ES2759503T3 - Conjugados de una glicoproteína o un glicano con una carga útil tóxica - Google Patents

Conjugados de una glicoproteína o un glicano con una carga útil tóxica Download PDF

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Abstract

Un procedimiento de preparación de un conjugado de la molécula de carga útil tóxica para glicoproteína representada por la fórmula I [D-L-G]n-Gp Fórmula I en la que Gp es una glicoproteína que comprende un N-glicano, en la que el N-glicano comprende un residuo de GlcNAc unido por una unión ß-N a una asparagina; n es un número entero de 1 a 20; D es una molécula de carga útil tóxica; L es un grupo ligador que une covalentemente G a D; y G es una estructura de sacárido representada por la fórmula II**Fórmula** en la que R es un enlace glicosídico al residuo de GlcNAc unido por una unión ß-N a una asparagina; X1 es H; X2 es un enlace a L y X3 y X4 son cada uno OH; X5 es CH2OH; en la que el procedimiento comprende las etapas de: proporcionar una glicoproteína que comprende un N-glicano que comprende un sitio aceptor, en el que la glicoproteína que comprende el N-glicano que comprende el sitio aceptor se prepara mediante el contacto de una glicoproteína que comprende un N-glicano con una endoglicosidasa, en el que el N-glicano es un N-glicano tipo híbrido y la endoglicosidasa es EndoS2; y hacer reaccionar una molécula donante con la glicoproteína que comprende el N-glicano que comprende el sitio aceptor en presencia de una glicosiltransferasa, en la que la glicosiltransferasa es ß1,4-GalT1(Y285L) humana o ß1,4-GalT1(Y285L) bovina; en la que la molécula donante es UDP-2-(2-azidoacetamido)-2-deoxi-Gal (UDP-GalNAz).

Description

DESCRIPCIÓN
Conjugados de una glicoproteína o un glicano con una carga útil tóxica
Campo de la invención
La invención se refiere a un conjugado de la molécula de carga útil tóxica para glicoproteína, a un conjugado de la molécula de carga útil tóxica-glicano, a un procedimiento para preparar el conjugado de la molécula de carga útil tóxica para glicoproteína, a una composición farmacéutica, a un procedimiento para modular el crecimiento de una población celular y a un procedimiento para tratar y/o modular el crecimiento y/o profilaxis de las células tumorales. Antecedentes de la invención
Los conjugados de moléculas de carga útil tóxicas, tales como fármacos citotóxicos con proteínas, por ejemplo anticuerpos, pueden ser útiles, por ejemplo, en la terapia del cáncer. Los conjugados disponibles actualmente utilizan diversas reacciones químicas para conjugar moléculas de carga útil tóxicas con proteínas; sin embargo, muchos de ellos pueden no ser óptimos en términos de, por ejemplo, actividad de la molécula de carga útil tóxica, solubilidad acuosa del conjugado o las condiciones de reacción requeridas para la conjugación.
Por ejemplo, un conjugado voluminoso o un conjugado que tiene una solubilidad subóptima puede no administrarse eficientemente a su diana. Una molécula de carga útil tóxica no siempre se libera eficientemente de la proteína y/o se administra a las células o en varias partes de las células. La toxicidad de la molécula de carga tóxica se puede reducir como resultado de la conjugación. En algunos casos, la unión de la molécula de carga útil tóxica puede no ser estable frente a la degradación química o bioquímica durante la fabricación o en condiciones fisiológicas, por ejemplo, en sangre, suero, plasma o tejidos. Además, la conjugación de la molécula de carga útil tóxica en una o más posiciones aleatorias y/o grupos químicos de la proteína puede perjudicar las propiedades farmacocinéticas del conjugado o la especificidad de la proteína, tal como un anticuerpo, hacia su diana.
El documento WO 2009/006620 describe derivados del ácido oligosiálico, procedimientos de fabricación y usos inmunológicos.
El documento WO 2005/012484 describe conjugados en los que una toxina se une a un anticuerpo a través de un grupo de unión a glicosilo.
Staudacher et al., Glycoconjugate Journal 1992, 9, 82-85 describe la a1-6(a1-3)-difucosilación de la N-acetilglucosamina unida a asparagina en la fosfolipasa de veneno de abeja A2.
El documento WO 2007/011968 describe conjugados de fármacos ligandos que comprenden un ligador a base de pglucurónido y procedimientos para usar tales compuestos.
El documento US 2007/027068 describe la remodelación y la glucoconjugación de la eritropoyetina.
El documento WO 97/34632 describe anticuerpos específicos de células B humanizadas glicosiladas.
El documento WO 2011/064303 describe compuestos sialoquiméricos.
El documento WO 2008/090151 describe compuestos antivirales.
El documento WO 2014/065661 describe anticuerpos modificados, conjugados de anticuerpos y procesos para su preparación.
Propósito de la invención
El propósito de la presente invención es proporcionar conjugados de molécula de carga útil tóxica para glicoproteína y conjugados de molécula de carga útil tóxica-glicano que tienen propiedades mejoradas en comparación con los conjugados conocidos y que retienen una alta actividad de la molécula de carga útil tóxica. El propósito de la presente invención también es proporcionar procedimientos para preparar los conjugados de la molécula de carga útil tóxica para la glicoproteína.
Sumario
El procedimiento para preparar un conjugado de la molécula de carga útil tóxica para glicoproteína de acuerdo con la presente invención se caracteriza por lo que se presenta en la reivindicación 1.
Breve descripción de los dibujos
Los dibujos adjuntos, que se incluyen para proporcionar una comprensión adicional de la invención y constituyen una parte de esta memoria descriptiva, ilustran realizaciones de la invención y, junto con la descripción, ayudan a explicar los principios de la invención. En los dibujos:
Figura 1 muestra la citotoxicidad in vitro de los derivados de dolastatina contra la línea celular de cáncer de ovario SKOV-3 como % de viabilidad en comparación con las células de control (eje y) medidas a diferentes concentraciones de derivados en el medio (eje x). La numeración del compuesto es de acuerdo con el Ejemplo 1:1,monometilauristatina F (MmAf ); 3,N-(6-O-propargil-D-galactosil)-MMAF; 5,N-(2-desoxi-D-glucosil)-MMAF; 8,N-[6-O-(p-D-galactopiranosil)-D-galactosil]-MMAF; 10,N-{4-O-[4-O-(a-D-galactopiranosil)-p-D-galactopiranosil]-D-glucosil}-MMAF; 11,N-{4-O-[3-O-(a-N-acetilneuraminil)-p-D-galactopiranosil]-D-glucosil}-MMAF(11);
Figura 2 muestra el análisis espectrométrico de masas MALDI-TOF de CMP-9-desoxi-9-azido-NeuAc purificado. El espectro muestra el producto como la señal principal en m/z 637 y CTP en m/z 479;
Figura 3 muestra el análisis MALDI-TOF MS de N-glicano A) cetuximab, B) cetuximab digerido con a1,3-galactosidasa, C) cetuximab digerido con a1,3-galactosidasa y sialidasa A y D) cetuximab digerido con a1,3-galactosidasa, sialidasa A y p1,4-galactosidasa;
Figura 4 muestra el análisis de MALDI-TOF MS de N-glicanos de cetuximab digerido con a l, 3-galactosidasa y Sialidasa A y galactosilado con p1,4-galactosiltransferasa;
Figura 5 demuestra el análisis de MALDI-TOF MS de la reacción de ST6Gal1 de cetuximab digerido con a1,3-galactosidasa-y Sialidasa A y galactosilado;
Figura 6 muestra el análisis de MALDI-TOF MS de N-glicanos de la región Fc de cetuximab digerido con Endo S;
Figura 7 muestra el MALDI-TOF de Fc-glicanos de cetuximab tratados con Endo S p1-4-galactosilados; Figura 8 muestra el MALDI-TOF de Fc-glicanos tratados con Endo S p-1,4-galactosilados y a-2,6-sialilados de cetuximab;
Figura 9 demuestra el MALDI-TOF de A) Fc-glicanos de cetuximab y B) Fc-glicanos de cetuximab p-1,4-galactosilados y a-2,6-sialilados;
Figura 10 muestra MALDI-TOF de Fc-glicanos de cetuximab tratados con Endo S p-1,4-galactosilados y a-2 ,6-sialilados oxidados;
Figura 11 muestra MALDI-TOF de N-glicanos de cetuximab p-1,4-galactosilados y a-2,6-sialilados oxidados. A) MALDI reflector negativo, B) Reflector positivo;
Figura 12 demuestra el MALDI-TOF MS de cadenas livianas aisladas de MODO-AOAA-levulinil-cetuximab; Figura 13 muestra los espectros de MALDI-TOF de fragmentos Fc obtenidos de (A) MODO-ABAA-cetuximab y (B) MODO-ABAA-cetuximab-S; y
Figura 14 muestra la citotoxicidad in vitro de conjugados de anticuerpo-fármaco en las células cancerosas. Descripción detallada de la invención
Se divulga un conjugado de la molécula de carga útil tóxica para glicoproteína representado por la fórmula I
[D-L-G]n-Gp Fórmula I
en la que
Gp es una glicoproteína que comprende un N-glicano, en la que el N-glicano comprende un residuo de GlcNAc unido por una unión p-N a una asparagina;
n es un número entero de 1 a 20;
D es una molécula de carga útil tóxica;
L es un grupo ligador que une covalentemente G a D; y
G es una estructura de sacárido representada por la fórmula II
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Fórmula II
en la que
R es un enlace glicosídico al N-glicano o un enlace glicosídico al residuo de GIcNAc unido por una unión p-N a una asparagina;
X1 es H o carboxilo;
X2, X3 y X4 son cada uno de modo independiente OH, H, amino, acilamida C2-C6, éster de fosfato o sulfato, o un enlace a L; X5 es CH2OH, carboxilo, CH3, H, alquilo C1-C3 o alquilo C1-C3 sustituido, o un enlace a L; a condición de que un sustituyente seleccionado de X2, X3, X4 y X5 es un enlace a L o se une por medio de un enlace a L; y
a condición de que cuando X1 es carboxilo, entonces X2 es H, X3 es OH, X5 es alquilo C1-C3 o alquilo C1-C3 sustituido; R es un enlace glicosídico al N-glicano; y X4 es un enlace a L o X5 se une por medio de un enlace a L; o
cuando X1 es H, entonces R es un enlace glicosídico al N-glicano o al residuo de GlcNAc unido por una unión p-N a una asparagina.
En este contexto, los términos "Neu5Ac", "NeuNAc" y "ácido neuramínico" se refieren al ácido N-acetilneuramínico; "Gal" se refiere a D-galactosa; "GlcNAc" se refiere a 2-acetamido-2-desoxi-D-glucosa (N-acetil-D-glucosamina); "Fuc" se refiere a L-fucosa; "Glc" se refiere a D-glucosa; "Man" se refiere a D-manosa; "Hex" se refiere a hexosa; "NeuGc" se refiere a ácido N-glicolil-neuramínico; y todos los residuos de monosacáridos están en forma de piranosa y azúcares D excepto L-fucosa a menos que se especifique lo contrario.
La notación de las estructuras de sacárido y los enlaces glicosídicos entre los residuos de sacárido usado en la presente memoria siguen a los comúnmente utilizados en la técnica, por ejemplo, "Galp4GlcNAcp" se debe entender que significa un residuo Gal unido por un enlace covalente entre el primer átomo de carbono del residuo Gal al cuarto átomo de carbono del residuo N-acetilglucosamina unido por un átomo de oxígeno en la configuración beta, y que ambos residuos de monosacáridos están en forma de piranosa p-anomérica.
La nomenclatura de carbohidratos en la presente memoria está esencialmente de acuerdo con las recomendaciones de la Comisión de Nomenclatura Bioquímica IUPAC-IUB (por ejemplo, Carbohydrate Res. 1998, 312, 167; Carbohydrate Res. 1997, 297, 1; Eur. J. Biochem. 1998, 257, 29).
La glicoproteína se puede referir a cualquier glicoproteína, siempre que comprenda al menos un N-glicano que comprende un residuo GlcNAc unido por una unión p-N a una asparagina de la glicoproteína. La glicoproteína se puede seleccionar en función de la unión selectiva que confiere para permitir la administración de la molécula de carga útil tóxica a células diana específicas
En una realización, la glicoproteína es un anticuerpo o un fragmento del mismo. El anticuerpo se puede seleccionar en función de la unión selectiva que confiere para permitir la administración de la molécula de carga útil tóxica a células diana específicas. En una realización, la glicoproteína es capaz de unirse a una molécula diana.
En una realización, la molécula diana es un receptor y la glicoproteína es un ligando para el receptor. En una realización, la molécula diana es una molécula diana de cáncer.
En una realización, el conjugado de la molécula de carga útil tóxica para glicoproteína se internaliza en una célula que expresa la molécula diana después de que el conjugado se une a la molécula diana. En otras palabras, después de unirse a su molécula diana en la célula diana, por ejemplo, en una célula tumoral, el conjugado de la molécula de carga útil tóxica para glicoproteína se internaliza en la célula diana como resultado de la unión. El efecto de esto es que el conjugado de la molécula de carga útil tóxica para la glicoproteína es captado por la célula diana.
Las moléculas diana o moléculas diana de cáncer (antígenos) para el conjugado de la molécula de carga útil tóxica para glicoproteína puede incluir las proteínas CD, tales como CD2, Cd3, CD4, CD5, CD6, CD11, CD8, CD11a, CD19, CD20, CD22, CD25, CD26, CD30, CD33, CD34, CD37, CD38, CD40, CD44, CD46, CD52, CD56, CD79, CD105, y CD138; miembros de la familia del receptor ErbB, tales como receptor del factor de crecimiento epidérmico 1 (EGFR), receptor del factor de crecimiento epidérmico 2 (HER2/neu), receptor HER3 o HER4; moléculas de adhesión celular, tales como LFA-1, Macl, p150,95, VLA-4, iCa M-1, VCAM, EpCAM, alfa4/beta7 integrina, y alfa v/beta3 integrina que incluyen sus subunidades alfa o beta; factores de crecimiento, tales como VEGF; factor tisular (TF); factor de necrosis tumoral alfa (TNF-a); factor de crecimiento endotelial vascular humano (VEGF); glicoproteína Ilb/IIIa; TGF-beta; interferón alfa (alfa-IFN); una interleuquina, tal como IL-8; un receptor de interleuquina, tal como receptor de IL-2; IgE; virus sincitial respiratorio (RSV); glicoproteína de envoltura gp120 HIV-1, N-glicanos tipo de alta manosa asociados a cáncer; antígenos del grupo sanguíneo Apo2, receptor de muerte; receptor de flk2/flt3; receptor de obesidad (OB); receptor mpl; CTLA-4; receptor de transferrina; estructura de glcano asociada con cáncer, tal como Lewis y o GD3; proteína C, etc.
En una realización, la molécula diana se selecciona del grupo que consiste en CD2, CD3, CD4, CD5, CD6, CD11, CD8, CD11a, CD19, CD20, CD22, CD25, CD26, CD30, CD33, CD34, CD37, CD38, CD40, CD44, CD46, CD52, CD56, CD79, CD105, CD138, receptor del factor de crecimiento epidérmico 1 (EGFR), receptor del factor de crecimiento epidérmico 2 (HER2/neu), receptor HER3 o HER4, LfA-1, Macl, p150,95, VLA-4, ICAM-1, VCAM, EpCAM, alfa4/beta7 integrina, alfa v/beta3 integrina que incluye sus subunidades alfa o beta (por ejemplo anticuerpos anti-CDlla, anti-CD18 o anti-CDllb), factor tisular (TF), factor de necrosis tumoral alfa (TNF-a), factor de crecimiento endotelial vascular humano (VEGF), glicoproteína Ilb/IIIa, TGF-beta, interferón alfa (alfa-IFN), IL-8, receptor de IL-2, IgE, virus sincitial respiratorio (RSV), glicoproteína de envoltura gp120 HIV-1, N-glicanos tipo de alta manosa asociados a cáncer, antígenos del grupo sanguíneo Apo2, receptor de muerte, receptor flk2/flt3, receptor de obesidad (OB), receptor mpl, CTLA-4, receptor de transferrina, Lewis y, GD3 y proteína C.
Los anticuerpos que se pueden usar son los anticuerpos para CD2, CD3, CD4, CD5, CD6, CD11, CD19, CD20, CD22, CD26, CD30, CD33, CD37, CD38, CD40, CD44, CD52, CD56, CD79, CD105, CD138, EphA receptors (por ejemplo, receptor EphA2), receptores EphB, EGFr, EGFRvIII, HER2, HER3, trastuzumab, pertuzumab mesotelina, cripto, alfa beta6 integrina, VEGF, VEGFr , receptor de folato (por ejemplo, FOLR1), receptor de transferrina, Lewis y, GD3, o EpCAM.
En una realización, la molécula diana es EGFR. En otras palabras, el conjugado de la molécula de carga útil tóxica para glicoproteína es un conjugado de anti-EGFR.
En una realización, la molécula diana es el receptor del factor de crecimiento epidérmico 1 (EGFR) que tiene una secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 1.
En una realización, la molécula diana es EGFR y la glicoproteína es EGF o un análogo de EGF capaz de unirse a EGFR.
Las enfermedades neoplásicas o los cánceres para cuyo tratamiento se pueden emplear los conjugados anti-EGFR de la invención son tumores que sobreexpresan EGFR, tumores del tracto respiratorio (por ejemplo, carcinomas parvicelulares y no parvicelulares, carcinoma bronquial), que incluyen preferiblemente carcinoma no parvicelular del pulmón; tumores de los órganos digestivos (por ejemplo, esófago, estómago, vesícula biliar, intestino delgado, intestino grueso, recto), que incluyen especialmente tumores intestinales; tumores de las glándulas endocrinas y exocrinas (por ejemplo, glándulas tiroides y paratiroides, páncreas y glándulas salivales), que incluyen preferiblemente páncreas; tumores de la región de la cabeza y cuello (por ejemplo, laringe, hipofaringe, nasofaringe, orofaringe, labios, cavidad oral, lengua y esófago); y/o gliomas.
En una realización, la molécula diana es HER2 que tiene una secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 2.
En una realización, la glicoproteína es transferrina y la molécula diana es el receptor de transferrina.
En una realización, la glicoproteína es un anticuerpo monoclonal o un fragmento del mismo.
En una realización, la glicoproteína es a recombinant anticuerpo o un fragmento del mismo.
En una realización, la glicoproteína es un anticuerpo IgG o un fragmento del mismo.
El anticuerpo también puede ser por ejemplo, un scFv, un anticuerpo de dominio único, un Fv, un anticuerpo VHH, un diacuerpo, un diacuerpo en tándem, un Fab, un Fab 'o un F(ab)2. Además, el anticuerpo o un fragmento del mismo puede estar presente en formas monovalentes monoespecíficas, multivalentes monoespecíficas, bivalentes monoespecíficas o multivalentes multiespecíficas.
En una realización, la glicoproteína es un anticuerpo dirigido contra elt factor de crecimiento endotelial vascular humano (VEGF), receptor del factor de crecimiento epidérmico 1 (EGFR), factor de necrosis tumoral alfa (TNF-a), CD20, CD22, receptor del factor de crecimiento epidérmico 2 (HER2/neu), CD52, CD33, CD11a, glicoproteína IIb/IIIa, CD25, IgE, receptor de IL-2, Lewis y, HIV-1 glicoproteína de envoltura gp120, N-glicanos tipo de alta manosa asociados a cáncer, o virus sincitial respiratorio (RSV). Sin embargo, estas dianas de anticuerpos se proporcionan solo como ejemplos, a los cuales no se limita la invención; una persona experta apreciará que la glicoproteína de la invención no está limitada a ningún anticuerpo particular o forma del mismo.
En una realización, la glicoproteína es el anticuerpo bevacizumab (disponible por ejemplo bajo la marca AVASTIN®), tositumomab (BEXXAR®), etanercept (ENBREL®), trastuzumab (HErCe PTIN®), adalimumab (HUMIRA®), alemtuzumab (CAMPAt H®), gemtuzumab ozogamicin (MYLOTa Rg®), efalizumab (RAPTIVE®), rituximab (RITUXAN®), infliximab (REMICADE®), abciximab (REOPRO®), basiliximab (SIMULECT®), palivizumab (SYNAGIS®), omalizumab XOLAIR®), daclizumab (ZENAPAX®), cetuximab (ERBITUX®), panitumumab (VECTIBIX®) o ibritumomab tiuxetano (ZEVALIN®).
En una realización, la glicoproteína es el anticuerpo bevacizumab, tositumomab, etanercept, trastuzumab, adalimumab, alemtuzumab, gemtuzumab ozogamicin, efalizumab, rituximab, infliximab, abciximab, basiliximab, palivizumab, omalizumab, daclizumab, cetuximab, panitumumab, epratuzumab, 2G12, lintuzumab, nimotuzumab, GCM011, GCM012 o ibritumomab tiuxetano, o sus anticuerpos de glicoforma en los que el anticuerpo de glicoforma de comprende uno o más sitios de N-glicosilación introducidos en la cadena liviana y/o pesada.
En una realización, la glicoproteína es el anticuerpo abagovomab, actoxumab, adecatumumab, afutuzumab, altumomab, amatuximab, anifrolumab, apolizumab, atinumab, atlizumab, atorolimumab, bapineuzumab, basiliximab, bavituximab, belimumab, benralizumab, bertilimumab, besilesomab, bezlotoxumab, bimagrumab, bivatuzumab, blinatumomab, blosozumab, brentuximab, briakinumab, brodalumab, canakinumab, cantuzumab, caplacizumab, capromab, carlumab, catumaxomab, CC49, cedelizumab, cixutumumab, clazakizumab, clenoliximab, clivatuzumab, conatumumab, concizumab, crenezumab, CR6261, dacetuzumab, dalotuzumab, daratumumab, demcizumab, denosumab, detumomab, drozitumab, duligotumab, dupilumab, dusigitumab, ecromeximab, eculizumab, edobacomab, edrecolomab, eldelumab, elotuzumab, elsilimomab, enavatuzumab, enlimomab, enokizumab, enoticumab, ensituximab, epitumomab, epratuzumab, ertumaxomab, etaracizumab, etrolizumab, evolocumab, exbivirumab, fanolesomab, faralimomab, farletuzumab, fasinumab, felvizumab, fezakinumab, ficlatuzumab, figitumumab, flanvotumab, fontolizumab, foralumab, foravirumab, fresolimumab, fulranumab, futuximab, galiximab, ganitumab, gantenerumab, gavilimomab, gevokizumab, girentuximab, glembatumumab, golimumab, gomiliximab, guselkumab, ibalizumab, icrucumab, imciromab, imgatuzumab, inclacumab, indatuximab, intetumumab, inolimomab, inotuzumab, ipilimumab, iratumumab, itolizumab, ixekizumab, keliximab, labetuzumab, lambrolizumab, lampalizumab, lebrikizumab, lemalesomab, lerdelimumab, lexatumumab, libivirumab, ligelizumab, lintuzumab, lirilumab, lodelcizumab, lorvotuzumab, lucatumumab, lumiliximab, mapatumumab, margetuximab, maslimomab, mavrilimumab, matuzumab, mepolizumab, metelimumab, milatuzumab, minretumomab, mitumomab, mogamulizumab, morolimumab, motavizumab, moxetumomab, muromonab, namilumab, narnatumab, natalizumab, nebacumab, necitumumab, nerelimomab, nesvacumab, nimotuzumab, nivolumab, obinutuzumab, ocaratuzumab, ocrelizumab, odulimomab, ofatumumab, olaratumab, olokizumab, onartuzumab, oregovomab, orticumab, otelixizumab, oxelumab, ozanezumab, ozoralizumab, pagibaximab, panobacumab, parsatuzumab, pascolizumab, pateclizumab, patritumab, pemtumomab, perakizumab, pertuzumab, pidilizumab, pinatuzumab, pintumomab, placulumab, po-latuzumab, ponezumab, priliximab, pritoxaximab, pritumumab, quilizumab, racotumomab, radretumab, rafivirumab, ramucirumab, raxibacumab, regavirumab, reslizumab, rilotumumab, robatumumab, roledumab, romosozumab, rontalizumab, rovelizumab, ruplizumab, samalizumab, sarilumab, satumomab, secukinumab, seribantumab, setoxaximab, sevirumab, sibrotuzumab, sifalimumab, siltuximab, simtuzumab, siplizumab, sirukumab, solanezumab, solitomab, sonepcizumab, sontuzumab, stamulumab, suvizumab, tabalumab, tacatuzumab, talizumab, tanezumab, taplitumomab, tefibazumab, tenatumomab, teneliximab, teplizumab, teprotumumab, TGN1412, ticilimumab, tildrakizumab, tigatuzumab, tocilizumab, toralizumab, tovetumab, tralokinumab, TRBS07, tregalizumab, tremelimumab, tucotuzumab, tuvirumab, ublituximab, urelumab, urtoxazumab, ustekinumab, vantictumab, vapaliximab, vatelizumab, vedolizumab, veltuzumab, vepalimomab, vesencumab, visilizumab, volociximab, vorsetuzumab, votumumab, zalutumumab, zanolimumab, zatuximab, ziralimumab, 2G12 (anti-HIV-1 glicoproteína de envoltura gp120), o zolimomab. Sin embargo, estos anticuerpos se proporcionan solo como ejemplos, a los cuales no se limita la invención; una persona experta apreciará que el anticuerpo de la invención no está limitado a ningún anticuerpo particular o forma del mismo.
En una realización, la glicoproteína es cetuximab.
En una realización, cetuximab tiene una secuencia expuesta en las SEQ ID NOs: 3 y 4. En una realización, se introducen sitios de N-glicosilación adicionales en la cadena pesada de cetuximab. En una realización, la cadena pesada de cetuximab comprende una o más sustituciones seleccionadas del grupo que consiste en G161S, Q177N, L184N, S192N y L195N en SEQ ID NO: 3.
En una realización, los sitios de N-glicosilación adicionales se introducen en la cadena liviana de cetuximab. En una realización, la cadena liviana de cetuximab comprende una o más sustituciones seleccionadas del grupo que consiste en R18N, L154S, Q160N, S174N, y T180N en la SEQ ID NO:4.
En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-EGFR (o anticuerpo de glicoforma de cetuximab) comprende unos o más sitios de N-glicosilación adicionales. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-EGFR (o anticuerpo de glicoforma de cetuximab) comprende una cadena pesada que comprende SEQ ID NO: 3 o una o más mutaciones seleccionadas del grupo de G161S, Q177N, L184N, S192N, y L195N en la SEQ ID NO: 3, y una cadena liviana que comprende la SEQ ID NO:4 o una o más mutaciones seleccionadas del grupo de R18N, L154S, Q160N, S174N, y T180N en la SEQ ID NO: 4.
En una realización, la glicoproteína es trastuzumab.
En una realización, trastuzumab tiene una secuencia expuesta en las SEQ ID NOs: 5 y 6. En una realización, los sitios de N-glicosilación adicionales se introducen en cadena pesada de trastuzumab. En una realización, cadena pesada de trastuzumab comprende una o más sustituciones seleccionadas del grupo de: E89N, G162S, Q178N, L185N, S193N, y/o L196N en la SEQ ID NO: 5.
En una realización, los sitios de N-glicosilación adicionales se introducen en la cadena liviana de trastuzumab. En una realización, la cadena liviana de trastuzumab comprende una o más sustituciones seleccionadas del grupo de: R18N, L154S, Q160N, S174N, y/o T180N en la SEQ ID NO:6.
En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-HER2 (o anticuerpo de glicoforma de trastuzumab) comprende unos o más sitios de N-glicosilación adicionales. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-HER2 (o anticuerpo de glicoforma de trastuzumab) comprende una cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 5 o una o más mutaciones seleccionadas del grupo de E89N, G162S, Q178N, L185N, S193N, y L196N en la SEQ ID NO: 5, y una cadena liviana que comprende la SEQ ID NO:6 o una o más mutaciones seleccionadas del grupo de R18N, L154S, Q160N, S174N, y T180N en la SEQ ID NO:6.
En una realización, el anticuerpo es rituximab. En una realización, rituximab tiene una secuencia expuesta en las SEQ ID NOs: 7 y 8. En una realización, los sitios de N-glicosilación adicionales se introducen en cadena pesada de rituximab. En una realización, cadena pesada de rituximab comprende una o más sustituciones seleccionadas del grupo de: E89N, G163S, Q179N, L186N, S194N, y/o L197N en la SEQ ID NO: 7.
En una realización, los sitios de N-glicosilación adicionales se introducen en cadena liviana de rituximab. En una realización, cadena liviana de rituximab comprende una o más sustituciones seleccionadas del grupo de: K18N, L153S, Q159N, S173N, y/o T179N en la SEQ ID NO:8.
En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-CD20 (o anticuerpo de glicoforma de rituximab) comprende uno o más sitios de N-glicosilación adicionales. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-CD20 (o anticuerpo de glicoforma de rituximab) comprende una cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 7 o una o más mutaciones seleccionadas del grupo de E89N, G163S, Q179N, L186N, S194N, y L197N en la SEQ ID NO: 7, y una cadena liviana que comprende la SEQ ID NO:8 o una o más mutaciones seleccionadas del grupo de K18N, L153S, Q159N, S173N, y T179N en la SEQ ID NO:8.
En una realización, el anticuerpo es bevacizumab. En una realización, bevacizumab tiene una secuencia expuesta en las SEQ ID NOs: 9 y 10. En una realización, los sitios de N-glicosilación adicionales se introducen en cadena pesada de bevacizumab. En una realización, la cadena pesada de bevacizumab comprende una o más sustituciones seleccionadas del grupo de: E89N, G165S, Q181N, L188N, S196N, y/o L199N en la SEQ ID NO: 9.
En una realización, los sitios de N-glicosilación adicionales se introducen en cadena liviana de bevacizumab. En una realización, la cadena liviana de bevacizumab comprende una o más sustituciones seleccionadas del grupo de: R18N, L154S, Q160N, S174N, y/o T180N en la SEQ ID NO: 10.
En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-VEGF-A (o anticuerpo de glicoforma de bevacizumab) comprende unos o más sitios de N-glicosilación adicionales. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-VEGF-A (o anticuerpo de glicoforma de bevacizumab) comprende una cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 9 o una o más mutaciones seleccionadas del grupo de E89N, G165S, Q181N, l 188N, S196N, y L199N en la SEQ ID NO: 9, y una cadena liviana que comprende la SEQ ID NO:10 o una o más mutaciones seleccionadas del grupo de R18N, L154S, Q160N, S174N, y T180N en la SEQ ID NO: 10.
En una realización, el anticuerpo es tositumomab. En una realización, tositumomab tiene una secuencia expuesta en las SEQ ID NOs: 11 y 12. En una realización, los sitios de N-glicosilación adicionales se introducen en cadena liviana de tositumomab. En una realización, los sitios de N-glicosilación adicionales se introducen en cadena pesada de tositumomab. En una realización, la cadena pesada de tositumomab comprende una o más sustituciones seleccionadas del grupo de: E89N, G159S, Q175N, L182N, S190N, y/o L193N en la SEQ ID NO: 11.
En una realización, cadena liviana de tositumomab comprende una o más sustituciones seleccionadas del grupo de: K18N, L153S, Q159N, S173N, T179N en la SEQ ID NO: 12.
En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-CD20 (o anticuerpo de glicoforma de tositumomab) comprende uno o más sitios de N-glicosilación adicionales. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-CD20 (o anticuerpo de glicoforma de tositumomab) comprende una cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 11 o una o más mutaciones seleccionadas del grupo de E89N, G159S, Q175N, L182N, S190N, y L193N en la SEQ ID NO: 11, y una cadena liviana que comprende la SEQ ID NO:12 o una o más mutaciones seleccionadas del grupo de K18N, L153S, Q159N, S173N, y T179N en la SEQ ID NO: 12.
En una realización, el anticuerpo es etanercept. En una realización, etanercept tiene una secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 13. En una realización, unos o más sitios de N-glicosilación adicionales se introducen en la secuencia de etanercept usando los procedimientos descriptos, por ejemplo, en el documento US2013/0084291.
En una realización, el anticuerpo es adalimumab. En una realización, adalimumab tiene una secuencia expuesta en las SEQ ID NOs: 14 y 15. En una realización, los sitios de N-glicosilación adicionales se introducen en la cadena pesada de adalimumab. En una realización, la cadena pesada de adalimumab comprende una o más sustituciones seleccionadas del grupo de:E89N, G163S, Q179N, L186N, S194N, y/o L197N en la SEQ ID NO: 16.
En una realización, los sitios de N-glicosilación adicionales se introducen en la cadena liviana de adalimumab. En una realización, la cadena liviana de adalimumab comprende una o más sustituciones seleccionadas del grupo de: R18N, L154S, Q160N, S174N, y/o T180N en la SEQ ID NO: 17.
En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-TNFA (o anticuerpo de glicoforma de adalimumab) comprende uno o más sitios de N-glicosilación adicionales. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-TNFA (o anticuerpo de glicoforma de adalimumab) comprende una cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 16 o una o más mutaciones seleccionadas del grupo de E89N, G163S, Q179N, L186N, S194N, y L197N en la SEQ ID NO: 16, y una cadena liviana que comprende la SEQ ID NO:17 o una o más mutaciones seleccionadas del grupo de R18N, L154S, Q160N, S174N, y T180N en la SEQ ID NO: 17.
En una realización, el anticuerpo es alemtuzumab. En una realización, alemtuzumab tiene una secuencia expuesta en las SEQ ID NOs: 18 y 19. En una realización, los sitios de N-glicosilación adicionales se introducen en la cadena pesada de alemtuzumab. En una realización, la cadena pesada de alemtuzumab comprende una o más sustituciones seleccionadas del grupo de: A91N, G165S, Q179N, L186N, S194N, L197N, y SEQ ID NO: 18.
En una realización, los sitios de N-glicosilación adicionales se introducen en la cadena liviana de alemtuzumab. En una realización, la cadena liviana de alemtuzumab comprende una o más sustituciones seleccionadas del grupo de: R18N, L154S, 35 Q160N, S174N, y/o T180N en la SEQ ID NO: 19.
En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-CD52 (o anticuerpo de glicoforma de alemtuzumab) comprende uno o más sitios de N-glicosilación adicionales. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-CD52 (o anticuerpo de glicoforma de alemtuzumab) comprende una cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 18 o una o más mutaciones seleccionadas del grupo de A91N, G165S, Q179N, l 186N, S194N, y L197N en la SEQ ID NO: 18, y una cadena liviana que comprende la SEQ ID NO:19 o una o más mutaciones seleccionadas del grupo de R18N, L154S, Q160N, S174N, y T180N en la SEQ ID NO: 19.
En una realización, el anticuerpo es efalizumab. En una realización, efalizumab tiene una secuencia expuesta en las SEQ ID NOs: 20 y 21. En una realización, los sitios de N-glicosilación adicionales se introducen en la cadena pesada de efalizumab. En una realización, la cadena pesada de efalizumab comprende una o más sustituciones seleccionadas del grupo de: E89N, G163S, Q179N, L186N, S194N, y/o L197N en la SEQ ID NO: 20.
En una realización, los sitios de N-glicosilación adicionales se introducen en la cadena liviana de efalizumab. En una realización, la cadena liviana de efalizumab comprende una o más sustituciones seleccionadas del grupo de: R18N, L154S, Q160N, S174N, y/o T180N en la SEQ ID NO: 21.
En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-CD11a (o anticuerpo de glicoforma de efalizumab) comprende unos o más sitios de N-glicosilación adicionales. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-CD11a (o anticuerpo de glicoforma de efalizumab) comprende una cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 20 o una o más mutaciones seleccionadas del grupo de E89N, G163S, Q179N, L186N, S194N, L197N, y SEQ ID NO: 20, y una cadena liviana que comprende la SEQ ID NO:21 o una o más mutaciones seleccionadas del grupo de R18N, L154S, Q160N, S174N, T180N, y SEQ ID NO: 21.
En una realización, el anticuerpo es infliximab. En una realización, infliximab tiene una secuencia expuesta en las SEQ ID NOs: 22 y 23. En una realización, los sitios de N-glicosilación adicionales se introducen en la cadena pesada de infliximab En una realización, la cadena pesada de infliximab comprende una o más sustituciones seleccionadas del grupo de: E91N, sustitución de G a S en aproximadamente el aminoácido 161 (en la secuencia NSG), Q a N en aproximadamente el aminoácido 177 (en la secuencia QSS), L a N en aproximadamente el aminoácido 184 (en la secuencia LSS), S a N en aproximadamente el aminoácido 192 (en la secuencia SSS), y/o L a N en aproximadamente el aminoácido 195 (en la secuencia LGT) en la secuencia de la cadena pesada de infliximab. En una realización, los sitios de N-glicosilación adicionales se introducen en la cadena liviana de infliximab. En una realización, la cadena liviana de infliximab comprende una o más sustituciones seleccionadas del grupo de: R18N, sustitución de L a S en aproximadamente el aminoácido 154 (en la secuencia NAL), sustitución de Q a N en aproximadamente el aminoácido 160 (en la secuencia QES), sustitución de S a N en aproximadamente el aminoácido 174 (secuencia SLS-> NLS), sustitución de T N en aproximadamente el aminoácido 180 (en la secuencia TLS) de la secuencia de cadena liviana liviana de infliximab.
En una realización, el anticuerpo es basiliximab. En una realización, basiliximab tiene una secuencia expuesta en las SEQ ID NOs: 24 y 25. En una realización, los sitios de N-glicosilación adicionales se introducen en la cadena pesada de basiliximab. En una realización, la cadena pesada de basiliximab comprende una o más sustituciones seleccionadas del grupo de: E87N, G157S, Q173N, L180N, S188N, y/o L191N en la SEQ ID NO: 24 o SEQ ID NO: 26.
En una realización, los sitios de N-glicosilación adicionales se introducen en la cadena liviana de basiliximab. En una realización, la cadena liviana de basiliximab comprende una o más sustituciones seleccionadas del grupo de: K18N, L151S, Q157N, S171N, T177N en la SEQ ID NO: 25.
En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-CD25 (o secuencia de la cadena pesada de basiliximab) comprende unos o más sitios de N-glicosilación adicionales. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-CD25 (o secuencia de la cadena pesada de basiliximab) comprende una cadena pesada que comprende las SEQ ID NOs: 24 o 26, o una o más mutaciones seleccionadas del grupo de E87N, G157S, Q173N, L180N, S188N, y L191N en la SEQ ID NO: 24 o SEQ ID NO: 26, y una cadena liviana que comprende la SEQ ID NO:25 o una o más mutaciones seleccionadas del grupo de K18N, L151S, Q157N, S171N, y T177N en la SEQ ID NO: 25.
En una realización, el anticuerpo es omalizumab. En una realización, omalizumab tiene una secuencia expuesta en las SEQ ID NOs: 27 y 28. En una realización, los sitios de N-glicosilación adicionales se introducen en la cadena pesada de omalizumab. En una realización, la cadena pesada de omalizumab comprende una o más sustituciones seleccionadas del grupo de: E89N, G163S, Q179N, L186N, S194N, y L197N en la SEQ ID NO: 27.
En una realización, los sitios de N-glicosilación adicionales se introducen en la cadena liviana de omalizumab. En una realización, la cadena liviana de omalizumab comprende una o más sustituciones seleccionadas del grupo de: R18N, L158S, Q164N, S178N, y T184N en la SEQ ID NO: 28.
En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-IgE (o secuencia de la cadena pesada de omalizumab) comprende uno o más sitios de N-glicosilación adicionales. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-IgE (o secuencia de la cadena pesada de omalizumab) comprende una cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 27 o una o más mutaciones seleccionadas del grupo de E89N, G163S, Q179N, L186n , S194N, y L197N en la SEQ ID NO: 27, y una cadena liviana que comprende la SEQ ID NO:28 o una o más mutaciones seleccionadas del grupo de R18N, L158S, Q164N, S178N, y T184N en la SEQ ID NO: 28.
En una realización, el anticuerpo es daclizumab. En una realización, daclizumab tiene una secuencia expuesta en las SEQ ID NOs: 29 y 30. En una realización, los sitios de N-glicosilación adicionales se introducen en la cadena pesada de daclizumab En una realización, la cadena pesada de daclizumab comprende una o más sustituciones seleccionadas del grupo de: E74N, E89N, G158S, Q174N, L181N, S189N, y/o L192N en las SEQ ID NOs: 29.
En una realización, los sitios de N-glicosilación adicionales se introducen en la cadena liviana de daclizumab. En una realización, la cadena liviana de daclizumab comprende una o más sustituciones seleccionadas del grupo de: R18N, L153S, Q159N, S173N, y/o T179N en la SEQ ID NO: 30.
En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-CD25 (o secuencia de la cadena pesada de daclizumab) comprende uno o más sitios de N-glicosilación adicionales. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-CD25 (o secuencia de la cadena pesada de daclizumab) comprende una cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 29 o una o más mutaciones seleccionadas del grupo de E74N, E89N, G158S, Q174N, L181N, S189N, y L192N en la SEQ ID NO: 29, y una cadena liviana que comprende la SEQ ID NO:30 o una o más mutaciones seleccionadas del grupo de R18N, L153S, Q159N, S173N, y T179N en la SEQ ID NO: 30.
En una realización, el anticuerpo es nimotuzumab. En una realización, nimotuzumab tiene una secuencia expuesta en las SEQ ID NOs: 31 y 32. En una realización, los sitios de N-glicosilación adicionales se introducen en la cadena pesada de nimotuzumab para generar una nueva secuencia del anticuerpo anti-EGFR. En una realización, la cadena pesada del nuevo anti-EGFR comprende una o más sustituciones seleccionadas del grupo de: E74N, E89N, G165S, Q181N, L188N, S196N, y/o L199N en la SEQ ID NO: 31.
En una realización, los sitios de N-glicosilación adicionales se introducen en la cadena liviana de nimotuzumab para generar una nueva secuencia del anticuerpo anti-EGFR. En una realización, la nueva cadena liviana de anti-EGFR cadena liviana comprende una o más sustituciones seleccionadas del grupo de: L159S, Q165N, S179N, y/o T185N en la SEQ ID NO: 32. En una realización, la nueva cadena liviana d anti-EGFR comprende la sustitución R a N en el aminoácido 18 de la SEQ ID NO:32.
En algunas realizaciones, el nuevo anticuerpo anti-EGFR comprende una cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 31 o una o más mutaciones seleccionadas del grupo de E74N, E89N, G165S, Q181N, L188N, S196N, y L199N en la SEQ ID NO: 31, y una cadena liviana que comprende la SEQ ID NO:32 o una o más mutaciones seleccionadas del grupo de R18N, L159S, Q165N, S179N, y T185N en la SEQ ID NO: 32.
En una realización, el nuevo anticuerpo anti-EGFR es GCM012 que comprende las secuencias expuestas en las SEQ ID NO: 31 y SEQ ID NO: 33.
En una realización, el anticuerpo es epratuzumab. En una realización, epratuzumab tiene una secuencia expuesta en las SEQ ID NOs: 34 y 35. En una realización, los sitios de N-glicosilación adicionales se introducen en la cadena pesada de epratuzumab. En una realización, la cadena pesada de epratuzumab comprende una o más sustituciones seleccionadas del grupo de: E74N, E89N, G158S, Q174N, L181N, S189N, y/o L192N en la SEQ ID NO: 34.
