TW202033557A - 特異性結合至人類T細胞受體之TRBV-9家族之β區的單株抗體及其使用之方法 - Google Patents
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Abstract
本發明係關於一種特異性結合至人類T細胞受體之TRBV9家族之單株人類化抗體或其抗原結合片段。本發明亦係關於一種編碼該抗體或其抗原結合片段之核酸、一種表現載體、一種用於製備該抗體之方法及該抗體用於治療與人類T細胞受體家族相關之疾病或病症的用途。本發明係關於可用於治療尤其AS、乳糜瀉及惡性血液疾病之抗體之產生,其致病機制涉及TRBV9家族TCR。
Description
本發明係關於生物技術及生物醫學之領域,尤其係關於抗體或其抗原結合片段,且係關於其用途。更特定言之,本發明係關於一種特異性結合至人類T細胞受體家族之單株人類化抗體。本發明亦係關於一種編碼該抗體或其抗原結合片段之核酸、一種表現載體、一種用於製備該抗體之方法及該抗體用於治療與人類T細胞受體家族相關之疾病或病症的用途。
自體免疫疾病由自體反應性T淋巴球所引起(Haroon N等人,Arthritis Rheum.2013年10月;65(10):2645-54,Duarte J.等人,PloS One 2010年5月10日;5(5):e10558;Konig M.等人,Front Immunol 2016年1月25日;7:11)。先前技術揭示T細胞受體(T cell receptor;TCR)序列為允許鑑別參與自體免疫疾病之致病機制的T淋巴球純系之標記物。在結構上,T細胞受體之次單元為免疫球蛋白超家族之成員且由若干個基因片段形成。TCR可變區形成TCR抗原結合位點。此意謂其為純系特異性的,亦即不同之處在於回應於相異抗原之T淋巴球。
就TCR可變域內之可變(V)基因片段之胺基酸同源性而言,將T細胞受體劃分成不同家族。根據IMGT命名法,將β鏈區分為26個相異家族,且將α鏈區分為41個家族(Turner SJ等人,Nature Reviews Immunology 2006,第6卷,883-894)。為判定TCR鏈家族,吾人使用測試
胺基酸序列及已知TCR鏈序列之多序列比對,其上之資訊概括於網際網路http://www.imgt.org上可用的IMGT資料庫中(「國際免疫遺傳學資訊系統(The international ImMunoGeneTics information system)」,Lefranc M-P.,Nucl Acids Res 2001;29:207-209)。TCR鏈家族之多序列比對及判定可使用IgBlast軟體包來執行。
WO9006758揭示人類T細胞受體可變域之β鏈區之單株抗體W112及2D1(其屬於TRBV5-3及TRBV8-1家族)提議為類風濕性關節炎(rheumatoid arthritis)之診斷及治療手段。該等單株抗體分別識別0.3至5%之攜帶TRBV5-3之周邊T淋巴球及0.5至13%之攜帶TRBV8-1之周邊T淋巴球。許多研究之結果表明T淋巴球參與類風濕性關節炎之致病機制會導致使用對T受體之β鏈區具有特異性之單株抗體。詳言之,Brennan等人,Clin Exp Immunol.1988年9月;73(3):417-423已表明與健康者相比,患有類風濕性關節炎之患者之滑膜樣品中攜帶TRBV5及TRBV8的T淋巴球之百分比較高。WO9405801揭示與人類T細胞受體之VB3.1可變區之抗原決定基相互作用的用於診斷及治療類風濕性關節炎之單株抗體,其與TCR V(β)3.1子族相互作用。
亦已描述特異性地識別大鼠TRC之第13家族β鏈之單株抗體。動物模型已表明藉助於此等抗體,有可能預防性地移除T細胞之小群體,其T受體包含VB13 β鏈(VB13+ T細胞),且已展示此程序防止易患糖尿病之大鼠中I型糖尿病之發展,並且亦顯著降低病毒誘導之糖尿病發展之風險(Zhijun Liu等人,Diabetes.2012年5月;61(5):1160-1168。)。同時,移除T細胞(其T受體包含相異β鏈家族(VB16))之結果並不與對照組之結果不同。值得注意的係即使針對VB13之單株抗體之第一次投與導致大鼠脾中之VB13+ T細胞數目減少60%。
已描述患有僵直性脊椎炎(AS或別赫切列夫氏疾病(Bekhterev's disease))之患者中之自體免疫TCR的共同變體,其已展示無論其HLA*B27對偶基因狀態如何,其存在於患有AS之患者的滑液及周邊血液中且在相同分析深度下不存在於健康供體中(Faham M.等人,Arthritis Rheumatol.2017;69(4):774-784;Komech E等人第12次EJI-EFIS Tatra
Immunology Conference;2016年9月3-7日;Strbske Pleso,Slovakia.Abstract book第39頁)。該等TCR為TRBV9家族之成員(根據IMGT命名法)。已展示攜帶TRBV9家族β鏈之T細胞受體亦參與此自體免疫疾病(如乳糜瀉(celiac disease))之發展(Petersen J等人,J Immunol.2015;194(12):6112-22)。其亦發現於經歷T細胞淋巴瘤及T細胞白血病(包括由埃-巴二氏病毒(Epstein-Barr virus;EBV)所引起T細胞淋巴瘤)之惡性化的T細胞表面上(Toyabe S等人,Clin Exp Immunol.2003;134(1):92-97)。
申請案第RU2017145662號最近已描述嵌合單株抗體能夠特異性結合至人類T受體之TRBV9家族β鏈區,該等抗體可用於其致病機制涉及屬於TRBV9家族之TCR的自體免疫及致癌疾病(例如AS、乳糜瀉以及一些T細胞淋巴瘤及T細胞白血病)之療法中。
該等抗體為目前可用於消除攜帶TRBV9家族TCR之T細胞的唯一已知抗體。該等抗體之主要缺點為相對較低程度之人類化,亦即其包含人類樣恆定區及結構組分,但具有大鼠樣可變域。該等抗體之重鏈之可變片段的人類化程度為72%,然而輕鏈之可變片段之人類化程度為69%。
上述親本單株抗體包括:
1)其重鏈(VH)之可變域,其包含3個高變區HCDR1、HCDR2及HCDR3,其中
HCDR1(根據Kabat編號方案)具有SEQ ID NO:1之胺基酸序列,
HCDR2具有SEQ ID NO:2之胺基酸序列
HCDR3具有SEQ ID No 3之胺基酸序列;
其輕鏈(VL)之可變域,其包含3個高變區LCDR1、LCDR2及LCDR3,其中:
LCDR1具有SEQ ID NO:4之胺基酸序列,
LCDR2具有SEQ ID NO:5之胺基酸序列,
LCDR3具有SEQ ID NO:6之胺基酸序列。
上述親本單株抗體包括重鏈及輕鏈之可變域,其具有展示於SEQ ID NO:8及10中之胺基酸序列。
上述親本單株抗體包括具有展示於SEQ ID No.12中之胺基酸序列的輕鏈及具有SEQ ID No.14之胺基酸序列之抗體重鏈。
編碼上述親本抗體之重鏈及輕鏈的該等胺基酸序列之核苷酸序列之實例展示於SEQ ID NO:13及11中。
本發明係關於單株抗體之產生,其可用於消除攜帶TRBV9家族TCR之T細胞,尤其用於治療AS、乳糜瀉及惡性血液疾病(其致病機制涉及TRBV9家族TCR,且其特徵為高度人類化)。同時,人類化經常導致抗體親和力及/或溶解度之關鍵性降低。因此,有關任務係產生人類化功能抗體。
本發明係關於一種人類化單株抗體及其抗原結合片段,其具有利用高親和力特異性結合至人類T受體之TRBV9家族β鏈區之能力。根據本發明之抗體可用作用於治療其致病機制涉及屬於TRBV9家族之TCR的自體免疫及致癌疾病(例如AS、乳糜瀉以及一些T細胞淋巴瘤及T細胞白血病)之藥劑。
在較佳實施例中,本發明之抗體包含具有三個高變區之重鏈(VH)可變域
1)HCDR 1(根據Kabat編號方案)具有SEQ ID NO:1之胺基酸序列,
2)HCDR 2具有SEQ ID NO:2之胺基酸序列
3)HCDR 3具有SEQ ID No 3之胺基酸序列;
2)具有三個高變區LCDR1、LCDR2及LCDR3之輕鏈(VL)可變域,其中:
LCDR 1具有SEQ ID NO:4之胺基酸序列,
LCDR 2具有SEQ ID NO:5之胺基酸序列,
LCDR 3具有SEQ ID NO:6之胺基酸序列。
除非另外特定陳述,否則在下文中使用熟知之Kabat編號方案以測定抗體之CDR。
因此,與親本者相比,抗體重鏈及輕鏈可變域包含重鏈及輕鏈可變域之FR片段中之胺基酸取代,從而增大抗體之人類化程度。
在一些實施例中,與親本抗體之重鏈可變域(其胺基酸序列展示於SEQ ID No 8中)相比,本發明之抗體之重鏈可變域包含至少10個人類化胺基酸取代。
在較佳實施例中,本發明之抗體之重鏈可變域具有展示於SEQ ID No:16中之序列。
在一些實施例中,本發明之抗體之重鏈可變域包含並未更改抗體特異性之其他胺基酸取代。
在一些實施例中,與親本抗體之輕鏈可變域(其胺基酸序列展示於SEQ ID No 10中)相比,本發明之抗體之輕鏈可變域包含至少10個人類化胺基酸取代。
在較佳實施例中,本發明之抗體之輕鏈可變域具有展示於SEQ ID NO 18中之序列。
在一些實施例中,本發明之抗體之輕鏈可變域包含並未更改抗體特異性之其他胺基酸取代。
在一些實施例中,本發明之單株抗體為全長人類IgG抗體,例如IgG1或IgG2或IgG3或IgG4。
在一些實施例中,本發明之抗體包括重鏈,其胺基酸序列與SEQ ID NO:20之胺基酸序列至少85%一致;或至少90%一致;或至少91%一致;或至少92%或至少93%一致;或至少94%、或至少95%、或至少96%、或至少97%、或至少98%或至少99%或100%一致。
在一些實施例中,本發明之抗體包括輕鏈,其胺基酸序列與SEQ ID NO:22之胺基酸序列至少85%一致;或至少90%一致;或至少91%一致;或至少92%或至少93%一致;或至少94%、或至少95%、或至少96%、或至少97%、或至少98%或至少99%或100%一致。
在一些實施例中,抗體具有輕鏈,其胺基酸序列展示於SEQ ID NO:22中;及重鏈,其胺基酸序列展示於SEQ ID NO:20中。
亦提供編碼本發明之抗體之重鏈及輕鏈之可變域的核酸、編碼根據本發明抗體及其功能片段之重鏈及輕鏈的核酸。
亦提供包括本發明之核酸及用於將核酸表現於所選擇宿主
細胞中必需之調節元件的表現卡匣(expression cassette)及表現載體。載體或表現卡匣可作為染色體外元件存在於宿主細胞中或由於將該表現卡匣或載體引入(藉由轉染)至細胞中而整合至細胞基因組中。
此外,提供包括本發明之核酸、載體或表現卡匣之細胞及穩定細胞株以及其製備之方法。
亦提供一種用於產生上述抗體或其抗原結合片段之方法,其包含在確保該抗體產生之條件下將上述宿主細胞培養於培養基中。在一些實施例中,方法包括所得抗體之後續分離及純化。
