CN116410313A - Cd30人源化鼠单抗开发 - Google Patents

Cd30人源化鼠单抗开发 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种抗CD30抗体。具体地，本发明提供了一类靶向CD30的单克隆抗体。本发明通过杂交瘤技术获得了一组抗CD30的抗体，还提供了人源化抗CD30抗体。本发明的抗CD30抗体能够特异性结合CD30，并具有高亲和力。因而本发明抗体具有治疗CD30相关疾病，尤其是治疗淋巴瘤方面的前景。在此基础上，完成了本发明。

Description

CD30人源化鼠单抗开发
技术领域
本发明涉及生物医药领域。具体地说，本发明涉及靶向CD30的单克隆抗体及人源化抗体。
背景技术
CD30分子，又名肿瘤坏死因子受体超家族成员8(TNFRSF8)。其主要以膜表达以及剪切可溶性形式存在于机体内。CD30过表达于经典霍奇金淋巴瘤(HL)和间变性大细胞淋巴瘤(ALCL)的整个细胞生长阶段。对于亚洲人群，存在一种预后不良的非霍奇金淋巴瘤亚型，即外周NK/T细胞淋巴瘤，据相关研究，CD30在其中的表达能够达到56.5％。
近些年免疫疗法(嵌合抗原受体CART疗法)对恶性肿瘤治疗取得了巨大突破。针对CD30分子已经有成熟的CD30抗体药物(BV)。然而，虽然现有抗体具有一定的针对CD30的亲和力，但异源性的抗体仍然存在免疫原性高，容易诱发机体免疫反应的不足。
因此，本领域有必要提供一种抗CD30的人源化抗体。
发明内容
本发明的目的就是提供一组抗CD30的抗体。
在本发明的第一方面，提供了一种抗CD30的抗体，所述的抗体包括重链和轻链，
其中，所述重链的可变区具有氨基酸序列如下所示的互补决定区CDR：
SEQ ID NO:6n+17所示的VH-CDR1，
SEQ ID NO:6n+18所示的VH-CDR1，和
SEQ ID NO:6n+19所示的VH-CDR1；
并且，所述轻链的可变区具有氨基酸序列如下所示的互补决定区CDR：
SEQ ID NO:6n+14所示的VL-CDR1，
SEQ ID NO:6n+15所示的VL-CDR2，和
SEQ ID NO:6n+16所示的VL-CDR3；
其中，n选自0、1、2或3的整数；
并且，上述CDR序列中任意一种氨基酸序列还包括任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸的，并使得含有所述衍生CDR序列的重链和轻链所构成的衍生抗体能够保留CD30结合亲和力的衍生序列。
在另一优选例中，所述抗体的重链可变区还包括人源的框架区，和/或所述抗体的轻链可变区还包括人源的框架区。
在另一优选例中，所述抗体的重链可变区还包括人源化的框架区，和/或所述抗体的轻链可变区还包括人源化的框架区。
在另一优选例中，所述抗体的重链可变区还包括鼠源的框架区，和/或所述抗体的轻链可变区还包括鼠源的框架区。
在另一优选例中，所述重链的可变区还具有框架区，所述框架区的氨基酸序列衍生自SEQ ID NO:2、4、6、8、12或13；
在另一优选例中，所述轻链的可变区还具有框架区，所述框架区的氨基酸序列衍生自SEQ ID NO:1、3、5、7、9、10或11。
在另一优选例中，所述重链的可变区具有SEQ ID NO:2、4、6、8、12或13所示的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述轻链的可变区具有SEQ ID NO:1、3、5、7、9、10或11所示的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述重链可变区的氨基酸序列与如序列表中SEQ ID NO:2、4、6、8、12或13所示的氨基酸序列至少有80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同源性或序列相同性。
在另一优选例中，所述轻链可变区的氨基酸序列与如序列表中SEQ ID NO:1、3、5、7、9、10或11所示的氨基酸序列至少有80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同源性或序列相同性。
在另一优选例中，所述重链的可变区对应SEQ ID NO:2所示序列存在选自下组的氨基酸突变：第5位谷氨酰胺(Q)、第11位亮氨酸(L)、第12位缬氨酸(V)、第13位精氨酸(R)、第20位异亮氨酸(I)、第38位赖氨酸(K)、第40位精氨酸(R)、第48位异亮氨酸(I)、第65位赖氨酸(K)、第67位赖氨酸(K)、第68位丙氨酸(A)、第76位丝氨酸(S)、第82位谷氨酰胺(Q)、第87位苏氨酸(T)、第91位丝氨酸(S)、第114位丝氨酸(S)。
在另一优选例中，所述的重链可变区对应于SEQ ID NO.2所示序列的突变选自下组：Q5V、L11V、V12K、R13K、I20V、K38R、R40A、I48M、K65Q、K67R、A68V、S76S、Q82E、T87R、S91T、S114L、或其组合。
在另一优选例中，所述轻链的可变区对应SEQ ID NO:1所示序列存在选自下组的氨基酸突变：第9位丙氨酸(A)、第10位丝氨酸(S)、第12位丙氨酸(A)、第13位缬氨酸(V)、第15位亮氨酸(L)、第17位谷氨酰胺(Q)、第21位异亮氨酸(I)、第22位丝氨酸(S)、第60位丝氨酸(S)、第62位缬氨酸(V)、第64位丙氨酸(A)、第76位丝氨酸(S)、第78位天冬酰胺(N)、第80位组氨酸(H)、第81位脯氨酸(P)、第82位缬氨酸(V)、第84位谷氨酸(E)、第85位天冬氨酸(D)、第87位异亮氨酸(I)、第108位亮氨酸(I)。
在另一优选例中，所述的轻链可变区对应于SEQ ID NO.1所示序列的突变选自下组：A9D、S10T、A12S、V13L、L15P、Q17E、I21L、S22N、S60T、V62I、A64D、S76T、N78T、H80S、P81S、V82L、E84P、D85E、I87F、L108V、或其组合。
在另一优选例中，所述抗体的重链可变区含有SEQ ID NO:2、4、6、8、12或13所示的氨基酸序列；并且所述抗体的轻链可变区含有SEQ ID NO:1、3、5、7、9、10或11所示的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述抗体具有选自下组的轻链可变区和重链可变区：
1)氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的轻链可变区，和氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的重链可变区；
2)氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示的轻链可变区，和氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示的重链可变区；
3)氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示的轻链可变区，和氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示的重链可变区；
4)氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示的轻链可变区，和氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示的重链可变区；或
5)氨基酸序列如SEQ ID NO:9、10或11所示的轻链可变区，和氨基酸序列如SEQ IDNO:SEQ ID NO:12或13所示的重链可变区；
在另一优选例中，所述的抗体为人源化抗体，且具有氨基酸序列如SEQ ID NO:9、10或11所示的轻链可变区，和氨基酸序列如SEQ ID NO:12或13所示的重链可变区。
在另一优选例中，所述抗体的重链可变区含有SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列；且所述抗体的轻链可变区含有SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述抗体的重链可变区含有SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列；且所述抗体的轻链可变区含有SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述重链还包括重链恒定区。
在另一优选例中，所述重链恒定区为人源的、鼠源的、或嵌合的。
在另一优选例中，所述轻链还包括轻链恒定区。
在另一优选例中，所述轻链恒定区为人源的、鼠源的、或嵌合的。
在另一优选例中，所述抗体选自下组：动物源抗体、嵌合抗体、人源化抗体、全人抗体、或其组合。
在另一优选例中，所述的抗体为单克隆抗体、或多克隆抗体。
在另一优选例中，所述的抗体是部分或全人源化、或全人的单克隆抗体。
在另一优选例中，所述的抗体为双链抗体、或单链抗体。
在另一优选例中，所述抗体为抗体全长蛋白、或抗原结合片段。
在另一优选例中，所述抗体为双特异性抗体、或多特异性抗体。
在另一优选例中，所述的抗体为药物偶联物形式。
在另一优选例中，所述抗体能够特异性结合于CD30。
在另一优选例中，所述抗体对CD30的亲和力水平为：KD≤10-8M，较佳地≤10-9M，更佳地≤10-10M。
在本发明的第二方面，提供了一种重组蛋白，所述的重组蛋白包括：
(i)如本发明第一方面所述的抗体；以及
(ii)任选的协助表达和/或纯化的标签序列。
在另一优选例中，所述的标签序列包括6His标签、GGGS序列、FLAG标签。
在另一优选例中，所述的重组蛋白(或多肽)包括融合蛋白。
在另一优选例中，所述的重组蛋白为单体、二聚体、或多聚体。
在另一优选例中，所述的重组蛋白特异性抗CD30。
在另一优选例中，所述的重组蛋白为融合蛋白。
在另一优选例中，所述的融合蛋白为单特异性抗体(即抗CD30的单特异性抗体)、双特异性抗体、或多特异性抗体(如三特异性抗体)。
在另一优选例中，所述的双特异性抗体或多特异性抗体不仅抗CD30，还特异性结合于额外的靶抗原(如其他的肿瘤抗原，如淋巴瘤的其他抗原或其他肿瘤的抗原)。
在本发明的第三方面，提供了一种嵌合抗原受体(CAR)构建物，所述的嵌合抗原受体构建物的抗原结合区域的scFv段特异性结合于CD30，并且所述scFv具有如本发明第一方面所述的抗体的重链可变区和轻链可变区。
在本发明的第四方面，提供了一种重组的免疫细胞，所述的免疫细胞表达外源的如本发明第三方面所述的CAR构建物。
在另一优选例中，所述的免疫细胞选自下组：NK细胞、T细胞。
在另一优选例中，所述的免疫细胞来自人或非人哺乳动物(如鼠)。
在本发明的第五方面，提供了一种抗体偶联物，所述抗体偶联物含有：
(a)抗体部分，所述抗体部分选自下组：如本发明第一方面所述的抗体；和
(b)与所述抗体部分偶联的偶联部分，所述偶联部分选自下组：可检测标记物、药物、酶、或其组合。
在另一优选例中，所述的可检测标记物包括放射性核素。
在另一优选例中，所述的药物包括毒素和细胞因子。
在另一优选例中，所述偶联物选自：荧光或发光标记物、放射性标记物、MRI(磁共振成像)或CT(电子计算机X射线断层扫描技术)造影剂、或能够产生可检测产物的酶、放射性核素、生物毒素、细胞因子(如IL-2等)、抗体、抗体Fc片段、抗体scFv片段、金纳米颗粒/纳米棒、病毒颗粒、脂质体、纳米磁粒、前药激活酶(例如，DT-心肌黄酶(DTD)或联苯基水解酶-样蛋白质(BPHL))、化疗剂(例如，顺铂)或任何形式的纳米颗粒等。
在另一优选例中，所述的抗体部分与所述的偶联部分通过化学键或接头进行偶联。
在本发明的第六方面，提供了一种活性成分的用途，所述活性成分选自下组：如本发明第一方面所述的抗体、如本发明第二方面所述的重组蛋白、如本发明第五方面所述的抗体偶联物、或其组合，其中所述活性成分被用于：
(a)制备诊断试剂、检测板或试剂盒；和/或
(b)制备预防和/或治疗与CD30表达或功能异常相关的疾病的药物。
在另一优选例中，所述试剂用于检测CD30。
在另一优选例中，所述试剂、检测板或试剂盒用于检测CD30表达或功能异常相关的疾病。