En una realización, los sitios de N-glicosilación adicionales se introducen en la cadena liviana de epratuzumab. En una realización, la cadena liviana de epratuzumab comprende una o más sustituciones seleccionadas del grupo de: L159S, Q165N, S179N, y/o T185N en la SEQ ID NO: 35.
En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-CD22 (o anticuerpo de glicoforma de epratuzumab) comprende unos o más sitios de N-glicosilación adicionales. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-CD22 (o anticuerpo de glicoforma de epratuzumab) comprende una cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 34 o una o más mutaciones seleccionadas del grupo de E74N, E89N, G158S, Q174N, L181N, S189N, y L192N en la SEQ ID NO: 34, y una cadena liviana que comprende la SEQ ID NO:35 o una o más mutaciones seleccionadas del grupo de L159S, Q165N, S179N, y T185N en la SEQ ID NO: 35.
En una realización, el anticuerpo es lintuzumab. En una realización, lintuzumab tiene una secuencia expuesta en las SEQ ID NOs: 36 y 37. En una realización, los sitios de N-glicosilación adicionales se introducen en la la cadena pesada de lintuzumab cadena pesada comprende una o más sustituciones seleccionadas del grupo de: E89N, G158S, Q174N, L181N, S189N, y/o L192N en la SEQ ID NO: 36.
En una realización, los sitios de N-glicosilación adicionales se introducen en la cadena liviana de lintuzumab. En una realización, la cadena liviana de lintuzumab comprende una o más sustituciones seleccionadas del grupo de: R18N, L157S, Q163N, S177N, y/o T183N en la SEQ ID NO: 37.
En una realización, el anticuerpo es un anticuerpo anti-CD33 (o anticuerpo de glicoforma de lintuzumab) que comprende sitios de N-glicosilación adicionales. En una realización, el anticuerpo es un anticuerpo anti-CD33 que comprende sitios de N-glicosilación adicionales en comparación con el correspondiente anticuerpo anti-CD33 humano o humanizado. En una realización, el anticuerpo anti-CD33 es GCM011 que tiene una secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 38. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-CD33 (o anticuerpo de glicoforma de lintuzumab) comprende una cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 36 o una o más mutaciones seleccionadas del grupo de E89N, G158S, Q174N, L181N, S189N, y L192N en la SEQ ID NO: 36, y una cadena liviana que comprende la SEQ ID NO:37 o una o más mutaciones seleccionadas del grupo de R18N, L157S, Q163N, S177N, y T183N en la SEQ ID NO: 37.
En una realización, la cadena pesada de lintuzumab comprende la sustitución E a N en el aminoácido 74 de la SEQ ID NO:36. En una realización, el anticuerpo anti-CD33 es GCM011 que comprende las secuencias expuestas en la SEQ ID NO: 38 y SEQ ID NO:37. En una realización, un anticuerpo anti-CD33 comprende una secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 38 y la sustitución R a N en el aminoácido de la SEQ ID NO: 37. En una realización, el anticuerpo es 2G12. En una realización, 2G12 tiene una secuencia expuesta en las SEQ ID NOs: 39 y 40. En una realización, los sitios de N-glicosilación adicionales se introducen en la cadena pesada de 2G12 cadena liviana. En una realización, 2G12 cadena liviana comprende una o más sustituciones seleccionadas del grupo de: T18N, L154S, Q160N S174N y/o T180N en la SEQ ID NO: 39.
En una realización, los sitios de N-glicosilación adicionales se introducen en la cadena pesada de 2G12. En una realización, la cadena pesada de 2G12 comprende una o más sustituciones seleccionadas del grupo de: E89N, G165S, Q181N, L188N, S196N, y/o L199N en la SEQ ID NO: 40.
En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-manosa (o la cadena pesada de2G12) comprende unos o más sitios de N-glicosilación adicionales. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-manosa (o la cadena pesada de2G12) comprende una cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 40 o una o más mutaciones seleccionadas del grupo de E89N, G165S, Q181N, L188N, S196N, y L199N en la SEQ ID NO: 40, y una cadena liviana que comprende la SEQ ID NO: 39 o una o más mutaciones seleccionadas del grupo de T18N, L154S, Q160N, S174N, y T180N en la SEQ ID NO: 39.
En una realización, el anticuerpo es ibritumomab tiuxetan. En una realización, los sitios de N-glicosilación adicionales se pueden introducir en las cadenas pesada y/o liviana descriptas anteriormente, por ejemplo, para el anticuerpo lintuzumab.
En una realización, el anticuerpo es panitumumab. En una realización, los sitios de N-glicosilación adicionales se pueden introducir en las cadenas pesada y/o liviana descriptas anteriormente, por ejemplo, para el anticuerpo lintuzumab.
En una realización, el anticuerpo es gemtuzumab ozogamicina. En una realización, los sitios de N-glicosilación adicionales se pueden introducir en las cadenas pesada y/o liviana descriptas anteriormente, por ejemplo, para el anticuerpo lintuzumab.
] En una realización, el anticuerpo es abciximab. En una realización, los sitios de N-glicosilación adicionales se pueden introducir en las cadenas pesada y/o liviana descriptas anteriormente, por ejemplo, para el anticuerpo lintuzumab.
En una realización, el anticuerpo es palivizumab. En una realización, los sitios de N-glicosilación adicionales se pueden introducir en las cadenas pesada y/o liviana descriptas anteriormente, por ejemplo, para el anticuerpo lintuzumab.
El N-glicano se puede unir a varias posiciones en la glicoproteína.
En las realizaciones en las que la glicoproteína es un anticuerpo, el N-glicano se puede unir a varias posiciones en el anticuerpo.
En una realización, el N-glicano se une a un sitio en que la glicoproteína o el anticuerpo están glicosilados naturalmente.
En una realización, el N-glicano se une al dominio Fc del anticuerpo.
El dominio Fc de las moléculas de IgG comprende un sitio único para la glicosilación unida a N dentro de su dominio CH2 en un residuo de asparagina 297 (Asn297) numerado de acuerdo con el índice EU (Kabat et al., Sequences of proteins of immunological interest, 5th ed., US Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91­ 3242). Típicamente, las estructuras de oligosacáridos unidas al dominio Fc comprenden cadenas biantenarias con galactosilación, sialilación y fucosilación variables.
En una realización, el N-glicano se une a un sitio en el dominio variable del anticuerpo.
En una realización, el anticuerpo es cetuximab y el N-glicano se une a la cadena pesada del residuo de asparagina en el dominio variable.
En una realización, la glicoproteína comprende al menos uno o al menos 2, o al menos 3, o al menos 4, o al menos 5, o al menos 6, o 1-6, o 2-5, o 3-4 sitios de N-glicosilación.
En una realización, la glicoproteína comprende al menos uno, o al menos 2, o al menos 3, o al menos 4, o al menos 5, o al menos 6, o 1-6, o 2-5, o 3-4, o 1-2 N-glicanos.
En una realización, la glicoproteína se manipula genéticamente para comprender uno o más sitios de N-glicosilación adicionales. Dichos sitios de N-glicosilación adicionales pueden estar en sitios que son accesibles para el disolvente y a una distancia de los sitios de unión a antígeno o unión a receptor de la glicoproteína o anticuerpo tal como un anticuerpo monoclonal. Dichos sitios se manipulan genéticamente para comprender la secuencia consenso de N-glicosilación Asn-Xaa-Ser/Thr, en la que Xaa es cualquier aminoácido codificado en el código genético humano, excepto que Xaa £Pro.
En una realización, la glicoproteína es un anticuerpo manipulado genéticamente para comprender unos o más sitios de N-glicosilación adicionales en el dominio Fc.
En una realización, la glicoproteína es un anticuerpo manipulado genéticamente para comprender uno o más sitios de N-glicosilación adicionales en la región variable.
En una realización, la glicoproteína es un anticuerpo manipulado genéticamente para comprender unos o más sitios de N-glicosilación adicionales en una región diferente del dominio Fc y la región variable.
En una realización, la glicoproteína es un anticuerpo que se puede modificar mediante la adición, supresión, o sustitución de uno o más residuos de aminoácidos para introducir uno o más sitios de glicosilación unidos a N, de este modo se produce un "anticuerpo de glicoforma". Los sitios de N-glicosilación adicionales se pueden manipular genéticamente en las cadenas livianas y pesadas por los procedimientos descriptos en, por ejemplo, WOg7/34632 y/o WOg5/15769. En el documento WOg7/34632, los sitios de N-glicosilación adicionales pueden ser los descriptos en la Fig 12 y correspondientes a HCN1, HCN2, HCN3, HCN4, y/o HCN5 para la cadena pesada, y KCN1, KCN2, KCN3, y/o KCN4 para la cadena liviana kappa. Los sitios de N-glicosilación adicionales en el anticuerpo significan uno o más sitios de N-glicosilación no Asn297. Los sitios de N-glicosilación no Asn297 pueden existir o se pueden introducir en una cadena pesada y/o liviana.
En una realización, la glicoproteína es un anticuerpo manipulado genéticamente para comprender al menos uno, o al menos 2, o al menos 3, o al menos 4, o al menos 5, o al menos 6, o 1-6, o 2-5, o 3-4 sitios de N-glicosilación adicionales.
En una realización, la glicoproteína es un anticuerpo manipulado genéticamente para comprender al menos uno, o al menos 2, o al menos 3, o al menos 4, o al menos 5, o al menos 6, o 1-6, o 2-5, o 3-4 sitios de N-glicosilación no Asn297 adicionales.
En una realización, la glicoproteína es un anticuerpo que se manipula genéticamente para comprender unos o más sitios de N-glicosilación adicionales que el correspondiente anticuerpo humano o humanizado. En este contexto, el correspondiente anticuerpo humano o humanizado se debe entender que se refiere al anticuerpo humano o humanizado que no se ha manipulado genéticamente para comprender unos o más sitios de N-glicosilación adicionales.
En una realización, la glicoproteína es un anticuerpo que comprende uno o más N-glicanos adicionales que el correspondiente anticuerpo humano o humanizado. Una persona experta entenderá que la adición de uno o más sitios de N-glicosilación adicionales no siempre produce que uno o más N-glicanos adicionales se incorporan a la glicoproteína. Tales uno o más sitios adicionales de N-glicosilación no siempre están glicosilados. En otras palabras, si la glicoproteína comprende varios sitios de glicosilación, el número de moléculas de carga útil tóxicas o de carga de moléculas de carga útil tóxicas ("relación fármaco/anticuerpo" cuando la glicoproteína es un anticuerpo) (n en la fórmula I) puede ser igual o menor que el número de sitios de glicosilación.
En consecuencia, en una realización, el conjugado de la molécula de carga útil tóxica para glicoproteína está representado por la fórmula I, en la que la glicoproteína comprende m sitios de glicosilación en la glicoproteína, y n > m.
En una realización, el número de sitios de glicosilación en la glicoproteína es al menos uno, o al menos 2, o al menos 3, o al menos 4, o al menos 5, o al menos 6, o 1-6, o 2-5, o 3-4; y n es menor que o igual al número de sitios de glicosilación.
En una realización, el número de sitios de glicosilación en la glicoproteína es al menos uno, o al menos 2, o al menos 3, o al menos 4, o al menos 5, o al menos 6, o 1-6, o 2-5, o 3-4; y n es al menos uno, o al menos 2, o al menos 3, o al menos 4, o al menos 5, o al menos 6, o 1-6, o 2-5, o 3-4.
En una realización, unos o más sitios de N-glicosilación adicionales, en particular sitios no Asn297, pueden estar todos o casi todos glicosilados. En otras palabras, si la glicoproteína comprende varios sitios de glicosilación, el número de moléculas de carga útil tóxicas (n en la fórmula I) puede ser igual o mayor que el número de sitios de glicosilación
En consecuencia, en una realización, el conjugado de la molécula de carga útil tóxica para glicoproteína está representado por la fórmula I, en la que la glicoproteína comprende m sitios de glicosilación en la glicoproteína, y n < m.
En una realización, el número de sitios de glicosilación en la glicoproteína es al menos uno, o al menos 2, o al menos 3, o al menos 4, o al menos 5, o al menos 6 , o 1-6, o 2-5, o 3-4; y n es mayor o igual al número de sitios de glicosilación.
En una realización, el número de sitios de glicosilación en la glicoproteína es al menos uno, o al menos 2, o al menos 3, o al menos 4, o al menos 5, o al menos 6, o 1-6, o 2-5, o 3-4; y n es al menos uno, o al menos 2, o al menos 3, o al menos 4, o al menos 5, o al menos 6, o 1-6, o 2-5, o 3-4.
En una realización, el número de sitios de glicosilación no Asn297 en la glicoproteína es al menos uno, o al menos 2, o al menos 3, o al menos 4, o al menos 5, o al menos 6 , o 1-6, o 2-5, o 3-4; y n es al menos uno, o al menos 2, o al menos 3, o al menos 4, o al menos 5, o al menos 6, o 1-6, o 2-5, o 3-4. En una realización, el número de sitios de glicosilación que no son Asn297 en la glicoproteína es al menos uno, o al menos 2, o al menos 3, o al menos 4, o al menos 5, o al menos 6, o 1-6, o 2-5, o 3-4; y n es al menos uno, o al menos 2, o al menos 3, o al menos 4, o al menos 5, o al menos 6, o 1-6, o 2-5, o 3-4. La de moléculas de carga útil tóxica, es decir, n, puede variar de 1 a aproximadamente 20 restos de carga útil (D) por glicoproteína o anticuerpo. El número promedio de restos de carga útil tóxicos por glicoproteína o anticuerpo en preparaciones de ADC a partir de reacciones de conjugación se puede caracterizar por medios convencionales tales como espectroscopía de masas y ensayo ELISA. También se puede determinar La distribución cuantitativa de ADC en términos de n. En algunos casos, la separación, purificación y caracterización de ADC homogéneo donde n es un cierto valor de ADC con otras cargas de fármaco se puede lograr por medios tales como la electroforesis.
Para los conjugados de la molécula de carga útil tóxica para la glicoproteína, n está limitado por el número de sitios de N-glicosilación y "antenas" de N-glicano por un N-glicano en la glicoproteína o el anticuerpo. Por ejemplo, cuando la unión es un N-glicano biantenario en Asn297, el anticuerpo puede tener uno, dos, tres o cuatro grupos de carbohidratos a través de los cuales se puede unir a un ligador o estructura de sacárido. Por otro lado, cuando se introduce un sitio de N-glicosilación adicional (sitio no Asn297) en el anticuerpo (por ejemplo, R/K18N en la cadena liviana), el anticuerpo puede tener tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho o más grupos de carbohidratos a través de los cuales se puede unir un ligador o estructura de sacárido además del N-glicano biantenario en Asn297. En esta realización, n es aproximadamente 8, mayor que 8, de aproximadamente 7 a aproximadamente 8, de aproximadamente 6 a aproximadamente 8, de aproximadamente 5 a aproximadamente 8, de aproximadamente 4 a aproximadamente 8, de aproximadamente 4 a aproximadamente 6, o de aproximadamente 5 a aproximadamente 6. En un ejemplo, el N-glicano es un N-glicano es multiantenario que comprende al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco o al menos seis antenas de N-glicano. En un ejemplo, el N-glicano en un sitio de glicosilación no Asn297 en la glicoproteína es un N-glicano es multiantenario. En un ejemplo, el N-glicano es un N-glicano con estructura de sacárido ramificado tales como estructura de N-acetillactosamina ramificada que comprende al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco o al menos seis ramas de la estructura de sacárido. En una realización, el N-glicano en un sitio de glicosilación no Asn297 en la glicoproteína es un N-glicano con estructura de sacárido ramificada. En estos ejemplos, existen al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco o al menos seis antenas y/o ramas a las que se pueden unir las moléculas de carga útil por sitio de glicosilación. En estos ejemplos, n es aproximadamente 8, mayor que 8, de aproximadamente 8 a aproximadamente 10, de aproximadamente 10 a aproximadamente 12, de aproximadamente 10 a aproximadamente 14, mayor que 14, de aproximadamente 7 a aproximadamente 8, de aproximadamente 6 a aproximadamente 8, de aproximadamente 5 a aproximadamente 8, de aproximadamente 4 a aproximadamente 8, de aproximadamente 4 a aproximadamente 6, o de aproximadamente 5 a aproximadamente 6. Estos ejemplos se pueden lograr mediante procedimientos conocidos en la técnica, por ejemplo, mediante la expresión de la glicoproteína en una línea celular adecuada capaz de producir dichas estructuras de N-glicano multiantenario y/o ramificado en la glicoproteína. Tales líneas celulares adecuadas son, por ejemplo, líneas celulares CHO o HEK-293. En uno de tales ejemplos, la glicoproteína es un anticuerpo que comprende un sitio de glicosilación no Asn297 que puede comprender dichas estructuras de N-glicano multiantenarias y/o ramificadas. En una realización, la glicoproteína comprende un N-glicano que comprende un sitio aceptor de sialiltransferasa seleccionado del grupo que consiste en Galp, Galp4GlcNAc, Galp3GlcNAc, Galp3GalNAc, GalNAcp, GalNAca, GalNAcp4GlcNAc y ácido siálico.
En un ejemplo, la glicoproteína comprende un N-glicano que comprende dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho o más sitios aceptores de sialiltransferasa seleccionados del grupo que consiste en Galp, Galp4GlcNAc, Galp3GlcNAc, Galp3GalNAc, GalNAcp, GalNAca, GalNAcp4GlcNAc y ácido siálico.
En una realización, la glicoproteína es una glicoproteína recombinante producida en una célula que es capaz de producir glicoproteínas en la que están enriquecidos los sitios aceptores de sialiltransferasa.
En una realización, la glicoproteína es una glicoproteína recombinante producida en una célula que es capaz de producir glicoproteínas en la que están enriquecidos los N-glicanos que comprenden residuos Galp terminal y/o que no comprenden ácido siálico terminal.
El N-glicano puede ser cualquier N-glicano, a condición de que el N-glicano comprenda un residuo de GlcNAc unido por una unión p-N a una asparagina.
En una realización, el N-glicano comprende un residuo de Galp terminal. En una realización, el N-glicano comprende uno, dos o más residuos de Galp terminales.
En un ejemplo, el N-glicano es un N-glicano tipo complejo biantenario.
En un ejemplo, el N-glicano es un N-glicano tipo complejo monoantenario.
En una realización, el N-glicano tiene una estructura de acuerdo con la fórmula
(ManaS^
ManaS, FucaS
(Manâ Jy \ \
Manp4GlcNAcf$4GlcNAc(3-N-Asn) Neu5AcaZGalp4GlcNAcp2Mana3 /
en la que
(p-N-Asn) = unión p-N a Asn;
Z = 3 o 6;
x = 0 o 1 ; y
y = 0 o 1.
En una realización, x = 1 e y = 1.
En este contexto, los términos "Neu5Ac", "NeuNAc" y "ácido siálico" se refieren al ácido N-acetilneuramínico; todos los residuos de monosacáridos están en forma de piranosa; todos los monosacáridos son azúcares D excepto L-fucosa; "HexNAc" se refiere a un azúcar N-acetilhexosamina; y "dHex" se refiere a un azúcar desoxihexosa. En una realización de la presente invención, el "ácido siálico" también se puede referir a otros ácidos siálicos además del ácido N-acetilneuramínico, tal como el ácido N-glicolilneuramínico (Neu5Gc).
En una realización, el N-glicano tiene una estructura de acuerdo con la siguiente fórmula:
Figure imgf000014_0001
El N-glicano de acuerdo con las dos fórmulas previas y procedimientos para producirlos se divulgan en detalle en la publicación del documento WO 2013/087992. En particular, los procedimientos para producirlos se divulgan en la p.
32, línea 30 - p. 48, línea 2 y en los Ejemplos 1,2, 5, 7 y 8 del documento WO 2013/087992.
En una realización, el N-glicano tiene una estructura de acuerdo con la siguiente fórmula:
Manas
an|4GlcNAcp4GlcMAc{P-N-Asn)
Galp4GlcNAcp2Mana3 >
en la que
(p-N-Asn) = unión p-N a Asn.
El N-glicano de acuerdo con esta fórmula y y procedimientos para producirlos se divulgan en detalle en la publicación del documento WO 2013/087993. En particular, los procedimientos para producirlos se divulgan en la p.
29, línea 31-p. 41, línea 21 y en los Ejemplos 1, 2, 5 y 8 del documento WO 2013/087993.
El N-glicano es a N-glicano tipo híbrido.
En un ejemplo, R es un enlace glicosídico al N-glicano o un enlace glicosídico al residuo de GlcNAc unido por una unión p-N a una asparagina;
X1 es H o carboxilo;
X2, X3 y X4 son cada uno de modo independiente OH, H, amino, acilamida C2-C6, éster de fosfato o sulfato, o un enlace a L;
X5 es CH2OH, carboxilo, CH3, H, alquilo C1-C3 o alquilo C1-C3 sustituido, o un enlace a L;
a condición de que un sustituyente seleccionado de X2, X3, X4 y X5 es un enlace a L o se une por medio de un enlace a L; y
a condición de que cuando X1 es carboxilo, entonces X2 es H; X3 es OH; X4 es OH, H, amino, acilamida C2-C6, o un enlace a L;
X5 es alquilo C1-C3 o alquilo C1-C3 sustituido; R es un enlace glicosídico al N-glicano; y X4 es un enlace a L o X5 se une por medio de un enlace a L; o
cuando X1 es H, entonces R es un enlace glicosídico al residuo de GlcNAc unido por una unión p-N a una asparagina.
En un ejemplo, G es una estructura de sacárido representada por la fórmula III
Figure imgf000015_0001
en la que
R es un enlace glicosídico al N-glicano;
X4 es OH, H, amino, acilamida C2-C6, éster de fosfato o sulfato, o un enlace a L; X5 es alquilo C1-C3 o alquilo C1-C3 sustituido;
y X4 es un enlace a L o X5 se une por medio de un enlace a L.
En una realización, G es una estructura de sacárido representada por la fórmula III,
en la que
R es un enlace glicosídico al N-glicano;
X4 es OH, H, amino, acilamida C2-C6 o éster de fosfato o sulfato; X5 es alquilo C1-C3 o alquilo C1-C3 sustituido;
y X5 se une por medio de un enlace a L.
En un ejemplo, la glicoproteína comprende un sitio aceptor de sialiltransferasa y R es un enlace glicosídico al sitio aceptor de sialiltransferasa.
En un ejemplo, el N-glicano comprende un residuo de Galp terminal y R es un enlace glicosídico al residuo de Galp terminal.
En un ejemplo, el N-glicano comprende una estructura de acuerdo con la siguiente fórmula
(Fuca6)y
\
Gaip4GlcNAc((3-N-Asn)
en la que y es 0 o 1.
En un ejemplo, el N-glicano consiste en una estructura de acuerdo con la siguiente fórmula
(Fuca6)y
\
Gaip4GlcNAc(p-N-Asn)
en la que y es 0 o 1.
En una realización, el N-glicano consiste en la estructura representada por la fórmula IV
Figure imgf000016_0001
Fórmula IV
en la que (p-N-Asn) es una unión p-N a una asparagina e y es 0 o 1.
En una realización, n es 2-18. En una realización, n es 2-16. En una realización, n es 2-10. En otras realizaciones, n es 2-6; 2-5; 2-4; 2-3; 3-4; o 1, 2, 3 o 4. n, es decir, el número de moléculas de carga útil tóxicas conjugadas a una glicoproteína única, puede depender por ejemplo de la glicoproteína, del número de N-glicanos presentes en la glicoproteína, la estructura de los N-glicanos presentes en la glicoproteína, y el procedimiento de preparación del conjugado de la molécula de carga útil tóxica para glicoproteína. Típicamente, un valor grande de n puede llevar a una mayor toxicidad del conjugado de la molécula de carga útil tóxica para glicoproteína; por otra parte, un valor grande de n en algunos casos puede afectar adversamente las propiedades del conjugado de la molécula de carga útil tóxica para glicoproteína, tal como las propiedades farmacocinéticas.
En una realización, la glicoproteína comprende uno, dos, tres, cuatro o más N-glicanos que comprenden un residuo GlcNAc unido por una unión p-N a una asparagina.
En una realización, la glicoproteína comprende uno, dos, tres, cuatro o más sitios aceptores de sialiltransferasa. En una realización, la glicoproteína comprende uno, dos, tres, cuatro o más N-glicanos que comprende un residuo de Galp terminal o un residuo de GlcNAc unido por una unión p-N a una asparagina.
En un ejemplo, G es una estructura de sacárido representada por la fórmula II
Figure imgf000016_0002
en la que R es un enlace glicosídico a la estructura representada por la fórmula IV
Figure imgf000016_0003
Fórmula IV
en la que (p-N-Asn) es una unión p-N a una asparagina e y es 0 o 1;
X1 es H;
X2, X3 y X4 son cada uno de modo independiente OH, H, amino, acilamida C2-C6, éster de fosfato o sulfato, o un enlace a L; X5 es CH2OH, carboxilo, CH3, H, alquilo C1-C3 o alquilo C1-C3 sustituido, o un enlace a L; a condición de que un sustituyente seleccionado de X2, X3, X4 y X5 es un enlace a L o se une por medio de un enlace a L.
En un ejemplo, el N-glicano comprende la estructura de sacárido G representado por la fórmula II
Figure imgf000017_0001
en la que R es un enlace glicosídico a la estructura representada por la fórmula IV
Figure imgf000017_0002
Fórmula IV
en la que (p-N-Asn) es una unión p-N a una asparagina e y es 0 o 1;
X1 es H;
X2, X3 y X4 son cada uno de modo independiente OH, H, amino, acilamida C2-C6, éster de fosfato o sulfato, o un enlace a L; X5 es CH2OH, carboxilo, CH3, H, alquilo C1-C3 o alquilo C1-C3 sustituido, o un enlace a L; a condición de que un sustituyente seleccionado de X2, X3, X4 y X5 es un enlace a L o se une por medio de un enlace a L.
En un ejemplo, la estructura anomérica de G se selecciona del grupo que consiste en la configuración p-D-galacto, p-D-gluco y a-L-fuco.
En un ejemplo, la estructura anomérica de G está en la configuración p-D-galacto o p-D-gluco y R es un enlace glicosídico en la posición 4 del residuo de GlcNAc.
En una realización, la estructura anomérica de G es la configuración p-D-galacto.
En una realización, R es un enlace glicosídico hidrolizable mediante una glicohidrolasa lisosómica.
En un ejemplo, G es una estructura de sacárido representada por la fórmula IIb
Figure imgf000017_0003
en la que X1 es H o carboxilo;
X2, X3 y X4 son cada uno de modo independiente OH, H, amino, acilamida C2-C6, éster de fosfato o sulfato, o un enlace a L; X5 es CH2OH, carboxilo, CH3, H, alquilo C1-C3 o alquilo C1-C3 sustituido, o un enlace a L; a condición de que un sustituyente seleccionado de X2, X3, X4 y X5 es un enlace a L o se une por medio de un enlace a L; y
R es un enlace glicosídico al N-glicano hidrolizable mediante una glicohidrolasa lisosómica.
En un ejemplo, el N-glicano comprende la estructura de sacárido G representado por la fórmula IIb
Figure imgf000018_0001
en la que X1 es H o carboxilo;
X2, X3 y X4 son cada uno de modo independiente OH, H, amino, acilamida C2-C6, éster de fosfato o sulfato,
o un enlace a L; X5 es CH2OH, carboxilo, CH3, H, alquilo C1-C3 o alquilo C1-C3 sustituido, o un enlace a L;
a condición de que un sustituyente seleccionado de X2, X3, X4 y X5 es un enlace a L o se une por medio de un enlace a L; y
R es un enlace glicosídico al N-glicano hidrolizable mediante una glicohidrolasa lisosómica.
En una realización, R es un enlace glicosídico hidrolizable mediante una glicohidrolasa lisosómica.
En este contexto, el término "enlace glicosídico hidrolizable mediante una glicohidrolasa lisosómica" se debe entender que se refiere a un enlace glicosídico que una glicohidrolasa lisosómica es capaz de hidrolizar in vitro o in vivo.
En una realización, R es un enlace O-glicosídico.
En una realización, la glicohidrolasa lisosómica es una p-galactosidasa, p-hexosaminidasa, p-glucuronidasa, agalactosidasa, a-glucosidasa, a-manosidasa, p-manosidasa, a-fucosidasa o neuraminidasa lisosómica.
En una realización, la glicohidrolasa lisosómica es una p-galactosidasa lisosómica.
En una realización, la glicohidrolasa lisosómica es una p-hexosaminidasa lisosómica.
En una realización, la glicohidrolasa lisosómica es una neuraminidasa lisosómica.
En un ejemplo, G es de acuerdo con la Fórmula IIb, en la que X1 es H y X5 es un enlace a L o se une por medio de un enlace a L.
En un ejemplo, G es de acuerdo con la Fórmula IIb, en la que X1 es H, la estructura anomérica de G es de configuración p-D-galacto y X5 es un enlace a L o se une por medio de un enlace a L.
En un ejemplo, G es de acuerdo con la Fórmula IIb, en la que X1 es H, la estructura anomérica de G es de configuración p-D-gluco y X5 es un enlace a L o se une por medio de un enlace a L.
En un ejemplo, G es de acuerdo con la Fórmula IIb, en la que X1 es H, la estructura anomérica de G es de configuración p-D-galacto, X3 y X4 son grupos OH, y X5 es un enlace a L o se une por medio de un enlace a L.
En un ejemplo, G es de acuerdo con la Fórmula IIb, en la que X1 es H, la estructura anomérica de G es de configuración p-D-galacto, X2 y X3 y X4 son grupos OH, y X5 es un enlace a L o se une por medio de un enlace a L.
En un ejemplo, G es de acuerdo con la Fórmula IIb, en la que X1 es H, la estructura anomérica de G es de configuración p-D-galacto o p-D-gluco, X2 es un grupo acetamido, X3 y X4 son grupos OH, y X5 es un enlace a L o se une por medio de un enlace a L.
En un ejemplo, G es de acuerdo con la Fórmula III, en la que X5 es un enlace a L o se une por medio de un enlace a
L.
En un ejemplo, G es de acuerdo con la Fórmula III, en la que X5 es CH(OH)CH(OH)CH2X9, en la que X9 es un enlace a L.
En un ejemplo, G es de acuerdo con la Fórmula III, en la que X4 es un grupo acilamido C2 tales como grupo acetamido, y X5 es CH(OH)CH(OH)CH2X9, en la que X9 es un enlace a L.
En un ejemplo, G es de acuerdo con la Fórmula III, en la que X4 es un grupo acilamido C2 tales como grupo acetamido, y X5 es CH(OH)CH(OH)CH2X9, en la que X9 es un enlace a L.
En un ejemplo, G es de acuerdo con la Fórmula III, en la que X4 es un enlace a L o se une por medio de un enlace a
L.
En un ejemplo, G es de acuerdo con la Fórmula III, en la que X4 es un enlace a L o se une por medio de un enlace a L, y X5 es CH(OH)CH(OH)CH2OH.
En un ejemplo, la estructura anomérica del sustituyente X5 en las estructuras de acuerdo con Fórmula III es como en el ácido neuramínico y como se expone en el Ejemplo 3.
Una glicohidrolasa lisosómica puede liberar la molécula de carga útil tóxica en forma activa dentro de una célula. El conjugado de la molécula de carga útil tóxica-glicano puede ser más potente y/o activo dentro de una célula que el conjugado de glicoproteína-molécula de carga útil tóxica.
En un ejemplo, la estructura anomérica de G y los sustituyentes X2, X3, X4 y X5 se selecciona de acuerdo con los ensayos de estabilidad en suero o plasma en pH neutro y ensayos de hidrólisis en presencia de glicohidrolasas lisosómicas en pH ácido.
En un ejemplo, la estructura anomérica de G y los sustituyentes X2, X3, X4 y X5 se selecciona de acuerdo con alta estabilidad en suero y plasma como se expone en el Ejemplo 15.
En un ejemplo, la estructura anomérica de G y los sustituyentes X2, X3, X4 y X5 se selecciona de acuerdo con tasa alta de hidrólisis en presencia de glicohidrolasa lisosómicas en pH ácido como se expone en el Ejemplo 16.
En un ejemplo, la estructura anomérica de G y los sustituyentes X2, X3, X4 y X5 se selecciona de acuerdo con alta estabilidad en suero y plasma como se expone en el Ejemplo 15 y de acuerdo con alta tasa de hidrólisis en presencia de glicohidrolasas lisosómicas en pH ácido como se expone en el Ejemplo 16.
Un conjugado de la molécula de carga útil tóxica-glicano representado por la fórmula V también se divulga
D-L-G Fórmula V
en la que
D es una molécula de carga útil tóxica;
L es un grupo ligador que une covalentemente G a D; y
G es una estructura de sacárido representada por la fórmula VI
Figure imgf000019_0001
en la que
R es OH, N-acetilglucosaminilasparagina o 6-fucosil-N-acetilglucosaminilasparagina;
X1 es H o carboxilo;
X2, X3 y X4 son cada uno de modo independiente OH, H, amino, acilamida C2-C6, éster de fosfato o sulfato, o un enlace a L; X5 es CH2OH, carboxilo, CH3, H, alquilo C1-C3 o alquilo C1-C3 sustituido, o un enlace a L; a condición de que un sustituyente seleccionado de X2, X3, X4 y X5 es un enlace a L o se une por medio de un enlace a L; y
a condición de que cuando X1 es carboxilo, entonces X2 es H, X3 es OH, X5 es alquilo C1-C3 o alquilo C1-C3 sustituido; R es OH; y X4 es un enlace a L o X5 se une por medio de un enlace a L; o
cuando X1 es H, entonces R es N-acetilglucosaminilasparagina o 6-fucosil-N-acetilglucosaminilasparagina. El conjugado molécula de carga útil tóxica-glicano se puede prepararse o formar, por ejemplo, mediante hidrólisis del glicoproteína-molécula de carga útil tóxica de acuerdo con una o más realizaciones descritas en la presente memoria con una hidrolasa lisosómica in vitro, por ejemplo de acuerdo con el Ejemplo 15, mediante el contacto del conjugado con células que internalizan el conjugado, por ejemplo de acuerdo con Ejemplo 14, o in vivo mediante la administración del conjugado a un animal que comprende células capaces de internalizar el conjugado (tales como las células cancerosas).
En un ejemplo, R es N-acetilglucosaminilasparagina o 6-fucosil-N-acetilglucosaminilasparagina, y la N-acetilglucosaminilasparagina o 6-fucosil-N-acetilglucosaminilasparagina está libre. En otras palabras, la N-acetilglucosaminilasparagina o 6-fucosil-N-acetilglucosaminilasparagina no se une a una glicoproteína.
En un ejemplo, G es una estructura de sacárido representada por la fórmula VII
Figure imgf000020_0001
R es OH;
X4 es OH, H, amino, acilamida C2-C6, éster de fosfato o sulfato, o un enlace a L;
X5 es alquilo C1-C3 o alquilo C1-C3 sustituido;
y X4 es un enlace a L o X5 se une por medio de un enlace a L.
En un ejemplo, G es una estructura de sacárido representada por la fórmula VII en la que
R es OH;
X4 es OH, H, amino, acilamida C2-C6, éster de fosfato o sulfato; X5 es alquilo C1-C3 o alquilo C1-C3 sustituido; y X5 se une por medio de un enlace a L.
En un ejemplo,
R es N-acetilglucosaminilasparagina o 6-fucosil-N-acetilglucosaminilasparagina;
X1 es H;
X2, X3 y X4 son cada uno de modo independiente OH, H, amino, acilamida C2-C6, éster de fosfato o sulfato, o un enlace a L; y X5 es CH2OH, carboxilo, CH3, H, alquilo C1-C3 o alquilo C1-C3 sustituido, o un enlace a L;
a condición de que un sustituyente seleccionado de X2, X3, X4 y X5 es un enlace a L o se une por medio de un enlace a L.
En un ejemplo, R es N-acetilglucosaminilasparagina o 6-fucosil-N-acetilglucosaminilasparagina, y la estructura anomérica de G se selecciona del grupo que consiste en la configuración p-D-galacto, p-D-gluco y a-L-fuco.
En un ejemplo, R es N-acetilglucosaminilasparagina o 6-fucosil-N-acetilglucosaminilasparagina, y la estructura anomérica de G está en la configuración p-D-galacto.
En un ejemplo, R está representado por la fórmula
Figure imgf000020_0002
en la que R4 es OH o un enlace glicosídico a G;
R6 es OH, a-L-fucosa o un enlace glicosídico a G;
A1 es amino y A2 es carboxilo;
a condición de que R4 o R6 es un enlace glicosídico a G.
En un ejemplo, R está representado por la fórmula
Figure imgf000021_0001
en la que R4 es un enlace glicosídico a G;
R6 es OH o a-L-fucosa;
A1 es amino y A2 es carboxilo;
y G es de acuerdo con la Fórmula II, en la que el anillo piranosa está en la configuración p-D-galacto o p-D-gluco;
X1 es H;
X2 es OH, grupo acetamido o un enlace a L; X3 y X4 son cada uno OH; y
X5 es CH2OH o un enlace a L;
a condición de que un sustituyente seleccionado de X2 y X5 es un enlace a L o se une por medio de un enlace a L.
En un ejemplo de la invención, uno o más de los sustituyentes X2, X3, X4 y X5 se selecciona del grupo que consiste en H, OH, CH2OH, COOH, COOR', alquilo C1-C8, O(alquilo C1-C8), arilo, COR', OCOR', CONH2, CONHR', CONR'2, NHCOR', SH, SO2R', SOR', OSO2OH, OPO(OH)2, halógeno, N3, NH2, NHR', NR'2, o NHCO(alquilo C1-C8), en los que cada R' es de modo independiente H, alquilo C1-C8 o arilo.
En un ejemplo, uno o más de los sustituyentes X2, X3, X4 y X5 se selecciona de todos los sustituyentes químicos descriptos en la presente memoria.
En un ejemplo, D es D', en el que D' es la molécula de carga útil tóxica que comprende un resto amino, a través del cual la molécula de carga útil tóxica se puede unir para formar una amina secundaria o terciaria. En las fórmulas VIII, IX, X y XI, D' en consecuencia se debe entender que se refiere a la misma molécula de carga útil tóxica como D mostrada en las fórmulas I, V y XIV a condición de que D es D'.
El grupo ligador puede ser un grupo ligador adecuado capaz de unir de modo covalente G a D. Los ligadores que se pueden utilizar, en principio, se describen por ejemplo en Dosio et al., Toxins 2011, 3, 848-883, y Sammet et al., Pharm. Pat. Analyst 2012, 1(1), 2046-8954.
En una realización, el grupo ligador es hidrófilo.
n una realización, el grupo ligador comprende al menos un grupo OH.
En una realización, L es un grupo ligador representado por la fórmula VIII
Fórmula VIII
en la que
Y es un oxígeno, azufre, amina, amida, péptido o ausente, en la que el péptido es una unidad E1-P-E2 en la que E1 y E2 son de modo independiente C=O, O o NRp, en la que Rp es H, alquilo C1-C6 o alquilo C1-C8 sustituido, P es una unidad peptídica de 2 a 5 aminoácidos de longitud, y E1 y E2 se pueden unir de modo independiente al péptido a través del nitrógeno terminal, carbono terminal o a través de una cadena lateral de uno de los aminoácidos del péptido;
Z es un sacárido o ausente;
D' es la molécula de carga útil tóxica, en la que la molécula de carga útil tóxica comprende un resto amina, a través del cual se une la molécula de carga útil tóxica para formar una amina secundaria o terciaria;
R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8 y R9 son cada uno de modo independiente H, OH, amina, acilamida C2-C6, carboxilo, carboxilo sustituido, alquilo C1-C6 o alquilo C1-C6 sustituido;
W es H, CH2OH, CH3, carboxilo, carboxilo sustituido, alquilo C1-C6 o alquilo C1-C6 sustituido;
a es un número entero de 0 a 6;
b es 0 o 1 ;
c y e son cada uno de modo independiente un número entero de 0 a 7;
d es un número entero de 1 a 7;
Q es E'-F'-E, en el que F' es una amina, amida, disulfuro, tioéter, tioéster, hidrazona, base de Schiff, oxima, producto de reacción de metátesis de olefina, grupo triazol o fosfina, u otro grupo generado por la reacción del grupo funcional F-E y el grupo funcional F', en el que F es un grupo funcional que puede reaccionar con una amina, tiol, azida, alqueno, alquino, aldehído, cetona, ácido carboxílico o hidroxilamina, y F' es una amina, tiol, azida, alqueno, alquino, aldehído, cetona, ácido carboxílico o hidroxilamina; y E está ausente o una unidad de unidad de polietilenoxi de fórmula (CH2CH2O)p, en la que p es un número entero de 2 a aproximadamente 20; y E y E' son cada uno de modo independiente ausente o es una unidad de polietilenoxi de fórmula (CH2CH2O)p, en la que es un número entero de 2 a aproximadamente 20; y
Q se une por medio de un enlace a G.
En una realización, L es un grupo ligador representado por la fórmula IX
Figure imgf000022_0001
en la que
Y es un oxígeno, azufre, amina, amida, péptido o ausente, en la que el péptido es una unidad E1-P-E2 en la que E1 y E2 son de modo independiente C=O, O o NRp, en la que Rp es H, alquilo C1-C6 o alquilo C1-C6 sustituido, P es una unidad peptídica de 2 a 5 aminoácidos de longitud, y E1 y E2 se pueden unir de modo independiente al péptido a través del nitrógeno terminal, carbono terminal o a través de una cadena lateral de uno de los aminoácidos del péptido;
Z es un sacárido o ausente;
D' es la molécula de carga útil tóxica, en la que la molécula de carga útil tóxica comprende un resto amina, a través del cual se une la molécula de carga útil tóxica para formar una amina secundaria o terciaria;
R1, R2, R9 y Ri0 son cada uno de modo independiente H, OH, amina, acilamida C2-C6, carboxilo, carboxilo sustituido, alquilo C1-C6 o alquilo C1-C6 sustituido;
a es un número entero de 0 a 6;
e es un número entero de 0 a 3;
d y f son números enteros de 0 a 4 a condición de que su suma es de 1 a 4;
Q es E'-F'-E, en el que F' es una amina, amida, amida, disulfuro, tioéter, tioéster, hidrazona, base de Schiff, oxima, producto de reacción de metátesis de olefina, grupo triazol o fosfina, u otro grupo generado por la reacción del grupo funcional F-E y el grupo funcional F', en el que F es un grupo funcional que puede reaccionar con una amina, tiol, azida, alqueno, alquino, aldehído, cetona, ácido carboxílico o hidroxilamina, y F' es una amina, tiol, azida, alqueno, alquino, aldehído, cetona, ácido carboxílico o hidroxilamina; y E está ausente o una unidad de unidad de polietilenoxi de fórmula (CH2CH2O)p, en la que p es un número entero de 2 a aproximadamente 20; y E y E' son cada uno de modo independiente ausente o es una unidad de polietilenoxi de fórmula (CH2CH2O)p, en la que es un número entero de 2 a aproximadamente 20; y
Q se une por medio de un enlace a G.
