CN113692412A - 特异性地结合人trbv9的单克隆抗体 - Google Patents

Abstract

本发明涉及特异性地结合人T细胞受体的TRBV9家族的单克隆人源化抗体或其抗原结合片段。本发明也涉及编码所述抗体或其抗原结合片段的核酸、表达载体、用于制备所述抗体的方法和所述抗体在治疗与人T细胞受体的所述家族有关的疾病或障碍中的用途。本发明涉及产生抗体，所述抗体可以用于治疗尤其是强直性脊柱炎(AS或别赫捷列夫氏病)、乳糜泻和血液癌症，其发病机制涉及TRBV9家族的T细胞受体。

Description

特异性地结合人TRBV9的单克隆抗体

技术领域

本发明涉及生物技术和生物医学的领域，具体地涉及抗体或其抗原结合片段，以及涉及其用途。更具体地，本发明涉及特异性地结合人T细胞受体家族的单克隆人源化抗体。本发明也涉及编码所述抗体或其抗原结合片段的核酸，表达载体，用于制备所述抗体的方法，和所述抗体在治疗与人T细胞受体家族有关的疾病或障碍中的用途。

背景技术

自身免疫疾病由自体反应性T淋巴细胞造成(Haroon N等人, Arthritis Rheum.2013年10月; 65(10):2645-54., Duarte J. 等人, PloS One 2010年5月10日; 5(5):e10558; Konig M. 等人, Front Immunol 2016年1月25日;7:11)。现有技术公开了T细胞受体(TCR)序列是允许鉴定参与自身免疫疾病的发病机制的T-淋巴细胞克隆的标志物。在结构上，T-细胞受体的亚基是免疫球蛋白超家族的成员，且由几个基因区段形成。TCR可变区形成TCR抗原结合位点。这意味着，它们是克隆-特异性的，即不同在于对独特抗原做出应答的T淋巴细胞。

根据在TCR可变结构域内的可变(V)基因区段的氨基酸同源性，将T细胞受体分成不同的家族。根据IMGT命名法，将β-链分类成26个独特家族，并将α链分类成41个家族(Turner SJ等人, Nature Reviews Immunology 2006, V.6, 883-894)。为了确定TCR链家族，人们使用试验氨基酸序列和已知TCR链序列的多重比对，关于已知TCR链序列的信息总结在IMGT数据库中(“The international ImMunoGeneTics information system”,Lefranc M-P., Nucl Acids Res 2001; 29:207-209)，该数据库可在http://www.imgt.org在因特网上得到。使用IgBlast软件包可以执行TCR链家族的多重比对和确定。

WO9006758公开了针对属于TRBV5-3和TRBV8-1家族的人T细胞受体可变结构域的β-链区域的单克隆抗体W112和2D1，被提议作为类风湿性关节炎的诊断和治疗工具。所述单克隆抗体分别识别0.3-5%的带有TRBV5-3的周围T淋巴细胞和0.5-13%的带有TRBV8-1的周围T淋巴细胞。许多证实T淋巴细胞在类风湿性关节炎的发病机制中的参与的研究的结果导致对T受体的β-链区域特异性的单克隆抗体的应用。具体地，Brennan等人, Clin ExpImmunol. 1988年9月; 73(3): 417-423已经证实了与健康个体相比在遭受类风湿性关节炎的患者的滑液样品中带有TRBV5和TRBV8的T淋巴细胞的升高的百分比。WO9405801公开了与人T-细胞受体的VΒ3.1可变区的表位相互作用的用于诊断和治疗类风湿性关节炎的单克隆抗体，其与TCR V(β)3.1亚家族相互作用。

还已经描述了特异性地识别大鼠TRC的第13个家族β-链的单克隆抗体。动物模型已经证实，在这些抗体的帮助下，可预防性地除去其T受体包含VB13β-链的T细胞的小群体(VB13+ T细胞)，且已经证实，这样的程序会保护免于I型糖尿病在糖尿病倾向系的大鼠中的发生，且也显著地降低病毒诱导的糖尿病的发生风险(Zhijun Liu等人, Diabetes.2012年5月; 61(5): 1160-1168.)。与此同时，其T受体包含独特β-链家族(VB16)的T细胞的除去结果没有不同于对照组的结果。重要的是，注意到，甚至针对VB13的单克隆抗体的第一次施用导致大鼠脾中的VB13+ T细胞数目的60%下降。

已经描述了具有强直性脊柱炎(AS或别赫捷列夫氏病)的患者中自身免疫TCR的一致变体，已经证实，它存在于具有AS的患者的滑液和外周血中，且在健康供体的相同深度分析中不存在，不论他们的HLA*B27等位基因状态如何(Faham M. 等人, ArthritisRheumatol. 2017;69(4):774-784; KomechЕ等人. 12th EJI-EFIS Tatra ImmunologyConference; 2016年9月3-7日; Strbske Pleso, Slovakia. Abstract book第39页)。所述TCR是TRBV9家族的成员(根据IMGT命名法)。已经证实，带有TRBV9家族β-链的T细胞受体也参与自身免疫疾病诸如乳糜泻的发生(Petersen J等人, J Immunol. 2015; 194(12):6112-22)。它们也存在于在T细胞淋巴瘤和T细胞白血病(包括由爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)造成的T-细胞淋巴瘤)中经受恶化的T细胞的表面(Toyabe S等人, Clin Exp Immunol.2003; 134(1): 92-97)。

申请号RU2017145662最近已经描述了能够特异性地结合人T受体的TRBV9家族β-链区域的嵌合单克隆抗体，其可以用于治疗其发病机制涉及属于TRBV9家族的TCR的自身免疫和肿瘤学疾病，例如AS、乳糜泻和一些T细胞淋巴瘤和T细胞白血病。

所述抗体是可以用于消除带有TRBV9家族TCR的T细胞的当前已知的仅有抗体。所述抗体的主要缺点是相对低的人源化程度，即它们包含人-样恒定区和结构组分，但是具有大鼠样可变结构域。所述抗体的重链的可变片段的人源化程度是72%，而轻链的可变片段的人源化程度是69%。

以上亲本单克隆抗体包括：

1)它们的重链的可变结构域(VH)，其包含3个高变区HCDR1、HCDR2和HCDR3，其中

HCDR1 (根据Kabat编号方案)具有SEQ ID NO: 1的氨基酸序列，

HCDR2具有SEQ ID NO: 2的氨基酸序列

HCDR3具有SEQ ID No: 3的氨基酸序列；

2)它们的轻链的可变结构域(VL)，其包含3个高变区LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中：

LCDR1具有SEQ ID NO: 4的氨基酸序列，

LCDR2具有SEQ ID NO: 5的氨基酸序列，

LCDR3具有SEQ ID NO: 6的氨基酸序列。

以上亲本单克隆抗体包括重链和轻链的可变结构域，其具有在SEQ ID NO: 8和10中所示的氨基酸序列。

以上亲本单克隆抗体包括具有在SEQ ID No. 12中所示的氨基酸序列的轻链和具有SEQ ID No. 14的氨基酸序列的抗体重链。

编码以上亲本抗体的重链和轻链的所述氨基酸序列的核苷酸序列的例子显示在SEQ ID NO: 13和11中。

本发明涉及制备单克隆抗体，其可以用于消除带有TRBV9家族TCR的T细胞，特别是用于治疗其发病机制涉及TRBV9家族TCR的AS、乳糜泻和恶性血液疾病，且其特征在于高人源化程度。与此同时，人源化经常导致抗体亲和力和/或溶解性的关键性下降。因而，制备人源化的功能性抗体是一个相关任务。

发明内容

本发明涉及一种人源化的单克隆抗体及其抗原结合片段，其具有以高亲和力特异性地结合人T受体的TRBV9家族β-链区域的能力。根据本发明的抗体可以用作药物，用于治疗其发病机制涉及属于TRBV9家族的TCR的自身免疫和肿瘤学疾病，例如，AS、乳糜泻和一些T细胞淋巴瘤和T细胞白血病。

在优选的实施方案中，本发明的抗体包含具有三个高变区的重链可变结构域(VH)

1) HCDR 1 (根据Kabat编号方案)具有SEQ ID NO: 1的氨基酸序列，

2) HCDR 2具有SEQ ID NO: 2的氨基酸序列

3) HCDR 3具有SEQ ID No: 3的氨基酸序列；

2)具有三个高变区LCDR1、LCDR2和LCDR3的轻链可变结构域(VL)，其中：

LCDR 1具有SEQ ID NO: 4的氨基酸序列，

LCDR 2具有SEQ ID NO: 5的氨基酸序列，

LCDR 3具有SEQ ID NO: 6的氨基酸序列。

除非另外特别说明，众所周知的Kabat编号方案在下文中用于确定抗体的CDR。

因此，抗体重链和轻链可变结构域包含在重链和轻链可变结构域的FR片段中的氨基酸置换，这会增加所述抗体与亲本抗体相比的人源化程度。

在某些实施方案中，与其氨基酸序列显示在SEQ ID No: 8中的亲本抗体的重链的可变结构域相比，本发明的抗体的重链的可变结构域包含至少10个人源化氨基酸置换。

在优选的实施方案中，本发明的抗体的重链的可变结构域具有在SEQ ID No: 16中所示的序列。

在某些实施方案中，本发明的抗体的重链的可变结构域包含不改变抗体特异性的其它氨基酸置换。

在某些实施方案中，与其氨基酸序列显示在SEQ ID No: 10中的亲本抗体的轻链的可变结构域相比，本发明的抗体的轻链的可变结构域包含至少10个人源化氨基酸置换。

在优选的实施方案中，本发明的抗体的轻链的可变结构域具有在SEQ ID NO: 18中所示的序列。

在某些实施方案中，本发明的抗体的轻链的可变结构域包含不改变抗体特异性的其它氨基酸置换。

在某些实施方案中，本发明的单克隆抗体是全长人IgG抗体，例如，IgG1或IgG2或IgG3或IgG4。

在某些实施方案中，本发明的抗体包括重链，其氨基酸序列与SEQ ID NO: 20的氨基酸序列具有至少85%同一性、或至少90%同一性、或至少91%同一性、或至少92%、或至少93%同一性、或至少94%、或至少95%、或至少96%、或至少97%、或至少98%或至少99%或100%同一性。

在某些实施方案中，本发明的抗体包括轻链，其氨基酸序列与SEQ ID NO: 22的氨基酸序列具有至少85%同一性、或至少90%同一性、或至少91%同一性、或至少92%、或至少93%同一性、或至少94%、或至少95%、或至少96%、或至少97%、或至少98%或至少99%或100%同一性。

在某些实施方案中，抗体具有其氨基酸序列显示在SEQ ID NO: 22中的轻链和其氨基酸序列显示在SEQ ID NO: 20中的重链。

还提供了编码根据本发明的抗体的重链和轻链的可变结构域的核酸，编码根据本发明的抗体的重链和轻链及其功能片段的核酸。

还提供了表达盒和表达载体，其包括本发明的核酸和所述核酸在选定的宿主细胞中的表达所必需的调节元件。所述载体或表达盒可以作为染色体外元件存在于宿主细胞中，或作为所述表达盒或载体向细胞中引入(通过转染)的结果而整合进细胞基因组中。

此外，提供了包括本发明的核酸、载体或表达盒的细胞和稳定细胞系，及其制备方法。

还提供了一种用于生产以上抗体或其抗原结合片段的方法，所述方法包括在确保所述抗体生产的条件下在培养基中培养以上宿主细胞。在某些实施方案中，方法包括随后分离和纯化得到的抗体。

还提供了用于预防或治疗由人T受体的TRBV9家族β-链区域介导的疾病或障碍的药物组合物，其包含与一种或多种药学上可接受的赋形剂组合的以上抗体或其抗原结合片段。

在实施方案之一中，药物组合物意图预防或治疗选自以下组的疾病或障碍：强直性脊柱炎、乳糜泻、T细胞白血病、T细胞淋巴瘤。

还提供了用于预防或治疗由带有TRBV9家族β-链的人T细胞受体介导的疾病或障碍的药物组合，其包含以上抗体或其抗原结合片段和至少一种其它的治疗活性化合物。

在实施方案之一中，药物组合意图预防或治疗选自以下组的疾病或障碍：强直性脊柱炎、乳糜泻、T细胞白血病、T细胞淋巴瘤。

在一个实施方案中，药物组合或组合物包含其它治疗活性化合物，其选自小分子、抗体或类固醇激素，诸如皮质类固醇。

还提供了一种用于在需要这种抑制的受试者中抑制T细胞受体的生物活性的方法，所述T细胞受体的β-链属于TRBV9家族，所述方法包括给所述受试者施用有效量的以上抗体或其抗原结合片段。

还提供了一种用于治疗由带有TRBV9家族β-链的人T细胞受体介导的疾病或障碍的方法，所述方法包括以治疗有效量给需要这种治疗的受试者施用以上抗体或其抗原结合片段或所述药物组合物。

