ES2607935T3 - Antídotos para inhibidores del factor Xa y procedimientos de uso de los mismos - Google Patents
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Abstract
Un polipéptido aislado que comprende (A) (i) la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 12 o 13 que comprende adicionalmente una modificación en el bucle de autolisis de la cadena pesada de la SEQ ID NO. 12 o 13 o (ii) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 95 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO. 12 o 13, y que comprende adicionalmente una o más mutaciones seleccionadas entre el grupo que consiste en Arg366Q/A, Lys370Q/A, Arg372Q/A, Arg376Q/A, y combinaciones de los mismos; en el que el bucle de autolisis corresponde a los restos de aminoácidos 366-376 de la SEQ ID NO. 1; (B) la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO. 20 o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 95 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO. 20, en la que el polipéptido no contiene el extremo C-terminal del factor Xa de tipo silvestre después del resto de aminoácido que corresponde a Arg429 de la SEQ ID NO. 3; (C) la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO. 21 o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 95 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO. 21, en la que el polipéptido tiene Gln en el resto de aminoácido correspondiente a Arg429 de la SEQ ID NO. 3; o (D) la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO. 22 o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 95 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO. 22, en la que el polipéptido tiene Gln en el resto de aminoácido que corresponde a Arg429 de la SEQ ID NO. 3, y tiene Ala en el resto de aminoácido que corresponde a Thr443 de la SEQ ID NO. 3, en el que el polipéptido (a) tiene una actividad procoagulante reducida en comparación con el factor Xa de tipo silvestre, (b) es capaz de unirse a un inhibidor del factor Xa, y (c) no se ensambla en un complejo de protrombinasa.
Description
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DESCRIPCION
Antfdotos para inhibidores del factor Xa y procedimientos de uso de los mismos Campo de la invencion
La presente invencion se refiere al uso de derivados del factor X (fX) y el factor Xa (fXa) que tienen actividad procoagulante intrfnseca reducida o carecen de ella pero tambien son capaces de unirse a y/o neutralizar inhibidores de fXa actuando de este modo como antfdotos para anticoagulantes dirigidos a fXa.
Antecedentes de la invencion
Los anticoagulantes atienden una necesidad en el mercado en el tratamiento o la prevencion de trombosis no deseada en pacientes con una tendencia a formar coagulos de sangre, tales como, por ejemplo, aquellos pacientes que tienen trastornos de coagulacion, confinados a periodos de inmovilidad o que se estan sometiendo a cirugfas medicas. Una de las principales limitaciones de la terapia anticoagulante, sin embargo, es el riesgo de hemorragia asociado con los tratamientos, y limitaciones en la capacidad de invertir rapidamente la actividad anticoagulante en caso de sobredosis o si se requiere un procedimiento quirurgico urgente. Por lo tanto, antfdotos especfficos y eficaces para todas las formas de terapia anticoagulante son altamente deseables. Por consideraciones de seguridad, tambien es ventajoso tener un par anticoagulante-antfdoto en el desarrollo de nuevos farmacos anticoagulantes.
Los pares anticoagulante-antfdoto disponibles actualmente para sobreanticoagulacion son heparina - protamina y warfarina - vitamina K. Plasma fresco congelado y factor Vila recombinante (rfVIIa) tambien se han usado como antfdotos inespecfficos en pacientes en tratamiento con heparina de bajo peso molecular, que padecen traumatismo grave o hemorragia grave. (Lauritzen, B. y col., Blood, 2005, 607A-608A). Tambien se describen fragmentos de protamina (patente de Estados Unidos N.° 6.624.141) y pequenos peptidos sinteticos (patente de Estados Unidos N.° 6.200.955) como heparina o antfdotos de heparina de bajo peso molecular; y mutefnas de trombina (patente de Estados Unidos N.° 6.060.300) como antfdotos para inhibidores de trombina. Intermedios y derivados de protrombina se han descrito como antfdotos para hirudina y trombina sintetica (patentes de Estados Unidos N.° 5.817.309 y 6.086.871).
Una forma prometedora de terapia anticoagulante se dirige al factor Xa (fXa), y de hecho, varios inhibidores de fXa directos estan actualmente en diferentes fases de desarrollo clfnico para uso en terapia anticoagulante. Se ha aprobado un inhibidor directo de fXa, Xarelto™ (rivaraoxaban), para su uso clfnico en la Union Europea y Canda para la prevencion de la tromboembolia venosa en pacientes de cirugfa ortopedica. Muchos de estos son moleculas pequenas. Aunque estos nuevos inhibidores de fXa se muestran prometedores para el tratamiento, aun se necesitan antfdotos especfficos y eficaces. En los casos de sobreanticoagulacion o requisito de cirugfa en pacientes tratados con estos inhibidores de fXa, puede requerirse un agente para neutralizar sustancialmente el inhibidor o inhibidores de fXa administrados y restaurar la hemostasia normal.
Los agentes disponibles actualmente, tales como el factor Vila recombinante (rfVIIa), estan mecanicamente limitados y son inespecfficos para la inversion de inhibidores de fXa y, por lo tanto, opciones mejoradas para el facultativo son altamente deseables. En estudios en ser humano, rfVIIa se ha usado para invertir el efecto de inhibidores de fXa dependientes de antitrombina III indirectos, tales como fondaparinux e idraparinux (Bijsterveld, NR y col., Circulation, 2002, 106: 2550-2554; Bijsterveld, NR y col., British J. of Haematology, 2004(124): 653-658). El mecanismo de accion del factor VIIa (fVIIa) es actuar con el factor tisular para convertir el factor X (fX) presente en la circulacion sangufnea en fXa para restaurar la hemostasia normal el pacientes. Este modo de accion dicta necesariamente que la concentracion potencial mas elevada de fXa que podrfa alcanzarse para neutralizar inhibidores de fXa dirigidos al sitio activo esta limitada por la concentracion plasmatica circulante de fX. Dado que la concentracion plasmatica circulante de fX es 150 nanomolar (“nM”), la cantidad maxima de fXa producida por este modelo serfa de 150 nM. Por lo tanto, el potencial de uso de rfVIIa para invertir el efecto de inhibidores de fXa directos esta mecanicamente limitado. Las concentraciones terapeuticas descritas de inhibidores de fXa de molecula pequena tales como rivaroxaban han sido mayores (aproximadamente 600 nM, Kubitza D, y col., Eur. J. Clin. Pharmacol., 2005, 61: 873-880) que la cantidad potencial de fXa generada por rfVIIa. El uso de rfVIIa para la inversion de niveles terapeuticos o supraterapeuticos de anticoagulacion mediante inhibidor de fXa proporcionarfa, por lo tanto, niveles inadecuados de eficacia. Tal como se muestra en la figura 4, el uso de rfVIIa tiene un efecto limitado en la neutralizacion de la actividad anticoagulante de un inhibidor del factor Xa Betrixaban (descrito a continuacion). El fVIIa recombinante mostraba una actividad de antfdoto sensible a la dosis de 50 nM a 100 nM, pero el efecto se estabilizaba entre 100 nM y 200 nM, indicando que su efecto de antfdoto esta limitado por factores diferentes de su concentracion. En todas las concentraciones de rfVIIa ensayadas, Betrixaban segufa mostrando una inhibicion en respuesta a la dosis de fXa, hasta aproximadamente el 75% de inhibicion a una concentracion de 250 nM. Esta observacion es coherente con el mecanismo de accion propuesto de fVIIa. Esto tambien esta apoyado por estudios que muestran que rfVIIa no invertfa completamente el efecto inhibidor of fondaparinux sobre los parametros de generacion de trombina y activacion de protrombina. (Gerotiafas, GT, y col., Thrombosis & Haemostasis 2204(91): 531-537).
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El fXa activo exogeno no puede administrate directamente a un sujeto de una manera similar a rfVIIa. A diferencia de rfVIIa, que tiene una muy baja actividad procoagulante en ausencia de su cofactor, el factor tisular, el fXa nativo es una potente enzima y tiene un riesgo potencial de causar trombosis. Por lo tanto, el uso de rfVIIa o fXa activo como antfdoto para una terapia anticoagulante de fXa presenta desventajas.
Por lo tanto, existe una necesidad de agentes antfdoto mejorados que no causen trombosis no deseada y que sean eficaces en neutralizar sustancialmente la actividad anticoagulante de un inhibidor de fXa en caso de una sobredosis del inhibidor de fXa o en caso de que sea necesario restaurar la hemostasia normal para prevenir o detener una hemorragia.
Resumen de la invencion
Se ha descubierto ahora que la administracion de derivados modificados de protefnas de fX son utiles como antfdotos para anticoagulantes dirigidos a fXa. Los derivados modificados de protefnas de fX no compiten con fXa para ensamblarse en el complejo de protrombinasa, sino que en su lugar se unen a y/o neutralizan sustancialmente los anticoagulantes, tales como inhibidores de fXa. Los derivados utiles como antfdotos se modifican para reducir o eliminar actividades procoagulante y anticoagulante intrfnsecas, mientras conservan la capacidad de unirse a los inhibidores. Se contempla que los derivados de la invencion pueden incluir modificar el sitio activo y cambiar o eliminar todo el dominio Gla de fXa. Se contempla, ademas, que la modificacion del dominio Gla reduce o elimina el efecto anticoagulante del derivado de fX sobre la hemostasia normal, debido a que se sabe que un fXa de longitud completa modificado en el sitio activo es un anticoagulante.
Por tanto, en una realizacion, la invencion se refiere a un polipeptido aislado que comprende
(A)
(i) la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO. 12 o 13 que comprende adicionalmente una modificacion en el bucle de autolisis de la cadena pesada de la SEQ ID NO. 12 o 13 o
(ii) una secuencia de aminoacidos que tiene al menos el 95 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO. 12 o 13, y que comprende adicionalmente una o mas mutaciones seleccionadas entre el grupo que consiste en Arg366Q/A, Lys370Q/A, Arg372Q/A, Arg376Q/A, y combinaciones de los mismos;
en el que el bucle de autolisis corresponde a los restos de aminoacidos 366-376 de la SEQ ID NO. 1;
(B) la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO. 20 o una secuencia de aminoacidos que tiene al menos el 95 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO. 20, en la que el polipeptido no contiene el extremo C-terminal del factor Xa de tipo silvestre despues del resto de aminoacido que corresponde a Arg429 de la SEQ ID NO. 3;
(C) la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO. 21 o una secuencia de aminoacidos que tiene al menos el 95 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO. 21, en la que el polipeptido tiene Gln en el resto de aminoacido correspondiente a Arg429 de la SEQ ID NO. 3; o
(D) la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO. 22 o una secuencia de aminoacidos que tiene al menos el 95 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO. 22, en la que el polipeptido tiene Gln en el resto de aminoacido que corresponde a Arg429 de la SEQ ID NO. 3, y tiene Ala en el resto de aminoacido que corresponde a Thr443 de la SEQ ID NO. 3,
en el que el polipeptido (a) tiene una actividad procoagulante reducida en comparacion con el factor Xa de tipo silvestre, (b) es capaz de unirse a un inhibidor del factor Xa, y (c) no se ensambla en un complejo de protrombinasa.
Las modificaciones adicionales de la divulgacion incluyen, pero no se limitan a lo siguiente: la totalidad o parte del peptido de activacion se elimina en un extremo N de una cadena pesada; el derivado tiene una modificacion de aminoacido que impide la escision de un peptido p; se elimina un peptido p; modificacion de un dominio de tipo EGF; el derivado comprende un peptido senal; hay una mutacion en el bucle de autolisis del factor Xa de la cadena pesada; y/o el enlazador que conecta la cadena ligera al peptido de activacion esta modificado.
El derivado conserva las caracterfsticas estructurales necesarias para unirse al anticoagulante (o inhibidor de fXa) dirigido a fXa. Mediante la union del derivado, directa o indirectamente, al inhibidor, el inhibidor es sustancialmente neutralizado.
En un aspecto, la invencion proporciona una composicion de la invencion para su uso en un metodo de neutralizacion o inversion de la anticoagulacion en un sujeto sometido a tratamiento anticoagulante con un factor inhibidor de Xa que necesita cesar la anticoagulacion o que padece sangrado. El derivado tiene ya sea una actividad procoagulante reducida o ninguna. El derivado de la invencion se une selectivamente a, e inhibe, un inhibidor del factor Xa administrado de forma exogena neutralizando sustancialmente de este modo la actividad anticoagulante de un inhibidor de fXa. Este metodo contempla metodos tanto in vitro como in vivo. Se contempla adicionalmente que las composiciones de la invencion son tambien para su uso en la prevencion o la reduccion del sangrado en un sujeto sometido a terapia anticoagulante con un inhibidor del factor Xa.
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Debe entenderse que los derivados contemplados por esta invencion no son factor Vila derivado de plasma, factor Vila recombinante, plasma fresco congelado, concentrados del complejo de protrombina, o sangre completa.
Un aspecto de la presente divulgacion es el uso de derivados del factor X y composiciones que los contienen para el tratamiento de pacientes que han recibido o estan recibiendo terapia de sobreanticoagulacion con un inhibidor del factor Xa o pacientes a los que se habfa administrado previamente un inhibidor del factor Xa y que necesitan entonces hemostasia, tal como la requerida por cirugfa opcional o de urgencia. Los derivados de fX se distinguen del fX o fXa de origen natural en que tienen actividad procoagulante intrfnseca reducida o eliminada y no interferiran en la funcion fisiologica de fXa en la hemostasia, mientras siguen siendo capaces de unirse a y sustancialmente neutralizar inhibidores de fXa.
En otro aspecto, el polipeptido de la invencion se coadministra con un agente capaz de prolongar la semivida en plasma (o semivida en circulacion) del derivado del factor X. En otro aspecto mas, el antfdoto esta conjugado con un resto para prolongar su semivida en plasma.
Tambien se proporcionan composiciones farmaceuticas que contienen el polipeptido de la invencion que se une a (y/o sustancialmente neutraliza) el inhibidor del factor Xa pero no se ensambla en el complejo de protrombinasa. La composicion farmaceutica comprende opcionalmente un transportador farmaceuticamente aceptable.
En otro aspecto, esta invencion proporciona un kit que comprende un inhibidor de fX para uso anticoagulante y un polipeptido de la invencion para uso cuando se necesita neutralizacion sustancial de la actividad anticoagulante del inhibidor de fXa.
Una realizacion de la divulgacion se refiere a un polipeptido aislado que comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO. 12, 13, 15, 19, 20, 21, 22, 23, 24, o 25 o un polipeptido que tiene al menos el 80 % de homologfa a 12, 13, 15, 19, 20, 21, 22, 23, 24, o 25. Los polipeptidos incluidos la invencion incluyen tanto el polipeptido de cadena unica (es decir, antes de que el polipeptido se excrete de la celula), asf como el polipeptido de dos cadenas (es decir, despues de la escision en el enlazador despues de que se secreta de la celula).
Se contempla que los polipeptidos de las SEQ ID NO. 19-25 mejoren la expresion general del antfdoto funcional y/o reduzcan la heterogeneidad en el extremo C de la cadena pesada.
Tambien se proporciona una composicion farmaceutica que comprende un transportador y un polipeptido que se acaba de describir.
Tambien se proporciona un polinucleotido que codifica un polipeptido que se acaba de describir.
En el presente documento se proporciona, ademas, un conjugado peptfdico que comprende un transportador enlazado covalente o no covalentemente a un polipeptido que se acaba de describir. El transportador puede ser un liposoma, una micela, un polfmero farmaceuticamente aceptable, o un transportador farmaceuticamente aceptable.
Esta divulgacion tambien se refiere a un anticuerpo que se une a un polipeptido que se acaba de describir. El anticuerpo es un anticuerpo policlonal, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo quimerico o un anticuerpo humanizado. Tambien esta proporcionado por la divulgacion un fragmento biologicamente activo del anticuerpo. El anticuerpo puede estar etiquetado de forma detectable. El anticuerpo (o fragmento de anticuerpo) tambien es proporcionado por la divulgacion como parte de una composicion que comprende ademas un transportador.
En una realizacion de la divulgacion, se proporciona un complejo anticuerpo-peptido que comprende el anticuerpo de la invencion y un polipeptido que se une especfficamente al anticuerpo. El polipeptido es el polipeptido contra el que se genera el anticuerpo. El anticuerpo puede ser un anticuerpo policlonal, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo quimerico o un anticuerpo humanizado.
En otra realizacion, se proporciona un procedimiento para preparar un polipeptido de la invencion que comprende expresar un polinucleotido que codifica el polipeptido en una celula huesped procariota o eucariota. En una realizacion, la celula huesped es una celula eucariota y en particular es una celula de ovario de hamster chino. En otra realizacion, el polipeptido esta aislado.
En otra realizacion mas de la divulgacion, se proporciona una celula huesped procariota o eucariota aislada que comprende un polinucleotido que codifica el polipeptido de la invencion. En una realizacion de la divulgacion, la celula huesped esta en una composicion que comprende ademas un transportador.
En aun otra realizacion mas de la divulgacion, se proporciona un procedimiento de prevencion o reduccion de hemorragia en un sujeto sometido a terapia anticoagulante con un inhibidor del factor Xa que comprende administrar al sujeto una cantidad efectiva de una composicion que comprende un polipeptido de la invencion y un transportador. Se proporciona, ademas, la composicion de la invencion para uso en un procedimiento de union selectivamente e inhibicion de un inhibidor del factor Xa administrado de forma exogena en un sujeto sometido a
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terapia anticoagulante que comprende administrar al sujeto una cantidad efectiva de una composicion recien
descrita.
Breve descripcion de los dibujos
La figura 1 muestra esquematicamente la estructura del dominio del factor X humano (SEQ ID NO. 1) mostrada en la tabla 1 tal como se describe en Leytus y col., Biochem., 1986, 25, 5098-5102. La SEQ ID NO. 1 es la secuencia de aminoacidos de fX humano codificada por la secuencia de nucleotidos de fX humano (SEQ ID NO. 2) tal como se muestra en la tabla 2 conocida en la tecnica anterior. Por ejemplo, la secuencia de aminoacidos traducida se describe en Leytus y col., Biochem., 1986, 25, 5098-5102 y puede encontrarse en el GenBank, “NM_000504” en <
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi?db=nuccore&id=89142731>. La numeracion de aminoacidos en esta secuencia se basa en la secuencia de fX. El precursor de fX humano (SEQ ID NO. 1) contiene una secuencia prepro-lfder (aminoacidos 1 a 40 de la SEQ ID NO. 1) seguida por secuencias correspondientes a la cadena ligera de fX (LC) (aminoacidos 41 a 179 de la SEQ ID NO. 1), el triplete RKR (aminoacidos 180 a 182 de la SEQ ID NO. 1) que se elimina durante la secrecion de fX, y la cadena pesada de fX (aminoacidos 183 a 488 de la SEQ ID NO. 1) que contiene el peptido de activacion (AP) (aminoacidos 183 a 234 de la SEQ ID NO. 1) y el dominio catalftico (aminoacidos 235 a 488 de la SEQ ID nO. 1).
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi?db=nuccore&id=89142731>. La numeracion de aminoacidos en esta secuencia se basa en la secuencia de fX. El precursor de fX humano (SEQ ID NO. 1) contiene una secuencia prepro-lfder (aminoacidos 1 a 40 de la SEQ ID NO. 1) seguida por secuencias correspondientes a la cadena ligera de fX (LC) (aminoacidos 41 a 179 de la SEQ ID NO. 1), el triplete RKR (aminoacidos 180 a 182 de la SEQ ID NO. 1) que se elimina durante la secrecion de fX, y la cadena pesada de fX (aminoacidos 183 a 488 de la SEQ ID NO. 1) que contiene el peptido de activacion (AP) (aminoacidos 183 a 234 de la SEQ ID NO. 1) y el dominio catalftico (aminoacidos 235 a 488 de la SEQ ID nO. 1).
La figura 2 (SEQ ID NO. 3) muestra la secuencia de aminoacidos de factor X humano maduro. La numeracion de aminoacidos en esta figura se basa en la secuencia fX madura comenzando desde el extremo N de la cadena ligera de fX. El factor X circula en el plasma como una molecula bicaternaria enlazada por un puente disulfuro. La cadena ligera (LC) tiene 139 residuos de aminoacidos (aminoacidos 41 a 179 de la sEq ID No. 1) y contiene el dominio rico en acido y-carboxiglutamico (Gla) (aminoacidos 1-45 de la SEQ ID NO. 3), incluyendo un corto apilamiento aromatico (AS) (aminoacidos 40-45 de la SEQ ID NO. 3), seguido por dos dominios similares al factor de crecimiento epidermico (EGF) (EGF1: aminoacidos 46-84, EGF2: aminoacidos 85-128 de la SEQ ID NO. 3). La cadena pesada (HC) tiene 306 aminoacidos y contiene un peptido de activacion de 52 aminoacidos (AP: aminoacidos 143-194 de la SEQ ID NO. 3) seguido por el dominio catalftico (aminoacidos 195-448 de la SEQ ID NO. 3). Los equivalentes de trfada catalftica a H57-D102-S195 en numeracion de quimotripsina estan ubicados en His236, Asp282 y Ser379 en la secuencia fX y estan subrayados (aminoacidos 236, 282 y 379 de la SEQ ID NO. 3).
La figura 3 muestra esquematicamente la estructura del dominio de factor X humano maduro mostrada en la figura 2. La numeracion de aminoacidos en esta figura se basa en la secuencia de fX maduro. Los sitios de escision para digestion con quimotripsina para eliminar el fragmento que contiene el dominio Gla (aminoacidos 144 de la SEQ ID NO. 3) y activacion de fX para eliminar el peptido de activacion estan resaltados. La digestion con quimotripsina de fXa da como resultado un fXa sin dominio Gla que carece de los residuos de aminoacidos 1-44 (SEQ ID NO. 4).
La figura 4 muestra el efecto de concentraciones variables de rfVIIa (denominado VIIa en la figura) en presencia de factor tisular (FT) sobre la actividad anticoagulante de un inhibidor de fXa Betrixaban (descrito a continuacion) en un ensayo de generacion de trombina (expresada como unidades de fluorescencia relativa (RFU) tal como se describe en el ejemplo 2). Los datos muestran que una combinacion de rfVIIa y factor tisular fue incapaz de neutralizar completamente la actividad anticoagulante de un inhibidor de fXa, Betrixaban, en concentraciones hasta 200 nM de rVIIa.
La figura 5 muestra que anhidro-fXa con su dominio Gla intacto invierte la inhibicion de fXa por Betrixaban en un sistema purificado que comprende fXa activo y Betrixaban (cfrculo abierto), mientras que anhidro-fXa en solitario tiene actividad procoagulante despreciable (triangulo abierto) en comparacion con fXa activo. La actividad cromogena de FXa se normalizo respecto a fXa activa en ausencia de cualquier inhibidor (cuadrado abierto). Esto se describe mas exhaustivamente en el ejemplo 4. Los datos muestran que anhidro-fXa es inactivo hacia sustrato fXa aunque conserva la afinidad de union al inhibidor de fXa.
La figura 6 muestra que el anhidro-fXa con dominio Gla intacto en la figura 5 es un potente inhibidor en ensayo de generacion de trombina en plasma (expresada como unidades de fluorescencia relativa (RFU)) (tal como se describe en el ejemplo 2). Este inhibfa casi completamente la generacion de trombina a aproximadamente 115 nM. Los datos muestran que anhidro-fXa sin modificacion del dominio Gla no es adecuado para uso como un antfdoto para el inhibidor de fXa.
La figura 7 muestra la comparacion de la actividad de coagulacion de fXa activo en un formato de placa de 96 pocillos antes de la digestion con quimotripsina, y despues de 15 minutos y 30 minutos de digestion con quimotripsina. Tal como se muestra en esta figura, el tiempo de coagulacion (cambio de DO405) se retraso significativamente despues de que el fXa se hubiera digerido por quimotripsina durante 15 minutos y no se observo coagulacion durante hasta 20 minutos cuando el fXa se digirio durante 30 minutos. Este resultado se uso tambien para establecer condiciones para digestion con quimotripsina de anhidro-fXa dado que no tienen ninguna actividad que pueda ser monitorizada durante la digestion. Esto se describe mas exhaustivamente en el ejemplo 3.
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La figura 8 muestra la afinidad de union de des-Gla anhidro-fXa por un inhibidor del factor Xa Betrixaban tal como se describe en el ejemplo 4. Los datos muestran que des-Gla anhidro-fXa, preparado mediante digestion quimotrfptica de anhidro-fXa para eliminar el fragmento que contiene el dominio Gla (residuos 1-44), es capaz de unirse a Betrixaban con afinidad similar a fXa nativo (fXa: Ki=0,12 nM, des-Gla anhidro-fXa: Kd=0,32 nM).
La figura 9 muestra la inversion de la actividad anticoagulante de concentraciones variables de Betrixaban mediante la adicion de un concentrado de 680 nM del antfdoto (des-Gla anhidro-fXa) en un ensayo de generacion de trombina del ejemplo 2. A la concentracion de 680 nM, des-Gla anhidro-fXa fue capaz de producir restauracion sustancialmente completa de actividad de fXa.
La figura 10 muestra la inversion de la actividad anticoagulante de 250 nM de Betrixaban mediante concentraciones variables del antfdoto (des-Gla anhidro-fXa) en ensayos de prolongacion de la coagulacion usando reactivo de aPTT en un formato de placa de 96 pocillos (tal como se describe en el ejemplo 3). Los datos muestran que el tiempo de coagulacion era comparable al del plasma pobre en plaquetas (PPP) de control cuando se usaron aproximadamente 608 nM del antfdoto para neutralizar 250 nM del inhibidor de fXa Betrixaban.
La figura 11 muestra el efecto sobre la actividad anticoagulante de enoxaparina (0,3125 - 1,25 U/ml) mediante 563 nM del antfdoto (des-Gla anhidro-fXa) en ensayos de prolongacion de la coagulacion usando un reactivo de aPTT en un formato de placa de 96 pocillos, expresado como cambios en veces despues de la normalizacion. El protocolo de ensayo se describe en el ejemplo 3. Los datos muestran que la adicion de 563 nM del antfdoto neutralizaba significativamente la actividad de una heparina de bajo peso molecular, enoxaparina.
La figura 12 muestra el efecto del antfdoto, des-Gla anhidro-fXa, sobre la actividad de trombina (5 nM) y su inhibicion por 50 nM de argatroban, un inhibidor de trombina especffico, en un ensayo cromogeno. El antfdoto del inhibidor de fXa no afecta de forma detectable a la actividad trombina o su inhibicion por el inhibidor especffico argatroban a concentraciones hasta 538 nM. Esto se describe mas exhaustivamente en el ejemplo 14.
La figura 13 muestra el efecto sobre la actividad anticoagulante de Betrixaban 400 nM mediante concentraciones variables del antfdoto, des-Gla anhidro-fXa, en un ensayo aPTT usando un temporizador de coagulacion estandar. El protocolo de ensayo se describe en el ejemplo 3. Los datos muestran que el antfdoto del inhibidor de fXa sustancialmente invierte la inhibicion de fXa por 400 nM de Betrixaban. Se estimo que la CE50 del antfdoto era de aproximadamente 656 nM con Betrixaban 400 nM.
La figura 14 muestra el mapa de la construccion de ADN para la expresion del mutante triple de fXa (SEQ ID NO. 12) en celulas CHO. ADN plasmfdico se linealizo y se transfecto en celulas CHO dhfr(-). Las celulas se seleccionaron usando medios deficientes en tetrahidrofolato (HT) mas metotrexato (MTX). Se cribaron clones estables para expresion de protefnas elevada mediante ELISA. El mutante triple de fXa se produjo en medio libre de suero y se purifico mediante combinacion de columnas de intercambio ionico y afinidad. La numeracion en el mapa se basaba en la secuencia de polinucleotidos que codifica fX humano, SEQ ID NO.1. Por ejemplo, una mutacion de alanina en el sitio activo S419 (SEQ ID nO.1) es equivalente a la mutacion en S379 (SEQ ID NO.3) de fX humano maduro descrita en toda la solicitud y mas particularmente, en el ejemplo 7. Los cebadores utilizados para construir el polipeptido que codifica el mutante triple r-Antfdoto se enumeran en la Tabla 28.
La figura 15A muestra una transferencia de Western de r-Antfdoto purificado mediante intercambio ionico y purificacion por afinidad. Tras la reduccion del puente disulfuro que conecta las cadenas ligera y pesada, la cadena pesada de r-antfdoto migra a un peso molecular esperado similar al del fXa derivado de plasma. La delecion de 6-39 aa en el dominio Gla de fXa mutante da como resultado una banda de peso molecular mas bajo de la cadena ligera de r-antfdoto en comparacion con FXa normal. La figura 15B y la figura 15C muestran un SD- PAGE y una transferencia de Western del mutante triple r-Antfdoto purificado mediante intercambio ionico y purificacion por afinidad seguidos de cromatograffa de exclusion por tamano.
La figura 16 muestra el nivel en plasma de Betrixaban en ratones (n=7-10 por grupo) despues de administracion oral de Betrixaban en solitario (15 mg/kg), o Betrixaban (15 mg/kg) seguido por inyeccion intravenosa (300 pg, IV) de antfdoto derivado de plasma (pd-antfdoto) preparado de acuerdo con el ejemplo 1. El pd-antfdoto se administro 5 minutos antes del punto temporal de 1,5 h, y muestras de sangre de raton (0,5 ml) se extrajeron a 1,5, 2,0 y 4,0 h despues de administracion oral de Betrixaban. Los niveles en plasma de INR en sangre completa, Betrixaban y antfdoto se analizaron. El nivel de Betrixaban (Media±SEM) en plasma de raton se represento graficamente en funcion del tiempo para ratones despues de 15 mg/kg (cuadrado abierto) y 15 mg/kg seguido por inyeccion del antfdoto (cfrculo abierto). La correlacion PK-PD del grupo tratado con antfdoto en el punto temporal de 1,5 h (5 min despues de la inyeccion del antfdoto) se resumio en la tabla A. Una unica inyeccion del antfdoto dio como resultado una reduccion >50% de Betrixaban funcional basandose en mediciones de INR. Esto se describe mas exhaustivamente en el ejemplo 8.
Las figuras 17A y B muestran los resultados de un experimento en raton con r-antfdoto purificado (n=4-10 por grupo). El nivel de Betrixaban en plasma de raton (figura 17A) e INR en sangre completa (figura 17B) se compararon despues de administracion oral de Betrixaban en solitario (15 mg/kg) o Betrixaban (15 mg/kg)
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seguido por inyeccion intravenosa (300 pg) de r-antfdoto. Se indicaron valores medios para cada grupo tratado. Tal como se resume en la tabla B, una unica inyeccion IV del r-antfdoto dio como resultado >50% de correccion de IRN en sangre completa ex vivo, justificando la neutralizacion eficaz de inhibidores de fXa por el antfdoto mediante una sola o multiples inyecciones u otros regfmenes. Estos resultados demuestran que las variantes de fXa de esta invencion tienen potencial de actuar como antfdotos universales para invertir el efecto anticoagulante de inhibidores de fXa en pacientes con hemorragia u otras urgencias medicas. Esto se describe mas exhaustivamente en el ejemplo 8.
La figura 18 muestra la inversion con r-antfdoto del efecto inhibidor de enoxaparina en un ensayo de coagulacion por cambio de turbidez de 96 pocillos. Los resultados son esencialmente similares a pd-antfdoto (figura 11) lo que indica que ambos derivados de fXa tienen actividad de antfdoto funcional comparable. r-antfdoto 50 nM sustancialmente corregfa (>75%) el efecto inhibidor de 1,25 U/ml de enoxaparina. El protocolo de ensayo se presenta en el ejemplo 11.
La figura 19 muestra la inversion con r-antfdoto del efecto inhibidor de heparina de bajo peso molecular (LMWH) como se ensaya en un ensayo de coagulacion en plasma humano. Ambas figuras 18 y 19 se describen en el ejemplo 11.
La figura 20 muestra la inversion con r-antfdoto del efecto anticoagulacion de rivaroxaban. Esto se describe mas exhaustivamente en el ejemplo 12.
La figura 21 muestra el alineamiento de la secuencia de polinucleotidos y la secuencia de polipeptidos traducida de r-antfdoto.
Las figuras 22A y B muestran los resultados de un experimento en raton con una unica inyeccion IV (1 inyeccion) o dos inyecciones (2 inyecciones) del r-antfdoto (n=5 por grupo, 312 ug/200 ul de r-antfdoto). El nivel de Betrixaban en plasma (figura 22A) se comparo despues de la administracion oral de Betrixaban (15 mg/kg) seguida por inyeccion intravenosa de vehfculo o r-antfdoto (vease el ejemplo 8 para detalles). Tal como se muestra en la figura 22A, una unica inyeccion IV de r-antfdoto incrementaba el nivel de Betrixaban en plasma en mas de 8 veces en comparacion con control con vehfculo (control_1), indicando la capacidad del antfdoto para unir eficazmente Betrixaban in vivo. Una segunda inyeccion del antfdoto incrementaba adicionalmente el nivel de Betrixaban en menos de 2 veces en comparacion con la unica inyeccion, indicando cantidad limitante de Betrixaban en sangre de raton y inversion de su efecto anticoagulante por el antfdoto. La figura 22B demuestra que la INR medida disminuye a medida que la relacion de antfdoto/Betrixaban se incrementa en plasma de raton despues de inyecciones individuales y dobles del antfdoto.
La figura 23 muestra el perfil de concentracion plasmatica-tiempo del r-antfdoto en ratas Sprague-Dawley basado en los datos recogidos en el Ejemplo 15.
La figura 24 muestra el perfil de concentracion plasmatica-tiempo del r-antfdoto en macacos de la India basado en los datos recogidos en el Ejemplo 15.
Descripcion detallada de la invencion
I. Definiciones
La practica de la presente invencion empleara, a menos que se indique lo contrario, tecnicas convencionales de cultivo tisular, inmunologfa, biologfa molecular, microbiologfa, biologfa celular y ADN recombinante, que estan dentro del alcance de la tecnica. Vease, por ejemplo, Sambrook and Russell eds. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3a edicion; la serie Ausubel y col. eds. (2007) Current Protocols in Molecular Biology; la serie Methods in Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.); MacPherson y col. (1991) PCR 1: A Practical Approach (IRL Press at Oxford University Press); MacPherson y col. (1995) PCR 2: A Practical Approach; Harlow and Lane eds. (1999) Antibodies, A Laboratory Manual; Freshney (2005) Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, 5a edicion; Gait ed. (1984) Oligonucleotide Synthesis; patente de Estados Unidos N.° 4.683.195; Hames and Higgins eds. (1984) Nucleic Acid Hybridization; Anderson (1999) Nucleic Acid Hybridization; Hames and Higgins eds. (1984) Transcription and Translation; Immobilized Cells and Enzymes (IRL Press (1986)); Perbal (1984) A Practical Guide to Molecular Cloning; Miller and Calos eds. (1987) Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (Cold Spring Harbor Laboratory); Makrides ed. (2003) Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells; Mayer and Walker eds. (1987) Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology (Academic Press, Londres); Herzenberg y col. eds (1996) Weir's Handbook of Experimental Immunology; Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, 3a edicion (Cold Spring Harbor Laboratory Press (2002)).
Todas las designaciones numericas, por ejemplo, pH, temperatura, tiempo, concentracion y peso molecular, incluyendo intervalos, son aproximaciones que se modifican (+) o (-) en incrementos de 0,1. Debe entenderse,
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aunque no se afirme siempre explfcitamente, que todas las designaciones numericas vienen precedidas por el termino “aproximadamente”. Debe entenderse tambien, aunque no siempre se afirme explfcitamente, que los reactivos descritos en el presente documento son meramente ejemplares y que los equivalentes de estos se conocen en la tecnica.
Tal como se usa en la memoria descriptiva y las reivindicaciones, la forma singular “un”, “uno” y “el/la” incluyen referencias en plural a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Por ejemplo, la expresion “un transportador farmaceuticamente aceptable” incluye una pluralidad de transportadores farmaceuticamente aceptables, incluyendo mezclas de los mismos.
Tal como se usa en el presente documento, la expresion “que comprende” pretende significar que las composiciones y procedimientos incluyen los elementos citados, pero no excluyen otros. “Que consiste/n esencialmente en” cuando se usa para definir composiciones y procedimientos, significara que excluye otros elementos de cualquier importancia esencial para la combinacion para el uso pretendido. Por lo tanto, una composicion que consiste esencialmente en los elementos tal como se definen en el presente documento no excluirfa contaminantes traza procedentes del procedimiento de aislamiento and purificacion y transportadores farmaceuticamente aceptables, tales como solucion salina tamponada con fosfato, conservantes, y similares. “Que consiste/n en” significara que excluye mas de un elemento traza de otros ingredientes y etapas del procedimiento sustanciales para administrar las composiciones de esta invencion. Realizaciones definidas por cada uno de estos terminos de transicion estan dentro del alcance de esta invencion.
Un “sujeto” de diagnostico o tratamiento es una celula o un mamffero, incluyendo un ser humano. Los sujetos animales no humanos para diagnostico o tratamiento incluyen, por ejemplo, murinos, tales como ratas, ratones, caninos, tales como perros, leporidos, tales como conejos, ganado, animales para la practica deportiva, y mascotas.
