BR112016013591B1 - Serpina modificada, célula recombinante que expressa a serpina, composição farmacêutica compreendendo a serpina e uso da serpina modificada para o tratamento ou prevenção de hemorragia ou para promoção de hemostasia - Google Patents

Abstract

SERPINAS MODIFICADAS PARA O TRATAMENTO DE TRANSTORNOS HEMORRÁGICOS. A presente invenção se refere a moléculas de serpina pró-coagulantes modificadas por meio de modificação dos resíduos em P4, P2, P1 e/ou P1' dentro do loop de centro reativo (RCL) para exibir especificidade aumentada por proteases anticoagulantes. Estas moléculas de serpina modificadas podem ser úteis em terapia, por exemplo, como pró-coagulantes para o tratamento de hemorragias.

Description

Campo

[001]A presente invenção se refere a moléculas de serpina modificadas com especificidade alterada, em particular as moléculas de serpina modificadas para ter especificidade aumentada por proteases anticoagulantes, tal como Proteína C ativada (Ativated Protein C - APC).

Antecedentes

[002]Hemofilias são transtornos hemorrágicos os quais são causados por uma deficiência no fVIII (hemofilia A, HA) ou fIX (hemofilia B, HB) em circulação no plasma (revisto em Bolton-Maggs & Pasi, 2003). Isto reduz a atividade da tenase intrínseca (Xase) e, deste modo, a quantidade de trombina gerada quando ocorre uma lesão tecidual. Isto leva à hemorragia não controlada após a lesão, bem como hemorragia espontânea nas articulações e tecidos moles.

[003]A hemofilia afeta em torno de 1 em 5.000 pessoas. Os 170.000 pacientes identificados na World Federation of Hemophilia Global Survey são uma subes- timativa do problema de saúde global (World Federation of Hemophilia, 2011). Os custos de tratamento são muito elevados e o tratamento é frequente e ao longo da vida.

[004]Os tratamentos padrões para a hemofilia envolvem a substituição do fator de coagulação afetado usando fatores recombinantes ou derivados de plasma (revisto em Mannucci, 2003; 2008). No entanto, uma percentagem significativa de pacientes tratados desta maneira desenvolverá anticorpos inibidores contra o fator de coagulação suplementado, tornando o tratamento ineficaz (revisto em Brettler, 1996). Inibidores ocorrem em 30% dos pacientes com hemofilia tratados (revisto em Teitel & Sholzberg 2013), mas as estimativas globais são baixas em virtude da eleva mortalidade em pacientes não tratados com inibidor e uma baixa prevalência de inibidores em muitos países nos quais a terapia de reposição de fator VIII não está disponível. Um outro inconveniente de terapias convencionais é seu custo, bem como a meia-vida curta do fator de coagulação injetado, requerendo tratamentos frequentes (revisto em Lee et al., 2006).

[005]No caso onde os pacientes desenvolvem anticorpos inibidores, agentes de "bypassing"são usados para o tratamento de eventos hemorrágicos (revisto em (Négrier et al., 2006)). Agentes de "bypassing" reduzem a hemorragia sem fornecer diretamente o fator de coagulação afetado; eles 'desviam' a atividade do complexo de tenase. Exemplos de agentes de "bypassing" atuais incluem fVIIa recombinante e FEIBA (Factor Eight_Bypassing Activity), um concentrado do complexo de protrombi- na. Estes tratamentos de reposição são muito caros (Bohn et al., 2004; Di Minno et al., 2010; Gringeri et al., 2003; Escobar, 2010) e precisam ser fornecidos em uma frequência ainda maior do que as terapias convencionais e em altas doses em virtude da curta meia-vida de ambos os produtos (revisto em Haya et al., 2007). Além disso, foi mostrado que a resposta do paciente era variável e imprevisível (revisto em Berntorp, 2009).

[006]Além disso, a meia-vida curta dos concentrados de fator torna a terapia de reposição padrão para hemofilia abaixo do ideal. Isto é particularmente evidente em hemofilia A, uma vez que o fator VIII tem uma meia-vida de menos de 12 horas. Consequentemente, apesar da disponibilidade de tratamento tanto para hemofilia A quanto hemofilia B, as taxas de hemorragia são mais elevadas em hemofilia A e ar- tropatia hemofílica crônica é mais comum. Isto pode estar relacionado à meia-vida curta do fator VIII e, consequentemente, a dificuldade de se manter um nível hemos- tático de fator VIII (Escobar e Sallah 2013). Em uma revisão nacional sobre tratamentos, a frequência anual de hemorragias em pacientes com hemofilia A grave sem inibidores era de 14 comparado a 9 em pacientes com hemofilia B (Nagel et al. 2011). A necessidade de cirurgia músculo-esquelética era 3 vezes maior em pacientes com hemofilia A. Tagariello et al. descobriram que pacientes com hemofilia A requeriam substituição de articulação três vezes mais frequentemente do que pacientes com hemofilia B (Tagariello et al. 2009). Lowe et al. descobriram que hospitalização era requerida três vezes mais frequentemente em pacientes com hemofilia A comparado com hemofilia B (Lowe e Ludlam 2008).

[007]Os tratamentos atuais para transtornos hemorrágicos, tal como hemofilia, portanto, têm uma série de inconvenientes.

Sumário

[008]Os presentes inventores reconheceram que a especificidade das moléculas de serpina pode ser manipulada ao modificar resíduos dentro do loop central reativo (Reactive Center Loop - RCL) e identificaram moléculas de serpina modificadas com especificidade aumentada por proteases anticoagulantes. Estas moléculas de serpina modificadas podem ser úteis em terapia, por exemplo, para o tratamento de hemorragias.

[009]Um aspecto da invenção fornece uma serpina modificada que tem mutações em um ou mais resíduos de P4, P2, P1 e P1' no loop central reativo (RCL) da mesma.

[010]Outro aspecto da invenção fornece uma serpina modificada que tem mutações em um ou ambos os resíduos de P1 e P2 e, opcionalmente, os resíduos P4 e/ou P1 no loop central reativo (RCL) da mesma.

[011]As mutações podem aumentar a inibição de proteína C ativada em relação à inibição de trombina.

[012]As mutações também podem aumentar a inibição de proteína C ativada em relação à inibição de outras proteases pró-coagulantes, tais como fVIIa, fIXa, fXa e fXIa.

[013]Outros aspectos da invenção se referem ao uso de serpinas modificadas conforme descrito aqui para o tratamento de hemorragias, por exemplo, hemorragias em pacientes com transtornos hemorrágicos hereditários e hemorragia adquirida, incluindo trauma, cirurgia e em pacientes que estão recebendo terapia anticoa- gulante.

Breve Descrição das Figuras

[014]A Figura 1 mostra a cascata de coagulação e o papel regulador das serpinas nesta cascata.

[015]A Figura 2 mostra os resultados de um ensaio de tempo de protrombina (Prothrombin Time - PT) para determinar o efeito do Inibidor de Proteína C (Protein C Inhibitor - ICP) com um truncamento N-terminal de 21 resíduos (resíduo N-terminal é A22 da sequência de tipo selvagem, quando de contagem do resíduo 1 do propep- tídeo como resíduo 1 da proteína madura) e que tem os resíduos K nas posições P2 e P1' dentro do RCL (PCI A22 P2KP1'K) sobre a coagulação através da via de fator tecidual (extrínseca). Plasma normal agrupado proveniente de três plasmas separados foi incubado sem PCI (barra preta, -) ou PCI A22 de tipo selvagem (WT) a 5 µM (barra cinza, WT) ou PCI A22 P2KP1'K a 5 µM (barra branca, P2KP1'K). A coagulação foi iniciada através da adição de reagente PT para iniciar a coagulação através da via extrínseca e o tempo até formação do coágulo medido. O ensaio foi realizado em triplicata, barras de erro mostram o desvio padrão. Plasma diluído duas vezes foi usado para aumentar a sensibilidade do ensaio aos inibidores de coagulação. PCI A22 P2KP1'K não tem nenhum efeito sobre a coagulação neste ensaio de tempo de protrombina (PT). Este resultado indica que não há nenhuma inibição significativa de TF:fVIIa, trombina e outras proteases pró-coagulantes pelo PCI A22 P2KP1'K.

[016]A Figura 3 mostra os resultados de um ensaio de tempo de tromboplas- tina parcial ativada (activated Partial Thromboplastin Time - aPTT) para determinar o efeito de PCI A22 P2KP1'K sobre a coagulação através da via de ativação de conta- to (intrínseco). A Figura 3A mostra plasma normal agrupado proveniente de três plasmas separados incubados com PCI (barra preta, -) ou PCI A22 de tipo selvagem (WT) a 5 µM (barra cinza, WT) ou PCI A22 P2KP1'K (barra branca, P2KP1'K). Reagente TTPA foi adicionado e as amostras foram incubadas durante 5 min a 37 °C. A coagulação foi, então, iniciada pela adição de CaCl2 para iniciar a coagulação através da via intrínseca e o tempo até formação do coágulo medido. As barras mostram as médias de pelo menos três medições, as barras de erro mostram o desvio padrão. O ensaio foi interrompido a 300 s. As amostras mostradas a 300 s não coagulam dentro do tempo do experimento e são marcadas com asteriscos. A Figura 3B mostra os dados derivados de A sem amostras de PCI A22 WT para mostrar um pequeno efeito sobre o tempo de coagulação.

[017]A Figura 4 mostra os resultados de um ensaio de tempo de protrombina (PT) para determinação do efeito de um mutante de a1-antitripsina Pittsburgh (Pitts) de comprimento completo (Full-Length - FL) (M358R = P1R) que compreende ainda uma mutação C232S e mutações P357K (P2) e S359K (P1'K) dentro do RCL (FL a1AT Pitts C232S P2KP1‘K) sobre a coagulação através da via do fator tecidual (extrínseca). Plasma normal agrupado proveniente de três plasmas separados foi incubado com a1AT (-, barra preta) ou FL a1AT Pitts C232S (Pitts, barra cinza) a 5 µM ou FL a1AT Pitts C232S P2KP1‘K (P2KP1'K, barra branca) a 5 µM. A coagulação foi iniciada através da adição de reagente PT e o tempo até formação do coágulo medido. As barras mostram as médias de pelo menos três medições, as barras de erro mostram o desvio padrão. Plasma diluído duas vezes foi usado para aumentar a sensibilidade do ensaio a inibidores de coagulação. FL a1AT Pitts C232S P2KP1‘K, ao contrário de FL a1AT Pitts C232S, não prolonga o PT. Isto indica que não há efeito inibidor significativo em relação a qualquer uma das proteases pró-coagulantes, incluindo TF-fVIIa, trombina ou fXa.

[018]A Figura 5 mostra os resultados de um ensaio de tempo de tromboplas- tina parcial ativada (aPTT) para determinar o efeito de FL aiAT Pitts C232S P2KP1K sobre a coagulação através da via de ativação de contato (intrínseca). A Figura 5A mostra o plasma normal agrupado proveniente de três plasmas separados incubados sem a1AT (barra preta) ou concentrações crescentes de FL a1AT Pitts C232S (barras cinzas) ou FL a1AT Pitts C232S P2KP1'K (barras brancas). Reagente TTPA foi adicionado e as amostras foram incubadas durante 5 min a 37 °C. A coagulação foi, então, iniciada pela adição de CaCl2 e o tempo até formação do coágulo medido. As barras mostram as médias de pelo menos três medições, as barras de erro mostram o desvio padrão. O ensaio foi interrompido a 300 s. As amostras mostradas em 300 s não coagulam dentro do tempo do experimento e são marcadas com asteris-cos. A Figura 5B mostra os dados provenientes de A sem amostras de FL a1AT Pitts C232S para mostrar um pequeno efeito sobre o tempo de coagulação por FL a1AT Pitts C232S P2KP1K. No entanto, este efeito não aumenta de forma dependente da dose.

[019]A Figura 6 mostra que FL a1AT Pitts C232S inibe a geração de trombi- na em plasma humano normal (Normal Plasma - NP). As Figuras A-C mostram as curvas representativas da geração de trombina por reações que contêm concentrações crescentes de FL a1AT Pitts C232S na presença de (A) sem trombomodulina (ThromboModulin - TM); (B) trombomodulina (TM) a 1,25 nM; (C) trombomodulina (TM) a 10 nM. As curvas mostram a média de duplicatas. Todos os ensaios foram realizados em plasma humano normal (NP) agrupado da George King Biomedical. A coagulação foi iniciada pela adição de CaCl2 e TF/fosfolipídio (reagente RB Low TF and Phospholipid # 5006210, Technoclone GmbH) para ativar a coagulação através da via extrínseca. A geração de trombina foi medida por meio da clivagem de um substrato fluorogênico (Z-Gly-Gly-Arg-AMC). As unidades de fluorescência foram convertidas em concentração de trombina através de calibração unidades de fluorescência contra concentrações conhecidas de trombina usando o kit de calibração Technothrombin (Technoclone). A Figura 6D mostra os potenciais de trombina endógena(Endogenous Thrombin Potentials - ETPs) médios que representam a quantidade total de trombina gerada durante as reações. As barras mostram a média de dois experimentos independentes realizados em duplicata. As barras de erro representam o desvio padrão. A trombomodulina (TM) usada foi produzida de forma re- combinante a partir de células HEK-EBNA e consiste no domínio extracelular de TM.

[020]A Figura 7 mostra que FL a1AT Pitts C232S P2KP1'K restaura o efeito anticoagulante de TM em plasma humano normal (NP). As Figuras 7A-C mostram as curvas representativas de geração de trombina para reações que contêm concentrações crescentes de FL a1AT Pitts C232S P2KP1'K na presença de (A) sem TM; (B) TM a 1,25 nM; (C) TM a 10 nM. As curvas mostram a média de duplicatas. Todos os ensaios foram realizados em plasma humano normal (NP) agrupado da George King Biomedical. A coagulação foi iniciada pela adição de CaCl2 e TF/fosfolipídio (reagente RB Low TF and Phospholipid # 5006210 Technoclone GmbH) para ativar a coagulação através da via extrínseca. A geração de trombina foi medida por meio da clivagem de um substrato fluorogênico (Z-Gly-Gly-Arg-AMC). As unidades de fluorescência foram convertidas em concentração de trombina através da calibração de unidades de fluorescência contra concentrações conhecidas de trombina usando o kit de calibração Technothrombin (Technoclone GmbH). A Figura 7D mostra os potenciais de trombina endógena (ETPs) médios que representam a quantidade total de trombina gerada durante as reações. As barras mostram a média de três experimentos independentes realizados em duplicata. As barras de erro representam o desvio padrão.

[021]A Figura 8 mostra que FL a1AT Pitts C232S elimina a geração de trom- bina em plasma humano com hemofilia A (HA, fVIII-deficiente) e plasma humano com hemofilia B (HB, fIX-deficiente). Os gráficos mostram os ETPs médios a partir de experimentos de geração de trombina realizados com concentrações crescentes de FL a1AT Pitts C232S em (A) plasma deficiente de fVIII (atividade de fVIII de menos de 1%) ou (B) plasma deficiente em fIX (atividade de fIX de menos de 1%) com as quantidades indicadas de trombomodulina (TM) adicionadas. Todos os plasmas eram da George King Biomedical. As reações foram iniciadas pela adição de CaCl2 e TF/fosfolipídios (reagente RB Low TF and Phospholipid # 5006210 Technoclone GmbH) com uma diluição final de 1:4000 de Dade Innovin (Siemens) para ativar a coagulação através da via extrínseca. A geração de trombina foi medida por meio da clivagem de um substrato fluorogênico (Z-Gly-Gly-Arg-AMC). As unidades de fluorescência foram convertidas em concentração de trombina através da calibração de unidades de fluorescência contra concentrações conhecidas de trombina usando o kit de calibração Technothrombin (Technoclone). Os ETPs médios são mostrados a partir de pelo menos dois experimentos independentes realizados em duplicata. As barras de erro mostram o desvio padrão.

[022]A Figura 9 mostra que FL a1AT Pitts C232S P2KP1'K restaura o efeito de TM sobre o plasma humano HA (plasma deficiente em fVIII). As Figuras 9A-C mostram as curvas representativas de geração de trombina para reações que contêm concentrações crescentes de FL a1AT Pitts C232S P2KP1'K na presença de (A) sem TM; (B) TM a 1,25 nM; (C) TM a 5 nM. As curvas mostram a média de duplicatas. Todos os ensaios foram realizados em plasma deficiente em fVIII (atividade de fVIII de menos de 1%) de George King Biomedical. A coagulação foi iniciada pela adição de CaCl2 e TF/fosfolipídio (reagente RB Low TF and Phospholipid # 5006210, Technoclone GmbH) e Dade Innovin (Siemens) a 1:4000 para ativar a coagulação através da via extrínseca. A geração de trombina foi medida por meio da clivagem de um substrato fluorogênico (Z-Gly-Gly-Arg-AMC). As unidades de fluorescência foram convertidos em concentração de trombina através da calibração unidades de fluorescência contra concentrações conhecidas de trombina usando o kit de calibra- ção Technothrombin (Technoclone). A Figura 9D mostra os ETPs (potenciais de trombina endógena) médios que representam a quantidade total de trombina gerada durante as reações. As barras mostram a média de dois experimentos independentes realizados em duplicata. As barras de erro representam o desvio padrão.

[023]A Figura 10 mostra que FL a1AT Pitts C232S P2KP1'K restaura o efeito de TM sobre o plasma humano HB (plasma deficiente em fIX). (A-C) Curvas de geração de trombina representativas são mostradas para reações que contêm concentrações crescentes de FL a1AT Pitts C232S P2KP1'K na presença de (A) sem TM; (B) TM a 1,25 nM; (C) TM a 5 nM. As curvas mostram a média de duplicatas. Todos os ensaios foram realizados em plasma deficiente em fIX (atividade CORRECÇÃO menos de 1%) a partir de George King Biomedical. A coagulação foi iniciada pela adição de CaCl2 e TF/fosfolipídio (reagente RB Low TF and Phospholipid # 5006210, Technoclone GmbH) e Dade Innovin (Siemens) a 1:4000 para ativar a coagulação através da via extrínseca. A geração de trombina foi medida por meio da clivagem de um substrato fluorogênico (Z-Gly-Gly-Arg-AMC). As unidades de fluorescência foram convertidas em concentração de trombina através da calibração de unidades de fluorescência contra concentrações conhecidas de trombina usando o kit de calibração Technothrombin (Technoclone). A Figura 10D mostra os ETPs (potenciais de trombina endógena) médios que representam a quantidade total de trombina gerada durante as reações. As barras mostram a média de pelo menos dois experimentos independentes realizados em duplicata. As barras de erro representam o desvio padrão.

[024]A Figura 11 mostra o efeito de FL a1AT Pitts C232S e FL a1AT Pitts C232S P2KP1'K em plasma de camundongo HB. As Figuras 11A-D mostram curvas representativas de geração de trombina que contêm concentrações crescentes de (A-B) FL a1AT Pitts C232S ou (C-D) FL a1AT Pitts C232S P2KP1'K na presença de (A e C) sem TM; (B e D) TM humana solúvel a 750 nM. Todos os ensaios foram realizados em plasma de camundongo HB coletado na cauda em citrato, centrifugado para remover os glóbulos vermelhos e congelado a -80 °C. A coagulação foi iniciada pela adição de CaCl2, TF/fosfolipídio (reagente RB Low TF and Phospholipid, Technoclone) e Dade Innovin (Siemens) a 1:12.000 para ativar a coagulação através da via extrínseca. A geração de trombina foi medida por meio da clivagem de um substrato fluorogênico (Z-Gly-Gly-Arg-AMC). As unidades de fluorescência foram convertidas em concentração de trombina através da calibração de unidades de fluorescência contra concentrações conhecidas de trombina usando o kit de calibração Technothrombin (Technoclone). A Figura 11E mostra os ETPs (potenciais de trombi- na endógena) médios que representam a quantidade total de trombina gerada du-rante as reações. As barras mostram a média de quatro experimentos independentes. As barras de erro representam o desvio padrão. Todos os ensaios foram realizados a 33 °C.

[025]A Figura 12 mostra que FL a1AT Pitts C232S P2KP1'K reduz a hemorragia em camundongos HB em um ensaio de grampo na cauda. Os resultados com grampos na cauda mostram a perda total de sangue ao longo de um período de coleta de 10 min após transecção da cauda a 3 mm de diâmetro para camundongos WT ou camundongos HB. Os camundongos foram injetados com PBS, FL a1AT Pitts C232S ou FL a1AT Pitts C232S P2KP1'K nas doses indicadas em um volume total de injeção de 200 µl. As soluções de proteínas foram feitas até 200 µl usando PBS. A perda de volume de sangue foi determinada por meio de coleta de sangue a partir da cauda em 14 ml de solução salina. O sangue coletado foi centrifugado e as células vermelhas foram submetidas à lise, seguido por medição da absorbância a 575 nm. Uma curva padrão foi construída através determinando a absorbância a 575 nm após lise das células vermelhas usando volumes conhecidos de sangue coletado. A perda de sangue nas amostras experimentais foi, então, calculada a partir deste pa-drão.Cada ponto mostrado indica dados provenientes de um único camundongo e as linhas horizontais mostram a média de todos os animais por grupo. Os P valores foram calculados usando um t-teste não pareado. Os círculos indicam camundongos WT injetados com PBS, quadrados indicam camundongos HB injetados com PBS, triângulos indicam camundongos HB injetados com FL a1AT Pitts C232S a 7,5 mg/kg, triângulos invertidos indicam camundongos HB injetados com FL a1AT Pitts C232S P2KP1K a 7,5 mg/kg e diamantes indicam camundongos HB injetados com FL a1AT Pitts C232S P2KP1'K a 15 mg/kg.