在用于治疗疾病或障碍的方法的实施方案之一中，所述疾病或障碍选自以下组：强直性脊柱炎、乳糜泻、T细胞白血病、T细胞淋巴瘤。

还提供了以上抗体或其抗原结合片段或以上药物组合物用于在需要这种治疗的受试者中治疗由带有TRBV9家族β-链的人T细胞受体介导的疾病或障碍的用途。

在用途的实施方案之一中，所述疾病选自以下组：强直性脊柱炎、乳糜泻、T细胞白血病、T细胞淋巴瘤。

本发明的技术结果在于获得具有高人源化程度的抗体，所述抗体以高亲和力特异性地结合其β-链属于TRBV9家族的TСR，且可以用于治疗其发病机制涉及其β-链属于TRBV9家族的TCR的自身免疫和肿瘤学疾病。

在优选的实施方案中，抗体重链可变片段的特征在于87%的人源化程度。在优选的实施方案中，抗体轻链可变片段的特征在于85%的人源化程度。

附图说明

图1显示了使用抗体MA-042分选T淋巴细胞的结果。

图2显示了在有1 ng/ml (右)和1 μg/ml (左)浓度的抗体MA-042存在下，在细胞毒性活性测定以后T淋巴细胞的流式细胞计量术的结果。矩形显示了CD45+ CD3+TRBV9+的群体。

图3显示了随MA-042浓度而变化的死T淋巴细胞的数目，以确定MA-042 (EC50)在细胞毒性测定中的半数有效浓度。

具体实施方式

本发明涉及具有特异性地结合人T受体的TRBV9家族β-链区域的能力的分离的单克隆抗体及其功能片段，其具有与类似物相比增加的人源化程度。还提供了编码本发明的抗体及其片段的核酸，包括包含本发明的核酸和所述核酸在选定的宿主细胞中的表达所必需的调节元件的表达盒和表达载体。此外，提供了包括本发明的核酸、载体或表达盒的细胞和稳定细胞系。还提供了一种用于生产单克隆抗体或其功能片段的方法，包含与一种或多种药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体组合的有效量的本发明的抗体的药物组合物和药物组合，和使用本发明的抗体诊断和治疗AS和其它疾病的方法。

定义

首先定义一些术语，会更容易理解本发明。

应当理解，本文提供的材料和方法不限于特定组合物和方法步骤，因为这些可以变化。必须指出，如在本文中和在所附权利要求书中所使用的，单数形式包括对应的复数形式，除非上下文另外清楚地指明。

人“T细胞受体”(也被称作“TCR”、“T受体”)是在T淋巴细胞表面上发现的异源二聚体蛋白复合物。T受体仅存在于T淋巴细胞上。TCR的主要功能是特异性地识别与主要组织相容性复合物(HLA)的分子结合的经过加工的抗原。

人TCR由通过二硫键连接并嵌在细胞膜上的2个亚基α和β链、或γ和δ链组成。每个TCR链具有N-端可变(V)结构域、连接结构域和连接至跨膜结构域的恒定(C)结构域，所述跨膜结构域将受体锚定在T淋巴细胞质膜中。α和β-链的恒定结构域的长度分别是91和129个氨基酸残基。α链的连接和跨膜结构域的长度是30和17个氨基酸残基(AAR)，且β-链的连接和跨膜结构域的长度是21和22个AAR。T受体可变结构域的长度在104-125个AAR之间变化。

小部分的T淋巴细胞具有γ/δ型受体。它们类似于α/β受体进行排列，但是在它们的一级结构上存在差异且具有许多功能特征。它们表现出低得多的变异性(有限的克隆特异性)，它们识别与“非经典的”(非-MHC)抗原呈递分子形成复合物的抗原或甚至游离抗原。

T受体通过6个决定其互补性的区域(CDR)与MHC/抗原复合物反应：3个α链区域和3个β-链区域。这些CDR是高变区，T细胞受体的可变结构域的环，Vα和Vβ。

术语“TRBV9”或“TRBV9家族”表示根据IMGT命名法区分的T细胞受体的β-链的第九个家族，其特征在于，其可变结构域的氨基酸序列包含CDR1 (氨基酸序列是S-G-D-L-S)和CDR2 (氨基酸序列是Y-Y-N-G-E-E)的独特基序。术语“TRBV9家族TCR”表示其β-链属于TRBV9家族的T细胞受体。

关于T淋巴细胞或TCR的术语“病理学的”是指，这样的TCR或带有TCR的T淋巴细胞与疾病或病理学有关和/或造成疾病和/或促成疾病的发生。

关于TCR的术语“自身免疫”是指，这样的TCR参与自身免疫疾病的发生。

本文中使用的术语“抗体”意图表示由通过二硫键连接的4个多肽链(2个重(H)链和2个轻(L)链)组成的免疫球蛋白分子。将轻链分类为κ或λ。将重链分类为γ、μ、α、δ或ε；它们分别决定了抗体同种型诸如IgG、IgM、IgA、IgD和IgE，且它们中的几个可以进一步分成亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。每个重链类型由特定恒定区表征。

每个重链包含重链可变区(在本文中缩写为HCVR或VH)和重链恒定区。重链恒定区包含三个结构域CH1、CH2和CH3。每个轻链包含轻链可变区(在本文中缩写为LCVR或VL)和轻链恒定区。轻链恒定区包含一个结构域CL。VH和VL区域可以进一步细分成高变异性的区域，称作互补性决定区(CDR)，其周围是更保守的区域，称作框架区(FR)。每个VH和VL由3个CDR和4个FR组成，从氨基端至羧基端以下列顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。

在本申请中，3个重链CDR被称作“HCDR1、HCDR2和HCDR3”，而3个轻链CDR被称作“LCDR1、LCDR2和LCDR3”。CDR含有与抗原特异性地相互作用的大多数残基。除非另有说明，否则根据众所周知的Kabat编号方案将在根据本发明的抗体的HCVR和LCVR内的CDR-氨基残基编号和定位。本申请包括氨基酸的常规字母代码，除非另有说明。

术语“抗-TRBV9抗体”、“针对TRBV9的抗体”、“特异性地结合TRBV9家族β-链的抗体”和“针对TRBV9家族β-链的抗体”在本申请的上下文中是可互换的，并涉及特异性地结合人T细胞受体的TRBV9家族β-链的表位的抗体。

另外，在本申请中使用的“单克隆抗体”可以是单链Fv-片段，其可以通过使编码LCVR和HCVR的DNA结合接头序列而得到(参见Pluckthun, The Pharmacology ofMonoclonal Antibodies, 第113卷, Rosenburg和Moore编, Springer-Verlag, NewYork, 第269-315页, 1994)。预见到，不论是否提及片段或部分，在本申请中使用的术语“抗体”包括这样的片段或部分以及单链形式。只要蛋白保持其特异性地或优选地结合其靶标(例如，表位或抗原)的能力，它就被术语“抗体”涵盖。抗体可以是糖基化的或未糖基化的，且仍然是在本发明范围内。

为了本申请的目的，术语“抗体”和“单克隆抗体”表示针对TRBV9家族TCR的单克隆抗体。本文中使用的“单克隆抗体”涉及啮齿类动物、灵长类动物或骆驼科的抗体，优选地涉及鼠、猴、骆驼或骆马抗体、嵌合抗体、人源化抗体或全人抗体，除非另有说明。

“单克隆抗体”的群体表示同质的或基本上同质的抗体群体(即群体中的至少约85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、更优选地至少约97%或98%或甚至更优选地至少99%的抗体将在ELISA中竞争相同的抗原/表位，或更优选地抗体在它们的氨基酸序列方面是相同的)。抗体可以是糖基化的或未糖基化的，而仍然在本发明范围内。如果它们具有相同的氨基酸序列，单克隆抗体可以是同质的，尽管它们可以在翻译后修饰(例如，糖基化模式)方面不同。

每对轻/重链的可变区形成抗体的抗原结合位点。如在本申请中使用的，“抗原结合部分”或“抗原结合区域”或“抗原结合结构域”或“抗原结合位点”可互换地表示抗体分子的这样的部分：其包含与抗原相互作用的氨基酸残基，并给所述抗体提供关于所述抗原的特异性和亲和力。抗体的该部分包括维持抗原结合残基的适当构象所需要的“框架”氨基酸残基。

本文中使用的术语“人抗体”表示这样的抗体，其中可变结构域和恒定结构域的序列源自人序列。根据本发明的人抗体可以包括人的非典型的氨基酸残基(例如，通过体外非定向或位点特异性诱变或体内体细胞突变引入的突变)，例如，在CDR中，和具体地，在CDR3中。

当关于抗体使用时，术语“人源化的”用于表示这样的抗体：其特征在于人-样恒定区和结构组分的存在，但是具有其它起源的免疫球蛋白的典型互补性决定区(CDR)，或经修饰的抗体的对应片段的典型互补性决定区(CDR)。

如在本申请中使用的“亲本”抗体是由用于获得变体的氨基酸序列编码的抗体。亲本抗体可以来自啮齿动物、骆马、嵌合的、人源化的或人的抗体。

与抗体有关的术语“人源化程度”用于表示人源化抗体的框架区序列与用于产生人源化抗体且可得自人文库的原始人受体框架区的同一性百分比。优选地，本发明的抗体包含与得自人文库的框架区具有至少80%同一性、通常至少82%、更经常至少83%、例如至少84%或至少85%或至少86%或至少87%同一性的框架区。

术语“人源化置换”表示增加抗体或其片段的人源化程度的氨基酸置换。

关于本发明的抗体的术语“嵌合的”用于表示这样的抗体：其特征在于人-样恒定区，但是具有其它起源的可变区。在这样的抗体中，非人起源(例如，大鼠起源)的轻链和/或重链的可变结构域可操作地连接到人起源的对应链的恒定结构域。

当用于描述抗体时，术语“可操作地连接”等表示置于彼此物理(共价，除非另外说明)和功能关联中的多肽序列。在最优选的实施方案中，嵌合分子的多肽组分的功能与分离的多肽组分的功能性能相比没有变化。当用于描述核酸时，术语“可操作地连接”等是指，所述核酸共价地连接，使得在它们的连接点处不存在读框移位和终止密码子。如本领域技术人员显而易见的，编码包含“可操作地连接的”组分(蛋白、多肽、接头序列、蛋白结构域等)的嵌合蛋白的核苷酸序列由编码所述组分的片段组成，其中所述片段共价地连接，使得在核苷酸序列的翻译和转录过程中产生全长嵌合蛋白，例如，根据本发明的嵌合抗体。

本文中使用的术语“分离的”是指处于特定环境中的分子或细胞，所述特定环境不同于所述分子或细胞在体内所存在的环境。

在优选的实施方案中，本发明的抗体是重组体，即使用重组DNA技术得到。本文中使用的术语“重组抗体”包括通过重组方式得到、表达、建立或分离的所有抗体，诸如使用引入宿主细胞中的重组表达载体表达的抗体，从一组已知的重组的组合人抗体文库分离的抗体，从人免疫球蛋白基因的转基因动物分离的抗体(参见，例如，Taylor L.D. 等人(1992)Nucl. Acids Res. 20:6287-6295)。在某些实施方案中，对所述重组人抗体进行体外诱变(或者，当使用人Ig序列的转基因动物时，进行体内体细胞诱变)，且因而重组抗体的VH和VL区域的氨基酸序列是这样的序列：其尽管源自人种系VH和VL序列和与人种系VH和VL序列有关，但是不可能天然存在于体内人抗体种系谱系内。

本申请中使用的术语“特异性地结合”表示这样的情形：其中特异性结合对的一个成员不显著地结合除了其特异性结合配偶体以外的分子。在例如本发明的抗体的抗原结合结构域对许多抗原携带的特定表位具有特异性的情况下，该术语也是适用的；在该情况下，包含抗原结合结构域的特异性抗体将能够特异性地结合各种携带所述表位的抗原。因此，本发明的单克隆抗体特异性地结合人T细胞受体的TRBV9家族β-链的表位，然而它不特异性地结合其它家族的TCRβ-链和TCRα链。

术语“表位”表示能够在抗体的抗原结合区中的一个或多个处被抗体识别和结合的分子的该部分。表位经常由分子(诸如氨基酸或糖侧链)的化学活性表面簇组成，且具有特定三维结构特征以及特定电荷特征。

本文中使用的术语“表位”尤其表示在动物中(优选地在哺乳动物例如小鼠、大鼠或人中)具有抗原活性和/或免疫原性活性的多肽片段。本申请中使用的术语“抗原性表位”是可以特异性地结合抗体且通过从现有技术众所周知的任何技术(例如，通过标准免疫测定)可以检测的多肽片段。抗原表位不一定是免疫原性的，但是，它们可以是免疫原性的。本文中使用的“免疫原性的表位”被定义为在动物中引起抗体应答的多肽片段，如通过从现有技术已知的任意方法所确定的。“非线性表位”或“构象表位”包含在结合表位特异性抗体的抗原蛋白内的非邻近多肽(或氨基酸)。

