JP5924795B2 - 複合体 - Google Patents

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Description

本発明は、ヒトにおけるＥＧＦＲ１発現腫瘍細胞の成長を治療または調節する複合体、医薬組成物および方法に関する。
ホウ素中性子捕捉療法（ＢＮＣＴ）は、原発性脳腫瘍および頭頸部がんなどの悪性腫瘍の非侵襲的療法の形態である。ＢＮＣＴでは、患者は、腫瘍内に局在化する能力を有しかつ非放射性ホウ素−１０原子を担持する薬剤を注入される。その薬剤に低エネルギー熱中性子が照射された場合、生物学的に有害なアルファ粒子およびリチウム−７原子核が放出される。
ホウ素−１０の含有量が高くかつ腫瘍内に特異的に局在化する能力がある複合体などの薬剤が、ＢＮＣＴのために必要である。こうした複合体は、容易に生成され、安定であり、可溶性かつ安全でなければならない。しかしながら、こうした複合体の供給は、一部の種類の化学的性質がホウ素−１０含有化合物と作用するとは思われないことなどによって複雑化する。
本発明の目的は、既知の複合体と比較して改善された特性を有しかつ高含有量のホウ素−１０を含有する複合体を提供することである。
本発明による複合体は、請求項１に提示される事柄によって特徴付けられる。
本発明による医薬組成物は、請求項１８に提示される事柄によって特徴付けられる。
本発明による薬物として使用するための複合体または医薬組成物は、請求項１９に提示される事柄によって特徴付けられる。
本発明によるがんの治療において使用するための複合体または医薬組成物は、請求項２０に提示される事柄によって特徴付けられる。
ヒトにおけるＥＧＦＲ１発現腫瘍細胞の成長を治療または調節する方法は、請求項２２に提示される事柄によって特徴付けられる。
本発明による原核宿主細胞は、請求項２６に提示される事柄によって特徴付けられる。
ヒトにおけるＥＧＦＲ１発現腫瘍細胞の成長を治療または調節するための方法は、請求項５６に提示される事柄によって特徴付けられる。
本発明によるポリヌクレオチドは、請求項５７に提示される事柄によって特徴付けられる。
本発明のさらなる理解を提供しかつ本明細書の一部分を成すために含まれる添付の図面は、本発明の実施形態を例示して説明と共に本発明の原理を説明することを助ける。
ＢＳＨ−デキストランのプロトン−ＮＭＲスペクトルである。ホウ素結合プロトンは、０．８〜２．０ｐｐｍの間で共鳴し、ＢＳＨ−デキストランのホウ素添加は、ホウ素−プロトンの積分をデキストランプロトンの積分と比較することによって概算され得る。未反応のアリル基は、４．２２、５．２９、５．３９および５．９９ｐｐｍにおいてシグナルを生じる。２．２２５ｐｐｍにおける急峻なシグナルは、アセトン（内部標準）である。 ＢＳＨ−Ｄｅｘ−複合体のゲルろ過分析である。 Ａ．抗ＥＧＦＲ１−Ｆａｂ−ＢＳＨ（８００Ｂ）−Ｄｅｘ。Ｙａｒｒａ ＳＥＣ−３０００ゲルろ過カラムで分析した場合に複合体は７．８ｍｌで溶離する。比較して抗ＥＧＦＲ１−Ｆａｂは９．１ｍｌで溶離する。Ｂ．抗ＥＧＦＲ１−Ｆａｂ２−ＢＳＨ（８００Ｂ）−Ｄｅｘ。Ｙａｒｒａ ＳＥＣ−３０００ゲルろ過カラムで分析した場合に複合体は６．９ｍｌで溶離する。比較して抗ＥＧＦＲ１−Ｆａｂ２は８．４ｍｌで溶離する。 非還元（パネルＡ）および還元（パネルＢ）条件における異なる量のホウ素を有する蛍光標識された抗ＥＧＦＲ１ Ｆａｂ／Ｆ（ａｂ’）２ホウ素複合体のＤＳ−ＰＡＧＥ分析である。抗ＥＧＦＲ１−Ｆａｂ−ＢＳＨ−Ｄｅｘ複合体：レーン１（９００Ｂ）、レーン２（７００Ｂ）、レーン４（５６０Ｂ）、レーン６（３６０Ｂ）。抗ＥＧＦＲ１−Ｆ（ａｂ’）２−ＢＳＨ−Ｄｅｘ複合体：レーン３（７００Ｂ）、レーン５（５６０Ｂ）、レーン７（３６０Ｂ）。レーン８は、抗ＥＧＦＲ１−Ｆａｂ−Ｄｅｘであり、レーン９は、抗ＥＧＦＲ１−Ｆ（ａｂ’）２とＦｃフラグメントとの混合物を含有する対照である（Ｆａｂフラグメントはゲル上でＦｃフラグメントのように移動する）。クマシーブルーでゲル染色。 蛍光標識された抗ＥＧＦＲ１−Ｆ（ａｂ’）２（パネルＡおよびＣ）および抗ＥＧＦＲ１−Ｆ（ａｂ’）２−ＢＳＨ（９００Ｂ）−Ｄｅｘ（パネルＢおよびＤ）のＨＳＣ−２細胞による細胞表面結合および内在化である。インキュベーションは、＋４℃（細胞表面への結合）および＋３７℃（細胞表面への結合および内在化）で行った。分析は、蛍光顕微鏡検査法によって行った。 シグナルペプチド最適化のためのベクター構成の例である。特定されたＴ５プロモーター、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）、シグナルペプチドならびに抗ＥＧＦＲ１ Ｆａｂ重鎖および軽鎖配列である。 Ｆａｂ発現のためのプロモーター最適化の結果である。１０ｍｌの液体ＬＢ培地中の発現培養物をＷ３１１０ ｐＧＦ１１９（Ａ）またはＢＬ２１（Ｄｅ３） ｐＧＦ１２１（Ｂ）のいずれかで作成した。誘導後培養物を＋２０℃で一晩成長させ、１ｍｌの試料を採取してペリプラズム抽出後にウエスタンブロット検出した。１）発現ベクター無しのバックグラウンド株、２）Ｗ３１１０ ｐＧＦ１１９クローン＃１、３）Ｗ３１１０ ｐＧＦ１１９クローン＃２、４）Ｗ３１１０ ｐＧＦ１１９クローン＃３、Ｃ）２５０ｎｇの対照Ｆａｂ。 Ｆａｂ発現のためのプロモーター最適化の結果である。１０ｍｌの液体ＬＢ培地中の発現培養物を、Ｗ３１１０ ｐＧＦ１３２で３つの異なる誘導後温度Ａ）＋２０℃、Ｂ）＋２８℃およびＣ）＋３７℃で作成した。異なるラムノース濃度を誘導に用いた：１）ｒｈａ ０、２）ｒｈａ ０．２５ｍＭ、３）ｒｈａ １ｍＭ、４）ｒｈａ ４ｍＭ、５）ｒｈａ ８ｍＭ。Ｃ＝１００ｎｇの対照ｆａｂ。誘導後培養物を示した温度で４時間成長させ、１ｍｌの試料を採取してペリプラズム抽出後にウエスタンブロット検出した。 ジシストロニックをデュアルプロモーター構成と比較したものである。ｐＧＦ１１９およびｐＧＦ１２１は、ジシストロニック、ｐＧＦ１２０およびｐＧＦ１３１は、デュアルプロモーターベクターである。１）非誘導対照、２）Ｗ３１１０ ｐＧＦ１１９＃１、３）Ｗ３１１０ ｐＧＦ１１９＃２、４）Ｗ３１１０ ｐＧＦ１２０非誘導、５）Ｗ３１１０ ｐＧＦ１２０＃１、６）Ｗ３１１０ ｐＧＦ１２０＃２、７）Ｌｅｍｏ２１（Ｄｅ３） ｐＧＦ１３１＃１、８）Ｌｅｍｏ２１（Ｄｅ３） ｐＧＦ１３１＃２、９）Ｌｅｍｏ２１（Ｄｅ３） ｐＧＦ１２１＃１、１０）ＢＬ２１（Ｄｅ３） ｐＧＦ１３１＃１、１１）ＢＬ２１（Ｄｅ３） ｐＧＦ１３１＃２、Ｃ）１００ｎｇの対照ｆａｂ。 ペリプラズムのシャペロンＳＫＰ（ｐＧＦ１３４）およびＳＫＰ／ＦｋｐＡ（ｐＧＦ１３５）でのＥ．ｃｏｌｉ Ｌｅｍｏ２１（Ｄｅ３）およびＢＬ２１（Ｄｅ３）における抗ＥＧＦＲ１ Ｆａｂ発現である。Ｌｅｍｏ２１（Ｄｅ３）培養は、ラムノースでの微調整を可能にしている株の組み入れられた機能を利用して作成された。レーン１）Ｌｅｍｏ２１（Ｄｅ３） ｐＧＦ１３１、２）Ｌｅｍｏ２１（Ｄｅ３） ｐＧＦ１３１ ｐＧＦ１３４、３）Ｌｅｍｏ２１（Ｄｅ３） ｐＧＦ１３１ ｐＧＦ１３５、４） ＢＬ２１（Ｄｅ３） ｐＧＦ１３１、５） ＢＬ２１（Ｄｅ３） ｐＧＦ１３１ ｐＧＦ１３４、６） ＢＬ２１（Ｄｅ３） ｐＧＦ１３１ ｐＧＦ１３５、Ｃ）対照Ｆａｂ １００ｎｇ。＋２８℃で２５０ｕＭのラムノースで、Ｌｅｍｏ２１（Ｄｅ３） ｐＧＦ１３１ ｐＧＦ１３４および、−ｐＧＦ１３５（レーン２および３）は、Ｌｅｍｏ２１（Ｄｅ３） ｐＧＦ１３１（レーン１）と比較して明らかに増量した抗ＥＧＦＲ１ Ｆａｂを産生した。＋２０℃で、ＢＬ２１（Ｄｅ３） ｐＧＦ１３１ ｐＧＦ１３４および−ｐＧＦ１３５（レーン５および６）は、ＢＬ２１（Ｄｅ３） ｐＧＦ１３１（レーン４）と比較して明らかに増量した抗ＥＧＦＲ１ Ｆａｂを産生した。 ペリプラズム発現した抗ＥＧＦＲ１ Ｆａｂのウエスタンブロット分析である。レーン１）分子量マーカー、レーン２）抗ＥＧＦＲ１ Ｆａｂ対照タンパク質、１００ｎｇ、レーン３）空白、レーン４）誘導前の細胞ペレット試料、レーン５）誘導後４時間の細胞ペレット試料、レーン６）誘導後１６時間の細胞ペレット試料、レーン７〜９）空白、レーン１０）誘導前培養上清試料、レーン１１）誘導後４時間の培養上清試料、レーン１２）誘導後１６時間の培養上清試料。全ての試料は、１０μｌの発酵槽培養懸濁液に相当する。発酵槽培養された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞のペリプラズム抽出物中の抗ＥＧＦＲ１ Ｆａｂ濃度は、誘導後１６時間の細胞ペレット試料（レーン６）における帯強度をレーン２における対照抗−ＥＧＲ１ Ｆａｂの帯強度（１００ｎｇ）に対して比較して概算した。レーン６は、３００ｎｇの抗−ＥＧＲ１ Ｆａｂを含有すると概算された：３００ｎｇ／１０μｌ＝３０ｍｇ／Ｌ。 ＨｉＴｒａｐ ＳＰ ＦＦ精製したペリプラズム抽出物のクロマトグラムである。画分Ａ５〜Ａ１０は、さらなる精製ステップのために貯蔵した。 プロテインＬ精製した試料のクロマトグラムである。画分Ａ５〜Ａ７は貯蔵した。 精製した抗ＥＧＦＲ１ ＦａｂのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析である。試料は、等量（２４μｌ）で充填した。レーン１）分子量マーカー、レーン２）パパイン消化由来抗ＥＧＦＲ１ Ｆａｂ、レーン３）Ｅ．ｃｏｌｉ産生Ｆａｂの１０％試料、レーン４）Ｅ．ｃｏｌｉ産生Ｆａｂの４０％試料。レーン３および４においてＬＣ（上部）とＨＣ（下部）の帯は分離している。レーン２においてＦａｂはグリコシル化され、ＬＣおよびＨＣは分離できなかった。 マイクロアレイスライド上のＥＧＦＲ１への抗ＥＧＦＲ１ Ｆａｂ（上パネル）またはＦａｂ ＢＳＨ−デキストラン（下パネル）の結合である
本発明は、抗ＥＧＦＲ１抗体またはそのＥＧＦＲ１結合フラグメントおよび少なくとも１つのデキストラン誘導体であって、
デキストラン誘導体が、少なくとも１つのＤ−グルコピラノシル単位の炭素２、３または４から選択される少なくとも１つの炭素が式
−Ｏ−（ＣＨ２）ｎ−Ｓ−Ｂ１２Ｈ１１ ２−
（式中、ｎは３から１０の範囲である）
の置換基によって置換された、少なくとも１つのＤ−グルコピラノシル単位を含み、かつ
デキストラン誘導体は、デキストラン誘導体のＤ−グルコピラノシル単位の酸化開裂によって形成される少なくとも１つのアルデヒド基と抗ＥＧＦＲ１抗体またはそのＥＧＦＲ１結合フラグメントのアミノ基との間の反応によって形成される結合を介して抗ＥＧＦＲ１抗体またはそのＥＧＦＲ１結合フラグメントに結合する、
デキストラン誘導体を含む複合体に関する。
複合体は、ホウ素中性子捕捉療法における使用に適する。「ホウ素中性子捕捉療法」（ＢＮＣＴ）は、非放射性ホウ素−１０が低エネルギー熱中性子を照射されて生物学的に有害なアルファ粒子およびリチウム−７原子核を生じる、標的放射線療法を指すと理解されるべきである。非放射性ホウ素−１０は、腫瘍局在複合体などの腫瘍局在薬剤内にそれを組み込むことにより標的とされ得る。
本明細書において「ＥＧＦＲ１」は、配列番号１に記載される配列を有するヒト上皮成長因子受容体１（ＥＧＦＲ１）を指すと理解されるべきである。
「抗ＥＧＦＲ１抗体」は、ＥＧＦＲ１に特異的に結合する抗体を指すと理解されるべきである。「特異的に結合する」と言う語は、結合相手の可能性がある複数の異なるタンパク質のプールから、ＥＧＦＲ１のみが結合するまたは有意に結合するという程度まで、ＥＧＦＲ１と任意の他のタンパク質とを区別する抗体の能力を指す。単なる例として、特異的な結合および／または速度論的測定は、例えばＢｉａｃｏｒｅ装置上で表面プラズモン共鳴に基づく方法を利用することによって、ＥＬＩＳＡなどの免疫学的手法によってまたは例えばタンパク質マイクロアレイによってアッセイしてよい。
「そのＥＧＦＲ１結合フラグメント」は、ＥＧＦＲ１に特異的に結合する能力がある抗ＥＧＦＲ１抗体の任意のフラグメントを指すと理解されるべきである。
一実施形態において、抗ＥＧＦＲ１抗体は、セツキシマブ、イムガツズマブ（ｉｍｇａｔｕｚｕｍａｂ）、マツズマブ、ニモツズマブ、ネシツムマブ、パニツムマブまたはザルツムマブである。
一実施形態において、抗ＥＧＦＲ１抗体は、セツキシマブである。
一実施形態において、セツキシマブは、配列番号２および３に記載される配列を有する。
一実施形態において、セツキシマブは、配列番号２および３に記載される配列を含むかまたはそれらからなる。
一実施形態において、抗ＥＧＦＲ１抗体は、ニモツズマブである。
一実施形態において、ニモツズマブは、配列番号４および５に記載される配列を有する。
一実施形態において、ニモツズマブは、配列番号４および５に記載される配列を含むかまたはそれらからなる。
抗ＥＧＦＲ１抗体は、例えばｓｃＦｖ、単一ドメイン抗体、Ｆｖ、ＶＨＨ抗体、二重特異性抗体、タンデム二重特異性抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｄｂ、ｄＡｂ−Ｆｃ、ｔａＦｖ、ｓｃＤｂ、ｄＡｂ２、ＤＶＤ−Ｉｇ、Ｂｓ（ｓｃＦｖ）４−ＩｇＧ、ｔａＦｖ−Ｆｃ、ｓｃＦｖ−Ｆｃ−ｓｃＦｖ、Ｄｂ−Ｆｃ、ｓｃＤｂ−Ｆｃ、ｓｃＤｂ−ＣＨ３またはｄＡｂ−Ｆｃ−ｄＡｂで有り得る。さらには、抗ＥＧＦＲ１抗体またはそのＥＧＦＲ１結合フラグメントは、一価単一特異性、多価単一特異性、二価単一特異性または多価多重特異性の形態で存在し得る。
一実施形態において、抗ＥＧＦＲ１抗体は、ヒト抗体またはヒト化抗体である。この文脈において、「ヒト抗体」と言う語は、当技術分野において通常用いられるように、ヒト由来の配列からフレームワーク領域および相補性決定領域（ＣＤＲ）の両方が生じる変異性の領域を有する抗体を意味すると理解される。この文脈において、「ヒト化抗体」と言う語は、当技術分野において通常用いられるように、ヒト由来の抗体のＣＤＲからの残基が所望の特異性、親和性および能力を有する非人類（マウス、ラットまたはウサギなど）のＣＤＲからの残基で置換されている抗体を意味すると理解される。
一実施形態において、抗ＥＧＦＲ１抗体フラグメントは、セツキシマブのＦａｂフラグメントを含む。一実施形態において、抗ＥＧＦＲ１ Ｆａｂフラグメントは、配列番号６および３に記載される配列を有する。一実施形態において、抗ＥＧＦＲ１ Ｆａｂフラグメントは、配列番号６および３に記載される配列を含むかまたはそれらからなる。
一実施形態において、抗ＥＧＦＲ１抗体は、セツキシマブのＦ（ａｂ’）２フラグメントを含む。一実施形態において、抗ＥＧＦＲ１ Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは、配列番号７および３に記載される配列を有する。一実施形態において、抗ＥＧＦＲ１ Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは、配列番号７および３に記載される配列を含むかまたはそれらからなる。
「デキストラン」は、直鎖がＤ−グルコピラノシル単位間のα−１，６グリコシド結合からなる、様々な長さの鎖から構成される分岐グルカンを指すと理解されるべきである。分岐は、α−１，３グリコシド結合、ならびに、より少ない程度に、α−１，２および／またはα−１，４グリコシド結合を介して結合される。デキストラン分子の直鎖の一部が、下記の略図に描かれる。
「Ｄ−グルコピラノシル単位」は、単一のＤ−グルコピラノシル分子を指すと理解されるべきである。デキストランはしたがって、複数のＤ−グルコピラノシル単位を含む。デキストランにおいて、それぞれのＤ−グルコピラノシル単位は、少なくとも１つの他のＤ−グルコピラノシル単位にα−１，６グリコシド結合を介して、α−１，３グリコシド結合を介してまたは両方を介して結合する。
デキストランのそれぞれのＤ−グルコピラノシル単位は、下記の略図において１から６の番号を付けられた、６個の炭素原子を含む。略図は、α−１，６グリコシド結合を介して２つの他のＤ−グルコピラノシル単位（図示せず）に結合した単一のＤ−グルコピラノシル単位を示す。
炭素２、３および４は、遊離ヒドロキシル基を含み得る。Ｄ−グルコピラノシル単位の炭素３がエーテル結合を介して第２のＤ−グルコピラノシル単位の炭素１に結合した、α−１，３グリコシド結合を介して第２のＤ−グルコピラノシル単位に結合したＤ−グルコピラノシル単位では、炭素２および４が、遊離ヒドロキシル基によって置換され得る。Ｄ−グルコピラノシル単位の炭素２または４がエーテル結合を介して第２のＤ−グルコピラノシル単位の炭素１に結合した、α−１，２またはα−１，４グリコシド結合を介して第２のＤ−グルコピラノシル単位に結合したＤ−グルコピラノシル単位では、それぞれ、炭素３および４または２および３が、遊離ヒドロキシル基によって置換され得る。
炭水化物命名法は、実質的にＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ ｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅによる勧告に従う（例えばＣａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｒｅｓ．１９９８，３１２，１６７；Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｒｅｓ．１９９７， ２９７，１；Ｅｕｒ．Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９８，２５７，２９３）。
「デキストラン誘導体」と言う語は、少なくとも１つのＤ−グルコピラノシル単位の炭素２、３または４から選択される少なくとも１つの炭素が式
−Ｏ−（ＣＨ２）ｎ−Ｓ−Ｂ１２Ｈ１１ ２−
（式中、ｎは３から１０の範囲である）
の置換基によって置換されたデキストランであって、かつ
デキストラン誘導体は、デキストラン誘導体のＤ−グルコピラノシル単位の酸化開裂によって形成される少なくとも１つのアルデヒド基と抗ＥＧＦＲ１抗体またはそのＥＧＦＲ１結合フラグメントのアミノ基との間の反応によって形成される結合を介して抗ＥＧＦＲ１抗体またはそのＥＧＦＲ１結合フラグメントに結合する、デキストランを指すと理解されるべきである。デキストラン誘導体は、例えば下記に述べるような、基本デキストラン構造への他の修飾をさらに含んでいてよい。
「ＢＳＨ」、「Ｂ１２Ｈ１１−ＳＨ」および「Ｎａ２Ｂ１２Ｈ１１ＳＨ」は、ナトリウムメルカプトドデカボラートおよび水素化ホウ素スルフヒドリルの別名でも知られる、ボロカプテイトナトリウムを指すと理解されるべきである。「Ｂ１２Ｈ１１ ２−」はしたがって、ＢＳＨの水素化ホウ素部分を指す。
少なくとも１つのＤ−グルコピラノシル単位の炭素２、３および４から選択される１つまたは複数の、すなわち１つ、２つまたは３つの炭素は、式−Ｏ−（ＣＨ２）ｎ−Ｓ−Ｂ１２Ｈ１１ ２−の置換基によって置換されていてよい。
一実施形態において、ｎは、３、４、５、６、７、８、９または１０である。一実施形態において、ｎは、３から４の範囲内、または３から５の範囲内、または３から６の範囲内、または３から７の範囲内、または３から８の範囲内、または３から９の範囲内である。
デキストランのＤ−グルコピラノシル単位は、ヒドロキシル基によって置換された２つの隣接する炭素間の結合の酸化開裂によって開裂され得る。酸化開裂は、隣接のジオール、すなわち２つの（遊離した）ヒドロキシル基が隣接位を占めるＤ−グルコピラノシル単位を開裂する。炭素２、３および４が遊離ヒドロキシル基を含有するＤ−グルコピラノシル単位はしたがって、炭素２と３または炭素３と４との間で酸化的に開裂され得る。したがって炭素２と３との間の結合および炭素３と４との間の結合から選択される結合は、酸化的に開裂され得る。デキストランのＤ−グルコピラノシル単位は、過ヨウ素酸ナトリウム、過ヨウ素酸および酢酸鉛（ＩＶ）などの酸化剤または隣接のジオールを酸化的に開裂する能力がある任意の他の酸化剤を用いる酸化開裂によって開裂され得る。
Ｄ−グルコピラノシル単位の酸化開裂は、酸化開裂によって形成される鎖のそれぞれの端部に１つのアルデヒド基がある、２つのアルデヒド基を形成する。複合体において、アルデヒド基は、原則として遊離アルデヒド基であってよい。しかしながら、複合体における遊離アルデヒド基の存在は、典型的には望ましくない。したがって遊離アルデヒド基は、抗ＥＧＦＲ１抗体またはそのＥＧＦＲ１結合フラグメントのアミノ基、または例えば追跡分子を用いてキャッピングするかまたは反応させてよい。
デキストラン誘導体は、デキストラン誘導体のＤ−グルコピラノシル単位の酸化開裂によって形成される少なくとも１つのアルデヒド基と抗ＥＧＦＲ１抗体またはそのＥＧＦＲ１結合フラグメントのアミノ基との間の反応によって形成される結合を介して抗ＥＧＦＲ１抗体またはそのＥＧＦＲ１結合フラグメントに結合する。
デキストラン誘導体は、デキストラン誘導体のＤ−グルコピラノシル単位の酸化開裂によって形成される少なくとも１つのアルデヒド基と抗ＥＧＦＲ１抗体またはそのＥＧＦＲ１結合フラグメントのアミノ基との間の反応によって形成される基を介しても抗ＥＧＦＲ１抗体またはそのＥＧＦＲ１結合フラグメントに結合し得る。
酸化開裂によって形成されるアルデヒド基は、水溶液などの溶液中のアミノ基と容易に反応する。しかし、得られる基または形成される結合は、多様な場合があり必ずしも容易には予測および／または特徴付けられない。デキストラン誘導体のＤ−グルコピラノシル単位の酸化開裂によって形成される少なくとも１つのアルデヒド基と抗ＥＧＦＲ１抗体またはそのＥＧＦＲ１結合フラグメントのアミノ基との間の反応は、例えばシッフ塩基の形成をもたらし得る。したがってそれを介してデキストラン誘導体が抗ＥＧＦＲ１抗体またはそのＥＧＦＲ１結合フラグメントに結合する基は、例えばシッフ塩基（イミン）または還元されたシッフ塩基（第二級アミン）で有り得る。
一実施形態において、デキストラン誘導体は、約３から約２０００ｋＤａの範囲内の分子質量を有する。この文脈において、デキストラン誘導体の分子質量は、デキストランおよびその置換基を含有するデキストラン誘導体の分子質量を含むが、抗ＥＧＦＲ１抗体またはそのＥＧＦＲ１結合フラグメントの分子質量は含まないものとして理解されるべきである。一実施形態において、デキストラン誘導体は、約３０から約３００ｋＤａの範囲内の分子質量を有する。
