BG62973B1

BG62973B1 - Имунореактивни полипептидни състави на вируса нахепатит с

Info

Publication number: BG62973B1
Application number: BG98653A
Authority: BG
Inventors: Amy Weiner; Michael Houghton
Original assignee: Chiron Corporation
Priority date: 1991-09-13
Filing date: 1994-03-11
Publication date: 2000-12-29
Also published as: JP2004073207A; US5756312A; FI941199A; JPH06511149A; EP0608261B1; US6303292B1; RO116199B1; DK0608261T3; JP2005176853A; FI941199A0; ES2182822T3; BG98653A; AU679429B2; US5766845A; WO1993006126A1; JP2008133301A; RU2212899C2; ATE228564T1; DE69232859T2; CA2116764A1

Abstract

Съставите включват вирусни епитопи на хепатит типс, методи за имунологични приложения на съставите, материали и методи за получаването им. </P>

Description

Област на техниката

Изобретението се отнася до имунореактивни полипептидни състави, до методи за имунологични приложения на съставите и до материали и методи за тяхното получаване.

Предшестващо състояние на техниката

Вирусът на хепатит С е идентифициран като главен причинител на посттрансфузионния хепатит (нито-А, нито-В) NANHB, а така също и като причина за комунално-првдобития NANHB. Материалите и методите за получаване на вирусни геномни последователности са известни от WO89/04669, WO90/11089 и WO90/14436.

Охарактеризирането на молекулно ниво на HCV генома показва, че е налице РНК молекула с позитивна полярност, съдържаща приблизително 10 000 нуклеотида, кодиращи полипротеин с около 3011 аминокиселини. Няколко сигурни линии предполагат, че HCV има сходна генетична организация като тази на вирусите от семейство Flaviviridae, което включва флави- и пестивирусите. Подобно на своите пести- и флавивирусни родственици, HCV кодира голям полипротеинов предшественик, от който са получени индивидуалните вирусни протеини (както структурни, така и неструктурни).

РНК-сьдържащи вируси могат да притежават относително високи стойности на спонтанна мутация, например от порядъка на 10'³ до 10* за инкорпориран нуклеотид. Поради това, доколкото хетерогенността и изменчивостта на генотипа са общи за РНК вирусите, в рамките на HCV вирусите може да има множество вирусни изолати, които да бъдат вирулентни или авирулентни.

Идентифицирани са множество различни изолати на HCV. Тяхната посредователност показва ограничената хетерогенна характеристика на РНК вирусите.

ИзолатмпНСУЛ.1 е опиш Τ. ««I (UU), Japan Ned.

AciAr Ка. 12 10347-10373; ТакаМ, Ltd (UM), Gau ίί 237-1Μ; TaJuadu a A (UM), NaAAaArtaa Ii 442L

Пиишгае кодираиш последователности плкх S- и 7- крайните последователности от два независими иаолата. HCV4 и ИК, са описашотКеммекаГайемепииСсиаветиаСКаелеик (UM),J. ПА ii: 1105-1113.)

Jlpjai публикации описваш HCV ижмапшпе^са следните:

HCV-1: Оео et ю (UM), tri. IM tat Ml 433M1; C*e« « A(UM), Гпс. Ν·Λ AM SA USA 333451-USS; Нш а аЩОД Гпа. NaL

AM Sci USA № 1711-1715; Eunpaaa Mad UMicMm NcJUJlL HCV41 a 'liC-JS: OtaaM a A (lf»l), JaparJ. &p. MA MA Ok 147-177.

HCT 1ST, HCT 23, Th. HCT 27, EC1 и ТС10: ITAur a A (IHl), VM. 1SS :343-343.

Tt-1, HCV-ΚΙ u HCV-K2.- Saaarala а A Пие an Me never tjpa Hocrii C ring a Jva Dir Ma of Gaamalaalagy, DapatauM е/ MiaM MatieM Kaaarmra MaAicA VauaMf, Jrra.

Клонове A, C, *D* & Έ: Гяйроеи- Man a al, А жМ pnap rf lupaA» mu, a Vine Gaus.

Типичен подход при диагностициране и определяне начина на ваксиниране е да се фокусира вниманието върху съхранените вирусни области. Такъв подход обаче игнорира важни епитопи, които могат да са разположени в различни епитопи.

Обект на настоящото изобретение е осигуряването на полипептидни състави, които да са имунологично кръстосано реактивни с мултиплени HCV изолати, по-специално по отношение на хетерогенни области от вируса.

Описание на изобретението

Установено е, че множество важни HCV епитопи варират във вирусните изолати и че тези епитопи могат да бъдат каргирани по отношение на специални домени. Това откритие позволява да се създаде стратегия на получаване на имунологично кръстосано-реактивни пелипептидни състави, която е фокусирана върху различни (не само съхранените) домени.

Съответно на това, едно от изпълненията на настоящото изобретение е имунореактивен състав, включващ полипептиди, които съдържат аминокиселинната последователност на един епитоп в рамките на първата вариабилна област от HCV, и поне две хетерогенни аминокиселинни последователности от първата вариабилна област от отделни HCV изолати.

Друго изпълнение на настоящото изобретение е имунореактивен състав, включващ множество от набор антигени, където: а) всеки антигенен набор се състои от множество по същество идентични полипептиди, включващи аминокиселинната последователност на един епитоп в рамките на първия вариабилен домен от един HCV изолат, и Ь) аминокиселинната последователност на епитопа от един набор е хетерогенен по отношение на аминокиселинната последователност на аналогична последователност от поне един друг набор.

Друг вариант на изобретението е имунореактивен състав, включващ множество полипеп2 тиди, където всеки полипептид е с формула:

R_r-(SV)_X-R’, в която R и R’ са аминокиселинни последователности от около 1 - 2000 аминокиселини и са еднакви или различни; г и г’ са 0 или 1 и са еднакви или различни; V е аминокиселинна последователност от един HCV вариабилен домен, където вариабилният домен обхваща поне един епитоп; S е цяло число > 1, представляващо подбран вариабилен домен; и η е цяло число > 1, представляващо подбран HCV изолат, хетерогенен при даден SV по отношение на поне един друг изолат с различни стойности за п, като п е независимо подбран за всяко χ; х е цяло число 1; и при условие, че аминокиселинните последователности, представляващи комбинация, подбрана от групата, състояща се от (i) 1V₍ и 1V₂, (ii) IV, и IV₂, и (iii) IV, и 2V,.

Друг аспект на изобретението е метод за получаване на имуногенен фармацевтичен състав HCV, включващ:

а/ осигуряване на имунореактивен състав, както е описан по-горе;

Ь/ осигуряване на подходящ ексципиент; и с/ смесване на имунореактивния състав от а/ с ексципиента от Ь/ в съотношение, осигуряващо имуногенен отговор при въвеждане в бозайници.

Аспект на изобретението е също метод за получаване на анти-HCV антитела, включващи въвеждане в бозайник на ефективно количество имунореактивен състав, както е описано по-горе.

Изобретението включва метод за откриване на антитела срещу HCV в биологични проби, който се състои от:

а/ осигуряване на биологична проба, за която се счита, че съдържа антитела срещу HCV;

Ь/ осигуряване на имунореактивния състав, описан по-горе;

с/ реагиране на биологичната проба от а/ с имунореактивния състав от Ь/;

d/ откриване на образуване на антигенантитяло комплекси, формирани между имунореактивния състав от а/ и антителата от биологичната проба от Ь/, ако има такива.

Друго изпълнение на изобретението е комплект за откриване на антитела срещу HCV в биологична проба, съдържащ имунореактивен състав, както е описан по-горе, опакован в подходящ контейнер.

Кратко описание на фигурите

Фигура 1 изобразява схематично генетичната организация на HCV генома;

фигура 2 - сравнение на предполагаемите аминокиселинни последователности от Е1 протеина, кодиран от група I и група IIHCV изолати;

фигура 3 - сравнение на аминокиселинните последователности от предполагаемата E1/NS1 област на HCV изолатите;

фигура 4 - графика, показваща антигенните профили на аминокрайната област от предполагаемия HCV E2/NS1 протеин (аминокиселини 384 - 420), и gp 120 V3 хипервариабилна област otHIV-1;

фигура 5 - серия от графики, даващи процентно вероятността даденият остатък от аминокрайната област от HCV E2/NS1 протеина (аминокиселини 384 до 420) да бъде установен, както в α-хеликоидалния, в β-листовидния, така и в βнасочения (a-helix, β-sheet and β-tum) структурен мотив;

фигура 6 - графики, показващи реактивността на антителата в плазмата от HCV 18 (части А-С) или Th (части D-f) с припокриващи се биотинирани 8-мерни пептиди, получени от аминокиселини 384 до 415 или 416 от HCV изолати НСТ 18 (A, D), Th (В, Е) и HCV JI (С, F), съответно;

фигура 7 - предполагаемите аминокиселинни последователности от две области на E2/NS1 полипептида, аминокиселини 384 - 414 и 547 647, дадени за Q1 и Q3 изолатите;

фигура 8А - предполагаемите аминокиселинни последователности на изолати HCV Л,1 и Л,2 от аминокиселини 384 до 647;

фигура 8 В - предполагаемите аминокиселинни последователности на изолатите НСТ 27 и HCVE1 от аминокиселини 384 до 651;

фигура 9 - цялата полипротеинова структура на изолата HCV-1.

Техническа същност на изобретението

Съгласно настоящото изобретение се използват, доколкото друго не е указано, конвенционални техники на молекулярната биология, микробиология, рекомбинантна ДНК и имунология, които са известни от литературата, например,

MauMttt. Ftocfc Λ Senintk, Moloetdar С1ояяр A Laborettry Mwtmi (JwW erf. 1999); DNA Ooumg, RWwmi 1 and 11 ( DM. Closer ad. 1995); OtywracfaaM* tyrtterif (M J, Gast «4 1994); Nucleic AeidiljbriditetiM (B.D.Haw AS. J. Higgins eds. 1994); TnatxriMon and Translation (B. D. Hames AS. J. Higginseds. 1994);AnimalCeOCulture (A. J. Fnslmcy ed. 1996 ); hawbilktl Ceils and Esqsui (IRL Press, 1996 );

B. Perbal, A TYnrfim/ Guide to Moloetdar Cloning (1994); At series, Methods й Enzymology (Aadtok Frets, Inc.) ; Gene Transfer Vtcton For Mmnmalian Cells (J. H. Muter end M. P. Calos eds 1997, Cold Spring Harbor Laboratory), Methods in Ebttsmmlogy Vol 154 and Vol 155 ( We and Grossman, and Wneds., mptabdy), Mayer and Walker, eds. (1997), Immunochemical Methods м Cell and Molecular Biology ( Academic Press, London), Scopes, (1997), Protest Purification: Prineipes and Practice, Second Edition ( Springer · Veriag, Ν. Ϊ.) and Handbook of Experimental hstmtmoiogy, Volumes I· IV ( D. M. Weir and C.

C, BlactoreOeds. 1986); Immunoassay: A Practical Guide (D.W. Chased. 1997).

HCV е нов член на семейство Flaviviridae, което включва пестивирусите (Холерен вирус по свинете и вируса на Говеждата вирусна диария) и флавивирусите, примери за които са Денга и вируса на Жълтата треска. Схемата на генетичната организация на HCV е показана на фигура 1. Аналогично на флави- и пестивирусите, HCV кодира основна полипептидна област (“С”) при N-края от вирусния палипротеин, последвано от два гликопротеинови домена (“El”, “E2/NS1”), upstream от неструктурните гани NS2 до NS5. Координатите на аминокиселините от предполагаемите протеинови домени са показани на таблица 1.

Таблица 1. Предполагаеми протеинови домени в НС*/ a, a. координати (приблизително) протеин

1- 191	С
192 - 383	Е1
384 - 750	E2/NS1
751 -1006	NS2
1007-1488	NS3
1489 -1959	NS4
1960 - 3011	NS5

Както е посочено по-горе, идентифицирани са .много HCV изолати. Сравнителният секвенционен анализ на пълната и частична последователност показва, че на базата на хомоложност на нуклеотидно и аминокиселинно ниво, HCV 5 изолатите могат да бъдат подразделени поне на три основни групи (табл. 2). Виж Houghton et al., (1991) Hepatology 14: 381 - 388. Само частичната последователност е подходяща за изолаллгге от група III. Поради това, когато последоваIQ телностите от тези изолати са определени, един или повече от тях може да съхрани разделянето на различни групи, включително потенциална четвърта група. Таблица 3 показва секвенционната хомоложност между отделните вирусни 15 протеини от различни HCV изолати, както е предположена от техните нуклеотидни последователности. Може да се види, че протеините от същата вирусна група проявяват по-голямо сходство от същите протеини, кодирани от различни вирусни групи (табл. 3). Изключение от това е нуклеокапсидният протеин, който е силно съхранен измежду всички последователности от група I и II на вирусните изолати. (На табл. 3, символът N7А означава, че последователностите са неподходящи за сравнение). За целите на настоящото изобретение група I изолати може да бъде определена като онези изолати, притежаващи своите вирусни протеини, по-специално Е1 и E2/NS1 протеини, около 90 % хомоложни или повече на аминокиселинно ниво на изолатите, класифици30 рани като група I. Група II е определена аналогично. Бъдещите групи могат да бъдат определени по подобен начин на базата на вирусната протеинова хомоложност спрямо изолат — прототип. По съшия начин могат да бъдат определени и 35 подгрупите чрез хомоложността им в ограничени протеини, като El, E2/NS1 или NS2 протеини или просто по-високите нива на хомоложност.

Таблица 2. Класифициране на хепатит С Вирусни аеномни РНК последователности в три основни групи.

НСУ. I	НСУ И	лоип
HCV-1	HCV-J1.1	Клонове A, С, D & Е
HCV-J1	HCV-J4	HCV-K2 (а&Ь)
НСГ 18	HCV-J
НСГ 23	ВК
ЕС1
Pt-1

Таблица 3. Хомоложност на аминокиселините (%) между вирусните протеини, кодирани от различни HCV изолати.