El termino “proteina” y “polipeptido” se usan de forma indistinta y en su sentido mas amplio para referirse a un compuesto de dos o mas subunidades de aminoacido, analogos de aminoacidos o peptidomimeticos. Las subunidades pueden estar enlazadas mediante enlaces peptfdicos. En otra realizacion, la subunidad puede estar enlazada mediante otros enlaces, por ejemplo, ester, eter, etc. Una proteina o peptido debe contener al menos dos aminoacidos y no se establece ninguna limitacion sobre el numero maximo de aminoacidos que puede comprender una secuencia de proteina o peptido. Tal como se usa en el presente documento, el termino “aminoacido” se refiere a aminoacidos naturales y/o no naturales o sinteticos, que incluyen glicina y los isomeros opticos tanto D como L, analogos de aminoacidos y peptidomimeticos. Abreviaturas de una letra y de tres letras de los aminoacidos de origen natural se enumeran a continuacion. Un peptido de tres o mas aminoacidos se denomina habitualmente un oligopeptido si la cadena peptfdica es corta. Si la cadena peptfdica es larga, el peptido se denomina habitualmente un polipeptido o una proteina.
- 1 -letra
- 3-letras Aminoacido
- Y
- Tyr L-tirosina
- G
- Gly L-glicina
- F
- Phe L-fenilalanina
- M
- Met L-metionina
- A
- Ala L-alanina
- S
- Ser L-serina
- I
- Ile L-isoleucina
- L
- Leu L-leucina
- T
- Thr L-treonina
- V
- Val L-valina
- P
- Pro L-prolina
- K
- Lys L-lisina
- H
- His L-histidina
- Q
- Gln L-glutamina
- E
- Glu Acido L-glutamico
- W
- Trp L-triptofano
- R
- Arg L-arginina
- D
- Asp Acido L-aspartico
- N
- Asn L-asparagina
- C
- Cys L-cistefna
“Factor Xa” o “fXa” o “proteina fXa” se refiere a una serina proteasa en la ruta de coagulacion sangufnea, que es producida a partir del factor X inactivo (fX). El factor Xa es activado por el factor IXa con su cofactor, el factor Villa, en un complejo conocido como Xasa intrfnseca, o factor Vila con su cofactor, el factor tisular, en un complejo conocido como Xasa extrfnseca. fXa forma un complejo protrombinasa unido a la membrana con el factor Va y es el componente activo en el complejo de protrombinasa que cataliza la conversion de protrombina en trombina. La trombina es la enzima que cataliza la conversion de fibrinogeno en fibrina, que, en ultima instancia, causa la
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formacion del coagulo sangufneo. Por lo tanto, la actividad biologica de fXa se denomina algunas veces “actividad procoagulante” en el presente documento.
El factor Xa es una molecula de dos cadenas unidas por un enlace disulfuro entre las dos cadenas. La cadena pesada contiene la serina proteasa, el sitio activo similar a la tripsina y el peptido de activacion N-terminal que esta glucosilado. La cadena pesada tiene al menos tres formas, a, p, y y, que difieren debido a la escision de un peptido C-terminal en la cadena pesada (Aronson, D. L. y col.. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 137(4):1262-1266 (1971); Mertens, K. y col.., Biochem J. 185:647-658 (1980)). Esto se analiza adicionalmente en las secciones que describen los derivados de fX y fXa.
La secuencia de nucleotidos que codifica el factor X humano (“fX”) puede encontrarse en el GenBank, “NM_000504” en <
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi?db=nuccore&id=89142731>, y se enumera en la SEQ ID NO. 2. La secuencia de aminoacidos y la estructura del dominio correspondientes de fX se describen en Leytus y col., Biochemistry, 1986, 25: 5098-5102. La estructura del dominio de fX maduro tambien se describe en Venkateswarlu, D. y col., Biophysical Journal, 2002, 82: 1190-1206. Tras la escision catalftica de los primeros 52 residuos (aminoacidos 143 a 194 de la SEQ ID NO. 3) de la cadena pesada, fX es activado a fXa (SEQ ID NO. 6). FXa contiene una cadena ligera (mostrada en la SEQ ID NO. 8 con postraduccion de restos de acido glutamico a acido camma-carboxiglutamico) y una cadena pesada (SEQ ID NO. 9). Los primeros 45 residuos de aminoacido (residuos 1-45 de la SEQ ID NO. 6) de la cadena ligera se denomina el dominio Gla porque contiene 11 residuos de acido y- carboxiglutamico modificados de forma posttraduccional (Gla). Tambien contiene una corta secuencia de apilamiento aromatico (6 residuos de aminoacido) (residuos 40-45 de la SEQ ID NO. 6). La digestion con quimotripsina elimina selectivamente los 1-44 residuos dando como resultado fXa sin dominio Gla (SEQ ID NO. 4). El dominio catalftico de serina proteasa de fXa se ubica en la cadena pesada C-terminal. La cadena pesada de fXa es altamente homologa con otras serina proteasas tales como trombina, tripsina, y protefna C activada.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi?db=nuccore&id=89142731>, y se enumera en la SEQ ID NO. 2. La secuencia de aminoacidos y la estructura del dominio correspondientes de fX se describen en Leytus y col., Biochemistry, 1986, 25: 5098-5102. La estructura del dominio de fX maduro tambien se describe en Venkateswarlu, D. y col., Biophysical Journal, 2002, 82: 1190-1206. Tras la escision catalftica de los primeros 52 residuos (aminoacidos 143 a 194 de la SEQ ID NO. 3) de la cadena pesada, fX es activado a fXa (SEQ ID NO. 6). FXa contiene una cadena ligera (mostrada en la SEQ ID NO. 8 con postraduccion de restos de acido glutamico a acido camma-carboxiglutamico) y una cadena pesada (SEQ ID NO. 9). Los primeros 45 residuos de aminoacido (residuos 1-45 de la SEQ ID NO. 6) de la cadena ligera se denomina el dominio Gla porque contiene 11 residuos de acido y- carboxiglutamico modificados de forma posttraduccional (Gla). Tambien contiene una corta secuencia de apilamiento aromatico (6 residuos de aminoacido) (residuos 40-45 de la SEQ ID NO. 6). La digestion con quimotripsina elimina selectivamente los 1-44 residuos dando como resultado fXa sin dominio Gla (SEQ ID NO. 4). El dominio catalftico de serina proteasa de fXa se ubica en la cadena pesada C-terminal. La cadena pesada de fXa es altamente homologa con otras serina proteasas tales como trombina, tripsina, y protefna C activada.
La estructura del dominio de factor X maduro puede encontrarse en Venkateswarlu D. y col., Biophysical J., 2002, 82, 1190-1206. La numeracion de aminoacidos en esta figura es la misma que en la figura 3. El tripeptido de Arg140- Lys141-Arg142 (el triplete RKR tal como se muestra en la figura 1) que conecta la cadena ligera con el peptido de activacion no se muestra, dado que la forma que carece del tripeptido es predominante en el plasma sangufneo en circulacion. Dominios individuales se muestran en cuadros. Esto incluye los aminoacidos 1-45 en la figura 2 (SEQ ID NO. 3). Residuos catalfticos funcionalmente importantes estan rodeados por un cfrculo, y “y” representa el residuo Gla (acido y-carboxiglutamico).
“fXa nativo" o “fXa de tipo silvestre” se refiere al fXa presente de forma natural en plasma o que esta aislado en su forma original, sin modificar, que procesa la actividad biologica de activar protrombina promoviendo, por lo tanto, la formacion del coagulo sangufneo. La expresion incluye polipeptidos de origen natural aislados a partir de muestras de tejido, asf como fXa producido de forma recombinante. “fXa activo” se refiere a fXa que tiene la actividad biologica de activar protrombina. “fXa activo” puede ser fXa nativo o fXa modificado que conserva actividad procoagulante.
"Derivados de fX" o derivados de "fXa modificado" se refieren a protefnas fX que han sido modificados de manera que se unen, ya sea directa o indirectamente, a un inhibidor del factor Xa y no se ensamblan en el complejo de protrombinasa. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, el polipeptido de la SEQ ID NO. 19. Se incluyen dentro de la definicion de derivados de fX los derivados de fXa que se analizan a continuacion. En algunas realizaciones, el derivado modificado tambien puede utilizar la expresion "Factor Xai".
“Derivados de fXa” o “fXa modificado” o “derivados de una protefna de factor Xa” se refiere a protefnas de fXa que han sido modificadas de modo que se unan, directa o indirectamente, a un inhibidor del factor Xa y no se ensamblen en el complejo de protrombinasa. Estructuralmente, los derivados se modifican para proporcionar ninguna actividad procoagulante o actividad procoagulante reducida. “Actividad procoagulante” se denomina en el presente documento como la capacidad de un agente para causar coagulacion sangufnea o formacion de coagulos. Actividad procoagulante reducida significa que la actividad procoagulante se ha reducido en al menos aproximadamente el 50%, o mas de aproximadamente el 90%, o mas de aproximadamente el 95% en comparacion con fXa de tipo silvestre durante el mismo perfodo. Por ejemplo, fX-S395A recombinante esencialmente no tiene ninguna actividad procoagulante, segun lo medido mediante ensayos in vitro, tales como ensayos de actividad de fXa.
Los derivados tienen sitios activos modificados y un dominio Gla modificado. Modificaciones adicionales tambien son contempladas. Se contempla que dichas modificaciones pueden realizarse de una o mas de las siguientes maneras: delecion de uno o mas de los aminoacidos de la secuencia, sustitucion de uno o mas residuos de aminoacidos con uno o mas residuos de aminoacidos diferentes, y/o manipulacion de una o mas cadenas laterales de aminoacido o sus extremos “C” o “N”.
La expresion “sitio activo” se refiere a la parte de una enzima o anticuerpo donde se produce una reaccion qufmica. Un “sitio activo modificado” es un sitio activo que ha sido modificado estructuralmente para proporcionar al sitio activo reactividad o especificidad qufmica incrementada o reducida. Se contempla que el sitio activo incluya no solo el sitio real sino tambien un dominio que contiene el sitio activo. Ejemplos de sitios activos incluyen, aunque sin
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limitarse a, el dominio catalftico de factor X humano que comprende los 235-488 residuos de aminoacido (figura 1), y el dominio catalftico de factor Xa humano que comprende los 195-488 residuos de aminoacido (figuras 2 y 3). La triada catalftica equivalente a H57-D102-S195 en la numeracion de la quimotripsina se localiza en His236, Asp282, y Ser379. Ejemplos de sitio activo modificado incluyen, aunque sin limitarse a, los residuos de la triada catalftica individualmente o en combinacion. Una modificacion se refiere a un derivado de fXa que tiene un sitio activo modificado Ser379/A. Ejemplos adicionales incluyen el dominio catalftico de factor Xa humano que comprende 195448 residuos de aminoacido en la SEQ ID NO. 10, 11, 12, 13 o 15 con al menos una sustitucion de aminoacidos en la posicion Arg306, Gly310, Arg347, Lys351, Lys414 o Arg424.
Los derivados de la invencion tienen todo el dominio Gla eliminado. Los ejemplos de derivados de fXa adecuados como antfdotos en los procedimientos de esta invencion son FXa sin dominio Gla (SEQ ID NO. 20, 21 o 22). Ejemplos adicionales de los derivados de fX y fXa contemplados por esta invencion se proporcionan a continuacion.
“sin dominio Gla” o “des-Gla” se refiere a fXa o fX que no tiene un dominio Gla y abarca derivados de fXa y fX que portan otras modificaciones ademas de la eliminacion del dominio Gla. Los ejemplos de FXa sin dominio Gla incluyen, aunque sin limitarse a, derivado de fXa que carece de los 1-39 residuos de aminoacido de la SEQ ID NO. 3; derivado de fXa que carece de los 6-39 residuos de aminoacido de la SEQ ID NO. 3, correspondientes a un mutante de fXa expresado en celulas CHO descrito con mas detalle a continuacion (SEQ ID NO. 12, tabla 12); derivado de fXa que carece de los 1-44 residuos de aminoacido de la SEQ ID NO. 3, correspondientes a des-Gla fXa despues de digestion quimotrfptica de fXa humano (SEQ ID NO. 4, figura 3); y derivado de fXa que carece de todos los residuos 1-45 del dominio Gla de la SEQ ID NO. 3 tal como se describe en Padmanabhan y col., Journal Mol. Biol., 1993, 232: 947-966 (SEQ ID NO 5). Otros ejemplos incluyen des-Gla anhidro fXa (SEQ ID NO. 10, tabla 10) y des-Gla fXa-S379A (SEQ ID NO. 11, tabla 11).
En algunas realizaciones, el des-Gla fXa comprende al menos los residuos de aminoacido 40 a 448 de la SEQ ID NO. 3 o un equivalente de la misma. En alguna realizacion, el des-Gla fXa comprende al menos los residuos de aminoacido 45 a 488 (SEQ ID NO. 4) o 46 a 488 (SEQ ID NO. 5) de la SEQ ID NO. 3 o equivalentes de la misma.
En alguna realizacion, el des-Gla fXa comprende al menos los residuos de aminoacido 40 a 139 y 195 a 448 de la SEQ ID NO. 3 o equivalentes de la misma. En alguna realizacion, el des-Gla fXa comprende al menos los residuos de aminoacido 45 a 139 y 195 a 448 de la SEQ ID NO. 3 o equivalentes de la misma. En otra realizacion, el des-Gla fXa comprende al menos residuos de aminoacido 46 a 139 y 195 a 448 de la SEQ ID NO. 3 o equivalentes de la misma.
“Deficiente en Gla” se refiere a fXa o fX con numero reducido de grupos y-carboxilo de cadena lateral libre en su dominio Gla. Como FXa sin dominio Gla, FXa deficiente en Gla tambien puede portar otras modificaciones. FXa deficiente en Gla incluye fXa no carboxilado, subcarboxilado y descarboxilado. “fXa no carboxilado” o “fXa descarboxilado” se refiere a derivados de fXa que no tienen los grupos y-carboxilo de los residuos de acido y- carboxiglutamico del dominio Gla, tal como fXa que tiene todos su acido y-carboxiglutamico del dominio Gla sustituido por diferentes aminoacidos, o fXa que tiene todo su y-carboxilo de cadena lateral eliminado o enmascarado por medios tales como aminacion, esterificacion, etc. Para protefna expresada de forma recombinante, fXa no carboxilado se denomina, algunas veces, fXa sin carboxilar. “fXa subcarboxilado” se refiere a derivados de fXa que tienen un numero reducido de grupo y-carboxilo en el dominio Gla en comparacion con fXa de tipo silvestre, tal como fXa que tiene uno o mas pero no todos de sus acidos y-carboxiglutamicos del dominio Gla sustituidos por uno o mas aminoacidos diferentes, o fXa que tiene al menos uno pero no todos de sus y-carboxilos de cadena lateral eliminados o enmascarados mediante medios tales como aminacion y esterificacion, etc.
La estructura del dominio de factor Xa sin dominio Gla humano puede encontrarse en Padmanabhan y col., J. Mol. Biol., 1993, 232, 947-966. La numeracion de los aminoacidos se basa en equivalencias topologicas con quimotripsina, donde, por ejemplo, Ser195 corresponde a Ser379 en la figura 2 cuando se usa la numeracion de fX maduro humano. Las inserciones se indican con letras, y las deleciones se indican mediante 2 numeraciones sucesivas. Se anade 300 a la numeracion de cadena ligera para diferenciarla de la numeracion de cadena pesada. P363 es p-hidroxi aspartato. Las barras diagonales indican escisiones proteolfticas observadas en material cristalizado. La secuencia de FXa sin dominio Gla que carece del fX maduro basado en 1-45 residuos de aminoacido (SEQ ID NO. 3) se enumera en la SEQ ID NO. 5.
En una realizacion de la invencion, la totalidad o parte del "peptido de activacion" (PA) se elimina. Lo que se entiende por el peptido de activacion es los aminoacidos 183 a 234 de la SEQ ID NO. 1, o como alternativa, los aminoacidos 143-194 de la SEQ ID NO. 3.
En otra realizacion, se incluye un peptido senalizador en el derivado. La expresion "peptido senalizador" se refiere a un peptido senalizador del factor X (SEQ ID NO. 18), un peptido senalizador de la transferrina (residuos de aminoacidos SP1 a SP19 de la SEQ ID NO. 27), o un peptido senalizador de la protrombina (residuos de aminoacidos SP1 a SP24 de la SEQ ID NO. 26).
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En una realizacion, el derivado de fXa puede carecer de una cadena ligera de fXa pero aun contiene un dominio catalftico de serina proteasa presente en la cadena pesada. Ademas, pueden usarse quimeras con otro dominio catalftico de serina proteasa para realizar sustituciones en la cadena pesada.
Un "peptido p" se refiere a la totalidad o a una parte de la cadena pesada.
“pd-antfdoto” o “antfdoto derivado de plasma” se refiere al derivado de des-Gla anhidro fXa y tiene los residuos de aminoacido de la SEQ ID NO. 10.
“r-antfdoto” o “antfdoto recombinante” se refiere a un derivado de fXa que carece de los 6-39 residuos de aminoacido de la SEQ ID NO. 3, correspondientes a un mutante de fXa expresado en celulas CHO y despues de la eliminacion del enlazador que se describe con mas detalle a continuacion (SEQ ID NO. 13, tabla 13).
“Agentes anticoagulantes” o “anticoagulantes” son agentes que inhiben la formacion de coagulos sangufneos. Los ejemplos de agentes anticoagulantes incluyen, aunque sin limitarse a, inhibidores especfficos de trombina, factor iXa, factor Xa, factor XIa, factor Xlla o factor Vila, heparina y derivados, antagonistas de vitamina K, y anticuerpos anti-factor tisular. Los ejemplos de inhibidores especfficos de trombina incluyen hirudina, bivalirudina (Angiomax®), argatroban y lepirudina (Refludan®). Los ejemplos de heparina y derivados incluyen heparina no fraccionada (UFH), heparina de bajo peso molecular (LMWH), tal como enoxaparina (Lovenox®), dalteparina (Fragmin®), y danaparoid (Orgaran®); y pentasacarido sintetico, tales como fondaparinux (Arixtra®). Los ejemplos de antagonistas de vitamina K incluyen warfarina (Coumadin®), fenocumarol, acenocumarol (Sintrom®), clorindiona, dicumarol, difenadiona, biscoumacetato de etilo, fenprocoumon, fenindiona y tioclomarol. En una realizacion, el anticoagulante es un inhibidor del factor Xa. En una realizacion, el anticoagulante es Betrixaban.
“Terapia anticoagulante” se refiere a un regimen terapeutico que se administra a un paciente para prevenir coagulos sangufneos o trombosis no deseados. Una terapia anticoagulante comprende administrar uno o una combinacion de dos o mas agentes anticoagulantes u otros agentes a una dosificacion y calendario adecuados para tratar o prevenir los coagulos sangufneos o trombosis no deseados en el paciente.
La expresion “inhibidores del factor Xa” o “inhibidores de factor Xa” se refieren a compuestos que pueden inhibir, directa o indirectamente, la actividad del factor de coagulacion Xa de catalizar la conversion de protrombina en trombina in vitro y/o in vivo. Los ejemplos de inhibidores de fXa conocidos incluyen, sin limitacion, edoxaban, fondaparinux, idraparinux, idraparinux biotinilado, enoxaparina, fragmina, NAP-5, rNAPc2, inhibidor de la ruta del factor tisular, DX-9065a (tal como se describe en, por ejemplo, Herbert, J.M., y col., J Pharmacol Exp Ther. 1996 276(3): 1030-8), YM-60828 (tal como se describe en, por ejemplo, Taniuchi, Y., y col., Thromb Haemost. 1998 79(3): 543-8), YM-150 (tal como se describe en, por ejemplo, Eriksson, B.I. et. al, Blood 2005; 106(11), Resumen 1865), apixaban, rivaroxaban, PD-348292 (tal como se describe en, por ejemplo, Pipeline Insight: Antithrombotics - Reaching the Untreated Prophylaxis Market, 2007), otamixaban, razaxaban (DPC906), BAY 59-7939 (tal como se describe en, por ejemplo, Turpie, A.G., y col., J. Thromb. Haemost. 2005, 3(11): 2479-86), edoxaban (tal como se describe en, por ejemplo, Hylek EM, Curr Opin Invest Drugs 2007 8(9): 778-783), LY517717 (tal como se describe en, por ejemplo, Agnelli, G., y col., J. Thromb. Haemost. 2007 5(4): 746-53), GSK913893, Betrixaban (tal como se describe a continuacion) y derivados de los mismos. La heparina de bajo peso molecular (“LMWH”) tambien se considera un inhibidor del factor Xa.
En una realizacion, el inhibidor del factor Xa se selecciona de entre Betrixaban, rivaroxaban, apixaban, edoxaban, LMWH, y combinaciones de los mismos.
El termino “Betrixaban” se refiere al compuesto “[2-({4-[(dimetilamino)iminometil]fenil}carbonilamino)-5-metoxifenil]-N- (5-cloro(2-piridil))carboxamida” o sales farmaceuticamente aceptables del mismo. “[2-({4- [(dimetilamino)iminometil]fenil}carbonilamino)-5-metoxifenil]-N-(5-cloro(2-piridil))carboxamida” se refiere al compuesto que tiene la siguiente estructura:
o un tautomero o sal farmaceuticamente aceptable del mismo.
El Betrixaban se describe en las patentes de Estados Unidos N.° 6.376.515 y 6.835.739 y la publicacion de solicitud de patente de Estados Unidos N.° 2007/0112039, presentada el 7 de noviembre de 2006. Se sabe que el Betrixaban
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es un inhibidor especffico del factor Xa.
Tal como se usa en el presente documento, el termino “antfdoto” o la expresion “antfdoto para un inhibidor del factor Xa” se refiere a moleculas, tales como derivados de fXa, que pueden neutralizar o invertir sustancialmente la actividad inhibidora de la coagulacion de un inhibidor de fXa compitiendo con fXa activo para unirse con inhibidores de fXa disponibles. Los ejemplos de los antfdotos de esta invencion son derivados de fXa con union a la membrana fosfolipfdica reducida, tal como des-Gla fXa o FXa deficiente en Gla, y derivados de fXa con actividad catalftica reducida, tal como derivados de fXa con el sitio activo modificado, y derivados con interaccion reducida con fV/Va, o fVIII/fVIIIa. Los ejemplos de antfdotos de la divulgacion con union a membrana reducida y actividad catalftica reducida incluyen, aunque sin limitarse a, des-Gla anhidro-fXa mediante digestion quimotrfptica de anhidro-fXa (tal como se describe en el ejemplo 1); des-Gla fXa-S379A (S 195A en numeracion de quimotripsina) mediante mutagenesis (tal como se describe en el ejemplo 6).
Otros ejemplos de antfdotos de la divulgacion incluyen protefnas o polipeptidos que contienen dominios catalfticos de serina proteasa que poseen suficiente similitud estructural con el dominio catalftico de fXa y son, por lo tanto, capaces de unirse a inhibidores de fXa molecula pequena. Los ejemplos incluyen, aunque sin limitarse a, trombina que se une al inhibidor de fXa GSK913893 (Young R., y col., Bioorg. Med. chem. Lett. 2007, 17(10): 2927-2930); calicrefna plasmatica que se une al inhibidor de fXa apixaban (Luettgen J., y col., Blood, 2006, 108(11) resumen 4130); y tripsina (o su homologo bacteriano subtilisina) que se une al inhibidor de fXa C921-78 con afinidad subnanomolar (Kd = 500 pM) (Betz A, y col., Biochem., 1999, 38(44): 14582-14591).
En una realizacion, el derivado de la invencion se une, directa o indirectamente a un inhibidor del factor Xa. Los terminos “union”, “se une” “reconocimiento” o “reconocer”, tal como se usan en el presente documento, pretenden incluir interacciones entre moleculas que pueden detectarse usando, por ejemplo, un ensayo de hibridacion. Los terminos tambien pretenden incluir interacciones “de union” entre moleculas. Las interacciones pueden ser, por ejemplo, protefna-protefna, protefna-acido nucleico, protefna-molecula pequena o molecula pequena-acido nucleico en la naturaleza. La union puede ser “directa” o “indirecta”. Union “directa” comprende contacto ffsico directo entre moleculas. Union “indirecta” entre molecula comprende las moleculas que tienen contacto ffsico directo con una o mas moleculas intermedias simultaneamente. Por ejemplo, se contempla que derivados de la invencion se unen indirectamente y neutralizan sustancialmente heparina de bajo peso molecular y otros inhibidores de factor Xa indirectos. Esta union puede dar como resultado la formacion de un “complejo” que comprende las moleculas de interaccion. Un “complejo” se refiere a la union de dos o mas moleculas mantenidas juntas mediante enlaces, interacciones o fuerzas covalentes o no covalentes.
“Neutralizar” “invertir” o “contrarrestar” la actividad de un inhibidor de fXa o frases similares se refieren a inhibir o bloquear la funcion inhibidora del factor Xa o anticoagulante de un inhibidor de fXa. Dichas frases se refieren a inhibicion o bloqueo parcial de la funcion, asf como a inhibir o bloquear la mayorfa o todo de la actividad inhibidora de fXa, in vitro y/o in vivo. Estos terminos tambien se refieren a correcciones de al menos aproximadamente el 20 % de los marcadores farmacodinamicos o sustitutos dependientes del inhibidor de FXa. Los ejemplos de marcadores incluyen, pero no se limitan a INR, PR, aPTT, ACT, unidades anti-fXa, la generacion de trombina (Technothrombin TGA), tromboelastograffa, CAT (Trombograma automatizado calibrado) y similares.
En ciertas realizaciones, el inhibidor del factor Xa es neutralizado sustancialmente (o es corregido como se acaba de describir), lo que significa que su capacidad de inhibir el factor Xa, directa o indirectamente, se reduce en al menos aproximadamente el 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o 100%.
La expresion “union a la membrana fosfolipfdica” se refiere a la capacidad un fXa activo de unirse a la membrana fosfolipfdica cargada negativamente u otra membrana celular, tal como plaquetas, en presencia de iones Ca2+. Esta union esta medida por los residuos de acido y-carboxiglutamico en el dominio Gla de fXa.
La expresion “interaccion reducida” se refiere a la capacidad disminuida del derivado de fXa de unirse o formar un complejo con iones u otros cofactores que normalmente se unen a o complejan con fXa silvestre. Los ejemplos de dicha interaccion incluyen, aunque sin limitarse a, union de fXa con iones de Ca2+ y membrana fosfolipfdica, interaccion con fV/fVa, o fVIII/f/VIIIa, etc. Se prefiere que la interaccion de un derivado de fXa de la divulgacion con los iones u otros cofactores se reduzca al 50% de la de un fXa silvestre. Mas preferentemente, la interaccion se reduce al 10%, 1%, y 0,1% de la de un fXa de tipo silvestre. Esto se refiere a la capacidad de los derivados de “ensamblarse en el complejo de protrombinasa”.
“Actividad de union al inhibidor de fXa” se refiere a la capacidad de una molecula de unirse a un inhibidor de fXa. Un antfdoto de la presente invencion posee actividad de union al inhibidor de fXa, ya sea directa o indirectamente.
La expresion “semivida en circulacion” o “semivida en plasma” se refiere al tiempo requerido para que la concentracion plasmatica de un antfdoto que circula en el plasma se reduzca a la mitad de su concentracion inicial despues de una unica administracion o despues del cese de la infusion.
La expresion “resto conjugado” se refiere a un resto que puede anadirse a un derivado de fXa formando un enlace
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covalente con un residuo del derivado de fXa. El resto puede unirse directamente a un residuo del derivado de fXa o puede formar un enlace covalente con un enlazador que, a su vez, forma un enlace covalente con un residuo del derivado de fXa.
Tal como se usa en el presente documento, un “anticuerpo” incluye anticuerpos completes y cualquier fragmento de union al antfgeno o una cadena sencilla del mismo. Por lo tanto, el termino “anticuerpo” incluye cualquier molecula que contiene protefna o peptido que comprende al menos una parte de una molecula de inmunoglobulina. Los ejemplos de estos incluyen, aunque sin limitarse a una region determinante de la complementariedad (CDR) de una cadena pesada o ligera o una parte de union a ligando del mismo, una region variable de cadena pesada o cadena ligera, una region constante de cadena pesada o cadena ligera, una region marco (FR), o cualquier parte de las mismas, o al menos una parte de una protefna de union.
Los anticuerpos pueden ser policlonales o monoclonales y pueden estar aislados de cualquier fuente biologica adecuada, por ejemplo, murina, de rata, oveja y canina.
Una “composicion” pretende significar una combinacion de agente activo y otro compuesto o composicion, inerte (por ejemplo, un agente o etiqueta detectable) o activo, tal como un adyuvante.
Una “composicion farmaceutica” pretende incluir la combinacion de un agente activo con un transportador, inerte o activo, que hace a la composicion adecuada para uso de diagnostico o terapeutico in vitro, in vivo o ex vivo.
“Una cantidad efectiva” se refiere a la cantidad de derivado suficiente para inducir un resultado biologico y/o terapeutico deseado. Ese resultado puede ser alivio de los signos, sfntomas, o causas de una enfermedad, o cualquier otra alteracion deseada de un sistema biologico. En la presente invencion, el resultado implicate normalmente uno o mas de los siguientes: neutralizacion de un inhibidor de fXa que ha sido administrado a un paciente, inversion de la actividad anticoagulante del inhibidor de fXa, eliminacion del inhibidor de fXa del plasma, restauracion de la hemostasia, y reduccion o cese de hemorragia. La cantidad efectiva variate dependiendo del agente antfdoto especffico usado, el inhibidor de fXa especffico que ha sido administrado al sujeto, el regimen de dosificacion del inhibidor de fXa, la temporizacion de administracion del antfdoto, el estado del sujeto y la enfermedad que estan siendo tratados, el peso y la edad del sujeto, la gravedad de la patologfa, la via de administracion y similares, todos los cuales pueden ser determinados facilmente por un experto en la materia.
Se describen dosis unitarias eficaces de los antidotes descritos en el presente documento en la solicitud provisional de los Estados Unidos n.° de Serie 61/225.887, presentada el 15 de julio de 2009 y titulada "Unit Dose Formulation of Antidotes for Factor Xa Inhibitors and Methods of Using the Same". Especfficamente, se contempla que la formulacion de dosis unitaria que comprende un vehfculo farmaceuticamente aceptable y un polipeptido que comprende dos cadenas de la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO. 13 o un polipeptido que tiene al menos un 80 % de homologfa a SEQ ID NO. 13 es una cantidad desde aproximadamente 10 miligramos a aproximadamente 2 gramos o de aproximadamente 100 miligramos a aproximadamente 1,5 gramos o de aproximadamente 200 miligramos a aproximadamente 1 gramo o de aproximadamente 400 miligramos a aproximadamente 900 miligramos. Se contempla, ademas, que otros antidotes de la invencion se pueden dosificar de una manera similar.
Tal como se usan en el presente documento, los terminos “tratar” “tratamiento” y similares se usan en el presente documento para significar obtener un efecto farmacologico y/o fisiologico deseado. El efecto puede ser profilactico en terminos de prevenir completa o parcialmente un trastorno o signo o sfntoma del mismo, y/o puede ser terapeutico en terminos de una cura parcial o completa para un trastorno y/o efecto adverso atribuible al trastorno.
“Tratar” tambien cubre cualquier tratamiento de un trastorno en un mamffero, e incluye: (a) prevenir que se produzca un trastorno en un sujeto que puede estar predispuesto a un trastorno, pero al que aun puede no habersele diagnosticado que lo tiene, por ejemplo, prevenir la hemorragia en un paciente con sobredosis de anticoagulante; (b) inhibir un trastorno, es decir, detener su desarrollo, por ejemplo, inhibir la hemorragia; o (c) aliviar o mejorar el trastorno, por ejemplo, reducir la hemorragia.
Tal como se usa en el presente documento, “tratar” incluye ademas mejora sistemica de los sfntomas asociados con la patologfa y/o un retardo de la aparicion de los sfntomas. Las evidencias clfnicas y subclfnicas de “tratamiento” variaran con la patologfa, el individuo y el tratamiento. Adicionalmente, el termino "prevenir" tambien se refiere a inhibir.
La “administracion” puede efectuarse en una dosis, de forma continua o de forma intermitente durante todo el tratamiento. Procedimientos de determinacion de los medios y dosificacion de administracion mas eficaces son conocidos por los expertos en la materia y variaran con la composicion usada para terapia, el proposito de la terapia, la celula diana que esta siendo tratada, y el sujeto que esta siendo tratado. Administraciones individuales o multiples pueden llevarse a cabo con el nivel de dosis y el patron que es seleccionado por el facultativo encargado del tratamiento. En la tecnica se conocen formulaciones de dosificacion y procedimientos de administracion de los agentes.
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Los agentes y composiciones de la presente invencion pueden usarse en la fabricacion de medicamentos y para el tratamiento de seres humanos y otros animales mediante administracion de acuerdo con procedimientos convencionales, tal como un ingrediente activo en composiciones farmaceuticas.
Un agente de la presente invencion puede administrarse para terapia mediante cualquier via adecuada, especfficamente mediante administracion parenteral (incluyendo subcutanea, intramuscular, intravenosa e intradermica). Tambien se apreciara que la via preferida variara con el estado y la edad del receptor, y la enfermedad que esta siendo tratada.
Se puede determinar si se consigue el procedimiento, es decir, la inhibicion o inversion de un inhibidor del factor Xa, mediante un numero de ensayos in vitro, tales como ensayo de generacion de trombina y unidades de anti-fXa y ensayos de coagulacion clfnica tales como aPTT, PT y ACT.
El termino “aislado/a”, tal como se usa en el presente documento, con respecto a acidos nucleicos, tales como ADN o ARN, se refiere a moleculas separadas de otros ADN o ARN, respectivamente que estan presentes en la fuente natural de la macromolecula. La expresion “acido nucleico aislado” pretende incluir fragmentos de acido nucleico que no son de origen natural como fragmentos y no se encontrarfan en el estado natural. El termino “aislado/a” tambien se usa en el presente documento para referirse a polipeptidos y protefnas que estan aisladas de otras protefnas celulares y pretende abarcar polipeptidos tanto purificados como recombinantes. En otras realizaciones, el termino “asilado/a” significa separado de constituyentes, celulares y otros, en los que la celula, tejido, polinucleotido, peptido, polipeptido, protefna, anticuerpo o un fragmento o fragmentos de los mismos, que estan normalmente asociados en la naturaleza. Por ejemplo, una celula aislada es una celula que esta separada de tejido o celulas de fenotipo o genotipo distinto. Tal como es evidente para los expertos en la materia, un polinucleotido, peptido, polipeptido, protefna, anticuerpo o fragmento o fragmentos de los mismos no de origen natural, no requiere “aislamiento” para distinguirlo de su contrapartida de origen natural.
Tal como se usa en el presente documento, la expresion “equivalente del mismo/de la misma” cuando se refiere a una protefna, polipeptido o acido nucleico de referencia, pretende incluir aquellos que tienen homologfa minima mientras siguen manteniendo la funcionalidad deseada. Por ejemplo, la homologfa puede ser, al menos el 75% de homologfa y como alternativa, al menos el 80%, o como alternativa al menos el 85%, o como alternativa al menos el 90%, o como alternativa al menos el 95%, o como alternativa el 98% de porcentaje de homologfa y muestran actividad biologica sustancialmente equivalente al polipeptido o protefna de referencia. Que un polinucleotido o region de polinucleotido (o un polipeptido o region de polipeptido) tiene cierto porcentaje (por ejemplo, 80%, 85%, 90% o 95%) de “identidad de secuencia” con otra secuencia significa que, cuando se alinean, ese porcentaje de bases (o aminoacidos) son los mismos al comparar las dos secuencias. Debe observarse que, cuando solamente se usa la cadena pesada de fXa (o una serina proteasa relacionada), la homologfa global podrfa ser inferior al 75%, tal como, por ejemplo, 65% o 50% sin embargo, la funcionalidad deseada permanece. Este alineamiento y el porcentaje de homologfa o identidad de secuencia pueden determinarse usando programas de software conocidos en la tecnica, por ejemplo los descritos en CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (F.M. Ausubel y col., eds., 1987) Suplemento 30, seccion 7.7.18, Tabla 7.7.1. Preferentemente, se usan parametros por defecto para el alineamiento. Un programa de alineamiento preferido es BLAST, usando parametros por defecto. En particular, programas preferidos son BLASTN y BLASTP, usando los siguientes parametros por defecto: Codigo genetico = estandar; filtro = ninguno; cadena = ambas; lfmite = 60; esperado = 10; Matriz = BLOSUM62; Descripciones = 50 secuencias; clasificadas por = PUNTUACION ELEVADA; Bases de datos = no redundantes, GenBank + EMBL + DDBJ + PDB + GenBank CDS translations + SwissProtein + SPupdate + PIR. Detalles de estos programas pueden encontrarse en la siguiente direccion de Internet:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/cgi-bin/BLAST.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/cgi-bin/BLAST.
Los terminos “polinucleotido” y “oligonucleotido” se usan indistintamente y se refieren a una forma polimerica de nucleotidos de cualquier longitud, desoxirribonucleotidos o ribonucleotidos o analogos de los mismos. Los polinucleotidos pueden tener cualquier estructura tridimensional y pueden realizar cualquier funcion, conocida o desconocida. Los siguientes son ejemplos no limitantes de polinucleotidos: un gen o fragmento de gen (por ejemplo, una sonda, cebador, marca EST o SAGE), exones, intrones, ARN mensajero (mARN), ARN transferente, ARN ribosomico, ribozimas, cADN, plinucleotidos recombinantes, plinucleotidos ramificados, plasmidos, vectores, ADN aislado de cualquier secuencia, ARN aislado de cualquier secuencia, sondas y cebadores de acido nucleico. Un plinucleotido puede comprender nucleotidos modificados, tales como nucleotidos metilados y analogos de nucleotidos. Si estan presentes, modificaciones a la estructura de nucleotidos pueden impartirse antes o despues del ensamblaje del plinucleotido. La secuencia de nucleotidos puede interrumpirse por componentes no nucleotfdicos. Un polinucleotido puede modificarse adicionalmente despues de la polimerizacion, tal como mediante conjugacion con un componente de etiquetado. El termino tambien se refiere a moleculas tanto bi- como monocatenarias. A menos que se especifique o requiera lo contrario, cualquier realizacion de esta invencion que es un polinucleotido abarca tanto la forma bicatenaria como cada una de dos formas monocatenarias complementarias que se sabe o se ha predicho que componen la forma bicatenaria.
