CN105418643B

CN105418643B - 一种双边生物素‑酞菁锌轭合物及其制备和应用

Info

Publication number: CN105418643B
Application number: CN201510965995.XA
Authority: CN
Inventors: 刘见永; 侯雪妮; 叶发荣; 薛金萍
Original assignee: Fuzhou University
Current assignee: Fuzhou University
Priority date: 2015-12-22
Filing date: 2015-12-22
Publication date: 2017-10-20
Anticipated expiration: 2035-12-22
Also published as: CN105418643A

Abstract

本发明公开了一种双边生物素‑酞菁锌轭合物及其制备和应用。本发明利用生物素—细胞促进生长因子（它是细胞维持正常功能、生长和繁殖的关键微量营养物质）作为肿瘤靶点，将其共价连接到可用于光动力治疗的酞菁锌光敏剂上，从而得到了可用于靶向治疗的第三代抗癌光敏剂。同时本发明以该生物素取代酞菁锌衍生物为研究对象，分别以人乳腺癌细胞MCF‑7和人胚肺成纤维细胞HELF为受试细胞株，展开了其体外抗癌活性研究，筛选出适合于分子靶向治疗的前药，为生物素取代酞菁锌衍生物应用于靶向治疗癌症奠定了基础。且此类化合物合成方法比较简单，原料易得，成本低，副反应少，产率较高，易提纯，有利于工业化生产。

Description

一种双边生物素-酞菁锌轭合物及其制备和应用

技术领域

本发明属于抗癌药物设计、合成领域，具体涉及一种双边生物素-酞菁锌轭合物及其制备和应用。

背景技术

癌症已日渐成为人类健康的第一杀手，它严重威胁着人们的健康。光动力治疗(Photodynamic Therapy，PDT)是继手术、化疗和放疗等三大传统肿瘤治疗手段之后的新型癌症治疗技术，是激光、医学、生物和化学的一个重要新型交叉学科和研究领域。光动力治疗是富集于病变组织的光敏剂被一定波长的光激发后经过一系列的光物理和光化学反应，使组织中的氧分子转变成具有细胞毒性的活性氧(Reactive Oxygen Species，ROS)，从而实现对病变细胞和组织的破坏，是治疗肿瘤与非肿瘤疾病的一种新手段。光动力治疗是基于对光敏剂的使用与控制：光敏剂能选择性地滞留在肿瘤细胞中，富集后用一定波长的光激发使其产生光动力反应，从而杀死癌细胞。完整的光动力治疗包含三个部分：光敏剂、光和分子氧，三要素相互作用，缺一不可。其中，光敏剂是光动力治疗的核心部分，对光动力治疗效果有直接的决定性作用。由于传统的第一、二代光敏剂存在一些缺点，如：组分不明、结构不确定、对肿瘤的选择性差、靶向性不足等。因此，在第二代光敏剂的基础上，提出第三代光敏剂，主要是针对第二代光敏剂的缺点设计的，是第二代光敏剂的衍生物。酞菁(Phthalocyanine，Pc) 是具有代表性的第二代光敏剂，是卟啉合成衍生物，属于苯并氮杂卟啉范畴(苯并四氮杂卟啉)。酞菁配合物在长波红光区(670 nm-770 nm)具有很强的吸收，摩尔消光系数大(2.5×10⁵ M^-1·cm^-1），光热稳定性好，单线态氧量子产率高。某些中心金属原子的引入可以提高光敏剂激发三线态的寿命，有利于单线态氧的产生。适当取代基的引入能使其吸收光谱进一步红移。由于酞菁良好的光物理和光化学性质以及化学可修饰性强，在光动力治疗研究领域备受亲睐。

