RU2675108C2 - Композиция на основе синтетических пептидов и липидов для вакцины против гепатита с - Google Patents
Композиция на основе синтетических пептидов и липидов для вакцины против гепатита с Download PDFInfo
- Publication number
- RU2675108C2 RU2675108C2 RU2015122718A RU2015122718A RU2675108C2 RU 2675108 C2 RU2675108 C2 RU 2675108C2 RU 2015122718 A RU2015122718 A RU 2015122718A RU 2015122718 A RU2015122718 A RU 2015122718A RU 2675108 C2 RU2675108 C2 RU 2675108C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- glycyl
- tyrosyl
- valyl
- threonyl
- leucyl
- Prior art date
Links
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims abstract description 66
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 64
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims abstract description 46
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 title description 4
- 229960002520 hepatitis vaccine Drugs 0.000 title 1
- 241000711549 Hepacivirus C Species 0.000 claims abstract description 57
- 102100021696 Syncytin-1 Human genes 0.000 claims abstract description 29
- 101710091045 Envelope protein Proteins 0.000 claims abstract description 28
- 101710188315 Protein X Proteins 0.000 claims abstract description 28
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims abstract description 19
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims abstract description 17
- BHEOSNUKNHRBNM-UHFFFAOYSA-N Tetramethylsqualene Natural products CC(=C)C(C)CCC(=C)C(C)CCC(C)=CCCC=C(C)CCC(C)C(=C)CCC(C)C(C)=C BHEOSNUKNHRBNM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 14
- PRAKJMSDJKAYCZ-UHFFFAOYSA-N dodecahydrosqualene Natural products CC(C)CCCC(C)CCCC(C)CCCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)C PRAKJMSDJKAYCZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 14
- 229940031439 squalene Drugs 0.000 claims abstract description 14
- TUHBEKDERLKLEC-UHFFFAOYSA-N squalene Natural products CC(=CCCC(=CCCC(=CCCC=C(/C)CCC=C(/C)CC=C(C)C)C)C)C TUHBEKDERLKLEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 14
- YYGNTYWPHWGJRM-UHFFFAOYSA-N (6E,10E,14E,18E)-2,6,10,15,19,23-hexamethyltetracosa-2,6,10,14,18,22-hexaene Chemical compound CC(C)=CCCC(C)=CCCC(C)=CCCC=C(C)CCC=C(C)CCC=C(C)C YYGNTYWPHWGJRM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 13
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 claims abstract description 13
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 claims abstract description 13
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims abstract description 12
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 12
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 10
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 claims abstract description 9
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 9
- 239000008215 water for injection Substances 0.000 claims abstract description 8
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 7
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 claims abstract description 7
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 claims abstract description 5
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 claims abstract description 5
- 125000000218 acetic acid group Chemical group C(C)(=O)* 0.000 claims 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 4
- 238000011161 development Methods 0.000 abstract description 3
- 230000028996 humoral immune response Effects 0.000 abstract description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 39
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 20
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 16
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 13
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 13
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 13
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 13
- 208000005176 Hepatitis C Diseases 0.000 description 11
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 10
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 10
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 10
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 10
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 9
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 9
- 239000000833 heterodimer Substances 0.000 description 9
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 9
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 8
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 8
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 8
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 7
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 7
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 7
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 7
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 6
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 6
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 6
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 6
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 6
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 6
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 6
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 6
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 6
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 6
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 5
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 5
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 5
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 5
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 5
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 5
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 5
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 4
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 4
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 4
- 208000010710 hepatitis C virus infection Diseases 0.000 description 4
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 4
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 4
- 229940023041 peptide vaccine Drugs 0.000 description 4
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 241000700112 Chinchilla Species 0.000 description 3
- 108010041986 DNA Vaccines Proteins 0.000 description 3
- 229940021995 DNA vaccine Drugs 0.000 description 3
- 230000002788 anti-peptide Effects 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- -1 for example Substances 0.000 description 3
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 3
- 230000004044 response Effects 0.000 description 3
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 3
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 3
- 238000002834 transmittance Methods 0.000 description 3
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 3
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 2
- 208000006154 Chronic hepatitis C Diseases 0.000 description 2
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 2
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 108010008038 Synthetic Vaccines Proteins 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 2
- 238000001917 fluorescence detection Methods 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 2
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 2
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 2
- 229940124551 recombinant vaccine Drugs 0.000 description 2
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 2
- ASOKPJOREAFHNY-UHFFFAOYSA-N 1-Hydroxybenzotriazole Chemical compound C1=CC=C2N(O)N=NC2=C1 ASOKPJOREAFHNY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010011732 Cyst Diseases 0.000 description 1
- 101710121417 Envelope glycoprotein Proteins 0.000 description 1
- 206010019663 Hepatic failure Diseases 0.000 description 1
- 206010019799 Hepatitis viral Diseases 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 102000004895 Lipoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090001030 Lipoproteins Proteins 0.000 description 1