[026]A Figura 13 mostra que FL a1AT Pitts C232S P2KP1'K aumenta a formaçãode coágulos estável em camundongos HB em um modelo de lesão a laser da arteríola cremaster. Camundongos HB foram infundidos com um anticorpo a-fibrina fluorescentemente marcado e um anticorpo fluorescentemente marcado para marcaçãode plaquetas através de uma cânula na veia jugular. Controles indicam o nível de linha de base de formação de coágulos após a lesão em camundongos infundidos com anticorpos apenas. m indica o número de camundongos por condição, n indica o número de lesões realizadas para esta condição. Cinza claro indica nenhum coágulo, cinza escuro indica um coágulo com plaqueta apenas e preto representa coágulos que contêm plaquetas e fibrina.

[027]A Figura 14 mostra que FL a1AT Pitts C232S P2KP1'K aumenta a formaçãode coágulos estável em camundongos HB em um modelo de lesão a laser da arteríola cremaster. A Figura 14 mostra os dados brutos dos resultados representativos mostrados na Figura 13. A fluorescência foi quantificada ao longo do tempo a partir de todas as lesões para cada condição. Os gráficos mostram o valor médio de todas as lesões na condição indicada. O número de camundongos e o número total de lesões foram os seguintes: Controle: 5 camundongos, 8 lesões; FL a1AT Pitts C232S a 7,5 mg/kg: 1 camundongo, 7 lesões; FL a1AT Pitts C232S P2KP1'K a 7,5 mg/kg: 4 camundongos, 18 lesões; FL a1AT Pitts C232S P2KP1'K a 15 mg/kg: 3 camundongos, 20 lesões.

[028]A Figura 15 mostra a inibição de trombina e fXa por mutantes de a1AT específicos para APC em relação à trombina que foram novamente testados quanto à inibição de fXa. Os quatro mutantes resultantes, os quais teriam inibição de fXa reduzida foram, então, testados quanto à inibição de (A) trombina e (B) fXa, para determinar se o rastreio tinha sido bem sucedido na produção de mutantes específicos para APC que não inibem a trombina ou fXa. Serpina a 1 µM foi incubada com protease a 12,5 nM durante diferentes períodos de tempo. Nos pontos de tempo indicados, a reação foi interrompida mediante a adição de um excesso de substrato cromogênico (S2238 para trombina, S2222 para fXa). A atividade enzimática residual foi dividida pela atividade enzimática inicial e o logaritmo natural deste valor representado em função do tempo. A inclinação destes gráficos é a constante de taxa ob-servada, kobs. Para obter uma estimativa da constante de taxa de segunda grandeza k2, kobs foi dividida pela concentração de serpina. Os valores selecionados são mostrados na figura para ilustrar a maior inibição de trombina e fXa, bem como o valor para o único mutante que não inibe substancialmente fXa (P2RP1'Q). Os mutantes mostrados têm todos a mutação Pitts (M358R, P1R).

Descrição Detalhada

[029]A presente invenção se refere à modificação de serpinas para aumentar sua especificidade por APC em relação a outras proteases de coagulação. Variantes de serpina modificada específicas para APC podem ser úteis, por exemplo, como pró-coagulantes.

[030]Uma vez que elas são específicas para APC, espera-se que as serpi- nas modificadas descritas aqui tenha poucos ou nenhum efeito fora do alvo e sejam específicas para vias que são ativadas quando de lesão. Isto permite que as serpi- nas modificadas sejam aplicadas terapêutica e profilaticamente, bem como em situações de emergência, ou seja, trauma. A dosagem de serpinas modificadas é previsível, uma vez que elas são inibidores de suicídio, significando que uma molécula de serpina não pode inibir mais do que uma molécula de protease. Além disso, uma vez que mecanismos de eliminação naturais eficientes são específicos para complexos de serpina:protease em relação a serpinas individualmente, a meia-vida plasmática de serpinas modificadas provavelmente excede àquela dos agentes de "bypassing" atuais. Por exemplo, a meia-vida de uma serpina modificada conforme descrito aqui pode ser cerca de 5 dias.

[031]A Proteína C (Gene ID 5624) é uma glicoproteína plasmática dependente de vitamina K que é clivada em sua forma ativada (Proteína C ativada, APC) através do complexo de trombina-trombomodulina. A Proteína C humana tem a sequência de aminoácidos de referência de NP_000303.1 GI: 4506115 e pode ser codificada pela sequência de nucleotídeos de referência de NM_000312.3 GI: 270483720. A APC é uma protease anticoagulante que cliva proteoliticamente fVa e fVIIIa (Figura 1), deste modo, atenuando a produção de trombina.

[032]Uma serpina modificada conforme descrito aqui pode ter uma ou mais mutações em seu loop central reativo (RCL). Por exemplo, a serpina modificada pode ter uma, duas, três, quatro ou mais de quatro mutações em seu RCL. Os resíduos em uma, duas, três ou todas as quatro posições P4, P2, P1 e P1' podem ter mutações. Por exemplo, os resíduos em uma ou em ambas as posições P1' e P2 e, opcionalmente, P1 e/ou P4 podem ter mutações.

[033]Os resíduos no RCL são numerados, aqui, de acordo com a nomenclatura de Schechter-Berger para substratos e inibidores de proteases de serina (Schechter & Berger, 1967). Esta nomenclatura padrão permite que o resíduo em posições específicas no RCL, tais como as posições P1', P1, P2 e/ou P4, sejam facilmente identificados em qualquer sequência de serpina.

[034]De preferência, a uma ou mais mutações são as únicas mutações no RCL da serpina modificada. Por exemplo, o RCL pode consistir na sequência do RCL da serpina de tipo selvagem com mutações em uma ou ambas as posições P1' e P2 e, opcionalmente, P1 e/ou P4.

[035]O RCL da serpina modificada pode ter mutações nas posições P1' e P2; mutações nas posições P1', P2 e P1; mutações nas posições P1', P2 e P4 ou mutações nas posições P1', P2, P1 e P4; uma mutação na posição P1'; mutações nas posições P1' e P1; mutações nas posições P1' e P4 ou mutações nas posições P1', P1 e P4; uma mutação na posição P2; mutações nas posições P2 e P1; mutações nas posições P2 e P4, mutações nas posições P2, P1 e P4, uma mutação na posição P1, uma mutação na posição P4; ou mutações nas posições P1 e P4. Os resíduos em outras posições no RCL pode ser resíduos de tipo selvagem sem mutação.

[036]De preferência, os resíduos na posição P1'; posições P1 e P2; posições P1', P2 e P1; posições P2 e P1; posições P1 e P1'; posições P1', P2 e P4 ou posições P1', P1, P2 e P4 do RCL têm mutação. Em algumas concretizações preferidas, os resíduos nas posições P1', P1 e P2 têm mutações.

[037]O loop central reativo (RCL) de uma serpina tem, tipicamente, cerca de 20 resíduos de comprimento e contém a ligação P1-P1'passível de cisão que é clivada pela protease alvo. O RCL se estende de fita 5 da beta folha A até a fita 1 da beta folha C da serpina. Os resíduos P17 Glu, P15 Gly e P14 Thr são conservados em serpinas. Por exemplo, o RCL de uma serpina pode compreender a sequência de consenso P17 E, P16 E/K/R, P15 G, P14 T/S, P12-P9 (A/G/S)4 (Hopkins et al. 1993; Irving et al., 2000). O RCL começa no resíduo em P17 e, em geral, termina no resíduo em P3'. RCLs podem ser estendidos em algumas serpinas, tal como PCI, por resíduos adicionais do lado P'. Por exemplo, o RCL de a1-antitripsina consiste nos resíduos P17-P3' e o RCL de PCI consiste nos resíduos P6-P17'. Exemplos de resíduos de serpinas com P1', P1, P2 e P4 realçados são mostrados em SEQ ID NOS: 1 a 11 abaixo. Os resíduos que constituem as sequências maduras de serpina também são indicados.

[038]Os resíduos em outras posições do RCL na serpina podem ser não modificados, ou seja, eles podem ser os resíduos nativos da sequência de serpina de tipo selvagem. A serpina modificada pode, portanto, compreender um RCL que tem uma sequência de tipo selvagem com mutações nas posições P1, P1', P2 e/ou P4, conforme descrito acima.

[039]A uma ou mais mutações no loop central reativo (RCL) da serpina modificada podem compreender ou consistir em uma mutação na posição P1' . De preferência, a mutação é uma substituição. O resíduo nativo em P1' no RCL da serpina de tipo selvagem pode ser substituído por um resíduo não nativo na serpina modificada. Por exemplo, o resíduo nativo de S na posição P1' na sequência de a1AT ou PCI de tipo selvagem pode ser substituído por um resíduo diferente de S na serpina modificada.

[040]O resíduo nativo em P1' no RCL da serpina de tipo selvagem pode ser substituído por um resíduo polar grande, tal como Q, N, Y; um resíduo hidrofóbico grande, tal como I, M e V; um resíduo positivamente carregado, tal como R, H ou K; ou outro resíduo, tal como C, A, S e E.

[041]Em algumas concretizações preferidas, o resíduo em P1' pode ser modificado para um resíduo polar grande, tal como Q, N, Y; um resíduo hidrofóbico grande, tal como V; ou um resíduo positivamente carregado, tal como R, H ou K; mais preferivelmente, um resíduo positivamente carregado ou um resíduo polar grande, tal como H, K, R ou Q; mais preferivelmente K.

[042]Em outras concretizações, o resíduo em P1' pode ser não modificado na serpina modificada. Por exemplo, o resíduo na posição P1' no RCL da serpina modificada pode ser o resíduo que está presente na posição P1' na sequência da serpina de tipo selvagem.

[043]A uma ou mais mutações no loop central reativo (RCL) da serpina modificada podem compreender ou consistir em uma mutação no resíduo em P2. De preferência, a mutação é uma substituição. Por exemplo, o resíduo nativo em P2 no RCL da serpina de tipo selvagem pode ser substituído por um resíduo não nativo na serpina modificada.

[044]O resíduo nativo em P2 no RCL da serpina de tipo selvagem pode ser substituído por um resíduo polar grande, tal como D, Q, N, Y, um resíduo hidrofóbico grande, tal como W, L, I, V e F, um resíduo positivamente carregado, tal como R, H ou K ou outro resíduo, por exemplo, C, A, T, S ou P.

[045]Em algumas concretizações, o resíduo em P2 na serpina modificada pode ser diferente de P.

[046]Em algumas concretizações preferidas, o resíduo em P2 pode ser modificado para um resíduo polar grande, tal como Q, N, Y, um resíduo hidrofóbico grande, tal como W ou um resíduo positivamente carregado, tal como I, H ou K, ainda mais preferivelmente um resíduo positivo, tal como H, K ou R, de preferência K.

[047]Em algumas concretizações, o resíduo em P2 pode ser não modificado na serpina modificada. Por exemplo, o resíduo na posição P2 no RCL da serpina modificada pode ser o resíduo que está presente no resíduo em P2 na sequência da serpina de tipo selvagem.

[048]A uma ou mais mutações no RCL da serpina modificada podem compreender ou consistir em substituições em resíduos em P1' e/ou P2, ou seja, os resíduos localizados nas posições P1' e/ou P2 no RCL da sequência da serpina de tipo selvagem podem ser substituídos por outros resíduos na serpina modificada.

[049]Em concretizações preferidas, a serpina modificada tem mutações em ambas as posições P2 e P1' do RCL.

[050]Resíduos adequados nas posições P2 e P1' da serpina modificada são conforme descrito acima.

[051]Em algumas serpinas modificadas descritas aqui, pelo menos um dos resíduos em P1' e P2 pode ser um resíduo positivamente carregado, tal como R, H ou K ou um resíduo polar grande, tal como D, Y, Q ou N; um resíduo hidrofóbico grande, tal como W, L, F, V, M ou I; ou outro resíduo, tal como L, C, A, E, T, S ou P. De preferência, pelo menos um dos resíduos em P1' e P2 é um resíduo positivamente carregado, tal como R, H ou K; um resíduo polar grande, tal como Y, Q ou N; ou um resíduo hidrofóbico grande, tal como W, L, F, V ou I.

[052]Exemplos de resíduos em P2 e P1', respectivamente, em uma serpina modificada conforme descrito aqui incluem KK, FK, RK, VK, LK, QK, CK, PK, FR, HR, IR, SR, TR, VR, YR, AR, PR, RS, KS, QV, RV, RI, RH, KH, TH, RC, RA, LY, QY, TY, DM, TM, WN, RN, HN, TN, KN, NN, PE, RQ, KQ e TQ.

[053]Em algumas concretizações preferidas, tanto o resíduo em P1' quanto o resíduo em P2 podem ser modificados para resíduos positivamente carregados, tais como K, H ou R, mais preferivelmente K.

[054]Em algumas concretizações, os resíduos em P2 e P1', respectivamente, em uma serpina modificada conforme descrito aqui, podem ser diferentes de PN, FS, QS, AS, TS, HS, TA, PT, CC, PS, PT, PM, PH, PA ou PC. Por exemplo, os resíduos em P2 e P1' podem ser diferentes de PN, FS, QS, AS, TS, HS, TA, PT, CC ou PC em uma base de PCI ou diferentes de PS, PT, PM, PH ou PA em uma base de a1AT.

[055]Em algumas concretizações, o resíduo em P1 pode ser não modificado na serpina modificada. Por exemplo, o resíduo na posição P1 no RCL da serpina modificada pode ser o resíduo que está presente no resíduo em P1 na sequência de serpina de tipo selvagem. Por exemplo, o resíduo em P1 em um PCI modificado pode ser um resíduo de R.

[056]Em outras concretizações, o resíduo em P1 pode ser ter uma mutação na serpina modificada. Por exemplo, a uma ou mais mutações no loop central reativo (RCL) da serpina modificada ainda compreendem uma mutação no resíduo em P1. De preferência, a mutação é uma substituição. O resíduo nativo em P1 no RCL da serpina de tipo selvagem pode ser substituído por um resíduo não nativo na serpina modificada.

[057]Em algumas concretizações, o resíduo em P1 pode ter uma mutação ou ser modificado para um resíduo positivamente carregado, tal como H, K ou R, de preferência R.

[058]De preferência, um resíduo nativo que é não positivamente carregado na posição P1 de uma serpina de tipo selvagem pode ser substituído por um resíduo positivamente carregado na serpina modificada. Por exemplo, M na posição P1 de a1AT de tipo selvagem pode ser substituído por um resíduo positivamente carregado, tal como R, em uma a1AT modificada. A variante Pittsburgh (Pitts) de a1AT tem uma mutação no resíduo 358 a qual substitui o resíduo M na posição P1 por um resíduo R.

[059]Em algumas concretizações, o resíduo em P4 pode ser não modificado na serpina modificada. Por exemplo, o resíduo na posição P4 no RCL da serpina modificada pode ser o resíduo que está presente no resíduo em P4 na sequência da serpina de tipo selvagem. Por exemplo, o resíduo em P4 em uma base de PCI pode ser F e o resíduo em P4 em uma base de a1AT pode ser A.

[060]Em outras concretizações, o resíduo em P4 pode ter uma mutação na serpina modificada. Por exemplo, a uma ou mais mutações no loop central reativo (RCL) da serpina modificada ainda compreendem uma mutação no resíduo em P4.

[061]De preferência, a mutação é uma substituição. O resíduo em P4 no RCL da serpina de tipo selvagem pode ser substituído por um resíduo diferente na serpina modificada. Por exemplo, o resíduo em P4 em um PCI modificado pode ter uma mutação ou ser modificado para outro resíduo F e o resíduo em P4 em uma a1AT modificada pode ter uma mutação ou ser modificado para um resíduo diferente de A.

[062]Resíduos adequados na posição P4 do RCL da serpina modificada incluem S, R, V, C, W, K, L, G, H, F, T, Q e A.

[063]Nos exemplos de serpinas pró-coagulantes modificadas conforme descrito aqui: o resíduo em P4 é Q, o resíduo em P2 é R, o resíduo em P1 é R e o resíduo em P1'é N; o resíduo em P4 é K, o resíduo em P2 é R, o resíduo em P1 é R e o resíduo em P1'é H; o resíduo em P4 é S, o resíduo em P2 é L, o resíduo em P1 é R e o resíduo em P1'é K; o resíduo em P4 é H, o resíduo em P2 é R, o resíduo em P1 é R e o resíduo em P1'é V; o resíduo em P4 é F, o resíduo em P2 é K, o resíduo em P1 é R e o resíduo em P1'é K; o resíduo em P4 é F, o resíduo em P2 é R, o resíduo em P1 é R e o resíduo em P1'é K; o resíduo em P4 é F, o resíduo em P2 é V, o resíduo em P1 é R e o resíduo em P1'é K; o resíduo em P4 é C, o resíduo em P2 é L, o resíduo em P1 é R e o resíduo em P1'é K; o resíduo em P4 é F, o resíduo em P2 é F, o resíduo em P1 é R e o resíduo em P1'é R; o resíduo em P4 é S, o resíduo em P2 é H, o resíduo em P1 é R e o resíduo em P1'é R; o resíduo em P4 é G, o resíduo em P2 é I, o resíduo em P1 é R e o resíduo em P1'é R; o resíduo em P4 é R, o resíduo em P2 é Q, o resíduo em P1 é R e o resíduo em P1'é V; o resíduo em P4 é T, o resíduo em P2 é R, o resíduo em P1 é R e o resíduo em P1'é V o resíduo em P4 é R, o resíduo em P2 é R, o resíduo em P1 é R e o resíduo em P1'é I; o resíduo em P4 é V, o resíduo em P2 é R, o resíduo em P1 é R e o resíduo em P1'é I; o resíduo em P4 é L, o resíduo em P2 é R, o resíduo em P1 é R e o resíduo em P1'é I; o resíduo em P4 é T, o resíduo em P2 é L, o resíduo em P1 é R e o resíduo em P1'é Y; o resíduo em P4 é A, o resíduo em P2 é Q, o resíduo em P1 é R e o resíduo em P1'é Y; o resíduo em P4 é K, o resíduo em P2 é D, o resíduo em P1 é R e o resíduo em P1'é M; o resíduo em P4 é W, o resíduo em P2 é W, o resíduo em P1 é R e o resíduo em P1'é N; o resíduo em P4 é A, o resíduo em P2 é K, o resíduo em P1 é R, e o resíduo em P1'é S; o resíduo em P4 é A, o resíduo em P2 é R, o resíduo em P1 é R, e o resíduo em P1'é S; o resíduo em P4 é A, o resíduo em P2 é P, o resíduo em P1 é R, e o resíduo em P1'é E; o resíduo em P4 é A, o resíduo em P2 é P, o resíduo em P1 é R, e o resíduo em P1'é R; o resíduo em P4 é A, o resíduo em P2 é P, o resíduo em P1 é R, e o resíduo em P1'é K; o resíduo em P4 é A, o resíduo em P2 é T, o resíduo em P1 é R, e o resíduo em P1'é M; o resíduo em P4 é A, o resíduo em P2 é Y, o resíduo em P1 é R, e o resíduo em P1'é R; o resíduo em P4 é A, o resíduo em P2 é A, o resíduo em P1 é R, e o resíduo em P1'é R; o resíduo em P4 é A, o resíduo em P2 é C, o resíduo em P1 é R, e o resíduo em P1'é K; o resíduo em P4 é A, o resíduo em P2 é W, o resíduo em P1 é R, e o resí-duo em P1'é N; o resíduo em P4 é A, o resíduo em P2 é H, o resíduo em P1 é R, e o resíduo em P1'é N; o resíduo em P4 é A, o resíduo em P2 é Q, o resíduo em P1 é R, e o resíduo em P1'é K; ou o resíduo em P4 é A, o resíduo em P2 é N, o resíduo em P1 é R, e o resíduo em P1'é N. o resíduo em P4 é F, o resíduo em P2 é F, o resíduo em P1 é R, e o resíduo em P1'é K. o resíduo em P4 é A, o resíduo em P2 é K, o resíduo em P1 é R, e o resíduo em P1'é Q, o resíduo em P4 é A, o resíduo em P2 é R, o resíduo em P1 é R, e o resíduo em P1'é Q..

[064]Em alguns serpinas modificadas preferidas, o resíduo em P4 é A, o resíduo em P2 é K, o resíduo em P1 é R e o resíduo em P1'é K.