一実施形態において、複合体は、約１０から約３００個または約２０から約１５０個の式−Ｏ−（ＣＨ２）ｎ−Ｓ−Ｂ１２Ｈ１１ ２−の置換基を含む。
一実施形態において、複合体は、約３００個のホウ素原子（３００Ｂ）、約８００個のホウ素原子（８００Ｂ）、約９００個のホウ素原子（９００Ｂ）または約１２００個のホウ素原子を含む。例えば「９００Ｂ」は、１モルのタンパク質当たり、ＢＳＨ分子中に約９００モルのホウ素原子を担持する、１モルのデキストランを担持する複合体を指す。
抗ＥＧＦＲ１抗体またはそのＥＧＦＲ１結合フラグメントは、典型的にはＮ末端アミン基および／またはリジン残基のアミノ基などの少なくとも１つのアミノ基を含有する。
一実施形態において、抗ＥＧＦＲ１抗体またはそのＥＧＦＲ１結合フラグメントのアミノ基は、抗ＥＧＦＲ１抗体またはそのＥＧＦＲ１結合フラグメントのリジン残基のアミノ基である。
一実施形態において、複合体は、デキストラン誘導体あるいは抗ＥＧＦＲ１抗体またはそのＥＧＦＲ１結合フラグメントに結合した少なくとも１つの追跡分子をさらに含む。
「追跡分子」は、検出可能な分子を指す。こうした検出可能な分子は、１４Ｃなどの放射性同位体、放射性同位体を含む化合物、放射性核種、放射性核種を含む化合物、蛍光標識分子（例えばＦＩＴＣ、ＴＲＩＴＣ、ＡｌｅｘａおよびＣｙ色素など）、ＤＯＴＡ（１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−四酢酸）などのキレート剤、またはガドリニウム−ＤＴＰＡ（ガドリニウム−ジエチレントリアミン五酢酸）などのＭＲＩ活性分子であってよい。追跡分子のデキストラン誘導体あるいは抗ＥＧＦＲ１抗体またはそのＥＧＦＲ１結合フラグメントへの結合を達成するための手順は、当技術分野によく知られている。追跡分子は、複合体が患者に投与されて特異的細胞を標的とした後に複合体の位置を特定することを可能にしてよく、このようにして、低エネルギー熱中性子照射を標的とされる複合体の位置に向けることができる。
一実施形態において、追跡分子は、デキストラン誘導体のＤ−グルコピラノシル単位の酸化開裂によって形成される少なくとも１つのアルデヒド基と追跡分子の基との間の反応によって形成される結合または基を介してデキストラン誘導体に結合する。適した追跡分子の基は、例えばアミノ基で有り得る。
デキストラン誘導体のＤ−グルコピラノシル単位の酸化開裂によって形成される１つまたは複数のアルデヒド基は、抗ＥＧＦＲ１抗体またはそのＥＧＦＲ１結合フラグメントのアミノ基あるいは追跡分子と反応しないことがあり得る。
一実施形態において、デキストラン誘導体は、デキストラン誘導体のＤ−グルコピラノシル単位の酸化開裂によって形成されるキャッピングされた少なくとも１つのアルデヒド基を含む。
少なくとも１つのアルデヒド基は、還元シッフ塩基などの、適した基によってキャッピングされてよい。
少なくとも１つのアルデヒド基は、少なくとも１つのアルデヒド基とエタノールアミン、リシン、グリシンまたはトリスなどの親水性のキャッピング剤との間の反応によって形成される基によってもキャッピングされ得る。
一実施形態において、エタノールアミンは、１４Ｃを含む。
キャッピングは、ＮａＣＮＢＨ３などの、還元剤を用いて安定化してよい。したがって還元シッフ塩基などのキャッピング基が、形成され得る。
一実施形態において、デキストラン誘導体は、抗ＥＧＦＲ１抗体またはそのＥＧＦＲ１結合フラグメントのアミノ基あるいは追跡分子と反応せずかつキャッピングされているデキストラン誘導体のＤ−グルコピラノシル単位の酸化開裂によって形成される少なくとも１つのアルデヒド基を含む。
一実施形態において、デキストラン誘導体の１つまたは複数のＤ−グルコピラノシル単位の酸化開裂によって形成される実質的に全てのアルデヒド基が、キャッピングされている。
一実施形態において、デキストラン誘導体は、デキストラン誘導体の１つまたは複数のＤ−グルコピラノシル単位の酸化開裂によって形成される実質的に全てのアルデヒド基がキャッピングされている、デキストラン誘導体のＤ−グルコピラノシル単位の酸化開裂によって形成される複数のアルデヒド基を含む。
一実施形態において、デキストラン誘導体の少なくとも１つのＤ−グルコピラノシル単位の炭素２、３または４から選択される少なくとも１つの炭素は、式
−Ｏ−（ＣＨ２）ｍＣＨ＝ＣＨ２
（式中、ｍは１から８の範囲である）
の置換基によって置換されている。こうした実施形態は典型的には望ましくないが、前記置換基がＢＳＨと反応しなかった場合には、副生物として発生し得る。
一実施形態において、複合体は、
ａ）デキストランの少なくとも１つのヒドロキシル基をアルケニル化してアルケニル化デキストランを取得するステップと、
ｂ）ボロカプテイトナトリウム（ＢＳＨ）をステップａ）から得られるアルケニル化デキストランと反応させてＢＳＨ−デキストランを取得するステップと、
ｃ）アルデヒド基が形成されるようにＢＳＨ−デキストランの少なくとも１つのＤ−グルコピラノシル残基を酸化的に開裂するステップと、
ｄ）ステップｃ）から得られる酸化的に開裂したＢＳＨ−デキストランを抗ＥＧＦＲ１抗体またはそのＥＧＦＲ１結合フラグメントと反応させて複合体を取得するステップと
を含む方法によって取得可能である。
本発明は、
ａ）デキストランの少なくとも１つのヒドロキシル基をアルケニル化してアルケニル化デキストランを取得するステップと、
ｂ）ボロカプテイトナトリウム（ＢＳＨ）をステップａ）から得られるアルケニル化デキストランと反応させてＢＳＨ−デキストランを取得するステップと、
ｃ）アルデヒド基が形成されるようにＢＳＨ−デキストランの少なくとも１つのＤ−グルコピラノシル残基を酸化的に開裂するステップと、
ｄ）ステップｃ）から得られる酸化的に開裂したＢＳＨ−デキストランを抗ＥＧＦＲ１抗体またはそのＥＧＦＲ１結合フラグメントと反応させて複合体を取得するステップと
を含む方法によって取得可能な複合体にも関する。
一実施形態において、デキストランは、約３から約２０００ｋＤａ、または約１０から約１００ｋＤａ、または約５から約２００ｋＤａ、または約１０から約２５０ｋＤａの範囲の分子質量を有する。前記範囲の分子質量を有するデキストランは、ステップａ）〜ｄ）に従っていないデキストランを指すと理解されるべきである。
この文脈において、「アルケニル化」または「アルケニル化する」と言う語は、アルケニルエーテルを与えるデキストランのＤ−グルコピラノシル単位へのアルケニル基の移動を指すと理解されるべきである。言い換えれば、デキストランのＤ−グルコピラノシル単位の少なくとも１つのヒドロキシル基が、アルケニルオキシ基になる。
ステップａ）において、デキストランの少なくとも１つのＤ−グルコピラノシル単位の炭素２、３または４に結合したヒドロキシル基の１つまたは複数が、アルケニル化反応において反応し得る。デキストランのＤ−グルコピラノシル単位の１つまたは複数、あるいは多数が、アルケニル化され得る。
一実施形態において、デキストランは、ステップａ）においてアルケニル化剤であって、式
Ｘ−（ＣＨ２）ｍＣＨ＝ＣＨ２
（式中、ｍは１から８の範囲であり、かつＸはＢｒ、ＣｌまたはＩである）
に従う構造を有するアルケニル化剤を用いてアルケニル化される。
一実施形態において、ｍは、１、２、３、４、５、６、７または８である。一実施形態において、ｍは、１から２の範囲内、または１から３の範囲内、または１から４の範囲内、または１から５の範囲内、または１から６の範囲内、または１から７の範囲内である。
一実施形態において、アルケニル化剤は、臭化アリルである。
一実施形態において、ステップａ）から得られるアルケニル化デキストランの少なくとも１つのＤ−グルコピラノシル単位の炭素２、３または４から選択される少なくとも１つの炭素は、式
−Ｏ−（ＣＨ２）ｍＣＨ＝ＣＨ２、
（式中、ｍは１から８の範囲である）
の置換基によって置換される。
一実施形態において、ｍは、１、２、３、４、５、６、７または８である。一実施形態において、ｍは、１から２の範囲内、または１から３の範囲内、または１から４の範囲内、または１から５の範囲内、または１から６の範囲内、または１から７の範囲内である。
ステップｂ）において、ＢＳＨのスルフヒドリル基は、アルケニル化デキストランのアルケニル基と反応してＢＳＨ−デキストランを形成してチオエーテルを与え得る。１つまたは複数のＢＳＨ分子が、アルケニル化デキストランと反応し得る。したがって、ステップｂ）から得られるＢＳＨ−デキストランは、複数のＢＳＨ部分（すなわち式−Ｓ−Ｂ１２Ｈ１１ ２−の基）を含有し得る。ＢＳＨのスルフヒドリル基は、２つ以上のアルケニル基を含有する単一のアルケニル化Ｄ−グルコピラノシル単位のアルケニル基または２つ以上のアルケニル化Ｄ−グルコピラノシル単位のアルケニル基と反応し得る。
したがってステップｂ）から得られるＢＳＨ−デキストランは、少なくとも１つのＤ−グルコピラノシル単位の炭素２、３または４から選択される少なくとも１つの炭素が式
−Ｏ−（ＣＨ２）ｎ−Ｓ−Ｂ１２Ｈ１１ ２−
（式中、ｎは３から１０の範囲である）
の置換基によって置換されたデキストラン誘導体であり得る。
一実施形態において、ステップｂ）から得られるＢＳＨ−デキストランは、約１０から約１００個または約２０から１００個の置換基あるいは約１０から約３００個または約２０から約１５０個の式−Ｏ−（ＣＨ２）ｎ−Ｓ−Ｂ１２Ｈ１１ ２−（式中、ｎは３から１０の範囲である）を含む。
一実施形態において、ＢＳＨは、ステップｂ）においてラジカル開始剤の存在下でステップａ）から得られるアルケニル化デキストランと反応する。ラジカル開始剤は、ＢＳＨのスルフヒドリル基（１つまたは複数）間およびアルケニル化デキストランのアルケニル基（１つまたは複数）との反応を触媒する能力がある。
この文脈において、「ラジカル開始剤」は、温和な条件下でラジカル種を生成する能力がありかつラジカル反応を促進する薬品を指すと理解されるべきである。「ラジカル開始剤」と言う語は、ＵＶ（紫外線）光も指し得る。ＵＶ光照射は、例えば適した光開始剤の存在下で、ラジカルを発生する能力がある。適したラジカル開始剤には、これに限定されないが、過硫酸アンモニウムまたは過硫酸カリウムなどの無機過酸化物、有機過酸化物およびＵＶ光が含まれる。
一実施形態において、ＢＳＨは、ステップｂ）において過硫酸アンモニウム、過硫酸カリウムおよびＵＶ光からなる群から選択されるラジカル開始剤の存在下でステップａ）から得られるアルケニル化デキストランと反応する。
ステップｂ）において、ステップａ）から得られるアルケニル化デキストランに対するＢＳＨの重量比またはモル比は、（デキストラン誘導体の）デキストラン部分当たりのＢＳＨ部分の数（すなわち式−Ｏ−（ＣＨ２）ｎ−Ｓ−Ｂ１２Ｈ１１ ２−の置換基の数）が異なる複合体を得るために適切に選択してよい。ＢＳＨ−デキストランのデキストラン部分当たりのＢＳＨ部分の数は、例えば実施例２に記載のように核磁気共鳴によってまたは実施例９に記載のように誘導結合プラズマ質量分析法（ＩＣＰ−ＭＳ）によって測定され得る。
一実施形態において、ステップｂ）において存在するアルケニル化デキストランに対するＢＳＨの比率は、１：５から２：１の範囲、または重量で１：４から１：１の範囲、または重量で１：２から３：４の範囲である。典型的には、アルケニル化デキストランに対するＢＳＨの比率が高いほど、ＢＳＨ−デキストランのデキストラン部分当たりのＢＳＨ部分の数が多い。
過硫酸アンモニウムまたは過硫酸カリウムなどの、ラジカル開始剤の比率も、ステップｂ）において異なっていてよい。一実施形態において、ＢＳＨおよび／またはステップｂ）において存在するデキストランに対するラジカル開始剤の比率は、１：５から２：１の範囲、または重量で１：４から１：１の範囲、または重量で１：２から３：４の範囲である。
一実施形態において、ステップｂ）におけるアルケニル化デキストランに対するラジカル開始剤の比率は、１：５から２：１の範囲、または重量で１：４から１：１の範囲、または重量で１：２から３：４の範囲である。
上述の通り、炭素２と３との間の結合および炭素３と４との間の結合から選択される結合は、ステップｃ）において酸化的に開裂され得る。酸化開裂では、Ｄ−グルコピラノシル環は、隣接のジオール間で開かれて、２つのアルデヒド基を残す。ステップｃ）から得られる酸化的に開裂したＢＳＨ−デキストランのアルデヒド基は、複合体を得るために抗ＥＧＦＲ１抗体またはそのＥＧＦＲ１結合フラグメントと反応してよい。アルデヒド基は、アミノ基などの適した基と反応してよい。
ＢＳＨ−デキストランの少なくとも１つのＤ−グルコピラノシル残基は、原則として、遊離ヒドロキシル基によって置換された２つの隣接の炭素間のＤ−グルコピラノシル単位を酸化的に開裂する能力がある任意の酸化剤を用いて酸化的に開裂され得る。酸化剤も、ＢＳＨ−デキストランの少なくとも１つのＤ−グルコピラノシル残基を実質的に特異的に酸化的に開裂できるように選択してよい。こうした酸化剤は、ＢＳＨ−デキストランの他の基または部分を酸化しない場合がある。
一実施形態において、ＢＳＨ−デキストランの少なくとも１つのＤ−グルコピラノシル残基は、ステップｃ）において過ヨウ素酸ナトリウム、過ヨウ素酸および酢酸鉛（ＩＶ）からなる群から選択される酸化剤を用いて酸化的に開裂される。
一実施形態において、ＢＳＨ−デキストランの少なくとも１つのＤ−グルコピラノシル残基は、ステップｃ）において水溶液中で酸化的に開裂される。
一実施形態において、方法は、ステップｃ）から得られる酸化的に開裂したＢＳＨ−デキストランまたはステップｄ）から得られる複合体を追跡分子と反応させるステップをさらに含む。
この文脈において、追跡分子は、本書に記載されている任意の追跡分子であってよい。
追跡分子は、ステップｃ）から得られる酸化的に開裂したＢＳＨ−デキストランの少なくとも１つのアルデヒド基と反応し得る。少なくとも１つのアルデヒド基と反応し得る追跡分子の適した基は、例えばアミノ基で有り得る。
一実施形態において、方法は、ステップｃ）から得られる酸化的に開裂したＢＳＨ−デキストランまたはステップｄ）から得られる複合体の未反応のアルデヒド基をキャッピングするステップｅ）をさらに含む。
一実施形態において、未反応のアルデヒド基は、エタノールアミン、リシン、グリシンまたはトリスなどの親水性のキャッピング剤を用いてキャッピングされる。
一実施形態において、親水性のキャッピング剤は、エタノールアミン、リシン、グリシンおよびトリスからなる群から選択される。
一実施形態において、１４Ｃを含むエタノールアミンは、追跡分子である。
一実施形態において、ステップａ）、ｂ）、ｃ）およびｄ）から選択される１つまたは複数のステップは、水溶液中で実行される。適した水溶液は、例えば約６から８のｐＨを有する水性リン酸緩衝液であってよい。
一実施形態において、ステップａ）〜ｄ）の全ては、水溶液中で実行される。
抗ＥＧＦＲ１抗体またはそのＥＧＦＲ１結合フラグメントは、典型的にはＮ末端アミン基および／またはリジン残基のアミノ基などの少なくとも１つのアミノ基を含有する。ステップｄ）において、ステップｃ）から得られる酸化的に開裂したＢＳＨ−デキストランのアルデヒド基は、したがって抗ＥＧＦＲ１抗体またはそのＥＧＦＲ１結合フラグメントの少なくとも１つのアミノ基と反応し得る。
一実施形態において、抗ＥＧＦＲ１抗体またはそのＥＧＦＲ１結合フラグメントのアミノ基は、抗ＥＧＦＲ１抗体またはそのＥＧＦＲ１結合フラグメントのリジン残基のアミノ基である。
一実施形態において、酸化的に開裂したＢＳＨ−デキストランは、酸化的に開裂したＢＳＨ−デキストランおよび抗ＥＧＦＲ１抗体またはそのＥＧＦＲ１結合フラグメントをステップｄ）において室温で約６から８のｐＨを有する水性リン酸緩衝液中でインキュベートすることによって抗ＥＧＦＲ１抗体またはそのＥＧＦＲ１結合フラグメントと反応する。
複合体は、例えば実施例４に記載のように、例えばゲルろ過によって、精製してよい。
本発明は、さらに原核宿主細胞における抗ＥＧＦＲ１抗体またはそのＥＧＦＲ１結合フラグメントの産生に関する。他のポリペプチド産生系と比較して、細菌、特に大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）は、多数の独特な利点を提供する。使用される原料物質（すなわち細菌細胞）は、安価かつ成長が容易であり、したがって産生のコストを削減する。原核宿主は、例えば、哺乳類の細胞よりもずっと早く成長し、遺伝子操作のより迅速な分析を可能にする。より短い世代時間および拡大の容易性も、細菌発酵を大量タンパク質産生のためのより魅力的手段にする。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を含めた多くの細菌種のゲノム構造および生物活性は、良く研究されていて広範囲の適したベクターが利用可能であり、望ましい抗体の発現をより簡便にしている。原核生物系における抗体または抗体フラグメント発現は、様々な規模で実行され得る。振とうフラスコ培養（２〜５リットルの範囲）は、典型的には５ｍｇ／リットルより少ない産生物（例えば抗体フラグメント）を発生するのに対して、発酵系においては５０〜３００ｍｇ／リットル規模が得られ得る。
さらには、原核宿主細胞は、アグリコシル化（ａｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ）抗−ＥＧＦＲ抗体またはそのＥＧＦＲ１結合フラグメントの産生を可能にし得る。
一実施形態において、原核宿主細胞は、抗ＥＧＦＲ１抗体またはそのＥＧＦＲ１結合フラグメントの
ｉ）軽鎖可変領域および
ｉｉ）重鎖可変領域
をコードする１つまたは複数のポリヌクレオチドを含む。「１つまたは複数のポリヌクレオチド」と言う語は、１種または複数の配列を介して直接または間接的に、共有結合していても良くしていなくても良い２つ以上のポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド分子を指し得る。例えば、２つ以上のポリヌクレオチドが、１つの発現カセットまたはベクターに含まれ得る。一例として、２つ以上のポリヌクレオチドは、軽鎖可変領域および重鎖可変領域の両方を含む融合タンパク質をコードするように、直接または間接的に、融合していてよい。これらは、２つの分離した発現カセットまたはベクターにも含まれ得る。「１つまたは複数のポリヌクレオチド」と言う語は、抗ＥＧＦＲ１抗体またはそのＥＧＦＲ１結合フラグメントの軽鎖可変領域および重鎖可変領域をコードする１つまたは複数のポリヌクレオチドあるいはポリヌクレオチドストレッチを含む単一の、連続的なポリヌクレオチド分子も指し得る。
一実施形態において、宿主細胞は、抗ＥＧＦＲ１抗体またはそのＥＧＦＲ１結合フラグメントをコードする本明細書に記載の１つまたは複数の実施形態によるポリヌクレオチドを含む。宿主細胞は、抗ＥＧＦＲ１抗体またはＥＧＦＲ１結合フラグメントを集合的にコードする１つまたは複数のポリヌクレオチドを含み得る。ベクターは、例えば、発現ベクターなどの組み換えベクターなど任意の種類であってよい。
種々の原核宿主細胞のいずれも用いてよい。
一実施形態において、原核宿主細胞は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞である。
一実施形態において、軽鎖可変領域および重鎖可変領域をコードする１つまたは複数のポリヌクレオチドは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞などの宿主細胞のために最適化されたコドンである。
一実施形態において、原核宿主細胞は、抗ＥＧＦＲ１抗体またはそのＥＧＦＲ１結合フラグメントの軽鎖可変領域および重鎖可変領域の両方をコードする単一の連続的なポリヌクレオチドを含む。こうした連続的なポリヌクレオチドは、ジシストロニックまたはポリシストロニックであってよい。
一実施形態において、原核宿主細胞は、抗ＥＧＦＲ１抗体またはそのＥＧＦＲ１結合フラグメントの軽鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドおよび抗ＥＧＦＲ１抗体またはそのＥＧＦＲ１結合フラグメントの重鎖可変領域をコードする別のポリヌクレオチドを含む。
一実施形態において、軽鎖可変領域は、シグナルペプチドが先頭に付加している。ポリヌクレオチドはしたがって、軽鎖可変領域の先頭に付加しているシグナルペプチドおよび軽鎖可変領域の両方をコードする。シグナルペプチドは、軽鎖可変領域の直前に付加していてもよく、またはシグナルペプチドと軽鎖可変領域との間に配列ストレッチがあってもよい。シグナルペプチドは、ｇＩＩＩ、ｍａｌＥ、ｐｈｏＡ、ｏｍｐＡ、ｐｅｌＢ、ｓｔＩＩおよびｓｔＩＩからなる群から選択され得る。シグナルペプチドは、ｏｍｐＡ、ｐｅｌＢ、ｓｔＩＩおよびｓｔＩＩからなる群からも選択され得る。これらのシグナルペプチドは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの原核宿主細胞における抗体またはフラグメントの産生において特に高い収率を可能にし得る。
一実施形態において、重鎖可変領域は、シグナルペプチドが先頭に付加している。シグナルペプチドは、ｇＩＩＩ、ｍａｌＥ、ｐｈｏＡ、ｏｍｐＡ、ｐｅｌＢ、ｓｔＩＩおよびｓｔＩＩからなる群から選択され得る。シグナルペプチドは、ｏｍｐＡ、ｐｅｌＢ、ｓｔＩＩおよびｓｔＩＩからなる群からも選択され得る。
一実施形態において、軽鎖可変領域および重鎖可変領域は、シグナルペプチドが先頭に付加している。
一実施形態において、軽鎖可変領域の先頭に付加しているシグナルペプチドは、重鎖可変領域の先頭に付加しているシグナルペプチド以外である。
一実施形態において、軽鎖可変領域および重鎖可変領域の先頭に付加しているシグナルペプチドは、独立にｇＩＩＩ、ｍａｌＥ、ｐｈｏＡ、ｏｍｐＡ、ｐｅｌＢ、ｓｔＩＩおよびｓｔＩＩからなる群から選択される。
一実施形態において、軽鎖可変領域および重鎖可変領域の先頭に付加しているシグナルペプチドは、独立にｏｍｐＡ、ｐｅｌＢ、ｓｔＩＩおよびｓｔＩＩからなる群から選択される。
一実施形態において、軽鎖可変領域の先頭に付加しているシグナルペプチドは、重鎖可変領域の先頭に付加しているシグナルペプチドと同一であって、かつシグナルペプチドは、ｇＩＩＩ、ｍａｌＥ、ｐｈｏＡ、ｏｍｐＡ、ｐｅｌＢ、ｓｔＩＩおよびｓｔＩＩからなる群から選択される。