亦提供一種用於預防或治療由人類T受體之TRBV9家族β鏈區介導之疾病或病症的醫藥組合物,其包含上述抗體或其抗原結合片段以及一或多種醫藥學上可接受之賦形劑。
在實施例中之一者中,醫藥組合物意欲預防或治療選自以下群的疾病或病症:僵直性脊椎炎、乳糜瀉、T細胞白血病、T細胞淋巴瘤。
亦提供一種用於預防或治療由攜帶TRBV9家族β鏈之人類T細胞受體介導之疾病或病症的醫藥組合,其包含上述抗體或其抗原結合片段及至少一種其他治療學上之活性化合物。
在實施例中之一者中,醫藥組合意欲預防或治療選自以下群之疾病或病症:僵直性脊椎炎、乳糜瀉、T細胞白血病、T細胞淋巴瘤。
在一個實施例中,醫藥組合或組合物包含選自小分子、抗體或類固醇激素(諸如皮質類固醇)之其他治療學上之活性化合物。
亦提供一種用於抑制其β鏈屬於TRBV9家族之T細胞受體之生物活性的方法,其在需要此抑制之個體中包含向個體投與有效量的上述抗體或其抗原結合片段。
亦提供一種用於治療由攜帶TRBV9家族β鏈之人類T細胞受體介導之疾病或病症的方法,其包含向需要此治療之個體投與呈治療有效量的上述抗體或其抗原結合片段或該醫藥組合物。
在用於治療疾病或病症之方法的實施例中之一者中,疾病或病症選自以下群:僵直性脊椎炎、乳糜瀉、T細胞白血病、T細胞淋巴瘤。
亦提供一種上述抗體或其抗原結合片段或上述醫藥組合物
的用途,其在需要此治療之個體中用於治療由攜帶TRBV9家族β鏈的人類T細胞受體介導之疾病或病症。
在用途之實施例中之一者中,疾病選自以下群:僵直性脊椎炎、乳糜瀉、T細胞白血病、T細胞淋巴瘤。
本發明之技術結果包括獲得具有高度人類化之抗體,其利用高親和力特異性結合至TCR(其β鏈屬於TRBV9家族),且可用於治療其致病機制涉及TCR(其β鏈屬於TRBV9家族)之自體免疫及致癌疾病。
在較佳實施例中,抗體重鏈可變片段之特徵為87%之人類化程度。在較佳實施例中,抗體輕鏈可變片段之特徵為85%之人類化程度。
圖1展示使用抗體MA-042對T淋巴球進行分類之結果。
圖2展示在1ng/ml(右)及1μg/ml(左)之濃度的抗體MA-042存在下,T淋巴球在細胞毒性活性分析之後的流式細胞量測術的結果。矩形展示CD45+ CD3+TRBV9+之群體。
圖3展示細胞毒性分析中隨MA-042濃度變化以測定MA-042之半數有效濃度(EC50)的死亡T淋巴球數目。
本發明係關於具有特異性結合至人類T受體之TRBV9家族β鏈區之能力的經分離單株抗體及其功能片段,其相對於類似物具有增大之人類化程度。亦提供編碼本發明之抗體及其片段之核酸、包括本發明之核酸及用於將核酸表現於所選擇宿主細胞中必需之調節元件的表現卡匣及表現載體。此外,提供包括本發明之核酸、載體或表現卡匣之細胞及穩定細胞株。亦提供一種用於產生單株抗體或其功能片段、包含呈有效量之本發明之抗體以及一或多種醫藥學上可接受之賦形劑、稀釋劑或載劑的醫藥組合物及醫藥組合之方法,及使用本發明之抗體診斷及治療AS及其他疾病的方法。
定義
首先定義一些術語將更較容易地理解本發明。
應理解,本文中所提供之材料及方法不限於特定組合物及方法步驟,因為此等可變化。必須注意,除非上下文另外明確指示,否則如本文中及所附申請專利範圍中所使用,單數形式包括對應複數個指示物。
人類「T細胞受體」(亦被稱作「TCR」、「T受體」)為T淋巴球之表面上所發現之異二聚體蛋白複合物。T受體僅存在於T淋巴球上。TCR之主要功能為特異性地識別與主要組織相容性複合物(HLA)之分子結合的經加工抗原。
人類TCR由兩個次單元α鏈及β鏈或γ鏈及δ鏈經由二硫鍵連接且對接至細胞膜上組成。TCR鏈中之每一者具有N端可變(V)域、連接域及連接至跨膜域之恆定(C)域,該跨膜域將受體錨定於T淋巴球質膜中。α鏈及β鏈之恆定域之長度分別為91個及129個胺基酸殘基。α鏈之連接及跨膜域之長度為30個及17個胺基酸殘基(amino acid residue;AAR),且β鏈之連接及跨膜域之長度為21個及22個AAR。T受體可變域之長度在104個至125個AAR之間變化。
T淋巴球之小部分具有γ/δ型T受體。其排列類似於α/β受體,但在其一級結構方面不同且具有多個功能特徵。其展現非常低之變異性(受限之純系特異性),其識別具有「非經典」(非MHC)抗原呈遞分子之複合物中之抗原或甚至游離抗原。
T受體經由其六個決定互補區域(CDR)與MHC/抗原複合物反應:三個α鏈區及三個β鏈區。此等CDR為高變區、T細胞受體之可變域之環、Vα及Vβ。
術語「TRBV9」或「TRBV9家族」係指T細胞受體之β鏈的第九家族,當根據IMGT命名法區別時,其特徵在於其可變域之胺基酸序列包含CDR1(胺基酸序列為S-G-D-L-S)及CDR2(胺基酸序列為Y-Y-N-G-E-E)之獨特基序。術語「TRBV9家族TCR」係指其β鏈屬於TRBV9家族之T細胞受體。
關於T淋巴球或TCR之術語「病理性」意謂此類TCR或攜帶T淋巴球之TCR與疾病或病理相關及/或引起疾病及/或促使疾病之發展。
關於TCR之術語「自體免疫」意謂此類TCR參與自體免疫疾病之發展。
如本文中所使用之術語「抗體」意欲指代由二硫鍵連接之四個多肽鏈(兩個重(H)鏈及兩個輕(L)鏈)組成之免疫球蛋白分子。將輕鏈分類為κ或λ。將重鏈分類為γ、μ、α、δ或ε;其分別決定諸如IgG、IgM、IgA、IgD及IgE之抗體同型,且其中之若干者可進一步劃分成子類(同型),例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2。各重鏈型之特徵為特定恆定區。
各重鏈包含重鏈可變區(本文中縮寫為HCVR或VH)及重鏈恆區。重鏈恆定區包含三個域CH1、CH2及CH3。各輕鏈包含輕鏈可變區(本文中縮寫為LCVR或VL)及輕鏈恆定區。輕鏈恆定區包含一個域CL。VH及VL區可進一步細分成高變區,稱為互補決定區(complementarity determining region;CDR),其由稱為構架區(framework region;FR)之更保守區包圍。各VH及VL由自胺基端至羧基端按以下次序排列之三個CDR及四個FR組成:FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。
在本申請案中,3個重鏈CDR被稱作「HCDR1、HCDR2及HCDR3」,而3個輕鏈CDR被稱作「LCDR1、LCDR2及LCDR3」。CDR含有與抗原特異性地相互作用之殘基之大部分。除非另外陳述,否則根據本發明之抗體的HCVR及LCVR內之CDR胺基殘基按照熟知之Kabat編號方案編號及定位。除非另外陳述,否則本申請案包括胺基酸之習知字母代碼。
術語「抗TRBV9抗體」、「針對TRBV9之抗體」、「特異性結合至TRBV9家族β鏈之抗體」及「針對TRBV9家族β鏈之抗體」在本申請案之上下文中可互換且係關於特異性結合至人類T細胞受體之TRBV9家族β鏈之抗原決定基的抗體。
另外,如本申請案中所使用之「單株抗體」可為單鏈Fv片段,其可藉由將編碼LCVR及編碼HCVR之DNA結合至連接子序列來獲得(參見Pluclkthun,The Pharmacology of Monoclonal Antibodies,第113卷,Rosenburg and Moore編,Springer-Verlag,New York,第269-315頁,1994)。
預期無論是否提及片段或部分,如本申請案中所使用之術語「抗體」包括此等片段或部分以及單鏈形式。只要蛋白質保持其特異性或較佳結合其目標(例如,抗原決定基或抗原)之能力,則其由術語「抗體」涵蓋。抗體可經醣基化或不經醣基化且仍在本發明之範疇內。
出於本申請案之目的,術語「抗體」及「單株抗體」係指針對TRBV9家族TCR之單株抗體。如本文中所使用,除非另外陳述,否則「單株抗體」係關於嚙齒動物、靈長類動物或駱駝科(Camelidae)家族之抗體,較佳地係關於鼠類、猴、駱駝或駱馬抗體、嵌合抗體、人類化抗體或完全人類抗體。
「單株抗體」之群體係指同源或實質上同質之抗體群體(亦即,群體中至少約85、90、91、92、93、94、95、96%,更佳地至少約97或98%或甚至更佳地至少99%之抗體將在ELISA中競爭相同抗原/抗原決定基,或更佳地抗體就其胺基酸序列而言為一致的)。抗體可經醣基化或不經醣基化,但仍在本發明之範疇內。若單株抗體具有一致之胺基酸序列,則其可為同源的,雖然其可能在轉譯後修飾方面不同,例如醣基化模式。
每對輕/重鏈之可變區形成抗體之抗原結合位點。如本申請案中所使用,「抗原結合部分」或「抗原結合區」或「抗原結合域」或「抗原結合位點」可互換地係關於包含胺基酸殘基之抗體分子之此部分,該等胺基酸殘基與抗原相互作用且得到關於抗原之抗體特異性及親和力。抗體之此部分包括維持抗原結合殘基之適當構形所需要之「構架」胺基酸殘基。
如本文中所使用,術語「人類抗體」係指其中可變域及恆定域之序列衍生自人類序列之抗體。根據本發明之人類抗體可包括並非人類典型之胺基酸殘基(例如,藉由活體外未定向或位點特異性突變誘發或活體內體細胞突變引入之突變),例如在CDR中且尤其在CDR3中。
術語「人類化」在關於抗體使用時用於指代抗體,其特徵為存在人類樣恆定區及結構組分,但具有係其他來源之免疫球蛋白或經修飾抗體之對應片段典型的互補決定區(CDR)。
如本申請案中所使用,「親本」抗體為由用於獲得變體之胺基酸序列編碼之抗體。親本抗體可來自嚙齒動物、駱馬、嵌合、人類化或
人類抗體。
關於抗體之術語「人類化程度」用於指人類化抗體之構架區序列與原始人類接受體構架區之一致性百分比,該原始人類接受體構架區用於產生人類化抗體且可自人類庫獲得。較佳地,本發明之抗體包含構架區,其相對於自人類庫獲得之構架區具有至少80%一致性,通常至少82%,更經常至少83%,例如至少84%或至少85%或至少86%或至少87%一致性。
術語「人類化取代」係指增大抗體或其片段之人類化程度之胺基酸取代。
關於本發明之抗體之術語「嵌合」用於指代其特徵為人類樣恆定區但具有其他來源之可變區的抗體。在此等抗體中,將非人類來源(例如,大鼠來源)之輕鏈及/或重鏈之可變域可操作地連接至人類來源之對應鏈之恆定域。
術語「可操作地連接」或其類似者在用於描述抗體時,係指置放於彼此之物理(共價,除非另外陳述)及功能關係中之多肽序列。在最佳實施例中,與經分離多肽組分之功能特性相比,嵌合分子之多肽組分的功能未經改變。術語「可操作地連接」或其類似者在用於描述核酸時,意謂核酸經共價連接以使得在其連接之點處不存在閱讀框架移位及終止密碼子。如熟習此項技術者顯而易見,編碼包含「可操作地連接」之組分(蛋白質、多肽、連接子序列、蛋白域等)之嵌合蛋白的核苷酸序列由編碼該等組分之片段組成,其中該等片段經共價連接以使得全長嵌合蛋白(例如,本發明之嵌合抗體)在核苷酸序列之轉譯及轉錄期間產生。
如本文中所使用,術語「分離」意謂處於與分子或細胞活體內所處之環境不同的環境中的分子或細胞。
