ES2548014T3 - Anticuerpos neutralizantes del citomegalovirus humano y uso de los mismos - Google Patents

Anticuerpos neutralizantes del citomegalovirus humano y uso de los mismos Download PDF

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Abstract

Un anticuerpo aislado, o un fragmento de unión al antígeno del mismo, que es específico para una combinación de las proteínas del hCMV UL128, UL130 y UL131A, formando la combinación el epítopo reconocido por dicho anticuerpo o fragmento de unión, y que neutraliza la infección de células endoteliales, de células retinianas o de células dendríticas por el citomegalovirus humano (hCMV),en el que el anticuerpo o el fragmento comprende las secuencias de la cadena pesada CDR1, CDR2 y CDR3 según se establecen en la SEQ ID NO: 1, en la SEQ ID NO: 2 y en la SEQ ID NO: 3 respectivamente, y comprende las secuencias de la cadena ligera CDR1, CDR2 y CDR3 según se establecen en la SEQ ID NO: 4, en la SEQ ID NO: 5 y en la SEQ ID NO: 6 respectivamente.

Description

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Los linfocitos B inmortalizados producidos mediante el uso de estos métodos pueden cultivarse entonces mediante el uso de los métodos conocidos en la materia, y aislarse los anticuerpos a partir de los mismos.
Los anticuerpos monoclonales pueden ser adicionalmente purificados, si se desea, mediante el uso de una filtración, una centrifugación y diversos métodos cromatográficos tales como una HPLC o una cromatografía de afinidad. Las técnicas para la purificación de anticuerpos monoclonales, incluyendo las técnicas para la producción de anticuerpos de calidad farmacéutica, son bien conocidas en la materia.
Los fragmentos de los anticuerpos monoclonales de la invención pueden obtenerse a partir de los anticuerpos monoclonales mediante métodos que incluyen la digestión con enzimas, tales como pepsina o papaína, y/o mediante la escisión de los puentes de disulfuro mediante una reducción química. Alternativamente, los fragmentos de los anticuerpos monoclonales pueden obtenerse mediante la clonación y la expresión de parte de las secuencias de las cadenas pesadas o ligeras. Los "fragmentos" de anticuerpos pueden incluir fragmentos Fab, Fab’, F(ab’)2 y Fv. La invención también incluye los fragmentos Fv de cadena única (scFv) derivados de las cadenas pesada y ligera de un anticuerpo monoclonal de la invención, por ejemplo, la invención incluye un scFv que comprende las CDR de un anticuerpo de la invención. También están incluidos los monómeros y los dímeros de cadenas pesadas o ligeras, así como los anticuerpos de cadena única, por ejemplo, Fv de cadena única, en los que los dominios variables de la cadena pesada y ligera están unidos mediante un péptido conector.
Pueden usarse técnicas habituales de biología molecular para la preparación de las secuencias de ADN que codifican para los anticuerpos o los fragmentos de los anticuerpos de la presente invención. Las secuencias de ADN deseadas pueden sintetizarse completamente o parcialmente mediante el uso de técnicas de síntesis con oligonucleótidos. Según sea apropiado, pueden usarse las técnicas de mutagénesis dirigida y de reacción en cadena de la polimerasa (PCR).
Puede usarse cualquier sistema adecuado de célula hospedadora / vector para la expresión de las secuencias de ADN que codifican para las moléculas de anticuerpos de la presente invención o para fragmentos de los mismos. Pueden usarse bacterias, por ejemplo, E. coli, y otros sistemas microbianos, en parte, para la expresión de fragmentos de anticuerpos tales como los fragmentos Fab y F(ab’)2, y especialmente fragmentos Fv de anticuerpos de cadena única, por ejemplo, Fv de cadena únicas. Pueden usarse sistemas de expresión celulares eucariotas, por ejemplo, de mamífero, para la producción de moléculas de anticuerpos mayores, incluyendo moléculas de anticuerpo completas. Algunas células hospedadoras de mamífero adecuadas incluyen células CHO, HEK293T, PER.C6, NSO, de mieloma o de hibridoma.