关于本发明的抗体或其功能片段的短语“生物学性能”或“生物学特征”或术语“活性”或“生物活性”在本申请中互换使用，且包括但不限于表位/抗原亲和力和特异性，中和或拮抗包括属于TRBV9家族的β-链的TCR的活性的能力。

抗体的其它可鉴别的生物学性能包括，例如，交叉反应性(即，通常，与靶肽的非人同系物，或与其它蛋白或组织)，和在哺乳动物细胞中保持高蛋白表达水平的能力。使用本领域中公认的技术可以观察、测量和/或评估前述性能或特征，所述技术包括、但不限于，ELISA、竞争性ELISA、BIACORE或KINEXA表面等离子体共振分析、体外或体内抑制测定(但不限于)、受体结合测定、细胞因子或生长因子生产和/或分泌测定、以及从各种来源(包括人、灵长类动物或任意其它来源)得到的组织切片的信号转导和免疫组织化学。

本申请中关于本发明的抗体的活性使用的术语“抑制”或“中和”表示基本上拮抗、阻止、预防、限制、减慢、破坏、消除、停止、减少例如要抑制的对象(包括、但不限于以上，抗体的生物活性，或性质、疾病或病症)的进展或严重程度的能力。

本文中使用的术语“突变体”或“变体”表示在本发明中公开的抗体，其中在本发明的抗体或其片段的N-端和/或C-端处和/或天然氨基酸序列内添加和/或置换和/或删除和/或插入一个或多个氨基酸。本文中使用的术语“突变体”也表示编码突变蛋白的核酸分子。此外，术语“突变体”表示比蛋白或核酸更短或更长的任何变体。

术语“同源性”用于描述核苷酸或氨基酸序列与其它核苷酸或氨基酸序列的关联，其取决于被对比的所述序列之间的同一性和/或相似性程度。

如果氨基酸或核苷酸序列与选择用于对比的区域内的指定序列具有至少85%同一性，那么本文中使用的氨基酸或核苷酸序列是与参照序列“基本上类似的”或“基本上相同的”。因而，基本上类似的序列包括具有例如至少90%同一性、或至少91%同一性、或至少92%同一性、或至少93%同一性、或至少94%同一性、或至少95%同一性、或至少96%同一性、或至少97%同一性、或至少98%同一性、或至少99%同一性的那些。彼此相同的2个序列也是基本上类似的。

基于参照序列来确定序列同一性。用于序列分析的算法是本领域已知的，诸如在Ye等人. Nucleic Acids Res. 2013, W34-40中描述的IgBLAST。为了本发明的目的，为了确定核苷酸序列和氨基酸序列之间的同一性和相似性的水平，可以在由美国国家生物技术信息中心(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/)提供的IgBLAST软件包的帮助下使用具有标准参数的有缺口比对对比核苷酸和氨基酸序列。为了计算同一性百分比，使用参照序列例如可变区的全长。

对“编码”多肽的核苷酸序列的提及是指，在mRNA的翻译和转录过程中从核苷酸序列生成多肽。由此，可以指示与mRNA相同且通常用在序列表中的编码链和充当转录模板的互补链。如本领域技术人员显而易见的，该术语也包括编码相同氨基酸序列的任何简并核苷酸序列。编码多肽的核苷酸序列包括包含内含子的序列。

抗体

如上所述，本发明涉及具有特异性地结合人T受体的TRBV9家族β-链区域的能力的分离的单克隆人源化抗体及其功能片段。

根据本发明的抗体可以是嵌合的、人源化的或人的抗体或其抗原结合片段，且可以用作用于治疗AS和其发病机制涉及属于TRBV9家族的TCR的其它疾病(例如，乳糜泻或T细胞淋巴瘤)的药物。

根据本发明的抗体是单克隆的。使用例如本领域众所周知的杂交瘤技术、以及重组技术、噬菌体展示技术、合成技术或这样的技术的组合或本领域众所周知的其它技术，可以生产本发明的单克隆抗体。在本申请中使用的术语“单克隆抗体”表示从单个拷贝或克隆(包括、例如，任何真核、原核或噬菌体克隆)得到的抗体，而不是表示其生产方法。

通过肽合成或使用下面“核酸”部分中描述的重组DNA技术，可以制备人源化和嵌合抗体。

在某些实施方案中，本发明的抗体是嵌合的且其特征在于，它们具有非人起源(例如，大鼠或鼠起源)的轻链和重链的可变结构域，和人起源恒定结构域。

本发明的抗体包含具有三个高变区的重链可变结构域(VH)

1) HCDR1 (根据Kabat编号方案)具有SEQ ID NO: 1的氨基酸序列，

2) HCDR2具有SEQ ID NO: 2的氨基酸序列，

3) HCDR3具有SEQ ID No: 3的氨基酸序列；

2)具有三个高变区LCDR1、LCDR2和LCDR3的轻链可变结构域(VL)，其中：

LCDR 1具有SEQ ID NO: 4的氨基酸序列，

LCDR 2具有SEQ ID NO: 5的氨基酸序列，

LCDR 3具有SEQ ID NO: 6的氨基酸序列。

除非另外特别说明，否则众所周知的Kabat编号方案在下文中用于确定抗体的CDR。

在所有的实施方案中，本发明的抗体的轻链和重链的可变结构域是人源化的且在人源化氨基酸置换方面不同于亲本抗体的那些，其中所述抗体的重链和轻链的可变结构域包含在重链和轻链的可变结构域的FR片段中的氨基酸置换，从而增加所述抗体与亲本抗体相比的人源化程度。

在某些实施方案中，与其氨基酸序列显示在SEQ ID No: 8中的亲本抗体的重链的可变结构域相比，本发明的抗体的重链的可变结构域包含至少10个人源化氨基酸置换。

在优选的实施方案中，本发明的抗体的重链的可变结构域具有在SEQ ID No: 16中所示的氨基酸序列。

在某些实施方案中，本发明的抗体的重链的可变结构域包含不改变抗体特异性的其它氨基酸置换。

在某些实施方案中，与其氨基酸序列显示在SEQ ID No: 10中的亲本抗体的轻链的可变结构域相比，本发明的抗体的轻链的可变结构域包含至少10个人源化氨基酸置换。

在优选的实施方案中，本发明的抗体的轻链的可变结构域包含氨基酸置换且具有在SEQ ID NO: 18中所示的序列。

在某些实施方案中，本发明的抗体的轻链的可变结构域包含不改变抗体特异性的其它氨基酸置换。

在某些实施方案中，本发明的单克隆抗体是全长人IgG抗体，例如，IgG1或IgG2或IgG3或IgG4。

在某些实施方案中，本发明的抗体包括重链，其氨基酸序列与SEQ ID NO: 20的氨基酸序列具有至少85%同一性、或至少90%同一性、或至少91%同一性、或至少92%、或至少93%同一性、或至少94%、或至少95%、或至少96%、或至少97%、或至少98%或至少99%或100%同一性。

在某些实施方案中，本发明的抗体包括轻链，其氨基酸序列与SEQ ID NO: 22的氨基酸序列具有至少85%同一性、或至少90%同一性、或至少91%同一性、或至少92%、或至少93%同一性、或至少94%、或至少95%、或至少96%、或至少97%、或至少98%或至少99%或100%同一性。

在某些实施方案中，抗体具有其氨基酸序列显示在SEQ ID NO: 22中的轻链和其氨基酸序列显示在SEQ ID NO: 20中的重链。

如从现有技术已知的，可以将突变引入抗体序列，包括可变结构域，这不会实质上改变抗体的结合抗原的能力。根据本发明的抗体还可以含有其它突变，其不会导致抗体的结合TCR的TRBV9家族β-链的能力的丧失，但是可以导致抗体依赖性细胞介导的细胞毒性的下降或抗体的亲和力或其它生物学性能的增加。具体地，从现有技术众所周知，可以在抗体序列中做出保守氨基酸置换。“保守置换”在本申请的上下文中表示这样的置换：其中一个氨基酸残基被另一个具有类似侧链的氨基酸残基替换。具有类似侧链的氨基酸残基的家族是本领域众所周知的，其包括碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β-支链侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。优选地，在VL和/或VH结构域中的CDR3区域包括不超过5个保守氨基酸置换，更经常不超过3个保守置换。通常，不在对于结合TRBV9家族β-链的表位而言关键性的氨基酸位置处做出保守置换。

通过肽合成或使用下面“核酸”部分中描述的重组DNA技术，可以得到根据本发明的抗体的以上变体(突变体)。

在优选的实施方案中，所述抗体包含重链的恒定区，诸如人IgG1、IgG2、IgGS、IgG4、IgA、IgE、IgM、IgD的恒定区。优选地，重链恒定区是人IgG1重链恒定区。此外，抗体可以包含轻链恒定区或轻链κ恒定区或轻链λ恒定区。优选地，抗体包含轻链κ恒定区。

在优选的实施方案中，抗体重链可变片段的特征在于87%的人源化程度。在优选的实施方案中，抗体轻链可变片段的特征在于85%的人源化程度。

还提供了本发明的抗体的抗原结合片段。本文中使用的术语“抗体的抗原结合片段”(或“抗体的功能片段”或“抗体的活性片段”)表示一种或多种保留特异性地结合抗原的能力的抗体片段。已经证实，抗体的抗原结合功能可以由全长抗体的片段执行。被术语抗体的“抗原结合部分”包含的结合片段的例子包括：(a) Fab片段，即由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(b) F(ab)2片段，即包含2个Fab片段的二价片段，所述Fab片段在铰链区通过二硫键连接；(c)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(d)由抗体的单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段；(e)由VH结构域组成的dAb片段(Ward等人(1989) Nature 341:544-546)，和(f)分离的互补性决定区(CDR)。此外，尽管Fv片段的2个结构域VL和VH由分开的基因编码，但它们可以使用重组方法通过合成接头进行连接，所述合成接头使得它们能够制备为单条蛋白链，其中VL和VH区域配对以形成单价分子(称为单链Fv (scFv)；参见例如，Bird等人(1988) Science 242:423-426; Huston等人(1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883)。这样的单链抗体也意欲包含在术语抗体的“抗原结合片段”内。它们还包括其它形式的单链抗体，诸如双体(diabody)。双体是二价的双特异性抗体，其中VH和VL结构域表达于单个多肽链上，但使用因为过短而不允许同一链上的两个结构域之间配对的接头，由此迫使所述结构域与另一链的互补结构域配对且产生两个抗原结合位点(参见例如，HolligerР. 等人(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448; Poljak R.J.等人(1994)结构2:1121-1123)。

使用常规技术，诸如完整抗体的分别木瓜蛋白酶或胃蛋白酶消化，可以从完整抗体得到抗体片段，诸如Fab和F(ab′)2。此外，使用标准的重组DNA技术可以得到抗体、抗体片段和免疫粘附分子。

抗体或其抗原结合部分可以是通过抗体或抗体片段与一种或多种蛋白或肽的共价或非共价缔合而形成的较大免疫粘附分子的部分。这样的免疫粘附分子的例子包括抗生蛋白链菌素核心区域用于制备四聚体scFv分子的用途(Kipriyanov S.M. 等人(1995)Human Antibodies and Hybridomas 6:93-101)以及半胱氨酸残基、标志肽和C-端聚组氨酸标签用于制备二价和缩小尺寸的scFv生物分子的用途(Kipriyanov S.M. 等人(1994)Mol. Immunol., 31:1047-1058)。在抗体片段之间的其它化学键也是从现有技术众所周知的。

根据本发明的抗体及其功能片段以分离形式存在，即这意味着，这样的蛋白基本上不含有其它蛋白或其它天然存在的生物分子(诸如寡糖、核酸及其片段等)的存在，其中术语“基本上不含有”在该情况下是指，小于70%、通常小于60%和更经常小于50%的所述包含分离的蛋白的组合物是其它天然存在的生物分子。在某些实施方案中，所述蛋白以基本上纯化的形式存在，其中术语“基本上纯化的形式”是指等于至少95%、通常等于至少97%和更经常等于至少99%的纯度。

用于纯化通过重组或杂交瘤技术得到的抗体的方法是本领域众所周知的，例如，通过色谱法(例如，离子交换色谱法、亲和色谱法，特别是对特定抗原蛋白A或蛋白G的亲和力，和尺寸柱色谱法)、离心、溶解度差异或用于纯化蛋白的任意其它标准技术，可以执行纯化。此外，通过根据本发明的技术得到的抗体或其片段可以融合至异源多肽序列(例如，组氨酸标签)以促进纯化。

通过确定解离常数(KD)，可以使用标准分析确定抗体亲和力。使用方程式KD=kdis/kon计算KD，其中kdis是抗体-抗原复合物的通过实验计算的解离速率常数，且kon是其通过实验计算的结合速率常数。

优选抗体是以以下KD值结合人抗原的那些抗体：不超过约1×10^-7 M；优选地不超过约1×10^-8 M；更经常不超过约1×10^-9 M；更优选地不超过约1×10^-10 M，且最优选地不超过约1×10^-11 M，例如，不超过约1×10^-12 M。