在較佳實施例中,本發明之抗體為重組的,亦即使用重組DNA技術獲得。如本文中所使用,術語「重組抗體」包括藉由重組方式獲得、表現、產生或分離之所有抗體,諸如使用引入至宿主細胞中的重組表現載體表現之抗體,自一組已知之重組、組合人類抗體庫分離之抗體,自人類免疫球蛋白基因轉殖基因的動物分離之抗體(參見例如,Taylor L.D.等人(1992)Nucl.Acids Res.20:6287-6295)。在一些實施例中,重組人
類抗體經受活體外突變誘發(或在使用人類Ig序列之動物轉殖基因時,活體內體細胞突變誘發),且因此重組抗體之VH及VL區的胺基酸序列為雖然衍生自人類生殖系VH及VL序列且與其有關但無法天然存在於活體內人類抗體生殖系基因譜(repertoire)內的序列。
如本申請案中所使用之術語「特異性結合」係指其中特異性結合對之一個成員並不顯著結合至除其特異性結合搭配物以外之分子的情況。術語亦可適用於例如本發明之抗體之抗原結合域對由多個抗原攜載之特定抗原決定基具有特異性的情況下;在此情況下,包含抗原結合域之特異性抗體將能夠特異性結合至攜載該抗原決定基之多種抗原。因此,本發明之單株抗體特異性結合人類T細胞受體之TRBV9家族β鏈的抗原決定基,然而其並不特異性結合其他家族之TCR β鏈及TCR α鏈。
術語「抗原決定基」係指能夠由處於抗體之抗原結合區中之一或多者的抗體識別且結合之分子的彼部分。抗原決定基經常由化學上活性表面分群之分子(諸如胺基酸或糖側鏈)組成,且具有特定三維結構特徵以及特定電荷特徵。
如本文中所使用,術語「抗原決定基」尤其係指動物中,較佳地在哺乳動物(例如小鼠、大鼠或人類)中具有抗原性及/或免疫原性活性的多肽片段。如本申請案中所使用之術語「抗原性抗原決定基」為可特異性結合抗體且可藉由先前技術所熟知之任何技術,例如藉由標準免疫分析來偵測的多肽片段。抗原性抗原決定基不一定為免疫原性的,然而,其可為免疫原性的。如本文中所使用之「免疫原性抗原決定基」定義為誘發動物中之抗體反應之多肽片段,如藉由先前技術已知之任何方法來測定。「非線性抗原決定基」或「構形抗原決定基」包含結合至抗原決定基特異性抗體之抗原蛋白質內之非相鄰多肽(或胺基酸)。
關於本發明之抗體或其功能片段的短語「生物特性」或「生物特徵」或術語「活性」或「生物活性」在本申請案中可互換使用,且包括(但不限於)抗原決定基/抗原親和力及特異性、中和或拮抗包括屬於TRBV9家族的β鏈之TCR之活性的能力。
抗體之其他可鑑別生物特性包括例如交叉反應(亦即,通常
與目標肽之非人類同源物或與其他蛋白質或組織)及保持哺乳動物細胞中蛋白質表現之高水準的能力。前述特性或特徵可使用此項技術中所認識之技術觀測、量測及/或評估,該等技術包括(但不限於)ELISA、競爭性ELISA、BIACORE或KINEXA表面電漿子共振分析、活體外或活體內抑制分析(但不限制)、受體結合分析、細胞介素或生長因子產生及/或分泌分析以及自各種來源(包括人類、靈長類動物或任何其他來源)獲得的組織切片之信號轉導及免疫組織化學。
如本申請案中所使用之術語「抑制」或「中和」在本發明之抗體活性方面係指對例如受抑制的進展或嚴重程度進行實質上拮抗、壓制、阻止、限制、減緩、擾亂、消除、終止、減少的能力,該進展或嚴重程度包括(但不限於)上述抗體之生物活性或特性、疾病或病狀。
如本文中所使用,術語「突變體」或「變體」係指揭示於本發明中之抗體,其中在N端及/或C端及/或在本發明之抗體或其片段之原生胺基酸序列內添加及/或取代及/或缺失及/或插入一或多個胺基酸。如本文中所使用,術語「突變體」亦係指編碼突變體蛋白質之核酸分子。此外,術語「突變體」係指比蛋白質或核酸更短或更長之任何變體。
術語「同源性」用於描述核苷酸或胺基酸序列與其他核苷酸或胺基酸序列之關係,其藉由正比較之該等序列之間的一致性及/或類似性之程度來判定。
如本文中所使用,若胺基酸或核苷酸序列在選擇用於比較之區域內與指定序列具有至少85%一致性,則胺基酸或核苷酸序列與參考序列「實質上類似」或「實質上相同」。因此,實質上類似序列包括具有例如至少90%一致性、或至少91%一致性、或至少92%一致性、或至少93%一致性、或至少94%一致性、或至少95%一致性、或至少96%一致性、或至少97%一致性、或至少98%一致性或至少99%一致性之彼等。彼此一致的兩個序列亦為實質上類似的。
序列一致性基於參考序列而判定。用於序列分析之演算法為此項技術中已知的,諸如Ye等人Nucleic Acids Res.2013,W34-40中所描述之IgBLAST。出於本發明之目的,為判定核苷酸序列與胺基酸序列之間
的一致性及類似性之水準,核苷酸及胺基酸序列可藉助於由國家生物技術資訊中心(National Center for Biotechnology Information)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/)提供之IgBLAST軟體包,使用具有標準參數之間隙比對來比較。為計算一致性百分比,使用參考序列之全長,例如可變區。
「編碼」多肽之核苷酸序列之參考意謂多肽在mRNA之轉譯及轉錄期間由核苷酸序列產生。因此,可指示與mRNA一致且通常用於序列清單中之編碼鏈及用作轉錄之模板之互補鏈二者。如熟習此項技術者顯而易見,術語亦包括編碼相同胺基酸序列之任何簡併核苷酸序列。編碼多肽之核苷酸序列包括包含內含子之序列。
抗體
如上文所提及,本發明係關於具有特異性結合至人類T受體之TRBV9家族β鏈區之能力的經分離單株人類化抗體及其功能片段。
根據本發明之抗體可為嵌合、人類化或人類抗體或其抗原結合片段,且可用作用於治療其致病機制涉及屬於TRBV9家族之TCR的AS及其他疾病(例如,乳糜瀉或T細胞淋巴瘤)之藥劑。
根據本發明之抗體為單株的。本發明之單株抗體可使用例如此項技術中熟知之融合瘤技術以及重組技術、噬菌體呈現技術、合成技術或此等技術之組合或此項技術中熟知之其他技術來產生。如本申請案中所使用之術語「單株抗體」係指自單個複本或純系(包括例如任何真核、原核或噬菌體純系)而非其產生方法獲得之抗體。
人類化及嵌合抗體可由肽合成或使用如下文「核酸」部分中所描述之重組DNA技術產生。
在一些實施例中,本發明之抗體為嵌合的且其特徵在於其具有非人類來源(例如,大鼠或鼠類來源)之輕鏈及重鏈之可變域及人類來源恆定域。
本發明之抗體包含具有三個高變區之重鏈(VH)可變域
1)HCDR1(根據Kabat編號方案)具有SEQ ID NO:1之胺基酸序
列,
2)HCDR2具有SEQ ID NO:2之胺基酸序列
3)HCDR3具有SEQ ID No 3之胺基酸序列;
2)具有三個高變區LCDR1、LCDR2及LCDR3之輕鏈(VL)可變域,其中:
LCDR 1具有SEQ ID NO:4之胺基酸序列,
LCDR 2具有SEQ ID NO:5之胺基酸序列,
LCDR 3具有SEQ ID NO:6之胺基酸序列。
除非另外特定陳述,否則在下文中使用熟知之Kabat編號方案以測定抗體之CDR。
在所有實施例中,本發明之抗體之輕鏈及重鏈之可變域為人類化的且與人類化胺基酸取代中之親本抗體之彼等不同,其中與親本者相比,抗體之重鏈及輕鏈之可變域包含重鏈及輕鏈之可變域的FR片段中之胺基酸取代,從而增大抗體之人類化程度。
在一些實施例中,與親本抗體之重鏈可變域(其胺基酸序列展示於SEQ ID No 8中)相比,本發明之抗體之重鏈可變域包含至少10個人類化胺基酸取代。
在較佳實施例中,本發明之抗體之重鏈可變域具有展示於SEQ ID No:16中之胺基酸序列。
在一些實施例中,本發明之抗體之重鏈可變域包含並未更改抗體特異性之其他胺基酸取代。
在一些實施例中,與親本抗體之輕鏈可變域(其胺基酸序列展示於SEQ ID No 10中)相比,本發明之抗體之輕鏈可變域包含至少10個人類化胺基酸取代。
在較佳實施例中,本發明之抗體之輕鏈可變域包含胺基酸取代,且具有展示於SEQ ID NO 18中之序列。
在一些實施例中,本發明之抗體之輕鏈可變域包含並未更改抗體特異性之其他胺基酸取代。
在一些實施例中,本發明之單株抗體為全長人類IgG抗體,
例如IgG1或IgG2或IgG3或IgG4。
在一些實施例中,本發明之抗體包括重鏈,其胺基酸序列與SEQ ID NO:20之胺基酸序列至少85%一致;或至少90%一致;或至少91%一致;或至少92%或至少93%一致;或至少94%、或至少95%、或至少96%、或至少97%、或至少98%或至少99%或100%一致。
在一些實施例中,本發明之抗體包括輕鏈,其胺基酸序列與SEQ ID NO:22之胺基酸序列至少85%一致;或至少90%一致;或至少91%一致;或至少92%或至少93%一致;或至少94%、或至少95%、或至少96%、或至少97%、或至少98%或至少99%或100%一致。
在一些實施例中,抗體具有輕鏈,其胺基酸序列展示於SEQ ID NO:22中;及重鏈,其胺基酸序列展示於SEQ ID NO:20中。
如自先前技術所已知,可將突變引入至抗體序列(包括可變域)中,此並未實質上更改結合至抗原之抗體能力。根據本發明之抗體亦可含有其他突變,其並未導致結合TCR之TRBV9家族β鏈之抗體能力之損失,但可導致抗體依賴性細胞介導的細胞毒性減少或抗體之親和力或其他生物特性增加。詳言之,自先前技術所熟知,可在抗體序列中進行保守胺基酸取代。「保守取代」在本申請案之上下文中係指其中胺基酸殘基經具有類似側鏈之另一胺基酸殘基置換的取代。具有類似側鏈之胺基酸殘基之家族為此項技術中熟知的,該等類似側鏈包括:鹼性側鏈(例如,離胺酸、精胺酸、組胺酸)、酸性側鏈(例如,天冬胺酸、麩胺酸)、非帶電極性側鏈(例如,甘胺酸、天冬醯胺、麩醯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、半胱胺酸)、非極性側鏈(例如,丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、甲硫胺酸、色胺酸)、β分支鏈側鏈(例如,蘇胺酸、纈胺酸、異白胺酸)及芳族側鏈(例如,酪胺酸、苯丙胺酸、色胺酸、組胺酸)。較佳地,VL及/或VH域中之CDR3區包括不超過五個保守胺基酸取代,更經常不超過三個保守取代。通常,在對結合TRBV9家族β鏈之抗原決定基具有決定性之胺基酸位置處不進行保守取代。
根據本發明之抗體之上述變體(突變體)可藉由肽合成或使用如下文「核酸」部分中所描述之重組DNA技術來獲得。
在較佳實施例中,抗體包含重鏈之恆定區,諸如人類IgG1、IgG2、IgGS、IgG4、IgA、IgE、IgM、IgD之恆定區。較佳地,重鏈恆定區為人類IgG1重鏈恆定區。此外,抗體可包含輕鏈恆定區或輕鏈κ恆定區或輕鏈λ恆定區。較佳地,抗體包含輕鏈κ恆定區。
在較佳實施例中,抗體重鏈可變片段之特徵為87%之人類化程度。在較佳實施例中,抗體輕鏈可變片段之特徵為85%之人類化程度。