HCV	с.	Е1	E2ZNS1	NS2	NS3	№4	NS5
Група
I В срайнение с
I	98-100	94-100	N/A	N/A	N /А	N/A	99-100
II	97-98	77-79	78-81	75-77	91-92	90-93	84-88
ш	N/A	N/A	N/A	N/A	86	76-80	71-74

П В сраВнение с
II	98-100	92-100	89-100	93-100	94-100	97-100	95-100
Ш	.N/A	N/A	.N7 А	N/A	84	76	74-75
ΠΙВ сраВнение с
Ш	N7A	.N/A	J4/A	N7A	.N/A	91-100	89-100

Заслужава внимание фактът, че вирусните протеини на обвивката, кодирани от EI и E2/NS1 гените, показват съществени аминокиселинни вариации между групите I и II. Само NS2 проявява по-висока степен на хетерогенност, докато С, NS3, NS4 и NS5 протеините показват по-висока секвенционна съхранимост между групите. Вариациите в последователността, наблюдавани в предполагаемите протеини на обвивката на вириона между групите I и II отразяват характерното разделяне на аминокиселините между двете групи. Пример за това е показан на фиг. 2, където последователността на Е1 генният продукт е сравнена с вирусите от групите I и II. Показани са Е1 аминокиселинните последователности от HCV групи I и I. На фигурата хоризонталните ивици показват секвенционната идентичност с HCV-1. Звездичките показват групово-специфичното разделяне на аминокиселините; групово специфичните остатъци могат да бъдат ясно идентифицирани. Последователностите за група I са HCV 1, НСТ18, НСТ23, НСТ27 и НС - Л. Последователностите за група II са НС - J4, HCV - J, HCV Л,1 и ВК. Такова групово-специфично разделяне на аминокиселини е налице и в други генни продукти, включително gp 72, кодирани от E2/NS1 гена. Фиг. 3 показва сравнителна аминокиселинна последователност от предполагаемата E2/NS област на HCV изолат, който се разделя като група I и група II. Късният протеин също съдържа една N-крайна хипервариабилна област (“HV”) от около 30 аминокиселини, което показва голямо вариране между всички изолати. (Weiner et al., 1991). Тази област се намира между аминокиселини 384 до 414, номерирани посредством системата за номериране на HCV-1.

Предполагаемият HCV гликопротеин Е2/ NS1 на обвивката може да съответства на gp 53 (BVDV) / gp 55 (Hog Cholera Virus) полипептид на обвивката от пестивирусите и NS1 от флавивирусите, като и двата придават предпазващ имунитет в гостоприемници, ваксинирани с такива полипептиди.

На базата на сходството между хипервариабилната област (“HV”) и HIV-1 gp 120 V3 домена по отношение степента на секвенционно вариране, предсказуемото въздействие на аминокиселинните изменения върху възможното свързване на антитялото в допълнение към отсъствието на дефинирана вторична структура предполага, че HV доменът кодира неутрализиращи антитела.

Имуногенността на домена е показана чрез експериментите на картиране на епитопите, описана в примерите. Резултатите от тези изследвания предполагат, че в допълнение към трите големи групи на HCV, съществуват също и специфични HV подгрупи.

Анализът на биологичните проби от индивиди с HCV индуциран NANBH показва, че индивидите могат да носят два или повече HCV варианта едновременно. Два от едновременно съществуващите HV варианти са установени в плазмата на един индивид, Л. В допълнение, частичното секвениране на гена от един индивид с хроничен NANBH, който притежава редуващи се пламвания на хепатит, показва, че индивидът Q е инфектиран с два HCV варианта (Q1 или Q3). Всеки вариант се асоциира само с един епизод на заболяването. Изследване по ELISA при използване на Q1 или Q3 специфичен пептид (аминокиселини 396 - 407) показва, че Q развива антитяло отговор срещу Q1 пептида, но не и срещу съответстващия Q3 пептид, предполагайки, че рисковите за заболяването индивиди Q се дължат на един HV вариант. Присъствието на антитела срещу Q1 пептида по време на втория епизод от заболяването предполага, че вариациите в HV домена може да е резултат от подтискането на имунния подбор. Аминокиселини 396 - 407 явно са обект на най-голям селективен натиск в HV домена. Тези така установени факти потвърждават тезата, че високи нива на хроничност при това заболяване може да се дължат на неадекватния отговор на гостоприемника спрямо HCV инфекция и/или на ефективни вирусни механизми на имунологично отклонение. Нещо повече, те насочват към E2/NS1 HV областта като генетична област, включена във вирусния механизъм за избягване и/или в механизма на неадекватен имунологичен отговор.

Както е описано по-горе, налице са няколко вариантни области в рамките на HCV генома. Един или повече от тях, като че най-много са включени във вирусния механизъм за избягване и/или в механизма на неадекватен имунологичен отговор. Поради това, желателно е да бъдат включвани в съставите за лечение на HCV полипептиди, които биха индуцирали имунологичен отговор срещу тези варианти.

Така Е1 и E2/NS1 областите от генома кодират предполагаеми полипептиди от типа на обвивката. Тези области биха били от специален интерес по отношение на имуногенността. Те са сред областите, срещу които е желателно да бъде индуциран и/или повишен даден имунен отговор за предпазване на индивида от HCV инфекция и за предотвратяване хроничното протичане на заболяването при инфектираните индивиди. В допълнение, тези области са сред онези, от които е желателно да се установят HCV вариантите, възникващи по време на инфектирането, а така също и като супер- или ко-инфектиране от два или повече варианта.

Настоящото изобретение описва състави и методи за лечение с оглед предотвратяване HCV инфекции, и по-специално хронични HCV инфекции. В допълнение, то описва състави и методи за откриване присъствието на анти-HCV антитела в биологични проби. Този последен метод е специално приложим за идентифициране на анти-HCV антитела, генерирани в отговор на имунологично различими HCV епитопи. Методът може също така да бъде използван за изследване еволюцията на множествени варианти от HCV в рамките на даден инфектиран индивид. В описанието на изобретението са използвани следните термини.

Терминът “полипептид” се отнася до полимер от аминокиселини и не се отнася до специфична дължина на продукта; така в дефиницията за полипептид са включени пептиди, олигопептиди и протеини. Този термин също не се отнася до или изключва постекспресионни модификации на полипептида, например, гликозилиране, ацетилиране, фосфорилиране и други. В рамките на дефиницията са включени също полипептиди, съдържащи един или повече аналози в дадена аминокиселина (включително, например, неприродни аминокиселини и др.), полипептиди със заместени връзки, а така също и други модификации, познати в областта, както срещащи се, така и не срещащи се в природата.

Както се използва тук, А е “по същество изолиран” от В, когато теглото на А е поне около 70 %, за предпочитане поне около 80 % и найдобре поне около 90 % от комбинираните тегла на А и В.

Полипептидните състави от настоящото изобретение са по същество чисти от тъкани на хора или на други примати (включително кръв, серум, клетъчни лизати, органели, протеини и др.) и клетъчно културална среда.

“Рекомбинантен полинуклеотид” предполага полинуклеотид от геномен, сДНК, полусинтетичен източник, който спрямо произхода си или манипулирането: (1) не се асоциира с всички или част от полинуклеотида, с който се асоциира в природата, (2) е свързан с полинуклеотид, различен от този, с който е свързан в природата, или (3) не се среша в природата.

“Полинуклеотид” е полимерна форма на нуклеотиди с каквато и да е дължина, независимо рибонуклеотиди или дезоксирибонуклеогиди. Този термин се отнася само до първична структура на молекулата. Така, този термин включва едно6 или двуверижни ДНК или РНК. Той включва също така познати типове на модификации, например, маркиране, което е познато за областта, метилирания, “капсули”, замествания на една или повече от природно срещаните нуклеотиди с даден аналог, интернуклеотидни модификации, например, онези с незаредени свързвания (като напр. фосфоротиоати, фосфородитиоати, и др.), онези, съдържащи очаквани количества, напр. протеини (включително нуклеази, токсини, антитела, сигнални пептиди, поли-Ь-лизин и др.), с интеркалатори (като акридин, псорален и др.); съдържащи хелатори 1 като метали, радиоактивни метали и др.); съдържащи алкилатори, такива с модифицирани свързвания (като α-аномерни нуклеинови киселини и др.), а така също и немодифицирани форми на полинуклеотида.

“Рекомбинантни клетки гостоприемници”, “клетки гостоприемници”, “клетки”, “клетъчни линии”, “клетъчни култури” и други подобни термини, обозначаващи микроорганизми или повисоки еукариотични клетъчни линии, култивирани като едноклетъчни, които могат да бъдат или са били използвани като реципиенти за рекомбинантен вектор или друг трансферен полинуклеотид, и включва прогените на първоначалната клетка, която е била трансфектирана. Разбираемо е, че прогенът на отделна родителска клетка може да не бъде задължително напълно идентична по морфология или по геномен или общ ДНК комплемент като родителската, благодарение на природни, случайни или предумишлени мутации.

“Репликон” е който и да е генетичен елемент като плазмид, хромозома, вирус, козмид и др., който се проявява като автономна единица на полинуклеотидна репликация в рамките на клетката; т.е. способен на репликация под свой собствен контрол.

“Вектор” е репликон, който освен това включва последователности, осигуряващи репликация и/или експресия на отворена рамка на разчитане.

“Контролна последователност” се отнася до полинуклеотидни последователности, които са необходими да предизвикат експресия на последователностите, към които те са лигирани. Природата на такива контролни последователности е различна в зависимост от гостоприемниковия организъм; в прокариоти такива контролни последователности включват главно промотор, рибозомен свързващ сайт и терминатори; в еукариоти такива контролни последователности включват промотори, терминатори и в някои случаи усилватели (енхансери). Терминът “контролни последователности” е с намерение да включва като минимум всички компоненти, чието присъствие е необходимо за експресия, и може също да включва допълнителни компоненти, чието присъствие е преимущество, например, лидерни последователности, които управляват секрецията.

“Промотор” е нуклеотидна последователност, която включва консенсус-последователности. което позволява свързването на РНК полимераза към ДНК матрицата така, че тРНК продуцирането се инициира при нормален сайт за иницииране на транскрибция за съседен структурен ген.

“Оперативно свързан” се отнася до съпоставяне, където така описаните компоненти са във взаимоотношения, позволяващи им да функционират по очакван начин. Контролна последователност, “оперативно свързана” към кодираща последователност е лигирана така, че експресията на кодиращата последователност се постига при условия, конкурентни с контролните последователности.

“Отворена рамка на разчитане (ORF) е област от полинуклеотидната последователност, кодираща полипептид; тази област може да представлява част от кодиращата последователност или цялата кодираща последователност.

“Кодираща последователност” е полинуклеотидна последователност, транскрибирана в тРНК и/или транслирана в полипептид, когато е поставена под контрола на подходящи регулаторни последователности. Свързванията на кодиращата последователност се определят от транслационен старт кодон при 5’-края и Транслационен стоп кодон при 3’-края. Кодиращата последователност може да включва, но не е ограничена до, тРНК, ДНК (включително сДНК), и рекомбинантни полинуклеотидни последователности.

Както се използва тук, “епитоп” или “антигенна детерминанта” означава аминокиселинна последователност, която е имунореактивна. Обикновено един епитоп се състои от поне около 8, или дори около 10 аминокиселини. Както се използва тук, един епитоп на даден полипептид притежава епитопи със същите аминокиселинни последователности както епитопа на дадения полипептид и неговите имунологични еквиваленти.

“Антиген” е полипептид, съдържащ един или повече епитопи.

“Имуногенен” означава способността да проявява клетъчен и/или хуморален отговор. Един имуногенен отговор може да се прояви чрез имунореакгивните полипептида самостоятелно или може да изисква присъствието на носител във или без наличие на помощно средство.

“Имунореактивен” се отнася до: (1) способността да се свързва имунологично към антитяло и/или към лимфоцитен антигенен рецептор или (2) способността да бъде имуногенен.

“Антитяло” е който и да е имуноглобулин, включително антитела и техни фрагменти, които свързват специфичен епитоп. Терминът обхваща общо поликлонални, моноклонални и химерни антитела. Примери за химерни антитела са описани bUS 4 816 567.

“Антигенен комплекс” се определя като състав, състоящ се от множество по същество идентични полипептиди, където полипептидите се състоят от аминокиседанната последователност на един определен епитоп.

“По същество идентични полипептиди” означава полипептиди, които са идентични, с изключение на вариантите, ограничени до типичния обхват на последователност или вариациите в размера, определени от метода на продуциране; например рекомбинантна експресия, химичен синтез, тьканни култури и т.н. Тези варирания не променят желаното функционално свойство на състав с по същество идентични полипептиди; например, съставът се държи като състав от идентични полипептиди. Вариациите могат да се дължат на, например, изменения, дължащи се на секреторни процеси по време на транспортирането на полипептида, на по-малко от 100 % ефективност при химичния синтез и т.н.

Както се използва тук, “вариабилен домен” (VD) на вирусния протеин е домен, който демонстрира постоянен образец на аминокиселинни вариации между поне два HCV изолата или субпопулации. За предпочитане, областта съдържа поне един епитоп. Вариабилната област може да варира от изолат до изолат толкова малко, калкото едно аминокиселинна изменение. Тези изолати могат да са от същата или от различна HCV група (и) или субгрупа(и). Вариабилните домени могат лесно да бъдат идентифицирани чрез състава на последователността измежду изолатите, като примери за тези техники са описани по-долу. За целите на описването на настоящото изобретение, вариабилните области ще бъдат определяни по отношение на аминокиселинния номер на полипротеина, кодиран от генома на HCV-1, както е показано на фиг. 9, с инициатор метионин, означен като позиция 1. Съответният вариабилен домен в друг HCV изолат е определен чрез подравняване на последователностите на два изолата по начин, който да изведе съхранените области извън която и да е вариабилна област по максимален начин. Това може да бъде осъществено с която и да е компютърна конфугирация, като ALIGN 1,0 (Attn: Dr. William R. Pearson). Виж Pearson etal., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444 - 2448. Аминокиселнините номера, дадени специално за вариабилния домен, са обект на избор. Така, началото и краят на вариабилните домени следва да се разбират като приблизителни и включващи припокриващи се области или субобласти, дотолкова, доколкото са обозначени.

Един епитоп е “имунологичен еквивалент” на друг епитоп в даден полипептид, когато реагира кръстосано с антитела, които се свързват имунологично към епитопа в дадения полипептид.

Епитопите обикновено са картирани така, че да обхващат поне около 5, понякога поне около 8, и дори около 10 или повече аминокиселини.

Аминокиселинните последователности, обхващащи HCV епитопа, могат да бъдат прикачени към друг полипептид (като носещ протеин) както посредством ковалентна връзка, така и чрез експресиране на слетия полинуклеотид за формиране на слят протеин. По желание, може да се инсертира или прикрепят мултиплени повторения на епитопа, и/или да се инкорпорира множество епитопи. Носещият протеин може да бъде получен от който и да е източник, но ще бъде относително голям, имуногенен протеин като BSA, KLH или други подобни. По желание, може да се използва HCV с по същество цялата дължина на протеина като носителя, мултиплицирайки броя на имуногенните епитопи. Обратно, аминокиселинната последователност от НС V епитопа може да бъде присъединена при аминокрая и/или карбоксикрая към не-HCV аминокиселинна последователност, като по този начин полипептидът би бил “слят полипептид”. Аналогични типове на полипептиди могат да бъдат конструирани с помощта на епитопи от други дадени протеини.

