PL171489B1

PL171489B1 - Sposób wytwarzania kompozycji immunogenicznej reagujacej immunologicznie krzyzowo z wieloma izolatami HCV PL

Info

Publication number: PL171489B1
Application number: PL92302729A
Authority: PL
Inventors: Amy J Weiner; Michael Houghton
Original assignee: Chiron Corp
Priority date: 1991-09-13
Filing date: 1992-09-11
Publication date: 1997-05-30
Also published as: JP2004073207A; US5756312A; FI941199A; JPH06511149A; EP0608261B1; US6303292B1; RO116199B1; DK0608261T3; JP2005176853A; FI941199A0; ES2182822T3; BG98653A; AU679429B2; US5766845A; WO1993006126A1; JP2008133301A; RU2212899C2; ATE228564T1; DE69232859T2; CA2116764A1

Abstract

1 Sposób wytwarzania kompozycji immunogenicznej reagujacej immunologicznie krzyzowo z wieloma izolatami HCV, w którym prowadzi sie ekspresje rekombinanta polipeptydu wytworzonego przez komórke gospodarza, stanowiaca komórke E. Coli, drozdzy, owada lub ssaka transformowana za pomoca ekspresyjnego ukladu kodujacego sekwencje aminokwasowa zawierajaca ten polipeptyd i elementy regulujace ekspresje, zawierajacych promotor kompatybilny z komórka gospodarza, inkubuje sie komórke gospodarza powodujac ekspresje polipeptydu, wyodrebnia sie eksprymowany polipeptyd i miesza sie go z farmaceutycznie dopusz- czalnym nosnikiem lub zaróbka, znam ienny tym, ze wytwarza sie co najmniej dwa rekombinowane ekspresyj- nie polipeptydy, z których kazdy zawiera co najmniej jeden epitop ze zmiennej domeny polipeptydu HCV, przy czym regiony zmiennej domeny sekwencji aminokwasowych sa wzajemnie heterogeniczne i pochodza z innych izolatów HCV. 10. Sposób wytwarzania kompozycji immunogenicznej reagujacej immunologicznie krzyzowo z wielo- ma izolatami HCV, w którym wytwarza sie polipeptyd przez polimeryzacje podloza aminokwasowego ze srodkiem polimeryzujacym, wyodrebnia sie otrzymany polipeptyd i miesza sie ten polipeptyd z farmaceutycznie dopuszczalnym nosnikiem lub zaróbka, znam ienny tym , ze syntetyzuje sie co najmniej dwa dzialajace immunogenicznie polipeptydy, z których kazdy zawiera co najmniej jeden epitop ze zmiennej domeny poli- peptydu HCV, przy czym regiony zmiennej domeny sekwencji aminokwasowych sa wzajemnie heterogeniczne i pochodza z innych izolatów HCV. PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania kompozycji immunogenicznej reagującej immunologicznie krzyżowo z wieloma izolatami HCV.

Wirus zapalenia wątroby typu C (wirus HCV) uznaje się ostatnio za główny czynnik powodujący po-transfuzyjne zapalenia wątroby Nie-A, Nie-B (NANHB) a ponadto, jako ważną przyczynę nabywanej w społeczeństwie żółtaczki Nie-A, Nie-B. Znane są materiały i sposoby uzyskiwania wirusowych sekwencji genomowych, na przykład z publikacji zgłoszeń PCT, nr W089/04669, WO90/11089 i WO90/14436.

Badania molekularne genomu HCV wykazują, że jest to cząsteczka RNA o dodatniej polarności, złożona z około 10.000 nukleotydów kodujących poliproteinę zawierającą około 3011 aminokwasów. Wiele dowodów wskazuje na to, że HCV posiada organizację genetyczną podobną do wirusów z rodziny Flaviviridae, do której należą Flaviwirusy i Pestiwirusy. Przypuszcza się, że podobnie jak pokrewne mu Pestiwirusy i Flaviwirusy, HCV koduje duży prekursor poliproteinowy, z którego wytwarzane są poszczególne białka wirusowe, zarówno strukturalne jak i niestrukturalne.

Wirusy zawierające RNA charakteryzują się stosunkowo wysokim stopniem mutacji spontanicznych. Według danych z piśmiennictwa jest to rząd 10'³ do 10⁴ na wbudowany nukleotyd. Ponieważ heterogeniczność i płynność genotypu są u RNA-wirusów cechami powszechnymi to w obrębie tego samego gatunku HCV może występować wiele izolatów wirusowych, zakaźnych lub niezakaźnych.

Dotychczas zidentyfikowano wiele różnych izolatów HCV. Sekwencje tych izolatów wykazują ograniczony stopień heterogeniczności charakterystyczny dla wirusów RNA.

Wyizolowany wirus HCV J1.1 jest opisany przez Kubo Y. i wsp. w publikacji Japan Nucl. Acids Res. 17: 10367-10372 (1989); przez Takeuchi K. i wsp. w publikacji Gene 91: 287-291 (1990); przez Takeuchi i wsp. w publikacji J. Gen. Virol. 71: 3027-3033 (1990) i przez tego samego autora w publikacji Nucl. Acids Res. 18: 4626 (1990).

Całkowite sekwencje kodujące oraz sekwencje końcowe 5'- i 3'- dwu niezależnych izolatów, HCV-J i BK opisali odpowiednio Kato i wsp. w publikacji Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 9524-9528 (1991) i Takamizawa i wsp. w publikacji J. Virology 65: 1105-1113.

Izolaty HCV są również opisane w następujących publikacjach:

- wirus HCV-1 - w publikacjach: Choo i wsp., Brit.Med. Bull. 46:423-441,1990); Choo i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 2451-2455 (1991); Han i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci USA 88:1711-1715; publikacja zgłoszeniowa patentu europejskiego nr 318 216.

- wirusHC-J1 i HC-J4-w publikacji: Okamoto i wsp., Japan J. Exp. Med. 60:167-177(1991).

- izolaty HCT 18, HCT23, :TH, HCT27, EC1 i EC10 - w publikacji: Weiner i wsp. Virol. 180: 842-848 (1991).

- izolaty Pt-1, HCV-K1 i HCV-K2 - Enomoto i wsp. Są to dwa główne wirusy zapalenia wątroby typu C w Japonii. Oddział Gastroenterologii Wydziału Medycyny Wewnętrznej, Kanazawa Medical University, Japonia.

171 489

- klony A, C, D i E: Tsukiyama-Kohara i wsp., rozdział A second group of hepatitis virus w książce Virus Genes.

W międzynarodowych publikacjach zgłoszeń PCT WO 89/04669, WO 90/11089, oraz w europejskim opisie patentowym EP 0 318 216 omówiono strukturę i funkcje genomu HCV. Omówiono w tych publikacjach różnorodność różnych izolatów i podkreślono ich ważność w odniesieniu do wirusowych diagnoz.

W publikacji międzynarodowego zgłoszenia PCT WO 90/14436 i w publikacji Houghton et al., Molecular Biology of the Hepatitis C Viruses 14:381-388 (Hepatology, Vol. 14, No 2, 1991) omówiono różnorodność sekwencji HCV, nie podano w nich jednak informacji o cząsteczkach zawierających różne regiony HCV.

W publikacji Tekeuchi et al., The Putative Nucleocapsid and Envelope Protein Genes of Hepatitis C Virus Determined by Comparison of the Nucleotide Sequence of Two Isolates Derived from an Experimentally Infected Chimpanzee and Healthy Human Carriers (J. Gen. Vir., vol. 71, 1990) omówiono różne izolaty w stosunku do konserwatywnych sekwencji i wskazano, że takie konserwatywne sekwencje mogą być użyteczne jako sondy hybrydyzujące. Ujawniono tam też fakt, że nowoodkryty izolat ma 75% aminokwasów identycznych jak inne znane izolaty i stwierdzono, że to należy wziąć pod uwagę przy opracowywaniu szczepionek ochronnych (str. 3032, kolumna druga). Nie podano jednak żadnego pouczenia ani nawet sugestii o zastosowaniu klonowanych zmiennych regionów, ani też mechanizmu dzięki któremu możnaby opracować takie szczepionki.

W publikacji Choo et al., Genetic Organization and Diversity of the Hepatitis C Virus. Procc. of Nat Acad, of Si, Vol. 88, 1991 omówiono genetyczną różnorodność różnych HCV i ważność tego w stosunku do innych wirusów. Nie pokazano jednak w tej publikacji ważności ani zależności zmienności w odniesieniu do szczepienia.

W publikacji Neurath i Strick Confronting the Hypervariability of an Immunodominant Epitope Eliciting Virus Neutralizing Antibodies from the Envelope Glycoprotein of the Human Immunodeficiency Virus Type 1 (HIV-1) w Molecular Immunology, Volume 27, No. 6, omówiono szczepionki HIV i zauważono, że przeciwciała neutralizujące wirusa są najczęściej specyficznym podtypem i przede wszystkim są ukierunkowane przeciwko epitopom na hiperzmiennej pętli z regionu 3 HI'V-1 gp 120 (str. 539). W tym zdaniu zawarto dwie ważne wskazówki co odróżnia HIV od HCV. Po pierwsze wiadomo, że przeciwciała neutralizujące HIV są specyficznymi podtypami. Nie wiadomo, czy to samo ma miejsce w przypadku HCV. Po drugie, neutralizujące przeciwciała dla HIV są zwykle specyficzne dla hiperzmiennej pętli. W tym przypadku regiony zmienne różnych izolatów są z definicji krytycznie ważne dla zapewnienia skutecznych szczepionek przeciwko HIV. Ich ważność nie jest spowodowana ich zmiennym charakterem ale faktem, że jest to region rozpoznany przez przeciwciała neutralizujące. Tak więc zmienne regiony nie są ważne same przez się, lecz tylko jeden zmienny region jest ważny i nawet wówczas nie ze względu na jego zmienny charakter.

W publikacji Haigwood i et al., Importance of Hypervariable Regions of HIV (AIDS Research and Human Retroviruses, Volume 6, No. &, 1990) omówiono obecność hiperzmiennych regionów gp 120. Omówiono zaledwie możliwość, ze immunogeny zawierające zmienne regiony HIV będą ważne w szczepieniu przeciwko HIV. Żadne z tych cytowanych publikacji nie ujawnia związku zmienności HIV w stosunku do żadnego innego wirusa.

W typowym podejściu do poszukiwań diagnostycznych i szczepionek zainteresowanie badaczy koncentruje się na konserwatywnych domenach wirusowych. Wadą tego podejścia jest jednak ignorowanie ważnych epitopów, które mogą leżeć w domenach zmiennych.

Celem wynalazku jest opracowanie sposobu wytwarzania kompozycji polipeptydowych reagujących immunologicznie krzyżowo z wieloma izolatami HCV, zwłaszcza z heterogenicznymi domenami tego wirusa.

Wykryto, że wiele ważnych epitopów HCV pochodzących z różnych izolatów wirusowych różni się między sobą i że epitopy te można mapować, przypisując je do poszczególnych domen.

171 489

To odkrycie pozwoliło na opracowanie strategii wytwarzania immunologicznie reaktywnych, reagujących krzyżowo kompozycji polipeptydowych opartych na wykorzystaniu domen zmiennych (a nie konserwatywnych).

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania kompozycji immunogenicznej reagującej immunologicznie krzyżowo z wieloma izolatami HCV, w którym prowadzi się ekspresję rekombinantu polipeptydu wytworzonego przez komórkę gospodarza, stanowiącą komórkę E. Coli, drożdży, owada lub ssaka transformowaną za pomocą ekspresyjnego układu kodującego sekwencję aminokwasową zawierającą ten polipeptyd i elementy regulujące ekspresję, zawierających promotor kompatybilny z komórką gospodarza, inkubuje się komórkę gospodarza powodując ekspresje polipeptydu, wyodrębnia się eksprymowany polipeptyd i miesza się go z farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem lub zaróbką, polegający na tym, że wytwarza się co najmniej dwa rekombinowane ekspresyjnie polipeptydy, z których każdy zawiera co najmniej jeden epitop ze zmiennej domeny polipeptydu HCV, przy czym regiony zmiennej domeny sekwencji aminokwasowych są wzajemnie heterogeniczne i pochodzą z innych izolatów HCV.

Alternatywny sposób wytwarzania kompozycji immunogenicznej reagującej immunologicznie krzyżowo z wieloma izolatami HCV, w którym wytwarza się polipeptyd przez polimeryzację podłoża aminokwasowego ze środkiem polimeryzującym, wyodrębnia się otrzymany polipeptyd i miesza się ten polipeptyd z farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem lub zaróbką, polega na tym, że syntetyzuje się co najmniej dwa działające immunogenicznie polipeptydy, z których każdy zawiera co najmniej jeden epitop ze zmiennej domeny polipeptydu HCV, przy czym regiony zmiennej domeny sekwencji aminokwasowych są wzajemnie heterogeniczne i pochodzą z innych izolatów HCV.

Korzystnie sprzęganie polipeptydów z białkiem nośnikowym przeprowadza się przed zmieszaniem z farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem.

Jako białko nośnikowe korzystnie stosuje się toksoid błonicy lub białko aktywowane przed sprzęganiem z polipeptydem, tworząc wiązanie estrowe maloimid-N-hydroksysukcynimid kwasu kapronowego.

Korzystnie stosowana zmienna domena pochodzi z regionu E2/NS1 poliproteiny HCV lub z białka Ei poliproteiny HCV.

Również korzystnie zmienna domena jest kodowana przez poliproteinę HCV od około aminokwasu 384 do około aminokwasu 411 albo od około aminokwasu 225 do około aminokwasu 260.

Kompozycja immunogeniczna wytworzona sposobem według wynalazku może zawierać także wiele zespołów antygenowych, gdzie (a) każdy zespół antygenowy składa się z wielu w zasadzie identycznych polipeptydów zawierających sekwencję aminokwasową epitopu z pierwszej zmiennej domeny izolatu HCV i (b) sekwencja aminokwasową epitopu jednego zespołu jest heterogeniczna w stosunku do sekwencji aminokwasowej analogicznej sekwencji z co najmniej jednego innego zespołu.

Taka kompozycja immunoreaktywna może zawierać wiele polipeptydów, w której to kompozycji każdy polipeptyd ma wzór:

Rr - (SV_n)_x - R'r gdzie R i R' oznaczają sekwencje aminokwasowe złożone z 1 do 2000 aminokwasów i są takie same lub różne; r i r' oznaczają 0 lub 1 i są takie same lub różne; V oznacza sekwencję aminokwasową zawierającą sekwencję z domeny zmiennej HCV, przy czym ta domena zmienna posiada przynajmniej jeden epitop; S oznacza liczbę całkowitą >, 1reprezentującą wybraną domenę zmienną; n oznacza liczbę całkowitą > 1, reprezentującą wybrany izolat HCV heterogeniczny przy danym SV w odniesieniu do co najmniej jednego innego izolatu posiadającego inną wartość n a n dobiera się indywidualnie dla każdego x; x oznacza liczbę całkowitą >1, z zastrzeżeniem, że znajdujące się w kompozycji sekwencje aminokwasowe reprezentują kombinację wybraną z grup (i) 1V1 i 1V2, (ii) 1V1 i 2V2 oraz (iii) 1V1i 2V1.

171 489

Wytwarzanie przeciwciał anty-HCV następuje po podaniu ssakom skutecznej ilości opisanej wyżej kompozycji immunoreaktywnej.

Tak wytworzone przeciwciała przeciw HCV można wykrywać w próbce biologicznej. Sposób wykrywania przeciwciał polega na:

(a) przygotowaniu próbki biologicznej, w której podejrzewa się obecność przeciwciał przeciw HCV;

(b) przygotowaniu opisanej powyżej kompozycji immunoreaktywnej;

(c) poddaniu reakcji próbki biologicznej (a) z kompozycją immunoreaktywną (b) w warunkach umożliwiających powstawanie kompleksów antygen-przeciwciało;

(d) wykryciu powstałych kompleksów antygen-przeciwciało utworzonych między kompozycją immunoreaktywną (a) i ewentualnie obecnymi przeciwciałami z próbki biologicznej (b).

Kompozycja immunoreaktywna odpowiednio przygotowana i umieszczona w odpowiednim pojemniku stanowi zestaw do wykrywania przeciwciał przeciw HCV w próbce biologicznej.

Sposób według wynalazku został zilustrowany na rysunku na którym fig. 1 przedstawia genetyczną organizację genomu HCV, fig. 2 przedstawia porównanie wyprowadzonych sekwencji aminokwasowych białka E1 kodowanych przez grupę I i grupę II izolatów hCv, fig. 3 przedstawia porównanie sekwencji aminokwasowych przypuszczalnego regionu E2/NS1 izolatów hCv, fig. 4 przedstawia wykresy krzywych antygeniczności dla N-końcowego regionu przypuszczalnego białka E2/NS1 HCV (aminokwasy 384 - 420) i białka gp 120 będącego hyper-zmiennym regionem HIV-1, fig. 5 przedstawia serię wykresów dających procentowe prawdopodobieństwo, że dana reszta z regionu N-końcowego białka E2/NS1 z HCV (aminokwasy 384 do 420) będzie znaleziona w strukturach drugorzędowych alfa-heliksie, beta-płacie albo w beta-skręcie, fig. 6 jest wykresem słupkowym przedstawiającym reaktywność przeciwciał w osoczu pochodzącym od chorych zakażonych przez HCV 18 (wykresy A - C) lub Th (wykresy D - F) z częściowo pokrywającymi się biotynylowanymi peptydami 8-merowymi pochodzącymi z aminokwasów 384 do 415 lub 416, odpowiednio izolatów HCT 18 (A, D), Th (B, E) i HCV J1 (C, F), fig. 7 przedstawia wyprowadzone sekwencje aminokwasowe dwu regionów polipeptydu E2/NSi, aminokwasów 384 - 414 i 547 - 647, dla izolatów Q1 i Q3, fig. 8A przedstawia wyprowadzone sekwencje aminokwasowe izolatów HCV J1.1 i J1.2 z aminokwasów 384 do 647, fig. 8B przedstawia wyprowadzone sekwencje aminokwasowe izolatów HCT27 i HCVE1 z aminokwasów 384 do 651, fig. 9 przedstawia całkowitą sekwencję poliproteinową izolatu HCV-1.

W przykładach wykonania wynalazku, o ile nie podano inaczej, stosowano konwencjonalne, ogólnie znane techniki biologii molekularnej, mikrobiologii, rekombinacji DNA i immunologii. Techniki te są szczegółowo opisane w piśmiennictwie. Jako przykładowe pozycje literaturowe można wymienić: Maniatis, Fitsch i Sambrook, Molecular Cloning; A Laboratory Manuał (II wydanie, 1989); DNA Cloning, tomy I i II (wydawca: D. N. Glover, 1985 r); Oligonucleotide Synthesis (wyd. M. J. Gait, 1984); Nucleic Acid Hybridization (wyd. B. D. Hames i S. J. Higgins, 1984); Transcription and Translation (wyd. B. D. Hames i S. J. Higgins, 1984); Animal Cell Culture (wyd. R. I. Freshney, 1986), Immobilized Cells and Enzymes (IRL Press, 1986); B. Perbal, A Practical Guide toMelocular Cloning (1984); seria Methods in Enzymology, Academic Press, Inc.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (wyd. J. H. Miller i M. P. Calos, 1987, Cold Spring Harbor Laboratory), Methods in Enzymology, tom 154 i tom 155 (wyd. Wu, Grossman i Wu), wyd. Mayer i Walker (1987), Immnochemical Methods in Cell and Molecular Biology (Academic Press, Londyn), Scopes (1987), Protein Purification: Principles and Practice, II wydanie (Springer-Verlag, N. Y), oraz Handbook of Experimental Immunology, tomy I-IV (wyd. D. M. Weir i C. C. Blackwell, 1986); Immunoassay: A Practical Guide (wyd. D. W. Chan, 1987).

HCV jest nowym członkiem rodziny Flaviviridae obejmującej pestywirusy (wirusa pomoru świń i wirusa biegunki bydląt) oraz Flaviwirusy, przykładami których są wirus Dengue i wirus żółtej gorączki. Schemat organizacji genetycznej HCV jest przedstawiony na fig. 1. Podobnie do pestywirusów i flaviwirusow, HCV koduje podstawową domenę

171 489 polipeptydową (C) przy N-końcu wirusowej poliproteiny, po której następują dwie domeny glikoproteinowe (E1, E2/NS1), w górę od niestrukturalnych genów NS2 do NS5. Współrzędne aminokwasowe przypuszczalnych domen białkowych są przedstawione w tabeli 1.

Tabela 1

Przypuszczalne domeny białkowe w HCV

a a. przybliżone współrzędne	białko
1 - 191	C
192- 383	El
3384- 750	E2/NS1
751 - 1006	NS2
1(007 - 1488	NS3
1489- 1959	NS4
1960-3011	NS5

Jak podano powyżej, dotychczas zidentyfikowano wiele izolatów HCV. Porównawcza analiza sekwencji całkowitej i częściowych sekwencji HCV wykazuje, że w oparciu o homologię na poziomach nukleotydu i aminokwasów, izolaty HCV można z grubsza podzielić na co najmniej trzy podstawowe grupy (tabela 2); patrz Houghton i wsp., Hepatology 14: 381-388 (1991). Jednakże dla izolatów z grupy III dostępna jest tylko sekwencja częściowa. Tak więc, jeśli sekwencje tych izolatów będą dokładniej określone to być może, jeden lub więcej z tych izolatów będzie wymagał oddzielenia w odrębną grupę, potencjalnie grupę czwartą Tabela 3 przedstawia homologię sekwencji pomiędzy poszczególnymi białkami wirusowymi pochodzącymi z różnych izolatów HCV jak to wyprowadzono z ich sekwencji nukleotydowych. Jest widoczne, że białka z tej samej grupy wirusów wykazują większe podobieństwo sekwencji niż te same białka kodowane przez różne grupy wirusów (tabela 3). Jedynym wyjątkiem od tego jest białko nukleokapsydu, które jest wysoce konserwatywne we wszystkich dotychczas znanych sekwencjach izolatów wirusowych grupy I i II. (W tabeli 3 symbole N/A oznaczają, że sekwencje nie były dostępne do porównania). Tak więc, dla celów niniejszego wynalazku izolaty grupy I można zdefiniować jako izolaty posiadające swe wirusowe białka, zwłaszcza białka E1 i E2/NS1 w stopniu 90% lub wyższym homologiczne na poziomie aminokwasów z izolatami sklasyfikowanymi jako grupa I. Grupa II jest zdefiniowana w sposób analogiczny. Przyszłe grupy mogą być definiowane podobnie w kategoriach homologii białka wirusowego do prototypowego izolatu. Podgrupy można również definiować w oparciu o homologię do wybranych białek, takich jak białka E1, E2/NS1 lub NS2 albo po prostu, na podstawie wyższego stopnia homologii.