En una realización, L es un grupo ligador representado por la fórmula X
Figure imgf000023_0001
en la que
Y es un oxígeno, azufre, amina, amida, péptido o ausente, en la que el péptido es una unidad E1-P-E2 en la que Ei y E2 son de modo independiente C=O, O o NRp, en la que Rp es H, alquilo C1-C6 o alquilo C1-C6 sustituido, P es una unidad peptídica de 2 a 5 aminoácidos de longitud, y Ei y E2 se pueden unir de modo independiente al péptido a través del nitrógeno terminal, carbono terminal o a través de una cadena lateral de uno de los aminoácidos del péptido;
Z es un sacárido o ausente;
D' es la molécula de carga útil tóxica, en la que la molécula de carga útil tóxica comprende un resto amina, a través del cual se une la molécula de carga útil tóxica para formar una amina secundaria o terciaria;
R1 y R2 son cada uno de modo independiente H, OH, amina, acilamida C2-C6, carboxilo, carboxilo sustituido, alquilo C1-C6 o alquilo C1-C6 sustituido;
a es un número entero de 0 a 6;
c y e son cada uno de modo independiente un número entero de 0 a 3;
Q es E'-F'-E, en el que F' es amina, amida, amida, disulfuro, tioéter, tioéster, hidrazona, base de Schiff, oxima, producto de reacción de metátesis de olefina, grupo triazol o fosfina, u otro grupo generado por la reacción del grupo funcional F-E y el grupo funcional F', en el que F es un grupo funcional que puede reaccionar con una amina, tiol, azida, alqueno, alquino, aldehído, cetona, ácido carboxílico o hidroxilamina, y F' es una amina, tiol, azida, alqueno, alquino, aldehído, cetona, ácido carboxílico o hidroxilamina; y E está ausente o es una unidad de polietilenoxi de fórmula (CH2CH2O)p, en la que p es un número entero de 2 a aproximadamente 20; y
Q se une por medio de un enlace a G.
En un ejemplo, F es un grupo reactivo amina, un grupo reactivo tiol, un grupo reactivo azida, un grupo reactivo alquino, un grupo reactivo carbonilo en un grupo reactivo hidroxilamina.
En un ejemplo, F es un grupo reactivo amina, tales como pero sin limitación) a un N-hidroxisuccinmida éster, pnitrofenil éster, dinitrofenil éster, o pentafluorofenil éster.
En un ejemplo, F es un grupo reactivo tiol, tal como (pero sin limitación) piridildisulfuro, nitropiridildisulfuro, maleimida, haloacetato o cloruro de ácido carboxílico.
En un ejemplo, F es un grupo reactivo azida, tal como (pero sin limitación) alquino.
En un ejemplo, F es un alquino.
n un ejemplo, F es CH=C.
En un ejemplo, F es un grupo dibenzociclooctilo (DBCO).
En una realización de la invención, F es un grupo reactivo alquino, (tal pero como sin limitación) azida.
En una realización, F es azida.
En un ejemplo, F es un grupo reactivo carbonilo, tal como (pero sin limitación) hidroxilamina.
En un ejemplo, F es un grupo reactivo hidroxilamina, tal como (pero sin limitación) aldehído o cetona.
En un ejemplo, F es isotiocianato, isocianato, cloruro de sulfonilo, glioxal, epóxido, oxirano, carbonato, haluro de arilo, imidoéster, carbodiimida, o anhídrido.
En una realización, Z está ausente.
En una realización, Z es un sacárido.
En una realización, Z es un oligosacárido con un grado de polimerización de 1 a aproximadamente 20; de 1 a 10; de 1 a 8; de 1 a 6; de 1 a 5; de 1 a 4; de 1 a 3; de 1 a 2; o 1,2, 3, 4 o 5.
En una realización, Z es un monosacárido, disacárido o trisacárido.
En una realización, Z es OH.
En una realización, Z es H.
En una realización, a es 1, 2, 3, 4, 5, o 6.
En una realización, a es 1.
En una realización, b es 0.
En una realización, b es 1.
En una realización, c es 0.
En una realización, c es 1, 2, 3, 4, 5, 6 o 7.
En una realización, d es 1, 2, 3, 4, 5, 6 o 7.
En una realización, d es 3, 4 o 5.
En una realización, d es 3.
En una realización, d es 4.
En una realización, d es 5.
En una realización, d es 6.
En una realización, e es 0.
En una realización, e es 1, 2, 3, 4, 5, 6 o 7.
En una realización, d es 3; y R7 es H.
En una realización, d es 4; y R7 es H.
En una realización, b es 1; y R3 y R4 son cada uno H.
En una realización, a es 1; y R1 y R2 son cada uno H.
En una realización, e es 1; y R8 y R9 son cada uno H.
En una realización, a, b, c, o e es 0.
En una realización, a, b, c, y/o e es 0.
En una realización, W es H.
En una realización, a es 2 o 3; y R1 y R2 son cada uno H.
En una realización, Y es oxígeno.
En una realización, Y es azufre.
En una realización, Y es un péptido.
En una realización, Y es un péptido que comprende una unidad E1-P-E2 en la que E1 y E2 son de modo independiente C=O, O o NRp, en la que Rp es H, alquilo C1-C6 o alquilo C1-C6 sustituido, P es una unidad peptídica de 2 a 5 aminoácidos de longitud, y E1 y E2 se pueden unir de modo independiente al péptido a través del nitrógeno terminal, carbono terminal o a través de una cadena lateral de uno de los aminoácidos del péptido. En una realización, Y es un péptido que es una unidad E1-P-E2 en la que E1 y E2 son de modo independiente C=O, O o NRp, en la que Rp es H, alquilo C1-C6 o alquilo C1-C6 sustituido, P es una unidad peptídica de 2 a 5 aminoácidos de longitud, y E1 y E2 se pueden unir de modo independiente al péptido a través del nitrógeno terminal, carbono terminal o a través de una cadena lateral de uno de los aminoácidos del péptido.
En una realización, Y es un péptido de 2 a 5 aminoácidos de longitud.
En una realización, el péptido está unido al grupo ligador a través del nitrógeno terminal es decir, a través del extremo amino terminal por un enlace amida.
En una realización, el péptido está unido al grupo ligador a través del carbono terminal es decir, a través del extremo terminal carboxi mediante un enlace amida o un enlace éster.
En una realización, el péptido está unido al grupo ligador a través de una cadena lateral de uno de los aminoácidos del péptido mediante un enlace amida, éster, disulfuro o tioéter.
En una realización, el péptido comprende una secuencia de aminoácidos escindible por una peptidasa lisosómica, por ejemplo L-Gly-L-Gly, L-Val-L-Cit, L-Phe-L-Leu, L-Leu-L-Ala-L-Leu, L-Leu-L-Ala-L-Ala, L-Ala-L-Leu-L-Ala-L-Leu, y similares.
En una realización, Q es E'-F'-E, en el que F' es un grupo triazol generado por la reacción del grupo funcional F-E y el grupo funcional F', en la que F es una azida y F' es un alquino; y E está ausente.
En una realización, R1, R2, R3, R4 y R7 son cada uno H; W es H; a es 1; b es 1; c y e son cada uno 0; y d es 4. En una realización, R3, R4, y R7 son cada uno H; W es H; b es 1; a, c y e son cada uno 0; y d es 4.
En una realización, L es un grupo ligador representado por la fórmula X, en la que Y es un oxígeno o ausente; Z es ausente;
D' es la molécula de carga útil tóxica, en la que la molécula de carga útil tóxica comprende un resto amina, a través del cual se une la molécula de carga útil tóxica para formar una amina secundaria o terciaria;
R1 y R2 son cada uno de modo
independiente H o OH; a es 1 o 2;
c es 0, 1, 2 o 3;
e es 0 o 1 ;
Q es E'-F'-E, en el que F' es un grupo triazol generado por la reacción del grupo funcional F-E y el grupo funcional F', en el que F es una azida y F' es un alquino; E está ausente; y
Q se une por medio de un enlace a G.
El término "alquilo" se debe entender que se refiere a un hidrocarburo saturado o insaturado de cadena lineal o ramificada que tiene el número indicado de átomos de carbono (por ejemplo, "alquilo C1-C8" se refiere a un grupo alquilo que tiene de 1 a 8 átomos de carbono). Cuando no se indica el número de átomos de carbono, el grupo alquilo tiene de 1 a 8 átomos de carbono. Los grupos representativos "alquilo C1-C8" incluyen (pero sin limitación) metilo (Me, CH3), etilo (Et, CH2CH3), 1 -propilo (n-Pr, n-propilo, CH2CH2CH3), 2-propilo (i-Pr, isopropilo, CH(CH3)2), 1-butilo (n-Bu, n-butilo, CH2CH2CH2CH3), 2-metil-1 -propilo (i-Bu, isobutilo, CH2CH(c H3)2), 2-butilo (s-Bu, s-butilo, CH(CH3)CH2CH3), 2-metil-2-propilo (t-Bu, terc-butilo, C(CH3)3), 1-pentilo (n-pentilo, CH2CH2CH2CH2CH3), 2-pentilo (CH(CH3)CH2CH2CH3), 3-pentilo (CH(CH2CH3)2), 2-metil-2-butilo (C(CH3)2CH2CH3), 3-metil-2-butilo(CH(CH3)CH(CH3)2),3-metil-1-butilo (CH2CH2CH(CH3)2), 2-metil-1-butilo (CH2CH(CH3)CH2CH3), 1-hexilo (CH2CH2CH2CH2CH2CH3), 2-hexilo (CH(CH3)CH2CH2CH2CH3), 3-hexilo (CH (CH2CH3XCH2CH2CH3)), 2-metil-2-pentilo (C(CH3)2CH2CH2CH3), 3-metil-2-pentilo (CH (CH3)CH(CH3)CH2CH3), 4-metil-2-pentil(CH(CH3)CH2CH(CH3)2), 3-metil-3-pentilo (C(CH3)(CH2CH3)2), 2-metil-3-pentilo (CH(CH2CH3)CH(CH3)2), 2,3-dimetil-2-butilo (C(CH3)2Ch (CH3)2), y 3, 3-dimetil-2-butilo (CH(CH3)C(c H3)3). Un grupo alquilo puede estar no sustituido o sustituido con uno o más grupos que incluyen, pero sin limitación, OH, O(alquilo C1-C8), arilo, COR', OCOR', CONH2, CONHR', CONR'2, NHCOR', SH, SO2R', SOR', OSO2OH, OPO(OH)2, halógeno, N3, NH2, NHR', NR'2, NHCO(alquilo C1-C8) o CN, en los ue cada R' es de modo independiente H, alquilo C1-C8 o arilo. El término "alquilo" también se debe entender que se refiere a un alquileno, un radical hidrocarbonado cíclico, saturado, ramificado o lineal de 1-18 átomos de carbono, y que tiene dos centros radicales monovalentes derivados de la eliminación de dos átomos de hidrógeno del mismo o dos átomos de carbono diferentes de un alcano original. Estos alquilenos típicos incluyen (pero sin limitación) metileno (CH2) 1,2-etilo (CH2CH2), 1,3-propilo (CH2CH2CH2), 1,4-butilo (CH2CH2CH2CH2), y similares. El término "alquilo" también debe entenderse que se refiere a los radicales arilalquilo y heteroarilalquilo como se describe a continuación.
El término "alquenilo" se debe entender que se refiere a un hidrocarburo C2-C18 que contiene átomos de carbono normales, secundarios, terciarios o cíclicos con al menos un sitio de insaturación, es decir, un doble enlace carbonocarbono, sp2. Los ejemplos incluyen, pero sin limitación etileno o vinilo (CH=CH2), alilo (CH2CH=CH2), ciclopentenilo (C5H7), y 5-hexenilo (CH2CH2CH2CH2CH=CH2). El término "alquenilo" también se debe entender que se refiere a un alquenileno, un radical hidrocarburo insaturado de cadena lineal o ramificada o cíclico de 2-18 átomos de carbono, y que tiene dos centros radicales monovalentes derivados de la eliminación de dos átomos de hidrógeno del mismo o dos átomos de carbono diferentes de un alqueno original. Los radicales alquenileno típicos incluyen, pero sin limitación 1,2-etileno (CH=CH).
El término "alquinilo" se debe entender que se refiere a un hidrocarburo C2-C18 que contiene átomos de carbono normales, secundarios, terciarios o cíclicos con al menos un sitio de insaturación, es decir, un triple enlace carbonocarbono, sp2. Los ejemplos incluyen, pero sin limitación acetilénico (C=CH) y propargilo (CH2C=CH). El término "alquinilo" también se debe entender que se refiere a un alquinileno, un radical hidrocarburo insaturado de cadena lineal o ramificada o cíclico de 2-18 átomos de carbono, y que tiene dos centros radicales monovalentes derivados de la eliminación de dos átomos de hidrógeno del mismo o dos átomos de carbono diferentes de un alquino original. Los radicales alquinileno típicos incluyen, pero sin limitación acetileno (C=C), propargilo (CH2C=CH), y 4-pentinilo (CH2CH2CH2C=C).
El término "arilo" se debe entender que se refiere a un radical hidrocarbonado aromático monovalente de 6-20 átomos de carbono derivado de la eliminación de un átomo de hidrógeno de un átomo de carbono único de un sistema de anillo aromático original. Un grupo arilo puede estar no sustituido o sustituido. Los grupos arilo típicos incluyen (pero sin limitación) radicales derivados de benceno, benceno sustituido, fenilo, naftaleno, antraceno, bifenilo y similares. Un arilo puede estar sustituido con uno o más grupos quen incluye, pero sin limitación, OH, O(alquilo C1-C8), arilo, COR', OCOR', CONH2, CONHR', CONR'2, NHCOR', SH, SO2R', SOR', OSO2OH, OPO(OH)2, halógeno, N3, NH2, NHR', NR'2, NHCO(alquilo C1-C8) o CN, en el que cada R' es de modo independiente H, alquilo C1-C8 o arilo. El término "arilo" también se debe entender que se refiere a un grupo arileno que es un grupo arilo que tiene dos enlaces covalentes y puede estar en las configuraciones para, meta u orto, en las que el grupo fenilo puede estar no sustituido o sustituido con hasta cuatro grupos que incluyen pero sin limitación OH, O(alquilo C1-C8), arilo, COR', OCOR', CONH2, CONHR', CONR'2, NHCOR', SH, SO2R', SOR', OSO2OH, OPO(OH)2, halógeno, N3, NH2, NHR', NR'2, NHCO(alquilo C1-C8) o CN, en el que cada R' es de modo independiente H, alquilo C1-C8 o arilo.
El término "arilalquilo" se debe entender que se refiere a un radical alquilo acíclico en el que uno de los átomos de hidrógeno unidos a un átomo de carbono, típicamente un átomo de carbono terminal o sp3, se reemplaza con un radical arilo. Los grupos arilalquilo típicos incluyen (pero sin limitación) bencilo, 2-feniletan-1-ilo, 2-fenileten-1-ilo, naftilmetilo, 2-naftiletilen-1-ilo, 2-naftileten-1-ilo, naftobencilo, 2-naftofeniletan-1-ilo, y similares. El grupo arilalquilo comprende de 6 a 20 átomos de carbono, por ejemplo, el resto alquilo, incluidos los grupos alcanilo, alquenilo o alquinilo, del grupo arilalquilo tiene de 1 a 6 átomos de carbono y el resto arilo tiene de 5 a 14 átomos de carbono.
El término "heteroarilalquilo" se debe entender que se refiere a un radical alquilo acíclico en el que uno de los átomos de hidrógeno unido a un átomo de carbono, típicamente un átomo de carbono terminal o sp3, se reemplaza con un radical heteroarilo. Los grupos heteroarilalquilo típicos incluyen (pero sin limitación) 2-bencimidazolilmetilo, 2-furiletilo y similares. El grupo heteroarilalquilo comprende de 6 a 20 átomos de carbono, por ejemplo, el resto alquilo, que incluyen los grupos alcanilo, alquenilo o alquinilo, del grupo heteroarilalquilo tiene de 1 a 6 átomos de carbono y el resto heteroarilo tiene de 5 a 14 átomos anulares, típicamente de 1 a 3 heteroátomos seleccionados de N, O, P y S, el resto son átomos de carbono. El resto heteroarilo del grupo heteroarilalquilo puede ser un monociclo que tiene 3 a 7 miembros anulares (2 a 6 átomos de carbono) o un biciclo que tiene 7 a 10 miembros anulares (4 a 9 átomos de carbono) y 1 a 3 heteroátomos seleccionados de N, O, P y S, por ejemplo: un sistema biciclo [4,5], [5,5], [5,6] o [6,6].
Los términos "alquilo sustituido", "arilo sustituido" y "arilalquilo sustituido" se debe entender que se refiere a alquilo, arilo, y arilalquilo, respectivamente, en los que uno o más átomos de hidrógeno se reemplazan cada uno de modo independiente con un sustituyente. Los sustituyentes típicos incluyen pero sin limitación X, R,-O-, OR, SR,-S-, NR2, NR3, =NR, CX3, CN, OCN, SCN, N=C=O, NCS, NO, NO2, =N2, N3, NRCOR, COR, CONR2,-SOa-, SO3H, SO2R, OSO2OR, SO2NR, SOR, OPO(OR)2, PO(OR)2,-PO3-, PO3H2, COR, COX, C(=S)R, CO2R-CO 2-, C(=S)OR, COSR, C(=S)SR, CONR2, C(=S)NR2, y C(=NR)NR2, donde cada X es de modo independiente un halógeno: F, Cl, Br, o I; y cada R es de modo independiente H, alquilo C2-C18, arilo C6-C20, heterociclo C3-C14 o grupo protector. Los grupos alquileno, alquenileno, y alquinileno descriptos anteriormente también se puede sustituir de modo similar.
Los términos "heteroarilo" y "heterociclo" se debe entender que se refiere a un sistema anular en que dos o más átomos anulares es un heteroátomo, por ejemplo, nitrógeno, oxígeno, fosfato y azufre. El radical heterociclo comprende 1 a 20 átomos de carbono y 1 a 3 heteroátomos seleccionados de N, O, P, y S. Un heterociclo puede ser un monociclo que tiene 3 a 7 miembros anulares (2 a 6 átomos de carbono y 1 a 3 heteroátomos seleccionados de N, O, P, y S) o un biciclo que tiene 7 a 10 miembros anulares (4 a 9 átomos de carbono y 1 a 3 heteroátomos seleccionados del N, O, P, y S), por ejemplo: un sistema biciclo [4,5], [5,5], [5,6], o [6 ,6]. Los heterociclos se describen en Paquette, "Principles of Modern Heterocyclic Chemistry" (W. A. Benjamin, New York, 1968), particularmente Capítulos 1, 3, 4, 6, 7, y 9; "The Chemistry of Heterocyclic Compounds, A series of Monographs" (John Wiley & Sons, New York, 1950 hasta el presente), en particular Volúmenes 13, 14, 16, 19, y 28; y J. Am. Chem. Soc. 82:5566 (1960).
Los ejemplos de heterociclos incluyen, a modo de ejemplo y no limitación, piridilo, dihidropiridilo, tetrahidro-piridilo (piperidilo), tiazolilo, tetrahidrotiofenilo, tetrahidrotiofenilo oxidado con azufre, pirimidinilo, furanilo, tienilo, pirrolilo, pirazolilo, imidazolilo, tetrazolilo, benzofuranilo, tianaftalenilo, indolilo, indolenilo, quinolinilo, isoquinolinilo, benzimidazolilo, piperidinilo, 4-piperidonilo, pirrolidinilo, 2-pirrolidonilo, pirrolinilo, tetrahidrofuranilo, bis-tetrahidrofuranilo, tetrahidropiranilo, bis-tetrahidropiranilo, tetrahidroquinolinilo, tetrahidroisoquinolinilo, decahidroquinolinilo, octahidroisoquinolinilo, azocinilo, triazinilo, 6H-1,2,5-tiadiazinilo, 2H,6H-1,5,2-ditiazinilo, tienilo, tiantrenilo, piranilo, isobenzofuranilo, cromenilo, xantenilo, fenooxatinilo, 2H-pirrolilo, isotiazolilo, isoxazolilo, pirazinilo, piridazinilo, indolizinilo, isoindolilo, 3H-indolilo, 1H-indazolilo, purinilo, 4H-quinolizinilo, ftalazinilo, naftiridinilo, quinoxalinilo, quinazolinilo, cinnolinilo, pteridinilo, 4aH-carbazolilo, carbazolilo, p-carbolinilo, fenantridinilo, acridinilo, pirimidinilo, fenantrolinilo, fenazinilo, fenotiazinilo, furazanilo, fenoxazinilo, isocromanilo, cromanilo, imidazolidinilo, imidazolinilo, pirazolidinilo, pirazolinilo, piperazinilo, indolinilo, isoindolinilo, quinuclidinilo, morfolinilo, oxazolidinilo, benzotriazolilo, benzisoxazolilo, oxindolilo, benzoxazolinilo, e isatinoílo.
A modo de ejemplo y no de limitación, los heterociclos unidos por carbono se unen en las siguientes posiciones: posición 2, 3, 4, 5, o 6 de una piridina; posición 3, 4, 5, o 6 de una piridazina; posición 2, 4, 5, o 6 de una pirimidina; posición 2, 3, 5, o 6 de una pirazina; posición 2, 3, 4, o 5 de un furano, tetrahidrofurano, tiofurano, tiofeno, pirrol o tetrahidropirrol; posición 2, 4, o 5 de un oxazol, imidazol o tiazol; posición 3, 4, o 5 de un isoxazol, pirazol, o isotiazol; posición 2 o 3 de un aziridina; posición 2, 3, o 4 de una azetidina; posición 2, 3, 4, 5, 6, 7, o 8 de una quinolina; o posición 1, 3, 4, 5, 6, 7, o 8 de una isoquinolina. Aún más típicamente, los heterociclos unidos por carbono incluyen 2-piridilo, 3-piridilo, 4-piridilo, 5-piridilo, 6-piridilo, 3-piridazinilo, 4-piridazinilo, 5-piridazinilo, 6-piridazinilo, 2-pirimidinilo, 4-pirimidinilo, 5-pirimidinilo, 6-pirimidinilo, 2-pirazinilo, 3-pirazinilo, 5-pirazinilo, 6-pirazinilo, 2-tiazolilo, 4-tiazolil y 5-tiazolilo.
A modo de ejemplo y no limitación, heterociclos unidos por nitrógeno se unen en la posición 1 de una aziridina, azetidina, pirrol, pirrolidina, 2-pirrolina, 3-pirrolina, imidazol, imidazolidina, 2-imidazolina, 3-imidazolina, pirazol, pirazolina, 2-pirazolina, 3-pirazolina, piperidina, piperazina, indol, indolina, o 1H-indazol; posición 2 de un esoindol o isoindolina; posición 4 de una morfolina; y posición 9 de un carbazol o p-carbolina. Aún más típicamente, los heterociclos unidos por nitrógeno incluyen 1 -aziridilo, 1-azetedilo, 1 -pirrolilo, 1 -imidazolilo, 1-pirazolil y 1 -piperidinilo. El término "carbociclo" se debe entender que se refiere a un anillo saturado o insaturado que tiene 3 a 7 átomos de carbono como un monociclo o 7 a 12 átomos de carbono como un biciclo. Los carbociclos monocíclicos 3 a 6 átomos anulares, aún más típicamente 5 o 6 átomos anulares. Los carbociclos bicíclicos tienen 7 a 12 átomos anulares, por ejemplo, dispuestos como un sistema biciclo [4,5], [5,5], [5,6] o [6,6], o 9 o 10 átomos anulares dispuestos como un sistema biciclo [5,6] o [6,6]. Los ejemplos de carbociclos monocíclicos incluyen ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, 1-ciclopent-1-enilo, 1-ciclopent-2-enilo, 1-ciclopent-3-enilo, ciclohexilo, 1-ciclohex-1-enilo, 1-ciclohex-2-enilo, 1-ciclohex-3-enilo, cicloheptilo y ciclooctilo.
El término "sacárido" se debe entender que se refiere a restos de azúcar simples únicos o monosacáridos o sus derivados, así como combinaciones de dos o más restos de azúcar únicos o monosacáridos unidos covalentemente para formar disacáridos, oligosacáridos y polisacáridos. Un sacárido puede ser un compuesto que incluye una o más unidades de monómero de cadena abierta o ciclado basado en una forma de cadena abierta de compuestos que tienen la estructura química H(CHOH)nC(=O)(CHOH)mH, en la que la suma de n+m es un número entero en el intervalo de 2 a 8. Por lo tanto, las unidades de monómero pueden incluir triosas, tetrosas, pentosas, hexosas, heptosas, octosas, nonosas y mezclas de las mismas. Uno o varios de los grupos hidroxilo en la estructura química se pueden reemplazar con otros grupos tales como hidrógeno, amino, amina, acilamido, acetilamido, halógeno, mercapto, acilo, acetilo, éster de fosfato o sulfato, y similares; y los sacáridos también pueden comprender otros grupos funcionales tales como grupos carboxilo, carbonilo, hemiacetal, acetal y tio. Los sacáridos pueden incluir monosacáridos que incluyen, pero sin limitación, aldosas simples tales como gliceraldehído, eritrosa, treosa, ribosa, arabinosa, xilosa, lixosa, alosa, altrosa, glucosa, manosa, gulosa, idosa, galactosa, talosa y manoheptulosa; cetosas simples tales como dihidroxiacetona, eritrulosa, ribulosa, xilulosa, psicosa, fructosa, sorbosa, tagatosa y seudoheptulosa; desoxi azúcares tales como fucosa, 2-desoxiglucosa, 2-desoxirribosa y ramnosa; ácidos siálicos tales como ácido cetodesoxinonulosónico, ácido N-acetilneuramínico y ácido 9-O-acetil-N-acetilneuramínico; ácidos urónicos tales como ácido glucurónico, ácido galacturónico y ácido idurónico; azúcares amino tales como 2-amino-2-desoxigalactosa y 2-amino-2-desoxiglucosa; azúcares de acilamino tales como 2-acetamido-2-desoxigalactosa, 2-acetamido-2-desoxiglucosa y ácido N-glicolilneuramínico; azúcares fosforilados y sulfatados tales como 6-fosfomanosa, 6-sulfo-N-acetilglucosamina y 3-sulfogalactosa; y derivados y modificaciones de los mismos. El término "sacárido" también incluye carbohidratos no reductores tales como inositoles y alditoles y sus derivados. Los sacáridos de acuerdo con la presente invención pueden estar en configuración D o L; en forma de cadena abierta, piranosa o furanosa; anómero a o p; y cualquier combinación de los mismos.
El término "oligosacárido" se debe entender que se refiere a sacáridos compuestos por dos o varios monosacáridos unidos entre sí por enlaces glicosídicos que tienen un grado de polimerización en el intervalo de 2 a aproximadamente 20. El término "oligosacárido" se debe entender como hetero y homopolímeros de referencia que pueden ser ramificados o lineales y tener un extremo reductor y un extremo no reductor, ya sea que el sacárido en el extremo reductor sea en efecto un azúcar reductor. Un oligosacárido descripto en la presente memoria se puede describir con el nombre o la abreviatura del sacárido no reductor, seguido de la configuración del enlace glicosídico (a o p), el enlace del anillo, la posición del anillo del sacárido reductor involucrado en el enlace, y posteriormente el nombre o la abreviatura del sacárido reductor, y así sucesivamente (por ejemplo, Galp1-4Glc para lactosa y Galal-4Galp1-4Glc para globotriosa).
En una realización, los monosacáridos están en formas cicladas de piranosa (P) o furanosa (F) de acuerdo con las fórmulas:
Figure imgf000028_0001
en la que los grupos R1, R2, R3, R4 y R5 son cada uno de modo independiente H, OH, CH2OH, COOH, COOR', alquilo C1-C8, O(alquilo Ci-Ca), arilo, COR', OCOR', CONH2, CONHR', CONR'2, NHCOR', SH, SO2R', SOR', 0 SO2OH, OPO(Oh )2, halógeno, N3, NH2, NHR', NR'2, NHCO(alquilo C1-C8) o RN, en la que cada R' es de modo independiente H, alquilo C1-C8 o arilo y cada RN es un sacárido de extremo no reductor; RE es H o estructura del extremo reductor tales como un sacárido; n es un número entero en el intervalo 0 a 3 en F o en el intervalo 0 a 4 en P; y la estereoquímica de cada R1, R2, R3, R4 y R5 es dependiente de la estructura de monosacárido y su configuración y anomericidad.
El término "disacárido" se debe entender que se refiere a un sacárido compuesto de dos monosacáridos unidos entre sí por un enlace glicosídico. Los ejemplos de disacáridos incluyen, pero sin limitación, lactosa, N-acetillactosamina, galactobiosa, maltosa, isomaltosa y celobiosa.
El término "trisacárido" se debe entender que se refiere a un sacárido compuesto de tres monosacáridos unidos entre sí por enlaces glicosídicos. Los ejemplos de trisacáridos incluyen, pero sin limitación, maltotriosa, sialillactosa, globotriosa, lacto-N-triosa y gangliotriosa.
El término "molécula de carga útil tóxica" se debe entender que se refiere a cualquier molécula tóxica adecuada para la conjugación de acuerdo con una o más realizaciones de la invención.
En una realización, a molécula de carga útil tóxica naturalmente comprende un resto amina primaria o secundaria. En una realización, una molécula de carga útil tóxica se modifica para comprender un resto amina primaria o secundaria. En una realización, la molécula de carga útil tóxica modificada con amina esencialmente retiene la actividad de la molécula de carga útil tóxica original.
La molécula de carga útil tóxica La molécula de carga útil tóxica puede ser cualquier compuesto que provoca la muerte de una célula, o induce la muerte celular, o de alguna manera disminuya la viabilidad celular. La molécula de carga útil tóxica puede ser cualquiera de muchos fármacos de molécula pequeña, que incluyen, pero sin limitacións, dolastatinas; auristatinas; epotilones; daunorrubicinas y doxorrubicinas; agentes alquilantes, tales como tiotepa y ciclofosfamida (CYTOXAN™); alquil sulfonatos tales como busulfano, improsulfano y piposulfano; aziridinas, tales como benzodopa, carboquona, meturedopa y uredopa; etileniminas y metilamelaminas que incluyen altretamina, trietilenmelamina, trietilenfosforamida, trietilentiofosforamida y trimetilolomelamina; acetogeninas (especialmente bulatacina y bulatacinona); camptotecinas (que incluyen el análogo sintético topotecano); briostatina; calistatina; CC-1065 (incluyendo sus análogos sintéticos de adozelesina, carzelesina y bizelesina); criptoficinas (particularmente criptoficina 1 y criptoficina 8); duocarmicina (que incluye los análogos sintéticos, KW-2189 y CBI-TMI); eleuterobina; pancratistatina; sarcodictiínas; espongistatina; mostazas nitrogenadas tales como clorambucilo, cloromafazina, clofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, clorhidrato de óxido de mecloretamina, melfalan, novembicina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostaza de uracilo; nitrosureas tales como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina, ranimustina; antibióticos, tales como los antibióticos de enediína (por ejemplo, calicheamicinas, especialmente calicheamicina y1 dinemicina, que incluyen dinemicina A; esperamicina; así como el cromóforo de neocarzinostatina y los cromóforos del antibiótico enediína cromoproteína relacionados), aclacinomisinas, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicina, cactinomicina, carabicina, caminomicina, carzinofilina; cromomicinas, dactinomicina, detorrubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, otros derivados de doxorrubicina que incluyen morfolinodoxorrubicina, cianomorfolino-doxorrubicina, 2-pirrolino-doxorrubicina y desoxidoxorrubicina, epirrubicina, esorubicina, idarrubicina, marcelomicina, nitomicinas, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorrubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorrubicina; antimetabolitos, tales como metotrexato y 5-fluorouracilo (5-FU); análogos de ácido fólico, tales como denopterina, metotrexato, pteropterina, trimetrexato; análogos de purina, tales como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; análogos de pirimidina tales como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, didesoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina, 5-fluorouracilo; andrógenos, tales como calusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostano, testolactona; anti-adrenales, tales como aminoglutetimida, mitotano, trilostano; repositor de ácido fólico, tal como ácido frolínico; aceglatona; aldofosfamida glicósido; ácido aminolevulínico; amsacrina; bestrabucilo; bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina; diaziquona; elfomitina; acetato de elliptinio; etoglucid; nitrato de galio; hidroxiurea; lentinano; lonidamina; maytansinoides, tales como maytansina, ansamitocinas, DM-1, DM-4; mitogazona; mitoxantrona; mopidamol; nitracrina; pentostatina; fenamet; pirarubicina; ácido podofilínico; 2-etilhidrazida; procarbazina; PSK®; razoxano; rizoxina; sizofurano; espirogermanium; ácido tenuazónico; triaziquona; 2,2',2"-triclorotrietilamina; tricotecenos (especialmente toxina T-2, verracurina A, roridina A y anguidina); uretano; vindesina; dacarbazina; manomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobromano; gacitosina; arabinósido (" Ara-C "); ciclofosfamida; tiotepa; taxoides, por ejemplo, paclitaxel (TAXOL®, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ) y doxetaxel (TAXOTERE®, Rhone-Poulenc Rorer, Antony, Francia); clorambucilo; gemcitabina; 6-tioguanina; mercaptopurina; metotrexato; análogos de platino tales como cisplatino y carboplatino; vinblastina; platino; etopósido (VP-l6); ifosfamida; mitomicina C; mitoxantrona; vincristina; vinorelbina; navelbina; novantrona; tenipósido; daunomicina; aminopterina; CPT-11; xeloda; ibandronato; CPT-11; inhibidor de topoisomerasa RFS 2000; difluorometilomitina (DMFO); ácido retinoico; capecitabina; agentes anti-hormonales que actúan para regular o inhibir la acción hormonal sobre los tumores, tales como los antiestrógenos que incluyen, por ejemplo, tamoxifeno, raloxifeno, inhibidores de la aromatasa 4(5)-imidazoles, 4-hidroxitamoxifeno, trioxifeno, keoxifeno, LY117018, onapristona y torremifeno. (Fareston); y antiandrógenos, tales como flutamida, nilutamida, bicalutamida, leuprolida y goserelina; ARNsi; y sales, ácidos o derivados farmacéuticamente aceptables de cualquiera de los anteriores, así como análogos y derivados de los mismos, algunos de los cuales se describen a continuación.
En una realización, la molécula de carga útil tóxica es una dolastatina, auristatina, doxorrubicina, DM1, epirrubicina, duocarmicina, o cualquiera de sus análogos o derivados.
En una realización, la molécula de carga útil tóxica es una dolastatina, auristatina, doxorrubicina, o cualquiera de sus análogos o derivados.
En una realización, la molécula de carga útil tóxica es dolastatina 10 o cualquiera de sus derivados.
En una realización, la molécula de carga útil tóxica es dolastatina 15 o cualquiera de sus derivados.
En una realización, la molécula de carga útil tóxica es auristatina F o cualquiera de sus derivados.
En una realización, la molécula de carga útil tóxica es dolastatina 10, dolastatina 15, o auristatina F.
En una realización, la molécula de carga útil tóxica es dolastatina 10.
En una realización, la molécula de carga útil tóxica es dolastatina 15.
En una realización, la molécula de carga útil tóxica es auristatina F.
Las dolastatinas que se pueden usar en la presente invención son bien conocidas en la técnica y se pueden aislar de fuentes naturales de acuerdo con procedimientos conocidos o preparar sintéticamente de acuerdo con procedimientos conocidos.
Los ejemplos de dolastatinas adecuadas incluyen monometil y desmetil dolastatinas 10, 15, C, D y H, monometil y desmetil isodolastatina H, y análogos y derivados de los mismos. Estas dolastatinas contienen una amina primaria o secundaria en el extremo N-terminal. Las dolastatinas 10 y 15 son las moléculas de carga útil tóxicas más potentes entre las dolastatinas naturales. Las monometil y desmetil dolastatinas 10 y 15 se pueden preparar mediante síntesis química de acuerdo con la química estándar de síntesis de péptidos.
Las auristatinas que se pueden usar en la presente invención incluyen (pero sin limitación) monometil y desmetil auristatinas E, F, EB, EFP, PY, PYE, PE, PHE, TP, 2-AQ y 6-AQ, por ejemplo, descripto en la patente U.S. Núm.
5.635.483; Int. J. Oncol. 15: 367-72 (1999); Mol. Cancer Ther. 3: 921-32 (2004); Solicitud U.S Núm. 11/134.826; Publicaciones de Patentes U.S: Nros. 20060074008 y 2006022925; y Pettit, G.R., et al. (2011) J. Nat. Pinchar. 74: 962-8.
En una realización, los derivados de monometil y desmetil auristatina y dolastatina 10 están representados por la fórmula:
Figure imgf000030_0001
en la que L es H, o se puede entender que se refiere al grupo ligador; R1, R5 y R9 son cada uno de modo independiente H o alquilo C-i-Ca; R2, R3 y R6 son cada uno de modo independiente H, alquilo C-i-Ca, carbociclo C3-C8, arilo, alquil C rC 8-arilo, alquilo C rC 8-(carbociclo C3-C8), heterociclo C3-C8 o alquilo C rC 8-(heterociclo C3-C8); R4 es H o CH3; o R3 y R4 forman en conjunto un anillo carbocíclico con el carbono al cual se unen y tienen la fórmula-(CRaRb)n-, en la que Ra y Rb se seleccionan de modo independiente de H, alquilo C1-C8 y carbociclo C3-C8; y n se selecciona de 2, 3, 4, 5 y 6; R7 y R8 se seleccionan cada uno de modo independiente de H, OH, alquilo C1-C8, C3-C8 carbociclo y O (alquilo C1-C8); R10 es CX2-CX2-arilo, CX2-CX2-(arilo sustituido), CX2-CX2-(heterociclo C3-C8), CX2-(C3-C10 heterociclo), CX2-CX2-(carbociclo C3-C8), C(=O)O(alquilo C1-C4) o CH(CH2R12)C(=O)ZR-,1; cada presentación de X es de modo independiente H, OH, alquilo C1-C8, carbociclo C3-C8, heterociclo C3-C8, 2-tiazol o O(alquilo C1-C8); Z es O, S, NH o N(alquilo C1-C8); R11 es H, alquilo C1-C20, arilo, heterociclo C3-C8, R13O)m-R-i4 o R13O)m-CH(R15)2; R12 es arilo o heterociclo C3-C8; m es un número entero que varía de 1-1000; R13 es alquilo C2-C8; R14 es H o alquilo C1-C8; cada presentación de R15 es de modo independiente H, COOH, (CH2)n-N(R16)2, (CH2)n-SO3H o (CH2)n-SO3-alquilo C1-C8; cada presentación de R16 es de modo independiente H, alquilo C1-C8 o (CH2)n-COOH; y n es un número entero en el intervalo de 0 a 6.
En una realización, los derivados de monometil y desmetil auristatinas y dolastatina 10 están representados por la fórmula:
Figure imgf000030_0002
en la que los sustituyentes son como se describieron anteriormente.
En una realización, los los derivados de monometil y desmetil auristatinas y dolastatina 10 están representadas por la fórmula:
Figure imgf000030_0003
en la que los sustituyentes son como se describieron anteriormente.
En una realización, los derivados de monometil y desmetil auristatina F están representados por la fórmula:
Figure imgf000031_0001
en la que L es H, o se puede entender que se refiere al grupo ligador; y R es H o CH3.
En una realización, los derivados de monometil y desmetil dolastatina 10 están representados por la fórmula:
Figure imgf000031_0002
en la que L es H, o se puede entender que se refiere al grupo ligador; y R1 es H o CH3.
En una realización, los análogos y derivados de monometil y desmetil dolastatina 15 están representados por la fórmula:
Figure imgf000031_0003
en la que L, R1, R2, R3, R4, R5 y R6 son como se describieron anteriormente; R7 es OH, NH2, NHR8 o NR8R9; R8 y R9 son cada una de modo independiente H, alquilo C1-C8, carbociclo C3-C8, arilo, alquilo C1-C8-arilo, alquilo C1-C8-(carbociclo C3-C8), heterociclo C3-C8, alquilo C1-C8-(heterociclo C3-C8), benzil o terc-butilo; o R8 y R9 forman en conjunto un anillo heterocíclico con el nitrógeno al que están unidos y tienen la fórmula-(CRaRb)n-, en la que Ra y Rb se seleccionan de modo independiente de H, alquilo C1-C8, carbociclo C3-C8, arilo, alquilo C1-C8-arilo, alquilo C1-C8-(carbociclo C3-C8), heterociclo C3-C8, alquilo C1-C8-(heterociclo C3-C8), O(alquilo C1-C8), un doble enlace con un átomo de carbono vecino, o forman en conjunto un grupo carbonilo; y n se selecciona de 2, 3, 4, 5 y 6.
En una realización, los análogos y derivados de monometil y desmetil dolastatina 15 están representados por la fórmula:
Figure imgf000031_0004
en la que los sustituyentes son como se describieron anteriormente.
En una realización, el análogo o derivados de monometil y desmetil dolastatina 15 se selecciona del grupo de monometil y desmetil dolastatina 15, monometil y desmetil cemadotina, monometil y desmetil tasidotina, y monometil y desmetil P5 (los correspondientes compuestos dimetilo se describe en Bai et al. 2009. Mol. Pharmacol. 75:218-26). n una realización, los análogos y derivados de monometil y desmetil dolastatina 15 están representadas por la fórmula:
en la que Los sustituyentes son como se describieron anteriormente.
En una realización, los derivados de monometil y desmetil dolastatina 15 están representados por la fórmula:
Figure imgf000032_0001
en la que L es H, o se puede entender que se refiere al grupo ligador; y R1 es H o CH3.
La molécula de carga útil tóxica de acuerdo con la presente invención también puede ser daunorrubicina o doxorrubicina. Se puede usar el grupo amino primario del resto de daunosamina o daunorrubicina o doxorrubicina de la presente invención se puede modificar para comprender otro resto amina primaria o secundaria. Las moléculas de carga útil de doxorrubicina y daunorrubicina preferidas útiles en la presente invención están de acuerdo con la fórmula:
Figure imgf000032_0002
en la que R es H o OH; y L es H, o se puede entender que se refiere al grupo ligador.
En una realización, la molécula de carga útil tóxica es un maytansinoide.
En una realización, la molécula de carga útil tóxica es maytansina, una ansamitocina, DM1 o DM4 (también conocido DM-4).
En una realización, la molécula de carga útil tóxica es DM1. DM1 también se conoce como DM-1 y mertansina. En una realización, la molécula de carga útil tóxica es una rubicina. Las rubicinas adecuadas puede ser por ejemplo daunorrubicinas, doxorrubicina, detorrubicina, otros derivados de doxorrubicina que incluyen morfolino-doxorrubicina, cianomorfolino-doxorrubicina, 2-pirrolinodoxorrubicina, deoxidoxorrubicina, epirrubicina, esorrubicina, idarrubicina, rodorrubicina, zorrubicina, y pirarubicina.
En una realización, la molécula de carga útil tóxica es epirrubicins.