“Вариант” нададен полипептидсе отнася до полипептид, в който аминокиселинната последователност на дадения полипептид е била изменена чрез делеция, заместване, добавяне или разместване на една или повече аминокиселини в последователността. Методи, чрез които се получават варианти (например, чрез рекомбинация) или са направени (например, чрез сайт насочена мутагеназа), са известни.

“Трансформиране” се отнася до въвеждане на екзогенен полинуклеотид в гостоприемникова клетка, независимо от използвания метод за въвеждане, например, директно взимане, трансдукция (включително вирусна инфекция), f-удвояване или електропорация. Екзогенният полинуклеотид може да бъде запазен като неинтегриран вектор, например плазмиден или вирусен геном, или обратно, може да бъде интегриран в гостоприемниковия геном.

“Индивид се отнася до vertebraia (гръбначни) , по-специално до някои видове бозайници, и включва, но не се ограничава до гризачи (мишки, плъхове, хамстери, морски свинчета), зайци, кози, свине, говеда, овце и примати (шимпанзета, Африкански зелени маймуни, бабуини, орангугани и хора).

Както се използва тук, “лечение” се отнася до което и да е от (i) предотвратяване на инфекция или реинфекция, както при традиционното ваксиниране, (ii) редуциране или елиминиране на симптомите, и (iii) съществено или пълно елиминиране на вируса. Лечението може да бъде профилактично (преди инфекцията) или терапевтично (следващо инфекцията).

Терминът “ефективно количество” се отнася до количество от носещия епитопа полипептид, достатъчно да индуцира имуногенен отговор у индивида, спрямо който се прилага, или в друг случай да прояви имуногенна реакция, която може да бъде установена в дадената система (например, имунологична проба). За предпочитане е ефективното количество да бъде достатъчно да въздейства при лечението, както е определено по-горе. Точното необходимо количество варира в зависимост от приложението. За ваксинални приложения или за генериране на поликлонални антисерум/антитела, например, ефективното количество може да варира в зависимост от вида, възрастта и общото състояние на индивида, различията в условията на третиране, специфичността на подбрания полипептид, начина на въвеждането му и т.н. Счита се също, че ефективното количество може да бъде установено в рамките на голям, некритичен интервал. Подходящо ефективно количество може да бъде определено с помощта само на рутинни експерименти.

Както се използва тук, “биологична проба се отнася до проба от тъкан или течност, изолирани от даден индивид, например, плазма, серум, спинална течност, външните части от кожата, респираторния, интестиналния и гениталния тракт, сълзи, слюнка, мляко, кръвни клетки, тумори, органи, биопсии и така също проби от in vitro клетъчно културални конституенти (кондиционирана среда, получена при развитието на клетките в клетъчно културалната среда, например, МаЬ продуциращи миеломни клетки, рекомбинантни клетки и клетъчни компоненти).

Имунореактивните полипептидни състави от настоящото изобретение включват смес от изо.тирано- или груповоспецифични епитопи от поне един HCV VD, По този начин в тях ще присъстват поне две хетерогенни аминокиселинни последователности, всяка определяща един епитоп, намерен в отличими HCV изолати, локализирани в същото или по същество същото място в даден HCV протеин; т.е. всяка последователност е разположена на едно и също място в рамките на НСV геном/полипептид. Доколкото последователностите са хетерогенни, местонахождението им се отнася както вариабилен домен (VD).

За по-добро пояснение на изобретението, най-напред ще бъдат обяснени отделните аминокиселинни последователности, влизащи в неговия състав. Следва описанието на множеството от такива последователности, които са установени з съставите съгласно изобретението.

Аминокиселинната последователност, която характеризира полипептидите от изобретението има основна структура както следва:

Ц - z - L’_y (I) в която Z представлява аминокиселинната последователност от област на протеина от подбран HCV изалат, където тази област обхваща поне един вариабилен домен и вариабилният домен обхваща поне един епитоп. L и L’ са неHCV аминокиселинни последователности, които не съдържат вариабилен домен, и които могат да бъдат еднакви или различни, у и у’ са 0 или 1 и могат да бъдат еднакви или различни. По този начин формула (²) представя аминокиселинна последователност, обхващаща последователността на един HCV VD, където VD включва епитоп.

Както бе дискутирано по-горе, епито път(ите) в Z обикновено ще включват минимум от около 5 аминокиселини, по-типично е те да са около 8 и дори още по-типично е да са минимум от около 10 аминокиселини.

Вариабилният домен от Z може да обхваща повече от един епитоп. Вариабилният домен от Z е поне толкова голям, колкото комбинираните последователности от присъстващия епитоп, като по този начин при наличието на един епитоп се съдържа минимум от около 5 аминокиселини. Доколкото епитопите могат да се припокриват, минимумът аминокиселинни последователности за комбиниран епитоп във вариабилен домен може да бъде по-малка от сумата от индивидуални последователности на епитопите.

Ζ е аминокиселинната последователност от един HCV изолат, включващ описаната погоре VD. По този начин минималният размер на Z е минималният размер на VD. Z може да включва повече HCV аминокиселинни последователности освен единствено CD, и дори повече от една CD. Обикновено, обаче, Z е последователността от целия HCV палипротеин (по-специално El, E2/XS2 NS3, NS4 и NS5) или дори нещо повече - фрагмент от такъв HCV протеин. По този начин, Z за предпочитане ще бъде в границите от минимум около 5 аминокиселини (попредпочитано около 8 или около 10 аминокиселини минимум) до максимум 1100 аминокиселини (по-предпочитано около 500, още по-предпочитано максимум около 400 или дори по-предпочитано максимум от около 200 аминокиселини максимално). Нещо повече, полипептидът от формула I и/или Z, когато са получени чрез, например, химичен синтез, включва около 50 аминокиселини, около 40 аминокиселини, но найвече включва - максимум от около 30 аминокиселини.

He-HCV аминокиселините последователности, L и L’, ако присъстват, могат да определят която и да е от множеството с подобна последователност. Например, L и L’ могат да представляват последователности на не-HCV, към които е слят Z, за да улесни рекомбинантната експресия (например, β-галактозидаза, супероксид, дисмутаза, инвертаза, α-фактор, ТРА лидер и др.), както бе посочено по-горе. Обратно, L - L’ могат да представляват епитопи на други патогени, като вируса на хепатит В. Bordetella pertussis, тетанусов токсоид, дифтерия и др. за осигуряване на състави, които са имунореактивни по отношение на много други патогени. L и L’ могат да бъдат аминокиселинни последователности, които улесняват присъединяването към твърда повърхност по време на пептидния синтез, повърхности, използвани при имунологичните изследвания, носещи протеини на ваксини и др. Фактически, L и L’ могат дори да обхващат една или повече излишни аминокиселини, без функционални преимущества. Няма критичен максимален размер за L и L’, дължината се регулира главно чрез желаната функция. Типичното е L и L’ всеки да бъде максимум от около 2000 аминокиселини, по-типично - максимум от около 1000 аминокиселини. Големината на L и L’ последователностите с полезни свойства ще бъде максимум около 500 аминокиселини. Желателно е, разбира се, да се подберат такива L и L’, че да не блокират имунореактивността на Z.

Съставът от полипептиди съгласно изобретението се характеризира чрез присъствието (в ефективно количество за имунореактивност) в рамките на състава от поне две аминокиселинни последователности, определени както следва с помощта на формула II и III, съответно:

Ц - Z, - Ц. (П)

L-L₂-L'_y, (III) където L, L’, у и у’ са дефинирани погоре, независимо от формулите II и III.

Z] и Zj са всеки поотделно HCV аминокиселинни последователности, както са определени по-горе за Z, включващ същата вариабилна област (т.е. физично разположение), но получена от различни HCV изалати, притежаващи помежду си поне един хетерогенен епитоп в обща вариабилна област на и Z₂. Като пример за илюстрация, аминокиселинна последователност съгласно формула II би съдържала като Z₁ фрагмент хипервариабилна област, покриваща аминокиселините 384-414 от изолата HCV-1 (или по-специално 396-407 или 396-408), докато Zj е аналогов фрагмент от изолат HCV-J 1.1. Тези два изолата са хетерогенни в дадената област, като аминокиселинните последователности от епитопа варират значително.

Следва да се разбере, че съставите от настоящото изобретение може да включват повече от точно две дискретни аминокиселинни последователности съгласно формула I, и че Z последователностите могат да бъдат разделени на групи, включващи различни вариабилни области. Например, състав съгласно изобретението може да включва група от HCV последователности (с аминокиселинни последователности съгласно формула I), включващ хипервариабилната област при аминокиселини 384-411 от изолати HCV-1, HCV-J 1.1, HC-J4 и др. Съставът би могъл още да включва допълнителна група от HCV последователности (включително аминокиселинните последователности съгласно формула I), обхващайки вариабилната област при аминокиселини 215-255 също при изолати HCV-1, HCV-J 1.1, HC-J1, HC-J4 и др. По смисъла на контекста за състава съгласно настоящото изобретение, поради това, последователността от формула I може по-нататък да бъде дефинирана като:

sv

V представя аминокиселинна последователност, включваща последователността от един HCV вариабилен домен, включващ поне един епитоп; т.е. формула². S и п са цяло число 1 или повече. S представлява специален вариабилен домен, а η означава определен изолат. Например, S=1 би представлявал вариабилният домен при аминокиселини 215-255; S“2 - вариабилният домен при аминокиселини 215-255; и п^ж1. 2, 3 и 4изолати HCV-1, HCV-J.l, НС-Л и J4, съответно. По този начин двете групи от последователности могат да бъдат представени чрез:

Група 1: IV,, 1V₂, IV, & 1V₄Група 2: 2V,, 2V,, 2V₃ & 2V₄

Налице са поне две отчетливи последователности от формула IV в съставите съгласно настоящото изобретение; например, съставът съдържа две различни последователности съгласно формула IV, където стойностите на S или η са различни. Например, присъстват поне IV, и IV,, или поне 1V₍ и 2V,, или поне IV, и 2V,.

Отчетливите последователности, които попадат в обхвата на формула I, са представени в състава както с едни и съши, така и с различни полипептидни молекули. С помощта на минималната комбинация от 1V, и IV, като илюстрация, тези две последователности могат да бъдат представени в същата полипептидна молекула (т.е. 1V,-1V,) или в отделни молекули. Тази характеристика на съставите от настоящото изобретение може да бъде описана като състави от полипептиди, както следва:

R_r - <sv_a)_x - r; (V) където S, V и η са описани по-горе; R и R’ са аминокиселинни последователности от около до 2000 аминокиселини и могат да са една и съща или различни; г и г’ са 0 или 1, и са една и съща или различни; х е цяло число >1; η е независимо подбрано за всяко х; и при положение, че аминокиселинните последователности се съдържат в състава, представляващ комбинация, подбрана от групата, състояща се от (i) IV, и IV,, (ii) IV, и IV,, и (iii) IV, и 2V,. Във вариантите за изпълнение на изобретението, където отчетливите последователности от формула IV са в различни пептиди, х може да бъде 1, макар че може да бъде и > 1, по желание; т.е. смес от полипептиди 1V,-1V, и 1V,-2V,. Когато х е 1, г и г’ са за предпочитане и двете 0, за да се избегне излишъкът от L_y и L’_y„ доколкото V може да бъде описан в предпочитания вариант на изпълнение съгласно формула I. Когато х е >1, комбинираните дължини от R и съседният L, и R’ и съседния L’, са за предпочитане не повече от типичните максимални дължини, описани по-горе за L и L’.

Подборът на HCV аминокиселинните последователности, включени в отчетливите V последователности от съставите, ще зависи от приложението на последователностите. На първо място НС V епитопите следва да бъдат систематизирани в два типа. Първият тип епитопи са онези, които са “групово-специфични”; например, съответстващите епитопи във всички или почти всички изолати в рамките на една група от HCV изолати, са имунологично кръстосано-реактивни с всеки друг, но не и със съответстващите епитопи от по същество всички изолати от друга група. За предпочитане, епитопите в групово-специфичен клас са съхранени в рамките на групата, но не и между групите. Вторият тип епитопи са онези, които са “изалат-специфични”, например, епитопьт е имунологично кръстосано-реактивен с всички или по същество всички отчетливи изолати.

Тези групово- или изолатспецифични епитопи могат да бъдат идентифицирани по смисъла на настоящото изобретение. Първо, последователностите от различни HCV изолати се сравняват, както е описано тук, и областите със секвенционна хетерогенност се идентифицират. Образците на хетерогенност обикновено индикират специфичност за групата или за изолата. Ако за дадена идентифицирана област е известно, че съдържа един или повече епитопи, тогава последователността със задоволителен размер, за да включи желаните епитопи, е подбрана както към вариабилна област, която може да бъде включена в съставите съгласно изобретението. Ако за дадена хетерогенна област не е известно да е имунореактивна, пептидите, представляващи последователностите, намерени в дадената област от различните НС V изолати, могат да бъдат получени и изследвани. Изследването може да включва имунологично изследване с различни източници от анти-HCV антитяло (като серум на пациента, неутрализиращи Mabs, и др.) или продуциране на антитяло и тестване на способността на антитялото да неутрализира вируса in vitro. Алтернативно, локусите на епитопите, идентифицирани в протокола на изследване като този, описан по-горе, могат да бъдат изпитани за хетерогенност сред различните изолати с оглед изследване имунологичните свойства на хетерогенните последователности.

Счита се, че вариабилните домени от Е1 и/или E2/NS1 домените биха били от особен интерес за приложение като ваксини. По-специално, Е1 вариабилен домен в рамките на аминокиселините от 215-255 (фиг. 2), както и E2/NS1 вариабилен домен в рамките на аминокиселини 384414 (фиг. 3), са идентифицирани като важни имунореактивни домени. Предварителните доказателства предполагат, че един или двата от тези домени могат да бъдат локуси за хетерогенност, отговорни за избягването на мутанти, водещи до хронични HCV инфекции. Така, полипептидните състави, както са описани по-горе, където вариабилният домен (и) в V са един или двата от тези вариабилни домени, са особено предпочитани. Нещо повече, полипептидните състави от настоящото изобретение, доколкото частично засягат основните линейни епитопи във вариабилните домени, могат също да включват конформационни епитопи. Например, съставът може да бъде включен в смес от рекомбинантни Е1 и/или E2/NS1 протеини (проявяващи вариабилните домени от различни изолати), експресирани в дадена рекомбинантна система (напр., клетки на инсекти или бозайници), които съхраняват конформационни епитопи както вътре, така и извън вариабилния домен. Обратно, една Е1 и/или E2/NS1 антигенна единица от отделен изолат, който съхранява конформационните епитопи, може да бъде комбиниран с полипептиден състав съгласно изобретението (напр., смес от синтетични полипептидни или денатурирани рекомбинантни полипептиди). В друго предпочитано приложение като ваксини, полипептидните състави, описани тук, се комбинират с други HCV антигенни субединици, опи сани в “Hepatitis С Virus Asialoglycoproteins” (Attorney Docket No 0154.002) от Robert 0. Ralston, Frank Marcus, Kent B. Thidium, Barbara Gervase and John Hall.

