RO116199B1 - Compozitie polipeptidica hcv imunogena - Google Patents

Abstract

Inventia se refera la o compozitie polipeptidica HCV imunogena, care cuprinde cel putin doua secvente de aminoacizi HCV, fiecare secventa HCV continand cel putin un epitop dintr-un domeniu variabil al unei peptide HCV, in care domeniul variabil estedin proteina E1/NS1 si este codificat de la aminoacidul 384 la aminoacidul 414 al unei poliproteine HCV sau domeniul variabil este din proteina E1 sieste codificat de la aminoacidul 215 la aminoacidul 255 al unei proteine HCV si in care regiunile domeniului variabil al secventelor de aminoacid sunt heterogene unei regiuni fata de alta si sunt derivate din izolate distincte HCV, compozitie utilizata in prepararea unor vaccinuri, administrate la randul lor, in tratamentul infectiilor cu HCV, in special in cazul infectiilor cronice.

Description

Invenția se referă la o compoziție de polipeptide HCV imunogene conținând epitopi heterogeni din domenii variabile, într-un amestec cu un excipient adecvat, administrate în tratamentul hepatitei C virale sau pentru producerea anticorpilor față de virusul hepatitei C, sau pentru detectarea anticorpilor anti HCV.

Recent s-a identificat că hepatita C virală este produsă de virusul hepatitei C, ca agent cauzator major al hepatitei non A non B (NANBH) post transfuzie și, de asemenea, al NANBH obținută asemănător.

Materialele și metodele pentru obținerea secvențelor genomice virale sunt cunoscute din WO 89/04669, 90/11089 și 90/14436

Caracterizarea moleculară a genomului HCV arată că acesta este reprezentat de o moleculă de acid ribonucleic (ARN) cu polaritate pozitivă, care conține aproximativ 1OOOO nucleotide care codifică o poliproteină având aproximativ 3011 aminoacizi. Diferitele linii de evidență sugerează că HCV are o organizare genetică similară cu cea a virusurilor din familia Flaviviridae, care include flavivirusul și pestvirusul. Datorită înrudirii pestvirale și flavivirale, HCV pare să codifice o poliproteină mare precursoare, din care sunt reproduse proteinele virale individuale (atât cele structurale, cât și cele nestructurale).

Virusurile care conțin acid ribonucleic pot avea proporții ridicate de mutație spontană, de exemplu, de ordinul 10³ până la 1CT⁴ per nucleotidă încorporată. De aceea, datorită heterogenității și fluidității genotipului, caracteristici care sunt comune la virusurile ARN, pot fi izolate virale multiple și, de asemenea, acestea pot fi virulente sau avirulente în cadrul speciilor de HCV. în prezent, s-a identificat un număr de diferite izolate HCV. Secvențele acestor izolate HCV demonstrează heterogenitatea caracteristică limitată a virusurilor ARN.

HCV izolat J 1.1 este descris în Kubo, Y și colab., (1989), Japan. Nuci. Acids Res.17: 10367-10372; Takeuchi, K și colab., (1990), Gene 97:287-291; Takeuchi și colab., (1990), J. Gen. Virol. 71: 3027-3033; Takeuchi și colab., (1990), Nuci. Acids Res. 18: 4626.

Secvențele de codificare complete plus secvențele terminale 5’ și 3' pentru cele două izolate independente, HCV J” și “BK” sunt descrise de Kato și colab., și, respectiv, Takamizawa și colab., (Kato și colab., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:95249528; Tkamizawa și colab., (1991), J. Virol. 65:1105-1113).

Alte publicații descriu HCV izolate, după cum urmează:

“HCV-Τ': Choo și colab., (1990), Brit. Med. Bull. 46:423-441; Choo și colab., (1991), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 2451-2455; Han și colab., (1991), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 1711-1715; EP 318216. “HC-J1 și “HC-J4: Okamoto și colab., (1991), Japan J. Exp. Med. 60: 167-177.“HCT 18”, “HCT 23, “Th”, “HCT 27, EC1 și “EC10: Weiner și colab., (1991), Virol. 180: 842-848.“PT-1, “HCV-K1 și “HCV-K2: Enomoto și colab. Există două tipuri majore de virusuri de hepatită prezentate de secția de Gastroenterologie, Departamentul de Medicină Internă, Kanazawa Medical University, Japonia din clonele “A, “C”, “D și Έ”: TsukiyamaKohara și o grupă secundară de virus al hepatitei, în Virus Genes.

O cale tipică de diagnostic și strategie a vaccinării este orientată către domeniile virale conservate. Această cale suferă, totuși, de dezavantajul că se ignoră epitopii importanți care se află în domenii variabile.

Invenția se referă la o compoziție polipeptidică HCV imunogenă care conține epitopii heterogeni din domenii variabile.

RO 116199 Bl

Compoziția polipeptidică HCV imunogenă, conform invenției, înlătură dezavantajele de mai sus prin aceea că cuprinde cel puțin două secvențe de aminoacizi ai HCV, fiecare secvență conținând cel puțin un epitop dintr-un domeniu variabil al unei 50 peptide HCV, iar domeniul variabil este din proteina E2/NS1 și este codificat de la aminoacidul 384 la aminoacidul 414 al unei poliproteine HCV, sau proteina E1, și este codificat de la aminoacidul 215 la aminoacidul 255 al unei poliproteine HCV, iar regiunile domeniului variabil al secvențelor de aminoacizi sunt heterogene una cu alta și sunt derivate din izolate HCV distincte. 55

Prin aplicarea invenției se obțin următoarele avantaje:

- o specificitate mult mai mare față de virusul hepatitei C;

- prin aplicarea compoziției polipeptidice HCV imunogene nu sunt ignorați epitopii importanți care se află în domeniile variabile;

Invenția se referă o compoziție de polipeptide care prezintă reactivitate imuno- 6 o logică încrucișată cu multiple izolate HCV, în special cu referire la domeniile heterogene ale virusului.

S-a observat astfel că un număr de epitopi HCV importanți variază printre izolatele de virusuri și că acești epitopi pot fi aplicați la domenii speciale. Această observație permite stabilirea unei strategii de producere a compozițiilor de polipeptide 65 cu reactivitate imunologică încrucișată, care se orientează către domenii variabile (preferate în locul celor conservate).

în acest sens, obiectul prezentei invenții este o compoziție imunoreactivă care cuprinde polipeptide care conțin secvențe de aminoacizi ale epitopului din primul domeniu variabil al HCV și cel puțin două secvențe heterogene de aminoacizi din primul 70 domeniu variabil al izolatelor HCV distincte.

Compoziția imunoreactivă cuprinde o pluralitate de seturi antigenice, în care:

(a) fiecare set antigenic constă dintr-o pluralitate de polipeptide substanțial identice, cuprinzând secvența de aminoacizi a epitopului conținând un prim domeniu variabil al HCV izolat; 75 (b) secvența de aminoacizi a epitopului dintr-un set este heterogenă față de secvența de aminoacizi a secvenței analoage a cel puțin unui alt set.

Compoziția imunoreactivă cuprinde o pluralitate de polipeptide în care fiecare polipeptidă are următoarea formulă:

Rr - (SVn)x - R’r’ 8 o în care:

R și R’ sunt secvențe de aminoacizi având aproximativ 1-2000 aminoacizi, fiind identici sau diferiți;

r și r’ sunt O sau 1 și sunt identici sau diferiți;

V este o secvență de aminoacizi cuprinzând secvența unui domeniu variabil 85 HCV, în care domeniul variabil cuprinde cel puțin un epitop;

S este un număr întreg > 1, reprezentând un domeniu variabil selectat și n este un număr întreg >1, reprezentând izolate HCV heterogene, selectate de la un SV dat cu referire la cel puțin un alt izolat având o valoare diferită pentru n, și n fiind independent selectat pentru fiecare x; 90 x este un număr întreg ă 1;

cu condiția ca secvențele de aminoacizi prezente în compoziție să reprezinte o combinație selectată dintr-o grupare care constă din (i) 1V_n și 1V₂, (ii) 1Vq și 2V₂ și (iii) 1Vq și 2Vq.

RO 116199 Bl

Invenția face referire la o metodă pentru prepararea compoziției farmaceutice

HCV imunogene, care cuprinde:

(a) compoziția imunoreactivă prevăzută așa cum s-a descris mai sus;

(b) excipientul convenabil prevăzut; și (c) amestecul compoziției imunoreactive conținând componentul de punctul (a) cu excipientul de la punctul (b), într-o proporție care prevede un răspuns imunogenic după administrare la un mamifer.

De asemenea, conform invenției, se face referire la o metodă de detectare a anticorpilor față de HCV, care cuprinde următoarele:

(a) prelevarea unei probe biologice care este suspectată de a conține anticorpi față de HCV;

(b) realizarea unei compoziții imunoreactive așa cum s-a descris mai înainte;

(c) punerea în reacție a probei biologice de la punctul (a) cu compoziția imunoreactivă de la punctul (b), în condiții în care se permite formarea unor complexe antigen-anticorp; și (d) detectarea formării complexelor antigen-anticorp formate între compoziția imunoreactivă (b) și anticorpii probei biologice (a).

Invenția face referire la un ansamblu pentru detectarea anticorpilor față de HCV în proba biologică, cuprinzând o compoziție imunoreactivă așa cum s-a descris mai înainte, într-un ambalaj corespunzător.

HCV este un membru nou al familiei Flaviviridae, care include pestvirusurile (Hog Cholera Virus și Bovine Viral Diarrhea Virus] și flavivirusurile, exemple din care fac parte Dengue virusul și virusul febrei galbene. O schemă a organizării genetice a HCV este arătată în fig 1. Similar cu flavivirusurile și pestivirusurile, HCV pare să codifice domeniul polipeptidelor de bază (“C”) la capătul N^terminal al poliproteinei virale de bază, urmând două domenii de glicoproteine (“E1, “E2/NST')în sens invers față de NS2 până la NS5. Pozițiile aminoacizilor din domeniile proteinelor putative sunt arătate în tabelul 1.

Domeniile putative din proteine În HCV

Tabelul 1

Poziția aminoacidului (aproximativă)	Proteina
1 -191	C
192 - 383	E1
384 - 750	E2/NS1
751 - 1006	NS2
1007-1488	NS3
1489-1959	NS4
1960-3001	NS5

RO 116199 Bl

140

Așa cum s-a discutat mai înainte, au fost identificate un număr de Izolate HCV. Analiza secvenței comparative a secvențelor HCV complete și parțiale arată că, pe baza omologiei la nivelul nucleotidei și aminoacizilor, izolatele HCV pot fi mult subdivizate în cel puțin trei grupe de bază (tabelul 2), vezi Houghton și colab., (1991), Hepatology 14: 381-388. Cu toate acestea, numai secvența parțială este convenabilă pentru izolatele HCV din grupa III. Așadar, când secvențele acestor izolate virale sunt mai mult definite, unul sau mai multe izolate HCV poate deservi separarea într-o grupă diferită, incluzând grupa a patra potențială. Tabelul 3 arată secvența omologiilor între proteinele virale individuale ale diferitelor izolate HCV, așa cum s-a dedus din secvențele nucleotidelor lor. Se poate vedea că proteinele din aceeași grupă de virusuri arată o similaritate mai mare a secvențelor decât aceleași proteine codificate prin grupările diferitelor virusuri (tabelul 3). 0 excepție la aceasta este că până acum proteina nucleocapsidei care este superior conservată între secvențele tuturor de izolatele de virusuridin grupa I și II. (în tabelul 3, simbolul N/A semnifică faptul că secvențele nu sunt convenabile pentru comparație.

Deci, grupa I de izolate de virusuri poate fi definită ca acele izolate de virusuri având proteinele virale, în special proteinele E1 și E2/NS1 omoloage în proporție de aproximativ 90% sau mai mult, la nivelul de aminoacizi al produselor izolate clasificate în grupa I, conform prezentei invenții. Grupa II este definită într-o manieră analoagă. Grupele următoare pot fi în mod asemănător definite în termenii de omologie a proteinei virale față de prototipul izolat. Subgrupele pot așadar să fie definite prin omologia proteinelor limitate, cum ar fi proteinele E1, E2/NS1 sau NS2 sau prin nivele mai ridicate de omologie.

145

150

155

160

Clasificarea secvențelor ARN genomic la virusul hepatitei C în trei grupe de bază

Tabelul 2

HCVI	HCV îl	HCV III
HCV-1	HCV-J1.1	Clonele A, C, D și E
HC-J1	HC-J4	HCV-K2 (a și b)
HCT 18	HCV-J
HCT 23	BK
Th	HCV-K1
HCT 27
EC1
Pt-1

165

170

RO 116199 Bl

Omologiile [%] aminoacizilor Între proteinele virale codificate prin Izolate HCV diferite

Tabelul 3

HCV	C	E1	E2/NS1	NS2	NS3	NS4	NS5
Grupa I în comparație cu: I	98-100	94-100	N/A	N/A	N/A	N/A	99-100
II	97-98	77-79	78-81	75-77	91-92	90-93	84-88
III	N/A	N/A	N/A	N/A	86	78-80	71-74
Grupa II în comparație cu: II	98-100	92-100	89-100	93-100	94-100	97-100	95-100
III	N/A	N/A	N/A	N/A	84	76	74-75
Grupa III în comparație cu: III	N/A	N/A	N/A	N/A	N/A	N/A	N/A

Se menționează că proteinele anvelopei virale putative, codificate prin genele E1 și E2/NS1, arată o variație substanțială a secvențelor de aminoacizi între grupele I și II. Numai NS2 prezintă un grad mai mare de heterogenitate, în timp ce proteinele C, NS3, NS4 și NS5 prezintă toate o conservare mai mare a secvenței între aceste grupe. Variația secvenței observată la proteinele anvelopei virionului putativ între grupele I și II reflectă o segregare caracteristică a aminoacizilor între grupele I și II. Un astfel de exemplu este cel arătat în fig. 2, în care secvența produsului genei E1 este comparată între virusurile grupei I și grupei II. Secvențele de aminoacizi E1 deduse din secvențele nucleotidei la grupele HCV II și III sunt astfel prezentate. în această figură, barele orizontale indică secvența identică cu HCV-1. Asteriscurile arată o segregare specifică grupei de aminoacizi; reziduurile specifice grupei pot fi identificate în mod clar. Secvențele grupei I sunt HCV-1, HCT 18, HCT 23, HCT 27 și HC-J1. Secvențele din grupa II sunt următoarele: HC-J4, HCV-J, HCV J1.1 și BK. Această segregare specifică grupei de aminoacizi este așadar prezentă la produse cu alte gene, incluzând gp 72 codificată de gena E2/NS1.

Fig. 3 arată secvența de aminoacizi comparativă din regiunea E2/NS1 a izolatelor HCV care segregă ca grupa I și grupa II. Cea de a doua proteină conține, așadar, o regiune hipervariabilă având N-terminal (HV”) de aproximativ 30 de aminoacizi care arată o variație mare aproape între toți produșii izolați (vezi Weiner și colab., (1881]], Această regiune se produce între aminoacizii 384 până la 414, utilizând sistemul HCV-1 de numerotare a aminoacizilor. Glicoproteina E2/NS1 a anvelopei HCV putative poate corespunde la peptida gp 53 (BVDV]/gp 55 (Hog Cholera Virus] care este polipeptida anvelopei pestvirusurilor și NS1 de la flavivirusuri, ambele virusuri conferind, așadar, imunitate protectoare la organismul gazdă vaccinat cu aceste polipeptide.

RO 116199 Bl

225

Similaritățile de activare între regiunea hipervariabilă (“HV) și domeniile HIV-1 gp 120 V3 se referă la gradul variației secvenței efectul predictiv al aminoacidului schimbând legătura anticorpului putativ în legătură cu adiția la absența structurii secundare definitive, care sugerează că domeniul HV codifică anticorpii de neutralizare. Imunogenitatea domeniului este arătată prin experimentele de aplicare a epitopului anticorpului, descrise în exemple. Rezultatele acestor studii sugerează că, în adiție la cele trei grupe majore ale HCV, există, așadar, subgrupe specifice HV.

