 無色澄明液體
pH 6.82 6.81 6.82 6.80 6.84
滲透壓 386 389 390 390 388
活性（%） 105% 103% 106% 100% 101%
2ml 5%葡萄糖注射液 外觀 無色澄明液體 無色澄明液體 無色澄明液體 無色澄明液體 無色澄明液體
pH 6.78 6.81 6.83 6.81 6.84
滲透壓 363 365 369 368 370
活性（%） 95% 102% 98% 87% 81%
[表25 製劑處方11的配伍穩定性試驗結果]
溶劑 檢測項目 放置時間（ h ）
0 2 4 6 8
2ml 滅菌注射用水 外觀 無色澄明液體 無色澄明液體 無色澄明液體 無色澄明液體 無色澄明液體
pH 6.82 6.84 6.83 6.85 6.84
滲透壓 101 102 100 101 102
活性（%） 101.0% 102.0% 98.9% 88.3% 82.2%
2ml 0.9%氯化鈉注射液 外觀 無色澄明液體 無色澄明液體 無色澄明液體 無色澄明液體 無色澄明液體
pH 6.85 6.87 6.86 6.84 6.85
滲透壓 379 386 381 385 376
活性（%） 100.0% 103.1% 102.1% 100.8% 101.0%
2ml 5%葡萄糖注射液 外觀 無色澄明液體 無色澄明液體 無色澄明液體 無色澄明液體 無色澄明液體
pH 6.84 6.82 6.85 6.86 6.83
滲透壓 365 361 370 368 364
活性（%） 102.0% 100.5% 99.9% 95.8% 90.8%
如 表 24和 表 25所示，使用3種不同的溶媒複溶並在室溫放置8h後，複溶的製劑6和製劑11的外觀均為無色澄明液體，pH未發生明顯變化。用2ml 0.9%氯化鈉注射液複溶的製劑11用於實施例1、2、4中的給藥。
人體血漿正常滲透壓為280~320 mOsm/kg，用2ml注射用水複溶的製劑6的滲透壓約為85 mOsm/kg，用2ml注射用水複溶的製劑11的滲透壓約為100 mOsm/kg，均低於人血漿正常滲透壓。用2ml 0.9%氯化鈉注射液或5%葡萄糖注射液複溶製劑6和製劑11後，製劑樣品溶液滲透壓均在360~400mOsm/kg之間，高於人血漿正常滲透壓。雖然3種溶媒複溶後的溶液均非等滲，但因本品為靜脈注射，給藥體積小，且人體血漿有一定的緩衝能力，因此，本發明的FX活化劑製劑給藥後不會對血漿滲透壓帶來不利影響。
關於FX活化劑活性的穩定性，用2ml 0.9%氯化鈉注射液複溶製劑6和製劑11，室溫下放置8小時後，FX活化劑的生物活性保持穩定。用2ml注射用無菌水或5%葡萄糖注射液複溶製劑6，室溫放置4小時後，FX活化劑活性基本穩定。用2 ml注射用無菌水或5%葡萄糖注射液複溶製劑11，室溫放置6小時後，FX活化劑活性基本穩定。
對於FX活化劑製劑在凍乾前後的穩定性及配伍穩定性研究表明製劑11穩定性良好。將該製劑按照1.0ml/瓶，生物學活性分別為5U/ml、50U/ml、10U/ml、100U/ml（即5U/瓶、50U/瓶、10U/瓶、100U/瓶4種規格）進行配製。研究上述規格的製劑在各種影響因素條件下的穩定性。結果表明，在各種條件下，上述規格的製劑（僅RVV-X含量不同，其餘組分含量並未變化）在水分、pH、滲透壓及生物學活性等關鍵指標上均能保持相對穩定，表明製劑11對製備不同規格的RVV-X均具有良好的穩定作用（結果未顯示）。
