CN116023497A

CN116023497A - 抗ddr1抗体及其用途

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Publication number: CN116023497A
Application number: CN202211396517.8A
Authority: CN
Inventors: 陶怡然; 杨金亮; 王誉熹; 赖钦淮
Original assignee: West China Hospital of Sichuan University
Current assignee: West China Hospital of Sichuan University
Priority date: 2022-11-09
Filing date: 2022-11-09
Publication date: 2023-04-28
Anticipated expiration: 2042-11-09
Also published as: CN116023497B

Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种抗DDR1的抗体及其用途。本发明要解决的技术问题是提供一种新的亲和力强的抗DDR1抗体或其抗原结合片段。本发明抗体或其抗原结合片段的重链互补决定区包含VH‑CDR1、VH‑CDR2、VH‑CDR3，轻链互补决定区包含VL‑CDR1、VL‑CDR2、VL‑CDR3。本发明的抗体或其抗原结合片段的亲和力高、内化效率快和特异性好，抗体结合DDR1胞外段的亲和力达到2.26×10¹⁰，可有效用于制备靶向DDR1的抗肿瘤药物开发，具有很好的应用前景。

Description

抗DDR1抗体及其用途

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种抗DDR1的抗体及其用途。

背景技术

盘状结构域受体(discoidin I-like domain receptors，DDRs)是一类以胶原蛋白为信号分子的跨膜受体酪氨酸激酶。目前发现哺乳动物DDRs家族包括DDR1与DDR2两个成员，它们虽然在蛋白氨基酸序列上不同，但在空间结构上非常相似。DDRl在上皮来源的高侵袭性肿瘤细胞中过度表达，包括乳腺癌、结直肠癌、卵巢癌、食管癌和胃癌等，而DDR2主要在肿瘤细胞周围的间质细胞上表达，提示DDRl和DDR2在肿瘤发展中具有不同作用。正常情况下，DDR1激酶在人体多种组织中呈低水平表达，参与细胞的黏附、增殖及细胞外基质的重塑，在人体多种生理过程中起到重要作用。目前，已在多种肿瘤组织中发现DDR1表达失调、磷酸化异常和发生突变，尤其是在生长速度快、侵袭性强的肿瘤。

DDR1参与肿瘤细胞的增殖、分化、转移和侵袭的过程。研究表明DDR1可以调节肿瘤细胞的生长状况，比如，在非小细胞肺癌和肝癌细胞中过表达DDR1，可使细胞的迁移能力提高；沉默DDR1基因的结肠癌、胶质瘤和胰腺癌细胞接种小鼠后，肿瘤的生长明显被抑制。最近研究发现，DDR1在原发性乳腺癌、结直肠癌、卵巢癌、食管癌和脑肿瘤等人类肿瘤中过度表达。DDR1激酶的过度表达和功能获得性突变可增加肿瘤模型动物的致瘤性，而敲除DDR1激酶基因能抑制肿瘤的发生和转移，提示DDR1激酶可能是一个肿瘤药物靶点。随着近几年来对DDR1的表达、功能和临床意义的大量研究，显示DDR1很有可能成为肿瘤潜在的治疗靶点。开发靶向DDR1的药物对开发新型抗癌药物具有积极意义。

抗体是由重链和轻链共同组成的生物大分子，由B淋巴细胞分泌，在机体的体液免疫中发挥重要作用。抗体分子的重链或轻链分别由可变区和恒定区组成，可变区主要发挥靶抗原结合作用，恒定区主要发挥免疫调控效应。根据空间结构和氨基酸序列特征，抗体可分为IgG、IgM、IgE、IgA、IgD等，并且重链和轻链也可进一步细分为多个亚型。比如，人IgG重链可分为IgG1、IgG2、IgG3和IgG4，轻链可分为κ和λ。由于抗体可以特异、高效地结合靶分子或靶细胞，调控靶分子下游的信号通路，或者通过免疫效应杀伤靶细胞，因此抗体可以开发为药物用于疾病治疗。当前，抗体已经发展成为一种重要的生物技术药物，其中单克隆抗体占据了绝大部分，这其中又以IgG型抗体为主，因此通常所说的单克隆抗体往往指的是IgG型抗体。单克隆抗体可以通过多种机制发挥药理作用。

IgG型抗体分子是由2条重链和2条轻链通过链间二硫键构成的四聚体，分子量约150kD。根据结构和功能特征，抗体分子可分为可变区和和恒定区，其中可变区主要发挥抗原结合作用，而恒定区主要发挥免疫学效应和转运等功能。抗体的可变区可进一步分为互补决定区CDR和框架区FR，其中重链或轻链各含有3个CDR区(重链VH-CDR1、VH-CDR2、VH-CDR3，轻链VL-CDR1、VL-CDR2、VL-CDR3。)和CDR区两侧的4个FR区(FR1、FR2、FR3、FR4)。CDR区形成的loop环是抗体分子与抗原结合的主要部位，FR区则通过空间折叠形成CDR区的支撑结构。抗体对不同抗原分子的特异性识别主要是通过6个CDR区(VH-CDR1、2、3和VL-CDR1、2、3)的氨基酸多态性以及loop环的构象多态性共同实现。由于不同抗体FR区的结构相似度较高，因此当把某一株抗体的CDR区去替换其他抗体分子的CDR区后，如果不同抗体分子之间的FR区匹配合适，那么替换前后CDR区构象变化较小，因此替换后形成的新可变区仍可以保留抗原结合能力。

抗体可变区可以结合细胞外的可溶性配体，阻断配体与受体的结合，切断配体诱导的下游信号传递，因此以免疫细胞因子为靶点开发的抗体药物可以改善炎症性疾病，比如adalimumab、belimumab、siltuximab等抗体已经获批上市。此外，以单克隆抗体为基础衍生出的双特异性抗体、抗体药物偶联物(antibody-drug conjugate，ADC)等新型抗体技术在近些年发展也很快，均实现了不同程度的突破。截止目前，癌症和炎症性疾病是抗体药物应用最多的疾病领域。而针对不同的疾病或者不同的靶点开发具有更好或者更多性能的抗体也是本领域的重点和难点，