Analiza probelor biologice de la indivizii cu HCV care induce NANBH, arată că indivizii pot fi purtători de două sau mai multe variante de HCV, simultan. Două variante HV, coexistente au fost găsite în plasma unui individ J1. în adiție, secvențarea parțială a genei unui individ cu NANBH cronică, care a avut intermitent simptome de hepatită, demonstrează că individul Q a fost infectat cu două variante de HCV (Q1 sau Q3). Fiecare variantă este asociată numai cu un epitop al acelei boli. Prin metoda de analiză ELISA, utilizând Q1 sau Q3 ca peptide specifice (aminoacizii 396+407) arată că Q dezvoltă un răspuns al anticorpului la peptida Q1, dar aceasta nu corespunde peptidei Q3, ceea ce sugerează că recrudescența bolii la Q se datorește apariției unui variant HV. Prezența anticorpilor la peptida Q1, cu absența răspunsului imunitar umoral la peptida Q3 în timpul celui de-al doilea episod al bolii, sugerează că variația în domeniul HV poate rezulta din presiunea selecției imunitare. Aminoacizii 396-407 par a fi subiectul unei presiuni selective majore în domeniul HV. Aceste descoperiri au la bază teza prin care niveluri superioare ale cronicității asociate cu boala, pot fi datorate unui răspuns al organismului gazdă, imunologic neadecvat, la infecția cu HCV și/sau mecanismele virale efective ale evaziunii imunologice. Mai mult decât atât, se punctează în regiunea E2/NS1 HV, ca fiind o regiune genetică care cuprinde un mecanism de evadare virală și/sau mecanismul sau mecanismele de răspuns imunologic inadecvat. Așa cum s-a discutat mai înainte, există diferite regiuni cu variante în genomul HCV. Una sau mai multe dintre aceste regiuni sunt în majoritate la fel cuprinse în mecanismul de evadare virală și/sau în mecanismul de răspuns imunologic neadecvat. De aceea, este de dorit să se includă în compoziții pentru tratament, polipeptidele HCV care vor induce un răpuns imunologic la aceste variante. În ceea ce privește regiunile E1 și E2/NS1 ale peptidelor de tipul anvelopei putative codificate genomic, aceste regiuni vor fi de un interes special referitor la imunogenitate. Astfel, aceste regiuni sunt printre cele la care este de dorit în special să se inducă și/sau să crească un răspuns imunologic pentru protecția individuală față de infecția cu HCV și pentru a ajuta la prevenirea recurenței cronice a bolii la indivizii injectați. în adiție, aceste regiuni vor fi printre cele de la care ar fi de dorit să se detecteze variații HCV care sunt dezvoltați în infecție, cât și în cazul superinfecției sau al coinfecției determinate de doi sau mai mulți varianți.

Invenția descrie o compoziție și metodele pentru tratamentul individual, de preferință de prevenire a infecțiilor cu HCV și, în special, de prevenire a infecțiilor cronice HCV. în adiție, se descriu compozițiile și metodele pentru detectarea prezenței anticorpilor anti-HCV în probele bilogice. Această ultimă metodă este în special utilizată pentru identificarea anticorpilor anti-HCV generați în răspunsul la epitopii HCV imunologic distincți. Acestă metodă poate fi, așadar, utilizată pentru studiul evoluțiilor varianților multipli ai HCV în infecțiile individuale. în cadrul discuției privind această invenție, se apreciază definițiile ce urmează:

230

235

240

245

250

255

260

265

RO 116199 Bl

Termenul “polipeptidă” se referă la un așa zis polimer de aminoacizilor și nu se referă la o lungime specifică a produsului; astfel, peptidele, oligopeptidele și proteinele sunt incluse în definția de polipeptide. Acest termen, așadar, nu se referă sau nu exclude modificările polipeptidelor post-exprimate, de exemplu glicozilările, acetilările, fosforilările și altele, incluse în această definiție sunt, de exemplu, polipeptidele care conțin unul sau mai mulți analogi ai aminoacizilor (incluzând, de exemplu, aminoacizii nenaturali, etc.,) polipetidele cu legături substituite, ca și alte modificări cunoscute în literatura de specialitate, care se produc atât pe cale naturală, cât și pe cale nenaturală.

Așa cum se utilizează în prezenta descriere de invenție, A este “substanțial izolat” din B când greutatea lui A este de cel puțin aproximativ 70%, preferabil de cel puțin aproximativ 80% și optim la cel puțin 90% din greutățile lui A și B combinate. Compozițiile de polipeptide, conform prezentei invenții, sunt, de preferință, substanțial libere de țesuturi umane sau alte țesuturi primate (incluzând sângele, serul, lizatul celular, organele celulare, proteinele celulare etc.) și mediul de cultură celular.

O polinucleotidă recombinantă” se referă la o polinucleotidă de origine genomică, cADN, semisintetică sau sintetică, care, datorită originii ei sau manipulării (1), nu este asociată cu toate polinucleotidele sau cu o porțiune de polinucleotidă cu care aceasta este asociată în natură, (2) este legată la polinucleotidă care este diferită de cea care se leagă în mod natural, sau (3) nu se produce în mod natural.

O “polinucleotidă” este o formă polimerică de nucleotide de orice lungime, fie ribonucleotide sau dezoxi-ribonucleotide. Astfel, acest termen include acidul dezoxiribonucleic și acidul ribonucleic, cu filamente dublu răsucite sau cu filamente simplu răsucite. Acest termen include, așadar, tipurile cunoscute de modificări, de exemplu, denumirile care sunt cunoscute în literatura de specialitate, metilarea, Caps” substituirea unei nucleotide sau a mai multor nucleotide produse în mod natural, cu un compus analog, modificările internucleotidelor, cum ar fi, de exemplu, cele cu legături incomplete (de exemplu, fosforotiolații, fosforoditiolații etc.) cei care conțin jumătățile pendante ca de exemplu proteinele (incluzând, de exemplu, nucleazele, toxinele, anticorpii, peptidele de semnalizare, poli-L-lisina etc.), cele cu intercalări (de exemplu acridina, psoralen etc.) cele care conțin chelatări (de exemplu metale, metalele radioactive etc.) cele care conțin alchelatări, cel cu legături modificate (de exemplu anomerii acizilor alfa nucleici etc.), ca și formele nemodificate ale polinucleotidei.

“Celulele gazdă recombinante”, “celulele gazdă”, “celulele”, “liniile celulare”, “culturile celulare” și alți astfel de termeni denotă microorganismele sau liniile eucariote superioare cultivate ca entități unicelulare, se referă la celulele care pot fi sau au fost utilizate ca recipiente pentru vectorul recombinant sau alte polinucleotide de transfer și includ descendenții unei singure celule parentale care a fost transfectată. Se înțelege că descendentul unei singure celule parentale nu este necesar să fie complet identic în morfologie sau în complementul genomic sau total ADN, ca fiind original datorită mutației deliberate, accidentale sau naturale.

Un replicon” este orice element genetic, de exemplu de plasmid, cromozom, virus, cosmid etc., care apare ca compariment la fel cu o unitate autonomă a polinucleotidei de replicație în celulă, de exemplu celula capabilă de replicație sub propriul control.

RO 116199 Bl

315

Un “vector” este un replicon care mai cuprinde secvențe ce determină replicarea și/sau exprimarea în sistem de citire deschis.

“Secvență control se referă la secvențele de polinucleotide necesare pentru efectuarea exprimării secvențelor codificate de care sunt legate. Natura unor astfel de secvențe de control diferă dependent de organismul gazdă; la procariote astfel de secvențe de control includ, în genera, promotorul, porțiunea de legătură ribozomală și terminatorul; la eucariote, în general, astfel de secvențe de control includ promotorii, terminatorii și în unele cazuri agenții de creștere. Termenul 2 “secvență de control are în intenție să includă, la minimum, toți componenții a căror prezență este necesară pentru exprimarea acestora și poate astfel include componenții adiționali a căror prezență este avantajoasă, de exemplu, secvențele principale care dirijează secreția.

Un promotor” este o secvență de nucleotide care este cuprinsă între secvențele de consens care permit legarea polimerezei acidului ribonucleic la modelul acidului dezoxiribonucleic astfel încât producția de ARNm să fie inițiată la o porțiune de transcripție normală pentru gena structurală adiacentă.

Termenul de “legat operabil” se referă la o juxtapoziție în care componentele astfel descrise sunt într-o relație care le permite să funcționeze în maniera lor proprie. 0 secvență de control “legată operabil” la o secvență codificată este legată astfel încât să se exprime secvența de codificare care este obținută în condiții compatibile cu secvențele de control.

Un “sistem de citire deschis” (ORF) este o regiune a secvenței de nucleotide care codifică o polipeptidă; această regiune poate reprezenta o porțiune a secvenței codificate sau o secvență de codificare totală. O “secvență codificată” este o secvență de polinucleotide care este transcrisă în mARN și/sau ca translație într-o polipeptidă, când este plasată sub controlul secvențelor de reglare corespunzătoare. Limitele secvenței codificate sunt determinate printr-un codon de start al translației la capătul 5' terminal și codonul de oprire al translației la capătul 3' terminal. O secvență de codificare poate include, fără a se limita la acestea, mARN, ADN (inluzănd cADN) și secvențele polinucleotidei recombinante.

Așa cum este utilizat în prezenta descriere de invenție, “epitop” sau “determinant antigenic este o secvență de aminoacizi care este imunoreactivă. în general, epitopul constă din cel puțin 3...5 aminoacizi uzual din 8 aminoacizi, sau chiar 10 animoacizi. Așa cum este utilizat în prezenta invenție, un epitop al polipeptidei desemnate denotă epitopii cu aceeași secvență de aminoacizi ca epitopul din polipeptidă desemnată și echivalenții imunologici ai acesteia.

Un “antigen” este este polipeptidă care conține unul sau mai mulți epitopi.

Termenul “imunogenic” reprezintă capacitatea de a obține un răspuns imunologic umoral și/sau de a obține un răspuns imunologic celular. Un răspuns imunogenic poate fi obținut numai de la polipeptidele imunoreactive sau acesta necesită prezența unui suport, în prezența sau în absența unui adjuvant.

Termenul de “imunoreactiv” se referă la (1) capacitatea de legătură imunogenică la un anticorp și/sau la receptorul antigen limfocitic sau (2) capacitatea de a fi imunogenic.

Un “anticorp” este orice imunoglobulină, incluzând anticorpi și fragmentele acestora, care se leagă la epitopul specific, termenul cuprinde “inter alia”, anticorpi policlonali, monoclonali și chimerici. Exemplele de anticorpi himerici sunt discutate în

US 4816397 și 4816567.

320

325

330

335

340

345

350

355

RO 116199 Bl

Un “set antigenic” este definit ca o compoziție care constă dintr-o pluralitate de polipeptide substanțial indentice în care polipetidele sunt cuprinse în secvența de aminoacizi a epitopului definit.

“Polipetidele identice substanțial” reprezintă acele polipeptide care sunt identice, cu excepția unei variații limitate la gradul tipic al secvenței sau a variațiilor dimensiunilor atribuibile metodei de producere a polipetidelor (de exemplu, expresia recombinantă, sinteza chimică cultura tisulară, etc.). Această variație nu va modifica proprietatea funcțională dorită compoziției substanțial identice, de exemplu, compoziția se comportă, din punct de vedere imunologic, ca o compoziție de polipeptide identice. Variațiile pot fi datorate, de exemplu, modificărilor care rezultă din procesul secretor în timpul transportului polipetidei, mai puțin de 1OO% eficiență în sinteza chimică etc.

Așa cum se utilizează în prezintă descriere de invenție, un “domeniu variabil” sau “VD” a proteinei virale este un domeniu care demonstrează un sistem consistent al variației de aminoacizi, cel puțin între doi izolați HCV sau două subpopulații. De preferință, domeniul conține cel puțin un epitop. Domeniile variabile pot varia de la izolat la izolat prin schimbarea a cel puțin unui aminoacid. Acești produși izolați pot fi de la aceleași grupări sau subgrupări, sau de la grupări sau subgrupări diferite de HCV. Domeniile variabile pot fi cu adevărat identificate prin secvența compoziției printre produsele izolate și exemplele acestor tehnici sunt descrise în continuare. în scopul descrierii prezentei invenții, domeniile variabile vor fi definite cu referire la un număr de aminoacizi al poliproteinei codificate de genomul HCV-1 așa cum este arătat în fig. 9, codonul de start, metionină, fiind desemnat la poziția 1. Domeniul variabil corespunzător la alt izolat HCV este determinat prin alinierea celor două secvențe izolate, astfel ca să se lege domeniile conservate la orice domenii variabile, într-un aliniament maxim. Acesta poate fi realizat cu orice număr de ambalaj computerizate cum ar fi ALIGN 1.0, disponibil de la Universitatea din Virginia, Departamentul de Biochemie (Attn: Dr. William R. Pearson). Vezi Pearson și colab., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444-2448. Este de înțeles că numerele de aminoacizi, date pentru un domeniu variabil special, sunt întrucâtva subiective și constituie o materie la alegere. Astfel, începutul și sfârșitul domeniilor variabile ar fi de înțeles că sunt aproximative și că includ domenii sau subdomenii suprapuse, în afară de alte indicații.

Un epitop este “echivalentul imunologic” al altui epitop într-o polipeptidă desemnată, când aceasta are reacții încrucișate cu anticorpii care se leagă imunologic la epitopul din polipeptidă desemnată.

Epitopii tipici sunt aplicați cuprinzând aproximativ 5 aminoacizi, uneori cel puțin 8 aminoacizi și chiar 10 aminoacizi sau mai mulți.

Secvența de aminoacizi cuprinzând epitopul HCV poate fi legată la altă polipeptidă (de exemplu o proteină suport), fie prin legături covalente sau prin exprimarea unei polinucleotide fuzionate, pentru a forma proteina de fuziune. Dacă de dorește, acestea se pot insera sau atașa prin repetiții multiple a epitopilor și/sau se pot încorpora ca o varietate de epitopi. Proteina suport poate fi derivată de la orice sursă, dar, în general, o proteină imunogenică, ca, de exemplu, BSA, KLH sau altele, poate fi relativ mare. Dacă se dorește, acestea se pot utiliza ca proteine HCV cu iungimi complete, sub formă de suport, multiplicând numărul epitopilor imunogenici. Alternativ, secvența de aminaocizi de la epitopul HCV poate fi legată la grupatea amino terminală și/sau gruparea carboxi terminală, la un aminoacid ne-HCV sub formă de secvență, astfel polipeptidă ar putea fi “ polipeptidă de fuziune”.

410

RO 116199 Bl

Tipurile analoage de polipeptide pot fi construite utilizând epitopii de la alte proteine virale desemnate.

Un “ variant “ al polipeptidei desemnate se referă la polipeptidă în care secvența de aminoacizi a polipeptidei desemnate a fost modificată prin eliminarea, substituirea sau rearanjarea unuia sau mai multor aminoacizi în secvență. Metodele prin care se prepară variații (de exemplu prin recombinare sau prin mutageneză directă parțială) sunt cunoscute în literatura de specialitate.

Prin “transformare” se înțelege inserția unei polipeptide exogene la celula gazdă, indiferent de metoda utilizată pentru inserție, de exemplu prin absorbție directă, transducție (incluzând infecția virală) f-mating sau electroporare. Polinucleotida exogenă poate fi menținută ca un vector neintegrat, de exemplu o plasmidă sau un genom viral sau alternativ pot fi integrate în genomul gazdă.

Un “individ se referă la un membru vertebrat, în special din speciile mamifere, și include fără a se limita la aceștia, rozătoarele (de exemplu șoarecele, șobolanul, hamsterii, cobaii), iepurii, caprele, porcii, pisicile, oile și primatele (de exemplu cimpanzeii, maimuțe verzi africane, babuini, urangutani și oameni).

Așa cum se utilizează în prezenta descriere de invenție, termenul de “tratament” se referă la orice (i) prevenire a infecției sau reinfecție, cum ar fi de exemplu vaccinul tradițional, (ii) reducerea și eliminarea simptomelor și (iii) eliminarea substanțială sau completă a virusului. Tratamentul poate fi efectuat profilactic (înainte de infectare) sau terapeutic (după infectare).

