CN108883160B - 因子xa解毒剂的冻干制剂 - Google Patents

Abstract

本公开涉及制备因子Xa(fXa)解毒剂的冻干制剂的溶液和方法。适用于冻干的合适的水性制剂可以包括fXa解毒剂、增溶剂、以及稳定剂，其中所述制剂在冻干期间不塌陷。

Description

因子XA解毒剂的冻干制剂

技术领域

本发明涉及因子XA解毒剂的领域。

背景技术

抗凝剂满足了市场上对在有形成血凝块的倾向的患者，例如像患有凝血障碍、被局限于一段时间不动或接受医疗手术的那些患者中治疗或预防不期望的血栓形成的需求。然而，抗凝治疗的主要局限之一是与所述治疗相关的出血风险以及在给药过量的情况下或如果需要紧急手术程序的话，快速逆转抗凝剂活性的能力方面的限制。因此，非常需要针对所有形式的抗凝治疗的特异性的和有效的解毒剂。

当口服递送不可行或需要即时治疗活性时，通过注射递送生物活性蛋白质一般是所选择的递送途径。然而，生物学障碍、化学障碍、以及物理障碍，如不佳的长期储存、重量克分子渗透压浓度、溶解度、以及稳定性使得通过注射向哺乳动物递送生物活性剂是有问题的。冻干可以解决长期储存问题。尽管如此，在冻干的情况下也存在问题，如冻干物的溶解度和稳定性不佳。因此，存在对针对抗凝剂的解毒剂的改进的注射制剂的需求，所述注射制剂是稳定的并且可溶的。本公开满足了这些需求和其它需求。

本文提到的任何和所有出版物、专利、专利申请在此以引用的方式整体并入本文。

发明内容

本公开提供了被称为“r-解毒剂”的因子Xa(fXa)蛋白质的衍生物(SEQ ID NO:8)或它的变体(例如SEQ ID NO:9)的冻干制剂。与野生型fXa蛋白质相比，所述r-解毒剂和它的变体包括对Gla结构域和活性位点的修饰，保留fXa结合fXa抑制剂的能力，但是不能组装成凝血酶原酶复合物。所述r-解毒剂是双链多肽(参见表3中的SEQ ID NO.7，它包括轻链(SEQ ID NO.2)和重链(SEQ ID NO.3)，所述轻链和所述重链以所述轻链的半胱氨酸98(Cys98)与所述重链的半胱氨酸108(Cys108)之间的单个二硫键连接。

还如同野生型fXa，所述r-解毒剂经历翻译后修饰，从而引起某些氨基酸残基处的糖基化，例如所述轻链的Ser56、Ser72、Ser76和Thr82以及所述重链的Thr249；和修饰的残基，即所述轻链的Asp29处的(3R)-3-羟基Asp。此外，除了链间二硫键之外，在所述轻链的半胱氨酸16与半胱氨酸27、半胱氨酸21与半胱氨酸36、半胱氨酸38与半胱氨酸47、半胱氨酸55与半胱氨酸66、半胱氨酸62与半胱氨酸75、和半胱氨酸77与半胱氨酸90之间、以及在所述重链的半胱氨酸7与半胱氨酸12、半胱氨酸27与半胱氨酸43、半胱氨酸156与半胱氨酸170、和半胱氨酸181与半胱氨酸209之间还形成链内二硫键。

当被配制成适用于施用的组合物时，诸如r-解毒剂的蛋白质可以在疏水界面处聚集并且形成颗粒。因此，在冷冻和冻干过程期间，可能期望使用各种冷冻保护剂和冻干保护剂将蛋白质维持在无定形相中。还期望开发高浓度的蛋白质的合适的无定形制剂。

因此，本文提供了诸如r-解毒剂的蛋白质的冻干组合物。本文还提供了适用于冻干的诸如r-解毒剂的蛋白质的水性制剂。在一些实施方案中，所述冻干组合物是可通过将如本文所述的水性制剂冻干而获得的。

一些实施方案提供了一种可通过将水性制剂冻干而获得的冻干组合物，其中所述水性制剂包含稳定剂、25mM至110mM的精氨酸、以及至少15mg/mL的双链多肽，所述双链多肽包含：包含氨基酸序列SEQ ID NO.4的第一链和包含氨基酸序列SEQ ID NO.5的第二链，其中所述多肽不能组装成凝血酶原酶复合物；所述水性制剂具有7.5至8的pH值；所述稳定剂包含2％至7％的蔗糖(w/v)和0％至5％的甘露糖醇(w/v)；并且所述稳定剂与所述多肽的摩尔比是至少100。

在一些实施方案中，冻干组合物是可通过将水性制剂冻干而获得的，其中所述水性制剂包含约45mM的精氨酸、约6％的蔗糖(w/v)、0％的甘露糖醇、以及约20mg/mL的双链多肽，所述双链多肽包含：包含氨基酸序列SEQ ID NO.4的第一链和包含氨基酸序列SEQ IDNO.5的第二链，其中所述多肽不能组装成凝血酶原酶复合物；并且所述水性制剂具有约7.8的pH值。

在一些实施方案中，冻干组合物是可通过将水性制剂冻干而获得的，其中所述水性制剂包含约100mM的精氨酸、约6％的蔗糖(w/v)、0％的甘露糖醇、以及约40mg/mL的双链多肽，所述双链多肽包含：包含氨基酸序列SEQ ID NO.4的第一链和包含氨基酸序列SEQ IDNO.5的第二链，其中所述多肽不能组装成凝血酶原酶复合物；并且所述水性制剂具有约7.8的pH值。

本公开的另一个实施方案提供了一种溶液，所述溶液是通过溶解本公开的冻干组合物来制备的。在一些方面，溶剂是水或盐水。

又另一个实施方案提供了一种在接受用因子Xa抑制剂进行的抗凝治疗的受试者中减少出血的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的本公开的溶液。在一些方面，所述因子Xa抑制剂是阿哌沙班(apixaban)、利伐沙班(rivaroxaban)或贝曲西班(betrixaban)。

具体实施方式

I.定义

所有数字指示，例如pH值、温度、时间、浓度、以及分子量(包括范围在内)都是变化(+)或(-)0.1％或10％的增量的近似值。应当了解的是，尽管并非总是明确说明，但是在所有数字指示之前都有术语“约”。还应当了解的是，尽管并非总是明确说明，但是本文所述的试剂仅仅是示例性的并且这些试剂的等同物是本领域已知的。

除非上下文另外明确规定，否则如本说明书和权利要求书中所用的单数形式“一个(种)(a/an)”和“所述”包括复数指代对象。举例来说，术语“一种药学上可接受的载体”包括多种药学上可接受的载体，包括其混合物在内。

如本文所用的术语“包含”意图意指组合物和方法包括所叙述的要素，但是并不排除其它要素。“基本上由……组成”在用于限定组合物和方法时应当意指排除对用于预期用途的组合具有任何重要意义的其它要素。因此，基本上由如本文所限定的要素组成的组合物将不会排除来自分离方法和纯化方法的痕量污染物和药学上可接受的载体，如磷酸盐缓冲盐水、防腐剂等。“由……组成”应当意指排除超过痕量的其它成分的元素和用于施用本公开的组合物的基本方法步骤。由这些过渡术语中的每一个过渡术语所限定的实施方案落入本公开的范围内。

术语“蛋白质”和“多肽”是可互换使用的并且在它们的最广泛的意义上指的是两个或更多个亚基氨基酸、氨基酸类似物、或拟肽的化合物。所述亚基可以通过肽键连接。在另一个实施方案中，所述亚基可以通过其它键，例如酯、醚等来连接。蛋白质或肽必须含有至少两个氨基酸并且可以构成蛋白质的序列或肽的序列的氨基酸的最大数量没有限制。如本文所用的术语“氨基酸”指的是天然氨基酸和/或非天然氨基酸或合成氨基酸，包括甘氨酸以及D型光学异构体和L型光学异构体这两者、氨基酸类似物以及拟肽。天然存在的氨基酸的单字母缩写和三字母缩写列于下文中。

“因子Xa”或“fXa”或“fXa蛋白质”是血液凝固途径中的丝氨酸蛋白酶，所述丝氨酸蛋白酶由无活性的因子X(fX，SEQ ID NO.1，表1)产生。编码人类因子X(“fX”)的核苷酸序列可以登录号“NM_000504”在基因库中找到。在催化切割重链的前52个残基之后，fX被激活成fXa。FXa含有轻链和重链。轻链的前45个氨基酸残基(SEQ ID NO.1的残基1-45)被称作Gla结构域，这是因为它含有11个翻译后修饰的γ-羧基谷氨酸残基(Gla)。它还含有短的(6个氨基酸残基)芳族堆叠序列(SEQ ID NO.1的残基40-45)。胰凝乳蛋白酶消化选择性地去除第1个-第44个残基，从而产生无Gla结构域的fXa。fXa的丝氨酸蛋白酶催化结构域位于C末端重链处。fXa的重链与其它丝氨酸蛋白酶，如凝血酶、胰蛋白酶、以及激活的蛋白C是高度同源的。

“天然fXa”或“野生型fXa”指的是天然存在于血浆中或以它的原始未修饰的形式分离的fXa，所述fXa处理激活凝血酶原的生物活性，从而促进血凝块的形成。所述术语包括从组织样品中分离的天然存在的多肽以及重组产生的fXa。“活性fXa”指的是具有激活凝血酶原的促凝血活性的fXa。“活性fXa”可以是天然fXa或保留促凝血活性的修饰的fXa。

