CN112566669A - 生物素修饰二聚体与酞菁染料的缀合物 - Google Patents

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巽俊文
高桥和希
儿玉龙彦
田中十志也
山下雄史
杉山晓
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Abstract

本发明的课题在于提供：用于在光免疫疗法中使用的生物素修饰二聚体与酞菁染料的缀合物。根据本发明，提供下述式(1)所示的化合物或其盐与酞菁染料的缀合物。式中的各符号的含义如本说明书中所定义。
Figure DEST_PATH_IMAGE002

Description

生物素修饰二聚体与酞菁染料的缀合物
技术领域
本发明涉及生物素修饰二聚体与酞菁染料的缀合物、以及其利用。
背景技术
亲和素与生物素、或者链霉亲和素与生物素之间的亲和性非常高(Kd＝10-15～10-14M)，作为生物双分子间的相互作用，这是最强的相互作用之一。目前，亲和素/链霉亲和素-生物素相互作用在生物化学、分子生物学或医学领域被广泛应用。已经设计了将亲和素/链霉亲和素与生物素的高结合能力和抗体分子组合的药物递送方法和预靶向法。关于这些研究，专利文献1中报道了：降低了对天然生物素的亲和性的链霉亲和素突变体、以及对于该对天然生物素呈低亲和性的链霉亲和素突变体具有高亲和性的生物素修饰二聚体。
另一方面，光免疫疗法是指为了在体内破坏特定的细胞而使用光敏剂和照射光的治疗方法。光敏剂在暴露于特异性波长的光时产生可诱发附近的细胞的凋亡、坏死和/或自噬作用的细胞毒性的活性氧种。例如，专利文献2中记载了使细胞死亡的方法，该方法包括：使包含细胞表面蛋白的细胞与治疗有效量的1个或多个抗体-IR700分子接触的步骤，且该抗体与该细胞表面蛋白特异性地结合的步骤；以660～740nm的波长、且以至少1Jcm-2的放射剂量对该细胞进行照射的步骤；以及在对该细胞照射的约0～8小时后，使该细胞与1个或多个治疗剂接触，由此使该细胞死亡的步骤。专利文献3中记载了在患有疾病或病态的受试者中诱发细胞毒性的方法，该方法包括：(a)对该受试者给予对治疗有效的药剂，该药剂包含在与受试者的细胞特异性地结合的探针上缀合的IRDye(注册商标)700DX等酞菁染料；以及(b)以有效诱发细胞死亡的量对上述细胞照射适当的激发光。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：国际公开WO2015/125820；
专利文献2：日本专利6127045号公报；
专利文献3：日本特表2017-524659号公报。
发明内容
发明所要解决的课题
本发明以提供用于在光免疫疗法中使用的生物素修饰二聚体与酞菁染料的缀合物作为所应解决的课题。本发明还以提供使用了上述的生物素修饰二聚体与酞菁染料的缀合物、以及链霉亲和素突变体-分子探针缀合物的组合的治疗试剂盒作为所应解决的课题。
用于解决课题的手段
为了解决上述课题，本发明人进行了深入研究，结果发现了：通过使用了生物素修饰二聚体与酞菁染料的缀合物的光免疫疗法，可抑制癌细胞的生长，从而完成了本发明。
即，根据本发明，提供以下的发明。
[1]下述式(1)所示的化合物或其盐与酞菁染料的缀合物：
[化学式1]
Figure BDA0002942179140000021
式中，
X1a、X1b、X2a和X2b分别独立地表示O或NH，
Y1和Y2分别独立地表示C或S，
Z1和Z2分别独立地表示O、S或NH，
V1和V2分别独立地表示S或S+-O-，n1和n2分别独立地表示0或1的整数，
L1和L2分别独立地表示二价连接基，
L3是在末端包含可与酞菁染料结合的官能团的基团，
L4表示三价连接基。
[2][1]所述的缀合物，其中，下述式(1)所示的化合物由下述式(2)所示：
[化学式2]
Figure BDA0002942179140000031
式中的各符号的含义与[1]同义。
[3][1]或[2]所述的缀合物，其中，X1a、X1b、X2a和X2b表示NH，Y1和Y2表示C，Z1和Z2表示NH，V1和V2表示S。
[4][1]～[3]中任一项所述的缀合物，其中，L1和L2分别独立地是由选自-CONH-、-NHCO-、-COO-、-OCO-、-CO-、-O-和碳原子数为1～10的亚烷基的基团的组合构成的二价连接基。
[5][1]～[4]中任一项所述的缀合物，其中，L3是由选自-CONH-、-NHCO-、-COO-、-OCO-、-CO-、-O-和碳原子数为1～10的亚烷基的基团的组合构成的基团，并且是在末端包含氨基的基团。
[6][1]～[5]中任一项所述的缀合物，其中，酞菁染料由下述式(21)所示：
[化学式3]
Figure BDA0002942179140000041
式中，L21表示二价连接基，R21表示可与式(1)所示的化合物或其盐结合的官能团，X和Y分别独立地是亲水性基团、-OH、氢原子或取代基。
[7][6]所述的缀合物，其中，X和/或Y所示的亲水性基团如下：
[化学式4]
Figure BDA0002942179140000042
[8][6]或[7]所述的缀合物，其中，L21是由选自-CONH-、-NHCO-、-COO-、-OCO-、-CO-、-O-和碳原子数为1～10的亚烷基的基团的组合构成的基团。
[9][6]～[8]中任一项所述的缀合物，其中，R21为活性酯基。
[10]以下的任一种缀合物：
[化学式5]
Figure BDA0002942179140000051
[化学式6]
Figure BDA0002942179140000052
[化学式7]
Figure BDA0002942179140000061
[11]治疗剂，其包含[1]～[10]中任一项所述的缀合物。
[12]治疗试剂盒，其包含：(1)[1]～[10]中任一项所述的缀合物；以及(b)包含SEQID NO:1所记载的氨基酸序列的链霉亲和素突变体与分子探针的缀合物。
[13][12]所述的治疗试剂盒，其中，分子探针为抗EREG抗体、抗CEA抗体或抗HER2抗体。
[14]由SEQ ID NO:2所记载的核苷酸序列编码的融合蛋白，其可表达包含SEQ IDNO:1所记载的氨基酸序列的链霉亲和素突变体与识别EREG抗原的scFv型抗体的融合蛋白。
发明效果
通过使用了本发明的生物素修饰二聚体与酞菁染料的缀合物的光免疫疗法，可抑制癌细胞的生长。
附图说明
[图1]图1显示使用了本发明的缀合物的细胞生长抑制实验的结果。
[图2]图2显示使用了本发明的缀合物的细胞生长抑制实验的结果。
[图3]图3显示结构域结构的概略(略图)。
[图4]图4显示CEA-V2122的SDS-PAGE电泳(泳動)CBB染色图像。
[图5]图5显示CEA-Cupid与抗原(CEACAM5)的结合性能评价。
[图6]图6显示CEA-Cupid与生物素修饰体的结合性能评价。
[图7]图7显示基于FITC标记CEA-V2122的细胞染色图像。
[图8]图8显示基于FITC标记CEA-V2122的细胞染色图像MKN45细胞时间系列数据。
[图9]图9显示结合有光活化化合物的生物素修饰体。
[图10]图10显示将CEA-Cupid与结合有光活化化合物的生物素修饰体组合的体外细胞毒性。
[图11]图11显示肿瘤块的大小的变化。
[图12]图12显示将CEA-Cupid与结合有光活化化合物的生物素修饰体组合的体内细胞毒性。
[图13]图13显示将CEA-Cupid与结合有光活化化合物的生物素修饰体组合的体内细胞毒性病理组织图像。
[图14]图14显示使用了抗CEACAM5抗体的病理切片的分析。
[图15]图15显示HER2-V2122结构图。
[图16]图16显示HER2-V2122的SDS-PAGE电泳CBB染色图像。
[图17]图17显示HER2-Cupid与抗原(HER2)的结合性能评价。
[图18]图18显示HER2-Cupid与生物素修饰体的结合性能评价。
[图19]图19显示将HER2-Cupid与结合有光活化化合物的生物素修饰体组合的体外细胞毒性。
具体实施方式
以下，更详细地对本发明进行说明。
(1)生物素修饰二聚体
本发明涉及生物素修饰二聚体与酞菁染料的缀合物。
生物素修饰二聚体是下述式(1)所示的化合物或其盐，优选为下述式(2)所示的化合物或其盐。生物素修饰二聚体可使用国际公开WO2015/125820号中记载的化合物。
[化学式8]
Figure BDA0002942179140000081
[化学式9]
Figure BDA0002942179140000082
式中，X1a、X1b、X2a和X2b分别独立地表示O或NH，
Y1和Y2分别独立地表示C或S，
Z1和Z2分别独立地表示O、S或NH，
V1和V2分别独立地表示S或S+-O-，n1和n2分别独立地表示0或1的整数，
L1和L2分别独立地表示二价连接基，
L3是在末端包含可与酞菁染料结合的官能团的基团，
L4表示三价连接基。
式(1)和式(2)中，下述结构：
[化学式10]
Figure BDA0002942179140000083
所示的部分优选为下述的任一种，但并不限于这些：
[化学式11]
Figure BDA0002942179140000091
优选X1a、X1b、X2a和X2b表示NH，优选Y1和Y2表示C，优选Z1和Z2表示NH，优选V1和V2表示S。