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供种新的亲和力强的抗DDR1抗体。本发明为解决上述技术问题是提供一种抗DDR1的抗体或其抗原结合片段。该抗体或其抗原结合片段的重链互补决定区包含VH-CDR1、VH-CDR2、VH-CDR3，其氨基酸序列分别为SEQ ID NO.1、SEQ IDNO.2、SEQ ID NO.3所示，所述抗体或其片段的轻链互补决定区包含VL-CDR1、VL-CDR2、VL-CDR3，其氨基酸序列分别为SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6所示。

其中，上述抗DDR1的抗体或其抗原结合片段中所述的重链可变区VH由所述的VH-CDR1、VH-CDR2、VH-CDR3与抗体框架区FR拼接而成；轻链可变区VL由上述的VL-CDR1、VL-CDR2、VL-CDR3与抗体框架区FR拼接而成。进一步的，所述的抗体框架区FR为人源或鼠源抗体框架区FR。

优选的，上述抗DDR1的抗体或其抗原结合片段中的重链可变区VH的氨基酸序列为SEQ ID NO.7所示。优选的，上述轻链可变区VL的氨基酸序列为SEQ ID NO.8所示。

其中，上述抗DDR1的抗体或其抗原结合片段中所述的抗原结合片段为Fab或scFv。

其中，上述抗DDR1的抗体或其抗原结合片段中所述的重链恒定区可以来自人或鼠的免疫球蛋白IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgE、IgA或IgD重链的恒定区，轻链恒定区可以来自人或鼠的免疫球蛋白κ或λ轻链的恒定区。

其中，上述抗DDR1的抗体或其抗原结合片段中所述的重链恒定区来自人或鼠的免疫球蛋白IgG1，轻链恒定区来自人或鼠的免疫球蛋白κ轻链的恒定区。进一步的，上述的鼠为小鼠。

其中，上述抗DDR1的抗体或其抗原结合片段还带有可检测的标记，所述可检测的标记为酶、放射性核素、荧光染料、发光物质或生物素。

本发明还提供了编码上述抗DDR1的抗体或其抗原结合片段中所述的抗DDR1的抗体或其片段的核酸分子。

本发明还提供了装载上述抗DDR1的抗体或其抗原结合片段中所述的核酸分子的重组载体。所述的载体可以是质粒载体、腺病毒载体、慢病毒载体等本领域常用的载体。

同时，本发明还提供了包含上述的核酸分子或重组载体的宿主细胞。

本发明也提供了一种制备上述的抗DDR1的抗体或其抗原结合片段的方法。该方法的步骤包括在允许所述抗DDR1的抗体或其抗原结合片段表达的条件下，培养上述的宿主细胞，并从培养的宿主细胞培养物中回收所述抗体或其抗原结合片段。

此外，本发明也提供了.一种药物组合物。该药物组合物含有上述抗DDR1的抗体或其抗原结合片段、或上述的载体、或上述的宿主细胞，以及药学上可接受的载体和/或赋形剂。

进一步的，本发明还提供了一种缀合物。该缀合物包含上述的抗DDR1的抗体或其抗原结合片段以及连接于所述抗DDR1的抗体或其抗原结合片段上的治疗剂。

进一步的，所述治疗剂选自细胞毒素或放射性同位素；所述细胞毒素选自喜树碱或喜树碱衍生物、加利车霉素、美登素或其衍生物、美登木素生物碱、多拉司他汀、澳瑞他汀或单端孢霉素。

同时，本发明也提供了上述抗DDR1的抗体或其抗原结合片段或其编码核酸分子或上述的药物组合物或所上述的缀合物用于抑制受试者中的肿瘤细胞生长、转移的用途。

同时，本发明也提供了上述的抗DDR1的抗体或其抗原结合片段或上述的核酸分子或上述的药物组合物或上述的缀合物在制备用于治疗或预防肿瘤、感染性疾病、炎症或自身免疫性疾病的药物中的用途。

同时，本发明也提供了上述的抗DDR1的抗体或其抗原结合片段或上述的核酸分子或上述的药物组合物或上述的缀合物在在制备用于诊断肿瘤、感染性疾病、炎症或自身免疫性疾病的试剂中的用途。

进一步的，上述的肿瘤选自食管癌、胃肠癌、胰腺癌、甲状腺癌、结直肠癌、肾癌、肺癌、肝癌、胃癌、头颈癌、膀胱癌、乳腺癌、子宫癌、宫颈癌、卵巢癌、前列腺癌、睾丸癌、生殖细胞癌、骨癌、皮肤癌、胸腺癌、胆管癌、黑素瘤、间皮瘤、间质瘤、淋巴瘤、骨髓瘤、肉瘤、成胶质细胞瘤、神经胶质母细胞瘤、白血病或癌症的转移性、难治性或复发性病灶。

本发明的有益效果在于，本发明以DDR1为靶点，通过杂交瘤技术筛选制备了一种全新的靶向DDR1胞外段的单克隆抗体，命名为Tytug。经过验证该抗体的特异性、亲和力、内化效率、体内肿瘤靶向性和安全性。结果表明本发明的抗DDR1抗体亲和力高、内化效率高和特异性好，抗体结合DDR1胞外段的亲和力在2.26×10¹⁰，是一种优秀的DDR1抗体，可有效用于制备靶向DDR1的抗肿瘤药物开发为抗肿瘤靶向治疗药物的研发奠定基础，具有很好的应用前景。

附图说明

图1.DDR1胞外段(DDR1 ECD)质粒构建。(A)DDR1 ECD表达结构示意图，通过基因合成的方法在EcoR I和Hind III酶切位点之间依次引入信号肽、DDR1 ECD、6×His标签；(B)DDR1 ECD表达载体酶切验证，利用EcoR I和Hind III两个酶切位点，双酶切验证DDR1 ECD表达质粒。