如本文所用的“fXa衍生物”指的是修饰的fXa蛋白质，所述修饰的fXa蛋白质不与fXa竞争组装成凝血酶原酶复合物并且具有降低的促凝血活性或催化活性或没有促凝血活性或催化活性，并且仍结合和/或基本上中和抗凝剂，如fXa抑制剂。在一些方面，fXa蛋白质或fXa衍生物的“促凝血活性”指的是野生型活性fXa多肽所携带的酶活性。fXa衍生物和制备这些衍生物的方法的实例提供于美国专利号8,153,590、8,455,441、9,062,298、8,268,783、和9,109,046、美国专利公布号2015/0376592、以及PCT公布WO2009/042962和WO2010/056765中，并且进一步提供于本文中，如SEQ ID NO:7-9和其生物等同物。

fXa多肽或其衍生物的“酶活性”指的是多肽经由与底物直接相互作用催化与所述底物的生化反应的能力。

SEQ ID NO:7相对于野生型fXa含有3个突变。第一个突变是fX的Gla结构域中6-39aa的缺失。第二个突变是用-RKR-置换激活肽序列143-194aa。这产生连接轻链(SEQ IDNO:2)和重链(SEQ ID NO:3)的-RKRRKR-(SEQ ID NO:6)接头。在分泌后，该接头被切割，从而产生双链多肽SEQ ID NO:8(r-解毒剂)。第三个突变是活性位点残基S379突变成Ala残基。该氨基酸取代在表2-表4中的SEQ ID NO:7-9中用粗体表示。

术语“r-解毒剂”指的是在切割接头之后SEQ ID NO:7的经过加工的双链多肽加工产物。这由SEQ ID NO:8表示。所述r-解毒剂公开于例如US 8,153,590中，该US 8,153,590的内容以引用的方式并入本公开中。所述r-解毒剂包括轻链(SEQ ID NO.2)和重链(SEQ IDNO.3)，所述轻链和所述重链以所述轻链的半胱氨酸98(Cys98)与所述重链的半胱氨酸108(Cys108)之间的单个二硫键连接。如同野生型fXa，在某些生产批次中，所述r-解毒剂经历翻译后修饰，从而引起某些氨基酸残基处的糖基化，例如所述轻链的Ser56、Ser72、Ser76和Thr82以及所述重链的Thr249；和修饰的残基，即所述轻链的Asp29处的(3R)-3-羟基Asp。此外，除了链间二硫键之外，在所述轻链的半胱氨酸16与半胱氨酸27、半胱氨酸21与半胱氨酸36、半胱氨酸38与半胱氨酸47、半胱氨酸55与半胱氨酸66、半胱氨酸62与半胱氨酸75、和半胱氨酸77与半胱氨酸90之间、以及在所述重链的半胱氨酸7与半胱氨酸12、半胱氨酸27与半胱氨酸43、半胱氨酸156与半胱氨酸170、和半胱氨酸181与半胱氨酸209之间还可以形成链内二硫键。

r-解毒剂的某些变体，如美国专利号8,153,590、8,455,441、9,062,298、8,268,783、以及9,109,046中所公开的那些变体与r-解毒剂具有相似的化学特性和生物活性。举例来说，SEQ ID NO:9(表4)示出了包括SEQ ID NO:1的氨基酸129-139(即具有Gla结构域(1-45)、EGF1结构域(46-84)、以及EGF2结构域(85-128)的缺失)和SEQ ID NO:1的氨基酸429-448(即具有β-肽的缺失)的双链变体，所述双链变体比r-解毒剂短，但是保留它的解毒活性。

表1：无活性的人类因子X的多肽序列(SEQ ID NO:1)

表2：在去除-RKRRKR-(SEQ ID NO.6)接头之前r-解毒剂的多肽序列(SEQ ID NO:7)

表3：在去除-RKRRKR-(SEQ ID NO.6)接头之后人类因子Xa三重突变体的多肽序列(SEQ ID NO:8)

表4：r-解毒剂的示例变体(SEQ ID NO:9)

本公开还提供了r-解毒剂(或它们的前体，由SEQ ID NO:7表示)的多种生物等同物、或可选的与SEQ ID NO:8或9具有一定的序列同一性的多肽。在一个方面，这些生物等同物保留SEQ ID NO:8或9的结构特征，即修饰的活性位点和缺失或修饰的Gla结构域，任选地具有EGF1结构域和/或EGF2结构域的缺失或修饰。在另一个方面，这些生物等同物保留SEQID NO:8或9的功能特征，即不与fXa竞争组装成凝血酶原酶复合物并且具有降低的促凝血活性(例如酶活性或催化活性)或没有促凝血活性(例如酶活性或催化活性)。

术语“活性位点”指的是酶或抗体中发生化学反应的部分。“修饰的活性位点”是如下的活性位点，所述活性位点在结构上已经被修饰以为所述活性位点提供增加或降低的化学反应性或特异性。活性位点的实例包括但不限于人类因子X的包含第235个-第488个氨基酸残基的催化结构域以及人类因子Xa的包含第195个-第448个氨基酸残基的催化结构域。修饰的活性位点的实例包括但不限于人类因子Xa的催化结构域，所述催化结构域包含SEQID NO:1中的第195个-第448个氨基酸残基，在位置Arg306、Glu310、Arg347、Lys351、Lys414、或Arg424处具有至少一个氨基酸取代。

“组合物”意图意指活性剂和另外的化合物或组合物的组合，所述另外的化合物或组合物是惰性的(例如可检测剂或标记)或活性的，如佐剂。

“药物组合物”意图包括活性剂与惰性或活性载体的组合，从而使得所述组合物适用于体外、体内或离体的诊断用途或治疗用途。

术语“冻干制剂”指的是被冷冻干燥的包含所关注的多肽的药物制剂或组合物。

术语“基本上无定形”材料包括具有不超过约10％结晶度的材料；并且“无定形”材料包括具有不超过约2％结晶度的材料。

如本文所用的术语“填充剂”指的是为冻干制剂提供本体的成分。填充剂的实例包括但不限于甘露糖醇、海藻糖、乳糖、蔗糖、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖、葡萄糖、甘氨酸、环糊精、葡聚糖、固体PEG、以及其衍生物和混合物。在一个实施方案中，本公开的制剂任选地包括填充剂。

如本文所用的术语“冻干”或冷冻干燥指的是其中在将产品冷冻并且放置在真空下，从而允许冰直接从固体变成蒸气而不通过液相之后从所述产品中去除水的过程。所述过程由三个独立的、独特的、以及相互依赖的过程组成；冷冻、一次干燥(升华)、以及二次干燥(解吸)。用于将用于本公开中的多肽冻干的方法描述于本文中并且是本领域公知的。

术语“稳定剂”表示药学上可接受的赋形剂，其在制造、储存以及应用期间保护活性成分(例如fXa衍生多肽)和/或制剂防止化学降解和/或物理降解。所述稳定剂可以是冷冻保护剂或冻干保护剂。稳定剂的实例可以包括蔗糖、精氨酸、柠檬酸盐、甘露糖醇、海藻糖、甘氨酸、氯化钠、葡聚糖以及葡萄糖。在一些实施方案中，所述稳定剂是无定形的。

“冷冻保护剂”是本领域已知的并且包括但不限于例如蔗糖、海藻糖、以及甘油。一般使用在生物系统中表现出低毒性的冷冻保护剂。

“冻干保护剂”指的是在冻干(在高真空中快速冷冻和干燥的过程)期间使蛋白质稳定的药学上可接受的物质。冻干保护剂的实例包括但不限于蔗糖或海藻糖。

如本文所用的术语“表面活性剂”指的是具有两亲结构的药学上可接受的有机物质；即，它由具有相反的溶解倾向的基团构成，所述基团通常是油溶性烃链和水溶性离子基。表面活性剂可以根据表面活性部分的电荷分类为阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、以及非离子表面活性剂。表面活性剂可以降低两种液体之间或液体与固体之间的表面张力(或界面张力)。这些表面活性剂例如使在产品复原期间冻干颗粒的聚集减到最低限度。表面活性剂常常作为润湿剂、乳化剂、增溶剂、以及分散剂用于生物材料的各种药物组合物和制剂。在本文所述的药物制剂的一些实施方案中，表面活性剂的量被描述为以重量/体积百分比(w/v％)表示的百分比。合适的药学上可接受的表面活性剂包括但不限于下组：脂肪酸和烷基磺酸盐、苄索氯铵(例如HY AMINE 1622)；聚氧乙烯脱水山梨糖醇脂肪酸酯(Tween)、聚氧乙烯烷基醚(Brij)、烷基苯基聚氧乙烯醚(Triton-X)、聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物(Poloxamer、Pluronic)、或十二烷基硫酸钠(SDS)。聚氧乙烯脱水山梨糖醇脂肪酸酯包括聚山梨酸酯20(以商标Tween 20^TM出售)和聚山梨酸酯80(以商标Tween 80^TM出售)。聚乙烯-聚丙烯共聚物包括以名称

F68或Poloxamer 188^TM出售的那些聚乙烯-聚丙烯共聚物。聚氧乙烯烷基醚包括以商标Brij^TM出售的那些聚氧乙烯烷基醚。烷基酚聚氧乙烯醚包括以商品名Triton-X出售的那些烷基酚聚氧乙烯醚。也可以使用天然表面活性剂，如牛磺胆酸钠、1-棕榈酰基-2-Sn-甘油基-3-磷酸胆碱、卵磷脂以及其它磷脂。表面活性剂可以占约0.001％至约5％w/v。

“结晶组分”指的是在冷冻干燥过程期间在包括多肽的制剂中形成结晶基质的分子。结晶组分的非限制性实例包括甘露糖醇和甘氨酸。

术语“增溶剂”指的是盐、离子、碳水化合物、络合剂、聚合物以及其它化合物，它们当存在于溶液中时增加另一种分子(例如活性成分)在溶液中的溶解度。增溶剂的非限制性实例包括精氨酸和柠檬酸盐。在一个方面，所述增溶剂是精氨酸。在一个方面，所述增溶剂是柠檬酸盐。

