ES2779974T3 - Conjugados que comprenden un anticuerpo anti-egfr1 - Google Patents

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Abstract

Un conjugado que comprende un anticuerpo anti-EGFR1 o un fragmento de unión al EGFR1 de este, y al menos un derivado del dextrano, en donde el derivado del dextrano comprende al menos una unidad D-glucopiranosilo, en donde al menos un carbono seleccionado del carbono 2, 3 o 4 de la al menos una unidad D-glucopiranosilo se sustituye por un sustituyente de la fórmula -O-(CH2)n-S-B12H112- en donde n está en el rango de 3 a 10; y el derivado del dextrano se une al anticuerpo anti-EGFR1 o un fragmento de unión al EGFR1 de este, a través de un enlace formado por una reacción entre al menos un grupo aldehído formado por escisión oxidativa de una unidad D-glucopiranosilo del derivado del dextrano y un grupo amino del anticuerpo anti-EGFR1 o un fragmento de unión al EGFR1 de este.

Description

DESCRIPCIÓN
Conjugados que comprenden un anticuerpo anti-egfrl
Campo de la invención
La invención se refiere a un conjugado y a una composición farmacéutica.
Antecedentes de la invención
La terapia de captura de neutrones de boro (BNCT) es una forma de terapia no invasiva de tumores malignos, tales como los tumores cerebrales primarios y el cáncer de cabeza y cuello. En la BNCT, a un paciente se le inyecta un fármaco que tiene la capacidad de localizarse en el tumor y que porta átomos de boro-10 no radioactivos. Cuando el fármaco se irradia con neutrones térmicos de baja energía, se emiten partículas alfa biológicamente destructivas y núcleos de litio-7.
Para la BNCT se requieren fármacos tales como los conjugados que tienen un alto contenido de boro-10 y que son capaces de localizarse específicamente en el tumor. Tales conjugados deben producirse fácilmente, ser estables, solubles y seguros. Sin embargo, la provisión de tales conjugados es complicada, por ejemplo, porque algunos tipos de productos químicos no parecen funcionar con los compuestos que contienen boro-10.
El propósito de la presente invención es proporcionar conjugados que tienen propiedades mejoradas en comparación con los conjugados conocidos y que contienen un alto contenido de boro-10.
Barth y otros, Applied Radiation and Isotopes 2004, 61 (5), 899-903 evalúan el anticuerpo monoclonal cetuximab como un agente de suministro de boro para la terapia de captura de neutrones (NCT) de los tumores cerebrales.
Pettersson y otros, Journal of Immunological Methods 1990, 126 (1), 95-102, describen estudios de inmunorreactividad para dos anticuerpos monoclonales con dextrano-boro, anticuerpo anti proteína ácida fibrilar glial y anticuerpo antihialuronectina.
Gedda y otros, Bioconjugate Chemistry 1996, 7 (5), 584-591, describen el desarrollo de conjugados que comprenden EGF y BSH unidos covalentemente a cadenas de dextrano aliladas.
Resumen de la invención
El conjugado de acuerdo con la presente invención se caracteriza por lo que se presenta en la reivindicación 1.
La composición farmacéutica de acuerdo con la presente invención se caracteriza por lo que se presenta en la reivindicación 13.
El conjugado o composición farmacéutica para usar como un medicamento, de acuerdo con la presente invención, se caracteriza por lo que se presenta en la reivindicación 14.
El conjugado o composición farmacéutica para usar en el tratamiento del cáncer de acuerdo con la presente invención se caracteriza por lo que se presenta en la reivindicación 15.
Breve descripción de los dibujos
Los dibujos adjuntos, que se incluyen para proporcionar una comprensión adicional de la invención y constituyen una parte de esta descripción, ilustran modalidades de la invención y, junto con la descripción, ayudan a explicar los principios de la invención. En los dibujos:
Figura 1. Espectro de RMN de protón de BSH-dextrano. Los protones unidos al boro resuenan entre 0,8-2,0 ppm, y la carga de boro de BSH-dextrano puede estimarse mediante la comparación de la integral de los protones de boro con respecto a la integral de los protones de dextrano. Los grupos alilo sin reaccionar producen señales a 4,22, 5,29, 5,39 y 5,99 ppm. La señal aguda a 2,225 ppm es acetona (estándar interno).
Figura 2. Análisis de filtración en gel de conjugados BSH-Dex.
A. Anti-EGFR1-Fab-BSH(800B)-Dex. El conjugado eluye a 7,8 mL cuando se analiza con la columna de filtración en gel Yarra SEC-3000. En comparación, el anti-EGFR1-Fab eluye a 9,1 mL. B. Anti-EGFR1-Fab2-BSH(800B)-Dex. El conjugado eluye a 6,9 mL cuando se analiza con la columna de filtración en gel Yarra SEC-3000. En comparación, el anti-EGFR1-Fab2 eluye a 8,4 mL.
Figura 3. Análisis SDS-PAGE de los conjugados de boro Fab/F(ab')2 anti-EGFRI marcados con fluorescencia con diferentes cantidades de boro en condiciones no reductoras (panel A) y reductoras (panel B). Conjugados anti-EGFR1-Fab-BSH-Dex: Carril 1 (900B), carril 2 (700B), carril 4 (560B), carril 6 (360B). Conjugados anti-EGFR1-F(ab')2-BSH-Dex: Carril 3 (700B), carril 5 (560B), carril 7 (360B). El carril 8 es Anti-EGFR1-Fab-Dex y el carril 9 es un control que contiene una mezcla de anti-EGFR1-F(ab')2 y fragmentos Fc (en el gel los fragmentos Fab migran como fragmentos Fc). Tinción del gel con azul de Coomassie.
Figura 4. Unión a la superficie celular e internalización de anti-EGFR1-F(ab')2 (paneles A y C) y anti-EGFR1-F(ab')2-BSH (900B)-Dex (paneles B y D) marcados con fluorescencia, por células HSC-2. Las incubaciones se realizaron a 4 °C (unión a la superficie celular) y a 37 °C (unión a la superficie celular e internalización). El análisis se realizó por microscopía de fluorescencia.
Figura 5. Un ejemplo de la configuración del vector para la optimización del péptido señal. Promotor T5, sitios de unión a ribosomas (RBS), péptidos señal y secuencias identificadas de las cadenas pesadas y ligeras del Fab anti-EGFRI. Figura 6. Resultados de la optimización del promotor para la expresión del Fab. Se prepararon cultivos de expresión de 10 mL en medio LB líquido con W3110 pGF119 (A) o BL21(De3) pGF121 (B). Los cultivos posteriores a la inducción se cultivaron durante toda la noche a 20 °C, se cosecharon muestras de 1 mL y las extracciones periplásmicas se siguieron mediante detección por transferencia Western. 1) cepa de fondo sin el vector de expresión; 2) W3l10 pGF119 clon # 1; 3) W3110 pGF119 clon # 2; 4) W3110 pGF119 clon # 3; C) 250 ng del Fab control.
Figura 7. Resultados de la optimización del promotor para la expresión del Fab. Se prepararon cultivos de expresión de 10 mL en medio LB líquido con W3110 pGF132 en tres temperaturas diferentes después de la inducción; A) 20 °C; B) 28 °C y C) 37 °C. Se usaron diferentes concentraciones de ramnosa para la inducción: 1) rha 0; 2) rha 0,25 mM; 3) rha 1 mM; 4) rha 4 mM; 5) rha 8 mM. C = 100 ng del fab control. Los cultivos posteriores a la inducción se cultivaron 4 horas a las temperaturas indicadas, se cosecharon muestras de 1 mL y se realizaron extracciones periplásmicas seguidas de la detección por transferencia Western.
Figura 8. Comparación de la configuración de promotor dicistrónico con respecto a la configuración dual. pGF119 y pGF121 son dicistrónicos, pGF120 y pGF131 son vectores con promotores duales. 1) control no inducido 2) W3110 pGF119#1 3) W3110 pGF119#2 4) W3110 pGF120 no inducido 5) W3110 pGF120#1 6) W3110 pGF120#2 7) Lemo21(De3) pGF131#1 8) Lemo21(De3) pGF131#2 9) Lemo21(De3) pGF121#1 10) BL21(De3) pGF131#1 11) BL21(De3) pGF131#2 C) 100 ng del fab control.
Figura 9. Expresión del Fab anti-EGFR1 en E. coli Lemo21(De3) y BL21(De3) con chaperonas periplásmicas SKP (pGF134) y SKP/FkpA (pGF135). Los cultivos de Lemo21(De3) se realizaron mediante el uso de la característica de la cepa incorporada, que permite la regulación precisa con ramnosa. Carril 1) Lemo21(De3) pGF131 2) Lemo21(De3) pGF131 pGF1343) Lemo21(De3) pGF131 pGF1354) BL21(De3) pGF131 5) BL21(De3) pGF131 pGF1346) BL21(De3) pGF131 pGF135 C) control Fab 100 ng. A 28 °C con 250 uM de ramnosa, Lemo21(De3) pGF131 pGF134 y - pGF135 (carriles 2 y 3) produjeron una cantidad claramente aumentada del Fab anti-EGFR1 en comparación con Lemo21(De3) pGF131 (carril 1). En 20 °C, BL21(De3) pGF131 pGF134 y - pGF135 (carriles 5 y 6) produjeron una cantidad claramente aumentada del Fab anti-EGFR1 en comparación con BL21(De3) pGF131 (carril 4).
Figura 10. Análisis de Transferencia Western del Fab anti-EGFR1 expresado en el periplasma. Carril 1) Marcador de Peso Molecular; Carril 2) proteína control Fab anti-EGFR1, 100 ng; Carril 3) Vacío; Carril 4) muestra de pellet de células de preinducción; Carril 5) muestra de pellet de células 4 horas después de la inducción; Carril 6) muestra de pellet de células 16 horas después de la inducción; Carriles 7-9) Vacío; Carril 10) muestra de sobrenadante de cultivo de preinducción; Carril 11) muestra de sobrenadante de cultivo 4 horas después de la inducción; Carril 12) muestra de sobrenadante de cultivo 16 horas después de la inducción. Todas las muestras representaron 10 pl del cultivo de suspensión del fermentador. La concentración del Fab anti-EGFR1 en el extracto periplásmico de células de E. coli cultivadas en fermentador se estimó mediante la comparación de la intensidad de las bandas en la muestra de pellet de células 16 horas después de la inducción (Carril 6) con la intensidad de la banda del Fab anti-EGR1 control en el carril 2 (100 ng). Se estimó que el carril 6 contenía 300 ng del Fab anti-EGR1: 300 ng/10 pL = 30 mg/L.
Figura 11. Cromatograma de extracto periplásmico purificado por HiTrap SP FF. Las fracciones A5-A10 se agruparon para etapas de purificación adicionales.
Figura 12. Cromatograma de la muestra de purificada por Proteína L. Las fracciones A5-A7 se agruparon.
Figura 13. Análisis de SDS-PAGE del Fab anti-EGFR1 purificado. Las muestras se cargaron en cantidades iguales (24 pL). Carril 1) Marcador de Peso Molecular; Carril 2) Fab anti-EGFR1 derivado de la digestión con papaína; Carril 3) 10 % de la muestra del Fab producido en E. coli; Carril 4) 40 % de la muestra del Fab producido en E. coli. En los carriles 3 y 4 se separaron las bandas LC (superior) y HC (inferior). En el carril 2, el Fab está glicosilado y LC y HC no pueden separarse.
Figura 14. Unión del Fab anti-EGFRI (panel superior) o Fab BSH-dextrano (panel inferior) al EGFR1 en portaobjetos de microarreglos.
Descripción detallada
La invención está definida por las reivindicaciones. Cualquier tema que quede fuera del alcance de las reivindicaciones se proporciona solo con fines informativos. Cualquier referencia en la descripción a los métodos de tratamiento se refiere a los compuestos, composiciones farmacéuticas y medicamentos de la presente invención para usar en un método para el tratamiento del cuerpo humano o animal mediante terapia. La presente invención se refiere a un conjugado que comprende un anticuerpo anti-EGFR1 o un fragmento de unión al EGFR1 de este, y al menos un derivado del dextrano, en donde
el derivado del dextrano comprende al menos una unidad D-glucopiranosilo, en donde al menos un carbono seleccionado del carbono 2, 3 o 4 de la al menos una unidad D-glucopiranosilo se sustituye por un sustituyente de la fórmula
-O-(CH2)n-S-B12H112'
en donde n está en el rango de 3 a 10; y
el derivado del dextrano se une al anticuerpo anti-EGFR1 o un fragmento de unión al EGFR1 de este, a través de un enlace formado por una reacción entre al menos un grupo aldehído formado por escisión oxidativa de una unidad D-glucopiranosilo del derivado del dextrano y un grupo amino del anticuerpo anti-EGFR1 o un fragmento de unión al EGFR1 de este.
El conjugado es adecuado para usar en la terapia de captura de neutrones de boro. La "terapia de captura de neutrones de boro" (BNCT) debe entenderse como una radioterapia dirigida, en donde el boro-10 no radiactivo se irradia con neutrones térmicos de baja energía para producir partículas alfa biológicamente destructivas y núcleos de litio-7. El boro-10 no radioactivo puede dirigirse mediante su incorporación en un fármaco de localización tumoral tal como un conjugado de localización tumoral.
"EGFR1" en la presente descripción debe entenderse que se refiere al receptor 1 del factor de crecimiento epidérmico humano (EGFR1) que tiene una secuencia establecida en la SEQ ID NO: 1.
Debe entenderse que "anticuerpo anti-EGFR1" se refiere a un anticuerpo que se une específicamente al EGFR1. El término "unión específica" se refiere a la capacidad del anticuerpo para discriminar entre el EGFR1 y cualquier otra proteína en la medida en que, a partir de un conjunto de una pluralidad de proteínas diferentes como posibles parejas de unión, solo el EGFR1 se une o se une significativamente. Como ejemplos solamente, las mediciones cinéticas y/o de unión específicas pueden analizarse, por ejemplo, mediante el uso de los métodos basados en resonancia de plasmón superficial en un equipo Biacore, mediante métodos inmunológicos tales como ELISA o, por ejemplo, microarreglos de proteínas.
Debe entenderse que "un fragmento de unión al EGFR1 de este" se refiere a cualquier fragmento de un anticuerpo anti-EGFR1 que es capaz de unirse específicamente al EGFR1.
En una modalidad, el anticuerpo anti-EGFR1 es cetuximab, imgatuzumab, matuzumab, nimotuzumab, necitumumab, panitumumab, o zalutumumab.
En una modalidad, el anticuerpo anti-EGFR1 es cetuximab.
En una modalidad, el cetuximab tiene una secuencia establecida en las SEQ ID NOs: 2 y 3.
En una modalidad, el cetuximab comprende o consiste en las secuencias establecidas en las SEQ ID NOs: 2 y 3.
En una modalidad, el anticuerpo anti-EGFR1 es nimotuzumab.
En una modalidad, el nimotuzumab tiene una secuencia establecida en las SEQ ID NOs: 4 y 5.
En una modalidad, el nimotuzumab comprende o consiste en las secuencias establecidas en las SEQ ID NOs: 4 y 5.
Un anticuerpo anti-EGFR1 puede ser, por ejemplo, un scFv, un anticuerpo de dominio único, un Fv, un anticuerpo VHH, un diacuerpo, un diacuerpo en tándem, un Fab, un Fab', un F(ab')2, un Db, un dAb-Fc, un taFv, un scDb, un dAb2, un DVD-Ig, un Bs(scFv)4-IgG, un taFv-Fc, un scFv-Fc-scFv, un Db-Fc, un scDb-Fc, un scDb-CH3, o un dAb-Fc-dAb. Además, el anticuerpo anti-EGFR1 o un fragmento de unión al EGFR1 de este, puede estar presente en formas monovalentes monoespecíficas, multivalentes monoespecíficas, bivalentes monoespecíficas, o multivalentes multiespecíficas.
En una modalidad, el anticuerpo anti-EGFRI es un anticuerpo humano o un anticuerpo humanizado. En este contexto, el término "anticuerpo humano", como se usa comúnmente en la técnica, debe entenderse que significa anticuerpos que tienen regiones variables en las que tanto el marco como las regiones determinantes de complementariedad (CDR) se derivan de secuencias de origen humano. En este contexto, el término "anticuerpo humanizado", como se usa comúnmente en la técnica, debe entenderse que significa anticuerpos en donde los residuos de una CDR de un anticuerpo de origen humano se reemplazan por residuos de una CDR de una especie no humana (tales como ratón, rata o conejo) que tienen la especificidad, afinidad y capacidad convenientes.
En una modalidad, el fragmento de anticuerpo anti-EGFR1 comprende un fragmento Fab de cetuximab. En una modalidad, el fragmento Fab anti-EGFR1 tiene una secuencia establecida en las SEQ ID NOs: 6 y 3. En una modalidad, el fragmento Fab anti-EGFR1 comprende o consiste en una secuencia establecida en las SEQ ID NOs: 6 y 3.
En una modalidad, el anticuerpo anti-EGFR1 comprende un fragmento F(ab')2 de cetuximab. En una modalidad, el fragmento F(ab')2 anti-EGFR1 tiene una secuencia establecida en las SEQ ID NOs: 7 y 3. En una modalidad, el fragmento F(ab')2 anti-EGFR1 comprende o consiste en una secuencia establecida en las SEQ ID NOs: 7 y 3.
Debe entenderse que "dextrano" se refiere a un glucano ramificado compuesto de cadenas de diferentes longitudes, en donde la cadena lineal consiste en enlaces glicosídicos a-1,6 entre las unidades de D-glucopiranosilo. Las ramificaciones se unen mediante enlaces glicosídicos a-1,3 y, en menor medida, mediante enlaces glicosídicos a-1,2 y/o a-1,4. Una porción de una cadena lineal de una molécula de dextrano se representa en la representación esquemática más abajo.
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Debe entenderse que "unidad de D-glucopiranosilo" se refiere a una sola molécula de D-glucopiranosilo. Por lo tanto, dextrano comprende una pluralidad de unidades de D-glucopiranosilo. En el dextrano, cada unidad de D-glucopiranosilo se une al menos a otra unidad de D-glucopiranosilo a través de un enlace glicosídico a-1,6, a través de un enlace glicosídico a-1,3 o a través de ambos.
Cada unidad de D-glucopiranosilo del dextrano comprende 6 átomos de carbono, que se enumeran del 1 al 6 en la representación esquemática más abajo. La representación esquemática muestra una sola unidad de D-glucopiranosilo unida a otras dos unidades de D-glucopiranosilo (no mostradas) a través de enlaces glicosídicos a-1,6.
Los carbonos 2, 3 y 4 pueden contener grupos hidroxilo libres. En las unidades de D-glucopiranosilo unidas a una segunda unidad de D-glucopiranosilo a través de un enlace glicosídico a-1,3, en donde el carbono 3 de la unidad de D-glucopiranosilo se une mediante un enlace éter al carbono 1 de la segunda unidad de D-glucopiranosilo, los carbonos 2 y 4 pueden sustituirse por grupos hidroxilo libres. En las unidades D-glucopiranosilo unidas a una segunda unidad D-glucopiranosilo a través de un enlace glicosídico a-1,2 o a-1,4, en donde el carbono 2 o 4 de la unidad D-glucopiranosilo se une a través de un enlace éter al carbono 1 de la segunda unidad de D-glucopiranosilo, los carbonos 3 y 4 o 2 y 3, respectivamente, pueden sustituirse por grupos hidroxilo libres.
La nomenclatura de los carbohidratos está esencialmente de acuerdo con las recomendaciones de la Comisión IUPAC-IUB de Nomenclatura Bioquímica (por ejemplo, Carbohydrate Res. 1998, 312, 167; Carbohydrate Res. 1997, 297, 1; Eur. J. Biochem. 1998, 257, 293).
El término "derivado del dextrano" debe entenderse como que se refiere al dextrano, en donde al menos un carbono seleccionado del carbono 2, 3 o 4 de la al menos una unidad D-glucopiranosilo se sustituye por un sustituyente de la fórmula
-O-(CH2)n-S-B12H112'
en donde n está en el rango de 3 a 10; y
el derivado del dextrano se une al anticuerpo anti-EGFR1 o un fragmento de unión al EGFR1 de este, a través de un enlace formado por una reacción entre al menos un grupo aldehido formado por escisión oxidativa de una unidad D-glucopiranosilo del derivado del dextrano y un grupo amino del anticuerpo anti-EGFR1 o un fragmento de unión al EGFR1 de este. El derivado del dextrano puede contener otras modificaciones de la estructura básica del dextrano, por ejemplo, como se describe más abajo.
Debe entenderse que “BSH”, “B12H11-SH” y “Na2B12HnSH” se refieren al borocaptato de sodio, conocido además como mercaptododecaborato de sodio y sulfuro de hidruro de boro. “B12H112'” se refiere, por lo tanto, a la porción hidruro de boro del BSH.
Uno o más, es decir, uno, dos o tres carbonos seleccionados de los carbonos 2, 3 y 4 de la al menos una unidad D-glucopiranosilo pueden sustituirse por un sustituyente de la fórmula -O-(CH2)n-S-B^Hn '.
En una modalidad, n es 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10. En una modalidad, n está en el rango de 3 a 4, o en el rango de 3 a 5, o en el rango de 3 a 6, o en el rango de 3 a 7, o en el rango de 3 a 8, o en el rango de 3 a 9.
Las unidades D-glucopiranosilo del dextrano pueden escindirse mediante la escisión oxidativa de un enlace entre dos carbonos adyacentes sustituidos por un grupo hidroxilo. La escisión oxidativa escinde dioles vecinales, es decir, unidades de D-glucopiranosilo en las que dos grupos hidroxilo (libres) ocupan posiciones vecinales. Las unidades de D-glucopiranosilo en las que los carbonos 2, 3 y 4 contienen grupos hidroxilo libres pueden dividirse oxidativamente entre los carbonos 2 y 3 o los carbonos 3 y 4. Por lo tanto, un enlace seleccionado del enlace entre los carbonos 2 y 3 y el enlace entre los carbonos 3 y 4 pueden escindirse oxidativamente. Las unidades D-glucopiranosilo del dextrano pueden escindirse por escisión oxidativa mediante el uso de un agente oxidante tal como el periodato de sodio, ácido periódico y acetato de plomo (IV), o cualquier otro agente oxidante capaz de escindir oxidativamente los dioles vecinales.