Termenul de “cantitate efectivă” se referă la o cantitate de polipeptidă care poartă epitopul, suficientă pentru a induce un răspuns imunogenic la individul la care această cantitate se administrează într-o imunoreacție detectabilă în propriul sistem (de exemplu imunoanalizele). De preferință, cantitatea efectivă este suficientă pentru efectuarea tratamentului, așa cum s-a definit mai înainte. Cantitatea necesară variază în funcție de aplicație. Pentru aplicațiile sub formă de vaccinuri sau în cazul generării de antiser policlonal/anticorpi, de exemplu, cantitatea efectivă poate varia în funcție de specii, vârsta și de condiția generală a individului de severitatea condiției care trebuie tratată, de polipeptidă specială selectată și de modul de administrare etc. Se crede, așadar, că, cantitățile efective vor fi în limite relativ largi, necritice. O cantitate efectivă corespunzătoare poate fi determinată în mod real, utilizând numai experimentarea de rutină. Așa cum se utilizează în prezenta descriere de invenție, termenul “probă biologică” se referă la o probă de țesut sau un fluid izolat de la individ, incluzând, fără a se limita la acestea, de exemplu, plasma, ser, fluid spinal, limfă fluidă, secreții externe ale pielii, secreții respiratorii, secreții intestinale și tractul genito-intestinal, lacrimi, salivă, lapte, celule sanguine, tumori, organe, biopsii și, de asemenea, probe de constituenți de cultură celulară in vitro (incluzând, fără a se limita la acestea, mediul rezultat din dezvoltarea celulelor în mediul de cultură celular, de exemplu celulele mielom care produc Mab, celulele recombinante și componentele celulare).

Compozițiile polipeptidice imunoreactive cuprind un amestec de epitopi izolați sau de epitopi din grupe specifice din cel puțin un domeniu variabil al HCV; astfel, vor fi prezente cel puțin două secvențe heterogene de aminoacizi, fiecare definind un epitop găsit în izolații de HCV distincți localizați în același loc fizic sau substanțial în acealași loc fizic în proteina HCV, de exemplu fiecare secvență se aplică în același loc din genomul/polipeptida HCV. Deoarece secvențele sunt heterogene, localizarea se

415

420

425

430

435

440

445

450

RO 116199 Bl referă la un domeniu variabil) VD. Pentru a înțelege mai bine prezenta invenție, mai întâi vor fi explicate secvențele individuale de aminoacizi care contribuie la obținerea compoziției. Apoi, se va discuta pluralitatea acestor secvențe care se găsesc în compozițiile prezentei invenții. Secvența de aminoacizi care caracterizează polipeptidele din prezenta invenție au o structură de bază după cum urmează:

ς-ζ-ς. (i) în care:

Z reprezintă o secvență de aminoacizi din regiunea proteinei de la HCV izolat, selectat, regiunea care cuprinde cel puțin un domeniu variabil și domeniul variabil cuprinde cel puțin un epitop.

L și L’ sunt secvențe de aminoacizi non HCV sau secvențe de aminoacizi HCV care nu conțin un domeniu variabil și care poate fi identic sau diferit;

y și y’ sunt O sau 1 și pot fi identici sau diferiți. Astfel, formula I reprezintă o secvență de aminoacizi care cuprinde secvența VD a HCV, în care VD cuprinde un epitop.

Așa cum s-a discutat mai înainte, epitopul sau epitopii în Z vor conține de obicei un minim de aproximativ 5 aminoacizi, 8 aminoacizi și chiar 10 aminoacizi.

Domeniul variabil al lui Z poate cuprinde mai mult decât un epitop. Domeniul variabil al lui Z este cel puțin la fel de mare ca al secvențelor combinate din epitopii prezenți; astfel, acesta are în mod tipic un minim de aproximativ 5 aminoacizi, când este prezent un singur epitop. Deoarece epitopii se pot suprapune, secvența minimă de aminoacid pentru epitopii combinați în domeniul variabil poate fi mai mică decât suma secvențelor epitopilor individuali. Z este o secvență de aminoacid a compusului HCV izolat cuprinzând VD descrisă mai sus. Astfel, dimensiunea lui Z este dimensiunea minimă de VD. Z poate cuprinde mai multe secvențe de aminoacizi HCV chiar și poate cuprinde mai departe mai mult decât VD. Dimensiunea maximă a lui Z nu este critică, dar în mod evident nu poate depăși lungimea poliproteinei HCV întregi, în mod tipic, totuși Z va fi secvența unei proteine HCV întregi (în special E1 .E2/NS1, NS2, NS3 și NS4, NS5) sau chiar mult mai tipică va fi sub forma unui fragment al unei astfel de proteine HCV. Astfel, Z va conține, de preferință, de la un minim de aproximativ 5 aminoacizi (preferabil aproximativ 8 aminoacizi sau chiar 10 aminoacizi), la un maxim de aproximativ 11QO de aminoacizi (preferat un maxim de 500 aminoacizi sau 400 aminoacizi sau chiar mai mult de 200 aminoacizi). Uzual, polipeptida cu formula I și/sau Z, când este preparată, de exemplu, prin sinteză chimică, este un maxim de aproximativ 50 de aminoacizi, mult mai tipic un maxim de aproximativ de 40 de aminoacizi și chiar mult mai tipic, un maxim de aproximativ 30 aminoacizi.

Dacă sunt prezente, secvențele de aminoacizi non-HCV, L și L’ pot constitui orice număr de tipuri de secvențe. De exemplu, L și L‘ pot reprezenta secvențele nonHCV la care Z este fuzionat pentru a facilita exprimarea recombinantă (de exemplu beta-galactozidază, superoxid dismutază, invertaza, factorul alfa TPA, etc), așa cum s-a discutat în continuare. în mod alternativ L și L’ pot reprezenta epitopii altor patogenii, cum ar fi, de exemplu virusul hepatitei B, Bordetella pertussis, tetanos toxoid, difteria etc, pentru a se prevedea compoziții care sunt relativ imunoreactive la un număr de alți patogeni. L și L’ pot fi secvențe de aminoacizi care facilitează atașarea la suporturile solide în timpul sintezei peptidelor, suporturile imunoanalizei, proteina suport pentru vaccinuri etc. De fapt, L și L’ pot cuprinde unul sau mai mulți aminoacizi

RO 116199 Bl

500 inutili, cu nici un avantaj funcțional. Nu există nici o dimensiune maximă critică pentru L sau L’, lungimea fiind în general guvernată de funcția dorită. în mod tipic, fiecare L și L’ va avea un maxim de aproximativ 2OOO de aminoacizi, preferabil un maxim de aproximativ 1000 de aminoacizi. Majoritatea secvențelor L și L’ vor fi de aproximativ 500 de aminoacizi. Este de dorit să se selecționeze L și L’ astfel ca să nu se blocheze imunoreactivitatea lui Z. Compoziția de polipeptide se caracterizează prin prezența în compoziție (într-o cantitate efectivă pentru imunoreactivitate) în compoziție, a cel puțin două secvențe de aminoacizi definite după cum urmează, prin formulele II și respectiv III:

Ly-^-L; (II)

Ly-Z₂-L> (III) în care L, L’, y și y’ sunt definiți ca mai înainte, ca și definirea independentă pentru fiecare din formulele II și III. Z₁ și Z₂ sunt fiecare secvențe de aminoacizi HCV așa cum s-au definit pentru Z mai sus, cuprinzând același domeniu variabil (de exemplu, locația fizică), dar care este derivat de la diferiți compuși din izolate HCV având între ei cel puțin un epitop heterogen în domeniul variabil comun al Z_y și Z₂. Ca un exemplu ilustrativ, o secvență de aminoacizi conform formulei II ar putea avea ca Z_y un fragment de domeniu hipervariabil cu un interval de 384-414 aminoacizi ai HCV-1 izolat (sau, mult mai special, 396-407 sau 396-408), în timp ce Z_y este un fragment analog al HCV-J1.1 izolat. Acești doi compuși izolați sunt heterogeni în acest domeniu, secvențele de aminoacizi ai epitopilor variind semnificativ. Se înțelege că compozițiile prezentei invenții pot cuprinde mai mult decât chiar două secvențe discrete de aminoacizi, conform formulei I și că Z conține secvențe care pot fi divizate în grupe incluzând diferite domenii variabile. De exemplu, o compoziție conform prezentei descrieri de invenție ar putea cuprinde o grupă de secvențe HCV (cu secvențele de aminoacizi conform formulei I), incluzând domeniul hipervariabil la aminoacizii 384-411 din izolatele HCV-1, HCV-J1.1, HC-J1, HC-J4 etc. Compoziția ar putea, așadar, cuprinde o grupă adițională de secvențe HCV (având secvențele de aminoacizi conform formulei I), incluzând domeniul variabil la aminoacizii 215-255, așadar de la compușii izolați HCV-1, HCV-J1.1, HC-J1, HCJ4, etc. Așadar, în contextul compozițiilor conform prezentei invenții, secvența formulei I poate fi definită în continuare după cum urmează:

Sv_n (IV) în care V reprezintă o secvență de aminoacizi cuprinzând secvența unui domeniu variabil HCV, în care domeniul variabil cuprinde cel puțin un epitop; de exemplu, formula I. S și n sunt numere întregi i 1. S reprezintă un domeniu variabil și n reprezintă un izolat special. De exemplu, S-1 ar putea reprezenta domeniul variabil la aminoacizii 384-411; S=2 ar putea reprezenta domeniul variabil la aminoacizii 215-255 și n=1,2, 3 și 4 ar putea reprezenta izolatele HCV-1, HCV-J1.1, HC-J1 și respectiv HCJ4. Astfel, cele două grupe de secvențe discutate mai sus ar putea fi reprezentate prin:

Grupa 1: 1V_v 1V₂, 1V₃ și 1V₄

Grupa 2: 2V_v 2V₂, 2V₃ și 2V₄.

Există cel puțin două secvențe distincte cu formula IV în compozițiile conform prezentei invenții, de exemplu compoziția conține două secvențe diferite conform formulei IV în care valorile pentru S și n sunt diferite.

505

510

515

520

525

530

535

540

RO 116199 Bl

De exemplu, sunt prezente cel puțin 1V, și 1V₂sau 1V _n și 2V_ssau 1V _nși 2V ., Secvențele distincte conform formulei IV sunt prezente în compoziție cu molecule de polipeptide identice, fie cu molecule de polipetide diferite. Utilizând o combinație minimă de 1 \β și 1V₂ pentru ilustrare, aceste două secvențe ar putea fi prezente în aceeași moleculă de polipetidă (de exemplu, 1V_r1V₂) sau în molecule separate. Această caracteristică a compozițiilor conform prezentei invenții poate fi descrisă ca compoziții de polipeptide, după cum urmează:

R_r-(SVJ_XR·, în care

S V și n sunt definiți ca mai sus;

R și R’ sunt secvențe de aminoacizi de aproximativ 1-2000 aminoacizi sunt identici sau diferiți;

r și r‘ sunt O sau 1 și sunt identici sau diferiți;

x este un număr întreg 2 1;

n este selectat independent pentru fiecare x;

și cu condiția ca secvențele de aminoacizi, care sunt prezente în compoziție, să fie reprezinte o combinație selectată dintr-o grupare care constă din (I) IV₄ și IV₂, (ii] IV_q și 2V₂ și (iii) 1 Vt și 2V_v în cazurile în care sunt polipeptide diferite, x poate fi 1, de asemenea acesta poate fi > 1 dacă se dorește; de exemplu, un amestec de polipeptide 1 V_r1 V₂ și 1V₁-2V₂. Când x este 1, r și r’ sunt de preferință ambii O pentru a se obține o redudanță cu Ly și L’y’, deoarece V poate fi descris prin întruchiparea preferată prin formula I. Când x este > 1, lungimile combinate ale lui r și Γ adiacent, sunt de preferință nu mai mari decât lungimile maxime tipice descrise mai sus pentru L și L’. Selecția secvențelor HCV de aminoacizi include secvențele V distincte ale compozițiilor, care depinde de aplicația prevăzută a secvențelor și descrierea acesteia este prezentată în referatele de specialitate. Mai întâi, se va aprecia că epitopii HCV menționați în prezenta invenție pot fi fragmentați în două grupe. Primul tip de epitopi sunt cei care sunt o “ grupă specială; de exemplu epitopii corespunzători în toți sau substanțial în toți compușii izolați, în grupa de izolați HCV au activitate imunologică încrucișată unul cu altul, dar și cu epitopii corespunzători ai compușilor izolați în totalitate din altă grupă. De preferință, epitopii dintr-o altă clasă cu o grupă specifică sunt substanțial conservați în această grupă, dar nu între sau printre alte grupe. Cel de-al doilea tip de epitopi sunt cei care sunt ‘‘specific izolați”, de exemplu, epitopul este reactiv imunologic încrucișat cu compușii izolați substanțial identici și nu este reactiv încrucișat cu toți compușii izolați sau cu toți compușii substanțial izolați.

Acești epitopi izolați sau cu grupe specifice, pot fi în mod real identificați în vederea prezentei descrieri. Mai întâi, secvențele diferite izolate HCV se compară, așa cum este descris în prezenta invenție, și se identifică ca suprafețele heterogenității secvenței. Modelul uzual de heterogenitate arată de obicei grupa sau specificitatea compusului izolat. Dacă o suprafață identificată este cunoscută că ar cuprinde unul sau mai mulți epitopi, secvența de o dimensiune suficientă include apoi epitopul sau epitopii doriți, care sunt selectați ca un domeniu variabil și pot fi incluși în compozițiile conform prezentei invenții. Dacă imunoreactivitatea unei suprafețe heterogene date nu este cunoscută, peptidele care reprezintă secvențele prezente în acea suprafață a izolatelor HCV diferite pot fi astfel preparate și ecranate. Ecranarea poate include, fără a se limita la aceasta, imunoanalizele cu diferite surse de anticorpi anti-HCV (de

RO 116199 Bl

595 exemplu, serul pacientului, Mabs de neutralizare etc.) sau generarea anticorpului și testarea capacității acestui anticorp de neutralizare a virusului, in vitro. Alternativ, locurile epitopilor identificați în protocolul de ecranare, așa cum este descris în continuare, pot fi examinate pentru heterogenitate, printre diferiții compuși izolați, iar proprietățile imunologice ale secvențelor heterogene corespunzătoare sunt astfel ecranate.

Pentru aplicații sub formă de vaccinuri, se crede că domeniile variabile de la E1 și/sau E2/NS1 vor fi de un interes special. în particular, un domeniu E1 variabil, conținând aminoacizii 215-255 (vezi fig. 2) și un domeniu variabil E2/NS1 conținând aminoacizii 384-414 (vezi fig. 3) au fost identificate ca fiind domenii importante imunoreactive. Evidența preliminară sugerează că unul sau ambele aceste domenii pot constitui locul responsabilității heterogene pentru mutanții care evadează, ceea ce conduce la infecții HCV cronice. Astfel, compozițiile de polipeptide, așa cum sunt descrise mai înainte, sunt domenii variabile în V, unul sau ambele din aceste domenii variabile fiind în special preferate. Mai mult, deoarece se referă, în general, la epitopii liniari în domeniile variabile, compozițiile de polipeptide, conform prezentei invenții, pot include, așadar, epitopi conformaționali. De exemplu, compoziția poate fi compusă dintr-un amestec de proteine recombinante E1 și/sau E2/NS1 (prezentând domeniile variabile ale diferiților compuși izolați), exprimate într-un sistem recombinant (de exemplu, celulele de mamifere sau insecte), care mențin epitopii conformaționali fie în interiorul, fie în exteriorul domeniului variabil. în mod alternativ, o subunitate de antigen E1 și/sau E2/NS1, de la un singur compus izolat care menține epitopii conformaționali, poate fi combinată cu o compoziție de polipeptidă conform prezentei descrieri de invenție (de exemplu, un amestec de polipeptide sintetice sau polipeptide recombinante denaturate). într-o altă aplicație preferată sub formă de vaccinuri, compozițiile de polipeptide descrise în prezenta invenție sunt combinate cu alți antigeni subunitari HCV, ca de exemplu, cei descriși U.S.S.N proprietate colectivă, intitulat “Hepatitis C Virus Asialoglycoproteins” (Attorney Docket No. 0154002) by Robert O. Ralston, Frank Marcus, Kent B. Thudium, Barbara Gervase și John Hali, înregistrat chiar la acea dată și menționat ca referințe.