优选抗体包括在下面的实验部分中详细描述的抗体MA-042。

可以用在本发明的组合物和方法中的抗体及其片段是生物活性的抗体和片段，即它们能够结合期望的抗原性表位并直接地或间接地表现出生物学效应。

根据本发明的抗体及其功能片段能够特异性地结合TRBV9家族β-链的表位(区域)。在优选的实施方案中，作为其对TRBV9家族的β链的特异性结合的结果，包括所述β-链的TCR的活性受到抑制。通常，抑制量优选地是至少约20%、或30%、或40%、或50%、或60%、或70%、或80%、或90%、或95%或更高。

在某些实施方案中，根据本发明的针对TRBV9家族β-链的抗体或其片段可以消除带有包含TRBV9家族β-链的TCR的T细胞。在某些实施方案中，根据本发明的抗体或其片段可以提供T淋巴细胞的至少约20%、至少约30%、至少约40%、至少约50%、至少约60%、至少约70%、至少约80%、至少约90%、至少约95%或约100%消除。

在本发明的一个优选实施方案中，所述抗体是抗体MA-042。

抗体MA-042包括重链和轻链的可变结构域，其具有在SEQ ID NO: 16和18中所示的氨基酸序列。

抗体MA-042包括重链和轻链，其具有分别在SEQ ID NO: 20和22中所示的氨基酸序列。

核酸

本发明提供了编码本发明的抗体的重链和轻链、其功能片段和可变结构域的核酸分子，其可以用于得到嵌合抗体，包括与人抗体的已知恒定结构域可操作地融合的本发明的可变结构域。

在优选的实施方案中，本发明的核酸编码抗体重链，其可变结构域含有3个高变区HCDR1、HCDR2和HCDR3，其中

HCDR1 (根据Kabat编号方案)具有SEQ ID No: 1的氨基酸序列；

HCDR2具有SEQ ID No: 2的氨基酸序列；

HCDR3具有SEQ ID No: 3的氨基酸序列。

在优选的实施方案中，本发明的核酸编码抗体轻链，其可变结构域包含3个高变区LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中：

LCDR1具有SEQ ID No: 4的氨基酸序列；

LCDR2具有SEQ ID No: 5的氨基酸序列；

LCDR3具有SEQ ID No: 6的氨基酸序列。

在优选的实施方案中，本发明的核酸编码抗体重链和轻链可变结构域，其含有在重链和轻链的可变结构域的FR片段中的氨基酸置换，这会增加所述抗体与亲本抗体相比的人源化程度。

编码所述抗体链的同系物和突变体、其功能片段和结构域的核酸分子也在本发明范围内。

在某些实施方案中，核酸编码本发明的抗体的重链的可变结构域，与其氨基酸序列显示在SEQ ID No: 8中的亲本抗体的重链的可变结构域相比，其含有至少10个人源化氨基酸置换。

在某些实施方案中，核酸编码抗体重链，其可变结构域具有SEQ ID No: 16的氨基酸序列。

在某些实施方案中，核酸编码抗体轻链，与其氨基酸序列显示在SEQ ID No: 10中的亲本抗体的轻链的可变结构域相比，其可变结构域包含至少10个人源化氨基酸置换。

在某些实施方案中，核酸编码抗体轻链，其可变结构域具有SEQ ID No: 18的氨基酸序列。

在某些实施方案中，核酸编码抗体重链，其氨基酸序列与SEQ ID NO: 20的氨基酸序列具有至少85%同一性、或至少90%同一性、或至少91%同一性、或至少92%、或至少93%同一性、或至少94%、或至少95%、或至少96%、或至少97%、或至少98%或至少99%或100%同一性。

在某些实施方案中，核酸编码抗体轻链，其氨基酸序列与SEQ ID NO: 22的氨基酸序列具有至少85%同一性、或至少90%同一性、或至少91%同一性、或至少92%、或至少93%同一性、或至少94%、或至少95%、或至少96%、或至少97%、或至少98%或至少99%或100%同一性。

编码本发明的轻链和重链的核酸的例子显示在SEQ ID No: 19和21中。

编码抗体的轻链和重链的可变结构域的核酸也是感兴趣的。编码抗体的轻链和重链的可变结构域的核酸可以用于与编码抗体的对应恒定结构域的核酸可操作融合。

在某些实施方案中，核酸编码抗体的重链的可变结构域，其氨基酸序列显示在SEQID No: 16中。

在某些实施方案中，核酸编码抗体的轻链的可变结构域，其氨基酸序列显示在SEQID No: 18中。

编码抗体的重链和轻链的可变结构域的核酸的例子显示在SEQ ID NO: 15和17中。

本文中使用的“核酸分子”或“核酸”是DNA分子，诸如基因组DNA分子或cDNA分子，或RNA分子，诸如mRNA分子。在某些实施方案中，本发明的核酸分子是含有开放读码框的DNA(或cDNA)分子，所述开放读码框编码本发明的抗体或抗体片段且能够在合适的条件(例如，生理学细胞内条件)下用于在异源表达系统中表达。

在某些实施方案中，通过基因工程方法生产本发明的核酸分子。生产核酸的方法是本领域众所周知的。例如，氨基酸序列信息或核苷酸序列信息的可用性使得能够通过寡核苷酸合成来制备本发明的分离的核酸分子。在氨基酸序列信息的情况下，可以合成许多由于简并密码而彼此不同的核酸。为期望的宿主选择密码子变体的方法是本领域众所周知的。

通过氨基亚磷酸酯方法可以制备合成的寡核苷酸，且可以根据本领域众所周知的方法，诸如高效液相色谱法(HPLC)或在例如Sambrook等人, Molecular Cloning: ALaboratory Manual, 第2版, (1989) Cold Spring Harbor Press, Cold SpringHarbor, NY中描述的其它方法，并在例如United States Dept. of HHS, NationalInstitute of Health (NIH) Guidelines for Recombinant DNA Research描述的指南下，纯化得到的构建体。可以以下述方式合成本发明的长双链DNA分子：合成几个具有适当互补性的较小片段，其包含能够与邻近片段粘结的适当末端。使用DNA连接酶或基于PCR的方法，可以连接邻近片段。

也可以从生物学来源克隆本发明的核酸分子。

本发明也包括与编码本发明多肽的核酸同源的、基本上相同的、相同的或由其衍生出的核酸。

本发明的核酸存在于它们天然所在的环境以外的环境，例如，它们是分离的，以增加的量存在，在体外系统中或在它们天然所存在的那些以外的细胞或生物中存在或表达。

密切相关的核酸序列之间的核苷酸序列的变化或差异可能代表在正常复制或重复过程中产生的序列中的核苷酸变化。可以为特定目的特别设计其它变化并引入序列中，诸如为了改变调节区中的特定氨基酸或核苷酸序列的密码子。这样的特别变化可以使用多种诱变技术在体外做出，或在置于诱导或选择这些变化的特异性选择条件下的宿主生物中产生。这样的特别得到的序列变体可以被称作原始序列的“突变体”或“衍生物”。

通过模板序列中一个或多个核苷酸的修饰、缺失或添加，或它们的组合，以得到模板核酸的变体，可以在选自以上核酸的模板核酸上得到突变体或衍生物核酸。通过本领域已知的任意方法(参见，例如，Gustin等人, Biotechniques (1993) 14: 22; Barany,Gene (1985) 37: 111-123；和Colicelli等人, Mol. Gen. Genet. (1985) 199:537-539,Sambrook等人, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (1989), CSH Press, 第15.3-15.108页)，包括易出错的PCR、改组、寡核苷酸指导的诱变、组装PCR、性别PCR诱变、体内诱变、盒式诱变、递归整体诱变、指数整体诱变、位点特异性的诱变、随机诱变、基因重新装配、基因位点饱和诱变(GSSM)、合成连接重新装配(SLR)或它们的组合，可以执行修饰、添加或缺失。通过包含重组、递归序列重组、硫代磷酸酯修饰的DNA诱变、含有尿嘧啶的模板诱变、缺口双链体诱变、点错配修复诱变、修复缺陷型宿主菌株诱变、化学诱变、放射诱变、缺失诱变、限制-选择诱变、限制-纯化诱变、人工基因合成、整体诱变、嵌合核酸多聚体产生和它们的组合的方法，也可以执行修饰、添加或缺失。

还提供了编码本发明的蛋白的核酸的简并变体。核酸的简并变体包括用编码相同氨基酸的其它密码子替换核酸的密码子。具体地，制备核酸的简并变体以增加在宿主细胞中的表达。在该实施方案中，将在宿主细胞基因中非偏爱的或次优选的核酸的密码子用在宿主细胞基因中的编码序列中过度表现的密码子替换，其中所述被替换的密码子编码相同的氨基酸。

以上修饰不会实质上改变抗体或其功能片段的性能，但是可以促进宿主细胞中的蛋白折叠，减小聚集容量，或调节蛋白的其它生化性能，例如，半衰期。在某些实施方案中，这些修饰不会改变蛋白的生化性能。在某些实施方案中，这些修饰导致降低的抗体免疫原性。在核酸水平执行上面指出的所有类型的修饰和突变。

可以以基本上纯化的形式分离和制备公开的核酸。基本上纯化的形式是指，所述核酸是至少约50%纯的，通常至少约90%纯的，且通常是“重组体”，即侧接一个或多个核苷酸，它在其天然宿主生物中天然存在的染色体上通常不伴随所述核苷酸。

还提供了编码包含本发明蛋白或其片段的融合蛋白的核酸，它们在下面更详细地讨论。编码本发明的可变结构域的核酸可以可操作地连接到编码抗体的轻链和重链的对应恒定结构域的核酸。编码抗体的轻链和重链的核酸可以可操作地连接到编码前导肽的核酸，所述前导肽促进表达产物从宿主细胞的运输。随后在多肽的成熟过程中除去前导肽。

载体

还提供了包含公开的核酸的载体和其它核酸构建体。术语“载体”表示能够运输它已经可操作地连接的另一种核酸的核酸分子。某些载体可以在它们被引入的宿主细胞中自主复制，而其它载体可以整合进宿主细胞基因组中并与宿主基因组一起复制。此外，有些载体能够指导它们已经可操作地连接的基因的表达。这样的载体在本文中被称作“重组表达载体”(或简称“表达载体”)，且示例性的载体是从现有技术众所周知的。合适的载体包括病毒和非病毒载体、质粒、粘粒、噬菌体等，优选质粒，并用于本发明的核酸序列的克隆、扩增、表达、向适当宿主的转移等。适当载体的选择是本领域技术人员显而易见的。通常借助于DNA连接酶与载体中经切割的限制性酶位点的连接，将全长核酸或其部分插入载体中。可替换地，通过体内同源重组，通常通过将同源性区域连接至载体上期望的核苷酸序列的侧翼，可以插入期望的核苷酸序列。通过寡核苷酸的连接，或通过使用引物的聚合酶链式反应，添加同源性区域，所述引物包含例如同源性区域和期望的核苷酸序列的部分。通常，载体具有确保其由于作为染色体外元件引入细胞中而在宿主细胞中复制的复制起点。载体也可以包含调节元件，其确保核酸在宿主细胞中的表达和靶多肽的产生。在表达载体中，所述核酸可操作地连接到调节序列，所述调节序列可以包括启动子、增强子、终止子、操纵基因、阻遏物和诱导物、以及多肽的起始密码子。在某些实施方案中，本发明的核酸进一步可操作地连接到前导肽，其确保表达产物从宿主细胞分离进细胞外空间中。

还提供了表达盒或系统，其尤其用于得到基于它们的公开多肽(例如，本发明的抗体的轻链和重链，或本发明的抗体的轻链和重链的可变结构域)，或用于复制公开的核酸分子。作为所述表达盒向细胞中引入的结果，所述表达盒可以作为染色体外元件存在，或可以整合进细胞基因组中。关于表达，在任何方便的表达系统中表达由本发明的核酸编码的蛋白产物，包括、例如，细菌系统、酵母、昆虫、两栖动物或哺乳动物细胞。在表达盒中，将靶核酸可操作地连接到调节序列，所述调节序列可以包括启动子、增强子、终止序列、操纵基因、阻遏物和诱导物、以及多肽的起始密码子。在某些实施方案中，本发明的核酸进一步可操作地连接到前导肽，所述前导肽确保表达产物从宿主细胞向细胞外空间中的分离。得到能够表达期望的产物的表达盒或系统的方法是本领域技术人员已知的。

宿主细胞

以上表达系统可以用在原核或真核宿主中。宿主-细胞，诸如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、酿酒酵母、与杆状病毒载体组合的昆虫细胞、或高等生物的细胞(其不是人胚胎细胞)诸如酵母、植物、脊椎动物，例如，CHO细胞(例如ATCC CRL-9096)、NS0细胞、SP2/0细胞、HEK293细胞、COS细胞(例如ATCC CRL-1650、CRL-1651)和HeLa (例如ATCC CCL-2)，可以用于得到所述蛋白。