在另一优选例中，所述试剂、检测板或试剂盒用于预测淋巴瘤的风险。
在另一优选例中，所述药剂用于预防和/或治疗肿瘤。
在另一优选例中，所述的药剂用于预防和/或治疗淋巴瘤。
在本发明的第七方面，提供了一种药物组合物，所述药物组合物含有：
(i)活性成分，所述活性成分选自下组：如本发明第一方面所述的抗体、如本发明第二方面所述的重组蛋白、如本发明第四方面所述的免疫细胞、如本发明第五方面所述的抗体偶联物、或其组合；以及
(ii)药学上可接受的载体。
在另一优选例中，所述的药物组合物为液态制剂。
在另一优选例中，所述的药物组合物为注射剂。
在另一优选例中，所述的药物组合物包括0.01～99.99％的如本发明第一方面所述的抗体、如本发明第二方面所述的重组蛋白、如本发明第四方面所述的免疫细胞、如本发明第五方面所述的抗体偶联物、或其组合和0.01～99.99％的药用载体，所述百分比为占所述药物组合物的质量百分比。
在另一优选例中，所述的药物组合物用于预防和/或治疗淋巴瘤。
在本发明的第八方面，提供了一种多核苷酸，所述多核苷酸编码选自下组的多肽：
(1)如本发明第一方面所述的抗体；
(2)如本发明第二方面所述的重组蛋白；或
(3)如本发明第三方面所述的嵌合抗原受体(CAR)构建物。
在本发明的第九方面，提供了一种载体，所述载体含有如本发明第八方面所述的多核苷酸。
在另一优选例中，所述的载体包括：细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒、或其他载体。
在另一优选例中，所述的载体为pcDNA3.1-IgG1Fc表达载体和/或pcDNA3.1-IgKc表达载体。
在本发明的第十方面，提供了一种工程化的宿主细胞，所述宿主细胞含有如本发明第九方面所述的载体或基因组中整合有如本本发明第八方面所述的多核苷酸。
在本发明的第十一方面，提供了一种检测样品中CD30的方法，所述方法包括步骤：
(1)将所述样品与如本发明第一方面所述的抗体接触；
(2)检测是否形成抗原-抗体复合物，其中形成复合物就表示样品中存在CD30。
在另一优选例中，所述检测为体外非治疗非诊断目的的。
在本发明的第十二方面，提供了一种体外检测样品中CD30的组合物，其包括如本发明第一方面所述的抗体、如本发明第二方面所述的重组蛋白、如本发明第五方面所述的抗体偶联物、如本发明第四方面所述的免疫细胞、或其组合作为活性成分。
在本发明的第十三方面，提供了一种检测板，所述的检测板包括：基片(支撑板)和测试条，所述的测试条含有如本发明第一方面所述的抗体、如本发明第二方面所述的重组蛋白、如本发明第五方面所述的抗体偶联物、如本发明第四方面所述的免疫细胞、或其组合。
在本发明的第十四方面，提供了一种试剂盒，所述试剂盒中包括：
(1)第一容器，所述第一容器中含有如本发明第一方面所述的抗体；和/或
(2)第二容器，所述第二容器中含有抗本发明第一方面所述抗体的二抗；
或者，
所述试剂盒含有如本发明第十三方面所述的检测板。
在本发明的第十五方面，提供了一种重组多肽的制备方法，该方法包括：
(a)在适合表达的条件下，培养如本发明第十方面所述的宿主细胞；
(b)从培养物中分离出重组多肽，所述的重组多肽是如本发明第一方面所述的抗体或如本发明第二方面所述的重组蛋白。
在本发明的第十六方面，提供了一种药物组合，包括：
(i)第一活性成分，所述第一活性成分包括如本发明第一方面所述的抗体、或如本发明第二方面所述的重组蛋白、或如本发明第四方面所述的免疫细胞、或如本发明第五方面所述的抗体偶联物、或如本发明第七方面所述的药物组合物、或其组合；
(ii)第二活性成分，所述第二活性成分包括其他抗肿瘤药物。
在另一优选例中，所述的抗肿瘤药物选自下组：化疗剂、靶向治疗剂、内分泌治疗剂。
在本发明的第十七方面，提供了如本发明第一方面所述的抗体，或本发明第二方面所述的重组蛋白、或本发明第五方面所述的抗体偶联物、或本发明第四方面所述的免疫细胞、和/或如本发明第七方面所述的药物组合物在制备用于治疗CD30表达或功能异常相关的疾病的药物中的用途。
在另一优选例中，所述的CD30表达异常指CD30过度表达。
在另一优选例中，所述的过度表达指CD30的表达量(F1)与生理情况下表达量(F0)之比(即F1/F0)≥1.5，优选地≥2，更优选地≥2.5。
在另一优选例中，所述的药物用于预防和/或治疗肿瘤发生、生长和/或转移。
在另一优选例中，所述的药物用于预防和/或治疗非霍奇金淋巴瘤。
在另一优选例中，所述药物为抗肿瘤药物。
在本发明的第十八方面，提供了一种治疗与CD30表达或功能异常相关的疾病的方法，向有需要的对象施用有效量的如本发明第一方面所述的抗体、或如本发明第二方面所述的重组蛋白、或如本发明第四方面所述的免疫细胞、或如本发明第五方面所述的抗体偶联物、或如本发明第七方面所述的药物组合物、或如本发明第十六方面所述的药物组合、或其组合。
在另一优选例中，所述的CD30表达或功能异常相关的疾病包括癌症或肿瘤。
在另一优选例中，所述癌症或肿瘤选自下组：血液肿瘤、淋巴瘤、实体瘤、或其组合。
在另一优选例中，所述血液肿瘤选自下组：急性髓细胞白血病(AML)、多发性骨髓瘤(MM)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、急性淋巴白血病(ALL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、或其组合。
在另一优选例中，所述淋巴瘤选自下组：霍奇金淋巴瘤(HL)，弥漫大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、滤泡淋巴瘤(FL)、慢性淋巴细胞白细胞(CLL)、小淋巴细胞淋巴瘤(SLL)、边缘区淋巴瘤(MZL)、套细胞淋巴瘤(MCL)、伯基特淋巴瘤(BL)以及其他复杂B细胞非霍奇金淋巴瘤。
在另一优选例中，所述实体瘤选自下组：胃癌、胃癌腹膜转移、肝癌、肾脏肿瘤、肺癌、小肠癌、骨癌、前列腺癌、结直肠癌、乳腺癌、大肠癌、宫颈癌、卵巢癌、淋巴癌、鼻咽癌、肾上腺肿瘤、膀胱肿瘤、非小细胞肺癌(NSCLC)、脑胶质瘤、子宫内膜癌、睾丸癌、结直肠癌、尿路肿瘤、甲状腺癌、或其组合。
在另一优选例中，所述的肿瘤为非霍奇金淋巴瘤。
在另一优选例中，所述的方法还包括：在施用第一活性成分之前、之中和/或之后，向所述对象施用安全有效量的第二活性成分。
在另一优选例中，所述的第二活性成分包括其他抗肿瘤药物，例如化疗剂、靶向治疗剂或内分泌治疗剂。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
下列附图用于说明本发明的具体实施方案，而不用于限定由权利要求书所界定的本发明范围。
图1显示了重链抗体表达载体结构示意图。
图2显示了轻链抗体表达载体表达示意图。
图3显示了小鼠血清免疫效价检测结果。
图4显示了融合板各个孔细胞的ELISA检测结果。
图5显示了第一次亚克隆板各个孔细胞的ELISA检测结果。
图6显示了第二次亚克隆板各个孔细胞的ELISA检测结果。
图7显示了第二次亚克隆板阳性克隆的流式检测结果。
图8显示了CD30嵌合抗体的流式检测结果。
图9显示了CD30人源化抗体的流式检测结果。
图10显示了人源化抗体的表达及鉴定。左图的泳道1代表人源化抗体7-A2-E8-E6-hVH+hVL的条带大小，泳道2代表7-A2-E8-E6嵌合抗体的条带大小，右图的泳道1代表人源化抗体7-A2-E8-E6-hVH-0917+hVL-0917的条带大小。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，首次意外地获得了一类靶向CD30的单克隆抗体。本发明通过杂交瘤技术获得了一组靶向CD30的抗体，其能够特异性结合CD30，并具有高亲和力。并且，本发明还筛选出了人源化抗体的轻重链。因而本发明抗体具有治疗CD30相关疾病，尤其是治疗淋巴瘤方面的前景。在此基础上，完成了本发明。
经流式检测验证，本发明开发抗CD30的嵌合抗体具有特异性结合CD30能力。并且，本发明所筛选的两条重链可变区和三条轻链可变区两两组合后，均能产生具有优秀结合力的抗体，其亲和力与嵌合抗体的亲和力一致。
术语
为了更容易理解本发明，以下具体定义了某些技术和科学术语。除非在本文中另有明确定义，本文使用的所有其它技术和科学术语都具有本发明所属领域的一般技术人员通常理解的含义。在描述本发明之前，应当理解本发明不限于所述的具体方法和实验条件，因为这类方法和条件可以变动。还应当理解本文所用的术语其目的仅在于描述具体实施方案，并且不意图是限制性的，本发明的范围将仅由所附的权利要求书限制。
除非另外定义，否则本文中所用的全部技术与科学术语均具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。如本文所用，在提到具体列举的数值中使用时，术语“约”意指该值可以从列举的值变动不多于1％。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。
本发明所用氨基酸三字母代码和单字母代码如J.biol.chem,243,p3558(1968)中所述。
如本文所用，术语“治疗”指给予患者内用或外用治疗剂，包含本发明的针对呼吸道合胞病毒融合蛋白(较佳地融合前F蛋白)的抗体及其组合物，所述患者具有一种或多种疾病症状，而已知所述治疗剂对这些症状具有治疗作用。通常，以有效缓解一种或多种疾病症状的治疗剂的量(治疗有效量)给予患者。
如本文所用，术语“任选”或“任选地”意味着随后所描述的事件或情况可以发生但不是必须发生。例如，“任选包含1-3个抗体重链可变区”是指特定序列的抗体重链可变区可以有但不是必须有，可以是1个、2个或3个。
本发明所述的“序列同一性”表示当具有适当的替换、插入或缺失等突变的情况下最佳比对和比较时，两个核酸或两个氨基酸序列之间的同一性程度。本发明中所述的序列和其具有同一性的序列之间的序列同一性可以至少为85％、90％或95％，优选至少为95％。非限制性实施例包括85％,86％,87％,88％,89％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％,100％。
CD30
如本文所用，术语“CD30”是由基因Tnfrsf8编码的细胞膜受体，也被称为肿瘤坏死因子受体超家族成员8。CD30最初通过单克隆抗体Ki-1被鉴定，是存在于霍奇金氏和里德-斯泰伯格氏细胞表面的抗原。CD30被激活后，还可以在非霍奇金淋巴瘤细胞、病毒感染的T细胞和B细胞以及正常T细胞和B细胞上表达。在T细胞中，CD30主要表达于分泌Th2类细胞因子的T细胞和共表达CD45RO与IL-4受体的CD4+/CD8+胸腺细胞。CD30与其配体结合可介导多种生理功能，包括细胞增殖、活化、分化和凋亡引起的细胞死亡。CD30可以在胸腺阴性选择中充当共刺激分子，并且在霍奇金病和其他CD30+淋巴瘤的病理中发挥关键作用。
抗体
如本文所用，术语“抗体”或“免疫球蛋白”是有相同结构特征的约150000道尔顿的异四聚糖蛋白，其由两个相同的轻链(L)和两个相同的重链(H)组成。每条轻链通过一个共价二硫键与重链相连，而不同免疫球蛋白同种型的重链间的二硫键数目不同。每条重链和轻链也有规则间隔的链内二硫键。每条重链的一端有可变区(VH)，其后是多个恒定区。每条轻链的一端有可变区(VL)，另一端有恒定区；轻链的恒定区与重链的第一个恒定区相对，轻链的可变区与重链的可变区相对。特殊的氨基酸残基在轻链和重链的可变区之间形成界面。
如本文所用，术语“可变”表示抗体中可变区的某些部分在序列上有所不同，它形成了各种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。然而，可变性并不均匀地分布在整个抗体可变区中。它集中于轻链和重链可变区中称为互补决定区(CDR)或超变区中的三个片段中。可变区中较保守的部分称为构架区(FR)。天然重链和轻链的可变区中各自包含四个FR区，它们大致上呈β-折叠构型，由形成连接环的三个CDR相连，在某些情况下可形成部分β折叠结构。每条链中的CDR通过FR区紧密地靠在一起并与另一链的CDR一起形成了抗体的抗原结合部位(参见Kabat等,NIH Publ.No.91-3242,卷I，647-669页(1991))。恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，但是它们表现出不同的效应功能，例如参与抗体的依赖于抗体的细胞毒性。