La escisión oxidativa de una unidad de D-glucopiranosilo forma dos grupos aldehido, un grupo aldehido en cada extremo de la cadena formado por la escisión oxidativa. En el conjugado, los grupos aldehido pueden ser, en principio, grupos aldehido libres. Sin embargo, la presencia de grupos aldehido libres en el conjugado es, típicamente, inconveniente. Por lo tanto, los grupos aldehído libres pueden estar protegidos o hacerse reaccionar con un grupo amino del anticuerpo anti-EGFR1 o un fragmento de unión al EGFR1 de este, o por ejemplo con una molécula de trazabilidad.
El derivado del dextrano se une al anticuerpo anti-EGFR1 o un fragmento de unión al EGFR1 de este, a través de un enlace formado por una reacción entre al menos un grupo aldehido formado por escisión oxidativa de una unidad D-glucopiranosilo del derivado del dextrano y un grupo amino del anticuerpo anti-EGFR1 o un fragmento de unión al EGFR1 de este.
El derivado del dextrano puede unirse, además, al anticuerpo anti-EGFR1 o un fragmento de unión al EGFR1 de este, a través de un grupo formado por una reacción entre al menos un grupo aldehido formado por escisión oxidativa de una unidad D-glucopiranosilo del derivado del dextrano y un grupo amino del anticuerpo anti-EGFR1 o un fragmento de unión al EGFR1 de este.
El grupo aldehido formado por escisión oxidativa reacciona fácilmente con un grupo amino en solución, tal como una solución acuosa. Sin embargo, el grupo o enlace resultante formado puede variar y no siempre puede predecirse y/o caracterizarse fácilmente. La reacción entre al menos un grupo aldehido formado por escisión oxidativa de una unidad D-glucopiranosilo del derivado del dextrano y un grupo amino del anticuerpo anti-EGFR1 o un fragmento de unión al EGFR1 de este, puede resultar, por ejemplo, en la formación de una base de Schiff. Por lo tanto, el grupo a través del cual el derivado del dextrano se une al anticuerpo anti-EGFR1 o un fragmento de unión al EGFR1 de este, puede ser, por ejemplo, una base de Schiff (imina) o una base de Schiff reducida (amina secundaria).
En una modalidad, el derivado del dextrano tiene una masa molecular en el rango de aproximadamente 3 a aproximadamente 2000 kDa. En este contexto, debe entenderse que la masa molecular del derivado del dextrano incluye la masa molecular del derivado del dextrano que contiene el dextrano y sus sustituyentes, pero no la masa molecular del anticuerpo anti-EGFR1 o un fragmento de unión al EGFR1 de este. En una modalidad, el derivado del dextrano tiene una masa molecular en el rango de aproximadamente 30 a aproximadamente 300 kDa.
En una modalidad, el conjugado comprende de aproximadamente 10 a aproximadamente 300, o de aproximadamente 20 a aproximadamente 150 sustituyentes de la fórmula -O-(CH2)n-S-B12H1i .
En una modalidad, el conjugado comprende aproximadamente 300 átomos de boro (300B), aproximadamente 800 átomos de boro (800B), aproximadamente 900 átomos de boro (900B), o aproximadamente 1200 átomos de boro. Por ejemplo, "900B" se refiere a un conjugado que porta por un mol de proteína un mol de dextrano, que transporta aproximadamente 900 moles de átomos de boro en moléculas BSH.
El anticuerpo anti-EGFR1 o un fragmento de unión al EGFR1 de este, contiene típicamente, al menos un grupo amino, tal como un grupo amino N-terminal y/o el grupo amino de un residuo de lisina.
En una modalidad, el grupo amino del anticuerpo anti-EGFR1 o un fragmento de unión al EGFR1 de este, es el grupo amino de un residuo de lisina del anticuerpo anti-EGFR1 o un fragmento de unión al EGFR1 de este.
En una modalidad, el conjugado comprende, además, al menos una molécula de trazabilidad unida al derivado del dextrano o al anticuerpo anti-EGFR1 o un fragmento de unión al EGFR1 de este.
"Molécula de trazabilidad" se refiere a una molécula detectable. Tal molécula detectable puede ser, por ejemplo, un radioisótopo, tal como 14C, un compuesto que comprende un radioisótopo, un radionúclido, un compuesto que comprende un radionúclido, una molécula marcadora fluorescente (tal como FITC, TRITC, los colorantes Alexa y Cy, etcétera), un quelante, tal como DOTA (ácido 1,4,7,10-tetraazaciclododecano-1,4,7,10-tetraacético), o una molécula activa de MRI, tal como gadolinio-DTPA (pentacetato de gadolinio-dietilentriamina). Los procedimientos para lograr la unión de la molécula de trazabilidad al derivado del dextrano o al anticuerpo anti-EGFR1 o un fragmento de unión al EGFR1 de este, son bien conocidos en la técnica. Una molécula de trazabilidad puede permitir localizar el conjugado después de que se haya administrado a un paciente y de dirigirse a células específicas; de esta manera, es posible dirigir la irradiación de neutrones térmicos de baja energía a la localización del conjugado dirigido.
En una modalidad, la molécula de trazabilidad se une al derivado del dextrano a través de un enlace o un grupo formado por una reacción entre al menos un grupo aldehído formado por escisión oxidativa de una unidad D-glucopiranosilo del derivado del dextrano y un grupo de la molécula de trazabilidad. Un grupo adecuado de la molécula de trazabilidad puede ser, por ejemplo, un grupo amino.
Es posible que uno o más grupos aldehído formados por escisión oxidativa de una unidad D-glucopiranosilo del derivado del dextrano no reaccionen con un grupo amino del anticuerpo anti-EGFR1 o un fragmento de unión al EGFR1 de este, o con una molécula de trazabilidad.
En una modalidad, el derivado del dextrano comprende al menos un grupo aldehído formado por escisión oxidativa de una unidad D-glucopiranosilo del derivado del dextrano que está protegido.
El al menos un grupo aldehído puede protegerse por un grupo adecuado, tal como una base reducida de Schiff.
El al menos un grupo aldehído puede protegerse, además, por un grupo formado por una reacción entre el al menos un grupo aldehído y un agente de protección hidrófilo, tal como etanolamina, lisina, glicina o Tris.
En una modalidad, la etanolamina comprende 14C.
La protección puede estabilizarse mediante el uso de un agente reductor, tal como NaCNBH3. Por lo tanto, puede formarse un grupo de protección tal como una base de Schiff reducida.
En una modalidad, el derivado del dextrano comprende al menos un grupo aldehído formado por escisión oxidativa de una unidad D-glucopiranosilo del derivado del dextrano que no reacciona con un grupo amino del anticuerpo anti-EGFR1 o un fragmento de unión al EGFR1 de este, o con una molécula de trazabilidad y la que está protegido.
En una modalidad, esencialmente todos los grupos aldehído formados por escisión oxidativa de una o más unidades D-glucopiranosilo del derivado del dextrano están protegidos.
En una modalidad, el derivado del dextrano comprende una pluralidad de grupos aldehido formados por escisión oxidativa de una unidad D-glucopiranosilo del derivado del dextrano, en donde esencialmente todos los grupos aldehído formados por escisión oxidativa de una o más unidades D-glucopiranosilo del derivado del dextrano están protegidos. En una modalidad, al menos un carbono seleccionado del carbono 2, 3 o 4 de al menos una unidad D-glucopiranosilo del derivado del dextrano se sustituye por un sustituyente de la fórmula
-O-(CH2)mCH=CH2
en donde m está en el rango de 1 a 8. Si bien tal modalidad es, típicamente, inconveniente, puede ocurrir como un producto secundario, cuando dicho sustituyente no ha reaccionado con BSH.
En una modalidad, el conjugado puede obtenerse mediante un método que comprende las etapas de:
a) alquenilar al menos un grupo hidroxilo del dextrano para obtener dextrano alquenilado;
b) hacer reaccionar borocaptato de sodio (BSH) con el dextrano alquenilado que se obtiene de la etapa a) para obtener BSH-dextrano;
c) escindir oxidativamente al menos un residuo D-glucopiranosilo del BSH-dextrano de manera que se formen grupos aldehído;
d) hacer reaccionar el BSH-dextrano escindido oxidativamente que se obtiene de la etapa c) con un anticuerpo anti-EGFR1 o un fragmento de unión al EGFR1 de este, para obtener un conjugado.
La presente invención se refiere, además, a un conjugado que se obtiene mediante un método que comprende las etapas de:
a) alquenilar al menos un grupo hidroxilo del dextrano para obtener dextrano alquenilado;
b) hacer reaccionar borocaptato de sodio (BSH) con el dextrano alquenilado que se obtiene de la etapa a) para obtener BSH-dextrano;
c) escindir oxidativamente al menos un residuo D-glucopiranosilo del BSH-dextrano de manera que se formen grupos aldehído;
d) hacer reaccionar el BSH-dextrano escindido oxidativamente que se obtiene de la etapa c) con un anticuerpo anti-EGFR1 o un fragmento de unión al EGFR1 de este, para obtener un conjugado.
En una modalidad, el dextrano tiene una masa molecular en el rango de aproximadamente 3 a aproximadamente 2000 kDa, o de aproximadamente 10 a aproximadamente 100 kDa, o de aproximadamente 5 a aproximadamente 200 kDa, o de aproximadamente 10 a aproximadamente 250 kDa. El dextrano que tiene una masa molecular en dicho rango debe entenderse que se refiere al dextrano que no se ha sometido a las etapas a)-d).
En este contexto, el término "alquenilación" o "alquenilante" debe entenderse que se refiere a la transferencia de un grupo alquenilo a una unidad D-glucopiranosilo del dextrano para dar un éter alquenílico. En otras palabras, al menos un grupo hidroxilo de la unidad D-glucopiranosilo del dextrano se convierte en un grupo alqueniloxi.
En la etapa a), uno o más de los grupos hidroxilo unidos a los carbonos 2, 3 o 4 de al menos una unidad D-glucopiranosilo del dextrano pueden reaccionar en la reacción de alquenilación. Una o más, o una pluralidad, de unidades de D-glucopiranosilo del dextrano pueden estar alqueniladas.
En una modalidad, el dextrano se alquenila en la etapa a) mediante el uso de un agente alquenilante, en donde el agente alquenilante tiene una estructura de acuerdo con la fórmula
X-(CH2)mCH=CH2
en donde m está en el rango de 1 a 8, y X es Br, Cl, o I.
En una modalidad, m es 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8. En una modalidad, m está en el rango de 1 a 2, o en el rango de 1 a 3, o en el rango de 1 a 4, o en el rango de 1 a 5, o en el rango de 1 a 6, o en el rango de 1 a 7.
En una modalidad, el agente alquenilante es bromuro de alilo.
En una modalidad, al menos un carbono seleccionado del carbono 2, 3 o 4 de al menos una unidad D-glucopiranosilo del dextrano alquenilado que se obtiene de la etapa a) se sustituye por un sustituyente de la fórmula -O-(CH2)mCH=CH2,
en donde m está en el rango de 1 a 8.
En una modalidad, m es 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8. En una modalidad, m está en el rango de 1 a 2, o en el rango de 1 a 3, o en el rango de 1 a 4, o en el rango de 1 a 5, o en el rango de 1 a 6, o en el rango de 1 a 7.
En la etapa b), el grupo sulfidrilo del BSH puede reaccionar con un grupo alquenilo del dextrano alquenilado para formar BSH-dextrano para dar un tioéter. Una o más moléculas de BSH pueden reaccionar con el dextrano alquenilado. Por lo tanto, el BSH-dextrano que se obtiene de la etapa b) puede contener una pluralidad de porciones BSH (es decir, grupos de la fórmula -S-B12H112"). Los grupos sulfidrilo del b Sh pueden reaccionar con grupos alquenilo de una sola unidad D-glucopiranosilo alquenilada que contiene más de un grupo alquenilo o con grupos alquenilo de dos o más unidades D-glucopiranosilo alqueniladas.
Por lo tanto, el BSH-dextrano que se obtiene de la etapa b) puede ser un derivado del dextrano en el que al menos un carbono seleccionado del carbono 2, 3 o 4 de la al menos una unidad D-glucopiranosilo se sustituye por un sustituyente de la fórmula
-O-(CH2)n-S-B12Hn2'
en donde n está en el rango de 3 a 10.
En una modalidad, el BSH-dextrano que se obtiene a partir de la etapa b) comprende de aproximadamente 10 a aproximadamente 100 o de aproximadamente 20 a 100 sustituyentes o de aproximadamente 10 a aproximadamente
300 o de aproximadamente 20 a aproximadamente 150 de la fórmula -O-(CH2)n-S-B12Hn2', en donde n está en el rango de 3 a 10.
En una modalidad, el BSH se hace reaccionar con el dextrano alquenilado que se obtiene de la etapa a) en presencia de un iniciador radical en la etapa b). El iniciador radical es capaz de catalizar la reacción entre el grupo o los grupos sulfidrilo del BSH y con el grupo o los grupos alquenilo del dextrano alquenilado.
En este contexto, "iniciador radical" debe entenderse como un agente capaz de producir especies radicales en condiciones suaves y promover reacciones radicales. El término "iniciador radical" puede referirse, además, a la luz UV (ultravioleta). La irradiación con luz UV es capaz de generar radicales, por ejemplo, en presencia de un fotoiniciador adecuado. Los iniciadores radicales adecuados incluyen, pero no se limitan a, peróxidos inorgánicos tales como persulfato de amonio o persulfato de potasio, peróxidos orgánicos, y luz UV.
En una modalidad, el BSH se hace reaccionar con el dextrano alquenilado que se obtiene de la etapa a) en presencia de un iniciador radical seleccionado del grupo que consiste en persulfato de amonio, persulfato de potasio y luz UV en la etapa b).
En la etapa b), la relación en peso o la relación molar del BSH con respecto al dextrano alquenilado que se obtiene de la etapa a) puede seleccionarse adecuadamente para obtener conjugados en los que el número de porciones del BSH (es decir, el número de sustituyentes de la fórmula -O-(CH2)n-S-B-i2H112') por porciones del dextrano (del derivado del dextrano) varía. El número de porciones del BSH por porciones del dextrano del BSH-dextrano puede medirse, por ejemplo, mediante resonancia magnética nuclear como se describió en el Ejemplo 2, o por espectrometría de masas de plasma acoplado inductivamente (ICP-MS) como se describió en el Ejemplo 9.
En una modalidad, la relación del BSH con respecto al dextrano alquenilado presente en la etapa b) está en el rango de
1:5 a 2:1, o en el rango de 1:4 a 1:1 en peso, o en el rango de 1:2 a 3:4 en peso. Típicamente, cuanto mayor es la relación del BSH con respecto al dextrano alquenilado, mayor es el número de porciones del BSH por porciones del dextrano del BSH-dextrano.
La relación del iniciador radical, tal como el persulfato de amonio o el persulfato de potasio, puede variar, además, en la etapa b). En una modalidad, la relación del iniciador radical con respecto al BSH y/o al dextrano presente en la etapa b) está en el rango de 1:5 a 2:1, o en el rango de 1:4 a 1:1 en peso, o en el rango de 1:2 a 3:4 en peso.
En una modalidad, la relación del iniciador radical con respecto al dextrano alquenilado en la etapa b) está en el rango de 1:5 a 2:1, o en el rango de 1:4 a 1:1 en peso, o en el rango de 1:2 a 3:4 en peso.
Como se describió anteriormente, un enlace seleccionado del enlace entre los carbonos 2 y 3 y el enlace entre los carbonos 3 y 4 puede escindirse oxidativamente en la etapa c). En la escisión oxidativa, el anillo D-glucopiranosilo se abre entre dioles vecinales, dejando dos grupos aldehído. Los grupos aldehído del BSH-dextrano escindido oxidativamente que se obtiene de la etapa c) pueden reaccionar con un anticuerpo anti-EGFR1 o un fragmento de unión al EGFR1 de este, para obtener un conjugado. Los grupos aldehido pueden reaccionar con un grupo adecuado tal como un grupo amino.
El al menos un residuo de D-glucopiranosilo del BSH-dextrano puede, en principio, escindirse oxidativamente mediante el uso de cualquier agente oxidante capaz de escindir oxidativamente la unidad de D-glucopiranosilo entre dos carbonos vecinales sustituidos por grupos hidroxilo libres. El agente oxidante puede seleccionarse, además, de manera que esencialmente escinde oxidativamente específicamente el al menos un residuo D-glucopiranosilo del BSH-dextrano. Tal agente oxidante puede no oxidar otros grupos o porciones del BSH-dextrano.
En una modalidad, el al menos un residuo D-glucopiranosilo del BSH-dextrano se escinde oxidativamente en la etapa c) mediante el uso de un agente oxidante seleccionado del grupo que consiste en periodato de sodio, ácido periódico y acetato de plomo (IV).
En una modalidad, el al menos un residuo de D-glucopiranosilo del BSH-dextrano se escinde oxidativamente en la etapa c) en una solución acuosa.
En una modalidad, el método comprende, además, la etapa de hacer reaccionar el BSH-dextrano escindido oxidativamente que se obtiene de la etapa c) o el conjugado que se obtiene de la etapa d) con una molécula de trazabilidad.
En este contexto, la molécula de trazabilidad puede ser cualquier molécula de trazabilidad descrita en este documento. La molécula de trazabilidad puede reaccionar con al menos un grupo aldehído del BSH-dextrano escindido oxidativamente que se obtiene de la etapa c). Un grupo adecuado de la molécula de trazabilidad que puede reaccionar con el al menos un grupo aldehído puede ser, por ejemplo, un grupo amino.
En una modalidad, el método comprende, además, la etapa e) de proteger los grupos aldehído sin reaccionar del BSH-dextrano escindido oxidativamente que se obtiene de la etapa c) o el conjugado que se obtiene de la etapa d).
En una modalidad, los grupos aldehído sin reaccionar se protegen mediante el uso de un agente de protección hidrófilo, tal como etanolamina, lisina, glicina o Tris.
En una modalidad, el agente de protección hidrófilo se selecciona del grupo que consiste en etanolamina, lisina, glicina y Tris.
En una modalidad, la etanolamina que comprende 14C es una molécula de trazabilidad.
En una modalidad, una o más etapas seleccionadas de las etapas a), b), c) y d) se realizan en una solución acuosa. Una solución acuosa adecuada puede ser, por ejemplo, un tampón fosfato acuoso que tiene un pH de aproximadamente 6 a 8.
En una modalidad, todas las etapas a)-d) se realizan en una solución acuosa.
El anticuerpo anti-EGFR1 o un fragmento de unión al EGFR1 de este, contiene, típicamente, al menos un grupo amino, tal como el grupo amino N-terminal y/o el grupo amino de un residuo de lisina. En la etapa d), los grupos aldehído del BSH-dextrano escindido oxidativamente que se obtiene de la etapa c) pueden reaccionar, por lo tanto, con el al menos un grupo amino del anticuerpo anti-EGFR1 o un fragmento de unión al EGFR1 de este.
En una modalidad, el grupo amino del anticuerpo anti-EGFR1 o un fragmento de unión al EGFR1 de este, es el grupo amino de un residuo de lisina del anticuerpo anti-EGFR1 o un fragmento de unión al EGFR1 de este.
En una modalidad, el BSH-dextrano escindido oxidativamente se hace reaccionar con el anticuerpo anti-EGFR1 o un fragmento de unión al EGFR1 de este, mediante la incubación del BSH-dextrano escindido oxidativamente y el anticuerpo anti-EGFR1 o un fragmento de unión al EGFR1 de este, a temperatura ambiente en tampón fosfato acuoso que tiene un pH de aproximadamente 6 a 8, en la etapa d).
El conjugado puede purificarse, por ejemplo, mediante filtración en gel, por ejemplo, como se describió en el Ejemplo 4. Además, en la presente descripción se describe la producción de anticuerpos anti-EGFR1 o fragmentos de unión al EGFR1 de estos, en células huésped procariotas. En comparación con otros sistemas de producción de polipéptidos, las bacterias, particularmente E. coli, ofrecen muchas ventajas únicas. Las materias primas usadas (es decir, las células bacterianas) son económicas y fáciles de cultivar, lo que reduce el costo de los productos. Los huéspedes procariotas crecen mucho más rápido que, por ejemplo, las células de mamíferos, lo que permite un análisis más rápido de las manipulaciones genéticas. El tiempo de generación más corto y la facilidad del escalado, además, hacen que la fermentación bacteriana sea un medio más atractivo para la producción de proteínas en grandes cantidades. La estructura genómica y la actividad biológica de muchas especies bacterianas, que incluye E. coli, se han estudiado a profundidad y existe una amplia gama de vectores adecuados disponibles, lo que hace que la expresión de un anticuerpo deseable sea más conveniente. La expresión de anticuerpos o fragmentos de anticuerpos en sistemas procariotas puede realizarse en diferentes escalas. Los cultivos en frascos de agitación (en el intervalo de 2-5 litros), típicamente, generan menos de 5 mg/litro de los productos (por ejemplo, fragmento de anticuerpo) mientras que pueden obtenerse escalas de 50-300 mg/litro en los sistemas de fermentación.
Además, las células huésped procariotas pueden permitir la producción de anticuerpos anti-EGFR aglicosilados o fragmentos de unión al EGFR1 de estos.
En una modalidad, la célula huésped procariota comprende uno o más polinucleótidos codificantes de
i) una región variable de la cadena ligera y
ii) una región variable de cadena pesada
de un anticuerpo anti-EGFR1 o un fragmento de unión al EGFR1 de este. El término "uno o más polinucleótidos" puede referirse a dos o más polinucleótidos o moléculas de polinucleótidos que pueden o no unirse covalentemente, directa o indirectamente a través de una o más secuencias. Por ejemplo, los dos o más polinucleótidos pueden estar comprendidos en un casete de expresión o en un vector. Los dos o más polinucleótidos pueden, como ejemplo, fusionarse, directa o indirectamente, para codificar una proteína de fusión que comprende tanto la región variable de la cadena ligera como la región variable de la cadena pesada. Además, pueden estar comprendidos en dos casetes o vectores de expresión separados. El término "uno o más polinucleótidos" puede referirse, además, a una única molécula de polinucleótido continua que comprende uno o más polinucleótidos o tramos de polinucleótidos codificantes de la región variable de la cadena ligera y la región variable de la cadena pesada de un anticuerpo anti-EGFR1 o un fragmento de unión al EGFR1 de este.