靶向治疗是指药物只作用于肿瘤组织或细胞而对正常部位无影响。药物对肿瘤组织的选择性可以通过多种方式来实现，包括被动靶向和主动靶向。主动靶向主要是在药物载体表面经修饰引入某种靶向基团或直接将药物和靶向基团共轭相连，如常用的靶向基团有 DNA/RNA 片段、单克隆抗体、多肽、糖类、脂蛋白、维生素类等，这些靶向基团与肿瘤细胞表面过度表达的受体或基因片段具有很强的特异性亲和作用和识别功能。受体介导的靶向药物传输系统利用某些组织特有的或肿瘤细胞过度表达的受体，通过受体介导的内吞作用将药物靶向转运到特定的组织或细胞，具有特异性高、亲和力强的特点，大大提高了药物转运效率。

小分子靶向基团具有大分子靶向基团所不具备的诸多优点，它们的可修饰性强，分子纯化简单、生物相容性好和靶向广谱性。生物素属于水溶性的维生素，是生物体维持正常功能的必要营养物质，研究表明其在繁殖和生长旺盛的组织需求量更大，尤其是肿瘤细胞，并且它们对应的受体表达量也较正常组织或细胞更高。通过共价键将其与酞菁锌光敏剂键连在一起，以期将光动力治疗与靶向性癌症治疗相结合，实现对癌症的有效治疗。

发明内容

本发明的目的在于提供一种双边生物素-酞菁锌轭合物及其制备和应用，通过将小分子靶向配体生物素引入至光敏剂酞菁锌上，从而增加肿瘤组织对光敏剂的靶向性摄取，得到了一种具有较好靶向性，较高生物相容性，毒副作用较小的新药；本发明合成的化合物结构单一且不存在异构体，产品容易提纯；合成方法比较简单，副反应少，产率较高，原料易得，成本低，有利于工业化生产。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种双边生物素-酞菁锌轭合物，其化学结构式为：

（Ⅰ）。

一种制备双边生物素-酞菁锌轭合物的方法，具体合成步骤为：

（1）将2当量的氢化钠均匀分散于无水四氢呋喃中，再将化合物（Ⅳ）的四氢呋喃溶液缓慢加入到上述反应液中，搅拌片刻后加入2当量的溴丙炔，氮气保护下60 ℃反应过夜，TLC检测反应完全，待反应液冷却至室温后加入少量水，搅拌片刻后，减压旋蒸除去THF，用二氯甲烷和水萃取，合并有机相并用无水Na₂SO₄干燥，减压旋蒸除去溶剂，以二氯甲烷-甲醇为洗脱剂，经硅胶色谱柱纯化得蓝绿色固体化合物（Ⅱ）；

（2）将D-(+)生物素加入到10 mL DMF中，再依次加入1.2当量的EDCI（1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐）和1.1当量的NHS（N-羟基丁二酰亚胺），氮气保护下反应24小时，TLC检测反应完全后，减压旋蒸除去DMF，剩余白色固体粉末用甲醇洗涤数次后真空干燥得活化中间体；

将活化中间体加入到10 mL DMF中，加入1.2当量的三乙胺和1当量的化合物（Ⅴ），氮气保护下反应24小时，TLC检测反应完全；减压旋蒸除去DMF，剩余物用二氯甲烷和水萃取，合并有机相并用无水Na₂SO₄干燥，减压旋蒸除去溶剂，以二氯甲烷-甲醇为洗脱剂经硅胶色谱柱纯化得白色固体产物（Ⅲ）；（化合物（Ⅲ）参考以下文献合成： Klein, E.; Kerth, P.; Lebeau, L. Enhancedselective immobilization of biomolecules onto solid supports coated withsemifluorinated self-assembled monolayers. Biomaterials 2008, 29 (2), 204-14.

（3）将化合物（Ⅱ）、化合物（Ⅲ）按摩尔比1:2.5加入至7 mL CHCl₃、乙醇和水的混合液中(12:1:1，v/v/v)，然后再将0.1-1当量的CuSO₄·5H₂O、0.2-2当量的抗坏血酸钠加入至混合液中，室温下剧烈搅拌24小时；TLC检测反应完全后，将反应液用二氯甲烷和水萃取；有机层经无水Na₂SO₄ 干燥后减压旋干除去溶剂；然后以二氯甲烷-甲醇(15:1，v/v)为洗脱剂，硅胶柱层析分离纯化后，用二氯甲烷-甲醇-石油醚（10:1:50，v/v/v）重结晶得到蓝绿色固体化合物（Ⅰ）。