雖然本發明已經藉由上述的一般描述、具體實施方法和實施例進行了詳細的描述，但本領域技術人員基於本發明可以在本發明的範圍內，不偏離本發明的主要目的進行修改和改進，這些修改或改進也屬於本發明的保護範圍。 [序列表] SEQ ID NO: 1 （ RVV-X 重鏈或 α 鏈； 431aa ）LVATSAQFNKAFIELIIIVDHSMAKKCNSTATNTKIYEIVNSANEIFNPLNIHVTLIGVEFWCDRDLINVTSSADETLDSFGEWRASDLMTRKSHDNALLFTDMRFDLNTLGITFLAGMCQAYRSVGIVQVQGNRNFKTAVIMAHELSHNLGMYHDGKNCICNDSSCVMSPVLSDQPSKLFSNCSIHDYQRYLTRYKPKCILYPPLRKDIVSPPVCGNEIWEEGEECDCGSPADCQNPCCDAATCKLKPGAECGNGLCCYQCKIKTAGTVCRRARNECDVPEHCTGQSAECPRDQLQQNGQPCQNNRGYCYNGDCPIMRNQCISLFGSRANVAKDSCFQENLKGSYYGYCRKENGRKIPCAPQDVKCGRLFCLNNSPGNKNPCNMHYSCMDQHKGMVDPGTKCEDGKVCNNKRQCVDVNTAYQSTTGFSQI SEQ ID NO: 2 （ RVV-X 輕鏈 1 或 γ 鏈； 123aa ）VLDCPSGWLSYEQHCYKGFNDLKNWTDAEKFCTEQKKGSHLVSLHSREEE EFVVNLISENLEYPATWIGLGNMWKDCRMEWSDRGNVKYKALAEESYCLIMITHEK EWKSMTCNFIAPVVCKF SEQ ID NO: 3 （ RVV-X 輕鏈 2 或 β 鏈； 135aa ）GLDCPPDSSLYRYFCYRVFKEHKTWEAAERFCMEHPNNGHLVSVESMEEAEFVAKLLSNITEKFITHFWIGLMIKDKEQECSSEWSDGSSVSYDNLDKREFRKCFVLEKESGYRMWFNRNCEERYLFVCKVPPEC SEQ ID NO: 4Suc-Ile-Gly(γPip)Gly-Arg-pNA SEQ ID NO: 5 （ RVV-X 輕鏈 1 或 γ 鏈； 123aa ）VLDCPSGWLSYEQHCYKGFNDLKNWTDAEKFCTEQKKGSHLVSLHSREEE KFVVNLISENLEYPATWIGLGNMWKDCRMEWSDRGNVKYKALAEESYCLIMITHEK VWKSMTCNFIAPVVCKF
無
圖1A-1D描述了單次注射和多次注射RVV-X的PK特徵。患者接受單次靜脈注射RVV-X，3個劑量組分別為0.16 U/kg、0.32 U/kg和0.48 U/kg。圖1A所示為單次注射後血漿中RVV-X的濃度-時間曲線。圖1B所示為單次注射後血漿中RVV-X的半對數藥物濃度-時間曲線。圖1C所示為單次注射後C max和劑量之間的血漿RVV-X濃度分析。圖1D所示為多次注射後血漿中RVV-X的濃度-時間曲線。
圖2A-2B描述了單次注射RVV-X藥效學（PD）特徵。患者接受單次靜脈注射RVV-X，6個劑量組分別為0.01 U/kg、0.04 U/kg、0.08 U/kg、0.16 U/kg、0.32 U/kg和0.48 U/kg。圖2A所示為凝血酶生成（TG）的峰高變化。圖2B所示為內源性凝血酶生成潛力（ETP）的變化。由RVV-X給藥後每個測試時間點的測量值減去基準值得到變化值。
圖3A-3B描述了單次注射RVV-X後的FX血漿濃度（FX:C）。患者接受RVV-X單次靜脈注射，6個劑量組分別為0.01 U/kg、0.04 U/kg、0.08 U/kg、0.16 U/kg、0.32 U/kg和0.48 U/kg。圖3A所示為FX:C的變化。圖3B所示為FX:C值。結果以平均數±標準差表示。
圖4描述了血漿樣品中RVV-X濃度與APTT的關係。
圖5所示為在0月，各凍乾處方中不溶性顆粒的數量。
圖6所示為加速6個月後，各凍乾處方中不溶性顆粒的數量。