脊椎动物抗体(免疫球蛋白)的“轻链”可根据其恒定区的氨基酸序列归为明显不同的两类(称为κ和λ)中的一类。根据其重链恒定区的氨基酸序列，免疫球蛋白可以分为不同的种类。主要有5类免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中一些还可进一步分成亚类(同种型)，如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA和IgA2。对应于不同类免疫球蛋白的重链恒定区分别称为α、δ、ε、γ、和μ。不同类免疫球蛋白的亚单位结构和三维构型是本领域人员所熟知的。
如本文所用，术语“单克隆抗体(单抗)”指从一类基本均一的群体获得的抗体，即该群体中包含的单个抗体是相同的，除少数可能存在的天然发生的突变外。单克隆抗体高特异性地针对单个抗原位点。而且，与常规多克隆抗体制剂(通常是具有针对不同决定簇的不同抗体)不同，各单克隆抗体是针对抗原上的单个决定簇。除了它们的特异性外，单克隆抗体的好处还在于它们是通过杂交瘤培养来合成的，不会被其它免疫球蛋白污染。修饰语“单克隆”表示了抗体的特性，是从基本均一的抗体群中获得的，这不应被解释成需要用任何特殊方法来生产抗体。
一般，抗体的抗原结合特性可由位于重链和轻链可变区的3个特定的区域来描述，称为可变区域(CDR)，将该段间隔成4个框架区域(FR)，4个FR的氨基酸序列相对比较保守，不直接参与结合反应。这些CDR形成环状结构，通过其间的FR形成的β折叠在空间结构上相互靠近，重链上的CDR和相应轻链上的CDR构成了抗体的抗原结合位点。可以通过比较同类型的抗体的氨基酸序列来确定是哪些氨基酸构成了FR或CDR区域。
术语“抗体的抗原结合片段”(或简称“抗体片段”)是指抗体的保持特异性结合抗原的能力的一个或多个片段。己显示可利用全长抗体的片段来进行抗体的抗原结合功能。术语“抗体的抗原结合片段”中包含的结合片段的实例包括(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab')2片段，包含通过较链区上的二硫桥连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体的单臂的VH和VL结构域组成的Fv片段。Fv抗体含有抗体重链可变区、轻链可变区，但没有恒定区，并具有全部抗原结合位点的最小抗体片段。一般的，Fv抗体还包含VH和VL结构域之间的多肽接头，且能够形成抗原结合所需的结构。
本发明不仅包括完整的单克隆抗体，还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab或(Fab')2片段；抗体重链；抗体轻链。
术语“表位”或“抗原决定簇”是指抗原上免疫球蛋白或抗体特异性结合的部位。表位通常以独特的空间构象包括至少3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14或15个连续或非连续的氨基酸。表位可以是抗原上不连续的，由本发明抗体或抗原结合片段识别的三维空间位点。
术语“特异性结合”、“选择性结合”、“选择性地结合”和“特异性地结合”是指抗体对预先确定的抗原上的表位的结合。通常，抗体以大约小于10-7M，例如大约小于10-8M、10-9M或l0-10M或更小的亲和力(KD)结合。
本发明不仅包括完整的抗体，还包括具有免疫活性的抗体的片段或抗体与其他序列形成的融合蛋白。因此，本发明还包括所述抗体的片段、衍生物和类似物。
在本发明中，抗体包括用本领域技术人员熟知技术所制备的鼠的、嵌合的、人源化的或者全人的抗体。重组抗体，例如嵌合的和人源化的单克隆抗体，包括人的和非人的部分，可以通过标准的DNA重组技术获得，它们都是有用的抗体。嵌合抗体是一个分子，其中不同的部分来自不同的动物种，例如具有来自鼠的单克隆抗体的可变区，和来自人免疫球蛋白的恒定区的嵌合抗体(见例如美国专利4,816,567和美国专利4,816,397,在此通过引用方式整体引入本文)。人源化的抗体是指来源于非人物种的抗体分子，具有一个或多个来源于非人物种的互补决定区(CDRs)和来源于人免疫球蛋白分子的框架区域(见美国专利5,585,089，在此通过引用方式整体引入本文)。这些嵌合和人源化的单克隆抗体可以采用本领域熟知的DNA重组技术制备。
在本发明中，抗体可以是单特异性、双特异性、三特异性、或者更多的多重特异性。
如本文所用，术语“重链可变区”与“VH”可互换使用。
如本文所用，术语“可变区”与“互补决定区(complementarity determiningregion,CDR)”可互换使用。
术语“CDR”是指抗体的可变结构域内主要促成抗原结合的6个高变区之一。所述6个CDR的最常用的定义之一由Kabat E.A等人，(1991)Sequences of proteins ofimmunological interest.NIH Publication91-3242)提供。
在本发明的一个优选的实施方式中，所述抗体的轻链包括上述轻链可变区和轻链恒定区，所述轻链恒定区可以为鼠源或人源。
在本发明中，本发明的抗体还包括其保守性变异体，指与本发明抗体的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表A进行氨基酸替换而产生。
表A
最初的残基 代表性的取代 优选的取代
Ala(A) Val；Leu；Ile Val
Arg(R) Lys；Gln；Asn Lys
Asn(N) Gln；His；Lys；Arg Gln
Asp(D) Glu Glu
Cys(C) Ser Ser
Gln(Q) Asn Asn
Glu(E) Asp Asp
Gly(G) Pro；Ala Ala
His(H) Asn；Gln；Lys；Arg Arg
Ile(I) Leu；Val；Met；Ala；Phe Leu
Leu(L) Ile；Val；Met；Ala；Phe Ile
Lys(K) Arg；Gln；Asn Arg
Met(M) Leu；Phe；Ile Leu
Phe(F) Leu；Val；Ile；Ala；Tyr Leu
Pro(P) Ala Ala
Ser(S) Thr Thr
Thr(T) Ser Ser
Trp(W) Tyr；Phe Tyr
Tyr(Y) Trp；Phe；Thr；Ser Phe
Val(V) Ile；Leu；Met；Phe；Ala Leu
抗CD30抗体
如本文所用，术语“本发明的抗体”、“本发明的抗CD30抗体”和“本发明的CD30中和抗体”可互换使用，均指本发明第一方面中所述的抗CD30的抗体。
本发明的抗体的功能是由此抗体轻链和重链可变区基因特异性基因序列决定。本发明的抗体可以高亲和力地结合CD30。利用本发明抗体的可变区基因或互补决定区(CDR)基因，可在利用原核和真核细胞的任何表达系统中改造和生产不同形式的基因工程抗体。
本发明提供了一种抗CD30的抗体，所述的抗体包括重链和轻链，
其中，所述重链的可变区具有氨基酸序列如下所示的互补决定区CDR：
SEQ ID NO:6n+17所示的VH-CDR1，
SEQ ID NO:6n+18所示的VH-CDR1，和
SEQ ID NO:6n+19所示的VH-CDR1；
并且，所述轻链的可变区具有氨基酸序列如下所示的互补决定区CDR：
SEQ ID NO:6n+14所示的VL-CDR1，
SEQ ID NO:6n+15所示的VL-CDR2，和
SEQ ID NO:6n+16所示的VL-CDR3；
其中，n选自0、1、2或3的整数；
上述CDR序列中任意一种氨基酸序列还包括任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸的，并使得含有所述衍生CDR序列的重链和轻链所构成的衍生抗体能够保留CD30结合亲和力的衍生序列。
优选地，所述抗体具有选自下组的轻链可变区和重链可变区：
1)氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的轻链可变区，和氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的重链可变区；
2)氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示的轻链可变区，和氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示的重链可变区；
3)氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示的轻链可变区，和氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示的重链可变区；
4)氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示的轻链可变区，和氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示的重链可变区；或
5)氨基酸序列如SEQ ID NO:9、10或11所示的轻链可变区，和氨基酸序列如SEQ IDNO:SEQ ID NO:12或13所示的重链可变区。
在本发明的优选实施方式中，所述的抗体为人源化抗体。所述人源化抗体是通过对上述SEQ ID NO:1、3、5或7所示的轻链可变区的框架区和SEQ ID NO:2、4、6或8所示的重链可变区的框架区进行回复突变获得的，并且优选地是通过对上述SEQ ID NO:1所示的轻链可变区的框架区和SEQ ID NO:2所示的重链可变区的框架区进行回复突变获得的。本发明的人源化抗体优选地具有氨基酸序列如SEQ ID NO:9、10或11所示的轻链可变区，和氨基酸序列如SEQ ID NO:12或13所示的重链可变区。
本领域普通技术人员公知的测定序列同源性或相同性的方法包括但不限于：计算机分子生物学(Computational Molecular Biology)，Lesk，A.M.编，牛津大学出版社，纽约，1988；生物计算：信息学和基因组项目(Biocomputing:Informatics and GenomeProjects)，Smith，D.W.编，学术出版社，纽约，1993；序列数据的计算机分析(ComputerAnalysis of Sequence Data)，第一部分，Griffin，A.M.和Griffin，H.G.编，HumanaPress，新泽西，1994；分子生物学中的序列分析(Sequence Analysis in MolecularBiology)，von Heinje，G.，学术出版社，1987和序列分析引物(Sequence AnalysisPrimer)，Gribskov，M.与Devereux，J.编M Stockton Press，纽约，1991和Carillo，H.与Lipman，D.，SIAM J.Applied Math.，48:1073(1988)。测定相同性的优选方法要在测试的序列之间得到最大的匹配。测定相同性的方法编译在公众可获得的计算机程序中。优选的测定两条序列之间相同性的计算机程序方法包括但不限于：GCG程序包(Devereux，J.等，1984)、BLASTP、BLASTN和FASTA(Altschul，S，F.等，1990)。公众可从NCBI和其它来源得到BLASTX程序(BLAST手册，Altschul，S.等，NCBI NLM NIH Bethesda，Md.20894；Altschul，S.等，1990)。熟知的Smith Waterman算法也可用于测定相同性。
较佳地，本文所述抗体为抗体全长蛋白、抗原抗体结合域蛋白质片段、双特异性抗体、多特异性抗体、单链抗体(single chain antibody fragment，scFv)、单域抗体(singledomain antibody，sdAb)和单区抗体(Signle-domain antibody)中的一种或多种，以及上述抗体所制得的单克隆抗体或多克隆抗体。所述单克隆抗体可以由多种途径和技术进行研制，包括杂交瘤技术、噬菌体展示技术、单淋巴细胞基因克隆技术等，主流是通过杂交瘤技术从野生型或转基因小鼠制备单克隆抗体。