- 208000031705 Neglected disease Diseases 0.000 description 1
- 238000009004 PCR Kit Methods 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 1
- 239000013614 RNA sample Substances 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 230000005867 T cell response Effects 0.000 description 1
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical class OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 1
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 1
- 230000033289 adaptive immune response Effects 0.000 description 1
- 230000004721 adaptive immunity Effects 0.000 description 1
- 230000000172 allergic effect Effects 0.000 description 1
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 208000010668 atopic eczema Diseases 0.000 description 1
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 1
- 230000001363 autoimmune Effects 0.000 description 1
- OHDRQQURAXLVGJ-HLVWOLMTSA-N azane;(2e)-3-ethyl-2-[(e)-(3-ethyl-6-sulfo-1,3-benzothiazol-2-ylidene)hydrazinylidene]-1,3-benzothiazole-6-sulfonic acid Chemical compound [NH4+].[NH4+].S/1C2=CC(S([O-])(=O)=O)=CC=C2N(CC)C\1=N/N=C1/SC2=CC(S([O-])(=O)=O)=CC=C2N1CC OHDRQQURAXLVGJ-HLVWOLMTSA-N 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 230000007882 cirrhosis Effects 0.000 description 1
- 208000019425 cirrhosis of liver Diseases 0.000 description 1
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000012568 clinical material Substances 0.000 description 1
- 238000010835 comparative analysis Methods 0.000 description 1
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 1
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 1
- 208000031513 cyst Diseases 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000007402 cytotoxic response Effects 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 238000002330 electrospray ionisation mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000001641 gel filtration chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 244000144993 groups of animals Species 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 210000002443 helper t lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229940124737 hepatitis-C vaccine Drugs 0.000 description 1
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 1
- 230000008348 humoral response Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 1
- 230000017555 immunoglobulin mediated immune response Effects 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 201000007270 liver cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000019423 liver disease Diseases 0.000 description 1
- 208000007903 liver failure Diseases 0.000 description 1
- 231100000835 liver failure Toxicity 0.000 description 1
- 230000005923 long-lasting effect Effects 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000000693 micelle Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000005375 photometry Methods 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 210000004180 plasmocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000000601 reactogenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 1
- 201000001862 viral hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 239000000277 virosome Substances 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
- A61K39/29—Hepatitis virus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Virology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Oncology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Mycology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Изобретение относится к медицине и касается композиции, выполненной в виде лиофилизата, для образования в организме млекопитающих антител, связывающих оболочечные белки вируса гепатита С и вирус гепатита С, содержащей в качестве синтетических пептидных антигенов пять пептидов, а также сквален, фосфолипид Липоид С100, твин 80, мальтозу. Композиция получена после лиофилизации водного раствора, содержащего синтетические пептидные антигены 0,002-0,01 мас. %, сквален 0,2 мас. %, фосфолипид Липоид С100 0,02 мас. %, твин 80 0,4 мас. %, мальтозу 10 мас. %, воду для инъекций до 100%. Изобретение обеспечивает выработку специфичного гуморального иммунного ответа с образованием антител, связывающих вирус гепатита С. 1 ил., 3 табл., 9 пр.
Description
Описание изобретения
Изобретение относится к области иммунологии, биотехнологии и медицины и касается состава композиции, которая может быть использована для разработки вакцины против гепатита С, направленной на выработку специфичного гуморального иммунного ответа с образованием антител, связывающих вирус гепатита С.
Более конкретно, изобретение представляет собой композицию, содержащую пять синтетических пептидных антигенов следующих структур: 1) ацетил-тирозил-пролил-тирозил-аргинил-лейцил-триптофил-гистидил-тирозил-пролил-глицил-глицил-серил-треонил-глицил-лейцил-изолейцил-гистидил-лейцил-гистидил-глутаминил-аспарагинил-изолейцил-валил-аспартил-валил-глутаминил-тирозил-лейцил-тирозил-глицин, 2) ацетил-аргинил-пролил-тирозил-цистеинил-триптофил-гистидил-тирозил-аланил-пролил-аргинил-серил-цистеинил-глицил-глицил-валил-цистеинил-глицил-пролил-валил-тирозил-цистеинил-фенилаланил-треонил-пролил-серил-пролил-валил-валил-валил-глицил-треонил-треонил-аспарагиновая кислота, 3) ацетил-глицил-серил-триптофил-гистидил-изолейцил-аспарагинил-серил-треонил-аланил-лейцил-аспарагинил-глицил-глицил-серил-треонил-глицил-лейцил-изолейцил-гистидил-лейцил-гистидил-глумаминил-аспарагинил-изолейцил-валил-аспартил-валил-глутаминил-тирозил-лейцил-тирозил-глицин, 4) ацетил-глицил-серил-триптофил-гистидил-изолейцил-аспарагинил-аргинил-треонил-аланил-лейцил-аспарагинил-глицил-глицил-валил-цистеинил-глицил-пролил-валил-тирозил-цистеинил-фенилаланил-треонил-пролил-серил-пролил-валил-валил-валил-глицил-треонил-треонил-аспарагиновая кислота, 5) серил-треонил-глицил-лейцил-изолейцил-гистидил-лейцил-гистидил-глутаминил-аспарагинил-изолейцил-валил-аспартил-валил-глутаминил-тирозил-лейцил-тирозил-глицил-цистеинил-пролил-тирозил-аспартил-цистеинил-фенилаланил-аргинил-лизил-гистидил-пролил-глутамил-аланил-треонил-тирозин, не обладающих антигенностью при введении в виде индивидуальных препаратов или смеси вне состава композиции, а также сквален, фосфолипид Липоид С100, твин 80, мальтозу, полученная после лиофилизации водного раствора, содержащего синтетические пептидные антигены 0,002-0,01 мас. %, сквален 0,2 мас. %, фосфолипид Липоид С100 0,02 мас. %, твин 80 0,4 мас. %, мальтозу 10 мас. %, воду для инъекций до 100%.
Отличительной характеристикой данной композиции является способность при введении в виде водного раствора вызывать образование в организме млекопитающих (мышей и кроликов) антител, принадлежащих к классу иммуноглобулинов G, которые связывают оболочечные белки вируса гепатита С и сам вирус гепатита С из плазмы крови больных.
Предпосылки создания изобретения.
По оценке ВОЗ доля инфицированных вирусом гепатита С (ВГС) в человеческой популяции составляет около 3% (1). Эта инфекция представляет серьезную угрозу здоровью людей из-за высокой вероятности (до 85%) возникновения хронического гепатита С, неизбежно приводящего в дальнейшем к развитию печеночной недостаточности, цирроза, в некоторых случаях - первичного рака печени, а также к системному поражению организма (1). Хотя ВГС был впервые обнаружен и выделен в 1988 г., вакцина против вызываемого им заболевания на рынке пока не появилась. Тому есть объективные причины: а) высокая степень генетического разнообразия и изменчивости ВГС, особенно белков его оболочки, ответственных за проникновение вируса в клетку-мишень (2), б) недостаточна информация о рецепторах ВГС и взаимодействии вируса с иммунной системой организма-хозяина (3), в) чрезвычайная сложность культивирования вируса в лабораторных условиях и г) отсутствие лабораторных моделей ВГС-инфекции на мелких животных (4).