如本文所用的术语“缓冲剂”表示药学上可接受的赋形剂，它使药物制剂的pH值稳定。合适的缓冲剂是本领域公知的并且可以参见于文献中。药学上可接受的缓冲剂包括但不限于tris缓冲剂、精氨酸缓冲剂、组氨酸缓冲剂、柠檬酸盐缓冲剂、丁二酸盐缓冲剂以及磷酸盐缓冲剂。独立于所使用的缓冲剂，可以使用本领域已知的酸或碱来调节pH值，所述酸或碱例如丁二酸、盐酸、乙酸、磷酸、硫酸和柠檬酸、丁二酸盐、柠檬酸盐、tris碱、组氨酸、盐酸组氨酸、氢氧化钠以及氢氧化钾。合适的缓冲剂包括但不限于组氨酸缓冲剂、2-(吗啉-1-基)乙磺酸(MES)、二甲胂酸盐、磷酸盐、乙酸盐、丁二酸盐、以及柠檬酸盐。缓冲剂的浓度可以是约4mM至约60mM，或可选地是约4mM至约40mM，或可选地是约5mM至约25mM。

“抗氧化剂”指的是能够减慢或防止其它分子氧化的分子。氧化是将电子从物质转移到氧化剂的化学反应。氧化反应可以产生自由基，所述自由基引发使蛋白质治疗剂不稳定并且最终影响产品活性的链反应。抗氧化剂通过去除自由基中间体来终止这些链反应并且通过自身氧化来抑制其它氧化反应。因此，抗氧化剂常常是还原剂、螯合剂以及除氧剂，如柠檬酸盐、EDTA、DPTA、硫醇、抗坏血酸或多酚。抗氧化剂的非限制性实例包括抗坏血酸(AA、E300)、硫代硫酸盐、甲硫氨酸、生育酚(E306)、没食子酸丙酯(PG、E310)、叔丁基氢醌(TBHQ)、丁基化羟基苯甲醚(BHA、E320)以及丁基化羟基甲苯(BHT、E321)。

“防腐剂”是添加到产品，如食品、药物、油漆、生物样品、木材等中以防止微生物生长或不期望的化学变化所引起的分解的天然或合成化学品。防腐剂添加剂可以单独使用或与其它保存方法结合使用。防腐剂可以是抗微生物防腐剂，所述抗微生物防腐剂抑制细菌和真菌的生长；或抗氧化剂，如氧吸收剂，所述抗氧化剂抑制成分的氧化。常见的抗微生物防腐剂包括苯扎氯铵、苯甲酸、氯己定(cholorohexidine)、甘油、苯酚、山梨酸钾、硫柳汞、亚硫酸盐(二氧化硫、亚硫酸氢钠、亚硫酸氢钾等)以及EDTA二钠。其它防腐剂包括通常用于肠胃外给药的蛋白质的那些防腐剂，如苯甲醇、苯酚、间甲酚、氯丁醇或对羟基苯甲酸甲酯。

如本文所用的术语“张力剂”表示用于调节制剂的张力的药学上可接受的试剂。等渗性一般涉及相对于溶液，通常相对于人类血清的渗透压。制剂可以是低渗的、等渗的或高渗的。在一个方面，所述制剂是等渗的。等渗制剂是液体或从固体形式，例如从冻干形式复原的液体并且表示与和它进行比较的一些其它溶液，如生理盐溶液和血清具有相同的张力的溶液。合适的等渗剂包括但不限于氯化钠、氯化钾、甘油、和如本文所定义的来自氨基酸、糖的组的任何组分以及其组合。

II.制剂

如所提供的野生型fXa是一种双链多肽。许多形式的fXa解毒剂也是如此，包括r-解毒剂(SEQ ID NO:8和9)，所述r-解毒剂包括轻链(SEQ ID NO.2或4)和重链(SEQ ID NO.3或5)，所述轻链和所述重链以所述轻链的半胱氨酸98(SEQ ID NO:2中的Cys98或SEQ IDNO:4中的Cys4)与所述重链的半胱氨酸108(SEQ ID NO:3或5中的Cys108)之间的单个二硫键连接。还如同野生型fXa，在细胞中表达的r-解毒剂经历翻译后修饰，从而引起某些氨基酸残基处的糖基化，例如所述轻链的Ser56、Ser72、Ser76和Thr82以及所述重链的Thr249；和修饰的残基，即所述轻链的Asp29处的(3R)-3-羟基Asp。此外，除了链间二硫键之外，在所述轻链的半胱氨酸16与半胱氨酸27、半胱氨酸21与半胱氨酸36、半胱氨酸38与半胱氨酸47、半胱氨酸55与半胱氨酸66、半胱氨酸62与半胱氨酸75、和半胱氨酸77与半胱氨酸90之间、以及在所述重链的半胱氨酸7与半胱氨酸12、半胱氨酸27与半胱氨酸43、半胱氨酸156与半胱氨酸170、和半胱氨酸181与半胱氨酸209之间还可以形成一个或多个链内二硫键。

鉴于fXa解毒剂的双链结构和各种翻译后修饰，开发包括高浓度的多肽的稳定的冻干制剂是一项巨大的挑战。

期望开发高浓度的多肽的合适的无定形制剂。使用更高浓度的多肽，可能需要更高浓度的无定形稳定剂(即冷冻保护剂和冻干保护剂)，同时仍维持对于递送来说适当的重量克分子渗透压浓度。在无定形组分和结晶组分的混合体系中，更高量的无定形稳定剂(即冷冻保护剂和冻干保护剂)可以增加玻璃化转变温度(Tg')，而结晶组分在包含高浓度的多肽的制剂中降低Tg'。因而，更高浓度的稳定剂和更低浓度的结晶组分可以增加Tg'。具有高Tg'的制剂是所期望的，这是因为如果需要的话，这些制剂可能更适合冻干。

因此，发现当甘露糖醇和蔗糖存在于本公开的制剂中时，具有大于1的蔗糖与甘露糖醇的比率的制剂是无定形的并且表现出Tg'。还发现当在制剂中不存在结晶组分并且包括无定形稳定剂时，可以实现冻干的无定形制剂。还考虑的是，增加稳定剂(如冻干保护剂)的浓度可以增加多肽的稳定性。

还发现增加如本文所述的多肽的浓度可以增加Tg'。可以在更高的pH值下或通过增加增溶剂，如精氨酸的添加来实现高浓度的多肽。

更确切地说，合适的冻干的无定形制剂可以由如本文所述的水性制剂产生。示例性r-解毒剂溶液包括约100mM精氨酸(90mM至约110mM)、约6％蔗糖(4％-5％)、以及0％甘露糖醇(即不包括甘露糖醇)。另一种示例性r-解毒剂溶液包括约45mM精氨酸(35mM至约55mM)、约6％蔗糖(4％-5％)、以及0％甘露糖醇(即不包括甘露糖醇)。此外，这些溶液包括约10mM tris(约5mM至约15mM)、和0.01％-0.02％(0.001％-0.5％)聚山梨酸酯80(PS80)以及所期望量的r-解毒剂(例如20mg/mL、25mg/mL、30mg/mL、35mg/mL、40mg/mL、45mg/mL、50mg/mL、55mg/mL、60mg/mL、65mg/mL、70mg/mL、75mg/mL、80mg/mL、85mg/mL、90mg/mL、95mg/mL、100mg/mL、110mg/mL、115mg/mL、120mg/mL、125mg/mL、130mg/mL、135mg/mL、140mg/mL、145mg/mL、或150mg/mL)并且具有约7.8的pH值。

因此，当这些溶液被冻干时，它将形成组合物，所述组合物使稳定剂(如蔗糖)和/或多肽维持无定形形式。在一些实施方案中，本文所述的制剂表现出约-5℃至约-50℃、-10℃至约-45℃、-15℃至约-40℃、-20℃至约-30℃、或约-27℃至约-37℃的玻璃化转变温度。

使用r-解毒剂所观测到的结果可以容易地外推到具有相似结构的其它fXa解毒剂，包括r-解毒剂(或它们的前体，由SEQ ID NO:2表示)的生物等同物。在一个方面，这些生物等同物与SEQ ID NO:8或9具有至少80％、85％、90％、或95％的序列同一性。在一个方面，这些生物等同物包括两条肽链，这两条肽链各自分别与SEQ ID NO:2或4或者SEQ ID NO:3或5具有至少80％、85％、90％、或95％的序列同一性。在一个方面，这些生物等同物保留SEQID NO:8的结构特征，即修饰的活性位点和缺失或修饰的Gla结构域。在另一个方面，这些生物等同物保留SEQ ID NO:8的功能特征，即不与fXa竞争组装成凝血酶原酶复合物并且具有降低的促凝血活性(例如酶活性或催化活性)或没有促凝血活性(例如酶活性或催化活性)。在一个方面，这些生物等同物保留SEQ ID NO:9的结构特征，即修饰的活性位点和缺失或修饰的Gla结构域以及EGF1结构域和EGF2结构域中的任何一个或这两者。在另一个方面，这些生物等同物保留SEQ ID NO:9的功能特征，即不与fXa竞争组装成凝血酶原酶复合物并且具有降低的促凝血活性(例如酶活性或催化活性)或没有促凝血活性(例如酶活性或催化活性)。

此外，考虑的是，精氨酸可以用另外的增溶剂替代并且蔗糖可以用另外的稳定剂(即冷冻保护剂或冻干保护剂)替代，它们中的每一种的足够的实例是本领域可获得的并且提供于本公开中。

A.适用于冻干的多肽溶液

在一个实施方案中，本公开提供了一种适用于冻干的水性制剂，所述制剂包括如在此所公开的fXa解毒剂或它的生物等同物、以及增溶剂和稳定剂(即冷冻保护剂或冻干保护剂)，其中所述稳定剂与所述fXa解毒剂的摩尔比是约100或更高。所述水性制剂还可以包括表面活性剂和/或缓冲剂。在一些方面，这些试剂中的每一种的存在使fXa解毒剂维持无定形形式。在一些方面，这些试剂中的每一种的存在防止fXa解毒剂在冻干期间塌陷，例如在冷冻干燥温度高于-30℃、-25℃、-20℃、-15℃、-10℃、-5℃、或0℃时。