[065]Em algumas concretizações, os resíduos nas posições P4, P2 e P1' em uma serpina pró-coagulante modificada conforme descrito aqui podem ser diferentes de HPN, DKN, HPE, FFS, LQS, HAS, YTS, AHS, ATA, LPT, ACC, APT, APA, APM, APH, APS e VPC, respectivamente. Por exemplo, um PCI modificado pode ter resí- duos diferentes de HPN, DKN, HPE, FFS, LQS, HAS, YTS, AHS, ATA, LPT, ACC e VPC nas posições P4, P2 e P1' e uma a1AT modificada pode ter resíduos diferentes de APT, APA, APM ou APH nas posições P4, P2 e P1'. Em algumas concretizações, a combinação de resíduos nas posições P4, P2 e P1' em uma serpina pró- coagulante modificada conforme descrito aqui pode ser de ocorrência não natural, ou seja, a combinação de resíduos nas posições P4, P2 e P1'não é encontrada na serpina precursora de tipo selvagem (ou seja, não modificada) ou em outras serpi- nas de tipo selvagem.

[066]Um serpina modificada conforme descrito aqui pode compreender a sequência de uma serpina de tipo selvagem (ou seja, não modificada), de preferência uma serpina madura de tipo selvagem, com uma ou mais mutações no RCL da mesma conforme descrito acima e opcionalmente uma ou mais mutações adicionais fora do RCL.

[067]As sequências de serpinas de tipo selvagem são bem conhecidas na técnica e podem incluir SEQ ID NOS: 1 a 11, conforme definido aqui. As sequências de serpinas de tipo selvagem podem incluir a sequência de proteínas maduras de tipo selvagem.

[068]A sequência madura do inibidor de Proteína C (PCI), incluindo seu pro- peptídeo, corresponde aos resíduos 20-406 de SEQ ID NO: 1. A a1-antiquimotripsina madura corresponde aos resíduos 26-423 de SEQ ID NO: 2. A sequência do inibidor de C1-esterase madura corresponde aos resíduos 23-500 de SEQ ID NO: 3. A sequência a2-antiplasmina madura corresponde aos resíduos 28-491 de SEQ ID NO: 4. A sequência de antitrombina madura (ATIII) corresponde aos resíduos 33-464 de SEQ ID NO: 5. A sequência de cofator II de heparina madura corresponde aos resíduos 20-499 de SEQ ID NO: 6. A sequência de a1-antitripsina madura (a1AT) corresponde aos resíduos 25-418 de SEQ ID NO: 7. A sequência de calistatina madura corresponde aos resíduos 21-427 de SEQ ID NO: 8. A sequência do inibidor de ati- vador de plasminogênio madura corresponde aos resíduos 24-402 de SEQ ID NO: 9. A sequência do inibidor dependente de proteína Z madura corresponde aos resíduos 22-444 de SEQ ID NO: 10. A sequência de protease nexina isoforma 1 madura corresponde aos resíduos 20-398 de SEQ ID NO: 11.

[069]Outras mutações de resíduos no RCL conforme descrito acima, uma serpina modificada pode ter 50 ou menos resíduos de aminoácidos alterados em relação a uma sequência de aminoácidos de uma serpina tipo selvagem (por exemplo, a sequência da serpina madura de uma de SEQ ID NOS: 1 a 11, de preferência SEQ ID NO: 1 ou 7), de preferência 45 ou menos, 40 ou menos, 30 ou menos, 20 ou menos, 15 ou menos, 10 ou menos, 5 ou menos ou 3 ou menos. Por exemplo, uma serpina modificada pode compreender a sequência de serpina de tipo selvagem com 50 ou menos, 45 ou menos, 40 ou menos, 30 ou menos, 20 ou menos, 15 ou menos, 10 ou menos, 5 ou menos ou três ou menos resíduos de aminoácidos mutantes ou alterados, além de um, dois, três ou quatro resíduos de aminoácidos no RCL da ser- pina que têm mutação ou são modificados, conforme descrito acima (ou seja, os resíduos nas posições P1 e/ou P2 e, opcionalmente, P1 e/ou P4).

[070]Um resíduo de aminoácido na sequência de aminoácidos de tipo selvagem pode ser alterado ou ter uma mutação por meio de inserção, eliminação ou substituição, de preferência substituição, de um resíduo de aminoácido diferente. Tais alterações podem ser causadas por um ou mais de adição, inserção, eliminação ou substituição de um ou mais nucleotídeos no ácido nucleico codificador.

[071]Por exemplo, uma serpina modificada pode compreender a sequência de aminoácidos dos resíduos 25-418 de SEQ ID NO: 12 que tem 50 ou menos mutações, em que as ditas mutações estão em outras posições que não P4, P2, P1 e P1', isto é, o resíduo em P4 no RCL da serpina modificada é A, o resíduo em P2 é, o resíduo em P1 é R e o resíduo P1'é K.

[072]O resíduo em P4 na serpina modificada de SEQ ID NO: 12 está locali- zado na posição 379 (355 da proteína madura), o resíduo em P2 está localizado na posição 381 (357 da proteína madura), o resíduo em P1 está localizado na posição 382 (358 da proteína madura) e o resíduo em P1'está localizado na posição 383 (359 da proteína madura).

[073]A serpina modificada pode compartilhar pelo menos 50% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos do tipo selvagem de uma serpina de tipo selvagem, por exemplo, a sequência da serpina madura de qualquer uma de SEQ ID NOS: 1 a 11, de preferência SEQ ID NO: 1 ou 7, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência.

[074]Por exemplo, uma serpina modificada pode compreender uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 50% de identidade de sequência com os resíduos 25-418 de SEQ ID NO: 12, em que o resíduo em P4 no RCL da serpina modificada é A, o resíduo em P2 é K, o resíduo em P1 é R e o resíduo em P1'é K.

[075]A identidade de sequência é, em geral, definida com referência ao algoritmo GAP (Wisconsin Package GCG, Accelerys Inc, San Diego, EUA). O GAP usa o algoritmo de Needleman e Wunsch para alinhar duas sequências completas que maximiza o número de emparelhamentos e minimiza o número de lacunas. Em geral, os parâmetros de defaultsão usados, com uma penalidade por criação de lacunas = 12 e penalidade por extensão de lacuna = 4. O uso do GAP pode ser preferido, mas podem ser usados outros algoritmos, por exemplo, BLAST (o qual usa o método de Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 405-410), FASTA (o qual usa o método de Pearson e Lipman (1988) PNAS USA 85: 2444-2448) ou o algoritmo de Smith-Waterman (Smith e Waterman (1981) J. Mol. Biol. 147: 195-197) ou o programa TBLASTN de Altschul et al. (1990) supra, geralmente empregando parâmetros de default. Em particular, o algoritmo psi-Blast pode ser usado (Nucl. Acids Res. (1997) 25, 3389-3402). A identidade e similaridade de sequência também podem ser determinadas usando o software GenomequestTM (Gene-TI, Worcester MA, EUA).

[076]As comparações de sequências são, de preferência, feitas ao longo de todo o comprimento da sequência relevante descrita aqui.

[077]De preferência, uma serpina pró-coagulante modificada conforme descrito aqui compreende o RCL de consenso P17 E, P16 S/E/K/R, P15 G, P14 T/S, P12-P9 (A/G/S)4.

[078]Uma serpina modificada pode ainda compreender um ou mais resíduos que são conservados em sequências de serpina de tipo selvagem. Por exemplo, uma serpina modificada pode compreender alguns ou todos os seguintes resíduos (numerados de acordo com sua posição em a1AT): 33F, 49N, 53S, 54P, 56S, 61L, 67G, 72T, 80L, 130F, 147F, 157I, 158N, 161V, 165T, 167G, 169I, 180T, 184L, 186N, 190F, 191K, 192G, 194W, 198F, 203T, 208F, 218V, 220M, 221M, 277Y, 254L, 255P, 289P, 290K, 299L, 303L, 307G, 312F, 316A, 327L, 334H, 342E, 344G, 347A, 369P, 370F, 383L, 384F, 386G e 391P (Irving et al. 2008). Os resíduos conservados cor-respondentes em outras sequências de serpina podem ser facilmente determinados usando análise de sequência de rotina.

[079]As mutações ou variações fora do RCL da serpina modificada podem incluir substituição de um ou mais resíduos de Cys na serpina modificada, tal como o resíduo C232 (numeração de acordo com a sequência madura) de a1AT, para suprimir a formação de pontes de dissulfureto ou outras modificações; eliminação ou substituição de resíduos no N-término da sequência de tipo selvagem, por exemplo, para facilitar a expressão; ou mutação ou modificação dos resíduos nos sítios de ligação de heparina das serpinas modificadas (isto é, hélice D ou hélice H), de modo a alterar a atividade de ligação à heparina da serpina modificada.

[080]Em algumas concretizações, a serpina modificada pode ter um truncamento N-terminal em relação à serpina de tipo selvagem. Por exemplo, a serpina modificada pode ter um truncamento de 10 a 30 resíduos no N-terminal, de preferência cerca de 20 resíduos.

[081]Um ou mais resíduos na serpina modificada podem ser aminoácidos não naturais, aminoácidos modificados ou D-aminoácidos. O uso de tais aminoáci- dos é bem conhecido por aqueles versados na técnica.

[082]Uma serpina modificada conforme descrito aqui pode exibir a estrutura secundária da serpina de tipo selvagem, por exemplo, uma serpina modificada pode exibir uma estrutura que compreende 3 8-9 beta folhas, alfa hélices e um RCL flexível de cerca de 20 resíduos.

[083]Em algumas concretizações preferidas, a serpina modificada pode consistir na sequência de aminoácidos de uma serpina de tipo selvagem com uma ou mais mutações no loop central reativo (RCL), conforme descrito aqui.

[084]De preferência, a serpina modificada é não imunogênica em um ser humano. Por exemplo, a serpina de tipo selvagem pode ser uma serpina humana, de preferência uma serpina de plasma humano.

[085]A serpina de tipo selvagem pode ser a1-antiquimotripsina (SERPINA3), a2-antiplasmina (SERPINF2) antitrombina (AT III) (SERPINC1), cofator II da heparina (HCII) (SERPIND1), inibidor de Proteína C (PCI) (SERPINA5), a1-antitripsina (a1AT) (SERPINA1), Calistatina (SERPINA4), inibidor de ativador de plasminogênio-1 (SERPINE1), inibidor de C1-esterase (SERPING1), protease nexina 1 (SERPINE2) ou inibidor dependente de proteína Z (SERPINA10) (Whisstock et al., JBC. 285 32 24.07-24312, Rau et al., Journal of Thrombosis and Hemostasis, 5 (Supl. 1): 102115, Huntington, Journal of Thrombosis e Hemostasis, 9 (Supl. 1): 26-34).

[086]De preferência, a serpina de tipo selvagem é ATIII, HCII, PCI ou a1AT, mais preferivelmente PCI ou a1AT (Huntington et al., Cell Mol. Life Sci. 66 (2009) 113-121; Li et al., JBC, 283 51 36039-36045; e Li et al., PNAS 2008 105 4661-4666).

[087]a1-antiquimotripsina (SERPINA3; Gene ID 12) pode ter a sequência de aminoácidos de referência de NP_001076.2 GI: 50659080 (SEQ ID NO: 2) e pode ser codificada pela sequência de nucleotídeos de referência de NM_001085.4 GI: 73858562.

[088]O inibidor de C1-esterase (SERPING1; Gene ID 710) pode ter a se-quência de aminoácidos de referência de NP_000053.2 GI: 73858568 (SEQ ID NO: 3) e pode ser codificado pela sequência de nucleotídeos de referência de NM_000062.2 GI: 73858567.

[089]a2-antiplasmina (SERPINF2; Gene ID 5345) pode ter a sequência de aminoácidos de referência de NP_000925.2 GI: 115583663 (SEQ ID NO: 4) e pode ser codificada pela sequência de nucleotídeos de referência de NM_001165920.1 GI: 260064047

[090]Antitrombina (AT III) (SERPINC1; Gene ID 462) pode ter a sequência de aminoácidos de referência de NP_000479.1 GI: 4502261 (SEQ ID NO: 5) e pode ser codificada pela sequência de nucleotídeos de referência de NM_000488.3 GI: 254588059

[091]Cofator II de heparina (HCII) (SERPIND1; Gene ID3053) pode ter a sequência de aminoácidos de referência de NP_000176.2 GI: 73858566 (SEQ ID NO: 6) e pode ser codificada pela sequência de nucleotídeos de referência de NM_000185.3 GI: 73858565.

[092]O inibidor de Proteína C (PCI) (SERPINA5; Gene ID 5104) pode ter a sequência de aminoácidos de referência de NP_000615.3 GI: 194018472 e pode ser codificada pela sequência de nucleotídeos de referência de NM_000624.5 GI: 401.782.581. Em algumas concretizações preferidas, o inibidor de Proteína C (PCI) pode ser uma variante alélica que resulta de uma substituição em SNP rs6115, VAR_013081 (a variante S45N, numeração de acordo com proteína madura, incluindo o propeptídeo) e que tem a sequência mostrada em SEQ ID NO: 1. Os resíduos 1-19 de SEQ ID NO: 1 correspondem à sequência sinalizadora. No plasma, o PCI pode existir em uma forma de comprimento completo, a qual inclui o propeptídeo de resíduos 20-25 de SEQ ID NO: 1 (isto é, os resíduos 20-406 de SEQ ID NO: 1) ou a forma N-terminalmente clivada que carece do propeptídeo (isto é, os resíduos 26406 de SEQ ID NO: 1).

[093]a1-antitripsina (a1AT) (SERPINA1; Gene ID 5265) pode ter a sequência de aminoácidos de referência de NP_000286.3 GI: 50363217 (SEQ ID NO: 7) e pode ser codificada pela sequência de nucleotídeos de referência de NM_000295.4 GI: 189.163.524.

[094]Calistatina (SERPINA4; Gene ID 5267) pode ter a sequência de amino- ácidos de referência de NP_006206.2 GI: 21361302 (SEQ ID NO: 8) e pode ser codificada pela sequência de nucleotídeos de referência de NM_006215.2 GI: 21361301.

[095]Inibidor de ativador do plasminogênio-1 (SERPINE1; Gene ID 5054) pode ter a sequência de aminoácidos de referência de NP_000593.1 GI: 10835159 (SEQ ID NO: 9) e pode ser codificada pela sequência de nucleotídeos de referência de NM_000602.4 GI: 383.286.745.

[096]O inibidor dependente de proteína Z (PZI) (SERPINA10; Gene ID 51156) pode ter a sequência de aminoácidos de referência de NP_057270.1 GI: 7705879 (SEQ ID NO: 10) e pode ser codificada pela sequência de nucleotídeos de referência de NM_016186.2 GI : 154.759.289.

[097]Protease nexina 1 (PN1) (SERPINE2; Gene ID 5270) pode ter a se-quência de aminoácidos de referência de NP_001130000.1 GI: 24307907, NP_001130002.1 GI: 211904152 ou NP_006207.1 GI: 211904156 (SEQ ID NO: 11) e pode ser codificada pela sequência de nucleotídeos de referência de NM_001136528.1 GI: 211904151, NM_001136530.1 GI: 211904155 ou NM_006216.3 GI: 211.904.150.

[098]Os resíduos em P1', P1, P2 e P4 que podem ter uma mutação conforme descrito acima são assinaladas em negrito em SEQ ID NOS: 1 a 11.

[099]A uma ou mais mutações no RCL alteram a especificidade da serpina modificada em relação àquela da serpina de tipo selvagem não modificada. A serpi- na modificada exibe seletividade aumentada por proteases anticoagulantes mais proteases pró-coagulantes em comparação com a serpina de tipo selvagem.

[0100]De preferência, a uma ou mais mutações dentro do RCL aumentam a inibição de APC pela serpina modificada em relação à inibição de outras proteases de coagulação, em particular uma ou mais proteases pró-coagulantes além de trom- bina, fXa, fVIIa, fIXa e fXIa.

[0101]Por exemplo, a uma ou mais mutações no RCL da serpina modificada podem aumentar a inibição de APC pela serpina modificada em relação à inibição de trombina. A inibição seletiva de APC em relação à trombina pode ser aumentada na presença ou ausência de heparina.

[0102]Além disso, a uma ou mais mutações no RCL da serpina modificada podem aumentar a inibição de APC pela serpina modificada em relação à inibição de uma, duas, três ou todas as quatro proteases pró-coagulantes fXa, fVIIa, fIXa e FXIa.

[0103]Uma serpina modificada conforme descrito aqui exibe uma maior inibição de APC em relação à trombina e outras proteases pró-coagulantes do que a serpina de tipo selvagem não modificada.

[0104]A serpina modificada pode mostrar maior inibição de APC do que a trombina. Por exemplo, a inibição de APC pela serpina modificada pode ser pelo menos 5 vezes mais, pelo menos 10 vezes mais ou pelo menos 1000 vezes mais do que a inibição de trombina pela serpina modificada. Em algumas concretizações, a serpina modificada pode inibir a APC com uma constante de taxa de segunda grandeza (k2) que é pelo menos 5 vezes mais, pelo menos 10 vezes mais, ou pelo menos 1000 vezes mais do que a constante de taxa de segunda grandeza para inibição de trombina. De preferência, a estequiometria de inibição da serpina modificada para APC é 1.

[0105]De preferência, uma serpina modificada conforme descrito aqui pode se ligar e inibir a APC, mas não exibe qualquer ligação ou inibição ou substancialmente nenhuma ligação ou inibição de trombina.

[0106]A uma ou mais mutações no RCL também podem aumentar a inibição de APC em relação à inibição de 1, 2, 3 ou todos os 4 de fVIIa, fIXa, fXa e fXIa. A inibição de APC em relação ao fVIIa, fIXa, fXa e/ou fXIa pode ser aumentada na presença ou na ausência de heparina.

[0107]Por exemplo, a serpina modificada pode exibir inibição de APC em relação a 1, 2, 3 ou todos os 4 de fVIIa, fIXa, fXa e fXIa maior do que aquela da serpi- na de tipo selvagem.

[0108]A serpina modificada pode inibir a APC mais do que ela inibe o fVIIa. Por exemplo, a inibição de APC pela serpina modificada pode ser pelo menos duas vezes mais, pelo menos 10 vezes mais, pelo menos 100 vezes mais ou pelo menos 1000 vezes mais do que a inibição de fVIIa pela serpina modificada. A serpina modificada inibe a APC com uma constante de taxa de segunda grandeza (k2) que é pelo menos duas vezes mais, pelo menos 10 vezes mais, pelo menos 100 mais ou pelo menos 1000 vezes mais do que a constante de taxa de segunda grandeza para a inibição de fVIIa.

[0109]A serpina modificada pode inibir a APC mais do que ela inibe o flXa. Por exemplo, a inibição de APC pela serpina modificada pode ser pelo menos duas vezes mais, pelo menos 10 vezes mais, pelo menos 100 vezes mais ou pelo menos 1000 vezes mais do que a inibição de flXa pela serpina modificada. A serpina modificada inibe a APC com uma constante de taxa de segunda grandeza (k2) que é pelo menos duas vezes mais, pelo menos 10 vezes mais, pelo menos 100 mais ou pelo menos 1000 vezes mais do que a constante de taxa de segunda grandeza para a inibição de fIXa.

[0110]A serpina modificada pode inibir a APC mais do que ela inibe o fXa. Por exemplo, a inibição de APC pela serpina modificada pode ser pelo menos 1,5 vezes mais, pelo menos duas vezes mais, pelo menos 10 vezes mais, pelo menos 100 vezes mais ou pelo menos 1000 vezes mais do que a inibição do fXa por serpi- na modificada. A serpina modificada inibe a APC com uma constante de taxa de segunda grandeza (k2) que é pelo menos 1,5 vezes mais, pelo menos duas vezes mais, pelo menos 10 vezes mais, pelo menos 100 vezes mais ou pelo menos 1000 vezes mais do que a constante de taxa de segunda grandeza para a inibição de fXa.

[0111]A serpina modificada pode inibir a APC mais do que ela inibe o fXIa. Por exemplo, a inibição de APC pela serpina modificada pode ser pelo menos duas vezes mais, pelo menos 10 vezes mais, pelo menos 100 vezes mais ou pelo menos 1000 vezes mais do que a inibição de fXIa pela serpina modificada. A serpina modificada inibe a APC com uma constante de taxa de segunda grandeza (k2) que é pelo menos duas vezes mais, pelo menos 10 vezes mais, pelo menos 100 mais ou pelo menos 1000 vezes mais do que a constante de taxa de segunda grandeza para a inibição de fXIa.

[0112]Uma serpina modificada conforme descrito aqui pode ser parte de uma proteína de fusão que contém uma ou mais sequências de aminoácidos heteró- logas adicionais à sequência de serpina modificada. Por exemplo, a proteína de fusão que compreende a serpina modificada pode compreender ainda um ou mais domínios adicionais que melhoram as propriedades de estabilidade, farmacocinética, objetivação, afinidade, purificação e produção da serpina modificada.