图2.DDR1胞外段(DDR1 ECD)表达。(A)SDS-PAGE检测HEK293F细胞转染第4、5、6天后的细胞上清(上样10μL)；(B)抗原DDR1 ECD表达纯化色谱图；(C)SDS-PAGE检测抗原DDR1ECD纯化，点样依次为marker，纯化洗脱峰1，纯化洗脱峰2，纯化流穿液；(D)western Blot检测抗原DDR1 ECD纯化。

图3流式细胞术检测亚克隆候选杂交瘤细胞上清中的抗体结合活性，展示部分杂交瘤的结果。

图4.ELISA法检测Tytug抗体对DDR1胞外段(圆点)和DDR2胞外段(三角)的结合力。分别包被DDR1胞外段(ECD)和DDR2 ECD，孵育不同浓度的Tytug，检测Tytug是否结合DDR1家族成员DDR2。

图5.利用BIACORE进行Tytug结合的动力学分析。(K_D＝2.26×10¹⁰mol/L)

图6.SDS-PAGE电泳分析Cy5.5-Tytug和Cy5.5-IgG的荧光标记情况。

图7Tytug在荷瘤小鼠体内的分布。HT-29荷瘤小鼠在尾静脉注射10mg/kg的Cy5.5-IgG(左)或Cy5.5-Tytug(右)后不同时间点活体成像拍照。红色剪头指示肿瘤位置。

图8.激光共聚焦检测Tytug与HT-29细胞的结合与内化。用10μg/ml荧光素偶联Tytug分别在4℃(不内化)和37℃(内化3小时)处理细胞，共聚焦荧光显微镜观察。绿色荧光染DDR1，蓝色荧光DAPI(4’，6-二氨基-2-苯基吲哚)染细胞核，红色荧光染溶酶体。红色标尺：10μm。图9.H&E染色初步评估裸鼠移植瘤模型给药后主要脏器的病理学变化。在Tytug(10mg/kg)或PBS给药7天后，取小鼠重要器官进行H&E染色图。放大倍数：×100。黑色标尺：100μm。

发明内容

本发明抗DDR1抗体最初的鼠源抗体是采用杂交瘤技术筛选获得。将人抗DDR1抗体蛋白与佐剂混合并免疫小鼠,待血清滴度合格后，分离小鼠脾细胞，在体外与小鼠骨髓瘤细胞融合后培养，获取含有抗体的细胞培养上清。首先，采用ELISA筛选具有抗DDR1抗体结合活性的杂交瘤抗体，进一步筛选具有良好结合动力学特征的抗体。在筛选中，意料之外地筛选得到了一株兼具亲和力高、内化效率快和特异性好等优点的抗体。实验还证明，该抗体能够与DDR1的胞外段结合，不与DDR家族成员蛋白DDR2胞外段结合，与DDR2之间无交叉反应性。在此基础上，得到了本发明的各项技术方案。

该抗体或其抗原结合片段的重链互补决定区包含VH-CDR1、VH-CDR2、VH-CDR3；所述抗体或其片段的轻链互补决定区包含VL-CDR1、VL-CDR2、VL-CDR3。

其中，上述抗DDR1的抗体或其抗原结合片段中所述的重链可变区VH由所述的VH-CDR1、VH-CDR2、VH-CDR3与人源抗体框架区FR拼接而成；轻链可变区VL由上述的VL-CDR1、VL-CDR2、VL-CDR3与人源抗体框架区FR拼接而成。

本发明中抗体的重链可变区VH及其VH-CDR1、VH-CDR2、VH-CDR3；轻链可变区VL及其VL-CDR1、VL-CDR2、VL-CDR3的氨基酸序列如下所示：

重链可变区CDR1氨基酸序列(SEQ ID NO.1)：GYSFTSYW；

重链可变区CDR2氨基酸序列(SEQ ID NO.2)：IHPSDSKT；

重链可变区CDR3氨基酸序列(SEQ ID NO.3)：AREGTYYYAMDF；

重链可变区VH氨基酸序列(SEQ ID NO.7)：

QVQLQQPGAELVRPGSSVRLSCKASGYSFTSYWMNWVKQRPGQGLEWIGMIHPSDSKTRLDQKFKDKATLTVDKSSSTAYMQLSSPTSEDSAVYYCAREGTYYYAMDFWGQGTSVTVSS；

轻链可变区CDR1氨基酸序列(SEQ ID NO.4)：QTIVHSNGNTY；

轻链可变区CDR2氨基酸序列(SEQ ID NO.5)：KVS；

轻链可变区CDR3氨基酸序列(SEQ ID NO.6)：FQGSHDPYT；

轻链可变区VL的氨基酸序列(SEQ ID NO.8)：

DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQTIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHDPYTFGGGTKLEIK。

本发明的抗DDR1抗体可以通过常规的基因重组技术改造为Fab(antigen bindingfragment)、scFv(single-chain fragment variable)等抗体片段。Fab、scFv等抗体片段体积较小，组织渗透性强，在一些应用领域具有独特优势。Fab是由重链可变区-恒定区1(VH-CH1)和轻链可变区-恒定区(VL-CL)组成的异二聚体，分子大小为IgG分子的1/3。由于没有Fc段，因此Fab诱导的免疫效应相较IgG明显降低，细胞因子释放作用较弱。目前以Fab为结构的抗体药物如abciximab、ranibizumab等已经被批准上市。scFv由VH和VL及其之间的连接肽linker融合而成，分子大小仅为IgG的1/6，具有组织渗透性强、半衰期较短等特点，在影像学诊断和一些治疗领域具有独特优势，以scFv为基础的双特异性抗体blinatumomab也已经被批准上市。抗体片段还可以进一步与其他蛋白质融合，或者与其他小分子偶联，通过靶向递送用于疾病的诊断和治疗。

本发明的抗DDR1抗体可以通过基因工程技术对CDR区中的氨基酸突变以进一步提高亲和力。抗体CDR区在抗体与抗原的结合中发挥关键作用，其中的氨基酸可以通过氢键、离子键、范德华力等与抗原的氨基酸相互作用。通过突变抗体CDR区中的氨基酸，可以进一步增强CDR与抗原的相互作用，从而提高抗体的亲和力。抗体库技术在抗体亲和力进化方面的应用已经比较成熟，可以通过丙氨酸热点突变、易错PCR等策略建立抗体突变库，进行突变抗体的高通量筛选，在体外实现抗体的亲和力进化。

