ES2354129T3 - Complementación de la deficiencia en factor xi mediante mutantes del factor v. - Google Patents

Abstract

Factor V resistente a APC (resistente a proteína activada) para su uso en la prevención o el tratamiento de la hemorragia en un paciente con una deficiencia en factor XI.

Description

La invención se refiere al campo de productos farmacéuticos, en particular factores de coagulación sanguínea y al uso de los mismos para la hemostasia.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La coagulación sanguínea es un proceso altamente regulado requerido para prevenir la pérdida de sangre en respuesta a lesión vascular. Debe desencadenarse inmediatamente tras la lesión y detenerse tan pronto como la vasculatura esté intacta. Cuando se altera este equilibrio entre activación (coagulación) e inactivación (anticoagulación), puede sobrevenir un trastorno hemorrágico o una enfermedad trombótica. Un ejemplo típico de un trastorno hemorrágico es la hemofilia.

Se muestra una vista simplificada del sistema de coagulación en la figura 1. La activación del sistema de coagulación se inicia mediante la formación del complejo TF- FVIIa y se propaga por la acción del complejo FVIIIa-FIXa. El complejo TF-FVIIa activa FX así como FIX para generar FXa y FIXa, respectivamente. El complejo FVIIIa-FIXa, de manera similar a TF-FVIIa, también activa FX. Activando así FIX, se amplifica la acción de TF-FVIIa sobre FX (figura 1). En condiciones fisiológicas, la mayoría de las respuestas hemostáticas necesitan esta amplificación dependiente de FIX y FVIII para garantizar una activación suficiente de FX (y por tanto, la generación de trombina). La falta de este bucle de amplificación se manifiesta por sí mismo en los trastornos hemorrágicos hemofilia A (deficiencia en FVIII) o B (deficiencia en FIX).

Normalmente, la hemofilia se gestiona mediante terapia sustitutiva, que se basa en la complementación del sistema de coagulación defectuoso del paciente con el factor de coagulación deficiente. Por tanto, se infunde a pacientes con hemofilia A y

B concentrados del factor VIII y factor IX para tratar o para prevenir episodios hemorrágicos.

FV desempeña un papel central en la cascada de coagulación. Tras la activación, FVa actúa como un cofactor para FXa, y aumenta la tasa de generación de trombina inducida por FXa en

300.000 veces en comparación con FXa solo (Mann y Kalafatis 2003). Por tanto, el factor V (FV) en su forma activada tiene una función procoagulante crítica.

Un sistema anticoagulante regula las funciones procoagulantes de la cascada de coagulación. Este sistema anticoagulante implica a la proteína C activada (APC), que inactiva FVIII y FV. En general, la APC constituye una proteína anticoagulante principal con un impacto significativo en la regulación del sistema de coagulación. FV también tiene efectos anticoagulantes puesto que puede actuar como un cofactor para APC para ayudar en la inactivación de FVIIIa (Thorelli et al, 1999; para una revisión véase Mann et al, 2003).

Se han descrito mutantes de FV resistentes a APC incluyendo FV-Leiden (Arg506Gln), FV-Cambridge (Arg306Thr) y FV-Hong Kong (Arg306Gly) (Bertina et al, 1994, Svensson et al 1994, Williamson et al, 1998 y Chan, 1998). Estos mutantes se inactivan más lentamente por la APC y por tanto prolongan la actividad del factor Xa. Por tanto, a través de sus efectos sobre FXa, estos mutantes de FV potencian la formación de trombina. FV resistente a APC no puede actuar como cofactor para la APC y por tanto carece del efecto anticoagulante de su homólogo de tipo natural.

Recientemente, se ha sugerido FV recombinante resistente a APC como una opción terapéutica para aumentar la generación de trombina en pacientes con hemofilia A o B (documento EP 0756638 B1; Van ‘t Veer et al, 1997; Bos et al, 2005).

La deficiencia en factor XI conduce al deterioro de un bucle de amplificación en la cascada de coagulación sanguínea, dando como resultado hemofilia C, que es un trastorno hemorrágico leve y la hemorragia se induce normalmente por cirugía o traumatismo (revisado en O’connell, 2004; Bolton- Maggs, 2000). Pueden tratarse pacientes con hemofilia C con

preparaciones que contienen factor XI, tales como concentrados de FXI o plasma congelado nuevo (véase por ejemplo, Bolton- Maggs, 2000). No está disponible en los EE.UU. un factor sustitutivo para el factor XI que esté inactivado viralmente (Aledort et al, 2005). También se ha propuesto administrar factor XI recombinante para tratamiento hemostático, véase por ejemplo el documento WO 2005/049070. Los pacientes con deficiencia grave en factor XI pueden desarrollar inhibidores para el factor XI, de modo que el tratamiento con el factor XI pasa a ser ineficaz (véase por ejemplo, Salomon et al, 2006). También se ha usado factor VII activado recombinante (rFVIIa) para tratar pacientes con deficiencia en factor XI (véase por ejemplo, O’Connell, 2004; Salomon et al, 2006; Shulman y Németh, 2006). Sin embargo, una posible desventaja de usar rFVIIa es el riesgo de acontecimientos tromboembólicos cuando se usa para tratar una deficiencia de coagulación relativamente más leve tal como deficiencia en FXI (Boggio 2005). Una desventaja adicional de rFVIIa es que se usa comúnmente en combinación con un antifibrinolítico tal como ácido traxenámico (O’Connell 2004). El motivo de esto es que se cree que el factor XI desempeña su papel en la coagulación a través de la generación de trombina (al igual que rFVIIa) pero también a través de la inhibición de la fibrinólisis mediante la activación de TAFI (lo que no puede hacer rFVIIa).

Sigue habiendo una necesidad de terapias adicionales para prevenir o tratar la hemorragia en sujetos con deficiencia en factor XI.