Показано, что в нейтрализации ВГС участвуют как клеточный, так и гуморальный механизмы адаптивного иммунитета (5). Первый реализуется посредством участия хелперных и цитотоксических Т-лимфоцитов, второй -посредством секреции специфичных антител образованными из В-лимфоцитов плазматическими клетками с участием Т-хелперных лимфоцитов. Разрабатываемые в мире вакцины против гепатита С направлены на стимуляцию либо одного, либо другого, либо обоих вместе механизмов иммунного ответа. По составу иммуногенов разрабатываемые вакцины против гепатита С можно разделить на: 1) рекомбинантные вакцины, содержащие рекомбинантные белки вируса либо их слитые фрагменты, а также системы их доставки, которыми могут быть липопротеидные вирусоподобные частицы, например, виросомы, липосомы, мицеллы (3, 6); 2) ДНК-вакцины - плазмиды, несущие один или несколько генов белков ВГС, вместе с системой доставки этих генов, которой может быть другой аттенуированный вирус, например, вирус осповакцины (3, 7); 3) пептидные вакцины - полученные химическим синтезом В- и/или Т-эпитопы консервативной структуры из белков ВГС, снабженные системой доставки и стимуляции иммунного ответа (8). Первый тип направлен на формирование гуморального протективного ответа против ВГС, второй - на формирование и гуморального, и цитотоксического ответа. Ответ на третий тип вакцин зависит от типа использованных эпитопов.
Существенным недостатком рекомбинантных вакцин, ДНК-вакцин, несущих гены целых белков, является специфичность в отношении узкого круга генетических вариантов ВГС (3). При использовании ДНК-вакцин существует риск проникновения в организм чужеродного генетического материала и посторонних патогенов и реактогенов. Все большее внимание привлекают технические решения разработки вакцин против гепатита С на основе фрагментов белков ВГС, в частности, полученных химическим синтезом пептидов.
Вакцины на основе синтетических пептидов обладают целым рядом преимуществ: а) безопасность технологий их производства; б) высокая степень стандартизации препаратов; в) формирование иммунного ответа на те фрагменты белка-антигена, которые в составе целой молекулы обладают слабой иммуногенностью; г) отсутствие высокореактогенных компонентов; д) исключение фрагментов антигенов, вызывающих аллергические и аутоиммунные реакции; е) возможность совмещения в одной молекуле эпитопов разных белков-антигенов (9).
Сущность изобретения.
Задачей настоящего изобретения является разработка композиции на основе синтетических пептидов, составленных из фрагментов оболочечного белка Е2 ВГС, липидов и вспомогательных соединений, способной при парентеральном введении вызывать образование специфичных антител класса иммуноглобулинов G, связывающих ВГС.
Указанная задача решается включением в состав композиции следующих соединений:
- эквимолярной смеси пяти синтетических пептидов, составленных из фрагментов оболочечного белка Е2 ВГС и имеющих следующие структуры: 1) ацетил-тирозил-пролил-тирозил-аргинил-лейцил-триптофил-гистидил-тирозил-пролил-глицил-глицил-серил-треонил-глицил-лейцил-изолейцил-гистидил-лейцил-гистидил-глутаминил-аспарагинил-изолейцил-валил-аспартил-валил-глутаминил-тирозил-лейцил-тирозил-глицин, 2) ацетил-аргинил-пролил-тирозил-цистеинил-триптофил-гистидил-тирозил-аланил-пролил-аргинил-серил-цистеинил-глицил-глицил-валил-цистеинил-глицил-пролил-валил-тирозил-цистеинил-фенилаланил-треонил-пролил-серил-пролил-валил-валил-валил-глицил-треонил-треонил-аспарагиновая кислота, 3) ацетил-глицил-серил-триптофил-гистидил-изолейцил-аспарагинил-серил-треонил-аланил-лейцил-аспарагинил-глицил-глицил-серил-треонил-глицил-лейцил-изолейцил-гистидил-лейцил-гистидил-глумаминил-аспарагинил-изолейцил-валил-аспартил-валил-глутаминил-тирозил-лейцил-тирозил-глицин, 4) ацетил-глицил-серил-триптофил-гистидил-изолейцил-аспарагинил-аргинил-треонил-аланил-лейцил-аспарагинил-глицил-глицил-валил-цистеинил-глицил-пролил-валил-тирозил-цистеинил-фенилаланил-треонил-пролил-серил-пролил-валил-валил-валил-глицил-треонил-треонил-аспарагиновая кислота, 5) серил-треонил-глицил-лейцил-изолейцил-гистидил-лейцил-гистидил-глутаминил-аспарагинил-изолейцил-валил-аспартил-валил-глутаминил-тирозил-лейцил-тирозил-глицил-цистеинил-пролил-тирозил-аспартил-цистеинил-фенилаланил-аргинил-лизил-гистидил-пролил-глутамил-аланил-треонил-тирозин в суммарном содержании пептидов в составе водного раствора композиции 0,002-0,01 мас. %,
- липида сквалена в содержании в составе водного раствора композиции 0,2 мас. %,
- фосфолипида Липоид С100 в содержании в составе водного раствора композиции 0,02 мас. %,
- вспомогательного соединения твина 80 в содержании в составе водного раствора композиции 0,4 мас. %,
- вспомогательного соединения мальтозы в содержании в составе водного раствора композиции 10 мас. %,
- воды для инъекций до 100 мас. %,
- последующей обработки водного раствора композиции микрофлюидизацией до достижения полного смешивания компонентов с образованием раствора со светопропусканием не ниже 90% при 660 нм по данным фотометрии,
- лиофилизации полученного раствора с получением лиофилизата, который легко восстанавливается до раствора при добавлении воды для инъекций до объема, равного объему водного раствора композиции до лиофилизации.
Существенным свойством вышеупомянутой композиции является способность при парентеральном введении ее водного раствора в организм вызывать специфический иммунный ответ, заключающийся в образовании антител класса иммуноглобулинов G, связывающих оболочечные белки ВГС. Для оценки продукции антител против оболочечного белка Е2 и гетеродимера обол очечных белков Е1Е2 ВГС при введении животным вышеупомянутых синтетических пептидных иммуногенных конструкций можно использовать стандартные методы иммуноанализа (предпочтительно ELISA, иммунодот или иммуноблоттинг) с оболочечным белком Е2 или гетеродимером обол очечных белков Е1Е2 в качестве антигена (предпочтительно фиксированных на твердой фазе). Еще одним существенным свойством вышеупомянутой композиции является способность при таком же введении в организм вызывать образование антител, связывающих ВГС из плазмы крови больных. Для оценки продукции антител, связывающих частицы ВГС из плазмы крови больных гепатитом С, может быть использована детекция связавшихся с антителами вирусных частиц методом ПЦР, включая ПНР в реальном времени.