Un polinucleotido esta compuesto por una secuencia especffica de cuatro bases de nucleotido: adenina (A); citosina (C); guanina (G); timina (T); y uracilo (U) para timina cuando el polinucleotido es ARN. Por lo tanto, la expresion “secuencia de polinucleotido” es la representacion alfabetica de una molecula de polinucleotido. Esta representacion
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alfabetica puede introducirse en bases de datos en un ordenador que tiene una unidad central de procesamiento y usarse para aplicaciones bioinformaticas tales como genomica funcional y busqueda de homologfa.
“Homologfa” o “identidad” o “similitud” se refiere a similitud de secuencia entre dos peptidos o entre dos moleculas de acido nucleico. La homologfa puede determinarse comparando una posicion en cada secuencia que pueden ser alineadas para fines de comparacion. Cuando una posicion en la secuencia comparada esta ocupada por la misma base o aminoacido, entonces las moleculas son homologas en esa posicion. Un grado de homologfa entre secuencias esta en funcion del numero de posiciones coincidentes u homologas compartidas por las secuencias. Una secuencia “no relacionada” o “no homologa” comparte menos del 40% de identidad, o como alternativa menos del 25% de identidad, con una de las de la presente invencion.
Que un polinucleotido o region de polinucleotido (o un polipeptido o region de polipeptido) tiene cierto porcentaje (por ejemplo, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% o 99%) de “identidad de secuencia” con otra secuencia significa que, cuando estan alineadas, ese porcentaje de bases (o aminoacidos) son los mismos al comparar las dos secuencias. Este alineamiento y el porcentaje de homologfa o identidad de secuencia pueden determinarse usando programas software conocidos en la tecnica, por ejemplo los descritos en Ausubel y col. eds. (2007) Current Protocols in Molecular Biology. Preferentemente, se usan parametros por defecto pata el alineamiento. Un programa de alineamiento es BLAST, usando parametros por defecto. En particular, son programas BLASTN y BLASTP, usando los siguientes parametros por defecto: Codigo genetico = estandar; filtro = ninguno; cadena = ambas; lfmite = 60; esperado = 10; Matriz = BLOSUM62; Descripciones = 50 secuencias; clasificadas por = PUNTUACION ELEVAdA; Bases de datos = no redundantes, GenBank + EMBL + DDBJ + PDB + GenBank CDS translations + SwissProtein + SPupdate + PIR. Detalles de estos programas pueden encontrarse en la siguiente direccion de Internet:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi, ultimo acceso el 26 de noviembre de 2007. Polinucleotidos biologicamente equivalentes son aquellos que tienen el porcentaje de homologfa especificado y que codifican un polipeptido que tiene la misma o similar actividad biologica.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi, ultimo acceso el 26 de noviembre de 2007. Polinucleotidos biologicamente equivalentes son aquellos que tienen el porcentaje de homologfa especificado y que codifican un polipeptido que tiene la misma o similar actividad biologica.
La expresion “un homologo de un acido nucleico” se refiere a un acido nucleico que tiene una secuencia de nucleotidos que tiene cierto grado de homologfa con la secuencia de nucleotidos del acido nucleico o complemento del mismo. Un homologo de un acido nucleico bicatenario pretende incluir acidos nucleicos que tienen una secuencia de nucleotidos que tiene cierto grado de homologfa con el o con el complemento del mismo. En un aspecto, los homologos de acidos nucleicos son capaces de hibridar con el acido nucleico o complemento del mismo.
Un “gen” se refiere a un polinucleotido que contiene al menos un marco abierto de lectura (ORF) que es capaz de codificar un polipeptido o protefna particular despues de haber sido transcrito y traducido. Cualquiera de las secuencias de polinucleotidos o polipeptidos descritas en el presente documento puede usarse para identificar fragmentos mas grandes o secuencias codificantes de longitud completa del gen con el que estan asociados. Procedimientos de aislamiento de secuencias de fragmentos mas grandes son conocidos por los expertos en la materia.
El termino “expresar” se refiere a la produccion de un producto genico.
Tal como se usa en el presente documento, “expresion” se refiere al proceso mediante cual polinucleotidos se transcriben a mARN y/o el proceso mediante el cual el mARN transcrito esta siendo posteriormente traducido en peptidos, polipeptidos, o protefnas. Si el polinucleotido se deriva de ADN genomico, la expresion puede incluir splicing del mARN en una celula eucariota.
El termino “codificar”, tal como se aplica a polinucleotidos, se refiere a un polinucleotido que se dice que “codifica” un polipeptido si, en su estado nativo o cuando se manipula mediante procedimientos bien conocidos por los expertos en la materia, puede transcribirse y/o traducirse para producir el mARN para el polipeptido y/o un fragmento del mismo. La cadena antisentido es el complemento de dicho acido nucleico, y la secuencia codificante puede deducirse a partir de ella.
Un “conjugado peptfdico” se refiere a la asociacion mediante union por enlace covalente o no covalente de uno o mas polipeptidos y otro compuesto qufmico o biologico. En un ejemplo no limitante, la “conjugacion” de un polipeptido con un compuesto qufmico da como resultado estabilidad o eficacia mejoradas del polipeptido para su proposito pretendido. En una realizacion, un peptido esta conjugado a un transportador, donde el transportador es un liposoma, una micela, o un polfmero farmaceuticamente aceptable.
Los “liposomas” son vesfculas microscopicas que consisten en bicapas lipfdicas concentricas. Estructuralmente, los liposomas varfan en tamano y forma desde largos tubos a esferas, con dimensiones desde unos pocos cientos de Angstroms a fracciones de un milfmetro. Los lfpidos formadores de vesfculas se seleccionan para conseguir un grado especificado de fluidez o rigidez del complejo final que proporciona la composicion lipfdica de la capa externa. Estos son neutros (colesterol) o bipolares e incluyen fosfolfpidos, tales como fosfatidilcolina (PC), fosfatidiletanolamina (PE), fosfatidilinositol (PI), y esfingomielina (SM) y otros tipos de lfpidos bipolares, incluyendo aunque sin limitarse a dioleoilfosfatidiletanolamina (DOPE), con una longitud de cadena de hidrocarburo en el
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intervalo de 14 a 22, y saturados o con uno o mas enlaces dobles C = C. Los ejemplos de lipidos capaces de producir un liposoma estable, en solitario, o en combinacion con otros componentes lipfdicos son fosfolipidos, tales como fosfatidilcolina de soja hidrogenada (HSPC), lecitina, fosfatidiletanolamina, lisolecitina, lisofosfatidiletanolamina, fosfatidilserina, fosfatidilinositol, esfingomielina, cefalina, cardiolipina, acido fosfatfdico, cerebrosidos, distearoilfosfatidiletanolamina (DSPE), dioleoilfosfatidilcolina (DOPC), dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC), palmitoiloleoilfosfatidilcolina (POPC), palmitoiloleoilfosfatidiletanolamina (POPE) y dioleoilfosfatidiletanolamina 4-(N-maleimido-metil)ciclohexano-1 carboxilato (DOPE-mal). Lipidos que no contienen fosforo adicionales que pueden ser incorporados en liposomas incluyen estearilamina, dodecilamina, hexadecilamina, miristato de isopropilo, lauril sulfato de trietanolamina, sulfato de alquilo-arilo, palmitato de acetilo, ricinoleato de glicerol, estearato de hexadecilo, polimeros acrilicos anfoteros, amidas de acidos grasos polietoxilados, y los lipidos cationicos mencionados anteriormente (DDAB, DODAC, DMRIE, DMTAP, DOGS, DOTAP (DOtMa), dOsPA, DPTAP, DSTAP, DC-Chol). Los lipidos cargados negativamente incluyen acido fosfatfdico (PA), dipalmitoilfosfatidilglicerol (DPPG), dioleoilfosfatidilglicerol y (DOPG), dicetilfosfato que son capaces de formar vesfculas. Normalmente, los liposomas pueden dividirse en tres categorfas basadas en su tamano global y la naturaleza de la estructura laminar. Las tres clasificaciones, segun lo desarrollado por la New York Academy Sciences Meeting, “Liposomes and Their Use in Biology and Medicine”, diciembre de 1977, son vesfculas multilaminares (MLV), pequenas vesfculas unilaminares (SUV) y granes vesfculas unilaminares (LUV).
Una “micela” es un agregado de moleculas de tensioactivo dispersadas en un coloide lfquido. Una micela tfpica en solucion acuosa forma un agregado con las regiones de “cabeza” hidrofilas en contacto con disolvente circundante, secuestrando las regiones de cola hidrofobas en el centro de la micela. Este tipo de micela es conocido como una micela en fase normal (micela de aceite en agua). Las micelas inversas tienen los grupos de cabeza en el centro de las colas con las colas extendiendose fuera (micela de agua en aceite). Las micelas pueden usarse para unir un polinucleotido, polipeptido, anticuerpo o composicion descrita en el presente documento para facilitar el suministro eficiente de la celula o tejido diana.
La frase “polfmero farmaceuticamente aceptable” se refiere al grupo de compuestos que pueden conjugarse con uno o mas polipeptidos descritos en el presente documento. Se contempla que la conjugacion de un polfmero con el polipeptido es capaz de prolongar la semivida del polipeptido in vivo e in vitro. Los ejemplos no limitantes incluyen polietilenglicoles, polivinilpirrolidonas, alcoholes polivinflicos, derivados de celulosa, poliacrilatos, polimetacrilatos, azucares, polioles y mezclas de los mismos.
Un “vehfculo de suministro de genes” se define como cualquier molecula que puede transportar polinucleotidos insertados a una celula huesped. Los ejemplos de vehfculos de suministro de genes son liposomas, micelas polimeros biocompatibles, incluyendo polimeros naturales y polimeros sinteticos; lipoprotefnas; polipeptidos; polisacaridos; lipopolisacaridos; envueltas virales artificiales; partfculas de metal; y bacterias, o virus, tales como baculovirus, adenovirus y retrovirus, bacteriofago, cosmido, plasmido, vectores fungicos y otros vehfculos recombinantes usados normalmente en la tecnica que se han descrito para expresion en diversos huespedes eucariotas y procariotas, y pueden usarse para terapia genica asf como para simple expresion de protefnas.
Un polinucleotido de esta invencion puede suministrarse a una celula o tejido usando un vehfculo de suministro de genes. “Suministro de genes”, “transferencia de genes”, “transduccion”, y similares tal como se usan en el presente documento, son expresiones que se refieren a la introduccion de un polinucleotido exogeno (algunas veces denominado como “transgen”) en una celula huesped, independientemente del procedimiento usado para la introduccion. Dichos procedimientos incluyen diversas tecnicas bien conocidas tales como transferencia de genes mediada por vectores (mediante, por ejemplo, infeccion vfrica/transfeccion, o diversos otros complejos de suministro de genes basados en protefnas o basados en lipidos) asf como tecnicas que facilitan el suministro de polinucleotidos “desnudos” (tales como electroporacion, suministro con “pistola genica” y diversas otras tecnicas usadas para la introduccion de polinucleotidos). El polinucleotido introducido puede mantenerse de forma estable o transitoria en la celula huesped. El mantenimiento estable normalmente requiere que el polinucleotido introducido contenga un origen de replicacion compatible con la celula huesped o se integre en un replicon de la celula huesped, tal como un replicon extracromosomico (por ejemplo, un plasmido) o un cromosoma nuclear o mitocondrial. Se conocen una serie de vectores que son capaces de mediar la transferencia de genes a celulas de mamffero, tal como se conoce en la tecnica y se describe en el presente documento.
Un “vector viral” se define como un virus o partfcula viral producida de forma recombinante que comprende un polinucleotido a suministrar a una celula huesped, in vivo, ex vivo o in vitro. Los ejemplos de vectores virales incluyen vectores retrovirales, vectores de adenovirus, vectores de virus adenoasociados, vectores de alfavirus y similares. Los vectores de alfavirus, tales como vectores basados en el virus Semliki Forest y vectores basados en el virus Sindbis, tambien se han desarrollados para uso en terapia genica e inmunoterapia. Vease, Schlesinger y Dubensky (1999) Curr. Opin. Biotechnol. 5: 434-439 y Ying, y col. (1999) Nat. Med. 5(7): 823-827. Donde la transferencia de genes esta mediada por un vector retroviral, una construccion de vector se refiere al polinucleotido que comprende el genoma retroviral o parte del mismo, y un gen terapeutico. Tal como se usa en el presente documento, “transferencia de genes mediada retroviral” o “transduccion retroviral” lleva el mismo significado y se refiere al proceso mediante el cual un gen o secuencias de acido nucleico son transferidas de forma estable en la celula huesped en virtud del virus que entra en la celula y que integra su genoma en el genoma de la celula
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huesped. El virus puede entrar en la celula huesped mediante su mecanismo de infeccion normal o modificarse de modo que se una a un receptor o ligando de la superficie de la celula huesped diferente para entrar en la celula. Tal como se usa en el presente documento, vector retroviral se refiere a una partfcula viral capaz de introducir acido nucleico exogeno en una celula a traves de un mecanismo de entrada viral o de tipo viral.
Los retrovirus portan sui informacion genetica en forma de ARN; sin embargo, una vez que el virus infecta una celula, el ARN es transcrito de forma inversa en forma de ADN que se integra en el ADN genomico de la celula infectada. La forma de ADN integrado se denomina provirus.
Donde la transferencia de genes es mediada por un vector viral de ADN, tal como un adenovirus (Ad) o virus adenoasociado (AAV), una construccion de vector se refiere al polinucleotido que comprende el genoma viral o parte del mismo, y un transgen. Los adenovirus (Ad) son un grupo de virus homogeneo, relativamente bien caracterizado, que incluye mas de 50 serotipos. Vease, por ejemplo, la solicitud PCT internacional N.° WO 95/27071. Los Ad no requieren integracion en el genoma de la celula huesped. Vectores derivados de Ad recombinante, particularmente aquellos que reducen el potencial de recombinacion y generacion de virus de tipo silvestre, tambien han sido construidos. Vease, las solicitudes PCT internacional N.° WO 95/00655 y WO 95/11984. El AAV de tipo silvestre tiene alta infectividad y especificidad integrandose en el genoma de la celula huesped. Vease, Hermonat and Muzyczka (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU. 81: 6466-6470 y Lebkowski y col. (1988) Mol. Cell. Biol. 8: 39883996.
Los vectores que contienen tanto un promotor como un sitio de clonacion en el que un polinucleotido puede enlazarse de forma operativa se conocen bien en la tecnica. Dichos vectores son capaces de transcribir ARN in vitro o in vivo, y estan disponibles en el mercado de fuentes tales como Stratagene (La Jolla, CA) y Promega Biotech (Madison, WI). Para optimizar la expresion y/o la transcripcion in vitro, puede ser necesario eliminar, anadir o alterar partes no traducidas 5' y/o 3' de los clones para eliminar codones de iniciacion extra, de potencial traduccion alternativa inapropiada u otras secuencias que pueden interferir en o reducir la expresion, a nivel de la transcripcion o la traduccion. Como alternativa, sitios de union al ribosoma consenso pueden insertarse inmediatamente 5' del codon de inicio para mejorar la expresion.
Los vehfculos de suministro de genes tambien incluyen complejos de ADN/liposoma, micelas y complejos protefna- ADN dirigidos. Los liposomas que tambien comprenden un anticuerpo de direccion o fragmento del mismo pueden usarse en los procedimientos de esta divulgacion. Para mejorar el suministro a una celula, el acido nucleico o las protefnas de esta invencion pueden conjugarse a anticuerpos o fragmentos de union de los mismos que se unen a antfgenos de la superficie celular, por ejemplo, un marcador de la superficie celular descubierto en celulas madre o cardiomiocitos. Ademas del suministro de polinucleotidos a una celula o poblacion de celulas, la introduccion directa de las protefnas descritas en el presente documento en la celula o poblacion de celulas puede realizarse mediante la tecnica no limitante de transfeccion de protefnas, como alternativa condiciones de cultivo que pueden mejorar la expresion y/o promover la actividad de las protefnas de esta invencion son otras tecnicas no limitantes.
La frase “soporte solido” se refiere a superficies no acuosas tales como “placas de cultivo” “chips genicos” o “micromatrices” (microarrays). Dichos chips genicos o micromatrices pueden usarse para fines de diagnostico y terapeuticos mediante una serie de tecnicas conocidas por un experto en la materia. En una tecnica, los oligonucleotidos se distribuyen sobre un chip genico para determinar la secuencia de ADN mediante la estrategia de hibridacion, tal como la perfilada en las patentes de Estados Unidos N.° 6.025.136 y 6.018.041. Los polinucleotidos de esta invencion pueden modificarse a sondas, que, a su vez, pueden usarse para la deteccion de una secuencia genetica. Dichas tecnicas han sido descritas, por ejemplo, en las patentes de Estados Unidos N.° 5.968.740 y 5.858.659. Una sonda tambien puede fijarse a la superficie de un electrodo para la deteccion electroqufmica de secuencias de acido nucleico tales como las descritas por Kayem y col., patente de Estados Unidos N.° 5.952.172 y por Kelley y col. (1999) Nucleic Acids Res. 27: 4830-4837.
Diversos “chips genicos” o “micromatrices” y tecnologfas similares son conocidas en la tecnica. Los ejemplos de estas incluyen, aunque sin limitarse a, LabCard (ACLARA Bio Sciences Inc.); GeneChip (Affymetric, Inc); LabChip (Caliper Technologies Corp); una matriz de baja densidad con deteccion electroqufmica (Clinical Micro Sensors); LabCD System (Gamera Bioscience Corp.); Omni Grid (Gene Machines); Q Array (Genetix Ltd.); un sistema de espectrometrfa de masas automatizado de alto rendimiento con tecnologfa de expresion en fase lfquida (Gene Trace Systems, Inc.); un sistema de dispensado de gotas por chorro termico (Hewlett Packard Company); Hyseq HyChip (Hyseq, Inc.); BeadArray (Illumina, Inc.); GEM (Incyte Microarray Systems); un sistema de formacion de micromatrices de alto rendimiento que puede dispensar de 12 a 64 gotas sobre multiples portaobjetos de vidrio (Intelligent Bio-Instruments); Molecular Biology Workstation y NanoChip (Nanogen, Inc.); un chip de vidrio microflufdico (Orchid biosciences, Inc.); BioChip Arrayer con cuatro puntas piezoelectricas de goteo a voluntad PiezoTip (Packard Instruments, Inc.); FlexJet (Rosetta Inpharmatic, Inc.); espectrometro de masas MALDI-TOF (Sequnome); ChipMaker 2 y ChipMaker 3 (TeleChem International, Inc.); y GenoSensor (Vysis, Inc.) tal como se identifican y describen en Heller (2002) Annu. Rev. Biomed. Eng. 4:129-153. Los ejemplos de “chips genicos” o una “micromatriz” tambien se describen en las publicaciones de patente de Estados Unidos N.°: 2007-0111322, 20070099198, 2007-0084997, 2007-0059769 y 2007-0059765 y las patentes de Estados Unidos N.°: 7.138.506, 7.070.740 y 6.989.267.
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En un aspecto, se preparan “chips genicos” o “micromatrices” que contienen sondas o cebadores homologos a un polinucleotido, polipeptido o anticuerpo descrito en el presente documento. Se obtiene una muestra adecuada del paciente, se lleva a cabo extraccion de ADN, ARN genomico, protefna o cualquier combinacion de los mismos y se amplifica en caso necesario. La muestra se pone en contacto con el chip genico o panel de micromatriz en condiciones adecuadas para hibridacion de los genes o productos genicos de interes con las sondas o cebadores contenidos en el chip genico o micromatriz. Las sondas o cebadores pueden estar etiquetadas de forma detectable identificando de este modo el uno o mas genes de interes. Como alternativa, puede usarse una reaccion qufmica o biologica para identificar las sondas o cebadores que hibridaron con el ADN o ARN del uno o mas genes) de interes. Los genotipos o el fenotipo del paciente se determinan a continuacion con ayuda del aparato y los procedimientos mencionados anteriormente.
Otros ejemplos no limitantes de un soporte en fase solida incluyen vidrio, poliestireno, polipropileno, polietileno, dextrano, nylon, amilasas, celulosas naturales y modificadas, poliacrilamidas, gabros y magnetita. La naturaleza del transportador puede ser soluble en cierta medida o insoluble. El material de soporte puede tener virtualmente cualquier configuracion estructural posible, siempre que la molecula acoplada sea capaz de unirse a un polinucleotido, polipeptido o anticuerpo. Por lo tanto, la configuracion del soporte puede ser esferica, como en una perla, o cilfndrica, como en la superficie interna de un tubo de ensayo, o la superficie externa de una varilla. Como alternativa, la superficie puede ser plana tal como una lamina, tira reactiva, etc., o, como alternativa, perlas de poliestireno. Los expertos en la materia conoceran muchos otros transportadores adecuados para unirse al anticuerpo o antfgeno, o seran capaces de determinar los mismos mediante el uso de experimentacion rutinaria.
Las “celulas eucariotas" comprenden todos los reinos de la vida, excepto monera. Se pueden distinguir facilmente a traves de un nucleo rodeado por una membrana. Animales, plantas, hongos y protistas son eucariotas u organismos cuyas celulas estan organizadas en estructuras complejas por las membranas internas y un citoesqueleto. La estructura rodeada por una membrana mas caracterfstica es el nucleo. Un huesped eucariota, incluyendo, por ejemplo, levadura, plantas superiores, insectos y celulas de mamfferos, o como alternativa a partir de una celula procariota tal como se ha descrito anteriormente. Los ejemplos no limitantes incluyen simio, bovino, porcino, murino, ratas, aviar, reptiliano y humano.
Las “celulas procariotas" que habitualmente carecen de un nucleo o cualesquiera otros organulos rodeados por una membrana y se dividen en dos dominios, bacterias y archaea. Ademas, en lugar de tener el ADN cromosomico, la informacion genetica de estas celulas esta en un bucle circular llamado un plasmido. Las celulas bacterianas son muy pequenas, aproximadamente del tamano de una mitocondria animal (aproximadamente 1-2 pm de diametro y 10 pm de largo). Las celulas procariotas presentan tres formas principales: en forma de barra, esferica y en espiral. En vez de someterse a procesos de replicacion elaborados como las eucariotas, las celulas bacterianas se dividen por fision binaria. Los ejemplos incluyen aunque sin limitarse a bacterias bacillus, bacterias E. coli bacterias Salmonella.
La expresion “anticuerpo humano”, tal como se usa en el presente documento, pretende incluir anticuerpos que tienen regiones variables y constantes derivadas de secuencias de inmunoglobulina de lfnea germinal humana. Los anticuerpos humanos de la divulgacion pueden incluir residuos de aminoacidos no codificados por secuencias de inmunoglobulina de lfnea germinal humana (por ejemplo, mutaciones introducidas por mutagenesis aleatoria o especffica de sitio in vitro o por mutacion somatica in vivo). Sin embargo, la expresion “anticuerpo humano”, tal como se usa en el presente documento, no pretende incluir anticuerpos en los que secuencias CDR derivadas de la lfnea germinal de otra especie de mamffero, tal como un raton, han sido injertadas en secuencias marco humanas. Por lo tanto, tal como se usa en el presente documento, la expresion “anticuerpo humano” se refiere a un anticuerpo en el que sustancialmente todas las partes de la protefna (por ejemplo, CDR, marco, dominios CL, CH (por ejemplo, CH1, CH2, Cm), bisagra, (VL, VH)) son sustancialmente no inmunogenas en seres humanos, con solamente cambios o variaciones de poca importancia en la secuencia. Del mismo modo, los anticuerpos designados de primate (mono, babuino, chimpance, etc.), roedores (raton, rata, conejo, cobaya, hamster, y similares) y otros mamfferos designan dichos anticuerpos especffico de especie, subgenero, genero, subfamilia, familia. Ademas, los anticuerpos quimericos incluyen cualquier combinacion de los anteriores. Dichos cambios o variaciones opcional y preferentemente retienen o reducen la inmunogenicidad en los seres humanos u otras especies con respecto a los anticuerpos no modificados. Por lo tanto, un anticuerpo humano es distinto de un anticuerpo quimerico o humanizado. Se senala que un anticuerpo humano puede ser producido por una celula animal no humana o procariota o eucariota que es capaz de expresar los genes de inmunoglobulina humana funcionalmente reordenados (por ejemplo, la cadena pesada y/o ligera). Ademas, cuando un anticuerpo humano es un anticuerpo monocatenario, puede comprender un peptido enlazador que no se encuentra en los anticuerpos humanos nativos. Por ejemplo, un Fv que puede comprender un peptido enlazador, tal como de dos a aproximadamente ocho residuos de glicina u otros aminoacidos, que une la region variable de la cadena pesada y la region variable de la cadena ligera. Se considera que dichos peptidos enlazadores son de origen humano.
Tal como se usa en el presente documento, un anticuerpo humano se “deriva de” una secuencia de lfnea germinal particular, si se obtiene el anticuerpo a partir de un sistema que usa secuencias de inmunoglobulina humana, por ejemplo, mediante la inmunizacion de un raton transgenico que porta genes de inmunoglobulina humana o cribando
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una biblioteca de genes de inmunoglobulina humana. Un anticuerpo humano que se “deriva de” una secuencia de inmunoglobulina de lmea germinal humana puede ser identificado como tal mediante la comparacion de la secuencia de aminoacidos del anticuerpo humano con la secuencia de aminoacidos de inmunoglobulinas de la lmea germinal humana. Un anticuerpo humano seleccionado normalmente es al menos 90% identico en la secuencia de aminoacidos a una secuencia de aminoacidos codificada por un gen de la lmea germinal de inmunoglobulina humana y contiene residuos de aminoacidos que identifican el anticuerpo humano como de ser humano, cuando se comparan con las secuencias de aminoacidos inmunoglobulina de lmea germinal de otras especies (por ejemplo, secuencias de la lmea germinal murina). En ciertos casos, un anticuerpo humano puede ser al menos el 95%, o incluso al menos 96%, 97%, 98% o 99% identica en la secuencia de aminoacidos a la secuencia de aminoacidos codificada por el gen de inmunoglobulina de la lmea germinal. Normalmente, un anticuerpo humano derivado de una secuencia de lmea germinal humana particular presentara no mas de 10 diferencias de aminoacidos respecto a la secuencia de aminoacidos codificada por el gen de inmunoglobulina de lmea germinal humana. En ciertos casos, el anticuerpo humano puede presentar no mas de 5, o incluso no mas de 4, 3, 2, o 1 diferencias de aminoacidos respecto a la secuencia de aminoacidos codificada por el gen de la lmea germinal de inmunoglobulina.
Un “anticuerpo monoclonal humano” se refiere a anticuerpos que presentan una sola especificidad de union que tienen regiones variables y constantes derivadas de secuencias de inmunoglobulina de lmea germinal humana. La expresion tambien pretende incluir anticuerpos humanos recombinantes. Procedimientos para fabricar estos anticuerpos se describen en el presente documento.
La expresion “anticuerpo humano recombinante”, tal como se usa en el presente documento, incluye todos los anticuerpos humanos que se preparan, expresan, crean o afslan mediante medios recombinantes, tales como anticuerpos aislados de un animal (por ejemplo, un raton) que es transgenico o transcromosomico para genes de inmunoglobulina humana o un hibridoma preparado a partir de los mismos, anticuerpos aislados de una celula huesped transformada para expresar el anticuerpo, por ejemplo, a partir de un transfectoma, anticuerpos aislados a partir de una biblioteca de anticuerpos humanos combinatoria, recombinante y anticuerpos preparados, expresados, creados o aislados mediante cualquier otro medio que implica splicing de secuencias genicas de inmunoglobulina humana con otras secuencias de ADN. Dichos anticuerpos humanos recombinantes tienen regiones variables y constantes derivadas de secuencias de inmunoglobulina de lmea germinal humana. En ciertas realizaciones, sin embargo, dichos anticuerpos humanos recombinantes pueden ser sometidos a mutagenesis in vitro (o, cuando se usa un animal transgenico para secuencias de Ig humana, mutagenesis somatica in vivo) y por lo tanto las secuencias de aminoacidos de las regiones VH y VL de los anticuerpos recombinantes son secuencias que, aunque derivadas de y relacionadas con secuencias VH y VL de la lmea germinal humana, pueden no existir de forma natural dentro del repertorio de la lmea germinal de anticuerpos humanos in vivo. Procedimientos para fabricar estos anticuerpos se describen en el presente documento.
Tal como se usa en el presente documento, “isotipo” se refiere a la clase de anticuerpos (por ejemplo, IgM o IgG1) que esta codificada por genes de la region constante de cadena pesada.
Las expresiones “anticuerpo policlonal” o “composicion de anticuerpo policlonal”, tal como se usan en el presente documento, se refieren a una preparacion de anticuerpos que se derivan de diferentes lmeas de celulas B. Son una mezcla de moleculas de inmunoglobulina secretadas contra un antfgeno espedfico, que reconoce, cada una, un epttopo diferente.
Las expresiones “anticuerpo monoclonal” o “composicion de anticuerpo monoclonal”, tal como se usan en el presente documento, se refieren a una preparacion de moleculas de anticuerpo de composicion molecular sencilla. Una composicion de anticuerpo monoclonal presenta una unica especificidad y afinidad de union para un epftopo particular.
Tal como se usa en el presente documento, el termino “etiqueta” pretende un compuesto o composicion directa o indirectamente detectable que esta conjugado directa o indirectamente a la composicion a detectar, por ejemplo, polinucleotido o protema tal como un anticuerpo para generar una composicion “etiquetada”. El termino tambien incluye secuencias conjugadas al polinucleotido que proporcionaran una senal en el momento de la expresion de las secuencias insertadas, tal como protema verde fluorescente (GFP) y similares. La etiqueta puede ser detectable por sf misma (por ejemplo etiquetas de radioisotopo o etiquetas fluorescentes) o, en el caso de una etiqueta enzimatica, puede catalizar la alteracion qmmica de un compuesto o composicion de sustrato que es detectable. Las etiquetas pueden ser adecuadas para deteccion a pequena escala o mas adecuadas para cribado de alto rendimiento. Por lo tanto, las etiquetas adecuadas incluyen, aunque sin limitarse a, radioisotopos, fluorocromos, compuestos quimioluminiscentes, tintes y protemas, incluyendo enzimas. La etiqueta puede detectarse simplemente o puede cuantificarse. Una respuesta que es simplemente detectada en general comprende una respuesta cuya existencia meramente es confirmada, mientras que una respuesta que se cuantifica generalmente comprende una respuesta que tiene un valor cuantificable (por ejemplo, numericamente notificable) tal como una intensidad, polarizacion, y/u otra propiedad. En ensayos de luminiscencia o fluorescencia, la respuesta detectable puede ser generada directamente a traves de un luminoforo o fluoroforo asociado a un componente del ensayo implicado realmente en la union, o indirectamente usando un luminoforo o fluoroforo asociado con otro componente (por ejemplo, informador o indicador).
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Los ejemplos de etiquetas luminiscentes que producen senales incluyen, aunque sin limitarse a, bioluminiscencia y quimioluminiscencia. Una respuesta de luminiscencia detectable comprende generalmente un cambio en, o una aparicion de, una senal de luminiscencia. Los procedimientos y luminoforos adecuados para los componentes de ensayo de etiquetado de forma luminiscente son conocidos en la tecnica y se describen por ejemplo, en Haugland, Richard P. (1996) Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals (6a ed.). Los ejemplos de sondas luminiscentes incluyen, aunque sin limitarse a, aecuorina y luciferasas.
Los ejemplos de etiquetas fluorescentes adecuadas incluyen, aunque sin limitarse a, fluorescefna, rodamina, tetrametilrrodamina, eosina, eritrosina, cumarina, metil-cumarinas, pireno, verde malaquita, estilbeno, Lucifer Yellow, Cascade Blue ™, y Rojo Texas. Otros colorantes opticos adecuados se describen en Haugland, Richard P. (1996) Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals (6a ed.).
En otro aspecto, la etiqueta fluorescente se funcionaliza para facilitar union covalente a un componente celular presente en o sobre la superficie de la celula o tejido tal como un marcador de la superficie celular. Grupos adecuados funcionales, incluyendo, aunque sin limitarse a, grupos isotiocianato, grupos amino, grupos haloacetilo, maleimidas, esteres de succinimidilo, y haluros de sulfonilo, todos los cuales pueden ser utilizados para unir la etiqueta fluorescente a una segunda molecula. La eleccion del grupo funcional de la etiqueta fluorescente dependera del sitio de union ya sea a un enlazador, el agente, el marcador o el segundo agente de etiquetado.
II. Antfdotos
Derivados de factor X y factor Xa
Un aspecto de la presente invencion es el uso de derivados de fX, tales como fX o fXa deficientes en dominio Gla o fX o FXa sin-Gla, como antfdotos seguros y eficaces para neutralizar sustancialmente la actividad de un inhibidor de la coagulacion fXa para prevenir o detener una hemorragia. Se contempla que los antfdotos de la presente invencion seran utiles para invertir el efecto anticoagulante de un inhibidor de fXa, especialmente un inhibidor de molecula pequena dirigido al sitio activo.
Se contempla que un antfdoto para un inhibidor de fXa tiene actividad procoagulante reducida o ninguna pero es capaz de unirse con un inhibidor de fXa. Se contempla que dicha actividad limitada permita dosificar del antfdoto a un nivel mayor que el fXa de tipo silvestre circulante. Ciertos derivados de fXa, tales como des-Gla fXa y FXa deficiente en Gla, son antfdotos adecuados de esta divulgacion. Ademas de tener actividad procoagulante reducida o disminuida, los antfdotos de la presente invencion deben ser tambien sustancialmente no inmunogenos para el sujeto. Un antfdoto puede contener una combinacion de dos o mas de las anteriores mutaciones y/o modificaciones. Ademas, cualquiera de los anteriores derivados de fXa puede administrarse en solitario o en combinacion con otro.
El factor Xa es una serina proteasa en la ruta de coagulacion sangufnea responsable de convertir protrombina en trombina. Se produce a partir del factor X inactivo tras la activacion por la Xasa intrfnseca (complejo formado por el factor IXa con su cofactor, factor Villa) o la Xasa extrfnseca (complejo formado por el factor Vila con su cofactor, factor tisular). El fX activado (fXa) puede someterse a escision autocatalftica adicional en el extremo C de su cadena pesada, que convierte fXaa en la subforma fXap (Jesty, J y col. J. Biol. Chem. 1975, 250(12): 4497-4504). Tanto fXaa como fXa^ son materiales adecuados para la presente invencion. El propio fXa convierte la protrombina a una velocidad lenta que no es suficiente para apoyar la coagulacion. Solamente cuando forma un complejo protrombinasa con cofactores Ca2+, fosfolfpido, y factor Va, fXa puede activar la protrombina a una velocidad suficientemente rapida para apoyar la coagulacion (Skogen, W.F., y col., J. Biol. Chem. 1984, 259(4): 2306-10). El complejo requiere union entre el fosfolfpido cargado negativamente y residuos de acido y-carboxiglutamico en el dominio Gla de fXa mediante establecimiento de puentes con Ca2+.
Por lo tanto, aunque el dominio Gla no contiene el sitio activo de fXa, permite a fXa formar el complejo de protrombinasa a traves de los residuos de acido y-carboxiglutamico. Esto se demuestra mediante eliminacion selectiva del dominio Gla de fXa mediante digestion con quimotripsina (vease la figura 7 y el ejemplo 1). Se realizaron ensayos de coagulacion en fXa durante la evolucion temporal de escision del dominio Gla mediante digestion con quimotripsina. Se ha descrito (Skogen y col., J. Biol. Chem. 1984, 259(4): 2306-10) que un complejo protrombinasa reconstituido que comprende fXa sin dominio Gla, fVa, fosfolfpidos e iones calcio produce trombina a una velocidad significativamente reducida (0,5% de producto generado en comparacion con el complejo de control que contiene fXa nativo). Tal como se muestra en la figura 7, la actividad de fXa en la formacion de coagulos se redujo parcialmente despues de que fXa fue digerido mediante quimotripsina durante 15 minutos y la actividad se perdio completamente despues de 30 minutos de digestion. Se ha descubierto, por lo tanto, que fXa no carboxilado o descarboxilado, que carecen de los residuos de acido gamma-carboxiglutamico apropiados requeridos para union a la membrana dependiente de calcio, son incapaces de ensamblaje del complejo de coagulacion dependiente de membrana y no apoyan la coagulacion sangufnea (Mann, KG y col., Blood, 1990, 76: 1-16).