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BREVE SUMARIO DE LA INVENCIÓN

La presente invención da a conocer el sorprendente hallazgo que el factor V resistente a APC puede evitar una deficiencia en factor XI y restaurar la coagulación en plasma que es deficiente en factor XI. FV de tipo natural no puede evitar el requisito de FXI en tal plasma. Se muestra que el factor V resistente a APC puede restaurar la coagulación (medida por la formación de fibrina) en plasma deficiente en FXI en ausencia de proteína C activada (APC) o trombomodulina añadida. Se demuestra además que la potencia de FV resistente a APC para evitar el requisito del FXI aumenta en presencia de concentraciones de APC elevadas. Estos hallazgos implican que puede usarse FV resistente a APC para tratar y/o prevenir la hemorragia en pacientes con hemofilia C.

La invención proporciona un método para prevenir o tratar la hemorragia en un paciente con una deficiencia en FXI (por ejemplo, hemofilia C), que comprende administrar a dicho paciente FV resistente a APC. También es un aspecto de la invención proporcionar un método para reducir o prevenir la posibilidad de generar inhibidores para el factor XI en un paciente con hemofilia C, que comprende administrar factor V resistente a APC al paciente.

Según los aspectos de la invención descritos anteriormente, se administra una cantidad hemostática de factor V resistente a APC a dicho paciente. Preferiblemente, dicha cantidad es una cantidad hemostática eficaz. Por tanto, la invención también proporciona un método para el tratamiento o la profilaxis de un paciente que tiene una deficiencia en o un inhibidor de FXI, que comprende administrar al paciente una cantidad hemostática eficaz de factor V resistente a APC.

En determinadas realizaciones, se administra factor V resistente a APC para obtener una concentración plasmática de aproximadamente entre 0,1 y 5, por ejemplo, de aproximadamente entre 0,5 y 2 unidades/ml.

En determinadas realizaciones, el factor V resistente a APC tiene una mutación de Arg306, Arg506 o tanto Arg306 como Arg506 en comparación con la secuencia del factor V de tipo natural

(SEQ ID NO: 1). En una realización, el factor V resistente a APC tiene una mutación de tanto Arg306 como Arg506 en comparación con la secuencia del factor V de tipo natural (SEQ ID NO: 1).

En determinadas realizaciones, el factor V resistente a APC está libre de otros factores de coagulación.

También es un aspecto de la invención proporcionar el uso de factor V resistente a APC para la fabricación de un medicamento para el tratamiento o la prevención (o al menos reducción) de la hemorragia en un paciente deficiente en FXI (hemofilia C).

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Figura 1. Esquema simplificado de la coagulación. Tras la lesión endotelial, queda expuesto a la sangre factor tisular (TF). FVII interacciona con TF y se activa para activar a su vez FX. FXa, en presencia de su cofactor FVa, convierte protrombina en trombina, que a su vez genera fibrina. El sistema se amplifica por 2 bucles, uno que implica FVIII y FIX, y el otro FXI. La proteína C activada (APC) actúa como anticoagulante inactivando FVa y FVIIIa.

Figura 2. Esquema de ensayo para la actividad del cofactor de preparaciones de factor V usando un ensayo cromogénico.

Figura 3. Esquema de ensayo para la actividad de coágulo de preparaciones de factor V, usando un ensayo de tiempo de protrombina (TP) en plasma humano deficiente en factor V.

Figura 4. Esquema de ensayo para la resistencia a APC de preparaciones de factor V, usando un ensayo de APTT en plasma humano deficiente en factor V con y sin proteína C activada (APC).

Figura 5. Esquema del ensayo de tiempo de generación de fibrina (FGT) usado para determinar la capacidad de preparaciones de factor V resistente a APC para restaurar la coagulación en plasma humano deficiente en FVIII. El punto final del ensayo es la formación de fibrina, que se registra a lo largo del tiempo mediante mediciones a una densidad óptica de 405 nm. Entonces se calcula el FGT (T1/2 máx.). Usando este

ensayo, el efecto de la adición de FV resistente a APC puede someterse a prueba y compararse con la adición de FXI.

Figura 6. FV-L/C restaura la coagulación en plasma humano empobrecido en FXI en ausencia de APC añadida. Condiciones: dilución del TF 1:132.000, sin APC añadida.

Figura 7. Potencia de FV-L/C en plasma humano empobrecido en FXI aumenta en comparación con pFXI en presencia de APC. Condiciones: dilución del TF 1:132.000, APC 9 nM.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

Hemostasia se refiere a los procesos, tales como activación de la coagulación, implicados en la detención de la hemorragia. Por consiguiente, una “cantidad hemostática” tal como se usa en el presente documento se define por tanto como una cantidad (de un factor de coagulación, por ejemplo FV resistente a APC) suficiente para restaurar la generación de trombina o la formación de fibrina hasta niveles suficientes para mantener la coagulación necesaria para detener o prevenir la hemorragia. Normalmente, esto puede alcanzarse, por ejemplo, añadiendo la cantidad del factor de coagulación que falta (por ejemplo, FXI en plasma con hemofilia C) que normalmente prevendría y/o detendría la hemorragia. Aunque no hay correlación directa con los niveles del factor XI y la gravedad de la hemorragia (muchos pacientes parcialmente deficientes tienen una tendencia a hemorragias graves mientras que algunos pacientes deficientes graves sólo muestran una tendencia a hemorragias leves), los pacientes deficientes en FXI graves se caracterizan normalmente por niveles de FXI circulantes de menos de 0,1 U/ml de plasma, mientras que la deficiencia parcial en FXI se caracteriza por niveles de FXI de 0,1-0,6 U/ml de plasma (para una revisión véase Bolton-Maggs, 2000). Los niveles en individuos normales oscilan desde 0,6-1,39 U/ml, el nivel medio está alrededor de 1 U/ml. Los tratamientos actuales de la hemorragia en pacientes deficientes en FXI que reciben o bien un concentrado de FXI o bien plasma congelado nuevo (FFP) tratan de alcanzar niveles plasmáticos de más de 0,2 U/ml de FXI. Usando los datos in vitro para determinar la potencia relativa de FV-L/C con respecto a

FXI, esto equivaldría a lograr un máximo de 3 U/ml de FV resistente a APC (equivalente a 0,3 U/ml de FXI en ausencia de APC) con respecto a un mínimo de 0,3 U/ml de FV resistente a APC (equivalente a 0,3 U/ml de FXI en presencia de APC).