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Claims (123)

  1. 一種藥物組合物，包含： i) 凝血因子X活化劑（FX活化劑），其含量為0.1 U/mL至200 U/mL； ii) 穩定劑，其含量為2 mg/ml至100 mg/ml； iii) 緩衝劑，其含量為0.1 mg/ml至50 mg/ml； iv) 表面活性劑，其含量為0.001% (w/v)至0.1% (w/v)；以及 v) 賦形劑，其含量為1 mg/ml至100 mg/ml， 其中，所述藥物組合物的pH值為6.0至8.0。
  2. 如請求項1所述之藥物組合物，其中所述FX活化劑是RVV-X。
  3. 如請求項2所述之藥物組合物，其中所述RVV-X是從圓斑蝰蛇（ Daboia russellii siamensis）的蛇毒中分離得到的。
  4. 如請求項2或3所述之藥物組合物，其中所述藥物組合物中所述RVV-X的純度至少為95%。
  5. 如請求項1至4中任一項所述之藥物組合物，其中所述FX活化劑的含量為1 U/mL至100 U/mL。
  6. 如請求項1至5中任一項所述之藥物組合物，其中所述FX活化劑的含量為5 U/mL至100 U/mL。
  7. 如請求項1至6中任一項所述之藥物組合物，其中所述FX活化劑的含量為5 U/mL至50 U/mL。
  8. 如請求項1至7中任一項所述之藥物組合物，其中所述FX活化劑的含量為10 U/mL。
  9. 如請求項1至8中任一項所述之藥物組合物，其中所述穩定劑包含蔗糖和海藻糖中的一種或兩種。
  10. 如請求項1至9中任一項所述之藥物組合物，其中所述穩定劑是蔗糖。
  11. 如請求項1至10中任一項所述之藥物組合物，其中所述穩定劑的含量為2 mg/ml至60 mg/ml。
  12. 如請求項1至11中任一項所述之藥物組合物，其中所述穩定劑的含量為15 mg/ml至60 mg/ml。
  13. 如請求項1至12中任一項所述之藥物組合物，其中所述穩定劑的含量為30 mg/ml至50 mg/ml。
  14. 如請求項1至13中任一項所述之藥物組合物，其中所述穩定劑的含量為30 mg/ml。
  15. 如請求項1至14中任一項所述之藥物組合物，其中所述緩衝劑包含組胺酸和精胺酸中的一種或兩種。
  16. 如請求項1至15中任一項所述之藥物組合物，其中所述緩衝劑是組胺酸。
  17. 如請求項1至16中任一項所述之藥物組合物，其中所述緩衝劑的含量為2 mg/ml至20 mg/ml。
  18. 如請求項1至17中任一項所述之藥物組合物，其中所述緩衝劑的含量為2 mg/ml至15 mg/ml。
  19. 如請求項1至18中任一項所述之藥物組合物，其中所述緩衝劑的含量為3 mg/ml至5 mg/ml。
  20. 如請求項1至19中任一項所述之藥物組合物，其中所述緩衝劑的含量為3 mg/ml。
  21. 如請求項1至20中任一項所述之藥物組合物，其中所述表面活性劑包含聚山梨醇酯和泊洛沙姆中的一種或兩種。
  22. 如請求項1至21中任一項所述之藥物組合物，其中所述表面活性劑選自聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80和泊洛沙姆188中的一種或多種。
  23. 如請求項1至22中任一項所述之藥物組合物，其中所述表面活性劑是聚山梨醇酯20。
  24. 如請求項1至23中任一項所述之藥物組合物，其中所述表面活性劑的含量為0.005% (w/v)至0.05% (w/v)。
  25. 如請求項1至24中任一項所述之藥物組合物，其中所述表面活性劑的含量為0.01% (w/v)至0.05% (w/v)。