Синтетические пептиды 1-5, входящие в состав композиции, составлены из ранее выявленных высококонсервативных фрагментов оболочечного белка Е2 (2) и получены с помощью стандартного метода твердофазного пептидного синтеза, как это указано в (9). Предпочтительность использования в составе композиции вышеуказанных пептидов состоит в том, что они включают фрагменты оболочечного белка ВГС, на который в организме формируется протективный антителоопосредованный иммунный ответ. Предпочтительность использования вышеуказанных пептидов определяется также консервацией первичных структур выбранных фрагментов оболочечного белка Е2, входящих в состав пептидов, поскольку это определяет возможность связывания образующимися в ответ на них антителами широкого набора генетических вариантов ВГС. Структуры пептидов разработаны в соответствии с принципом объединения в одной молекуле В- и Т-эпитопа, как указано в (10), однако структуры пептидов, входящих в вышеуказанную композицию, существенно отличаются от приведенных в публикации (10).
Предпочтительность добавления в состав композиции к пептидам сквалена, фосфолипидов и твина 80 определяется тем, что вышеуказанные пептиды не обладали иммуногенностью вне состава композиции, а именно в виде раствора каждого из пептидов в отдельности, а также смеси всех 5 пептидов в 0,9%-ном растворе натрия хлорида при парентеральном введении млекопитающим (мышам и кроликам). Включение в состав вакцинных композиций сквалена и твина 80 является обычной практикой, поскольку известно, что эти компоненты в сочетании способны повышать интенсивность иммунного ответа на вводимые в составе композиции антигены. Однако отличительной характеристикой заявляемой композиции является соотношение антигена, сквалена, фосфолипидов и твина 80 в ее составе, а именно (1-5):20:2:40 по массе, и низкая концентрация сквалена (2 г/л) в водном растворе композиции, тогда как обычно содержание сквалена и твина 80 в композициях в несколько десятков и даже сотен раз выше содержания антигенов, как это указано в (8), а фосфолипиды не всегда присутствуют в описанных ранее композициях.
Данное изобретение и его промышленная применимость иллюстрируются следующими примерами, которые никоим образом не должны рассматриваться как ограничивающие область настоящего изобретения.
Пример 1. Синтез пептидов 1-5, входящих в состав композиции. Пептиды 1-5 синтезировали методом стандартного твердофазного пептидного синтеза с использованием в качестве активатора HBTU в присутствии 1-гидрокси-бензотриазола и N-диизопропил-N-этиламина. Для очистки целевых пептидов от примесей реагентов, использовавшихся в ходе синтеза, а также побочных продуктов синтеза применяли стандартные процедуры осаждения и кристаллизации из растворов, гель-фильтрации и высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). После очистки препараты подвергали лиофилизации. Очищенные препараты синтетических пептидных иммуногенных конструкций характеризовали стандартными методами аналитической ВЭЖХ и масс-спектрометрии с ионизацией электрораспылением для подтверждения степени чистоты и правильности синтеза. В таблице 1 приведены результаты анализов препаратов синтетических пептидов 1-5. Все препараты получены в кристаллической форме в виде натриевых и трифторацетатных солей.
Пример 2. Синтетические пептиды 1-5 по отдельности растворяли в 0,9%-ном растворе натрия хлорида для инъекций до концентрации пептида 0,01 мг/мл и вводили этот раствор белым беспородным мышам массой 20 г внутримышечно в дозе 5 мкг пептида/животное. Раствор каждого из пептидов вводили двум группам мышей: пяти самкам и пяти самцам. Инъекции повторяли трижды с интервалом в две недели. Кровь собирали после декапитации через 7 дней после последней иммунизации. Для получения сыворотки кровь инкубировали 1 час при комнатной температуре, после чего центрифугировали при 3000 об/мин (диаметр ротора центрифуги 15-20 см) 10 минут, сыворотку отбирали аликвотами по 100 мкл в пробирки типа «эппендорф» и хранили при -30°С. В качестве контроля использовали сыворотку крови, полученную от контрольных групп животных (5 самцов и 5 самок), которым вводили 0,9%-ный раствор натрия хлорида для инъекций в том же объеме и с той же периодичностью, что и растворы пептидов. Титры антител против соответствующих пептидов в сыворотках крови определяли методом ELISA. Для этого синтезированные пептиды 1-5 сорбировали по отдельности из 0,05 М натрий-бикарбонатного буфера, рН 8,5 в лунки предварительно УФ-облученного полистирольного планшета высокой сорбционной емкости ("Costar", США, кат. №9018) в количестве 0,2 мкг пептида/лунку. В лунки с сорбированными пептидами вносили раствор обезжиренного молока (50% молока по объему) в фосфатно-солевом буфере с 0,1% Твина 20 (ФСБТ-молоко) и инкубировали 1 ч при комнатной температуре при перемешивании. После удаления этого раствора в лунки вносили сыворотку крови мыши, полученную против соответствующей синтетической пептидной конструкции, разведенную в 20, 200, 1000 раз ФСБТ-молоком, и инкубировали 1,5 ч при 37°С. После удаления раствора сыворотки крови лунки планшета промывали трижды по 300 мкл ФСБТ и вносили в них раствор конъюгата пероксидазы хрена с антителами козы против IgG мыши в разведении 1:10000 в ФСБТ-молоке. Инкубировали 1 час при перемешивании при температуре 37°С, после чего трижды промывали планшет ФСБТ, как указано выше. После этого в лунки планшета вносили по 100 мкл раствора субстрата пероксидазы: ABTS в концентрации 0,5 мг/мл и H2O2 в концентрации 0,01% в 0,08М цитратном буфере, рН 4,0; раствор готовили непосредственно перед употреблением в склянке темного стекла). Инкубировали 40 мин в темноте при 37°С (при перемешивании), после чего измеряли оптическую плотность растворов в лунках при 405 нм. За величину титра антител принимали такое разведение сыворотки крови иммунизированного животного, для которого соответствующее значение оптической плотности в ELISA превышает двукратное значение оптической плотности контрольного образца сыворотки крови, взятого в таком же разведении. Ни у одного животного не было зарегистрировано появления в сыворотке крови пептид-специфичных антител в титре ниже 1:20 при иммунизации одними пептидами, растворенными в 0,9%-ном растворе натрия хлорида.