La presente invención da a conocer que también pueden alcanzarse cantidades hemostáticas con el factor V resistente a APC en plasma empobrecido en FXI, por ejemplo, mediante la adición de esta molécula para alcanzar concentraciones de entre aproximadamente 0,1 y 5 U/ml de plasma. En determinadas realizaciones, dichas cantidades hemostáticas en plasma empobrecido en FXI se obtienen mediante concentraciones de aproximadamente entre 0,5 y 2 U/ml de plasma, por ejemplo a aproximadamente 1 unidad/ml de plasma. Por tanto, la invención proporciona un método para la prevención o el tratamiento de la hemorragia en un paciente con una deficiencia en FXI (hemofilia C), que comprende administrar a dicho paciente FV resistente a APC.

En general, una unidad de un factor de coagulación sanguínea se define como la cantidad que está presente en 1 ml de plasma humano normal reunido. Una unidad de antígeno o actividad de factor V corresponde a la cantidad del factor V en

1 ml de plasma normal, que es de aproximadamente 5-10 g/ml. Por tanto, para el factor V resistente a APC, una unidad se define como que tiene la misma cantidad de antígeno del factor V que está presente en plasma humano reunido. Por consiguiente, 1 U de FV-L/C corresponde a aproximadamente 5-10 g/ml.

Sorprendentemente, la presente invención da a conocer que el factor V resistente a APC puede restaurar la generación de fibrina en plasma que es deficiente en factor XI, y es más potente en tal plasma en condiciones con altos niveles de APC. El nivel requerido de FV resistente a APC (por ejemplo, 0,1-5 U/ml de plasma) en un paciente humano con una deficiencia en factor XI puede obtenerse mediante la administración de FV resistente a APC a una frecuencia y dosificación (por kg de peso corporal) que dependerá de la farmacocinética, la recuperación y la potencia in vivo de la preparación de FV resistente a APC,

tal como conoce bien y puede determinar rutinariamente el experto. Por tanto, está dentro de las habilidades del experto determinar la dosis y frecuencia para obtener los niveles deseados de factor V resistente a APC en el plasma del sujeto. Normalmente, el volumen del plasma es de aproximadamente 50 ml por kg de peso corporal. Por tanto, el médico puede variar la dosis y frecuencia para llegar a la terapia óptima. Según la presente invención, generalmente puede usarse una dosis de desde aproximadamente 0,1 hasta 5, por ejemplo aproximadamente desde 0,5 hasta 2 unidades/ml de plasma. La frecuencia de dosificación será habitualmente cada 1 a 7 días para profilaxis. En determinadas realizaciones de la presente invención, puede administrarse FV resistente a APC a 0,1-500 unidades por kg de peso corporal, por ejemplo entre 1-50 U/kg.

En determinadas realizaciones, el sujeto que tiene una deficiencia en factor XI es un paciente que padece hemofilia C. En determinadas realizaciones, dicho sujeto tiene una mutación en el gen del factor XI, por ejemplo, dando como resultado o bien deficiencias de tipo I, tipo II o tipo III homocigotas o bien combinaciones heterocigotas de deficiencia (por ejemplo, tipo II/tipo III) o deficiencias únicas heterocigotas (por ejemplo, tipo III/normal). En determinadas realizaciones, el sujeto tiene inhibidores para el factor XI.

Puede usarse el factor V resistente a APC según la invención para profilaxis, lo que significa que se usa para la prevención de la hemorragia, es decir, en momentos en los que no se produce hemorragia. También puede usarse para el tratamiento de la hemorragia, es decir, en momentos en los que ya se ha iniciado la hemorragia, para detener la hemorragia.

La hemorragia en pacientes deficientes en FXI es particularmente prevalente en determinados tejidos blandos con una alta actividad fibrinolítica (por ejemplo, vías urinarias, encías, amígdala, cavidad nasal etc.). El plasma humano de personas normales contiene cantidades bajas pero medibles de proteína C activada (Gruber et al, 1992). La concentración de APC depende de los niveles de trombomodulina (TM). La TM se ubica en el endotelio. Se ha mostrado que la concentración de TM

en la microcirculación (capilares) es particularmente alta (100500 nmoles/l; Esmon, 1989). Por tanto, la mayoría de la trombina en el lecho microvascular se unirá a la TM y activará a la proteína C. Por tanto, la concentración de APC es la más alta en la microcirculación. Por tanto, FV resistente a APC puede ser muy adecuado para tratar episodios hemorrágicos en la microcirculación, por ejemplo, en las articulaciones, músculos o tejidos blandos.