L1和L2分别独立地优选为由选自-CONH-、-NHCO-、-COO-、-OCO-、-CO-、-O-和碳原子数为1～10的亚烷基的基团的组合构成的二价连接基。
L1和L2分别独立地优选为由选自-CONH-、-NHCO-、-O-和碳原子数为1～10的亚烷基的基团的组合构成的二价连接基。
L1和L2分别独立地优选为由选自-CONH-、-NHCO-和碳原子数为1～10的亚烷基的基团的组合构成的二价连接基。
L4表示三价连接基，优选为：
[化学式12]
Figure BDA0002942179140000092
或
[化学式13]
Figure BDA0002942179140000093
(来源于苯的三价连接基或氮原子)。
L3优选为由选自-CONH-、-NHCO-、-COO-、-OCO-、-CO-、-O-和碳原子数为1～10的亚烷基的基团的组合构成的基团，并且是在末端包含氨基的基团。
(2)酞菁染料
酞菁染料优选为硅酞菁染料。像IRDye(注册商标)700DX这样的酞菁染料的具体例子，例如记载在美国专利第7,005,518号中。
作为酞菁染料，可使用下述式(21)所示的染料，作为其一个例子，可使用下述式(22)所示的染料：
[化学式14]
Figure BDA0002942179140000101
[化学式15]
Figure BDA0002942179140000102
式中，L21表示二价连接基，R21表示可与式(1)所示的化合物或其盐结合的官能团。
X和Y分别独立地是亲水性基团、-OH、氢原子或取代基。作为这里所说的取代基，可列举：卤原子(氟原子)、包含碳原子的取代基(烃基等)、包含氮原子的取代基(氨基等)等，但没有特别限定。
作为X和Y的具体例子，可列举：
(i)：X和Y均为亲水性基团的情况；
(ii)：X和Y的一方为亲水性基团，X和Y的另一方为-OH或氢原子的情况；
(iii)：X和Y为-OH或氢原子的情况。
对X和/或Y所示的亲水性基团没有特别限定，以下给出一个例子：
[化学式16]
Figure BDA0002942179140000111
作为酞菁染料，可使用IRDye(注册商标)700DX等市售品。本发明中，使用IRDye(注册商标)700DX的NHS酯，使其与具有氨基的生物素修饰二聚体反应，从而可制造缀合物。IRDye(注册商标)700DX的其他变种记载在美国专利第7,005,518号中，也可使用它们。
R21表示可与式(1)所示的化合物或其盐结合的官能团。R21优选为可与生物素修饰二聚体上的羧基、胺或硫醇基反应并进行结合的官能团。R21可优选列举：活化酯、卤代酰基、卤代烷基、适当取代的胺、酸酐、羧酸、碳二亚胺、羟基、碘乙酰胺、异氰酸酯、异硫氰酸酯、马来酰亚胺、NHS酯、亚磷酰胺、磺酸酯、硫醇或硫氰酸酯等，但没有特别限定。
L21表示二价连接基，例如可包含：醚、硫醚、胺、酯、氨基甲酸酯、脲、硫脲、氧或酰胺键的任意组合、或者碳-碳单键、碳-碳双键、碳-碳三键或芳族碳-碳键；或者磷-氧、磷-硫、氮-氮、氮-氧、或氮-铂键；或者芳族或杂芳族键。L21优选为由选自-CONH-、-NHCO-、-COO-、-OCO-、-CO-、-O-和碳原子数为1～10的亚烷基的基团的组合构成的基团。
-L21-R21可包含亚磷酰胺基、NHS酯、活性羧酸、硫氰酸酯、异硫氰酸酯、马来酰亚胺、和碘乙酰胺。
L21包含-(CH2)n-基，式中，n为1～10的整数，优选n为1～4的整数。作为一个例子，-L21-R21为-O-(CH2)3-OC(O)-NH-(CH2)5-C(O)O-N-琥珀酰亚胺基。
(3)使用了生物素修饰二聚体与酞菁染料的缀合物的治疗试剂盒
根据本发明，提供将本发明的生物素修饰二聚体与酞菁染料的缀合物和链霉亲和素突变体-分子探针缀合物组合的治疗试剂盒。
作为链霉亲和素突变体，可使用国际公开WO2014/129446和国际公开WO2015/125820中记载的链霉亲和素突变体。特别优选可使用国际公开WO2015/125820的实施例3(国际公开WO2015/125820的SEQ ID NO:4)(本申请说明书的SEQ ID NO:1)中记载的链霉亲和素突变体LISA314-V2122。
作为分子探针，例如可列举：抗体、肽、核酸、适体等，具体而言，可使用以在癌中特异性地表达的以下抗原为靶的抗体、肽、核酸、适体等。
外调蛋白(EREG：epiregulin)、ROBO1,2,3,4、1-40-β-淀粉状蛋白、4-1BB、5AC、5T4、ACVR2B、腺癌抗原、甲胎蛋白(α-fetoprotein)、血管生成素-2、炭疽毒素、AOC3(VAP-1)、B-淋巴瘤细胞、B7-H3、BAFF、β淀粉状蛋白、C242抗原、C5、CA-125、碳酸酐酶9(CA-IX)、心脏肌球蛋白、CCL11(嗜酸性粒细胞趋化因子-1(eotaxin-1))、CCR4、CCR5、CD11、CD18、CD125、CD140a、CD147(基础免疫球蛋白(basigin))、CD147(基础免疫球蛋白)、CD15、CD152、CD154(CD40L)、CD154、CD19、CD2、CD20、CD200、CD22、CD221、CD23(IgE受体)、CD25(IL-2受体的α链)、CD28、CD3、CD30(TNFRSF8)、CD33、CD37、CD38(环状ADP核糖水解酶)、CD4、CD40、CD41(整联蛋白α-IIb)、CD44 v6、CD5、CD51、CD52、CD56、CD6、CD70、CD74、CD79B、CD80、CEA、CFD、ch4D5、CLDN18.2、艰难梭菌(Clostridium difficile)、聚集因子(clumping factor)A、CSF2、CTLA-4、巨细胞病毒、巨细胞病毒糖蛋白B、DLL4、DR5、大肠杆菌志贺毒素1型、大肠杆菌志贺毒素2型、EGFL7、EGFR、内毒素、EpCAM、上皮唾液蛋白(episialin)、ERBB3、大肠杆菌(Escherichia coli)、呼吸道合胞体{こきゅうきごうほうたい}病毒(respiratorysyncytial virus)的F蛋白、FAP、纤维蛋白IIβ链、纤连蛋白胞外结构域-B、叶酸受体1、卷曲受体(Frizzled receptor)、GD2、GD3神经节苷脂、GMCSF受体α链、GPNMB、乙型肝炎表面抗原、乙型肝炎病毒、HER1、HER2/neu、HER3、HGF、HIV-1、HLA-DRβ、HNGF、Hsp90、人β淀粉状蛋白、人分散因子(scatter factor)受体激酶、人TNF、ICAM-1(CD54)、IFN-α、IFN-γ、IgE、IgEFc区、IGF-1受体、IGF-I、IgG4、IGHE、IL-1β、IL-12、IL-13、IL-17、IL-17A、IL-22、IL-23、IL-4、IL-5、IL-6、IL-6受体、IL-9、ILGF2、甲型流感血凝素、胰岛素样生长因子I受体、整联蛋白α4、整联蛋白α4β7、整联蛋白α5β1、整联蛋白α7β7、整联蛋白αIIbβ3、整联蛋白αvβ3、整联蛋白γ诱导蛋白、干扰素受体、干扰素α/β受体、ITGA2、ITGB2(CD18)、KIR2D、L-选择素(CD62L)、Lewis-Y抗原、LFA-1(CD11a)、脂磷壁酸(lipoteichoicacid)、LOXL2、LTA、MCP-1、间皮素、MS4A1、MUC1、粘蛋白癌抗原、肌生长抑制素、N-羟乙酰神经氨酸(N-glycolylneuraminic acid)、NARP-1、NCA-90(粒细胞抗原)、NGF、NOGO-A、NRP1、穴兔(Oryctolagus cuniculus)、OX-40、oxLDL、PCSK9、PD-1、PDCD1、PDGF-Rα、磷脂酰丝氨酸、前列腺癌细胞、绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)、狂犬病{きょうけんびょう}病毒糖蛋白、RANKL、呼吸道合胞体{こきゅうきごうほうたい}病毒、RHD、Rh(Rhesus)因子、RON、RTN4、骨硬化蛋白(sclerostin)、SDC1、选择素P、SLAMF7、SOST、1-磷酸鞘氨醇、TAG-72、TEM1、肌腱蛋白C、TFPI、TGFβ1、TGFβ2、TGF-β、TNF-α、TRAIL-R1、TRAIL-R2、肿瘤抗原CTAA16.88、MUC1的肿瘤特异性糖基化、TWEAK受体、TYRP1(糖蛋白75)、VEGF-A、VEGFR-1、VEGFR2、波形蛋白、VWF。
上述之中，优选外调蛋白(EREG)、CEA和HER2。
调制癌抗原特异性抗体分子等的分子探针与链霉亲和素突变体的融合体，将其给予患者，从而可使链霉亲和素突变体特异性地聚集于癌细胞。接下来，通过对患者给予对上述链霉亲和素突变体具有亲和性的生物素修饰二聚体与酞菁染料的缀合物，可使酞菁染料准确地聚集于癌细胞。
或者，在本发明中，还可调制使癌抗原特异性抗体分子等的分子探针和链霉亲和素突变体的缀合物、与生物素修饰二聚体和酞菁染料的缀合物结合而得到的复合物，且将该复合物给予患者。
与链霉亲和素突变体结合的抗体可使用各种分子。多克隆抗体、单克隆抗体均可使用。对抗体的亚类没有特别限定，但优选使用IgG，特别适合使用IgG1。另外，“抗体”包括修饰抗体和抗体片段的全部。可列举：人源化抗体、人型抗体、人抗体，小鼠、兔、大鼠、豚鼠、猴等各种动物来源的抗体，人抗体与各种动物来源的抗体的嵌合抗体，双抗体、scFv、Fd、Fab、Fab’、F(ab)’2，但并不限于这些。