En una realización, la molécula de carga útil tóxica es duocarmicina. Las duocarmixinas adecuadas pueden ser por ejemplo duocarmicina A, duocarmicina B1, duocarmicina B2, duocarmicina, C1, duocarmicina C2, duocarmicina D, duocarmicina SA, duocarmicina MA, y CC-1065. El término "duocarmicina" se entender que se refiere también a los análogos sintéticos de las duocarmicinas, tales como adozelesina, bizelesina, carzelesina, KW-2189 y CBI-TMI. En una realización, la duocarmicina es una duocarmicina adecuada para conjugar con el grupo ligador L. En una realización, la duocarmicina comprende un grupo amino u otro grupo químico adecuado para conjugar la duocarmicina con el grupo En una realización, la duocarmicina es una duocarmicina adecuada para conjugar con el grupo ligador L. En una realización, la duocarmicina comprende un grupo amino u otro grupo químico adecuado para conjugar la duocarmicina con el grupo ligador L. En una realización, el grupo amino es un grupo amino libre Un experto en la técnica de moléculas de carga útil tóxicas comprenderá fácilmente que cada una de las moléculas de carga útil tóxicas descritas en el presente documento puede modificarse de tal manera que el compuesto resultante aún conserva la especificidad y/o actividad del compuesto de partida. La persona experta también comprenderá que muchos de estos compuestos se pueden usar en lugar de las moléculas de carga útil tóxicas descritas aquí. Por lo tanto, las moléculas de carga útil tóxicos de la presente invención deben entenderse como incluyendo cualquier análogos y derivados de los compuestos descritos en el presente documento. L. En una realización, el grupo amino es un grupo amino libre
Un experto en la técnica de moléculas de carga útil tóxicas comprenderá fácilmente que cada una de las moléculas de carga útil tóxicas descriptas en la presente memoria se puede modificar de tal manera que el compuesto resultante aún conserva la especificidad y/o actividad del compuesto de partida. La persona experta también comprenderá que muchos de estos compuestos se pueden usar en lugar de las moléculas de carga útil tóxicas descriptas en la presente memoria. Por lo tanto, se debe entender que las moléculas de carga útil tóxicas de la presente invención incluyen cualquier análogos y derivados de los compuestos descriptos en la presente memoria. En un ejemplo, el conjugado de la molécula de carga útil tóxica para glicoproteína se selecciona del grupo que consiste en conjugado de monometildolastatina-ácido aminooxiacético-cetuximab, conjugado de monometilauristatina-ácido aminooxiacético-cetuximab, conjugado de monometildolastatina-ácido aminooxiacéticolevulinil-cetuximabe, conjugado de N-(6-N3-Gal)-MODO-(triazol)-ABAA-ácido siálico oximecetuximab, conjugado de N-(6-N3-Gal)-MODO-(triazol)-ABAA-ácido siálico oxima-cetuximab tratada con Endo S, conjugado de triazol de 9-azido-NeuAc-cetuximab y N-(6-O-propargil-D-galactosil)-mono-metildolastatina, conjugado de ABAA-MODO-7-aldehído-NeuNAc-trastuzumab, conjugado de ABAA-MODO-7-aldehído-NeuNAc-anti-CD33, conjugado de ABAA-MODO-7-aldehído-NeuNAc-afucosil trastuzumab, conjugado de MO-DO-TREA-DBCO-9-azido-NeuNAc-G2F-trastuzumab, conjugado de MODO-TRSLac-Lys-DBCO-9-azido-NeuNAc-G2F-trastuzumab, conjugado de DM1-DBCO-9-azido-NeuNAc-G2F-cetuximab, conjugado de MODO-Val-Cit-PAB-DBCO-9-azido-NeuAc-cetuximab, conjugado de N-(6-O-propargil-D-galactosil)-epirrubicinas y 9-azido-NeuAc-cetuximab, conjugado de N-(6-O-propargil-D-galactosil)-doxorrubicina y conjugado de 9-azido-NeuAc-cetuximab, conjugado de N-(6-O-propargil-D-galactosil)-daunorrubicina y 9-azido-NeuAc-cetuximab, conjugado de N-(6-O-propargil-D-galactosil)duocarmicina, MA y 9-azido-NeuAc-cetuximab, conjugado de N-(6-O-propargil-D-galactosil)duocarmicina, y 9-azido-NeuAccetuximab, ABAA-MODO-7-aldehído-NeuNAc-cetuximab y ABAA-MODO-7-aldehído-NeuNAc-GMC012. El conjugado de monometildolastatina-ácido aminooxiacético-cetuximab se debe entender que se refiere al conjugado de MODO-AOAA-cetuximab, es decir, el conjugado mostrado en el Esquema 12.
El conjugado de monometilauristatina-ácido aminooxiacético-cetuximab se debe entender que se refiere al conjugado de MMAF-AOAA-cetuximab, es decir, el conjugado que tiene la misma estructura como el conjugado mostrado en el Esquema 12 excepto en que la monometildolastatina se ha reemplazado con monometilauristatina. El conjugado de monometildolastatin-ácido aminooxiacético-levulinil-cetuximab se debe entender que se refiere al conjugado mostrado en el Esquema 12 excepto en el que cetuximab se ha conjugado con ácido levulínico. La conjugación de ácido levulínico con cetuximab se puede realizar por la amidación del ácido levulínico en los grupos amino libres en cetuximab, por ejemplo como se describe en el Ejemplo 24.
El conjugado de N-(6-N3-Gal)-MODO-(triazol)-ABAA-ácido siálico oximecetuximab se debe entender que se refiere al conjugado mostrado en el Esquema 15.
El conjugado de N-(6-N3-Gal)-MODO-(triazol)-ABAA-ácido siálico oxima-cetuximab tratada con Endo S se debe entender que se refiere al conjugado mostrado en elEsquema 15, excepto que el cetuximab se ha tratado con Endo S.
El conjugado triazol de 9-azido-NeuAc-cetuximab y N-(6-O-propargil-D-galactosil)-monometildolastatina 10 se debe entender que se refiere al conjugado mostrado en el Esquema 6.
El conjugado de ABAA-MODO-7-aldehído-NeuNAc-trastuzumab se debe entender que se refiere al conjugado mostrado en el Esquema 16.
El conjugado de ABAA-MODO-7-aldehído-NeuNAc-anti-CD33 se debe entender que se refiere al conjugado, cuya preparación se describe en el Ejemplo 42. En el contexto de esta molécula, anti-CD33 se debe entender que se refiere a GCM011.
El conjugado de ABAA-MODO-7-aldehído-NeuNAc-afucosil trastuzumab se debe entender que se refiere al conjugado cuya preparación se describe en el Ejemplo 44, es decir, al conjugado mostrado en eln Esquema 16 en que el trastuzumab es afucosilado.
El conjugado de MODO-TREA-DBCO-9-azido-NeuNAc-G2F-trastuzumab se debe entender que se refiere al conjugado mostrado en el Esquema 17.
El conjugado de MODO-TRSLac-Lys-DBCO-9-azido-NeuNAc-G2F-trastuzumab se debe entender que se refiere al conjugado mostrado en el Esquema 18.
El conjugado de DM1-DBCO-9-azido-NeuNAc-G2F-cetuximab se debe entender que se refiere al conjugado mostrado en el Esquema 19.
El conjugado de MODO-Val-Cit-PAB-DBCO-9-azido-NeuAc-cetuximab se debe entender que se refiere al conjugado mostrado en el Esquema 20.
El conjugado de N-(6-O-propargil-D-galactosil)-epirrubicins y 9-azido-NeuAc-cetuximab se debe entender que se refiere al conjugado mostrado en el Esquema 21.
El conjugado de N-(6-O-propargil-D-galactosil)-doxorrubicina y 9-azido-NeuAc-cetuximab se debe entender que se refiere al conjugado de N-(6-O-propargil-D-galactosil)-epirrubicinas y 9-azido-NeuAc-cetuximab, en la que las epirrubicinas se reemplaza con doxorrubicina.
El conjugado de N-(6-O-propargil-D-galactosil)-daunorrubicina y 9-azido-NeuAc-cetuximab se debe entender que se refiere al conjugado de N-(6-O-propargil-D-galactosil)-epirrubicins y 9-azido-NeuAc-cetuximab, en la que las epirrubicinas se reemplaza con daunorrubicina.
El conjugado de N-(6-O-propargil-D-galactosil)duocarmicina, MA y 9-azido-NeuAc-cetuximab se debe entender que se refiere al conjugado mostrado en el Esquema 22.
ABAA-MODO-7-aldehído-NeuNAc-cetuximab se debe entender que se refiere al conjugado mostrado en el Esquema 16, en el que trastuzumab se reemplaza con cetuximab.
ABAA-MODO-7-aldehído-NeuNAc-GMC012 se debe entender que se refiere al conjugado mostrado en el Esquema 16, en la que el trastuzumab se reemplaza con GMC012.
En un ejemplo, D-L-G se selecciona del grupo que consiste en D-ácido aminooxiacético-7-aldehído-NeuAc, D-ácido aminooxiacético-7-aldehído-NeuAc, N-(6-N3-Gal)-D-(triazol)-ABAA-ácido siálico oxima, N-(6-N3-Gal)-D-(triazol)-ABAA-ácido siálico oxima, conjugado de triazol de 9-azido-NeuAc y N-(6-O-propargil-D-galactosil)-D, ABAA-D-7-aldehído-NeuNAc, D-TREA-DBCO-9-azido-NeuNAc, D-TRSLac-Lys-DBCO-9-azido-NeuNAc, D-DBCO-9-azido-Neu-NAc, D-Val-Cit-PAB-DBCO-9-azido-NeuAc, conjugado de N-(6-O-propargil-D-galactosil)-D y 9-azido-NeuAc, conjugado de N-(6-O-propargil-D-galactosil)-D y 9-azido-NeuAc, conjugado de N-(6-O-propargil-D-galactosil)-D y 9-azido-NeuAc, conjugado de N-(6-O-propargil-D-galactosil)-D y 9-azido-NeuAc, y conjugado de N-(6-O-propargil-D-galactosil)-D y 9-azido-NeuAc, en el que D es una molécula de carga útil tóxica. En esta realización, D puede ser cualquier molécula de carga útil tóxica descripta en este documento.
En un ejemplo, D-L-G se selecciona del grupo que consiste en monometildolastatin-ácido aminooxiacético-7-aldehído-NeuAc,monometilauristatina-ácido aminooxiacético-7-aldehído-NeuAc,N-(6-N3-Gal)-MODO-(triazol)-ABAA-ácido siálico oxima, N-(6-N3-Gal)-MODO-(triazol)-ABAA-ácido siálico oxima, conjugado de triazol de 9-azido-Neu-Ac y N-(6-O-propargil-D-galactosil)-monometildolastatina 10, ABAA-MODO-7-aldehído-NeuNAc, MODO-TREA-DBCO-9-azido-NeuNAc, MODO-TRSLac-Lys-DBCO-9-azido-NeuNAc, DM1-DBCO-9-azido-NeuNAc, MODO-Val-Cit-PAB-DBCO-9-azido-NeuAc, conjugado de N-(6-O-propargil-D-galactosil)-epirrubicinas y 9-azido-NeuAc, conjugado de N-(6-O-propargil-D-galactosil)-doxorrubicina y 9-azido-NeuAc, conjugado de N-(6-O-propargil-D-galactosil)-daunorrubicina y 9-azido-NeuAc, conjugado de N-(6-O-propargil-D-galactosil)duocarmicina, MA y 9-azido-NeuAc, y conjugado de N-(6-O-propargil-D-galactosil)duocarmicina, y 9-azido-NeuAc.
La presente invención se refiere a un procedimiento para preparar un conjugado de la molécula de carga útil tóxica para glicoproteína de acuerdo con una o más realizaciones descriptas en la presente memoria, en la que el procedimiento comprende las etapas de:
proporcionar una glicoproteína que comprende un N-glicano que comprende un sitio aceptor; y
hacer reaccionar una molécula donante con la glicoproteína que comprende un N-glicano que comprende un sitio aceptor en presencia de una glicosiltransferasa;
en la que la molécula donante está representada por la fórmula XI
L'-G Fórmula XI
en la que G es una estructura de sacárido representada por la fórmula XII
Figure imgf000035_0001
en la que
R es CMP, UDP o GDP;
X1 es H o carboxilo;
X2, X3 y X4 son cada uno de modo independiente OH, H, amino, acilamida C2-C6, éster de fosfato o sulfato, o un enlace a L'; X5 es CH2OH, carboxilo, CH3, H, alquilo C1-C3 o alquilo C1-C3 sustituido, o un enlace a L'; a condición de que un sustituyente seleccionado de X2, X3, X4 y X5 es un enlace a L' o se une por medio de un enlace a L';
a condición de que cuando X1 es carboxilo, entonces X2 es H, X3 es OH, X5 es alquilo C1-C3 o alquilo C1-C3 sustituido; R es CMP; y X4 es un enlace a L' o X5 se une por medio de un enlace a L'; o
cuando X1 es H, entonces R es UDP o GDP;
y en la que L' es D-L, en el que D es una molécula de carga
útil tóxica y L es un grupo ligador que une covalentemente G a D, o L' comprende F-E, en el que F es un grupo funcional que puede reaccionar con una amina, tiol, azida, alqueno, alquino, aldehído, cetona, ácido carboxílico o hidroxilamina, y E está ausente o una unidad de polietilenoxi de fórmula (CH2CH2O)p, en el que p es un número entero de 2 a aproximadamente 20.
La molécula donante puede comprender así un grupo funcional al que se puede conjugar un compuesto que comprende el grupo ligador y la molécula de carga tóxica en una etapa posterior.
El grupo funcional se puede seleccionar, por ejemplo, de modo que el producto del procedimiento, es decir, un conjugado de glicoproteína-molécula donante, se puede unir a una molécula que comprende el grupo ligador y la molécula de carga útil tóxica utilizando conjugación click tal como reacción de cicloadición azida-alquino catalizada con cobre (I) (CuAAC ). También se puede utilizar la conjugación click, tal como la química de clics sin cobre.
En un ejemplo, L' es DL, en el que D es una molécula de carga útil tóxica y L es un grupo ligador que une covalentemente G a D. Esta realización tiene la utilidad adicional de que no son necesarias más etapas para la preparación del conjugado de glicoproteína-molécula de carga tóxica.
En un ejemplo, L' comprende F-E, en el que F es un grupo funcional que puede reaccionar con una amina, tiol, azida, alqueno, alquino, aldehído, cetona, ácido carboxílico o hidroxilamina, y E estás ausente o una unidad de polietilenoxi de fórmula (CH2CH2O)p, en el que p es un número entero de 2 a aproximadamente 20. Esta realización tiene la utilidad adicional que la molécula de carga útil tóxica se puede conjugar en una etapa posterior.
En un ejemplo, el grupo funcional que puede reaccionar con un amina, tiol, azida, alqueno, alquino, aldehído, cetona, ácido carboxílico o hidroxilamina es una amina, tiol, azida, alqueno, alquino, aldehído, cetona, ácido carboxílico o hidroxilamina.
En un ejemplo, el grupo funcional es un ciclooctino o un derivado de este, tal como un grupo dibenzociclooctilo (DBCO).
En este contexto, la abreviatura "CMP" se debe entender que se refiere a monofosfato de citidina.
En este contexto, la abreviatura "UDP" se debe entender que se refiere a difosfato de uridina.
En este contexto, la abreviatura "GDP" se debe entender que se refiere a difosfato de guanidina.
En una realización, el procedimiento comprende las siguientes etapas en el siguiente orden:
proporcionar una glicoproteína que comprende un N-glicano que comprende un sitio aceptor; y
hacer reaccionar una molécula donante con la glicoproteína que comprende un N-glicano que comprende un sitio aceptor en presencia de una glicosiltransferasa;
en la que la molécula donante está representada por la fórmula XI descripta anteriormente.
La glicoproteína, en principio, puede ser cualquier glicoproteína descripta en este documento.
En este contexto, el término "sitio aceptor" se debe entender que se refiere a un residuo de sacárido del N-glicano al que se puede conjugar la molécula donante usando una glicosiltransferasa.
En principio, el N-glicano puede ser cualquier N-glicano descripto en este documento, con la condición que comprenda un sitio aceptor.
En este contexto, el término "un sitio aceptor" se debe entender que se refiere a uno o más sitios aceptores.
En una realización, el sitio aceptor es un sitio aceptor de sialiltransferasa o un residuo de GlcNAc unido por una unión p-N a una asparagina.
En un ejemplo, el sitio aceptor es un sitio aceptor de sialiltransferasa seleccionado del grupo que consiste enGalp, Galp4GlcNAc, Galp3GlcNAc, Galp3GalNAc, GalNAcp, GalNAca, Gal-NAcp4GlcNAc y ácido siálico.
En un ejemplo, el sitio aceptor es un residuo de Galp terminal.
En una realización, el sitio aceptor es un residuo de GlcNAc unido por una unión p-N a una asparagina.
En una realización, la glicoproteína comprende uno, dos, tres, cuatro o más N-glicanos que comprenden un sitio aceptor.
]En una realización, la glicoproteína comprende uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho o más sitios aceptores. En una realización, el N-glicano comprende uno, dos o más sitios aceptores.
En una realización, el procedimiento comprende la etapa de proporcionar una composición que incluye una glicoproteína que comprende un N-glicano que comprende un sitio aceptor.
En una realización, al menos 50%, o al menos 60%, o al menos 70%, o al menos 80%, o al menos 90%, o al menos 95%, o al menos 98%, o al menos 99% de las glicoproteínas totales de la composición que comprende un N-glicano comprenden un N-glicano que comprende al menos un sitio aceptor.
En una realización, al menos 50%, o al menos 60%, o al menos 70%, o al menos 80%, o al menos 90%, o al menos 95%, o al menos 98%, o al menos 99%, o esencialmente 100% de glicoproteínas totales de la composición que comprende un N-glicano comprenden al menos un sitio aceptor.
En una realización, al menos 50%, o al menos 60%, o al menos 70%, o al menos 80%, o al menos 90%, o al menos 95%, o al menos 98%, o al menos 99%, o esencialmente 100% de glicoproteínas totales de la composición que comprende un N-glicano comprenden al menos dos N-glicanos que comprende al menos un sitio aceptor.
En una realización, al menos 50%, o al menos 60%, o al menos 70%, o al menos 80%, o al menos 90%, o al menos 95%, o al menos 98%, o al menos 99% de glicoproteínas totales de la composición que comprende un N-glicano comprenden dos sitios aceptores.
En una realización, al menos 50%, o al menos 60%, o al menos 70%, o al menos 80%, o al menos 90%, o al menos 95%, o al menos 98%, o al menos 99% de glicoproteínas totales de la composición que comprende un N-glicano comprenden al menos un residuo de Galp terminal.
En una realización, al menos 50%, o al menos 60%, o al menos 70%, o al menos 80%, o al menos 90%, o al menos 95%, o al menos 98%, o al menos 99% de glicoproteínas totales de la composición que comprende un N-glicano comprenden al menos dos N-glicanos que comprende al menos un residuo de Galp terminal.
En una realización, al menos 50%, o al menos 60%, o al menos 70%, o al menos 80%, o al menos 90%, o al menos 95%, o al menos 98%, o al menos 99% de glicoproteínas totales de la composición que comprende un N-glicano comprenden dos residuos de Galp terminal.
En una realización, al menos 50%, o al menos 60%, o al menos 70%, o al menos 80%, o al menos 90%, o al menos 95%, o al menos 98%, o al menos 99% de glicoproteínas totales de la composición que comprende un N-glicano comprenden al menos un residuo de Galp terminal.
En una realización, al menos 50%, o al menos 60%, o al menos 70%, o al menos 80%, o al menos 90%, o al menos 95%, o al menos 98%, o al menos 99% de glicoproteínas totales de la composición que comprende un N-glicano comprenden un N-glicano que consiste en la estructura representada por la fórmula IV.
En este contexto, el término "glicosiltransferasa" se debe entender que se refiere a cualquier enzima capaz de conjugar la molécula donante al sitio aceptor.
La glicosiltransferasa es una galactosiltransferasa.
En un ejemplo, la glicosiltransferasa se selecciona del grupo que consiste en a2,6-sialiltransferasas tales como ST6GAL1 humana; a2,3-sialiltransferasas tales como a2,3-N-sialiltransferasa de rata; galactosiltransferasas tales como p1,4-GalT1 humana, p1,4-GalT2 humana, p1,4-GalT de leche bovina y p1,4-GalT1 bovina; y N-acetilhexosaminiltransferasas tales como p1,4-GalT1(Y285L) humana y p1,4-GalT1(Y285L) bovina.
La glicosiltransferasa se selecciona del grupo que consiste en p1,4-GalT1(Y285L) humana y bovine p1,4-GalT1(Y289L).
En un ejemplo, X1 es carboxilo, X2 es H; X3 es OH; X4 es OH, H, amino, acilamida C2-C6, o un enlace a L; X5 es alquilo C1-C3 o alquilo C1-C3 sustituido; R es un enlace glicosídico al N-glicano; y X4 es un enlace a L o X5 se une por medio de un enlace a L.
En un ejemplo, X1 es H y X5 es un enlace a L' o se une por medio de un enlace a L'.
En un ejemplo, X1 es H, la estructura anomérica de G es de configuración p-D-galacto y X5 es un enlace a L' o se une por medio de un enlace a L'.
En un ejemplo, X1 es H, la estructura anomérica de G es de configuración p-D-gluco y X5 es un enlace a L' o se une por medio de un enlace a L'.
En un ejemplo, X1 es H, la estructura anomérica de G es de configuración p-D-galacto, X3 y X4 son grupos OH, y X5 es un enlace a L' o se une por medio de un enlace a L'.
En un ejemplo, X1 es H, la estructura anomérica de G es de configuración p-D-galacto, X2 y X3 y X4 son grupos OH, y X5 es un enlace a L' o se une por medio de un enlace a L'.
En un ejemplo, X1 es H, la estructura anomérica de G es p-D-galacto o configuración p-D-gluco, X2 es un grupo acetamido, X3 y X4 son grupos OH, y X5 es un enlace a L' o se une por medio de un enlace a L'.
En un ejemplo, G es una estructura de sacárido representada por la fórmula XIII
Figure imgf000037_0001
en la que
R es CMP;
X4 es OH, H, amino, acilamida C2-C6, éster de fosfato o sulfato, o un enlace a L';
X5 es alquilo C1-C3 o alquilo C1-C3 sustituido;
y X4 es un enlace a L' o X5 se une por medio de un enlace a L'; y
la glicosiltransferasa es una sialiltransferasa.
En un ejemplo, G es una estructura de sacárido representada por la fórmula XIII, en la que X5 se une por medio de un enlace a L'. En un ejemplo, el enlace entre X5 y L' es un enlace oxima. En un ejemplo, el enlace entre X5 y L' es un enlace triazol.
Una sialiltransferasa adecuado puede ser, por ejemplo, ST6Gal1 a2,6-sialiltransferasa humana o a2,3-N-sialiltransferasa de rata.
En un ejemplo, G es una estructura de sacárido representada por la fórmula XIII
Figure imgf000038_0001
en la que
R es CMP;
X4 es OH, H, amino, acilamida C2-C6, éster de fosfato o sulfato, o un enlace a L';
X5 es alquilo C1-C3 o alquilo C1-C3 sustituido;
y X4 es un enlace a L' o X5 se une por medio de un enlace a L';
L' es D-L, en el que D es una molécula de carga útil tóxica y L es un grupo ligador que une covalentemente G a D; y
la glicosiltransferasa es una sialiltransferasa.
En un ejemplo, G es una estructura de sacárido representada por la fórmula XIII, en la que X5 se une por medio de un enlace a D-L, en el que D es una molécula de carga útil tóxica y L es un grupo ligador que une covalentemente G a D. En una realización, el enlace entre X5 y D-L es un enlace oxima. En una realización, el enlace entre X5 y D-L es un enlace triazol.
En un ejemplo, G es una estructura de sacárido representada por la fórmula XIII
Figure imgf000038_0002
en la que
R es CMP;
X4 es OH, H, amino, acilamida C2-C6, éster de fosfato o sulfato, o un enlace a L';
X5 es alquilo C1-C3 o alquilo C1-C3 sustituido;
y X4 es un enlace a L' o X5 se une por medio de un enlace a L';
L' comprende F-E, en el que F es un grupo funcional que puede reaccionar con una amina, tiol, azida, alqueno, alquino, aldehido, cetona, ácido carboxílico o hidroxilamina, y E está ausente o una unidad de polietilenoxi de fórmula (CH2CH2O)p, en la que p es un número entero de 2 a aproximadamente 20; y la glicosiltransferasa es una sialiltransferasa.
En un ejemplo, X5 es un enlace a L' o se une por medio de un enlace a L'.
En un ejemplo, X5 es CH(OH)CH(OH)CH2X9, en la que X9 es un enlace a L'. En una realización, el enlace a L' es un enlace oxima. En una realización, el enlace a L' es un enlace triazol.
En un ejemplo, X4 es un grupo acilamido C2 tales como grupo acetamido, y X5 es CH(OH)CH(OH)CH2X9, en la que X9 es un enlace a L'. En una realización, el enlace a L' es un enlace oxima. En una realización, el enlace a L' es un enlace triazol.
En un ejemplo, X4 es un grupo acilamido C2 tales como grupo acetamido, y X5 es CH(OH)CH(OH)CH2X9, en la que X9 es un enlace a L'. En una realización, el enlace a L' es un enlace oxima. En una realización, el enlace a L' es un enlace triazol.
En un ejemplo, X5 es CH2X7, en la que X7 es un enlace a L'. En una realización, el enlace a L' es un enlace oxima. En una realización, el enlace a L' es un enlace triazol.
En un ejemplo, X4 es un grupo acilamido C2 tales como grupo acetamido, y X5 es CH2X7, en la que X7 es un enlace a L'. En una realización, el enlace a L' es un enlace oxima. En una realización, el enlace a L' es un enlace triazol. En un ejemplo, X4 es un grupo acilamido C2 tales como grupo acetamido, y X5 es CH2X7, en la que X7 es un enlace o L'. En una realización, el enlace a L' es un enlace oxima. En una realización, el enlace a L' es un enlace triazol.
En un ejemplo, las estructuras descriptas en la presente en las que X5 es CH2X7, en la que X7 es un enlace a L', se generan por oxidación leve con peryodato y escisión específica del enlace entre el ácido siálico C-7 y C-8. En un ejemplo, la oxidación leve de peryodato y la escisión específica del enlace entre el ácido siálico C-7 y C-8 se realiza como se expone en los Ejemplos de la presente invención. En un ejemplo, la oxidación leve de peryodato se realiza en la glicoproteína completa. En un ejemplo, la oxidación leve de peryodato se optimiza para que otros residuos de glicano no se oxiden. En un ejemplo, la oxidación leve de peryodato se optimiza para que otros grupos funcionales en la glicoproteína no se oxiden. En un ejemplo, la oxidación leve de peryodato se optimiza para que otros grupos funcionales en la glicoproteína no se oxiden.
En un ejemplo, X4 es un enlace a L' o se une por medio de un enlace a L'.
En un ejemplo, X4 es un enlace a L' o se une por medio de un enlace a L', y X5 es CH(OH)CH(OH)CH2OH.
En un ejemplo, X4 es NH(CO)n1 '(CH2)n2'X4'(CH3)n3', en la que X4' es un enlace a L', n1' es 0 o 1, n2' es un número entero entre 1 y aproximadamente 6, y n3' es 0 o 1. En una realización, X5 es CH(OH)CH(OH)CH2OH.
En un ejemplo, X4 es NHCOCH2CH2X4'CH3, en la que X4' es un enlace a L'. En un ejemplo, las estructuras descriptas en la presente memoria, en la que X4 es NHCOCH2CH2X4'CH3, en la que X4' es un enlace a L', se generan mediante la reacción del grupo carbonilo en NH(C=O)CH2CH2COCH3. En un ejemplo, el enlace a L' es un enlace oxima.
En un ejemplo, la estructura anomérica del sustituyente X5 en las estructuras de acuerdo con Fórmula XIII es como en el ácido neuramínico y como se expone en el Ejemplo 3.
En un ejemplo, la estructura anomérica de G y los sustituyentes X2, X3, X4 y X5 se selecciona de acuerdo con los ensayos de estabilidad en suero o plasma en pH neutro y ensayos de hidrólisis en presencia de glicohidrolasa lisosómicas en pH ácido.
En un ejemplo, la estructura anomérica de G y los sustituyentes X2, X3, X4 y X5 se selecciona de acuerdo con alta estabilidad en suero y plasma como se expone en el Ejemplo 15.
En un ejemplo, la estructura anomérica de G y los sustituyentes X2, X3, X4 y X5 se selecciona de acuerdo con alta tasa de hidrolisis en presencia de glicohidrolasas lisosómicas en pH ácido como se expone en el Ejemplo 16.
En un ejemplo, la estructura anomérica de G y los sustituyentes X2, X3, X4 y X5 se seleccionan de acuerdo con alta estabilidad en suero y plasma como se expone en el Ejemplo 15 y de acuerdo con la alta tasa de hidrolisis en presencia de glicohidrolasa lisosómicas en pH ácido como se expone en el Ejemplo 16.
En una realización, el N-glicano consiste en la estructura representada por la fórmula IV
Figure imgf000039_0001
Fórmula IV
en la que (p-N-Asn) es una unión p-N a una asparagina y y es 0 o 1.
En un ejemplo, el N-glicano consiste en la estructura representada por la fórmula IV
Figure imgf000040_0001
Fórmula i v
en la que (p-N-Asn) es una unión p-N a una asparagina y y es 0 o 1;
y en la que
X1 es H;
X2, X3 y X4 son cada uno de modo independiente OH, H, amino, acilamida C2-C6, éster de fosfato o sulfato, o un enlace a L'; X5 es CH2OH, carboxilo, CH3, H, alquilo C1-C3 o alquilo C1-C3 sustituido, o un enlace a L'; a condición de que un sustituyente seleccionado de X2, X3, X4 y X5 es un enlace a L' o se une por medio de un enlace a L' ;
R es UDP; y
la glicosiltransferasa es una galactosiltransferasa o una N-acetilhexosaminiltransferasa.
Las galactosiltransferasas adecuadas son por ejemplo, p1,4-GalT1 humana, p1,4-GalT2 humana, p1,4-GalT de leche bovina o p1,4-GalT1 bovina; y las N-acetilhexosaminiltransferasas adecuadas son por ejemplo p1,4-GalT1(Y285L) humana y pi,4-GalT1(Y289L) bovina.
La molécula donante es UDP-2-(2-azidoacetamido)-2-deoxi-Gal (UDP-GalNAz).
Se puede proporcionar cualquier glicoproteína que comprende un N-glicano que comprende uno o más sitios aceptores.
En un ejemplo, la glicoproteína comprende naturalmente un N-glicano que comprende un sitio aceptor.
En un ejemplo, la glicoproteína que comprende un N-glicano que comprende un sitio aceptor se produce en una línea celular adecuada.
La línea celular adecuada se puede modificar para producir N-glicanos que comprenden un mayor número o proporción de sitios aceptores.
Las células o líneas celulares que proporcionan glicoproteínas descriptas en la presente memoria incluyen, pero sin limitación, células de mamífero, líneas celulares de mamífero modificadas para producir N-glicanos que comprenden un número o proporción mayor de residuos de Galp terminales en comparación con una línea celular no modificada (tales como las líneas celulares CHO optimizadas para galactosilación proporcionadas por ProBioGen AG, Suiza), las líneas celulares de mamíferos modificadas para producir N-glicanos que comprenden un menor número o proporción de residuos Galp terminales en comparación con una línea celular no modificada (tal como líneas celulares CHO-S productoras de anticuerpos generadas en el Ejemplo 13), líneas celulares de mamífero modificadas para producir N-glicanos que comprenden cantidades reducidas de o esencialmente ninguna fucosa, y células fúngicas o de levadura o de levadura que se manipulan genéticamente para expresar, por ejemplo, endoglicosidasas (por ejemplo, como se describe en el documento WO 2010015722).
En una realización de la invención, la glicosilación en la línea celular que produce la glicoproteína se modifica mediante el uso de inhibidores de la glicosidasa. Un experto en la materia conoce numerosos inhibidores de la glicosidasa útiles para la invención y concentraciones efectivas para su aplicación en el medio de cultivo. En una realización, la fucosilación del núcleo de N-glicano de la glicoproteína es inhibida por un inhibidor de la fucosilación. En una realización, la fucosilación del núcleo de N-glicano se inhibe mediante la adición de aproximadamente 50 mM de 2-desoxi-2-fluoro-L-fucosa peracetilada al medio de cultivo de células CHO para producir sitios aceptores de acuerdo con la Fórmula IV en la que y es 0.
Todos los N-glicanos no comprenden un sitio aceptor; además, solo un subconjunto de N-glicanos presentes en muchas glicoproteínas comprende uno o más sitios aceptores adecuados. Para proporcionar una glicoproteína que comprende un N-glicano que comprende uno o más sitios aceptores, una glicoproteína que comprende un N-glicano se puede recortar o modificar para comprender uno o más sitios aceptores adecuados.
La glicoproteína que comprende un N-glicano que comprende un sitio aceptor se prepara mediante el contacto de una glicoproteína que comprende un N-glicano con una glicosidasa.
La glicosidasa es una endoglicosidasa.
En un ejemplo, la glicosidasa es una sialidasa tal como la Sialidasa A disponible en Glyko. Esta realización tiene la utilidad adicional que, por ejemplo, los residuos terminales NeuAc y NeuGc presentes en muchos complejos de N-glicanos de tipo biantenario se pueden eliminar para exponer los sitios aceptores como los residuos de Galp terminales.
En un ejemplo, la glicosidasa es una a-galactosidasa tal como a-galactosidasa de granos de café verde disponibles en por ejemplo, Sigma.
En un ejemplo, la glicosidasa es una p-galactosidasa tal como p1,4-galactosidasa de S. pneumoniae y pgalactosidasa de frijoles Jack disponibles en Sigma.
La glicosidasa es una endoglicosidasa. Esta realización tiene la utilidad adicional que, por ejemplo, la masa de las estructuras heterogéneas de N-glicano se pueden eliminar para exponer un sitio aceptor, tal como un residuo GlcNAc unido por un enlace p-N a una asparagina. Esta realización también permite producir una glicoproteína que comprende un N-glicano que consiste en la estructura representada por la fórmula IV.
Un ejemplo de reacción de tal realización se muestra en los siguientes esquemas:
(FUCCtó)y (Ga!04)mGlcNAc02Manot6
\
Manp4GlcNAcP4GlcNAc((3-N-Asn)
/
(Galp4)nGlcNAcp2Mana3
Figure imgf000041_0001
EndoS
(Fuca6^y
GlcNAc(p-N-Asn)
en la que y es 0 o 1 ; y m y n son cada uno de modo independiente 0 o 1.
Las endoglicosidasas adecuadas pueden ser por ejemplo, endoS, endoS2, endoT, endoH, endoA, endoB, endoFI, endoF2, endoF3 y endoD. Se describe el uso de endoS para desglicosilar anticuerpos, por ejemplo, en las publicaciones WO 2009033670 y WO 2013037824. El uso de endoS2 para desglicosilar anticuerpos se puede realizar con por ejemplo, la enzima GlycINATOR disponible de Genovis, Suecia, de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
EndoS y endoS2 tienen especificidad para los N-glicanos del dominio Fc del anticuerpo en el sitio de glicosilación conservado (Asn297). Para hidrolizar los N-glicanos en otras glicoproteínas u otros sitios de N-glicosilación en anticuerpos, se puede seleccionar otra endoglicosidasa. Para hidrolizar N-glicanos en el dominio Fc y otros sitios de N-glicosilación en anticuerpos simultáneamente, se puede seleccionar una combinación de endoS o endoS2 y otra endoglicosidasa.
Se sabe que las endoglicosidasas tienen especificidades de sustrato de glicano distintas. En base a las especificidades conocidas y las estructuras de N-glicano presentes en la glicoproteína para modificar, una persona experta en la técnica puede seleccionar una endoglicosidasa adecuada o una combinación de endoglicosidasas adecuadas para hidrolizar la glicoproteína y producir un alto número de sitios aceptores para la glicoproteína.
En un ejemplo, la glicosidasa es una glicósido hidrolasa.
Las glicósido hidrolasas adecuadas pueden ser por ejemplo glicósido hidrolasas de la familia 18 (descripta por ejemplo en la página web http://www.cazy.org/GH18_all.html) y 85 (descripta por ejemplo en la página web http://www.cazy.org/GH85_all.html).
En un ejemplo, la glicosidasa es una fucosidasa tal como fucosidasa de almendras.
En una realización, la glicoproteína que comprende un N-glicano que comprende un sitio aceptor se prepara mediante el contacto de una glicoproteína que comprende un N-glicano con más de una glicosidasa. Las glicosidasas se pueden seleccionar para obtener un número o proporción óptimo de sitios aceptores en los N glicanos de la glicoproteína.
En un ejemplo, la glicoproteína que comprende un N-glicano que comprende un sitio aceptor se prepara mediante el contacto de una glicoproteína que comprende un N-glicano con una glicosiltransferasa y un sustrato para la glicosiltransferasa.
En un ejemplo, la glicosiltransferasa es una galactosiltransferasa y el sustrato para la glicosiltransferasa es UDP-Gal. Esta realización tiene la utilidad adicional de que se puede producir un número o proporción mayor de residuos de Galp terminales en los N-glicanos de la glicoproteína.
Las galactosiltransferasas adecuadas son por ejemplo pi,4-GalT1 humana, pi,4-GalT2 humana, pi,4-GalT de leche bovina o pi,4-GalT1 bovina.
Un ejemplo de reacción de tal ejemplo se muestra en el siguiene esquema:
(F u c c x 6 ^ )y
G lc N A c ( ( 3 - N - A s n )
Figure imgf000042_0001
en la que y es 0 o 1.
En un ejemplo, la glicoproteína que comprende un N-glicano que comprende un sitio aceptor se prepara mediante el contacto de una glicoproteína que comprende un N-glicano con una endoglicosidasa y una glicosiltransferasa.
E un ejemplo, la glicoproteína que comprende un N-glicano que comprende un sitio aceptor se prepara mediante el contacto de una glicoproteína que comprende un N-glicano con una endoglicosidasa tal como endoS y una galactosiltransferasa.
En un ejemplo, la glicoproteína que comprende un N-glicano que comprende un sitio aceptor se prepara mediante el contacto de unaglicoproteína que comprende un N-glicano con una endoglicosidasa, una galactosiltransferasa y un sustrato para la galactosiltransferasa. En una realización, la endoglicosidasa es endoS. En una realización, la galactosiltransferasa es pi,4-GalT. En una realización, el sustrato para la galactosiltransferasa es UDP-Gal.
Un ejemplo de reacción de tal realización se muestra en el siguiente esquema:
Figure imgf000042_0002
(Fucot6^y
Galp4GlcNAc(|3’N’A$n)
en la que y es 0 o 1 ; y m y n son cada uno de modo independiente 0 o 1.
En una realización, L' es F-E, y el procedimiento además comprende la etapa de:
hacer reaccionar un producto que se puede obtener mediante el procedimiento de acuerdo con una o más realizaciones del procedimiento con un compuesto representado por la fórmula XIV
D-L-L" Fórmula XIV
en el que D es la molécula de carga útil tóxica;
L es el grupo ligador que une covalentemente L" a D; y
L" es una amina, tiol, azida, alqueno, alquino, aldehido, cetona, ácido carboxílico o hidroxilamina.
Una persona experta en la técnica es capaz de seleccionar cada uno de F y L "para que puedan reaccionar entre sí. En el contexto del presente procedimiento, se debe entender que L se refiere a cualquier grupo ligador como se describió anteriormente.
En el contexto del presente procedimiento, se debe entender que la glicoproteína se refiere a cualquier glicoproteína como se describió anteriormente.
Además, la molécula de carga útil tóxica se debe entender que se refiere a cualquier molécula de carga útil tóxica como se definió anteriormente.
El procedimiento también puede comprender por ejemplo, una etapa de purificación del conjugado de la molécula de carga útil tóxica para glicoproteína obtenido.
También se divulga una composición farmacéutica que comprende el conjugado de la molécula de carga útil tóxica para glicoproteína o conjugado de la molécula de carga útil tóxica-glicano de acuerdo con una o más realizaciones descriptas en la presente memoria.
La composición farmacéutica puede comprender además un portador farmacéuticamente aceptable. Los ejemplos de portadores farmacéuticamente aceptables adecuados son bien conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, soluciones salinas tamponadas con fosfato, agua, emulsiones de aceite/agua, agentes humectantes y liposomas. Las composiciones que comprenden tales portadores se pueden formular mediante procedimientos bien conocidos en la técnica. La composición farmacéutica puede comprender además otros componentes tales como vehículos, aditivos, conservantes, otras composiciones farmacéuticas administradas simultáneamente, y similares.
En un ejemplo, la composición farmacéutica comprende una cantidad efectiva del conjugado de la molécula de carga útil tóxica para glicoproteína o conjugado de la molécula de carga útil tóxica-glicano de acuerdo con una o más realizaciones de la invención.
En un ejemplo, la composición farmacéutica comprende una cantidad terapéuticamente efectiva del conjugado de glicoproteína-molécula de carga útil tóxica o conjugado de la molécula de carga útil tóxica-glicano de acuerdo con una o más realizaciones de la invención.
El término "cantidad terapéuticamente efectiva" o "cantidad efectiva" del conjugado de la molécula de carga útil tóxica para glicoproteína o el conjugado de la molécula de carga útil tóxica-glicano se debe entender que se refiere al régimen de dosificación para modular el crecimiento de células cancerosas y/o tratar la enfermedad de un paciente. La cantidad terapéuticamente efectiva se puede seleccionar de acuerdo con una variedad de factores, que incluyen edad, peso, sexo, dieta y estado médico del paciente, la gravedad de la enfermedad, la vía de administración y las consideraciones farmacológicas, tales como la actividad, eficacia, farmacocinética y perfiles de toxicología del conjugado particular utilizado. La cantidad terapéuticamente efectiva también se puede determinar con referencia a textos médicos estándares, tales como el Physicians Desk Reference 2004. El paciente puede ser un animal, un mamífero o un ser humano. El paciente también puede ser hombre o mujer, y puede ser un bebé, un niño o un adulto.
En el contexto de esta divulgación, el término "tratamiento" o "tratar" se usa en el sentido convencional y significa asistir, cuidar y atender a un paciente con el objetivo de combatir, reducir, atenuar o aliviar una enfermedad o anormalidad de la salud y mejorar las condiciones de vida deterioradas por esta enfermedad, como, por ejemplo, con una enfermedad de cáncer.
En un ejemplo, la composición farmacéutica comprende una composición para, por ejemplo, administración oral, parenteral, transdérmica, intraluminal, intraarterial, intratecal y/o intranasal o para inyección directa en el tejido. La administración de la composición farmacéutica se puede realizar de diferentes maneras, por ejemplo, por administración intravenosa, intraperitoneal, subcutánea, intramuscular, tópica o intradérmica.