  26. 如請求項1至25中任一項所述之藥物組合物，其中所述表面活性劑的含量為0.01% (w/v)至0.03% (w/v)。
  27. 如請求項1至26中任一項所述之藥物組合物，其中所述表面活性劑的含量為0.02% (w/v)。
  28. 如請求項1至27中任一項所述之藥物組合物，其中所述賦形劑是甘露醇。
  29. 如請求項1至28中任一項所述之藥物組合物，其中所述賦形劑的含量為10 mg/ml至60 mg/ml。
  30. 如請求項1至29中任一項所述之藥物組合物，其中所述賦形劑的含量為30 mg/ml至60 mg/ml。
  31. 如請求項1至30中任一項所述之藥物組合物，其中所述賦形劑的含量為40 mg/ml。
  32. 如請求項1至31中任一項所述之藥物組合物，其中所述藥物組合物的pH值為6.3至7.3。
  33. 如請求項1至32中任一項所述之藥物組合物，其中所述藥物組合物的pH值為6.8至7.0。
  34. 如請求項1至33中任一項所述之藥物組合物，其中所述藥物組合物的pH值為6.85。
  35. 如請求項1至34中任一項所述之藥物組合物，其中所述藥物組合物進一步包含抗氧化劑。
  36. 如請求項35所述之藥物組合物，其中所述抗氧化劑是甲硫胺酸。
  37. 如請求項35或36所述之藥物組合物，其中所述抗氧化劑的含量為0.01 mg/ml至1 mg/ml。
  38. 如請求項35至37中任一項所述之藥物組合物，其中所述抗氧化劑的含量為0.05 mg/ml至1 mg/ml。
  39. 如請求項1至38中任一項所述之藥物組合物，其中所述藥物組合物進一步包含鈣鹽。
  40. 如請求項39所述之藥物組合物，其中所述鈣鹽是氯化鈣。
  41. 如請求項39或40所述之藥物組合物，其中所述鈣鹽的含量為0.1 mg/ml至10 mg/ml。
  42. 如請求項1至41中任一項所述之藥物組合物，其中所述藥物組合物包含： i) RVV-X，其含量為10 U/mL； ii) 蔗糖，其含量為30 mg/ml； iii) 組胺酸，其含量為3 mg/ml； iv) 聚山梨醇酯20，其含量為0.02% (w/v)；以及 v) 甘露醇，其含量為40 mg/ml， 其中，所述藥物組合物的pH值為6.85。
  43. 如請求項1至42中任一項所述之藥物組合物，所述藥物組合物是凍乾的。
  44. 如請求項1至43中任一項所述之藥物組合物，所述藥物組合物是無菌的。
  45. 如請求項43或44所述之藥物組合物，所述藥物組合物在下列條件下是穩定的： i) 複溶後，置於25℃至少4小時； ii) 置於2-8℃至少3個月；和/或 iii) 置於25℃加速穩定條件下至少3個月。
  46. 如請求項43至45中任一項所述之藥物組合物，其中所述藥物組合物在25℃加速穩定條件下儲存6個月後再進行複溶，其包含少於5%的直徑大於10 μm的不溶性顆粒。
  47. 如請求項2至46中任一項所述之藥物組合物，其中所述RVV-X包含： a) i) 重鏈，其包含序列SEQ ID NO: 1，或與SEQ ID NO: 1具有至少80%序列同一性的序列；ii) 輕鏈1，其包含序列SEQ ID NO: 2，或與SEQ ID NO: 2具有至少80%序列同一性的序列；以及iii) 輕鏈2，其包含序列SEQ ID NO: 3，或與SEQ ID NO: 3具有至少80%序列同一性的序列； b) i) 重鏈，其包含序列SEQ ID NO: 1，或與SEQ ID NO: 1具有至少80%序列同一性的序列；ii) 輕鏈1，其包含序列SEQ ID NO: 5，或與SEQ ID NO: 5具有至少80%序列同一性的序列；以及iii) 輕鏈2，其包含序列SEQ ID NO: 3，或與SEQ ID NO: 3具有至少80%序列同一性的序列；或 c) a)和b)的混合物。