За диагностично приложение би било полезно да се използват съставите съгласно изобретението като антигени, поради подобряване способността за установяване на антитяло за строго определени HCV изолати. Обикновено полипептидните смеси могат да бъдат използвани директно за изследване в хомогенна или хетерогенна форма, последната за предпочитане включваща имобилизирането на полипептидите върху твърда повърхност (например микротитърни блюда с ямки, пластмасови перли, нитроцелулоза и др.). Виж напр. WO90/11089; ЕР 360088; Immunoassay: a Practical Guide, supra. Обратно, всеки по същество идентичен полипептид, който образува полипептидния състав от настоящото изобретение, може да бъде имобилизиран върху същата повърхност при дискретни локуси, като по този начин обезпечава информация спрямо кой изолат или група е продуцирано антитялото. Това може да бъде по-специално важно в диагностиката, ако множество изолати причиняват хепатит, рак или други заболявания с различни клинични прогнози. Предпочитаната форма е Chiron RIBA™ ивичеста форма за имунологично изследване, описана в U.S.S.N. 07/138894 А и US 07/456637 А.

Полипептидите, приложими при производството на съставите от настоящото изобретение, могат да бъдат получени по рекомбинантен път, синтетично или чрез тъканна култура. Рекомбинантните полипептиди, включени в скъсената HCV последователност или в цялата дължина на протеините, могат да бъдат изградени изцяло от HCV последователности (с един или повече епитопа, изцяло прилежащи или неприлежаши), или последователности на слетия протеин. В слетите протеини полезните хетероложни последователности включват последователности, обезпечаващи секретирането от страна на рекомбинантния гостоприемник, благодарение на имунологичната реактивност на HCV епитопа (ите), или улесняват присъединяването на полипептида към повърхността или ваксиналния носител. ЕР 116201; US 4722840; ЕР 259149; US 4629783, които са включени в литературната справка.

Полипептиди с пълна дължина, както и включени в скъсени HCV последователности, и техните мутанти могат да бъдат получени чрез химичен синтез. Методите за получаване на полипептиди чрез химичното им синтезиране са известни. Те могат да бъдат получени също така и чрез рекомбинантна технология. ДНК последователност, кодираща HCV-1, като ДНК последователности с вариабилни области от други HCV изолати са описани и/или включени в литературната справка. Достъпността на тези последователности позволява конструирането на полинуклеотиди, кодиращи имунореактивни области на HCV полипептиди.

Полинуклеотиди, кодиращи желания полипептид, включени от един или повече от имунореактивните HCV епитопи от различни домени на HCV, могат да бъдат синтезирани по химичен път или да бъдат изолирани и да бъдат включени в експресионен вектор. Векторите могат или не да съдържат части от слети последователности, като β-галактозвдазаилисуперокащдисмутаза (SOD). Приложими методи и вектори за получаване на полипептиди, съдържащи слети последователности на SOD, са описани в ЕР 0196056.

ДНК, кодираща желания полипептид, независимо дали е в слята или в зряла форма и дали съдържа или не сигнална последователност, за да позволи секрецията, може да бъде лигирана към експресионни вектори, подходящи за който и да е удобен гостоприемник. Гостоприемниците след това се трансформират с експресионния вектор. Както еукариотните, така и прокариотните гостоприемникови системи понастоящем се използват за формиране на рекомбинантни полипептиди. По-долу са представени сумарно някои от по-общите контролни системи и гостоприемникови клетъчни линии. Гостоприемниковите клетки са инкубирани при условия, които позволяват експресиране на желания полипептид. След това полипептидът се изолира от лизираните клетки или от културалната среда и се пречиства до необходимата за неговото приложение степен на чистота.

Известни са основните похвати, използвани при екстрахиране на HCV генома от даден вирус, получаване и проби за ДНК библиотеки, секвениране на клонове, конструиране на експресионни вектори, трансформиране на клетки, осъществяване на имунологични изпитания като радиоимуноизследвания и ELISA изследвания, култивиране на клетки в култура и други.

Трансформирането на вектора, съдържащ желаната последователност в подходящ гостоприемник, може да бъде осъществено по който и да е познат метод за въвеждане на полинук леотиди в госгоприемникова клетка, включително, например, опаковането на полинуклеотида във зирус и трансдукцията на гостоприемниковата клетка с вируса, или чрез директно поглъщане на полинуклеотида. Използваната процедура за трансформиране зависи от гостоприемника, подлежащ на трансформиране. Бактериалната трансформация чрез директно поглъщане обикновено се осъществява чрез третиране с калциев или рубидиев хлорид (Cohlen, 1972), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69:2110. Трансформирането на дрождите чрез директно поглъщане може да бъде осъществено по метода на Hinnen et al. (1978), J. Adv. Enzyme Reg. 7: 1929. Трансформирането на бозайникови клетки чрез директно поглъщане може да бъде осъществено по метода на преципитиране с калциев фосфат на Graham and Van cer Eb (1978), Virology 52:546, или различни познати модификации на този метод. Други методи за въвеждане на рекомбинантни палинуклеотиди в клетки, по-специално в клетки на бозайници, които са познати на специалистите в областта, включват декстраново медиираната трансфекция, калциево-фосфатно медиирана трансфекция, полибреново медиирана трансфекция, протопластна фузия, електропорация, капсулиране на полинуклеотиди в липозоми и директно микроинжектиране на полинуклеотиди в ядро.

С оглед получаване на желани кодиращи последователности, гостоприемникови клетки се трансформират с полинуклеотиди (които могат да бъдат експресионни вектори), които да са зключени в контролни последователности, оперативно свързани към желани кодиращи последователности. Контролните последователности са съвместими с посочения гостоприемник. Сред прокариотните гостоприемници, най-често се използва Ξ. coli. Експресионните контролни последователности за прокариоти включват промотори, факултативно съдържащи операторни частици и рибозомални свързващи сайтове. Векторите за трансфер, съвместими с прокариотните гостоприемници, са най-общо получени от, например рВЙ322-плазмидсъдържащ оперони, допринасящи за ампицилинова и тетрациклинова резистентност, и различните pUC вектори, които също съдържат последователности на допринасящите за антибиотичната резистентност маркери. Промоторните последователности могат да бъдат природно срещани, например, β-лактамаза (пеницилиназа) (Weisman, 1981), “The cloning of interferon and other mistakes” in Interferon 3 (ed. I. Gresser), лактоза (lac) (Chang et al. (1977), Nature 198:1056) и триптофан (trp) (Goeddel et al. (1980), Nucl. Acids Res. 8:4057), и а-получена P_L промоторна система и N генен рибозомален свързващ сайт (Shimatake et al. (1981), Nature 292:128). В допълнение, синтетични промотори, които не се срещат в природата, също функционират като бактериални промотори. Например, транскрибционни активиращи последователности от един промотор могат да бъдат съединени с последователностите на оперена на друг промотор, създавайки синтетичен хибриден промотор (например, tac промотор, който е получен от последователности на trp и lac промотори (De Boer et al. (1983), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:21). Описаните системи специално са конкурентни на Е. coli; по желание, могат да бъдат използвани други прокариотни гостоприемници като щамове на. Bacillus или Pseudomonas със съответните контролни последователности.

Еукариотните гостоприемници включват дрождеви и бозайникови клетки в културални системи. Най-широко използваните дрождеви гостоприемници са Saccharomices cerevisiae и Saccharomices carlsbergensis и са удобни фунгални гостоприемници. Дрождевите конкурентни вектори обикновено носят маркери, които позволяват подбор на успешни трансформанти чрез осъществяване на прототрофия срещу ауксотрофни мутанти или устойчивост на тежки метали у дивите щамове. Дрождевите съвместими вектори могат да използват двумикронното начало на репликация (Broach et al. (1983), Meth. Enz. 101:307), комбинацията от CEN3 и ARS1 или други средства за осигуряване на репликацията, като последователности, които биха довели до включване на подходящ фрагмент в гостоприемниковия клетъчен геном. Контролни последователности за дрождеви вектори са познати за специалистите в областта и включват промотори за синтез на гликолитични ензими (Hess et al. (1968), J. Adv. Enzyme Reg. 7:149); например, алкохол дехидрогеназа (ADH) (E.P.O. Publication № 284044), енолаза, глюкокиназа, глюко-6фосфатизомераза, глицералдехид-3-фосфат дехидрогеназа (GAP или GAPDH), хексокиназа, фосфорцитокиназа, 3-глицерофосфатмутаза и пируваткиназа (РуК) (ЕР 329203). Дрождевият РН05 ген, кодиращ кисела фосфатаза, също осигурява полезни промоторни последователности.

В допълнение, синтетични промотори, които не се срещат в природата, също функционират като дрождеви промотори. Например, активиращите в посока upstream последователности (UAS) от един дрождев промотор може да бъде свързана с областта за активиране на транскрибцията от друг дрождев промотор, създавайки синтетичен хибриден промотор. Примери за такива хибридни промотори включват ADH регулаторна последователност, присъединена към GAP областта за активиране на транскрибцията (US 4876197 и US 4880734). Други примери за хибридни промотори включват промотори, които се състоят от регулаторните последователности както от ADH2, GAL4, GAL10 или РН05 гените, комбинирани с областта за активиране на транскрибцията на гена на гликолитичния ензим, напр. GAP или РуК (ЕР 164556). Нещо повече, дрождев промотор може да включва природно срещани промотори от недрождев произход, който притежава способността да свързва дрождева РНК полимераза за подходящо иницииране на транскрибцията.

Други контролни елементи, които могат да бъдат включени в дрождевите експресионни вектори, са терминатори, напр. от GAPDH, и от енолазния ген (Holland (1981), J. Biol. Chem. 256:1385) и лидерни последователности. Лидерният секвенционен фрагмент обикновено кодира сигнален пептид, включен в хидрофобни аминокиселини, които насочват секретирането на протеина от клетката. ДНК, кодираща подходящи сигнални последователности, могат да бъдат получени от гени за секретираните на дрождеви протеини, като генът за дрождева инвертаза (ЕР 12873) и генът за α-фактора (US 4588684). Обратно, лидери с недрождев произход, например интерферонови, също осигуряват секрецията в дрожди (ЕР 60057). Предпочитаният клас от секреторни лидери са онези, които използват фрагмент от дрождевия ген за α-фактора, който съдържа както “пре” сигнална последователност, така и “про” област. Типовете на α-факторните фрагменти, които могат да бъдат използвани, включват препро-а-факторния лидер с пълната му дължина, както и същински α-факторни лидери (US 4546084 и US 4870008; US 324274). Допълнителни лидери, използващи α-факторен лидерен фрагмент, който обезпечава секрецията, включват хибридни а-факторни лидери, образувани от пре-последователносг на една дрождева клетка и про-област от втори дрождев α-фактор. (WO 89/02463).

Експресионни вектори, както екстрахромозомни репликони, така и интегриращи вектори, са създадени с оглед трансформиране в много дрожди. Например, експресионни вектори са получени за Candida albicans (Kurtz et al. (1986), 5

Mol. Cell Biol. 6:142), Candida maltosa (Kunze et al. (1985), J. Basic Microbiol. 25:141), Hanzenula polymorpha (Gleeson et al. (1986), J. Gen. Microbiol. 132:3459), Kluiveromicesfragilis (Dasetal. (1984), J. Bacteriol. 154: 1165), Kluiveromices lactis (De 10 Louvencourt et al. (1983), J. Bacteriol. 154: 737), Pichia guillerimondii, (Kunze et al. (1985), supra), Pichia pastoris (Cregg et al. (1985), Mol. Cell. Biol. 5:3376; US 4 837 148 и US 4 929 555)), Schizosaccharomyces pombe (Beach and Nurse 15 (1981), Nature 300:706) и Yarrowia lipolitica (Davidow et al. (1985), Curr. Genet. 10:39).

Като подходящи гостоприемници за експресия са известни и клетъчни линии от бозайници. Последните включват клетъчни линии, достъпни 20 от American Type Culture Collection (ATCC), като например Hela клетки, овариални клетки от Китайски хамстер (СНО), бъбречни клетки от хамстер в младенческа възраст (ВНК), COS маймунски клетки и много други клетъчни линии. 25 Подходящи промотори за клетки на бозайници също са известни в областта и включват вирусни промотори като тези от Simian virus 40 (SV40), Rous sarcoma virus (RSV), adenovirus (ADV) и говежди папиломен вирус (BPV) (виж Sambrook 30 (1989) за примери на подходящи промотори). Бозайниковите клетки могат да изискват освен това терминаторни последователности и поли А допълнителни последователности; подсилващите последователности, т.е. такива, които подсилват 35 експресията, също могат да бъдат включени, а също и такива, които причиняват амплификация на гена също са желателни. Посочените последователности са известни.

Познати са и подходящите за репликация 40 в бозайникови клетки вектори. Последните могат да включват вирусни репликони или последователности, които обезпечават интегриране на подходящи последователности, кодиращи желаните полипептиди в гостоприемниковия геном. 45

Вектор, приложим за експресия на чужда ДНК и който може да бъде използван също и при получаването на ваксини, е Vaccinia вирус. В този случай, хетероложната ДНК е инсертирана в генома на Vaccinia. Техниките за инсертиране 50 на чуждата ДНК във ваксиналния вирусен геном са познати в областта и използват, например, хомоложна рекомбинация. Инсертирането на хетероложната ДНК обикновено е в ген, който е неесенциален в природата, например, генът на тимидин киназа (tk), който освен това осигурява селективен маркер. Описани са плазмидни вектори. които силно улесняват конструирането на рекомбинантните вируси (виж, например, Mackett etal. (1984) in “DNA Cloning”, Vol. II. IRLPress, p. 191, Chakrabarti et al. (1985), Mol. Cell Biol. 5:3403; Moss (1987) in “Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells” (Miller and Calos, eds., p. 10). След това експресия на желаните полипептиди, включени в имунореактивните региони се осъществява в клетки или индивиди, които са инфектирани и/или имунизирани с жив рекомбинантен Vaccinia вирус.