一実施形態において、軽鎖可変領域の先頭に付加しているシグナルペプチドは、重鎖可変領域の先頭に付加しているシグナルペプチドと同一であって、かつシグナルペプチドは、ｏｍｐＡ、ｐｅｌＢ、ｓｔＩＩおよびｓｔＩＩからなる群から選択される。
一実施形態において、軽鎖可変領域は、ｐｅｌＢシグナルペプチドが先頭に付加しかつ重鎖可変領域は、ｏｍｐＡシグナルペプチドが先頭に付加している。
一実施形態において、軽鎖可変領域および重鎖可変領域の両方とも、ｓｔＩＩシグナルペプチドが先頭に付加している。
一実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号８に記載される配列および配列番号９に記載される配列を含むかまたはそれらからなる。
一実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号８に記載される配列または配列番号８と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％一致する配列、および配列番号９に記載される配列または配列番号９と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％一致する配列を含むかあるいはそれらからなる。
一実施形態において、軽鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドは、配列番号８に記載される配列を含むかまたはそれらからなりかつ重鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドは、配列番号９に記載される配列を含むかまたはそれらからなる。
一実施形態において、軽鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドは、配列番号８に記載される配列、または配列番号８と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％一致する配列を含むかあるいはそれらからなり、かつ重鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドは、配列番号９に記載される配列、または配列番号９と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％一致する配列を含むかあるいはそれらからなる。
一実施形態において、原核宿主細胞は、抗体の抗ＥＧＦＲ１結合フラグメントの
ｉ）軽鎖および
ｉｉ）重鎖
をコードする１つまたは複数のポリヌクレオチドを含む。
一実施形態において、１つまたは複数のポリヌクレオチドは、ＦａｂまたはｓｃＦｖである抗ＥＧＦＲ１結合フラグメントをコードする。
一実施形態において、軽鎖をコードするポリヌクレオチドは、配列番号１０に記載される配列を含むかまたはそれらからなり、かつ重鎖配列をコードするポリヌクレオチドは、配列番号１１に記載される配列を含むかまたはそれらからなる。
一実施形態において、軽鎖をコードするポリヌクレオチドは、配列番号１０に記載される配列、または配列番号１０と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％一致する配列を含むかあるいはそれらからなり、かつ重鎖配列をコードするポリヌクレオチドは、配列番号１１に記載される配列または配列番号１１と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％一致する配列を含むかあるいはそれらからなる。
一実施形態において、１つまたは複数のポリヌクレオチドは、配列番号１０に記載される軽鎖配列および配列番号１１に記載される重鎖配列を含むかまたはそれらからなる。
一実施形態において、１つまたは複数のポリヌクレオチドは、配列番号１０に記載される軽鎖配列または配列番号１０と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％一致する配列、および配列番号１１に記載される重鎖配列または配列番号１１と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％一致する配列を含むかあるいはそれらからなる。
一実施形態において、宿主細胞は、配列番号１２に記載される配列または配列番号１２と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％一致する配列を含むかあるいはそれらからなるポリヌクレオチドを含む。
一実施形態において、宿主細胞は、配列番号１３に記載される配列または配列番号１３と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％一致する配列を含むかあるいはそれらからなるポリヌクレオチドを含む。
一実施形態において、宿主細胞は、シャペロンタンパク質および／またはシャペロンタンパク質をコードする１つもしくは複数のポリヌクレオチドを含む。シャペロンタンパク質は、Ｄｓｂタンパク質（ＤｓｂＡ、ＤｓｂＢ、ＤｓｂＣ、ＤｓｂＤ、ＦｋｐＡおよび／またはＤｓｂＧ）などの、原核シャペロンタンパク質であってよい。
一実施形態において、シャペロンタンパク質は、宿主細胞内で過剰発現している。
一実施形態において、シャペロンタンパク質は、ＤｓｂＡおよび／またはＤｓｂＣである。
一実施形態において、シャペロンタンパク質は、ＤｎａＫ、ＤｎａＪ、ＧｒｐＥ、Ｓｋｐ、ＦｋｐＡ、ＧｒｏＥＬ、およびＧｒｏＥＳからなる群から選択される。
一実施形態において、シャペロンタンパク質は、Ｓｋｐである。
本明細書で使用する場合「原核宿主細胞」という語は、組み換えプラスミドまたはベクターなどの、外因性ポリヌクレオチドの導入によって遺伝子改変されている、または遺伝子改変される能力がある原核細胞を指すことが意図される。こうした語は、特定の対象である細胞だけではなくこうした細胞の子孫も指すことが意図されることを理解すべきである。突然変異または環境の影響のいずれかが原因で後に続く世代においてある種の変異が発生し得るので、こうした子孫は、実際には、親細胞と一致しない場合があるが、それでもやはり本明細書で使用する場合「原核宿主細胞」という語の範囲内に含まれる。
原核宿主細胞は、例えば発現またはクローニングベクターにおいて、抗ＥＧＦＲ１抗体またはそのＥＧＦＲ１結合フラグメントをコードする上記のポリヌクレオチドでトランスフェクトおよび好ましくは形質転換されて、プロモーターを誘導するため、形質転換体を選択するため、または所望の抗体もしくは抗体フラグメント配列をコードする遺伝子を増幅するために必要に応じて変性された従来型の栄養培地において培養される。原核宿主と共に用いるために適したプロモーターには、ＰｈｏＡプロモーター、β−ラクタマーゼおよびラクトースプロモーター系、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系ならびにｔａｃまたはｔｒｃプロモーターなどのハイブリッドプロモーターが含まれる。しかしながら、細菌（他の既知の細菌など）において機能的な他のプロモーターは、同様に適する。それらのヌクレオチド配列は公表されており、それによって熟練作業者が対象とする軽鎖および重鎖をコードするシストロンにリンカーまたはアダプターを用いてそれらを作動可能に結合して（Ｓｉｅｂｅｎｌｉｓｔら、（１９８０） Ｃｅｌｌ ２０： ２６９）任意の必要とされる制限部位を供給することを可能にする。
一実施形態において、１つまたは複数のポリヌクレオチドは、Ｔ７、Ｔ５およびＲｈａｍからなる群から独立に選択されるプロモーターによって駆動される、すなわち作動可能に結合される。
一実施形態において、１つまたは複数のポリヌクレオチドは、プロモーターＴ７によって駆動される。抗ＥＧＦＲ１抗体またはそのＥＧＦＲ１結合フラグメントを産生するために用いられる原核宿主細胞は、一般に「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ」 ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ （Ｍｉｃｈａｅｌ ＧｒｅｅｎおよびＪｏｓｅｐＨＳａｍｂｒｏｏｋ、第４版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、２０１２年）に記載されるように培養してよい。本発明の抗体を発現するために適した原核宿主細胞には、グラム陰性またはグラム陽性生物などの、古細菌および真正細菌が含まれる。有用な細菌の例には、エシェリキア属（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））、桿菌（例えば、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、腸内細菌、シュードモナス属種（例えば、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、ネズミチフス菌、セラチア菌、クレブシエラ属、プロテウス属、赤痢菌、根粒菌、ビトレオシラ属またはパラコッカス属が含まれる。一実施形態において、グラム陰性細胞が用いられる。一実施形態において、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞は、本発明のための宿主として用いられる。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株の例には、Ｗ３１１０株（Ｂａｃｈｍａｎｎ、Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第２巻（ワシントンＤ．Ｃ．：米国微生物学会、１９８７年）、１１９０〜１２１９頁、ＡＴＣＣ Ｄｅｐｏｓｉｔ Ｎｏ． ２７，３２５）および遺伝子型Ｗ３１１０ΔｆｈｕＡ （ΔｔｏｎＡ） ｐｔｒ３ ｌａｃ Ｉｑ ｌａｃＬ８ Δｏｍｐ ＴΔ（ｎｍｐｃ−ｆｅｐＥ） ｄｅｇＰ４１ ｋａｎＲ（米国特許第５，６３９，６３５号）を有する３３Ｄ３株を含めたそれらの誘導体ならびに６３Ｃ１株および６４Ｂ４株が含まれる。他の株およびそれらの誘導体、例えばＥ．ｃｏｌｉ ２９４（ＡＴＣＣ ３１，４４６）、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｂ、Ｅ．ｃｏｌｉ、１７７６（ＡＴＣＣ ３１，５３７）およびＥ．ｃｏｌｉ ＲＶ３０８（ＡＴＣＣ ３１，６０８）も適する。これらの例は、限定ではなく例示である。適切な細菌を選択するために細菌の細胞におけるレプリコンの再製可能性を考慮することが一般に必要で有り得る。例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）種は、レプリコンを供給するためにｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＡＣＹＣ １７７、またはｐＫＮ４１０などの良く知られたプラスミドが用いられる場合に宿主として適切に用いられ得る。典型的には宿主細胞は、最小量のタンパク質分解酵素を分泌してよく、かつ追加のプロテアーゼ阻害剤は望ましくは細胞培養に組み込まれ得る。
一実施形態において、宿主細胞は、１種または複数のタンパク質分解酵素が欠損している。
一実施形態において、タンパク質分解酵素は、プロテアーゼＩＩＩ、ＯｍｐＴ、ＤｅｇＰ、Ｔｓｐ、プロテアーゼＩ、プロテアーＭｉ、プロテアーゼＶ、プロテアーゼＶＩ、およびＬｏｎからなる群から選択される。
形質転換後、抗ＥＧＦＲ１抗体またはそのＥＧＦＲ１結合フラグメントの産生に用いられた原核細胞は、当技術分野において既知でありかつ選択された宿主細胞の培養に適した培地中で育てられる。適した培地の例には、Ｌｕｒｉａ ｂｒｏｔｈ（ＬＢ）、Ｔｅｒｒｉｆｉｃ ｂｒｏｔｈ（ＴＢ）ならびに酵母抽出物、大豆加水分解物および他の植物加水分解物などの栄養補給剤を加えた最小合成培地が含まれる。一部の実施形態において、培地は、発現ベクターを含有する原核細胞の成長を選択的に可能にするために発現ベクターの構造に基づいて選択された選択剤も含有する。例えば、アンピシリンは、アンピシリン耐性遺伝子を発現する細胞の成長のために培地に加えられる。炭素、窒素および無機リン酸塩の供給源以外の任意の必要な補給剤も、単独でまたは別の補給剤または複合窒素供給源などの培地との混合物として導入されて適切な濃度で含まれていてよい。場合によっては培養培地は、グルタチオン、システイン、シスタミン、チオグリコレート、ジチオエリトリトールおよびジチオスレイトールからなる群から選択される１種または複数の還元剤を含有してよい。
原核宿主細胞は、適した温度で培養される。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）成長のために、例えば、好ましい温度は、約２０℃から約３９℃の範囲である。培地のｐＨは、主として宿主生物に応じて、約５から約９の範囲の任意のｐＨであってよい。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のためには、ｐＨは、好ましくは約６．８から約７．４、およびより好ましくは約７．０である。発現ベクターにおいて誘導性プロモーターが用いられる場合、抗ＥＧＦＲ１抗体またはＥＧＦＲ１結合フラグメントタンパク質発現は、プロモーターの活性化に適した条件下で誘導される。
一実施形態において、抗ＥＧＦＲ１抗体またはそのＥＧＦＲ１結合フラグメントは、原核宿主細胞のペリプラズムへ分泌されかつそこから回収される。タンパク質回収は典型的には、一般に浸透圧衝撃、音波処理または溶解などの手段により、微生物を破壊することを伴う。一旦細胞が破壊されると、細胞片または細胞全体は、遠心分離またはろ過によって取り出され得る。タンパク質は、例えば、Ｆａｂフラグメントの精製に適したアフィニティー樹脂クロマトグラフィーまたはプロテインＬカラムによって、さらに精製してもよい。あるいは、タンパク質は、培養培地に移されてその中で単離してもよい。細胞は、ろ過される培養および培養上清から取り出して産生したタンパク質のさらなる精製のために濃縮してよい。発現したポリペプチドは、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）およびウエスタンブロットアッセイなどの一般的な既知の方法を用いてさらに単離および特定してよい。
本発明の一態様において、抗ＥＧＦＲ１抗体またはＥＧＦＲ１結合フラグメント産生は、発酵法によって大量に行われる。種々の大規模流加発酵手順が、組み換えタンパク質の産生のために利用可能である。大規模発酵は、少なくとも５００リットルの容量を有する。これらの発酵槽は、酸素および養分、特にグルコース（好ましい炭素／エネルギー供給源）を分散させるために撹拌羽根を使用する。小規模発酵は、一般には容積が約１００リットル以下の発酵槽における発酵を指し、約１リットルから約１００リットルの範囲であり得る。
発酵法においては、タンパク質発現の誘導は、典型的には細胞が適した条件下で成長した後に開始されて細胞の段階が早期定常期である、所望の密度、例えば、約１８０〜２２０のＯＤ５５０まで行われる。採用されるベクター構造に従って、当技術分野において知られかつ上述されているような、種々の誘導物質を用いてよい。細胞は、誘導に先立ってより短い期間成長させて良い。細胞は、通常約１２〜５０時間誘導されるが、より長いまたはより短い誘導時間を用いてもよい。
抗ＥＧＦＲ１抗体またはＥＧＦＲ１結合フラグメントの産生収率および品質を改善するために、種々の発酵条件を変更してよい。例えば、分泌された抗体ポリペプチドの適切な集合およびフォールディングを改善するために、Ｄｓｂタンパク質（ＤｓｂＡ、ＤｓｂＢ、ＤｓｂＣ、ＤｓｂＤ、および／またはＤｓｂＧ）、ＳｋｐまたはＦｋｐＡ（シャペロン活性を有するペプチジルプロリルシス、トランス−イソメラーゼ）などのシャペロンタンパク質を過剰発現させる追加のベクターを、宿主原核細胞を同時形質転換するために用いてよい。シャペロンタンパク質は、適切なフォールディングおよび細菌宿主細胞において産生される異種タンパク質の溶解性を促進することが実証されている。Ｃｈｅｎら、（１９９９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２７４：１９６０１〜１９６０５、Ｇｅｏｒｇｉｏｕら、米国特許第６，０８３，７１５号、Ｇｅｏｒｇｉｏｕら、米国特許第６，０２７，８８８号、ＢｏｔｈｍａｎｎおよびＰｌｕｃｋｔｈｕｎ（２０００）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２７５：１７１００〜１７１０５、ＲａｍｍおよびＰｌｕｃｋｔｈｕｎ、（２０００）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２７５：１７１０６〜１７１１３、Ａｒｉｅら、（２００１）Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３９：１９９〜２１０。
一実施形態において、ＤｎａＫ／ＤｎａＪ／ＧｒｐＥ、Ｓｋｐ、Ｓｋｐ／ＦｋｐＡ、ＧｒｏＥＬ／ＧｒｏＥＳなどのシャペロンは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの細菌宿主細胞において発現する。
発現した抗ＥＧＦＲ１抗体またはそのＥＧＦＲ１結合フラグメントの（特にタンパク質分解感受性であるもの）タンパク質分解を最小化するために、タンパク質分解酵素が欠損しているある種の宿主株を用いてよい。例えば、宿主細胞株は、プロテアーゼＩＩＩ、ＯｍｐＴ、ＤｅｇＰ、Ｔｓｐ、プロテアーゼＩ、プロテアーゼＭｉ、プロテアーゼＶ、プロテアーゼＶＩおよびそれらの組み合わせなどの既知の細菌プロテアーゼをコードする遺伝子における遺伝子突然変異（１種または複数）を生じさせるために改変してもよい。一部の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）プロテアーゼ欠損株は、入手可能であり、例えば、Ｊｏｌｙら、（１９９８）、ｓｕｐｒａ、Ｇｅｏｒｇｉｏｕら、米国特許第５，２６４，３６５号、Ｇｅｏｒｇｉｏｕ、米国特許第５，５０８，１９２号、Ｈａｒａら、Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｄｒｕｇ Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ、２：６３〜７２（１９９６）に記載されている。
一実施形態において、タンパク質分解酵素が欠損しておりかつ１種または複数のシャペロンタンパク質を過剰発現しているプラスミドで形質転換された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株が、本発明の発現系において宿主細胞として用いられる。
抗ＥＧＦＲ１抗体またはそのＥＧＦＲ１結合フラグメントの精製は、当技術分野において承認されている方法を用いて達成してよい。以下の手順（免疫親和性で分留またはイオン交換カラム、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカまたはＤＥＡＥなどの陽イオン交換樹脂上でのクロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、硫酸アンモニウム沈殿、および例えばＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−７５を用いるゲルろ過）は、適した精製手順の例示である。
一実施形態において、固相に固定化されたプロテインＡは、抗ＥＧＦＲ１抗体の免疫親和性精製に用いられる。
一実施形態において、固相に固定化されたプロテインＬは、本発明の抗ＥＧＦＲ１抗体フラグメントの免疫親和性精製に用いられる。
精製の第１ステップとして、上述のような細胞培養から導かれる調製物は、プロテインＡまたはプロテインＬが固定化された固相に適用されて抗ＥＧＦＲ１抗体のプロテインＡへの特異的な結合、またはＦａｂフラグメントなどの抗ＥＧＦＲ１抗体フラグメントのプロテインＬへの特異的な結合を可能にする。次いで固相は、固相に非特異的に結合した汚染物質を除去するために洗浄される。最後に抗体または抗体フラグメントを、溶離によって固相から回収する。
一実施形態において、軽鎖可変領域は、ｐｅｌＢシグナルペプチドが先頭に付加しかつ重鎖可変領域は、ｏｍｐＡシグナルペプチドが先頭に付加し、宿主細胞は、シャペロンタンパク質Ｓｋｐおよび／またはシャペロンタンパク質Ｓｋｐをコードするポリヌクレオチドを含み、かつ宿主細胞は、タンパク質分解酵素ＬｏｎおよびＯｍｐＴが欠損している。
一実施形態において、軽鎖可変領域および重鎖可変領域は、ｓｔＩＩシグナルペプチドが先頭に付加し、宿主細胞は、シャペロンタンパク質Ｓｋｐおよび／またはシャペロンタンパク質Ｓｋｐをコードするポリヌクレオチドを含み、かつ宿主細胞は、タンパク質分解酵素ＬｏｎおよびＯｍｐＴが欠損している。
抗ＥＧＦＲ１抗体またはそのＥＧＦＲ１結合フラグメントの
ｉ）軽鎖可変領域および
ｉｉ）重鎖可変領域
をコードするポリヌクレオチドも、開示される。
「ポリヌクレオチド」と言う語は、この文脈において１つまたは複数の配列を介して直接または間接的に共有結合していてもよくしていなくてもよい１つ、２つまたはそれ以上のポリヌクレオチドもしくはポリヌクレオチド分子を指し得る。例えば、２つ以上のポリヌクレオチドが、１つの発現カセットまたはベクターに含まれ得る。一例として、２つ以上のポリヌクレオチドは、軽鎖可変領域および重鎖可変領域の両方を含む融合タンパク質をコードするように、直接または間接的に、融合していてよい。これらは、２つの分離した発現カセットまたはベクターにも含まれ得る。「ポリヌクレオチド」と言う語は、抗ＥＧＦＲ１抗体またはそのＥＧＦＲ１結合フラグメントの軽鎖可変領域および重鎖可変領域をコードする１つまたは複数のポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドストレッチを含む単一の、連続的なポリヌクレオチド分子も指し得る。ポリヌクレオチドは、ジシストロニックまたはポリシストロニックであってよい。