También se divulga un procedimiento para modular el crecimiento de una población celular que expresa una molécula diana, en el que el procedimiento comprende la etapa de poner en contacto el conjugado de la molécula de carga útil tóxica para glicoproteína o el conjugado de la molécula de carga útil tóxica-glicano de acuerdo con una o más realizaciones de la invención o la composición farmacéutica de acuerdo con la invención con la población celular.
En este contexto, el término "una población celular" se debe entender que se refiere a una o más poblaciones celulares.
En este contexto, el término "una molécula diana" se debe entender como cualquiera molécula diana definida anteriormente.
El conjugado de la molécula de carga útil tóxica para glicoproteína o el conjugado de la molécula de carga útil tóxicaglicano se puede poner en contacto in vitro, in vivo y/o ex vivo con la población celular, por ejemplo, células cancerosas, que incluyen, por ejemplo, cáncer de la sangre, plasma, pulmón, mama, colon, próstata, riñón, páncreas, cerebro, huesos, ovario, testículos y órganos linfáticos; más preferiblemente cáncer de pulmón, colon, próstata, plasma, sangre o colon; o en enfermedades autoinmunes, tales como lupus sistémico, artritis reumatoide y esclerosis múltiple; rechazos de injerto, tales como rechazo de trasplante renal, rechazo de trasplante de hígado, rechazo de trasplante de pulmón, rechazo de trasplante cardíaco y rechazo de trasplante de médula ósea; enfermedad de injerto contra huésped; infecciones virales, tales como infección por CMV, infección por VIH y SIDA; e infecciones parasitarias, tales como giardiasis, amebiasis, esquistosomiasis y similares; o, por ejemplo, células que expresan proteínas LRP-1 relacionadas con el receptor de lipoproteínas de baja densidad tales como células de fibrosarcoma. La "modulación del crecimiento de las poblaciones celulares" incluye la inhibición de la proliferación de poblaciones celulares, por ejemplo, poblaciones de células tumorales (por ejemplo, poblaciones de células de mieloma múltiple, tales como células MOLP-8, células OPM2, células H929 y similares) de la división a producir más células; reducir la tasa de aumento en la división celular en comparación, por ejemplo, con células no tratadas; destruir poblaciones de células; y/o evitar que las poblaciones celulares (tales como las células cancerosas) formen metástasis. El crecimiento de las poblaciones celulares se puede modular in vitro, in vivo o ex vivo.
En un ejemplo, la población celular es una población celular de cáncer.
También se divulga el conjugado de la molécula de carga útil tóxica para glicoproteína o el conjugado de la molécula de carga útil tóxica-glicano de acuerdo con una o más realizaciones descriptas en la presente memoria para usado como medicamento.
También se divulga el conjugado de la molécula de carga útil tóxica para glicoproteína o el conjugado de la molécula de carga útil tóxica-glicano de acuerdo con una o más realizaciones descriptas en la presente memoria para usar en la terapia.
También se divulga el conjugado de la molécula de carga útil tóxica para glicoproteína o el conjugado de la molécula de carga útil tóxica-glicano de acuerdo con una o más realizaciones descriptas en la presente memoria para usar en el tratamiento del cáncer.
También se divulga el uso del conjugado de la molécula de carga útil tóxica para glicoproteína o el conjugado de la molécula de carga útil tóxica-glicano de acuerdo con una o más realizaciones descriptas en la presente memoria para la fabricación de un medicamento.
También se divulga el uso del conjugado de la molécula de carga útil tóxica para glicoproteína o el conjugado de la molécula de carga útil tóxica-glicano de acuerdo con una o más realizaciones descriptas en la presente memoria para la fabricación de un medicamento para el tratamiento del cáncer.
En un ejemplo, el cáncer se selecciona del grupo que consiste en leucemia, linfoma, cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer de ovario, cáncer colorrectal, cáncer gástrico, cáncer escamoso, cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer de cabeza y cuello, cáncer resistente a múltiples fármacos y cáncer testicular.
También se divulga un procedimiento para tratar y/o modular el crecimiento y/o la profilaxis de células tumorales en humanos o animales, en el que el conjugado de la molécula de carga útil tóxica para glicoproteína, el conjugado de la molécula de carga útil tóxica-glicano o la composición farmacéutica de acuerdo con una o más realizaciones descriptas en la presente memoria se administra a un ser humano o animal en una cantidad efectiva.
En un ejemplo, las células tumorales se seleccionan del grupo que consiste en células de leucemia, células de linfoma, células de cáncer de mama, células de cáncer de próstata, células de cáncer de ovario, células de cáncer colorrectal, células de cáncer gástrico, células de cáncer escamoso, células de cáncer de pulmón de células pequeñas, células de cáncer de cabeza y cuello, células cancerosas resistentes a múltiples fármacos y células de cáncer testicular, o células cancerosas metastásicas, avanzadas, resistentes a fármacos u hormonas o resistentes a múltiples fármacos, o versiones de las mismas
También se divulga un procedimiento para tratar cáncer en seres humanos o animales, en el que el conjugado de la molécula de carga útil tóxica para glicoproteína o el conjugado de la molécula de carga útil tóxica-glicano de acuerdo con una o más realizaciones descriptas en la presente memoria se administra a un ser humano o animal en una cantidad efectiva.
En un ejemplo, un conjugado de la molécula de carga útil tóxica para glicoproteína, un conjugado de la molécula de carga útil tóxica-glicano o una composición farmacéutica de acuerdo con una o más realizaciones descriptas en la presente memoria también se puede usar para tratar efectivamente los cánceres resistentes a fármacos, que incluye los cánceres resistentes a múltiples fármacos, "resistencia a múltiples fármacos", que significa la resistencia de las células cancerosas a más de un agente quimioterapéutico. La resistencia a múltiples fármacos se puede ayudar, por ejemplo, mediante una bomba transmembrana de glicoproteína P que reduce la concentración de fármacos en la célula. Como se sabe en la técnica, la resistencia de las células cancerosas a la quimioterapia es uno de los problemas centrales en el tratamiento del cáncer. Ciertos cánceres, tales como el cáncer de próstata y de mama, se pueden tratar con terapia hormonal, es decir, con hormonas o fármacos antihormonas que retrasan o detienen el crecimiento de ciertos cánceres al bloquear las hormonas naturales del cuerpo. Tales cánceres pueden desarrollar resistencia, o ser intrínsecamente resistentes, a la terapia hormonal. La presente divulgación contempla además el uso de un conjugado de molécula de carga útil tóxica para glicoproteína, un conjugado de la molécula de carga útil tóxica-glicano o una composición farmacéutica de acuerdo con una o más realizaciones descriptas en la presente memoria en el tratamiento de estos cánceres "resistentes a hormonas" o "refractarios a hormonas".
En un ejemplo, un conjugado de la molécula de carga útil tóxica para glicoproteína, un conjugado de la molécula de carga útil tóxica-glicano o una composición farmacéutica de acuerdo con una o más realizaciones descriptas en la presente memoria, se usa en el tratamiento de versiones metastásicas, avanzadas, resistentes a fármacos o hormonas, o resistentes a múltiples fármacos, de tumores sólidos. En un ejemplo, un conjugado de la molécula de carga útil tóxica para glicoproteína, un conjugado de la molécula de carga útil tóxica-glicano o una composición farmacéutica de acuerdo con una o más realizaciones descriptas en la presente memoria se usa en el tratamiento de una leucemia, que incluye una leucemia metastásica, avanzada o resistente a fármacos o resistente a múltiples fármacos, o una versión de la misma.
Las realizaciones de la invención descriptas anteriormente en la presente memoria se pueden usar en cualquier combinación entre sí. Varias de las realizaciones se pueden combinar entre sí para formar una realización adicional de la invención. Un procedimiento con el que se relaciona la invención puede comprender al menos una de las realizaciones de la invención descriptas anteriormente en la presente memoria.
El conjugado de la molécula de carga útil tóxica para glicoproteína de acuerdo con una o más realizaciones descriptas en la presente memoria tiene numerosas propiedades ventajosas.
El conjugado es altamente citotóxico.
El conjugado de la molécula de carga útil tóxica para glicoproteína de acuerdo con una o más realizaciones descriptas en la presente memoria comprende un resto de molécula de carga útil tóxica-glicano relativamente pequeño que se libera eficazmente dentro de las células. Además, el resto liberado es relativamente pequeño; los conjugados de molécula de carga útil de toxina pequeña tienden a ser más tóxicos que los conjugados de molécula de carga útil tóxica grande, por ejemplo, que comprende una estructura de núcleo de N-glicano de tipo complejo. El conjugado molécula de carga útil tóxica-glicano liberado del conjugado de la molécula de carga útil tóxica para glicoproteína en las células es capaz de suministrar la molécula de la carga útil tóxica a las células y posteriormente al citosol, el núcleo o el retículo endoplásmico.
Diversas realizaciones del conjugado de la molécula de carga útil tóxica para glicoproteína comprenden un grupo ligador hidrófilo que comprende uno o más grupos hidroxilo. Dicho grupo ligador transmite una buena solubilidad en soluciones acuosas. El resto glicano del conjugado de la molécula de carga útil tóxica para glicoproteína también es relativamente bien soluble en soluciones acuosas.
El conjugado de la molécula de carga útil tóxica para glicoproteína de acuerdo con una o más realizaciones descriptas en la presente memoria es suficientemente estable frente a la degradación química o bioquímica durante la fabricación o en condiciones fisiológicas, por ejemplo, en sangre, suero, plasma o tejidos.
El conjugado de la molécula de carga útil tóxica de acuerdo con una o más realizaciones descriptas en la presente memoria aquí también es relativamente estable, por ejemplo, en condiciones reductoras, en pH bajo y dentro de las células, organelas celulares, endosomas y lisosomas.
El conjugado de la molécula de carga útil tóxica para glicoproteína de acuerdo con una o más realizaciones descriptas en la presente memoria, sin embargo, se puede escindir por ejemplo en condiciones reductoras, en pH bajo, o dentro de las células, organelas celulares, endosomas y lisosomas. Posteriormente, la molécula de carga útil tóxica se puede liberar en condiciones seleccionadas o en ubicaciones seleccionadas, como las células cancerosas diana. El conjugado de la molécula de carga útil tóxica para glicoproteína de acuerdo con una o más realizaciones descriptas en la presente memoria, por ejemplo, se puede escindir por una hidrolasa lisosómica presente a niveles relativamente altos en las células cancerosas.
El procedimiento de acuerdo con una o más realizaciones de la presente invención permite conjugar las moléculas de carga útil tóxicas en sitios aceptores específicos en una glicoproteína. El conjugado de la molécula de carga útil tóxica para glicoproteína de acuerdo con una o más realizaciones de la presente divulgación tiene mejores propiedades farmacocinéticas en comparación con un conjugado al que una molécula de carga útil tóxica se conjuga aleatoriamente, por ejemplo debido a la conjugación de la molécula de carga útil tóxica con las cadenas laterales de aminoácidos aleatorias.
EJEMPLOS
A continuación, la presente invención se describirá con más detalle. Ahora se hará referencia en detalle a las realizaciones de la presente invención, cuyos ejemplos se ilustran en los dibujos adjuntos. La descripción a continuación describe algunas realizaciones de la invención con tal detalle que una persona experta en la técnica puede utilizar la invención sobre la base de la divulgación. No todas las etapas de las realizaciones se discuten en detalle, ya que muchas de las etapas serán obvias para el experto en la materia sobre la base de esta memoria descriptiva.
Ejemplo 1. Síntesis de derivados de dolastatina
A menos que se indique lo contrario, los materiales se obtuvieron de proveedores comerciales con el mayor grado de pureza disponible y se usaron sin purificaciones adicionales. Los disolventes de reacción se secaron y destilaron antes de su uso cuando fue necesario. Todas las reacciones que contienen reactivos sensibles a la humedad o al aire se llevaron a cabo bajo una atmósfera de argón. La monometilauristatina F (MMAF) y la monometildolastatina 10 se adquirieron en Concortis (San Diego, CA, EE. UU.). Cianoborohidruro de sodio, hidruro de sodio (NaH), metanol, 4-bromo-1-butino, 5-yodo-1-pentino, 2-desoxi-D-glucosa, 66-O-(p-D-galacto-piranosil)-D-galactosa, diisopropiletilamina y ácido 2,5-dihidroxibenzoico se adquirieron en Sigma-Aldrich. El dimetilsulfóxido (DMSO) y la N, N-dimetilformamida (DMF) se adquirieron en VWR. 2-acetamido-2-deoxi-4-O-(p-D-galactopiranosil)-D-glucosa, N-{4-O-[4-O-(a-D-galactopiranosil)-p-D-galactopiranosil]-D-glucosa y 4-O-[3-O-(a-N-acetilneuraminil)-p-D-galactopiranosil]-D-glucosa eran de Kyowa Hakko Kogyo. El ácido trifluoroacético y el hidrógeno carbonato de amonio se adquirieron en Fluka, acetonitrilo (ACN) de J.T.Baker y glutarato de disuccinimidilo de Pierce. Los espectros de RMN se registraron con un espectrómetro Bruker Avance que funciona a 600,13 MHz (1H: 600,13 MHz, 13C: 150,90 MHz). Se utilizaron secuencias de pulsos proporcionadas por el fabricante. La temperatura de la sonda durante los experimentos se mantuvo a 22 °C a menos que se mencione lo contrario. Los desplazamientos químicos se expresan en la escala 8 ((en ppm) utilizando TMS (tetrametilsilano), cloroformo residual, acetona, H2O o metanol como estándares internos. Las constantes de acoplamiento se dan en Hz y se proporcionan solo una vez cuando se encuentran por primera vez. Los patrones de acoplamiento se dan como s, singulete, d, doblete, t, triplete, etc.a TLC se realizó en láminas de aluminio prerrevestidas con gel de sílice 60 F254 (Merck). La cromatografía flash se realizó sobre gel de sílice 60 (0,040-0,060 mm, Aldrich). Las manchas se visualizaron por UV seguido de carbonización con H2SO4/MeOH 1 : 8 y calentamiento
Síntesis de 1,2;3,4-di-O-isopropiliden-6-O-tosil-a-D-galactopiranosa (Esquema 1,2): 0,39 g (1,5 mmol) del(Esquema 1,1) se disolvieron en 5 ml de piridina seca bajo una atmósfera de argón. La mezcla de reacción se enfrió en un baño de hielo y se añadieron 0,88 g (3,1 equiv) de TsCl. La reacción se calentó lentamente a RT y se agitó durante la noche. Después de 22 horas la reacción se diluyó con 30 ml de CH2Cl2 y se lavó con 30 ml de agua helada. La fase orgánica se lavó con 20 ml de 10% (p/v) de solución acuosa de CuSO4, 20 ml de solución saturada de NaHCO3 y 20 ml H2O. La fase orgánica se separó, se secó con Na2SO4, se filtró y concentró. El producto bruto se purificó por cromatografía en columna (Hexano:EtOAc 1:1) para proporcionar (Esquema 1,2) como un aceite amarillento (0,49 g, 81%). TLC: Rf = 0,74 (Hexano:EtOAc 1:1). 1H RMN (600 MHz, CDCh , 22°C): 8 = 7,81-7,32 (m, 4 H, CH3C6H4SO2), 5,45 (d, 1 H, J i,2 = 4,9 Hz, H-1), 4,59 (dd, 1 H, J32 = 2,5, J34 = 7,9 Hz, H-3), 4,29 (dd, 1 H, H-2), 4,22-4,18 (m, 2 H, H-6a, H-4), 4,09 (dd, 1 H, Jeb,5 = 6,9, Jeb, ea=-10,3 Hz, H-6b), 4,05 (ddd, 1 H, J54 = 1,9, J5,ea = 6,2 Hz, H-5), 2,44 (s, 3 H, CH3C6H4SO2 ), 1,50, 1,34, 1,31 y 1,28 (cada s, cada 3 H, O2C(CH3 )2) ppm.
Síntesis de 1,2;3,4-di-O-isopropiliden-6-deoxi-6-azido-a-D-galactopiranosa (Esquema 1,3). A una solución que contiene 1,5 g (3,7 mmol) del (Esquema 1,2) en 20 ml de DMF seco (bajo una atmósfera de argón) se añadieron 1,7 g (7 equiv.) NaN3 y la mezcla resultante se agitó a 120 °C durante la noche. Después de 18 horas, la mezcla de reacción se llevó a RT, se diluyó con 20 ml CHCl3, se filtró y concentró. El producto bruto se purificó por cromatografía en columna (Hexano:EtOAc 3:1) para proporcionar (Esquema 1,3) como un aceite incoloro (0,7 g, 68%). TLC: Rf = 0,52 (Hexano:EtOAc 3:1). 1H RMN (600 MHz, CDCh , 22 °C): 8 = 5,55 (d, 1 H, J i , 2 = 5,1 Hz, H-1), 4,63 (dd, 1 H, J3,2 = 2,5, J3,4 = 8,1 Hz, H-3), 4,33 (dd, 1H, H-2), 4,19 (dd, 1 H, Ja, 5 = 2,0 Hz, H-4), 3,92 (ddd, 1 H, J5, eb = 5,3, J5,ea = 7,8 Hz, H-5), 3,51 (dd, 1 H, Jea.eb =-12,9 Hz, H-6a), 3,36 (dd, 1 H, H-6b), 1,55, 1,46, 1,35 y 1,34 (cada s, cada 3 H, O2C(CH3)2) ppm.
Síntesis de 6-azido-6-deoxi-D-galactosa (Esquema 1,4). 80 mg (0,3 mmol) del (Esquema 1,3) se disolvieron en 3 ml de TFA 60% y la mezcla resultante se agitó a 50 °C durante 1 hora. La mezcla posteriormente se diluyó con agua y se concentró para proporcionar (Esquema 1,4) como un aceite incoloro (60 mg, cuantitativo, furanosa:piranosa 3:97, alfapiranosa:betapiranosa 35:65). Datos de RMN seleccionados: 1H RMN (600 MHz, D2O, 22 °C): 8 = 5,28 (d, 1 H, J12 = 4.7 Hz, H-1furanosa), 5,26 (d, 1 H, J-,,2 = 3,9 Hz, H-1apiranosa), 5,22 (d, 1 H, J-,,2 = 3,4 Hz, H-1furanosa), 4,60 (d, 1 H, J-,,2 = 7.8 Hz, H-1pp¡ranosa).
Esquema 2 Síntesis de 6-0-proparqil-D-qalactosa
NaH, bromuro de propargilo DMF, RT, 3 h, 91%; ii) 60% TFA, 50°
h, cuantitativo
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1,2;3,4-di-O-isopropiliden-6-O-propargil-a-D-galactopiranosa (Esquema 2,2). A una solución que contiene 0,27 g (1,0 mmol) 1 en 5 ml de DMF seco (bajo una atmósfera de argón) se añadieron 75 mg (2,0 equiv.) de NaH a 0 °C. La mezcla resultante se agitó durante 20 min. y se añadieron 171 ml (1,5 equiv.) de bromuro de propargilo. Después de 20 min la mezcla se llevó a RT y se agitó durante 2,5 horas adicionales. La mezcla se enfrió en un baño de hielo y se inactivó mediante la adición de MeOH (0,5 ml). La mezcla de reacción se llevó a RT, se diluyó con 20 ml de CH2O 2 y se lavó con 20 ml de solución saturada de NaHCO3. La fase acuosa se extrajo con 20 ml de CH2Cl2. La fase orgánica combinada se lavó con 20 ml de H2O, se secó con Na2SO4, se filtró y concentró. El producto bruto se purificó por cromatografía en columna (Hexano:EtOAc 2:1) para proporcionar (Esquema 2,2) como un sólido blanco (0,27 g, 91%). TLC: R f = 0,77 (Hexano:EtOAc 1:1). 1H RMN (600 MHz, CDCh, 22 °C): 8 = 5,54 (d, 1 H, J i , 2 = 5,1 Hz, H-1), 4,61 (dd, 1 H, J 3 ,2 = 2,5, J 3 ,4 = 8,0 Hz, H-3), 4,32 (dd, 1H, H-2), 4,26 (dd, 1 H, J a, 5 = 1,9 Hz, H-4), 4,25 (dd, 1 H, J CH 2 a ,=CH = 2,4, JcH2a,cH2b =-15,9 Hz, C H aC=CH), 4,20 (dd, 1 H, J cH2b, =CH = 2,4 Hz, CH2bC=CH), 4,00 (ddd, 1 H, J5, ea = 5,4, J5, eb = 7,1 Hz, H-5), 3,78 (dd, 1 H, Jea, eb =-10,1 Hz, H-6a), 3,67 (dd, 1 H, H-6b), 2,43 (dd, 1 H, CH2C=CH), 1,55, 1,45, 1,34 y 1,33 (cada s, cada 3 H, O2C(CH3)2) ppm.
Síntesis de 6-O-propargil-D-galactosa (Esquema 2,3). Se disolvieron 25 mg (0,08 mmol) del (Esquema 2,3) en 3 ml de TFA 60% y la mezcla resultante se agitó a 50 °C durante 1 hora. La mezcla posteriormente se diluyó con agua y se concentró para proporcionar (Esquema 2,3) como un aceite incoloro (18 mg, cuantitativo, furanosa:piranosa 3:97, alfa piranosa:beta panosa 35:65). Datos de RMN seleccionados: 1H RMN (600 MHz, D2O, 22 °C): 8 = 5,26 (d, 1 H, Ji , 2 = 4,7 Hz, H-1furanosa), 5,23 (d, 1 H, Jl,2 = 3,8 Hz, H-1apiranosa), 5,20 (d, 1 H, Jl,2 = 3,5 Hz, H-1furanosa), 4,55 (d, 1 H, Jl,2 = 7,9 Hz, H-1ppiranosa).
Se prepararon los siguientes derivados de MMAF (1) y monometildolastatina 10 (2)(3-14):
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Figure imgf000049_0001
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N-(6-O-propargil-D-galactosil)-MMAF (3): cianoborohidruro de sodio (200 |jmol) y 6-O-propargil-D-galactosa (45 |jmol) se añadieron a la solución de MMAF (2,7 jmol) en dimetilsulfóxido (0,7 ml). La mezcla se agitó a 60 °C durante tres días.
N-(6-azido-6-deoxi-D-galactosil)-MMAF (4): cianoborohidruro de sodio (160 jimol) y 6-azido-6-deoxi-D-galactosa (95 jimol) se añadieron a la solución de MMAF (2,7 jimol) en DMSO (0,6 ml). La mezcla se agitó a 60 °C durante tres días.
N-(2-deoxi-D-glucosil)-MMAF (5): cianoborohidruro de sodio (28 jmol) y 2-deoxi-D-glucosa (21 jmol) se añadieron a la solución de MMAF (1,4 jmol) en DMSO (0,6 ml). La mezcla se agitó a 60 °C durante tres días.
N-(3-butinil)-MMAF (6): a la solución de MMAF (2,7 jmol) en DMF seco (0,6 ml) se añadió NaH (54 jmol) y 4-bromo-1-butino (27 jmol). La mezcla se agitó a 60 °C durante 4 horas. La reacción se inactivó mediante la adición de metanol seco (0,2 ml).
N-(4-pentinil)-MMAF (7): a la solución de MMAF (1,4 jmol) en DMF seco (0,4 ml) se añadió NaH (7 jmol) y 5-yodo-1-pentino (7 jmol). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 3 horas. La reacción se inactivó mediante la adición de metanol seco (0,2 ml)
N-[6-O-(p-D-galactopiranosil)-D-galactosil]-MMAF (8): cianoborohidruro de sodio (25 jmol) y 6-O-(p-D-galactopiranosil)-D-galactosa (5,3 jmol) se añadieron a la solución de MMAF (0,7 jmol) en DMSO (0,25 ml). La mezcla se agitó a 60 °C durante cinco días.
N-[2-acetamido-2-deoxi-4-O-(p-D-galacto-piranosil)-D-glucosil)-MMAF (9): cianoborohidruro de sodio (50 jmol) y 2-acetamido-2-deoxi-4-O-(p-D-galactopiranosil)-D-glucosa (11 jmol) se añadieron a la solución de MMAF (1,4 jmol) en DMSO (0,4 ml). La mezcla se agitó a 60 °C durante cinco días.
N-{4-O-[4-O-(a-D-galactopiranosil)-p-D-galactopiranosil]-D-glucosil}-MMAF (10): cianoborohidruro de sodio (50 jmol) y 4-O-[4-O-(a-D-galactopiranosil)-p-D-galactopiranosil]-D-glucosa (11 jmol) se añadieron a la solución de MMAF (1,4 jmol) en DMSO (0,4 ml). La mezcla se agitó a 60 °C durante cinco días.
N-{4-O-[3-O-(a-N-acetilneuraminil)-p-D-galactopiranosil]-D-glucosil}-MMAF (11): cianoborohidruro de sodio (50 jmol) y 4-O-[3-O-(a-N-acetil-neuraminil)-p-D-galactopiranosil]-D-glucosa (11 jmol) se añadieron a la solución de MMAF (1,4 |jmol) en DMSO (0,4 ml). La mezcla se agitó a 60 °C durante cinco días.
N-(6-O-propargil-D-galactosil)-dolastatina 10 (12): cianoborohidruro de sodio (200 jmol) y 6-O-propargil-D-galactosa (45 jmol) se añadieron a la solución de momometildolastatina 10 (2,5 jmol) en DMSO (0,7 ml). La mezcla se agitó a 60 °C durante tres días.
N-(6-azido-6-deoxi-D-galactosil)-dolastatina 10 (13): cianoborohidruro de sodio (160 jmol) y 6-azido-6-de-oxi-D-galactosa (95 jmol) se añadieron a la solución de momometildolastatina 10 (2,5 jmol) en DMSO (0,6 ml). La mezcla se agitó a 60 °C durante tres días.
N-(N-hidroxisuccinimidilglutaril)-MMAF (14): glutarato de disuccinimidilo (20 jmol) y diisopropiletilamina (20 jmol) se añadieron a la solución de MMAF (1,4 jmol) en ACN (0,4 ml). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante la noche. Para producir N-glutaril-MMAF (14b), una alícuota de (14) se hidrolizó en solución acuosa.
Los productos se purificaron mediante un instrumento HPLC purificador Ákta purificador 10 (GE Healthcare) con una columna de fase inversa Gemini-NX-5u C-18 (4,6 x 250 mm, 110 A (Phenomenex)) se eluyó con gradiente de ACN en hidrógeno carbonato de amonio acuoso o ácido trifluoroacético acuoso.
Por ejemplo, el N-(2-desoxi-D-glucosil)-MMAF (5) se eluyó con una concentración de ACN más baja a los 19,6 min (aproximadamente 37% de ACN) antes de ambos MMAF originales (1) a 21,7 min (aproximadamente 40% de ACN) y N-(3-butinil)-MMAF (6) a 26,0 min (aproximadamente 45% de ACN), lo que demuestra que era más hidrófilo. Los espectros de masas del desorción-ionización láser asistida por matriz-tiempo de vuelo (MALDI-TOF) se registraron en un espectrómetro de masas Bruker Ultraflex III TOF/TOF (Bruker Daltonics, Bremen, Alemania) usando una matriz de ácido 2,5-dihidroxibenzoico (3) m/z = 956 [M+Na], (4) m/z = 943 [M+Na], (5) m/z = 902 [M+Na], (6) m/z = 806 [M+Na], (7) m/z = 820 [M+Na], (8)m/z = 1080 [M+Na], (9) m/z = 1121 [M+Na], (10) m/z = 1242 [M+Na], (11) m/z = 1371 [M+Na], (12) m/z = 995 [M+Na], (13) m/z = 982 [M+Na], (14) m/z = 868 para NHS hidrolizado [M+Na].
Ejemplo 2. Citotoxicidad in vitro de los derivados de dolastatina
La línea celular de cáncer de ovario humano SKOV-3 provino de ATCC (Manassas, Virginia, USA). Las células se cultivaron de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Se recogieron cultivos en fase logarítmica y se sembraron 5000 células/pocillo en placas de 96 pocillos y se incubaron durante 24 h. Se realizaron diluciones seriadas de las moléculas de prueba a partir de una solución madre de 100 jM en DMSO 10% en medio de cultivo celular, se añadieron a las células (la concentración máxima de dimetilsulfóxido fue 1%) y los cultivos se incubaron adicionalmente durante 96 h. La viabilidad celular se evaluó utilizando el reactivo de viabilidad celular PrestoBlue (Life Technologies, Carlsbad, California, USA). De acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las células se incubaron durante 2 h, y la reducción de colorante se midió por absorbancia a 570 nm. Los compuestos se analizaron 1-2 veces por triplicado.
Los resultados de un ensayo ejemplar se muestran en la Figura 1, en la que la numeración de los compuestos está de acuerdo con el Ejemplo 1. Los resultados se expresan en la Tabla 1 como valores de IC50 de los derivados analizados. En conclusión, 1) todos los derivados de alquilo analizados de MMAF y dolastatina 10 fueron citotóxicos contra las células de cáncer de ovario SKOV-3; 2) los derivados de monosacáridos 3, 4 y 5 fueron igual o solo un poco menos citotóxicos que 1, y los derivados de monosacáridos 13 y 14b fueron igualmente o solo un poco menos citotóxicos que 2, lo que demuestra que los conjugados de amina de sacáridos y MMAF o monometildolastatina 10 han conservado la capacidad para unirse a la tubulina; 3) los derivados de oligosacáridos 8, 11 y 12 fueron menos citotóxicos que 1 cuando se aplicaron al medio de cultivo celular, lo que refleja su alta hidrofilicidad y su capacidad reducida para pasar a través de las membranas celulares; y 4) el derivado de alquilo hidrófobo 6 era más citotóxico que 1, lo que demuestra que un ligador hidrófobo aumenta la capacidad del conjugado para pasar a través de las membranas celulares.
Tabla 1. Citotoxicidad de derivados de dolastatina. 1) Los valores de IC50 se determinaron como el intervalo de concentración en el que la viabilidad de células de cáncer de ovario SKOV-3 cae al 50%. 2) El intervalo medido fue entre 1 nM-10 jM.
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Ejemplo 3. Síntesis de CMP-9-deoxi-9-azido-NeuNAc
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Ácido 5-acetamido-9-azido-3,5,9-trideoxi-D-glicero-D-galacto-2-nonulosónico (2): A una solución que contiene 63 mg de 1 (0,2 mmol) en 5 ml de MeOH seco (bajo argón) se añadieron 127 mg de AG 50W-38 (2 equiv en peso) y la mezcla resultante se agitó a 45 °C o/n. La mezcla posteriormente se filtró y concentró para proporcionar neuraminato de metil N-acetilo como un sólido blanco (65 mg, cuantitativo). TLC: R f = 0,43 (DCM:MeOH 3:1).
157 mg de neuraminato de metil N-acetilo (0,49 mmol) se disolvieron en 5 ml de piridina seca (bajo argón) y la mezcla de reacción se enfrió a 0 °C. Se añadieron 135 mg de TsCl (0,7 mmol, 1,4 equiv.) y la mezcla de reacción se calentó lentamente a RT y se dejó agitar o/n. Después de 23 horas se añadieron 134 mg de TsCl (0,7 mmol, 1,4 equiv.) a la mezcla de reacción y se agitó durante 2 horas adicionales a RT. La mezcla posteriormente se enfrió a 0 °C y la reacción se inactivó con MeOH. La mezcla se concentró y el producto bruto se purificó por cromatografía en columna (MeOH:DCM 1:9) para proporcionar 9-O-tosil-W-acetil-neuraminato de metilo como un aceite amarillento (159 mg, 67%). TLC: R f = 0,29 (DCM:MeOH 9:1). 1H RMN (600MHz, CD3OD, 22 °C): 8 Datos de RMN seleccionados; 7,80-7,43 (m, 4 H, CH3C6H4SO2), 4,28 (dd, 1 H, J = 2,2, 10,1 Hz), 4,06-3,99 (m, 2 H), 3,93 (dd, 1 H, J = 1,5, 10,6 Hz), 3,85 (ddd, 1 H, J = 2,0, 5,7, 8,5 Hz), 3,77 (s, 3 H, CO2CH3M 3 (dd, 1 H, J = 1,5, 9,0 Hz), 2,46 (s, 3 H, CH3C6H4SO2), 2,19 (dd, 1 H, J = 4,9, 12,9 Hz, H-3eq), 2,00 (s, 3 H, NHCOCH3), 1,86 (dd, 1 H, J = 11,5, 12,9 Hz, H-3ax). HRMS: calculado para C-ig^yO-nNNaS [M+Na]+ 500,12; experimental 500,20.
110 mg de 9-O-tosil-W-acetil-neuraminato de metilo (0,23 mmol) se disolvieron en 2 ml de acetona:H2O 3:1 y se añadieron 70 mg de NaN3 (1,1 mmol, 4,3 equiv.). La mezcla resultante se calentó a 75 °C y se agitó o/n. La mezcla de reacción posteriormente se concentró y el producto bruto se purificó por cromatografía de filtración en gel para proporcionar 2 como una espuma amarillenta (40 mg, 52%). Datos de RMN seleccionados; 1H RMN (600MHz, D2O, 22 °C): 84,03 (ddd, 1 H, J = 5,1, 10,1, 10,3 Hz), 3,99 (dd, 1 H, J = 0,9, 10,6 Hz), 3,94-3,89 (m, 2 H), 3,61 (dd, 1 H, J = 2,8, 13,1 Hz), 3,53 (ap d, 1 H, J = 9,4 Hz), 3,49 (dd, 1H, J = 6,0, 13,1 Hz), 2,22 (dd, 1 H, J = 4,9, 12,9 Hz, H-3eq), 2,07 (s, 3 H, NHCOCH3), 1,83 (dd, 1 H, J = 11,7, 12,9 Hz, H-3ax) . HRMS: calculado para C-i-i^eOs^Na [M+Na]+ 357,10; experimental 357,12; calculado para C iiH i8O8N4Na [M+2Na-H]+ 379,08; experimental 379,10.
Ácido citidina-5'-monofosfo-5-acetamido-9-azido-3,5,9-trideoxi-D-glicero-D-galacto-2-nonulosónico (CMP-9'-azido-NeuAc) (3): La síntesis enzimática de CMP-9'-azido-NeuAc se realizó en 2 ml de tampón Tris-HCl 100 mM pH 8,5 que contiene MgCl220 mM, CTP 15 mM, 10 mg (15 mM) de 9'-azido-NeuAc y 100 mU de CMP-sintetasa de ácido siálico CMP (Sigma Aldrich). Todos los reactivos excepto 9'-azido-NeuAc fueron de origen comercial. La reacción se dejó proceder durante 2,5 horas a 37 °C. Después de 1 hora, se añadió CTP para alcanzar la concentración final de CTP de 30 mM y el pH se ajustó a 8,5 con NaOH. La reacción se controló en los puntos de tiempo 1 h y 2,5 h tomando muestras para análisis MALDI-TOF MS. Los análisis MALDI-TOF MS se realizaron utilizando 2',4',6'-trihidroxiacetofenona (THAP) como matriz en modo de ión negativo reflector con el instrumento Bruker Ultraflex III (Bruker Daltonics, Alemania). Después de 2,5 horas, la enzima se eliminó de la mezcla haciendo pasar la mezcla de reacción a través de la columna Bond Elute C18 (Varian Inc.). La muestra de CMP-9'-azido-NeuAc-eluida de la columna Bond Elute se purificó por cromatografía de filtración en gel con columna de péptido Superdex (GE Healthcare) usando bicarbonato de amonio 0,1 M como eluyente. Dos corridas cromatográficas consecutivas produjeron una muestra que contiene principalmente CMP-9'-azido-NeuAc con una proporción menor de CTP como se ejemplifica por el espectro MALDI en la Fig 2: CMP-9'-azido-NeuAc, m/z 637; cTp , m/z 479. El rendimiento final de CMP-9'-azido-NeuAc basado en la absorbancia a 280 nm (contra el estándar CTP) fue de 5,7 mg.
Ejemplo 4. Síntesis de UDP-6-O-propargil-galactosa
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Esquema 4. i) NaH, bromuro de propargilo DMF, RT, 3 h,
91%; ii) 60% TFA, 50°C, 1 h, cuantitativo; iii) 1) TMSCl, piri—
dina, 0 °C ^ RT, 2 h, 54 %; 2) a) TMSI, DCM, 0 °C, 1 h; b) UDP,
-30 °C, 1 h, después 0 °C, 2 h, después Bu4NF, THF, RT, 1 h, 33 %.
1,2;3,4-di-0-isopropiliden-6-0-propargil-a-D-galactopiranosa (2): A una solución que contiene 0,27 g (1,0 mmol) 1 en 5 ml de DMF seco (bajo una atmósfera de argón) se añadieron 75 mg (2,0 equiv) NaH a 0 °C. La mezcla resultante se agitó durante 20 min y se añadieron 171 ml (1,5 equiv) de bromuro de propargilo. Después de 20 min la mezcla se llevó a RT y se agitó durante 2,5 horas adicionales. La mezcla se enfrió en un baño de hielo y se inactivó durante la adición de MeOH (0,5 ml). La mezcla de reacción se llevó a RT, se diluyó con 20 ml de CH2Cl2 y se lavó con 20 ml solución saturada de NaHCO3. La fase acuosa se extrajo con 20 ml de CH2Cl2. La fase orgánica combinada se lavó con 20 ml de H2O, se secó con Na2SO4, se filtró y concentró. El producto bruto se purificó por cromatografía en columna (Hexano:EtOAc 2:1) para proporcionar el compuesto del título como un sólido blanco (0,27 g, 91%). TLC: R f = 0,77 (Hexano:EtOAc 1:1). 1H RMN (600 MHz, CDCla, 22 °C): 8= 5,54 (d, 1 H, J i , 2 = 5,1 Hz, H-1), 4,61 (dd, 1 H, J 32 = 2,5, J 34 = 8,0 Hz, H-3), 4,32 (dd, 1 H, H-2), 4,26 (dd, 1 H, J 45 = 1,9 Hz, H-4), 4,25 (dd, 1 H, Jch2 s.ch = 2,4, JCH2a,CH2b =-15,9 Hz, CH2aC=CH), 4,20 (dd, 1 H, J cH2b,.cH = 2,4 Hz, CH 2 bC=CH), 4,00 (ddd, 1 H, J 5 ,6a = 5,4, J 5 ,6b = 7,1 Hz, H-5), 3,78 (dd, 1 H, J 6a, 6b =-10,1 Hz, H-6a), 3,67 (dd, 1 H, H-6b), 2,43 (dd, 1 H, CH2C=CH), 1,55, 1,45, 1,34 y 1,33 (cada s, cada 3 H, O2C(CH3)2) ppm.
6-O-propargil-D-galactosa (3): 25 mg (0,08 mmol) de 2 se disolvieron en 3 ml de TFA 60% y la mezcla resultante se agitó a 50 °C durante 1 hora. La mezcla posteriormente se diluyó con agua y se concentró para proporcionar el compuesto del título como un aceite incoloro (18 mg, cuant., furanosa:piranosa 3:97, apiranosa:ppiranosa 35:65). Datos de RMN seleccionados: 1H RMN (600 MHz, D2O, 22 °C): 8 = 5,26 (d, 1 H, J i 2 = 4,7 Hz, H-1furanosa), 5,23 (d, 1 H, J i 2 = 3,8 Hz, H-1 apiranosa), 5,20 (d, 1 H, J i ,2 = 3,5 Hz, H-1furanosa), 4,55 (d, 1 H, J i ,2 = 7,9 Hz, H-1 ppiranosa).
6-0-propargil-D-galactopiranosil-1-uridinildifosfato (4): A una solución que contiene 73 mg (0,33 mmol) de 3 en 4 ml de piridina seca (bajo atmósfera de argón) se añadieron 0,25 ml (2,0 mmol, 6 equiv) de TMSCl a 0 °C. La mezcla resultante se llevó lentamente a RT y se agitó durante 1,5 horas. La mezcla se diluyó con 20 ml de pentano y se lavó con 6 ml (53) de H2O. La fase orgánica se secó con Na2SO4, se filtró y concentró para proporcionar 6-0-propargil-1,2,3,4-tetra-O-trimetilsilil-D-galactopiranosa (TLC: R f = 0,80 [Hexano:EtOAc 6:1]) como un aceite incoloro (92 mg, 54 %). Se disolvieron 92 mg (0,18 mmol) de 6-0-propargil-1,2,3,4-tetra-0-trimetilsilil-D-galactopiranosa en 2 ml de DCM seco (bajo una atmósfera de argón) y 26 ml (0,18 mmol, 1 equiv.) Se añadió TMSI a 0 °C. La mezcla resultante se agitó durante 1 hora y media de la cantidad (1 ml) se transfirió a un matraz separado. La solución restante se enfrió a-30 °C, se agitó durante 15 minutos y se añadieron 80 mg (0,09 mmol, 1 equiv) de UDP (como su forma de sal Bu4N+) disuelta en 1 ml de DCM. La mezcla resultante se agitó durante 1 hora a-30 °C, posteriormente se llevó lentamente a 0 °C y se agitó durante 3 horas adicionales. El producto posteriormente se desprotegió mediante la adición de 0,15 ml de Bu4NF (solución 1 M en THF). La mezcla resultante se agitó durante 1 hora a RT y se concentró para proporcionar el producto bruto. El producto bruto se purificó por cromatografía de filtración en gel para proporcionar el compuesto del título (18 mg, 33 %, alfa:beta 30:70). Datos de RMN seleccionados: 1H RMN (600 MHz, D2O, 22 °C): 8 = 5,64(dd, 1 H, J i,2 = 3,0, 3J1,P = 6,9 Hz, H-1a), 4,97 (t, 1 H, J i, 2 = 8,0, 3J1,P = 8,0 Hz, H-1p). HRMS: calculado para C1sH25N2O17P2[M-H]-603,06; experimental 603,07.
Ejemplo 5. Síntesis enzimática de sacáridos modificados con azido-y propargilo
El hexasacárido Gal-NAzp4GlcNAcp3Galp4GlcNAcp3Galp4Glc (GalNAz, N-(2-azido)acetil-D-galactosamina) se preparó con una reacción enzimática usando UDP-GalNAz (Invitrogen) y pentasacárido Glc-NAcp3Galp4GlcNAcp3Galp4Glc (GNLNLac) de la siguiente manera: UDP-GalNAz y GNLNLac se mezclaron con tampón MOPS pH 7,2 y MnCh. Se añadió enzima bovina GalT1 (Y289L) (Invitrogen) a la mezcla de reacción y se mezcló suavemente. La cantidad de enzima y las concentraciones finales de los componentes son las siguientes:
10 Ml GalT1 bovina (Y289L)
50 mM MOPS, pH 7,2
20 mM MnCl2
0,15 mM GNLNLac
10 ug UDP-GalNaz
Volumen total 20 ml
Las muestras se incubaron a 37 °C durante la noche.
La mezcla de reacción se purificó con columnas de 150 mg/4 ml Carbograph Extract-Clean (Grace Davison Discovery Sciences) y se eluyó con ACN 25% en TFA acuoso 0,05%. Las muestras eluidas se secaron en un evaporador centrífugo antes del almacenamiento.