  48. 一種治療個體出血性疾病的方法，包括向該個體施用有效量的如請求項1至47中任一項所述之藥物組合物。
  49. 一種治療個體出血性疾病的方法，包括向該個體施用有效量的FX活化劑，其中所述FX活化劑的給藥劑量為0.01 U/kg至0.48 U/kg。
  50. 如請求項49所述之方法，其中所述FX活化劑的給藥劑量為0.08 U/kg至0.48 U/kg或0.1 U/kg至0.48 U/kg。
  51. 如請求項49所述之方法，其中所述FX活化劑的給藥劑量為0.01 U/kg至0.16 U/kg或0.1 U/kg至0.16 U/kg。
  52. 如請求項49至51中任一項所述之方法，其中所述FX活化劑的給藥劑量為0.08 U/kg至0.16 U/kg。
  53. 如請求項49至52中任一項所述之方法，其中所述FX活化劑的給藥劑量為0.1 U/kg、0.12 U/kg、0.14 U/kg或0.16 U/kg。
  54. 如請求項49至53中任一項所述之方法，其中所述FX活化劑的給藥次數為1次。
  55. 如請求項49至53中任一項所述之方法，其中所述FX活化劑最多給藥6次。
  56. 如請求項49至53和55中任一項所述之方法，其中所述FX活化劑的給藥次數為4次。
  57. 如請求項49至53、55和56中任一項所述之方法，其中所述FX活化劑的給藥間隔為每4小時（q4h）至每8小時（q8h）給藥1次。
  58. 如請求項49至53和55至57中任一項所述之方法，其中所述FX活化劑的給藥間隔為q4h。
  59. 如請求項49所述之方法，其中所述FX活化劑的單次給藥劑量為0.01 U/kg至0.48 U/kg。
  60. 如請求項49所述之方法，其中所述FX活化劑的給藥劑量為0.1 U/kg或0.16 U/kg q4h，最多給藥6次。
  61. 如請求項49或60所述之方法，其中所述FX活化劑的給藥劑量為0.1 U/kg或0.16 U/kg q4h，給藥4次。
  62. 如請求項49至61中任一項所述之方法，其中所述FX活化劑是RVV-X。
  63. 如請求項61或62所述之方法，其中所述RVV-X是從圓斑蝰蛇（Daboia russellii siamensis）的蛇毒中分離得到的。
  64. 如請求項63所述之方法，其中所述RVV-X的純度至少為95%。
  65. 如請求項49至64中任一項所述之方法，其中所述FX活化劑包含在藥物組合物中。
  66. 如請求項65所述之方法，其中所述FX活化劑在藥物組合物中的濃度為0.1 U/mL至200 U/mL。
  67. 如請求項65或66所述之方法，其中所述FX活化劑在藥物組合物中的濃度為1 U/mL至100 U/mL。
  68. 如請求項65至67中任一項所述之方法，其中所述FX活化劑在藥物組合物中的濃度為5 U/mL至100 U/mL。
  69. 如請求項65至68中任一項所述之方法，其中所述FX活化劑在藥物組合物中的濃度為5 U/mL至50 U/mL。
  70. 如請求項65至69中任一項所述之方法，其中所述FX活化劑在藥物組合物中的濃度為10 U/mL。
  71. 如請求項65至70中任一項所述之方法，其中所述藥物組合物進一步包含穩定劑、緩衝劑、表面活性劑和賦形劑中的一種或多種。
  72. 如請求項71所述之方法，其中所述穩定劑包含蔗糖和海藻糖中的一種或兩種。
  73. 如請求項71或72所述之方法，其中所述穩定劑是蔗糖。
  74. 如請求項71至73中任一項所述之方法，其中所述穩定劑的含量為2 mg/ml至100 mg/ml。
  75. 如請求項71至74中任一項所述之方法，其中所述穩定劑的含量為2 mg/ml至60 mg/ml。