所述的抗体全长蛋白为本领域常规的抗体全长蛋白，其包括重链可变区、轻链可变区、重链恒定区和轻链恒定区。所述的蛋白质的重链可变区和轻链可变区与人源重链恒定区和人源轻链恒定区构成全人源抗体全长蛋白。较佳地，所述的抗体全长蛋白为IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。
本发明的抗体可以是双链或单链抗体，并且可以是选自动物源抗体、嵌合抗体、人源化抗体，更优选为人源化抗体、人-动物嵌合抗体，更优选为全人源化抗体。
本发明所述抗体衍生物可以是单链抗体、和/或抗体片段，如：Fab、Fab'、(Fab')2或该领域内其他已知的抗体衍生物等，以及IgA、IgD、IgE、IgG以及IgM抗体或其他亚型的抗体中的任意一种或几种。
所述的单链抗体为本领域常规的单链抗体，其包括重链可变区、轻链可变区和15～20个氨基酸的短肽。
其中，所述动物优选为哺乳动物，如鼠。
本发明抗体可以是靶向CD30(例如人CD30)的嵌合抗体、人源化抗体、CDR嫁接和/或修饰的抗体。
本发明上述内容中，所述添加、缺失、修饰和/或取代的氨基酸数量，优选为不超过初始氨基酸序列总氨基酸数量的40％，更优选为不超过35％，更优选为1-33％，更优选为5-30％，更优选为10-25％，更优选为15-20％。
本发明上述内容中，更优选地，所述添加、缺失、修饰和/或取代的氨基酸数量，可以是1-7个，更优选为1-5个，更优选为1-3个，更优选为1-2个。
重组蛋白
本发明还提供一种重组蛋白，其包括本发明的抗体的重链CDR1(VH-CDR1)、重链CDR2(VH-CDR2)和重链CDR3(VH-CDR3)中的一种或多种，和/或，本发明CD30的轻链CDR1(VL-CDR1)、轻链CDR2(VL-CDR2)和轻链CDR3(VL-CDR3)中的一种或多种。
较佳地，所述的重组蛋白还包括抗体重链恒定区和/或抗体轻链恒定区，所述的抗体重链恒定区为本领域常规，较佳地为大鼠源抗体重链恒定区或人源抗体重链恒定区，更佳地为人源抗体重链恒定区。所述的抗体轻链恒定区为本领域常规，较佳地为大鼠源轻链抗体恒定区或人源抗体轻链恒定区，更佳地为人源抗体轻链恒定区。
在另一优选例中，所述的重组蛋白包括本发明的抗体。
所述的重组蛋白为本领域常规的蛋白质，较佳地，其为抗体全长蛋白、抗原抗体结合域蛋白质片段、双特异性抗体、多特异性抗体、单链抗体(single chain antibodyfragment，scFv)、单域抗体(single domain antibody，sdAb)和单区抗体(Signle-domainantibody)中的一种或多种，以及上述抗体所制得的单克隆抗体或多克隆抗体。所述单克隆抗体可以由多种途径和技术进行研制，包括杂交瘤技术、噬菌体展示技术、单淋巴细胞基因克隆技术等，主流是通过杂交瘤技术从野生型或转基因小鼠制备单克隆抗体。
所述的抗体全长蛋白为本领域常规的抗体全长蛋白，其包括重链可变区、轻链可变区、重链恒定区和轻链恒定区。所述的蛋白质的重链可变区和轻链可变区与人源重链恒定区和人源轻链恒定区构成全人源抗体全长蛋白。较佳地，所述的抗体全长蛋白为IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。
所述的单链抗体为本领域常规的单链抗体，其包括重链可变区、轻链可变区和15～20个氨基酸的短肽。
所述的抗原抗体结合域蛋白质片段为本领域常规的抗原抗体结合域蛋白质片段，其包括轻链可变区、轻链恒定区和重链恒定区的Fd段。较佳地，所述的抗原抗体结合域蛋白质片段为Fab和F(ab')。
所述的单域抗体为本领域常规的单域抗体，其包括重链可变区和重链恒定区。
所述的单区抗体为本领域常规的单区抗体，其仅包括重链可变区。
其中，所述重组蛋白的制备方法为本领域常规的制备方法。所述制备方法较佳地为：从重组表达该蛋白质的表达转化体中分离获得或者通过人工合成蛋白质序列获得。所述的从重组表达该蛋白质的表达转化体中分离获得优选如下方法：将编码所述蛋白质并且带有点突变的核酸分子克隆到重组载体中，将所得重组载体转化到转化体中，得到重组表达转化体，通过培养所得重组表达转化体，即可分离纯化获得所述重组蛋白。
核酸
本发明还提供一种核酸，其编码上述的本发明的抗体或重组蛋白或本发明的的抗体的嵌合抗原受体(CAR)构建物。
所述核酸的制备方法为本领域常规的制备方法，较佳地，包括以下的步骤：通过基因克隆技术获得编码上述蛋白质的核酸分子，或者通过人工全序列合成的方法得到编码上述蛋白质的核酸分子。
本领域技术人员知晓，编码上述蛋白质的氨基酸序列的碱基序列可以适当引入替换、缺失、改变、插入或增加来提供一个多聚核苷酸的同系物。本发明中多聚核苷酸的同系物可以通过对编码该蛋白序列基因的一个或多个碱基在保持抗体活性范围内进行替换、缺失或增加来制得。
载体
本发明还提供一种包含所述核酸的重组表达载体。
其中所述重组表达载体可通过本领域常规方法获得，即：将本发明所述的核酸分子连接于各种表达载体上构建而成。所述的表达载体为本领域常规的各种载体，只要其能够容载前述核酸分子即可。所述载体较佳地包括：各种质粒、粘粒、噬菌体或病毒载体等。
本发明还提供一种包含上述重组表达载体的重组表达转化体。
其中，所述重组表达转化体的制备方法为本领域常规的制备方法，较佳地为：将上述重组表达载体转化至宿主细胞中制得。所述的宿主细胞为本领域常规的各种宿主细胞，只要能满足使上述重组表达载体稳定地自行复制，且所携带所述的核酸可被有效表达即可。较佳地，所述宿主细胞为E.coli TG1或E.coli BL21细胞(表达单链抗体或Fab抗体)，或者HEK293或CHO细胞(表达全长IgG抗体)。将前述重组表达质粒转化至宿主细胞中，即可得本发明优选的重组表达转化体。其中所述转化方法为本领域常规转化方法，较佳地为化学转化法，热激法或电转法。
抗体的制备
本发明抗体或其片段的DNA分子的序列可以用常规技术，比如利用PCR扩增或基因组文库筛选等方法获得。此外，还可将轻链和重链的编码序列融合在一起，形成单链抗体。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。
目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码所述的本发明的抗体(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。
本发明还涉及包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体。这些载体可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。
宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。优选的动物细胞包括(但并不限于)：SP2/0细胞、CHO-S、HEK-293细胞。
通常，在适合本发明抗体表达的条件下，培养转化所得的宿主细胞。然后用常规的免疫球蛋白纯化步骤，如蛋白A-Sepharose、羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析、离子交换层析、疏水层析、分子筛层析或亲和层析等本领域技术人员熟知的常规分离纯化手段纯化得到本发明的抗体。
所得单克隆抗体可用常规手段来鉴定。比如，单克隆抗体的结合特异性可用免疫沉淀或体外结合试验(如放射性免疫测定(RIA)或酶联免疫吸附测定(ELISA))来测定。单克隆抗体的结合亲和力例如可用Munson等,Anal.Biochem.,107:220(1980)的Scatchard分析来测定。
本发明的抗体可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超声处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
抗体-药物偶联物(ADC)
本发明还提供了基于本发明抗体的抗体偶联药物(antibody-drug conjugate，ADC)。
典型地，所述抗体偶联药物包括所述抗体、以及效应分子，所述抗体与所述效应分子偶联，并优选为化学偶联。其中，所述效应分子优选为具有治疗活性的药物。此外，所述效应分子可以是毒蛋白、化疗药物、小分子药物或放射性核素中的一种或多种。
本发明抗体与所述效应分子之间可以是通过偶联剂进行偶联。所述偶联剂的例子可以是非选择性偶联剂、利用羧基的偶联剂、肽链、利用二硫键的偶联剂中的任意一种或几种。所述非选择性偶联剂是指使效应分子和抗体形成共价键连接的化合物，如戊二醛等。所述利用羧基的偶联剂可以是顺乌头酸酐类偶联剂(如顺乌头酸酐)、酰基腙类偶联剂(偶联位点为酰基腙)中的任意一种或几种。
抗体上某些残基(如Cys或Lys等)用于与多种功能基团相连，其中包括成像试剂(例如发色基团和荧光基团)，诊断试剂(例如MRI对比剂和放射性同位素)，稳定剂(例如乙二醇聚合物)和治疗剂。抗体可以被偶联到功能剂以形成抗体-功能剂的偶联物。功能剂(例如药物，检测试剂，稳定剂)被偶联(共价连接)至抗体上。功能剂可以直接地、或者是通过接头间接地连接于抗体。
抗体可以偶联药物从而形成抗体药物偶联物(ADCs)。典型地，ADC包含位于药物和抗体之间的接头。接头可以是可降解的或者是不可降解的接头。可降解的接头典型地在细胞内环境下容易降解，例如在目标位点处接头发生降解，从而使药物从抗体上释放出来。合适的可降解的接头包括，例如酶降解的接头，其中包括可以被细胞内蛋白酶(例如溶酶体蛋白酶或者内体蛋白酶)降解的含有肽基的接头，或者糖接头例如，可以被葡糖苷酸酶降解的含葡糖苷酸的接头。肽基接头可以包括，例如二肽，例如缬氨酸-瓜氨酸，苯丙氨酸-赖氨酸或者缬氨酸-丙氨酸。其它合适的可降解的接头包括，例如，pH敏感接头(例如pH小于5.5时水解的接头，例如腙接头)和在还原条件下会降解的接头(例如二硫键接头)。不可降解的接头典型地在抗体被蛋白酶水解的条件下释放药物。
连接到抗体之前，接头具有能够和某些氨基酸残基反应的活性反应基团，连接通过活性反应基团实现。巯基特异性的活性反应基团是优选的，并包括：例如马来酰亚胺类化合物，卤代酰胺(例如碘、溴或氯代的)；卤代酯(例如碘、溴或氯代的)；卤代甲基酮(例如碘、溴或氯代)，苄基卤代物(例如碘、溴或氯代的)；乙烯基砜，吡啶基二硫化物；汞衍生物例如3,6-二-(汞甲基)二氧六环，而对离子是醋酸根、氯离子或者硝酸根；和聚亚甲基二甲基硫醚硫代磺酸盐。接头可以包括，例如，通过硫代丁二酰亚胺连接到抗体上的马来酰亚胺。
药物可以是任何细胞毒性，抑制细胞生长或者免疫抑制的药物。在实施方式中，接头连接抗体和药物，而药物具有可以和接头成键的功能性基团。例如，药物可以具有可以和连接物成键的氨基，羧基，巯基，羟基，或者酮基。在药物直接连接到接头的情况下，药物在连接到抗体之前，具有反应的活性基团。
有用的药物类别包括，例如，抗微管蛋白药物、DNA小沟结合试剂、DNA复制抑制剂、烷化试剂、抗生素、叶酸拮抗物、抗代谢药物、化疗增敏剂、拓扑异构酶抑制剂、长春花生物碱等。特别有用的细胞毒性药物类的例子包括，例如，DNA小沟结合试剂、DNA烷基化试剂、和微管蛋白抑制剂、典型的细胞毒性药物包括、例如奥瑞他汀(auristatins)、喜树碱(camptothecins)、多卡霉素/倍癌霉素(duocarmycins)、依托泊甙(etoposides)、美登木素(maytansines)和美登素类化合物(maytansinoids)(例如DM1和DM4)、紫杉烷(taxanes)、苯二氮卓类(benzodiazepines)或者含有苯二氮卓的药物(benzodiazepine containingdrugs)(例如吡咯并[1,4]苯二氮卓类(PBDs)，吲哚啉苯并二氮卓类(indolinobenzodiazepines)和噁唑烷并苯并二氮卓类(oxazolidinobenzodiazepines))和长春花生物碱(vinca alkaloids)。
在本发明中，药物-接头可以用于在一个简单步骤中形成ADC。在其它实施方式中，双功能连接物化合物可以用于在两步或多步方法中形成ADC。例如，半胱氨酸残基在第一步骤中与接头的反应活性部分反应，并且在随后的步骤中，接头上的功能性基团与药物反应，从而形成ADC。