亦提供本發明之抗體之抗原結合片段。如本文中所使用,抗體(或「抗體之功能片段」或「抗體之活性片段」)的術語「抗原結合片段」係指保持特異性結合抗原之能力的一或多個抗體片段。已展示,抗體之抗原結合功能可由全長抗體之片段執行。抗體之術語「抗原結合部分」內所涵蓋之結合片段的實例包括:(a)Fab片段,由VL、VH、CL及CH1域組成之單價片段;(b)F(ab)2片段,包含在鉸鏈區經二硫橋鍵連接之兩個Fab片段的二價片段;(c)Fd片段,由VH及CH1域組成;(d)Fv片段,由抗體之單臂之VL及VH域組成;(e)dAb片段(Ward等人(1989)Nature 341:544-546),由VH域組成及(f)經分離之互補決定區(CDR)。此外,雖然Fv片段之兩個域VL及VH由獨立基因編碼,但其可使用重組方法,藉由合成連接子連接,使得其能夠成為單個蛋白質鏈,其中VL及VH區配對以形成單價分子(已知為單鏈Fv(scFv);參見例如,Bird等人(1988)Science 242:423-426;Huston等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883)。亦預期此等單鏈抗體涵蓋於抗體之術語「抗原結合部分」內。其亦包括其他形式之單鏈抗體,諸如雙功能抗體。雙功能抗體為二價雙特異性抗體,其中VH及VL域表現於單個多肽鏈上,但使用太短而不允許同一鏈上之兩個域之間進行配對的連接子,藉此迫使該等結構域與另一鏈之互補域配對且產生兩個抗原結合位點(參見例如,Holliger P.等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448;Poljak R.J.等人(1994)Structure 2:1121-1123)。
諸如Fab和F(ab')2之抗體片段可由全抗體,使用習知技術,諸如對全抗體分別進行木瓜蛋白酶或胃蛋白酶消化來獲得。此外,抗體、抗體片段及免疫黏附分子可使用標準重組DNA技術獲得。
抗體或其抗原結合部分可為藉由抗體或抗體片段與一或多種蛋白質或肽共價或非共價締合而形成的較大免疫黏附分子之一部分。此等免疫黏附分子之實例包括使用抗生蛋白鏈菌素(streptavidin)核心區製備四聚scFv分子(Kipriyanov S.M.等人(1995)Human Antibodies and Hybridomas 6:93-101)及使用半胱胺酸殘基、標記物肽及C端聚組胺酸標籤製備二價及大小縮減之scFv生物分子(Kipriyanov S.M.等人(1994)Mol.Immunol.,31:1047-1058)。抗體片段之間的其他化學鍵亦自當前技術而熟知。
根據本發明之抗體及其功能片段以分離形式存在,亦即此意謂此蛋白質實質上不含存在之其他蛋白質或其他天然存在之生物分子,諸如寡醣、核酸及其片段等,其中術語「實質上不含」在此情況下意謂小於70%,通常小於60%,且更經常小於50%的包含經分離蛋白質之該組合物為其他天然存在之生物分子。在一些實施例中,該等蛋白質以實質上純化形式存在,其中術語「實質上經純化形式」意謂純度等於至少95%,通常等於至少97%,且更經常等於至少99%。
用於純化由重組或融合瘤技術獲得之抗體的方法為此項技術中所熟知的,舉例而言,純化可由層析法(例如,離子交換層析法、親和性層析法(尤其針對特異性抗原蛋白A或蛋白G之親和力)及篩分管柱層析法)、離心、差異性溶解度或用於純化蛋白質之任何其他標準技術執行。此外,可將根據本發明之技術獲得之抗體或其片段融合至異源多肽序列(例如,組胺酸標籤)以促進純化。
抗體親和力可藉由測定解離常數(dissociation constant;KD),使用標準分析來測定。KD使用方程式KD=kdis/kon來計算,其中kdis為以實驗方式計算之解離速率常數且kon為以實驗方式計算之抗體-抗原複合物的締合速率常數。
較佳抗體為結合人類抗原之彼等,其中KD值不大於約1×10-7M;較佳地不大於約1×10-8M;更經常不大於約1×10-9M;更佳地不大於約1×10-10M,且最佳地不大於約1×10-11M,例如不大於約1×10-12M。
較佳抗體包括詳細地描述於下文實驗部分中之抗體
MA-042。
可用於本發明組合物及方法中之抗體及其片段為生物活性抗體及片段,亦即,其能夠結合所需抗原性抗原決定基且直接地或間接地展現生物效應。
根據本發明之抗體及其功能片段能夠特異性結合TRBV9家族β鏈之抗原決定基(區域)。在較佳實施例中,由於其與TRBV9家族之β鏈之特異性結合,抑制包括該β鏈之TCR之活性。通常,抑制較佳地相當於至少約20、或30、或40、或50、或60、或70、或80、或90、或95%或更高。
在一些實施例中,針對根據本發明之TRBV9家族β鏈的抗體或其片段可消除攜帶包含TRBV9家族β鏈之TCR之T細胞。在一些實施例中,根據本發明之抗體或其片段可提供T淋巴球之至少約20%、至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%或約100%消除。
在本發明之一較佳實施例中,抗體為抗體MA-042。
抗體MA-042包括重鏈及輕鏈之可變域,其具有展示於SEQ ID NO:16及18中之胺基酸序列。
抗體MA-042包括重鏈及輕鏈,其分別具有展示於SEQ ID NO:20及22中之胺基酸序列。
核酸
本發明提供編碼本發明之抗體之重鏈及輕鏈、其功能片段及可變域的核酸分子,其可用於獲得包括與人類抗體之已知恆定域可操作地融合之本發明的可變域之嵌合抗體。
在較佳實施例中,本發明之核酸編碼抗體重鏈,其可變域含有3個高變區HCDR1、HCDR2及HCDR3,其中
HCDR1(根據Kabat編號方案)具有SEQ ID No 1之胺基酸序列;
HCDR2具有SEQ ID No 2之胺基酸序列;
HCDR3具有SEQ ID No 3之胺基酸序列。
在較佳實施例中,本發明之核酸編碼抗體輕鏈,其可變域包含3個高變區LCDR1、LCDR2及LCDR3,其中:
LCDR1具有SEQ ID No 4之胺基酸序列;
LCDR2具有SEQ ID No 5之胺基酸序列;
LCDR3具有SEQ ID No 6之胺基酸序列。
在較佳實施例中,本發明之核酸編碼抗體重鏈及輕鏈可變域,其與親本者相比,含有重鏈及輕鏈之可變域之FR片段中之胺基酸取代,此增大抗體之人類化程度。
編碼該等抗體鏈之同源物及突變體之核酸分子、其功能片段及結構域亦在本發明之範疇內。
在一些實施例中,核酸編碼本發明之抗體之重鏈可變域,該可變域與親本抗體之重鏈可變域(其胺基酸序列展示於SEQ ID No 8中)相比,含有至少10個人類化胺基酸取代。
在一些實施例中,核酸編碼抗體重鏈,其可變域具有SEQ ID No:16之胺基酸序列。
在一些實施例中,核酸編碼抗體輕鏈,該抗體輕鏈之可變域與親本抗體之輕鏈可變域(其胺基酸序列展示於SEQ ID No 10中)相比,包含至少10個人類化胺基酸取代。
在一些實施例中,核酸編碼抗體輕鏈,其可變域具有SEQ ID No:18之胺基酸序列。
在一些實施例中,核酸編碼抗體重鏈,其胺基酸序列與SEQ ID NO:20之胺基酸序列至少85%一致;或至少90%一致;或至少91%一致;或至少92%或至少93%一致;或至少94%、或至少95%、或至少96%、或至少97%、或至少98%或至少99%或100%一致。
在一些實施例中,核酸編碼抗體輕鏈,其胺基酸序列與SEQ ID NO:22之胺基酸序列至少85%一致;或至少90%一致;或至少91%一致;或至少92%或至少93%一致;或至少94%、或至少95%、或至少96%、或至少97%、或至少98%或至少99%或100%一致。
編碼本發明之輕鏈及重鏈之核酸的實例展示於SEQ ID No:
19及21中。
編碼抗體之輕鏈及重鏈之可變域的核酸亦受關注。編碼抗體之輕鏈及重鏈之可變域的核酸可用於與編碼抗體之對應恆定域之核酸可操作性融合。
在一些實施例中,核酸編碼抗體之重鏈之可變域,其胺基酸序列展示於SEQ ID No:16中。
在一些實施例中,核酸編碼抗體之輕鏈之可變域,其胺基酸序列展示於SEQ ID No:18中。
編碼抗體之重鏈及輕鏈之可變域的核酸之實例展示於SEQ ID No:15及17中。
如本文中所使用,「核酸分子」或「核酸」為DNA分子,諸如基因體DNA分子或cDNA分子;或RNA分子,諸如mRNA分子。在一些實施例中,本發明之核酸分子為含有開放閱讀框架之DNA(或cDNA)分子,該開放閱讀框架編碼本發明之抗體或抗體片段且在適合條件(例如,生理胞內條件)下能夠用於在異源表現系統中之表現。
在一些實施例中,本發明之核酸分子藉由基因工程(genetic engineering)方法產生。用於產生核酸之方法為此項技術中所熟知的。舉例而言,胺基酸序列資訊或核苷酸序列資訊之可用性使得能夠藉由寡核苷酸合成而製備本發明之經分離核酸分子。在胺基酸序列資訊之情況下,可合成多個由於簡併譯碼而彼此不同之核酸。選擇用於所需宿主之密碼子變體之方法為此項技術中所熟知的。
合成寡核苷酸可藉由胺基磷酸酯方法製備,且所得構築體可根據此項技術中熟知之方法(諸如高效液相層析法(HPLC))或如例如Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第2版,(1989)Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harbor,NY中所描述之其他方法且在例如美國衛生部(United States Dept.of HHS),National Institute of Health(NIH)Guidelines for Recombinant DNA Research中所描述之指導下來純化。本發明之長雙股DNA分子可以以下方式來合成:藉由合成適當互補之若干較小片段,該等片段包含能夠與相鄰片段黏結之適當末端。相鄰片段
可使用DNA連接酶或基於PCR之方法連接。
本發明之核酸分子亦可自生物源選殖。
本發明亦涵蓋與編碼本發明之多肽的核酸同源、實質上相同、一致或自其衍生之核酸。
本發明之核酸存在於除其天然存在之環境以外的環境中,舉例而言,其經分離,以增加之量存在,呈現或表現於活體外系統中或於除其天然存在之彼等以外的細胞或生物體中。
緊密相關核酸序列之間的核苷酸序列之變化或差異可表示在正常複製(replication/duplication)之過程期間出現之序列中之核苷酸變化。出於特定目的,其他變化可經專門設計且引入至序列中,以便改變調節區中之特定胺基酸或核苷酸序列之密碼子。此等特定變化可使用各種突變誘發技術來活體外進行或在置放於誘導或選擇此等變化之特定選擇條件下的宿主生物體中產生。此類專門獲得之序列變體可稱為初始序列之「突變體」或「衍生物」。