[0113]Domínios adicionais adequados incluem domínios Fc de imunoglobuli- na. Domínios Fc de imunoglobulina são bem conhecidos na técnica e incluem o domínio Fc de IgG1 humana. Um domínio Fc de imunoglobulina humana pode estar localizado na extremidade N-terminal ou C-terminal da serpina modificada.

[0114]As serpinas conforme descrito aqui podem ser fornecidas usando técnicas de síntese ou recombinantes que são convencionais na técnica de modifica- ção.

[0115]Em algumas concretizações, a serpina modificada pode ser produzida como uma proteína de fusão que compreende ainda um marcador de afinidade o qual pode, por exemplo, ser útil para purificação. Um marcador de afinidade é uma sequência peptídica heteróloga que forma um membro de um par de ligação específica. Os polipeptídeos que contêm um marcador podem ser purificados por meio da ligação ao outro membro do par de ligação específica para o polipeptídeo, por exemplo, em uma coluna de afinidade. Por exemplo, a sequência de marcador pode formar um epítopo que é ligado por uma molécula de anticorpo.

[0116]Marcadores de afinidade adequados incluem, por exemplo, glutationa- S-transferase, (GST), o domínio de ligação à maltose (MBD), MRGS(H)6, DYKDDDDK (FLAGTM), T7-, S- (KETAAAKFERQHMDS), poli-Arg (R5-6), poli-His (H2- 10), poli-Cys (C4) poli-Phe(F11) poli-Asp(D5-16), o marcador SUMO (Invitrogen Champion pET SUMO Expression System), o marcador Strept-II (WSHPQFEK), c-myc (EQKLISEEDL), o marcador de Influenza-HA (Murray, P. J. et al. (1995) Anal Bio- chem 229, 170-9), o marcador Glu-Glu-Phe (Stammers, D. K. et al. (1991) FEBS Lett 283, 298-302), Tag.100 (Qiagen; marcador de 12 aa derivado de quinase MAP 2 de mamífero), o marcador Cruz 09™ (MKAEFRRQESDR, Santa Cruz Biotechnology Inc.) e o marcador Cruz 22™ (MRDALDRLDRLA, Santa Cruz Biotechnology Inc.). Sequências de marcadores conhecidas são revistas em Terpe (2003) Appl. Microbiol. Biotechnol. 60 523-533. Em concretizações preferidas, um marcador poli-His, tal como (H)6, o marcador His-SUMO (Invitrogen Champion pET SUMO Expression System) ou MRGS(H)6 pode ser usado.

[0117]A sequência do marcador de afinidade pode ser separada da serpina modificada após purificação, por exemplo, usando proteases sítio específicos.

[0118]Em algumas concretizações, a serpina modificada pode ser acoplada a um peptídeo líder sinalizador apropriado para dirigir a secreção do polipeptídeo de fusão das células para o meio de cultura. Uma série de peptídeos líderes sinalizadores adequados são conhecidos na técnica. O peptídeo líder sinalizador pode ser uma sequência sinalizadora de serpina ou pode ser heteróloga em relação à serpina modificada, isto é, pode ser uma sequência sinalizadora que não serpina. Por exemplo, pode ser empregado um sinal de secreção de a-fator ou sequência sinalizadora BiP. De preferência, o peptídeo sinalizador é removido por meio de processamento pós-traducional após expressão do polipeptídeo.

[0119]Serpinas modificadas, conforme descrito aqui, podem ser isoladas, no sentido de serem isentas de contaminantes, tais como serpinas não modificadas e outros polipeptídeos e/ou os componentes do soro.

[0120]As serpinas modificadas conforme descrito aqui podem inibir uma ou mais atividades de Proteína C ativada (APC). Por exemplo, as serpinas modificadas conforme descrito aqui podem inibir a clivagem proteolítica de um ou mais substratos de APC, tais como fVa ou fVIIIa. Por exemplo, a ligação da serpina modificada ao APC pode resultar em uma redução ou pelo menos 5 vezes, pelo menos 10 vezes ou pelo menos 15 vezes na clivagem proteolítica de fVa, fVIIIa e/ou outro substrato de APC. Em algumas concretizações, a ligação de APC pela serpina modificada pode resultar em nenhuma clivagem detectável do substrato fVa ou fVIIIa pela APC.

[0121]Métodos para medir a atividade de APC, por exemplo, através de medição da clivagem proteolítica de substratos de APC in vitro, são convencionais na técnica e são descritos aqui. Ensaios adequados para uso na determinação de atividade de APC incluem ensaios cinéticos convencionais, por exemplo, para medir as constantes de taxa, e ensaios de coagulação, incluindo ensaios de geração de trom- bina (Thrombin Generation Assay - TGA).

[0122]Métodos para medir a atividade das proteases pró-coagulantes, por exemplo, através de medição da clivagem proteolítica de substratos cromogênicos in vitro, são convencionais na técnica e são descritos aqui. Ensaios adequados para uso na determinação da atividade de protease incluem ensaios cinéticos convencionais, por exemplo, para medir as constantes de taxa, e ensaios de coagulação, incluindo ensaios de geração de trombina (TGA), ensaios de tempo de protrombina (PT) e ensaios de tempo de tromboplastina parcial ativada (aPTT).

[0123]Em algumas concretizações, serpinas modificadas conforme descrito aqui podem ainda ser modificadas por meio de modificação química, por exemplo, através de PEGuilação ou incorporação em um lipossoma para melhorar suas propriedadesfarmacêuticas, por exemplo, aumento da meia-vida in vivo.

[0124]Um serpina modificada conforme descrito aqui pode ser ligada a um ou mais de polietileno glicol (PEG) ou outras porções para aumentar a meia-vida in vivo da serpina modificada (Cantin et al., 2002, Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 27; 659665). Por exemplo, uma serpina modificada pode ser mono-peguilada ou poli- peguilada (por exemplo, com 2-6 porções de PEG). Métodos de PEGilação adequadossão bem conhecidos na técnica.

[0125]O efeito de uma serpina modificada sobre a coagulação e hemorragia pode ser determinado. Métodos adequados são convencionais na técnica. Por exemplo, o efeito de uma serpina modificada sobre a geração de trombina pode ser determinado usando um ensaio de geração de trombina (TGA) ou um ensaio de tempo de tromboplastina parcial ativada ou um ensaio de tempo de protrombina descrito aqui. Modelos in vivo adequados incluem modelos de lesão a laser da arte- ríola cremaster, modelos de FeCl3 em artéria carótida e ensaios de grampo na cauda, conforme descrito aqui. Outros modelos de coagulação adequados são bem conhecidos na técnica.

[0126]Outros aspectos da presente invenção fornecem um ácido nucleico que codifica uma serpina modificada conforme descrito acima e um vetor que compreende tal ácido nucleico.

[0127]Podem ser escolhidos ou construídos vetores adequados que contêm sequências reguladoras apropriadas, incluindo sequências promotoras, fragmentos terminadores, sequências de poliadenilação, sequências intensificadoras, genes marcadores e outras sequências, conforme adequado. De preferência, o vetor con-tém sequências reguladoras apropriadas para dirigir a expressão do ácido nucleico em células de mamífero. Um vetor também pode incluir sequências tais como ori-gens de replicação, regiões promotoras e marcadores adequados, os quais permi-tem sua seleção, expressão e replicação em hospedeiros bacterianos, tal como E. coli.

[0128]Os vetores podem ser plasmídeos, virais, por exemplo, fagos, ou fa- gemídeos, conforme apropriado. Para maiores detalhes vide, por exemplo, Molecular Cloning: a Laboratory Manual: 3aedição, Russel et al., 2001, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Muitas técnicas e protocolos conhecidos para manipulação de ácido nucleico, por exemplo, no preparo de construtos de ácido nucleico, mutagêne- se, sequenciamento, introdução de DNA em células e expressão gênica, estão descritos em detalhes em Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al. eds. John Wiley & Sons, 1992.

[0129]Um ácido nucleico ou vetor conforme descrito aqui pode ser introduzido em uma célula hospedeira.

[0130]Outro aspecto da invenção fornece uma célula recombinante que compreende um ácido nucleico ou um vetor que expressa um polipeptídeo que compreende ou consiste em uma serpina modificada conforme descrito acima.

[0131]Uma variedade de células hospedeiras adequadas para a produção de serpinas modificadas recombinantes são conhecidas nas técnicas. As células hospedeiras adequadas podem incluir células procariotas, em particular bactérias, tais como Escherichia coli e Lactococcus lactis, e células eucariotas, incluindo células de mamífero, tais como células CHO e linhagens de células derivadas de CHO (células Lec), HeLa, COS, HEK293 e HEK-EBNA, células de anfíbio, tais como oócitos de Xenopus, células de inseto, tal como Trichoplusia ni, Sf9 e Sf21, e células de levedura, tal como Pichia pastoris.

[0132]Métodos para introdução de ácido nucleico em células são bem estabelecidos na técnica e qualquer método adequado pode ser empregado de acordo com as circunstâncias particulares. Para células eucariotas, métodos adequados podem incluir transfecção com fosfato de cálcio, DEAE-Dextrana, eletroporação, transfecção mediada por lipossomas e transdução usando retrovírus ou outros vírus, por exemplo, adenovírus, AAV, vaccinia ou lentivírus. Para células bacterianas, métodos adequados podem incluir transformação com cloreto de cálcio, eletroporação e transfecção usando bacteriófagos.

[0133]Genes marcadores, tais como genes de resistência ou sensibilidade a antibióticos, podem ser usados na identificação de clones que contêm ácido nucleico de interesse, conforme é bem conhecido na técnica.

[0134]O ácido nucleico introduzido pode estar em um vetor extracromossô- mico dentro da célula ou o ácido nucleico pode ser integrado no genoma da célula hospedeira. A integração pode ser promovida por inclusão de sequências dentro do ácido nucleico ou vetor que promovem a recombinação com o genoma, de acordo com técnicas convencionais.

[0135]Em algumas concretizações, o ácido nucleico que codifica uma serpi- na modificada conforme descrito aqui pode estar contido em um vetor de adequado para administração a um indivíduo, por exemplo, para aplicações em terapia gênica. Vetores adequados incluem vetores retrovirais, vetores lentivirais, vetores adenovi- rais e vetores de AAT.

[0136]A introdução pode ser seguida por expressão do ácido nucleico para produzir a serpina modificada codificada. Em algumas concretizações, as células hospedeiras (as quais podem incluir células realmente transformadas embora, mais provavelmente, as células serão descendentes das células transformadas) podem ser cultivadas in vitro sob condições para expressão do ácido nucleico, de modo que o polipeptídeo de serpina codificado seja produzido. Quando um promotor induzível é usado, a expressão pode requerer ativação do promotor induzível.

[0137]O polipeptídeo expresso que compreende ou consiste na serpina modificada pode ser isolado e/ou purificado após sua produção. Isto pode ser alcançado usando qualquer método conveniente conhecido na técnica. Métodos para purificação de polipeptídeos recombinantes são bem conhecidos na técnica e incluem, por exemplo, HPLC, FPLC ou cromatografia de afinidade. Em algumas concretizações, a purificação pode ser realizada usando um marcador de afinidade sobre o polipeptídeo, conforme descrito acima.

[0138]Outro aspecto da invenção fornece um método de produção de uma serpina modificada que compreende expressão de um ácido nucleico que codifica uma serpina modificada conforme descrito acima em uma célula hospedeira e, opcionalmente, isolamento e/ou purificação da serpina modificada assim produzida.

[0139]Os polipeptídeos que compreendem ou consistem em uma serpina modificada produzida conforme descrito pode ser investigados, por exemplo, as propriedadesfarmacológicas e/ou atividade podem ser determinadas. Métodos e meios de análise de proteínas são bem conhecidos na técnica.

[0140]Um serpina modificada conforme descrito aqui, o ácido nucleico que codifica uma serpina modificada ou uma célula recombinante que expressa um ser- pina modificada pode ser útil em terapia. Por exemplo, uma serpina modificada conforme descrito aqui, o ácido nucleico que codifica uma serpina modificada ou uma célula recombinante que expressa um serpina modificada pode ser administrada a um indivíduo para o tratamento de hemorragias.

[0141]Embora uma serpina modificada possa ser administrada individual-mente, as serpinas modificadas serão, em geral, administradas na forma de uma composição farmacêutica que pode compreender pelo menos um componente além da serpina modificada, por exemplo, um ácido nucleico que codifica a serpina modificada ou célula recombinante que expressa a serpina modificada. Assim, as composições farmacêuticas podem compreender, além da serpina modificada, ácido nu- cleico ou célula, um excipiente, veículo, tampão, estabilizante ou outros materiais farmaceuticamente aceitáveis bem conhecidos por aqueles versados na técnica. O termo "farmaceuticamente aceitável", conforme usado aqui, se refere a compostos, materiais, composições e/ou formas de dosagem que são, dentro do âmbito do são juízo médico, adequados para uso em contato com os tecidos de um indivíduo (por exemplo, ser humano) sem toxicidade excessiva, irritação, resposta alérgica ou outro problema ou complicação, comensurável com uma proporção benefício/risco razoável. Cada veículo, excipiente, etc. também têm de ser "aceitável"no sentido de ser compatível com os outros ingredientes da formulação. A natureza precisa do veículo ou outro material dependerá da via de administração, a qual pode ser por bolus, infusão, injeção ou qualquer outra via adequada, conforme discutido abaixo.

[0142]Em algumas concretizações, serpinas modificadas, ácidos nucleicos ou células podem ser fornecidas em uma forma liofilizada para reconstituição antes de administração. Por exemplo, serpinas liofilizadas podem ser reconstituídas com água estéril e misturadas com solução salina antes de administração a um indivíduo.

[0143]Para administração parentérica, por exemplo, administração subcutânea ou intravenosa, por exemplo, por injeção, a composição farmacêutica que compreende a serpina modificada, ácido nucleico ou célula pode estar na forma de uma solução aquosa parentericamente aceitável que é isenta de pirogênios e tem pH, isotonicidade e estabilidade adequados. Aqueles versados na técnica são bem capazes de preparar soluções adequadas usando, por exemplo, veículos isotônicos, tais como Injeção de Cloreto de Sódio, Injeção de Ringer, Injeção de Lactato de Ringer. Conservantes, estabilizantes, tampões, antioxidantes e/ou outros aditivos podem ser usados, conforme necessário, incluindo tampões, tais como fosfato, citrato e outros ácidos orgânicos; antioxidantes, tais como ácido ascórbico e metionina; conservantes (tais como cloreto de octadecildimetilbenzilamônio; cloreto de hexametô- nio; cloreto de benzalcônio, cloreto de benzetônio; fenol, álcool butílico ou benzílico; alquilparabenos, tais como metil ou propil parabeno; catecol; resorcinol; ciclo- hexanol; 3'-pentanol; e m-cresol); polipeptídeos de baixo peso molecular; proteínas, tais como albumina sérica, gelatina ou imunoglobulinas; polímeros hidrofílicos, tal como polivinilpirrolidona; aminoácidos, tais como glicina, glutamina, asparagina, his- tidina, arginina ou lisina; monossacarídeos, dissacarídeos e outros carboidratos, incluindo glicose, manose ou dextrinas; agentes de quelação, tal como EDTA; açúcares, tais como sacarose, manitol, trealose ou sorbitol; sal formador de contra-íons, tal como sódio; complexos metálicos (por exemplo, complexos de Zn-proteína); e/ou tensoativos não iônicos, tais como TWEENTM, PLURONICSTM ou polietileno glicol (PEG). Veículos, excipientes, adequados, etc., podem ser encontrados em textos farmacêuticos convencionais, por exemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18aedição, Mack Publishing Company, Easton, Pa., 1990.

[0144]As composições farmacêuticas e formulações podem ser convenientemente apresentadas na forma de dosagem unitária e podem ser preparadas por meio de quaisquer métodos bem conhecidos na técnica de farmácia. Tais métodos incluem a etapa de colocar em associação a serpina modificada com o veículo que constitui um ou mais ingredientes acessórios. Em geral, as composições são preparadas ao colocar, uniforme e intimamente, o composto ativo em associação com veículoslíquidos ou veículos sólidos finamente divididos ou ambos e, depois, se necessário, moldando o produto.

[0145]De preferência, as serpinas modificadas, ácidos nucleicos ou células conforme descrito aqui são formulados em uma composição farmacêutica para administração intravenosa ou subcutânea.

[0146]Uma composição farmacêutica que compreende uma serpina modifi- cada, ácido nucleico ou célula pode ser administrada individualmente ou em combinação com outros tratamentos, quer simultânea ou sequencialmente, dependendo da condição a ser tratada.

[0147]Uma serpina modificada, ácido nucleico ou célula conforme descrito aqui pode ser usado em um método de tratamento do corpo humano ou de um animal, incluindo tratamento terapêutico e profilático ou preventivo (por exemplo, tratamento antes do início de uma condição em um indivíduo para reduzir o risco de que a condição ocorra no indivíduo, retardar seu aparecimento ou reduzir sua gravidade após o início). O método de tratamento pode compreender administração de uma serpina modificada a um indivíduo que precisa da mesma.

[0148]Um indivíduo adequado para tratamento conforme descrito acima pode ser um mamífero, tal como um roedor (por exemplo, uma cobaia, um hâmster, um rato, um camundongo), murino (por exemplo, um camundongo), canino (por exemplo, um cão), felino (por exemplo, um gato), equino (por exemplo, um cavalo), um primata, símio (por exemplo, um macaco ou chimpanzé), um macaco (por exemplo, saguim, babuíno), um macaco (por exemplo, gorila, chimpanzé, orangotango, gibão) ou um ser humano.

[0149]Em algumas concretizações preferidas, o indivíduo é um ser humano. Em outras concretizações preferidas, mamíferos não humanos, em particular mamíferos que são convencionalmente usados como modelos para demonstrar a eficácia terapêutica em seres humanos (por exemplo, murino, primata, suínos, caninos, animais ou coelho) pode ser empregado. A inibição de APC humana e de murino por serpinas modificadas sem a inibição de trombina humana ou de murinho é mostrada abaixo.

[0150]A administração é normalmente em uma "quantidade terapeuticamen- te eficaz" ou "quantidade profilaticamente eficaz", sendo esta suficiente para apresentar um benefício para um paciente. Tal benefício pode ser pelo menos melhora de pelo menos um sintoma. A quantidade real administrada e a velocidade e curso da administração dependerão da natureza e gravidade do que está sendo tratado, do mamífero a ser tratado em particular, da condição clínica do paciente individual, da causa do transtorno, do local de distribuição da composição, do método de administração, do esquema de administração e outros fatores conhecidos dos praticantes de medicina.

[0151]Uma composição pode ser administrada individualmente ou em combinação com outros tratamentos, quer simultânea ou sequencialmente, dependendo das circunstâncias do indivíduo a ser tratado.

[0152]A prescrição do tratamento, por exemplo, decisões sobre a dosagem, etc., é da responsabilidade dos clínicos gerais e outros médicos e pode depender da gravidade dos sintomas e/ou progressão de uma doença a ser tratada. Doses apropriadas de polipeptídeos terapêuticos são bem conhecidas na técnica (Ledermann J.A. et al. (1991) Int. J. Cancer 47: 659-664; Bagshawe K.D. et al. (1991) Antibody, Immunoconjugates and Radiopharmaceuticals 4: 915-922). As dosagens específicas podem ser indicadas aqui ou no Physician Desk Reference (2003) conforme apropriado para o tipo de medicamento a ser administrado pode ser usado. Uma quantidade ou dose terapeuticamente eficaz adequada de uma serpina modificada pode ser determinada ao comparar sua atividade in vitro e a atividade in vivo em um modelo animal. Métodos para extrapolação de dosagens eficazes em camundongos e outros animais de teste para seres humanos são conhecidos. A dose exata dependerá de uma série de fatores, incluindo se a serpina modificada é para prevenção ou para tratamento, o tamanho e localização da área a ser tratada, a natureza exata da ser- pina modificada e a natureza de qualquer marcador detectável ou outra molécula ligada à serpina modificada.

[0153]Uma dose típica de serpina modificada estará na faixa de 0,1 mg/kg a 100 mg/kg, por exemplo, 1 a 80 mg/kg. Por exemplo, uma dose na faixa de 100 µg a 1 g pode ser usada para aplicações sistêmicas e 1 µg a 1 mg para aplicações tópi-cas. Uma dose de carga inicial maior, seguido por uma ou mais doses menores podem ser administradas. Esta é uma dose para um único tratamento de um paciente adulto, a qual pode ser proporcionalmente ajustada para lactentes e crianças e também ajustada para outros formatos de serpina modificadas em proporção ao peso molecular. Os tratamentos podem ser repetidos diariamente, duas vezes por semana, semanal ou mensalmente, a critério do médico. O esquema de tratamento de um indivíduo pode ser dependente das propriedades farmacodinâmicas e farmacocinéti- cas da composição de serpina modificada, da via de administração e da natureza da condição a ser tratada.