一実施形態において、軽鎖可変領域および重鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドは、宿主細胞のために最適化されたコドンである。宿主細胞は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞などの原核細胞であってよい。
一実施形態において、軽鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドは、配列番号８に記載される配列または配列番号８と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％一致する配列を含むかあるいはそれらからなる。一実施形態において、重鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドは、配列番号９に記載される配列または配列番号９と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％一致する配列を含むかあるいはそれらからなる。
一実施形態において、軽鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドは、配列番号８に記載される配列を含むかまたはそれらからなりかつ重鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドは、配列番号９に記載される配列を含むかまたはそれらからなる。
一実施形態において、軽鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドは、配列番号８に記載される配列、または配列番号８と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％一致する配列を含むかあるいはそれらからなり、かつ重鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドは、配列番号９に記載される配列、または配列番号９と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％一致する配列を含むかあるいはそれらからなる。
一実施形態において、ポリヌクレオチドは、抗体の抗ＥＧＦＲ１結合フラグメントの
ｉ）軽鎖および
ｉｉ）重鎖
をコードする。
一実施形態において、ポリヌクレオチドは、ＦａｂまたはｓｃＦｖである抗ＥＧＦＲ１結合フラグメントをコードする。
一実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号１０に記載される軽鎖配列、または配列番号１０と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％一致する配列を含むかあるいはそれらからなる。
一実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号１１に記載される重鎖配列、または配列番号１１と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％一致する配列を含むかあるいはそれらからなる。
一実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号１０に記載される軽鎖配列および配列番号１１に記載される重鎖配列を含むかまたはそれらからなる。
一実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号１０に記載される軽鎖配列、または配列番号１０と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％一致する配列、および配列番号１１に記載される重鎖配列、または配列番号１１と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％一致する配列を含むかあるいはそれらからなる。
一実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号１２に記載される配列、または配列番号１２と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％一致する配列を含むかあるいはそれらからなる。
一実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号１３に記載される配列、または配列番号１３と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％一致する配列を含むかあるいはそれらからなる。
一実施形態において、軽鎖可変領域および重鎖可変領域は、シグナルペプチドが先頭に付加している。ポリヌクレオチドはしたがって、シグナルペプチドおよび軽鎖可変領域、ならびにシグナルペプチドおよび重鎖可変領域の両方をコードする。２つのシグナルペプチドは、互いに独立に選択してよく、または同一のシグナルペプチドであってよい。
一実施形態において、軽鎖可変領域の先頭に付加しているシグナルペプチドは、重鎖可変領域の先頭に付加しているシグナルペプチド以外である。
一実施形態において、軽鎖可変領域および重鎖可変領域の先頭に付加しているシグナルペプチドは、独立にｇＩＩＩ、ｍａｌＥ、ｐｈｏＡ、ｏｍｐＡ、ｐｅｌＢ、ｓｔＩＩおよびｓｔＩＩからなる群から選択される。
一実施形態において、軽鎖可変領域および重鎖可変領域の先頭に付加しているシグナルペプチドは、独立にｏｍｐＡ、ｐｅｌＢ、ｓｔＩＩおよびｓｔＩＩからなる群から選択される。
一実施形態において、軽鎖可変領域の先頭に付加しているシグナルペプチドは、重鎖可変領域の先頭に付加しているシグナルペプチドと同一であって、かつシグナルペプチドは、ｇＩＩＩ、ｍａｌＥ、ｐｈｏＡ、ｏｍｐＡ、ｐｅｌＢ、ｓｔＩＩおよびｓｔＩＩからなる群から選択される。
一実施形態において、軽鎖可変領域の先頭に付加しているシグナルペプチドは、重鎖可変領域の先頭に付加しているシグナルペプチドと同一であって、かつシグナルペプチドは、ｏｍｐＡ、ｐｅｌＢ、ｓｔＩＩおよびｓｔＩＩからなる群から選択される。
一実施形態において、軽鎖可変領域は、ｐｅｌＢシグナルペプチドが先頭に付加しかつ重鎖可変領域は、ｏｍｐＡシグナルペプチドが先頭に付加している。
一実施形態において、軽鎖可変領域および重鎖可変領域の両方とも、ｓｔＩＩシグナルペプチドが先頭に付加している。
ポリヌクレオチドは、作動可能に結合してもよく、すなわちプロモーターによって駆動されるか、またはプロモーターを含む。プロモーターは、ポリヌクレオチドの効率的な発現を可能にし得る。プロモーターは、誘導性プロモーターであってもよく、それによってポリヌクレオチドの誘導性発現を可能にする。
一実施形態において、ポリヌクレオチドは、Ｔ７、Ｔ５およびＲｈａｍからなる群から選択されるプロモーターによって駆動される、すなわち作動可能に結合する、またはそれを含む。
一実施形態において、ポリヌクレオチドは、プロモーターＴ７によって駆動されるかまたはそれを含む。一実施形態において、原核宿主細胞は、少なくとも２０ｍｇ／Ｌ、少なくとも３０ｍｇ／Ｌ、少なくとも５０ｍｇ／Ｌ、少なくとも１００ｍｇ／Ｌ、少なくとも２００ｍｇ／Ｌ、または少なくとも５００ｍｇ／Ｌの抗ＥＧＦＲ１抗体または抗ＥＧＦＲ１抗体のＥＧＦＲ１結合フラグメントを産生する。一実施形態において、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞は、少なくとも２０ｍｇ／Ｌ、少なくとも３０ｍｇ／Ｌ、少なくとも５０ｍｇ／Ｌ、少なくとも１００ｍｇ／Ｌ、少なくとも２００ｍｇ／Ｌ、もしくは少なくとも５００ｍｇ／Ｌの抗ＥＧＦＲ１抗体または抗ＥＧＦＲ１抗体のＥＧＦＲ１結合フラグメントを産生する。
一実施形態において、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞は、少なくとも少なくとも２０ｍｇ／Ｌ、少なくとも３０ｍｇ／Ｌ、少なくとも５０ｍｇ／Ｌ、少なくとも１００ｍｇ／Ｌ、少なくとも２００ｍｇ／Ｌ、または少なくとも５００ｍｇ／Ｌの抗ＥＧＦＲ１ Ｆａｂを産生する。
一実施形態において、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞は、少なくとも２０ｍｇ／Ｌ、少なくとも３０ｍｇ／Ｌ、少なくとも５０ｍｇ／Ｌ、少なくとも１００ｍｇ／Ｌ、少なくとも２００ｍｇ／Ｌ、または少なくとも５００ｍｇ／Ｌの抗ＥＧＦＲ１ ｓｃＦｖを産生する。
一実施形態において、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞は、配列番号８に記載されるポリヌクレオチドまたは配列番号８と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％一致する配列、および配列番号９に記載される配列または配列番号９と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％一致する配列を含むかあるいはそれらからなり、かつ大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞は、少なくとも２０ｍｇ／Ｌ、少なくとも３０ｍｇ／Ｌ、少なくとも５０ｍｇ／Ｌ、少なくとも１００ｍｇ／Ｌ、少なくとも２００ｍｇ／Ｌ、もしくは少なくとも５００ｍｇ／Ｌの抗ＥＧＦＲ１抗体または抗ＥＧＦＲ１抗体のＥＧＦＲ１結合フラグメントを産生する。
一実施形態において、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞は、配列番号８に記載されるポリヌクレオチドまたは配列番号８と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％一致する配列、および配列番号９に記載される配列または配列番号９と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％一致する配列を含むかあるいはそれらからなり、かつ大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞は、少なくとも２０ｍｇ／Ｌ、少なくとも３０ｍｇ／Ｌ、少なくとも５０ｍｇ／Ｌ、少なくとも１００ｍｇ／Ｌ、少なくとも２００ｍｇ／Ｌ、もしくは少なくとも５００ｍｇ／Ｌの抗ＥＧＦＲ１ Ｆａｂまたは抗ＥＧＦＲ１ ｓｃＦｖを産生する。
一実施形態において、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞は、配列番号８に記載されるポリヌクレオチドおよび配列番号９に記載される配列を含むかまたはそれらからなりかつ大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞は、少なくとも２０ｍｇ／Ｌ、少なくとも３０ｍｇ／Ｌ、少なくとも５０ｍｇ／Ｌ、少なくとも１００ｍｇ／Ｌ、少なくとも２００ｍｇ／Ｌ、もしくは少なくとも５００ｍｇ／Ｌの抗ＥＧＦＲ１ Ｆａｂまたは抗ＥＧＦＲ１ ｓｃＦｖを産生する。
一実施形態において、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞は、配列番号１０に記載されるポリヌクレオチド、または配列番号１０と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％一致する配列、および配列番号１１に記載される重鎖配列または配列番号１１と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％一致する配列を含むかあるいはそれらからなり、かつ大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞は、少なくとも２０ｍｇ／Ｌ、少なくとも３０ｍｇ／Ｌ、少なくとも５０ｍｇ／Ｌ、少なくとも１００ｍｇ／Ｌ、少なくとも２００ｍｇ／Ｌ、もしくは少なくとも５００ｍｇ／Ｌの抗ＥＧＦＲ１抗体または抗ＥＧＦＲ１抗体のＥＧＦＲ１結合フラグメントを産生する。
一実施形態において、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞は、配列番号１０に記載されるポリヌクレオチド、または配列番号１０と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％一致する配列、および配列番号１１に記載される重鎖配列、または配列番号１１と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％一致する配列を含むかあるいはそれらからなり、かつ大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞は、少なくとも２０ｍｇ／Ｌ、少なくとも３０ｍｇ／Ｌ、少なくとも５０ｍｇ／Ｌ、少なくとも１００ｍｇ／Ｌ、少なくとも２００ｍｇ／Ｌ、または少なくとも５００ｍｇ／Ｌの抗ＥＧＦＲ１ Ｆａｂを産生する。
一実施形態において、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞は、配列番号１２に記載されるポリヌクレオチド、または配列番号１２と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％一致する配列を含むかあるいはそれらからなり、かつ大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞は、少なくとも２０ｍｇ／Ｌ、少なくとも３０ｍｇ／Ｌ、少なくとも５０ｍｇ／Ｌ、少なくとも１００ｍｇ／Ｌ、少なくとも２００ｍｇ／Ｌ、または少なくとも５００ｍｇ／Ｌの抗ＥＧＦＲ１ ｓｃＦｖを産生する。
一実施形態において、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞は、配列番号１３に記載されるポリヌクレオチド、または配列番号１３と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％一致する配列を含むかあるいはそれらからなり、かつ大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞は、少なくとも２０ｍｇ／Ｌ、少なくとも３０ｍｇ／Ｌ、少なくとも５０ｍｇ／Ｌ、少なくとも１００ｍｇ／Ｌ、少なくとも２００ｍｇ／Ｌ、または少なくとも５００ｍｇ／Ｌの抗ＥＧＦＲ１ ｓｃＦｖを産生する。
本発明は、１つまたは複数の本発明の実施形態による複合体を含む医薬組成物にさらに関する。
本発明の医薬組成物は、薬学的に許容可能な担体をさらに含んでいてよい。適した薬学的に許容可能な担体の例は、当技術分野においてよく知られており例えばリン酸緩衝食塩水、水、油／水エマルション、湿潤剤、およびリポソームが含まれ得る。こうした担体を含む組成物は、当技術分野においてよく知られている方法によって配合され得る。医薬組成物は、賦形剤、添加剤、防腐剤、同時に投与される他の医薬組成物、および同類のものなどの他の成分をさらに含んでいてよい。
一実施形態において、医薬組成物は、１つまたは複数の本発明の実施形態による有効量の複合体を含む。
一実施形態において、医薬組成物は、１つまたは複数の本発明の実施形態による治療的有効量の複合体を含む。
複合体の「治療的有効量」または「有効量」という語は、がん細胞が中性子放射で衝撃される場合またはＢＮＣＴを受ける場合にがん細胞の成長を調節するおよび／または患者の疾患を治療するための用法量を指すと理解されるべきである。治療的有効量は、患者の年齢、体重、性別、食餌および医学的状態、疾患の重症度、ならびに使用される特定の複合体の活性、効能、薬物動態学的および毒物学特徴などの薬理学的考慮事項を含めた、種々の要因に従って選択してよい。治療的有効量は、Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ２００４などの、標準的な医療テキストを参照することによっても決定され得る。患者は、男性または女性であってよく、かつ乳幼児、子供または大人であってよい。
「治療」または「治療する」という語は、病気または健康状態の異常と闘い、軽減し、和らげまたは緩和して、この病気によって、例えば、がん疾患などで害された生活状態を改善することを目的として患者を手当てする、看護する、および看病する従来の観念および意味において用いられる。
一実施形態において、医薬組成物は、例えば経口、非経口、経皮、腔内、動脈内、髄腔内、腫瘍内（ｉ．ｔ．）、および／または鼻腔内の投与あるいは組織内への直接注入のための組成物を含む。医薬組成物の投与は、異なる方法で、例えば静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、腫瘍内、局部的または皮内の投与によって達成されてよい。
本発明は、薬物として使用するための１つまたは複数の本発明の実施形態による複合体あるいは１つまたは複数の本発明の実施形態による複合体を含む医薬組成物にさらに関する。
本発明は、ホウ素中性子捕捉療法のための薬物として使用するための１つまたは複数の本発明の実施形態による複合体あるいは１つまたは複数の本発明の実施形態による複合体を含む医薬組成物にさらに関する。
「ホウ素中性子捕捉療法」（ＢＮＣＴ）は、非放射性ホウ素−１０が低エネルギー熱中性子を照射されてアルファ粒子およびリチウム−７原子核を生じる、標的放射線療法を指すと理解されるべきである。非放射性ホウ素−１０は、腫瘍局在複合体などの腫瘍局在薬剤内にそれを組み込むことにより標的とされ得る。
本発明は、ホウ素中性子捕捉療法において使用するための１つまたは複数の本発明の実施形態による複合体あるいは１つまたは複数の本発明の実施形態による複合体を含む医薬組成物にさらに関する。
本発明は、がんの治療において使用するための１つまたは複数の本発明の実施形態による複合体あるいは１つまたは複数の本発明の実施形態による複合体を含む医薬組成物にさらに関する。
一実施形態において、がんは、頭頸部がんである。
一実施形態において、がんは、頭頸部がん、白血病、リンパ腫、乳がん、前立腺がん、卵巣がん、大腸がん、胃がん、扁平上皮がん、小細胞肺がん、多剤耐性がんおよび精巣がんからなる群から選択される。
本発明は、ホウ素中性子捕捉療法によるがんの治療において使用するための１つまたは複数の本発明の実施形態による複合体あるいは１つまたは複数の本発明の実施形態による複合体を含む医薬組成物にさらに関する。
本発明は、薬物の製造における１つまたは複数の本発明の実施形態による複合体または医薬組成物の使用にさらに関する。
本発明は、ホウ素中性子捕捉療法のための薬物の製造における１つまたは複数の本発明の実施形態による複合体または医薬組成物の使用にさらに関する。
本発明は、がんの治療のための薬物の製造における１つまたは複数の本発明の実施形態による複合体または医薬組成物の使用にさらに関する。
一実施形態において、がんは、頭頸部がんである。
一実施形態において、がんは、頭頸部がん、白血病、リンパ腫、乳がん、前立腺がん、卵巣がん、大腸がん、胃がん、扁平上皮がん、小細胞肺がん、多剤耐性がんおよび精巣がんからなる群から選択される。
本発明は、ホウ素中性子捕捉療法によるがんの治療のための薬物の製造における１つまたは複数の本発明の実施形態による複合体または医薬組成物の使用にさらに関する。
一実施形態において、薬物は、ホウ素中性子捕捉療法による頭頸部がんの腫瘍内治療用である。
一実施形態において、薬物は、ホウ素中性子捕捉療法による頭頸部がんの静脈内治療用である。
一実施形態において、薬物は、ホウ素中性子捕捉療法による頭頸部がんの腫瘍内および静脈内治療用である。
本発明は、１つまたは複数の本発明の実施形態による複合体または医薬組成物が有効量でヒトに投与される、ヒトにおけるＥＧＦＲ１発現腫瘍細胞の成長の治療および調節の方法にも関する。
一実施形態において、１つまたは複数の本発明の実施形態による複合体または医薬組成物は、ホウ素中性子捕捉療法において有効量でヒトに投与される。
一実施形態において、ホウ素の濃度は、複合体または医薬組成物の投与後に腫瘍細胞において分析される。
一実施形態において、ホウ素の濃度は、複合体または医薬組成物の投与後に血液において分析される。
一実施形態において、ホウ素の濃度は、複合体または医薬組成物の投与後に筋肉において、または他の非腫瘍組織において分析される。
腫瘍細胞、血液または両方におけるホウ素の濃度は、例えば誘導結合プラズマ質量分析法（ＩＣＰ−ＭＳ）または誘導結合プラズマ原子発光分光法（ＩＣＰ−ＡＥＳ）（例えば実施例９）によって分析または測定され得る。これらの方法は、試料中のホウ素原子の量（モル）または濃度を測定する。
腫瘍細胞、血液または両方におけるホウ素の濃度は、例えば追跡分子を含む複合体の実施形態を用いて追跡分子の濃度を分析または測定することによって、間接的にも分析または測定され得る。例えば、追跡分子が蛍光性または放射性である場合、追跡分子の蛍光性または放射性が測定または視覚化され得る。
一実施形態において、ホウ素の濃度は、複合体または医薬組成物の投与後に腫瘍細胞および血液において分析され、腫瘍細胞中のホウ素の濃度の血液中のホウ素の濃度に対する比率は、１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、１１：１、１２：１、１３：１、１５：１、２０：１、３０：１、４０：１、５０：１、６０：１、７０：１、８０：１、９０：１、１００：１、１１０：１、１２０：１、１３０：１、１４０：１、１５０：１、２００：１、２１０：１、２２０：１、２３０：１、２４０：１、または２５０：１より高い。
一実施形態において、ホウ素の濃度は、複合体または医薬組成物の投与後に、腫瘍細胞および筋肉、または他の非腫瘍組織において分析され、腫瘍細胞中のホウ素の濃度の筋肉、または他の非腫瘍組織中のホウ素の濃度に対する比率は、１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、１１：１、１２：１、１３：１、１５：１、２０：１、３０：１、４０：１、５０：１、６０：１、７０：１、８０：１、９０：１、１００：１、１１０：１、１２０：１、１３０：１、１４０：１、１５０：１、２００：１、２１０：１、２２０：１、２３０：１、２４０：１、または２５０：１より高い。