Se ha establecido tambien que fXa deficiente en dominio Gla es capaz de unirse a inhibidores de fXa dirigidos al sitio activo. (Brandstetter, H y col., J. Bio. Chem., 1996, 271: 29988-29992). Ha habido informes de cristalograffa de
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inhibidor de fXa de molecula pequena unido a des-Gla fXa humano, que proporcionaron descripcion estructural del sitio activo escindido (Brandstetter, J. Bio. Chem., 1996, 271: 29988-29992 y Roehrig, J. Med. Chem. 2005, 48(19): 5900-8). La figura 8 muestra que un des-Gla anhidro-fXa mostraba una afinidad de union de 0,319 nM con un inhibidor de fXa Betrixaban, comparable a la de un fXa nativo.
Se ha descubierto ahora que des-Gla fXa, y otros derivados de fXa que tienen actividad procoagulante reducida pero son capaces de union al inhibidor de fXa, pueden usarse como un antfdoto para un inhibidor de fXa. Tal como se muestra en la figura 9, el des-Gla anhidro-fXa mostraba inversion completa de actividad anticoagulante de Betrixaban a una concentracion de 680 nM. Tal como se detalla en el ejemplo 2, la generacion de trombina se inicio anadiendo reactivo que contenfa TF (Innovin) y, por lo tanto, indicativa de funcion de factores de coagulacion en la ruta de coagulacion extrfnseca. Tambien se ha demostrado en los ejemplos 9-13, que el antfdoto recombinante es util para invertir una amplia variedad de anticoagulantes.
Ensayos de prolongacion de la coagulacion con el reactivo de tiempo de tromboplastina parcial activada (aPTT) (Actina FS) que determinan la funcion del factor de coagulacion en la ruta de coagulacion intrfnseca tambien indican que el des-Gla anhidro-fXa posee actividad de antfdoto. La figura 10 muestra el efecto de antfdoto dependiente de la dosis de des-Gla anhidro-fXa contra 250 nM de Betrixaban, con inversion completa a 600 nM. La figura 11 muestra que des-Gla anhidro-fXa tambien fue capaz de invertir la actividad anticoagulante de otro inhibidor de fXa, enoxaparina. La figura 12 muestra que des-Gla anhidro-fXa no mostraba actividad de antfdoto significativa contra un inhibidor de trombina directo, argatroban. Por lo tanto, el des-Gla anhidro-fXa es un antfdoto selectivo para inhibidor de fXa y es capaz de restaurar la actividad procoagulante de fXa iniciada por la ruta extrfnseca o la intrfnseca.
Ademas, la actividad de antfdoto de des-Gla anhidro-fXa se demostro mediante los ensayos de prolongacion del aPTT medido con un temporizador de coagulacion tradicional. Tal como se muestra en la figura 13, el propio des-Gla anhidro-fXa no tiene ningun efecto sobre el aPTT de plasma de control a las concentraciones mas altas ensayadas (2576 nM). 400 nM de Betrixaban prolongaban el aPTT mas de dos veces. Este efecto anticoagulante de Betrixaban es invertido por des-Gla anhidro-fXa de manera sensible a la dosis, con retorno de aPTT a un nivel cercano al normal de plasma de control a concentraciones de antfdoto mayores de 1610 nM.
Se contempla que truncamientos adicionales en la cadena ligera de fXa, por ejemplo, delecion adicional del dominio EGF1, los dominios EGF1 mas EGF2, o fragmentos de los mismos, y fXa inactivo con solamente la cadena pesada pueden ser antfdotos utiles de esta divulgacion. En una realizacion, el derivado comprende la supresion de sustancialmente todo el dominio EGF1, la supresion de sustancialmente la totalidad de un dominio EGF2, o ambos. En una realizacion, la supresion de sustancialmente todo el dominio EGF1 comprende al menos aproximadamente el 50 % o al menos aproximadamente el 80 % de los restos de aminoacidos 46 a 84 de la SEQ ID NO. 3 o un equivalente del mismo. En otra realizacion, la supresion de sustancialmente todo el dominio EGF2 comprende al menos aproximadamente el 50 % o al menos aproximadamente el 80 % de los restos de aminoacidos 85-128 de la SEQ ID NO. 3.
FXa deficiente en dominio Gla no apoya coagulacion normal por debajo de la concentracion fisiologicamente relevante. Sin embargo, la protefna tiene la capacidad de escindir muchos sustratos y causar coagulacion a concentraciones mas elevadas. Por ejemplo, Skogen y col., (Skogen, W.F., y col., J. Biol. Chem. 1984, 259(4): 230610) mostraron que des-Gla fXa bovino tiene aproximadamente un 0,5-1,0% de actividad del complejo de protrombinasa con respecto al fXa de tipo silvestre. Por lo tanto, modificaciones que reducen adicionalmente o eliminan completamente la actividad procoagulante de un derivado de fXa estan contempladas por procedimientos de la invencion. Dicha modificacion puede ser, por ejemplo, en un dominio catalftico de fXa.
Varias maneras de modificar el dominio catalftico en la cadena pesada de fXa para reducir su actividad procoagulante estan contempladas. El residuo del sitio activo S379 de fXa (tal como se muestra en la SEQ ID No. 7), por ejemplo, puede sustituirse selectivamente por deshidroalanina (vease el ejemplo 1) o alanina (vease el ejemplo 6) para reducir o eliminar la actividad procoagulante. Tambien se conoce que la formacion de un complejo entre fXa y un reactivo dirigido al exositio de fXa puede bloquear la afinidad de union macromolecular de fXa, reduciendo de este modo su actividad procoagulante mientras conserva afinidad de union a molecula pequena en el sitio activo. Este reactivo dirigido al exositio incluye, sin limitacion, anticuerpos monoclonales dirigidos a una region eliminada del sitio activo (Wilkens, M y Krishnaswamy, S, J. Bio. Chem., 2002, 277 (11), 9366-9374), o a-2-macroglobulina. Se ha conocido que el complejo a-2-macroglobulina-serina proteasa, tal como con tripsina, trombina o fXa, es capaz de unirse a sustrato de molecula pequena (Kurolwa, K. y col., Clin. Chem. 1989, 35(11), 2169-2172).
Tambien se conoce que un fXa inactivo con modificaciones unicamente en la cadena pesada, mientras mantiene su cadena ligera sin cambios, actuarfa como un inhibidor de protrombinasa (Hollenbach, S. y col., Thromb. Haemost., 1994, 71(3), 357-62) dado que interfiere en la actividad procoagulante de fXa normal, tal como se muestra en la figura 6. Por lo tanto, en una realizacion, el derivado de fXa presenta modificaciones tanto en la cadena ligera como en la cadena pesada. Se ha descubierto que estas modificaciones reducen o eliminan las actividades tanto procoagulante como anticoagulante, mientras conservan la capacidad de union a inhibidores del derivado de fXa.
Pueden usarse varios procedimientos para producir derivados de fXa deficiente en dominio Gla u otros derivados de
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fXa descritos en el presente documento. Por ejemplo, el dominio Gla puede eliminarse completamente mediante escision quimotnptica, produciendo fXa sin dominio Gla. Como alternativa, un fX sin dominio Gla puede producirse mediante escision quimotnptica de fX nativo. El fX sin dominio Gla puede convertirse entonces en fXa sin dominio Gla mediante un activador de fX. fX puede aislarse de plasma de la misma o una especie diferente que el sujeto a tratar. fX bovino, por ejemplo, ha demostrado ser funcional en ensayos en plasma humano. Los ejemplos de un activador de fX incluyen, sin limitacion, un veneno de serpiente, tal como veneno de vfbora de Russell, y complejos de fVIIa/factor tisular o fIXa/fVIIIa. Dicho medio es conocido para un experto en la materia. Por ejemplo, Rudolph A.E. y col., describieron un fXa recombinante producido a partir de un factor X (fX) recombinante con una unica sustitucion de Arg347 por Glutamina (fXR347N) (Biochem. 2000, 39 (11): 2861 -2867). En una realizacion, los derivados de fXa producidos a partir de fuentes no humanas son no inmunogenos o sustancialmente no inmunogenos. El ejemplo 7 tambien proporciona un procedimiento de produccion de un antidoto recombinante que tiene la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO. 12.
Los derivados de fXa tambien pueden purificarse a partir de plasma humano, o pueden producirse mediante un procedimiento de ADN recombinante donde un gen apropiado para el derivado de fXa se expresa en un organismo huesped adecuado. La expresion y purificacion de fXa recombinante ha sido descrita por varios grupos, vease, por ejemplo, Larson, P.J., y col., Biochem., 1998, 37: 5029-5038, y Camire, R.M., y col., Biochem., 2000, 39, 1432214329 para producir fX recombinante; Wolf, D.L. y col., J. Bio. chem., 1991, 266(21): 13726-13730 para producir fXa recombinante. fXa modificado puede prepararse de acuerdo con estos procedimientos usando un cADN modificado genericamente que tiene una secuencia de nucleotidos que codifica el fXa mutante deseado. El ejemplo 6 da mas detalles para expresion directa de un FXa sin dominio Gla-S379 mutante con actividad funcional como antfdoto.
Esta contemplado que fXa mutado o modificado en el sitio activo con dominio Gla deficiente, tal como fXa subcarboxilado, tambien pueda ser util como antfdoto de inhibidor de fXa. El fXa subcarboxilado puede prepararse mediante medios recombinantes reteniendo derivados de vitamina K durante la expresion de protemas (los derivados de vitamina K son necesarios para modificacion postraduccional para formar los residuos de Gla) o anadiendo antagonistas de vitamina K tales como warfarina durante el cultivo tisular. FXa descarboxilado puede prepararse calentando (Bajaj P., J. Biol. Chem., 1982, 257(7): 3726-3731) o mediante digestion proteolttica mediante quimotripsina (Morita T., y col., J. Biol. Chem., 1986, 261(9): 4015-4023). El antidoto tambien puede generarse en sistemas procariotas seguido por replegamiento o constitucion in vitro del sitio de union del inhibidor de fXa.
Los residuos de Gla tambien pueden modificarse qmmicamente para eliminar el grupo carboxilo responsable de union a la membrana dependiente de iones calcio. Por ejemplo, los grupos carboxilo en los residuos de Gla pueden eliminarse selectivamente en condiciones de descarboxilacion o pueden estar cubiertos, por ejemplo, mediante esterificacion o aminacion. Es deseable que dicha esterificacion o aminacion sea resistente a hidrolisis in vivo de modo que el fXa modificado no se convierta facilmente en fXa activo, lo que puede causar trombosis.
Otros mutantes o derivados de fXa tambien pueden ser antidotos utiles de esta invencion. En una realizacion, esta invencion abarca el uso de mutantes descritos en Peter J. Larson y col., Biochem., 1998, 37: 5029-5038 como antfdotos de inhibidores de fXa.
Pueden hacerse modificaciones adicionales de la protema fX para producir antfdotos utiles para los inhibidores de fXa. Una modificacion de este tipo incluye la supresion de todo o parte del peptido de activacion en el extremo N- terminal de la cadena pesada. En una realizacion de la divulgacion, esto incluye la supresion de todos los de la parte del peptido de activacion o de los restos de aminoacidos 143-194 de la SEQ ID NO. 3 o un equivalente del mismo. Esto puede lograrse mediante procedimientos descritos en Sinha y col.. Protein Expression and Purification, 3, 518524 (1992) y Wolf y col.. J. Biol. Chem. 266(21), 13726-13730 (1991). Se describen a continuacion metodos adicionales.
En otra realizacion, una modificacion de aminoacidos impide la escision de un peptido p en el que el peptido p se refiere a una parte o a toda la cadena pesada. Esta modificacion puede incluir la supresion, la sustitucion o la insercion de un aminoacido. Dicha modificacion incluye sustituciones de uno o mas de Arg429 o Ser436. Por ejemplo, hay una sustitucion Arg 429Gln y tambien puede incluir una sustitucion Thr443Ala. La conversion de fXaa a fXap ha sido descrita por, por ejemplo, por Pryzdial y Kessler (Pryzdial LG y Kessler GE, Journal of Biological Chemistry, 271 (28), 16621-16626 (1996). La patente de los EE.Uu. 7.220.569 (B2) describe modificaciones en el peptido de activacion fX y el peptido p.
En otra realizacion mas, el derivado comprende una supresion de un peptido p. En una realizacion, la supresion del peptido p comprende una supresion de al menos los restos de aminoacidos 430-448 de la SEQ ID NO. 3 o un equivalente del mismo.
En otra realizacion, una secuencia de peptido senal del factor X nativo o una secuencia de peptido senal alternativa se usan para expresar los derivados. Por ejemplo, el peptido senal del factor X nativo (SEQ ID NO. 18) puede utilizarse como la secuencia senal para la SEQ ID NO. 12-15 y 19-25. El peptido senal puede seleccionarse entre un peptido senal del factor X (SEQ ID NO. 18), un peptido senal de la transferrina (restos de aminoacidos SP1-SP19 de la SEQ ID NO. 27) y un peptido senal de la protrombina (restos de aminoacidos SP1-SP24 de SEQ ID. NO 26). Se
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contempla que el peptido senal del factor X pueda usarse en que el peptido senal de cualquiera de las secuencias descritas en este documento. El uso de un peptido senal de la protrombina en la sustitucion del peptido senal nativo fX ha sido descrito por Guarna y col.. (Guarna MM y col., Protein Expression and Purification, 20(2) 133-41 (2000)) y Camire y col. (Camire RM, y col.., Biochemistry, 39, 14322-14329 (2000)). El uso de peptido senal de transferencia ha sido descrito por Rezaie y Esmon (Rezaie AR y Charles T. Esmon CT, J. Biol. Chem., 267 (36), 26104-26109 (1992)).
En otra realizacion mas de la invencion, el polipeptido tiene un peptido precursor que es una cadena polipeptfdica. En una realizacion, hay un enlazador RKR (SEQ ID NO. 40) a un C-terminal de una cadena ligera o un enlazador RKRRKR (SEQ ID NO. 41) en el extremo C-terminal de una cadena ligera. En otra realizacion, el derivado es un polipeptido de dos cadenas. La expresion de un fXa mutante adecuado como antfdoto o precursor de antfdoto de la invencion con un enlazador RKRRKR se ha descrito con todo detalle en la publicacion de patente de los Estados Unidos 2009/0098119A1. El uso del enlazador RKR (SEQ ID NO. 40) para conectar la cadena ligera fXa y el peptido de activacion se ha analizado en la patente de los EE.UU. 5.990.079.
En otra realizacion, esta invencion abarca el uso de mutantes de fXa catalfticamente inactivos para preparar antfdotos de inhibidores de fXa. Por ejemplo, mutantes descritos en Sinha, U., y col., Protein Expression and Purif. 1992, 3: 518-524 rXai, mutantes con modificaciones qufmicas, tales como deshidroalanina (anhidro fXa), tal como se describe en Nogami, y col., J. Biol. Chem. 1999, 274(43): 31000-7. FXa con serina en el sitio activo (Ser379 en numeracion de fX tal como se muestra en la SEQ ID NO. 7, y Ser195 en numeracion de quimotripsina) sustituida por alanina (fXa-S379A en numeracion de fX, o fXa-S195A en numeracion de quimotripsina), donde la actividad procoagulante se elimino, tambien pueden usarse como antfdotos de inhibidores de fXa. La invencion tambien preve derivados de fXa con el residuo serina del sitio activo acilado de forma irreversible que aun es capaz de unirse a inhibidores de molecula pequena. FXa con la serina del sitio activo acilada de forma reversible ha sido descrita por Wolf, y col., Blood, 1995, 86(11): 4153-7. Dicha acilacion reversible, sin embargo, es capaz de produccion dependiente del tiempo de fXa activo y pude conducir a un exceso de fXa activo durante un periodo de tiempo. La velocidad de desacilacion puede reducirse mediante estrategias similares a las descritas en Lin P.H. y col., Thrombosis Res., 1997, 88(4), 365-372. Por ejemplo, moleculas de fXa con Ser379 (Ser195 en numeracion de quimotripsina) acilada mediante grupos 4-metoxibencilo y 3-bromo-4-metoxibencilo recuperan menos del 50% de su actividad original cuando se incuban en un tampon que tiene pH 7,5 a 37°C durante 4 horas.
Una realizacion se refiere al uso de derivados de fXa con mutaciones en residuos de fXa que se sabe que son importantes para interaccion de fXa con el cofactor fV/fVa. Dichos residuos incluyen, sin limitacion, Arg306, Glu310, Arg347, Lys351 o Lys414 (SEQ ID NO. 3 y 7, estos aminoacidos corresponden a Arg125, Glu129, Arg165, Lys169, Lys230 en la numeracion de quimotripsina). Los ejemplos de dichos mutantes se describen en Rudolph, A.E. y col., J. Bio. Chem., 2001, 276: 5123-5128. Ademas, mutaciones en residuos de fXa que se sabe que son importante para la interaccion fVIII/fVIIIa, tales como Arg424 en la SEQ ID NO. 3 y 7 (Arg240 en numeracion de quimotripsina), tambien pueden usarse como antfdotos de inhibidores de fXa. Los ejemplos de dichos mutantes se describen en Nogami, K. y col., J. Biol. Chem., 2004, 279(32): 33104-33113.
Otra modificacion de residuos del sitio activo de fXa o residuos que se sabe que son importantes para interacciones con serina proteasa tambien pueden conducir a antfdotos utiles de esta invencion, por ejemplo, sustitucion de Glu216, Glu218, y Arg332 en la SEQ ID NO. 3 y 7 (Glu37, Glu39 y Arg150 en numeracion de quimotripsina, respectivamente) con otros residuos de aminoacido.
Una realizacion se refiere a mutaciones en el bucle de autolisis de la cadena pesada de FXa para eliminar la degradacion potencial. FXa, como otras serina proteasas de la familia, tiene un bucle de superficie expuesto (bucle de autolisis) que es susceptible a la escision por diversas proteasas. Este bucle, incluyendo los aminoacidos RTHEKGrQsTr (SEQ ID NO. 39), que son los aminoacidos 366 a 376 de la SEQ ID NO. 1, contiene varios restos cargados positivamente (Arg366, Lys370, Arg372, Arg376) con Arg372 como el sitio potencial de reconocimiento para la escision (Brandstetter H., et. al., J. Biol. Chem., 271 (1996), 29988-29992). Se completa que estos restos cargados estan mutados a Gln (Q) o Ala (A) para prohibir la posible escision. En un aspecto, la mutacion es Arg366Q/A. En otro aspecto, la mutacion es Lys370Q/A. En otro aspecto mas, la mutacion es Arg372Q/A. En otro aspecto mas, la mutacion es Arg376Q/A. En algunas realizaciones, un derivado de fXa tiene una o mas de dichas mutaciones.
Una realizacion de la invencion se refiere a un polipeptido aislado que tiene al menos un 95 % de homologfa a las SEQ ID NO. 12 o 13 que comprende ademas una o mas mutaciones seleccionadas entre el grupo que consiste en Arg366Q/A, Lys370Q/A, Arg372Q/A, Arg376Q/A y sus combinaciones. Los polipeptidos incluidos en la invencion incluyen tanto el polipeptido de cadena unica (es decir, antes de que el polipeptido se excrete de la celula), asf como el polipeptido de dos cadenas (es decir, despues de la escision en el enlazador despues de que se secreta de la celula).
En una realizacion, la actividad procoagulante residual de un antfdoto, segun lo evaluado mediante ensayo de escision de sustrato amidolftico, es < 1%, preferentemente < 0,1%, mas preferentemente < 0,05 % de fXa nativo derivado de plasma humano. Por ejemplo, no hay ninguna actividad procoagulante medible para fXa-S379A
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recombinante cuando el sitio activo Ser379 (S195 en numeracion de quimotripsina) es sustituido por un residuo de alanina segun lo medido mediante ensayos de coagulacion.
La invencion se refiere ademas a secuencias de acido nucleico, en particular secuencias de ADN, que codifican los derivados de fXa descritos anteriormente. Estas pueden determinarse facilmente traduciendo la secuencia polipeptfdica de vuelta a la secuencia de ADN correspondiente de acuerdo con el codigo genetico. Los codones usados preferentemente son aquellos que causan la expresion correcta en el organismo huesped requerido. Las secuencias de acido nucleico pueden prepararse mediante mutagenesis especffica de sitio comenzando a partir de la secuencia genica de fXa natural o incluso mediante sfntesis de ADN completo.
Polipeptidos de la invencion
En ciertos aspectos, la invencion se refiere a un polipeptido aislado que comprende
(A)
(i) la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO. 12 o 13 que comprende adicionalmente una modificacion en el bucle de autolisis de la cadena pesada de la SEQ ID NO. 12 o 13 o
(ii) una secuencia de aminoacidos que tiene al menos el 95 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO. 12 o 13, y que comprende adicionalmente una o mas mutaciones seleccionadas entre el grupo que consiste en Arg366Q/A, Lys370Q/A, Arg372Q/A, Arg376Q/A, y combinaciones de los mismos;
en el que el bucle de autolisis corresponde a los restos de aminoacidos 366-376 de la SEQ ID NO. 1;
(B) la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO. 20 o una secuencia de aminoacidos que tiene al menos el 95 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO. 20, en la que el polipeptido no contiene el extremo C-terminal del factor Xa de tipo silvestre despues del resto de aminoacido que corresponde a Arg429 de la SEQ ID NO. 3;
(C) la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO. 21 o una secuencia de aminoacidos que tiene al menos el 95 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO. 21, en la que el polipeptido tiene Gln en el resto de aminoacido correspondiente a Arg429 de la SEQ ID NO. 3; o
(D) la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO. 22 o una secuencia de aminoacidos que tiene al menos el 95 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO. 22, en la que el polipeptido tiene Gln en el resto de aminoacido que corresponde a Arg429 de la SEQ ID NO. 3, y
tiene Ala en el resto de aminoacido que corresponde a Thr443 de la SEQ ID NO. 3, en el que el polipeptido (a) tiene una actividad procoagulante reducida en comparacion con el factor Xa de tipo silvestre, (b) es capaz de unirse a un inhibidor del factor Xa, y (c) no se ensambla en un complejo de protrombinasa.
Los polipeptidos que comprenden las secuencias de aminoacidos de la invencion pueden prepararse expresando polinucleotidos que codifican las secuencias polipeptfdicas de esta invencion en una celula huesped apropiada. Esto puede conseguirse mediante procedimientos de tecnologfa de ADN recombinante conocidos por los expertos en la materia. Por consiguiente, esta invencion tambien proporciona procedimientos para producir de forma recombinante los polipeptidos de esta invencion en una celula huesped eucariota o procariota. Las protefnas y polipeptidos de esta invencion tambien pueden obtenerse mediante sfntesis qufmica usando un sintetizador de peptidos automatizado disponible en el mercado tal como los fabricados por Perkin Elmer/Applied Biosystems, Inc., Modelo 430A o 431A, Foster City, CA, EE. UU. La protefna o polipeptido sintetizado pueden precipitarse y purificarse adicionalmente, por ejemplo mediante cromatograffa lfquida de alta resolucion (HPLC). Por consiguiente, esta divulgacion tambien proporciona un proceso para sintetizar qufmicamente las protefnas de esta invencion proporcionando la secuencia de la protefna y reactivos, tales como aminoacidos y enzimas y uniendo entre sf los aminoacidos en la orientacion y la secuencia lineal apropiadas.
Es conocido para los expertos en la materia que pueden realizarse modificaciones a cualquier peptido para proporcionarle propiedades alteradas. Los polipeptidos de la invencion pueden modificarse para incluir aminoacidos no naturales. Por lo tanto, los peptidos pueden comprender D-aminoacidos, una combinacion de D- y L-aminoacidos, y diversos aminoacidos “de diseno” (por ejemplo, p-metil aminoacidos, C-a-metil aminoacidos, y N-a-metil aminoacidos, etc.) para llevar propiedades especiales a peptidos. Adicionalmente, asignando aminoacidos especfficos en etapas de acoplamiento especfficas, pueden generarse peptidos con helices a, giros p, laminas p, giros a, y peptidos cfclicos. Generalmente, se cree que se prefiere estructura secundaria a-helicoidal o estructura secundaria aleatoria.
En una realizacion adicional, se seleccionaran subunidades de polipeptidos que otorgan propiedades qufmicas y estructurales utiles. Por ejemplo, peptidos que comprenden D-aminoacidos pueden ser resistentes a proteasas especfficas de L-aminoacidos in vivo. Compuestos modificados con D-aminoacidos pueden sintetizarse con los aminoacidos alineados en orden inverso para producir los peptidos de la invencion como peptidos retro-inversos. Ademas, la presente invencion preve preparar peptidos que tienen propiedades estructurales mejor definidas, y el uso de peptidomimeticos, y enlaces peptidomimeticos, tales como enlaces ester, para preparar peptidos con propiedades novedosas. En otra realizacion, puede generarse un peptido que incorpore un enlace peptfdico
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reducido, es decir, R1-CH2NH-R2, donde R1, y R2 son residuos o secuencias de aminoacido. Un enlace peptfdico reducido puede introducirse como una subunidad dipeptido. Dicha molecula serfa resistente a hidrolisis de enlaces peptfdicos, por ejemplo, actividad proteasa. Dichas moleculas proporcionarfan ligandos con funcion y actividad unicas, tales como semividas prolongadas in vivo debido a resistencia a descomposicion metabolica, o actividad proteasa. Ademas, es bien conocido que, en ciertos sistemas, peptidos constrenidos muestran actividad funcional mejorada (Hruby (1982) Life Sciences 31: 189-199 y Hruby y col., (1990) Biochem J. 268: 249-262); la presente invencion proporciona un procedimiento para producir un peptido constrenido que incorpora secuencias aleatorias en todas las demas posiciones.
Los siguientes aminoacidos no convencionales pueden incorporarse en los peptidos de la invencion para introducir motivos conformacionales particulares: 1,2,3,4-tetrahidroisoquinolina-3-carboxilato (Kazrnierski y col., (1991) J. Am. Chem. Soc. 113: 2275-2283. ); (2S, 3S)-metil-fenilalanina, (2S, 3R)-metil-fenilalanina, (2R, 3S)-metil-fenilalanina y (2R, 3R)-metil-fenilalanina (Kazmierski y Hruby (1991) Tetrahedron Lett 32 (41): 5769-5772); acido 2- aminotetrahidronaftaleno-2-carboxflico (Landis (1989) Tesis Doctoral, Universidad de Arizona); hidroxi-1,2,3,4- tetrahidroisoquinolina-3-carboxilato (Miyake y col., (1989) J. Takeda Res Labs. 43:53-76) acido carboxflico de histidina e isoquinolina (Zechel y col., (1991) Int. J. Pep Protein Res 38 (2): 131-138); e HIC (histidina urea cfclica), (Dharanipragada y col., (1993) Int. J. Pep. Protein Res 42 (1): 68-77)) y (Dharanipragada y col., (1992) Acta. Crystallogr. C. 48: 1239-1241).
Los siguientes analogos de aminoacido y peptidomimeticos pueden incorporarse en un peptido para inducir o favorecer estructuras secundarias especfficas: LL-Acp (acido LL-3-amino-2-propenidona-6-carboxflico), un analogo de dipeptido que induce giros p (Kemp y col., (1985) J. Org. Chem. 50: 5834-5838); analogos que inducen lamina p (Kemp y col., (1988) Tetrahedron Lett. 29: 5081-5082); analogos que inducen giro p (Kemp y col., (1988) Tetrahedron Lett. 29: 5057-5060); analogos que inducen helice a (Kemp y col., (1988) Tetrahedron Lett. 29: 49354938); analogos que inducen giro a (Kemp y col., (1989) J. Org. Chem. 54: 109:115); analogos proporcionados por las siguientes referencias: Nagai y Sato (1985) Tetrahedron Lett. 26: 647-650; y DiMaio y col., (1989) J. Chem. Soc. Perkin Trans. p. 1687; un analogo de giro Gly-Ala (Kahn y col., (1989) Tetrahedron Lett. 30: 2317); isostero de enlace amida (Clones y col., (1988) Tetrahedron Lett. 29: 3853-3856); tetrazol (Zabrocki y col., (1988) J. Am. Chem. Soc. 110: 5875-5880); DTC (Samanen y col., (1990) Int. J. Protein Pep. Res. 35: 501:509); y analogos ensenados en Olson y col., (1990) J. Am. Chem. Sci. 112: 323-333 y Garvey y col., (1990) J. Org. Chem. 56: 436. Mimeticos restringidos conformacionalmente de giros beta y protuberancias beta, y peptidos que los contienen, se describen en la patente de Estados Unidos N.° 5.440.013, expedida el 8 de agosto de 1995 a Kahn.
Es conocido por los expertos en la materia que pueden realizarse modificaciones a cualquier peptido sustituyendo uno o mas aminoacidos con uno o mas aminoacidos funcionalmente equivalentes que no alteran la funcion biologica del peptido. En un aspecto, el aminoacido que es sustituido por un aminoacido que posee propiedades intrfnsecas similares incluyendo, aunque sin limitacion, hidrofobicidad, tamano o carga. Procedimientos usados para determinar el aminoacido apropiado a sustituir y por que aminoacido, son conocidos para un experto en la materia. Los ejemplos no limitantes incluyen modelos de sustitucion empfricos tal como se describe por Dahoff y col., (1978) en Atlas of Protein Sequence and Structure Vol. 5 supl. 2 (ed. M.O. Dayhoff), pags. 345-352. National Biomedical Research Foundation, Washington DC; Matrices PAM incluyendo matrices de Dayhoff (Dahoff y col., (1978), supra, o matrices JTT tal como se describe por Jones y col., (1992) Comput. Appl. Biosci. 8: 275-282 y Gonnet y col., (1992) Science 256: 1443-1145; el modelo empfrico descrito por Adach y Hasegawa (1996) J. Mol. Evol. 42: 459-468; las matrices de sustitucion de bloques (BLOSUM) segun lo descrito por Henikoff y Henikoff (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU. 89:109; modelos de Poisson segun lo descrito por Nei (1987) Molecular Evolutionary Genetics. Columbia University Press, New York.; y el procedimiento de la Maxima Probabilidad (ML) segun lo descrito por Muller y col., (2002) Mol. Biol. Evol. 19: 8-13.
Conjugados polipeptfdicos
Los polipeptidos y complejos polipeptfdicos de la invencion pueden usarse en diversas formulaciones, que pueden variar dependiendo del uso pretendido. Por ejemplo, uno o mas pueden estar enlazados (complejados) de forma covalente o no covalente a diversas otras moleculas, cuya naturaleza puede variar dependiendo del fin particular. Por ejemplo, un peptido de la invencion puede complejarse de forma covalente o no covalente con un transportador macromolecular, incluyendo, aunque sin limitacion, polfmeros, protefnas, polisacaridos, polipeptidos (aminoacidos), alcohol polivinflico, polivinilpirrolidona, y lfpidos naturales y sinteticos. Un peptido puede estar conjugado a un acido graso, para introduccion en un liposoma, vease la patente de Estados Unidos N.° 5.837.249. Un peptido de la invencion puede complejarse de forma covalente o no covalente con un soporte solido, de los cuales se conoce una variedad en la tecnica y se describen en el presente documento. Un epftopo de peptido antigenico de la invencion puede estar asociado con una matriz de presentacion de antfgenos tal como un complejo MHC con o sin moleculas coestimuladoras.
Los ejemplos de transportadores de protefna incluyen, aunque sin limitarse a, superantfgenos, albumina de suero, toxoide tetanico, ovoalbumina, tiroglobulina, mioglobulina e inmunoglobulina.
Polfmeros transportadores de peptido-protefna pueden formarse usando agentes de reticulacion convencionales
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tales como carbodiimidas. Son ejemplos de carbodiimidas 1-ciclohexil-3-(2-morfolinil-(4-etil) carbodiimida (CMC), 1- etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC) y 1-etil-3-(4-azonia-44-dimetilpentil) carbodiimida.
Son ejemplos de otros agentes de reticulacion adecuados bromuro de cianogeno, glutaraldehfdo y anhfdrido succfnico. En general, cualquiera de una serie de agentes homobifuncionales incluyendo un aldehfdo homobifuncional, un epoxido homobifuncional, un imido-ester homobifuncional, un ester de N-hidroxisuccinimida homobifuncional, una maleimida homobifuncional, un haluro de alquilo homobifuncional, un disulfuro de piridilo homobifuncional, un haluro de arilo homobifuncional, una hidrazida homobifuncional, un derivado de diazonio homobifuncional y un compuesto fotorreactivo homobifuncional pueden utilizarse. Tambien se incluyen compuestos heterobifuncionales, por ejemplo, compuestos que tienen un amina-reactivo y un grupo sulfhidrilo-reactivo, compuestos con un amina-reactivo y un grupo fotorreactivo y compuestos con un carbonilo-reactivo y un grupo sulfhidrilo-reactivo.
Ejemplos especfficos de dichos agentes de reticulacion homobifuncionales incluyen los ditiobis N-hidroxisuccinimida esteres (succinimidilpropionato) bifuncionales, suberato de disuccinimidilo, y tartrato de disuccinimidilo; los imido- esteres de adipimidato de dimetilo bifuncionales, pimelimidato de dimetilo, y suberimidato de dimetilo; los agentes de reticulacion sulfhidrilo-reactivo bifuncionales 1,4-di-[3'-(2'-piridilditio)propionamido]butano, bismaleimidohexano, y bis- N-maleimido-1,8-octano; los haluros de arilo bifuncionales 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenceno y 4,4'-difluoro-3,3'- dinitrofenulsulfona; agentes fotorreactivos bifuncionales tales como bis-[b-(4-azidosalicilamido)etil]disulfuro; los aldehfdos bifuncionales formaldehfdo, malondialdehfdo, succinaldehfdo, glutaraldehfdo y adipaldehfdo; un epoxido bifuncional tal como 1,4-butanodiol diglicidil eter; la hidrazidas bifuncionales dihidrazida de acido adfpico, carbohidrazida y dihidrazida de acido succfnico; los diazonios bifuncionales o-tolidina, diazotan y bencidina bis- diazotan; los haluros de alquilo bifuncionales N1N'-etilen-bis(yodoacetamida), N1N'-hexametilen-bis (yodoacetamida), N1N'-undecametilen-bis(yodoacetamida), asf como haluros de bencilo y halomostazas, como acido ala'-diyodo-p-xileno sulfonico y tri(2-cloroetil)amina, respectivamente.
Los ejemplos de agentes de reticulacion heterobifuncionales comunes que pueden usarse para efectuar la conjugacion de protefnas a peptidos incluyen, aunque sin limitarse a, SMCC (succinimidil-4-(N- maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato), MBS (m-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida ester), SIAB (N- succinimidil(4-yodoacetil)aminobenzoato), SMPB (succinimidil-4-(p-maleimidofenil)butirato), GMBS (N-(y-
maleimidobutiriloxi)succinimida ester), MPBH hidrazida de acido (4-(4-N-maleimidofenil) butfrico), M2C2H (4-(N- maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilo-hidrazida), SMPT (succinimidiloxicarbonil-a-metil-a-(2-piridilditio)tolueno), y SPDP (3-(2-piridilditio)propionato de N-succinimidilo).
La reticulacion puede conseguirse acoplando un grupo carbonilo a un grupo amino o un grupo hidrazida mediante aminacion reductora.
Los peptidos de la invencion tambien se pueden formular como union no covalente de monomeros a traves de interacciones ionicas, de adsorcion o bioespecfficas. Los complejos de peptidos con moleculas altamente cargadas positiva o negativamente se pueden realizar a traves de la formacion de puentes de sal en ambientes de fuerza ionica baja, tales como en agua desionizada. Pueden crearse complejos grandes usando polfmeros cargados tales como acido poli-(L-glutamico) o poli-(L-lisina) que contienen numerosas cargas negativas y positivas, respectivamente. La adsorcion de peptidos se puede realizar a superficies tales como perlas de latex de micropartfculas o a otros polfmeros hidrofobos, formando complejos de peptido-superantfgeno asociados no covalentemente que imitan de manera efectiva la protefna reticulada o polimerizada qufmicamente. Finalmente, los peptidos pueden estar enlazados no covalentemente a traves del uso de interacciones bioespecfficas entre otras moleculas. Por ejemplo, la utilizacion de la fuerte afinidad de la biotina por protefnas tales como avidina o estreptavidina o sus derivados se podrfa utilizar para formar complejos peptfdicos. Estas protefnas de union a biotina contienen cuatro sitios de union que pueden interactuar con biotina en solucion o unirse covalentemente a otra molecula. (Vease Wilchek (1988) Anal Biochem 171: 1-32). Los peptidos pueden ser modificados para poseer grupos biotina usando reactivos de biotinilacion comunes tales como el ester de N-hidroxisuccinimidilo de D-biotina (NHS-biotina) que reacciona con los grupos amino disponibles de la protefna. Peptidos biotinilados pueden ser incubados a continuacion con avidina o estreptavidina para crear complejos grandes. La masa molecular de dichos polfmeros puede ser regulada a traves de un control cuidadoso de la relacion molar del peptido biotinilado con respecto a la avidina o estreptavidina.
Tambien se proporcionan mediante esta solicitud los peptidos y polipeptidos descritos en el presente documento conjugados a una etiqueta, por ejemplo, una etiqueta fluorescente o bioluminiscente, para uso en los procedimientos de diagnostico. Por ejemplo, peptidos y polipeptidos etiquetados de forma detectable pueden estar unidos a una columna y usarse para la deteccion y purificacion de anticuerpos. Las etiquetas fluorescentes adecuadas incluyen, aunque sin limitarse a, fluorescefna, rodamina, tetrametilrrodamina, eosina, eritrosina, cumarina, metil-cumarinas, pireno, verde Malaquita, estilbeno, Lucifer Yellow, Cascade Blue ™, y Rojo Texas. Otros colorantes opticos adecuados se describen en Haugland, Richard P. (1996) Molecular Probes Handbook.