Las muestras se analizaron con el modo positivo MALDI-TOF usando DHB (ácido 2,5-dihidroxibenzoico) como matriz. El espectro de masas mostró que no estaba presente ningún aceptor de pentasacáridos GNLNLac (933,4 m/z) y la reacción así se completó. Los picos de producto en m/z 1177,549 ym/z 1421,623 indicaron la adición de una y dos unidades GalNAz al glicano aceptor, respectivamente, lo que demuestra que el sacárido aceptor fue modificado efectivamente por los grupos azido.
El hexasacárido 6-propargilgalactosa-GNLNLac se preparó con una reacción enzimática usando UDP-6-propargilgalactosa (UDP-PrGal) y pentasacárido GNLNLac como sigue: GNLNLac y UDP-PrGal se mezclaron con tampón MOPS pH 7,2 y MnCh. Se añadió la enzima GalT de leche bovina (Calbiochem) o la enzima GalT1 humana (Y285L) (R&D Systems) a la mezcla de reacción y se mezcló suavemente. Las cantidades de enzimas y las concentraciones finales de componentes fueron las siguientes:
100 mU leche bovina GalT 0,2 ug GalT1 humana (Y285L)
50 mM MOPS, pH 7,2 50 mM MOPS, pH 7,2
20 mM MnCl2 20 mM MnCl2
0,3 mM GNLNLac 0,3 mM GNLNLac
Figure imgf000054_0001
Volumen total 20 ul Volumen total 10 ul
Las muestras se incubaron a 37 °C durante la noche.
Los productos de reacción se purificaron con columnas de 150 mg/4 ml Carbograph Extract-Clean (Grace Davison Discovery Sciences) y se eluyeron con ACN 25% en TFA acuoso 0,05%. Las muestras eluidas se secaron en un evaporador centrífugo antes del almacenamiento.
Las muestras se analizaron con MALDI-TOF MS en modo positivo usando DHB (ácido 2,5-dihidroxibenzoico) como matriz. El espectro de masas de los productos de reacción purificados de la reacción con GalT de leche bovina mostró señales importantes en m/z 1133,549, m/z 1333,627 y m/z 1533,688, que representan productos con una, dos y tres unidades de propargilgalactosa unidas al pentasacárido aceptor, respectivamente, lo que muestra que el sacárido aceptor fue modificado efectivamente por grupos propargilo.
Ejemplo 6. Generación de unidades GlcNAc(P-N-Asn) en glicoproteínas
Transferrina
Los N-glicanos del complejo biantenario de la transferrina bovina (Sigma) se truncaron en unidades GlcNAc individuales por digestión con endo-p-N-acetilglucosaminidasa F2 según las instrucciones del proveedor de la enzima (Endo F2 de Elizabethkingia miricola, Calbiochem). En resumen, se incubaron 300 |jg de transferrina bovina con 30 mU de Endo F2 en 50 j l de acetato de sodio 50 mM, pH 4,5, durante aprox. 24 h a 37 °C. El análisis MALDI-TOF MS del producto de reacción implicó que aprox 40% de los N-glicanos se convirtieron en unidades GlcNAc(p-N-Asn) individuales.
ARNasa B
Los N-glicanos con alta manosa de la ARNasa B bovina (Sigma) se truncaron en unidades de GlcNAc únicas por digestión con endo-p-N-acetilglucosaminidasa H, según las instrucciones del proveedor de la enzima (Endoglucosidasa H de Streptomyces plicatus, Calbiochem). En resumen, se incubaron 200 jg de ARNasa B bovina con 20 mU de Endo H en 50 j l de acetato de sodio 50 mM, pH 5,5, durante aprox. 24 h a 37 °C. El análisis MALDI-TOF MS del producto de reacción mostró la conversión completa de N-glicanos en unidades GlcNAc (p-N-Asn) individuales.
Trastuzumab
Los N-glicanos complejos del dominio Fc del anticuerpo trastuzumab (Roche) se truncaron en unidades GlcNAc individuales por digestión con endo-p-N-acetilglucosaminidasa S según las instrucciones del proveedor de enzimas (IgGZERO, Genovis). En resumen, se incubaron 8 mg de anticuerpo con 1000 U de Endo H en 1050 j l de fosfato de sodio 10 mM, NaCl 150 mM, pH 7,4, durante 4 ha 37 °C. El análisis SDS-PAGE del producto de reacción mostró una clara reducción de peso molecular, lo que implica una escisión eficiente del N-glicano. Además, el análisis de N-glicano del anticuerpo tratado con Endo S mostró que prácticamente todos los N-glicanos de tipo complejo se habían escindido.
Ejemplo 7. Modificación de las unidades GlcNAc(P-N-Asn) en las glicoproteínas
La galactosilación de las unidades GlcNAc(p-N-Asn) en glicoproteínas se lleva a cabo mediante la incubación de la glicoproteína aceptora con la enzima p1,4-galactosiltransferasa y UDP-galactosa. Por ejemplo, 1 mg de glucoproteína, 30 mM de UDP-Gal, 20 mM de MnCh y 3,2 mU/jl p1,4-galactosiltransferasa se mezclan en 100 j l de tampón apropiado (por ejemplo, tampón MOPS 50 mM, pH 7,0), e incuban durante 24-48 ha 37 °C.
Se añade 6-propargilgalactosa a las unidades GlcNAc (p-N-Asn) en glicoproteínas mediante la incubación de la glicoproteína aceptora con la enzima p1,4-galactosiltransferasa apropiada, por ejemplo galactosiltransferasa de leche bovina (Sigma) o mutante humano galactosiltransferasa 1 (Y285L; R&D Systems) y el donante UDP-PrGal. Por ejemplo, 1 mg de glucoproteína, 30 mM de UDP-PrGal, 20 mM de MnCh y 3,2 mU/jl de galactosiltransferasa se mezclan en 100 j l de tampón apropiado (por ejemplo, tampón MOPS 50 mM, pH 7,0) y se incuban durante 24-48 h a 37 °C para la producción de unidades de 6-propargil-Galp4GlcNAc (p-N-Asn) en glicoproteínas.
Se añade GalNAz a las unidades GlcNAc (p-N-Asn) en glicoproteínas mediante la incubación de la glicoproteína aceptora con la enzima apropiada p1,4-galactosiltransferasa, por ejemplo, galactosiltransferasa 1 bovina mutante (Y289L; Invitrogen) o galactosiltransferasa humana mutante 1 (Y285L; R&D Systems) y el donante UDP-GalNAz. Por ejemplo, 1 mg de glicoproteína, 30 mM de UDP-GalNAz, 20 mM de MnCh y 3,2 mU/jl de galactosiltransferasa se mezclan en 100 j l de tampón apropiado (por ejemplo, tampón MOPS 50 mM, pH 7,0) y se incuban durante 24-48 h a 37 °C para la producción de unidades de GalNAzp4GlcNAc (p-N-Asn) en glicoproteínas.
MODO-TREA-DBCO se preparó como se describe en el Ejemplo 34, y posteriormente se conjugó con unidades GalNAz en GalNAz-trastuzumab (ver arriba) en una reacción click sin cobre de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El análisis Fc después de la conjugación reveló una reacción completa con señal principal a m/z 25695 correspondiente a MODO-TREA-DBCO-GalNA2-p4 ((Fuca6)GlcNAc-trastuzumab.
El ácido azido-N-acetilneuramínico se transfiere a las unidades Gal-NAzp4GlcNAc (p-N-Asn) en glicoproteínas mediante la incubación de la glicoproteína aceptora con la sialiltransferasa apropiada, por ejemplo ST6Gal1 a2,6-sialiltransferasa humana recombinante, y el donante CMP-9-desoxi-9-azido-NeuNAc. El aceptor de glicoproteína se puede modificar con las estructuras Galp4GlcNAc (p-N-Asn) o Gal-NAzp4GlcNAc (p-N-Asn) como se describió anteriormente. Por ejemplo, 0,5-10 mg de a-2,6-sialiltransferasa humana ST6Gal1 (R&D Systems), 0,5 mg de aceptor de glicoproteína y 30 mM de CMP-9'-azido-NeuAc se mezclan en 75 j l de tampón apropiado (por ejemplo, Tris-HCl 50 mM, NaCI 50 mM, pH 7,5), y se incubaron durante 24-48 ha 37 °C.
Ejemplo 8. Modificación enzimática de cetuximab
Cetuximab (Merck Serono) se digirió con 1) a1,3-gaIactosidasa (Sigma Aldrich), 2) a1,3-gaIactosidasa y Sialidasa A (Glyko) o 3) a1,3-galactosidasa, Sialidasa A y p 1,4-galactosidasa (Calbiochem). Las reacciones se llevaron a cabo durante la noche a 37 °C en Na-acetato 50 mM pH 5,5 que contiene 5 mg de cetuximab. Las concentraciones de enzimas en las reacciones fueron 10 mU tampón MOPS 50 mM de de a1,3-galactosidasa, 0,4 mU/pl Sialidasa A y 0,19 mU/pl p1,4-galactosidasaa. Después de las reacciones o/n, el progreso de las digestiones se confirmó mediante aislamiento con N-glicano seguido de análisis MALDI-TOF MS: se precipitaron 10-20 mg de anticuerpo con etanol helado 67% (v/v). El precipitado se sedimentó por centrifugación y los N-glicanos se liberaron por incubación o/n con N-glicosidasa F (Glyko). Las mezclas de reacción se purificaron sucesivamente en placas Hypersep C-18 e Hypersep Hypercarb 50 mg de 96 pocillos (Thermo Scientific). Los glicanos neutros y ácidos se eluyeron juntos de Hypercarb con acetonitrilo 25% en ácido trifluoroacético acuoso 0,05%. Los análisis MALDI-TOF MS se llevaron a cabo en modo de ión positivo reflector usando ácido 2,5-dihidroxibenzoico (DHB, Aldrich) como matriz.
El análisis de MALDI TOF MS de los N-glicanos aislados del cetuximab original reveló las señales mayores para Hex5HexNac2 en m/z 1257, Hex3HexNAc4dHex en m/z 1485 y Hex4HexNAc4dHex en m/z 1647 correspondiente a los glicanos unidos a N Man5GlcNAc2, GlcNAc-Man(GlcNAcMan)ManGlcNAcGlcNAc (G0F) y GalGlcNAc-Man(GlcNAcMan)ManGlc-NAcGlcNAc (G1F) (Fig. 3). Las señales menores para Hex5HexNAc4dHex en m/z 1809, Hex7HexNAc4dHex en m/z 2133 y Hex6HexNAc4dHexNeuGcNa2OH en m/z 2300 correspondieron a los glicanos unidos a N GalGlcNAcMan(GalGlcNAcMan)Man-GlcNAcGlcNAc (G2F), G2F di-a-1,3-galactosilado y G2F mono-a-1,3-galactosilado que contiene NeuGc.
El análisis de MALDI TOF MS de Cetuximab digerido con a1,3-galactosidasa reveló las señales mayores para Hex5HexNac2 en m/z 1257, Hex3HexNAc4dHex en m/z 1485 y Hex4HexNAc4dHex en m/z 1647 correspondiente a los glicanos unidos a N Man5GlcNAc2, G0F y G1F. Las señales menores para Hex4HexNAc4dHexNeuGcNa2OH en m/z 1976 y Hex5HexNAc4dHexNeuGcNa2OH en m/z 2138 correspondieron a G1F y G2F que contienen NeuGc. El análisis de MALDI TOF MS de cetuximab digeridos con a1,3-galactosidasa y Sialidasa A reveló las señales mayores para Hex5HexNac2 en m/z 1257, Hex3HexNAc4dHex en m/z 1485 y Hex4HexNAc4dHex en m/z 1647 correspondiente a glicanos unidos a N Man5GlcNAc2, G0F y G1F.
El análisis MALDI de cetuximaba digerido con a1,3-galactosidasa, Sialidasa A y p1,4-galactosidasa reveló las señales mayores para Hex5HexNac2 en m/z 1257 y Hex3HexNAc4dHex en m/z 1485 correspondiente a los glicanos unidos a N Man5GlcNAc y G0F.
El análisis MALDI-TOF MS de N-glicano de A) cetuximab, B) cetuximab digerido con a1,3-galactosidasa, C) cetuximab digerido con a1,3-galactosidasa y Sialidasa A y D) cetuximab digerido con a1,3-galactosidasa, Sialidasa A y p1,4-galactosidasa se muestra en la Fig. 3.
Las mezclas de reacción se almacenaron congeladas hasta que se purificaron con columna de proteína G HiTrap (GE Healthcare) usando fosfato de Na 0,02 M pH 7 como tampón de unión y ácido cítrico 0,1 M pH 2,6 como tampón de elución. Las fracciones que contenían IgG se mezclaron y neutralizaron con Na2HPO41 M.
Ejemplo 9. pi,4-Galactosilación de cetuximab modificado
Cetuximab tratado con a1,3-galactosidasa o con a1,3-galactosidasa y Sialidasa A se galactosiló con p1,4-galactosiltransferasa (Calbiochem). Las reacciones se llevaron a cabo en 100 pl de tampón MOPS 50 mM pH 7,0 qye contiene 5 mg de cetuximab modificado, 30 mM de UDP-Gal, 20 mM de MnCh y 3,2 mU/pl de p1,4-galactosiltransferasa durante 48 h a 37 °C. La finalización de la reacción se confirmó mediante análisis de N-glicano seguido de análisis MALDI-TOF MS como se describió anteriormente.
Las mezclas de reacción se almacenaron congeladas hasta que se purificaron con la columna HiTrap Proteína G como se describió anteriormente.
El análisis de MALDI TOF MS de Cetuximab tratado con p1,4-galactosiltransferasa digerido con a1,3-galactosidasa reveló señales mayores para Hex5HexNAc2 en m/z 1257 y Hex5HexNAc4dHex en m/z 1809, correspondiente a los glicanos unidos a N Man5GlcNAc2 y G2F, respectivamente, en consecuencia se confirma la galactosilación exitosa. La señal menor para Hex5HexNAc4dHexNeuGcNa2-H en m/z 2138 correspondió a G2F que contiene NeuGc.
El análisis de MALDI TOF MS de cetuximab digerido con a1,3-galactosidasa y Sialidasa A tratado con p1,4-galactosiltransferasa reveló las señales mayores para Hex5HexNAc2 en m/z 1257 y Hex5HexNAc4dHex en m/z 1809 correspondientes a los glicanos unidos a N Man5GlcNAc2 y G2F (Fig. 4). Este resultado confirmó la galactosilación exitosa.
Ejemplo 10. a2,6-Sialilación de cetuximab modificado enzimáticamente con el donante de CMP-9-deoxi-9-azido-NeuNAc
Cetuximab digerido con a1,3-galactosidasa y Sialidasa A y galactosilado con p1,4-galactosiltransferasa purificado por proteína G se sometió a sialilación con a2,6-Sialiltransferasa humana (ST6Gal1, R&D Systems) y CMp-9-deoxi-9-azido-NeuNAc (anteriormente). La reacción se llevó a cabo para 2 x durante la noche a 37 °C en Tris-HCl 50 mM, NaCl 50 mM pH 7,5 que contiene 0,5 mg de cetuximab modificado y 30 mM de CMP-9'-azido-NeuAc en 75 j l de volumen. La reacción se controló por aislamiento de N-glicanos seguido por el análisis de MALDI-TOF MS como se describió anteriormente. Las mezclas de reacción se almacenaron congeladas hasta que se purificaron con la columna HiTrap Proteína G como se describió anteriormente.
El análisis MALDI de cetuximab tratado con ST6Gal1 reveló señales de Hex5HexNac2 en m/z 1257 y Hex5HexNAc4dHex en m/z 1809 correspondientes a los glicanos unidos a N Man5GlcNAc2 y G2F, respectivamente, y glicanos sialilados en m/z 2147 y m/m z 2485, correspondientes a G2F que lleva una y dos unidades de 9-azido-NeuNAc, respectivamente (Fig. 5). Esta muestra se denominó 9-azido-NeuAc-cetuximab.
Ejemplo 11. Síntesis de TGTA (tris{[1-(6-D-galactosil)-1H-1,2,3-triazol-4-il]metil}amina)
Detalles experimentales generales: los reactivos y disolventes se adquirieron en fuentes comerciales. Los disolventes de reacción se secaron y destilaron antes de su uso cuando fue necesario. Todas las reacciones que contienen reactivos sensibles a la humedad o al aire se llevaron a cabo bajo una atmósfera de argón. La preparación de 1 se ha descrito previamente y se emplearon vías similares en la síntesis actual (véase, por ejemplo, Yang, J., et al., 2003. J. S. Org. Lett. 5: 2223-6).
Los espectros de RMN se registraron con un espectrómetro Bruker Avance que funciona a 600 MHz (1H: 600 MHz, 13C: 150 MHz). Se utilizaron secuencias de pulsos proporcionadas por el fabricante. La temperatura de la sonda durante los experimentos se mantuvo a 22 °C a menos que se mencione lo contrario. Los desplazamientos químicos se expresan en la escala 8 ((en ppm) utilizando TMS (tetrametilsilano), cloroformo residual, acetona, H2O o metanol como estándares internos. Las constantes de acoplamiento se dan en Hz y se proporcionan solo una vez cuando se encuentran por primera vez. Los patrones de acoplamiento se dan como s, singulete, d, doblete, t, triplete, etc. Los espectros de masas se obtuvieron con un espectrómetro de masas Bruker Ultraflex III MALDI-TOF operado en modo positivo/negativo. La TLC se realizó en láminas de aluminio revestidas previamente con gel de sílice 60 F254 (Merck). La cromatografía flash se realizó sobre gel de sílice 60 (0,040-0,060 mm, Aldrich). Las manchas se visualizaron por UV seguido de carbonización con H2SOVMeOH y calentamiento.
Figure imgf000057_0001
TGTA protegido (2): A una solución que contiene 43 mg de 1 (0,15 mmol, 5 equiv.) y 4,3 ml tripropargilamina (0,03 mmol, 1 equiv.) en 2 ml de DMF:H2O (3:1) se añadieron 2,4 mg de CuSO4 (0,015 mmol, 0,5 equiv.) y 6,4 mg de L-ascorbato de sodio (0,03 mmol, 1 equiv). La mezcla resultante se agitó a RT durante 40 h (durante este tiempo un sólido blanco precipitó de la mezcla de reacción). Después de 40 h, la mezcla de reacción se diluyó con 20 ml de EtOAc, se transfirió a un embudo de separación y se lavó con 5 ml de solución NH4Cl (preparada por disolución de una solución saturada de NH4Cl con cantidad igual de agua 1:1 v/v) y 15 ml de salmuera. La fase orgánica se secó con Na2SO4, se filtró y concentró para proporcionar el producto bruto.
El producto bruto se purificó por cromatografía en columna (EtOAc^-EtOAc:MeOH 3:1) para proporcionar 2 como un aceite incoloro (30 mg, cuantitativo). TLC: Rf = 0,22 (EtOAc). 1 H RMN (600MHz, CDCI3, 25 °C): 5 = 8,56 (s, 3 H, triazol-H), 5,48 (d, 3 H, J i,2 = 5,0Hz, H-1), 4,67 (dd, 3 H, J6a,5 = 3,1, Jea,eb = 14,1Hz, H-6a), 4,65 (dd, 3 H, J32 = 2,5, J3,4 = 8,1, H-3), 4,58 (dd, 3 H,Jeb,5 = 9,0Hz, H-6b), 4,41 y 4,33 (cada d, cada 3 H. JNCH2a NCH2b = 14,1Hz, N(CH2)a ), 4,32 (dd, 3 H, H-2), 4,25 (dd, H, J45 = 1,4Hz, H-4), 4,17 (ddd, 3 H, H-5), 1,50, 1,39, 1,37 y 1,25 (cada s, cada 9 H, O2C(CH3)2 ) ppm. HRMS: calculado para C45H66N1üO15 Na [M+Na]+ 1009,46; experimental 1009,40.
TGTA (3) : 33 mg de 2 (0,034 mmol) se disolvieron en 3 ml de TFA 60% (en H2O) y se agitaron a 50 °C durante 1,5 horas. La mezcla de reacción posteriormente se diluyó con agua, se concentró y se secó bajo vacío para proporcionar 3 como un sólido blanco (25 mg, cuantitativo, a:p 2:3). Datos de r Mn seleccionados; 1H RMN (600MHz, D2O, 25 °C): 5 = 8,32 (s, 6 H (a y p, 3 H cada), triazol-H), 5,21 (d, 3 H, J i,2 = 3,9Hz, H-1a), 4,59 (s, 12 H (a y p, 6 H cada), N(CH2)3), 4,50 (d, 3 H, J i,2 = 8,1Hz, H-1p).
HRMS: calculado para C27H42N1üO15 Na [M+Na]+ 769,27; experimental 769,23.
La estructura del TGTA y su modo propuesto de quelación con cobre (I):
Figure imgf000058_0001
Ejemplo 12. Conjugación de 9-azido-NeuAc-cetuximab con N-(6-propargil-D-galactosa)-monometildolastatina 10
N-(6-propargil-D-galactosa)-monometildolastatina 10 (MODO-Gal) se conjugó con N-glicanos 9-azido-NeuAccetuximab por medio de ácidos siálicos modificados con 9-azido. La reacción se llevó a cabo durante 3,5 horas a RT en PBD diluido que contiene 75 |jg de 9-azido-NeuAc-cetuximab (above), 13 nmol MODO-Gal, 25 nmol de TGTA, 25 nmol de ascorbato Na y 5 nmol de CuSO4. El producto de reacción se purificó en un concentrador Amicon Ultracel 30 K (Millipore) en varias adiciones de PBS y posteriores centrifugaciones. La reducción de SDS-PAGE del producto de reacción reveló cadenas livianas de IgG (“ 30 kDa) y pesadas (“ 55 kDa). No se pudo detectar productos de escisión de proteínas.
Figure imgf000058_0002
glicano-cetuximab
Esquema 6: Estructura del conjugado de anticuerpo-fármaco de cetuximab y dolastatina 10
Ejemplo 13. Producción de glicoformas del anticuerpo monoclonal en las células CHO
El trastuzumab se produjo de manera transitoria con el Sistema de expresión Max FreeStyle™ (Life Technologies) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las secuencias de aminoácidos de trastuzumab estaban de acuerdo con la base de datos IMGT (htpp: //www.imgt.org) para las secuencias de cadena liviana (7637_L) y cadena pesada (7367_H). Las secuencias de nucleótidos optimizadas que codifican las secuencias de la cadena pesada y liviana se adquirieron en GeneArt (Life Technologies) y se clonaron por separado en vectores de expresión pCEP4 (Life Technologies). Para la expresión de anticuerpos, las células CHO-S FreeStyle™ se transfectaron 1: 1 con vectores de cadena liviana y cadena pesada.
El análisis de N-glicano se realizó en los anticuerpos de Trastuzumab producidos como se describió anteriormente. El análisis reveló el siguiente perfil de N-glicanos: 1,2% de Hex3HexNAc3, 9,6% de Hex5HexNAc2 (Man5), 2,2% de Hex3HexNAc3dHex, 2,5% de Hex3HexNAc4 (G0), 3,3% de Hex6HexNAc2, 56,7% de Hex3HexNAc4dHex (G0F), 1,8% de Hex4HexNAc4 (G1), 1,6% de Hex7HexNAc2, 7,4% de Hex4HexNAc4dHex (G1F), 1,1% de Hex5HexNAc4 (G2), 5,6% de Hex3HexNAc5dHex, 1,5% de Hex8HexNAc2, 1,9% de Hex5HexNAc4dHex (G2F) y 1,2% de Hex9HexNAc2. En consecuencia los tipos de N-glicano más importantes fueron G0(F) (59%), G1(F) (9%) y Man5 (10%).
El kit Freedom CHO-S (Life Technologies) se utilizó para el desarrollo de líneas celulares estables que producen cetuximab. El trabajo se realizó de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las secuencias de aminoácidos de cetuximab estaban de acuerdo con la base de datos IMGT (http://www.imgt.org) para las secuencias de cadena liviana y cadena pesada. Las secuencias de nucleótidos optimizadas que codifican las secuencias de la cadena pesada y liviana se adquirieron de GeneArt (Life Technologies) y se clonaron por separado en vectores de expresión pCEP4 (Life Technologies). Para una expresión estable, las células CHO-S FreeStyle™ se transfectaron con vectores de cadena liviana y cadena pesada 1: 1 linealizados. Los transfectantes se seleccionaron con puromicina y metotrexato, después de lo cual se realizó el aislamiento del clon mediante clonación de dilución limitada. Las líneas celulares clonadas se aumentaron de escalay se evaluó la productividad.^
Se realizó un análisis de glicano a los anticuerpos de cetuximab producidos como se describió anteriormente. El análisis de un clon de células productoras de anticuerpos seleccionado reveló el siguiente perfil de N-glicano: 11,7% de Hex3HexNAc3, 5,7% de Hex5HexNAc2, 4,8% de Hex3HexNAc3dHex, 2,8% de Hex3HexNAc4 (G0), 1,6% de Hex6HexNAc2, 75,3% de Hex3HexNAc4dHex (G0F), 4,3% de Hex4HexNAc4dHex (G1F) y 2,8% de Hex3HexNAc5dHex. Por lo tanto, los N-glicanos eran principalmente de tipo G0 (F) (> 78%) con solo proporciones menores de glicanos con alto contenido de manosa (Hex5HexNAc2, Hex6HexNAc2), galactosilados (G1F) o afucosilados (G0). Otros clones celulares analizados también fueron de manera similar principalmente del tipo G0 (F). El análisis de las cadenas pesadas de Fab aisladas mostró que los sitios de N-glicosilación de dominio variable de los anticuerpos de cetuximab producidos estaban glicosilados. En consecuencia, las líneas celulares generadas tenían un nivel de galactosilación inesperadamente bajo y una alta proporción de residuos de GlcNAc accesibles también en los N-glicanos de dominio variable.
Ejemplo 14. Citotoxicidad in vitro de conjugados de anticuerpo
La línea celular de cáncer de ovario humano SKOV-3 y la línea celular de cáncer de cabeza y cuello HSC-2 eran del ATCC (Manassas, Virginia, USA). Las células se cultivaron de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Se recogieron cultivos en fase logarítmica y se sembraron 5000 células/pocillo en placas de 96 pocillos y se incubaron durante 24 h. Se prepararon diluciones seriadas de las moléculas de prueba en medio de cultivo celular, se añadieron a las células y los cultivos se incubaron adicionalmente durante 96 h. La viabilidad celular se evaluó utilizando el reactivo de viabilidad celular PrestoBlue (Life Technologies, Carlsbad, California, USA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las células se incubaron durante 2 h, y la reducción de colorante se midió por absorbancia a 570 nm. Los compuestos se analizaron 1-2 veces por triplicado.
Los resultados se expresan como valores de IC50 de los derivados analizados como el intervalo de concentración en equivalentes de dolastatina en que la viabilidad de las células cancerosas cae al 50%. El conjugado de triazol de 9-azido-NeuAc-cetuximab y N-(6-O-propargil-D-galactosil)-monometildolastatina 10 fue citotóxico para ambas líneas celulares SKOV-3 y HSC-2 con IC50 a 1 nM o menos, mientras que el derivado no conjugado N-(6-O-propargil-D-galactosil)-monometildolastatina 10 fue al menos 100 veces menos tóxico para las células que el anticuerpo conjugado en los mismos experimentos.
Ejemplo 15. Ensayos de estabilidad de los conjugados de sacárido
La estabilidad del conjugado de sacárido se evalúa mediante incubación a 37 °C durante períodos de tiempo variables de aproximadamente 1 hora a aproximadamente 1 semana en suero humano o animal preparado mediante la incubación de sangre a temperatura ambiente y centrifugación para separar el coágulo, o incubación de manera similar en plasma humano o animal preparado por recolección de sangre fresca en tubos heparinizados. El conjugado se aísla y analiza como se describe anteriormente para detectar la proporción de conjugado intacto. Ejemplo 16. Ensayos de hidrólisis de conjugados de sacáridos
La tasa de hidrólisis del conjugado de sacárido se evalúa mediante incubación a 37 °C durante períodos de tiempo variables de aproximadamente 1 minuto a aproximadamente 1 día en presencia de una fuente de enzima a pH ácido, preferiblemente a pH 4,5. La fuente de enzima es por ejemplo peptidasa recombinante o enzima glucohidrolasa como la p-galactosidasa o p-hexosaminidasa lisosómica humana disponible en R&D Systems, o un lisado de células humanas o animales como fuente de todas las enzimas lisosómicas, o la membrana de glóbulos rojos humanos se prepara como fuente de sialidasa lisosómica. El conjugado se aísla y analiza como se describe anteriormente para detectar la proporción de conjugado intacto.
Ejemplo 17. Síntesis del ligador aminooxi
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Esquema 7. Síntesis decomDuestos 2 y 3 : i) N-metilmorfolina(NMM), isobutilcloroformiato (IBCF), 1-amino-
3-butino, tetrahidrofurano (THF), RT, 1.5 h ; ii) DCMrTFA (1:1), RT, 1 h.
2-[A/-(terc-butoxicarbonil)aminooxi]-A/-(butinil)acetamida (2)
0,41 g (2,1 mmol) de 1 se disolvieron en 7 ml de THF seco (bajo atmósfera de argón) y la mezcla se enfrió en un baño de hielo. Se añadieron 0,24 ml (2,1 mmol, 1 equiv.) de NMM y 0,28 ml (2,1 mmol, 1 equiv.) de IBCF y la mezcla de reacción se agitó durante 0,5 h a 0 °C. Se añadieron 0,18 ml (2,1 mmol, 1 equiv.) de 1-amino-3-butino y la mezcla resultante se llevó a RT y se agitó durante 1,5 h adicionales. La mezcla posteriormente se filtró y concentró y el producto bruto se disolvió en 20 ml de Et2O y se lavó con 10 ml de NaOH 0,1 M, 10 ml de HCl 1 M y 10 ml de salmuera. La fase orgánica se secó con Na2SO4, se filtró y concentró. El producto bruto se purificó por cromatografía en columna (hexano:EtOAc 1:2) para proporcionar el compuesto del título como un sólido blanco. TLC: Rf = 0,34 (en hexano:EtOAc 1:2). 1H RMN (600 MHz, CDCl3, 22 °C) : 88,25 (br s, 1 H, NH), 7,48 (s, 1 H, NH), 4,33 (s, 2 H, OCH2CO), 3,49 (ap q, 2 H, J = 6,8 Hz,HCH2CH2C=CH), 2,44 (ap td, 2 H, J = 2,6, 6,8 Hz, NHCH2CH2C=CH), 1,99 (ap t, 1 H, J = 2,6 Hz, NHCH2CH2C=CH) y 1,49 (s, 9 H, OC(CH3)3) ppm.
2-[N-aminooxi]-N-(butinil) acetamida (3)
0,13 g (0,5 mmol) de 2 se disolvieron en 2 ml de DCM, se enfrió en un baño de hielo y 2 ml de TFA se añadieron lentamente a la mezcla. La mezcla se agitó durante 1 h a RT (control de TLC) y se concentró para proporcionar el compuesto del título como un aceite incoloro. 1H RMN (600 MHz, D2O, 22 °C) : 84,62 (s, 2 H, OCH2C0 ), 3,40 (ap t, 2 H, J = 6,7 Hz, NHCH2CH2C=CH), 2,43 (ap td, 2 H, J = 2,6, 6,7 Hz, NHCH2CH2C=CH) y 2,34 (ap t, 1 H, J = 2,6 Hz, NHCH2CH2C=CH) ppm.
Ejemplo 18. Síntesis de NeuNAc 9-modificado
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0,3 ml (2,93 mmol) de ácido levulínico se disolvieron en 7 ml de DMF seco (bajo atmósfera de argón) y se añadieron 0,84 g (4,4 mmol, 1,5 equiv.) de EDC3HCl y 0,41 g (3,5 mmol, 1,2 equiv.) de NHS. La mezcla resultante se agitó o/n a RT, posteriormente se diluyó con 20 ml de EtOAc y se lavó con 20 ml de una solución saturada de cloruro de amonio, 20 ml de H2O y 20 ml de salmuera. La fase orgánica se separó y se secó con Na2SO4, se filtró y concentró para proporcionar el producto bruto como un polvo blanco (0,45 g, 71 %). El producto bruto se utilizó como tal en la siguiente etapa.
Ácido 5-acetamido-9-azido-3,5,9-trideoxi-D-glicero-D-galacto-2-nonulosónico (2)
A una solución que contiene 63 mg de 1 (0,2 mmol) en 5 ml de MeOH seco (bajo argón) se añadieron 127 mg de AG 50W38 (Forma H+, 2 equiv en peso) y la mezcla resultante se agitó a 45 °C o/n. La mezcla posteriormente se filtró y concentró para proporcionar neuraminato de metil N-acetilo como un sólido blanco (65 mg, cuantitativo). TLC: Rf = 0,43 (DCM:MeOH 3:1).
157 mg de neuraminato de metil N-acetilo (0,49 mmol) se disolvieron en 5 ml de piridina seca (bajo argón) y la mezcla de reacción se enfrió a 0 °C. Se añadieron 135 mg de TsCl (0,7 mmol, 1,4 equiv.) y la mezcla de reacción se calentó lentamente a RT y se dejó agitar o/n. Después de 23 horas se añadieron 134 mg de TsCl (0,7 mmol, 1,4 equiv.) a la mezcla de reacción y se agitó durante 2 horas adicionales a RT. La mezcla posteriormente se enfrió a 0 °C y la reacción se inactivó con MeOH. La mezcla se concentró y el producto bruto se purificó por cromatografía en columna (MeOH:DCM 1:9) para proporcionar metilo 9-O-tosil-N-acetil-neuraminato como un aceite amarillento (159 mg, 67%). TLC: Rf = 0,29 (DCM:MeOH 9:1).
Datos de RMN seleccionados; 1H RMN (600MHz, CD3OD, 22 °C): 87,80-7,43 (m, 4 H, CH3C6H4SO2), 4,28 (dd, 1 H, J = 2,2, 10,1 Hz), 4,06-3,99 (m, 2 H), 3,93 (dd, 1 H, J = 1,5, 10,6 Hz), 3,85 (ddd, 1 H, J = 2,0, 5,7, 8,5 Hz), 3,77 (s, 3 H, CO2CH3), 3,43 (dd, 1 H, J = 1,5, 9,0 Hz), 2,46 (s, 3 H, CH3C6H4SO2), 2,19 (dd, 1 H, J = 4,9, 12,9 Hz, H-3eq), 2,00 (s, 3 H, NHCOCH3) y 1,86 (dd, 1 H, J = 11,5, 12,9 Hz, H-3ax) ppm. HRMS: calculado para C-i^ O - i -i NNaS [M+Na]+ 500,12; experimental 500,20.
110 mg de 9-O-tosil-N-acetil-neuraminato de metilo (0,23 mmol) se disolvieron en 2 ml de acetona:H2O (3:1) y se añadieron 70 mg de NaN3 (1,1 mmol, 4,3 equiv.). La mezcla resultante se calentó a 75 °C y se agitó o/n. La mezcla de reacción posteriormente se concentró y el producto bruto se purificó por cromatografía de filtración en gel para proporcionar 2 como una espuma amarillenta (40 mg, 52%). Datos de RMN seleccionados; 1H RMN (600MHz, D2O, 22 °C): 84,03 (ddd, 1 H, J = 5,1, 10,1, 10,3 Hz), 3,99 (dd, 1 H, J = 0,9, 10,6 Hz), 3,94-3,89 (m, 2 H), 3,61 (dd, 1 H, J = 2,8, 13,1 Hz), 3,53 (ap d, 1 H, J = 9,4 Hz), 3,49 (dd, 1H, J = 6,0, 13,1 Hz), 2,22 (dd, 1 H, J = 4,9, 12,9 Hz, H-3eq), 2,07 (s, 3 H, NHCOCH3 ) y 1,83 (dd, 1 H, J = 11,7, 12,9 Hz, H-3ax) ppm. HRMS: calculado para C11 H18Os N4Na [M+Na]+ 357,10; experimental 357,12; calculado para C-n H17O8N4Na2 [M+2Na-H]+ 379,08; experimental 379,10. Ácido 5-acetamido-3,5,9-trideoxi-9-[(1,4-dioxopentil)amino]-D-glicero-D-galacto-2-nonulosónico (3)
26 mg (0,08 mmol) de 2 se disolvieron en 2,5 ml de H2O y el pH se ajustó a 1/3 con AcOH. Se añadieron 7,9 mg (0,3 equiv peso) de Pd/C (10 % Pd) y la mezcla resultante se colocó dentro un reactor de hidrogenación. La presión de hidrógeno se ajustó a 40 psi (~ 2,7 bar) y la mezcla se agitó o/n, posteriormente se filtró a través de celite y se concentró para proporcionar el producto bruto ácido 5-acetamido-3,5,9-trideoxi-9-amino-D-glicero-D-galacto-2-nonulosónico como un aceite amarillento. Este producto se utilizó como tal en la siguiente etapa.
22 mg (0,07 mmol) de ácido 5-acetamido-3,5,9-trideoxi-9-amino-D-glicero-D-galacto-2-nonulosónico se disolvió en 3 ml de H2O y el pH se ajustó a 8/9 con una solución saturada de NaHCO3. 23 mg (0,11 mmol, 1,5 equiv.) de éster NHS de ácido levulínico se disolvieron en 4 ml de dioxano y se añadieron lentamente a la solución que contiene el ácido siálico en H2O. La mezcla de reacción posteriormente se agitó a RT o/n en la oscuridad y se concentró. El producto bruto se purificó por cromatografía de filtración en gel para proporcionar el compuesto del título. HRMS: calculado para C16H26O1ü N2 Na [M+Na]+ 429,15; experimental 429,19; calculado para C16H25O1ü N2 Na2 [M+2Na-H]+ 451,13; experimental 451,17.
Síntesis de otros análogos NeuNAc 9-modificados
Figure imgf000062_0001
4: CH, OCHíCHkijN,
5; CH2CH2CCH
6; CHoSH
Esquema 9- Síntesis del compuesto 2-6: i) correspondiente e s t e r a HS; WaHCG dioxano;: H20 (4:3), RT, o/n.
Procedimiento general para la síntesis de los esteres HHS de acido carboxrnco
El correspondiente acido carboxílico se disolvió en 2 ml de DMF seco/mmol de acido (bajo atmósfera de argón) y se añadieron 1,5 equiv. de EDCxHCl y 1,2 equiv de NHS. La mezcla resultante se agitó o/n t RT, posteriormente se diluyó con 7 ml de EtOAc/mmol de ácido y se lavó con 7 ml de una solución saturada de cloruro de amonio/mmol de ácido, 7 ml H2O/mmol de ácido y 7 ml salmuera/mmol de ácido. La fase orgánica se separó y se secó con Na2SO4, se filtró y concentró para proporcionar el producto bruto. El producto bruto se utilizó como tal en la siguiente etapa. Procedimiento general para la síntesis de NeuNAc modificado con 9-amido
El ácido 5-acetamido-3,5,9-trideoxi-9-amino-D-glicero-D-galacto-2-nonulosónico se disolvió en 2 ml de H2O/30 mg de 1 y el pH se ajustó a 8/9 con una solución saturada de NaHCO3.1,5 equiv. del correspondiente éster NHS de ácido carboxílico se disolvieron en 2 ml de dioxano/30 mg de Éster NHS y se añadieron lentamente a la solución que contiene el ácido siálico en H2O. La mezcla de reacción posteriormente se agitó a RT o/n en la oscuridad y se concentró. El producto bruto se purificó por cromatografía de filtración en gel para proporcionar el correspondiente 9-amido NeuNAc.
Éster NHS del ácido hexinoico
La síntesis comenzó de acuerdo con el procedimiento general para síntesis de éster NHS de ácido carboxílicos para proporcionar el compuesto del título como un aceite amarillento en rendimiento cuantitativo.
Éster NHS del ácido 5-azidopentanoico
La síntesis comenzó de acuerdo con el procedimiento general para síntesis de éster NHS de ácido carboxílicos para proporcionar el compuesto del título como un aceite incoloro en rendimiento cuantitativo.
Compuesto 2
La síntesis comenzó de acuerdo con el procedimiento general para síntesis de NeuNAc modificado con 9-amido. HRMS: calculado para C- ^ ^ - i OgNs Na [M+Na]+ 414,12; experimental 413,97; calculado para C-i3 H20OgN5Na2 [M+2Na-H]+ 436,11; experimental 435,97. RMN de acuerdo con los datos publicados por J. C. Paulson et. al. en Angew. Chem. Int. Ed. 2012, 51, 11014.
Compuesto 3
La síntesis comenzó de acuerdo con el procedimiento general para síntesis de NeuNAc modificado con 9-amido. Datos de RMN seleccionados; 1H RMN (600MHz, D2O, 22 °C): 83,56 (dd, 1 H, J = 3,0, 14,1 Hz), 3,40 (dd, 1 H, J = 1,0, 9,0 Hz), 3,25 (dd, 1 H, J = 7,8, 14,1 Hz), 2,03 (s, 3 H, NHCOCH3 ) y 1,68-1,55 (m, 4 H, NHCOCH2CH2CH2CH2 N3 ) ppm. HRMS: calculado para C-i 6H2709N5Na [M+Na]+ 456,17; experimental 456,21; calculado para ^ ^ 609^ ^ 2 [M+2Na-H]+ 478,15; experimental 478,17.
Compuesto 4
La síntesis comenzó de acuerdo con el procedimiento general para síntesis de NeuNAc modificado con 9-amido. HRMS: calculado para C22H390-i 3N5Na [M+Na]+ 604,22; experimental 604,23; calculado para C22H3s013N5Na2 [M+2Na-H]+ 626,23; experimental 626,21.
Compuesto 5
La síntesis comenzó de acuerdo con el procedimiento general para síntesis de NeuNAc modificado con 9-amido. Datos de RMN seleccionados; 1H RMN (600MHz, D2O, 22 °C): 83,55 (dd, 1 H, J = 2,9, 14,2 Hz), 3,40 (dd, 1 H, J = 1,0, 9,1 Hz),3,27 (dd, 1 H, J = 7,6, 14,2 Hz), 2,03 (s, 3 H, NHCOCH3 ) y 1,83-1,76 (m, 2 H) ppm. HRMS: calculado para C-i7 H26O4N2 Na [M+Na]+ 425,15; experimental 425,11; calculado para C-i7 H25O4N2 Na2 [M+2Na-H]+ 447,14; experimental 447,10.
Compuesto 6
La síntesis comenzó de acuerdo con el procedimiento general para síntesis de NeuNAc modificado con 9-amido a partir de 1 y SPDP (el grupo protector de piridilditiol se escinde parcialmente en las condiciones de reacción para proporcionar 6). HRMS: calculado para C-i4 H24O4N2SNa [M+Na]+ 419,11; experimental 419,16; calculado para C-i4 H23O4N2SNa2 [M+2Na-H]+ 441,09; experimental 441,13.
Ejemplo 19. Síntesis de NeuNAc 5-modificado
Figure imgf000063_0001
96,3 mg (0,17 mmol) de 1 se disolvieron en 7 ml de MeOH seco (bajo atmósfera de argón) y se añadieron 0,45 ml de MeSO3H. La mezcla resultante se agitó a 60 °C o/n y se concentró para proporcionar el producto bruto. Este producto se utilizó como tal en la siguiente etapa. Datos analíticos seleccionados; HRMS: calculado para C 16 H24O7 NS [m +H]+ 374,13; experimental 374,15; calculado para C-i6 H23O7 NSNa2 [M+Na]+ 396,11; experimental 396,13.