Tabela 2

Klasyfikacja sekwencji RNA genomu wirusa zapalenia wątroby C na trzy podstawowe grupy

HCV I	HCV II	HCV III
HCV-1	HCV-J1 1	Klony A, C, D i E
HC-J1	HC-J4	HCV-K2 (a i b)
HCT 18	HCV-J
HCT 23	BK
Th	HCV-K1
HCT 27
EC1
Pt-1

171 489

Tabela 3

Homologia aminokwasową (w procentach) w białkach wirusowych kodowanych przez rozne izolaty HCV

HCV	C	El	E2/NS1	NS2	NS3	NS4	NS5
Grupa I w	porównaniu do
I	98-100	94-100	N/A	N/A	N/A	N/A	99-100
II	97-98	77-79	78-89	75-77	91-93	90-93	84-88
III	N/A	N/A	N/A	N/A	86	76-80	71-74
Grupa II w	porównaniu do
II	98-100	92-100	89-100	93-100	94-100	97-100	95-100
III	N/A	N/A	N/A	N/A	84	76	74-75
Grupa III w porównaniu do
III	N/A	N/A	N/A	N/A	N/A	91-100	89-100

Godny uwagi jest fakt, że przypuszczalne wirusowe białka otoczkowe kodowane przez geny E1 i E2/NS1 wykazują znaczną zmienność sekwencji aminokwasowych pomiędzy grupami I i II. Jedynie NS2 wykazuje wyższy stopień heterogeniczności, podczas gdy wszystkie białka: C, NS3, NS4 i NS5 wykazują większą konserwatywność sekwencji pomiędzy grupami. Zmienność sekwencji obserwowana w przypuszczalnych białkach otoczkowych wirionu między grupami I i II jest odbiciem charakterystycznego podziału aminokwasów na te dwie grupy. Przykład tej zmienności jest przedstawiony na fig. 2, gdzie jest porównana sekwencja produktu genu El u wirusów z grupy I i II. Pokazane są sekwencje aminokwasowe E1 wyprowadzone z sekwencji nukleotydowych HCV z grup I i II. Poziom kreski na tej figurze wskazują na identyczność sekwencji z HCV-1. Gwiazdki oznaczają grupowo specyficzną segregację aminokwasów; reszty grupowo-specyficzne są łatwe do zidentyfikowania. Sekwencje grupy I to HCV-1, HCT18, HCT23, HCT27 i HC-J1. Sekwencje grupy II to HC-J4, HCV-J, HCV J1.1 i BK. Taki grupowo-specyficzny podział aminokwasów występuje również w innych produktach genowych, w tym w białku gp72 kodowanym przez gen E2/NS1. Figura 3 przedstawia porównawczy obraz sekwencji aminokwasowych przypuszczalnego regionu E2/NS1 izolatów HCV posegregowanych na grupę I i grupę II. To ostatnie białko zawiera również N-końcowy hyper-zmienny region (HV) składający się z około 30 aminokwasów, wykazujący ogromną zmienność wśród prawie wszystkich izolatów. Stwierdza to Weiner i wsp. (1991), cytowany powyżej. Ten region występuje pomiędzy aminokwasami 384 a 414 według systemu numeracji przyjętego dla HCV-1.

Przypuszczalna glikoproteina otoczki HCV, E/NS1, może odpowiadać białku gp53 (BVDV)/gp55 z wirusa pomoru świń będącego polipeptydem otoczkowym pesty wirusów i Ns 1 z flawiwirusów. Obydwa te rodzaje wirusów nadają ochronną odporność u gospodarzy szczepionych tymi pohpeptydami.

Uderzające podobieństwa pomiędzy regionem hyper-zmiennym (HV) i domenami V3 białka gp-120 z wirusa HIV-1 pod względem stopnia zmienności sekwencji, przewidywanego wpływu sekwencji aminokwasowych na wiązanie przypuszczalnego przeciwciała aponadto, pod względem braku zdecydowanej struktury drugorzędowej, wskazują na to, że domena HV koduje przeciwciała neutralizujące.

Immunogenność tej domeny jest wykazana w opisanych przykładach w doświadczeniach z mapowaniem epitopu dla przeciwciała. Wyniki tych badań sugerują, że poza trzema głównymi grupami HCV istnieją również specyficzne pod-grupy HV.

Analiza próbek biologicznych od osobników z NANBH wywołanym wirusem HCV wskazują, że osobnicy ci mogą być nosicielami dwóch lub więcej wariantów HCV jednocześnie. W osoczu jednego pacjenta, oznaczonego symbolem J1, wykryto dwa współistniejące jednocześnie warianty HCV. Ponadto, częściowe sekwencjonowanie genu od osobnika z przewlekłym NANBH, u którego występowały okresowe rzuty zapalenia wątroby ujawniło, że osobnik ten oznaczony symbolem Q, był zakazony dwoma wariantami HCV (Q1 lub Q3). Każdy wariant był związany z tylko jednym atakiem choroby. Technika ELISA z zastosowaniem peptydu

171 489 swoistego względem Q1 albo Q3 (aminokwasy 396 - 407) wykazała ze u pacjenta Q rozwinęły się przeciwciała przeciw peptydowi Q1 ale nie przeciw odpowiadającemu mu peptydowi Q3, co sugeruje, że zaostrzenie choroby u osobnika Q było wynikiem pojawienia się wariantu HV. Obecność przeciwciał przeciw peptydowi Q1 przy braku odpowiedzi immunologicznej na peptyd Q3 podczas drugiego rzutu choroby może świadczyć o tym, że zmienność w domenie HV może wynikać z immunologicznej presji selekcyjnej. Celem największej presji selekcyjnej w domenie Hv wydają się aminokwasy 396-407. Te spostrzeżenia potwierdzają tezę, że znaczna chroniczność związana z tą chorobą może wynikać z nieodpowiedniej immunologicznej odpowiedzi gospodarza na zakażenie HCV i/lub ze skutecznych mechanizmów obejścia immunologicznego wirusów. Co więcej, wskazują one na region E2/NS1 HV jako region genetyczny zaangażowany w mechanizmy ucieczki wirusów (przed reakcją immunologiczną) i/lub na nieodpowiednie mechanizmy odpowiedzi immnologicznej.

Jak opisano powyżej, w genomie HCV istnieje wiele zmiennych regionów. Jeden lub więcej z tych regionów jest najprawdopodobniej zaangażowanych w mechanizm ucieczki immunologicznej i/lub w mechanizmy nieodpowiedniej odpowiedzi immunologicznej. Tak więc, byłoby pożądane aby do kompozycji przeznaczonych do leczenia HCV włączyć polipeptydy, które mogłyby wywoływać odpowiedź immunologiczną na te warianty.

Ponieważ regiony E1 i E2/NS1 genomu kodują przypuszczalne polipeptydy otoczkowe, regiony te mogłyby mieć szczególne znaczenie jako czynniki immunogenne. Tak więc, regiony te należy zaliczyć do takich, które byłyby szczególnie pożądane do wywoływania i/lub zwiększania odpowiedzi immunologicznej, chroniąc przed zakażeniem HCV i zapobiegając chronicznym nawrotom choroby u chorych zakażonych. Ponadto, regiony te mogłyby należeć do takich, które służyłyby do wykrywania wariantów HCV rozwijających się podczas trwania zakażenia jak również super-infekcji lub ko-infekcji przez dwa lub więcej warianty.

W niniejszym opisie wynalazku podane są kompozycje i sposoby traktowania osobników w celu zapobiegania zakażeniom wirusem HCV a zwłaszcza zakażeniom chronicznym. Ponadto opisane są kompozycje i sposoby wykrywania obecności przeciwciał anty-HCV w próbkach biologicznych. Ten ostatni sposób jest szczególnie użyteczny do identyfikowania przeciwciał anty-HCV wytworzonych w odpowiedzi na odległe immunologicznie epitopy HCV. Ten sposób można również stosować do badania ewolucji wielu wariantów HCV u zakażonego osobnika. W opisie wynalazku mają zastosowanie następujące definicje.

Termin polipeptyd odnosi się do polimeru aminokwasów natomiast nie odnosi się do określonej długości produktu; tak więc w definicji polipeptydu mieszczą się peptydy, oligopeptydy i białka. Termin ten nie obejmujeO post-ekspresyjnych modyfikacji polipeptydów, na przykład glikozylacji, acetylacji, fosforylacji i podobnych procesów. W definicji mieszczą się natomiast przykładowo polipeptydy zawierające jeden lub więcej analogów aminokwasów (w tym np. aminokwasy nie występujące w stanie naturalnym), polipeptydy z podstawionymi wiązaniami, jak również inne znane modyfikacje, zarówno występujące jak i nie występujące w stanie naturalnym.

Według terminologii stosowanej w opisie, A jest zasadniczo wyizolowany z B jeśli waga A stanowi co najmniej około 70%, bardziej korzystnie co najmniej około 80% a najbardziej korzystnie co najmniej około 90% połączonych mas A i B. W korzystnym wykonaniu, kompozycje polipeptydowe są w zasadzie wolne od tkanki ludzkiej lub innych naczelnych (np. krwi, surowicy, lizatu komórkowego, organelli komórkowych, białek komórkowych i podobnych substancji) i od pożywki hodowli komórkowych.

Polinukleotyd rekombinantowy oznacza polinukleotyd pochodzenia genomowego, cDNA, półsyntetyczny lub syntetyczny który z racji swego pochodzenia lub przetworzenia: (1) nie jest związany z całym lub z częścią polinukleotydu, z którym jest on związany w stanie naturalnym, (2) jest związany z polinukleotydem innym od tego, z którym jest związany w stanie naturalnym lub (3) nie występuje w stanie naturalnym.

Polinukleotyd jest polimeryczną formą nukleotydów o dowolnej długości, rybonukleotydów albo dezoksyrybonukleotydów. Termin ten odnosi się jedynie do struktury pierwszorzędowej cząsteczki. Tak więc, termin ten obejmuje dwu- i jedno-niciowe DNA i RNA. Obejmuje on również znane typy modyfikacji, np. znane w technice znaczniki, formy metylowane, formy

171 489 w postaci czapeczki powstałe w procesie redystrybucji typu capping, podstawienia jednego lub więcej występujących w stanie naturalnym nukleotydów analogiem, modyfikacje wewnątrznukleotydowe, takie jak np. wiązania bez ładunku elektrycznego (np. tiolofosforowe, ditiofosforany i podobne), takie, które zawierają wolne reszty, na przykład białka (w tym np. nukleazy, toksyny, przeciwciała, peptydy sygnalne, poli-L-lizyna i podobne), takie, które zawierają ugrupowania interkalujące (np. akrydyna, psoralen), takie, które zawierają grupy chelatujące (przykładowo metale, metale radioaktywne), takie, które zawierają ugrupowania alkilujące, zawierające wiązania zmodyfikowane (na przykład α-anomeryczne kwasy nukleinowe i podobne) jak również niemodyfikowane formy polinukleotydów.

Terminy typu rekombinantowe komórki gospodarza, komórki gospodarza, komórki, linie komórkowe, hodowle komórkowe i inne podobne terminy oznaczające linie komórkowe pochodzące z mikroorganizmów lub wyższych organizmów eukariotycznych hodowane jako zbiory komórek jednorodnych odnoszą się do komórek, które mogą być lub są stosowane jako biorcy wektora rekombinantowego lub innego przenoszonego polinukleotydu i obejmują komórki potomne komórki pierwotnej, do której dokonano transfekcji. Jest zrozumiałe, że potomstwo pojedynczej komórki macierzystej niekoniecznie musi być całkowicie identyczne pod względem morfologii lub składu genomowego lub całkowitego DNA z oryginalną komórką macierzystą, w wyniku naturalnej, przypadkowej lub zamierzonej mutacji.

Termin replikon oznacza każdy element genetyczny, na przykład plazmid, chromosom, wirus, kosmid i podobne, zachowujący się jako autonomiczna jednostka polinukleotydowa replikująca się w obrębie komórki, to znaczy, zdolna do replikacji pod swą własną kontrolą.

Wektor jest replikonem posiadającym ponadto sekwencje zapewniające replikację i/lub ekspresję z otwartej ramki odczytu.

Termin sekwencja kontrolna odnosi się do sekwencji polinukleotydowych, które są niezbędne do wywołania ekspresji sekwencji kodujących, z którymi są połączone. Właściwości takich sekwencji kontrolnych różnią się w zależności od organizmu gospodarza; w organizmach prokariotycznych do sekwencji kontrolnych należą w zasadzie promotor, miejsce wiązania z rybosomem i sekwencje terminatorowe; w organizmach eukariotycznych, do takich sekwencji kontrolnych na ogół zalicza się promotory, terminatory i w niektórych przypadkach, sekwencje wzmacniające. Pod terminem sekwencje kontrolne należy rozumieć przynajmniej wszystkie te składniki, których obecność jest niezbędna do ekspresji; termin ten może również obejmować dodatkowe komponenty, których obecność jest korzystna, na przykład sekwencje liderowe rządzące sekrecją.

Terminem promotor określona jest sekwencja nukleotydowa zawarta w sekwencjach consensus, pozwalająca na wiązanie polimerazy RNA do matrycy w taki sposób, że synteza mRNA rozpoczyna się w normalnym miejscu początku transkrypcji dla przyległego genu strukturalnego.

Termin operacyjnie związany odnosi się do pozycji, w której opisane tym terminem komponenty znajdują się we wzajemnym stosunku umożliwiającym im funkcjonowanie w zamierzony sposób. Sekwencja kontrolna operacyjnie związana z sekwencją kodującą jest połączona z nią w taki sposób, że ekspresja sekwencji kodującej zachodzi w warunkach zgodnych z sekwencjami kontrolnymi.

Otwarta ramka odczytu (ORF) jest regionem sekwencji polinukleotydowej kodującej polipeptyd; ten region może reprezentować część sekwencji kodującej albo całą sekwencję kodującą.

Sekwencją kodującą jest sekwencja polinukleotydowa podlegająca transkrypcji do mRNA i/lub translacji do polipeptydu jeśli znajduje się pod kontrolą odpowiednich sekwencji regulacyjnych. Miejsca wiązań sekwencji kodującej są zdeterminowane kodonem początku translacji na końcu 5' i kodonem końca translacji na końcu 3'. Sekwencją kodującą może być między innymi mRNA, DNA (w tym cDNA) i rekombinantowe sekwencje polinukleotydowe.

Stosowany w opisie termin epitop albo determinanta antygenowa oznacza immunoreaktywną sekwencję aminokwasową. Na ogół, epitop składa się z co najmniej 3 do 5 aminokwasów, częściej z co najmniej 8 a nawet około 10 aminokwasów. Według terminologii stosowanej w opisie, epitop określonego polipeptydu oznacza epitopy o tej samej sekwencji aminokwasowej jak epitop w tym określonym polipeptydzie i jego immunologicznych równoważnikach.

Antygenem jest polipeptyd zawierający jeden lub więcej epitopów.

Określenie lmmunogeniczny oznacza zdolność do wywoływania komórkowej i/lub humoralnej odpowiedzi immunologicznej. Odpowiedź immunologiczna może być wywołana przez same immunoreaktywne polipeptydy albo może wymagać obecności nośnika z dodatkiem lub bez dodatku adiuwanta.

Określenie immunoreaktywny oznacza (1) zdolność immunologicznego wiązania z przeciwciałem i/lub z receptorem antygenu limfocytarnego albo (2) zdolność do wykazywania immunogenności.

Przeciwciało jest immunoglobuliną, zarówno całym przeciwciałem jak jego fragmentem, wiążącym swoisty epitop. Termin ten obejmuje między innymi przeciwciała poliklonalne, monoklonalne i chimerowe. Przykłady przeciwciał chimerowych są podane w opisach patentowych Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4 816 397 i 4 816 567.

Zbiór antygenów definiuje się jako kompozycję składającą się z wielu w zasadzie identycznych polipeptydów, przy czym te polipeptydy zawierają sekwencję aminokwasową jednego określonego epitopu.

Określenie polipeptydy w zasadzie identyczne oznacza polipeptydy identyczne za wyjątkiem różnic ograniczonych do typowego zakresu sekwencji lub różnic w rozmiarach wynikających ze sposobu wytwarzania danego polipeptydu, na przykład ekspresji rekombinantu, syntezy chemicznej, hodowli tkankowej i podobnych czynników. Różnice te nie zmieniają żądanej właściwości funkcyjnej kompozycji w zasadzie identycznych polipeptydów, co oznacza, że kompozycja ta zachowuje się pod względem immunologicznym jak kompozycja polipeptydów identycznych. Różnice mogą wypływać przykładowo z różnic w procesie wydzielania podczas transportu danego polipeptydu, wydajności poniżej 100% w syntezie chemicznej i podobnych czynników.

W niniejszym opisie pod terminem domena zmienna albo VD białka wirusowego rozumie się domenę wykazującą znaczny stopień zmian w składzie aminokwasowym pomiędzy co najmniej dwoma izolatami lub subpopulacjami wirusaHCV. Korzystnie, domenatakazawiera co najmniej jeden epitop. Różnice w domenach zmiennych między poszczególnymi izolatami mogą dotyczyć zmiany w tylko jednym aminokwasie. Izolaty te mogą pochodzić z tej samej grupy lub podgrupy HCV. Domeny zmienne można łatwo zidentyfikować przez oznaczenie składu sekwencji w poszczególnych izolatach; przykłady tych technik są opisane poniżej. Do celów opisu niniejszego wynalazku domeny zmienne można zdefiniować pod względem ilości aminokwasów w poliproteinie kodowanej przez genom HCV-1, co jest pokazane na fig. 9, wyznaczając inicjującą metioninę jako pozycję 1. Odpowiadającą domenę zmienną w innym izolacie HCV oznacza się przez wzajemne ustawienie sekwencji tych dwu izolatów w taki sposób, że orientuje się domeny konserwatywne na zewnątrz domeny zmiennej doprowadzając do maksymalnego dostrojenia. Można to przeprowadzić przy pomocy jednego z wielu pakietów programów komputerowych, takich jak ALIGN 1.0, udostępniany przez University of Virginia, Department of Biochemistry od dr Williama R. Pearsona (patrz Pearson i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444-2448, 1988). Jest zrozumiałe, że numeracja aminokwasów dla konkretnej domeny zmiennej jest nieco subiektywna i jest sprawą wyboru. T ak więc, należy mieć na uwadze, że o ile nie jest wyraźnie zaznaczone inaczej, początki i końce domen zmiennych są przybliżone i zawierają domeny częściowo się nakładające albo subdomeny.

Epitop może być immunologicznym równoważnikiem innego epitopu w wyznaczonym polipeptydzie jeśli reaguje on krzyżowo z przeciwciałami wiążącymi się immunologicznie z epitopem w tym wyznaczonym polipeptydzie.

Na ogół epitopy mapuje się; zawierają one co najmniej około 5 aminokwasów, czasem co najmniej około 8 aminokwasów a nawet około 10, a nawet więcej aminokwasów.

Sekwencja aminokwasową zawierająca epitop HCV może być połączona z innym polipeptydem (na przykład z białkiem nośnikowym) albo wiązaniami kowalencyjnymi albo w wyniku ekspresji polinukleotydu fuzyjnego z utworzeniem białka fuzyjnego. O ile to potrzebne, można dokonać insercji lub przyłączenia wielokrotnych jednostek epitopu i/lub wbudować wiele

171 489 różnych epitopów. Białko nośnika może pochodzić z dowolnego źródła ale na ogół będzie nim stosunkowo duże immunogenne białko takie jak BSA, KLH i podobne. Jeśli to wskazane, jako białko nośnikowe można zastosować białko HCV w zasadzie pełnej długości, zwielokratniając ilość immonogennych epitopów. Alternatywnie, sekwencję aminokwasową z epitopu HCV można łączyć jej końcem aminowym i/lub karboksylowym z sekwencją aminokwasową nieHCV w taki sposób, że utworzony polipeptyd będzie polipeptydem fuzyjnym. Stosując epitopy z innych wyznaczonych białek wirusowych można konstruować analogiczne typy polipeptydów.

Termin wariant określonego polipeptydu odnosi się do polipeptydu, w którym została zmieniona sekwencja aminokwasową w stosunku do tego określonego polipeptydu przez delecję, podstawienie, dodanie lub przegrupowanie jednego lub więcej aminokwasów w tej sekwencji. Metody, za pomocą których takie warianty pojawiają się (na przykład przez rekombinację) lub są konstruowane (na przykład przez ukierunkowaną mutagenezę) są znane.

Termin transformowanie określa insercję egzogennego polinukleotydu do komórki gospodarza, niezależnie od metody stosowanej do tej insercji, na przykład przez bezpośrednie wprowadzenie do komórki, transdukcję (łącznie z zakazeniem wirusowym), f-kojarzenie lub elektroporację. Ten egzogenny polinukleotyd może być utrzymywany w komórce jako wektor nie-zintegrowany, na przykład jako plazmid lub genom wirusowy albo alternatywnie, może być zintegrowany z genomem gospodarza.

Określenie osobnik oznacza kręgowce, zwłaszcza osobnika z gatunku ssaków i obejmuje ale nie ogranicza się do gryzoni (np. myszy, szczury, chomiki, świnki morskie), królików, kóz, świń, krów, owiec i naczelnych (np. szympansów, afrykańskich małp zielonych, pawianów, orangutanów i ludzi).

Stosowane tu określenie leczenie odnosi się do dowolnego typu (i) zapobiegania zakażeniu lub zakażeniu wtórnemu, tak jak w tradycyjnym szczepieniu, (ii) zmniejszania lub eliminacji objawów i (iii) znacznego lub całkowitego wyeliminowania wirusa. Leczenie można prowadzić profilaktycznie (przed zakażeniem) lub leczniczo (po zakażeniu).

Termin skuteczna ilość oznacza ilość polipeptydu zawierającego epitop wystarczającą do wywołania odpowiedzi immunologicznej u osobnika, któremu się go podaje albo do reakcji immunologicznej w stopniu wykrywalnym w żądanym układzie (np. w próbie immunologicznej). Korzystnie, taka skuteczna ilość wystarcza do skutecznego leczenia według powyższej definicji. Dokładna potrzebna ilość zależy od zastosowania. Do zastosowań jako szczepionki albo do wywoływania powstawania poliklonalnej antysurowicy/przeciwciał skuteczna ilość może się zmieniać i zależy od gatunku, wieku i ogólnego stanu osobnika, stanu zaawansowania choroby, która ma być leczona, konkretnego wybranego polipeptydu i drogi jego podania. Przyjmuje się, że skuteczne ilości będzie się oznaczać spośród stosunkowo dużego niekrytycznego zakresu. Odpowiednią skuteczną ilość można łatwo oznaczyć w rutynowych doświadczeniach.

Stosowany w opisie termin próbka biologiczna odnosi się do próbki tkanki lub cieczy wyizolowanej od osobnika, takiej jak próbka osocza, surowicy, płynu rdzeniowego, płynu limfatycznego, zewnętrznych wycinków skóry, próbek z układu oddechowego, pokarmowego, moczowo-płciowego, łez, śliny, mleka, komórek krwi, nowotworów, narządów, skrawków z biopsji oraz próbek składników hodowli komórkowych in vitro (włączając w to, lecz nie ograniczając do czynników kondycjonowanych otrzymanych ze wzrostu komórek na pożywce do hodowli komórkowych, np. komórek szpiczaka, komórek rekombinantowych i składników wytwarzających przeciwciała monoklonalne).