本公开的一个实施方案提供了一种可以用于冻干的水性制剂。所述水性制剂包括fXa衍生多肽，例如包含SEQ ID NO.8或9的氨基酸序列或与SEQ ID NO.8或9具有至少95％的序列同一性的氨基酸序列的多肽。除了所述多肽之外，所述水性制剂还包括增溶剂和稳定剂，其中所述稳定剂与所述fXa衍生多肽的摩尔比是约100或更高。

在一个方面，与野生型fXa蛋白质相比，所述fXa衍生多肽具有对Gla结构域和活性位点的修饰。在一个方面，所述fXa衍生多肽保留fXa结合fXa抑制剂的能力，但是不组装成凝血酶原酶复合物。在一个方面，所述fXa衍生多肽是一种具有氨基酸序列SEQ ID NO.8的双链多肽，其包括轻链(SEQ ID NO.2)和重链(SEQ ID NO.3)，所述轻链和所述重链以所述轻链的半胱氨酸98(Cys98)与所述重链的半胱氨酸108(Cys108)之间的单个二硫键连接。在一个方面，所述fXa衍生多肽是一种具有氨基酸序列SEQ ID NO.9的双链多肽，其包括轻链(SEQ ID NO.4)和重链(SEQ ID NO.5)，所述轻链和所述重链以所述轻链的半胱氨酸4(Cys4)与所述重链的半胱氨酸108(Cys108)之间的单个二硫键连接。在一个方面，所述水性制剂包括至少15mg/mL的多肽。在一个方面，所述水性制剂包括至少5mg/mL、10mg/mL、15mg/mL、20mg/mL、25mg/mL、30mg/mL、35mg/mL、40mg/mL、45mg/mL、50mg/mL、55mg/mL、60mg/mL、65mg/mL、70mg/mL、75mg/mL、80mg/mL、85mg/mL、90mg/mL、95mg/mL、100mg/mL、105mg/mL、110mg/mL、115mg/mL、120mg/mL、125mg/mL、130mg/mL、135mg/mL、140mg/mL、145mg/mL、或150mg/mL的多肽。

在一些方面，在所述水性制剂中包括增溶剂。在本文证实了增溶剂的存在可用于保持fXa多肽在制剂中是可溶的和稳定的。在一些方面，增溶剂(例如精氨酸)的浓度是至少40mM，或可选地是至少20mM、25mM、30mM、35mM、45mM、50mM、60mM、70mM、80mM、90mM、或100mM。在一些方面，增溶剂(例如精氨酸)的浓度不高于150mM、145mM、140mM、135mM、130mM、125mM、120mM、115mM、或110mM。在一些方面，增溶剂的浓度是约25mM至约110mM、约20mM至约130mM、约30mM至约120mM、或约40mM至约110mM、或约40mM至约105mM。在一些方面，增溶剂的浓度是约40mM至约50mM或约45mM。在一些方面，增溶剂的浓度是约90mM至约110mM、或约95mM至约105mM、或约100mM。应当指出的是，如本文所用的术语精氨酸指的是所述氨基酸以及其盐(例如精氨酸盐酸盐)。精氨酸具有约174.2道尔顿的分子量并且精氨酸盐酸盐(例如L-精氨酸盐酸盐)具有约210.7道尔顿的分子量。

在一个实施方案中，增溶剂是柠檬酸根或其盐。柠檬酸根的盐是柠檬酸钠。在一个方面，柠檬酸根包括约1.0mM至约200.0mM的浓度。在另一个方面，柠檬酸根的浓度是约25mM。在另一个方面，柠檬酸根的浓度是约50mM。在另一个实施方案中，柠檬酸根的浓度是约5mM、10mM、或20mM。在另一个实施方案中，柠檬酸根包括约0.05M至约0.2M的浓度。

在一些方面，在所述水性制剂中包括稳定剂。在一个方面，所述稳定剂是无定形甘露糖醇和/或无定形蔗糖。在一个方面，稳定剂是无定形蔗糖。

在一个方面，所述水性制剂中稳定剂(例如蔗糖)的浓度是至少约1.5％(w/v)。在一个方面，所述水性制剂中稳定剂(例如蔗糖)的浓度是至少约2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％、5％、5.5％、6％、6.5％、或约7％(w/v)。在一个方面，所述水性制剂中稳定剂(例如蔗糖)的浓度不大于约10％、9.5％、9％、8.5％、8％、7.5％、或7％(w/v)。在一个方面，所述水性制剂中稳定剂(例如蔗糖)的浓度是约2％至约8％、或约2％至约7％、或约2.5％至约7.5％、或约3％至约7％、或约3.5％至约6.5％、或约4％至约7％、或约4％至约6％、或约4.5％至约5.5％、或约3％至约5％、或约3.5％至约4.5％、或5％至7％、或约5.5％至约7.5％、或约5.5％至约6.5％、或约3.5％、4％、4.5％、5％、5.5％、6％、6.5％、或7％(w/v)。

在一个方面，所述水性制剂中甘露糖醇的浓度是约0％至约5％(w/v)、约0％至约4％、或约0％至约3％。在一些实施方案中，所述水性制剂中甘露糖醇的浓度是至少约0.001％、约0.5％、约1％、约1.5％、或约2％(w/v)。在一个方面，所述水性制剂中甘露糖醇的浓度不大于约6％、约5.5％、约5％、约4.5％、约4％、或约3.5％(w/v)。在一些实施方案中，所述水性制剂不包括甘露糖醇。

在一个方面，所述水性制剂中所述稳定剂与所述蛋白质的摩尔比是至少约50、至少约75、至少约100、至少约200、至少约300、至少约400、至少约500、至少约600、至少约700、至少约800、至少约900、或至少约1000。在一个方面，所述水性制剂中所述稳定剂与所述蛋白质的摩尔比是10至约1000、约50至约900、约60至约800、约70至约700、约80至约800、约90至约700、约100至约600、约100至约500、100至约400、110至约380、约150至约200、约175至约185、约350至约400、或约355至约365。在一些方面，所述水性制剂中所述稳定剂与所述蛋白质的摩尔比是至少约90、110、120、130、140、或150。

在一些方面，所述水性制剂还可以包括表面活性剂、缓冲剂、张力剂、冷冻保护剂、表面活性剂、冻干保护剂、防腐剂或其组合。

在一些方面，所述水性制剂具有6或更高、或6.5或更高、或7或更高、或7.5或更高的pH值。在一些方面，pH值不高于9、8.5、或8。在一些方面，pH值是6至9、6.5至8.5、7至8.5、7.5至8.2、7.6至8.1、7.7至7.9、或约6.7、6.8、6.9、7、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9或8。

在一些实施方案中，除了所述多肽之外，所述水性制剂还包括增溶剂、结晶组分(如甘露糖醇)、以及稳定剂(如蔗糖)，其中所述稳定剂与所述结晶组分的比率高到足以防止结晶。这样的制剂在所期望的条件下冻干期间也不会塌陷并且可以被冻干以获得冻干的无定形组合物。在一个方面，所述所期望的条件是在高于-40℃，或可选地是高于-30℃、-25℃、-20℃、-15℃、或-10℃的温度下进行冷冻干燥。在另一个方面，所述所期望的条件是在低于5℃、0℃、-5℃、或-10℃的温度下进行冷冻干燥。

在一些方面，所述水性制剂可以包括缓冲剂，其中所述缓冲剂是Tris。在这些实施方案中，所述水性制剂可以包括至少约1mM tris、2mM tris、4mM tris、6mM tris、8mMtris、10mM tris、12mM tris、14mM tris、16mM tris、18mM tris、或20mM tris。在一些方面，所述水性制剂可以包括少于约35mM tris、33mM tris、30mM tris、28mM tris、26mMtris、或25mM tris。

在一些方面，所述水性制剂可以包括表面活性剂，如聚山梨酸酯80。在一些方面，聚山梨酸酯80的浓度是约0.0001％至约1％、0.001％至约0.9％、0.001％至约0.5％、约0.001％至约0.3％、约0.005％至约0.03％、约0.005％至约0.02％、或约0.01％至约0.02％。在一些方面，聚山梨酸酯80的浓度是至少约0.0001％、0.001％、或0.002％。

在一个方面，所述水性制剂包括约45mM的精氨酸、约6％的蔗糖(w/v)、以及约20mg/mL的双链r-解毒剂，其中所述制剂具有约7.8的pH值。在一个方面，所述水性制剂包括约100mM的精氨酸、约6％的蔗糖(w/v)、以及约40mg/mL的双链r-解毒剂，其中所述制剂具有约7.8的pH值。在一个方面，所述水性制剂包括约100mM的精氨酸、约6％的蔗糖(w/v)、以及约40mg/mL的双链r-解毒剂，其中所述制剂具有约7.8的pH值。在一个方面，所述水性制剂还包括0.005％-0.02％(w/v)的聚山梨酸酯80和缓冲剂。在一个方面，所述水性制剂还包括0.01％(w/v)的聚山梨酸酯80和缓冲剂。

B.冻干和冻干组合物

在一些实施方案中，还提供了将本公开的水性制剂冻干的方法。

在另一个方面，冻干循环包括如表9中所述的步骤。还应当指出的是，一旦鉴定出适用于冻干的水溶液，就可以使用本领域已知的方法相应地得到将所述溶液冻干的方法。在一个方面，在-40℃或更高的温度下进行所述干燥步骤中的一个或多个或全部。在一个方面，在约-35℃、-30℃、-25℃、-20℃、-15℃、-10℃、-5℃、或0℃的温度下进行所述干燥步骤。

在一些方面，还提供了通过将本公开的水性制剂冻干所制备的冻干的无定形组合物。基于每一种试剂在水性制剂中的浓度，可以容易地确定所述试剂在冻干组合物中的相对含量。

在一个方面，所述冻干组合物包括至少5％、或可选地至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％或60％(w/w)的fXa衍生多肽。在一些实施方案中，所述冻干组合物包含呈无定形形式的蔗糖。