通常，选择接头上功能性基团，以利于特异性地与药物部分上的合适的反应活性基团进行反应。作为非限制性的例子，基于叠氮化合物的部分可以用于特异性地与药物部分上的反应性炔基基团反应。药物通过叠氮和炔基之间的1,3-偶极环加成，从而共价结合于接头。其它的有用的功能性基团包括，例如酮类和醛类(适合与酰肼类和烷氧基胺反应)，膦(适合与叠氮反应)；异氰酸酯和异硫氰酸酯(适合与胺类和醇类反应)；和活化的酯类，例如N-羟基琥珀酰亚胺酯(适合与胺类和醇类反应)。这些和其它的连接策略，例如在《生物偶联技术》，第二版(Elsevier)中所描述的，是本领域技术人员所熟知的。本领域技术人员能够理解，对于药物部分和接头的选择性反应，当选择了一个互补对的反应活性功能基团时，该互补对的每一个成员既可以用于接头，也可以用于药物。
本发明还提供了制备ADC的方法，可进一步地包括：将抗体与药物-接头化合物，在足以形成抗体偶联物(ADC)的条件下进行结合。
在某些实施方式中，本发明方法包括：在足以形成抗体-接头偶联物的条件下，将抗体与双功能接头化合物进行结合。在这些实施方式中，本发明方法还进一步地包括：在足以将药物部分通过接头共价连接到抗体的条件下，将抗体接头偶联物与药物部分进行结合。
应用
本发明还提供了本发明抗体、抗体偶联物ADC、重组蛋白、嵌合抗原受体(CAR)构建物和/或免疫细胞的用途，例如用于制备诊断制剂或制备药物。
较佳地，所述的药物是用于预防和/或治疗与CD30表达或功能异常相关的疾病的药物。
本发明中，所述与CD30表达或功能异常相关的疾病是本领域常规的与CD30表达或功能异常相关的疾病。较佳地，所述与CD30表达或功能异常相关的疾病为癌症。
在优选的实施例例中，所述的CD30表达或功能异常相关的疾病为淋巴瘤。
检测用途和试剂盒
本发明的抗体或其ADC可用于检测应用，例如用于检测样本，从而提供诊断信息。
本发明中，所采用的样本(样品)包括细胞、组织样本和活检标本。本发明使用的术语“活检”应包括本领域技术人员已知的所有种类的活检。因此本发明中使用的活检可以包括例如肿瘤的切除样本、通过内窥镜方法或器官的穿刺或针刺活检制备的组织样本。
本发明中使用的样本包括固定的或保存的细胞或组织样本。
本发明还提供了一种指含有本发明的抗体(或其片段)的试剂盒，在本发明的一个优选例中，所述的试剂盒还包括容器、使用说明书、缓冲剂等。在优选例中，本发明的抗体可以固定于检测板。
药物组合物
本发明还提供了一种组合物。在优选例中，所述的组合物是药物组合物，它含有上述的抗体或其活性片段或其融合蛋白或其ADC或相应的免疫细胞，以及药学上可接受的载体。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。
配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：瘤内、腹膜内、静脉内、或局部给药。典型地，本发明所述的药物组合物的给药途径较佳地为注射给药或口服给药。所述注射给药较佳地包括静脉注射、动脉注射、肌肉注射、腹腔注射、皮内注射或皮下注射等途径。所述的药物组合物为本领域常规的各种剂型，较佳地为固体、半固体或液体的形式，可以为水溶液、非水溶液或混悬液，更佳地为片剂、胶囊、颗粒剂、注射剂或输注剂等。
本发明所述抗体也可以是由核苷酸序列在细胞内表达用于的细胞治疗，比如，所述抗体用于嵌合抗原受体T细胞免疫疗法(CAR-T)等。
本发明所述的药物组合物是用于预防和/或治疗与CD30表达或功能异常相关的疾病的药物组合物。
本发明的药物组合物可直接用于抗CD30分子，并阻断CD30与SHH结合，抑制SHH释放，因而可用于预防和治疗肿瘤和肿瘤转移等疾病。
本发明的药物组合物含有安全有效量(如0.001-99wt％,较佳地0.01-90wt％，更佳地0.1-80wt％)的本发明上述的单克隆抗体(或其偶联物)以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约1微克/千克体重-约5毫克/千克体重。此外，本发明的多肽还可与其他治疗剂一起使用。
在本发明的一个优选例中，本发明的多肽可以与化疗剂、其他靶向治疗剂、内分泌治疗剂等治疗和/或预防癌症的治疗剂联用。
本发明中，较佳地，本发明所述的药物组合物还包括一种或多种药用载体。所述的药用载体为本领域常规药用载体，所述的药用载体可以为任意合适的生理学或药学上可接受的药物辅料。所述的药物辅料为本领域常规的药物辅料，较佳的包括药学上可接受的赋形剂、填充剂或稀释剂等。更佳地，所述的药物组合物包括0.01～99.99％的上述蛋白质和0.01～99.99％的药用载体，所述百分比为占所述药物组合物的质量百分比。
本发明中，较佳地，所述的药物组合物的施用量为有效量，所述有效量为能够缓解或延迟疾病、退化性或损伤性病症进展的量。所述有效量可以以个体基础来测定，并将部分基于待治疗症状和所寻求结果的考虑。本领域技术人员可以通过使用个体基础等上述因素和使用不超过常规的实验来确定有效量。
使用药物组合物时，是将安全有效量的免疫偶联物施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约50毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约20毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
本发明提供上述药物组合物在制备预防和/或治疗与CD30表达或功能异常相关的疾病的药物中的应用。较佳地，所述与CD30表达或功能异常相关的疾病为癌症。更佳地，所述与CD30表达或功能异常相关的疾病为淋巴瘤。
检测样品中CD30的方法、组合物
本发明还提供一种检测样品中CD30(例如检测过表达CD30细胞)的方法，包括如下的步骤：上述的抗体与待检样品在体外接触，检测上述的抗体与所述待检样品是否结合形成抗原-抗体复合物即可。
所述的过表达的含义为本领域常规，指CD30在待检样品中的RNA或蛋白质的过表达(由于转录增加、转录后加工、翻译、翻译后加工以及蛋白质降解改变)，以及由于蛋白质运送模式改变(核定位增加)而导致的局部过表达和功能活性提高(如在底物的酶水解作用增加的情况下)。
本发明中，上述是否结合形成抗原-抗体复合物的检测方式是本领域常规的检测方式，较佳地为流式细胞实验(FACS)检测。
本发明提供一种检测样品中CD30的组合物，其包括上述的抗体、重组蛋白、抗体偶联物、免疫细胞、或其组合作为活性成分。较佳地，其还包括上述的抗体的功能片段组成的化合物作为活性成分。
本发明的主要优点包括：
1)本发明的抗体能够特异性结合CD30，且具有高亲和力。
2)本发明提供了人源化CD30，其在具有人源化抗体低免疫原性的特点的同时，保持了与嵌合抗体相当的结合力。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
实验方法
1.主要试剂
PBS(Gibco,CAT#14190-250)；DMEM(Gibco,CAT#41965-062)；CHOGrow CD1(上海源培，Cat#H110KJ)；FBS(Gibco,CAT#10099-141)；T4DNA Ligase(Takara,CAT#2011B)；CD30Protein,Human,Recombinant(Fc Tag)(由iCarTab制备)；PrimeScriptTM 1st StrandcDNA Synthesis Kit(Takara,Cat#6110A)；Trizol RNA提取试剂(Thermo,CAT#15596018)；Q5 PCR Cloning kit(NEB,Cat#E0555S)；AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒(Axygen,Cat#AP-GX-250G)；BamHI限制性内切酶(NEB,CAT#R3136M)；KpnI限制性内切酶(NEB,CAT#R3142M)；TOP10感受态(由iCarTab制备)；pcDNA3.1-IgG1Fc载体(由iCarTab制备)；pcDNA3.1-IgKc载体(由iCarTab制备)；PE-Anti-human-IgG(Biolegend,CAT#409304)；Goat anti-human IgG(H+L)-Alexa488(eBioscience,CAT#A11013)；PE-Anti-mouse IgG(MultiSciences,CAT#70-GAM0041)；OPM-293CD05 Medium(奥浦迈生物,CAT#81075-001)；LVtransm转染试剂(iCarTab,Cat#LVTran100)；缓冲液：HBS-EP+10X(GE,Cat#BR100669)；氨基偶联试剂盒(GE,Cat#BR100050)；10mM Glycine 2.5(GE,Cat#BR100356)；S系列CM5芯片(GE,Cat#29149603)；
2.主要耗材
50mL Falcon离心管(Corning,CAT#352070)；15mL Falcon离心管(Corning,CAT#430052)；6孔板(Corning,CAT#3516)；96孔板(Corning,CAT#3365)；T125摇瓶(Corning,CAT#431143)。
3.主要设备
普通光学倒置显微镜；台式离心机Thermo ST41；高速离心机Thermo RC6+；生物安全柜；Thermo Attune Nxt flow cytometer；Thermo 3111CO2培养箱；BiaCore T200；精骐CO-O6U摇床。
4.实验步骤
4.1杂交瘤筛选
4.1.1小鼠免疫
所有小鼠饲养于屏障系统中，使用灭菌颗粒饲料和高压灭菌饮用水进行饲养。取5只Balb/c小鼠(SPF级)用耳标标记，并按“第一次免疫→第二次免疫→第三次免疫→第一次采血→第四次免疫→第二次采血→加强免疫”的免疫流程，使用纯化的CD30-Fc重组蛋白进行免疫。
4.1.2免疫效价检测
1)从笼子内取出小鼠，使用75％的医用酒精棉球对小鼠的尾部消毒，使用5mm的采血针在小鼠的尾部刺出一个小的创口；
2)使用毛细玻璃采血管收集血滴；
3)采集完血液后，使用干的无菌棉球轻轻压迫采血点止血后，将小鼠还至笼内稍作观察；
4)将收集有血液样本的离心管置于37℃培养箱内放置1小时；然后将血液样本转移至4℃过夜。
5)将血清从血块中分离，并转移至一个新的无菌离心管中，4℃、10000xg离心10min；
6)将血清转移至一个新的无菌离心管中，采用FACS检测免疫效价。
4.1.3 FACS检测
1.从液氮中复苏CHO空细胞及CHO-CD30重组细胞株，调整细胞状态至对数生长期。
2.将两种细胞分别分为若干份，每份细胞的数量为5*105个细胞，分别加入稀释好的小鼠血清(1:1000稀释)，充分混匀后，室温孵育1小时。
3. 800xg室温离心5分钟，去掉含有抗体的上清，使用PBS洗涤细胞3次；
4.加入1uL PE标记的Anti-mouse IgG，充分混匀后，室温避光孵育30min；
5. 800xg室温离心5分钟，去掉含有二抗的上清，使用PBS洗涤细胞3次；
6.使用500uL PBS重悬细胞，进行流式分析。
4.1.4杂交瘤融合
1)取免疫效价检测最好的小鼠颈部脱臼处死，无菌条件下获得小鼠脾脏，制备B细胞单细胞悬液，并以1:1的比例与非抗体分泌性SP2/0骨髓瘤细胞混合，使用BTX ECM2001电融合仪进行细胞融合。
2)电融合后，所有细胞立即悬浮在完全培养基(DMEM，20％FBS和HAT)中，并接种至96孔板中。
3)融合后约10天改为HT培养基，培养两天后，取上清检测特异性抗体。
4.1.5杂交瘤筛选
从96孔板的每个孔中取出120uL培养基上清，同时向每个孔内补充新鲜的HT培养基。将取出的培养基上清与预包被目的抗原的ELISA孔板进行孵育，按照标准的ELISA操作步骤进行鉴定。选择O.D值较高的孔进行第二轮亚克隆。每轮亚克隆结束后，均参照相同的步骤进行ELISA鉴定，直至单克隆形成。
4.1.6ELISA检测
1)使用无菌PBS稀释CD30重组蛋白至终浓度为1ug/mL。取一块新的96孔板，加入100uL/孔4℃包被过夜。
2)去掉抗原包被液，使用PBST(含0.5％的吐温)洗涤3次。
3)加入200uL/孔的3％BSA 37℃封闭2小时；
4)去掉封闭缓冲液后，使用PBST洗涤孔板3次；
5)加入100ul杂交瘤上清，室温孵育1小时，对照孔为PBS；
6)去掉孔内的液体，并使用PBST洗涤3次；
7)加入100uL HRP-mouse IgG(1:20000稀释)，室温孵育1小时；
8)去掉孔内的液体后，使用PBST洗涤孔板3次；