Metil éster del ácido fenil 5-[(1,4-dioxopentil)amino]-2-tio-D-neuramínico (3)
El producto bruto de la etapa previa (63 mg, 0,17 mmol) se disolvieron en 3 ml de H2O y el pH se ajustó a 8/9 con una solución saturada de NaHCO3.0,1 g (0,51 mmol, 3 equiv.) del éster NHS de ácido levulínico disuelto en 4 ml de dioxano se añadió lentamente a la mezcla de reacción. La mezcla resultante se agitó o/n a RT en la oscuridad y posteriormente se concentró. El producto bruto se purificó por cromatografía en columna (MeOH:DCM 1:5 ^ 1:3) para proporcionar el compuesto del título como un aceite incoloro (80 mg, cuant.). TLC: Rf = 0,43 (DCM:MeOH 5:1). Datos de RMN seleccionados; 1H RMN (600MHz, CD3OD, 22 °C): 87,62-7,32 (m, 5 H, arom. H), 4,53 (dd, 1 H, J = 0,7, 10,6 Hz), 4,13 (m, 1 H, H-4), 3,87 (t, 1 H, J = 10,2 Hz), 3,82 (dd, 1 H, J = 2,9, 11,3 Hz), 3,78 (m, 1 H), 3,67 (dd, 1 H,, J = 5,5, 11,3 Hz), 3,57 (d, 1 H, 9,4 Hz), 3,50 (s, 3 H, CO2CH3 ) y 2,19 (s, 3 H, NHCOCH2CH2COCH3) ppm.
HRMS: calculado para C21H2gOgNSNa [M+Na]+ 494,15; experimental 494,16.
5-[(1,4-dioxopentil)amino]-D-ácido neuramínico (4)
80 mg (0,17 mmol) de 3 se disolvieron en 5 ml de acetona:H2O(9:1) y se enfrió en un baño de hielo. Se añadieron 127 mg (0,72 mmol, 4,2 equiv.) de NBS y la mezcla resultante se agitó durante 2 h (0 °C ^ RT; controlo por TLC) y se concentró. El producto bruto se purificó por cromatografía en columna (MeOH:DCM 1:5 ^ MeOH:EtOAc 1:3) para proporcionar 5-[(1,4-dioxopentil)amino]-D-ácido neuramínico metilo ester como un aceite incoloro (36 mg, 56 %). TLC: Rf = 0,17 (DCM:MeOH 5:1). HRMS: calculado para C ^ gO-u^Na [M+Na]+ 402,14; experimental 402,16.
36 mg (0,096 mmol) de metil éster de ácido 5-[(1,4-dioxopentil)amino]-D-neuramínico se disolvieron en 4 ml de MeOH seco (bajo atmósfera de argón) y 70 pl ode una solución 5 M de NaOMe en MeOH. Se añadieron algunas gotas de H2O y la mezcla resultante se dejó agitar o/n a RT. La mezcla de reacción posteriormente se neutralizó con AG 50W38 (Forma H+), se filtró y concentró para proporcionar el producto bruto. El producto bruto se purificó por cromatografía de filtración en gel para proporcionar el compuesto del título. HRMS: calculado para Ci4H23OioNNa [M+Na]+ 388,12; experimental 388,17; calculado para C^H22O^NNa2 [M+2Na-H]+ 410,10; experimental 410,15. Ejemplo 20. Generación de unidades de Fuca1-6GlcNAc(P-N-Asn) en cetuximab
Los N-glicanos complejos del dominio Fc del anticuerpo cetuximab se truncaron en unidades Fuca1-6GlcNAc por digestión con endo-p-N-acetilglucosaminidasa S (Endo S) de acuerdo con las instrucciones del fabricante (IgGZERO, Genovis). En resumen, se incubaron 13 mg de anticuerpo con 1500 U de Endo S en 1375 pl de fosfato de sodio 10 mM, NaCl 150 mM, pH 7,4, a 37 °C durante la noche. El análisis Fc del anticuerpo tratado con Endo S mostró que todos los N-glicanos de tipo complejo se habían escindido (Figura 6). La enzima del fabricante utilizada en el análisis Fc escindió algunos de los residuos de lisina en el sitio de escisión. En consecuencia, las señales m/z 24132 y 24262 corresponden a Fuca1-6GlcNAc-Fc sin lisina y Fuca1-6GlcNAc-Fc con lisina. No se observaron signos de escisión de N-glicano de la región Fab de la cadena pesada.
La mezcla de reacción se purificó con la columna HiTrap Proteína G (GE Healthcare) usando fosfato de Na 0,02 M pH 7 como el tampón de unión y ácido cítrico 0,1 M pH 2,6 como el tampón de elución. Las fracciones que contienen IgG se mezclaron y neutralizaron con Na2HPO41 M.
La Figura 6 muestra MALDI-TOF de N-glicanos de la región Fc de cetuximab digeridos con Endo S.
Ejemplo 21. Galactosilación y sialilación de unidades de GlcNAc(p-N-Asn) en cetuximab tratado con Endo S La galactosilación de las unidades de Fuca1-6GlcNAc(p-N-Asn) en cetuximab se llevó a cabo mediante la incubación del anticuerpo con la enzima p1,4-galactosiltransferasa y UDP-galactosa. 12 mg de anticuerpo, 30 mM de UDP-Gal, 20 mM de MnCh y 3,2 mU/pl de p1,4-galactosiltransferasa se mezclaron en 400 ml de tampón MOPS 50 mM, pH 7,2, y se incubaron durante 24 h a 37 °C. La muestra se llevó al análisis Fc. Después de ello se añadieron enzima a-2,6-Sialiltransferasa y CMP-NeuNAc a la mezcla de reacción a concentraciones finales de 0,03 mg/ml y 30 mM, respectivamente, y la incubación continuó 3 días.
El análisis Fc de la muestra tratada con p1,4-galactosiltransferasa reveló la galactosilación completa de N-acetilglucosaminas (Figura 7). Las señales de m/z 24302 y 24431 corresponden a Galp1-4(Fuca1-6)GlcNAc-Fc sin lisina y Galp1-4(Fuca1-6)GlcNAc-Fc con lisina.
El análisis Fc de la muestra tratada con p1,4-galactosiltransferasa y a-2,6-sialiltransferasa reveló las señales mayores en m/z 24298,24591 y 24720 correspondiente a Galp1-4(Fuca1-6)GlcNAc-Fc sin lisina, NeuNaca2-6Galp1-4(Fuca1-6)GlcNAc-Fc sin lisina y NeuNaca2-6Galp1-4(Fuca1-6)GlcNAc-Fc con lisina (Figure 8). Se sialilaron aproximadamente el 65% de las galactosas.
La Figura 7 muestra el MALDI-TOF de los Fc-glicanos tratados con Endo S p1-4-galactosilados.
La Figura 8 muestra el MALDI-TOF de Fc-glicanos tratados con Endo S p-1,4-galactosilados y a-2,6-sialilados. La mezcla de reacción se purificó con la columna HiTrap Proteína G (GE Healthcare) usando fosfato de Na 0,02 M pH 7 como el tampón de unión y ácido cítrico 0,1 M pH 2,6 como el tampón de elución. Las fracciones que contienen IgG se mezclaron y se neutralizaron con Na2HPO41 M.
Ejemplo 22. Galactosilación y sialilación de cetuximab
La galactosilación de GlcNAc terminal en los N-glicanos complejos de cetuximab se llevó a cabo mediante la incubación del anticuerpo con la enzima p-1,4-galactosiltransferasa y UDP-galactosa. 13 mg de anticuerpo, 30 mM de UDP-Gal, 20 mM de MnCh y 2,5 mU/pl de p1,4-galactosiltransferasa se mezclaron en 400 ml de tampón MOPS 50 mM, pH 7,2, y se incubó durante 48 h a 37 °C. Después de ello la enzima a-2,6-Sialiltransferasa y CMP-NeuNac se añadieron a concentraciones finales de 0,03 mg/ml y 30 mM, respectivamente, y la incubación continuó 4 días. El análisis Fc de cetuximab antes de la galactosilación y sialilación reveló la mayor señal en m/z 25230 correspondiente a G0F-Fc. El análisis Fc de la muestra tratada con p1,4-galactosiltransferasa y a-2,6-sialiltransferasa reveló las señales mayores en m/z 25555 y 25847 correspondientes a G2F-Fc y G2F-Fc monosialilado, respectivamente (Figura 9B). La ausencia de señal de G0F-Fc en m/z 25230 reveló la galactosilación completa en la reacción de p-1,4-galactosiltransferasa.
Ejemplo 23. Oxidación ácidos siálicos en cetuximab galactosilado y sialilado (tratado con Endo S/no tratado con Endo S)
Los ácidos siálicos en los N-glicanos de las muestras de cetuximab galactosilado y sialilado se oxidaron selectivamente con peryodato. 5-10 mg de anticuerpo se mezclaron con meta-peryodato de sodio 1 mM en 1 ml de tampón acetato de Na 0,1 M pH 5,5 y se incubaron 0,5 h RT en la oscuridad. El meta-peryodato de sodio sin reaccionar se eliminó mediante adiciones repetidas de PBS y centrifugaciones en una unidad de filtro centrífugo Amicon Ultracel 30 K 0,5 ml (Millipore).
El análisis Fc del cetuximab tratado con Endo S, galactosilado, sialilado y oxidado reveló las señales mayores en m/z 24333, 24463, 24565 y 24688 correspondiente a Galp1-4(Fuca1-6)GlcNAc-Fc sin lisina y con lisina y ox-NeuNaca2-6Galp1-4(Fuca1-6)GlcNAc-Fc sin lisina y con lisina, respectivamente (Figura 10).
El MALDI-TOF en modo reflector negativo después del análisis de N-glicano del cetuximab galactosilado, sialilado y oxidado reveló la mayor señal en m/z 2104 correspondiente a G2F mono-sialilado que contiene ácido siálico oxidado (Figura 11A). La misma muestra en el modo reflector positivo reveló las señales mayores en m/z 1663, 1809 y 2060 correspondientes a G2, G2F y G2F mono-sialilada que contiene ácido siálico oxidado. Es decir, 7-aldehído-NeuAc.
Ejemplo 24. Conjugación de ácido levulínico a cetuximab
La amidación del ácido levulínico a grupos amino libres en cetuximab se realizó de la siguiente manera: a 5 mg (33 nmol) de cetuximab en PBS (200 jl) se añadió un exceso de 10-30 molar de succinimidil éster de ácido levulínico (preparado como se describe en el Ejemplo 18) en ACN (8-25 j l) y la mezcla se dejó reaccionar durante 4 horas a temperatura ambiente. Los reactivos de bajo peso molecular se eliminaron mediante una unidad de filtro centrífugo Amicon, 30 K, de acuerdo con las instrucciones del fabricante utilizando PBS como eluyente de lavado.
Para analizar el éxito de la amidación de levulinato, se liberaron cadenas livianas de anticuerpos por desnaturalización de loss anticuerpos con guanidina-HCl 6 M a 60 °C durante 0,5 horas. Los enlaces disulfuro se redujeron posteriormente con ditiotreitol 0,1 M a 60 °C durante 0,5 horas. Las cadenas livianas se purificaron a partir de la mezcla de reacción con columnas Poros R1 miniaturizadas de fabricación propia con elución con ACN 60% en TFA 0,1% (5 jl). El análisis de la cadena liviana se realizó mediante espectros de masas MALDI-TOF usando matriz de ácido sinapínico. El análisis mostró que 1-4 grupos de levulinato estaban unidos a la cadena liviana del anticuerpo.
Ejemplo 25. Conjugación de monometildolastatina (MODO) mediante el ligador de Val-Cit-PAB a cetuximab Val-Cit-PAB-MODO
6,5 mg (8 jmol) MODO en DMF (200 jl), 2 exceso molar de Fmoc-Val-Cit-PAB-pnp, 0,3 mg (2 jmol) de HoBt en DMF (28 jl), 7 ml (40 jmol) de diisopropiletilamina y 65 j l DMF se agitaron durante dos días a temperatura ambiente. La mezcla de reacción bruta se analizó por espectros de masa MALDI-TOF usando la matriz de ácido 2,5-dihidroxibenzoico, que muestra la masa esperada para Fmoc-Val-Cit-PAB-MODO (m/z 1420 [M+Na]).
Fmoc se eliminó mediante la adición de 150 j l de dietilamine y mediante agitación a temperatura ambiente durante la noche. El análisis de masa MALDI-TOF usando la matriz de ácido 2,5-dihidroxibenzoico mostró la generación del producto desprotegido esperado (m/z 1198 [M+Na]).
Val-Cit-PAB-MODO se purificó mediante el instrumento HPLC purificador Ákta (GE Healthcare) con columna de fase inversa Gemini 5 jm NX-C18 (21,1 x 250 mm, 110 A, AXIA (Phenomenex)) se eluyó con gradiente de ACN en acetato de amonio acuoso.
Alquino-Val-Cit-PAB-MODO
15 mg (67 jmol) de éster HHS de ácido 3-propargiloxipropiónico (Cambio, Dry Drayton, Cambs, UK) y 2 mg (24 jmol) de hidrógeno carbonato de sodio se añadieron a la solución de Val-Cit-PAB-MODO (6,4 jmol) en DMSO 75% (1 ml). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante dos días. El producto se analizó por MALDI-TOF MS, lo que muestra el producto esperado (m/z 1308 [M+Na]).
Alquino-Val-Cit-PAB-MODO se purificó mediante el instrumento HPLC purificador Ákta (GE Healthcare) con una columna de fase inversa Gemini 5 jm NX-C18 (4,6 x 250 mm, 110 A (Phenomenex)) que se eluye con gradiente de ACN en acetato de amonio acuoso.
PEG-N3-Cetuximab
1 mg (6,7 nmol) de cetuximab en PBS (150 jl) se incubó con 10 exceso molar de N3-PEG-NHS (Pierce)en DMSO (9 jl) durante 2 horas a temperatura ambiente. El N3-PEG-NHS sin reaccionar se separó por unidad de filtro centrífugo Amicon, 30K.
Para verificar la unión de PEG-azida, se liberaron cadenas livianas de anticuerpos por desnaturalización de los anticuerpos con guanidina-HCl 6 M a 60 °C durante 0,5 horas, seguido de reducción de disulfuro con ditiotreitol 0,1 M a 60 °C durante 0,5 horas. Las cadenas livianas se purificaron a partir de la mezcla de reacción con columnas Poros R1 miniaturizadas de fabricación propia mediante su elución con ACN 60% en TFA 0,1% (5 jl). El análisis de la cadena liviana se realizó por MALDI-TOF MS, que confirmó la presencia de unidades de PEG-azida (+273 Da). Val-Cit-PAB-MODO-Cetuximab
El conjugado del fármaco-anticuerpo del título (Esquema 11) se generó por una reacción click catalizada con cobre(II) que contiene 3,2 nmol de PEG-N3-Cetuximab en PBS (90 jl), 32 nmol de Alquino-Val-Cit-PAB-MODO en DMSO (125 |jl), 1250 nmol de TGTA en MQ (90 |jl), 1250 nmol de ascorbato de Na en MQ (12,6 |jl), 250 nmol de CuSO4 en MQ (5 jl) y PBS (volumen de reacción 0,5 ml). La mezcla se dejó reaccionar durante 1 hora a RT. El conjugado de anticuerpo se purificó en la unidad de filtro centrífugo Amicon, 30k .
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Esquema 11. Estructura del conjugado Val-Cit-PAB-MODO-Cetuximab
Para estimar la relación fármaco-anticuerpo (DAR), el conjugado se sometió al asilamiento del fragmento Fc y la cadena liviana. Los fragmentos Fc se liberaron mediante la enzima FabRICATOR (Genovis AB, Lund, Suecia) durante la noche a 37 °C y se purificaron con puntas Poros R1. Los fragmentos Fc se eluyeron con ACN 60%, TFA 0,1% (5 jl). Las cadenas livianas se liberaron con guanidina-HCl 6 M y ditiotreitol como anteriormente, y se recuperaron usando puntas Poros R1. Sobre la base del análisis MALDI-TOF MS de estos dominios de proteínas, la relación fármaco-anticuerpo fue en promedio de 1,5.
Ejemplo 26. Síntesis de derivados de hidroxilamina de monometildolastatina 10 y monometilauristatina F 10 mg de monometildolastatina (11,3 jimol) o 10 mg monometilauristatina (11,8 jimol) se disolvieron en acetonitrilo (2,5 ml). Se añadieron 10x de exceso molar de ácido Boc-aminooxiacético y DMT-MM. Se añadieron 25 j l de diisopropiletilamina y las mezclas de reacción se agitaron durante la noche a temperatura ambiente. El análisis MALDI-TOF MS mostró la formación de productos esperados, amida del ácido monometildolastatina-bocaminooxiacético, m/z = 966 [M Na], y amida del ácido monometilauristatina-boc-aminooxiacético, m/z = 927 [M Na]. Las mezclas de reacción se secaron con un flujo de gas nitrógeno. El grupo protector de Boc se eliminó mediante la disolución de las mezclas de reacción en 2 ml de diclorometano: ácido trifluoroacético (12,5: 1) en hielo y la reacción se dejó continuar durante 4 horas. Las muestras se analizaron por MALDI: ácido monometildolastatinaaminooxiacético (MODO-AOAA), [M+Na] m/z 866 y ácido monometilauristatina-aminooxiacético (MMAF-AOAA) [M Na] m/z 827. Los productos se secaron y purificaron por HPLC en una columna de fase inversa Gemini-NX-5u C-18 eluida con gradiente de acetonitrilo en tampón de acetato de amonio pH 5,6.
Ejemplo 27. Conjugación de MODO-AOAA y MMAF-AOAA a 7-aldehído-NeuAc-cetuximab
200 jg de 7-aldehído-NeuAc-cetuximab (preparado como se describe en el Ejemplo 23) en tampón de acetato de sodio 0,1 M pH 5,5 (90 jl) se mezclaron con 100 de exceso molar de MODO-AOAA o 300 de exceso molar de MMAF-AOAA en DMSO (10 jl). Las reacciones se dejaron proceder durante 18-120 h a temperatura ambiente.
El fragmento Fc del conjugado de MODO-AOAA-Cetuximab se aisló como se describe en el Ejemplo 25 y se analizó por MALDI-TOF MS. El espectro del fragmento Fc mostró una señal mayor en m/z 26637, correspondiente al producto de oxima esperado (Esquema 12).
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El fragmento Fc del conjugado de MMAF-AOAA-Cetuximab se aisló como se describe en el Ejemplo 25 y se analizó por MALDI-TOF MS. El espectro del fragmento Fc mostró una señal mayor en m/z 26614, correspondiente al producto de oxima esperado.
Ejemplo 28. Conjugación de MODO-AOAA a levulinil-cetuximab
2,7 nmol de levulinil-cetuximab (preparado como en el Ejemplo 24) en tampón de acetato de sodio 0,1 M pH 5,5 (100 |jl) se mezclaron con 100 de exceso molar de MODO-AoAa en DMSO (10 jl). La reacción se dejó proceder 2d a temperatura ambiente y 4d a 37 °C. Para el análisis MALDI, las cadenas livianas el conjugado se aislaron como se describe en el Ejemplo 24 y se analizaron por MALDI-TOF MS (Fig. 12). El espectro muestra dos señales correspondientes a los conjugados de fármaco: m/z 24361 y m/z 25282, correspondientes a una y dos unidades de MO-DO-AOAA unidas en las cadenas livianas, respectivamente.
Ejemplo 29. Conjugación de Boc-aminooxibutinilacetamida (Boc-ABAA) con N-(6-azido-6-deoxi-D-galactosil)-monometildolastatina 10 (N-(6 -N3-Gal)-MODO)
Boc-ABAA se conjugó con N-(6-N3-Gal)-MODO mediante la reacción de cicloadición de azida-alquino catalizada por cobre (I).
La reacción contenía 2,5 jmol de N-(6-N3-Gal)-MODO, 6,3 jmol de Boc-ABAA (2,5 x exceso molar en N-(6-N3-Gal)-MODO), 25 jmol de ascorbato de Na (10 x exceso molar en N-(6-N3-Gal)-MoDo) y 5 jmol de CuSO4 (2 x exceso molar en N-(6-N3-Gal)-MODO). Boc-ABAA y N-(6-N3-Gal)-MODO se disolvieron en DMSO y ascorbato de Na y CuSO4 en MilliQ-H2O antes de añadirse a la reacción. El volumen total de la reacción fue 117 j l que contiene 64% de DMSO. La reacción se llevó a cabo durante 1,5 horas a RT. La conjugación se detuvo con 40 j l de EDTA 0,5M pH 8 (20 jmol EDTA).
El progreso de la reacción se analizó con MALDI-TOF MS usando la matriz de ácido 2,5-dihidroxibenzoico en el modo reflector de ion positivo. La señal mayor se observó en m/z 1224,6, que corresponde al ion [M+Na]+ del producto de reacción click esperado (Esquema 13).
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Ejemplo 30. Conjugación de aminooxibutinilacetamida (ABAA) a 7-aldehído-NeuAc-cetuximab usando ligación de oxima
2,67 mg (17,8 nmol) de 7-aldehído-NeuAc-cetuximab (Ejemplo 23) se incubó con 100x de exceso molar de ABAA (1,78 |jmol; obtenido como se muestra en el Ejemplo 17) en tampón de acetato de sodio 0,2 M pH 5,5 (650 ml) durante la noche a temperatura ambiente. Se eliminó el ABAA sin reaccionar y el tampón se intercambió con PBS mediante varias adiciones de PBS en el concentrador Amicon Ultracel 30 K (Millipore).
Los fragmentos Fc del conjugado obtenido se aislaron como se describe en el Ejemplo 25, y se sometieron al análisis MALDI-TOF MS en la matriz de 2,5-dihidroxiacetofenona. La señal mayor se observó en m/z 25955, correspondiente a la oxima ABAA-ácido siálico en el fragmento Fc. (Esquema 14).
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Esquema 14. Estructura de! cetuximab-ABAA.
Figure imgf000068_0002
s o lo se m u e s t r a n los residuos de ácido siálico y galactosa
En una reacción similar, ABAA se unió a cetuximab tratado con Endo S, posteriormente galactosilado, sialilado y oxidado (Ejemplo 23).
El análisis del fragmento Fc del producto de ligación de la oxima reveló una señal mayor en m/z 24703, correspondiente a una oxima de ABAA-ácido siálico en el fragmento Fc.
Ejemplo 31. Conjugación de Cetuximab-ABAA con N-(6-N3-Gal)-MODO
Cetuximab-ABAA obtenido como se mostró anteriormente se conjugó con N-(6-N3-Gal)-MODO usando una reacción de cicloadición azida-alquino.
La reacción contenía 1 mg (6,6 nmol) de anticuerpo-ABAA (en 195 j l PBS), 660 nmol de N-(6-N3-Gal)-MODO (100 x exceso molar en anticuerpo-ABAA), 330 nmol ascorbato de Na (50 x exceso molar en anticuerpo-ABAA), 66 nmol de CuSO4 (10 x exceso molar en anticuerpo-ABAA) y 330 nmol de TGTA (50 x exceso molar en anticuerpo-ABAA). Ascorbato de Na, CuSO4 y TGTA se disolvieron en MNMQ-H2O y N-(6-N3-Gal)-MODO en DMSO antes de la adición a la reacción. El volumen total de la reacción fue 250 j l que contiene 195 j l de PBS y DMSO 6%. La reacción se llevó a cabo durante dos horas a RT.
Los conjugados de anticuerpo-fármaco resultantes (ADC) se purificaron y el tampón se intercambió a PBS mediante varias adiciones de PBS con el concentrador Amicon Ultracel 30 K (Millipore).
Los fragmentos Fc del ADC así obtenido se aislaron como se describe en el Ejemplo 25, y se sometieron al análisis MALDI-TOF MS en la matriz de 2,5-dihidroxiacetofenona. El producto de conjugación mayor se observó en m/z 26902, correspondiente a la oxima N-(6-N3-Gal)-MODO-(triazol)-ABAA-ácido siálico en el fragmento Fc (ver Esquema 15).
Figure imgf000069_0001
En una reacción click similar, N-(6-N3-Gal)-MODO se unió a ABAA-cetuximab tratado con Endo S (MODO-ABAA-cetuximab-S; Ejemplo 30).
El análisis MS del fragmento Fc del producto de reacción click reveló una señal mayor en m/z 25641, correspondiente a la oxima de N-(6-N3-Gal)-MODO-(triazol)-ABAA-ácido siálico en el fragmento Fc (Fig. 13).
Ejemplo 32. Citotoxicidad in vitro de los conjugados de anticuerpo-fármaco
La línea celular de cáncer de ovario humano SKOV-3 (EGFR+ HER2+), la línea celular de carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello HSC-2 (EGFR+) y la línea celular de carcinoma colorrectal resistente a múltiples fármacos LS513 (EGFR+) provenían de ATCC (Manassas, Virginia, USA). Las células se cultivaron de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Los ensayos de citotoxicidad in vitro con las células se realizaron como anteriormente. Los resultados de un ensayo ejemplar se muestran en la Figura 14A, en la que se compararon las citotoxicidades de los conjugados monometildolastatina 10 (MODO) glicoconjugados MODO-ABAA-cetuximab y MODO-ABAA-cetuximab-S con cetuximab-VC-MODO (Val-Cit-PAB-MODO-cetuximab) que contiene un ligador sensible a la valina-citrulina peptidasa para las lisinas de anticuerpos en contraste con el resto ligador hidrófilo para los residuos de glicano. Ambos MODO-ABAA-cetuximab y MODO-ABAA-cetuximab-S fueron más efectivos contra las células de cáncer de cabeza y cuello HSC-2 que cetuximab-VC-MODO.
La Figura 14 muestra la citotoxicidad in vitro de conjugados de anticuerpo-fármaco con células cancerosas. Todas las concentraciones de fármaco en el eje y se normalizaron al contenido real de fármaco de monometildolastatina 10 en cada conjugado. A) Las citotoxicidades de MODO-ABAA-cetuximab y MODO-ABAA-cetuximab-S (conjugados de monometildolastatina 10 (MODO) glicoconjugados) y cetuximab-VC-MODO (Val-Cit-PAB-MODO-cetuximab) se compararon con el control (PBS) en células de cáncer de cabeza y cuello HSC-2. B) Las citotoxicidades de MODO-ABAA-cetuximab y MODO-ABAA-cetuximab-S se compararon con cetuximab-VC-MODO en células de cáncer colorrectal LS513 resistentes a múltiples fármacos.
En otros experimentos, los valores de IC50 se establecieron para el conjugado preparado de anticuerpo y fármaco de cetuximab y dolastatina 10 de acuerdo con el Esquema 6 contra las células cancerosas como se describió anteriormente: IC50 contra las células SKOV-3 era de 1 nM a 10 nM e IC50 contra las células HSC-2 era de 1nM a 10nM en los experimentos.
En el experimento descripto en la Figura 14B, las citotoxicidades de MODO-ABAA-cetuximab y MODO-ABAA-cetuximab-S se compararon con cetuximab-VC-MODO en células de cáncer colorrectal LS513 resistentes a múltiples fármacos. Tanto el MODO-ABAA-cetuximab como el MODO-ABAA-cetuximab-S (que contiene un enlazador que libera el fármaco con el resto del enlazador hidrofílico por acción de la glucohidrolasa dentro de las células) fueron más efectivos que el cetuximab-VC-MODO (que contiene un ligador que libera un fármaco no conjugado dentro de las células).
Ejemplo 33. Síntesis de MODO-TREA (1-[MODO-Gal]-1,2,3-triazol-4-etilamina)
12 |jmol de N3-Gal-MODO (Ejemplo 1) en DMSO (40 jl), 2x exceso molar de 1-amino-3-butino en DMSO (20 jl), 3,1 mg (19 mmol) de CuSO4 en Mq (50 jl), 19,2 mg de ascorbato de Na en MQ (50 jl), 90 j l de DMSO y 400 j l MQ se agitaron a RT durante 2,5 horas. La mezcla de reacción bruta se analizó por espectros de masa MALDl-TOF usando la matriz de ácido 2,5-dihidroxibenzoico, que muestra la masa esperada para MO-DO-TREA (m/z 1051 [M+Na]). MODO-TREA se purificó mediante el instrumento HPLC purificador Ákta (GE Healthcare) con la columna de fase inversa Gemini 5 jim NX-AXIA-C18 (21,2 x 250 mm, 110 A (Phenomenex)) que se eluye con gradiente de ACN en acetato de amonio acuoso.
Ejemplo 34. Síntesis de MODO-TREA-DBCO
8 |jmol de MODO-TREA, 5x de exceso molar de DBCO-éster NHS (Jena Bioscience) en DMF (1 ml) y 16 |jl de diisopropiletilamina se agitaron a RT durante tres horas. La mezcla de reacción bruta se analizó por espectros de masa MALDI-TOF usando la matriz de ácido 2,5-dihidroxibenzoico, que muestra la masa esperada para MODO-TREA-DBCO (m/z 1338 [M+Na]).
MODO-TREA-DBCO se purificó mediante el instrumento HPLC purificador Ákta (GE Healthcare) con columna de fase inversa Gemini 5 jm NX-AXIA-C18 (21,2 x 250 mm, 110 A (Phenomenex)) que se eluye con gradiente de ACN en acetato de amonio acuoso.
Ejemplo 35. Síntesis de MODO-TRSLac (1-(MODO-Gal)-1,2,3-triazol-4-[9-sialiMactosa])
N3-NeuNAca2,6 lactosa se obtuvo mediante la a2,6-sialilación enzimática de lactosa usando CMP-9-deoxi-9-azido-NeuNAc (Ejemplo 3) y a2,6-sialiltransferasa de P. damsela (Sigma). El producto trisacárido se purificó por cromatografía de intercambio iónico en DE-AE Sefarosa de flujo rápido (GE Healthcare) usando un gradiente de bicarbonato de amonio.
9 jmol de N3-NeuNAca2,6 lactosa en MQ (100 jl), 1,5x de exceso molar de propargil-Gal-MODO en DMSO (300 jl), 4 mg (25 jmol) de CuSO4 en MQ (50 ml), 32,8 mg (44 jmol) de TGTA en MQ (50 jl) 8,9 mg ascorbato de Na (45 jmol) en MQ (50 jl) y 50 j l de MQ se agitaron a RT durante 4 horas. La mezcla de reacción bruta se analizó por espectros de masa MALDI-TOF usando la matriz de ácido 2,5-dihidroxibenzoico, que muestra la masa esperada para MODO-TRSLac (m/z 1653 [M+Na]).
MODO-TRSLac se purificó mediante el instrumento HPLC purificador Ákta (GE Healthcare) con columna de fase inversa Gemini 5 jm NX-AXIA-C18 (21,2 x 250 mm, 110 A (Phenomenex)) que se eluye con gradiente de ACN en acetato de amonio acuoso.
Ejemplo 36. Síntesis de MODO-TRSLac-Lys
~8 jmol MODO-TRSLac en DMSO (1,6 ml), ~50 exceso molar de lisina en MQ (150 jl), 44 mg (707 jmol) NaCNBH3 en MQ (174 jl) y 76 j l de diisopropiletilamina se agitaron a 60 °C durante dos días.
MODO-TRSLac-Lys se purificó mediante el instrumento HPLC purificador Ákta (GE Healthcare) con la columna de fase inversa Gemini 5 jm NX-AXIA-C18 (21,2 x 250 mm, 110 A (Phenomenex)) que se eluye con gradiente de ACN en acetato de amonio acuoso.
Ejemplo 37. Síntesis de MODO-TRSLac-Lys-DBCO
~6 jmol de MODO-TRSLac-Lys, ~5 exceso molar de DBCO-éster NHS en DMF (72 jl), 10 ml de diisopropiletilamina y 450 j l de DMF se agitaron a RT durante la noche. La mezcla de reacción bruta se analizó por espectros de masa MALDI-TOF usando la matriz de ácido 2,5-dihidroxibenzoico, que muestra la masa esperada para MODO-TRSLac-Lys-DBCO (m/z 2093 [M-H+2Na]+).
MODO-TRSLac-Lys-DBCO se purificó mediante el instrumento HPLC purificador Ákta (GE Healthcare) con la columna de fase inversa Gemini 5 jm NX-AXIA-C18 (21,2 x 250 mm, 110 A (Phenomenex)) que se eluye con gradiente de ACN en acetato de amonio acuoso.
Ejemplo 38. Síntesis de DM1 carboximetilado (DM1-S-CH2COOH)
3,9 jmol de DM1, 2,5 de exceso molar de ácido yodoacético en DMF (33 jl), 67 j l de DMF y 90 j l de NH4HCO3200 mM se agitaron a RT durante una hora. La mezcla de reacción bruta se analizó por espectros de masa MALDI-TOF usando la matriz de ácido 2,5-dihidroxibenzoico que muestra la masa esperada para DM1-S-CH2COOH (m/z 818 [M+Na]).
Ejemplo 39. Síntesis de DM1-DBCO
~3,9 jmol de DM1-S-CH2COOH, 3,5 de exceso molar de DBCO-NH2 (Sigma) en DMF (200 jl) y 26 mg (95 jmol) de DMT-MM en DMF (500 jl) se agitaron a RT durante la noche. La mezcla de reacción bruta se analizó por espectros de masa MALDI-TOF usando la matriz de ácido 2,5-dihidroxibenzoico, que muestra la masa esperada para DM1-DBCO (m/z 1076 [M+Na]). DM1-DBCO se purificó por cromatografía de fase inversa como se describe en el Ejemplo 25.
Ejemplo 40. Síntesis de MODO-Val-Cit-PAB-DBCO
~2 jmol MODO-Val-Cit-PAB (Ejemplo 25), ~5 de exceso molar de DBCO-éster NHS en DMF (126 jl) y 3,5 j l de diisopropiletilamine se agitaron a RT durante tres horas. La mezcla de reacción bruta se analizó por espectros de masa MALDI-TOF usando la matriz de ácido 2,5-dihidroxibenzoico, que muestra la masa esperada para MODO-Val-Cit-PAB-DBCO (m/z 1485 [M+Na]).
MODO-Val-Cit-PAB-DBCO se purificó por cromatografía de fase inversa como se describe en el Ejemplo 25.
Ejemplo 41. Conjugación de aminooxibutinilacetamida-monometildolastatina 10 (ABAA-MODO) con 7-aldehído-NeuNAc-trastuzumab
Modo-Boc-aminooxibutinilacetamide (Boc-ABAA-MODO, esquema 13) se preparó como se describe en el Ejemplo 29, y se purificó por extracción de fase sólida en cartucho de extracción Bond-Elut C18. El grupo protector Boc se eliminó mediante la incubación en diclorometano-TFA (12,5:1), y el producto MODO-ABAA se aisló por cromatografía de fase inversa usando la columna Gemini NX C18 (Phenomenex) usando un gradiente de acetonitrilo en acetato de amonio 20 mM, pH 5,6.
Fc N-glicanos de trastuzumab se galactosilaron y sialilaron esencialmente como en el Ejemplo 21. El análisis Fc de la muestra tratada con p1,4-galactosiltransferasa y a2,6-sialiltransferasa reveló la mayor señal en m/z 25846 correspondiente a NeuNAc-G2F-Fc sin lisina C-terminal. Aproximadamente 95% de las galactosas se sialilaron. Los ácidos siálicos posteriormente se oxidaron selectivamente a 7-aldehído-NeuNAc con peryodato 1 mM como en el Ejemplo 23. El análisis Fc del trastuzumab galactosilado, sialilado y oxidado reveló la mayor señal en m/z 25821 correspondiente a 7-aldehído-NeuAc-G2F-Fc.
La conjugación de ABAA-MODO con los ácidos siálicos oxidados de tratuzumab se realizó mediante la ligación oxima con modificaciones menores como en el ejemplo 30. Brevemente, 180 mg (1,2 nmol) de 7-aldehído-NeuNActrastuzumab se incubó con 75x de exceso molar de ABAA-MODO en DMSO 10%, tampón de acetato de sodio 0,2 M pH 4,5 (300 ml) durante la noche a temperatura ambiente. El ABAA sin reaccionar se eliminó y el tampón se intercambió a PBS mediante varias adiciones de PBS en el concentrador Amicon Ultracel 30 K (Millipore).
El análisis Fc de ABAA-MODO-7-aldehído-NeuNAc-trastuzumab (ver Esquema 16) reveló la mayor señal en m/z 26908 correspondiente a ABAA-MODO-7-aldehído-NeuAc-G2F-Fc y la señal menor en m/z 27990 correspondiente a 7-aldehído-NeuAc-G2F-Fc con dos ABAA-MODO unidos. Se observó una desaparición casi completa de la señal del 7-aldehído-NeuAc-G2F-Fc.
Figure imgf000071_0001
Esquema 16. Estructura de
Figure imgf000071_0002
la oxima N- (6-N.;-Gal} MODO-(triazol) - ABAA-ácido siálico CMODO-ABAA-1rasthelimab), Por claridad solo se muestran los residuos de ácido siálico y galactosa del H-glicar.o Ejemplo 42. Conjugación de aminooxibutinilacetamida-monometildolastatina 10 (ABAA-MODO) a 7-aldehído-NeuNAc-anti-CD33
GCM011, un anticuerpo anti-CD33 humanizado con un sitio adicional de N-glicosilación en la secuencia de la región variable de la cadena pesada, se produjo como sigue. Las secuencias de ADN sintéticas optimizadas para la expresión de células CHO se solicitaron a GeneArt (Life Technologies) que codifican 1) cadena pesada y 2) cadena liviana del anticuerpo y estas secuencias se clonaron en el vector pCHO1,0 con péptidos señal N-terminales y mutación E74N en La secuencia de la cadena pesada (Glu-74 cambió a Asn):
1) Secuencia de ADN que codifica la secuencia de aminoácidos del péptido señal MAVLGLLFCLVTFPSCVLS fusionado a la SEQ ID NO: 38, y
2) Secuencia de ADN ADN que codifica la secuencia de aminoácidos del péptido señal MVSTPQFLVFLLFWIPASRS fusionado a la SEQ ID NO: 37.
Para la expresión de anticuerpos, las células CHO-S FreeStyle™ se transfectaron con los vectores usando el Sistema de expresión FreeStyle™ Max (Life Technologies) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El sobrenadante se recogió de las células en el día 10 y los anticuerpos se purificaron con cromatografía de afinidad con proteína G. El análisis MALDI-TOF MS de los productos de reacción digeridos con FabRICATOR, así como los N-glicanos liberados por N-glicosidasa, demostraron que el sitio adicional de N-glicosilación en la cadena pesada Asn-74 estaba 100% glicosilado con N-glicanos de tipo complejo y el anticuerpo expresado así contenía cuatro N-glicanos/molécula de anticuerpo.
La galactosilación y sialilación de N-glicano se realizó con anti-CD33 GCM011 esencialmente como en el Ejemplo 21. Se liberaron fragmentos Fc de una pequeña alícuota de muestra con la enzima Fabricator como en el ejemplo 25. Se liberaron cadenas pesadas variables con guanidina-HCl 6 M y ditiotreitol, y se recuperaron usando puntas Poros R1. El análisis MALDI-TOF MS de Fc purificado reveló la mayor señal en m/z 25865 correspondiente a NeuNAc-G2F-Fc sin lisina. El análisis MALDI-TOf MS de la cadena pesada variable purificada reveló la mayor señal en m/z 27359 correspondiente a NeuNAc2-G2F-Fab HC.
Los ácidos siálicos en GCM011 galactosilado y sialilado se oxidaron como en el Ejemplo 23 y la conjugación ABAA-MODO a ácidos 7-aldehído-siálicos se realizó mediante ligación de oxima como en el Ejemplo 41. Los fragmentos Fc se analizaron como en el Ejemplo 25 y reveló una señal en m/z 26889 correspondiente a ABAA-MODO-7-aldehído-NeuNAc-G2F-Fc y una señal menor en m/z 27965 correspondiente a 7-aldehído-NeuAc-G2F-Fc con dos ABAA-MODO unidos.
En otro experimento, la oxidación selectiva del peryodato y la conjugación ABAA-MODO con ácidos 7-aldehídosiálicos se realizó a anti-CD33 GCM011no modificado (es decir, no se realizó galactosilación o sialilación antes de la oxidación). La oxidación de peryodato se realizó como en el Ejemplo 23 excepto que se usó peryodato 3 mM. La conjugación ABAA-MODO se realizó como en el Ejemplo 41, excepto que se usó un 18x de exceso molar de ABAA-MODO con el anticuerpo. Los N-glicanos Fab HC se analizaron como en el Ejemplo 41 y revelaron señales en m/z 28543 y 28667 correspondientes a ABAA-MODO-7-aldehído-NeuAc-G2F-Fab HC y ABAA-MODO-7-aldehído-NeuAc2-G2F-Fab HC. Se detectaron señales menores en m/z 26292 y 26757 correspondientes a 7-aldehído-NeuAc-G2F-Fc con dos ABAA-MODO unidos y 7-aldehído-NeuAc2-G2F-Fab HC con dos a Ba A-MODO unidos.
Ejemplo 43. Producción de trastuzumab afucosilado
El trastuzumab afucosilado se produjo en células CHO-S (Invitrogen) mediante la transfección transitoria de las células con ADN de cadena pesada y liviana de trastuzumab de acuerdo con las instrucciones de CHO-S de Invitrogen. Antes de la transfección y durante la producción de anticuerpos AV39 (un inhibidor de la síntesis de GDP-fucosa; Glykos Finland Ltd., Helsinki, Finlandia) se añadió a las células para evitar la fucosilación de N-glicano. En el día 5 después de la transfección, se recogieron los sobrenadantes y se purificó el anticuerpo con la columna HiTrap Proteína G (GE Healthcare) usando fosfato de sodio 0,02 M pH 7 como tampón de unión y ácido cítrico 0,1 M pH 2,6 como tampón de elución. Las fracciones que contienen IgG se mezclaron y neutralizaron con Na2HPO41 M. La inhibición de la fucosilación se confirmó mediante análisis de N-glicano como en el Ejemplo 8.
Ejemplo 44. Conjugación de MODO-ABAA con 7-aldehído-NeuNAc-trastuzumab afucosilado
El trastuzumab afucosilado se galactosiló y sialiló como en el Ejemplo 21. El análisis Fc de la muestra tratada con p1,4-galactosiltransferasa y a-2,6-sialiltransferasa reveló la mayor señal en m/z 25700 correspondiente a Neu-NAc-G2-Fc sin lisina. El 85% de los N-glicanos estaban mono-sialilados. La oxidación selectiva de ácidos siálicos se realizó como en el Ejemplo 23 y MO-DO-ABAA se conjugó con ácidos 7-aldehido-siálicos como en el Ejemplo 41. El análisis Fc de ABAA-MODO-7-aldehido-NeuNAc-afucosil trastuzumab reveló la mayor señal en m/z 26754 correspondiente a ABAA-MODO-7-aldehído-NeuAc-G2-Fc sin lisina. Se observó la desaparición completa de la señal de 7-aldehído-NeuAc-G2F-Fc.