突變或衍生核酸可在選自上述核酸之模板核酸上,藉由模板序列中之一或多種核苷酸之修飾、缺失或添加或其組合來獲得,以獲得模板核酸之變體。修飾、添加或缺失可由此項技術中已知之任何方法執行(參見例如,Gustin等人,Biotechniques(1993)14:22;Barany,Gene(1985)37:111-123;及Colicelli等人,Mol.Gen.Genet.(1985)199:537-539、Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,(1989),CSH Press,第15.3-15.108頁),該等方法包括易錯PCR、改組(shuffling)、寡核苷酸定向之突變誘發、組裝PCR、有性PCR突變誘發、活體內突變誘發、卡匣突變誘發、遞歸整合突變誘發(recursive ensemble mutagenesis)、指數整合突變誘發(exponential ensemble mutagenesis)、位點特異性突變誘發、隨機突變誘發、基因重組裝、基因位點飽和突變誘發(gene site saturated mutagenesis;GSSM)、合成連接重裝(synthetic ligation reassembly;SLR)或其組合。修飾、添加或缺失亦可藉由包含以下之方法執行:重組、遞歸序列重組、硫代磷酸酯修飾之DNA突變誘發、含有尿嘧啶之模板突變誘發、有間隙之雙重突變誘發(gapped duplex mutagenesis)、位點錯配修復突
變誘發(point mismatch repair mutagenesis)、修復缺陷型宿主菌株突變誘發(repair-deficient host strain mutagenesis)、化學突變誘發、放射突變誘發、缺失突變誘發、限制選擇之突變誘發(restriction-selection mutagenesis)、限制純化突變誘發(restriction-purification mutagenesis)、人工基因合成、整合突變誘發、嵌合核酸多聚體生成(chimeric nucleic acid multimer creation)及其組合。
亦提供編碼本發明之蛋白質之核酸之簡併變體。核酸之簡併變體包括具有編碼相同胺基酸之其他密碼子的核酸之密碼子之替代物。詳言之,產生核酸之簡併變體以增大宿主細胞中之表現。在此實施例中,在宿主細胞中之基因中為不佳或不太佳的核酸密碼子經宿主細胞中基因中之編碼序列中過度表示的密碼子置換,其中該等經置換密碼子編碼相同胺基酸。
上述修飾並未實質上更改抗體或其功能片段之特性,但可有助於宿主細胞中之蛋白質摺疊,降低聚集能力或調節蛋白質之其他生物化學特性,例如半衰期時段。在一些實施例中,此等修飾並未改質蛋白質之生物化學特性。在一些實施例中,此等修飾導致抗體免疫原性降低。在核酸水準下執行上文所指定之所有類型之修飾及突變。
所揭示之核酸可以實質上純化形式分離及製備。實質上純化形式意謂核酸為至少約50%純度,通常至少約90%純度且通常為「重組的」,亦即由一或多種核苷酸側接,其通常不藉此與本質上發生在其自然宿主生物體中之染色體締合。
亦提供編碼包含本發明之蛋白質之融合蛋白的核酸或其片段,其更詳細地論述於下文中。編碼本發明之可變域之核酸可可操作地連接至編碼抗體之輕鏈及重鏈的對應恆定域之核酸。編碼抗體之輕鏈及重鏈之核酸可可操作地連接至編碼有助於轉運來自宿主細胞之表現產物的前導肽之核酸。前導肽隨後在多肽之成熟期間經移除。
載體
亦提供一種載體及包含所揭示之核酸之其他核酸構築體。術語「載體」
係指能夠轉運與其可操作地連接之另一核酸的核酸分子。某些載體可在將其引入之宿主細胞中自主地複製,而其他載體可整合至宿主細胞基因組中且與宿主基因組一起複製。此外,一些載體能夠引導與其可操作地連接之基因的表現。此等載體在本文中稱為「重組表現載體」(或簡稱「表現載體」)且說明性載體自先前技術所熟知。適合之載體包括病毒及非病毒載體、質體、黏質體、噬菌體等,較佳地質體,且用於將本發明之核酸序列選殖、擴增、表現、轉移等至適當宿主中。適當載體之選擇為熟習此項技術者顯而易見的。全長核酸或其部分通常藉助於DNA連接酶連接至載體中之裂解限制酶位點而插入至載體中。替代地,所需核苷酸序列可藉由活體內同源重組,通常藉由將同源區連接至所需核苷酸序列之側面上之載體來插入。同源區藉由連接寡核苷酸或藉由聚合酶鏈反應,使用包含例如同源區及所需核苷酸序列之一部分二者的引子來添加。通常,載體具有由於將其作為染色體外元件引入至細胞中而確保其在宿主細胞中之繁殖的複製起點。載體亦可包含確保核酸於宿主細胞中之表現及目標多肽之產生的調節元件。在表現載體中,該核酸可操作地連接至可包括啟動子、強化子、終止子、操縱子、抑制因子及誘導物之調節序列以及多肽之起始密碼子。在一些實施例中,本發明之核酸進一步可操作地連接至確保表現產物自宿主細胞分離至細胞外空間中之前導肽。
亦提供所使用之表現卡匣或系統,其尤其用於基於其上來獲得所揭示之多肽(例如,本發明之抗體之輕鏈及重鏈或本發明的抗體之輕鏈及重鏈之可變域)或用於複製所揭示之核酸分子。表現卡匣可以染色體外元件之形式存在或可由於將該表現卡匣引入至細胞中而整合至細胞基因組中。對於表現,由本發明之核酸編碼之蛋白質產物表現於任何適宜表現系統中,該表現系統包括例如細菌系統、酵母、昆蟲、兩棲動物或哺乳動物細胞。在表現卡匣中,目標核酸可操作地連接至可包括啟動子、強化子、終止序列、操縱子、抑制因子及誘導物之調節序列以及多肽之起始密碼子。在一些實施例中,本發明之核酸進一步可操作地連接至確保表現產物自宿主細胞分離至細胞外空間中之前導肽。獲得能夠表現所需產物之表現卡匣或系統之方法為熟習此項技術者所已知。
宿主細胞
上述表現系統可用於原核或真核宿主中。宿主細胞,諸如大腸桿菌(E.coli)、枯草芽孢桿菌(B.subtilis)、釀酒酵母(S.cerevisiae)、與桿狀病毒載體組合之昆蟲細胞或並非人類胚胎細胞(諸如酵母、植物、脊椎動物)之高等生物體之細胞,例如CHO細胞(例如ATCC CRL-9096)、NS0細胞、SP2/0細胞、HEK293細胞、COS細胞(例如ATCC CRL-1650、CRL-1651)及HeLa(例如ATCC CCL-2)可用於獲得蛋白質。
為產生本發明之抗體,宿主細胞與包含編碼抗體輕鏈之核酸的表現載體及包含編碼抗體重鏈之核酸的表現載體共轉化。在一些實施例中,使用單個表現載體,將編碼抗體之輕鏈及重鏈二者之核酸引入至該表現載體中。
對於輕鏈及重鏈之表現,將編碼重鏈及輕鏈之表現載體轉化(共轉化)至宿主細胞中以使得輕鏈及重鏈表現於宿主細胞中且較佳地分泌至培養基中,在該培養基中培養宿主細胞並且抗體可自該培養基分離。術語「轉化」之多種解釋意欲包括常用於將外源DNA引入至原核或真核宿主細胞中之廣泛範圍的方法,舉例而言,如以下中所描述之電穿孔、磷酸鈣沈澱、DEAE-聚葡萄糖轉染等:Sambrook,Fritsch及Maniatis(編)Molecular Cloning;A Laboratory Manual,第二版,Cold Spring Harbor,N.Y.(1989);Ausubel F.M.等人(編)Current Protocols in Molecular Biology,Green Publishing Associates(1989)。
當將含有抗體之核酸之重組表現載體引入至宿主細胞中時,抗體藉由培養宿主細胞持續足以將抗體表現於宿主細胞中或(更佳地)將抗體分泌至培養基(宿主細胞生長於其中)中的時間段來獲得。抗體可使用標準蛋白質純化技術自培養基分離。細胞培養條件為熟習此項技術者所熟知,且描述於2000年由John Wiley & Sons,Inc.公佈之Current Protocols in Cell Biology,Bonifacino J.S.,Dasso M.,Harford J.B.,Lippincott-Schwartz J.及Yamada K.M.(編)中。
若使用上述宿主細胞或適用於複製及/或表現本發明之核酸
的其他宿主細胞或生物體中之任一者,則所得經複製核酸、經表現蛋白質或多肽作為宿主細胞或生物體之產物在本發明之範疇內。產物可由此項技術中已知之適合技術分離。
穩定表現本發明之蛋白質的細胞株可藉由此項技術中已知之方法(例如具有可選標記物(諸如dhfr、gpt、新黴素(neomycin)、潮黴素(hygromycin))之共轉染,其允許鑑別且分離含有整合至基因組中之基因的經轉染細胞)來選擇。
本發明之核酸分子亦可用於測定生物樣品中之基因表現。檢查存在特定核苷酸序列(諸如基因體DNA或RNA)之細胞之方法明確於此項技術中。簡言之,DNA或mRNA自細胞樣品分離。mRNA可藉由RT-PCR,使用逆轉錄酶以形成互補DNA鏈,接著使用對個體DNA序列具有特異性之引子進行聚合酶鏈反應擴增來擴增。替代地,mRNA樣品藉由凝膠電泳分隔開,轉移至適合載劑(例如硝化纖維、耐綸等),且隨後用作為探針之個體DNA之片段來探測。亦可使用其他技術,諸如寡核苷酸連接分析、原位雜交及固定於固態晶片上之DNA探針的雜交。偵測與個體序列雜交之mRNA指示樣品中之基因表現。
本發明之抗體之醫療用途
在一個態樣中,本發明之抗體或其活性片段用於治療與攜帶表面TRBV9家族TCR之病理性T淋巴球之活性相關的病症,例如展現自體免疫T淋巴球於AS、乳糜瀉、T細胞淋巴瘤中之活性。
如本申請案中所使用,術語「患者」係指包括(但不限於)小鼠、猴、人類、家畜哺乳動物、運動哺乳動物及寵物哺乳動物之哺乳動物;較佳地,術語適用於人類。在一特定實施例中,患者之其他特徵為由其體內存在之TCR(其β鏈屬於TRBV9家族)介導之疾病或病症或病狀。如自先前技術所已知,其β鏈屬於TRBV9家族之TCR與AS及乳糜瀉相關。此外,其β鏈屬於TRBV9家族之TCR可能與多種血液疾病(諸如由埃-巴二氏病毒所引起之T細胞淋巴瘤)之發展相關。
如本文中所使用,關於抗體與一或多種其他治療劑之術語
「共投與(co-administration/co-administered)」及「組合」預期意謂、係指且包括以下:
1)向需要治療之患者同時投與本發明之抗體及治療劑之此組合,此時將此等組分一起調配成單一劑型,該單一劑型在實質上同一時間釋放該等組分至該患者,
2)向需要治療之患者同時投與本發明之抗體及治療劑之此組合,此時將此等組分彼此分開調配成各別劑型,該等各別劑型在實質上同一時間由該患者服用,隨後該等組分在實質上同一時間釋放至該患者,
3)向需要治療之患者依序投與本發明之抗體及治療劑之此組合,此時將此等組分彼此分開調配成各別劑型,該等各別劑型由該患者服用連續次,每次投與之間具有顯著時間間隔,隨後該等組分在實質上不同之時間釋放至該患者;以及
4)向需要治療之患者依序投與本發明之抗體及治療劑之此組合,此時將此等組分一起調配成以受控方式釋放該等組分之單一劑型,隨即其在同一時間及/或不同時間同時、連續及/或重疊地釋放至該患者,其中各部分可藉由相同或不同途徑投與。
可投與本發明之抗體而無需進一步治療性治療,亦即作為獨立療法。此外,利用本發明之抗體之治療可包含至少一種額外治療性治療(組合療法)。在本發明之一些實施例中,抗體可與另一藥劑/藥物共投與或調配以用於自體免疫或致癌疾病(其致病機制涉及包含TRBV9 β鏈之TCR),例如AC、乳糜瀉、T細胞淋巴瘤、T細胞白血病。