Други системи за експресия на полипептиди включват клетки на насекоми и вектори, подходящи за приложение върху тези клетки. Тези системи са познати и включват, например, насекомни експресионни трансфер вектори, получени от бакуловируса Autographa califomica ядрен полихидрозен вирус (AcNP V), който е хелпер-независим, вирусен експресионен вектор. Експресионни вектори, получени от тази система, обикновено използват силния вирусен полихидронен генен промотор за водене на експресията на хетероложни гени. Напоследък най-широко използваният трансфер вектор за въвеждане на чужди гени в AcNPV е рАс373. За подобряване на експресията са проектирани много други вектори, познати на специалистите в областта. Те включват, например, pVL985 (който изменя полихедрон старт кодона от ATG на АТТ, и който въвежда BamHl клониращ сайт от 32 двойки бази в посока downstream от АТТ; Виж Luckow and Summers (1989), Virology 17:31. Добра експресия на нефузионни чужди протеини обикновено изискват чужди гени, които по идея притежават къса лидерна последователност, съдържаща подходящи транслационни сигнали, предшестващи ATG стартсигнала. Плазмидът също така съдържа полихедроновия полиаденилационен сигнал и ампицилинрезистентния (amp) ген и източник на репликация за подбор и размножаване в Е. coli.

Методи за въвеждането на хетероложна ДНК в желания сайт в бакуловируса са познати в областта. (Виж Summers and Smith, Texas Agricultural Experiment Station Bulletin No 15555; Ju et al. (1987), in “Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells” (Miller and Calos, eds.); Smith et al.

(1989), supra). Например, инсерцията може да бъде осъществена в ген като полихедроновия ген чрез хомоложна рекомбинация; инсерция може да бъде също в мястото на рестрикция с рестрикционния ензим в конкретен бакуловирусен ген. Инсертираните последователности могат да бъдат такива, които кодират всички или различни сегменти от желаните HCV полипептиди, включително при поне един епитоп от вариабилния домен.

Сигналите за постранслационни модификации, например разграждане на сигнален пептид, протеолитично разграждане и фосфорилиране, очевидно се разпознават от клетките на насекоми. Сигналите, необходими за секретиране и ядрено акумулиране също очевидно се съхраняват между клетките на гръбначни и на безгръбначни. Примери за сигнални последователности от клетки на гръбначни, които са ефективни в клетки на безгръбначни, са познати в областта, например, човешки интерлевкин-2 сигнал (IL2), който е сигнал за транспортиране извън клетките, се разпознава и наистина се отстранява от клетките на насекоми.

Често е желателно полипептидите, използващи горните гостоприемникови клетки и вектори, да бъдат слети полипептиди. Както и неслетите полипептиди, слетите могат да останат интрацелуларни след експресиране. Обратно, слети протеини могат също да бъдат секретирани от клетката към културалната среда, ако са обхванати от лидерния секвенционен фрагмент. За предпочитане, съществуват действащи сайтове между лидерния фрагмент и останалия от чуждия ген, който може да бъде разграден както in vivo, така и in vitro.

В случаите, когато съставът следва да бъде използван за лечение на HCV, желателно е той да бвде имуногенен. Тогава, когато синтезираният полипептид е с правилна конфигурация, така че да обезпечи коректен епитоп, но е твърде малък, за да бъде имуногенен, полипептидът може да бъде свързан към подходящ носител. Множество техники за получаване на подобно свързване са известни в областта, включително формирането на дисулфидни връзки с помощта на N-сукцинимидил-3-(2-пиридил-тио)пропионат (SPDP) и сукцинимидил 4-(1Ч-малеимвдометил) циклохексан1-карбоксилат (SMCC) (ако в пептида отсъства сулфхидрилна група, тя може да бъде осигурена чрез добавяне на цистеинов остатък). Тези реагенти създават дисулфидно свързване помежду им и пептидните цистеинови остатъци от един протеин и една амидна връзка през ε-амино от лизин или друга свободна аминогрупа в други аминокиселини. Познати са множество такива дисулфид/амидформиращи средства. Виж, напр. Immun. Rev. (1982) 62:185, “Други бифункционални свързващи средства за тиоетерно вместо дисулфидно свързване”. Много от тези тиоестерформиращи агенти са търговски стоки и включват реактивни естери на 6-малеимидокапроинова киселина, 2-бромооцетна киселина, 2-йодооцетна киселина, 4-(М-малеимидо-метил)циклохексан-1карбоксилна киселина и други подобни. Карбоксилните групи могат да бъдат активирани чрез комбинирането им със сукцинимид или 1-хидроксил-2-нитро-4-сулфонова киселина, натриева сол. Допълнителни методи за свързване на антигени използват ротавирусната / “свързващ пептид” система, описана в ЕР 149259. Могат да бъдат използвани също и много модификации на посочените съединения.

Може да се прилага какъвто и да е носител, който сам по себе си не индуцира продукцията на антитела, вредни за гостоприемника. Подходящите носители са обикновено големи, бавно метаболизиращи макромолекули като протеини; полизахариди като активирана с латекс сефароза, агароза, целулоза, целулозни перли и други подобни; полимерни аминокиселини като полиглутаминова киселина, полилизин и др.; аминокиселинни кополимери; и инактивирани вирусни частички. Специално приложими протеинови субстрати са серумни албумини, хемоцианин, имуноглобулинови молекули, тироглобулин, овалбумин, тетанусов токсоид и други известни протеини.

Имуногенността на епитопите от HCV вариабилните домени, по-специално Е1 и Е2/ NS1, може също да бъде подсилена чрез получаването им в еукариотни системи, слети с или комбинирани с частичко-формиращи протеини, например тези, асоциирани с хепатит В повърхностен антиген. Виж, например US 4722840. Структурите, където полипептидът, съдържащ HCV епитопа от вариабилен домен, се свързва директно към частичко-формиращ протеин, кодиращ последователности, продуцира хибриди, които са имуногенни по отношение на HCV епитопа. В допълнение, всички от получените вектори включват епитопи, специфични за HCV, притежаващи различни степени на имуногенност, например, npe-S пептвда. Така частичките, конструирани от частичко-формиращ протеин, който включва HCV последователности, са имуногенни по отношение на HCV и HBV.

Показано е, че хепатитният повърхностен антиген (HBSAg) е формиран и събран в частици в S. cerevisiae (Valenzuela et al. (1982), Nature 298:344), както и, например, в клетки на бозайници (Valenzuella et al. (1984), in “Hepatitis B”, Milman I. et al., ed.). Показано е, че формирането на такива частички повишава имуногенността на мономерните субединици. Структурите могат освен това да включват имунодоминантния епитоп на HBSAg, включващ 55-те аминокиселини от преповърхностната (pre-S) област. Neurath et al. (1984). Структурите от pre-S-HBSAg частичките, подходящи за експресиране в дрожди, са разкрити в ЕР 174 444; хибриди, включващи хетероложни вирусни последователности за дрождева експресия, са разкрити в ЕР 175 261. Тези структури могат също да бъдат експресирани в клетки на бозайници като СНО клетки с помощта на 5У40-дихидрофолат редуктазния вектор (Michelle et al (1984)).

В допълнение, частици от частичко-формиращата протеинова последователност може да бъдат изместени с кодони, кодиращи епитоп от един HCV вариабилен домен. При това изместване областите, които не са необходими за медииране агрегирането на единиците за формиране на имуногенни частици в дрождеви или бозайникови клетки, могат да бъдат делетирани, по този начин елиминирайки допълнителни HCV антигенни сайтове от конкуренцията с HCV епитопа(ите).

Получаването на ваксини, които съдържат имуногенен полипептид (и) като активен иштредиент(и), е познато на специалистите в областта. Обикновено такива ваксини се приготвят като инжекционни - както течни разтвори, така и суспензии; твърди форми, подходящи за разтваряне или суспендиране в течности преди инжектирането, също могат да бъдат приготвяни. Получаването им може да се съпътства от емулгиране или полипептидьт(те) да бъде капсулиран в липозоми. Активните имуногенни ингредиенти често се смесват с ексципиенти, които са фармакологично подходящи и конкурентни с активната съставка. Подходящи ексципиенти са, например, вода, физиологичен разтвор, декстроза, глицерол, етанол или други подобни и комбинации между тях. В допълнение, по желание, ваксината може да съдържа малки количества от допълнителни субстанции като омокрящи или емулгиращи агенти, pH буферни агенти и/или помощни средства, които повишават ефективността на ваксината. Примери за помощни средства, които могат да бъдат ефективни, включват алуминиев хидроксид, Х-ацетил-мурамил-Ь-треонил-О-изоглутамин (thrMDP), азот-ацетил-нор-мурамил-Ь-аланил-О-изоглутамин (CGP 11637), отнасян като нор-MDP; №ацетилмурамил-1.-аланил-О-изоглутаминил-Ег аланин-2- (1 ’-2’-дипалмитоил-зп-глицеро-3-хидроксифосфорилокси)-етиламин (CGP 19835А, отнасян като МТР-РЕ и RIBI, който съдържа три компонента, екстрахирани от бактерия, монофосфорил липид А, трехалозо димиколат и скелет на клетъчните стени (MPL + TDM + CWS) в 2%ен сквален/Tween 80 емулсия. Ефективността на помощното средство може да бъде определена чрез измерване на количеството на антителата, насочени срещу имуногенен полипептид, съдържащ HCV епитоп от вариабилен домен, антителата, резултиращи от въвеждане на този полипептид във ваксини, които също са включени в различни помощни средства.

Протеините могат да бъдат включени във ваксината като неутрални или солеви форми. Подходящите във фармацевтично отношение соли включват соли с излишък на киселина (формирана със свободни аминогрупи от пептида) и които са образувани с неорганична киселина като хидрохлорна или фосфорна киселина, или органични киселини като оцетна, оксалова, тартарова и други. Соли, образувани със свободните карбоксилни групи, също могат да бъдат получени от неорганични бази, например, натрий, калий, калций, амоний или ферохидроксиди и такива органични бази, като изопропиламид, 2-етил-аминоетанол, хистидин, прокаин и др.

Ваксините се въвеждат парентерално чрез инжектиране, например както субкутатно, така и интрамускулно. Допълнителни форми, подходящи за други начини на въвеждане, включват супозитории и, в някои случаи, орални форми. Традиционните свързващи вещества и носители за супозиториите могат да включват, например, полиалкиленгликоли или триглицериди; такива супозитории могат да бъдат формирани от смеси, съдържащи активните ингредиенти в интервала от 0,5 до 10%, за предпочитане 1-2%. Оралните форми включват такива обичайно включвани ексципиенти като манитол, лактоза, нишесте, магнезиев стеарат, натриев захарин, целулоза, магнезиев карбонат и др. подходящи за формацевтични цели вещества. Тези съединения могат да са под форма на разтвори, суспензии, таблетки, прахове, капсули, издържали освобождаване форми или прахове и съдържат от 10 до 95% от активните ингредиенти, за предпочитане от 25 до 70%.

В допълнение към горното, възможно е да се изготвят и живи ваксини от атенюирани микроорганизми, които експресират рекомбинантни полипептиди от HCV антигенните вериги. Подходящи атенюирани микроорганизми са известни в областта и включват, например, вируси (например, vaccinia virus), а така също и бактерии.

Ваксините се въвеждат по начин, съответстващ на дозите, в които количеството би било профилактично и/или терапевтично ефективно. Количеството на въвеждане, което е обикновено в границите от 5 до 250 pg от антигена за доза, зависи от субекта, подлаган на третиране, капацитета на неговата имунна система да синтезира антитела и степента на желаната защита. Точното количество на необходимите за въвеждане активни ингредиенти зависи от преценката на лекуващия лекар и е специфична за всеки индивид.

Ваксината може да бъде давана по схема в единични дози, или за предпочитане, по схема с множество дози. Схемата с множество дози може да бъде такава, съгласно която първичният курс на ваксиниране може да бъде проведен с 110 отделни дози, последвани от други дози, давани в следващи във времето интервали, необходими за съхраняване и/или повторно засилване на имунния отговор, например, 1-4 месеца за втората доза, ако е необходимо, с последваща доза (и) след няколко месеца. Разпределението на дозите, ще се определя също, поне частично, в зависимост от нуждата на индивида и в зависимост от преценката на лекуващия лекар.

В допълнение, ваксината, съдържаща антигенния комплекс от HCV полипептидите, описани по-горе, могат да бъдат въвеждани и съвместно с други имунорегулаторни агенти, например, имуноглобулини.

Съставите съгласно настоящото изобретение могат да бъдат въвеждани у индивидите с оглед генериране поликлонални антитела (пречистени или изолирани от серум с помощта на конвенционални техники), които след това могат да бъдат използвани за много различни приложения. Например, поликлоналните антитела могат да бъдат използвани за пасивно имунизиране на индивиди или като имунохимични реагенти.

В друг вариант на изобретението описаните по-горе имунореактивни състави, включени в множество от HCV антигенни комплекси, се използват за насочване на анти-HCV антитела в рамките на биологични проби, включително кръвни или серумни проби. Конструирането на имунологичните проби силно варира и множество от вариантите са известни. Независимо от това, имунопробата ще използва антигенни комплекси, състоящи се от множество по същество идентични полипептиди, включващи аминокиселинната последователност от даден епитоп в рамките на първия вариабилен домен от даден HCV изолат и аминокиселинната последователност от един комплекс е хетерогенен по отношение на аминокиселинната последователност на поне един друг комплекс. Начините на провеждане на имунологичното изпитване може да се основават, например на конкурентност или директна реакция, или на сандвичев тип анализ. Освен това, може да бъдат използвани твърди повърхности или да бъдат имунопреципитирани. Повечето анализи включват използването на белязано антитяло или полипептид; маркерите могат да бъдат, например, флуоресцентни, хемилуминесцентни, радиоактивни или цветни молекули. Сигналите, които амплифицират сигналите от сондата, също са познати, примери за които са изпитвания с биотин и авидин и ензимнобелязани и медиирани имуноизпитвания, например ELISA.

Китове, удобни за имунодиагностика и съдържащи подходящи белязани реагенти, са конструирани посредством опаковането на съответните подходящи материали, включително съставите от изобретението, съдържащи HCV епитопи от вариабилни домени, в удобни контейнери, успоредно с останалите реагенти и материали (например буфери, солени разтвори и др.), необходими за провеждане на изпитването, а така също и съответните инструкции за това.

Следващите примери илюстрират изобретението, без да го ограничават.

Примери на изпълнение

В примерите са използвани следните материали и методи:

Проби от пациенти и РНК екстракция Асимптоматични HCV носители НСТ 18 и HCV Ли хронично инфектиран HCV пациент Th са описани от Weiner et al. (1991) Virol. 180: 842-848. Пациент Q е диагностициран като носител на хронично активен хепатит, на базата на чернодробна биопсия и е поставен на а-2Ь интер феронова терапия (3 милиона единици, три пъти в седмицата) за 6 месеца. РНК от 0,2 ml плазма се екстрахира съгласно метода на Chomcynski and Sacchi, (1987) Anal. Biochem. 162:156-159, c помощта на РНКзол™ В реагент (Cinna/Biotecx Laboratories), съдържащ 10 pg/ml MS2 носител на РНК (Boehringer Mannheim, 165-948), както е посочено от производителя. РНК се ресуспендира в 200 μΐ диетилпирокарбонатно третирана дестилирана вода и се репреципитира в крайна концентрация от 0,2М натриев ацетат и два и половина обема от 100% етанол (-20°С).