此外，在一些方面，提供了一种通过将本公开的冻干组合物溶解在溶剂中所制备的溶液。在一些方面，所述溶剂是水或盐水。在一个方面，所述溶剂是水。在一个方面，所述溶液包括至少20mg/ml或可选地至少40mg/ml的靶多肽。

III.使用所述制剂的方法

本公开还涉及在接受用fXa抑制剂进行的抗凝治疗的受试者中治疗、预防或减少出血的治疗方法，所述治疗方法包括在将冻干制剂溶解在合适的溶剂中后向受试者施用有效量的所述冻干制剂。考虑的是，本公开的解毒剂或衍生物可以是待用于选择性情况或紧急情况下的持续时间短的药物，它们可以安全地和特异性地中和fXa抑制剂的常规抗凝特性而不会引起有害的血液动力学副作用或对损伤的增殖性血管响应的恶化。

如本文所用的术语“治疗(treating)”、“治疗(treatment)”等在本文用于意指获得所期望的药理作用和/或生理作用。所述作用就完全或部分预防病症或其体征或症状而言可能是预防性的和/或就部分或完全治愈病症和/或可归因于所述病症的不利影响而言可能是治疗性的。

“治疗”还涵盖了对哺乳动物的病症的任何治疗，并且包括：(a)在可能易患病症，但是可能尚未被诊断为患有所述病症的受试者中预防所述病症发生，例如在有抗凝剂给药过量的患者中预防出血；(b)抑制病症，即阻止它发展，例如抑制出血；或(c)减轻或缓解所述病症，例如减少出血。

如本文所用的“治疗”还包括与病理相关的症状的全身性改善和/或症状发作的延迟。“治疗”的临床证据和亚临床证据将随病理、个体以及治疗而变。

“施用”可以在一次剂量中、在整个治疗过程中连续地或间歇地进行。确定最有效的施用方式和剂量的方法是本领域技术人员已知的并且将随用于治疗的组合物、治疗的目的、所治疗的靶细胞、以及所治疗的受试者而变。可以使用由治疗医师选择的剂量水平和模式进行单次施用或多次施用。施用所述药剂的合适的剂量制剂和方法是本领域已知的。诊断或治疗的“受试者”是细胞或哺乳动物，包括人类。诊断或治疗的非人类动物受试者包括例如鼠类，如大鼠、小鼠；犬科动物，如狗；兔类，如兔；家畜、竞技动物、以及宠物。

本公开的药剂和组合物可以用于制造药物并且可以用于通过根据常规程序进行施用来治疗人类和其它动物，如药物组合物中的活性成分。

本公开的药剂可以通过任何合适的途径，特别是通过肠胃外(包括皮下、肌内、静脉内、以及真皮内)施用来施用以用于治疗。还将了解的是，优选的途径将随接受者的情况和年龄以及所治疗的疾病而变。

短语“药学上可接受的聚合物”指的是可以与在此所述的一种或多种多肽缀合的一组化合物。考虑的是，聚合物与多肽缀合能够延长所述多肽在体内和体外的半衰期。非限制性实例包括聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、纤维素衍生物、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、糖、多元醇以及其混合物。

“抗凝血剂”或“抗凝剂”是抑制血凝块形成的药剂。抗凝血剂的实例包括但不限于凝血酶、因子IXa、因子Xa、因子XIa、因子XIIa或因子VIIa的特异性抑制剂、肝素和衍生物、维生素K拮抗剂、以及抗组织因子抗体。凝血酶的特异性抑制剂的实例包括水蛭素、比伐卢定(bivalirudin)

阿加曲班(argatroban)以及来匹卢定(lepirudin)

肝素和衍生物的实例包括未分级肝素(UFH)、低分子量肝素(LMWH)，如依诺肝素(enoxaparin)

达肝素(dalteparin)

以及达那肝素(danaparoid)

以及合成五糖，如磺达肝癸(fondaparinux)

维生素K拮抗剂的实例包括华法林(warfarin)

苯香豆素(phenocoumarol)、醋硝香豆素(acenocoumarol)

氯茚二酮(clorindione)、双香豆素(dicumarol)、二苯茚酮(diphenadione)、双香豆素乙酸乙酯、苯丙香豆素(phenprocoumon)、苯茚二酮(phenindione)、以及噻氯香豆素(tioclomarol)。在一个实施方案中，所述抗凝剂是因子Xa的抑制剂。在一个实施方案中，所述抗凝剂是贝曲西班。

“抗凝治疗”指的是向患者施用以预防不期望的血凝块或血栓形成的治疗方案。抗凝治疗包括以适用于在患者中治疗或预防不期望的血凝块或血栓形成的剂量和方案施用两种或更多种抗凝血剂或其它药剂中的一种或组合。

术语“因子Xa抑制剂”或“因子Xa的抑制剂”指的是可以直接或间接抑制凝血因子Xa在体外和/或体内催化凝血酶原转化成凝血酶的活性的化合物。

“直接因子Xa抑制剂”直接与fXa结合并且非限制性实例包括NAP-5、rNAPc2、组织因子途径抑制剂(TFPI)、DX-DX-9065a(如例如Herbert,J.M.等,J Pharmacol ExpTher.1996 276(3):1030-8中所述)、YM-60828(如例如Taniuchi,Y.等,ThrombHaemost.1998 79(3):543-8中所述)、YM-150(如例如Eriksson,B.I.等,Blood 2005；106(11),摘要1865中所述)、阿哌沙班、利伐沙班、TAK-442、PD-348292(如例如PipelineInsight:Antithrombotics-Reaching the Untreated Prophylaxis Market,2007中所述)、奥米沙班(otamixaban)、依度沙班(edoxaban)(如例如Hylek EM,Curr Opin InvestDrugs 2007 8(9):778-783中所述)、LY517717(如例如Agnelli,G.等,J.Thromb.Haemost.2007 5(4):746-53中所述)、GSK913893、雷扎沙班(razaxaban)、贝曲西班或其药学上可接受的盐、以及其组合。在一个具体方面，直接因子Xa抑制剂是利伐沙班。在一些方面，直接fXa抑制剂是小分子化合物。

“间接因子Xa抑制剂”对fXa活性的抑制是由一种或多种其它因子介导的。间接因子Xa抑制剂的非限制性实例包括磺达肝癸、依达肝素(idraparinux)、生物素化的依达肝素、依诺肝素、法安明(fragmin)、亭扎肝素(tinzaparin)、低分子量肝素(“LMWH”)、以及其组合。在一个具体方面，间接因子Xa抑制剂是依诺肝素。

在一个实施方案中，因子Xa抑制剂选自依度沙班、磺达肝癸、依达肝素、生物素化的依达肝素、依诺肝素、法安明、NAP-5、rNAPc2、组织因子途径抑制剂、DX-9065a、YM-60828、YM-150、阿哌沙班、利伐沙班、PD-348292、奥米沙班、DU-176b、LY517717、GSK913893、雷扎沙班、低分子量肝素、贝曲西班或其药学上可接受的盐、以及其组合。

术语“贝曲西班”指的是化合物“[2-({4-[(二甲氨基)亚氨基甲基]苯基}羰基氨基)-5-甲氧基苯基]-N-(5-氯(2-吡啶基))甲酰胺”或其药学上可接受的盐。“[2-({4-[(二甲氨基)亚氨基甲基]苯基}羰基氨基)-5-甲氧基苯基]-N-(5-氯(2-吡啶基))甲酰胺”指的是具有以下结构的化合物：

或其互变异构体或药学上可接受的盐。在一个实施方案中，它是顺丁烯二酸盐。

贝曲西班描述于美国专利号6,376,515和6,835,739以及2006年11月7日提交的美国专利申请公布号2007/0112039中，这些文献的内容以引用的方式并入本文。已知贝曲西班是特异性因子Xa抑制剂。

“中和”、“逆转”或“抵消”fXa抑制剂的活性或相似短语指的是抑制或阻断fXa抑制剂的因子Xa抑制功能或抗凝功能。这些短语指的是在体外和/或体内部分抑制或阻断功能以及抑制或阻断大部分的或全部的fXa抑制剂活性。

“有效量”指的是足以诱导所期望的生物学结果和/或治疗结果的衍生物的量。该结果可以是减轻疾病的体征、症状、或病因、或生物系统的任何其它所期望的改变。在本公开中，结果通常将涉及以下一种或多种：中和已经向患者施用的fXa抑制剂、逆转fXa抑制剂的抗凝活性、从血浆中去除fXa抑制剂、恢复止血、以及减少或停止出血。有效量将根据所使用的特定解毒剂、已经向受试者施用的特定fXa抑制剂、fXa抑制剂的给药方案、解毒剂的施用时间、所治疗的受试者和疾病状况、受试者的体重和年龄、疾病状况的严重程度、施用方式等而变化，所有这些因素可以容易地由本领域的普通技术人员确定。

在某些方面，施用所述溶液以递送约10毫克(mg)至约2克(g)的量的fXa衍生物(例如r-解毒剂)。所使用的r-解毒剂的其它量包括约100mg至约1.5g；约200mg至约1g；以及约400mg至约900mg。在一些方面，所使用的r-解毒剂的量是约400mg或960mg。在一些方面，所使用的r-解毒剂的量是约10mg至约100mg；约15mg至约95mg；以及约20mg至约80mg。

在另一个实施方案中，以中和量施用所述溶液，所述中和量是r-解毒剂的循环浓度与因子Xa抑制剂的循环浓度的至少约1:1倍摩尔比，持续至少约30分钟的时间。在其它实施方案中，摩尔比是约1:1或约2:1或约4:1。