投與之劑量及途徑
本發明之抗體將以有效治療所討論之病狀的量,亦即在達成所需結果所需之劑量下及在其時間段內投與。治療有效量可根據以下因素,諸如待治療之特定病狀、患者之年齡、性別及重量以及抗體是單獨或與一或多種額外免疫抑制或抗炎性治療技術組合投與而變化。
可調整給藥方案以提供最佳反應。舉例而言,可投與單個大丸劑,可隨著時間推移投與若干分次劑量,或可如治療情況之緊急狀態所
指示而按比例減少或增加劑量。就容易投與及劑量之均一性而言,將非經腸組合物調配成單位劑型尤其有利。如本文中所使用之標準劑型意欲指適合作為待治療之患者/個體之單位劑量的物理離散單位;各單位含有經計算以產生所需治療效果之預定數量的與所需醫藥載劑結合之活性化合物。本發明之標準劑型之規格通常藉由以下指示且直接取決於:(a)化學治療劑之獨特特徵及待實現之特定治療或預防效果;及(b)混配用於治療個體之敏感性的此類活性化合物之技術中所固有的限制。
因此,熟習此項技術者應瞭解,基於本文中所提供之揭示內容,根據治療技術中熟知之方法調整劑量及給藥方案。亦即,可容易確定最大可耐受劑量,且亦可測定向患者提供可偵測治療益處之有效量,亦可測定投與各試劑以向患者提供可偵測治療益處的暫時需求。因此,雖然一些劑量及療程方案作為實例既定於本文檔中,但此等實例決不限制本發明之實踐中患者可能必需之投藥劑量及療程。
應注意,劑量值可隨待減輕之病狀的類型及嚴重程度而變化,且可包括單次或多次劑量。此外,應理解,針對任何特定個體,特定給藥方案應根據個別需要及投與或監督組合物投與之醫療專業人員的判斷而隨時間調整,且本文中所闡述之劑量範圍僅為例示性的並且不意欲限制所主張之組合物的範疇或實踐。此外,具有本發明之組合物之給藥方案可基於多種因素,包括疾病之類型、年齡、重量、性別、患者之健康狀況、病狀之嚴重程度、投與途徑及所使用之特定抗體。因此,給藥方案可廣泛變化,但可使用標準方法常規地測定。舉例而言,可基於藥物動力學或藥效學參數調整劑量,該等參數可包括臨床效果,諸如毒性效果及/或實驗值。因此,本發明涵蓋如熟習此項技術者所測定之患者內劑量遞增。用於確定適當劑量及療程之方法為此項技術中所熟知,且在提供本文中所揭示之構思時為熟習此項技術者所理解。
上文提供適合投藥方法之實例。
預期本發明之抗體之適合劑量將在0.1至200mg/kg,較佳地0.1至100mg/kg之範圍內,包括約0.5至50mg/kg,例如約1至20mg/kg。抗體可以例如至少0.25mg/kg,諸如至少0.5mg/kg,包括至少1mg/kg,例
如至少1.5mg/kg,諸如至少2mg/kg,例如至少3mg/kg,包括至少4mg/kg,例如至少5mg/kg;且例如至多50mg/kg之最大值,包括至多30mg/kg之最大值,例如至多20mg/kg之最大值,包括至多15mg/kg之最大值的劑量投與。將通常以適當之時間間隔重複投藥,諸如一週一次、每兩週一次、每三週一次或每四週一次,且只要負責醫師認為適當,則必要時,其可在一些情況下增加或減少劑量。
醫藥組合物
本發明之抗體可併入適用於向患者投與之醫藥組合物中。本發明之抗體可單獨或與醫藥學上可接受之載劑、稀釋劑及/或賦形劑組合投與單次或多次劑量。用於投與之醫藥組合物經設計以適合於所選之投與模式,且視需要使用醫藥學上可接受之稀釋劑、載劑及/或賦形劑,諸如分散劑、緩衝液、界面活性劑、防腐劑、助溶劑、等張劑、穩定劑及其類似者。根據如在例如提供如從業者通常已知之用於獲得組合物的多種技術之Remington,The Science and Practice of Pharmacy,第19版,Gennaro編,Mack Publishing Co.,Easton,PA 1995中之習知技術來設計該等組合物。
「醫藥(藥物)」為作為醫藥組合物之化合物或化合物混合物,其呈以下形式:錠劑、膠囊、散劑、凍乾物、注射液、輸注液、軟膏以及意欲用於恢復、改善或修改人類及動物之生理功能且亦用於疾病之治療及預防、診斷、麻醉、避孕、美容學及其他目的的其他即用形式。此項技術中認可之用於投與肽、蛋白質或抗體之任何方法可適合地用於本發明之抗體。
術語「醫藥學上可接受」係指適用於投與哺乳動物(較佳地人類)的一或多種相容性液體或固體組分。
術語「賦形劑」在本文中用於描述除本發明之上述成分以外的任何成分。為賦予藥品必需之物理化學特性,此等為醫藥製造時所使用之具有無機或有機性質的物質。
術語「緩衝液(buffer)」、「緩衝液組合物」、「緩衝劑(buffering agent)」係指一種溶液,其能夠藉由其酸-鹼結合組分之作用抵抗pH之變
化,且其允許抗體藥物抵抗pH之變化。大體而言,醫藥組合物較佳地具有介於4.0至8.0範圍內之pH。所使用之緩衝液之實例包括(但不限於)乙酸鹽、磷酸鹽、檸檬酸鹽、組胺酸、丁二酸鹽等緩衝溶液。
如本文中所使用,術語「張力劑」、「滲透液」或「滲透劑」係指可增大液體抗體調配物之滲透壓之賦形劑。「等張性」藥物為具有等效於人類血液滲透壓之滲透壓的藥物。等張性藥物通常具有約250至350mOsm/kg之滲透壓。作為等張劑,可使用(但不限於)多元醇、醣類及蔗糖、胺基酸、金屬鹽(例如氯化鈉)等。
「穩定劑」係指提供活性劑之物理及/或化學穩定性之賦形劑或兩種或更多種賦形劑之混合物。作為穩定劑,可使用胺基酸,例如(但不限於)精胺酸、組胺酸、甘胺酸、離胺酸、麩醯胺酸、脯胺酸;界面活性劑,例如(但不限於)聚山梨醇酯20(商標名:Tween 20)、聚山梨醇酯80(商標名:Tween 80)、聚乙烯-聚丙二醇及其共聚物(商標名:泊洛沙姆(Poloxamer)、普洛尼克(Pluronic)、十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate;SDS));抗氧化劑,例如(但不限於)甲硫胺酸、乙醯半胱胺酸、抗壞血酸、單硫代甘油、亞硫酸鹽等;螯合劑,例如(但不限於),乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid;EDTA)、二伸乙基三胺五乙酸(diethylenetriaminepentaacetic acid;DTPA)、檸檬酸鈉等。
若活性劑在所指定之存放期期間、在例如2至8℃之儲存溫度下保持其物理穩定性及/或化學穩定性及/或生物活性,則醫藥組合物為「穩定的」。較佳地,活性劑保持物理及化學穩定性二者,以及生物活性。基於加速或天然老化條件下之穩定性測試結果來選擇儲存時段。
含有本發明之單株抗體之組合物可使用標準投與技術投與至展現如本申請案中所描述之病變的患者,包括經口、靜脈內、腹膜內、皮下、經肺、經皮、肌肉內、鼻內、經頰、舌下或栓劑投與。
本發明之醫藥組合物較佳地含有或為「治療有效量」的本發明之抗體。術語「治療有效量」意欲指在必需劑量下及在必需時間段內有效達成所需治療結果的量。抗體之治療有效量可根據以下因素,諸如個體之疾病狀態、年齡、性別及重量以及抗體或其部分在個體中引發所需反應
的能力而變化。治療有效量亦為抗體之治療有益效果超過任何毒性或有害效果的量。「預防有效量」意欲指代在必需劑量下及在必需時間段內有效達成所需預防結果的量。由於在疾病之初期之前或處於其下規定個體之預防劑量,因此預防有效量通常可小於治療有效量。
治療有效量或預防有效量至少為小於活性劑之毒性劑量之最小治療有益劑量。在另一方面,本發明之抗體之治療有效量為在哺乳動物(較佳地人類)中例如經由結合TCR(其β鏈屬於TRBV9家族)降低自體免疫純系之生物活性的量,其中該等純系之存在引起或有助於非所要病理學效果;或減少TCR(其β鏈屬於TRBV9家族),引起哺乳動物(較佳地人類)中之有益治療效果。
本發明之抗體之投與途徑可為經口、非經腸、吸入或局部。較佳地,本發明之抗體可包括於可接受非經腸投與之醫藥組合物中。如本申請案中所使用之術語「非經腸」包括靜脈內、肌肉內、皮下、經直腸、經陰道或腹膜內投與。靜脈內、腹膜內或皮下注射為較佳投與途徑。用於此等注射之可接受的醫藥學載劑自先前技術中所熟知。
如適當指南中所描述,醫藥組合物應在產生及儲存於容器中之條件下為無菌及穩定的,該容器由例如氣密密封式小瓶(安瓿)或注射器提供。因此,醫藥組合物可在製備組合物之後經受過濾滅菌,或可藉由任何其他技術使其在微生物學上適合。用於靜脈內輸注之典型組合物可包括250至1000ml之流體,諸如無菌林格氏溶液(Ringer's solution)、生理鹽水、右旋糖溶液或漢克氏鹽溶液(Hank's salt solution);及治療有效劑量(例如,1至100mg/ml或更高)之抗體濃縮物。劑量可視疾病類型及嚴重程度而變化。自醫學技術之狀態所熟知,患者中之任一者之劑量視多個因素,包括患者之大小、體表面積、年齡、待投與之特定化合物、性別、持續時間及投與途徑、一般健康狀態及其他同時投與藥療法而定。典型劑量可例如在0.001至1000μg範圍內;然而,尤其鑒於上文所提及之參數預期低於及高於此說明性範圍之劑量。每日非經腸給藥方案可為總體重之0.1μg/kg至100μg/kg,較佳地0.3μg/kg至10μg/kg,且更佳地1μg/kg至1μg/kg,甚至更佳地每天體重之0.5至10μg/kg。可藉由定期評估患者之健
康狀態來監測治療製程。對於數天或更長時間之重複投與,視患者之病狀而定,重複治療直至疾病症狀之所需反應或抑制為止。然而,亦可應用本文中未描述之另一給藥方案。所需劑量可藉由單次快速或多次快速給藥,或藉助於抗體之連續輸注投與,視從業者所需之藥物動力學分解而定。
抗體之此等經估計量大部分視醫師決策而定。預期效果為用於選擇正確劑量及療程之關鍵因素。本文中所考慮之因素包括待治療之某一疾病、接受治療之某一哺乳動物、某一患者之臨床病狀、病症病因、抗體投與位點、特異性抗體類型、投與途徑、投藥療程及醫學技術中熟知之其他因素。
本發明之治療劑可經冷凍或凍乾且在投與之前復原於適當無菌載劑中。冷凍乾燥及復原可導致抗體活性之一些損失。劑量可經調整以補償此損失。大體而言,6至8之醫藥組合物pH值為較佳的。
製品(產物)及套組
本發明之另一實施例為一種含有用於治療自體免疫疾病及有關病狀以及惡性血液疾病(其致病機制涉及攜帶TRBV9家族β鏈之TCR)之產物的製品。此等疾病包括例如AS、乳糜瀉、T細胞白血病、T細胞淋巴瘤及其他疾病。
製品為具有標籤及藥品說明書之容器,其可呈泡殼及/或封裝形式。適合之容器包括例如小瓶、安瓿、注射器等。容器可由多種材料,諸如玻璃或聚合材料製成。容器包含有效治療某一病狀之組合物,且可具有無菌進入孔。組合物中之至少一種活性成分為根據本發明之抗體。標籤及藥品說明書指示藥物意欲用於治療某一病狀。標籤及/或藥品說明書額外含有用於在患者中投與抗體組合物之說明書,包括此等治療產物之適應症、頻率、劑量、投與途徑、禁忌及/或注意事項。在一個實施例中,藥品說明書指示組合物意欲用於治療。
此外,製品可包含(但不限於)商業目的所必需或消費者所必需之其他產品,諸如溶劑、稀釋劑、過濾器、針及注射器。