сДНК и полимеразни верижни реакции

Всички реакции са проведени съгласно Weiner et al. (1990) Lancet 335:1-5. Съгласуването на М13 се осъществява съгласно Messing et al. <1983), Methods in Enzymology 101:20-37. Koh5 сенсус последователностите от поне четири клонирани инсерта са представени с изключването на HCV J1.2 E2/NS1 последователност, получена от два клона.

Клонирането и секвенирането на НСТ 18 10 и Th се провежда така, както е докладвано от Weiner et al. (1991), по-горе. PCR праймерите, използвани за клониране на аминокрайния и проксимален сегмент на E2/NS1 у пациента Q, са:

PCR I

X ( Е2) 14 GGTGCTCACTGGGGAGTCCT (1367 -1386 ) S

X (Е2) 18J TCCATGGTGGGG.AACTGGGC (1608 - 1588 ) А, PCR П

Х(Е2)4 TCCATGGTGGGGAACTGGGC (1406 -1425 ) S

X ( Е2 ) 19J TGCCAACTGCCATTGGTGTT ( 1528 -1562 ) А;

PCR I

X (Е2) 14 (above) S

Jlrcl2 TAACGGGCTGAGCTCGGA (2313 - 2296 ) А

PCRH

US (Е2) 5 CAATTGGTTCGGTTGTACC ( 1960 - 1978 ) S

Jlrcl3 CGTCCAGTTGCAGGCAGCTTC (2260 - 2240 ) A.

PCR праймерите, използвани за клониране на HCV JI E2/NSaeHaca: PCR I

J1(E2)14 (above) S

Л (E2) rc30** CAGGGCAGTATCTGCCACTC ( 2349 - 2330 ) A

J1IZ - 2* TGAGACGGACGTGCTGCTCCT ( 1960 -1978 ) S

JI (E2) rc32** TTTGATGTACCAGGCGGCGCA (2658 - 2636) A PCR Π - E2384.5*

GGATCCGCTAGCCATACCCGCGTGACGGGGGGGGTGCAA (1469 -1495) S

DSCONUBX*

GGATCCICTAGATTACrcrTCrGACCTATCCCTGTCCTCCAAGT CACA (2272-2301)A *, nt последователност от Takeuchi et aL, (1990) NucL Acids Res. 18:4626; **,nt последователностот Kato etaL, (1989) Proc. Jpn. Acad. 65B: 219-223.

Сенс или антисенс праймери са дадени в 5’ към 3’ ориентация съгласно нуклеотидните номера в литературната справка.

Синтез на биотинирани пептиди

Припокриващите се октапептиди за хипервариабилните области на три щама от HCV са синтезирани върху линкер, способен на разграждане, производен и полиетиленови иглички, както са описани от Maeji et al., (1990) J. Immunol. Methods 134: 23-33, който се присъединява към N-края на всеки пептид. Накрая биотинът се присъединява към N-края с помощта на 150 μΐ диметилформамидов разтвор, съдържащ 40 тМ биотин, 40 тМ 1-хидроксибензотриазол (HOBt), 40 тМ бензогриазол-1-ил-окси-трис-пирилидонофосфониум хексафлуорофосфат (РуВОР, NOVABIOCHEM) и 60 тМ N-метилморфолин (NMM), реагиращи за една нощ при -20°С.

След биотинирането се извършва премахване на защитата на страничните вериги на пептидите и тяхното промиване и пептвдите от всяка игличка се разграждат в 200 μΐ 0,1 М фосфатен буфер (pH 7,2). Микротитьрните блюда, съдържащи разтворите от разцепени пептиди, се съхраняват при -20°С до необходимост.

Тестване по ELISA на биотинираните пептиди

Полистиренови блюда (Nunc immuno plate maxisorb R96) се покриват със стрептавидин чрез инкубиране за една нощ при 4°С с 0,1 ml/за кладенче от 5 pg/ml разтвор на стрептавидин (Sigma Cat. No. S4762) в 0,1 М карбонатен буфер при pH 9,6. След отстраняването на стрептавидиновия разтвор, ямките се промиват четирикратно с 0,1% разтвор на Tween 20 в PBS. Неспецифичните свързвания се блокират чрез инкубиране на всяка ямка с 0,2 ml от 2% BSA в PBS за 1 h при 20°С. След инкубирането, блюдата се промиват четирикратно с PBS/Tween 20. Всяка ямка се инкубира със 100 μΐ от подходящ разтвор на серум (разреден с 2% BSA в PBS, съдържащ 0,1 % натриев азид) за 1 h при 20°С или за една нощ при 4°С, последвано от четири промивания с PBS/Tween 20. Свързаното антитяло се открива чрез реакция за 1 h при 20°С в 0,1 ml конюгат. Той се състои от 0,25 ml/Ι (наситено ниво) белязан с пероксидаза от хрян кози анти-плъши IgG (H+L) (Kirkegaard and Perry Labs, Gauthersburg, MD) в CASS (0,1 % овчи серум, 0,1 % Tween 20, 0,1% натриев казеинат, разреден в 0,1 М PBS, pH 7,2). Ямките се промиват двукратно с PBS/ Tween 20, последвано от две промивания само с

PBS. Присъствието на ензима се открива посредством реакция за 45 min при 20°С с 0,1 ml прясно приготвен разтвор, съдържащ 50 mg амониев 2,2’-азино-бис [З-етилбензотиазолин-6-сулфонат (ABTS, Boeringer Mannheim Cat, no. 122661) и 0,03 ml от 35% (w/w) разтвор на разтвор на водороден прекис в 100 ml от 0,1 М фосфат / 0,08 М цитратен буфер, pH 4,0. Цветно развитие е измерено в Titertek Multiscan МС пластинка по двойно вълнистия начин при 405 nm срещу цитирана дължина на вълната от 492 nm.

Компютърно генериран антигенен профил Антигенните профили за HCV E2/NS1 протеин и HIV-1 gp 120 хипервариабилен регион V3 (аа 303 -338), са получени от компютърна програма, основана на степента на секвенционна вариабилност, както е предложено на Rabat [Sequences of proteins of immunological interest. U.S.Department of Health Service, National Institutes of Helth (1983)] за идентифициране на хипервариабилните бримки от имуноглобулини, мултиплицирани чрез средната от индивидуалните вероятности, която антитяло свързването е съхранило за всяка вероятна двойка аминокиселини. Вероятностите за съхраняване на антитяло свързването, асоциирано с дадено изменение на аминокиселина, са степените, експериментално определени чрез оценяване ефектите на антитяло свързване за всички възможни аминокиселинни замествания за 103 охарактеризирани линеарни епитопи. Geysen et al., (1988) J.Mol. Res.l:32-41. Taka този алгоритъм дава значението на индекса на вариабилност, за да придаде по-голяма значимост на аминокиселинните изменения, подобно на антитяло свързването, т.е. компенсира консервативните аминокиселинни изменения. Петнадесет HCV последователности [HCV-1, Q3.2, НСТ 23, ЕС10, HC-J1, HCVE1, TH, НСТ 27, Q1.2, НСТ18, HC-J4, HCV JI. 2/HCV J1.1, HCV J, HCV ВК], са използвани за определяне антигенния профил за HCV.H CV-1 V3 профилът е получен чрез осредняване на 242 индивидуални профила на 15 последователности, подбрани случайно от числово по-голяма база данни, състояща се от уникални HIV-1 последователности. La Rosa et al., (1990) Science 249:932-935 & Correction in Science (1991)p. 811.

Компютърно предсказани вторични структури

Спирала, β-sheet и β-tum вторични структурни варианти за аминокрайния регион (384420) са определени с помощта на алгоритъм, който определя възможностите за всяка от трите горни вторични структурни мотива спрямо всеки остатък. Използваните коефициенти в алгоритъма са получени за всички двойки комбинации от остатъци на структурната база данни. Levitt and Greer, (1977) J.Mol.Biol. 114:181-293. Предсказаните параметри, получени от тези коефициенти, пастват към наблюдавания резултат, когато алгоритъмът се прилага обратно върху базата данни за получаване вероятността даден остатък да бъде намерен в един от трите определени вторични структурни мотива.

Пример 1.

Сравнение на вторичната структура и варирането в аминокиселините в HCV E2/NS1 HV и HIV -1 gp 120 областите

Аминокиселините последователности от петнадесет HCV и H²V-1 изолати са сравнени по отношение числото на позициите, при които се наблюдава хетерогенност в аминокиселинната последователност в HCVE2 HV или H/V-l gp 120 V3 областите (фиг.4, А и В, съответно). Тиретата на х-оста на фиг.4А и В представят аминокиселините позиции, където вариабилните аминокиселинни остатъци се появяват и инвариантните аминокиселини са дадени в еднобуквен аминокиселинен код. Антигенните профили, показани на фигура 4, означават, че аналогично на V3 бримката от HIV-1 gp 120 протеина (фиг.4В), е идентифициран блок от аминокиселинни остатъци в HCV Е2 (аминокиселини 384-414 на фиг.4А), чиито вариации имат предсказуем неблагоприятен ефект върху антитяло свързването. Даните на фиг.4 показват, че HCV Е2 областта е сходна на HIV-1 gp 120 V3 областта, за която се знае, че кодира вирус неутрализиращи епитопи както по степен, така и по предсказуема значимост на наблюдаваните аминокиселинни вариации и предполага, че Е2 HV областта може да има аналогична функция, както gp 120 V3 областта.

Линеарните епитопи са в по-голямо подобие асоциирани с по-малко структурни региони от протеини, в частност, краищата на протеини, или с повърхностно удължени бримки. За предсказване вероятността даден отделен остатък да се асоциира с определен вторичен структурен мотив за 15 Е2 HV аминокиселинни последователности между остатъците 384 до 420 се използва компютърен анализ. Фиг.4 показва, че областта между Е2 аминокрайния остатък 384 и строго предсказания, добре съхранен β-tum (остатъци 415-418) е относително неструктурирано, както е показано с по-малко от 50% вероятност за аспирала, β-cheet или β-tum характер. Липсата на строго предсказуема структура в Е2 Η V домена се съгласува с устойчивостта на екстензивни секвеннионни вариации, намерени между изолатите, и е в противоположност на силно стурктурираните региони, определящи четвъртичната структура на протеина. HCV Е2 HV областта се явява дори по-малко структурирана от V3, по принцип неутрализираща област от HIV-1 gp 120, за която е докладвано, че съдържа β-верижен тип II ββtum α-верижно спиралообразен мотив и може да притежава по-голяма структурна строгост на аминокиселината вариабилност отколкото HCV Е2 HV домена. Като цяло, доказателството предполага, че Е2 HV доменът очевидно притежава характерна черта на протеинови области, които съдържат подобни сайтове на линеарни неутрализиращи епитопи.

Пример 2

Картиране на епитопите от HCV Е2/ NS1NV домена

Припокриващите се биотинирани 8-мерни пептиди, съответстващи на и разширяващи се зад E2/NS1 HV домена (аминокиселини 384 до 416) от НСТ 18 (A,D), Th (Ь,Е) и HCV JI (C,F), се свързват към блюда, покрити със стрептавидин и реагират с плазма както от НСТ 18 (А-С), така и с Th (D-F). Резултатите са показани на фиг.6 за HCV изолати HCY 18 (фиг.бА и 6D), Th (Фиг.бВ и 6Е), и HCV Л (Фиг.бС HCV и 6F). НСТ 18 плазма се разрежда 1:20 и Th плазма се разрежда 1500. HVE-1, -2, -3, -4 и -5 представят изолат специфичните епитопи.

Както може да се види от фиг.6, НСТ 18 плазма идентифицира линеарен епитоп (⁴⁰⁷PKQNV⁴¹¹) при тестване с пептиди, получени от НСТ18 последователността (HVE-I kd Brhw, d 6D), но не реагира с пептиди, съответстващи на HV домена от два различни щама Th и HCV Л (фиг. 6В и 6С). Противоположно на това, Th плазма идентифицира линеен епитоп HVE-IV в HV домен от HV на Th (⁴⁰⁹ QNIQLI⁴¹⁴, фиг.бЕ), и също епитопи в щам НСТ 18 (^3W IVRFFAP⁴⁰⁵, φΗΓ.όϋ) и HCV. J1 Jh 1, би могъл да бъде изложен на множество щамове HCV.

Както Th, така и НСТ 18 плазмата, реагират с епитоп (аминокиселини 413-419), общи за всичките три изолата (данни не са показани тогава, когато се използва ELISA със синтезирани припокриващи се 8-мерни пептиди от всеки изолат.

За да се оцени специфичността на свързването на антитялото, антитела, свързани към биотинирани пептиди и съдържащи аминокиселини 403-407, се елюират и се използват за блокиране реактивността на НСТ 18 плазма с иглички, съдържащи припокриващи се 8-мери за НСТ 18 HV домена. Тези данни показват, че 1) E2/NS1 HV доменът е имуногенен, 2) налице са множество епитопи, които прилягат към тази област и 3) комплекс от епитопи (HVE-1,-2,-3,-4 или -5 на фиг.6) в HV домена се изолират специфично.

Пример 3. Определяне на факта, че вариантни E2/NS1HV домени могат да бъдат асоциирани с избухвания на хепатит

За да се изследва възможността за намиране на HCV варианти, свързани с редуващи се избухвания на хепатит, често установявани при хроничните HCV инфекции, частично се секвенира E2/NS1 генът от пациента Q с хроничен хепатит по време на два отчетливи периода на заболяване приблизително две години назад (Q1 и Q3, съответно) . Вторият хепатитен епизод бе след назначаване на интерфероново лечение.

Различията в дедуцираната аминокиселинна последователност на Q1 и Q3 E2/NS1 HV област бяха поразителни само между аминокиселини 391-408 със седем от осем изменения, появяващи се между аминокиселина 398 и 407 <фиг.7). Фиг. 7 показва дедуцираните аминокиселинни последователности на два региона от E2/NS1 полипептида, аминокиселини 384-414 и 547-647, за Q1 и Q3 изолати. Аминокиселинната (Е) над Q1 последователността е установена в един от четирите Q1 клона. Заградените аминокиселини представят локализацията на Q1 или Q3 HVE 12-мерен пептид. Аминокиселинните 5 различия, установени между Q1 и Q3 са напечатани удебелено.