Immunoreaktywne kompozycje polipeptydowe wytwarzane sposobem według wynalazku zawierają mieszaninę swoistych dla izolatu lub swoistych grupowo epitopów z co najmniej jednej domeny zmiennej HCV. Tak więc, w kompozycjach tych będą obecne przynajmniej dwie heterogeniczne sekwencje aminokwasowe, z których każda określa epitop znajdujący się w innych izolatach HCV zlokalizowany w tym samym albo prawie tym samym miejscu fizycznym w białku HCV, co oznacza, że sekwencja dopasowuje się do tego samego miejsca w obrębie genomu/polipeptydu HCV. Ponieważ sekwencje są heterogeniczne, ten obszar uznaje się jako domenę zmienną (VD).

171 489

Dla lepszego zrozumienia wynalazku, na początku będą opisane poszczególne sekwencje aminokwasowe składające się na kompozycje otrzymywane sposobem według wynalazku. Następnie będzie opisana liczność takich sekwencji znajdujących się w tych kompozycjach.

Sekwencja aminokwasowa charakteryzująca polipeptydy wchodzące w skład kompozycji otrzymywanej sposobem według wynalazku posiada następującą podstawową strukturę:

Ly - Z - L'y' (I) gdzie Z oznacza sekwencję aminokwasową z regionu białka z określonego izolatu, przy czym region ten zawiera co najmniej jedną domenę zmienną a ta domena zmienna zawiera co najmniej jeden epitop. L i L' są sekwencjami aminokwasowymi nie-HCV albo takimi sekwencjami aminokwasowymi HCV, które nie zawierają domeny zmiennej; mogą one być takie same lub różne. Symbole y i y' oznaczają liczby 0 lub 1 i mogą być takie same lub różne. Wzór I przedstawia sekwencję aminokwasową zawierającą sekwencję z domeny zmiennej HCV, przy czym ta domena zmienna posiada epitop.

Jak podano powyżej, epitop (epitopy) na sekwencji Z będzie na ogół zawierać co najmniej około 5 aminokwasów, częściej co najmniej około 8 aminokwasów a najczęściej co najmniej około 10 aminokwasów.

Domena zmienna sekwencji Z może zawierać więcej niż jeden epitop. Domena zmienna Z jest co najmniej tak duża jak połączone sekwencje zawartych w niej epitopów, co oznacza, że przy obecności pojedynczego epitopu składa się ona w zasadzie z co najmniej około 5 aminokwasów. Ponieważ epitopy mogą się na siebie częściowo nakładać, minimalna sekwencja aminokwasową dla połączonych epitopów w domenie zmiennej może być mniejsza niż suma poszczególnych sekwencji epitopowych.

Z jest sekwencją aminokwasową izolatu HCV zawierającą opisaną powyżej domenę zmienną. Tak więc, minimalną wielkością Z jest minimalna wielkość domeny zmiennej. Zmoże zawierać więcej sekwencji aminokwasowych niż tylko domena zmienna (VD) a ponadto może zawierać więcej niż jedną domenę zmienną. Maksymalne wymiary Z nie są wielkością krytyczną lecz oczywiście, nie mogą przekraczać długości całej poliproteiny HCV. Na ogół jednak, Z będzie sekwencją całkowitego białka HCV (zwłaszcza E1, E2/NS1, NS2, NS3, NS4 i NS5) albo nawet częściej, fragmentem takiego białka HCV. Tak więc, korzystnie, wielkość Z będzie się zawierać w granicach od minimum około 5 aminokwasów (bardziej korzystnie od około 8 do około 10 aminokwasów) do maksimum około 1100 aminowkasów (korzystniej do około 500, bardziej korzystnie do co najmniej około 400 a najkorzystniej do maksimum 200 aminokwasów). Na ogół, polipeptyd o wzorze I i/lub Z jeśli jest wytworzony metodą np. syntezy chemicznej, będzie się składał z maksymalnej ilości około 50 aminokwasów, częściej z około 40 aminokwasów a najczęściej z maksymalnej ilości około 30 aminokwasów.

Sekwencje aminokwasowe L i L' nie należące do HCV, o ile są obecne, mogą się składać z wielu różnych typów takich sekwencji. Przykładowo, L i L' mogą być sekwencjami nie-HCV, do których została dołączona sekwencja z dla ułatwienia ekspresji tego rekombinantu (np. może to być β-galaktozydaza, dysmutaza nadtlenkowa, inwertaza, czynnik a, lider TPA i podobne), opisane poniżej. Alternatywnie, L i L' mogą oznaczać epitopy innych patogenów, takich jak wirusa zapalenia wątroby typu B, pałeczki krztuśca (Bordetella pertussis), toksyna laseczki tężca, błonica i podobne. Uzyskuje się wówczas kompozycje, które są immunoreaktywne wobec wielu tych innych organizmów chorobotwórczych. L i L' mogą być sekwencjami aminokwasowymi, które ułatwiają przyłączenie do stałego podłoża podczas syntezy peptydów, do podłoża podczas prób immunologicznych, mogą to być białka - nośniki szczepionki i podobne. W rzeczywistości, L i L' mogą nawet zawierać jeden lub więcej aminokwasów zbędnych, bez jakiegokolwiek znaczenia funkcyjnego. Nie ma krytycznej wielkości maksymalnej dlaL i L'. Ich długość będzie na ogół zależała od spełnianej funkcji. Na ogół, każda z sekwencji L i L' będzie zawierała najwyżej około 2000 aminokwasów, częściej najwyżej około 1000 aminokwasów. Większość sekwencji L i L' o użytecznych właściwościach będzie zawierała maksymalnie około 500 aminokwasów. Zaleca się oczywiście takie dobranie sekwencji L i L' aby nie blokowały one immunoreaktywności sekwencji Z.

171 489

Kompozycja polipeptydowa otrzymywana sposobem według wynalazku charakteryzuje się obecnością (w ilości skutecznej pod względem immunoreaktywności) w swym składzie co najmniej dwóch sekwencji aminokwasowych zdefiniowanych poniżej wzorami II i III:

Ly - Z, - L'y

Ly Z₂ - L> (III) gdzie L, L', y i y' mają wyżej podane znaczenie jak również znaczenie niezależnie określone dla każdego ze wzorów II i III oddzielnie. Każdy z symboli Zi i Z₂ oznacza sekwencje aminokwasowe HCV zdefiniowane dla Z obejmujące tę samą domenę zmienną (to znaczy w tym samym położeniu) ale pochodzące z różnych izolatów HCV, posiadając między nimi przynajmniej jeden heterogeniczny epitop we wspólnej dla Z1 Z₂ domenie zmiennej. Przykładem takiego rozwiązania może być sekwencja aminokwasów a weuhig wzoru II posiadaj ącajako Zi, fragment hiper-zmiennej kamnny roz^ciaj^iyąc>ę się om aminokwas8 384 do 414 z izolatu HCV1 1 (albo dokładniej, od 396 do 407 lub 396 do 408), a Z₂ oznacza analogiczny fragment z izolatu HCV-J 1.1. Te dwa izolaty są w tej domenie heterogeniczne, sekwencje aminokwasowe epitopów znacznie się różnią.

Jest zrozumiałe, że kompozycje mogą zawierać więcej niż akurat dwie oddzielone od siebie sekwencje aminnawasowe o wzorze I i że sekwencje Z mogą być podzielone na grupy obejmujące różne domeny zmienne. Przykładowo, kompozycja taka może zawierać grupę sekwencji HCV (o sekwencjach aminokwasnwych odpowiadających wzorowi I) obejmujących hiperzmienną domenę aminokwasów 384-411 z izolatów HCV-1, HCV-J1.1, HC-J1, HCJ4 1 podobnych. Kompozycja ta może również zawierać dodatkową grupę sekwencji HCV (o sekwencjach aminokwasowych odpowiadających wzorowi I) obejmujących domenę zmienną aminokwasów 215-255, również z izolatów HCV-1, HCV-J 1.1, HC-J1, HC-J4 i podobnych. Tak więc, w ramach wyżej opisanych kompozycji wytworzonych sposobem według wynalazku sekwencję o wzorze I można dalej zdefiniować wzorem:

SVn (IV) gdzie V oznacza sekwencję aminokwasową zawierającą sekwencję domeny zmiennej HCV, przy czym ta domena zmienna zawiera przynajmniej jeden epitop, np. o wzorze I. Symbole S i n oznaczają liczbę całkowitą 1 lub większą. S oznacza konkretną domenę zmienną a n oznacza konkretny izolat. Przykładowo, S = 1 może oznaczać domenę zmienną w obrębie aminokwasów 384 - 411 ; S = 2 może oznaczać domenę zmienną w obrębie aminokwasów 215-255, n = 12,3 i 4 może oznaczać odpowiednio izolaty HCV-1, HCV-J.1, HC-J1, HC-J4. Tak więc, opisane powyżej te dwie grupy sekwencji można przedstawić następująco:

grupa 1: 1Vi, 1© 1V₃ i 1V4 grupa 2: 2Vi,2V₂, 2V₃ i 2V4.

W kompozycjach otrzymywanych sposobem według wynalazku istnieją co najmniej dwie różne sekwencje o wzorze IV, co oznacza, że kompozycja zawiera dwie różne sekwencje o wzorze IV, gdzie wartości dla S i/lub n są różne. Przykładowo, kompozycja zawiera co najmniej 1V1 i 1V2 albo co najmniej 1V1 2V2 albo co najmniej 1V1 12Vn

Odrębne sekwencje odpowiadające wzorowi IV występują w kompozycji albo w tej samej albo w różnych cząsteczkach pklipeptydowych. Ilustrując to minimalną kombinacją IV1 i 1V2, można powiedzieć, że te dwie sekwencje występują w tej samej cząsteczce pklipeptydu (np. 1V1 - 1V1 albo w oddzielnych cząsteczkach. Tę cechę kompozycji otrzymywaną sposobem według wynalazku można przedstawić jako kompozycję polipeptydów o wzorze:

Rr - (SVn)x - R'r (V) gdzie S, V 1n mają wyżej podane znaczenie; R i R' są sekwencjami aminokwasowymi o długości około 1 - 2000 aminokwasów i mogą być takie same lub różne; r i r' oznaczają 0 albo 1 i mogą

171 489 być takie same lub różne; x oznacza liczbę całkowitą > 1; n dobiera się niezależnie dla każdego x; z zastrzeżeniem, że sekwencje aminokwasowe występujące w kompozycji reprezentują kombinację wybraną z grupy (i) 1Vj i 1V₂, (ii) 1V1 i 2V₂ oraz (iii) 1Vj i 2V| W tych rozwiązaniach, gdzie różne sekwencje o wzorze IV są rozmieszczone w różnych polipeptydach x może mieć wartość 1, aczkolwiek, o ile to wskazane, może on mieć również wartość powyżej 1, to jest, może być mieszaniną polipeptydów 1V| - 1V₂ i 1Vt- 2V₂. Jeśli x oznacza 1, obydwa r i r' oznaczają korzystnie 0 w celu uniknięcia powielania z Ly i L'y', podczas gdy V można przedstawić w korzystnym rozwiązaniu wzorem I. Jeśli x jest > wówczas połączone długości R i sąsiadującej sekwencji L oraz R' i sąsiedniej sekwencji L' korzystnie nie mogą być większe od typowych maksymalnych długości poddanych powyżej dla L i L'.

Wybór sekwencji aminokwasowych HCV zawartych w odmiennych sekwencjach V w kompozycjach będzie zależał od zamierzonego zastosowania tych sekwencji i leży w zakresie stanu techniki. Po pierwsze, należy zaznaczyć, że interesujące z punktu widzenia wynalazku epitopy HCV można podzielić na dwa typy. Do pierwszego typu epitopów zalicza się te, które są grupowo swoiste, to znaczy, że odpowiednie epitopy we wszystkich albo w zasadzie wszystkich izolatach w obrębie tej grupy izolatów wchodzą ze sobą wzajemnie w krzyżowe reakcje immunologiczne ale nie wchodzą w reakcje z odpowiednimi epitopami znajdującymi się w zasadniczo wszystkich izolatach należących do innej grupy. Korzystnie, epitopy w klasie grupowo-swoistej są w zasadzie konserwatywne w obrębie grupy ale nie pomiędzy grupami. Drugim typem epitopów są te, które są swoiste dla izolatu, co oznacza, ze epitop reaguje krzyżowo immunologicznie z zasadniczo identycznymi izolatami a nie reaguje krzyżowo ze wszystkimi lub w zasadzie wszystkimi odległymi izolatami.

Te swoiste grupowo i swoiste dla izolatu epitopy można łatwo zidentyfikować poniżej przedstawionymi metodami. Po pierwsze, w sposób podany w opisie porównuje się sekwencje kilku izolatów HCV i identyfikuje się obszary heterogeniczności sekwencji. Wzór heterogeniczności zazwyczaj wykazuje swoistość grupową lub swoistość dla izolatu. Jeśli wiadomo, że zidentyfikowany obszar zawierajeden lub więcej epitopów to wybiera się sekwencję o wielkości wystarczającej do objęcia danego epitopu (epitopów) jako domenę zmienną, którą można włączyć do kompozycji wytwarzanej sposobem według wynalazku. Jeśli immunoreaktywność danego heterogenicznego obszaru nie jest znana to można otrzymać i przeprowadzić skrining peptydów reprezentujących sekwencje znalezione w tym obszarze w różnych izolatach HCV. Taki skrining może obejmować ale nie ogranicza się do prób immunologicznych z różnymi źródłami przeciwciał anty-HCV (np. z surowicą pacjenta, z przeciwciałami monoklonalnymi neutralizującymi i podobnymi czynnikami) albo do wytworzenia przeciwciała i oznaczania zdolności tego przeciwciała do neutralizacji wirusa in vitro. Alternatywnie, bada się miejsca epitopów zidentyfikowanych w skriningu, w sposób opisany poniżej na heterogeniczność między różnymi izolatami i oznacza się metodą skriningu właściwości immunologicznie odpowiednich sekwencji heterogenicznych.

Przypuszcza się, że do stosowania w szczepionkach duże znaczenie mają domeny zmienne z domen E1 i E2/NS1. Zidentyfikowano zwłaszcza domenę zmienną E1 w obrębie aminokwasów 215-255 (fig. 2) i domenę zmienną E2/NS1 w obrębie aminokwasów 384-414 (fig. 3) jako ważne domeny reaktywne immunologicznie. Wstępne dowody wskazują, że jedna lub obydwie te domeny mogą być miejscami heterogeniczności odpowiedzialnej za ucieczkę mutantów prowadzącą do infekcji przewlekłych HCV. Tak więc, szczególnie korzystne są opisane powyżej kompozycje, w których domena (domeny) zmienna w V sąjedną lub obydwiema tymi domenami zmiennymi. Ponadto, kompozycje polipeptydowe otrzymywane sposobem według wynalazku, szczególnie jeśli są związane z zasadniczo liniowymi epitopami w domenach zmiennych, mogą również zawierać epitopy konformacyjne. Przykładowo, kompozycja może się składać z mieszaniny rekombinantowych białek E1 i/lub E2/NS1 (wykazujących domeny zmienne różnych izolatów) wydzielanych w układzie rekombinantowym (np. w komórkach owada lub ssaka) utrzymującym epitopy konformacyjne albo wewnątrz albo na zewnątrz tej domeny zmiennej. Alternatywnie, można łączyć antygen podjednostki E1 i/lub E2/NS1 z pojedynczego izolatu, zawierający epitopy konformacyjne, z kompozycją polipeptydową otrzymywaną sposobem według wynalazku (np. z mieszaniną syntetycznych polipeptydów albo denaturowanych poli16

171 489 peptydów rekombinantowych). W innych korzystnych zastosowaniach do szczepionek, opisane powyżej kompozycje polipeptydowe łączy się z innymi antygenami podjednostki HCV, takimi jak w te, które są opisane w powszechnie dostępnym opisie zgłoszenia patentowego Stanów

Zjednoczonych Ameryki nr_, o tytule: Hepatitis C Virus Asialoglycoproteina (numer rzecznika 0154.002) należącym do Roberta O. Ralston’a, Franka Marcus’a, Kenta B. Thudium’a, Barbary Gervase i Johna Hall’a, zgłoszonego w tej samej dacie co niniejsze zgłoszenie.

Do zastosowań diagnostycznych przydatne jest użycie kompozycji otrzymywanej sposobem według wynalazku jako antygenów, przez co polepsza się ich zdolność do wykrywania przeciwciała przeciw odmiennym izolatom HCV. Na ogół, takie mieszaniny polipeptydów można stosować bezpośrednio w próbie immunologicznej homogenicznej lub heterogenicznej, w tej ostatniej korzystna jest immobilizacja polipeptydu na stałym substracie (na przykład w studzienkach płytek do mikromianowania, na perełkach plastikowych, na nitrocelulozie). Sposoby te są ujawnione w publikacji zgłoszenia PCT, WO90/11089; publikacji zgłoszenia europejskiego EPO nr 360 088; oraz w wydawnictwie Immunoassay: Practical Guide. Ponadto, można również każdy, w zasadzie identyczny polipeptyd, który składa się na kompozycję otrzymywaną sposobem według wynalazku immobilizować na tym samym nośniku w oddzielnych miejscach, przez co uzyskuje się informację, w stosunku do którego izolatu lub grupy jest swoiste powstałe przeciwciało. Może to mieć szczególne znaczenie w diagnostyce jeśli zapalenie wątroby, raka lub inne choroby o odmiennych rokowaniach klinicznych powodują różne izolaty. Korzystną techniką analizy immunologicznej jest analiza RIBA™ firmy Chiron wykonywana na paskach, opisana w powszechnie dostępnych zgłoszeniach patentowych Stanów Zjednoczonych Ameryki 07/138 894 i 07/456 637.

Polipeptydy użyteczne do wytwarzania kompozycji sposobem według wynalazku można otrzymywać na drodze rekombinacji, syntetycznie albo w hodowli tkankowej. Polipeptydy rekombinantowe występujące w postaci skróconych sekwencji HCV lub białek HCV o pełnej długości mogą się składać wyłącznie z sekwencji HCV (jeden lub więcej epitopów, łączących się ze sobą lub oddzielonych) albo z sekwencji w białku fuzyjnym. W białkach fuzyjnych, do użytecznych sekwencji heterologicznych należą sekwencje potrzebne do wydzielania z gospodarza rekombinantowego, wzmocnienia reaktywności immunologicznej epitopu (epitopów) HCV albo do sprzęgania tego polipeptydu z nośnikiem lub z nośnikiem szczepionki. Odpowiednie ujawnienia są zawarte w publikacji patentu europejskiego EPO nr 116 201; w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4 722 840; w publikacji patentu europejskiego EPO nr 259 149 i w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki 4 629 783.

Białka o pełnej długości, jak również polipeptydy złożone ze skróconych sekwencji HCV i ich mutanty można wytwarzać na drodze syntezy chemicznej. Sposoby wytwarzania polipeptydów na drodze chemicznej są znane. Można je również wytwarzać techniką rekombinacyjną. W niniejszym opisie została podana sekwencja DNA kodująca HCV-1 oraz sekwencje dNa z różnych regionów zmiennych innych izolatów HCV. Dostępność tych sekwencji umożliwia konstruowanie polinukleotydów kodujących immunoreaktywne regiony polipeptydów HCV.

Polinukleotydy kodujące żądany polipeptyd zawierający jeden lub więcej immunoreaktywnych epitopów HCV z domeny zmiennej HCV można syntetyzować chemicznie lub izolować i wprowadzać do wektora ekspresyjnego. Wektory mogą ale nie muszą zawierać części sekwencji fuzyjnych, takich jak gen β-galaktozydazy lub dysmutazy nadtlenkowej (SOD). Sposoby i wektory użyteczne do wytwarzania polipeptydów zawierające sekwencje fuzyjne SOD są opisane w publikacji patentu europejskiego nr 0 196 056 opublikowanej 1 października 1986 r.

DNA kodujący żądany polipeptyd w postaci białka fuzyjnego lub dojrzałego, zawierający sekwencję sygnalną umożliwiającą sekrecję lub nie zawierający tej sekwencji, poddaje się ligacji z wektorami ekspresyjnymi odpowiednimi dla danego wybranego gospodarza. Następnie transformuje się organizmy gospodarza tym wektorem ekspresyjnym. Obecnie do wytwarzania polipeptydów rekombinantowych stosuje się zarówno układy gospodarzy eukariotycznych jak i prokariotycznych; przegląd niektórych częściej stosowanych układów kontrolnych i linii komórkowych gospodarzy jest podany w cytowanym powyżej odnośniku literaturowym Komórki gospodarzy inkubuje się w warunkach pozwalających na ekspresję żądanego polipeptydu.

171 489

Polipeptyd ten izoluje się z poddanych lizie komórek albo z pożywki hodowlanej i oczyszcza do poziomu wymaganego do zamierzonego użycia.

Ogólne techniki stosowane do ekstrakcji genomu HCV z wirusa, preparowania i sondowania banków DNA, sekwencjonowania klonów, konstruowania wektorów ekspresyjnych, transformowania komórek, prowadzenia prób immunologicznych takich jak próby radioimmunologiczne i ELIS A dla komórek rosnących w hodowli są ogólnie znane (odpowiednie pozycje literaturowe podano w innych częściach opisu).

Transformowanie wektora zawierającego żądaną sekwencję do odpowiedniego gospodarza wykonuje się dowolną znaną techniką wprowadzania polinukleotydów do komórki gospodarza, przykładowo techniką upakowania polinukleotydu w wirusie i zakazenia komórki gospodarza tym wirusem lub przez bezpośrednie wprowadzenie polinukleotydu. Użyta procedura transformacji zależy od gospodarza. Transformowanie bakterii przez bezpośrednie wprowadzenie do komórki bakteryjnej wymaga traktowania chlorkiem wapnia lub rubidu (Cohen, Proc. Natl. Acad. Sci. 69: 2110, 1972). Bezpośrednie transformowanie drożdży wykonuje się metodą Hinnen’a i wsp. (J. Adv. Enzyme Reg., 7:1929,1978). Transformowanie komórek ssaków przez bezpośredni pobór można prowadzić metodą Graham’ a i Van der Eb’a z zastosowaniem strącania fosforanem wapniowym (Virology 52:546,1978) albo znanymi modyfikacjami tej metody. Inne znane metody wprowadzania rekombinantowych polinukleotydów do komórek, zwłaszcza do komórek ssaków polegają na transfekcji za pośrednictwem dekstranu, transfekcji z udziałem fosforanu wapniowego, transfekcji z udziałem polibrenu, fuzji protoplastów, elektroporacji, kapsułkowaniu polinukleotydu (polinukleotydów) w liposomach i na bezpośredniej mikroinjekcji tych polinukleotydów do jąder.