La molécula del factor V (FV) tal como está presente en la sangre de individuos normales se compone de tres dominios A, un dominio B y dos dominios C. Esta estructura se parece a la del factor VIII (Jenny et al. 1987). Tras la síntesis en el hígado, la molécula del FV sufre múltiples alteraciones postraduccionales, incluyendo sulfatación, fosforilación y glicosilación. El FV en plasma es una proteína de cadena sencilla con un PM de 330 kD. Durante la activación mediante trombina, FV sufre varias escisiones proteolíticas, es decir en Arg709, Arg1018 y Arg1545, y además el dominio B de conexión grande se libera de la molécula. Como resultado, su actividad de cofactor para FXa se potencia en varios órdenes de magnitud. El FVa resultante se compone de las cadenas ligeras (A3-C1-C2) y pesadas (A1-A2) asociadas de manera no covalente. Al servir como un cofactor esencial de FXa, FVa tiene un efecto procoagulante claro. La actividad del FV activado se regula estrechamente mediante la proteína C activada (APC), que inactiva la molécula mediante escisión de uno o más de los varios residuos para producir FVi (para una revisión véase Mann et al, 2003).

El factor V humano contiene sitios de escisión para la proteína C activada (APC), que va a escindirse entre Arg306Asn307 , Arg506-Gly507 , Arg679-Lys680 y Arg1765-Leu1766 (documento EP 0756638). Una molécula del “factor V resistente a APC” tal como se usa en el presente documento dará como resultado un tiempo de coagulación (por ejemplo, en una prueba de APTT) que es inferior al 150%, normalmente, inferior al 120% (por ejemplo, el 80-120%,

o el 90-110%), del tiempo de coagulación en ausencia de APC añadida, en condiciones en las que la APC está presente a una concentración tal que el factor V de tipo natural (a partir de

plasma humano reunido) tiene un tiempo de coagulación que es al menos el 150% (normalmente al menos el 180%, por ejemplo el 20030%) del tiempo de coagulación en ausencia de APC añadida. Preferiblemente, el factor V resistente a APC tal como se usa en la presente invención es una molécula del factor V (FV) que tiene una modificación en o cerca del sitio de escisión para APC de modo que reduce o suprime la actividad de la APC para escindir en el sitio de escisión original, es decir para inducir resistencia a APC. Preferiblemente, el FV resistente a APC se deriva de la secuencia de FV humano, pero también podría derivarse de FV de otras especies, por ejemplo mono, bovino, porcino etc. En determinadas realizaciones preferidas, el FV resistente a APC se deriva de FV humano y tiene una modificación en la posición de aminoácido Arg306 (una posible mutación es a Thr que produce una molécula de FV denominada ‘factor V- Cambridge’ o ‘FV-C’), o Arg506 (una posible mutación es a Gln que produce una molécula de FV denominada ‘factor V-Leiden’ o ‘FVL’), o Arg679, o tanto Arg306 como Arg506 (por ejemplo, mutaciones de Arg306 a Thr y Arg506 a Gln que producen una molécula también denominada ‘factor V-Leiden/Cambridge’ o ‘FV-L/C’), u otras combinaciones de las mismas (todas en comparación con la secuencia madura dada a conocer en Jenny et al, 1987, o con la secuencia de aminoácidos tal como se presenta en la entrada P12259 de Swiss-Prot, que representan ambas secuencias del factor V humano de tipo natural; la SEQ ID NO: 1 en la presente descripción proporciona una secuencia del factor V humano maduro de tipo natural). La modificación en determinadas realizaciones es una sustitución de aminoácidos. En determinadas realizaciones, el residuo de arginina que precede al sitio de escisión de APC se cambia a una Gln, Ile, Thr, Gly, o cualquier otro aminoácido. En determinadas realizaciones, se reemplaza Arg306 por Thr (‘FV-R306T’). En otras realizaciones, se reemplaza Arg506 por Gln (‘FV-R506Q’). En determinadas realizaciones, se reemplaza Arg306 por Thr y se reemplaza Arg506 por Gln (‘FVR306T/R506Q’). Estará claro para el experto que podrían estar presentes adiciones, deleciones y/o sustituciones de aminoácidos adicionales en la molécula sin afectar adicionalmente a la

actividad biológica de FV resistente a APC para el fin de la presente invención, por ejemplo el dominio B podría delecionarse (Pittman et al 1994), o podrían usarse variantes alélicas, y se entenderá que tales moléculas se incluyen dentro de la definición de factor V resistente a APC según la presente invención. La preparación de tales variantes puede hacerse mediante métodos de biología molecular de rutina. Se prefiere que el FV resistente a APC esté en forma no activada para su uso según la presente invención, pero también podría estar completamente o en parte en su forma activada (factor Va resistente a APC) para su uso según la presente invención y, por tanto, el factor Va resistente a APC se incluye dentro del alcance de la expresión factor V resistente a APC según la presente invención. La activación del FV durante la purificación

o el almacenamiento in vitro puede prevenirse mediante la adición de inhibidores de trombina, y/o el almacenamiento a pH inferior a 7,4, etc. Las moléculas del FV resistente a APC usadas en el presente documento incluirán variantes, fragmentos, equivalentes funcionales, derivados, homólogos y fusiones de la molécula del FV resistente a APC nativa siempre que el producto conserve la resistencia a APC y la propiedad procoagulante del factor V. Generalmente, los derivados útiles tienen similitud de secuencia sustancial (al nivel de aminoácidos) en regiones o dominios de las moléculas del FV resistente a APC tal como se identificaron anteriormente (FV-R306T, FVF506Q, FV-R306T/R506Q), por ejemplo son al menos el 50%, al menos el 60%, preferiblemente al menos el 70%, más preferiblemente al menos el 80%, todavía más preferiblemente al menos el 90%, todavía más preferiblemente al menos el 95% idénticos en secuencia de aminoácidos con las moléculas del factor V resistente a APC identificadas anteriormente.

Griffin et al han descrito moléculas del factor estabilizadas con enlaces disulfuro modificados por ingeniería genética (documento US 2003/0125232). Tales moléculas también son funcionalmente resistentes a APC (se escinden por APC, pero debido a los puentes disulfuro esta escisión no elimina la actividad procoagulante), y por tanto se incluyen dentro del

alcance de la expresión factor V resistente a APC según la presente invención.