在施用时所述制剂将因子Xa抑制剂中和至少约20％、或至少约50％、或至少约75％、或至少约90％、或至少约95％。

可以通过许多体外测定(如凝血酶产生测定)以及临床凝血测定(如aPTT、PT以及ACT)来确定是否实现了所述方法，即抑制或逆转因子Xa抑制剂。

本公开的一个方面涉及在接受用fXa抑制剂进行的抗凝治疗的受试者中选择性地结合和抑制外源施用的fXa抑制剂的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的所述冻干制剂的溶液。适用于该治疗的患者先前已经接受抗凝治疗，例如，他们已经接受一种或多种抗凝剂，如直接或间接fXa抑制剂的施用。

在一些实施方案中，在施用过量的fXa抑制剂之后或在可能使受试者暴露于出血风险的手术之前施用所述溶液。所述受试者可以是细胞或哺乳动物，如人类。

在另一个方面，本文提供的方法在接受用因子Xa抑制剂进行的抗凝治疗的受试者中选择性地结合和抑制外源施用的因子Xa抑制剂，所述方法包括向所述受试者施用所述冻干制剂的溶液。所述受试者可以是细胞或哺乳动物，如人类。

将受益于本文所述的溶解的冻干制剂的施用和所附方法的受试者包括正经历或倾向于临床大出血事件或有临床意义的非大出血事件的那些受试者。临床大出血事件的实例选自由以下组成的组：出血、出血到重要器官中、需要再次手术或新治疗程序的出血、以及出血指数≥2.0伴有相关明显出血(Turpie AGG等,NEJM,2001,344:619-625)。此外，所述受试者可能正经历或倾向于非大出血事件，所述非大出血事件选自由以下组成的组：持续性的或复发性的并且大量的或在没有干预的情况下将不会停止的鼻出血、不会上升到需要治疗程序的水平的直肠或泌尿道出血、自发或在轻微创伤的情况下发生的注射部位或其它地方的显著血肿、超过通常与不需要引流的手术程序相关的大量失血、以及需要非计划性输血的出血。

在一些实施方案中，在施用过量的fXa抑制剂之后或在可能使受试者暴露于出血风险的手术之前施用溶解的冻干制剂。

在本文所述的方法中的任一种中，应当了解的是，即使并非总是明确说明，也要向所述受试者施用有效量的溶解的冻干制剂。所述量可以由治疗医师凭经验确定并且将随受试者的年龄、性别、体重以及健康情况而变。治疗医师要考虑的另外的因素包括但不限于可能已经施用的因子Xa抑制剂的身份和/或量、将向受试者施用冻干制剂的方法或方式、以及患者的治疗终点。考虑到这些变量，本领域技术人员将向待治疗的受试者施用治疗有效量。

实施例

通过参考以下实施例进一步了解本公开，所述实施例仅意图举例说明本公开。本公开的范围不受所举例说明的实施方案的限制，所述实施方案仅意图说明本公开的单个方面。功能上等同的任何方法落入本公开的范围内。根据上述说明，除了本文所述的那些修改之外，对本公开的各种修改对于本领域技术人员来说也将变得显而易见。这些修改落入所附权利要求的范围内。

除非另有说明，否则所有温度均是以摄氏度为单位的。此外，在这些实施例和其它地方，缩写具有以下含义：

hr ＝小时

M ＝摩尔/升

mg ＝毫克

mg/kg ＝毫克/公斤

mg/mL ＝毫克/毫升

min ＝分钟

mL ＝毫升

mM ＝毫摩尔/升

PS80 ＝聚山梨酸酯80

RH ＝相对湿度

w/v ＝重量/体积

μL或uL ＝微升

μM ＝微摩尔/升

实施例1：制备用于制备r-解毒剂的无定形制剂的水溶液

通过超滤/渗滤将r-解毒剂制备成10mM tris、45mM L-精氨酸盐酸盐、6％w/v蔗糖、pH7.8的制剂。将r-解毒剂以12mg/mL缓冲液交换到10mM tris、45mM L-精氨酸盐酸盐、6％w/v蔗糖(pH 7.8)中，然后浓缩到30mg/mL。在稀释之后，目标r-解毒剂浓度是20mg/mL。

实施例2a：热表征

制备十一种不同的制剂以测试pH值、甘露糖醇(结晶组分)、蔗糖(稳定剂)、以及r-解毒剂浓度对制剂的Tg'(玻璃化转变温度)的影响。通过差示扫描量热法(DSC)测量Tg'。这些制剂的每一种组分的量和Tg'汇总于表5中。

表5

*没有检测到Tg'。溶液表现出结晶事件。

基于上述热表征，发现含有r-解毒剂、Tris、L-精氨酸盐酸盐、甘露糖醇、蔗糖、以及聚山梨酸酯80并且其中蔗糖与甘露糖醇的比率大于1的制剂是无定形的并且表现出Tg'。在其中蔗糖与甘露糖醇的比率小于1的诸如表5中的制剂10a的制剂中，观测到结晶事件。统计分析表明增加蔗糖和r-解毒剂的量增加了Tg'，而增加甘露糖醇的量降低了无定形制剂的Tg'。

实施例2b：热表征

通过DSC评价在pH 8.0在10mM Tris、100mM L-精氨酸盐酸盐中递增浓度的r-解毒剂的制剂。具有Tg'的所有制剂都是无定形的。如下表6中所示，随着蛋白质浓度增加，Tg'增加。具有高Tg'的制剂是所期望的，这是因为如果需要的话，它们更适合于冻干。

表6

实施例3：制剂-液体的稳定性

在稳定性方面评估表5中的液体制剂。在5℃和25℃/60％RH下14天之后和在40℃/75％RH下4天之后通过尺寸排阻色谱法(SEC)测试所述制剂。在25℃/60％RH和40℃/75％RH下4天之后还进行离子交换(IEX)色谱法。SEC高分子量(HMW)物质的形成主要受pH值的影响，但是总体上，所有制剂都保持高SEC单体含量。对于IEX，在25℃/60％RH下4天之后没有变化并且在40℃/75％RH下4天之后酸性物质增加而碱性物质减少。总体上，所述制剂是稳定的，如由SEC和IEX所示(表7)。

表7

NT＝未测试

实施例4：塌陷温度

通过冷冻干燥显微镜术来评价两种制剂以鉴定它们的塌陷温度。

将约0.15mL的溶液分配到玻璃池中。将所述池放置在温度受控的冷冻干燥台上。所述样品池在所述池的底部和中心处具有直接放置到材料中的2个热电偶。将液体样品以0.5℃/分钟冷却到-60℃。将台室抽空以引发升华。然后以0.5℃/分钟的平均速率使所述台升温。使用与Super WDR CCD照相机联接的能够从16倍放大到330倍的Infinivar显微镜检查样品的塌陷。

在pH 7.8下20mg/mL r-解毒剂、10mM tris、45mM L-精氨酸、6％w/v蔗糖、0.01％w/v聚山梨酸酯80的制剂表现出-26℃的塌陷温度。

在pH 7.8下40mg/mL r-解毒剂、10mM tris、45mM L-精氨酸、6％w/v蔗糖、0.01％w/v聚山梨酸酯80的制剂表现出-24℃的塌陷温度。

这两种制剂的塌陷温度是足够高的，足以用于开发冻干循环。

实施例5：冻干

使用表9中汇总的冻干循环来将表8中汇总的制剂冻干。将2.5mL的每一种制剂填充到5mL玻璃小瓶中并且部分塞住，之后开始冻干循环。

表8

表9

所有冻干制剂在外观上都是固体并且是药学上优质的。制剂1b表现出轻微塌陷，而制剂2b和制剂3b没有显示出任何塌陷。

实施例6：冻干制剂的稳定性

在加速稳定性上将冻干制剂在40℃/75％RH下放置长达1个月。如通过SEC、HPLC以及IEX所测定的稳定性结果分别示于下表10、表11、以及表12中。所述制剂在40℃保持稳定长达1个月。

表10

表11

表12

实施例7：r-解毒剂溶解度

研究在各种pH值和各种浓度的赋形剂下r-解毒剂的溶解度。将r-解毒剂进行缓冲液交换并且浓缩成表13中详述的制剂。将溶液用0.45μm过滤器过滤。在室温下对所述制剂进行视觉外观、浓度、以及pH值测量。随着pH值从6.8增加到7.8，蛋白质的溶解度增加。对于含有25mM至100mM的L-精氨酸盐酸盐的制剂，所获得的浓度在114mg/mL至151mg/mL的范围内。溶液是澄清的，这表明蛋白质可以被浓缩得更高，并且没有达到溶解度极限。在添加L-精氨酸盐酸盐的情况下，pH值对溶解度的影响减小。基于这些结果，可以在更高的pH值下或通过添加L-精氨酸盐酸盐来实现高浓度的r-解毒剂的制剂。基于实施例2b，更高蛋白质浓度的制剂降低了Tg'，这允许更有效的冻干循环以制造冻干的蛋白质溶液。