Un proceso para la producción de una molécula de anticuerpo de acuerdo con la presente invención puede comprender el cultivo de una célula hospedadora que comprende un vector de la presente invención en unas condiciones adecuadas para dar lugar a la expresión de la proteína a partir del ADN que codifica para la molécula de anticuerpo de la presente invención, y el aislamiento de la molécula de anticuerpo.
La molécula de anticuerpo puede comprender únicamente un polipéptido de la cadena pesada o ligera, en cuyo caso sólo se requiere la utilización de un polipéptido de la cadena pesada o de la cadena ligera que codifica para la secuencia en la transfección de las células hospedadoras. Para la producción de los productos que comprenden ambas cadenas pesada y ligera, la línea celular puede ser transfectada con dos vectores, un primer vector que codifica para un polipéptido de la cadena ligera y un segundo vector que codifica para un polipéptido de la cadena pesada. Alternativamente, puede usarse un único vector, incluyendo el vector las secuencias que codifican para los polipéptidos de la cadena ligera y de la cadena pesada.
Alternativamente, los anticuerpos de acuerdo con la invención pueden ser producidos mediante i) la expresión de una secuencia de ácidos nucleicos de acuerdo con la invención en una célula, y ii) el aislamiento del producto de anticuerpo expresado. Adicionalmente, el método puede incluir iii) la purificación del anticuerpo.
Cribado y aislamiento de los linfocitos B
Los linfocitos B pueden cribarse para buscar aquellos que producen los anticuerpos con la especificidad de antígeno deseada, y después pueden producirse clones individuales de linfocitos B a partir de las células positivas.
La etapa de cribado puede realizarse mediante un ELISA, mediante la tinción de los tejidos o de las células (incluyendo células transfectadas), un ensayo de neutralización o uno de los otros diversos métodos conocidos en la materia para la identificación de la especificidad de antígeno deseada. El ensayo puede elegirse sobre la base del reconocimiento de antígeno simple, o puede elegirse sobre la base adicional de una función deseada, por ejemplo, para seleccionar los anticuerpos de neutralización en lugar de únicamente los anticuerpos que se unen al antígeno, para seleccionar los anticuerpos que pueden modificar las características de las células diana, tales como sus cascadas de señalización, su forma, su velocidad de crecimiento, a su capacidad para influir sobre células, respuesta frente a la influencia de otras células o de otros reactivos, o mediante un cambio en las condiciones, en su estado de diferenciación, etc.
La etapa de clonación para la separación de los clones individuales de la mezcla de células positivas puede llevarse
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clorhidratos, bromhidratos, fosfatos y sulfatos, o sales de ácidos orgánicos, tales como acetatos, propionatos, malonatos y benzoatos.
Los portadores farmacéuticamente aceptables de las composiciones terapéuticas pueden contener adicionalmente líquidos tales como agua, solución salina, glicerol y etanol. Adicionalmente, puede haber presentes sustancias auxiliares, tales como agentes humectantes o emulsionantes o sustancias tamponantes del pH en dichas composiciones. Dichos portadores permiten que las composiciones farmacéuticas se formulen en forma de comprimidos, píldoras, grageas, cápsulas, líquidos, geles, jarabes y suspensiones, para su ingestión por el paciente.
En el ámbito de la invención, las formas de administración pueden incluir aquellas formas adecuadas para la administración parenteral, por ejemplo, mediante inyección o infusión, por ejemplo, mediante inyección en bolo o en infusión continua. Cuando el producto es para inyección o infusión, puede tomar la forma de una suspensión, de una solución o de una emulsión en un vehículo oleoso o acuoso, y puede contener agentes de formulación, tales como agentes suspensores, conservantes, estabilizantes y/o dispersantes. Alternativamente, la molécula de anticuerpo puede estar en forma seca, para su reconstitución antes del uso con un líquido estéril apropiado.