Pueden obtenerse preparaciones que contienen FV resistente a APC mediante purificación a partir de plasma de pacientes que tienen una mutación en el gen del FV que conduce a resistencia a APC (véase por ejemplo, el documento EP0756638), por ejemplo, que tienen una mutación de FV-L o FV-C. Sin embargo, preferiblemente, las moléculas del FV resistente a APC se producen a través de la tecnología de ADN recombinante que implica la expresión de las moléculas en células, preferiblemente células eucariotas, por ejemplo, células de ovario del hámster chino (CHO), células HEK293, células BHK, células PER.C6 (tales como las depositadas en la ECACC con el n.º 96022940; para la expresión recombinante de proteínas en células PER.C6 véase por ejemplo la patente estadounidense 6.855.544), levaduras, hongos, células de insecto, y similares,

o células procariotas, o animales o plantas transgénicos. En determinadas realizaciones, se logra la expresión recombinante en células PER.C6 que sobreexpresan además un sialiltransferasa,

por ejemplo, -2,3-sialiltransferasa humana bajo el control de un promotor heterólogo (véase por ejemplo el documento WO 2006/070011). Se conocen en la técnica métodos para la expresión recombinante de proteínas deseadas, y se ha descrito la producción recombinante de FV resistente a APC (por ejemplo, documento EP 0756638 B1; Egan et al, 1997; Bos et al, 2005). En general, la producción de una proteína recombinante, tal como FV resistente a APC de la invención, en una célula huésped comprende la introducción de ácido nucleico que codifica para la proteína en formato expresable dentro de la célula huésped, cultivar las células en condiciones propicias para la expresión del ácido nucleico y permitir la expresión de dicho ácido nucleico en dichas células. El ácido nucleico que codifica para una proteína en formato expresable puede estar en forma de un casete de expresión, y habitualmente requiere secuencias que pueden provocar la expresión del ácido nucleico, tales como potenciador(es), promotor, señal de poliadenilación y similares.

Pueden usarse varios promotores para la expresión de ácido nucleico recombinante, y estos pueden comprender promotores virales, de mamífero, sintéticos y similares. En determinadas realizaciones, un promotor que dirige la expresión del ácido nucleico de interés es el promotor temprano inmediato de CMV, por ejemplo, que comprende los nt. de -735 a +95 del potenciador/promotor génico temprano inmediato de CMV. El ácido nucleico de interés puede ser un ADN genómico, un ADNc, ADN sintético, una combinación de estos, etc. Están disponibles medios de cultivo celular de diversos proveedores, y puede elegirse un medio adecuado rutinariamente para que una célula huésped exprese la proteína de interés, en este caso el factor V resistente a APC. El medio adecuado puede contener o no suero.

La recogida y purificación de la proteína de interés puede hacerse según métodos disponibles rutinariamente para el experto, por ejemplo, empleando cromatografía tal como cromatografía de afinidad, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de exclusión molecular y similares. Se han descrito protocolos para la purificación de factor V resistente a APC a partir de sangre o plasma de pacientes con una mutación de FV-L (EP 0756638). También se han descrito protocolos para la purificación de factor V resistente a APC a partir de cultivo celular recombinante (por ejemplo, Bos et al, 2005, que describen un procedimiento basado en cromatografía de afinidad con un anticuerpo monoclonal) y por tanto están disponibles para el experto.

Para la administración a seres humanos, la invención puede emplear composiciones farmacéuticas que comprenden el factor V resistente a APC y un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable. En el presente contexto, la expresión “farmacéuticamente aceptable” significa que el vehículo o excipiente, a las dosificaciones y concentraciones empleadas, no provocará ningún efecto no deseado o perjudicial en los pacientes a los que se administra. Tales portadores y excipientes farmacéuticamente aceptables se conocen bien en la técnica (véase Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18ª edición,

A. R. Gennaro, Ed., Mack Publishing Company [1990];

Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins,

S. Frokjaer y L. Hovgaard, Eds., Taylor & Francis [2000]; y Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3ª edición, A. Kibbe, Ed., Pharmaceutical Press [2000]). Preferiblemente, el FV resistente a APC de esta invención se formula y se administra como una disolución estéril aunque está dentro del alcance de esta invención utilizar preparaciones liofilizadas. Las disoluciones estériles se preparan mediante filtración estéril o mediante otros métodos conocidos per se en la técnica. Entonces las disoluciones se liofilizan o se cargan en envases de dosificación farmacéutica. Generalmente, el pH de la disolución está en el intervalo de pH de 3,0 a 9,5, por ejemplo, pH de 5,0 a 7,5. Normalmente, la proteína está en una disolución que tiene un tampón farmacéuticamente aceptable adecuado, y la disolución de la proteína también puede contener una sal. Opcionalmente, puede estar presente un agente estabilizante, tal como albúmina. En determinadas realizaciones, se añade detergente. Para su uso en esta invención, puede formularse el FV resistente a APC en una preparación inyectable. Las formulaciones parenterales son adecuadas para su uso en la invención, preferiblemente para administración intravenosa. Estas formulaciones contienen cantidades terapéuticamente eficaces del FV resistente a APC, son o bien disoluciones líquidas estériles, suspensiones líquidas o bien versiones liofilizadas y opcionalmente contienen estabilizadores o excipientes.

Puede administrarse el FV resistente a APC mediante inyección por vía intravenosa, o mediante otras vías y/o sitios de administración, en una cantidad hemostática, que por tanto es suficiente para corregir la deficiencia en FXI.

El factor V resistente a APC administrado a los pacientes según la invención puede estar libre de otros factores de coagulación sanguínea. Se muestra en el presente documento que el FV resistente a APC puede administrarse para restaurar la hemostasia en plasma empobrecido en FXI, sin adición de factor

XI. En otras realizaciones, puede combinarse factor V resistente a APC con otros factores de coagulación sanguínea, por ejemplo uno o más de factor VIII, factor VIIa, factor IX y similares. En

determinadas realizaciones está libre de factor Va (resistente a APC y/o de tipo natural).