本发明抗体可以采用稳定细胞株表达，以便用于规模化生产大量蛋白质。编码抗体氨基酸的基因可以通过常规的基因重组技术获得，经过DNA序列优化、合成、PCR扩增后，可以插入至表达载体中。所用的载体可以是分子生物学常用的质粒、病毒或基因片段。在编码抗体的DNA序列前端加上蛋白分泌信号肽基因，以保证抗体能够分泌至细胞外。载体序列中含有用于基因表达的启动子、蛋白质翻译起始和终止信号、多聚腺苷酸(PolyA)等元件。载体中含有抗生素抗性基因，以利于载体在宿主细胞如细菌中的复制，用于载体制备。另外，载体中还可以包含选择性基因，以利于稳定转染宿主细胞的选择，用于构建稳定表达的细胞株。

在完成含有编码抗体DNA序列的载体构建后，即可用该载体转染或转化宿主细胞，表达相应的蛋白质。能够用于表达抗体的表达系统有多种，可以是真核细胞，也可以是原核细胞，它们包括哺乳动物细胞、昆虫细胞、酵母、细菌等。由于原核细胞表达完整抗体时容易形成包涵体，因此哺乳动物细胞是表达该蛋白的优选系统。可用于大规模表达抗体的哺乳动物细胞有多种，例如CHO细胞、HEK293细胞、NS0细胞、COS细胞等，它们都包括在本发明所能使用的细胞之列。含有编码上述抗体基因的重组载体可经转染进入宿主细胞，转染细胞的方法有多种，包括电穿孔法、脂质体转染法和磷酸钙转染法等。

一种较佳的蛋白表达方法是利用稳定转染的包含选择性基因的宿主细胞表达。例如，用含有新霉素(Neomycin)抗性基因的重组载体稳定转染缺乏新霉素抗性的宿主细胞后，可在细胞培养液中增加新霉素的浓度以筛选出高表达的稳定细胞株。

哺乳动物细胞以外的其他表达系统，例如昆虫细胞、酵母、细菌等也可以用于表达本发明的抗体或其片段，它们也被包含本发明所能使用的宿主细胞之列。这些表达系统的蛋白质表达量在一些情况下比哺乳动物细胞高，但容易形成包涵体，因此需要进一步进行蛋白复性。

本发明的抗DDR1抗体还可以用病毒载体来运载和表达，这些病毒载体包括但不限于腺病毒载体(adenoviral vectors)、腺相关病毒载体(adeno-associated viralvectors)、反转录病毒载体(retroviral vectors)、单纯疱疹病毒载体(herpes simplexvirus-based vectors)、慢病毒载体(lentiviral vectors)等。

本发明的抗DDR1用可于DDR1的检测，可使用在包括ELISA、流式细胞术等在内的检测方法中，具有良好的特异性。本发明的抗DDR1抗体在及增强肿瘤免疫方面显示出良好的功能活性，在癌症治疗领域具有应用价值。

本发明的抗体可以按照药剂学常规技术制备成各种形式的药物制剂，较优选的是液体注射剂和冷冻干燥注射剂。本发明的抗体可以与其他药物形成药物组合物，所述组合物可以和其他治疗方法一起治疗疾病，所述其他治疗方法包括化学疗法、放射疗法、生物疗法等。

以下实例对本发明所涉及抗体的发现、制备、试验和应用作了详细说明。但是本发明的内容和用途并不仅限于实施例的范畴。

实施例一DDR1胞外段蛋白的构建和表达

1、DDR1ECD蛋白表达载体的构建

在NCBI数据库中查找得到人DDR1受体的氨基酸序列，DDR1全长的第21-417位氨基酸构成胞外段，C端引入6个His标签，构建pTT5/DDR1 ECD的表达载体；设计真核表达载体，利用基因重组技术，将DDR1 ECD序列构建到含有EcoR I/Hind III双酶切的pTT5表达载体上，具体组成部分如下：EcoR I-Kozak序列-信号肽-DDR1 ECD碱基序列-His Tag-终止密码子-Hind III；根据真核细胞表达体系对DDR1 ECD序列进行密码子优化；由常州基宇生物科技有限公司进行基因合成得到。

DDR1胞外段(DDR1 ECD)包括的氨基酸序列为该受体全长的第21-417位氨基酸，共计397个氨基酸，理论分子量为44030.5Da。氨基酸序列如下所示(SEQ ID NO.9)(下划线部分为19个氨基酸的信号肽，*为C端引入的6个His标签)：