如上所述的轭合物在制备分子靶向抗癌光敏药物中的应用，用于光动力治疗。

本发明合成了一个在近红外区具有较强吸收的酞菁锌衍生物，通过共价连接将小分子靶向配体——生物素连接到酞菁锌母体上，从而增加了其生物相容性和靶向性。

本发明的显著优点在于：

（1）本发明将生物素连接到酞菁光敏剂上，能够增强肿瘤细胞或组织对酞菁光敏剂的靶向性摄取，同时也可以增加其生物相容性；

（2）本发明合成的双边生物素-酞菁锌轭合物，其最大吸收波长位于690 nm，较无取代酞菁锌红移了20 nm，其组织穿透能力更强，光动力治疗时皮肤光毒性明显降低，是较为理想的抗癌光敏剂；

（2）本发明的合成方法目标化合物结构单一，不存在异构体，产物容易分离和纯化；合成方法简单，原料易得，副反应少，生产成本低，有利于工业化生产。

附图说明

图1 加入生物素（Biotin）前后，双边生物素-酞菁锌轭合物（ZnPc-Biotin）在MCF-7细胞中的摄取变化；

图2生物素（Biotin）（2.5 mM）存在下双边生物素-酞菁锌轭合物（ZnPc-Biotin）对MCF-7细胞光毒性的影响（**表示P＜0.01）。

具体实施方式

具有靶向光动力抗癌活性的双边生物素-酞菁锌轭合物的具体制备过程包括：

（1）将2当量的氢化钠均匀分散于无水四氢呋喃（THF）中，再将化合物（Ⅳ）的THF溶液缓慢加入到上述反应液中，搅拌片刻后加入2当量的溴丙炔，氮气保护下60℃反应过夜，TLC检测反应完全，待反应液冷却至室温后加入少量水，搅拌片刻后，减压旋蒸除去THF，用二氯甲烷和水萃取，合并有机相并用无水Na₂SO₄干燥，减压旋蒸除去溶剂，以二氯甲烷-甲醇(30:1，v/v)为洗脱剂，经硅胶色谱柱纯化得蓝绿色固体化合物（Ⅱ），产率98%；

（2）将D-(+)生物素加入到10 mL DMF中，再依次加入1.2当量的EDCI和1.1当量的NHS，氮气保护下反应24小时，TLC检测反应完全后，减压旋蒸除去DMF，剩余白色固体粉末用甲醇洗涤数次后真空干燥得活化中间体，产率98%；将活化中间体加入到10 mL DMF中，加入1.2当量的三乙胺和1当量的化合物（Ⅴ），氮气保护下反应24小时，TLC检测反应完全；减压旋蒸除去DMF，剩余物用二氯甲烷和水萃取，合并有机相并用无水Na₂SO₄干燥，减压旋蒸除去溶剂，以二氯甲烷-甲醇(15:1，v/v)为洗脱剂，经硅胶色谱柱纯化得白色固体化合物（Ⅲ），产率78%；

（3）将化合物（Ⅱ）和（Ⅲ）按摩尔比1:2.5加入至7 mL CHCl₃、乙醇和水的混合液中(12:1:1，v/v/v)，然后再将0.1-1当量的CuSO₄·5H₂O、0.2-2当量的抗坏血酸钠加入至混合液中，室温下剧烈搅拌24小时；TLC检测反应完全后，将反应液用二氯甲烷和水萃取；有机层经无水Na₂SO₄ 干燥后减压旋干除去溶剂；然后以二氯甲烷-甲醇(15:1，v/v)为洗脱剂，硅胶柱层析分离纯化后，用二氯甲烷-甲醇-石油醚（10:1:50，v/v/v）重结晶得到蓝绿色固体化合物（Ⅰ），产率44%。