Según la presente invención, se tratan pacientes con hemofilia C con factor V resistente a APC. En aspectos preferidos, ya no es necesario administrar factor XI, o puede disminuirse la administración de factor XI a niveles mucho más bajos, por ejemplo, a niveles suficientemente bajos como para no provocar una respuesta inmunitaria en el paciente frente a FXI.

En determinadas realizaciones, la invención proporciona un método para la prevención o el tratamiento según la invención, en el que el nivel hemostático de factor V resistente a APC se determina en un ensayo in vitro que comprende: a) dotar plasma de un paciente con hemofilia C de (una dilución del) factor tisular, Ca2+ , y opcionalmente proteína C activada o trombomodulina a concentraciones en las que el tiempo de coagulación (o formación de fibrina/trombina) depende de la adición de factor XI, b) medir la generación de fibrina o trombina en ausencia de FXI, c) medir la generación de fibrina o trombina en presencia de una dosis de entre 0,1 y 5 U/ml del FXI, y d) medir la generación de fibrina o trombina en ausencia de FXI en presencia de factor V resistente a APC, para determinar un nivel hemostático de dicho factor V resistente a APC para reemplazar al FXI que es deficiente en dicho plasma. La invención proporciona además un método para someter a prueba la capacidad del factor V resistente a APC para evitar la deficiencia en FXI en un plasma, que comprende: a) dotar plasma que tiene una deficiencia en factor XI de (una dilución del) factor tisular, Ca2+, y opcionalmente proteína C activada y/o trombomodulina a concentraciones en las que el tiempo de coagulación (o generación de fibrina/trombina) depende de la adición de FXI; b) medir la generación de fibrina o trombina en ausencia de FXI; c) medir la generación de fibrina o trombina en presencia de una dosis de entre 0,1 y 5 U/ml de FXI; y d) medir la generación de fibrina o trombina en ausencia de FXI en presencia de factor V resistente a APC, para establecer la capacidad del factor V resistente a APC para reemplazar al FXI que es deficiente en dicho plasma. Preferiblemente, se realiza

el ensayo en condiciones con APC (o trombomodulina, que induce APC) y, en determinadas realizaciones, el efecto de la APC se somete a prueba a diferentes concentraciones.

La práctica de la presente invención empleará, a menos que se indique lo contrario, técnicas convencionales de biología molecular y similares, que se encuentran dentro de la habilidad de la técnica. Tales técnicas se explican completamente en la bibliografía. Véase, por ejemplo, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (J. Sarnbrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989); Current Protocols in Molecular Biology (F. Ausubel et al., eds., 1987 actualizado); Essential Molecular Biology (T. Brown ed., IRL Press 1991); Gene Expression Technology (Goeddel ed., Academic Press 1991); Methods for Cloning and Analysis of Eukaryotic Genes (A. Bothwell et al. eds., Bartlett Publ. 1990); Gene Transfer and Expression (M. Kriegler, Stockton Press 1990); Recombinant DNA Methodology (R. Wu et al. eds., Academic Press 1989); PCR: A Practical Approach (M. McPherson et al., IRL Press at Oxford University Press 1991); Oligonucleotide Synthesis (M. Gait ed., 1984); Cell Culture for Biochemists (R. Adams ed., Elsevier Science Publishers 1990); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J. Miller & M. Calos eds., 1987); Mammalian Cell Biotechnology (M. Butler ed., 1991); Animal Cell Culture

(J. Pollard et al. eds., Humana Press 1990); Culture of Animal Cells, 2.sup.nd Ed. (R. Freshney et al. eds., Alan R. Liss 1987); Flow Cytometry and Sorting (M. Melamed et al. eds., Wiley-Liss 1990); la serie Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); y Animal Cell Culture (R. Freshney ed., IRL Press 1987); y Wirth M. y Hauser H. (1993) Genetic Engineering of Animal Cells, En: Biotechnology vol. 2 Puhler A (ed.) VCH, Weinhcim 663-744.

EJEMPLOS

Ejemplo 1: Producción recombinante y pruebas del factor V resistente a APC

Usando métodos de biología molecular de rutina, se construyeron tres vectores de expresión, uno que contiene la

región codificante del factor V de tipo natural, uno que contiene una mutación puntual en la posición de aminoácido 506 (Arg506 a Gln, Factor V Leiden), y uno que contiene una mutación doble (Arg506 a Gln, y Arg306 a Thr). Se insertaron las regiones codificantes del factor V detrás de un promotor de CMV en el vector de expresión pcADN2001Neo(-), dando como resultado pCPFV-wt (que contiene la secuencia codificante del factor V de tipo natural), pCP-FV-L1 (que contiene la secuencia codificante del factor V pero con una mutación que da como resultado la mutación R506Q en la proteína; mutante Leiden), y pCP-FV-LC1 (que contiene la secuencia codificante del factor V pero con una mutación que da como resultado la mutación R506Q y la R306T en la proteína; mutante doble Leiden/Cambridge).

La secuencia del factor V usada (Bos et al., 2005) codificaba para la secuencia de aminoácidos del factor V tal como se presenta en la entrada P12259 de Swiss-Prot. Las posiciones de aminoácido son según la secuencia codificante del factor V, pero tras el procesamiento del péptido líder de 28 aminoácidos.

También se construyeron y se usaron plásmidos de expresión similares con las mismas secuencias del factor V, pero además con un ADNc de -2,3-sialiltransferasa (número de registro de Genbank L23767, véase también la patente estadounidense 5.494.790) bajo control de un promotor de CMV separado, para obtener clones que expresan el factor V resistente a APC.