链霉亲和素突变体与抗体的结合物可利用本领域技术人员已知的方法得到。例如，可通过化学结合方法(US5,608,060)得到，也可通过连接编码链霉亲和素突变体的DNA和编码抗体的DNA，使用表达载体等使其在宿主细胞中表达，从而以融合蛋白的形式得到。编码链霉亲和素突变体的DNA与编码抗体的DNA的连接，可经由编码称作接头的适当的肽的DNA进行。关于链霉亲和素突变体-抗体结合物，希望保留抗体与靶分子的特异性结合力来制作。
(4)光免疫疗法
对受试者给予本发明的生物素修饰二聚体与酞菁染料的缀合物，以有效诱发细胞生长的抑制或细胞死亡的量对细胞照射激发光，从而可诱发细胞生长的抑制或细胞死亡，来治疗受试者。
优选对受试者给予本发明的生物素修饰二聚体和酞菁染料的缀合物、与链霉亲和素突变体-分子探针缀合物的复合物，以有效诱发细胞生长的抑制或细胞死亡的量对细胞照射激发光，从而可诱发细胞生长的抑制或细胞死亡，来治疗受试者。
作为受试者，包括人和非人哺乳动物，可列举人或小鼠等实验动物。作为受试者，优选患有希望抑制细胞生长或诱发细胞死亡的疾病的受试者，例如可列举具有癌症或实体瘤的受试者。
“癌症”可列举：癌瘤、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤和白血病或恶性淋巴瘤。作为癌症的具体例子，可列举：鳞状细胞癌(例如，上皮鳞状细胞癌)、包括小细胞肺癌在内的肺癌、非小细胞肺癌(“NSCLC”)、肺腺癌和肺鳞状细胞癌、腹膜癌、肝细胞癌、包括消化系统癌症在内的胃体癌或胃癌、胰腺癌、成胶质细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝细胞癌、乳腺癌、结肠癌、直肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾癌或肾部癌、前列腺癌、外阴部癌、甲状腺癌、肝细胞癌、肛门癌、阴茎癌、以及头颈部癌。
实体瘤无论是良性还是恶性通常是指不含包囊的异常细胞块。作为实体瘤，可列举：神经胶质瘤、星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、脑膜瘤、黑色素瘤、成神经细胞瘤和视网膜母细胞瘤。
在光免疫疗法中，对受试者给予“生物素修饰二聚体与酞菁染料的缀合物”或“生物素修饰二聚体与酞菁染料的缀合物、和链霉亲和素突变体-分子探针缀合物的复合物”，之后照射光，从而可处置(治疗)受试者。
作为对受试者的给予(给药)方法，可列举：局部途径、注射(皮下注射、肌肉内注射、皮内注射、腹腔内注射、肿瘤内注射和静脉内注射等)、口服途径、眼途径、舌下途径、直肠途径、经皮途径、鼻腔内途径、阴道途径和吸入途径等，但并不限于这些。
“生物素修饰二聚体与酞菁染料的缀合物”或“生物素修饰二聚体与酞菁染料的缀合物、和链霉亲和素突变体-分子探针缀合物的复合物”优选以治疗有效量进行给予。治疗有效量为每60千克给予至少0.5毫克(mg/60kg)、至少5mg/60kg、至少10mg/60kg、至少20mg/60kg、至少30mg/60kg、至少50mg/60kg。例如，在静脉内给予的情况下，为1mg/60kg、2mg/60kg、5mg/60kg、20mg/60kg或50mg/60kg的用量(剂量)等、例如0.5～50mg/60kg。在其他例子中，治疗有效量为至少100μg/kg、至少500μg/kg或至少500μg/kg等、至少10μg/kg，例如，在肿瘤内给予或腹腔内给予的情况下，为100μg/kg、250μg/kg、约500μg/kg、750μg/kg或1000μg/kg的用量等、例如10μg/kg～1000μg/kg。在一个例子中，治疗有效量为以局部用溶液进行给予的10μg/ml、20μg/ml、30μg/ml、40μg/ml、50μg/ml、60μg/ml、70μg/ml、80μg/ml、90μg/ml或100μg/ml等、20μg/ml～100μg/ml之间等、至少500μg/ml等、至少1μg/ml。
可将上述的给予量通过1次或多次的分割用量(2、3或4次的用量等)或单一制剂进行给予。
“生物素修饰二聚体与酞菁染料的缀合物”或“生物素修饰二聚体与酞菁染料的缀合物、和链霉亲和素突变体-分子探针缀合物的复合物”可单独给予，也可在药学上可接受的载体的存在下进行给予，还可在其他治疗剂(其他抗癌药等)的存在下进行给予。
“生物素修饰二聚体与酞菁染料的缀合物”或“生物素修饰二聚体与酞菁染料的缀合物、和链霉亲和素突变体-分子探针缀合物的复合物”可与循环的肿瘤细胞或实体瘤细胞等靶细胞或靶组织结合。之后，若照射光，则上述缀合物或复合物可吸收光，损伤或破坏靶细胞或组织。
在光免疫疗法中，照射光的波长优选为660～740nm，例如具有660nm、670nm、680nm、690nm、700nm、710nm、720nm、730nm或740nm的波长。光的照射可通过使用具备近红外(NIR)发光二极管的装置来进行。
光的照射量为至少1J/cm2、例如至少4J/cm2、至少10J/cm2、至少15J/cm2、至少20J/cm2、至少50J/cm2、或至少100J/cm2、例如1～500J/cm2。光照射可实施多次(例如，2、3、4、5、6、7、8、9或10次)。
通过以下的实施例来进一步具体地说明本发明，但本发明并不受实施例的限定。
实施例
＜制造例1＞
[化学式17]
Figure BDA0002942179140000171
Figure BDA0002942179140000181
在1.8mg(1.6μmol)Psyche J中加入3.0mg(1.5μmol)IR Dye 700NHS Ester、144μL磷酸氢二钠缓冲液(pH8.4)和120μL二甲基亚砜，用铝箔避光，在室温下搅拌24小时。将反应液用水稀释至500μL，所得的稀释液通过反相HPLC(梯度：0％5分钟、0-100％100分钟，乙腈的50mM三乙基乙酸铵水溶液(pH6.5)，保留時间＝47.2分钟，YMC-Triart C18，流速＝3.5mL/分钟)进行纯化，从而得到了目标化合物1(深蓝绿色)。由针对IR700报道的水中694nm的摩尔吸光系数165,000(M-1cm-1)进行定量，算出收率(1.0μmol,72％)。
LRMS(ESI):m/z 1303[M+2H]2+,869[M+3H]3+
＜制造例2＞
[化学式18]
Figure BDA0002942179140000191
在0.375mg(144nmol)化合物1中加入266μL 0.1％甲酸水溶液和133μL乙腈，用旋涡混合器搅拌，进行离心，之后在暗室、37℃的条件下静置90分钟。将其溶液通过反相HPLC(梯度：0％5分钟、0-100％100分钟，乙腈的50mM三乙基乙酸铵水溶液(pH6.5)，保留時间＝51.6分钟，YMC-Triart C18，流速＝3.5mL/分钟)进行纯化，从而得到了目标化合物2(深蓝绿色)。同样地进行定量，算出收率(48nmol，33％)。LRMS(ESI):m/z 1054[M-H2O+2H]2+,703[M-H2O+3H]3+
＜制造例3＞
[化学式19]
Figure BDA0002942179140000201
在0.375mg(144nmol)化合物1中加入266μL 0.1％甲酸水溶液和133μL乙腈，用旋涡混合器搅拌，进行离心，之后在暗室、37℃的条件下静置28小时。将其溶液通过反相HPLC(梯度：0％5分钟、0-100％100分钟，乙腈的50mM三乙基乙酸铵水溶液(pH6.5)，保留時间＝56.2分钟，YMC-Triart C18，流速＝3.5mL/分钟)进行纯化，从而得到了目标化合物3(深蓝绿色)。同样地进行定量，算出收率(15nmol，10％)。LRMS(ESI):m/z 813[M-H2O+2H]2+,542[M-H2O+3H]3+
试验例1：
＜scFv-Cupid分子表达载体的调制＞
将识别EREG抗原的scFv型抗体与Cupid分子(氨基酸序列见序列表的SEQ ID NO:1)融合并利用大肠杆菌表达融合蛋白的基因序列、ST01(核苷酸序列和氨基酸序列见SEQID NO:2和SEQ ID NO:3)和蛋白伴侣分子(Chaperone molecule)skp的基因序列，通过人工合成而获取。大肠杆菌中的蛋白表达使用pETDuet-1载体。具体而言，使用引物(skp_Fw:tacatatgGATAAA ATTGCCATTGTTAAT(SEQ ID NO:6),skp_Rv:TTTTATCcatatgtatat ctccttc(SEQ ID NO:7))，通过PCR扩增人工合成的蛋白伴侣skp基因序列(核苷酸序列和氨基酸序列见SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5)，进行基于电泳的谱带的切出和纯化。另外，pETDuet-1载体是制作了通过限制酶Nde I处理在MCS2的Nde I位点直链化(线性化)的载体。按照In-Fusion HD克隆试剂盒(Takara Bio公司)的用法用量连接skp和直链化载体，通过克隆和序列分析，确认了插入有目标序列。插入到同一载体的MCS2中，调制表达载体，作为pETDuet_skp。