W celu uzyskania ekspresji żądanych sekwencji kodujących, transformuje się komórki gospodarza polinukleotydami (mogącymi stanowić wektory ekspresyjne), zawierającymi sekwencje kontrolne związane operacyjnie z żądanymi sekwencjami kodującymi. Sekwencje kontrolne są zgodne z wyznaczonym gospodarzem. Spośród gospodarzy prokariotycznych najczęściej stosuje się E. coli. Do sekwencji kontrolujących ekspresję u prokariotów należą promotory, ewentualnie zawierające części operatorowe i miejsca wiązania z rybosomem. Wektory przeniesienia zgodne z gospodarzami prokariotycznymi na ogół pochodzą np. z pBR322, zawierających plazmid operonów nadających oporność na ampicylinę i tetracyklinę oraz z różnych wektorów pUC, które również zawierają sekwencje będące markerami oporności na antybiotyk. Można stosować sekwencje promotora występujące w stanie naturalnym, na przykład, układy promotorowe β-laktamazy (penicylinazy) (Weissman, The cloning of interferon and other mistakes, Interferon 3 (wydawca I. Grosser, 1981), laktozy (lac) (Chang i wsp., Nature, 198:1056, 1977) i tryptofanu (trp) (Goeddel i wsp., Nucl. Acids Res., 84057, 1980) i promotory lambda Pl oraz miejsce wiązanie z rybosomem N genu (Shimatake i wsp. Nature, 292: 128,1981). Ponadto, promotory syntetyczne nie występujące w stanie naturalnym również funkcjonują jako promotory bakteryjne. Przykładowo, sekwencje aktywujące transkrypcję jednego promotora można łączyć z sekwencjami operonowymi innego promotora, uzyskując syntetyczny promotor hybrydowy (na przykład promotor tac, który pochodzi z sekwencji promotorów trp i lac (De Boer i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:21, 1983). Powyższe układy są szczególnie zgodne z E. coli; jeśli zachodzi potrzeba, można użyć innych prokariotycznych gospodarzy, takich jak szczepy Bacillus lub Pseudomonas z odpowiednimi sekwencjami kontrolnymi.

Do gospodarzy eukariotycznych należą drożdże i komórki ssaków w układach hodowli. Najpowszechniej stosowanymi gospodarzami drożdżowymi są Saccharomyces cerevisiae i Saccharomyces carlsbergensis; są one wygodnymi gospodarzami grzybowymi. Wektory zgodne z drożdżami na ogół mają markery pozwalające na selekcję transformantów przez nadanie cechy prototroficzności mutantom auksotroficznym albo oporności na metale ciężkie szczepom typu dzikiego. W wektorach zgodnych z drożdżami można stosować jako źródło replikacji plazmid 2 mikrometry (Broach i wsp., Meth. Enz. 101: 307, 1983), kombinację CEN3 i ARS1 lub inne środki zapewniające replikację, takiejak sekwencje zapewniające wprowadzenie odpowiedniego fragmentu do genomu komórki gospodarza. Sekwencje kontrolne dla gospodarzy drożdżowych są znane; obejmują one promotory do syntezy enzymów glikolitycznych (Hess i wsp., J. Adv. Enzyme Reg. 7: 149, 1968); przykładowo dehydrogenazy alkoholowej, ADH (publikacja opisu

17J 489 patentu europejskiego nr 284 044), enolazy, glukokinazy, izomerazy glukozo-6-fosforanu, dehydrogenazy gliceraldehydo-3-fosforanu (GAP lub GAPDH), heksokinazy, fosfofruktokinazy, mutazy 3-glicerofosforanu i kinazy pirogronianowej, PyK (publikacja opisu patentu europejskiego EPO nr 329 203). Drożdżowy gen PHO5, kodujący kwaśną fosfatazę również dostarcza użyteczne sekwencje promotorowe. Ponadto, promotory syntetyczne, nie występujące w przyrodzie również funkcjonują jako promotory drożdzowe. Przykładowo, można łączyć idące w górę sekwencje aktywujące (UAS) jednego promotora drożdżowego z regionu aktywacji transkrypcji drugiego promotora drożdżowego uzyskując syntetyczny promotor hybrydowy. Przykłady takich promotorów hybrydowych obejmują sekwencję regulatorową ADH połączoną z regionem aktywacji transkrypcji GAP (opisy patentowe Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4 876 197 i 4 880 734). Inne przykłady promotorów hybrydowych obejmują promotory składające się z sekwencji regulatorowych jednego z genów ADH2, GAL4, GAL10 albo PH05, połączonych z regionem aktywacji transkrypcji genu enzymu glikolitycznego takiego jak GAP albo PyK (publikacja opisu patentu europejskiego nr 164 556). Ponadto, promotor drożdżowy może zawierać występujące w stanie naturalnym promotory pochodzenia niedrożdżowego, posiadające zdolność wiązania drożdżowej polimerazy RNA do odpowiedniego inicjowania transkrypcji.

Innymi elementami kontrolnymi, które można włączać do drożdżowego wektora ekspresyjnego są terminatory (na przykład z GAPDH i z genu enolazy; Holland, J. Biol. Chem. 256: 1385) i sekwencje liderowe. Fragment sekwencji liderowej na ogół koduje peptyd sygnalny złożony z aminokwasów hydrofobowych kierujących sekrecjąbiałka z komórki. DNa kodujący odpowiednie sekwencje sygnalne może pochodzić z genów dla wydzielanych białek drożdżowych, takich jak gen inwertazy drożdżowej (publikacja opisu patentu europejskiego EPO nr 12 873) i gen czynnika α (publikacja opisu patentowego Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4 588 684). Alternatywnie, sekrecję w drożdżach umożliwiają również lidery pochodzenia nie-drozdżowego, takie jak lider interferonu (publikacja opisu patentu europejskiego EPO nr 60 057). Korzystną klasą liderów sekrecji jest ta, w której stosuje się fragment drożdżowego genu czynnika-α, zawierający zarówno sekwencję pre sygnalną jak i region pro. Do fragmentów czynnika-α, które można zastosować należą: lider pre-pro-czynnika-α o pełnej długości oraz skrócone lidery czynnika-α (opisy patentowe Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4 546 083 i 4 870 007 oraz publikacja opisu patentu europejskiego EPO nr 324 274). Do innych, zapewniających sekrecję liderów, w których zastosowany jest fragment lidera czynnika-α należą lidery hybrydowego czynnika-α wytworzone z pre-sekwencji pierwszych drożdży i z pro-regionu pochodzącego z czynnika-α z drugich drożdży (publikacja opisu patentu światowego WO 89/02463).

Opracowano wektory ekspresyjne, replikony poza chromosomalne lub wektory integrujące się do transformowania do wielu gospodarzy drożdżowych. Przykładowo, opracowano wektory ekspresyjne dla Candida albicans (Kurtz i wsp., Mol Cell Biol. 6: 142, 1986), Candida maltoza (Kunze i wsp., J. Basic Microbiol. 25: 141, 1985), Hansenula polymorpha (Gleeson i wsp., J. Gen. Microbiol. 132: 3459,1986), Kluyveromyces fragilis (Das i wsp., J. Bactenol. 158: 1165, 1984), Kluyveromyces lactis (De Louvencourt i wsp., J. Bacteriol. 154:737, 1983), Pichia quilleriomondii (Kunze i wsp., (1985, jak wyżej), Pichia pastoris (Cregg i wsp.. Mol. Cell Biol. 5:3376, 1985; opisy patentowe Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4 837 148 i 4 929 555), Schizosaccharomyces pombe (Beach i Nurse, Naturę, 300:706, 1981) i Yarrowia lipolytica (Davidow i wsp., Curr. Genet. 10:39, 1985).

Znane są linie komórkowe ssaków w charakterze gospodarzy ekspresyjnych. Obejmują one między innymi nieuśmiercone linie komórkowe dostępne w Amerykańskim Muzeum Szczepów, American Type Culture Collection (ATCC), przykładowo komórki HeLa, komórki jajników chomika chińskiego (CHO), komórki nerek młodych chomików (BHK), małpie komórki COS i wiele innych linii komórkowych. Promotory dla komórek ssaków są również znane i obejmują promotory wirusowe, takie jak promotor z wirusa SV40, z wirusa mięsaka Rous’a (RSV), z adenowirusa (ADV) i z wirusa brodawczaka bydląt (BPV). Przykłady odpowiednich promotorów podane są w książce Sambrook’a (1989). Komórki ssaków wymagają również sekwencji terminatorowych i sekwencji addycji poli A. Można również włączać sekwencje

171 489 wzmacniające, które zwiększają ekspresję. Korzystne jest również włączenie sekwencji powodujących amplifikację genu. Sekwencje te są znane.

Wektory odpowiednie do replikacji w komórkach ssaków są znane i mogą zawierać replikony wirusowe albo sekwencje zapewniające integrację odpowiednich sekwencji kodujących żądane polipeptydy z genomem gospodarza.

Wektorem, który stosuje się do ekspresji obcego DNA, takim, który stosuje się w preparatach szczepionek jest wirus krowianki. W tym przypadku, dokonuje się insercji heterologicznego DNA do genomu wirusa krowianki. Techniki insercji obcego DNA do genomu wirusa krowianki są znane. Taką techniką jest na przykład rekombinacja homologiczna. Insercji heterologicznego DNA dokonuje się zwykle do genu nie mającego zasadniczego znaczenia, na przykład do genu kinazy tymidynowej (tk), który zapewnia ponadto marker selekcyjny. Wektory plazmidowe znacznie ułatwiające konstruowanie wirusów rekombinantowych są opisane. Przykładowe publikacje na ten temat to: Mackett i wsp.: DNA cloning, tom II, (1984), IRL Press, str. 191; Chakrabarti i wsp., Mol. Cell Biol., 5: 3403, 1985; Moss, Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells, 1987, wyd. Miller i Calos, str. 10. Ekspresja żądanych polipeptydów zawierających regiony immunoreaktywne zachodzi następnie w komórkach i w osobnikach zakażonych i/lub immunizowanych żywym rekombinantowym wirusem krowianki.

Do innych układów ekspresji polipeptydów należą komórki owadów i wektory odpowiednie do użycia w tych komórkach. Układy te są znane i przykładowo obejmują wektory transferowe do ekspresji w owadach pochodzące z wirusa jądrowej polihedrozy baculowirusa Autographa californica (AcNPV) będące wirusowymi wektorami ekspresyjnymi helper-niezależnymi. Wektory ekspresyjne pochodzące z tego układu zwykle zawierają promotor silnego wirusowego genu polihedronu w celu pobudzenia ekspresji genów heterologicznych. Ostatnio, najpowszechniej stosowanym wektorem transferowym do wprowadzania obcych genów do AcNPV jest pAc373. W celach zwiększenia ekspresji opracowano wiele innych wektorów znanych specjalistom z tej dziedziny. Należą do nich na przykład pVL985 (zmieniający kodon startu polihedronu z ATG na ATT i wprowadzający miejsce klonowania Bam HI w odległości 32 pary zasad od ATT w kierunku 3' (Lucków i Summers, Virology 17:31, 1989). Do dobrej ekspresji nie-fuzyjnych obcych białek na ogół potrzebne są obce geny, które najkorzystniej posiadają krótką sekwencję liderową zawierającą odpowiednie sygnały początku translacji poprzedzające sygnał startu ATG. Plazmid ten zawiera również sygnał poliadenylacji polihedronu i gen oporności na ampicylinę (amp) oraz źródło replikacji do selekcji i namnażania w E. coli.

Sposoby wprowadzania heterologicznego DNA do żądanego miejsca w baculowirusie są znane (Summers i Smith), Texas Agricultural Experiment Station Bulletin nr 1555; Ju i wsp., Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells, wyd. Miller i Calos, 1987; Smith i wsp., Mol. Cell Biol. 3: 2156, 1983 oraz Lucków i Summers, jak wyżej, 1989). Przykładowo, metodą homologicznej rekombinacji dokonuje się insercji do genu takiego jak gen polihedronu; miejscem insercji może być również miejsce enzymu restrykcyjnego sztucznie wbudowane do żądanego genu baculowirusa. Włączanymi sekwencjami mogą być również te, które kodują wszystkie lub różne segmenty żądanych polipeptydów HCV łącznie z co najmniej jednym epitopem z domeny zmiennej.

Okazuje się, że sygnały dla modyfikacji posttranslacyjnych, takie jak sygnał rozszczepienia peptydu, rozszczepienia proteolitycznego i fosforylacji jest rozpoznawany przez komórki owada. Sygnały wymagane do sekwencji i akumulacji jądrowej wydają się również jednakowe dla komórek bezkręgowców i kręgowców. Przykłady sekwencji sygnalnych z komórek kręgowców, które są efektywne w komórkach bezkręgowców są znane; jako przykład może służyć sygnał dla ludzkiej interleukiny 2 (IL2), który jest sygnałem transportu na zewnątrz o ile tylko komórka ta zostanie rozpoznana i właściwie usunięta w komórkach owadzich.

Często jest pożądane aby polipeptydy wytwarzane z użyciem wyżej opisanych komórek gospodarzy i wektorów były polipeptydami fuzyjnymi. Tak jak polipeptydy nie-fuzyjne, polipeptydy fuzyjne mogą po ekspresji pozostawać wewnątrz komórki. Alternatywnie, białka fuzyjne mogą być również wydzielane z komórki do środowiska wzrostu jeśli posiadają fragment sekwencji liderowej. Korzystnie, między fragmentem lidera a pozostałą częścią obcego genu znajdują się miejsca przetwarzania, które można rozszczepiać in vivo lub in vitro.

171 489

W przypadkach, gdy kompozycja ma być stosowana do leczenia HCV, pożądane jest aby była ona immunogenna. W przypadkach, gdy syntetyzowany polipeptyd ma prawidłową konfigurację zapewniającą istnienie prawidłowego epitopu ale jest za mały aby był immunogenny, można go związać z odpowiednim nośnikiem. Znanych jest wiele technik uzyskiwania takich połączeń, między innymi tworzenie wiązań dwusiarczkowych za pomocą N-sukcynimidylo-3(2-pirydylo-tio) propionianu (SPDP) i sukcynimidylo -4-(N-maleimidometylo) cykloheksano1-karboksylanu (SMCC); jeśli peptyd nie ma grupy sulfhydrylowej to można ją wprowadzić dodając resztę cysteiny. Reagenty te budują wiązania dwusiarczkowe pomiędzy grupami sulfhydrylowymi oraz pomiędzy resztami cysteiny na jednym białku a wiązaniem amidowym poprzez grupę -aminową w lizynie albo inną wolną grupą aminową w innych aminokwasach. Znanych jest wiele takich środków tworzących wiązania dwusiarczkowo-amidowe. (Immun. Rev. 62:185, 1982). Inne dwufunkcyjne reagenty sprzęgające dają wiązania tioeterowe a nie dwusiarczkowe. Wiele takich środków dających tioetery jest dostępnych w handlu; należą do nich reaktywne estry kwasu 6-maleimidokapronowego, 2-bromooctowego, 2-jodooctowego, 4-(N-muleimidometylo)cyk]oheksano- 1 -karboksylowego i podobne. Grupy karboksylowe można aktywować przez łączenie ich z sukcynimidem albo z solą sodową kwasu 1-hydroksy-2-nitro-4-sulfonowego. W innych metodach sprzęgania antygenów stosuje się układ: rotawirus/peptyd wiążący opisany w publikacji opisu patentu europejskiego, nr 259 149. Powyższa lista nie jest wyczerpująca i mogą być wykonywane modyfikacje wymienionych związków.

Można stosować dowolny nośnik, który sam nie wywołuje wytwarzania przeciwciał szkodliwych dla gospodarza. Odpowiednimi nośnikami są tu duże, wolno metabolizujące się makrocząsteczki, takie jak białka; polisacharydy, takie jak sepharoza funkcjonalizowana lateksem, agaroza, celuloza, perełki celulozowe i podobne; polimeryczne aminokwasy, takie jak kwas poliglutaminowy, polilizyna i podobne; kopolimery aminokwasowe; nieaktywne cząsteczki wirusa (patrz wyżej). Szczególnie użytecznymi substratami białkowymi są: albuminy surowicy, hemocyjanina z mięczaków, cząsteczki immunoglobulin, tyroglobulina, owalbumina, anatoksyna laseczki tężca i inne dobrze znane białka.

Immunogenność epitopów na domenach zmiennych HCV, zwłaszcza E1 i E2/NS1 można również wzmocnić poprzez wytwarzanie ich w układach eukariotycznych sprzężonych z lub wbudowanych do białek tworzących cząstki, takich jak na przykład białka związanego z antygenem powierzchniowym wirusa zapalenia wątroby B (Opis patentowy Stanów Zjednoczonych nr 4 722 840). Konstrukcje, w których polipeptyd zawierający epitop HCV z domeny zmiennej jest przyłączony bezpośrednio do sekwencji kodującej białko tworzące cząsteczkę daje hybrydy immunogenne w odniesieniu do epitopu HCV. Ponadto, wszystkie wytworzone wektory zawierają epitopy swoiste w stosunku do HBV, o różnych stopniach immunogenności, takie jak na przykład peptyd pre-S. Tak więc, cząsteczki skonstruowane z białka tworzącego cząsteczkę, zawierające sekwencje HCV są immunogenne w odniesieniu do HCV i HBV.

Antygen powierzchniowy zapalenia wątroby (HBSAg) został utworzony i wbudowany do cząsteczek w S. cerevisiae (Valenzuela i wsp., Nature 298: 344,1982) jak również w komórkach ssaków (yalenzuela i wsp.: Hepatitis B, wyd. Millman i wsp., 1984). Okazało się, że tworzenie takich cząsteczek wzmacnia immunogenność podjednostki monomerycznej. Takie konstrukcje mogą również zawierać epitop immunodominantowy HBSAg zawierający 55 aminokwasów regionu pre-powierzchni (Pre-S) (Neurath i wsp. (1984). Konstrukcje cząsteczki pre-S-HBSAg, których ekspresja zachodzi w drożdżach są ujawnione w publikacji opisu patentu europejskiego EPO nr 174 444; hybrydy zawierające heterologiczne sekwencje wirusowe do ekspresji w drożdżach są ujawnione w publikacji opisu patentu europejskiego EPO nr 175 261. Ekspresja tych konstrukcji może również zachodzić w komórkach ssaków takich jak komórki CHO jeśli zastosuje się wektor SV40 - reduktazy dihydrofolianowej (Michelle i wsp. (1984).

Ponadto, części sekwencji kodujące białka tworzące cząsteczki mogą być zastąpione kodonami kodującymi epitop z domeny zmiennej HCV. W tej zamianie, można wyciąć regiony, które nie są konieczne do agregacji tych jednostek z utworzeniem immunogennych cząsteczek w drożdżach lub ssakach, przez co eliminuje się dodatkowe miejsca antygenowe HBV z konkurowania z epitopem (epitopami) HCV.

Znane są preparaty szczepionek zawierających immunogenne polipeptydy jako składniki aktywne. Na ogół, takie szczepionki wytwarza się w postaci form iniekcyCnych, jako roztwory albo zawiesiny; form stałych nadających się do przygotowania roztworu lub zawiesiny bezpośrednio przed iniekcją. Preparaty te można również emulgować lub polipeptydy te można zamykać w mikrokapsułkach liposomowych. Aktywne składniki immunogenne często miesza się ze środkami pomocniczymi dopuszczalnymi farmaceutycznie i zgodnymi ze składnikiem aktywnym. Odpowiednimi środkami pomocniczymi są tu na przykład woda, sól fizjologiczna, glukoza, glicerol, etanol i podobne oraz ich kombinacje. O ile to wskazane, szczepionka może również zawierać niewielkie ilości substancji dodatkowych takich jak środki zwilżające lub emulgatory, bufory, utrzymujące żądane pH i/lub adrnwanty zwiększające skuteczność szczepionki. NieogranicraCącymi przykładami adiuwantów, które mogą się okazać efektywne są· wodorotlenek glinowy, N-acetylo-moramylo-L-treonylo-D-lzoglutaa^ina (thr-MPD), N-acetylo-normuramylo-L- alanylo-D-izoglutamina (CGP 11637) nazywana skrótowo nor-MDP, Nacetylk-muramylo-L- alanyM-D-izo glutaminy^ -L-alanino-2- 11'-2'-dipalmitkilo-snglicero-3-hydroksyfksfkryloksy)etyloamina (CGP 19835A, nazywana skrótowo MPT-PE oraz RIBI, która zawiera trzy składniki ekstrahowane z bakterii, monkfksforyln-lipid A, dimykolam trehalkzy i szkielet ściany komórkowej (MPL+TDM+CWS) w emulsji 2% skwalenu i Tweenu 80. Efektywność adiuwanta można oznaczyć przez pomiar ilości przeciwciał przeciw immunogenicznemu polipeptądnwi zawierającemu epitop HCV z domeny zmiennej, które to przeciwciała tworzą się po podaniu tego polipeptydu w szczepionkach zawierających ponadto te różne adiuwanty.

Białka mogą występować w szczepionce w formie związków obojętnych lub soli. Sole dopuszczalne farmaceutycznie obejmują sole addycyjne z kwasami (z wolnymi grupami aminowymi peptydu) i sole powstające z kwasami nieorganicznymi, takimi jak kwas chlorowodorowy lub fosforowy albo z organicznymi, takimi jak kwas octowy, szczawiowy, winowy, maleinowy i podobne. Sole utworzone z wolnymi grupami karboksylowymi mogą również pochodzić z nieorganicznych zasad, takich jak na przykład wodorotlenek sodowy, potasowy, amonowy, wapniowy lub żelazowy i takich zasad organicznych jak izopropyloamina, trójmetyloamina, 2-etyloaminketanol, histydyna, prokaina i podobne.

Szczepionki dogodnie podaje się pozajelitowo przez iniekcję, np. podskórną lub domięśniową. Dodatkowe formy, dostosowane do innych dróg podawania obejmują czopki i w pewnych przypadkach, formy doustne. Do form czopkowych stosuje się tradycyjne środki wiążące i nośniki, na przykład, glikole polialailenowe lub trójgliceryny, takie czopki można formować z mieszanin zawierających składnik aktywny w ilości od 0,5% do 10%, korzystnie 1 % do 2%. Do form doustnych stosuje się powszechnie używane środki pomocnicze, na przykład mannitol, laktozę, skrobię, stearynian magnezowy, sól sodową sacharozy, celulozę, węglan magnezowy i podobne, wszystkie o czystości do celów farmaceutycznych. Kompozycje te sporządza się w postaci roztworów, zawiesin, tabletek, pigułek, kapsułek, form o przedłużonym działaniu lub proszków; zawierają one 10% do 95% składnika aktywnego, korzystnie 25% do 70%.

Ponadto, jest również możliwe wytworzenie żywych szczepionek atenokwanych mikroorganizmów, w których zachodzi ekspresja rekombinantowych pklipeptydów z układu antygenowego HCV. Odpowiednie atenuowane mikroorganizmy są znane; należą do nich na przykład wirusy (np. wirus krkwianal) i bakterie.

Szczepionki podaje się w sposób zgodny z daną postacią farmaceutyczną i w takiej ilości aby były skuteczne profilaktycznie i terapeutycznie. Dawka przeznaczona do podania mieści się w zakresie od 5 pg do 250 pg antygenu/dawkę i zależy od osobnika, zdolności układu immunologicznego tego osobnika do syntetyzowania przeciwciał i żądanego stopnia ochrony. Konkretne dawki składnika aktywnego zalecone do podania będą zależeć od oceny lekarza prowadzącego i mogą być dostosowane indywidualnie dla każdego pacjenta.