以下几个实施例进一步阐述本发明，但是本发明不仅限于此。

实施例1

（1）将氢化钠(18 mg，0.44 mmol)均匀分散于无水THF中，再将化合物（Ⅳ）(195mg，0.20 mmol)的THF溶液缓慢加入到上述反应液中，搅拌片刻后加入溴丙炔(34 μL，0.44mmol)，氮气保护下60 ℃反应过夜，TLC检测反应完全，待反应液冷却至室温后加入少量水，搅拌片刻后，减压旋蒸除去THF，用二氯甲烷和水萃取，合并有机相并用无水Na₂SO₄干燥，减压旋蒸除去溶剂，以二氯甲烷-甲醇(30:1，v/v)为洗脱剂，经硅胶色谱柱纯化得蓝绿色固体化合物（Ⅱ）：，(215 mg，98%)；¹H NMR (400MHz, CDCl₃和少量C₅D₅N): δ 9.36-9.40 (m, 4 H, Pc-H_α), 9.29 (d, J = 6.8 Hz, 2 H,Pc-H_α), 8.08-8.15 (m, 6 H, Pc-H_β), 7.45 (s, 2 H, Pc-H_β), 4.92(t, J = 5.0 Hz, 4H, CH₂), 4.51 (t, J = 5.0 Hz, 4 H, CH₂), 4.12-4.14 (m, 8 H, CH₂ and CH₂-C≡C),3.86 (t, J = 4.8 Hz, 4 H, CH₂), 3.71 (t, J = 4.8 Hz, 4 H, CH₂), 3.63-3.65 (m,12 H, CH₂), 2.38 (t, J = 2.0 Hz, 2H, -C≡CH); HRMS (ESI) calcd for C₅₄H₅₂N₈O₁₀Zn[M+H]⁺, 1037.3171, found 1037.3154；

（2）将D-(+)生物素(320 mg，1.31 mmol)加入到10 mL DMF中，再依次分别加入EDCI(301 mg，1.57 mmol)和NHS(166 mg，1.44 mmol)，氮气保护下反应24小时，TLC检测反应完全后，减压旋蒸除去DMF，剩余白色固体粉末用甲醇洗涤数次后真空干燥得活化中间体(437 mg，98%)；

将活化中间体(257 mg，0.73 mmol)加入到10 mL DMF中，加入三乙胺(204 μL，1.46 mmol)和化合物（Ⅴ）(191 mg，1.10 mmol)，氮气保护下反应24小时，TLC检测反应完全；减压旋蒸除去DMF，剩余物用二氯甲烷和水萃取，合并有机相并用无水Na₂SO₄干燥，减压旋蒸除去溶剂，以二氯甲烷-甲醇(15:1，v/v)为洗脱剂，经硅胶色谱柱纯化得白色固体化合物（Ⅲ）：，(227 mg，78%)；

（3）将化合物（Ⅱ） (376 mg，0.37 mmol)和化合物（Ⅲ）(370 mg，0.93 mmol)按摩尔比1:2.5加入至7 mL CHCl₃、乙醇和水的混合液中(12:1:1，v/v/v)，然后再加入CuSO₄·5H₂O (13 mg，0.05 mmol)和抗坏血酸钠(26 mg，0.13 mmol)，所得混合物加毕，于室温下剧烈搅拌24小时；TLC检测反应完全后，将反应液用二氯甲烷和水萃取，有机层经无水Na₂SO₄干燥后减压旋干除去溶剂，然后以二氯甲烷-甲醇(15:1，v/v)为洗脱剂，硅胶柱层析分离纯化后，用二氯甲烷-甲醇-石油醚（10:1:50，v/v/v）重结晶得到蓝绿色固体化合物（Ⅰ）：，(49 mg，44%)；¹HNMR (400 MHz, CDCl₃ 和少量 C₅D₅N): δ 9.22-9.36 (m, 6 H, Pc-H_α), 8.08-8.11 (m,6 H, Pc-H_β), 7.59 (s, 2 H, Triazole-H), 7.41 (br s, 2 H, Pc-H_β), 6.65 (s, 2 H,NCONH-), 6.26 (s, 2 H, -NHCON), 5.37 (s, 2 H, -NHCO-), 4.88 (br s, 4 H, CH₂),4.46 (br s, 8 H, CH₂), 4.33 (br s, 4 H, CH₂), 4.23 (t, J = 5.8 Hz, 2 H, CHN),4.05-4.09 (m, 6 H, CH₂ and CHN), 3.81 (br s, 4 H, CH₂), 3.66 (br s, 8 H, CH₂),3.54 (br s, 12 H, CH₂), 3.33-3.37 (m, 12 H, CH₂), 3.25 (t, J = 4.2 Hz, 4 H,CH₂), 2.89 (m, 2 H, CH), 2.69 (dd, J = 8.0, 4.8 Hz, 2 H, CH₂), 2.53 (d, J =8.4 Hz, 2 H, CH₂), 2.01 (t, J = 7.0 Hz, 4 H, CH₂), 1.42-1.51 (m, 8 H, CH₂),1.19-1.25 (m, 4 H, CH₂); HRMS (ESI) calcd for C₈₆H₁₀₈N₂₀O₁₈S₂Zn [M+2H] ²⁺920.3519, found 920.3513。