为了生产本发明的抗体，用包含编码抗体轻链的核酸的表达载体和包含编码抗体重链的核酸的表达载体共转化宿主细胞。在某些实施方案中，使用单一表达载体，其中引入了编码抗体的轻链和重链的核酸。

为了表达轻链和重链，将编码重链和轻链的表达载体转化(共转化)进宿主细胞中，使得所述轻链和重链在宿主细胞中表达且优选地分泌进在其中培养宿主细胞的培养基中，且可以从所述培养基分离抗体。术语“转化”的各种解释意图包括宽范围的通常用于将外源DNA引入原核或真核宿主细胞中的方法，例如，电穿孔、磷酸钙沉淀、DEAE-葡聚糖转染等，如在Sambrook, Fritsch和Maniatis (编) Molecular Cloning; A LaboratoryManual, 第2版, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989; Ausubel F.M. 等人(编) CurrentProtocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates (1989)中所述。

当将含有抗体的核酸的重组表达载体引入宿主细胞中时，如下得到抗体：将宿主细胞培养足以在宿主细胞中表达抗体或(更优选地)将抗体分泌进在其中培养宿主细胞的培养基中的时间段。使用标准的蛋白纯化技术，可以从培养基分离抗体。细胞培养条件是本领域技术人员众所周知的，且描述在Current Protocols in Cell Biology, BonifacinoJ.S., Dasso M., Harford J.В., Lippincott-Schwartz J. 和Yamada K.M. (编)，JohnWiley & Sons, Inc.在2000年出版。

如果使用适合用于复制和/或表达本发明的核酸的以上宿主细胞或其它宿主细胞或生物中的任一种，那么得到的复制的核酸、表达的蛋白或多肽作为宿主细胞或生物的产物是在本发明范围内。通过本领域已知的合适技术可以分离所述产物。

通过本领域已知的方法(例如与选择标记诸如dhfr、gpt、新霉素、潮霉素的共转染，其允许鉴定和分离转染的细胞，所述细胞含有整合进基因组中的基因)，可以选择稳定地表达本发明的蛋白的细胞系。

本发明的核酸分子也可以用于确定生物样品中的基因表达。在其中针对特定核苷酸序列(诸如基因组DNA或RNA)的存在来检查细胞的方法是本领域中熟知的。简而言之，从细胞样品分离DNA或mRNA。可以通过RT-PCR来扩增mRNA，其中使用逆转录酶形成互补DNA链，随后使用对主题DNA序列特异性的引物进行聚合酶链式反应扩增。可替换地，将mRNA样品通过凝胶电泳分离，转移至合适的载体，例如硝酸纤维素、尼龙等, 并然后用主题DNA的片段作为探针进行探测。也可以使用其它技术，诸如寡核苷酸连接测定、原位杂交和与固定化在固体芯片上的DNA探针的杂交。与主题序列杂交的mRNA的检测指示样品中的基因表达。

本发明的抗体的治疗用途

在一个方面，将本发明的抗体或其活性片段用于治疗与带有表面TRBV9家族TCR的病理性T淋巴细胞的活性有关的障碍，例如，在AS、乳糜泻、T细胞淋巴瘤中表现出自身免疫性T淋巴细胞的活性。

如在本申请中使用的术语“患者”表示哺乳动物，包括、但不限于小鼠、猴、人类、家畜哺乳动物、运动哺乳动物和宠物哺乳动物；优选地该术语适用于人类。在一个特定实施方案中，所述患者进一步特征在于由TCR在其身体中的存在介导的疾病或障碍或病症，所述TCR的β-链属于TRBV9家族。如从现有技术已知的，其β-链属于TRBV9家族的TCR与AS和乳糜泻有关。此外，其β-链属于TRBV9家族的TCR可能与许多血液疾病(诸如由爱泼斯坦-巴尔病毒造成的T细胞淋巴瘤)的发生有关。

如本文中使用的，表示抗体与一种或多种其它治疗剂的术语“共同施用”、“共同施用的”和“与……联合”预期是指、表示和包括以下：

1)当将这样的组分一起配制在单一剂型中时，所述剂型基本上同时向所述患者释放所述组分，将本发明的抗体和治疗剂的这种组合同时施用给需要治疗的患者，

2)当将这样的组分彼此分开配制在单独剂型中时，所述剂型基本上同时被所述患者服用，此后所述组分基本上同时释放给所述患者，将本发明的抗体和治疗剂的这种组合同时施用给需要治疗的患者，

3)当将这样的组分彼此分开配制在单独的剂型中时，所述剂型先后被所述患者服用，在每次施用之间有显著的时间间隔，此后所述组分在基本上不同的时间释放给所述患者，将本发明的抗体和治疗剂的这种组合序贯施用给需要治疗的患者；以及

4)当将这样的组分一起配制在单一剂型中，所述剂型以受控方式释放所述组分，此后它们在相同和/或不同的时间并行地、连贯地和/或重叠地释放给所述患者，其中每个部分可以通过相同的或不同的途径施用，将本发明的抗体和治疗剂的这种组合序贯施用给需要治疗的患者。

可以不经进一步治疗性处理施用本发明的抗体，即作为独立疗法。此外，本发明的抗体的治疗可以包含至少一种额外的治疗性处理(联合治疗)。在本发明的某些实施方案中，抗体可以与用于自身免疫或肿瘤学疾病的另一种药剂/药物共同施用或配制，所述疾病的发病机制涉及包含TRBV9β-链的TCR，例如，AC、乳糜泻、T细胞淋巴瘤、T细胞白血病。

施用剂量和途径

本发明的抗体将以有效治疗目标病症的量施用，即以达到期望的结果所需要的剂量和持续时间。治疗有效量可以随因素诸如要治疗的具体病症、患者的年龄、性别和重量、以及单独施用抗体还是与一种或多种另外的免疫抑制性或抗炎性治疗技术联合而变化。

可以调节剂量方案以提供最适应答。例如，可施用单次大剂量递送，可随时间施用几个分份剂量，或可根据治疗形势的急迫性所指示而按比例降低或提高所述剂量。特别有利的是，为了施用容易和剂量均匀，将胃肠外组合物配制在单位剂型中。本文中使用的标准剂型意图表示适合作为要治疗的患者/受试者的单位剂量的物理上离散的单元；每个单位含有与期望的药用载体组合的经计算会产生期望的治疗效果的预定量的活性化合物。本发明的标准剂型的规范通常取决于和直接依赖于：(a)化学治疗剂的独特特征以及要实现的特定治疗或预防效果，和(b)配制领域中的固有限制，诸如用于治疗受试者的敏感性的活性化合物。

因而，熟练的技术人员基于本文提供的公开内容会明白，根据治疗领域中众所周知的方法调节剂量和剂量方案。也就是说，可以容易地确立最大耐受剂量，且也可以确定给患者提供可检测的治疗益处的有效量，还可以确定施用每种药剂以给患者提供可检测的治疗益处的时间要求。因而，尽管在该文件中作为实例给出了一些剂量和剂量方案，但是这些实例绝不限制患者在本发明的实践中可能必需的施用剂量和方案。

应当指出，剂量值可以随要减轻的病症的类型和严重程度而变化，且可以包括单次或多次剂量。此外，应当理解，对于任何特定受试者，应当根据个体需要以及施用所述组合物或监督所述组合物的施用的医学专业人员的判断随时间调整具体剂量方案，并且在本文中阐述的剂量范围仅仅是示例性的且无意限制要求保护的组合物的范围或实践。此外，使用本发明的组合物的剂量方案可以基于多种因素，包括疾病的类型、年龄、重量、性别、患者的健康状况、病症的严重程度、施用途径和使用的特定抗体。因而，剂量方案可以宽泛地变化，但是可以使用标准方法常规地确定。例如，可以基于药代动力学或药效动力学参数来调节剂量，所述参数可以包括临床效应诸如毒性效应和/或实验室值。因而，本发明包括本领域技术人员确定的患者内剂量递增。用于确定适当剂量和方案的方法是本领域众所周知的，并且是熟练的技术人员在获知本文中公开的想法后会理解的。

上面提供了合适的施用方法的例子。

预见到，本发明的抗体的合适剂量是在0.1-200 mg/kg的范围内，优选0.1-100mg/kg，包括约0.5-50 mg/kg，例如约1-20 mg/kg。可以施用抗体，例如以至少0.25 mg/kg的剂量，诸如至少0.5 mg/kg，包括至少1 mg/kg，例如至少1.5 mg/kg，诸如至少2 mg/kg，例如至少3 mg/kg，包括至少4 mg/kg，例如至少5 mg/kg；和例如至多50 mg/kg的最大值，包括至多30 mg/kg的最大值，例如至多20 mg/kg的最大值，包括至多15 mg/kg的最大值。通常以适当的时间间隔重复施用，诸如每周1次、每2周1次、每3周1次或每4周1次，只要负责医师认为适当即可，在某些情况下，如果必要的话，所述负责医师可能增加或减少剂量。

药物组合物

可以将本发明的抗体掺入适合用于施用给患者的药物组合物中。可以以单剂量或多剂量单独地或与药学上可接受的载体、稀释剂和/或赋形剂组合地施用本发明的抗体。将用于施用的药物组合物设计成适合所选的施用模式，并在适当时使用药学上可接受的稀释剂、载体和/或赋形剂，诸如分散剂、缓冲剂、表面活性剂、防腐剂、增溶剂、等渗剂、稳定剂等。根据常规技术设计所述组合物，如例如，在Remington, The Science and Practice ofPharmacy, 第19版, Gennaro, 编, Mack Publishing Co., Easton, PA 1995中所述，如从业人员通常已知的，其提供了用于得到组合物的各种技术。

“药剂(药物)”-是化合物或化合物的混合物，其作为呈片剂、胶囊剂、粉剂、冻干粉剂、注射剂、输注剂、软膏剂和其它现成形式的形式的药物组合物，意图用于恢复、改善或修饰人类和动物的生理功能，并且也用于治疗和预防疾病，用于诊断、麻醉、避孕、整容术等。本领域中接受的用于施用肽、蛋白或抗体的任何方法可以适当地用于本发明的抗体。

术语“药学上可接受的”表示适合用于在哺乳动物、优选人中施用的一种或多种相容的液体或固体组分。

术语“赋形剂”在本文中用于描述除了本发明的以上成分以外的任何成分。这些是无机或有机性质的物质，它们被用在药物制备中以便给药物产品提供必要的物理化学性能。

术语“缓冲液”、“缓冲液组合物”、“缓冲剂”表示溶液，其能够抵抗由它的酸-碱缀合物组分的作用造成的pH变化，且其允许抗体药物耐受pH变化。通常，药物组合物优选地具有在4.0-8.0的范围内的pH。使用的缓冲剂的例子包括、但不限于乙酸盐、磷酸盐、柠檬酸盐、组氨酸、琥珀酸盐等缓冲溶液。

本文中使用的术语“张度剂”、“渗透物”或“渗透剂”表示可以增加液体抗体制剂的渗透压的赋形剂。“等渗的”药物是具有与人血液的渗透压相等的渗透压的药物。等渗的药物通常具有约250-350 mOsm/kg的渗透压。可以使用的等渗剂包括、但不限于多元醇、糖和蔗糖、氨基酸、金属盐，例如，氯化钠等。

“稳定剂”表示一种赋形剂或两种或更多种赋形剂的混合物，其提供活性剂的物理和/或化学稳定性。可以使用的稳定剂包括氨基酸，例如，但不限于：精氨酸、组氨酸、甘氨酸、赖氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸；表面活性剂，例如，但不限于：聚山梨酯20 (商业名称: 吐温20)、聚山梨酯80 (商业名称: 吐温80)、聚乙烯-聚丙二醇及其共聚物(商业名称：泊洛沙姆、Pluronic、十二烷基硫酸钠(SDS)；抗氧化剂，例如，但不限于：甲硫氨酸、乙酰半胱氨酸、抗坏血酸、单硫代甘油、亚硫酸盐等；螯合剂，例如，但不限于：乙二胺四乙酸(EDTA)、二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)、柠檬酸钠等。

如果活性剂在指定的贮存期限中在例如2-8℃的贮存温度保持其物理稳定性和/或化学稳定性和/或生物活性，那么药物组合物是“稳定的”。优选地，活性剂保持物理和化学稳定性、以及生物活性。基于在加速或天然老化条件下的稳定性试验的结果选择贮存时间段。

使用标准施用技术，包括口服、静脉内、腹膜内、皮下、肺、透皮、肌肉内、鼻内、含服、舌下或栓剂施用，可以如在本申请中所述将含有本发明的单克隆抗体的组合物施用给表现出病状的患者。

本发明的药物组合物优选地含有或是“治疗有效量”的本发明的抗体。术语“治疗有效量”意图表示在达到期望的治疗结果所需的剂量和持续时间有效的量。抗体的治疗有效量可以随因素诸如受试者的疾病状态、年龄、性别和重量以及抗体或其部分在受试者中引起期望的应答的能力而变化。治疗有效量也是这样的量：其中抗体的治疗有益效果胜过任何有毒或有害作用。“预防有效量”意图表示在达到期望的预防结果所需的剂量和持续时间有效的量。由于在疾病之前或在疾病的早期阶段为个体开出预防剂量，所以通常预防有效量可以小于治疗有效量。