之后，对于pETDuet_skp，ST01的插入如下实施。以pETDuet_skp为模板，使用引物(Linear1 Rv:ggtatatctccttcttaaag(SEQ ID NO:8),Linear1 Fw:aattcgagctcggcgcgcctg(SEQ ID NO:9))进行载体的直链化。另外，使用引物(ST01 Fw:agaaggagatataccATGAAATATCTGCTGCCGAC(SEQ ID NO:10),ST01 Rv:cgccgagctcgaattTTAATGATGGTGATGATGATG(SEQ ID NO:11))，通过PCR对人工合成的ST01基因进行扩增，切出凝胶并纯化，实施插入物的调制。直链化载体和插入物是按照In-Fusion HD克隆试剂盒(TakaraBio公司)的用法用量进行克隆，通过序列分析确认所插入的基因正确，作为ST01表达载体。
＜scFv-Cupid蛋白的表达和纯化＞
将进行克隆、序列分析而确认到插入有目标基因的质粒载体导入感受态细胞BL21(DE3)(ECOS感受态E.coli BL21(DE3),NIPPON GENE公司)中进行转化。将用100mL的2xYT培养基培养了一夜的培养液接种(食菌)在1升的培养液中，在37℃下进行培养，在600nm的OD值超过2.0时，添加IPTG使最终浓度达到0.5mM，进行蛋白的表达诱导。
ST01在IPTG表达诱导后于16℃下培养一夜，之后回收培养上清。
对于回收的培养上清，使用Ni-NTA树脂(cOmplete His-Tag PurificationResin,SIGMA-ALDRICH公司)，利用附加在蛋白C末端的6×His-Tag，通过批量法进行亲和纯化，作为粗纯化物。再使用蛋白L树脂(Capto L,GE Healthcare)，进行基于κ轻链的亲和纯化。此时，结合/洗涤缓冲液使用PBS，洗脱缓冲液使用10mM的甘氨酸盐酸溶液(pH2.0)。纯化物利用离心过滤滤器(Vivaspi Turbo 15100K MWCO,sartorius公司)进行浓缩。浓缩后，使用缓冲液交换用一次性柱(PD-10，GEHealthcare)，将产物的缓冲液置换成PBS。
＜培养细胞的准备＞
DLD-1细胞(EREG阳性)(来源于人结肠腺癌的细胞)用10％FBS RPMI1640(富士胶卷和光纯药株式会社)进行培养。为了细胞毒性试验，在96孔培养板的每孔中接种3×103～5×103个细胞。这些细胞是在细胞毒性试验的前一天准备的。
＜预缀合物的调制＞
各ST01和用100％DMSO溶解的化合物1、2、3在培养基稀释前以摩尔比1:2的比例分别混合，在室温下培养10分钟，之后用培养液(10％FBS RPMI1640)进行稀释使scFv-Cupid的终浓度达到10μg/mL(60～61nM)、Psyche化合物的终浓度达到120nM，在室温下培养10分钟，作为试验溶液。需要说明的是，使用培养液作为未添加scFv-Cupid的对照，使用DMSO作为化合物的对照。
＜细胞中的试验＞
舍弃如上所述地在前一天培养的细胞的培养液，以每孔100μL的容量添加试验溶液，培养4小时，照射690nm±10nm的峰值波长的光。使用在光功率计PM121D上连接有400-1100nm的传感器(均为THORLABS公司)的测定仪，测定在培养板上的照射能量，确定照射时间。设为1.1J/cm2(2分钟)、4.5J/cm2(8分钟)、18.4J/cm2(30分钟)。在各时间的照射后，在5％CO2、37℃下进行培养，在48小时后使用细胞计数试剂盒-8(同仁化学公司)，实施细胞生长测定。具体而言，每孔加入10μL的细胞计数试剂盒-8溶液，在5％CO2、37℃下进行1～2小时的培养。之后，使用吸光度计测定了450nm的吸光度。以仅有培养基的孔作为背景(BG)，以仅添加DMSO的孔作为100％对照(Cont.)。各培养条件的细胞生长％的值由下式计算。100×(测定值A﹣BG)/(Cont.﹣BG)(单位为％)。
在图1中确认到与ST01的预培养依赖性且光照射依赖性的细胞生长抑制。
在图2中，即使是未进行与ST01的预培养的情况下也确认到：有时会确认到细胞生长抑制。
＜SEQ ID NO:2是ST01的核苷酸序列＞
ATGAAATACCTATTGCCTACGGCAGCCGCTGGATTGTTATTACTCGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGGTGCAGCTGCAGCAGTCTGGCGCCGAAGTGAAGAAACCTGGCGCCTCCGTGAAGGTGTCCTGCAAGGCCTCCGGCTTCAACATCAAGGACACCTACATGCACTGGGTGCGACAGGCCCCTGAGCAGGGCCTGGAATGGATGGGCAGAATCGACCCCCTGAACGACAAGACTAAGTACGACCCCAAGTTCCAGGGCAGAGTGACCATCACCGCCGACACCTCTACCAACACCGCCTACCTGGAACTGTCCTCCCTGACCTCTGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCTAGAGGCGGCGGAGATCCCGTGTTCGTGTATTGGGGCCAGGGCACCCTCGTGACCGTGTCTGCTTCTTCTGGCGGAGGCGGATCTGGGGGCGGAGGTTCTGGTGGTGGTGGAAGCGGTGGCGGTGGATCTGGCGGCGATATCCAGATGACCCAGTCCCCCAGCTCCCTGTCTGCCTCTGTGGGCGACCGCGTGACCATTACATGCAAGGCCAGCCAGGACATCAACAAGTACCTGGCCTGGTATCAGCACAAGCCCGGCCAGGCTCCTCGGCTGCTGATCCACTATACCTCCACCCTGCACCCCGGCATCCCTTCCAGATTCTCCGGCTCTGGCTCCGGCACCGACTTTACCTTCTCCATCTCCAGCCTGCAGCCCGAGGATATCGCTACCTACTACTGCCTGCAGTACGACAACCTGCGGACCTTCGGAGGCGGCACCAAGGTGGAAATCAAGCGGACCAGCGGCGGAGGTGGAAGCGGTGGAGGTGGAGCCGAAGCAGGTATTACCGGCACCTGGAGCGATCAGCTGGGCGATACCTTTATTGTGACCGCCGGCGCAGATGGTGCGCTGACCGGCACCTATGAAAATGCCGTGGGTGGTGCGGAAAGCCGTTATGTTCTGACCGGTCGTTATGATAGCGCACCGGCAACCGATGGCAGCGGCACCGCCCTGGGTTGGACCGTGGCGTGGAAAAACAATAGCAAAAACGCCCATAGCGCGACCACCTGGAGCGGCCAGTATGTTGGCGGTGCCGATGCGAAAATTAACACCCAGTGGCTGCTGACCAGCGGCACCACCAATGCCAATGCGTGGAAAAGCACCCTGGTGGGTCATGATACCTTTACCAAAGTTAAACCGAGCGCGGCCAGCCACCACCACCACCACCACTGA
＜SEQ ID NO:4是skp的核苷酸序列＞
GATAAAATTGCCATTGTTAATATGGGTAGCCTGTTTCAGCAGGTTGCACAGAAAACCGGTGTTAGCAATACCCTGGAAAATGAATTTAAAGGTCGTGCAAGCGAACTGCAGCGTATGGAAACCGATCTGCAGGCAAAAATGAAAAAACTGCAGAGCATGAAAGCAGGTAGCGATCGTACCAAACTGGAAAAAGATGTTATGGCACAGCGTCAGACCTTTGCCCAGAAAGCACAGGCATTTGAACAGGATCGTGCACGTCGTAGCAATGAAGAACGTGGTAAACTGGTTACCCGTATTCAGACCGCAGTTAAAAGCGTTGCAAATAGCCAGGATATTGATCTGGTTGTTGATGCAAATGCCGTTGCCTATAATAGCAGTGATGTGAAAGATATTACCGCAGACGTTCTGAAACAAGTGAAATAA
实施例2：CEA-V2122蛋白的表达和纯化
V2122是国际公开WO2015/125820的实施例3(国际公开WO2015/125820的SEQ IDNO:4)中记载的链霉亲和素突变体。将V2122的氨基酸序列(在C末端具有6×His标签的序列)记载于序列表的SEQ ID NO:12中。
scFv-V2122是使抗CEACAM5的单链抗体(scFv)与上述的V2122结合而得到的。该scFv型的抗CEACAM5抗体为专利文献US7626011B2中记载的scFv序列。将scFv型的抗CEACAM5抗体的氨基酸序列记载于序列表的SEQ ID NO:13中。另外，将CEA-V2122的氨基酸序列记载于序列表的SEQ ID NO:14中，所述CEA-V2122的氨基酸序列是将scFv型的抗CEACAM5抗体和V2122通过氨基酸接头(GGGGSGGGG)(SEQ ID NO:22)结合而得到的。