应用实施例 1

对本发明制得的双边生物素-酞菁锌轭合物的离体抗癌活性进行了研究，该实验能为以后在体实验提供一定的参考价值，具有较重要的意义。光敏剂的细胞毒性实验包括光毒性和暗毒性两部分，本实验采用经典的MTT法 (四氮唑盐还原法)进行测定。MTT(即3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐）是一种黄色染料，常用于活细胞的检测。该方法的检测原理是活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为不溶于水的蓝紫色结晶甲瓒并沉积在细胞中，而死细胞中并无琥珀酸脱氢酶不能将MTT还原，因此不会产生甲瓒。甲瓒的生成量与活细胞数成正比。用DMSO(二甲基亚砜)溶解活细胞产生的甲瓒，用酶标仪测定其在570 nm波长处的吸收值(即OD值)，可间接反映活细胞数量，OD值越大则说明活细胞越多，相应的药物对细胞的杀伤力效果差；反之则药物活性较好。

MTT实验：取生长状态良好的人乳腺癌细胞MCF-7和人胚肺成纤维细胞HELF，用0.25%胰酶消化传代，用RPMI-1640培养基(含10%小牛血清)配制3×10⁴ cells/mL细胞悬液，将每孔100 μl接种于96孔培养板内，置37 ℃、5% CO₂培养箱内培养过夜，贴壁后加药；实验设空白对照组(空白对照组是指对照组除了不加药物溶液外，其他条件与受试样品组一致)和溶剂对照组(溶剂对照组是指对照组不加细胞，其他条件与受试样品组一致)。将双边生物素-酞菁锌轭合物预先配制为DMSO(含5%蓖麻油)储备液，所有药液配制后均经有机膜过滤(0.22 µm)，使用时药物溶液用培养基稀释为不同浓度，终浓度中 DMSO的含量为1%。每个浓度设定6个复孔，每孔加入100 μl不同浓度的药物后置于培养箱内孵育24小时。

光毒实验：去除旧的培养基，换上100 μl新鲜培养基，然后用LED灯（波长为690nm）对细胞进行照射，照射能量密度为 1.5 J·cm^-2，照射时间20分钟。光照完毕后，将96孔板重置于37 ℃、5% CO₂的培养箱内，继续培养 (暗毒实验则在换完新鲜培养基后直接放入培养箱中继续培养，操作过程应避免光照)。24 h后，每孔加入10 μl 浓度为5 mg·mL^-1的MTT工作液，继续培养4小时后小心弃去上清液，每孔加入100 μl DMSO溶解甲瓒结晶，于摇床中摇晃15分钟使甲瓒完全溶解后，用酶标仪测定各孔在570 nm处的吸收值。