Pentru aplicarea în diagnostic, în compoziții, se utilizează antigenii, și astfel se îmbunătățește capacitatea de detectare a anticorpilor în izolate HCV distincte. în mod tipic, amestecurile de polipeptide pot fi utilizate direct într-un format de imunoanaliză omogen sau heterogen, ultimul cuprinzând, de preferință, polipeptidă imobilizată pe substratul solid (de exemplu, cavitățile plăcii microtitrate, bile de material plastic, nitroceluloză, etc.). Vezi, de exemplu, PCT. WO 90/11089, EP 360088; Immunoassay: A practicai guide, prezentate mai sus. Alternativ, fiecare polipeptidă substanțial identică, care contribuie la prepararea compoziției de polipeptide conform prezentei invenții, ar putea fi imobilizată pe același suport la locul sensibil, prin care se obține informația, la care compus izolat sau la care grupă de anticorp această informație a fost generată. Aceasta poate fi în special importantă în diagnosticarea diferiților compuși izolați care cauzează hepatita, cancerul sau alte boli cu diferite prognoze clinice. Un format preferat este imunoanaliza strip Chiron RIBA™ descrisă în proprietate comună USSN 07/138894 și USSN 07/456637, descrieri care sunt menționate ca referințe.

600

605

610

615

620

625

630

635

RO 116199 Bl

Polipetidele utilizate le prepararea compozițiilor prezentei invenții pot fi realizate recombinant, sintetic sau ca cultură tisulară. Polipeptidele recombinante, cuprinzând secvențele HCV trunchiate sau proteinele HCV cu lungimi complete, pot fi realizate în întregime în secvențele HCV (unul sau mai mulți epitopi, fie contagioși, fie necontagioși] sau în secvențele dintr-o proteină de fuziune. în proteinele de fuziune, secvențele heteroloage utilizate includ secvențele care prevăd secreția din celula gazdă recombinantă, care include o reactivitate imunologică a epitopului sau epitopilor HCV, sau facilitează cuplarea polipeptidei la suportul vaccinului. Vezi, de exemplu, EP 116201; US 4722840; EP 258149; US 4629783, descrieri care sunt menționate ca referințe.

Metodele de preparare a polipeptidelor prin sinteză chimică sunt cunoscute în literatura de specialitate. Polipeptidele pot fi preparate, așadar, prin tehnologie recombinantă. O secvență ADN codificând HCV-1, ca și secvențele ADN din regiunile variabile de la compușii izolați HCV au fost descrise și/sau conținute ca referințe. Disponibilitatea acestor secvențe permite construcția polinucleotidelor care codifică regiunea imunoreactivă a polipeptidelor HCV. Polinucleotidele care codifică polipeptida dorită cuprind unul sau mai mulți epitopi HCV imunoreactivi din domeniul variabil al HCV, care poate fi sintetizat chimic sau izolat și inserat în vectorul de exprimare. Vectorii pot conține sau nu pot conține porțiuni de secvențe de fuziune cum ar fi, de exemplu, bet^galactozidază sau superoxid dismutaza (SOD). Metodele și vectorii care sunt utilizați pentru producerea polipeptidelor care conțin secvențe de fuziune ale SOD sunt descrise în EP 0196056, publicat în 1 octombrie, 1986. Acidul dezoxiribonucleic care codifică polipeptida dorită, în formă fuzionată sau în formă matură, și care nu conține secvența semnal care permite secreția, poate fi legat convenabil la vectorii de exprimare pentru oricare organism gazdă ales. Organismele gazdă sunt apoi transformate cu vectorul de exprimare. Atât sistemele eucariote, cât și organismul gazdă procariot, sunt utilizate în prezent în formarea polipeptidelor recombinante; de asemenea, este prezentat un sumar pentru câteva din cele mai comune sisteme de control și pentru liniile celulare ale organismului gazdă. Celulele gazdă sunt incubate în condițiile în care se permite exprimarea polipeptidelor dorite. Polipeptida este izolată apoi din celulele lizate sau din mediul de cultură și purificate atât cât este necesar pentru utilizarea prevăzută. Tehnicile generale, utilizate în extracția genomului HCV din virus, prepararea și probarea colecțiilor de acizi dezoxiribonucleici ADN, secvențarea clonelor, construirea vectorilor de exprimare, transformarea celulelor, analizele imunologice de performare cum ar fi, de exemplu, radioimunoanalizele și analizele ELISA pentru celulele care se dezvoltă în cultură și altele, sunt cunoscute în literatura de specialitate (vezi, de exemplu, referințele citate în secțiunea de descriere a câmpului inveției de mai sus, ca și referințele citate la începutul acestei secțiuni despre modurile de punere în practică a invenției). Transformarea vectorului care conține secvența dorită la gazda corespunzătoare poate fi realizată prin orice metodă cunoscută pentru introducerea polinucleotidelor în celula gazdă, incluzând, de exemplu, înglobarea polinucleotidei în virus și transducția celulei gazdă cu virusul sau prin absorbția directă a polinucleotidei. Procedeul de transformare utilizat depinde de celulele gazdă care trebuie transformate. Transformarea bacteriană prin absorbție directă utilizează, în general, tratamentul cu

RO 116199 Bl

685 clorură de calciu sau cu clorură de rubidiu (Cohen, 1972, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 69: 2110). Transformarea drojdiei prin absorbție directă poate fi efectuată utilizând metoda lui Hinnen și colab., (1978), J.Adv.Enzyme Reg. 7: 1929. Transformările mamiferelor prin absorbție directă pot fi conduse utilizând fosfatul de calciu în metoda de precipitare a lui Graham și Van der Eb (1978), Virologz 52: 546 sau diferitele modificări cunoscute ale acestora. Alte metode pentru introducerea polinucleotidelor recombinante în celule, în special în celulele mamiferelor, care sunt cunoscute în literatura de specialitate, includ transfectarea mediată de dextran, fosfatul de calciu care mediază transfectarea, polibrenul care mediază transfectarea, fuziunea protoplastului, electroporarea, încapsularea polinucleotidelor în lipozomi și microinjectarea directă a polinucleotidelor în nuclee.

în vederea obținerii expresiei secvențelor dorite, codificate, celulele gazdă sunt transformate cu polinucleotidele (care pot fi vectorii de exprimare) care sunt cuprinse de secvențele de control operabil legate la secvențele de codificare dorite. Secvențele de control sunt compatibile cu celulele gazdă desemnate. Printre celulele gazdă procariote, Escherichia coli este utilizată cel mai frecvent. Exprimarea secvențelor de control pentru procariote include promotorii, care conțin opțional porțiuni operatoare și porțiuni de legătură ale ribozomilor. Vectorii de transfer compatibili cu celulele gazdă procariote sunt derivate în mod obișnuit din, de exemplu, pBR322, un plasmid conținând operonii care conferă rezistență la ampicilina și tetraciclină și diferiții vectori pUC, care conțin, așadar, secvențe care conferă markeri de rezistență la antibiotice. Secvențele promotoare pot fi produse în mod natural, de exemplu, beta-lactamazele (penicilinază) (Weissman, (1981), “Clonizarea interferonului și alte lipsuri”, în Interferon 3 (ed.\, Gresser) lactoza (lac) (Chang și colab., (1977), Nature 198: 1056) și triptofan (trp)(Goeddel și colab., (1980), Nucl.Acids Res. 8: 4057) și sistemul promotor Pt lambda derivat și gena N din porțiunea de legătură a ribozomilor (Shimatake și colab., (1981), Nature 292: 128). în plus, promotorii sintetici care nu se produc în natură, funcționează așadar ca promotori bacterieni. De exemplu, secvențele de activare a transcripției pentru un promotor pot fi unite cu secvențele operon ale altui promotor, creând un promotor hibrid sintetic (de exemplu, promotorii trp și promotorii lac (de Boer și colab., (1983), Proc.Natl.Acad.Sci. USA 80: 21). Sistemele menționate mai înainte sunt în special compatibile cu Escherichia coli; dacă se dorește, se pot utiliza alte celule gazdă procariote, cum ar fi, de exemplu, speciile de Bacillus sau Pseudomonas, cu secvențele de control corespunzătoare. Celulele gazdă eucariote includ drojdia și celulele de mamifere în sistemele de cultură. Saccharomyces cerevisiae și Saccharomyces carlsbergensis sunt mult mai comun utilizate ca celule gazdă de drojdie și sunt celule fungice convenabile. Vectorii compatibili de drojdie poartă, în general, markerii care permit selecția transformanților cu succes deplin, prin conferirea prototropiei la mutanții auxotropici sau a rezistenței la metalele grele pe specii de tipuri naturale. Vectorii compatibili de drojdie pot întrebuința cei doi microni originali de replicare (Broach și colab., (1983), Meth.Enz. 101: 307), combinația de CEN3 sau ARS1 sau alte mijloace pentru asigurarea replicării, cum ar fi, de exemplu, secvențele care vor rezulta din încorporarea unui fragment corespunzător în genomul celular al gazdei. Secvențele de control pentru vectorii de drojdie sunt cunoscute în literatura de specialitate și includ promotorii pentru sinteza enzimelor glicolitice (Hess și colab., (1968), J.Adv.Enzyme Reg. 7:149); pentru alcool

690

695

700

705

710

715

720

725

RO 116199 Bl dehidrogenază se dau ca exemple (ADH) (EP 284044), enolaza, glucochinaza, glucozo-6-fosfat izomeraza, gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenaza (GAP sau GAPDH), hexokinaza, fosfofructokinaza, 3-glicerofosfat mutaza și piruvat kinaza (PyK)(EP 329203). Gena drojdiei PHO5, acid fosfataza codificată prevăd, așadar, secvența promotoare folositoare. în adiție, promotorii sintetici care nu se produc în natură, funcționează, așadar, ca promotori de drojdii. De exemplu, secvențele de activare (UAS) invers față de promotorul drojdiei, pot fi legate al regiunea de activare transcripțională a altui promotor de drojdii, creând un promotor hibrid sintetic. Exemplele acestor promotori hibrizi includ secvența de reglare ADH unită la regiunea de activare transcripțională (US 4876197 și 4880734). Alte exemple de promotori hibrizi includ promotorii care constau din secvențe de reglare a ADH2, GA L4, GAL1O sau PHO5 ca gene, combinate cu regiunea de activare transcripțională a genei enzimei glicolitice, cum ar fi, de exemplu, GAP sau PyK (EP 164556). Mai mult decât atât, promotorul din drojdii poate include promotorii care se produc în mod natural în origine non drojdii, care au capacitatea de a lega ARN polimeraza drojdiei pentru o inițiere corespunzătoare a transcripției. Alte elemente de control care pot fi incluse în vectorul de exprimare din drojdii sunt terminatorii (de exemplu, de la GAPDH și de la gena enolazei) (Holland, 1981, J.Biol.Chem. 256: 1385) și liderii secvențelor. Fragmentul secvenței lider codifică o peptidă semnal care cuprinde aminoacizii hidrofobi care dirijează secreția proteinei din celule. Acidul dezoxiribonucleic, codificat corespunzător de secvențele semnal, poate fi derivat din genele pentru proteinele din drojdie secretate, cum ar fi, de exemplu, gena care codifică invertaza în drojdie (EP 12873) și gena factorului alfa (US 4588684). Alternativ, liderii de origine non-drojdii, cum ar fi, de exemplu, liderul interferon, este prevăzut așadar pentru secreția în drojdii (EP 60057). 0 clasă preferată de lideri de secreție este cea care utilizează un fragment de drojdie având factorul alfa, care conține atât secvența de “pre” semnal, cât și regiunea “pro”. Tipurile de fragmente de factor alfa care pot fi utilizate, includ lungimea completă a liderului pre-pro factor alfa, ca și liderii factorului alfa trunchiați (US 4546083 și 4870008, EP 324274). Liderii adiționali care utilizează un fragment lider de factor alfa care prevede secreția, include liderii factor alfa hibrizi, obținuți cu o presecvență a primei drojdii, dar include și o preregiune din cel de-al doilea factor alfa din drojdii (vezi, de exemplu, PCT WO 89/02463). Vectorii de exprimare, fie ca replicații extracromozomiale, sau ca vectori de integrare, au fost dezvoltați prin transformare în mai multe drojdii. De exemplu, vectorii de exprimare au fost dezvoltați pentru Candida albicans (Kurtz și colab.,). Mol. Cell. Biol. 6:142), Candida maltosa (Kunze și colab., 1985) J. Basic Microbiol.25 141), Hansenula polimorpha (Glaeeson și colab., 1986 J. Gen. Micro. Bio. 132: 3459), Kluyveromyces fragilis (Das și coiab., 1984, J. Bacteriol. 158: 1165), Kluyveromyces lactis (De Louvencourt și colab., 1983, J. Bacteriol. 154: 727), Pichia quillerimondii(Kunze și colab., 1985, ), Pichia pastoris (Cregg și colab., 1985) mol. Cell. Biol. 5: 3376; US 4837148 și 4929555)) Schizosaccharomyces pompe (Beach and Nurse (1981), Nature (300:706) și Yarrowia lipolytica (Davidow și colab., 1985, Curr. Genet. 10: 39). Liniile celulare de la mamifere convenabile ca celule gazdă pentru extrimare, sunt cunoscute în literatura de specialitate și includ multe linii celulare imortalizaze convenabile, din American Type Culture Collection (ATCC), incluzând, de exemplu, celulele Hela, celulele

RO 116199 Bl

775 de ovar de hamster chinezesc (CHO), celulele de rinichi de pui de hamster (BHK), celulele de maimuță (COS) și un număr de alte linii celulare. Promotorii convenabili pentru celulele de mamifere sunt cunoscute în literatura de specialitate și includ promotori virali ca de exemplu cei de la Simian Virus 40 (SC40) Rous sarcoma virus (RSV), adenovirus (ADV), și virusul papilonului de bovine (BPV) (Vezi Sembrook 1989) ca promotori corespunzători. Celulele de la mamifere pot necesita, așadar, secvențe terminale și secvențe de adiție poli A; secvențele de mărire care cresc exprimarea, pot fi, de asemenea, incluse și secvențele care cauzează amplificarea genei pot fi așadar dezirabile. Aceste secvențe sunt cunoscute în literatura de specialitate.

Vectorii convenabili pentru replicarea în celulele de mamifere sunt cunoscuți în literatura de specialitate și pot include replicări virale sau secvențe care asigură integrarea secvențelor corespunzătoare care codifică polipeptidele dorite în genomul gazdă. Un vector utilizat pentru exprimarea acidului dezoxiribonucleic străin și care poate fi utilizat la preparatea vaccinului este virusul Vaccinia. în acest caz, acidul dezoxiribonucleic heterolog este inserat în genomul Vaccinia. Tehnicile de inserție ale acidului dezoxiribonucleic străin în genomul virusului Vaccinia sunt cunoscute în literatura de specialitate și utilizează, de exemplu, recombinarea omoloagă. Inserția acidului dezoxiribonucleic heterolog se efectuează, în general, în gena care nu este esențială în natură, de exemplu, gena timin kinaza (tk) care prezintă, marker selectabil. Vectorii plasmidului care facilitează mai mult construcția virusurilor recombinate, au fost descrise (vezi, de exemplu, Mackett și colab., 1984 în ADN Cloning Voi. III IRL Press, P.1991, Chakrabarti și colab., 1985), mol. Cel. Biol. 5: 3405; Moss 1987 în Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells” (Miller and Calos, EDS p. 10). Exprimarea polipeptidelor dorite, cuprinse în regiunile cuprinse în regiunile imunoreactive se produce apoi în celulele sau indivizii care sunt infectați și/sau imunizați cu virusul vacinului recombinant viu.

Alte sisteme de exprimare a polipeptidelor includ celulele de insecte și vectorii convenabili pentru utilizare în aceste celule. Aceste sisteme sunt cunoscute în literatura de specialitate și includ, de exemplu, expresia vectorilor de transfer de exprimare a insectelor, derivați de la baculovirusul Autographa Californica, virusul polihidrosis nuclear (AcNPV) care este un helper independent, un vector de exprimare viral. Vectorii de exprimare derivați de la acest sistem utilizează de obicei, promotorul genei palindromice virale puternice, pentru a dirija exprimarea genelor heteroloage. în mod curent, cei mai comuni vectori de transfer utilizați pentru inducerea genelor străine în AcNPV este pAc373. Mulți alți vectori cunoscuți în literatura de specialitate au fost desemnați pentru o exprimare îmbogățită. Aceștia includ, de exemplu, pVL985 (care codifică codonul de start de palindromi de la ATG la ATT și care induce partea de donare BamHI cu 32 perechi de bază în sensul de la ATT; (vezi de exemplu, Luckow and Summers 1989, Virologz 17:31).0 bună exprimare a proteinelor străine nefuzionate, necesită de obicei genele străine care, ideal, au secvența lider scurtă și conține semnal de start. Plasmidul conține, așadar, semnalul palindrom de poliadenilare și gena (amp) de rezistență la ampicilină, ca și originea replicării pentru selecția și propagarea în Escherichia coli. Modelele pentru inducerea acidului dezoxiribonucleic în porțiunea dorită din baculovirus, sunt cunoscute în literatura ( Vezi Summers and Smith, Texas Agricultural Experiment Station Bulletin No. 1555; Ju și colab., (1987) în “ Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells” (Miller and Calos, eds); Smith și colab., L989).