为了表达CEA-V2122融合蛋白，使将用于在大肠杆菌中分泌表达的pelB信号插入N末端、并将6×His-Tag序列插入C末端而得到的CEA-V2122基因序列的DNA密码子在大肠杆菌中优化，进行了人工基因合成。将该氨基酸序列记载于序列表的SEQ ID NO:15中、DNA序列记载于序列表的SEQ ID NO:16中。另外，结构域结构的概略见图3。
具体的蛋白表达载体使用了在pETDuet1载体的MCS2中插入有蛋白伴侣skp基因而得到的载体。对于skp基因，根据序列表的SEQ ID NO:17中记载的氨基酸序列，将密码子在大肠杆菌中优化，进行了DNA的人工基因合成。所合成的skp基因使用引物(AAGGAG ATATACATATGGATAAAATTGCCATTGTTAATAT(SEQ ID NO:23)、TTGAGATCTGCCATATGTTATTTCACTTGTTTCAGAACG(SEQ ID NO:24))，通过PCR进行扩增，使用In-Fusion HD克隆试剂盒，将其克隆到经限制酶NdeI进行了直链化的pETDue1载体的MCS2中，制成pETDuet_skp。接下来，在pETDuet_skp的MCS1中插入CEA-V2122基因。具体而言，使用引物(AGAAGGAGATATACCATGAAATATCTGCTGCCGAC(SEQ ID NO:25)、CGCCGAGCTCGAATTTTAATGATGGTGATGATGATG(SEQ ID NO:26))，通过PCR扩增人工合成的CEA-V2122基因。另外，使用引物(GGTATATCTCCTTCTTAAAGTTAAAC(SEQID NO:27)、AATTCGAGCTCGGCGCGCCTGCAG(SEQ ID NO:28))，通过PCR将pETDuet_skp进行直链化。使用In-Fusion HD克隆试剂盒，对通过PCR扩增的CEA-V2122和直链化的pETDuet_skp进行克隆。根据测序进行所插入的基因序列的确认，所克隆的载体为pETDuet_CEA-V2122_skp。
为了蛋白表达，将pETDuet_CEA-V2122_skp转化至BL21(DE3)(Nippon Gene公司)，在2×YT培养基(SIGMA-ADLRICH公司)中、于37℃下进行一夜的预培养。将已进行预培养的培养基添加在新的培养基中使其稀释100倍，在37℃下进行培养直至OD(600nm)＝0.5～2.0。接下来，添加最终浓度为0.5mM的IPTG，在37℃下培养4小时，回收培养上清，之后在4℃下保存。
对于CEA-V2122蛋白，利用附加在C末端的6×His-Tag，通过批量法进行粗纯化。具体而言，将用缓冲液A(50mM TrisHCl、0.2M NaCl、1mM EDTA、5mM咪唑、pH8.0)进行了平衡化的cOmplete His-Tag Purification Resin添加在于4℃下保存的培养上清中，在4℃下搅拌2小时～一夜，进行与树脂的蛋白结合处理。接下来，将树脂回收到柱中，用缓冲液A进行20柱容量的洗涤操作。之后，用缓冲液B(50mM TrisHCl、0.2M NaCl、1mM EDTA、400mM咪唑、pH8.0)洗脱，回收CEA-V2122的粗纯化物。
接下来，利用蛋白L柱对粗纯化物进行纯化。具体而言，将1mL Capto L(GEHealthcare Life Sciences)填充至PD-10柱，用10倍柱体积的PBS进行平衡化，之后加载上述的粗纯化物，用10倍柱容积的PBS洗涤，之后用10mM甘氨酸盐酸(pH2.0)洗脱，利用Vivaspin Turbo 15(MWCO 100,000)进行离心浓缩。再使用PD-10(GE Healthcare LifeSciences公司)，进行向PBS的缓冲液置换，再利用Vivaspin Turbo 4(MWCO 100,000)进行离心浓缩，制成最终纯化物。SDS-PAGE电泳后，通过CBB染色进行四聚体CEA-V2122的纯度检测，结果见图4。SDS-PAGE凝胶使用Mini-PROTEAN TGX 4-15％(Bio-Rad公司)，CBB染色液使用Bullet CBB Stain One(Ready To Use)(Nacalai Tesque公司)。
由图4确认到：所纯化的CEA-V2122以约150kDa的四聚体作为主要成分。
实施例3：CEA-V2122在SPR中的性能评价
使用表面等离子共振(SPR)测定装置：Biacore T200(GE Healthcare LifeSciences公司)，实施CEA-V2122与抗原CEACAM5的亲和性。具体而言，使用胺偶联试剂盒(GEHealthcare Life Sciences公司)，将重组人CEACAM-5/CD66e Protein,CF(R&D SYSTEMS公司)在传感器芯片CM5(GE Healthcare Life Sciences公司)上进行固定化操作，配体的最终固定化量为279RU。另外，所纯化的CEA-V2122调整成1E-08M～6.25E-10M的2倍稀释系列，作为分析物。相互作用分析通过单循环动力学(Single-Cycle Kinetics)分析获取数据。使用Biacore T200评估软件2.0版，以Bivalent Analyze模式对所得数据实施曲线拟合，得到了ka1＝3.208E+5、kd1＝3.461E-7的值。另外，在Bivalent Analyze中可通过KD＝kd1/ka1进行评价，因此得到了KD＝kd1/ka1＝3.461E-7/3.208E+5＝1.078E-12的评价值。它们的结果见图5。
由图5所示的传感图、KD值确认到：CEA-V2122与CEACAM5强力结合。
另外，CEA-V2122与生物素修饰体的相互作用分析还可利用Biacore T200进行实施。具体的生物素修饰体是国际公开WO2018/07239的实施例1中记载的标题化合物14。另外，具体的分析方法如下。使用胺偶联试剂盒，对传感器芯片CM5设定成目标值5000RU，进行所纯化的CEA-V2122的固定化。分析物的浓度使用1E-08M～6.25E-10M的2倍稀释系列的5种。相互作用分析通过单循环动力学分析获取数据。使用Biacore T200评估软件2.0版，以Bivalent Analyze模式对所得数据实施曲线拟合，得到了ka1＝3.792E+4、kd1＝4.424E-6的值。另外，在Bivalent Analyze中可通过KD＝kd1/ka1进行评价，因此得到了KD＝kd1/ka1＝3.792E+4/4.424E-6＝1.167E-10的评价值。它们的结果见图6。
由图6所示的传感图、KD值确认到：CEA-V2122与生物素修饰体强力结合。
实施例4：使用了FITC标记CEA-V2122的CEACAM5表达细胞株的细胞染色
为了CEACAM5表达阳性的癌细胞株的染色，使用100μg所纯化的CEA-V2122蛋白进行FITC标记。具体而言，使用荧光素标记试剂盒-NH2(同仁化学研究所)，按照操作手册的用法用量实施标记，以所得产物作为CEA-V2122-FITC。具体的CEACAM5表达阳性的癌细胞株的染色如下。在CELLSTAR,μClear,96孔板(Greiner公司)上接种来源于CEACAM5阳性的人胃癌的MKN-45细胞和来源于CEACAM5阴性的人结肠癌的DLD1细胞使达到2.0×104个细胞/孔，培养一夜。接下来，添加包含20nM CEA-V2122-FITC和1μM Hoechist的培养液使达到100μL/孔，在4℃下反应30分钟，之后利用In Cell Analyzer 6000(GE Healthcare LifeSciences公司)获取图像。其结果见图7和图8。
由图7所示的结果确认到：CEA-V2122-FITC特异性地识别细胞膜表面的CEACAM5。另外，由图8所示的结果确认到：CEACAM5在CEA-V2122-FITC结合后滞留在细胞膜表面。
实施例5：使用CEA-V2122和光活化化合物标记生物素修饰体的体外细胞毒性试验
使用光活化化合物标记生物素修饰体、化合物1、化合物2和化合物3，实施细胞毒性试验。这些化合物是申请号：日本特愿2018-149295中记载的化合物。化合物1、化合物2和化合物3见图9。具体而言，在细胞培养用96孔板上接种MKN45细胞使细胞数达到5×103个细胞/孔、培养液达到50μL/孔，培养一夜。CEA-V2122与光活化化合物标记生物素修饰体的复合物溶液以CEA-V2122与各化合物的摩尔比达到1:2的方式混合，在室温下进行10分钟的培养，使用培养液进行浓度调整使CEA-V2122的最终浓度达到10μg/mL。稀释系列以20μg/mL作为开始浓度，4倍稀释系列为4个系列(5.0μg/mL、1.25μg/mL、0.312μg/mL、0.078μg/mL)，制成5个系列的复合物稀释系列溶液。另外，只以不含复合物的培养基作为零对照。
在培养了一夜的细胞中，以50μL/孔向各孔中分别添加复合物稀释系列溶液，使最终浓度为10μg/mL、2.5μg/mL、0.625μg/mL、0.156μg/mL、0.039μg/mL。在复合物添加、1小时后、2小时后，使用发出690±10nm的波长的光的LED，对细胞照射光使达到100J/cm2。之后，培养48小时，使用细胞计数试剂盒-8(同仁化学公司)，进行活细胞数的比较。各条件设为n＝3。用法用量按照操作说明书，在试剂添加1.5小时于37℃、CO2培养箱中进行培养后，测定450nm的吸光度，计算平均值，在进行背景校正后，以对照作为100％，计算各条件下的细胞生长与对照的比例。其结果见图10。