治疗有效量或预防有效量至少是最小治疗有益剂量，其小于活性剂的有毒剂量。另一方面，本发明的抗体的治疗有效量是这样的量，其在哺乳动物、优选人类中降低自身免疫克隆的生物活性，例如通过结合其β-链属于TRBV9家族的TCR，其中所述克隆的存在会造成或促进不希望的病理学效应，或通过减少其β-链属于TRBV9家族的TCR，在哺乳动物、优选人中造成有益的治疗效果。

本发明的抗体的施用途径可以是口服、胃肠外、吸入或局部。优选地，可以将本发明的抗体包含在胃肠外施用可接受的药物组合物中。本申请中使用的术语“胃肠外”包括静脉内、肌肉内、皮下、直肠、阴道或腹膜内施用。静脉内、腹膜内或皮下注射是优选的施用途径。这样的注射剂的可接受的药用载体是从现有技术众所周知的。

如在适当的指南中所述，药物组合物在生产和在容器中贮存的条件下应当是无菌的和稳定的，所述容器由例如气密密封的管形瓶(安瓿)或注射器提供。因而，可以在制备所述组合物以后对药物组合物进行过滤灭菌，或可以通过任意其它技术造成在微生物学上合适。用于静脉内输注的典型组合物可以包括250-1000 ml流体诸如无菌的林格氏溶液、生理盐水、右旋糖溶液或汉克氏盐溶液，和治疗有效剂量(例如，1-100 mg/ml或更多)的抗体浓缩物。剂量可以随疾病类型和严重程度而变化。从医学领域现有技术众所周知，任何患者的剂量取决于多种因素，包括患者的大小、体表面积、年龄、要施用的具体化合物、性别、施用的持续时间和途径、一般健康状况和其它同时施用的药物。典型剂量可以例如在0.001-1000µg的范围内；但是，预见到比该示例性范围更低和更高的剂量，特别鉴于上述的参数。每天胃肠外的定量施用方案可以是0.1µg/kg至100µg/kg总体重，优选0.3µg/kg至10µg/kg，且更优选1µg/kg至1µg/kg，甚至更优选每天0.5-10µg/kg体重。通过定期评估患者的健康状况，可以监测治疗过程。关于持续几天或更久的重复施用，取决于患者的状况，重复治疗直到期望的应答或疾病征状的抑制。但是，还可以应用本文未描述的另外的定量施用方案。根据从业人员期望的药代动力学崩解，通过单次推注或多次推注施用或借助于抗体的连续输注，可以施用期望的剂量。

抗体的这些估计量主要依赖于医师的判断。期望的效果是选择适当剂量和方案的关键因素。在本文中考虑的因素包括要治疗的某种疾病、要接受治疗的某种哺乳动物、某位患者的临床状况、病症原因、抗体施用部位、特异性抗体类型、施用途径、施用方案和医学领域众所周知的其它因素。

可以将本发明的治疗剂冷冻或低压冻干并在施用前在适当的无菌载体中重构。冷冻干燥和重构可以导致抗体的活性的一些损失。可以调节剂量以补偿该损失。一般而言，在6-8之间的药物组合物pH值是优选的。

制成品(产品)和试剂盒

本发明的另一个实施方案是制成品，其含有用于治疗自身免疫疾病和有关的病症和恶性血液疾病(其发病机制涉及带有TRBV9家族β-链的TCR)的产品。这样的疾病包括，例如，AS、乳糜泻、T细胞白血病、T细胞淋巴瘤等。

制成品是具有标签和包装插页的容器，其可以是在泡罩和/或包装中。合适的容器包括，例如，管形瓶、安瓿、注射器等。容器可以由各种材料制成，诸如玻璃或聚合物材料。容器包含有效地治疗某种病症的组合物，且可以具有无菌的存取端口。组合物中的至少一种活性成分是根据本发明的抗体。标签和包装插页指示，药物意图用于治疗某种病症。标签和/或包装插页另外含有关于在患者中施用抗体组合物的说明，包括这样的治疗产品的适应症、频率、剂量、施用途径、禁忌证和/或警告。在一个实施方案中，包装插页指示，组合物意图用于治疗。

此外，制成品可以包含，但不限于，商业目的所必需的或消费者所必需的其它产品，诸如溶剂、稀释剂、过滤器、针头和注射器。

本发明也涉及试剂盒，其可以用于多种目的，例如，用于评估杀死带有TRBV9家族TCR的T细胞的能力，用于从细胞纯化或免疫沉淀TRBV9受体。为了分离和纯化，试剂盒可以含有与珠子(例如，琼脂糖珠子)偶联的抗体。试剂盒包含容器、标签和包装插页。

诊断用途

本发明的抗体也用于诊断目的(例如，体外, 离体)。例如，抗体可以用于检测或测量从患者得到的样品(例如，组织样品或体液样品，诸如炎症渗出物、血液、肠液、唾液或尿)中包含TRBV9家族TCR的T淋巴细胞的水平。合适的检测和测量方法包括免疫测定，诸如流式细胞计量术、酶联免疫吸附测定(ELISA)、化学发光测定、放射免疫测定和免疫组织学。本发明还包括试剂盒，例如，包含本文描述的抗体的诊断试剂盒。

为了更好地理解本发明，给出以下实施例。这些实施例只是用于例证的目的，不应解释为以任何方式限制本发明的范围。

在本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请通过引用并入本文。尽管为了避免模糊解释，通过举例和实例已经比较详细地描述了以上发明，但是本领域技术人员基于本发明公开的想法会非常明白，在不偏离本发明的包括的实施方案的实质和范围的情况下可以做出某些变化和修改。

实验部分

实施例1. 抗体可变结构域序列的计算机环境人源化

作为亲本(参考)序列，使用了抗-TRBV9-2抗体的重链和轻链的可变结构域序列，其氨基酸序列显示在SEQ ID NO: 8和10中。

将重链和轻链的可变结构域的氨基酸序列与从由开放源和Biocad (俄罗斯)提供的供体文库得到的人免疫球蛋白的可变结构域的种系序列、大鼠免疫球蛋白的可变结构域的种系序列、成熟人和大鼠抗体的序列的集合进行了对比。将Ylab软件包用于分析(Biocad, 俄罗斯)。

分析确定的位置和它们的组合在试验抗体的可变结构域序列中是最象动物的且不象人的。与此同时，确定了在这些位置在人抗体中最经常表示的氨基酸组合。基于得到的数据设计了可变结构域的人工序列，其含有增加抗体的人源化程度的置换。

并且，对编码主题氨基酸变体的核苷酸序列进行了密码子优化以在CHO细胞系中表达人源化抗体。从头合成了重链和轻链的可变结构域的人源化核苷酸序列(SEQ ID NO:15和17)并分别在SalI/NheI和SalI/BsiWI限制位点克隆进pEE-HC、pEE-CK载体、IgG1形式中(Xu等人. Front. Chem. Sci. Eng. 2015, 9(3): 376-380)。

通过Senger测序验证了得到的轻链和重链的核酸序列。选择抗体MA-042用于进一步研究，其轻链和重链的氨基酸和核苷酸序列显示在SEQ ID NO: 19-22中。

抗体MA-042包括重链和轻链的可变结构域，其具有在SEQ ID NO: 16和18中所示的氨基酸序列。

抗体MA-042的重链的可变结构域的人源化程度是87%，而轻链的可变结构域的人源化程度是85%(表1)。重链恒定结构域由IgG1形式、Gm3同种异型表示。

表1. 亲本抗体和抗体MA-042的可变结构域之间的人源化程度的对比。

抗体	重链可变结构域的人源化程度，%	轻链可变结构域的人源化程度，%
			TRBV9-2	72	69
MA-042	87	85

实施例2.重组抗体的制备及其亲和力的确定

在大肠杆菌细胞中扩增如实施例1所述得到的、包含编码抗体MA-042轻链和重链的核酸的载体，并使用来自Qiagen (德国)的质粒DNA纯化试剂盒进行纯化，并根据生产商的说明书使用线性聚乙烯亚胺(PEI“MAX”, “Polysciences”, USA)用于转染CHO-Fut8细胞系。将得到的反应混合物在振荡器上在37℃温育。转染后9天，通过穿过0.5/0.22µm过滤器过滤，将培养液与细胞分离。过滤后，将培养液用于分离抗体，其中使用在0.2 mlPreDictor RoboColumn MabSelect SuRe柱(GE Healthcare, USA)上的亲和色谱法，该柱用磷酸盐缓冲盐水(PBS, pH 7.4)平衡过。然后将柱用5体积的PBS洗涤。使用0.1 M甘氨酸缓冲液рН3洗脱载体结合的蛋白。我们收集了含有蛋白的主峰，并用1 M Tris缓冲液(pH7.5)调节pH至中性。在110 cm/h流速进行所有阶段。然后将蛋白使用透析转移至PBS (pH7.4)，穿过0.22 μm过滤器过滤，转移至新的无菌试管。

使用12%PAGE在变性条件下评价分离质量。通过在280A测量NanoDrop2000显微分光光度计，进行定量评估。将分离的蛋白在-70℃储存。

在OctetRed 96系统(ForteBio, USA)上确定抗体亲和力。根据标准方案和生产商的说明书，将在20 μg/ml的浓度的抗原固定化在AR2G传感器(ForteBio)的表面上。使用包含0.1%吐温20和0.1%BSA的PBS作为工作缓冲液，在30℃进行分析。在基线记录以后，将传感器浸渍到含有抗体溶液的孔中300秒，在那里缔合复合物。然后检测在缓冲溶液中的复合物解离600秒。

使用Octet Data Analysis (9.0版)软件根据标准规程和使用1:1全局相互作用模型，分析在减去参比信号以后的结合曲线。得到的数据(表2)表明，抗体特异性地且以高亲和力结合人抗原。

表2. 抗体MA-042亲和力特征。

抗体	KD (M)	kon(1/Ms)	kdis(1/s)	全R^2
					МА-042	<1.0E-12	3.19E+05	<1.0E-07	0.9758

实施例3. 以IgG1形式稳定产生抗体的细胞系的制备和抗体的生产

如在实施例1中所述制备抗体MA-042的重链和轻链的序列，并在HindIII、XbaI限制位点处克隆进pSX载体。将得到的质粒在大肠杆菌细胞中培养，并使用BenchPro (LifeTechnologies, США)根据生产商的说明书分离600-700 μg。使用PvuI内切核酸酶将质粒线性化过夜，然后将乙醇沉淀，将沉淀物溶解在水中，终体积中的浓度为900-1100 ng/μl。

在Ham氏F12 Gibco培养基(Thermo, USA)中培养CHO-K1-S细胞系。使用在Nucleofector™(Lonza, 瑞士)上的电穿孔根据生产商的方案用包含МА-042链的编码序列的基因构建体进行转染。

转染后一天，通过向培养基中加入嘌呤霉素(7.2 μg/ml的终浓度)和潮霉素B(640 μg/ml的终浓度)，对转染的细胞进行抗生素选择24天。然后选择在表达高水平的MA-042的结构方面同质的抗生素抗性的细胞克隆。

为了培养表达MA-042的CHO-K1-S，使用了补充了25-100 uM 2-脱氧-2-氟-L-岩藻糖(CarboSynth, UK)的无血清培养基Ham氏F12 Gibco (Thermo, USA)。在50 L HyClone一次性使用的生物反应器发酵罐(Thermo Fisher Scientific)中生产用于临床前研究的单克隆抗体MA-042。使用Millistak C0HC深度过滤器(Merck-Millipore, USA)从培养液除去生产细胞。在蛋白A亲和吸附剂上进行抗体从清洁培养基的初步纯化。在酸性条件下用pH3.3-3.8的甘氨酸缓冲液特异性地洗脱靶蛋白。为了病毒灭活的目的将收集的洗脱液暴露于酸性pH 30-60 min，然后用1M Tris-HCl溶液中和至pH 6.5-7.0。使用CaptoAdhere吸附剂(GE Healthcare LifeSciences)以流穿模式进行最终的色谱纯化以除去可能的杂质(DNA、生产细胞蛋白、释放的亲和吸附剂的配体、聚集体和抗体片段)。因而，使蛋白溶液在低电导率(< 3msec/cm²)下流动穿过用pH 6.5-7.0的Tris缓冲液平衡过的准备的吸附剂。然后对纯化的蛋白使用Viresolve PRO过滤试剂盒(Millipore, USA)进行除去病毒的过滤，浓缩，并针对含有乙酸盐缓冲液(pH 5.0-5.5)和海藻糖的最终缓冲液进行渗滤。