780

785

790

795

800

805

810

815

RO 116199 Bl

De exemplu, pentru această inserție poate fi în gena palindrom, prin recombinare omoloagă; inserția poate fi, de asemenea, în porțiunea de restricție enzimatică prelucrată în gena dorită a bacilovirusului. Secvențele inserate pot fi cele care codifică toate segmentele sau diferite segmente ale polipeptidelor HCV dorite, incluzând cel puțin un epitop din domeniul variabil.

Semnalele pentru modificările post-transcripționale, cum ar fi, de exemplu, clivajul polipeptidei semnal, clivajul proteolitic și fosforilarea, par a fi recunoscute de celulele insectelor. Semnalele necesare pentru secreție și pentru acumularea nucleară par a fi conservate între celulele de nevertebrate și celulele de vertebrate. Exemple de secvențe semnal, de la celule vertebrate care există efectiv, în celulele de nevertebrate, sunt cunoscute în literatura de specialitate, de exemplu secvența semnal interleuchinei 2 umane (2IL) care este un semnal pentru transportul exterior atunci când celula este recunoscută și îndepărtată pe drept cuvânt în celule, la insecte.

Dacă se dorește, polipeptidele pot fi preparate utilizând celulele gazdă, iar vectorii menționați mai sus vor fuziona cu polipeptidele. Ca și în cazul polipeptidelor nefuzionate, fuziunea polipeptidelor poate rămâne intracelulară după exprimare. Alternativ, fuziunea proteinelor poate fi, așadar, secretată din celule, în mediul de dezvoltare dacă acestea sunt cuprinse în fragmentul peptidei lider. De preferință, exită părți de prelucrare între lider și cel care rămâne în gena străină, care se poate cliva in vivo sau in vitro.

în cazul în care compoziția trebuie utilizată pentru tratamentul hepatitei C virale, este de dorit ca, compoziția să fie imunogenă. în cazurile în care polipeptida sintetizată este corect configurată, astfel încât să prezinte epitopul corect, dar este prea mică pentru a fi imunogenă, polipeptida poate fi legată la un suport corespunzător. Pentru obținerea unor astfel de legături, în literatura de specialitate sunt cunoscute tehnici incluzând formarea legăturilor disufurice, utilizând N-succinimid-3-(2-piridiltio) propionatul (SPDP) și succinimidil 4{N-maleimidometil]ciclohaxan-1-carboxilat (SMCC) (dacă peptidei îi lipsește o grupare sulfhidril, aceasta poate fi introdusă, prin adiția reziduului de cisteină) acești reactivi creează o legătură disulfurică între ele și reziduurile de cisteină ale peptidei la o proteină și o legătură amidică prin ξ-amino, pe lisină sau altă grupare amino liberă la alți aminoacizi. Vezi, de exemplu, Immun. Rev-1982 62:185. Pentru un tioeter, se pot utiliza alți agenți de cuplare bifuncționalL_mai bine decât pentru legătura disulfurică. Mulți dintre acești agenți de formare a legăturii tioeterice sunt convenabili din punct de vedere comercial și includ esterii reactivi ai acidului 6maleimidocapronic, acidului 2-bromoacetic, acidului 3-iodoacetic, acidul 4-(Nmaleimido-metil)ciclohexan-1-carboxilic și alți acizi asemănători. Grupările carboxil pot fi activate prin combinarea lor cu succinimidă sau acidul 1-hidroxil-2-nitri-4-sulfonic, sarea de sodiu. Metodele adiționale de cuplare a antigenilor utilizează sistemul rotavirus peptidă de legătură” descris în EP 259149. Lista precedentă nu înseamnă că este exhaustivă și modificările compușilor menționați pot fi utilizate clar.

Orice purtător poate fi utilizat astfel ca să nu includă el însuși producția de anticorpi nocivi la gazdă. Purtătorii convenabili sunt tipic molecule mari, respectiv, macromolecule slab metabolizate cum ar fi, de exemplu proteinele, polizaharidele ca de exemplu latexul sepharozei funcționalizate, agaroza, celuloza, bilele de celuloză și altele; aminoacizii polimerici, ca, de exemplu, acidul poliglutamic, polilisina și altele, copolimerii de aminoacizi, și particulele de virus inactiv.

RO 116199 Bl

Substraturile de proteina utilizate sunt în special albuminele serice, keyhole limpet homocianina, moleculei de imunoglobulină, tiroglobulină, ovalbumină, tetanus toxoidul și alte proteine bine cunoscute în literatura de specialitate.

Imunogenitatea epitopilor din domeniile variabile HCV, în special E1 și E2/NS1, poate fi așadar obținută prin prepararea lor în sistemul eucariot fuzionat cu sau asamblat cu proteinele de formare a particulelor, cum ar fi, de exemplu, cele asociate cu antigenul de suprafață a hepatitei B (vezi, de exemplu, US 4722840). Construcțiile în care polipeptidele care conțin epitopul HCV din domeniul variabil sunt legate direct la secvențele de codificare a proteinei care formează particulele, produc hibrizi care sunt imunogenici față de epitopul HCV. în adiție, toți vectorii preparați includ epitopii specifici HCV, având diferite grade de imunogenitate, ca de exemplu peptidă Pre-S. Astfel, particulele construite din particule care formează proteina includ secvențele HCV care sunt deci imunogenice față de HCV și HBV.

Antigenul de suprafață al hepatitei (HBSAg) s-a demonstrat a fi format și asamblat în particoleîn S. Cerevisiae (Valenzula și colab., 1982, Nature 298; 044 și de exemplu în celulele de mamifere) Valenzuela și colab., 1984, în “Hepatitis S' Milliam I. și colab.,]. Formarea acestor particule include imunogenitatea subunităților monomerice. Construcțiile pot, așadar, include epitopul imunodominant al HBSAg, cuprinzând 55 de aminoacizi din regiunea de suprafață (pre-S). Neutrath și colab., 1984. Construcțiile de particule pre-S-HBSAg expresiile de drojdii sunt descrise în EP 174444; hibrizii includ secvențele virale heteroloage pentru exprimarea drojdiilor, așa cum este descris în EP 175261. Aceste construcții pot fi, de asemenea, exprimate în celulele mamiferelor cum ar fi celulele CHO utilizând un vector al SV-dihidrofolat reductaza [Michelle și colab., 1984)

În adiție, porțiunile secvenței care codifică proteina ce formează proteina pot fi înlocuite în codonul de codificare a epitopului din domeniul variabil HCV. în această înlocuire, regiunile care nu necesită medierea agregării unităților, pentru a forma particule imunogenice în drojdii sau la mamifere, pot fi eliminate, și în acest fel se elimină părțile antigenice HCV adiționale din competiția cu epitopul sau cu epitopii HCV.

Prepararea vaccinurilor care conțin o polipeptidă sau mai multe polipeptide imunogenice, ca ingredient sau ca ingredienți activi, este cunoscută în literatura de specialitate. în mod tipic, astfel de vaccinuri sunt preparate ca produse injectabile, fie ca soluții sau suspensii. De asemenea, este preparat lichidul care precede injectarea pentru formele solide convenabile pentru solubilizare în formă de soluții sau în suspensii. Preparatul poate fi astfel emulsionat, încapsulat sau sub formă de polipeptide. Ingredientele imunogenice active sunt adesea amestecate cu excipienți care sunt acceptabili din punct de vedere farmaceutic și compatibili cu ingredientul activ. Ca excipienți corespunzători se pot utiliza, de exemplu, apa, soluția salină, dextroză, glicerolul, etanolul sau alți compuși sau amestecuri asemănătoare. în adiție, dacă se dorește, vaccinul poate conține cantități minore de substanțe auxiliare ca, de exemplu, agenți de emulsionare sau agenți de umectare, agenți de tamponare a pH-ului și/sau adjuvanți care determină obținerea eficacității vaccinului. Exemplele de adjuvanți care pot fi efective, includ, fără a se limita la aceștia, hidroxidul de aluminiu, N-acetilmurami^L-alanil-D-izoglutamina (CGP 11637), se referă la non-MDP, N-acetilmuramil-Lalanil-D-izoglutaminil-L-alanina-P-ÎT-P'-dipalmitoil-sn-glicero-S-hidroxifosforiloxiJ-etilamina (CGP 19835 A, se referă la MTP-PE și RIBI, care conține trei componente extrase din

865

870

875

880

885

890

895

900

905

910

RO 116199 Bl bacterii, lipidul monofosforil A, dimicolat trehaloza și scheletul pereților celulari (MPL+TDM+CWS într-o emulsie de 2% scualen Tween 80. Eficacitatea adjuvantului poate fi determinată prin măsurarea cantității de anticorpi direcționați către o polipeptidă imunogenă care conține un epitop HCV dintr-un domeniu variabil, anticorpii rezultând din administrarea acestei polipeptide în vaccinurile care sunt așadar compuse din diferiți adjuvanți.

Proteinele pot fi formulate ca vaccinuri sub forme neutre sau sub formă de săruri. Sărurile acceptabile din punct de vedere farmaceutic includ sărurile de adiție acide (formate cu grupări amino libere de peptide) și care sunt formate cu acizii anorganici ca, de exemplu, acizii clorhidric sau fosforic, sau acizii organici ca, de exemplu, acidul acetic, acidul oxalic, acidul tartric, acidul maleic și alți acizi asemănători. Sărurile formate cu grupări carboxilice libere pot fi așadar derivate de la bazele anorganice, cum ar fi, de exemplu, hidroxizii de sodiu, potasiu, amoniu, calciu sau hidroxizii ferici și astfel de baze organice ca, de exemplu, izopropilamina, 2-etilaminoetanolul, histidina, procaina și altele.

Vaccinurile sunt administrate în mod convențional prin injectare, de exemplu pe cale parenterală prin injecții subcutanate sau intramusculare. Formele care sunt convenabile pentru alte moduri de administrare includ supozitoarele și, în unele cazuri, formele pentru administrare orală. Pentru supozitoare, lianții și vehiculele tradiționale includ, de exemplu, polialchilen glicolii sau trigliceridele; astfel de supozitoare pot fi formate din amestecuri care conțin ingredientul activ în proporție de la 0,5% până la 10%, de preferință 1 % până la 2%. Formulele orale includ astfel excipienți normal utilizați, de exemplu, grade farmaceutice de manitol, lactoză, amidon, stearat de magneziu, zaharină sodică, celuloză, carbonat de magneziu și alți compuși. Aceste compoziții iau forma de soluții, suspensii, tablete, pilule, capsule, formule sau pudre de eliberare susținută și conțin 10% până la 95% un ingredient activ, de preferință

25...70%.

în adiție la cele de mai sus, este posibil să se prepare vaccinuri vii, de microorganisme atenuate, care exprimă polipeptidele recombinante ale seturilor de antigeni HCV. Microorganismele atenuate convenabile sunt cunoscute în literatură și acestea includ, de exemplu, virusuri (de exemplu virusul vaccinului) ca și alte bacterii asemenea.

Vaccinurile sunt administrate într-o manieră compatibilă cu o formă de dozare și într-o astfel de cantitate pentru a fi profilactic și/sau terapeutic, efectivă. Cantitatea care trebuie administrată, care este, în general, curinsă între 5 micrograme până la 250 micrograme de antigen per doză, depinde de subiectul care trebuie tratat, capacitatea sistemului imunitar al subiectului de sintetizare a anticorpilor și gradul de protecție dorit. Cantitățile necesare de ingredient activ necesare se vor administra conform indicațiilor specialistului și pot varia de la individ la individ.

Vaccinul poate fi dat într-o singură doză, de preferință într-o schemă dozare multiplă. O schemă multiplă de dozare este una în care un curs primar de vaccinare poate fi 1-10 doze separate, urmând alte doze la intervale de timp secundare, necesare pentru a menține și/sau a consolida răspunsul imunologic, de exemplu la

...4 luni pentru o a doua doză și dacă este necesar, doze suplimentare după câteva luni. Regimul de dozare va fi, așadar, cel puțin parțial, determinat prin necesarul intervalului și va depinde de opinia specialistului.

RO 116199 Bl

960 în adiție, vaccinul care conține seturi antigenice cuprinde polipeptidele HCV descrise mai sus, care pot fi administrate împreună cu alți agenți imunoregulatori, de exemplu, imunoglobulinele. Compoziția conform invenției poate fi administrată la indivizi, pentru a genera anticorpi policlonali (purificați sau izolați, utilizând tehnicile convenționale) care pot apoi să fie utilizate într-un număr de aplicații. De exemplu, anticorpii policlonali pot fi utilizați pentru o imunizare pasivă a individului sau ca reactivi imunogenici.

Conform invenției, compozițiile imunoreactive descrise mai sus cuprind o pluralitate de seturi antigenice HCV utilizate pentru detectarea anticorpilor anti-HCV în probele bilogice, incluzând, de exemplu, sângele sau probele serice. Aspectul imunoanalizelor este subiectul unei distribuții mari în ceea ce privește variațiile, și o mare parte a acestora se cunoaște în literatură. Cu toate acestea, imunoanaliza va utiliza seturi antigenice în care fiecare set antigenic constă dintr-o pluralitate de polipeptide substanțial identice, cuprinzând secvențele de aminoacid a epitopului într-un prim domeniu variabil al izolatului HCV și secvența de aminoacid a unui set este heterogenă, comparativ cu secvența de aminoacid a cel puțin altui set. Protocoalele pentru imunoanaliză pot fi clasificate, de exemplu, după reacția de competiție sau după reacția directă, sau în analizele de tip Sandwich. In cadrul protocoalelor, se pot utiliza suporturi solide care pot fi de imunoprecipitare. Majoritatea analizelor includ utilizarea anticorpului marcat sau a polipetidei; marcajele pot fi, de exemplu, fluorescente, chemiluminescente, radioactive sau molecule colorate. Analizele care amplifică semnalele din probe sunt așadar cunoscute; analizele care utilizează biotina, avidina și enzima marcată și imunoanalizele mediate sunt de tipul analizelor ELISA.

Kiturile convenabile pentru imunodiagnostic și care conțin reactivi marcați corespunzător sunt constituite prin ambalare în materiale corespunzătoare, incluzând compozițiile prezentei invenții care conțin epitopii HCV din domeniile variabile, în containere convenabile la un loc cu reactivii rămași și materialele (de exemplu substanțele tampon convenabile, soluțiile saline etc) necesare pentru conducerea analizei, ca și setul convenabil al instrucțiunilor de analiză.

în continuare, sunt prezentate exemplele de realizare a prezentei invenții, în conformitate cu fig. 1 ...9, care care reprezintă:

- fig. 1, o prezentare schematică a organizării genetice a HCV.

- fig. 2, o comparație a secvențelor de aminoacizi deduse, a proteinei E1 codificate de izolații HCV din grupa I și grupa II.

- fig. 3, o comparație a secvențelor de aminoacizi din regiunea E2/NS1 a izolatelor HCV.

- fig. 4, graficele de profiluri de antigenitate pentru capătul animo-terminal a proteinei HCV E2/NS1 (aminoacizii 384420) și pentru regiunea hipervariabilă gp 120 V3. A HCV-1.

-fig. 5, grafice care dau procentajele probabile la care reziduul dat din regiunea de amino-terminală a HCV E2/proteina NS1 (aminoacizii 384 până la 420) va fi găsit în motivul structural secundar a/fe-helix, betaSheet sau beta-turn, respectiv spirală alfa, înveliș beta și rotire beta.

- fig. 6, grafice care conțin reactivitatea anticorpilor în plasma de la HCV 18 (modelele A-C) sau Th (modelel D-f) cu peptidele octamere biotinilate suprapuse derivate de la aminoacizii 384 până la 415 ai HCV izolați HCT 18 (A,D), Th (B, E) și respectiv HCV J1 (C, F).