如图10所示，确认到：CEA-V2122与化合物1、化合物2、化合物3的复合物，浓度依赖性地显示出细胞毒性。
实施例6：基于使用了异种移植模型小鼠的CEA-V2122和光活化化合物标记生物素修饰体的体内细胞毒性试验
向裸鼠的皮下移植MKN45细胞，制作了异种移植模型小鼠。购入4周龄的裸鼠，驯养1周后，以细胞数2×105个细胞/只，向皮下移植细胞。移植后，约10天从尾静脉给予实验例4中记载的CEA-V2122与光活化化合物标记生物素修饰体化合物1的100μg复合物。使用产生波长690nm的光的LED光源(USHIO OPTO SMICONDUCTORS,INC.,LD690D-66-60-550.)、T-Cube LED Driver(THORLABS,NC0713145)和T-CUBE 15V POWER SUPPLY(THORLABS,TPS001)，在给予6小时后照射690nm的光使达到230J/cm2。在给予复合物24小时后，再次照射690nm的光使达到230J/cm2。作为光源的肿瘤的体积变化的曲线图见图11。给予复合物5天后的小鼠个体的照片见图12。另外，在给予复合物的第7天对小鼠个体实施安乐死，进行解剖，对肿瘤部分进行病理分析。具体手法如下。以一块的形式摘出小鼠皮下肿瘤及其周围组织，室温下在4％多聚甲醛溶液(和光纯药，163-20145)中浸渍一夜，将组织固定。对于固定后的皮下肿瘤组织，切下约3～5mm厚的部分，制作石蜡包埋块，使用切片机制作4μm厚的薄切病理标本。
关于苏木精-伊红染色，室温下将薄切病理标本在二甲苯溶液(和光纯药,241-00091)中浸渍10分钟，进行脱石蜡处理，之后实施苏木精染色(Sakura Finetek，#8650)和伊红染色(Sakura Finetek，#8660)。该结果见图13。
另外，针对CEACAM5的免疫染色如下实施。室温下将薄切病理标本在二甲苯溶液(和光纯药,241-00091)中浸渍10分钟，进行脱石蜡处理，之后通过使用了枸橼酸缓冲液(pH＝6.0)的高压灭菌处理(121℃、5分钟)进行抗原激活。之后，室温下在0.3％过氧化氢(和光纯药,081-04215)/甲醇(和光纯药、137-01823)溶液中浸渍10分钟，去除内源性过氧化物酶。非特异性反应的封闭在2％BSA(Sigma Aldrich、A1470)/磷酸缓冲盐溶液中实施。使抗CEACAM5抗体(R&D SYSTEMS、MAB41281)、浓度1/100)在4℃下反应一夜后，使用Histostar(商标)(MBL、#8460)和DAB底物溶液(MBL、#8469)，将免疫染色信号可见化，最后实施基于苏木精(Sakura Finetek、#8650)的核染色。该结果见图14。
由图13和图14确认到：通过给予CEA-V2122与化合物1的复合物、并照射690nm的光，可诱导异种移植模型小鼠的肿瘤的坏死。
实施例7：HER2-V2122蛋白的表达和纯化
V2122是国际公开WO2015/125820的实施例3(国际公开WO2015/125820的SEQ IDNO:4)中记载的链霉亲和素突变体。V2122的氨基酸序列记载于序列表的SEQ ID NO:12中。
scFv-V2122是使抗HER2(ERBB2)的单链抗体(scFv)与上述的V2122结合而得到的。该scFv型的抗HER2抗体为Zhang H等人,Therapeutic potential of an anti-HER2single chain antibody-DM1conjugates for the treatment of HER2-positivecancer.Signal Transduct Target Ther.2017May 19；2:17015.doi:10.1038/sigtrans.2017.15中记载的scFv序列。将scFv型的抗HER2抗体的氨基酸序列记载于序列表的SEQ ID NO:18中。另外，将scFv型的抗HER2抗体与V2122通过氨基酸接头(GGGGGSGGGGG)(SEQ ID NO:29)结合而得到的HER2-V2122的结构图见图15，氨基酸序列见序列表的SEQ IDNO:19。
为了HER2-V2122融合蛋白的表达，使将用于在大肠杆菌中分泌表达的pelB信号插入N末端、并将6×His-Tag序列插入C末端而得到的HER2-V2122基因序列的DNA密码子在大肠杆菌中优化，进行人工基因合成。将该氨基酸序列记载于序列表的SEQ ID NO:20中，将DNA序列记载于序列表的SEQ ID NO:21中。
具体的蛋白表达载体使用了在pETDuet1载体的MCS2中插入有蛋白伴侣skp基因的载体。对于skp基因，根据序列表的SEQ ID NO:6中记载的氨基酸序列，将密码子在大肠杆菌中优化，进行了DNA的人工基因合成。所合成的skp基因使用引物(AAGGAGATATACATATGGATAAAATTGCCATTGTTAATAT(SEQ ID NO:23)、TTGAGATCTGCCATATGTTATTTCACTTGTTTCAGAACG(SEQ ID NO:24))，通过PCR进行扩增，使用In-Fusion HD克隆试剂盒，将其克隆到经限制酶NdeI进行了直链化的pETDue1载体的MCS2中，制成pETDuet_skp。接下来，在pETDuet_skp的MCS1中插入HER2-V2122基因。具体而言，使用引物(AGAAGGAGATATACCATGAAATATCTGCTGCCGAC(SEQ ID NO:25)、CGCCGAGCTCGAATTTTAATGATGGTGATGATGATG(SEQ ID NO:26))，通过PCR扩增人工合成的HER2-V2122基因。另外，使用引物(GGTATATCTCCTTCTTAAAGTTAAAC(SEQ ID NO:27)、AATTCGAGCTCGGCGCGCCTGCAG(SEQ ID NO:28))，通过PCR将pETDuet_skp进行直链化。使用In-Fusion HD克隆试剂盒，对通过PCR扩增的CEA-V2122和直链化的pETDuet_skp进行克隆。根据测序进行所插入的基因序列的确认，所克隆的载体为pETDuet_HER-V2122_skp。
为了蛋白表达，将pETDuet_HER2-V2122_skp转化至BL21(DE3)(Nippon Gene公司)，在2×YT培养基(SIGMA-ADLRICH公司)中于37℃下进行一夜的预培养。将已进行预培养的培养基添加至新的培养基中使其稀释100倍，在37℃下进行培养直至OD(600nm)＝0.5～2.0。接下来，添加最终浓度为0.5mM的IPTG，在37℃下培养4小时，回收培养上清，之后在4℃下保存。
对于HER2-V2122蛋白，利用附加在C末端的6×His-Tag，通过批量法进行粗纯化。具体而言，将用缓冲液A(50mM TrisHCl、0.2M NaCl、1mM EDTA、5mM咪唑、pH8.0)进行了平衡化的cOmplete His-Tag Purification Resin添加在于4℃下保存的培养上清中，在4℃下搅拌2小时～一夜，进行与树脂的蛋白结合处理。接下来，将树脂回收到柱中，用缓冲液A进行20倍柱容量的洗涤操作。之后，用缓冲液B(50mM TrisHCl、0.2MNaCl、1mM EDTA、400mM咪唑、pH8.0)洗脱，回收HER2-V2122的粗纯化物。
接下来，利用蛋白L柱对粗纯化物进行纯化。具体而言，将1mL Capto L(GEHealthcare)填充至PD-10柱，用10倍柱体积的PBS进行平衡化后，加载上述的粗纯化物，用10倍柱体积的PBS洗涤，之后用10mM甘氨酸盐酸(pH2.0)洗脱，利用Vivaspin Turbo 15(MWCO 100,000)进行离心浓缩。再使用PD-10(GE Healthcare)，进行向PBS的缓冲液置换，再利用Vivaspin Turbo 4(MWCO 100,000)进行离心浓缩，制成最终纯化物。通过CBB染色对纯化物进行四聚体HER2-V2122的纯度检测，结果见图16。SDS-PAGE凝胶使用Mini-PROTEANTGX 4-15％(Bio-Rad公司)，CBB染色液使用Bullet CBB Stain One(Ready To Use)(Nacalai Tesque公司)。
由图16确认到：所纯化的HER2-V2122以约150kDa的四聚体作为主要成分。
实施例8：HER2-V2122在SPR中的性能评价
使用表面等离子共振(SPR)测定装置：Biacore T200(GE Healthcare LifeSciences公司)，实施HER2-V2122与抗原CEACAM5的亲和性。具体而言，使用胺偶联试剂盒(GE Healthcare Life Sciences公司)，将ErbB2/Fc嵌合、人、重组体、无载体(R&DSYSTEMS、1129-ER-050)在传感器芯片CM5(GE Healthcare Life Sciences公司)上进行固定化操作，配体的最终固定化量为279RU。另外，所纯化的HER2-V2122调整成1E-08M～6.25E-10M的2倍稀释系列，作为分析物。相互作用分析通过单循环动力学分析获取数据。使用Biacore T200评估软件2.0版，以BivalentAnalyze模式对所得数据实施曲线拟合，得到了ka1＝3.857E+5、kd1＝1.710E-6的值。另外，在Bivalent Analyze中，可通过KD＝kd1/ka1进行评价，因此得到了KD＝kd1/ka1＝1.710E-6/3.857E+5＝4.433E-12的评价值。它们的结果见图17。