9)加入100uL/孔TMB显色液；
10)室温避光孵育15分钟；
11)加入50uL/孔终止液；
12)使用酶标仪读取孔内的O.D值。
4.1.7杂交瘤克隆流式检测
1)从液氮中复苏CHO-CD30细胞株，调整细胞状态至对数生长期。
2)将CHO-CD30细胞株分为若干份，每份细胞的数量为5*10^5个细胞，分别使用100uL杂交瘤上清孵育靶细胞，充分混匀后，室温孵育1小时。
3)800xg室温离心5分钟，去掉含有抗体的上清，使用PBS洗涤细胞3次。
4)加入PE标记的Anti-mouse IgG(1:800稀释)，充分混匀后，室温避光孵育30分钟；
5)800xg室温离心5分钟，去掉含有二抗的上清，使用PBS洗涤细胞3次；
6)使用500uL PBS重悬细胞，进行流式分析。
4.2杂交瘤测序
1)取5×106个最终筛选获得的杂交瘤细胞，使用Trizol进行裂解，参照标准方法提取杂交瘤细胞的总RNA。
2)使用逆转录试剂盒将总RNA逆转录为cDNA样品后，使用杂交瘤测序引物采用PCR法将抗体的重链和轻链可变区扩增出来，然后进行TA克隆，将PCR获得的片段亚克隆至pMD-19T载体中。蓝白斑筛选后，每条链分别挑取10个克隆进行测序。并对最终获取的抗体序列进行分析。
4.3鼠抗人源化
4.3.1人源化抗体序列设计
根据上述测序获取到的目的抗体重链和轻链的氨基酸序列信息进行人源化设计，保留原始抗体的CDR区序列不变，根据germline alignment的结果以及抗体结构模拟的结果，重链和轻链分别选择不同的人源抗体模版，并在人源化之后的框架区进行backmutation，设计了候选的人源化抗体序列。
4.3.2人源化抗体基因合成及表达载体构建
将如上述所设计的人源化抗体的重链和轻链分别进行基因合成，重链亚克隆至pcDNA3.1-IgG1Fc表达载体，轻链亚克隆至pcDNA3.1-IgKc表达载体(载体示意图如下)。载体经测序验证无误后，使用Qiagen质粒大抽试剂盒制备无内毒素质粒。
4.3.3人源化抗体表达
1.从冰箱中取出LVTransm转染试剂及抗体表达载体，室温解冻后，用移液枪上下吹打完全混匀。取出PBS缓冲液，温热至室温。取2mL PBS至6孔板的一个孔，分别加入2μgpcDNA3.1-IgG1Fc和2μg pcDNA3.1-IgKc，移液枪上下吹打充分混匀后，加入12μLLVTransm，立即用移液器上下吹打混匀，室温下静置10分钟。
2.将上述DNA/LVTransm复合物加入到1.5mL 293F细胞中，轻轻晃动充分混匀。将细胞置于37℃、5％CO2培养箱，120RPM培养6～8小时后，加入1.5mL新鲜的293F培养基，将细胞重新放回培养箱中继续培养。
3.连续培养3天后，离心收集培养基上清，用0.45μm的滤膜过滤，滤液转至无菌离心管中，进行流式检测。
4.3.4人源化抗体表达纯化
1.从冰箱中取出LVTransm转染试剂及抗体表达载体，室温解冻后，用移液枪上下吹打完全混匀。取出PBS缓冲液，温热至室温。取4mL PBS至6孔板的一个孔，分别加入40μgpcDNA3.1-IgG1Fc和80μg pcDNA3.1-IgKc，移液枪上下吹打充分混匀后，加入360μLLVTransm，立即用移液器上下吹打混匀，室温下静置10分钟。
2.将上述DNA/LVTransm复合物加入到50mL 293F细胞中，轻轻晃动充分混匀。将细胞置于37℃、5％CO2培养箱，120RPM培养6～8小时后，加入50mL新鲜的293F培养基，将细胞重新放回培养箱中继续培养。
3.连续培养7天后，离心收集培养基上清，使用0.45μm的滤膜过滤，使用ProteinA亲和柱进行纯化，纯化后蛋白进行定量，同时采用SDS-PAGE变性电泳进行检测。
4.3.5流式鉴定人源化抗体与靶蛋白的结合
1.从液氮中复苏CHO空细胞及CHO-CD30重组细胞株，调整细胞状态至对数生长期。
2.将两种细胞分别分为若干份，每份细胞的数量为5*105个细胞，分别加入人源化抗体，每个抗体均需与CHO空细胞及CHO-CD30重组细胞株孵育，充分混匀后，室温孵育1小时。
3. 800xg室温离心5分钟，去掉含有抗体的上清，使用PBS洗涤细胞3次；
4.加入1uL PE或者Alexa488标记的Anti-human IgG，充分混匀后，室温避光孵育30min；
5. 800xg室温离心5分钟，去掉含有二抗的上清，使用PBS洗涤细胞3次；
6.使用500uL PBS重悬细胞，进行流式分析。
4.3.6人源化抗体亲和力检测
将CD30-Fc重组蛋白使用10mM醋酸偶联缓冲液固定在CM5芯片上，以上述制备的流式鉴定阳性的人源化抗体及人鼠嵌合抗体作为流动相，检测人源化前后抗体与靶蛋白CD30的结合能力，具体实验参数见亲和力结果分析部分。
5.结果
5.1小鼠免疫效价FACS检测
小鼠免疫实验方法如上4.1.1所述，免疫效价检测实验方法如4.1.2和4.1.3所述。从所有免疫小鼠的尾静脉分离血清，按照1:1000稀释后，按分别与CHO和CHO-CD30细胞进行FACS检测。
结果：FACS检测结果如图3所示。流式结果显示194号小鼠免疫效价最好，选择其进行冲击免疫以及后续的杂交瘤融合。
5.2融合板ELISA检测结果
杂交瘤融合及筛选实验方法如上4.1.4和4.1.5所述。ELISA检测实验方法如上4.1.6所述。从融合后的孔板中取100μL上清，采用预包被目标抗原的96孔板进行ELISA检测。
结果：融合板各个孔细胞的ELISA检测结果如图4所示。根据融合克隆ELISA检测结果，选择OD值高以及生长较好的克隆进行第一次亚克隆。
5.3第一次亚克隆板ELISA检测结果
从第一次亚克隆后的孔板中取100μL上清，采用预包被目标抗原的96孔板进行ELISA检测。
结果：第一次亚克隆板各个孔细胞的ELISA检测结果如图5所示。根据第一次亚克隆ELISA检测结果，选择OD值高以及生长较好的克隆进行第二次亚克隆。
5.4第二次亚克隆板ELISA检测结果
从第二次亚克隆后的孔板中取100μL上清，采用预包被目标抗原的96孔板进行ELISA检测。根据第二次亚克隆ELISA检测结果，选择OD值高以及生长较好的克隆进行流式复检。
结果：第二次亚克隆板各个孔细胞的ELISA检测结果如图6所示。流式结果如图7所示。根据流式检测结果选择杂交瘤7-H11-E4-F9，7-A2-E8-E6，7-B7-B10-F9，7-B8-G10-D10，3-G6-B8-G4和8-F2-H8-D6进行杂交瘤测序。
5.5杂交瘤测序结果
挑选FACS鉴定结果好的克隆进行扩增，使用TRIZOL试剂裂解，提取RNA并逆转录为cDNA后，使用杂交瘤测序引物对该杂交瘤抗体对应的重链和轻链可变区进行测序，分析其中的CDR区和Framework区，杂交瘤测序共获得4个抗体序列，结果如下：
7-A2-E8-E6
>VL
EIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESLEYYGTSLMLWYQQKPGQPPKLLIYSASNVESGVPARFSGSGSGTDFSLNIHPVEEDDIAMYFCQQRRKVPSTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO:1)
>VH
EVQLQQSGAELVRPGSSVKISCKASGYAFSSYWMNWVKQRPGQGLEWIGQIYPGDGDTNYNGKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYFCARRINGNFAMDYWGQGTSVTVSS(SEQ ID NO:2)
7-H11-E4-F9
>VL
DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVDSYGNSFMHWYQQKPGQPPKLLIYRASNLESGIPARFSGSGSRTDFTLTINPVEADDVATYYCQQSNEDPTWTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO:3)
>VH
EVQLQQSGAELVRPGASVKLSCKASGYSFTSYWMNWVKQRPGQGLEWIGMIHPSDSETRLNQKFKDKATLTVDKSSSTAYMQLSSPTSEDSAVYYCASPMDYYYAMDYWGQGTSVTVSS(SEQ ID NO:4)
7-B8-G10-D10
>VL
DIVMTQSPATLSVTPGDSVSLSCRASQNVTNNLHWYQQKSHESPRLLIKYASQSISGIPSRFSGSGSGTDFTLSINNVETEDFGMYFCQQTNSWPLTFGAGTKLELK(SEQ ID NO:5)
>VH
EVMLVESGGGLVQPGGSLKLSCATSGFTFSDYYMYWVRQTPEKRLEWVAYISNGGGYTFYSDTVKGRFTISRDNTKNTLSLQMSRLKSEDTAMYYCARQGILDGGAYWGQGTLLTVSA(SEQ ID NO:6)
8-F2-H8-D6
>VL
DIVMTQSPKFMSTSVGDRVSVTCKASQNVNTNVAWYQQKPGQSPKALIYSASYRYSGVPDRFTGSGSGTDLTLTIINIQSEDLAEYFCQQYNTYPLTFGVGTKLELK(SEQ ID NO:7)
>VH
EVTLKVSGPGISQPSQTLSLTCSFSGFSLSTYGMGVSWIRQPSGKGLEWLAHIYWDDDKRYNPSLKSRLTISKDTSSNQVFLKITSVDTADTATYYCARRAELRDFYFDYWGQGTTLTVSS(SEQ ID NO:8)
其中，下划线示出了各可变区的CDR区序列。
本发明抗体的CDR区序列如表1所示。
表1本发明抗体CDR区序列
Figure BDA0003453038480000301
5.6嵌合抗体表达载体的构建和FACS验证
将测序获得抗体序列构建嵌合表达载体，表达嵌合抗体进行验证。将杂交瘤测序获得的重链可变区亚克隆至pcDNA3.1-IgG1Fc表达载体，轻链可变区亚克隆至pcDNA3.1-IgKc表达载体。将构建好的轻链和重链表达载体分别进行两两组合。瞬时共转293F细胞，转染48小时后，收集表达的上清进行FACS检测。
结果：CD30嵌合抗体的流式检测结果如图8所示。根据流式检测结果7-H11-E4-F9，7-A2-E8-E6，7-B8-G10-D10和8-F2-H8-D6均可以和CHO-CD30结合，选择7-A2-E8-E6抗体进行抗体人源化设计。
5.7人源化抗体构建及流式细胞检测结果
如上述实验方法4.3.1所述，构建人源化抗体。
人源化候选抗体轻重链可变区氨基酸序列信息如下：
>7-A2-E8-E6-hVL
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASESLEYYGTSLMLWYQQKPGQPPKLLIYSASNVETGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYFCQQRRKVPSTFGGGTKVEIK(SEQ ID NO:9)
>7-A2-E8-E6-hVL-0917
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASESLEYYGTSLMLWYQQKPGQPPKLLIYSASNVESGIPARFSGSGSGTDFSLTISSLEPEDFAMYFCQQRRKVPSTFGGGTKVEIK(SEQ ID NO:10)
>7-A2-E8-E6-hVL-N1
EIVLTQSPDSLAVSLGERATINCRASESLEYYGTSLMLWYQQKPGQPPKLLIYSASNVESGVPDRFSGSGSGTDFSLTISSLEPEDIAMYFCQQRRKVPSTFGGGTKVEIK(SEQ ID NO:11)
>7-A2-E8-E6-hVH
EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYAFSSYWMNWVRQAPGQGLEWMGQIYPGDGDTNYNGKFQGRVTLTADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYFCARRINGNFAMDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:12)