Пример 3. Синтетические пептиды 1-5, взятые в виде эквимолярной смеси в растворе 0,9%-ного натрия хлорида для инъекций в суммарной концентрации 0,05 мг/мл, вводили белым беспородным мышам массой 20 г внутримышечно в дозе 10 мкг пептида/животное. Раствор каждого из пептидов вводили двум группам мышей: пяти самкам и пяти самцам. Инъекции повторяли трижды с интервалом в две недели. Кровь собирали после декапитации через 7 дней после последней иммунизации. Получали сыворотку крови и определяли титр антипептидных антител, как это описано в примере 2. Ни у одного из иммунизированных животных не было зарегистрировано появления в сыворотке крови пептид-специфичных антител ни к одному из пептидов в титре ниже 1:20 при иммунизации раствором смеси пептидов.
Пример 4. Синтетические пептиды 1-5, взятые в виде эквимолярной смеси в растворе 0,9%-ного натрия хлорида для инъекций в суммарной концентрации 0,1 мг/мл, вводили двум кроликам-самцам породы «Советская шиншилла» массой 2.5 кг внутримышечно в дозе 0,2 мг пептида/животное. Инъекции повторяли трижды с интервалом в две недели. Кровь отбирали из ушной вены. Получали сыворотку крови и определяли титр антипептидных антител, как это описано в примере 2, но вместо раствора конъюгата пероксидазы хрена с антителами козы против IgG мыши использовали раствор конъюгата пероксидазы хрена с антителами козы против IgG кролика. У обоих иммунизированных животных не было зарегистрировано появления в сыворотке крови пептид-специфичных антител ни к одному из пептидов в титре ниже 1:20 при иммунизации раствором смеси пептидов.
Пример 5. Для получения водного раствора композиции синтетических пептидов 1-5 со скваленом, Липоидом С100 С и твином 80 20, 50 или 100 мг эквимолярной смеси пептидов 1-5, 2,0 г сквалена, 0,2 г Липоида С100, 4,0 г твина 80 вносили в 900 мл воды для инъекций, проводили первичную гомогенизацию механическим диспергированием, затем добавляли воду до общего объема 1000 мл и проводили микрофлюидизацию до достижения светопропускания полученной композиции не ниже 90% при 660 нм, измеренного с помощью спектрофотометра Multiscan Spectrum (Thermo Fisher Scientific). По окончании микрофлюидизации композицию подвергали микрофильтрации через фильтр с порами 0,22 мкм в стерильные флаконы. Полученная композиция представляла собой стабильный коллоидный раствор, не изменявший величину светопропускания при хранении при +4оС в течение по крайней мере 1 месяца.
Пример 6. Водный раствор композиции, полученный как в примере 5, с содержанием 0,02 мас. % эквимолярной смеси пептидов 1-5, растворяли в воде для инъекций и вводили белым беспородным мышам массой 20 г внутримышечно в дозе, соответствующей 5 мкг смеси пептидов/животное. Композицию вводили двум группам мышей: пяти самкам и пяти самцам. Инъекции повторяли трижды с интервалом в две недели. Кровь собирали после декапитации через 7 дней после последней иммунизации. Получали сыворотку крови и определяли титр антител против оболочечного белка Е2 и гетеродимера обол очечных белков Е1Е2 ВГС методом ELISA, как это описано в примере 2, но вместо пептидов в лунках планшета сорбировали препарат рекомбинантного оболочечного белка Е2 либо препарат гетеродимера рекомбинантных оболочечных белков Е1Е2. У 3 мышей-самок из 5 и у 3 мышей-самцов из 5 в сыворотке крови были выявлены антитела против рекомбинантного оболочечного белка Е2 и гетеродимера оболочечных белков Е1Е2 ВГС в титре 1:20.
Пример 7. Водный раствор композиции, полученный как в примере 5, с содержанием 0,05 мас. % эквимолярной смеси пептидов 1-5, растворяли в воде для инъекций и вводили 4 кроликам-самцам породы «Советская шиншилла» массой 2,5 кг внутримышечно в дозе, соответствующей 0,1 мг смеси пептидов/животное. Инъекцию повторяли трижды с интервалом в две недели. Кровь отбирали из ушной вены через 7 дней после последней иммунизации. Получали сыворотку крови и определяли титр антител против оболочечного белка Е2 и гетеродимера оболочечных белков Е1Е2 ВГС методом ELISA, как это описано в примере 6, но вместо раствора конъюгата пероксидазы хрена с антителами козы против IgG мыши использовали раствор конъюгата пероксидазы хрена с антителами козы против IgG кролика. У 3 кроликов из 4 в сыворотке крови были выявлены антитела против оболочечного белка Е2 и гетеродимера оболочечных белков Е1Е2 ВГС в титре 1:20.
Пример 8. Водный раствор композиции, полученный как в примере 5, с содержанием 100 мг эквимолярной смеси пептидов 1-5 в 1 л водного раствора, вводили 4 кроликам-самцам породы «Советская шиншилла» массой 2,5 кг внутримышечно в дозе 0,2 мг смеси пептидов/животное. Инъекцию повторяли трижды с интервалом в две недели. Кровь отбирали из ушной вены через 7 дней после последней иммунизации. Получали сыворотку крови и определяли титр антител против оболочечного белка Е2 и гетеродимера оболочечных белков Е1Е2 ВГС методом ELISA, как это описано в примере 6, но вместо раствора конъюгата пероксидазы хрена с антителами козы против IgG мыши использовали раствор конъюгата пероксидазы хрена с антителами козы против IgG кролика. У всех 4 кроликов в сыворотке крови были выявлены антитела против оболочечного белка Е2 и гетеродимера оболочечных белков Е1Е2 ВГС в титре 1:20, у двух кроликов из 4 титр анти-Е2 антител достигал 1:40.