  76. 如請求項71至75中任一項所述之方法，其中所述穩定劑的含量為15 mg/ml至60 mg/ml。
  77. 如請求項71至76中任一項所述之方法，其中所述穩定劑的含量為30 mg/ml至50 mg/ml。
  78. 如請求項71至77中任一項所述之方法，其中所述穩定劑的含量為30 mg/ml。
  79. 如請求項71至78中任一項所述之方法，其中所述緩衝劑包含組胺酸和精胺酸中的一種或兩種。
  80. 如請求項71至79中任一項所述之方法，其中所述緩衝劑是組胺酸。
  81. 如請求項71至80中任一項所述之方法，其中所述緩衝劑的含量為0.1 mg/ml至50 mg/ml。
  82. 如請求項71至81中任一項所述之方法，其中所述緩衝劑的含量為2 mg/ml至20 mg/ml。
  83. 如請求項71至82中任一項所述之方法，其中所述緩衝劑的含量為2 mg/ml至15 mg/ml。
  84. 如請求項71至83中任一項所述之方法，其中所述緩衝劑的含量為3 mg/ml至5 mg/ml。
  85. 如請求項71至84中任一項所述之方法，其中所述緩衝劑的含量為3 mg/ml。
  86. 如請求項71至85中任一項所述之方法，其中所述表面活性劑包含聚山梨醇酯和泊洛沙姆中的一種或兩種。
  87. 如請求項71至86中任一項所述之方法，其中所述表面活性劑選自聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80和泊洛沙姆188中的一種或多種。
  88. 如請求項71至87中任一項所述之方法，其中所述表面活性劑是聚山梨醇酯20。
  89. 如請求項71至88中任一項所述之方法，其中所述表面活性劑的含量為0.001% (w/v)至0.1% (w/v)。
  90. 如請求項71至89中任一項所述之方法，其中所述表面活性劑的含量為0.005% (w/v)至0.05% (w/v)。
  91. 如請求項71至90中任一項所述之方法，其中所述表面活性劑的含量為0.01% (w/v)至0.05% (w/v)。
  92. 如請求項71至91中任一項所述之方法，其中所述表面活性劑的含量為0.01% (w/v)至0.03% (w/v)。
  93. 如請求項71至92中任一項所述之方法，其中所述表面活性劑的含量為0.02% (w/v)。
  94. 如請求項71至93中任一項所述之方法，其中所述賦形劑是甘露醇。
  95. 如請求項71至94中任一項所述之方法，其中所述賦形劑的含量為1 mg/ml至100 mg/ml。
  96. 如請求項71至95中任一項所述之方法，其中所述賦形劑的含量為10 mg/ml至60 mg/ml。
  97. 如請求項71至96中任一項所述之方法，其中所述賦形劑的含量為30 mg/ml至60 mg/ml。
  98. 如請求項71至97中任一項所述之方法，其中所述賦形劑的含量為40 mg/ml。
  99. 如請求項65至98中任一項所述之方法，其中所述藥物組合物的pH值為6.0至8.0。
  100. 如請求項65至99中任一項所述之方法，其中所述藥物組合物的pH值為6.3至7.3。
  101. 如請求項65至100中任一項所述之方法，其中所述藥物組合物的pH值為6.8至7.0。
  102. 如請求項65至101中任一項所述之方法，其中所述藥物組合物的pH值為6.85。
  103. 如請求項65至102中任一項所述之方法，其中所述藥物組合物進一步包含抗氧化劑。
  104. 如請求項103所述之方法，其中所述抗氧化劑是甲硫胺酸。
  105. 如請求項103或104所述之方法，其中所述抗氧化劑的含量為0.01 mg/ml至1 mg/ml。