Los polipeptidos de esta invencion tambien pueden combinarse con diversos transportadores en fase lfquida, tales como soluciones esteriles o acuosas, transportadores farmaceuticamente aceptables, suspensiones y emulsiones.
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Los ejemplos de disolventes no acuosos incluyen propiletilenglicol, polietilenglicol y aceites vegetales. Cuando se usan para preparar anticuerpos, los transportadores tambien pueden incluir un adyuvante que es util para aumentar inespecfficamente una respuesta inmunitaria especffica. Un experto en la materia puede determinar facilmente si se requiere un adyuvante y seleccionar uno. Sin embargo, para fin de ilustracion solamente, los adyuvantes adecuados incluyen, aunque sin limitarse a, adyuvante completo de Freund, adyuvante incompleto de Freund y sales minerales.
Celulas huesped
Tambien son proporcionadas celulas huesped que comprenden uno o mas de los polipeptidos de esta invencion. En un aspecto, los polipeptidos se expresan y presentan en la superficie celular (de forma extracelular). Celulas adecuadas que contienen los polipeptidos de la invencion incluyen celulas procariotas y eucariotas, que incluyen, aunque sin limitarse a, celulas bacterianas, celulas de levadura, celulas de insecto, celulas animales, celulas de mamffero, celulas murinas, celulas de rata, celulas de oveja, celulas de simio y celulas humanas. Los ejemplos de celulas bacterianas incluyen Escherichia coli, Salmonella enterica y Streptococcus gordonii. Las celulas pueden adquirirse de un proveedor comercial tales como la American Type Culture Collection (ATCC, Rockville Maryland, EE. UU.) o cultivarse a partir de un aislado usando procedimientos conocidos en la tecnica. Los ejemplos de celulas eucariotas adecuadas incluyen, aunque sin limitarse a, celulas 293T HEK, asf como la lfnea celular de hamster CHO, BHK-21; las lfneas celulares murinas designadas NIH3T3, NS0, C127, las lfneas celulares de simio COS, Vero; y las lfneas celulares humanas HeLa, PER.C6 (disponible en el mercado de Crucell) U-937 y Hep G2. Un ejemplo no limitante de celulas de insecto incluyen Spodoptera frugiperda. Los ejemplos de levaduras utiles para la expresion incluyen, aunque sin limitarse a Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Hansenula, Candida, Torulopsis, Yarrowia o Pichia. Vease por ejemplo, las patentes de Estados Unidos N.° 4.812.405; 4.818.700; 4.929.555; 5.736.383; 5.955.349; 5.888.768 y 6.258.559.
Ademas de especificidad de especie, las celulas pueden ser de cualquier tipo de tejido particular tal como neuronal o como alternativa una celula madre somatica o embrionaria tal como una celula madre que puede o no puede diferenciarse en una celula neuronal, por ejemplo, celula madre embrionaria, celula madre adiposa, celula madre neuronal y celula madre hematopoyetica. La celula madre puede ser de origen humano o animal, tal como de mamffero.
Polinucleotidos aislados y composiciones
Esta invencion tambien proporciona los polinucleotidos complementarios a las secuencias identificadas anteriormente o sus complementos. La complementariedad puede determinarse usando hibridacion tradicional en condiciones de astringencia moderada o alta. Tal como se usa en el presente documento, el termino polinucleotido pretende ADN y ARN asf como nucleotidos modificados. Por ejemplo, esta invencion tambien proporciona la cadena de polinucleotido antisentido, por ejemplo ARN antisentido a estas secuencias o sus complementos.
Tambien son proporcionados por la divulgacion polinucleotidos que codifican polipeptidos sustancialmente homologos y biologicamente equivalentes a los polipeptidos y complejos polipeptfdicos de la invencion. Sustancialmente homologos y biologicamente equivalentes pretende incluir aquellos que tienen grados de homologfa variables, tales como al menos el 65%, o como alternativa, al menos el 70%, o como alternativa, al menos el 75%, o como alternativa al menos el 80%, o como alternativa, al menos el 85%, o como alternativa al menos el 90%, o como alternativa, al menos el 95%, o como alternativa al menos el 97% homologos, tal como se ha definido anteriormente, y que codifican polipeptidos que tienen la actividad biologica para unirse a inhibidores del factor Xa y no se ensamblan en el complejo de protrombinasa, tal como se describe en el presente documento. Debe entenderse, aunque no siempre se afirme explfcitamente, que realizaciones para polipeptidos y polinucleotidos sustancialmente homologos estan destinadas para cada aspecto de esta invencion, por ejemplo, polipeptidos, polinucleotidos y anticuerpos.
Los polinucleotidos de esta invencion pueden replicarse usando tecnicas recombinantes convencionales. Como alternativa, los polinucleotidos pueden replicarse usando tecnologfa de PCR. La PCR es el asunto de las patentes de Estados Unidos N.° 4.683.195; 4.800.159; 4.754.065; y 4.683.202 y se describe en PCR: The Polymerase Chain Reaction (Mullis y col., eds, Birkhauser Press, Boston (1994)) y referencias citadas en ese documento. Es mas, un experto en la materia puede usar las secuencias proporcionadas en el presente documento y un sintetizador de ADN comercial para replicar el ADN. Por consiguiente, esta divulgacion tambien proporciona un proceso para obtener los polinucleotidos de esta invencion proporcionando la secuencia lineal del polinucleotido, moleculas de cebador apropiadas, productos qufmicos tales como enzimas e instrucciones para su replicacion y replicar o enlazar qufmicamente los nucleotidos en la orientacion apropiada para obtener los polinucleotidos. En una realizacion diferente, estos polinucleotidos se afslas adicionalmente. Es mas, un experto en la materia puede enlazar de forma operativa los polinucleotidos a secuencias reguladoras para su expresion en una celula huesped. Los polinucleotidos y las secuencias reguladoras se insertan en la celula huesped (procariota o eucariota) para replicacion y amplificacion. El ADN amplificado de este modo puede aislarse de la celula mediante procedimientos bien conocidos por los expertos en la materia. Un proceso para obtener polinucleotidos mediante este procedimiento se proporciona adicionalmente en el presente documento asf como los polinucleotidos obtenidos de este modo.
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Puede obtenerse ARN insertando en primer lugar un polinucleotido de ADN en una celula huesped procariota o eucariota adecuada. El ADN puede insertarse mediante cualquier procedimiento apropiado, por ejemplo, mediante el uso de un vehfculo de suministro de genes apropiado (por ejemplo, liposoma, plasmido o vector) o mediante electroporacion. Cuando la celula se replica y el ADN es transcrito a ARN; el ARN puede aislarse a continuacion usando procedimientos bien conocidos por los expertos en la materia, por ejemplo, tal como se describe en Sambrook y Russell (2001) sura. Por ejemplo, puede aislarse mARN usando diversas enzimas lfticas o soluciones qufmicas de acuerdo con los procedimientos descritos en Sambrook y Russell (2001) supra o extraerse mediante resinas de union a acido nucleico siguiendo las instrucciones adjuntas proporcionadas por los fabricantes.
En un aspecto, el ARN es ARN interferente pequeno, tambien conocido como siARN. Los procedimientos para preparar y cribar ARN interferente y seleccionarlo por la capacidad de bloquear la expresion de polinucleotidos se conocen en la tecnica y ejemplos no limitantes de los mismos se muestran a continuacion Estos ARN interferentes son proporcionados por esta divulgacion.
Las secuencias de siARN pueden disenarse obteniendo la secuencia de mARN diana y determinando una secuencia complementaria de siARN apropiada. Los siARN de la invencion estan disenados para interactuar con una secuencia diana, lo que significa que complementan una secuencia diana suficientemente para hibridar con esa secuencia. Un siARN puede ser el 100% identico a la secuencia diana. Sin embargo, la homologfa de la secuencia de siARN con la secuencia diana puede ser menor del 100% siempre que el siARN pueda hibridar con la secuencia diana. Por lo tanto, por ejemplo, la molecula de siARN puede ser al menos un 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% identica a la secuencia diana o el complemento de la secuencia diana. Por lo tanto, tambien pueden usarse moleculas de siARN con inserciones, deleciones o mutaciones puntuales individuales con respecto a una diana. La generacion de varias secuencias de siARN diferentes por mARN diana se recomienda para permitir el cribado para la secuencia diana optima. Una busqueda de homologfa, tal como una busqueda BLAST, debe realizarse para garantizar que la secuencia de siARN no contiene homologfa a ningun gen de mamffero conocido.
En general, es preferible que la secuencia diana este ubicada a al menos 100-200 nucleotidos del codon de inicio AUG y al menos a 50-100 nucleotidos del codon de terminacion del mARN diana (Duxbury (2004) J. Surgical Res. 117: 339-344).
Los investigadores han determinado que ciertas caracterfsticas son comunes en moleculas de siARN que silencian eficazmente su gen diana (Duxbury (2004) J. Surgical Res. 117: 339-344; Ui-Tei y col., (2004) Nucl. Acids Res. 32: 936-48). Como gufa general, siARN que incluyen una o mas de las siguientes condiciones son particularmente utiles en silenciacion de genes en celulas de mamffero: proporcion GC de entre 45-55%, sin series de mas de 9 residuos G/C, G/C en el extremo 5' de la cadena sentido; A/U en el extremo 5' de la cadena antisentido; y al menos 5 residuos A/U en las primeras 7 bases del extremo 5' de la cadena antisentido.
Los siARN son, en general, de aproximadamente 10 a aproximadamente 30 nucleotidos de longitud. Por ejemplo, el siARN puede ser de 10-30 nucleotidos de largo, 12-28 nucleotidos de largo, 15-25 nucleotidos de largo, 19-23 nucleotidos de largo o 21-23 nucleotidos de largo. Cuando un siARN contiene dos cadenas de diferentes longitudes, la mas larga de las cadenas designa la longitud del siARN. En esta situacion, los nucleotidos no emparejados de la cadena mas larga formarfan un saliente.
El termino siARN incluye ARN de horquilla corto (shARN). Los shARN comprenden una unica cadena de ARN que forma una estructura tallo-bucle, donde el tallo consiste en las cadenas sentido y antisentido complementarias que comprenden un siARN bicatenario, y el bucle es un enlazador de tamano variable. La estructura del tallo de los shARN generalmente es de aproximadamente 10 a aproximadamente 30 nucleotidos de largo. Por ejemplo, el tallo puede ser de 10-30 nucleotidos de largo, 12-28 nucleotidos de largo, 15-25 nucleotidos de largo, 19-23 nucleotidos de largo o 21-23 nucleotidos de largo.
Herramientas para ayudar al diseno de siARN estan facilmente disponibles para el publico. Por ejemplo, una herramienta de diseno de siARN basado en ordenador esta disponible en internet en
www.dharmacon.com, ultimo acceso el 26 de noviembre de 2007.
www.dharmacon.com, ultimo acceso el 26 de noviembre de 2007.
Sfntesis de dsARN y siARN
dsARN y siARN pueden sintetizarse qufmica o enzimaticamente in vitro tal como se describe en Micura (2002) Agnes Chem. Int. Ed. Emgl. 41: 2265-2269; Betz (2003) Promega Notes 85: 15-18; y Paddison y Hannon (2002) Cancer Cell. 2: 17-23. La sfntesis qufmica puede realizarse mediante procedimientos manuales o automatizados, ambos de los cuales se conocen bien en la tecnica, tal como se describe en Micura (2002), supra. El siARN tambien puede expresarse de forma endogena dentro de las celulas en forma de shARN tal como se describe en Yu y col., (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU. 99: 6047-6052; y McManus y col., (2002) RNA 8: 842-850. La expresion endogena se ha conseguido usando sistemas de expresion basados en plasmido usando pequenos promotores de ARN nuclear, tales como ARN polimerasa III U6 o H1, o ARN polimerasa II U1 tal como se describe en Brummelkamp y col., (2002) Science 296: 550-553 (2002); y Novarino y col., (2004) J. Neurosci. 24: 5322-5330.
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La sfntesis enzimatica in vitro de dsARN y siARN puede realizarse usando un proceso mediado por ARN polimerasa para producir cadenas sentido y antisentido individuales que se hibridan in vitro antes del suministro al interior de las celulas elegidas, tal como se describe en Fire y col., (1998) Nature 391: 806-811; Donze y Picard (2002) Nucl. Acids Res. 30(10): e46; Yu y col., (2002); y Shim y col., (2002) J. Biol. Chem. 277: 30413-30416. Varios fabricantes (Promega, Ambion, New England Biolabs, y Stragene) producen kits de transcripcion utiles para realizar la sfntesis in vitro.
La sfntesis in vitro de siARN puede conseguirse, por ejemplo, usando un par de oligonucleotidos dobles cortos que contienen promotores de T7 ARN polimerasa cadena arriba de las secuencias de ARN sentido y antisentido como plantilla de ADN. Cada oligonucleotido del duplex es una plantilla diferente para la sfntesis de una cadena del siARN. Las cadenas de ARN cortas diferentes que se sintetizan se hibridan a continuacion para formar siARN tal como se describe en Protocols and Applications, Chapter 2: RNA interference, Promega Corporation, (2005).
La sfntesis in vitro de dsARN puede conseguirse, por ejemplo, usando un promotor de T7 ARN polimerasa en los extremos 5' de ambas cadenas de la secuencia diana de ADN. Esto se consigue usando plantillas de ADN diferentes, que contienen, cada una, la secuencia diana en una orientacion diferente con respecto al promotor T7, transcritas en dos reacciones diferentes. Los transcritos resultantes se mezclan e hibridan de forma posttranscripcional. Plantillas de ADN usadas en esta reaccion pueden crearse mediante PCR o usando dos plantillas de plasmido linealizadas, que contienen, cada una, el promotor de T7 polimerasa en un extremo diferente de la secuencia diana. Protocols and Applications, Chapter 2: RNA interference, Promega Corporation, (2005).
Para expresar las protefnas descritas en el presente documento, el suministro de secuencias de acido nucleico que codifican el gen de interes pueden suministrarse mediante varias tecnicas. Ejemplos de los cuales incluyen tecnologfas virales (por ejemplo vectores retrovirales, vectores de adenovirus, vectores de virus adenoasociados, vectores de alfavirus y similares) y tecnologfas no virales (por ejemplo complejos ADN/liposoma, micelas y complejos de protefna-ADN viral dirigidos) tal como se describe en el presente documento. Una vez dentro de la celula de interes, la expresion del transgen puede estar bajo el control de promotores ubicuos (por ejemplo EF-1a) o promotores especfficos de tejido (por ejemplo el promotor de calcio calmodulina quinasa 2 (CaMKI), promotor NSE y promotor Thy-1 humano). Como alternativa, los niveles de expresion pueden controlarse mediante el uso de un sistema promotor inducible (por ejemplo promotor Tet on/off) tal como se describe en Wiznerowicz y col., (2005) Stem Cells 77: 8957-8961.
Los ejemplos no limitantes de promotores incluyen, aunque sin limitarse a, el promotor de citomegalovirus (CMV) (Kaplitt y col., (1994) Nat. Genet. 8: 148-154), promotor CMV/humano p3-globina (Mandel y col., (1998) J. Neurosci. 18: 4271-4284), promotor NCX1, promotor aMHC, promotor MLC2v, promotor GFAP (Xu y col., (2001) Gene Ther., 8: 1323-1332), el promotor de enolasa especffica de neuronas de 1,8-kb (NSE) (Klein y col., (1998) Exp. Neurol. 150: 183-194), el promotor de beta actina de pollo (CBA) (Miyazaki (1989) Gene 79: 269-277) y el promotor de p- glucuronidasa (GUSB) (Shipley y col., (1991) Genetics 10: 1009-1018), el promotor de albumina de suero humano, el promotor de alfa-1-antitripsina. Para mejorar la expresion, otros elementos reguladores pueden unirse adicionalmente de forma operativa al transgen, tales como, por ejemplo, el elemento post-regulador del virtus e la Hepatitis de marmota (wPrE) (Donello y col., (1998) J. Virol. 72: 5085-5092) o el sitio de poliadenilacion de hormona del crecimiento bovina (BGH).
Tambien se desvela en el presente documento una sonda o cebador de polinucleotidos que comprende al menos 10, o como alternativa, al menos17 o como alternativa al menos 20, o como alternativa, al menos 50, o como alternativa, al menos 75 polinucleotidos, o como alternativa al menos 100 polinucleotidos que codifican las SEQ ID NO: 12 a 15 o sus complementos. Sondas y cebadores adecuados se han descrito supra. En la tecnica se conoce que una sonda “perfectamente emparejada” no es necesaria para una hibridacion especffica. Cambios secundarios en la secuencia de la sonda conseguidos mediante sustitucion, delecion o insercion de un pequeno numero de bases no afectan a la especificidad de hibridacion. En general, puede tolerarse hasta el 20% de emparejamiento erroneo de pares de bases (cuando estan alineadas de forma optima). Una sonda util para detectar el mARN mencionado anteriormente es al menos aproximadamente el 80% identica a la region homologa de tamano comparable contenida en las secuencias identificadas previamente (identificadas anteriormente) que corresponden a polinucleotidos caracterizados previamente de esta invencion. Como alternativa, la sonda es el 85% identica a la secuencia genica correspondiente despues del alineamiento de la segundo homologa; y es mas, muestra un 90% de identidad, o aun mas, al menos el 95% identica.
Estas sondas pueden usarse en radioensayos (por ejemplo analisis por transferencia de Southern y Northern) para detectar o monitorizar la expresion de los polinucleotidos o polipeptidos de esta invencion. Las sondas tambien pueden unirse a un soporte solido o una matriz tal como un chip para uso en ensayos de cribado de alto rendimiento para la deteccion de la expresion del gen correspondiente a uno o mas polinucleotidos de esta invencion.
Los polinucleotidos y fragmentos de los polinucleotidos de la presente invencion tambien pueden servir como cebadores para la deteccion de genes o transcritos de genes que se expresan en celulas neuronales, por ejemplo, para confirmar la transduccion de los polinucleotidos en celulas huesped. En este contexto, amplificacion significa
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cualquier procedimiento que emplea una polimerasa dependiente de cebador capaz de replicar una secuencia diana con fidelidad razonable. La amplificacion puede llevarse a cabo mediante ADN polimerasas naturales o recombinantes tales como T7 ADN polimerasa, fragmento de Klenow de ADN polimerasa de E. coli, y transcriptasa inversa. La longitud del cebador es la misma que la identificada para sondas, anteriormente.
La invencion proporciona ademas los polinucleotidos aislados de la presente invencion, enlazados de forma operativa a un promotor de la transcripcion de ARN, asf como otras secuencias reguladoras para replicacion y/o expresion transitoria o estable del ADN o ARN. Tal como se usa en el presente documento, la expresion “enlazado de forma operativa” significa posicionado de tal manera que el promotor dirigira la transcripcion de ARN de la molecula de ADN. Los ejemplos de dichos promotores son SP6, T4 y T7. En ciertas realizaciones, se usan promotores especfficos de celulas para expresion especffica de celulas del polinucleotido insertado. Vectores que contienen un promotor o un promotor/potenciador, con codones de terminacion y secuencias marcadoras seleccionables, asf como un sitio de clonacion en el que un trozo insertado de ADN puede estar enlazado de forma operativa a ese promotor, se conocen bien en la tecnica y estan disponibles en el mercado. Para estrategias de metodologfa y clonacion generales, vease Gene Expression Technology (Goeddel ed., Academic Press, Inc. (1991)) y referencias citadas en ese documento y Vectors: Essential Data Series (Gacesa and Ramji, eds., John Wiley & Sons, N.Y. (1994)), que contiene mapas, propiedades funcionales, proveedores comerciales y una referencia a los numeros de entrada de GenEMBL para diversos vectores adecuados. Preferentemente, estos vectores son capaces de transcribir ARN in vitro o in vivo.
Los vectores de expresion que contienen estos acidos nucleicos son utiles para obtener sistemas de vectores huesped para producir protefnas y polipeptidos. Se da a entender que estos vectores de expresion deben ser replicables en los organismos huesped ya sea como episomas o como una parte integrante del ADN cromosomico. Los vectores de expresion adecuados incluyen plasmidos, vectores virales, incluyendo adenovirus, virus adenoasociados, retrovirus, cosmidos, etc. Los vectores adenovirales son particularmente utiles para introducir genes en los tejidos in vivo debido a sus altos niveles de expresion y la transformacion eficiente de celulas tanto in vitro como in vivo. Cuando se inserta un acido nucleico en una celula huesped adecuada, por ejemplo, una celula procariota o una eucariota y la celula huesped se replica, la protefna puede producirse de forma recombinante. Las celulas huesped adecuadas dependeran del vector y pueden incluir celulas de mamffero, celulas animales, celulas humanas, celulas de simio, celulas de insecto, celulas de levadura y celulas bacterianas, tal como se ha descrito anteriormente y construirse usando procedimientos bien conocidos. Vease Sambrook y Russell (2001), supra. Ademas del uso de un vector viral para la insercion de un acido nucleico exogeno en las celulas, el acido nucleico se puede insertar en la celula huesped mediante procedimientos bien conocidos en la tecnica tales como la transformacion de celulas bacterianas; transfeccion usando precipitacion con fosfato calcico para celulas de mamffero; DEAE-dextrano; electroporacion; o microinyeccion. Vease Sambrook y Russell (2001), supra para esta metodologfa.
La presente divulgacion tambien proporciona vehfculos de suministro adecuados para el suministro de un polinucleotido de la invencion al interior de celulas (ya sea in vivo, ex vivo o in vitro). Un polinucleotido de la invencion puede estar contenido dentro de un vehfculo de suministro de genes, un vector de clonacion o un vector de expresion. Estos vectores (especialmente vectores de expresion) pueden ser manipulados, a su vez, para asumir cualquiera de una serie de formas que pueden, por ejemplo, facilitar el suministro a y/o la entrada en una celula.
Estas celulas huesped aisladas que contienen los polinucleotidos de esta invencion son utiles para la replicacion recombinante de los polinucleotidos y para la produccion recombinante de peptidos y para cribado de alto rendimiento.
Los polinucleotidos de esta invencion pueden conjugarse a una etiqueta detectable o combinarse con un transportador tal como un soporte solido o transportador farmaceuticamente aceptable. Los soportes solidos adecuados se han descrito anteriormente al igual que las etiquetas adecuadas. Procedimientos para unir una etiqueta a un polinucleotido son conocidos por los expertos en la materia. Vease Sambrook y Russell (2001), supra.
Composiciones de anticuerpos terapeuticas
Esta divulgacion tambien proporciona un anticuerpo capaz de formar especfficamente un complejo con una protefna o polipeptido de esta divulgacion, que son utiles en los procedimientos terapeuticos de la presente invencion. El termino “anticuerpo” incluye anticuerpos policlonales y anticuerpos monoclonales, fragmentos de anticuerpos, asf como derivados de los mismos (descritos anteriormente). Los anticuerpos incluyen, aunque no se limitan a, anticuerpos de raton, rata, y conejo o humanos. Los anticuerpos pueden ser producidos en cultivo celular, en un fago, o en diversos animales, incluyendo aunque sin limitarse a, vacas, conejos, cabras, ratones, ratas, hamsteres, cobayas, ovejas, perros, gatos, monos, chimpances, simios, etc. los anticuerpos tambien son utiles para identificar y purificar polipeptidos terapeuticos.
Esta divulgacion tambien proporciona un complejo anticuerpo-peptido que comprende los anticuerpos descritos anteriormente y un polipeptido que se une especfficamente al anticuerpo. En un aspecto, el polipeptido es el polipeptido contra el cual se genero el anticuerpo. En un aspecto, el complejo anticuerpo-peptido es un complejo
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aislado. En un aspecto adicional, el anticuerpo del complejo es, aunque sin limitarse a, un anticuerpo policlonal, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo humanizado o un derivado de anticuerpo descritos en el presente documento. Cualquiera o ambos del anticuerpo o el peptido del complejo anticuerpo-peptido puede ser etiquetado de forma detectable. En un aspecto, el complejo anticuerpo-peptido de la divulgacion se puede usar como una muestra de control o de referencia en los ensayos de diagnostico o cribado.
Los anticuerpos policlonales de la divulgacion se pueden generar usando tecnicas convencionales conocidas en la tecnica y que estan bien descritas en la literatura. Existen varias metodologfas para la produccion de anticuerpos policlonales. Por ejemplo, los anticuerpos policlonales se producen normalmente mediante inmunizacion de un mamffero adecuado, tal como, aunque sin limitarse a, pollos, cabras, cobayas, hamsteres, caballos, ratones, ratas y conejos. Un antfgeno se inyecta en el mamffero, que induce a los linfocitos B a producir inmunoglobulinas IgG especfficas para el antfgeno. Esta IgG se purifica a partir del suero de mamfferos. Las variaciones de esta metodologfa incluyen la modificacion de adyuvantes, vfas y punto de administracion, los volumenes de inyeccion por sitio y el numero de sitios por animal para la produccion optima y el trato humano de los animales. Por ejemplo, los adyuvantes normalmente se usan para mejorar o potenciar una respuesta inmunitaria a los antfgenos. La mayorfa de los adyuvantes posibilitan un deposito de antfgeno en el sitio de inyeccion, lo que permite una liberacion lenta del antfgeno en ganglios linfaticos de drenaje. Otros adyuvantes incluyen tensioactivos que promueven la concentracion de moleculas de antfgeno de protefna sobre una gran area superficial y moleculas inmunoestimulantes. Los ejemplos no limitantes de adyuvantes para la generacion de anticuerpos policlonales incluyen adyuvantes de Freund, sistema adyuvante de Ribi, y Titermax. Los anticuerpos policlonales se pueden generar utilizando procedimientos descritos en las patentes de Estados Unidos N.° 7.279.559; 7.119.179; 7.060.800; 6.709.659; 6.656.746; 6.322.788; 5.686.073; y 5.670.153.
Los anticuerpos monoclonales de la divulgacion pueden generarse usando tecnicas de hibridoma convencionales conocidas en la tecnica y bien descritas en la literatura. Por ejemplo, un hibridoma se produce fusionando una lfnea celular inmortal adecuada (por ejemplo, una lfnea celular de mieloma tal como, aunque sin limitacion, Sp2/0, Sp2/0- AG14, NSO, NS1, NS2, AE-1, L.5, >243, P3X63Ag8.653, Sp2 SA3, Sp2 MAI, Sp2 SS1, Sp2 SA5, U397, MLA 144, ACT IV, MOLT4, DA-1, JURKAT, WEHI, K-562, COS, RAJ I, NIH 3T3, HL-60, MLA 144, NAMAIWA, NEURO 2A, CHO, PerC.6, YB2/O) o similar, o heteromielomas, productos de fusion de los mismos, o cualquier celula o celula de fusion derivada de ellos, o cualquier otra lfnea celular adecuada tal como se conoce en la tecnica (vease, por ejemplo, www.atcc.org,
www.lifetech.com., ultimo acceso el 26 de noviembre de 2007, y similares), con celulas productoras de anticuerpos, tales como, aunque sin limitarse a, celulas de bazo aisladas o clonadas, sangre periferica, linfa, amfgdala, u otras celulas inmunitarias o que contienen celulas B, o cualquier otro tipo de celulas que expresan secuencias constante o variable o marco o CDR de cadena pesada o ligera, ya sea como acido nucleico endogeno o heterologo, como recombinante o endogeno, viral, bacteriano, de algas, procariota, anfibio, insecto, reptil, pez, de mamffero, roedor, equina, ovina, cabra, oveja, ADN de primate, eucariota, genomico, cADN, rADN, aDn o ARN mitocondrial, ADN o ArN de cloroplasto, hnARN, mARN, tARN, de cadena sencilla, doble o triple, hibridada, y similares, o cualquier combinacion de los mismos. Celulas productoras de anticuerpos tambien pueden obtenerse a partir de sangre periferica o, preferentemente del bazo o los ganglios linfaticos, de seres humanos u otros animales adecuados que han sido inmunizados con el antfgeno de interes. Cualquier otra celula huesped adecuada tambien puede usarse para expresar el acido nucleico heterologo o endogeno que codifica un anticuerpo, fragmento especificado o variante del mismo, de la presente divulgacion. Las celulas fusionadas (hibridomas) o celulas recombinantes se pueden aislar usando condiciones de cultivo selectivas u otros procedimientos conocidos adecuados, y se clonaron por dilucion limitante o la clasificacion de celulas, u otros procedimientos conocidos.
www.lifetech.com., ultimo acceso el 26 de noviembre de 2007, y similares), con celulas productoras de anticuerpos, tales como, aunque sin limitarse a, celulas de bazo aisladas o clonadas, sangre periferica, linfa, amfgdala, u otras celulas inmunitarias o que contienen celulas B, o cualquier otro tipo de celulas que expresan secuencias constante o variable o marco o CDR de cadena pesada o ligera, ya sea como acido nucleico endogeno o heterologo, como recombinante o endogeno, viral, bacteriano, de algas, procariota, anfibio, insecto, reptil, pez, de mamffero, roedor, equina, ovina, cabra, oveja, ADN de primate, eucariota, genomico, cADN, rADN, aDn o ARN mitocondrial, ADN o ArN de cloroplasto, hnARN, mARN, tARN, de cadena sencilla, doble o triple, hibridada, y similares, o cualquier combinacion de los mismos. Celulas productoras de anticuerpos tambien pueden obtenerse a partir de sangre periferica o, preferentemente del bazo o los ganglios linfaticos, de seres humanos u otros animales adecuados que han sido inmunizados con el antfgeno de interes. Cualquier otra celula huesped adecuada tambien puede usarse para expresar el acido nucleico heterologo o endogeno que codifica un anticuerpo, fragmento especificado o variante del mismo, de la presente divulgacion. Las celulas fusionadas (hibridomas) o celulas recombinantes se pueden aislar usando condiciones de cultivo selectivas u otros procedimientos conocidos adecuados, y se clonaron por dilucion limitante o la clasificacion de celulas, u otros procedimientos conocidos.
En una realizacion, los anticuerpos descritos en el presente documento pueden ser generados utilizando un sistema de peptido antigenico multiple (MAP). El sistema de MAP utiliza un nucleo de peptidilo de tres o siete residuos de lisina ramificados radialmente, sobre el que los peptidos antigenicos de interes pueden construirse usando qufmica en fase solida estandar. El nucleo de lisina produce el MAP que porta alrededor de 4 a 8 copias del epftopo peptfdico dependiendo del nucleo interno que generalmente representa menos de 10% del peso molecular total. El sistema MAP no requiere una protefna portadora para conjugacion. Se ha demostrado que la alta relacion molar y denso empaquetamiento de multiples copias del epftopo antigenico en un MAP producen una fuerte respuesta inmunogena. Este procedimiento se describe en la patente de Estados Unidos N.° 5.229.490.
Pueden usarse otros procedimientos adecuados de produccion o aislamiento de anticuerpos de la especificidad requerida, incluyendo, aunque sin limitacion, procedimientos que seleccionan un anticuerpo recombinante a partir de una biblioteca de peptidos o protefnas (por ejemplo, aunque sin limitacion, un bacteriofago, ribosoma, oligonucleotido, ARN, cADN, so similares, biblioteca de presentacion; por ejemplo, como estan disponibles de diversos proveedores comerciales tales como Cambridge Antibody Technologies (Cambridgeshire, RU), MorphoSys (Martinsreid/Planegg, Del.), Biovation (Aberdeen, Scotland, RU) BioInvent (Lund, Suecia), usando procedimientos conocidos en la tecnica. Vease las patentes de Estados Unidos N.° 4.704.692; 5.723.323; 5.763.192; 5.814.476; 5.817.483; 5.824.514; 5.976.862. Procedimientos alternativos dependen de la inmunizacion de animales transgenicos (por ejemplo, ratones SCID, Nguyen y col., (1977) Microbiol. Immunol. 41: 901-907 (1997); Sandhu y col., (1996) Crit. Rev. Biotechnol. 16: 95-118; Eren y col., (1998) Immunol. 93: 154-161 que son capaces de producir un repertorio de anticuerpos humanos, tal como se conoce en la tecnica y/o tal como se describe en el presente documento. Dichas tecnicas, incluyen, aunque sin limitarse a, presentacion en ribosomas (Hanes y col., (1997) Proc.
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Natl. Acad. Sci. EE. UU., 94: 4937-4942; Hanes y col., (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU., 95: 14130-14135); tecnologfas que producen anticuerpos de una sola celula (por ejemplo, el procedimiento de anticuerpo de linfocito seleccionado (“SLAM”) (patente de Estados Unidos N.° 5.627.052, Wen y col., (1987) J. Immunol. 17: 887-892; Babcook y col., Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU. (1996) 93: 7843-7848); microgota de gel y citometrfa de flujo (Powell y col., (1990) Biotechnol.; One Cell Systems, (Cambridge, Mass); Gray y col., (1995) J. Imm. Meth. 182: 155-163; y Kenny y col., (1995) Bio. Technol. 13: 787-790); seleccion de celulas B (Steenbakkers y col., (1994) Molec. Biol. Reports 19: 125-134.
Derivados de anticuerpos de la presente divulgacion tambien pueden prepararse suministrando un polinucleotido que codifica un anticuerpo de esta invencion a un huesped adecuado para proporcionar animales transgenicos o mamfferos, tales como cabras, vacas, caballos, ovejas, y similares, que producen dichos anticuerpos en su leche. Estos procedimientos se conocen en la tecnica y se describen, por ejemplo, en las patentes de Estados Unidos N.° 5.827.690; 5.849.992; 4.873.316; 5.849.992; 5.994.616; 5.565.362; y 5.304.489.
La expresion “derivado de anticuerpo” incluye modificacion posttraduccional a la secuencia polipeptfdica lineal del anticuerpo o fragmento. Por ejemplo, la patente de Estados Unidos N.° 6.602.684 B1 describe un procedimiento para la generacion de formas modificadas con glicol de anticuerpos, incluyendo moleculas de anticuerpo completas, fragmentos de anticuerpo, o protefnas de fusion que incluyen una region equivalente a la region Fc de una inmunoglobulina, que tiene toxicidad celular mediada por Fc mejorada, y glucoprotefnas generadas de este modo.
Tambien pueden prepararse derivados de anticuerpos mediante suministrando un polinucleotido de esta invencion para proporcionar plantas transgenicas y celulas vegetales cultivadas (por ejemplo, aunque sin limitarse a tabaco, mafz, y lenteja de agua) que producen dichos anticuerpos, partes o variantes especificadas en las partes de la planta o en celulas cultivadas de las mismas. Por ejemplo, Cramer y col., (1999) Curr. Top. Microbol. Immunol. 240: 95-118 y las referencias citadas en ese documento, describen la produccion de hojas de tabaco transgenico que expresan grandes cantidades de protefnas recombinantes, por ejemplo, usando un promotor inducible. El mafz transgenico se han usado para expresar protefnas de mamffero a niveles de produccion comercial, con actividades biologicas equivalentes a las producidas en otros sistemas recombinantes o purificadas de fuentes naturales. Vease, por ejemplo, Hood y col., (1999) Adv. Exp. Med. Biol. 464: 127-147 y las referencias citadas en ese documento. Derivados de anticuerpos tambien se han producido en grandes cantidades a partir de semillas de plantas transgenicas, incluyendo fragmentos de anticuerpos, tales como anticuerpos monocatenarios (scFv), incluyendo de semillas de tabaco y tuberculos de patata. Vease, por ejemplo, Conrad y col., (1998) Plant Mol. Biol. 38: 101-109 y referencia citadas en este documento. Por lo tanto, los anticuerpos de la presente divulgacion tambien se pueden producir usando plantas transgenicas, de acuerdo con procedimientos conocidos.
Los derivados de anticuerpos tambien pueden producirse, por ejemplo, anadiendo secuencias exogenas para modificar la inmunogenicidad o reducir, mejorar o modificar la union, afinidad, tasa de asociacion, tasa de disociacion, avidez, especificidad, semivida, o cualquier otra caracterfstica adecuada. Generalmente parte o la totalidad de las secuencias de CDR no humanas o humanas se mantienen, mientras que las secuencias no humanas de las regiones variables y constantes se sustituyen con aminoacidos humanos o de otro tipo.
En general, los residuos de CDR estan directamente y de la manera sustancial implicados en influir en la union al antfgeno. La humanizacion o genomanipulacion de anticuerpos de la presente invencion puede realizarse usando cualquier procedimiento conocido tal como, aunque sin limitacion, los descritos en las patentes de Estados Unidos N.° 5.723.323; 5.976.862; 5.824.514; 5.817.483; 5.814.476; 5.763.192; 5.723.323; 5.766.886; 5.714.352; 6.204.023; 6.180.370; 5.693.762; 5.530.101; 5.585.089; 5.225.539; y 4.816.567.