Para lo siguiente, se uso el vector de expresión pCP-FV-LC1 (que codifica para FV-R306T/R506Q, denominado adicionalmente FVL/C).

Se generaron líneas celulares PER.C6 estables que expresaban rFV-L/C usando técnicas de biología molecular y cultivo celular convencionales (por ejemplo, patente estadounidense 6.855.544, documento WO 2006/070011). Las líneas celulares que se transfectaron con el vector de expresión que contenía sólo el ADNc del factor V-L/C se denominaron PER.C6-FVL/C. Las líneas celulares que se transfectaron con el vector de

expresión que contenía el ADNc del factor V-L/C y la -2,3

sialiltransferasa humana se denominaron PER.C6-FV-L/C-ST. Los productos producidos por estas células se denominan rEV-L/C y rFV-L/C-ST, respectivamente.

Se sometieron a prueba las líneas celulares para detectar la producción de proteína recombinante midiendo los niveles de FV en sobrenadante de cultivo con un ELISA que usa anticuerpos IgG policlonales de oveja anti-FV humano (sheep a-human Factor V; Kordia, Leiden, Países Bajos). Se usaron líneas celulares que producían las cantidades más altas del factor V para la producción del factor V recombinante.

Se produjeron sobrenadantes de cultivos celulares de estas líneas celulares en frascos de cultivo rotatorios en medios de cultivo que contenían suero (por ejemplo, DMEM con FCS al 2,5%), usando técnicas de cultivo celular convencionales. Se purificó

FV-L/C

usando técnicas de cromatografía convencionales,

incluyendo cromatografía de inmunoafinidad y

de intercambio

iónico (véase por ejemplo, Bos et al, 2005).

Se

almacenaron muestras purificadas en un tampón que

contenía Tris/HCl 50 mM (pH 7,4), NaCl 100 mM, CaCl2 5 mM y glicerol al 50% (v/v). FV-L/C es estable (SDS-PAGE, inmunotransferencia de tipo Western, ensayo cromogénico) durante >6 meses en esta formulación.

Se obtuvo FV plasmático usando el mismo procedimiento. Se usó plasma humano normal (Sanquin Plasma Products, Ámsterdam, Países Bajos) como fuente de FV.

En un gel de SDS-PAGE al 5% teñido con plata, todas las especies de FV presentaron una banda predominante a 330 kDa, y una banda secundaria a 220 kDa. Mediante inmunotransferencia usando IgG policlonal anti-FV, se identificaron las bandas como FV.

Se sometió a prueba la actividad de las preparaciones para la actividad de coágulo y cromogénica específica así como para la resistencia a APC.

Se sometió a prueba la actividad cromogénica en el siguiente ensayo.

Se añadió cada muestra (12,5 l) a 50 l de una mezcla de activación que contenía FXa 2 nM (Kordia), reactivos PTT 20 M (Roche), CaCl2 en un tampón que contiene NaCl 0,1 M, TRIS 0,05 M y HSA al 0,1% (p/v) (Sigma) y 12,5 l de protrombina (Kordia) y 5 se incubó la placa durante 5 minutos a 37ºC. Entonces se detuvo la reacción mediante la adición de 12,5 l de EDTA 0,1 M en NaCl 0,1 M y tampón TRIS 0,05 M. Se añadió (12,5 l) un sustrato cromogénico (S2238, Chromogenix) y se leyó la reacción a 405 nm. La figura 2 muestra una vista esquemática del ensayo 10 cromogénico. Se usó plasma reunido como patrón (concentración de FV = 1 U/ml). Se calculó la actividad cromogénica específica a partir de la actividad cromogénica (UChr) dividida entre la concentración de antígeno (UAg). Todas las preparaciones de FVL/C preparadas tal como se describió anteriormente mostraron

15 actividad cromogénica específica.

Tabla 2. Actividad de FV-L/C.

Actividad cromogénicaespecífica(UChr/UAg)

Actividad de coáguloespecífica(UCl/UAg)

PER.C6-FV-L/C(3 lotes)

1,03(DE+/-0,23) 1,53(DE+/-0,12)

PER.C6-FV-L/C-ST(4 lotes)

0,60(DE+/-0,08) 2,23(DE+/-0,05)

FV en plasmapurificado(4 lotes)

0,73(DE+/-0,21) 0,90(DE+/-0,22)

Se sometió a prueba la actividad de coágulo en un ensayo de tiempo de protrombina (TP) realizado usando plasma humano 5 deficiente en FV. La figura 3 muestra una vista esquemática del ensayo de actividad de coágulo. En resumen, se añadieron preparaciones purificadas a plasma deficiente en FV (Dade Behring, Liederbach, Alemania) empleando plasma humano normal como referencia. Se indujo la coagulación con Innovin® (Dade 10 Behring) o con Thromborel S (Dade Behring). De nuevo se usó plasma reunido como patrón. Una unidad de antígeno o actividad del factor V es similar a la cantidad de FV en 1 ml de plasma normal ( 8 g/ml). Se calculó la actividad de coágulo específica a partir de la actividad de coágulo (UCl) dividida

15 entre la concentración de antígeno (UAg). Los resultados confirman que el FV-L/C producido tiene actividad de coágulo (tabla 2). De hecho, la actividad de coágulo específica algo superior del FV-L/C en comparación con el FV derivado de plasma de tipo natural puede deberse a la resistencia a APC de FV-L/C.

20 Se sometió a prueba la resistencia a APC en un ensayo de tiempo de tromboplastina parcial activada (APTT) en plasma humano deficiente en FV con y sin APC (Kordia, Leiden, Países Bajos). La figura 4 muestra una vista esquemática de este ensayo. Los resultados confirman que el FV-L/C producido es

25 completamente resistente a APC (tabla 3).