由图17所示的传感图和所计算的KD值确认到：HER-V2122识别ErbB2，并与其强力结合。
另外，HER2-V2122与生物素修饰体(制造例1、化学式17所示的化合物)的相互作用分析也利用Biacore T200来实施。具体而言，使用胺偶联试剂盒，对传感器芯片CM5设定成目标值5000RU，进行所纯化的HER2-V2122的固定化。分析物的浓度使用1E-08M～6.25E-10M的2倍稀释系列的5种。相互作用分析通过单循环动力学分析获得数据。使用Biacore T200评估软件2.0版，以Bivalent Analyze模式对所得数据实施曲线拟合，得到了ka1＝1.4E+4、kd1＝1.0E-3的值。另外，在Bivalent Analyze中，可通过KD＝kd1/ka1进行评价，因此得到了KD＝kd1/ka1＝kd1＝1.0E-3/1.4E+4＝7.4E-8的评价值。它们的结果见图18。
实施例9：使用了HER2-V2122和光活化化合物标记生物素修饰体的体外细胞毒性试验
使用光活化化合物标记生物素修饰体、化合物1、化合物2和化合物3，实施细胞毒性试验。这些化合物是申请号：日本特愿2018-149295中记载的化合物。化合物1、化合物2和化合物3见图9。具体而言，将用包含10％FBS的McCoy’s培养基培养的SK-BR-3细胞接种在细胞培养用96孔板上，使细胞数达到5.0×103个细胞/孔、培养液达到50μL/孔，培养一夜。CEA-V2122与光活化化合物标记生物素修饰体的复合物溶液以CEA-V2122与各化合物的摩尔比达到1:2的方式混合，在室温下进行10分钟的培养，用培养液进行浓度调整，使HER2-V2122的最终浓度达到10μg/mL。稀释系列以20μg/mL作为开始浓度，4倍稀释系列为4个系列(5.0μg/mL、1.25μg/mL、0.312μg/mL、0.078μg/mL)，制成5个系列的复合物稀释系列溶液。另外，只以不含复合物的培养基作为零对照。
在培养了一夜的细胞中，以50μL/孔向各孔中分别添加复合物稀释系列溶液使最终浓度达到10μg/mL、2.5μg/mL、0.625μg/mL、0.156μg/mL、0.039μg/mL。在复合物添加、1小时后、2小时后，使用发出690±10nm的波长的光的LED，对细胞照射光使达到100J/cm2。之后，培养48小时，使用细胞计数试剂盒-8(同仁化学公司)，进行活细胞数的比较。各条件设为n＝3。用法用量按照操作说明书，在试剂添加1.5小时于37℃、CO2培养箱中进行培养，之后测定450nm的吸光度，计算平均值，背景校正后，以对照作为100％，计算各条件下的细胞生长与对照的比例。其结果见图19。
由图19的结果确认到：HER2-Cupid与光活化化合物标记生物素修饰体的复合物，浓度依赖性地具有细胞毒性。
SEQ ID NO:12
AEAGITGTWSDQLGDTFIVTAGADGALTGTYENAVGGAESRYVLTGRYDSAPATDGSGTALGWTVAWKNNSKNAHSATTWSGQYVGGADAKINTQWLLTSGTTNANAWKSTLVGHDTFTKVKPSAASHHHHHH
SEQ ID NO:13(sm3E-scFv序列)
QVKLEQSGAEVVKPGASVKLSCKASGFNIKDSYMHWLRQGPGQRLEWIGWIDPENGDTEYAPKFQGKATFTTDTSANTAYLGLSSLRPEDTAVYYCNEGTPTGPYYFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSENVLTQSPSSMSVSVGDRVNIACSASSSVPYMHWLQQKPGKSPKLLIYLTSNLASGVPSRFSGSGSGTDYSLTISSVQPEDAATYYCQQRSSYPLTFGGGTKLEIK
SEQ ID NO:14
QVKLEQSGAEVVKPGASVKLSCKASGFNIKDSYMHWLRQGPGQRLEWIGWIDPENGDTEYAPKFQGKATFTTDTSANTAYLGLSSLRPEDTAVYYCNEGTPTGPYYFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSENVLTQSPSSMSVSVGDRVNIACSASSSVPYMHWLQQKPGKSPKLLIYLTSNLASGVPSRFSGSGSGTDYSLTISSVQPEDAATYYCQQRSSYPLTFGGGTKLEIKGGGGSGGGGAEAGITGTWSDQLGDTFIVTAGADGALTGTYENAVGGAESRYVLTGRYDSAPATDGSGTALGWTVAWKNNSKNAHSATTWSGQYVGGADAKINTQWLLTSGTTNANAWKSTLVGHDTFTKVKPSAASHHHHHH
SEQ ID NO:15
MKYLLPTAAAGLLLLAAQPAMAQVKLEQSGAEVVKPGASVKLSCKASGFNIKDSYMHWLRQGPGQRLEWIGWIDPENGDTEYAPKFQGKATFTTDTSANTAYLGLSSLRPEDTAVYYCNEGTPTGPYYFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSENVLTQSPSSMSVSVGDRVNIACSASSSVPYMHWLQQKPGKSPKLLIYLTSNLASGVPSRFSGSGSGTDYSLTISSVQPEDAATYYCQQRSSYPLTFGGGTKLEIKGGGGSGGGGAEAGITGTWSDQLGDTFIVTAGADGALTGTYENAVGGAESRYVLTGRYDSAPATDGSGTALGWTVAWKNNSKNAHSATTWSGQYVGGADAKINTQWLLTSGTTNANAWKSTLVGHDTFTKVKPSAASHHHHHH
SEQ ID NO:16
ATGAAATATCTGCTGCCGACCGCAGCAGCGGGTCTGCTGCTGCTGGCAGCACAGCCTGCAATGGCACAGGTTAAACTGGAACAGAGCGGTGCCGAAGTTGTTAAACCGGGTGCAAGCGTTAAACTGAGCTGTAAAGCAAGCGGCTTTAACATCAAAGATAGCTATATGCATTGGCTGCGTCAGGGTCCGGGTCAGCGTCTGGAATGGATTGGTTGGATTGATCCGGAAAATGGTGATACCGAATATGCACCGAAATTTCAGGGTAAAGCAACCTTTACCACCGATACCAGCGCAAATACCGCATATCTGGGTCTGAGCAGCCTGCGTCCGGAAGATACCGCAGTGTATTATTGTAATGAAGGCACCCCGACCGGTCCGTATTATTTCGATTATTGGGGTCAGGGCACCCTGGTTACCGTTAGCAGCGGTGGTGGTGGTAGTGGTGGCGGTGGTTCAGGCGGTGGCGGTAGCGAAAATGTTCTGACCCAGAGCCCGAGCAGCATGAGCGTTAGCGTTGGTGATCGTGTTAATATTGCATGTAGCGCAAGCAGCAGCGTTCCGTACATGCACTGGCTGCAGCAGAAACCGGGTAAAAGCCCGAAACTGCTGATTTATCTGACCAGCAATCTGGCAAGCGGTGTTCCGAGCCGTTTTAGCGGTAGCGGTAGTGGCACCGATTATAGCCTGACCATTAGCAGCGTGCAGCCTGAAGATGCAGCAACCTATTATTGTCAGCAGCGTAGCAGTTATCCGCTGACCTTTGGTGGTGGCACCAAACTGGAAATTAAAGGGGGTGGTGGCTCAGGTGGCGGAGGTGCAGAAGCAGGTATTACCGGTACATGGTCAGATCAGCTGGGTGATACCTTTATTGTTACCGCAGGCGCAGATGGTGCACTGACCGGCACCTATGAAAATGCAGTTGGTGGTGCAGAAAGCCGTTATGTGCTGACCGGTCGTTATGATAGCGCACCGGCAACCGATGGTAGCGGCACCGCACTGGGTTGGACCGTTGCATGGAAAAATAACAGCAAAAATGCACATAGCGCAACCACCTGGTCAGGTCAGTATGTGGGTGGTGCCGATGCCAAAATTAACACCCAGTGGCTGCTGACCAGCGGTACAACCAATGCAAATGCCTGGAAAAGTACCCTGGTTGGTCATGATACATTCACCAAAGTTAAACCGAGCGCAGCAAGCCATCATCATCACCATCATTAA
SEQ ID NO:17