>7-A2-E8-E6-hVH-0917
EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYAFSSYWMNWVKQAPGQGLEWIGQIYPGDGDTNYNGKFKGRVTLTADKSSSTAYMELSSLRSEDTAVYFCARRINGNFAMDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:13)
将人源化抗体表达载体分别组合瞬时转染293F细胞后，收集培养基上清，采用流式细胞仪检测人源化后抗体与重组细胞CHO-CD30细胞膜表面的抗原结合情况。以原始鼠源抗体VH和VL构建的人鼠嵌合抗体作为对照。
结果：CD30人源化抗体的流式检测结果如图9所示。结果显示人源化抗体均与重组CHO-CD30细胞结合，根据流式检测结果人源化抗体均可以和CHO-CD30结合，且和嵌合抗体一致，选择hVH-0917-hVL-0917和hVH-hVL进行抗体表达纯化和亲和力检测。
5.8人源化抗体的表达纯化及亲和力测定
使用上述实验方法4.3.4进行人源化抗体表达纯化，SDS-PAGE变性电泳检测发现CD30嵌合抗体和hVH-0917-hVL-0917，hVH-hVL人源化抗体纯度大于90％，可以用于亲和力检测。亲和力检测
结果：CD30人源化抗体及嵌合抗体的亲和力检测结果如图10和表所示。
Figure BDA0003453038480000321
根据亲和力检测结果，2个7-A2-E8-E6人源化抗体与嵌合抗体的亲和力一致。
讨论：
本发明通过大量实验研究，开发了抗CD30的嵌合抗体，及人源化抗体。具体地，本发明开发了具有特异性结合CD30能力的7-H11-E4-F9，7-A2-E8-E6，7-B8-G10-D10和8-F2-H8-D6四种嵌合抗体，其特异性结合能力已得到流式检测验证。
并且，本发明还基于其中的7-A2-E8-E6抗体，在保持CDR区不变的情况下，对框架区进行设计，并筛选出了人源化抗体的轻重链。经验证发现，所筛选的两条重链可变区和三条轻链可变区两两组合(6种组合)后，均能产生具有优秀结合力的抗体，其亲和力与嵌合抗体的亲和力一致。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 博生吉医药科技（苏州）有限公司
<120> CD30人源化鼠单抗开发
<130> P2021-3293
<160> 37
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Leu Glu Tyr Tyr
20 25 30
Gly Thr Ser Leu Met Leu Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Asn Val Glu Ser Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Asn Ile His
65 70 75 80
Pro Val Glu Glu Asp Asp Ile Ala Met Tyr Phe Cys Gln Gln Arg Arg
85 90 95
Lys Val Pro Ser Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 2
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Gln Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Ile Asn Gly Asn Phe Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 3
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Ser Tyr
20 25 30
Gly Asn Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn
65 70 75 80
Pro Val Glu Ala Asp Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn
85 90 95
Glu Asp Pro Thr Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Met Ile His Pro Ser Asp Ser Glu Thr Arg Leu Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Pro Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ser Pro Met Asp Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Asp Ser Val Ser Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asn Val Thr Asn Asn
20 25 30
Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser His Glu Ser Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Asn Val Glu Thr
65 70 75 80
Glu Asp Phe Gly Met Tyr Phe Cys Gln Gln Thr Asn Ser Trp Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Glu Val Met Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Tyr Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Tyr Ile Ser Asn Gly Gly Gly Tyr Thr Phe Tyr Ser Asp Thr Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Thr Lys Asn Thr Leu Ser
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Arg Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gln Gly Ile Leu Asp Gly Gly Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Leu Thr Val Ser Ala
115
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Val Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Asn Thr Asn
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Ala Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Leu Thr Leu Thr Ile Ile Asn Ile Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Glu Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Asn Thr Tyr Pro Leu
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Thr Phe Gly Val Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Glu Val Thr Leu Lys Val Ser Gly Pro Gly Ile Ser Gln Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Tyr
20 25 30
Gly Met Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Ala His Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Asn Pro Ser
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Ser Asn Gln Val
65 70 75 80
Phe Leu Lys Ile Thr Ser Val Asp Thr Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Arg Ala Glu Leu Arg Asp Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Leu Glu Tyr Tyr
20 25 30
Gly Thr Ser Leu Met Leu Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Asn Val Glu Thr Gly Ile Pro Ala
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Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
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Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Arg Arg
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Lys Val Pro Ser Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
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Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Leu Glu Tyr Tyr
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Gly Thr Ser Leu Met Leu Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
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Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Asn Val Glu Ser Gly Ile Pro Ala
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Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Met Tyr Phe Cys Gln Gln Arg Arg
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
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Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Arg Ala Ser Glu Ser Leu Glu Tyr Tyr
20 25 30
Gly Thr Ser Leu Met Leu Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Asn Val Glu Ser Gly Val Pro Asp