Las tecnicas para fabricar anticuerpos de parcial a completamente humanos son conocidas en la tecnica y puede usarse cualquiera de dichas tecnicas. De acuerdo con una realizacion, las secuencias de anticuerpos humanos completos se fabrican en un raton transgenico que ha sido disenado para expresar genes de anticuerpo de cadena pesada y ligera humanos. Se han preparado multiples estirpes de dichos ratones transgenicos que puede producir diferentes clases de anticuerpos. Celulas B de ratones transgenicos que producen un anticuerpo deseable se pueden fusionar para preparar lfneas celulares de hibridoma para la produccion continua del anticuerpo deseado. (Vease por ejemplo, Russel y col., (2000) Infection and Immunity abril de 2000: 1820-1826; Gallo y col., (2000) European J. of Immun. 30: 534-540; Green (1999) J. of Immun. Methods 231: 11-23; Yang y col., (1999A) J. of Leukocyte Biology 66: 401-410; Yang (1999B) Cancer Research 59(6): 1236-1243; Jakobovits. (1998) Advanced Drug Delivery Reviews 31: 33-42; Green y Jakobovits (1998) J. Exp. Med. 188(3): 483-495; Jakobovits (1998) Exp. Opin. Invest. Drugs 7(4): 607-614; Tsuda y col., (1997) Genomics 42: 413-421; Sherman-Gold (1997) Genetic Engineering News 17(14); Mendez y col., (1997) Nature Genetics 15: 146-156; Jakobovits (1996) Weir's Handbook of Experimental Immunology, The Integrated Immune System Vol. IV, 194. 1-194.7; Jakobovits (1995) Current Opinion in Biotechnology 6: 561-566; Mendez y col., (1995) Genomics 26: 294-307; Jakobovits (1994) Current Biology 4(8): 761-763; Arbones y col., (1994) Immunity 1(4): 247-260; Jakobovits (1993) Nature 362(6417): 255-258; Jakobovits; y la patente de Estados Unidos N.° 6.075.181.)
Los anticuerpos de esta divulgacion tambien pueden modificarse para crear anticuerpos quimericos. Los anticuerpos quimericos son aquellos en los que los diversos dominios de las cadenas pesadas y ligeras de los anticuerpos estan
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El procedimiento de “remodelacion en superficie” hace uso de los datos de secuencia disponibles para dominios variables de anticuerpos humanos compilados por Kabat y col., (1987) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4a ed., Bethesda, Md., National Institutes of Health, actualizaciones de esta base de datos, y otras bases de datos accesibles estadounidenses y extranjeras (tanto de acidos nucleicos y protefnas). Los ejemplos de los procedimientos utilizados para generar anticuerpos remodelados en superficie incluyen EP 519596; patente de Estados Unidos N.° 6.797.492; y se describen en Padlan y col., (1991) Mol. Immunol. 28(4-5): 489-498.
La expresion “derivado de anticuerpo” tambien incluye “diacuerpos”, que son pequenos fragmentos de anticuerpo con dos sitios de union al antfgeno, donde los fragmentos comprenden un dominio variable de cadena pesada (VH) conectado a un dominio variable de cadena ligera (VL) en la misma cadena polipeptfdica. (Vease por ejemplo, EP 404.097; WO 93/11161; y Hollinger y col., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU. 90: 6444-6448). Mediante el uso de un enlazador que es demasiado corto para permitir el emparejamiento entre los dos dominios en la misma cadena, los dominios son forzados a emparejarse con los dominios complementarios de otra cadena y crear dos sitios de union al antfgeno. (Vease tambien, la patente de Estados Unidos N.° 6.632.926 de Chen y col., que describe variantes de anticuerpo que tienen uno o mas aminoacidos insertados en una region hipervariable del anticuerpo parental y una afinidad de union para un antfgeno diana que es al menos aproximadamente dos veces mas potente que la afinidad de union del anticuerpo parental por el antfgeno).
La expresion “derivado de anticuerpo” incluye, ademas, “anticuerpos lineales”. El procedimiento para la fabricacion de anticuerpos lineales se conoce en la tecnica y se describe en Zapata y col., (1995) Protein Eng. 8(10): 10571062. En resumen, estos anticuerpos comprenden un par de segmentos Fd en tandem (VH-CH1-VH-CH1) que forman un par de regiones de union al antfgeno. Los anticuerpos lineales pueden ser biespecfficos o monoespecfficos.
Los anticuerpos de esta divulgacion se pueden recuperar y purificar a partir de cultivos de celulas recombinantes mediante procedimientos conocidos que incluyen, aunque sin limitarse a, purificacion de la protefna A, precipitacion con sulfato de amonio o etanol, extraccion con acido, cromatograffa de intercambio anionico o cationico, cromatograffa de fosfocelulosa, cromatograffa de interaccion hidrofoba, cromatograffa de afinidad, cromatograffa de hidroxiapatita y cromatograffa de lectina. Tambien puede usarse cromatograffa lfquida de alta resolucion (“HPLC”) para la purificacion.
Los anticuerpos de la presente divulgacion productos purificados, productos de procedimientos sinteticos qufmicos, y productos producidos mediante tecnicas recombinantes a partir de un huesped eucariota, incluyendo, por ejemplo, levaduras, plantas superiores, celulas de insecto y de mamffero, o como alternativa a partir de una celula procariota tal como se ha descrito anteriormente.
Si un anticuerpo monoclonal que esta siendo ensayado se une a una protefna o polipeptido, entonces el anticuerpo que esta siendo ensayado y los anticuerpos proporcionados por los hibridomas de esta divulgacion son equivalentes. Tambien es posible determinar sin experimentacion excesiva, si un anticuerpo tiene la misma especificidad que el anticuerpo monoclonal de esta divulgacion determinando si el anticuerpo que esta siendo ensayado impide que un anticuerpo monoclonal de esta divulgacion se una a la protefna o polipeptido con el que el anticuerpo monoclonal es reactivo normalmente. Si el anticuerpo que esta siendo ensayado compite con el anticuerpo monoclonal de la divulgacion, tal como se muestra mediante una disminucion de la union por el anticuerpo monoclonal de esta divulgacion, entonces es probable que los dos anticuerpos se unan al mismo epftopo o a uno estrechamente relacionado. Como alternativa, se puede preincubar el anticuerpo monoclonal de esta divulgacion con una protefna con la que es reactivo normalmente, y determinar si el anticuerpo monoclonal que esta siendo ensayado es inhibido en su capacidad de unirse al antfgeno. Si el anticuerpo monoclonal que esta siendo ensayado es inhibido entonces, con toda probabilidad, tiene la misma, o una relacionada estrechamente, especificidad epitopica que el anticuerpo monoclonal de esta divulgacion.
El termino “anticuerpo” tambien pretende incluir anticuerpos de todos los isotipos. Isotipos particulares de un anticuerpo monoclonal se pueden preparar ya sea directamente mediante la seleccion de la fusion inicial, o se
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pueden preparar de forma secundaria, a partir de un hibridoma parental que secreta un anticuerpo monoclonal de diferente isotipo utilizando la tecnica de seleccion sib para aislar variantes de cambio de clase usando el procedimiento descrito en Steplewski, y col., (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU. 82: 8653 o Spira, y col., (1984) J. Immunol. Methods 74: 307.
El aislamiento de otros hibridomas que secretan anticuerpos monoclonales con la especificidad de los anticuerpos monoclonales de la invencion tambien se puede conseguir por un experto en la materia mediante la produccion de anticuerpos antiidiotfpicos. Herlyn, y col., (1986) Science 232: 100. Un anticuerpo antiidiotfpico es un anticuerpo que reconoce determinantes unicos presentes en el anticuerpo monoclonal producido por el hibridoma de interes.
La identidad idiotfpica entre los anticuerpos monoclonales de dos hibridomas demuestra que los dos anticuerpos monoclonales son iguales con respecto a su reconocimiento del mismo determinante epitopico. Por lo tanto, usando anticuerpos para los determinantes epitopicos en un anticuerpo monoclonal, es posible identificar otros hibridomas que expresan anticuerpos monoclonales de la misma especificidad epitopica.
Tambien es posible usar tecnologfa de anti-idiotipo para producir anticuerpos monoclonales que imitan un epftopo. Por ejemplo, un anticuerpo monoclonal antiidiotfpico preparado para un primer anticuerpo monoclonal tendra un dominio de union en la region hipervariable que es la imagen especular del epftopo al que se une el primer anticuerpo monoclonal. De este modo, en este ejemplo, el anticuerpo monoclonal antiidiotfpico podrfa usarse para inmunizacion para la produccion de estos anticuerpos.
En algunos aspectos de esta divulgacion, sera util etiquetar de forma detectable o terapeutica el anticuerpo. Las etiquetas adecuadas se han descrito supra. Los procedimientos para conjugar anticuerpos a estos agentes son conocidos en la tecnica. Para proposito de ilustracion solamente, los anticuerpos se pueden etiquetar con un resto detectable tal como un atomo radioactivo, un cromoforo, un fluoroforo, o similares. Dichos anticuerpos etiquetados se pueden usar para tecnicas de diagnostico, ya sea in vivo, o en una muestra de ensayo aislada.
El acoplamiento de anticuerpos a haptenos de bajo peso molecular puede aumentar la sensibilidad del anticuerpo en un ensayo. Los haptenos pueden detectarse a continuacion especfficamente por medio de una segunda reaccion. Por ejemplo, es habitual usar haptenos tales como biotina, que reacciona con avidina, o dinitrofenol, piridoxal y fluorescefna, que pueden reaccionar con anticuerpos antihapteno especfficos. Vease, Harlow y Lane (1988) supra.
Los anticuerpos pueden etiquetarse con un resto detectable tal como un atomo radioactivo, un cromoforo, un fluoroforo, o similares. Dichos anticuerpos etiquetados pueden usarse para tecnicas de diagnostico, ya sea in vivo, o en una muestra de ensayo aislada. Los anticuerpos tambien pueden conjugarse, por ejemplo, a un agente farmaceutico, tal como farmaco quimioterapeutico o una toxina. Estos se pueden enlazar a una citoquina, a un ligando, a otro anticuerpo. Los agentes adecuados para el acoplamiento a anticuerpos para conseguir un efecto antitumoral incluyen citoquinas, tales como interleuquina 2 (IL-2) y factor de necrosis tumoral (TNF); fotosensibilizadores, para uso en terapia fotodinamica, incluyendo ftalocianina tetrasulfonato de aluminio (III), hematoporfirina, y ftalocianina; radionucleidos, tales como yodo-131 (1311), itrio-90 (90Y), bismuto-212 (212Bi), bismuto-213 (213Bi), tecnecio-99m (99mTc), renio-186 (186Re), y renio-188 (188Re); antibioticos, tales como doxorrubicina, adriamicina, daunorrubicina, metotrexato, daunomicina, neocarzinostatina, y carboplatino; toxinas bacterianas, vegetales, y otras, tales como toxina de la difteria, exotoxina de pseudomonas A, enterotoxina A estafilococica, toxina abrina-A, ricina A (ricina A desglicosilada y ricina natural A), toxina TGF-alfa, citotoxina de cobra China (naja naja atra), y gelonina (una toxina vegetal); protefnas inactivadoras del ribosoma de plantas, bacterias y hongos, tales como restrictocina (una protefna inactivadora del ribosoma producida por Aspergillus restrictus), saporina (una protefnas inactivadora del ribosoma de Saponaria officinalis), y RNasa; inhibidores de la tirosina quinasa; ly207702 (un nucleosido de purina difluorado); liposomas que contienen agentes anti-qufsticos (por ejemplo, oligonucleotidos antisentido, plasmidos que codifican toxinas, metotrexato,. etc.); y otros anticuerpos o fragmentos de anticuerpos, tales como F(ab).
Los anticuerpos de la divulgacion tambien se pueden unir a muchos transportadores diferentes. Por lo tanto, esta divulgacion tambien proporciona composiciones que contienen los anticuerpos y otra sustancia, activa o inerte. Los ejemplos de transportadores bien conocidos incluyen vidrio, poliestireno, polipropileno, polietileno, dextrano, nylon, amilasas, celulosas naturales y modificadas, poliacrilamidas, agarosas y magnetita. La naturaleza del transportador puede ser soluble o insoluble para los fines de la divulgacion. Los expertos en la materia conoceran otros transportadores adecuados para la union de anticuerpos monoclonales, o seran capaces de determinarlos, usando experimentacion rutinaria.
III. Metodos de la invencion
Un aspecto de la presente divulgacion se refiere a un metodo de prevenir o reducir una hemorragia en un sujeto sometido a terapia anticoagulante administrando al sujeto una cantidad efectiva de un derivado proteico de factor Xa. El derivado tiene un sitio activo modificado y un dominio Gla modificado, teniendo de este modo actividad procoagulante reducida o ninguna. El derivado actua como antfdoto y sustancialmente neutraliza la actividad anticoagulante del inhibidor. El derivado es deficiente en Gla. El sujeto puede ser un mamffero o, mas
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En otra realizacion, la divulgacion se refiere a un derivado de fXa de la invencion para uso en un procedimiento para unirse a e inhibir selectivamente un inhibidor del factor Xa administrado de forma exogena en un sujeto. El procedimiento comprende administrar al paciente una cantidad efectiva de un derivado de un derivado de factor Xa tal como se ha descrito anteriormente. El sujeto puede ser una celula o un mamffero, tal como un ser humano.
Los pacientes adecuados para esta terapia se han sometido a terapia anticoagulante anterior, por ejemplo, se les ha administrado uno o mas de un anticoagulante, tal como un inhibidor de factor Xa. Los ejemplos de anticoagulantes que son inhibidores del factor Xa, incluyen aunque sin limitarse a, fondaparinux, idraparinux, idraparinux biotinilado, enoxaparina, fragmina, NAP-5, rNAPc2, inhibidor de la ruta del factor tisular, DX-9065a, YM-60828, YM-150, apixaban, rivaroxaban, PD-348292, otamixaban, edoxaban, LY517717, GSK913893, heparina de bajo peso molecular y Betrixaban, o cualquier combinacion de los mismos. La fuente de diversos anticoagulantes se encuentra en toda la descripcion.
El derivado tiene un sitio activo modificado y un dominio Gla eliminado. En un aspecto de la divulgacion, el derivado del factor Xa no tiene o muestra ninguna actividad procoagulante. Es este aspecto de la divulgacion, el derivado comprende al menos los residuos de aminoacido 40 a 448, 45 a 448, o 46 a 448 de la SEQ ID NO. 3 o equivalentes de la misma. En otro aspecto de la divulgacion, el derivado comprende al menos los residuos de aminoacido 45 a 139 y 195 a 448 o 46 a 139 y 195-448 de la SEQ ID NO. 3 o equivalentes de la misma.
El derivado de fXa conserva la estructura tridimensional del sitio activo de la protefna fXa. Informacion respecto a la estructura tridimensional del des-Gla fXa puede encontrarse en Brandstetter, H y col. J. Bio. Chem., 1996, 271: 29988-29992.
En otro aspecto de la divulgacion, los derivados de fXa pueden carecer del dominio Gla asf como uno cualquiera de los dos dominios EGF. En otro aspecto de la divulgacion, los derivados de fXa carecen completamente de cadena ligera. Otras modificaciones de la cadena pesada pueden comprender el dominio catalftico de serina proteasas relacionadas que son capaces de unirse a inhibidores. Las serina proteasas relacionadas tienen dominios catalfticos que poseen suficiente similitud estructural con el dominio catalftico fXa y son, por lo tanto, capaces de unirse a inhibidores de fXa de molecula pequena. Los ejemplos de serina proteasas relacionadas incluyen, aunque sin limitarse a, proteasas de mamffero tales como calicrefna plasmatica, trombina y tripsina o la proteasa bacteriana subtilisina. Estos derivados incluyen ademas modificaciones en los residuos de aminoacidos equivalentes a residuos serina (SER379) o acido aspartico (ASP282) del sitio activo, descritos en el presente documento.
La protefna del factor Xa con actividad procoagulante reducida comprende una cadena ligera modificada, donde la modificacion es delecion del dominio Gla para reducir la union a la membrana fosfolipfdica de fXa. En algunas realizaciones de la divulgacion, la secuencia de aminoacidos principal de fXa no ha cambiado, pero la cadena lateral
de ciertos aminoacidos se ha cambiado. Los ejemplos del dominio Gla modificado que reduce la union a la
membrana fosfolipfdica de fXa comprenden polipeptidos o protefnas que tienen la secuencia de aminoacidos
primaria de la SEQ ID NO. 3 o un equivalente de la misma, con al menos una sustitucion, adicion o delecion de
aminoacidos en comparacion con el dominio Gla de una protefna de factor Xa humano de tipo silvestre. En algunas realizaciones de la divulgacion, al menos un aminoacido que es sustituido o delecionado es un acido y- carboxiglutamico (Gla). Los residuos de Gla se muestran en la SEQ ID NO. 3 en las posiciones de aminoacidos 6, 7, 14, 16, 19, 20, 25, 26, 29, 32 y 39. En algunas realizaciones de la divulgacion, la secuencia de aminoacidos primaria del antfdoto es identica a la SEQ ID NO. 3 o equivalente de la misma, pero es una protefna de factor Xa no carboxilada, subcarboxilada o descarboxilada. En algunas realizaciones de la divulgacion, el antfdoto es un des-Gla anhidro-fXa o des-Gla fX-S379A. En algunas realizaciones de la divulgacion, la protefna del factor Xa con union a la membrana fosfolipfdica reducida comprende, ademas, modificacion o delecion de los EGF1 y/o EGF2 (mostrados en la figura 3 como los aminoacidos 46 a 84 y 85 a 128, respectivamente) o una parte, es decir fragmento de los dominios EGF1 y/o EGF2. En algunas realizaciones de la divulgacion, toda la cadena ligera o sustancialmente toda la cadena ligera se modifica o elimina. Por ejemplo, la protefna de fXa modificada con union a la membrana fosfolipfdica reducida puede contener solamente la cadena pesada o el fXa modificado puede contener la cadena pesada y un fragmento de la cadena ligera que contiene Cys132, el residuo de aminoacido que forma el unico puente disulfuro con Cys302 de la cadena pesada en la SEQ ID NO. 3. En algunas realizaciones de la divulgacion, el derivado comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO. 12. En algunas realizaciones de la divulgacion, el derivado es el polipeptido bicatenario que comprende la SEQ ID NO. 13. En otras realizaciones de la divulgacion, el derivado es el polipeptido de la SEQ ID NO. 15. En otras realizaciones, el derivado es el polipeptido de las SEQ ID NO. 20, 21 o 22.
En algunas realizaciones, el derivado de la protefna del factor Xa comprende una cadena pesada modificada que contiene el dominio catalftico de dicha protefna del factor Xa. En algunas realizaciones, al menos una sustitucion de aminoacidos esta presente en una o mas posiciones de aminoacido de fXa seleccionadas de entre el grupo que consiste en Glu216, Glu218, Arg332, Arg347, Lys351 y Ser379 en la SEQ ID NO. 3 y 7 (Glu37, Glu39, Arg150, Arg165, Lys169 y Ser195 en numeracion de quimotripsina, respectivamente). En algunas realizaciones, el antfdoto es una protefna del factor Xa con residuo serina (Ser379 en la SEQ ID NO. 3 y 7, Ser195 en numeracion de quimotripsina) en el sitio activo modificado a alanina. Dichas modificaciones pueden realizarse a protefna fXa de tipo
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silvestre o a cualquiera de las protefnas de fXa modificadas o fragmentos descritos anteriormente. Por ejemplo, el des-Gla anhidro-fXa con residuos serina en el sitio activo sustituidos por deshidroalanina descrito en el ejemplo 1 ha mostrado actividad de antfdoto.
En otras realizaciones, el derivado tiene interaccion reducida con ATIII, cofactores fV/fVa y fVIII/fVIIIa en comparacion con factor Xa de tipo silvestre o de origen natural. En algunas realizaciones, al menos una sustitucion de aminoacidos esta presente en la posicion de aminoacido Arg306, Glu310, Arg347, Lys351, Lys414 o Arg424 en la SEQ ID NO. 3 y 7 (Arg125, Glu129, Arg165, Lys169, Lys230 o Arg240 en numeracion de quimotripsina, respectivamente). Dichas modificaciones pueden realizarse a protefna fXa de tipo silvestre o a cualquiera de las protefnas de fXa modificadas o fragmentos descritos anteriormente.
En otras realizaciones de la divulgacion, el antfdoto es una protefna que comprende la secuencia de aminoacidos de un dominio catalftico de serina proteasa que puede imitar la capacidad de union al inhibidor de la cadena pesada de fXa. Dichas protefnas pueden incluir proteasas de mamffero tales como calicrefna plasmatica, trombina, tripsina (o su homologo bacteriano subtilisina) que han sido modificadas de forma recombinante para carecer de actividad serina proteasa capaz de escindir sustratos de protefna pero aun posee las caracterfsticas estructurales del sitio activo escindido.
Tambien son proporcionadas por esta invencion composiciones farmaceuticas que contienen uno o mas de los derivados del factor Xa modificados y un transportador farmaceuticamente aceptable. Las composiciones se administran a un sujeto que lo necesita en una cantidad que proporcionara el beneficio deseado, una reduccion o detencion de hemorragia. Las composiciones pueden coadministrarse con cualquier agente o terapia adecuada que complemente o mejore la actividad del derivado del factor Xa. Un ejemplo de estos es un segundo agente capaz de prolongar la semivida en plasma del antfdoto. Los ejemplos de segundos agentes adecuados incluyen, aunque sin limitarse a, un anticuerpo anti-fXa que reconoce en exositio de la cadena pesada de fXa o un derivado de fXa unido alfa-2-macroglobulina. La formacion del complejo entre el derivado de fXa y un segundo agente (anticuerpo de exositio o alfa-2-macroglobulina) bloquearfa interacciones macromoleculares pero conserva la capacidad de active uniones al inhibidor dependientes del sitio. Los ejemplos de anticuerpos anti-fXa adecuados para coadministracion incluyen, aunque sin limitarse a, los descritos en Yang Y.H., y col., J. Immunol. 2006, 1; 177(11): 8219-25, Wilkens, M y Krishnaswamy, S., J. Bio. Chem., 2002, 277 (11), 9366-9374, y Church WR, y col., Blood, 1988, 72(6), 19111921.
En algunas realizaciones, una protefna de factor Xa se modifica mediante medios qufmicos, enzimaticos o recombinantes. Por ejemplo, el sitio activo Ser379 puede modificarse qufmicamente a deshidroalanina, y el dominio Gla puede eliminarse enzimaticamente mediante digestion con quimotripsina tal como se describe en el ejemplo 1. Un fXa modificado descrito en el presente documento tambien puede producirse mediante medios recombinantes modificando la secuencia del cADN que codifica fX de tipo silvestre (SEQ ID NO. 2) descrita con mas detalles en el ejemplo 7 para expresion directa de antfdoto recombinante (r-antfdoto) o como alternativa, una protefna fX con la modificacion deseada puede producirse mediante medios recombinantes seguida por activacion del fXa modificado por un activador, tal como un veneno de serpiente, por ejemplo veneno de vfbora de Russell, y complejos de fVIIa/factor tisular o fIXa/fVIIIa.
Los sujetos que se beneficiaran de la administracion de las composiciones descritas en el presente documento y los procedimientos adjuntos incluyen aquellos que estan experimentando, o predispuestos a un evento de hemorragia clfnica grave o un evento de hemorragia no grave clfnicamente significativa. Los ejemplos de eventos de hemorragia clfnica grave se seleccionan de entre el grupo que consiste en hemorragia, hemorragia en organos vitales, hemorragia que requiere reintervencion o un nuevo procedimiento terapeutico, y un fndice de hemorragia de > 2,0 con una hemorragia manifiesta asociada. (Turpie AGG, y col., NEJM, 2001, 344: 619-625.) Adicionalmente, el sujeto puede estar experimentando o predispuesto a un evento de hemorragia no grave seleccionado de entre el grupo que consiste en epistaxis que es persistente o recurrente y en cantidad sustancial o no se detendra sin intervencion, hemorragia rectal o del tracto urinario que no se alzan hasta un nivel que requiere un procedimiento terapeutico, hematomas sustanciales en sitios de inyeccion o en cualquier otro lugar que son espontaneos o se producen con traumatismo trivial, perdida de sangre sustancial mas de habitualmente asociada con un procedimiento quirurgico que no requiere drenaje, y hemorragia que requiere transfusion no planificada.
En algunas realizaciones, el antfdoto se administra despues de la administracion de una sobredosis de un inhibidor de fXa o antes de una cirugfa, que puede exponer a los sujetos al riesgo de hemorragia.
En cualquiera de los procedimientos descritos en el presente documento, debe entenderse, incluso aunque no siempre se afirme explfcitamente, que una cantidad efectiva del derivado se administra al sujeto. La cantidad puede ser determinada empfricamente por el facultativo encargado del tratamiento y variara con la edad, el genero, el peso y la salud del sujeto. Factores adicionales a considerar por el facultativo encargado del tratamiento incluyen, aunque sin limitarse a, la identidad y/o cantidad de inhibidor del factor Xa, que puede haber sido administrado, la via o el modo en que el antfdoto sera administrado al sujeto, la formulacion del antfdoto, y el criterio de valoracion terapeutico para el paciente. Con estas variables en mente, un experto en la materia administrara una cantidad terapeuticamente efectiva al sujeto a tratar. Se contempla que una cantidad terapeuticamente efectiva de los
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antfdotos descritos en el presente documento suficiente para contrarrestar, o sustancialmente neutralizar, un anticoagulante en un sujeto puede contener de aproximadamente 0,01 miligramos de antfdoto por kilogramo de peso corporal de un sujeto a 1 gramo de antfdoto por kilogramo de peso corporal de un sujeto de antfdoto. Se contempla, ademas, que el antfdoto puede proporcionarse al sujeto en un intervalo de concentracion de aproximadamente 10 nanomolar a aproximadamente 100 micromolar, o de aproximadamente 10 nanomolar a aproximadamente 5 micromolar, o de aproximadamente 100 nanomolar a aproximadamente 2,5 micromolar.
Las composiciones pueden administrarse en cantidades que son eficaces para que el antfdoto reconozca selectivamente y se una, directa o indirectamente, al inhibidor del factor Xa en el sujeto. Tambien pueden administrarse en cantidades para inhibir sustancialmente o sustancialmente neutralizar los inhibidores del factor Xa administrados de forma exogena en un sujeto.
En otro aspecto mas, la invencion se refiere a una composicion farmaceutica para invertir o neutralizar la actividad anticoagulante de un inhibidor del factor Xa administrado a un sujeto, que comprende administrar una cantidad efectiva de un antfdoto al inhibidor del factor Xa y un transportador farmaceuticamente aceptable, a condicion de que el antfdoto no sea factor Vila derivado de plasma, factor Vila recombinante, plasma fresco congelado, concentrados del complejo de protrombina y sangre completa.
En algunas realizaciones, el antfdoto es uno cualquiera de los antfdotos de la invencion. En algunas realizaciones, el antfdoto esta conjugado con un resto capaz de prolongar la semivida en circulacion del antfdoto. En algunas realizaciones, el resto se selecciona de entre el grupo que consiste en polietilenglicol, un grupo acilo, un liposoma, una protefna transportadora, una membrana fosfolipfdica artificial, y una nanopartfcula. Por ejemplo, un residuo lisina o cistefna no en el sitio activo de un derivado de fXa descrito en el presente documento puede modificarse qufmicamente para unirse a una molecula de polietilenglicol. Otros procedimientos proporcionados en Werle, M. & Bernkop-Schnurch, A. Strategies to Improve Plasma Half Life Time of Peptide and Protein Drugs, Amino Acids 2006, 30(4): 351-367 pueden usarse para prolongar la semivida en plasma de los antfdotos de esta invencion.
En otras realizaciones de la invencion, la semivida del derivado de fXa mejora acoplando el antfdoto a dominios transportadores de Fc. En una realizacion, el antfdoto esta acoplado a un fragmento Fc, tal como una parte peptfdica de inmunoglobulina o un fragmento de IgG1. En una realizacion, se contempla una protefna quimerica que comprende el derivado de fXa y la parte peptfdica de inmunoglobulina. En otra realizacion mas, el derivado de fXa y el peptido de inmunoglobulina se acoplan mediante una reaccion qufmica, tal como un puente disulfuro, con la cadena pesada de IgG humana y regiones constantes de cadena ligera kappa.
En algunas realizaciones, la composicion farmaceutica comprende ademas un agente capaz de prolongar la semivida plasmatica del antfdoto. En otro aspecto, la composicion farmaceutica ha sido coformulada con un agente capaz de prolongar la semivida plasmatica del antfdoto. En algunas realizaciones, el agente coadministrado o coformulado es un anticuerpo anti-fXa que reconoce el exositio de fXa o un derivado de fXa unido a alfa-2- macroglobulina.
IV. Terapias
La presente divulgacion se refiere a un procedimiento terapeutico de prevencion o reduccion de hemorragias en un sujeto sometido a terapia anticoagulante. Se contempla que los antfdotos o derivados de la presente invencion pueden ser farmacos de corta duracion para usarlos en situaciones de eleccion o de emergencia que pueden neutralizar de forma segura y especffica propiedades anticoagulantes convencionales de un inhibidor de fXa sin causar efectos secundarios o hemodinamicos perjudiciales o exacerbacion de la respuesta vascular proliferativa a la lesion.
En una realizacion, la cantidad terapeuticamente efectiva de un antfdoto muestra un fndice terapeutico elevado. El fndice terapeutico es la relacion de dosis entre efectos toxicos y terapeuticos que pueden expresarse como la relacion entre DL50 y DE50. La DL50 es la dosis letal para el 50% de la poblacion y la DE50 es la dosis terapeuticamente efectiva en el 50% de la poblacion. La DL50 y la DE50 se determinan mediante procedimientos farmaceuticos estandar en cultivos celulares animales o animales experimentales. Los antfdotos o derivados de esta invencion pueden administrarse una o varias veces cuando se necesitan para neutralizar el efecto de un inhibidor de fXa presente en el plasma de un sujeto. Preferentemente, los antfdotos de esta invencion son suficientes cuando se administran en una unica dosis.
Se contempla que una dosis tfpica de los antfdotos de la invencion dependera del entorno clfnico real y de la concentracion del inhibidor en el plasma. En ensayos in vitro, tales como generacion de trombina, ensayos clfnicos de coagulacion tales como aPTT, PT y ACT, se espera que una cantidad terapeuticamente efectiva de un antfdoto produzca produce una correccion de la actividad de coagulacion ex vivo del 10% o mas. Los ensayos in vitro indican que una relacion de antfdoto/inhibidor > 1,0 debe mostrar un efecto de inversion. Se espera que la concentracion plasmatica maxima para antfdoto este en el intervalo micromolar, probablemente entre 10 micromolar o por debajo.
En un entorno clfnico, uno de los criterios en la determinacion de la eficacia de un antfdoto es que produzca
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cualquier cambio de las medidas reales de hemorragia. En los ensayos clfnicos, las categorfas de hemorragias graves son la hemorragia fatal, las hemorragias en organos vitales (intracraneal, intraocular, retroperitoneal, medular, pericardica), cualquier hemorragia que requiere reintervencion o un nuevo procedimiento terapeutico (por ejemplo, aspiracion de una rodilla operada, insercion de un tubo de toracotomfa para hemotorax, electrocoagulacion endoscopica, etc.) o un mdice de hemorragia de > 2,0 si se asocia con una hemorragia manifiesta. El mdice de hemorragia se define como el numero de unidades de globulos rojos empaquetados o sangre completa transfundida, ademas de los valores de hemoglobina antes del episodio de hemorragia menos los valores de hemoglobina despues de que la hemorragia se ha estabilizado (en gramos por decilitro).
Otro criterio para la eficacia de antfdoto en un entorno clfnico es que reduzca hemorragia no grave clfnicamente significativa. Esta categorfa de hemorragias incluyen hemorragia que no es importante, pero es mayor de lo habitual y justifica la atencion clfnica, incluyendo epistaxis que es persistente o recurrente y en cantidad sustancial o no se detendra sin la intervencion; hemorragia rectal o del tracto urinario que no llega a un nivel que requiere un procedimiento terapeutico (por ejemplo, la nueva insercion de un cateter Foley o inspeccion cistoscopia), hematomas sustancial en los sitios de inyeccion o en otros lugares que son espontaneos o se producen con traumatismo trivial; perdida considerable de sangre; hemorragia que requiere transfusion no planificada. Tal como se usa en el presente documento, “perdida de sangre sustancial” se refiere a la cantidad de perdida de sangre que es mayor de esa cantidad por lo general asociada con el procedimiento quirurgico. Perdida de sangre sustancial conduce a la hinchazon que se gestiona de forma conservadora, ya que se queda corta para requerir drenaje.
En una realizacion, los derivados de esta invencion tienen suficiente semivida en plasma circulante para neutralizar sustancialmente el inhibidor de fXa presente en el plasma. El fXa activado esencialmente no tiene semivida en circulacion en seres humanos, ya que es inhibido eficazmente por ATIII, TFPI y otros inhibidores de plasma (Fuchs, H.E. y Pizzo, S.V., J. Clin. Invest., 1983, 72: 2041-2049). Se ha demostrado que el fXa inactivo tiene una semivida en circulacion de 2-3 horas en seres humanos. En un modelo de babuino, la semivida de un fXa bloqueado en el sitio activo por DEGR ([5-(dimetilamino)1-naftalenosulfonilo]-glutamilglicilarginil clorometil cetona) fue de aproximadamente 10 horas o 2 horas, tal como se determina mediante ensayos isotopicos o inmunoadsorbentes ligados a enzima, respectivamente (Taylor, F.B. y col., Blood, 1991, 78(2): 364-368).
Puede ser deseable prolongar la semivida de un derivado de antfdoto fXa a 24-48 horas. Se contempla que la conjugacion o adicion de uno o mas d los siguientes restos incrementara la semivida en plasma de un antfdoto:
a) polietilenglicol;
b) un grupo acilo;
c) liposomas y agentes de encapsulacion;
d) protefnas transportadoras;
e) membrana fosfolipfdica artificial;
f) inmunoglobulina; y
g) nanopartfcula.
El sitio de conjugacion puede no estar limitado a la cadena o residuo especial, siempre que la conjugacion no enmascare el sitio o sitios de union al del antfdoto. Los antfdotos descritos en el presente documento se pueden administrar en combinacion con uno cualquiera o mas de uno de los compuestos descritos anteriormente.
En general, los anticuerpos administrados tienen una semivida mucho mas larga que las protefnas circulantes de coagulacion sangufnea. Es posible usar un complejo que consiste en fXa deficiente en dominio Gla y un anticuerpo unido al exositio de fXa como antfdoto de semivida en circulacion prolongada. La formacion de un complejo entre fXa y el anticuerpo dirigido el exositio puede reducir la interaccion de un fXa deficiente en dominio Gla con sustratos e inhibidores macromoleculares, tales como protrombina y la antitrombina III, mientras que deja el sitio activo escindido inalterado, de modo que el complejo puede actuar como un antfdoto para unirse al inhibidor de molecula pequena dirigido al sitio activo. La formacion de complejo de a-2-macroglobulina-fXa tambien puede ser de utilidad como antfdoto para los inhibidores de molecula pequena de fXa.
La eficacia de los antfdotos en la inversion de la actividad anticoagulante de los inhibidores de fXa, asf como su actividad procoagulante puede determinarse mediante ensayos in vitro y modelos animales por los expertos en la materia. Son ejemplos de ensayos in vitro la generacion de trombina, los ensayos clfnicos de coagulacion tales como aPTT, pT y ACT. Se contempla que un antfdoto de esta invencion sea capaz de producir el 10% o mas de correccion de la actividad de coagulacion ex vivo. Varios modelos animales in vivo de tiempo de hemorragia y/o perdida de sangre en, por ejemplo, roedores, tales como ratones, perros y primates, tales como monos, se pueden usar para medir la eficacia.
V. Composiciones farmaceuticas
La presente invencion proporciona, ademas, composiciones que comprenden un derivado de fXa y un transportador farmaceuticamente aceptable.
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“Transportadores farmaceuticamente aceptables” se refiere a cualesquiera diluyentes, excipientes o transportadores que pueden usarse en las composiciones de la invencion. Los transportadores farmaceuticamente aceptables incluyen intercambiadores de iones, alumina, estearato de aluminio, lecitina, protefnas del suero, tales como albumina de suero humano, sustancias tamponantes, tales como fosfatos, glicina, acido sorbico, sorbato de potasio, mezclas de gliceridos parciales de acidos grasos vegetales saturados, agua, sales o electrolitos, tales como sulfato de protamina, hidrogenofosfato disodico, hidrogenofosfato de potasio, cloruro de sodio, sales de zinc, sflice coloidal, trisilicato de magnesio, polivinilpirrolidona, sustancias basadas en celulosa, polietilenglicol, carboximetilcelulosa sodica, poliacrilatos, ceras, copolfmeros de bloque de polietileno-polioxipropileno, polietilenglicol y grasa de lana. Los transportadores farmaceuticos adecuados se describen en Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, un texto de referencia estandar en este campo. Se seleccionan preferentemente con respecto a la forma pretendida de administracion, es decir, comprimidos orales, capsulas, elixires, jarabes y similares, y consecuentes con las practicas farmaceuticas convencionales.
Las composiciones farmaceuticas de la invencion pueden fabricarse mediante procedimientos bien conocidos en la tecnica tales como procesos de granulacion convencional, mezcla, disolucion, encapsulacion, liofilizacion, emulsion, entre otros. Las composiciones pueden producirse de diversas formas, incluyendo granulos, precipitados o partfculas, polvos, incluyendo secado por congelacion, secado rotatorio o polvos secados por pulverizacion, polvos amorfos, inyecciones, emulsiones, elixires, suspensiones o soluciones. Las formulaciones pueden contener opcionalmente estabilizantes, modificadores de pH, tensioactivos, modificadores de la biodisponibilidad y combinaciones de estos.