[0154]O tratamento pode ser periódico e o período entre as administrações pode ser de cerca de uma semana ou mais, por exemplo, cerca de duas semanas ou mais, cerca de três semanas ou mais, cerca de quatro semanas ou mais, uma vez por mês ou mais, cerca de cinco semanas ou mais ou cerca de seis semanas ou mais. Por exemplo, o tratamento pode ser a cada duas a quatro semanas ou cada quatro a oito semanas. O tratamento pode ser administrado antes e/ou após uma cirurgia e/ou pode ser administrado ou aplicado diretamente no local anatômico do trauma, cirurgia ou procedimento invasivo. Formulações e vias de administração adequadas são descritos acima.

[0155]Em algumas concretizações, as serpinas modificadas conforme des-crito aqui podem ser administradas como injeções subcutâneas. Injeções subcutâ-neas podem ser administradas usando um autoinjetor, por exemplo, para a profila- xia/tratamento a longo prazo.

[0156]Em algumas concretizações preferidas, o efeito terapêutico da serpina modificada pode persistir por longo período, dependendo da dose.

[0157]As serpinas modificadas descritas aqui inibem a APC sem inibir ou inibir substancialmente fatores pró-coagulantes, tal como a trombina, e podem ser úteis no tratamento de transtornos hemorrágicos e hemorragia; em particular transtornos provocados pela geração reduzida de trombina ou atividade aumentada da via anti- coagulante de APC.

[0158]A hemostase é a resposta normal de coagulação à lesão, isto é, a prevenção de sangramento ou hemorragia, por exemplo, a partir de um vaso san-guíneo lesionado. A hemostasia interrompe o sangramento e hemorragia dos vasos sanguíneos no corpo. Serpinas modificadas podem promover a hemostasia, ou seja, elas podem promover ou aumentar a interrupção de sangramento e hemorragia dos vasos sanguíneos no corpo, por exemplo, em indivíduos com transtornos hemorrágicos ou trauma.

[0159]Alguns aspectos da invenção fornecem uma serpina modificada conforme descrito aqui para uso em um método de tratamento do corpo humano ou de um animal; uma serpina modificada conforme descrito aqui para uso em um método de tratamento de hemorragia ou promoção de hemostasia; o uso de uma serpina modificada conforme descrito aqui na fabricação de um medicamento para o tratamento de hemorragia ou promoção de hemostasia; e um método de tratamento de hemorragia ou promoção de hemostase que compreende administração de uma serpina modificada conforme descrito aqui a um indivíduo que precisa da mesma.

[0160]O sangramento pode incluir sangramento ou hemorragia de vasos sanguíneos no corpo.

[0161]Um indivíduo adequado para tratamento com uma serpina modificada conforme descrito aqui pode ter um transtorno hemorrágico.

[0162]Transtornos hemorrágicos podem ser causados ou associados à ge-ração reduzida de trombina ou atividade aumentada da via anticoagulante de APC.

[0163]Transtornos hemorrágicos podem incluir qualquer transtorno hemorrágicohereditário ou adquirido no qual há uma redução na produção de trombina, formação reduzida de coágulos de fibrina ou estabilidade reduzida do coágulo. Por exemplo, transtornos hemorrágicos podem incluir deficiências congênitas de fatores VII, VIII, X, IX, XI e XIII; deficiência combinada V e VIII; deficiência de protrombina; deficiência de fibrina; e deficiências raras de outros fatores de coagulação; hemofilia A, B e C; aumento de hemorragia associado à hiperfibrinólise; aumento de hemorragia em virtude de contagem reduzida de plaquetas ou função plaquetária reduzida; e doença de von Willebrand.

[0164]Transtornos hemorrágicos adquiridos podem incluir coagulopatia dilu- cional associada à grande perda de sangue, hemorragia decorrente de trauma e cirurgia e efeitos de terapia anticoagulante.

[0165]Em algumas concretizações, o indivíduo pode ser resistente a fatores de coagulação exógenos, tal como fVIII ou fIX exógeno. Por exemplo, o fVIII ou fIX exógeno pode estimular uma resposta imune no indivíduo, por exemplo, produção de aloanticorpos inibidores.

[0166]Um indivíduo adequado para tratamento com uma serpina modificada conforme descrito aqui pode ter um transtorno hemorrágico adquirido, tal como hemorragia relacionada a trauma, cirurgia ou terapia anticoagulante.

[0167]Por exemplo, um indivíduo para tratamento adequado com uma serpi- na modificada conforme descrito aqui pode ter sofrido um traumatismo ou pode ter sofrido ou ter sido submetido a uma cirurgia ou terapia anticoagulante. Indivíduos adequados podem estar com uma hemorragia ou em risco de hemorragias provenientes de um ou mais vasos sanguíneos no corpo.

[0168]Em algumas concretizações, uma serpina modificada conforme descrito aqui pode ser útil na prevenção ou tratamento de i) hemorragia em pacientes com aloanticorpos ao fator de coagulação; ii) hemorragia em pacientes com alto risco de desenvolvimento de inibidores, por exemplo, para evitar o desenvolvimento de aloanticorpos; iii) hemorragias em pacientes com deficiência de fator VIII na ausência de inibidores; iv) hemorragia em pacientes com transtornos hemorrágicos congê- nitos, por exemplo, um transtorno hemorrágico congênito para o qual não existe uma terapia de reposição recombinante ideal atualmente, tal como deficiência grave de fator VII, deficiência de fator XI, deficiência combinada de VIII e V, deficiência de fator X e deficiência de fator V; v) hemorragias em pacientes com hemofilia, por exemplo, pacientes para os quais a terapia de reposição não é apropriada ou não está disponível; ou vi) hemorragia adquirida, incluindo hemorragia relacionada a trauma, cirurgia e terapia anticoagulante.

[0169]Outros aspectos da invenção fornecem o uso de uma serpina modificada conforme descrito aqui como um pró-coagulante e o uso de uma serpina modificada para inibir a APC no tratamento de hemorragia.

[0170]Vários aspectos e concretizações adicionais da presente invenção serão evidentes para aqueles versados na técnica em vista da presente descrição.

[0171]Outros aspectos e concretizações da invenção fornecem os aspectos e concretizações descritos acima, com o termo "que compreende"substituído pelo termo "que consiste em" e aspectos e concretizações descritos acima, com o termo "que compreende"substituído pelo termo "que consiste essencialmente em" .

[0172]Deverá ser entendido que o Pedido descreve todas as combinações de qualquer um dos aspectos e concretizações descritos acima uns com os outros, a menos que o contexto exija de outra forma. Similarmente, o Pedido descreve todas as combinações de características preferidas e/ou opcionais, quer isoladamente ou em conjunto com qualquer um dos outros aspectos, a menos que o contexto exija de outra forma.

[0173]Modificações das concretizações acima, outras concretizações e modificações das mesmas serão evidentes para aqueles versados na técnica ao ler a presente descrição e, como tal, estas estão dentro do âmbito da presente invenção.

[0174]Todos os documentos e entradas em bancos de dados de sequência mencionados no presente relatório descritivo são incorporados aqui por referência na íntegra para todas as finalidades.

[0175]"E/ou", onde usado aqui, deverá ser tomado como uma descrição específica de cada uma das duas características ou componentes especificados com ou sem o outro. Por exemplo, "A e/ou B" deve ser tomado como uma descrição específica de cada um de (i) A, (ii) B e (iii) A e B, como cada um é definido aqui individualmente.

[0176]Determinados aspectos e concretizações da invenção serão agora ilustrados por meio de exemplo e com referência às figuras descritas acima e às Tabelas descritas a seguir.

[0177]A Tabela 1 mostra as constantes de taxa de segunda grandeza para inibição de trombina e APC por A22 PCI (PCI com um truncamento N-terminal, começando em Ala22, numeração usa a sequência da proteína madura, incluindo o propeptídeo), FL a1AT Pitts (a1AT de comprimento completo com a mutação P1R Pittsburgh (Pitts)) e suas variantes. O erro padrão é mostrado. * A constante de taxa de inibição para trombina pela variante P2KP1' de PCI é uma estimativa inicial uma vez que, após a inibição, as reações não parecem se aproximar da inibição completa, potencialmente em virtude do fato de que a serpina está sendo consumida pelo substrato ou dissociação do complexo inibidor covalente de serpina:protease.

[0178]Tabela 2 mostra as constantes de taxa de segunda grandeza para inibição de trombina e APC por ICP e variantes na presença de heparina. O erro padrão é mostrado. * A constante de taxa de inibição de trombina pela variante P2KP1'K de PCI é uma estimativa a partir da inclinação inicial do gráfico de atividade residual de trombina em função do tempo. Inibição completa não é conseguida potencialmente do fato de que a serpina está sendo consumida pelo substrato ou dissociação do complexo inibidor covalente de serpina:protease.

[0179]A Tabela 3 mostra as constantes de taxa de segunda grandeza para inibição de FXa por a1AT Pitts e PCI e suas variantes. O erro padrão é mostrado.

[0180]A Tabela 4 mostra as constantes de taxa de segunda grandeza para inibição de fXIa por ICP e a variante PCI P2KP1'K. A inibição de APC é mostrada para comparação (a partir da Tabela 1). O erro padrão é mostrado.

[0181]A Tabela 5 mostra as constantes de taxa de segunda grandeza para a inibição de trombina e APC por variantes de PCI geradas por meio de mutagênese aleatória objetivada. O erro padrão é mostrado. As constantes para WT e P2KP1' PCI são mostradas para comparação. * A constante de taxa de inibição para trombi- na pela variante P2KP1' de PCI é uma estimativa inicial uma vez que, após a inibição, as reações não parecem se aproximar da inibição completa, potencialmente em virtude do fato de que a serpina está sendo consumida pelo substrato ou dissociação do complexo inibidor covalente de serpina:protease.

[0182]A Tabela 6 mostra as constantes de taxa de segunda grandeza para a inibição de fXIa por FL a1AT Pitts C232S e sua variante P2KP1'K. A inibição de APC é mostrada para comparação (a partir da Tabela 1). O erro padrão é mostrado.

[0183]A Tabela 7 mostra uma fração das sequências de RCL das variantes de PCI determinadas por meio de mutagênese aleatória objetivada específica para a inibição de APC em relação à inibição da trombina. As sequências mostradas são de um experimento inicial em que 88 mutantes foram avaliados. Os resíduos em P4, P2 e P1' que foram variados neste experimento são mostrados em negrito. Sequências de WT PCI e PCI P2KP1'K são mostradas para comparação.

[0184]A Tabela 8 mostra uma fração das sequências de RCL das variantes de PCI determinadas por meio de mutagênese aleatória objetivada específica para a inibição de APC em relação à inibição de trombina. As sequências mostradas são de um experimento maior no qual 460 mutantes foram avaliados. Os resíduos em P4, P2 e P1' que foram variados neste experimento são mostrados em negrito. Sequências WT PCI e PCI P2KP1'K são mostradas para comparação.

[0185]A Tabela 9 mostra uma fração das sequências de RCL de variantes de a1AT determinadas por meio de mutagênese aleatória objetivada específica para a inibição de APC em relação à inibição de trombina. As sequências são mostradas em comparação tanto com WT a1AT quanto a1AT Pitts. Os resíduos em P2 e P1'são exibidos em negrito, os resíduos em P1 estão sublinhados. Os prefixos mostram a biblioteca de origem para o mutante particular, com mutantes denotados P2.nr provenientes da biblioteca variante de P2, P1'.nr. provenientes da biblioteca variante de P1' e mutantes marcados 1-5.nr. provenientes de placas 1-5 da biblioteca variante de P2P1' .

[0186]A Tabela 10 mostra as constantes de taxa de segunda grandeza para a inibição de trombina e APC por um subconjunto de variantes de a1AT determinadas por mutagênese aleatória objetivada específica para APC em vez de trombina. O erro padrão é fornecido. As constantes de taxa de segunda grandeza para a trom- bina e inibição de APC por FL a1AT Pitts C232S P2KP1'K e FL a1AT Pitts C232S são fornecidas para comparação.

[0187]A Tabela 11 mostra os resultados dos ensaios de TP e aPTT para investigar a inibição de proteases pró-coagulantes por "hits" de mutagênese aleatória com base em FL a1AT Pitts C232S. Os ensaios de TP foram realizados usando plasma diluído a 1/4 para aumentar a sensibilidade do ensaio e realizados em tripli- cata, exceto quanto às reações mostradas para FL a1AT Pitts C232S P2RP1'C, as quais foram realizadas em duplicata. O erro mostrado é o desvio padrão. Os ensaios de aPTT foram experimentos individuais, nenhum erro é mostrado. Tanto para PT quanto aPTT, um tampão de controle apenas onde, em vez de proteínas, tampão (TBS) adicionado ao plasma foi usado como um controle. Aumentos em PT ou aPTT em relação ao controle são uma indicação de inibição de proteases pró-coagulantes. Para ambos os ensaios de PT e aPTT, os mutantes de serpina foram usados em uma concentração de 5 µM. Para fins de comparação, os mutantes P2K e P1'K são apresentados como uma média de triplicatas. Conforme mostrado a partir das cons- tantes de inibição nas Tabelas 1 e 3, estes mutantes exibem uma elevada especificidade por PCA em relação à trombina, mas inibem o fXa de forma significativa. Eles são, portanto, um bom comparador para uma inibição de outras proteases pró- coagulantes que não a trombina. ND indica não determinado.

[0188]A Tabela 12 mostra as constantes de taxa de segunda grandeza para inibição de fXa por variantes de a1AT a partir de mutagênese aleatória objetivada. Os mutantes avaliados aqui mostraram especificidade pela APC em relação à trom- bina, inibição substancial de APC e não mostraram qualquer prolongamento do PT. A maioria também mostrou apenas pequenos prolongamentos em aPTT. Em virtude destas características, eles foram selecionados para posterior análise. Para comparação, a inibição de fXa por FL aiAT Pitts C232S e FL aiAT Pitts C232S P2KPTK também é mostrada (a partir da Tabela 3).

[0189]A Tabela 13 mostra um resumo da caracterização de mais dois mutan- tes de a1AT encontrados ao combinar informações de mutagênese racional e aleatória.FL aiAT Pitts C232S e FL aiAT Pitts C232S P2KPTK C232S são mostrados para comparação (dados a partir das Tabelas 1 e 3 e Figura 5). aPTTs para P2RP1'Q e P2KPi'Q são a média de quatro medições separadas, o erro mostrado é o desvio padrão. O valor obtido para o plasma com tampão é mostrado entre parêntesis, novamente com o desvio padrão como o erro. Os aPTTs mostrados para Pitts e P2KPi'K são o resultado de pelo menos três medições separadas, o erro mostrado é o desvio padrão. O valor apresentado entre parênteses é o valor obtido para o plasma com tampão, mostrado com o desvio padrão como o erro. Todos os aPTTs foram obtidos usando uma concentração final de serpina de 5 µM. FL aiAT Pitts C232S nesta concentração tornou o plasma não coagulável. O valor de 300 s mostradoé o ponto de corte para o ensaio. As constantes de taxa de segunda grandeza para a inibição de trombina, APC e fXa pelas variantes são apresentadas com o erro padrão.

Experimentos

[0190]A cascata de coagulação e o papel regulador das serpinas nesta cas-cata são mostrados na Figura 1. Duas vias levam à ativação da cascata de coagula-ção, a cascata extrínseca (ou via do fator tecidual) e a via intrínseca (via de ativação de contato). Acredita-se que a principal via fisiológica de ativação seja a via extrínseca. Nesta via, o fator tecidual (TF) está exposto na superfície do vaso sanguíneo lesionado. O TF pode, então, se ligar ao fVIIa e fVII. TF:fVIIa ativa o fVII, assim como TF:fVII ativa espontaneamente TF:fVIIa. TF:fVIIa ativa fX em fXa e isso ativa a pro- trombina em trombina (fIIA); a protease central da cascata de coagulação. A trombi- na ativa as plaquetas por meio de clivagem de receptores ativados de protease (PARs) e cliva o fibrinogênio em fibrina. A fibrina é reticulada por fXIIIa o qual é, em si, ativado pela trombina para formar o coágulo de fibrina estável. A trombina, além disso, ativa um mecanismo de feedback positivo para potencializar sua própria formação. Ela ativa fVIII em fVIIIa e fVa em fV. fVIIIa se liga ao flXa para formar o complexo de tenase intrínseca (Xase). A Xase intrínseca ativa mais fX. Este fXa pode se ligar ao fVa para formar protrombinase. A protrombinase ativa a protrombina em trombina e é responsável pela maior parte da trombina produzida após início da coagulação. Além do mecanismo de feedback positivo da trombina, a trombina também pode encerrar sua própria ativação através de um mecanismo de feedback negativo. Quando se liga o seu cofator, trombomodulina (TM), o complexo de trombina:TM pode ativar a Proteína C (PC) em Proteína C ativada (APC). A APC cliva e inativa tanto fVIIIa quanto fVa, interrompendo efetivamente a geração de trombina. Serpinas são inibidoras importantes da cascata de coagulação. As ações inibidoras das serpi- nas inibidor de Proteína C (PCI), antitrombina (AT III), cofator II de heparina (HCII) e a1-antitripsina (a1AT) são mostradas na Figura 1.

[0191]Abaixo descrevemos a conversão de serpinas em inibidores específicos de APC para uso como agentes pró-coagulantes (tratamento, profilaxia, "bypas- sing" ou sinérgico) no tratamento de transtornos hemorrágicos, tal como hemofilia. As modificações descritas aqui tanto para PCI quanto aiAT mostram como uma prova de princípio de que pequenas alterações nestas proteínas podem ser usadas para criar inibidores específicos para APC.

[0192]O PCI foi descrito pela primeira vez como o inibidor fisiológico de APC e, portanto, serve como um ponto de partida para investigações (Suzuki et al., 1983; 1984). No entanto, o PCI é promíscuo e também inibe a trombina, trombina:TM, fXIa, fXa e TF:fVIIa (Elisen et al., 1998; Mosnier et al., 2001; Suzuki et al., 1984; Fortenberryet al., 2011; Meijers et al., 1988). Como uma consequência, o PCI pode funcionar tanto como um pró- quanto um anticoagulante. Sua atividade é regulada pela ligação a glicosaminoglicanas, tais como heparina e sulfato de heparana (Pratt & Church, 1992; Pratt et al., 1992; Li & Huntington, 2008). Para uma visão geral do papel do PCI na cascata de coagulação, vide a Figura 1.

[0193]a1AT é o inibidor natural de elastase de neutrófilos (Kalsheker, 1989). Ao contrário de outras serpinas na cascata de coagulação que têm Arg ou Leu em P1, a1AT tem uma Met em vez disso. Isto o torna um inibidor de proteases de coagulação muito pobre. No entanto, em virtude da alta concentração de a1AT no plasma, acredita-se que ela inibe a APC em um grau fisiologicamente significativo (Heeb & Griffin, 1988). Mutagênese do resíduo em P1 mostrou que o uso de uma Arg ou Leu em P1 melhora drasticamente a inibição das proteases de coagulação por a1AT (Heeb et al., 1990). Isto é exemplificado pela variante Pittsburgh (M358R (P1R); Pitts) de a1AT, a qual provoca uma doença hemorrágica grave (Owen et al., 1983).

[0194]Para desenvolver serpinas específicas para a inibição de APC em relação a proteases pró-coagulantes, PCI e a1AT Pittsburgh (P1R, a1AT Pitts) foram usadas como bases de serpina modelo. Todas as proteínas usadas neste estudo foram expressas a partir de culturas Escherichia coli (Rosetta2(DE3)pLysS, Novagen) usando o vetor de expressão pETSUMO (Invitrogen) e purificadas usando uma combinação de Ni-cromatografia de permuta aniônica e, no caso de PCI, cromato- grafia de afinidade por heparina. O marcador SUMO foi posteriormente removido por meio de clivagem com protease SUMO e o marcador removido através de cromato- grafia de troca Ni-aniônica aleatória para a1AT Pittsburgh (Pitts, P1R) e cromatogra- fia de permuta aniônica para heparina aleatória para PCI. O construto de PCI é truncado no N-término, começando em Ala22 (A22, numeração de acordo com a sequência da proteína madura, começando com o propeptídeo). O construto a1AT Pitts (P1R) é de comprimento completo (FL) e tem uma mutação C232S adicional para suprimir a formação de ligações de dissulfureto intermoleculares e outras modificações durante expressão e purificação (Yamasaki et al., 2011). Em virtude do vetor de expressão usado, o construto a1AT Pitts tem uma Ser (S) como seu primeiro resíduo, em vez de Glu (E). Espera-se que as mutações C232S e E1S não alterem a atividade de a1AT.

[0195]Os resíduos de Lys foram introduzidos em diferentes posições no RCL de PCI e a1AT Pittsburgh e os mutantes resultantes testados quanto à inibição de trombina e APC. Nos estágios iniciais deste estudo, os inibidores não foram rastrea- dos ou testados quanto à sua inibição de outras proteases de coagulação sob a premissa de que, uma vez que a inibição de trombina foi eliminada em favor da inibição de APC, o inibidor poderia ser potencialmente ainda modificado se ele tivesse atividade inibidora residual significativa em relação a outras proteases de coagulação.Os resíduos de RCL são numerados de acordo com a nomenclatura de Schechter-Berger para Serpinas (Schechter & Berger, 1967).