En una modalidad, la célula huésped comprende un polinucleótido de acuerdo con una o más modalidades descritas en esta descripción codificante de un anticuerpo anti-EGFR1 o un fragmento de unión al EGFR1 de este. La célula huésped puede comprender uno o más polinucleótidos que codifican colectivamente el anticuerpo anti-EGFR1 o un fragmento de unión al EGFR1. Un vector puede ser de cualquier tipo, por ejemplo, un vector recombinante tal como un vector de expresión.
Puede usarse cualquiera de una variedad de células huésped procariotas.
En una modalidad, la célula huésped procariota es una célula de E. coli.
En una modalidad, el uno o más polinucleótidos codificantes de la región variable de la cadena ligera y de la región variable de la cadena pesada son optimizados por codones para la célula huésped, tal como una célula de E. coli. En una modalidad, la célula huésped procariota comprende un único polinucleótido continuo codificante de la región variable de la cadena ligera y de la región variable de la cadena pesada de un anticuerpo anti-EGFR1 o un fragmento de unión al EGFR1 de este. Tal polinucleótido continuo puede ser dicistrónico o policistrónico.
En una modalidad, la célula huésped procariota comprende un polinucleótido codificante de una región variable de cadena ligera de un anticuerpo anti-EGFR1 o un fragmento de unión al EGFR1 de este, y otro polinucleótido codificante de una región variable de cadena pesada de un anticuerpo anti-EGFR1 o un fragmento de unión al EGFR1 de este. En una modalidad, la región variable de la cadena ligera está precedida por un péptido señal. Por lo tanto, el polinucleótido codifica el péptido señal que precede a la región variable de la cadena ligera y la región variable de la cadena ligera. El péptido señal puede preceder inmediatamente a la región variable de la cadena ligera, o puede haber un tramo de secuencia entre el péptido señal y la región variable de la cadena ligera. El péptido señal puede seleccionarse del grupo que consiste en gIII, malE, phoA, ompA, pelB, stII, y stII. El péptido señal, además, puede seleccionarse del grupo que consiste en ompA, pelB, stII y stII. Estos péptidos señal pueden permitir rendimientos particularmente altos en la producción del anticuerpo o fragmento en una célula huésped procariota, tal como E. coli. En una modalidad, la región variable de la cadena pesada está precedida por un péptido señal. El péptido señal puede seleccionarse del grupo que consiste en gIII, malE, phoA, ompA, pelB, stII, y stII. El péptido señal, además, puede seleccionarse del grupo que consiste en ompA, pelB, stII, y stII.
En una modalidad, la región variable de la cadena ligera y la región variable de la cadena pesada están precedidas por un péptido señal.
En una modalidad, el péptido señal que precede a la región variable de la cadena ligera es diferente del péptido señal que precede a la región variable de la cadena pesada.
En una modalidad, el péptido señal que precede a la región variable de la cadena ligera y a la región variable de la cadena pesada se seleccionan independientemente del grupo que consiste en gIII, malE, phoA, ompA, pelB, stII, y stII. En una modalidad, el péptido señal que precede a la región variable de la cadena ligera y a la región variable de la cadena pesada se seleccionan independientemente del grupo que consiste en ompA, pelB, stII, y stII.
En una modalidad, el péptido señal que precede a la región variable de la cadena ligera es el mismo que el péptido señal que precede a la región variable de la cadena pesada, y en donde el péptido señal se selecciona del grupo que consiste en gIII, malE, phoA, ompA, pelB, stII, y stII.
En una modalidad, el péptido señal que precede a la región variable de la cadena ligera es el mismo que el péptido señal que precede a la región variable de la cadena pesada, y en donde el péptido señal se selecciona del grupo que consiste en ompA, pelB, stII, y stII.
En una modalidad, la región variable de la cadena ligera está precedida por el péptido señal pelB y la región variable de la cadena pesada está precedida por el péptido señal ompA.
En una modalidad, la región variable de la cadena ligera y la región variable de la cadena pesada están precedidas por el péptido señal stII.
En una modalidad, el polinucleótido comprende o consiste en la secuencia establecida en la SEQ ID NO: 8 y la secuencia establecida en la SEQ ID NO: 9.
En una modalidad, el polinucleótido comprende o consiste en la secuencia establecida en la SEQ ID NO: 8 o una secuencia que es al menos 90 %, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98, % o al menos 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 8, y la secuencia establecida en la SEQ ID NO: 9 o una secuencia que es al menos 90 %, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98, % o al menos 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 9. En una modalidad, el polinucleótido codificante de una región variable de cadena ligera comprende o consiste en la secuencia establecida en la SEQ ID NO: 8 y el polinucleótido codificante de una región variable de la cadena pesada comprende o consiste en la secuencia establecida en la SEQ ID NO: 9.
En una modalidad, el polinucleótido codificante de una región variable de la cadena ligera comprende o consiste en la secuencia establecida en la SEQ ID NO: 8, o una secuencia que es al menos 90 %, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, o al menos 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 8, y el polinucleótido codificante de una región variable de cadena pesada comprende o consiste en la secuencia establecida en la SEQ ID NO: 9, o una secuencia que es al menos 90 %, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, o al menos 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 9.
En una modalidad, la célula huésped procariota comprende uno o más polinucleótidos codificantes de
i) una cadena ligera y
ii) una cadena pesada de un fragmento de unión anti-EGFR1 de un anticuerpo.
En una modalidad, el uno o más polinucleótidos codifican un fragmento de unión anti-EGFR1 que es un Fab o un scFv. En una modalidad, el polinucleótido codificante de la cadena ligera comprende o consiste en la secuencia establecida en la SEQ ID NO: 10, y el polinucleótido codificante de la secuencia de cadena pesada comprende o consiste en la secuencia establecida en la SEQ ID NO: 11.
En una modalidad, el polinucleótido codificante de la cadena ligera comprende o consiste en la secuencia establecida en la SEQ ID NO: 10, o una secuencia que es al menos 90 %, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, o al menos 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 10, y el polinucleótido codificante de la secuencia de la cadena pesada comprende o consiste en la secuencia establecida en la SEQ ID NO: 11 o una secuencia que es al menos 90 %, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, o al menos 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 11. En una modalidad, el uno o más polinucleótidos comprenden o consisten en la secuencia de la cadena ligera establecida en la SEQ ID NO: 10 y la secuencia de cadena pesada establecida en la SEQ ID NO: 11.
En una modalidad, el uno o más polinucleótidos comprenden o consisten en la secuencia de la cadena ligera establecida en la SEQ ID NO: 10 o una secuencia que es al menos 90 %, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, o al menos 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 10, y la secuencia de la cadena pesada establecida en SEQ ID NO: 11 o una secuencia que es al menos 90 %, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, o al menos 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 11.
En una modalidad, la célula huésped comprende un polinucleótido que comprende o que consiste en la secuencia establecida en la SEQ ID NO: 12 o una secuencia que es al menos 90 %, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, o al menos 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 12.
En una modalidad, la célula huésped comprende un polinucleótido que comprende o que consiste en la secuencia establecida en la SEQ ID NO: 13 o una secuencia que es al menos 90 %, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, o al menos 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 13.
En una modalidad, la célula huésped comprende una proteína chaperona y/o uno o más polinucleótidos codificantes de una proteína chaperona. La proteína chaperona puede ser una proteína chaperona procariota, tal como las proteínas Dsb (DsbA, DsbB, DsbC, DsbD, FkpA y/o DsbG.
En una modalidad, la proteína chaperona se sobreexpresa en la célula huésped.
En una modalidad, la proteína chaperona es DsbA y/o DsbC.
En una modalidad, la proteína chaperona se selecciona del grupo que consiste en DnaK, DnaJ, GrpE, Skp, FkpA, GroEL, y GroES.
En una modalidad, la proteína chaperona es Skp.
El término "célula huésped procariota", como se usa en la presente descripción, pretende referirse a una célula procariota que se ha alterado genéticamente, o que puede alterarse genéticamente mediante la introducción de un polinucleótido exógeno, tal como un plásmido o vector recombinante. Debe entenderse que tales términos pretenden referirse no solo a la célula sujeto particular sino a la progenie de tal célula. Debido a que pueden producirse determinadas modificaciones en generaciones sucesivas debido a mutaciones o a influencias ambientales, tal progenie de hecho, puede no ser idéntica a la célula parental, pero aun así se incluye dentro del alcance del término "célula huésped procariota" como se usa en la presente descripción.
Las células huésped procarióticas se transfectan y se transforman, preferentemente, con los polinucleótidos descritos anteriormente codificantes del anticuerpo anti-EGFR1 o los fragmentos de unión al EGFR1 de estos, por ejemplo, en vectores de expresión o clonación y se cultivan en medios de nutrientes convencionales modificados según sea apropiado para inducir promotores, seleccionar los transformantes, o amplificar los genes codificantes del anticuerpo deseado o las secuencias de fragmentos de anticuerpos. Los promotores adecuados para usar con huéspedes procariotas incluyen el promotor PhoA, los sistemas de promotores de p-lactamasa y lactosa, un sistema de promotor de triptófano (trp) y promotores híbridos tales como el promotor tac o el trc. Sin embargo, otros promotores que son funcionales en bacterias (tales como otras bacterias conocidas) también son adecuados. Sus secuencias de nucleótidos se han publicado, lo que permite a un experto calificado ligarlas operativamente a cistrones codificantes de las cadenas ligeras y pesadas diana (Siebenlist y otros, (1980) Cell 20: 269) mediante el uso de conectores o adaptadores para proporcionar cualquier sitio de restricción requerido.
En una modalidad, el uno o más polinucleótidos son conducidos por, es decir, unidos operativamente a, un promotor seleccionado independientemente del grupo que consiste en T7, T5, y Rham.
En una modalidad, uno o más polinucleótidos son conducidos por el promotor T7.Las células huésped procariotas usadas para producir los anticuerpos anti-EGFR1 o los fragmentos de unión al EGFR1 de estos, pueden cultivarse como se describe generalmente en el manual de laboratorio “Molecular Cloning” (Michael Green and Joseph Sambrook; cuarta edición; Cold Spring Harbour Laboratory Press; 2012). Las células huésped procariotas adecuadas para expresar anticuerpos descritos en la presente descripción incluyen Archaebacteria y Eubacteria, tales como organismos gramnegativos o grampositivos. Los ejemplos de bacterias útiles incluyen Escherichia (por ejemplo, E. coli), Bacilos (por ejemplo, B. subtilis), Enterobacterias, especies de Pseudomonas (por ejemplo, P. aeruginosa), Salmonella typhimurium, Serratia marcescans, Klebsiella, Proteus, Shigella, Rhizobia, Vitreoscilla, o Paracoccus. En una modalidad, se usan células gramnegativas. En una modalidad, las células de E. coli se usan como huéspedes como se describió en la presente descripción. Los ejemplos de cepas de E. coli incluyen la cepa W3110 (Bachmann, Cellular and Molecular Biology, vol. 2 (Washington, dC: American Society for Microbiology, 1987), págs. 1190-1219; ATCC Deposito Núm.
27,325) y derivados de estas, que incluyen la cepa 33D3 que tiene el genotipo W3110AfhuA (AtonA) ptr3 lac Iq lacL8 Aomp TA(nmpc-fepE) degP41 kanR (patente de los EE.UU. núm. 5639635) y las cepas 63C1 y 64B4. Además, son adecuadas otras cepas y derivados de estas, tales como E. coli 294 (ATCC 31 446), E. coli B, E. coli, 1776 (ATCC 31 537) y E. coli RV308 (ATCC 31 608). Estos ejemplos son ilustrativos más que limitativos. En general, puede ser necesario seleccionar las bacterias apropiadas teniendo en cuenta la capacidad de replicación del replicón en las células de una bacteria. Por ejemplo, las especies de E. coli pueden usarse adecuadamente como el huésped cuando se usan plásmidos bien conocidos tales como pBR322, pBR325, pACYC 177, o pKN410 para proporcionar el replicón. Típicamente, la célula huésped puede secretar cantidades mínimas de enzimas proteolíticas, y pueden incorporarse, convenientemente, inhibidores de proteasa adicionales en el cultivo celular.
En una modalidad, la célula huésped es deficiente para una o más enzimas proteolíticas.
En una modalidad, la enzima proteolítica se selecciona del grupo que consiste en Proteasa III, OmpT, DegP, Tsp, Proteasa I, Proteasa Mi, Proteasa V, Proteasa VI, y Lon.
Después de la transformación, las células procariotas usadas para producir los anticuerpos anti-EGFR1 o los fragmentos de unión al EGFR1 de estos, se cultivan en medios conocidos en la técnica y adecuados para el cultivo de las células huéspedes seleccionadas. Los ejemplos de medios adecuados incluyen caldo Luria (LB), caldo Terrific (TB) y medios sintéticos Mínimos más suplementos nutritivos tales como extracto de levadura, hidrolizado de soja y otros hidrolizados vegetales. En algunas modalidades, los medios contienen, además, un agente de selección, que se escoge en función de la construcción del vector de expresión, para permitir selectivamente el crecimiento de las células procariotas que contienen el vector de expresión. Por ejemplo, la ampicilina se añade a los medios para el crecimiento de células que expresan el gen resistente a la ampicilina. Cualquier suplemento necesario, además de las fuentes de carbono, nitrógeno, y fosfato inorgánico, puede incluirse en concentraciones apropiadas, introducido solo o como una mezcla con otro suplemento o medio, tal como una fuente compleja de nitrógeno. Opcionalmente, el medio de cultivo puede contener uno o más agentes reductores seleccionados del grupo que consiste en glutatión, cisteína, cistamina, tioglicolato, ditioeritritol y ditiotreitol.
Las células huésped procariotas se cultivan a temperaturas adecuadas. Para el crecimiento de E. coli, por ejemplo, la temperatura preferida varía de aproximadamente 20°C a aproximadamente 39°C. El pH del medio puede ser cualquier pH que varíe de aproximadamente 5 a aproximadamente 9, principalmente en dependencia del organismo huésped. Para E. coli, el pH es, preferentemente, de aproximadamente 6,8 a aproximadamente 7,4, y con mayor preferencia de aproximadamente 7,0. Si se usa un promotor inducible en el vector de expresión, se induce la expresión de proteína del anticuerpo anti-EGFR1 o del fragmento de unión al EGFR1 en condiciones adecuadas para la activación del promotor. En una modalidad, el anticuerpo anti-EGFR1 o el fragmento de unión al EGFR1 de este, se secretan y se recuperan del periplasma de las células huéspedes procariotas. La recuperación de proteínas generalmente implica la ruptura del microorganismo, generalmente por medios tales como shock osmótico, sonicación o lisis. Una vez que las células se rompen, los restos celulares o las células completas pueden eliminarse mediante centrifugación o filtración. Las proteínas pueden purificarse adicionalmente, por ejemplo, mediante cromatografía de resina de afinidad o columnas de proteína L adecuadas para la purificación de fragmentos Fab. Alternativamente, las proteínas pueden transportarse a los medios de cultivo y aislarse a partir de estos. Las células pueden eliminarse del cultivo y el sobrenadante del cultivo puede filtrarse y concentrarse para la purificación adicional de las proteínas producidas. Los polipéptidos expresados pueden aislarse e identificarse adicionalmente mediante el uso de métodos comúnmente conocidos tales como electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE) y ensayo de transferencia Western.
En un aspecto, la producción del anticuerpo anti-EGFR1 o fragmento de unión al EGFR1 se realiza a gran escala mediante un proceso de fermentación. Diversos procedimientos de fermentación a gran escala en lotes alimentados están disponibles para la producción de proteínas recombinantes. Las fermentaciones a gran escala tienen al menos 500 litros de capacidad. Estos fermentadores usan impulsores agitadores para distribuir oxígeno y nutrientes, especialmente glucosa (la fuente preferida de carbono/energía). La fermentación a pequeña escala se refiere generalmente a la fermentación en un fermentador que no tiene más de aproximadamente 100 litros de capacidad volumétrica y puede variar de aproximadamente 1 litro a aproximadamente 100 litros.
En un proceso de fermentación, la inducción de la expresión de proteínas se inicia, típicamente, después que las células se han cultivado en condiciones adecuadas hasta lograr una densidad conveniente, por ejemplo, una OD550 de aproximadamente 180-220, etapa en que las células se encuentran en la fase estacionaria temprana. Pueden usarse una variedad de inductores, de acuerdo con la construcción del vector empleado, como se conoce en la técnica y se describió anteriormente. Las células pueden crecer durante períodos más cortos antes de la inducción. Las células generalmente se inducen durante aproximadamente 12-50 horas, aunque puede usarse un tiempo de inducción más largo o más corto.
Para mejorar el rendimiento de producción y la calidad del anticuerpo anti-EGFR1 o los fragmentos de unión al EGFR1, pueden modificarse diversas condiciones de fermentación. Por ejemplo, para mejorar el ensamblaje y el plegamiento correcto de los polipéptidos de los anticuerpos secretados, pueden usarse vectores adicionales que sobreexpresan proteínas chaperonas, tales como las proteínas Dsb (DsbA, DsbB, DsbC, DsbD, y/o DsbG), Skp o FkpA (un peptidilprolil cis, trans -isomerasa con actividad de chaperona) para co-transformar las células procariotas huéspedes. Se ha demostrado que las proteínas chaperonas facilitan el plegamiento y la solubilidad adecuados de las proteínas heterólogas producidas en las células huéspedes bacterianas. Chen y otros, (1999) J. Biol. Chem. 274:19601-19605; Georgiou y otros, patente de los EE.UU. núm. 6 083 715; Georgiou y otros, patente de los EE.UU. núm. 6 027 888; Bothmann y Pluckthun (2000) J. Biol. Chem. 275:17100-17105; Ramm y Pluckthun, (2000) J. Biol. Chem. 275:17106-17113; Arie y otros, (2001) Mol. Microbiol. 39: 199-210.
En una modalidad, las chaperonas tales como DnaK/DnaJ/GrpE, Skp, Skp/FkpA, GroEL/GroES se expresan en la célula huésped bacteriana tal como E. coli.
Para minimizar la proteólisis del anticuerpo anti-EGFR1 o los fragmentos de unión al EGFR1 expresados (especialmente aquellos que son sensibles proteolíticamente), pueden usarse determinadas cepas huésped deficientes en enzimas proteolíticas. Por ejemplo, las cepas de la célula huésped pueden modificarse para efectuar mutaciones genéticas en los genes codificantes de proteasas bacterianas conocidas tales como Proteasa III, OmpT, DegP, Tsp, Proteasa I, Proteasa Mi, Proteasa V, Proteasa VI, y combinaciones de estas. Algunas cepas de E. coli deficientes en proteasa están disponibles y se describen en, por ejemplo, Joly y otros, (1998), supra; Georgiou y otros, Patente de EE.UU. núm. 5264365; Georgiou y otros, Patente de EE.UU. núm. 5508192; Hara y otros, Microbial Drug Resistance, 2:63-72 (1996).
En una modalidad, las cepas de E. coli deficientes en enzimas proteolíticas y transformadas con plásmidos que sobreexpresan una o más proteínas chaperonas se usan como células huésped en el sistema de expresión descrito en la presente descripción.
La purificación de anticuerpos anti-EGFR1 o fragmentos de unión al EGFR1 de estos, puede lograrse mediante el uso de métodos reconocidos en la técnica. Los siguientes procedimientos son ilustrativos de los procedimientos de purificación adecuados: fraccionamiento en columnas de inmunoafinidad o de intercambio iónico, precipitación con etanol, HPLC de fase inversa, cromatografía en sílice o en una resina de intercambio catiónico tal como DEAE, cromatoenfoque, SDS-PAGE, precipitación con sulfato de amonio, y filtración en gel mediante el uso de, por ejemplo, Sephadex G-75.
En una modalidad, la proteína A inmovilizada en una fase sólida se usa para la purificación por inmunoafinidad de los anticuerpos anti-EGFR1.
En una modalidad, la proteína L inmovilizada en una fase sólida se usa para la purificación por inmunoafinidad de los fragmentos de anticuerpo anti-EGFR1 descritos en la presente descripción.
Como la primera etapa de purificación, la preparación derivada del cultivo celular, como se describió anteriormente, se aplica sobre la fase sólida inmovilizada de proteína A o proteína L para permitir la unión específica del anticuerpo anti-EGFR1 a la proteína A, o del fragmento de anticuerpo anti-EGFR1, tal como el fragmento Fab, a la proteína L. Después la fase sólida se lava para eliminar los contaminantes unidos inespecíficamente a la fase sólida. Finalmente, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo se recupera de la fase sólida mediante elución.
En una modalidad, la región variable de la cadena ligera está precedida por el péptido señal pelB y la región variable de la cadena pesada está precedida por el péptido señal ompA; la célula huésped comprende la proteína chaperona Skp y/o un polinucleótido codificante de la proteína chaperona Skp; y la célula huésped es deficiente para las enzimas proteolíticas Lon y OmpT.
En una modalidad, la región variable de la cadena ligera y la región variable de la cadena pesada están precedidas por el péptido señal stII; la célula huésped comprende la proteína chaperona Skp y/o un polinucleótido codificante de la proteína chaperona Skp; y la célula huésped es deficiente para las enzimas proteolíticas Lon y OmpT.
Además, se describe un polinucleótido codificante de
i) una región variable de la cadena ligera y
ii) una región variable de cadena pesada de un anticuerpo anti-EGFR1 o un fragmento de unión al EGFR1 de este. El término "un polinucleótido" puede referirse, en este contexto, a uno, dos o más polinucleótidos o moléculas de polinucleótidos que pueden o no unirse covalentemente, directa o indirectamente a través de una o más secuencias. Por ejemplo, los dos o más polinucleótidos pueden estar comprendidos en un casete de expresión o en un vector. Los dos o más polinucleótidos pueden, como ejemplo, fusionarse, directa o indirectamente, para codificar una proteína de fusión que comprende tanto la región variable de la cadena ligera como la región variable de la cadena pesada. Además, pueden estar comprendidos en dos casetes o vectores de expresión separados. El término "un polinucleótido" puede referirse, además, a una única molécula de polinucleótido continuo que comprende uno o más polinucleótidos o tramos de polinucleótidos codificantes de la región variable de la cadena ligera y de la región variable de la cadena pesada de un anticuerpo anti-EGFR1 o un fragmento de unión al EGFR1 de este.El polinucleótido puede ser dicistrónico o policistrónico.