Una vez formuladas, las composiciones de la invención pueden ser administradas directamente al sujeto. En una forma de realización las composiciones están adaptadas para su administración a sujetos humanos.
Las composiciones farmacéuticas de esta invención pueden ser administrada mediante cualquier vía, incluyendo, pero no se limita a, las vías oral, intravenosa, intramuscular, intraarterial, intramedular, intraperitoneal, intratecal, intraventricular, transdérmica, transcutánea, tópica, subcutánea, intranasal, enteral, sublingual, intravaginal o rectal. También pueden usarse hipoesprays para la administración de las composiciones farmacéuticas de la invención. Normalmente, las composiciones terapéuticas pueden prepararse en forma de inyectables, en soluciones o en suspensiones líquidas. También pueden prepararse formas sólidas adecuadas para su disolución o su suspensión en vehículos líquidos antes de la inyección.
La administración directa de las composiciones se llevará a cabo generalmente mediante una inyección subcutánea, intraperitoneal, intravenosa o intramuscular, o se administrará en el espacio intersticial de un tejido.
Las composiciones también pueden administrarse en una lesión. La dosis de tratamiento puede ser un programa de dosis única o un programa de dosis múltiples. Los productos farmacéuticos basados en anticuerpos proporcionan una orientación relativa a la frecuencia de administración, por ejemplo, si un producto farmacéutico debería ser administrado diariamente, semanalmente, mensualmente, etc. La frecuencia y la dosis también dependen de la gravedad de los síntomas.
Las composiciones de la invención pueden prepararse en diversas formas. Por ejemplo, las composiciones pueden prepararse en forma de inyectables, en soluciones o en suspensiones líquidas. También pueden prepararse formas sólidas adecuadas para su disolución o su suspensión en vehículos líquidos antes de la inyección (por ejemplo, una composición liofilizada, como Synagis™ y Herceptin™, para su reconstitución con agua estéril que contiene un conservante). La composición puede prepararse para su administración tópica, por ejemplo, en forma de un ungüento, una crema o un polvo. La composición puede prepararse para su administración oral, por ejemplo, en forma de un comprimido o de una cápsula, en forma de un aerosol o en forma de un jarabe (opcionalmente saborizado). La composición puede prepararse para su administración pulmonar, por ejemplo, en forma de un inhalador, mediante el uso de un polvo fino o de un aerosol. La composición puede prepararse en forma de un supositorio o de un óvulo vaginal. La composición puede prepararse para su administración nasal, ótica u ocular, por ejemplo, en forma de gotas. La composición puede estar en forma de un kit, diseñado de tal forma que se reconstituye una composición combinada justo antes de su administración a un paciente. Por ejemplo, puede proporcionarse un anticuerpo liofilizado en forma de un kit con agua estéril y un tampón estéril.
Se apreciará que el principio activo de la composición será una molécula de un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo o variantes y derivados de los mismos. Como tal, será susceptible a una degradación en el tracto gastrointestinal. Por lo tanto, si la composición se va a administrar mediante una vía que hace uso del tracto gastrointestinal, será necesario que la composición contenga agentes que protejan el anticuerpo frente a la degradación pero que liberen el anticuerpo una vez que ha sido absorbido desde el tracto gastrointestinal.
Un análisis meticuloso de los portadores farmacéuticamente aceptables está disponible en Gennaro (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20ª edición, ISBN: 0683306472.
Las composiciones farmacéuticas de la invención tienen generalmente un pH de entre 5,5 y 8,5, en algunas formas de realización este puede estar entre 6 y 8, y en algunas formas de realización adicionales en aproximadamente 7. El pH puede mantenerse mediante el uso de un tampón. La composición puede ser estéril y/o exenta de pirógenos. La composición puede ser isotónica con respecto a los seres humanos. En una forma de realización, las composiciones farmacéuticas de la invención se suministran en recipientes precintados herméticamente.