实施例4. 抗体用于特异性结合TRBV9家族TCR的用途

将如实施例3中所述得到的单克隆抗体MA-042用于分选淋巴细胞亚群。使用异硫氰酸荧光素试剂(Sigma, USA)根据生产商的方案用荧光素标记抗体。通过在495/280 nm的波长的吸收光谱比率，控制与抗体分子反应的荧光团的数目。

从来自健康供体的外周血得到T淋巴细胞。将血液收集在EDTA Vacuette试管(各2x9 ml)中，根据描述的标准规程(Kovalchuk L. V. 等人. Immunology: Workshop -2010. - 176 p.)分离单核级分。分离以后，将细胞转移至含有0.5%牛血清白蛋白(BSA)和2mM EDTA的磷酸盐缓冲盐水(PBS)。通过Lang N.R.描述的锥虫蓝染色方法(Stimulation oflymphocytes M.: Medicine , 1976.-288 p.)，确定细胞的总数及其生存力。将等体积的0.1%锥虫蓝溶液加入细胞悬浮液，然后在Goryaev室中计数染色的(死的)和未染色的蓝色细胞。基于这些数据，确定试验样品中死细胞的百分比。

为了证实MA-042与带有属于TRBV9家族的膜TCR的T-淋巴细胞靶群体的结合的选择性，将单核级分的500,000个细胞等分试样加入包含0.5%牛血清白蛋白(BSA)、2 mM EDTApH8、用FITC标记的抗体MA-042、CD3-eFluor405 (T淋巴细胞标志物) (eBioscience, USA)和100 ng/ml浓度的CD45-PC5 (eBioscience, USA) (总白细胞标志物)的PBS缓冲液中。将50 μl反应混合物在室温温育30 min，此后将细胞用补充了0.5%BSA、2mM EDTA的PBS缓冲液洗涤。染色规程以后，将细胞用于使用流式细胞计量术的分选(FACSARIA III, USA, 图1)。这些标志物在染色中的应用使其可分离携带表面TRBV9+、CD3+、CD45+的靶群体细胞，以及得到阴性群体细胞，即与免疫表型“TRBV9-、CD3+、CD45+”对应的那些。将来自2个重复的TRBV9+和TRBV9- 群体细胞用于总RNA的分离和TCRβ-链的测序。将得到的细胞级分放在RLT缓冲液(Quagen, 德国)中，使用Quiagen RNAeasy mini试剂盒#217004试剂试剂盒(Quagen)根据生产商的方案从其分离RNA。在分离的RNA模板上合成cDNA，根据Britanova等人(J Immunol, 2016, 196(12) 5005-5013)描述的方案，使用Mint cDNA合成试剂盒(Eurogen, 俄罗斯)扩增T受体β-链的片段。将Illumina接头(USA)连接至生产的扩增子，根据测序仪生产商的方案在MiSeq Illumina平台上执行测序。使用在因特网上在https://milaboratory.com可得到的MiGEC、MiXCR和VDJtools软件分析测序数据。得到的TCRβ-链谱系的分析表明，通过使用抗体MA-042分选得到的文库富集了93%的由TRBV9基因区段编码的序列，而在“TRBV9-”阴性级分β-链的谱系中没有检测到包含TRBV9的序列。

实施例5. 抗体MA-042的体外功能活性

如在实施例3中所述得到单克隆抗体MA-042。如在实施例4中所述得到人血液的单核级分。使用细胞荧光测定方法确定MA-042的细胞毒性活性。将来自单核级分的细胞等分试样用于计算细胞的总数，通过用锥虫蓝染色的能力确定生存力。为了评估细胞毒性效率，将3-4 x 10⁶个细胞与以下浓度的抗体MA-042一起在PBS缓冲液中温育1小时：20 ng/ml、40ng/ml、100 ng/ml、200 ng/ml、500 ng/ml和1 μg/ml，对于“零对照”，在没有加入抗体的情况下温育细胞。温育以后，将细胞用PBS洗涤2次，转移至包含10%人血清的RPMI培养基，并在CO₂培养箱中温育72小时。然后将细胞离心并用抗体CD4-PE、CD3-eFluor405(eBioscience，USA)和MA-042-FITC染色。将染色的细胞样品用于在FacsAria III细胞分选仪(BD, USA)上的细胞计数分析中。通过逐渐降低CD3+ 淋巴细胞群体中的TRBV9-阳性细胞的比例(与抗体MA-042浓度的增加有关的靶细胞数目的减少直到靶群体的完全消除)，评估细胞毒性效应。在500 ng/ml的抗体浓度检测在MA-042染色以后靶群体的完全消除。在“零对照”中，TRBV9 T淋巴细胞的百分比保持不变。图2显示了流式细胞计量术的典型结果。由此得到EC50值(半数最大有效浓度表示在指定的时间段以后诱导给定抗体的最大效应的一半的抗体浓度)，其对于抗体MA-042而言量达到100 ng/ml (图3)。

实施例6. 抗体MA-042的体内功能活性

如在实施例3中所述得到单克隆抗体MA-042。进行MA-042对恒河猴(Macaca mulatta)的单次静脉内施用以评估比活性和基本药代动力学参数。对4-10 kg体重的性成熟的雄性恒河猴进行实验，它们由Federal State Budget Scientific Institution“Scientific Research Institute of Medical Primatology”提供。在递送以后，对动物进行30-天检疫。

初步估计外周血中TRBV9+ 淋巴细胞的级分含量以形成实验和对照动物的组群。将动物的静脉血以4 ml/试管收集进EDTA真空试管(Vacuette, Greiner Bio-One, 奥地利)中。然后通过Ficoll梯度分离单核细胞级分(1.077 g/cm3 PanEco, 俄罗斯)。对于免疫表型分型，我们使用了100,000个细胞，给其补充了1 μl市售的抗-CD8 PE/Cy5 (克隆RPA-T8)抗体(BioLegend, USA)、抗-CD4-Alexa Fluor 488 (克隆S3.5)抗体(Thermo Fisher,USA)和抗-CD2-PerCP Cy 5.5 (克隆RPA-2.10)抗体(BioLegend, USA)、抗-TcRVβ1(TRBV9)-PE抗体(Beckman Coulter, USA)，在室温温育20分钟并用等体积的汉克氏溶液洗涤2次。使用FACSAria III细胞分选仪(USA)分析样品。

关于实验时间，将选择的动物保持在配备饲料箱、标签支架的单个金属笼子中，每个笼子1只动物。饮食由根据平均饲养标准的全合一饲料、水果、蔬菜构成。动物从中央水供给器接收水。

基于用针对主要淋巴细胞表面决定簇(CD4、CD8、CD2)的抗体的细胞计数分析的结果，将动物分成三组，4只动物/组，包括对照组。对照组的动物静脉内接收人免疫球蛋白(“Immunovenin”, Microgen, 俄罗斯)。

关于随着产物剂量而变化的恒河猴(Macaca mulatta)的外周血中TRBV9+ T细胞的百分比(%)的对比研究，分别以每只动物1和10 mg的剂量给2个实验组施用MA-042。根据说明书将“Immunovenin”用无菌水稀释，并以每只动物10 mg的浓度施用。将MA-042产物用不含钙和镁的Dulbecco氏磷酸盐缓冲盐水(DPBS)稀释。将产物以每次注射不超过5 ml的体积施用进右前肢的肘静脉中。

观察期持续42天。如在表3中所指示，选择血液样品。如上所述进行样品的免疫表型分型和分析。

表3. 用于确定T细胞中的TRBV9+的百分比(%)的全血取样方案。

周	天	小时	备注
				1	1	0	背景(在第一次施用前)
1	4	72	施用后72小时
				1	7	144	施用后144小时
3	15	336	施用后336小时
				4	25	576	施用后576小时
6	42	984	施用后984小时

结果，在MA-042施用后72小时，动物在两种浓度表现出外周血中的TRBV9+的几乎完全消除。在1 mg/动物的浓度，在产物施用后336小时，检测到TRBV9+ 淋巴细胞的一部分。在接受10 mg剂量的产物的动物中，没有检测到TRBV9+ 淋巴细胞。在施用后42天，在实验组中没有检测到TRBV9+ 淋巴细胞的病例；对照组表现出与在实验之前相同水平的TRBV9+ 淋巴细胞。

实施例8. 包含本发明的抗体的药物组合物的制备

通过本领域已知的标准技术，得到药物组合物。

药物组合物的组分显示在表4中。

表4. 药物组合物的组分的浓度。

组分	浓度
		抗体МА-042	10-50 mg/ml
10 mM柠檬酸盐缓冲液至pH	6.0-7.0
		氯化钠	50-150 mM
蔗糖、海藻糖	0.3-0.5%
		注射用水	补至1 ml.

实施例9. 包含含抗体的药物组合物的试剂盒

为了生产含有包含抗体MA-042组合物的剂型的试剂盒，将根据实施例5制备的药物组合物在无菌条件下密封在1 ml安瓿或注射器中，贴标签，并包装进塑料或卡纸板容器中。

并且，在安瓿容器中包括插页。

<110> 拜奥卡德联合股份公司

<120> 特异性地结合人TRBV9的单克隆抗体

<130> MA042.docx

<150> RU 2018146029

<151> 2019-12-24

<160> 22

<170> PatentIn 3.5版

<210> 1

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 亲本抗体TRBV9-2的HCDR1序列

<400> 1

Asp Tyr Leu Val His

1 5

<210> 2

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 亲本抗体TRBV9-2的HCDR2序列

<400> 2

Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Thr Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe Glu

1 5 10 15

Gly

<210> 3

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 亲本抗体TRBV9-2的HCDR3序列

<400> 3

Ser Trp Arg Arg Gly Leu Arg Gly Ile Gly Phe Asp Tyr

1 5 10

<210> 4

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 亲本抗体TRBV9-2的LCDR1序列

<400> 4

Lys Ala Ser Lys Ser Ile Asn Lys Tyr Leu Ala

1 5 10

<210> 5

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 亲本抗体TRBV9-2的LCDR2序列

<400> 5

Asp Gly Ser Thr Leu Gln Ser

1 5

<210> 6

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 亲本抗体TRBV9-2的LCDR3序列

<400> 6

Gln Gln His Asn Glu Tyr Pro Pro Thr

1 5

<210> 7

<211> 366

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 亲本抗体TRBV9-2的重链的可变结构域的核苷酸序列

<400> 7

caaatacaac tggtgcagag cgggccagaa ttgagagaac ccggagaatc tgtgaagctg 60

agttgtaagg ccagcggata cactttcact gactatctcg tgcactgggt gaaacaggct 120

cccggtaagg gattgaaatg gatgggatgg atcaatactt ataccggcac acctacatat 180

gcagacgatt tcgaggggcg atttgtgttc agtttggagg cctctgccag cacggcgaac 240

ctgcagatat cgaatctcaa gaatgaggac accgccacgt atttctgcgc tagatcttgg 300

agacgcggat tgagaggtat cggattcgac tactggggac aaggcgtctt cgtgactgta 360

tcatcc 366

<210> 8

<211> 122

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 亲本抗体TRBV9-2的重链的可变结构域的氨基酸序列

<400> 8

Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Arg Glu Pro Gly Glu

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Leu Val His Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Thr Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe

50 55 60

Glu Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Glu Ala Ser Ala Ser Thr Ala Asn

65 70 75 80

Leu Gln Ile Ser Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Trp Arg Arg Gly Leu Arg Gly Ile Gly Phe Asp Tyr Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Val Phe Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 9

<211> 321

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 亲本抗体TRBV9-2的轻链可变结构域的核苷酸序列

<400> 9

gatgtacaga tgacacaatc accctacaac cttgctgctt cccctgggga aagtgtcagt 60

atcaattgca aggcatcgaa gtcgatcaac aagtatcttg cgtggtatca gcagaagcca 120

ggaaagccca acaagctcct gatctatgac ggctctacac tgcaatctgg cataccttcg 180

cggttttctg gctcggggtc cgggactgac ttcactctta caatacgagg acttgaaccc 240

gaagacttcg gcctgtatta ctgccagcag cacaatgagt atccacctac cttcggggct 300

ggcaccaagt tggagcttaa g 321

<210> 10

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 亲本抗体TRBV9-2的轻链可变结构域的氨基酸序列

<400> 10

Asp Val Gln Met Thr Gln Ser Pro Tyr Asn Leu Ala Ala Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Ser Val Ser Ile Asn Cys Lys Ala Ser Lys Ser Ile Asn Lys Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Pro Asn Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asp Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Arg Gly Leu Glu Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Gly Leu Tyr Tyr Cys Gln Gln His Asn Glu Tyr Pro Pro