Пример 9. Из сыворотки крови одного из кроликов, имевших титр анти-Е2 антител 1:40, получили фракцию иммуноглобулинов G осаждением раствором сульфата аммония 50%-ного насыщения и хроматографией на белок А-агарозе в соответствии с инструкцией к препарату белок А-агарозы.
В микропробирки объемом 1,5 мл для ПЦР вносили по 300 мкл препарата IgG, разведенного стерильным фосфатно-солевым буфером (0,01М фосфат натрия, рН 7,4, 0,14 М NaCl) до концентрации 1 мг/мл. Инкубировали 1 час при 37°С, затем ночь при 4°С. Раствор из микропробирок удаляли при помощи вакуумного аспиратора. Добавили по 400 мкл блокирующего буфера, содержащего 0,01М ФСБ и 10% (об.) 0,5% молока. Инкубировали 1 час при комнатной температуре при перемешивании на орбитальном мини-шейкере ELMI S-3. Промыли микропробирки 3 раза ФСБТ по 400 мкл в лунку.
Смешали 100 мкл плазмы крови, содержащей ВГС, с 300 мкл 0,01М стерильного ФСБ и внесли полученный раствор в микропробирки с сорбированными антителами. Микропробирки инкубировали 2 ч при 4°С при перемешивании на мини-шейкере ELMI S-3, затем раствор удалили с помощью аспиратора и промыли микропробирки 4 раза 25 мМ Tris-HCl буфером, рН 8.0, содержащим 300 мМ NaCl.
Выделение тотальной РНК проводили с помощью комплекта для выделения РНК/ДНК «РИБО-сорб-12» ФГУН ЦНИИЭ в соответствии с инструкцией к комплекту. Параллельно проводили выделение РНК из плазмы крови пациентов. При выделении РНК из плазмы крови пациентов в микропробирки к «Лизирующему раствору» и ВКО добавляли образец плазмы объемом 100 мкл. Для постановки отрицательного контроля выделения в пробирку с «Лизирующим раствором» и ВКО добавляли 100 мкл отрицательного контрольного образца (ОКО). В пробирку положительного контроля (ПК) выделения вносили 90 мкл ОКО и 10 мкл «ПКО HCV-rec».
Были поставлены отрицательный контроль выделения РНК и два положительных контрольных образца выделения («ПКО-1-HCV» и «ПКО-2-HCV»). Для отрицательного контроля в пробирку с лизирующим раствором добавили 100 мкл отрицательного контрольного образца (ОКО) и 10 мкл «ВКО HCV-M-FRT». Для положительных контролен в каждую пробирку добавили по 90 мкл ОКО, по 10 мкл «ВКО HCV-M-FRT» и 10 мкл соответствующего «ПКО-1-HCV» или «ПКО-2-HCV»
Полученный препарат РНК-пробы в надосадочной жидкости использовали для проведения совмещенной реакции обратной транскрипции РНК и ПЦР-амплификации кДНК вируса гепатита С с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме «реального времени» с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме «реального времени» на приборе Rotor-Gene Q (QIAGEN, Германия) «ПЦР-комплектом» набора реагентов для количественного определения РНК вируса гепатита С в клиническом материале методом полимеразной цепной реакции «АмплиСенс® HCV-Mohhtop-FRT» согласно прилагаемой к набору инструкции ФГУН Центрального Научно-исследовательского института эпидемиологии.
Полученные данные - кривые накопления флуоресцентного сигнала по двум каналам - анализировали с помощью программного обеспечения прибора Rotor-Gene Q для проведения ПНР в режиме «реального времени». По одному из каналов регистрировали накопление продукта амплификации участка кДНК ВГС (ПКО), а по другому - ВКО. На основании значений порогового цикла «Ct» (пересечение кривой флуоресценции с установленной на соответствующем уровне пороговой линией) и исходя из заданных значений калибраторов ПКО и ВКО происходило автоматическое построение калибровочной прямой и расчет количества копий кДНК ПКО и ВКО в ПЦР-пробе. Полученные значения использовали для расчета концентрации РНК HCV в исследуемых и контрольных образцах по формуле: (число копий кДНК ВГС в ПЦР пробе / число копий кДНК ВКО в ПНР пробе) × коэффициент = ME ВГС/мл образца, где ME - международные единицы (1МЕ = 1/4 РНК HCV копий/мл для данной тест-системы). Коэффициент для данных приборной и аналитической систем составлял 14390.
Количество вирусных частиц, связавшихся с IgG, равнялось количеству копий обнаруженной РНК ВГС в микропробирках с сорбированными на их внутренней поверхности IgG. Это количество копий РНК рассчитывали по калибровочным графикам, построенным при использовании ДНК-калибраторов, амплификация которых проходила в тех же условиях. Накопление продуктов амплификации ДНК-калибраторов регистрировали по двум каналам FAM/Green и JOE/Yellow, поскольку концентрация РНК ВГС рассчитывалась из соотношения количества копий кДНК ВГС и ВКО. Накопление продукта амплификации участка кДНК ВГС детектировалось по каналу JOE/Yellow, а накопление продукта амплификации ВКО - по каналу для детекции флуорофора FAM/Green. По результатам амплификации, представленным на рис. 1, видно, что кривые накопления флуоресцентного сигнала по каналу JOE/Yellow (кДНК ВГС) пересекают пороговую линию на различных циклах и имеют характерную S-образную форму. Это означает, что IgG связали нативные вирусные частицы из образцов плазмы крови больных, поскольку после отмывки микропробирок из них были выделены молекулы РНК ВГС. Так как в случае с препаратами IgG из преиммунных сывороток тех же животных, которые использовались в качестве контроля, кривые накопления флуоресцентного сигнала не пересекают пороговую линию, это означает, что препараты IgG, выделенные из антисывороток, способны специфически связывать вирусные частицы. В таблице 3 приведены результаты определения концентраций РНК ВГС в плазме крови больных и в препаратах вирусных частиц, полученных после сорбции на антипептидных антителах. Всего были проведены эксперименты с 8 образцами плазмы крови больных гепатитом С, в которых в ходе лабораторно-клинического анализа было выявлено присутствие ВГС различных субтипов.