一実施形態において、腫瘍細胞中のホウ素の濃度の血液、筋肉、または他の非腫瘍組織中のホウ素の濃度に対する比率は、腫瘍細胞中のホウ素原子の血液、筋肉、または他の非腫瘍組織中のホウ素原子に対するモル比である。
本発明は、ＥＧＦＲ１タンパク質発現細胞集団の成長を調節するための方法であって、
１つまたは複数の本発明の実施形態による複合体あるいは１つまたは複数の本発明の実施形態による医薬組成物を、ＥＧＦＲ１タンパク質発現細胞集団と接触させるステップ
を含む方法にも関する。
一実施形態において、ＥＧＦＲ１タンパク質発現細胞集団は、がん細胞集団または腫瘍細胞集団である。
この文脈において、「がん細胞集団」と言う語は、１つまたは複数のがん細胞集団を指すと理解されるべきである。
複合体は、細胞集団、例えば、血液、血漿、肺、胸部、結腸、前立腺、腎臓、膵臓、脳、骨、卵巣、精巣、およびリンパ器官のがんなどを含めたがん細胞、より好ましくは肺、結腸、前立腺（ｃｏｌｏｎ ｐｒｏｓｔｒａｔｅ）、血漿、血液または結腸がんとｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉｎ ｖｉｖｏおよび／またはｅｘ ｖｉｖｏで接触させてよく、「がん細胞集団の成長を調節する」は、分裂してより多くの細胞を産生させないように細胞集団の増殖を抑制すること、例えば、未処理の細胞と比較して細胞分裂における増加速度を低減すること、細胞集団を死滅させることおよび／または細胞集団（がん細胞など）が転移するのを防ぐことを含む。細胞集団の成長は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで調節してよい。
一実施形態において、がんは、頭頸部がん、白血病、リンパ腫、乳がん、前立腺がん、卵巣がん、大腸がん、胃がん、扁平上皮がん、小細胞肺がん、多剤耐性がんおよび精巣がんからなる群から選択される。
本発明は、１つまたは複数の本発明の実施形態による複合体または医薬組成物が有効量でヒトに投与される、ヒトにおける腫瘍細胞の成長を治療するおよび／または調節するならびに／あるいは腫瘍細胞を予防する方法にさらに関する。
一実施形態において、有効量は、治療的有効量である。
一実施形態において、１つまたは複数の本発明の実施形態による複合体または医薬組成物は、ホウ素中性子捕捉療法において有効量でヒトに投与される。
一実施形態において、腫瘍細胞は、白血病細胞、リンパ腫細胞、乳がん細胞、前立腺がん細胞、卵巣がん細胞、大腸がん細胞、胃がん細胞、扁平上皮がん細胞、小細胞肺がん細胞、頭頸部がん細胞、多剤耐性がん細胞、および精巣がん細胞、転移性の、進行した、薬剤またはホルモン耐性、多剤耐性がん細胞、ならびにその変種からなる群から選択される。
本発明は、１つまたは複数の本発明の実施形態による複合体または医薬組成物が有効量でヒトに投与される、ヒトにおけるがんを治療する方法にさらに関する。
一実施形態において、１つまたは複数の本発明の実施形態による複合体または医薬組成物は、ホウ素中性子捕捉療法において有効量でヒトに投与される。
一実施形態において、有効量は、治療的有効量である。
一実施形態において、１つまたは複数の本発明の実施形態による複合体または医薬組成物は、静脈内にホウ素中性子捕捉療法における治療的有効量でヒトに投与される。
一実施形態において、１つまたは複数の本発明の実施形態による複合体または医薬組成物は、腫瘍内にホウ素中性子捕捉療法における治療的有効量でヒトに投与される。
一実施形態において、１つまたは複数の本発明の実施形態による複合体または医薬組成物は、腫瘍内および静脈内にホウ素中性子捕捉療法における治療的有効量でヒトに投与される。
一実施形態において、１つまたは複数の本発明の実施形態による複合体または医薬組成物は、頭頸部腫瘍へ腫瘍内にホウ素中性子捕捉療法における治療的有効量でヒトに投与される。
一実施形態において、がんは、頭頸部がん、白血病、リンパ腫、乳がん、前立腺がん、卵巣がん、大腸がん、胃がん、扁平上皮がん、小細胞肺がん、多剤耐性がんおよび精巣がんからなる群から選択される。
一実施形態において、１つまたは複数の実施形態による複合体または医薬組成物は、
１つまたは複数の実施形態による原核宿主細胞を培養するステップと、
抗ＥＧＦＲ１抗体またはそのＥＧＦＲ１結合フラグメントを単離および／あるいは精製するステップと
を含む方法によって取得可能な抗ＥＧＦＲ１抗体またはそのＥＧＦＲ１結合フラグメントを含む。
一実施形態において、１つまたは複数の実施形態による複合体または医薬組成物の抗ＥＧＦＲ１抗体またはそのＥＧＦＲ１結合フラグメントは、配列番号１４または配列番号１５に記載されるアミノ酸配列を含むかまたはそれらからなる。
本発明は、１つまたは複数の実施形態による複合体あるいは１つまたは複数の実施形態による医薬組成物が有効量でヒトに投与される、ヒトにおけるＥＧＦＲ１発現腫瘍細胞の成長を治療または調節するための方法にも関する。上に述べる本発明の実施形態は、互いに任意の組み合わせで用いてもよい。実施形態の幾つかは、共に組み合わせられて本発明のさらなる実施形態の形を取り得る。本発明が関係する製品、使用法または方法は、上に述べる本発明の実施形態の少なくとも１つを含んでいてよい。
１つまたは複数の本発明の実施形態による複合体は、いくつかの有利な特性を有する。
１つまたは複数の本発明の実施形態による複合体は、低エネルギー中性子照射が無いので相対的に非毒性でありかつ抗原性が低い。
複合体は、複合体分子当たり多数のホウ素−１０原子を含有する。さらには、複合体は、比較的良好な水溶性を示す。
１つまたは複数の本発明の実施形態による複合体は、良好な薬物動態も示す。複合体は、血液における適した保持率、標的とする細胞における高い取り込みならびに標的としない細胞および器官における低い取り込みを有する。
複合体の産生プロセスは、比較的単純であり水溶液中で実行してよい。
１つまたは複数の本発明の実施形態による複合体は、製造時または生理学的条件、例えば血液、血清、血漿もしくは組織内において化学的または生化学的分解に対して十分に安定である。
以下において、本発明が、より詳細に記載される。ここで本発明の実施形態が詳細に参照され、その実施例が添付の図面において例示される。下記の記述は、幾つかの本発明の実施形態を当業者が本開示に基づいて本発明を利用できるように詳細に開示する。ステップの多くは本明細書に基づいて当業者に明らかになるので、実施形態の全てのステップが詳細に説明されているというわけではない。
実施例１．デキストランのアリル化
２００ｍｇのデキストラン７０ｋＤ（Ｓｉｇｍａ）を２ｍｌの０．６Ｍ ＮａＯＨに溶解した。２５０μｌの臭化アリル（Ｓｉｇｍａ）を加えて、６０℃で３時間反応を進行させた。次いで反応混合物を１Ｍ酢酸で中和して生成物を１０体積の冷アセトン（−２０℃）を用いて沈殿により単離した。沈殿物を遠心分離によって回収してアセトンで２回洗った。アリル化デキストラン（図式１）を、１Ｈ−ＮＭＲ分析にかけ、アリル化のレベルは約３６％であることが示された。
図式１。臭化アリルの使用によるデキストランのアリル化。
実施例２．アリルデキストランへのＢＳＨの添加
実施例１に記載のように調製した５０ｍｇのアリルデキストラン７０ｋＤ、５０ｍｇの過硫酸アンモニウムおよび５０ｍｇのボロカプテイトナトリウム（ＢＳＨ、Ｋａｔｃｈｅｍ Ｌｔｄ， Ｃｚｅｃｈ Ｒｅｐｕｂｌｉｃ）を、０．５ｍｌのＨ２Ｏに溶解した。
反応を、５０℃で２時間進行させた。反応生成物、ＢＳＨ−デキストラン（図式２）を、遠心ろ過器（Ａｍｉｃｏｎ、１０Ｋカットオフ）を用いて限外ろ過で単離した。１Ｈ−ＮＭＲ分析は、デキストラン鎖当たり１２００個のホウ素原子に相当する、平均で１００ＢＳＨ単位がアリルデキストランに結合したことを示した（図１）。小さな変更で、例えばデキストランにおけるよりも低いアリル化レベルの使用によって、デキストラン鎖当たり約９００個のホウ素または８００個のホウ素を有するＢＳＨデキストランが得られた。
図式２。過硫酸塩触媒反応におけるアリルデキストランへのボロカプテイトナトリウムの添加。
上述の反応におけるＢＳＨおよび過硫酸塩の量を変えることにより、明らかにより低いＢＳＨレベルを有するＢＳＨ−デキストランを調製することが可能であった：１）２０ｍｇのアリルデキストラン、１５ｍｇの過硫酸アンモニウムおよび１５ｍｇのＢＳＨを含有する反応において、単離されたＢＳＨ−デキストランは、デキストラン鎖当たり約７００個のホウ素原子を含有することが分かった。２）２０ｍｇのアリルデキストラン、１０ｍｇの過硫酸アンモニウムおよび１０ｍｇのＢＳＨを含有する反応において、単離されたＢＳＨ−デキストランは、デキストラン鎖当たり約５６０個のホウ素原子を含有することが分かった。３）２０ｍｇのアリルデキストラン、５ｍｇの過硫酸アンモニウムおよび５ｍｇのＢＳＨを含有する反応において、単離されたＢＳＨ−デキストランは、デキストラン鎖当たり約３６０個のホウ素原子を含有することが分かった。
実施例３．ＢＳＨ−デキストランの酸化
実施例２に記載のように調製した５０ｍｇのＢＳＨ−デキストランを、３ｍｌの０．１Ｍ酢酸ナトリウム中２５ｍＭ ＮａＩＯ４、ｐＨ５．５に溶解した。反応管を、アルミニウム箔で覆って室温で一晩インキュベートした。反応生成物、酸化ＢＳＨ−デキストラン（図式３）を、遠心ろ過器（Ａｍｉｃｏｎ、１０Ｋカットオフ）を用いて限外ろ過で単離した。
図式３。過ヨウ素酸ナトリウムの使用によるＢＳＨ−デキストランの酸化。
実施例４．抗ＥＧＦＲ１ Ｆａｂ／Ｆ（ａｂ’）２への酸化ＢＳＨ−デキストランの複合体化
２ｍｌのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中２ｍｇ（４０ｎｍｏｌ）の抗ＥＧＦＲ１ Ｆａｂを、１．６ｍｌのＰＢＳ中５．１ｍｇ（６０ｎｍｏｌ）の酸化ＢＳＨ−デキストラン（実施例３）と混合した。反応を、室温で一晩進行させた。反応に４００μｌの０．５Ｍ ＮａＣＮＢＨ３を加えてアルデヒド−リシン結合を安定させ反応を室温で２時間インキュベートした。８００μｌの０．２Ｍエタノールアミン−ＨＣｌ ｐＨ８を加えて反応を室温で１時間インキュベートした。４００μｌの０．５Ｍ ＮａＣＮＢＨ３を加えてエタノールアミンキャッピングを安定させ反応を室温で２時間インキュベートした。低分子量試薬を、洗浄溶離剤としてＰＢＳを用いて製造業者の説明に従いＡｍｉｃｏｎ遠心ろ過器ユニット（ＭＷＣＯ ３０Ｋ）によって除去した。
２ｍｌのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中２ｍｇ（４０ｎｍｏｌ）の抗ＥＧＦＲ１ Ｆ（ａｂ’）２を、１．６ｍｌのＰＢＳ中２．５６ｍｇ（３０ｎｍｏｌ）の酸化ＢＳＨ−デキストラン（実施例３）と混合した。上記のように複合体を安定させ、キャッピングして限外ろ過で精製した。
両方の複合体を、１０％アセトニトリル（ＡＣＮ）−５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５を溶離緩衝液として用いてＹａｒｒａ ３μｍ ＳＥＣ−３０００ゲルろ過カラム（３００ｘ７．８ｍＭ、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）を備えたＡｅｋｔａ（Ａｅはアーウムラウト） ｐｕｒｉｆｉｅｒ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によって分析した（図２）。
実施例５．抗ＥＧＦＲ１−Ｆａｂおよび−Ｆ（ａｂ’）２、ならびに対照−Ｆａｂおよび−Ｆ（ａｂ’）２フラグメントの生成
ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントを、市販のセツキシマブ（Ｅｒｂｉｔｕｘ、Ｒｏｃｈｅ）またはＣＨＯ細胞（Ｆｒｅｅｄｏｍ ＣＨＯ−Ｓキット、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）において産生されたセツキシマブのいずれかから生成した。セツキシマブを産生する安定な細胞株の発育のためにＦｒｅｅｄｏｍ ＣＨＯ−Ｓキット（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用した。作業は、製造業者の説明に従って行った。重鎖および軽鎖配列をコードする最適化ヌクレオチド配列を、ＧｅｎｅＡｒｔ （Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）から購入してｐＣＥＰ４発現ベクター（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）内へ別々にクローン化した。安定した発現のために、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）ＣＨＯ−Ｓ細胞を、直線化した１：１の軽鎖および重鎖ベクターでトランスフェクトした。トランスフェクタントを、ピューロマイシンおよびメトトレキサートで選別した後に限界希釈クローニングによってクローン単離を行った。クローン化細胞株を、拡大して産生性について評価した。
対照−Ｆａｂおよび−Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを、市販のオマリズマブ（抗−ＩｇＥ）（Ｘｏｌａｉｒ、Ｎｏｖａｒｔｉｓ）から生成した。
抗ＥＧＦＲ１ Ｆａｂフラグメントを、固定化パパイン（Ｐｉｅｒｃｅ）で製造業者の説明に従い小さな変更を加えて抗体を消化することにより調製した。用いた基質に対する酵素の比率は１：６０（ｗ／ｗ）でありインキュベート時間は７時間であった。Ｆａｂフラグメントを、固定化プロテインＡのカラム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で製造業者の説明に従って未消化のＩｇＧおよびＦｃフラグメントから分離した。
抗ＥＧＦＲ１ Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを、製造業者の説明に従ってＦｒａｇＩＴ ＭａｘｉＳｐｉｎ（Ｇｅｎｏｖｉｓ）を用いてまたは製造業者の説明に従い小さな変更を加えてＦａｂｒｉｃａｔｏｒ酵素（Ｇｅｎｏｖｉｓ）を用いてのいずれかで抗体を消化することにより調製した。５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ６．６中の抗体のｍｇ当たり１２０単位の酵素でＦａｂｒｉｃａｔｏｒ酵素消化を行い、インキュベート時間は＋３７℃で１時間であった。Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを、製造業者の説明に従って固定化ＨｉＴｒａｐプロテインＬカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で精製した。反応緩衝液を、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ濃縮器（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）（１０ｋＤａカットオフ）でＰＢＳに交換した。
生成したフラグメントをＳＤＳ−ＰＡＧＥで特定してそれぞれのフラグメントのタンパク質濃度を２８０ｎｍにおけるＵＶ吸光度を測定することにより決定した。
実施例６ホウ素複合体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析
抗ＥＧＦＲ１ ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントのホウ素複合体を、複合体化が成功していることおよび複合体化後に非複合体化ＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２フラグメントが存在しないことを確認するためにＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて分析した。図３は、非還元条件（パネルＡ）および還元条件（パネルＢ）下の勾配ゲル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、４〜１５％）において異なる量のホウ素を有する抗ＥＧＦＲ１ Ｆａｂ／Ｆ（ａｂ’）２ホウ素複合体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。パネルＡの結果は、非複合体化ＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２フラグメントが見えないので複合体化が完了している（またはほぼ完了している）ことを示す。ＢＳＨは、負に帯電した分子でありかつタンパク質に複合した場合に複合体のゲル上での移動速度は、その理論分子量に基づいて予想されるよりも速い。図３の実施例（パネルＡ）は、大量のホウ素を有する複合体は、より少量のホウ素を有する複合体（例えば比較レーン１、２、４および６）よりも非還元ゲル上でより早く移動することを示す。図３の結果（パネルＡ）は、複合体の大部分が、試料が２つの異なる種類の複合体の混合物を含有することを意味する非還元ゲル上の２つの帯に分離することも示す。還元条件におけるホウ素複合体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（図３、パネルＢ）は、異なる量のホウ素を有する全てのＦａｂ複合体が還元条件下のゲル上と同様に移動することを示す（レーン１、２、４、６）。同様に、異なる量のホウ素を有する還元Ｆ（ａｂ’）２複合体は、全く同様に移動する（レーン３、５、７）。一般に、還元ホウ素複合体は、非還元複合体よりもゲル上で早く移動する。
実施例７．ホウ素複合体のＩｎ ｖｉｔｒｏ内在化アッセイ
ホウ素複合体のＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８標識
５μｇのＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８カルボン酸、スクシンイミジルエステル標識（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、１００μｇのホウ素複合体（抗ＥＧＦＲ１−Ｆａｂ、抗ＥＧＦＲ１−Ｆ（ａｂ’）２、抗ＥＧＦＲ１−ｍＡｂ、対照−Ｆａｂ、対照−Ｆ（ａｂ’）２、対照−ｍＡｂ）または対応する非複合体化化合物と共に１００μｌのＰＢＳ中１０μｌの１Ｍ ＮａＨＣＯ３、ｐＨ９を含有する緩衝液中で室温で１５分間インキュベートした。インキュベート後に過剰標識を、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ濃縮器（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）（１０ｋＤａカットオフ）で緩衝液をＰＢＳに交換することに除去した。それぞれの化合物のタンパク質濃度を、２８０ｎｍにおけるＵＶ吸光度を測定することにより決定して製造業者（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の説明に従って標識度を計算した。
ホウ素複合体のトリチウム標識
蒸発によるトルエン溶媒の除去後、１００μＣｉのトリチウム標識Ｎ−スクシンイミジルプロピオン酸（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を、１００μｇの抗ＥＧＦＲ１−Ｆａｂ−ＢＳＨ（８００Ｂ）−Ｄｅｘ、抗ＥＧＦＲ１−Ｆ（ａｂ’）２−ＢＳＨ（８００Ｂ）−Ｄｅｘ、抗ＥＧＦＲ１−ｍＡｂおよび対照−ｍＡｂと共に１００μｌのＰＢＳ中２０μｌの１Ｍ Ｎａ−ホウ酸緩衝液、ｐＨ８．８を含有する緩衝液中でインキュベートした。反応を室温で一晩進行させて次にＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ濃縮器（１０ｋＤａカットオフ）を用いて緩衝液をＰＢＳに交換することにより過剰標識を除去した。放射能の量を、液体シンチレーションカクテル（Ｕｌｔｉｍａ Ｇｏｌｄ、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）の存在下でシンチレーションカウンターを用いて測定した。化合物中のトリチウム標識の量を、ｃｐｍ／タンパク質μｇとして計算した。
細胞培養
ＨＳＣ−２細胞（口腔のヒト扁平上皮細胞がん腫、ＪＣＲＢ細胞バンク、日本）およびＦａＤｕ細胞（咽頭のヒト扁平上皮細胞がん腫、ＡＴＣＣ）を、２％グルタミン、１０％ウシ胎児血清および１％ペニシリン／ストレプトマイシンと共にイーグル最小必須培地中でＴ７５フラスコにおいて培養した。ＨＥＫ（ヒト胚腎臓、ＡＴＣＣ）細胞を、２％グルタミン、１０％ウシ胎児血清および１％ペニシリン／ストレプトマイシンを有するダルベッコ改変イーグル培地中でＴ７５フラスコにおいて培養した。
蛍光顕微鏡検査法において視覚化した内在化アッセイ
ＨＳＣ−２細胞（５ｘ１０４）を、チャンバースライド上に播種して２４時間成長させた。次いで細胞を、１０μｇ／ｍｌのＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８標識されたＢＳＨ−複合体を含有する１００μｌの培地中で＋３７℃または＋４℃で３時間インキュベートした。インキュベート後に細胞をＰＢＳで２回洗って４％パラホルムアルデヒドで２０分間固定した。マウント培地（ＤＡＰＩを有するＰｒｏｌｏｎｇ Ｇｏｌｄ褪色防止試薬）を加えて細胞を顕微鏡カバーガラスで覆った。細胞を、蛍光顕微鏡検査法（Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏ Ｓｃｏｐｅ Ａ１、ＰｒｏｇＲｅｓ Ｃ５、ＪＥＮＯＰＴＩＫ ＡＧ）で撮影した。