En una modalidad, el polinucleótido codificante de la región variable de la cadena ligera y de la región variable de la cadena pesada es optimizado por codón para una célula huésped. La célula huésped puede ser una célula procariota, tal como una célula de E. coli.
En una modalidad, el polinucleótido codificante de una región variable de la cadena ligera comprende o consiste en la secuencia establecida en la SEQ ID NO: 8 o una secuencia que es al menos 90 %, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, o al menos 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 8. En una modalidad, el polinucleótido codificante de una región variable de la cadena pesada comprende o consiste en la secuencia establecida en la SEQ ID NO: 9 o una secuencia que es al menos 90 %, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, o al menos 99% idéntica a la SEQ ID NO: 9.
En una modalidad, el polinucleótido codificante de una región variable de cadena ligera comprende o consiste en la secuencia establecida en la SEQ ID NO: 8 y el polinucleótido codificante de una región variable de la cadena pesada comprende o consiste en la secuencia establecida en la SEQ ID NO: 9.
En una modalidad, el polinucleótido codificante de una región variable de la cadena ligera comprende o consiste en la secuencia establecida en la SEQ ID NO: 8, o una secuencia que es al menos 90 %, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, o al menos 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 8, y el polinucleótido codificante de una región variable de cadena pesada comprende o consiste en la secuencia establecida en la SEQ ID NO: 9, o una secuencia que es al menos 90 %, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, a al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, o al menos 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 9.
En una modalidad, el polinucleótido codifica
i) una cadena ligera y
ii) una cadena pesada de un fragmento de unión anti-EGFR1 de un anticuerpo.
En una modalidad, el polinucleótido codifica un fragmento de unión anti-EGFR1 que es un Fab o un scFv.
En una modalidad, el polinucleótido comprende o consiste en la secuencia de la cadena ligera establecida en la SEQ ID NO: 10, o una secuencia que es al menos 90 %, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, o al menos 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 10.
En una modalidad, el polinucleótido comprende o consiste en la secuencia de la cadena pesada establecida en la SEQ ID NO: 11, o una secuencia que es al menos 90 %, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, o al menos 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 11.
En una modalidad, el polinucleótido comprende o consiste en la secuencia de la cadena ligera establecida en la SEQ ID NO: 10 y la secuencia de la cadena pesada establecida en la SEQ ID NO: 11.
En una modalidad, el polinucleótido comprende o consiste en la secuencia de la cadena ligera establecida en la SEQ ID NO: 10, o una secuencia que es al menos 90 %, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, o al menos 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 10, y la secuencia de la cadena pesada establecida en la SEQ ID NO: 11, o una secuencia que es al menos 90 %, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, o al menos 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 11.
En una modalidad, el polinucleótido comprende o consiste en la secuencia establecida en la SEQ ID NO: 12, o una secuencia que es al menos 90 %, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94%, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, o al menos 99% idéntica a la SEQ ID NO: 12.
En una modalidad, el polinucleótido comprende o consiste en la secuencia establecida en la SEQ ID NO: 13, o una secuencia que es al menos 90 %, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, o al menos 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 13.
En una modalidad, la región variable de la cadena ligera y la región variable de la cadena pesada están precedidas por un péptido señal. Por lo tanto, el polinucleótido codifica un péptido señal y la región variable de la cadena ligera, y un péptido señal y la región variable de la cadena pesada. Los dos péptidos señal pueden seleccionarse independientemente uno del otro, o pueden ser el mismo péptido señal.
En una modalidad, el péptido señal que precede a la región variable de la cadena ligera es diferente del péptido señal que precede a la región variable de la cadena pesada.
En una modalidad, el péptido señal que precede a la región variable de la cadena ligera y a la región variable de la cadena pesada se seleccionan independientemente del grupo que consiste en gIII, malE, phoA, ompA, pelB, stII, y stII. En una modalidad, el péptido señal que precede a la región variable de la cadena ligera y a la región variable de la cadena pesada se seleccionan independientemente del grupo que consiste en ompA, pelB, stII, y stII.
En una modalidad, el péptido señal que precede a la región variable de la cadena ligera es el mismo que el péptido señal que precede a la región variable de la cadena pesada, y en donde el péptido señal se selecciona del grupo que consiste en gIII, malE, phoA, ompA, pelB, stII, y stII.
En una modalidad, el péptido señal que precede a la región variable de la cadena ligera es el mismo que el péptido señal que precede a la región variable de la cadena pesada, y en donde el péptido señal se selecciona del grupo que consiste en ompA, pelB, stII, y stII.
En una modalidad, la región variable de la cadena ligera está precedida por el péptido señal pelB y la región variable de la cadena pesada está precedida por el péptido señal ompA.
En una modalidad, la región variable de la cadena ligera y la región variable de la cadena pesada están precedidas por el péptido señal stII.
Además, el polinucleótido puede unirse operativamente a, es decir, es conducido por, o comprende un promotor. El promotor puede permitir la expresión eficiente del polinucleótido. El promotor puede ser, además, un promotor inducible, por lo que permite la expresión inducible del polinucleótido.
En una modalidad, el polinucleótido es conducido por, es decir, se une operativamente a, o comprende, un promotor seleccionado del grupo que consiste en T7, T5 y Rham.
En una modalidad, el polinucleótido es conducido por o comprende el promotor T7.En una modalidad, una célula huésped procariota produce al menos 20 mg/L, al menos 30 mg/L, al menos 50 mg/L, al menos 100 mg/L, al menos 200 mg/L, o al menos 500 mg/L de un anticuerpo anti-EGFR1 o un fragamento de unión al EGFR1 de un anticuerpo anti-EGFR1. En una modalidad, una célula E. coli produce al menos 20 mg/L, al menos 30 mg/L, al menos 50 mg/L, al menos 100 mg/L, al menos 200 mg/L, o al menos 500 mg/L de un anticuerpo anti-EGFR1 o un fragmento de unión al EGFR1 de un anticuerpo anti-EGFR1.
En una modalidad, una célula de E. coli produce al menos 20 mg/L, al menos 30 mg/L, al menos 50 mg/L, al menos 100 mg/L, al menos 200 mg/L, o al menos 500 mg/L de un Fab anti-EGFR1.
En una modalidad, una célula de E. coli produce al menos 20 mg/L, al menos 30 mg/L, al menos 50 mg/L, al menos 100 mg/L, al menos 200 mg/L, o al menos 500 mg/L de un scFv anti-EGFR1.
En una modalidad, una célula de E. coli comprende o consiste en el polinucleótido establecido en la SEQ ID NO: 8 o una secuencia que es al menos 90 %, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, o al menos 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 8, y la secuencia establecida en la SEQ ID NO: 9 o una secuencia que es al menos 90 %, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, o al menos 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 9, y la célula de E. coli produce al menos 20 mg/L, al menos 30 mg/L, al menos 50 mg/L, al menos 100 mg/L, al menos 200 mg/L, o al menos 500 mg/L de un anticuerpo anti-EGFR1 o un fragmento de unión al EGFR1 de un anticuerpo anti-EGFR1.
En una modalidad, una célula de E. coli comprende o consiste en el polinucleótido establecido en la SEQ ID NO: 8 o una secuencia que es al menos 90 %, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, o al menos 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 8, y la secuencia establecida en la SEQ ID NO: 9 o una secuencia que es al menos 90 %, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, o al menos 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 9, y la célula de E. coli produce al menos 20 mg/L, al menos 30 mg/L, al menos 50 mg/L, al menos 100 mg/L, al menos 200 mg/L, o al menos 500 mg/L de un Fab anti-EGFR1 o un scFv anti-EGFR1.
En una modalidad, una célula de E. coli comprende o consiste en el polinucleótido establecido en la SEQ ID NO: 8 y la secuencia establecida en la SEQ ID NO: 9 y la célula de E. coli produce al menos 20 mg/L, al menos 30 mg/L, al menos 50 mg/L, al menos 100 mg/L, al menos 200 mg/L, o al menos 500 mg/L de un Fab anti-EGFR1 o un scFv anti-EGFR1. En una modalidad, una célula de E. coli comprende o consiste en el polinucleótido establecido en la SEQ ID NO: 10, o una secuencia que es al menos 90 %, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, o al menos 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 10, y la secuencia de la cadena pesada establecida en la SEQ ID NO: 11, o una secuencia que es al menos 90 %, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, o al menos 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 11, y la célula de E. coli produce al menos 20 mg/L, al menos 30 mg/L, al menos 50 mg/L, al menos 100 mg/L, al menos 200 mg/L, o al menos 500 mg/L de un anticuerpo anti-EGFR1 o un fragmento de unión al EGFR1 de un anticuerpo anti-EGFR1.
En una modalidad, una célula de E. coli comprende o consiste en el polinucleótido establecido en la SEQ ID NO: 10, o una secuencia que es al menos 90 %, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, o al menos 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 10, y la secuencia de la cadena pesada establecida en la SEQ ID NO: 11, o una secuencia que es al menos 90 %, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, o al menos 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 11, y la célula de E. coli produce al menos 20 mg/L, al menos 30 mg/L, al menos 50 mg/L, al menos 100 mg/L, al menos 200 mg/L, o al menos 500 mg/L de un Fab anti-EGFR1.
En una modalidad, una célula de E. coli comprende o consiste en el polinucleótido establecido en la SEQ ID NO: 12, o una secuencia que es al menos 90 %, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, o al menos 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 12, y la célula de E. coli produce al menos 20 mg/L, al menos 30 mg/L, al menos 50 mg/L, al menos 100 mg/L, al menos 200 mg/L, o al menos 500 mg/L de un scFv anti-EGFR1.
En una modalidad, una célula de E. coli comprende o consiste en el polinucleótido establecido en la SEQ ID NO: 13, o una secuencia que es al menos 90 %, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, o al menos 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 13, y la célula de E. coli produce al menos 20 mg/L, al menos 30 mg/L, al menos 50 mg/L, al menos 100 mg/L, al menos 200 mg/L, o al menos 500 mg/L de un scFv anti-EGFR1.
La presente invención se refiere, además, a una composición farmacéutica que comprende el conjugado de acuerdo con una o más modalidades de la presente invención.
La composición farmacéutica de la presente invención puede comprender, además, un vehículo aceptable farmacéuticamente. Los ejemplos de vehículos aceptables farmacéuticamente adecuados son bien conocidos en la técnica y pueden incluir, por ejemplo, soluciones salinas tamponadas con fosfato, agua, emulsiones de aceite/agua, agentes humectantes, y liposomas. Las composiciones que comprenden tales vehículos pueden formularse mediante métodos bien conocidos en la técnica. La composición farmacéutica puede comprender, además, otros componentes tales como vehículos, aditivos, conservantes, otras composiciones farmacéuticas administradas simultáneamente, y similares.
En una modalidad, la composición farmacéutica comprende una cantidad eficaz del conjugado de acuerdo con una o más modalidades de la invención.
En una modalidad, la composición farmacéutica comprende una cantidad con eficacia terapéutica del conjugado de acuerdo con una o más modalidades de la invención.
El término "cantidad con eficacia terapéutica" o "cantidad eficaz" del conjugado debe entenderse como el régimen de dosificación para modular el crecimiento de células cancerosas y/o tratar la enfermedad de un paciente cuando las células cancerosas se bombardean con radiación de neutrones o se exponen a BNCT. La cantidad con eficacia terapéutica puede seleccionarse de acuerdo con una variedad de factores, que incluyen la edad, el peso, el sexo, la dieta y la afección médica del paciente, la gravedad de la enfermedad, y las consideraciones farmacológicas, tales como la actividad, la eficacia, la farmacocinética y los perfiles de toxicología del conjugado particular usado. La cantidad con eficacia terapéutica puede determinarse, además, mediante la referencia a textos médicos estándar, tal como el Physicians Desk Reference 2004. El paciente puede ser hombre o mujer, y puede ser un bebé, un niño o un adulto. El término "tratamiento" o "tratar" se usa en el sentido convencional y significa atender, cuidar y asistir a un paciente con el objetivo de combatir, reducir, atenuar o aliviar una enfermedad o anormalidad de salud y mejorar las condiciones de vida deterioradas por esta enfermedad, tal como, por ejemplo, con una enfermedad cancerosa.
En una modalidad, la composición farmacéutica comprende una composición para, por ejemplo, administración oral, parenteral, transdérmica, intraluminal, intraarterial, intratecal, intratumoral (i.t.) y/o intranasal o para inyección directa en el tejido. La administración de la composición farmacéutica puede realizarse de diferentes maneras, por ejemplo, mediante administración intravenosa, intraperitoneal, subcutánea, intramuscular, intratumoral, tópica o intradérmica. La presente invención se refiere, además, al conjugado de acuerdo a una o más modalidades de la presente invención o la composición farmacéutica que comprende el conjugado de acuerdo a una o más modalidades de la presente invención para usar como un medicamento.
Además, se describe el conjugado de acuerdo con una o más modalidades de la presente invención o la composición farmacéutica que comprende el conjugado de acuerdo con una o más modalidades de la presente invención para usar como un medicamento para la terapia de captura de neutrones de boro.
La "terapia de captura de neutrones de boro" (BNCT) debe entenderse como una radioterapia dirigida, en donde el boro-10 no radiactivo se irradia con neutrones térmicos de baja energía para producir partículas alfa y núcleos de litio-7. El boro-10 no radioactivo puede dirigirse mediante su incorporación en un fármaco de localización tumoral tal como un conjugado de localización tumoral.
Además, se describe el conjugado de acuerdo con una o más modalidades de la presente invención o la composición farmacéutica que comprende el conjugado de acuerdo con una o más modalidades de la presente invención para usar en la terapia de captura de neutrones de boro.
La presente invención se refiere, además, al conjugado de acuerdo con una o más modalidades de la presente invención o la composición farmacéutica que comprende el conjugado de acuerdo con una o más modalidades de la presente invención para usar en el tratamiento del cáncer.
En una modalidad, el cáncer es un cáncer de cabeza y cuello.
En una modalidad, el cáncer se selecciona del grupo que consiste en cáncer de cabeza y cuello, leucemia, linfoma, cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer de ovario, cáncer colorrectal, cáncer gástrico, cáncer escamoso, cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer resistente a múltiples fármacos y cáncer testicular.
La presente invención se refiere, además, al conjugado de acuerdo con una o más modalidades de la presente invención o la composición farmacéutica que comprende el conjugado de acuerdo con una o más modalidades de la presente invención para usar en el tratamiento del cáncer mediante la terapia de captura de neutrones de boro.
Además, se describe el uso del conjugado o la composición farmacéutica de acuerdo con una o más modalidades de la presente invención en la fabricación de un medicamento.
Además, se describe el uso del conjugado o la composición farmacéutica de acuerdo con una o más modalidades de la presente invención en la fabricación de un medicamento para la terapia de captura de neutrones de boro.
Se describe, además, el uso del conjugado o la composición farmacéutica de acuerdo con una o más modalidades de la presente invención en la fabricación de un medicamento para el tratamiento del cáncer.
En una modalidad, el cáncer es un cáncer de cabeza y cuello.
En una modalidad, el cáncer se selecciona del grupo que consiste en cáncer de cabeza y cuello, leucemia, linfoma, cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer de ovario, cáncer colorrectal, cáncer gástrico, cáncer escamoso, cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer resistente a múltiples fármacos y cáncer testicular.
Además, se describe el uso del conjugado o la composición farmacéutica de acuerdo con una o más modalidades de la presente invención en la fabricación de un medicamento para el tratamiento del cáncer mediante terapia de captura de neutrones de boro.
En una modalidad, el medicamento es para el tratamiento intratumoral del cáncer de cabeza y cuello mediante terapia de captura de neutrones de boro.
En una modalidad, el medicamento es para el tratamiento intravenoso del cáncer de cabeza y cuello mediante la terapia de captura de neutrones de boro.
En una modalidad, el medicamento es para el tratamiento intratumoral e intravenoso del cáncer de cabeza y cuello mediante la terapia de captura de neutrones de boro.
Además, se describe un método para tratar o modular el crecimiento de células tumorales que expresan EGFR1 en un humano, en donde el conjugado o la composición farmacéutica de acuerdo con una o más modalidades de la invención se administran a un humano en una cantidad eficaz.
En una modalidad, el conjugado o la composición farmacéutica de acuerdo con una o más modalidades de la invención se administran a un humano en una cantidad eficaz en la terapia de captura de neutrones de boro.
En una modalidad, la concentración de boro se analiza en células tumorales después de administrar el conjugado o la composición farmacéutica.
En una modalidad, la concentración de boro se analiza en sangre después de administrar el conjugado o la composición farmacéutica.
En una modalidad, la concentración de boro se analiza en el músculo, o en otro tejido no tumoral, después de administrar el conjugado o la composición farmacéutica.
La concentración de boro en células tumorales, en sangre o en ambas puede analizarse o medirse, por ejemplo, mediante espectrometría de masas de plasma acoplado inductivamente (ICP-MS) o espectroscopía de emisión atómica de plasma acoplado inductivamente (ICP-AES) (por ejemplo, Ejemplo 9). Estos métodos miden la cantidad (en moles) o la concentración de átomos de boro en la muestra.
Además, la concentración de boro en las células tumorales, en la sangre o en ambas puede analizarse o medirse indirectamente, por ejemplo, mediante el uso de una modalidad del conjugado que comprende una molécula de trazabilidad y mediante análisis o medidas de la concentración de la molécula de trazabilidad. Por ejemplo, si la molécula de trazabilidad es fluorescente o radioactiva, la fluorescencia o radioactividad de la molécula de trazabilidad puede medirse o visualizarse.
En una modalidad, la concentración de boro se analiza en células tumorales y en sangre después de administrar el conjugado o la composición farmacéutica, y la relación de la concentración de boro en células tumorales con respecto a la concentración de boro en sangre es mayor que 1:1,2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1, 11:1, 12:1, 13:1, 15:1, 20:1, 30:1, 40:1, 50:1, 60:1, 70:1, 80:1, 90:1, 100:1, 110:1, 120:1, 130:1, 140:1, 150:1, 200:1, 210:1, 220:1, 230:1, 240:1, o 250:1.
En una modalidad, la concentración de boro se analiza en células tumorales y en un músculo, o en otro tejido no tumoral, después de administrar el conjugado o la composición farmacéutica, y la relación de la concentración de boro en células tumorales con respecto a la concentración del boro en un músculo u otro tejido no tumoral es mayor que 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1, 11:1, 12:1, 13:1, 15:1, 20:1, 30:1, 40:1, 50:1, 60:1, 70:1, 80:1, 90:1, 100:1, 110:1, 120:1, 130:1, 140:1, 150:1, 200:1, 210:1,220:1, 230:1, 240:1, o 250:1.
En una modalidad, la relación de la concentración de boro en células tumorales con respecto a la concentración de boro en sangre, en un músculo o en otro tejido no tumoral es la relación molar de átomos de boro en células tumorales con respecto a los átomos de boro en sangre, en un músculo o en otro tejido no tumoral.
Además, se describe un método para modular el crecimiento de una población celular que expresa la proteína EGFR1, en donde el método comprende la etapa de
poner en contacto el conjugado de acuerdo con una o más modalidades de la invención o la composición farmacéutica de acuerdo con una o más modalidades de la invención con la población celular que expresa la proteína EGFR1.
En una modalidad, la población celular que expresa la proteína EGFR1 es una población de células cancerosas o una población de células tumorales.
En este contexto, el término "una población de células cancerosas" debe entenderse como una referencia a una o más poblaciones de células cancerosas.
El conjugado puede ponerse en contacto in vitro, in vivo y/o ex vivo con la población celular, por ejemplo, células cancerosas, que incluyen, por ejemplo, cáncer de sangre, plasma, pulmón, mama, colon, próstata, riñón, páncreas, cerebro, huesos, ovarios, testículos y órganos linfáticos; con mayor preferencia cáncer de pulmón, colon, próstata, plasma, sangre o colon; "La modulación del crecimiento de las poblaciones de células cancerosas" incluye la inhibición de la proliferación de poblaciones de células que se dividen para producir más células; reducir la tasa de aumento en la división celular en comparación, por ejemplo, con células no tratadas; destruir poblaciones de células; y/o evitar que las poblaciones celulares (tales como las células cancerosas) hagan metástasis. El crecimiento de las poblaciones celulares puede modularse in vitro, in vivo o ex vivo.
En una modalidad, el cáncer se selecciona del grupo que consiste en cáncer de cabeza y cuello, leucemia, linfoma, cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer de ovario, cáncer colorrectal, cáncer gástrico, cáncer escamoso, cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer resistente a múltiples fármacos y cáncer testicular.
Además, se describe un método para tratar y/o modular el crecimiento y/o la profilaxis de células tumorales en humanos, en donde el conjugado o la composición farmacéutica de acuerdo con una o más modalidades de la invención se administra a un humano en una cantidad eficaz.
En una modalidad, la cantidad eficaz es una cantidad con eficacia terapéutica.
En una modalidad, el conjugado o la composición farmacéutica de acuerdo con una o más modalidades de la invención se administran a un humano en una cantidad eficaz en la terapia de captura de neutrones de boro.
En una modalidad, las células tumorales se seleccionan del grupo que consiste en células de leucemia, células de linfoma, células de cáncer de mama, células de cáncer de próstata, células de cáncer de ovario, células de cáncer colorrectal, células de cáncer gástrico, células de cáncer escamoso, células de cáncer de pulmón de células pequeñas, células de cáncer de cabeza y cuello, células de cáncer resistentes a múltiples fármacos, y células de cáncer testicular, células de cáncer metastásico, avanzado, resistentes a fármacos u hormonas, resistentes a múltiples fármacos, y versiones de estas.
Además, se describe un método para tratar el cáncer en humanos, en donde el conjugado o la composición farmacéutica de acuerdo con una o más modalidades de la invención se administran a un humano en una cantidad eficaz.