Между аминокиселини 547 и 647 от Q1 и Q3 E2/NS1 полипептидите (фиг.7) е установена само една аминокиселинна хетерогенност.

]θ За изпитване въздействието на аминокиселините замествания, наблюдавани в Q1 и Q3 Е 2 HV при антитяло свързването, се синтезира Q I и Q3 специфичен 12-мерен пептид от аминокиселини 396 до 407 (HVE Q1 или Q3 на фиг.7В) и ге осъществява специфична реакция на Q1 и Q3 плазма с всеки пептид в ELISA. Таблица 4 показва, че антителата както в плазма Q1, така и з плазма Q3 реагират с Q1 пептида, но не и с Q3 пептида. Статистическият анализ (Student’s Test) показва, че свързването на Q1/Q3 плазма към Q1 пептида е значително над нивото на свързването на тази плазма към блок от 12 случайно избрани контролни пептиди (Р < 0.001), докато свързването както на Q1, така и на Q3 плазмата към Q3 пептида не е статистически значимо. Данните показват, че макар пациентът Q да развива антитела спрямо HCV QI HV областта, които могат да бъдат открити, дори дзе години по-късно във времето при точка Q3, но се установява развитие на хуморален отговор срещу Q3 Е2 HV варианта, който е предоминантен по време на втория хепатитен епизод.

ТАБЛИЦА 4

Резултати, получени на El JSA за 12мерен педтид

TARFAGFFQSGA

TAGFVRLFETGP

плазма	QI seq	Q3 seq Стойност	sd
Стойност	sc
Q1	1.158	0.134	0.691	0.123
Q3	1.022	0.123	0.693	0.036

Пример 4.

Установяване на съвместно съществуващи E2/NS1 гени, различни FE2/NS1 HV домени в HCV инфектирани индивиди

Фигура 8А показва аминокиселинните последователности, изведени от два изолата на HCV Л (J1.1 & J1.2), които са клонирани от една плазмена проба на Японски доброволен донор на кръв HCV Л. Kubo et al., (1989) NucLAcids Res.l7:10367-10372. От общо 23-те аминокиселин ни изменения между HCV J1.1 и HCV J1.2, девет различия, индикирани с удебелен шрифт, са групирани в състоящия се от 30 аминокиселини E2/NS1 HV домен. Доколкото HCV Ле единствената група II HCV геном, която е клонирана съгласно изобретението, като че ли тези разлики се дължат на кръстосаното контаминиране на HCV Л плазмата. HCV Л.2 последователността представлява малката последователност в HCV Л кръвта, доколкото са идентифицирани само два E2/NS1 HV вариантни последователности от 7-те клонирани последователности, произхождащи от две независими PCR реакции.

Интересно е това, че сравнението на НСТ 27 и HCV Е1 изолатите (фиг.8В), които са секвенирани в различни лаборатории и са получени от несвързани по презумпция индивиди показва, че числото на аминокиселинните различия в Е2/ NS1 HV областта на тези изолати е по-малко от тези на наблюдаваните различия между изолати от същия индивид.

Описаните по-горе резултати водят до предположението, че HCV геномът е силнозастьпен в индивидите и популацията.

Пример 5. Формулиране и изготвяне на ваксина. Присъединяване на Дифтерийния токсоиден носещ протеин към MCS. Необходими материали:

- етилен диамин тетраоцетна киселина (EDJA Na^HjO) (MW 372);

- 6-малеимидо-капроинова киселина Nхидроксисукцинимиден естер (MCS);

- (Sigma) -95% чистота;

- натриев дихидрогенен ортофосфат (NaH₂PO₄);

- азот;

- диметилформамид - ΑΡΟΝ;

- мили Q вода;

- 0.1 М фосфатен буфер, съдържащ 5 mMEDTA, pH 6.66;

0.1 М фосфатен буфер, pH 8.0;

- 0.1 М фосфатен буфер, pH 7.0;

- натриев сукцинат [(CHj;COONa)₂.6H₂O];

- цистеин;

- хидрохлорна киселина (2% разтвор);

- 0.1 М натриев сукцинат/ 0.1 EDTA, pH 5.6. Пречистен дифтериен токсоид (Commonwealth Serum Laboratories, Victoria, Australia) се присъединява към MCS съгласно метода, описан от Lee et al., (1980) Mol. Immunol. 17:749; Partis et al., (1983) Prot. Chem. 2:263 Peeters et al., (1989) J.Immunol. Methods 120:133; Jones et al., 5 (1989) J; Immunol. Methods 123:211.100 ml от дифтерийния токсоид се прекарват през колона G25 Sephadex (17 х 4 cm) за отстраняване на тиомерсала. Токсоидът се елюира с 0.1 М фосфатен буфер с pH 7.0 и протеиновото съдържание IQ на елюата се изпитва с помощта на ВСА протеиново определяне (Pierce). Полученият в резултат разтвор се концентрира с помощта на Амиконова ултрафилтрационна единиид до крайна концентрация от 10 mg/ml.

1 ml от токсоидния разтвор се диализира с 0.1 М фосфатен буфер, pH 8.0 и след това се смесва с разтвор от 1.5 mg MCS в 200 μΐ DMF. Полученият в резултат разтвор се инкубира на стайна температура за 1 h на тъмно при разбъркване от време на време. За да се отдели несвързаният MCS от MCS-токсоида, разтворът се прекарва през колона Sephadex PD10, уравновесена с 0.1 фосфатен буфер, pH 6.66 и протеиновата фракция се събира.

Броят на малеимидовите групи, присъединени към една молекула носител, се определя преди присъединяването на HCV пептидите.

ml от сукцинат/EDTA буфера се поставят в азотна среда за 2 min. 5 mg цистеин се прехвърлят в 25 ml по обем колби и се разтварят 30 в 25 ml от така обработения буфер. Равни количества от разтворите, показани на таблица 5, се прехвърлят в две 25 ml бутилки със завинтващи се запушалки. С помощта на отделни пипета всяка от тях се продухва с азот. Всяка бутилка 35 след това се инкубира на стайна температура и на тъмно за 40 min при разбъркване от време на време.

ТАБЛИЦА 5

Разтвор	Проба (ml)	Стандарт (ml)	Празна (ml)
активиран	0.3	-	-
носител
фосфатен буфер	-	03	03
цистеинов	1.0	1.0	-
разтвор
сукцинатен	-	-	1.0

А* 0.1 ml количество от всеки от трите разтвора се взима за определяне по ЕИтап.

A* 0.1 ml количество от всеки от трите разтвора се взима за определяне по Ellman.

Тест на Ellman за количествено сулфхидрилно определяне

Необходими материали:

Фосфатен буфер, pH 8.0.

Разтварят се 15.6 g NaH₂PO₄ или 12.0 g NaH₂ РО₄ анхидрид в приблизително 700 ml Milli Q вода. pH се довежда до 8.0 с помощта на 50% NaOH. Добавя се Milli Q вода за краен обем от 1000 ml. Следва коригиране на pH, ако е необходимо.

Реагент на Ellman.

Разтварят се 10.0 mg от 5,5’-дитиобис-2нитробензолна киселина (DTNB) в 2.5 ml фосфатен буфер, pH 8.0.

0.1 ml от реагента на Ellman се добавя към всяка от 0.1 ml част на разтвора, приготвен както по-горе, наречени проба, стандарт и празни разтвори. 5 ml от фосфатния буфер, pH 8.0 след това се добавят към всяка от тези части, смесват се добре и се оставят за 15 min. Абсорбцията на всяка от частите се измерва в 1 cm клетка при 412 nm.

Броят на малеимидовите групи, присъстващи върху носещия протеин, се определя съгласно следния метод. 0.01 mol за ml разтвор на -SH предизвиква адсорбция от 0.136 в 1 cm светла пътека при 412 nm. Абсорбирането на Стандартната или на Проба (А) е еднакво на количеството цистеин, реагирало с присъединените малеимидови групи върху активирания носещ протеин. Докато 1 mol от свободните -SH реагират с 1 mol малеимидо, концентрацията в цгпо! на малеимидовите групи, присъстващи в тестваната част, е еднаква на А (0.01)/0.136 pmol/ml. Общият обем на разтвора е 5.2 mi. Поради това общият брой на присъстващите μπιοί е равен на А(0.01) (5.2)/0.136. Разтворът на пробата има общ обем от 1.3 ml, от които 0.3 представляват активиран носещ протеин. Количеството на малеимидовите групи, присъстващи в разтвора на пробата, се изчислява като А (0.01) (5.2) (1.3)/ (0.136) (0.1) (0.3) = А916 = 57) pmol/ml. MCS-активираният носещ протеин се съхранява при -20°С.

Редукция на HCV пептидите

Преди присъединяването на HCV пептидите към MCS- активирания носещ протеин, пептидите се редуцират така, че да е гарантирано тиоловите групи, присъстващи в пептида, да са в напълно редуцирана -SH форма.

Необходими материали:

- дитиотреитол (DDT);

- амониев хидроген карбонат (NH₄HCO₃);

- метанол;

SEP-PAKs (Cl8 патрон, Воден), 1 патрон за всеки 8 mg от пептида 0.1 М амониев хидроген карбонатен буфер

Разтварят се 7.9 g NH₄ НСО₃1 1 LMilli Q вода

Буфер А, 0.1% v/v трифлуороцетна киселина (TFA) в Milli Q вода.

Буфер В, 60% v/v ацетонитрил, 0.1 % v/v TFA в Milli Q вода.

mg от всеки два пептида, съответстващи на аминокиселини 384-411 и 225-260, съответно, от HIV полипротеина, се добавят към 2.5 ml от 0.1 М амониев хфидроген карбонат, съдържащ 10 кратно по-голямо маларно количество от DTT. Получените в резултат разтвори се смесват, докато пептидът се разтвори и след това се оставя на стайна температура. Две двойки SEP-PAKs се свързват в серии и се активират чрез прекарване приблизително 20 ml от метанола и след това 20 ml от Буфер А през всяка двойка от SEP-PAKs. Всяка пептидно/DTT проба се прекарва бавно през двойка от SEP-PAKs. DTT се елуира със 7 ml от Бефер В в предварително претеглена колба и след това се лиофилизира през нощта. След това колбите се претеглят за определяне количеството на възстановения пептид. Редуцираните пептиди след това незабавно се присъединяват към MCS-активиран носещ протеин.

Присъединяване на HIV пептиди към MCS-активиран носещ протеин

Приблизително 100 ml от 0.1 М фосфатен буфер с 5 mM EDTA, pH 6.66 се вакуумират и след това се напръсква с азот за 10 min.

ml от 10 mg/ml разтвор на MCS-актизиран носещ протеин внимателно се напръсква с азот за предотвратяване интензивното разпензане. 5 mg от всеки от редуцираните пептиди се разтваря в приблизително 0.2 ml от фосфатния буфер, обработен както по-горе, pH 6.66 и след това се смесва с разтвор на MCS-активиран протеинов носител. Получената в резултат смес се прехвърля в колба със запушалка на винт, която след това се пълни с азот и се запечатва. След това разтворът се обезгазява чрез поставяне на колбата в ултразвукова баня на Branson 2000 ® за 2 min. Колбата след това се покрива с алуминиево фолио и се инкубира за една нощ при стайна температура при бавно размесване на клатачка.

Полученият в резултат конюгат е разтворим и несвързаният пептид се отстранява чрез прекарване на сместа през колона на Sephadex PD 10, която се уравновесява с фосфатно/EDTA 5 буфер, pH 6.66. Протеиновата фракция се събира и количеството пептид, конюгирал с протеиновия носещ протеин, се определя чрез аминокиселинен анализ.

Провежда се аминокиселинен анализ на 10

150 μΐ части от конюгата и от носещия протеин. Определя се средното съотношение от нивото на аминокиселините, дължащи се на носещия протеин, за да се изчисли количеството на получения конюгирал пептид. Нивата на серин, треонин, триптофан, метионин, тирозин и цистеин не се определят, тъй като тези аминокиселини са модифицирани при условията на стандартната хидролиза. Типичните резултати, получени при тези изчисления, са представени в таблица 6.

ТАБЛИЦА6

АМИНО-	САМО НОСИТЕЛ	КОНЮГАТ
КИСЕЛИНИ
D	212	193
Е	194	170
G	153	108
R	60	56
А	150	384
Р	79	163

За конюгата стойностите на удебелените аминокиселини са на присъстващите в пептидите. За конюгати, съдържащи аланин и пролин, факторът (193 + 179 + 180 + 56)(+212 + 194 + 153 + 60) = 0.8659 се умножава по количеството на нивото на аминокиселините за нормализиране на резултата.

Получаване на ваксинални състави

Инжекционни състави, състоящи се от HCV пептиди, конюгирали с MCS-активирани дифтерийни токсоидни носители на протеин, се приготвят, както е описано по-горе и субмиконно маслено-водно емулсионно помощно средство, както е описано в WO 9014837. Допълнително се изготвят инжекционни състави, състоящи се от имуностимулант, липофилен мурамилов пептид (МТР-РЕ, CIBA-GELGY, Basel, Switzerland) в допълнение към HCV конюгиралите пептиди и помощното средство. Ваксиналните състави представляват общо 50% протеин и 50% помощно средство.

Формула за ваксинални състави с МТР-РЕ За получаване на 10 ml инжекционен ваксинален състав:

2.5 ml сквален (Sigma Chemical Co., St.Louis, Mo.)

0.25 ml Твин 80 (Sigma Chemical Co.)

0.25 ml SPAN 85 (Sigma Chemical Co.)

000 pg MTP-PE

000 pg HCV пептид, конюгирал c MCSактивиран дифтерии токсоиден носещ протеин.

Формула за ваксинален състав без МТР-РЕ.

За получаване на 10 ml инжекционен ваксинален състав:

2.5 ml сквален (Sigma Chemical Co., St.Louis, Mo.)

2.25 ml Твин 80 (Sigma Chemical Co.) 0.25 ml SPAN 85 \Sigma Chemical Co.) 1000 pg HCV пептид, конюгирал c MCSактивиран дифтериен токсоиден носещ проеин

Пример 6. Метод за тестване на ваксинални препарати за токсичност

Ваксината, изготвена съгласно методиката от пример 5, се тества за токсичност у малки животни. 50 mg/kg от ваксината се въвежда в морски свинчета, мишки и зайци чрез интраперитонеално инжектиране. Ваксината също така се въвежда чрез интраперитонеално инжектиране в маймуни резус и примати. Половината от тестваната популация от маймуните резус и приматите получават 5 pg/kg дози от ваксината, докато другата половина получава 50 pg/kg дози. Използваните контролни животни във всяко от изследванията се инжектират със сравнимо количество от състава, състоящо се от компонентите на ваксиналния препарат, с изключение на вирусните пептиди.