  106. 如請求項103至105中任一項所述之方法，其中所述抗氧化劑的含量為0.05 mg/ml至1 mg/ml。
  107. 如請求項65至106中任一項所述之方法，其中所述藥物組合物進一步包含鈣鹽。
  108. 如請求項107所述之方法，其中所述鈣鹽是氯化鈣。
  109. 如請求項107或108所述之方法，其中所述鈣鹽的含量為0.1 mg/ml至10 mg/ml。
  110. 如請求項65至109中任一項所述之方法，其中所述藥物組合物包含： i) RVV-X，其含量為10 U/mL； ii) 蔗糖，其含量為30 mg/ml； iii) 組胺酸，其含量為3 mg/ml； iv) 聚山梨醇酯20，其含量為0.02% (w/v)；以及 v) 甘露醇，其含量為40 mg/ml， 其中，所述藥物組合物的pH值為6.85。
  111. 如請求項65至110中任一項所述之方法，所述藥物組合物是凍乾的。
  112. 如請求項65至111中任一項所述之方法，所述藥物組合物是無菌的。
  113. 如請求項111或112所述之方法，所述藥物組合物在下列條件下是穩定的： i) 複溶後，置於25℃至少4小時； ii) 置於2-8℃至少3個月；和/或 iii) 置於25℃加速穩定條件下至少3個月。
  114. 如請求項111至113中任一項所述之方法，其中所述藥物組合物在25℃加速穩定條件下儲存6個月後再進行複溶，其包含少於5%的直徑大於10 μm的不溶性顆粒。
  115. 如請求項49至114中任一項所述之方法，其中所述FX活化劑通過靜脈給藥。
  116. 如請求項48至115中任一項所述之方法，其中所述出血性疾病是先天性出血性疾病或獲得性出血性疾病。
  117. 如請求項48至116中任一項所述之方法，其中所述出血性疾病選自由因缺乏凝血因子引起的疾病、因存在獲得性凝血因子抑制物引起的疾病、血液疾病、出血性疾病、血管性血友病、因施用維生素K拮抗劑進行抗凝治療引起的疾病、遺傳性血小板疾病、維生素K環氧化物還原酶C1缺乏症、γ-羧化酶缺乏症、與創傷或損傷或外科相關的出血、血栓、血小板減少症、腦中風、凝血功能障礙、彌散性血管內凝血（DIC）、Bernard-Soulier症候群、格蘭茲曼血栓形成症和儲存池缺乏症組成的組中。
  118. 如請求項48至117中任一項所述之方法，其中所述出血性疾病是由於缺乏凝血因子。
  119. 如請求項48至118中任一項所述之方法，其中所述出血性疾病是血友病。
  120. 如請求項48至119中任一項所述之方法，其中所述血友病是血友病A或血友病B。
  121. 如請求項119或120所述之方法，其中所述血友病是伴抑制物血友病。
  122. 如請求項48至121中任一項所述之方法，其中所述個體是人類。
  123. 如請求項62至122中任一項所述之方法，其中所述RVV-X包含： a) i) 重鏈，其包含序列SEQ ID NO: 1，或與SEQ ID NO: 1具有至少80%序列同一性的序列；ii) 輕鏈1，其包含序列SEQ ID NO: 2，或與SEQ ID NO: 2具有至少80%序列同一性的序列；以及iii) 輕鏈2，其包含序列SEQ ID NO: 3，或與SEQ ID NO: 3具有至少80%序列同一性的序列； b) i) 重鏈，其包含序列SEQ ID NO: 1，或與SEQ ID NO: 1具有至少80%序列同一性的序列；ii) 輕鏈1，其包含序列SEQ ID NO: 5，或與SEQ ID NO: 5具有至少80%序列同一性的序列；以及iii) 輕鏈2，其包含序列SEQ ID NO: 3，或與SEQ ID NO: 3具有至少80%序列同一性的序列；或 c) a)和b)的混合物。
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