En una modalidad, el conjugado o la composición farmacéutica de acuerdo con una o más modalidades de la invención se administran a un humano en una cantidad eficaz en la terapia de captura de neutrones de boro.
En una modalidad, la cantidad eficaz es una cantidad con eficacia terapéutica.
En una modalidad, el conjugado o la composición farmacéutica de acuerdo con una o más modalidades de la invención se administran por vía intravenosa a un humano en una cantidad con eficacia terapéutica en la terapia de captura de neutrones de boro.
En una modalidad, el conjugado o la composición farmacéutica de acuerdo con una o más modalidades de la invención se administran intratumoralmente a un humano en una cantidad con eficacia terapéutica en la terapia de captura de neutrones de boro.
En una modalidad, el conjugado o la composición farmacéutica de acuerdo con una o más modalidades de la invención se administran intratumoral e intravenosamente a un humano en una cantidad con eficacia terapéutica en la terapia de captura de neutrones de boro.
En una modalidad, el conjugado o la composición farmacéutica de acuerdo con una o más modalidades de la invención se administran intratumoralmente en el tumor de cabeza y cuello en una cantidad con eficacia terapéutica en la terapia de captura de neutrones de boro.
En una modalidad, el cáncer se selecciona del grupo que consiste en cáncer de cabeza y cuello, leucemia, linfoma, cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer de ovario, cáncer colorrectal, cáncer gástrico, cáncer escamoso, cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer resistente a múltiples fármacos y cáncer testicular.
En una modalidad, el conjugado o la composición farmacéutica de acuerdo con una o más modalidades comprende un anticuerpo anti-EGFR1 o fragmento de unión al EGFR1 de este, que se obtiene mediante un método que comprende cultivar la célula huésped procariota de acuerdo con una o más modalidades; y
aislar y/o purificar el anticuerpo anti-EGFRI o un fragmento de unión al EGFR1 de este.
En una modalidad, el anticuerpo anti-EGFR1 o un fragmento de unión al EGFR1 de este, del conjugado o la composición farmacéutica de acuerdo con una o más modalidades comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 14 o SEQ ID NO: 15.
Además, se describe un método para tratar o modular el crecimiento de células tumorales que expresan EGFR1 en un ser humano, en donde el conjugado de acuerdo con una o más modalidades o la composición farmacéutica de acuerdo con una o más modalidades se administran a un humano en una cantidad eficaz.
Las modalidades de la invención descritas anteriormente en la presente descripción pueden usarse en cualquier combinación entre sí. Varias de las modalidades pueden combinarse entre sí para formar una modalidad adicional de la invención. Un producto, un uso o un método con el que se relaciona la invención pueden comprender al menos una de las modalidades de la invención descritas anteriormente en la presente descripción.
El conjugado de acuerdo una o más modalidades de la invención tiene varias propiedades ventajosas.
El conjugado de acuerdo con una o más modalidades de la invención es relativamente no tóxico en ausencia de irradiación de neutrones de baja energía y tiene baja antigenicidad.
Contiene una gran cantidad de átomos de boro-10 por molécula del conjugado. Además, exhibe una solubilidad acuosa relativamente buena.
El conjugado de acuerdo con una o más modalidades de la invención, además, exhibe una buena farmacocinética. Tiene una retención adecuada en la sangre, una alta absorción en las células a las que se dirige y una baja absorción en las células y órganos a los que no se dirige.
Su proceso de producción es relativamente simple y puede realizarse en soluciones acuosas.
El conjugado de acuerdo con una o más modalidades de la invención es suficientemente estable frente a la degradación química o bioquímica durante la fabricación o en condiciones fisiológicas, por ejemplo, en sangre, suero, plasma o tejidos.
EJEMPLOS
A continuación, la presente invención se describirá con más detalle. Ahora se hará referencia en detalle a las modalidades de la presente invención, cuyos ejemplos se ilustran en los dibujos adjuntos. La descripción más abajo describe algunas modalidades de la invención con tal detalle que una persona experta en la técnica puede utilizar la invención basándose en la descripción. No todas las etapas de las modalidades se discuten en detalle, ya que muchas de las etapas serán obvias para el experto en la técnica basándose en esta descripción.
EJEMPLO 1. Alilación del dextrano
Se disolvieron 200 mg de Dextrano 70 kD (Sigma) en 2 mL de NaOH 0,6 M. Se añadieron 250 pl de bromuro de alilo (Sigma), y la reacción se dejó continuar durante 3 horas a 60 °C. La mezcla de reacción se neutralizó después con ácido acético 1 M y el producto se aisló mediante precipitación con 10 volúmenes de acetona fría (-20 °C). El precipitado se recolectó por centrifugación y se lavó dos veces con acetona. El dextrano alilado (Esquema i) se sometió a análisis de 1H-NMR, que mostró que el nivel de alilación era de aproximadamente 36 %.
Figure imgf000022_0001
Esquema 1. Alilación del dextrano mediante el uso de bromuro de alilo.
EJEMPLO 2. Adición de BSH al alil dextrano
Se preparó 50 mg de alilo dextrano 70 kD como se describió en el Ejemplo 1, persulfato de amonio 50 mg y borocaptato de sodio 50 mg (BSH; Katchem Ltd, República Checa) se disolvieron en 0,5 mL H2O.
La reacción se dejó proceder durante 2 horas a 50 °C. El producto de reacción, BSH-dextrano (Esquema 2), se aisló con ultrafiltración mediante el uso de un filtro centrífugo (Amicon, corte de 10K). El análisis de 1H-NMR mostró que, en promedio, 100 unidades de BSH se unieron al alil dextrano, lo que corresponde a 1200 átomos de boro por cadena del dextrano (Fig. 1). Con modificaciones menores, por ejemplo, mediante el uso de un nivel de alilación más bajo en el dextrano, se obtuvo BSH dextrano con aproximadamente 900 boros u 800 boros por cadena del dextrano.
Figure imgf000023_0001
Esquema 2. Adición de borocaptato de sodio al alil dextrano en una reacción catalizada por persulfato.
Al variar la cantidad de BSH y persulfato en la reacción descrita anteriormente, fue posible preparar BSH-dextranos con un nivel de BSH claramente inferior: 1) En una reacción que contenía 20 mg de alil dextrano, 15 mg de persulfato de amonio y 15 mg de BSH, se encontró que el BSH-dextrano aislado contenía aproximadamente 700 átomos de boro por cadena del dextrano. 2) En una reacción que contenía 20 mg de alil dextrano, 10 mg de persulfato de amonio y 10 mg de BSH, se encontró que el BSH-dextrano aislado contenía aproximadamente 560 átomos de boro por cadena del dextrano. 3) En una reacción que contenía 20 mg de alil dextrano, 5 mg de persulfato de amonio y 5 mg de BSH, se descubrió que el BSH-dextrano aislado contenía aproximadamente 360 átomos de boro por cadena del dextrano.
EJEMPLO 3. Oxidación del BSH-dextrano
Se disolvieron 50 mg del BSH-dextrano, preparado como se describió en el Ejemplo 2, en 3 mL de NaIO425 mM en acetato de sodio 0,1 M, pH 5,5. El tubo de reacción se cubrió con papel de aluminio y se incubó a temperatura ambiente durante toda la noche. El producto de reacción, BSH-dextrano oxidado (Esquema 3), se aisló con ultrafiltración mediante el uso de un filtro centrífugo (Amicon, corte de 10K).
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Esquema 3. Oxidación del BSH-dextrano mediante el uso de periodato de sodio.
EJEMPLO 4. Conjugación del BSH-dextrano oxidado al Fab/F(ab')2 anti-EGFR1
Se mezclaron 2 mg (40 nmol) del Fab anti-EGFR1 en 2 mL de solución salina tamponada con fosfato (PBS) con 5,1 mg (60 nmol) del BSH-dextrano oxidado (Ejemplo 3) en 1,6 mL de PBS. La reacción se dejó proceder durante toda la noche a temperatura ambiente. A la reacción se añadieron 400 pl de NaCNBH3 0,5 M para estabilizar los vínculos aldehídolisina y la reacción se incubó durante 2 horas a temperatura ambiente. Se añadieron 800 pl de etanolamina-HCl 0,2 M pH 8 y la reacción se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente. Para estabilizar la protección con etanolamina se añadieron 400 pl de NaCNBH30,5 M y la reacción se incubó durante 2 horas a temperatura ambiente. Los reactivos de bajo peso molecular se eliminaron mediante una unidad de filtro centrífugo Amicon (MWCO 30K) de acuerdo con las instrucciones del fabricante, mediante el uso de PBS como eluyente de lavado.
Se mezclaron 2 mg (40 nmol) del F(ab')2 anti-EGFR1 en 2 mL de solución salina tamponada con fosfato (PBS) con 2,56 mg (30 nmol) del BSH-dextrano oxidado (Ejemplo 3) en 1,6 mL de PBS. El conjugado se estabilizó, se protegió y se purificó mediante ultrafiltración como anteriormente.
Ambos conjugados se analizaron mediante el purificador Ákta (GE Healthcare) con una columna de filtración de gel SEC-3000 Yarra de 3 |jm (300 x 7,8 mm; Phenomenex) mediante el uso de acetonitrilo al 10 % (ACN)-50 mM Tris-HCl, pH 7,5 como el tampón de elución (Figura 2).
EJEMPLO 5. Generación del Fab y -F(ab')2 anti-EGFRI y fragmentos Fab y -F(ab')2 de control
Se generaron fragmentos Fab y F(ab')2 a partir de cetuximab comercial (Erbitux, Roche) o de cetuximab producido en células CHO (kit Freedom CHO-S, Invitrogen). El kit Freedom CHO-S (Life Technologies) se usó para el desarrollo de líneas celulares estables que producen cetuximab. El trabajo se realizó de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las secuencias de nucleótidos optimizadas codificantes de las secuencias de la cadena pesada y ligera se adquirieron de GeneArt (Life Technologies) y se clonaron por separado en vectores de expresión pCEP4 (Life Technologies). Para la expresión estable, las células FreeStyle™ c HO-S se transfectaron con vectores de cadena ligera y de cadena pesada 1:1 linealizados. Los transfectantes se seleccionaron con puromicina y metotrexato, después de lo cual el aislamiento del clon se realizó mediante clonación por dilución limitante. Las líneas celulares clonadas se escalaron y se evaluaron para determinar la productividad.
Se generaron fragmentos -Fab y -F(ab')2 Control a partir de omalizumab comercial (anti-IgE) (Xolair, Novartis).
Los fragmentos del Fab anti-EGFRI se prepararon mediante la digestión del anticuerpo con papaína inmovilizada (Pierce) de acuerdo con las instrucciones del fabricante, con modificaciones menores. La relación enzima a sustrato que se usó fue 1:60 (p/p) y el tiempo de incubación fue de 7 horas. Los fragmentos Fab se separaron de los fragmentos IgG y Fc no digeridos con una columna de proteína A inmovilizada (Thermo Scientific) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Los fragmentos F(ab')2 anti-EGFR1 se prepararon mediante la digestión del anticuerpo con FraglT MaxiSpin (Genovis) de acuerdo con las instrucciones del fabricante o con la enzima Fabricator (Genovis) de acuerdo con las instrucciones del fabricante, con modificaciones menores. La digestión enzimática con la enzima Fabricator se realizó con 120 unidades de enzima por mg de anticuerpo en tampón de fosfato de sodio 50 mM, pH 6,6 y el tiempo de incubación fue de 1 hora a 37 °C. Los fragmentos F(ab')2 se purificaron con una columna de proteína L HiTrap inmovilizada (GE Healthcare) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El tampón de reacción se cambió a PBS con concentrador Amicon Ultra (Millipore) (corte de 10 kDa).
Los fragmentos generados se identificaron con SDS-PAGE y se determinó la concentración de proteína de cada fragmento midiendo la absorbancia UV a 280 nm.
EJEMPLO 6. Análisis por SDS-PAGE de los conjugados de boro
Los conjugados de boro de los fragmentos Fab y F(ab')2 anti-EGFR1 se analizaron mediante el uso de SDS-PAGE para verificar que las conjugaciones tuvieron éxito y que los fragmentos Fab o F(ab')2 no conjugados no estuvieran presentes después de la conjugación. La Figura 3 muestra un análisis por SDS-PAGE de los conjugados de boro Fab/F(ab')2 anti-EGFR1 con diferentes cantidades de boro en un gel de gradiente (Bio-Rad, 4-15 %) en condiciones no reductoras (panel A) y reductoras (panel B). Los resultados del panel A muestran que la conjugación fue completa (o casi completa) porque los fragmentos Fab o F(ab')2 no conjugados no eran visibles. El BSH es una molécula cargada negativamente y cuando se conjuga con una proteína, la velocidad de migración de un conjugado es más rápida en un gel de lo esperado en función de su peso molecular teórico. El ejemplo de la Figura 3 (Panel A) indica que los conjugados con alta cantidad de boro migran más rápido en un gel no reductor que los conjugados con menor cantidad de boro (por ejemplo, comparar los carriles 1, 2, 4 y 6). Los resultados de la Figura 3 (Panel A) indican, además, que en un gel no reductor la mayoría de los conjugados se separan en dos bandas, lo que implica que las muestras contienen una mezcla de dos tipos diferentes de conjugados. El análisis por SDS-PAGE de los conjugados de boro en condiciones reductoras (Figura 3, panel B) muestra que en el gel en condiciones reductoras todos los conjugados Fab con diferentes cantidades de boro migran de manera similar (Carriles 1, 2, 4, 6). Del mismo modo, los conjugados F(ab')2 reducidos con diferentes cantidades de boro migran de forma idéntica (carriles 3, 5, 7). En general, los conjugados de boro reducidos migran más rápido en el gel que los conjugados no reducidos.
EJEMPLO 7. Ensayos de internalización in vitro de los conjugados de boro
Mareaje con AlexaFluor488 de los conjugados de boro
Se incubaron 5 jg de ácido carboxílico AlexaFluor488, marcador de éster succinimidílico (Invitrogen) con 100 jg de los conjugados de boro (Fab anti-EGFR1, F(ab')2 anti-EGFR1, AcM anti-EGFR1, Fab control, F(ab')2 control, AcM control) o compuestos no conjugados correspondientes durante 15 min a temperatura ambiente en un tampón que contiene 10 j l de NaHCO3, 1 M pH 9 en 100 j l de PBS. Después de la incubación, se eliminó el exceso de marcaje mediante el cambio del tampón a PBS con concentrador Amicon Ultra (Millipore) (corte de 10 kDa). La concentración de proteína de cada compuesto se determinó midiendo la absorbancia UV a 280 nm y el grado de marcaje se calculó de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Invitrogen).
Mareaje con tritio de los conjugados de boro
Después de la eliminación del disolvente de tolueno mediante evaporación, se incubaron 100 jC i de propionato de N-succinimidilo marcado con tritio (Perkin Elmer) con 100 |jg de anti-EGFR1-Fab-BSH(800B)-Dex, anti-EGFR1-F(ab')2-BSH(800B)-Dex, AcM anti-EGFRI y AcM control en un tampón que contiene 20 j l de tampón de borato de Na 1 M, pH 8,8 en 100 j l de PBS. Se dejó que la reacción continuara durante toda la noche a temperatura ambiente y después se eliminó el exceso de marcaje mediante el cambio del tampón a PBS con un concentrador Amicon Ultra (límite de 10 kDa). La cantidad de radiactividad se midió con un contador de centelleo en presencia de un cóctel de líquido de centelleo (Ultima Gold, Perkin Elmer). La cantidad de marcaje de tritio en los compuestos se calculó como cpm/jg de proteína.
Cultivo de células
Las células HSC-2 (carcinoma humano de células escamosas de la boca, JCRP Cellbank, Japón) y las células FaDu (carcinoma humano de células escamosas de faringe, ATCC) se cultivaron en frascos T75 en medio esencial mínimo de Eagle con glutamina 2 %, suero fetal bovino 10 % y penicilina/estreptomicina 1 %. Las células HEK (riñón embrionario humano, ATCC) se cultivaron en frascos T75 en medio Eagle modificado de Dulbecco con glutamina 2%, suero fetal bovino 10 % y penicilina/estreptomicina 1 %.
Ensayo de intemalización visualizado en microscopía de fluorescencia
Las células HSC-2 (5x104) se sembraron en un portaobjetos de cámara y se dejaron crecer durante 24 horas. Después, las células se incubaron durante 3 horas a 37 °C o a 4 °C en 100 j l de medio que contenía 10 jg/mL de conjugados BSH marcados con AlexaFluor488. Después de la incubación, las células se lavaron dos veces con PBS y se fijaron con paraformaldehído al 4 % durante 20 minutos. Se añadió medio de montaje (reactivo antifade Prolong Gold con DAPI) y las células se cubrieron con cubreobjetos de microscopía. Las células se fotografiaron con microscopía de fluorescencia (Zeiss Axio Scope A1; ProgRes C5, Je NOPTIK AG).
La internalización del anti-EGFR1-F(ab')2 -BSH(900B)-Dex y anti-EGFR1-F(ab')2 no conjugado por la línea celular tumoral HSC-2 se analizó por microscopía de fluorescencia (Figura 4). El experimento se realizó a 4 °C (los compuestos se unen a la superficie celular pero no pueden internalizarse) y a 37 °C (las células pueden internalizar los compuestos unidos a la superficie). Tanto el anti-EGFR1-F(ab')2 no conjugado como el conjugado de boro se unieron a la superficie celular a 4 °C (paneles A y B) y se internalizaron a 37 °C (paneles C y D). De hecho, el conjugado de boro se internalizó de manera más eficiente que el anti-EGFR1-F(ab')2 no conjugado. El ensayo de internalización con anti-EGFR1-Fab-BSH(900B)-Dex y EGFR1-AcM-BSH(900B)-Dex y los correspondientes anti-EGFR1-Fab y AcM anti-EGFR1 no conjugados dieron resultados muy similares a los datos presentados en la Figura 4 (no mostrado). El efecto de la carga de boro para la internalización se examinó mediante el uso de conjugados de boro anti-EGFR1-Fab-BSH-Dex y anti-EGFR1-F(ab')2-BSH-Dex) con diferentes cantidades de boro. Los resultados indicaron que los conjugados con más boro se internalizaron de manera más eficiente por las células HSC-2 que los conjugados con baja carga de boro a 37 °C (no mostrado). Control-F(ab')2 -BSH(900B)-Dex se internalizó solo muy débilmente (no mostrado).
Ensayo de internalización (FACS)
Las células HSC-2, FaDu y HEK (2x105) se sembraron en una placa de 24 pocillos y se dejaron crecer durante 24 horas. Después, las células se incubaron durante 3 horas a 37 °C en 300 j l de medio que contenía 5 jg/mL de compuestos marcados con AlexaFluor488. Después de la incubación, las células se lavaron dos veces con PBS y se separaron mediante la incubación con 100 j l de Tripsina-EDTA durante 10 minutos a 37 °C. Las células se neutralizaron mediante la adición de 300 j l de medio y se suspendieron en PBS y se analizaron mediante el uso de un citómetro de flujo (FACS LRS II). La intensidad de fluorescencia media de cada muestra se calculó mediante el uso del programa informático FACS Diva. Los datos presentados en las Tablas 1-3 se expresan como "Intensidad de fluorescencia media normalizada" donde la intensidad de fluorescencia se normalizó con respecto al grado del marcaje para cada compuesto.
Ensayos con FACS
La internalización de los conjugados de boro marcados fluorescentemente (900 átomos de boro) y fragmentos de Ac no conjugados por la línea celular de cáncer HNC humano HSC-2 se evaluó mediante el uso de la FACS. Los resultados representan los compuestos unidos a la superficie celular más los internalizados, que ocurre cuando las células se incubaron a 37 °C (Tabla 1). El anti-EGFR1-Fab-BSH-Dex se internalizó de manera más eficiente que los otros conjugados de boro o que el Fab anti-EGFR1- no conjugado. Otros conjugados de boro anti-EGFR1 (anti-EGFR1-F(ab')2-BSH-Dex y anti-EGFR1-AcM-BSH-Dex) se internalizaron igualmente bien que el anti-EGFR1-Fab y anti-EGFR1-F(ab')2 no conjugados. Los conjugados de boro de control-F(ab')2 y -AcM se internalizaron muy débilmente.
Tabla 1. Unión a la superficie celular e internalización de los conjugados de boro marcados fluorescentemente y de los compuestos no conjugados, por las células HSC-2. El análisis se realizó mediante FACS y la intensidad de fluorescencia se normalizó con respecto al grado de marcaje para cada compuesto.
HSC-2
Figure imgf000026_0001
Muestra Intensidad de fluorescencia media normalizada
Anti-E FR1-Fab-B H 900B -Dex 158700
Anti-EGFR1-F(ab')2-BSH(900B)-Dex 81100
Control-F(ab')2-BSH(900B)-Dex 2200
Anti-EGFR1-AcM-BSH(900B)-Dex 92700
Control-AcM-BSH(900B)-Dex 8200
Anti-EGFR1-Fab 99500
Anti-EGFR1-F(ab')2 93100
Anti-EGFR1-AcM 21300
Control-AcM 700
Los conjugados de boro con diferentes cantidades de boro (360-900 átomos de boro) se sintetizaron a partir del F(ab')2 y -Fab anti-EGFR1 para estudiar el efecto de la carga de boro en el proceso de internalización. El ejemplo muestra el ensayo de internalización con conjugados marcados con fluorescencia mediante el uso de la línea celular de cáncer humano HNC HSC-2 y una línea celular humana HEK de control. Los resultados del análisis de citometría de flujo representan los compuestos unidos a la superficie celular más los internalizados, que ocurren cuando las células se incubaron a 37 °C (Tabla 2). La internalización de todos los conjugados de boro de los fragmentos de Ac del anti-EGFR1 fue muy similar a la analizada mediante citometría de flujo. Sin embargo, los experimentos con microscopía revelaron que los conjugados con más boro se internalizaron de manera más eficiente que los conjugados con baja carga de boro (no mostrado).
Tabla 2. Unión a la superficie celular e internalización de los conjugados de boro marcados con fluorescencia con diferentes cantidades de boro por las células HSC-2 y HEK. El análisis se realizó mediante citometría de flujo y la intensidad de fluorescencia se normalizó con respecto al grado de marcaje para cada compuesto.