965

970

975

980

985

990

995

1000

RO 116199 Bl

-fig. 7, secvețelede aminoacizi deduse din două regiuni al polipeptidei E2/NS1, cuprinzând aminoacizii 384-414 și 547-647, dată pentru izolații Q1 și Q3.

- fig. 8A, secvențele de aminoacizi deduse ale HCV izolați, J1.1 și J1.2 din aminoacizii 384 până la 647.

- fig. 8B, secvențele de aminoacizi deduse, ale HTC 27 și HCVE1 izolați din aminoacizii 384 până la 651.

-fig. 9, o secvență întreagă de poliproteină a HCV-1 izolat.

Cu următoarele moduri de practicare, în afara cazurilor în care se dau alte indicații, tehnicile convenționale de biologie moleculară, microbiologie, acid dezoxiribonucleic recombinant și imunologie, care sunt cuprinse în referatele de specialitate. Astfel de tehnici sunt explicate complet în literatură, de exemplu: Maniatis, Fitsch și Sambrook, Molecular Cloning; A Laboratory Manuaf (2nd ed. 1989); “DNA Cloning Voi. 1 și 2 (D. N. Glover ed. 1985); “Oligonucleotide Syntesis(M. J. Gait ed. 1984); “Nucleic Acid Hibridization” (B. D. Hames și S. J. Higgins eds. 1984); “Transcription and translation” (B. D. Hames și S. J. Higgins eds. 1984); “Animal Cell Culture” (R. I. Freshney ed. 1986); Immobilized cells and enzymes (IRL Press, 1986); B. Perbal, “A practicai guide to molecular clonincf 1984; the series, “Methods in enzimolog/ (Academic Press, Inc.,); “Gene transfer Vectors for Mammalian Cells” (J. H. Miller and Μ. P. Calos eds. 1987, Cold Spring Harbor Laboratory). “Methods in enzimolog/ voi. 154 and voi. 155 (Wu and Grossman și respectiv Wu eds.,). Mayer and Walker eds. (1987), “Immunochemical methods in cell and molecular biolog/ (Academic Press, London), Scops, 1987, “Protein purification: Principles and practice”, Second Edition (Springer-Verlag, N. Y.) And “Handbook of experimental immunolog/ voi l-IV, (D. M. Weir and C. C. Blackwell eds 1986);

Materiale și metode

Probele de la pacient și extractele ARN

Purtătorii HCV asimptomatici HCT 18 și HCV J1 și pacientul Th infectat cronic cu HCV, au fost descriși de Weiner și colab., (1991) “Virof 18G: 842-848. Pacientul Q, diagnosticat cu hepatită cronică activă pe baza unei biopsii a ficatului, este plasat pentru o terapie cu interferon a//a-2b (3 milioane de unități, de trei ori pe zi) timp de șase luni. Acidul ribonucleic din 0,2 ml de plasmă este extras conform metodei date de Chomcynski and Sacchi )1987) “Anal. Biochem.” 162: 156-159, utilizând ARNyol™ B reactivul (Cinnabiotex Laboratories) conținând 10 mg per ml MS2 suport de acid ribonucleic (Boehringer Mannheim, 165-948) așa cum s-a indicat de către producător. Acidul ribonucleic este suspendat în 200 pl de pirocarbonat dietilictratat cu apă distilată și reprecipitat într-o concentrație finală de 0,2 M acetat de sodiu și două volume și jumătate de etanol 100 % (-2O°C).

Reacțiile în lanț ale cADN și polimerazei

Toate reacțiile sunt efectuate conform Weiner și colab., (1990) Lancet 335:15. Secvențarea lui M13 a fost realizată conform Messing și colab., (1983). Metodele din Enzimologie 101: 20-37. Secvențele consens a cel puțin patru inserții donate se prezintă cu excepția secvenței HCV J1, 2 E2/NS1 care derivă de la două clone.

Clonarea și secvențarea HCT18 și Th au fost raportate de Weiner și colab., (1991).

Primerii PCR în serie sunt utilizați pentru clonarea segmentelor amino-terminale și a segmentelor proximalecarboxi ale E2/NS1 la pacientul Q, ca PCR1:

RO 116199 Bl

X (E2) 14 GGTGCTCACTGGGGAGTCCT (1367-1386)

X (E2) 18J CATTGCAGTTCAGCGCCGTGCTA (1608-1588)a, PCT II

X (E2) 4 TCCATGGTGCGGAACTGGGC (1406-1425)

X (E2) 19J TGCCAACTGCCATTGGTGTT (1582-1562) A; PCR I

X (E2) 14 S (ca mai sus),

Jlrc12 TAACGCGCTGAGCTCGGA (2313-2296)A PRC II: US (E2)5 CAATTGGTTCGCTTGTACC (1960-1978) S J1rc13 CGTCCAGTTGCAGGCAGCTTC (2260-2240) A Primerii PCR utilizați pentru donarea genei HCV J1 E2/NS1 sunt: PCR I: J1 (E2)14 S (ca mai sus)

J1 (E2)rc30** CAGGGCAGTATCTGCCACTC (2349-2330) A

J11Z-2* TGAGACGGACGTGCTGCTCCT (1960-1978)S

J1 (E2JRC32** TTTGATGTACCAGGCGGCGCA (2658-2636) A

PCR II-E2384, 5*

GGATCCGCTAGCCATACCCGCGTGACGGGGGGGGTGCAA (1469-1495) S DSC0N1JBX * GGATCCTCTAGATTACTCTTCTGACCTATCCCTGTCCTGTCCTCCAAGTC ACA (2272-2301) A

J1 IZ -1 * CAACTGGTTCGGCTGTACA (1915-1935) S

J1 (E2)rc31** (2566-2546)A în care:

*, secvența nt este de la Takeuchi și colab., (1990) Nucleic acids Res. 18: 4626;

**, secvența nt este de la Kato și colab., (1989) “Proc. Jpn. Acad. 65B: 219-223. Primerii PCR cu sensul (S) sau antisensul (A) sunt dați conform orientării ca număr de nucleotide, în referință.

Sinteza peptidelor biotinilate

Octapeptidele suprapuse pentru regiunea hipervariabilă a trei specii de HCV au fost sintetizate pe linkeri convenabili, derivați din suporturile esențiale de polietilenă așa cum s-a descris de către Maeji și colab., (1990) “J.lmunol. Methods 134: 23-35, care au fost cuplate la N-terminal de la fiecare peptidă. în final, biotina este cuplată la capătul N-terminal, utilizându-se 150 pl soluție de dimetilformamidă care conține 40 mM de biotină, 40 mM 1-hidroxibenzotriazol (HOBt), 40 mM de benzotriazol-1-iloxi-tris-pirilidino-fosforrom hexafluorofosfat (PyBOP, NOVABIOCHEM) și 60 mM Nmetilmorfolină (NMM) care reacționează până a doua zi la temperatura de 20°C. După biotinilare, peptidele sunt deprotejate la catenele secundare, spălate, și peptida din fiecare suport este clivată în 200 microlitri de de 0,1 M tampon fosfat (pH 7,2). Plăcile microtitrate conținând soluțiile de peptide elevate sunt conservate atât cât este necesar, la temperatura de -20°C.

Analiza prin testare ELISA a peptidelor biotinilate

Plăcile de polistiren (plăci maxisorb imuno Nune F 96) sunt acoperite cu streptavidin prin incubare până a doua zi la temperatura de 4°C, cu 0,1 ml cavitate de 5 pg per ml de soluție de streptavidină (Sigma Cat. No. S4762) în 0,1 M tampon carbonat la pH 5,6. După îndepărtarea soluției de streptavidină, cavitățile sunt spălate de patru ori cu o soluție de 0,1% Tween în PBS. Legăturile nespecifice sunt blocate prin incubarea în fiecare cavitate a 0,2 ml de 2% BSA în PBS timp de 1h la temperatura de 20°C. Cavitățile sunt din nou spălate de patru ori cu PBS/Tween 20. Plăcile sunt apoi uscate la aer și menținute la temperatura de 4°C atât cât este necesar.

1050

1055

1060

1065

1070

1075

1080

1085

1090

RO 116199 Bl

Streptavidina din fiecare cavitate se cuplează prin incubare a 10 pl de soluție de peptide clivate de 1:100 diluție, cu 0,1% BSAÎn PBS conținând 0,1% azidă de sodiu timp de o oră la 2O°C. După incubare, placa este spălată de patru ori cu PBS/Tween 20. Fiecare cavitate este incubată cu 100 pl de ser diluat corespunzător (diluat cu 2% BSA în PBS care conține 0,1% azidă de sodiu) timp de 1 h la temperatura de 20°C sau până a doua zi la temperatura de 4°C după care se spală de patru ori cu PBS/Tween 20. Anticorpul legat este detectat prin reacția a 0,1 ml conjugat timp de 1 h la temperatura de 2O°C. Aceasta constă în 0,25 mililitri per litru (nivelul de saturare) de peroxidază de hrean marcată cu IgG de capră (H+L) (Kikegaard and Perry Labs, Gaithersburg, MD) în CASS (0,1% ser de oaie, 0,1% Tween 20, 0,1% caseinat de sodiu diluat în 0,1 M PBS, pH 7,2). Cavitățile sunt spălate de două ori cu PBS/Tween 20 după care se spală de două ori numai cu PBS. Prezența enzimei este detectată prin reacția timp de 45 min. la temperatura de 20°C, cu 0,1 ml de soluție proaspăt preparată conținând 50 de ml de soluție proaspăt preparată de amoniu 2,2'azino-bis (3-etilbenzotioazolina-6-sulfonat) (ABTS, Boehringer Mannheim Cat. No. 122661) și 0,03 ml de 35% (greutate pe greutate) de soluție de peroxid de hidrogen în 100 ml de 0,1 fosfat/0,08 M tampon citrat, la pH 4,0. Dezvoltarea culorii este măsurată pe placa Titertek Multiscan MC cu citire în modul lungimii de undă dual la 405 nm față de lungimea de undă de referință de 492 nm.

Profilul antigenității, generat pe computer

Profilurile de antigenitate pentru proteina HCV E2/NS1 și HIV-1 gp120 în regiunea hipervariabilă V3 (aa 303-338) sunt derivate de la computerul program pe baza gradului secvenței cu variabilitate propusă original de Kabat (“Secevențele proteinelor de interes imunologic, US Department of Health and Human Services, Public Health Service, Național Institute of Health (1983)) pentru identificarea regiunilor hipervariabile ale imunoglobulinelor multiplicate prin media probabilității individuale care leagă anticorpul prin care se reține fiecare mod posibil de perechi de aminoacizi. Probabilitățile pentru retenția anticorpului în legătură asociată cu o schimbare dată a aminoacidului, reprezintă valorile experimentale determinate prin evaluarea efectelor legăturii anticorpului pentru toate substituirile posibile de aminoacizi pentru 103 epitopi caracterizați linear (Geysen și colab., (1988), J.Mol.Rec. 1: 32-41). Acest algoritm cântărește astfel indicele de variabilitate, pentru a da o mai mare semnificație schimbărilor asemănătoare de aminoacizi, pentru a avea un efect semnificativ asupra legăturii anticorpului, de exemplu, compensatele pentru schimbările de aminoacizi. Cincizeci de secvențe HCV (HCV-1, Q3.2, HCT 23, EC10, HC-J1, HCVE1, TH, HCT 27, Q1.2, HCT18, HC-J4, HCV J1,2/HCV J1.1, HCV J, HCV BK), se utilizează pentru determinarea profilului de antigenitate pentru HCV. Profilul HIV-1 V3 este obținut prin profilurile individuale medii 242 ale celor 15 secvențe selectate la întâmplare din baza de date numeric mai mare a secvențelor HIV-1 unice (LaRosa și colab., (1990) “Science 249: 932-935 și “Correction in Science” (1991) p.811). Secvențele de aminoacizi pentru câțiva dintre acești compuși izolați între aminoacizi 384 și 420, sunt prezentate în fig. 3.

Predicțiile structurii secundare, generate de computer

Posibilitățile structurii secundare a helix β-secundară de înveliș și spiră pentru regiunea amino terminală (384-420) au fost determinate, utilizând un algoritm care stabilește probabilitățile pentru fiecare din cele trei motive structurale secundare de

RO 116199 Bl

1145 mai sus la fiecare reziduu. Coeficienții utilizați în algoritm sunt obținuți pentru toate combinațiile de reziduuri pereche din baza de date structurală (Levitt and Greer (1977), “J. Mol. Biol. 114: 181-293. Parametrii de predicție obținuți de la acești coeficienți sunt fixați la rezultatele observate, când algoritmul este aplicat spre baza de date, pentru a se obține probabilitatea că un reziduu dat să fie găsit într-unul din motivele structurale secundare din cele trei aefinite.

Exemplul 1. Compararea structurii secundare și a variației secvenței de aminoacizi în domeniile HCV E2/NS1 HVși HIV-1 gp120

Secvențele de aminoacizi de la cincizeci HCV 1 și HIV-1 izolate sunt comparate cu referire la numărul de poziții la care se observă heterogenitățile secvenței de aminoacizi în domeniile HCV E2 HV sau HIV-1 gp12O V3 (fig. 4, A și B respectiv). Heterogenitățile aminoacizilor se produc în 25 de poziții ale celor 30 de aminoacizi din regiunea E2 HV și 23 ale celor poziții ale celor 35 de aminoacizi din domeniul HIV-1 gp120 V3. Liniile de pe axul X din fig. 4A și B reprezintă pozițiile aminoacizilor la care se produc reziduurile variabile de aminoacizi și invariantele de aminoacizi sunt date într-un singur cod al literei aminoacidului. Profilurile de antigenitate sunt prezentate în fig. 4, indicând că, similar, la orificiul V3 al proteinei HIV-1 gp120 (fig. 4B), un bloc de reziduuri de aminoacizi în HCV E2 (aminoacizii 384-414 în fig. 4A] a fost identificat, bloc a cărui variație are un efect advers predictat, asupra legăturii anticorpului. Datele din fig. 4 arată că domeniul HCV E2 se aseamănă cu domeniul HIV-1 gp120 care este cunoscut pentru codificarea epitopilor de neutralizare a virusului; în ambele grade, semnificația predictată a variației observate pentru aminoacizi sugerează că domeniul E2 HV poate avea o funcție similară cu a domeniului gp120 V3.

Epitopii liniari sunt mult mai asemănători asociați cu regiuni mai puțin structurate de proteine, în special, cu terminațiile proteinelor sau cu orificii de suprafață extinse. O analiză de computer a fost utilizată pentru analiza probabilității conform căreia reziduul individual este asociat cu un motiv structural secundar, definit pentru secvențele a 15 E2 HV aminoacizi între reziduurile 384 până la 420. Fig. 4 arată că regiunea între reziduul E2 amino-terminal din poziția 384 și rotirea β-superior conservată, puternic anticipată (reziduurile 415-418) este relativ nestructurată așa cum s-a indicat cu o probabilitate de mai puțin 50 % față de caracterul de rotire a-helix, pTnveliș și de spiră probabilitate de α-spirală, beta înveliș sau caracter de rotire beta. Absența unei structuri puternic anticipate în domeniul E2 HV este consistentă cu toleranța pentru variația secvenței extensive găsită între compușii izolați și este în contrast cu regiunile superior structurate care contribuie la multiplicarea terțiară a proteinei. Domeniul HCV E2 HV pare să fie chiar mai puțin structurat decât domeniul V3 principal, de neutralizare al HIV-1 gp120, care conține o structură spiralată alfa filamentată, beta-r otită, de tipul II beta, beta filamentat și poate avea legături structurale mai mari privind variabilitatea aminoacizilor decât domeniul HCV E2 HV. Luați la un loc, se sugerează la un loc că domeniul E2 HV pare a avea trăsături caracteristice cu domeniile proteinelor care conțin porțiuni asemănătoare cu epitopii de neutralizare liniar.

Exemplul 2. Introducerea epitopului În domeniul HCV E27NS1 HV

Peptidele octamere suprapuse, biotinilate, care corespund domeniului E2/NS1

HV și extinderea mai mult decât domeniul E2/NS1 HV (aminoacizii 384 până la 416] a HCT 18 (A,D), Th (B,E) și HCV J1 (C,F) sunt aduse pe plăcile acoperite cu streptavidină și reacționează cu plasma, de la HCT 18 (A-C) sau Th (D-F).