我们采用MTT法测定了实施例1中制备的双边生物素-酞菁锌轭合物分别在光照和无光照条件下，对人乳腺癌细胞MCF-7以及人胚肺成纤维细胞HELF的杀伤效果，光照波长为690 nm，光照能量密度为1.5 J·cm^-2。数据由平行三次独立实验得到，结果以Means±SD来表示。由实验数据可知：在无光照条件下，在药物浓度为1 μM时，双边生物素-酞菁锌轭合物对两种细胞均没有任何杀伤作用；在有光照条件下，该药物在1 μM时对人胚肺成纤维细胞HELF亦没有杀伤作用，而它们对人乳腺癌细胞MCF-7则表现出很强的体外光毒性，其半数抑制浓度(IC₅₀值)为43.76 nM(见表1)。该实验结果表明：经生物素修饰的酞菁锌衍生物对人乳腺癌细胞MCF-7表现出一定的靶向光动力抗癌活性。

表1 双边生物素-酞菁锌轭合物对MCF-7细胞的IC₅₀值

应用实施例2

为了验证双边生物素-酞菁锌轭合物

的靶向性，选择具有过度表达生物素受体的人乳腺癌细胞MCF-7和人胚肺成纤维细胞HELF（正常细胞）作为药物靶向性研究的细胞系，分别研究外源性生物素的加入对药物摄取和药物毒性的抑制作用，试图揭示肿瘤细胞对双边生物素-酞菁锌轭合物的摄取机制，验证双边生物素-酞菁锌轭合物靶向肿瘤细胞的可靠性。

（1）靶向摄取研究

具体实验方法和步骤：

处于对数生长且状态良好的细胞经消化后吹打均匀、计数，将细胞配成1×10⁵/mL的细胞悬液，向12孔板中各均匀加入1 mL，每种药物设3个复孔。置于5% CO₂、37 ℃培养箱中贴壁生长过夜。

贴壁后弃去上层培养基，向试验组每孔加入1 mL药物-抑制剂-培养基溶液（其中含0.95% DMSO，0.05% CEL），该体系中加入的抑制剂生物素浓度为2.5 mM，药物浓度为5 μM。向参照组每孔中加入1 mL培养基-药物溶液（其中含0.95% DMSO，0.05% CEL），且试验组和参照组中的药物浓度保持一致，同时设置空白对照实验（不加药物和抑制剂，只加含有0.95% DMSO，0.05% CEL的培养基）。放回培养箱中继续培养24 h。

弃去上层培养基，用PBS洗涤三次，彻底除去残余的药物。向各孔加入150 μL胰蛋白酶进行消化，吹打均匀后转移至1.5 mL离心管中，1000 r/min离心3 min，弃去上清液并用PBS洗涤，重复两次后加入100 μl无血清无酚红培养基。

将细胞轻轻吹打成单细胞均匀分散的细胞悬液，用流式细胞仪进行统计分析。选用APC-H通道进行荧光分析（激发波长为633 nm，发射波长为690 nm），每次进样体积为30 μl，每个样本执行10000个事件，分析速度为慢速。对试验组、参照组和空白对照组作半重叠全填充直方图。每个药物以相同条件重复实验三次。

由图1可知，加入外源性生物素后，具有过渡表达生物素受体的肿瘤细胞MCF-7对双边生物素-酞菁锌轭合物的摄取明显受到抑制。而无过渡表达受体的正常细胞HELF在加入生物素前后对双边生物素-酞菁锌轭合物的摄取没有明显影响。这说明MCF-7细胞对双边生物素-酞菁锌轭合物的摄取是在生物素受体介导作用下完成的。

（2）靶向光毒性研究：

具体实验方法和步骤：

取处于对数生长状态良好的细胞，经胰蛋白酶消化后吹打均匀，用培养基配制成密度为3×10⁴/mL的细胞悬液。向96孔板中每孔加入100 μl，每种药物设3个不同的的浓度梯度，每个浓度设6个平行复孔。置于5% CO₂、37 ℃培养箱中贴壁生长过夜。