Всяко от животните се наблюдава за симп25 томи, показателни за отговор на токсичния материал, по-специално в продължение на две седмици се следи за треска, летария, загуба на теглото, изменения в хранителните навици и за лезии, подувания и чувствителност на мястото на инжектирането. Лимфните възли проксимално на мястото на инжектирането също се изпитват за подувания и/или изсъхване. Животните също така се наблюдават по за две седмици в цялостен период от няколко месеца.

Пример 7. Демонстрация на получаването на неутрализиращо антитяло у ваксинираните животни

Ваксина, получена съгласно методологията от примера 5, се тества в шимпанзета за определяне ефективността на ваксината при предизвикване продуцирането на вирус неутрализиращо антитяло у ваксинираните субекти. Шимпанзетата се ваксинират с доза 5 gg/kg ваксина, получена съгласно методологията, описана в пример 5, в продължение на период от над 6 мес. в интервали 0, 1, 3, и 6 месеца. Контролните шимпанзета се инжектират със сравними количества от състав, включващ компонентите от ваксината, с изключение на вирусните пептиди. Две седмици след въвеждането на последната доза, тестваните и контролните шимпанзета всяко се провокира с 10 СШ₅₀ (Инфекциозни за шимпанзетата единици) доза от CDC/910 плазмен инокулум. Започвайки една седмица след вирусната провокация, всяко от шимпанзетата се наблюдава за виремия в продължение на една седмица.

За откриване на виремиа, кръвните проби и чернодробната биопсия се събират от контролните и тествани животни в продължение на една седмица до няколко месеца. Тъканите, събрани от чернодробната биопсия, се изпитват хистологично за белези на некрозис и/или възпаление. В допълнение, хепатоцити от биопсичния материал се изпитват чрез електронна микроскопия за присъствие на тубули, характеризиращи HCV инфекцията. Кръвните проби също се анализират по метода ELISA, описан по-горе, за присъствието на антитела при сегментите на вирусните полипептиди, които не са използвани при получаването на ваксината. В частност, всяка от кръвните проби се скринира с ELISA за присъствие на антитела срещу NS₃, NS₄ и NS₃ пептиди. Присъствието на антитела спрямо тези пептиди в серума на шимпанзе е показателно за HCV инфекция.

За установяване на вирусни РНК, циркулиращи в плазмата или присъстващи в черно дробните биопсични тъкани, събрани от шимпанзепгга, се използва следният метод.

cPCR метод за откриване на HCV РНК в черен дроб и в серум

В cPCR пробите, вероятната вирусна РНК в проба е обратно транскрибирана в сДНК с обратна транскрибтаза; сегмент от получената в резултат сДНК след това се амплифицира с помощта на модифицирана версия на PCR техниката. описана от Saiki et al. (1986). Праймерите за ?CR техниката са получени от HCV РНК, която може да бъде идентифицирана със семейството от HCV сДНК, описани тук.

cPCR/KCV изследване, използвано в тези изследвания, се осъществява с помощта на следващите методи за получаване на РНК, обратното транскрибиране на РНК в сДНК, амплифициране нз специфични сегменти от сДНК чрез PCR и анализ на PCR продуктите.

РНК се екстрахира от черен дроб с помощта на гуанидин тиоцианатен метод за получаване на обща РНК, описан от Maniatis et al. 1982).

За изолиране на обща РНК от плазмата, плазмата се разрежда пет- до десеткратно с TENB 0.1 М NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 8.0,1 mM EDTA) и се инкубира в протеиназен К/SDS разтвор 0.5% SDS, 1 mg/ml протеиназа К, 20 gg/ml ?oly А носител) за 60 до 90 min при 37°С. Пробите зе екстрахират веднъж с фенол (pH 6.5), получената органична фаза се реекстрахира веднъж с TENB, съдържащ 0.1 % SDS, и водните фази от двете екстракции се отливат и екстрахират двукратно с еднакъв обем от фенол/СНС1₃/ изоамилов алкохол [1:1 (99:1)].Получените в резултат водни фази се екстрахират с еднакъв обем СН

С1₃ /изоамилов алкохол (99:1) двукратно, и се преципитират с алкохол с помощта на 0.2М натриев ацетат, pH 6.5, и 2.5 обема от 100% етанол; преципитацията се осъществява за една нощ при -20°С.

Използваната като матрица сДНК за PCR реакцията се изготвя с помощта на посочените проби за получаване на съответните сДНК.

Всяка РНК проба (съдържаща или 2 gg от денатурираната с висока температура обща чернодробна РНК от шимпанзе или РНК от 2 gl плазма) се инкубира в 25 gl-ова реакция, съдържаща 1 gmol от всеки праймер, 1 gmol от всеки дезоксирибонуклеотид трифосфат (dNTP), 50 moi Tris-HCL, pH 8. 3,5 gmol MgClj, 5 gmol дитиотреитол (DTT), 73 gmol KC1, 40 единици от

РНК азен инхибитор (RNASLN) и 5 единици от AMV обратна транскрибтаза. Инкубацията се осъществява за 60 min при 37°С. След сДНК синтеза, реакцията се разрежда с 50 μΐ дейонизирана вода (DIW), вряла 10 min и охладена върху лед.

Амплифицирането на сегмент от HCV сДНК се осъществява с помощта на два синтетични олигомерни 16-мерни праймера, чиито последователности са получени от HCV сДНК клонове 36 (антисенс) и 37 b (сенс). Последователността на праймера от клон 36 е:

5’ GCA TGT CAT GAT GTA ТЗ’

Последователността на праймера от клон 37Ь е:

5’ АСА АТА CGT GTG ТСА С 3’.

Праймерите са използвани при крайна концентрация от по 1 μιηοΐ всеки. За амплифициране на сегмента от KCV сДНК, който е обграден от праймерите, сДНК пробите се инкубират с 0.1 pg РНКаза А и PCR реактанти от Perkin Elmer Cetus PCR kum (N801-0043 или N801-0055) съгласно инструкциите на производителя. PCR реакцията се осъществява или за 30, или за 60 цикъла в Perkin Elmer Cetus ДНК термален циклизатор. Всеки цикъл се състои от едноминутен денатуриращ етап при 94°С, етап на ренатуриране с продължителност от 2 min при 37°С и етап на удължаване от 3 min при 72°С. Обаче, етап на удължаване в крайния цикъл (30 или 60) е 7 вместо 3 min. След амплифицирането, пробите се екстрахират с еднакъв обем от фенолхлороформ (1:), последвано от екстракция с еднакъв обем от хлороформ и след това пробите се преципитират с етанол, съдържащ 0.2 М натриев ацетат.

PCR продуктите се анализират, както следва:

Продуктите се подлагат на електрофореза върху 1.8% алкално-агарозен гел съгласно Murakawa et al. (1988), и се прехвърлят върху хартия ZETA® (BioRad Corp.) чрез оцветяващи галове за през нощта в 0.4 М NaOH. Петната се неутрализират в 2 х SSC (1 х SSC съдържа 0.15 М NaCI, 15 mN натриево фосфатен буфер, pH 6.8, 15 mMEDTA, 1.0% SDS,0.5% обезмаслено мляко (Carnation Co.), и 0.5 mg/ml денатурирана с ултразвук ДНК от сперма на пъстърва. Петната, подлежащи на анализ за HCV сДНК фрагменти, се хибридизират с 32р - белязана проба, генерирана чрез nick-транслация на HIV сДНК инсерционна последователност в клон 35, описана в US

07/456,637. След хибридизиране, петната се промиват в 0.1 х SSC (1 х SSC съдържа 0.15 М NaCI, 0.01 + Na-цитрат) при 65°С, изсушават се и се авторадиографират. Очакваният размер на продукта е 586 нуклеотида дължина, продуктите, които се хибридизират с пробата и мигрират в галовете в този размер се счита за позитивни за вирусна РНК.

Като контрола се използват cPCR праймерите, предназначени за амплифициране на а- антитрипсинова тРНК с оглед доказване присъствието на РНК във всяка анализирана проба. Кодиращата област от α-1-антитрипсиновия ген е описана в Rosenberg et al. (1984). Получени са синтетични олигомерни 16-мерни праймери, създадени за амплифициране на 365 нуклеотиден фрагмент от кодиращата област на α-1-антитрипсиновия ген от нукелотиди 22-27 (сенс) и 372-387 (антисенс). PCR продуктите се откриват с помощта на ³²Р nick-транслационна проба, която лежи между и не включва сДНК/PCR праймерните последователности.

Благодарение на изключителната чувствителност на PCR реакцията, всички проби се обработват минимум три пъти. Всички лъжливи позитивни сигнали се отстраняват, като се вземат предвид следните предпазни мерки: 1) отстраняване на аерозоли с помощта на епруветки със завинтващи се запушалки с ръбесто 0-пръстенно запечатване; 2) пипетиране с Ranin MICROMAN* позитивни гутатори с разместване бутило/капиляри; и 3) подбор на алигонуклеотидни последователности за сДНК и PCR праймери от два неприлежащи сДНК клона.

Индустриална приложимост

Имунореактивните състави от изобретението са приложими за получаване на материали, например ваксини, които на свой ред могат да бъдат използвани за лечение на отделни индивиди срещу HCV инфекции, по-специално хронични HCV инфекции. В допълнение, съставите могат да бъдат използвани за получаване на материали за откриване на множество варианти на HCV в биологични проби. Например, имунореактивни състави от настоящето изобретение могат да се прилагат за генериране на състави на поликлонални антитела, които разпознават повече от един HCV изолат, или като антиген в анти-HCV антитяло имунологични изследвания. Последният метод може да служи за скрининг на кръвни продукти за позитивна HCV контаминация. Поликлоналният антисерум или антитела могат да бь дат използвани за позитивно имунизиране на отделен индивид.

Claims

1. Имунореактивен състав, характеризиращ се с това, че включва полипептиди, съдържащи аминокиселинна последователност от един епитоп в рамките на един първи вариабилен домен от вируса на хепатит С (НС V), и поне две хетерогенни аминокиселинни последователности от първия вариабилен домен на отделен HCV изолат.

2. Имунореактивен състав съгласно претенция 1, включващ множество антигенни комплекси, характеризиращ се с това, че а) всеки антигенен комплекс се състои от множество по същество идентични полипептиди, включващи аминокиселинната последователност от един епитоп в рамките на първия вариабилен домен от един HCV изолат, и (Ь) аминокиселинната последователност от епитопа на един комплекс е хетерогенна по отношение на аминокиселинната последователност на аналожната последователност на поне един друг комплекс.

3. Имунореактивен състав съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че първата хетерогенна аминокиселинна последователност е от един HCV група I изолат, а втората хетерогенна аминокиселина е от HCV група II изолат.

4$ се смесва имуногенният състав от етап I с пълнителя от етап II.

4. Имунореактивен състав съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че вариабилният домен е в рамките на E2/NS1 протеина.

5 19. Клетка- гостоприемник, съдържаща

ДНК молекулата от претенция 18.

20. Клетка-гостоприемник съгласно претенция 19, характеризираща се с това, че ДНК молекулата съдържа контролни последователности,

5 10. Имунореактивен състав, включващ множество полипептиди, съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че всеки полипептид е с формулата ₁₀ R_r-<sv_a)_x-R’, в която R и R’ са аминокиселинни последователности от около 1-2000 аминокиселини, и са еднакви при различни; г и г’ са 0 или 1, и са еднакви или различни; V е аминокиселинна пос15 ледователност, включваща последователността от един HCV вариабилен домен, където вариабилният домен съдържа поне един епитоп; S е цяло число >1, представляващо подбрания вариабилен домен, и п е цяло число >1, представляващо 20 подбраният HCV изолат хетерогенен при даден S+ по отношение на поне един друг изолат с различна степен за п, и п е независимо подбран за всяко х;

х е цяло число >1; и при условие, че ами25 нокиселинните последователности са представени в състава, представляващ комбинация, подбрана от групата, състояща се от (i) IV] и 2V_p (ii) IV] и 2V₂, и (iii) IV] и 2V_]t

5. Имунореактивен състав съгласно претенция 4, характеризиращ се с това, че вариабилният домен е кодиран от аминокиселина 384 до аминокиселина 411 от HCV полипротеина.

6. Имунореактивен състав съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че вариабилният домен е в рамките на Е1 протеина.

7. Имунореактивен състав съгласно претенция 6, характеризиращ се с това, че вариабилният домен е кодиран от аминокиселина 225 до аминокиселина 260 от HCV полипротеина.

8. Имунореактивен състав съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че полипептидите включват освен това аминокиселинна последователност от един епитоп в рамките на втори вариабилен домен от вируса на хепатит С (HCV), и поне две хетерогенни аминокиселинни последователности от втория вариабилен домен на отделни HCV изолати.

9. Имунореактивен състав съгласно претен ция 8, характеризиращ се с това, че първият вариабилен домен е в рамките на E2/NS1 протеин и вторият вариабилен домен е в рамките на Е1 протеина.

10 способни да предизвикат експресия на полипеп. тила.

21. Метод за получаване на рекомбинантен протеин, включващ култивиране на популация от клетки -гостоприемници от претенция 20 при

11. Имунореактивен състав съгласно пре30 тенция 10, характеризиращ се с това, че полипептидът е с формула

R, -IV, - 1V₂ - R>

12. Имунореактивен състав съгласно пре35 тенция 10, характеризиращ се с това, че поли- пептидният състав включва смес от полипептиди с формули

R - IV, - Rf и R_r - 1V₂ - Rf.

13. Метод за получаване на имуногенен състав за лечение на HCV, характеризиращ се с това, че се осигурява имуногенен състави съгласно претенция 1; осигурява се подходящ пълнител и

14. Метод за получаване на анти-HCV антитела, характеризиращ се с това, че се въвежда у бозайници ефективно количество имуно-

5Q реактивен състав съгласно претенция 1.

15. Състав на поликлонално антитяло, създаден съгласно претенция 14.

16. Метод за откриване на антитела срещу HCV в рамките на биологична проба, характеризиращ се с това, че а) се осигурява биологична проба, за която се счита, че съдържа антитела срещу множество щамове на HCV;

b) осигурява се имунореактивен състав съгласно претенция 1;

c) биологичната проба от (а) реагира с имунореактивния състав от (Ь) при условия, които позволяват образуването на антиген-антитяло комплекси;

и

d) открива се образуването на комплекси между антигена от (а) и антителата от биологичната проба от (Ь) при наличие на такива.

17. Комплект за откриване на антитела срещу множество щамове на HCV в рамките на биологична проба, съдържащ имунореактивен състав съгласно претенция 1, включен в подходящ контейнер.

18. ДНК молекула, кодираща полипептид, съдържащ две хетерогенни аминокиселинни последователности от същия вариабилен домен от чисти HCV изолати.

15 условия, обезпечаващи експресията на полипептида.