ＨＳＣ−２腫瘍細胞株による抗ＥＧＦＲ１−Ｆ（ａｂ’）２−ＢＳＨ（９００Ｂ）−Ｄｅｘおよび非複合体化抗ＥＧＦＲ１−Ｆ（ａｂ’）２の内在化を、蛍光顕微鏡検査法により分析した（図４）。実験は、＋４℃で実行し（化合物は細胞表面には結合するが内在化はできない）および＋３７℃（細胞は表面結合化合物を内在化できる）で実行した。非複合体化抗ＥＧＦＲ１−Ｆ（ａｂ’）２およびホウ素複合体の両方とも、＋４℃で細胞表面に結合して（パネルＡおよびＢ）＋３７℃で内在化した（パネルＣおよびＤ）。実際には、ホウ素複合体は、非複合体化抗ＥＧＦＲ１−Ｆ（ａｂ’）２よりも効率よく内在化した。抗ＥＧＦＲ１−Ｆａｂ−ＢＳＨ（９００Ｂ）−ＤｅｘおよびＥＧＦＲ１−ｍＡｂ−ＢＳＨ（９００Ｂ）−Ｄｅｘならびに対応する非複合体化抗ＥＧＦＲ１−Ｆａｂおよび抗ＥＧＦＲ１−ｍＡｂを用いた内在化アッセイは、図４に示すデータに非常に類似した結果を与えた（図示せず）。内在化へのホウ素添加の効果は、異なる量のホウ素を有するホウ素複合体（抗ＥＧＦＲ１−Ｆａｂ−ＢＳＨ−Ｄｅｘおよび抗ＥＧＦＲ１−Ｆ（ａｂ’）２−ＢＳＨ−Ｄｅｘ）を用いて試験した。結果は、より多くのホウ素を有する複合体は、＋３７℃において低いホウ素添加を有する複合体よりもＨＳＣ−２細胞によってより効率よく内在化されることを示す（図示せず）。対照−Ｆ（ａｂ’）２−ＢＳＨ（９００Ｂ）−Ｄｅｘは、非常に弱く内在化しただけであった（図示せず）。
内在化アッセイ（ＦＡＣＳ）
ＨＳＣ−２、ＦａＤｕおよびＨＥＫ細胞（２ｘ１０５）を、２４ウェルプレート上に播種して２４時間成長させた。次いで細胞を、５μｇ／ｍｌのＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８標識化合物を含有する３００μｌの培地中で＋３７℃で３時間インキュベートした。インキュベート後に細胞をＰＢＳで２回洗って１００μｌのＴｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡで＋３７℃で１０分間インキュベートすることにより分離した。細胞を、３００μｌの培地を加えることにより中和してＰＢＳ中で再懸濁させてフローサイトメーター（ＦＡＣＳ ＬＲＳ ＩＩ）を用いて分析した。それぞれの試料の平均蛍光強度を、ＦＡＣＳ Ｄｉｖａソフトウェアを用いて計算した。表１〜３に示すデータは、蛍光強度がそれぞれの化合物のための標識度に正規化された「正規化平均蛍光強度」として表わされる。
ＦＡＣＳを用いたアッセイ
蛍光標識されたホウ素複合体（９００個のホウ素原子）および非複合体化ＡｂフラグメントのヒトＨＮＣがん細胞株ＨＳＣ−２による内在化を、ＦＡＣＳを用いて評価した。結果は、細胞が＋３７℃でインキュベートされた場合に生じる内在化に加えて細胞表面結合した化合物を示す（表１）。抗ＥＧＦＲ１−Ｆａｂ−ＢＳＨ−Ｄｅｘは、他のホウ素複合体または非複合体化抗ＥＧＦＲ１−Ｆａｂよりも効率よく内在化した。他の抗ＥＧＦＲ１ホウ素複合体（抗ＥＧＦＲ１−Ｆ（ａｂ’）２−ＢＳＨ−Ｄｅｘおよび抗ＥＧＦＲ１−ｍＡｂ−ＢＳＨ−Ｄｅｘ）は、非複合体化抗ＥＧＦＲ１−Ｆａｂおよび抗ＥＧＦＲ１−Ｆ（ａｂ’）２と同等に良好に内在化した。対照−Ｆ（ａｂ’）２および−ｍＡｂのホウ素複合体は、非常に弱く内在化した。
表１．蛍光標識されたホウ素複合体および非複合体化化合物のＨＳＣ−２細胞による細胞表面結合および内在化。分析はＦＡＣＳによって実行して蛍光強度はそれぞれの化合物のための標識度に正規化した。
抗ＥＧＦＲ１ Ｆ（ａｂ’）２および−Ｆａｂから異なる量のホウ素（３６０〜９００個のホウ素原子）を有するホウ素複合体を合成して内在化過程におけるホウ素添加の影響を調査した。実施例は、ヒトＨＮＣがん細胞株ＨＳＣ−２および対照ヒト細胞株ＨＥＫを用いる蛍光標識された複合体での内在化アッセイを示す。フローサイトメトリー分析からの結果は、細胞が＋３７℃でインキュベートされた場合に生じる内在化に加えて細胞表面結合した化合物を示す（表２）。抗ＥＧＦＲ１ Ａｂフラグメントの全てのホウ素複合体の内在化は、フローサイトメトリーによって分析されたように非常に類似した。しかしながら、顕微鏡法を用いた実験は、より多くのホウ素を有する複合体がより低いホウ素添加を有する複合体よりも効率よく内在化したことを明らかにした（図示せず）。
表２．異なる量のホウ素を有する蛍光標識されたホウ素複合体のＨＳＣ−２およびＨＥＫ細胞による細胞表面結合および内在化。分析はフローサイトメトリーによって実行し蛍光強度はそれぞれの化合物のための標識度に正規化した。
蛍光標識されたホウ素複合体（１２００または８００個のホウ素原子）および非複合体化ＡｂフラグメントのヒトＨＮＣがん細胞株（ＨＳＣ−２およびＦａＤｕ）および対照細胞株ＨＥＫによる内在化を、フローサイトメトリーを用いて評価した。結果は、細胞が＋３７℃でインキュベートされた場合に生じる内在化に加えて細胞表面結合した化合物を示す（表３）。抗ＥＧＦＲ１−Ｆａｂ−ＢＳＨ（１２００Ｂ）−Ｄｅｘおよび非複合体化抗ＥＧＦＲ１−Ｆａｂは、ＨＳＣ−２およびＦａＤｕ細胞によって最強の内在化を示した。ＦａＤｕ細胞による内在化は、ＨＳＣ−２細胞よりも一貫して弱く、細胞表面におけるより少量のＥＧＦＲ１受容体が原因である可能性が高い。対照ホウ素複合体（対照−Ｆａｂ−ＢＳＨ（８００Ｂ）−Ｄｅｘおよび対照−Ｆ（ａｂ’）２−ＢＳＨ（８００Ｂ）−Ｄｅｘ）および対応する非複合体化化合物は、非常に弱く内在化した。対照細胞株ＨＥＫは、ホウ素複合体および非複合体化化合物を非常に弱く内在化しただけであった。
表３．蛍光標識されたホウ素複合体（１２００Ｂまたは８００Ｂ）および非複合体化化合物のＨＳＣ−２、ＦａＤｕおよびＨＥＫ細胞による細胞表面結合および内在化。分析はフローサイトメトリーによって実行して蛍光強度はそれぞれの化合物のための標識度に正規化した。
放射標識された試料での内在化アッセイ
ＨＳＣ−２、ＦａＤｕおよびＨＥＫ細胞（２ｘ１０５）を、２４ウェルプレート上に播種して２４時間成長させた。次いで細胞を、５μｇ／ｍｌのトリチウム標識化合物を含有する３００μｌの培地中で＋３７℃で３時間インキュベートした。インキュベート後に培地を取り出して細胞をＰＢＳで３回洗い３００μｌの１Ｍ ＮａＯＨを加えることにより溶解した。培地および細胞溶解物中の放射能の量を、液体シンチレーションカクテル（Ｕｌｔｉｍａ Ｇｏｌｄ）の存在下でシンチレーションカウンターで測定した。内在化した化合物の量を、ウェルあたりの放射能の総量から計算して１０００００細胞に正規化した。
抗ＥＧＦＲ１−Ｆａｂおよび−Ｆ（ａｂ’）２ならびに非複合体化抗ＥＧＦＲ１−ｍＡｂのホウ素複合体（８００個のホウ素原子）を、トリチウムでタンパク質部分のリジン残基に標識した。放射標識化合物での内在化アッセイを、ヒトＨＮＣがん細胞株、ＨＳＣ−２およびＦａＤｕ、ならびに対照として細胞株ＨＥＫを用いて実行した。結果は、細胞が＋３７℃でインキュベートされた場合に生じる内在化に加えて細胞表面結合した化合物を示す。結果（表４）は、抗ＥＧＦＲ１−Ｆａｂおよび−Ｆ（ａｂ’）２のホウ素複合体が、ＨＳＣ−２およびＦａＤｕ細胞によって非複合体化抗ＥＧＦＲ１−ｍＡｂと同じ程度に効率よく内在化したことを示す。ＨＳＣ−２細胞による内在化は、ＦａＤｕ細胞によるよりも１００倍強く、ＨＳＣ−２細胞における細胞表面のより多量のＥＧＦＲ１受容体が原因である可能性が高い。対照細胞株ＨＥＫは、非常に弱い内在化を示しただけであった。
表４．放射標識されたホウ素複合体のＨＳＣ−２、ＦａＤｕおよびＨＥＫ細胞による内在化。内在化した化合物の量を、ウェルあたりの放射能の総量から計算して１０００００細胞に正規化した。結果は、３回の測定の平均＋／−標準偏差である。
実施例８．トリチウム標識された複合体でのＩｎ ｖｉｖｏ実験
液体シンチレーション計数法のためのマウス組織および血液試料の調製
重みづけしたマウス器官を、０．２ｇの組織当たり１ｍｌの組織可溶化剤（Ｓｏｌｖａｂｌｅ（商標）、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）に溶解した。試料を、＋６０℃で一晩インキュベートした。次いで３００μｌの溶解した器官当たり１５０μｌのＨ２Ｏ２を加えて試料を＋６０℃で１時間インキュベートした。骨を、最初に１Ｍ ＨＣｌで＋６０℃で一晩、次いでＳｏｌｖａｂｌｅおよびＨ２Ｏ２で処理した。器官中の放射能の量を、液体シンチレーションカクテル（Ｕｌｔｉｍａ Ｇｏｌｄ（商標）、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）の存在下でシンチレーションカウンターで測定した。データは、組織のｇにおける総注入量のパーセントとして表わされる。結果は、３匹のマウスの平均＋／−標準誤差である。マウスのそれぞれが２つの腫瘍を有するので、腫瘍における結果は、６回の測定の平均＋／−標準誤差である。
クリアランス試験における血液試料を、エッペンドルフチューブに集めて１００μｌのＳｏｌｖａｂｌｅを追加して＋６０℃で一晩インキュベートした後に体積を測定した。次いで１００μｌのＨ２Ｏ２を加えて試料を＋６０℃で１時間インキュベートした。血液試料中の放射能の量を、液体シンチレーションカクテル（Ｕｌｔｉｍａ Ｇｏｌｄ、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）の存在下でシンチレーションカウンターで測定した。データは、総注入量のパーセントとして表わされる。結果は、２匹のマウスの平均である。
非腫瘍マウスにおけるホウ素複合体の血液クリアランス
同齢の成体雌マウス（Ｈａｒｌａｎ ＨＳＤ：Ａｔｈｙｍｉｃ ｎｕｄｅ Ｆｏｘｎ１ｎｕ）を使用した。８００Ｂおよび３００Ｂホウ素添加を有する抗ＥＧＦＲ１−Ｆａｂおよび−Ｆ（ａｂ’）２の放射標識された（３Ｈ）ホウ素複合体を、１００μｌのＰＢＳ中で尾静脈を介して静脈内に注入した。注入量は、マウス当たり３０μｇ＝１．３〜２ｘ１０６ｃｐｍでありかつ試料当たり２匹のマウスを用いた。注入の前後に異なる時点で約１０μｌの血液試料を採取して放射能を計数した。実験の終わり（４８時間）にマウスをと殺して器官を採取し複合体の組織体内分布の測定のために放射能を計数した。
非腫瘍マウスにおける血液クリアランス試験を、８００Ｂおよび３００Ｂホウ素添加を有する抗ＥＧＦＲ１−Ｆａｂおよび−Ｆ（ａｂ’）２の３Ｈ標識されたホウ素複合体を用いて実行した。ホウ素添加が血液循環からの複合体のクリアランス率への影響を有するかどうかを見るために２つの異なるホウ素添加を用いた。結果は、ホウ素複合体の血液クリアランスが高速でありホウ素添加と無関係であることを示す（表５）。クリアランス率は、対応する非複合体化Ｆ（ａｂ’）２およびＦａｂフラグメントのクリアランスと同等であった（図示せず）。組織分布調査は、ホウ素複合体が４８時間でどの器官にも蓄積されていないことを示す（図示せず）。
表５．非腫瘍マウスにおけるホウ素複合体の血液クリアランス。結果は、２回の測定の平均である。時間は投与後の時間（分）であり値は総注入量の％である。
ＨＳＣ−２腫瘍マウスにおけるホウ素複合体の体内分布
同齢の成体雌マウス（Ｈａｒｌａｎ ＨＳＤ：Ａｔｈｙｍｉｃ ｎｕｄｅ Ｆｏｘｎ１ｎｕ）を使用した。ＥＭＥ−培地および５０％マトリゲル中の１５０μｌ中２５０万から３００万個のＨＳＣ−２細胞（ＪＣＲＰ細胞バンク、日本）を、ヌードマウスの両方の脇腹に接種した。マウス当たり少なくとも１つの腫瘍が少なくとも直径６ｍｍのサイズ（６〜１０ｍｍ）に成長して腫瘍体積がおおよそ１００〜５００ｍｍ３に相当した時に投薬した。抗ＥＧＦＲ１−Ｆａｂ／Ｆ（ａｂ’）２および対照−Ｆａｂ／Ｆ（ａｂ’）２の放射標識された（３Ｈ）ホウ素複合体（８００Ｂ）を、１００μｌのＰＢＳ中で尾静脈を介して静脈内に注入した。注入量は、マウス当たり５０μｇ＝１．３〜２．６ｘ１０６ｃｐｍでありかつ試料当たり３匹のマウスを用いた。異なる時点（２４時間、４８時間および７２時間）でマウスをと殺して器官を採取し複合体の組織体内分布の決定のために放射能を計数した。
ホウ素複合体の組織分布（表６）は、抗ＥＧＦＲ１−Ｆａｂおよび−Ｆ（ａｂ’）２のホウ素複合体が腫瘍内に蓄積したが任意の他の器官には蓄積せず、一方で対照ホウ素複合体は腫瘍内に有意には蓄積しなかったことを示す。抗ＥＧＦＲ１−Ｆａｂおよび−Ｆ（ａｂ’）２のホウ素複合体の腫瘍蓄積は、２４時間で最高であり、その後の時点（４８時間および７２時間）においてはゆっくり減少した。
表６．ＨＳＣ−２腫瘍マウスにおけるホウ素複合体の体内分布。結果は、６回の測定の平均＋／−標準誤差である腫瘍を除いて３回の測定の平均＋／−標準誤差を表わす。値は、総注入量／器官ｇの％である。
ＨＳＣ−２異種移植マウスにおけるホウ素複合体の腫瘍対血液の分布を、異なる時点（２４時間、４８時間および７２時間）において計算した（表７）。腫瘍／血液比は、抗ＥＧＦＲ１−Ｆａｂ複合体については４〜５であり、抗ＥＧＦＲ１−Ｆ（ａｂ’）２複合体については２〜６であった。抗ＥＧＦＲ１−Ｆａｂ−ＢＳＨ−Ｄｅｘは、抗ＥＧＦＲ１−Ｆ（ａｂ’）２−ＢＳＨ−Ｄｅｘ（４８時間）よりも早く最大比率に達した（２４時間）。対照複合体の腫瘍／血液比は、調査を通して一定のレベルのままであった（約１〜２）。
表７．ＨＳＣ−２腫瘍マウスにおけるホウ素複合体の腫瘍／血液分布。結果は、血液試料については３回の測定の平均に基づき腫瘍（マウス当たり２腫瘍）については３回の測定の平均に基づいて＋／−標準偏差したものである。
ＦａＤｕ腫瘍マウスにおけるホウ素複合体の体内分布
同齢の成体雌マウス （Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｃｒｌ：Ａｔｈｙｍｉｃ ｎｕｄｅ Ｆｏｘｎ１ｎｕ）を使用した。ＥＭＥ−培地および５０％マトリゲル中の１５０μｌ中３００万個のＦａＤｕ細胞（ＡＴＣＣ） を、ヌードマウスの両方の脇腹に接種した。マウス当たり少なくとも１つの腫瘍が少なくとも直径６ｍｍのサイズ（６〜１０ｍｍ）に成長して腫瘍体積がおおよそ１００〜５００ｍｍ３に相当した時に投薬した。抗ＥＧＦＲ１−Ｆａｂ／Ｆ（ａｂ’）２および対照−Ｆａｂ／Ｆ（ａｂ’）２の放射標識された（３Ｈ）ホウ素複合体（８００Ｂまたは１２００Ｂ）を、１００μｌのＰＢＳ中で尾静脈を介して静脈内に注入した。注入量は、マウス当たり５０μｇ＝２．３〜２．７ｘ１０６ｃｐｍでありかつ試料当たり３匹のマウスを用いた。異なる２時点（２４時間および４８時間）でマウスをと殺して器官を採取し複合体の組織体内分布の測定のために放射能を計数した。
ＦａＤｕ異種移植腫瘍マウスにおける体内分布調査を、抗ＥＧＦＲ１−Ｆ（ａｂ’）２−ＢＳＨ（８００Ｂ）−Ｄｅｘおよび抗ＥＧＦＲ１−Ｆａｂ（８００Ｂまたは１２００Ｂ）−ＢＳＨ−Ｄｅｘならびに対照−Ｆ（ａｂ’）２および−Ｆａｂのホウ素複合体（８００Ｂ）を用いて実行した。複合体を、タンパク質のリジン残基に放射標識（３Ｈ）した。腫瘍および血液を含めた、組織試料中の放射能を、異なる２時点（２４時間および４８時間）において計数した。ホウ素複合体の組織分布（表８）は、抗ＥＧＦＲ１−Ｆａｂおよび−Ｆ（ａｂ’）２のホウ素複合体が腫瘍内に蓄積したが任意の他の器官には有意には蓄積せず、一方で対照ホウ素複合体は腫瘍内に有意には蓄積しなかったことを示す。対照−Ｆ（ａｂ’）２−ＢＳＨ（８００Ｂ）−Ｄｅｘは、２４時間でまだ血液循環中および全ての器官中に見られ得るが、４８時間で循環から除去された。抗ＥＧＦＲ１−Ｆａｂおよび−Ｆ（ａｂ’）２のホウ素複合体の腫瘍蓄積は、２４時間で最高であり４８時間で減少した。
表８．ＦａＤｕ腫瘍マウスにおけるホウ素複合体の体内分布。結果は、６回の測定の平均＋／−標準誤差である腫瘍を除いて３回の測定の平均＋／−標準誤差を表わす。値は、総注入量／器官ｇの％である。
ＦａＤｕ異種移植マウスにおけるホウ素複合体の腫瘍対血液分布を、２４時間および４８時間において計算した（表９）。腫瘍／血液比は、１２００個のホウ素を有する抗ＥＧＦＲ１−Ｆａｂおよび−Ｆ（ａｂ’）２複合体について２４時間で約７であり、４８時間で標識タンパク質が分解されて細胞の外に分泌されたことを示唆する３〜４に比率が減少した。８００個のホウ素を有する抗ＥＧＦＲ１−Ｆａｂ複合体の腫瘍／血液比は、両方の時点において約４〜５であった。対照複合体の比は、一定のレベルのままであった（約１〜２）。
表９．ＦａＤｕ腫瘍マウスにおけるホウ素複合体の腫瘍／血液分布。結果は、血液試料については３回の測定の平均に基づき腫瘍（マウス当たり２腫瘍）については６回の測定の平均に基づいて＋／−標準偏差したものである。
実施例９．誘導結合プラズマ質量分析法（ＩＣＰ−ＭＳ）によるＢＳＨ−デキストラン中のホウ素の定量（ＢＳＨ−デキストラン１モル当たりのホウ素のモル数）
ＢＳＨ−デキストランのホウ素添加をＢＳＨ−デキストランのプロトン−ＮＭＲスペクトルから概算して（図１）試料中のホウ素の量を定量するためにＩＣＰ−ＭＳを用いた。本実施例において分析したＢＳＨ−デキストラン試料は、ＮＭＲ分析に基づいて約１２００個のホウ素を含有すると概算された。約２．１μｇ（０．０２２８ｎｍｏｌ）のＢＳＨ−デキストラン（平均分子量９２ｋＤａ）を、基本的にはＬａａｋｓｏら、２００１年、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４７、１７９６〜１８０３に記載のようにマイクロ波アシスト湿式灰化で液化してＩＣＰ−ＭＳによって分析した。異なる希釈の試料は、ＩＣＰ−ＭＳによって分析してバックグラウンドホウ素を試料から引いた。７回の測定の平均を表している結果は、試料が約０．３４１μｇ（３１．５ｎｍｏｌ）のホウ素原子を含有する、または１モルのＢＳＨ−デキストランが１３８１モルのホウ素原子を含有することを示す。
実施例１０．Ｉｎ ｖｉｖｏ実験およびホウ素定量
同齢の成体雌マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｃｒｌ：Ａｔｈｙｍｉｃ ｎｕｄｅ Ｆｏｘｎ１ｎｕ）を使用した。ＥＭＥ−培地および５０％マトリゲル中の１５０μｌ中２３０万個のＨＳＣ−２または５００万個のＦａＤｕ細胞を、ヌードマウスの右脇腹に接種した。腫瘍が少なくとも直径６ｍｍのサイズ（６〜１０ｍｍ）に成長して腫瘍体積がおおよそ１００〜５００ｍｍ３に相当した時に投薬した。抗−ＥＧＦＲ−Ｆａｂ−ＢＳＨ（１２００）−ｄｅｘまたは抗−ＥＧＦＲ−Ｆ（ａｂ’）２−ＢＳＨ（１２００）−ｄｅｘ（共に非標識）複合体を、１００μｌのＰＢＳ中で尾静脈を介して静脈内に注入した。注入量は、マウス当たり５０μｇまたは２５０μｇでありかつ試料当たり３匹のマウスを用いた。マウスを２４時間および４８時間でと殺してホウ素測定のために器官を採取した。
マイクロ波加熱炉（Ｍｉｌｅｓｔｏｎｅ、ＥＴＨＯＳ １２００）内の密閉されたテフロン（登録商標）容器中で組織試料（血液を含む）を消化した。消化温度は２００Ｃであり消化の継続時間は５０分であった。消化において用いた酸は、ＨＮＯ３（６．０ｍｌ、Ｅ． Ｍｅｒｃｋ、Ｓｕｐｒａｐｕｒ）であった。冷却後に反応生成溶液を、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水で２５ｍｌに希釈した。消化した試料をＩＣＰ−ＭＳ分析のために１％ＨＮＯ３でさらに希釈した（１：１０または１：５０）。試料に内部標準ベリリウムを加えて試料中の最終濃度である、１０ｐｐｂのＢｅを得た。分析のためにＳｐｅｃｔｒａｓｃａｎの単一元素標準溶液（Ｈ２Ｏ中にＨ３ＢＯ３として１０００ｕｇ／ｍｌのホウ素）から１、５、１０および２０μｇ／Ｌ濃度の標準溶液を希釈した。分析のための対照試料を、ＳＰＥＸ（ＣＬＭＳ−４）による多元素混合標準液から調製した。分析は、高分解能セクターフィールド誘導結合プラズマ質量分析計（ＨＲ−ＩＣＰ−ＭＳ、Ｅｌｅｍｅｎｔ２、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で行った。希釈試料中のホウ素の濃度は、低分解能（Ｒ≒３００）および中分解能（Ｒ≒４０００）モードの両方で１０Ｂおよび１１Ｂのピークから規定した。試料間で試料導入系を、最初に５％ＨＮＯ３で次いで１％ＨＮＯ３で洗ってホウ素に典型的な記憶効果を排除した。
２４時間における２つのＨＳＣ−２腫瘍マウスの最初のホウ素分析は、筋肉当たりのホウ素腫瘍比が５．３および６．３であったことを示す。
血液からの最初のホウ素測定は非決定的または検出限界を超えたので血液の代わりに筋肉を対照組織として用いた。
実施例１１．１４Ｃ標識抗ＥＧＦＲ１ Ｆａｂ ＢＳＨ−デキストランでのＩｎ ｖｉｖｏ実験
抗ＥＧＦＲ１ Ｆａｂ ＢＳＨ−デキストランの調製
ＢＳＨ−デキストランを、それぞれ実施例１および２に記載のように調製した。ＮＭＲ分析によるとＢＳＨ−デキストランは約６５０個のホウ素を含有した。酸化は、実施例３に記載の通りであるが２回分において行い、一方は５０ｍｇで他方は１００ｍｇのＢＳＨ−デキストランであった。
抗ＥＧＦＲ１ Ｆａｂフラグメントを、実施例５に記載のようにパパイン消化によって調製した。複合体化反応を実施例４の通りであるが、４回分において実行し、１）２９ｍｇの酸化ＢＳＨ−デキストランおよび１０．４ｍｇの抗ＥＧＦＲ１ Ｆａｂ、２）１６．５ｍｇの酸化ＢＳＨ−デキストランおよび５．９ｍｇの抗ＥＧＦＲ１ Ｆａｂ、３）５０ｍｇの酸化ＢＳＨ−デキストランおよび１９．８ｍｇの抗ＥＧＦＲ１ Ｆａｂ、４）５０ｍｇの酸化ＢＳＨ−デキストランおよび１９．７ｍｇの抗ＥＧＦＲ１ Ｆａｂで合わせて５５．８ｍｇの抗ＥＧＦＲ１ Ｆａｂを得た。全てを、実施例６におけるようにＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて分析してそれぞれの試料をＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８−ＮＨＳで標識した。Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８標識分子での内在化アッセイを、実施例７に記載のようにＨＳＣ−２細胞で実行した。
非標識Ｆａｂ−ＢＳＨ−デキストラン回分を組み合わせて３９ｍｇの抗ＥＧＦＲ１ Ｆａｂ ＢＳＨ−デキストランを得た。試料緩衝液を、非標識と１４Ｃ標識の抗ＥＧＦＲ１ Ｆａｂ ＢＳＨ−デキストランとを組み合わせることおよびそれに続くろ過滅菌法に先だってＰＢＳ中５％マンニトール−０．１％Ｔｗｅｅｎ８０に交換した。
１４Ｃ標識抗ＥＧＦＲ１ Ｆａｂ ＢＳＨ−デキストランの調製