Szczepionkę można podawać w postaci jednej dawki albo korzystnie, według schematu wielkdawkkwego. W schemacie wielodawkowym pierwszy etap szczepienia składa się z 1 do 10 oddzielnych dawek i następnych kolejnych dawek podawanych w odstępach czasu, potrzebnych do utrzymania i/lub wzmocnienia odpowiedzi immunologicznej. Przykładowo, następną dawkę podaje się po upływie 1 - 4 miesięcy i o ile to potrzebne, kolejną dawkę podaje się po kilku

171 489 miesiącach. Schemat dawkowania, przynajmniej częściowo będzie określany potrzebą danego osobnika i będzie zależał od oceny lekarza prowadzącego.

Szczepionka zawierająca opisany powyżej zespół antygenów znajdujących się w polipeptydach HCV może być również podawana łącznie z innymi środkami immunoregulującymi, np. z immunoglobulinami.

Kompozycje otrzymywane sposobem według wynalazku można podawać w celu wywołania u osobników wytwarzania przeciwciał poliklonalnych (oczyszczanych lub izolowanych z surowicy znanymi technikami), które z kolei mają szereg różnych zastosowań, na przykład do immunizacji biernej albo jako reagenty immunochemiczne.

Opisane wyżej kompozycje immunoreaktywne otrzymywane sposobem według wynalazku zawierające wiele układów antygenowych HCV stosuje się do wykrywania przeciwciał przeciw HCV w próbkach biologicznych, w tym we krwi i w surowicy. Istnieje duży wybór różnych możliwości opracowania prób immunologicznych i wiele z nich jest znanych. Jednak w tej próbie immunologicznej będzie się stosować zespoły antygenów, przy czym każdy taki zespół będzie zawierał wiele w zasadzie identycznych polipeptydów posiadających sekwencję aminokwasów z epitopu na pierwszej domenie zmiennej izolatu HCV a sekwencja aminokwasową jednego zespołu będzie heterogeniczna w odniesieniu do sekwencji aminokwasowej co najmniej jednego innego zespołu. Zasada tej próby immunologicznej może być oparta na przykład na konkurencji lub bezpośredniej reakcji albo na technice kanapkowej. W próbach tych można również stosować stałe nośniki lub immunoprecypitację. W większości prób wykorzystuje się znakowane przeciwciało albo polipeptyd; znacznikiem może być przykładowo związek fluorescencyjny, chemiluminescencyjny, radioaktywny lub cząsteczka barwnika. Znane są również próby, z których amplifikuje się sygnały z sondy; ich przykładami są próby z zastosowaniem biotyny i awidyny oraz próby immunologiczne ze znakowanym enzymem i zachodzące za pośrednictwem enzymu, takie jak próby ELISA.

Zestawy do diagnozy immunologicznej, zawierające odpowiednie znakowane reagenty przygotowuje się przez pakowanie odpowiednich materiałów, w tym kompozycji otrzymywanych sposobem według wynalazku zawierających epitopy HCV z domen zmiennych w odpowiednich pojemnikach razem z pozostałymi reagentami i materiałami (np. odpowiednimi buforami, roztworami soli itp.) potrzebnymi do przeprowadzenia próby jak również z kompletem instrukcji prowadzenia próby.

Poniżej opisane są przykłady realizacji niniejszego wynalazku, załączone w celu jego ilustracji i nie ograniczającymi zakresu wynalazku. W świetle niniejszego ujawnienia, wiele rozwiązań objętych zakresem zastrzeżeń będzie oczywistych dla specjalistów z tej dziedziny.

W przykładach stosuje się następujące materiały i sposoby.

Próbki pobrane od pacjentów i ekstrakcja RNA

Bezobjawowi nosiciele HCV, HCT 18 i HCV J1 oraz pacjent Th z przewlekłym zakażeniem HCV są opisani przez Weiner’a i wsp. (Virol. 180: 842-848, 1991). U pacjenta Q zdiagnozowano przewlekłą aktywną postać zapalenia wątroby na podstawie biopsji wątroby; pacjent ten był leczony interferonem a-2b (3 miliony jednostek, trzy razy w tygodniu) przez 6 miesięcy. RNa z ilości 0,2 ml osocza ekstrahowano metodą Chomcynski’ego i Sacchi (Anal. Biochem. 162: 156-159, 1987) stosując odczynnik RNAzol ^MB (Cinna/Biotecx Laboratories) zawierający 10gg/ml nośnikowego RNAzMS2 (Boehringer Mannheim, 165-948) i postępując według przepisu podanego przez producenta. RNA zawieszano w 200 μl pirowęglanu dwuetylowego, traktowano wodą destylowaną i strącano w roztworze o końcowym stężeniu 0,2 M octanu sodowego i 2,5 objętości 100% etanolu, w temperaturze -20°C.

cDNA i enzymatyczna reakcja amplifikacji PCR

Wszystkie reakcje prowadzono według Weinera i wsp. (Lancet 335: 1-5, 1990). Sekwencjonowanie M13 prowadzono według Messinga i wsp. (Methods in Enzymology, 1983, 101: 20-37). Wykazano sekwencję zgodną (consensus) w co najmniej czterech sklonowanych insertach za wyjątkiem sekwencji HCV J1.2 E2/NS1, która pochodziła z dwu klonów.

Klonowanie i sekwencjonowanie materiału od HCT 18 i Th prowadzono według Weinera i wsp. (1991, jak wyżej). Komplet hierarchicznych primerów do reakcji PCR użytych do

171 489 klonowania amino-terminalnych i karboksy-początkowych segmentów E2/NS1 od pacjenta Q był następujący:

PCR I

X (E2) 14 GGTGCTCACTGGGGAGTCCT (1367-1386) S X (E2) 18J CATTGCAGTTCAGGGCCGTGCTA (1608-1588) A

PCR II

X (E2) 4 TCCATGGTGGGGAACTGGGC (1406-1425) S X (E2) 19J TGCCAACTGCCATTGGTGTT (1582-1562) A

PCR I

X (E2) 14 (jak wyżej) S

Jirc12 TAACGGGCTGAGCTCGGA (2313-2296) A PCR II

US (E2) 5 CAATTGGTTCGGTTGTACC (1960-1978) S Jirc 13 CGTCCAGTTGCAGGCAGCTTC (2260-2240) A

Primery reakcji PCR stosowane do klonowania genu E2/NS1 HCV Ji były następujące:

PCR I

J1 (E2) 14 (jak wyżej) S

J1 (E2)rc30* CAGGGCAGTATCTGCCACTC (2349-2330) A J1IZ-2* TGAGACGGACGTGCTGCTCCT (1960-1978) S J1 (E2)ec32** TTTGATGTACCAGGCGGCGCA (2658-2636) A

PCR II-E2384.5*

GGATCCGCTAGCCATACCCGCGTGACGGGGGGGGTGCAA (1469-1495) S DSCON1JBX*

GGATCCTCTAGATTACTCTTCTGACCTATCCCTGTCCTCCAAGTCACA (2272-27011 A

J1IZ-1* CAACTGGTTCGGCTGTACA (1915-1935) S J1(E2)rc31** (2566-2546) A.

* - sekwencja nt według Takeuchi i wsp (Nucl Acids Res. 18-4626, 1990),

- sekwencja nt według Kato i wsp (proc Jpn Acad. 65B:219-223, 1989).

Primery sensowne (S) i antysensowne (A) są podane w orientacji 5' do 3' zgodnie z podanymi numerami nukleotydów.

Synteza biotynylowanych peptydów

Częściowo nakładające się oktapeptydy dla hyper-zmiennych regionów trzech szczepów HCV syntetyzuje się na rozszczepialnym łączniku, derywatyzuje się je i N-końce każdego peptydu sprzęga się ze szpilkami polietylenowymi, w zasadzie takimi samymi jak są opisane przez Maeji i wsp. (J. Immunol. Methods 134: 23-33, 1990). Na końcu, do N-końca sprzęga się biotynę stosując 150 pl roztworu dimetyloformamidu zawierającego 40 mM biotyny, 40 mM 1 -hydroksybenzotriazolu (HOBt), 40 mM heksafluorofosforanu benzotriazol-1 -ilo-oksy-tris-pirydyno-fosfoniowego (PyBOP, firmy Novabiochem) i 60 mM N-metylomorfoliny (NMM). Reakcję prowadzi się przez dobę w temperaturze 20°C.

Po biotynylowaniu, w peptydach odblokowuje się łańcuchy boczne, przemywa się i odszczepia się peptydy od szpilek polietylenowych w 200 pl 0,1M buforu fosforanowego (pH=7,2). Płytki do mikromiareczkowania zawierające roztwory rozszczepionego peptydu przechowuje się w temperaturze -20°C.

Badanie biotynylowanych peptydów w próbie ELISA

Płytki polistyrenowe (Nunc immuno maxisorb F96) powleka się streptawidyną przez dobową inkubację w temperaturze 4°C z roztworem 5 pl/ml streptawidyny (Sigma, numer katalogowy S4762) w ilości 0,1 ml/studzienkę, w 0,1 M buforze węglanowym (pH = 9,6). Po usunięciu roztworu streptawidyny studzienki przemywa się cztery razy 0,1% roztworem Twe24

171 489 en’u 20 w PBS. Wiązanie nieswoiste blokuje się przez inkubację każdej studzienki z 0,2 ml 2% roztworu BSA w PBS przez godzinę w temperaturze 20°C. Studzienki powtórnie przemywa się cztery razy roztworem Tween 20/PBS. Płytki suszy się na powietrzu i przechowuje w temperaturze 4°C aż do użycia. Streptawidynę w każdej studzience sprzęga się z rozszczepionymi peptydami przez inkubację z ilością 100 μl rozcieńczenia 1:100 roztworu rozszczepionego peptydu z 0,1% BSA w PBS, z dodatkiem 0,1% azydku sodowego w czasie godziny, w temperaturze 20°C. Po inkubacji, płytkę przemywa się cztery razy roztworem PBS/Tween 20. Następnie, każdą studzienkę inkubuje się z ilością 100 gl odpowiedniego rozcieńczenia surowicy (rozcieńczonej w 2% BSA w PBS z dodatkiem 0,1% azydku sodowego) w czasie godziny w temperaturze 20°C albo przez dobę w temperaturze 4°C, po czym przemywa się cztery razy w roztworze PBS/Tween 20. Wiązanie przeciwciała wykrywa się w reakcji w 0,1 % ml koniugatu w czasie godziny w temperaturze 20°C. Koniugat zawiera 0,25 ml/litr (poziom nasycenia) znakowanej peroksydazą chrzanu koziej IgG przeciw-króliczej (H+L) (Kirkegaard and Perry Labs., Gaithersburg, MD) w CASS (0,1 % surowicy owczej, 0,1 % Tween’u 20,0,1 % kazeinianu sodowego rozcieńczonego w 0,1 M PBS (pH=7,2). Studzienki przemywa się 2 razy roztworem PBS/Tween 20 a następnie 2 razy samym PBS. Obecność enzymu wykrywa się w reakcji prowadzonej w czasie 45 minut w temperaturze 20°C z ilością 0,1 ml świeżo sporządzonego roztworu zawierającego 50 mg soli amoniowej kwasu 2,2'-azyno-bis-[3-etylo benzotiazolino-6sulfonowego (ABTS, Boehringer Mannheim, numer katalogowy 122661) i 0,03 ml 35% (wagowo) roztworu nadtlenku wodoru w 100 ml buforu 0,1 M fosforanu/0,08 M cytrynianu (pH = 4,0). Pomiary zabarwienia wykonywano w czytniku do płytek Titertek Multiscan MC techniką przy podwójnej długości fali: przy 405 nm, wobec odnośnej długości 492 nm. Generowany komputerowo profil antygeniczności

Profile antygeniczności dla białka HCV E2/NS1 i hiper-zmiennego regionu białka gp-120 HIV-1 (aa 303-338) wyprowadzono za pomocą programu komputerowego opartego na stopniu zmienności sekwencji, opracowanego po raz pierwszy przez Kabata (Sequences of proteins of immunological interest Ministerstwo Zdrowia i Opieki Społecznej Stanów Zjednoczonych Ameryki, Powszechna Służba Zdrowia, Narodowy Instytut Zdrowia (1983) do celów identyfikacji hiper-zmiennych pętli immunoglobulin; ten stopień zmienności mnożono przez średnią indywidualnego prawdopodobieństwa, że cecha wiązania przeciwciałajest utrzymana dla każdej możliwej pary aminokwasów. Prawdopodobieństwa utrzymania wiązania przeciwciała związane ze zmienną każdego aminokwasu były wartościami oznaczonymi eksperymentalnie przez oszacowanie wszystkich możliwych podstawień aminokwasowych na wiązanie przeciwciała dla 103 scharakteryzowanych liniowych epitopów (Geysen i wsp., J. Mol. Rec. 1:32-41,1988). Ten algorytm daje wartości ważone dla współczynnika zmienności, przez co uzyskuje się większe znaczenie wiązania przeciwciała, co oznacza, że równoważy się zmiany w aminokwasach konserwatywnych. Dla oznaczenia profilu antygeniczności dla HCV zastosowano piętnaście następujących sekwencji HCV: HCV-1, Q3.2, HCT 23, EC10, HC-J1, HCVE1, TH, HCT 27, Q1.2, HCT 18, HC-J4, HCV J1.2/HCV J1.1, HCV J, HCV BK. Profil dla domeny V3 HIV-1 uzyskano przez uśrednienie 242 poszczególnych profili z 15 sekwencji wybranych losowo z ilościowo większej bazy danych unikalnych sekwencji HIV-1 (LaRosą i wsp., Science 249: 932-935, 1990 i korekta w Science, 1991, str. 811). Sekwencje aminokwasowe niektórych izolatów w odcinku 384-420 są przedstawione na fig. 3.

Generowane komputerowo struktury drugorzędowe

Prawdopodobieństwo drugorzędowej struktury α-helisy, β-platu i β-skrętu dla rejonu N-końcowego (384-420) oznaczano stosując algorytm, który wyznacza prawdopodobieństwo dla każdego z trzech powyższych miejsc w strukturze drugorzędowej dla każdej reszty. Współczynniki użyte w tym algorytmie otrzymano dla wszystkich kombinacji par reszt bazy struktur (Levitt i Greer, J. Mol. Biol., 114: 181-293, 1977). Parametry prognozy uzyskane na podstawie tych współczynników były zgodne z wynikami eksperymentalnymi jeśli algorytm ten zastosowano z powrotem do tej bazy danych do otrzymania prawdopodobieństwa, że dana reszta mogłaby występować w jednym z tych trzech zdefiniowanych miejsc w strukturze drugorzędowej.

171 489

Przykład I. Porównanie zmian w drugorzędowej strukturze sekwencji aminokwasowych w domenie HV E2/NS1 HCV z domeną gp-120 z HIV-1.

Porównano sekwencje aminokwasowe z piętnastu izolatów HCV i HIV-1 pod względem ilości pozycji, w których zaobserwowano heterogeniczności w sekwencjach aminokwasowych z domeny HV E2 z HCV i domeny V3 z gp-120 HIV-1 (odpowiednio figury 4 A i B). Heterogeniczności występują w 25 na 30 pozycji aminokwasowych w rejonie E2 Hv i w 23 na 35 pozycji aminokwasowych w domenie gp-120 V3 z HIV-1. Kreski na osi x na fig. 4A i 4B oznaczają pozycje aminokwasowe, gdzie występują zmienne reszty aminokwasowe a niezmienne aminokwasy oznaczone są jednoliterowym kodem stosowanym dla aminokwasów. Profile antygeniczności przedstawione na fig. 4 wskazują na to, iż podobnie do pętli V3 w białku gp-120HIV-1 (fig. 4B), również w HCV E2 (aminokwasy 384-414 na fig. 4A) zidentyfikowano blok reszt aminokwasowych, którego zmienność ma przewidywany niepożądany wpływ na wiązanie z przeciwciałem. Dane przedstawione na fig. 4 wykazują, że domena HCV E2 przypomina domenę V3 gp-120 z HIV-1, o której wiadomo, że koduje wirusowe epitopy neutralizujące o podobnym znaczeniu pod względem stopnia i przewidywanego znaczenia zmienności aminokwasów i sugeruje, że domena E2 HV może mieć podobną funkcję jak domena V3 gp-120.

Przypuszcza się, że liniowe epitopy są związane z mniej złożonymi strukturalnie rejonami białek, zwłaszcza z końcami białek albo z rozciągniętymi powierzchniami pętli. W celu określenia prawdopodobieństwa, że konkretna reszta jest związana z określoną strukturą drugorzędową, dla 15 aminokwasowych sekwencji E2 HV pomiędzy resztami 384 do 420 przeprowadzono analizę komputerową. Na fig. 4 jest widoczne, że region pomiędzy N-końcową resztą 384 z E2 a łatwym do przewidzenia, wysoce konserwatywnym beta-skrętem (reszty 415-418) ma stosunkowo słabo rozbudowaną strukturę drugorzędową, co wynika z poniżej 50% prawdopodobieństwa występowania alfa-helisy, beta-płatu i beta-skrętu. Brak wyraźnie przewidywalnej struktury w domenie E2 HV jest zgodny z cechą tolerancji dla dużej zmienności sekwencji wykrywanej w izolatach i w przeciwieństwie do regionów o wysokim stopniu złożoności struktury występującym w białkach sfałdowanych trzeciorzędowo. Domena E2 HV z HCV wydaje się być nawet mniej złożona niż domena V3, będąca główną neutralizującą domeną gp-120 HIV-1, o której wiadomo, że zawiera motyw: beta nić typu II- beta skręt, beta nić- alfa heliksę i może mieć większy ograniczający wpływ na zmienność aminokwasów niż domena E2 HV z HCV. Reasumując, powyższy dowód wykazuje, że domena E2 HV posiada cechy charakterystyczne dla domen białkowych posiadających miejsca liniowych neutralizujących epitopów.

Przykład II. Mapowanie epitopów w domenie HV E2/NS1 wirusa HCV

Częściowo nakładające się biotynylowane peptydy 8-merowe odpowiadające i rozciągające się poza domenę HV E2/NS1 (aminokwasy 384 do 416) z HCT 18 (A, D), Th (B, E) i HCV J1 (C, F) wiąże się z powierzchnią płytek powleczonych streptawidyną i poddaje reakcji z osoczem albo od osobnika HCT 18 (A-C) albo od osobnika Th (D-F). Wyniki są przedstawione na fig. 6: dla izolatów HCV 18 na fig. 6A i 6D; dla Th na fig. 6B i 6E; dla HcV J1 na fig. 6C i 6F. Osocze od HCT 18 rozcieńcza się w stosunku 1 : 200 a osocze od Th rozcieńcza się w stosunku 1 : 500. HVE-1, -2, -3, -4 i -5 reprezentują epitopy specyficzne dla izolatu.

Jak to jest uwidocznione na fig. 6, osocze HCT 18 identyfikuje liniowy epitop (⁴⁰⁷PKQNV⁴¹') w testach z peptydami pochodzącymi z sekwencji HCT 18 (HVE-I na fig. 6A) ale nie reaguje z peptydami korespondującymi z domeną HV dwu różnych szczepów Th i HCV J1 (fig. 6B i 6C). W przeciwieństwie do tego, osocze Th identyfikuje liniowy epitop HVE-IV w domenie HV od Th (4°⁹QLIQLI4^<)<i, fig. 6E) i również epitopy w szczepie hCt 18 (³⁹⁹IVRFFAP405), fig. 6d) i _w HCV J1. Th, biorca leków IV, może być narażony na wiele szczepów HCV.

Osocze zarówno od Th jak i HCT 18 reaguje z epitopem (aminokwasy 413-419) wspólnym dla wszystkich trzech izolatów (dane nie są przytoczone) w próbach ELISA, gdzie stosowano syntetyzowane na stałym nośniku, częściowo nakładające się peptydy 8-merowe z każdego izolatu.

W celu oceny swoistości wiązania przeciwciał, eluuje się przeciwciała związane z biotynylowanymi peptydami zawierającymi aminokwasy 403-407 i stosuje się je do blokowania reaktywności osocza HCT 18 ze szpilkami (peptydami osadzonymi na stałym nośniku poprzez

171 489 szpilki polietylenowe) zawierającymi częściowo się nakładające 8-mery dla domeny HV HCT 18. Dane te wskazują że 1) domena HV HCT 18 jest immunogenna, 2) istnieje wiele epitopów, które plasują się w tym rejonie i 3) podzbiór epitopów (HVE-1, -2, -3, -4 lub -5 na fig. 6) w domenie HV jest swoisty dla izolatu.

Przykład III. Wykazanie, ze różne domeny HV z E2/NS1 mogą być związane z rzutami zapalenia wątroby.

W celu zbadania możliwości znalezienia wariantów HCV związanych z okresowymi rzutami zapalenia wątroby często występującymi u pacjentów z przewlekłymi infekcjami HCV, wykonano częściowe sekwencjonowanie genu E2/NS1 od pacjenta Q z przewlekłym zapaleniem wątroby podczas dwu ataków żółtaczki, które wystąpiły w odstępie około dwóch lat (odpowiednio Q1 i Q3). Drugi atak żółtaczki wystąpił po upływie 1,5 roku od zakończenia leczenia interferonem. Różnice w wyprowadzonej sekwencji aminokwasowej w rejonie HV E2/NS1 pacjentów Q1 i Q3 były uderzające tylko w aminokwasach 391-408, przy czym 7 na 8 zmian pojawiło się między aminokwasami 398 a 407 (fig. 7). Na fig. 7 przedstawione są wyprowadzone sekwencje aminokwasowe, dwu rejonów polipeptydu E2/NS1; są to aminokwasy 384-414 i 547-647 dla izolatów Q1 i Q3. Aminokwas (E), powyżej sekwencji Q1 znaleziono w jednym z czterech klonów Q1. Aminokwasy wzięte w ramkę reprezentują lokalizację 12-merowego peptydu HVE od pacjenta Q1 lub Q3. Różnice w sekwencji aminokwasowej pomiędzy Q1 a Q3 są oznaczone tłustym drukiem.

Zaobserwowano tylko jedną heterogeniczność pomiędzy aminokwasami 547 i 647 polipeptydów E2/NS1 od pacjentów Q1 i Q3 (fig. 7).

Dla oznaczenia wpływu podstawień aminokwasowych zaobserwowanych w domenach zmiennych E2 pacjentów Q1 i Q3 na wiązanie przeciwciała, zsyntetyzowano swoisty dla Q1 i Q2 peptyd 12-merowy od aminokwasu 396 do 407 (HVE Q1 albo Q3 na fig. 7B) i przeprowadzono oddzielne reakcje osocza Q1 i Q2 z każdym z tych peptydów w próbie ELISA. Na tabeli 4 jest widoczne, że przeciwciała obecne zarówno w osoczu Q1 jak i Q3 reagują z peptydem Q1 ale nie z peptydem Q3. Analiza statystyczna (test Studenta) wykazuje, że wiązanie osocza Q1/Q3 do peptydu Q1 było znacząco powyżej poziomu wiązania tego osocza z panelem 12 losowo wybranych peptydów kontrolnych (P<0,001), podczas gdy wiązanie osocza Q1 ani Q3 z peptydem Q3 nie było statystycznie znamienne. Dane te wykazują, że jakkolwiek u pacjenta Q rozwinęły się przeciwciała przeciw domenie HV HCV Q1, które były ciągle wykrywalne po dwu latach od punktu czasowego Q3, to nie rozwinęła się wykrywalna odpowiedź humoralna przeciw wariantowi Q3 domeny zmiennej E2, który dominował podczas drugiego ataku zapalenia wątroby.