[0196]As constantes de taxa de inibição de trombina e APC foram medidas sob condições de pseudo-primeira grandeza usando um excesso de serpina em relação à protease (Tabela 1). Serpina e protease foram incubadas juntas durante diferentesperíodos de tempo e a atividade residual foi determinada pela adição de um excesso de substrato cromogênico para a protease (S2238 para trombina e S2366 para APC). A atividade de protease residual foi, então, medida acompanhando a ab- sorbância a 405 nm. Gráficos de atividade de protease residual ao longo do tempo forneceram a constante de taxa observada kobs. A constante de taxa de segunda grandeza, k2, é a inclinação do gráfico de kobs em função da concentração de serpina (montado usando um modelo de regressão linear). O erro padrão da inclinação é mostrado.

[0197]As mutações de lisina introduzidas em P2 e P1' foram altamente eficazes em aumentar a especificidade de PCI e a1AT pela PCA em relação à trombina para todas as variantes mostradas na Tabela 1. De um modo geral, a inibição de trombina foi grandemente reduzida em todos os casos. A inibição de APC também foi reduzida para todos os mutantes, mas não quase com a mesma intensidade. Ambas as serpinas inibiram inicialmente a trombina melhor do que a APC. Isto se inverteu para todos os mutantes testados.

[0198]O PCI, ao contrário de a1AT, se liga à heparina e esta ligação aumenta consideravelmente sua inibição de trombina e APC (Pratt & Church, 1992). Portanto, testamos a inibição de trombina e APC pelos mutantes P1'K e P2KP1'K PCI na presença de heparina para ver se a troca na especificidade observada na Tabela 1 persistiria. As constantes de taxa foram medidas sob condições de pseudo- primeira grandeza usando um excesso de PCI em relação à protease. PCI foi pré- incubado com uma concentração equimolar de heparina não fracionada durante 30 minutos antes do experimento. PCI:heparina e protease foram incubados juntos durante diferentes períodos de tempo e a atividade residual após determinados intervalos de tempo determinada pela adição de um excesso de substrato cromogênico para protease misturado com polibreno para ligação à heparina. Gráficos de atividade de protease residual ao longo do tempo forneceram a constante de taxa observada kobs. A constante de taxa de segunda grandeza, k2, é a inclinação do gráfico de kobs em função da concentração de serpina (montado usando um modelo de regressão linear). O erro padrão da inclinação é mostrado. O valor calculado para a inibição de trombina por P2KP1'K PCI foi uma estimativa a partir da inclinação inicial do gráfico de atividade de trombina residual em função do tempo, uma vez que o gráfico sugere que inibição completa não é conseguida. Isto poderia ser em virtude da via de substrato ou dissociação de complexo. As constantes de taxa de segunda grandeza são mostradas na Tabela 2. Assim como para a inibição na ausência de heparina, os mutantes P1'K e P2KP1'K de PCI, ao contrário da proteína WT, eram específicos para PCA em relação à trombina (Tabela 2).

[0199]Estes experimentos mostraram que a introdução de apenas uma ou duas modificações no RCL de serpina foi suficiente para suprimir ou reduzir grandemente a inibição de trombina, tanto na presença quanto na ausência de cofatores. A inibição de APC foi reduzida, mas ainda considerável, especialmente para as variantes de a1AT e as variantes de PCI na presença de heparina. No entanto, a especificidade do PCI e a1AT Pitts não está limitada à trombina e APC. Ambas as serpinas também inibem o fXa, outra protease pró-coagulante. De modo a não inibir a coagulação,nossas variantes também precisam ser específicas para APC em relação ao fXa. Portanto, também determinamos as constantes de taxa de inibição de PCI e a1AT e suas variantes para fXa (Tabela 3). As constantes de taxa foram medidas sob condições de pseudo-primeira grandeza usando um excesso de serpina em relação à protease. Serpina e protease foram incubadas juntas durante diferentes períodos de tempo e a atividade residual determinada pela adição de um excesso de substrato cromogênico (S2222) para a protease. Gráficos de atividade de protease residual ao longo do tempo forneceram a constante de taxa observada kobs. A constante de taxa de segunda grandeza, k2, é a inclinação do gráfico de kobs em função da concentração de serpina (montado usando um modelo de regressão linear). O erro padrão da inclinação é mostrado (Tabela 3).

[0200]Conforme observado anteriormente para a trombina, WT PCI inibiu o fXa melhor do APC. a1AT Pitts inibiu a APC melhor do fXa, mas a inibição de fXa ainda era considerável. A inibição de fXa ainda era significativa para P1'K PCI, P2K a1AT Pitts e P1'K a1AT Pitts (Tabela 3). As variantes P2KP1'K de a1AT Pitts e PCI eram altamente específicas para APC em relação ao fXa, com inibição ausente ou insignificante de fXa e, portanto, foram consideradas candidatos protótipo. A variante P1'K de PCI também é de interesse, uma vez que sua inibição de fXa é muito lenta na ausência de heparina. A presença de heparina acelera a taxa de inibição de APC de forma significativa, o que poderia distorcer potencialmente a proporção de especificidade em favor da APC.

[0201]Os compostos protótipo de PCI serão discutidos primeiro, seguido pelo composto protótipo a1AT.

[0202]Para investigar as propriedades de A22 P2KP1'K PCI em um sistema plasmático mais complexo e descartar quaisquer efeitos negativos sobre as proteases pró-coagulantes, foi realizado um ensaio de tempo de protrombina (PT). Este ensaio mede o tempo até formação do coágulo no plasma após a coagulação ser iniciada pela via extrínseca. A22 WT PCI mostrou um pequeno aumento no tempo de coagulação, enquanto que P2KP1'K mostrou um aumento menor, consistente com a atividade inibidora reduzida em relação a proteases pró-coagulantes (Figura 2).

[0203]Além disso, queríamos excluir qualquer efeito do mutante de PCI sobre a via de ativação de contato da coagulação. Para fazê-lo, as constantes de taxa de inibição foram medidas para inibição de fXIa e um teste de aPTT foi realizado. Este ensaio é similar ao ensaio de TP, exceto que ele mede a coagulação iniciada através da via intrínseca.

[0204]As constantes de taxa de segunda grandeza para inibição de fXIa por ICP e da variante P2KP1'K foram medidas sob condições de pseudo-primeira grandeza usando um excesso de serpina em relação à protease. Serpina e protease fo- ram incubadas juntas durante diferentes períodos de tempo e a atividade residual determinada pela adição de um excesso de substrato cromogênico para protease (S2366). Gráficos de atividade de protease residual ao longo do tempo forneceram a constante de taxa observada kobs. A constante de taxa de segunda grandeza, k2, é a inclinação do gráfico de kobs em função da concentração de serpina (montado usando um modelo de regressão linear). O erro padrão da inclinação é fornecido. A inibição de fXIa pela PCI A22 P2KP1'K não é completa ao longo do experimento, potencialmente em virtude da clivagem de serpina pela protease. Em comparação com WT, o mutante P2KP1'K mostrou uma inibição muito reduzida de fXIa e maior especificidade por APC do que por fXIa (Tabela 4).

[0205]O ensaio de aPTT mostrou que o WT PCI era um inibidor potente da via de ativação de contato, potencialmente em virtude da inibição de fXIa ou fXIIa (Figura 3). O mutante P2KP1'K mostrou um pequeno aumento no aPTT. No entanto, uma vez que a via de ativação de contato ativa a coagulação principalmente através de ativação de fIXa, a inibição de ativação de contato em uma extensão pequena provavelmente é insignificante em hemofílicos, uma vez que eles são deficientes tanto no principal alvo da ativação de contato (fIX) quanto seu cofator (fVIII).

[0206]Os resultados apresentados aqui até agora, portanto, mostram que tanto PCI P1'K A22 quanto PCI A22 P2KP1'K são compostos protótipos específicos para APC promissores para o desenvolvimento de agentes de "bypassing" para o tratamento de hemofilia.

[0207]Para gerar mutantes de PCI adicionais com especificidade por APC em relação à trombina, uma estratégia de mutagênese aleatória objetivada foi em-pregada com base no PCI. Os resíduos objetivados foram P4, P2 e P1'. A abordagemaleatória se baseia em uma seleção para inibição de APC e contra a inibição de trombina por meio de ensaios de atividade inibidora de lisatos bacterianos após expressão de PCI em um formato de 96 cavidades.

[0208]O ensaio foi calibrado usando o mutante de PCI mais específico gerado a partir de mutagênese racional combinado com o ensaio para especificidade esboçado acima; PCI A22 P2KP1'K. WT PCI foi usado como um controle adicional. A seleção negativa contra inibição de trombina foi realizada por meio de incubação de lisatos bacterianos durante um período de tempo, de modo que o WT A22 PCI mostrasseinibição completa e o período de incubação prolongado a partir deste ponto de tempo para selecionar também contra inibição diversa. Seleção positiva para inibição de APC foi calibrada de modo que tanto WT quanto P2KP1'K PCI caíssem na faixa intermediária de atividade inibidora de APC, para que sejamos capazes de determinar tanto aumentos quanto diminuições na inibição.

[0209]Em um ensaio inicial, 88 variantes foram rastreadas quanto à atividade inibidora de trombina e APC. As culturas foram cultivadas, induzidas e a proteína expressa em placas com 96 cavidades. As células foram submetidas à lise mediante adição de um tampão de lise e os lisatos ensaiados quanto à atividade inibidora contra trombina e APC através de incubação do lisato com a protease durante 1 h para trombina e 30 min para APC. A atividade de protease residual foi, então, lida medianteadição de um substrato cromogênico para protease. A22 WT PCI e PCI A22 P2KP1'K foram usados como controle. Qualquer lisato com atividade de trombina residual maior ou equivalente e menor ou equivalente à atividade de APC residual em comparação com P2KP1'K PCI foi considerado como sendo um candidato promissorespecífico para a APC. Estas sequências são apresentadas na Tabela 7. As posições P4, P2 e P1'são exibidas em negrito.

[0210]O mutante com a maior atividade inibidora de APC a partir deste conjunto de experimentos (D8; P4QP2RP1'N) foi caracterizado de um modo preliminar e foi demonstrado ser mais específico para inibição de APC do que para a trombina, embora usando mutações diferentes de P2KP1'K (Tabela 5). Isto indicou que seria possível fazer mutações adicionais no RCL de serpina, as quais teriam efeitos equi valentes à mutações já descritas.

[0211]Para gerar um conjunto de dados maior, mais de 460 mutantes foram pesquisados tanto em ensaios de seleção positiva quanto negativa. As culturas foram cultivadas, induzidas e a proteína expressa em cinco placas com 96 cavidades. As células foram submetidas à lise mediante adição de um tampão de lise e os lisa- tos ensaiados quanto à atividade inibidora contra trombina e APC através de incubação do lisato com a protease durante 1 h para trombina e 30 min para APC. A atividade de protease residual foi, então, lida mediante adição de um substrato cromo- gênico para protease (S2238 para trombina, S2366 para APC). A22 WT PCI e PCI A22 P2KP1'K foram usados como controle. Qualquer lisato com atividade de trombi- na residual maior ou equivalente e menor ou equivalente à atividade de APC residual em comparação com P2KP1'K PCI foi considerado como sendo um candidato promissor especifico para APC. A partir deste conjunto de dados, as colônias foram escolhidas e sequenciadas quanto às serpinas que mostraram melhor inibição de APC e inibição pior ou equivalente de trombina em relação ao P2KP1'K e estas foram novamente testadas em triplicata no mesmo ensaio para verificar que estas eram realmente verdadeiros "hits" e não falsos positivos. A partir deste novo ensaio, um conjunto de 15 dos 17 mutantes encontrados no rastreio inicial foi determinado como sendo melhor ou equivalente na inibição de APC do que P2KP1'K e pior ou equivalente na inibição de trombina (Tabela 8). As sequências de variantes que eram positivas após o novo teste são mostradas na Tabela 8. Curiosamente, a mu- tagênese aleatória confirmou os efeitos benéficos de resíduos positivamente carregados nas posições P2 e as P1'. No entanto, composições alternativas de RCL também foram encontradas.

[0212]As constantes de taxa de segunda grandeza preliminares para a inibição de trombina e APC por variantes de PCI através de mutagênese aleatória foram medidas sob condições de pseudo-primeira grandeza usando um excesso de serpi- na em relação à protease. Serpina e protease foram incubadas juntas durante dife-rentesperíodos de tempo e a atividade residual determinada pela adição de um ex-cesso de substrato cromogênico para a protease. Gráficos de atividade de protease residual ao longo do tempo forneceram a constante de taxa observada kobs. A constante de taxa de segunda grandeza, k2, é a inclinação do gráfico de kobs em função da concentração de serpina (montado usando um modelo de regressão linear). WT e P2KP1'K são mostrados para comparação. As constantes de taxa são mostradas na Tabela 5. O erro mostrado é o erro padrão da inclinação.

[0213]Caracterização preliminar de alguns dos mutantes selecionados a partir do ensaio de mutagênese aleatória mostrou que os mutantes selecionados eram pelo menos funcionalmente equivalente a P2KP1'K PCI e alguns tinham uma taxa de inibição de APC ligeiramente aprimorada (Tabela 5). Estes experimentos sugerem fortemente que P2KP1'K não é a única composição que pode ser usada para gerar serpinas específicas para APC.

[0214]O principal composto protótipo com base em a1AT Pitts das constantes de taxa mostradas na Tabelas 1 e 3 foi FL a1AT Pitts C232S P2KP1'K. Este mutantenão mostrou inibição de trombina e inibiu fXa apenas lentamente, mas manteve a inibição de APC (Tabelas 1 e 3).

[0215]Para investigar as propriedades deste mutante em um sistema plas- mático mais complexo e descartar quaisquer efeitos negativos sobre as proteases pró-coagulantes, foi realizado um ensaio de tempo de protrombina (PT). Este ensaio mede o tempo até formação do coágulo após a coagulação ser iniciada pela via extrínseca.Conforme esperado, o anticoagulante a1AT Pitts mostrou um aumento no tempo de coagulação em virtude de sua inibição de trombina e fXa (Figura 4). Em contraste, o mutante de P2KP1'K a1AT Pitts não mostrou nenhum aumento no tempo de coagulação e, portanto, não interfere com a coagulação normal neste ensaio.

[0216]Os dados até agora indicam que o mutante P2KP1'K de a1AT Pitts não interferiu com proteases pró-coagulantes tanto na via extrínseca (fator tecidual) quanto na via comum de coagulação. Além disso, queríamos determinar se FL a1AT Pitts C232S P2KP1'K afetou a via intrínseca (ativação de contato). As constantes de taxa de segunda grandeza de inibição de fXIa por FL a1AT Pitts C232S e a variante P2KP1'K foram medidas sob condições de pseudo-primeira grandeza usando um excesso de serpina em relação à protease. Serpina e protease foram incubadas juntas durante diferentes períodos de tempo e a atividade residual determinada pela adição de um excesso de substrato cromogênico para a protease (S2366). Gráficos de atividade de protease residual ao longo do tempo forneceram a constante de taxa observada kobs. A constante de taxa de segunda grandeza, k2, é a inclinação do gráfico de kobs em função da concentração de serpina (montado usando um modelo de regressão linear). O erro padrão da inclinação é fornecido.

[0217]fXI é ativado durante a via de ativação de contato e é alimentado na via comum de coagulação através da ativação de fIX. Além disso, uma vez fXI é ativado, a coagulação é iniciada pela trombina. fXIa foi inibido de forma significativa por FL a1AT Pitts C232S, no entanto, esta inibição foi bastante reduzida para FL a1AT Pitts C232S P2KP1'K (Tabela 6).

[0218]Uma vez que foi detectado um pequeno grau de inibição de fXIa pelo mutante de P2KP1'K de a1AT Pitts e para determinar qualquer efeito negativo sobre fXIIa, foi adicionalmente realizado um ensaio de aPTT. Este ensaio é similar ao ensaio de TP, exceto que ele mede a coagulação iniciada através da via intrínseca de coagulação. O aPTT poderia, portanto, ser usado para detectar qualquer efeito negativo sobre fXIa e a via de ativação de contato da coagulação. Neste ensaio, o plasma incubado com FL a1AT Pitts C232S não coagula dentro do tempo de ensaio, exceto quanto a uma reação com serpina a 0,67 µM (Figura 5A). FL aiAT Pitts C232S P2KP1'K mostrou um pequeno aumento no tempo de coagulação, mas não houve um aumento dependente da dose (Figura 5B). Isto indica que a atividade ini- bidora de fXIa do FL a1AT Pitts C232S P2KP1'K provavelmente é muito lento para afetar significativamente a via de ativação de contato. Além disso, a via de ativação de contato ativa a cascata de coagulação através da ativação de flXa. Uma vez que hemofílicos carecem de fIX ou seu cofator essencial fVIII, é provável o papel de um pequeno grau de inibição da via de ativação de contato em hemofílicos seja mínimo.

[0219]Para investigar se o mutante P2KP1'K de a1AT Pitts era capaz de inibir a APC em um sistema plasmático, foi usado um ensaio de geração de trombina modificado (TGA). A geração de trombina foi medida em plasma humano normal (NP) na presença e ausência de trombomodulina solúvel recombinante (TM). Esta TM foi expressa e purificada a partir de um sistema de expressão de células HEK- EBNA e compreende o domínio extracelular solúvel. A TM não está normalmente presente na TGA fisiologicamente porque ela é uma proteína transmembrana presente na membrana endotelial e está grandemente ausente do plasma. Portanto, não há ativação da via PC em um TGA normal ou outros ensaios de coagulação usando plasma, tais como os ensaios de PT e aPTT. Adição de TM ao ensaio permite a ativação PC e, assim, pode fornecer uma imagem mais realista da geração de trombina in vivo. Os ensaios apresentados nas Figuras 6 e 7 foram realizados em plasma humano normal (NP) agrupado da George King Biomedical. A coagulação foi iniciada pela adição de CaCl2 e TF/fosfolipídio (reagente RB Low TF and Phospholipid, Technoclone) para ativar a coagulação através da via extrínseca. A geração de trombina foi medida por meio da clivagem de um substrato fluorogênico (Z-Gly-Gly- Arg-AMC). As unidades de fluorescência foram convertidas em concentração de trombina através da calibração de unidades de fluorescência contra concentrações conhecidas de trombina usando o kit de calibração Technothrombin (Technoclone).

[0220]A adição de TM à mistura de plasma normal reduziu a produção de trombina de um modo dependente da concentração. A partir deste experimento, escolhemos duas concentrações de TM para reduzir a geração de trombina, quer para níveis intermediários (concentração final de TM de 1,25 nM no ensaio) ou níveis baixos(concentração final de TM de 10 nM no ensaio). Estas concentrações foram usadas em ensaios subsequentes para avaliar a capacidade de FL a1AT Pitts C232S P2KP1'K de inibir a APC no plasma.

[0221]A adição de FL a1AT Pitts C232S ao plasma humano normal (NP) reduziu a geração de trombina em todas as concentrações usadas, provavelmente em virtude da inibição de trombina, bem como fXa (Figura 6). Em contraste, FL a1AT Pitts C232S P2KP1'K não teve nenhum efeito sobre o NP na ausência de TM (Figura 7A). No entanto, na presença de TM, FL a1AT Pitts C232S P2KP1'K restaurou a geração de trombina dependente da dose (Figura 7B-D). Este efeito é o resultado da inibição específica de APC por FL a1AT Pitts C232S P2KP1'K.

[0222]De modo a executar os mesmos experimentos em plasma deficiente de fVIII ou fIX, foi necessário aumentar a quantidade de fator tecidual (TF) usada para iniciar o ensaio porque, nas condições de base (gatilho RB apenas), não houve geração detectável de trombina em plasma deficiente de fator. Para demonstrar o efeito de um aumento da geração de trombina em TF, as reações foram adicionadas com diferentes diluições de reagente TF (Dade Innovin, Siemens) além do reagente RB usado para desencadear o ensaio sob condições basais. A concentração de TF no reagente Innovin não é descrita pelo fabricante, no entanto, medições anteriores mostraram que estão em torno de 7,36 nM (Duckers et al., 2010). Aumento do tempo de retardo desencadeado por TF e aumentou tanto o pico de trombina quanto o potencialendógeno de trombina (ETP) em plasma NP humano deficiente em fVIII (HA) e deficiente em fIX (HB). A partir destes experimentos, escolhemos uma diluição de Innovin de 1:4000 no final da reação para iniciar a geração de trombina. Reagente RB, o qual tanto fosfolipídios quanto TF, foi adicionado em virtude da necessidade de adicionar fosfolipídios ao ensaio.