1150

1155

1160

1165

1170

1175

1180

1185

RO 116199 Bl

Rezultatele sunt arătate în fig. 6 pentru izolate HCT 18 din HCV (fig. 6A și 6D), Th (fig. 6B și 6E) și HCV J1 (fig. 6C și 6F). Plasma HCT 18 este diluată 1:2OO și plasma Th este diluată 1:5OO. HVE-1, HVE-2, HVE-3, HVE-4 și HVE-5 care reprezintă epitopii specifici izolați. Așa cum se vede din fig. 6, plasma HCT 18 identificată în epitopul linear (⁴⁰⁷PKQNV⁴¹¹) când este testată cu peptidele derivate din secvența HCT 18 (HVE-1 în fig. 6A), dar reacționează cu peptidele corespunzătoare domeniului HV al celor două specii diferite Th și HCV <J1 (fig. 6B și 6C). în contrast cu aceasta, plasma Th în care se identifică epitopul liniar HVE-IVÎn domeniul HV al Th (⁴⁰⁹QNIQLI⁴¹⁴, fig. 6E) și, de asemenea, epitopii din specia HCT 18 (³⁹⁹IVRFFAR⁴⁰⁵, fig. 6D) și HCV J1. Th, un consumator de medicamente IV, poate fi expus la multiple specii de HCV. Ambele plasme Th și HCT 18 reacționează fiecare cu un epitop (aminoacizii 413-419) comuni cu toți cei trei compuși izolați (datele nu arată) când se utilizează analiza ELISA cu suportul sintetizat cuprinzând peptidele octamericâ suprapuse, din fiecare compus izolat. în vederea validării specificității de legare a anticorpilor, anticorpii legați la peptidele biotinilate conținând aminoacizii 403-407 sunt eluați și utilizați pentru blocarea reactivității plasmei HCT 18 cu suportul care conține peptidele octamerice suprapuse pentru domeniul HCT 18 HV. Aceste date arată că:

1) domeniul E2/NS1 HV este imunogenic

2) există multipli epitopi care se aplică în această regiune și 3) un subset de epitopi (HVE-1, HVE-2, HVE3, HVE4 și HVE5 din fig. 6) în domeniul HV, este izolat într-un mod specific.

Exemplul 3. Determinarea faptului că domeniul variabil E2/NS1 HV poate fi asociat cu simptomele de hepatită

Pentru investigarea posibilității de descoperire a varianților HCV asociați cu simptomele intermitente de hepatită, care se găsesc adesea în infecțiile cronice cu HCV, s-a secvențat parțial gena E2/NS1 de la un pacient Q cu hepatita cronică, în timpul a două episoade distincte de hepatită la intervale de aproximativ doi ani (Q1 și respectiv Q3). Episodul secundar al hepatitei se produce la 1,5 ani după terminarea tratamentului cu interferon. Diferențele în secvența dedusă de aminoacizi în regiunea Q1 și Q3 E2/NS1 HV sunt puternic diferite numai între aminoacizii 391-408 cu șapte din cele opt schimbări care se produc între aminoacizii 398 și 407 (fig. 7). Fig. 7 arată secvențele de aminoacizi deduse din cele două regiuni ale polipeptidei E2/NS1, aminoacizii 384-414 și 547-647, pentru izolatele Q1 și Q3. Secvența Q1 a aminoacidului de mai sus (E) a fost găsită într-una din cele patru clone Q1. Aminoacizii boxați reprezintă domeniile Q1 sau Q3 HVE din peptida dodecamerică. Diferențele secvențelor de aminoacizi între Q1 și Q3 sunt imprimate în tipul gras. Numai o heterogenitate a aminoacidului este observată între aminoacizii 547 și 647 aparținând polipeptidelor Q1 și Q3 E2/NS1 (figura 7).

Pentru examinarea efectului substituirilor de aminoacizi în domeniile Q1 și Q3 E2 HV la legătura anticorpului, am sintetizat peptida Q1 și Q3 12-merică specifică de la aminoacizii 396 până la 407 (HVE Q1 sau Q3 în fig. 7B) și separat s-a efectuat reacția plasmei Q1 și Q3 cu fiecare peptidă prin analiza ELISA. Tabelul 4 arată că anticorpii în ambele plasme Q1 și Q3 reacționează cu peptida Q1, dar nu și cu peptida Q3. Analiza statistică (Testul studentului) arată că legătura plasmei Q1/Q3 cu peptida Q1 are semnificație față de legătura de bază a acestei plasme la modelul 12 al peptidelor de control alese întâmplător (P<0,001), în timp ce legătura la plasma Q1 sau Q3 cu peptida Q3 nu are o semnificație statistic.

RO 116199 Bl

Datele arată că pacientul Q dezvoltă anticorpi în domeniul HCV Q1 HV, care sunt încă detectabili doi ani mai târziu la intervalul de timp Q3; la variantul Q3 E2, care este predominant în timpul celui de-al doilea stadiu de hepatită, nu s-a dezvoltat nici un răspuns umoral detectabil.

Rezultatele analizei ELISA pentru peptidele dodecamerice

1235

1240

Tabelul 4

Plasma	TARFAGFFQSGA Secvența Q1	TAGFVRLFETGP Secvența Q3
	Medie Sd	Medie Sd
Q1	1,158 0,134	0,691 0,123
Q3	1,022 0,123	0,093 0,036

1245

Exemplul 4. Detectarea genelor coexistente E2/NS1 cu domeniile distincte E2/NS1 HV, la indivizii HCV infectați

Fig. 8A arată secvențele de aminoacizi deduse de la compuși izolați din HCV J1 (J1.1 și J1.2) care au fost donați în proba de plasmă a donatorilor japonezi de sânge cu HCV J1 voluntari de sânge, (Kubo și colab.,(1989), “Nucl.Acids Res.” 17: 1036710372). Din numărul total de modificări de aminoacizi între HCV J1.1 și HCV J1.2, un număr de 9 modificări indicate de tipul gras sunt aglomerate în domeniul E2/NS1 HV. Cinci dintre cele 9 substituiri de aminoacizi în domeniul E2/NS1 HV reprezintă modificări nonconservative de aminoacizi. Deoarece HCV J1 este numai o grupă a genomului II HCV care a fost donată în laboratorul nostru, este puțin probabil ca aceste diferențe să se datoreze contaminării încrucișate a plasmei HCV J1. Secvența HCV J1.2 reprezintă o secvență minoritară în sângele HCV al pacientului J1, deoarece numai două secvențe variante E2/NS1 HV au fost identificate din secvențele 7 donate care au originea la cele două reacții PCR independent.

Interesantă este o comparație a compușilor izolați HCT27 și HCV E1 (fig. 8B) care sunt secvențate în diferite laboratoare și derivă de la individul presupus irelevant, arată că numărul de diferențe de aminoacizi în domeniul E2/NS1 HV al acestor compuși izolați este mai mic decât numărul diferențelor observate între compușii izolați de la același individ. Rezultatele descrise mai sus duc la sugestia că genomul HCV este rapid dezvoltat la indivizi și la populație.

Exemplul 5. Formularea și prepararea vaccinului

Cuplarea proteinei purtătoare de toxoid difteric la MCS.

Materiale necesare:

Acid etilen diamino tetraacetic (EDTA Na2.2H20) (Greut.Mol.372) Esterul 6-maleimido acid caproic-N-hidroxisuccinimidă (MCS(sigma)95% puritate. Ortofosfatul de sodiu hidrogenic (Na₂H₂P0₄); nitrogen; dimetil-formamidă (DMF); Milli Q apă;

0.1 M fosfat tampon conținând 5 mM EDTA, la pH 6,66;

0.1 M fosfat tampon la pH 8,0;

0,1 M fosfat tampon la pH 7,0;

succinat de sodiu ((CH₂C0DNa)2.6 H₂0); cisteină; acid clorhidric (soluție 2%); 0,1 M succinat de sodiu/0,1 EDTA, la pH 5,6.

1250

1255

1260

1265

1270

1275

RO 116199 Bl

Toxoidul difteriei purificat (Commonwealth Serum Laboratories, Victoria, Australia), este cuplat la MCS conform metodei descrise de Lee și colab., (198Q), “Mol. Immunol. 17: 749; Partis și colab., (1983), “Prot.Chem.“ 2: 263, Peeters și colab., (1989) “J.Immunol.Methods 120: 133, Jones și colab., (1989), “J. Immunol.Methods 123: 211. Se utilizează 100 ml de toxoid difteric care se trece printr-o coloană Sephadex G25 (17 cm x 4 cm) pentru îndepărtarea tiomersalului. Toxoidul este eluat cu 0,1 M fosfat tampon la pH 7,0 și conținutul în proteină a eluatului este analizat utilizând metoda de determinare a proteinei BCA (Pierce). Soluția rezultată este concentrata utilizând un dispozitiv de ultrafiltrare Amicon, pentru o concentrație finală de 10 ml per ml.

Un mililitru de soluție toxoid este dializat cu 0.1 M fosfat tampon la pH 8,0 și apoi se amestecă cu o soluție de 1,5 ml MCS în 200 pl de dimetilformamida. Soluția astfel rezultată este incubată la temperatura camerei timp de o oră la întuneric, cu amestecare ocazională. în vederea separării MCS necuplat de la toxoidul MCS, soluția este trecută printr-o coloană Sephadex PD10 care a fost echilibrată cu 0,1 M tampon fosfat la pH 6,66 și fracțiunea de proteină este colectată, Numărul de grupări maleimidocuplate per moleculă suport este determinat înainte de cuplarea peptidelor HCV. 30 ml de tampon succinat/EDTA se purifică cu nitrogen timp de 2 min. 5 ml de cisteină se transferă într-un flacon de 25 ml capacitate și se dizolvă într-un volum final de 25 ml de soluție tampon barbotată. Alicoții de soluții arătați în tabelul 5 sunt transferați în duplicat la 25 ml capacitate a flacoanelor acoperite cu dop. Utilizându-se pipete de separare, nitrogenul este barbotat în fiecare alicot. Fiecare flacon este apoi sigilat și incubat la temperatura camerei la întuneric timp de 40 min. cu agitare ocazională.

Tabelul 5

Soluție	Proba (ml)	standard (ml)	Proba oarbă (ml)
Suport activat	3	-	-
Tampon fosfat	-	3	3
Soluția de cisteină	10	10	-
Tampon succinat	-	-	10

*f\ 0,1 ml alicot din fiecare din cele 3 soluții este luat pentru determinarea Ellman. Testul Ellman pentru determinarea cantitativă a sulfhidrilului

Materialele necesare

Fosfat tampon pH 8,0: se dizolvă 15,6 g de NaH₂P0₄ sau 12,0 g NaH₂P0₄ anhidru în aproximativ 700 ml Milli Q apă. Se ajustează pH-ul la valoarea 8,0 utilizând 50% NaOH. Se adaugă Milli Q apă pentru un volum final de 1000 ml și apoi se ajustează pH-ul dacă este necesar.

Reactivul Ellman:

Se dizolvă 10,0 mg de acid 5,5'-ditiobis-2-nitrobenzoic (DTNB) în 25 ml de fosfat tampon la pH 8,0. Se adaugă 0,1 ml de reactiv Ellman la fiecare alicot de 0,1 ml din soluțiile preparate mai sus, numite probe stansard sau soluții oarbe. 5 ml de fosfat tampon la ph 8,0 se adaugă apoi la fiecare alicot, se amestecă bine și se lasă

RO 116199 Bl

1325 să stea în repaus timp de 15 min. Absorbanta pentru fiecare alicot este măsurată pe o lungime a traiectoriei celulare de 1 cm, la 412 nm. Numărul de grupări maleilimido prezente pe suportul proteinei este determinat conform următoarei metode; 0,01 microni per mililitru de soluție de -SH produc o absorbanță de 0,136 la o triectorie de 1 cm la 412 nm. Absorbanța probei standard sau a probei (A) este egală cu cantitatea de cisteină care reacționează cu grupările maleimido cuplate pe peptida suport, activată. Deoarece 1 mol de grupări -SH recționează cu 1 mol de maleimido, concentrația în microni ale grupărilor maleimido prezentă în alicotul testat este egală cu A(0,01 )/0,136 pmoli/ml. Volumul total de soluție este de 5,2 ml. De aceea, numărul total de microni prezent este egal cu A(0,01 )(5,2)/0,136. Soluția probei are un volum de 1,3 ml din care 0,3 ml constau din proteina suport activată. Cantitatea grupărilor maleimido prezentă în soluția probei este calculată ca A(0,01 )(5,3)(1,3)/ (0,136)(0,1)(0,3)=A(16,57)micromoli/ml. Proteina suport MCS activată este păstrată la -20°C.

Reducerea peptidelor HCV înainte de cuplarea peptidelor HCV cu proteine suport MCS activată, peptidele sunt reduse pentru a asigura ca grupările tiol prezente pe peptide sunt în formă de -SH complet redusă.

Materiale necesare

Ditiotreitol (DTT)

Carbonat acid de amoniu (NH₄HCQ₃);

Metanol;

SEP-PA Kg (cartuș C18, ape), un cartuș pentru fiecare 8 mg de peptide;

în 0,1, M tampon de carbonat acid de amoniu se dizolvă 7,9 grame carbonat acid de amoniu NH₄HC0₃ în 1 litru Milli Q apă;

Tampon A, O,1%volum per volum acid trifluoroacetic (TFA) în milli Q apă; Tamponul B, 60% volum la volum acetonitril, 0,1% volum la volum TFA în milli Q apă.

Se adaugă 15 mg din fiecare din cele două peptide HCV corespunzătoare la aminoacizii 384-411 și respectiv 225-260, din proteina HCV, la 2,5 ml de carbonat acid de amoniu 0,1 M conținând de 10 ori exces molar de DTT. Soluțiile care rezultă astfel sunt amestecate până ce peptida este dizolvată și sunt apoi lăsate în repaus timp de o oră la temperatura camerei. Două perechi de SEP-PAKs sunt conectate în serii și activate prin trecerea a aproximativ 20 mililitri de metanol și apoi 20 ml de tampon A prin fiecare pereche de SEP-PAKs. Fiecare probă de peptidă/STT este trecută lent printr-o pereche de SEP-PAKs. DTT este eluat cu 20 ml de tampon A. Peptida redusă este eluată cu 7 ml de tampon B într-un flacon cântărit în prealabil și apoi este uscat prin congelare până a doua zi. Flacoanele sunt apoi cântărite pentru determinarea cantității de peptide recuperate. Peptidele reduse sunt apoi cuplate imediat la proteina suport MCS activată.

Cuplarea peptidelor HCV la proteina suport activată MCS

Aproximativ 100 ml de fosfat tampon 0,1 M cu 5mM de EDTA, la pH 6,66 se degazeifică sub vacuum și apoi se barborează cu azot timp de 10 min. 20 ml de soluție a 10 miligrame per mililitru de proteină suport MCS activată se barbotează cu atenție, cu azot pentru prevenirea excesivă a spumării. Se dizolvă apoi 5 miligrame din fiecare din peptidele reduse în aproximativ 0,2 mililitri de amestec tampon degazeificat barbotat, de fosfat/EDTA la pH 6,66 și apoi se amestecă cu o soluție de proteină

1330

1335

1340

1345

1350

1355

1360

1365

RO 116199 Bl suport MCS activată. Amestecul astfel rezultat este transferat într-un flacon cu dop cu filet, care este apoi umplut cu azot și sigilat. Soluția este poi degazeificată prin menținerea flaconului într-o baie de sonificare de tip Brason 2000, timp de 2 min. Flaconul este acoperit cu o folie de aluminiu și incubat până a doua zi la temperatura camerei cu amestecare lentă pe o masă vibratoare.

Conjugatul rezultate este solubil și peptidă necuplată este separată prin trecerea amestecului pe o coloană de Sephadex PD 10 care a fost echilibrată cu amestec tampon fosfat/EDTA la pH 6,66. Fracțiunea proteică este colectată. Cantitatea de peptidă conjugată la proteina suport este determinată prin analiza aminoacizilor. Analiza acestor aminoacizi utilizâmd alicoți de 150 microlitri de compus conjugat și proteină suport este astfel efectuată. Raportul mediu al nivelului de aminoacizi la care contribuie numai proteina suport este determinat pentru calcularea cantității de peptidă conjugată produsă. Nivelele de serină, treonină, triptofan, metionină, tirozină și cisteină nu sunt determinate deoarece acești aminoacizi sunt modificați în condiții de hibridizare standard. Rezultatele tipice obținute în aceste calcule sunt prezentate în tabelul 6.