表13

*Conc.＝浓度。制剂是澄清的，这表明没有达到溶解度极限。所报告的浓度值是由浓缩溶液所获得的值，但是不代表溶解度极限。

序列表

<110> 博尔托拉制药公司

<120> 因子XA解毒剂的冻干制剂

<130> 181154CN

<140> PCT/US2017/019502

<141> 2017-02-24

<150> 62/299,369

<151> 2016-02-24

<160> 9

<170> PatentIn 3.5版

<210> 1

<211> 448

<212> PRT

<213> 智人

<400> 1

Ala Asn Ser Phe Leu Glu Glu Met Lys Lys Gly His Leu Glu Arg Glu

1 5 10 15

Cys Met Glu Glu Thr Cys Ser Tyr Glu Glu Ala Arg Glu Val Phe Glu

20 25 30

Asp Ser Asp Lys Thr Asn Glu Phe Trp Asn Lys Tyr Lys Asp Gly Asp

35 40 45

Gln Cys Glu Thr Ser Pro Cys Gln Asn Gln Gly Lys Cys Lys Asp Gly

50 55 60

Leu Gly Glu Tyr Thr Cys Thr Cys Leu Glu Gly Phe Glu Gly Lys Asn

65 70 75 80

Cys Glu Leu Phe Thr Arg Lys Leu Cys Ser Leu Asp Asn Gly Asp Cys

85 90 95

Asp Gln Phe Cys His Glu Glu Gln Asn Ser Val Val Cys Ser Cys Ala

100 105 110

Arg Gly Tyr Thr Leu Ala Asp Asn Gly Lys Ala Cys Ile Pro Thr Gly

115 120 125

Pro Tyr Pro Cys Gly Lys Gln Thr Leu Glu Arg Arg Lys Arg Ser Val

130 135 140

Ala Gln Ala Thr Ser Ser Ser Gly Glu Ala Pro Asp Ser Ile Thr Trp

145 150 155 160

Lys Pro Tyr Asp Ala Ala Asp Leu Asp Pro Thr Glu Asn Pro Phe Asp

165 170 175

Leu Leu Asp Phe Asn Gln Thr Gln Pro Glu Arg Gly Asp Asn Asn Leu

180 185 190

Thr Arg Ile Val Gly Gly Gln Glu Cys Lys Asp Gly Glu Cys Pro Trp

195 200 205

Gln Ala Leu Leu Ile Asn Glu Glu Asn Glu Gly Phe Cys Gly Gly Thr

210 215 220

Ile Leu Ser Glu Phe Tyr Ile Leu Thr Ala Ala His Cys Leu Tyr Gln

225 230 235 240

Ala Lys Arg Phe Lys Val Arg Val Gly Asp Arg Asn Thr Glu Gln Glu

245 250 255

Glu Gly Gly Glu Ala Val His Glu Val Glu Val Val Ile Lys His Asn

260 265 270

Arg Phe Thr Lys Glu Thr Tyr Asp Phe Asp Ile Ala Val Leu Arg Leu

275 280 285

Lys Thr Pro Ile Thr Phe Arg Met Asn Val Ala Pro Ala Cys Leu Pro

290 295 300

Glu Arg Asp Trp Ala Glu Ser Thr Leu Met Thr Gln Lys Thr Gly Ile

305 310 315 320

Val Ser Gly Phe Gly Arg Thr His Glu Lys Gly Arg Gln Ser Thr Arg

325 330 335

Leu Lys Met Leu Glu Val Pro Tyr Val Asp Arg Asn Ser Cys Lys Leu

340 345 350

Ser Ser Ser Phe Ile Ile Thr Gln Asn Met Phe Cys Ala Gly Tyr Asp

355 360 365

Thr Lys Gln Glu Asp Ala Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Val

370 375 380

Thr Arg Phe Lys Asp Thr Tyr Phe Val Thr Gly Ile Val Ser Trp Gly

385 390 395 400

Glu Gly Cys Ala Arg Lys Gly Lys Tyr Gly Ile Tyr Thr Lys Val Thr

405 410 415

Ala Phe Leu Lys Trp Ile Asp Arg Ser Met Lys Thr Arg Gly Leu Pro

420 425 430

Lys Ala Lys Ser His Ala Pro Glu Val Ile Thr Ser Ser Pro Leu Lys

435 440 445

<210> 2

<211> 105

<212> PRT

<213> 智人

<400> 2

Ala Asn Ser Phe Leu Phe Trp Asn Lys Tyr Lys Asp Gly Asp Gln Cys

1 5 10 15

Glu Thr Ser Pro Cys Gln Asn Gln Gly Lys Cys Lys Asp Gly Leu Gly

20 25 30

Glu Tyr Thr Cys Thr Cys Leu Glu Gly Phe Glu Gly Lys Asn Cys Glu

35 40 45

Leu Phe Thr Arg Lys Leu Cys Ser Leu Asp Asn Gly Asp Cys Asp Gln

50 55 60

Phe Cys His Glu Glu Gln Asn Ser Val Val Cys Ser Cys Ala Arg Gly

65 70 75 80

Tyr Thr Leu Ala Asp Asn Gly Lys Ala Cys Ile Pro Thr Gly Pro Tyr

85 90 95

Pro Cys Gly Lys Gln Thr Leu Glu Arg

100 105

<210> 3

<211> 254

<212> PRT

<213> 智人

<400> 3

Ile Val Gly Gly Gln Glu Cys Lys Asp Gly Glu Cys Pro Trp Gln Ala

1 5 10 15

Leu Leu Ile Asn Glu Glu Asn Glu Gly Phe Cys Gly Gly Thr Ile Leu

20 25 30

Ser Glu Phe Tyr Ile Leu Thr Ala Ala His Cys Leu Tyr Gln Ala Lys

35 40 45

Arg Phe Lys Val Arg Val Gly Asp Arg Asn Thr Glu Gln Glu Glu Gly

50 55 60

Gly Glu Ala Val His Glu Val Glu Val Val Ile Lys His Asn Arg Phe

65 70 75 80

Thr Lys Glu Thr Tyr Asp Phe Asp Ile Ala Val Leu Arg Leu Lys Thr

85 90 95

Pro Ile Thr Phe Arg Met Asn Val Ala Pro Ala Cys Leu Pro Glu Arg

100 105 110

Asp Trp Ala Glu Ser Thr Leu Met Thr Gln Lys Thr Gly Ile Val Ser

115 120 125

Gly Phe Gly Arg Thr His Glu Lys Gly Arg Gln Ser Thr Arg Leu Lys

130 135 140

Met Leu Glu Val Pro Tyr Val Asp Arg Asn Ser Cys Lys Leu Ser Ser

145 150 155 160

Ser Phe Ile Ile Thr Gln Asn Met Phe Cys Ala Gly Tyr Asp Thr Lys

165 170 175

Gln Glu Asp Ala Cys Gln Gly Asp Ala Gly Gly Pro His Val Thr Arg

180 185 190

Phe Lys Asp Thr Tyr Phe Val Thr Gly Ile Val Ser Trp Gly Glu Gly

195 200 205

Cys Ala Arg Lys Gly Lys Tyr Gly Ile Tyr Thr Lys Val Thr Ala Phe

210 215 220

Leu Lys Trp Ile Asp Arg Ser Met Lys Thr Arg Gly Leu Pro Lys Ala

225 230 235 240

Lys Ser His Ala Pro Glu Val Ile Thr Ser Ser Pro Leu Lys

245 250

<210> 4

<211> 11

<212> PRT

<213> 智人

<400> 4

Pro Tyr Pro Cys Gly Lys Gln Thr Leu Glu Arg

1 5 10

<210> 5

<211> 234

<212> PRT

<213> 智人

<400> 5

Ile Val Gly Gly Gln Glu Cys Lys Asp Gly Glu Cys Pro Trp Gln Ala

1 5 10 15

Leu Leu Ile Asn Glu Glu Asn Glu Gly Phe Cys Gly Gly Thr Ile Leu

20 25 30

Ser Glu Phe Tyr Ile Leu Thr Ala Ala His Cys Leu Tyr Gln Ala Lys

35 40 45

Arg Phe Lys Val Arg Val Gly Asp Arg Asn Thr Glu Gln Glu Glu Gly

50 55 60

Gly Glu Ala Val His Glu Val Glu Val Val Ile Lys His Asn Arg Phe

65 70 75 80

Thr Lys Glu Thr Tyr Asp Phe Asp Ile Ala Val Leu Arg Leu Lys Thr

85 90 95

Pro Ile Thr Phe Arg Met Asn Val Ala Pro Ala Cys Leu Pro Glu Arg

100 105 110

Asp Trp Ala Glu Ser Thr Leu Met Thr Gln Lys Thr Gly Ile Val Ser

115 120 125

Gly Phe Gly Arg Thr His Glu Lys Gly Arg Gln Ser Thr Arg Leu Lys

130 135 140

Met Leu Glu Val Pro Tyr Val Asp Arg Asn Ser Cys Lys Leu Ser Ser

145 150 155 160

Ser Phe Ile Ile Thr Gln Asn Met Phe Cys Ala Gly Tyr Asp Thr Lys

165 170 175

Gln Glu Asp Ala Cys Gln Gly Asp Ala Gly Gly Pro His Val Thr Arg

180 185 190

Phe Lys Asp Thr Tyr Phe Val Thr Gly Ile Val Ser Trp Gly Glu Gly

195 200 205

Cys Ala Arg Lys Gly Lys Tyr Gly Ile Tyr Thr Lys Val Thr Ala Phe

210 215 220

Leu Lys Trp Ile Asp Arg Ser Met Lys Thr

225 230

<210> 6

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 6

Arg Lys Arg Arg Lys Arg

1 5

<210> 7

<211> 346

<212> PRT

<213> 智人

<400> 7

Ala Asn Ser Phe Leu Phe Trp Asn Lys Tyr Lys Asp Gly Asp Gln Cys

1 5 10 15

Glu Thr Ser Pro Cys Gln Asn Gln Gly Lys Cys Lys Asp Gly Leu Gly

20 25 30