Tabela 4

Wyniki próby ELISA z peptydami 12-merowymi

Osocze	TARFAGFFQSGA	TAGFVRLFETGP
sekwencja średnia	Q1 sd*	sekwencja średnia	Q3 sd
Q1	1,158	0,134	0,691	0,123
Q3	1,022	0,123	0,693	0,036

(sd = odchylenie standardowe)

Przykład IV. Skład i wytwarzanie szczepionki Sprzęganie nośnikowego białka anatoksyny błonicy z MCS

Wymagane materiału kwas etylenodiamino-czterooctowy (EDTA Na2 · 2H2O), masa cząsteczkowa 372 ester kwasu 6-maleimido-kapronowego z N-hydroksysukcynimidem (MCS); Sigma - czystość 95%

Ortofosforan dwuwodorosodowy (NaH2 PO4) azot dimetyloformamid (DMF)

171 489

Woda Milll Q bufor 0,1 M fosforanowy zawierający 5 mM EDTA (pH = 6,66) bufor 0,1 M fosforanowy, (pH = 8,0) bufor 0,1 M fosforanowy (pH = 7,0) bursztynian sodowy [(CHsCOONah · 6H2O] cysteina kwas solny (roztwór 2%)

0,1 M bursztynian sodowy/0,1% EDTA (pH = 5,6)

Oczyszczoną anatoksynę błonicy uzyskaną z Commonwealth Serum Laboratories, Victoria, Australia) sprzęga się z MCS metodą opisaną przez Lee i wsp. (Mol. Immunol. 17:749,1980); Partis^i wsp. (Prot. Chem. 2:263, 1983), Peeters’ai wsp. (J. Immunol. Methods 120:133,1989) oraz Jones’a i wsp. (J. Immunol. Methods 123:211, 1989). Ilość 100 ml anatoksyny błonicy przepuszcza się przez kolumnę Sephadex G25 o wymiarach 17 cm x 4 cm w celu usunięcia tiomersalu. Anatoksynę eluuje się 0,1 M buforem fosforanowym o pH = 7,0 1 oznacza się zawartość białka w eluacie metodą BCA (Pierce). Otrzymany roztwór zatęża się w jednostce do ultrafiltracji do końcowego stężenia 10 mg/ml.

Jeden ml roztworu anatoksyny dializuje się w buforze 0,1 M fosforanowym o pH = 8,0 i następnie miesza się z roztworem 1,5 mg MCS w 200 pl DMF. Otrzymany roztwór inkubuje się w temperaturze pokojowej przez godzinę, bez dostępu światła, od czasu do czasu mieszając. W celu oddzielenia niesprzężonego MCS od połączenia MCS-anatoksyna, roztwór przepuszcza się przez kolumnę Sephadex PD 10 uprzednio zrównoważoną 0,1 M buforem fosforanowym (pH = 6,66) 1 zbiera się frakcję białka.

Ilość sprzężonych grup maleimidowych na cząsteczkę nośnika oznaczono przed samym sprzęganiem peptydów HCV. Przez bufor bursztynian/EDTA (30 ml) przepuszcza się azot przez 2 minuty. Cysteinę (5 mg) przenosi się do kolby miarowej o pojemności 25 ml i rozpuszcza w przepłukanym azotem buforze uzyskując końcową objętość roztworu 25 ml. Ilości roztworów podane w tabeli 5 przenosi się (nastawiając po dwie próbki) do 25 ml butelek z nakrętkami. Za pomocą osobnych pipetek, przez każdą próbkę przepuszcza się azot. Następnie każdą butelkę szczelnie się zamyka i inkubuje w temperaturze pokojowej, w ciemności, przez 40 minut, od czasu do czasu zawirowując.

Tabela 5

Roztwór	Próbka (ml)	Standard (ml)	Ślepa próbka (ml)
aktywowany nośnik	0,3	-
bufor fosfoianowy	-	0,3	0,3
roztwór cysteiny	1,0	1,0	-
bufor bursztymanów	-	-	1,0

*Ilość 0,1 ml każdego z tych trzech roztworów pobiera się do oznaczenia Ellman’a.

Próba Ellmana ilościowego oznaczania grup sulfydrylowych

Materiały

Bufor fosforanowy, pH = 8,0

Rozpuszcza się 15,6 g NaH2PO4 albo 12,0 g bezwodnego NuH2PO4 w około 700 ml Milli Q. Wartość pH ustawia się na 8,0 za pomocą 50% NaOH. Dodaje się wody Milli Q do końcowej objętości 1000 ml i w razie potrzeby ustawia się wartość pH.

Odczynnik Ellman’a rozpuszcza się 10 mg kwasu 5,5'-ditiobis-2-nitrobenzoesowego (DTNB) w 2,5 ml buforu fosforanowego o pH = 8,0.

Do każdej próbki 0,1 ml roztworów przygotowanych powyżej, to znaczy próbki, standardu 1 ślepej próbki, dodaje się po 0,1 ml odczynnika Ellmana. Następnie, do każdej próbki dodaje się po 5 ml buforu fosforanowego (pH = 8,0) dokładnie się miesza i pozostawia na 15 minut. Absorbancję każdej próbki mierzy się w celkach o długości 1 cm, przy 412 nm.

Ilość grup maleimidowych obecnych na białku nośnikowym oznacza się w sposób następujący. Ilość 0,01 gmola grup -SH/ml roztworu daje absorbancję 0,136 przy pomiarze w celce

171 489 cm przy 412 nm. Absorbancja standardu lub próbki (A) jest równa ilości cysteiny reagującej ze sprzężonymi grupami maleimidowymi na aktywowanym białku nośnikowym. Ponieważ 1 mol dostępnej grupy -SH reaguje z 1 molem grupy maleimidowej to stężenie w gmolach grup maleimidowych obecnych w oznaczanej ilości równa się A(0,01/0,136 μmoll/ml. Całkowita objętość roztworu wynosiła 5,2 ml. Tak więc, całkowita ilość μmoll równa się A(0,01)(5,2)/0,136. Roztwór próbki miał całkowitą objętość 1,3 ml, z czego 0,3 ml to aktywowane białko nośnikowe. Ilość grup maleimidowych obecnych w roztworze próbki wyliczano ze wzoru:

A(0,01) (5,2)( 1,3)/(0,136)(0,1)(0,3) = A(16,57) gmoli/ml

Białko nośnikowe aktywowane MCS przechowuje się w temperaturze -20°C.

Redukcja peptydów HCV

Przed sprzęganiem peptydów HCV z aktywowanym MCS białkiem nośnikowym peptydy te redukuje się aby grupy tiolowe obecne w tych peptydach znajdowały się w całkowicie zredukowanej formie -SH.

Materiały ditiotreitol (dTt) wodorowęglan amonowy (NH4HCO3) metanol

SEP-AK (wkładki C18, Waters), i wkładka na każde 8 mg peptydu bufor 0,1 M wodorowęglanu amonowego

Rozpuszcza się 7,9 g NH4HCO3 w litrze wody Milli Q.

bufor A - 0,1% (objętościowo) kwas trójfluorooctowy (TFA) w wodzie Milli Q bufor B - 60% (objętościowo) acetonitryl, 0,1% (objętościowo) TFA w wodzie Milli Q

Ilości po 15 mg każdego z dwu peptydów HCV odpowiadających aminokwasem 384-411 i 225-260 poliproteiny HCV dodaje się do 2,5 ml 0,1 M wodorowęglanu amonowego zawierającego 10-krotny molarny nadmiar DTT. Powstałe roztwory miesza się do czasu rozpuszczenia peptydu po czym odstawia na godzinę w temperaturze pokojowej. Dwie pary- SEP-PAK łączy się w serie i aktywuje przez przepuszczenie przez każdą parę SEP-PAK około 20 ml metanolu i następnie 20 ml buforu A. Każdą próbkę peptyd/DTT przepuszcza się powoli przez parę SEP-PAK. DTT wymywa się ilością 20 ml buforu A. Zredukowany peptyd eluuje się ilością 7 ml buforu B do zważonej uprzednio butelki i liofilizuje się przez dobę. Następnie butelki wazy się oznaczając ilość odzyskanego peptydu. Zredukowane peptydy natychmiast sprzęga się z aktywowanym MCS białkiem nośnikowym.

Sprzęganie peptydów HCV z aktywowanym MCS białkiem nośnikowym

Ilość około 100 ml 0,1 M buforu fosforanowego z dodatkiem 5 mM EDTA (pH = 6,66) odgazowuje się pod zmniejszonym ciśnieniem po czym płucze się azotem przez 10 minut. Dwadzieścia ml roztworu o stężeniu 10 mg/ml aktywowanego MCS białka nośnikowego ostrożnie przepłukuje się azotem nie dopuszczając do nadmiernego pienienia. Po 5 ml każdego zredukowanego peptydu rozpuszcza się w około 0,2 ml odgazowanego i przepłukanego azotem buforu: fosforan/EDTA (pH = 6,66) i miesza się z roztworem aktywowanego MCS białka nośnikowego. Uzyskaną mieszaninę przenosi się do butelki z nakrętką, napełnia azotem i szczelnie zamyka. Roztwór dalej odgazowuje się przez utrzymywanie butelki w przez 2 minuty w łaźni sonifikacyjnej Branson 2000 . Butelkę owija się folią aluminiową i inkubuje przez dobę w temperaturze pokojowej z powolnym mieszaniem we wstrząsarce.

Wytworzony koniugat jest rozpuszczalny; niesprzężony peptyd usuwa się przez przepuszczenie mieszaniny przez kolumnę Sephadex PD 10 uprzednio zrównoważoną buforem fosforan/EDTA o pH 6,66. Zbiera się frakcję białka. Ilość peptydu skoniugowanego z białkiem nośnikowym oznacza się metodą analizy aminokwasów.

Prowadzi się analizę aminokwasów w ilościach po 150 μl koniugatu i białka nośnikowego. W celu wyliczenia ilości wytwrzonego peptydu skoniugowanego oznacza się średni stosunek poziomu aminokwasów należących wyłącznie do białka nośnikowego. Nie oznaczano poziomów seryny, treoniny, tryptofanu, metioniny, tyrozyny i cysteiny, gdyż te aminokwasy ulegają

171 489 modyfikacji w standardowych warunkach hydrolizy. Typowe wyniki uzyskiwane w tych wyliczeniach są przedstawione w tabeli 6.

Tabela 6

aminokwas	tylko nośnikowy	knniugatowy
D	212	193
E	194	170
G	153	108
R	60	56
A	150	384
P	79	163

Dla aoniogato, wartości pogrubione są aminokwasami, które występują również w peptydach.

W celu znormalizowania wyniku, dla koniugatów zawierających alaninę i prolinę współczynnik. (193+179+180+56)/(212)+194+153+60) = 0,8659 mnoży się przez liczbę wyrażającą poziom tych aminokwasów

Przygotowuje się kompozycje iniekcyjne zawierające peptydy HCV skkniugowane z białkiem nośnikowym aktywowanej MCS anatoksyny błonicy, sporządzone w sposób opisany powyżej oraz emulsję adiuwanta typu olej w wodzie o submikronnweC wielkości cząstek, opisaną w opisie zgłoszenia PCT nr WO9014837, opublikowanym 13 grudnia 1990 r. Ponadto przygotowuje się iniekcyjne kompozycje zawierające poza skkmogowanymi peptydami HCV i adiuwantem również środek immunostymulujący, lipofilowy muramylo-peptyd (MTP-PE, Ciba-Geigy, Bazylea, Szwajcaria). Kompozycje szczepionki zawierają na ogół 50% białka i 50% adiuwanta.

Skład kompozycji szczepionki z MPT-PE

Do przygotowania 10 ml iniekcyjnej szczepionki stosuje się:

2,5 ml skwalenu (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO)

0,25 ml Tween 80 (Sigma Chemical Co.)

0,25 ml SPAN 85 (Sigma Chemical Co.)

1000 pg MPT-PE

1000 pg peptydu HCV skoniugowanego z aktywowanym MCS białkiem nośnikowym anatoksyny błonicy

Skład kompozycji szczepionki bez MPT-PE

Do przygotowania 10 ml szczepionki iniekcyjnej stosuje się:

2,5 ml skwalenu (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO)

0,25 ml Tween’u 80 (Sigma Chemical Co.)

0,25 ml SPAN’u 85 (Sigma Chemical Co.)

1000 pg peptydu HCV skoniugowanegn z aktywowanym MCS białkiem nośnikowym anatoksyny błonicy

Przykład V. Sposób oznaczania toksyczności preparatów szczepionki

Toksyczność szczepionki wytworzonej sposobem opisanym w przykładzie 5 badano na małych zwierzętach. Świnkom morskim, myszom i królikom podaje się dootrzewnowo iniekcje 50 pg szczepionki na kg wagi ciała. Dootrzewnowo iniekcje szczepionki podaje się również małpom rhesus i naczelnym. Połowa badanej populacji małp rhesus i naczelnych otrzymała dawkę 5 pg/kg szczepionki a druga połowa otrzymała dawkę 50 pg/kg. Zwierzęta kontrolne stosowane w każdym oznaczeniu otrzymywały iniekcję porównywalnej ilości kompozycji składającej się ze wszystkich składników preparatu szczepionki za wyjątkiem peptydów wirusowych.

U każdego zwierzęcia monitorowano objawy wskazujące na reakcję na toksyczny materiał. Dokładniej, u każdego zwierzęcia badano dwa razy w tygodniu następujące objawy: gorączkę, letarg, utratę wagi, zmiany w sposobie jedzenia oraz uszkodzenia, obrzmienia lub bolesność przy ucisku w miejscu iniekcji. Badano również węzły chłonne w pobliżu miejsca iniekcji na obrzmienie i/lub odwodnienie. Zwierzęta monitorowano dwa razy na tydzień przez kilka miesięcy.

171 489

Przy kład VI. Wykazanie wytwarzani a przeciwciał neutralizujących u szczepionych zwierząt

W celu oznaczenia skuteczności szczepionki pod względem wywoływania wytwarzania przeciwciał neutralizujących wirusa u szczepionych osobników, przeprowadzono badania szczepionki wytworzonej według przykładu 5 u szympansów. Szympansy szczepiono dawkami 5 pg/kg szczepionki sporządzonej sposobem opisanym w przykładzie 5 w czasie 6 miesięcy w odstępach 0, 1, 3 i 6 miesięcy. Kontrolnym szympansom podawano iniekcje porównywalnych ilości kompozycji składającej się ze wszystkich składników szczepionki za wyjątkiem peptydów wirusowych. Po dwu tygodniach od podania ostatniej dawki szczepionki, szympansom badanym i kontrolnym podawano dawkę 10 CIU50 (jednostka infekcyjna szympansia) inoculum osocza CDC/910. Zaczynając po tygodniu od zakażenia wirusowego u każdego z szymapnsów monitorowano co tydzień rozwój wiremii.

W celu wykrycia wiremii, co tydzień, przez kilka miesięcy pobierano od zwierząt kontrolnych i badanych próbki krwi i wycinki z biopsji wątroby. Tkankę uzyskiwaną z biopsji wątroby badano histologicznie na objawy martwicy i/lub zapalenia. Ponadto, hepatocyty z materiału biopsyjnego badano w mikroskopie elektronowym na obecność kanalików charakterystycznych dla zakażenia HCV. Próbki krwi analizowano także opisaną powyżej techniką ELISA na obecność przeciwciał przeciw tym segmentom polipeptydów wirusowych, które nie były wykorzystane przy sporządzaniu szczepionki. Przede wszystkim, każda próbka krwi była badana techniką ELISA na obecność przeciwciał przeciw peptydom NS3, NS4 i NS5. Obecność przeciwciał przeciw tym peptydom w surowicy szympansów wskazuje na zakażenie HCV.

Do wykrywania wirusowego RNA krążącego w osoczu albo obecnego w tkance z biopsji wątroby zebranej od szympansów, zastosowano opisany poniżej sposób. Zastosowanie enzymatycznej reakcji amplifikacji cPCR) do wykrywania RNA w wątrobie 1 w surowicy.

W analizie cPCR, przypuszczalny wirusowy RNA w próbce poddaje się odwrotnej transkrypcji do cDNA z udziałem odwrotnej transkryptazy; Odcinek uzyskanego cDNA amplifikuje się stosując zmodyfikowaną wersję techniki PCR opisaną przez Saiki i wsp. (1986). Primery do techniki cPCR pochodziły z RNA HCV, które można zidentyfikować za pomocą przytaczanej w niniejszym opisie rodziny cDNA HCV. Produkt po amplifikacji, odpowiadający RNA z HCV wykrywa się za pomocą sondy uzyskanej z rodziny cDNA HCV.

Stosowaną w niniejszych badaniach analizę cPCR/HCV prowadzono stosując następujące metody preparowania RNA, odwrotnej transkrypcji RNA do cDNA, amplifikacji pewnych segmentów cDNA techniką PCR 1 analizy produktów reakcji PCR:

RNA izoluje się z wątroby przez ekstrakcję stosując metodę z izotiocyjanianem guanidyniowym uzyskiwania całkowitego RNA, opisaną przez Maniatis’a i wsp. (1982).

W celu wyizolowania całkowitego RNA z osocza, osocze rozcieńcza się 5- do 10-krotnie odczynnikiem TeNB (0,1 M NaCl, 50 mM Tris-HCl (pH = 8,0), 1 mM EDTA) i prowadzi się inkubację w roztworze Proteinazy K/SDS (0,5% SDS, i mg/ml proteinazy K, 20 pg/ml nośnika Poły A) w czasie 60 - 90 minut w temperaturze 37°C. Próbki poddaje się ekstrakcji raz fenolem (pH = 6,5), otrzymaną fazę organiczną ekstrahuje się raz odczynnikiem TENB zawierającym 0,1% SDS, zbiera się fazy wodne z obydwu ekstrakcji i poddaje się je dwukrotnej ekstrakcji równymi objętościami mieszaniny fenolu/chloroformu/alkoholu izoamylowego [1:1 (99:1)]. Otrzymane fazy wodne poddaje się dwukrotnej ekstrakcji równymi objętościami mieszaniny chloroformu i alkoholu izoamylowego (99:1) 1 strąca się etanolem stosując 0,2 M octan sodowy (pH = 6,5) i 2,5 objętości 100% etanolu; precypitacja trwa dobę w temperaturze -20°C.

cDNA użyty jako matryca do enzymatycznej reakcji amplifikacji PCR preparuje się stosując próbki wyznaczone do preparowania odpowiednich sekwencji cDNA. Każdą próbkę RNA (zawierającą 2 pg denaturowego wysoką temperaturą RNA z wątroby szympansa albo RNA z 2 pl osocza) inkubuje się w 25 pl mieszaniny reakcyjnej zawierającej po i pmolu każdego primera, i pmolu każdego trójfosforanu dezoksyrybonukleotydu (dNTP), 50 milimoli Tris-HCl (pH = 8,3), 5 milimoli MgCk, 5 milimoli ditiotreitolu (DtT), 73 milimoli KCl, 40 jednostek inhibitora RNAzy (RNASIN) i 5 jednostek odwrotnej transkryptazy AMV. Inkubacja trwała przez 60 minut w temperaturze 37°C. Po wykonaniu syntezy cDNA, mieszaniny reakcyjne rozcieńczano za pomocą 50 pl dejonizowanej wody (DIW), utrzymywano we wrzeniu przez 10 minut 1 oziębiano w lodzie.

171 489

Amplifikację segmentu cDNA z HCV prowadzono z zastosowaniem dwóch syntetycznych oligomerycznych 16-merowych primerów, których sekwencje pochodziły z klonów cDNA HCV nr 36 (antysensowny) i nr 37b (sensowny).

Sekwencja primeru z klonu 36 była następująca'

5' GCA TGT CAT GAT GTA T 3'

Sekwencja primera z klonu 37B była następująca:

5' ACA ATA CGT GTG TCA C 3'.

Primery stosowano w końcowym stężeniu po 1 gmola każdy. W celu amplifikacji segmentu cDNA HCV, który jest flankowany przez primery, próbki cDNA inkubowano z 0,1 μg RNAzy A i z reagentami wchodzącymi w skład zestawu do reakcji PCR firmy Perkin Elmer Cetus (N801-0043 albo N801-0055), postępując według instrukcji producenta..

Reakcje PCR prowadzono w 30 lub 60 cyklach w aparaturze Perkin Elmer Cetus DNA thermal cycler. Każdy cykl składał się z 1 minuty etapu denaturacji w temperaturze 94°C, minut etapu przyłączania (annealing) w temperaturze 37°C i z 3 minut etapu wydłużania w temperaturze 72°C. W ostatnim cyklu (30 albo 60) etap wydłużania prowadzi się przez 7 minut a nie 3 minuty. Po amplifikacji, prowadzi się ekstrakcję próbek równą objętością mieszaniny fenolu i chloroformu (1:1) następnie równą objętością chloroformu, po czym próbki strąca się etanolem zawierającym 0,2 M octanu sodowego.

Produkty reakcji PCR analizuje się następująco:

Produkty te poddaje się elektroforezie w 1,8% alkalicznych żelach agarozowych metodą Murakawa i wsp. (1988) i przenosi się na filtry sondy ZETA ^K (BioRad Corp.) przez utrzymywanie nałożonej bibuły na żelach przez dobę w 0,4 M NaOH. Plamy neutralizuje się w 2 x SSC (1 x SSC zawiera 0,15 M NaCl, 0,015 M cytrynian sodowy), prehydrydyzuje się w roztworze zawierającym 0,3 M NaCl, 15 mM buforu fosforanu sodowego (pH = 6,8), 15 mMEDTA, 1,0% SDS, 0,5% beztłuszczowego mleka (Cornation Co.) i 0,5 mg/ml dena,urowego ultradźwiękami DNA ze spermy łososia. Filtry przeznaczone do analizy na obecność fragmentów cDNA HCV hybrydyzuje się z sondą znakowaną ³²P, uzyskaną przez translację z przemieszczaniem pęknięć (translację typu nick) sekwencji insertu cDNA z HCV w klonie 35 opisaną w zgłoszeniu patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 07/456 637. Po hybrydyzacji filtry przemywa się w 0,1 x SSC (1 x SSC zawiera 0,15 M NaCl i 0,01 M cytrynianu sodowego) w temperaturze 65°C, suszy się i poddaje autoradiografii. Przypuszczalna wielkość produktu to 586 nukleotydów długości: produkty, które hybrydyzują z sondą i migrują w żelach w tym zakresie wielkości zbiera się jako pozytywne dla wirusowego RNA.