３ｍｇのＦａｂ−ＢＳＨ−デキストラン（エタノールアミンキャッピング前）を、（実施例４におけるように）ＮａＣＮＢＨ３を含有するＰＢＳ中６６μＣｉ の１４Ｃ−エタノールアミン（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｉｎｃ．）で一晩インキュベートによって１４Ｃ標識してその後２時間キャッピングを非放射性エタノールアミンで終了して、実施例４に記載のように低分子量試薬を除去した。本反応は、９．２１μＣｉの放射能を含有する１４Ｃ標識抗ＥＧＦＲ１ Ｆａｂ ＢＳＨ−デキストランを生じた。
動物試験用に１４Ｃ標識抗ＥＧＦＲ１ Ｆａｂ ＢＳＨデキストランを、非標識「冷」抗ＥＧＦＲ１ Ｆａｂ ＢＳＨデキストランと表１０に示す分量で混合した。
表１０．試験物質の調製
１４Ｃ標識抗ＥＧＦＲ１ Ｆａｂ ＢＳＨ−デキストランでのＩｎ ｖｉｖｏ実験
異種移植マウスを、ＨＳＣ−２細胞を右脇腹に接種して腫瘍が少なくとも直径８ｍｍのサイズ（８〜１２ｍｍ）に成長して腫瘍体積がおおよそ２００〜８００ｍｍ３に相当する時に投薬したことを除いて実施例８に記載のように生成した。放射標識された（１４Ｃ）抗ＥＧＦＲ１−Ｆａｂホウ素複合体を、５％マンニトールおよび０．１％ポリソルベートを含有する１００μｌのＰＢＳ中で尾静脈を介して静脈内にまたは腫瘍内投与（グループＸ）のいずれかによって注入した（調査グループは表１０に示す）。試料当たり３匹のマウスを用いた。それぞれのマウスに、約４０００００ｃｐｍの複合体を投与した（上記の動物試験用の抗ＥＧＦＲ１ Ｆａｂ ＢＳＨデキストラン複合体の調製、表１０を参照）。２４時間または４８時間でマウスをと殺して（グループＩＸ）器官を採取し複合体の組織体内分布の測定のために放射能を計数した。血液試料も、ホウ素複合体の投与後３０分、２時間、および８時間で採取した。
組織を、１４Ｃ定量用に実施例８に記載のように調製した。クリアランス試験における血液試料は、２００μｌのＳｏｌｖａｂｌｅおよび９０μｌのＨ２Ｏ２を用いたことを除いて実施例８におけるように調製した。結果は、３匹のマウスの平均である。
表１１は、１４Ｃ標識抗ＥＧＦＲ１ Ｆａｂデキストラン複合体を投与したマウスについての血液に対する腫瘍の比を示す。
表１１．ＨＳＣ−２腫瘍マウスにおける１４Ｃホウ素複合体の腫瘍／血液比。血液中の放射能は０％であると判定されたので（全ての血液試料がバックグラウンドレベルの差し引き後に陰性であった）Ｇ ＩＸについての値は腫瘍／脳比である。グループＩ：２５０μｇ、グループＩＩ：５００μｇ、グループＩＩＩ：１０００μｇ、グループＩＶ：１５００μｇ、グループＶ：２０００μｇ、グループＸ：２５０μｇ、グループＶＩＩＩ：２５０μｇ＋２時間後２５０μｇ、およびグループＩＸ：２５０μｇ＋２４時間２５０μｇ。グループＸの腫瘍内投与を除いた全てのグループは静脈内投与。器官はグループＩＸの４８時間を除き２４時間で採取。グループＶＩＩＩの腫瘍／血液比は１匹のマウスからである（グループ中の１つの血液ｃｐｍ値の存在によるもの）。
表１２．３つのグループにおける１４Ｃホウ素複合体の血液クリアランス。左列は投与後時間（分／時間）を示し値は総注入量／血液ｇの％である。
実施例１２．直接ホウ素定量による抗ＥＧＦＲ１ Ｆａｂ ＢＳＨ−デキストランでのＩｎ ｖｉｖｏ実験
抗ＥＧＦＲ１ Ｆａｂ ＢＳＨ−デキストランの調製
抗ＥＧＦＲ１ Ｆａｂ ＢＳＨ−デキストランを、それぞれ実施例１および２に記載のように調製した。実施例３に記載のように酸化を行ったが２回分で行い、一方は８０ｍｇ、他方は９６ｍｇのＢＳＨ−デキストランであった。ＮＭＲ分析によるとＢＳＨ−デキストラン試料は、それぞれ約８８０個および５００個のホウ素を含有した。
抗ＥＧＦＲ１ Ｆａｂフラグメントを、実施例５に記載のようにパパイン消化により調製した。複合体化反応は、実施例４におけるように実行したが、４回分であり、２回分は１５．７ｍｇの抗ＥＧＦＲ１ Ｆａｂおよび４０ｍｇのｏｘ−ＢＳＨ−デキストラン、他の２回分は１８．８ｍｇの抗ＥＧＦＲ１ Ｆａｂおよび４８ｍｇのｏｘ−ＢＳＨ−デキストランで行った。
全てのホウ素複合体を、実施例６におけるようにＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて分析してＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標） ４８８−ＮＨＳで標識した。ＨＳＣ−２細胞での内在化アッセイを、実施例７に記載のようにＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ標識分子で実行した。
試料緩衝液を、マウス試行試料の調製およびろ過滅菌に先だってＰＢＳ中５％マンニトール−０．１％Ｔｗｅｅｎ８０に交換した。
抗−ＥＧＦＲ Ｆａｂ ＢＳＨ−デキストランでのＩｎ ｖｉｖｏ実験
実施例１１におけるように異種移植マウスを生成した。抗−ＥＧＦＲ Ｆａｂ ＢＳＨ−デキストランを、１００μｌのマンニトール／Ｔｗｅｅｎ／ＰＢＳ溶液で静脈内にまたは４０μｌのマンニトール／Ｔｗｅｅｎ／ＰＢＳ溶液で腫瘍内（ｉ．ｔ．）に投与した。ｉ．ｔ．投与では単一の注入部位を通して針を腫瘍内に通過させ開扇法（ｆａｎｎｉｎｇ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）で動かして試験物質を腫瘍全体にくまなく分散させた。腫瘍のサイズおよび形状に応じて、合計で３または４通過を用いた。
器官は２４時間で採取し血液試料は３０分、２時間、および８時間で採取した（調査グループＩＩおよびＶ）。
ホウ素の定量
上述のようにＩＣＰ−ＭＳによる直接ホウ素定量のために組織を調製した。約１５０ｍｇのＮＩＳＴ参照標準１５７３トマト葉を含有する３種の対照試料も消化した。消化した試料を、１：１０または１：１００に希釈した。
表１３は、選択された器官中のホウ素を例示し表１４は、腫瘍の血液に対する比率を示す。腫瘍内投与は、静脈内投与と比較して著しく高い腫瘍ホウ素濃度を示す。
表１３．ホウ定量によるＨＳＣ−２腫瘍マウスにおける抗ＥＧＦＲ１ Ｆａｂ ＢＳＨ−デキストラン複合体の体内分布。結果は、４回の測定の平均＋／−標準誤差を表す。調査グループは、グループＩ：緩衝液のみ（マンニトール／Ｔｗｅｅｎ／ＰＢＳ）静脈内、グループＩＩ：２ｍｇ静脈内、グループＩＩＩ：２ｍｇ＋デキストラン静脈内、グループＩＶ：２５０μｇ腫瘍内、グループＶ：２ｍｇ腫瘍内であった。値は、器官ｇ中のホウ素μｇである。スチューデントのｔ検定を、グループＩＩ対ＩＩＩおよびグループＩＶ対Ｖの腫瘍ホウ素値について（Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａ １２ソフトウェア［ＳｔａｔＳｏｆｔ］を用いて）実行した。グループＩＶおよびＶは、ホウ素量間で有意差を示した（ｐ値＝０．００９）。
表１４．腫瘍対血液比＋／−ＳＥＭ。
実施例１３．大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における抗ＥＧＦＲ１ Ｆａｂの産生
抗ＥＧＦＲ１ Ｆａｂのペリプラズム分泌のためのシグナルペプチドの最適化
抗ＥＧＦＲ１ Ｆａｂのための発現戦略は、安定なジスルフィド架橋が形成され得るペリプラズムを標的とした。
市販のベクターセットｐＤＤ４４１−ＳＳＫＴ（Ｔ５プロモーター、カナマイシン選択）を、シグナルペプチドの最適化のために用いた。以下のシグナルペプチド、ｉ）ＭａｌＥ（マルトース結合タンパク質）、ｉｉ）ｐｅｌＢ（ペクチン酸リアーゼ）、ｉｉｉ）ｏｍｐＡ（外膜プロテインＡ）、ｉｖ）ｐｈｏＡ（細菌性アルカリホスファターゼ）およびｖ）ｇＩＩＩ（ＰＲＶエンベロープ糖タンパク質）を使用した。ベクターｐＧＦ１１５〜ｐＧＦ１１９は、合成ＤＮＡ配列、高忠実度ポリメラーゼを有するＰＣＲ増幅およびルーチンツールとしてシームレスなギブソンアセンブリを用いることによって構築した。加えて、Ｃａｒｔｅｒら１９９２：Ｈｉｇｈ ｌｅｖｅｌ Ｅ．ｃｏｌｉ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｂｉｖａｌｅｎｔ ｈｕｍａｎｉｚｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｆｒａｇｍｅｎｔ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｎ Ｙ）、１０（２）１６３〜７に従って重鎖および軽鎖の両方のためにシグナルペプチドｓｔＩＩ（耐熱性エンテロトキシンＩＩ）を有するベクターｐＧＦ１５０を構築した。ベクターｐＧＦ１５０は、ジシストロニックであり発現のためのＴ７プロモーターを有した。抗ＥＧＦＲ１ Ｆａｂのための発現カセットは、重鎖と軽鎖との間の内部リボソーム結合部位を有するジシストロニックであった。シグナルペプチド最適化のための一般的な発現ベクター構成を、図５に例示する。ベクターｐＧＦ１１５〜ｐＧＦ１１９におけるシグナルペプチドの組み合わせを表１５に示す。
表１５．ベクターｐＧＦ１１５〜ｐＧＦ１１９におけるシグナルペプチドの組み合わせ。
ベクターｐＧＦ１１５〜ｐＧＦ１１９を、製造業者の説明に従ってプログラムＥｃ２でパルス出力したＢｉｏｒａｄ ＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒを用いてＥ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０エレクトロコンピテント（ＡＴＣＣ ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）細胞に形質転換した。形質転換を、ＬＢ＋アガー＋カナマイシン２５ｍｇ／Ｌに平板化して＋３７℃で一晩培養した。
単一のコロニーを、標準的プロトコールに従って発現スクリーニングにかけた。１日目に、一晩の前培養を、最終濃度２０ｍｇ／Ｌでカナマイシンを補った５ｍｌの液体ＬＢに接種し、２２０ｒｐｍで振動させた状態で＋３７°で培養した。２日目に、２００μＬの一晩の前培養を、１０ｍＬの液体ＬＢ＋カナマイシン１０ｍｇ／Ｌに再接種した。培養を、ＯＤ６００がレベル０．６〜０．９に達するまで＋３７°で２２０ｒｐｍで振動させ続けた。Ｆａｂ産生をＩＰＴＧで誘導し、最終濃度５００μＭであった。培養を、＋２０℃で、２２０ｒｐｍで一晩振動させ続けた。１ｍＬの試料を、誘導後４時間および一晩の時点から採取した。細胞を、遠心分離８０００ｘＧで１０分によって採取し、上清を廃棄し、ペレットを１００μｌの１０ｘＴＥ ｐＨ７．５（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ）に再懸濁させた。試料を、室温で勢いよく１時間ボルテックスし、１６０００ｘＧで１０分造粒して上清（ｓｕｐ）をペリプラズム抽出物として新しいエッペンドルフチューブに採取した。
ペリプラズム抽出物を、ウエスタンブロットでさらに分析した。１００μｌの抽出物を、２０μｌの還元または非還元添加液のいずれかと混合した。２０μｌの混合物を、４〜２０％のＰｒｅｃｉｓｅ Ｔｒｉｓ−Ｇｌｙｃｉｎｅ ＳＤＳ−Ｐａｇｅゲル（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に添加した。ゲルを、１ｘＬａｅｍｍｌｉ泳動緩衝液（ｒｕｎｎｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ）中で２００Ｖで約４５分実行してＴｒｉｓ−Ｇｌｙｃｉｎｅブロッティング緩衝液中のニトロセルロース膜に３５０ｍＡで約４５分ブロットした。ＳＤＳ−ＰａｇｅおよびブロッティングのためにＢｉｏＲａｄ Ｍｉｎｉ−ｐｒｏｔｅａｎ系を用いた。ブロットした膜を、ＰＢＳ中の１％ＢＳＡでブロックした。ペルオキシダーゼ複合体（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ａ０２９３）およびＬｕｍｉｎａｔａ Ｆｏｒｔｅ Ｗｅｓｔｅｒｎ ＨＲＰ基質（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、カタログ番号ＷＢＬＵＦ０５００）と共に抗−ヒトＩｇＧ（Ｆａｂ特異的）で検出を行った。化学発光反応を、富士フィルムＬｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｉｍａｇｅ Ａｎａｌｙｚｅｒ ＬＡＳ４０００で検出した。
いくつかの発現培養からのウエスタンブロット分析によると、ベクターｐＧＦ１１９およびｐＧＦ１１５は、他よりも良好であるように見えた。ペリプラズムに産生されたＦａｂの量は保ったが、しかしながら、これらの初期実験における０．３〜０．８ｍｇ／Ｌのレベルであった。ベクターｐＧＦ１１９において用いた組み合わせ（ＨＣのためにｏｍｐＡシグナルペプチドおよびＬＣのためにｐｅｌＢシグナルペプチド）を、継続のために選択した。
抗ＥＧＦＲ１ Ｆａｂの重鎖および軽鎖両方を標的とするペリプラズムのためにＴ７プロモーターおよびシグナル配列ｓｔＩＩを有するベクターｐＧＦ１５０を、株ＢＬ２１（Ｄｅ３）に形質転換した。他と比較すると、これは、ベクターｐＧＦ１１９において用いられる場合、少なくとも軽鎖のためのｐｅｌＢおよび重鎖のためのｏｍｐＡと同様に良好に見えた。
Ｆａｂ発現のためのプロモーターの最適化
３つの異なるプロモーター（ＩＰＴＧ−誘導性のＴ５、ＩＰＴＧ−誘導性のＴ７およびラムノース誘導性のＲｈａｍ）を、予備スクリーニングにおいて用いた。市販のベクターｐＥＴ−１５ｂ、ｐＤ４４１およびｐＤ８８１由来のプロモーター配列である。ＨＣのためにシグナルペプチドｏｍｐＡおよびＬＣのためにｐｅｌＢを用いた。発現カセットを、ジシストロニックな方法（それぞれのベクターにおける重鎖と軽鎖との間の内部リボソーム結合部位ｔａａＧＧＡＴＣＣＧＡＡＴＴＣＡＡＧＧＡＧＡＴＡＡＡＡＡａｔｇ（配列番号２２））で構築した。ベクターコードおよびプロモーターを表１６に示す。
表１６．Ｆａｂ発現のためのプロモーター系の最適化、使用したベクターおよびプロモーター。
ｐＧＦ１１９およびｐＧＦ１３２を、上述のようにＥ．ｃｏｌｉ株Ｗ３１１０に電気穿孔した。Ｔ７プロモーターベクターｐＧＦ１２１を、供給業者によって提供されたヒートショックプロトコールに従ってＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（Ｄｅ３）ケミカルコンピテント細胞（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）に形質転換した。ペリプラズム抽出物の発現培養、試料調製および分析を、上述のように行った。第１の比較は、株Ｗ３１１０ ｐＧＦ１１９とＢＬ２１（Ｄｅ３） ｐＧＦ１２１との間で行った。ペリプラズム抽出物を、１０ＸＴＥ緩衝液および０．０５％デオキシコール酸塩緩衝液で並行して作成した。
図６において例証されるように、Ｔ７プロモーターはＴ５プロモーターよりもわずかに優れていたが、注目するほどの差ではなかった。それでもＷ３１１０ ｐＧＦ１１９およびＢＬ２１（Ｄｅ３） ｐＧＦ１２１株での繰り返し実験は、ＢＬ２１（Ｄｅ３） ｐＧＦ１２１を用いた発現培養がＷ３１１０ ｐＧＦ１１９よりも安定で再現性があることを明らかにした。Ｗ３１１０ ｐＧＦ１１９を用いるよりもより速い成長速度および高い細胞密度が、ＢＬ２１（Ｄｅ３） ｐＧＦ１２１を用いて達成された（データは示さず）。
プロモータースクリーニングにおける第２のステップは、Ｗ３１１０ ｐＧＦ１３２（ラムノース誘導性のプロモーター）を用いた小規模培養からの予備発現レベルを分析することであった。ラムノース誘導プロモーターの利点の１つは、ラムノース濃度を変化させることによって発現レベルを微調整し得ることである。対象の幾つかのタンパク質で、より低い発現レベルが、実際には標的タンパク質の正確なフォールディングおよび集合ならびに産生株のより高い細胞密度が理由でより高い全体的な力価に繋がった。そのことからラムノースの濃度を増加して１０ｍｌの液体ＬＢ培養（０、０．２５ｍＭ、１ｍＭ、４ｍＭおよび８ｍＭ）で平行して誘導を行った。３つの異なる誘導後温度（＋２０℃、＋２８℃および＋３７℃）を用いた。１ｍｌの試料を、誘導後４時間の時点で採取した。試料採取、ペリプラズムの抽出および分析を、実施例１に記載のように行った。
図７に示すように、ラムノース誘導性のプロモーターでの発現レベルは、ＢＬ２１（Ｄｅ３） ｐＧＦ１２１（Ｔ７プロモーター）で達成されるレベルより低いままであった。ラムノースの濃度を増加することでのプロモーター制御は、＋２０℃で最も機能的であった。それでも、ラムノース系での最高力価は、＋２８℃において達成された。
上述の繰り返し実験に基づいて、ＢＬ２１（Ｄｅ３）およびＴ７プロモーター系を、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における抗ＥＧＦＲ１ Ｆａｂの産生のための基本プラットフォームとして選択した。
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞における発現のための抗ＥＧＦＲ１ Ｆａｂのコドン最適化
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のための異なるコドン最適化パターンを有する３つのＨＣ／ＬＣ配列および当初ＣＨＯ細胞のために最適化した１つのＨＣ／ＬＣ配列を試験した。ベクターを、ｐＧＦ１１９に関して述べたようにジシストロニックな方法およびＴ５プロモーター駆動の発現で構築した。発現宿主は、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０であった。ペリプラズム抽出物の小規模培養、試料採取および分析を、上述のように行った。ベクターｐＧＦ１１９における配列を、ベースラインレベルとして選択した。コドン最適化パターンは、発現レベルに劇的影響を与えた（表１７）。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）変種２（ｐＧＦ１２８）およびＣＨＯ細胞最適化（ｐＧＦ１２６）配列は、Ｗ３１１０宿主株において作用せず、ウエスタンブロットによって発現培養から微量のＦａｂが検出されたのみであった。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）変種３（ｐＧＦ１２９）で達成された発現レベルは、有意により良好であったが、やはりベースラインレベルと同様であった。ベクターのほとんどが既に大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）変種１（ｐＧＦ１１９）で作成されていたためおよびコドン最適化パターンを変更することによりベースラインと比較して改善が無かったため、ベクターｐＧＦ１１９からの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）変種１配列（配列番号１０および配列番号１１）を、使用のために選択した。
表１７．異なるコドン最適化パターンを有する抗ＥＧＦＲ１ Ｆａｂコード配列を試験。ベクターのコーディングおよび結果。
ジシストロニックをデュアルプロモーターベクター構成と比較
ジシストロニックなベクター構成において、リボソーム結合部位を含めた、重鎖と軽鎖との間のスペーサー配列は、比較的短く、ｐＧＦ１１９において２５ヌクレオチドだけである。重鎖と軽鎖との間のこのスペースを拡大するために、鎖の両方とも別々のＴ５またはＴ７プロモーターの対照の下でそれぞれ発現した、ベクターｐＧＦ１２０およびｐＧＦ１３１を構築した。ベクターを、ジシストロニックなベクターｐＧＦ１２１上の既存の配列を利用することにより構築した。完成したら、ｐＧＦ１２０をＷ３１１０株に電気穿孔してｐＧＦ１３１をＢＬ２１（Ｄｅ３）およびＬｅｍｏ２１（Ｄｅ３）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ケミカルコンピテント細胞に形質転換した。上記のように小規模発現試験を行ってジシストロニックとデュアルプロモーターベクターとの間の比較を行った（ｐＧＦ１１９対ｐＧＦ１２０、ｐＧＦ１２１対ｐＧＦ１３１）。
図８において実証されるように、デュアルＴ５プロモーターは、明らかにジシストロニック構成よりも抗ＥＧＦＲ１ Ｆａｂ産生について効率的であった。Ｔ７プロモーターを用いると、差は明白ではなかったが、ジシストロニックな構成を用いるよりも大量の非集合Ｆａｂ鎖がデュアルプロモーター系で存在したことが分かった。計画した次の最適化ステップは、シャペロンヘルパープラスミドを発現株に適用して正確なフォールディングおよび集合を促進することであった。継続のためにＴ７プロモーター（ベクターｐＧＦ１３１）を有するデュアルプロモーター構成を選択した。
シャペロンヘルパープラスミドの構築
Ｆａｂ発現を増大するために、ベクターｐＧＦ１３１での共発現のためのペリプラズムおよび細胞質のシャペロンを選択した。シャペロンヘルパープラスミドのための主鎖ベクターとして、ｐＣＤＦ−１ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ）を選択した。ｐＣＤＦ−１ｂは、Ｔ７プロモーター、ｌａｃオペレーター、ＣｌｏＤＦ１３由来の複製開始点の複製およびストレプトマイシン／スペクチノマイシン抗生物質耐性を有する。これはｐＥＴベクターとの共発現に適合し、かつその理由からｐＥＴ−１５ｂ主鎖を有するｐＧＦ１３３と一緒に発現させるのに適する。
シャペロン配列は、ＰＣＲおよび高忠実度ｐｈｕｓｉｏｎポリメラーゼ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ゲノムＤＮＡから増幅したＰＣＲであった。増幅したフラグメントを、従来の消化／連結クローニングおよびシームレスなギブソンアセンブリを利用してｐＣＤＦ−１ｂ主鎖にクローン化した。シャペロンヘルパープラスミドの構成を、表１８〜２０においてより詳細に記述する。５〜７。
表１８．シャペロンヘルパープラスミドｐＧＦ１３４、ｐＧＦ１３５、ｐＧＦ１３７、ｐＧＦ１３８のクローニング戦略。
表１９．シャペロンヘルパープラスミドの構築のために使用したプライマー配列。
表２０．使用したシャペロン。
ヘルパープラスミドでの抗ＥＧＦＲ１ Ｆａｂ共発現
ベクターｐＧＦ１３１を、製造業者の説明に従ってＢＬ２１（Ｄｅ３）およびＬｅｍｏ２１（Ｄｅ３）ケミカルコンピテント細胞に形質転換した。少数のクローンを選んで上述のように予備発現培養によって抗ＥＧＦＲ１ Ｆａｂの発現を確認した。最良のクローンを、シャペロンヘルパープラスミドでの共発現のためのバックグラウンドとして選択した。