HSC-2 HEK
Muestra Intensidad de fluorescencia media normalizada
Figure imgf000026_0002
Anti-EGFR1-Fab-BSH(900B)-Dex 33900
Anti-EGFR1-Fab-BSH(700B)-Dex 48300 590
Anti-EGFR1-Fab-BSH(560B)-Dex 48000 860
Anti-EGFR1-Fab-BSH(360B)-Dex 37000 470
Anti-EGFR1-F(ab')2 -BSH(700B)-Dex 41900 600
Anti-EGFR1-F(ab')2 -BSH(560B)-Dex 48400 530
Anti-EGFR1-F(ab')2 -BSH(360B)-Dex 43100 470
Anti-EGFR1-AcM 10700 110
La internalización de los conjugados de boro marcados fluorescentemente (1200 u 800 átomos de boro) y los fragmentos de Ac no conjugados por líneas celulares de cáncer humano HNC (HSC-2 y FaDu) y una línea celular HEK de control se evaluó mediante el uso de la citometría de flujo. Los resultados representan los compuestos unidos a la superficie celular más los internalizados, que ocurren cuando las células se incubaron a 37 °C (Tabla 3). El anti-EGFR1-Fab-BSH(1200B)-Dex y el Fab anti-EGFRI no conjugado mostraron la internalización más fuerte por las células HSC-2 y FaDu. La internalización por las células FaDu fue consistentemente más débil que la de las células HSC-2, probablemente debido a la menor cantidad de receptores EGFR1 en la superficie celular. Los conjugados de boro de control (control-Fab-BSH(800B)-Dex y control-F(ab')2 -BSH(800B)-Dex) y los correspondientes compuestos no conjugados se internalizaron muy débilmente. La línea celular HEK de control internalizó los conjugados de boro y los compuestos no conjugados solo muy débilmente.
Tabla 3. Unión a la superficie celular e internalización de los conjugados de boro marcados con fluorescencia (1200B u 800B) y de los compuestos no conjugados, por las células HSC-2, FaDu y HEK. El análisis se realizó mediante citometría de flujo y la intensidad de fluorescencia se normalizó con respecto al grado de marcaje para cada compuesto.
HSC-2 FaDu HEK
Figure imgf000027_0001
Muestra Intensidad de fluorescencia media normalizada
Anti-E FR1-Fab 43006 6820 274
Anti-EGFR1-F(ab')2 18432 3461 168 Control-Fab 1165 970 555 Control-F(ab')2 823 443 337
Anti-EGFR1-Fab-BSH(1200)-Dex 45270 8060 615
Anti-EGFR1-F(ab')2-BSH(1200)-Dex 10043 2813 198 Control-Fab-BSH(800)-Dex 1233 428 158 Control-F(ab')2 -BSH(800)-Dex 236 169 61
Ensayo de intemalizadón con muestras radiomarcadas
Las células HSC-2, FaDu y HEK (2x105) se sembraron en una placa de 24 pocilios y se dejaron crecer durante 24 horas. Después, las células se incubaron durante 3 horas a 37 °C en 300 j l de medio que contenía 5 jg/mL de compuestos marcados con tritio. Después de la incubación, se retiraron los medios y las células se lavaron tres veces con PBS y se lisaron mediante la adición de 300 j l de NaOH 1 M. La cantidad de radiactividad en los medios y en los lisados celulares se midió con contador de centelleo en presencia del cóctel de líquido de centelleo (Ultima Gold). La cantidad de compuestos internalizados se calculó a partir de la cantidad total de radiactividad por pocillo y se normalizó con respecto a 100000 células.
Los conjugados de boro (800 átomos de boro) del anti-EGFR1-Fab y -F(ab')2, así como también el AcM anti-EGFRI no conjugado se marcaron con tritio en los residuos de lisina de una parte de la proteína. El ensayo de internalización con los compuestos radiomarcados se realizó mediante el uso de líneas celulares de cáncer humano HNC, HSC-2 y FaDu, así como también en una línea celular HEK de control. Los resultados representan los compuestos internalizados más los unidos a la superficie celular, que ocurren cuando las células se incubaron a 37 °C. Los resultados (Tabla 4) indican que los conjugados de boro del anti-EGFR1-Fab y -F(ab')2 se internalizaron tan eficientemente como el AcM anti-EGFRI no conjugado por las células HSC-2 y FaDu. La internalización por las células HSC-2 fue 100 veces más fuerte que por las células FaDu, probablemente debido a la mayor cantidad de receptores EGFR1 en la superficie celular en las células HSC-2. La línea celular HEK de control mostró solo una internalización muy débil.
Tabla 4. Internalización de los conjugados de boro radiomarcados por las células HSC-2, FaDu y HEK. La cantidad de compuestos internalizados se calculó a partir de la cantidad total de radiactividad por pocillo y se normalizó con respecto a 100000 células. Los resultados son un promedio de tres determinaciones /- S.D.
HSC-2 FaDu HEK
Muestras % internalizado/100000 células
Anti-EGFR1-Fab-BSH(800B)-Dex 4,0±0,3 0,04±0,02 0,004±0,001
Anti-EGFR1-F(ab')2-BSH(800B)-Dex 5,4±1,0 0,06±0,02 0,006±0,001
Anti-EGFR1-AcM 5,0±0,5 0,04±0,02 0,007±0,001
Control-AcM 0,1±0,1 0,01±0,01 0,002±0,002
EJEMPLO 8. Experimentos in vivo con los conjugados marcados con tritio
Preparación de muestras de tejidos de ratón y de sangre para el conteo del líquido de centelleo
Los órganos de ratón pesados se disolvieron en 1 mL de solubilizante de tejidos (Solvable™, Perkin Elmer) por 0,2 g de tejido. Las muestras se incubaron durante toda la noche a 60 °C. Después, se añadieron 150 j l de H2O2 por 300 j l de órgano disuelto y las muestras se incubaron durante una hora a 60 °C. Los huesos se trataron primero con HCl 1 M durante toda la noche a 60 °C y después con Solvable y H2O2. La cantidad de radiactividad en los órganos se midió con un contador de centelleo en presencia de cóctel de líquido de centelleo (Ultima Gold Tlv1, Perkin Elmer). Los datos se presentan como el porcentaje de la dosis total inyectada en g de tejido. Los resultados son un promedio de tres ratones /- SEM. Dado que cada uno de los ratones tenía dos tumores, los resultados en los tumores son un promedio de seis determinaciones /- SEM.
Las muestras de sangre en las pruebas de aclaramiento se recolectaron en tubos Eppendorf y se midieron los volúmenes después de agregar 100 j l de Solvable y de incubar durante toda la noche a 60 °C. Después, se añadieron 100 j l de H2O2 y las muestras se incubaron durante una hora a 60 °C. La cantidad de radiactividad en las muestras de sangre se midió con un contador de centelleo en presencia de cóctel de líquido de centelleo (Ultima Gold, Perkin Elmer). Los datos se presentan como un porcentaje de la dosis total inyectada. Los resultados son un promedio de dos ratones. Aclaramiento en sangre de los conjugados de boro en ratones no portadores de tumores
Se usaron ratones adultos hembras de la misma edad (Harían HSD:Atímico desnudo Foxnlnu). Los conjugados de boro radiomarcados (3H) del anti-EGFR1-Fab y -F(ab')2 con una carga de boro de 800B y 300B se inyectaron por vía i.v. a través de la vena de la cola en 100 |jl de PBS. La dosis inyectada fue de 30 |jg = 1,3-2 x 106 cpm por ratón y se usaron dos ratones por muestra. Antes y después de la inyección en diferentes puntos de tiempo se recolectaron las muestras de sangre de aproximadamente 10 j l y se contó la radioactividad. Al final del experimento (48 horas) se sacrificaron los ratones y se recolectaron los órganos y se contó la radioactividad para determinar la biodistribución de los conjugados en los tejidos.
El estudio de aclaramiento en sangre en los ratones que no portaban tumores se realizó mediante el uso de conjugados de boro marcados con 3H del anti-EGFR1-Fab y -F(ab')2 con una carga de boro 800B y 300B. Se usaron dos cargas de boro diferentes para ver si la carga de boro tiene un efecto sobre la tasa de aclaramiento del conjugado de la circulación sanguínea. Los resultados indican que el aclaramiento sanguíneo de los conjugados de boro fue rápido e independiente de la carga de boro (Tabla 5). La tasa de aclaramiento fue comparable al aclaramiento de los fragmentos F(ab')2 y Fab correspondientes no conjugados (no mostrados). El estudio de distribución en los tejidos indicó que los conjugados de boro no se acumularon en ningún órgano a las 48 horas (no mostrado).
Tabla 5. Aclaramiento en sangre de los conjugados de boro en ratones no portadores de tumores. Los resultados son un promedio de dos determinaciones. El tiempo es el tiempo después de la administración (min) y los valores en % de la dosis total inyectada.
Anti-EGFR- Anti-EGFR- Anti-EGFR - Anti-EGFR
Hora Fab-BSH(300)- Fab-BSH(800)- Fab2-BSH(300)- Fab2-BSH(800)-Dex Dex Dex Dex
0 100,0 100,0 100,0 100,0
5 35,4 31,3 42,9 40,8
15 31,8 19,9 34,3 20,2
30 26,7 10,5 29,3 16,3
60 13,6 10,7 22,6 9,7
120 6,8 5,2 16,1 6,3
240 4,6 2,5 9,4 4,3
460 2,4 2,0 4,1 1,7
1440 0,9 0,8 1,7 1,1
2880 0,4 0,4 0,6
Biodistribudón de los conjugados de boro en ratones portadores de tumor HSC-2
Se usaron ratones adultos hembras de la misma edad (Harlan HSD:Atímico desnudo Foxn1nu). Se inocularon de dos y medio a tres millones de células HSC-2 (JCRP Cellbank, Japón) en 150 j l en medio EME y Matrigel al 50 % en ambos flancos de los ratones desnudos. La dosificación se administró cuando al menos un tumor por ratón creció hasta un tamaño de al menos 6 mm de diámetro (6 - 10 mm) correspondiente aproximadamente al volumen del tumor de 100­ 500 mm3. Los conjugados de boro radiomarcados (3H) (800B) del anti-EGFR1-Fab/F(ab')2 y el control-Fab/F(ab')2 se inyectaron por vía i.v. a través de la vena de la cola en 100 j l de PBS. La dosis inyectada fue de 50 jg = 1,3-2,6 x 106 cpm por ratón y se usaron tres ratones por muestra. Los ratones se sacrificaron en diferentes puntos de tiempo (24 horas, 48 horas y 72 horas) y los órganos se recolectaron y se contó la radioactividad para determinar la biodistribución de los conjugados en los tejidos.
La distribución de los conjugados de boro en los tejidos (Tabla 6) muestra que los conjugados de boro del anti-EGFR1-Fab y -F(ab')2 se acumularon en los tumores pero no en ningún otro órgano, mientras que los conjugados de boro del control no se acumularon significativamente en los tumores. La acumulación de los conjugados de boro del anti-EGFR1-Fab y -F(ab')2 en los tumores fue más alta a las 24 horas y disminuyó lentamente en los puntos de tiempo posteriores (48 horas y 72 horas).
Tabla 6. Biodistribución de los conjugados de boro en ratones portadores de tumor HSC-2. Los resultados representan un promedio de tres determinaciones /- SEM, excepto para los tumores que son un promedio de seis determinaciones /- SEM. Los valores son el % de la dosis total inyectada/g de órgano.
Anti-EGFR- Anti-EGFR-24 h Control-Fab- Control-Fab2-Fab-BSH(800)-Dex Fab2-BSH(800)- BSH(800)-Dex BSH(800)-Dex
Dex
Órgano
sangre 0,23±0,02 0,34±0,07 0,23±0,05 0,47±0,23
orina 0,16±0,07 2,22±0,9 0,94±0,05 3,03±1,16
hígado 0,34±0,03 0,28±0,03 0,26±0,07 0,29±0,14
riñón 0,28±0,01 0,31±0,04 0,24±0,05 0,32±0,15
pulmón 0,19±0,02 0,44±0,14 0,19±0,04 0,45±0,30
músculo 0,19±0,01 0,21±0,05 0,17±0,06 0,20±0,09
piel 0,23±0,02 0,31±0,03 0,22±0,04 0,29±0,15
tumor 1,00±0,08 0,75±0,15 0,32±0,60 0,57±0,27
48 h Anti-EGFR- Anti-EGFR-Control-Fab- Control-Fab2-Órgano Fab-BSH(800)- Fab2-BSH(800)- BSH(800)-Dex BSH(800)-Dex
Dex Dex
sangre 0,10±0,02 0,10±0,01 0,10±0,01 0,20±0,02
orina 0,36±0,11 0,46±0,04 0,28±0,17 1,00±0,32
hígado 0,23±0,04 0,18±0,03 0,15±0,01 0,14±0,03
riñón 0,17±0,02 0,14±0,01 0,15±0,02 0,17±0,01
pulmón 0,10±0,02 0,10±0,01 0,09±0,02 0,12±0,01
músculo 0,11±0,01 0,12±0,01 0,11±0,01 0,15±0,01
piel 0,12±0,01 0,14±0,01 0,11±0,04 0,18±0,02
tumor 0,41±0,06 0,58±0,06 0,21±0,03 0,29±0,02
72 h
Órgano Anti-EGFR- Anti-EGFR- Control-Fab- Control-Fab2-Fab-BSH(800)- Fab2-BSH(800)- BSH(800)-Dex BSH(800)-Dex
Dex Dex
sangre 0,06±0,01 0,08±0,01 0,08±0,01 0,10±0,01
orina 0,23±0,07 0,24±0,10 0,23±0,02 0,30±0,05
hígado 0,11±0,01 0,15±0,02 0,12±0,01 0,09±0,01
riñón 0,11±0,02 0,12±0,01 0,12±0,01 0,12±0,01
pulmón 0,05±0,01 0,06±0,01 0,05±0,01 0,08±0,01
músculo 0,07±0,01 0,10±0,02 0,09±0,01 0,08±0,02
piel 0,08±0,01 0,11±0,01 0,08±0,01 0,09±0,01
tumor 0,25±0,04 0,30±0,05 0,11±0,01 0,18±0,02
La distribución de los conjugados de boro en los tumores versus en la sangre en ratones con xenoinjerto de HSC-2 se calculó en diferentes puntos de tiempo (24 horas, 48 horas y 72 horas) (Tabla 7). La relación tumor/sangre fue 4-5 para el conjugado anti-EGFR1-Fab y 2-6 para el conjugado anti-EGFR1-F(ab')2. El anti-EGFR1-Fab-BSH-Dex alcanzó la relación máxima antes (24 horas) que el anti-EGFR1-F(ab')2-BSH-Dex (48 horas). La relación tumor/sangre de los conjugados de control permaneció a un nivel constante durante todo el estudio (aproximadamente 1-2).
Tabla 7. Distribución de los conjugados de boro tumores/sangre en ratones portadores de tumor HSC-2. Los resultados se basan en un promedio de tres determinaciones para las muestras de sangre y un promedio de seis determinaciones para los tumores (2 tumores por ratón) /- S.D.
Conjugado de boro 24h 48h 72h
Anti-EGFR-Fab-BSH(800B) 4,2±0,3 4,2±1,1 4,0±0,9
Anti-EGFR-Fab2-BSH(800B)-dex 2,2±0,3 6,1±1,4 3,8±1,0
Control-Fab-BSH(800B)-dex 1,5±0,3 2,2±0,5 1,5±0,3
Control-Fab2-BSH(800B)-dex 1,5±0,5 1,8±0,2 1,9±0,5
Biodistribución de los conjugados de boro en ratones portadores de tumor FaDu
Se usaron ratones hembras adultas de la misma edad (Charles River Crl:Atímico desnudo Foxn1nu). Se inocularon tres millones de células FaDu (ATCC) en 150 pl en medio EME y Matrigel al 50 % en ambos flancos de los ratones desnudos. La dosificación se administró cuando al menos un tumor por ratón creció hasta un tamaño de al menos 6 mm de diámetro (6 - 10 mm) correspondiente aproximadamente al volumen del tumor de 100-500 mm3. Los conjugados de boro radiomarcados (3H) (800B o 1200B) del anti-EGFR1-Fab/F(ab')2 y control-Fab/F(ab')2 se inyectaron por vía i.v. a través de la vena de la cola en 100 |jl de PBS. La dosis inyectada fue de 50 |jg = 2,3-2,7 x 106 cpm por ratón y se usaron tres ratones por muestra. Los ratones se sacrificaron en dos puntos de tiempo diferentes (24 horas y 48 horas) y los órganos se recolectaron y se contó la radiactividad para determinar la biodistribución de los conjugados en los tejidos.
El estudio de biodistribución en ratones portadores de tumor de xenoinjerto FaDu se realizó mediante el uso de los conjugados anti-EGFR1-F(ab')2-BSH(800B)-Dex y anti-EGFR1-Fab(800B o 1200B)-BSH-Dex y los conjugados de boro (800B) de control-F(ab')2 y -Fab. Los conjugados se marcaron radioactivamente (3H) en los residuos de lisina de una proteína. La radiactividad en las muestras de tejido, que incluye los tumores y la sangre, se contó en dos puntos de tiempo diferentes (24 horas y 48 horas). La distribución de los conjugados de boro en los tejidos (Tabla 8) muestra que los conjugados de boro del anti-EGFR1-Fab y -F(ab')2 se acumularon en los tumores pero no significativamente en ningún otro órgano, mientras que los conjugados de boro de control no se acumularon significativamente en los tumores. El control-F(ab')2-BSH(800B)-Dex puede encontrarse aún en la circulación sanguínea y en todos los órganos a las 24 horas, pero se aclaró de la circulación a las 48 horas. La acumulación de los conjugados de boro en el tumor de los anti-EGFR1-Fab y -F(ab')2 fue mayor a las 24 horas y disminuyó a las 48 horas.
Tabla 8. Biodistribución de los conjugados de boro en ratones portadores de tumor FaDu. Los resultados representan un promedio de tres determinaciones /- SEM, excepto para los tumores que son un promedio de seis determinaciones /- SEM. Los valores son el % de la dosis total inyectada/g de órgano.
24 h Anti-EGFR- Anti-EGFR- Anti-EGFR-Control-Fab-Órgano Fab- Fab- Fab2- BSH(800)- Control-Fab2-BSH(800)- BSH(1200)- BSH(1200)- Dex BSH(800)-Dex
Dex Dex Dex
sangre 0,34±0,03 0,13±0,01 0,10±0,01 0,20±0,02 0,52±0,05
orina 2,45±0,58 0,94±0,06 0,59±0,25 1,95±0,38 3,48±0,42
hígado 0,30±0,02 0,35±0,01 0,29±0,04 0,30±0,04 0,38±0,05
riñón 0,29±0,01 0,21±0,02 0,15±0,02 0,29±0,02 0,44±0,05
pulmón 0,15±0,01 0,11±0,01 0,09±0,02 0,18±0,01 0,32±0,04
músculo 0,15±0,01 0,16±0,02 0,11±0,01 0,19±0,01 0,24±0,03
piel 0,20±0,02 0,21±0,04 0,16±0,01 0,23±0,04 0,53±0,09
tumor 1,44±0,34 0,93±0,23 0,73±0,10 0,41±0,06 0,86±0,13
48 h Anti-EGFR- Anti-EGFR- Anti-EGFR-Control-Fab-Órgano Fab- Fab- Fab2- BSH(800)- Control-Fab2-BSH(800)
BSH(800)- BSH(1200)- BSH(1200)- Dex Dex
Dex Dex Dex
sangre 0,14±0,04 0,12±0,01 0,08±0,01 0,13±0,01 0,22±0,04
orina 0,77±0,07 0,33±0,05 0,42±0,08 0,66±0,09 1,05±0,15
hígado 0,17±0,03 0,14±0,03 0,18±0,04 0,16±0,01 0,15±0,03
riñón 0,14±0,01 0,12±0,02 0,12±0,02 0,17±0,01 0,17±0,02
pulmón 0,09±0,01 0,08±0,02 0,07±0,01 0,11±0,01 0,13±0,01
músculo 0,12±0,01 0,11±0,03 0,10±0,01 0,13±0,01 0,13±0,02
piel 0,11±0,01 0,08±0,02 0,09±0,01 0,13±0,01 0,16±0,01
tumor 0,70±0,11 0,39±0,13 0,31±0,04 0,19±0,02 0,24±0,04
La distribución de los conjugados de boro en los tumores versus la sangre en ratones portadores de xenoinjerto FaDu se calculó a las 24 horas y 48 horas (Tabla 9). La relación tumor/sangre fue de aproximadamente 7 para los conjugados anti-EGFR1-Fab y -F(ab')2 con 1200 boros a las 24 horas, y la proporción disminuyó a 3-4 a las 48 horas, lo que sugiere que la proteína marcada se degrada y se secreta fuera de las células. La relación tumor/sangre del conjugado anti-EGFR1-Fab con 800 boros fue de aproximadamente 4-5 en ambos puntos de tiempo. La relación de los conjugados de control se mantuvo en un nivel constante (aproximadamente 1-2).
Tabla 9. Distribución de los conjugados de boro en tumores/sangre en ratones portadores de tumor FaDu. Los resultados se basan en un promedio de tres determinaciones para las muestras de sangre y un promedio de seis determinaciones para los tumores (2 tumores por ratón) /- S.D.
Conjugado de boro 24h 48h
anti-EGFR-Fab-BSH(800)-dex 4,4±2,2 5,5±1,5
anti-EGFR-Fab-BSH(1200)-dex 6,9±2,8 3,4±2,0
anti-EGFR-Fab2-BSH(1200)-dex 7,6±1,7 4,2±1,1
control-Fab-BSH(800)-dex 1,8±0,5 1,5±0,2
control-Fab2-BSH(800)-dex 1,7±0,4 1,2±0,4
EJEMPLO 9. Cuantificación de boro en el BSH-Dextrano por espectrometría de masas de plasma acoplado inductivamente (ICP-MS) (mol de boro por mol de BSH-Dextrano)
La carga de boro del BSH-dextrano se estimó a partir del espectro de RMN de protón del BSH-dextrano (Figura 1) y se usó ICP-MS para cuantificar la cantidad de boro en las muestras. Se estimó que la muestra de BSH-Dextrano analizada en este ejemplo contenía aproximadamente 1200 boros según el análisis de RMN. Aproximadamente 2,1 |jg (0,0228 nmol) del BSH-Dextrano (MW promedio 92 kDa) se licuaron con cenizas húmedas con la ayuda del microondas y se analizaron mediante ICP-MS esencialmente como se describe en Laakso y otros, 2001, Clinical Chemistry 47, 1796­ 1803. Diferentes diluciones de la muestra se analizaron mediante ICP-Ms y el boro de fondo se sustrajo de las muestras. Los resultados que representan un promedio de 7 determinaciones indican que la muestra contiene aproximadamente 0,341 jg (31,5 nmol) de átomos de boro, o un mol del BSH-Dextrano contiene 1381 moles de átomos de boro.