Tabelul 6

Aminoacid	Proteină suport	Conjugat
D '	212	193
E	194	170
G	153	108
R	60	56
A	150	384
P	79	163

Pentru conjugat, valorile în tipul gras sunt aminoacizii care sunt, așadar, prezenți în peptide. Pentru conjugatele care conțin alanină și prolină, factorul (193+179+180+56)/(212+194+153+60)=0,8659, este multiplicat prin cantitatea de aminoacid la nivelul prevăzut în vederea normalizării rezultatului.

Prepararea compoziției vaccinului

Compozițiile injectabile care constau din peptide HCV conjugate la proteina suport a toxoidului difteric MCS activat preparate așa cum s-a descris mai sus și emulsia adjuvantă submicron ulei în apă, așa cum s-a descris în PCT Internațional Publication No. WO 9014837, publicată pe 13 decembrie 1990, care este menționată ca referință. în consecință sunt preparate, compozițiile injectabile care conțin un imunostimulent, peptidă muramil liofilică (MTP-PE, CIBA-GEIGY, Basel, Switzerland) în adiție la peptidele conjugate HCV și adjuvantul. Compozițiile de vaccin sunt, în general, cuprinse cu 50% proteină și 50% adjuvant.

Formula pentru compoziția de vaccin cu MTP-PE

Pentru prepararea a 10 ml de compoziție de vaccin injectabilă, se utilizează:

2,5 ml Squalen (Sigma Chemical Co., St.louis, No.J

0,25 ml Tween 80 (Sigma Chemical Co.)

0,25 ml SPÂN 85 (Sigma Chemical Co.); 1000 pg MTP-PE

1000 pg peptidă HCV conjugată cu proteina suport a toxoidului difteric.

RO 116199 Bl

Formula pentru compoziția de vaccin fără MTP-PE

2,5 ml Squalen (Sigma Chemical Co., St.louis, No.)

0,25 ml Tween 80 (Sigma Chemical Co.)

0,25 ml SPÂN 85 (Sigma Chemical Co.) și 1000 pg peptidă HCV conjugată cu proteina suport a toxoidului difteric MCS-activată.

Exemplul 6. Metoda pentru testarea vaccinurilor sub formă de preparate, pentru toxicitate

Vaccinul preparat conform metodologiei din exemplul 5 a fost testat pentru toxicitate, la animale mici. Cincizeci micrograme de vaccin per kilogram se administrează la cobai, șoareci și iepuri prin injectare intraperitoneală. Vaccinul este, așadar, administrat prin injectare intraperitoneală la maimuțele Rhesus și la primate. Jumătate din populația maimuțelor Rhesus și primatele, primesc o doză de 5 micrograme per kilogram de vaccin, iar cealaltă jumătate primește o doză de 50 micrograme per kilogram. Animalele de control, utilizate în fiecare studiu, sunt injectate cu o cantitate comparabilă dintr-o compoziție care constă din componente ale preparatului de vaccinare, cu excepția peptidelor virale.

Fiecare dintre animalele testate este monitorizat pentru simptomele indicate la răspunsul materialului toxic. Mult mai specific, fiecare animal studiat este examinat de două ori pe săptămână pentru simptomele care includ febra, letargia, pierderea în greutate, schimbările în rutina de hrană și, de asemenea, pentru leziuni, tumefieri sau sensibilitate în porțiunea injectării. Nodulii limfatici aflați în apropiere de partea injectată sunt, de asemenea, examinați privind gradul de tumefiere și/sau drenaj. Animalele sunt monitorizate pe baza testării bisăptămânale pentru o perioadă de câteva luni.

Exemplul 7. Demonstrarea producerii anticorpului de neutralizare la animalele vaccinate

Vaccinul preparat conform metodologiei din exemplul 5 este testat pe cimpanzei, în vederea determinării eficacității vaccinului în elucidarea producerii anticorpului de neutralizare a virusului la subiecții vaccinați. Cimpanzeii sunt vaccinați cu doze de 5 micrograme per kilogram de vaccin preparat conform metodologiei din exemplul 5, o perioadă de timp de de peste șase luni la intervalele de O, 1, 3 și 6 luni. Cimpanzeii de control sunt injectați cu cantități comparabile dintr-o compoziție care constă din componentele vaccinului, cu excepția peptidelor virale. La două săptămâni după ultima doză de vaccin administrată, cimpanzeii de testare și cei de control sunt ambii inoculați cu 10 CIU₅₀ (unitatea de infecție per cimpanzeu) ca doză de plasmă CDC/910. începând cu o săptămână după inocularea virală, fiecare cimpanzeu se monitorizează pentru viremie, după o perioadă de o săptămână. în vederea detectării viremiei, probele de sânge și specimenele de biopsie de ficat sunt colectate de la animalele de control și de la animalele de testare săptămânal, timp de mai multe luni. Țesutul colectat la biopsia de ficat este examinat histologic pentru semnele de necroză și/sau inflamație. în adiție, hepatocitele din materialul bioptic sunt examinate prin microscopie electronică pentru prezența tubulelor caracteristice pentru infecția cu HCV. Probele de sânge sunt, așadar, analizate prin analiza ELISA descrisă mai sus, pentru determinarea prezenței anticorpilor la segmenții polipeptidelor virale care nu sunt utilizați la prepararea vaccinului. în special, fiecare din probele de sânge este controlată prin analiză ELISA pentru prezența anticorpilor la peptidele NS3, NS4 și NS5. Prezența anticorpilor la aceste peptide în serul de cimpanzeu este un indiciu

1415

1420

1425

1430

1435

1440

1445

1450

1455

1460

RO 116199 Bl pentru infecția cu HCV. Metoda următoare este utilizată pentru detectarea acidului ribonucleic viral care circulă în plasmă sau este prezent în țesutul bioptic al ficatului colectat de la cimpanzei.

Metoda cPCR de detectare a ARN HCV în ficat și în ser în analiza cPCR, acidul ribonucleic viral putativ, din probă, este revers transcris în ADNc cu revers transcriptaza; un segment de acid dezoxiribonucleic ADNc care rezultă astfel, este amplificat apoi utilizând o versiune modificată a tehnicii PCR descrisă de Saiki și colab., (1986). Primerii pentru tehnica cPCR sunt derivați de la ARN HCV, care pot fi identificați prin familia de ADNc HCV prevăzută aici. Produsul amplificat corespunzător la ARN-HCV este detectat utilizând o probă derivată de la familia ADNc HCV prevăzută aici.

Analiza cPCR/HCV utilizată în aceste studii este efectuată utilizând următoarele metode pentru prepararea acidului ribonucleic, transcrierea acidului ribonucleic ARN în ADNc, amplificarea segmentelor specifice ale ADNc prin PCR și analiza produselor PCR. Acidul ribonucleic este extras din ficat utilizând metoda cu guanidin izocianat, pentru prepararea acidului ribonucleic total, descrisă de Maniatis și colab., (1982).

în vederea izolării acidului ribonucleic total din plasmă, plasma este diluată de cinci până la zece ori cu TENB (0,1 M NaCI, 5D mM de Tris-HCI, la pH 8,0, 1 mM EDTA) și incubată în soluție de Proteinază K/SDS (0,5% SDS, 1 ml/ml proteinază K, 20 micrograme per mililitru suport Poli A) pentru 60 până la 90 min la temperatura de 37°C. Probele sunt extrase o dată cu fenol (la pH 6,5), iar faza organică rezultată este re-extrasă o dată cu TENB conținând 0,1 % SDS și fazele apoase ale ambelor extracții sunt comasate și extrase de două ori cu un volum egal de amestec format dintr-o parte fenol și o parte cloroform CHC13 în amestec cu 99 părți cloroform și o parte alcool izoamilic.

Fazele apoase astfel rezultate sunt extrase cu un volum egal format dintr-un amestec de 99 părți cloroform și o parte alcool izoamilic, de două ori și apoi se precipită cu etanol utilizând 0,2, M acetat de sodiu la pH 6,5 și 2,5 volume de etanol 100%; precipitarea se efectuează până a doua zi la temperatura de -20°C.

Acidul dezoxiribonucleic ADNc utilizat ca model pentru reacția PCR, este preparat utilizând probele desemnate pentru prepararea ADNc-lor corespunzători. Fiecare probă de acid ribonucleic (conținând câte 2 pg de acid ribonucleic de ficat de cimpanzeu, total denaturat, sau acid ribonucleic din doi pl de plasmă) este incubată într-o reacție cu 25 pl amestec care conține 1 pmol din fiecare primer, 1 ml de dezoxiribonucleotidă trifosfat (dNTP), 50 mmoli de tris-HCI la pH 8,3, 5 mmoli MgCI2, 5 mmoli ditiotreitorl (DTT), 73 mmoli KCI, 40 de unități de inhibitor de RNază (RNASIN) și 5 unități de transcirptază AMVîn fază reversă. Incubarea este de 60 min la temperatura de 37°C. După sinteza ADNc, amestecurile de reacție sunt diluate cu 30 pl de apă neionizată(DIW), după care se fierbe timp de 10 min și se răcește pe gheață. Amplificarea segmentului de ADNc HCV este efectuată utilizând doi primeri 16-merici, oligomeri sintetici ale căror secvențe sunt derivate de la clonele ADNc HCV 36 (antisens) și 37b (sens). Secvența primerului din clona 36 este următoarea: 5' GCA TGT CAT GAT GTA T 3'.

Secvența primerului din clona 37b este următoarea:

5' ACA ATA CGT GTG TCA C 3'.

RO 116199 Bl

Primerii sunt utilizați la o concentrație finală de 1 micromol fiecare. în vederea amplificării segmentului de ADNc HCV care este flancat de primeri, probele ADNc sunt incubate cu 0,1 pg de RNază A și reactanții PCR ai kitului Perkin Elmer Cetus PCR (N801-0043 sau N8O1-OO55) conform instrucțiunilor de preparare.

Reacția PCR este realizată fie pentru 30 de cicluri sau pentru 60 de cicluri în aparatul cycler termal Perkin Elmer Cetus pentru acid dezoxiribonucleic ADN. Fiecare ciclu constă dintr-o fază de denaturare de un minut la temperatura de 94°C și faza de regenerare de 2 min. la temperatura de 37°C și o fază de extensie de 3 min. la temperatura de 72°C. Cu toate acestea, faza de extensie în ciclul final (30 sau 60) este de 7 minute mai degrabă decât cea de 3 min. După amplificarea probelor, acestea sunt extrase cu un volum egal de amestec format din părți egale de fenol și cloroform după care urmează extracția cu un volum egal de cloroform și apoi probele sunt precipitate cu etanol conținând 0,2 M acetat de sodiu. Produsele cPCR sunt analizate după cum urmează. Produsele sunt supuse electroforezei pe geluri de agaroză alcalină 1,8% conform metodei date de Murakawa și colab., (1988) și apoi se transferă pe o hârtie, proba ZETA^R(BioRad Corp.), prin capacitatea de absorbție a gelulrilor până a doua zi în 0,4 M NaOH. Petele de adsorbție sunt apoi neutralizate în 2 x SSC (1 x SSC care conține 0,15 M NaCI, 0,015 M citrat de sodiu) apoi, sunt prehibridizate îm 0,3 M NaCI, 15mM tampon fosfat de sodiu la pH 6,8 15 mMEDTA, 1,0% SDS, 0,5% lapte degresat (Carnation Co.) și 0,5 miligrame per mililitru de acid dezoxiribonucleic ADN din spermaceti de somon denaturat, sonicat. Petele de adsorbție care trebuie analizate pentru fragmentele de HCV cADN sunt hibridizate la o probă marcată 32p, generată prin translația canelurilor secvenței de inserție HCV cADN din clona 35, așa cum este descris în US 07/456 637. După hibridizare, petele de adsorbție sunt spălate în 0,1 x SSC (1 x SSC care conține 0,15 M NaCI, 0,01 M citrat de sodiu) la temperatura de 65°C, după care se usucă și se autoradiografiază. Dimensiunea prevăzută pentru produs este de lungimea a 586 nucleotide; produsul care este hibridizat cu această probă și care migrează în gel în acest ordin de mărime înregistrat ca fiind pozitiv pentru ARN viral. Drept control, primerii cPCR desemnați pentru amplificarea alfa 1-anti-tripsină mARN sunt prevăzuți pentru a verifica prezența acidului ribonucleic fiecare probă analizată. Regiunea codificată a genei alfa-î anti-tripsină este descrisă de către Rosenberg și colab., (1984). Primerii 16-merici oligomeri sintetici desemnați pentru amplificarea fragmentului cu 365 nucleotide din regiunea codificată a genei antitripsină alfa-l sunt derivați din nucleotidele 22-37 (sens) și nucleotidele 372-387 (antisens). Produsele PCR, care sunt detectate utilizând o ³²P de translație a canelurii, se situează între secvențele primerului cADN/PCR, neincluzându-le.

Datorită unei sensibilități extreme PCR, toate probele se efectuează de cel puțin trei ori. Toate semnalele pozitive false sunt eliminate când sunt constatate, conform precauțiilor:

1) prin eliminarea aerosolilor prin utilizarea tuburilor sigilate, acoperite cu dopuri de cauciuc inelare C;

2) prin pipetarea cu ajutorul pipetelor de dislocuire pozitivă de tip Ranin MICR0MAN^R cu pistoane/capilare, de evacuare și

3) selectarea secvențelor de oligonucleotide pentru primerii cADN, cele două clone neadiacente.

Claims (7)

1. Compoziție polipeptidică HCV imunogenă, caracterizată prin aceea că, cuprinde cel puțin două secvențe de aminoacizi ai HCV, fiecare secvență conținând cel puțin un epitop dintr-un domeniu variabil al unei peptide HCV, iar domeniul variabil este din proteina E2/NS1 care are secvența de la aminoacidul 384 la aminoacidul 414 al unei poliproteine HCV, sau proteina E1 are secvența de la aminoacidul 215 la aminoacidul 255 al unei poliproteine HCV, iar regiunile domeniului variabil al secvențelor de aminoacizi sunt heterogene una față de alta și sunt derivate din izolate distincte HCV.

2. Compoziție polipeptidică HCV imunogenă, conform revendicării 1, caracterizată prin aceea că, cel puțin un epitop dintr-un domeniu variabil al poliproteinei HCV poate proveni dintr-o pluralitate de seturi antigenice și fiecare set antigenic constă dintr-o pluralitate de secvențe substanțial identice, cuprinzând cel puțin un epitop dintr-un domeniu variabil al polipeptidei HCV.

3. Compoziție polipeptidică HCV imunogenă, conform revendicărilor 1 sau 2, caracterizată prin aceea că izolatele distincte de HCV includ un izolat HCV din grupa I și un izolat HCV din grupa II.

4. Compoziție polipeptidică HCV imunogenă, conform revendicărilor 1...3, caracterizată prin aceea că una din secvențele de aminoacizi mai cuprinde un epitop dintr-un al doilea domeniu variabil al poliproteinei HCV, în care regiunile celui de-al doilea domeniu variabil al secvențelor de aminoacizd sunt heterogene una cu alta și sunt derivate din izolate distincte HCV.

5. Compoziție polipeptidică HCV imunogenă, conform revendicării 4, caracterizată prin aceea că primul domeniu variabil aparține proteinei E2/NS1 și al doilea domeniu variabil aparține proteinei E1.

6. Compoziție polipeptidică HCV imunogenă, conform revendicării 1, caracterizată prin aceea că este administrată ca o compoziție imunogenică pentru tratamentul HCV, care constă dintr-un amestec al compoziției imunogenice, așa cum este definită în revendicările 1 ...3, cu un excipient adecvat.

7. Compoziție polipeptidică HCV imunogenă, conform revendicării 1, caracterizată prin aceea că se administrează pentru producerea anticorpilor antiHCV și este folosită pentru detectarea anticorpilor HCV într-o probă biologică, prin reacția probei biologice cu compoziția imunoreactivă, care duce la formarea complecșilor anticorp-antigen și la detectarea formării complecșilor antigen-anticorp.