Las composiciones farmacéuticas incluirán una cantidad eficaz de uno o más anticuerpos de la invención y/o de uno o
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nucleicos adecuados son conocidos en la materia.
Las composiciones pueden incluir un antimicrobiano, particularmente si están envasadas en un formato de dosis múltiples.
5 Las composiciones pueden comprender un detergente, por ejemplo, un Tween (polisorbato), tal como Tween 80. Los detergentes están presentes generalmente a unos niveles bajos, por ejemplo, < 0,01 %.
Las composiciones pueden incluir sales de sodio (por ejemplo, cloruro de sodio) para dar tonicidad. Es típica una 10 concentración de 10 ± 2 mg/ml de NaCl.
Las composiciones pueden comprender un alcohol de azúcar (por ejemplo, manitol) o un disacárido (por ejemplo, sacarosa o trehalosa), por ejemplo, aproximadamente a 15 -30 mg/ml (por ejemplo, a 25 mg/ml), particularmente si van a ser liofilizadas o si incluyen un material que ha sido reconstituido a partir de un material liofilizado. El pH de una
15 composición para liofilización puede ajustarse a aproximadamente 6,1 antes de la liofilización.
Las composiciones de la invención también pueden comprender uno o más agentes inmunoreguladores. En una forma de realización, uno o más de los agentes inmunoreguladores incluye(n) un adyuvante.
20 Tratamientos médicos y usos
Los anticuerpos y los fragmentos de anticuerpos de la invención, o los derivados y las variantes de los mismos, pueden usarse para el tratamiento de una infección por el hCMV, para la prevención de una infección por el hCMV o para el diagnóstico de una infección por el hCMV.
25 Los métodos de diagnóstico pueden incluir poner en contacto un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo con una muestra. Dichas muestras pueden ser muestras de tejido tomadas a partir de, por ejemplo, glándulas salivares, pulmón, hígado, páncreas, riñón, oído, ojo, placenta, tracto alimentario, corazón, ovarios, pituitaria, glándulas adrenales, tiroides, cerebro y piel. Los métodos de diagnóstico pueden incluir también la detección de un complejo de antígeno /
30 anticuerpo.
La invención proporciona por lo tanto un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo del mismo de acuerdo con la invención, para su uso en terapia.
35 Un método de tratamiento de un paciente puede comprender la administración a ese paciente de un anticuerpo o de un fragmento de anticuerpo del mismo de acuerdo con la invención.
La invención también proporciona el uso de un anticuerpo o de un fragmento de anticuerpo del mismo de acuerdo con la invención en la preparación de un medicamento para la prevención o el tratamiento de una infección por el hCMV.
40 La invención proporciona una composición de la invención para su uso como un medicamento para la prevención o el tratamiento de una infección por el hCMV. También proporciona el uso de un anticuerpo de la invención en la preparación de un medicamento para el tratamiento de un paciente y/o el diagnóstico de un paciente. Un método para el tratamiento de un sujeto y/o para la realización de un diagnóstico en un sujeto puede comprender la etapa de
45 administrar al mismo una composición de la invención. En algunas formas de realización, el sujeto puede ser un ser humano. Una forma de comprobar la eficacia del tratamiento terapéutico implica la vigilancia de los síntomas de la enfermedad después de la administración de la composición de la invención. El tratamiento puede ser un programa de dosis única o un programa de dosis múltiples.
50 Un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo, un clon de linfocitos B inmortalizados, un epítopo o una composición descritos en el presente documento pueden ser administrados a un sujeto en necesidad de dicho tratamiento. Dicho sujeto incluye, pero no se limita a, uno que esté particularmente en riesgo de, o sea susceptible a, una infección por el hCMV, incluyendo, por ejemplo, un sujeto inmunodeprimido. Algunos ejemplos de sujetos incluyen aquellos que padecen VIH o están bajo una terapia inmunodepresora, tales como los pacientes trasplantados.