[0223]Uma vez que o uso de plasma deficiente em fator requeria a modifica- ção dos parâmetros de ensaio, repetiu-se o experimento de titulação de TM para plasma humano normal agrupado no plasma humano HA com a adição de Innovin a 1:4000. O ensaio foi realizado em plasma humano deficiente em fVIII (atividade de fVIII de menos de 1% de) da George King Biomedical. A coagulação foi iniciada pela adição de CaCl2 e/ou TF/fosfolipídio (reagente RB Low TF and Phospholipid, Technoclone) com diluição final de Dade Innovin (Siemens) de 1:4000 para ativar a coagulação através da via extrínseca. A geração de trombina foi medida por meio da clivagem de um substrato fluorogênico (Z-Gly-Gly-Arg-AMC). As unidades de fluorescência foram convertidas em concentração de trombina através da calibração de unidades de fluorescência contra concentrações conhecidas de trombina usando o kit de calibração Technothrombin (Technoclone). Descobriu-se que a trombomoduli- na (TM) reduz a geração de trombina no ensaio de geração de trombina (TGA) no plasma deficiente em fVIII (HA).

[0224]A partir deste experimento, TM a 1,25 nM e 5 nM foi selecionada para os experimentos subsequentes. A concentração elevada de TM usada foi menor do que para o NP, principalmente porque a geração de trombina total no plasma HA as condições de ensaio usadas era menor.

[0225]Os efeitos tanto de a1AT FL quanto FL Pitts C232S a1AT Pitts C232S P2KP1'K em plasma HA e HB foram comparáveis aos resultados para NP agrupado. FL a1AT Pitts inibiu a geração de trombina na presença e na ausência de TM tanto em plasma HA (fVIII-deficiente) quanto HB (fIX-deficiente) (Figura 8). FL a1AT Pitts C232S P2KP1'K pôde restaurar o efeito da TM na geração de trombina, tanto em plasma deficiente em fVIII- quanto fIX e não teve nenhum efeito na ausência de TM (Figuras 9 e 10). Isto indica que FL a1AT Pitts C232S P2KP1'K pode inibir a APC e tem um efeito pró-coagulante no plasma deficiente em fator. Isso significa que ele poderia promover a formação de coágulos e reduzir hemorragias em pacientes com hemofilia. A magnitude deste efeito pró-coagulante será determinada pela contribui- ção relativa do sistema de Proteína C para a redução na produção de trombina in vivo. Os experimentos in vitro mostrados aqui não podem ser usados para prever a eficácia provável deste mutante in vivo, no entanto, mostram que, em sistemas plasmáticos complexos, FL a1AT Pitts C232S P2KP1'K pode inibir a APC e não interfere com as vias pró-coagulantes e que estes efeitos são independentes da presença ou ausência de fIX e fVIII.

[0226]De modo a verificar os nossos dados in vitro, queríamos usar modelos de hemofilia em camundongos in vivo. No entanto, para verificar se o efeito de a1AT humano em plasma de camundongo seria comparável ao efeito observado em plasma humano, foi realizada um primeiro TGA em plasma de camundongo. Isto foi realizado usando um protocolo modificado de TGA (Bunce et al., 2011; Ivanciu et al., 2011). Estas modificações foram necessárias em virtude das maiores concentrações de proteínas inibidoras em plasma de camundongo que impedem ensaios de TGA sob condições convencionais (Tchaikovski et al., 2007; Bunce et al., 2011; Ivanciu et al., 2011). Comparável ao sistema humano, não houve nenhuma geração de trombi- na no plasma de camundongo HB sob as condições de linha de base do ensaio. Para tanto, realizamos uma titulação em diferentes concentrações de Innovin. Uma concentração de Innovin a 1:12.000 foi escolhida para os ensaios subsequentes.

[0227]Uma vez que não havia TM de murino disponível, foi usada TM humana solúvel conforme usado em TGAs de plasma humano para promover a formação da APC no ensaio TGA de camundongo. A concentração necessária para observar qualquer efeito da TM humana em plasma de camundongo HB foi ~ 100 vezes mais elevada do que aquela observada no plasma humano. Isto poderia ser explicado pela observação de que camundongo com knockdown para TM humana mostram uma capacidade reduzida de ativar PC de murino (Raife et al., 2011). Isto indicou que a TM humana é menos potente na promoção da ativação de PC de murino do que a TM de murino. Uma concentração de TM humana a 750 nM foi usada em ex- perimentos subsequentes.

[0228]Diferentes concentrações tanto de a1AT FL quanto FL Pitts C232S a1AT Pitts C232S P2KP1'K foram, então, adicionadas às condições determinadas no plasma de camundongo HB tanto na ausência quanto na presença de TM para comparar o efeito destes mutantes em plasma de camundongo com os resultados anteriores de TGA em plasma humano.

[0229]FL a1AT Pitts C232S reduziu a geração de trombina no plasma de camundongo HB na ausência de TM, conforme observado em plasma humano (Figura 11A). No entanto, na presença de TM, na concentração a1AT menor, houve uma restauração parcial da geração de trombina (Figura 11B). Isto pode ser potencialmente em virtude de uma diferença nas taxas relativas de inibição para trombina de murino e APC de murino por FL a1AT Pitts em comparação com as taxas observadas em seres humanos, de modo que a APC gerada é inibida antes da inibição de trombina. Quando a concentração de FL a1AT Pitts C232S é aumentada para níveis tais que toda a APC é inibida, a trombina também é inibida. Isto poderia explicar os resultados observados na Figura 11B, mas ainda não foi investigado. FL a1AT Pitts C232S P2KP1'K restaurou a geração de trombina reduzida pela adição de TM em plasma de camundongo HB, assim como em plasma humano (Figura 11D). No entanto, quando FL a1AT Pitts C232S P2KP1'K foi adicionado ao plasma de camundongo HB na ausência de TM, um aumento na geração de trombina foi também observado (Figura 11C). É possível que este efeito se relacione ao método de coleta de sangue usado para estes experimentos. Para a coleta de plasma, a cauda foi seccionado e sangue coletado em citrato. Este foi, então, centrifugado e o plasma removido e congelado. A lesão infligida para coleta de sangue leva à ativação do sistema de coagulação e pode causar a geração de APC no plasma antes do expe-rimento.Além disso, os camundongos não têm PCI em seu plasma (Zechmeister- Machhart et al., 1996), o que pode aumentar a meia-vida em circulação de APC, de modo que ele não é inativado antes do ensaio TGA. Uma explicação alternativa que não pode ser descartada neste momento seria um efeito pró-coagulante fora do alvo no plasma de camundongo. No entanto, uma vez que este efeito não é observado no plasma humano, isto envolveria a inibição de uma protease anticoagulante específica de camundongo.

[0230]Para investigar um potencial efeito in vivo de FL a1AT Pitts C232S P2KP1'K e determinar se ele poderia ser potencialmente útil quer como um agente profilático ou um tratamento para hemofilia, foram usados dois ensaios in vivo em camundongos: grampo na cauda e um modelo de lesão a laser da arteríola cremaster. Os camundongos usados eram do sexo masculino, camundongos BALB/c com knockout de fIX (Lin et al., 1997; Ivanciu et al., 2011).

[0231]No ensaio de grampo na cauda, proteína ou tampão foi injetado através da veia da cauda e, após um período de incubação de 5 min, a cauda foi seccionada com um diâmetro de 3 mm e colocada em 14 ml de solução salina a 37 °C em um banho de água 37 °C . O sangue foi coletado durante 10 minutos e a perda de sangue resultante foi quantificada medindo-se a hemoglobina total após lise dos glóbulos vermelhos através de medição da absorbância a 575 nm (Ivanciu et al., 2011). A perda de volume de sangue foi calculada fazendo uma curva padrão onde volumes conhecidos de sangue coletado por transecção da cauda foram processados de um modo similar para as amostras de grampo na cauda. Após lise dos glóbulos vermelhos, a absorbância a 575 nm foi determinada e representada graficamente contra a perda volumétrica de sangue para gerar a curva padrão. Os ensaios de grampo na cauda mostraram um efeito pró-coagulante potente de FL a1AT Pitts C232S P2KP1'K (Figura 12). Na dose de 15 mg/kg, a perda de sangue dos camundongos HB foi restaurada para o nível de camundongos WT injetados com PBS (Figura 12). A menor dose de FL a1AT Pitts C232S P2KP1'K também mostrou uma tendência para redução de hemorragia em relação aos camundongos HB, embora esta não fosse estatisticamente significativa. FL a1AT Pitts C232S não mostrou nenhum efeito significativo sobre a perda de sangue a 7,5 mg/kg.

[0232]Outro modelo in vivo usado para avaliar agentes pró-coagulantes é o modelo de lesão na arteríola cremaster induzida por laser intravital (Falati et al., 2002). Neste sistema, uma cânula é inserida na veia jugular do camundongo para permitir a infusão da proteína terapêutica, bem como anticorpos fluorescentemente marcados à fibrina e plaquetas. O músculo cremaster é, então, preparado para ima- giologia. Uma imagem da formação de coágulos após a lesão induzida por laser nas arteríolas é tomada e quantificada usando microscopia de fluorescência.

[0233]Para uma avaliação qualitativa global, as lesões foram classificadas em três categorias: nenhum coágulo (ausência de fluorescência detectada), coágulo de plaquetas (apenas plaquetas visíveis, estes coágulos eram geralmente instáveis e dissolviam durante o curso da imagiologia) e plaquetas + fibrina (tanto plaquetas quanto fibrina com fluorescência visível e coágulo permaneceu estável ao longo da imagiologia). Isto mostrou que não havia um aumento dependente da dose na formação de plaquetas e coágulo de fibrina estável com o aumento da concentração de FL a1AT Pitts C232S P2KP1'K (Figura 13). Todas as imagens foram quantificadas por fluorescência de plaquetas e fibrina. O valor médio para cada ponto de tempo foi calculado e os resultados representados na Figura 14. Estes dados incluíam a quantificação de todas as imagens, independentemente de sua categoria atribuída para a Figura 13. As gráficos da mediana mostram que camundongos que receberam uma infusão de controle ou FL a1AT Pitts C232S não exibem formação de coágulos, enquanto que a maior e menor dose de FL a1AT Pitts C232S P2KP1'K mostraram agregação plaquetária e deposição de fibrina no local da lesão. Nenhuma diferença pôde ser detectada entre as duas doses em termos de agregação de plaquetas. Para fibrina, houve um aumento dependente da dose na deposição de fibrina para o FL a1AT Pitts C232S P2KP1'K e nenhuma fibrina para camundongos que receberam uma infusão de controle ou FL a1AT Pitts C232S (Figura 14).

[0234]Tomados juntos, estes resultados mostram que FL a1AT Pitts C232S P2KP1'K tem um efeito pró-coagulante tanto em ensaios in vitro quanto modelos in vivo de hemofilia. Os experimentos in vivo foram todos feitos em modelos de camundongos com hemofilia B, no entanto, os resultados de TGA no plasma humano (Figuras 9 e 10) e o mecanismo de ação proposto de FL a1AT Pitts C232S P2KP1'K indicam que seu efeito pró-coagulante deve ser independente da deficiência de fIX ou fVIII e poderia, portanto, ser usado tanto em hemofilia A quanto B. O efeito pró- coagulante in vivo observado era suficiente para reduzir a hemorragia para os mesmosníveis observados para camundongos WT (Figura 12), indicando que serpinas que inibem a APC podem ser usadas para o tratamento de transtornos hemorrágicos e não apenas como um tratamento profilático ou um adjuvante aos tratamentos existentes.

[0235]A estratégia de mutagênese aleatória objetivada também foi empregada na base a1AT de modo a explorar potenciais mutantes específicos adicionais de APC na base a1AT.

[0236]Três bibliotecas variantes de a1AT diferentes foram geradas na base FL a1AT Pitts C232S: uma randomizada em P2, uma randomizada em P1' e uma terceira biblioteca randomizada tanto em P2 quanto P1'. As bibliotecas de plasmí- deos resultantes foram transformadas na cepa de expressão Rosetta2 (DE3) pLysS e a proteína expressa em placas com 96 cavidades. As bactérias foram submetidas à lise e os lisatos ensaiados quanto à inibição de trombina e APC.

[0237]Para as bibliotecas de variantes individuais, 88 colônias foram analisadas por biblioteca. Para a biblioteca variante dupla (P2P1' ), 460 colônias foram analisadas. FL a1AT Pitts e FL a1AT Pitts P2KP1'K (as variantes específicas para APC protótipo) foram expressos em todas as placas de ensaio como uma referência. As variantes com atividade inibidora de APC maior ou igual (atividade de APC resi dual menor ou igual) e atividade inibidora de trombina menor ou igual (atividade de trombina residual maior ou igual) em comparação com P2KP1'K a1AT foram considerados candidatos a variantes específicas para APC em relação à trombina. Um subconjunto de variantes candidatas foi escolhido e novamente ensaiado na mesma configuração para verificar os resultados da primeira triagem. Os mutantes que mostram propriedades similares em ambos os ensaios foram, então, sequenciados. As sequências resultantes são mostradas na Tabela 9. Para verificar a capacidade do presente ensaio de escolher variantes que eram específicas para PCA em relação à trombina, nove variantes identificadas na Tabela 9 foram expressas em uma escala maior em E. coli e purificadas. A constante de taxa de segunda grandeza de inibição em relação à trombina e APC foi, então, determinada para cada mutante. Os resultadossão mostrados na Tabela 10. Estes resultados confirmam que todas as variantes testadas tinham uma especificidade maior pela APC do que pela trombina, ao contrário da variante FL a1AT Pitts C232S.

[0238]Certos tipos de resíduos foram favorecidos na base a1AT Pitts em ambas as posições P1' e P2 (Tabela 9). A especificidade foi conferida principalmente pela presença de resíduos polares grandes (Q, N, Y), resíduos hidrofóbicos grandes (W) ou positivamente carregados (R, H, K) em P2 e P1' . Outros resíduos observados nestas posições incluíam C, A, T, S e V. Estes resíduos médios a pequenos foram acompanhados na biblioteca variante dupla através de complementação de um resíduo grande positivamente carregado (R, K) ou resíduo polar grande (Y, N, Q) na outra posição, o que provavelmente tem uma influência maior sobre a troca de especificidade. No entanto, pode haver um efeito cooperativo destas mutações também, especialmente onde P1'é R. P1'R mostrou variação de resultados no rastreio da biblioteca variante única e pode ter alguma atividade inibidora de trombina residual. P2P é conhecida por ser importante para a clivagem de trombina de substratos (Gallwitz et al., 2012). Simples remoção deste resíduo acoplado a uma mutação de troca de especificidade em P1' pode ser suficiente para gerar um inibidor específico para APC com uma atividade inibidora de trombina residual. Especialmente, T em P2 poderia ter algum efeito em si, fora de seus resíduos parceiros em P1' (Q, N, Y, R), apenas R foi identificado no único resíduo na biblioteca variante P1' como sendo suficiente para causar uma troca especificidade em si.

[0239]Curiosamente, foi mostrado que os mutantes não específicos que se agrupavam em torno do controle a1AT Pitts eram, em grande parte, a1AT Pitts. Todos mantiveram a P2P, mostrando sua importância na manutenção de atividade ini- bidora de trombina. A P1' foi mais variável, consistente com a distribuição de mutan- tes na biblioteca de variantes P1'. Comparando a propagação de variantes em bibliotecas de P2 e P1', a trombina pareceu ser mais tolerante a mutações em P1' do que mutações em P2. No entanto, o aparecimento de resíduos favoráveis nas bibliotecas duplas variantes que não estavam presentes nas bibliotecas de variantes individuais indicam que os efeitos destes resíduos sobre a especificidade podem ser cooperativos e mutações duplas podem ser mais eficazes do que mutações pontuais no aumento de especificidade.

[0240]Os resultados de mutagênese aleatória apresentados acima mostra-ram que era possível produzir mutantes que exibem especificidade por APC em relação à trombina além dos mutantes de lisina já identificados. Até agora, foi usada a estratégia de mutagênese aleatória assumindo que, uma vez que foi obtida especificidade em relação à trombina, estes mutantes também mostram algum grau de especificidade por APC em relação a outras proteases pró-coagulantes. Para testar isto, o PT e aPTTs dos mutantes aleatórios na Tabela 10 foram testados. Estes resultadossão apresentados na Tabela 11. Nenhum dos mutantes teve um efeito significativo sobre o PT, ao contrário do anteriormente mostrado para FL a1AT Pitts C232S (Figura 4). Isso fornece uma indicação de que os mutantes, em grande parte, perderam sua atividade inibidora de proteases pró-coagulantes. No entanto, aPTTs são mais sensíveis à presença de inibidores. Portanto, a medição do aPTT pode fornecer uma representação mais precisa da menor inibição do residual. Experimentos anteriores (Figura 5) demonstraram que FL a1AT Pitts C232S tornou o plasma não coagulável no ensaio de aPTT. Em contraste, apenas um dos mutantes avaliado aqui exibiu este efeito (P2TP1'N). Alguns mutantes, tais como P2KP1'H e P2KP1'N, mostraram apenas um prolongamento relativamente pequeno do aPTT e, portanto, eram potencialmente interessantes.

[0241]A partir destes resultados, foram selecionados quatro mutantes, P2R, P2QP1'K, P2KP1'H e P2KP1'N (todos com base Pitts, P1R). Estes mostraram tanto uma alta inibição de APC em relação à trombina (Tabela 10) e, para alguns, também um baixo prolongamento do aPTT (P2KP1'H e P2KP1'N). uma vez que eles não prolongam o PT, é improvável que eles inibam TF:fVIIa. Os candidatos mais prováveis para o prolongamento do aPTT seriam a inibição de fXIa ou fXa. Destes, a inibição de fXa inibiria mais os estágios iniciais da coagulação e, portanto, foi considerado como sendo uma barreira mais significativa para um inibidor bem sucedido. As constantes de inibição para a inibição de fXa por estes quatro mutantes foram, portanto, determinadas conforme descrito acima (Tabela 12). P2R mostrou uma inibição significativa de fXa, a qual pode ser a razão para seu prolongamento do aPTT. Os outros três mutantes exibiram menor inibição de fXa, mas nenhum dos mutantes eram tão específico quanto o mutante P2KP1'K anteriormente identificado. No entanto, P2KP1'N, P2QP1'K e P2KP1'H representam candidatos promissores adicionais para desenvolvimento adicional, pois mostram especificidade por APC em relação à trombina e fXa. Além disso, a inibição de APC é cerca de duas vezes maior em relação ao mutante P2KP1'K descrito anteriormente. Esta inibição mais rápida pode, em parte, compensar a especificidade ligeiramente reduzida.

[0242]No entanto, estes resultados indicam que a seleção para a especifici-dade por PCA em relação à trombina não é completamente suficiente para a con- cepção de um inibidor que também mostre especificidade em relação ao fXa e outras proteases pró-coagulantes. Por isso, a estratégia de mutagênese aleatória foi ampliada. Mutantes que tinham sido previamente selecionados quanto à especificidade por APC em relação à trombina foram novamente testados contra fXa e mutan- tes selecionados, os quais tinham inibição reduzida de fXa, ao mesmo tempo em que mantinham baixa inibição de trombina e inibição de APC.

[0243]Quatro mutantes adicionais foram identificados a partir desta triagem adicional. Todos eles tinham a mutação P1R e, além disso, tinham a mutação P2RP1'A, P2RP1'Q, P2WP1'I ou P2WP1'H. Para verificar a especificidade destes mutantes, um experimento inicial foi realizado usando apenas uma concentração de serpina e testando sua inibição de trombina e fXa. A inibição da APC não foi considerado neste estágio, porque os mutantes foram selecionados com base em sua fraca inibição de trombina e fXa. Serpina e protease foram incubadas durante diferentes tempos e nos pontos de tempo indicados, a reação foi interrompida mediante a adição de um excesso de substrato cromogênico. A atividade de protease residual foi dividida pela atividade de protease e o log natural inicial deste valor em função do tempo (Figura 15). A inclinação desta linha dividida pela concentração das serpinas fornece uma estimativa da constante de taxa de inibição de segunda grandeza. Es-tes ensaios mostraram que, embora todos os mutantes dificilmente tenham inibido a trombina, com o inibidor mais rápido, P2WP1'H tendo uma constante de taxa de segunda grandeza de 50,3 ~ M-1.s-1 (comparar com a constante de inibição de FL a1AT Pitts C232S, 2,928 x 105 M-1.s-1). No entanto, P2RP1'A, P2WP1'I e P2WP1'H mostraram uma inibição significativa de fXa. A constante de taxa de segunda grandeza foi reduzida apenas ~ 10 vezes para estes mutantes em comparação com FL a1AT Pitts C232S (4070,1 M-1.s-1 para P2RP1'A em comparação com 4,13 x 104 M-1.s-1 para FL a1AT Pitts C232S). P2RP1'A, P2WP1'I e P2WP1'H mostraram inibição de fXa similar uns aos outros.