MDKIAIVNMGSLFQQVAQKTGVSNTLENEFKGRASELQRMETDLQAKMKKLQSMKAGSDRTKLEKDVMAQRQTFAQKAQAFEQDRARRSNEERGKLVTRIQTAVKSVANSQDIDLVVDANAVAYNSSDVKDITADVLKQVK
SEQ ID NO:18
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIK
SEQ ID NO:19
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKGGGGGSGGGGGAEAGITGTWSDQLGDTFIVTAGADGALTGTYENAVGGAESRYVLTGRYDSAPATDGSGTALGWTVAWKNNSKNAHSATTWSGQYVGGADAKINTQWLLTSGTTNANAWKSTLVGHDTFTKVKPSAASHHHHHH
SEQ ID NO:20
MKYLLPTAAAGLLLLAAQPAMAEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKGGGGGSGGGGGAEAGITGTWSDQLGDTFIVTAGADGALTGTYENAVGGAESRYVLTGRYDSAPATDGSGTALGWTVAWKNNSKNAHSATTWSGQYVGGADAKINTQWLLTSGTTNANAWKSTLVGHDTFTKVKPSAASHHHHHH
SEQ ID NO:21
ATGAAATATCTGCTGCCGACCGCAGCAGCGGGTCTGCTGCTGCTGGCAGCACAGCCTGCAATGGCAGAAGTTCAGCTGGTTGAAAGCGGTGGTGGTCTGGTTCAGCCTGGTGGTAGCCTGCGTCTGAGCTGTGCAGCAAGCGGTTTTAACATTAAAGATACCTATATTCATTGGGTGCGTCAGGCACCTGGTAAAGGTCTGGAATGGGTTGCACGTATTTATCCGACCAATGGTTATACCCGTTATGCCGATAGCGTTAAAGGTCGTTTTACCATTAGCGCAGATACCAGCAAAAATACCGCATACCTGCAGATGAATAGTCTGCGTGCAGAGGATACCGCAGTGTATTATTGTAGCCGTTGGGGTGGTGATGGTTTTTATGCAATGGATTATTGGGGTCAGGGCACCCTGGTTACCGTTAGCTCAGGTGGAGGCGGTTCCGGTGGCGGAGGTTCCGGTGGAGGTGGCTCCGGTGGCGGAGGTTCCGATATTCAGATGACCCAGAGTCCGAGCAGCCTGAGCGCAAGCGTTGGTGATCGTGTGACCATTACCTGTCGTGCAAGCCAGGATGTTAATACAGCAGTTGCATGGTATCAGCAGAAACCGGGTAAAGCACCGAAACTGCTGATTTATAGCGCAAGCTTTCTGTATAGCGGTGTTCCGAGCCGTTTTAGCGGTAGCCGTAGCGGCACCGATTTTACCCTGACCATTAGCAGCCTGCAGCCGGAAGATTTTGCAACCTATTATTGTCAGCAGCATTACACCACACCGCCTACCTTTGGCCAGGGCACCAAAGTTGAAATTAAAGGAGGTGGCGGTGGATCCGGCGGAGGTGGCGGAGCAGAAGCAGGTATTACCGGTACATGGTCAGATCAGCTGGGTGATACCTTTATTGTTACCGCAGGCGCAGATGGTGCACTGACCGGCACCTATGAAAATGCAGTTGGTGGTGCAGAAAGCCGTTATGTGCTGACCGGTCGTTATGATAGCGCACCGGCAACCGATGGTAGCGGCACCGCACTGGGTTGGACCGTTGCATGGAAAAATAACAGCAAAAATGCACATAGCGCAACCACCTGGTCAGGTCAGTATGTGGGTGGTGCCGATGCCAAAATTAACACCCAGTGGCTGCTGACCAGCGGTACAACCAATGCAAATGCCTGGAAAAGTACCCTGGTTGGTCATGATACATTCACCAAAGTTAAACCGAGCGCAGCAAGCCATCATCATCACCATCATTAA
SEQ ID NO:22
GGGGSGGGG
SEQ ID NO:23
AAGGAGATATACATATGGATAAAATTGCCATTGTTAATAT
SEQ ID NO:24
TTGAGATCTGCCATATGTTATTTCACTTGTTTCAGAACG
SEQ ID NO:25
AGAAGGAGATATACCATGAAATATCTGCTGCCGAC
SEQ ID NO:26
CGCCGAGCTCGAATTTTAATGATGGTGATGATGATG
SEQ ID NO:27
GGTATATCTCCTTCTTAAAGTTAAAC
SEQ ID NO:28
AATTCGAGCTCGGCGCGCCTGCAG
SEQ ID NO:29
GGGGGSGGGGG。
Figure IDA0002942179210000011
Figure IDA0002942179210000021
Figure IDA0002942179210000031
Figure IDA0002942179210000041
Figure IDA0002942179210000051
Figure IDA0002942179210000061
Figure IDA0002942179210000071
Figure IDA0002942179210000081
Figure IDA0002942179210000091
Figure IDA0002942179210000101
Figure IDA0002942179210000111
Figure IDA0002942179210000121
Figure IDA0002942179210000131
Figure IDA0002942179210000141
Figure IDA0002942179210000151
Figure IDA0002942179210000161

Claims (13)

1.下述式(1)所示的化合物或其盐与酞菁染料的缀合物：
[化学式1]
Figure DEST_PATH_IMAGE001
式中，
X1a、X1b、X2a和X2b分别独立地表示O或NH，
Y1和Y2分别独立地表示C或S，
Z1和Z2分别独立地表示O、S或NH，
V1和V2分别独立地表示S或S+-O-，n1和n2分别独立地表示0或1的整数，
L1和L2分别独立地表示二价连接基，
L3是在末端包含可与酞菁染料结合的官能团的基团，
L4表示三价连接基。
2.权利要求1所述的缀合物，其中，下述式(1)所示的化合物由下述式(2)所示：
[化学式2]
Figure 348400DEST_PATH_IMAGE002
式中的各符号的含义与权利要求1同义。
3.权利要求1或2所述的缀合物，其中，X1a、X1b、X2a和X2b表示NH，Y1和Y2表示C，Z1和Z2表示NH，V1和V2表示S。
4.权利要求1～3中任一项所述的缀合物，其中，L1和L2分别独立地是由选自-CONH-、-NHCO-、-COO-、-OCO-、-CO-、-O-和碳原子数为1～10的亚烷基的基团的组合构成的二价连接基。
5.权利要求1～4中任一项所述的缀合物，其中，L3是由选自-CONH-、-NHCO-、-COO-、-OCO-、-CO-、-O-和碳原子数为1～10的亚烷基的基团的组合构成的基团，并且是在末端包含氨基的基团。
6.权利要求1～5中任一项所述的缀合物，其中，酞菁染料由下述式(21)所示：
[化学式3]
Figure DEST_PATH_IMAGE003
式中，L21表示二价连接基，R21表示可与式(1)所示的化合物或其盐结合的官能团，X和Y分别独立地是亲水性基团、-OH、氢原子或取代基。
7.权利要求6所述的缀合物，其中，X和/或Y所示的亲水性基团如下：
[化学式4]
Figure 265541DEST_PATH_IMAGE004
。
8.权利要求6或7所述的缀合物，其中，L21是由选自-CONH-、-NHCO-、-COO-、-OCO-、-CO-、-O-和碳原子数为1～10的亚烷基的基团的组合构成的基团。
9.权利要求6～8中任一项所述的缀合物，其中，R21为活性酯基。
10.以下的任一种缀合物：
[化学式5]
Figure DEST_PATH_IMAGE005
化合物1
[化学式6]
Figure 514119DEST_PATH_IMAGE006
化合物2
[化学式7]
Figure DEST_PATH_IMAGE007
化合物3。
11.治疗剂，其包含权利要求1～10中任一项所述的缀合物。
12.治疗试剂盒，其包含：(1) 权利要求1～10中任一项所述的缀合物；以及(b)包含SEQID NO: 1所记载的氨基酸序列的链霉亲和素突变体与分子探针的缀合物。
13.权利要求12所述的治疗试剂盒，其中，分子探针为抗EREG抗体、抗CEA抗体或抗HER2抗体。
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