EJEMPLO 10. Experimentos in vivo y cuantificación de boro
Se usaron ratones hembras adultas de la misma edad (Charles River Crl:Atímico desnudo Foxn1nu). Se inocularon 2,3 millones de células HSC-2 o 5 millones de células FaDu en 150 j l en medios EME y 50 % de Matrigel en el flanco derecho de los ratones desnudos. La dosis se administró cuando el tumor creció hasta un tamaño de al menos 6 mm de diámetro (6 - 10 mm) correspondiente aproximadamente al volumen del tumor de 100-500 mm3. Los conjugados Anti-EGFR-Fab-BSH(1200)-dex o anti-EGFR-F(ab')2-BSH(1200)-dex (ambos no marcados) se inyectaron i.v. a través de la vena de la cola en 100 j l de PBS. La dosis inyectada fue de 50 jg o 250 jg por ratón y se usaron tres ratones por muestra. Los ratones se sacrificaron a las 24 horas y 48 horas y se recolectaron los órganos para la determinación de boro.
Las muestras de tejido (que incluye la sangre) se digirieron en recipientes cerrados de teflón en un horno de microondas (Milestone, ETHOS 1200). La temperatura de digestión fue de 200 °C y la duración de la digestión fue de 50 minutos. El ácido usado en las digestiones fue HNO3 (6,0 mL, E. Merck, Suprapur). Después de enfriar, la solución resultante se diluyó hasta 25 mL con agua Milli-Q. Las muestras digeridas se diluyeron adicionalmente (1:10 o 1:50) con HNO3 1% para el análisis de ICP-MS. Se añadió el berilio estándar interno a la muestra para obtener la concentración final, 10 ppb de Be, en las muestras. Las soluciones estándar con concentraciones de 1, 5, 10 y 20 jg/L para los análisis se diluyeron a partir de la solución estándar de un solo elemento Spectrascan (1000 ug/mL de boro como H3BO3 en H2O). La muestra de control para el análisis se preparó a partir de una solución estándar de elementos múltiples mediante SPEX (CLMS-4). Los análisis se realizaron con el espectrómetro de masas de plasma acoplado inductivamente en campo sectorial de alta resolución (HR-ICP-MS, Element2, Thermo Scientific). La concentración de boro en muestras diluidas se definió a partir de los picos de 10B y 11B, tanto en modo de baja resolución (R “ 300) como de resolución media (R “ 4000). Entre las muestras, el sistema de introducción de muestras se lavó primero con HNO35 % y después con HNO31 % para excluir el efecto de memoria típico del boro.
El análisis inicial de boro de dos ratones portadores de tumor HSC-2 a las 24 horas indicó que las relaciones del boro del tumor por músculo fueron 5,3 y 6,3.
El músculo se usó como tejido de control en lugar de sangre porque las mediciones iniciales de boro de la sangre no fueron concluyentes o superaron el límite de detección.
EJEMPLO 11. En experimentos in vivo con anti-EGFR1 Fab BSH-dextrano marcado con 14C
Preparación del anti-EGFRI Fab BSH-dextrano
Se preparó BSH-dextrano como se describió en los Ejemplos 1 y 2, respectivamente. Según el análisis de RMN, el BSH-dextrano contenía aproximadamente 650 boros. La oxidación se realizó como se describió en el Ejemplo 3 pero en dos lotes; uno con 50 mg y el otro con 100 mg de BSH-dextrano.
Los fragmentos Fab anti-EGFR1 se prepararon mediante digestión con papaína como se describió en el Ejemplo 5. Las reacciones de conjugación se realizaron como en el Ejemplo 4 pero en cuatro lotes: 1) 29 mg de BSH-dextrano oxidado y 10,4 mg del Fab anti-EGFRI, 2) 16,5 mg de Dextrano BSH oxidado y 5,9 mg del Fab anti-EGFRI, 3) 50 mg BSH-dextrano oxidado y 19,8 mg del Fab anti-EGFR1,4) 50 mg de dextrano BSH oxidado y 19,7 mg del Fab anti-EGFR1 que producen juntos 55,8 mg del Fab anti-EGFR1. Todos se analizaron en SDS-PAGE como en el Ejemplo 6 y las muestras de cada uno se marcaron con Alexa Fluor 488-NHS. El ensayo de internalización con moléculas marcadas con Alexa Fluor 488 se realizó con las células HSC-2 como se describió en el Ejemplo 7.
Se combinaron lotes del Fab-BSH-dextrano sin marcar para producir 39 mg del Fab BSH-dextrano anti-EGFR1. El tampón de muestra se cambió a manitol 5 % - Tween80 0,1 % en PBS antes de combinar el no marcado y el anti-EGFR1 Fab BSH-dextrano marcado con 14C y filtración estéril posterior.
Preparación de anti-EGFRI Fab BSH-dextrano marcado con 14C
3 mg del Fab-BSH-dextrano (antes de la protección con etanolamina) se marcaron con 14C mediante la incubación con 66 |jC¡ de 14C-etanolamina (American Radiolabeled Chemicals Inc.) en PBS que contiene NaCNBH3 (como en el Ejemplo 4) o/n después de lo cual se terminó la protección con etanolamina no radioactiva durante 2 horas, y los reactivos de bajo peso molecular se eliminaron como se describió en el Ejemplo 4. Esta reacción resultó en anti-EGFR1 Fab BSH-dextrano marcado con 14C que contenía 9,21 j C¡ de radiactividad.
Para el estudio en animales el anti-EGFR1 Fab BSH-dextrano marcado con 14C se mezcló con anti-EGFR1 Fab BSH dextrano no marcado “frío” en porciones que se muestran en la Tabla 10.
Tabla 10. Preparación de materiales de prueba.
Figure imgf000032_0002
Experimento in vivo con anti-EGFR1 Fab BSH-dextrano marcado con 14C
Se generaron ratones portadores de xenoinjerto como se describió en el Ejemplo 8, excepto porque las células HSC-2 se inocularon en el flanco derecho y porque se administró la dosis cuando el tumor había crecido al menos hasta un diámetro de 8 mm (8 - 12 mm) correspondiente aproximadamente al volumen tumoral de 200 -800 mm3. Los conjugados de boro anti-EGFR1-Fab radiomarcados (14C) se inyectaron por vía i.v. a través de la vena de la cola o mediante inyección intratumoral (Grupo X) en 100 j l de PBS que contenía manitol 5 % y polisorbato 0,1 % (los grupos de estudio se enumeran en la Tabla 10). Se usaron tres ratones por muestra. A cada ratón se le administraron aproximadamente 400 000 cpm del conjugado (ver anteriormente la preparación de los conjugados anti-EGFR1 Fab BSH dextrano para el estudio en animales; Tabla 10). Los ratones se sacrificaron a las 24 horas o 48 horas (Grupo IX) y los órganos se recolectaron y se contó la radioactividad para determinar la biodistribución de los conjugados en los tejidos. Además, se recolectaron muestras de sangre a los 30 min, 2 horas y 8 horas después de la administración de los conjugados de boro.
Los tejidos se prepararon para la cuantificación de 14C como se describió en el Ejemplo 8. Las muestras de sangre en las pruebas de aclaramiento se prepararon como en el Ejemplo 8 con la excepción de que se usaron 200 j l de Solvable y 90 j l de H2O2. Los resultados son un promedio de tres ratones.
La Tabla 11 muestra las relaciones de tumor a sangre para los ratones administrados con el conjugado anti-EGFR1 Fab dextrano marcado con 14C.
Tabla 11. Relación tumor/sangre del conjugado de boro 14C en ratones portadores de tumor HSC-2. El valor para el G IX es la relación tumor/cerebro ya que se determinó que la radioactividad en la sangre era del 0 % (todas las muestras de sangre fueron negativas después de deducir los niveles de fondo). Grupo I: 250 |jg; Grupo II: 500 |jg; Grupo III 1000 jg; Grupo IV: 1500 jg ; Grupo V: 2000 jg ; Grupo X: 250 jg ; Grupo VIII: 250 jg 250 jg después de 2 horas; y Grupo IX: 250 jg 250 jg después de 24 horas. Todos los grupos se administraron por vía iv excepto el Grupo X que se administró intratumoral. Los órganos se recolectaron a las 24 horas excepto el Grupo IX a las 48 horas. Relación tumor/sangre del Grupo VIII de un ratón (debido a la presencia de un valor de cpm en sangre en el grupo).
Figure imgf000032_0001
Tabla 12. Aclaramiento en sangre de los conjugados de boro 14C en los tres grupos. La columna izquierda muestra el tiempo después de la administración (min/hora) y los valores son el % de la dosis total inyectada/g de sangre.
Figure imgf000033_0001
EJEMPLO 12. Experimentos in vivo con anti-EGFR1 Fab BSH-dextrano mediante cuantificación directa de boro Preparación del anti-EGFRI Fab BSH-dextrano
El anti-EGFR1 Fab BSH-dextrano se preparó como se describió en los Ejemplos 1 y 2, respectivamente. La oxidación se realizó como se describió en el Ejemplo 3 pero en dos lotes; uno con 80 mg, el otro con 96 mg de BSH-dextrano. Según los análisis de RMN, las muestras del BSH-dextrano contenían aproximadamente 880 y 500 boros, respectivamente.
Los fragmentos Fab anti -EGFR1 se prepararon mediante digestión con papaína como se describió en el Ejemplo 5. Las reacciones de conjugación se realizaron como en el Ejemplo 4 pero en cuatro lotes: dos con 15,7 mg del Fab anti-EGFR1 y 40 mg de ox-BSH-dextrano, otros dos con 18,8 mg del Fab anti-EGFR1 y 48 mg de ox-BSH-dextrano.
Todos los conjugados de boro se analizaron en SDS-PAGE como en el Ejemplo 6 y se marcaron con Alexa Fluor® 488-NHS. El ensayo de internalización con células HSC-2 se realizó con las moléculas marcadas con Alexa Fluor como se describió en el Ejemplo 7.
El tampón de muestra se cambió a manitol 5 % - Tween80 0,1 % en PBS antes de la preparación de la muestra de prueba para el ratón y la filtración estéril.
Experimento in vivo con anti-EGFR Fab BSH-dextrano
Se generaron ratones portadores de xenoinjerto como en el Ejemplo 11. El anti-EGFR Fab BSH-dextrano se administró en 100 |jl de solución de manitol/Tween/PBS i.v. o en 40 j l de solución de manitol/Tween/PBS por vía intratumoral (i.t.). En la administración i.t., la aguja se pasó al tumor a través de un único sitio de inyección y se movió en una técnica de abanico para distribuir la sustancia de prueba por todo el tumor. En dependencia del tamaño y la forma del tumor, se usó un total de tres o cuatro pasadas.
Los órganos se recolectaron a las 24 horas y las muestras de sangre se recolectaron a los 30 min, 2 horas y 8 horas (grupos de estudio II y V).
Cuantificación de boro
Los tejidos se prepararon para la cuantificación directa de boro mediante ICP-MS como se describió anteriormente. Además, se digirieron tres muestras de control que contenían ~ 50 mg del estándar de referencia NIST, 1573 hojas de tomate. Las muestras digeridas se diluyeron a 1:10 o 1:100.
La tabla 13 ilustra el boro en órganos seleccionados y la tabla 14 muestra las relaciones tumor a sangre. La administración intratumoral muestra una concentración de boro tumoral considerablemente mayor en comparación con la administración iv.
Tabla 13. Biodistribución de los conjugados Fab BSH-dextrano anti-EGFR1 en ratones portadores de tumor HSC-2 mediante cuantificación de boro. Los resultados representan un promedio de cuatro determinaciones /- SEM. Los grupos de estudio fueron: Grupo I: tampón solamente (manitol/Tween/PBS) i.v.; Grupo II: 2 mg i.v.; Grupo III: 2 mg dextrano i.v.; Grupo IV: 250 jg i.t.; Grupo V: 2 mg i.t. Los valores son jg de boro en g de órgano. Se realizó la prueba t de Student (mediante el uso del programa informático Statistica 12[StatSoft]) para los valores de boro del tumor de los grupos II vs III y para los grupos Iv vs V. Los grupos IV y V mostraron diferencias significativas entre las cantidades de boro (valor de p = 0,009).
Figure imgf000034_0002
Tabla 14. Relaciones de tumor a sangre /- SEM.
Figure imgf000034_0003
EJEMPLO 13. Producción del Fab anti-EGFRI en E. coli
Optimización del péptido señal para la secreción periplásmica del Fab anti-EGFR1
La estrategia de expresión para el Fab anti-EGFR1 estaba dirigida al periplasma, donde pueden formarse puentes disulfuro estables.
El conjunto de vectores comerciales pDD441-SSKT (promotor T5, selección de kanamicina) se usó para la optimización del péptido señal. Se usaron los siguientes péptidos señal: i) MalE (proteína de unión a maltosa), ii) pelB (pectato liasa), iii) ompA (proteína de membrana externa A), iv) phoA (fosfatasa alcalina bacteriana) y v) gIII (glicoproteína de envoltura de PRV). Los vectores pGF115 - pGF119 se construyeron mediante el uso de secuencias de ADN sintéticas, amplificación por PCR con polimerasa de alta fidelidad y ensamblaje continuo de Gibson como herramientas de rutina. Además, se construyó el vector pGF150 con péptido señal stII (enterotoxina II estable al calor) para la cadena pesada y ligera de acuerdo con Carter y otros, 1992: High level E. coli expression and production of bivalent humanized antibody fragment, Biotechnology (N Y), 10(2) 163-7. El vector pGF150 era dicistrónico y tenía el promotor T7 para la expresión. El casete de expresión para el Fab anti-EGFR1 era dicistrónico con un sitio interno de unión al ribosoma entre la cadena pesada y la ligera. La configuración del vector de expresión general para la optimización del péptido señal se ejemplifica en la Figura 5. Las combinaciones de péptidos señal en los vectores pGF115 - pGF119 se enumeran en la Tabla 15. Tabla 15. Combinaciones de péptidos señal en los vectores pGF115 - pGF119.
Figure imgf000034_0001
Las células E. coli W3110 (colección de microbiología ATCC) electrocompetentes se transformaron con los vectores pGF115 - pGF119 con Biorad GenePulser, pulsado con el programa Ec2 de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las transformaciones se sembraron en placas con LB agar kanamicina 25 mg/L y se cultivaron durante toda la noche a 37 °C.
Las colonias individuales se sometieron a selección de la expresión de acuerdo con el protocolo estándar. En el día 1, se inocularon precultivos durante toda la noche en 5 mL de LB líquido suplementado con kanamicina con una concentración final de 20 mg/L, se cultivaron con agitación a 220 rpm, 37 °C. En el día 2, 200 pL de precultivo o/n se volvieron a inocular en 10 mL de LB líquido kanamicina 10 mg/L. El cultivo continuó con agitación 220 rpm, 37 °C, hasta que la OD600 alcanzó el nivel 0,6 - 0,9. La producción del Fab se indujo con IPTG, a una concentración final de 500 pM. El cultivo continuó con agitación 220 rpm, 20 °C, durante toda la noche. Se recolectaron muestras de 1 mL de los puntos de tiempo post-inducción 4 horas y o/n. Las células se cosecharon por centrifugación 8000 x G 10 min, se desechó el sobrenadante, el sedimento se suspendió a 100 |jl de TE 10 x pH 7,5 (Tris-HCl 100 mM, EDTA 10 mM). Las muestras se sometieron a agitación en vortex vigorosamente 1 hora a temperatura ambiente, se centrifugaron a 16000 x G 10 minutos y el sobrenadante se recolectó en un tubo Eppendorf nuevo como un extracto periplásmico.
Los extractos periplásmicos se analizaron posteriormente mediante transferencia Western. Se mezclaron 100 j l de extracto con 20 j l de tampón de carga reductor o no reductor. Se cargaron 20 j l de mezcla en gel Precise Tris-Glicina SDS-Page 4-20 % (Thermo Scientific). El gel se corrió en tampón de corrida Laemmli 1 x, 200 V ~ 45 min y se transfirió a una membrana de nitrocelulosa en tampón de transferencia Tris-Glicina, 350 mA ~ 45 min. Se usó el sistema BioRad Mini-protean para SDS-Page y para la transferencia. La membrana transferida se bloqueó con BSA al 1 % en PBS. La detección se realizó con IgG antihumana (específica del Fab) con conjugado de peroxidasa (Sigma Aldrich; cat. núm. A0293) y sustrato Luminata Forte Western h Rp (Millipore; cat. núm. WBLUF0500). La reacción de quimioluminiscencia se detectó con el analizador Fujifilm Luminescent Image LAS4000.
De acuerdo con los análisis de transferencia Western de varios cultivos de expresión, los vectores y pGF119 pGF115 parecían ser mejor que los demás. Sin embargo, la cantidad del Fab producida en el periplasma se mantuvo en el nivel de 0,3 - 0,8 mg/L en estos experimentos iniciales. La combinación usada en el vector pGF119 (péptido señal ompA para HC y péptido señal pelB para LC) se seleccionó para la continuación.
El vector pGF150 con el promotor T7 y la secuencia señal stII para el direccionamiento periplásmico de la cadena pesada y de la cadena ligera del Fab anti-EGFR1 se transformó en la cepa BL21(De3). En comparación con otros, parecía al menos tan bueno como pelB para la cadena ligera y ompA para la cadena pesada, como se usó en el vector pGF119.
Optimización del promotor para la expresión del Fab
En las evaluaciones preliminares se usaron tres promotores diferentes; T5 inducible por IPTG, T7 inducible por IPTG y Rham inducible por ramnosa. Las secuencias promotoras se originaron a partir de los vectores comerciales pET-15b, pD441 y pD881. Se usaron péptidos señal ompA para HC y pelB para LC. Los casetes de expresión se construyeron de manera dicistrónica, sitio de unión al ribosoma interno faaGGATCCGAATTCAAGGAGATAAAAAafg (SEQ ID NO: 22) entre la cadena pesada y la ligera en cada vector. Los códigos de los vectores y los promotores se presentan en la Tabla 16.
Tabla 16. Optimización del sistema promotor para la expresión del Fab; códigos de los vectores y los promotores usados.
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pGF119 y pGF132 se electroporaron en E. coli cepa W3110 como se describió anteriormente. Las células E. coli BL21(De3), químicamente competentes (New England Biolabs), se transformaron con el vector pGF121 con el promotor T7 de acuerdo con el protocolo de choque térmico proporcionado por el proveedor. Se realizaron cultivos de expresión, preparación de muestras y análisis de extractos periplásmicos como se describió anteriormente. Se realizó la primera comparación entre las cepas W3110 pGF119 y BL21(De3) pGF121. Los extractos periplásmicos se hicieron en paralelo con tampón 10XTE y con tampón de desoxicolato al 0,05 %.
Como se ejemplificó en la Figura 6, el promotor T7 fue ligeramente mejor que el promotor T5, aunque la diferencia no fue muy notable. Los experimentos repetidos con las cepas W3110 pGF119 y BL21(De3) pGF121 revelaron de todos modos que los cultivos de expresión con BL21(De3) pGF121 eran más estables y reproducibles que con W3110 pGF119. Se lograron tasas de crecimiento más rápidas y mayores densidades celulares con BL21(De3) pGF121 que con W3110 pGF119 (datos no mostrados).
La segunda etapa en la selección del promotor fue analizar los niveles de expresión preliminares de cultivos a pequeña escala con W3110 pGF132 (promotor inducible por ramnosa). Una de las ventajas del promotor inducido por ramnosa es que el nivel de expresión puede ajustarse variando la concentración de ramnosa. Con algunas proteínas de interés, el nivel de expresión más bajo ha conducido realmente a títulos globales más altos debido al plegamiento y ensamblaje correcto de la proteína diana y a una mayor densidad celular de la cepa de producción. Como resultado de lo anterior, la inducción se realizó con concentraciones crecientes de ramnosa en cultivos paralelos de 10 mL de LB líquido (0, 0,25 mM, 1 mM, 4 mM y 8 mM). Se usaron tres temperaturas diferentes después de la inducción; 20 °C, 28 °C y 37 °C. Se cosecharon muestras de 1 mL en el punto de tiempo de 4 horas después de la inducción. El muestreo, la extracción periplásmica y el análisis se realizaron como se describió en el ejemplo 1.
Como se muestra en la Figura 7, el nivel de expresión con el promotor inducible por ramnosa permaneció por debajo del nivel alcanzado con BL21(De3) pGF121 (promotor T7). La regulación del promotor con concentraciones crecientes de ramnosa fue más funcional a 20 °C. De cualquier manera, los títulos más altos con el sistema ramnosa se lograron a 28 °C.
En base a los experimentos repetidos descritos anteriormente, el sistema promotor BL21(De3) y T7 se seleccionaron como una plataforma básica para la producción del Fab anti-EGFR1 en E. coli.
Optimización de codones del Fab anti-EGFR1 para la expresión en células de E. coli
Se evaluaron tres secuencias HC/LC con diferentes patrones de optimización de codones para E. coli y una secuencia HC/LC optimizada originalmente para células CHO. Los vectores se construyeron como se describió para pGF119, de manera dicistrónica y el promotor T5 que conduce la expresión. El huésped de expresión fue E. coli W3110. Se realizaron cultivos a pequeña escala, muestreo y análisis de extractos periplásmicos como se describió anteriormente. La secuencia en el vector pGF119 se seleccionó como nivel de referencia. El patrón de optimización de codones tuvo un efecto drástico en el nivel de expresión (Tabla 17). Las secuencias de E. coli versión 2 (pGF128) y células CHO optimizadas (pGF126) no funcionaron en la cepa huésped W3110, solo se detectaron trazas del Fab de los cultivos de expresión mediante transferencia Western. El nivel de expresión alcanzado con E. coli versión 3 (pGF129) fue significativamente mejor, pero aún similar a los niveles de referencia. Debido a que la mayoría de los vectores ya estaban hechos con E. coli versión 1 (pGF119) y debido a que no se realizaron mejoras en comparación con la referencia mediante el cambio del patrón de optimización de codones, se seleccionaron para usar las secuencias de E. coli versión 1 del vector pGF119 (SEQ ID NO: 10 y SEQ ID NO: 11).