Полученные результаты показывают, что при иммунизации водным раствором заявленной композиции на основе синтетических пептидов и липидов у животных образуются антитела, специфично связывающие разные изоляты вируса гепатита С, относящиеся к различным субтипам и генетическим вариантам.
Все приведенные выше примеры свидетельствуют о том, что разработанная композиция на основе синтетических пептидов и липидов обладает иммуногенностью, способна при введении млекопитающим вызывать у них образование антител, связывающих оболочечные белки вируса гепатита С и сам вирус, и может быть использована в вакцине против гепатита С.
* % от внесенного количества РНК ВГС. **н.о. - не определяли
Использованная литература.
1. Gal-Tanamy, М. Hepatitis С./ М. Gal-Tanamy [et al.] // In: Vaccines for Biodefence and Emerging and Neglected Diseases. Eds. A.T. Barrett and L.R. Stanberry., London [etc]: Academic Press. - 2009. - P. 413-440.
2. Sobolev, B.N. Comparative analysis of amino acid sequences from envelope proteins isolated from different hepatitis С virus variants: possible role of conservative and variable regions / B.N. Sobolev [et al.] // Journal of Viral Hepatitis. - 2000 - Vol. 7(5). - P. 368-374.
3. Waheed, A. Virus-neutralizing antibodies to hepatitis С virus/ D. Steinmann [et al.] // Wahid A., Dubuisson J. //Journal of Viral Hepatitis. - 2013. - Vol. 20. - P. 369-376.
4. Bukh, J. Animal models for the study of hepatitis С virus infection and related liver disease. / J. Bukh // Gastroenterology. - 2012. - Vol. 142. - P. 1279-1287.
5. Neuman-Haefelin, C. Adaptive immune responses in hepatitis С virus infection / C. Neumann-Haefelin, RThimme // Current Topics in Microbiology and Immunology. - 2013. - Vol. 369. - P. 243-262.
6. Law, J.L. A hepatitis С virus (HCV) vaccine comprising envelope glycoproteins gpEl/gpE2 derived from a single isolate elicits broad cross-genotype neutralizing antibodies in humans / J.L. Law [et al.] // PLoS ONE. - 2013. - Vol. 8. - e59776.: doi: 10.1371/journal.pone.0059776.
7. Fournillier, A. An accelerated vaccine schedule with a poly-antigenic hepatitis С virus MVA-based candidate vaccine induces potent, long lasting and in vivo cross-reactive T cell responses / A. Fournillier [et al.] // Vaccine. - 2007. - Vol. 25. - P. 7339-7353.
8. Klade, C.S. Therapeutic Vaccination of Chronic Hepatitis С Nonresponder Patients with the Peptide Vaccine IC41. / C.S. Klade [et al.] //Gastroenterology. - 2009. - Vol. 134. - P. 1385-1395.
9. Мойса, A.A. Синтетические пептидные вакцины. / A.A. Мойса, Е.Ф. Колесанова // Биомедицинская химия. - 2011. - Т.57. - Вып.1. - С. 14-30.
10. Колесанова, Е.Ф. Путь к пептидной вакцине против гепатита С./ Е.Ф. Колесанова [и др.] // Биомедицинская химия. - 2015. - Т.61. - Вып.2. - С. 254-264.
Claims (1)
- Композиция, выполненная в виде лиофилизата, для образования в организме млекопитающих антител, связывающих оболочечные белки вируса гепатита С и вирус гепатита С, содержащая в качестве синтетических пептидных антигенов пять пептидов следующей структуры: 1) ацетил-тирозил-пролил-тирозил-аргинил-лейцил-триптофил-гистидил-тирозил-пролил-глицил-глицил-серил-треонил-глицил-лейцил-изолейцил-гистидил-лейцил-гистидил-глутаминил-аспарагинил-изолейцил-валил-аспартил-валил-глутаминил-тирозил-лейцил-тирозил-глицин, 2) ацетил-аргинил-пролил-тирозил-цистеинил-триптофил-гистидил-тирозил-аланил-пролил-аргинил-серил-цистеинил-глицил-глицил-валил-цистеинил-глицил-пролил-валил-тирозил-цистеинил-фенилаланил-треонил-пролил-серил-пролил-валил-валил-валил-глицил-треонил-треонил-аспарагиновая кислота, 3) ацетил-глицил-серил-триптофил-гистидил-изолейцил-аспарагинил-серил-треонил-аланил-лейцил-аспарагинил-глицил-глицил-серил-треонил-глицил-лейцил-изолейцил-гистидил-лейцил-гистидил-глумаминил-аспарагинил-изолейцил-валил-аспартил-валил-глутаминил-тирозил-лейцил-тирозил-глицин, 4) ацетил-глицил-серил-триптофил-гистидил-изолейцил-аспарагинил-аргинил-треонил-аланил-лейцил-аспарагинил-глицил-глицил-валил-цистеинил-глицил-пролил-валил-тирозил-цистеинил-фенилаланил-треонил-пролил-серил-пролил-валил-валил-валил-глицил-треонил-треонил-аспарагиновая кислота, 5) серил-треонил-глицил-лейцил-изолейцил-гистидил-лейцил-гистидил-глутаминил-аспарагинил-изолейцил-валил-аспартил-валил-глутаминил-тирозил-лейцил-тирозил-глицил-цистеинил-пролил-тирозил-аспартил-цистеинил-фенилаланил-аргинил-лизил-гистидил-пролил-глутамил-аланил-треонил-тирозил-серин, а также сквален, фосфолипид Липоид С100, твин 80, мальтозу, полученная после лиофилизации водного раствора, содержащего синтетические пептидные антигены 0,002-0,01 мас. %, сквален 0,2 мас. %, фосфолипид Липоид С100 0,02 мас. %, твин 80 0,4 мас. %, мальтозу 10 мас. %, воду для инъекций до 100%.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2015122718A RU2675108C2 (ru) | 2015-06-15 | 2015-06-15 | Композиция на основе синтетических пептидов и липидов для вакцины против гепатита с |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2015122718A RU2675108C2 (ru) | 2015-06-15 | 2015-06-15 | Композиция на основе синтетических пептидов и липидов для вакцины против гепатита с |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2015122718A RU2015122718A (ru) | 2017-01-10 |