55 Los anticuerpos de la invención pueden ser usados en la inmunización pasiva.
Los anticuerpos y los fragmentos de los mismos según se describen en la presente invención también pueden usarse en un kit para el diagnóstico de una infección por el hCMV.
60 Los epítopos capaces de unirse a un anticuerpo de la invención, por ejemplo, el anticuerpo monoclonal 6G4, pueden usarse en un kit para monitorizar la eficacia de los procedimientos de vacunación mediante la detección de la presencia de anticuerpos protectores anti-hCMV.
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positivos según se describe en la referencia 36. Se determinaron las concentraciones de IgG en el sobrenadante de los clones seleccionados mediante el uso de un ELISA específico de IgG.
Para el ensayo de neutralización vírica se mezcló una cantidad titulada de una cepa clínica del hCMV con un volumen igual del sobrenadante del cultivo o con diluciones de suero humano que contienen los anticuerpos de neutralización. Después de 1 hora de incubación a la temperatura ambiente, la mezcla se añadió a monocapas confluyentes de células endoteliales (por ejemplo, células HMEC-1), de células epiteliales (por ejemplo, células retinianas ARPE) o de fibroblastos (por ejemplo, células MRC-9 o madre mesenquimáticas) en placas de fondo redondo de 96 pocillos y se incubaron a 37 ºC durante dos días. El sobrenadante se desechó, las células se fijaron con metanol frío y se tiñeron con una mezcla de anticuerpos monoclonales de ratón contra los antígenos tempranos del hCMV, seguido de una Ig anti-ratón de cabra marcada con fluoresceína. Las placas se analizaron mediante el uso de un microscopio de fluorescencia. En ausencia de los anticuerpos de neutralización, las células infectadas eran ∼1.000 / campo, mientras que en presencia de concentraciones saturantes de los anticuerpos de neutralización, la infección fue completamente inhibida. El ensayo de neutralización vírica también se llevó a cabo mediante el uso de células dendríticas como células diana. El título de neutralización está indicado como la concentración de anticuerpo (µg/ml) que proporciona una reducción del 50 % de una infección por el hCMV. La Tabla 2 muestra que el 6G4, que se ha demostrado que es específico para una combinación de la UL128, la UL130 y la UL131A, era capaz de neutralizar una infección por el hCMV de células endoteliales, retinianas y dendríticas a unas concentraciones muy bajas (es decir, con una elevada potencia).
Tabla 2
Neutralización al 50 % (µg/ml) de:
Clon
Fibroblastos Células endoteliales / retinales / dendríticas
6G4
* 0,004
Cytotec �
5.000 50
Suero de donante
33 1
* no hay neutralización a la mayor concentración ensayada (es decir, > 2 µg/ml). � Cytotect (Biotest) es un conjunto de IgG hiperinmune del hCMV.
Ejemplo 2: identificación de los antígenos diana reconocidos por los anticuerpos monoclonales
Para cartografiar las especificidades del anticuerpo monoclonal humano 6G4 en la neutralización de la infección de las células endoteliales, se construyeron vectores de expresión que codifican para las UL128, UL130, UL131A, gH y gL completas. Se transfectaron células HEK293T con estos vectores solos o en combinación. Después de 36 h, las células fijaron, se permeabilizaron y se tiñeron con 6G4 seguido de cabra anti-IgG humana. La Figura 1 muestra que las células teñidas de anticuerpo monoclonal 6G4 se expresan conjuntamente con al menos la UL128, la UL130 y la UL131A. La intensidad de la tinción de 6G4 aumentaba cuando se transfectaban conjuntamente las gH y gL junto con las UL128, UL130 y UL131A para reconstituir el supuesto complejo glucoproteico gCIII completo. Estos datos sugieren que el anticuerpo monoclonal 6G4 es específico para un epítopo conformacional determinado por una combinación de las proteínas del hCMV UL128, UL130 y UL131A. Lo más probable es que este epítopo esté en la conformación apropiada únicamente cuando las UL128, UL130 y UL131A son ensambladas conjuntamente en el gCIII junto con las gH y gL
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