Las formulaciones farmaceuticas pueden prepararse como suspensiones o soluciones lfquidas usando un lfquido esteril, tal como aceite, agua, alcohol, y combinaciones de los mismos. Tensioactivos, agentes de suspension o agentes emulsionantes farmaceuticamente adecuados, se pueden anadir para administracion oral o parenteral. Las suspensiones pueden incluir aceites, tales como aceite de cacahuete, aceite de sesamo, aceite de semilla de algodon, aceite de mafz y aceite de oliva. La preparacion en suspension tambien puede contener esteres de acidos grasos, tales como oleato de etilo, miristato de isopropilo, gliceridos de acidos grasos y gliceridos de acidos grasos acetilados. Las formulaciones en suspension pueden incluir alcoholes, tales como etanol, alcohol isopropflico, alcohol hexadecflico, glicerol y propilenglicol. Eteres, tales como poli(etilenglicol), hidrocarburos de petroleo, tales como aceite mineral y vaselina, y agua tambien se pueden usar en formulaciones en suspension.
Las composiciones de esta invencion estan formadas para administracion farmaceutica a un mamffero, preferentemente un ser humano. Dichas composiciones farmaceuticas de la invencion pueden administrarse de diversas maneras, preferentemente por via parenteral.
Se contempla que para invertir rapidamente la actividad anticoagulante de un inhibidor de fXa presente en el plasma de un paciente en una situacion de emergencia, el antfdoto de esta invencion puede o pueda ser administrado a la circulacion sistemica mediante administracion parenteral. El termino “parenteral”, tal como se usa en el presente documento, incluye tecnicas de inyeccion o infusion subcutanea, intravenosa, intramuscular, intraarticular, intrasinovial, intraesternal, intratecal, intrahepatica, intralesional e intracraneal. Sin embargo, en casos en que el inhibidor de fXa que esta siendo neutralizado tiene una larga semivida en plasma, una infusion continua o una formulacion de liberacion sostenida puede ser necesaria para unirse al inhibidor de fXa y de este modo liberar el fXa activo antes de la eliminacion del inhibidor de fXa del cuerpo.
Las formas inyectables esteriles de las composiciones de esta invencion pueden ser suspension acuosa u oleaginosa. Estas suspensiones pueden formularse de acuerdo con tecnicas conocidas en la tecnica usando agentes dispersantes o humectantes y agentes de suspension adecuados. La preparacion inyectable esteril puede ser tambien una solucion o suspension inyectable esteril en un diluyente o disolvente parenteralmente aceptable no toxico, por ejemplo como una solucion en 1,3-butanodiol. Entre los vehfculos y disolventes aceptables que pueden emplearse estan agua, solucion de Ringer y solucion isotonica de cloruro sodico. Ademas, los aceites fijos esteriles se emplean convencionalmente como medio disolvente o de suspension. Para este fin, puede emplearse cualquier aceite fijo suave incluyendo mono- o digliceridos sinteticos. Los acidos grasos, tales como acido oleico y sus derivados gliceridos son utiles en la preparacion de inyectables, como lo son los aceites naturales farmaceuticamente aceptables, tales como aceite de oliva o aceite de ricino, especialmente en sus versiones polioxietiladas. Estas soluciones o suspensiones en aceite tambien pueden contener un diluyente o dispersante alcoholico de cadena larga, tal como carboximetilcelulosa o agentes dispersantes similares que se usan comunmente en la formulacion de formas de dosificacion farmaceuticamente aceptables incluyendo emulsiones y suspensiones. Otros tensioactivos usados comunmente, tales como Tweens, Spans y otros agentes emulsionantes o potenciadores de la biodisponibilidad que se usan comunmente en la fabricacion de formas de dosificacion solidas, lfquida, u farmaceuticamente aceptables tambien pueden usarse para fines de formulacion. Los compuestos pueden formularse para administracion parenteral por inyeccion tal como por inyeccion en embolada o infusion continua. Una forma de dosificacion unitaria para inyeccion puede ser en ampollas o en recipientes de multiples dosis.
Ademas de las formas de dosificacion descritas anteriormente, excipientes y transportadores y formas de dosificacion farmaceuticamente aceptables son conocidos generalmente por los expertos en la materia y estan incluidos en la invencion. Debe entenderse que un regimen de dosificacion y tratamiento especffico para cualquier
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paciente particular dependera de diversos factores, incluyendo la actividad del antfdoto especffico empleado, la edad, peso corporal, estado de salud general, sexo y dieta, la funcion renal y hepatica del paciente, y el tiempo de administracion, la velocidad de excrecion, la combinacion de farmacos, criterio del facultativo o el veterinario a cargo del tratamiento y la gravedad de la enfermedad particular que esta siendo tratada.
VI. Kits
La invencion proporciona ademas kits o paquetes. En algunas realizaciones, el kit de la presente invencion comprende: (a) un primer recipiente que contiene un inhibidor de fXa para la administracion regular para el tratamiento de la trombosis, y (b) un segundo recipiente que contiene un antfdoto de esta invencion para usarlo en los casos en hay una sobredosis del inhibidor de fXa en (a) o cuando la hemostasia normal necesita ser restaurada para detener o prevenir la hemorragia. En otras realizaciones, el kit comprende ademas una etiqueta que explica cuando deben usarse estos dos agentes en (a) y (b).
El primer y segundo recipiente puede ser un frasco, tarro, vial, matraz, jeringa, tubo, bolsa, o cualquier otro recipiente usado en la fabricacion, el almacenamiento o la distribucion de un producto farmaceutico. El prospecto puede ser una etiqueta, marca, marcador, o similares, que recita informacion relativa a la composicion farmaceutica del kit. La informacion recitada por lo general es determinada por la agencia reguladora que regula la zona en la que se va a comercializar la composicion farmaceutica, tal como la Food and Drug Administration. Preferiblemente, en el prospecto recita especfficamente las indicaciones para las que la composicion farmaceutica se ha aprobado. El prospecto puede estar hecho de cualquier material sobre el que una persona pueda leer la informacion contenida en el mismo o sobre el mismo. Preferiblemente, el prospecto es un material imprimible, tal como papel, carton con reverso adhesivo, papel de aluminio, o plastico, y similares, en el que se ha impreso o aplicado la informacion deseada.
Ejemplos
La invencion se entendera adicionalmente mediante referencia a los siguientes ejemplos, que pretenden ser puramente ejemplares de la invencion. La presente invencion no esta limitada en alcance por las realizaciones ejemplificadas, que pretenden ser ilustraciones de aspectos individuales de la invencion solamente. Cualesquiera procedimiento que son funcionalmente equivalentes estan dentro del alcance de la invencion. Diversas modificaciones de la invencion ademas de las descritas en el presente documento seran evidentes para los expertos en la materia a partir de la descripcion anterior y las figuras adjuntas. Dichas modificaciones estan dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas.
A menos que se indique otra cosa, todas las temperaturas estan en grados Celsius. Ademas, en estos ejemplos y en cualquier otra parte, las abreviaturas tienen los siguientes significados:
aa = aminoacido ab = anticuerpo
ACT = Tiempo de coagulacion activado
aPTT= tiempo de tromboplastina parcial activada
celula CHO = celula de ovario de hamster chino
celulas CHO dhfr (-)= celulas CHO que carecen de gen dhfr
hr= hora
INR= Relacion normalizada internacional
IV = intravenosa
kg = kilogramo
M = molar
mg = miligramo
mg / kg = Miligramo/kilogramo
mg/ml= Miligramo/mililitro
min = minuto
ml = mililitro
mM = milimolar
nm = nanometros
nM = nanomolar
PO= oral
PRP= Plasma rico en plaquetas
PT = Tiempo de protrombina
RFU = Unidad de fluorescencia relativa
s = segundo
TF = Factor tisular
U/ml= Unidades/mililitrol
pl o Ul= microlitro
pM= micromol
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pg= microgramo
Ejemplo 1. Preparacion de des-Gla anhidro-fXa mediante digestion con quimotripsina
Se preparo des-Gla anhidro-fXa de acuerdo con el procedimiento de Morita, T. y col., J. Bio. Chem., 1986, 261(9): 4015-4023 mediante la incubacion de anhidro-fXa, en el que deshidroalanina sustituye a la serina del sitio activo, con quimotripsina en Tris-HCl 0,05 M, NaCl 0,1 M, a pH 7,5 y 22°C durante 60 minutos. En un entorno de experimento tfpico, 0,5 miligramos/mililitro (mg/ml) de anhidro-fXa se incubaron con perlas de 5 unidades/mililitro (U/ml) de a-quimotripsina-agarosa con agitacion suave. Al final de la reaccion, las perlas de a-quimotripsina-agarosa se eliminaron por centrifugacion o filtracion. A esto le siguio incubacion con cantidad en exceso de inhibidores fluoruro de 4-amidino-fenil-metanosulfonilo (APMSF), tosil-L-lisina clorometil cetona (TLCK), y tosil-L-fenilalanina clorometil cetona (TPCK) para inactivar la actividad fXa residual o cualquier actividad de la quimotripsina posiblemente lixiviada a partir de las perlas. El fragmento de dominio Gla y los inhibidores se eliminaron del producto final, des-Gla anhidro-fXa, por un dispositivo de filtro Amicon Ultra Centrifugal (membrana YM10) o mediante dialisis convencional. La concentracion o el intercambio de tampon, en caso necesario, tambien se logro al mismo tiempo.
El anhidro-fXa que contiene dominio Gla se preparo de acuerdo con el procedimiento descrito por Nogami, y col., J. Biol. Chem. 1999, 274 (43): 31000-7. Como se muestra en la Figura 5, el anhidro-fXa que contenfa Gla tiene una actividad enzimatica disminuida pero es capaz de unirse a inhibidores de fZa tales como Betrixaban. Esto se describe en detalle en el Ejemplo 4.
La digestion con quimotripsina de fXa activo puede llevarse a cabo de acuerdo con el procedimiento anterior sin usar APMSF. La actividad de coagulacion de fXa activo se determino antes de la digestion con quimotripsina, y despues de 15, 30 y 60 minutos de la digestion con quimotripsina de acuerdo con el procedimiento descrito en el ejemplo 3 a continuacion. La figura 7muestra una perdida completa de la actividad de coagulacion despues de 30 minutos de digestion con quimotripsina. El tiempo de incubacion se prolongo a 60 minutos para asegurar la eliminacion completa del dominio Gla.
Ejemplo 2. Ensayo de generacion de trombina en plasma pobre en plaquetas (PPP) o plasma rico en plaquetas (PRP)
En este ejemplo, las muestras de plasma rico en plaquetas o pobre en plaquetas humanas se prepararon a partir de sangre de donantes sanos extrafda en el 0,32% de citrato. PRP y PPP se prepararon centrifugando la sangre anticoagulada a ~100 gravedades o 1000 gravedades durante 20 minutos, respectivamente, a temperatura ambiente. 75-100 microlitros de plasma (pl) se mezclaron con CaCl 2 y Z-Gly-Gly-Arg-aminometilcumarina (Z-GGR- AMC, un sustrato fluorogeno de trombina). Se anadio el factor tisular (Innovin, Dade Behring) para iniciar la generacion de trombina. Para un experimento tfpico, la mezcla de reaccion contenfa Ca2+ 15 milimolar (mM), Z- GGR-AMC 100 micromolar (pM), y el factor tisular (TF) (Innovin) 0,1 nanomolar (nM). La formacion de trombina se monitorizo de forma continua a 37°C mediante un lector de placas fluorometrico (Molecular Devices) midiendo las unidades de fluorescencia relativa (RFU). Inhibidor y antfdoto, cuando estan presentes, se preincubaron con plasma durante 20 minutos a temperatura ambiente antes del inicio de la generacion de trombina.
Los resultados de diversos experimented usando este ensayo pueden encontrarse en las figuras 4, 6 y 9.
Ejemplo 3. Ensayos de prolongacion de la coagulacion
Se usaron dos formatos de ensayo de coagulacion para poner a prueba los efectos de los inhibidores del factor Xa y el antfdoto sobre la prolongacion de la coagulacion. En el primer formato, se uso una placa de 96 pocillos para medir varias muestras al mismo tiempo. En el segundo formato de ensayo, se midio aPTT con un instrumento de coagulacion convencional (temporizador de coagulacion automatico MLA Electra 800).
En el procedimiento de formato de placa de 96 pocillos, plasma pobre en plaquetas o plasma rico en plaquetas humano se preparo de manera similar a los procedimientos en el ejemplo 2. De 75 a 100 pl de plasma se recalcificaron con CaCl2, se incubaron a 37°C durante 3 minutos y la formacion de coagulos se inicio anadiendo factor tisular (Innovin, Dade Behring) o un reactivo de aPTT (Actin FS, Dade Behring). El cambio de DO405 se monitorizo continuamente mediante un lector de placas (Molecular Devices). El tiempo de coagulacion se definio como el tiempo (segundos) cuando se alcanzo la mitad del valor maximo de cambio de absorbancia (DO405nm). El inhibidor del Factor Xa y el antfdoto, cuando estaban presentes, se preincubaron con plasma a temperatura ambiente durante 20 minutos antes del inicio de la reaccion.
Cuando un fXa activo se ensayo para su actividad de coagulacion tal como se muestra en la figura 7, 75-100 pl de plasma deficiente en fX (George King Bio-Medical, Inc.) se recalcificaron con CaCl2, se incubaron a 37°C durante 3 minutos y productos de fXa despues de la digestion con quimotripsina se anadieron al plasma para iniciar la formacion de coagulos. El cambio de DO405 se monitorizo continuamente mediante un lector de placas, tal como se ha descrito anteriormente.
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En la figura 13, el efecto de Betrixaban 400 nM sobre la prolongacion del aPTT de plasma humano normal y la inversion del efecto inhibidor de Betrixaban por antfdoto des-Gla anhidro-fXa se midio con un temporizador de coagulacion automatico MLA Electra 800. 100 pl de plasma humano combinado se mezclaron con Betrixaban 400 nM y diferentes concentraciones de antfdoto. Se anadieron reactivo de aPTT (Actin FS, Dade Behring) y CaCl2 segun las instrucciones del fabricante para la medicion de los tiempos de coagulacion.
Los resultados de experimentos adicionales usando este ensayo pueden encontrarse en la figuras 10 y 11.
Ejemplo 4. Inversion de la inhibicion de fXa por Betrixaban mediante des-Gla anhidro-fXa
Para medir la inhibicion de la actividad fXa por Betrixaban y la inversion de su efecto inhibidor, se purifico fXa activo, diferentes concentraciones de Betrixaban y fXa anhidro o des-Gla anhidro-fXa se anadieron a Tris 20 mM, NaCl 150 mM, Ca2+ 5 mM, y albumina de suero bovino (BSA) al 0,1%. Despues de la incubacion a temperatura ambiente durante 20 minutos, se anadieron 100 pM de Spectrozyme FXa (un sustrato cromogeno del factor Xa, American Diagnostica) a la mezcla y la velocidad de escision de sustrato se monitorizo continuamente durante 5 minutos a 405 nanometros (nm) mediante un lector de placas. En la figura 5, la actividad cromogena se normalizo respecto a fXa activo en ausencia de cualquier inhibidor. La velocidad inicial de formacion de producto en funcion de la concentracion de inhibidor y antfdoto se analizo por regresion no lineal para estimar la afinidad de Betrixaban por el antfdoto (figura 8).
El efecto del antfdoto des-Gla anhidro-fXa sobre la actividad de trombina hacia un sustrato cromogeno S2288 (200 mM) se midio de manera similar como anteriormente, con o sin Argatroban, un inhibidor de Ila de molecula pequena espedfico. Como se esperaba, el antfdoto (538 nM) no afecta a la actividad amidolftica de Ila (5 nM) o su inhibicion por Argatroban 50 nM.
Ejemplo 5. Preparacion de fXa con residuos de acido y-carboxiglutamico descarboxilados
Un derivado de fXa con residuos de acido y-carboxiglutamico descarboxilados puede prepararse tratando protema fXa, por ejemplo, basandose en el procedimiento descrito por Bajaj, y col., J. Biol. Chem., 1982, 257(7): 3726-3731. De 2 a 5 mg de fXa purificado o recombinante en 2 ml de bicarbonato de amonio 0,1 molar a pH 8,0 se liofilizan. El polvo resultante se sello a un vacfo de menos de 20 pM y se calento a 110°C durante diversos penodos de tiempo para obtener fXa descarboxilado.
Ejemplo 6. Preparacion de des-Gla fXa-S379A recombinante
Los derivados de fXa pueden producirse mediante procedimiento de ADN recombinante con uno de los siguientes procedimientos basados en cADN de fX (SEQ ID No. 2) para expresar fX (SEQ ID NO. 1, 3) o derivados de fXa (SEQ ID NO. 4, 5, 9 y 11) en un organismo huesped adecuado de acuerdo con procedimientos generales de mutagenesis y biologfa molecular.
fX recombinante y derivados de fX pueden expresarse en, por ejemplo, celulas de rinon embrionario humano HEK293 basandose en procedimientos descritos en Larson, P.J., y col., Biochem., 1998, 37: 5029-5038, y Camire, R.M., y col., Biochem., 2000, 39, 14322-14329. fX recombinante puede activarse a rfXa mediante el activador del factor X veneno de vfbora de Russell (RVV). rfXa puede procesarse adicionalmente a des-Gla anhidro-fXa basandose en procedimientos descritos en el ejemplo 1.
fX-S379A recombinante (S195A en numeracion de quimotripsina) con el residuo serina del sitio activo siendo sustituido por alanina, y preferentemente el mutante de fXa activado, rfXa-S379A, puede expresarse, por ejemplo, en celulas de ovario de hamster chino (CHO) basandose en procedimiento descritos por Sinha y col., Protein Expression and Purif. 1992, 3: 518-524; Wolf, D.L. y col., J. Biol. Chem., 1991, 266(21): 13726-13730.
Des-Gla fXa-S379A puede prepararse mediante digestion con quimotripsina de fXa-S379A de acuerdo con procedimiento descritos en el ejemplo 1.
Mas preferentemente, Des-Gla fXa-S379A puede expresarse directamente de acuerdo con procedimiento previos con delecion del fragmento del dominio Gla mediante procedimientos de mutagenesis. Por ejemplo, puede usarse expresion de protemas recombinantes para expresar: des-Gla(1-39)-fXa-S379A, despues de la eliminacion del fragmento de dominio Gla 1-39 de la SeQ ID NO. 3; des-Gla(1-44)-fXa-S379A, equivalente a la SEQ ID NO. 10 con deshidroalanina siendo sustituida por alanina; y des-Gla(1-45)-fXa-S379A con todo el dominio Gla siendo eliminado (SEQ ID NO. 11).
Tambien pueden realizarse truncamientos adicionales en el dominio EGF1 o EGF1 mas EGF2 (figura 2) para expresar derivados des(1-84)-fXa-S379A o des(1-128)-fXa-S379A.
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Ejemplo 7. Expresion de mutante de fXa recombinante en celulas CHO
Este ejemplo describe la construccion de expresion de protefna recombinante y la linea celular para la expresion directa de una variante de fXa-S379A sin dominio Gla (S195A en la numeracion de quimotripsina). El antfdoto recombinante no requiere las etapas de activacion o modificacion qufmica necesarias para producir el pd-antfdoto y tiene una afinidad comparable a la protefna derivada de plasma en los ensayos in vitro descritos en el presente documento.
En este ejemplo, un mutante de fXa (SEQ ID NO. 13, tabla 13) se expreso directamente en una celula CHO (vease la figura 14 para vector de expresion) y la protefna funcional se purifico a partir de medio acondicionado como se describe a continuacion. La actividad funcional del antfdoto recombinante (r-antfdoto) se ensayo in vitro y en un modelo animal (ejemplo 8).
Se uso PCR para mutar la secuencia de cADN de fX (SEQ ID NO. 2) en tres regiones. La primera mutacion fue la delecion de 6 a 39 aa en el dominio Gla de FX (SEQ ID NO. 3, figura 3). La segunda mutacion fue sustituir la secuencia del peptido de activacion de 143-194 aa con -RKR-. Esto produjo un enlazador -RKRRKR- que conecta la cadena ligera y la cadena pesada. Tras la secrecion, este enlazador se elimina en CHO dando como resultado una molecula de fXa bicatenaria. La tercera mutacion es la mutacion del residuo del sitio activo S379 a un residuo de Ala.
El polipeptido producido mediante el cADN (SEQ ID NO. 16) que se acaba de describir, se describe en la tabla 12 (sEq ID NO. 12). El alineamiento del cADN con el polipeptido se muestra en la tabla 17. La molecula de fXa bicatenaria producida despues de la secrecion es un fragmento de cadena ligera descrito en la tabla 14 (SEQ ID NO. 14) y un fragmento de cadena pesada descrito en la tabla 15 (SEQ ID NO. 15).
Los primeros 1-5 aa en la secuencia de fX se reservaron y se usaron para conectar el polipeptido de mutante de fXa con el prepropeptido de fX (SEQ ID NO. 1, figura 1), garantizando el apropiado procesamiento del prepropeptido en el mutante de fXa.
La secuencia de ADN que codifica el polipeptido de mutante de fXa descrito anteriormente se secuencio y se inserto en el vector de expresion mostrado en la Figura 14. El polinucleotido del vector de expresion se muestra en la SEQ ID NO. 17. El ADN del plasmido se linealizo y se transfecto a celulas CHO dhfr(-). Las celulas se seleccionaron usando medios deficientes en tetrahidrofolato (HT) mas metotrexato (MTX). Se cribaron clones estables para expresion elevada de protefnas usando un kit de ELISA de fX (Enzyme Research Laboratories, numero de catalogo FX-EIA). La protefna mutante de fXa se expreso en medio libre de suero y el medio acondicionado se recogio y se proceso para purificacion.
La protefna diana en el medio acondicionado se puede aislar mediante cromatograffa de intercambio ionico y purificarse posteriormente mediante cromatograffa de afinidad de etapa unica (tal como un anticuerpo anti-fXa acoplado a una matriz) o mediante una combinacion de varias etapas de cromatograffa, tales como matrices hidrofobas y de exclusion por tamano. Las purificaciones por afinidad pueden incluir material cromatografico que se une selectivamente al sitio activo escindido de fXa, tal como benzamidina-sefarosa o inhibidor de tripsina de soja- agarosa (STI-agarosa).
La figura 15 muestra las transferencias de Western de mutante de fXa purificado por afinidad (STI-Agarosa, n° de catalogo de Sigma T0637) usando anticuerpos monoclonales (Enzyme Research Laboratories, FX-EIA) que reconoce la cadena pesada y ligera de fX, respectivamente. Tras la reduccion del puente disulfuro que conecta la cadena ligera y pesada, el r-Antfdoto muestra la banda de cadena pesada de movilidad esperada (similar a fXa derivado de plasmap9 en la transferencia de Western. La delecion de los restos de aminoacidos 6-39 en el dominio Gla del mutante de fXa da como resultado una banda de peso molecular mas bajo para la cadena ligera de r- Antfdoto en comparacion con fXa derivado del plasma. Las marcas de peso molecular tambien pueden verse en la transferencia.
Las Figuras B y 15C muestran un SDS-PAGE y una transferencia de Western de r-Antfdoto purificado mediante intercambio ionico y purificacion por afinidad seguidos de cromatograffa de exclusion por tamano usando una columna Superdex 75 10/300 GL (Ge Healthcare, n.° del catalogo 17-5174-01).
Ejemplo 8. Modelo en raton in vivo
Se ensayaron el perfil farmacocinetico y farmacodinamico (PK-PD) de Betrixaban en ratones macho C57B1/6 con o sin la administracion de antfdoto. La administracion oral unica de Betrixaban se dosifico a 0, 15, 25 y 75 mg/kg para los grupos de control. Se usaron 15 mg/kg para el grupo tratado con antfdoto. Una unica inyeccion intravenosa (IV) de antfdoto (300 pg/200 pl) o vehfculo (solucion salina normal, 200 pl) se administro 5 minutos antes del punto temporal de 1,5 h.
A las 1,5, 2,0, y 4,0 horas despues de la administracion oral de Betrixaban, los ratones fueron anestesiados con un
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coctel de ketamina (SC) y se desangraron por puncion cardiaca. Se obtuvieron muestras de sangre (0,5 ml) en 50 pi de citrato trisodico. La INR de sangre total se midio usando cartuchos de HEMOCHRON Jr. (International Technidyne Corporation) segun las instrucciones del fabricante. Se preparo plasma pobre en plaquetas de raton por centrifugacion para determinaciones de la concentracion plasmatica de Betrixaban y antfdoto (ELISA).
Para experimento con antfdoto recombinante (r-antfdoto), a los ratones se les administro por via oral Betrixaban a 0, 15, 25 y 75 mg/kg para grupos de control. Se usaron 15 mg/kg para el grupo tratado con antfdoto (300 pg/200 pl). Se tomaron muestras a 1,5 h despues de la administracion oral de Betrixaban (5 min. despues de la inyeccion de antfdoto).
Tal como se muestra en la figuras 16 y 17 y las tablas 13A y 14A, una unica inyeccion (300 pg, IV) de antfdoto derivado de plasma (pd-antfdoto) o mutante de fXa recombinante (r-antfdoto) a ratones despues de la administracion de Betrixaban (15 mg/kg, PO) capturaba eficazmente el inhibitor in vivo. La correlacion PK-PD de INR de sangre completa y la concentracion plasmatica de antfdoto (tablas A y B) indicaba una reduccion >50% de Betrixaban funcional basandose en mediciones de INR, y justificaron la neutralizacion eficaz de inhibidores de fXa mediante el antfdoto mediante multiples inyecciones u otros regfmenes. Se contempla que estos resultados demuestran que los derivados de fXa de esta invencion tienen potencial para actuar como antfdotos universales para invertir el efecto anticoagulante de inhibidores de fXa en pacientes con hemorragia u otras urgencias medicas.
Tabla A - correlacion PK-PD en ratones tratados con pd-antfdoto a 1,5 h despues de la administracion oral de
- Animal tratado con pd-Antfdoto
- 1 2 3 4 5 6 7 media
- Betrixaban (ng/ml)
- 673 793 1170 415 217 664 879 687
- INR esperada
- 4,2 4,5 5,2 3,3 2,3 4,1 4,7 4,0
- INR medida
- 2,3 2,3 3,3 0,8 0,8 1,5 2,0 1,9
- % de correccion
- 63,9 66,6 52,3 100 100 83,1 74,4 77,2
Tabla B-correlacion PK-PD en ratones tratados con r-Antfdoto a 1,5 h despues de la administracion oral de 15 mg/kg de Betrixaban (5 min despues de la inyeccion del antfdoto)
- Animal tratado con r-Antfdoto
- 1 2 3 4 Media
- Betrixaban (ng/ml)
- 434 262 335 494 381
- INR esperada
- 3,2 2,5 2,8 3,5 3,0
- INR medida
- 2,0 0,9 1,2 0,9 1,3
- % de correccion
- 50,0 94,1 80,0 93,6 77,3
La figura 22 muestra un experimento en raton con una sola inyeccion IV (1 inyeccion) o dos inyecciones (2 inyecciones) del r-antfdoto (n = 5 por grupo, 312 pg/200 pl de r-antfdoto) despues de la administracion oral de Betrixaban (15 mg/kg). Para el grupo de inyeccion unica, se tomaron muestras de sangre de raton a 1 h despues de la administracion oral de Betrixaban. Vehfculo (control_1) o r-Antfdoto (1 inyeccion) se administro 5 min antes del punto temporal de 1 h. Para el grupo de doble inyeccion, se inyecto vehfculo o r-antfdoto a los 55 min y se repitieron al 115 min despues de la administracion oral de Betrixaban. Se tomaron muestras de sangre de raton a las 2 h para los ratones tratados con vehfculo (control_2) y r-antfdoto (2 inyecciones). La INR se midio en funcion de la relacion de antfdoto/Betrixaban en plasma de raton despues de las inyecciones individuales o dobles del antfdoto, tal como se muestra en la figura 22B.
Ejemplo 9. Inversion in vitro de rivaroxaban y apixaban mediante antfdoto
Como se esperaba, los antfdotos contemplados por esta invencion tambien fueron capaces de unirse a y neutralizar otros inhibidores de fXa dirigidos al sitio activo. Las tablas 15 y 16 muestran correccion in vitro de la inhibicion por Betrixaban, rivaroxaban y apixaban mediante pd-antfdoto y r-antfdoto. FXa purificado (3,0 nM), inhibidor (7,5 nM), y diferentes concentraciones de antfdoto se incubaron durante 10 min a 22°C en un tampon con Tris 20 mM, NaCl 150 mM, BSA al 0,1%, pH 7,4. La actividad de fXa se ensayo similar al ejemplo 4.
Tabla C-% de correccion de inhibicion mediante inhibidores de fXa
- pd-Antfdoto (nM)
- Betrixaban Rivaroxaban Apixaban
- 0
- 0
- 0
- 0
- 10,2
- 13,1 10,6 6,5
- 20,4
- 34,8 37,4 11,4
- 40,7
- 47,1 46,8 15,0
- 61,1
- 68,4 55,7 40,3
- 101,8
- 67,5 69,4 52,3
- 162,9
- 80,5 74,0 56,0
- 203,7
- 82,6 72,6 60,2
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35
Tabla D-% de correccion de inhibicion mediante inhibidores de fXa
- r-Antfdoto (nM)
- Betrixaban Rivaroxaban Apixaban
- 0
- 0
- 0
- 0
- 9,3
- 21,5 23,2 13,3
- 18,6
- 52,7 54,2 33,5
- 37,2
- 75,5 72,6 49,9
- 55,8
- 86,5 79,9 59,2
- 93,1
- 94,9 89,1 64,4
- 148,9
- 99,3 96,7 74,8
- 186,1
- 99,5 94,8 72,6
Tal como se muestra en la tabla C, pd-antfdoto 204 nM produce al menos el 60% de correccion de los efectos inhibidores de inhibidores de la prueba, mientras que, en la tabla D se consigue >95% de correccion de inhibicion mediante el r-antfdoto (186 nM) para Betrixaban y rivaroxaban y > 70% inversion de apixaban.
Ejemplo 10. Inversion in vitro de Betrixaban mediante r-antfdoto
En la tabla E, se ensayo el efecto de la protefna antfdoto recombinante sobre la inversion de la anticoagulacion por Betrixaban en un ensayo de coagulacion en plasma humano. El efecto de Betrixaban 300 nM y 400 nM sobre una prolongacion del aPTT de plasma y la inversion del efecto inhibidor se midio mediante un temporizador de coagulacion automatico MLA Electra 800. 100 pL de plasma humano anticoagulado combinado se mezclaron con Betrixaban 300 nM o 400 nM y diferentes concentraciones de antfdoto. Se anadieron reactivo de aPTT (Actin FS, Dade Behring) y CaCh segun las instrucciones del fabricante.
Tabla E - inversion con r-antfdoto de^ la actividad anticoagulante de Betrixaban
- aPTT (s) Veces de cambio % de correccion de anticoagulacion
- Plasma humano de control
- 35,2 1,00 -
- Betrixaban 300 nM
- 61,8 1,76 -
- Betrixaban 300 nM + r-antfdoto 570 nM
- 38,3 1,09 88
- Betrixaban 300 nM + r-antfdoto 760 nM
- 38,2 1,09 88
- Betrixaban 300 nM + r-antfdoto 1140 nM
- 38,1 1,08 90
- Betrixaban 400 nM
- 66,3 1,88 -
- Betrixaban 400 nM + r-antfdoto 380 nM
- 47,1 1,34 61
- Betrixaban 400 nM + r-antfdoto 570 nM
- 39,9 1,13 85
- Betrixaban 400 nM + r-antfdoto 760 nM
- 39,9 1,13 85
- Betrixaban 400 nM + r-antfdoto 1140 nM
- 37,8 1,07 92
- Betrixaban 400 nM + r-antfdoto 1520 nM
- 39,4 1,12 86
- r-antfdoto 1140 nM
- 38,9 1,11 -
- r-antfdoto 1520 nM
- 38,8 1,10 -
Ejemplo 11. Inversion in vitro de heparina de bajo peso molecular (“LMWH”) mediante r-antfdoto
En la figura 18, se ensayo el efecto de r-antfdoto para invertir el efecto inhibidor de la LMWH enoxaparina (Sanofi- Aventis) mediante cambios de turbidez en plasma humano. Se incubo enoxaparina (0-1,25 U/ml) a 22°C durante 20 min con o sin r-antfdoto 508 nM. Se midieron cambios de turbidez de acuerdo con procedimiento descritos en el ejemplo 3. El r-antfdoto 508 nM sustancialmente corregfa (>75%) el efecto inhibidor de 0,3125-1,25 U/ml de enoxaparina.
En la figura 19, se ensayo el efecto de r-antfdoto sobre la inversion de anticoagulacion mediante una heparina de bajo peso molecular (LMWH enoxaparina, Sanofi-Aventis) en un ensayo de coagulacion en plasma humano. El efecto de 1 unidad de antiXa/ml de LMWH sobre una prolongacion del aPTT de plasma y la inversion del efecto inhibidor se midio mediante un temporizador de coagulacion automatico MLA Electra 800. 100 pl de plasma humano anticoagulado con citrato combinado se mezclaron con enoxaparina y diferentes concentraciones de antfdoto. Antes de la medicion del tiempo de coagulacion, se anadieron reactivo de aPTT (Actin FS, Dade Behring) y CaCl2 segun las instrucciones del fabricante. La adicion de antfdoto recombinante 1,14 pM producfa una correccion del 52% de anticoagulacion producida por 1 unidad/ml de enoxaparina.
Ejemplo 12. Inversion in vitro de rivaroxaban mediante r-antfdoto
En la figura 20, se ensayo el efecto de protefna de antfdoto recombinante sobre la inversion de anticoagulacion mediante un inhibidor del factor Xa de molecula pequena (rivaroxaban, Bay 59-7939) en un ensayo de coagulacion
5
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20
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40
45
50
en plasma humano. Segun lo descrito por Perzborn y col., J. Thromb. Haemost. 3: 514-521, 2005; las mediciones del tiempo de protrombina son un procedimiento preciso para evaluar el efecto anticoagulante de rivaroxaban. El efecto de rivaroxaban 1 pM sobre la prolongacion del tiempo de protrombina (PT) de plasma humano combinado y la inversion del efecto inhibidor se midio mediante un temporizador de coagulacion automatico MLA Electra 800. 100 pl de plasma humano anticoagulado con citrato combinado se mezclaron con rivaroxaban y diferentes concentraciones de antfdoto. Antes de la medicion del tiempo de coagulacion, se anadio reactivo Thromboplastin C Plus de cerebro de conejo (Dade Behring) a muestras de plasma segun las instrucciones del fabricante. La adicion de anticuerpo recombinante 1,9 pM produjo una correccion del 100% de la anticoagulacion producida por rivaroxaban 1 pM.
Ejemplo 13. Inversion in vitro de apixaban mediante r-antfdoto
En la tabla F, se ensayo el efecto de protefna de antfdoto recombinante sobre la inversion de anticoagulacion mediante apixaban en un ensayo de coagulacion en plasma humano. Segun lo descrito por Pinto y col., J. Med. Chem. 55(22): 5339-5356, 2007; las mediciones del tiempo protrombina (PT) son un procedimiento preciso de evaluar los efectos anticoagulantes ex vivo de apixaban. El efecto de apixaban 1 pM y 1,5 pM sobre la prolongacion del tiempo de protrombina (PT) de plasma humano combinado y la inversion del efecto inhibidor se midio mediante un temporizador de coagulacion automatico MLA Electra 800. 100 pl de plasma humano anticoagulado con citrato combinado se mezclaron con apixaban y diferentes concentraciones de antfdoto. Antes de la medicion del tiempo de coagulacion, se anadio reactivo Thromboplastin C Plus de cerebro de conejo (Dade Behring) a muestras de plasma segun las instrucciones del fabricante. La adicion de antfdoto recombinante 1,9 pM produjo una correccion del 97% de la anticoagulacion producida por apixaban 1,5 pM.
Tabla F - inversion con r-antfdoto de la actividad anticoagulante de Apixaban
- PT (s) Veces de cambio
- Plasma humano de control
- 14,1 -
- 1 pM de apixaban
- 16,4 1,16
- 1 pM de apixaban + r-antfdoto 380 nM
- 15,3 1,09
- 1 pM de apixaban + r-antfdoto 760 nM
- 14,9 1,06
- 1 pM de apixaban + 1,14 pM de r-antfdoto
- 14,2 1,01
- 1 pM de apixaban + 1,52 pM de r-antfdoto
- 14,2 1,01
- 1,5 pM de apixaban
- 18,4 1,31
- 1,5 pM de apixaban + 1,52 pM de r-antfdoto
- 14,6 1,04
- 1,5 pM de apixaban + 1,90 pM de r-antfdoto
- 14,3 1,01
- 1,52 pM de r-antfdoto
- 14 -
- 1,90 pM de r-antfdoto
- 14,2 -
Ejemplo 14. Inhibicion in vitro de argatroban mediante des-Gla anhidro-fXa
Para medir la inhibicion de la actividad de trombina mediante argatroban y la inversion de su efecto inhibidor, se anadieron trombina humana purificada (5 nM), argatroban (50 nM) y diferentes concentraciones de antfdoto des-Gla anhidro fXa a un tampon que contenfa Tris 20 mM, NaCl 0,15 M, cloruro calcico 5 mM, albumina de suero bovino al 0,1%, pH 7,4. Despues de la incubacion a temperatura ambiente durante 20 min, se anadio un sustrato amidolftico S2288 (200 uM) a la mezcla y la velocidad de escision de sustrato de p-nitroanilida se monitorizo mediante absorbancia a 405 nm. Los resultados se presentan en la figura 12.