本發明亦係關於可用於多種目的之套組,例如用於評估殺死
攜帶TRBV9家族TCR之T細胞的能力,用於純化或免疫沈澱來自細胞之TRBV9受體。對於分離及純化,套組可含有偶合至珠粒(例如,瓊脂糖珠粒)之抗體。套組包含容器、標籤及藥品說明書。
診斷用途
本發明之抗體亦用於診斷目的(例如,活體外、離體)。舉例而言,抗體可用於偵測或量測自患者獲得之樣品(例如組織樣品或體液樣品,諸如發炎性分泌物、血液、腸液、唾液或尿液)中之包含TRBV9家族TCR的T淋巴球之含量。用於偵測及量測之適合方法包括免疫分析,諸如流式細胞量測術、酶聯免疫吸附分析(enzyme-linked immunosorbent assay;ELISA)、化學發光分析、放射免疫分析及免疫組織化學。本發明進一步包括套組,例如包含本文中所描述之抗體的診斷套組。
為了可更好地理解本發明,闡述以下實例。此等實例僅用於說明之目的且不應視為以任何方式限制本發明之範疇。
本說明書中所提及之所有公開案、專利及專利申請案以引用之方式併入本文中。雖然已藉由說明及實例相當詳細地描述前述發明以便避免模糊解釋,但本領域中的專家基於本發明中所揭示之構想應非常清楚,可在不偏離本發明所包括之實施例之要素及範疇的情況下作出某些改變及修改。
實驗部分
實例1.抗體可變域序列之電子雜交(In silico)人類化
作為親本(參考)序列,使用抗TRBV9-2之重鏈及輕鏈之可變域的序列,其胺基酸序列展示於SEQ ID No:8及10中。
重鏈及輕鏈之可變域之胺基酸序列與一組人類免疫球蛋白之可變域的生殖系序列、大鼠免疫球蛋白之可變域之生殖系序列、自開放來源及由Biocad(Russia)提供之供體庫二者獲得的成熟人類及大鼠抗體之序列進行比較。Ylab軟體包用於分析(Biocad,Russia)。
分析測定了在測試抗體之可變域之序列中為大部分動物樣
而非人類樣的位置及其組合。同時,測定最常表示於此等位置中之人類抗體中之胺基酸組合。含有增大抗體之人類化程度的取代之可變域之人工序列基於所得資料來設計。
另外,編碼個體胺基酸變體之核苷酸序列經密碼子最佳化以表現CHO細胞株中之人類化抗體。重鏈及輕鏈之可變域之人類化核苷酸序列(SEQ ID No:15及17)重新合成且分別選殖至SalI/NheI及SalI/BsiWI限制位點處之pEE-HC、pEE-CK載體、IgG1格式(Xu等人Front.Chem.Sci.Eng.2015,9(3):376-380)中。
所得輕鏈及重鏈之核酸序列藉由Senger測序驗證。選擇用於進一步研究之抗體MA-042,其輕鏈及重鏈之胺基酸及核苷酸序列展示於SEQ ID No:19至22中。
抗體MA-042包括重鏈及輕鏈之可變域,其具有展示於SEQ ID NO:16及18中之胺基酸序列。
抗體MA-042之重鏈可變域的人類化程度為87%,而輕鏈可變域之人類化程度為85%(表1)。重鏈恆定域由IgG1格式、Gm3同種異型表示。
實例2.製備重組抗體且測定其親和力
包含編碼如實例1中所描述來獲得的抗體MA-042輕鏈及重鏈之核酸的載體繁殖於大腸桿菌細胞中,且使用來自Qiagen(德國(Germany))之質體DNA純化套組純化,並且用於根據製造商之說明書,使用直鏈聚乙烯亞胺(PEI「MAX」,「Polysciences」,USA)轉染CHO-Fut8細胞株。將所得反應混合物在振盪器上在37℃下培育。轉染之後的第9天,藉由0.5/0.22μm過濾器過濾而將培養液與細胞分離。過濾之後,培養液用於在用磷酸鹽緩衝鹽水(PBS,pH 7.4)平衡之0.2ml PreDictor RoboColumn MabSelect
SuRe管柱(GE Healthcare,USA)上,使用親和性層析法分離抗體。管柱隨後用5體積之PBS洗滌。使用0.1M甘胺酸緩衝液pH 3溶離載劑結合之蛋白質。吾等收集含有主峰之蛋白質,且用1M Tris緩衝液(pH 7.5)調整pH至中性。在110cm/h流動速率下進行所有階段。隨後使用透析將蛋白質轉移至PBS(pH 7.4),經由0.22μm過濾器過濾,轉移至新無菌管。
在變性條件下,使用12% PAGE評價分離品質。藉由在280A下量測NanoDrop2000顯微分光光度計實行定量評估。將經分離蛋白質儲存於-70℃下。
在OctetRed 96系統(ForteBio,USA)上測定抗體親和力。根據標準協定及製造商之說明書將20μg/ml之濃度之抗原固定至AR2G感測器(ForteBio)之表面上。在30℃下,使用包含0.1% Tween 20及0.1% BSA之PBS作為工作緩衝液進行分析。在基線記錄之後,將感測器浸沒至含有抗體溶液之孔中持續300秒,其中複合物發生締合。接著偵測緩衝溶液中之複合物解離持續600秒。
使用Octet資料分析(9.0版)軟體根據標準程序且使用1:1相互作用模型分析扣除參考信號之後的結合曲線。所得資料(表2)展示抗體特異性地且以高親和力結合至人類抗原。
實例3.製備穩定產生IgG1格式之抗體的細胞株且產生抗體
抗體MA-042之重鏈及輕鏈之序列如實例1中所描述來製備且選殖至HindIII、XbaI限制位點之pSX載體中。將所得質體培養於大腸桿菌細胞中,且根據製造商之說明書,使用BenchPro(Life Technology,CIIIA)分離600至700μg。質體使用PvuI核酸內切酶線性化隔夜,隨後沈澱乙醇,將沈澱物溶解於水中,最終體積之濃度為900至1100ng/μl。
將CHO-K1-S細胞株培養於哈姆氏(Ham's)F12 Gibco培養基(Thermo,USA)中。在NucleofectorTM(Lonza,Switzerland)上,根
據製造商之協定使用電穿孔執行包含編碼MA-042鏈之序列的基因構築體之轉染。
在轉染之後的當天,藉由將嘌呤黴素(puromycin)(最終濃度7.2μg/ml)及潮黴素B(最終濃度640μg/ml)添加至培養基中而使經轉染細胞經受抗生素選擇24天。隨後選擇在表現高含量MA-042的結構中同質的抗生素耐受性細胞純系。
為培養表現MA-042之CHO-K1-S,使用補充有25至100μm 2-去氧-2-氟-L-岩藻糖(CarboSynth,UK)之無血清培養基哈姆氏F12 Gibco(Thermo,USA)。用於臨床前研究之單株抗體MA-042產生於50L HyClone一次性生物反應器醱酵槽(Thermo Fisher Scientific)中。生產細胞使用Millistak C0HC深度過濾器(Merck-Millipore,USA)自培養液移除。在蛋白質A親和力吸附劑上執行來自經清除培養基之抗體的初次純化。目標蛋白在酸性條件下用甘胺酸緩衝液pH 3.3至3.8特異性地溶離。出於病毒去活性化的目的,將收集之溶離液暴露於酸性pH持續30至60min,且隨後用1M Tris-HCl溶液中和至pH 6.5至7.0。以流通模式使用CaptoAdhere吸附劑(GE HealthCare LifeSciences)執行移除可能雜質(DNA、生產細胞蛋白質、釋放之親和吸附劑之配體、聚集體及抗體片段)之最終層析純化。因此,蛋白質溶液在低導電性(<3毫秒/平方公分)下,流過用pH 6.5至7.0之Tris緩衝液平衡之所製備吸附劑。隨後使用Viresolve PRO過濾器套組(Millipore,USA)使純化蛋白質經受病毒移除過濾,針對含有乙酸鹽緩衝液(pH 5.0至5.5)及海藻糖之最終緩衝液進行濃縮且透濾。
實例4.特異性結合至TRBV9家族TCR之抗體的用途。
如實例3中所描述獲得之單株抗體MA-042用於分類淋巴球亞群。根據製造商之協定,使用螢光異硫氰酸鹽試劑(Sigma,USA)用螢光素標記抗體。在495/280nm之波長下,與抗體分子反應之螢光團數目受吸收光譜比率控制。
T淋巴球獲自健康供體之周邊血液。將血液收集於EDTA Vacuette管(各自2×9ml)中,根據描述於(Kovalchuk L.V.等人Immunology:
Workshop-2010.-第176頁)中之標準程序分離單核溶離份。在分離之後,將細胞轉移至包含0.5%牛血清白蛋白(BSA)及2mM EDTA之磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)。細胞及其存活力之總數目藉由如Lang N.R.(Stimulation of lymphocytes M.:Medicine,1976.-第288頁)所描述之錐蟲藍(trypan blue)染色方法來測定。將等體積之0.1%錐蟲藍溶液添加至細胞懸浮液中,隨後在Goryaev腔室中計數經染色(死亡)及未經染色之藍色細胞。基於此等資料,測定死亡細胞於測試樣品中之百分比。
為確認MA-042與攜帶屬於TRBV9家族之膜TCR之T淋巴球的目標群體結合之選擇率,將單核溶離份之500,000個細胞等分試樣添加至100ng/ml濃度之PBS緩衝液中,該PBS緩衝液包含0.5%牛血清白蛋白(BSA)、2mM EDTA pH8、標記有FITC之抗體MA-042、CD3-eFluor405(T淋巴球標記物)(eBioscience,USA)及CD45-PC5(eBioscience,USA)(總白血球標記物)。將50μl反應混合物在室溫下培育30min,其後細胞用補充有0.5% BSA、2mM EDTA之PBS緩衝液洗滌。在染色程序之後,細胞用於使用流式細胞量測術(FACSARIA III,USA,圖1)進行分類。染色中之此等標記物之使用使其有可能分離攜帶表面TRBV9+、CD3+、CD45+之目標群體細胞,以及獲得陰性群體細胞,亦即對應於免疫表型「TRBV9-、CD3+、CD45+」之彼等細胞。來自兩個複製之TRBV9+及TRBV9群體細胞用於分離總RNA且測序TCR β鏈。將所得細胞溶離份置放於RLT緩衝液(Quagen,Germany)中,根據製造商之協定使用Quiagen RNAeasy微型套組#217004試劑套組(Quagen)自其分離RNA。將cDNA合成於經分離之RNA模板上,根據描述於Britanova等人(J Immunol,2016,196(12)5005-5013)中之協定,使用Mint cDNA合成套組(Eurogen,Russia)擴增T受體β鏈之片段。將Illumina適配器(USA)接合至生成之擴增子,根據測序儀製造商之協定在MiSeq Illumina平台上執行測序。使用可在https://milaboratory.com之網際網路上獲得的MiGEC、MiXCR及VDJtools軟體分析測序資料。TCR β鏈之所得譜系之分析展示藉由使用抗體MA-042分類而獲得之庫富含93%的由TRBV9基因區段編碼之序列,而在「TRBV9」陰性溶離份β鏈之譜系中未偵測到包含TRBV9之序列。
實例5.抗體MA-042之活體外功能活性