Glu Tyr Thr Cys Thr Cys Leu Glu Gly Phe Glu Gly Lys Asn Cys Glu

35 40 45

Leu Phe Thr Arg Lys Leu Cys Ser Leu Asp Asn Gly Asp Cys Asp Gln

50 55 60

Phe Cys His Glu Glu Gln Asn Ser Val Val Cys Ser Cys Ala Arg Gly

65 70 75 80

Tyr Thr Leu Ala Asp Asn Arg Lys Arg Arg Lys Arg Ile Val Gly Gly

85 90 95

Gln Glu Cys Lys Asp Gly Glu Cys Pro Trp Gln Ala Leu Leu Ile Asn

100 105 110

Glu Glu Asn Glu Gly Phe Cys Gly Gly Thr Ile Leu Ser Glu Phe Tyr

115 120 125

Ile Leu Thr Ala Ala His Cys Leu Tyr Gln Ala Lys Arg Phe Lys Val

130 135 140

Arg Val Gly Asp Arg Asn Thr Glu Gln Glu Glu Gly Gly Glu Ala Val

145 150 155 160

His Glu Val Glu Val Val Ile Lys His Asn Arg Phe Thr Lys Glu Thr

165 170 175

Tyr Asp Phe Asp Ile Ala Val Leu Arg Leu Lys Thr Pro Ile Thr Phe

180 185 190

Arg Met Asn Val Ala Pro Ala Cys Leu Pro Glu Arg Asp Trp Ala Glu

195 200 205

Ser Thr Leu Met Thr Gln Lys Thr Gly Ile Val Ser Gly Phe Gly Arg

210 215 220

Thr His Glu Lys Gly Arg Gln Ser Thr Arg Leu Lys Met Leu Glu Val

225 230 235 240

Pro Tyr Val Asp Arg Asn Ser Cys Lys Leu Ser Ser Ser Phe Ile Ile

245 250 255

Thr Gln Asn Met Phe Cys Ala Gly Tyr Asp Thr Lys Gln Glu Asp Ala

260 265 270

Cys Gln Gly Asp Ala Gly Gly Pro His Val Thr Arg Phe Lys Asp Thr

275 280 285

Tyr Phe Val Thr Gly Ile Val Ser Trp Gly Glu Gly Cys Ala Arg Lys

290 295 300

Gly Lys Tyr Gly Ile Tyr Thr Lys Val Thr Ala Phe Leu Lys Trp Ile

305 310 315 320

Asp Arg Ser Met Lys Thr Arg Gly Leu Pro Lys Ala Lys Ser His Ala

325 330 335

Pro Glu Val Ile Thr Ser Ser Pro Leu Lys

340 345

<210> 8

<211> 359

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 8

Ala Asn Ser Phe Leu Phe Trp Asn Lys Tyr Lys Asp Gly Asp Gln Cys

1 5 10 15

Glu Thr Ser Pro Cys Gln Asn Gln Gly Lys Cys Lys Asp Gly Leu Gly

20 25 30

Glu Tyr Thr Cys Thr Cys Leu Glu Gly Phe Glu Gly Lys Asn Cys Glu

35 40 45

Leu Phe Thr Arg Lys Leu Cys Ser Leu Asp Asn Gly Asp Cys Asp Gln

50 55 60

Phe Cys His Glu Glu Gln Asn Ser Val Val Cys Ser Cys Ala Arg Gly

65 70 75 80

Tyr Thr Leu Ala Asp Asn Gly Lys Ala Cys Ile Pro Thr Gly Pro Tyr

85 90 95

Pro Cys Gly Lys Gln Thr Leu Glu Arg Ile Val Gly Gly Gln Glu Cys

100 105 110

Lys Asp Gly Glu Cys Pro Trp Gln Ala Leu Leu Ile Asn Glu Glu Asn

115 120 125

Glu Gly Phe Cys Gly Gly Thr Ile Leu Ser Glu Phe Tyr Ile Leu Thr

130 135 140

Ala Ala His Cys Leu Tyr Gln Ala Lys Arg Phe Lys Val Arg Val Gly

145 150 155 160

Asp Arg Asn Thr Glu Gln Glu Glu Gly Gly Glu Ala Val His Glu Val

165 170 175

Glu Val Val Ile Lys His Asn Arg Phe Thr Lys Glu Thr Tyr Asp Phe

180 185 190

Asp Ile Ala Val Leu Arg Leu Lys Thr Pro Ile Thr Phe Arg Met Asn

195 200 205

Val Ala Pro Ala Cys Leu Pro Glu Arg Asp Trp Ala Glu Ser Thr Leu

210 215 220

Met Thr Gln Lys Thr Gly Ile Val Ser Gly Phe Gly Arg Thr His Glu

225 230 235 240

Lys Gly Arg Gln Ser Thr Arg Leu Lys Met Leu Glu Val Pro Tyr Val

245 250 255

Asp Arg Asn Ser Cys Lys Leu Ser Ser Ser Phe Ile Ile Thr Gln Asn

260 265 270

Met Phe Cys Ala Gly Tyr Asp Thr Lys Gln Glu Asp Ala Cys Gln Gly

275 280 285

Asp Ala Gly Gly Pro His Val Thr Arg Phe Lys Asp Thr Tyr Phe Val

290 295 300

Thr Gly Ile Val Ser Trp Gly Glu Gly Cys Ala Arg Lys Gly Lys Tyr

305 310 315 320

Gly Ile Tyr Thr Lys Val Thr Ala Phe Leu Lys Trp Ile Asp Arg Ser

325 330 335

Met Lys Thr Arg Gly Leu Pro Lys Ala Lys Ser His Ala Pro Glu Val

340 345 350

Ile Thr Ser Ser Pro Leu Lys

355

<210> 9

<211> 245

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 9

Pro Tyr Pro Cys Gly Lys Gln Thr Leu Glu Arg Ile Val Gly Gly Gln

1 5 10 15

Glu Cys Lys Asp Gly Glu Cys Pro Trp Gln Ala Leu Leu Ile Asn Glu

20 25 30

Glu Asn Glu Gly Phe Cys Gly Gly Thr Ile Leu Ser Glu Phe Tyr Ile

35 40 45

Leu Thr Ala Ala His Cys Leu Tyr Gln Ala Lys Arg Phe Lys Val Arg

50 55 60

Val Gly Asp Arg Asn Thr Glu Gln Glu Glu Gly Gly Glu Ala Val His

65 70 75 80

Glu Val Glu Val Val Ile Lys His Asn Arg Phe Thr Lys Glu Thr Tyr

85 90 95

Asp Phe Asp Ile Ala Val Leu Arg Leu Lys Thr Pro Ile Thr Phe Arg

100 105 110

Met Asn Val Ala Pro Ala Cys Leu Pro Glu Arg Asp Trp Ala Glu Ser

115 120 125

Thr Leu Met Thr Gln Lys Thr Gly Ile Val Ser Gly Phe Gly Arg Thr

130 135 140

His Glu Lys Gly Arg Gln Ser Thr Arg Leu Lys Met Leu Glu Val Pro

145 150 155 160

Tyr Val Asp Arg Asn Ser Cys Lys Leu Ser Ser Ser Phe Ile Ile Thr

165 170 175

Gln Asn Met Phe Cys Ala Gly Tyr Asp Thr Lys Gln Glu Asp Ala Cys

180 185 190

Gln Gly Asp Ala Gly Gly Pro His Val Thr Arg Phe Lys Asp Thr Tyr

195 200 205

Phe Val Thr Gly Ile Val Ser Trp Gly Glu Gly Cys Ala Arg Lys Gly

210 215 220

Lys Tyr Gly Ile Tyr Thr Lys Val Thr Ala Phe Leu Lys Trp Ile Asp

225 230 235 240

Arg Ser Met Lys Thr

245

Claims (15)

1.一种冻干组合物，所述冻干组合物能够通过将水性制剂冻干而获得，其中：

所述水性制剂包含稳定剂、25 mM至110 mM的精氨酸、以及20 mg/mL至40 mg/mL的双链多肽，所述双链多肽的氨基酸序列为SEQ ID NO. 8或SEQ ID NO. 9，其中所述多肽不能组装成凝血酶原酶复合物；

所述水性制剂具有7.5至8的pH值；

所述稳定剂为5.5%至7.5%的蔗糖(w/v)；并且

所述稳定剂与所述多肽的摩尔比是至少100。

2.如权利要求1所述的组合物，其中所述水性制剂包含40 mM至50 mM的精氨酸、5.5%至7.5%的蔗糖(w/v)、以及20 mg/mL的所述多肽。

3.如权利要求1所述的组合物，其中所述水性制剂包含90 mM至110 mM的精氨酸、5.5%至7.5%的蔗糖(w/v)、以及30 mg/mL至40 mg/mL的所述多肽。

4.如权利要求1所述的组合物，其中所述水性制剂不包含甘露糖醇。

5.如权利要求1所述的组合物，其中所述水性制剂不包含甘露糖醇并且包含40 mg/mL的所述多肽。

6.如权利要求1所述的组合物，其中所述多肽包含被修饰为与天然氨基酸不同的氨基酸残基。

7.如权利要求1所述的组合物，其中所述SEQ ID NO. 8的残基Asp29在Asp29处被修饰成(3R)-3-羟基Asp。

8.如权利要求1-7中任一项所述的组合物，其中所述多肽包含至少一个链内二硫键。

9.如权利要求1-7中任一项所述的组合物，其中所述水性制剂还包含表面活性剂和缓冲剂。

10.一种冻干组合物，所述冻干组合物能够通过将水性制剂冻干而获得，其中：

所述水性制剂包含45 mM的精氨酸、6%的蔗糖(w/v)、0%的甘露糖醇、以及20 mg/mL的双链多肽，所述双链多肽的氨基酸序列为SEQ ID NO. 8或SEQ ID NO. 9，其中所述多肽不能组装成凝血酶原酶复合物；并且

所述水性制剂具有7.8的pH值。

11.一种冻干组合物，所述冻干组合物能够通过将水性制剂冻干而获得，其中：

所述水性制剂包含100 mM的精氨酸、6%的蔗糖(w/v)、0%的甘露糖醇、以及40 mg/mL的双链多肽，所述双链多肽的氨基酸序列为SEQ ID NO. 8或SEQ ID NO. 9，其中所述多肽不能组装成凝血酶原酶复合物；并且

所述水性制剂具有7.8的pH值。

12.如权利要求11所述的组合物，其中与野生型fXa蛋白质相比，所述双链多肽具有对Gla结构域和活性位点的修饰，能够结合fXa抑制剂，但是不组装成凝血酶原酶复合物。

13.如权利要求10-12中任一项所述的组合物，其中所述水性制剂还包含表面活性剂和缓冲剂。

14.通过将如权利要求1-13中任一项所述的组合物溶解在水性溶剂中所制备的溶液在制备用于在接受用因子Xa抑制剂进行的抗凝治疗的受试者中减少出血的药物中的应用。

15.如权利要求14所述的应用，其中所述因子Xa抑制剂是阿哌沙班、利伐沙班或贝曲西班。