ＢＬ２１（Ｄｅ３） ｐＧＦ１３１およびＬｅｍｏ２１（Ｄｅ３） ｐＧＦ１３１エレクトロコンピテント細胞を、下記のように構築した。５ｍｌの前培養を、カナマイシン２０ｍｇ／Ｌを補った液体ＬＢ中で一晩成長させた。２日目に、１ｍｌの前培養を、カナマイシン２０ｍｇ／Ｌを有する５０ｍｌの液体ＬＢに再接種した。培養を、ＯＤ６００がレベル０．５に達するまで＋３７℃、２２０ｒｐｍで約３時間継続した。細胞を、遠心分離、１０分間８０００ｘｇによって採取して１０ｍｌの１０％氷冷グリセロールに再懸濁させた。遠心分離による採取を繰り返し、その後５ｍｌの１０％氷冷グリセロールに再懸濁させた。細胞を、１０ｘ５００ｕｌのアリコートに分取して−８０℃で保管した。
シャペロンヘルパープラスミドｐＧＦ１３４およびｐＧＦ１３５を、ＢｉｏＲａｄ Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ、プログラムＥｃ２でＢＬ２１（Ｄｅ３）およびＬｅｍｏ２１（Ｄｅ３）株に電気穿孔した。混合物を、＋３７℃における短い前培養後にＬＢ＋ｋｍ＋ｓｔｒｅに平板化して平板を＋３７℃において一晩培養した。上記のように予備発現培養を行った。
図９において例証されるように、ＳＫＰシャペロンは、産生への明らかに有益な影響を有するが、発現プラスミドｐＧＦ１３１だけに宿るバックグラウンド株に対する差は、顕著ではなかった。それでも、シャペロンヘルパープラスミドでのクローンは、より早く成長してより高い細胞密度を達成する傾向があった。シャペロンヘルパープラスミドｐＧＦ１３４での培養も、より再現性があり安定であった。ペリプラズムのシャペロンヘルパープラスミドｐＧＦ４１３４（ＳＫＰシャペロン）とｐＧＦ１３５（ＳＫＰおよびＦｋｐＡシャペロン）との間には差が無かった。ヘルパープラスミドｐＧＦ１３８からの細胞質のシャペロンＤｎａＫ／Ｊ ＧｒｐＥの発現は、発現レベルをさらには改善しなかった。その理由からＬｅｍｏ２１（Ｄｅ３） ｐＧＦ１３１ ｐＧＦ１３４株およびＢＬ２１（Ｄｅ３） ｐＧＦ１３１ ｐＧＦ１３４株を、継続および発酵過程開発のために選択した。
抗ＥＧＦＲ一本鎖
シグナル配列ｏｍｐＡ（配列番号１３）を有する抗ＥＧＦＲ１ ＳｃＦｖのための発現ベクターｐＧＦ１５５を構築して高忠実度ポリメラーゼおよびギブソンアセンブリでｐＥＴ−１５ｂ主鎖にＰＣＲ増幅した。構築において、軽鎖可変領域および重鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドを、配列番号３０に記載される１５−ｍｅｒリンカー配列をコードするＧ４Ｓリンカー／スペーサー配列（配列番号２９）によって分離した。
ベクターｐＧＦ１５５を、単独またはシャペロンヘルパープラスミドとの組み合わせのいずれかでバックグラウンド株ＢＬ２１（Ｄｅ３）に形質転換して、発現レベルを１０ｍＬの予備培養に基づいて評価する。
発酵槽培養した大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株（ＢＬ２１［ＤＥ３］ｐＧＦ１３１ｐＧＦ１３４）における抗ＥＧＦＲ１ Ｆａｂ産生、酵母抽出物を補った培養。
接種
いくつかの（５〜８コロニー）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）コロニー（ＢＬ２１［ＤＥ３］ｐＧＦ１３１ｐＧＦ１３４）を、カナマイシン（２５ｍｇ／Ｌ）およびストレプトマイシン（３０ｍｇ／Ｌ）を補った５ｍｌの液体ＬＢ培地におけるＬＢ寒天平板から接種した。接種材料（第１の接種材料）を、＋３７℃、２２０ｒｐｍで、５時間インキュベートした。１ｍｌの第１の接種材料を用いて５００ｍｌの振とうフラスコ内でカナマイシン（２５ｍｇ／Ｌ）およびストレプトマイシン（３０ｍｇ／Ｌ）を補った１００ｍｌの接種材料培養培地（下記）を接種した（第２の接種材料）。第２の接種材料を、＋３７℃、２２０ｒｐｍで、＜１６時間インキュベートした。１０ｍｌの第２の接種材料を、５００ｍｌの振とうフラスコ内でカナマイシン（２５ｍｇ／Ｌ）およびストレプトマイシン（３０ｍｇ／Ｌ）を補った１００ｍｌの接種材料培養培地（下記）に移した（第３の接種材料）。第３の接種材料を、＋３７℃、２２０ｒｐｍでＯＤ６００約２．０が達成されるまでインキュベートしてこの接種材料を用いて発酵槽培養容器（２ｌ）内でカナマイシン（２５ｍｇ／Ｌ）およびストレプトマイシン（３０ｍｇ／Ｌ）を補った９００ｍｌの発酵槽回分培養培地（下記）を接種して１０００ｍｌの最終体積およびＯＤ６００値０．２を得た。
表２１．接種材料培養培地成分（ＦｅＣｌ３ｘ６Ｈ２ＯからＭｇＳＯ４ｘ７Ｈ２Ｏまで微量金属元素［ＴＭＥ］）。
表２２．発酵槽回分培養培地（ＦｅＣｌ３ｘ６Ｈ２ＯからＭｇＳＯ４ｘ７Ｈ２Ｏまで微量金属元素［ＴＭＥ］）。
発酵回分段階
発酵槽培養容器の接種後、Ｂｉｏｓｔａｔ（登録商標）Ｂ Ｐｌｕｓ Ｄｉｇｉｔａｌ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｕｎｉｔを用いて以下のパラメータを設定した：
−温度＋３７℃
−ｐＨ６．８（１２．５％ ＮＨ３、１５％ Ｈ３ＰＯ４）
−ｐＯ２（カスケードモード）＞２５％
−撹拌速度１５％〜７５％（＝３００ｒｐｍ〜１５００ｒｐｍ）
−気体流（空気）１３％〜５０％（＝０．４Ｌ〜１．５Ｌ）
発酵回分段階の約８．５時間の時点で、ＤＯＴ（溶存酸素圧）値が突然頂点に達してその結果撹拌スピードおよび気体流が減少した。これは、回分培養培地（２５ｇ／ｌ）中に存在するグルコースの枯渇および発酵回分段階の終わりを示した。ＯＤ６００値３１は、発酵回分段階中に達した。
発酵流加段階
ＦＳ（供給液）１．１（６７％Ｇｌｃ、２％ＭｇＳＯ４）を、発酵槽培養容器内に０．２４ｍＬ／分で６時間２０分注入した。このＦＳ１．１流加段階中にＯＤ６００値７０に達した。
ＦＳ１．２（５０％Ｇｌｃ、１．５％ＭｇＳＯ４、７．４ｇ／１００ｍＬの酵母抽出物、発酵槽回分培養培地と比較して１５倍のＴＭＥ［微量金属元素］濃度、０．３２ｇ／Ｌのチアミン）を、発酵槽培養容器に０．２４ｍＬ／分で７時間注入した。ＯＤ６００値１３４に達した。ここで１１時間４０分ポンプの速度を０．１３ｍＬ／分に減速した。ＯＤ６００値は、１３４から増加しなかった。酵母抽出物の補充無しで別の発酵槽運転も実行してこの発酵槽運転は下記の通りウエスタンブロッティング分析で見積もられるように約２０ｍｇ／Ｌの抗ＥＧＦＲ１ Ｆａｂを生じた。
流加段階中の培養懸濁液におけるグルコース濃度は、Ｋｅｔｏ−ｄｉａｂｕｒ−ｔｅｓｔ ５０００スティック（Ｒｏｃｈｅ、カタログ番号：１０６４７７０５１８７）を用いて製造業者の説明に従って観察した。
タンパク質合成の誘導
タンパク質合成のＩＰＴＧ誘導に先立って、培養温度を＋３７℃から＋２０℃に下げた。タンパク質合成のＩＰＴＧ誘導（最終ＩＰＴＧ濃度１ｍＭ）をＯＤ６００値８６において実行した。タンパク質合成の誘導は、１６時間実行した。
発酵ラウンド中の試料の回収
ウエスタンブロット分析用の試料（２Ｘ１ｍＬのペレット試料および２Ｘ１ｍＬの上清試料）を、異なる時点で回収した。誘導前試料を、タンパク質合成のＩＰＴＧ誘導の直前に取った。別の試料の組を、４時間の誘導時点で回収した。最後の試料の組を、培養採取の前に１６時間の誘導時点で回収した。細胞を、試料中で造粒して（＋４℃、５０００Ｘｇ、１５分）上清を新しいチューブに移した。試料を、ウエスタンブロット法を用いて分析するまで−２０℃で保管した。
細胞採取
発酵培養懸濁液を、Ｗａｔｓｏｎ Ｍａｒｌｏｗ ５０４Ｕ ０５６．３７６２．００ポンプを用いてＳＬＡ ３０００遠心分離チューブ（Ｓｏｒｖａｌｌ ＲＣ６）に回収して、遠心分離チューブを平衡させた。細胞を造粒して（＋４℃、５０００Ｘｇ、６０分）上清を破棄した。細胞ペレットを−２０℃で保管した。
ペリプラズム発現した抗ＥＧＦＲ１ Ｆａｂのウエスタンブロット分析
１ｍＬの発酵培養懸濁液に相当するペレット試料を、１ｍＬの１０ｘＴＥ ｐＨ７．５（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ）中に再懸濁させた。試料を、室温で２時間勢いよくボルテックスし、＋４℃、１２０００ｘｇで６０分間造粒して上清をペリプラズム抽出物として回収した。
ペリプラズム抽出物を、ウエスタンブロッティングでさらに分析した。１００μＬの抽出物を、２５μＬの非還元添加液と混合した。１２．５μＬの混合物を、４〜２０％のＰｒｅｃｉｓｅ Ｔｒｉｓ−Ｇｌｙｃｉｎｅ ＳＤＳ−Ｐａｇｅゲル（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に添加した。ゲルを、１ｘＬａｅｍｍｌｉ泳動緩衝液中で２００Ｖで約４５分動かしてＴｒｉｓ−Ｇｌｙｃｉｎｅブロッティング緩衝液中のニトロセルロース膜に３５０ｍＡで約１．５時間ブロットした。ＳＤＳ−ＰａｇｅおよびブロッティングのためにＢｉｏＲａｄ Ｍｉｎｉ−ｐｒｏｔｅａｎ系を用いた。ブロットした膜を、ＰＢＳ中の１％ＢＳＡでブロックした。ペルオキシダーゼ複合体（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ａ０２９３）およびＬｕｍｉｎａｔａ Ｆｏｒｔｅ Ｗｅｓｔｅｒｎ ＨＲＰ基質（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、カタログ番号ＷＢＬＵＦ０５００）と共に抗−ヒトＩｇＧ（Ｆａｂ特異的）で検出を行った。化学発光反応を、富士フィルムＬｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｉｍａｇｅ Ａｎａｌｙｚｅｒ ＬＡＳ４０００で検出した。
１０μＬのそれぞれの培養上清試料を、２．５μＬの非還元添加液と混合してこれらの試料をペリプラズム抽出物試料に関して上述のようにＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル中で実行してニトロセルロース膜上でブロットした。図１０に結果を示す。
Ｆａｂ精製
ろ過したペリプラズム抽出物の緩衝液を、５ｍｌの陽イオン交換カラム（ＨｉＴｒａｐ ＳＰ ＦＦ、 ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）による第１の精製ステップに先だってＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ １０Ｋ遠心ろ過器を用いて５０ｍＭ ＭＥＳ ｐＨ６に交換した。移動相Ａは５０ｍＭ ＭＥＳ ｐＨ６であり移動相Ｂは５０ｍＭ ＭＥＳ ｐＨ６＋５００ｍＭ ＮａＣｌであった。実施前に試料を１．２μｍの膜を通してろ過した。最初は、１０％試料をカラムに流速２．５ｍｌ／分で５分間注入し、その後流速を５ｍｌ／分に変更した。カラムを、相Ａの５７．５ｍｌで実行し、次いで３５ｍｌより多く０％Ｂから１００％Ｂの直線濃度勾配を適用した。２．５ｍｌの画分を回収して画分Ａ５〜Ａ９を貯蔵した。試料の残りを、上述のように２回の別々の運転において実行して画分Ａ５〜Ａ１０を貯蔵した（図１１）。パパイン消化した抗ＥＧＦＲ１ Ｆａｂを、対照として用いた。
貯蔵した画分（Ａ５〜Ａ１０）を、緩衝液を交換せずにプロテインＬカラム（１ｍｌ）に注入した。プロテインＬを、試料注入中は流速０．２ｍｌ／分でならびに洗浄および溶離中は１ｍｌ／分で実行した。移動相Ａは、ＰＢＳおよびＢは、０．１Ｍ クエン酸ナトリウム ｐＨ３であった。試料を、１００％Ｂで溶離した。鋭いピークで溶離したタンパク質（図１２）および画分Ａ５〜Ａ７を貯蔵して２Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ９で中和した。２つの精製ステップ後のＦａｂの収量は約４４ｍｇ／Ｌになると概算された。別の回分を、プロテインＬ精製のみにかけてこれはＦａｂ画分の約７２ｍｇ／Ｌを与えた。パパイン消化した抗ＥＧＦＲ１ Ｆａｂを、対照として用いた。
貯蔵した画分を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて分析した。プロテインＬカラムを用いたクロマトグラフの実行からのこれら３つの貯蔵した試料のそれぞれ２４μＬを、６μＬの還元添加液と混合してＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル中で実行した。ゲルを、クマシー系の染料で染色した（図１３）。
実施例１４．抗ＥＧＦＲ１ Ｆａｂおよび抗ＥＧＦＲ１ Ｆａｂ ＢＳＨ−デキストランのＥＧＦＲ１への結合
プロテインＡ精製した抗ＥＧＦＲ１産生ＣＨＯ細胞を、パパイン消化し、ＮＡｂ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ Ｐｌｕｓ Ｓｐｉｎカラムで精製して二分岐オリゴ糖および１つのＧｌｃＮＡｃ単位を残す高マンノースを非グリコシル化Ｆａｂフラグメントが得られるようにアスパラギンに開裂する組み換えＥｎｄｏ Ｆ２（Ｅｌｉｚａｂｅｔｈｋｉｎｇｉａ ｍｅｎｉｎｇｏｓｅｐｔｉｃｕｍ（Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍにおいて産生される））で処理した。１００ｍＵの酵素を約１ｍｇの抗ＥＧＦＲ１ Ｆａｂに加えて５０ｍＭ ＮａＡｃ ｐＨ４．５中で＋３７℃で一晩インキュベートした。
１００μｇの抗ＥＧＦＲ１ Ｆａｂおよび１００μｇの抗ＥＧＦＲ１ Ｆａｂ ＢＳＨ−デキストランを、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｃｙ３ ｍｏｎｏ−ｒｅａｃｔｉｖｅを用いて製造業者の説明に従ってＣｙ３標識してマイクロアレイ印刷に用いられるクエン酸／リン酸緩衝液ｐＨ７中で０．５ｍｇ／ｍｌの溶液を調製した。
６種の異なる分子のアレイ（ＨＥＲ２、ヒトＥＧＦＲ１、ＣＤ６４、ＣＤ１６ａ、ＨＳＡおよび抗デキストランＩｇＧ）を、アミン反応性のＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）で活性化したマイクロアレイスライド上に印刷した（それぞれの分子について４つの平行な点）。Ｃｙ３標識した抗ＥＧＦＲ１ Ｆａｂ ＢＳＨ−デキストラン複合体および抗ＥＧＦＲ１ Ｆａｂを、スライドの別々のウェル上で０．４ｎＭから９００ｎＭの範囲の８種の濃度でインキュベートした。非特異的な結合を、１０ｘ非複合体化ＢＳＨデキストランを用いて除去した。スライドの洗浄後にレーザースキャナーを用いて蛍光シグナルを検出した。それぞれの濃度点についての平均強度および標準偏差を、４つの平行なデータ点から計算した。Ｋｄ値を、データをラングミュア等温式：
Ｆ＝（Ｆｍａｘ［ｐ］）／（［ｐ］＋Ｋｄ）
（式中、Ｆ＝蛍光強度、Ｆｍａｘ＝飽和における最大強度、［ｐ］＝Ｃｙ３標識分子の濃度およびＫｄ＝解離定数）に適合させることにより決定した。
抗ＥＧＦＲ１ Ｆａｂ ＢＳＨ−デキストラン複合体は、解離定数約Ｋｄ＝９７ｎＭでＥＧＦＲ１に結合した。非複合体化Ｆａｂは、抗ＥＧＦＲ１ Ｆａｂ ＢＳＨデキストランと比較して約２倍高いＥＧＦＲ１への親和性を有する（図１４）。ＨＥＲ２、ＣＤ６４、ＣＤ１６ａ、ＨＳＡまたは抗デキストランＩｇＧに結合している抗ＥＧＦＲ１ Ｆａｂ ＢＳＨ−デキストランまたは非複合体化Ｆａｂは、検出限界以下であった。
技術の進歩に伴って本発明の基本的着想が種々の方法において実践され得ることは当業者に明らかである。本発明およびその実施形態はしたがって、上記の実施例には限定されず、むしろこれらは特許請求の範囲内で変更し得る。

Claims (21)

  1. 抗ＥＧＦＲ１抗体またはそのＥＧＦＲ１結合フラグメントおよび少なくとも１つのデキストラン誘導体を含む複合体であって、
    前記デキストラン誘導体は、少なくとも１つのＤ−グルコピラノシル単位の炭素２、３または４から選択される少なくとも１つの炭素が式
    −Ｏ−（ＣＨ２）ｎ−Ｓ−Ｂ１２Ｈ１１ ２−
    （式中、ｎは３から１０の範囲である）
    の置換基によって置換された、前記少なくとも１つのＤ−グルコピラノシル単位を含み、かつ
    前記デキストラン誘導体は、前記デキストラン誘導体のＤ−グルコピラノシル単位の酸化開裂によって形成される少なくとも１つのアルデヒド基と前記抗ＥＧＦＲ１抗体またはそのＥＧＦＲ１結合フラグメントのアミノ基との間の反応によって形成される結合を介して前記抗ＥＧＦＲ１抗体またはそのＥＧＦＲ１結合フラグメントに結合する、複合体。
  2. 前記デキストラン誘導体は、約３から約２０００ｋＤａ、または約３０から約３００ｋＤａの範囲の分子質量を有する、請求項１に記載の複合体。
  3. 前記複合体は、式−Ｏ−（ＣＨ２）ｎ−Ｓ−Ｂ１２Ｈ１１ ２−の約１０から約３００個の置換基または約２０から約１５０個の置換基を含む、請求項１または２に記載の複合体。
  4. 前記抗ＥＧＦＲ１抗体またはそのＥＧＦＲ１結合フラグメントのアミノ基は、前記抗ＥＧＦＲ１抗体またはそのＥＧＦＲ１結合フラグメントのリジン残基のアミノ基である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の複合体。
  5. 前記複合体は、前記デキストラン誘導体あるいは前記抗ＥＧＦＲ１抗体またはそのＥＧＦＲ１結合フラグメントに結合した少なくとも１つの追跡分子をさらに含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の複合体。
  6. 前記デキストラン誘導体は、前記デキストラン誘導体のＤ−グルコピラノシル単位の酸化開裂によって形成されるキャッピングされた少なくとも１つのアルデヒド基を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の複合体。
  7. 前記デキストラン誘導体が、前記デキストラン誘導体のＤ−グルコピラノシル単位の酸化開裂によって形成された複数のアルデヒド基を含み、かつ前記デキストラン誘導体の１つまたは複数のＤ−グルコピラノシル単位の酸化開裂によって形成された実質的に全ての前記アルデヒド基がキャッピングされている、請求項６に記載の複合体。
  8. ａ）デキストランの少なくとも１つのヒドロキシル基をアルケニル化してアルケニル化デキストランを取得するステップと、
    ｂ）ボロカプテイトナトリウム（ＢＳＨ）をステップａ）から得られる前記アルケニル化デキストランと反応させてＢＳＨ−デキストランを取得するステップと、
    ｃ）アルデヒド基が形成されるように前記ＢＳＨ−デキストランの少なくとも１つのＤ−グルコピラノシル残基を酸化的に開裂するステップと、
    ｄ）ステップｃ）から得られる前記酸化的に開裂されたＢＳＨ−デキストランを抗ＥＧＦＲ１抗体またはそのＥＧＦＲ１結合フラグメントと反応させて複合体を取得するステップと
    を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の複合体の製造方法。
  9. デキストランが、ステップａ）においてアルケニル化剤を用いてアルケニル化され、前記アルケニル化剤は式
    Ｘ−（ＣＨ２）ｍＣＨ＝ＣＨ２
    （式中、ｍは１から８の範囲であり、かつＸはＢｒ、ＣｌまたはＩである）
    に従う構造を有する、請求項８に記載の複合体の製造方法。
  10. ステップａ）から得られる前記アルケニル化デキストランの少なくとも１つのＤ−グルコピラノシル単位の炭素２、３または４から選択される少なくとも１つの炭素が、式
    −Ｏ−（ＣＨ２）ｍＣＨ＝ＣＨ２
    （式中、ｍは１から８の範囲である）、
    の置換基によって置換された、請求項８または９に記載の複合体の製造方法。
  11. ＢＳＨは、ステップｂ）において過硫酸アンモニウム、過硫酸カリウムおよびＵＶ光からなる群から選択されるラジカル開始剤の存在下でステップａ）から得られる前記アルケニル化デキストランと反応する、請求項８〜１０のいずれか一項に記載の複合体の製造方法。
  12. 前記ＢＳＨ−デキストランの前記少なくとも１つのＤ−グルコピラノシル残基が、ステップｃ）において過ヨウ素酸ナトリウム、過ヨウ素酸および酢酸鉛（ＩＶ）からなる群から選択される酸化剤を用いて酸化的に開裂される、請求項８〜１１のいずれか一項に記載の複合体の製造方法。
  13. 前記方法が、ステップｃ）から得られる前記酸化的に開裂したＢＳＨ−デキストランまたはステップｄ）から得られる前記複合体を追跡分子と反応させるステップをさらに含む、請求項８〜１２のいずれか一項に記載の複合体の製造方法。
  14. 前記方法が、ステップｃ）から得られる前記酸化的に開裂したＢＳＨ−デキストランまたはステップｄ）から得られる前記複合体の未反応のアルデヒド基をキャッピングするステップｅ）をさらに含む、請求項８〜１３のいずれか一項に記載の複合体の製造方法。
  15. 前記未反応のアルデヒド基が、エタノールアミン、リシン、グリシンまたはトリスなどの親水性のキャッピング剤を用いてキャッピングされる、請求項１４に記載の複合体。
  16. 前記デキストランが、約３から約２０００ｋＤａ、または約１０から約１００ｋＤａ、または約５から約２００ｋＤａ、または約１０から約２５０ｋＤａの範囲の分子質量を有する、請求項８〜１５のいずれか一項に記載の複合体の製造方法。
  17. 前記酸化的に開裂したＢＳＨ−デキストランは、前記酸化的に開裂したＢＳＨ−デキストランおよび前記抗ＥＧＦＲ１抗体またはそのＥＧＦＲ１結合フラグメントをステップｄ）において約６から８のｐＨを有する水性リン酸緩衝液中で室温においてインキュベートすることにより前記抗ＥＧＦＲ１抗体またはそのＥＧＦＲ１結合フラグメントと反応する、請求項８〜１６のいずれか一項に記載の複合体の製造方法。
  18. 請求項１〜７のいずれか一項に記載の複合体を含む、医薬組成物。
  19. 薬物として使用するための、請求項１〜７のいずれか一項に記載の複合体または請求項１８に記載の医薬組成物。
  20. がんの治療において使用するための、請求項１〜７のいずれか一項に記載の複合体または請求項１８に記載の医薬組成物。
  21. 前記がんは、頭頸部がんである、請求項２０に記載の使用のための複合体または医薬組成物。
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