Tabla 3. Resistencia a APC de FV-L/C

Preparación

Sin APC (seg.) Con APC (seg.) Razón de APC

PER.C6-FV-L/C(3 lotes)

53,3(DE+/-10,9) 49,2(DE+/-8,2) 0,92(DE+/-0,03)

PER.C6-FV-L/C-ST(4 lotes)

49,8(DE+/-8,9) 45,3(DE+/-8,9) 0,91(DE+/-0,02)

FV de plasmapurificado(4 lotes)

61,6(DE+/-13,4) 146,8(DE+/-21,8) 2,39(DE+/-0,24)

En conclusión, la caracterización bioquímica del FV-L/C producido demuestra que pudo obtenerse una preparación con una

5 pureza de más del 90% a una concentración de más de 1 mg/ml, que tiene una actividad de cofactor del factor V específica, tiene actividad de coágulo y es completamente resistente a APC.

Ejemplo 2: FV-L/C restaura la coagulación en plasma empobrecido 10 en FXI

Se sometieron a prueba moléculas de rFV-L/C purificadas usando un ensayo de tiempo de generación de fibrina (FGT) (mostrado esquemáticamente en la figura 5), realizado en plasma humano empobrecido en FXI inmunitario.

15 Se estableció el ensayo usando plasma empobrecido en FXI inmunitario. Se valoraron las concentraciones de factor tisular (TF) y de proteína C activada (APC) para proporcionar una respuesta a la dosis para el factor XI. Se desencadenó la formación de trombina por la adición de TF en presencia de APC.

20 El punto final del ensayo es el tiempo de coagulación (o tiempo de generación de fibrina). Se usó una dilución de TF 1:132.000 (Innovin®, Dade Behring, Alemania) en los ensayos en los siguientes ejemplos. Se introdujeron cien microlitros de plasma humano

25 empobrecido en FXI inmunitario (Dade Behring, OSDF135) por duplicado en placas de microtitulación (unión baja, fondo plano). Se añadió factor XI (FXI recombinante producido en células BHK (Meijers et al, 1992)) o FV-L/C recombinante (véase el ejemplo 1) o FV de plasma purificado a las concentraciones indicadas en las figuras. Tras la adición de 75 l de tampón HEPES (HEPES 25 mM (Boehringer Mannheim), NaCl 137 mM (Merck) y ovalbúmina al 0,1% (Sigma, A-5503), pH 7,4), se incubaron las muestras durante 5 min. a 37ºC. Entonces, se añadieron 75 l de una dilución precalentada (37ºC) de TF (Innovin, Dade Behring, B4212-50). Se prepararon diluciones de TF en tampón HEPES-calcio: HEPES 25 mM (Boehringer Mannheim), NaCl 137 mM (Merck), ovalbúmina al 0,1% (Sigma, A-5503), CaCl2 38 mM, pH 7,4. Tras mezclar, se analizaron inmediatamente las muestras para detectar la generación de fibrina. Se midió la generación de fibrina en el tiempo mediante el uso del lector de placas de microtitulación SpectraMax y el software Softmax pro.

FV-L/C pudo reducir el tiempo de coagulación en plasma empobrecido en FXI imunitario en ausencia de APC añadida (fig. 6). En plasma humano empobrecido en FXI inmunitario, rFV-L/C 1 U/ml restaura el tiempo de coagulación equivalente a aproximadamente 0,1 U/ml del rFXI (fig. 6). Por tanto, puede considerarse que el factor V resistente a APC es adecuado para restaurar o mantener la hemostasia en plasma deficiente en FXI a niveles de APC bajos o ausentes (normalmente, las concentraciones de APC endógena en plasma humano están en el intervalo de 60-80 pM). Se obtuvieron datos similares usando rFV-L/C-ST.

Se sometió a prueba el efecto de adición de APC, puesto que APC desempeña un papel importante en la regulación de la coagulación sanguínea en condiciones fisiológicas. La figura 7 muestra que la potencia de rFV-L/C aumenta en presencia de APC 9 nM en comparación con pFXI (Hemoleven) en plasma humano empobrecido en FXI inmunitario. La adición de 1 U/ml de rFV-L/C restauró el tiempo de coagulación de plasma humano empobrecido en FXI inmunitario en un grado similar que 1 U/ml de rFXI. Se obtuvieron datos similares usando rFV-L/C-ST.

Por tanto, estos experimentos demuestran muy sorprendentemente que rFV-L/C puede restaurar o mantener la hemostasia en plasma deficiente en FXI.

23

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C.

Tabla 4. Secuencia del factor V de tipo natural maduro (SEQ ID NO:1)

imagen1

26

Claims (7)

1. REIVINDICACIONES

   1. Factor V resistente a APC (resistente a proteína activada) para su uso en la prevención o el tratamiento de la hemorragia en un paciente con una deficiencia en factor

   XI.

2. 2.

   Factor V resistente a APC para su uso en la reducción o prevención de la posibilidad de generar inhibidores para el factor XI en un paciente con hemofilia C.

3. 3.

   Factor V resistente a APC para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, teniendo el factor V resistente a APC una mutación de Arg306, Arg506 o tanto Arg 306 como Arg506 en comparación con la secuencia del factor V de tipo natural.

4. 4.

   Factor V resistente a APC para su uso según la reivindicación 3, teniendo el factor V resistente a APC una mutación de Arg306 y Arg506 en comparación con la secuencia del factor V de tipo natural.

5. 5.

   Factor V resistente a APC para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, estando el factor V resistente a APC libre de otros factores de coagulación.

6. 6.

   Factor V resistente a APC para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, administrándose el factor V resistente a APC para obtener una concentración plasmática del mismo de entre 0,1 y 5 unidades/ml.

7. 7.

   Factor V resistente a APC para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, habiéndose obtenido el factor V resistente a APC mediante expresión recombinante.