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Glu Pro Glu Asp Ile Ala Met Tyr Phe Cys Gln Gln Arg Arg
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Lys Val Pro Ser Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
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Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
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Gly Gln Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe
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Gln Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
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Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
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Ala Arg Arg Ile Asn Gly Asn Phe Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
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Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
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Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Gln Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Ile Asn Gly Asn Phe Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Glu Ser Leu Glu Tyr Tyr Gly Thr Ser Leu
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Ser Ala Ser
1
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Gln Gln Arg Arg Lys Val Pro Ser Thr
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<211> 8
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Ala Arg Arg Ile Asn Gly Asn Phe Ala Met Asp Tyr
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Ser Tyr Gly Asn Ser Phe Met His
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Gln Gln Ser Asn Glu Asp Pro Thr Trp Thr
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Ser Tyr Trp Met Asn
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Met Ile His Pro Ser Asp Ser Glu Thr Arg Leu Asn Gln Lys Phe Lys
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Asp
<210> 25
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
Ala Ser Pro Met Asp Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 26
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
Arg Ala Ser Gln Asn Val Thr Asn Asn Leu His
1 5 10
<210> 27
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser
1 5
<210> 28
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
Gln Gln Thr Asn Ser Trp Pro Leu Thr
1 5
<210> 29
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
Asp Tyr Tyr Met Tyr
1 5
<210> 30
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
Tyr Ile Ser Asn Gly Gly Gly Tyr Thr Phe Tyr Ser Asp Thr Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 31
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
Gln Gly Ile Leu Asp Gly Gly Ala Tyr
1 5
<210> 32
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
Lys Ala Ser Gln Asn Val Asn Thr Asn Val Ala
1 5 10
<210> 33
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser
1 5
<210> 34
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
Gln Gln Tyr Asn Thr Tyr Pro Leu Thr
1 5
<210> 35
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
Thr Tyr Gly Met Gly Val Ser
1 5
<210> 36
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
His Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser
1 5 10 15
<210> 37
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
Arg Ala Glu Leu Arg Asp Phe Tyr Phe Asp Tyr
1 5 10

Claims (10)

1.一种抗CD30的抗体，所述的抗体包括重链和轻链，
其中，所述重链的可变区具有氨基酸序列如下所示的互补决定区CDR：
SEQ ID NO:6n+17所示的VH-CDR1、
SEQ ID NO:6n+18所示的VH-CDR1、和
SEQ ID NO:6n+19所示的VH-CDR1；
并且，所述轻链的可变区具有氨基酸序列如下所示的互补决定区CDR：
SEQ ID NO:6n+14所示的VL-CDR1，
SEQ ID NO:6n+15所示的VL-CDR2，和
SEQ ID NO:6n+16所示的VL-CDR3；
其中，n选自0、1、2或3的整数；
并且，上述CDR序列中任意一种氨基酸序列还包括任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸的，并使得含有所述衍生CDR序列的重链和轻链所构成的衍生抗体能够保留CD30结合亲和力的衍生序列。
2.如权利要求1所述的抗CD30的抗体，其特征在于，所述重链的可变区还具有框架区，所述框架区的氨基酸序列衍生自SEQ ID NO:2、4、6、8、12或13；
并且，所述轻链的可变区还具有框架区，所述框架区的氨基酸序列衍生自SEQ ID NO:1、3、5、7、9、10或11。
3.如权利要求1所述的抗CD30的抗体，其特征在于，所述抗体具有选自下组的轻链可变区和重链可变区：
1)氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的轻链可变区，和氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的重链可变区；
2)氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示的轻链可变区，和氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示的重链可变区；
3)氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示的轻链可变区，和氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示的重链可变区；
4)氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示的轻链可变区，和氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示的重链可变区；或
5)氨基酸序列如SEQ ID NO:9、10或11所示的轻链可变区，和氨基酸序列如SEQ ID NO:SEQ ID NO:12或13所示的重链可变区。
4.如权利要求1所述的抗CD30的抗体，其特征在于，所述的抗体为人源化抗体，且具有氨基酸序列如SEQ ID NO:9、10或11所示的轻链可变区，和氨基酸序列如SEQ ID NO:12或13所示的重链可变区。
5.一种重组蛋白，其特征在于，所述的重组蛋白包括：
(i)如权利要求1所述的抗体；以及
(ii)任选的协助表达和/或纯化的标签序列。
6.一种嵌合抗原受体(CAR)构建物，其特征在于，所述的嵌合抗原受体构建物的抗原结合区域的scFv段特异性结合于CD30，并且所述scFv具有如权利要求1所述的抗体的重链可变区和轻链可变区。
7.一种重组的免疫细胞，其特征在于，所述的免疫细胞表达外源的如权利要求6所述的CAR构建物。
8.一种抗体偶联物，其特征在于，所述抗体偶联物含有：
(a)抗体部分，所述抗体部分选自下组：如权利要求1所述的抗体；和
(b)与所述抗体部分偶联的偶联部分，所述偶联部分选自下组：可检测标记物、药物、酶、或其组合。
9.一种活性成分的用途，其特征在于，所述活性成分选自下组：如权利要求1所述的抗体、如权利要求5所述的重组蛋白、如权利要求8所述的抗体偶联物、或其组合，其中所述活性成分被用于：
(a)制备诊断试剂、检测板或试剂盒；和/或
(b)制备预防和/或治疗与CD30表达或功能异常相关的疾病的药物。
10.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物含有：
(i)活性成分，所述活性成分选自下组：如权利要求1所述的抗体、如权利要求5所述的重组蛋白、如权利要求7所述的免疫细胞、如权利要求9所述的抗体偶联物、或其组合；以及
(ii)药学上可接受的载体。
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