1 MGWSCIILFLVATATGVHSD MKGHFDPAKC RYALGMQDRT IPDSDISASS

51 SWSDSTAARH SRLESSDGDG AWCPAGSVFP KEEEYLQVDL QRLHLVALVG

101 TQGRHAGGLG KEFSRSYRLR YSRDGRRWMG WKDRWGQEVI SGNEDPEGVV

151 LKDLGPPMVA RLVRFYPRAD RVMSVCLRVE LYGCLWRDGL LSYTAPVGQT

201 MYLSEAVYLN DSTYDGHTVG GLQYGGLGQL ADGVVGLDDF RKSQELRVWP

251 GYDYVGWSNH SFSSGYVEME FEFDRLRAFQ AMQVHCNNMH TLGARLPGGV

301 ECRFRRGPAM AWEGEPMRHN LGGNLGDPRARAVSVPLGGR VARFLQCRFL

351 FAGPWLLFSE ISFISDVVNN SSPALGGTFP PAPWWPPGPP PTNFSSLELE

401 PRGQQPVAKAEGSPTAHHHHHH*。

2、DDR1 ECD蛋白的表达、纯化和鉴定

DDR1 ECD的表达载体pTT5/DDR1 ECD如图1A所示。采用EcoR I和Hind III双酶切，琼脂糖电泳结果同基因合成公司反馈的结果一致，结果如图1B，片段大小符合理论值。采用HEK293F哺乳动物细胞瞬时表达系统表达DDR1 ECD，收集转染后第四、五、六天的细胞上清，检测目的蛋白的表达。SDS-PAGE电泳可见细胞上清中目的蛋白的表达量逐渐增加(图2A)。综合考虑细胞密度、活力及蛋白表达量等因素，我们决定在转染质粒后第6天收集细胞上清，进行后续工作。首先，过滤浓缩细胞上清，使用镍柱纯化带His标签的DDR1 ECD蛋白，纯化图见图2B。得到的目的蛋白经SDS-PAGE验证，纯度较高，达到后续实验要求。蛋白表达量为7.5mg/L。由于蛋白存在翻译后修饰，如糖基化，加之电泳环境中蛋白的移动速率受多种因素影响导致抗原在SDS-PAGE电泳所在位置为55kDa左右(如图2C)，比预测分子量稍大。采用western blot鉴定表达纯化的DDR1 ECD，孵育抗DDR1胞外段的抗体可检测到洗脱峰中的目的蛋白条带(如图2D)。采用ELISA鉴定表达纯化的DDR1 ECD，抗DDR1抗体可识别结合该蛋白。综合上述工作验证，制备的抗原满足实验要求，能够用于后续免疫和筛选实验。

实施例二通过杂交瘤技术制备抗DDR1抗体杂交瘤细胞株筛选得到Tytug抗体1、抗DDR1母克隆抗体制备

1.1DDR1 ECD抗原免疫

具体免疫流程如表1：

表1

本研究采用杂交瘤技术制备抗DDR1单克隆抗体。杂交瘤技术的基本原理是通过PEG介导B淋巴细胞和骨髓瘤细胞SP2/0融合，在含有HAT的选择培养基的作用下，只有B淋巴细胞与骨髓瘤细胞发生融合的杂交细胞才能存活，从而能够得到在体外无限增殖并且分泌特异性抗体的杂交瘤细胞。本研究中，我们以每次肌肉注射100μg DDR1 ECD的抗原加佐剂(佐剂为Quick Antibody-Mouse 5W)的方式免疫BALB/c小鼠，总共免疫3次；在融合前三天，腹腔注射不含佐剂的100μg DDR1 ECD抗原再冲击免疫1次。随后进行细胞融合。ELISA检测鼠尾静脉取血的血清中的抗体效价，抗体效价应在1:10,000-1:10,000,000范围内，抗体效价大于10,000即可进行融合，本发明一般选择抗体效价大于100,000的小鼠进行融合。

1.2免疫小鼠血清抗体效价

采用ELISA法检测免疫后BALB/c小鼠的血清抗体效价，阴性对照使用未进行免疫的同批小鼠血清。设置阴性值的2.1倍作为Cutoff值。Elisa检测结果可以看到小鼠在初次免疫后，血清抗体效价较低，随着第二次、第三次加强免疫，血清抗体效价开始升高。在第三次加强免疫后，抗体效价达到1:512000。第四次冲击免疫后，小鼠血清抗体效价在1：204800以上(表2)。三天后选取抗体效价高的小鼠进行细胞融合。

表2.第四次冲击免疫后小鼠血清效价检测(OD₄₅₀)。

2.3细胞融合

按照杂交瘤细胞融合的实验步骤，分批将免疫的小鼠脾脏与SP2/0细胞融合，用含有HAT的培养基重悬融合细胞并铺96孔板，做好标记，放入37℃细胞培养箱培养定期观察细胞生长情况，10-15天后，共计获得8000多个原始细胞系(85个96孔板)，取上清进行后续检测。

2.4抗DDR1母克隆抗体的筛选

细胞融合共获得8000多个原始母克隆细胞系，首先对所有原始母克隆进行ELISA筛选，得到能分泌与DDR1 ECD结合的阳性原始母克隆细胞系200株左右；再通过流式细胞术的方法的筛选，得到130多株原始母克隆细胞系克隆分泌的抗体能结合细胞水平的DDR1；用SPR技术对这130多原始母克隆细胞系分泌的杂交瘤上清抗体进行结合解离力检测，筛选得到50多株亲和力较好的候选杂交瘤原始母克隆细胞系。

2.5抗DDR1亚克隆筛选

将获得的近1000株杂交瘤单克隆细胞系，首先经ELISA筛选得到阳性单克隆细胞系共计236株；再经过流式细胞术检测这236株杂交瘤单克隆细胞系分泌的抗体的结合力以及内化效率，获得阳性的单克隆细胞系121株；最后利用SPR技术检测亲和力，获得亲和力较好的单克隆细胞系16株。

采用流式细胞术筛选可以与人源细胞表达的DDR1结合的亚克隆候选杂交瘤抗体，在6孔板中亚克隆细胞，待细胞长满后，收集亚克隆细胞培养上清，上清中即含有杂交瘤抗体。采用流式细胞术，以DDR1细胞膜表达呈阳性的人源结肠癌细胞系HT-29作为筛选细胞，鼠同型对照IgG作为阴性对照(又称Isotype组，实心峰)，不同亚克隆候选克隆细胞株培养上清作为实验组(空心峰)，通过空心峰相对于实心峰的向右偏移情况来判断是否抗体与HT-29细胞有结合能力，即阴性或者阳性，偏移的多少表示阳性率的高低，即为判断培养上清中抗体含量的高低或者结合能力的强弱的标准，部分实验结果如图3所示。通过流式细胞术筛选，共计130多原始细胞株分泌的杂交瘤抗体能与表达在HT-29细胞膜上的DDR1分子具有较好的结合活性。

DDR1与胶原结合后可以发生受体介导的内化。内化的受体可以进入溶酶体被降解。筛选与DDR1结合后可被内化进入细胞质中的抗体，可以使抗体-DDR复合物内化进入细胞并被降解。若抗体上偶联有细胞杀伤性药物，则可随抗体-DDR复合物一起被运送至肿瘤细胞内部从而杀伤肿瘤细胞，达到抗肿瘤靶向治疗的目的。