W próbach kontrolnych, prowadzi się reakcje z primerami cPCR tak zaprojektowanymi, aby amplifikowały mRNA α-1 anty-trypsyny dla zweryfikowania obecności RNA w każdej analizowanej próbce. Region kodujący genu a-1 anty-trypsyny jest opisany przez Rosenberga i wsp. (1984). Syntetyczne oligomeryczne 16-merowe primery zaprojektowane do amplifikacji fragmentu nukleotydowego 365 z regionu kodującego genu a-1 anty-trypsyny pochodziły z nukleotydów 22-37 (sensownych) i nukleotydów 372-387 (antysensownych). Produkty reakcji PCR wykrywano za pomocą sondy znakowanej 32p otrzymanej przez translację z przemieszczaniem pęknięć (typu nick) leżącej pomiędzy sekwencjami primera cDNA/PCR ale nie obejmującej tych sekwencji.

Z powodu wyjątkowej czułości reakcyjnej PCR, wszystkie próby prowadzono co najmniej trzy razy. Odrzucano wszystkie fałszywe sygnały pozytywne przy przestrzeganiu następujących środków ostrożności: 1) wyeliminowano aerozole, stosowano jedynie probówki z nakrętkami, z gumowymi pierścieniami samouszczelniającymi; 2) pipetowano w urządzeniach do napełniania pipet Ranin MICROMAN^r z pipetami wyporowymi, z regulowanymi tłokami/kapilarami; 3) wybierano sekwencje oligonukleotydowe do cDNA i primerów reakcji PCR z dwu nie-sąsiadujących ze sobą klonów cDNA.

Zastosowanie przemysłowe

Immunoreaktywne kompozycje otrzymywane sposobem według wynalazku mają zastosowanie do przygotowywania materiałów takich jak na przykład szczepionki, które z kolei mogą być używane do ochrony przed zakażeniem HCV, zwłaszcza przed przewlekłymi infekcjami HCV. Ponadto, kompozycje te mogą być stosowane do materiałów służących do wykrywania

171 489 wielu różnych wariantów HCV w próbkach biologicznych. Immunoreaktywne kompozycje mogą być stosowane do wytwarzania kompozycji przewciwciał poliklonalnych rozpoznających więcej niż jeden izolat HCV albo jako antygeny w próbach immunologicznych na wykrywanie przeciwciał anty-HCV. Ten ostatni sposób może być użyty do skriningu produktów krwi na możliwe skażenie wirusem HCV. Poliklonalne antysurowice albo przeciwciała mogą być stosowane do immunizacji biernej.

171 489

CO rf rf Z a Pi Pi

ΙΛ

CO co rf csi

O O rf 2 S W •N g W u P P rf O ISJ CM •μ· co

CM

IO co co rf rf

CC N rf rf « W m e· p p w £ ffi CM

o

CM

CO

F3 co

UJ

CM

1^-.

O.

Ο»

CO co.

cx

Ο» σ>.

W
a	>1
p	a
rf	H
N	W
O	Eh
N	O
ω	Pi	H
P	CM	«
CM	O	N
tH	«	U
N	H	9
Pi	p	A
CM	o	O

to O >< W Pi rf W o w rf m a w 2 p z w

u o rf*« .n p rf*rf H >4 5 »

lO	Ό rf ρ rf w CQ HI
	0	rf
	«Λ	H
	O	ó
>H		«
a	p	a
K	w	P
o	H	fo

171 489

192 YQVRNSTGLYHVTNDCPNSSIVYEAADAILHTPGCVPC

I

I co

I

H

I

H i

CO i

t

I I I t I I I I I I I I

CO CO CO CO i » H i

I

I I I I » i 4! i I I I I * 2 S z 33

I I I I * J

I I I I I I I I I I < i * co co co co

I I I I I I I I I I I I I I

Η Η Η H I I I I

Ul CO Ol * > > > > I I I I i » i a * w w w w >5» CU

I

X

I

I » I I I I I I I I

I I I I I I I I I I I I

I I I I

233 2SS saaa

I I I I

I I I I I I I I * > > > >

I I I I

U J 45 u

I I I I σι Cu oi co

I I I I

Q Ul 55 · >>

* CO CO CO CO

I I I I I I ¹ < • I

I t I I I* I I I I I I I I I I I I I I

I I I

CO CO CO

I I I

I I I I I I I I rH

Figura. 2QQQD > > t i > > > J

I I I I

W W W >

• >« i

I I I i i i I I I I I I I I o

m

CN

O σ\ ci

H 00	ił £* rH	rC Ί* 6	H 00	n c· h	H b	H 00 C*ł C r-ł	rH n· ho Ej
i H ee.	(Nfsb 3 e e ύ	Ó Β B a	• H BBa	CN d e e ύ	ύ Β B «	• r-ł N Cl b	ó Β B a
a a E	« a a a	a a a a	a a h	a a a	a a a a	33 33 M 33 33 5S	a a a a

HCV-1 350

HCT18

Th

HCT23

HCT27

HC-J1

HC-J4 HCV-J HCV J1 BK

GAHViGVLAGIAYFSMVGNWAKVLWLLLFAGVDA * * t *

.........L--Y........I-A..........

.........L--Y........I-M..........

.........L--Y--A.....I-M..........

00(30

Figuro, 2-2

171 489

Porównawcza sekwencja aminokwasowa przypuszczalnego rejonu E2/NS1 izolatów HCV

E-ι I I moi ci

OKO oi oioi oi m Si

Η Η H H H H H i i i « « « «

I I I I I oi < m m m m

Ol I I I Ol I CU

I I I I I o ' · o ' m

P c? S9 ⁰³ £? 2

Dc Cc ta i Cc bj b, SC * £ I I I I I I I

4 i < ' F ¹hhJJLI J J i i i F W P S cg o 2 i m > > « i 2 i cg · M < 2 co *4 2 I I >OQ O< ot> *<

o ro h r- h i M

OT OT « ·

H £ I 04 I I I I

I < K X Q

I o o o o >

lilii I Η H I-I H

I I I I

H <· b b b · H ___P-OTKUUbK^

XXXXXPiXXKb«

OT OT OT OT OT fc Oi Q W Q Οι Oi O< OT W fc ΟΊΒ Pfl ^{1 1}

5C i E i i E-* H Eh EOS Ot · 2

2 · ·

I I I I

W S4 t4 OOQQ Η Η H I-I OT Ε-»

S fc 33 S l-l

OT ·

M OT U 2

OT fc fc

O ·

OT J iJ O! « 14 Q fc fc fc fc fc D Q

I-I I l OT i i p o ω w

I I I I I I

Oi Oi · OT

I I I I

OP 2 H

I I I I I I I I I I I I

2 2 2

I I I I Η I Oi Cu Οι Oi I I I I

I I I I w σσσ

I I I

I

Oi Oi •4 J i4

W 01

I I

Q ł I I ł fc Oi

I I I |

I I ' > I |

0< Ol Oi o

OT OT

OOM ‘ OT OT

OO Oi Oi Oi Oi

I I I 2 2 2 o

ro *

* *

*

O

OT rir« h ri<fb • rs ω b b · h > h ? O i i > i 6 U 6 Γ* OT 2 U U G K 14 KKKKK^KKKbK l-l C*· rl I Μ M δδδ>°χ:όύδκ«

KKKKKHWKWbffl

Figura, 3171 489

550 FGCTWMNSTGFTKVCGAPPCVIGGAGNNTLHCPTDCFRKHPDATYSRCGSGPWITPRCLV

WWW

O>>< W Di co w

M 03 i I

WWW

WWW i I i i ι i I 1

CS i

>>>

t I

S5 »S5

I I ι i i i I I I I I I o

rH >>>

WWW i i i > > > I I I I

Figura

171 489

670 ^OWQVLPCSFTTLPALSTGLIHIHQNIVDVQYLYGVGSS IASWAIKWEYWLLFLLLADA > H OJ

I

I >4

H

I

CM

I

<	I	>4 >
H	1	u ·
1	1	w ·
1	1	U 1
W	w	> H
1	1	Oi >

o m

Ρ» o* o

Η Ί< t-j b) · I I ___r> m .c u u δ i !»;

κκκκκηκκκο®

H r- rl <N M

ΠίΠΠΗΛ

H l3 Ό bój'

I i > P* I

SSKKKEKKKSbffl o

cn r* rl> H»f *3b i oj b b I ' H έδχίύύέέκ

KKESSKKb

171 489

WSPÓŁCZYNNIK ANTYGENOWOSCI WSPÓŁCZYNNIK ANTYGENOWOSCI

I I I I

390 400 410 420

NUMER AMINOKWASU

171 489

PROCENT PRAWDOPODOBIEŃSTWA WYSTĘPOWANIA PODANEJ STRUKTURY

384 390 400 410 420

100 βskręt

FIG. 5

T i

384

G i

390

400

G Q L NINGSW 410 420

NUMERY AMINOKWASÓW

171 489

Μ

Η < « W Ο H

« Ο

W CM

Η © ~ Cń

Λ ,-’

CO 5 < ο τ··

CO ο >1

EH m ρμ λ

Ο °

-υ

-ω ο g ®^Χ ω

α 2 Μ J X

Ο > ΣΖ- 2 * Ο»

CU ο CU < X Cu ο X $->

Η

Ο

Ε¹ £-<

X ο

<

S ⁵³$-ϋ ο ω Ε® Ł τ- Ε-¹Η W Ο X ττττττττ-ΓΠ-ΓΠΤ

Cu X X > > > Η Η Η H

O O O OO E-t Eh f-t £» Η E-*

SSJSSSSS

Ε-’Ε-’Ε-’Ε-’Ε-^Ε-^Ε-’Ε-* χχχχχχχχ

OOOOOOOO ^4 ^4 ^4 ^4 ^4 ^4 zzzzzzzz o o o o o o o o o o o o o w w w w w Η Ε-Έ-· E>1 >-· >·

E-· E· ω

Αχ

Euk

NSk

Η H J X X X > s o 1« > > > > & ;ś stż ΟΟΟΟ Χ,Χ « χ cu cu cu cu σσ x x χ

01 04 04 oooo o o o (U (U X X X X <3 < <3 <3 <3 Cu (U Du fU Cu CU Cu

UJ >

X <

<&

o sZ

171 489

Ο w

ο ο

CM

ΙΛ

Ιβ ·»— β

Ν <

,- οω , >.HO

I— +ι w W

Ο aa τ °

-*· (U

Ό -ΗΙΛ χη Χ»Ο ΟΌ μ μ Μ Ch_ σ Α ο ?ο co

Ε

H ►4 σ

Ο Η σ

&

ο σ

%

X

Ο W

Η

Ο w < ϋ X < < ο ω $-ϋ ” ο

Ε >

Ε

W χ:

Η

CD m~rn~rrfh~i 111111111 r

	Ε-»
	g 3
	H H H
W	WWW
oo	Ol GO'
Η Η H	h-i H u
2 22 2	2 2 2
αασαα	ααο

χ χ pa tk χ χ χ χ rfj rtj rtj rt, ^3 ^3 rtj

00000000 σαοοοοοα 5522222222 ΧΧΧΧΧΧΧΧΧ WWWWWWWWW

HHHHHHHHH 000000000

000000000

ΧΧΧΧΧΧΧΧΧ <J < < < -£<<«$< <3<3<<3<<1<<< wwwwwwww 0000000 000000 EEEEE > > > >

Η H E

E H

W ffl <D d

E

1X1 >

I

171 489

°.+. CM

ΙΛ

LL sz

Η w

tSJ w

o

Π3 ci N

U _ >irfO P w ·

O P w

Ό „'Λ Ό3 Φ · 0 M® +J A 03 Ό αχ MO O Łq

Πί-ι mr i l~hT

Dzn

°. 4CM oo

H

O

I nJ

C

N

A WrftH O p

W

Ό

Ό3 0)0 O -H A A 03 A—. <D> M . O OO n~n 1111 ΓΤτί >

JJ α

O u ΣΣ- M

O*

W <

O

CU

X

JJ o w O-H

EW >

X

O o»

8-g « §

Eh >

PS

-3 E-t δ “

X o αα > >> o o o o oo £h Eh Eh >>> PS PS PS EH Eh X

Eh JJ Jl

Eh Eh Eh W W W W

Eh Eh Eh Eh Eh >>>>>> HM Μ Μ »T« Hrt KK >-M t-M HH

0000000 ασσοοσ >>>>>

o o o o

000

Eh Eh >

X X X

JJ JJ WWWM Eh Eh Eh E· JJ JJ JJ M Eh Eh Eh Eh «WWW Eh Eh E· >>

X

>> Jl Jl JJ σσσσ

H H H Η H X X X X X X σοοσοσο wwwwwwww rfj rfj rfj rfj 000000 CU CU CU CU P4

X xxxx X X X X JJ JJ JJ w w

Eh

O co d

UL

171 489

Jl.l 384 HTR\/TGGVQGHVTSTLTSLFRPGASQKIQL\/NTNGSWHINRTALNCNDSLQTGFL|AALFY

I

Figura

	XJ»	*
<·	o	10	<N
	m	in	*0

	CN	rH	CN	H	CN	H	CN
•	•	•	•	•	•	•	•
	r4	rM			H	rH	r-ł
b	b		b	b	b		b

δδ δδ

171 489

E2HV

Figura 8171 489

Met 1

Ser

Thr

Aen

Pro 5

Lya

Pro

Gin

Lys

Lye 10

Asn

Lye

Arg

Asn

Thr 15

Asn

Arg

Pro

Gin 20

Aap

Val

Lys

Phe

Pro 25

Gly

Gin

Ile 30

Val

Gly

Val

Tyr 35

Leu

Pro

Arg

Arg 40

Gly

Pro

Arg

Leu

Gly 45

Val

Arg

Ala

Thr

Arg 50

Lys

Thr

Ser

Glu

Arg 55

Ser

Gin

Pro

Arg

Gly 60

Arg

Gin

Pro

Ile 65

Pro

Lye

Ala

Arg

Arg 70

Pro

Glu

Gly

Arg

Thr 75

Trp

Ala

Gin

Pro

Gly 80

Tyr

Pro

Trp

Pro

Leu 85

Tyr

Gly

Aen

Glu

Gly 90

Cya

Gly

Trp

Ala

Gly 95

Trp

Leu

Ser

Pro 100

Arg

Gly

Ser

Arg

Pro 105

Ser

Trp

Gly

Pro

Thr 110

Aep

Pro

Arg

Arg 115

Ser

Arg

Aen

Leu

Gly 120

Lys

Val

Ile

Aep

Thr 125

Leu

Thr

Cys

Gly

Phe 130

Ala

Aep

Leu

Met

Gly 135

Tyr

Ile

Pro

Leu

Val 140

Gly

Ala

Pro

Leu

Gly 145

Gly

Ala

Arg

Ala 150

Leu

Ala

Hie

Gly

Val 155

Arg

Val

Leu

Glu

Aep 160

Gly

Val

Aon

Tyr

Ala 165

Thr

Gly

Aen

Leu

Pro 170

Gly

Cya

Ser

Phe

Ser 175

Ile

FIGURA 9-1

171 489

Phe

Leu

Ala 180

Leu

Ser

Cys

Leu 185

Thr

Val

Pro

Ala

Ser 190

Ala

Tyr

Gin

Val

Arg 195

Aen

Ser

Thr

Gly

Leu 200

Tyr

Hle

Val

Thr

Aen 205

Aep

Cya

Pro

Aen

Ser 210

Ser

Ile

Val

Tyr

Glu 215

Ala

Aep

Ala

Ile 220

Leu

Hle

Thr

Pro

Gly 225

Cye

Val

Pro

Cys

Val 230

Arg

Glu

Gly

Aen

Ala 235

Ser

Arg

Cye

Trp

Val 240

Ala

Met

Thr

Pro

Thr 245

Val

Ala

Thr

Arg

Aep 250

Gly

Lye

Leu

Pro

Ala 255

Thr

Gin

Leu

Arg

Arg 260

Hle

Ile

Aep

Leu

Leu 265

Val

Gly

Ser

Ala

Thr 270

Leu

Cye

Ser

Ala

Leu 275

Tyr

Val

Gly

Aep

Leu 280

Cye

Gly

Ser

Val

Phe 285

Leu

Val

Gly

Gin

Leu 290

Phe

Thr

Phe

Ser

Pro 295

Arg

Hle

Trp

Thr 300

Thr

Gin

Gly

Cys

Asn 305

Cys

Ser

Ile

Tyr

Pro 310

Gly

Hle

Ile

Thr

Gly 315

Hle

Arg

Met

Ala

Trp 320

Aep

Met

Aen 325

Trp

Ser

Pro

Thr

Thr 330

Ala

Leu

Val

Met

Ala 335

Gin

Leu

Arg

Ile

Pro

Gin

Ala

Ile

Leu

Aep

Met

Ile

Ala

Gly

Ala

Hle

340 345 350

FIGURA 9-2

171 489

Trp

Gly

Val 355

Leu

Ala

Gly

Ile

Ala 360

Tyr

Phe

Ser

Met

Val 365

Gly

Aen

Trp

Ala

Lye 370

Val

Leu

Val

Leu 375

Leu

Phe

Ala

Gly 380

Val

Aep

Ala

Glu

Thr 385

His

Val

Thr

Gly

Gly 390

Ser

Ala

Gly

Hie

Thr 395

Val

Ser

Gly

Phe

Val 400

Ser

Leu

Ala

Pro 405

Gly

Ala

Lye

Gin

Aen 410

Val

Gin

Leu

Ile

Aen 415

Thr

Aen

Gly

Ser

Trp 420

Hie

Leu

Aen

Ser

Thr 425

Ala

Leu

Aen

Cye

Aen 430

Ser

Leu

Aen

Thr 435

Gly

Trp

Leu

Ala

Gly 440

Leu

Phe

Tyr

Hie

His 445

Lye

Phe

Aen

Ser

Ser 450

Gly

Cye

Pro

Glu

Arg 455

Leu

Ala

Ser

Cye

Arg 460

Pro

Leu

Thr

Aep

Phe 465

Aep

Gin

Gly

Trp

Gly 470

Pro

Ile

Ser

Tyr

Ala 475

Aen

Gly

Ser

Gly

Pro 480

Aep

Gin

Arg

Pro

Tyr 485

Cye

Trp

Hie

Tyr

Pro 490

Pro

Lye

Pro

Cye

Gly 495

Ile

Val

Pro

Ala

Lye 500

Ser

Val

Cye

Gly

Pro 505

Val

Tyr

Cye

Phe

Thr 510

Pro

Ser

Pro

Val

Gly

Thr

Aep

Arg

Ser

Gly

Ala

Pro

Thr

Tyr

Ser

515 520 525

FIGURA 9-3

Trp

Gly 530

Glu

Aen

Aep

Thr

Aep 535

Val

Phe

Val

Leu

Aen 540

Asn

Thr

Arg

Pro

Pro 545

Leu

Gly

Asn

Trp

Phe 550

Gly

Cye

Thr

Trp

Met 555

Aen

Ser

Thr

Gly

Phe 560

Thr

Lye

Val

Cys

Gly 565

Ala

Pro

Cys

Val 570

Ile

Gly

Ala

Gly 575

Asn

Aen

Thr

Leu

Hie 580

Cye

Pro

Thr

Aep

Cye 585

Phe

Arg

Lye

Hie

Pro 590

Asp

Ala

Thr

Tyr

Ser 595

Arg

Cye

Gly

Ser

Gly 600

Pro

Trp

Ile

Thr

Pro 605

Arg

Cye

Leu

Val

Asp 610

Tyr

Pro

Tyr

Arg

Leu 615

Trp

His

Tyr

Pro

Cye 620

Thr

Ile

Asn

Tyr

Thr 625

Ile

Phe

Lye

Ile

Arg 630

Met

Tyr

Val

Gly

Gly 635

Val

Glu

Hie

Arg

Leu 640

Glu

Ala

Cye

Aen 645

Trp

Thr

Arg

Gly

Glu 650

Arg

Cye

Aep

Leu

Glu 655

Asp

Arg

Aep

Arg

Ser 660

Glu

Leu

Ser

Pro

Leu 665

Leu

Thr

Thr 670

Gin

Trp

Gin

Val

Leu 675

Pro

Cye

Ser

Phe

Thr 680

Thr

Leu

Pro

Ala

Leu 685

Ser

Thr

Gly

Leu

Ile

Hie

Leu

Hie

Gin

Aen

Ile

Val

Aep

Val

Gin

Tyr

Leu

Tyr

Gly

690 695 700

FIGURA 9-4

171 489

Val 705

Gly

Ser

Ile

Ala 710

Ser

Trp

Ala

Ile

Lye 715

Trp

Glu

Tyr

Val

Val 720

Leu

Phe

Leu

Leu 725

Leu

Ala

Aep

Ala

Arg 730

Val

Cye

Ser

Cys

Leu 735

Trp

Met

Leu

Leu 740

Ile

Ser

Gin

Ala

Glu 745

Ala

Leu

Glu

Aen 750

Leu

Val

Ile

Leu

Asn 755

Ala

S@r

Leu

Ala 760

Gly

Thr

Hie

Gly

Leu 765

Val

Ser

Phe

Leu

Val 770

Phe

Cye

Phe

Ala 775

Trp

Tyr

Leu

Lye

Gly 780

Lye

Trp

Val

Pro

Gly 785

Ala

Val

Tyr

Thr

Phe 790

Tyr

Gly

Met

Trp

Pro 795

Leu

Leu 800

Leu

Ala

Leu

Pro

Gin 805

Arg

Ala

Tyr

Ala

Leu 810

Aep

Thr

Glu

Val

Ala 815

Ala

Ser

Cys

Gly

Gly 820

Val

Leu

Val

Gly 825

Leu

Met

Ala

Leu

Thr 830

Leu

Ser

Pro

Tyr

Tyr 835

Lye

Arg

Tyr

Ile

Ser 840

Trp

Cys

Leu

Trp

Trp 845

Leu

Gin

Tyr

Phe

Leu 850

Thr

Arg

Val

Glu

Ala 855

Gin

Leu

His

Val

Trp 860

Ile

Pro

Leu

Asn

Val

Arg

Gly

Arg

Aep

Ala

Val

Ile

Leu

Met

Cye

Ala

Val

865

870

875

880

FIGURA. 9-5

171 489

His Pro	Thr Leu Val 885	Phe Aep Ile	Thr	Lye Leu Leu Leu Ala Val Phe
890	895
Gly Pro	Leu Trp Ile 900	Leu Gin Ala	Ser 905	Leu	Leu Lye Val Pro Tyr Phe 910
Val Arg	Val Gin Gly 915	Leu Leu Arg 920	Phe	Cys	Ala Leu Ala Arg Lye Met 925
Ile Gly Gly His Tyr 930	Val Gin Met 935	Val	Ile	Ile Lye Leu Gly Ala Leu 940
Thr Gly 945	Thr Tyr Val	Tyr Aen Hie 950	Leu	Thr	Pro Leu Arg Aep Trp Ala 955 960
His Asn	Gly Leu Arg 965	Aep Leu Ala	Val	Ala 970	Val Glu Pro Val Val Phe 975
Ser Gin	Met Glu Thr 980	Lye Leu Ile	Thr 985	Trp	Gly Ala Aep Thr Ala Ala 990
Cys Gly	Aep Ile Ile 995	Aen Gly Leu Pro 1000	Val	Ser Ala Arg Arg Gly Arg 1005
Glu Ile Leu Leu Gly 1010	Pro Ala Aep 1015	Gly	Met	Val Ser Lye Gly Trp Arg 1020
Leu Leu 1025	Ala Pro Ile	Thr Ala Tyr 1030	Ala	Gin	Gin Thr Arg Gly Leu Leu 1035 1040
Gly Cye	Ile Ile Thr Ser Leu Thr 1045	Gly	Arg Aep Lye Aen Gin Val Olu 1050 1055