[0244]Apenas um mutante mostrou seletividade significativa tanto contra a trombina quanto fXa. Este mutante tinha uma mutação P2RP1'Q, além de (P1R) Pitts. Em virtude de sua seletividade, ele era interessante para uma investigação mais aprofundada. Resultados anteriores de estudos de mutagênese aleatória e racional indicaram que os resíduos R e K têm um desempenho razoavelmente similar. Por esse motivo, também geramos um mutante P2KP1'Q na base P1R como era de se esperar a partir dos resultados mostrados aqui como tendo propriedades similares. Os resultados de medições das constantes de inibição e aPTTs (experimentos realizados conforme descrito antes) para ambos os mutantes são apresentados na Tabela 13. O mutante P2KP1'K é mostrado para comparação. Tanto P2KP1'Q quanto P2RP1'Q mostraram inibição muito baixa de trombina e fXa. Além disso, também não houve praticamente nenhum efeito sobre o aPTT. A inibição APC foi significativa, sendo apenas ligeiramente reduzida em comparação com P2KP1'K. Portanto, seria de esperar que estes dois mutantes tivessem um desempenho similar ao P2KP1'K e podem representar outras moléculas potencialmente alternativas promissoras para posterior desenvolvimento.

[0245]Foram avaliadas a inibição de trombina e APC de murino por FL a1AT Pitts C232S P2KP1'K. A trombina e APC foram obtidas a partir de fontes recombi- nantes. As proteases usadas são truncadas em relação à versão plasmática, incluindo apenas os domínios de EGF2-protease para APC (APC sem domínios Gla) e o domínio de protease para trombina. Portanto, também testamos as versões humanas destas proteases para assegurar que as diferenças eram em virtude de uma diferença entre espécies, em vez de uma diferença de construto. Trombina humana e de murino não mostrou nenhuma ou muito pouca reatividade com FL a1AT Pitts C232S P2KP1'K por SDS-PAGE indicando que, a este respeito, os resultados a partir de sistemas modelo seriam relevantes para o sistema humano. As constantes de taxa de inibição de segunda grandeza foram de (8,14 ± 0,58) x 103 M-1.s-1 para APC humana sem domínios Gla, (3,80 ± 0,37) x 103 M-1.s-1 para APC de murino sem domínios Gla em comparação com (14,88 ± 1,87) x 103 M-1.s-1 para APC em plasma humano. Estes resultados forneceram uma indicação de que, embora a reatividade do mutante em modelos de camundongo provavelmente seja mais baixa do que em seres humanos, isto é, pode ser necessário que a dose relativa para o mesmo efeito seja maior, é provável o efeito em termos de inibição de protease seja similar.

[0246]Os dados apresentados mostram, como uma prova de princípio, que a base de serpina pode ser usada para gerar inibidores específicos de APC usando apenas muito poucas mutações, que estes inibidores podem ter atividades pró- coagulantes, tanto in vitro quanto in vivo e, como tal, mostra promessa como agentespró-coagulantes para tratamento e profilaxia de distúrbios hemorrágicos, tal como hemofilia. Referências Berntorp E (2009) Haemophilia15: 3-10 Bertina RM, et al(1994) Nature 369: 64-67 Bohn RL et al (2004) Haemophilia 10: 63-68 Bolton-Maggs PHB & Pasi KJ (2003) Lancet 361: 1801-1809 Brettler DB (1996) Baillieres Clin. Haematol.9: 319-329 Brummel-Ziedins KE et al (2011) J. Thromb. Haemost. 9: 2262-2267 Bunce MW et al (2011). Blood 117: 290-298 Butenas S et al (2006) J. Thromb. Haemost. 4: 2411-2416 Carrell R et al (1985) Trends in Biochemical Sciences 10: 20-24 Chuansumrit A et al (2000) Haemophilia 6: 61-65 De Nanteuil G et al (2006) J. Med. 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A sequência sinalizadora corresponde aos resíduos 1-19. O propeptídeo cor-responde aos resíduos 20-25. Os resíduos P4, P2, P1 e P1’ da RCL em negrito e sublinhado. 1 mermlpllal gllaagfcpa vlchpnspld eenltqenqd rgthvdlgla sanvdfafsl 61 ykqlvlkapd knvifsplsi stalaflslg ahnttlteil kglkfnltet seaeihqsfq 121 hllrtlnqss delqlsmgna mfvkeqlsll drftedakrl ygseafatdf qdsaaakkli 181 ndyvkngtrg kitdlikdld sqtmmvlvny iffkakwemp fdpqdthqsr fylskk- kwvm 241 vpmmslhhlt ipyfrdeels ctvvelkytg nasalfilpd qdkmeeveam llpetlkrwr 301 dslefreige lylpkfsisr dynlndillq lgieeaftsk adlsgitgar nlavsqvvhk 361 avldvfeegt easaatavki tllsalvetr tivrfnrpfl miivptdtqn iffmskvtnp 421 kqa SEQ ID NO: 2 Alfa-1-antiquimotripsina Proteína madura corresponde aos resíduos 26 a 423. Os resíduos P4, P2, P1 e P1’ da RCL em negrito e sublinhado 1 masrltlltl lllllagdra ssnpnatsss sqdpeslqdr gegkvattvi skmlfvepil 61 evsslpttns ttnsatkita nttdepttqp ttepttqpti qptqpttqlp tdsptqpttg 121 sfcpgpvtlc sdleshstea vlgdalvdfs lklyhafsam kkvetnmafs pfsiaslltq 181 vllgagentk tnlesilsyp kdftcvhqal kgfttkgvts vsqifhspdl airdtfvnas 241 rtlysssprv lsnnsdanle lintwvaknt nnkisrllds lpsdtrlvll naiylsakwk 301 ttfdpkktrm epfhfknsvi kvpmmnskky pvahfidqtl kakvgqlqls hnlslvilvp 361 qnlkhrledm eqalspsvfk aimeklemsk fqptlltlpr ikvttsqdml simekleffd 421 fsydlnlcgl tedpdlqvsa mqhqtvlelt etgveaaaas aisvartllv fevqqpflfv 481 lwdqqhkfpv fmgrvydpra SEQ ID NO: 3 Inibidor de C1-esterase Proteína madura corresponde aos resíduos 23-500. Os resíduos P4, P2, P1 e P1’ da RCL em negrito e sublinhado 1 mallwgllvl swsclqgpcs vfspvsamep lgrqltsgpn qeqvspltll klgnqepggq 61 talksppgvc srdptpeqth rlarammaft adlfslvaqt stcpnlilsp lsvalalshl 121 algaqnhtlq rlqqvlhags gpclphllsr lcqdlgpgaf rlaarmylqk gfpikedfle 181 qseqlfgakp vsltgkqedd laninqwvke ategkiqefl sglpedtvll llnaihfqgf 241 wrnkfdpslt qrdsfhldeq ftvpvemmqa rtyplrwfll eqpeiqvahf pfknnmsfvv 301 lvpthfewnv sqvlanlswd tlhpplvwer ptkvrlpkly lkhqmdlvat lsqlglqelf 361 qapdlrgise qslvvsgvqh qstlelsevg veaaaatsiamsrmslssfs vnrpflffif 421 edttglplfv gsvrnpnpsa prelkeqqds pgnkdflqsl kgfprgdklf gpdlklvppm 481 eedypqfgsp SEQ ID NO: 4 a2-Antiplasmina Proteína madura corresponde aos resíduos 28-491. Os resíduos P4, P2, P1 e P1’ da RCL para inibição de quimotripsina em negrito, resíduos para a inibição de plasmina sublinhados 1 mysnvigtvt sgkrkvylls llligfwdcv tchgspvdic takprdipmn pmciyrspek 61 katedegseq kipeatnrrv welskansrf attfyqhlad skndndnifl splsistafa 121 mtklgacndt lqqlmevfkf dtisektsdq ihfffaklnc rlyrkankss klvsanrlfg 181 dksltfnety qdiselvyga klqpldfken aeqsraaink wvsnktegri tdvipseain 241 eltvlvlvnt iyfkglwksk fspentrkel fykadgescs asmmyqegkf ryrrvaegtq 301 vlelpfkgdd itmvlilpkp ekslakveke ltpevlqewl deleemmlvv hmprfriedg 361 fslkeqlqdm glvdlfspek sklpgivaeg rddlyvsdaf hkaflevnee gseaaastav 421 viagrslnpn rvtfkanrpf Ivfirevpln tiifmgrvan pcvk SEQ ID NO: 5 Antitrombina (ATIII) Proteína madura corresponde aos resíduos 33-464. Os resíduos P4, P2, P1 e P1’ da RCL em negrito e sublinhado 1 mkhslnalli fliitsawgg skgpldqlek ggetaqsadp qweqlnnknl smpllpadfh 61 kentvtndwi pegeedddyl dlekifsedd dyidivdsls vsptdsdvsa gnilqlfhgk 121 sriqrlniln akfafnlyrv lkdqvntfdn ifiapvgist amgmislglk getheqvhsi 181 lhfkdfvnas skyeittihn lfrklthrlf rrnfgytlrs vndlyiqkqf pilldfktkv 241 reyyfaeaqi adfsdpafis ktnnhimklt kglikdalen idpatqmmil nciyfkgswv 301 nkfpvemthn hnfrlnerev vkvsmmqtkg nflaandqel dcdilqleyv ggis- mlivvp 361 hkmsgmktle aqltprvver wqksmtnrtr evllpkfkle knynlveslk lmgirmlfdk 421 ngnmagisdq riaidlfkhq gtitvneegt qattvttvgf mplstqvrft vdrpflfliy 481 ehrtscllfm grvanpsrs SEQ ID NO: 6 Cofator II de heparina Proteína madura corresponde aos resíduos 20-499. Os resíduos P4, P2, P1 e P1’ da RCL em negrito e sublinhado 1 mpssvswgil llaglcclvp vslaedpqgd aaqktdtshh dqdhptfnki tpnlaefafs 61 lyrqlahqsn stniffspvs iatafamlsl gtkadthdei leglnfnlte ipeaqihegf 121 qellrtlnqp dsqlqlttgn glflseglkl vdkfledvkk lyhseaftvn fgdteeakkq 181 indyvekgtq gkivdlvkel drdtvfalvn yiffkgkwer pfevkdteee dfhvdqvttv 241 kvpmmkrlgm fniqhckkls swvllmkylg nataifflpd egklqhlene lthdiitkfl 301 enedrrsasl hlpklsitgt ydlksvlgql gitkvfsnga dlsgvteeap lklskavhka 361 vltidekgte aagamfle a i pmsippevkf nkpfvflmie qntksplfmg kvvnptqk SEQ ID NO: 7 a 1-antitripsina (a1AT) Proteína madura corresponde aos resíduos 25-418. Os resíduos P4, P2, P1 e P1’ da RCL em negrito e sublinhado 1 mhlidyllll lvgllalshg qlhvehdges csnsshqqil etgegspslk iapanadfaf 61 rfyyliaset pgkniffspl sisaayamls lgacshsrsq ileglgfnlt elsesdvhrg 121 fqhllhtlnl pghgletrvg salflshnlk flakflndtm avyeaklfht nfydtvgtiq 181 lindhvkket rgkivdlvse lkkdvlmvlv nyiyfkalwe kpfissrttp kdfyvdentt 241 vrvpmmlqdq ehhwylhdry lpcsvlrmdy kgdatvffil pnqgkmreie evltpemlmr 301 wnnllrkrnf ykklelhlpk fsisgsyvld qilprlgftd lfskwadlsg itkqqkleas 361 ksfhkatldv deagteaaaa tsfaikffsa qtnrhilrfn rpflvvifst stqsvlflgk 421 vvdptkp SEQ ID NO: 8 Calistatina Proteína madura corresponde aos resíduos 21-427. Os resíduos P4, P2, P1 e P1’ da RCL em negrito e sublinhado 1 mqmspaltcl vlglalvfge gsavhhppsy vahlasdfgv rvfqqvaqas kdrn- vvfspy 61 gvasvlamlq lttggetqqq iqaamgfkid dkgmapalrh lykelmgpwn kdeisttdai 121 fvqrdlklvq gfmphffrlf rstvkqvdfs everarfiin dwvkthtkgm isnllgkgav 181 dqltrlvlvn alyfngqwkt pfpdssthrr lfhksdgstv svpmmaqtnk fnytefttpd 241 ghyydilelp yhgdtlsmfi aapyekevpl saltnilsaq lishwkgnmt rlprllvlpk 301 fsletevdlr kplenlgmtd mfrqfqadft slsdqeplhv aqalqkvkie vnesgtvass 361 stavivsarm apeeiimdrp flfvvrhnpt gtvlfmgqvm ep SEQ ID NO: 9 Inibidor de ativador de plasminogênio Proteína madura corresponde aos resíduos 24-402. Os resíduos P4, P2, P1 e P1’ da RCL em negrito e sublinhado 1 mkvvpsllls vllaqvwlvp glapspqspe tpapqnqtsr vvqapkeeee deqeaseeka 61 seeekawlma srqqlakets nfgfsllrki smrhdgnmvf spfgmslamt glml- gatgpt 121 etqikrglhl qalkptkpgl lpslfkglre tlsrnlelgl tqgsfafihk dfdvketffn 181 lskryfdtec vpmnfrnasq akrlmnhyin ketrgkipkl fdeinpetkl ilvdyilfkg 241 kwltpfdpvf tevdtfhldk yktikvpmmy gagkfastfd knfrchvlkl pyqgnatmlv 301 vlmekmgdhl aledylttdl vetwlrnmkt rnmevffpkf kldqkyemhe llrqmgirri 361 fspfadlsel satgrnlqvs rvlqrtviev dergteavag ilseitaysm ppvikvdrpf 421 hfmiyeetsg mllflgrvvn ptll SEQ ID NO: 10 Inibidor dependente de proteína Z Proteína madura corresponde aos resíduos 22-444. Os resíduos P4, P2, P1 e P1’ da RCL em negrito e sublinhado 1 mnwhlplfll asvtlpsics hfnplsleel gsntgiqvfn qivksrphdn ivisphgias 61 vlgmlqlgad grtkkqlamv mrygvngvgk ilkkinkaiv skknkdivtv anavfvknas 121 eievpfvtrn kdvfqcevrn vnfedpasac dsinawvkne trdmidnlls pdlidgvltr 181 lvlvnavyfk glwksrfqpe ntkkrtfvaa dgksyqvpml aqlsvfrcgs tsapndlwyn 241 fielpyhges ismlialpte sstplsaiip histktidsw msimvpkrvq vilpkftava 301 qtdlkeplkv lgitdmfdss kanfakittg senlhvshil qkakievsed gtkasaatta 361 iliarssppw fivdrpflff irhnptgavl fmgqinkp SEQ ID NO: 11 Protease nexina 1 Proteína madura corresponde aos resíduos 20-398 - isoforma a. Os resí-duos P4, P2, P1 e P1’ da RCL em negrito e sublinhado 1 mpssvswgil llaglcclvp vslaedpqgd aaqktdtshh dqdhptfnki tpnlaefafs 61 lyrqlahqsn stniffspvs iatafamlsl gtkadthdei leglnfnlte ipeaqihegf 121 qellrtlnqp dsqlqlttgn glflseglkl vdkfledvkk lyhseaftvn fgdteeakkq 181 indyvekgtq gkivdlvkel drdtvfalvn yiffkgkwer pfevkdteee dfhvdqvttv 241 kvpmmkrlgm fniqhckkls swvllmkylg nataifflpd egklqhlene lthdiitkfl 301 enedrrsasl hlpklsitgt ydlksvlgql gitkvfsnga dlsgvteeap lklskavhka 361 vltidekgte aagamfleai krkippevkf nkpfvflmie qntksplfmg kvvnptqk SEQ ID NO: 12 Serpina modificada na base a1AT Proteína madura corresponde aos resíduos 25-418. Os resíduos P4, P2, P1 e P1’ da RCL em negrito e sublinhado

Claims (15)

1. Serpina modificada CARACTERIZADA pelo fato de que compreende a sequência de aminoácidos de resíduos 25-418 da SEQ ID NO: 7 tendo mutações nos resíduos P1' e P2 e opcionalmente P1 e/ou P4 no loop central reativo (RCL) da mesma, em que os resíduos P4, P2, P1 e P1' são resíduos 379, 381, 382 e 383 da SEQ ID NO: 7, respectivamente, em que o resíduo P1 da serpina modificada tem uma mutação para R; o resíduo P1' tem uma mutação para Q, H, K ou R; e o resíduo P2 tem uma mutação para H, K ou R; e em que as ditas mutações aumentam a inibição da Proteína C ativada em relação à inibição de uma ou mais proteases pró-coagulantes selecionadas de trom- bina, fVIIa, fXa, fIXa e fXIa, em que opcionalmente a serpina modificada compreende ainda: (i) uma mutação C para S no resíduo 256 da SEQ ID NO: 7; (ii) uma mutação de E para S no resíduo 25 da SEQ ID NO: 7; ou (iii) uma mutação E para S no resíduo 25 e uma mutação C para S no resíduo 256 da SEQ ID NO: 7.

2. Serpina modificada, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que o resíduo P1' tem uma mutação para K ou Q.

3. Serpina modificada, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, CARACTERIZADA pelo fato de que o resíduo P2 tem uma mutação para K.

4. Serpina modificada, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que os resíduos P2 e P1', respectivamente, na serpina modificada são KK, RK, RH, KH, RQ ou KQ.

5. Serpina modificada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, CARACTERIZADA pelo fato de que a serpina modificada compreende uma muta- ção em P4, em que opcionalmente o resíduo P4 tem uma mutação para F, S, R, V, C, W, K, G, L, H, T, Q ou A.

6. Serpina modificada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, CARACTERIZADA pelo fato de que as mutações no RCL da serpina modificada consistem em mutações nas posições P1' e P2; posições P1', P2 e P1; mutações nas posições P1', P2 e P4; ou posições P1', P2, P4 e P1.

7. Serpina modificada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, CARACTERIZADA pelo fato de que: o resíduo P4 no RCL da serpina modificada é A, o resíduo P2 é K e o resíduo P1'é K; o resíduo P4 no RCL da serpina modificada é A, o resíduo P2 é R e o resíduo P1'é H; o resíduo P4 no RCL da serpina modificada é A, o resíduo P2 é K e o resíduo P1'é H; o resíduo P4 no RCL da serpina modificada é A, o resíduo P2 é R e o resíduo P1'é Q; o resíduo P4 no RCL da serpina modificada é A, o resíduo P2 é K e o resíduo P1'é Q; o resíduo P4 no RCL da serpina modificada é A, o resíduo P2 é K, o resíduo P1 é R e o resíduo P1'é K; o resíduo P4 no RCL da serpina modificada é A, o resíduo P2 é K, o resíduo P1 é R e o resíduo P1'é Q; ou o resíduo P4 no RCL da serpina modificada é A, o resíduo P2 é R, o resíduo P1 é R e o resíduo P1'é Q; o resíduo P4 no RCL da serpina modificada é K, o resíduo P2 é R e o resíduo P1'é H; o resíduo P4 no RCL da serpina modificada é F, o resíduo P2 é K e o resí- duo P1'é K; o resíduo P4 no RCL da serpina modificada é F, o resíduo P2 é R e o resíduo P1'é K; ou o resíduo P4 no RCL da serpina modificada é S, o resíduo P2 é H e o resíduo P1'é R.

8. Serpina modificada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, CARACTERIZADA pelo fato de que o resíduo P4 no RCL da serpina modificada é A, o resíduo P2 é K, o resíduo P1 é R e o resíduo P1'é K.

9. Serpina modificada, de acordo com a reivindicação 8, CARACTERIZADA pelo fato de que compreende: (i) a sequência de aminoácidos de resíduos 25-418 da SEQ ID NO: 12; (ii) a sequência de aminoácidos de resíduos 25-418 da SEQ ID NO: 12 com uma mutação de C para S no resíduo 256; (iii) a sequência de aminoácidos de resíduos 25-418 da SEQ ID NO: 12 com uma mutação de E para S no resíduo 25; ou (iv) a sequência de aminoácidos de resíduos 25-418 da SEQ ID NO: 12 com uma mutação de E para S no resíduo 25 e uma mutação de C para S no resíduo 256.

10. Célula recombinante CARACTERIZADA pelo fato de que expressa uma serpina modificada, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 9, em que a célula recombinante é uma célula recombinante de bactéria ou de levedura.

11. Composição farmacêutica CARACTERIZADA pelo fato de que compreende uma serpina modificada, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 9, e um excipiente farmaceuticamente aceitável.

12. Uso de uma serpina modificada, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 9, CARACTERIZADO pelo fato de que é para a fabricação de um medicamento para o tratamento ou prevenção de hemorragia ou para promoção de hemostasia em um indivíduo.

13. Uso, de acordo com a reivindicação 12, CARACTERIZADO pelo fato de que o indivíduo tem um transtorno hemorrágico.

14. Uso, de acordo com a reivindicação 13, CARACTERIZADO pelo fato de que o transtorno hemorrágico é hemofilia.

15. Uso, de acordo com a reivindicação 12, CARACTERIZADO pelo fato de que o indivíduo é um paciente de trauma.