| RU2015122718A3 RU2015122718A3 (ru) | 2018-06-18 |
| RU2675108C2 true RU2675108C2 (ru) | 2018-12-17 |
Family
ID=57955462
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2015122718A RU2675108C2 (ru) | 2015-06-15 | 2015-06-15 | Композиция на основе синтетических пептидов и липидов для вакцины против гепатита с |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2675108C2 (ru) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2777204C2 (ru) * | 2020-12-29 | 2022-08-01 | Федеральное Государственное Бюджетное Образовательное Учреждение Высшего Образования "Московский Государственный Университет Технологий И Управления Имени К.Г. Разумовского (Первый Казачий Университет)" | Способ получения ультрадисперсных водных лиозолей терпентинного масла с заданными размерами частиц |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2136311C1 (ru) * | 1991-09-13 | 1999-09-10 | Чирон Корпорейшн | Иммуногенная полипептидная композиция, способ получения композиции, способ продуцирования и способ обнаружения антител, набор |
| RU2364419C2 (ru) * | 2003-04-25 | 2009-08-20 | Новартис Вэксинес Энд Дайэгностикс, Инк. | Композиции, содержащие катионные микрочастицы и днк hcv е1е2, и способы их применения |
| US20100034844A1 (en) * | 2006-01-04 | 2010-02-11 | Michael Houghton | Activation of HCV Specefic T Cells |
-
2015
- 2015-06-15 RU RU2015122718A patent/RU2675108C2/ru active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2136311C1 (ru) * | 1991-09-13 | 1999-09-10 | Чирон Корпорейшн | Иммуногенная полипептидная композиция, способ получения композиции, способ продуцирования и способ обнаружения антител, набор |
| RU2364419C2 (ru) * | 2003-04-25 | 2009-08-20 | Новартис Вэксинес Энд Дайэгностикс, Инк. | Композиции, содержащие катионные микрочастицы и днк hcv е1е2, и способы их применения |
| US20100034844A1 (en) * | 2006-01-04 | 2010-02-11 | Michael Houghton | Activation of HCV Specefic T Cells |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| MOISA A.A. et al. [Synthetic peptide vaccines].[Article in Russian] Biomed Khim. 2011 Jan-Feb; 57(1):14-30. * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2777204C2 (ru) * | 2020-12-29 | 2022-08-01 | Федеральное Государственное Бюджетное Образовательное Учреждение Высшего Образования "Московский Государственный Университет Технологий И Управления Имени К.Г. Разумовского (Первый Казачий Университет)" | Способ получения ультрадисперсных водных лиозолей терпентинного масла с заданными размерами частиц |
| RU2811696C1 (ru) * | 2022-12-20 | 2024-01-16 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ГНЦ ВБ "Вектор" Роспотребнадзора) | Способ получения вакцинного адъюванта в виде эмульсии |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2015122718A (ru) | 2017-01-10 |
| RU2015122718A3 (ru) | 2018-06-18 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| ES2834072T3 (es) | Polipéptidos y anticuerpos para el tratamiento de la infección por vhb y enfermedades relacionadas | |
| CN105669838B (zh) | 来自水痘-带状疱疹病毒gE蛋白的中和表位及针对其的抗体 | |
| ES2373055T3 (es) | Péptido antígeno de rechazo de cáncer derivado de glipican-3 (gpc3) para uso en pacientes positivos a la hla-a2 y producto farmacéutico que comprende el antígeno. | |
| ES2548014T3 (es) | Anticuerpos neutralizantes del citomegalovirus humano y uso de los mismos | |
| US20100310586A1 (en) | Idiotypic vaccine | |
| JP2023547197A (ja) | Ｔｌｒ４アゴニストを含有するリポソーム、その製造および使用 | |
| US20240131152A1 (en) | Nano-particles that contain synthetic variants of gm3 ganglioside as adjuvants in vaccines | |
| WO2021206638A1 (en) | Vaccine and/or antibody for viral infection | |
| US20080019972A1 (en) | Method for Amplifying Therapeutic Vaccine Activity | |
| Chiang et al. | Induction of robust immunity by the emulsification of recombinant lipidated dengue-1 envelope protein domain III | |
| RU2675108C2 (ru) | Композиция на основе синтетических пептидов и липидов для вакцины против гепатита с | |
| WO2016207408A1 (en) | Novel vaccines in prevention and treatment of malaria | |
| JPWO2009001673A1 (ja) | Ａｔｐ含有免疫アジュバント | |
| CN114057850A (zh) | 一种预防新型冠状病毒肺炎covid-19的多肽、免疫原性偶联物及其用途 | |
| JP7086000B2 (ja) | 体液性親和性の加速に関する方法及び組成物 | |
| BR112021012250A2 (pt) | Composições, métodos e usos para induzir uma resposta imune | |
| CN114057846B (zh) | 一种预防新型冠状病毒感染covid-19的多肽、免疫原性偶联物及其用途 | |
| CN114057851B (zh) | 一种预防新型冠状病毒肺炎covid-19的多肽、免疫原性偶联物及其用途 | |
| CN114057847B (zh) | 一种预防新型冠状病毒covid-19的多肽、免疫原性偶联物及其用途 | |
| CN114057848B (zh) | 一种预防新型冠状病毒肺炎covid-19的多肽、免疫原性偶联物及其用途 | |
| CN114057843B (zh) | 一种预防新型冠状病毒感染covid-19的多肽、免疫原性偶联物及其用途 | |
| EP4282880A1 (en) | Fully human broad-spectrum neutralizing antibody 76e1 against coronavirus, and use thereof | |
| JPWO2009004900A1 (ja) | ユビキノン含有免疫アジュバント | |
| WO2022083805A1 (es) | Antígeno quimérico que comprende el dominio extracelular de pd-l1 | |
| TW202320846A (zh) | 用於治療及預防b型及d型肝炎的組成物及方法 |