單株抗體MA-042如實例3中所描述來獲得。人類血液之單核溶離份如實例4中所描述來獲得。使用細胞螢光量測方法測定MA-042之細胞毒性活性。來自單核溶離份之細胞等分試樣用於計算細胞之總數目,存活力藉由用錐蟲藍染色之能力來測定。為評估細胞毒性效率,將3-4×106個細胞與20ng/ml、40ng/ml、100ng/ml、200ng/ml、500ng/ml及1μg/ml濃度之抗體MA-042在PBS緩衝液中培育一小時,對於「零對照」,在不需添加抗體之情況下培育細胞。在培育之後,細胞用PBS洗滌兩次,轉移至包含10%人類血清之RPMI培養基中,且在CO2培育箱中培育72小時。隨後使細胞離心且經抗體CD4-PE、CD3-eFluor405(eBioscience,USA)及MA-042-FITC染色。細胞之染色樣品在FacsAria III細胞分類器(BD,USA)上用於細胞學分析。細胞毒性效果藉由逐漸地減少TRBV9陽性細胞於CD3+淋巴球群體中之比例來評估,目標細胞數目之減少與抗體MA-042濃度之增大有關直至完全消除目標群體。在MA-042染色之後,在500ng/ml之抗體濃度下偵測目標群體之完全消除。在「零對照」中,TRBV9 T淋巴球之百分比保持不變。圖2展示流式細胞量測術之典型結果。因此獲得EC50值(半數最大有效濃度係指在指定時間段之後誘導既定抗體之最大效果之一半的抗體濃度),其相當於100ng/ml之抗體MA-042(圖3)。
實例6.抗體MA-042之活體內功能活性
單株抗體MA-042如實例3中所描述來獲得。執行將MA-042單次靜脈內投與至恆河猴(恆河獼猴(Macaca mulatta))以評估特定活性及基本藥物動力學參數。對體重4至10kg之性成熟雄性恆河猴執行實驗,該等恆河猴由聯邦國家預算科學機構(the Federal State Budget Scientific Institution)「靈長類醫學科學研究所(Scientific Research Institute of Medical Primatology)」提供。在遞送之後,動物經受30天隔離。
周邊血液中TRBV9+淋巴球之部分含量經初步估計以形成實驗及對照動物之群組。將動物靜脈血液以4毫升/管收集至EDTA真空管
(Vacuette,Greiner Bio-One,Austria)中。單核細胞溶離份(1.077g/cm3 PanEco,Russia)隨後藉由菲科爾梯度(Ficoll gradient)分離。對於免疫表型,吾等使用100,000個補充有1μl之商業抗CD8 PE/Cy5(純系RPA-T8)抗體(BioLegend,USA)、抗CD4-Alexa Fluor 488(純系S3.5)抗體(Thermo Fisher,USA)及抗CD2-PerCP Cy 5.5(純系RPA-2.10)抗體(BioLegend,USA)、抗TcRVβ1(TRBV9)-PE抗體(Beckman Coulter,USA)之細胞,在室溫下培育20分鐘且用等體積的漢克氏溶液(Hanks'solution)洗滌2次。使用FACSAria III細胞分類器(USA)分析樣品。
實驗期間,所選動物保持於裝備有饋料槽、標籤架之單獨金屬籠中,每籠有1隻動物。根據平均饋入標準,飲食由一體式饋料、水果、蔬菜構成。動物自中央水供應器接收水。
基於利用抗體對主要淋巴球表面決定子(CD4、CD8、CD2)之細胞學分析之結果,將動物以4隻動物/組劃分成三個組,包括對照組。動物之對照組經靜脈內接受人類免疫球蛋白(「免疫蛇毒素(Immunovenin)」,Microgen,Russia)。
兩個實驗組分別以每隻動物1及10mg劑量投與MA-042,以用於恆河猴(恆河獼猴)之周邊血液中TRBV9+ T細胞的百分比(%)隨產物劑量而變化之比較研究。「免疫蛇毒素」根據說明書用無菌水稀釋且以每隻動物10mg之濃度投與。MA-042產物用不含鈣及鎂之杜爾貝科氏磷酸鹽緩衝鹽水(Dulbecco's phosphate-buffered saline;DPBS)稀釋。將產物以每次注射不超過5ml之體積投與至右前肢之肘脈中。
觀測週期持續42天。如表3中所指示來選擇血液樣品。如上文所描述來執行樣品之免疫表型及分析。
因此,在投與MA-042後72小時,動物展現在兩種濃度下幾乎完全消除周邊血液中之TRBV9+。在投與1毫克/動物之濃度的產物後336小時偵測到TRBV9+淋巴球之一部分。在接受劑量10mg之產物的動物中未偵測到TRBV9+淋巴球。投與後42天,在實驗組中未偵測到TRBV9+淋巴球之案例;對照組展現TRBV9+淋巴球之水準與實驗前相同。
實例8.製備包含本發明之抗體的醫藥組合物
藉由此項技術中已知之標準技術來獲得醫藥組合物。
醫藥組合物之組分展示於表4中。
實例9.包含具有抗體之醫藥組合物的套組
為產生具有包含抗體MA-042組合物之劑型的套組,將根據實例5製備之醫藥組合物在無菌條件下密封於1ml安瓿或注射器中,標記且封裝至塑膠或紙板容器中。
另外,插入物包括於安瓿容器中。
<110> JSC「BIOCAD」
<120> 特異性結合至人類T細胞受體之TRBV-9家族之β區的單株抗體及其使用之方法
<130> MA042.docx
<160> 22
<170> PatentIn version 3.5
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<223> 親本抗體TRBV9-2之HCDR1序列
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<223> 親本抗體TRBV9-2之HCDR2序列
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<223> 親本抗體TRBV9-2之LCDR3序列
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<212> DNA
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<223> 親本抗體TRBV9-2之重鏈可變域之核苷酸序列
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<223> 親本抗體TRBV9-2之輕鏈可變域之胺基酸序列
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<213> 人工
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<220>
<223> 抗體MA-042之可變輕鏈之胺基酸序列
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<223> 抗體MA-042之重鏈之核苷酸序列
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<223> 抗體MA-042之重鏈之胺基酸序列
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<223> 抗體MA-042之輕鏈之胺基酸序列
<400> 22
Claims (18)
- 一種特異性結合至人類T細胞受體之TRBV-9家族β鏈區的單株抗體或其抗原結合片段,其包含:重鏈可變域,其胺基酸序列展示於SEQ ID NO:16中;及輕鏈可變域,其胺基酸序列展示於SEQ ID NO:18中。
- 如請求項1之單株抗體,其包括具有SEQ ID No:20之胺基酸序列之重鏈及具有SEQ ID No:22之胺基酸序列之輕鏈。
- 如請求項2之單株抗體,其為全長IgG抗體。
- 一種編碼如請求項1至3中任一項之單株抗體或其抗原結合片段之核酸,其中該抗體或其抗原結合片段特異性地結合至人類T受體之TRBV9家族β鏈區。
- 一種表現載體,其含有如請求項4之核酸。
- 一種獲得產生如請求項1至3中任一項之抗體或其抗原結合片段之宿主細胞的方法,其包含細胞與如請求項5之載體的共轉化。
- 一種用於獲得如請求項1至3中任一項之抗體或其抗原結合片段的宿主細胞,其包含如請求項4之核酸。
- 一種獲得如請求項1至3中任一項之抗體或其抗原結合片段的方法,其包含在確保該抗體產生之條件下將如請求項7之宿主細胞培養於培養基中,接著分離及純化所獲得抗體。
- 一種用於預防或治療由人類T受體之TRBV9家族β鏈區介導之疾病或病症的醫藥組合物,其包含呈治療有效量之如請求項1至3中任一項之抗體或其抗原結合片段以及一或多種醫藥學上可接受之賦形劑。
- 如請求項9之醫藥組合物,其中該疾病或病症選自以下群:僵直性脊椎炎、乳糜瀉(celiac disease)、T細胞白血病、T細胞淋巴瘤。
- 一種用於預防或治療由攜帶TRBV9家族β鏈之人類T細胞受體介導之疾病或病症的醫藥組合物,其含有呈治療有效量之如請求項1至3中任一項之抗體或其抗原結合片段及呈治療有效量的至少一種其他治療學上之活性化合物。
- 如請求項11之醫藥組合物,其中該疾病或病症選自以下群:僵直性脊椎炎、乳糜瀉、T細胞白血病、T細胞淋巴瘤。
- 如請求項11至12中任一項之醫藥組合物,其中該其他治療學上之活性化合物選自小分子、抗體或類固醇激素。
- 一種用於抑制其β鏈屬於TRBV9家族之T細胞受體之生物活性的方法,其在需要此抑制之個體中包含向該個體投與有效量的如請求項1至3中任一項之抗體或其抗原結合片段。
- 一種用於治療由攜帶TRBV9家族β鏈之人類T細胞受體介導之疾病或病症的方法,其包含向需要此治療之個體投與呈治療有效量的如請求項1至3中任一項之抗體或其抗原結合片段或如請求項9至13中任一項之醫藥組合物。
- 一種用於治療如請求項17之疾病或病症的方法,其中該疾病或病症選自以下群:僵直性脊椎炎、乳糜瀉、T細胞白血病、T細胞淋巴瘤。
- 一種如請求項1至3中任一項之抗體或其抗原結合片段或如請求項9至13中任一項之醫藥組合物的用途,其在需要此治療之個體中用於治療由攜帶TRBV9家族β鏈的人類T細胞受體介導之疾病或病症。
- 如請求項17之用途,其中該疾病選自以下群:僵直性脊椎炎、乳糜瀉、T細胞白血病、T細胞淋巴瘤。
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RU2018146029 | 2018-12-25 | ||
RU2018146029A RU2711871C1 (ru) | 2018-12-25 | 2018-12-25 | Моноклональные антитела, которые специфически связываются с участком бета цепи семейства TRBV-9 Т-клеточного рецептора человека, и способы их применения |
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