细胞贴壁后向试验组每孔中加入100 μl药物-抑制剂-培养基溶液（含0.95%DMSO，0.05% CEL，生物素浓度为2.5 mM），同时相应于每个试验组设定参照组即加入药物-培养基溶液（含0.95% DMSO，0.05% CEL），阴性对照（空白孔）、阳性对照（不加药物，只含0.95% DMSO，0.05% CEL）和抑制剂对照组（不加药物，放回培养箱继续培养12 h。向各孔中加入100 μl新鲜培养基，用相应波长的LED灯照射20 min，而后继续培养24 h。

向各孔中加入10 μl 浓度为5 mg/mL的MTT工作液，培养4 h。弃去上层清夜，加入100 μl DMSO溶解结晶甲瓒，于摇床中摇晃15 min后用多功能酶标仪测定各孔在570 nm处的吸光度。相对于阳性对照组计算出试验组和抑制剂参照组细胞相对存活率Mean±SD，并用Graph-Pad prism 5.0作柱状图，在相同条件下重复3次平行实验。

细胞对光敏剂的摄取量直接影响细胞内产生ROS的水平，从而影响光敏剂对细胞的抑制率。从图2可知，外源性生物素的加入明显减弱了双边生物素-酞菁锌轭合物对MCF-7细胞的光动力杀伤作用，与无生物素实验组之间存在极显著差异（P＜0.01）。这主要是因为在游离生物素存在的情况下，双边生物素-酞菁锌轭合物在MCF-7细胞中的摄取被抑制，导致细胞内ROS水平降低，药物对MCF-7细胞的杀伤作用降低，细胞的存活率升高。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

Claims

1.一种双边生物素-酞菁锌轭合物，其特征在于：其化学结构式为：

（Ⅰ）。

2.一种制备如权利要求1所述的双边生物素-酞菁锌轭合物的方法，其特征在于：

以化合物（Ⅱ）和化合物（Ⅲ）为起始原料，合成化合物（Ⅰ）。

3.根据权利要求2所述的双边生物素-酞菁锌轭合物的制备方法，其特征在于：

所述的化合物（Ⅱ）是以化合物（Ⅳ）、溴丙炔和氢化钠为起始原料而合成的。

4.根据权利要求2所述的双边生物素-酞菁锌轭合物的制备方法，其特征在于：化合物（Ⅰ）的具体合成步骤为：将化合物（Ⅱ）和化合物（Ⅲ）按摩尔比1:2.5加入至7 mL CHCl₃、乙醇和水的混合液中，然后再将0.1-1当量的CuSO₄·5H₂O、0.2-2当量的抗坏血酸钠加入至混合液中，室温下剧烈搅拌24小时；TLC检测反应完全后，将反应液用二氯甲烷-水萃取；有机层经无水Na₂SO₄ 干燥后减压旋干除去溶剂；然后以二氯甲烷-甲醇为洗脱剂，硅胶柱层析分离纯化后，用二氯甲烷-甲醇-石油醚重结晶得到化合物（Ⅰ）。

5.根据权利要求4所述的双边生物素-酞菁锌轭合物的制备方法，其特征在于：CHCl₃、乙醇和水按体积比12:1:1混合制得混合液；二氯甲烷、甲醇按体积比15:1混合作为洗脱剂；二氯甲烷、甲醇、石油醚按体积比10:1:50混合用于重结晶。

6.根据权利要求3所述的双边生物素-酞菁锌轭合物的制备方法，其特征在于：化合物（Ⅱ）的具体合成步骤为：将2当量的氢化钠均匀分散于无水四氢呋喃中，再将化合物（Ⅳ）的四氢呋喃溶液缓慢加入到上述反应液中，搅拌均匀后加入2当量的溴丙炔，氮气保护下60℃反应过夜，TLC检测反应完全，待反应液冷却至室温后加入少量水，搅拌片刻后，减压旋蒸除去四氢呋喃，用二氯甲烷和水萃取，合并有机相，并用无水Na₂SO₄干燥，减压旋蒸除去溶剂，以二氯甲烷-甲醇为洗脱剂，经硅胶色谱柱纯化得蓝绿色固体化合物（Ⅱ）。

7.一种如权利要求1所述的轭合物在制备分子靶向抗癌光敏药物中的应用。