85 90 95

Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys

100 105

<210> 11

<211> 639

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 亲本抗体TRBV9-2的轻链的核苷酸序列

<400> 11

gacgtgcaga tgacccagtc cccctacaac ctggccgcct cccccggcga gtccgtgtcc 60

atcaactgca aggcctccaa gtccatcaac aagtacctgg cctggtacca gcagaagccc 120

ggcaagccca acaagctgct gatctacgac ggctccaccc tgcagtccgg catcccctcc 180

aggttctccg gctccggctc cggcaccgac ttcaccctga ccatcagggg cctggagccc 240

gaggacttcg gcctgtacta ctgccagcag cacaacgagt acccccccac cttcggcgcc 300

ggcaccaagc tggagctgaa gcgaactgtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 360

tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgtcgtgt gcctgctgaa taacttctat 420

cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 480

gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 540

ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 600

ctgtcctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagag 639

<210> 12

<211> 213

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 亲本抗体TRBV9-2的轻链的氨基酸序列

<400> 12

Asp Val Gln Met Thr Gln Ser Pro Tyr Asn Leu Ala Ala Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Ser Val Ser Ile Asn Cys Lys Ala Ser Lys Ser Ile Asn Lys Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Pro Asn Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asp Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Arg Gly Leu Glu Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Gly Leu Tyr Tyr Cys Gln Gln His Asn Glu Tyr Pro Pro

85 90 95

Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu

210

<210> 13

<211> 1365

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 亲本抗体TRBV9-2的重链的核苷酸序列

<400> 13

cagatccagc tggtgcagtc cggccccgag ctgagggagc ccggcgagtc cgtgaagctg 60

tcctgcaagg cctccggcta caccttcacc gactacctgg tgcactgggt gaagcaggcc 120

cccggcaagg gcctgaagtg gatgggctgg atcaacacct acaccggcac ccccacctac 180

gccgacgact tcgagggcag gttcgtgttc tccctggagg cctccgcctc caccgccaac 240

ctgcagatct ccaacctgaa gaacgaggac accgccacct acttctgcgc caggtcctgg 300

aggaggggcc tgaggggcat cggcttcgac tactggggcc agggcgtgtt cgtgaccgtg 360

tcctccgcct ccaccaaggg cccatcggtc ttccccctgg caccctcctc caagagcacc 420

tctgggggca cagcggccct gggctgcctg gtcaaggact acttccccga accggtgacg 480

gtgtcgtgga actcaggcgc cctgaccagc ggcgtgcaca ccttcccggc tgtcctacag 540

tcctcaggac tctactccct cagcagcgtg gtgactgtgc cctctagcag cttgggcacc 600

cagacctaca tctgcaacgt gaatcacaag cccagcaaca ccaaggtgga caagaaagtt 660

gagcccccga aatcttgtga caaaactcac acatgcccac cgtgcccagc acctgaactc 720

ctggggggac cgtcagtctt cctcttcccc ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc 780

cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag 840

ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag 900

cagtacaaca gcacgtaccg tgtggtcagc gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg 960

aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa 1020

accatctcca aagccaaagg gcagccccga gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc 1080

cgggatgagc tgaccaagaa ccaggtcagc ctgacctgcc tggtcaaagg cttctatccc 1140

agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat gggcagccgg agaacaacta caagaccacg 1200

cctcccgtgc tggactccga cggctccttc ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag 1260

agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac 1320

cactacacgc agaagagcct ctccctgtct ccgggtaaat gataa 1365

<210> 14

<211> 453

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 亲本抗体TRBV9-2的重链的氨基酸序列

<400> 14

Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Arg Glu Pro Gly Glu

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Leu Val His Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Thr Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe

50 55 60

Glu Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Glu Ala Ser Ala Ser Thr Ala Asn

65 70 75 80

Leu Gln Ile Ser Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Trp Arg Arg Gly Leu Arg Gly Ile Gly Phe Asp Tyr Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Val Phe Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro

115 120 125

Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr

130 135 140

Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr

145 150 155 160

Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro

165 170 175

Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr

180 185 190

Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn

195 200 205

His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Pro Lys

210 215 220

Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu

225 230 235 240

Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr

245 250 255

Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val

260 265 270

Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val

275 280 285

Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser

290 295 300

Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu

305 310 315 320

Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala

325 330 335

Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro

340 345 350

Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln

355 360 365

Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala

370 375 380

Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr

385 390 395 400

Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu

405 410 415

Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser

420 425 430

Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser

435 440 445

Leu Ser Pro Gly Lys

450

<210> 15

<211> 366

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 抗体MA-042的可变重链的核苷酸序列

<400> 15

caggtgcaac ttgttcagtc ggggagcgaa cttaagaagc caggggaaag tgtaaaagtg 60

agctgcaaag cctcaggcta cacgtttacc gattatcttg tgcattgggt tagacaggct 120

ccaggtcaag gactggaatg gatgggatgg atcaatacct atacagggac acccacatat 180

gccgatgact ttgagggacg gtttgtcttc tcacttgata ccagtgtttc cactgctaac 240

ctccagataa gcagcctgaa ggcagaggac accgccgttt atttctgcgc ccgatcatgg 300

aggagaggct tgcgaggaat tggattcgat tactggggtc agggcacttt agtcactgtc 360

tctagc 366

<210> 16

<211> 122

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 亲本抗体MA-042的重链的可变结构域的氨基酸序列

<400> 16

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Leu Val His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Thr Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe

50 55 60

Glu Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Asn

65 70 75 80

Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Trp Arg Arg Gly Leu Arg Gly Ile Gly Phe Asp Tyr Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 17

<211> 321

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 抗体MA-042的可变轻链的核苷酸序列

<400> 17

gacatacaga tgactcaaag cccttattcg ctcagtgcgt cggtcgggga cagagtaacc 60

atcacctgca aggcgtcaaa gtcaatcaat aagtatctgg cgtggttcca gcagaagcca 120

ggaaagccta acaagctatt aatatacgat gggtctaccc tccaatccgg ggtcccttca 180

cgattttctg gaagcggctc aggaaccgat ttcacgctga ccatcagtag cttggagcct 240

gaggactttg ccacttatta ttgccagcag cacaacgagt atcctcccac cttcggacag 300

ggtacaaaac tggagatcaa g 321

<210> 18

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 抗体MA-042的可变轻链的氨基酸序列

<400> 18

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Tyr Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Lys Ser Ile Asn Lys Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Pro Asn Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asp Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Asn Glu Tyr Pro Pro

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 19

<211> 1356

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 抗体MA-042的重链的核苷酸序列

<400> 19

caggtgcaac ttgttcagtc ggggagcgaa cttaagaagc caggggaaag tgtaaaagtg 60

agctgcaaag cctcaggcta cacgtttacc gattatcttg tgcattgggt tagacaggct 120

ccaggtcaag gactggaatg gatgggatgg atcaatacct atacagggac acccacatat 180

gccgatgact ttgagggacg gtttgtcttc tcacttgata ccagtgtttc cactgctaac 240

ctccagataa gcagcctgaa ggcagaggac accgccgttt atttctgcgc ccgatcatgg 300

aggagaggcc tacgaggaat cggattcgat tactggggtc agggcacttt agtcactgtc 360

tctagcgcta gcaccaaggg cccatcggtc ttccccctgg caccctcctc caagagcacc 420

tctgggggca cagcggccct gggctgcctg gtcaaggact acttccccga accggtgacg 480

gtgtcgtgga actcaggcgc cctgaccagc ggcgtgcaca ccttcccggc tgtcctacag 540

tcctcaggac tctactccct cagcagcgtg gtgaccgtgc cctccagcag cttgggcacc 600

cagacctaca tctgcaacgt gaatcacaag cccagcaaca ccaaggtgga caagagagtt 660

gagcccaaat cttgtgacaa aactcacaca tgcccaccgt gcccagcacc tgaactcctg 720

gggggaccgt cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg 780

acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc 840

aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag 900

tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat 960

ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc 1020

atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg 1080

gaggagatga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc 1140

gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct 1200

cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctatagca agctcaccgt ggacaagagc 1260

aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac 1320

tacacgcaga aaagcctctc cctgtccccg ggtaaa 1356

<210> 20

<211> 452

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 抗体MA-042的重链的氨基酸序列

<400> 20

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Leu Val His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Thr Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe

50 55 60

Glu Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Asn

65 70 75 80

Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Trp Arg Arg Gly Leu Arg Gly Ile Gly Phe Asp Tyr Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro

115 120 125

Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr

130 135 140

Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr

145 150 155 160

Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro

165 170 175

Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr

180 185 190

Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn

195 200 205

His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser

210 215 220

Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu

225 230 235 240

Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu

245 250 255

Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser

260 265 270

His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu

275 280 285

Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr

290 295 300

Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn

305 310 315 320

Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro

325 330 335

Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln

340 345 350

Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val

355 360 365

Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val

370 375 380

Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro

385 390 395 400

Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr

405 410 415

Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val

420 425 430

Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu

435 440 445

Ser Pro Gly Lys

450

<210> 21

<211> 642

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 抗体MA-042的轻链的核苷酸序列

<400> 21

gacatacaga tgactcaaag cccttattcg ctcagtgcgt cggtcgggga cagagtaacc 60

atcacctgca aggcgtcaaa gtcaatcaat aagtatctgg cgtggttcca gcagaagcca 120

ggaaagccta acaagctatt aatatacgat gggtctaccc tccaatccgg ggtcccttca 180

cgattttctg gaagcggctc aggaaccgat ttcacgctga ccatcagtag cttggagcct 240

gaggactttg ccacttatta ttgccagcag cacaacgagt atcctcccac cttcggacag 300

ggtacaaaac tggagatcaa gcgtacggtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 360

tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 420

cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 480

gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 540

ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 600

ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gt 642

<210> 22

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 抗体MA-042的轻链的氨基酸序列

<400> 22

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Tyr Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Lys Ser Ile Asn Lys Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Pro Asn Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asp Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Asn Glu Tyr Pro Pro

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

Claims (18)

1. 特异性地结合人T细胞受体的TRBV-9家族β-链区域的单克隆抗体或其抗原结合片段，包含其氨基酸序列显示在SEQ ID No: 16中的重链可变结构域和其氨基酸序列显示在SEQ ID No: 18中的轻链可变结构域。

2. 根据权利要求1所述的单克隆抗体，所述单克隆抗体包括具有SEQ ID No: 20的氨基酸序列的重链和具有SEQ ID No: 22的氨基酸序列的轻链。

3.根据权利要求2中的任一项所述的单克隆抗体，所述单克隆抗体是全长IgG抗体。

4.编码根据权利要求1-3中的任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段的核酸，其中所述抗体或其抗原结合片段特异性地结合人T受体的TRBV9家族β-链区域。

5.含有根据权利要求4所述的核酸的表达载体。

6.得到宿主细胞的方法，所述宿主细胞用于生产根据权利要求1-3中的任一项所述的抗体或其抗原结合片段，所述方法包括用根据权利要求5所述的载体共转化细胞。

7.用于得到根据权利要求1-3中的任一项所述的抗体或其抗原结合片段的宿主细胞，所述宿主细胞包含根据权利要求4所述的核酸。

8.得到根据权利要求1-3中的任一项所述的抗体或其抗原结合片段的方法，所述方法包括，在确保所述抗体产生的条件下在培养基中培养根据权利要求7所述的宿主细胞，随后分离和纯化得到的抗体。

9.用于预防或治疗由人T受体的TRBV9家族β-链区域介导的疾病或障碍的药物组合物，所述药物组合物包含与一种或多种药学上可接受的赋形剂组合的治疗有效量的根据权利要求1-3中的任一项所述的抗体或其抗原结合片段。

10.根据权利要求9所述的药物组合物，其中所述疾病或障碍选自：强直性脊柱炎、乳糜泻、T细胞白血病、T细胞淋巴瘤。

11.用于预防或治疗由带有TRBV9家族β-链的人T细胞受体介导的疾病或障碍的药物组合物，所述药物组合物含有治疗有效量的根据权利要求1-3中的任一项所述的抗体或其抗原结合片段和至少治疗有效量的一种其它治疗活性化合物。

12.根据权利要求11所述的药物组合物，其中所述疾病或障碍选自：强直性脊柱炎、乳糜泻、T细胞白血病、T细胞淋巴瘤。

13.根据权利要求11-12中的任一项所述的药物组合物，其中所述其它治疗活性化合物选自小分子、抗体或类固醇激素。

14.一种用于在需要这种抑制的受试者中抑制其β-链属于TRBV9家族的T细胞受体的生物活性的方法，所述方法包括给所述受试者施用有效量的根据权利要求1-3中的任一项所述的抗体或其抗原结合片段。

15.一种用于治疗由带有TRBV9家族β-链的人T细胞受体介导的疾病或障碍的方法，所述方法包括给需要这种治疗的受试者施用治疗有效量的根据权利要求1-3中的任一项所述的抗体或其抗原结合片段或根据权利要求9-13所述的药物组合物。

16.根据权利要求17所述的用于治疗疾病或障碍的方法，其中所述疾病或障碍选自：强直性脊柱炎、乳糜泻、T细胞白血病、T细胞淋巴瘤。

17.根据权利要求1-3中的任一项所述的抗体或其抗原结合片段或根据权利要求9-13中的任一项所述的药物组合物用于在需要这种治疗的受试者中治疗由带有TRBV9家族β-链的人T细胞受体介导的疾病或障碍的用途。

18.根据权利要求17所述的用途，其中所述疾病选自：强直性脊柱炎、乳糜泻、T细胞白血病、T细胞淋巴瘤。

Images