Tabla 17. Evaluación de las secuencias codificantes del Fab anti-EGFR1 con diferentes patrones de optimización de codones. Vector codificante y resultados.
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Comparación de la configuración dicistrónica con la configuración dual vector promotor
En la configuración del vector dicistrónico, la secuencia espaciadora entre la cadena pesada y la ligera, que incluye el sitio de unión al ribosoma, es relativamente corta, solo 25 nucleótidos en el pGF119. Para expandir este espacio entre la cadena pesada y la ligera, se construyeron los vectores pGF120 y pGF131, en los que ambas cadenas se expresaron bajo el control de los promotores T5 o T7 separados, respectivamente. Los vectores se construyeron mediante el uso de las secuencias existentes en el vector dicistrónico pGF121. Una vez completado, el pGF120 se electroporó en la cepa W3110 y las células E. coli, químicamente competentes BL21(De3) y Lemo21(De3), se transformaron con el pGF131. Se realizaron evaluaciones de la expresión a pequeña escala como anteriormente y se hizo una comparación entre vectores promotores dicistrónicos y duales (pGF119 vs pGF120; pGF121 vs pGF131).
Como se demostró en la Figura 8, el promotor dual T5 fue claramente más eficiente para la producción del Fab anti-EGFR1 que la configuración dicistrónica. Con el promotor T7, la diferencia no era tan clara, pero se notó que había una mayor cantidad de cadena Fab no ensamblada presentada con un sistema de promotor dual que con una configuración dicistrónica. La siguiente etapa de optimización planeada fue aplicar plásmidos auxiliares de chaperonas a la cepa de expresión para promover el plegamiento y ensamblaje correcto. La configuración del promotor dual con el promotor T7 (vector pGF131) se seleccionó para la continuación.
Construcción de plásmidos auxiliares de chaperonas
Para mejorar la expresión del Fab, se seleccionaron las chaperonas periplásmicas y citoplasmáticas para la expresión conjunta con el vector pGF131. Como un vector principal para plásmidos auxiliares de chaperonas, se seleccionó pCDF-1b (Novagen). pCDF-1b tiene promotor T7, operador lac, origen de replicación derivado de CloDF13 y resistencia a antibióticos estreptomicina/espectinomicina. Es compatible para la expresión conjunta con vectores pET, y por esa razón es adecuado para expresarse junto con pGF133 que tiene una cadena principal pET-15b.
Las secuencias de chaperona se amplificaron por PCR a partir de ADN genómico de E. coli con PCR y polimerasa de fusión de alta fidelidad (Thermo Scientific). Los fragmentos amplificados se clonaron en el esqueleto de pCDF-1b mediante el uso de la digestión/ligación tradicional de clonación y el ensamblaje continuo de Gibson. La configuración de los plásmidos auxiliares de chaperonas se describe con más detalles en las tablas 18-20. 5 - 7.
Tabla 18. Estrategia de clonación de los plásmidos auxiliares de chaperonas pGF134, pGF135, pGF137, pGF138.
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Tabla 19. Secuencias de cebadores usadas para la construcción de los plásmidos auxiliares de chaperona.
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Tabla 20. Chaperonas usadas.
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Coexpresión del Fab anti-EGFR1 con plásmidos auxiliares
Las células BL21(De3) y Lemo21(De3) químicamente competentes se transformaron con el vector pGF131 de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se seleccionaron pocos clones y se verificó la expresión del Fab anti-EGFR1 mediante cultivos de expresión preliminares, como se describió anteriormente. Se seleccionaron los mejores clones como fondo para la expresión conjunta con plásmidos auxiliares de chaperona.
Las células electrocompetentes BL21(De3) pGF131 y Lemo21(De3) pGF131 se construyeron como sigue. Se cultivaron 5 mL de precultivo o/n en LB líquido suplementado con kanamicina 20 mg/L. El día 2, se volvió a inocular 1 mL de precultivo en 50 mL de LB líquido con kanamicina 20 mg/L. El cultivo continuó a 37 °C 220 rpm ~ 3 horas, hasta que la OD600 alcanzó el nivel 0,5. Las células se cosecharon por centrifugación, 10 min 8000 x g y se suspendieron en 10 mL de glicerol al 10 % enfriado con hielo. Se repitió la cosecha por centrifugación, seguida de suspensión en 5 mL de glicerol al 10 % enfriado en hielo. Las células se dividieron en alícuotas de 10 x 500 ul y se almacenaron a -80 °C. Los plásmidos auxiliares de chaperona pGF134 y pGF135 se electroporaron en las cepas BL21(De3) y Lemo21(De3) con BioRad Gene Pulser, programa Ec2. La mezcla se sembró en placas de LB km stre después de un precultivo corto a 37 °C y las placas se cultivaron a 37 °C durante toda la noche. Los cultivos de expresión preliminares se hicieron como anteriormente.
Como se ejemplificó en la Figura 9, la chaperona SKP tiene un efecto claramente beneficioso sobre la producción, pero la diferencia con la cepa de fondo que alberga solo el plásmido de expresión pGF131 no fue notable. De cualquier manera, los clones con plásmido auxiliar de chaperona tendieron a crecer más rápido y alcanzar mayores densidades celulares. Los cultivos con plásmido auxiliar de chaperona pGF134, además, fueron más reproducibles y estables. No hubo diferencias entre los plásmidos auxiliares de chaperonas periplásmicos pGF4134 (chaperona s Kp ) y pGF135 (chaperonas SKP y FkpA). La expresión de las chaperonas citoplasmáticos DnaK/J GrpE del plásmido auxiliar pGF138 no mejoró adicionalmente el nivel de expresión. Por esa razón las cepas de Lemo21(De3) pGF131 pGF134 y BL21(De3) pGF131 pGF134 se seleccionaron para la continuación y para el desarrollo del proceso de fermentación. Anti-EGFR de cadena única
El vector de expresión pGF155 para el ScFv anti-EGFR1 con secuencia señal ompA (SEQ ID NO: 13) se construyó y se amplificó por PCR con polimerasa de alta fidelidad y ensamblaje de Gibson en el esqueleto pET-15b. En la construcción, los polinucleótidos codificantes de la región variable de la cadena ligera y de la región variable de la cadena pesada se separaron mediante la secuencia de enlace/espaciadora G4S (SEQ ID NO: 29) que codifica la secuencia enlazadora de 15 mer establecida en la SEQ ID NO: 30.
La cepa de fondo BL21(De3) se transformó con el vector pGF155 solo o en combinación con plásmidos auxiliares de chaperona, y los niveles de expresión se evaluaron en base a cultivos preliminares de 10 mL.
Producción del Fab anti-EGFR1 en la cepa de E. coli cultivada con fermentador (BL21[DE3]pGF131pGF134); cultivo suplementado con extracto de levadura.
Inoculación
Se inocularon varias (5-8 colonias) colonias de E. coli (BL21[DE3]pGF131pGF134) de la placa de agar LB en 5 mL de medio líquido LB suplementado con kanamicina (25 mg/L) y estreptomicina (30 mg/L). El inóculo (1er inóculo) se incubó a 37 °C, 220 rpm, durante 5 horas. Se usó 1 mL de 1er inóculo para inocular 100 mL de medio de cultivo de inóculo (abajo) suplementado con kanamicina (25 mg/L) y estreptomicina (30 mg/L) en un frasco de agitación de 500 mL (2do inóculo). El 2do inóculo se incubó a 37 °C, 220 rpm, <16 horas. Se transfirieron 10 mL de segundo inóculo en 100 mL de medio de cultivo Inóculo (abajo) suplementado con kanamicina (25 mg/L) y estreptomicina (30 mg/L) en un frasco de agitación de 500 mL (3er inóculo). El 3er inóculo se incubó a 37 °C, 220 rpm, hasta alcanzar la OD600 ~ 2,0 y este inóculo se usó para inocular 900 mL de medio de cultivo por Lotes de Fermentador (abajo) suplementado con kanamicina (25 mg/L) y estreptomicina (30 mg/L) en el recipiente de cultivo de fermentador (2 L) que resultó en un volumen final de 1000 mL y un valor de OD600 de 0,2.
Tabla 21. Componentes del medio de cultivo de inóculo (elementos metálicos traza[TME] de FeCh x 6 H2O to MgSO4 x 7 H2O).
Reactivo Mw (g/mol) mg/L c (mmol/L)
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Tabla 22. Medio de Cultivo por Lotes de Fermentador (elementos metálicos traza[TME] de FeCl3 x 6 H2O to MgSO4 x 7 H2O).
Reactivo Mw (g/mol) mg/l c(mmol/l)
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Fase de fermentación por lotes
Después de inocular el recipiente de cultivo de fermentador, se establecieron los siguientes parámetros mediante el uso de la unidad de control digital Biostat®B Plus:
-temperatura 37 °C
-pH 6,8 (12,5 % NH3, H3PO415 %)
-pO2 (modo en cascada) > 25 %
-Tasa de agitación 15 % - 75 % (=300 rpm - 1500 rpm)
-Flujo de gas (aire) 13 % - 50 % (= 0,4 L - 1,5 L)
En el punto de tiempo ~ 8,5 horas de la fase del lote de fermentación, el valor de DOT (Tensión de oxígeno disuelto) alcanzó su punto máximo bruscamente, lo que redujo la velocidad de agitación y el flujo de gas. Esto indicó el agotamiento de la glucosa presente en el medio de cultivo en lotes (25 g/L) y el final de la fase de fermentación por lote. Se alcanzó el valor de OD60031 durante la fase de fermentación por lote.
Fase de alimentación por lotes de fermentación
Se bombeó FS (solución de alimentación) 1.1 (Glc 67 %, MgSO42 %) en el recipiente de cultivo del fermentador durante 6 horas 20 min, 0,24 mL/min. Durante esta fase del lote alimentado FS 1.1, se alcanzó el valor OD60070.
Se bombeó FS 1.2 (Glc 50 %, MgSO4 1,5 %, 7,4 g/100 mL de extracto de levadura, 15 veces la concentración de TME[elementos metálicos traza] en comparación con el medio de cultivo por lotes de fermentador, 0,32 g/L de tiamina) en el recipiente de cultivo de fermentador durante 7 horas, 0,24 mL/min. Se alcanzó el valor OD600 134. En este punto, la velocidad de bombeo se redujo a 0,13 mL/min durante 11 horas 40 min. El valor de OD600 no aumentó de 134. Además, se realizó otra corrida de fermentador sin suplementar con extracto de levadura y esta corrida de fermentador resultó en aproximadamente 20 mg/L del Fab anti-EGFR1 como se estimó con el análisis de transferencia Western como se muestra más abajo.
Durante la fase de alimentación en lote, se siguió la concentración de glucosa en el cultivo en suspensión mediante el uso de barras Keto-diabur-test 5000 (Roche, Cat #: 10647705187) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Inducción de síntesis de proteínas
Antes de la inducción de la síntesis de proteínas con IPTG, la temperatura de cultivo se redujo de 37 °C a 20 °C. La inducción de la síntesis de proteínas con IPTG (concentración final de IPTG 1 mM) se realizó a un valor de OD600 de 86. La inducción de la síntesis de proteínas se realizó durante 16 horas.
Recolección de las muestras durante la ronda de fermentación
Se recolectaron muestras para análisis por transferencia Western (muestra de pellet de 2 X 1 mL y muestra de sobrenadante de 2 X 1 mL) en diferentes puntos de tiempo. Se tomaron muestras previas a la inducción justo antes de la inducción de la síntesis de proteínas con IPTG. Se recolectó otro conjunto de muestras a las 4 horas del punto de tiempo de inducción. El último conjunto de muestras se recolectó en el punto de tiempo de inducción de 16 horas antes de la cosecha del cultivo. Las células se centrifugaron en las muestras (+4 °C, 5000 X g, 15 min) y los sobrenadantes se transfirieron a tubos nuevos. Las muestras se almacenaron a -20 °C hasta que se analizaron mediante el uso del método de transferencia Western.
Cosecha de células
La suspensión de cultivo de fermentación se recolectó en tubos de centrífuga SLA 3000 (Sorvall RC6) mediante el uso de una bomba Watson Marlow 504U 056.3762.00, y los tubos de centrífuga se equilibraron. Las células se centrifugaron (+4 °C, 5000 X g, 60 min) y se desechó el sobrenadante. Los pellet celulares se almacenaron a -20 °C.
Análisis de transferencia Western del Fab anti-EGFR1 expresado en periplasma
Las muestras de pellets que representan 1 mL de la suspensión del cultivo de fermentación se suspendieron en 1 mL de 10 x TE pH 7,5 (Tris-HCl 100 mM, EDTA 10 mM). Las muestras se agitaron vigorosamente durante 2 horas a temperatura ambiente, se centrifugaron a 4 °C, 12000 x g, 60 min y los sobrenadantes se recolectaron como extractos periplásmicos.
Los extractos periplásmicos se analizaron adicionalmente con transferencia Western. Se mezclaron 100 pL de extracto con 25 pL de tampón de carga no reductor. Se cargaron 12,5 pl de mezcla en gel de SDS-Page de Tris-Glicina Precise al 4-20 % (Thermo Scientific). El gel se corrió en tampón de ejecución Laemmli 1 x 200 V ~ 45 min y se transfirió a una membrana de nitrocelulosa en tampón de transferencia Tris-Glicina, 350 mA ~ 1,5 horas. Se usó el sistema BioRad Mini-protean para SDS-Page y para la transferencia. La membrana transferida se bloqueó con BSA al 1 % en PBS. La detección se realizó con IgG antihumana (específica del Fab) con conjugado de peroxidasa (Sigma Aldrich; cat. núm. A0293) y sustrato Luminata Forte Western HRP (Millipore; cat. núm. WBLUF0500). La reacción de quimioluminiscencia se detectó con el analizador Fujifilm Luminescent Image LAS4000.
Se mezclaron 10 pl de cada muestra de sobrenadante de cultivo con 2,5 pl de tampón de carga no reductor y estas muestras se procesaron en gel SDS-PAGE y se transfirieron a la membrana de nitrocelulosa como se describió anteriormente para las muestras de extracto periplásmico. Los resultados se muestran en la Figura 10.
Purificación del Fab
El tampón del extracto periplásmico filtrado se intercambió a MES 50 mM pH 6 mediante el uso de un filtro centrífugo Amicon Ultra 10K antes de la primera etapa de purificación mediante una columna de intercambio catiónico de 5 mL (HiTrap SP FF, GE Healthcare). La fase móvil A era MES 50 mM pH 6 y la fase móvil B era MES 50 mM pH 6 NaCl 500 mM. La muestra se filtró a través de una membrana de 1,2 pm antes de la corrida. Primero, se inyectó el 10 % de la muestra en la columna a una velocidad de flujo de 2,5 mL/min durante 5 minutos, después de lo cual la velocidad de flujo se cambió a 5 mL/min. La columna se corrió con 57,5 mL de fase A, y después se aplicó un gradiente lineal desde 0 % B a 100 % B sobre 35 mL. Se recolectaron fracciones de 2,5 mL y se agruparon las fracciones A5-A9. El resto de la muestra se corrió en dos ejecuciones separadas como se describió anteriormente y las fracciones A5-A10 se agruparon (Figura 11). Se usó el Fab anti-EGFR1 digerido con papaína como control.
Las fracciones agrupadas (A5-A10) se inyectaron en la columna de proteína L (1 mL) sin cambiar el tampón. La proteína L se corrió a una velocidad de flujo de 0,2 mL/min durante la inyección de la muestra y 1 mL/min durante el lavado y la elución. La fase móvil A era PBS y B citrato de Na 0,1 M pH 3. La muestra se eluyó con 100 % de B. La proteína eluyó con un pico agudo (Figura 12) y las fracciones A5-A7 se agruparon y se neutralizaron con Tris-HCl 2 M pH 9. Después de las dos etapas de purificación, se estimó que el rendimiento del Fab era de aproximadamente 44 mg/L. Se sometió otro lote solo para la purificación por proteína L y esto produjo aproximadamente 72 mg/L de la fracción Fab. Se usó el Fab anti-EGFR1 digerido con papaína como control.
Las fracciones agrupadas se analizaron en SDS-PAGE. 24 pl de cada una de estas tres muestras agrupadas de corridas cromatográficas con la columna de proteína L, se mezclaron con 6 pl de tampón de carga reductora y se corrieron en gel SDS-PAGE. El gel se tiñó con tinción a base de Coomassie (Figura 13).
EJEMPLO 14. Unión del Fab anti-EGFR1 y el Fab anti-EGFR1 BSH-dextrano al EGFR1

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Un conjugado que comprende un anticuerpo anti-EGFRI o un fragmento de unión al EGFR1 de este, y al menos un derivado del dextrano, en donde
el derivado del dextrano comprende al menos una unidad D-glucopiranosilo, en donde al menos un carbono se­ leccionado del carbono 2, 3 o 4 de la al menos una unidad D-glucopiranosilo se sustituye por un sustituyente de la fórmula
-O-(CH2)n-S-B12H112'
en donde n está en el rango de 3 a 10; y
el derivado del dextrano se une al anticuerpo anti-EGFR1 o un fragmento de unión al EGFR1 de este, a través de un enlace formado por una reacción entre al menos un grupo aldehído formado por escisión oxidativa de una unidad D-glucopiranosilo del derivado del dextrano y un grupo amino del anticuerpo anti-EGFR1 o un fragmento de unión al EGFR1 de este.
2. El conjugado de conformidad con la reivindicación 1, en donde el grupo amino del anticuerpo anti-EGFR1 o un fragmento de unión al EGFR1 de este, es el grupo amino de un residuo de lisina del anticuerpo anti-EGFR1 o un fragmento de unión al EGFR1 de este.
3. El conjugado de conformidad con la reivindicación 1 o 2, en donde el conjugado comprende, además, al menos una molécula de trazabilidad unida al derivado del dextrano o al anticuerpo anti-EGFR1 o un fragmento de unión al EGFR1 de este.
4. El conjugado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 - 3, en donde el derivado del dextrano comprende al menos un grupo aldehído formado por escisión oxidativa de una unidad D-glucopiranosilo del deri­ vado del dextrano que está protegido.
5. El conjugado de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 1 - 4, que se obtiene mediante un méto­ do que comprende las etapas de:
a) alquenilar al menos un grupo hidroxilo del dextrano para obtener dextrano alquenilado;
b) hacer reaccionar borocaptato de sodio (BSH) con el dextrano alquenilado que se obtiene de la etapa a) para obtener el BSH-dextrano;
c) escindir oxidativamente al menos un residuo D-glucopiranosilo del BSH-dextrano de manera que se formen grupos aldehído;
d) hacer reaccionar el BSH-dextrano escindido oxidativamente que se obtiene de la etapa c) con un anticuerpo anti-EGFR1 o un fragmento de unión al EGFR1 de este, para obtener un conjugado.
6. El conjugado de conformidad con la reivindicación 5, en donde el dextrano se alquenila en la etapa a) mediante el uso de un agente alquenilante, en donde el agente alquenilante tiene una estructura de acuerdo con la fórmula X-(CH2)mCH=CH2
en donde m está en el rango de 1 a 8, y X es Br, Cl, o I.
7. El conjugado de conformidad con la reivindicación 5 o 6, en donde al menos un carbono seleccionado del car­ bono 2, 3 o 4 de al menos una unidad D-glucopiranosilo del dextrano alquenilado que se obtiene de la etapa a) se sustituye por un sustituyente de la fórmula
-O-(CH2)mCH=CH2,
en donde m está en el rango de 1 a 8.
8. El conjugado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 5 - 7, en donde el BSH se hace reaccionar con el dextrano alquenilado que se obtiene de la etapa a) en presencia de un iniciador radical seleccionado del grupo que consiste en persulfato de amonio, persulfato de potasio y luz UV, en la etapa b).
9. El conjugado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 5 - 8, en donde el al menos un residuo de D-glucopiranosilo del BSH-dextrano se escinde oxidativamente en la etapa c) mediante el uso de un agente oxidan­ te seleccionado del grupo que consiste en periodato de sodio, ácido periódico y acetato de plomo (IV).
10. El conjugado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 5 - 9, en donde el método comprende, ade­ más, la etapa de hacer reaccionar el BSH-dextrano escindido oxidativamente que se obtiene de la etapa c), o el conjugado que se obtiene de la etapa d), con una molécula de trazabilidad.
11. El conjugado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 5 - 10, en donde el método comprende, además, la etapa e) de proteger los grupos aldehído sin reaccionar del BSH-dextrano escindido oxidativamente que se obtiene de la etapa c), o el conjugado que se obtiene de la etapa d).
12. El conjugado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 5 - 11, en donde el BSH-dextrano escindido oxidativamente se hace reaccionar con el anticuerpo anti-EGFR1 o un fragmento de unión al EGFR1 de este, mediante la incubación del BSH-dextrano escindido oxidativamente y el anticuerpo anti-EGFR1, o un fragmento de unión al EGFR1 de este, a temperatura ambiente en un tampón fosfato acuoso que tiene un pH de aproxima­ damente 6 a 8, en la etapa d).
13. Una composición farmacéutica que comprende el conjugado de conformidad con cualquiera de las reivindicacio­ nes 1 - 12.
14. El conjugado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 - 12 o la composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 13 para usar como un medicamento.
15. El conjugado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 - 12 o la composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 13 para usar en el tratamiento del cáncer, tal como un cáncer de cabeza y cue­ llo.
El conjugado o la composición farmacéutica para usar de conformidad con la reivindicación 14, en donde el me­ dicamento es para el tratamiento intratumoral y/o intravenoso del cáncer de cabeza y cuello mediante la terapia de captura de neutrones de boro.
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