FIGURA 9-6

171 489

Gly	Glu Val	Gin Ile 1060	Val Ser	Thr Ala Ala Gin Thr Phe Leu Ala Thr
1065	1070
Cya	Ile Aen Gly Val 1075	Cya Trp	Thr Val Tyr Hia Gly 1080	Ala Gly Thr Arg 1085
Thr	Ile Ala 1090	Ser Pro	Lya Gly Pro Val Ile Gin Met Tyr Thr Aen Val 1095 1100
Aap Gin Aap 1105	Leu Val	Gly Trp 1110	Pro Ala Pro Gin Gly 1115	Ser Arg Ser Leu 1120
Thr	Pro Cya	Thr Cya Gly Ser 1125	Ser Aap Leu Tyr Leu 1130	Val Thr Arg Hia 1135
Ala	Aap Val	Ile Pro 1140	Val Arg	Arg Arg Gly Aap Ser 1145	Arg Gly Ser Leu 1150
Leu	Ser Pro Arg Pro 1155	Ile Ser	Tyr Leu Lya Gly Ser 1160	Ser Gly Gly Pro 1165
Leu	Leu Cys 1170	Pro Ala	Gly His Ala Val Gly Ile Phe Arg Ala Ala Val 1175 1180
Cya Thr Arg 1185	Gly Val	Ala Lya 1190	Ala Val Aap Phe Ile 1195	Pro Val Glu Aan 1200
Leu	Glu Thr	Thr Met Arg Ser 1205	Pro Val Phe Thr Aap 1210	Aan Ser Ser Pro 1215
Pro	Val Val	Pro Gin 1220	Ser Phe	Gin Val Ala Hia Leu 1225	Hia Ala Pro Thr 1230

FIGURA 9-7

171 489

Gly Ser	Gly Lye Ser Thr Lye Val Pro Ala Ala Tyr Ala Ala Gin Gly
1235	1240	1245
Tyr Lye	Val Leu Val Leu	Aen Pro Ser Val	Ala Ala Thr Leu Gly Phe
1250	1255	1260
Gly Ala	Tyr Met Ser Lye	Ala Mis Gly Ile	Aep Pro Aen Ile Arg Thr
1265	1270	1275 1280
Gly Val	Arg Thr Ile Thr	Thr Gly Ser Pro	Ile Thr Tyr Ser Thr Tyr
	1285	1290 1295
Gly Lye	Phe Leu Ala Aep Gly Gly Cye Ser	Gly Gly Ala Tyr Aep Ile
	1300	1305	1310
Ile Ile	Cye Aep Glu Cye	Hie Ser Thr Aep	Ala Thr Ser Ile Leu Gly
	1315	1320	1325
Ile Gly	Thr Val Leu Aep	Gin Ala Glu Thr	Ala Gly Ala Arg Leu Val
1330	1335	1340
Val Leu	Ala Thr Ala Thr	Pro Pro Gly Ser	Val Thr Val Pro Hie Pro
1345	1350	1355 1360
Aen Ile	Glu Glu Val Ala	Leu Ser Thr Thr	Gly Glu Ile Pro Phe Tyr
	1365	1370 1375
Gly Lye	Ala Ile Pro Leu	Glu Val Ile Lye Gly Gly Arg Hie Leu Ile
	1380	1385	1390
Phe Cya	Hie Ser Lye Lye	Lye Cye Aep Glu	Leu Ala Ala Lye Leu Val

1395 1400 1405

FIGURA 9-8

171 489

Ala Leu Gly 1410	Ile Aen Ala Val Ala Tyr Tyr Arg Gly Leu Asp Val Ser
1415	1420
Val Ile Pro 1425	Thr Ser Gly Aep Val 1430	Val Val Val Ala Thr Asp Ala Leu 1435 1440
Met Thr Gly	Tyr Thr Gly Aep Phe 1445	Aep Ser Val Ile Aep Cys Asn Thr 1450 1455
Cys Val Thr	Gln Thr Val Asp Phe 1460	Ser Leu Aep Pro Thr Phe Thr Ile 1465 1470
Glu Thr Ile Thr Leu Pro Gln Asp Ala Val Ser Arg Thr Gln Arg Arg 1475 1480 1485
Gly Arg Thr 1490	Gly Arg Gly Lye Pro 1495	Gly Ile Tyr Arg Phe Val Ala Pro 1500
Gly Glu Arg 1505	Pro Ser Gly Met Phe 1510	Aep Ser Ser Val Leu Cye Glu Cye 1515 1520
Tyr Aep Ala	Gly Cye Ala Trp Tyr 1525	Glu Leu Thr Pro Ala Glu Thr Thr 1530 1535
Val Arg Leu	Arg Ala Tyr Met Asn 1540	Thr Pro Gly Leu Pro Val Cye Gln 1545 1550
Asp His Leu Glu Phe Trp Glu Gly Val Phe Thr Gly Leu Thr His Ile 1555 1560 1565
Aep Ala His 1570	Phe Leu Ser Gln Thr 1575	Lye Gln Ser Gly Glu Asn Leu Pro 1580

FIGURA 9-9

171 489

Tyr 1585	Leu Val Ala Tyr	Gin Ala 1590	Thr Val	Cye	Ala Arg Ala Gin Ala Pro
	1595	1600
Pro	Pro Ser Trp Aep 1605	Gin Met	Trp Lye	Cye Leu Ile Arg Leu 1610	Lye Pro 1615
Thr	Leu Hle Gly Pro 1620	Thr Pro	Leu Leu Tyr 1625	Arg Leu Gly Ala Val Gin 1630
Asn	Glu Ile Thr Leu 1635	Thr Hle	Pro Val 1640	Thr	Lye Tyr Ile Met 1645	Thr Cye
Met	Ser Ala Aep Leu 1650	Glu Val Val Thr 1655	Ser	Thr Trp Val Leu 1660	Val Gly
Gly Val Leu Ala Ala 1665	Leu Ala 1670	Ala Tyr	Cye	Leu Ser Thr Gly 1675	Cye Val 1680
Val	Ile Val Gly Arg Val Val 1685	Leu Ser	Gly Lys Pro Ala Ile 1690	Ile Pro 1695
Asp	Arg Glu Val Leu 1700	Tyr Arg	Glu Phe Aep 1705	Glu Met Glu Glu Cye Ser 1710
Gin	Hle Leu Pro Tyr 1715	Ile Glu	Gin Gly 1720	Met	Met Leu Ala Glu 1725	Gin Phe
Lye	Gin Lye Ala Leu 1730	Gly Leu Leu Gin 1735	Thr	Ala Ser Arg Gin 1740	Ala Glu
Val Ile Ala Pro Ala 1745	Val Gin 1750	Thr Aen	Trp	Gin Lye Leu Glu 1755	Thr Phe 1760

FIGURA 9-10

Trp	Ala Lys His Met Trp Aen Phe Ile Ser Gly Ile Gin Tyr Leu Ala
1765	1770	1775
Gly	Leu Ser Thr Leu Pro 1780	Gly Aan Pro Ala Ile Ala Ser 1785	Leu Met Ala 1790
Phe	Thr Ala Ala Val Thr 1795	Ser Pro Leu Thr Thr Ser Gin Thr Leu Leu 1800 1805
Phe	Aan Ile Leu Gly Gly 1810	Trp Val Ala Ala Gin Leu Ala 1815 1820	Ala Pro Gly
Ala Ala Thr Ala Phe Val Gly Ala Gly Lau Ala Gly Ala 1825 1830 1835	Ala Ile Gly 1840
Ser	Val Gly Leu Gly Lya 1845	Val Leu Ile Aap Ile Leu Ala 1850	Gly Tyr Gly 1855
Ala	Gly Val Ala Gly Ala 1860	Leu Val Ala Phe Lya Ile Met 1865	Ser Gly Glu 1870
Val	Pro Ser Thr Glu Aap 1875	Leu Val Aan Leu Leu Pro Ala Ile Leu Ser 1880 1885
Pro	Gly Ala Leu Val Val 1890	Gly Val Val Cya Ala Ala Ile 1895 1900	Leu Arg Arg
His Val Gly Pro Gly Glu Gly Ala Val Gin Trp Met Aen 1905 1910 1915	Arg Leu Ile 1920
Ala	Phe Ala Ser Arg Gly Aan Hie Val Ser Pro Thr Hia	Tyr Val Pro

1925 1930 1935

FIGURA, 9-11

Glu	Ser	Aep Ala Ala Ala Arg 1940	Val Thr Ala Ile Leu Ser Ser Leu Thr
1945	1950
Val	Thr	Gin Leu Leu Arg Arg 1955	Leu Hie Gin Trp Ile 1960	Ser Ser Glu Cye 1965
Thr	Thr Pro Cye Ser Gly Ser Trp Leu Arg Aep Ile Trp Aep Trp Ile 1970 1975 1980
Cys Glu 1985	Val Leu Ser Aep Phe 1990	Lye Thr Trp Leu Lye 1995	Ala Lye Leu Met 2000
Pro	Gin	Leu Pro Gly Ile Pro 2005	Phe Val Ser Cye Gin 2010	Arg Gly Tyr Lye 2015
Gly	Val	Trp Arg Val Aep Gly 2020	Ile Met His Thr Arg 2025	Cye Hie Cye Gly 2030
Ala	Glu	Ile Thr Gly Hie Val 2035	Lye Aen Gly Thr Met 2040	Arg Ile Val Gly 2045
Pro	Arg Thr Cye Arg Aen Met Trp Ser Gly Thr Phe Pro Ile Aen Ala 2050 2055 2060
Tyr Thr 2065	Thr Gly Pro Cye Thr 2070	Pro Leu Pro Ala Pro 2075	Aen Tyr Thr Phe 2080
Ala	Leu	Trp Arg Val Ser Ala 2085	Glu Glu Tyr Val Glu 2090	Ile Arg Gin Val 2095
Gly Aep	Phe Hie Tyr Val Thr	Gly Met Thr Thr Aep	Aen Leu Lye Cye

2100 2105 2110

FIGURA 9-12

171 489

Pro	Cye Gin Val 2115	Pro Ser Pro Glu Phe Phe Thr Glu Leu Asp Gly Val
2120	2125
Arg	Leu Hie Arg 2130	Phe Ala Pro Pro Cye 2135	Lye Pro Leu Leu Arg Glu Glu 2140
Val Ser Phe Arg 2145	Val Gly Leu Hie Glu 2150	Tyr Pro Val Gly Ser Gin Leu 2155 2160
Pro	Cye Glu Pro	Glu Pro Aep Val Ala 2165	Val Leu Thr Ser Ket Leu Thr 2170 2175
Aep	Pro Ser Hie Ile Thr Ala Glu Ala Ala Gly Arg Arg Leu Ala Arg 2180 2185 2190
Gly	Ser Pro Pro 2195	Ser Val Ala Ser Ser 2200	Ser Ala Ser Gin Leu Ser Ala 2205
Pro	Ser Leu Lye 2210	Ala Thr Cye Thr Ala 2215	Aen His Aep Ser' Pro Aep Ala 2220
Glu Leu Ile Glu 2225	Ala Aen Leu Leu Trp 2230	Arg Gin Glu Met Gly Gly Aen 2235 2240
Ile	Thr Arg Val	Glu Ser Glu Aen Lye 2245	Val Val Ile Leu Aep Ser Phe 2250 2255
Aep	Pro Leu Val Ala Glu Glu Aep Glu Arg Glu Ile Ser Val Pro Ala 2260 2265 2270
Glu	Ile Leu Arg Lye Ser Arg Arg Phe 2275 2280	Ala Gin Ala Leu Pro Val Trp 2285

FIGURA 9-13

171 489

Ala Arg Pro 2290	Aep Tyr Aen Pro Pro Leu Val Glu Thr Trp Lye Lye Pro
2295	2300
Asp Tyr Glu 2305	Pro Pro Val Val Hle 2310	Gly Cye Pro Leu Pro Pro Pro Lye 2315 2320
Ser Pro Pro	Val Pro Pro Pro Arg 2325	Lye Lye Arg Thr Val Val Leu Thr 2330 2335
Glu Ser Thr	Leu Ser Thr Ala Leu 2340	Ala Glu Leu Ala Thr Arg Ser Phe 2345 2350
Gly Ser Ser Ser Thr Ser Gly Ile Thr Gly Asp Aen Thr Thr Thr Ser 2355 2360 2365
Ser Glu Pro 2370	Ala Pro Ser Gly Cye 2375	Pro Pro Aep Ser Aep Ala Glu Ser 2380
Tyr Ser Ser 2385	Met Pro Pro Leu Glu 2390	Gly Glu Pro Gly Aep Pro Aep Leu 2395 2400
Ser Asp Gly	Ser Trp Ser Thr Val 2405	Ser Ser Glu Ala Asn Ala Glu Aep 2410 2415
Val Val Cye	Cye Ser Met Ser Tyr 2420	Ser Trp Thr Gly Ala Leu Val Thr 2425 2430
Pro Cye Ala Ala Glu Glu Gln Lye Leu Pro Ile Asn Ala Leu Ser Aen 2435 2440 2445
Ser Leu Leu 2450	Arg Hle Hle Aen Leu Val Tyr Ser Thr Thr Ser Arg Ser 2455 2460

FIGURA 9-14

Ala Cya Gin 2465	Arg Gin Lye Lye Val Thr Phe Aep Arg Leu Gin Val Leu
2470	2475	2480
Aep Ser His	Tyr Gin Aep Val	Leu Lye Glu Val Lye	Ala Ala Ala Ser
	2485	2490	2495
Lye Val Lys	Ala Aen Leu Leu	Ser Val Glu Glu Ala	Cye Ser Leu Thr
	2500	2505	2510
Pro Pro Hia	Ser Ala Lye Ser	Lye Phe Gly Tyr Gly	Ala Lye Aep Val
2515	2520	2525
Arg Cya Hia	Ala Arg Lye Ala	Val Thr His Ile Aen	Ser Val Trp Lye
2530	2535 2540
Aep Leu Leu	Glu Aep Aen Val	Thr Pro Ile Aep Thr	Thr Ile Met Ala
2545	2550	255S	2560
Lye Aen Glu	Val Phe Cye Val	Gin Pro Glu Lys Gly	Gly Arg Lye Pro
	2565	2570	2575
Ala Arg Leu	Ile Val Phe Pro	Aep Leu Gly Val Arg	Val Cye Glu Lys
	2580	2585	2590
Het Ala Leu	Tyr Aep Val Val	Thr Lys Leu Pro Leu	Ala Val Met Gly
2595	2600	2605
Ser Ser Tyr Gly Phe Gin Tyr	Ser Pro Gly Gin Arg	Val Glu Phe Leu
2610	2615 2620
Val Gin Ala Trp Lye Ser Lye Lye Thr Pro Met Gly Phe Ser Tyr Aep
2625	2630	2635	2640

FIGURA 9-15

171 489

Thr	Arg Cye Phe Asp Ser Thr Val Thr Olu Ser Aep Ile Arg Thr Glu
2645	2650	2655
Glu	Ala Ile Tyr Gin Cye 2660	Cye Aep Leu Aep Pro Gin Ala 2665	Arg Val Ala 2670
Ile	Lye Ser Leu Thr Glu 2675	Arg Leu Tyr Val Gly Gly Pro Leu Thr Asn 2680 2685
Ser	Arg Gly Glu Aen Cye 2690	Gly Tyr Arg Arg Cye Arg Ala 2695 2700	Ser Gly Val
Leu Thr Thr Ser Cye Gly Aen Thr Leu Thr Cye Tyr Ile 2705 2710 2715	Lye Ala Arg 2720
Ala	Ala Cye Arg Ala Ala 2725	Gly Leu Gin Aep Cye Thr Met 2730	Leu Val Cye 2735
Gly	Aep Aep Leu Val Val 2740	Ile Cye Glu Ser Ala Gly Val 2745	Gin Glu Aep 2750
Ala	Ala Ser Leu Arg Ala 2755	Phe Thr Glu Ala Met Thr Arg Tyr Ser Ala 2760 2765
Pro	Pro Gly Aep Pro Pro 2770	Gin Pro Glu Tyr Aep Leu Glu 2775 2780	Leu Ile Thr
Ser Cye Ser Ser Aen Val Ser Val Ala Hie Aep Gly Ala 2785 2790 2795	Gly Lye Arg 2800
Val	Tyr Tyr Leu Thr Arg Aep Pro Thr Thr Pro Leu Ala	Arg Ala Ala

2805 2810 2815

FIGURA 9-16

171 489

Trp Glu Thr	Ala Arg 2820	His Thr	Pro Val Asn Ser Trp Leu Gly Asn Ile
	2825	2830
Ile Met Phe Ala Pro 2835	Thr Leu	Trp Ala Arg Met Ile 2840	Leu Met Thr His 2845
Phe Phe Ser 2850	Val Leu	Ile Ala Arg Aep Gin Leu Glu Gin Ala Leu Asp 2855 2860
Cys Glu Ile 2865	Tyr Gly	Ala Cys 2870	Tyr Ser Ile Glu Pro 2875	Leu Asp Leu Pro 2880
Pro Ile Ile	Gin Arg Leu Hlo 2885	Gly Leu Ser Ala Phe 2890	Ser Leu His Ser 2895
Tyr Ser Pro	Gly Glu 2900	Ile Asn	Arg Val Ala Ala Cys 2905	Leu Arg Lys Leu 2910
Gly Val Pro Pro Leu 2915	Arg Ala	Trp Arg His Arg Ala 2920	Arg Ser Val Arg 2925
Ala Arg Leu 2930	Leu Ala	Arg Gly Gly Arg Ala Ala Ile Cys Gly Lys Tyr 2935 2940
Leu Phe Aen 2945	Trp Ala	Val Arg 2950	Thr Lys Leu Lys Leu 2955	Thr Pro Ile Ala 2960
Ala Ala Gly	Gin Leu Asp Leu 2965	Ser Gly Trp Phe Thr 2970	Ala Gly Tyr Ser 2975
Gly Gly Asp	Ile Tyr 2980	His Ser	Val Ser His Ala Arg 2985	Pro Arg Trp Ile 2990

FIGURA 9-17

Trp Phe Cys Leu Leu Leu Leu Ala Ala Gly Val Gly Ile Tyr Leu Leu 2995 3000 3005

Pro Asn Arg 3010

FIGURA 9-18

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz. Cena 6,00 zł

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Sposób wytwarzania kompozycji immunogenicznej reagującej immunologicznie krzyżowo z wieloma izolatami HCV, w którym prowadzi się ekspresję rekombinantu polipeptydu wytworzonego przez komórkę gospodarza, stanowiącą komórkę E. Coli, drożdży, owada lub ssaka transformowaną za pomocą ekspresyjnego układu kodującego sekwencję aminokwasową zawierającą ten polipeptyd i elementy regulujące ekspresję, zawierających promotor kompatybilny z komórką gospodarza, inkubuje się komórkę gospodarza powodując ekspresję polipeptydu, wyodrębnia się eksprymowany polipeptyd i miesza się go z farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem lub zaróbką, znamienny tym, że wytwarza się co najmniej dwa rekombinowane ekspresyjnie polipeptydy, z których każdy zawiera co najmniej jeden epitop ze zmiennej domeny polipeptydu HCV, przy czym regiony zmiennej domeny sekwencji aminokwasowych są wzajemnie heterogeniczne i pochodzą z innych izolatów HCV.
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że dodatkowo sprzęga się polipeptydy z białkiem nośnikowym przed zmieszaniem z farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem.
3. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, ze jako białko nośnikowe stosuje się toksoid błonicy.
4. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że białko nośnikowe aktywuje się przed sprzęganiem z polipeptydem, tworząc wiązanie estrowe maloimid-N-hydroksysukcynimid kwasu kapronowego.
5. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że białko nośnikowe aktywuje się przed sprzęganiem z polipeptydem, tworząc wiązanie estrowe maloimid-N-hydroksysukcynimid kwasu kapronowego.
6. Sposób według zastrz. 1 albo 2, albo 3, albo 4, albo 5, znamienny tym, że stosuje się domenę zmienną będącą w regionie E2/NS1 poliproteiny HCV.
7. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że stosuje się domenę zmienną kodowaną poliproteinę HCV od około aminokwasu 384 do około aminokwasu 411.
8. Sposób według zastrz. 1, albo 2, albo 3, albo 4, albo 5, znamienny tym, że stosuje się domenę zmienną pochodzącą z białka E1 poliproteiny HCV.
9. Sposób według zastrz. 8, znamienny tym, że stosuje się domenę zmienną kodowaną przez poliproteinę HCV od około aminokwasu 225 do około aminokwasu 260.
10. Sposób wytwarzania kompozycji immunogenicznej reagującej immunologicznie krzyżowo z wieloma izolatami HCV, w którym wytwarza się polipeptyd przez polimeryzację podłoża aminokwasowego ze środkiem polimeryzującym, wyodrębnia się otrzymany polipeptyd i miesza się ten polipeptyd z farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem lub zaróbką, znamienny tym, że syntetyzuje się co najmniej dwa działające immunogenicznie polipeptydy, z których każdy zawiera co najmniej jeden epitop ze zmiennej domeny polipeptydu HCV, przy czym regiony zmiennej domeny sekwencji aminokwasowych są wzajemnie heterogeniczne i pochodzą z innych izolatów HCV.
11. Sposób według zastrz. 10, znamienny tym, że dodatkowo sprzęga się polipeptydy z białkiem nośnikowym przed zmieszaniem z farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem.
12. Sposób według zastrz. 11, znamienny tym, że jako białko nośnikowe stosuje się toksoid błonicy.
13. Sposób według zastrz. 11, znamienny tym, że białko nośnikowe aktywuje się przed sprzęganiem z polipeptydem, tworząc wiązanie estrowe maloimid-N-hydroksysukcynimid kwasu kapronowego.
14. Sposób według zastrz. 12, znamienny tym, że białko nośnikowe aktywuje się przed sprzęganiem z polipeptydem, tworząc wiązanie estrowe maloimid-N-hydroksysukcynimid kwasu kapronowego.
15. Sposób według zastrz. 10, albo 11, albo 12, albo 13, albo 14, znamienny tym, że stosuje się domenę zmienną będącą w regionie E2/NS1 poliproteiny HCV.
16. Sposób według zastrz. 15, znamienny tym, że stosuje się domenę zmienną kodowaną przez poliproteinę HCV od około aminokwasu 384 do około aminokwasu 411.
17. Sposób według zastrz. 10, albo 11, albo 12, albo 13, albo 14, znamienny tym, że stosuje się domenę zmienną pochodzącą z białka E1 poliproteiny HCV.
18. Sposób według zastrz. 17, znamienny tym, że stosuje się domenę zmienną kodowaną przez poliproteinę HCV od około aminokwasu 225 do około aminokwasu 260.