采用流式细胞术筛选内化效率高的亚克隆候选杂交瘤，使用DDR1阳性HT-29结肠癌细胞系分别与PBS和亚克隆细胞培养上清孵育，内化时将与抗体结合的细胞分为两组，一组4℃放置3h(空心峰)，另一组在37℃内化3h(实心峰)，进行内化检测，实心相对于空心峰的差值表示内化的情况，向左偏移的越多，表示内化效率相对较快，反之亦然。本发明筛选了182株杂交瘤单克隆细胞系，得到121株分泌抗体可被内化的杂交瘤单克隆细胞系，利用对照组的荧光强度作为基准，以(37℃内化组的荧光强度-4℃对照组的荧光强度)/4℃对照组的荧光强度×100％为计算公式，计算实验组的内化效率，抗体3小时内化效率在10-50％之间，内化效率较高的部分株系的数据如表3所示。

表3亚克隆候选杂交瘤上清抗体内化效率较高的株系

杂交瘤细胞系	内化效率
		T4-E11-F10	49.82％
T4-H11-H5	40.66％
		Y4-D4-G11	24％
Y2-D2-F8	23.60％
		T6-F10-A4	21.50％
T1-C10-C2	15.65％

2.6亚克隆抗体亲和力检测

采用基于光学表面等离子共振(Surface Plasmon Resonance，简称SPR)原理的Biacore仪器，对121株单克隆抗体与抗原的结合动力学进行高通量检测。将抗体和抗原的结合及解离速率常数用1:1的模型进行分析，进一步计算其与抗原的亲和力，不同的亚克隆抗体与抗原结合和解离的过程各不相同，根据它们的动力学特征将其进行筛选淘汰。通过Biacore测定亚克隆抗体与DDR1抗原相互作用的结合速率常数(association rateconstant，K_a)和解离速率常数(dissociation rate constant，K_d)以及计算的亲和力(dissociation equilibrium constant,K_D)，最终获得亲和力较好的单克隆细胞系4株，数据如表4所示。其中T4-E11-F10亲和力K_D最高，达到2.26×10¹⁰M，命名为Tytug抗体。

表4.Biacore检测候选杂交瘤上清抗体与抗原相互作用的动力学实验结果

杂交瘤细胞系	<![CDATA[K<sub>a</sub>(M<sup>-1</sup>s<sup>-1</sup>)]]>	<![CDATA[K<sub>d</sub>(s<sup>-1</sup>)]]>	<![CDATA[K<sub>D</sub>(M)]]>
				T4-E11-F10(Tytug)	<![CDATA[2.067×10<sup>5</sup>]]>	<![CDATA[4.663×10<sup>-5</sup>]]>	<![CDATA[2.26×10<sup>10</sup>]]>
T4-H11-H5	<![CDATA[1.514×10<sup>5</sup>]]>	<![CDATA[3.167×10<sup>-4</sup>]]>	<![CDATA[2.09×10<sup>9</sup>]]>
				Y4-D4-G11	<![CDATA[1.570×10<sup>5</sup>]]>	<![CDATA[1.936×10<sup>-4</sup>]]>	<![CDATA[1.23×10<sup>9</sup>]]>
Y4-D4-G11	<![CDATA[1.994×10<sup>5</sup>]]>	<![CDATA[1.357×10<sup>-5</sup>]]>	<![CDATA[6.61×10<sup>9</sup>]]>

实施例、获取抗体可变区和互补决定区的氨基酸序列

收集杂交瘤细胞亚克隆细胞培养上清，采用Trizol法提取RNA。以提取的RNA为模板，进行逆转录获得cDNA。采用简并引物(Novagen Ig-Primer Sets)分别对抗体的重、轻链可变区进行PCR扩增，并用琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物。采用胶回收试剂盒获得目标DNA片段，随后进行TA克隆构建重组质粒。采用热激法将重组质粒转化至感受态细胞，涂板进行蓝白斑筛选。挑取白色单菌落至0.5mL LB液体培养基，于37℃、220rpm条件下振荡培养3h，取菌液送样测序。测序分析得到Tytug抗体互补决定区CDR氨基酸序列为：

(1)重链可变区CDR1氨基酸序列(SEQ ID NO.1)：GYSFTSYW；

(2)重链可变区CDR2氨基酸序列(SEQ ID NO.2)：IHPSDSKT；

(3)重链可变区CDR3氨基酸序列(SEQ ID NO.3)：AREGTYYYAMDF；

(4)轻链可变区CDR1氨基酸序列(SEQ ID NO.4)：QTIVHSNGNTY；

(5)轻链可变区CDR2氨基酸序列(SEQ ID NO.5)：KVS；

(6)轻链可变区CDR3氨基酸序列(SEQ ID NO.6)：FQGSHDPYT。

同时也得到Tytug抗体重链可变区VH的氨基酸序列(SEQ ID NO.7)：

QVQLQQPGAELVRPGSSVRLSCKASGYSFTSYWMNWVKQRPGQGLEWIGMIHPSDSKTRLDQKFKDKATLTVDKSSSTAYMQLSSPTSEDSAVYYCAREGTYYYAMDFWGQGTSVTVSS。

Tytug轻链可变区VL的氨基酸序列(SEQ ID NO.8)：

DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQTIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSG SGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHDPYTFGGGTKLEIK。

实施例三Tytug抗体的纯度和性质

1、亲和纯化

将初纯后的抗体用亲和纯化的binding buffer重悬，经过0.22μm滤器过滤，利用AKTA Pure纯化系统、Hitrap^TM Protein G亲和层析柱进行亲和层析纯化。ProteinG有着相对宽广的结合谱，常用于分离纯化来自细胞培养物中的抗体或者抗体片段，以及从各种种属的血清中纯化抗体。纯化后的抗体经色谱和SDS-PAGE检测，纯度符合要求。