Ejemplo 15. Metodos para extender la semivida plasmatica de la circulacion de antfdoto despues de la dosificacion en seres humanos
Los datos farmacocineticos recientes en animales han demostrado que el antfdoto recombinante expresado en celulas CHO DuxB1 tiene una semivida plasmatica de aclaramiento (T1/2) de 19 minutos en ratas SD y de 30 minutos en macacos de la Indica. Una semivida de aclaramiento mas larga puede ser deseable para el uso humano. La extension de la T1/2 en los seres humanos puede requerir la modificacion de la protefna por un resto conjugado capaz de extender la semivida circulante del derivado de fXa. El resto conjugado tal como un anticuerpo puede incluir anticuerpos enteros y cualquier fragmento de union a antfgeno o una cadena sencilla de los mismos. Por tanteo, el termino "anticuerpo" incluye cualquier molecula que contenga una protefna o un peptido que comprenda al menos una porcion de una molecula de inmunoglobulina. Los ejemplos del mismo incluyen, pero no se limitan a una region determinante de la complementariedad (RDC) de una cadena pesada o ligera o una porcion de union del ligando del mismo, una cadena pesada o cadena ligera de la region variable, una cadena de region constante de cadena pesada o ligera, una region marco conservada (RMC), o cualquier parte del mismo, o al menos una porcion de una protefna de union. Los anticuerpos pueden ser policlonales o monoclonales y pueden aislarse de cualquier fuente biologica adecuada, por ejemplo, murinos, de rata, ovinos y caninos. Un resto de conjugado tambien puede seleccionarse entre un grupo que consiste en polietilenglicol, un grupo acilo, un liposoma, un agente de encapsulacion, una protefna transportadora, una membrana fosfolipfdica artificial, una nanopartfcula y combinaciones de los mismos.
5
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25
Farmacocinetica del Antfdoto en rata
Se administro un miligramo de antfdoto en forma de una infusion intravenosa corta durante cinco minutos a cuatro ratas Sprague-Dawley. Se recogieron muestras de plasma en serie y se analizaron para determinar la concentracion de antfdoto utilizando un ensayo de inmunoabsorcion ligado a enzimas (ELISA). Los perfiles de concentracion plasmatica-tiempo del antfdoto pueden describirse mediante un modelo de dos compartimentos. El aclaramiento sistemico del antfdoto era bajo (1,65 ml/min/kg) y el volumen de distribucion era pequena (0,27 l/kg). La semivida de distribucion fue de 19 minutos, seguida de una semivida terminal mucho mas larga de 10 horas. Debido a la necesidad de mantener de inmediato la concentracion plasmatica del antfdoto por encima de la de un inhibidor del factor Xa (anticoagulante), se espera que la semivida de distribucion tenga un impacto mucho mayor que la semivida terminal en la seleccion de la dosis durante un tratamiento de sobredosis. Los datos se presentan en la Figura 23.
Farmacocinetica del antfdoto en macaco de la Indica
Se dosificaron dos animales cada uno con 10 mg de antfdoto por dosificacion intravenosa durante un perfodo de diez minutos. Las muestras de plasma para la determinacion de la T1/2 se obtuvieron de una manera similar a la del estudio en ratas. La semivida plasmatica de eliminacion (T1/2) fue de aproximadamente 30 minutos. Los datos se presentan en la Figura 24.
Debe entenderse que, aunque la invencion se ha descrito junto con las realizaciones anteriores, la descripcion y los ejemplos anteriores pretenden ilustrar y no limitar el alcance de la invencion. Otros aspectos, ventajas y modificaciones dentro del alcance de la invencion seran evidentes para los expertos en la materia a la que pertenece la invencion.
____Tabla 1-Secuencia ID NO. 1 - Secuencia polipeptfdica de Factor X Humano___________
1 MGRPLHLVLL SASLAGLLLL GESLFIRREQ ANNILARVTR AN5FLEEMKK GHLERECMEE 61 TCSYEEAREV FEDSDKTNEF WNKYKDGDQC ETSPCQNQGK CKDGLGEYTC TCLEGFEGKN 121 CELFTRKLCS LDNGDCDQFC HEEQNSWCS CARGYTLADN GKACIPTGPY PCGKQTLERR 181 KRSVAQATSS SGEAPDSITK KPYDAADLDP TENPFDLLDF NQTQPERGDN NLTRIVGGQE 241 CKDGECPWQA LLINEENEGF CGGTILSEFY ILTAAHCLYQ AKRFKVRVGD RNTEQEEGGE 301 AVHEVEWIK HNRFTKETYD FDIAVLRLKT PITFRMNVAP ACLPERDWAE STLMTQKTGI 361 VSGFGRTHEK GRQSTRLKML EVPYVDRNSC KLSSSFIITQ NMFCAGYDTK QEDACQGDSG 421 GPHVTRFKDT YFVTGIVSHG EGCARKGKYG IYTKVTAFLK WIDRSMKTRG LPKAKSHAPE 481 VITSSPLK
Tabla 2 - Secuenia ID NO. 2 - Una secuencia polinucleotfdica que codifica para el Factor X
5 Tabla 3 - Secuencia ID NO. 3 - Secuencia polipeptfdica de Factor X maduro humano
1 ANSFLEEMKK GHLERECMEE TCSYEEAREV FEDSDKTNEF WNKYKDGDQC ETSPCQNQGK
61 CKDGLGEYTC TCLEGFEGKN CELFTRKLCS LDNGDCDQFC HEEQNSWCS CARGYTLADN
121 GKACIPTGPY PCGKQTLERR KRSVAQATSS SGEAPDSITW KPYDAADLDP TENPFDLLDF
181 NQTQPERGDN NLTRIVGGQE CKDGECPWQA LLINEENEGF CGGTILSEFY ILTAAHCLYQ
241 AKRFKVRVGD RNTEQEEGGE AVHEVEWIK HNRFTKETYD FDIAVLRLKT PITFRMNVAP
301 ACLPERDVJAE STLMTQKTGI VSGFGRTHEK GRQSTRLKML EVPYVDRNSC KLSSSFIITQ
361 NMFCAGYDTK QEDACQGDSG GPHVTRFKDT YFVTGIVSWG EGCARKGKYG IYTKVTAFLK
421 WIDRSMKTRG LPKAKSHAPE VITSSPLK
Tabla 4 - Secuencia ID NO. 4 - Secuencia polipeptfdica de Factor Xa sin dominio Gla que carece de los
restos de aminoacidos 1 a 44
- Cadena ligera 1
- KDGDQC ETSPCQNQGK
- 61
- CKDGLGEYTC TCLEGFEGKN CELFTRKLCS LDNGDCDQFC HEEQNSVVCS CARGYTLADN
- 121
- GKACIPTGPY PCGKQTLER
- Cadena pesada 181
- IVGGQE CKDGECPWQA LLINEENEGF CGGTILSEFY ILTAAHCLYQ
- 241
- AKRFKVRVGD RNTEQEEGGE AVHEVEVVIK HNRFTKETYD FDIAVLRLKT PITFRMNVAP
- 301
- ACLPERDWAE STLMTQKTGI VSGFGRTHEK GRQSTRLKML EVPYVDRNSC KLSSSFIITQ
- 361
- NMFCAGYDTK QEDACQGDSG GPHVTRFKDT YFVTGIVSWG EGCARKGKYG IYTKVTAFLK
- 421
- WIDRSMKTRG LPKAKSHAPE VITSSPLK
Tabla 5 - Secuencia ID NO. 5 - Secuencia polipeptfdica de Factor Xa sin dominio Gla que carece de los
restos de aminoacidos 1 a 45
- Cadena ligera 1
- DGDQC ETSPCQNQGK
- 61
- CKDGLGEYTC TCLEGFEGKN CELFTRKLCS LDNGDCDQFC HEEQNSVVCS CARGYTLADN
- 121
- GKACIPTGPY PCGKQTLER
- Cadena pesada 181
- IVGGQE CKDGECPWQA LLINEENEGF CGGTILSEFY ILTAAHCLYQ
- 241
- AKRFKVRVGD RNTEQEEGGE AVHEVEVVIK HNRFTKETYD FDIAVLRLKT PITFRMNVAP
- 301
- ACLPERDWAE STLMTQKTGI VSGFGRTHEK GRQSTRLKML EVPYVDRNSC KLSSSFIITQ
- 361
- NMFCAGYDTK QEDACQGDSG GPHVTRFKDT YFVTGIVSWG EGCARKGKYG IYTKVTAFLK
- 421
- WIDRSMKTRG LPKAKSHAPE VITSSPLK
5
Claims (13)
- 51015202530354045505560651. Un polipeptido aislado que comprende(A)(i) la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO. 12 o 13 que comprende adicionalmente una modificacion en el bucle de autolisis de la cadena pesada de la SEQ ID NO. 12 o 13 o(ii) una secuencia de aminoacidos que tiene al menos el 95 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO. 12 o 13, y que comprende adicionalmente una o mas mutaciones seleccionadas entre el grupo que consiste en Arg366Q/A, Lys370Q/A, Arg372Q/A, Arg376Q/A, y combinaciones de los mismos;en el que el bucle de autolisis corresponde a los restos de aminoacidos 366-376 de la SEQ ID NO. 1;(B) la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO. 20 o una secuencia de aminoacidos que tiene al menos el 95 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO. 20, en la que el polipeptido no contiene el extremo C-terminal del factor Xa de tipo silvestre despues del resto de aminoacido que corresponde a Arg429 de la SEQ ID NO. 3;(C) la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO. 21 o una secuencia de aminoacidos que tiene al menos el 95 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO. 21, en la que el polipeptido tiene Gln en el resto de aminoacido correspondiente a Arg429 de la SEQ ID NO. 3; o(D) la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO. 22 o una secuencia de aminoacidos que tiene al menos el 95 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO. 22, en la que el polipeptido tiene Gln en el resto de aminoacido que corresponde a Arg429 de la SEQ ID NO. 3, y tiene Ala en el resto de aminoacido que corresponde a Thr443 de la SEQ ID NO. 3,en el que el polipeptido (a) tiene una actividad procoagulante reducida en comparacion con el factor Xa de tipo silvestre, (b) es capaz de unirse a un inhibidor del factor Xa, y (c) no se ensambla en un complejo de protrombinasa
- 2. El polipeptido aislado de la reivindicacion 1, en el que el polipeptido comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada entre SEQ ID NO. 20, 21 o 22.
- 3. El polipeptido de la reivindicacion 1, en el que la modificacion en el bucle de autolisis comprende la sustitucion de al menos un resto de aminoacido seleccionado entre el grupo que consiste en Arg366, Lys370, Arg372 y Arg376 a Gln (Q) o Ala (A).
- 4. Un conjugado peptfdico que comprende un vehfculo unido covalentemente o no covalentemente al polipeptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3.
- 5. El conjugado peptfdico de la reivindicacion 4, en el que el vehfculo es un liposoma, una micela, un polfmero farmaceuticamente aceptable o un vehfculo farmaceuticamente aceptable.
- 6. Un polinucleotido que codifica el polipeptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5.
- 7. Un metodo para preparar el polipeptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, que comprende expresar un polinucleotido que codifica el polipeptido en una celula hospedadora procariota o eucariota.
- 8. Una composicion farmaceutica que comprende un vehfculo y el polipeptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3.
- 9. La composicion farmaceutica de la reivindicacion 8, para su uso en un metodo de neutralizacion o inversion de la anticoagulacion en un sujeto sometido a tratamiento anticoagulante con un inhibidor del factor Xa que necesita el cese de la anticoagulacion o que padece sangrado.
- 10. La composicion farmaceutica de la reivindicacion 8, para su uso en un metodo de union e inhibicion selectivamente a un inhibidor del factor Xa administrado de forma exogena en un sujeto.
- 11. La composicion de la reivindicacion 9 o 10 para su uso como se define en dichas reivindicaciones, en la que el inhibidor del factor Xa se selecciona entre el grupo que consiste en fondaparinux, idraparinux, idraparinux biotinilado, enoxaparina, fragmin, NAP-5, rNAPc2, inhibidor de la via del factor tisular, DX-9065A, YM-60828, YM-150, apixaban, rivaroxaban, PD-348292, otamixaban, edoxaban, LY517717, GSK913893, razaxaban, heparina de bajo peso molecular, betrixaban o una sal farmaceuticamente aceptable de los mismos y combinaciones de los mismos.
- 12. La composicion de la reivindicacion 9 o 10 para su uso como se define en dichas reivindicaciones, en la que el sujeto esta experimentando un acontecimiento clfnico grave de sangrado seleccionado entre el grupo que consiste en una hemorragia, el sangrado en organos vitales, el sangrado que requiere volver a operar o un nuevo procedimiento terapeutico, y un fndice de sangrado de igual o mas de 2,0 con un sangrado manifiesto asociado.
- 1
- PrcPro
- LC RKR AP DOMINIO CATAUTICO
FIG. 1
10 20 30 40 5j 00
I I I I ICadena ligera 1 AHSFLEEKKK GHLEftECMEE ICSYEEAREV FEDSDKTMEF WNKYKDGGQC £IS?CQMQGK
DOMINIO GLA( 1 -45> !61 -KroiGEVT': i:41g'.vj»fc feevnjvvx's gargy.t:..a:;nEGF1(46-34) | EGF2(85-128)121 GKACiFTGPY PCGKQTLERCadena pesada SVAUATSS SgOBAPUSltW KPYUAAU..UF lEMPmOEDF(RKR) PbPTIDO DEACTIVACION181 NCTQPERGDN NLTRIVGGQE CKDGECPKQA LLINEENEGr CGGTILSEFY ILTAAHCIYQHIS236(H57)241 AKRFKVRVGD RNTEQEEGGE AVEEVEWIK HNRFTKETYD FDlAVlFCKT PITFRKNVA?A3P282(D1U2)30i ACLPERDKAE STLMTQKTG1 VSGFGRTHEK GRQSTRLKML EVPYVDRNSC KLSSSFIITQ361 NKFCAGYOTK QEDACQGOSG GPHVTRFKDT YFVTGIVSWG 2GCARKGKYG IYTKVTAFLK SER379(S195)421 WIDRSMKTRG LPKAKSKAPE VITSSPLKFIG. 2imagen1 imagen2 300000 rESSiSTF+Viia (50 nM)IZZ3TF+V!!a (100 nM)200000LXjTF+Vlia (200 nM)1000000,0031,2562,50125,00 250,00Betrixaban (nM)F r* I\j4□ Xa 2,4 nM1001 *■o Xa 2.4 nM + Betrixaban75 - 2.5 nMA Tampon25m-%00200300Gla anhidro-FXa (nM)F P c: U. DRFU
imagen3 Velocidad inicial (mDO/min)imagen4 Coagulacion (Veces)[Betrixaban]: 250 nMimagen5 Antidoto (nM)FIG. 10i I Sin antidotoimagen6 Enoxaparina (nM)FIG. 11aPTT (s) Actividad de lla (mDO/min)cm lla {5 nM) Wfa Ha (5 nM)+Argatroban (50 nM)imagen7 0 90 179 269 359 448 538Antidoto (nM)FIG. 12imagen8 ES5S3 Control (PPP)WZZVi Betrixaban+Antidoto i [Control + AntidotoAntidoto (nM)FIG. 13imagen9 Xhal (2)Sad (6932) \ Ncol (25)delecion de GLAPstI(312)Psfl (6925)promotor EF1adelecion de RVVX a triple mutPstl (6420)a!a419Ba mill (1255)Sa cl (1292)Not I (1368)Ncol (3829)5a el (2221;DHFRA'col (2582)SV40E Poli AAmp rSacl (2857)pUC oriF G. 14FXa r-Antidoto FXa r-Antidotoimagen10 Anticuerpo anti-HC Anticuerpo anti-LCFIG. 15imagen11 Betrixaban (ng/ml)imagen12 FIG. 17AFIG. 17Bimagen13 Enoxaparina (U/ml)Fi r' a oIU. lo00roTi0roo4, %+\\\ \A\\\ \ % ^% %- e° ' * % <*Tiempo de protrombina (segundos)-k. -a K> N3o oi o cn o cn_____\______—t —..A________-1________i%%%%X-. 7%% <%7*£>%% w°7% '&\ ^°7\ 'XA, %.Xt ■»AP,%<%%FIG. 19aPTT (segundos)-iMUAUlffiSOXOooooooooooimagen14 atggggcgcccactgcacctcgtcctgcfccagtgcctccctggctggcctcctgctgctcMGRPLHLVLLSASLAGLLLLggggaaagtctgttcatccgcagggagcaggccaacaacatcctggcgagggtcacgaggGESLFIRREQANNILARVTRgccaattcctttcttttctggaataaatacaaagatggcgaccagtgtgagaccagtcctAN3FLFWNKYKDGDQCETSPtgccagaaccagggcaaatgtaaagacggcctcggggaatacacctgcacctgtttagaaCQNQGKCKDGLGEYTCTCLEggattcgaaggcaaaaactgtgaattattcacacggaagctctgcagcctggacaacgggLFTRKLCSLDNG ggaacagaactctgtggtgtgctcctgcgcccgcggg EQNSVVCSCARG tacaccctggctgacaacggcaaggcctgcattcccacagggccctacccctgtgggaaa YTLADNGKACI PTGPYPCGK cagaccctggaacgcaggaagaggaggaagaggatcgtgggaggccaggaatgcaaggac Q T L E R R K R R K R I V G G Q E C K D ggggagtgtccctggcaggccctgctcatcaatgaggaaaacgagggtttctgtggtgga- G F E
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---|---|---|---|---|
BRPI0711296A2 (pt) | 2006-05-05 | 2011-08-23 | Millennium Phamaceutical Inc | inibidores de fator xa |
CN101802188B (zh) * | 2007-09-28 | 2013-08-21 | 普托拉制药有限公司 | 用于因子Xa抑制剂的解毒剂和其使用方法 |
EP2414517B1 (en) * | 2009-03-30 | 2016-09-21 | Portola Pharmaceuticals, Inc. | Antidotes for factor xa inhibitors and methods of using the same |
WO2011008885A1 (en) * | 2009-07-15 | 2011-01-20 | Portola Pharmaceuticals, Inc. | Unit dose formulation of antidotes for factor xa inhibitors and methods of using the same |
WO2011075602A1 (en) * | 2009-12-17 | 2011-06-23 | Millennium Pharmaceuticals, Inc. | Methods of preparing factor xa inhibitors and salts thereof |
CA2784921A1 (en) * | 2009-12-17 | 2011-07-14 | Millennium Pharmaceuticals, Inc. | Salts and crystalline forms of a factor xa inhibitor |
US9371522B2 (en) * | 2011-09-30 | 2016-06-21 | The Children's Hospital Of Philadelphia | Compositions and methods for modulating hemostasis |
JP2015507929A (ja) | 2012-02-14 | 2015-03-16 | ポートラ ファーマシューティカルズ, インコーポレイテッド | 第Xa因子阻害剤に対する組み換え拮抗剤を製作するためのプロセス |
ES2612458T3 (es) * | 2012-06-14 | 2017-05-17 | Portola Pharmaceuticals, Inc. | Procedimiento para purificación de derivados de factor Xa recombinante |
US9145552B2 (en) | 2012-07-25 | 2015-09-29 | Catalyst Biosciences, Inc. | Modified factor X polypeptides and uses thereof |
US20140346397A1 (en) * | 2012-12-27 | 2014-11-27 | Portola Pharmaceuticals, Inc. | Compounds and methods for purification of serine proteases |
US9200268B2 (en) | 2012-12-27 | 2015-12-01 | Portola Pharmaceuticals, Inc. | Compounds and methods for purification of serine proteases |
FR3000895B1 (fr) * | 2013-01-11 | 2017-02-24 | Laboratoire Francais Du Fractionnement Et Des Biotechnologies Sa | Utilisation d'antidotes d'inhibiteurs de la coagulation indiques dans la prevention ou le traitement de pathologies thromboemboliques |
US20150352194A1 (en) * | 2013-01-24 | 2015-12-10 | Portola Pharmaceuticals, Inc. | Inhibition of tissue factor pathway inhibitor with factor xa derivatives |
MX2015008813A (es) | 2013-01-31 | 2016-03-31 | Pfizer | Composiciones y metodos para contrarrestar la inhibicion del factor xa. |
WO2015031793A1 (en) * | 2013-08-29 | 2015-03-05 | Ged Integrated Solutions, Inc. | Window cleaning system and method |
US9545383B2 (en) | 2014-04-01 | 2017-01-17 | Massachusetts Institute Of Technology | Blood clotting control |
US10676731B2 (en) | 2014-08-19 | 2020-06-09 | The Children's Hospital Of Philadelphia | Compositions and methods for modulating factor IX function |
EA036091B1 (ru) * | 2014-08-20 | 2020-09-25 | Портола Фармасьютикалз, Инк. | ВОДНЫЕ СОСТАВЫ АНТИДОТОВ ФАКТОРА Xa (fXa) ДЛЯ ПРЕДУПРЕЖДЕНИЯ ИЛИ УМЕНЬШЕНИЯ КРОВОТЕЧЕНИЯ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ |
US9849125B1 (en) | 2015-11-03 | 2017-12-26 | Banner Lifie Sciences LLC | Anti-overingestion dosage forms |
WO2017147522A1 (en) | 2016-02-24 | 2017-08-31 | Portola Pharmaceuticals, Inc. | Lyophilized formulations for factor xa antidote |
TW201802121A (zh) | 2016-05-25 | 2018-01-16 | 諾華公司 | 抗因子XI/XIa抗體之逆轉結合劑及其用途 |
HUE054597T2 (hu) | 2016-06-17 | 2021-09-28 | Alexion Pharma Inc | Az XA faktor származékainak elõkészítése |
KR102616666B1 (ko) | 2016-12-23 | 2023-12-27 | 노파르티스 아게 | 인자 xi 항체 및 사용 방법 |
FR3064917A1 (fr) * | 2017-04-07 | 2018-10-12 | Universite Grenoble Alpes | Facteur x mute |
US10335375B2 (en) | 2017-05-30 | 2019-07-02 | Patheon Softgels, Inc. | Anti-overingestion abuse deterrent compositions |
KR20200087236A (ko) * | 2017-11-22 | 2020-07-20 | 노파르티스 아게 | 항-인자 XI/XIa 항체에 대한 반전 결합제 및 이의 용도 |
US20210371842A1 (en) * | 2018-06-19 | 2021-12-02 | Alexion Pharmaceuticals, Inc. | Antidotes to factor xa inhibitors |
US20220251534A1 (en) * | 2019-08-08 | 2022-08-11 | Alexion Pharmaceuticals, Inc. | Compositions and methods for preparing factor xa and derivatives |
US20220389071A9 (en) * | 2020-09-22 | 2022-12-08 | Yang Wei | Long-lasting glp1 analogue drug for type-2 diabetes |
WO2022236176A2 (en) * | 2021-05-07 | 2022-11-10 | City Of Hope | Fxa protein for treating and/or preventing covid-19 |
Family Cites Families (95)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4816567A (en) | 1983-04-08 | 1989-03-28 | Genentech, Inc. | Recombinant immunoglobin preparations |
US4754065A (en) | 1984-12-18 | 1988-06-28 | Cetus Corporation | Precursor to nucleic acid probe |
US4683202A (en) | 1985-03-28 | 1987-07-28 | Cetus Corporation | Process for amplifying nucleic acid sequences |
US4683195A (en) | 1986-01-30 | 1987-07-28 | Cetus Corporation | Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences |
EP0590689B2 (fr) | 1985-03-30 | 2006-08-16 | KAUFFMAN, Stuart A. | Procédé d'obtention d'ADN, ARN, peptides, polypeptides ou protéines, par une technique de recombinaison d'ADN |
US6492107B1 (en) | 1986-11-20 | 2002-12-10 | Stuart Kauffman | Process for obtaining DNA, RNA, peptides, polypeptides, or protein, by recombinant DNA technique |
US5837249A (en) | 1985-04-19 | 1998-11-17 | The Wistar Institute | Method for generating an immunogenic T cell response protective against a virus |
US5516650A (en) * | 1985-06-27 | 1996-05-14 | Zymogenetics, Inc. | Production of activated protein C |
US4818700A (en) | 1985-10-25 | 1989-04-04 | Phillips Petroleum Company | Pichia pastoris argininosuccinate lyase gene and uses thereof |
US5618920A (en) | 1985-11-01 | 1997-04-08 | Xoma Corporation | Modular assembly of antibody genes, antibodies prepared thereby and use |
US4800159A (en) | 1986-02-07 | 1989-01-24 | Cetus Corporation | Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences |
US4812405A (en) | 1986-02-18 | 1989-03-14 | Phillips Petroleum Company | Double auxotrophic mutants of Pichia pastoris and methods for preparation |
US5225539A (en) | 1986-03-27 | 1993-07-06 | Medical Research Council | Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies |
US4704692A (en) | 1986-09-02 | 1987-11-03 | Ladner Robert C | Computer based system and method for determining and displaying possible chemical structures for converting double- or multiple-chain polypeptides to single-chain polypeptides |
EP0279582A3 (en) | 1987-02-17 | 1989-10-18 | Pharming B.V. | Dna sequences to target proteins to the mammary gland for efficient secretion |
US5202231A (en) | 1987-04-01 | 1993-04-13 | Drmanac Radoje T | Method of sequencing of genomes by hybridization of oligonucleotide probes |
US6270961B1 (en) | 1987-04-01 | 2001-08-07 | Hyseq, Inc. | Methods and apparatus for DNA sequencing and DNA identification |
US5229490A (en) | 1987-05-06 | 1993-07-20 | The Rockefeller University | Multiple antigen peptide system |
US4873316A (en) | 1987-06-23 | 1989-10-10 | Biogen, Inc. | Isolation of exogenous recombinant proteins from the milk of transgenic mammals |
US4929555A (en) | 1987-10-19 | 1990-05-29 | Phillips Petroleum Company | Pichia transformation |
US5530101A (en) | 1988-12-28 | 1996-06-25 | Protein Design Labs, Inc. | Humanized immunoglobulins |
US5298599A (en) * | 1988-12-30 | 1994-03-29 | Oklahoma Medical Research Foundation | Expression and purification of recombinant soluble tissue factor |
DE3920358A1 (de) | 1989-06-22 | 1991-01-17 | Behringwerke Ag | Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung |
US6075181A (en) | 1990-01-12 | 2000-06-13 | Abgenix, Inc. | Human antibodies derived from immunized xenomice |
US5686073A (en) | 1990-05-23 | 1997-11-11 | The University Of Iowa Research Foundation | Polyclonal and monoclonal antibodies against a 43 KDA dystrophin associated protein |
CA2090126C (en) | 1990-08-02 | 2002-10-22 | John W. Schrader | Methods for the production of proteins with a desired function |
US5278144A (en) * | 1990-09-04 | 1994-01-11 | Cor Therapeutics, Inc. | Antithrombosis agents |
US5597799A (en) * | 1990-09-04 | 1997-01-28 | Cor Therapeutics, Inc. | Recombinant agents affecting thrombosis |
US5583107A (en) | 1990-09-04 | 1996-12-10 | Cor Therapeutics, Inc. | Agents affecting thrombosis and hemostasis |
WO1992013878A2 (en) | 1991-02-07 | 1992-08-20 | Board Of Trustees Of The University Of Illinois | Conformationally restricted mimetics of beta turns and beta bulges and peptides containing the same |
EP0519596B1 (en) | 1991-05-17 | 2005-02-23 | Merck & Co. Inc. | A method for reducing the immunogenicity of antibody variable domains |
US6797492B2 (en) | 1991-05-17 | 2004-09-28 | Merck & Co., Inc. | Method for reducing the immunogenicity of antibody variable domains |
PL171489B1 (pl) | 1991-09-13 | 1997-05-30 | Chiron Corp | Sposób wytwarzania kompozycji immunogenicznej reagujacej immunologicznie krzyzowo z wieloma izolatami HCV PL |
AU3178993A (en) | 1991-11-25 | 1993-06-28 | Enzon, Inc. | Multivalent antigen-binding proteins |
EP0571613B1 (en) | 1991-12-13 | 2003-09-17 | Xoma Corporation | Methods and materials for preparation of modified antibody variable domains and therapeutic uses thereof |
DE4203965A1 (de) | 1992-02-11 | 1993-08-12 | Max Planck Gesellschaft | Antidot fuer hirudin und synthetische thrombininhibitoren |
US6117836A (en) * | 1992-03-20 | 2000-09-12 | Cor Therapeutics, Inc. | Glycosylation-mediated inhibition of factor X |
ATE304604T1 (de) | 1993-06-24 | 2005-09-15 | Frank L Graham | Adenovirus vektoren für gentherapie |
US5858659A (en) | 1995-11-29 | 1999-01-12 | Affymetrix, Inc. | Polymorphism detection |
SK283703B6 (sk) | 1993-10-25 | 2003-12-02 | Canji, Inc. | Rekombinantný adenovírusový vektor a jeho použitie |
US5455338A (en) | 1993-11-05 | 1995-10-03 | Zymogenetics, Inc. | DNA encoding novel human kunitz-type inhibitors and methods relating thereto |
US5952172A (en) | 1993-12-10 | 1999-09-14 | California Institute Of Technology | Nucleic acid mediated electron transfer |
US5827690A (en) | 1993-12-20 | 1998-10-27 | Genzyme Transgenics Corporatiion | Transgenic production of antibodies in milk |
US7252989B1 (en) | 1994-04-04 | 2007-08-07 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Adenovirus supervector system |
DE4430205A1 (de) | 1994-08-26 | 1996-02-29 | Behringwerke Ag | Zusammensetzungen, die als Gegenmittel für Blut-Antikoagulanzien geeignet sind und deren Verwendung |
US5589571A (en) * | 1994-10-28 | 1996-12-31 | Cor Therapeutics, Inc. | Process for production of inhibited forms of activated blood factors |
AT404357B (de) | 1995-06-13 | 1998-11-25 | Immuno Ag | Prothrombin-derivate |
US5968740A (en) | 1995-07-24 | 1999-10-19 | Affymetrix, Inc. | Method of Identifying a Base in a Nucleic Acid |
US5955349A (en) | 1996-08-26 | 1999-09-21 | Zymogenetics, Inc. | Compositions and methods for producing heterologous polypeptides in Pichia methanolica |
DE19605126A1 (de) | 1996-02-12 | 1997-08-14 | Basf Ag | Thrombinmuteine als Antidot für Thrombininhibitoren |
US5714352A (en) | 1996-03-20 | 1998-02-03 | Xenotech Incorporated | Directed switch-mediated DNA recombination |
US6200955B1 (en) | 1996-06-11 | 2001-03-13 | Commonwealth Biotechnologies, Inc. | Heparin binding peptides |
US5736383A (en) | 1996-08-26 | 1998-04-07 | Zymogenetics, Inc. | Preparation of Pichia methanolica auxotrophic mutants |
US6709659B1 (en) | 1996-08-02 | 2004-03-23 | Zymogenetics, Inc. | Antibodies that bind testis-specific insulin homolog polypeptides |
SE9604744D0 (sv) * | 1996-12-20 | 1996-12-20 | Pharmacia & Upjohn Ab | A modified coagulation agent |
AT405516B (de) * | 1997-02-27 | 1999-09-27 | Immuno Ag | Faktor x-analoge mit modifizierter proteasespaltstelle |
AT405517B (de) | 1997-02-27 | 1999-09-27 | Immuno Ag | Faktor x-deletionsmutanten und analoge davon |
AU6673898A (en) | 1997-03-07 | 1998-09-22 | Washington University | Factor x variant |
JPH1149800A (ja) * | 1997-06-05 | 1999-02-23 | Fujimori Kogyo Kk | アンヒドロトロンビンの合成方法 |
DK2180007T4 (da) | 1998-04-20 | 2017-11-27 | Roche Glycart Ag | Glycosyleringsteknik for antistoffer til forbedring af antistofafhængig cellecytotoxicitet |
US6322788B1 (en) | 1998-08-20 | 2001-11-27 | Stanley Arthur Kim | Anti-bacterial antibodies and methods of use |
JP2002530081A (ja) | 1998-11-18 | 2002-09-17 | ジェネンテック・インコーポレーテッド | 親抗体より高度な結合親和性を持つ抗体変異体 |
WO2000054787A1 (en) * | 1999-03-16 | 2000-09-21 | The Children's Hospital Of Philadelphia | Enhanced gamma-carboxylation of recombinant vitamin k-dependent clotting factors |
US6624141B1 (en) | 1999-03-17 | 2003-09-23 | The Regents Of The University Of Michigan | Protamine fragment compositions and methods of use |
US6258559B1 (en) | 1999-03-22 | 2001-07-10 | Zymogenetics, Inc. | Method for producing proteins in transformed Pichia |
US6939545B2 (en) | 1999-04-28 | 2005-09-06 | Genetics Institute, Llc | Composition and method for treating inflammatory disorders |
EP1095933A1 (en) * | 1999-10-30 | 2001-05-02 | Aventis Pharma Deutschland GmbH | Novel N-guanidinoalkylamides, their preparation, their use, and pharmaceutical preparations comprising them |
CA2401778C (en) | 2000-02-29 | 2010-12-21 | Cor Therapeutics, Inc. | Benzamides and related inhibitors of factor xa |
WO2001068605A1 (en) * | 2000-03-13 | 2001-09-20 | Pharmacia Corporation | Polycyclic aryl and heteroaryl substituted benzenes useful for selective inhibition of the coagulation cascade |
MXPA03002049A (es) | 2000-09-08 | 2003-07-24 | Schering Corp | Genes de mamiferos: reactivos y metodos relacionados. |
US7070740B1 (en) | 2000-09-28 | 2006-07-04 | Beckman Coulter, Inc. | Method and apparatus for processing biomolecule arrays |
US20030064414A1 (en) * | 2001-03-30 | 2003-04-03 | Benecky Michael J. | Rapid assessment of coagulation activity in whole blood |
WO2002090599A1 (en) | 2001-05-09 | 2002-11-14 | Genetic Id, Inc. | Universal microarray system |
US6989267B2 (en) | 2001-07-02 | 2006-01-24 | Agilent Technologies, Inc. | Methods of making microarrays with substrate surfaces having covalently bound polyelectrolyte films |
US20040198660A1 (en) * | 2002-11-06 | 2004-10-07 | Petersen Lars Christian | Tissue factor antagonist and protein C polypeptide compositions |
US7247654B2 (en) * | 2003-06-04 | 2007-07-24 | Bristol-Myers Squibb Company | 3,4-disubstituted benzamidines and benzylamines, and analogues thereof, useful as serine protease inhibitors |
WO2005088310A2 (en) | 2004-03-05 | 2005-09-22 | The Scripps Research Institute | High throughput glycan microarrays |
JP4441336B2 (ja) | 2004-06-11 | 2010-03-31 | 日本碍子株式会社 | マイクロアレイの製造方法 |
US9223929B2 (en) | 2005-03-14 | 2015-12-29 | The California Institute Of Technology | Method and apparatus for detection, identification and quantification of single-and multi-analytes in affinity-based sensor arrays |
US7119179B1 (en) | 2005-03-21 | 2006-10-10 | Los Alamos National Security, Llc | Preparation of high nitrogen compound and materials therefrom |
US9164108B2 (en) | 2005-03-22 | 2015-10-20 | Sri International | Liposome-based microarray and methods of use thereof |
PT1948608E (pt) * | 2005-11-08 | 2012-05-24 | Millennium Pharm Inc | Novos sais farmacêuticos e polimorfos de um inibidor do fator xa |
MX2008006313A (es) | 2005-11-15 | 2008-11-06 | Philadelphia Children Hospital | Metodos y composiciones para modular la hemostasia. |
US20070111322A1 (en) | 2005-11-15 | 2007-05-17 | Lin-Cheng Yang | Novel method of using inject printing for creating microarrays |
EP1820508A1 (en) | 2006-02-21 | 2007-08-22 | CSL Behring GmbH | Coagulation factor X polypeptides with modified activation properties |
ES2627923T3 (es) | 2007-01-11 | 2017-08-01 | Novo Nordisk A/S | Anticuerpos anti-KIR, formulaciones y usos de los mismos |
CN101802188B (zh) * | 2007-09-28 | 2013-08-21 | 普托拉制药有限公司 | 用于因子Xa抑制剂的解毒剂和其使用方法 |
EP2364165B1 (en) * | 2008-11-14 | 2018-01-03 | Portola Pharmaceuticals, Inc. | Antidotes for factor xa inhibitors and methods of using the same in combination with blood coagulating agents |
WO2010070137A1 (en) | 2008-12-19 | 2010-06-24 | INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) | Serine protease derivatives and uses in the prevention or the treatment of blood coagulation disorders |
WO2010070713A1 (ja) | 2008-12-19 | 2010-06-24 | 富士通株式会社 | 情報処理装置、制御方法 |
EP2414517B1 (en) | 2009-03-30 | 2016-09-21 | Portola Pharmaceuticals, Inc. | Antidotes for factor xa inhibitors and methods of using the same |
WO2011008885A1 (en) | 2009-07-15 | 2011-01-20 | Portola Pharmaceuticals, Inc. | Unit dose formulation of antidotes for factor xa inhibitors and methods of using the same |
EA036091B1 (ru) * | 2014-08-20 | 2020-09-25 | Портола Фармасьютикалз, Инк. | ВОДНЫЕ СОСТАВЫ АНТИДОТОВ ФАКТОРА Xa (fXa) ДЛЯ ПРЕДУПРЕЖДЕНИЯ ИЛИ УМЕНЬШЕНИЯ КРОВОТЕЧЕНИЯ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ |
EP3078378B1 (en) * | 2015-04-08 | 2020-06-24 | Vaiomer | Use of factor xa inhibitors for regulating glycemia |
HUE054597T2 (hu) * | 2016-06-17 | 2021-09-28 | Alexion Pharma Inc | Az XA faktor származékainak elõkészítése |
-
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