Ejemplo 45. Unión enzimática de CMP-9-deoxi-9-azido-NeuNAc a Fc N-glicanos de trastuzumab
Los Fc N-glicanos de trastuzumab (Herceptin) se galactosilaron con p1,4-galactosiltransferasa como en el Ejemplo 21. Posteriormente se usó a2,6-sialiltransferasa para sialilar galactosas terminales con 9-azido-NeuNAc usando CMP-9-deoxi-9-azido-NeuNAc (Ejemplo 3) como el sustrato donante. La reacción de sialilación se realizó como en el Ejemplo 21. El análisis Fc de la muestra tratada con p1,4-galactosiltransferasa y a2,6-sialiltransferasa reveló la mayor señal en m/z 25872 correspondiente a G2F-Fc con un residuo unido de 9-deoxi-9-azido-NeuNAc. La proporción de esta señal fue >90% de todas las señales.
Ejemplo 46. Conjugación de MODO-TREA-DBCO a Fc N-glicanos modificados de trastuzumab
20 |jM de trastuzumab galactosilado y 9-azido-sialilado (Ejemplo 45) se incubó con 400 j M de MODO-TREA-DBCO (Ejemplo 34) en PBS, DMSO 2,5%. La reacción se dejó proceder 16 h a temperatura ambiente después de lo cual el MODO-TREA-DBCO no conjugado se eliminó mediante adiciones repetidas de PBS y centrifugaciones a través de filtro centrífugo Amicon Ultracel 30 k. Se tomó una muestra para el análisis Fc, que reveló la mayor señal en m/z 27189 correspondiente a MODO-TREA-DBCO-9-azido-NeuNAc-G2F-trastuzumab (ver Esquema 17). El grado de conjugación fue mayor de 95%.
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Esquema 17 Estructura de MODO-TREA-DBCO ADC (MODO—TREA— DBCO-9-azido-NeuNAc-G2F-trastuzumab) . Por claridad, solo se muestran Los res iduos de ác ido s iá l ic o y ga lac tosa d e l N -g lic a n o
Ejemplo 47. Conjugación de MODO-TRSLac-Lys-DBCO a Fc N-glicanos modificados de trastuzumab
20 |jM de trastuzumab galactosilado y sialilado que porta 9-deoxi-9-azido-NeuNAc en los extremos terminales Fc-N-glicano (Ejemplo 45) se incubó con 400 j M de MODO-TRSLac-Lys-DBCO (Ejemplo 37) en PBS. El 8% de DMSO y el 20% de propilenglicol estuvieron presentes en la reacción para evitar la precipitación de toxinas. La reacción se dejó proceder 16 h a temperatura ambiente, después de lo cual se eliminó MODO-TRSLac-Lys-DBCO no conjugado mediante adiciones repetidas de PBS y centrifugaciones a través de un filtro centrífugo Amicon Ultracel 30 k. Se tomó una muestra para el análisis Fc, que reveló la mayor señal en m/z 27923 correspondiente a MODO-TRSLac-Lys-DBCO-9-azido-NeuNAc-G2F-trastuzumab. Las señales en m/z 25559 y 25871 revelaron la presencia de cantidades menores de G2F-trastuzumab y azido-NeuNAc-G2F-trastuzumab
Figure imgf000073_0002
Esquema 18. Estructura de MODO-TRSLac-Lys-DBCO ADC MODO TRSLac-Lys-DBCO-9-azido-NeuNAc-G2F-trastuzumab). P o r c l a r i d a d .
s o lo s e m u e s t r a n l o s r e s id u o s de a c id o s i á l i c o y g a la c t o s a d e l N - g l i c a n o
Ejemplo 48. Conjugación de DM1-DBCO con Fc N-glicanos modificados de cetuximab
Cetuximab se agalactosiló y sialiló con ácido 9-azido-N-acetilneuramínico esencialmente como se describe en los Ejemplos 9 y 10.
El análisis de MALDI-TOF MS del producto de reacción digerido con FabRICATOR implicó que aprox 74% de los N-glicanos se convirtieron en G2F con una azido-NeuAc, la porción restante es la glicoforma g2f .
DM1-DBCO (Ejemplo 39) se conjugó con N-glicanos 9-azido-NeuAc-cetuximab en una reacción click libre de cobre como se describe en el Ejemplo 46. Los productos de reacción se purificaron en los concentradores Amicon Ultracel 30 K (Millipore) en varias adiciones de 5% de manitol, 0,1% de Tween 20 en PBS y centrifugaciones posteriores. El análisis de MALDI-TOF MS de los ADC digeridos con FabRICATOR revelaron la reacción completa en los azido N-glicanos(ver Esquema 19).
Figure imgf000074_0001
Cetuximab se agalactosiló y sialiló con ácido 9-azido-N-acetilneuramínico esencialmente como se describe en los Ejemplos 9 y 10. El análisis de MALDI-TOF MS del producto de reacción digerido con FabRICATOR implicó que aprox 74% de los N-glicanos se convirtieron en G2F con una azido-NeuAc, la porción restante es la glicoforma G2F.
MODO-Val-Cit-PAB-DBCO (Ejemplo 40) se conjugó con N-glicanos 9-azido-NeuAc-cetuximab en una reacción click libre de cobre como se describe en el Ejemplo 46 (ve Esquema 20). Los productos de reacción se purificaron como se describió anteriormente en el Ejemplo 48. La mayor parte de los grupos azido reaccionaron como se analizó por análisis de MALDI-TOF MS de la parte Fc.
Figure imgf000074_0002
Ejemplo 50. Síntesis de N-(6-O-propargil-D-galactosil)epirrubicinas y conjugación con 9-azido-NeuAccetuximab
La epirrubicina se alquila en N mediante aminación reductora en solución acuosa alcalina usando 6-propargil-6-deoxi-D-galactosa (Ejemplo 1) y cianoborohidruro de sodio. El producto N-(6-O-propargil-D-galactosil)-epirrubicina se aísla con cromatografía de fase inversa usando el procedimiento descripto en el Ejemplo 1. N-(6-O-propargil-D-galactosil)-epirrubicina se conjuga con 9-azido-NeuAc-cetuximab (Ejemplo 10) en una reacción click catalizada por cobre como se describe en el Ejemplo 12 (ver el Esquema 21).
Figure imgf000075_0001
Como es evidente para un experto en la técnica, otras toxinas similares, por ejemplo doxorrubicina y daunorrubicina, se pueden derivarizar y conjugar de modo similar.
Ejemplo 51. Síntesis de N-(6-O-propargil-D-galactosil)duocarmicina, MA y conjugación con 9-azido-NeuAccetuximab
La duocarmicina MA (ALB Technology Limited) se trata con ácido trifluoroacético seco en DCM para eliminar el grupo Boc, y el derivado de duocarmicina no protegido se alquila en N mediante aminación reductora en solución acuosa alcalina usando 6-propargil-6-deoxi-D-galactosa (Ejemplo 1) y cianoborohidruro de sodio. El producto N-(6-O-propargil-D-galactosil)-duocarmicina MA se aísla con cromatografía de fase inversa usando por ejemplo, procedimiento descripto en el Ejemplo 1. N-(6-O-propargil-D-galactosil)-duocarmicina MA se conjuga con 9-azido-NeuAc-cetuximab (Ejemplo 10) en una reacción click catalizada con cobre como se describe en el Ejemplo 12 (ver Esquema 22).
Ejemplo 52. Experimento in vivo
Figure imgf000076_0001
Un estudio no aleatorizado de conjugados de anticuerpo anti-EGFR IgG1-fármaco (ADC; sustancias de prueba preparadas mediante la conjugación de monometildolastatina 10 a N-glicanos de anticuerpo cetuximab expresado en CHO para formar MODO-abaa-cetuximab como se describe en los Ejemplos anteriores) y el control (solución salina tamponada con fosfato, PBS) se realizó en un modelo de ratón desnudo con xenoinjerto para evaluar la eficacia in vivo de los ADC. El estudio se realizó de acuerdo con las pautas estándares de la instalación de prueba y fue aprobado por el comité ético apropiado (Universidad de Turku y Hospital de la Universidad de Turku, Turku, Finlandia).
Se implantó por vía s.c. la línea celular de cáncer humano LS531 (EGFR+ , carcinoma colorrectal con fenotipo resistente a múltiples fármacos) en un flanco de ratones Harlan HSD hembra y adulta: Foxn1nu atímicos desnudos. La primera dosis de las sustancias de prueba o control se administró cuando los tumores habían crecido por encima del volumen promedio de 100 mm3 (4-8 mm de diámetro). La longitud del tumor (L) y el ancho (W) se registraron en mm. Los volúmenes tumorales (V) en mm3 se calcularon de acuerdo con la fórmula V = A L x W2 Los ratones con tumores de diferentes tamaños se dividieron por igual en grupos de estudio para obtener grupos homogéneos (cuatro o cinco ratones en cada grupo).
La sustancia de prueba se administró i.v. 10 mg/kg de ADC en PBS tres veces a intervalos de siete días y los animales de control recibieron PBS. El volumen tumoral, el peso del animal y los signos clínicos y el comportamiento general de los animales fueron seguidos dos veces por semana. Se registraron signos o comportamientos inusuales. El criterio de valoración del estudio fue a las ocho semanas después de la primera dosis.
MODO-abaa-cetuximab mostró actividad antitumoral e inhibió el crecimiento tumoral en comparación con el tratamiento de control. El volumen promedio del tumor al final del experimento fue 189% en comparación con el volumen promedio en el momento de la primera inyección de ADC (100%) en ratones tratados con MODO-abaacetuximab, mientras que en los ratones de control que recibieron solo PBS, el volumen promedio del tumor al final del experimento fue del 375% en comparación con el volumen promedio en el momento de la primera inyección de ADC.
Otro estudio no aleatorizado de conjugados de anticuerpo anti-EGFR IgG1-fármaco se llevó a cabo en un modelo de ratón desnudo de xenoinjerto para evaluar la eficacia in vivo de los ADC. Las sustancias de prueba se prepararon mediante la conjugación de monometildolastatina 10 a N-glicanos de cetuximab expresado en CHO y cetuximab expresado en CH tratado con Endo S para formar el conjugado de MODO-abaa-cetuximab y N-(6-N3-Gal)-MODO-(triazol)-ABAA-oxima de ácido siálico-cetuximab tratado con Endo S (MODO-abaa-EndoS-cetuximab), respectivamente, como se describe en los ejemplos anteriores. El tratamiento de control fue PBS sin ADC. El estudio se realizó de acuerdo con las pautas estándares de la instalación de prueba y fue aprobado por el comité ético apropiado (Universidad de Turku y Hospital de la Universidad de Turku, Turku, Finlandia).
Se implantó por vía s.c la línea celular de cáncer humano HSC-2 (EGFR+, carcinoma de cabeza y cuello de células escamosas) en un flanco de ratones Harlan HSD hembra y adulta: Foxn1nu atímicos desnudos. La primera dosis de las sustancias de prueba o control se administró cuando los tumores habían crecido por encima del volumen promedio de 100 mm3 (4-8 mm de diámetro). La longitud del tumor (L) y el ancho (W) se registraron en mm. Los

Claims (1)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Un procedimiento de preparación de un conjugado de la molécula de carga útil tóxica para glicoproteína representada por la fórmula I
    [D-L-G]n-Gp Fórmula I
    en la que
    Gp es una glicoproteína que comprende un N-glicano, en la que el N-glicano comprende un residuo de GlcNAc unido por una unión p-N a una asparagina;
    n es un número entero de 1 a 20;
    D es una molécula de carga útil tóxica;
    L es un grupo ligador que une covalentemente G a D; y
    G es una estructura de sacárido representada por la fórmula II
    Figure imgf000123_0001
    Fórmula II
    en la que
    R es un enlace glicosídico al residuo de GlcNAc unido por una unión p-N a una asparagina;
    X1 es H;
    X2 es un enlace a L y X3 y X4 son cada uno OH;
    X5 es CH2OH;
    en la que el procedimiento comprende las etapas de:
    proporcionar una glicoproteína que comprende un N-glicano que comprende un sitio aceptor, en el que la glicoproteína que comprende el N-glicano que comprende el sitio aceptor se prepara mediante el contacto de una glicoproteína que comprende un N-glicano con una endoglicosidasa, en el que el N-glicano es un N-glicano tipo híbrido y la endoglicosidasa es EndoS2; y
    hacer reaccionar una molécula donante con la glicoproteína que comprende el N-glicano que comprende el sitio aceptor en presencia de una glicosiltransferasa, en la que la glicosiltransferasa es p1,4-GalT1(Y285L) humana o p1,4-GalT1(Y285L) bovina;
    en la que la molécula donante es UDP-2-(2-azidoacetamido)-2-deoxi-Gal (UDP-GalNAz). 2. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el N-glicano consiste en la la estructura representada por la fórmula IV
    Figure imgf000123_0002
    Fórmula IV
    en la que (p-N-Asn) es una unión p-N a una asparagina y y es 0 o 1.
    El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en el que la glicoproteína es capaz de unirse a una molécula diana seleccionada del grupo que consiste en CD2, CD3, CD4, CD5, CD6, Cd 11, CD8, CD11a, CD19, CD20, CD22, CD25, CD26, CD30, CD33, CD34, CD37, CD38, CD40, CD44, CD46, CD52, CD56, CD79, CD105, CD138, receptor del factor de crecimiento epidérmico 1 (EGFR), receptor del factor de crecimiento epidérmico 2 (HER2/neu), receptor HER3 o HER4, LFA-1, Mac1, p150,95, VLA-4, ICAM-1, VCAM, EpCAM, alfa4/beta7 integrina, alfa v/beta3 integrina que incluye las subunidades alfa o beta de la misma, factor tisular (TF), factor de necrosis tumoral alfa (TNF-a), factor de crecimiento endotelial vascular humano (VEGF), glicoproteína Ilb/IIIa, TGF-beta, interferón alfa (alfa-IFN), IL-8, receptor de IL-2, IgE, virus sincitial respiratorio (RSV), HIV-1 glicoproteína de envoltura gp120, N-glicanos tipo de alta manosa asociados a cáncer, antígeno del grupo sanguíneo Apo2, receptor de muerte, receptor de flk2/flt3, receptor de obesidad (OB), receptor mpl, CTLA-4, receptor de transferrina y proteína C.
    El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que la glicoproteína es un anticuerpo o un fragmento del mismo.
    El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que la glicoproteína es un anticuerpo IgG o un fragmento del mismo.
    El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en el que la glicoproteína es el anticuerpo bevacizumab, tositumomab, etanercept, trastuzumab, adalimumab, alemtuzumab, gemtuzumab ozogamicin, efalizumab, rituximab, infliximab, abciximab, basiliximab, palivizumab, omalizumab, daclizumab, cetuximab, panitumumab, epratuzumab, 2G12, lintuzumab, nimotuzumab, GCM011, GCM012, o ibritumomab tiuxetano, o sus anticuerpos de glicoforma en el que el anticuerpo de glicoforma comprende uno o más de los sitios de N-glicosilación introducidos en la cadena liviana y/o pesada; o abagovomab, actoxumab, adecatumumab, afutuzumab, altumomab, amatuximab, anifrolumab, apolizumab, atinumab, atlizumab, atorolimumab, bapineuzumab, basiliximab, bavi-tuximab, belimumab, benralizumab, bertilimumab, besilesomab, bezlotoxumab, bimagrumab, bivatuzumab, blinatumomab, blosozumab, brentuximab, briakinumab, brodalumab, canakinumab, cantuzumab, caplacizumab, capromab, carlumab, catumaxomab, CC49, cedelizumab, cixutumumab, clazakizumab, clenoliximab, clivatuzumab, conatumumab, concizumab, crenezumab, CR6261, dacetuzumab, dalotuzumab, daratumumab, demcizumab, denosumab, detumomab, drozitumab, duligotumab, dupilumab, dusigitumab, ecromeximab, eculizumab, edobacomab, edrecolomab, eldelumab, elotuzumab, elsili-momab, enavatuzumab, enlimomab, enokizumab, enoticumab, ensituximab, epitumomab, epratuzumab, ertumaxomab, etaracizumab, etrolizumab, evolocumab, exbivirumab, fanolesomab, faralimomab, farletuzumab, fasinumab, felvizumab, fezakinumab, ficlatuzumab, figitumumab, flanvotumab, fontolizumab, foralumab, foravirumab, fresolimumab, fulranumab, futuximab, galiximab, ganitumab, gantenerumab, gavilimomab, gevokizumab, girentuximab, glembatumumab, golimumab, gomiliximab, guselkumab, ibalizumab, icrucumab, imciromab, imgatuzumab, inclacumab, indatuximab, intetumumab, inolimomab, inotuzumab, ipilimumab, iratumumab, itolizumab, ixekizumab, keliximab, labetuzumab, lambrolizumab, lampalizumab, lebrikizumab, lemalesomab, lerdelimumab, lexatumumab, libivirumab, ligelizumab, lintuzumab, lirilumab, lodelcizumab, lorvotuzumab, lucatumumab, lumiliximab, mapatumumab, margetuximab, maslimomab, mavrilimumab, matuzumab, mepolizumab, metelimumab, milatuzumab, minretu-momab, mitumomab, mogamulizumab, morolimumab, motavizumab, moxetumomab, muromonab, namilumab, nar-natumab, natalizumab, nebacumab, necitumumab, nerelimomab, nesvacumab, nimotuzumab, nivolumab, obinutuzumab, ocaratuzumab, ocrelizumab, odulimomab, ofatumumab, olaratumab, olokizumab, onartuzumab, oregov-omab, orticumab, otelixizumab, oxelumab, ozanezumab, ozoralizumab, pagibaximab, panobacumab, parsatuzumab, pascolizumab, pateclizumab, patritumab, pemtumomab, perakizumab, pertuzumab, pi-dilizumab, pinatuzumab, pintumomab, placulumab, polatuzumab, ponezumab, priliximab, pritoxaximab, pritumumab, quilizumab, racotumomab, radretumab, rafivirumab, ramucirumab, raxibacumab, regavirumab, reslizumab, rilotumumab, robatumumab, roledumab, romosozumab, rontalizumab, rovelizumab, ruplizumab, samalizumab, sarilumab, satumomab, secukinumab, seribantumab, setoxaximab, sevirumab, sibrotuzumab, sifalimumab, siltuximab, simtuzumab, siplizumab, sirukumab, solanezumab, solitomab, sonepcizumab, sontuzumab, stamulumab, suvizumab, tabalumab, taca-tuzumab, talizumab, tanezumab, taplitumomab, tefiba-zumab, tenatumomab, teneliximab, teplizumab, teprotumumab, TGN1412, ticilimumab, tildrakizumab, tigatuzumab, tocilizumab, toralizumab, tovetumab, tralokinumab, TRBS07, tregalizumab, tremelimumab, tucotuzumab, tuvirumab, ublituximab, urelumab, urtoxazumab, ustekinumab, vantictumab, vapaliximab, vatelizumab, vedolizumab, veltuzumab, vepalimomab, vesencumab, visilizumab, volociximab, vorsetuzumab, votumumab, zalutumumab, zanolimumab, zatuximab, ziralimumab, 2G12 (anti-HIV-1 glicoproteína de envoltura gp120), o zolimomab.
    El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en el que la glicoproteína comprende uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho o más sitios aceptores.
    El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en el que el procedimiento además comprende las etapas de:
    hacer reaccionar un producto que se puede obtener mediante el procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-7 con un compuesto representado por la fórmula XIV
    D-L-L" Fórmula XIV
    en la que D es la molécula de carga útil tóxica;
    L es el grupo ligador que une covalentemente L" a D; y
    L" es un alquino.
    9. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en el que el producto del procedimiento se une a una molécula que comprende el grupo ligador y la molécula de carga útil tóxica mediante la utilización de la conjugación click, tal como reacción de cicloadición de azida alquino catalizada con cobre (I) o química click sin cobre.
    10. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en el que el procedimiento comprende la etapa de proporcionar una composición que incluye la glicoproteína que comprende el N-glicano que comprende el sitio aceptor, y al menos 95%, o al menos 98%, o al menos 99% de todas las glicoproteínas de la composición que comprende un N-glicano comprenden un N-glicano que consiste en la estructura representada por la fórmula IV.
    11. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en el que el procedimiento comprende la etapa de proporcionar una composición que incluye la glicoproteína que comprende el N-glicano que comprende el sitio aceptor, y al menos 95%, o al menos 98%, o al menos 99%, o esencialmente 100% de las glicoproteínas totales de la composición que comprende un N-glicano comprenden al menos dos N-glicanos que comprenden al menos un sitio aceptor.
    12. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-11, en el que el grupo ligador es hidrófilo.
    13. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-12, en el que la molécula de carga útil tóxica es una dolastatina, auristatina, doxorrubicina, DM1, epirrubicina, o duocarmicina.
    14. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-13, en el que n es 1, 2, 4 o 6.
    15. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-13, en el que n es 2-6.
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Families Citing this family (30)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014052713A2 (en) 2012-09-27 2014-04-03 Massachusetts Institute Of Technology Her2-and vegf-a-binding proteins with enhanced stability
US20160106860A1 (en) * 2013-05-02 2016-04-21 Glykos Finland Oy Conjugates of a glycoprotein or a glycan with a toxic payload
US20170319709A1 (en) * 2013-07-05 2017-11-09 Formation Biologics Inc. Egfr antibody conjugates
JP6564369B2 (ja) 2013-12-09 2019-08-21 デュレクト コーポレイション 薬学的活性剤複合体、ポリマー複合体、ならびにこれらを伴う組成物及び方法
EP3129402A4 (en) * 2014-04-08 2017-12-13 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Site-specific antibody-drug glycoconjugates and methods
ES2779974T3 (es) 2014-06-13 2020-08-21 Tenboron Oy Conjugados que comprenden un anticuerpo anti-egfr1
WO2015197919A1 (en) * 2014-06-25 2015-12-30 Glykos Finland Oy Antibody drug conjugates binding to high-mannose n-glycan
US10973920B2 (en) * 2014-06-30 2021-04-13 Glykos Finland Oy Saccharide derivative of a toxic payload and antibody conjugates thereof
EP3240797A4 (en) * 2014-12-31 2018-08-01 Development Center for Biotechnology Site-specific conjugation through glycoproteins linkage and method thereof
CN105820248A (zh) * 2015-01-07 2016-08-03 上海张江生物技术有限公司 一种新型抗egfr单克隆抗体的制备方法及应用
EP3878861A1 (en) 2015-02-16 2021-09-15 Lonza Ltd. Cl and/or ch1 mutated antibodies for drug conjugation
US20170114127A1 (en) * 2015-10-22 2017-04-27 Massachusetts Institute Of Technology Vegf-a-binding proteins and her2-binding proteins with enhanced stability against aggregation
US10874746B2 (en) 2016-02-08 2020-12-29 Synaffix B.V. Sulfamide linkers for use in bioconjugates
CN108883191B (zh) * 2016-02-08 2022-10-14 西纳福克斯股份有限公司 用于靶向cd30肿瘤的具有改善的治疗指数的抗体-缀合物以及用于改善抗体-缀合物的治疗指数的方法
CN109069658B (zh) * 2016-02-08 2022-10-14 西纳福克斯股份有限公司 用于靶向her2肿瘤的具有改善的治疗指数的抗体-缀合物以及用于改善抗体-缀合物的治疗指数的方法
WO2017137457A1 (en) * 2016-02-08 2017-08-17 Synaffix B.V. Antibody-conjugates with improved therapeutic index for targeting cd30 tumours and method for improving therapeutic index of antibody-conjugates
US11951175B2 (en) 2016-02-08 2024-04-09 Synaffix B.V. Bioconjugates containing sulfamide linkers for use in treatment
KR102445255B1 (ko) 2016-03-02 2022-09-22 에자이 알앤드디 매니지먼트 가부시키가이샤 에리불린-기반 항체-약물 콘주게이트 및 사용 방법
US11135306B2 (en) * 2016-11-14 2021-10-05 CHO Pharma Inc. Antibody-drug conjugates
TWI673363B (zh) * 2016-12-29 2019-10-01 財團法人生物技術開發中心 製備醣蛋白-藥物共軛物之方法
WO2018146506A1 (en) * 2017-02-10 2018-08-16 Universitat Politècnica De València Therapeutic derivatives
JP7320455B2 (ja) 2017-06-21 2023-08-03 グリコス・フィンランド・オーワイ 親水性リンカーおよびそのコンジュゲート
AU2018358120A1 (en) * 2017-11-02 2020-04-30 Genmab A/S Anti-tissue factor antibody-drug conjugates and their use in the treatment of cancer
JP7304863B2 (ja) 2017-12-29 2023-07-07 グリコミメティクス， インコーポレイテッド Ｅ－セレクチンおよびガレクチン－３のヘテロ二機能性阻害剤
CN113490665A (zh) 2018-12-27 2021-10-08 糖模拟物有限公司 抑制c-糖苷的半乳凝素-3
US11845771B2 (en) 2018-12-27 2023-12-19 Glycomimetics, Inc. Heterobifunctional inhibitors of E-selectin and galectin-3
US20230038373A1 (en) * 2019-12-18 2023-02-09 Glykos Biomedical Oy Stabile conjugate
EP4267193A1 (en) 2020-12-23 2023-11-01 Ludwig-Maximilians-Universität München Improved cd30 targeting antibody drug conjugates and uses thereof
AU2022222386A1 (en) 2021-02-16 2023-07-20 Glykos Finland Oy Linker-payloads and conjugates thereof
CN116997337A (zh) * 2021-03-10 2023-11-03 拜奥海芬治疗学有限公司 半乳糖缺陷型免疫球蛋白的双官能降解剂

Family Cites Families (113)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0299007A4 (en) * 1986-12-11 1990-03-08 Genzyme Corp PREPARATION OF 1-AMINO-1-DEOXYOLIGOSACCHARIDES AND DERIVATIVES THEREOF.
JP3476455B2 (ja) 1991-03-18 2003-12-10 ザ スクリップス リサーチ インスティテュート ＮｅｕＡｃα２、６Ｇａｌβ１、４ＧｌｃＮＡｃ及びシアリルＬｅｘの合成法
US5278299A (en) 1991-03-18 1994-01-11 Scripps Clinic And Research Foundation Method and composition for synthesizing sialylated glycosyl compounds
US5461143A (en) 1991-03-18 1995-10-24 The Scripps Research Institute Oligosaccharide enzyme substrates and inhibitors: methods and compositions
ATE161051T1 (de) 1991-07-17 1997-12-15 Ciba Geigy Ag Verfahren zur herstellung aktivierter sialinsäuren
US5635483A (en) 1992-12-03 1997-06-03 Arizona Board Of Regents Acting On Behalf Of Arizona State University Tumor inhibiting tetrapeptide bearing modified phenethyl amides
US5443953A (en) 1993-12-08 1995-08-22 Immunomedics, Inc. Preparation and use of immunoconjugates
DE69729283T2 (de) 1996-03-20 2005-05-25 Immunomedics, Inc. GLYKOSYLIERTE IgG ANTIKÖRPER
WO2001062912A2 (en) 2000-02-24 2001-08-30 University Of Guelph Method of modulating glycosylation pathways
US20060034828A1 (en) 2000-06-28 2006-02-16 Gerngross Tillman U Immunoglobulins comprising predominantly a GlcNAcMAN5GLCNAC2 glycoform
EP1363673A2 (en) 2000-09-25 2003-11-26 Pro-Pharmaceuticals, Inc. Compositions for reducing side effects in chemotherapeutic treatments
WO2003102583A1 (en) * 2002-05-29 2003-12-11 Symbiontics, Inc. Targeted therapeutic proteins
US7820714B2 (en) 2001-06-19 2010-10-26 Sorge Kelm Siglec inhibitors
ES2411007T3 (es) * 2001-10-10 2013-07-04 Novo Nordisk A/S Remodelación y glicoconjugación de péptidos
US7265085B2 (en) 2001-10-10 2007-09-04 Neose Technologies, Inc. Glycoconjugation methods and proteins/peptides produced by the methods
EP2305311A3 (en) 2001-10-10 2011-07-20 BioGeneriX AG Glycoconjugation of peptides
US7696163B2 (en) * 2001-10-10 2010-04-13 Novo Nordisk A/S Erythropoietin: remodeling and glycoconjugation of erythropoietin
US8008252B2 (en) 2001-10-10 2011-08-30 Novo Nordisk A/S Factor VII: remodeling and glycoconjugation of Factor VII
US20050233949A1 (en) 2002-04-12 2005-10-20 Holick Michael F Conjugates comprising cancer cell specific ligands, a sugar and cancer chemotherapeutic agents/boron neutron capture therapy agents, and uses thereof
ES2369542T3 (es) 2002-07-31 2011-12-01 Seattle Genetics, Inc. Conjugados de auristatina y su uso para tratar cáncer, una enfermedad autoinmune o una enfermedad infecciosa.
CA2511205C (en) * 2002-12-26 2009-07-14 Otsuka Chemical Co., Ltd. Sugar-chain asparagine derivatives and processes for the preparation thereof
AU2004204463B2 (en) 2003-01-10 2009-02-12 Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services National Institutes Of Health Catalytic domains of beta(1,4)-galactosyltransferase I having altered donor and acceptor specificities, domains that promote in vitro protein folding, and methods for their use
WO2005012484A2 (en) * 2003-07-25 2005-02-10 Neose Technologies, Inc. Antibody-toxin conjugates
US7332355B2 (en) 2003-11-18 2008-02-19 California Institute Of Technology Method and compositions for the detection of protein glycosylation
US20070258986A1 (en) 2003-11-19 2007-11-08 Govt of the US as represented by the secretary, Targeted Delivery System for Bioactive Agents
WO2005056783A1 (en) 2003-12-05 2005-06-23 Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Catalytic domains of beta(1,4)-galactosyltransferase i having altered metal ion specificity
WO2005082023A2 (en) 2004-02-23 2005-09-09 Genentech, Inc. Heterocyclic self-immolative linkers and conjugates
RU2402548C2 (ru) 2004-05-19 2010-10-27 Медарекс, Инк. Химические линкеры и их конъюгаты
JP4193771B2 (ja) 2004-07-27 2008-12-10 セイコーエプソン株式会社 階調電圧発生回路及び駆動回路
US8431558B2 (en) 2004-11-01 2013-04-30 The Regents Of The University Of California Compositions and methods for modification of biomolecules
DK1812031T3 (en) 2004-11-01 2015-09-14 Univ California Compositions and methods for the modification of biomolecules
WO2006102652A2 (en) 2005-03-24 2006-09-28 Neose Technologies, Inc. Expression of soluble, active eukaryotic glycosyltransferases in prokaryotic organisms
EP4026840A1 (en) * 2005-07-18 2022-07-13 Seagen Inc. Beta-glucuronide-linker drug conjugates
DK2388273T3 (en) 2005-10-21 2017-10-09 Lfb Usa Inc ANTIBODIES WITH INCREASED ANTIBODY-DEPENDENT CELLULAR CYTOTOXICITY ACTIVITY, PROCEDURES FOR THE PRODUCTION OF THESE AND USE THEREOF
JP2009513640A (ja) 2005-10-27 2009-04-02 メルク エンド カムパニー インコーポレーテッド Ｈｉｖインテグラーゼインヒビター
WO2007056525A2 (en) 2005-11-10 2007-05-18 James Paulson High affinity siglec ligands
US8716033B2 (en) 2006-02-10 2014-05-06 Life Technologies Corporation Oligosaccharide modification and labeling of proteins
EP2001358B1 (en) 2006-03-27 2016-07-13 University Of Maryland, Baltimore Glycoprotein synthesis and remodeling by enzymatic transglycosylation
US8524865B2 (en) 2006-05-30 2013-09-03 Genentech, Inc. Antibodies and immunoconjugates and uses therefor
CA2654000A1 (en) 2006-06-06 2008-05-22 Genentech, Inc. Anti-dll4 antibodies and methods using same
TWI412367B (zh) 2006-12-28 2013-10-21 Medarex Llc 化學鏈接劑與可裂解基質以及其之綴合物
US8398956B2 (en) 2007-01-11 2013-03-19 Immunomedics, Inc. In vivo copper-free click chemistry for delivery of therapeutic and/or diagnostic agents
US8227425B2 (en) * 2007-01-23 2012-07-24 Therapicon Srl Antiviral compounds
KR20170091174A (ko) 2007-04-03 2017-08-08 옥시레인 유케이 리미티드 분자의 글리코실화
WO2008143944A2 (en) 2007-05-14 2008-11-27 Government Of The Usa, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Methods of glycosylation and bioconjugation
JP5702600B2 (ja) * 2007-07-03 2015-04-15 チルドレンズ ホスピタル アンド リサーチ センター アット オークランド オリゴシアル酸誘導体、製造方法および免疫学的使用
CN101828113B (zh) 2007-07-25 2014-04-16 德国弗劳恩霍夫协会债权安格万特学术研究所 自结合重组抗体融合蛋白
US8512991B2 (en) 2007-08-22 2013-08-20 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Beta 1,4-galactosyltransferases with altered donor and acceptor specificities, compositions and methods of use
US8425901B2 (en) 2007-08-22 2013-04-23 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Alpha 1-3 N-galactosyltransferase with altered donor specificities
US8323908B2 (en) 2007-09-14 2012-12-04 Genovis Ab Method of assessing glycosylation state or functional quality of an IgG containing sample
JP5498952B2 (ja) 2007-11-21 2014-05-21 ユニバーシティ・オブ・ジョージア・リサーチ・ファウンデイション・インコーポレイテッド アルキン類及び１，３−双極子機能性化合物とアルキン類を反応させる方法
JP5647899B2 (ja) 2008-01-08 2015-01-07 ラツィオファルム ゲーエムベーハーｒａｔｉｏｐｈａｒｍ ＧｍｂＨ オリゴサッカリルトランスフェラーゼを使用するポリペプチドの複合糖質化
WO2009102820A2 (en) 2008-02-11 2009-08-20 Government Of The U.S A., As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Modified sugar substrates and methods of use
US8815580B2 (en) 2008-08-08 2014-08-26 Vib Vzw Cells producing glycoproteins having altered glycosylation patterns and method and use thereof
BRPI1012676A2 (pt) 2009-04-01 2016-04-05 Genentech Inc anticorpos anti-fcrh5 e imunoconjugados e métodos de uso
EP2253635B1 (en) 2009-04-28 2014-03-19 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Novel hydrophilic and lipophilic rhodamines for labelling and imaging
WO2011028507A2 (en) 2009-08-24 2011-03-10 Duke University Compositions, methods, and kits for determining an alkyl transferase
US20120195831A1 (en) 2009-10-09 2012-08-02 Ningyan Zhang Generation, characterization and uses thereof of anti-her3 antibodies
GB0919070D0 (en) 2009-10-30 2009-12-16 Univ East Anglia Compounds and their uses in glycosyltransferase binding assays
GB0919423D0 (en) 2009-11-05 2009-12-23 Glaxosmithkline Llc Novel compounds
DK2501805T3 (en) 2009-11-19 2019-04-15 Oxyrane Uk Ltd Yeast strains producing mammalian-like complex N-Glycans
IT1396620B1 (it) * 2009-11-25 2012-12-14 Therapicon Srl Analoghi chimerici
EP2515914A4 (en) 2009-12-23 2013-09-11 Scripps Research Inst BIOCONJUGATION OF TYROSINE BY EYE REACTIONS IN AQUEOUS MEDIA
US8519122B2 (en) 2010-02-12 2013-08-27 The Regents Of The University Of California Compositions and methods for modification of biomolecules
EP2563753B9 (en) 2010-04-27 2016-07-06 SynAffix B.V. Fused cyclooctyne compounds and their use in metal-free click reactions
DK2566335T3 (en) 2010-05-05 2016-10-03 Prolynx Llc Controlled release of active ingredients from macromolecular CONJUGATES
US8912322B2 (en) 2010-07-29 2014-12-16 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Aza-dibenzocyclooctynes and methods of making and using same
US9326939B2 (en) 2010-07-31 2016-05-03 The Scripps Research Institute Liposome targeting compounds and related uses
BR112013002444A2 (pt) 2010-08-13 2016-05-24 Roche Glycart Ag anticorpo, polinucleotídeo e polipeotídeo isolados, composição, vetor, cécula hospedeira, conjulgado de anticorpo, formulação farmacêutica, uso do anticorpo, métodos para produzir um anticorpo, tratar um indivíduo, induzir a lise celular de uma célula tumorosa e diagnosticar uma doença em um indivíduo
EP2621532A1 (en) 2010-09-30 2013-08-07 Merck Sharp & Dohme Corp. Generation, characterization and uses thereof of anti-her3 antibodies
JP6105477B2 (ja) 2010-11-05 2017-03-29 ライナット ニューロサイエンス コーポレイション 操作されたポリペプチドコンジュゲートおよびトランスグルタミナーゼを用いてそれを作製する方法
WO2012064733A2 (en) 2010-11-09 2012-05-18 Medimmune, Llc Antibody scaffold for homogenous conjugation
CN103221072A (zh) 2010-12-02 2013-07-24 免疫医疗公司 用于递送治疗剂和/或诊断剂的体内无铜催化的点击化学
EP2966061B1 (en) 2011-03-04 2017-05-03 Life Technologies Corporation Compounds and methods for conjugation of biomolecules
EP2688867B1 (en) 2011-03-25 2018-09-05 Life Technologies Corporation Heterobifunctional esters for use in labeling target molecules
DK2694111T3 (en) 2011-04-01 2016-10-10 Wyeth Llc Antibody pharmaceutical conjugates
CA2832387A1 (en) 2011-04-20 2012-10-26 Genmab A/S Bispecifc antibodies against her2
LT2707031T (lt) 2011-05-08 2019-10-10 Legochem Biosciences, Inc. Baltymo-aktyvaus agento konjugatai ir jų gamybos būdas
US8852599B2 (en) 2011-05-26 2014-10-07 Bristol-Myers Squibb Company Immunoconjugates, compositions for making them, and methods of making and use
SG195183A1 (en) * 2011-05-27 2013-12-30 Ambrx Inc Compositions containing, methods involving, and uses of non-natural amino acid linked dolastatin derivatives
CA2837586C (en) * 2011-05-27 2018-12-11 Ambrx, Inc. Compositions containing, methods involving, and uses of non-natural amino acid linked dolastatin derivatives
EP2714731A1 (en) * 2011-05-31 2014-04-09 ProBioGen AG Methods for preparation of fucose-linked site specific conjugates of proteins with toxins, adjuvants, detection labels and pharmacokinetic half life extenders
WO2012170938A1 (en) 2011-06-08 2012-12-13 Acceleron Pharma Inc. Compositions and methods for increasing serum half-life
AU2012275390A1 (en) 2011-06-28 2014-01-16 Whitehead Institute For Biomedical Research Using sortases to install click chemistry handles for protein ligation
BR112014000324A8 (pt) 2011-07-19 2019-01-29 Cellmosaic Inc reagentes reticulantes, macromoléculas, conjugados terapêuticos e métodos sintéticos dos mesmos
US20130066063A1 (en) 2011-09-09 2013-03-14 John Cooke Hodges Bicyclo[6.1.0]non-4-yne regents for chemical modification of oligonucleotides
GB201115841D0 (en) 2011-09-13 2011-10-26 Genovis Ab Protein and method
WO2013087992A1 (en) 2011-12-13 2013-06-20 Glykos Finland Oy Glycoprotein
EP2791164B1 (en) 2011-12-13 2017-08-16 Glykos Finland Oy Non-fucosylated glycoprotein comprising the Fc domain of an antibody
EP2610263A1 (de) 2011-12-30 2013-07-03 Brossmer, Reinhard Sialinsäure-Dimere
EP2812442B9 (en) 2012-02-10 2023-02-15 University of Maryland, Baltimore Chemoenzymatic glycoengineering of antibodies and fc fragments thereof
US9545449B2 (en) 2012-05-11 2017-01-17 Advanced Proteone Therapeutics Inc. Site-specific labeling and targeted delivery of proteins for the treatment of cancer
EP2859017B1 (en) 2012-06-08 2019-02-20 Sutro Biopharma, Inc. Antibodies comprising site-specific non-natural amino acid residues, methods of their preparation and methods of their use
US9539336B2 (en) 2012-06-21 2017-01-10 Reinhard Brossmer Sialic acid derivatives
ES2611788T3 (es) 2012-06-26 2017-05-10 Sutro Biopharma, Inc. Proteínas de Fc modificadas que comprenden residuos de aminoácidos no naturales específicos del sitio, conjugados de las mismas, métodos para su preparación y métodos para su uso
SG11201501464TA (en) 2012-08-31 2015-03-30 Sutro Biopharma Inc Modified amino acids comprising an azido group
LT3912642T (lt) * 2012-10-23 2023-07-25 Synaffix B.V. Modifikuotas antikūnas, antikūno konjugatas ir jų gamybos būdas
EP2912459A2 (en) 2012-10-25 2015-09-02 Life Technologies Corporation Methods and compositions for enzyme-mediated site-specific radiolabeling of glycoproteins
EP2934596A1 (en) * 2012-12-21 2015-10-28 Glykos Finland Oy Linker-payload molecule conjugates
EP2956173B1 (en) 2013-02-14 2017-03-29 Bristol-Myers Squibb Company Tubulysin compounds, methods of making and use
GB2511137A (en) 2013-02-26 2014-08-27 Glykos Finland Oy Chelator Molecule
JP2016512239A (ja) 2013-03-15 2016-04-25 バーテックス ファーマシューティカルズ インコーポレイテッドＶｅｒｔｅｘ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ Ａｔｒキナーゼの阻害剤として有用な化合物
US20160106860A1 (en) * 2013-05-02 2016-04-21 Glykos Finland Oy Conjugates of a glycoprotein or a glycan with a toxic payload
WO2014189370A1 (en) 2013-05-24 2014-11-27 Stichting Katholieke Universiteit Substituted azadibenzocyclooctyne compounds and their use in metal-free click reactions
AU2014283185B2 (en) 2013-06-21 2019-05-02 Innate Pharma Enzymatic conjugation of polypeptides
US9987373B2 (en) 2013-10-14 2018-06-05 Synaffix B.V. Modified glycoprotein, protein-conjugate and process for the preparation thereof
EP2935608A1 (en) 2013-10-14 2015-10-28 SynAffix B.V. Modified glycoprotein, protein-conjugate and process for the preparation thereof
EP3057618B1 (en) 2013-10-14 2022-12-14 SynAffix B.V. Glycoengineered antibody, antibody-conjugate and methods for their preparation
US20160257764A1 (en) 2013-10-14 2016-09-08 Synaffix B.V. Glycoengineered antibody, antibody-conjugate and methods for their preparation
EP2910561A1 (de) 2014-02-25 2015-08-26 Reinhard Brossmer Sialinsäurederivate
CN108883191B (zh) 2016-02-08 2022-10-14 西纳福克斯股份有限公司 用于靶向cd30肿瘤的具有改善的治疗指数的抗体-缀合物以及用于改善抗体-缀合物的治疗指数的方法
US10874746B2 (en) 2016-02-08 2020-12-29 Synaffix B.V. Sulfamide linkers for use in bioconjugates
EP3414328B1 (en) 2016-02-08 2024-01-10 Synaffix B.V. Enzymes for trimming of glycoproteins

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