最后将洗脱下来的蛋白溶液加入到用1×PBS润洗过的超滤管中，4,000rpm转速离心10-15min，弃去超滤管下层套管中的液体，向上层内管中加入1×PBS，并用加样枪充分混匀内管中的蛋白样品。重复此步骤5次，将蛋白样品的缓冲液置换为1×PBS，检测浓度，-80℃保存。

2、单克隆抗体Tytug的性质分析

2.1Tytug的结合力检测

使用ELISA检测方法，以DDR1 ECD蛋白作为包被抗原，从1.25μg/ml开始2倍稀释Tytug作为一抗，HRP标记的山羊抗鼠抗体作为二抗进行抗原抗体结合力检测。结果表明，Tytug可与DDR1胞外区特异性结合，结合活性如图4中的曲线(圆点标识)。

2.2Tytug的亚型鉴定

利用ELISA法检测OD_450nm的吸光度，结果显示Tytug的IgG亚型为IgG1，轻链为κ。

2.3Tytug抗体特异性检测

DDR2胞外段共378个氨基酸，是受体全长的第22-399位氨基酸，与DDR1胞外段氨基酸的同源性为48.75％，其中DS区域58.9％，DS-like区域50.8％。ELISA检测Tytug抗体分别与DDR1胞外段和DDR2胞外段的结合力，结果参见图4。结果表明，Tytug抗体能够与DDR1的胞外段很好的结合，而不与DDR家族成员蛋白DDR2胞外段结合，说明Tytug抗体与DDR2之间无交叉反应性。

2.5SPR技术分析Tytug的亲和力

抗体的结合解离常数是评估单克隆抗体性质的一项重要指标。抗体和抗原决定簇之间的亲和力本质上是一种非共价作用力，包括范德华力、静电引力、氢键和疏水作用，体现了抗体与抗原结合的紧密程度，对筛选抗体十分重要。抗原与抗体的结合是可逆的。结合力常数(K_a)越大，表示抗原抗体的亲和力越好；解离常数(K_d)越小，表示抗原抗体结合的越稳定。根据动力学基本公式，可以计算出亲和力常数K_D＝K_a/K_d。

使用Biacore T200(GE Healthcare,USA)，将带His标签DDR1 ECD作为固定相偶联至NTA芯片上，分别将不同浓度的Tytug作为流动相，检测其与抗原的结合和解离速率，用1:1的模型进行分析，进一步计算其与抗原的亲和力。经过拟合计算得到，Tytug的结合常数ka为2.067×10⁵M^-1s^-1，解离常数kd为4.663×10^-5s^-1，亲和力常数K_D为2.26×10¹⁰M(图5)。

实施例四Tytug的体内肿瘤靶向能力

1、小动物活体成像观察Tytug在体内的肿瘤靶向性

本实验通过将Tytug标记荧光素Cy5.5，利用小动物活体成像技术，对其在结肠癌细胞系HT-29裸鼠皮下瘤模型中的分布和肿瘤部位的富集情况进行实时监测。荧光素Cy5.5标记后的Tytug抗体溶液肉眼可见呈蓝色，经SDS-PAGE电泳后，IVIS Luminasystem(PerkinElmer，USA)小动物活体成像仪中拍照，激发波长675nm，散射波长694nm。结果如图6显示Tytug和IgG均已成功标记荧光素Cy5.5。当裸鼠皮下肿瘤长至150-200mm³大小时进行实验。Cy5.5-Tytug和对照Cy5.5-IgG通过尾静脉注射进入裸鼠体内。在不同时间的检测，发现给药后4小时Cy5.5-Tytug就开始在肿瘤部位富集，肿瘤部位的荧光富集可维持4天(96h)以上(图7，右边小鼠)。然而，Cy5.5-IgG在小鼠体内代谢，在肿瘤部位检测到荧光信号(图7，左边小鼠)。因此，本实验表明Tytug可以靶向并且富集在肿瘤部位。

2、活体成像切片

为了进一步研究Tytug在荷瘤裸鼠体内的肿瘤部位的富集情况，取Cy5.5-Tytug尾静脉注射后12小时的裸鼠肿瘤组织及重要器官(心、肝、脾、肺和肾)，制作冰冻切片，用共聚焦显微镜检测这些组织的荧光信号强度。结果显示，肿瘤组织的Cy5.5-Tytug红色荧光最强，肝、脾和肾组织中可观察到较弱的红色荧光，心和肺组织未出现红色荧光。此外，对照Cy5.5-IgG在肿瘤组织有红色荧光，但是呈非特异分布，多聚集在细胞间质；而在肿瘤组织中，Tytug主要聚集在细胞质中，这表明Tytug在体内可有效靶向肿瘤组织并进入肿瘤细胞内部。

实施例五Tytug抗体的细胞内化效率研究

1、流式细胞术观察抗体的内化效率

抗体Tytug与细胞表面DDR1抗原结合后，观察分别放置在4℃和37℃不同时间段抗体的内化效率。结果显示：在4℃，细胞放置30分钟，1小时，3小时抗体的内化率没有发生变化，说明抗体在4℃未进行内化；在37℃，30分钟，1小时，3小时可检测到抗体的内化率随时间增长而增长，说明抗体在37℃发生内化，进入细胞内部，所以细胞膜表面的抗体减少，随着时间延长，内化的抗体越多，细胞表面上可检测到的抗体越少(参见表5)。

表5 Tytug的细胞内化效率

37℃内化时间(小时)	内化率
		0	0
0.5	32.8％
		1	32.4％
3	49.8％

2、细胞免疫荧光观察DDR1结合Tytug抗体后的在肿瘤细胞中的内化情况

为进一步证明Tytug内化进入细胞，进行了细胞免疫荧光实验。利用激光共聚焦显微镜，观察DDR1结合Tytug抗体后的在肿瘤细胞中的内化情况。本实验选取DDR1表达阳性细胞HT-29作为研究对象。在研究Tytug是否可以通过DDR1介导的内吞进入细胞之前，首先观察Tytug与细胞表面DDR1结合的情况。将Tytug(绿色荧光)与结肠癌细胞在4℃孵育40min，两者的结合情况如图8第一行所示。Tytug可以与DDR1表达阳性细胞HT-29细胞表面结合。检测DDR1阳性细胞对Tytug的内化情况，Tytug与细胞结合后，放进37℃孵箱进行内化3小时。为了观察Tytug在细胞质中的定位，通过溶酶体染料标记溶酶体(红色)，观察到Tytug被转运至溶酶体，Tytug和溶酶体重叠区域为橙色，如图8第二行图所示。结果表明，Tytug可以通过DDR1介导的内吞作用进入细胞质，并且被转运到溶酶体，这是ADCs药物降解，弹头药物释放的重要过程。

实施例六Tytug抗体的安全性评价

因为鼠源DDR1和人源DDR1 ECD氨基酸序列相同，为了评估Tytug的潜在毒性，使用多次给药的BALB/c nude裸鼠模型进行了初步安全性评价。

使用裸鼠结肠癌细胞HT-29移植瘤模型，Tytug以10mg/kg的剂量尾静脉给药三次。在给药后，各组裸鼠行为活动正常，未出现死亡。最后一次给药后的第7天，分别取对照组、Tytug抗体组裸鼠的心、肝、脾、肺、肾，制作病理切片，苏木精-易红(H&E)染色，用CaseViewer2.0图像分析软件进行组织病理切片的观察(×100)，结果如图9所示。与对照组相比较，Tytug抗体组裸鼠的各个脏器未见明显组织病变，说明在该给药剂量下Tytug对裸鼠无明显毒副作用。

Claims

1.抗DDR1的抗体或其抗原结合片段，其特征在于：所述抗体或其抗原结合片段的重链互补决定区包含VH-CDR1、VH-CDR2、VH-CDR3，其氨基酸序列分别为SEQ ID NO.1、SEQ IDNO.2、SEQ ID NO.3所示；所述抗体或其片段的轻链互补决定区包含VL-CDR1、VL-CDR2、VL-CDR3，其氨基酸序列分别为SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6所示。

2.根据权利要求1所述的抗DDR1的抗体或其抗原结合片段，其特征在于：重链可变区VH由所述的VH-CDR1、VH-CDR2、VH-CDR3与抗体框架区FR拼接而成，轻链可变区VL由所述的VL-CDR1、VL-CDR2、VL-CDR3与抗体框架区FR拼接而成。

3.根据权利要求1或2任一项所述的抗DDR1的抗体或其抗原结合片段，其特征在于所述重链可变区VH的氨基酸序列为SEQ ID NO.7所示、所述轻链可变区VL的氨基酸序列为SEQID NO.8所示。

4.根据权利要求1～3任一项所述的抗DDR1的抗体或其抗原结合片段，其特征在于所述的抗原结合片段为Fab或scFv。

5.根据权利要求1～4任一项所述的抗DDR1的抗体或其抗原结合片段，所述抗体的重链恒定区来自人或鼠的免疫球蛋白IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgE、IgA或IgD重链的恒定区；或者，所述轻链恒定区来自人或鼠的免疫球蛋白κ或λ轻链的恒定区。

6.根据权利要求1～4任一项所述的抗DDR1的抗体或其抗原结合片段，所述抗体的重链恒定区来自人或鼠的免疫球蛋白IgG1，轻链恒定区来自人或鼠的免疫球蛋白κ轻链的恒定区。

7.根据权利要求1～6任一所述的抗DDR1的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗DDR1的抗体或其抗原结合片段带有可检测的标记，所述可检测的标记为酶、放射性核素、荧光染料、发光物质或生物素。

8.编码权利要求1～7中任一项所述抗DDR1的抗体或其片段的核酸分子；或者包含编码权利要求1～7中任一项所述抗DDR1的抗体或其片段的核酸分子的重组载体。

9.包含权利要求8所述的核酸分子或重组载体的宿主细胞。

10.一种制备权利要求1～7任一所述的抗DDR1的抗体或其抗原结合片段的方法，包括，在允许所述抗DDR1的抗体或其抗原结合片段表达的条件下，培养权利要求9所述的宿主细胞，和从培养的宿主细胞培养物中回收所述抗体或其抗原结合片段。

11.一种药物组合物，其含有权利要求1～7任一所述的抗DDR1的抗体或其抗原结合片段、或权利要求8所述的载体、或者权利要求9所述的宿主细胞中的至少一种，以及药学上可接受的载体和/或赋形剂。

12.一种缀合物，其包含权利要求1～7任一所述的抗DDR1的抗体或其抗原结合片段以及连接于所述抗DDR1的抗体或其抗原结合片段的治疗剂。

13.权利要求12所述的缀合物，其特征在于所述治疗剂选自细胞毒素或放射性同位素；所述细胞毒素选自喜树碱或喜树碱衍生物、加利车霉素、美登素或其衍生物、美登木素生物碱、多拉司他汀、澳瑞他汀或单端孢霉素。

14.权利要求1～7任一项所述的抗DDR1的抗体或其抗原结合片段或权利要求8所述的核酸分子或权利要求11所述的药物组合物或权利要求12或中的任一项所述的缀合物的用途，其为以下至少一项：

a)、在制备用于抑制受试者中的肿瘤细胞生长、转移的药物中的用途；

b)、或者，在制备用于治疗或预防肿瘤、感染性疾病、炎症或自身免疫性疾病的药物中的用途；

c)、或者，在制备用于诊断肿瘤、感染性疾病、炎症或自身免疫性疾病的试剂中的用途。

15.权利要求14所述的用途，其特征在于：所述肿瘤选自食管癌、胃肠癌、胰腺癌、甲状腺癌、结直肠癌、肾癌、肺癌、肝癌、胃癌、头颈癌、膀胱癌、乳腺癌、子宫癌、宫颈癌、卵巢癌、前列腺癌、睾丸癌、生殖细胞癌、骨癌、皮肤癌、胸腺癌、胆管癌、黑素瘤、间皮瘤、间质瘤、淋巴瘤、骨髓瘤、肉瘤、成胶质细胞瘤、神经胶质母细胞瘤、白血病或癌症的转移性、难治性或复发性病灶。